【手続補正書】
【提出日】令和2年6月18日(2020.6.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．異種プロモーターポリヌクレオチドと、
ｂ．ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドと
を含む、増強された工業的性能を有する遺伝子操作された原核宿主細胞であって、
該異種プロモーターポリヌクレオチドが、該ＲＮＡ分解遺伝子をコードする該ポリヌクレオチドに作動可能に連結している、遺伝子操作された原核宿主細胞。
【請求項２】
前記異種プロモーターが、プロモーターラダー由来のプロモーターを含む、請求項１に記載の遺伝子操作された原核宿主細胞。
【請求項３】
前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号４５、配列番号３６、配列番号３８、および配列番号３９からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする、請求項１または請求項２に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項４】
前記異種プロモーターが、配列番号２、配列番号１、配列番号６、および配列番号５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むプロモーターであり、前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドが配列番号４５をコードする、請求項１から３のいずれか一項に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項５】
前記異種プロモーターが、配列番号１のヌクレオチド配列を含むプロモーターである、請求項４に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項６】
前記異種プロモーターが、配列番号２のヌクレオチド配列を含むプロモーターである、請求項４に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項７】
前記異種プロモーターが、配列番号３、配列番号６、配列番号５、および配列番号２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むプロモーターであり、前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドが配列番号３６をコードする、請求項１から３のいずれか一項に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項８】
前記異種プロモーターが、配列番号３のヌクレオチド配列を含むプロモーターである、請求項７に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項９】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する、請求項１から８のいずれか一項に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項１０】
飽和バイオマスを増加させる、または生体分子収率を増加させることが可能な原核宿主細胞を生成するための方法であって、
ａ．該宿主細胞のゲノムに異種プロモーターポリヌクレオチドを導入することによって、遺伝子操作された宿主細胞を作製するステップであって、該異種プロモーターポリヌクレオチドは、ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結している、ステップ
を含み、該遺伝子操作された宿主細胞は、同一条件下で培養された対照宿主細胞の飽和バイオマス、または生体分子収率と比較して増加した該飽和バイオマス、または増加した生体分子収率を呈し、該対照宿主細胞は、該異種プロモーターポリヌクレオチドを含まない、方法。
【請求項１１】
前記異種プロモーターが、プロモーターラダー由来のプロモーターを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号４５、配列番号３６、配列番号３８、および配列番号３９からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記異種プロモーターが、配列番号２、配列番号１、配列番号６、および配列番号５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むプロモーターであり、前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドが配列番号４５をコードする、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記異種プロモーターが、配列番号１のヌクレオチド配列を含むプロモーターである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記異種プロモーターが、配列番号２のヌクレオチド配列を含むプロモーターである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記異種プロモーターが、配列番号３、配列番号６、配列番号５、および配列番号２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むプロモーターであり、前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドが配列番号３６をコードする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記異種プロモーターが、配列番号３のヌクレオチド配列を含むプロモーターである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記原核宿主細胞がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する、請求項１０から１７のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３３】
しかし、本明細書に引用した任意の参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開、および特許出願の言及は、これらが有効な先行技術を構成するか、または世界のいずれかの国における共通の一般的知識の一部を形成するという承認または何らかの形式の示唆として解釈されず、かつそのように解釈されるべきでない。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ａ．異種プロモーターポリヌクレオチドと、
ｂ．ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドと
を含む、増強された工業的性能を有する遺伝子操作された宿主細胞であって、
該異種プロモーターポリヌクレオチドが、該ＲＮＡ分解遺伝子をコードする該ポリヌクレオチドに作動可能に連結している、遺伝子操作された宿主細胞。
（項目２）
前記ＲＮＡ分解遺伝子が内在性遺伝子である、項目１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
（項目３）
前記異種プロモーターが、配列番号２、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むプロモーターである、項目１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
（項目４）
前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号１７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号９、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む遺伝子である、項目３に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
（項目５）
前記異種プロモーターが、配列番号２、配列番号１、配列番号５、および配列番号６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むプロモーターであり、前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドが配列番号２０である、項目１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
（項目６）
前記遺伝子操作された宿主細胞が、前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結した前記異種プロモーターの組合せを含み、該組合せが、ａ−（配列番号１：：配列番号１０）、ｂ−（配列番号１：：配列番号１４）、ｃ−（配列番号１：：配列番号１８）、ｄ−（配列番号１：：配列番号２０）、ｅ−（配列番号２：：配列番号１１）、ｆ−（配列番号２：：配列番号１８）、ｇ−（配列番号２：：配列番号１３）、ｈ−（配列番号２：：配列番号１８）、ｉ−（配列番号２：：配列番号１７）、ｊ−（配列番号２：：配列番号１９）、ｋ−（配列番号３：：配列番号１１）、ｌ−（配列番号３：：配列番号１４）、ｍ−（配列番号３：：配列番号１２）、ｎ−（配列番号３：：配列番号１５）、ｏ−（配列番号３：：配列番号１７）、ｐ−（配列番号３：：配列番号１９）、ｑ−（配列番号５：：配列番号１４）、ｒ−（配列番号５：：配列番号１１）（配列番号６：：配列番号１３）、ｓ−（配列番号６：：配列番号１９）、ｔ−（配列番号８：：配列番号２１）、ｕ−（配列番号８：：配列番号１４）、ｖ−（配列番号６：：配列番号２０）、ｗ−（配列番号６：：配列番号１１）、ｘ−（配列番号８：：配列番号９）、およびｙ−（配列番号８：：配列番号１８）からなる群から選択される、項目１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
（項目７）
前記遺伝子操作された宿主細胞が、前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結した前記異種プロモーターの組合せを含み、該組合せが、ａ−（配列番号１：：配列番号１４）、ｂ−（配列番号２：：配列番号１３）、ｃ−（配列番号３：：配列番号１１）、ｄ−（配列番号３：：配列番号１４）、ｅ−（配列番号６：：配列番号１１）、およびｆ−（配列番号８：：配列番号９）からなる群から選択される、項目１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
（項目８）
前記異種プロモーターが、配列番号１のヌクレオチド配列を含むプロモーターであり、前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドが配列番号２０である、項目１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
（項目９）
前記異種プロモーターが、配列番号６のヌクレオチド配列を含むプロモーターであり、前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドが配列番号２０である、項目１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
（項目１０）
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する、項目１から９のいずれか一項に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
（項目１１）
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、項目１から１０のいずれか一項に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
（項目１２）
前記増強された工業的性能が飽和バイオマスであり、前記遺伝子操作された宿主細胞が、同一条件下で培養したとき、前記異種プロモーターポリヌクレオチドを欠く遺伝的に同一の宿主細胞よりも少なくとも約５％高い飽和バイオマスを呈する、項目１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
（項目１３）
前記増強された工業的性能が飽和バイオマスであり、前記遺伝子操作された宿主細胞が、同一条件下で培養したとき、前記異種プロモーターポリヌクレオチドを欠く遺伝的に同一の宿主細胞よりも少なくとも約１０％高い飽和バイオマスを呈する、項目１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
（項目１４）
前記増強された工業的性能が飽和バイオマスであり、前記遺伝子操作された宿主細胞が、同一条件下で培養したとき、前記異種プロモーターポリヌクレオチドを欠く遺伝的に同一の宿主細胞よりも少なくとも約２０％高い飽和バイオマスを呈する、項目１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
（項目１５）
アミノ酸、有機酸、およびアルコールからなる群から選択される生体分子を産生する、項目１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
（項目１６）
前記アミノ酸が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、メチオニン、またはリシンである、項目１５に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
（項目１７）
前記有機酸が、スクシネート、ラクテート、またはピルベートである、項目１５に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
（項目１８）
前記アルコールが、エタノールまたはイソブタノールである、項目１５に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
（項目１９）
前記増強された工業的性能が産物収率であり、前記遺伝子操作された宿主細胞が、同一条件下で培養したとき、前記異種プロモーターポリヌクレオチドを欠く遺伝的に同一の宿主細胞よりも少なくとも約２％高い収率の前記生体分子を産生する、項目１５に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
（項目２０）
前記増強された工業的性能が産物収率であり、前記遺伝子操作された宿主細胞が、同一条件下で培養したとき、前記異種プロモーターポリヌクレオチドを欠く遺伝的に同一の宿主細胞よりも少なくとも約３％高い収率の前記生体分子を産生する、項目１５に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
（項目２１）
前記増強された工業的性能が産物収率であり、前記遺伝子操作された宿主細胞が、同一条件下で培養したとき、前記異種プロモーターポリヌクレオチドを欠く遺伝的に同一の宿主細胞よりも少なくとも約６％高い収率の前記生体分子を産生する、項目１５に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
（項目２２）
生体分子を産生する方法であって、該生体分子を産生するのに適した条件下で項目１から２１のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
（項目２３）
生体分子収率を増加させることが可能な宿主細胞を生成するための方法であって、
ａ．該宿主細胞のゲノムに異種プロモーターポリヌクレオチドを導入することによって、遺伝子操作された宿主細胞を作製するステップであって、前記異種プロモーターポリヌクレオチドは、ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結している、ステップ
を含み、該遺伝子操作された宿主細胞は、同一条件下で培養された対照宿主細胞の生体分子収率と比較してより高い該生体分子収率をもたらし、該対照宿主細胞は、該異種プロモーターポリヌクレオチドを含まない、方法。
（項目２４）
飽和バイオマスを増加させることが可能な宿主細胞を生成するための方法であって、
ａ．該宿主細胞のゲノムに異種プロモーターポリヌクレオチドを導入することによって、遺伝子操作された宿主細胞を作製するステップであって、該異種プロモーターポリヌクレオチドは、ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結している、ステップ
を含み、該遺伝子操作された宿主細胞は、同一条件下で培養された対照宿主細胞の飽和バイオマスと比較して増加した該飽和バイオマスを呈し、該対照宿主細胞は、該異種プロモーターポリヌクレオチドを含まない、方法。
（項目２５）
前記ＲＮＡ分解遺伝子が内在性遺伝子である、項目２３または２４に記載の方法。
（項目２６）
前記異種プロモーターポリヌクレオチドが、配列番号２、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８からなる群から選択される、項目２３または２４に記載の方法。
（項目２７）
前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号１７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号９、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２からなる群から選択される、項目２３または２４に記載の方法。
（項目２８）
前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドが配列番号２０である、項目２３または２４に記載の方法。
（項目２９）
前記遺伝子操作された宿主細胞が、前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結した前記異種プロモーターポリヌクレオチドの組合せを含み、該組合せが、ａ−（配列番号２：：配列番号１７）、ｂ−（配列番号３：：配列番号１７）、ｃ−（配列番号６：：配列番号２０）、ｄ−（配列番号６：：配列番号１１）、およびｆ−（配列番号８：：配列番号９）からなる群から選択される、項目２３に記載の方法。
（項目３０）
前記遺伝子操作された宿主細胞が、前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結した前記異種プロモーターポリヌクレオチドの組合せを含み、該組合せが、ａ−（配列番号６：：配列番号１１）、およびｆ−（配列番号８：：配列番号９）からなる群から選択される、項目２３に記載の方法。
（項目３１）
前記異種プロモーターポリヌクレオチドが配列番号６であり、前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドが配列番号２０である、項目２３に記載の方法。
（項目３２）
前記遺伝子操作された宿主細胞が、前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結した前記異種プロモーターポリヌクレオチドの組合せを含み、該組合せが、ａ−（配列番号１：：配列番号１０）、ｂ−（配列番号１：：配列番号１４）、ｃ−（配列番号２：：配列番号１３）、ｄ−（配列番号２：：配列番号１８）、ｅ−（配列番号２：：配列番号１７）、ｆ−（配列番号２：：配列番号１９）、ｇ−（配列番号３：：配列番号１１）、ｈ−（配列番号３：：配列番号１４）、ｉ−（配列番号３：：配列番号１９）、ｊ−（配列番号５：：配列番号１４）、ｋ−（配列番号６：：配列番号１３）、ｌ−（配列番号６：：配列番号１９）、ｍ−（配列番号８：：配列番号２１）、およびｎ−（配列番号８：：配列番号１４）からなる群から選択される、項目２４に記載の方法。
（項目３３）
前記遺伝子操作された宿主細胞が、前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結した前記異種プロモーターポリヌクレオチドの組合せを含み、該組合せが、ａ−（配列番号１：：配列番号１４）、ｂ−（配列番号２：：配列番号１３）、ｃ−（配列番号３：：配列番号１１）、およびｄ−（配列番号３：：配列番号１４）からなる群から選択される、項目２４に記載の方法。
（項目３４）
前記異種プロモーターポリヌクレオチドが配列番号１であり、前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドが配列番号２０である、項目２４に記載の方法。
（項目３５）
前記遺伝子操作された宿主細胞がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する、項目２３から３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記遺伝子操作された宿主細胞がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、項目２３から３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記生体分子が、アミノ酸、有機酸、およびアルコールからなる群から選択される、項目２３および２５から３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記アミノ酸が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、メチオニン、またはリシンである、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記有機酸が、スクシネート、ラクテート、またはピルベートである、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
前記アルコールが、エタノールまたはイソブタノールである、項目３７に記載の方法。
（項目４１）
ａ．ＲＮＡ分解遺伝子をコードするポリヌクレオチドと、
ｂ．（ａ）の該ポリヌクレオチドの開始コドンにおける変異と
を含む、増強された工業的性能を有する遺伝子操作された宿主細胞であって、
該変異が、異なる開始コドンでの該ポリヌクレオチドの内在性開始コドンの置き換えをもたらす、宿主細胞。
（項目４２）
前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２からなる群から選択される、項目４１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
（項目４３）
前記ＲＮＡ分解遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドが配列番号１９である、項目４１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
（項目４４）
内在性の前記ＲＮＡ分解遺伝子の前記開始コドンが、「ＡＴＧ」または「ＧＴＧ」から「ＴＴＧ」に変化している、項目４２に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
（項目４５）
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する、項目４１から４４のいずれか一項に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
（項目４６）
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、項目４１から４５のいずれか一項に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
（項目４７）
アミノ酸、有機酸、およびアルコールからなる群から選択される生体分子を産生する、項目４１に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
（項目４８）
前記アミノ酸が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、メチオニン、またはリシンである、項目４７に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
（項目４９）
前記有機酸が、スクシネート、ラクテート、またはピルベートである、項目４７に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
（項目５０）
前記アルコールが、エタノールまたはイソブタノールである、項目４７に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
（項目５１）
同一培養条件下で、異種プロモーターポリヌクレオチドを欠く遺伝的に同一の宿主細胞よりも少なくとも２％高い収率の前記生体分子を産生する、項目４７に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
（項目５２）
生体分子収率を増加させることまたは飽和バイオマスを増加させることが可能な宿主細胞を生成するための方法であって、
ａ．該宿主細胞を遺伝的に改変するステップであって、該改変するステップは、内在性ＲＮＡ分解遺伝子の開始コドンを変異させることを含み、該改変により、遺伝子操作された宿主細胞が生成される、ステップ
を含み、該遺伝子操作された宿主細胞は、対照宿主細胞の生体分子収率と比較して増加した該生体分子収率を有するか、または該遺伝子操作された宿主細胞は、該対照宿主細胞の飽和バイオマスと比較してより高い該飽和バイオマスを達成し、該対照宿主細胞は、該遺伝子操作された宿主細胞の開始コドン変異を含まず、該遺伝子操作された宿主細胞および該対照宿主細胞は、同一条件下で培養される、方法。
（項目５３）
前記内在性ＲＮＡ分解遺伝子が、配列番号１７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号９、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む遺伝子である、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記ＲＮＡ分解遺伝子が、配列番号１９のヌクレオチド配列を含む遺伝子である、項目５２に記載の方法。
（項目５５）
前記内在性ＲＮＡ分解遺伝子の開始コドンが、「ＡＴＧ」または「ＧＴＧ」から「ＴＴＧ」に変化している、項目５３に記載の方法。
（項目５６）
前記遺伝子操作された宿主細胞がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する、項目５２から５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記遺伝子操作された宿主細胞がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、項目５２から５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
前記生体分子が、アミノ酸、有機酸、およびアルコールからなる群から選択される、項目５２から５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記アミノ酸が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、メチオニン、またはリシンである、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記有機酸が、スクシネート、ラクテート、またはピルベートである、項目５８に記載の方法。
（項目６１）
前記アルコールが、エタノールまたはイソブタノールである、項目５８に記載の方法。
（項目６２）
前記遺伝子操作された宿主細胞が、同一条件下で培養したとき、異種プロモーターポリヌクレオチドを欠く遺伝的に同一の宿主細胞よりも少なくとも２％高い収率の前記生体分子を産生する、項目５８に記載の方法。