【手続補正書】
【提出日】令和2年10月9日(2020.10.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．レポータータンパク質のＮ末端断片と、
ｂ．神経毒素切断部位を含むリンカーと、
ｃ．前記レポータータンパク質のＣ末端断片と
をＮ末端からＣ末端の順序で含む単鎖ポリペプチドであって、
前記Ｎ末端断片及び前記Ｃ末端断片が、機能性レポータータンパク質配列をまとめて含み、
前記リンカーによって前記Ｎ末端断片と前記Ｃ末端断片とが機能的に連結されることで機能性レポーター融合タンパク質が生成する、前記単鎖ポリペプチド。
【請求項２】
前記レポータータンパク質が、ルシフェラーゼタンパク質である、請求項１に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項３】
前記Ｎ末端断片が、配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１〜１５９の配列（Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９）を有し、前記Ｃ末端断片が、配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１６０〜１７０の配列（Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０）を有する、請求項１に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項４】
前記Ｎ末端断片が、配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１〜１５９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列（Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９）を含み、前記Ｃ末端断片が、配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１６０〜１７０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列（Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０）を含む、請求項３に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項５】
前記Ｎ末端断片が、配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１〜１５９に対する置換、欠失、または付加が１０アミノ酸残基未満である配列（Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９）を含み、前記Ｃ末端断片が、配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１６０〜１７０に対する置換、欠失、または付加が３アミノ酸残基未満である配列（Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０）を含む、請求項３に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項６】
前記神経毒素切断部位が、Ｃ．ボツリヌム（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）神経毒素（ＢｏＮＴ）切断部位及び／または破傷風神経毒素切断部位である、請求項１に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項７】
前記ＢｏＮＴ切断部位が、セロタイプＡ、Ｅ、Ｃ、Ｂ、Ｄ、Ｆ、またはＧのＢｏＮＴによって認識される、請求項６に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項８】
前記ＢｏＮＴ切断部位が、ＳＮＡＲＥタンパク質に由来する、請求項６に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項９】
前記ＳＮＡＲＥタンパク質が、ＳＮＡＰ−２５、シナプトブレビン（ＶＡＭＰ）、またはシンタキシンである、請求項８に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項１０】
前記ＳＮＡＲＥタンパク質が、ヒトＳＮＡＰ−２５ｂのアミノ酸１４１〜２０６である、請求項８に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項１１】
前記ＳＮＡＲＥタンパク質が、ヒトＶＡＭＰ１のアミノ酸３５〜９６である、請求項８に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項１２】
前記ＳＮＡＲＥタンパク質が、ヒトＳＮＡＰ２５ｂのアミノ酸１〜２０６である、請求項８に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項１３】
前記リンカーが、神経毒素結合断片をさらに含む、請求項１に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項１４】
前記神経毒素結合断片が、前記Ｎ末端断片と前記神経毒素切断部位との間に位置する、請求項１３に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項１５】
前記神経毒素結合断片が、ヒト、マウス、ラット、または霊長類の神経毒素受容体である、請求項１３に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項１６】
前記神経毒素受容体が、ＳＶ２Ｃである、請求項１５に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項１７】
前記神経毒素受容体が、ヒトＳＶ２Ｃのアミノ酸５２９〜５６６を含む、請求項１５に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項１８】
前記神経毒素受容体が、ＳＹＴＩである、請求項１５に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項１９】
前記神経毒素受容体が、ＳＹＴＩのアミノ酸３２〜５２を含む、請求項１５に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項２０】
前記神経毒素受容体が、ＳＹＴ２である、請求項１５に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項２１】
前記神経毒素受容体が、ＳＹＴ２のアミノ酸４０〜６０を含む、請求項１５に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項２２】
前記リンカーが、前記Ｎ末端断片と前記神経毒素切断部位との間に位置するインタクトな第２のレポーターポリペプチドをさらに含む、請求項１に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項２３】
前記第２のレポーターポリペプチドが、ホタルルシフェラーゼ（例えば、フォティヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ））、細菌ルシフェラーゼ（例えば、ビブリオ・フィシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）、ビブリオ・ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉ））、ウミシイタケルシフェラーゼ（ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ））、渦鞭毛藻ルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、またはカイアシルシフェラーゼである、請求項２２に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項２４】
ポリヒスチジン親和性タグをさらに含む、請求項１に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項２５】
前記リンカーが、前記神経毒素切断部位と前記Ｎ末端断片との間に位置する１つまたは複数のスペーサー、前記神経毒素切断部位と前記Ｃ末端断片との間に位置する１つまたは複数のスペーサー、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項１に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項２６】
前記リンカーが、前記神経毒素結合断片と前記Ｎ末端断片との間に位置する１つまたは複数のスペーサーをさらに含む、請求項１４に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項２７】
前記リンカーが、前記神経毒素結合断片と前記神経毒素切断部位との間に位置する１つまたは複数のスペーサーをさらに含む、請求項１４に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項２８】
前記リンカーが、前記第２のレポーターポリペプチドと前記Ｎ末端断片との間に位置する１つまたは複数のスペーサーをさらに含む、請求項２２に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項２９】
前記リンカーが、前記第２のレポーターポリペプチドと前記神経毒素切断部位との間に位置する１つまたは複数のスペーサーをさらに含む、請求項２２に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項３０】
請求項１に記載の単鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
【請求項３１】
請求項３０に記載の核酸を含む、核酸ベクター。
【請求項３２】
請求項３０に記載の核酸を含む、細胞。
【請求項３３】
Ｃ．ボツリヌム神経毒素（ＢｏＮＴ）の効力を決定するための方法であって、以下の段階を含む、方法：
（ａ）ＢｏＮＴ活性に適した条件下で単鎖ポリペプチドに前記ＢｏＮＴを接触させる段階であって、前記単鎖ポリペプチドが、
（ｉ）レポータータンパク質のＮ末端断片と、
（ｉｉ）ＢｏＮＴ切断部位を含むリンカーと、
（ｉｉｉ）前記レポータータンパク質のＣ末端断片と
を含む、段階；および
（ｂ）参照基準と比較して前記ポリペプチドのレポーター活性を決定し、それによって効力を決定する段階。
【請求項３４】
試料におけるＣ．ボツリヌム神経毒素（ＢｏＮＴ）活性を検出するための方法であって、以下：
（ａ）ＢｏＮＴ活性に適した条件下で単鎖ポリペプチドに前記試料を接触させる段階であって、前記単鎖ポリペプチドが、
（ｉ）レポータータンパク質のＮ末端断片と、
（ｉｉ）ＢｏＮＴ切断部位を含むリンカーと、
（ｉｉｉ）前記レポータータンパク質のＣ末端断片と
を含む、段階；および
（ｂ）前記試料の非存在下での前記ポリペプチドのレポーター活性と比較して前記ポリペプチドのレポーター活性を決定する段階
を含み、レポーター活性の減少が、前記試料における神経毒素の活性を示す、方法。
【請求項３５】
前記単鎖ポリペプチドが、神経細胞によって発現され、前記方法が、前記接触段階の後に、
前記神経細胞を約１２時間〜約６０時間の期間インキュベートする段階；及び
前記神経細胞から溶解液を回収する段階
をさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
以下を含む、キット：
（ａ）１つもしくは複数の、請求項１に記載の単鎖ポリペプチドであって、
前記単鎖ポリペプチドのそれぞれもしくは組み合わせが、独立した容器に収容されている、前記単鎖ポリペプチド；
（ｂ）前記１つもしくは複数の（ａ）の単鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、１つもしくは複数の、核酸もしくは核酸ベクターであって、
前記核酸もしくは核酸ベクターのそれぞれもしくは組み合わせが、独立した容器に収容されている、前記核酸もしくは核酸ベクター；及び／または
（ｃ）前記１つもしくは複数の（ａ）の単鎖ポリペプチドを発現する１つもしくは複数の細胞であって、
前記細胞のそれぞれもしくは組み合わせが、独立した容器に収容されている、前記細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
１つの態様では、ａ）１つもしくは複数の本明細書に記載の単鎖ポリペプチドであって、単鎖ポリペプチドのそれぞれもしくは組み合わせが、独立した容器に収容される単鎖ポリペプチド、ｂ）１つもしくは複数の本明細書に記載の核酸もしくは核酸ベクターであって、核酸もしくは核酸ベクターのそれぞれもしくは組み合わせが、独立した容器に収容される核酸もしくは核酸ベクター、及び／またはｃ）１つもしくは複数の本明細書に記載細胞であって、細胞のそれぞれもしくは組み合わせが、独立した容器に収容される細胞、を含むキットが本明細書に記載される。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、キットは、独立した容器に収容されたルシフェラーゼ基質をさらに含む。
[本発明1001]
ａ．レポータータンパク質のＮ末端断片と、
ｂ．神経毒素切断部位を含むリンカーと、
ｃ．前記レポータータンパク質のＣ末端断片と、
をＮ末端からＣ末端の順序で含む単鎖ポリペプチドであって、
前記Ｎ末端断片及び前記Ｃ末端断片が、機能性レポータータンパク質配列をまとめて含み、前記リンカーによって前記Ｎ末端断片と前記Ｃ末端断片とが機能的に連結されることで機能性レポーター融合タンパク質が生成する、前記単鎖ポリペプチド。
[本発明1002]
前記レポータータンパク質が、ルシフェラーゼタンパク質である、本発明1001の単鎖ポリペプチド。
[本発明1003]
ａ．配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸1〜159に対して少なくとも90％の配列同一性を有する配列を含むＮ末端ドメイン（Ｎ−ｎａｎｏ1〜159）と、
ｂ．前記Ｎ−ｎａｎｏ1〜159のＣ末端に位置し、神経毒素切断部位を含むリンカーと、
ｃ．前記リンカーのＣ末端に位置し、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸160〜170に対して少なくとも90％の配列同一性を有する配列を有するＣ末端ドメイン（Ｃ−ｎａｎｏ160〜170）と、
を含む単鎖ポリペプチドであって、
前記リンカーによって前記Ｎ−ｎａｎｏ1〜159と前記Ｃ−ｎａｎｏ160〜170とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する、前記単鎖ポリペプチド。
[本発明1004]
ａ．配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸1〜159に対する置換、欠失、または付加が10アミノ酸残基未満である配列を含むＮ末端ドメイン（Ｎ−ｎａｎｏ1〜159）と、
ｂ．前記Ｎ−ｎａｎｏ1〜159のＣ末端に位置し、神経毒素切断部位を含むリンカーと、
ｃ．前記リンカーのＣ末端に位置し、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸160〜170に対する置換、欠失、または付加が3アミノ酸残基未満である配列を有するＣ末端ドメイン（Ｃ−ｎａｎｏ160〜170）と、
を含む単鎖ポリペプチドであって、
前記リンカーによって前記Ｎ−ｎａｎｏ1〜159と前記Ｃ−ｎａｎｏ160〜170とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する、前記単鎖ポリペプチド。
[本発明1005]
前記Ｎ末端ドメインが、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸1〜159の配列（Ｎ−ｎａｎｏ1〜159）を有し、前記Ｃ末端ドメインが、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸160〜170の配列（Ｃ−ｎａｎｏ160〜170）を有する、本発明1003〜1004のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1006]
前記神経毒素切断部位が、Ｃ．ボツリヌム（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）神経毒素（ＢｏＮＴ）切断部位及び／または破傷風神経毒素切断部位である、本発明1001〜1005のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1007]
前記リンカーが、前記ＢｏＮＴ切断部位と前記Ｎ末端断片もしくはＮ末端ドメインとの間、前記神経毒素切断部位と前記Ｃ末端断片もしくはＣ末端ドメインとの間、またはそれらの両方に位置する1つまたは複数のスペーサーをさらに含む、本発明1001〜1006のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1008]
前記リンカーが、前記ＢｏＮＴ及び／または破傷風神経毒素に対する受容体の結合断片をさらに含む、本発明1001〜1007のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1009]
前記結合断片が、前記Ｎ末端断片またはＮ末端ドメインと前記ＢｏＮＴ切断部位との間に位置する、本発明1008の単鎖ポリペプチド。
[本発明1010]
前記リンカーが、前記結合断片と前記ＢｏＮＴ切断部位との間に位置するスペーサーをさらに含む、本発明1008〜1009のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1011]
少なくとも1つのスペーサーが、グリシン及びセリンから構成される、本発明1001〜1010のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1012]
少なくとも1つのスペーサーが、5〜15アミノ酸である、本発明1001〜1011のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1013]
少なくとも1つのスペーサーが、配列番号4〜9から選択される、本発明1001〜1012のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1014]
前記ＢｏＮＴが、Ａ、Ｅ、Ｃ、Ｂ、Ｄ、Ｆ、またはＧである、本発明1006〜1013のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1015]
前記ＢｏＮＴ切断部位が、ＳＮＡＲＥタンパク質に由来する、本発明1006〜1014のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1016]
前記ＳＮＡＲＥタンパク質が、ＳＮＡＰ−25、シナプトブレビン（ＶＡＭＰ）、またはシンタキシンである、本発明1015の単鎖ポリペプチド。
[本発明1017]
前記ＢｏＮＴ切断部位が、ヒトＳＮＡＰ−25ｂのアミノ酸141〜206である、本発明1006〜1016のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1018]
前記ＢｏＮＴ切断部位が、ヒトＶＡＭＰ1のアミノ酸35〜96である、本発明1006〜1016のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1019]
前記受容体が、ヒトＳＶ2Ｃである、本発明1008〜1017のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1020]
前記結合断片が、ヒトＳＶ2Ｃのアミノ酸529〜566であるか、またはヒトＳＶ2Ｃのアミノ酸529〜566との同一性が少なくとも90％である配列であるか、またはヒトＳＶ2Ｃのアミノ酸529〜566に対する置換、欠失、もしくは付加が10アミノ酸残基以下である配列である、本発明1019の単鎖ポリペプチド。
[本発明1021]
ポリヒスチジン親和性タグをさらに含む、本発明1001〜1020のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1022]
前記ポリヒスチジン親和性タグが、前記ポリペプチドのＣ末端に位置する、本発明1021の単鎖ポリペプチド。
[本発明1023]
前記リンカーが、前記Ｎ末端断片またはＮ末端ドメインと前記ＢｏＮＴ切断部位との間に位置するインタクトな第2のルシフェラーゼポリペプチドをさらに含む、本発明1001〜1022のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1024]
前記第2のルシフェラーゼポリペプチドが、ホタルルシフェラーゼ（例えば、フォティヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ））、細菌ルシフェラーゼ（例えば、ビブリオ・フィシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）、ビブリオ・ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉ））、ウミシイタケルシフェラーゼ（ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ））、渦鞭毛藻ルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、またはカイアシルシフェラーゼである、本発明1023の単鎖ポリペプチド。
[本発明1025]
前記リンカーが、前記第2のルシフェラーゼポリペプチドと前記ＢｏＮＴ切断部位との間に位置するスペーサーをさらに含む、本発明1023または本発明1024の単鎖ポリペプチド。
[本発明1026]
前記スペーサーが、5〜15アミノ酸である、本発明1025の単鎖ポリペプチド。
[本発明1027]
前記スペーサーが、
2019532651.tif 000001
である、本発明1025または本発明1026の単鎖ポリペプチド。
[本発明1028]
ａ．配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸1〜159（Ｎ−ｎａｎｏ1〜159）と、
ｂ．ｉ．5〜15アミノ酸の第1のスペーサー、
ｉｉ．前記第1のスペーサーのＣ末端に位置し、ＳＶ2Ｃのアミノ酸529〜566から構成される結合断片、
ｉｉｉ．前記結合断片のＣ末端に位置する第2のスペーサー、
ｉｖ．前記第2のスペーサーのＣ末端に位置し、ヒトＳＮＡＰ25ｂのアミノ酸141〜206を含むＢｏＮＴ切断部位、
ｖ．前記ＢｏＮＴ切断部位のＣ末端に位置する5〜15アミノ酸の第3のスペーサー
を含む、前記Ｎ−ｎａｎｏ1〜159のＣ末端に位置するリンカーと、
ｃ．前記リンカーのＣ末端に位置する、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸160〜170（Ｃ−ｎａｎｏ160〜170）と、
を含む単鎖ポリペプチドであって、
前記リンカーによって前記Ｎ−ｎａｎｏ1〜159と前記Ｃ−ｎａｎｏ160〜170とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する、前記単鎖ポリペプチド。
[本発明1029]
ａ．配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸1〜159（Ｎ−ｎａｎｏ1〜159）と、
ｂ．ｉ．5〜15アミノ酸の第1のスペーサー、
ｉｉ．前記第1のスペーサーのＣ末端に位置し、ヒトＳＮＡＰ25ｂのアミノ酸141〜206を含むＢｏＮＴ切断部位、
ｉｉｉ．前記ＢｏＮＴ切断部位のＣ末端に位置する5〜15アミノ酸の第2のスペーサー、
を含む、前記Ｎ−ｎａｎｏ1〜159のＣ末端に位置するリンカーと、
ｃ．前記リンカーのＣ末端に位置する、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸160〜170（Ｃ−ｎａｎｏ160〜170）と、
を含む単鎖ポリペプチドであって、
前記リンカーによって前記Ｎ−ｎａｎｏ1〜159と前記Ｃ−ｎａｎｏ160〜170とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する、前記単鎖ポリペプチド。
[本発明1030]
ａ．配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸1〜159（Ｎ−ｎａｎｏ1〜159）と、
ｂ．ｉ．5〜15アミノ酸の第1のスペーサー、
ｉｉ．前記第1のスペーサーのＣ末端に位置し、ヒトＶＡＭＰ1のアミノ酸35〜96を含むＢｏＮＴ切断部位、
ｉｉｉ．前記ＢｏＮＴ切断部位のＣ末端に位置する5〜15アミノ酸の第2のスペーサー、
を含む、前記Ｎ−ｎａｎｏ1〜159のＣ末端に位置するリンカーと、
ｃ．前記リンカーのＣ末端に位置する、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸160〜170（Ｃ−ｎａｎｏ160〜170）と、
を含む単鎖ポリペプチドであって、
前記リンカーによって前記Ｎ−ｎａｎｏ1〜159と前記Ｃ−ｎａｎｏ160〜170とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する、前記単鎖ポリペプチド。
[本発明1031]
ａ．配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸1〜159（Ｎ−ｎａｎｏ1〜159）と、
ｂ．ｉ．第2の機能性ルシフェラーゼポリペプチド、
ｉｉ．前記第2のルシフェラーゼポリペプチドのＣ末端に位置する5〜15アミノ酸の第1のスペーサー、
ｉｉｉ．前記第1のスペーサーのＣ末端に位置し、ヒトＳＮＡＰ25ｂのアミノ酸1〜206を含むＢｏＮＴ切断部位、
ｉｖ．前記ＢｏＮＴ切断部位のＣ末端に位置する5〜15アミノ酸の第2のスペーサー、
を含む、前記Ｎ−ｎａｎｏ1〜159のＣ末端に位置するリンカーと、
ｃ．前記リンカーのＣ末端に位置する、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸160〜170（Ｃ−ｎａｎｏ160〜170）と、
を含む単鎖ポリペプチドであって、
前記リンカーによって前記Ｎ−ｎａｎｏ1〜159と前記Ｃ−ｎａｎｏ160〜170とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する、前記単鎖ポリペプチド。
[本発明1032]
1つまたは複数のスペーサーが、
2019532651.tif 000002
である、本発明1028〜1031のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1033]
前記Ｃ末端に位置するＨｉｓ6配列（配列番号12）をさらに含む、本発明1028〜1032のいずれかの単鎖ポリペプチド。
[本発明1034]
本発明1001〜1033のいずれかの単鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
[本発明1035]
本発明1034の核酸を含む、核酸ベクター。
[本発明1036]
発現ベクターであり、発現可能な形態の前記核酸配列を含む、本発明1035の核酸ベクター。
[本発明1037]
ウイルス発現ベクター、原核生物発現ベクター、酵母発現ベクター、昆虫発現ベクター、または哺乳類発現ベクターからなる群から選択される、本発明1036の核酸ベクター。
[本発明1038]
本発明1034の核酸または本発明1035〜1037のいずれかの核酸ベクターを含む、細胞。
[本発明1039]
本発明1001〜1033のいずれかの単鎖ポリペプチドを発現する、本発明1038の細胞。
[本発明1040]
原核細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または動物細胞である、本発明1039の細胞。
[本発明1041]
ボツリヌス神経毒素の効力を決定するための方法であって、
（ａ）ＢｏＮＴ活性に適した条件下で本発明1001〜1033のいずれかの単鎖ポリペプチドに前記神経毒素を接触させること、及び
（ｂ）参照基準と比較して前記ポリペプチドのルシフェラーゼ活性を決定し、それによって前記効力を決定すること、
を含む、前記方法。
[本発明1042]
試料におけるＣ．ボツリヌム神経毒素（ＢｏＮＴ）活性を検出するための方法であって、
（ａ）ＢｏＮＴ活性に適した条件下で本発明1001〜1033のいずれかの単鎖ポリペプチドに前記試料を接触させること、及び
（ｂ）前記試料の非存在下での前記ポリペプチドのルシフェラーゼ活性と比較して前記ポリペプチドのルシフェラーゼ活性を決定すること、
を含み、ルシフェラーゼ活性の減少によって前記試料におけるＢｏＮＴ活性が示される、前記方法。
[本発明1043]
インビトロで実施される、本発明1041〜1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
前記接触が、50ｍＭのＨＥＰＥＳ、20μＭのＺｎＣｌ2、2ｍＭのＤＴＴ、1ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む緩衝液（ｐＨ7．1）において実施される、本発明1041〜1043のいずれかの方法。
[本発明1045]
前記試料と接触する前記単鎖ポリペプチドの濃度が、約30ｎＭ〜300ｎＭである、本発明1041〜1044のいずれかの方法。
[本発明1046]
前記試料と接触する単鎖ポリペプチドの濃度が、約30ｎＭである、本発明1045の方法。
[本発明1047]
前記ルシフェラーゼ活性が、ルシフェラーゼ基質を前記単鎖ポリペプチドに添加し、生成する発光シグナルを定量的に測定することによって決定される、本発明1041〜1046のいずれかの方法。
[本発明1048]
前記条件が、約37℃で約1時間〜約36時間の期間インキュベートすることを含む、本発明1041〜1047のいずれかの方法。
[本発明1049]
前記条件が、約37℃で約1時間〜約24時間の期間インキュベートすることを含む、本発明1041〜1048のいずれかの方法。
[本発明1050]
前記条件が、約37℃で約4時間〜約24時間の期間インキュベートすることを含む、本発明1041〜1049のいずれかの方法。
[本発明1051]
前記リンカーが、
5〜15アミノ酸の第1のスペーサーと、
前記第1のスペーサーのＣ末端かつ前記ＢｏＮＴ切断部位のＮ末端に位置する、ヒトＳＶ2Ｃのアミノ酸529〜566の結合断片と、
前記ＢｏＮＴ切断部位のＣ末端に位置する5〜15アミノ酸の第2のスペーサーと、
を含み、
前記ＢｏＮＴ切断部位が、ヒトＳＮＡＰ25のアミノ酸141〜206を含む、本発明1041〜1050のいずれかの方法。
[本発明1052]
前記リンカーが、
前記ＢｏＮＴ切断部位のＮ末端に位置する5〜15アミノ酸の第1のスペーサーと、
前記ＢｏＮＴ切断部位のＣ末端に位置する5〜15アミノ酸の第2のスペーサーと、
を含み、
前記ＢｏＮＴ切断部位が、ヒトＳＮＡＰ25のアミノ酸141〜206を含む、本発明1041〜1050のいずれかの方法。
[本発明1053]
前記リンカーが、
前記ＢｏＮＴ切断部位のＮ末端に位置する5〜15アミノ酸の第1のスペーサーと、
前記ＢｏＮＴ切断部位のＣ末端に位置する5〜15アミノ酸の第2のスペーサーと、
を含み、
前記ＢｏＮＴ切断部位が、ヒトＶＡＭＰ1のアミノ酸35〜96を含む、本発明1041〜1050のいずれかの方法。
[本発明1054]
前記単鎖ポリペプチドが、神経細胞によって発現され、前記方法が、前記接触段階の後に、
前記神経細胞を約12時間〜約60時間の期間インキュベートすること、及び
前記神経細胞から溶解液を回収すること、
をさらに含む、本発明1041〜1053のいずれかの方法。
[本発明1055]
試料におけるＣ．ボツリヌム神経毒素（ＢｏＮＴ）活性を検出するための方法であって、
（ａ）配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸1〜159（Ｎ−ｎａｎｏ1〜159）と、配列番号1のルシフェラーゼのアミノ酸160〜170（Ｃ−ｎａｎｏ160〜170）とが、前記Ｎ−ｎａｎｏ1〜159のＣ末端かつ前記Ｃ−ｎａｎｏ160〜170のＮ末端に位置する、ＢｏＮＴ切断部位を含むリンカーによって分断かつ機能的に連結されたものを含む単鎖ポリペプチドを発現する神経細胞に前記試料を接触させること、
（ｂ）前記神経細胞を約12時間〜約60時間の期間インキュベートすること、
（ｃ）前記神経細胞から溶解液を回収すること、
（ｄ）前記試料の非存在下で同一の処理を実施した神経細胞におけるルシフェラーゼ活性と比較して前記溶解液におけるルシフェラーゼ活性を測定すること、
を含み、
前記ルシフェラーゼ活性の減少によって前記試料におけるＢｏＮＴ活性が示される、前記方法。
[本発明1056]
前記リンカーが、前記Ｎ−ｎａｎｏ1〜159と前記切断部位との間に位置するインタクトな第2のルシフェラーゼポリペプチドをさらに含む、本発明1041〜1055のいずれかの方法。
[本発明1057]
第2のルシフェラーゼポリペプチドが、ホタルルシフェラーゼ（フォティヌス・ピラリス）、細菌ルシフェラーゼ（ビブリオ・フィシェリ、ビブリオ・ハーベイ）、ウミシイタケルシフェラーゼ（ウミシイタケ）、渦鞭毛藻ルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、またはカイアシルシフェラーゼである、本発明1056の方法。
[本発明1058]
前記試料における前記第2のルシフェラーゼポリペプチドの前記ルシフェラーゼ活性が決定され、前記回収された溶解液に存在する総単鎖ポリペプチドの指標として使用される、本発明1056〜1057のいずれかの方法。
[本発明1059]
前記神経細胞が、ウイルス発現ベクターから前記単鎖ポリペプチドを発現する、本発明1054〜1058のいずれかの方法。
[本発明1060]
前記単鎖ポリペプチドが、段階（ａ）の前の6日間発現する、本発明1059の方法。
[本発明1061]
前記ウイルス発現系が、レンチウイルス発現系である、本発明1059の方法。
[本発明1062]
前記インキュベート段階が、約48時間実施される、本発明1054〜1061のいずれかの方法。
[本発明1063]
前記回収段階が、溶解緩衝液を添加することによって実施される、本発明1054〜1062のいずれかの方法。
[本発明1064]
前記ＢｏＮＴ切断部位が、ＳＮＡＰ−25、シナプトブレビン（ＶＡＭＰ）、またはシンタキシンに由来するものである、本発明1041〜1063のいずれかの方法。
[本発明1065]
前記ＢｏＮＴ切断部位が、ＢｏＮＴ  Ａ、ＢｏＮＴ  Ｅ、及びＢｏＮＴ  Ｃによって特異的に認識されるか、またはＢｏＮＴ  Ｂ、ＢｏＮＴ  Ｄ、ＢｏＮＴ  Ｆ、及びＢｏＮＴ  Ｇによって特異的に認識される、本発明1041〜1064のいずれかの方法。
[本発明1066]
異なるＢｏＮＴ切断部位を有する単鎖ポリペプチドの組み合わせが使用される、本発明1041〜1065のいずれかの方法。
[本発明1067]
前記ＢｏＮＴ切断部位が、ヒトＳＮＡＰ−25のアミノ酸141〜206、またはヒトＶＡＭＰ1のアミノ酸35〜96、ヒトＳＮＡＰ35のアミノ酸1〜206、またはＶＡＭＰ1のアミノ酸1〜96である、本発明1041〜1066のいずれかの方法。
[本発明1068]
前記リンカーが、ＢｏＮＴ受容体の結合断片をさらに含む、本発明1041〜1067のいずれかの方法。
[本発明1069]
前記受容体が、ＳＶ2Ｃである、本発明1068の方法。
[本発明1070]
前記結合断片が、ヒトＳＶ2Ｃのアミノ酸529〜566を含む、本発明1068〜1069のいずれかの方法。
[本発明1071]
前記リンカーが、
第2のルシフェラーゼポリペプチドと、
前記第2のルシフェラーゼポリペプチドのＣ末端かつ前記ＢｏＮＴ切断部位のＮ末端に位置する5〜15アミノ酸の第1のスペーサーと、
前記ＢｏＮＴ切断部位のＣ末端に位置する5〜15アミノ酸の第2のスペーサーと、
を含み、
前記ＢｏＮＴ切断部位が、ヒトＳＮＡＰ25のアミノ酸1〜206を含み、前記第1のスペーサーのＣ末端に位置する、本発明1041〜1070のいずれかの方法。
[本発明1072]
ルシフェラーゼ活性の測定が、前記ルシフェラーゼに特異的な基質を添加し、得られる発光シグナルを定量的に検出することによって実施される、本発明1041〜1071のいずれかの方法。
[本発明1073]
配列番号1のルシフェラーゼの前記基質が、フリマジン（2−フラニルメチル−デオキシ−セレンテラジン）である、本発明1072の方法。
[本発明1074]
以下を含む、キット：
（ａ）1つもしくは複数の、本発明1001〜1033のいずれかの単鎖ポリペプチドであって、前記単鎖ポリペプチドのそれぞれもしくは組み合わせが、独立した容器に収容されている、前記単鎖ポリペプチド、
（ｂ）1つもしくは複数の、本発明1034〜1037のいずれかの核酸もしくは核酸ベクターであって、前記核酸もしくは核酸ベクターのそれぞれもしくは組み合わせが、独立した容器に収容されている、前記核酸もしくは核酸ベクター、及び／または
（ｃ）1つもしくは複数の、本発明1038〜1040のいずれかの細胞であって、前記細胞のそれぞれもしくは組み合わせが、独立した容器に収容されている、前記細胞。
[本発明1075]
独立した容器に収容されたルシフェラーゼ基質をさらに含む、本発明1074のキット。