(57)【要約】  本発明は、感光剤および少なくとも１種のパラベンを含む組成物を使用して、パラベン相乗作用に受容性を有するグラム陰性有機体に対する光線力学殺菌の抗菌有効性を向上させるための組成物を含む。また、本発明は、前記組成物を所望の処置領域に適用するステップと、前記処置領域内に存在し、パラベン相乗作用に受容性を有するグラム陰性有機体を阻害するために、前記感光剤によって吸収される波長で前記所望の処置領域に光を照射するステップと、を含む光線力学殺菌のための方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
光線力学殺菌用の組成物であって、
感光剤と、
少なくとも１種のパラベンとを含み、前記組成物は、パラベン相乗作用に受容性を有し、所望の処置領域内に存在するグラム陰性有機体の光線力学殺菌に使用される組成物。
【請求項２】
前記組成物は薬学的に許容される担体を更に含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記感光剤がフェノチアジニウム塩である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記感光剤がメチレンブルーである、請求項１乃至３いずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記感光剤の濃度が約０．００１％ｗ／ｖ〜約１％ｗ／ｖの範囲である、請求項１乃至４いずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記少なくとも１種のパラベンは、メチルパラベン、プロピルパラベン、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１乃至５いずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記少なくとも１種のパラベンの濃度が、約０．００１％ｗ／ｖ〜約１％ｗ／ｖである、請求項１乃至６いずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記感光剤は濃度約０．０１％のメチレンブルーであり、前記少なくとも１種のパラベンは濃度約０．１８％ｗ／ｖの濃度のメチルパラベンと、濃度約０．０２％ｗ／ｖの濃度のプロピルパラベンとを含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物のｐＨレベルが約６．０〜約７．０から下がるように調整される、請求項１乃至８いずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記グラム陰性有機体は、大腸菌、緑膿菌、ポルフィロモナス属、プレボテーラ属、フゾバクテリウム属、アクチノバチルス属、セレノモナス属、エイケネラ属、カンピロバクター、ウォリネラ属およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１乃至９いずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記グラム陰性有機体はポルフィロモナスジンジバリスである、請求項１乃至９いずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記グラム陰性有機体はプレボテラインターメディアである、請求項１乃至９いずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記グラム陰性有機体は大腸菌である、請求項１乃至９いずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記グラム陰性有機体は緑膿菌である、請求項１乃至９いずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
光線力学殺菌中にグラム陰性有機体を低減させるための薬剤を製造するための感光性組成物の使用であって、
ａ．感光剤および少なくとも１種のパラベンを含む組成物を所望の処置領域に適用するステップと、
ｂ．所望の処置領域内に存在し、パラベン相乗作用に受容性を有するグラム陰性有機体を阻害するために、前記感光剤によって吸収される波長で前記所望の処置領域に光を照射するステップと、を含む方法。
【請求項１６】
前記感光剤がメチレンブルーであり、前記波長が約６００ｎｍ〜約７００ｎｍの範囲である、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記所望の処置領域に前記光を照射するステップ中に前記所望の処置領域に照射される前記光のエネルギー量は、約１Ｊ／ｃｍ２〜約５０Ｊ／ｃｍ２の範囲である、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１種のパラベンは、メチルパラベン、プロピルパラベン、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１５乃至１７いずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】
前記感光剤は濃度約０．０１％のメチレンブルーであり、前記少なくとも１種のパラベンは、濃度約０．１８％ｗ／ｖの濃度のメチルパラベンと、濃度約０．０２％ｗ／ｖの濃度のプロピルパラベンとを含む、請求項１５乃至１８いずれか１項に記載の使用。
【請求項２０】
前記所望の処置領域は口腔内の軟組織であり、前記グラム陰性有機体は、大腸菌、緑膿菌、ポルフィロモナス属、プレボテーラ属、フゾバクテリウム属、タネレラ属、アクチノバチルス属、セレノモナス属、エイケネラ属、カンピロバクター、ウォリネラ属およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１５乃至１９いずれか１項に記載の使用。
【請求項２１】
前記グラム陰性有機体はポルフィロモナスジンジバリスまたはプレボテラインターメディアである、請求項１５乃至１９いずれか１項に記載の使用。
【請求項２２】
前記感光剤がフェノチアジニウム塩である、請求項１５乃至２１いずれか１項に記載の使用。
【請求項２３】
前記所望の処置領域に照射される前記光を提供するためにレーザが使用される、請求項１５乃至２２いずれか１項に記載の使用。
【請求項２４】
前記組成物を適用する前記ステップと、前記所望の処置領域段階に前記光を照射する前記ステップとが、前記所望の処置領域内に存在する前記グラム陰性有機体が９０パーセント超低減するまで反復される、請求項１５乃至２３いずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グラム陰性有機体の光線力学殺菌に有用な感光剤組成物に関する。より詳細には、本発明は、光線力学殺菌に用いられる場合に、感光剤と１種以上のパラベンとの相乗的抗菌効果により、特定のグラム陰性有機体に対する抗菌有効性が大幅に改善された感光剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
光線力学殺菌（ＰＤＤ）は、抗生物質を使用しない生体外で有効な殺菌法であることが示されている。グラム陰性有機体処置法（modality）としてのＰＤＤの利点の例の１つとして、その非特異的な殺菌機構により、一般に、抗生物質の使用時に問題となる耐性の問題のない点が挙げられる。別の例示的な利点として、ＰＤＤは、抗生物質を持続的に局所送達することが問題となりうる口腔または鼻腔等の領域に投与することができる、局所的な局所療法として使用することができる。これらの理由および他の理由により、ＰＤＤは、急速に、歯周病などの細菌が関与する状態の治療のための有益な手段となりつつある。
【０００３】
ＰＤＤは、感光性組成物の１種以上の感光剤を活性化させるために、基本的に光エネルギーの使用を必要とし、この結果、この感光剤が、基質／標的に直接相互作用する（Ｉ型反応）か、あるいは、分子酸素と相互作用して、一重項酸素および他の活性酸素種を発生させる（ＩＩ型反応）ことができるようになる。このような反応は、主に、脂質の過酸化、膜の損傷および細胞内の成分の損傷を引き起こして、微生物の細胞の非特異的な殺菌を仲介する。この過程が、微生物を殺菌および／または低減させるためには、感光剤がこのような微生物の細胞のエンベロープ内に入るか、あるいはエンベロープと密に結合することが、一般に望ましい。
【０００４】
ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル（一般にパラベンと呼ばれる）は、化粧品および医薬組成物において最も一般に使用されている防腐剤の１つである。パラベンは、広い抗菌活性、広範なｐＨ範囲にわたる有効性、低毒性のほか、過敏性の可能性が低いという利点を有する。また、これらの化合物は、比較的無臭、無色で、極めて安定である。パラベンは、一般に、真菌類およびグラム陽性菌に対して最も有効である。メチルパラベン（メチル−４−ヒドロキシベンゾアート）およびプロピルパラベン（プロピル−４−ヒドロキシベンゾアート）等のパラベンの組合せは、個々のパラベン単独と比較して、より高い防腐活性と高い溶解性とを与え、これらの組合せは市販の商品に広く使用されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
パラベンの抗菌作用の機構の完全な理解はまだ緒についたばかりであり、いくつかの過程の証拠が提案されている。ファーおよびラッセルは、セラチアマルセッセンスをパラベンに曝した場合に、ＲＮＡが細胞内に漏れることを検出し、これは、細胞の膜輸送過程の破壊を示す（J. R. Furr and A. D. Russell, Factors influencing the activity of esters of p-hydroxybenzoic acid on Serratia marcescens, Microbios, 1972参照）。フリーズらは、パラベンが膜輸送系と電子伝達系の両者に干渉していることをつきとめた（E. Freese, C. W. Sheu and E. Galliers, Function of lipophilic acids as antimicrobial food additives, Nature, 1973, 241 :321-325参照）。
【０００６】
エークルンドは、パラベンが細胞質膜のｐＨが変化できないようにするが、プロトン駆動力の膜電位成分を阻止しないことを発見した。その後、エークルンドは、プロトン駆動力の中和とその後に起こる輸送阻害とが阻害の唯一の機構となり得ないと結論付けた（T. J. Eklund, The effect of sorbic acid and esters of p-hydroxybenzoic acid on the protonmotive force in Escherichia coli membrane vesicles, Gen Microbiol 1985, 131 :73-6参照）。
【０００７】
膜系モデルとしてのジパルミトイルホスファチジン酸ベシクルを用いたパニッカーの研究は、プロピルパラベンの脂質膜との濃度依存相互作用を明らかにした。プロピルパラベンは、低濃度では、細胞壁と相互作用することによって、膜機能を変え、標的受容器への受動膜通過拡散を可能する。プロピルパラベンは、高濃度では、脂質成分と相互作用し、細胞壁をより硬くする。これがひいては、膜の半透性、このため膜機能を変える（L. Panicker, Effect of propyl paraben on the dipalmitoyl phosphatidic acid vesicles, J Colloid Interface Science, 2007, 311 :407-416参照）。
【０００８】
ブレディンらは、大腸菌をプロピルパラベンに曝すと、膜の不安定化が惹起されたと報告した。曝露時に、外膜易透化のポリミキシンＢ誘発と同様に、カリウムが放出された。更に、この流出は、ポーリンチャネル活性に依存していた（J. Bredin, A. Davin-Regli and J. M. Pages, Propyl paraben induces potassium efflux in Escherichia coli, J Antimicrobial Chemo. 2005, 55:1013-1015参照）。
【０００９】
グエンらは、エチルパラベンおよびプロピルパラベンが、コンダクタンスが大小の機械感覚性チャネルと相互作用し、これにより大腸菌の浸透勾配を乱すことを示した（T. Nguyen, B. Clare, W. Guo and B. Martinac, The effects of parabens on the mechanosensitive channels of E. coli, EurBiophys J., 2005, 34(5):389-95参照）。
【００１０】
最後に、マらは、パラベンが、膜を乱す機構に加えて、細菌酵素系の非常に有効な阻害剤であることも示した。例えば、Ｆ−ＡＴＰアーゼが、ストレプトコッカスミュータンス内で可逆的に阻害されたが、グルコースの取り込みおよびリン酸化のためのホスホピルバート（phosphopyruvate）：ホスホトランスフェラーゼ系は不可逆的に阻害された（Y. Ma, and R. E. Marquis, Irreversible paraben inhibition of glycolysis by Streptococcus mutans GS-5, Lett Appl Microbiol, 1996, 23:329-33参照）。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、特定のグラム陰性有機体に対する相乗的抗菌効果を提供するために、感光剤および少なくとも１種のパラベンを含む組成物を提供する。特定のグラム陰性有機体に対するこの相乗的抗菌効果（以下、「パラベン相乗作用」と称する）が、本明細書で以下に定義および記載される。上記組成物が、薬学的に許容される担体を更に含むことが好ましい。
【００１２】
また、本発明は、所望の処置領域内に存在し、パラベン相乗作用に受容性を有するグラム陰性有機体に、感光剤および少なくとも１種のパラベンを含む組成物を適用するステップと、グラム陰性有機体を除去するように感光剤によって吸収される波長で処置領域に光を照射するステップと、を有する光線力学殺菌のための方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例Ｉで後述する２種の組成物の吸光度プロフィルを示すグラフである。
【本発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の各種特徴および発明的態様は、以下の詳細な説明、特許請求の範囲、図面などを読むことで明らかになる。
【００１５】
本発明の組成物は、感光剤および少なくとも１種のパラベンを含む。この組成物は、好ましくは、薬学的に許容される担体を更に含む。以下の実施例に示すように、この組成物は、同じグラム陰性有機体に対する、（同様のパラメータまたは同一パラメータでの）光線力学殺菌とパラベン単独との合計の抗菌有効性よりも、特定のグラム陰性有機体に対してより高い抗菌有効性を有する。このような特定のグラム陰性有機体に対する、この高い抗菌有効性を、以降「パラベン相乗作用」と呼ぶ。
【００１６】
感光剤は、当業界で開示されている適切な感光剤であればどのようなものでもよい。例えば、感光剤は、フェノチアジニウム塩（例えば、メチレンブルー、トルイジンブルーＯおよびこれらの誘導体など）でもよい。アリアノルスチールブルー、クリスタルバイオレット、アズール青ｃｅｒｔ、塩化アズールＢ、アズール２、塩化アズールＡ、アズールＢテトラフルオロボレート、チオニン、アズールＡエオシネート、アズールＢエオシネート、アズールミックスｓｉｃｅ、アズールＩＩエオシネート、ヘマトポルフィリンＨＣｌ、ヘマトポルフィリンエステル、アルミニウム二スルホン化フタロシアニンは、適切な感光剤の例である。ポルフィリン、ピロール、テトラピロールの化合物、拡張ピロール巨大環およびこれらのそれぞれの誘導体は、適切な感光剤の更に別の例である。カナダ国ブリティッシュコロンビア州バンクーバ所在のＱＬＴ  ＰｈｏｔｏＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社によって製造されているフォトフリン（登録商標）は、適切な感光剤のさらに別の例である。他の感光剤の例は、米国特許第５，６１１，７９３号明細書および米国特許第６，６９３，０９３号明細書に記載されている。上に記載した感光剤は例であり、いかなる形であれ本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００１７】
所望の用途に応じて、組成物は、任意選択で複数の感光剤を含んでもよい。感光剤の量または濃度は、所望の用途、使用する特定の感光剤、および阻害すべき標的グラム陰性有機体によって変わりうる。「阻害するおよび／または阻害される」とは、阻止、低減、破壊、殺菌、除去などを意味する。例えば、組成物中の感光剤の濃度は、約０．００００１％ｗ／ｖ〜約２５％ｗ／ｖ、約０．０００１％ｗ／ｖ〜約１０％ｗ／ｖ、約０．００１％ｗ／ｖ〜約１％ｗ／ｖ、約０．００１％ｗ／ｖ〜約０．１％ｗ／ｖ、約０．０１％ｗ／ｖ〜約１％ｗ／ｖ、約０．００５％ｗ／ｖ〜約０．０５％ｗ／ｖなどである。本明細書のここで使用する「約」との文言は、記載した値の±２０％を意味するものとする。
【００１８】
少なくとも１種のパラベンは、当業界で開示されている適切なパラベン化合物（「ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル」とも呼ばれる）であれば、どのようなものでもよい。例えば、メチルパラベン（メチル−４−ヒドロキシベンゾアート）、プロピルパラベン（プロピル４−ヒドロキシベンゾアート）およびその組合せなどである。パラベンの量または濃度は、所望の用途、使用する特定の感光剤、および阻害すべき標的グラム陰性有機体によって変わりうる。例えば、組成物中のパラベンの濃度は、約０．００００１％ｗ／ｖ〜約２５％ｗ／ｖ、約０．０００１％ｗ／ｖ〜約１０％ｗ／ｖ、約０．００１％ｗ／ｖ〜約１％ｗ／ｖ、約０．０１％ｗ／ｖ〜約０．１％ｗ／ｖ、約０．０１％ｗ／ｖ〜約０．５％ｗ／ｖ、約０．００５％ｗ／ｖ〜約０．０５％ｗ／ｖなどである。
【００１９】
薬学的に許容される担体は、希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルであり、これと共に組成物の他の成分（例えば感光剤および少なくとも１種のパラベンなど）が投与される。薬学的に許容される担体は、好ましくは、米国連邦政府または州政府の監督機関に承認されているか、あるいは、動物、より詳細にはヒトでの使用が、米国薬局方または他の一般に認識されている薬局方に記載されているものである。薬学的に許容される担体の例は、水、生理食塩水、デキストロース溶液、グリセロール溶液、リン酸バッファ生理食塩水などがあるが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
組成物は、抗炎症剤、緩衝液、溶液の張性を調整する塩類、抗酸化剤、追加の防腐剤、粘性調整剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等）、着香料／香料（例えば、スクラロース等）、酸素担体分子、細胞易透化剤、抗生物質、殺菌剤／制菌剤などの添加成分を任意選択で含んでもよい。
【００２１】
また、本発明は、所望の処置領域内に存在し、パラベン相乗作用に受容性を有するグラム陰性有機体に、感光剤および少なくとも１種のパラベンを含む組成物を適用するステップと、グラム陰性有機体を阻害するように感光剤によって吸収される波長で所望の処置領域に光を照射するステップと、を有する光線力学殺菌のための方法も提供する。所望の処置領域は、抗菌処置を行ないたいどのような領域（例えば、人体組織、動物組織、他の基質の周囲など）でもよい。
【００２２】
「グラム陰性有機体はパラベン相乗作用に受容性を有する」との文言は、本発明の組成物を使用する光線力学殺菌を受けると、グラム陰性有機体がパラベン相乗作用を示すことを指す。パラベン相乗作用に受容性を有するグラム陰性有機体の例は、大腸菌（Ｅコライ）、緑膿菌、アシネトバクター種、および口腔内に常在している病原性グラム陰性有機体（例えば、ポルフィロモナス属、プレボテーラ属、フゾバクテリウム属、タネレラ属、アクチノバチルス属、セレノモナス属、エイケネラ属、カンピロバクター、ウォリネラ属など）を含むが、これらに限定されない。ポルフィロモナスジンジバリスおよびプレボテラインターメディアは、このような口腔の病原性グラム陰性有機体の例である。
【００２３】
波長は、組成物の感光剤によって吸収される光波長であれば、どのような波長でもよい。波長には、紫外光（ＵＶ）、可視光、赤外光（近赤外、中赤外および遠赤外）などの連続電磁スペクトルから選択される波長が含まれる。例えば、波長は、一般に約１６０ｎｍ〜約１６００ｎｍ、４００ｎｍ〜約８００ｎｍ、約５００ｎｍ〜約８５０ｎｍ、約６００ｎｍ〜約７００ｎｍｍであるが、波長は、使用する特定の感光剤および光強度に応じて変わりうる。光は、レーザ（例えば、非熱レーザ等）、発光ダイオード（ＬＥＤ）、白熱源、蛍光源など、光線力学殺菌に使用される、当業界で開示されている適切な発光素子であれば、どのようなものによっても生成することができる。
【００２４】
感光剤の濃度および発光素子のパワーに応じて、処置部位への光照射は、短時間でよいこともあり、例えば、約１５秒〜約５分未満、好ましくは約１５秒〜約２分、より好ましくは１５秒〜約９０秒、最も好ましくは約３０秒〜６０秒などでもよい。各光照射サイクル中に供給される光エネルギーは、約１Ｊ／ｃｍ２〜約５０Ｊ／ｃｍ２、約１Ｊ／ｃｍ２〜約２５Ｊ／ｃｍ２、約５Ｊ／ｃｍ２〜約２０Ｊ／ｃｍ２、および約６Ｊ／ｃｍ２〜約１２Ｊ／ｃｍ２の範囲をとりうる。処置部位に存在するグラム陰性有機体の性質および範囲に応じて、医師が処置部位に複数の光照射サイクル（例えば約２〜約１０サイクル、約３〜約５サイクルなど）を適用してよく、この結果、処置部位に適用される累積総光エネルギーが、各サイクル中に供給される光エネルギーよりも実質的に上昇しうる。
【００２５】
また、処置部位に存在するグラム陰性有機体の性質および範囲に応じて、所望の効果が得られるまで、方法全体が複数回（例えば約２〜約１０回、約３〜約５回など）繰り返されてもよい。処置部位に適用される感光剤の濃度、波長および／または累積総光エネルギーの選択により、本発明の方法が、処置部位における標的グラム陰性有機体の約９０％超、より好ましくは９５％超、最も好ましくは９９％超を低減させることが好ましい。また、処置部位への光照射が、処置部位および／またはその周囲の宿主組織に生理学的損傷を惹き起こさないことが好ましい。
【００２６】
本発明は、ここに記載する特定の実施形態によって、その範囲が限定されることはない。実際、ここに記載する本発明とそのさまざまな変更は、前述の説明と添付の図面から当業者にとって明らかとなろう。このような変更は、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。更に、すべての数値が概算値であり、説明のみのために示されるものであると理解される。本願にわたって引用されるすべての特許出願および刊行物は、その全内容がここに援用される。
【実施例】
【００２７】
本発明に従って示す以下の実施例は、例示のみを目的としており、本発明を限定することを意図するものではない。
実施例Ｉ
【００２８】
組成物Ａは、リン酸バッファ生理食塩水中に約０．０１％ｗ／ｖのメチレンブルーの活性成分を含有していた。組成物Ｂは、約０．１８％ｗ／ｖのメチルパラベンと約０．０２％ｗ／ｖのプロピルパラベンも含有する以外は、組成物Ａと同じであった。
【００２９】
特別に設計された１ｍｍの経路長のセルを使用し、組成物Ａおよび組成物Ｂの光学吸光度特性を分光光度法で検査した。その結果を図１に示す。図１の縦軸のスケールは、１ｍｍの経路長における光濃度（すなわち吸光度）を示す。図１の横軸のスケールは、波長をｎｍ単位で示す。図１の線Ａは、組成物Ａの吸光度プロファイルを表す。図１の線Ｂは、組成物Ｂの吸光度プロファイルを表す。
【００３０】
６６５〜６７０ｎｍ範囲の吸光度ピークは、メチレンブルーの単量体形の存在を示す。６００〜６１０ｎｍの第２のピークは、メチレンブルーの二量体形の存在を示す。メチレンブルーの二量化形は一重項酸素の生成の効果が低いことが示されており、このため、抗菌有効性が低いと考えられている。
【００３１】
図１に示した特徴的な吸光度プロファイルにより、組成物Ａは組成物Ｂよりもメチレンブルーの単量体形の濃度が低かったことが示された。パラベンを含有する組成物Ｂは、メチレンブルーの単量体の吸光度ピークが高かった。パラベンの添加により、メチレンブルーの単量体：二量体の比率が、メチレンブルーの単量体形にシフトしたように思われる。ターディボらが説明しているように、非凝集（すなわち単量体）形のメチレンブルーは、光化学的に励起されて量子収率の高い三重項形を形成することができ、抗菌光線力学殺菌の主な毒性物質であると考えられている一重項酸素を発生させる。これに対して、メチレンブルーの凝集形（二量体、三量体など）は、一重項酸素の生成を行なわず、このため、抗菌の観点から有用性が低い。このため、抗菌用途に設計されたメチレンブルー感光剤製剤では、二量体に対する単量体の比率が高いことが望ましい（Tardivo, J., Giglio, A., Oliveira, C, Gabrielli, D., Junqueira, H., Tada, D., Severino, D., Turchiello, R., Baptista, M., 2005. Methylene blue in photodynamic therapy: From basic mechanisms to clinical applications, Photodiagnosis and Photodynamic Therapy, v. 2, p. 175-191参照）。
実施例ＩＩ
【００３２】
１ミリリットルにつき約１０７〜１０８のコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍｌ）のプランクトニック大腸菌（大腸菌ＡＴＣＣ（登録商標）２５９２２（商標））の培養組織に、リン酸バッファ生理食塩水を含有する対照と、以下の２種類の組成物とを適用することによってインビトロ実験を行なった。組成物Ｃは、約０．２％ｗ／ｖの濃度の安息香酸ナトリウムを防腐剤として添加した等張バッファビヒクル中に、約０．０１％ｗ／ｖの濃度のメチレンブルーの活性成分を含有していた。組成物Ｄは、等張バッファビヒクル中に、約０．０１％ｗ／ｖの濃度のメチレンブルーの活性成分と、約０．１８％ｗ／ｖの濃度のメチルパラベンおよび約０．０２％ｗ／ｖの濃度のプロピルパラベンとを含有していた。この等張バッファビヒクルは、リン酸バッファ生理食塩水中に、着香料（例えば、スクラロース）および粘性調整剤（例えば、カルボキシメチルセルロース）を含有する。リン酸バッファ生理食塩水のみの対照および上記の組成物は、ｐＨがほぼ中性（例えば、ｐＨ約７）であった。
【００３３】
波長約６７０ｎｍ、パワー出力約２２０ｍＷのレーザを使用し、約６０秒間、約３４４ｍＷ／ｃｍ２の出力密度で、組成物Ｃまたは組成物Ｄのいずれかに曝したプランクトニック大腸菌培養組織に、総エネルギー量約２０．６Ｊ／ｃｍ２で照射を行なった。また、照射を行なわずに、リン酸バッファ生理食塩水、組成物Ｃまたは組成物Ｄのいずれかに６０秒間曝したプランクトニック大腸菌培養組織を「非照射」対照として使用した。上記の処置の後、サンプルを連続的に希釈し、固体培地で２４時間培養した（非照射のリン酸バッファ生理食塩水のみの対照中で、プランクトニック大腸菌のコロニーを観察可能にした（対照）。各実験条件を繰り返し、プレートカウントの平均を求めて、希釈を考慮してＣＦＵ／ｍｌのデータに逆算した。このデータは、処置後に生存していた有機体をＣＦＵ／ｍｌで表わすものであり、プランクトニック大腸菌の生存度の低下率（殺菌率）を、対照と比較した実験のサンプル中のこの値として計算し、プランクトニック大腸菌の生存度（ＰＥ生存度）のｌｏｇ１０とパーセントとの低下として表わした。この結果から、照射ありで組成物Ｄに曝した場合、照射を行なった組成物Ｃと比較して、極めて高い抗菌有効性を示すことが示された。照射を行なった組成物ＣのＰＥ生存度の低下が３．１ｌｏｇ１０であったのに対し、照射を行なった組成物Ｄは、プランクトニック大腸菌が完全に殺菌された（ＰＥ生存度の７．２ｌｏｇ１０超の低下）。殺菌率のこの相違は、統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。非照射の組成物Ｄに曝した場合は、ＰＥ生存度の観察可能な低下が得られず、パラベンは、この濃度ではパラベンのみでは急峻な抗菌効果を示さなかった。この結果は予想外であり、感光剤（例えば、メチレンブルー等のフェノサイアジン）とパラベンとの組合せがパラベン相乗作用を与えたことを示し、光線力学殺菌に使用した場合に、プランクトニック大腸菌に対してより高い抗菌有効性を示した。
実施例ＩＩＩ
【００３４】
実施例ＩＩで説明したものと同じリン酸バッファ生理食塩水を含有する対照および以下４種類の感光剤組成物を、プランクトニック大腸菌（大腸菌ＡＴＣＣ（登録商標）２５９２２（商標））の約１０７〜１０８ＣＦＵ／ｍｌの培養組織に適用して、別のインビトロ試験を行なった。組成物Ｅは、実施例ＩＩで説明した等張バッファビヒクル中に、約０．０１％ｗ／ｖの濃度のメチレンブルーの活性成分を含有していた。組成物Ｆは、約０．１８％ｗ／ｖの濃度のメチルパラベンを更に含有する以外は、組成物Ｅと同じである。組成物Ｇは、約０．０２％ｗ／ｖの濃度のプロピルパラベンを更に含有する以外は、組成物Ｅと同じである。組成物Ｈは、約０．１８％ｗ／ｖの濃度のメチルパラベンと約０．０２％ｗ／ｖの濃度のプロピルパラベンとを更に含有する以外は、組成物Ｅと同じである。全ての組成物は中性のｐＨレベル（例えば、ｐＨ約７）であった。
【００３５】
波長約６７０ｎｍ、パワー出力約２２０ｍＷのレーザを使用し、約６０秒間、約３４４ｍＷ／ｃｍ２の出力密度で、上記の４種類の組成物（組成物Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ）に曝したプランクトニック大腸菌培養組織に、総エネルギー量約２０．６Ｊ／ｃｍ２で照射を行なった。上記の処置の後、サンプルを連続的に希釈し、固体培地で２４時間培養した（対照中のプランクトニック大腸菌のコロニーを観察可能にした）。各実験条件を繰り返し、プレートカウントの平均を求めて、希釈を考慮してＣＦＵ／ｍｌのデータに逆算した。このデータは、処置後に生存していた有機体をＣＦＵ／ｍｌで表わすものであり、殺菌率を、対照と比較した実験サンプル中のこの値として計算し、プランクトニック大腸菌の生存度のｌｏｇ１０とパーセントとの低下として表わした。
【００３６】
このデータにより、約０．１８％ｗ／ｖの濃度のメチルパラベンのみ、または約０．０２％ｗ／ｖのプロピルパラベンとの組み合わせを含有する、照射を行なった感光剤組成物（組成物Ｆおよび組成物Ｈ）は、大腸菌を完全に殺菌した（すなわち、ＰＥ生存度の７．９ｌｏｇ１０超の低下）ことが示された。照射を行なった組成物Ｇ（約０．０２％ｗ／ｖのプロピルパラベンを含有）は、ＰＥ生存度の低下が７．０ｌｏｇ１０であった。照射を行なったパラベン非含有の組成物Ｅは、ＰＥ生存度の低下率が３．９ｌｏｇ１０であり、抗菌有効性が著しく低かった。
【００３７】
この試験の結果から、グラム陰性有機体の光線力学殺菌に使用する場合、感光剤組成物にパラベンを添加するとパラベン相乗作用が得られることが更に示された。
実施例ＩＶ
【００３８】
約１０７〜１０８ＣＦＵ／ｍｌのプランクトニック大腸菌（大腸菌ＡＴＣＣ（登録商標））２５９２２（商標））の培養組織を８種類の感光剤組成物に曝すことによってインビトロ試験を行なった。約０．０１％ｗ／ｖの濃度のメチレンブルーを含有する実施例ＩＩで説明した等張バッファビヒクルを、約５、６、７および８のｐＨレベルに調整して、ｐＨ約５の組成物Ｉ、ｐＨ約６の組成物Ｊ、ｐＨ約７の組成物ＫおよびｐＨ約８の組成物Ｌを得た。組成物Ｍ（ｐＨ約５）、組成物Ｎ（ｐＨ約６）、組成物Ｏ（ｐＨ約）および組成物Ｐ（ｐＨ約）は、実施例ＩＩで説明したのと同じ等張バッファビヒクル中に、約０．０１％ｗ／ｖの濃度のメチレンブルー、約０．１８％ｗ／ｖの濃度のメチルパラベン、約０．０２％ｗ／ｖの濃度のプロピルパラベンをそれぞれ含有していた。
【００３９】
波長約６７０ｎｍ、パワー出力約２２０ｍＷのレーザを使用し、約６０秒間、約３４４ｍＷ／ｃｍ２の出力密度で、上記の８種類の組成物に曝したプランクトニック大腸菌培養組織に、総エネルギー量約２０．６Ｊ／ｃｍ２で照射を行なった。上記の処置の後、サンプルを連続的に希釈し、固体培地で２４時間培養した（対照中のプランクトニック大腸菌のコロニーを観察可能にした）。各実験条件を繰り返し、プレートカウントの平均を求めて、希釈を考慮してＣＦＵ／ｍｌのデータに逆算した。このデータは、処置後に生存していた有機体をＣＦＵ／ｍｌで表わすものであり、殺菌率を、対照と比較した実験サンプル中のこの値として計算し、プランクトニック大腸菌の生存度のｌｏｇ１０とパーセントとの低下として表わした。
【００４０】
照射を行なった組成物ＩではＰＥ生存度の低下が２．７ｌｏｇ１０であったのに対し、同じ約５のｐＨレベルの照射を行なった組成物Ｍでは、ＰＥ生存度の３．４ｌｏｇ１０の低下が得られた。照射を行なった組成物ＪではＰＥ生存度の低下が４．３ｌｏｇ１０であったのに対し、同じ約６のｐＨレベルの照射を行なった組成物Ｎでは、ＰＥ生存度の５．４ｌｏｇ１０の低下が得られた。照射を行なった組成物ＫではＰＥ生存度の低下が４．７ｌｏｇ１０であったのに対し、同じ約７のｐＨレベルの照射を行なった組成物Ｏでは、完全な殺菌が行なわれた（ＰＥ生存度の７．９ｌｏｇ１０超の低下）。最後に、照射を行なった組成物ＬではＰＥ生存度の低下が４．８ｌｏｇ１０であったのに対し、同じ約８のｐＨレベルの照射を行なった組成物Ｐでは、完全な殺菌が行なわれた（ＰＥ生存度の７．９ｌｏｇ１０超の低下）。
【００４１】
このデータにより、照射を行なったパラベン含有組成物（組成物Ｍ，Ｎ，Ｏ，Ｐ）は、試験を行なった全ｐＨレベルにおいて、パラベン非含有の同じ感光剤組成物（組成物Ｉ，Ｊ，Ｋ，Ｌ）よりも高い抗菌有効性を有することが示された。また、パラベン含有感光剤組成物、パラベン非含有組成物の両者について、ｐＨレベルの上昇と共に抗菌有効性が全体的に増加することが示された。
実施例Ｖ
【００４２】
大腸菌ＡＴＣＣ（登録商標）２５９２２（商標）（グラム陰性）、緑膿菌ＡＴＣＣ（登録商標）９０２７（商標）（グラム陰性）、セラチアマルセッセンスＡＴＣＣ（登録商標）４３８６２（商標）（グラム陰性）、黄色ブドウ球菌亜種アウレウスＡＴＣＣ（登録商標）２５９２３（商標）（メチシリン感受性かつグラム陽性）、および表皮ブドウ球菌ＡＴＣＣ（登録商標）４９４６１（商標）（グラム陽性）培養組織の約１０６〜１０７ＣＦＵ／ｍｌのプランクトニック細菌培養のそれぞれに対して、リン酸バッファ生理食塩水を含有する対照および下記の３種類の感光剤組成物を適用することによって、別のインビトロ試験を行なった。組成物Ｑは、実施例ＩＩで説明した等張バッファビヒクル中に、約０．０１％ｗ／ｖの濃度のメチレンブルーの活性成分を含有していた。組成物Ｒは、約０．１８％ｗ／ｖの濃度のメチルパラベンと約０．０２％ｗ／ｖの濃度のプロピルパラベンとを更に含有する以外は、組成物Ｑと同じ成分を含有していた。組成物Ｓは、約０．２％ｗ／ｖの濃度の安息香酸ナトリウムを防腐剤として添加した実施例ＩＩで説明した等張バッファビヒクル中に、約０．０１％ｗ／ｖの濃度のメチレンブルーを含有していた。すべての組成物は中性のｐＨレベル（例えば、ｐＨ約７）であった。
【００４３】
上記の組成物（組成物Ｑ，Ｒ，Ｓ）のいずれかに曝した後に、波長約６７０ｎｍ、パワー出力約２２０ｍＷのレーザを使用し、約６０秒間、約３４４ｍＷ／ｃｍ２の出力密度で、各細菌培養組織に総エネルギー量約２０．６Ｊ／ｃｍ２で照射を行なった。上記の処置の後、サンプルを連続的に希釈し、固体培地で２４時間培養した（非照射のリン酸バッファ生理食塩水のみの対照中で、細菌のコロニーを観察可能にした）。各実験条件を繰り返し、プレートカウントの平均を求めて、希釈を考慮してＣＦＵ／ｍｌのデータに逆算した。このデータは、処置後に生存していた有機体をＣＦＵ／ｍｌで表わすものであり、殺菌率は、適応可能な非照射のリン酸バッファ生理食塩水のみの対照と比較した実験サンプル中のこの値として計算し、ｌｏｇ１０および細菌の生存度（Ｂ．生存度）低下パーセントとして示される。
【００４４】
この実験は、光線力学殺菌に用いるパラベン含有ならびにパラベン非含有の感光剤組成物の、グラム陰性有機体およびグラム陽性有機体に対する抗菌有効性を検査したものである。大腸菌の場合、照射を行なったパラベン非含有組成物（組成物Ｑ，Ｓ）はいずれも、Ｂ．生存度の低下が３．９ｌｏｇ１０であったのに対し、照射を行なったパラベン含有組成物（組成物Ｒ）は、Ｂ．生存度の低下が５．６ｌｏｇ１０であった。緑膿菌の場合、照射を行なったパラベン非含有組成物（組成物Ｑ，Ｓ）はいずれも、Ｂ．生存度の低下が２．８ｌｏｇ１０であったのに対し、照射を行なったパラベン含有組成物（組成物Ｒ）は、Ｂ．生存度の低下が６．６ｌｏｇ１０であった。セラチアマルセッセンスの場合、照射を行なったパラベン非含有組成物Ｑは、Ｂ．生存度の低下が３．３ｌｏｇ１０であり、照射を行なったパラベン非含有組成物Ｓは、Ｂ．生存度の低下が４．１ｌｏｇ１０であった。同じ有機体に対し、照射を行なったパラベン含有組成物（組成物Ｒ）は、Ｂ．生存度の低下が４．１ｌｏｇ１０であった。黄色ブドウ球菌の場合、照射を行なったパラベン非含有組成物（組成物Ｑ，Ｓ）はいずれも、Ｂ．生存度の低下が４．０ｌｏｇ１０であったのに対し、照射を行なったパラベン含有組成物（組成物Ｒ）は、Ｂ．生存度の低下が３．９ｌｏｇ１０であった。最後に、表皮ブドウ球菌の場合、照射を行なったパラベン非含有組成物Ｑは、Ｂ．生存度の低下が３．４ｌｏｇ１０であり、照射を行なったパラベン非含有組成物Ｓは、Ｂ．生存度の低下が３．７ｌｏｇ１０であった。同じ有機体に対し、照射を行なったパラベン含有組成物（組成物Ｒ）は、Ｂ．生存度の低下が４．６ｌｏｇ１０であった。
【００４５】
この試験の結果から、照射を行なったパラベン含有感光剤組成物（組成物Ｒ）は、照射を行なったパラベン非含有組成物（組成物Ｑ，Ｓ）と較べ、グラム陰性菌株の大腸菌および緑膿菌に対して高い抗菌有効性を有することが示された。評価を行なった第３のグラム陰性有機体（セラチアマルセッセンス）では、パラベン含有組成物を使用した場合の殺菌の程度がさほど大きくなく、この有機体がパラベン相乗作用の影響を受けにくいことが示された。以前の研究で、ファーおよびラッセルは、メチルパラベンおよびエチルパラベンは、セラチアマルセッセンスの全細胞または分離した細胞壁に取り込まれないが、プロピルパラベンおよびブチルパラベンは取り込まれることを観察した。（J. R. Furr and A. D. Russell, Factors influencing the activity of esters of p-hydroxybenzoic acid on Serratia marcescens, Microbios, 1972参照）。評価を行なった２種類のグラム陽性有機体（黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌）もパラベン相乗作用の影響を受けにくく、パラベン組成物と非パラベン組成物とに曝し、照射を行なった後の殺菌効果は同程度であった。以上まとめると、これらの結果は、パラベンが、特定のグラム陰性有機体（すなわち、パラベン相乗作用に受容性を有するグラム陰性有機体）に対する光線力学殺菌の抗菌有効性を増強させ、かつｐＨが約中性以上の場合にパラベン相乗作用効果が最も高いことを示す。
【００４６】
パラベンは、細菌膜の浸透性を変化させるので、これによりグラム陰性有機体の細胞内への感光剤の侵入が促進されたと考えられる。また、この変化により、光線力学殺菌の主な作用部位であるグラム陰性の細菌膜（すなわちリポ多糖部分）自体とのメチレンブルー分子の結合を増加させたと考えられる。また、パラベン含有感光剤組成物中のメチレンブルー単量体の割合が高くなるに伴い、単量体によって生成される一重項酸素が増加するため、光線力学殺菌の抗菌有効性が改善されることも判明した。光線力学殺菌中の感光剤組成物のパラベン相乗作用により、短い照射処置時間（すなわち、低い印加エネルギー量）で、同じレベルの抗菌有効性を実現することができる。また、更に短い処置時間で、所望の治療部位から大腸菌等の病原体を完全に殺菌することができ、微生物の再コロニー化および／または再感染を防ぐことができる。
実施例Ｖｌ
【００４７】
２種類の一般的な周辺病原体（periopathogens）であるポルフィロモナスジンジバリスおよびプレボテラインターメディアに対するパラベン相乗作用効果の有無を決定するために、パラベンが存在する場合と存在しない場合での、感光剤のメチレンブルーを使用した光線力学殺菌の有効性を評価した。これらの周辺病原体は、歯周病の病因であることが強力に示されている。
【００４８】
嫌気的条件下で（例えば、ヘミンを添加したブルセラ寒天およびビタミンＫ培地を使用して）ポルフィロモナスジンジバリス（ＡＴＣＣ（登録商標）３３２７７）プレボテラインターメディア（ＡＴＣＣ（登録商標）２５６１１）を対数期に成長させ、約１０７ＣＦＵ／ｍｌの濃度の液体プランクトニック培養組織を作製してインビトロ実験を行なった。その後、これらのプランクトニック培養組織を、リン酸バッファ生理食塩水を含有する対照または下記の２種類の組成物のいずれかに曝した。実施例ＩＩで説明した等張バッファビヒクル中に、約０．０１％ｗ／ｖの濃度のメチレンブルーの活性成分を含有する組成物Ｔ。約０．１８％ｗ／ｖの濃度のメチルパラベンと約０．０２％ｗ／ｖの濃度のプロピルパラベンとを更に含有する以外は、組成物Ｔと同じ成分を含有する組成物Ｕ。
【００４９】
予備実験を行ない、光を照射せずに、約０．１８％ｗ／ｖの濃度のプロピルパラベンと約０．０２％ｗ／ｖの濃度のメチルパラベンとを含有する組成物Ｕに最大５分間曝しても、細菌生存度が全く低下しないことを確認した。この結果は、パラベン成分は、これらのパラメータ下では、それ自体では高い抗菌活性を示さなかったことを示唆している。
【００５０】
波長約６７０ｎｍ、パワー出力約１００ｍＷのレーザを使用し、約６０秒間、約１６０ｍＷ／ｃｍ２の出力密度で、上記の組成物（組成物Ｔ，Ｕ）のいずれかに曝した上記の有機体のプランクトニック培養組織に、総エネルギー量約９．６Ｊ／ｃｍ２で照射を行なった。
【００５１】
上記の処置の後、サンプルを連続的に希釈し、最大５日間、固体培地で培養した（非照射のリン酸バッファ生理食塩水のみの対照中で、細菌のコロニーを観察可能にした）。各実験条件を繰り返し、プレートカウントの平均を求めて、希釈を考慮してＣＦＵ／ｍｌのデータに逆算した。このデータは、処置後に生存していた有機体をＣＦＵ／ｍｌで表わすものであり、殺菌率を、適応可能な非照射のリン酸バッファ生理食塩水のみの対照と比較した実験サンプル中のこの値として計算し、細菌の生存度（Ｂ．生存度）のｌｏｇ１０とパーセントとの低下として表わした。
【００５２】
この試験の結果から、メチレンブルーを単独で使用した場合（組成物Ｔ）と比べ、パラベンが存在する場合（組成物Ｕ）は光線力学殺菌の抗菌有効性が改善されるというパラベン相乗作用が示された。ポルフィロモナスジンジバリスの場合、かつ対照と比較した場合、照射を行なった組成物Ｔに曝した場合のＢ．生存度の低下は６．０ｌｏｇ１０であり、照射を行なった組成物Ｕに曝した場合のＢ．生存度の低下は７．２ｌｏｇ１０であった。このため、組成物Ｕに曝した場合、組成物Ｔと比べて、細菌の殺菌が１．２ｌｏｇ１０（１０倍超）向上した。プレボテラインターメディアの場合、照射を行なった組成物Ｔに曝した場合のＢ．生存度の低下は３.５ｌｏｇ１０であり、照射を行なった組成物Ｕに曝した場合のＢ．生存度の低下は５．１ｌｏｇ１０であった。このため、組成物Ｕに曝した場合、組成物Ｔと比べて、細菌の殺菌が１．６ｌｏｇ１０向上した。周辺病原体であるポルフィロモナスジンジバリスおよびプレボテラインターメディアを使用したこの試験の結果は、これらの有機体のメチレンブルー光線力学殺菌に対する。明らかなパラベン相乗作用効果を示唆している。
【図１】
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【国際調査報告】
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