(57)【要約】インターロイキン−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）に対するヒト型化ＰＭ−１抗体のサブタイプであって、片方の重鎖Ｃ末端がＰｒｏ−ＮＨ２（４４７）である抗体サブタイプ（１）、及びインターロイキン−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）に対するヒト型化ＰＭ−１抗体のサブタイプであって、両方の重鎖Ｃ末端がＰｒｏ−ＮＨ２（４４７）である抗体サブタイプ（２）、並びにこれらを含んで成る医薬組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）に対するヒト型化ＰＭ−１抗体のサブタイプであって、片方の重鎖Ｃ末端がＰｒｏ−ＮＨ２（４４７）である抗体サブタイプ（１）。
【請求項２】
インターロイキン−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）に対するヒト型化ＰＭ−１抗体のサブタイプであって、両方の重鎖Ｃ末端がＰｒｏ−ＮＨ２（４４７）である抗体サブタイプ（２）。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のサブタイプに対応するヒト型化ＰＭ−１抗体の生来型の重鎖が、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１又は２に記載の抗体サブタイプ。
【請求項４】
重鎖Ｎ末端のグルタミン（Ｇｌｎ）がピログルタミン酸（ｐＧｌｕ）である、請求項３に記載の抗体サブタイプ。
【請求項５】
前記ヒト型化ＰＭ−１抗体サブタイプの軽鎖が、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体サブタイプ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の、サブタイプ（１）もしくはサブタイプ（２）、又はサブタイプ（１）及び（２）の両者を含んで成る医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、インターロイキン−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）に対する抗体の一種であるヒト型化ＰＭ−１抗体の新規なサブタイプに関する。
【背景技術】  遺伝子組換えにより生産されたタンパク質は、理論上は、遺伝子配列から推定されるアミノ酸配列を有するはずであるが、実際上は、種々の変異体が生産される場合がある。これは、既知の又は新規な生体内（転写後）修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）や自然発生の（非酵素的な）タンパク分解によるものである（Ｒ．Ｊ．Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ７０５（１９９５）１２９−１３４）。医薬品の成分として使用されるタンパク質は、生体による生合成過程を利用する遺伝子組換え法により生産されるため、分子構造が異なるサブタイプが生産される可能性がある。サブタイプの種類や含有量は医薬品の品質を規定するものであるので、サブタイプのプロファイルを特性解析し、医薬品組成物としての有用性を担保することが重要である。
ＩＬ−６はＢ細胞刺激因子２（ＢＳＦ２）あるいはインターフェロンβ２とも呼称されたサイトカインである。ＩＬ−６は、Ｂリンパ球系細胞の活性化に関与する分化因子として発見され（Ｈｉｒａｎｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２４，７３−７６）、その後、種々の細胞の機能に影響を及ぼす多機能サイトカインであることが明らかになった（Ａｋｉｒａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９３）５４，１−７８）。ＩＬ−６は、Ｔリンパ球系細胞の成熟化を誘導することが報告されている（Ｌｏｔｚ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９８８）１６７，１２５３−１２５８）。
ＩＬ−６は、細胞上で二種の蛋白質を介してその生物学的活性を伝達する。一つは、ＩＬ−６が結合する分子量約８０ｋＤのリガンド結合性蛋白質のＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）である（Ｔａｇａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９８７）１６６，９６７−９８１，Ｙａｍａｓａｋｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）２４１，８２５−８２８）。ＩＬ−６Ｒは、細胞膜を貫通して細胞膜上に発現する膜結合型の他に、主にその細胞外領域からなる可溶性ＩＬ−６Ｒとしても存在する。
抗ＩＬ−６Ｒ抗体に関しては、いくつかの報告がある（Ｎｏｖｉｃｋ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（１９９１）１０，１３７−１４６、Ｈｕａｎｇ，Ｙ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（１９９３）１２，６２１−６３０、国際特許出願公開番号ＷＯ  ９５−０９８７３、フランス特許出願公開番号ＦＲ  ２６９４７６７、米国特許番号ＵＳ  ５２１６２８）。その一つであるマウス抗体ＰＭ−１（Ｈｉｒａｔａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８９）１４３，２９００−２９０６）の相捕性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体へ移植することにより得られたヒト型化ＰＭ−１抗体が知られている（国際特許出願公開番号ＷＯ  ９２−１９７５９）。
しかしながら、ヒト型化ＰＭ−１抗体のサブタイプについては知られていない。
【特許文献１】ＷＯ  ９２／１９７５９
【特許文献２】特開平８−９９９０２合公報
【特許文献３】フランス特許出願公開番号ＦＲ  ２６９４７６７
【特許文献４】米国特許番号ＵＳ  ５２１６２８
【非特許文献１】Ｒ．Ｊ．Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ  ７０５（１９９５）１２９−１３４
【非特許文献２】Ｈｉｒａｎｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２４，７３−７６
【非特許文献３】Ａｋｉｒａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９３）５４，１−７８
【非特許文献４】Ｌｏｔｚ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９８８）１６７，１２５３−１２５８
【非特許文献５】Ｔａｇａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９８７）１６６，９６７−９８１
【非特許文献６】Ｙａｍａｓａｋｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）２４１，８２５−８２８
【非特許文献７】Ｎｏｖｉｃｋ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（１９９１）１０，１３７−１４６
【非特許文献８】Ｈｕａｎｇ，Ｙ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（１９９３）１２，６２１−６３０
【非特許文献９】Ｈｉｒａｔａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８９）１４３，２９００−２９０６
【発明の開示】
従って、本発明はヒト型化ＰＭ−１抗体の新規なサブタイプ、及び当該サブタイプを含んで成る医薬組成物を提供するものである。
本発明者は、組換え生産されたヒト型化ＰＭ−１抗体を精密に分離した結果、ヒト型化ＰＭ−１抗体の重鎖を構成する定常領域のＣ−末端（４４８位）のＧｌｙが欠落して４４７位のＰｒｏがアミド化された分子種が存在し、且つ、抗体を構成する２本の重鎖の内、一方のみがアミド化されている抗体サブタイプ（サブタイプ１と称する）と両方がアミド化されている抗体サブタイプ（サブタイプ２と称する）が存在することを見出した。更に、本発明者は、上記いずれのサブタイプも、Ｃ−末端がＧｌｙ（４４８）である生来型抗体と同等の抗原結合性及び細胞増殖阻害活性を有することを見出し、本発明を完成した。
従って、本発明は、インターロイキン−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）に対するヒト型化ＰＭ−１抗体のサブタイプであって、片方の重鎖Ｃ末端がＰｒｏ−ＮＨ２（４４７）である抗体サブタイプ（１）、及びインターロイキン−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）に対するヒト型化ＰＭ−１抗体のサブタイプであって、両方の重鎖Ｃ末端がＰｒｏ−ＮＨ２（４４７）である抗体サブタイプ（２）を提供する。上記の両サブタイプに対応するヒト型化ＰＭ−１抗体の生来型の重鎖Ｃ末端はＧｌｙ（４４８）である。好ましい態様において、アミド化された重鎖サブタイプに対応する生来の重鎖は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有する。好ましい一つの態様において、重鎖Ｎ末端のグルタミン（Ｇｌｎ）がピログルタミン酸（ｐＧｌｕ）に変っている。また、好ましい態様において、本発明の抗体サブタイプを構成する軽鎖は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する。
本発明はまた、上記のサブタイプ（１）もしくはサブタイプ（２）又はサブタイプ（１）及び（２）の両者を含んで成る医薬組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】  図１は、ペプチド断片ＳＬＳＬＳＰの液体クロマトグラフ（ＬＣ）‐質量分析（ＭＳ）における液体クロマトグラフィーの結果を示し、上段は２１５ｎｍの紫外線で検出したクロマトグラムを示し、下段はベースピーククロマトグラムを示す。
図２は、ペプチド断片ＳＬＳＬＳＰの液体クロマトグラフ（ＬＣ）‐質量分析（ＭＳ）におけるマススペクトルを示す。
図３は、ペプチド断片ＳＬＳＬＳＰの液体クロマトグラフ（ＬＣ）‐質量分析（ＭＳ）におけるズームスキャンスペクトルを示す。
図４は、ペプチド断片ＳＬＳＬＳＰ−ＮＨ２液体クロマトグラフ（ＬＣ）‐質量分析（ＭＳ）における液体クロマトグラフィーの結果を示し、上段は２１５ｎｍの紫外線で検出したクロマトグラムを示し、下段はベースピーククロマトグラムを示す。
図５は、ペプチド断片ＳＬＳＬＳＰ−ＮＨ２の液体クロマトグラフ（ＬＣ）‐質量分析（ＭＳ）におけるマススペクトルを示す。
図６は、ペプチド断片ＳＬＳＬＳＰ−ＮＨ２の液体クロマトグラフ（ＬＣ）‐質量分析（ＭＳ）におけるズームスキャンスペクトルを示す。
図７は、ペプチド断片ＳＬＳＬＳＰとＳＬＳＬＳＰ−ＮＨ２の混合溶液の、液体クロマトグラフ（ＬＣ）‐質量分析（ＭＳ）における液体クロマトグラフィーの結果を示し、上段は２１５ｎｍの紫外線で検出したクロマトグラムを示し、下段はベースピーククロマトグラムを示す。
図８は、図７における保持時間４４分でのピークのマススペクトルを示す。
図９は、図７における保持時間５１分でのピークのマススペクトルを示す。
図１０において、Ａは、ヒト型化ＰＭ−１抗体（Ｍａｉｎ）を還元／カルボキシメチル化しトリプシン消化したペプチドのペプチドマップを示し；ＢにおいてＳＬＳＬＳＰＧ（ｍ／ｚ  ６６０．３±０．５における選択的モニタリング）の、ＣにおいてＳＬＳＬＳＰ−ＮＨ２（ｍ／ｚ  ６０２．３±０．５における選択的モニタリング）の、そしてＤにおいてＳＬＳＬＳＰ（ｍ／ｚ  ６０３．３±０．５における選択的モニタリング）の分子量についてのＭＳクロマトグラムを示す。
図１１は、ヒト型化ＰＭ−１抗体（Ｍａｉｎ）を還元／カルボキシメチル化しトリプシン消化したペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の結果を示し、上段は２１５ｎｍの紫外線で検出したクロマトグラムを示し、下段はベースピーククロマトグラムを示す。
図１２は、図１１における保持時間５０分でのピークのマススペクトルを示す。
図１３は、図１１と同じピークのズームスキャンスペクトルを示す。
図１４において、Ａは、ヒト型化ＰＭ−１抗体サブタイプ１をトリプシン消化し、還元／カルボキシメチル化したペプチドのペプチドマップを示し；ＢにおいてＳＬＳＬＳＰＧ（ｍ／ｚ  ６６０．３±０．５における選択的モニタリング）の、ＣにおいてＳＬＳＬＳＰ−ＮＨ２（ｍ／ｚ  ６０２．３±０．５における選択的モニタリング）の、そしてＤにおいてＳＬＳＬＳＰ（ｍ／ｚ  ６０３．３±０．５における選択的モニタリング）の分子量についてのＭＳクロマトグラムを示す。
図１５は、ヒト型化ＰＭ−１抗体サブタイプ１を還元／カルボキシメチル化しトリプシン消化したペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析における液体クロマトグラフィー（ＬＣ）の結果（図１７のＢのピークについて）を示し、の上段は２１５ｎｍの紫外線で検出したクロマトグラムを示し、下段はベースピーククロマトグラムを示す。
図１６は、図１５における保持時間４８分でのピークのマススペクトルを示す。
図１７は、図１６と同じピークのズームスキャンスペクトルを示す。
図１８は、ヒト型化ＰＭ−１抗体サブタイプ１を還元／カルボキシメチル化し、トリプシン消化したペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析における液体クロマトグラフィー（ＬＣ）の結果（図１７のＣのピークについて）を示し、上段は２１５ｎｍの紫外線で検出したクロマトグラムを示し、下段はベースピーククロマトグラムを示す。
図１９は、図１８における保持時間４６分でのピークのマススペクトルを示す。
図２０は、図１９と同じピークのズームスキャンスペクトルを示す。
図２１において、Ａは、ヒト型化ＰＭ−１抗体サブタイプ２を還元／カルボキシメチル化し、トリプシン消化したペプチドのペプチドマップを示し；ＢにおいてＳＬＳＬＳＰＧ（ｍ／ｚ  ６６０．３±０．５における選択的モニタリング）の、ＣにおいてＳＬＳＬＳＰ−ＮＨ２（ｍ／ｚ  ６０２．３±０．５における選択的モニタリング）の、そしてＤにおいてＳＬＳＬＳＰ（ｍ／ｚ  ６０３．３±０．５における選択的モニタリング）の分子量についてのＭＳクロマトグラムを示す。
図２２は、ヒト型化ＰＭ−１抗体サブタイプ２を還元／カルボキシメチル化し、トリプシン消化したペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析における液体クロマトグラフィー（ＬＣ）の結果を示し、上段は２１５ｎｍの紫外線で検出したクロマトグラムを示し、下段はベースピーククロマトグラムを示す。
図２３は、図２２における保持時間４５分でのピークのマススペクトルを示す。
図２４は、図２３と同じピークのズームスキャンスペクトルを示す。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明の抗体サブタイプに対応する生来のヒト型化ＰＭ−１抗体は、ＩＬ−６Ｒに対する、ＰＭ−１と称するマウスモノクローナル抗体の重鎖（Ｈ鎖）及び軽鎖（Ｌ鎖）を構成する可変領域（Ｖ領域）中の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、ヒト抗体Ｖ領域の対応するＣＤＲ領域と置き換えたものである。前記マウス抗ＩＬ−６Ｒ抗体のＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲのアミノ酸配列は、国際公開ＷＯ  ９２／１９７５９の表２のＬＶＰＭ−１の行のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に記載されており、また、前記マウス抗ＩＬ−６Ｒ抗体のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲのアミノ酸配列は、国際公開ＷＯ  ９２／１９７５９の表３のＨＶＰＭ−１の行のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に記載されている。
上記ヒト型化ＰＭ−１抗体のＬ鎖Ｖ領域のフレームワーク領域（ＦＲ）は、ヒト抗体ＲＥＩ由来のものが好ましく、そのアミノ酸配列は、国際公開ＷＯ  ９２／１９７５９の表２のＲＥＩの行のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＥＲ４に記載されている。また、上記ヒト型化ＰＭ−１抗体のＨ鎖Ｖ領域のフレームワーク領域（ＦＲ）は、ヒト抗体ＮＥＷ由来のものが好ましく、そのアミノ酸配列は、国際公開ＷＯ  ９２／１９７５９の表３のＮＥＷの行のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４に記載されている。
更に、上記の、ヒト抗体のＦＲとマウスＰＭ−１抗体のＣＤＲから構成されるＶ鎖の内、ＦＲ領域は、抗原結合性や中和活性の改善のため、種々改変されていても良く、例えば、Ｌ鎖Ｖ領域については、国際公開ＷＯ  ９２／１９７５９の表２のＲＶＬａ及びＲＶＬｂの行のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４に記載されている（バージョンａ及びバージョンｂと称する）、また、Ｈ鎖Ｖ領域については、国際公開ＷＯ  ９２／１９７５９の表３のＲＶＨａ〜ＲＶＨｆの行のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４に記載されている（バージョンａ〜バージョンｆと称する）。
ヒト型化ＰＭ−１抗体のＬ鎖は、上に記載したＬ鎖Ｖ領域とヒト抗体Ｌ鎖の定常領域（Ｃ領域）とから成り、またヒト型化ＰＭ−１抗体のＨ鎖は、上に記載したＨ鎖Ｖ領域とヒト抗体Ｈ鎖の定常領域（Ｃ領域）とから成る。Ｌ鎖を構成するＣ領域としては、ヒトγ−ＩＣ領域が好ましく、またＨ鎖を構成するＣ領域としては、ヒトκＣ領域が好ましい。
モノクローナル抗体のＮ末端アミノ酸のグルタミンはピログルタミル化することが知られており、本発明のヒト型化ＰＭ−１抗体のサブタイプ１及び２は、その重鎖のＮ末端のグルタミンがピログルタミル化されたものであってもよい。すなわち、本発明のヒト型化ＰＭ−１抗体のサブタイプ１及び２は、重鎖Ｎ末端のグルタミン（Ｇｌｎ）がピログルタミン酸（ｐＧｌｕ）である抗体サブタイプであってもよい。
こうして構成されるヒト型化ＰＭ−１抗体のＬ鎖及びＨ鎖としては上記の如く、ＦＲ領域の改変により種々のバージョンが存在するが、特に好ましい例として、配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するＨ鎖、及び配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するＬ鎖が挙げられる。
なお、モノクローナル抗体ＰＭ−１のＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを含んで成るプラスミドｐＰＭ−ｋ３を含む大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５  α  ｐＰＭ−ｋ３はＮＣＩＭＢ  ４０３６６として、またモノクローナル抗体ＰＭ−１のＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを含んで成るプラスミドｐＰＭ−ｈ１を含む大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５  α  ｐＰＭ−ｈ１はＮＣＩＭＢ  ４０３６２として、１９９１年２月１２日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ  Ｅｓｔａｔｅ，Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ  ＡＢ２１  ９ＹＡ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）にブタペスト条約に基づき国際寄託されている。また、モノクローナル抗体ＰＭ−１を産生するハイブリドーマＰＭ１は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−２９９８として、１９８９年７月１２日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にプタペスト条約に基づき国際寄託されている。
上記の如きアミノ酸配列を有するＬ鎖又はＨ鎖をコードするＤＮＡは、常法に従って構築することが出来る。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ＦＲ；ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ  ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ  ９２−１９７５９参照）。
ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。
ヒト型化抗体には、ヒト抗体Ｃ領域が使用される。ヒト抗体Ｃ領域としては、Ｃγが挙げられ、例えば、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３又はＣγ４を使用することができる。
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現される抗体遺伝子、その３’側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させたＤＮＡあるいはそれを含むベクターにより発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター／エンハンサー（ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ）を挙げることができる。
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス４０（ＳＶ  ４０）等のウィルスプロモーター／エンハンサーやヒトエロンゲーションファクター１  α（ＨＥＦ１α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサーを用いればよい。
例えば、ＳＶ  ４０  プロモーター／エンハンサーを使用する場合、Ｍｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８−１１４）、また、ＨＥＦ１αプロモーター／エンハンサーを使用する場合、Ｍｉｚｕｓｈｉｍａらの方法（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．ａｎｄ  Ｎａｇａｔａ，Ｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）に従えば容易に実施することができる。
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列、発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーターとしては、ｌａｃＺプロモーター、ａｒａＢプロモーターを挙げることができる。ｌａｃＺプロモーターを使用する場合、Ｗａｒｄらの方法（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４−５４６；Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）、ａｒａＢプロモーターを使用する場合、Ｂｅｔｔｅｒらの方法（Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）に従えばよい。
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９−４３８３）を使用すればよい。ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切にリフォールド（ｒｅｆｏｌｄ）して使用する（例えば、ＷＯ９６／３０３９４を参照）。
複製起源としては、ＳＶ  ４０、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の産生系を使用することができる。抗体製造のための産生系は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの産生系がある。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、動物細胞、植物細胞、又は真菌細胞を用いる産生系がある。動物細胞としては、（１）哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏなど、（２）両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは（３）昆虫細胞、例えば、ｓｆ９、ｓｆ２１、Ｔｎ５などが知られている。植物細胞としては、ニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えばアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）などが知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌が知られている。
これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。培養は、公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。また、抗体遺伝子を導入した細胞を動物の腹腔等へ移すことにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにて抗体を産生してもよい。
一方、ｉｎ  ｖｉｖｏの産生系としては、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系などがある。
哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシなどを用いることができる（Ｖｉｃｋｉ  Ｇｌａｓｅｒ，ＳＰＥＣＴＲＵＭ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３）。また、昆虫としては、カイコを用いることができる。植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。
これらの動物又は植物に抗体遺伝子を導入し、動物又は植物の体内で抗体を産生させ、回収する。例えば、抗体遺伝子をヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生される蛋白質をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
また、カイコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させ、このカイコの体液より所望の抗体を得る（Ｍａｅｄａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５，５９２−５９４）。さらに、タバコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を植物発現用ベクター、例えばｐＭＯＮ  ５３０に挿入し、このベクターをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えばＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍに感染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得る（Ｊｕｌｉａｎ，Ｋ．−Ｃ．Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４，１３１−１３８）。
上述のようにｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏの産生系にて抗体を産生する場合、抗体重鎖（Ｈ鎖）又は軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで、宿主を形質転換させてもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ  ９４−１１５２３参照）。
本発明のヒト型化ＰＭ−１抗体のサブタイプ１及び２を製造するには、宿主として動物の培養細胞、特に好ましくはＣＨＯ細胞を使用し、それを動物細胞培養用培地で培養するのが好ましい。また、タンパク質の加水分解物であるペプトンを含む培地が好ましく、牛肉、豚肉、大豆、米、魚肉などに由来するペプトンが使用される。一般に動物由来ペプトンで発現効果が高く、また魚肉（例えば、カツオ）に由来するペプトンを用いると発現量に効果がある。この場合、哺乳動物性ペプトンを含む培地を用いてヒト型化ＰＭ−１抗体を製造する場合、サブタイプ１及び２の生成が殆ど見られず、魚肉由来ペプトンや植物性ペプトンなどを含む培地を用いてヒト型化ＰＭ−１抗体を製造する場合、サブタイプ１及び２の比率が高くなる。従って、本発明のヒト型化ＰＭ−１抗体のサブタイプ１又は２を製造するには、宿主として動物の培養細胞、特に好ましくはＣＨＯ細胞を使用し、それを魚肉由来ペプトンや植物由来ペプトンを含む培地で培養するのが特に好ましい。
前記のように産生、発現された抗体は、細胞内外、宿主から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティークロマトグラフィーにより行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。プロテインＡカラムに用いる担体として、例えば、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、ＰＯＲＯＳ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。
また、上記アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィー、例えば、一般のカラムクロマトグラフィー、例えばイオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなどの組み合わせによって行うことが出来る。
更に、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせれば、本発明で使用される抗体を分離、精製することができる。これらのクロマトグラフィーはＦＰＬＣ（Ｆａｓｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）或はＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）に適用し得る。また、逆相ＨＰＬＣ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｈａｓｅ  ＨＰＬＣ）を用いてもよい。
上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又はＥＬＩＳＡ等により行うことができる。すなわち、吸光度の測定による場合には、ＰＢＳ（−）で適当に希釈した後、２８０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍＬを約１．３５  ＯＤとして算出する。また、ＥＬＩＳＡによる場合は以下のように測定することができる。すなわち、０．１Ｍ重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で１μｇ／ｍＬに希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＴＡＧ製）１００μＬを９６穴プレート（Ｎｕｎｃ製）に加え、４℃で一晩インキュベーションし、抗体を固相化する。ブロッキングの後、適宜希釈した本発明で使用される抗体又は抗体を含むサンプル、あるいは標品としてヒトＩｇＧ（ＣＡＰＰＥＬ製）１００μＬを添加し、室温にて１時間インキュベーションする。
洗浄後、５０００倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ（ＢＩＯ  ＳＯＵＲＣＥ製）１００μＬを加え、室温にて１時間インキュベートする。洗浄後、基質溶液を加えインキュベーションの後、ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ  ＲＥＡＤＥＲ  Ｍｏｄｅｌ  ３５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）を用いて４０５ｎｍでの吸光度を測定し、目的の抗体の濃度を算出する。
本願発明のヒト型化ＰＭ−１抗体のサブタイプは、生来のヒト型化ＰＭ−１抗体と実質的に同じ抗原結合性を有するため、生来のヒト型化ＰＭ−１抗体と同様にＩＬ−６が関連する各種の疾患の治療または予防のために用いることが出来る。ＩＬ−６関連疾患の例としては、急性、慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、例えば、腎炎、メサンギュウム増殖性腎炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、膵炎、小児慢性関節炎、または全身型若年性特発性関節炎、血管炎、川崎病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、乾癬、シェーグレン症候群、成人スチル病；腫瘍性疾患、例えば、多発性骨髄腫、キャッスルマン病、悪性リンパ腫、腎癌；感染症、例えば、ＨＩＶ感染症、ＥＢＶ感染症；悪液質；その他、プラズマサイト−シス、高イムノグロブリン症、貧血などがあげられ、好ましくは、慢性関節リウマチ、プラズマサイト−シス、高イムノグロブリン症、貧血、腎炎、悪液質、多発性骨髄腫、キャッスルマン病、メサンギュウム増殖性腎炎、全身性エリテマトーデス、クローン病、膵炎、乾癬、小児慢性関節炎、または全身型若年性突発性関節炎である。
本発明の医薬組成物は、経口的にまたは非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、胸腔内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐薬、注腸、経口性腸溶剤などを選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。有効投与量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇから１００ｍｇの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり１〜１０００ｍｇ、好ましくは５〜５０ｍｇの投与量を選ぶことができる。
好ましい投与量、投与方法は、たとえば抗ＩＬ−６レセプター抗体の場合には、血中にフリーの抗体が存在する程度の量が有効投与量であり、具体的な例としては、体重１ｋｇあたり１ヶ月（４週間）に０．５ｍｇから４０ｍｇ、好ましくは１ｍｇから２０ｍｇを１回から数回に分けて、例えば２回／週、１回／週、１回／２週、１回／４週などの投与スケジュールで点滴などの静脈内注射、皮下注射などの方法で、投与する方法などである。投与スケジュールは、病状の観察および血液検査値の動向を観察しながら２回／週あるいは１回／週から１回／２週、１回／３週、１回／４週のように投与間隔を延ばしていくなど調整することも可能である。
本発明の医薬組成物は、投与経路次第で医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。このような担体および添加物の例として、水、医薬的に許容される無機塩、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などが挙げられる。使用される添加物は、剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。
【実施例】  以下、実施例および参考例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１． 生来のヒト型化ＰＭ−１抗体／サブタイプ１／サブタイプ２を含む抗体組成物の発現
発現細胞の構築
（１）ヒトＩＬ−６レセプター抗体ＰＭ−１の調製
Ｈｉｒａｔａらの方法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４３：２９００−２９０６，１９８９）により作成した抗ＩＬ−６Ｒ抗体ＭＴ１８をＣＮＢｒにより活性化させたセファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）と添付の処方にしたがって結合させ、ＩＬ−６Ｒ（Ｙａｍａｓａｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：８２５−８２８，１９８８）を精製した。
すなわち、ヒトミエローマ細胞株Ｕ２６６を１％ジギトニン（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）、１０ｍＭトリエタノールアミン（ｐＨ７．８）および０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む１ｍＭ  ｐ−パラアミノフェニルメタンスルフォニルフルオライドハイドロクロリド（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）（ジギトニン緩衝液）で可溶化し、セファロース４Ｂビーズと結合させたＭＴ１８抗体と混合した。その後、ビーズをジギトニン緩衝液で６回洗浄し、免疫に用いる部分精製ＩＬ−６Ｒとした。
ＢＡＬＢ／ｃマウスを３×１０９個のＵ２６６細胞から得た上記部分精製ＩＬ−６Ｒで１０日おきに４回免疫し、その後常法によりハイブイドーマを作成した。成長陽性ウェルからのハイブリドーマ培養上清を下記の方法にてＩＬ−６Ｒへの結合活性を調べた。５×１０７個のＵ２６６細胞を３５Ｓ−メチオニン（２．５ｍＣｉ）で標識し、上記ジギトニン緩衝液で可溶化した。
可溶化したＵ２６６細胞を０．０４ｍＬ容量のセファロース４Ｂビーズと結合させたＭＴ１８抗体と混合し、その後、ジギトニン緩衝液で６回洗浄し、０．２５ｍＬのジギトニン緩衝液（ｐＨ３．４）により３５Ｓ−メチオニン標識ＩＬ−６Ｒを流出させ、０．０２５ｍＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）で中和した。０．０５ｍＬのハイブリドーマ培養上清を０．０１ｍＬのＰｒｏｔｅｉｎＧセファロース（Ｐｈｒａｍａｃｉａ製）と混合した。
洗浄した後、セファロースを上記で調製した０．００５ｍＬの３５Ｓ標識ＩＬ−６Ｒ溶液とともにインキュベートした。免疫沈降物質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ＩＬ−６Ｒと反応するハイブリドーマ培養上清を調べた。その結果、反応陽性ハイブリドーマクローンＰＭ−１を樹立した。ハイブリドーマＰＭ−１から産生されるＩＬ−６Ｒ抗体ＰＭ−１は、ＩｇＧｌκ型のサブタイプを有する。
ハイブリドーマＰＭ−１が産生する抗体のヒトＩＬ−６Ｒに対するＩＬ−６の結合阻害活性をヒトミエローマ細胞株Ｕ２６６を用いて調べた。ヒト組換え型ＩＬ−６を大腸菌より調製し（Ｈｉｒａｎｏら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１７：４１，１９８８）、ボルトン−ハンター試薬（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ．ＭＡ）により１２５Ｉ標識した（Ｔａｇａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：９６７，１９８７）。４×１０５個のＵ２６６細胞を、１００倍量の過剰な非標識ＩＬ−６の存在下で室温にて、１時間、７０％（ｖ／ｖ）のハイブリドーマＰＭ−１の培養上清及び１４０００ＣＰＭの１２５Ｉ標識ＩＬ−６とともに培養した。７０μＬのサンプルを４００μＬのマイクロフュージポリエチレンチューブに入れた３００μＬのＦＣＳ上に重層し、遠心の後、細胞上の放射活性を測定した。その結果、ハイブリドーマＰＭ−１が産生する抗体は、ＩＬ−６のＩＬ−６Ｒに対する結合を阻害することが明らかとなった。
（２）ヒト型化抗体ｈＰＭ−１の作成
国際特許出願公開番号ＷＯ９２／１９７５９号公報の実施例１０に記載されたヒトエロンゲーションファクターＩαプロモーターを利用し、特開平８−９９９０２号公報の参考例２に記載された方法に準じて、Ｌ鎖およびＨ鎖両遺伝子を含む単一の発現ベクターを作成し、この発現ベクターをＣＨＯ細胞に挿入することにより作製したヒト型化ＰＭ−１抗体（抗ヒトＩＬ−６レセプター抗体）を産生するＣＨＯ細胞株を用いて試験した。得られたヒト型化抗体のヒトＩＬ−６Ｒへの結合能はＥＬＩＳＡにて確認した。さらに、ｈＰＭ−１はマウス抗体およびキメラ抗体と同様に、ヒトＩＬ−６のヒトＩＬ−６Ｒへの結合を阻害した。
細胞培養とヒト型化ＰＭ−１抗体の発現
大量のヒト型化ＰＭ−１抗体を得るために、発現細胞を市販の無血清培地またはその改変培地で培養した。培養条件は、一般にＣＨＯ細胞の培養に適した環境で行った。培地中には目的抗体の発現量を増やすため、種々の添加物を加えることが可能であった。その中で、各種ペプトンは一般に広く用いられている。牛肉、豚肉、大豆、米、魚肉などに由来するペプトンが広く市販されているが、その効果は細胞株との相性による。一般に動物由来ペプトンで発現効果が高い。各種ペプトンによる効果を調べる過程で、魚肉（カツオ）に由来するペプトンを用いると発現量に効果があることがわかった。
発現された抗体の精製は、一般的なカラムクロマトグラフィー、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなどの組み合わせによって行った。魚肉に由来するペプトンを用いてＣＨＯ細胞を培養して発現されたヒト型化ＰＭ−１抗体の分子種に、牛肉由来ペプトンを用いた時には僅かしか見られない分子種が見られた。この分子種は、植物由来ペプトンを用いた場合にも見られた。
実施例２． ヒト型化ＰＭ−１抗体サブタイプ１及びサブタイプ２の分析
材料および方法
試料として、ヒト型化ＰＭ−１抗体の生来型（Ｍａｉｎと称する場合がある）、当該抗体のサブタイプ１及びサブタイプ２、並びに比較標準ペプチドとして、ヒト型化ＰＭ−１抗体のＣ−末端に存在し、Ｃ−末端のＧｌｙが除去されたペプチドＳｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ（ＳＬＳＬＳＰ）及びそのＣ−末端Ｐｒｏがアミド化されたペプチドＳＬＳＬＳＰ−ＮＨ２を使用した。ペプチドＳＬＳＬＳＰ及びアミド化ペプチドＳＬＳＬＳＰ−ＮＨ２は化学合成した。ヒト型化ＰＭ−１抗体Ｍａｉｎ、当該抗体のサブタイプ１及びサブタイプ２は、実施例１で得たヒト型化ＰＭ−１抗体を、下記の方法で、カラムクロマトグラフィーにより分取、精製することにより得た。
カラムとしてＰｏｌｙ  ＬＣ製Ｐｏｌｙ  ＣＡＴ  Ａ（１００×４．６ｍｍ）、ガードカラムとしてＰｏｌｙ  ＬＣ製Ｐｏｌｙ  ＣＡＴ  Ａ  Ｊａｖｅｌｉｎ  ｇｕａｒｄ（１０×４．０ｍｍ）を使用した。移動相として、移動相Ａ（０．０５％  ＮａＮ３を含むｐＨ６．１の２５ｍＭ  ２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸緩衝液）及び移動相Ｂ（２５０ｍＭ酢酸ナトリウムと０．０５％  ＮａＮ３を含むｐＨ６．１の２５ｍＭ  ２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸緩衝液）を使用した。グラジエント条件は、移動相Ｂの比率を、０分／３５％、５分／３５％、５９分／６０％、６０分／１００％とした。流速を１ｍＬ／分とし、２８０ｎｍにおける紫外可視吸光度により検出した。
ヒト型化ＰＭ−１抗体  Ｍａｉｎ、サブタイプ１及びサブタイプ２の酵素消化
２００μｇ相当量のヒト型化ＰＭ−１抗体  Ｍａｉｎ、サブタイプ１及びサブタイプ２を、それぞれ簡易限外濾過カートリッジ（ミニセント，東ソー製）に入れ、変性剤溶液（７Ｍ  グアニジン、１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸を含むｐＨ８．３の１００ｍＭ  ２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール‐塩酸緩衝液）を加えて液量を５００μＬとした。カートリッジを５℃で遠心し、液量を約５０μＬとした。マイクロチューブに試料を回収し、変性剤溶液（前記と同一組成）を加え全量を３００μＬとした。
各溶液にＤＴＴ溶液（１６２ｍＭジチオスレイトールを含む変性剤溶液）５０μＬを加えヘッドスペースをＮ２置換し、恒温ブロック中３７℃で１時間放置した。さらに、ＩＡＡ溶液（４１７ｍＭヨード酢酸を含む０．２Ｎ水酸化ナトリウム溶液）４５μＬを加え、遮光下３７℃で３０分間放置した。反応液を回収し、それぞれの試料について、透析チューブを用いてＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（２Ｍ尿素を含むｐＨ８．０の１００ｍＭ  ２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール‐塩酸緩衝液）５００ｍＬに対し、５℃で約２０時間透析（透析膜：ｍ．ｗ．＝８０００，スペクトラム製）を行なった。透析した試料を回収し、それぞれにトリプシン溶液（トリプシンをＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（前記と同じ組成）に溶解し２５０ｎｇ／μＬとする）を２０μＬ加え、３７℃で１６時間放置した。
トリプシン処理物及び比較標準ペプチドの分析
上記の通りトリプシン処理した試料４０μＬを液体クロマトグラフ‐質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）測定に供した。標準ペプチド溶液、即ち、ＳＬＳＬＳＰ溶液（ＳＬＳＬＳＰを水に溶解し４μＭとする）及びＳＬＳＬＳＰ−ＮＨ２溶液（ＳＬＳＬＳＰ−ＮＨ２を水に溶解し４μＭとする）については、５０μＬを液体クロマトグラフ‐質量分析に供した。
液体クロマトグラフ条件は次の通りとした。即ち、カラムとしてワイエムシィ製ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ（２５０×２．０ｍｍ、５μｍ、３００Å）を使用した。移動相として、移動相Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸を含む５％アセトニトリル溶液）及び移動相Ｂ（０．１％トリフルオロ酢酸を含む９５％アセトニトリル溶液）を使用した。グラジエント条件は、移動相Ｂの比率を、０分／０％、１０分／０％、１２０分／３５％、１４０分／３５％とした。流速を０．２ｍＬ／分とし、２１５ｎｍにおける紫外可視吸光度により検出を行なった。
トリプシン処理物及び比較標準ペプチドの分析結果
（１）比較標準ペプチド断片の測定
（ａ）ペプチド断片ＳＬＳＬＳＰの測定
図１〜図３は、ペプチド断片ＳＬＳＬＳＰの液体クロマトグラフ（ＬＣ）‐質量分析（ＭＳ）結果を示す。図１の上段は２１５ｎｍの紫外線で検出したクロマトグラムを示し、下段はベースピーククロマトグラムを示す。図２はマススペクトルを示し、そして図３はズームスキャンスペクトルを示す。得られた分子量（６０２．２）は、理論値（６０２．３；モノアイソトピック分子量）とほぼ一致した（図２及び図３）。
（ｂ）ペプチド断片ＳＬＳＬＳＰ−ＮＨ２の測定
図４〜６は、ペプチド断片ＳＬＳＬＳＰ−ＮＨ２の液体クロマトグラフ（ＬＣ）‐質量分析（ＭＳ）結果を示す。図４の上段は２１５ｎｍの紫外線で検出したクロマトグラムを示し、下段はベースピーククロマトグラムを示す。図５はマススペクトルを示し、そして図６はズームスキャンスペクトルを示す。得られた分子量（６０１．２）は、理論値（６０１．３；モノアイソトピック分子量）とほぼ一致した（図５及び図６）。
（ｃ）ペプチド断片ＳＬＳＬＳＰとＳＬＳＬＳＰ−ＮＨ２の混合の測定
図７〜９は、ペプチド断片ＳＬＳＬＳＰとＳＬＳＬＳＰ−ＮＨ２の混合溶液の、液体クロマトグラフ（ＬＣ）‐質量分析（ＭＳ）結果を示す。図７の上段は２１５ｎｍの紫外線で検出したクロマトグラムを示し、下段はベースピーククロマトグラムを示す。図８は、図７における保持時間４４分でのピークのマススペクトルを示し、そして図９は、図７における保持時間５１分でのピークのマススペクトルを示す。両ペプチド断片は上記の液体クロマトグラフィーの条件で完全に分離された。
（２）ヒト型化ＰＭ−１抗体のＨ鎖Ｃ末端構造の解析
（ａ）ヒト型化ＰＭ−１抗体（Ｍａｉｎ）のＨ鎖Ｃ末端構造の解析
図１０のＡにヒト型化ＰＭ−１抗体（Ｍａｉｎ）を還元／カルボキシメチル化し、トリプシン消化したペプチドのペプチドマップを示す。Ｈ鎖Ｃ末端断片の構造を調べるため、図１０のＢにおいてＳＬＳＬＳＰＧ（ｍ／ｚ  ６６０．３±０．５における選択的モニタリング）の、図１０のＣにおいてＳＬＳＬＳＰ−ＮＨ２（ｍ／ｚ  ６０２．３±０．５における選択的モニタリング）の、そして図１０のＤにおいてＳＬＳＬＳＰ（ｍ／ｚ  ６０３．３±０．５における選択的モニタリング）の分子量についてのＭＳクロマトグラムを示す。ＳＬＳＬＳＰＧに相当するピークが４９．７分に検出されたが、ＳＬＳＬＳＰ−ＮＨ２及びＳＬＳＬＳＰの分子量を持つペプチドフラグメントは存在しなかった。
図１１〜図１３は、ヒト型化ＰＭ−１抗体（Ｍａｉｎ）を還元／カルボキシメチル化し、トリプシン消化したペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の結果を示す。図１１の上段は２１５ｎｍの紫外線で検出したクロマトグラムを示し、下段はベースピーククロマトグラムを示す。図１２は、図１１における保持時間５０分でのピークのマススペクトルを示し、そして図１３は、図１１と同じピークのズームスキャンスペクトルを示す。これらの結果から、検出されたピークはアミノ酸配列ＳＬＳＬＳＰＧを持つ事が示された。従って、ヒト型化ＰＭ−１抗体（Ｍａｉｎ）の両方のＨ鎖Ｃ末端は−ＳＬＳＬＳＰＧ配列を持つ事が示された。
（ｂ）ヒト型化ＰＭ−１抗体サブタイプ１のＨ鎖Ｃ末端構造の解析
図１４のＡにヒト型化ＰＭ−１抗体サブタイプ１を還元／カルボキシメチル化し、トリプシン消化したペプチドのペプチドマップを示す。Ｈ鎖Ｃ末端断片の構造を調べるため、図１４のＢにおいてＳＬＳＬＳＰＧ（ｍ／ｚ  ６６０．３±０．５における選択的モニタリング）の、図１４のＣにおいてＳＬＳＬＳＰ−ＮＨ２（ｍ／ｚ  ６０２．３±０．５における選択的モニタリング）の、そして図１４のＤにおいてＳＬＳＬＳＰ（ｍ／ｚ  ６０３．３±０．５における選択的モニタリング）の分子量についてのＭＳクロマトグラムを示す。ＳＬＳＬＳＰＧに相当するピークが４７．７ｍｉｎに検出されたのに加え、ＳＬＳＬＳＰ−ＮＨ２に相当するピークも４６．２ｍｉｎに認められた。（図１４のＤにおいて分子量６０３．３のピークが４６ｍｉｎ付近に認められたが、保持時間からＳＬＳＬＳＰではない。）
図１５〜図１７は、ヒト型化ＰＭ−１抗体サブタイプ１を還元／カルボキシメチル化し、トリプシン消化したペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の結果（図１４のＢのピークについて）を示す。図１５の上段は２１５ｎｍの紫外線で検出したクロマトグラムを示し、下段はベースピーククロマトグラムを示す。図１６は、図１５における保持時間４８分でのピークのマススペクトルを示し、そして図１７は、図１６と同じピークのズームスキャンスペクトルを示す。
図１８〜図２０は、ヒト型化ＰＭ−１抗体サブタイプ１を還元／カルボキシメチル化し、トリプシン消化したペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の結果（図１４のＣのピークについて）を示す。図１８の上段は２１５ｎｍの紫外線で検出したクロマトグラムを示し、下段はベースピーククロマトグラムを示す。図１９は、図１８における保持時間４６分でのピークのマススペクトルを示し、そして図２０は、図１９と同じピークのズームスキャンスペクトルを示す。
これらの結果から、検出されたピークはアミノ酸配列ＳＬＳＬＳＰＧ及びＳＬＳＬＳＰ−ＮＨ２を持つ事が示された。従って、ヒト型化ＰＭ−１抗体サブタイプ１のＨ鎖Ｃ末端の一方は−ＳＬＳＬＳＰＧ、もう一方は−ＳＬＳＬＳＰ−ＮＨ２配列を持つ事が示された。
（ｃ）ヒト型化ＰＭ−１抗体サブタイプ２のＨ鎖Ｃ末端構造の解析
図２１のＡにヒト型化ＰＭ−１抗体サブタイプ２を還元／カルボキシメチル化し、トリプシン消化したペプチドのペプチドマップを示す。Ｈ鎖Ｃ末端断片の構造を調べるため、図２１のＢにおいてＳＬＳＬＳＰＧ（ｍ／ｚ  ６６０．３±０．５における選択的モニタリング）の、図２１のＣにおいてＳＬＳＬＳＰ−ＮＨ２（ｍ／ｚ  ６０２．３±０．５における選択的モニタリング）の、そして図２１のＤにおいてＳＬＳＬＳＰ（ｍ／ｚ  ６０３．３±０．５における選択的モニタリング）の分子量についてのＭＳクロマトグラムを示す。ＳＬＳＬＳＰＧに相当するピークが僅かに検出されたが、ＳＬＳＬＳＰ−ＮＨ２に相当するピークがより強く検出された。（図２６のＤにおいて分子量６０３．３のピークが４５分付近に認められたが、保持時間から考えてＳＬＳＬＳＰではない。）
図２２〜図２４は、ヒト型化ＰＭ−１抗体サブタイプ２を還元／カルボキシメチル化し、トリプシン消化したペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の結果を示す。図２２の上段は２１５ｎｍの紫外線で検出したクロマトグラムを示し、下段はベースピーククロマトグラムを示す。図２３は、図２２における保持時間４５分でのピークのマススペクトルを示し、そして図２４は、図２３と同じピークのズームスキャンスペクトルを示す。これらの結果から、検出されたピークはアミノ酸配列ＳＬＳＬＳＰ−ＮＨ２を持つ事が示された。従って、ヒト型化ＰＭ−１抗体サブタイプ２の両方のＨ鎖Ｃ末端は−ＳＬＳＬＳＰ−ＮＨ２配列を持つ事が示された。
実施例３． ヒト型化ＰＭ−１抗体サブタイプ１及びサブタイプ２の生物活性の測定
（１）ＩＬ−６受容体結合活性の測定
（ａ）測定方法
測定方法は、下記の工程により行なった。
１）ｐＨ９．６の炭酸ナトリウム緩衝液を用いて５μｇ／ｍＬに希釈した抗ＩＬ−６レセプター抗体を，イムノプレートの各ウエルに１００μＬずつ添加し，１晩以上冷所で放置する。
２）各ウエルを０．０５％ポリソルベート２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（以後ＲＢ）３００μＬで３回洗浄する。
３）各ウエルに１％の牛血清アルブミンを含むｐＨ８．１のトリス塩酸緩衝液（以後ＤＢ）２００μＬを加え，室温で２時間以上放置する。
４）ウエル内の溶液を捨てた後，ＤＢを用いて０．１μｇ／ｍＬに希釈した可溶性ＩＬ−６受容体１００μＬを各ウエルに添加し，室温で２時間放置する。
５）各ウエルをＲＢ  ３００μＬで３回洗浄する。
６）一定のビオチン化ＭＲＡを含むＤＢを用いて段階希釈した試料溶液１００μＬを各ウエルに添加し，室温で１時間放置する。
７）各ウエルをＲＢ  ３００μＬずつで３回洗浄する。
８）ＤＢを用いて０．５μｇ／ｍＬに希釈したアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン１００μＬを各ウエルに添加し，室温で１時間放置する。
９）イムノプレートの各ウエルをＲＢ  ３００μＬで５回洗浄する。
１０）発色試薬（ＳＩＧＭＡ  ＦＡＳＴ  ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を水で溶解し，各ウエルに１００μＬ添加し，室温で３０分間放置する。
１１）各ウエルの反応液の４０５ｎｍにおける吸光度と６５５ｎｍにおける吸収度の差を求める。
１２）得られた吸光度から，平行線検定法（３＋３）により各試料溶液の結合活性を算出する。
（ｂ）結果
結果を下記の表１に示す。
【表１】
2005090405.tif 000002
表１の結果から、ヒト型化ＰＭ−１抗体（Ｍａｉｎ）、サブタイプ１、およびサブタイプ２は、実質的に同じ抗原結合性をしめすことが明らかである。
（２）ＫＴ−３細胞増殖阻害
（ａ）測定方法
測定方法は下記の工程により行なった。
１）マイクロプレートの各ウエルに，ＲＰＭＩ培地で２ｎｇ／ｍＬに希釈したＩＬ−６溶液５０μＬを添加した後，ＲＰＭＩ培地で段階希釈した試料溶液を５０μＬ加える。なお，ブランクのウエルにはＲＰＭＩ培地５０μＬを加える。
２）更に，各ウエルにＲＰＭＩ培地を用いて５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整したＫＴ−３細胞浮遊液を１００μＬ添加し，ＣＯ２インキュベーター内で３日間培養する。
３）各ウエルに，ＲＰＭＩ培地で適当に希釈した３Ｈ−チミジン溶液５０μＬを添加し，ＣＯ２インキュベーター内で６時間培養する。
４）マイクロプレート内の細胞を，セルハーベスターを用いてガラスフィルター上に捕集する。
５）ガラスフィルターを電子レンジを用いて１０分間乾燥した後，ホットプレート等で加熱しながら固形シンチレーターをガラスフィルターに染み込ませる。
６）液体シンチレーションカウンターを用いて放射活性（ｃｐｍ）を測定する。
７）得られた放射活性から，平行線検定法（４＋４）により各試料溶液の生物活性を算出する。
結果を下記の表２に示す。
【表２】
2005090405.tif 000003
表２の結果から、ヒト型化ＰＭ−１抗体（Ｍａｉｎ）、サブタイプ１、およびサブタイプ２は、実質的に同じ細胞増殖阻害活性を示すことが明らかである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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