(57)【要約】以下の性質：（１）動物から採取した組織を酵素処理することによって得られる細胞型混合集団に含まれ、（２）前記（１）の細胞型混合集団を遠心分離して得られる沈降細胞集団に含まれ、（３）２％以下の血清と１〜１００ｎｇ／ｍｌの繊維芽細胞増殖因子−２を含む培養液で培養すると選択的に増殖し、（４）培養条件を調節することによって脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、腱細胞、心筋細胞、筋芽細胞、神経細胞または血管内皮細胞の特徴を持つ細胞に分化する分化多能性細胞と、この細胞から分化した細胞、およびこの分化多能性細胞を簡便かつ多量に取得する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の性質：
（１）  動物から採取した組織を酵素処理することによって得られる細胞型混合集団に含まれ、
（２）  前記（１）の細胞型混合集団を遠心分離して得られる沈降細胞集団に含まれ、
（３）  ２％（ｖ／ｖ）以下の血清と１〜１００ｎｇ／ｍｌの繊維芽細胞増殖因子−２を含む培養液で培養すると選択的に増殖し、
（４）培養条件を調節することによって脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、腱細胞、心筋細胞、筋芽細胞、神経細胞または血管内皮細胞の特徴を持つ細胞に分化する、
を有することを特徴とする分化多能性細胞。
【請求項２】
動物がヒト、サル、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジまたはニワトリである請求項１の分化多能性細胞。
【請求項３】
採取した組織が皮下脂肪、大網、内臓脂肪、筋肉または臓器である請求項１または２の分化多能性細胞。
【請求項４】
性質（１）の細胞型混合集団に含まれる細胞が、ＣＤ３４陽性かつＣＤ４５陰性の細胞である請求項１の分化多能性細胞。
【請求項５】
性質（３）の選択的に増殖する細胞が、ＣＤ３４陰性、ＣＤ１３陽性、ＣＤ９０陽性およびＣＤ１０５陽性の細胞である請求項４の分化多能性細胞。
【請求項６】
請求項１記載の分化多能性細胞から分化した細胞であって、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、腱細胞、心筋細胞、筋芽細胞、神経細胞または血管内皮細胞のいずれかの特徴を有する細胞。
【請求項７】
脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、腱細胞、心筋細胞、筋芽細胞、神経細胞または血管内皮細胞の特徴を持つ細胞に分化する分化多能性細胞を取得する方法であって、
（ａ）  動物組織を酵素処理することによって細胞型混合集団を調製する工程、
（ｂ）  前記（ａ）の細胞型混合集団を遠心分離することによって沈降細胞集団を調製する工程、
（ｃ）  前記（ｂ）の細胞集団から、２％（ｖ／ｖ）以下の血清と１〜１００ｎｇ／ｍｌの繊維芽細胞増殖因子−２を含む培養液で培養すると選択的に増殖する細胞を選択する工程、
を含むことを特徴とする分化多能性細胞の取得方法。
【請求項８】
工程（ａ）において、ヒト、サル、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジまたはニワトリの組織を酵素処理することによって細胞型混合集団を調製する請求項７の方法。
【請求項９】
工程（ａ）において、動物の皮下脂肪、大網、内臓脂肪、筋肉または臓器を酵素処理することによって細胞型混合集団を調製する請求項７の方法。
【請求項１０】
工程（ａ）において、ＣＤ３４陽性かつＣＤ４５陰性の細胞集団を調整する請求項７の方法。
【請求項１１】
工程（ｃ）において、ＣＤ３４陰性、ＣＤ１３陽性、ＣＤ９０陽性およびＣＤ１０５陽性の細胞を選択する請求項１０の方法。
【請求項１２】
請求項１記載の分化多能性細胞を動物体内に移植することを特徴とする細胞移植方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  この出願の発明は、動物組織に偏在的に存在し、体外に取り出して培養することによって増殖し、動物体を形成している組織細胞に分化し、これを移植することによって障害や機能不全に陥った体組織と置換できる分化多能性細胞と、この分化多能性細胞の取得方法に関するものである。
【背景技術】  「医薬」に依存してきた医療に代わって、人体内の複雑系を人体外で量産し、障害や機能不全に陥った複雑系と置換する再生医療の時代が始まっている。これからは、「医薬」が「医療材料」に主役を譲り、「医療材料」を生産する産業が製薬産業と肩を並べる時代になる。このような「医療材料」の中で、最も重要視されているのが「分化多能性細胞」（または「幹細胞」）である。最近、高い増殖性と多分化能を持つ幹細胞が各国で発見されて、これを人体から分離して増殖させたり、人体の部分構造を形成させる技術開発が活発に進められている。このような分化多能性細胞には、人体のあらゆる細胞に分化する胚性幹細胞（万能細胞）、血球系細胞を生み出す血球系幹細胞、パーキンソン病などの中枢神経系の障害の治療に利用できる神経系幹細胞などがある。人体の骨組みを形成している骨、軟骨、骨格筋、心筋、平滑筋、および脂肪などの間葉系組織の細胞に分化できる間葉系幹細胞も重要視されている。このような分化多能性細胞を患者から簡便かつ安全に分離して体外で大量に増殖させることができれば、失われたり機能低下した体組織を補強、修復、置換および再建する医療分野に根底的な改革をもたらすものと期待される。
白血病、再生不良性貧血、およびリンパ腫などの血球系細胞の異常による疾病を治療するために、健常者の骨髄から採取した血球系幹細胞を含む細胞集団を患者に移植する骨髄移植法が確立されている。この骨髄移植法では、組織適合性の不一致による拒絶反応を回避するために、骨髄バンクと呼ばれている公的システムを発達させて、多数の登録者の中から患者と組織適合性が一致する供与者を検索し、血縁者間だけでなく他人間で移植できる体制が整備されている。この骨髄移植法では、採取した骨髄液に何の操作も加えず患者に移植しており、血球系幹細胞を体外で増殖培養させることはなかった。
重度の熱傷、糖尿病患者の慢性皮膚潰瘍、高齢者の床ずれ、色素性母斑等の治療に用いることを目的にした培養皮膚が開発されている。これには培養真皮と培養表皮があるが、何れの場合にも、用いられている細胞が繊維芽様細胞または表皮角化細胞にしか分化せず、多分化能を持つ幹細胞を利用していない。また、救急治療に用いることを目的に、組織適合性が一致しない個人間の移植も想定されている。
多様な体組織の細胞に分化する能力を持っている分化多能性細胞が骨髄液に潜在することが発見され、これを分離する方法が開発されている。この分化多能性細胞は骨髄液に含まれる細胞の０．０１から０．００１％に過ぎず、多くの体組織の再生治療に必要となる１０８個以上の細胞数を確保するには、１００から１０００リットルもの骨髄液が必要になる。臨床現場の研究者が患者の骨髄液から選択的に分離したこの種の分化多能性細胞を培養操作を加えずに自家移植する治療を試みているが、大量の骨髄液の採取は患者に大きな負担を与えるだけでなく危険を伴う。
この出願の発明者らは、多分化能を持つ幹細胞（分化多能性細胞）が脂肪組織に内在していることを報告している（非特許文献１）が、カリフォルニア大学ロスアンジェルス校のＭａｒｃ  Ｈ．Ｈｅｄｒｉｃｋらはこの分化多能性細胞の分離を目指して、肥満患者から吸引採取した大量の脂肪組織を遠心分離して、沈降画分（ＳＶＦ画分）の細胞集団に分化多能性細胞が含まれることを報告している（非特許文献２）。さらに、筋肉内に存在することが以前から知られていた衛星細胞（ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｃｅｌｌ）が、多分化能を持つ幹細胞であることも報告されている（非特許文献３）。
しかし、これらの分化多能性細胞の含有量は非常に少ないので、分化多能性細胞の取得効率は極めて低い。またＳＶＦ画分は非常に不均一な細胞集団であり、ＳＶＦ画分に含まれるどのような細胞が分化多能性細胞であるか不明である。事実、Ｈｅｄｒｉｃｋらは３３０ｍｌもの吸引脂肪を用いてはじめて間葉系幹細胞の分離に成功したが（非特許文献２）、このように大量の脂肪を採取できる肥満患者は少ないので実用性に乏しい。筋肉からの分化多能性細胞の取得にも、多大の時間と労力を必要とする単コロニー分離法が必要である。
なお、分化多能性細胞の取得に関する従来技術としては、この出願の発明者らによる特許出願（特許文献１）の他、特許文献２、３が存在する。
文献リスト
【特許文献１】特開２００４−１２９５４９号公報
【特許文献２】特開２００２−０５２３６５号公報
【特許文献３】国際公開ＷＯ９９／２７０７６号パンフレット
【非特許文献１】Ｋａｗａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９８；９５：１０６２−１０６６
【非特許文献２】Ｚｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００１；７，２１１−２２８
【非特許文献３】Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００２；１２９，２９８７−２９９５
【発明の開示】
失われたり、機能不全に陥った骨、軟骨、骨格筋、心筋、脂肪および神経等の組織を、患者自身または組織適合性が一致する他者から採取した分化多能性細胞を移植することにより補強、修復、置換および再建する治療が為されている。このような治療には、症例当たり１０８個以上の分化多能性細胞が必要である。
ところが、この種の分化多能性細胞（特に、間葉系幹細胞）を分離する従来技術では、大量の骨髄液または脂肪組織が必要であり、また、分化多能性細胞を拡大培養するためにも多大の時間と労力が必要である。この種の分化多能性細胞の移植治療が普及するには、簡便かつ安全に採取できる分化多能性細胞を特定し、それらの効率的な分離法および増殖を可能とする技術が必要である。
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、簡便かつ安全に、しかも大量に採取することのできる分化多能性細胞（特に、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、腱細胞、心筋脂肪、筋芽細胞、神経細胞または血管内皮細胞への分化能を有する分化多能性細胞）と、この細胞から分化された細胞を提供することを課題としている。
またこの出願の発明は、上記の分化多能性細胞を取得する方法を提供することを課題としている。
さらにこの出願の発明は、上記の分化多能性細胞を用いた細胞移植方法を提供することを課題としている。
この出願は、前記の課題を解決する第１の発明として、以下の性質：
（１）  動物から採取した組織を酵素処理することによって得られる細胞型混合集団に含まれ、
（２）  前記（１）の細胞型混合集団を遠心分離して得られる沈降細胞集団に含まれ、
（３）  ２％（ｖ／ｖ）以下の血清と１〜１００ｎｇ／ｍｌの繊維芽細胞増殖因子−２を含む培養液で培養すると選択的に増殖し、
（４）培養条件を調節することによって脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、腱細胞、心筋細胞、筋芽細胞、神経細胞または血管内皮細胞の特徴を持つ細胞に分化する、
を有することを特徴とする分化多能性細胞を提供する。
この第１発明においては、動物がヒト、サル、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジまたはニワトリであること、また採取した組織が皮下脂肪、大網、内臓脂肪、筋肉または臓器であることをそれぞれ好ましい態様としている。
またこの第１発明においては、性質（１）の細胞型混合集団に含まれる細胞がＣＤ３４陽性かつＣＤ４５陰性の細胞であること、さらに性質（３）の選択的に増殖する細胞がＣＤ３４陰性、ＣＤ１３陽性、ＣＤ９０陽性およびＣＤ１０５陽性の細胞であることをそれぞれ別の好ましい態様としている。
この出願は、第２の発明として、前記第１発明の分化多能性細胞から分化した細胞であって、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、腱細胞、心筋細胞、筋芽細胞、神経細胞または血管内皮細胞のいずれかの特徴を有する細胞を提供する。
この出願は、第３の発明として、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、神経細胞または血管内皮細胞の特徴を持つ細胞に分化する分化多能性細胞を取得する方法であって、
（ａ）  動物組織を酵素処理することによって細胞型混合集団を調製する工程、
（ｂ）  前記（ａ）の細胞型混合集団を遠心分離することによって沈降細胞集団を調製する工程、
（ｃ）  前記（ｂ）の細胞集団から、２％（ｖ／ｖ）以下の血清と１〜１００ｎｇ／ｍｌの繊維芽細胞増殖因子−２を含む培養液で培養すると選択的に増殖する細胞を選択する工程、
を含むことを特徴とする分化多能性細胞の取得方法を提供する。
この第３発明においては、工程（ａ）において、ヒト、サル、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジまたはニワトリの組織を酵素処理することによって細胞型混合集団を調製すること、さらには工程（ａ）において、皮下脂肪、大網、内臓脂肪、筋肉または臓器を酵素処理することによって細胞型混合集団を調製することを好ましい態様としている。
またこの第３発明では、工程（ａ）においてＣＤ３４陽性かつＣＤ４５陰性の細胞集団を調製すること、そして工程（ｃ）においてＣＤ３４陰性、ＣＤ１３陽性、ＣＤ９０陽性およびＣＤ１０５陽性の細胞を選択することをそれぞれ別の好ましい態様としている。
さらにこの出願は、第４の発明として、前記第１発明の分化多能性細胞を動物体内に移植することを特徴とする細胞移植方法を提供する。
なお、この出願の前記発明において、「分化多能性細胞」とは、骨、軟骨、骨格筋、心筋、脂肪、腱、靱帯、間質細胞、神経細胞または血管内皮細胞の特徴を持つ細胞に分化する能力を有する細胞（幹細胞）をいう。なお、以下の説明では、分化多能性細胞を単に「幹細胞」と記載することもある。
【図面の簡単な説明】  図１は、２２歳男性皮下脂肪由来の分化多能性細胞の増殖曲線である。
図２は、ヒト血清を使用した場合、およびウシ胎児血清を使用した場合、の分化多能性細胞の増殖曲線である。
図３は、２２歳男性皮下脂肪由来の分裂増殖した分化多能性細胞が脂肪細胞に分化したことを示す写真像である。
図４は、２２歳男性皮下脂肪由来の分裂増殖した分化多能性細胞が骨芽細胞へ分化したことを示す写真像である。
図５は、４８歳女性大網組織由来の分裂増殖した分化多能性細胞が脂肪細胞に分化したことを示す写真像である。
図６は、４８歳女性大網組織由来の分裂増殖した分化多能性細胞が骨芽細胞に分化したことを示す写真像である。
図７は、２２歳男性皮下脂肪由来の分裂増殖した分化多能性細胞が軟骨細胞へ分化したことを示す写真像である。
図８は、ＣＤ３４陽性かつＣＤ４５陰性細胞集団由来の分裂増殖した分化多能性細胞が脂肪分化の特徴を有することを示す写真像である。
図９は、ＣＤ３４陽性かつＣＤ４５陰性細胞集団由来の分裂増殖した分化多能性細胞が骨芽分化の特徴を有することを示す写真像である。
図１０は、２２歳男性皮下脂肪由来の分裂増殖した分化多能性細胞を、マウスに移植した時の脂肪構築を示す写真像である。
発明の効果
この出願の発明により、組織再建のための移植に必要な症例当たり１０８個以上、実際には１０９個以上の分化多能性細胞を、ドナーに負担をかけることなく得ることが可能となる。また、移植に必要な分化多能性細胞を選択的に増殖させることが可能となる。そしてこの分化多能性細胞は、動物体内（ドナー自身、または他のレシピエント）に移植することによって、脂肪組織、骨、軟骨、筋肉、神経、血管等を形成することができる。従って、この出願の発明によって、各種組織に分化できるドナー自身の分化多能性細胞が大量に準備できるようになるので、これをドナー体内に移植することによって、失われたり機能低下した骨、軟骨や脂肪組織などを再建する医療が可能になる。外傷や癌によって軟部組織を失った患者や、顔面の半側の皮下結合組織だけが萎縮する顔面半側萎縮症の患者などの治療には、患者自身の脂肪組織を必要とする部位に自家移植する方法が採用されてきたが、移植後に吸収や瘢痕化が起こりやすく、移植した体積が失われる難点があった。これは移植脂肪の大半を占めていた成熟脂肪細胞が壊死するためと考えられるが、体外で選択的に増殖させた幹細胞を移植すればこの問題は解決できると期待される。このような間葉系組織の再建術は、豊胸術などの美容外科分野への発展も期待される。この分化多能性細胞の多分化能を活用すれば、開放骨折などで失われた骨格の大規模な再建も可能になる。この分化多能性細胞が心筋細胞にも分化することが確かめられれば、働き盛りの中高年層を襲う心臓病の克服が期待できる。この発明が可能にしたドナーの分化多能性細胞を大量に取得する方法は、このような新しい再生医療分野の開拓にもつながるので、その効果は計り知れない。安全かつ簡便に採取できる脂肪から分化多能性細胞が量産できるこのシステムを健常人に拡大すれば、「分化多能性細胞バンク」の構築が可能になり、組織適合個体間の若年者から老人への移植も展望できる。
【発明を実施するための最良の形態】  第１発明の分化多能性細胞は、前記のとおりの（１）から（４）の性質を有することを特徴とする細胞であるが、この細胞は、第３発明の方法によって取得することができる。すなわち第３発明の方法は以下の手順で実施することができる。
（ａ）細胞型混合集団を調製する工程
動物組織は、例えばヒト、サル、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジまたはニワトリ等の組織である。組織は、動物体から切除等によって単離された組織であり、例えば、皮下脂肪、大網、腸間膜や腎臓周囲の内臓脂肪、精巣上体脂肪、および筋肉組織内脂肪などの脂肪組織だけでなく、筋肉、心臓、肺臓、肝臓、腎臓、胃、小腸、大腸等である。より好ましくは、皮下脂肪や大網等である。また、採取する組織の量は、ドナー種や組織の種類によって異なるが、例えば１〜１０ｇ程度であり、特にヒトをドナーとする場合には、ドナーへの負担を考慮して約２ｇ程度とすることが好ましい。
例えば、脂肪組織の場合には、ドナーから脂肪吸引により皮下脂肪を採取したり、ドナーの体表面から少量（例えば、幅１ｃｍと長さ２ｃｍ程度の範囲で紡錘状に０．５ｃｍの深さ）の皮膚と皮下脂肪を採取する。またあるいは大網の場合には、全身麻酔したドナーの腹腔から内視鏡を用いて少量の大網を採取するようにする。
得られた動物組織片は、例えば培地溶液等で洗浄することによって、血液等を除去する。
酵素処理は、これら動物組織を、コラゲナーゼ、トリプシン、プロナーゼ、ディスパーゼ、エラスターゼまたはヒアルロニダーゼ等の酵素によって消化することにより行う。このような酵素処理は、当業者に既知の手法および条件により可能である（例えば、Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ参照）。あるいは、後記実施例に記載の手法および条件により行うこともできる。
このような酵素処理によって、細胞型混合集団が得られる。この細胞型混合集団には、２種類以上の異種性の細胞、例えば、間葉系幹細胞、様々な成熟段階にある組織細胞集団、内皮細胞、周細胞、間質細胞、および様々な血球系細胞などが含まれている。
また、この細胞型混合集団は、その表現抗原の型を指標として、ＣＤ３４陽性かつＣＤ４５陰性の細胞集団として調製することもできる。すなわち、下記の実施例において示されているように、最終的にある種の分化多能性細胞となる細胞は、細胞型混合集団におけるＣＤ３４陽性かつＣＤ４５陰性細胞であるため、このような表面抗原型の細胞集団を調製することによって、より効率よく分化多能性細胞を得ることができる。ＣＤ３４陽性かつＣＤ４５陰性細胞は、それぞれの抗体（抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ４５抗体）を用いた方法や、これらの抗体を結合させたマイクロビーズを用いる方法など、当該技術分野における公知の手段によって分離取得することができる。
（ｂ）沈降細胞集団を調製する工程
前記（ａ）で得た細胞型混合集団を遠心処理することによって、沈降細胞集団を得る。すなわち、細胞型混合集団に含まれる酵素未処理組織等を濾過等によって除去した後の細胞懸濁液を、遠心処理する。遠心は、細胞の種類や量によって異なるが、例えば、１から１０分間、８００から１５００ｒｐｍ程度で行うことができる。そして、この遠心処理後の沈殿として、沈降細胞集団が得られる。
得られた沈降細胞集団には、例えば、間葉系幹細胞、様々な成熟段階にある組織細胞集団、内皮細胞、周細胞、間質細胞、および様々な血球系細胞などが含まれている。
（ｃ）低血清培地での選択的培養工程
この工程では、前記（ｂ）の細胞集団から、２％（ｖ／ｖ）以下の血清と１〜１００ｎｇ／ｍｌの繊維芽細胞増殖因子−２（（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ）−２）を含む培養液で培養し、選択的に増殖する細胞を選択する。
培地は、血清量が２％（ｖ／ｖ）以下であることを条件として、通常の動物細胞培養用の培地を使用することができる。例えば、Ａｌｐｈａ−ＭＥＭ（大日本製薬株式会社等）、ＡＴＣＣ−ＣＲＣＭ  ３０（ＡＴＣＣ）、Ｃｏｏｎ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｆ１２（ＳＩＧＭＡ等）、ＤＭ−１６０およびＤＭ−２０１（日本製薬株式会社）、Ｄｏｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）ｗｉｔｈ  Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ（４５００ｍｇ／Ｌ）（大日本製薬株式会社等）、Ｄｏｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）ｗｉｔｈ  Ｌｏｗ  Ｇｌｕｃｏｓｅ（１０００ｍｇ／Ｌ）（和光純薬工業株式会社等）、ＤＭＥＭ：Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２混合培地（１：１）（大日本製薬株式会社等）、ＤＭＥＭ：ＲＰＭＩ１６４０混合培地（１：１）、Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ（ＥＢＭ）（大日本製薬株式会社等）、Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）（大日本製薬株式会社等）、ＥＭＥＭ：ＲＰＭＩ１６４０混合培地（１：１）、ＥＳ  ｍｅｄｉｕｍ（日水製薬株式会社）、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（和光純薬工業株式会社等）、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（大日本製薬株式会社等）Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２  ｍｅｄｉｕｍ（大日本製薬株式会社等）、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２：ＲＰＭＩ１６４０混合培地（１：１）、Ｋａｉｇｈｎｓ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（Ｆ１２Ｋ）（大日本製薬株式会社等）、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ−１５  ｍｅｄｉｕｍ（大日本製薬株式会社等）、ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ（大日本製薬株式会社等）、ＲＩＴＣ８０−７培地（機能性ペプチド研究所）、ＨＦ−Ｃ１培地（機能性ペプチド研究所）、ＭＣＤＢ１０７培地（機能性ペプチド研究所）、ＭＣＤＢ２０１培地（ＳＩＧＭＡ）、ＨＳＭＣ−Ｃ１培地（機能性ペプチド研究所）、ＨＥＣ−Ｃ１培地（機能性ペプチド研究所）、ＭＣＤＢ１３１培地（機能性ペプチド研究所）ＨＳＭＣ−Ｃ２培地（機能性ペプチド研究所）、ＭＣＤＢ１５３培地（機能性ペプチド研究所）、ＭＣＤＢ１５３ＨＡＡ培地（機能性ペプチド研究所）、Ｍｅｄｉｕｍ１９９（大日本製薬株式会社等）、ＮＣＴＣ１３５（大日本製薬株式会社等）、ＲＰＭＩ１６４０（大日本製薬株式会社等）、Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓ  ＭＢ７５２／１  ｍｅｄｉｕｍ（大日本製薬株式会社等）、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’ｍｅｄｉｕｍ  Ｅ（大日本製薬株式会社等）などである。
これらの培地が、無血清培地である場合には、２％（ｖ／ｖ）以下の血清を添加する。また血清を含む培地の場合には、血清を除去する等の方法により、血清含有量を２％（ｖ／ｖ）以下に調製して用いる。なお、通常の動物細胞の培養では、ウシ胎児血清を１０−２０％（ｖ／ｖ）の濃度で用いるが、この発明方法では、これを２％（ｖ／ｖ）以下に減少させて血清中に含まれる細胞増殖因子の作用を制限した培養条件を指定している。また「血清」とは通常法で用いられているウシ胎児血清に限定したものではなく、患者から採取できるヒト血清をも包含している。
このような培養液で培養することによって、第１発明の分化多能性細胞を選択的に増殖させることができる。また上記の培養条件で増殖する幹細胞は高い増殖活性を持つので、継代培養によって、組織の再生医療に必要な症例当たり１０８個以上の分化多能性細胞を得ることができる。
あるいはまた、この選択的に増殖する細胞は、その表現抗原の型を指標としてＣＤ３４陰性、ＣＤ１３陽性、ＣＤ９０陽性およびＣＤ１０５陽性の細胞として取得することもできる。すなわち、下記の実施例において示されているように、最終的にある種の分化多能性細胞となる細胞は、前記のとおりの細胞表面抗原型を有する細胞であるため、このような細胞表面抗原型の細胞を取得することによって、より効率よく分化多能性細胞を得ることができる。ＣＤ３４陰性、ＣＤ１３陽性、ＣＤ９０陽性およびＣＤ１０５陽性は、それぞれの抗体を用いた方法や、これらの抗体を結合させたマイクロビーズを用いる方法など、当該技術分野における公知の手段によって分離取得することができる。
以上の方法（第３発明の方法）によって得られた分化多能性細胞（第１発明の細胞）は、培養条件を調節することによって脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、腱細胞、心筋細胞、筋芽細胞、神経細胞または血管内皮細胞の特徴を持つ細胞に分化する。
例えば、脂肪細胞への分化は、例えば後記実施例４に示したように、ウシ胎児血清、イソブチル−１−メチルキサンチン、インドメタシン、ハイドロコルチゾン、インスリン、デキサメタゾン等を適量含む脂肪細胞誘導培地で細胞を培養することによって行うことができる。また骨芽細胞への分化は、例えば後記実施例５に示したように、ウシ胎児血清、アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩ｎ水和物、β−グリセロリン酸、デキサメタゾン等を適量含む骨芽細胞誘導培地で細胞を培養することによって行うことができる。さらに、軟骨細胞への分化は、後記実施例７に示したように、例えば、無血清基本培地に１００ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−β１等を添加して調製した軟骨細胞誘導培地を用いて行うことができる。血管内皮細胞へは血管内皮細胞増殖因子を含む培地によって、筋芽細胞へは５−アザシチジンを適量含む培地によって、神経細胞へは２−メルカプトエタノールまたはジメチルスルホキシドを適量含む培地によって、心筋細胞へは５−アザシチジンを適量含む培地によって、腱細胞へはコラーゲンゲル内で培養し、適切な物理的刺激を加えることによって、それぞれ誘導することができる。
第２発明の細胞は、以上のとおりの処理によって、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、腱細胞、心筋細胞、筋芽細胞、神経細胞または血管内皮細胞のいずれかの特徴を有するように分化した細胞である。なお、特定細胞に効率良く分化させるためには、それぞれに特定の動物組織から調製した細胞型混合集団を対象として前記発明３の方法により分化多能性細胞を得ることも好ましい。すなわち、分化多能性細胞を脂肪細胞へ分化させる場合には、細胞型混合集団を脂肪組織から、骨芽細胞、軟骨細胞へ分化させるためには骨組織から、筋芽細胞を分化させるためには筋組織から、神経細胞へ分化させるためには神経系組織から、血管内皮細胞へ分化させるためには血管組織から、それぞれ細胞型混合集団を調製することが好ましい。
この出願の第４発明は、前記第１発明の分化多能性細胞を動物体内に移植することを特徴とする細胞移植方法である。すなわち、後記の実施例に示したように、第１発明の分化多能性細胞は、動物体内に移植されると、その細胞が由来する組織を構成する細胞と同様の特徴を有する細胞へと分化する。従って、ヒトを含めた様々な哺乳動物に分化多能性細胞を移植することによって、例えば、特定細胞が欠損または消失したことによってその細胞が発現する特定機能が傷害を受けた動物（ヒト、あるいは家畜や愛玩動物等の有用非ヒト動物）に、その細胞機能を回復させるような治療を施すことができる。また、特定の細胞を非ヒト哺乳動物に移植し、その細胞を過度に増殖させることによって、特定細胞機能が亢進した動物モデル（例えば、脂肪細胞を過度に有する肥満モデル動物など）を作製することもできる。
分化多能性細胞の移植は、例えば後記実施例の記載のとおりに行うことができる。移植する細胞数は、細胞の種類や動物種によっても異なるが、１０６個以上とすることができる。また、ヒトや有用非ヒト動物をレシピエントとする場合、同一個体から調製された分化多能性細胞を移植することが好ましい。また動物モデル等の非ヒト動物の場合は、免疫機能を欠損した動物を用いることによって、ドナーとレシピエントは別個体とすることもできる。
【実施例】  以下、実施例を示したこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
実施例１
脂肪組織に含まれる幹細胞の培養に適した低血清培地の調製
細胞の初代培養は、ダルベッコ変法イーグル培地（日水製薬株式会社）とＭＣＤＢ２０１培地（ＳＩＧＭＡ）を３：２の割合で混合した溶液にＬｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ−Ａｌｂｕｍｉｎ（ＳＩＧＭＡ）および１００×ＩＴＳ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳＩＧＭＡ）を１００分の１量、０．１ｍｍｏｌ／ｌアスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩ｎ水和物（和光純薬工業株式会社）、５０Ｕ／ｍｌペニシリン（明治製菓株式会社）、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（明治製菓株式会社）を添加した培地（無血清基本培地）に対して、２％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＩＣＮバイオメディカル社）を添加し、さらに２０ｎｇ／ｍｌヒトＦＧＦ−２（ペプロテック社）を添加した培地（低血清培地）を用いた。
実施例２
低血清培養による脂肪組織由来幹細胞の取得
インフォームドコンセントにより承諾を得た２２歳男性患者から、手術時の残渣である背部正常部位の皮下脂肪組織（１．２ｇ）を回収した。この組織をダルベッコ変法イーグル培地とハムＦ１２培地（日水製薬株式会社）を等量混合した培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）で洗浄し、付着している血液等を除去した。脂肪組織塊を外科用ハサミで約２ｍｍ角にカットし、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ溶液（コラゲナーゼタイプＩ、ＷＯＲＴＨＩＮＧＴＯＮ）を２．４ｍｌ加えて１時間３７℃にて振とうした。処理溶液を孔径が２５０μｍのスチールメッシュでろ過し、コラゲナーゼ消化されていない組織片を取り除いた。室温で５分間、１２００ｒｐｍの遠心で細胞懸濁液を遠心することで、沈渣する沈降細胞集団（ＳＶＦ画分）を得た。ＳＶＦ画分をＤＭＥＭ／Ｆ１２培地にて遠心操作により３回洗浄し、チュルク液（ナカライテスク株式会社）にて染色し、有核細胞数を計測した。
１．６×１０５の細胞をヒトフィブロネクチン（ＳＩＧＭＡ）でコーティングした２５ｃｍ２フラスコ（ＮＵＮＣ）に播種し、２％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清を含む低血清培地を５ｍｌ加えて、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の飽和条件下で培養した。フラスコに播種した２４時間後、フラスコ底面に付着していない赤血球などの細胞を培地とともに除去し、あらたに低血清培地を添加した。
実施例３
低血清培養により選択された幹細胞の継代培養
実施例２にて増殖したコンフルエント直前の細胞を、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ（和光純薬工業株式会社）／リン酸緩衝生理食塩水（日水製薬株式会社）で洗浄後、０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシン溶液（ＳＩＧＭＡ）を加え、２分間インキュベートすることで細胞を剥離させた。新しい低血清培地を加え、細胞を分散させたあと、チュルク液にて染色し、細胞数を計測した。２×１０５の細胞をヒトフィブロネクチンでコートした新しい２５ｃｍ２フラスコに播種し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の飽和条件下で培養した。培地は２日ごとに新鮮な低血清培地と交換した。
結果は図１に示したとおりである。すなわち、５２日間にわたる１３回の継代培養の後に１０１８個にまで増殖したと計算された（図１）。この高い増殖能は、これらの細胞が平均４０回以上の分裂能力を持つことを示す。
図１の例は２％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清を含む培養液を用いて継代培養したものであるが、２％（ｖ／ｖ）のヒト血清（コスモバイオ社）を含む培養液を用いても同等あるいはそれ以上の増殖が得られた。図２に１８歳男性由来ヒト血清２％（ｖ／ｖ）、１９歳女性由来のヒト血清２％（ｖ／ｖ）、あるいは２９歳男性由来ヒト血清２％（ｖ／ｖ）をそれぞれ含む低血清培地で培養した２２歳男性皮下脂肪組織由来の幹細胞の増殖曲線を示す。
実施例４
脂肪細胞への誘導
平均１０回分裂増殖した細胞をヒトフィブロネクチンでコートした２５ｃｍ２フラスコにて培養し、コンフルエント直前に脂肪細胞誘導培地（ダルベッコ変法イーグル培地、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、０．５ｍｍｏｌ／ｌイソブチル−１−メチルキサンチン（ＳＩＧＭＡ）、０．１ｍｍｏｌ／ｌインドメタシン（和光純薬工業株式会社）、１μｍｏｌ／ｌハイドロコルチゾン（ＳＩＧＭＡ）、１０μｇ／ｍｌインスリン（ＳＩＧＭＡ）、１μｍｏｌ／ｌデキサメタゾン（ＳＩＧＭＡ）を加えて、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の飽和条件下、１５日間培養した。培地は３日ごとに新鮮な培地に交換した。脂肪細胞特異的な形態変化を、倒立型顕微鏡を用いて観察した。９０％以上の細胞が油滴をためた脂肪細胞の特徴を示した（図３）。
実施例５
骨芽細胞への誘導
平均１０回分裂増殖した細胞をヒトフィブロネクチンでコートした２５ｃｍ２フラスコにてＤＭＥＭ／Ｆ１２、２０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清培地で培養し、コンフルエント直前に骨芽細胞誘導培地（ダルベッコ変法イーグル培地、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、５０μｍｏｌ／ｌアスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩ｎ水和物、１０ｍｍｏｌ／ｌ  β−グリセロリン酸（ＳＩＧＭＡ）、０．１μｍｏｌ／ｌデキサメタゾン）を加えて、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の飽和条件下、３週間培養した。培地は３日ごとに新鮮な培地に交換した。
実施例６
アルカリフォスファターゼ反応とｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色（骨芽細胞分化の確認）
誘導を始めてから３週間後に培地を除き、リン酸緩衝生理食塩水で一度洗浄した。１０％（ｖ／ｖ）中性緩衝ホルムアルデヒド溶液（和光純薬工業株式会社）に１５分間浸して細胞を固定したあと、蒸留水で一度洗浄し、さらに蒸留水に１５分間浸した。アルカリフォスファターゼ基質液（０．２ｍｇ／ｍｌ  Ｎａｐｈｔｏｌ  ＡＳ  ＭＸ−ＰＯ４（ＳＩＧＭＡ）、０．８％（ｖ／ｖ）Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（和光純薬工業株式会社）、１．２ｍｇ／ｍｌ  Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ  Ｖｉｏｌｅｔ  ＬＢ  ｓａｌｔ（ＳＩＧＭＡ）、０．１ｍｏｌ／ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３））を加えて室温で４５分間反応させたあと、蒸留水で３度洗浄した。２．５％（ｗ／ｖ）硝酸銀（和光純薬工業株式会社）水溶液を加え、室温で３０分間反応させ、蒸留水で３度洗浄した。染色の様子を図４に示す。
図４に示したように、この発明の分化多能性細胞に対して骨芽細胞への分化誘導処理を施すと、高い効率で骨芽細胞に分化することが確認された。
さらに、ヒトの大網組織に対して実施例１−３と同様の操作を施すことによって、同じく継代培養が繰り返せる高い増殖能と脂肪、骨芽細胞への多分化能を示す線維芽様細胞が得られた。図は４８歳女性大網組織から得た平均２０回分裂増殖した幹細胞を、実施例４に示す方法で脂肪細胞へ誘導した場合（図５）、あるいは実施例５−６に示す方法で骨芽細胞へ誘導した場合（図６）である。大網組織からも脂肪細胞や骨芽細胞に分化する多分化能を有する幹細胞が回収された。
実施例７
軟骨細胞への誘導
平均１０回分裂増殖した細胞を、ヒトフィブロネクチンでコートした２５ｃｍ２フラスコにて培養し、コンフルエント直前に軟骨細胞誘導培地（無血清基本培地に１００ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−β１（ペプロテック社）を添加した培地）を加えて、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の飽和条件下、１２日間培養した。培地は４日ごとに新鮮な培地に交換した。軟骨細胞特異的な形態変化を、倒立型顕微鏡を用いて観察した。ＴＧＦ−β１依存的に細胞の形態変化、凝集が観察された。
実施例８
アルシアンブルー染色（軟骨細胞への分化の確認）
誘導を始めてから１２日後に培地を除き、リン酸緩衝生理食塩水で一度洗浄した。１０％（ｗ／ｖ）中性緩衝ホルムアルデヒド溶液に１５分間浸して細胞を固定したあと、蒸留水で一度洗浄し、０．１ｍｏｌ／ｌ塩酸溶液に５分間浸した。１％（ｗ／ｖ）アルシアンブルー（ＳＩＧＭＡ）を０．１ｍｏｌ／ｌ塩酸に溶解させた染色液を加え、３０分間室温で反応させた。０．１ｍｏｌ／ｌ塩酸溶液で一度洗浄したあと、蒸留水で洗浄した。染色の様子を図７に示す。ＴＧＦ−β１依存的に分化誘導した細胞は軟骨細胞特異的グルコサミノグリカンであるコンドロイチン硫酸陽性を示す緑青色に染色された。
実施例９
酵素処理後の培養をしていないＳＶＦ画分のフローサイトメーターによる細胞表面の抗原解析
実施例２に示す方法により回収した１２歳男性ヒト皮下脂肪組織由来のＳＶＦ画分の細胞１０４個を、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ３４抗体およびＰＣ７標識抗ヒトＣＤ４５抗体（いずれもベックマンコールター社）で染色し、フローサイトメトリー法により解析した。どちらの抗体も０．１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ナカライテスク株式会社）を含むリン酸緩衝生理食塩水にて１／２０に希釈して、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、リン酸緩衝生理食塩水にて細胞を洗浄したあと、ＪＳＡＮデスクトップセルソーター（ベイバイオサイエンス社）にて解析を行った。培養をしていないＳＶＦ画分は、約５０％がＣＤ３４陽性かつＣＤ４５陰性の細胞集団で、約４０％がＣＤ３４陰性かつＣＤ４５陽性の細胞集団であった。
また、これらの細胞集団を、抗ヒトＣＤ１３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５抗体（いずれもベックマンコールター社）および抗ヒトＣＤ３７抗体（ベクトンディキンソン社）で染色し、フローサイトメトリー法により解析した。培養をしていないＳＶＦ分画に含まれるＣＤ３４陽性かつＣＤ４５陰性細胞集団は、ＣＤ３７およびＣＤ９０については陽性、ＣＤ１３およびＣＤ１０５については陰性であった。
実施例１０
低血清培養により選択的に増殖するＳＶＦ画分中の細胞集団の同定
実施例２に示す方法により回収した４９歳女性ヒト大網組織由来のＳＶＦ画分をＣＤ４５マイクロビーズ（第一化学薬品）を用いて、ＣＤ４５陰性細胞集団とＣＤ４５陽性細胞集団に分離した。ＣＤ４５陰性細胞集団はさらにＣＤ３４マイクロビーズ（第一化学薬品）を用いて、ＣＤ３４陽性細胞集団とＣＤ３４陰性細胞集団に分離した。
分離したＣＤ４５陽性細胞集団、ＣＤ３４陽性かつＣＤ４５陰性細胞集団、ＣＤ３４陰性かつＣＤ４５陰性細胞集団をそれぞれ実施例１に示す低血清培地により培養をした。ＣＤ４５陽性細胞集団由来の細胞はほとんど増殖せず、ＣＤ３４陰性かつＣＤ４５陰性細胞集団由来の細胞は緩やかな増殖、ＣＤ３４陽性かつＣＤ４５陰性細胞集団由来の細胞は良好な増殖を示した。増殖した、ＣＤ３４陰性かつＣＤ４５陰性細胞集団由来の細胞、およびＣＤ３４陽性かつＣＤ４５陰性細胞集団由来の細胞をそれぞれ実施例４−５に示す方法により、脂肪細胞へ分化誘導および骨芽細胞へ分化誘導した。その結果、ＣＤ３４陽性かつＣＤ４５陰性細胞集団由来の細胞でのみ、脂肪細胞（図８）および骨芽細胞（図９）への分化の特徴を示した。
実施例１１
低血清培養した細胞のフローサイトメーターによる細胞表面の抗原解析
実施例２に示した方法により得たヒト皮下脂肪組織由来のＳＶＦ画分を、実施例３と同様にコンフルエント直前まで低血清培養により増殖させ、平均１０回分裂した細胞を剥離、分散させた。１０４個の細胞をそれぞれ抗ヒトＣＤ１３、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１１７抗体（いずれもベックマンコールター社）で染色し、フローサイトメトリー法により解析した。ＳＶＦ画分から低血清培養により増殖した細胞集団は、ＣＤ１３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５については陽性、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１０６およびＣＤ１１７については陰性であった。
実施例１０に示した方法により、ＳＶＦ画分から分離したＣＤ３４陽性かつＣＤ４５陰性細胞集団を、実施例３と同様にコンフルエント直前まで低血清培養により増殖させ、平均１０回分裂した細胞を剥離、分散させた。１０４個の細胞をそれぞれ抗ヒトＣＤ１３、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１１７抗体で染色し、フローサイトメトリー法により解析した。ＳＶＦ画分中のＣＤ３４陽性かつＣＤ４５陰性細胞集団から低血清培養により増殖した細胞集団は、ＣＤ１３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５については陽性、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１０６およびＣＤ１１７については陰性であった。ＳＶＦ画分全細胞集団から低血清培養により増殖した細胞集団と、ＳＶＦ画分中のＣＤ３４陽性かつＣＤ４５陰性細胞集団のみを低血清培養により増殖させた細胞集団は、同じ細胞表面の抗原発現様式を示した（表１）。
【表１】
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実施例１２
低血清培養により選択的に増殖した分化多能性細胞の動物モデルへの移植
平均２０回分裂増殖したヒト皮下脂肪組織由来の分化多能性細胞を、ヒトフィブロネクチンでコートした２５ｃｍ２フラスコにて培養し、コンフルエント直前に１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ／リン酸緩衝生理食塩水で洗浄後、０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシン溶液を加え、２分間インキュベートすることで細胞を剥離させた。回収した１０７個の分化多能性細胞を、１μｇのＦＧＦ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社）を含む２００μｌのフィブリノーゲン（Ｂａｘｔｅｒ社）に懸濁させた。前日に抗アシアロＧＭ１抗体（和光純薬工業株式会社）５０μｌを腹腔内投与しておいた７週齢オスのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス背部皮下に、細胞−フィブリノーゲン懸濁液を注入した。
移植後２週間経過後にパラフィン切片を作製し、ＨＥ染色にて移植部位の脂肪細胞の形状を観察した。その結果、移植した分化多能性幹細胞が脂肪へ分化していることを確認した（図１０）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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