(57)【要約】  無染色生物試料１２の少なくとも２つの化学的に異なる関心物質。各々に対して、画像の領域ごとに物質の量を示す物質画像２４，２６が生成される。多色画像が物質画像に基づいて生成される。関連する態様において、データキャリアはコンピュータに該方法を制御又は実行するよう指示するための命令を担持する。別の関連する態様において、無染色生物試料１２のシステム１０は、選択周波数の紫外光１８に暴露するため、及び試料の様々な領域に対して透過紫外光２０の強度を測定するため、及び暴露するステップと測定するステップを異なる紫外周波数に対して繰り返し、それによって各周波数に対して紫外画像を生成するための光学系と、紫外画像に基づいて物質画像を生成するため、及び物質画像に基づいて多色画像を生成するためのコンピュータとを有する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
無染色生物試料の多色画像を生成する方法であって、前記試料は少なくとも２つの化学的に異なる関心物質を有し、前記方法は、
前記関心物質の各々に対して、画像の領域ごとに前記物質の量を示す物質画像を生成するステップと、
前記物質画像に基づいて前記多色画像を生成するステップとを有する、方法。
【請求項２】
前記試料が可視光に対して実質的に透過性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記物質画像に基づいて前記多色画像を生成するステップが、
前記関心物質の各々に仮想色を割り当てるステップと、
前記物質画像の各々を前記割り当てられた色を持つ単色画像に変換するステップと、
前記単色画像を重ね合わせるステップとを有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記関心物質の少なくとも１つが、その物質に結合することができる染料の色と一致する色を割り当てられる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記試料が第１の関心物質としてタンパク質を、第２の関心物質として核酸を有し、前記タンパク質が赤又はピンク色を割り当てられ、前記核酸が青、バイオレット、又は紫色を割り当てられる、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記多色画像が減法混色モデルに従って前記重ね合わされた単色画像から得られる、請求項３乃至５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記変換するステップと重ね合わせるステップがコンピュータ上で実行される、請求項３乃至６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
各物質画像を単色画像に変換するステップが、
物質の量を色強度に関連付けるルックアップテーブルを調べるステップ、及び／又は、
物質の量を色強度に関連付ける指数関数を評価するステップを有する、請求項３乃至７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記物質画像に基づいて前記多色画像を生成するステップが、
前記関心物質の各々に可視周波数領域における仮想吸収スペクトルを割り当てるステップと、
前記物質画像と前記仮想吸収スペクトルに基づいて透過光画像を計算するステップとを有し、前記透過光画像は、これらの物質の各々が前記仮想吸収スペクトルを持つと仮定して、白色光によって照射された場合に前記関心物質によって透過され得る光のスペクトルを前記画像の領域ごとに示す、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１０】
前記透過光画像が、前記物質画像と前記仮想吸収スペクトルを入力データとしてランベルト・ベールの法則を用いて計算される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記物質画像が、
前記試料を選択周波数の紫外光に暴露するステップと、
前記試料の様々な領域に対して透過紫外光の強度を測定するステップと、
前記暴露するステップと測定するステップを異なる周波数に対して実行し、それによって各周波数に対して紫外画像を生成するステップと、
前記紫外画像から前記物質画像を導き出すステップとによって決定される、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記物質画像がランベルト・ベールの法則を用いて前記紫外画像から導き出される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の方法をコンピュータに制御又は実行するよう指示するための命令を担持するデータキャリア。
【請求項１４】
無染色試料の多色画像を生成するためのシステムであって、前記試料は少なくとも２つの化学的に異なる関心物質を有し、前記システムは、
前記試料を選択周波数の紫外光に暴露するため、及び、前記試料の様々な領域に対して透過紫外光の強度を測定するため、及び、前記暴露するステップと測定するステップを異なる紫外周波数に対して繰り返し、それによって各周波数に対して紫外画像を生成するための、光学系と、
前記紫外画像に基づいて物質画像を生成するため、及び、前記物質画像に基づいて前記多色画像を生成するための、コンピュータとを有する、システム。
【請求項１５】
前記光学系が顕微鏡を有する、請求項１４に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
第１の態様において、本発明は無染色生物試料の多色画像を生成する方法に関し、該試料は少なくとも２つの化学的に異なる関心物質を有する。
【０００２】
第２の態様において、本発明はデータキャリアに関する。
【０００３】
第３の態様において、本発明は無染色生物試料の多色画像を生成するためのシステムに関し、対象物は少なくとも２つの化学的に異なる関心物質を有する。
【背景技術】
【０００４】
組織病理学及び細胞病理学において、病理学者は組織又は細胞塗抹標本からとられる顕微鏡画像を日常的に解析する。試料は典型的には可視光を用いる標準顕微鏡で解析される。細胞及び組織は可視光をほとんど吸収しないという事実のため、試料を染色することが一般的なやり方である。染色化学物質は可視光において観察されることができる。染色化学物質は、これが典型的に結合する構造の存在を示し、一般的にはその量もまた示す。長年の訓練と経験の間に、病理学者は試料の染色画像を解釈し、診断に至る方法を学ぶ。デジタル病理学界において染色化学物質の使用は一般的に透過においてスライド標本を画像化するために必須であるとみなされている。
【０００５】
どの染色法が選ばれるかは典型的には病理学者が関心を持っている特異的構造に依存する。非常に有名な染色法はヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色である。ヘマトキシリンは好塩基構造に結合してそれらを青紫色に染める。好塩基構造は例えば核酸を含む細胞成分及びＲＮＡを多く含む細胞質領域である。好酸性構造は一般的に細胞内又は細胞外タンパク質から成り、エオシンによってピンクに染められる。
【０００６】
しかしながら染色はいくつかの主要な欠点を持つ。その１つは、染色試料の画像における演色が、使用された染色法に強く依存するということである。Ｔ．Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ（Ｔ．Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ，"Ｃｏｌｏｕｒ  Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｍａｇｅｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｄｙｅ  Ａｍｏｕｎｔ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ"．Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ，Ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．４，２００５，ｐｐ．２９３‐３００）によって指摘される通り、染色の質は一定ではない。しかし良い質は病理学者が適切な診断に至ることを可能にするために重要である。別の問題は、従来の病理学の自動診断への移行に関連し、これは今日重要な発展である。病院の間で、又は染色機械の間でも、又は染色機械において経時的に観察される質の変動は、自動診断にとって深刻な障害を示す。これらの問題を解決するために異なる解決法が提案されており、例えば染色プロセスの制御を改良すること、又はコンピュータを用いて染色標本の多色画像をデジタル補正すること（Ｔ．Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌによる上述の論文を参照）などによる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、試料の染色を必要としない無染色生物試料の多色画像を生成する方法を提供することである。
【０００８】
この目的は独立請求項の特徴によって実現される。さらなる明細及び好適な実施形態は従属請求項に概説される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１の態様によれば、該方法は、
関心物質の各々に対して、画像の領域ごとに該物質の量を示す物質画像を生成するステップと、
物質画像に基づいて多色画像を生成するステップとを有する。従って各物質画像は試料中の各物質の分布のマップである。物質画像は任意の適切な方法によって得られることができる。特に、試料による多波長の光の吸光度を測定し、この測定データをＲＧＢ画像データに変換することが提案されている。このＲＧＢ画像データは、試料が例えば一般的な染色法ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）法で染色され、従来の顕微鏡で観察された場合の試料のＲＧＢ画像の近い近似となり得る。従って染色が完全に回避されることができる。本発明は組織病理学の全分野に適用可能であり得る。染色はほぼ全ての組織／細胞に基づく診断にとって慣習となっている（１年当たり病院当たりほぼ３００．０００＋標本程度）。染色手順を回避することはスループット時間を劇的に増加し、コンピュータによる診断の（部分的）自動化を促進する。
【００１０】
試料は可視光に対して実質的に透過性であり得、例えば８０％を超える、又は９０％を超える透過率を持つ。試料は組織病理学的試料であり得、これは顕微鏡スライド上に配置され得る。
【００１１】
物質画像に基づいて多色画像を生成するステップは、
関心物質の各々に仮想色を割り当てるステップと、
物質画像の各々を、割り当てられた色を持つ単色画像に変換するステップと、
単色画像を重ね合わせるステップとを有し得る。
【００１２】
関心物質の少なくとも１つは、その物質に結合することができる染料の色と一致する色を割り当てられ得る。より具体的には、
例えば吸光度変動を介して、無染色試料に存在する成分の量を測定することを可能にする画像／検出モダリティを用いて第１の画像を取得し、
成分の少なくとも１つの量を推定し、
推定された量を用いることによって、まるで試料が所定の染色化学物質（例えばＨ＆Ｅ）で染色されたかのように着色される第２の画像を作り出すことが提案される。従って最終画像は、試料が染色されていないにもかかわらず、病理学者が精通している表現を示す。ここで、白黒（Ｂ＆Ｗ）又はグレースケール画像を作り得る任意の画像技術に対するデジタル病理学界における強い偏見があることが留意され得る。病理学者は、コンピュータが何をするとしても、最終診断に至るための重要なステップは、彼らが理解し彼らが慣れているやり方で病理学者に見えるようにされなければならないことが、彼らにとって重要であることを強調してきた。特に病理学者は、例えば２つの隣接核の単色画像に各核内の核酸の量を示す数を重ね合わせたものには満足しそうにない。彼はむしろ多色画像に数を重ね合わせたものを受け入れるだろう。核の色は、Ｈ＆Ｅ染色がしたであろうと同様に、核酸の量が多い核に対して濃い染色を示すだろう。
【００１３】
試料は第１の関心物質としてタンパク質を、第２の関心物質として核酸を有し得る。タンパク質は赤又はピンク色を割り当てられ得、核酸は青、バイオレット、又は紫色を割り当てられ得る。
【００１４】
多色画像は減法混色モデルに従って重ね合わされた単色画像から得られ得る。つまり、様々な関心物質に割り当てられた色の各々は、割り当てられた色のみを透過するフィルタとしてはたらく。そして多色画像は白色背景上に単色画像を重ね合わせることによって作られ得る。例えば青と赤を重ね合わせると紫ではなくグレー色調又は黒を作り出す。それによって従来の染色に基づく画像との多色画像の類似性が向上されることができる。
【００１５】
変換及び重ね合わせのステップはコンピュータ上で実行され得る。
【００１６】
各物質画像の単色画像への変換は、
物質の量を色の強度に関連付けるルックアップテーブルを調べるステップ、及び／又は、
物質の量を色の強度に関連付ける指数関数を評価するステップを有し得る。
【００１７】
物質画像に基づいて多色画像を生成するステップは、
関心物質の各々に可視周波数領域における仮想吸収スペクトルを割り当てるステップと、
物質画像と仮想吸収スペクトルに基づいて透過光画像を計算するステップとを有し得、透過光画像は、これらの物質の各々が仮想吸収スペクトルを持つと仮定して、白色光によって照射された場合に関心物質によって透過され得る光のスペクトルを画像の領域ごとに示す。従って透過光画像は関心物質による光の透過をシミュレートすることによって生成され、これらの物質の真の吸収スペクトルの代わりに仮想吸収スペクトルが使用される。これは、得られる多色画像が染色法によって得られる画像を特にうまく模倣することを確実にし得る。シミュレーションにおいて関心物質によって透過されるべき光は特に白色光であり得る。
【００１８】
透過光画像は、物質画像と仮想吸収スペクトルを入力データとして、ランベルト・ベールの法則を用いて計算され得る。
【００１９】
物質画像は、
試料を選択周波数の紫外光に暴露すること、
試料の様々な領域に対して透過紫外光の強度を測定すること、
暴露及び測定のステップを異なる周波数に対して実行し、それによって各周波数に対して紫外画像を生成すること、
紫外画像から物質画像を導き出すことによって決定され得る。従って物質画像は多重スペクトル解析を用いて取得される。無染色試料は可視光を吸収しないので、ＵＶ波長が特に有利であり得る。周知の通り、細胞及び組織は高周波数（ＵＶ／深ＵＶ）の光を吸収する。Ｚｅｓｋｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ（Ｂ．Ｊ．Ｚｅｓｋｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ，"Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍａｓｓ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｂｙ  ｌｉｖｅ‐ｃｅｌｌ  ｄｅｅｐ‐ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ"．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．７，Ｊｕｌｙ  ２００７，ｐｐ．５６７‐５６９）は、多重スペクトル画像から得られるスペクトル情報が細胞中の特定構造（例えば核酸又はタンパク質）の量を推定することを可能にすることを示した。組織／細胞の多重スペクトル画像を用いて、画像を比較することによって画像画素当たりの組織／細胞の特定構造の量が推定されることができる。この知識はこれらの構造を同定するために通常使用される染色化学物質の'理想'スペクトルの知識と組み合されることができる。この組み合わせから、まるで染色されたかのように組織／細胞をあらわすＲＧＢ色画像が人工的に、すなわちコンピュータを用いて作られることができる。この手順は染色の欠点を欠くにもかかわらず、同様の出力を生じる。'理想'とは応用に依存する。ほとんどの病理学者は特定の染色の質について個人的な定義を持つ。自動化の目的のため、最適コントラストが望まれ得る。しかしながら、ユーザは最も好むいかなるスペクトルも自由に使用することができる。
【００２０】
物質画像はランベルト・ベールの法則を用いて紫外画像から導き出され得る。これは以下により詳細に概説される。
【００２１】
本発明の第２の態様によれば、データキャリアはコンピュータに上記方法を制御又は実行するよう指示するための命令を担持する。コンピュータはＰＣ又は任意の他の適切な情報処理装置又は電子制御装置であり得る。
【００２２】
本発明の第３の態様によれば、無染色試料の多色画像を生成するためのシステムは、
試料を選択周波数の紫外光に暴露するため、及び、試料の様々領域に対して透過紫外光の強度を測定するため、及び、暴露及び測定のステップを異なる紫外周波数に対して繰り返し、それによって各周波数に対して紫外画像を生成するための、光学系と、
紫外画像に基づいて物質画像を生成するため、及び、物質画像に基づいて多色画像を生成するための、コンピュータとを有する。
【００２３】
光学系は顕微鏡を有し得る。顕微鏡は、試料を照射すること、及び試料から集光することの両方に役立ち得る。顕微鏡は従来の光学顕微鏡又は走査顕微鏡であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】無染色試料の多色画像を生成するための装置を概略的に図示する。
【図２】試料を概略的に図示する。
【図３】第１の物質画像を概略的に図示する。
【図４】第２の物質画像を概略的に図示する。
【図５】第１の物質画像に重ね合わされた第２の物質画像を概略的に図示する。
【図６】無染色試料の多色画像を生成するステップを図示するフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
他に指定されない限り、異なる図にあらわれる同一又は同様の参照数字は同一又は同様の構成要素を表示する。
【００２６】
図１は試料１２の二次元多色画像を生成するためのシステム１０を概略的に図示し、一方図２は試料１２の斜視図を提供する。試料１２は、例えば個別細胞などの有機物質を含む液体層であるか、又は生物材料が埋め込まれたパラフィンのスライスであり得る。試料１２は基本的に図の平面に対して垂直なｘ‐ｙ平面に沿ってのびる。試料１２は少なくとも第１の物質（例えばタンパク質）と第２の物質（例えば核酸）を有する。第１の周波数の紫外光１８が試料１２の上面１４上に照らされる。同じ周波数の透過紫外光２０は下面１６を介して試料１２から出て検出器２２に到達する。検出器２２は、透過紫外光２０に応じて検出器２２によって供給されるデータを登録するためのプログラムを担持する、例えばパーソナルコンピュータ又は別の適切な情報処理装置などのコンピュータ（不図示）に結合される。こうして試料１２の第１の紫外画像が生成される。続くステップにおいて第２の周波数の紫外光（不図示）が試料１２の上面１４上に照らされ、試料１２の第２の紫外画像をもたらす。関心領域にわたる、すなわち画像領域にわたる第１の物質及び第２の物質の空間分布は、ランベルト・ベールの法則を用いて、Ｚｅｓｋｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ（上述の論文を参照）によって提案されたものと同様のアプローチで以下のように導き出される。試料１２におけるｚ軸６に平行な選択軸上の周波数νの光の強度Ｉ（ν，ｚ）を考える。特定のｚ位置において強度は次のように近似されることができる。
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σ１（ν）とσ２（ν）はそれぞれ第１の物質と第２の物質の吸収断面積（例えば平方メートル）であり、Ｎ１（ｚ）とＮ２（ｚ）はそれぞれ第１の物質と第２の物質の位置０及びｚの間の軸上の単位面積当たりの粒子の数である。より正確には、Ｎ１（ｚ）とＮ２（ｚ）は、単位面積で割られる、その単位面積上のｚ方向に沿った射影を持つ粒子の数である。位置０は上面１４上に選ばれる。ｚ値は下面１６に対応するように選ばれ、今後は削除される。その代わりｘ及びｙへの、つまりｘ‐ｙ平面２，４における位置への依存度を導入する。
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【００２７】
２つの紫外周波数ν１及びν２に対する上記関係を評価することによって、それぞれ第１の物質及び第２の物質の単位面積当たりの粒子の数、Ｎ１（ｘ，ｙ）及びＮ２（ｘ，ｙ）に対する線形系が得られる。
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【００２８】
本願において、関数Ｎ１（ｘ，ｙ）及びＮ２（ｘ，ｙ）は、表面（この場合は試料１２の下面１６）上の各物質の分布の画像をもたらすため、物質画像と称される。これらは異なる方法で、例えば陰影単色画像として、等高線図として、又はｘ‐ｙ平面上に定義される表面として図で表現されることができる。入射強度値Ｉ０（ν１，ｘ，ｙ）及びＩ０（ν２，ｘ，ｙ）によって正規化される透過強度値Ｉ（ν１，ｘ，ｙ）及びＩ（ν２，ｘ，ｙ）は、上述の紫外画像を形成する。これらは入射紫外光の強度と透過紫外光の強度をｘ‐ｙ平面における様々な位置に対して測定することによって、及び場合により隣接位置間を補間することによって得られる。断面σ１（ν１），σ２（ν１），σ１（ν２），σ１（ν２）は既知であると考えられる。例えば、ヘマトキシリン及びエオシンの最適／正規化スペクトル吸収係数はＡｂｅ  ｅｔ  ａｌによって発表されている（上述の論文を参照）。そして物質画像Ｎ１（ｘ，ｙ）及びＮ２（ｘ，ｙ）は上記線形系を解くことによって導き出される。このアプローチは２つよりも多くの物質に容易に一般化されることができる。資料１２中のＭ個の物質の各々に対して物質画像を決定するために、試料１２は毎回異なる周波数の光を用いてＭ回連続的に照射される。
【００２９】
図３及び図４に、第１の物質の物質画像Ｎ１（ｘ，ｙ）と第２の物質の物質画像Ｎ２（ｘ，ｙ）が概略的にあらわされる。第１の物質画像２４は単位面積当たりの第１の物質の粒子の数が平均を上回る領域３０を有する。同様に、第２の物質画像２６は単位面積当たりの第２の物質の粒子の数が平均を上回る領域３２を有する。
【００３０】
図５において、物質画像Ｎ１（ｘ，ｙ）及びＮ２（ｘ，ｙ）が"複数物質"画像として一緒に概略的にあらわされる。本発明に沿って、例えばｘ‐ｙ平面における任意の選択点に対してＮ１（ｘ，ｙ）及びＮ２（ｘ，ｙ）をそれぞれ赤色と青色によってあらわすことにより、物質画像Ｎ１（ｘ，ｙ）及びＮ２（ｘ，ｙ）に基づいて多色画像が生成され、色の強度又は彩度はそれぞれ値Ｎ１（ｘ，ｙ）及びＮ２（ｘ，ｙ）に対応する。有利なことに、多色画像は一方における物質画像、及び他方における多色画像の間のマッピングの結果である。つまり、一方における値Ｎ１及びＮ２と他方における明度との間に１対１対応がある。好適には１対１対応は多色画像の領域ごとに同じである。
【００３１】
ここで図６を参照すると、無染色試料の多色画像を生成する方法のフローチャートが示され、試料は少なくとも第１の物質と第２の物質を有する。第１のステップ６０１において、第１の物質画像Ｎ１（ｘ，ｙ）が生成され、第１の物質画像は画像の領域ごとにその領域に位置する第１の物質の量、例えば物質の粒子の数を示す。第２のステップ６０２において、第２の物質画像Ｎ２（ｘ，ｙ）が生成され、第２の物質画像は画像の領域ごとにその領域に位置する第２の物質の量、例えば物質の粒子の数を示す。続く第３のステップ６０３において、物質画像に基づいて多色画像Ｃ（ｘ，ｙ）が生成され、Ｃは色を示し、色空間、例えばレッド‐グリーン‐ブルー（ＲＧＢ）加法混色空間又はシアン‐マゼンタ‐イエロー（ＣＭＹＫ）若しくはＣＭＹ減法混色空間におけるベクトルによってあらわされることができる。
【００３２】
本発明は図面と前述の説明に詳細に図示され記載されているが、図面と説明は例示であって限定ではないとみなされるものとする。本発明は開示された実施形態に限定されない。上記に記載されない均等物、組み合わせ、及び変更もまた本発明の範囲から逸脱することなく実現され得る。
【００３３】
"有する"という動詞とその派生語は、"有する"が参照するものにおける他のステップ又は要素の存在を除外しない。不定冠詞"ａ"又は"ａｎ"はその冠詞が参照する対象の複数を除外しない。請求項で言及される複数の手段の機能を単一のユニットが提供してもよいこともまた留意される。特定の特徴が相互に異なる従属請求項に列挙されているという単なる事実は、これらの特徴の組み合わせが有利に使用されることができないことを示すものではない。請求項における任意の参照符号は範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【図１】
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【図２】
2012510069.tif 000007
【図３】
2012510069.tif 000008
【図４】
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【図５】
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【図６】
2012510069.tif 000011
【国際調査報告】
2012510069.tif 000012
2012510069.tif 000013
2012510069.tif 000014