(57)【要約】サンプル中の複数種のタンパク質に関するデータからなるデータベースを使用することを特徴とする、当該サンプル中の複数のリン酸化タンパク質を検出する方法、および、金属固定化担体またはチタニア担体を用いてリン酸化タンパク質を精製する方法であって、アセトニトリルを４０％（Ｖ／Ｖ）以上６０％（Ｖ／Ｖ）以下含有する溶液を使用することを特徴とする、前記方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の複数種のタンパク質に関するデータからなるデータベースを使用することを特徴とする、当該サンプル中の複数種のリン酸化タンパク質を検出する方法。
【請求項２】
サンプル中の複数種のタンパク質に関するデータからなるデータベースを使用することを特徴とする、当該サンプル中の複数種のリン酸化タンパク質を検出する方法であって、
（ａ）サンプル中の複数種のリン酸化タンパク質を分離する工程と、
（ｂ）当該分離されたリン酸化タンパク質の質量を分析する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で得られたデータを、上記データベースから検索してリン酸化タンパク質を検出する工程と、
を含む、前記方法。
【請求項３】
サンプル中の複数種のタンパク質に関するデータからなるデータベースが、
（ａ）サンプル中の複数種のタンパク質の質量を分析する工程と、
（ｂ）得られた分析結果よりタンパク質を同定する工程と、
（ｃ）当該同定されたタンパク質に関するデータからなるデータベースを作成する工程と、
を含む工程から作成されるものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
サンプル中の複数種のタンパク質に関するデータからなるデータベースが、サンプル中の複数種のタンパク質の質量分析により同定されたタンパク質に関するものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
サンプル中の複数種のタンパク質に関するデータからなるデータベースを使用することを特徴とする、当該サンプル中の複数種のリン酸化タンパク質を検出する方法であって、
（ａ）サンプル中の複数種のタンパク質の質量を分析する工程と、
（ｂ）得られた分析結果よりタンパク質を同定する工程と、
（ｃ）当該同定されたタンパク質に関するデータからなるデータベースを作成する工程と、
（ｄ）サンプル中の複数種のリン酸化タンパク質を分離する工程と、
（ｅ）当該分離されたリン酸化タンパク質の質量を分析する工程と、
（ｆ）工程（ｅ）で得られたデータを、工程（ｃ）で得られたデータベースから検索してリン酸化タンパク質を検出する工程と、
を含む、前記方法。
【請求項６】
サンプルが、組織、生体液、細胞、細胞器官またはタンパク質複合体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
サンプル中の複数種のリン酸化タンパク質を分離する工程が、金属固定化担体またはチタニア担体と、アセトニトリルを４０％（Ｖ／Ｖ）以上６０％（Ｖ／Ｖ）以下含有する溶液とを使用することを特徴とするものである、
請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
金属固定化担体またはチタニア担体を用いてリン酸化タンパク質を精製する方法であって、アセトニトリルを４０％（Ｖ／Ｖ）以上６０％（Ｖ／Ｖ）以下含有する溶液を使用することを特徴とする、前記方法。
【請求項９】
金属固定化担体またはチタニア担体を用いてリン酸化タンパク質を精製する方法であって、
アセトニトリルを４０％（Ｖ／Ｖ）以上６０％（Ｖ／Ｖ）以下含有する溶液を、金属固定化担体若しくはチタニア担体の平衡化溶媒、サンプルを溶解する溶媒および／または金属固定化担体若しくはチタニア担体における展開溶媒として使用することを特徴とする、前記方法。
【請求項１０】
金属固定化担体またはチタニア担体を用いてリン酸化タンパク質を精製する方法であって、
アセトニトリルを４０％（Ｖ／Ｖ）以上６０％（Ｖ／Ｖ）以下含有する溶液で金属固定化担体またはチタニア担体を平衡化する工程と、
サンプルを、アセトニトリルを４０％（Ｖ／Ｖ）以上６０％（Ｖ／Ｖ）以下含有する溶液に溶解する工程と、
当該溶解したサンプルと、前記平衡化された担体とを接触させる工程と、
リン酸化タンパク質を溶出させる工程と、
を含む、前記方法。
【請求項１１】
アセトニトリルを４０％（Ｖ／Ｖ）以上６０％（Ｖ／Ｖ）以下含有する溶液が、さらに酸を含有する溶液である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
酸が強酸である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
強酸が、トリフルオロ酢酸または塩酸である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
トリフルオロ酢酸の濃度が、０．１％（Ｖ／Ｖ）以上１．０％（Ｖ／Ｖ）以下である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
塩酸の濃度が、０．０３％（Ｖ／Ｖ）以上０．３％（Ｖ／Ｖ）以下である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
金属固定化担体に固定される金属イオンが、鉄イオン（ＩＩＩ）またはガリウムイオン（ＩＩＩ）である、請求項８〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  Ｂｅｎｚｏｉｃ  Ａｃｉｄを含まないことを特徴とする、請求項８〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
アセトニトリルを４０％（Ｖ／Ｖ）以上含有する溶液を含む、リン酸化タンパク質精製キット
【請求項１９】
請求項８〜１７のいずれか１項に記載の方法に使用するための、請求項１７に記載のキット
【請求項２０】
アセトニトリルを４０％（Ｖ／Ｖ）以上含有する溶液を含む、リン酸化タンパク質精製溶液。
【請求項２１】
請求項８〜１７のいずれか１項に記載の方法に使用するための、請求項２０に記載の溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、サンプル中の複数種のタンパク質に関するデータからなるデータベースを使用することを特徴とする、当該サンプル中の複数種のリン酸化タンパク質を検出する方法に関する。また、本発明は、金属固定化担体またはチタニア担体を用いてリン酸化タンパク質を精製（本明細書において、「精製」とは、分離および／または濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）することを含むものとする）する方法であって、アセトニトリルを４０％（Ｖ／Ｖ）（容量対容量百分率を表す。本明細書および特許請求の範囲について同じ。）以上６０％（Ｖ／Ｖ）以下含有する溶液を使用することを特徴とする、サンプル中の１または複数種のリン酸化タンパク質を精製する方法に関する。
【背景技術】  多くのタンパク質は、翻訳後に種々の修飾を受けることが知られている。その中でもタンパク質のリン酸化は、さまざまなタンパク質の生理活性や酵素活性を変化させ、細胞内情報伝達や細胞内代謝活性を調節するものとして主要なものである。よって、細胞内におけるタンパク質のリン酸化を解析することは非常に重要である。これまでに、タンパク質のリン酸化について調べる様々な手法が開発されてきており、その一つに、質量分析計を用いた分析法がある１）。
具体的には、電気泳動などによって分離、精製したタンパク質を酵素消化してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳなどで測定する。これによって得られたペプチド・マス・フィンガープリントとデータベースとを照合してタンパク質の同定を行う。その際にアミノ酸の一次配列から得られる理論値よりも８０Ｄａ大きいペプチド鎖があるなら、そのペプチド鎖のどこか一ヶ所がリン酸化されている可能性が高い。そして、そのペプチド鎖をアルカリフォスファターゼ処理により特異的にリン酸基をはずして、もう一度質量分析計で測定した際に、今度はそのペプチド鎖が８０Ｄａ小さくなって理論値と一致すれば、そのペプチド鎖は一ヶ所リン酸化されていたことになる。２）
このように、ある１つのタンパク質のリン酸化については、そのタンパク質を消化してペプチド断片を質量分析計で解析していけば、リン酸化ペプチド、そしてリン酸化部位を同定することが可能である。
しかしながら、プロテオーム解析においては一度に測定するタンパク質の数が数百から数千になる。ここで、用語「プロテオーム解析」とは、遺伝子情報と細胞内で複雑に相互作用している多様なタンパク質との関係を明らかにする解析のことをいう３）。つまり、プロテオーム解析は、細胞を構成するすべてのタンパク質を網羅的に解析する手法をいう。
そのため、プロテオーム解析においては、質量分析スペクトルを一つ一つ確認することは極めて困難であり、自動検索エンジン（例えば、ＭＡＳＣＯＴ等）の結果を鵜呑みにする場合がほとんどである。
このとき、通常、プロテオーム解析ではタンパク質データベース（例えば、ＮＣＢＩｎｒ、ＩＰＩ、Ｓｐｏｒｔ等）を使用するが、自動検索エンジン（例えば、ＭＡＳＣＯＴ等）を用いた場合、偽陽性および偽陰性が非常に多くなること、また、検索時間に膨大な時間を要することから、プロテオーム解析を効率よく高精度に行うことが困難である。
通常、タンパク質の多くは、リン酸化されている分子とされていない分子が混在しており、ほとんどのタンパク質分子がリン酸化されているタンパク質はほとんどない。また、タンパク質分子が複数箇所リン酸化されていたり、他種のタンパク質が混在していたりするため、リン酸化タンパク質を質量分析計で直接検出することは困難である。
さらに、一般的に、タンパク質がリン酸化を受けるとそのタンパク質の質量分析計での検出感度が下がることが知られている。そのため、目的のタンパク質を純度よく精製できなかったり、少量しか精製できなかったりすると、リン酸化タンパク質を検出することは困難である。それゆえ、サンプル中の目的のタンパク質が極めて少ない場合には、リン酸化タンパク質を検出することは極めて困難である。したがって、リン酸化タンパク質を網羅的に解析するためには、リン酸化タンパク質を特異的に精製してから質量分析計で測定することが望ましい。
リン酸化タンパク質を特異的に精製する方法として、金属固定化アフィニティークロマトグラフィー（以下、ＩＭＡＣと称することがある）が汎用されている。ＩＭＡＣカラムは、複数のカルボン酸を介したキレート形成基に金属として３価の鉄イオンもしくはガリウムを固定化したものからなる。三価の鉄イオンにリン酸基が特異的に強く結合する性質があるため、ＩＭＡＣカラムにリン酸化タンパク質を結合させることができる。ＩＭＡＣカラムにリン酸基を結合させるときは酸性条件下で行い、リン酸基を遊離させるには溶媒のｐＨを弱アルカリにするもしくはリン酸緩衝液による競合的溶出手段が用いられる４−１２）。
しかし、カルボン酸もＩＭＡＣカラムに対して親和性を持つため、酸性アミノ酸を有するペプチドもまた多かれ少なかれＩＭＡＣカラムに結合する。そのため、ＩＭＡＣカラムを用いてリン酸化タンパク質のみを精製するのは容易ではない。
この問題を解決するため、タンパク質をトリプシンで消化後に、無水メタノール・塩酸液中でカルボン酸のメチルエステル化を行うことでＩＭＡＣカラムに対する酸性アミノ酸の吸着を抑える精製方法が報告されている１３）。しかし、エステル化反応が定量的に進行しなかったり、副反応が起きたり、選択性が期待通りよくならなかったり、エステル化した後にペプチドが不溶化したりするため、特異的に精製できないことも多い１４）。
さらには、従来からリン酸化タンパク質の精製に用いられているＤｉｈｙｄｒｏｘｙ  Ｂｅｎｚｏｉｃ  Ａｃｉｄ（以下、「ＤＨＢ」と称する場合がある）は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳには使えるが、ＬＣ−ＭＳには使えない。
このような状況下では、リン酸化タンパク質を検出することが困難である。
参照文献
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８）Ｗｕ  Ｘ，Ｒａｎｇａｎａｔｈａｎ  Ｖ，Ｗｅｉｓｍａｎ  ＤＳ，Ｈｅｉｎｅ  ＷＦ，Ｃｉｃｃｏｎｅ  ＤＮ，Ｏ’Ｎｅｉｌｌ  ＴＢ，Ｃｒｉｃｋ  ＫＥ，Ｐｉｅｒｃｅ  ＫＡ，Ｌａｎｅ  ＷＳ，Ｒａｔｈｂｕｎ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．：ＡＴＭ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｉｊｍｅｇｅｎ  ｂｒｅａｋａｇｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｉｎ  ａ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０００，４０５：４７７−４８２．
９）Ｓｔｅｎｓｂａｌｌｅ  Ａ，Ａｎｄｅｒｓｅｎ  Ｓ，Ｊｅｎｓｅｎ  ＯＮ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｇｅｌｓ  ｂｙ  ｎａｎｏｓｃａｌｅ  Ｆｅ（ＩＩＩ）ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｗｉｔｈ  ｏｆｆ−ｌｉｎｅ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００１，１：２０７−２２２．
１０）Ｚｈｏｕ  Ｗ，Ｍｅｒｒｉｃｋ  ＢＡ，Ｋｈａｌｅｄｉ  ＭＧ，Ｔｏｍｅｒ  ＫＢ：Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｍｅｔａｌ  ｉｏｎ  ｂｅａｄｓ  ｂｙ  ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  ２０００，１１：２７３−２８２．
１１）Ｎｕｗａｙｓｉｒ  ＬＭ，Ｓｔｕｌｔｓ  ＪＴ：Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｏｎ−ｌｉｎｅ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｍｅｔａｌ−ｉｏｎ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  １９９３，４：６６２−６６９．
１２）Ｈａｙｄｏｎ  ＣＥ，Ｅｙｅｒｓ  ＰＡ，Ａｖｅｌｉｎｅ−Ｗｏｌｆ  ＬＤ，Ｒｅｓｉｎｇ  ＫＡ，Ｍａｌｌｅｒ  ＪＬ，Ａｈｎ  ＮＧ．：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｓ  Ｓｉｔｅｓ  ｏｎ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ  Ａｕｒｏｒａ  Ａ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｂｙ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｍｅｔａｌ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００３，２：１０５５−１０６７．
１３）Ｆｉｃａｒｒｏ  ＳＢ，ＭｃＣｌｅｌａｎｄ  ＭＬ，Ｓｔｕｋｅｎｂｅｒｇ  ＰＴ，Ｂｕｒｋｅ  ＤＪ，Ｒｏｓｓ  ＭＭ，Ｓｈａｂａｎｏｗｉｔｚ  Ｊ，Ｈｕｎｔ  ＤＦ，Ｗｈｉｔｅ  ＦＭ：Ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２，２０：３０１−３０５．
１４）Ｎｕｈｓｅ  ＴＳ，Ｓｔｅｎｓｂａｌｌｅ  Ａ，Ｊｅｎｓｅｎ  ＯＮ，Ｐｅｃｋ  ＳＣ．Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｍｅｔａｌ  Ｉｏｎ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ａｎｄ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００３，２：１２３４−１２４３．
【発明の開示】
本発明は、このような状況を鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、サンプル（例えば、組織、生体液、細胞、細胞器官またはタンパク質複合体等）中の複数種のリン酸化タンパク質を精度よく、かつ、短時間に検出することにある。
また、サンプル（例えば、組織、生体液、細胞、細胞器官またはタンパク質複合体等）中の１または複数種のリン酸化タンパク質を効率的に精製することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、サンプル（例えば、組織、生体液、細胞、細胞器官またはタンパク質複合体等）中の複数種のタンパク質に関するデータからなるデータベースを作成し、サンプルから分離したリン酸化タンパク質を質量分析計により測定し、測定の結果得られたデータを、当該作成されたデータベースを使用して解析することにより、サンプル中の複数種のリン酸化タンパク質を精度よく、かつ、短時間に検出できることを見出した。
また、金属固定化担体によるリン酸化タンパク質の精製において、アセトニトリルを４０％（Ｖ／Ｖ）以上６０％（Ｖ／Ｖ）以下含有し、さらにトリフルオロ酢酸を０．１％以上（Ｖ／Ｖ）以上１．０％（Ｖ／Ｖ）以下または塩酸を０．０３％（Ｖ／Ｖ）以上０．３％（Ｖ／Ｖ）以下含有する溶液を使用することにより、非特異的吸着が劇的に減少し、サンプル（例えば、組織、生体液、細胞、細胞器官またはタンパク質複合体等）中の１または複数のリン酸化タンパク質を効率的に精製することが出来ることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下に関する。
（１）サンプル中の複数種のタンパク質に関するデータからなるデータベースを使用することを特徴とする、当該サンプル中の複数種のリン酸化タンパク質を検出する方法。
（２）サンプル中の複数種のタンパク質に関するデータからなるデータベースを使用することを特徴とする、当該サンプル中の複数種のリン酸化タンパク質を検出する方法であって、
（ａ）サンプル中の複数種のリン酸化タンパク質を分離する工程と、
（ｂ）当該分離されたリン酸化タンパク質の質量を分析する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で得られたデータを、上記データベースから検索してリン酸化タンパク質を検出する工程と、
を含む、前記方法。
（３）サンプル中の複数種のタンパク質に関するデータからなるデータベースが、
（ａ）サンプル中の複数種のタンパク質の質量を分析する工程と、
（ｂ）得られた分析結果よりタンパク質を同定する工程と、
（ｃ）当該同定されたタンパク質に関するデータからなるデータベースを作成する工程と、
を含む工程から作成されるものである、（１）または（２）に記載の方法。
（４）サンプル中の複数種のタンパク質に関するデータからなるデータベースが、サンプル中の複数種のタンパク質の質量分析により同定されたタンパク質に関するものである、（１）または（２）に記載の方法。
（５）サンプル中の複数種のタンパク質に関するデータからなるデータベースを使用することを特徴とする、当該サンプル中の複数種のリン酸化タンパク質を検出する方法であって、
（ａ）サンプル中の複数種のタンパク質の質量を分析する工程と、
（ｂ）得られた分析結果よりタンパク質を同定する工程と、
（ｃ）当該同定されたタンパク質に関するデータからなるデータベースを作成する工程と、
（ｄ）サンプル中の複数種のリン酸化タンパク質を分離する工程と、
（ｅ）当該分離されたリン酸化タンパク質の質量を分析する工程と、
（ｆ）工程（ｅ）で得られたデータを、工程（ｃ）で得られたデータベースから検索してリン酸化タンパク質を検出する工程と、
を含む、前記方法。
（６）サンプルが、組織、生体液、細胞、細胞器官またはタンパク質複合体である、（１）〜（５）のいずれか１項に記載の方法。
（７）サンプル中の複数のリン酸化タンパク質を分離する工程が、金属固定化担体またはチタニア担体と、アセトニトリルを４０％（Ｖ／Ｖ）以上６０％（Ｖ／Ｖ）以下含有する溶液とを使用することを特徴とするものである、（２）〜（６）のいずれか１項に記載の方法。
（８）金属固定化担体またはチタニア担体を用いてリン酸化タンパク質を精製する方法であって、アセトニトリルを４０％（Ｖ／Ｖ）以上６０％（Ｖ／Ｖ）以下含有する溶液を使用することを特徴とする、前記方法。
（９）金属固定化担体またはチタニア担体を用いてリン酸化タンパク質を精製する方法であって、
アセトニトリルを４０％（Ｖ／Ｖ）以上６０％（Ｖ／Ｖ）以下含有する溶液を、金属固定化担体若しくはチタニア担体の平衡化溶媒、サンプルを溶解する溶媒および／または金属固定化担体若しくはチタニア担体における展開溶媒として使用することを特徴とする、前記方法。
（１０）金属固定化担体またはチタニア担体を用いてリン酸化タンパク質を精製する方法であって、
アセトニトリルを４０％（Ｖ／Ｖ）以上６０％（Ｖ／Ｖ）以下含有する溶液で金属固定化担体またはチタニア担体を平衡化する工程と、
サンプルを、アセトニトリルを４０％（Ｖ／Ｖ）以上６０％（Ｖ／Ｖ）以下含有する溶液に溶解する工程と、
当該溶解したサンプルと、前記平衡化された担体とを接触させる工程と、
リン酸化タンパク質を溶出させる工程と、
を含む、前記方法。
（１１）アセトニトリルを４０％（Ｖ／Ｖ）以上６０％（Ｖ／Ｖ）以下含有する溶液が、さらに酸を含有する溶液である、（８）〜（１０）のいずれか１項に記載の方法。
（１２）酸が強酸である、（１１）に記載の方法。
（１３）強酸が、トリフルオロ酢酸または塩酸である、（１２）に記載の方法。
（１４）トリフルオロ酢酸の濃度が、０．１％（Ｖ／Ｖ）以上１．０％（Ｖ／Ｖ）以下である、（１３）に記載の方法。
（１５）塩酸の濃度が、０．０３％（Ｖ／Ｖ）以上０．３％（Ｖ／Ｖ）以下である、（１３）に記載の方法。
（１６）金属固定化担体に固定される金属イオンが、鉄イオン（ＩＩＩ）またはガリウムイオン（ＩＩＩ）である、（８）〜（１５）のいずれか１項に記載の方法。
（１７）Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  Ｂｅｎｚｏｉｃ  Ａｃｉｄを含まないことを特徴とする、（８）〜（１６）のいずれか１項に記載の方法。
（１８）アセトニトリルを４０％（Ｖ／Ｖ）以上含有する溶液を含む、リン酸化タンパク質精製キット
（１９）（８）〜（１７）のいずれか１項に記載の方法に使用するための、（１８）に記載のキット。
（２０）アセトニトリルを４０％（Ｖ／Ｖ）以上含有する溶液を含む、リン酸化タンパク質精製溶液。
（２１）（８）〜（１７）のいずれか１項に記載の方法に使用するための、（２０）に記載の溶液。
本発明により、サンプル（例えば、組織、生体液、細胞、細胞器官またはタンパク質複合体等）中の複数種のリン酸化タンパク質を精度よく検出することができ、かつ、検索時間も短縮することが可能になった。
すなわち、従来の自動検索エンジン（例えば、ＭＡＳＣＯＴ等）およびタンパク質データベース（例えば、ＮＣＢＩｎｒ、ＩＰＩ、Ｓｐｏｒｔ等）を使用する方法では、偽陽性および偽陰性が非常に多く、また、検索時間に膨大な時間を要していたが、リン酸化タンパク質を検出する対象となる被検サンプル中の複数種のタンパク質に関するデータからなるデータベースを作成し、サンプルから分離したリン酸化タンパク質を質量分析計により測定し、測定の結果得られたデータを、当該作成されたデータベースを使用して解析することにより、サンプル中の複数種のリン酸化タンパク質を精度よく、かつ、短時間に検出できるようになった。また、従来の方法では検出できなかったリン酸化タンパク質をも検出することができるようになった。
また、本発明により、金属固定化担体またはチタニア担体によるリン酸化タンパク質の精製において、アセトニトリルを４０％（Ｖ／Ｖ）以上６０％（Ｖ／Ｖ）以下含有し、さらに好ましくはトリフルオロ酢酸（例えば、０．１％（Ｖ／Ｖ）以上１．０％（Ｖ／Ｖ）以下）または塩酸（例えば、０．０３％（Ｖ／Ｖ）以上０．３％（Ｖ／Ｖ）以下）などの強酸を含有する溶液を使用することにより、非特異的吸着が劇的に減少し、サンプル（例えば、組織、生体液、細胞、細胞器官またはタンパク質複合体等）中の１または複数種のリン酸化タンパク質を効率的に精製することが可能となった。
従来の方法では、カルボン酸もＩＭＡＣカラムに対して親和性を持つため、酸性アミノ酸を有するタンパク質もまた多かれ少なかれＩＭＡＣカラムに結合する。したがって、ＩＭＡＣカラムを用いてリン酸化タンパク質のみを精製するのは容易ではなかった。また、疎水性ペプチドもＩＭＡＣに対して非特異的な作用を有するため除去できないことが多かった。これに対し、本発明の方法により、カルボン酸や疎水性によるＩＭＡＣカラムに対する吸着を抑制することができ、サンプル（例えば、組織、生体液、細胞、細胞器官またはタンパク質複合体等）中の１または複数種のリン酸化タンパク質を効率的に精製することが可能となった。
さらには、タンパク質のカルボン酸のメチルエステル化を行うことでＩＭＡＣカラムに対する酸性アミノ酸の吸着を抑える精製方法における課題点、すなわち、エステル化反応が定量的に進行しなかったり、副反応が起きたり、選択性が期待通り改良しなかったり、エステル化した後にペプチドが不溶化したりするため、特異的に精製できないことも多いという課題点についても解決し、本発明の方法はメチルエステル化を行うことなくサンプル（例えば、組織、生体液、細胞、細胞器官またはタンパク質複合体等）中の１または複数種のリン酸化タンパク質を効率的に精製することが可能となった。
また、本発明は、リン酸化タンパク質の精製においてＤＨＢを用いる必要がないため、ＤＨＢを除く操作をすることなく、精製したサンプルをＭＡＬＤＩ−ＭＳのみならずＬＣ−ＭＳにおいても測定することが可能となった。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明のタンパク質検出方法の模式図である。
図２は、ＮＣＢＩｎｒデータベースにおけるＦＡＳＴＡ形式で表されたｇｉ番号およびアミノ酸配列を示す（ｇｉ｜２８５３６７７：配列番号４、ｇｉ｜２５６４２４５：配列番号５）。先頭文字が”＞”で始まる行がタンパクの名称を示し、次の行がアミノ酸配列を示し、この２行の塊が複数個で構成される。
図３は、金属固定化担体を用いてリン酸化タンパク質を精製する方法において、０．１Ｍの酢酸水を使用し、精製したリン酸化タンパク質を質量分析計で測定した結果を表す。オボアルブミンの２ヶ所のリン酸化タンパク質（ＥＶＶＧＳＡＥＡＧＶＤＡＡＳＶＳＥＥＦＲ２０８９（配列番号１）およびＬＰＧＦＧＤＳＩＥＡＱＣＧＴＳＶＮＶＨ２０８２（配列番号２）、ただし後者についてはトリプシンの非特異的切断が起き、本来はＬＰＧＦＧＤＳＩＥＡＱＣＧＴＳＶＮＶＨＳＳＬＲ（配列番号３）である）以外の多くのタンパク質が検出され、リン酸化タンパク質を選択的に精製することはできなかった。
図４は、金属固定化担体を用いてリン酸化タンパク質を精製する方法において、トリフルオロ酢酸０．３％を含む５０％アセトニトリル溶液を使用し、精製したリン酸化タンパク質を質量分析計で測定した結果を表す。オボアルブミンの２ヶ所のリン酸化タンパク質（ＥＶＶＧＳＡＥＡＧＶＤＡＡＳＶＳＥＥＦＲ２０８９（配列番号１）およびＬＰＧＦＧＤＳＩＥＡＱＣＧＴＳＶＮＶＨ２０８２（配列番号２）、ただし後者についてはトリプシンの非特異的切断が起き、本来はＬＰＧＦＧＤＳＩＥＡＱＣＧＴＳＶＮＶＨＳＳＬＲである（配列番号３））を選択的に精製することが可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】  以下に本発明の実施の形態について説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
本発明において「タンパク質」とは、２以上のアミノ酸がペプチド結合によって結合したペプチドを含む。
本発明において「リン酸化タンパク質」とは、タンパク質中の１残基以上のアミノ酸（例えば、チロシン、セリンまたはスレオニン等）がリン酸化されたタンパク質をいう。
本明細書において「サンプル」とは、タンパク質を含む検出対象物、調製対象物、分画対象物、または精製対象物を示し、好ましくは、組織、生体液、細胞、細胞器官またはタンパク質複合体を指す。組織としては、例えば、脳、脳の各部位（例えば、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、十二指腸、小腸、大腸、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、耳下腺、舌下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などがあげられる。生体液としては、例えば、血液（血漿、血清を含む）、尿、糞、唾液、涙液、浸潤液（腹水、組織液を含む）などがあげられる。細胞としては、例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例えば、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好酸球、好塩基球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、間質細胞もしくはこれらの前駆細胞、幹細胞、癌細胞などがあげられる。細胞器官としては、例えば、核、細胞小器官（核小体、核膜、細胞膜、ミトコンドリア、リソソーム、リボソーム、ペルオキシソーム、小胞体（粗面小胞体、滑面小胞体、筋小胞体など）、ゴルジ体、微小管、中心体、アクチンフィラメントなど）、サイトゾル、シナプス、基底膜、細胞間接着装置などがあげられる。タンパク質複合体とは、二以上のタンパク質が物理的に結合している状態のものをいう。ここにあげたサンプルは具体例であって、これらに限定されるものではない。
上記目的のサンプル（例えば、組織、生体液、細胞、細胞器官またはタンパク質複合体）は、生体からメスまたは注射器などを用いて採取することができる。細胞の場合、生体から目的細胞を採取した後に酵素で処理し、あるいはセルソーターなどで目的細胞のみ選別したものを用いることができる。サンプルとして用いる細胞には、初代培養細胞、細胞株、またはそれらの培養物も含まれ、刺激、誘導等のさまざまな培養条件下の細胞であってもよい。
本発明において、「データベース」とは、プロテオーム解析に用いられるアミノ酸配列情報の集合であって、電子計算機を用いて検索することができるように当該配列情報を体系的に構成したものをいう。プロテオーム解析に際し、データベースおよび電子計算機を用いてアミノ酸配列情報を検索し、タンパク質を同定することは、当業者において通常用いられる技術である。
本発明において、「サンプル中の複数種のタンパク質に関するデータからなるデータベース」とは、目的とするサンプル中の複数種のタンパク質のアミノ酸配列情報の集合であって、電子計算機を用いて検索することができるように当該配列情報を体系的に構成したものをいう（以下、「本発明のデータベース」と称する場合がある）。したがって、本発明のデータベースには、アミノ酸配列情報の他に、データベースを体系的に構築するための文字および記号などが含まれていてもよく、また、検索に使用するキー情報およびタンパク質の名称などが含まれていてもよい。
Ａ．リン酸化タンパク質検出方法
本発明は、サンプル中の複数種のタンパク質に関するデータからなるデータベースを作成し、使用する工程を特徴とする、サンプル中の複数種のリン酸化タンパク質を検出する方法を提供する。
この方法は、サンプル中の複数種のタンパク質に関するデータからなるデータベースを作成する工程と、サンプル中の複数種のリン酸化タンパク質を分離する工程と、当該リン酸化タンパク質の質量を分析する工程と、当該得られたデータを、上記本発明のデータベースから検索してリン酸化タンパク質を検出する工程とを含む、リン酸化タンパク質を検出する方法である（図１（ａ））。
以下に、詳細について記載する。
１．本発明のデータベースの作成
本発明のデータベースは、リン酸化タンパク質を検出する対象となる被検サンプル（以下、「リン酸化タンパク質の検出対象サンプル」ともいう）中のタンパク質を調製し、質量分析計でその質量を測定し、得られたデータを用いてタンパク質を同定し、当該タンパク質のアミノ酸配列情報を得て、電子計算機を用いて検索することができるように体系的に構成することにより作成できる（図１（ｂ））。また、測定しなくても既知情報からサンプル中に含まれるタンパク質のアミノ酸配列情報を知ることができる場合には、当該アミノ酸配列情報を得て、電子計算機を用いて検索することができるように体系的に構成することにより作成できる。
以下に、リン酸化タンパク質の検出対象サンプル中のタンパク質を質量分析計で測定し、得られたデータを用いてタンパク質を同定し、当該複数種のタンパク質のアミノ酸配列情報からデータベースを作成する方法を記載する。
（１）本発明のデータベースを作成するための測定サンプルの調製方法（図１（ｃ））
本発明のデータベースを作成するための測定サンプルは、リン酸化タンパク質の検出対象サンプルと同種の組織、生体液、細胞、細胞器官またはタンパク質複合体を用いることができる。本発明のデータベースを作成するための測定サンプルは、好ましくはリン酸化タンパク質の検出対象サンプルと同一の組織、生体液、細胞、細胞器官またはタンパク質複合体があげられる。
測定サンプルの調製方法の例を図１（ｃ）に示すが、当該方法はこれに限定されるわけではない。
リン酸化タンパク質の検出対象サンプルを破砕し、タンパク質粗液を抽出（図１（ｃ）（ｉ））後、遠心分画することができる（図１（ｃ）（ｉｉ））。これを「遠心分画したタンパク質」とする。破砕・抽出する方法は、ダウンス型テフロンＴＭ・ホモジナイザー、ポリトロン、ワーリング・ブレンダー、ポッター型ガラス・ホモジナイザー、超音波破砕装置、細胞溶解液（例えばピアス社製のＭ−ＰＥＲ：ｃａｔ  ｎｏ．７８５０１，Ｔ−ＰＥＲ：ｃａｔ  ｎｏ．７８５１０など）を用いる方法または凍結融解法があげられ、好ましくはダウンス型テフロンＴＭ・ホモジナイザー、ポッター型ガラス・ホモジナイザーを用いる方法である。遠心分画する方法は、分画遠心法やショ糖密度勾配遠心法などがあげられ、好ましくはショ糖密度勾配遠心法である。
次に、必要に応じて、遠心分画したタンパク質を粗精製することができる（図１（ｃ）（ｉｉｉ））。これを「粗精製したタンパク質」とする。粗精製する方法は、群特異的アフィニティーカラム精製、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーを利用する方法、免疫沈降法、硫安沈殿法、有機溶媒による沈殿法、限外ろ過法、ゲルろ過法、透析法またはこれらの組合せなどがあげられ、好ましくは群特異的アフィニティーカラム精製である。また、リン酸化タンパク質またはリン酸化されていないタンパク質を粗精製するために、後述する金属固定化担体（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９４，２６９：２９５２０−２９５２９、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０００，１９２：１７５５−１７６２、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １９９７，６：２４３６−２４４５、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  １９９９，７１：２８８３−２８９２、Ｎａｔｕｒｅ  ２０００，４０５：４７７−４８２、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００１，１：２０７−２２２、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  ２０００，１１：２７３−２８２、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  １９９３，４：６６２−６６９、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００１，２７６：６９５９−６９６６、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２：２０，３０１−３０５、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００３：１００，４４３−４４８）またはチタニア担体を利用してもよい。これらの担体を使用した場合、担体に吸着するタンパク質がリン酸化タンパク質であり、担体に吸着しないタンパク質がリン酸化されていないタンパク質である。
破砕・抽出、遠心分画、粗精製の各操作は、これらに限定されるものではなく、当業者における技術常識により、適当なものを選択し、また、組み合わせればよい。
その後、必要に応じて、粗精製したタンパク質の分画および／または消化を行うことができる（図１（ｃ）（ｉｖ）、（ｖ））。これをそれぞれ「分画したタンパク質」および「消化したタンパク質」とする。分画方法は、二次元電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、各種クロマトグラフィー（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィーなど）等を採用することができるが、これらに限定されるものではなく、適当なものを選択すればよい。消化方法には、酵素消化、化学分解等があげられ、好ましくは酵素消化であるが、これに限定されるものではなく、適当なものを選択すればよい。酵素消化に用いる酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、Ｌｙｓ−Ｃ，Ａｓｐ−Ｎ，Ｇｌｕ−Ｃなどがあげられ、好ましくはトリプシンである。また、酵素消化の際には、界面活性剤、好ましくは５−ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−ｐｅｎｔｙｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｍａｌｔｏｓｉｄｅ（米国特許第５６７４９８７号明細書および米国特許第５７６３５８６号明細書、アナトレース社（Ａｎａｔｒａｃｅ  Ｉｎｃ．，Ｍａｕｍｅｅ，ＯＨ，ＵＳＡ））を加えることが望ましい。
こうして得られた遠心分画したタンパク質、粗精製したタンパク質、分画したタンパク質または消化したタンパク質は、ＨＰＬＣによりさらに分画することができる（図１（ｃ）（ｖｉ））。これを「ＨＰＬＣにより分画されたタンパク質」とする。ＨＰＬＣに用いるカラムは、当業者における技術常識により、適当なものを選択すればよく、好ましくはアニオン交換カラムまたはカチオン交換カラムである。ＨＰＬＣの諸条件（流速、検出器、移動相など）は、当業者における技術常識により、適宜選択できる。
また、粗精製したタンパク質が、例えば、金属固定化担体またはチタニア担体で粗精製したリン酸化されたタンパク質の場合には、当該リン酸化されたタンパク質を消化した後、金属固定化担体またはチタニア担体によりリン酸化されたタンパク質およびリン酸化されていないタンパク質をさらに分画することもできる。すなわち、リン酸化されていないタンパク質を選択的に分画するために、再び金属固定化担体またはチタニア担体を利用して、金属固定化担体またはチタニア担体に吸着されないタンパク質を金属固定化担体またはチタニア担体に吸着されたタンパク質から分画することにより、リン酸化されていないタンパク質を得ることができる。これを「分画したリン酸化されていないタンパク質」とする。このとき、少量（例えば、０．０１％から２０％）のリン酸化タンパク質が混入していてもよい。少量のリン酸化タンパク質が混入していても、リン酸化されていないタンパク質の測定結果にはほとんど影響を与えないからである。
リン酸化されていないタンパク質は、以下の二つの使用法がある。
第一に、リン酸化タンパク質の検出対象サンプル中に存在するタンパク質から、リン酸化タンパク質を分離する方法によって、リン酸化されたタンパク質とリン酸化されていないタンパク質とを分離し、リン酸化されていないタンパク質を用いてデータベースを作成し、リン酸化されたタンパク質を用いてリン酸化タンパク質を検出するというものである。
第二に、リン酸化タンパク質の検出対象サンプル中に存在するタンパク質から、リン酸化タンパク質を分離する方法によって、リン酸化されたタンパク質を分離し、当該リン酸化されたタンパク質を消化して、リン酸化されたタンパク質（ペプチド）とリン酸化されていないタンパク質（ペプチド）とを用意する。そして、リン酸化されていないタンパク質（ペプチド）を測定してデータベースを作成し、リン酸化されたタンパク質（ペプチド）を用いてリン酸化されたタンパク質を検出するというものである。このとき、リン酸化されていないタンパク質（ペプチド）は、上記の「分画したリン酸化されていないタンパク質」を使用することができる。当該データベースは、サンプル中に含まれるタンパク質の中でもリン酸化タンパク質に限定されたデータベースとなるため、本発明の検出方法において特に有用である。
（２）本発明のデータベースを作成するための測定サンプルの質量測定方法
次に、上記の操作により得られた測定サンプル（遠心分画したタンパク質、粗精製したタンパク質、分離したタンパク質、消化したタンパク質、ＨＰＬＣにより分離されたタンパク質または分離したリン酸化されていないタンパク質を意味する）に含まれるタンパク質の質量を質量分析計で測定する。質量分析計は、ガスクロマトグラフと結合された質量分析装置であるガスクロマトグラフィーマススペクトロメトリー（ＧＣ／ＭＳ）や液体クロマトグラフと結合された質量分析装置である液体クロマトグラフィーマススペクトロメトリー（ＬＣ／ＭＳ）等の汎用の装置を用いて行うことができる。質量分析計におけるイオン化方法は、各装置に応じて適宜選択できる。例えば、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化法）、ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化法）、ＥＩ（電子イオン化法）、ＣＩ（化学イオン化法）、ＡＰＣＩ（大気圧化学イオン化法）、ＦＡＢ（高速原子衝撃法）、ＬＤ、ＦＤ、ＳＩＭＳ、ＴＳＰ等があげられ、好ましくはＭＡＬＤＩまたはＥＳＩである。アナライザーは、各装置に応じて適宜選択できる。例えば、ＴＯＦ（飛行時間型）、イオントラップ、二重収束型、四重極型、フーリエ変換型等の汎用の装置を用いて行うことができる。質量分析計の装置および方法は、ここに例示したものに限定されるものではなく、当業者において質量分析に通常使用されるものを適宜選択すればよい。
（３）タンパク質の同定方法
質量分析計による測定の結果得られたデータを用いて、タンパク質を同定することができる。すなわち、得られたデータを、ソフトフェア（例えば、ＳｏｎａｒＭＳＭＳ（Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ社製））およびデータベース（例えば、ＮＣＢＩｎｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）、ＩＰＩ、Ｓｐｏｒｔ等のデータベース）を使用することにより解析し、サンプル中のタンパク質を同定することが可能である。質量分析計による測定データを用いて、タンパク質を同定することは当業者にとって容易である（Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．１９９８：２０，４６−５０；Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９８：１４１，９６７−９７７；Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０００：１４８，６３５−６５１；Ｎａｔｕｒｅ．２００２：４１５，１４１−１４７；Ｎａｔｕｒｅ．２００２：４１５，１８０−１８３；Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００３：１５，１９９−２０５；Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００３：７，２１−２７）。同定されたタンパク質の情報から、アミノ酸配列情報を得ることは、当業者にとって容易である。
（４）データベースの作成方法
得られた複数のアミノ酸配列情報を、電子計算機を用いて検索することができるように体系的に構成する。データベースの作成に用いるアミノ酸配列情報は、調製方法の異なるサンプルから得られた複数のアミノ酸配列情報を組み合わせてもよい。
本明細書において「体系的に」構成するとは、得られた複数のアミノ酸配列情報を、電子計算機を用いて使用できるように秩序づけて統一の様式で構成することを意味する。
本発明のデータベースは、リン酸化タンパク質の検出対象サンプル中の同定されたタンパク質のアミノ酸配列情報を、電子計算機を用いて検索することができるように体系的に構成されていれば、形式は特に限定されない。
本発明のデータベースの作成方法は、リン酸化タンパク質の検出対象サンプル中の同定されたタンパク質のアミノ酸配列情報を、電子計算機を用いて検索することができるように体系的に構成することにより作成することができる。
以下に、本発明のデータベースの作成方法の一例を記載する。
同定されたタンパク質には、使用したデータベースにアクセス可能なように、必ずユニークなキー情報が存在する。例えば、ＮＣＢＩｎｒデータベースの場合には、ｇｉ番号である。
また、通常、タンパク質同定ソフトウェアで使用するデータベース形式は、ＦＡＳＴＡ形式と呼ばれ、先頭文字が”＞”で始まる行がタンパク質の名称を示し、次の行がアミノ酸配列を示し、この２行の塊が複数個で構成される、という規則で記載されている（図２）。
タンパク質同定ソフトウエアで同定されたタンパク質情報からｇｉ番号（ｇｉ｜ＸＸＸＸＸＸ）（ｇｉ｜２８５３６７７、配列番号４）（ｇｉ｜２５６４２４５、配列番号５）で構成されたキー情報を取り出し、ＦＡＳＴＡ形式で定義されたデータベースをサーチし、タンパク質の名称が定義された行とキー情報とが部分一致した行と次のアミノ酸配列が定義された行をとりだす。それを同定されたタンパク質全てに関して実行し、同定されたタンパク質のみのＦＡＴＳＡ形式のデータベースを新規に作成する。
このデータベースをタンパク質同定ソフトウエアに登録することで、検索可能となる。
以上のように、本発明のデータベースは、サンプル中の複数種のタンパク質の質量分析により同定されたタンパク質に関するものであって、リン酸化タンパク質の検出対象サンプル中のタンパク質を質量分析計で測定し、得られたデータを用いてタンパク質を同定し、当該タンパク質のアミノ酸配列情報を得て、電子計算機を用いて検索することができるように体系的に構成することにより作成できる。
なお、同種の組織、生体液、細胞、細胞器官またはタンパク質複合体は、同一のタンパク質を発現していると考えられるため、本発明のデータベースは、同種の組織、生体液、細胞、細胞器官またはタンパク質複合体については、実験ごとに作成する必要がなく、実験間において繰り返し使用できる。
２．リン酸化タンパク質の分離
以下に、リン酸化タンパク質の検出対象サンプル中からリン酸化タンパク質を分離する方法を記載する。
（１）リン酸化タンパク質の調製方法（図１（ｄ）（ｉ））
前述の測定サンプルの調製方法と同様にして、リン酸化タンパク質の検出対象サンプルを破砕し、タンパク質を抽出、遠心分画、粗精製、分画、もしくは消化またはこれらの組合せにより、消化したタンパク質を得ることができる。本発明において、好ましくは、リン酸化タンパク質は、サンプルを破砕し、タンパク質を抽出、遠心分画、粗精製、分画及び消化することにより調製される。図１（ｄ）（ｉ）は、リン酸化タンパク質の調製方法の一態様を示したものであり、当該方法はこれに限定されるわけではない。
（２）リン酸化タンパク質の分離方法（図１（ｄ）（ｉｉ））
消化したタンパク質からリン酸化タンパク質をさらに分離する。これを「分離したリン酸化タンパク質」とする。リン酸化タンパク質の分離は、選択的にリン酸化タンパク質を分離できる方法であれば何でもよく、例えば、金属固定化担体またはチタニア担体を用いた分離方法、抗リン酸化抗体を用いた免疫沈降法などが挙げられ、好ましくは「Ｂ．リン酸化タンパク質の精製方法」で後述する金属固定化担体またはチタニア担体を用いた分離（精製）方法である。
金属固定化担体またはチタニア担体を用いた、リン酸化タンパク質の分離方法は、初めに、アセトニトリルを含有する溶液で金属固定化担体またはチタニア担体を平衡化する。次に、上記（１）の操作により調製したタンパク質を、アセトニトリルを含有する溶液に溶解する。続いて、上記溶液に溶解したタンパク質と、上記溶液で平衡化した金属固定化担体またはチタニア担体とを接触させる。その後、金属固定化担体またはチタニア担体をアセトニトリルを含有する溶液で洗浄することが望ましい。そして、適当な溶出溶液でリン酸化タンパク質を溶出する。溶出溶液は、特に限定されないが、例えば、５％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリルを含む１５０ｍＭのアンモニア水、５％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリルを含む０．１％リン酸等を用いることができる。アンモニア水で溶出させた場合には、溶出液をそのまま乾燥させ、リン酸で溶出させた場合には、脱塩操作を行うことが望ましい。
上記の平衡化、溶解、洗浄の各操作において、アセトニトリルを含有する溶液中のアセトニトリル濃度は、３０％（Ｖ／Ｖ）以上７０％（Ｖ／Ｖ）以下、好ましくは３５％（Ｖ／Ｖ）以上６５％（Ｖ／Ｖ）以下、より好ましくは４０％（Ｖ／Ｖ）以上６０％（Ｖ／Ｖ）以下、特に好ましくは４５％（Ｖ／Ｖ）以上５５％（Ｖ／Ｖ）以下、例えば、５０％（Ｖ／Ｖ）である。また、当該溶液には、酸溶液を加えることができる。使用する酸溶液は、好ましくは、強酸、例えば、トリフルオロ酢酸、塩酸等があげられ、特に好ましくはトリフルオロ酢酸であるが、特に限定されない。当該溶液中の酸溶液の濃度は、トリフルオロ酢酸においては、好ましくは０．１％（Ｖ／Ｖ）以上１．０％（Ｖ／Ｖ）以下、特に好ましくは０．２％（Ｖ／Ｖ）以上０．６％（Ｖ／Ｖ）以下、例えば０．３％（Ｖ／Ｖ）であり、塩酸においては、好ましくは０．０３％（Ｖ／Ｖ）以上０．３％（Ｖ／Ｖ）以下、特に好ましくは０．０６％（Ｖ／Ｖ）以上０．２％（Ｖ／Ｖ）以下、例えば、０．１％（Ｖ／Ｖ）である。
以上のように、リン酸化タンパク質を分離することができる。
３．質量分析計によるリン酸化タンパク質の測定
次に、分離したリン酸化タンパク質を質量分析計にて測定する。質量分析計は、ガスクロマトグラフと結合された質量分析装置であるガスクロマトグラフィーマススペクトロメトリー（ＧＣ／ＭＳ）および液体クロマトグラフと結合された質量分析装置である液体クロマトグラフィーマススペクトロメトリー（ＬＣ／ＭＳ）等の汎用の装置を用いて行うことができ、液体クロマトグラフィーマススペクトロメトリーを用いて行うことが好ましい。質量分析計におけるイオン化方法は、各装置に応じて適宜選択できる。例えば、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化法）、ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化法）、ＥＩ（電子イオン化法）、ＣＩ（化学イオン化法）、ＡＰＣＩ（大気圧化学イオン化法）、ＦＡＢ（高速原子衝撃法）、ＬＤ、ＦＤ、ＳＩＭＳ、ＴＳＰ等があげられ、好ましくはＭＡＬＤＩまたはＥＳＩである。アナライザーは、各装置に応じて適宜選択できる。例えば、ＴＯＦ（飛行時間型）、イオントラップ、二重収束型、四重極型、フーリエ変換型等の汎用の装置を用いて行うことができる。質量分析計の装置および方法は、ここにあげたものに限定されるものではなく、当業者において質量分析に通常使用されるものを適宜選択すればよい。
４．リン酸化タンパク質のデータ解析、検出
データ解析には、データベースとして、本発明のデータベースを用いる。
質量分析計による測定の結果得られたデータをソフトフェア（例えば、ＭＡＳＣＯＴ（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製））および本発明のデータベースを使用することにより解析し、サンプル中のリン酸化タンパク質を同定することが可能である。
得られた結果については手作業で一つ一つ質量分析スペクトルを確認することが好ましいが、これに限定されるものではない。その際、リン酸化されるアミノ酸がセリンまたはスレオニンの場合には、親イオンのピーク（リン酸化されていないタンパク質のピーク）から９８Ｄａ外れたピークが明確に（イオントラップ型のＥＳＩ−ＭＳでは非常に強く）観測され、リン酸化されるアミノ酸がチロシンの場合には、８０Ｄａ外れたピークが明確に観測されていることが好ましい。この判定基準は、当業者であれば容易に想定されるものである。
これらの方法により、リン酸化タンパク質を効率よく検出でき、かつ検索時間も大幅に短縮できる。
Ｂ．リン酸化タンパク質の精製方法
本発明は、金属固定化担体またはチタニア担体を用いてリン酸化タンパク質を精製する方法であって、アセトニトリルを４０％（Ｖ／Ｖ）以上６０％（Ｖ／Ｖ）以下含有する溶液を使用することを特徴とする、リン酸化タンパク質を精製する方法を提供する。
以下に、詳細について記載する。
１．金属固定化担体またはチタニア担体
本発明において、「金属固定化担体」とは、キレート形成基（例えば、イミノジ酢酸基（以下、ＩＤＡと称する場合がある）、ニトリロ三酢酸基（以下、ＮＴＡと称する場合がある）等）に金属イオンをキレート結合させた担体をいう。金属固定化担体としては、例えば、鉄イオン（ＩＩＩ）をキレート結合させた鉄イオン（ＩＩＩ）担体、ガリウム（ＩＩＩ）イオンをキレート結合させたガリウム（ＩＩＩ）イオン担体等があげられる。
担体としては、アガロースゲル、アクリルアミド、磁気ビーズ、セルロースなどがあげられ、好ましくはアガロースゲルである。
金属固定化担体は、キレート形成基（例えば、ＩＤＡ、ＮＴＡ等）を有する担体に、適当な金属イオン、好ましくは鉄イオン（ＩＩＩ）、またはガリウム（ＩＩＩ）イオンをキレート結合させることにより、作製することができる。
キレート形成基（例えば、ＩＤＡ、ＮＴＡ等）を有する担体は、例えば、アマシャム  バイオサイエンス社等から購入することができる（Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、アマシャム  バイオサイエンス社製、Ｃａｔ  Ｎｏ．１７−０５７５−０１）。
鉄イオン（ＩＩＩ）担体は、例えば、キレート形成基（例えば、ＩＤＡ、ＮＴＡ等）を有する担体を０．１％酢酸水で洗浄し、続いて、０．１％酢酸に溶かした５０ｍＭ塩化鉄ＩＩＩ（ＦｅＣｌ３）と混ぜ、その後、０．１％酢酸水で洗浄することによって、作製することができる。
また、キレート形成基を有する担体は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入することによっても入手することができる（ＰＨＯＳ−Ｓｅｌｅｃ  Ｉｒｏｎ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、Ｃａｔ  Ｎｏ．Ｐ９７４０）。
ガリウムイオン（ＩＩＩ）担体は、例えば、キレート形成基（例えば、ＩＤＡ、ＮＴＡ等）を有する担体を０．１％酢酸水で洗浄し、続いて、０．１％酢酸に溶かした５０ｍＭ塩化ガリウムＩＩＩ（ＧａＣｌ３）と混ぜ、その後、０．１％酢酸水で洗浄することによって、作製することができる。
また、当該担体はＰｉｅｒｃｅ社から購入することによっても入手することができる（Ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｐｉｅｒｃｅ社製、Ｃａｔ  Ｎｏ．８９８５３）。
金属固定化担体は、適当なカラム（例えば、ポリプレップエンプティカラム（バイオラド社製、Ｃａｔ  Ｎｏ．７３１−１５５０）等）に充填することによって、金属固定化アフィニティークロマトグラフィーカラム（ＩＭＡＣカラム）として使用できる。また、金属固定化担体は、適当なチューブ（例えば、エッペンドルフチューブ（エッペンドルフ社製）等）に加えることによって、使用することもできる。
本発明において「チタニア」とは、酸化チタン（ＩＶ）（ＴｉＯ２、Ｔｉｔａｎｉｕｍ  ｄｉｏｘｉｄｅ（ＩＶ））をいう。また、本発明において「チタニア担体」とは、チタニアが、直径数から数十マイクロメートル程度の丸いビーズ状となっているものをいう。チタニア担体は、ＧＬサイエンス社から購入することによって入手することができる。
チタニア担体は、適当なカラム（例えば、マイクロバイオスピンエンプティカラム（バイオラド社製、Ｃａｔ  Ｎｏ．７３２−６２０４）等）に充填することによって、チタニアカラムとして使用できる。また、チタニア担体は、適当なチューブ（例えば、エッペンドルフチューブ（エッペンドルフ社製）等）に加えることによって、使用することもできる。
２．本発明の精製溶液
本発明において、上記金属固定化担体またはチタニア担体によってリン酸化タンパク質を精製する方法は、アセトニトリルを４０％（Ｖ／Ｖ）以上６０％（Ｖ／Ｖ）以下含有する溶液（以下、「本発明の精製溶液」と称する場合がある）を用いることを特徴とする。
アセトニトリルは、市販のものを用いればよく、例えば、和光純薬などから購入することによって入手することができる。
本発明の精製溶液は、金属固定化担体またはチタニア担体に用いる。より具体的には、例えば、金属固定化担体若しくはチタニア担体の平衡化溶媒、サンプルを溶解する溶媒および／または金属固定化担体若しくはチタニア担体における展開溶媒としての使用等に用いる。本発明の精製溶液中のアセトニトリル濃度は、少なくとも３０％（Ｖ／Ｖ）以上７０％（Ｖ／Ｖ）以下、好ましくは３５％（Ｖ／Ｖ）以上６５％（Ｖ／Ｖ）以下、より好ましくは４０％（Ｖ／Ｖ）以上６０％（Ｖ／Ｖ）以下、特に好ましくは４５％（Ｖ／Ｖ）以上５５％（Ｖ／Ｖ）以下、例えば、５０％（Ｖ／Ｖ）である。また、当該本発明の精製溶液には、他の物質が含まれていてもよい。
本発明の精製溶液には、酸溶液を加えることができる。使用する酸溶液は、好ましくは、強酸、例えば、トリフルオロ酢酸、塩酸等があげられ、特に好ましくはトリフルオロ酢酸であるが、特に限定されない。また、使用する酸溶液濃度は、トリフルオロ酢酸においては、好ましくは０．１％（Ｖ／Ｖ）以上１．０％（Ｖ／Ｖ）以下、特に好ましくは０．２％（Ｖ／Ｖ）以上０．６％（Ｖ／Ｖ）以下、例えば０．３％（Ｖ／Ｖ）であり、塩酸においては、好ましくは０．０３％（Ｖ／Ｖ）以上０．３％（Ｖ／Ｖ）以下、特に好ましくは０．０６％（Ｖ／Ｖ）以上０．２％（Ｖ／Ｖ）以下、例えば、０．１％（Ｖ／Ｖ）である。これら本発明の精製溶液は、当業者であれば容易に調製できる。
トリフルオロ酢酸は、市販のものを用いればよく、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ社などから購入することによって入手することができる。
塩酸は、市販のものを用いればよく、例えば、和光純薬などから購入することによって入手することができる。
３．リン酸化タンパク質
本発明において、精製されるタンパク質は、リン酸化タンパク質を含むものであれば、その種類は限定されない。好ましくは、サンプル（組織、生体液、細胞、細胞器官またはタンパク質複合体等）から抽出したタンパク質である。
以下に、サンプル中のリン酸化タンパク質を精製する方法を記載する。
（１）サンプル中のタンパク質の調製方法
サンプルを破砕し、タンパク質粗液を抽出後、遠心分画することができる。これを「遠心分画したタンパク質」とする。破砕・抽出する方法は、ダウンス型テフロンＴＭ・ホモジナイザー、ポリトロン、ワーリング・ブレンダー、ポッター型ガラス・ホモジナイザー、超音波破砕装置、細胞溶解液（例えばピアス社のＭ−ＰＥＲ：ｃａｔ  ｎｏ．７８５０１，Ｔ−ＰＥＲ：ｃａｔ  ｎｏ．７８５１０など）を用いる方法または凍結融解法があげられ、好ましくはダウンス型テフロンＴＭ・ホモジナイザー、ポッター型ガラス・ホモジナイザーを用いる方法である。遠心分画する方法は、分画遠心法やショ糖密度勾配遠心法などがあげられ、好ましくはショ糖密度勾配遠心法である。
次に、必要に応じて、遠心分画したタンパク質を粗精製することができる。これを「粗精製したタンパク質」とする。粗精製する方法は、群特異的アフィニティーカラム精製、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーを利用する方法、免疫沈降法、硫安沈殿法、有機溶媒による沈殿法、限外ろ過法、ゲルろ過法、透析法またはこれらの組合せなどがあげられ、好ましくは群特異的アフィニティーカラム精製である。破砕・抽出、遠心分画、粗精製の各操作は、これらに限定されるものではなく、当業者における技術常識により、適当なものを選択し、また、組み合わせればよい。
その後、必要に応じて、粗精製したタンパク質の分画および消化を行うことができる。これをそれぞれ「分画したタンパク質」および「消化したタンパク質」とする。分画方法は、二次元電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、各種クロマトグラフィー（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィーなど）等を採用することができるが、これらに限定されるものではなく、適当なものを選択すればよい。消化方法には、酵素消化、化学分解等があげられ、好ましくは酵素消化であるが、これに限定されるものではなく、適当なものを選択すればよい。酵素消化に用いる酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、Ｌｙｓ−Ｃ，Ａｓｐ−Ｎ，Ｇｌｕ−Ｃなどがあげられ、好ましくはトリプシンである。また、酵素消化の際には、界面活性剤、好ましくは５−ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−ｐｅｎｔｙｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｍａｌｔｏｓｉｄｅ（米国特許第５６７４９８７号明細書および米国特許第５７６３５８６号明細書、アナトレース社（Ａｎａｔｒａｃｅ  Ｉｎｃ．，Ｍａｕｍｅｅ，ＯＨ，ＵＳＡ））を加えることが望ましい。
こうして得られた遠心分画したタンパク質、粗精製したタンパク質、分画したタンパク質または消化したタンパク質は、ＨＰＬＣによりさらに分画することができる。これを「ＨＰＬＣにより分画されたタンパク質」とする。ＨＰＬＣに用いるカラムは、当業者における技術常識により、適当なものを選択すればよく、好ましくはアニオン交換カラムまたはカチオン交換カラムである。ＨＰＬＣの諸条件（流速、検出器、移動相など）は、当業者における技術常識により、適宜選択できる。
（２）リン酸化タンパク質の精製方法
次に、上記の操作により得られたタンパク質（遠心分画したタンパク質、粗精製したタンパク質、分画したタンパク質、消化したタンパク質、ＨＰＬＣにより分画されたタンパク質または分離したリン酸化されていないタンパク質を意味する）を金属固定化担体またはチタニア担体で精製する。
以下、精製方法を詳細に説明する。
初めに、本発明の精製溶液で金属固定化担体またはチタニア担体を平衡化する。平衡化する工程は、金属固定化担体またはチタニア担体が、適当なカラムに充填されている場合には、本発明の精製溶液をカラムにアプライすることによって、金属固定化担体またはチタニア担体が、適当なチューブに加えられている場合には、本発明の精製溶液をチューブに添加することによって、それぞれ行うことができる。
次に、上記の操作により得られたタンパク質を、本発明の精製溶液に溶解する。当該タンパク質が溶媒に溶解している場合には、濃厚な本発明の精製溶液を希釈して用いることもできる。このとき、本発明の精製溶液は、タンパク質の溶媒に含まれる溶質に応じて酸の濃度を調整することもできる。
酸溶液の最終濃度は、トリフルオロ酢酸においては、好ましくは０．１％（Ｖ／Ｖ）以上１．０％（Ｖ／Ｖ）以下、特に好ましくは０．２％（Ｖ／Ｖ）以上０．６％（Ｖ／Ｖ）以下、例えば０．３％（Ｖ／Ｖ）であり、塩酸においては、好ましくは０．０３％（Ｖ／Ｖ）以上０．３％（Ｖ／Ｖ）以下、特に好ましくは０．０６％（Ｖ／Ｖ）以上０．２％（Ｖ／Ｖ）以下、例えば、０．１％（Ｖ／Ｖ）である。
続いて、本発明の精製溶液に溶解したタンパク質と、本発明の精製溶液で平衡化した金属固定化担体またはチタニア担体とを接触させる。本発明の精製溶液に溶解したタンパク質と、本発明の精製溶液で平衡化した金属固定化担体またはチタニア担体とを接触させる工程は、当該金属固定化担体またはチタニア担体が、適当なカラムに充填されている場合には、本発明の精製溶液に溶解したタンパク質をカラムにアプライすることによって行うことができ、当該金属固定化担体またはチタニア担体が、適当なチューブに加えられている場合には、本発明の精製溶液に溶解したタンパク質をチューブに添加することによって、それぞれ行うことができる。
その後、金属固定化担体またはチタニア担体を本発明の精製溶液で洗浄することが望ましい。洗浄操作は、金属固定化担体またはチタニア担体が、適当なカラムに充填されている場合には、本発明の精製溶液をカラムに添加することによって、金属固定化担体またはチタニア担体が、適当なチューブに加えられている場合には、本発明の精製溶液をチューブに添加し、遠心操作をすることによって、それぞれ行うことができる。
そして、適当な溶出溶液でリン酸化タンパク質を溶出する。リン酸化タンパク質を溶出させる工程は、金属固定化担体またはチタニア担体が、適当なカラムに充填されている場合には、適当な溶出溶液をカラムにアプライすることによって、金属固定化担体またはチタニア担体が、適当なチューブに加えられている場合には、適当な溶出溶液をチューブに添加し、遠心操作をすることによって、それぞれ行うことができる。溶出溶液は、特に限定されないが、例えば、５％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリルを含む１５０ｍＭのアンモニア水、５％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリルを含む０．１％リン酸等を用いることができる。アンモニア水で溶出させた場合には、溶出液をそのまま乾燥させ、リン酸で溶出させた場合には、脱塩操作を行うことが望ましい。
これらの方法により、リン酸化タンパク質を効率的に精製することができる。このようにして得られたリン酸化タンパク質は、各種実験に用いることができ、好ましくは、ＭＳによるリン酸化タンパク質の解析に用いることができる。
４．リン酸化タンパク質精製キット
本発明は、金属固定化担体またはチタニア担体を用いてリン酸化タンパク質を精製する方法であって、アセトニトリルを４０％（Ｖ／Ｖ）以上６０％（Ｖ／Ｖ）以下含有する溶液を使用することを特徴とする、前記方法に使用する溶液を含むリン酸化タンパク質精製キット（以下、「本発明の精製キットと称する場合がある）を提供する。
本発明の精製キットは、リン酸化タンパク質の精製方法（前記「Ｂ．３．（２）リン酸化タンパク質の精製方法」を示す）に用いられるものである。
本発明の精製キットに含まれる担体、溶液等の例としては、次のものが挙げられる。
（ｉ）金属固定化担体またはチタニア担体
（ｉｉ）アセトニトリルを４０％（Ｖ／Ｖ）以上含有する溶液
（ｉｉｉ）酸、好ましくは強酸、例えば、トリフルオロ酢酸または塩酸、特に好ましくはトリフルオロ酢酸
（ｉｖ）その他必要な溶液（例えば、ＰＢＳ、トリス緩衝液など）
アセトニトリルを４０％（Ｖ／Ｖ）以上含有する溶液には、酸、好ましくは強酸、例えば、トリフルオロ酢酸または塩酸、特に好ましくはトリフルオロ酢酸があらかじめ加えられていてもよい。
また、本発明の精製キットには、精製に必要なチューブ、カラム、容器、取扱説明書などがさらに含まれていてもよい。
５．リン酸化タンパク質精製溶液
本発明は、金属固定化担体またはチタニア担体を用いてリン酸化タンパク質を精製する方法であって、アセトニトリルを４０％（Ｖ／Ｖ）以上６０％（Ｖ／Ｖ）以下含有する溶液を使用することを特徴とする、前記方法に使用する溶液を含むリン酸化タンパク質精製溶液（以下、「本発明のリン酸化タンパク質精製溶液」と称する場合がある）を提供する。
本発明のリン酸化タンパク質精製溶液は、リン酸化タンパク質の精製方法（前記「Ｂ．３．（２）リン酸化タンパク質の精製方法」を示す）に用いられるものである。
本発明のリン酸化タンパク質精製溶液は、アセトニトリルを４０％（Ｖ／Ｖ）以上含有する溶液であり、酸、好ましくは強酸、例えば、トリフルオロ酢酸または塩酸、特に好ましくはトリフルオロ酢酸があらかじめ加えられていてもよい。
以下に、具体的な例をもって本発明を示すが、本発明はこれに限られるものではない。
［参考例１］
マウスの脳から以下の操作によりＰｏｓｔ  Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｄｅｎｓｉｔｙ（以下、ＰＳＤとする）フラクションを調製した。
７週齢のＢＡＬＢ／ｃ（メス）の全脳を取り出し、氷冷したＰＢＳ（プロテアーゼ・カクテル入り、ロッシュ社：１８７３５８０）を加えてテフロンＴＭコートしたガラス製ホモジナイザーで全脳を細かく摺り潰した。固形物を取り除き、まず１４００Ｇの遠心１０分で沈殿物を取り除き、その上清を１３８００Ｇの遠心（１６分）にかけ、沈殿物を集めた。これを０．３２Ｍシュークロースに懸濁し、下から順に１．２Ｍ，１Ｍ，０．８５Ｍの層にしたシュークロースの上に、このサンプルをのせて８２５００Ｇの遠心を１２０分間行った。下から２番目の層に溜まった画分（Ｓｙｎａｐｔｏｓｏｍｅ）を集めて０．３２Ｍのシュークロースに懸濁し、続いて６ｍＭのトリス緩衝液を加えて氷冷下４５分間攪拌した。その後に、３２８００Ｇの遠心を２０分間行って沈殿物を集めた。これを０．３２Ｍのシュークロースに懸濁し、下から順に０．８Ｍ，０．６Ｍ，０．４Ｍの層にしたシュークロースの上にこのサンプルをのせて６４７００Ｇで１２０分間遠心した。下から２番目の層を取り出し、４８２００Ｇの遠心を３０分間行った。この沈殿物に対して１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むトリス緩衝液・０．３２Ｍシュークロース混液を加えて１５分間攪拌した。４８２００Ｇで３０分間遠心して集めた沈殿物をＰＳＤフラクションとした。
このＰＳＤフラクションを７Ｍ尿素・２Ｍチオ尿素・２％１ＣＨＡＰＳに溶かし、溶けたタンパク質について、以下の組合せの消化、分画および解析を行った。
また、沈殿物についても、ＳＤＳに溶かし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質を分画後にゲル内でトリプシン消化を行い、Ｃ１８カラムを使ったＬＣ／ＭＳ／ＭＳで解析を行った。
１）トリプシン消化後、陽イオン交換カラム（アマシャム社製。以下、ＳＣＸカラムと称する）で分画し、それぞれの画分を、Ｃ１８カラムを使ったＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（フィニガン社、ＬＣＱ）で解析した（以下、消化−ＳＣＸカラム−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳと称する）。
２）トリプシン消化後、シアノプロピルカラム（ＹＭＣ社製。以下、ＣＮカラムと称する）で分画し、それぞれの画分を、Ｃ１８カラムを使ったＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（フィニガン社、ＬＣＱ）で解析した（以下、消化−ＣＮカラム−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳと称する）。
３）トリプシン消化後、陰イオン交換カラム（アマシャム社製。以下、ＳＡＸカラムと称する）で分画し、それぞれの画分を、Ｃ１８カラムを使ったＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（フィニガン社、ＬＣＱ）で解析した（以下、消化−ＳＡＸカラム−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳと称する）。
４）トリプシン消化後、ＳＡＸカラムで分画した後、さらにＣＮカラムで分画し、それぞれの画分を、Ｃ１８カラムを使ったＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（フィニガン社、ＬＣＱ）で解析した（以下、消化−ＳＡＸカラム−ＣＮカラム−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳと称する）。
５）ＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質を分画後、ゲル内でトリプシン消化を行い、Ｃ１８カラムを使ったＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（フィニガン社、ＬＣＱ）で解析した（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（タンパク質分画）−消化−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳと称する）。
６）ＭｏｎｏＱカラム（アマシャム社製）でタンパク質を分画後、各画分についてトリプシンで消化し、ＳＣＸカラムで分画し、それぞれの画分を、Ｃ１８カラムを使ったＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（フィニガン社、ＬＣＱ）で解析した（以下、ＭｏｎｏＱカラム（タンパク質分画）−消化−ＳＣＸカラム−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳと称する）。
７）ＭｏｎｏＱカラム（アマシャム社製）でタンパク質を分画後、各画分についてトリプシンで消化し、ＳＡＸカラムで分画し、それぞれの画分を、Ｃ１８カラムを使ったＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（フィニガン社、ＬＣＱ）で解析した（以下、ＭｏｎｏＱカラム（タンパク質分画）−消化−ＳＡＸカラム−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳと称する）。
８）ＭｏｎｏＱカラム（アマシャム社製）でタンパク質を分画後、各画分についてトリプシンで消化し、ＣＮカラムで分画し、それぞれの画分を、Ｃ１８カラムを使ったＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（フィニガン社、ＬＣＱ）で解析した（以下、ＭｏｎｏＱカラム（タンパク質分画）−消化−ＣＮカラム−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳと称する）。
９）ＭｏｎｏＱカラム（アマシャム社製）でタンパク質を分画し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質を分画後、ゲル内でトリプシン消化を行い、Ｃ１８カラムを使ったＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（フィニガン社、ＬＣＱ）で解析した（以下、ＭｏｎｏＱカラム（タンパク質分画）−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（タンパク質分画）−消化−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳと称する）。
１０）ＭｏｎｏＱカラム（アマシャム社製）でタンパク質を分画し、トリプシン消化し、ＳＡＸカラムで分画した後、さらにＣＮカラムで分画し、それぞれの画分を、Ｃ１８カラムを使ったＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（フィニガン社、ＬＣＱ）で解析した（以下、ＭｏｎｏＱカラム（タンパク質分画）−消化−ＳＡＸカラム−ＣＮカラム−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳと称する）。
１１）沈殿物について、ＳＤＳに溶かし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質を分画後、ゲル内でトリプシン消化を行い、Ｃ１８カラムを使ったＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（フィニガン社、ＬＣＱ）で解析した（以下、沈殿物−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（タンパク質分画）−消化−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳと称する）。
これらの結果、それぞれ、１）消化−ＳＣＸカラム−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによりタンパク質１０８個、２）消化−ＣＮカラム−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによりタンパク質９４個、３）消化−ＳＡＸカラム−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによりタンパク質２１２個、４）消化−ＳＡＸカラム−ＣＮカラム−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによりタンパク質３７６個、５）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（タンパク質分画）−消化−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによりタンパク質９２個、６）ＭｏｎｏＱカラム（タンパク質分画）−消化−ＳＣＸカラム−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによりタンパク質１４０個、７）ＭｏｎｏＱカラム（タンパク質分画）−消化−ＳＡＸカラム−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによりタンパク質３０１個、８）ＭｏｎｏＱカラム（タンパク質分画）−消化−ＣＮカラム−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによりタンパク質１９９個、９）ＭｏｎｏＱカラム（タンパク質分画）−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（タンパク質分画）−消化−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによりタンパク質２３３個、１０）ＭｏｎｏＱカラム（タンパク質分画）−消化−ＳＡＸカラム−ＣＮカラム−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによりタンパク質４５０個、１１）沈殿物−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（タンパク質分画）−消化−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによりタンパク質１５２個を同定した。このうち、重複を除くと８８８個のタンパク質を同定することが出来た（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳとしては合計１１５０回、同定されたペプチド（未修飾）は１０５９２個であった）。
次に、今回の実験では膨大な数のペプチドが分析にかけられており、解析によって同定には至らなかったものの中にはリン酸化ペプチドもあるであろうと考えて、自動検索エンジンＭＡＳＣＯＴ（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）およびＮＣＢＩｎｒデータベースを使用して、リン酸化修飾を受けたタンパク質を検索した。
具体的には、機器ＮＣＢＩｎｒのタンパク質データをＣｏｍｐａｑ社のＰｒｏＬｉａｎｔ  ＭＬ５３０（ハードディスク容量４２５ＧＢ、メモリ容量３．７６７８２８ＧＢ、ＣＰＵ  ＩｎｔｅｌＴＭＸＥＯＮＴＭ２．４０ＧＨｚ、論理ＣＰＵの数４）のＰＣサーバー（Ｗｉｎｄｏｗｓ  ２０００  Ｓｅｒｖｅｒ）に保存した。また、先の解析で得られたＬＣ／ＭＳ／ＭＳの全データもこのＰＣサーバーに保管した。そして、当該ＰＣサーバーにインストールされている自動検索エンジンＭＡＳＣＯＴを使って、１１５０回の測定サンプルに含まれているリン酸化タンパク質の検索をおこなった。検索条件としては、Ｖａｒｉａｂｌｅ  ＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎにＯｘｉｄａｔｉｏｎ（Ｍ），Ｐｈｏｓｐｈｏ（ＳＴ），Ｐｈｏｓｐｈｏ（Ｙ）を指定し、ｍｉｓｓｅｄ  ｃｌｅａｖａｇｅｓを２として、データベースにはＮＣＢＩｎｒを指定した。Ｍｉｓｓｅｄ  ｃｌｅａｖａｇｅｓを２としたのは、これまでの経験からリン酸化ペプチドは、トリプシンによる消化効率が悪くなることがわかっているためである。
その結果、検索開始後、何日たっても検索が終わらないため実用的でないと考えて途中で打ち切った。
一般に、翻訳後修飾ペプチドについて自動検索エンジンＭＡＳＣＯＴを使って検索する際には、まず翻訳後修飾を受けていないペプチドでタンパク質を同定してから、次に翻訳後修飾の有無について吟味するように推奨している
（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７６：８４７５−８４８３，２００１．）。
［参考例２］
そこで、次に検索する際のデータベースとして、非常に情報件数が多いデータベース（例えば、ＮＣＢＩｎｒなど）を使用するのではなく、先に同定した８８８個のタンパク質に関するデータからなるデータベースを使用した。
この先に同定した８８８個のタンパク質に関するデータからなるデータベースの作成は、ＮＣＢＩｎｒデータベースにアクセスするためのキー情報であるｇｉ番号を取り出し、検索に使用したＮＣＢＩｎｒのＦＡＳＴＡ形式のファイルを使い、タンパク質の名称とアミノ酸配列の定義部分を取り出した。これを先に同定した８８８個のタンパク質全てについて実行し、ＦＡＳＴＡ形式のデータベースを新規に作成した。このように作成したデータベース（以下、「本実験のデータベース」と称する）をＭＡＳＣＯＴに登録し、検索可能とした。検索条件としては、Ｖａｒｉａｂｌｅ  ＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎにＯｘｉｄａｔｉｏｎ（Ｍ），Ｐｈｏｓｐｈｏ（ＳＴ），Ｐｈｏｓｐｈｏ（Ｙ）を指定し、ｍｉｓｓｅｄ  ｃｌｅａｖａｇｅｓを２として、データベースには本実験のデータベースを指定した。
様々な翻訳後修飾を一度に検索するのではなくリン酸化タンパク質のみについて検索した。その結果、信頼値９５％以上のスコアを出したのは３６個のペプチドとなった。これらについてＭＳ／ＭＳの質量分析スペクトルを確認した結果、リン酸化ペプチドのＭＳ／ＭＳであろうと考えられたものは１個であった。つまり、検索条件を絞った（本実験のデータベースを使用した）にも関わらず、その大半が偽陽性であった。
このように、検索エンジン（例えば、ＭＡＳＣＯＴなど）を使って網羅的にリン酸化タンパク質を同定しようとすると間違ったものを同定してしまう危険性が高い。今回の実験では１１種類の異なった組み合わせの分離方法で計１１５０回も測定を行っているので、高い確率でリン酸化ペプチドが分離され検出できているであろうと予想した。しかし、実際には混合サンプルの中からリン酸化ペプチドを検出するのは極めて難しかった。その理由として、同じペプチド配列であってもリン酸化されることによって検出感度が低下すること、そして、生体内では同一のペプチドであってもリン酸化されている分子は、ペプチドの一部の分子でしかないこと、これらの理由によって他の種類のペプチドが数多く存在する混合サンプルではリン酸化ペプチドは簡単には検出できないと考えられる。
［参考例３］
次に、リン酸化ペプチドの精製を試みた。
ＩＭＡＣカラムの１種としてＰＨＯＳ−ＳＥＬＥＣＴ（シグマ社製）ゲル０．１ｍＬをエッペンドルフのチューブに入れ、０．１％酢酸と３０秒間混合した。これを遠心し上清を捨てた。この洗浄操作を３回繰り返した。続いて参考例１で得られたＰＳＤフラクションをＭｏｎｏ−Ｑカラム（アマシャム社製）で分画後、各画分についてトリプシンで消化したサンプルを、酢酸を加えてｐＨ３とした。次に、得られたサンプルをＰＨＯＳ−ＳＥＬＥＣＴに加えて室温で３時間ゆっくり混合した。その後、遠心し上清を捨て、０．５ｍＬの０．１％酢酸で３回洗浄操作を行った。そして、１５％のアセトニトリルを含む０．１５Ｍアンモニア水０．５ｍＬを加えて遠心した。次に、上清を集めて溶媒を蒸発させた。このように、ＰＳＤフラクション中のリン酸化ペプチドを分離した。そして、得られた残渣を５％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリルと０．１％ＴＦＡを含む溶媒２０μＬに溶かして、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる測定を行った。
次に、得られた測定データを自動検索エンジンＭＡＳＣＯＴおよびデータベースＮＣＢＩｎｒを使用して、リン酸化修飾を受けたタンパク質を検索した。
具体的には、機器ＮＣＢＩｎｒのタンパク質データをＣｏｍｐａｑ社のＰｒｏＬｉａｎｔ  ＭＬ５３０（ハードディスク容量４２５ＧＢ、メモリ容量３．７６７８２８ＧＢ、ＣＰＵＩｎｔｅｌＴＭＸＥＯＮＴＭ２．４０ＧＨｚ、論理ＣＰＵの数４）のＰＣサーバー（Ｗｉｎｄｏｗｓ  ２０００  Ｓｅｒｖｅｒ）に保存した。また、先の測定で得られたＬＣ／ＭＳ／ＭＳの全データもこのＰＣサーバーに保管した。そして、当該ＰＣサーバーにインストールされている自動検索エンジンＭＡＳＣＯＴを使って検索をおこなった。検索条件としては、Ｖａｒｉａｂｌｅ  ＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎにＰｈｏｓｐｈｏ（ＳＴ），Ｐｈｏｓｐｈｏ（Ｙ）を指定し、ｍｉｓｓｅｄ  ｃｌｅａｖａｇｅｓを２として、ＤａｔａｂａｓｅにはＮＣＢＩｎｒを指定した。
その結果、翻訳後修飾としてリン酸化のみを指定したにも関わらず、１つのＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータの検索に２時間を要した。そして、４３個のリン酸化ペプチドが９５％以上の信頼値で同定され、その一つ一つの質量分析スペクトルを確認した結果、２３個のリン酸化ペプチドについては信頼性が高いと考えられた。
【実施例１】  次に、ＩＭＡＣカラムを使ってＰＳＤフラクション中のリン酸化ペプチドを分離し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる測定を行った結果得られた測定データ（参考例３）について、自動検索エンジンＭＡＳＣＯＴ（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）および本実験のデータベースを使用して、リン酸化修飾を受けたタンパク質を検索した。
具体的には、本実験のデータベース（参考例２）をＣｏｍｐａｑ社のＰｒｏＬｉａｎｔ  ＭＬ５３０（ハードディスク容量４２５ＧＢ、メモリ容量３．７６７８２８ＧＢ、ＣＰＵ  ＩｎｔｅｌＴＭＸＥＯＮＴＭ２．４０ＧＨｚ、論理ＣＰＵの数４）のＰＣサーバー（Ｗｉｎｄｏｗｓ  ２０００  Ｓｅｒｖｅｒ）に保存した。また、先の解析で得られたＬＣ／ＭＳ／ＭＳの全データ（参考例３）もこのＰＣサーバーに保管した。そして、当該ＰＣサーバーにインストールされている自動検索エンジンＭＡＳＣＯＴを使って検索をおこなった。検索条件としては、Ｖａｒｉａｂｌｅ  ＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎにＰｈｏｓｐｈｏ（ＳＴ），Ｐｈｏｓｐｈｏ（Ｙ）を指定し、ｍｉｓｓｅｄ  ｃｌｅａｖａｇｅｓを２として、データベースには本実験のデータベースを指定した。
その結果、一つのＬＣ／ＭＳデータの検索時間は、僅か３−５分程度であった。そして、１５５個のリン酸化ペプチドが９５％以上の信頼値で同定され、その一つ一つの質量分析スペクトルを確認した結果、１０７個のリン酸化ペプチドについては信頼性が高いと考えられた。
以上のように、リン酸化タンパク質の検出対象サンプル中の複数のタンパク質に関するデータからなるデータベースを作成し、サンプルから分離したリン酸化タンパク質を質量分析計により測定し、測定の結果得られたデータを、当該データベースを使用して解析することにより、サンプル中の複数のリン酸化タンパク質を精度よく、かつ、短時間に検出できるようになった。また、従来の方法では、検出できなかったリン酸化タンパク質をも検出することができるようになった。
【実施例２】（１）サンプル液の調製
オボアルブミン（シグマ社、Ｃａｔ  Ｎｏ．Ａ２５１２）１ｍｇを８Ｍ尿素を含む０．５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．６  ａｔ  ｒｏｏｍ  ｔｅｍｐ．）１ｍＬに溶かした。１ｍｇのディチオスレイトール（ナカライテスク社・京都、ｃａｔ  ｎｏ．１４１１２−５２）を加えて３７℃で１時間還元処理を行った後、２．５ｍｇのアクリルアミド（バイオラド社、ｃａｔ  ｎｏ．１６１−０１０）を加え、室温にて１時間インキュベートすることによりアルキル化処理を施した。この後、２．５ｍｇのディチオスレイトールを加えて未反応のアクリルアミドを失活させ、ピアス社のＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  ＭｉｎｉＤｉａｌｙｓｉｓ  Ｕｎｉｔ（Ｃａｔ  Ｎｏ．６９５７２）を使い５Ｌの５０ｍＭ炭酸水素アンモニア水に対して１晩透析を行った。これをＳａｖａｎｔ社のＳｐｅｅｄＶａｃにてサンプル液を乾燥させ、８Ｍ尿素を含む５０ｍＭの炭酸水素アンモニア水１ｍＬに溶解させた。これに５０ｍＭの炭酸水素アンモニア水を加えて全量を８ｍＬとした。次に、トリプシン５０μｇ（プロメガ社、ｃａｔ  ｎｏ．Ｖ５２８０）を加えて３７℃にて一晩消化を行い、４℃の冷蔵庫で保存し、これを本実施例においてサンプル液とした。
（２）酸の検討（金属固定化担体）
最初に、金属固定化担体を用いてリン酸化タンパク質を精製する際に用いる精製溶液について、添加する酸の効果を検討した。検討する酸として酢酸、ギ酸、トリフルオロ酢酸、塩酸の４種類を選択し、それぞれ０．１％（Ｖ／Ｖ）の各酸溶液を用意した。次に、サンプル液２０μＬを取り、０．１％（Ｖ／Ｖ）の各酸溶液で２０倍に希釈した。
一方、１．６ｍＬ容量のエッペンドルフチューブに、金属固定化担体であるＰＨＯＳ−Ｓｅｌｅｃ  Ｉｒｏｎ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌを５０μＬ取り（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社，Ｃａｔ  Ｎｏ．Ｐ９７４０）、あらかじめサンプルを希釈した酸と同じ０．１％（Ｖ／Ｖ）の各酸溶液で洗浄した。そこに、上記の希釈したサンプル液を加えて３０秒間激しく攪拌した。２００００ｇ（ｇは重力加速度を表す）で１分間遠心した後、上清を捨てた。続いて、同じ０．１％（Ｖ／Ｖ）の各酸溶液を２００μＬ加えて３０秒間激しく攪拌し、２００００ｇで１分間遠心した後、上清を捨てた。次に、１５０ｍＭのアンモニア水を加えて３０秒間激しく攪拌し、２００００ｇで１分間遠心した後、上清を集めてＳａｖａｎｔ社のＳｐｅｅｄＶａｃにて乾燥させた。
次に、乾燥させたサンプルに５μＬの３３％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリル０．１％（Ｖ／Ｖ）トリフルオロ酢酸を加えてサンプルを再溶解し、当該再溶解したサンプル液０．５μＬをＭａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＭＡＬＤＩ）プレートに乗せ、３３％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリル０．１％（Ｖ／Ｖ）トリフルオロ酢酸で飽和したマトリクス液（ａｌｐｈａ−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ，アルドリッチ社ｃａｔ  ｎｏ．４７６８７−０）０．５μＬを、ＭＡＬＤＩプレート上で先に乗せたサンプル液に液滴が広がらないように重ね合わせて自然乾燥させた。これをアプライドバイオシステムズ社の質量分析装置（ＭＳ）ＡＢＩ４７００の正イオン検出のリニアモードにてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ測定を行った。
その結果、酸としてトリフルオロ酢酸または塩酸を使った場合、酢酸またはギ酸を使った場合に比べ、カラムへの非特異的な吸着が少ないことが明らかになった。
（３）アセトニトリル濃度の検討（金属固定化担体）
次に、金属固定化担体を用いてリン酸化タンパク質を精製する際に用いる精製溶液について、アセトニトリルの濃度を検討した。検討するアセトニトリル濃度として、０％から９０％（Ｖ／Ｖ）まで５％単位で変えたものを用意した。精製溶液に添加する酸としては０．１％（Ｖ／Ｖ）のトリフルオロ酢酸を用いて上記と同等の検討を行った。
具体的には、サンプル液２０μＬを取り、各濃度のアセトニトリル溶液で２０倍に希釈した。一方、１．６ｍＬ容量のエッペンドルフチューブに金属固定化担体であるＰＨＯＳ−Ｓｅｌｅｃ  Ｉｒｏｎ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌを５０μＬ取り（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社，Ｃａｔ  Ｎｏ．Ｐ９７４０）、あらかじめサンプルを希釈した溶媒と同じ濃度のアセトニトリル溶媒（０．１％（Ｖ／Ｖ、以下同様）トリフルオロ酢酸を含む）で洗浄した。そこに、上記の希釈したサンプル液を加えて３０秒間激しく攪拌した。２００００ｇで１分間遠心した後、上清を捨てた。続いて、同じ濃度のアセトニトリル溶媒（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）を２００μＬ加えて３０秒間激しく攪拌し、２００００ｇで１分間遠心した後、上清を捨てた。次に、１５０ｍＭのアンモニア水を加えて３０秒間激しく攪拌し、２００００ｇで１分間遠心した後、上清を集めてＳａｖａｎｔ社のＳｐｅｅｄＶａｃにて乾燥させた。
次に、乾燥させたサンプルに５μＬの３３％アセトニトリル０．１％トリフルオロ酢酸を加えてサンプルを再溶解し、当該再溶解したサンプル液０．５μＬをＭａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＭＡＬＤＩ）プレートに乗せ、３３％アセトニトリル０．１％トリフルオロ酢酸で飽和したマトリクス液（ａｌｐｈａ−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ，アルドリッチ社ｃａｔ  ｎｏ．４７６８７−０）０．５μＬを、ＭＡＬＤＩプレート上で先に乗せたサンプル液に液滴が広がらないように重ね合わせて自然乾燥させた。これをアプライドバイオシステムズ社の質量分析装置（ＭＳ）ＡＢＩ４７００の正イオン検出のリニアモードにてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ測定を行った。
その結果、アセトニトリル濃度が４０％から６０％の場合において、非特異的な吸着が少ないことが明らかになった。
なお、有機溶媒としてアセトニトリル以外にメタノール、エタノール、アセトンを用いて２０−８０％濃度の範囲で１０％おきに検討したが、これらの有機溶媒種では、いかなる濃度においても非特異的な吸着を減らす顕著な効果はなかった。
（４）酸濃度の検討（金属固定化担体）
そこで、金属固定化担体を用いてリン酸化タンパク質を精製する際に用いる精製溶液について、アセトニトリル濃度を５０％に固定して、添加する酸の濃度を検討した。添加する酸としては上記と同様に酢酸、ギ酸、トリフルオロ酢酸、塩酸の４種類について検討した。検討する酸の濃度は、０％、０．０１％，０．０３％，０．１％，０．３％，１％，３％，１０％とした。これらの溶媒を用いて、上記と同様の検討を行った。
具体的には、サンプル液２０μＬを取り、各濃度の酸を含むアセトニトリル溶液で２０倍に希釈した。一方、１．６ｍＬ容量のエッペンドルフチューブに金属固定化担体であるＰＨＯＳ−Ｓｅｌｅｃ  Ｉｒｏｎ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌを５０μＬ取り（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社，Ｃａｔ  Ｎｏ．Ｐ９７４０）、あらかじめサンプルを希釈した溶媒と同じ各濃度の酸を含むアセトニトリル溶液で洗浄した。そこに、上記の希釈したサンプル液を加えて３０秒間激しく攪拌した。２００００ｇで１分間遠心した後、上清を捨てた。続いて、同じ各濃度の酸を含むアセトニトリル溶液を２００μＬ加えて３０秒間激しく攪拌し、２００００ｇで１分間遠心した後、上清を捨てた。次に、１５０ｍＭのアンモニア水を加えて３０秒間激しく攪拌し、２００００ｇで１分間遠心した後、上清を集めてＳａｖａｎｔ社のＳｐｅｅｄＶａｃにて乾燥させた。
次に、乾燥させたサンプルに５μＬの３３％アセトニトリル０．１％トリフルオロ酢酸を加えてサンプルを再溶解し、当該再溶解したサンプル液０．５μＬをＭａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＭＡＬＤＩ）プレートに乗せ、３３％アセトニトリル０．１％トリフルオロ酢酸で飽和したマトリクス液（ａｌｐｈａ−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ，アルドリッチ社ｃａｔ  ｎｏ．４７６８７−０）０．５μＬを、ＭＡＬＤＩプレート上で先に乗せたサンプル液に液滴が広がらないように重ね合わせて自然乾燥させた。これをアプライドバイオシステムズ社の質量分析装置（ＭＳ）ＡＢＩ４７００の正イオン検出のリニアモードにてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ測定を行った。
その結果、トリフルオロ酢酸の濃度が０．１％以上１％以下の場合において、および塩酸の濃度が０．０３％以上０．３％以下の場合において、非特異的な吸着の減少が認められた。一方、酢酸およびギ酸を用いた場合には、非特異的な吸着の減少は認められなかった。
以上の結果から、金属固定化担体を用いてリン酸化タンパク質を精製する方法において、アセトニトリルを４０％（Ｖ／Ｖ）以上６０％（Ｖ／Ｖ）以下含有する溶液を使用することにより、リン酸化タンパク質を効率的に精製することが明らかになった。
さらに、酸として、トリフルオロ酢酸０．１％以上１．０％以下または塩酸０．０３％以上０．３％以下を添加することが好ましいことが明らかになった。
（５）チタニア担体での検討
また、チタニア担体を用いてリン酸化タンパク質を精製する際に用いる精製溶液について、金属固定化担体の場合と同様の検討を行った。
その結果、チタニア担体においても、アセトニトリルを４０％（Ｖ／Ｖ）以上６０％（Ｖ／Ｖ）以下含有する溶液を使用することにより、リン酸化タンパク質を効率的に精製することが明らかになった。
さらに、酸として、トリフルオロ酢酸０．１％以上１．０％以下または塩酸０．０３％以上０．３％以下を添加することが好ましいことが明らかになった。
（６）塩化ナトリウム、界面活性剤の影響
そこで、負荷量が大きいチタニアを使い、トリフルオロ酢酸０．３％を含む５０％アセトニトリル溶液を用いて上記と同様の検討を行った。
具体的には、サンプル液２０μＬを取り、トリフルオロ酢酸０．３％を含む５０％アセトニトリル溶液で２０倍に希釈した。一方、１．６ｍＬ容量のエッペンドルフチューブにチタニア担体（ＧＬサイエンス社製）を５０μＬ取り、あらかじめサンプルを希釈した溶媒と同じトリフルオロ酢酸０．３％を含む５０％アセトニトリル溶液で洗浄した。そこに、上記の希釈したサンプル液を加えて３０秒間激しく攪拌した。２００００ｇ、１分間遠心した後、上清を捨てた。続いて、同じトリフルオロ酢酸０．３％を含む５０％アセトニトリル溶液を２００μＬ加えて３０秒間激しく攪拌し、２００００ｇで１分間遠心した後、上清を捨てた。次に、１５０ｍＭのアンモニア水を加えて３０秒間激しく攪拌し、２００００ｇで１分間遠心した後、上清を集めてＳａｖａｎｔ社のＳｐｅｅｄＶａｃにて乾燥させた。
次に、乾燥させたサンプルに５μＬの３３％アセトニトリル０．１％トリフルオロ酢酸を加えてサンプルを再溶解し、当該再溶解したサンプル液０．５μＬをＭａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＭＡＬＤＩ）プレートに乗せ、３３％アセトニトリル０．１％トリフルオロ酢酸で飽和したマトリクス液（ａｌｐｈａ−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｅ  ａｃｉｄ，アルドリッチ社ｃａｔ  ｎｏ．４７６８７−０）０．５μＬを、ＭＡＬＤＩプレート上で先に乗せたサンプル液に液滴が広がらないように重ね合わせて自然乾燥させた。これをアプライドバイオシステムズ社の質量分析装置（ＭＳ）ＡＢＩ４７００の正イオン検出のリニアモードにてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ測定を行った。
ただし、サンプル液にはあらかじめ５Ｍ塩化ナトリウム水溶液を添加して、最終濃度をそれぞれ０，０．０５Ｍ，０．１Ｍ，０．２Ｍ，０．５Ｍ，０．７５Ｍ，１Ｍとしておいた。
しかし、塩化ナトリウムは、リン酸化タンパク質の精製、非特異的な吸着に何ら影響を及ぼさなかった。
さらに、リン酸化タンパク質を精製する際に用いる精製溶液において、界面活性剤の影響を検討するため、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００，Ｎｏｎｉｄｅｔ  ｐ４０，５−ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−ｐｅｎｔｙｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｍａｌｔｏｓｉｄｅ，ｂｅｔａ−ｏｃｔｙｌ  ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ，ＣＨＡＰＳをサンプル液に０．１％になるように添加し、影響を調べた。
その結果、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００，Ｎｏｎｉｄｅｔ  ｐ４０、ＣＨＡＰＳの３種類については、マススペクトルに対して悪影響を認めた（途中の過程で除去できなかった）が、５−ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−ｐｅｎｔｙｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｍａｌｔｏｓｉｄｅ  ｂｅｔａ−ｏｃｔｙｌ  ｇｌｕｃｏｓｉｄｅについてはこのような問題を生じなかった。
これらの結果から、サンプル液中に０．１％程度の５−ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−ｐｅｎｔｙｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｍａｌｔｏｓｉｄｅやｂｅｔａ−ｏｃｔｙｌ  ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ、１Ｍまでの塩化ナトリウムが混在していても本発明における方法において特に影響がないことが明らかになった。
（７）溶出条件の検討
また、金属固定化担体またはチタニア担体に吸着させたリン酸化タンパク質を溶出させる条件として、１５０ｍＭのアンモニア水、リン酸、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウムを使って比較したが、いずれの場合においても結果に大差はなく、溶出させる条件は特に限定されないことが明らかになった。
（８）従来法との比較
次に、比較実験としてシグマ社推奨のプロトコールに基づき、まず、サンプル液を０．１Ｍの酢酸水で２０倍に希釈した。次に、１．６ｍＬ容量のエッペンドルフチューブに金属固定化担体であるＰＨＯＳ−Ｓｅｌｅｃ  Ｉｒｏｎ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌを５０μＬ取り、あらかじめ０．１Ｍの酢酸水で洗浄した。そこに、上記の０．１Ｍの酢酸水で希釈したサンプル液を加えて３０秒間激しく攪拌した。次に、２００００ｇで１分間遠心した後、上清を捨てた。続いて、０．１Ｍの酢酸水を２００μＬ加えて３０秒間激しく攪拌し、２００００ｇで１分間遠心後、上清を捨てた。次に、１５０ｍＭのアンモニア水を加えて３０秒間激しく攪拌し、２００００ｇで１分間遠心後、上清を集めてＳａｖａｎｔ社のＳｐｅｅｄＶａｃにて乾燥させた。
次に、乾燥させたサンプルに５μＬの３３％アセトニトリル０．１％トリフルオロ酢酸を加えてサンプルを再溶解し、当該再溶解したサンプル液０．５μＬをＭａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＭＡＬＤＩ）プレートに乗せ、３３％アセトニトリル０．１％トリフルオロ酢酸で飽和したマトリクス液（ａｌｐｈａ−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ，アルドリッチ社ｃａｔ  ｎｏ．４７６８７−０）０．５μＬを、ＭＡＬＤＩプレート上で先に乗せたサンプル液に液滴が広がらないように重ね合わせて自然乾燥させた。これをアプライドバイオシステムズ社の質量分析装置（ＭＳ）ＡＢＩ４７００の正イオン検出のリニアモードにてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ測定を行った。
その結果、従来の０．１Ｍの酢酸水を用いた方法では、オボアルブミンの２ヶ所のリン酸化タンパク質（ＥＶＶＧＳＡＥＡＧＶＤＡＡＳＶＳＥＥＦＲ２０８９（配列番号１）およびＬＰＧＦＧＤＳＩＥＡＱＣＧＴＳＶＮＶＨ２０８２（配列番号２）、ただし後者についてはトリプシンの非特異的切断が起き、本来はＬＰＧＦＧＤＳＩＥＡＱＣＧＴＳＶＮＶＨＳＳＬＲ（配列番号３）である）以外の多くのタンパク質が検出され、リン酸化タンパク質を選択的に精製することはできなかった（図３）。一方、本発明のトリフルオロ酢酸０．３％を含む５０％アセトニトリル溶液を用いた方法では、オボアルブミンの２ヶ所のリン酸化タンパク質（ＥＶＶＧＳＡＥＡＧＶＤＡＡＳＶＳＥＥＦＲ２０８９（配列番号１）およびＬＰＧＦＧＤＳＩＥＡＱＣＧＴＳＶＮＶＨ２０８２（配列番号２）、ただし後者についてはトリプシンの非特異的切断が起き、本来はＬＰＧＦＧＤＳＩＥＡＱＣＧＴＳＶＮＶＨＳＳＬＲ（配列番号３）である）を選択的に精製することが可能になった（図４）。
【産業上の利用可能性】  本発明により、サンプル（例えば、組織、生体液、細胞、細胞器官またはタンパク質複合体等）中の複数種のリン酸化タンパク質を精度よく検出することができ、かつ、検索時間も短縮することが可能になった。
すなわち、従来の自動検索エンジン（例えば、ＭＡＳＣＯＴ等）およびタンパク質データベース（例えば、ＮＣＢＩｎｒ、ＩＰＩ、Ｓｐｏｒｔ等）を使用する方法では、偽陽性および偽陰性が非常に多く、また、検索時間に膨大な時間を要していたが、リン酸化タンパク質の検出対象サンプル中の複数種のタンパク質に関するデータからなるデータベースを作成し、サンプルから分離したリン酸化タンパク質を質量分析計により測定し、測定の結果得られたデータを、当該データベースを使用して解析することにより、サンプル中の複数種のリン酸化タンパク質を精度よく、かつ、短時間に検出できるようになった。また、従来の方法では、検出できなかったリン酸化タンパク質をも検出することができるようになった。
また、本発明により、金属固定化担体またはチタニア担体によるリン酸化タンパク質の精製において、アセトニトリルを４０％（Ｖ／Ｖ）以上６０％（Ｖ／Ｖ）以下含有し、さらに好ましくはトリフルオロ酢酸（例えば、０．１％以上（Ｖ／Ｖ）以上１．０％以下（Ｖ／Ｖ））または塩酸（例えば、０．０３％（Ｖ／Ｖ）以上０．３％以下（Ｖ／Ｖ））を含有する溶液を使用することにより、非特異的吸着が劇的に減少し、サンプル（例えば、組織、生体液、細胞、細胞器官またはタンパク質複合体等）中の１または複数種のリン酸化タンパク質を効率的に精製することが可能となった。
すなわち、従来の方法では、カルボン酸もＩＭＡＣカラムに対して親和性を持つため、酸性アミノ酸を有するタンパク質もまた多かれ少なかれＩＭＡＣカラムに結合し、ＩＭＡＣカラムを用いてリン酸化タンパク質のみを精製するのは容易ではなかった。また、疎水性ペプチドもＩＭＡＣに対して非特異的な作用を有するため除去できないことが多かったが、本発明の方法により、カルボン酸や疎水性によるＩＭＡＣカラムに対する吸着を抑制することができ、サンプル（例えば、組織、生体液、細胞、細胞器官またはタンパク質複合体等）中の１または複数種のリン酸化タンパク質を効率的に精製することが可能となった。
さらには、タンパク質のカルボン酸のメチルエステル化を行うことでＩＭＡＣカラムに対する酸性アミノ酸の吸着を抑える精製方法における課題点、すなわち、エステル化反応が定量的に進行しなかったり、副反応が起きたり、選択性が期待通りよくならなかったり、エステル化した後にペプチドが不溶化したりするため、特異的に精製できないことも多いという課題点についても解決し、サンプル（例えば、組織、生体液、細胞、細胞器官またはタンパク質複合体等）中の１または複数種のリン酸化タンパク質を効率的に精製することが可能となった。
【配列表フリーテキスト】配列番号１：リン酸化タンパク質
配列番号２：リン酸化タンパク質
配列番号３：リン酸化タンパク質
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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