【手続補正書】
【提出日】令和2年11月11日(2020.11.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞（ＰＳＣ）から分化した細胞の培養物中に残存する未分化なＰＳＣを定量するための方法であって、前記方法が、以下：
ラミニン−５２１及びＥ−カドヘリンでコートした基材上で、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む培地中で、分化した細胞（未分化なPSCが存在する場合、それを含む）を培養し、未分化なPSCが存在する場合、それは選択的に増幅されること；
残存する未分化なＰＳＣのマーカーの、培養された、分化した細胞（未分化なPSCが存在する場合、それを含む）中における発現を定量すること；及び
培養された、分化した細胞（未分化なPSCが存在する場合、それを含む）中におけるマーカーの発現を、割合が既知の未分化なＰＳＣが混入された、基準の細胞培養物におけるマーカーの発現と比較すること、
を含み、
分化した細胞（未分化なPSCが存在する場合、それを含む）の培養物における、割合が既知の未分化なＰＳＣが混入された、基準の細胞培養物におけるマーカーの発現よりも低いマーカーの発現が、残存する未分化なＰＳＣが、培養された、分化した細胞中に存在しないか、又は残存する未分化なＰＳＣが、基準の細胞培養物中の、混入された、割合が既知の未分化なＰＳＣよりも低い割合で、培養された、分化した細胞中に存在することを示す、方法。
【請求項２】
前記マーカーの発現が、ＬＩＮ２８、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＦＯＸＤ３、ＮＡＮＯＧ、ＰＯＤＸＬ、ＲＥＸ１、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ４、ＤＰＰＡ２又はＤＰＰＡ３の発現である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＯＣＫ阻害剤がＹ２７６３２である、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が約１０μＭのＹ２７６３２中で培養される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤を含む培地中で、約３日間培養することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤を含む培地中で培養後に、ＲＯＣＫ阻害剤を含まない培地中で、約２日間培養することを更に含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記マーカー発現が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって定量される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＣＲが、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ｑＲＴ−ＰＣＲが、５’→３’配列ＣＧＣＡＴＧＧＧＧＴＴＣＧＧＣＴＴＣＣＴＧＴＣＣ（配列番号１５）からなるプローブ、５’→３’配列ＣＡＣＧＧＴＧＣＧＧＧＣＡＴＣＴＧ（配列番号１６）からなるプライマー及び５’→３’配列ＣＣＴＴＣＣＡＴＧＴＧＣＡＧＣＴＴＡＣＴＣ（配列番号１７）からなるプライマーを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記マーカー発現が標準化される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記マーカー発現がＧＡＰＤＨの発現に対して標準化される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記既知の割合が０．００１％である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＰＳＣがｉＰＳＣである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記分化した細胞がＭＳＣである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＭＳＣがＥ８完全培地中で培養される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
残存する未分化なＰＳＣが、存在しないか、又は混入された、既知の割合よりも低い割合である、分化した細胞の培養物を、治療用組成物に製剤化することを更に含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
治療用組成物を製造するための方法であって、前記方法が、残存する未分化なＰＳＣが、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法によって検出した場合、存在しないか、又は混入された、既知の割合よりも低い割合である、ＰＳＣから分化した細胞の培養物を、被検体に治療的に投与するための組成物に製剤化することを含む、方法。
【請求項１８】
被検体における状態を治療又は予防するための医薬の製造における、残存する未分化なＰＳＣが、存在しないか、又は混入された、既知の割合よりも低い割合である、ＰＳＣから分化した細胞の培養物の使用であって、ＰＳＣから分化した細胞の培養物中に残存する未分化なＰＳＣが、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法によって検出される、使用。
【請求項１９】
前記状態が、骨嚢腫、骨新生物、骨折、軟骨欠損、変形性関節症、靱帯損傷、骨形成不全症、骨壊死、骨粗鬆症、再生不良性貧血、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、骨髄異形成症候群、１型糖尿病、２型糖尿病、自己免疫性肝炎、肝硬変、肝不全、拡張型心筋症、心不全、心筋梗塞、心筋虚血、クローン病、潰瘍性大腸炎、火傷、表皮水疱症、エリテマトーデス、関節リウマチ、シェーグレン病、全身性硬化症、気管支肺異形成症、慢性閉塞性気道疾患、気腫、肺線維症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、脳損傷、運動失調、変性円板疾患、多系統萎縮症、多発性硬化症、パーキンソン病、網膜色素変性症、ロムベルグ病、脊髄損傷、脳卒中、筋ジストロフィー、四肢虚血、腎損傷、ループス腎炎、子宮内膜症、及び骨髄又は固形臓器の移植の合併症から選択される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
ＰＳＣから分化した細胞の培養物中に残存する未分化なＰＳＣを検出するためのキットであって、前記キットが、以下：
ラミニン−５２１；及び
Ｅ−カドヘリン；及び
ＲＯＣＫ阻害剤
を含む、キット。
【請求項２１】
残存する未分化なＰＳＣのマーカーの培養細胞中における発現を定量するための、ＰＣＲプライマー、及び必要に応じてＰＣＲプローブを更に含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
必要に応じてＲＯＣＫ阻害剤を含む培地を更に含む、請求項２０又は請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
必要に応じてラミニン−５２１及びＥ−カドヘリンでコートした基材を更に含む、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２０】
n) TaqMan（登録商標）Gene Expression Assay(複数可)、直ぐに使用できるプライマー及びFAM/MGB-NFQプローブの混合物（TE中、20倍）を含む。FAMは最も一般的な蛍光レポーターである。（1×＝250 nM TaqMan Probe＋900 nMの各PCRプライマー (フォワード及びリバース)）。以下のカタログ番号は、特注のアッセイのサイズを指す。感光性。1.5 mlのAmbion（登録商標）Non-Stickチューブ中、-20℃で、1回使用分のアリコート（one-time use aliquots）で保存することが推奨される。
i) Custom TaqMan（登録商標）Gene Expression Assays (20×、1本のチューブ)、Thermo Fisher Scientific、受注生産。（特注のアッセイは、FAM-MGBプローブと共にのみ注文できることに注意する。）
(1) カタログ番号4331348 (Small＝360反応＠20μL qRT-PCR)
(2) カタログ番号4332078 (Medium＝750反応＠20μL qRT-PCR)
ii) LIN28 Custom TaqMan（登録商標）Gene Expression Assay、Thermo Fisher Scientific；カタログ番号：4331348；アッセイID：AIVI48S；アッセイ名：LIN28。QRT-PCR；スケール：S：360反応；受注生産。これは、Kurodaら（PLoS ONE 7、1-9 (2012) Highly Sensitive In Vitro Methods for Detection of Residual Undifferentiated Cells in Retinal Pigment Epithelial Cells Derived from Human iPS Cells）に開示されている、公知のプライマー及びプローブの配列を用いて、特注で設計したアッセイである。LIN28プローブの配列 (5′→3′) CGCATGGGGTTCGGCTTCCTGTCC (配列番号15)；LIN28フォワードプライマー配列 (5′→3′) CACGGTGCGGGCATCTG (配列番号16)；LIN28リバースプライマー配列 (5′→3′) CCTTCCATGTGCAGCTTACTC (配列番号17)。
iii) TaqMan（登録商標）内在性コントールアッセイ：これらのアッセイは、事前に設計されており、在庫が調べられてもよい。FAM-MGB又はVIC-MGBプローブを含む内在性コントールが利用可能である。VIC-MGBプローブを選択し、識別アッセイからコントールアッセイを識別することが推奨される。
(1) GAPDH TaqMan（登録商標）Gene Expression Assay (遺伝子記号：GAPDH、hCG2005673)、Life Technologies；カタログ番号：4448489；アッセイID：Hs02758991_g1 (VIC-MGBプローブ)；受注生産。「Best Coverage」アッセイは、事前に設計された複数のGAPDHアッセイから選択された。このアッセイは、イントロンに及んでおり、それゆえ、ゲノムDNAを検出すべきでない。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2019534052000001.app