【手続補正書】
【提出日】令和2年9月24日(2020.9.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ＣａｓＸポリペプチド、または前記ＣａｓＸポリペプチドをコードする核酸分子と、
ｂ）ＣａｓＸガイドＲＮＡ、または前記ＣａｓＸガイドＲＮＡをコードする１つ以上のＤＮＡ分子と
を含んでおり、
前記ＣａｓＸポリペプチドが、配列番号１または配列番号２または配列番号３に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記ＣａｓＸガイドＲＮＡが、標的核酸内のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、
前記ＣａｓＸポリペプチドが、前記ＣａｓＸガイドＲＮＡと複合体を形成し、前記標的核酸に結合する、
組成物。
【請求項２】
前記ＣａｓＸポリペプチドが、配列番号１または配列番号２または配列番号３に記載されるアミノ酸配列に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＣａｓＸガイドＲＮＡが、単一ガイドＲＮＡまたは二重ガイドＲＮＡである、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＣａｓＸポリペプチドが、
ａ）二本鎖標的核酸分子の一方の鎖のみを切断することができるニッカーゼであるか、または
ｂ）触媒能がないＣａｓＸポリペプチド（ｄＣａｓＸ）であり、
任意に、前記ＣａｓＸポリペプチドが、配列番号１のＤ６７２、Ｅ７６９、及びＤ９３５から選択されるものに対応する位置に１つ以上の突然変異を含む、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
ＤＮＡドナーテンプレートをさらに含んでおり、任意に、前記ＤＮＡドナーテンプレートが、標的核酸に対する相同性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
ａ）（ｉ）標的核酸にハイブリダイズし、任意に、１９〜３０ヌクレオチドの長さを有するガイド配列、及び
（ｉｉ）二重鎖形成セグメント   
を含む標的化因子配列と、
ｂ）前記標的化因子配列の前記二重鎖形成セグメントとハイブリダイズしてＣａｓＸポリペプチドに結合し得る二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）二本鎖を形成し、単一ガイドＲＮＡと複合される際に標的核酸に結合する活性化因子配列と
を含んでおり、
前記ＣａｓＸポリペプチドが、配列番号１または配列番号２または配列番号３に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
ＣａｓＸ単一ガイドＲＮＡ分子。
【請求項７】
請求項６に記載のＣａｓＸ単一ガイドＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ分子。
【請求項８】
ａ）配列番号１または配列番号２または配列番号３に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣａｓＸガイドＲＮＡと複合される際に標的核酸に結合するＣａｓＸポリペプチド、及び
ｂ）前記ＣａｓＸポリペプチドのＮ末端及び／またはＣ末端に融合される異種ポリペプチド
を含む、ＣａｓＸ融合ポリペプチド。
【請求項９】
前記ＣａｓＸポリペプチドが、配列番号１または配列番号２または配列番号３に記載されるアミノ酸配列に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
【請求項１０】
前記ＣａｓＸポリペプチドが、
ａ）二本鎖標的核酸分子の一方の鎖のみを切断することができるニッカーゼであるか、または
ｂ）触媒能がないＣａｓＸポリペプチド（ｄＣａｓＸ）であり、
任意に、前記ＣａｓＸポリペプチドが、配列番号１のＤ６７２、Ｅ７６９、及びＤ９３５から選択されるものに対応する位置に１つ以上の突然変異を含む、
請求項８または請求項９に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
【請求項１１】
前記異種ポリペプチドが、
ａ）標的細胞または標的細胞型上の細胞表面部分への結合をもたらす標的化ポリペプチドであるか、
ｂ）標的ＤＮＡを修飾する酵素活性を呈し、任意に、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、及びグリコシラーゼ活性から選択される１つ以上の酵素活性を呈するか、
ｃ）標的核酸に関連した標的ポリペプチドを修飾する酵素活性を呈し、任意に、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、脱ミリストイル化活性、グリコシル化活性（例えば、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼからの）、及び脱グリコシル化活性から選択される１つ以上の酵素活性を呈するか、
ｄ）エンドソーム脱出ポリペプチドである、
ｅ）葉緑体移行ペプチドであり、任意に、前記葉緑体移行ペプチドは配列番号８３〜９３に記載されるアミノ酸配列から選択されるか、
ｆ）転写を増加または減少させ、任意に、転写抑制因子ドメインまたは転写活性化ドメインから選択されるタンパク質であるか、
ｇ）タンパク質結合ドメインであるか、または
ｈ）核局在シグナルである、
請求項８〜１０のいずれか１項に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれか１項に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、
任意に、前記ヌクレオチド配列が、プロモーターに動作可能に連結されている、
核酸。
【請求項１３】
（ａ）活性化因子ＲＮＡ、及び標的核酸内のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む標的化因子ＲＮＡを含むＣａｓＸガイドＲＮＡと、
（ｂ）配列番号１または配列番号２または配列番号３に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上または８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＣａｓＸガイドＲＮＡと複合体を形成して前記標的核酸に結合するＣａｓＸポリペプチドと
をコードする、１つ以上の核酸分子。
【請求項１４】
前記ＣａｓＸガイドＲＮＡが、単一ガイドＲＮＡまたは二重ガイドＲＮＡである、請求項１３に記載の１つ以上の核酸分子。
【請求項１５】
ａ）配列番号１または配列番号２または配列番号３に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣａｓＸガイドＲＮＡと複合される際に標的核酸に結合するＣａｓｘポリペプチド、または前記Ｃａｓｘポリペプチドをコードする核酸分子、
ｂ）（ｉ）配列番号１または配列番号２または配列番号３に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣａｓＸポリペプチドと、（ｉｉ）ＣａｓＸガイドＲＮＡと複合される際にＣａｓＸ融合ポリペプチドが標的核酸に結合する融合パートナーとを含むＣａｓＸ融合ポリペプチド、または前記ＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードする核酸分子、及び
ｃ）ＣａｓＸガイドＲＮＡ、または前記ＣａｓＸガイドＲＮＡをコードする核酸分子のうちの１つ以上を含んでおり、
前記ＣａｓＸガイドＲＮＡが、（ｉ）標的核酸内のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）前記ＣａｓＸポリペプチドがＣａｓＸガイドＲＮＡと複合体を形成して前記標的核酸に結合するように、配列番号１または配列番号２または配列番号３に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣａｓＸポリペプチドに結合するヌクレオチド配列を含む、
真核細胞。
【請求項１６】
前記Ｃａｓｘポリペプチドをコードする前記核酸分子を含み、前記核酸分子が、前記真核細胞のゲノムＤＮＡに統合されている、請求項１５に記載の真核細胞。
【請求項１７】
植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、クモ形網動物細胞、真菌細胞、鳥類細胞、爬虫類細胞、両生類細胞、無脊椎動物細胞、マウス細胞、ラット細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、またはヒト細胞である、請求項１５または請求項１６に記載の真核細胞。
【請求項１８】
請求項８〜１１のいずれか１項に記載のＣａｓＸ融合ポリペプチド、または前記ＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、細胞。
【請求項１９】
標的核酸を修飾するインビトロでの方法であって、
前記標的核酸を、
ａ）配列番号１または配列番号２または配列番号３に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣａｓＸポリペプチド、及び
ｂ）前記標的核酸の標的配列にハイブリダイズするガイド配列を含むＣａｓＸガイドＲＮＡと接触させることを含み、
前記接触させることが、前記ＣａｓＸポリペプチドによる前記標的核酸の修飾をもたらし、
任意に、前記接触させることが、
（ｉ）前記ＣａｓＸポリペプチド、または前記ＣａｓＸポリペプチドをコードする核酸分子と、
（ｉｉ）前記ＣａｓＸガイドＲＮＡ、または前記ＣａｓＸガイドＲＮＡをコードする核酸分子と、任意に、
（ｉｉｉ）ＤＮＡドナープレートと
を細胞内に導入することを含んでおり、
任意に、前記ＤＮＡドナープレートが、前記標的核酸に相同性を有するヌクレオチド配列を含み、
前記修飾が、前記標的核酸内への前記ＤＮＡドナープレートの統合であり、
前記細胞が真核細胞であって、任意に、前記真核細胞が、真菌細胞、哺乳動物細胞、爬虫類細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞、寄生虫細胞、節足動物細胞、無脊椎動物の細胞、脊椎動物の細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、及びヒト細胞から選択される、
方法。
【請求項２０】
標的ＤＮＡからの転写を変調するか、標的核酸を修飾するか、または標的核酸に関連したタンパク質を修飾する方法であって、
前記標的核酸を、
ａ）異種ポリペプチドに融合されたＣａｓＸポリペプチドを含む、ＣａｓＸ融合ポリペプチド、及び
ｂ）前記標的核酸の標的配列にハイブリダイズするガイド配列を含むＣａｓＸガイドＲＮＡと接触させることを含んでおり、
前記ＣａｓＸポリペプチドが、配列番号１または配列番号２または配列番号３に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
任意に、前記ＣａｓＸポリペプチドが、触媒能がないＣａｓＸポリペプチド（ｄＣａｓＸ）である、ならびに／または、配列番号１のＤ６７２、Ｅ７６９、及びＤ９３５から選択されるものに対応する位置に１つ以上の突然変異を含み、
任意に、前記接触させることが、細胞中に、
（ｉ）前記ＣａｓＸ融合ポリペプチド、または前記ＣａｓＸ融合ポリペプチドをコードする核酸分子、及び
（ｉｉ）前記ＣａｓｘガイドＲＮＡ、または前記ＣａｓＸガイドＲＮＡをコードする核酸分子を導入することを含む、
方法。
【請求項２１】
遺伝子導入の多細胞非ヒト生物であって、
それらのゲノムが、
ａ）配列番号１または配列番号２または配列番号３に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣａｓＸガイドＲＮＡと複合される際に標的核酸に結合するＣａｓＸポリペプチド、
ｂ）（ｉ）配列番号１または配列番号２または配列番号３に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣａｓＸポリペプチドと、（ｉｉ）ＣａｓＸガイドＲＮＡと複合される際にＣａｓＸ融合ポリペプチドが標的核酸に結合する融合パートナーとを含むＣａｓＸ融合ポリペプチド、及び
ｃ）ＣａｓＸガイドＲＮＡ
のうちの１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む、遺伝子導入の多細胞非ヒト生物。