【手続補正書】
【提出日】令和2年10月2日(2020.10.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞（ＰＳＣ）に由来する造血前駆細胞（ＨＰＣ）をエリスロイド細胞、リンフォイド細胞、またはミエロイド細胞に分化させる方法であって、破壊されたメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）を呈するＨＰＣを得ること、およびエリスロイド分化、ミエロイド分化またはリンフォイド分化を促進する条件下で前記ＨＰＣを培養することにより、エリスロイド細胞、ミエロイド細胞またはリンフォイド細胞を産生することを含む方法。
【請求項２】
前記ＨＰＣが、メチル化ＤＮＡに本質的に結合しない非機能性ＭｅＣＰ２を発現するか、または前記ＨＰＣが、ＭｅＣＰ２のＤＮＡ結合活性を発揮するのに十分なレベルでＭｅＣＰ２を発現しない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＭｅＣＰ２が、ＭｅＣＰ２遺伝子のトランケーション、エクソンスキッピング、または突然変異により非機能性である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
破壊されたＭｅＣＰ２を呈するＨＰＣを得ることが、ＰＳＣと、ＭｅＣＰ２に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、タンパク質阻害剤、または低分子阻害剤とを接触させること、および前記ＰＳＣを分化させて破壊されたＭｅＣＰ２を有するＨＰＣを産生することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
破壊されたＭｅＣＰ２を呈するＨＰＣを得ることが、ＭｅＣＰ２の発現、活性、および／または機能を破壊するようにＰＳＣを工学操作すること、および前記ＰＳＣを分化させて破壊されたＭｅＣＰ２を有するＨＰＣを産生することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工学操作することがＭｅＣＰ２遺伝子の遺伝子破壊を含み、遺伝子破壊が、ＭｅＣＰ２のメチルＣｐＧ結合ドメインの前へのＤＮＡ−結合ドメインの導入による停止コドンの挿入を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
遺伝子破壊が、ＭｅＣＰ２のメチルＣｐＧ結合ドメインの前への停止コドンの挿入を含み、停止コドンの挿入がＤＮＡ−結合ドメインの導入を含み、前記ＤＮＡ結合ドメインがジンクフィンガー、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲのＤＮＡ結合ドメインである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＳＣが誘導多能性幹細胞（ｉＰＳｃｓ）である、請求項４または５に記載の方法。
【請求項９】
前記ＰＳＣを分化させてＨＰＣを産生することが、
（ａ）少なくとも１つの成長因子を含む第１の規定培地で前記ＰＳＣを培養すること、
（ｂ）複数の細胞の分化を促進するのに十分な量のＢＭＰ４およびＶＥＧＦおよびｂＦＧＦを含む第２の規定培地で前記細胞を培養すること、および
（ｃ）複数の細胞の分化を促進するのに十分な量のＩＬ−３、Ｆｌｔ３リガンド、およびＩＬ−６を含む第３の規定培地で前記細胞を培養することによりＨＰＣを産生すること、
の逐次工程を含む、請求項４または５に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＨＰＣが、ＣＤ４３、ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ４１、ＣＤ２３５、ＤＬＬ４、およびＣＤ４５からなる群から少なくとも２つのマーカーを発現する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＣＤ３４とＣＤ４３とを発現するＨＰＣがリンフォイド分化を促進するように低酸素条件下で培養される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
複数の前記多能性細胞が胚様体（ＥＢ）を形成する、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記ミエロイド細胞が、マクロファージ、肥満細胞、赤血球、巨核球、血小板、樹状細胞、単球、好塩基球、好酸球、好中球、多形核顆粒球、マイクログリア、またはそれらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記エリスロイド細胞が、εグロビンおよび／またはγグロビンの発現と比較してβグロビンをより多く発現する赤血球である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記リンフォイド細胞がＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、またはＴ／ＮＫ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
エリスロイド分化を促進するように前記細胞を培養することが、
（ｉ）赤芽球を生成させるように規定培地で前記ＨＰＣを培養すること、および
（ｉｉ）エリスロイド細胞富化集団を産生するように拡大条件下で前記赤芽球を培養すること、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記エリスロイド細胞富化集団が７０％超のエリスロイド細胞を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記エリスロイド細胞がＣＤ７１、ＣＤ２３５ａ、および／またはＣＤ３６を発現する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ミエロイド分化を促進するように前記細胞を培養することが、
（ａ）マイクログリアを生成させるのに十分な時間にわたりＭＣＳＦとＴＧＦβとＩＬ−３４とを含む規定マイクログリア培地で前記ＨＰＣを培養すること、および
（ｂ）ＣＤ２００とＣＸＣＬ１とをさらに含む規定マイクログリア培地で前記マイクログリアを成熟させることによりマイクログリア集団を産生すること、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記マイクログリア集団が、ＩＢＡ、Ｐ２ＲＹ、および／またはＴＲＥＭ−２が陽性の細胞を少なくとも２５％含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
リンフォイド分化を促進するように前記細胞を培養することが、
（ｉ）Ｎｏｔｃｈリガンドを含むマトリックス被覆プレート上の規定培地でＣＤ３４および／またはＣＤ４３を発現するＨＰＣを培養すること、および
（ｉｉ）１種以上のサイトカインの存在下で前記培養を維持することによりリンフォイド細胞を産生すること、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記規定培地がアスコルビン酸および／またはニコチンアミドを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＰＳＣに由来する胚体内胚葉（ＤＥ）細胞を内胚葉細胞に分化させる方法であって、破壊されたメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）を含むＤＥ細胞を得ること、および内胚葉分化を促進する条件下でＤＥを培養することにより内胚葉細胞を産生することを含む方法。
【請求項２４】
内胚葉分化を促進する条件下で前記ＤＥ細胞を培養することが、前記ＤＥ細胞を内胚葉前駆細胞（ＥＰＣ）に分化させることを含み、前記ＤＥ細胞および／またはＥＰＣが、メチル化ＤＮＡに本質的に結合しない非機能性ＭｅＣＰ２を発現する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
破壊されたＭｅＣＰ２を呈するＤＥ細胞またはＥＰＣを得ることが、ＭｅＣＰ２の発現、活性、および／または機能を破壊するようにＰＳＣを工学操作すること、および前記ＰＳＣを分化させてＤＥ細胞またはＥＰＣを産生することを含み、
前記ＰＳＣを分化させてＤＥ細胞を産生することが、
（ａ）ＭＴＧとアクチビンＡとを含む培地で前記ＰＳＣを培養すること、
（ｂ）アスコルビン酸とＢＭＰ４とｂＦＧＦとＶＥＧＦとをさらに含む培地で前記細胞を培養すること、および
（ｃ）ＤＥ細胞を産生するのに十分な時間にわたりＢＭＰ４とｂＦＧＦとアクチビンＡとＶＥＧＦとを含む培地で前記細胞をさらに培養すること、
の逐次工程を含む、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＤＥ細胞をＥＰＣに分化させることをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
内胚葉分化を促進する条件下で前記ＤＥ細胞を培養することが、β細胞集団を産生するのに十分な時間にわたりアクチビンＡとＢＭＰ４とＴＧＦβとＥＧＦとＶＥＧＦとＨＧＦとを含む培地で前記ＤＥ細胞を培養することを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記β細胞集団が、少なくとも２５％のＰＤＸ１陽性細胞、少なくとも２０％のＮｅｕｒｏＤ１陽性細胞、および／又は少なくとも５％のＮＫＸ６．１陽性細胞を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
内胚葉分化を促進する条件下で前記ＤＥ細胞を培養することが、
（ａ）低酸素条件下でＢＭＰ４、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、Ｄｅｘ、ＤＭＳＯ、および／またはＦＧＦ−１０を含む培地で前記ＤＥ細胞を培養すること、
（ｂ）ＤＡＰＴとビタミンＫとを含む培地で前記細胞をさらに培養すること、および
（ｃ）肝細胞集団を産生するのに十分な時間にわたりＤＡＰＴおよびビタミンＫが本質的にフリーの培地で前記細胞を分化させること、
を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記肝細胞集団が少なくとも２０％のアルブミン陽性細胞を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
規定培地が、ｅｘｃｙｔｅとホロトランスフェリンを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項３２】
破壊されたＭｅＣＰ２を含む、造血前駆細胞（ＨＰＣ）。
【請求項３３】
前記ＨＰＣが、メチル化ＤＮＡに本質的に結合しない非機能性ＭｅＣＰ２を発現するか、および／または、ＭｅＣＰ２のＤＮＡ結合活性を発揮するのに十分なレベルでＭｅＣＰ２を発現しない、請求項３２に記載のＨＰＣ。