【手続補正書】
【提出日】令和2年8月6日(2020.8.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サポシンリポタンパク質粒子のライブラリーを調製するためのプロセスであって、ライブラリーは、異なる膜脂質と、膜タンパク質組成物を含むサポシンリポタンパク質粒子の異種混合物とを含む、一連の異なるサポシンリポタンパク質粒子を意味し、前記粒子は、細胞または細胞小器官膜からの膜成分と、脂質と相互作用するタンパク質のＳＡＰＬＩＰファミリーに属するサポシン様タンパク質である脂質結合ポリペプチドまたはその誘導体形態とを含み、前記プロセスが、
ａ）古細菌、真核生物または原核生物の細胞または細胞小器官膜から得られる未精製膜小胞の混合物を提供する工程であって、前記未精製膜小胞が、供給源である前記未精製の細胞または細胞小器官の膜からの膜脂質および膜タンパク質とを両方とも含む工程と、
ｂ）工程ａ）の前記混合物と、前記脂質結合ポリペプチドとを液体環境中で接触させる工程と、
ｃ）前記粒子を自己集合させる工程とを含む、プロセス。
【請求項２】
工程ａ）の前記未精製膜小胞が、
ａ．１）細胞および／または細胞の細胞小器官を提供する工程；
ａ．２）前記細胞および／または前記細胞の細胞小器官を溶解または破壊する工程；
ａ．３）未精製膜フラクションを得る工程；および
ａ．４）工程ａ．３）で得られた前記未精製膜フラクションから未精製膜小胞を調製する工程、のうち少なくとも１つまたは全てによって調製される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記プロセスが、さらに、工程ａ）と工程ｂ）の間に、
ｂ．１）前記未精製膜小胞と界面活性剤とを液体環境で接触させ、次いで、工程ｂ）において、工程ｂ．１）から得られた前記混合物を工程ｃ）で前記脂質結合ポリペプチドと接触させる工程を含み、および／または
工程ｂ）が、界面活性剤存在下で行われる、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記界面活性剤が、アルキルベンゼンスルホネートまたは胆汁酸、カチオン性界面活性剤および非イオン性または両性イオン性界面活性剤、例えば、ラウリル−ジメチルアミン−オキシド（ＬＤＡＯ）、Ｆｏｓ−コリン、ＣＨＡＰＳ／ＣＨＡＰＳＯ、アルキルグリコシド、例えば、短鎖、中鎖または長鎖のアルキルマルトシド、特に、ｎ−ドデシル  β−Ｄ−マルトシド、グルコシド、マルトース−ネオペンチルグリコール（ＭＮＧ）両親媒性分子、両親媒性ポリマー（アンフィポール）、フェノールとアルデヒドのヒドロキシアルキル化生成物に基づく大環状または環状オリゴマー（カリックスアレーン）、およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項３に記載のプロセス。
【請求項５】
ｉ）前記粒子が、円盤形状であり、特に、前記粒子が円盤形状であって、親水性または水性のコアを含まず、
ｉｉ）前記粒子は、一般的に、最大直径が２ｎｍ〜２００ｎｍ、特に３ｎｍ〜１５０、好ましくは３ｎｍ〜１００ｎｍであり；
ｉｉ）工程ｃ）の前記粒子の前記自己集合が、２．０〜１０．０、特に６．０〜１０．０、好ましくは６．０〜９．０、特に好ましくは７．０〜９．０、最も好ましくは７．０〜８．０のｐＨで行われ；および／または
ｉｉｉ）前記プロセスは、工程ｃ）で、またはその後の工程ｄ）として、遊離膜脂質、遊離膜タンパク質、遊離脂質結合ポリペプチド、不可溶性または凝集した物質および／または界面活性剤を少なくとも部分的に除去することによって前記粒子を精製することを含み、場合により、前記精製は、クロマトグラフィー、特に、サイズ排除クロマトグラフィー；超遠心分離；透析；界面活性剤に結合するバイオビーズとの接触；濃縮剤の使用；限定されないが、結合していない／組み込まれていない脂質および／または疎水性化合物を除去するためのクロマトグラフィー、磁気ビーズ、免疫精製および／または膜／フィルターを含むアフィニティ精製方法によって行われる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項６】
前記脂質結合タンパク質が、サポシンＡ、サポシンＢ、サポシンＣ、サポシンＤ、またはこれらの誘導体または先端が切断された形態であり、場合により、前記ＳＡＰＬＩＰの前記誘導体形態が、
ｉ）配列番号１、２、３、４、５または６の全長配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質；
ｉｉ）配列番号１、２、３、４、５または６の全長配列に対して少なくとも４０％の配列同一性を有するタンパク質であり、前記タンパク質が、両親媒性であり、少なくとも１つのαらせんを形成し、前記プロセスで使用されると、可溶化した脂質と共にリポタンパク質粒子へと自己集合することができる、タンパク質；および
ｉｉｉ）１〜４０アミノ酸が欠失し、付加され、挿入され、および／または置換されている、配列番号１、２、３、４、５または６の配列を含むタンパク質；
から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項７】
前記粒子が、前記少なくとも１種類の脂質結合ポリペプチドと、前記細胞または細胞小器官の膜の成分、特に、工程ａ）で引用される前記細胞または細胞小器官の膜に由来する膜脂質および／または膜タンパク質とから本質的になる、請求項１〜６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項８】
ｉ）前記粒子が、工程ａ）で引用される前記細胞または前記細胞小器官の膜に由来する膜脂質を含み、前記膜脂質が、場合により、リン脂質、糖脂質、コレステロールおよびこれらの混合物からなる群から選択され、および／または
ｉｉ）前記粒子の少なくとも一部が、工程ａ）で引用される前記細胞または前記細胞小器官の膜に由来する膜タンパク質を含み、前記膜タンパク質が、場合により、一体的な膜貫通タンパク質、一体的な一回貫通型膜タンパク質、表在性膜タンパク質、脂質に結合した状態での両指向性タンパク質、脂質に固定されたタンパク質、融合した疎水性膜貫通ドメインを有するキメラタンパク質、およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項９】
前記未精製膜小胞の成分以外のさらなる脂質が前記プロセスに添加されない、請求項１〜８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１０】
精製されたサポシンリポタンパク質粒子を調製するためのプロセスであって、請求項１〜９のいずれか一項に記載のプロセスに従ってライブラリーを調製する工程と、
ｆ）少なくとも１種類のサポシンリポタンパク質粒子を前記ライブラリーから精製するさらなる工程を含み、場合により、工程ｆ）での前記少なくとも１種類の粒子の前記調製が、限定されないが、アフィニティクロマトグラフィーを含むアフィニティ精製によって、および／または免疫精製、特に、精製される前記粒子中に存在する膜タンパク質上の抗原またはタグを用いることによって行われ、および／または場合により、前記精製は、クロマトグラフィー、特に、サイズ排除クロマトグラフィー；超遠心分離；透析；界面活性剤に結合するバイオビーズとの接触；または濃縮剤の使用によって行われる、プロセス。
【請求項１１】
前記粒子が、その脂質および／またはタンパク質の組成という点で異なっており、好ましくは、タンパク質の組成という点で、特に好ましくは、膜タンパク質の組成という点で異なっている、請求項１〜９のいずれか一項に記載のプロセスによって得ることができる、サポシンリポタンパク質粒子のライブラリー。
【請求項１２】
請求項１０に記載のプロセスによって得ることができる、サポシンリポタンパク質粒子。
【請求項１３】
診断方法、化粧品処理に使用するための、またはワクチン接種製剤として使用するための請求項１１に記載の粒子のライブラリーまたは請求項１２に記載の粒子。
【請求項１４】
薬物開発、薬物スクリーニング、薬物発見、抗体開発、治療用生物医薬の開発のため、膜または膜タンパク質精製のため、膜タンパク質発現のため、膜および／または膜タンパク質研究、特にリピドミクスおよびプロテオミクスのため、好ましくは、膜および／または膜タンパク質の単離、同定および／または試験、またはリピドームまたはプロテオームデータベースの作成のためのツールとしての請求項１１に記載の粒子のライブラリーまたは請求項１２に記載の粒子の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
従来技術のアポリポタンパク質に由来するナノ円盤とは対照的に、本発明の脂質結合ポリペプチドは、脂質が二重のベルト状の様式に囲まれておらず、むしろ、本発明の粒子は、頭部−尾部の配置で並んだ２つ以上のほぼＶ字形またはブーメラン型の形状の脂質結合ポリペプチドによって囲まれている脂質を含むコアによって一緒に保持されており、本発明の所与の粒子内の個々の脂質結合ポリペプチドとの間に実質的に直接的なタンパク質−タンパク質の接触が存在しない（図２ａから図２ｆを参照）。この理論により束縛されることを望まないが、本発明の粒子中の脂質結合ポリペプチドと脂質のこの配置が、本発明の粒子に嵩高い疎水性薬剤が組み込まれるか、または組み込まれる脂質の量が増えるときに観察される大きさの自由度を与えると考えられる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１８】
本発明に係るサリプロ粒子は、膜タンパク質を欠いていてもよく、すなわち、脂質結合ポリペプチドおよび未精製膜小胞からの膜脂質のみから本質的に構成されていてもよい（「空の」サリプロ粒子）。しかし、好ましくは、サリプロ粒子は、膜タンパク質も含む（「充填された」サリプロ粒子）。膜タンパク質は、天然で膜に埋め込まれているタンパク質であるか、または場合により、膜にのみ会合するタンパク質である。膜タンパク質は、種々の機能を示すことができる。例えば、膜受容体タンパク質は、細胞の内側環境と外側環境との間でシグナルを連携し、輸送タンパク質が、分子およびイオンを膜を介して移動する。膜タンパク質は、酵素として作用してもよく、酵素は、多くの活性（例えば、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼまたはヒドロラーゼの活性）を有していてもよい。膜タンパク質は、例えば、細胞接着分子であってもよい。