【手続補正書】
【提出日】令和2年7月27日(2020.7.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
操作されたＦｏｋＩ切断ハーフドメインであって、前記操作された切断ハーフドメインが、以下の置換変異：
（ｉ）４８１位における野生型のＧｌｎ（Ｑ）残基が、Ａｌａ（Ａ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）またはＳｅｒ（Ｓ）残基で置換される（Ｑ４８１Ａ、Ｑ４８１Ｃ、Ｑ４８１Ｄ、Ｑ４８１ＥまたはＱ４８１Ｓ）；
（ｉｉ）４１８位における野生型のＳｅｒ（Ｓ）残基が、Ｇｌｕ（Ｅ）またはＡｓｐ（Ｄ）残基で置換される（Ｓ４１８ＥまたはＳ４１８Ｄ）；
（ｉｉｉ）４７９位における野生型のＩｌｅ（Ｉ）残基が、Ｇｌｎ（Ｑ）またはＴｈｒ（Ｔ）残基で置換される（Ｉ４７９ＱまたはＩ４７９Ｔ）；
（ｉｖ）４７８位における野生型のＰｒｏ（Ｐ）残基が、Ａｓｐ（Ｄ）残基で置換される（Ｐ４７８Ｄ）；
（ｖ）５２５位における野生型のＬｙｓ（Ｋ）残基が、Ａｌａ（Ａ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）またはＶａｌ（Ｖ）残基で置換される（Ｋ５２５Ａ、Ｋ５２５Ｃ、Ｋ５２５Ｅ、Ｋ５２５Ｉ、Ｋ５２５Ｓ、Ｋ５２５ＴまたはＫ５２５Ｖ）；
（ｖｉ）４１６位における野生型のＡｒｇ（Ｒ）残基が、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｈｉｓ（Ｈ）またはＡｓｎ（Ｎ）残基で置換される（Ｒ４１６Ｄ、Ｒ４１６Ｅ、Ｒ４１６ＨまたはＲ４１６Ｎ）；
（ｖｉｉ）４８０位における野生型のＧｌｙ（Ｇ）残基が、Ａｓｐ（Ｄ）残基で置換される（Ｇ４８０Ｄ）；
（ｖｉｉｉ）４７２位における野生型のＳｅｒ（Ｓ）残基が、Ａｓｐ（Ｄ）残基で置換される（Ｓ４７２Ｄ）；
（ｉｘ）４７６位における野生型のＡｓｎ（Ｎ）残基が、Ｇｌｕ（Ｅ）またはＧｌｙ（Ｇ）残基で置換される（Ｎ４７６ＥまたはＮ４７６Ｇ）；
（ｘ）５２７位における野生型のＡｓｎ（Ｎ）残基が、Ａｓｐ（Ｄ）残基で置換される（Ｎ５２７Ｄ）；
（ｘｉ）５３１位における野生型のＧｌｎ（Ｑ）残基が、Ａｒｇ（Ｒ）またはＴｈｒ（Ｔ）残基で置換される（Ｑ５３１ＲまたはＱ５３１Ｔ）；
（ｘｉｉ）４２２位における野生型のＡｒｇ（Ｒ）残基が、Ｈｉｓ（Ｈ）残基で置換さ
れる（Ｒ４２２Ｈ）；
（ｘｉｉｉ）４４６位における野生型のＳｅｒ（Ｓ）残基が、Ａｓｐ（Ｄ）残基で置換される（Ｓ４４６Ｄ）；
（ｘｉｖ）４４８位における野生型のＬｙｓ（Ｋ）残基が、Ａｌａ（Ａ）残基で置換される（Ｋ４４８Ａ）；
（ｘｖ）５２３位における野生型のＨｉｓ（Ｈ）残基が、Ｇｌｕ（Ｅ）残基で置換される（Ｈ５２３Ｅ）；
（ｘｖｉ）４２４位における野生型のＬｅｕ（Ｌ）残基が、Ｐｈｅ（Ｆ）残基で置換される（Ｌ４２４Ｆ）；及び
（ｘｖｉｉ）５４２位における野生型のＡｓｎ（Ｎ）が、Ａｓｐ（Ｄ）残基で置換される（Ｎ５４２Ｄ）；
の１つ以上を含み、
前記アミノ酸残基が、配列番号１に示される完全長ＦｏｋＩ野生型切断ドメインに対して、完全長ＦｏｋＩタンパク質のアミノ酸残基３８４で開始して、番号付けされる、
前記操作されたＦｏｋＩ切断ハーフドメイン。
【請求項２】
４８１位における野生型のＧｌｎ（Ｑ）残基が、Ａｌａ（Ａ）残基で置換される、請求項１に記載の操作された切断ハーフドメイン。
【請求項３】
以下の変異：
Ｒ４１６Ｄ、Ｒ４１６Ｅ、Ｒ４１６Ｈ、もしくはＲ４１６Ｎ変異及びＲ４２２Ｈ変異；Ｒ４１６Ｄ、Ｒ４１６Ｅ、Ｒ４１６Ｈ、もしくはＲ４１６Ｎ変異及びＫ４４８Ａ変異；Ｋ４４８Ａ及びＩ４７９Ｑ変異；Ｋ４４８Ａ及びＱ４８１Ａ変異；ならびに／または、Ｋ４４８Ａ変異及びＫ５２５Ａ、Ｋ５２５Ｃ、Ｋ５２５Ｅ、Ｋ５２５Ｉ、Ｋ５２５Ｓ、Ｋ５２５ＴもしくはＫ５２５Ｖ変異、
を含む、請求項１または２に記載の操作された切断ハーフドメイン。
【請求項４】
さらに、４３２、４４１、４８３、４８６、４８７、４９０、４９６、４９９、５２７、５３７、５３８及び５５９位のうちの１つ以上において追加のアミノ酸変異を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の操作された切断ハーフドメイン。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の第１の操作された切断ハーフドメインと、第２の切断ハーフドメインとを含む、ヘテロ二量体。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の操作された切断ハーフドメインと、ＤＮＡ結合ドメインとを含む、人工ヌクレアーゼ。
【請求項７】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥエフェクタードメイン、またはシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む、請求項６に記載の人工ヌクレアーゼ。
【請求項８】
前記ジンクフィンガータンパク質が、３〜６個のジンクフィンガードメインを含み、前記ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインの各々が、２つのβ−シート、α−ヘリックス、ヌクレオチド配列に結合する認識ヘリックス領域を含み、さらに、前記ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインの１つ以上が、α−ヘリックス領域の開始に対して番号付けして、（−５）、（−９）及び／または（−１４）位における１つ以上の変異を含む、請求項７に記載の人工ヌクレアーゼ。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の前記操作された切断ハーフドメイン、請求項５に記載の前記第１及び第２の操作された切断ドメイン、または請求項６〜８のいずれか一項
に記載の人工ヌクレアーゼ、をコードする、１つ以上のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の前記操作された切断ハーフドメイン、請求項５に記載のヘテロ二量体、請求項６〜８のいずれか一項に記載の人工ヌクレアーゼ、または請求項９に記載のポリヌクレオチド、を含む、単離された細胞。
【請求項１１】
ゲノム細胞クロマチンを対象領域において切断するためのインビトロ方法であって、
前記方法が、請求項６〜８のいずれか一項に記載の操作された切断ドメインを含む人工ヌクレアーゼを細胞内で発現させることを含み、
前記ヌクレアーゼが、前記ゲノム細胞クロマチンの前記対象領域内でヌクレオチド配列を部位特異的に切断する、前記インビトロ方法。
【請求項１２】
前記細胞を、ドナーポリヌクレオチドと接触させることをさらに含み、前記細胞クロマチンの切断が、前記ドナーポリペプチドと前記細胞クロマチンとの間の相同組換えを容易にする、請求項１１に記載のインビトロ方法。
【請求項１３】
ゲノム細胞クロマチンにおける少なくとも２つの標的部位を切断するインビトロ方法であって、前記方法が、ゲノム細胞クロマチンにおける少なくとも第１及び第２の標的部位を切断することを含み、各標的部位が、請求項６〜８のいずれか一項に記載の人工ヌクレアーゼを含む組成物を用いて切断される、前記インビトロ方法。
【請求項１４】
疾患の治療または予防に用いるための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の前記操作された切断ハーフドメイン、請求項５に記載のヘテロ二量体、請求項６〜８のいずれか一項に記載の人工ヌクレアーゼ、または請求項１０に記載の単離された細胞。
【請求項１５】
第１の人工ヌクレアーゼをコードする請求項９に記載の第１のポリヌクレオチド及び第２の人工ヌクレアーゼをコードする請求項９に記載の第２のポリヌクレオチドを含む、組成物であって、前記第１及び第２の人工ヌクレアーゼの比は、１：１ではなく、任意に、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：８、１：９、１：１０、１：２０または１：３０の比である、前記組成物。
【請求項１６】
操作されたヌクレアーゼ切断特異性を増大するためのインビトロ方法であって、前記方法は、細胞を、請求項１〜４のいずれか一項に記載の操作された切断ハーフドメインパートナーを含む操作されたヌクレアーゼ複合体と接触させることを含み、前記パートナーの比は、１：１ではなく、任意に：
（ｉ）１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：８、１：９、１：１０もしくは１：２０、もしくはその間の任意の値、もしくは１：３０より大きな比であり；及び／または
（ｉｉ）各パートナーは、ｍＲＮＡとして細胞へ送達されるか、もしくは、各パートナーをコードするｍＲＮＡもしくはベクターの異なる量が送達されるウイルス性もしくは非ウイルス性ベクター中で送達される、
前記インビトロ方法。