【手続補正書】
【提出日】令和2年1月16日(2020.1.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、幹細胞の集団を有効量の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤と少なくとも約２日間接触させるステップを含み、幹細胞の前記集団を、有効量の
（ａ）Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、
（ｂ）ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、および
（ｃ）ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤
の１つまたは複数とさらに接触させて、１種または複数の神経堤、頭蓋プラコード、または非神経外胚葉系統マーカーを発現する分化細胞の集団を生成するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項２】
幹細胞の前記集団を形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤と少なくとも約１２日間接触させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤とＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤を、幹細胞の前記集団に同時に接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
幹細胞の前記集団を、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤と接触させ、ここで、前記細胞が、１種または複数の神経堤系統マーカーを発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤とＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤を、幹細胞の前記集団に同時に接触させる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
幹細胞の前記集団を、ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化剤と接触させ、ここで、前記細胞が、１種または複数の頭蓋プラコード系統マーカーを発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＦＧＦシグナル伝達の前記活性化剤を、前記細胞のＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤との最初の接触の約２日後に、幹細胞の前記集団に接触させる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記頭蓋プラコード系統マーカーが、水晶体プラコード系統マーカーである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
幹細胞の前記集団をＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤と接触させるステップをさらに含み、前記細胞が、１種または複数の三叉神経プラコード系統マーカーを発現する、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
Ｗｎｔシグナル伝達の前記活性化剤を、前記細胞のＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤との最初の接触の約２日後に、幹細胞の前記集団に接触させる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
幹細胞の前記集団を、ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触させ、ここで、前記細胞が、１種または複数の非神経外胚葉系統マーカーを発現する、請求項１に記
載の方法。
【請求項１２】
形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤とＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤を、幹細胞の前記集団に同時に接触させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
幹細胞の前記集団の、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤との最初の接触から約１２日目またはその後に、前記神経堤、頭蓋プラコード、または非神経外胚葉系統マーカーの１種または複数を発現する分化細胞の集団へと分化させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤が、ＳＢ４３１５４２、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
Ｗｎｔシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤が、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化のためにグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を低下させる、請求項４または９に記載の方法。
【請求項１６】
Ｗｎｔシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤が、ＣＨＩＲ９９０２１、そのＷＮＴ３Ａ誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子である、請求項４または９に記載の方法。
【請求項１７】
ＦＧＦシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤が、ＦＧＦ２、その誘導体、およびそれらの混合物を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１８】
前記１種または複数の神経堤系統マーカーが、ＳＯＸ１０からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記１種または複数の頭蓋プラコード系統マーカーが、ＳＩＸ１、ＰＡＸ３、ＰＩＴＸ３、クリスタリンアルファＡ、クリスタリンアルファＢ、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記１種または複数の非神経外胚葉系統マーカーが、ＴＦＡＰ２Ａ、および検出可能なＳＩＸ１およびＳＯＸ１０発現の非存在からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記幹細胞が、ヒト胚性幹細胞、ヒト人工多能性幹細胞、ヒト単為生殖幹細胞、始原生殖細胞様多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、およびＦクラス多能性幹細胞からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
幹細胞の集団を有効量の
（ａ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、
（ｂ）少なくとも約２日間のＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、
（ｃ）ＳＨＨシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、および
（ｄ）ＦＧＦシグナル伝達の２種またはそれより多い活性化剤
と接触させるステップを含み、
細胞の前記集団を、（ｃ）および（ｄ）に約２０日間またはそれより長い間接触させて、
１種または複数の下垂体プラコード系統マーカーを発現する分化細胞の集団を生成するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項２３】
１種または複数の神経堤、頭蓋プラコード、または非神経外胚葉系統マーカーを発現するｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団であって、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法に従って幹細胞の集団から誘導されるｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団。
【請求項２４】
請求項２３に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団を含む組成物。
【請求項２５】
被験体における神経変性障害または下垂体障害を処置するための組成物であって、請求項２３に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した細胞を含む組成物。
【請求項２６】
前記下垂体障害が下垂体機能低下障害である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
神経変性障害または下垂体障害を処置するための医薬の製造における、請求項２３に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した細胞集団の使用。
【請求項２８】
前記下垂体障害が下垂体機能低下障害である、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、有効量の１種または複数の
（ａ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、
（ｂ）ＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、
（ｃ）ウイングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１種または複数の活性化剤、
（ｃ）ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、
（ｄ）ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、
（ｅ）ＳＨＨシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、および
（ｆ）前記幹細胞の、１種または複数の神経堤、頭蓋プラコード、または非神経外胚葉系統マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示書
を含むキット。
【請求項３０】
幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、有効量の
（ａ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、
（ｂ）ＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、
（ｃ）ウイングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１種または複数の活性化剤、および
（ｄ）前記幹細胞の、１種または複数の神経堤系統マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示書
を含むキット。
【請求項３１】
幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、有効量の
（ａ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、
（ｂ）ＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、
（ｃ）ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、および
（ｄ）前記幹細胞の、１種または複数の頭蓋プラコード系統マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示書
を含むキット。
【請求項３２】
（ｅ）ウイングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１種または複数の活性化剤をさらに含む、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、有効量の
（ａ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、
（ｂ）ＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、
（ｃ）ＳＨＨシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、
（ｄ）ＦＧＦシグナル伝達の２種またはそれより多い活性化剤、および
（ｅ）前記幹細胞の、１種または複数の下垂体プラコード系統マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示書
を含むキット。
【請求項３４】
幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、有効量の
（ａ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、
（ｂ）ＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、
（ｃ）ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および
（ｄ）前記幹細胞の、１種または複数の非神経外胚葉系統マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示書
を含むキット。
【請求項３５】
分化した幹細胞の集団を含むキットであって、幹細胞の前記集団を、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法に従って分化させるキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
ある特定の実施形態では、下垂体障害は、下垂体機能低下障害である。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、幹細胞の集団を有効量の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤と少なくとも約２日間接触させるステップを含み、幹細胞の前記集団を、有効量の
（ａ）Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、
（ｂ）ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、および
（ｃ）ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤
の１つまたは複数とさらに接触させて、１種または複数の神経堤、頭蓋プラコード、または非神経外胚葉系統マーカーを発現する分化細胞の集団を生成するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
（項目２）
幹細胞の前記集団を形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤と少なくとも約１２日間接触させるステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤とＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤を、幹細胞の前記集団に同時に接触させる、項目１に記載の方法。
（項目４）
幹細胞の前記集団を、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤と接触させ、ここで、前記細胞が、１種または複数の神経堤系統マーカーを発現する、項目１に記載の方法。
（項目５）
形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤とＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤を、幹細胞の前記集団に同時に接触させる、項目４に記載の方法。
（項目６）
幹細胞の前記集団を、ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化剤と接触させ、ここで、前記細胞が、１種または複数の頭蓋プラコード系統マーカーを発現する、項目１に記載の方法。
（項目７）
ＦＧＦシグナル伝達の前記活性化剤を、前記細胞のＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤との最初の接触の約２日後に、幹細胞の前記集団に接触させる、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記頭蓋プラコード系統マーカーが、水晶体プラコード系統マーカーである、項目６に記載の方法。
（項目９）
幹細胞の前記集団をＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤と接触させるステップをさらに含み、前記細胞が、１種または複数の三叉神経プラコード系統マーカーを発現する、項目６に記載の方法。
（項目１０）
Ｗｎｔシグナル伝達の前記活性化剤を、前記細胞のＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤との最初の接触の約２日後に、幹細胞の前記集団に接触させる、項目９に記載の方法。
（項目１１）
幹細胞の前記集団を、ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触させ、ここで、前記細胞が、１種または複数の非神経外胚葉系統マーカーを発現する、項目１に記
載の方法。
（項目１２）
形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤とＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤を、幹細胞の前記集団に同時に接触させる、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
幹細胞の前記集団の、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤との最初の接触から約１２日目またはその後に、前記神経堤、頭蓋プラコード、または非神経外胚葉系統マーカーの１種または複数を発現する分化細胞の集団へと分化させる、項目１に記載の方法。
（項目１４）
ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤が、ＳＢ４３１５４２、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子を含む、項目１に記載の方法。
（項目１５）
Ｗｎｔシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤が、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化のためにグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を低下させる、項目４または９に記載の方法。
（項目１６）
Ｗｎｔシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤が、ＣＨＩＲ９９０２１、そのＷＮＴ３Ａ誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子である、項目４または９に記載の方法。
（項目１７）
ＦＧＦシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤が、ＦＧＦ２、その誘導体、およびそれらの混合物を含む、項目６に記載の方法。
（項目１８）
前記１種または複数の神経堤系統マーカーが、ＳＯＸ１０からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記１種または複数の頭蓋プラコード系統マーカーが、ＳＩＸ１、ＰＡＸ３、ＰＩＴＸ３、クリスタリンアルファＡ、クリスタリンアルファＢ、およびこれらの組合せからなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記１種または複数の非神経外胚葉系統マーカーが、ＴＦＡＰ２Ａ、および検出可能なＳＩＸ１およびＳＯＸ１０発現の非存在からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記幹細胞が、ヒト胚性幹細胞、ヒト人工多能性幹細胞、ヒト単為生殖幹細胞、始原生殖細胞様多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、およびＦクラス多能性幹細胞からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目２２）
幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
幹細胞の集団を有効量の
（ａ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、
（ｂ）少なくとも約２日間のＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、
（ｃ）ＳＨＨシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、および
（ｄ）ＦＧＦシグナル伝達の２種またはそれより多い活性化剤
と接触させるステップを含み、
細胞の前記集団を、（ｃ）および（ｄ）に約２０日間またはそれより長い間接触させて、
１種または複数の下垂体プラコード系統マーカーを発現する分化細胞の集団を生成するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
（項目２３）
１種または複数の神経堤、頭蓋プラコード、または非神経外胚葉系統マーカーを発現するｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団であって、項目１から２２のいずれか一項に記載の方法に従って幹細胞の集団から誘導されるｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団。
（項目２４）
項目２３に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団を含む組成物。
（項目２５）
被験体における神経変性障害または下垂体障害を処置する方法であって、有効量の項目２３に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した細胞を、神経変性障害を患っている被験体へと投与するステップを含む方法。
（項目２６）
前記下垂体障害が下垂体機能低下障害である、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
神経変性障害または下垂体障害を処置するための医薬の製造における、項目２３に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した細胞集団の使用。
（項目２８）
前記下垂体障害が下垂体機能低下障害である、項目２７に記載の使用。
（項目２９）
幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、有効量の１種または複数の
（ａ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、
（ｂ）ＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、
（ｃ）ウイングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１種または複数の活性化剤、
（ｃ）ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、
（ｄ）ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、
（ｅ）ＳＨＨシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、および
（ｆ）前記幹細胞の、１種または複数の神経堤、頭蓋プラコード、または非神経外胚葉系統マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示書
を含むキット。
（項目３０）
幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、有効量の
（ａ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、
（ｂ）ＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、
（ｃ）ウイングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１種または複数の活性化剤、および
（ｄ）前記幹細胞の、１種または複数の神経堤系統マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示書
を含むキット。
（項目３１）
幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、有効量の
（ａ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、
（ｂ）ＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、
（ｃ）ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、および
（ｄ）前記幹細胞の、１種または複数の頭蓋プラコード系統マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示書
を含むキット。
（項目３２）
（ｅ）ウイングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１種または複数の活性化剤をさらに含む、項目３１に記載のキット。
（項目３３）
幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、有効量の
（ａ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、
（ｂ）ＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、
（ｃ）ＳＨＨシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、
（ｄ）ＦＧＦシグナル伝達の２種またはそれより多い活性化剤、および
（ｅ）前記幹細胞の、１種または複数の下垂体プラコード系統マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示書
を含むキット。
（項目３４）
幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、有効量の
（ａ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、
（ｂ）ＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、
（ｃ）ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および
（ｄ）前記幹細胞の、１種または複数の非神経外胚葉系統マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示書
を含むキット。
（項目３５）
分化した幹細胞の集団を含むキットであって、幹細胞の前記集団を、項目１から２２のいずれか一項に記載の方法に従って分化させるキット。
４．図面の簡単な説明