【手続補正書】
【提出日】令和2年6月18日(2020.6.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料（６）中の１つまたは複数の空間方向において単離分子（２４）の位置を高い空間分解能で確定するための方法であって、前記単離分子（２４）は、励起光（３）によりルミネセンス光（１２）を放射するように励起可能であり、
前記励起光（３）は、ゼロ箇所（２０）および強度上昇領域（２２）を有する強度分布（１９）をもって前記試料（６）に指向され、前記強度上昇領域（２２）は各空間方向において前記ゼロ箇所（２０）に両側で隣接し、
前記試料（６）中の前記ゼロ箇所（２０）の種々の位置（Ａ〜Ｄ）の各々について、前記単離分子（２４）から放射される前記ルミネセンス光（１２）が記録され、
前記試料（６）中の前記単離分子（２４）の位置が、前記ゼロ箇所（２０）の種々の位置（Ａ〜Ｄ）について記録された前記ルミネセンス光（１２）の強度（ＩＡ〜ＩＤ）から導出される、
方法において、
前記単離分子（２４）の位置を、ｎ個の空間方向において前記ゼロ箇所（２０）の種々の位置（Ａ〜Ｄ）について記録された前記ルミネセンス光（１２）の強度（ＩＡ〜ＩＤ）から導出するために、前記ゼロ箇所（２０）は、前記試料（６）中のｎ×３以下の異なる位置（Ａ〜Ｄ）に配置され、
前記ゼロ箇所（２０）が前記試料（６）中に配置される前記種々の位置（Ａ〜Ｄ）は、前記試料（６）中の前記単離分子（２４）の位置が確定される各空間方向において、前記試料（６）中に前記単離分子（２４）が配置された制限された位置領域（２３）の中心の両側に各１つの位置（Ａ〜Ｃ）を含む、ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記単離分子（２４）の位置を、ｎ個の空間方向において前記ゼロ箇所（２０）の種々の位置（Ａ〜Ｄ）について記録された前記ルミネセンス光（１２）の強度（ＩＡ〜ＩＤ）から導出するために、前記ゼロ箇所（２０）は、前記試料（６）中の（ｎ×２）＋１以下の異なる位置（Ａ〜Ｄ）に配置される、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記単離分子（２４）の位置を、ｎ個の空間方向において前記ゼロ箇所（２０）の種々の位置（Ａ〜Ｄ）について記録された前記ルミネセンス光（１２）の強度（ＩＡ〜ＩＤ）から導出するために、前記ゼロ箇所（２０）は、前記試料（６）中のｎ＋２以下の異なる位置（Ａ〜Ｄ）に配置される、ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ゼロ箇所（２０）が前記試料（６）中に配置される前記種々の位置（Ａ〜Ｄ）は、前記試料（６）中の前記単離分子（２４）の位置が確定される各空間方向において、制限された位置領域（２３）の中心の両側にある２つの位置（Ａ〜Ｃ）の他に、制限された位置領域（２３）の中心にある１つの位置（Ｄ）を含む、ことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ゼロ箇所（２０）が前記試料（６）中に配置される前記種々の位置（Ａ〜Ｄ）は、前記単離分子（２４）の位置が２つの空間方向で確定される場合、１つの中心位置（Ｄ）と３つの周辺位置（Ａ〜Ｃ）であり、
前記周辺位置（Ａ〜Ｃ）は、２つの空間方向により張架され、前記中心位置を通って延在する平面内において、前記中心位置を中心にする円弧（２５）上に等間隔に配置される、ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ゼロ箇所（２０）が前記試料（６）中に配置される前記種々の位置は、前記単離分子（２４）の位置が３つの空間方向で確定される場合、１つの中心位置と４つの周辺位置であり、
前記周辺位置は、前記中心位置を中心にして配置された球殻上に等間隔に配置される、ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記励起光（３）の最大強度は、前記ゼロ箇所（２０）の各位置（Ａ〜Ｄ）から、前記試料（６）中の前記ゼロ箇所（２０）の（複数）位置（Ａ〜Ｄ）の間の各点までの最大間隔が、間隔（ａ）の方向での各強度上昇領域（２２）の広がり以下であるように調節され、前記広がりにわたって前記励起光（３）の強度は、前記励起光（３）の飽和強度（ＩＳ）の９０％まで上昇する、ことを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ゼロ箇所（２０）に隣接する前記強度上昇領域（２２）は、前記ゼロ箇所（２０）を中心にして回転対称に構成される、ことを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ルミネセンス光（１２）は、前記ゼロ箇所（２０）を位置（Ａ〜Ｄ）の間で反復してシフトすることにより、前記ゼロ箇所（２０）の位置（Ａ〜Ｄ）について疑似的に同時に記録される、ことを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ルミネセンス光（１２）は前記ゼロ箇所（２０）の位置（Ａ〜Ｄ）について、前記ゼロ箇所（２０）の位置（Ａ〜Ｄ）について記録される前記ルミネセンス光（１２）の強度（ＩＡ〜ＩＤ）が十分な精度で検出されるまで記録され、前記単離分子（２４）の位置は所定の精度で確定可能であり、
前記所定の精度は、０．５から２０ｎｍの間の範囲にある、ことを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法を、前記試料（６）中の前記ゼロ箇所（２０）の位置（Ａ〜Ｄ）の間隔を小さくしながら反復実施することであって、
前記試料（６）中の前記ゼロ箇所（２０）の位置（Ａ〜Ｄ）が、本方法の各反復の際に、本方法の先行の実施の際に前記ルミネセンス光（１２）の記録された強度（ＩＡ〜ＩＤ）から導出された、前記試料（６）中の前記単離分子（２４）の位置の周囲に配置される、反復実施。
【請求項１２】
試料（６）中の複数の空間方向において単離分子（２４）の位置を高い空間分解能で確定（３１）するための方法であって、前記単離分子（２４）は、励起光（３）によりルミネセンス光（１２）を放射するように励起可能であり、
前記励起光（３）は、ゼロ箇所（２０）および強度上昇領域（２２）を有する強度分布（１９）をもって前記試料（６）に指向され、前記強度上昇領域（２２）は前記単離分子（２４）の位置が確定される各空間方向において前記ゼロ箇所（２０）に両側で隣接し、
前記ゼロ箇所（２０）は、前記単離分子（２４）の位置が確定される各空間方向において前記試料（６）中でシフトされ、前記試料（６）中の前記ゼロ箇所（２０）の各位置（Ａ〜Ｄ）について、前記単離分子（２４）から放射される前記ルミネセンス光（１２）が記録される、方法において、
前記単離分子（２４）が配置された前記試料（６）中の初期位置領域（２３）が決定され、
前記単離分子（２４）の位置が確定される各空間方向において前記ゼロ箇所（２０）の少なくとも１つの初期位置（Ａ，Ｂ，Ｃ）が、前記初期位置がそれぞれの空間方向において前記初期位置領域（２３）の片側に来るように設定され、
前記ルミネセンス光（１２）は、前記ゼロ箇所（２０）を前記初期位置（Ａ，Ｂ，Ｃ）の間で反復してシフトすることにより、前記単離分子（２４）の位置が確定される全ての空間方向に割り当てられた前記ゼロ箇所（２０）の前記初期位置（Ａ，Ｂ，Ｃ）について疑似的に同時に記録され、
前記ゼロ箇所（２０）の前記初期位置（Ａ，Ｂ，Ｃ）は、各初期位置（Ａ，Ｂ，Ｃ）について記録された前記ルミネセンス光（１２）の光子に依存して、前記初期位置領域（２３）に漸次入るようにシフトされることにより、前記ゼロ箇所（２０）の前記初期位置（Ａ，Ｂ，Ｃ）は、前記試料（６）中の前記単離分子（２４）の実際の位置に近似され、これにより、前記初期位置領域（２３）と比較して縮小された位置領域に制限され、前記縮小された位置領域の寸法は、前記単離分子（２４）の位置を確定する精度に相当することを特徴とする方法。
【請求項１３】
前記ゼロ箇所（２０）の前記初期位置（Ａ，Ｂ，Ｃ）は、各初期位置（Ａ，Ｂ，Ｃ）について記録された前記ルミネセンス光（１２）の光子に依存して、前記初期位置領域（２３）に漸次入るようにシフトされる、ことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ゼロ箇所（２０）の前記初期位置（Ａ，Ｂ，Ｃ）の数は、ｎから２ｎの間であり、ｎは、前記単離分子（２４）が局在化される空間方向の数である、ことを特徴とする請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
空間方向の少なくとも１つにおいて、前記試料（６）中の前記単離分子（２４）の位置は、
それぞれの空間方向に割り当てられた前記ゼロ箇所（２０）の前記初期位置（Ａ，Ｂ，Ｃ）であって、前記ゼロ箇所（２０）について記録される前記ルミネセンス光（１２）の光子の割合が最小化されている当該位置と同一であるとされ、または
それぞれの空間方向の少なくとも１つに割り当てられた前記ゼロ箇所（２０）の前記初期位置（Ａ，Ｂ，Ｃ）について記録される前記ルミネセンス光（１２）の光子の割合若しくは時間的間隔から導出される、ことを特徴とする請求項１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ゼロ箇所（２０）の前記初期位置（Ａ，Ｂ，Ｃ）は、各空間方向について、それぞれの空間方向で前記初期位置領域（２３）の両側にある２つの位置を含み、
全ての空間方向に割り当てられた前記ゼロ箇所（２０）の前記初期位置（Ａ，Ｂ，Ｃ）を、前記ルミネセンス光（１２）の光子の、全ての位置を確定するための割合または時間的間隔に依存して漸次シフトすることにより、前記ゼロ箇所（２０）の前記初期位置（Ａ，Ｂ，Ｃ）の間に残った前記単離分子（２４）の位置領域が漸次狭められる、ことを特徴とする請求項１２から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ゼロ箇所（２０）の前記初期位置（Ａ，Ｂ，Ｃ）の間に残った前記単離分子（２４）の位置領域は、その寸法が所定の精度以下になるまで漸次狭められ、
前記所定の精度は、０．５から２０ｎｍの間の範囲または１ｎｍから１０ｎｍの範囲にある、ことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
各空間方向において前記ゼロ箇所（２０）に隣接する前記強度上昇領域（２２）は、前記ゼロ箇所（２０）に対して回転対称に構成される、ことを特徴とする請求項１２から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
全て空間方向に割り当てられた前記ゼロ箇所（２０）の前記初期位置（Ａ，Ｂ，Ｃ）の少なくとも１つは、これまでの位置において前記ルミネセンス光（１２）の平均でｐ個の光子が記録されると直ちにシフトされ、ここでｐは３０，２０，１０または５以下である、ことを特徴とする請求項１２から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
全ての空間方向に割り当てられた前記ゼロ箇所（２０）の前記初期位置（Ａ，Ｂ，Ｃ）の少なくとも１つは、これまでの位置において全部でｎ×ｑ個の前記ルミネセンス光（１２）の光子が記録されると直ちにシフトされ、ここでｎは、前記試料（６）中の前記単離分子（２４）の位置が確定される空間方向の数であり、ｑは５０，２５、または５以下である、ことを特徴とする請求項１２から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
各ゼロ箇所（２０）の前記初期位置（Ａ，Ｂ，Ｃ）は、これまでの位置において前記ルミネセンス光（１２）のｍ個の光子が記録されると直ちにシフトされ、ここでｍは３０，２０，１０、５または３以下である、ことを特徴とする請求項１２から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記励起光（３）の最大強度（ＩＡ）は、前記初期位置領域（２３）が前記ゼロ箇所（２０）の各位置を基準にして、前記励起光（３）の飽和強度（ＩＳ）の９０％以下の領域に存在するように調整される、ことを特徴とする請求項１２から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記励起光（３）の絶対強度（ＩＡ）は、前記ゼロ箇所（２０）の前記初期位置（Ａ，Ｂ，Ｃ）のシフト（２３４）によって漸次高められる、ことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記励起光（３）の絶対強度（ＩＡ）は、前記ゼロ箇所（２０）のそれぞれ全ての前記初期位置（Ａ，Ｂ，Ｃ）について記録された光子の割合が、少なくとも一次的に同じに留まるように高められる、ことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記励起光（３）の絶対強度（ＩＡ）は、全体で少なくとも５０％だけ高められる、ことを特徴とする請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
試料（６）中の１つまたは複数の空間方向において単離分子（２４）の位置を高い空間分解能で確定するための方法であって、前記単離分子（２４）は、励起光（３）によりルミネセンス光（１２）を放射するように励起可能であり、
前記励起光（３）が強度分布（１９）をもって前記試料（６）に指向され、前記強度分布は、前記単離分子（２４）の位置が確定される各空間方向において、前記強度分布（１９）の基点（２０，３２６）までの間隔にわたって前記励起光（３）の強度（ＩＡ）が既知の厳密に単調に経過する少なくとも１つの強度上昇領域（２２）を有し、
前記強度分布（１９）の前記基点（２０，３２６）は、前記単離分子（２４）の位置が確定される各空間方向において前記前記試料（６）中の種々異なる位置に配置され、
前記試料（６）中の前記強度分布（１９）の前記基点（２０，３２６）の各位置について、前記単離分子（２４）から放射される前記ルミネセンス光（１２）が記録され、
前記試料（ｘ０）中の前記単離分子（２４）の位置が、記録された前記ルミネセンス光（１２）の強度から導出される、
方法において、
前記試料（６）中の前記単離分子（２４）が配置された初期位置領域（２３）が決定され、
（ｉ）空間方向の各々において前記強度分布（１９）の前記基点（２０，３２６）の少なくとも１つの位置が、少なくとも１つの前記強度上昇領域（２２）が前記単離分子（２４）の位置が確定される各空間方向において前記初期位置領域（２３）にわたって伸長するように設定され、
（ｉｉ）前記単離分子（２４）の位置が確定される各空間方向について２つの強度値（Ｉ１，ＩＳＷないしＩ１ａ，Ｉ１ｂ）を含み、これら強度値の一方（Ｉ１ないしＩ１ａ）が前記強度分布（１９）の基点の少なくとも１つの位置について記録された前記ルミネセンス光（１２）の強度を指示する、前記ルミネセンス光（１２）の強度値（Ｉ１，ＩＳＷ，Ｉ１ａ，Ｉ１ｂ）から、前記単離分子（２４）が配置されており、かつ前記初期位置領域（２３）よりも小さい、前記試料（６）中のさらなる位置領域（３２４，３２５）が決定され、
前記単離分子（２４）の位置が確定されるそれぞれの空間方向についての第２の強度値は、
前記強度分布（１９）の基点の第２の位置について記録された前記ルミネセンス光（１２）の強度（Ｉ１ｂ）であり、前記第２の位置は、それぞれの空間方向において、前記強度分布（１９）の基点の少なくとも１つの位置と同じ側の別の箇所にあるか、または前記強度分布（１９）の基点の少なくとも１つの位置に対向する、前記初期位置領域（２３）の側にあり、
前記励起光（３）により励起される際の前記単離分子（２４）の前記ルミネセンス光（１２）の強度（ＩＬ）の飽和値（ＩＳＷ）であり、
前記ステップ（ｉ）と（ｉｉ）は、前記さらなる位置領域を新たな開始位置領域（２３）として使用して、少なくとも一度繰り返される、ことを特徴とする方法。
【請求項２７】
前記基点は、前記強度分布（１９）のゼロ箇所（２０）であり、前記ゼロ箇所（２０）には、空間方向の各々において片側に少なくとも１つの強度上昇領域（２２）が続いており、対向する側にさらなる強度上昇領域（２２）が続いている、ことを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも１つの前記強度上昇領域（２２）とさらなる前記強度上昇領域（２２）は、前記ゼロ箇所（２０）に対して対称に構成されている、ことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ステップ（ｉ）の各実施の際に設定される位置の数は、ｎ＋１から２ｎの間であり、ｎは、前記単離分子（２４）が局在化される空間方向の数である、ことを特徴とする請求項２６から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ルミネセンス光（１２）は、前記強度分布（１９）の基点に位置について、前記基点（２０，３２６）を（複数）位置の間で反復してシフトすることにより、疑似的に同時に記録される、ことを特徴とする請求項２６から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ルミネセンス光（１２）は、前記強度分布（１９）の前記基点（２０，３２６）の位置について、当該位置について記録される前記ルミネセンス光（１２）の強度が十分な精度で検出されるまで記録され、前記さらなる位置領域（３２４，３２５）は、所定の値だけ前記初期位置領域（２３）よりも小さく決定可能である、ことを特徴とする請求項２６から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記さらなる位置領域（３２４，３２５）をそれぞれの空間方向において前記初期位置領域（２３）よりも小さく決定可能な前記所定の値は、５％から７５％の範囲にある、ことを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記励起光（３）の最大強度は、前記初期位置領域（２３）が前記強度分布（１９）の前記基点（２０，３２６）の各位置を基準にして、前記励起光（３）の飽和強度（ＩＳ）の９０％以下の領域に存在するように調整される、ことを特徴とする請求項２６から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記励起光（３）の最大強度は、前記ループ（ｉ）と（ｉｉ）の少なくとも一回の反復で高められ、
前記励起光（３）の最大強度は、前記ステップ（ｉ）と（ｉｉ）の全ての反復にわたって少なくとも５０％だけ高められる、ことを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ステップ（ｉ）と（ｉｉ）は、前記さらなる位置領域（３２４，３２５）が所定の精度よりも大きくならなくなるまで繰り返され、
前記所定の精度は、０．５から２０ｎｍの間の範囲にある、ことを特徴とする請求項２６から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ルミネセンス光（１２）は空間分解能により記録され、付加的に、記録された前記ルミネセンス光（１２）全体の空間的分布が、前記試料（６）中の前記単離分子（２４）の位置に関して評価される、ことを特徴とする請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記試料（６）には前記単離分子（２４）の位置確定の前に切替信号が印加され、該切替信号は、隣接する同種の分子が単離後には、前記単離分子（２４）とは異なり、前記励起光（３）により前記ルミネセンス光（１２）を放射するように励起することができないことによって、前記単離分子（２４）を隣接する同種の分子から単離する、ことを特徴とする請求項１から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
順次単離され、前記励起光（３）により前記ルミネセンス光（１２）の放射が励起可能な複数の前記単離分子（２４）であって、前記試料（６）中の対象構造をマーキングする分子の位置を確定するための、請求項１から３７のいずれか一項に記載の方法の反復実施。
【請求項３９】
前記試料（６）中で運動する前記単離分子（２４）を追跡するための、請求項１から３７のいずれか一項に記載の方法の反復実施。
【請求項４０】
ＳＴＥＤラスタ蛍光顕微鏡（１）により提供されるＳＴＥＤビームを前記励起光（３）として使用する、請求項１から３９のいずれか一項に記載の方法を実施するためのＳＴＥＤラスタ蛍光顕微鏡（１）の使用。