【手続補正書】
【提出日】令和2年7月2日(2020.7.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生細胞コンストラクト又は支持体を作る方法であって：
（ａ）頂部表面、底部表面、及びその間の中間部分を有する非細胞性有機ポリマー支持体を提供することと、
（ｂ）前記中間部分において前記ポリマーの架橋の勾配を作出するために十分な時間に渡って、前記支持体の１つの面に架橋剤を接触させることと；
（ｃ）任意に、前記中間部分の架橋の前記勾配が、前記中間部分において自由なアミノ及び／又はカルボキシ基の対応する勾配を生じ、所期の化合物を前記自由なアミノ及び／又はカルボキシ基にカップリングして、前記中間部分において所期の前記化合物の勾配を生ずることと；
（ｄ）任意に、未分化の上皮生細胞を前記非細胞性支持体に接触させることと、
（ｅ）任意に、未分化の及び／又は分化した上皮細胞単層を前記頂部表面において増やすことと、
を含む、生細胞コンストラクト又は支持体を作る方法。
【請求項２】
単層中の細胞が：
（ｉ）未分化の細胞と；
（ｉｉ）未分化の細胞との組み合わせとしての分化した細胞と、
を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
未分化の上皮生細胞が、胃腸管上皮細胞、泌尿器上皮細胞、呼吸器上皮細胞、生殖器上皮細胞、内分泌及び内分泌腺上皮細胞、リンパ管上皮細胞、血管上皮細胞、又は脳室上衣上皮細胞である、
請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
未分化の上皮生細胞が、結腸、小腸、胃、食道、舌、鼻咽頭、口咽頭、咽頭喉頭部（laryngeopharynx）、膵臓、腎臓、膀胱、気管、肺、精巣、卵巣、生殖器の導管、子宮内膜、甲状腺、副腎、副甲状腺、脳室上衣、及び／又は脳からである、
請求項３に記載の方法。
【請求項５】
さらに、培養培地を生細胞の前記単層に接触させ、この培養培地が生細胞の前記単層を持続させること、
を含む、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記支持体が多孔質支持体であり、
前記支持体が、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、エラスチン、フィブロネクチン、ヘパラン硫酸（heparin sulfate）、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸（keratin sulfate）、ヒアルロン酸、エンゲルブレット−ホルム−スワームマウス肉腫細胞によって分泌される膠様蛋白質混合物、及びその組み合わせを含み；並びに／又は前記支持体が、天然又は合成ポリマーから形成されるハイドロゲルを含む、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記頂部表面が、その中に形成された複数のウェルを有し；前記ウェルのそれぞれが頂部開口部、側壁、及び床部を有し；前記上皮細胞単層が前記ウェル側壁及び床部上に広がり、ウェル頂部開口部は開いたままであって、細胞によって内張りされた開いた内腔（又は「陰窩」）を前記ウェル中に形成する、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
生細胞コンストラクト、又は生細胞コンストラクトを生ずることにとって有用な支持体であって：
（ａ）頂部表面、底部表面、及びその間の中間部分を有する非細胞性有機ポリマー支持体と（前記中間部分は、その中に形成された前記ポリマーの架橋の勾配を有する）；
（ｂ）任意に、前記頂部表面に形成された未分化の及び／又は分化した上皮生細胞の単層と；
（ｃ）任意に、（ｉ）前記中間部分における自由な反応性アミノ酸及び／若しくはカルボン酸基の勾配、又は（ｉｉ）前記中間部分におけるアミノ酸及び／若しくはカルボン酸基に共有結合的にカップリングされた所期の化合物の勾配と、
を含む、
生細胞コンストラクト、又は生細胞コンストラクトを生ずることにとって有用な支持体。
【請求項９】
前記単層中の前記生細胞が：
（ｉ）未分化の細胞と；
（ｉｉ）前記未分化の細胞との組み合わせとしての分化した細胞と、
を含む、
請求項８に記載のコンストラクト。
【請求項１０】
上皮細胞が、胃腸管上皮細胞、泌尿器上皮細胞、呼吸器上皮細胞、生殖器上皮細胞、内分泌及び内分泌腺上皮細胞、リンパ管上皮細胞、血管上皮細胞、又は脳室上衣上皮細胞である、
請求項８又は９に記載のコンストラクト。
【請求項１１】
上皮細胞が、結腸、小腸、胃、食道、舌、鼻咽頭、口咽頭、咽頭喉頭部（laryngeopharynx）、膵臓、腎臓、膀胱、気管、肺、精巣、卵巣、生殖器の導管、子宮内膜、甲状腺、副腎、副甲状腺、脳室上衣、及び／又は脳からであり、
前記支持体が、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、エラスチン、フィブロネクチン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、エンゲルブレット−ホルム−スワームマウス肉腫細胞によって分泌される膠様蛋白質混合物、及びその組み合わせを含み；並びに／又は前記支持体が、天然又は合成ポリマーから形成されるハイドロゲルを含む、
請求項１０に記載のコンストラクト。
【請求項１２】
さらに、培養培地が生細胞の前記単層に接触し、この培養培地が生細胞の前記単層を持続させること、
を含む、
請求項８〜１２のいずれか一項に記載のコンストラクト。
【請求項１３】
前記支持体が多孔質である、
請求項８〜１２のいずれか一項に記載のコンストラクト。
【請求項１４】
前記頂部表面が、その中に形成された複数のウェルを有し、前記ウェルのそれぞれが頂部開口部、側壁、及び床部を有し；
前記上皮細胞単層が前記ウェル側壁及び床部上に広がり、前記ウェル頂部開口部は被覆されないままであって、開いた細胞内腔（又は「陰窩」）を前記ウェル中に形成し、
前記ウェルが、１００、２００、若しくは３００ミクロンの深さから、最大８００若しくは１０００ミクロンの深さ若しくはそれ以上までであり、及び／又は前記ウェルが、１０若しくは５０ミクロンの幅から、最大１００若しくは２００ミクロンの幅若しくはそれ以上までであり、及び／又は前記ウェルの少なくとも１０、５０、若しくは１００個が前記頂部表面に形成される、
請求項８〜１３のいずれか一項に記載のコンストラクト。
【請求項１５】
前記単層中の前記生細胞が、分化した細胞及び未分化の細胞両方を組み合わせとして含み；
前記分化した細胞及び前記未分化の細胞が前記単層中において勾配として位置し；
前記勾配が前記ウェル側壁に対して又はそれに沿って定位する、
請求項１４に記載のコンストラクト。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
前述は本発明の例解であり、その限定として受け取られるべきではない。本発明は次の請求項によって定められ、請求項の均等物はその中に包含される。
〔付記１〕
生細胞コンストラクト又は支持体を作る方法であって：
（ａ）頂部表面、底部表面、及びその間の中間部分を有する非細胞性有機ポリマー支持体を提供することと、
（ｂ）前記中間部分において前記ポリマーの架橋の勾配を作出するために十分な時間に渡って、前記支持体の１つの面に（例えば、水系条件下において）架橋剤を接触させることと；
（ｃ）任意に、前記中間部分の架橋の前記勾配が、前記中間部分において自由なアミノ及び／又はカルボキシ基の対応する勾配を生じ、所期の化合物を前記自由なアミノ及び／又はカルボキシ基にカップリングして、前記中間部分において所期の前記化合物の勾配を生ずることと；
（ｄ）任意に、未分化の上皮生細胞を前記非細胞性支持体に接触させることと、
（ｅ）任意に、未分化の及び／又は分化した上皮細胞単層を前記頂部表面において増やすことと、
を含む、生細胞コンストラクト又は支持体を作る方法。
〔付記２〕
単層中の細胞が：
（ｉ）未分化の細胞（例えば、幹又は前駆細胞）と；
（ｉｉ）任意に、未分化の細胞との組み合わせとしての分化した細胞と、
を含む、
付記１に記載の方法。
〔付記３〕
未分化の上皮生細胞が、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、及び昆虫細胞からなる群から選択される、
付記１又は２のいずれか一項に記載の方法。
〔付記４〕
未分化の上皮生細胞が、胃腸管上皮細胞、泌尿器上皮細胞、呼吸器上皮細胞、生殖器上皮細胞、内分泌及び内分泌腺上皮細胞、リンパ管上皮細胞、血管上皮細胞、又は脳室上衣上皮細胞である、
付記１〜３のいずれか一項に記載の方法。
〔付記５〕
未分化の上皮生細胞がヒト細胞である、
付記１〜４のいずれか一項に記載の方法。
〔付記６〕
未分化の上皮生細胞が癌又は腫瘍細胞ではない、
付記１〜５のいずれか一項に記載の方法。
〔付記７〕
未分化の上皮生細胞が、結腸、小腸、胃、食道、舌、鼻咽頭、口咽頭、咽頭喉頭部（laryngeopharynx）、膵臓、腎臓、膀胱、気管、肺、精巣、卵巣、生殖器の導管、子宮内膜、甲状腺、副腎、副甲状腺、脳室上衣、及び／又は脳からである、
付記１〜６のいずれか一項に記載の方法。
〔付記８〕
さらに：
（ｄ）培養培地を生細胞の前記単層に接触させ（例えば、この培養培地は前記支持体中又は上にある）、この培養培地が生細胞の前記単層を持続させること、
を含む、
付記１〜７のいずれか一項に記載の方法。
〔付記９〕
前記培養培地が短鎖脂肪酸を含む、
付記８に記載の方法。
〔付記１０〕
（ｉ）前記培養培地が１０ミリモーラー以下の単糖プラス二糖を含有し；
（ｉｉ）前記培養培地が少なくとも２ミリモーラーの前記短鎖脂肪酸（例えば最大２０、５０、又は１００ミリモーラーまでの前記短鎖脂肪酸）を含有する、
付記９に記載の方法。
〔付記１１〕
前記支持体が多孔質支持体である、
付記１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
〔付記１２〕
前記支持体が、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、エラスチン、フィブロネクチン、ヘパラン硫酸（heparin sulfate）、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸（keratin sulfate）、ヒアルロン酸、エンゲルブレット−ホルム−スワームマウス肉腫細胞によって分泌される膠様蛋白質混合物（例えば、マトリゲル（登録商標）、Ｇｅｌｔｒｅｘ（登録商標）、ＭａｘＧｅｌ（商標）等）、及びその組み合わせを含み；並びに／又は前記支持体が、天然又は合成ポリマー（例えば、キトサン、アガロース、アルギン酸、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリレートポリマー、ポリエチレングリコール、合成ペプチド等。任意に、上に記載されている化合物によって表面修飾される）から形成されるハイドロゲルを含む、
付記１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
〔付記１３〕
前記支持体底部表面が、多孔質担体（例えば、多孔質膜（これはポリテトラフルオロエチレン［ＰＴＦＥ］、ポリエステル、ポリカーボネート、セルロース等から形成され得る）、メッシュ（これはナイロン、生分解性ポリマー、金属等から形成され得る）、無機グリッド、ハイドロゲル、又はその組み合わせの上にある、
付記１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
〔付記１４〕
前記頂部表面が、その中に形成された複数のウェルを有し；前記ウェルのそれぞれが頂部開口部、側壁、及び床部を有し；前記上皮細胞単層が前記ウェル側壁及び床部上に広がり、ウェル頂部開口部は開いたままであって、細胞によって内張りされた開いた内腔（又は「陰窩」）を前記ウェル中に形成する、
付記１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
〔付記１５〕
生細胞コンストラクト、又は生細胞コンストラクトを生ずることにとって有用な支持体であって：
（ａ）頂部表面、底部表面、及びその間の中間部分を有する非細胞性有機ポリマー支持体と（前記中間部分は、その中に形成された前記ポリマーの架橋の勾配を有する）；
（ｂ）任意に、前記頂部表面に形成された未分化の及び／又は分化した上皮生細胞の単層と；
（ｃ）任意に、（ｉ）前記中間部分における自由な反応性アミノ酸及び／若しくはカルボン酸基の勾配、又は（ｉｉ）前記中間部分におけるアミノ酸及び／若しくはカルボン酸基に共有結合的にカップリングされた所期の化合物の勾配と、
を含む、
生細胞コンストラクト、又は生細胞コンストラクトを生ずることにとって有用な支持体。
〔付記１６〕
前記単層中の前記生細胞が：
（ｉ）未分化の細胞（例えば、幹又は前駆細胞）と；
（ｉｉ）任意に、前記未分化の細胞との組み合わせとしての分化した細胞と、
を含む、
付記１４に記載のコンストラクト。
〔付記１７〕
上皮細胞が、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、及び昆虫細胞からなる群から選択される、
付記１５又は付記１６に記載のコンストラクト。
〔付記１８〕
上皮細胞が、胃腸管上皮細胞、泌尿器上皮細胞、呼吸器上皮細胞、生殖器上皮細胞、内分泌及び内分泌腺上皮細胞、リンパ管上皮細胞、血管上皮細胞、又は脳室上衣上皮細胞である、
付記１５〜１７のいずれか一項に記載のコンストラクト。
〔付記１９〕
未分化の上皮生細胞がヒト細胞である、
付記１５〜１８のいずれか一項に記載のコンストラクト。
〔付記２０〕
上皮細胞が悪性（癌又は腫瘍）細胞ではない、
付記１５〜１９のいずれか一項に記載のコンストラクト。
〔付記２１〕
上皮細胞が、結腸、小腸、胃、食道、舌、鼻咽頭、口咽頭、咽頭喉頭部（laryngeopharynx）、膵臓、腎臓、膀胱、気管、肺、精巣、卵巣、生殖器の導管、子宮内膜、甲状腺、副腎、副甲状腺、脳室上衣、及び／又は脳からである、
付記１５〜２０のいずれか一項に記載のコンストラクト。
〔付記２２〕
さらに：
（ｃ）培養培地が生細胞の前記単層に接触し（例えば、この培養培地は前記支持体中又は上にある）、この培養培地が生細胞の前記単層を持続させること、
を含む、
付記１５〜２１のいずれか一項に記載のコンストラクト。
〔付記２３〕
前記培養培地が短鎖脂肪酸（例えば、酪酸、酢酸、プロピオン酸、バルプロ酸等）を含む、
付記２２に記載のコンストラクト。
〔付記２４〕
（ｉ）前記培養培地が１０ミリモーラー以下の単糖プラス二糖を含有し；
（ｉｉ）前記培養培地が少なくとも２ミリモーラーの前記短鎖脂肪酸（例えば最大２０、５０、又は１００ミリモーラーまでの前記短鎖脂肪酸）を含有する、
付記２３に記載のコンストラクト。
〔付記２５〕
前記支持体が、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、エラスチン、フィブロネクチン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、エンゲルブレット−ホルム−スワームマウス肉腫細胞によって分泌される膠様蛋白質混合物（例えば、マトリゲル（登録商標）、Ｇｅｌｔｒｅｘ（登録商標）、ＭａｘＧｅｌ（商標）等）、及びその組み合わせを含み；並びに／又は前記支持体が、天然又は合成ポリマー（例えば、キトサン、アガロース、アルギン酸、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリレートポリマー、ポリエチレングリコール、合成ペプチド等。任意に、上に記載されている化合物によって表面修飾される）から形成されるハイドロゲルを含む、
付記１５〜２４のいずれか一項に記載のコンストラクト。
〔付記２６〕
前記支持体が多孔質である、
付記１５〜２５のいずれか一項に記載のコンストラクト。
〔付記２７〕
前記支持体底部表面が、多孔質担体（例えば、多孔質膜（これはポリテトラフルオロエチレン［ＰＴＦＥ］、ポリエステル、ポリカーボネート、セルロース等から形成され得る）、メッシュ（これはナイロン、生分解性ポリマー、金属等から形成され得る）、無機グリッド、ハイドロゲル、又はその組み合わせの上にある、
付記１５〜２６のいずれか一項に記載のコンストラクト。
〔付記２８〕
前記頂部表面が、その中に形成された複数のウェルを有し、前記ウェルのそれぞれが頂部開口部、側壁、及び床部を有し；
前記上皮細胞単層が前記ウェル側壁及び床部上に広がり、前記ウェル頂部開口部は被覆されないままであって、開いた細胞内腔（又は「陰窩」）を前記ウェル中に形成する、
付記１５〜２７のいずれか一項に記載のコンストラクト。
〔付記２９〕
前記ウェルが、１００、２００、若しくは３００ミクロンの深さから、最大８００若しくは１０００ミクロンの深さ若しくはそれ以上までであり、及び／又は前記ウェルが、１０若しくは５０ミクロンの幅から、最大１００若しくは２００ミクロンの幅若しくはそれ以上までであり、及び／又は前記ウェルの少なくとも１０、５０、若しくは１００個が前記頂部表面に形成される、
付記２８に記載のコンストラクト。
〔付記３０〕
前記単層中の前記生細胞が、分化した細胞及び未分化の細胞（例えば、幹又は前駆細胞）両方を組み合わせとして含み；
前記分化した細胞及び前記未分化の細胞が前記単層中において勾配として位置し（例えば、より高い濃度の分化した細胞を勾配の一端に；より高い濃度の未分化の細胞を前記勾配の他端に有する）；
前記勾配が前記ウェル側壁に対して又はそれに沿って定位する、
付記２８又は付記２９に記載のコンストラクト。
〔付記３１〕
生細胞コンストラクトを持続させる方法であって：
（ａ）付記１５〜３０のいずれか一項に記載のコンストラクトを提供することと；
（ｂ）第１の培養培地を前記頂部表面に接触させることと；
（ｃ）第２の培養培地を前記底部表面に接触させることと、
を含み、
前記培養培地の１つが増えている幹及び前駆細胞の分化を誘導し、前記培養培地の他方が未分化の細胞の増えることを誘導する、
生細胞コンストラクトを持続させる方法。
〔付記３２〕
試験化合物又は微生物を毒物学的、生理学的、又は発癌性効果についてスクリーニングする方法であって：
（ａ）付記１５〜３０のいずれか一項に記載のコンストラクト又は付記３１に記載の方法に従って持続させられるコンストラクトを提供することと、
（ｂ）試験化合物又は微生物を前記コンストラクトに接触させることと；それから
（ｃ）前記コンストラクトの細胞に及ぼす前記試験化合物又は微生物の毒物学的、生理学的、又は発癌性効果を検出することと（例えば、前記接触後のコンストラクトを、前記試験化合物若しくは微生物が接触させられていない同様のコンストラクトと比較することによってであり、及び／又は前記接触ステップ後のコンストラクトを前記接触ステップ前の前記コンストラクトと比較することによる）、
を含む、
試験化合物又は微生物を毒物学的、生理学的、又は発癌性効果についてスクリーニングする方法。
〔付記３３〕
前記試験化合物が、芳香族有機化合物、脂肪族有機化合物、並びに混合された芳香族及び脂肪族有機化合物からなる群から選択される、
付記３２に記載の方法。
〔付記３４〕
前記試験微生物が、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌、酵母、及び糸状菌からなる群から選択される、
付記３２に記載の方法。