(57)【要約】  カーボン電極２１の表面にキャプチャープローブ２８ａが結合してなる電極と、Ｌ−プロリン脱水素酵素２６により標識されたレポータプローブ２８ｃと、このＬ−プロリン脱水素酵素２６と反応する基質であるＬ−プロリン２５とを用いる。そして、キャプチャープローブ２８ａと、レポータプローブ２８ｃとにターゲットＤＮＡ２８ｂを結合させる。そして、レポータプローブ２８ｃに標識されたＬ−プロリン脱水素酵素２６とＬ−プロリン２５による反応によりカーボン電極２１に流れる限界酸化電流の電流値を測定することによりターゲットＤＮＡ２８ｂを検出する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キャプチャープローブと、耐熱酵素により標識されたレポータプローブと、前記耐熱酵素と反応する基質とを用いて、
前記キャプチャープローブと、前記レポータプローブとにターゲットＤＮＡを結合させ、前記レポータプローブに標識された前記耐熱酵素と前記基質による反応により電気化学的に前記ターゲットＤＮＡを検出することを特徴とするＤＮＡ検出方法。
【請求項２】
前記キャプチャープローブを導電体表面に結合させて電極を構成し、
前記キャプチャープローブと、前記レポータプローブとにターゲットＤＮＡを結合させ、前記レポータプローブに標識された前記耐熱酵素と前記基質による反応により前記電極に流れる電流値を測定することにより前記ターゲットＤＮＡを検出することを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項３】
前記耐熱酵素は、超好熱菌に由来する酵素であることを特徴とする請求項１又は２に記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項４】
前記超好熱菌に由来する酵素は、Ｌ−プロリン脱水素酵素であることを特徴とする請求項３のいずれか１つに記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項５】
前記Ｌ−プロリン脱水素酵素は、サーモコッカス・プロファンダス(Thermococcus profundus)、サーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)、ピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)、及び、ピロコッカス・ホリコシＯＴ−３(Pyrococcus horikoshi OT-3)からなる群から選ばれる生物に由来することを特徴とする請求項４に記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項６】
ターゲットＤＮＡの変性のための熱処理時に、前記耐熱酵素により標識されたレポータプローブを、前記ターゲットＤＮＡが含まれる溶液中に投入することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１つに記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項７】
キャプチャープローブに結合するターゲットＤＮＡに、さらに結合するレポータプローブであって、
耐熱酵素により標識されており、
前記耐熱酵素と基質による反応により電気化学的に前記ターゲットＤＮＡを検出するために用いられることを特徴とするレポータプローブ。
【請求項８】
前記レポータプローブは、導電体表面にキャプチャープローブが結合してなる電極の前記キャプチャープローブに結合するターゲットＤＮＡに、さらに結合し、
前記耐熱酵素と基質による反応により前記電極に流れる電流値を測定することにより前記ターゲットＤＮＡを検出するために用いられることを特徴とする請求項７に記載のレポータプローブ。
【請求項９】
前記耐熱酵素は、超好熱菌に由来する酵素であることを特徴とする請求項７又は８に記載のレポータプローブ。
【請求項１０】
前記超好熱菌に由来する酵素は、Ｌ−プロリン脱水素酵素であることを特徴とする請求項９に記載のレポータプローブ。
【請求項１１】
前記Ｌ−プロリン脱水素酵素は、サーモコッカス・プロファンダス(Thermococcus profundus)、サーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)、ピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)、及び、ピロコッカス・ホリコシＯＴ−３(Pyrococcus horikoshi OT-3)からなる群から選ばれる生物に由来することを特徴とする請求項１０に記載のレポータプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、導電体表面にキャプチャープローブが結合してなる電極と、酵素が標識されたレポータプローブとを用いて、ターゲットＤＮＡを結合させ、電流値を測定することによりターゲットＤＮＡを検出するＤＮＡ検出方法及びレポータプローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、バッチ式のシステムにおいて、二種類の酸化還元酵素と補酵素とを組み合わせて、基質（例えば、生体内物質等）を高感度に定量する方法及び酵素活性を測定する方法が確立されている（例えば、非特許文献１参照。）。【０００３】
この方法を用いてサンドイッチハイブリダイゼーションによりＤＮＡの検出を行う場合は、レポータプローブに酵素を標識し、酵素反応に基づく電子の授受を測定する。この方法によれば、ハイブリダイゼーションをさせるためにターゲットＤＮＡを一本鎖に変性させる必要があるが、ハイブリダイゼーションの効率を上げるためには、９０℃以上の高温が必要となる。【０００４】
一方、超好熱菌であるサーモコッカス・プロファンダス(Thermococcus profundus)ＤＳＭ９５０３に由来するＬ−プロリン脱水素酵素が精製され、このＬ−プロリン脱水素酵素の活性が示されている（例えば、非特許文献２参照。）。
【非特許文献１】生化学実験講座、第５巻、酵素研究法（東京化学同人）p121-129
【非特許文献２】ハルヒコ  サクラバ(Haruhiko Sakuraba)、ヨシノリ  タカマツ(Yoshinori Takamatsu)、タケノリ  サトムラ(Takenori Satomura)、リュウシ  カワカミ(Ryushi Kawakami)、トシヒサ  オオシマ(Toshihisa Ohshima)著,「アプライド・アンド・エンヴァイラメンタル・マイクロバイオロジー(Applied and Environmental Microbiology)」,(米国),2001年,第67巻,p.1470-1475
【発明の開示】
【０００５】
上記の方法を用いてＤＮＡの検出を行う場合、従来から使用されている耐熱酵素は９０℃近くの高温では失活してしまうため、酵素により標識されたレポータプローブは、７０℃程度まで反応液の温度を下げてから投入する必要があった。つまり、ハイブリッドダイゼーションの効率にかかわらず、酵素により標識されたレポータプローブは、酵素が失活しない温度までサンプル液の温度が下がってから投入しなければならなかった。
【０００６】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、その目的は、より高感度かつ効率的にＤＮＡを検出するためのＤＮＡ検出方法及びレポータプローブを提供することにある。
【０００７】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、その目的は、より高感度かつ効率的にＤＮＡを検出するためのＤＮＡ検出方法及びレポータプローブを提供することにある。
【０００８】
本発明のＤＮＡ検出方法は、キャプチャープローブと、耐熱酵素により標識されたレポータプローブと、前記耐熱酵素と反応する基質とを用いて、前記キャプチャープローブと、前記レポータプローブとにターゲットＤＮＡを結合させ、前記レポータプローブに標識された前記耐熱酵素と前記基質による反応により電気化学的に前記ターゲットＤＮＡを検出する。これによれば、耐熱酵素により標識されたレポータプローブを、この耐熱酵素が活性を保つ温度である高温の反応液に投入することができる。従って、より高い温度でレポータプローブを反応液に投入できるため、ハイブリダイゼーションの効率が上がり、より高感度かつ効率的にターゲットＤＮＡの検出を行うことができる。
【０００９】
このＤＮＡ検出方法において、前記キャプチャープローブを導電体表面に結合させて電極を構成し、前記キャプチャープローブと、前記レポータプローブとにターゲットＤＮＡを結合させ、前記レポータプローブに標識された前記耐熱酵素と前記基質による反応により前記電極に流れる電流値を測定することにより前記ターゲットＤＮＡを検出することができる。これによれば、前記キャプチャープローブを導電体表面に結合させて構成した電極と耐熱酵素により標識されたレポータプローブとを用いて、電極に流れる電流値を測定することにより、より高感度かつ効率的にターゲットＤＮＡの検出を行うことができる。
【００１０】
このＤＮＡ検出方法において、前記耐熱酵素を、超好熱菌に由来する酵素とすることができる。これによれば、超好熱菌に由来する耐熱酵素により標識されたレポータプローブを、この超好熱菌に由来する耐熱酵素が活性を保つ温度である高温の反応液に投入することができる。従って、ハイブリダイゼーションの効率が上がり、より高感度かつ効率的にターゲットＤＮＡの検出を行うことができる。
【００１１】
このＤＮＡ検出方法において、前記超好熱菌に由来する酵素は、Ｌ−プロリン脱水素酵素とすることができる。これによれば、超好熱菌に由来するＬ−プロリン脱水素酵素により標識されたレポータプローブを、このＬ−プロリン脱水素酵素が活性を保つ温度である高温の反応液に投入することができる。従って、ハイブリダイゼーションの効率が上がり、より高感度かつ効率的にターゲットＤＮＡの検出を行うことができる。
【００１２】
このＤＮＡ検出方法において、前記Ｌ−プロリン脱水素酵素は、サーモコッカス・プロファンダス(Thermococcus profundus)、サーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)、ピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)、及び、ピロコッカス・ホリコシＯＴ−３(Pyrococcus horikoshi OT-3)からなる群から選ばれる生物に由来するとすることができる。これによれば、これらの各生物に由来するＬ−プロリン脱水素酵素により標識されたレポータプローブを、このＬ−プロリン脱水素酵素が活性を保つ温度で反応液に投入することができる。このため、ターゲットＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに変性させてから、高温の状態で、ターゲットＤＮＡにレポータプローブを反応させることができる。従って、ハイブリダイゼーションの効率が上がり、より高感度かつ効率的にターゲットＤＮＡの検出を行うことができる。
【００１３】
このＤＮＡ検出方法において、ターゲットＤＮＡの変性のための熱処理時に、前記耐熱酵素により標識されたレポータプローブを、前記ターゲットＤＮＡが含まれる溶液中に投入することができる。これによれば、電極に固定されたキャプチャープローブと耐熱酵素により標識されたレポータプローブとをハイブリダイゼーションのためのターゲットＤＮＡの変性時にターゲットＤＮＡと共存させることができる。これにより、ハイブリダイゼーションの効率が上がり、より高感度かつ効率的にターゲットＤＮＡの検出を行うことができる。また、より簡易な操作で処理を行うことができる。
【００１４】
本発明のレポータプローブは、キャプチャープローブに結合するターゲットＤＮＡに、さらに結合するレポータプローブであって、耐熱酵素により標識されており、前記耐熱酵素と基質による反応により電気化学的に前記ターゲットＤＮＡを検出するために用いられる。これによれば、耐熱酵素により標識されたレポータプローブを、この耐熱酵素が活性を保つ温度である高温の反応液に投入することができる。従って、より高い温度でレポータプローブを反応液に投入できるため、ハイブリダイゼーションの効率が上がり、より高感度かつ効率的にターゲットＤＮＡの検出を行うことができる。
【００１５】
このレポータプローブにおいて、前記レポータプローブは、導電体表面にキャプチャープローブが結合してなる電極の前記キャプチャープローブに結合するターゲットＤＮＡに、さらに結合し、前記耐熱酵素と基質による反応により前記電極に流れる電流値を測定することにより前記ターゲットＤＮＡを検出するために用いることができる。これによれば、前記キャプチャープローブを導電体表面に結合させて構成した電極と耐熱酵素により標識されたレポータプローブとを用いて、電極に流れる電流値を測定することにより、より高感度かつ効率的にターゲットＤＮＡの検出を行うことができる。
【００１６】
このレポータプローブにおいて、前記耐熱酵素を、超好熱菌に由来する酵素とすることができる。これによれば、超好熱菌に由来する耐熱酵素により標識されたレポータプローブを、この超好熱菌に由来する耐熱酵素が活性を保つ温度である高温の反応液に投入することができる。従って、ハイブリダイゼーションの効率が上がり、より高感度かつ効率的にターゲットＤＮＡの検出を行うことができる。
【００１７】
このレポータプローブにおいて、前記超好熱菌に由来する酵素は、Ｌ−プロリン脱水素酵素とすることができる。これによれば、超好熱菌に由来するＬ−プロリン脱水素酵素により標識されたレポータプローブを、このＬ−プロリン脱水素酵素が活性を保つ温度である高温の反応液に投入することができる。従って、ハイブリダイゼーションの効率が上がり、より高感度かつ効率的にターゲットＤＮＡの検出を行うことができる。
【００１８】
このレポータプローブにおいて、前記Ｌ−プロリン脱水素酵素は、サーモコッカス・プロファンダス(Thermococcus profundus)、サーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)、ピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)、及び、ピロコッカス・ホリコシＯＴ−３(Pyrococcus horikoshi OT-3)からなる群から選ばれる生物に由来するとすることができる。これによれば、これらの各生物に由来するＬ−プロリン脱水素酵素により標識されたレポータプローブを、このＬ−プロリン脱水素酵素が活性を保つ温度で反応液に投入することができる。このため、ターゲットＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに変性させてから、高温の状態で、ターゲットＤＮＡにレポータプローブを反応させることができる。従って、ハイブリダイゼーションの効率が上がり、より高感度かつ効率的にターゲットＤＮＡの検出を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の一実施形態を示す概略模式図。
【図２】本発明の一実施形態で用いられるバイオセンサを示す概略模式図。
【図３】本発明の一実施形態を示す概略模式図。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明のＤＮＡ検出方法では、本発明のレポータプローブである、耐熱酵素で標識されたレポータプローブを用いて、ターゲットＤＮＡの検出を行う。ここでは、まず、レポータプローブに標識された耐熱酵素について説明し、次に、本発明のＤＮＡ検出方法の一実施形態で用いられる電極について説明した後、本発明のＤＮＡ検出方法の一実施形態について説明する。【００２１】
（レポータプローブに標識された耐熱酵素）
本発明のレポータプローブ、及び、本発明のＤＮＡ検出方法で用いられるレポータプローブは、耐熱酵素により標識されている。耐熱酵素は、人工合成による酵素又は天然の酵素のいずれでもよい。天然の耐熱酵素としては、超好熱菌から得られる酵素が挙げられる。【００２２】
なお、超好熱菌とは、好熱菌のうち特に高い温度（通常８５℃〜９０℃以上）で生育できる菌をいう。このような超好熱菌からは、高温（９０℃近く）でも活性を保つ酵素を得ることができる。すなわち、このような超好熱菌から、ターゲットＤＮＡの変性温度で完全には失活しない酵素を得ることができる。このような酵素として、例えば、超好熱菌に由来するＬ−プロリン脱水素酵素が挙げられる。なお、本発明における耐熱酵素及び超好熱菌に由来する酵素は、これに限定されるものではない。【００２３】
超好熱菌に由来するＬ−プロリン脱水素酵素としては、例えば、サーモコッカス・プロファンダス(Thermococcus profundus)、サーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)、ピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)、及び、ピロコッカス・ホリコシＯＴ−３(Pyrococcus horikoshi OT-3)に由来するＬ−プロリン脱水素酵素が挙げられる。このうち、サーモコッカス・プロファンダス(Th ermococcus profundus)に由来するＬ−プロリン脱水素酵素が特に好ましい。【００２４】
なお、超好熱菌に由来するＬ−プロリン脱水素酵素として、サーモコッカス・プロファンダス(Thermococcus profundus)ＤＳＭ９５０３、サーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)、ＤＳＭ１０３４３、ピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)ＤＳＭ３６３８、及びピロコッカス・ホリコシ(Pyrococcus horikoshi)ＯＴ−３に由来するＬ−プロリン脱水素酵素が抽出されている。このうち、サーモコッカス・プロファンダス(Thermococcus profundus)ＤＳＭ９５０３に由来するＬ−プロリン脱水素酵素について、精製され、各条件下における活性が調べられている。このサーモコッカス・プロファンダス(Thermococcus profundus)ＤＳＭ９５０３に由来するＬ−プロリン脱水素酵素の活性には、温度については８０℃が好適であり、９０℃においても高い活性が示されることが報告されている（非特許文献２参照。）。【００２５】
（電気化学的方法によるＤＮＡの検出）
本発明のＤＮＡ検出方法では、キャプチャープローブと、耐熱酵素により標識されたレポータプローブと、耐熱酵素と反応する基質とを用いる。そして、キャプチャープローブとレポータプローブとにターゲットＤＮＡを結合させ、レポータプローブに標識された耐熱酵素と基質による反応により電気化学的にターゲットＤＮＡを検出する。【００２６】
以下、電気化学的方法によりＤＮＡ検出を行う場合として、キャプチャープローブを導電体表面に結合させて電極を構成し、この電極に流れる電流値を測定することによりターゲットＤＮＡを検出する場合について詳述する。【００２７】
（電極）
本実施形態で用いられる電極は、レポータプローブに標識されたＬ−プロリン脱水素酵素の活性を測定するために用いることができるものである。【００２８】
導電体としては、通常、電極として用いられるものであればどのような材料でも使用することができる。例えば、グラファイト、カーボン、カーボンファブリック等；アルミニウム、銅、金、白金、銀等の金属又は合金、ＳｎＯ2、Ｉｎ2Ｏ3、ＷＯ3、ＴｉＯ2等、導電性酸化物等種々の材料の単層又は２種以上の積層構造が挙げられる。電極の膜厚、大きさ及び形状等は特に限定されるものではなく、使用するメディエータ、酵素等の種類、得ようとするバイオセンサの性能等によって適宜調整することができる。例えば、厚み０．１〜５ｍｍ程度、１〜１００００ｍｍ2程度の面積の矩形形状であることが適当である。【００２９】
導電体には、メディエータが積層されていてもよい。なお、メディエータは、導電体に積層されず、溶液中に存在していてもよい。
メディエータとしては、電極とＬ−プロリン脱水素酵素との間で電子を授受し得る電子移動媒体として機能するもので、Ｌ−プロリン脱水素酵素の反応に悪影響を与えないものであれば、どのようなものでも使用することができる。例えば、フェロセン、フェリシアン化アルカリ金属（フェリシアン化カリウム、フェリシアン化リチウム、フェリシアン化ナトリウム等）又はこれらのアルキル置換体（メチル置換体、エチル置換体、プロピル置換体等）、フェナジンメトサルフェート、ｐ−ベンゾキノン、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、メチレンブルー、β−ナフトキノン−４−スルホン酸カリウム、フェナジンエトサルフェート、ビタミンＫ、ビオローゲン等の酸化還元性の有機又は無機化合物の１種あるいは２種以上の組み合わせが挙げられる。なかでも、水や水溶性有機溶媒（低級アルコール等）に溶解し、取り扱いが容易であるもの、電子移動媒体としての機能が安定しているものが好ましく、例えば、フェロセン、フェリシアン化カリウム等が好適に用いられる。【００３０】
なお、Ｌ−プロリン脱水素酵素による反応における電子受容体としては、例えば、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フェレドキシン等を用いることができる。
導電体上に積層されるメディエータの膜厚は、特に限定されるものではなく、導電体の大きさ、用いるメディエータの種類、後述する酵素層の酵素の種類及び量、測定対象である酵素の種類等によって適宜調整することができる。例えば、０．１μｍ〜１０００μｍ程度が挙げられる。なお、メディエータを導電体上に積層する方法は、メディエータの種類によって、適当なものを適宜選択することができる。例えば、メディエータをその機能を阻害しない溶媒、例えば、水又は水溶性有機溶媒等に溶解させ、塗布、乾燥する方法、メディエータを適当な担体、例えば、樹脂、タンパク等の高分子化合物等に混合及び分散させ、担体を薄膜状に形成する方法、交互積層法（現代化学、１９９７年１月、ｐ２０〜２５参照）等、当該分野で公知の薄膜形成法のすべてを利用することができる。なかでも、後述する交互積層法が好ましい。【００３１】
なお、酵素層が、さらに、導電体上に積層されたメディエータの上に積層されてもよいし、メディエータ及び酵素の種類等によっては、酵素層をメディエータとともに導電体上に配置してもよい。酵素層の膜厚は、特に限定されるものではなく、導電体の大きさ、用いるメディエータの種類、測定対象である酵素の種類等によって適宜調整することができる。例えば、０．１μｍ〜１０００μｍ程度が挙げられる。なお、酵素層を積層する方法としては、メディエータとともに、あるいはメディエータの上に、メディエータを積層するのと同様の方法が挙げられる。【００３２】
このＤＮＡ検出方法で用いられる電極では、上述したメディエータ、酵素層が、高分子担体とともに層状で積層されていてもよい。ここで用いることができる高分子担体としては、電荷を有すること、ポリマーであること及び水溶性であることのいずれか１種、好ましくは全ての性質を満足するものが適当である。電荷は正及び負のいずれでもよい。高分子担体は、例えば、各種タンパク質（例えば、酵素、抗体、レセプタータンパク等）、ポリペプチド（例えば、ポリリシン、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸等）、水溶性合成高分子化合物（例えば、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸、カルボキシメチルセルロース、ポリスチレンスルホン酸、ポリジメチルジアリルアンモニウムクロライド等）、天然高分子（アルギン酸及びその塩類、トラガントガム等）が挙げられる。【００３３】
メディエータ等を高分子担体とともに積層する方法としては、特に限定されるものではなく、メディエータ等を高分子担体に分散、あるいは高分子担体とともに適当溶媒（水、緩衝液、水溶性有機溶媒等）に溶解又は分散し、塗布、乾燥する方法でもよいし、交互積層法を利用してもよい。【００３４】
メディエータ及び酵素層を積層する交互積層法（ここでは、各層を順次積層する方法）は、例えば、以下のように行うことができる。
まず、導電体表面を活性化することにより、正又は負に帯電させる。次いで、メディエータを構成する分子、あるいはメディエータを分散／メディエータと結合した高分子担体を負又は正に帯電させ、これを導電体表面に接触させることにより、正と負との電荷の間の相互作用を通してメディエータを導電体表面に積層する。なお、このような１回の正負の相互作用によって、必要なメディエータ量を確保することができれば、上述のような積層は１層のみでよいが、さらに多量のメディエータを導電体表面に積層したい場合は、上述の相互作用を複数回行うことによって、メディエータ層を複数層、例えば、２〜２０層程度積層してもよい。この場合、積層されたメディエータ上に、これと反対の電荷を有する担体（例えば、上述した高分子担体）又はメディエータ等を積層し、再度、メディエータを構成する分子等を、この高分子担体等の上に積層するという一連の操作を繰り返すことによって、多数層のメディエータの積層を実現することができる。【００３５】
また、このＤＮＡ測定装置の電極では、測定対象となる酵素の活性を測定するために、（１）活性の測定対象となる酵素が積層されていてもよいし、（２）電極に接触するように、この電極とは別個に測定対象となる酵素が配置されていてもよい。（１）の場合には、メディエータ等と同様の積層法を利用して積層することができ、同様に、交互積層法によって形成することが好ましい。なお、（１）の場合には、測定対象となる酵素が導電体上に積層されていることにより、例えば、酵素が基質とともに溶液によって供給されるのに比較して、測定対象の酵素の反応に起因して発生する電流値が十分に高い出力として得ることができ、より測定感度が良好となり、測定誤差を低減することが可能になるという利点がある。（２）の場合には、例えば、測定対象となる酵素を、好ましくは基質の存在下において、溶液状、懸濁又は分散された液状で、電極に接触させてもよい。なお、（２）の場合には、測定対象となる酵素が含有された液状であってもよい。【００３６】
本実施形態で用いる電極には、さらに、ＤＮＡ断片を固定させておく。このＤＮＡ断片は、ＤＮＡの相補性を利用して、検出及び／又は定量目的のＤＮＡ（以下「ターゲットＤＮＡ」と記す）と対合させるためのキャプチャープローブである。【００３７】
ターゲットＤＮＡは、ＤＮＡの相補性を利用して、このキャプチャープローブと対合させられる検出及び／又は定量目的のＤＮＡ断片である。本発明のＤＮＡ検出方法では、キャプチャープローブとレポータプローブとにそれぞれ相補性を有する特定のＤＮＡ断片の検出を行うが、検出対象のＤＮＡ断片が、ターゲットＤＮＡに相当する。なお、採取されたＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅されて用いられる。【００３８】
レポータプローブは、ＤＮＡの相補性を利用してターゲットＤＮＡと対合する。このレポータプローブには、ターゲットＤＮＡの検出及び／又は定量するために酵素が標識されている。本発明において、この酵素は、Ｌ−プロリン脱水素酵素である。【００３９】
そして、このキャプチャープローブとターゲットＤＮＡとレポータプローブとを反応させることにより、キャプチャープローブ、ターゲットＤＮＡ、レポータプローブがこの順に電極に結合させられる。つまり、電極上で、いわゆるターゲットＤＮＡのハイブリダイゼーションを行わせる。そして、ターゲットＤＮＡ及びレポータプローブが結合された電極を用いて、メディエータを介する間接的な電子授受を、例えば、電流値として測定することによって、ターゲットＤＮＡの検出及び／又は定量を行うことができる。【００４０】
電極上にキャプチャープローブを固定する方法としては、当該分野で公知の方法の全て及びそれらに準じた方法を利用することができる。例えば、電極上にストレプトアビジンを積層し、キャプチャープローブの５’末端をビオチン修飾し、アビジン−ビオチンの相互作用により固定する方法又はこれに準じた方法が挙げられる。【００４１】
なお、ＤＮＡ断片（キャプチャープローブ、レポータプローブ）を用いる方法、つまりＤＮＡプローブ法、ＤＮＡハイブリダイゼーション自体は当該分野で公知の方法の全て及びそれらに準じた方法を利用することができる。この際に利用するＤＮＡ断片は、市販されているいずれを用いてもよい。例えば、サルモネラのプローブ（Rahn K., S. A. De Grandis, R. C. Clarke, S. A. McEwen, J. E. Galan, C. Ginocchio, R. Curtiss and C.L. Gyles, Mol. Cell. Probes, 6, 271-279 (1992)参照）、タカラバイオケミカルス、赤痢菌および腸管侵入性大腸菌（EIEC）invE遺伝子検出用Primer Set INV-1& 2、赤痢菌および腸管侵入性大腸菌（EIEC）ipaH遺伝子検出用Primer Set IPA-1& 2、コレラ毒素遺伝子検出用Primer Set VCT-1 & 2（いずれも（株）島津製作所製）等が挙げられる。【００４２】
上記のようにして作成された電極は、通常、対電極と、これらの電極及び対電極とを収容し、液体、好ましくは測定対象の酵素の基質を含有する溶液を収容することができる反応器内に配置され、さらにこの反応器内に、両電極がほぼ完全に浸漬する程度に溶液で充填されたバイオセンサにおいて、利用されることが適当である。このようなバイオセンサにおいては、サイクリックボルタンメトリの結果をもとにして、例えば両電極に所定の電位差を有する定電位を与え、測定対象の酵素の反応に起因して発生する電流値を測定して（例えば、限界酸化電流値として測定する）、測定対象の酵素の活性を判定することができる。電流値の検出は、例えば、ポテンショスタット、電流計等の電流検出部によって行うことができる。本実施形態においては、このようなバイオセンサを用いて電流値を測定することによりＤＮＡの検出を行う。【００４３】
本実施形態におけるＤＮＡ検出方法では、レポータプローブが耐熱酵素により標識され、この耐熱酵素の基質を含有する溶液を反応器内に収容する。そして、上記のように作成された電極と、対電極と、参照電極とを、この基質を含有する溶液に浸漬させ、この電極と対電極とに所定の電位差を有する定電位を与え、耐熱酵素と基質による反応に起因して発生する電流値を測定する。【００４４】
＜本実施形態におけるＤＮＡ検出方法＞
以下に、本実施形態におけるＤＮＡ検出方法を、図面に基づいて具体的に説明する。なお、ここでは耐熱酵素が超好熱菌に由来するＬ−プロリン脱水素酵素である場合について説明するが、上述のとおり、本発明における耐熱酵素は、これに限られるものではない。【００４５】
（作用電極）
図１に示すように、作用電極は、カーボン電極２１上にメディエータ２２を介してターゲットＤＮＡ２８ｂと相補的にハイブリダイズするキャプチャープローブ２８ａを固定化している。なお、メディエータ２２は、カーボン電極２１に固定化されていなくてもよく、溶液中に存在していてもよい。【００４６】
そして、キャプチャープローブ２８ａ、ターゲットＤＮＡ２８ｂ、Ｌ−プロリン脱水素酵素２６により標識されたレポータプローブ２８ｃを結合させることにより、Ｌ−プロリン脱水素酵素２６により標識されたレポータプローブ２８ｃを結合した作用電極を得ることができる。ここで、ＤＮＡサンプル液中に検出対象のＤＮＡが存在する場合、このＤＮＡを変性させた１本鎖ＤＮＡが、１本鎖のターゲットＤＮＡ２８ｂに相当する。ターゲットＤＮＡ２８ｂの検出を行うためには、ＤＮＡサンプル液中に、ターゲットＤＮＡ２８ｂの検出のために十分なだけ、採取されたＤＮＡが存在する必要がある。このため、まず、ターゲットＤＮＡ２８ｂの検出のために十分な量のＤＮＡを得るために、ＤＮＡサンプル液を用いてＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）を行うことにより、サンプル液中のＤＮＡを増幅させる。【００４７】
そして、このＤＮＡサンプル液を、例えば、９６℃で３０秒間、熱処理することにより、２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに変性させる。そして、作用電極をサンプル液に挿入するとともに、Ｌ−プロリン脱水素酵素２６により標識されたレポータプローブ２８ｃを投入する。なお、Ｌ−プロリン脱水素酵素２６により標識されたレポータプローブ２８ｃは、凍結乾燥させた状態のものを用いてもよいし、液状試薬を用いてもよい。【００４８】
ここで、レポータプローブ２８ｃに標識されたＬ−プロリン脱水素酵素２６の活性を保つためには、反応液の温度がＬ−プロリン脱水素酵素２６の耐熱温度より低いことが必要である。超好熱菌に由来するＬ−プロリン脱水素酵素２６の耐熱温度より反応液の温度が低ければ、さらに冷却することなく、Ｌ−プロリン脱水素酵素２６で標識されたレポータプローブ２８ｃを反応液に投入できる。【００４９】
ここで、ＤＮＡサンプル液中にターゲットＤＮＡ２８ｂが存在する場合、図１に示すように、キャプチャープローブ２８ａ、１本鎖のターゲットＤＮＡ２８ｂ及びレポータプローブ２８ｃがアニールさせられる。ここで、検出対象のＤＮＡが得られている場合には、この検出対象のＤＮＡが、１本鎖のターゲットＤＮＡ２８ｂに相当する。従って、サンプル液中に検出対象のＤＮＡが含まれている場合に、キャプチャープローブ２８ａ、ターゲットＤＮＡ２８ｂ、レポータプローブ２８ｃがこの順にカーボン電極２１に結合させられる。【００５０】
（バイオセンサ）
このＤＮＡ検出方法では、上記の作用電極と、参照電極及び対電極とを用いて、ＤＮＡの検出を行う。すなわち、作用電極と参照電極と対電極とを備えたバイオセンサを用いる。このバイオセンサの概略図を図２に示す。【００５１】
図２に示すように、バイオセンサ１８は、反応器１５内に、リード１１ａに接続された作用電極１１と、同じくリード１４ａに接続された対電極１４と、リード１２ａに接続された参照電極１２とを収容する。そして、反応器１５内に、電解液１３として、レポータプローブに標識されたＬ−プロリン脱水素酵素の基質であるＬ−プロリンを含有した緩衝液（例えば、トリス緩衝液）を収容する。そして、この緩衝液に、作用電極、参照電極及び対電極を浸漬させる。なお、作用電極１１と対電極１４との間にセパレータ１６を装備する。また、リード１１ａには、作用電極１１において発生した電流値を測定するための電流検出部として電流計１７が接続されている。【００５２】
このようなバイオセンサ１８の作用電極１１に、参照電極１２を基準として、例えば＋５００ｍＶの電位を印加することにより、電解液１３中の基質（Ｌ−プロリン）と酵素（Ｌ−プロリン脱水素酵素）等が反応し、メディエータを介して電子の授受が行われる。これにより作用電極に流れる電流を限界酸化電流として、電流計によって測定することができる。従って、この電解液１３中のＬ−プロリン、レポータプローブに標識されたＬ−プロリン脱水素酵素及びメディエータ等による電子の授受により、作用電極１１に流れる電流を限界酸化電流として、電流計１７によって測定することができる。【００５３】
（電流値の測定によるターゲットＤＮＡの検出）
次に、上記の様に構成された電極（作用電極１１）を備えたバイオセンサ１８を用いて電流値の測定を行うことによるターゲットＤＮＡの検出について説明する。【００５４】
ここで、サンプル液中に検出対象のＤＮＡが含まれていた場合には、作用電極１１上には、キャプチャープローブ２８ａ、ターゲットＤＮＡ２８ｂ、レポータプローブ２８ｃが、この順で結合されている。なお、レポータプローブ２８ｃは、Ｌ−プロリン脱水素酵素２６により標識されている。【００５５】
電流値の測定は、バイオセンサ１８の作用電極１１に、参照電極１２を基準として＋５００ｍＶの電位を印加し、作用電極１１に流れる電流を測定することにより行う。
ここで、バイオセンサ１８の作用電極１１に電位を印加すると、反応液中のＬ−プロリン２５とＬ−プロリン脱水素酵素２６が反応し、メディエータ２２を介して電子の授受が行われる。具体的には、図１に示すように、Ｌ−プロリン脱水素酵素２６が、基質であるＬ−プロリン２５と反応してΔ１−ピロリン−５−カルボン酸２７を生成する際に、メディエータ２２が水素を受け取ることで還元型に変換される。この還元型のメディエータ２２が、水素を移動させて、これによって生じた電子の授受をカーボン電極２１に伝達させる。【００５６】
この作用電極１１と、対電極１４と、参照電極１２とを用いて、作用電極１１のカーボン電極２１に流れる電流（限界酸化電流）の電流値を測定する。作用電極１１に、参照電極１２を基準として、例えば、＋５００ｍＶの電位を印加することにより、反応液中の、Ｌ−プロリン２５と、Ｌ−プロリン脱水素酵素２６とが反応し、メディエータ２２を介して電子の授受が行われ、作用電極１１に流れる電流を、限界酸化電流として、電流計１７によって測定することができる。【００５７】
なお、電解質溶液のみを用い、Ｌ−プロリン脱水素酵素２６による酵素反応が起こらない場合であっても、ベースとなる電流が発生するが、酵素反応が起こった場合の酸化還元反応の電子の移動を、このベース電流に比較してより大きな値として測定することができる。【００５８】
このように、Ｌ−プロリン脱水素酵素２６による酵素反応に基づく酵素−電極間の電子伝達をモニタする、つまり、一連の電子移動を電流として捕らえることにより、ターゲットＤＮＡの有無又は濃度を検知することができる。従って、ターゲットＤＮＡを捕捉するキャプチャープローブ及びキャプチャーしたターゲットＤＮＡにさらに結合し、信号を得るためのレポータプローブを用いるサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイによりＤＮＡの検出を行うことが可能となる。【００５９】
以上、本実施形態によれば、以下に示す効果を得ることができる。
・  上記実施形態では、キャプチャープローブと、耐熱酵素により標識されたレポータプローブと、耐熱酵素と反応する基質とを用いて、キャプチャープローブとレポータプローブとにターゲットＤＮＡを結合させ、レポータプローブに標識された耐熱酵素と基質による反応により電気化学的に前記ターゲットＤＮＡを検出する。これにより、耐熱酵素により標識されたレポータプローブを、この耐熱酵素が活性を保つ温度である高温の反応液に投入することができる。従って、より高い温度でレポータプローブを反応液に投入できるため、ハイブリダイゼーションの効率が上がり、より高感度かつ効率的にターゲットＤＮＡの検出を行うことができる。【００６０】
・  上記実施形態では、キャプチャープローブを導電体表面に結合させて電極を構成し、キャプチャープローブとレポータプローブとにターゲットＤＮＡを結合させ、レポータプローブに標識された耐熱酵素と基質による反応により電極に流れる電流値を測定することによりターゲットＤＮＡを検出する。これにより、キャプチャープローブを導電体表面に結合させて構成した電極と耐熱酵素により標識されたレポータプローブとを用いて、電極に流れる電流値を測定することにより、より高感度かつ効率的にターゲットＤＮＡの検出を行うことができる。【００６１】
・  上記実施形態では、超好熱菌に由来する酵素により標識されたレポータプローブを用いる。超好熱菌からは、ターゲットＤＮＡの変性温度で完全には失活しない酵素を得ることができるため、これによれば、ターゲットＤＮＡの変性温度で、レポータプローブを反応液に投入することが可能となる。このため、ハイブリダイゼーションの効率が上がり、より高感度かつ効率的にターゲットＤＮＡの検出を行うことができる。【００６２】
・  上記実施形態では、カーボン電極２１の表面にキャプチャープローブ２８ａが結合してなる電極と、超好熱菌に由来するＬ−プロリン脱水素酵素２６により標識されたレポータプローブ２８ｃと、このＬ−プロリン脱水素酵素２６と反応する基質であるＬ−プロリン２５とを用いる。そして、キャプチャープローブ２８ａと、レポータプローブ２８ｃとにターゲットＤＮＡ２８ｂを結合させ、レポータプローブ２８ｃに標識されたＬ−プロリン脱水素酵素２６とＬ−プロリン２５による反応に基づいてカーボン電極２１に流れる限界酸化電流の電流値を測定することによりターゲットＤＮＡ２８ｂを検出する。これによれば、超好熱菌に由来するＬ−プロリン脱水素酵素２６により標識されたレポータプローブ２８ｃを、このＬ−プロリン脱水素酵素２６が活性を保つ温度である高温で反応液に投入することが可能となる。従って、ハイブリダイゼーションの効率が上がり、より高感度かつ効率的にターゲットＤＮＡの検出を行うことができる。【００６３】
・  上記実施形態では、超好熱菌に由来する酵素により標識されたレポータプローブを用いる。超好熱菌からは、ターゲットＤＮＡの変性温度で完全には失活しない酵素を得ることができるため、これによれば、ターゲットＤＮＡの変性温度で、レポータプローブを反応液に投入することが可能となる。このため、ハイブリダイゼーションの効率が上がり、より高感度かつ効率的にターゲットＤＮＡの検出を行うことができる。【００６４】
・  上記実施形態では、カーボン電極２１の表面にキャプチャープローブ２８ａが結合してなる電極と、超好熱菌に由来するＬ−プロリン脱水素酵素２６により標識されたレポータプローブ２８ｃと、このＬ−プロリン脱水素酵素２６と反応する基質であるＬ−プロリン２５とを用いる。そして、キャプチャープローブ２８ａと、レポータプローブ２８ｃとにターゲットＤＮＡ２８ｂを結合させ、レポータプローブ２８ｃに標識されたＬ−プロリン脱水素酵素２６とＬ−プロリン２５による反応に基づいてカーボン電極２１に流れる限界酸化電流の電流値を測定することによりターゲットＤＮＡ２８ｂを検出する。これによれば、超好熱菌に由来するＬ−プロリン脱水素酵素２６により標識されたレポータプローブ２８ｃを、このＬ−プロリン脱水素酵素２６が活性を保つ温度である高温で反応液に投入することが可能となる。従って、ハイブリダイゼーションの効率が上がり、より高感度かつ効率的にターゲットＤＮＡの検出を行うことができる。【００６５】
・  上記実施形態では、超好熱菌に由来するＬ−プロリン脱水素酵素２６により標識されたレポータプローブ２８ｃを用いる。これによれば、超好熱菌に由来するＬ−プロリン脱水素酵素２６により標識されたレポータプローブ２８ｃを、このＬ−プロリン脱水素酵素２６が活性を保つ温度である高温の反応液に投入することができる。このため、ターゲットＤＮＡを１本鎖のターゲットＤＮＡ２８ｂに変性させてから、Ｌ−プロリン脱水素酵素２６が活性を保つ温度である高温で、ターゲットＤＮＡ２８ｂにレポータプローブ２８ｃを反応させることが可能となる。従って、ハイブリダイゼーションの効率が上がり、より高感度かつ効率的にターゲットＤＮＡの検出を行うことができる。【００６６】
・  上記実施形態では、サーモコッカス・プロファンダス(Thermococcus profundus)、サーモコッカス・ペプトノフィラス(Thermococcus peptonophilus)、ピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)、及び、ピロコッカス・ホリコシＯＴ−３(Pyrococcus horikoshi OT-3)からなる群から選ばれる生物に由来するＬ−プロリン脱水素酵素を用いることができる。このため、これらの各生物に由来するＬ−プロリン脱水素酵素により標識されたレポータプローブを、このＬ−プロリン脱水素酵素が活性を保つ温度で反応液に投入することが可能となる。このため、ターゲットＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに変性させてから、高温の状態で、ターゲットＤＮＡにレポータプローブを反応させることが可能となる。従って、ハイブリダイゼーションの効率が上がり、より高感度かつ効率的にターゲットＤＮＡの検出を行うことができる。【００６７】
・  上記実施形態では、ハイブリダイゼーションのためのターゲットＤＮＡの変性時に、電極に固定されたキャプチャープローブとＬ−プロリン脱水素酵素により標識されたレポータプローブを、ターゲットＤＮＡが含まれる溶液中に投入する。このため、電極に固定されたキャプチャープローブとＬ−プロリン脱水素酵素により標識されたレポータプローブとをハイブリダイゼーションのためのターゲットＤＮＡの変性時にターゲットＤＮＡと共存させることができる。これにより、ハイブリダイゼーションの効率が上がり、より高感度かつ効率的にターゲットＤＮＡの検出を行うことができる。また、より簡易な操作で処理を行うことができる。【００６８】
なお、上記実施形態は、以下の態様に変更してもよい。
○  上記実施形態では、キャプチャープローブを導電体表面に結合させて電極を構成し、この電極に流れる電流値を測定することによりターゲットＤＮＡを検出したが、電気化学的方法によるＤＮＡ検出の方法は、これに限定されるものではない。例えば、ｐＨ感応膜上にキャプチャープローブを固定しておき、酵素反応によるｐＨ変化を電圧の変化により検出し、これによりターゲットＤＮＡを検出してもよい。以下、この場合の実施形態について説明する。【００６９】
図３は、本発明の一実施形態のＤＮＡ検出方法で用いられる電界効果トランジスタ構造を示す。この電界効果トランジスタ構造は、ｐ型のシリコン基板３１、ｐＨ感応膜３２、対極３４、ソース電極３５、ドレイン電極３６、ｎ+型層３７を備えている。ｐＨ感応膜３２は、ｐＨ応答を示し、例えば、Ｓｉ3Ｎ4（シリコン窒化膜）等を用いることができる。そして、ｐＨ感応膜３２及び対極３４を電解液に浸漬させる。【００７０】
（ｐＨ感応膜）
本実施形態では、図３の下部の拡大図に示すように、ｐＨ感応膜３２上にキャプチャープローブ４８ａを固定化させている。このキャプチャープローブ４８ａは、ターゲットＤＮＡ４８ｂと相補的にハイブリダイズする。そして、図３に示すように、キャプチャープローブ４８ａ、ターゲットＤＮＡ４８ｂ、耐熱酵素４６により標識されたレポータプローブ４８ｃを結合させることにより、耐熱酵素４６をｐＨ感応膜３２の近傍に保持することができる。【００７１】
なお、ここでは電圧の測定によりｐＨの変化を検出することによりＤＮＡの検出を行うため、耐熱酵素４６と基質４５との反応はｐＨの変化を伴う必要がある。そこで、本実施形態においては、耐熱酵素４６として、例えば、グルコースオキシダーゼのように、基質４５との反応においてｐＨを変化させる酵素を用いる。【００７２】
ＤＮＡサンプル液中に検出対象のＤＮＡが存在する場合、このＤＮＡを変性させた１本鎖ＤＮＡが、１本鎖のターゲットＤＮＡ４８ｂに相当する。ターゲットＤＮＡ４８ｂの検出を行うためには、ＤＮＡサンプル液中に、ターゲットＤＮＡ４８ｂの検出のために十分なだけ、採取されたＤＮＡが存在する必要がある。このため、まず、ターゲットＤＮＡ４８ｂの検出のために十分な量のＤＮＡを得るために、ＤＮＡサンプル液を用いてＰＣＲを行うことにより、サンプル液中のＤＮＡを増幅させる。【００７３】
そして、このＤＮＡサンプル液を、例えば、９６℃で３０秒間、熱処理することにより、２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに変性させる。そして、このサンプル液にｐＨ感応膜３２を浸漬させるとともに、耐熱酵素４６により標識されたレポータプローブ４８ｃを投入する。ここで、レポータプローブ４８ｃに標識された耐熱酵素４６の活性を保つためには、反応液の温度が耐熱酵素４６の耐熱温度より低いことが必要である。耐熱酵素４６の耐熱温度より反応液の温度が低ければ、これをさらに冷却することなく、耐熱酵素４６により標識されたレポータプローブ４８ｃを反応液に投入できる。【００７４】
ターゲットＤＮＡ４８ｂが存在する場合、図３に示すように、キャプチャープローブ４８ａ、１本鎖のターゲットＤＮＡ４８ｂ及びレポータプローブ４８ｃがアニールさせられる。ここで、検出対象のＤＮＡが得られている場合には、この検出対象のＤＮＡが、１本鎖のターゲットＤＮＡ４８ｂに相当する。従って、サンプル液中に検出対象のＤＮＡが含まれている場合に、キャプチャープローブ４８ａ、ターゲットＤＮＡ４８ｂ、レポータプローブ４８ｃがこの順にｐＨ感応膜３２に結合する。【００７５】
（電圧の測定によるターゲットＤＮＡの検出）
次に、上記の様に構成された電界効果トランジスタを用いて電圧の測定を行うことによるターゲットＤＮＡの検出について説明する。【００７６】
まず、反応液を廃棄し、電解液である緩衝液にｐＨ感応膜３２及び対極３４を浸漬させる。ここで、サンプル液中に検出対象のＤＮＡが含まれていた場合には、ｐＨ感応膜３２上には、キャプチャープローブ４８ａ、ターゲットＤＮＡ４８ｂ、耐熱酵素４６により標識されたレポータプローブ４８ｃが、この順で結合されている。従って、この場合、ｐＨ感応膜３２の近傍に耐熱酵素４６が保持されている。【００７７】
そして、レポータプローブに標識された耐熱酵素４６と反応する基質４５をこの電解液中に投入すると、電解液中の基質４５と耐熱酵素４６とが反応して反応後基質４７を生成し、ｐＨ感応膜３２の近傍のｐＨが変化する。【００７８】
上記のように構成された電界効果トランジスタにおいて、ｐＨの変化に応じてｐＨ感応膜３２と電解液との界面電位が変化する。この界面電位の変化を測定する。例えば、ドレイン電流とソース／ドレイン間電圧とを一定に保持し、ゲート電圧を測定する。このように、ｐＨの変化を電圧の測定により検出することにより、ターゲットＤＮＡの有無又は濃度を検知することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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