(57)【要約】  マイナス鎖RNAウイルスが治療効果を有する遺伝子を持たない場合であっても、効果的な腫瘍抑制効果を有することが見出された。本発明は、マイナス鎖RNAウイルスを含む抗癌剤を提供する。また本発明は、マイナス鎖RNAウイルスと薬学的に許容される担体とを混合する工程を含む、抗癌剤の製造方法を提供する。また本発明は、マイナス鎖RNAウイルスを癌組織へ投与する工程を含む癌の抑制方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイナス鎖ＲＮＡウイルスを含む抗癌剤。
【請求項２】
マイナス鎖ＲＮＡウイルスが外来蛋白質をコードしない、請求項１に記載の抗癌剤。
【請求項３】
マイナス鎖ＲＮＡウイルスが感染性または非感染性ウイルス粒子である、請求項１または２に記載の抗癌剤。
【請求項４】
ＲＮＡウイルスがゲノムＲＮＡ−蛋白複合体である、請求項１から３のいずれかに記載の抗癌剤。
【請求項５】
マイナス鎖ＲＮＡウイルスがパラミクソウイルスである、請求項１から４のいずれかに記載の抗癌剤。
【請求項６】
パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、請求項５に記載の抗癌剤。
【請求項７】
マイナス鎖ＲＮＡウイルスと、薬学的に許容される担体または媒体とを混合する工程を含む、抗癌剤の製造方法。
【請求項８】
マイナス鎖ＲＮＡウイルスを癌組織へ投与する工程を含む癌の抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌治療の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、進行癌を対象とした増殖型ウイルスによるウイルス療法 (virotherapy) の臨床研究が進められている。ウイルス療法とは、HSV-1やアデノウイルスなどの増殖型ウイルスを腫瘍細胞に感染させ、ウイルス増殖に伴うウイルスの殺細胞効果により腫瘍の治癒を図る治療法である。HSV-1やアデノウイルスの場合、腫瘍治療用の増殖型ウイルスは、ウイルスゲノムに遺伝子操作を加えた変異ウイルスで、腫瘍内での複製能を保ちつつ、ヒト正常組織での病原性が最小限に押さえられている。腫瘍細胞に感染した治療用の増殖型ウイルスは、細胞内で複製し、その過程で感染細胞は死滅する。増殖したウイルスは周囲の腫瘍細胞に再感染し、抗腫瘍作用を広げる（Alemany R. et al., Replicative adenoviruses for cancer therapy. Nat Biotechnol., 2000, 18:723-727; Curiel, D.T., The development of conditionally replicative adenoviruses for cancer therapy., Clin Cancer Res., 2000, 6:3395-9; Kirn, D., Virotherapy for cancer: Current status, hurdles, and future directions., Cancer Gene Therapy, 9:959-960, 2002; Mineta T. et al., Attenuated multi-mutated herpes simplex virus-1 for the treatment of malignant gliomas. Nat Med 1:938-943,1995）。癌に対するウイルス療法は、手術・放射線療法・化学療法といった従来の治療法との併用が可能で、固形癌一般に適用が可能であること、反復投与が可能であること、サイトカインなどの治療遺伝子をウイルスゲノムに直接組み込んで抗腫瘍効果を増強できることなど、その応用範囲が広く、実用面で優れている。より効果的なウイルス療法を開発することができれば、癌治療に大きく貢献できるものと期待される。【０００３】
【非特許文献１】Alemany R. et al., Replicative adenoviruses for cancer therapy. Nat Biotechnol., 2000, 18:723-727
【非特許文献２】Curiel, D.T., The development of conditionally replicative adenoviruses for cancer therapy., Clin Cancer Res., 2000, 6:3395-9
【非特許文献３】Kirn, D., Virotherapy for cancer: Current status, hurdles, and future directions., Cancer Gene Therapy, 2002, 9:959-960
【非特許文献４】Mineta T. et al., Attenuated multi-mutated herpes simplex virus-1 for the treatment of malignant gliomas. Nat Med , 1995, 1:938-943
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、癌に対するより効果的なウイルス療法、並びに、抗癌剤の提供を課題とする。より詳しくは本発明は、マイナス鎖RNAウイルスを含む抗癌剤の製造方法、および、マイナス鎖RNAウイルスを用いた癌の治療方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、RNAウイルスのインビボ投与による腫瘍に対する治療効果を検証するために、メラノーマ細胞株を腹側皮下へ接種したマウスを用いて実験を行った。その結果、治療遺伝子を持たないマイナス鎖RNAウイルスを、該動物の腫瘍内へ注射することにより、腫瘍サイズが有意に縮小することを見出した。即ち、マイナス鎖RNAウイルスのインビボ投与は、該ウイルスが治療遺伝子を持たない場合であっても、抗腫瘍効果を発揮することが分かった。
マイナス鎖RNAウイルスは、それ自体が有効な抗癌剤となるものと考えられる。また、該ウイルスを直接、腫瘍部位（癌組織）へ注入することにより、有効な抗腫瘍効果が期待でき、該ウイルスは、癌の治療に有用である。【０００６】
すなわち本発明は、マイナス鎖RNAウイルスを含む抗癌剤、該抗癌剤の製造方法、および該RNAウイルスを用いた癌の抑制方法に関し、より具体的には請求項の各項に記載の発明に関する。なお同一の請求項を引用する請求項に記載の発明の１つまたは複数の組み合わせからなる発明は、それらの請求項に記載の発明に既に意図されている。すなわち本発明は、
〔１〕マイナス鎖ＲＮＡウイルスを含む抗癌剤、
〔２〕マイナス鎖ＲＮＡウイルスが外来蛋白質をコードしない、〔１〕に記載の抗癌剤、
〔３〕マイナス鎖ＲＮＡウイルスが感染性または非感染性ウイルス粒子である、〔１〕または〔２〕に記載の抗癌剤、
〔４〕ＲＮＡウイルスがゲノムＲＮＡ−蛋白複合体である、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の抗癌剤、
〔５〕マイナス鎖ＲＮＡウイルスがパラミクソウイルスである、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の抗癌剤、
〔６〕パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、〔５〕に記載の抗癌剤、
〔７〕マイナス鎖ＲＮＡウイルスと、薬学的に許容される担体または媒体とを混合する工程を含む、抗癌剤の製造方法、
〔８〕マイナス鎖ＲＮＡウイルスを癌組織へ投与する工程を含む癌の抑制方法、
に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】GFP発現SeV、可溶型FGF受容体発現SeV、または可溶型PDGFRα発現SeVのin vivo投与によるメラノーマに対する治療効果を示す図である。
【図２】皮下接種されたB16メラノーマ細胞の増殖曲線を示す図である。
【図３】YAC-1ターゲット細胞の51Cr放出アッセイの結果を示す図である。
【図４】TRP2ペプチド+EL-4の51Cr放出アッセイの結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、有効成分としてマイナス鎖RNAウイルスを含む抗癌剤（制癌剤）を提供する。本発明においてRNAウイルスとは、RNAゲノムを持つウイルスを言う。
本発明の抗癌剤の有効成分とするRNAウイルスは、好ましくは、マイナス鎖RNAウイルスである。マイナス鎖RNAウイルスとは、マイナス鎖（ウイルス蛋白質をコードするセンス鎖に対するアンチセンス鎖）のRNAをゲノムとして含むウイルスである。マイナス鎖RNAはネガティブ鎖RNAとも呼ばれる。本発明において用いられるマイナス鎖RNAウイルスとしては、特に一本鎖マイナス鎖RNAウイルス（非分節型（non-segmented）マイナス鎖RNAウイルスとも言う）が挙げられる。「一本鎖ネガティブ鎖RNAウイルス」とは、一本鎖ネガティブ鎖［すなわちマイナス鎖］RNAをゲノムに有するウイルスを言う。このようなウイルスとしては、パラミクソウイルス（Paramyxoviridae; Paramyxovirus, Morbillivirus, Rubulavirus, および Pneumovirus属等を含む）、ラブドウイルス（Rhabdoviridae; Vesiculovirus, Lyssavirus, および Ephemerovirus属等を含む）、フィロウイルス（Filoviridae）、オルトミクソウイルス（Orthomyxoviridae; Infuluenza virus A, B, C, および Thogoto-like viruses 等を含む）、ブニヤウイルス（Bunyaviridae; Bunyavirus, Hantavirus, Nairovirus, および Phlebovirus属等を含む）、アレナウイルス（Arenaviridae）などの科に属するウイルスが含まれる。【０００９】
本発明において好適に用いられるマイナス鎖RNAウイルスとしては、例えばパラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)ウイルスのセンダイウイルス(Sendai virus)を挙げることができる。他の例としては、ニューカッスル病ウイルス(Newcastle disease virus)、おたふくかぜウイルス(Mumps virus)、麻疹ウイルス(Measles virus)、RSウイルス(Respiratory syncytial virus)、牛疫ウイルス(rinderpest virus)、ジステンパーウイルス(distemper virus)、サルパラインフルエンザウイルス（SV5）、ヒトパラインフルエンザウイルス1,2,3型、オルトミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)のインフルエンザウイルス(Influenza virus)、ラブドウイルス科(Rhabdoviridae)の水疱性口内炎ウイルス(Vesicular stomatitis virus)、狂犬病ウイルス(Rabies virus)等が挙げられる。【００１０】
本発明において用いることができるウイルスをさらに例示すれば、例えば Sendai virus (SeV)、human parainfluenza virus-1 (HPIV-1)、human parainfluenza virus-3 (HPIV-3)、phocine distemper virus (PDV)、canine distemper virus (CDV)、dolphin molbillivirus (DMV)、peste-des-petits-ruminants virus (PDPR)、measles virus (MV)、rinderpest virus (RPV)、Hendra virus (Hendra)、Nipah virus (Nipah)、human parainfluenza virus-2 (HPIV-2)、simian parainfluenza virus 5 (SV5)、human parainfluenza virus-4a (HPIV-4a)、human parainfluenza virus-4b (HPIV-4b)、mumps virus (Mumps)、およびNewcastle disease virus (NDV) などが含まれる。より好ましくは、Sendai virus (SeV)、human parainfluenza virus-1 (HPIV-1)、human parainfluenza virus-3 (HPIV-3)、phocine distemper virus (PDV)、canine distemper virus (CDV)、dolphin molbillivirus (DMV)、peste-des-petits-ruminants virus (PDPR)、measles virus (MV)、rinderpest virus (RPV)、Hendra virus (Hendra)、および Nipah virus (Nipah) からなる群より選択されるウイルスが挙げられる。【００１１】
より好ましくは、パラミクソウイルス亜科（レスピロウイルス属、ルブラウイルス属、およびモルビリウイルス属を含む）に属するウイルスまたはその誘導体であり、より好ましくはレスピロウイルス属（genus Respirovirus）（パラミクソウイルス属（Paramyxovirus）とも言う）に属するウイルスまたはその誘導体である。誘導体には、ウイルスによる遺伝子導入能を損なわないように、ウイルス遺伝子が改変されたウイルス、および化学修飾されたウイルス等が含まれる。本発明を適用可能なレスピロウイルス属ウイルスとしては、例えばヒトパラインフルエンザウイルス１型（HPIV-1）、ヒトパラインフルエンザウイルス３型（HPIV-3）、ウシパラインフルエンザウイルス3型（BPIV-3）、センダイウイルス(Sendai virus; マウスパラインフルエンザウイルス１型とも呼ばれる)、およびサルパラインフルエンザウイルス10型（SPIV-10）などが含まれる。【００１２】
本発明のマイナス鎖RNAウイルスとしては、最も好ましくはセンダイウイルスである。【００１３】
本発明におけるマイナス鎖RNAウイルスは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、および人為的に構築された株などに由来してもよい。つまり、マイナス鎖RNAウイルスは、天然から単離されたマイナス鎖RNAウイルスであっても、遺伝子組み換えにより人為的に作出したマイナス鎖RNAウイルスであってもよい。また、感染細胞においてゲノムRNAを複製する能力を保持する限り、野生型マイナス鎖RNAウイルスが持ついずれかの遺伝子に変異や欠損があるものであってよい。例えば、マイナス鎖RNAウイルスのエンベロープ蛋白質または外殻蛋白質をコードする少なくとも１つの遺伝子に変異または欠損を有するマイナス鎖RNAウイルスを好適に用いることができる。このようなマイナス鎖RNAウイルスは、感染細胞においてはRNAゲノムを複製することはできるが、感染性ウイルス粒子を形成できない。従って、周囲に感染を拡大する懸念がないので安全性が高い。例えば、F、H、HN、またはGなどのエンベロープ蛋白質またはスパイク蛋白質をコードする少なくとも１つの遺伝子、あるいはそれらの組み合わせが含まれていないマイナス鎖RNAウイルスを用いることができる（WO00/70055 および WO00/70070; Li, H.-O. et al., J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000)）。ゲノム複製に必要な蛋白質（例えば N、P、およびL蛋白質）をゲノムRNAにコードしていれば、感染細胞においてゲノムを増幅することができる。欠損型ウイルスを製造するには、例えば、欠損している遺伝子産物またはそれを相補できる蛋白質をウイルス産生細胞において外来的に供給する（WO00/70055 および WO00/70070; Li, H.-O. et al., J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000)）。但し、例えばマイナス鎖RNAウイルスにおいては、M蛋白質遺伝子を持つウイルスであれば、F蛋白質やHN蛋白質などのスパイク蛋白質をコードする遺伝子を持たなくても非感染性のウイルス粒子（VLP）が放出されるので、ウイルス蛋白質を相補することなくVLPを製造することが可能である（WO00/70070）。また、エンベロープ蛋白質遺伝子を何も持たなくても、N、L、P蛋白質、およびゲノムRNAからなるRNPは細胞内において増幅することができるので、細胞ライセートから遠心分離等によりRNPを回収することができる。【００１４】
また、変異型のRNAウイルスを用いて本発明の抗癌剤を製造することもできる。例えば、エンベロープ蛋白質や外殻蛋白質において多数の温度感受性変異が知られている。これらの温度感受性変異蛋白質遺伝子を有するRNAウイルスを本発明において好適に用いることができる。温度感受性変異とは、低温 (例えば30℃ないし32℃) に比べ、ウイルス宿主の通常の温度（例えば37℃ないし38℃）において有意に活性が低下する変異のことである。このような、温度感受性変異を持つ蛋白質は、許容温度（低温）下でウイルスを作製することができるので有用である。【００１５】
例えば、マイナス鎖RNAウイルスのM遺伝子の温度感受性変異としては、センダイウイルスのM蛋白質におけるG69、T116、およびA183からなる群より任意に選択される部位のアミノ酸置換が挙げられる（Inoue, M. et al., J.Virol. 2003, 77: 3238-3246）。他のマイナス鎖RNAウイルスM蛋白質の相同な部位のアミノ酸は容易に同定できるが、具体的に示せば、例えばSeV M蛋白質のG69に相当するM蛋白質の相同部位としては、human parainfluenza virus-1 (HPIV-1)（括弧は略称）であればG69、human parainfluenza virus-3 (HPIV-3) であればG73、phocine distemper virus (PDV)およびcanine distemper virus (CDV)であればG70、dolphin molbillivirus (DMV)であればG71、peste-des-petits-ruminants virus (PDPR)、measles virus (MV)、およびrinderpest virus (RPV)であればG70、Hendra virus (Hendra)およびNipah virus (Nipah)であればG81、human parainfluenza virus-2 (HPIV-2)であればG70、human parainfluenza virus-4a (HPIV-4a)およびhuman parainfluenza virus-4b (HPIV-4b)であればE47、mumps virus (Mumps)であればE72が挙げられる（文字と番号はアミノ酸とその位置を表す）。また、SeV M蛋白質のT116に相当する各M蛋白質の相同部位としては、human parainfluenza virus-1 (HPIV-1)であればT116、human parainfluenza virus-3 (HPIV-3)であればT120、phocine distemper virus (PDV)およびcanine distemper virus (CDV)であればT104、dolphin molbillivirus (DMV)であればT105、peste-des-petits-ruminants virus (PDPR)、measles virus (MV)およびrinderpest virus (RPV)であればT104、Hendra virus (Hendra)およびNipah virus (Nipah)であればT120、human parainfluenza virus-2 (HPIV-2)およびsimian parainfluenza virus 5 (SV5)であればT117、human parainfluenza virus-4a (HPIV-4a)およびhuman parainfluenza virus-4b (HPIV-4b)であればT121、mumps virus (Mumps)であればT119、Newcastle disease virus (NDV)であればS120が挙げられる。SeV M蛋白質のA183に相当する各M蛋白質の相同部位としては、human parainfluenza virus-1 (HPIV-1)であればA183、human parainfluenza virus-3 (HPIV-3)であればF187、phocine distemper virus (PDV)およびcanine distemper virus (CDV)であればY171、dolphin molbillivirus (DMV)であればY172、peste-des-petits-ruminants virus (PDPR)、measles virus (MV)およびrinderpest virus (RPV)であればY171、Hendra virus (Hendra)およびNipah virus (Nipah)であればY187、human parainfluenza virus-2 (HPIV-2)であればY184、simian parainfluenza virus 5 (SV5)であればF184、human parainfluenza virus-4a (HPIV-4a)およびhuman parainfluenza virus-4b (HPIV-4b)であればF188、mumps virus (Mumps)であればF186、Newcastle disease virus (NDV)であればY187が挙げられる。ここに挙げたウイルスにおいて、それぞれのM蛋白質に上記の3つの部位のいずれか、好ましくは任意の2部位の組み合わせ、さらに好ましくは3つの部位全てのアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異M蛋白質をコードするゲノムを有するウイルスは、本発明において好適に用いられる。【００１６】
アミノ酸変異は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましく、例えばBLOSUM62マトリックス（Henikoff, S. and Henikoff, J. G. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919）の値が3以下、好ましくは2以下、より好ましくは1以下、より好ましくは0以下のアミノ酸に置換する。具体的には、センダイウイルス M蛋白質のG69、T116、およびA183あるいは他のウイルスM蛋白質の相同部位を、それぞれGlu (E)、Ala (A)、およびSer (S) へ置換することができる。また、麻疹ウイルス温度感受性株 P253-505（Morikawa, Y. et al., Kitasato Arch. Exp. Med. 1991: 64; 15-30）のM蛋白質の変異と相同な変異を利用することも可能である。変異の導入は、例えばオリゴヌクレオチド等を用いて、公知の変異導入方法に従って実施すればよい。【００１７】
また、HN遺伝子の温度感受性変異としては、例えばセンダイウイルスのHN蛋白質のA262、G264、およびK461からなる群より任意に選択される部位のアミノ酸置換が挙げられる（Inoue, M. et al., J.Virol. 2003, 77: 3238-3246）。好ましい一例を挙げれば、センダイウイルス HN蛋白質のA262、G264、およびK461あるいは他のウイルスHN蛋白質の相同部位を、それぞれThr (T)、Arg (R)、およびGly (G) へ置換する。また、例えば、ムンプスウイルスの温度感受性ワクチン株 Urabe AM9を参考に、HN蛋白質の464及び468番目のアミノ酸に変異導入することもできる（Wright, K. E. et al., Virus Res. 2000: 67; 49-57）。【００１８】
またマイナス鎖RNAウイルスは、P遺伝子またはL遺伝子に変異を有していてもよい。このような変異としては、具体的には、SeV P蛋白質の86番目のGlu（E86）の変異、SeV P蛋白質の511番目のLeu（L511）の他のアミノ酸への置換、または他のマイナス鎖RNAウイルスP蛋白質の相同部位の置換が挙げられる。具体的には、86番目のアミノ酸のLysへの置換、511番目のアミノ酸のPheへの置換などが例示できる。またL蛋白質においては、SeV L蛋白質の1197番目のAsn（N1197）および/または1795番目のLys（K1795）の他のアミノ酸への置換、または他のマイナス鎖RNAウイルスL蛋白質の相同部位の置換が挙げられ、具体的には、1197番目のアミノ酸のSerへの置換、1795番目のアミノ酸のGluへの置換などが例示できる。P遺伝子およびL遺伝子の変異は、持続感染性、2次粒子放出の抑制、または細胞傷害性の抑制の効果を顕著に高めることができる。さらに、エンベロープ蛋白質遺伝子の変異および/または欠損を組み合わせることで、これらの効果を劇的に上昇させることができる。【００１９】
またエンベロープウイルスを用いる場合は、ウイルスが本来持つエンベロープ蛋白質とは異なる蛋白質をエンベロープに含むウイルスを使用してもよい。例えば、ウイルス製造の際に、所望の外来性エンベロープ蛋白質をウイルス産生細胞で発現させることにより、これを含むウイルスを製造することができる。このような蛋白質に特に制限はなく、哺乳動物細胞への感染能を付与する所望の蛋白質が用いられる。具体的には、例えば水疱性口内炎ウイルス（Vesicular stomatitis virus; VSV）のG蛋白質（VSV-G）を挙げることができる。VSV-G蛋白質は、任意のVSV株に由来するものであってよく、例えば Indiana血清型株（J. Virology 39: 519-528 (1981)）由来のVSV-G蛋白を用いることができるが、これに限定されない。本発明において用いられるマイナス鎖RNAウイルスは、他のウイルス由来のエンベロープ蛋白質を任意に組み合わせて含むことができる。【００２０】
また本発明のマイナス鎖RNAウイルスは、それ自体で抗癌作用を有することを特徴とする。即ち、該マイナス鎖RNAウイルスは、外来蛋白質もしくは該蛋白質をコードする核酸を有する必要はない。従って本発明は、外来蛋白質をコードしないマイナス鎖RNAウイルスを含む抗癌剤に関する。本発明のマイナス鎖RNAウイルスは、ゲノムRNA中に外来蛋白質あるいは外来遺伝子をコードしてもよいし、しなくてもよい。外来蛋白質をコードしないマイナス鎖RNAウイルスでも抗癌（制癌）作用を発揮するため、外来遺伝子は必ずしも必要ではない。従って本発明には、野生型マイナス鎖RNAウイルスや天然から単離されたマイナス鎖RNAウイルス（変異株を含む）などの所望のマイナス鎖RNAウイルスを利用できる利点がある。例えば本発明において用いるRNAウイルスとしては、癌治療効果を有する蛋白質をコードしないRNAウイルスを用いることができる。このようなウイルスとしては、癌治療効果を有さない所望の外来蛋白質をコードするRNAウイルスが含まれ、例えばRNAウイルスの導入を検出するために、緑色蛍光蛋白質（GFP）、ルシフェラーゼ、各種ペプチドタグなどのマーカー蛋白質をコードするRNAウイルスなどを用いることができる。あるいは、マイナス鎖RNAウイルスへ抗癌（制癌）作用を助ける外来蛋白質あるいは外来遺伝子をさらに組み込むことで、制癌（抗癌）作用をより高めることもできる。【００２１】
外来遺伝子を持つ組み換えマイナス鎖RNAウイルスの再構成は公知の方法を利用して行えばよい。具体的な手順は、典型的には、（ａ）マイナス鎖RNAウイルスゲノムRNAをコードするcDNAを、ウイルス粒子形成に必要なウイルス蛋白質を発現する細胞で転写させる工程、（ｂ）生成したウイルスを含む培養上清を回収する工程、により製造することができる。ウイルス蛋白質は、転写させたウイルスゲノムRNAから発現されてもよいし、ゲノムRNA以外からトランスに供給されてもよい。ゲノムRNAにおいて粒子形成に必要なウイルス遺伝子が欠損している場合は、そのウイルス遺伝子をウイルス産生細胞で別途発現させ、粒子形成を相補する。ウイルス蛋白質やRNAゲノムを細胞内で発現させるためには、該蛋白質やゲノムRNAをコードするDNAを宿主細胞で機能する適当なプロモーターの下流に連結したベクターを宿主細胞に導入する。転写されたゲノムRNAは、ウイルス蛋白質の存在下で複製され、感染性ウイルス粒子が形成される。エンベロープ蛋白質などの遺伝子を欠損する欠損型ウイルスを製造する場合は、欠損する蛋白質またはその機能を相補できる他のウイルス蛋白質などをウイルス産生細胞において発現させる。【００２２】
例えば、本発明のマイナス鎖RNAウイルスの製造は、以下の公知の方法を利用して実施することができる（WO97/16539; WO97/16538; WO00/70055; WO00/70070; WO01/18223; Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997、Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587 及び Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466; Durbin, A. P. et al., 1997, Virology 235: 323-332; Whelan, S. P. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell. M. J. et al., 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F. et al., 1995, EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481; Garcin, D. et al., 1995, EMBO J. 14: 6087-6094; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Baron, M. D. and Barrett, T., 1997, J. Virol. 71: 1265-1271; Bridgen, A. and Elliott, R. M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404）。これらの方法により、パラインフルエンザ、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、リンダーペストウイルス、センダイウイルスなどを含むマイナス鎖RNAウイルスをDNAから再構成させることができる。本発明においては、マイナス鎖RNAウイルス、特に一本鎖マイナス鎖RNAウイルス、より好ましくはパラミクソウイルス科ウイルス、より好ましくはレスピロウイルス属ウイルスを好適に用いることができる。【００２３】
マイナス鎖RNAウイルスに搭載させる外来遺伝子としては、特に制限はないが、天然の蛋白質としては、例えばホルモン、サイトカイン、増殖因子、受容体、細胞内シグナル分子、酵素、抗体（全長抗体、Fabなどの抗体断片、一本鎖抗体などを含む）、ペプチドなどが挙げられる。蛋白質は分泌蛋白質、膜蛋白質、細胞質蛋白質、核蛋白質などであり得る。人工的な蛋白質としては、例えば、キメラ毒素などの融合蛋白質、ドミナントネガティブ蛋白質（受容体の可溶性分子または膜結合型ドミナントネガティブ受容体を含む）、欠失型の細胞接着分子および細胞表面分子などが挙げられる。また、分泌シグナル、膜局在化シグナル、または核移行シグナル等を付加した蛋白質であってもよい。導入遺伝子としてアンチセンスRNA分子またはRNA切断型リボザイムなどを発現させて、特定の遺伝子の機能を抑制することもできる。外来遺伝子として制癌作用を示す治療用遺伝子を用いてウイルスを調製すれば、制癌作用をより高めることが可能となる。【００２４】
例えば、血管形成または血管新生を阻害する遺伝子を用いれば、抗癌効果をより高めることができる。血管形成または血管新生を促進する遺伝子としては、例えば線維芽細胞増殖因子2（FGF2）（Baffour, R. et al., J. Vasc. Surg. 16(2):181-91, 1992）、内皮細胞増殖因子（endothelial cell growth factor; ECGF）（Pu, L. Q. et al., J. Surg. Res. 54(6):575-83, 1993）、血管内皮増殖因子/血管透過性因子（vascular endothelial growth factor; VEGF / vascular permeability factor; VPF）（Takeshita, S. et al., Circulation 90(5 Pt 2):II228-34, 1994; Takeshita, S. et al., J. Clin. Invest. 93(2):662-70, 1994）、肝細胞増殖因子/scatter因子 (hepatocyte growth factor/scatter factor) (HGF/SF) などが知られている。これらのシグナル分子の作用を阻害する分泌蛋白質をコードする遺伝子を外来遺伝子として利用することが可能である。具体的には、これらのシグナル分子またはその受容体に結合する抗体またはその抗原結合断片を含むポリペプチド、該受容体の可溶型蛋白質（リガンド結合部を持ち、膜貫通領域を持たない分泌型受容体）などが挙げられる。特に、FGF受容体（FGF-R）の可溶型ポリペプチドをコードするマイナス鎖RNAウイルスは、癌の増殖抑制効果を有意に上昇させることができる。従って、可溶性FGF-Rをコードするマイナス鎖RNAウイルスは、本発明において好適に用いられる。可溶性FGF-Rとしては、天然の可溶型FGF-Rを用いることもできるし、膜結合型のFGF-R（FGF-R1など）の細胞外ドメインからなる断片を用いてもよい（A. Hanneken and A. Baird, Investigative Ophthalmology & Visual Science, Vol 36, 1192-1196, 1995; Takaishi, S. et al., Biochem Biophys Res Commun., 267(2):658-62, 2000; Seno M, et al., Cytokine, 10(4):290-4, 1998; Hanneken, A., FEBS Lett. 489:176, 2001）。【００２５】
また、サイトカイン類を発現させれば、免疫系を刺激して癌に対する免疫応答を高めることから、サイトカインをコードする遺伝子を導入したマイナス鎖RNAウイルスも有用である。免疫刺激性サイトカインをコードする遺伝子を搭載するマイナス鎖RNAウイルスは効果的な腫瘍免疫誘導作用を有する抗癌剤となる。例えば、免疫刺激性サイトカインとして、インターロイキン（例えば、IL-1alpha、IL-1beta、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-23、IL-27）、インターフェロン（例えば、IFN-alpha、IFN-beta、IFN-gamma）、腫瘍壊死因子（TNF）、トランスフォーミング増殖因子(TGF)-beta、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インスリン様増殖因子 (IGF)-Ｉ、IGF-2、Flt-3リガンド、Fasリガンド、およびc-kitリガンド、ならびに他の免疫調節蛋白質（ケモカインおよびコスティミュラトリー分子など）が含まれる。【００２６】
これらのサイトカインのアミノ酸配列は当業者には周知であり、IL-4については、例えば、Araiら (1989)、J. Immunol. 142(1) 274-282、IL-6については、例えば、Yasukawaら (1987)、EMBO J.、6(10): 2939-2945、IL-12は、例えば、Wolfら (1991)、J. Immunol. 146(9): 3074-3081、IFN-alphaは、例えば、Grenら (1984) J. Interferon Res. 4(4): 609-617、およびWeismannら (1982) Princess Takamatsu Symp. 12: 1-22、IFN-betaは、例えばAccession number NM_002176 の139〜636番目の配列（アミノ酸配列はNP_002167の22〜187番目）を含む配列が挙げられる（Derynck, R. et al., Nature 285, 542-547 (1980); Higashi, Y. et al., J. Biol. Chem. 258, 9522-9529 (1983); Kuga, T. et al., Nucleic Acids Res. 17, 3291 (1989)）。また、TNFは、例えば、Pennicaら (1984) Nature 312: 724-729、G-CSFは、例えば、Hiranoら (1986) Nature 324:73-76、GM-CSFは、例えば、Cantrellら (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82(18): 6250-6254 を参照することができる。より具体的には、GM-CSFをコードする核酸配列としては Accession number NM_000758の84〜461番目の配列（アミノ酸配列はNP_000749の18〜144番目）を含む配列が挙げられる。IL-4をコードする核酸配列としては、Accession number NM_000589の443〜829番目の配列（アミノ酸配列はNP_000580の25〜153番目）を含む配列が挙げられる。シグナルペプチド配列は、適宜他の蛋白質のシグナルペプチドの配列に置換してもよい。これらのサイトカインをコードする天然の遺伝子または遺伝子暗号の縮重を利用して、機能的サイトカインをコードする変異遺伝子を構築し利用することができる。【００２７】
また、これらのサイトカインの改変体を発現するように遺伝子改変してもよい。例えば、前駆体および成熟体の２つの形態を持つサイトカイン（例えば、シグナルペプチドの切断により活性フラグメントを生成するもの、または蛋白質の限定分解により活性フラグメントを生成するものなど）について、前駆体または成熟体のいずれかを発現するように遺伝子改変してもよい。その他の改変体（例えば、サイトカインの活性フラグメントと異種配列（例えば、異種シグナルペプチド）との間の融合タンパク質）を用いてもよい。【００２８】
なお、本発明において組み換えウイルスとは、組み換えポリヌクレオチドを介して生成したウイルス、またはそのウイルスの増幅産物を言う。組み換えポリヌクレオチドとは、両端または片端が自然の状態と同じようには結合していないポリヌクレオチドを言う。具体的には、組み換えポリヌクレオチドは、人の手によってポリヌクレオチド鎖の結合が改変（切断および/または結合）されたポリヌクレオチドである。組み換えポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド合成、ヌクレアーゼ処理、リガーゼ処理等を組み合わせて、公知の遺伝子組み換え方法により生成させることができる。組み換えウイルスは、遺伝子操作により構築されたウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチドを発現させ、ウイルスを再構築することによって生成することができる。例えば、ウイルスゲノムをコードするcDNAから、ウイルスを再構成する方法が知られている（Y. Nagai, A. Kato, Microbiol. Immunol., 43, 613-624 (1999)）。【００２９】
本発明において遺伝子とは遺伝物質を指し、転写される配列をセンスまたはアンチセンスに含む核酸を言う。遺伝子はRNAであってもDNAであってもよい。本発明において蛋白質をコードする核酸は、該蛋白質の遺伝子と呼ぶ。また遺伝子は蛋白質をコードしていなくてもよく、例えば遺伝子はリボザイムまたはアンチセンスRNAなどの機能的RNAをコードするものであってもよい。遺伝子は天然由来または人為的に設計された配列であり得る。また、本発明において「DNA」とは、一本鎖DNAおよび二本鎖DNAを含む。また蛋白質をコードするとは、ポリヌクレオチドが該蛋白質を適当な条件下で発現できるように、該蛋白質のアミノ酸配列をコードするORFをセンスまたはアンチセンスに含むことを言う。【００３０】
マイナス鎖RNAウイルスは、ゲノムRNAに、必要に応じて外来遺伝子に対応するアンチセンスをコードしていてもよい。ゲノムRNAとは、マイナス鎖RNAウイルスのウイルス蛋白質と共にリボヌクレオプロテイン（RNP）を形成し、該蛋白質によりゲノム中の遺伝子が発現し、このRNAが複製されて娘RNPが形成される機能を持つRNAである。一般にマイナス鎖RNAウイルスのゲノムは、3'リーダー領域と5'トレイラー領域の間に、ウイルス遺伝子がアンチセンス配列として並んだ構成をしている。各遺伝子のORFの間には、転写終結配列(E配列) - 介在配列(I配列) - 転写開始配列(S配列) が存在し、これにより各遺伝子のORFをコードするRNAが別々のシストロンとして転写される。【００３１】
マイナス鎖RNAウイルスのウイルスタンパク質をコードする遺伝子としては、NP、P、M、F、HN、およびL遺伝子が含まれる。「NP、P、M、F、HN、およびL遺伝子」とは、それぞれヌクレオキャプシド、ホスホ、マトリックス、フュージョン、ヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ、およびラージ蛋白質をコードする遺伝子のことを指す。パラミクソウイルス亜科に属する各ウイルスにおける各遺伝子は、一般に次のように表記される。一般に、NP遺伝子は「N遺伝子」と表記されることもある。
レスピロウイルス属     NP   P/C/V   M   F   HN    -     L
ルブラウイルス属       NP   P/V     M   F   HN   (SH)   L
モービリウイルス属     NP   P/C/V   M   F   H     -     L【００３２】
例えばセンダイウイルスの各遺伝子の塩基配列のデータベースのアクセッション番号は、NP遺伝子については M29343、M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M69046, X17218、P遺伝子については M30202, M30203, M30204, M55565, M69046, X00583, X17007, X17008、M遺伝子については D11446, K02742, M30202, M30203, M30204, M69046, U31956, X00584, X53056、F遺伝子については D00152, D11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046, X00152, X02131、HN遺伝子については D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X00586, X02808, X56131、L遺伝子については D00053, M30202, M30203, M30204, M69040, X00587, X58886を参照のこと。またその他のウイルスがコードするウイルス遺伝子を例示すれば、N遺伝子については、CDV, AF014953; DMV, X75961; HPIV-1, D01070; HPIV-2, M55320; HPIV-3, D10025; Mapuera, X85128; Mumps, D86172; MV, K01711; NDV, AF064091; PDPR, X74443; PDV, X75717; RPV, X68311; SeV, X00087; SV5, M81442; および Tupaia, AF079780、P遺伝子については、CDV, X51869; DMV, Z47758; HPIV-l, M74081; HPIV-3, X04721; HPIV-4a, M55975; HPIV-4b, M55976; Mumps, D86173; MV, M89920; NDV, M20302; PDV, X75960; RPV, X68311; SeV, M30202; SV5, AF052755; および Tupaia, AF079780、C遺伝子については CDV, AF014953; DMV, Z47758; HPIV-1. M74081; HPIV-3, D00047; MV, ABO16162; RPV, X68311; SeV, AB005796; および Tupaia, AF079780、M遺伝子については CDV, M12669; DMV Z30087; HPIV-1, S38067; HPIV-2, M62734; HPIV-3, D00130; HPIV-4a, D10241; HPIV-4b, D10242; Mumps, D86171; MV, AB012948; NDV, AF089819; PDPR, Z47977; PDV, X75717; RPV, M34018; SeV, U31956; および SV5, M32248、F遺伝子については CDV, M21849; DMV, AJ224704; HPN-1. M22347; HPIV-2, M60182; HPIV-3. X05303, HPIV-4a, D49821; HPIV-4b, D49822; Mumps, D86169; MV, AB003178; NDV, AF048763; PDPR, Z37017; PDV, AJ224706; RPV, M21514; SeV, D17334; および SV5, AB021962、HN（HまたはG）遺伝子については CDV, AF112189; DMV, AJ224705; HPIV-1, U709498; HPIV-2. D000865; HPIV-3, AB012132; HPIV-4A, M34033; HPIV-4B, AB006954; Mumps, X99040; MV, K01711; NDV, AF204872; PDPR, Z81358; PDV, Z36979; RPV, AF132934; SeV, U06433; および SV-5, S76876 が例示できる。但し、各ウイルスは複数の株が知られており、株の違いにより上記に例示した以外の配列からなる遺伝子も存在する。【００３３】
これらのウイルス蛋白質をコードするORFおよび外来遺伝子のORFは、ゲノムRNAにおいて上記のE-I-S配列を介してアンチセンスに配置される。ゲノムRNAにおいて最も3'に近いORFは、3'リーダー領域と該ORFとの間にS配列のみが必要であり、EおよびI配列は必要ない。またゲノムRNAにおいて最も5'に近いORFは、5'トレイラー領域と該ORFとの間にE配列のみが必要であり、IおよびS配列は必要ない。また２つのORFは、例えばIRES等の配列を用いて同一シストロンとして転写させることも可能である。このような場合は、これら2つのORFの間にはE-I-S配列は必要ない。例えば、野生型のパラミクソウイルスの場合、典型的なRNAゲノムは、3'リーダー領域に続き、N、P、M、F、HN、およびL蛋白質をアンチセンスにコードする６つのORFが順に並んでおり、それに続いて5'トレイラー領域を他端に有する。本発明のゲノムRNAにおいては、ウイルス遺伝子の配置はこれに限定されるものではないが、好ましくは、野生型ウイルスと同様に、3'リーダー領域に続き、N、P、M、F、HN、およびL蛋白質をコードするORFが順に並び、それに続いて5'トレイラー領域が配置されることが好ましい。ある種のウイルスにおいては、ウイルス遺伝子が異なっているが、そのような場合でも上記と同様に各ウイルス遺伝子を野生型と同様の配置とすることが好ましい。一般に N、P、およびL遺伝子を保持しているウイルスは、細胞内で自律的にRNAゲノムから遺伝子が発現し、ゲノムRNAが複製される。さらにFおよびHN遺伝子等のエンベロープ蛋白質をコードする遺伝子、およびM遺伝子の働きにより、感染性のウイルス粒子が形成され、細胞外に放出される。従って、このようなウイルスは伝播能を有するウイルスとなる。「伝播能を有する」とは、ウイルスが宿主細胞に感染した場合、該細胞においてウイルスが複製され、感染性ウイルス粒子が産生されることを指す。本発明において外来遺伝子は、必要に応じて、このゲノム中の蛋白質非コード領域に挿入すればよい。【００３４】
また、本発明のマイナス鎖RNAウイルスは、野生型ウイルスが持つ遺伝子のいずれかを欠損したものであってよい。例えば、M、F、またはHN遺伝子、あるいはそれらの組み合わせが含まれていないウイルスも、本発明において好適に用いることができる。このようなウイルスの再構成は、例えば、欠損している遺伝子産物を外来的に供給することにより行うことができる。このようにして製造されたウイルスは、野生型ウイルスと同様に宿主細胞に接着して細胞融合を起こすが、細胞に導入されたウイルスゲノムはウイルス遺伝子に欠損を有するため、最初と同じような感染力を持つ娘ウイルス粒子は形成されない。このため、一回限りの遺伝子（例えば、外来遺伝子）導入力を持つ安全なウイルスとして有用である。ゲノムから欠損させる遺伝子としては、例えばF遺伝子および／またはHN遺伝子が挙げられる。例えば、F遺伝子が欠損した組み換えマイナス鎖RNAウイルスゲノムを発現するプラスミドを、F蛋白質の発現ベクターならびにNP、P、およびL蛋白質の発現ベクターと共に宿主細胞にトランスフェクションすることにより、ウイルスの再構成を行うことができる（WO00/70055 および WO00/70070; Li, H.-O. et al., J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000)）。また、例えば、F遺伝子が染色体に組み込まれた宿主細胞を用いてウイルスを製造することもできる。これらの蛋白質群は、そのアミノ酸配列はウイルス由来の配列そのままでなくとも、核酸の導入における活性が天然型のそれと同等かそれ以上ならば、変異を導入したり、あるいは他のウイルスの相同遺伝子で代用してもよい。【００３５】
また、本発明において用いられるウイルスとして、ウイルスゲノムが由来するウイルスのエンベロープ蛋白質とは異なる蛋白質をエンベロープに含むウイルスを作製することもできる。例えば、ウイルス再構成の際に、ベースとなるウイルスのゲノムがコードするエンベロープ蛋白質以外のエンベロープ蛋白質を細胞で発現させることにより、所望のエンベロープ蛋白質を有するウイルスを製造することができる。このような蛋白質に特に制限はない。細胞への感染能を与える所望の蛋白質が用いられる。例えば、他のウイルスのエンベロープ蛋白質、例えば水疱性口内炎ウイルス（Vesicular stomatitis virus; VSV）のG蛋白質（VSV-G）を挙げることができる。VSV-G蛋白質は、任意のVSV株に由来するものであってよい。例えば Indiana血清型株（J. Virology 39: 519-528 (1981)）由来のVSV-G蛋白を用いることができるが、これに限定されない。また本発明のウイルスは、他のウイルス由来のエンベロープ蛋白質を任意に組み合わせて含むことができる。例えば、このような蛋白質として、ヒト細胞に感染するウイルスに由来するエンベロープ蛋白質が好適である。このような蛋白質としては、特に制限はないが、レトロウイルスのアンフォトロピックエンベロープ蛋白質などが挙げられる。レトロウイルスのアンフォトロピックエンベロープ蛋白質としては、例えばマウス白血病ウイルス（MuLV）4070A株由来のエンベロープ蛋白質を用い得る。また、MuMLV 10A1由来のエンベロープ蛋白質を用いることもできる（例えばpCL-10A1(Imgenex)（Naviaux, R. K. et al., J. Virol. 70: 5701-5705 (1996)）。また、ヘルペスウイルス科の蛋白質としては、例えば単純ヘルペスウイルスのgB、gD、gH、gp85蛋白質、EBウイルスのgp350、gp220蛋白質などが挙げられる。ヘパドナウイルス科の蛋白質としては、B型肝炎ウイルスのS蛋白質などが挙げられる。これらの蛋白質は、細胞外ドメインをF蛋白質またはHN蛋白質の細胞内ドメインと結合させた融合蛋白質として用いてもよい。このように本発明において用いられるウイルスには、VSV-G蛋白質などのように、ゲノムが由来するウイルス以外のウイルスに由来するエンベロープ蛋白質を含むシュードタイプウイルスが含まれる。ウイルスのゲノムRNAにはこれらのエンベロープ蛋白質をゲノムにコードされないように設計すれば、ウイルス粒子が細胞に感染した後は、ウイルスからこの蛋白質が発現されることはない。【００３６】
また、本発明において用いられるウイルスは、例えば、エンベロープ表面に特定の細胞に接着しうるような接着因子、リガンド、受容体等の蛋白質、抗体またはその断片、あるいはこれらの蛋白質を細胞外領域に有し、ウイルスエンベロープ由来のポリペプチドを細胞内領域に有するキメラ蛋白質などを含むものであってもよい。これらはウイルスゲノムにコードされていてもよいし、ウイルスの再構成時に、ウイルスゲノム以外の遺伝子（例えば別の発現ベクターまたは宿主染色体上などにある遺伝子）の発現により供給されてもよい。【００３７】
またウイルスは、例えばウイルス蛋白質による免疫原性を低下させるために、またはRNAの転写効率または複製効率を高めるために、ウイルスに含まれる任意のウイルス遺伝子が野生型遺伝子から改変されていてよい。具体的には、例えば複製因子であるN、P、およびL遺伝子の中の少なくとも一つを改変し、転写または複製の機能を高めることが考えられる。また、エンベロープ蛋白質の１つであるHN蛋白質は、赤血球凝集素であるヘマグルチニン（hemagglutinin）活性とノイラミニダーゼ（neuraminidase）活性との両者の活性を有するが、例えば前者の活性を弱めることができれば、血液中でのウイルスの安定性を向上させることが可能であろうし、例えば後者の活性を改変することにより、感染能を調節することも可能である。また、F蛋白質を改変することにより膜融合能を調節することもできる。また、例えば、細胞表面の抗原分子となりうるF蛋白質および/またはHN蛋白質の抗原提示エピトープ等を解析し、これを利用してこれらの蛋白質に関する抗原提示能を弱めたウイルスを作製することもできる。【００３８】
またマイナス鎖RNAウイルスは、アクセサリー遺伝子が欠損したものであってよい。例えばSeVのアクセサリー遺伝子の１つであるV遺伝子をノックアウトすることにより、培養細胞における遺伝子発現および複製は障害されることなく、マウス等の宿主に対するSeVの病原性が顕著に減少する（Kato, A. et al., 1997, J. Virol. 71:7266-7272; Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16:578-587; Curran, J. et al., WO01/04272, EP1067179）。【００３９】
マイナス鎖RNAウイルスは、例えば、それ自体の抗癌作用との相乗効果が期待される外来遺伝子を導入するためのベクターとしての役割を担わせることも可能である。該ベクターは、宿主細胞の細胞質でのみ転写・複製を行い、DNAフェーズを持たないため染色体への組み込み（integration）は起こらない（Lamb, R.A. and Kolakofsky, D., Paramyxoviridae: The viruses and their replication. In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM, (eds). Fields of virology. Vol. 2. Lippincott - Raven Publishers: Philadelphia, 1996, pp. 1177-1204）。このため染色体異常による癌化および不死化などの安全面における問題が生じない。マイナス鎖RNAウイルスのこの特徴は、ベクターとして利用した際の安全性に大きく寄与している。異種遺伝子発現の結果では、例えばセンダイウイルス（SeV）を連続多代継代しても殆ど塩基の変異が認められず、ゲノムの安定性が高く、挿入異種遺伝子を長期間に渡って安定に発現する事が示されている（Yu, D. et al., Genes Cells 2, 457-466 (1997)）。また、カプシド構造蛋白質を持たないことによる導入遺伝子のサイズまたはパッケージングの柔軟性（flexibility）など性質上のメリットがある。このように、マイナス鎖RNAウイルスには、ヒトの遺伝子治療のための高効率ベクターとしての機能を付加的に担わせることも可能である。例えば、伝播能を有するセンダイウイルスは、外来遺伝子を少なくとも4kbまで導入可能であり、転写ユニットを付加することによって２種類以上の遺伝子を同時に発現する事も可能である。【００４０】
またセンダイウイルスは、齧歯類にとっては病原性で肺炎を生じることが知られているが、人に対しては病原性がない。これはまた、野生型センダイウイルスの経鼻的投与によって非ヒト霊長類において重篤な有害作用を示さないというこれまでの報告によっても支持されている（Hurwitz, J.L. et al., Vaccine 15: 533-540, 1997）。センダイウイルスのこれらの特徴は、センダイウイルスが、ヒトの治療へ応用できることを示唆し、癌の遺伝子治療の有望な選択肢の一つとなることを結論づけるものである。【００４１】
本発明のマイナス鎖RNAウイルスは、必須ではないが、ゲノムRNA中に外来遺伝子をコードしてもよい。外来遺伝子を含む組換えウイルスは、上記のウイルスのゲノムに外来遺伝子を挿入することによって得られる。外来遺伝子としては、本発明のRNAウイルスの抗癌作用との相乗効果などを期待できる所望の遺伝子を用いることができる。外来遺伝子は天然型蛋白質をコードする遺伝子であってもよく、あるいは欠失、置換または挿入により天然型蛋白質を改変した蛋白質をコードする遺伝子であってもよい。外来遺伝子の挿入位置は、例えばウイルスゲノムの蛋白質非コード領域の所望の部位を選択することができ、例えばゲノムRNAの3'リーダー領域と3'端に最も近いウイルス蛋白質ORFとの間、各ウイルス蛋白質ORFの間、および/または5'端に最も近いウイルス蛋白質ORFと5'トレイラー領域の間に挿入することができる。また、FまたはHN遺伝子などを欠失するゲノムでは、その欠失領域に外来遺伝子をコードする核酸を挿入することができる。パラミクソウイルスに外来遺伝子を導入する場合は、ゲノムへの挿入断片のポリヌクレオチドの鎖長が6の倍数となるように挿入することが望ましい（Journal of Virology, Vol. 67, No. 8, 4822-4830, 1993）。挿入した外来遺伝子とウイルスORFとの間には、E-I-S配列が構成されるようにする。E-I-S配列を介して2またはそれ以上の遺伝子をタンデムに並べて挿入することができる。【００４２】
マイナス鎖RNAウイルスに搭載する外来遺伝子の発現レベルは、その遺伝子の上流（ネガティブ鎖の3'側）に付加する転写開始配列の種類により調節することができる（WO01/18223）。また、ゲノム上の外来遺伝子の挿入位置によって制御することができ、ネガティブ鎖の3'の近くに挿入するほど発現レベルが高く、5'の近くに挿入するほど発現レベルが低くなる。このように、外来遺伝子の挿入位置は、該遺伝子の所望の発現量を得るために、また前後のウイルス蛋白質をコードする遺伝子との組み合わせが最適となる様に適宜調節することができる。一般に、外来遺伝子の高い発現が得られることが有利と考えられるため、外来遺伝子は、効率の高い転写開始配列に連結し、ネガティブ鎖ゲノムの3'端近くに挿入することが好ましい。具体的には、3'リーダー領域と3'に最も近いウイルス蛋白質ORFとの間に挿入される。あるいは、3'に一番近いウイルス遺伝子のORFと2番目の遺伝子のORFの間に挿入してもよい。野生型パラミクソウイルスにおいては、ゲノムの3'に最も近いウイルス蛋白質遺伝子はN遺伝子であり、2番目の遺伝子はP遺伝子である。逆に、導入遺伝子の高発現が望ましくない場合は、例えばウイルスにおける外来遺伝子の挿入位置をネガティブ鎖のなるべく5'側に設定したり、転写開始配列を効率の低いものにするなどして、ウイルスからの発現レベルを低く抑えることで適切な効果が得られるようにすることも可能である。【００４３】
マイナス鎖RNAウイルスを製造するには、哺乳動物細胞において、ウイルスの成分であるRNPの再構成に必要なウイルス蛋白質、すなわちN、P、およびL蛋白質の存在下、ウイルスのゲノムRNAをコードするcDNAを転写させる。転写によりネガティブ鎖ゲノム（すなわちウイルスゲノムと同じアンチセンス鎖）を生成させてもよく、あるいはポジティブ鎖（ウイルス蛋白質をコードするセンス鎖）を生成させても、ウイルスRNPを再構成することができる。マイナス鎖RNAウイルスの再構成効率を高めるには、好ましくはポジティブ鎖を生成させる。RNA末端は、天然のウイルスゲノムと同様に3'リーダー配列と5'トレイラー配列の末端をなるべく正確に反映させることが好ましい。転写産物の5'端を正確に制御するためには、例えば転写開始部位としてT7 RNAポリメラーゼ認識配列を利用し、該RNAポリメラーゼを細胞内で発現させればよい。転写産物の3'端を制御するには、例えば転写産物の3'端に自己切断型リボザイムをコードさせておき、このリボザイムにより正確に3'端が切り出されるようにすることができる（Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997、Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587 及び Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466）。【００４４】
例えば、外来遺伝子を有する組み換えセンダイウイルスは、Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997、Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587 及び Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466の記載等に準じて、次のようにして構築することができる。【００４５】
まず、目的の外来遺伝子のcDNA塩基配列を含むDNA試料を用意する。DNA試料は、25ng/micro-L 以上の濃度で電気泳動的に単一のプラスミドと確認できることが好ましい。以下、NotI部位を利用してウイルスゲノムRNAをコードするDNAに外来遺伝子を挿入する場合を例にとって説明する。目的とするcDNA塩基配列の中にNotI認識部位が含まれる場合は、部位特異的変異導入法などを用いて、コードするアミノ酸配列を変化させないように塩基配列を改変し、NotI部位を予め除去しておくことが好ましい。この試料から目的の遺伝子断片をPCRにより増幅し回収する。2つのプライマーの5'部分にNotI部位を付加しておくことにより、増幅された断片の両端をNotI部位とする。ウイルスゲノム上に挿入された後の外来遺伝子のORFとその両側のウイルス遺伝子のORFとの間にE-I-S配列が配置されるように、プライマー中にE-I-S配列を含めるように設計する。【００４６】
例えば、フォワード側合成DNA配列は、NotIによる切断を保証するために 5'側に任意の２以上のヌクレオチド（好ましくはGCGおよびGCCなどのNotI認識部位由来の配列が含まれない４塩基、更に好ましくはACTT）を選択し、その3'側にNotI認識部位gcggccgcを付加し、さらにその3'側にスペーサー配列として任意の９塩基または９に６の倍数を加えた数の塩基を付加し、さらにその3'側に所望のcDNAの開始コドンATGからこれを含めてORFの約25塩基相当の配列を付加した形態とする。最後の塩基はGまたはCとなるように該所望のcDNAから約25塩基を選択してフォワード側合成オリゴDNAの3'の末端とすることが好ましい。【００４７】
リバース側合成DNA配列は5'側から任意の２以上のヌクレオチド（好ましくはGCGおよびGCCなどのNotI認識部位由来の配列が含まれない４塩基、更に好ましくはACTT）を選択し、その3'側にNotI認識部位gcggccgcを付加し、さらにその3'側に長さを調節するための挿入断片のオリゴDNAを付加する。このオリゴDNAの長さは、最終的なPCR増幅産物のNotI断片の鎖長が６の倍数になるように塩基数を設計する（いわゆる「6のルール（rule of six）」； Kolakofski, D. et al., J. Virol. 72:891-899, 1998; Calain, P. and Roux, L., J. Virol. 67:4822-4830, 1993; Calain, P. and Roux, L., J. Virol. 67: 4822-4830, 1993）。このプライマーにE-I-S配列を付加する場合には、挿入断片のオリゴDNAの3'側にセンダイウイルスのS配列、I配列、およびE配列の相補鎖配列、好ましくはそれぞれ 5'-CTTTCACCCT-3'（配列番号：１）、5'-AAG-3'、および 5'-TTTTTCTTACTACGG-3'（配列番号：２）を付加し、さらにその3'側に所望のcDNA配列の終始コドンから逆に数えて約25塩基相当の相補鎖の最後の塩基がGまたはCになるように長さを選択して配列を付加し、リバース側合成DNAの3'の末端とする。【００４８】
PCRは、Taqポリメラーゼまたはその他のDNAポリメラーゼを用いる通常の方法を用いることができる。増幅した目的断片はNotIで消化した後、pBluescript等のプラスミドベクターのNotI部位に挿入する。得られたPCR産物の塩基配列をシークエンサーで確認し、正しい配列のプラスミドを選択する。このプラスミドから挿入断片をNotIで切り出し、ゲノムcDNAを含むプラスミドのNotI部位にクローニングする。またプラスミドベクターを介さずにゲノムcDNAのNotI部位に直接挿入し、組み換えセンダイウイルスcDNAを得ることも可能である。【００４９】
例えば、組み換えセンダイウイルスゲノムcDNAであれば、文献記載の方法に準じて構築することができる（Yu, D. et al., Genes Cells 2: 457-466, 1997; Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997）。例えば、NotI制限部位を有する18bpのスペーサー配列（5'-(G)-CGGCCGCAGATCTTCACG-3'）（配列番号：３）を、クローニングされたセンダイウイルスゲノムcDNA（pSeV(+)）のリーダー配列とN蛋白質のORFとの間に挿入し、デルタ肝炎ウイルスのアンチゲノム鎖（antigenomic strand）由来の自己開裂リボザイム部位を含むプラスミドpSeV18+ b(+)を得る（Hasan, M. K. et al., 1997, J. General Virology 78: 2813-2820）。pSeV18+ b(+)のNotI部位に外来遺伝子断片を挿入し、所望の外来遺伝子が組み込まれた組み換えセンダイウイルスcDNAを得ることができる。【００５０】
このようにして作製した組み換えウイルスのゲノムRNAをコードするDNAを、上記のウイルス蛋白質（L、P、およびN）存在下において細胞内で転写させることにより、ウイルスを再構成することができる。【００５１】
また、組み換えウイルスの再構成は公知の方法を利用しても行うことができる（WO97/16539; WO97/16538; Durbin, A. P. et al., 1997, Virology 235: 323-332; Whelan, S. P. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell. M. J. et al., 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F. et al., 1995, EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481; Garcin, D. et al., 1995, EMBO J. 14: 6087-6094; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Baron, M. D. and Barrett, T., 1997, J. Virol. 71: 1265-1271; Bridgen, A. and Elliott, R. M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404）。これらの方法により、パラインフルエンザ、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、リンダーペストウイルス、センダイウイルスなどを含むマイナス鎖RNAウイルスをDNAから再構成させることができる。これらの方法に準じて、本発明のウイルスを再構成させることができる。ウイルスDNAにおいて、F遺伝子、HN遺伝子、および/またはM遺伝子を欠失させた場合には、そのままでは感染性のウイルス粒子を形成しないが、宿主細胞に、これら欠失させた遺伝子および/または他のウイルスのエンベロープ蛋白質をコードする遺伝子などを別途、細胞に導入し発現させることにより、感染性のウイルス粒子を形成させることが可能である。【００５２】
具体的な手順は、（ａ）マイナス鎖RNAウイルスゲノムRNA（ネガティブ鎖RNA）またはその相補鎖（ポジティブ鎖）をコードするcDNAを、N、P、およびL蛋白質を発現する細胞で転写させる工程、（ｂ）生成したマイナス鎖RNAウイルスを含む培養上清を回収する工程、により製造することができる。転写のために、ゲノムRNAをコードするDNAは適当なプロモーターの下流に連結される。転写されたゲノムRNAは N、L、およびP蛋白質の存在下で複製されRNP複合体を形成する。そして M、HN、およびF蛋白質の存在下でエンベロープに包まれたウイルス粒子が形成される。ゲノムRNAをコードするDNAは、例えばT7プロモーターの下流に連結させ、T7 RNA ポリメラーゼによりRNAに転写させる。プロモーターとしては、T7ポリメラーゼの認識配列を含むもの以外にも所望のプロモーターを利用することができる。あるいは、インビトロで転写させたRNAを細胞にトランスフェクトしてもよい。【００５３】
DNAからのゲノムRNAの最初の転写に必要なT7 RNAポリメラーゼ等の酵素は、これを発現するプラスミドまたはウイルスベクターの導入によって供給することができるし、または、例えば細胞の染色体にRNAポリメラーゼ遺伝子を、発現を誘導できるように組み込んでおき、ウイルス再構成時に発現を誘導することにより供給することもできる。またゲノムRNA、およびウイルス再構成に必要なウイルス蛋白質は、例えばこれらを発現するプラスミドの導入によって供給する。これらのウイルス蛋白質の供給において、野生型またはある種の変異マイナス鎖RNAウイルスなどのヘルパーウイルスを用いることもできる。【００５４】
ゲノムRNAを発現するDNAを細胞内に導入する方法には、例えば次のような方法、(i) 目的の細胞が取り込めるようなDNA沈殿物を作る方法、(ii) 目的の細胞による取りこみに適し、かつ細胞毒性の少ない陽電荷特性を持つDNAを含む複合体を作る方法、(iii) 目的の細胞膜に、DNA分子が通り抜けられるだけに十分な穴を電気パルスによって瞬間的に開ける方法などがある。【００５５】
(ii)としては、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。例えば、DOTMA（Roche）、Superfect（QIAGEN #301305）、DOTAP、DOPE、DOSPER（Roche #1811169）などが挙げられる。(i)としては例えばリン酸カルシウムを用いたトランスフェクション法が挙げられ、この方法によって細胞内に入ったDNAは貪食小胞に取り込まれるが、核内にも十分な量のDNAが入ることが知られている（Graham, F. L. and Van Der Eb, J., 1973, Virology 52: 456; Wigler, M. and Silverstein, S., 1977, Cell 11: 223）。ChenおよびOkayamaはトランスファー技術の最適化を検討し、1) 細胞と共沈殿物のインキュベーション条件を 2〜4％ CO2、35℃、15〜24時間、2) DNAは直鎖状より環状のものが活性が高く、3) 沈殿混液中のDNA濃度が 20〜30 micro-g/mlのとき最適な沈殿が得られると報告している（Chen, C. and Okayama, H., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2745）。(ii)の方法は、一過的なトランスフェクションに適している。古くはDEAE-デキストラン（Sigma #D-9885 M.W. 5×105）混液を所望のDNA濃度比で調製し、トランスフェクションを行う方法が知られている。複合体の多くはエンドソームの中で分解されてしまうため、効果を高めるためにクロロキンを加えることもできる（Calos, M. P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015）。(iii)の方法は電気穿孔法と呼ばれる方法で、細胞選択性がないという点で(i)または(ii)の方法に比べて汎用性が高い。効率はパルス電流の持続時間、パルスの形、電界（電極間のギャップ、電圧）の強さ、バッファーの導電率、DNA濃度、細胞密度の最適条件下で良いとされている。【００５６】
以上、３つのカテゴリーの中で(ii)の方法は操作が簡便で多量の細胞を用いて多数の検体を検討することができるので、ウイルス再構成のためのDNAの細胞への導入には、トランスフェクション試薬が適している。好適には Superfect Transfection Ragent（QIAGEN, Cat No. 301305）、または DOSPER Liposomal Transfection Reagent（Roche, Cat No. 1811169）が用いられるが、これらに制限されない。【００５７】
cDNAからのウイルスの再構成は具体的には例えば以下のようにして行うことができる。
24穴から６穴程度のプラスチックプレートまたは100mmペトリ皿等で、10％ウシ胎児血清(FCS)および抗生物質（100 units/ml ペニシリンGおよび100 micro-g/ml ストレプトマイシン）を含む最少必須培地（MEM)を用いてサル腎臓由来細胞株LLC-MK2（ATCC CCL-7）をほぼ100％コンフルエントになるまで培養し、例えば 1 micro-g/ml psoralen（ソラレン）存在下、紫外線 (UV) 照射処理を20分処理で不活化した、T7 RNAポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウイルスvTF7-3（Fuerst, T. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8122-8126,1986、Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996）を2 PFU/細胞で感染させる。ソラレンの添加量およびUV照射時間は適宜調整することができる。感染1時間後、2〜60 micro-g、より好ましくは3〜20 micro-gの組換えセンダイウイルスのゲノムRNAをコードするDNAを、ウイルスRNPの生成に必須なトランスに作用するウイルス蛋白質を発現するプラスミド（0.5〜24 micro-gのpGEM-N、0.25〜12 micro-gのpGEM-P、および0.5〜24 micro-gのpGEM-L)（Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996）と共にSuperfect（QIAGEN社）を用いたリポフェクション法等によりトランスフェクションする。N、P、およびLをコードする発現ベクターの量比は例えば 2：1：2 とすることが好ましく、プラスミド量は、例えば1〜4 micro-gのpGEM-N、0.5〜2 micro-gのpGEM-P、および1〜4 micro-gのpGEM-L程度で適宜調整する。【００５８】
トランスフェクションを行った細胞は、所望により100 micro-g/mlのリファンピシン（Sigma）及びシトシンアラビノシド（AraC）、より好ましくは40 micro-g/mlのシトシンアラビノシド（AraC）（Sigma）のみを含む血清不含のMEMで培養し、ワクシニアウイルスによる細胞毒性を最少にとどめ、ウイルスの回収率を最大にするように薬剤の最適濃度を設定する（Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579）。トランスフェクションから48〜72時間程度培養後、細胞を回収し、凍結融解を３回繰り返して細胞を破砕した後、RNPを含む破砕物をLLC-MK2細胞に再度トランスフェクションして培養する。または、培養上清を回収し、LLC-MK2細胞の培養液に添加して感染させ培養する。トランスフェクションは、例えばリポフェクトアミンまたはポリカチオニックリポソームなどと共に複合体を形成させて細胞に導入することが可能である。具体的には、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。例えば、DOTMA（Roche）、Superfect（QIAGEN #301305）、DOTAP、DOPE、DOSPER（Roche #1811169）などが挙げられる。エンドソーム中での分解を防ぐため、クロロキンを加えることもできる（Calos, M. P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015）。RNPが導入された細胞では、RNPからのウイルス遺伝子の発現およびRNPの複製の過程が進行しウイルスが増幅する。得られたウイルス溶液を希釈（例えば106 倍）して再増幅を繰り返すことにより、ワクシニアウイルスvTF7-3は完全に除去することができる。再増幅は、例えば３回以上繰り返す。得られたウイルスは-80℃で保存することができる。エンベロープ蛋白質をコードする遺伝子を欠損した伝播能を持たないウイルスを再構成させるには、エンベロープ蛋白質を発現するLLC-MK2細胞をトランスフェクションに使用するか、またはエンベロープ発現プラスミドを共にトランスフェクションすればよい。また、トランスフェクションを行った細胞にエンベロープ蛋白質を発現するLLC-MK2細胞を重層して培養することによって欠損型ウイルスを増幅することもできる（国際公開番号 WO00/70055 および WO00/70070参照）。【００５９】
回収されたウイルスの力価は、例えばCIU（Cell-Infected Unit）測定または赤血球凝集活性(HA)の測定することにより決定することができる（WO00/70070; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Yonemitsu, Y. & Kaneda, Y., Hemaggulutinating virus of Japan-liposome-mediated gene delivery to vascular cells. Ed. by Baker AH. Molecular Biology of Vascular Diseases. Method in Molecular Medicine: Humana Press: pp. 295-306, 1999）。また、GFP（緑色蛍光蛋白質）などのマーカー遺伝子を搭載したウイルスについては、マーカーを指標に直接的に感染細胞をカウントすることにより力価を定量することができる（例えばGFP-CIUとして）。このようにして測定した力価は、CIUと同等に扱うことができる（WO00/70070）。【００６０】
ウイルスが再構成する限り、再構成に用いる宿主細胞は特に制限されない。例えば、センダイウイルス等の再構成においては、サル腎由来のLLC-MK2細胞およびCV-1細胞、ハムスター腎由来のBHK細胞などの培養細胞、ヒト由来細胞等を使うことができる。これらの細胞に適当なエンベロープ蛋白質を発現させることで、その蛋白質をエンベロープに有する感染性ウイルス粒子を得ることもできる。また、大量にセンダイウイルスを得るために、上記の宿主から得られたウイルスを発育鶏卵に感染させ、該ウイルスを増幅することができる。鶏卵を使ったウイルスの製造方法は既に開発されている（中西ら編,(1993),「神経科学研究の先端技術プロトコールIII, 分子神経細胞生理学」, 厚生社, 大阪, pp.153-172）。具体的には、例えば、受精卵を培養器に入れ9〜12日間 37〜38℃で培養し、胚を成長させる。ウイルスを尿膜腔へ接種し、数日間（例えば３日間）卵を培養してウイルスを増殖させる。培養期間等の条件は、使用する組み換えセンダイウイルスにより変わり得る。その後、ウイルスを含んだ尿液を回収する。尿液からのセンダイウイルスの分離・精製は常法に従って行うことができる（田代眞人,「ウイルス実験プロトコール」, 永井、石浜監修, メジカルビュー社, pp.68-73,(1995)）。【００６１】
例えば、F遺伝子を欠失したセンダイウイルスの構築と調製は、以下のように行うことができる（WO00/70055 および WO00/70070参照）。【００６２】
＜１＞ F遺伝子欠失型センダイウイルスゲノムcDNAおよびF発現プラスミドの構築
センダイウイルス（SeV）全長ゲノムcDNA、pSeV18+b(+)（Hasan, M. K. et al., 1997, J. General Virology 78: 2813-2820）（「pSeV18+ b(+)」は「pSeV18+」ともいう）のcDNAをSphI/KpnIで消化してフラグメント(14673bp)を回収し、pUC18にクローニングしてプラスミドpUC18/KSとする。F遺伝子欠損部位の構築はこのpUC18/KS上で行う。F遺伝子の欠損は、PCR-ライゲーション方法の組み合わせで行い、結果としてＦ遺伝子のORF（ATG-TGA=1698bp）を除いて例えばatgcatgccggcagatga（配列番号：４）で連結し、Ｆ遺伝子欠失型SeVゲノムcDNA（pSeV18+/ΔF）を構築する。PCRは、Fの上流には［forward: 5'-gttgagtactgcaagagc／配列番号：５, reverse: 5'-tttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaacc／配列番号：６］、F遺伝子の下流には［forward: 5'-atgcatgccggcagatga／配列番号：７, reverse: 5'-tgggtgaatgagagaatcagc／配列番号：８］のプライマー対を用いたPCRの産物をEcoT22Iで連結する。このように得られたプラスミドをSacIとSalIで消化して、F遺伝子欠損部位を含む領域の断片（4931bp）を回収してpUC18にクローニングし、pUC18/dFSSとする。このpUC18/dFSSをDraIIIで消化して、断片を回収してpSeV18+のF遺伝子を含む領域のDraIII断片と置き換え、ライゲーションしてプラスミドpSeV18+/ΔF を得る。
外来遺伝子は、例えばpUC18/dFSSのＦ遺伝子欠失部位にある制限酵素 NsiI および NgoMIV 部位に挿入する。このためには、例えば外来遺伝子断片を、NsiI-tailedプライマーおよびNgoMIV-tailedプライマーで増幅すればよい。【００６３】
＜２＞ SeV-F蛋白を誘導発現するヘルパー細胞の作製
センダイウイルスのF遺伝子（SeV-F）を発現するCre/loxP誘導型発現プラスミドの構築はSeV-F遺伝子をPCRで増幅し、Cre DNAリコンビナーゼにより遺伝子産物が誘導発現されるように設計されたプラスミドpCALNdlw（Arai, T. et al., J. Virology 72, 1998, p1115-1121）のユニークサイト SwaI部位に挿入し、プラスミドpCALNdLw/Fを構築する。
F遺伝子欠損ゲノムから感染ウイルス粒子を回収するため、SeV-F蛋白を発現するヘルパー細胞株を樹立する。細胞は、例えばSeVの増殖によく用いられているサル腎臓由来細胞株LLC-MK2細胞を用いることができる。LLC-MK2細胞は、10％の熱処理した不動化ウシ胎児血清(FBS)、ペニシリンGナトリウム 50単位/ml、およびストレプトマイシン 50 micro-g/mlを添加したMEMで37℃、5％ CO2で培養する。SeV-F遺伝子産物は細胞傷害性を有するため、Cre DNAリコンビナーゼによりF遺伝子産物を誘導発現されるように設計された上記プラスミドpCALNdLw/Fを、リン酸カルシウム法（mammalian transfection kit (Stratagene)）により、周知のプロトコールに従ってLLC-MK2細胞に導入する。
10cmプレートを用い、40％コンフルエントまで生育したLLC-MK2細胞に10 micro-gのプラスミドpCALNdLw/Fを導入後、10mlの10% FBSを含むMEM培地にて、37℃の５％CO2 インキュベーター中で24時間培養する。24時間後に細胞をはがし、10ml培地に懸濁後、10cmシャーレ５枚を用い、5ml 1枚、2ml 2枚、0.2ml 2枚に蒔き、G418 (GIBCO-BRL)を1200 micro-g/mlを含む10mlの10%FBSを含むMEM培地にて培養を行い、２日毎に培地交換しながら、14日間培養し、遺伝子の安定導入株の選択を行う。該培地により生育してきたG418に耐性を示す細胞はクローニングリングを用いて回収する。回収した各クローンは10cmプレートでコンフルエントになるまで拡大培養を続ける。
F蛋白質の発現誘導は、細胞を6cmシャーレにてコンフルエントまで生育させた後、アデノウイルスAxCANCreを斉藤らの方法（Saito et al., Nucl. Acids Res. 23: 3816-3821 (1995); Arai, T.et al., J. Virol 72,1115-1121 (1998)）により例えば moi=3 で感染させて行うことができる。【００６４】
＜３＞ F遺伝子欠失SeVウイルスの再構築及び増幅
上記 pSeV18+/ΔF の外来遺伝子が挿入されたプラスミドを以下のようにしてLLC-MK2細胞にトランスフェクションする。LLC-MK2 細胞を5×106 cells/dish で100mmのシャーレに播く。T7 RNAポリメラーゼによりゲノムRNAの転写を行わせる場合には、細胞培養24時間後、ソラレン（psoralen）と長波長紫外線（365nm）で 20 分間処理したT7 RNAポリメラーゼを発現するリコンビナントワクシニアウイルス（PLWUV-VacT7：Fuerst, T.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126 (1986)）をMOI 2程度で室温で１時間感染させる。ワクシニアウイルスへの紫外線照射には、例えば15ワットバルブを5本が装備された UV Stratalinker 2400（カタログ番号 400676 (100V), ストラタジーン社, La Jolla, CA, USA）を用いることができる。細胞を無血清のMEMで洗浄した後、ゲノムRNAを発現するプラスミド、およびマイナス鎖RNAウイルスのそれぞれN、P、L、F、およびHN蛋白質を発現する発現プラスミドを、適当なリポフェクション試薬を用いてこの細胞にトランスフェクトする。プラスミドの量比は、これに限定されないが、好適には順に 6：2：1：2：2：2 とすることができる。例えば、ゲノムRNAを発現するプラスミド、並びにN、P、L、および FプラスHN蛋白質を発現する発現プラスミド（pGEM/NP，pGEM/P，pGEM/L及びpGEM/F-HN; WO00/70070, Kato, A. et al., Genes Cells 1, 569-579 (1996)）を、それぞれ12 micro-g, 4 micro-g, 2 micro-g, 4 micro-g及び4 micro-g／dishの量比トランスフェクトする。数時間培養後、血清を含まないMEMで細胞を２回洗浄し、40 micro-g/mLの Cytosine β-D-arabinofuranoside （AraC：Sigma, St.Louis, MO）及び7.5 micro-g/mLのTrypsin（Gibco-BRL, Rockville, MD）を含むMEMで培養する。これらの細胞を回収し、ペレットをOptiMEM に懸濁する（107 cells/ml）。凍結融解を３回繰り返してlipofection reagent DOSPER (Boehringer mannheim)と混合し（106cells/25 micro-L DOSPER）室温で15分放置した後、上記でクローニングしたF発現ヘルパー細胞にトランスフェクション（106cells /well 12-well-plate）し、血清を含まないMEM（40 micro-g/ml AraC, 7.5 micro-g/ml トリプシンを含む)で培養し、上清を回収する。F以外の遺伝子、例えばHNまたはM遺伝子を欠損したウイルスも、これと同様の方法で調製することができる。【００６５】
なお、本発明のマイナス鎖RNAウイルスは、組み換えウイルスでなく、天然のウイルスであっても使用することが可能であり、各RNAウイルスの精製方法、増殖方法、単離株の取得方法については、ウイルス学実験学 各論、改訂二版（国立予防衛生研究所学友会編、丸善、1982）を参照することができる。例えば、パラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）のセンダイウイルスなどパラインフルエンザウイルスは、各型ともサル腎臓（MK2）、ヒト胎児肺、腎臓、羊膜の初代培養細胞、およびトリプシン添加 Vero 細胞で良く増殖し（同上, p334；Itoh H et al., Jap.J.Med.Sci.Biol. 23, 227 (1970)）回収することができる。精製は、ショ糖密度勾配遠心法、平衡遠心法などで精製できる（p336）。麻疹ウイルスは、サル由来の各種細胞で良く増殖でき（Matsumoto M, Bact. Rev. 30, 152 (1966)）Vero 細胞が最も汎用されているが、CV1, FL, KB, HeLa HEp2 などを使用して増殖可能である（p351）。狂犬病ウイルスなどのラブドウイルス科（Rhabdoviridae）では組織培養法を用いて、BHK、CEおよびVero細胞などが使用されている。精製法としては、感染3〜4日の培養液をpH7.4以上に補正し、低速遠心で細胞片を除き濃縮する（p376）。ラッサウイルスなどのアレナウイルス科（Arenaviridae）は、in vitroで継代されているほとんどの培養細胞でよく増殖するが、HK-21/13S細胞に感染させた後、寒天中にsuspendした形で培養することによって増殖が可能である（Sedwik W.D.,J.Virol.1,1224（1967））（p240）。インフルエンザウイルスなどのオルソミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）は、発育鶏卵やMDCK細胞において増殖できる（p295）。精製は遠心分画法、赤血球への吸着・游出による精製（Laver W.G., Fundamental Techniques in Virology, 82 （1969））などで精製できる（p317）。【００６６】
本発明の一つの態様において、マイナス鎖RNAウイルスにより導入する外来遺伝子としては、特に制限はないが、天然の蛋白質としては、例えばホルモン、サイトカイン、増殖因子、受容体、細胞内シグナル分子、酵素、ペプチドなどが挙げられる。蛋白質は分泌蛋白質、膜蛋白質、細胞質蛋白質、核蛋白質などであり得る。人工的な蛋白質としては、例えば、キメラ毒素などの融合蛋白質、ドミナントネガティブ蛋白質（受容体の可溶性分子または膜結合型ドミナントネガティブ受容体を含む）、欠失型の細胞接着分子および細胞表面分子などが挙げられる。また、分泌シグナル、膜局在化シグナル、または核移行シグナル等を付加した蛋白質であってもよい。導入遺伝子としてアンチセンスRNA分子またはRNA切断型リボザイムなどを発現させて、特定の遺伝子の機能を抑制することもできる。外来遺伝子として疾患の治療用遺伝子を用いて本発明のウイルスを調製すれば、このウイルスを投与して遺伝子治療を行うことが可能となる。【００６７】
本明細書に記載したウイルス製造方法に従えば、本発明のウイルスは、例えば 1×105 CIU/mL以上、好ましくは 1×106 CIU/mL以上、より好ましくは 5×106 CIU/mL以上、より好ましくは 1×107 CIU/mL以上、より好ましくは 5×107 CIU/mL以上、より好ましくは 1×108 CIU/mL以上、より好ましくは 5×108 CIU/mL以上の力価でウイルス産生細胞の細胞外液中に放出させることが可能である。ウイルスの力価は、本明細書および他に記載の方法により測定することができる（Kiyotani, K. et al., Virology 177(1), 65-74 (1990); WO00/70070）。【００６８】
回収したウイルスは実質的に純粋になるよう精製することができる。精製方法はフィルトレーション（濾過）、遠心分離、吸着、およびカラム精製等を含む公知の精製・分離方法またはその任意の組み合わせにより行うことができる。「実質的に純粋」とはウイルスを含む溶液中でウイルスの成分が主要な割合を占めることを言う。例えば実質的に純粋なウイルス組成物は、溶液中に含まれる全蛋白質（但しキャリアーや安定剤として加えた蛋白質は除く）のうち、ウイルスの成分として含まれる蛋白質の割合が10% (重量/重量) 以上、好ましくは20%以上、より好ましくは50％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上を占めることにより確認することができる。例えばパラミクソウイルスであれば、具体的な精製方法としては、セルロース硫酸エステルまたは架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用いる方法（特公昭62-30752号公報、特公昭62-33879号公報、および特公昭62-30753号公報）、およびフコース硫酸含有多糖および/またはその分解物に吸着させる方法（WO97/32010）等を例示することができるが、これらに制限されない。【００６９】
本発明におけるマイナス鎖RNAウイルスは、例えば、感染性ウイルス粒子であっても非感染性ウイルス粒子であってもよい。また、本発明のRNAウイルスは、ゲノムRNA-蛋白複合体(ribonucleoprotein complex; RNP)であってもよい。これらの粒子もしくは複合体を利用する場合には、これら粒子もしくは複合体を、リポフェクション試薬と混合させてインビボ投与することが好ましい。例えばリポフェクトアミンやポリカチオニックリポソームなどと粒子もしくは複合体とを混合させて、その混合物をインビボ投与することができる（WO00/70055）。この方法においては、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。例えば、DOTMA（Boehringer）、Superfect（QIAGEN #301305）、DOTAP、DOPE、DOSPER（Boehringer #1811169）などが挙げられる。エンドソーム中での分解を防ぐため、クロロキンを加えることもできる（Calos, M.P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015）。【００７０】
本発明におけるマイナス鎖RNAウイルスを含む抗癌剤の製造においては、マイナス鎖RNAウイルスは必要に応じて薬理学的に許容される所望の担体または媒体と混合する（組み合わせる）ことができる。
即ち本発明は、マイナス鎖RNAウイルスと、薬学的に許容される担体または媒体とを混合する工程を含む、抗癌剤の製造方法を提供する。【００７１】
「薬学的に許容される担体または媒体」とは、マイナス鎖RNAウイルスと共に投与することが可能であり、マイナス鎖RNAウイルスの感染を有意に阻害しない材料である。このような担体または媒体としては、例えば脱イオン水、滅菌水、塩化ナトリウム溶液、デキストロース溶液、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸含有リンゲル溶液、培養液、血清、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）などが挙げられ、これらとマイナス鎖RNAウイルスを適宜組み合わせて製剤化することが考えられる。また、必要に応じて遠心などにより濃縮され、培養液または生理食塩水などの生理的溶液中に再懸濁されてよい。また、リポソームの膜安定化剤（例えばコレステロール等のステロール類）を含んでいてもよい。また、抗酸化剤（例えばトコフェロールまたはビタミンEなど）を含んでいてもよい。さらに、その他にも、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。また保存剤やその他の添加剤を添加することができる。本発明の組成物は、水溶液、カプセル、懸濁液、シロップなどの形態であり得る。また本発明のウイルス組成物は溶液、凍結乾燥物、またはエアロゾルの形態の組成物であってよい。凍結乾燥物の場合は安定化剤としてソルビトール、シュークロース、アミノ酸及び各種蛋白質等を含んでいてもよい。【００７２】
本発明のマイナス鎖RNAウイルスは抗癌活性を有しており、腫瘍（癌組織）に投与することにより抗癌（制癌）作用を発揮できる。つまり本発明は、マイナス鎖RNAウイルスを癌組織へ投与（インビボ投与）する工程を含む、癌の抑制方法（癌細胞増殖の抑制方法、または癌の治療方法）に関する。【００７３】
例えば、癌患者に対して癌治療を行うことができる。この方法は、マイナス鎖RNAウイルス（本発明の抗癌剤）を投与する工程を含む方法である。具体的には、マイナス鎖RNAウイルスの治療上有効量を、患者に投与する工程を含む方法である。本方法により、本発明のマイナス鎖RNAウイルスを投与しない場合に比べ、癌細胞の増殖を抑制することが期待できる。マイナス鎖RNAウイルスは、外来遺伝子を持たないものであってもよく、あるいは癌抗原、免疫刺激性サイトカイン、血管新生を阻害する蛋白質などの１つまたは複数をコードする遺伝子（外来遺伝子）を持つものであってもよい。【００７４】
本発明は、所望の固形癌に適用することができ、例えば舌癌、歯肉癌、悪性リンパ腫、悪性黒色腫(メラノーマ)、上顎癌、鼻癌、鼻腔癌、喉頭癌、咽頭癌、神経膠腫、髄膜腫、神経膠腫、肺癌、乳癌、膵癌、消化器癌（食道癌、胃癌、十二指腸癌、大腸癌）、扁平上皮癌、腺癌、肺胞上皮癌、睾丸腫瘍、前立腺癌、甲状腺癌、肝癌、卵巣癌、横紋筋肉腫、線維肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫などが挙げられる。対象となる癌は、好ましくは上皮癌であり、より好ましくは、皮膚扁平上皮癌、皮膚基底細胞癌、皮膚ボーエン病、皮膚ページェット病、皮膚悪性黒色腫などを含む皮膚癌である。【００７５】
本発明のマイナス鎖RNAウイルス（本発明の抗癌剤）のインビボでの投与量は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与目的、投与組成物の形態、投与方法、導入遺伝子等により異なるが、当業者であれば適宜決定することが可能である。投与経路は適宜選択することができるが、例えば経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、腹腔内、静脈内、関節内、または皮下等に行われうる。投与は局所あるいは全身であってよい。投与されるウイルスは好ましくは約105 CIU/mlから約1011 CIU/ml、より好ましくは約107 CIU/mlから約109 CIU/ml、最も好ましくは約1×108 CIU/mlから約5×108 CIU/mlの範囲内の量を薬学上容認可能な担体中で投与することが好ましい。ヒトにおいては１回当たりの投与量は 2×105 CIU〜 2×1011 CIUが好ましく、投与回数は、１回または臨床上容認可能な副作用の範囲で複数回可能であり、１日の投与回数についても同様である。ヒト以外の動物についても、例えば目的の動物とヒトとの体重比または投与標的部位の容積比（例えば平均値）で上記の投与量を換算した量を投与することができる。なお、伝播性のマイナス鎖RNAウイルスを個体または細胞に投与後、治療が完了するなどウイルスの増殖を抑止する必要が生じた際には、RNA依存性RNAポリメラーゼ阻害剤を投与すれば、宿主に障害を与えずにウイルスの増殖だけを特異的に抑止することもできる。【００７６】
本発明のマイナス鎖RNAウイルスを投与する場合は、好ましくは、患者の癌病巣に投与する。癌病巣とは、癌組織またはその周囲（例えば癌から5 mm以内、好ましくは3 mm以内）の領域を言う。なお投与量は、癌のタイプやステージ、導入遺伝子の有無等により適宜調節されてよい。マイナス鎖RNAウイルスは外来遺伝子を搭載していなくても抗腫瘍効果が期待されるが、より相乗的な効果を期待して、例えば、IFN-beta遺伝子または可溶性FGF受容体遺伝子などをRNAウイルスに搭載させることも可能である。【００７７】
マイナス鎖RNAウイルスの投与回数は、１回または臨床上容認可能な副作用の範囲で複数回可能であり、１日の投与回数についても同様である。投与対象としては特に制限はないが、例えば、ニワトリ、ウズラ、マウス、ラット、イヌ、ブタ、ネコ、ウシ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、サル、およびヒトなどを含む鳥類、哺乳動物（ヒトおよび非ヒト哺乳動物）が挙げられる。ヒト以外の動物に投与する場合は、例えば目的の動物とヒトとの体重比で上記の投与量を換算した量を投与することができる。【００７８】
また本発明は、マイナス鎖RNAウイルスの、癌治療における使用に関する。また、本発明は、マイナス鎖RNAウイルスの、抗癌剤（または制癌剤、癌増殖抑制剤など）の製造における使用に関する。【００７９】
また本発明は、マイナス鎖RNAウイルスを含むパッケージであって、該マイナス鎖RNAウイルスを癌抑制に（抗癌剤として）使用することの記載を含むパッケージに関する。マイナス鎖RNAウイルスは、培養液または生理食塩水などの溶液中に懸濁されていてよい。癌抑制に使用することとは、例えばマイナス鎖RNAウイルス、またはそれを含む組成物が、腫瘍増殖抑制、癌の縮退、癌治療、癌患者の処置・治療、癌患者の延命、または抗癌剤として用いられることである。該記載は、パッケージに直接記載されていてもよいし、該記載を含む紙やシールをパッケージに含んでいてもよい。パッケージは、マイナス鎖RNAウイルスを含む容器であってよく、その場合、容器は、例えばボトル、チューブ、ビニールバッグ、バイアル、シリンジ等であってよい。また本発明のパッケージは、該容器を収納するバッグまたは外箱等を含んでもよい。パッケージには、マイナス鎖RNAウイルスの投与方法が記載された説明書を含んでもよく、マイナス鎖RNAウイルス投与のためのシリンジ、カテーテル、および/または注射針等をさらに含んでもよい。【００８０】
さらに本発明は、マイナス鎖RNAウイルスを少なくとも構成成分として含有する、癌治療用もしくは抗癌剤製造用キットに関する。本発明のキットは、マイナス鎖RNAウイルス以外に、例えば、担体、生理食塩水、緩衝液、ボトル、チューブ、ビニールバッグ、バイアル、シリンジ等を、適宜含んでいてもよい。また、使用書をパッケージングすることもできる。
なお、本明細書中に引用された文献は、すべて本明細書の一部として組み込まれる。
【実施例】
【００８１】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。【００８２】
〔実施例１〕  治療遺伝子を持たないセンダイウイルスによる抗腫瘍効果
メラノーマ細胞株 B16F1（ATCC CRL-6323）1×105個を、C57BL/6マウス（６〜８週齢、雌）の腹側皮下へ接種した（n = 4）。接種後5日（day 5）および12日（day 12）に、特別な治療遺伝子を有さないセンダイウイルス（GFP発現SeV；SeV-GFP）、ヒト可溶型FGF受容体を発現するセンダイウイルス（SeV-sFGFR）、またはヒトPDGFRα可溶型を発現するセンダイウイルス（SeV-hsPDGFRα）、各1×108PFUを腫瘍内注射し、以降、腫瘍サイズを経時的に測定した。
その結果、いずれのSeV投与群においても、SeV非投与群に比べて腫瘍サイズが有意に縮小した（図１）。このように、SeVのインビボ投与は、治療遺伝子を持たないものであっても抗腫瘍効果を発揮することができた。可溶型FGF受容体を発現するSeVを投与した場合は、SeV-GFP投与群よりも強い腫瘍増殖抑制効果が確認され、可溶型PDGFRαを発現するSeVを投与した場合の抗腫瘍効果は最も顕著で、腫瘍サイズはほどんど増加しなかった。
以上から、治療遺伝子等の外来遺伝子を持たないSeVであっても、十分な抗腫瘍効果を発揮することが明らかとなった。【００８３】
〔実施例２〕  治療遺伝子(IFNβ)を有するセンダイウイルスによる抗腫瘍効果
本実施例は、RNAウイルスのインビボおよびエクスビボ投与による腫瘍の治療方法の一例を示す。
腫瘍モデルとして、MHC Class Iを非常に低いレベルでしか発現せず免疫原性に乏しいB16メラノーマの移植モデルを採用した。腫瘍モデルマウスには、C57BL/6マウス（6〜8週齢、メス）（日本チャールズ・リバー）を用い、樹状細胞はC57BL/6マウス（8週齢、メス）（日本チャールズ・リバー）より採取した。樹状細胞は、C57BL/6 マウスの大腿骨より骨髄を採取し、SpinSepTM, murine hematopoetic progenitor enrichmentcocktail (抗CD5抗体, 抗CD45R抗体, 抗CD11b抗体, 抗Gr-1抗体,抗TER119抗体, 抗7/4抗体、StemCell technology) を使用し、T cellを除去した後、IL-4およびGM-CSFを添加し1週間培養して得た。1 x 105/100 micro-L のB16メラノーマ細胞をday 0にマウスの腹部皮下 (s.c.) 接種した。Day 10、17、および24に、活性化刺激を加えない樹状細胞、LPSで活性化させた樹状細胞 (LPS DC)、あるいはSeV-GFPまたはマウスインターフェロンβを発現するSeV-IFNβを導入して活性化させた樹状細胞 (それぞれSeV GFP DCまたはSeV IFNβ DC) を腫瘍周囲に投与した。このとき、樹状細胞に腫瘍抗原（B16のfreeze and thawによる腫瘍ライセート）をパルスしてから投与する実験も行った。これらとは別に、腫瘍接種後10日目 (day 10) にSeV-IFNβを直接、腫瘍内注入 (intratumoral injection) して抗腫瘍効果を調べる実験も行った。
樹状細胞へのSeVの導入では、上記のように1週間培養した樹状細胞にSeV-IFNβをMOI 40で感染させ、8時間培養した。腫瘍抗原をパルスする場合は、上記のように1週間培養した樹状細胞を回収し、腫瘍抗原となるtumor lysateをパルス (DC : tumor lysate= 1 : 3) し、18時間培養した後、SeV-IFNβをMOI 40で感染させ、8時間培養した。その後、これらの樹状細胞を回収し、5x105 から 10x105 細胞数をマウスの腫瘍周囲に投与した。【００８４】
図２に示すように、SeV-IFNβの直接腫瘍内注入および樹状細胞を介したエクスビボ投与は、どちらも腫瘍増殖を抑制した。特にDC/SeV-IFNβで処理したマウスでは、非常に強い腫瘍抑制効果が観察された。【００８５】
上記の各治療群における抗腫瘍効果をより詳細に検討した。ナチュラルキラー (NK) 細胞活性をアッセイするために、上記の各治療群について、3回のDC療法終了7日後のマウスより脾臓を摘出し、エフェクター細胞を作成した。ターゲットとしてYac-1を使用し、51Cr放出アッセイを行った。また、Tリンパ球の細胞傷害性をアッセイするため、上記のNK細胞活性アッセイに使用した脾臓細胞の残りを用いて、B16の腫瘍抗原であるTRP-2ペプチドとともに、5日間培養した細胞をエフェクター細胞として用い、mTRP-2ペプチドをパルスしたEL-4ターゲット細胞と共培養し、51Cr放出アッセイを行った。特異的51Cr放出の割合は以下のように計算した。
[(試料のcpm - 自発放出のcpm) / (最大放出のcpm - 自発放出のcpm)] x 100
ここで、最大放出は1% triton X と共にインキュベートしたターゲット細胞、自発放出は培養液のみでインキュベートしたターゲット細胞を用いた。【００８６】
ナチュラルキラー (NK) 細胞の活性化は、直接SeVを注入したマウスにのみ見られ、樹状細胞投与群では検出されなかった（図３）。これに対して、細胞傷害性Tリンパ球 (cytotoxic T-lymphocytes, CTL) の活性化は、DC/LPS処理群およびDC/SeV-IFNβで処理したマウスで最も強く、DC/SeV-GFP処理群ではそれよりも若干弱く、SeV-IFNβの直接注入群では検出されなかった（図４）。腫瘍ライセートのパルスは、腫瘍増殖にもCTL応答にも有意に影響しなかった。このように、SeV-IFNβの直接投与はNK細胞を強く活性化することが判明した。
従って、SeVを投与した場合の腫瘍抑制効果は、NK細胞の活性化を機序とするものであることが示唆された。さらに、治療遺伝子を持たないSeVを投与することに加えて、治療効果が期待される遺伝子を有するSeVを投与することによっても、癌に対して、より有効な治療効果が発揮されることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明により、マイナス鎖RNAウイルスを有効成分とする抗癌剤が提供された。本発明のRNAウイルスは、治療効果を有する外来遺伝子を持たない状態で、効果的な癌治療効果が発揮されることから、外来遺伝子の導入のためのコストの削減、およびウイルスの調製のための操作時間の削減に大きく寄与するものと考えられる。本発明は、マイナス鎖RNAウイルスによる新たなウイルス療法を可能にする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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