(57)【要約】本願発明は、トリプトファンアナログを含む非天然アミノ酸含有蛋白質製造において、（イ）非天然型アミノ酸を運ぶｔＲＮＡは内在性のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）には認識されず、非天然型アミノ酸専用のａａＲＳにのみ認識され、（ハ）また内在性のｔＲＮＡは非天然型アミノ酸専用のａａＲＳに認識されない蛋白質合成系を提供することを課題とする。  真核生物由来の無細胞蛋白質合成系で、酵母ミトコンドリアのトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素をミトコンドリア  ｔＲＮＡＴｒｐ（ｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐ）と組み合わせて使用すること。【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質中の特定部位のアミノ酸を非天然アミノ酸に変異させた非天然アミノ酸含有蛋白質を製造する方法において、前記蛋白質をコードする遺伝子中の前記特定部位のアミノ酸コドンをオパールコドンに変異させた変異遺伝子、ミトコンドリア  トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素（ｍｔＷＲＳ）及びミトコンドリアｔＲＮＡＴｒｐ（ｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐ）又はオパールサプレッサーｔＲＮＡを蛋白質翻訳合成系に添加して前記非天然アミノ酸含有蛋白質を製造する方法。
【請求項２】
蛋白質合成系が無細胞蛋白質合成系又は真核細胞である請求項１記載の方法。
【請求項３】
無細胞蛋白質合成系が小麦胚芽由来の無細胞蛋白質合成系である請求項２記載の方法。
【請求項４】
ミトコンドリア  トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素（ｍｔＷＲＳ）及びミトコンドリア  ｔＲＮＡＴｒｐ（ｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐ）が酵母のミトコンドリア  トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素（ｍｔＷＲＳ）及び酵母のミトコンドリア  ｔＲＮＡＴｒｐ（ｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐ）である請求項１〜３いずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記非天然アミノ酸がトリプトファンアナログである請求項１〜４いずれか１項記載の方法。
【請求項６】
以下の（１）、（２）、又は（３）のいずれかのポリペプチドからなるミトコンドリア  トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素
（１）  配列番号２で表されるアミノ酸配列、
（２）  配列番号２で表されるアミノ酸配列の一部であって、少なくともＮ末から位置番号２３７までを含むアミノ酸配列、
（３）  配列番号２で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換，付加，及び／又は欠失した配列であって、しかもＮ末から５アミノ酸はＩＳＴＶＱであり、ミトコンドリア  トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項７】
配列番号４で表される核酸、又は
配列番号４で表される核酸に相補的な核酸にストリンジェントな条件下で、ハイブリダイズする核酸であって、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
【請求項８】
配列番号４で示される遺伝子を含む組換え発現ベクターを大腸菌に導入することによる酵母ミトコンドリア  トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素の製造方法。
【請求項９】
請求項６記載のミトコンドリア  トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素に特異的に反応する抗体。
【請求項１０】
請求項６記載のミトコンドリア  トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素に対する阻害剤候補の存在下、前記ミトコンドリア  トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素及びミトコンドリアｔＲＮＡＴｒｐ（ｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐ）を含む溶液中で、ｔＲＮＡのトリプトファン受容能を調べることを含む、ｔＲＮＡ合成酵素阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項１１】
以下の工程を含むｔＲＮＡの合成方法。
（１）ｔＲＮＡをコードするＤＮＡの５’側に付加配列を設けることにより５’側に付加配列に有するｔＲＮＡをコードするＤＮＡを調製する工程、
（２）５’側に付加配列を有するｔＲＮＡをコードするＤＮＡを転写して、前駆体ｔＲＮＡを調製する工程、
（３）前記ｔＲＮＡをＲＮａｓｅＰで処理して、ｔＲＮＡを得る工程。
【請求項１２】
ｔＲＮＡがｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐである請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記５’側の付加配列がｇｇｇａｇａｃｃａｃａａｃｇｇｔｔｔｃｃｃｔｃｔａｇａである請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
前記ＲＮａｓｅＰがＣ５蛋白質とＭ１  ＲＮＡとからなる請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
前記ＲＮａｓｅＰがＭ１  ＲＮＡからなる請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
請求項１１〜１５記載のいずれかの方法により調製したｔＲＮＡを利用した請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本願発明は、ミトコンドリア由来のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素に関する。より具体的には、酵母ミトコンドリアｔＲＮＡＴｒｐをアミノアシル化することができる酵母ミトコンドリア由来のトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素に関する。
更に、本願発明は、酵母ミトコンドリア由来のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を利用する非天然アミノ酸含有蛋白質の製造方法に関する。
又、本願発明は、ＲＮＡの調製に関する。より具体的には、ｔＲＮＡのアミノアシル化など機能を有するｔＲＮＡを製造する方法に関する。
【背景技術】  １．アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素は、すべての生物に存在する酵素で、蛋白質合成において、ＡＴＰの加水分解エネルギーを利用し、アミノ酸を活性化しトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）に結合させる酵素である。原核生物では、２０種類の天然アミノ酸に対応し、２０種類のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素が存在し、真核生物では、細胞質に存在するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素２０種類と、ミトコンドリアに存在するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素２０種がある。これらのアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素は、大きくは、クラスＩとクラスＩＩに分類され、クラスＩは、アミノ酸配列中にＨＸＧＨというシグニチャー配列及びＫＭＳＫのヌクレオチド結合領域（ロスマンフォールド）を有している。クラスＩは、アルギニン、システイン、グルタミン、グルタミン酸、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンに対するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素が含まれる。
クラスＩＩは、これら特徴的配列を含んでおらず、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、及びセリンのそれぞれに対するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素が含まれる。
それぞれのアミノ酸に対するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素は、アミノ酸をｔＲＮＡに結合させる工程を触媒し、チロシルｔＲＮＡ合成酵素を例に取れば、Ｔｙｒ＋ＡＴＰ＋ｔＲＮＡＴｙｒ＋チロシルｔＲＮＡ合成酵素＋−＞ＡＭＰ＋Ｔｙｒ−ｔＲＮＡＴｙｒ＋チロシルｔＲＮＡ合成酵素と反応する。
これまでに、種々の生物種から、それぞれのアミノ酸についての、アミノアシルＲＮＡ合成酵素が採取され、報告されている。
例えば、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素としては、大腸菌由来のもの（非特許文献１：  ＪＢＣ  Ｖｏｌ．２５７，ｎｏ．１１，ｐｐ．６１３２−６１３６）、バチラスズブチル由来のもの（非特許文献２：  ＪＢＣ  Ｖｏｌ．２６４、ｐｐ．４３０４−４３１１）などが知られている。
また、微生物由来のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素は、新規な抗生物質の標的としても利用されている。更にこれに対する特異的抗体を利用することもできる。
２．非天然型アミノ酸含有蛋白質の製造方法
サプレッサーｔＲＮＡを用い、本来３つある終始コドンの１つ（アンバーコドン）を非天然型アミノ酸コドンとして、部位特異的に非天然型アミノ酸を組み込む方法が開発された（非特許文献３：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１８２−１８８（１９８９））。本方法は、遺伝子中の非天然アミノ酸を導入したい部位のコドンをサプレッサーｔＲＮＡに対応するコドンに変異させ、かかる変異遺伝子を用いて、サプレッサーｔＲＮＡと非天然型アミノ酸を化学的に結合された非天然型アミノ酸結合ｔＲＮＡの存在下で無細胞蛋白質翻訳を行わせることにより調製された。
その後、変異遺伝子を用いて、サプレッサーｔＲＮＡと非天然型アミノ酸を化学的に結合された非天然型アミノ酸結合ｔＲＮＡをＸＥＮＯＰＵＳ卵母細胞へ注入し、非天然型アミノ酸を部位特異的に含む蛋白質が合成もされている（非特許文献４：ＪＢＣ  ｖｏｌ．２７１，ｐｐ．２３１６９）。
また、サプレッサーｔＲＮＡを利用する方法では、非天然アミノ酸の導入率が限られるということで、種々のｔＲＮＡの一部に非天然アミノ酸を結合させる方法（特許文献１参照）がある。この製造法は、無細胞蛋白質合成系下で、特定のアミノ酸に対応するアイソアクセプティングｔＲＮＡのうち、一部のもののみを非天然型アミノ酸と結合させたものと、蛋白質構成アミノ酸とを用いて蛋白質合成を行って、非天然型アミノ酸を特定のコドングループに組込むものである。
更に、最近では、特定のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素とｔＲＮＡを組み合わせて用いることにより、ｔＲＮＡを再利用しつつ、非天然アミノ酸含有蛋白質（以下非天然アミノ酸蛋白質とも呼ぶ）を合成することが行われている。メタノコッカス属由来のチロシル‐ｔＲＮＡ合成酵素を非天然アミノ酸に特異的に変異させた変異体酵素とそれに対応するｔＲＮＡを用いて大腸菌内で非天然アミノ酸含有蛋白質の合成を行っている（非特許文献５：  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｖｏｌ．２９２，ｐｐ．４９８−５００）。
本願発明者らも、すでに、チロシンアナログと、サプレッサーｔＲＮＡと、前記チロシンアナログをサプレッサーｔＲＮＡに結合させるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体とを含有する蛋白質合成系に、鋳型を加えて蛋白質合成させる方法を発明している。本方法は、チロシンアナログとして、アジドチロシン、アセチルチロシン、アミノチロシン又はドーパを導入できるものである（特許文献２：特開２００４−２６１１６０）。
一方、従来より、蛋白質のＸ線結晶構造解析には、例えば非特許文献７に開示されている方法により製造されたセレノメチオニン置換蛋白質が用いられている。このセレノメチオニン置換蛋白質を製造する際には、まず、大腸菌のメチオニン要求株と目的蛋白質の遺伝子が挿入されているプラスミドを準備して形質転換を行った後、抗生物質を含むアガロースゲルプレートを用いて目的蛋白質を発現する単一コロニーを単離する。次に、単離された形質転換体をメチオニンの代わりにセレノメチオニンを含む培地中で培養することにより目的蛋白質を発現させて精製するものである。
３．ｔＲＮＡ
遺伝情報であるＤＮＡと機能を示す蛋白質とのつながりは、「セントラルドグマ」という考え方で示された。これは、ＤＮＡから蛋白質が作られる過程を２段階にとらえ、第１段階は「ＤＮＡのある領域（遺伝子）が、蛋白質の合成に使えるような形（ＲＮＡ（ｍＲＮＡ））にコピーされる段階」、第２段階は「ＲＮＡを使って蛋白質が作られる段階」でる。第１段階では、ＤＮＡの２重らせんがほどかれ、その一方のＤＮＡ鎖を鋳型にし、ＲＮＡ鎖（このとき作られるＲＮＡを特にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と呼ぶ）が作られる。この過程を「転写」と呼ぶ。第２段階はｍＲＮＡという核酸の情報をアミノ酸に置き換え蛋白質を合成する過程であり、「翻訳」と呼ばれる。遺伝情報を持ったｍＲＮＡ上の３つの塩基（トリプレット）が１つのアミノ酸に対応する。このトリプレットを「コドン」といい、４ｘ４ｘ４＝６４通りの組み合わせで、２０種類のアミノ酸と蛋白質合成の終了を示す「終止コドン」を指定している。このことは遺伝暗号表にまとめられる。数個のコドンで１つのアミノ酸を指定するものがあれば、メチオニンのように１つのコドンしか使用しないという組み合わせもあった。特にこのメチオニン・コドン（ＡＵＧ）は蛋白質の合成開始を示す「開始コドン」でもある。このコドンとアミノ酸の架け橋の役目をする分子がトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）であり、遺伝暗号の翻訳に欠かせない分子である。
【特許文献１】特許第３３１７９８３号公報
【特許文献２】特開２００４−２６１１６０号公報
【非特許文献１】ＪＢＣ  Ｖｏｌ．２５７，ｎｏ．１１，ｐｐ．６１３２−６１３６
【非特許文献２】ＪＢＣ  Ｖｏｌ．２６４、ｐｐ．４３０４−４３１１
【非特許文献３】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１８２−１８８（１９８９）
【非特許文献４】ＪＢＣ  ｖｏｌ．２７１，ｐｐ．２３１６９
【非特許文献５】Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｖｏｌ．２９２，ｐｐ．４９８−５００
【非特許文献６】清水敏之、岡田健吾、箱嶋敏雄、第１７章  Ｘ線結晶構造解析セレノメチオニン置換タンパク質の発現と調製、「基礎生化学実験法３タンパク質Ｉ．検出・構造解析法」、株式会社東京化学同人、第１版第１刷２００１年２月１５日、ｐ．１８９−１９０
【発明の開示】
ミトコンドリア由来のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素は、抗生物質などの医薬開発に重要なターゲットである。
更に、上述したように、サプレッサーｔＲＮＡと、前記アミノ酸アナログをサプレッサーｔＲＮＡに結合させるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を蛋白質合成系に利用する方法は、非天然アミノ酸蛋白質を効率的に生産する上で望ましい。しかしながら、現在までのところ、導入できる非天然アミノ酸の種類に限定があり、チロシンのアナログ（類縁体）、アラニンのアナログなどに限られていた。
そこで、（１）本願発明は、新規なアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の提供を１つの課題とする。
更に（２）本願発明は、サプレッサーｔＲＮＡと、前記アミノ酸アナログをサプレッサーｔＲＮＡに結合させるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を用いて、チロシン以外のアミノ酸の変異体を蛋白質に導入する、新たな非天然アミノ酸含有蛋白質合成系の提供を第２の課題とする。
更に、アミノ酸の内、蛍光標識などが可能なトリプトファンについても、変異体を効率的に導入できることが重要であるから、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素の提供すること、及びサプレッサーｔＲＮＡと、トリプトファンアナログをサプレッサーｔＲＮＡに結合させるトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素を蛋白質合成系の提供することも課題とする。
また、サプレッサーｔＲＮＡと、前記アミノ酸アナログをサプレッサーｔＲＮＡに結合させるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を蛋白質合成系に利用する方法は、（イ）非天然型アミノ酸を運ぶｔＲＮＡは内在性のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）には認識されず、（ロ）非天然型アミノ酸専用のａａＲＳにのみ認識されなければならず、（ハ）また内在性のｔＲＮＡは非天然型アミノ酸専用のａａＲＳに認識されてはいけないことを要件とするので、トリプトファンアナログを含む非天然アミノ酸含有蛋白質製造において、上記要件を満たす系の提供を更なる課題とする。
また、ｔＲＮＡの調製に際し、現在は鋳型ＤＮＡとＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写法が利用されている。しかしこの方法では転写開始にグアノシン（Ｇ）が好んで用いられるために最初の塩基がＧ以外のｔＲＮＡを作成することは困難であった。近年この問題を解決するためにＲＮＡからなる人工酵素（リボザイム）を利用する調製法が報告されたが、効率の良いものではなかった。
本願発明者らは、酵母ミトコンドリアのトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を実際に発現させることにより、新規で活性なトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素を単離した。
更に、真核生物由来の無細胞蛋白質合成系で、本酵素をトリプトファンｔＲＮＡＴｒｐと組み合わせて使用することで、（イ）非天然型アミノ酸を運ぶｔＲＮＡは内在性のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳと略す）には認識されず、（ロ）非天然型アミノ酸専用のａａＲＳにのみ認識され、（ハ）また内在性のｔＲＮＡは非天然型アミノ酸専用のａａＲＳに認識されないという要件を満たす、トリプトファンアナログを部位特異的に含めることができる非天然アミノ酸含有蛋白質の製造できることを見出した。
更に本願発明者らは、大腸菌由来ＲＮａｓｅＰの大量発現系を構築し、はじめの塩基がＧ以外で始まる配列を持つｔＲＮＡを製造できることを見いだした。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００４−３３８１７８号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】  図１は、１％アガロースゲル電気泳動による、ｍｔＷＲＳ遺伝子の増幅の確認を示す。
図２は、ｐＵＣ１９とのライゲーション後、ｍｔＷＲＳ遺伝子が組み込まれたかの確認を示す。
図３は、ｍｔＷＲＳ遺伝子のｐＹＣ２／ＣＴ  ｖｅｃｔｏｒへのサブクローニングの確認を示す。
図４は、ｍｔＷＲＳ遺伝子の挿入が確認されたｐＹＣ２ＷＲＳを用いて、ｍｔＷＲＳの発現の確認を示す。
図５は、Ｃ５蛋白質遺伝子の挿入が確認されたｐＥＴＣ５を用いて、Ｃ５蛋白質の発現の確認を示す。
図６は、Ｍ１  ＲＮＡ調製の確認を示す。
図７は、Ｃ５蛋白質、Ｍ１  ＲＮＡによる活性確認を示す。
図８は、ミトコンドリアｔＲＮＡＴｒｐ調製の確認を示す。
図９は、細胞質ｔＲＮＡＴｒｐおよびその変異体調製の確認を示す。
図１０は、ｔＲＮＡＴｙｒ調製の確認を示す。
図１１は、ｍｔＷＲＳとｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐを用いてｔＲＮＡの１４Ｃ−トリプトファン受容能の確認を示す。
図１２は、ｍｔＷＲＳのシグナルペプチド切断部位の同定のための電気泳動を示す。
図１３は、小麦胚芽抽出液Ｓ１００画分（核酸抜き）と小麦ｔＲＮＡｍｉｘを用いて、ｍｔＷＲＳとｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐとの交差反応の確認を示す。
図１４は、小麦胚芽抽出液由来無細胞タンパク質合成系におけるオパールコドンサプレッションの確認を示す。
図１５は、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＴｒｐＲＳの結晶構造のアミノ酸ポケット及び括弧内はｍｔＷＲＳでの残基を示す。
図１６は、Ｔ．ＴｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓｉのＥＦ−Ｔｕを用いた三者複合体形成による、トリプトファン及びトリプトファンアナログのｍｔＷＲＳとＦ３８Ａによるｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐへの受容確認を示す。
図１７は、トリプトファン及びトリプトファンアナログのｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐへの受容確認を示す。
【発明を実施するための最良の形態】Ｉ．ミトコンドリアトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素
１．新規ミトコンドリアトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素
本発明者らは、ミトコンドリアトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素のアミノ酸配列を推定したところ、配列番号１のアミノ酸配列を得た。そして、これに対し、通常のシグナルペプチド予想プログラムで予想したところ、位置番号で１９、２２、又は２４で切断されるとの予想に基づいて、ミトコンドリアトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素を大腸菌において遺伝子工学的に発現しようとしてところ、不溶性蛋白質しか得られず、可溶化効率も非常に悪く、活性のある蛋白質を回収することはできなかった。そして、本願発明者の研究により、シグナルペプチドが、配列番号１の配列において、位置番号で１−１５であることを見出し、これをもとに設計して初めて可溶性蛋白質を活性を持って回収することに成功した。
そこで、本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の内、位置番号１６以降のアミノ酸から、言い換えれば、配列番号２からなるサッカロマイセスセレビシエ由来のミトコンドリアトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素を包含する。
更に、本願発明には、以下のポリペプチドを包含する。
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列の一部で少なくともＮ末から位置番号２３７までの配列で表されるポリペプチドであって、ミトコンドリアトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素活性を有するポリペプチド。
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１又は数個、例えば、１〜５０個、好適には１〜３０個、更に好適には１〜１０個のアミノ酸が置換、付加、及び／又は欠失した配列であって、しかもＮ末から５アミノ酸はＩＳＴＶＱである、ミトコンドリアトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素活性を有するポリペプチド。
（３）Ｎ末から５アミノ酸はＩＳＴＶＱであって、配列番号２の配列に７５％以上、好適には、８５％以上、更に好適には、９５％以上の同一性を有し、ミトコンドリアトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素活性を有するポリペプチド。
２．ミトコンドリアトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子
本願発明のミトコンドリアトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子としては、配列番号３で表される塩基配列及びその相補的配列からなる核酸を挙げることができる。特に好適には、配列番号３で表される核酸配列の第４５塩基を含め第４５塩基より下流の塩基配列又はその相補的配列からなる核酸を挙げることができる。
配列番号３で表される核酸又は配列番号３で表される核酸に相補的な核酸にストリンジェントな条件下で、ハイブリダイズする核酸であって、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸も含まれる。ストリンジェントな条件としては、一般的なストリンジェントな条件、例えば、１２０℃で２０分間処理してＤＮＡを結合させたＨｙｂｏｎｄＮ＋ナイロンメンブレン（アマシャムファルマシア）をリン酸塩緩衝液（０．５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび７％ＳＤＳ）中、６５℃で５分間処理し、プレハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションは同緩衝液中に配列番号３で表される遺伝子を添加後、６５℃で１７時間行う。ハイブリダーゼーション後のメンブレンは室温で２０分間、０．１％ＳＤＳを含む２ｘＳＳＣ（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｃｉｔｒａｔｅ；１ｘＳＳＣは１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ、ｐＨ７．０）で処理下後、０．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＣ中６５℃で２０分間の洗浄を２回行う。さらに０．１％ＳＤＳを含む０．１ｘＳＳＣ、６５℃で２０分間処理し洗浄を完了する。Ｘ線フィルムへの感光は−８０℃で２４時間行う。
３．ミトコンドリアトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素の調製
ミトコンドリアトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素は、以下のように調製することができる。
配列番号３又は４の遺伝子を周知の発現ベクターに組み込み、当該発現ベクターに適切な宿主に導入し、上記ミトコンドリアトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子を発現させることにより、調製することができる。
宿主としては、遺伝子発現用の任意の宿主、例えば、大腸菌など細菌、昆虫細胞、ＣＯＳ又はＣＨＯなどの動物細胞、好適には酵母細胞を用いることができる。
発現ベクターとしては、特に限定されないが、例えば、Ｈｉｓタグなどの精製手段が付加された蛋白質として発現されるベクターを用いることが好ましい。宿主として大腸菌を用いる場合には、ｐＥＴ系、例えば、ｐＥＴ１０１等、ｐＧＥＸ（アマシャムファルマシア）、ｐＲＳＥＴ（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）を用いることができる。宿主としては、ＣＯＳ又はＣＨＯなどの動物細胞を宿主として用いる場合には、ｐＸＭ、ｐＤＣ２０１、ｐＣＩ等を用いることができる。昆虫細胞を宿主として用いる場合には、バキュロウイルス発現ベクターを用いることができる。酵母を宿主としてもちいる場合には、酵母発現ベクターｐＰＩＣＺα、更には、ｐＹＣ２／Ｃｔ等ｐＹＣ系を用いることができる。これらベクターは、周知の手段で、宿主に遺伝子導入され、誘導性発現ベクターの場合は、目的のミトコンドリアトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子の発現を誘導し、ミトコンドリアトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素を産生させる。産生されたミトコンドリアトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素は、細胞画に分泌されるように設計した場合は、細胞外培養液から、細胞内に蓄積される場合は、宿主細胞を破砕して、ミトコンドリアトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素を回収し、周知の手段の組み合わせ、例えば、ミトコンドリアトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素に対する抗体などを調製し該抗体により、精製する。例えば、Ｈｉｓ  ｔａｇが付されている場合には、Ｎｉ−ＮＴＡなどを利用することができる。
配列番号４で示されるミトコンドリアトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子を、大腸菌用の高性能発現ベクターに組換え、大腸菌に遺伝子導入することにより、大量に製造することができる。具体的にはｐＥＴ系ベクター（ｐＥＴ２１−ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いることができる。
４．変異体ミトコンドリアトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素及びその遺伝子並びにそれらの調製方法
本発明のミトコンドリアトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素は、更に、トリプトファンアナログをｔＲＮＡに結合させることができるように、点突然変異を生じさせることができる。
また、例えば、配列番号１において、３８位フェニルアラニン  １９３位バリンを改変の対象とし、アラニン又はグリシンに置換することにより、基質アミノ酸（トリプトファン）の認識を低下させ且つトリプトファンアナログの認識を上昇させることができる。
５．ミトコンドリアトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素に対する阻害剤、抗体、医薬
ミトコンドリアトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素に対する抗体を、周知の方法で調製することができる。
例えば、ミトコンドリアトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素に対するモノクローナル抗体は、以下のようにして調製できる。精製したミトコンドリアトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素を、好適には、適宜なアジュバント、例えば、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、等と混合して免疫源として用いることができる。
免疫する動物としては、ラット・マウス等の哺乳動物が挙げられ、好適には、マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）又はラットを用いることができる。
免疫源は、免疫対象となる動物に接種される。免疫方法は、動物種、抗原量、アジュバントの必要性、免疫回数・等を考慮して決定することができる。例えば、マウスの場合、皮下、静脈、又は腹腔等に、抗原をアジュバントと混合して注射することができる。必要に応じ、１〜４週間後に追加免疫をすることができる。
最初の免疫後４〜１０週間後に、最終免疫した場合は、最終免疫から３〜４日後に、免疫された動物の例えば脾臓からＢ細胞を採取する。
採取された免疫Ｂ細胞は、ミルシュタイン等の周知の方法により、ミエローマ細胞と融合させられる。
ミエローマ細胞としては、例えば、マウスでは、Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８（Ｘ６３）、Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４、Ｓｐ／０／Ｆｏ−２等が挙げられ、ラットでは、例えば、Ｙ−Ａｇ１．２．３、ＹＢ／０、ＩＲＦ９８３Ｆを挙げることができる。
免疫脾臓細胞（Ｂ細胞）とミエローマ細胞は、例えば、脾臓細胞対ミエローマ細胞の割合を１〜１０として、細胞融合させられる。細胞融合は、例えば、ポリエチレングリコール（３０〜４０％）、ＨＶＪ（センダイウイルス）等の周知の細胞融合剤を用いて行うことができる。融合された細胞は、例えば、ＨＡＴ培地を用いて選抜することができる。
選抜された融合細胞から、更に目的のモノクローナル抗体を産生する融合細胞を選抜することができる。
また、本発明のミトコンドリアトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素は、抗生物質の標的としてきわめて有用で、新規抗生物質又は新規医薬のスクリーニングに利用できる。
具体的には、候補化合物の存在下で、ミトコンドリアトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素の活性を測定し、ミトコンドリアトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素活性が低下する候補化合物として選択することができる。ミトコンドリアトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素の活性は、例えば、ミトコンドリアトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素（ｍｔＷＲＳ）とｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐを用いてｔＲＮＡの１４Ｃ−トリプトファン受容能を検出することにより、測定できる。
ＩＩ．非天然アミノ酸含有蛋白質合成系
１．ミトコンドリアトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素をトリプトファンｔＲＮＡＴｒｐと組み合わせて使用する非天然アミノ酸含有蛋白質合成系
（１）蛋白質をコードする遺伝子又はｍＲＮＡの特定部位のアミノ酸をコードするコドンから終始コドンへ変異させた変異遺伝子又は変異ｍＲＮＡ並びにアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素及びアミノ酸アナログサプレッサーｔＲＮＡを用いて該アミノ酸アナログを含んだ非天然アミノ酸蛋白質を製造する方法、（２）蛋白質をコードする遺伝子から転写したｍＲＮＡ並びにアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素及びＲＮＡを用いてアミノ酸アナログを過剰に存在させ、該アミノ酸アナログを含んだ非天然アミノ酸蛋白質を製造する方法などがある。
上記（１）の場合、（イ）使用する蛋白質合成系に内在するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素により、サプレッサーｔＲＮＡに天然アミノ酸が結合されると、目的の非天然アミノ酸蛋白質は得られない、（ロ）添加した非天然アミノ酸をｔＲＮＡに結合させるためのアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素が内在性のｔＲＮＡに非天然のアミノ酸を結合しないように設計する必要がある。言い換えれば、添加するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素及びアミノ酸アナログサプレッサーｔＲＮＡが蛋白質合成系の内在性のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素及びｔＲＮＡと交差反応を起こさないことが必要である。又、このような交差反応を起こさない系を開発できれば、当該系は、十分非天然アミノ酸蛋白質合成に使用できるものである。
発明者らは、上記した蛋白合成系の内在性のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素及びｔＲＮＡと交差しないアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素及びｔＲＮＡの組み合わせとして、ミトコンドリアのアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素及びｔＲＮＡ、特に、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素及びトリプトファンｔＲＮＡＴｒｐ又はサプレッサーｔＲＮＡを用いて試験したところ、細胞質のトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素及びトリプトファンｔＲＮＡＴｒｐと交差反応しないことを見出した。特に、ミトコンドリアｔＲＮＡＴｒｐはＵＧＧのみならず、揺らぎにより、ＵＧＡを認識することがあるので、又トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素は、サプレッサーｔＲＮＡとしてオパールコドンを認識するものを用いると、効率的に、サプレッサーｔＲＮＡにトリプトファン又はトリプトファンアナログを結合させることができると考えられる。
つまり、本願発明には、蛋白質中の特定部位のアミノ酸を非天然アミノ酸に変異させた非天然アミノ酸含有ポリペプチドを製造する方法において、前記蛋白質をコードする遺伝子中の前記特定部位のアミノ酸コドンをオパールコドンに変異させた変異遺伝子、ミトコンドリア  トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素（ｍｔＷＲＳ）及びミトコンドリア  ｔＲＮＡＴｒｐ又はミトコンドリア  サプレッサーｔＲＮＡＯｐａｌを蛋白質翻訳合成系に添加して前記非天然アミノ酸含有ポリペプチドを製造する方法が包含される。
２．基礎となる蛋白質合成系
本願発明には、ミトコンドリアトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素（以下ｍｔＷＲＳと略す）及びミトコンドリアｔＲＮＡＴｒｐ（以下ｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐと略す）を用いる天然アミノ酸蛋白質合成方法が含まれる。
本ｍｔＷＲＳ及びｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐは、本ｍｔＷＲＳ及びｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐを含む非天然アミノ酸蛋白質合成方法に用いる蛋白質発現系としては、無細胞蛋白質発現系又は植物細胞、動物細胞、昆虫細胞その他の真核細胞を用いる蛋白合成系を用いることができる。本発明の非天然アミノ酸蛋白質合成方法には、大腸菌の蛋白質合成系は適さないが、大腸菌ゲノムおよび遺伝子に改変を加え、非天然アミノ酸の導入に負に働く因子（例えばトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素、ｔＲＮＡＴｒｐ等）を破壊（欠損）、又は基質特異性の改変、又は免疫沈降等により取り除いた細胞抽出液は用いることができる。
無細胞蛋白質合成系としては、鋳型としてのｍＲＮＡからの翻訳を行わせるインビトロ翻訳系、又は鋳型としてのＤＮＡから転写及び翻訳を行わせるインビトロ転写翻訳系の両者とも利用可能である。これらインビトロ蛋白質合成系としては、従来は、細胞を破砕し、Ｓ３０を中心に、２０種類のアミノ酸並びにエネルギー源としてのＡＴＰ及びＧＴＰを添加し、更に、エネルギー再生系を加えた系が用いられてきており、特に大腸菌、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球から調製したものが広く用いられてきている。本発明では、このうち、ウサギ網状赤血球、特に好適には小麦胚芽抽出物の系を用いることができる。
更に最近では翻訳、必要に応じ転写に必要な成分をそれぞれ精製し、混合することにより構築された系も用いることができる。又は、前記両者の系を混合することにより構築されたものが用いることができる。
また、培養細胞等を用いる系としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、バキュロウィルスベクター蛋白質発現系、アフリカツメガエル卵母細胞等が好適に用いられる。また、非天然アミノ酸の導入に負に働く因子（例えば核酸分解酵素、蛋白質分解酵素、解離因子、酸化・還元酵素等）を破壊（欠損）、又は免疫沈降等により取り除いた細胞抽出液も好適に用いられる。
３．ｍｔＷＲＳ及びｍｔ  ｔＲＮＡの組み合わせ
本発明の非天然アミノ酸蛋白質合成系に用いることができるｍｔＷＲＳ及びｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐとしては、同一の生物種由来のものを用いることが好ましい。
（Ａ）ｍｔＷＲＳとしては、ミトコンドリア由来のトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素であれば、種々のものを利用することができるが、好適には、以下のものを挙げることができる。
（１）配列番号２からなるサッカロマイセス  セレビシエ由来のミトコンドリアトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素。
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列の一部で少なくともＮ末から位置番号２３７までの配列で表されるポリペプチドであって、ミトコンドリアトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素活性を有するポリペプチドを包含する。
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１又は数個、例えば、１〜５０個、好適には１〜３０個、更に好適には１〜１０個のアミノ酸が置換、付加、及び／又は欠失した配列であって、しかもＮ末から５アミノ酸はＩＳＴＶＱである、ミトコンドリアトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素活性を有するポリペプチドを含有する。
（４）Ｎ末から５アミノ酸はＩＳＴＶＱであって、配列番号２の配列に７５％以上、好適には、８５％以上、更に好適には、９５％以上の同一性を有し、ミトコンドリアトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素活性を有するポリペプチド。
（５）シグナルペプチドを含めた配列番号１に示されるポリペプチドにおいて、３８位フェニルアラニン及び／又は  １９３位バリンを、アラニン又はグリシンに置換したポリペプチド。
（Ｂ）ｍｔ＿ＲＮＡとしては、ミトコンドリア由来のサプレッサーｔＲＮＡ、又はｔＲＮＡｔｒｐであれば、種々のものを利用することができるが、ｍｔＷＲＳとして酵母由来のものを用いる場合は、ｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐも酵母由来のものを用いることが望ましい。ｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐ遺伝子としては、
ＡＡＧＧＡＴＡＴＡＧＴＴＴＡＡＴＧＧＴＡＡＡＡＣＡＧＴＴＧＡＴＴＴＣＡＡＡＴＣＡＡＴＣＡＴＴＡＧＧＡＧＴＴＣＧＡＡＴＣＴＣＴＴＴＡＴＣＣＴＴＧＣＣＡを用いることができる。更に、下記実施例に説明する酵母細胞質ｔＲＮＡＴｒｐの変異体の調製に準じて、アンチコドン部位を野生型からアンバー型（ＣＴＡ）、オーカー型（ＴＣＡ）およびオパール型（ＴＴＡ）（いずれもＤＮＡ表記）、好適には、オパール型に変異させることができる。
また、例えば、アクセプターステムやアンチコドンステム等に点突然変異を導入し、ｍｔＷＲＳ以外のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の認識を低下させることができる。点突然変異は、点突然変異導入用プライマーを調製し、ＰＣＲにより導入することができる。
４．アミノ酸アナログ
本件発明の非天然アミノ酸アナログとしては、次のアナログを挙げることができる。
一般式１
【化１】
2006054807.tif 000002
2006054807.tif 000003
なお、上記一般式１において、Ｒα、ＲαＮ及びＲ１は、炭素数が５以下の分岐のある又は分岐のないアルキル基、好適にはメチル基である。Ｒ５は、ＯＨ、ＯＭｅ、Ｍｅ又はＦ、Ｂｒ、Ｒ６は、Ｍｅ又はＦ、Ｒ７はＡｚａ又はＭｅである。
更に、
【化２】
2006054807.tif 000004
【化３】
2006054807.tif 000005
2006054807.tif 000006
を採用することもできる。
具体的には、ａｌｐｈａ−ｍｅｔｈｙｌ−ＤＬ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ，１−ｍｅｔｈｙｌ−ＤＬ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ，５−ｍｅｔｈｙｌ−ＤＬ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ，６−ｍｅｔｈｙｌ−ＤＬ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ，７−ｍｅｔｈｙｌ−ＤＬ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ，５−ｆｌｕｏｒｏ−ＤＬ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ，５−ｂｒｏｍｏ−ＤＬ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ６−ｆｌｕｏｒｏ−ＤＬ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ，Ｌ−ａｂｒｉｎｅ，ＤＬ−７−ａｚａｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ，Ｌ−ｋｙｎｕｒｅｎｉｎｅ，３−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＤＬ−ｋｙｎｕｒｅｎｉｎｅ，４−ｈｙｄｒｏｘｙｉｎｄｏｌｅ，５−ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｌ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ，５−ｍｅｔｈｏｘｙ−ＤＬ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ，ｂｒｏｍｏ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎを挙げることができる。
これらの、トリプトファンアナログを含む非天然アミノ酸含有蛋白質を製造することにより、天然蛋白質とは異なる吸光波長を有する非天然蛋白質、異なる蛍光波長を有する非天然蛋白質を調製ることができ、標的とする蛋白質を他の蛋白質と区別して、計測又は観察することができる。また５−ｂｒｏｍｏ−ＤＬ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎの場合は、Ｘ線結晶構造解析において好適に利用できる。
５．非天然アミノ酸含有蛋白質の製造
非天然アミノ酸含有蛋白質は、本発明者らによる先願（特開２００４−２６１１６０）の方法に準じて、上記した２．基礎となる蛋白質合成系において、上記３．ｍｔＷＲＳ及びｍｔ  ｔＲＮＡの組み合わせを用いて、４．アミノ酸アナログのアミノ酸アナログの存在下で、鋳型ｍＲＮＡ又は鋳型ＤＮＡを元に非天然アミノ酸（アミノ酸アナログ）を含有する非天然蛋白質を製造することができる。
好適には、トリプトファンアナログが天然のトリプトファンよりも合成系に多量に含まれる。また、ｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐ又はｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐ変異体の量は、蛋白質合成系に通常含まれる各ｔＲＮＡの量と同程度であることが好ましい。
ＩＩＩ．ｔＲＮＡの合成
本願発明には、ｔＲＮＡをコードするＤＮＡの５’側に付加配列を設けることにより５’側に付加配列に有するｔＲＮＡをコードするＤＮＡを調製し、該５’側に付加配列を有するｔＲＮＡをコードするＤＮＡを転写して、前駆体ｔＲＮＡを調製し、該前駆体ｔＲＮＡをＲＮａｓｅＰで処理して、ｔＲＮＡを得る方法が包含される。
５’側に付加する配列としては、１又は数個、例えば、１〜１００個、好適には１〜５０個、更に好適には１〜３０個の塩基からなる任意の配列であって、最初の塩基はＧを含有する。例えば、ｇｇｇａｇａｃｃａｃａａｃｇｇｔｔｔｃｃｃｔｃｔａｇａである。
前駆体ｔＲＮＡを処理するＲＮａｓｅＰとしては、Ｃ５蛋白質及びＭ１  ＲＮＡもしくはＭ１  ＲＮＡのみからなるＲＮａｓｅＰを用いることができる。
【実施例】  以下の実施例では、材料としては，次のものを用いた。
酵母ゲノムＤＮＡは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株（ＩＦＯ  １２３４）（財団法人発光研究所）からゲノムＤＮＡを調製した。使用した菌株は、大腸菌ＪＭ１０９株（Ｐｒｏｍｅｇａ）及び酵母ＩＮＶＳｃ１株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。又、使用したプラスミドは、ｐＵＣ１９（宝酒造）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びｐＹＣ２／ＣＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。無細胞蛋白質合成系としては、小麦胚芽抽出液（Ｓ１００画分は愛媛大学で調製したものを使用し、ｔＲＮＡｍｉｘと３Ｈ  Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎは愛媛大学  堀  弘幸  研究室で準備していただいたもの）を使用した。培地としては、ＬＢ培地（Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ）１０ｇ、Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ）５ｇ、及びＮａＣｌ（Ｗａｋｏ）１０ｇをｄＨ２Ｏで１Ｌとした。）を用いた。なお、プレート培地のときは上記の組成に１．５％（ｗ／ｖ）になるようにＡｇａｒ（Ｗａｋｏ）を加えた。さらにＬＢ−ａｍｐの場合はａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ（Ｂｉｏ−１０１  Ｉｎｃ．）を５０μｇ／ｍＬになるように加えたものである。
又、ＹＰＤ培地（Ｄｒｉｅｄ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ（Ｗａｋｏ）１０ｇ、Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ（Ｗａｋｏ）２０ｇ、及びＧｌｕｃｏｓｅ（Ｗａｋｏ）２０ｇを、ｄＨ２Ｏで１Ｌとした）を用いた。発現用培地としては、ＹＰＤ培地のＧｌｕｃｏｓｅを除き、Ｒｕｆｆｉｎｏｓｅ（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を２％、Ｇａｌａｃｔｏｓｅ（Ｗａｋｏ）を１％になるように加えたものを用いた。完全最小培地（選択培地：Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｏｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ（Ｄｉｆｃｏ）６．７ｇ、Ａｄｅｎｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ）０．１ｇ、各アミノ酸（Ａｒｇｉｎｉｎｅ、Ｃｙｓｔｅｉｎ、Ｌｅｕｃｉｎｅ、Ｌｙｓｉｎｅ、Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ、Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ、Ａｓｐａｒｔａｔｅ、Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ、Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ、Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ、Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ、Ｐｒｏｌｉｎｅ、Ｓｅｒｉｎｅ、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ、Ｖａｌｉｎｅ）それぞれ、０．１ｇ、及びＧｌｕｃｏｓｅ２０ｇを、ｄＨ２Ｏで１Ｌとした。）を用いた。
ＰＣＲには、ＴａＫａＲａ  ＴａｑＴＭ（宝酒造）、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を用いた。
ＤＮＡ精製には、ＥＡＳＹＴＲＡＰＴＭ（宝酒造）を用いた。Ｌｉｇａｔｉｏｎには、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｐａｃｋ（ニッポンジーン）を用いた。蛋白質精製には、Ｎｉ−ＮＴＡ  ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（ＱＩＡＧＥＮ）及びＭａｇｎｅＨｉｓＴＭＮｉ−Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いた。その他試薬などとしては、蛋白質マーカー（第一化学薬品工業）、Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ−２０Ｔ（日本生化学工業）、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＰＯＬＹＥＴＨＹＬＥＮＥ  ＧＬＹＣＯＬ３４００（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）、１４Ｃ  ｌａｂｅｌｅｄ  Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ（Ｍｏｒａｖｅｋ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）を用い、その他の試薬はＷａｋｏ社製のものを用いた。
Ｉ．ミトコンドリアトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素の調製
［実施例１］
ｍｔＷＲＳのクローニング
１：大腸菌Ｊ１０９株コンピテントセルの調製
大腸菌ＪＭ１０９株の１コロニーを爪楊枝でつつき、アルミキャップ付き試験管の２ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃で一晩培養した。１００ｍＬのＬＢ培地に菌体培養液を１ｍＬ加え、濁度（Ａ６００）を３０ｍｉｎごとに測定し、濁度が０．３〜０．４になったところで培養液を５０ｍＬのファルコンチューブに移し、氷上で１５ｍｉｎ放置し、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ａｖａｎｔｉ−Ｊ２５ｉｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅで６，５００ｒｐｍ×１５ｍｉｎ遠心分離して集菌した後、菌体に１×ＴＳＳを４ｍＬ加え氷上で丁寧に懸濁した。この懸濁液を１００μＬずつスクリューエッペンに小分けし使用した。コンピテントセルをすぐに使用しない場合は液体窒素で凍結して−８０℃で保存した。−８０℃で保存したコンピテントセルを使用する場合は氷上でゆっくりと解凍して使用した。なお、１×ＴＳＳは、２．５×ＬＢ培地を調製し、オートクレーブし、この溶液に２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ６０００を２５ｍＬ、１Ｍ  ＭｇＣｌ２を２．５ｍＬ、ＤＭＳＯを２．５ｍＬ無菌的に加えたものを用いた。
［実施例２］
ｐＵＣｍｔＷＲＳの調製
［実施例２−１］
ｍｔＷＲＳ遺伝子の増幅
酵母ゲノムＤＮＡよりミトコンドリアトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子（ｍｔＷＲＳ遺伝子）をＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）により増幅させた。ＰＣＲに用いたプライマーとしては、５’プライマーは、ｇｇｇｇｇｇａｔｃｃａａａａａａａｔｇｔｃｔａａｔａａｇｃａｇｇｃｇｇｔｔｃｔｇａａｇｔｔａａｔ、３’プライマーは、ｇｇｇｇａｃｃｇｇｔｃｔｃｇａｇｇａａｇｃｃｃａｔｔａｔｔｔｔａｔｇａａｔｇｔｃｇｇ、を用いた。ＰＣＲ反応時の組成と反応条件を以下に示す。ＰＣＲ反応液は、１０×ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μＬ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘ  ４μＬ、５’プライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ、３’プライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ、酵母ゲノムＤＮＡ  １μＬ、及びｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μＬ）０．５μＬ、をｄＨ２Ｏで５０μＬにして調製した。ＰＣＲ反応は、予備変性を９５℃で２分、変性を９５℃で１分、アニーリングを４５℃で３０秒、及び伸長を７２℃で１０分間のサイクルを３０サイクル行った。
ＰＣＲ産物は５Ｍ  ＮａＣｌ水溶液を溶液の１／２０量加え、エタノール沈殿を行った。沈殿を減圧乾燥し、ＤＮＡ断片を回収した。
回収したＤＮＡ断片を、１％アガロースゲル電気泳動を行い、ｍｔＷＲＳ遺伝子の増幅を確認した。その結果を図１に示す。なお、図１中でＭは：マーカー（上から１０、８、６、５、４、３．５、３、２．５、２、１．５、１．２、１．０３、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１ｋｂｐ）を示す。
１はＰＣＲ反応後のサンプルを表し，矢印は約１．１５ｋｂｐのｍｔＷＲＳ遺伝子を示している。
図１より、ｍｔＷＲＳ遺伝子の鎖長とほぼ同じところにバンドが検出されたのでｍｔＷＲＳ遺伝子の増幅が確認できた。
［実施例２−２］
次に回収したＤＮＡ断片をｐＵＣ１９ベクターに組み込むために、ｐＵＣ１９ベクターをＨｉｎｃＩＩで消化した。反応液の組成は以下の通りで、反応は３時間行った。消化反応液は、１０×Ｙ／ＴＡＮＧＯＴＭ  ｂｕｆｆｅｒ  ２μＬ、ｐＵＣ１９（０．０５μｇ／μＬ）２μＬ、及びＨｉｎｃＩＩ（１０Ｕ／μＬ）１μＬをｄＨ２Ｏで２０μＬにして調製した。
消化反応後の反応液に６×Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＬＳ）を１×になるように加え、１％アガロースゲルで１×ＴＡＥ  ｂｕｆｆｅｒを用いてＴＯＹＯＢＯ  Ｇｅｌ  Ｍａｔｅ２０００で電気泳動を３０ｍｉｎ行った。ゲルをエチジウムブロミド溶液に浸し、ＵＶ（３５５ｎｍ）下で観察し、該当するバンドをカミソリで切り出し、ゲル片をエッペンドルフチューブに移した。
ゲル片からのＤＮＡ抽出にはＥＡＳＹＴＲＡＰＴＭを用い、プロトコルに従い次の操作を行った。ゲル片の重量を量り、３倍量のＮａＩ溶液を加えて５５℃でゲル片を溶解させ、１５μＬのガラスパウダーを加えて、室温で５ｍｉｎ放置した。その後、ＩＷＡＫＩＣＥＮＴＲＩＦＵＧＥ、ＭＩＣＲＯ  ＣＦＭ−１００を使って、ｍａｘ  ｓｐｅｅｄで１０ｓｅｃ遠心し、上清を除いた後、洗浄用緩衝液（ｋｉｔ添付）をガラスパウダー量の５０倍量加えて、よく懸濁しガラスパウダーを洗浄した。この洗浄操作を２回行った後、沈殿しているガラスパウダーに３０μＬのｄＨ２Ｏを加え、５５℃で１０ｍｉｎ保温し、ＤＮＡを抽出した。その溶液をｍａｘ  ｓｐｅｅｄで２ｍｉｎ遠心し、ＤＮＡ溶液である上清を回収した。この操作を２回繰り返し、ＤＮＡ断片を精製した。これをエタノール沈殿し、減圧乾燥後、沈殿を３０μＬのｄＨ２Ｏで溶かした。なお、６×Ｌｏｄｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎは、ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）０．２５％、キシレンシアノール（ＸＣ）０．２５％、及びＧｌｙｃｅｒｏｌ  ３０％（ｗ／ｖ）を含有する。１×ＴＡＥ  Ｂｕｆｆｅｒは、Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ８．３）４０ｍＭ及びＥＤＴＡ  １ｍＭを含有する。
ゲル片から回収したＤＮＡ溶液とＰＣＲ産物を混合し、キャリアとして酵母ｔＲＮＡ  ｍｉｘｔｕｒｅを０．１Ａ２６０ｕｎｉｔ加え、エタノール沈殿を行った。沈殿は減圧乾燥し、以下のように反応液を調製し、ライゲーション反応を行った。反応はニッポンジーンのＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｐａｃｋを使用し、１６℃で２、３ｈｒ行った。なお、Ｌｉｇａｔｉｏｎ反応溶液は、１０×Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  ２μＬ、ＤＮＡ混合物として前記沈殿、ＢＳＡ（ｋｉｔに添付）２．５μＬ、及びＴ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ  ０．５μＬをｄＨ２Ｏで２０μＬにして調製した。
ライゲーション反応後の溶液をＪＭ１０９株コンピテントセル１００μＬに加え、氷上で５ｍｉｎ放置した。青白選別法を行うため、Ｘ−Ｇａｌを塗ったＬＢ−ａｍｐ培地のプレートに溶液を塗り広げ、３７℃で一晩放置した。白色で生えてきたコロニーをＭｉｎｉ−ｐｒｅｐ．法を行って、プラスミドＤＮＡを回収した。このプラスミドＤＮＡをｐＵＣｍｔＷＲＳと名付けた。
Ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ．法（アルカリ法）は以下の手順で行った。プラスミドＤＮＡの調製はアルカリ法により以下の操作手順で行った。プレートに生えてきたコロニーを爪楊枝でつつき、アルミキャップ付き試験管の２ｍＬのＬＢ−ａｍｐ（５０μｇ／ｍＬのａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）培地に植菌し、３７℃で一晩振とう培養した。エッペンドルフチューブに菌体培養液を１．５ｍＬ分注し、１０，０００ｒｐｍ×２ｍｉｎ遠心分離を行い、集菌した。培地をできるだけ取り除き、菌体を１００μＬのＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉに懸濁し、２００μＬのＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩを加え、チューブを上下して穏やかに撹拌した。つぎに１５０μＬのＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩＩを加え、さらに撹拌した後、１５０μＬのフェノール：クロロホルム（１：１）溶液を加え、十分に懸濁し、１２，０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ遠心した。上層を回収し、エタノール沈殿した。遠心分離して得られた沈殿は３０μＬのＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒに溶解させた。なお、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（ＴＥ−Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ）は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）２５ｍＭ、ＥＤＴＡ−Ｎａ（ｐＨ７．０）１０ｍＭ、及びＧｌｕｃｏｓｅ  ５０ｍＭを含有する。
また、ＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩは、ＮａＯＨ  ０．２Ｍ、及びＳＤＳ  １％であり、ＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩＩ（１００ｍＬ）は、５Ｍ酢酸カリウム  ６０ｍＬ、氷酢酸１１．５ｍＬ、及びｄＨ２Ｏ  ２８．５ｍＬからなる。ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒは、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１０ｍＭ、及びＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）１ｍＭ、を含有する。
（結果）
ｐＵＣ１９とのライゲーション後、ｍｔＷＲＳ遺伝子が組み込まれたかを確認した。
結果を図２に示す。ｐＵＣｍｔＷＲＳをＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩで消化した。これを１％アガロースゲル電気泳動した。
Ｍは、マーカー（上から１０、８、６、５、４、３．５、３、２．５、２、１．５、１．２、１．０３、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１ｋｂｐ）を示す。
１は、ｐＵＣｍｔＷＲＳの消化反応後のサンプルを示す。
矢印は１では上からｐＵＣ１９（約２．９ｋｂｐ）、ｍｔＷＲＳ（約１．１５ｋｂｐ）である。
ｐＵＣｍｔＷＲＳをＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化反応を行うとｐＵＣ１９  ｖｅｃｔｏｒの断片（約２．９ｋｂｐ）とｍｔＷＲＳの断片（約１．１５ｋｂｐ）が確認できるはずである。結果としてはバンドが予測と一致しているのでｐＵＣｍｔＷＲＳプラスミドが構築できたことが確認できた。
［実施例３］
ｐＹＣ２／ＣＴへのサブクローニング
実施例２−２で得られたｐＵＣｍｔＷＲＳの沈殿の状態のもの及びｐＹＣ２／ＣＴ  ｖｅｃｔｏｒを制限酵素ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化反応を行った。消化反応の方法は上記の方法と同じで、組成は以下に示す。消化反応液は、１０×Ｙ／ＴＡＮＧＯＴＭ  ｂｕｆｆｅｒ  ４μＬ、ｐＵＣｍｔＷＲＳ沈殿、ＢａｍＨＩ（１０Ｕ／μＬ）１μＬ、ＸｈｏＩ（１０Ｕ／μＬ）１μＬをｄＨ２Ｏで２０μＬとして調製した。
なお、１０×Ｙ／ＴＡＮＧＯＴＭ  ｂｕｆｆｅｒは、ｐＹＣ２／ＣＴ  １μｇ、ＢａｍＨＩ（１０Ｕ／μＬ）１μＬ、ＸｈｏＩ（１０Ｕ／μＬ）１μＬ、をｄＨ２Ｏで２０μＬとした。
アガロースゲルでＤＮＡ断片を精製するのは上記と同様の方法で行い。ただし、回収するＤＮＡを加えるエッペンドルフチューブは１つにし、エタノール沈殿を行った。沈殿をライゲーション反応を行い（組成は同じ）、同様の方法で大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセルに加えてｐＹＣ２ＷＲＳプラスミドを回収した。
（結果）
ｍｔＷＲＳ遺伝子のｐＹＣ２／ＣＴ  ｖｅｃｔｏｒへのサブクローニングの確認
ｍｔＷＲＳ遺伝子をｐＹＣ２／ＣＴ  ｖｅｃｔｏｒにサブクローニングしたものをＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化反応を行うとｐＹＣ２／ＣＴ  ｖｅｃｔｏｒの断片（約４．５  ｋｂｐ）とｍｔＷＲＳの断片（約１．１５ｋｂｐ）が確認できるはずである。そこで、ｐＹＣ２ＷＲＳのＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩでの消化し、１％アガロースゲルで電気泳動した。
結果を図３に示す。
Ｍは、マーカー（上から１０、８、６、５、４、３．５、３、２．５、２、１．５、１．２、１．０３、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１ｋｂｐ）を示す。
１は、ｐＹＣ２ＷＲＳの消化反応後のサンプルを示す。
矢印は１では上からｐＹＣ２／ＣＴ（約４．５ｋｂｐ）、ｍｔＷＲＳ（約１．１５ｋｂｐ）である。したがって、結果は予測したバンドが得られたのでｐＹＣ２／ＣＴ  ｖｅｃｔｏｒにｍｔＷＲＳ遺伝子がサブクローニングされ、ｐＹＣ２ＷＲＳプラスミドの構築が確認された。
［実施例４］
−−ｍｔＷＲＳの発現−−
（１）宿主株ＩＮＶＳｃ１の培養
形質転換を行うための宿主株ＩＮＶＳｃ１をＹＰＤ培地プレートでコロニーがある程度、生育するまで３０℃で培養した。コロニーを１０ｍＬのＹＰＤ培地を用いて３０℃で一晩、プレ培養した。そして、濁度が０．４  ＯＤ６００になるように５０ｍＬのＹＰＤ培地を調製し、３０℃で４ｈｒ培養したものを室温で３０００ｘｇ、５ｍｉｎで遠心し、集菌した。
（２）キャリアー本鎖ＤＮＡの調製、
まず、フラスコに０．１ｇの一本鎖ＤＮＡを入れ、１０ｍＬのＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ（滅菌済み）で完全に溶かし、４℃以上で一晩放置した。その後、平均７ｋｂｐになるようにアガロースゲルで確認しながら、超音波破砕機でＤＮＡの切断を行った。この溶液を２．５ｍＬずつ遠沈管に分けて、ＴＥ飽和フェノールを２．５ｍＬ加えて１００００ｘｇ、５ｍｉｎ、４℃で遠心し、上清を違う遠沈管に移して２．５ｍＬのＴＥ飽和フェノール：クロロホルム（１：１）を加えて１００００ｘｇ、５ｍｉｎ、４℃で遠心した。さらに、上清を違う遠沈管に移し、２．５ｍＬのクロロホルムを加えて、１００００ｘｇ、５ｍｉｎ、４℃で遠心し、上清を回収し、３Ｍ酢酸ナトリウムを１／１０量加え、冷エタノールを１２．５ｍＬ加えてエタノール沈殿を行った。減圧乾燥した沈殿を１０ｍＬのＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ（滅菌済み）を加えて、エッペンドルフチューブ小分けして−２０℃で保存した。
（３）リチウム法による形質転換
集菌した菌体を４０ｍＬのＴＥ  ｂｕｆｆｅｒで洗う。遠心し、集菌後、２ｍＬの１×ＬｉＡｃ／０．５×ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒで懸濁し、室温で１０ｍｉｎ放置した。この溶液１００μＬをスクリューエッペンドルフチューブに移し、１μｇのｐＹＣ２ＷＲＳと１００μｇのキャリア一本鎖ＤＮＡを加えてよくピペッティングを行い、７００μＬの１×ＬｉＡｃ／４０％  ＰＥＧ−３４００／１×ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒを加え、よく混ぜて３０℃で３０ｍｉｎ放置した。その後、８８μＬのＤＭＳＯを加えてよく混ぜ、４２℃で７ｍｉｎヒートショックを与える。微小遠心機で遠心し、上清を除去する。沈殿を１ｍＬのＴＥ  ｂｕｆｆｅｒで洗い、５０μＬのＴＥ  ｂｕｆｆｅｒで溶かして、完全最小培地（選択培地）プレートに塗り広げた。このプレートを３０℃でコロニーが生育するまで放置した。なお、１×ＬｉＡｃ／０．５×ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒは、Ｌｉｔｉｕｍ  Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７．５）１００ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）５ｍＭ、及びＥＤＴＡ  ０．５ｍＭを含有する。１×ＬｉＡｃ／４０％  ＰＥＧ−３４００／１×ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒは、Ｌｉｔｉｕｍ  Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７．５）１００ｍＭ、ＰＥＧ−３４００  ４０％、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１０ｍＭ、及びＥＤＴＡ  １ｍＭを含有する。
（４）ｍｔＷＲＳの発現
生育してきたコロニーを１Ｌの選択培地に植菌し、３０℃、２４ｈｒ、１８０ｒｐｍで振とう培養した。次にクリーンベンチ内で、オートクレーブで滅菌しておいた１Ｌ用遠沈管にプレ培養液を移し、ＨＩＴＡＣＨＩ社製ｈｉｍａｃ  ＣＲ２２Ｇで１，５００ｘｇ、５ｍｉｎで沈殿を回収し、２００ｍＬ程度のＹＰＤ培地で懸濁した。懸濁液の濁度（ＯＤ６００）を測定後、４Ｌの発現用培地に０．４  ＯＤ６００になるように懸濁液を加え、３０℃、２４ｈｒ、１８０ｒｐｍで振とう培養した。
培養液を１Ｌ用遠沈管でｈｉｍａｃ  ＣＲ２２Ｇで５，０００ｘｇ、３ｍｉｎで沈殿を回収し、沈殿量を測定した。菌体にＴＳＤ  ｂｕｆｆｅｒを０．５ｇ／ｍＬになるように加えて懸濁し、３０℃、９０ｒｐｍで３０ｍｉｎ放置した。この懸濁液を３，０００ｘｇ、５ｍｉｎで遠心した。沈殿を１．２Ｍ  Ｓｏｒｂｉｔｏｌで懸濁し、３，０００ｘｇ、５ｍｉｎで遠心した。これをＳＫＰ  ｂｕｆｆｅｒで０．１５ｇ／ｍＬになるように加え懸濁し、Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ  ２０Ｔを５ｍｇ／ｇになるように加えて３０℃、９０ｒｐｍで６０ｍｉｎ程度反応させ、スフェロプラストにした。その溶液を３，０００ｘｇ、５ｍｉｎ、４℃で遠心し、沈殿を再度１．２Ｍ  Ｓｏｒｂｉｔｏｌで懸濁しスフェロプラストを洗い、３，０００ｘｇ、５ｍｉｎ、４℃で遠心した。これを２回繰り返し、沈殿をＭＴＢＰ  ｂｕｆｆｅｒ  ０．１５ｇ／ｍＬになるように加え懸濁し、ｔｉｇｈｔ−ｆｉｔｔｉｎｇ  Ｄｏｕｎｃｅ  ｈｏｍｏｚｉｎｉｚｅｒで１０ストローク程度破砕した。破砕した溶液に等量のＭＴＢＰ  ｂｕｆｆｅｒを加えて、３，０００ｘｇ、５ｍｉｎ、４℃で遠心し上清を遠沈管に移して、１５，０００ｘｇ、１０ｍｉｎ、４℃で遠心した。この沈殿をＭＴＢＰ  ｂｕｆｆｅｒで懸濁し、３，０００ｘｇ、５ｍｉｎ、４℃で遠心し上清をさらに、１５，０００ｘｇ、１０ｍｉｎ、４℃で遠心した。ここで回収された沈殿がミトコンドリア画分である。
この沈殿量を測定し、沈殿と２倍量のＢｒｅａｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒで懸濁し、Ｂ．ＢＲＡＵＮ社製ＭＳＫ  Ｃｅｌｌ  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒのガラス瓶に移し、沈殿と同量のガラスビーズを加え、酵母菌体の破砕を４０００ｒｐｍ、１ｍｉｎで行った。破砕溶液をガラスビーズを吸わないようにピペットマンで遠沈管に移し、Ｂｅｃｋｍａｎ社製Ａｖａｎｔｉ  Ｊ２５Ｉで３０，０００ｘｇ、３０ｍｉｎ遠心して、Ｓ３０画分を回収した。
ｍｔＷＲＳの精製にはＨｉｓ−Ｔａｇに特異的につく、Ｎｉ−ＮＴＡ  ｓｕｐｅｒｆｌｏｗを使用した。まず、はじめにＢＩＯ−ＲＡＤ社製のＰｏｌｙ−Ｐｒｅｐ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｃｏｌｕｍｎｓに樹脂を２５０μＬロードし、５ｍＬのＢｒｅａｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで平衡化した。つぎに破砕溶液の上清をロードした。非特異的な吸着をなくすために５ｍＬ×２のＢｒｅａｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒと５ｍＬ×２のＷａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒで樹脂を洗った。最後に、Ｎｉ−ＮＴＡ  ｓｕｐｅｒｆｌｏｗに吸着したｍｔＷＲＳを外すために、１ｍＬ×５のＥｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒで溶出した。Ｅｌｕｔｉｏｎは濃縮して保存用ｂｕｆｆｅｒで透析を行った。
なお、ＴＳＤ  ｂｕｆｆｅｒは、Ｔｒｉｓ−ＳＯ４（ｐＨ９．４）０．１Ｍ、及びＤＴＴ  １０ｍＭを含有する。ＳＫＰ  ｂｕｆｆｅｒは、Ｓｏｒｂｉｔｏｌ  １．２Ｍ、及びＫＰｉ  ２０ｍＭを含有する。ＭＴＢＰ  ｂｕｆｆｅｒは、Ｍａｎｎｉｔｏｌ  ０．６Ｍ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）１０ｍＭ、ＢＳＡ  ０．１％、及びＰＭＳＦ  １ｍＭを含有する。Ｂｒｅａｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒは、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １０ｍＭ、ＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌ  ｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）１ｍＭ、及びＧｌｙｃｅｒｏｌ  ５％を含有する。Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒは、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １０ｍＭ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５％、及びＩｍｉｄａｚｏｌ  １０ｍＭを含有する。Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒは、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １０ｍＭ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５％、及びＩｍｉｄａｚｏｌ  ２５０ｍＭを含有する。
保存用透析ｂｕｆｆｅｒは、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ、β−メルカプトエタノール６ｍＭ、ＫＣｌ  ４０ｍＭ、及びＧｌｙｃｅｒｏｌ  ５０％を含有する。
蛋白質の純度検定および分子量分析にはＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた。サンプルと同量のＳａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒを混合し、９５℃で２ｍｉｎ加熱した。ＳＤＳ−Ｂｕｆｆｅｒを用いて、濃縮ゲルを抜けるまでは２０ｍＡで泳動し、分離ゲルに入ったら４０ｍＡに上げた。泳動後はＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ（ＣＢＢ）Ｒ−２５０染色液で染色し、ＣＢＢ脱色液でバンドが確認できるまで脱色した。分離ゲルは、１．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）２ｍＬ、４０％アクリルアミド溶液（アクリルアミド：ｂｉｓ＝１９：１）２ｍＬ、及び１０％ＳＤＳ  ８０μＬをｄＨ２Ｏで８ｍＬに調製した。濃縮ゲルは、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）１ｍＬ、４０％アクリルアミド溶液（アクリルアミド：ｂｉｓ＝１９：１）０．４ｍＬ、及び１０％ＳＤＳ  ４０μＬをｄＨ２Ｏで４ｍＬに調製した。ＳＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒは、Ｔｒｉ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）０．３ｍＭ、β−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ  ０．７Ｍ、ＢＰＢ  ０．００１３％（ｗ／ｖ）、ＳＤＳ  ２％（ｗ／ｖ）、及びＧｌｙｃｅｒｏｌ  １０％（ｗ／ｖ）を含有する。ＣＢＢ脱染液は、エタノール２５％、酢酸１０％を含有する。ＣＢＢ染色液は、ＣＢＢ−Ｒ  ０．２５％、エタノール２５％、酢酸１０％を含有する。
（結果）
ｍｔＷＲＳ遺伝子の挿入が確認されたｐＹＣ２ＷＲＳを用いて、ｍｔＷＲＳの発現を行った。発現確認のため少量のＳ３０画分をＭａｇｎｅＨｉｓＴＭＮｉ−Ｐａｒｔｉｃｌｅｓを用いて精製したものを１０％アクリルアミドゲルを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで行った。結果は図４示す。ＭａｇｎｅＨｉｓＴＭＮｉ−Ｐａｒｔｉｃｌｅｓは非特異的なものがつきにくくＥｌｕｔｉｏｎに見られるバンドが一つであることから、ｍｔＷＲＳが発現されていることがわかる。なお，図４中で，Ｍは蛋白質マーカー（上から分子量９７、６６、４２、３０Ｋ）であり、レーン１は素通り、レーン２はＷａｓｈ、レーン３は、Ｅｌｕｔｉｏｎ（ｍｔＷＲＳ）を示す。矢印は分子量が約４１Ｋを示す。
ＩＩ．ｔＲＮＡの調製
［実施例５］
Ｃ５蛋白質の調製
Ｃ５蛋白質遺伝子（ｒｎｐＡ）は大腸菌ＪＭ１０９株のゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。ＮｄｅＩとＸｈｏＩサイトを付加するために、使用したプライマーはそれぞれ５’−ＧＧＧ  ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＴＡＴ  ＧＧＴ  ＴＡＡ  ＧＣＴ  ＣＧＣ  ＡＴＴ  ＴＣＣ  ＣＡＧ−３’と５’−ＧＧＧ  ＧＣＴ  ＣＧＡ  ＧＣＣ  ＴＧＧ  ＧＣＧ  ＣＴＣ  ＧＧＴ  ＣＣＧ  ＣＴＧ−３’（下線部がＮｄｅＩとＸｈｏＩサイト）である。ＰＣＲしたフラグメントはｐＥＴ２１ａにクローニングした。ｐＥＴＣ５をトランスフォーメーションした大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株は１リットルのＬＢ培地でＯＤ６００が０．５−０．８になるまで培養し、０．５ｍＭのＩＰＴＧによって発現誘導した。４時間保温した後、発現菌体は集菌、冷凍した。冷凍された菌体は５０ｍＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），５ｍＭ  ＥＤＴＡ，１０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  １Ｍ  ＮａＣｌ溶液で懸濁し、超音波破砕機（バイオラプター、トウショウデンキジャパン）で破砕した。３０，０００ｘｇで３０分遠心した後、上清は５０％の飽和硫酸アンモニウム沈殿処理を行った。１７，０００ｘｇで１５分遠心した後、上清は８０％の飽和硫酸アンモニウム沈殿処理を行った。１７，０００ｘｇで１５分遠心して回収した沈殿は、バッファーＡ（５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．５），５ｍＭ  ＥＤＴＡ，及び０．２５Ｍ  ＮａＣｌ）に溶解し、その溶液をさらにバッファーＡに対して透析した。透析した蛋白質溶液は、１０ｍｌのＳＰセファロースカラム（アマシャム）を用いて精製を行った。流速２ｍｌ／ｍｉｎでＮａＣｌの直線濃度勾配（０．２５−１．０Ｍ，トータル２００ｍＬ）で溶出操作を行った。Ｃ５蛋白質を含むフラクションを回収、アミコンウルトラで濃縮、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，４０ｍＭ  ＫＣｌ，６ｍＭ  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ及び５０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌに対して一晩透析し、−３０℃で保存した。
（結果）
Ｃ５蛋白質遺伝子の挿入が確認されたｐＥＴＣ５を用いて、Ｃ５蛋白質の発現を行った。発現確認のため少量のＳ３０画分をＮｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅを用いて精製したものを１５％アクリルアミドゲルを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで行った。結果は図５に示す。Ｅｌｕｔｉｏｎに見られるバンドが一つであることから、Ｃ５蛋白質が発現されていることがわかる。なお，図５中で，Ｍは蛋白質マーカー（下から分子量１４．３，１８．４Ｋ）であり、レーン１はＥｌｕｔｉｏｎ（Ｃ５蛋白質）、レーン２は、Ｗａｓｈ、レーン３は、Ｓ３０、レーン４は、素通りを示す。右側矢印は分子量が約１７Ｋを示す。
［実施例６］
Ｍ１  ＲＮＡの調製
Ｍ１  ＲＮＡのゲノム（ｒｎｐＢ）は、大腸菌ＪＭ１０９株のゲノムＤＮＡからＰＣＲで増幅した。プライマーは、ＥｃｏＲＩサイトとＴ７プロモーターを融合させるために５’−ＧＧＧ  ＧＧＡＡＴＴ  ＣＴＡ  ＡＴＡ  ＣＧＡ  ＣＴＣ  ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＧＡＣ  ＣＡＧ  ＡＣＡ  ＧＴＣ  ＧＣ−３’（下線部）そしてＢａｍＨＩを組み込むために５’−ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＡＴＣ  ＣＧＧ  ＡＴＧ  ＡＣＧ  ＴＡＡ  ＡＴＣ  ＡＧＧ  ＴＧＡ  ＡＡＣ  ＴＧ−３’を用いた。ＰＣＲ後の断片はｐＵＣＭ１を作成するために、ｐＵＣ１９プラスミドにクローニングした。Ｍ１  ＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写のためのテンプレートは、Ｔ７プロモーター領域（５’−ＡＧＧ  ＴＧＡ  ＡＡＣ  ＴＧＡ  ＣＣＧ  ＡＴＡ  ＡＧ−３’）とハイブリダイズするＴ７プライマーとＭ１  ＲＮＡの３’末端領域と相補的なプライマー（５’−ＡＧＧ  ＴＧＡ  ＡＡＣ  ＴＧＡ  ＣＣＧ  ＡＴＡ  ＡＧ−３’）によって、ｐＵＣＭ１からＰＣＲ増幅で調製した。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写は、（Ｓａｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．ａｎｄ  Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，Ｏ．Ｃ．１９８８  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５  １０３３−１０３７）に従って行った。転写後、反応混合物は、１ｍｌのＱセファロースカラム（アマシャム）で精製した。０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速で、ＮａＣｌの直線グラジェント（０．４−１．０Ｍ，トータル２０ｍＬ）によって溶出操作を行った。Ｍ１  ＲＮＡは溶出液からエタノール沈殿によって回収した。
（結果）
Ｍ１  ＲＮＡ遺伝子の挿入が確認されたｐＵＣＭ１からＰＣＲ増幅を用いて鋳型の調製を行った。これを用いＭ１  ＲＮＡの転写調製を行った。確認を６％アクリルアミドゲルを用いて行った。結果は図６に示す。目的の長さに相当するバンドが確認できることからＭ１  ＲＮＡが効率よく調製できたことが確認できる。なお，図６中で，Ｍはマーカー（下からｃｌａｓｓ  １  ｔＲＮＡ，ｃｌａｓｓ  ２  ｔＲＮＡ，５Ｓ  ｒＲＮＡ）であり、レーン１は転写物を示す。右側矢印はＭ１  ＲＮＡ（３７７塩基）を示す。
［実施例７］
−−Ｃ５蛋白質及びＭ１  ＲＮＡの活性確認−−
酵素の活性を測定するために５’側に付加配列を有するｔＲＮＡＴｙｒ前駆体１５０ｐｍｏｌと、Ｃ５蛋白質３０ｐｍｏｌ及びＭ１  ＲＮＡ  ３０ｐｍｏｌを各々、又は混合して反応を行った、反応ｂｕｆｆｅｒは、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １０ｍＭ、及びＮＨ４Ｃｌ  １００ｍＭを含有する。反応液を７Ｍ尿素を含む変性ポリアクリルアミドゲルにより分離し、メチレンブルーにより核酸成分の染色を行った。
（結果）
ＲＮａｓｅＰの各成分を用い切断反応を行った。結果は図７に示す。Ｃ５蛋白質のみでは切断活性は確認できないが、Ｍ１  ＲＮＡのみでも切断活性が確認できた。Ｃ５蛋白質とＭ１  ＲＮＡが共存する場合切断効率はよいことが確認できる。なお，図７中で，レーン１は切断前、レーン２はＣ５蛋白質を加えた場合、レーン３はＭ１  ＲＮＡを加えた場合、レーン４は共に加えた場合を示す。右側矢印は上からＭ１  ＲＮＡ、付加配列を有するｔＲＮＡ、切断された機能あるｔＲＮＡ、付加部分を示す。
［実施例８］
−−ミトコンドリアｔＲＮＡＴｒｐおよび変異体の調製−−
（１）ｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐのクローニング
酵母ミトコンドリアｔＲＮＡＴｒｐ（ｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐ）をコードする遺伝子をＰＣＲ法により増幅させた。ＰＣＲは上記と同様の方法で行った。５’プライマーは、ｇｇｇｔｃｔａｇａａａｇｇａｔａｔａｇｔｔｔａを、３’プライマーは、ｇｇｇａａｇｃｔｔｃｃｔｇｇｃａａｇｇａｔａａａｇａを用いた。
ＰＣＲ産物を６％ポリアクリルアミドゲルで精製（精製方法も上記と同様）後、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩで消化して、同様に消化したｐＧＥＭＥＸ−１  ｖｅｃｔｏｒにライゲーションした。ｐＧＥＭＥＸ−１に組み込まれたものをｐＧＥＭｍｔＲＮＡと名付けた。
（２）ｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐの転写による調製
ｐＧＥＭｍｔＲＮＡを鋳型に転写法によりｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐを調製した。まず、（Ｋａｏ，Ｃ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｍ．ａｎｄ  Ｒｕｄｉｓｓｅｒ，Ｓ．１９９９  ＲＮＡ，５，１２６８−１２７２）に従い３’末端のＣＣＡでストップさせるためのプライマーを設計した。
３’プライマーは、ｔ（Ｇｍ）ｇｃａａｇｇａｔａａａｇａｇａｔｔ、５’プライマー（Ｔ７  ｐｒｉｍｅｒ）は、ｇｇｇｇｃｔｇｃａｇｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａを用いた。
これらのプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。反応の組成とプログラムは次のとおりである。ＰＣＲ反応液は、１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ２０μＬ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘ×１６μＬ、５’プライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ）２μＬ、３’プライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ）２μＬ、ｐＧＥＭｍｔＲＮＡ（Ｍｉｎｉ  ｐｒｅｐ後を２０００培希釈したもの）４μＬ、及びＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μＬ）１μＬをｄＨ２Ｏで５０μＬに調製した。ＰＣＲプログラムは、予備変性を９５℃で２ｍｉｎ、変性を９５℃で３０ｓｅｃ、アニーリングを５５℃で３０ｓｅｃ、及び伸長を７２℃で３０ｓｅｃからなるサイクルを３０サイクルとした。
ＰＣＲ反応後の溶液を５μＬとり、１μＬのＬＳを加えて、３％ＧＴＧアガロースゲルで増幅を確認した。残りの１９５μＬは同量のフェノール：クロロホルム（１：１）溶液を加え、１５，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ遠心し、上清を別のエッペンドルフチューブにとり、１／２０量の５Ｍ  ＮａＣｌ溶液を加えて、エタノール沈殿を行った。沈殿は減圧乾燥し、転写反応に用いた。なお、上記反応液組成は、１０×転写ｂｕｆｆｅｒ５０μＬ、２５ｍＭ  ＮＴＰ  ｍｉｘ４０μＬ、１Ｍ  ＭｇＣｌ２１０μＬ、ＰＣＲ産物  沈殿、及びＴ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ２μＬをｄＨ２Ｏで５００μＬに調製した。また、１０×転写ｂｕｆｆｅｒは、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）４００ｍＭ、スペルミジン１０ｍＭ、ＤＴＴ  ５０ｍＭ、及びＢＳＡ  ５００μｇ／ｍＬを含有する。
ここで得られたｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐには余分な配列を持っているので活性型のｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐを得るにはＲＮａｓｅＰで余分な配列を切らなければならない。ＲＮａｓｅＰは活性中心であるＭ１  ＲＮＡとＣ５蛋白質からなる酵素であり、上記実施例５及び６に従い調製したものを使用した。Ｍ１  ＲＮＡとＣ５蛋白質を２５０ｐｍｏｌずつ各々加え、３７℃で１ｈｒ反応させた。これを１５％アクリルアミドＵｒｅａゲルで確認して、精製は２ｍｍの厚さのゲル板を使い、ゲルエリューション法を用いた。まず、１５％アクリルアミドＵｒｅａゲルに全量をロードして、泳動を行った。ＵＶ（３５５ｎｍ）下でゲルを切り出し、１５ｍＬのファルコンチューブに移し、４ｍＬのゲルエリューションｂｕｆｆｅｒを加え、３７℃で一晩振とうした。次の日に溶液を回収し、エタノール沈殿を行った。ゲル片には２ｍＬのゲルエリューションｂｕｆｆｅｒを加えて、３０ｍｉｎ程度振とうさせてから溶液を混ぜて、エタノール沈殿を行った。この沈殿を１ｍＬ程度のｄＨ２Ｏに溶かしてろ過エッペンでゲル片を除いて、エッペンドルフチューブに移して、もう一度エタノール沈殿を行って、ｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐを回収した。これを１００μＬのｄＨ２Ｏを加えて溶かし、濃度を測定した。
１５％アクリルアミドＵｒｅａ溶液（１×ＴＢＥになるように調製する）は、Ｕｒｅａ  ７Ｍ、アクリルアミド１４．２５％、及びＮ，Ｎ’メチレンビスアクリルアミド０．７５％を含有する。
ゲルエリューションｂｕｆｆｅｒは、ＮＨ４ＣＯＣＨ３  ０．１Ｍ、ＳＤＳ  ０．１％、及びＥＤＴＡ  １ｍＭを含有する。
（結果）
転写反応後、ＲＮａｓｅＰによる切断反応を行った。結果は図８に示す。レーン２に示すように目的物の回収が確認できる。なお，図８中で，Ｍはマーカー（左矢印下からｃｌａｓｓ１  ｔＲＮＡ，ｃｌａｓｓ２  ｔＲＮＡ，５Ｓ  ｒＲＮＡ）であり、レーン１はＲＮａｓｅＰ未処理、レーン２はＲＮａｓｅＰ処理物を示す。右側上矢印はＲＮａｓｅＰによる切断が起きなかったものを示し、右側下矢印は切断が起きた活性を有するｔＲＮＡを示す。
［実施例９］
−−酵母細胞質ｔＲＮＡＴｒｐおよび変異体の調製−−
（１）ｃｙｔ  ｔＲＮＡＴｒｐおよびアンチコドン変異体のクローニング
酵母細胞質ｔＲＮＡＴｒｐ（ｃｙｔ  ｔＲＮＡＴｒｐ）をコードする遺伝子をＰＣＲ法により増幅させた。ＰＣＲは上記と同様の方法で行った。５’プライマーは、ｇｇｇｔｃｔａｇａｇａａｇｃｇｇｔｇｇｃｔｃｔを、３’プライマーは、ｇｇｇａａｇｃｔｔｃｃｔｇｇｔｇａａａｃｇｇａｃａｇを用いた。
ＰＣＲ産物を６％ポリアクリルアミドゲルで精製（精製方法も上記と同様）後、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩで消化して、同様に消化したｐＧＥＭＥＸ−１  ｖｅｃｔｏｒにライゲーションした。ｐＧＥＭＥＸ−１に組み込まれたものをｐＧＥｃｙｔｔＲＮＡと名付けた。アンチコドン部位を野生型（ＣＣＡ）からアンバー型（ＣＴＡ）、オーカー型（ＴＣＡ）およびオパール型（ＴＴＡ）（いずれもＤＮＡ表記）に変異させたｐＧＥｃｙｔｔＲＮＡａｍｂｅｒ、ｐＧＥｃｙｔｔＲＮＡｏｃｈｒｅ、及びｐＧＥｃｙｔｔＲＮＡｏｐａｌを作成した。いずれも変異配列を持つプライマーとＰＣＲを利用したクイックチェンジ法により行った。
（２）ｃｙｔ  ｔＲＮＡＴｒｐの転写による調製
実施例８に示す方法と同様に鋳型を調製し転写反応を行った。その後ＲＮａｓｅＰによる処理を行い、目的物の回収を行った。
（結果）
酵母細胞質ｔＲＮＡＴｒｐ遺伝子およびその変異体遺伝子の挿入が確認されたｐＧＥｃｙｔｔＲＮＡ、ｐＧＥｃｙｔｔＲＮＡａｍｂｅｒ、ｐＧＥｃｙｔｔＲＮＡｏｃｈｒｅ、及びｐＧＥｃｙｔｔＲＮＡｏｐａｌからＰＣＲ増幅を用いて鋳型の調製を行い、さらに転写反応およびＲＮａｓｅＰ処理により調製を行った。確認を７Ｍ尿素を含む変性１０％ポリアクリルアミドゲルを用いて行った。結果は図９に示す。目的の長さに相当するバンドが確認できることから目的物が効率よく調製できたことが確認できる。なお、図９中で、Ｍはマーカー（右矢印  下からｃｌａｓｓ１  ｔＲＮＡ，ｃｌａｓｓ２  ｔＲＮＡ，５Ｓ  ｒＲＮＡ）であり、レーン１は野生型細胞質ｔＲＮＡＴｒｐ、２はアンチコドン部位アンバー型変異ｔＲＮＡＴｒｐ、３はアンチコドン部位オーカー型変異ｔＲＮＡＴｒｐ、４はアンチコドン部位オパール型変異ｔＲＮＡＴｒｐ、を示す。左側上矢印はＲＮａｓｅＰによる切断が起きなかったものを示し、左側下矢印は切断が起きた活性を有するｔＲＮＡを示す。
この結果より、転写法とＲＮａｓｅＰを利用したｔＲＮＡおよびその変異体が容易に調製できることが確認できた。
［実施例１０］
−−ｔＲＮＡＴｙｒの調製−−
ｐＧＥＭＥＸ  プラスミドｐＧＥＭＥＸ−ｙＴｙｒは以下のように調製した。相補領域を含む二つのオリゴヌクレオチド、５’−ＧＧＧ  ＧＴＣ  ＴＡＧ  ＡＣＴ  ＣＴＣ  ＧＧＴ  ＡＧＣ  ＣＡＡ  ＧＴＴ  ＧＧＴ  ＴＴＡ  ＡＧＧ  ＣＧＣ  ＡＡＧ  ＡＣＴ  ＧＴＡ  ＡＡＴ  ＣＴＴ  ＧＡＧ  ＡＴＣ  ＧＧＧ  Ｃ−３’および、５’−ＧＧＧ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＴＧＧ  ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＧＧＧ  ＧＧＣ  ＧＡＧ  ＴＣＧ  ＡＡＣ  ＧＣＣ  ＣＧＡ  ＴＣＴ  ＣＡＡ  ＧＡＴ  ＴＴ−３’を３７℃で１時間アニーリングし、クレノウフラグメント（タカラ社）により、二本鎖とした。合成アンバーサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子はＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩによって消化し、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ）のＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩサイトにライゲーションした。配列確認はジデオキシシークエンス法で行った。
ｔＲＮＡの転写およびｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセシング
酵母ｔＲＮＡＴｙｒの５’末端にはピリミジン環が存在するので、（Ｓａｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．ａｎｄ  Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，Ｏ．Ｃ．１９８８  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，１０３３−１０３７）に従ったＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによる転写法が利用できない。そこで、ｔＲＮＡの５’領域に２７ヌクレオチド伸長された前躯体（ｐｒｅ−ｔＲＮＡ）として、酵母から一連の変異ｔＲＮＡを転写し、その後、Ｍ１  ＲＮＡとＣ５蛋白質から成るＲＮａｓｅＰによってプロセシングした。ｐｒｅ−ｔＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のテンプレートは、Ｔ７プライマーおよび酵母ｔＲＮＡＴｙｒの３’末端領域と相補的で、転写伸長から免れるために２番目のヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルグアノシンであるプライマー（５’−Ｔ（Ｇｍ）Ｇ  ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＧＧＧ  ＧＧＣ  ＧＡＧ  Ｔ−３’）を用いて、ｐＧＥＭＥＸ−１中にそれぞれのゲノムがクローニングされた適切なプラスミドから、ＰＣＲ増幅によって、調製した（Ｋａｏ，Ｃ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｍ．ａｎｄ  Ｒｕｄｉｓｓｅｒ，Ｓ．１９９９  ＲＮＡ，５，１２６８−１２７２）。ｐｒｅ−ｔＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写は基本的に（Ｓａｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．ａｎｄ  Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，Ｏ．Ｃ．１９８８  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，１０３３−１０３７）に従って行った。転写のために２時間インキュベートした後、１ｍｌの反応当たり２５０ｐｍｏｌのＭ１  ＲＮＡとＣ５蛋白質を加え、反応混合物は４２℃で１時間以上インキュベートした。完全ｔＲＮＡ転写物は７Ｍ尿素含有１０％ＰＡＧＥで精製した。
（結果）
転写反応後、ＲＮａｓｅＰによる切断反応を行った。結果は図１０に示す。レーン２に示すように目的物の回収が確認できる。なお，図１０中で，Ｍはマーカー（左矢印下からｃｌａｓｓ１  ｔＲＮＡ，ｃｌａｓｓ２  ｔＲＮＡ，５Ｓ  ｒＲＮＡ）であり、レーン１はＲＮａｓｅＰ未処理、レーン２はＲＮａｓｅＰ処理物を示す。右側上矢印はＲＮａｓｅＰによる切断が起きなかったものを示し、右側中矢印は切断が起きた活性を有するｔＲＮＡを示す。右側下矢印は切断された付加配列に相当する。
ＩＩＩ．ＭｔＷＲＳの解析
［実施例１１］
−−ｍｔＷＲＳの解析−−
アミノアシル化活性の測定
酵素の活性を測定するために１４Ｃトリプトファンを使ってアミノアシル化反応を行った。下記の反応組成で酵素を除いた状態で反応液を３０℃で５ｍｉｎ程度保温した後、酵素を加え３０℃でインキュベートし、０、１、４、９、１６ｍｉｎの各時間で５％ＴＣＡを湿らせておいた濾紙にスポットし、５％ＴＣＡに浸した。各時間の反応液をスポットし終わったら、５％ＴＣＡをいったん捨て、新たな５％ＴＣＡをビーカーに加え１０ｍｉｎ間振とうした。これを２回繰り返したら１００％エタノールを加えて軽く振とうし、電熱灯下で乾燥させた。その後、シンチレーターに浸し、液体シンチレーションカウンターでカウントを測定した。
アミノアシル化反応液組成は、５×ＡＡＭ（Ａｍｉｎｏ  Ａｃｙｌａｔｉｏｎ  Ｍｉｘｔｕｒｅ）１０μＬ、ｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐ  ０．０５Ａ２６０ｕｎｉｔ、酵素（加える量は濃度による）適量、１４Ｃトリプトファン２μＬをｄＨ２Ｏで５０μＬに調製した。
５×ＡＡＭ（Ａｍｉｎｏ  Ａｃｙｌａｔｉｏｎ  Ｍｉｘｔｕｒｅ）は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）５００ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ５０ｍＭ、ＫＣｌ  ２００ｍＭ、及びＡＴＰ  ２０ｍＭを含有した。
シンチレーターは、Ｄｏｔｉｔｅ  ＤＰＯ  ４ｇ、Ｄｏｔｉｔｅ  ＰＯＰＯＰ  ０．１ｇをトルエンで１Ｌに調製した。
（結果）
ｍｔＷＲＳとｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐを用いてｔＲＮＡの１４Ｃ−トリプトファン受容能を確認した。その結果を図１１に示す。なお、計算式を以下に示す。
１４Ｃ  トリプトファンの放射能が４８ｍＣｉ／ｍｍｏｌで１ｍＣｉ＝３７ＭＢｑより
３７ＭＢｑ×４８ｍＣｉ／ｍｍｏｌ＝１７７６ＭＢｑ／ｍｍｏｌ＝１．８ＧＢｑ／ｍｍｏｌ
１ｄｐｍ＝６０ｄｐｓ、１Ｂｑ＝１ｄｐｓにより
１．８ＧＢｑ／ｍｍｏｌ＝１．８Ｂｑ／ｐｍｏｌ＝１．８ｄｐｓ／ｐｍｏｌ×６０ｓｅｃ＝１０８ｄｐｍ／ｐｍｏｌ
濾紙にスポットする量が５０μＬ中９μＬなので１スポットでのｔＲＮＡ量は
０．０５×９／５０＝０．００９  Ａ２６０ｕｎｉｔであるから、よって
受容能（ｐｍｏｌ／Ａ２６０ｕｎｉｔ）＝測定値／（１０８×０．００９）
加える酵素濃度が少し濃かったがトリプトファンの受容が見られたことにより、発現したものはｍｔＷＲＳだと確定できた。さらに、酵素、ｔＲＮＡのどちらか一方が欠けた場合も受容が見られないので２つをくわえたときのみ受容されることがわかる。
［実施例１２］
ｍｔＷＲＳのシグナルペプチド切断部位の同定
ペプチドシーケンスのためのサンプルを調製した。方法は以下に示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの分離ゲルと濃縮ゲルを作り、陽極側電極液と陰極側電極液を使って電気泳動を行った。濃縮ゲルを切り取り、Ｅ．Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  Ｃに５ｍｉｎ浸し、ろ紙をゲルに合わせて切り、それぞれのｂｕｆｆｅｒに浸しておいた。ＰＶＤＦメンブレンをメタノールに浸してからＥ．Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  Ｃに５ｍｉｎ浸した。図１２のように並べ、１ｍＡ／ｃｍ２（ｃ．ｃ．）で９０ｍｉｎ間電流を流した。エレクトロブロッティング後、ＰＶＤＦメンブレンをｄＨ２Ｏで洗い、ポンソーＳで染色した。脱色液（１％  ＡｃＯＨ）で脱色した後、ｄＨ２Ｏで洗いバンドを切り取り、エッペンドルフチューブに入れ、ペプチドシーケンスを行うときまで４℃で保存した。
陽極電極液は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．９）２４．２ｇをｄＨ２Ｏで１００ｍＬに調製した。
陰極電極液は、Ｔｒｉｓ  １２．１ｇ、Ｔｒｉｃｉｎｅ  １７．９ｇ、及びＳＤＳ  １．０ｇを、ｄＨ２Ｏで１Ｌに調製した。Ｅ．Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  Ａは、Ｔｒｉｓ  ３６．３ｇ、１０％  ＳＤＳ  ５ｍＬ及びＭｅｔｈａｎｏｌ  ２００ｍＬをｄＨ２Ｏで１Ｌに調製した。２×Ｅ．Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  Ｂは、Ｔｒｉｓ  ３ｇ、１０％  ＳＤＳ  ５ｍＬ、及びＭｅｔｈａｎｏｌ  ２００ｍＬをｄＨ２Ｏで５００ｍＬに調製した。Ｅ．Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  Ｃは、２×Ｅ．Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ  ５００ｍＬ、及び６−Ａｍｉｎｏ−Ｎ−ｃａｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ  ５．２ｇをｄＨ２Ｏで１Ｌに調製した。
ペプチドシーケンスはＡＢＩ社製Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いて、Ｎ末の５残基を読んだ。
（結果）
シグナルペプチド切断部位の同定
シグナルペプチド切断部位を同定するためにペプチドシーケンサーを用いてＮ末端アミノ酸配列を調べた。その結果（ｔａｂｌｅ１）と同定された配列を以下に示す。
【表１】
2006054807.tif 000007
同定されたＮ末側５アミノ酸の配列：ＩＳＴＶＱ
［実施例１３］
小麦胚芽抽出液由来ＴｒｐＲＳ、ｔＲＮＡとの交差反応の確認
ｍｔＷＲＳとｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐのペアが小麦胚芽抽出液内で非天然アミノ酸を導入するためのペアとして使用が可能かをアミノアシル化による交差反応で検討した。
まず、次の方法で小麦胚芽からＳ１００画分を調製した。小麦胚芽１ｇをガーゼに包み、ビーカー内でＭｉｌｌｉＱで洗った。さらに超音波洗浄機で０．５％ノニデットＰ４０でよく洗った。つぎに、ｄＨ２Ｏに置換し、超音波洗浄を行った。洗浄した胚芽を濾紙にはさんで水気をとり、−８０℃に冷やしておいた乳鉢に入れ、液体窒素を加えながら粉砕した。粉砕した胚芽を別の乳鉢に移し、Ｂｕｆｆｅｒ  Ａを５ｍＬ加えペースト状にし、１００，０００ｘｇ、２ｈｒ、４℃で超遠心を行った。上清を回収し、Ｐｏｌｙ−Ｐｒｅｐ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｃｏｌｕｍｎｓにＤＥ５２樹脂を３ｍＬ充填したものにロードした。（脱核酸処理）Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂで溶出したものを透析Ｂｕｆｆｅｒで一晩透析した。これをＳ１００画分と呼ぶ。Ｂｕｆｆｅｒ  Ａは、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ５ｍＭ、ＤＴＴ  １ｍＭ、及びＫＣｌ  ５０ｍＭ、をｄＨ２Ｏで１００ｍＬに調製した。Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂは、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ５ｍＭ、ＤＴＴ  １ｍＭ、及びＫＣｌ  ３００ｍＭを、ｄＨ２Ｏで５０ｍＬに調製した。透析Ｂｕｆｆｅｒは、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ５ｍＭ、ＤＴＴ  １ｍＭ、ＫＣｌ  ５０ｍＭ、及びＧｌｙｃｅｒｏｌ  ５０％をｄＨ２Ｏで５００ｍＬに調製した。
このＳ１００画分と小麦ｔＲＮＡｍｉｘを用いて交差反応のアミノアシル化による確認を行った。アミノアシル化反応は次の組成で行った。小麦胚芽Ｓ１００と小麦ｔＲＮＡｍｉｘは、５×ＡＡＭ１０μＬ、Ｓ１００  １０μＬ、ｔＲＮＡｍｉｘ  ２Ａ２６０ｕｎｉｔ、及び３Ｈトリプトファン３μＬをｄＨ２Ｏで５０μＬに調製した。小麦胚芽Ｓ１００とｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐは、５×ＡＡＭ  １０μＬ、Ｓ１００  １０μＬ、ｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐ  ０．５Ａ２６０ｕｎｉｔ、及び３Ｈトリプトファン３μＬをｄＨ２Ｏで５０μＬに調製した。小麦胚芽Ｓ１００と小麦ｔＲＮＡｍｉｘは、５×ＡＡＭ  １０μＬは、ｍｔＷＲＳ  ０．５μｇ、ｔＲＮＡｍｉｘ  ２Ａ２６０ｕｎｉｔ、及び３Ｈトリプトファン３μＬをｄＨ２Ｏで５０μＬに調製した。ｍｔＷＲＳとｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐは、５×ＡＡＭ  １０μＬ、ｍｔＷＲＳ  ０．５μｇ、ｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐ  ０．５Ａ２６０ｕｎｉｔ、及び３Ｈトリプトファン３μＬをｄＨ２Ｏで５０μＬに調製した。
（結果）
小麦胚芽抽出液Ｓ１００画分（核酸抜き）と小麦ｔＲＮＡｍｉｘを用いて、ｍｔＷＲＳとｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐとの交差反応の確認を行った。その結果を図１３に示す。
なお、図１３中の、×はｍｔＷＲＳとｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐを、◆（傾いた四角）は、小麦Ｓ１００画分（核酸抜き）と小麦ｔＲＮＡｍｉｘを、■（四角）は、小麦Ｓ１００画分（核酸抜き）とｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐを、▲（三角）は、ｍｔＷＲＳと小麦ｔＲＮＡｍｉｘを表す。
この結果により、ｍｔＷＲＳとｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐのペアと小麦胚芽内のＷＲＳとｔＲＮＡのペアだけがアミノアシル化反応を起こすので、ｍｔＷＲＳとｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐのペアが小麦胚芽抽出液内で交差反応を起こさないことが分かった。
［実施例１４］  オパールコドンサプレッション
（１）ｐＥＵＤＨＦＲｏｐａｌの調製
市販のｐＥＵ−ＤＨＦＲ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて活性に関係ない部分として分かっている１２８位のチロシンをオパールストップコドンに変異させるため以下のようなプライマーを設計した。
プライマーＦ：Ｔ  ＴＴＣ  ＣＣＧ  ＧＡＴ  ＴＧＡ  ＧＡＧＣＣＧ  ＧＡＴ  Ｇ
プライマーＲ：Ｃ  ＡＴＣ  ＣＧＧ  ＣＴＣ  ＴＣＡ  ＡＴＣ  ＣＧＧＧ  ＡＡＡ
上記の２つのプライマーを用いてＰＣＲ法により小麦胚芽抽出液由来無細胞蛋白質合成系用のｐＥＵ−ＤＨＦＲの１２８位を以下の反応条件でＰＣＲによりオパールコドンに改変した。
反応液は、１０×ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ｂｕｆｆｅｒを５μＬ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘを４μＬ、プライマーＦ（１００ｐｍｏｌ／μＬ）を１μＬ、プライマーＲ（１００ｐｍｏｌ／μＬ）を１μＬ、ｐＥＵ−ＤＨＦＲ０．１μｇ、ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μＬ）を０．５μＬを含有し、ｄＨ２Ｏで５０μＬとしたものを用いた。ＰＣＲプログラムは、予備変性９５℃  ５ｍｉｎ、変性９５℃  １ｍｉｎ、アニーリング５０℃  ３０ｓｅｃ、及び伸長７２℃  １２ｍｉｎからなるサイクルを１８サイクルとした。
ＰＣＲ産物をエタノール沈殿し、１０μＬのｄＨ２Ｏに解かしてＸＬ１Ｂｌｕｅ株コンピテントセルに加えて形質転換を行い、ＬＢ−ａｍｐプレートに塗り広げ、一晩培養した。生えてきたコロニーをアルミキャップ付き試験管の２ｍＬのＬＢ−ａｍｐの液体培地に植菌し一晩培養した。
翌日、液体培地をエッペンに集菌し、アルカリ法によりプラスミドを回収した。これをＤＮＡシーケンス法により１２８位がＴＧＡに変わっていることを確認した。得られたプラスミドをｐＥＵＤＨＦＲｏｐａｌとした。
つぎに小麦胚芽抽出液由来無細胞蛋白質合成系で使用するために以下の反応条件でｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写法によりｍＲＮＡの調製を行なった。
（２）小麦胚芽抽出液由来無細胞蛋白質合成系を用いたオパールコドンサプレッションの検討
得られたｍＲＮＡを使用して小麦胚芽抽出液由来無細胞蛋白質合成系であるＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いたオパールコドンのサプレッションを行なった。
具体的には、反応液としては、以下の組成を用いた。
（ｉ）ＤＨＦＲ−ＷＴ（野生型ＤＨＦＲをコードするｍＲＮＡを用いたコントロール用の反応液）は、Ｂｕｆｆｅｒ＃１（キット添付）０．８５μＬ、Ｂｕｆｆｅｒ＃２（キット添付）１．５μＬ、Ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ（１０ｍｇ／ｍＬ）０．５μＬ、１４Ｃ  Ｌｅｕｃｉｎｅ  ０．５μＬ、ｍＲＮＡ（ＷＴ）３μｇ、ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／μＬ）０．２５μＬ，及びＷｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ｅｘｔｒａｃｔ  ２．５μＬ，をｄＨ２Ｏで１２．５μＬにして調製した。
（ｉｉ）ＤＨＦＲｏｐａｌ＋ｍｔＷＲＳ（上記したｏｐａｌ変異を導入したＤＨＦＲをコードするｍＲＮＡにｍｔＷＲＳを添加した反応用の反応液）は、Ｂｕｆｆｅｒ＃１  ０．８５μＬ、Ｂｕｆｆｅｒ＃２  １．５μＬ、Ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ（１０ｍｇ／ｍＬ）０．５μＬ、１４Ｃ  Ｌｅｕｃｉｎｅ  ０．５μＬ、ｍＲＮＡ（ＷＴ）３μｇ、ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、Ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ｅｘｔｒａｃｔ  ２．５μＬ、及びｍｔＷＲＳ  １．２μｇをｄＨ２Ｏで１２．５μＬに調製した。
（ｉｉｉ）ＤＨＦＲｏｐａｌ＋ｍｔＷＲＳ＋ｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐ（上記したｏｐａｌ変異を導入したＤＨＦＲをコードするｍＲＮＡにｍｔＷＲＳ及びｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐを添加した反応用の反応液）は、Ｂｕｆｆｅｒ＃１（キット添付）０．８５μＬ、Ｂｕｆｆｅｒ＃２（キット添付）１．５μＬ、Ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ（１０ｍｇ／ｍＬ）０．５μＬ、１４Ｃ  Ｌｅｕｃｉｎｅ  ０．５μＬ、ｍＲＮＡ（ＷＴ）３μｇ、ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、Ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ｅｘｔｒａｃｔ  ２．５μＬ、ｍｔＷＲＳ  １．２μｇ、及びｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐ０．０５Ａ２６０ｕｎｉｔをｄＨ２Ｏで１２．５μＬとして調製した。
上記の反応液で蛋白質合成を２８℃で２時間行なった。反応液に１００μＬのアセトンを加えて、−３０℃で５分間放置し、１５，０００ｒｐｍで１０分遠心した。これを２回繰り返したあと乾燥させた。これを２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ない、泳動後にフィルムとろ紙で挟みゲルを乾燥した後、イメージングプレートで検出した。
（結果）
結果は、図１４に示した。通常ではＵＧＡで終結したペプチド断片のみが合成されるが、新規ｔＲＮＡ／ｍｔＷＲＳを加えることでＵＧＡをトリプトファンで、読み過ごした完全長のジヒドロ葉酸還元酵素が合成されることが図１４より分かる。
［実施例１５］酵母ミトコンドリア  トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素（ｍｔＷＲＳ）の改変
（１）ｍｔＷＲＳ変異体Ｆ３８Ａ遺伝子の作製
非天然アミノ酸をｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐに受容させるためにｍｔＷＲＳのアミノ酸特異性を改変させた。
始めに、結晶構造が報告されているＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＷＲＳを参考にｍｔＷＲＳと種々のＷＲＳのアミノ酸配列を比較し、トリプトファン結合部位を推測した。その中でトリプトファンのインドール環の固定に関与していると思われるｍｔＷＲＳの３８位のフェニルアラニン残基をアラニンまたはグリシンに変異させることにしプライマーＤＮＡを設計した。（図１５）
プライマー１：Ｔ  ＧＣＴ  ＡＣＧ  ＧＴＡ  ＧＳＣ  ＡＧＴ  ＡＴＧ  ＡＴＴ  Ｃ
プライマー２：Ｇ  ＡＡＴ  ＣＡＴ  ＡＣＴ  ＧＳＣ  ＴＡＣ  ＣＧＴ  ＡＧＣ  Ａ      Ｓ＝Ｇ  ｏｒ  Ｃ
上記の２つのプライマーを用いてＰＣＲ法によりｍｔＷＲＡ酵母発現用プラスミドｐＹＣｍｔＷＲＳの３８位を以下の反応液を用いて次のＰＣＲ条件でアラニンに改変した。反応液は、１０×ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μＬ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘ  ４μＬ、プライマー１（１００ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ、プライマー２（１００ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ、ｐＹＣｍｔＷＲＳ０．１μｇ、及びｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μＬ）０．５μＬをｄＨ２Ｏで５０μＬに調製した。
ＰＣＲプログラムは、予備変性を９５℃で５分間、変性を９５℃で１分間、アニーリングを５０℃で３０秒、及び伸長を７２℃で１２分間を行なうサイクルを１８サイクルとした。
ＰＣＲ産物をエタノール沈殿し、１０μＬのｄＨ２Ｏに解かしてＸＬ１Ｂｌｕｅ株コンピテントセルに加えて形質転換を行い、ＬＢ−ａｍｐプレートに塗り広げ、一晩培養した。生えてきたコロニーをアルミキャップ付き試験管の２ｍＬのＬＢ−ａｍｐの液体培地に植菌し一晩培養した。
翌日、液体培地をエッペンに集菌し、アルカリ法によりプラスミドを回収した。これをＤＮＡシーケンス法により３８位がアラニンに変異したことを確認し、得られたプラスミドをｐＹＣ３８Ａとした。
（２）Ｆ３８Ａの発現と精製
宿主株ＩＮＶＳｃ株をＹＰＤ培地プレートに画線培養し、３０℃でコロニーがある程度の大きさになるまで生育させた。そのコロニーを１０ｍＬのＹＰＤ培地を用いて３０℃で一晩培養した。翌日、この培養液に濁度が０．４０Ｄ６００になるようにＹＰＤ培地を加え、３０℃で４時間培養し、３，０００×ｇで５分遠心してファルコンチューブに集菌した。
次にこの菌体を４０ｍＬのＴＥバッファー（滅菌済み）で洗った。遠心で回収後、２ｍＬの１×ＬｉＡｃ／０．５×ＴＥバッファー（滅菌済み）で懸濁し、室温で１０分間放置した。この溶液をスクリューエッペンドルフチューブに１００μＬ移し、１μｇのｐＹＣ３８Ａと１００μｇのキャリアーＤＮＡを加えてよく懸濁した。その溶液に７００μＬの１×ＬｉＡｃ／４０％ＰＥＧ３４００を加えて、３０℃で３０分間放置した。つぎに、８８μＬのＤＭＳＯを加えて、４２℃で７分間ヒートショックを与えた。この溶液を遠心し、上清を除去し、沈殿を１ｍＬのＴＥバッファー（滅菌済み）で洗った。遠心後、適量のＴＥバッファー（滅菌済み）に懸濁し、選択培地プレートに塗り広げた。
生えてきたコロニーを１００ｍＬの選択培地（グルコース）に植菌して３０℃で一晩培養した。この培養液を１Ｌの選択培地（グルコース）に加えて３０℃で一晩培養した。この培養液を滅菌した遠沈管で集菌し、１Ｌの選択培地（ラフィノース）培地に懸濁し１時間３０℃で培養した。この培養液を１０ＬのＹＰＲ＋１％ガラクトース培地に移して２４時間発現培養した。
なお、ＹＰＤ培地及びＹＰＲ培地は、Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ１０ｇ、Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ  ２０ｇ、及びそれぞれグルコース又はラフィノース１０ｇをｄＨ２Ｏで１Ｌにして、調製した。また、ＴＥバッファーは、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び１ｍＭ  ＥＤＴＡを組成としている。
菌体を回収し、ＴＳＤバッファー（組成は、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＳＯ４（ｐＨ９．４）及び１０ｍＭ  ＤＴＴからなる。）を０．５ｇ／ｍＬになるように加えて懸濁し、３０℃で１０分放置した。この菌体を３，０００×ｇで５分遠心し、沈殿を１．２Ｍソルビトールで洗った。次に３，０００×ｇで５分遠心した菌体をＳＫＰバッファー（組成は、１．２Ｍソルビトール及び２０ｍＭ  ＫＰｉ（ｐＨ７．６）からなる。）を０．１５ｇ／ｍＬになるように加えて懸濁後、Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ２０Ｔ（生化学工業）が５ｍｇ／菌体ｇになるように加え３０℃で３時間程度反応させてスフェロプラストにした。この懸濁液を３，０００×ｇで５分遠心し、沈殿を１．２Ｍソルビトールで３回洗った。遠心後、スフェロプラストにＭＴＢＰバッファー（組成は、０．６Ｍマンニトール、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１％  ＢＳＡ及び１ｍＭ  ＰＭＳＦからなる。）を０．１５ｇ／ｍＬで加えて、ｔｉｇｈｔ−ｆｉｔｔｉｎｇ  Ｄｏｕｎｃｅ  ｈｏｍｏｚｉｎｉｚｅｒで破砕した。破砕液を３，０００×ｇで５分遠心し、上清をさらに１５，０００×ｇで１０分遠心した。得られた沈殿をミトコンドリア画分とし回収した。
この沈殿を１０ｍＬの破砕バッファーに懸濁し、３０分間超音波破砕した。破砕液を３０，０００×ｇで３０分遠心してＳ３０画分を回収した。Ｐｏｌｙ−Ｐｒｅｐ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）にＮｉ−ＮＴＡ  ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（ＱＩＡＧＥＮ）を５００μＬ充填し、５ｍＬの破砕バッファーで樹脂を平衡化した。ここにＳ３０画分をロードして樹脂にＦ３８Ａを結合させた。樹脂をウォッシュバッファーで３回洗った後、５００μＬのエリューションバッファーで４回、Ｆ３８Ａを溶出させた。なお、破砕バッファーは、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １０ｍＭ、ＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌ  ｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）１ｍＭ、及びＧｌｙｃｅｒｏｌ  ５％を含有する。ウォッシュバッファーは、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １０ｍＭ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５％、及びＩｍｉｄａｚｏｌ  １０ｍＭを含有する。エリューションバッファーは、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １０ｍＭ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ５％、及びＩｍｉｄａｚｏｌ  ２５０ｍＭを含有する。
次に陽イオン交換カラムＨｉＴｒａｐＴＭＳＰ  ＨＰ  １ｍＬ（ＡＭＥＲＳＨＡＭ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ）を用いて、２０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．６）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌを含むバッファーを用い、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎでＫＣｌの直線濃度勾配（０−０．５Ｍ，トータル３０ｍＬ）で溶出操作を行った。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥでピークが見られたフラクション周辺を確認した。得られたＦ３８ＡはＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）で濃縮し、透析バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ  ＫＣｌ、５０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）で一晩透析した。
（３）Ｆ３８Ａのアミノ酸特異性の確認
トリプトファン及びトリプトファンアナログのｍｔＷＲＳとＦ３８Ａによるｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐへの受容確認をＴ．ＴｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＥＦ−Ｔｕを用いた三者複合体形成によって行なった。ＥＦ−ＴｕはＥＦ−Ｔｓと複合体を形成するが、この複合体にＧＴＰが接触すると、ＥＦ−Ｔｓは解離し、アミノアシルｔＲＮＡが存在するとアミノアシルｔＲＮＡ・ＥＦ−Ｔｕ・ＧＴＰの複合体を形成する。つまりトリプトファン及びトリプトファンアナログがｍｔｔＲＮＡＴｒｐに受容された時に、三者複合体が形成されることになる。
反応は以下の条件で各トリプトファン及びトリプトファンアナログについて同様に行なった。
反応液の組成は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、５０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、７ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、２ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＧＴＰ、０．１ｍＭ  ＥＦ−Ｔｕ、０．０１ｍＭ  ＥＦ−Ｔｓ、０．００３Ａ２６０ｕｎｉｔ／μＬ  ｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐ、０．０５ｇ／Ｌ  ｍｔＷＲＳ又はＦ３８Ａ、０．１ｍＭ  トリプトファン又はトリプトファンアナログからなる。
上記の反応液で、３７℃で３０分間反応させた後、６％ＴＡＭ−ＰＡＧＥを１時間行なった。泳動後のゲルをＣＢＢ−Ｒで染色し、脱色後にメチレンブルーで染色しバンドを検出した。
なお、６％ＴＡＭ−ＰＡＧＥは、２０×ＴＡＭ  ０．５ｍＬ及び  ４０％アクリルアミド溶液１．５ｍＬをｄＨ２Ｏで１０ｍＬにした。ここで、２０×ＴＡＭは、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｂａｓｅで０．５Ｍ酢酸及び０．１Ｍ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２を含有している。
（結果）
結果を図１６に示し、その分析結果を図１７に示した。
本実施例１５の結果及び前記実施例１４の結果から、本Ｆ３８Ａ変異体と小麦胚芽抽出液由来無細胞蛋白質合成系を利用すれば、トリプトファンアナログをＵＧＡ特異的に導入することが可能となることが示された。
【産業上の利用可能性】  本発明により、確実に部位特異的に変異アミノ酸を入れた非天然アミノ酸蛋白質を効率的に製造できるようになり、更に、従来から、効率的なアナログの導入が期待されていたトリプトファンアナログを含有する非天然型アミノ酸蛋白質を製造できる。
また、本発明の新規ミトコンドリアトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素を用いて、新規抗生物質をはじめ医薬の開発が可能となる。
更に、本発明により、はじめの塩基がＧ以外で始まる配列を持つｔＲＮＡが製造できるようになり、更に、その変異体の製造が容易になる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年8月24日(2006.8.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】請求の範囲
【請求項１】蛋白質中の特定部位のアミノ酸をトリプトファンアナログに変異させた非天然アミノ酸含有蛋白質を製造する方法において、前記蛋白質をコードする遺伝子中の前記特定部位のアミノ酸コドンをオパールコドンに変異させた変異遺伝子、Ｆ３８Ａに変異した酵母のミトコンドリア  トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素（ｍｔＷＲＳ）及び酵母のミトコンドリア  ｔＲＮＡＴｒｐ（ｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐ）又は酵母のミトコンドリア  オパールサプレッサーｔＲＮＡを蛋白質合成系に添加して前記非天然アミノ酸含有蛋白質を製造する方法。
【請求項２】蛋白質合成系が無細胞蛋白質合成系又は真核細胞である請求項１記載の方法。
【請求項３】無細胞蛋白質合成系が小麦胚芽由来の無細胞蛋白質合成系である請求項２記載の方法。
【請求項４】（削除）
【請求項５】（削除）
【請求項６】配列番号１で表されるアミノ酸配列において３８番目のフェニルアラニンをアラニンに置換したアミノ酸配列で表されるポリペプチドであって、ミトコンドリア  トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素活性を有するポリペプチド、又は
配列番号１で表されるアミノ酸配列において３８番目のフェニルアラニンがアラニンに置換し、１−１５アミノ酸であるシグナルペプチドが欠失した、ミトコンドリア  トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項７】（削除）
【請求項８】（削除）
【請求項９】（削除）
【請求項１０】（削除）
【請求項１１】酵母のミトコンドリア  ｔＲＮＡＴｒｐ（ｍｔ  ｔＲＮＡＴｒｐ）又は酵母のミトコンドリア  オパールサプレッサーｔＲＮＡが以下の工程を含むｔＲＮＡの合成方法により調製される請求項１記載の方法。
（１）ｔＲＮＡをコードするＤＮＡの５’側に付加配列を設けることにより５’側に付加配列に有するｔＲＮＡをコードするＤＮＡを調製する工程、
（２）５’側に付加配列を有するｔＲＮＡをコードするＤＮＡを転写して、前駆体ｔＲＮＡを調製する工程、
（３）前記ｔＲＮＡをＲＮａｓｅ  Ｐで処理して、ｔＲＮＡを得る工程。
【請求項１２】（削除）
【請求項１３】前記５’側の付加配列がｇｇｇａｇａｃｃａｃａａｃｇｇｔｔｔｃｃｃｔｃｔａｇａである請求項１１記載の方法。
【請求項１４】前記ＲＮａｓｅ  ＰがＣ５蛋白質とＭ１  ＲＮＡとからなる請求項１１記載の方法。
【請求項１５】前記ＲＮａｓｅ  ＰがＭ１  ＲＮＡからなる請求項１１記載の方法。
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【国際調査報告】
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