(57)【要約】真核生物由来の蛋白質のような、正確なフォーム形成が必要な、２以上のポリペプチドから構成される蛋白質を細菌に生産させることが求められている。本発明は、翻訳ユニット間に特定のスペーサー配列を含むＤＮＡ構築体、ベクターと宿主、形質転換体、及びそれらを用いた２以上のポリペプチドで構成される蛋白質の生産方法、及びまたそのような蛋白質を含む医薬組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
スペーサー配列を含むＤＮＡ構築体であって、該スペーサー配列が以下の（１）または（２）のＤＮＡ配列を含む、ＤＮＡ構築体。
（１）ブレビバチルス属細菌の細胞壁蛋白質オペロン中の、ｍｉｄｄｌｅ  ｗａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子の終止コドンの直後からｏｕｔｅｒ  ｗａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列の直前までのＤＮＡ配列のうちの、任意の２０ヌクレオチド長以上からなるＤＮＡ配列。
（２）（１）のＤＮＡ配列中に、１または数個のヌクレオチドの置換、欠失および／または付加を有するＤＮＡ配列であって、かつ（１）のＤＮＡ配列と同等の機能を有するＤＮＡ配列。
【請求項２】
シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、および２種類以上のポリペプチドから構成される蛋白質のいずれか１つのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む翻訳ユニットの２種類以上が、該スペーサー配列を介して連結され、かつ単一のプロモーター配列に作動可能に連結されている、請求項１記載のＤＮＡ構築体。
【請求項３】
前記翻訳ユニットが２個であり、かつ前記蛋白質のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のそれぞれが完全長抗体を構成する軽鎖（Ｌ鎖）又は重鎖（Ｈ鎖）をコードするものである、請求項２記載のＤＮＡ構築体。
【請求項４】
１の翻訳ユニットが、ブレビバチルス属細菌のｍｉｄｄｌｅ  ｗａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、および完全長抗体の軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡ配列を含み、かつ、他の翻訳ユニットが、ブレビバチルス属細菌のｏｕｔｅｒ  ｗａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、および完全長抗体の重鎖（Ｈ鎖）をコードするＤＮＡ配列を含む、請求項３記載のＤＮＡ構築体。
【請求項５】
１の翻訳ユニットが、ブレビバチルス属細菌のｍｉｄｄｌｅ  ｗａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、および完全長抗体の重鎖（Ｈ鎖）をコードするＤＮＡ配列を含み、かつ、他の翻訳ユニットが、ブレビバチルス属細菌のｏｕｔｅｒ  ｗａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、および完全長抗体の軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡ配列を含む、請求項３記載のＤＮＡ構築体。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築体を含むベクター。
【請求項７】
請求項６記載のベクターを宿主に導入して得られる形質転換体。
【請求項８】
前記宿主がブレビバチルス属またはバチルス属細菌である、請求項７記載の形質転換体。
【請求項９】
異種蛋白質を生産し、かつ分泌する、請求項８記載の形質転換体。
【請求項１０】
前記ブレビバチルス属細菌が、ブレビバチルス・ブレビス、ブレビバチルス・ボルステレンシス又はブレビバチルス・チョウシネンシスである、請求項９記載の形質転換体。
【請求項１１】
２種類以上のポリペプチドから構成される蛋白質の製造方法であって、請求項７から１０のいずれか１項に記載の形質転換体を培養し前記蛋白質を生産させる工程、および生産された該蛋白質を回収する工程を含む製造方法。
【請求項１２】
蛋白質が完全長抗体である、請求項１１記載の製造方法。
【請求項１３】
請求項１１記載の製造方法によって得られる蛋白質。
【請求項１４】
請求項１１記載の製造方法によって得られる蛋白質、および製薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２種類以上のポリペプチドから構成される蛋白質、とりわけ完全長抗体を、宿主を用いて効率よく製造する事を可能にするＤＮＡ構築体に関する。さらに、当該ＤＮＡ構築体を含むベクター、当該ベクターにより宿主を形質転換して得られる形質転換体、および、当該形質転換体を用いた２種類以上のポリペプチドから構成される蛋白質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物は、生体の恒常的維持にとって有害である種々の疾患発病や病気の原因となる抗原（例えばウイルス、細菌毒素、化学物質等）、また悪性自己抗原（例えば自己反応性リンパ球、腫瘍細胞、過剰のサイトカインやホルモンなどの生体内因子など）を特異的に捕捉し生体から排除する防御システムすなわち体液性免疫を有している。この体液性免疫では、上述した抗原の刺激の結果、主に抗体と呼ばれる高分子蛋白質が産生される。【０００３】
この抗体は高等生物の生体防御系において中心的な役割を担っており、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤの５つの抗体クラスに分けられて、基本構造は各クラス共通である。抗体は、分子量５万−７万の２本のポリペプチド鎖（抗体重鎖、Ｈ鎖とも呼ばれる）と分子量約２．３万−２．５万の２本のポリペプチド鎖（抗体軽鎖、Ｌ鎖とも呼ばれる）との計４本のポリペプチド鎖により構成され、それぞれ相同な２本のＨ鎖と２本のＬ鎖がジスルフィド結合及び非共有結合により結合した、分子量１５０万から１９０万となるＹ字型の基本構造を有する高分子蛋白質である。抗体がこのＹ字型構造を有するためには、Ｈ鎖中のＮ末端側から数えて約２１５残基前後から始まるヒンジ部と呼ばれる領域内の、２つのシステイン残基同士のジスルフィド結合が必須である。【０００４】
Ｌ鎖、Ｈ鎖のＮ末端ドメインにはアミノ酸配列が抗原結合に固有である可変部と呼ばれる機能単位が存在し、結合相手である抗原が特定化される。その可変部以降Ｃ末端側のアミノ酸配列は、同種動物の各抗体クラスがほぼ一定な定常部とよばれるドメインを有している。このドメインはＦｃ領域とも呼ばれ、補体、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、好中球、マクロファージなどの抗体Ｆｃ領域受容体と結合する。また抗体分子のＦｃ領域は、細胞による細胞障害作用のうち、抗体を必要とする抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）に関与することから、生体における抗体の生物学的活性に重要な役割を持つ。【０００５】
抗体は、生体における有害な抗原の捕捉及び排除という機能を有する医薬品として古くより利用されている。初期の抗体医薬は、いわゆる細菌毒素やヘビ毒に対する様々なタイプの抗体が混在する抗血清すなわちポリクローナル抗体である。しかしながら、この抗血清を取得するためには、血清からの回収による方法に限られていることから、その抗体医薬としての抗血清の供給は限りがあった。また、様々なタイプの抗体が混在することから、特定の抗原に対する特異性を持つ単一タイプの抗体分子、すなわちモノクローナル抗体を単離する上でも非常に困難が伴う。【０００６】
これらの問題は１９７５年にケーラーとミルシュタインによる細胞融合技術、すなわちハイブリドーマ法によるモノクローナル抗体の作製の成功により解決され、均一で高い抗原特異性と親和性を持ち、安定的に供給可能なマウスモノクローナル抗体を得ることが可能となった（非特許文献１参照）。この方法は特定の抗原と反応するマウスＢ細胞とマウス腫瘍細胞とを融合して、特定の抗体を産生しかつ安定に増殖するハイブリドーマを作製し、ハイブリドーマ細胞を培養することにより細胞培養液中からモノクローナル抗体を精製、取得することを可能とする。【０００７】
モノクローナル抗体は従来の抗血清のようなポリクローナル抗体に比較し、その抗原特異性が格段に優れ、特異的に結合することにより抗原の生物活性を阻害、増強、またはリガンドに代わるシグナル伝達の阻害や細胞間接着を阻害することが出来ることから、様々な疾患の予防及び治療のための極めて有用な検査薬や医薬品として用いられている。【０００８】
近年、遺伝子工学の発展によりマウスモノクローナル抗体の一部とヒトモノクローナル抗体との一部から成る組み換え型キメラ抗体、並びに完全ヒト化抗体が研究開発されている。ヒトに投与したとき従来から問題とされていたＨＡＭＡ（ヒト抗マウス抗体）が誘導されること無く、様々な疾患治療に対し十分な効果を持つ抗体医薬品が生産されるようになっている。この遺伝子組換えによる抗体生産は、現在一般的に、動物細胞、特にチャイニーズハムスター卵巣細胞由来のＣＨＯ細胞、及びマウスミエローマー由来のＮＳ０細胞及びＳＰ２／０細胞（非特許文献２参照）で行われている。【０００９】
しかし、動物細胞による組換え抗体医薬品製造は、培養に用いられる培地に掛かる費用や多大な培養日数などのために製造コストが非常に高い。さらに安定な細胞を樹立するには多数の細胞株から選択する必要がある。このように、生産使用可能な安定的な抗体発現細胞株の樹立までには手間と労力とが必要となっている。従って、もし動物細胞において目的の抗体を多量に得ようとするのであれば、生産量を上げるため高価で大量の培地を用い、継続的な培地の添加により培養日数を増加させざるを得ない。その製造コストはそのまま薬品価格へ反映されるのが一般的である。以上のような背景のもと、目的の抗体を安価かつ高生産できる技術が望まれている。【００１０】
この動物細胞による抗体生産技術の問題点を克服するため、組換え抗体を微生物、トランスジェニック植物や動物において安価に生産させる技術が開発されている。中でも微生物では、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を用いた抗体生産技術が数多く報告されており、特に抗体の抗原特異的結合性のみを利用したい場合に用いられるような一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）や、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆｖといった低分子抗体断片が比較的高収量にて生産できる技術が開発されている（非特許文献３、非特許文献５参照）。また近年、完全長抗体の発現および生産を指向する方法が報告され、抗体のＬ鎖及びＨ鎖を個別にプロモーター下流へ配置させたプラスミドにより、Ｌ鎖、Ｈ鎖を別々に大腸菌のペリプラズムスペース内に発現させ、そして抗体断片を構成させる方法によりＦａｂ′型の抗体や完全長抗体を生産させている（非特許文献４、特許文献１参照）。ブレビバチルス属細菌においても本開示技術を適用することによりＬ鎖及びＨ鎖の発現量や量比を制御できると期待された。しかし、ブレビバチルス・ブレビス細菌においてＬ鎖及びＨ鎖の発現量をコントロールすることができないため、完全長抗体を効率よく生産し得なかった（本明細書の比較例２参照）。さらに、これらの開示は、完全長抗体のような２以上のポリペプチドから構成される蛋白質の生産のためには、２プロモーターを使用する２シストロン系が好適であることを指摘する。【００１１】
大腸菌による抗体生産は、必要な培養日数や培養コストから動物細胞に比較し大幅に製造コストを削減することができ、安価で供給が可能であることから動物細胞に代わる製造技術として期待されている。ところが、大腸菌による低分子抗体断片や完全長抗体の発現の場合、そのペリプラズムスペースに分泌発現することから、精製時に菌体を集め破砕処理を行うなどの操作が必要となり、操作上の不便性が生じるだけでなく、目的とする蛋白質精製時に菌体成分由来の汚染が避けられないという精製工程上のマイナス面も生じる。さらにジスルフィド結合の多い抗体蛋白質などの場合、目的とする抗体蛋白質の発現時、正確な高次構造形成がとれず細胞内でプロテアーゼによる分解作用を受けることや、翻訳後、細胞内へ不活性型の封入体を形成してしまうことが多い。この不活性型の封入体から活性型へ変換するには、複雑なリフォールディング操作が必要となるだけでなく、活性型蛋白質の回収率に多大な影響をおよぼす。【００１２】
大腸菌による蛋白質生産の上記問題点を解消するため、鵜高らはブレビバチルス・ブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）を用いた蛋白質生産に対する画期的な宿主ベクター系を開発し、現在までに多種類の蛋白質に対する生産系を開発している（特許文献２、特許文献３参照）。この技術によるバチルス属細菌を用いた組換え抗体蛋白質生産では、低分子抗体である抗ヒトウロキナーゼ・マウス・ヒトキメラＦａｂ′抗体を効率良く分泌生産させことに成功している（非特許文献６、特許文献４、特許文献４の優先権を主張した特許文献５）。即ち、ブレビバチルス・ブレビスの細胞壁蛋白質の一つとして知られるｍｉｄｄｌｅ  ｗａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＷＰ）のプロモーター下流にＳＤ配列を介してＭＷＰのシグナルペプチドを持つ抗ヒトウロキナーゼ・マウス・ヒトキメラ抗体Ｌ鎖と、同様にＭＷＰのＳＤ配列及びシグナルペプチドを有したＦｄ’断片鎖（Ｈ鎖の可変部領域からヒンジ部の最初のシステイン残基までの蛋白質をコードしている領域）をタンデムに配置させた発現プラスミドを用い、目的とする組み換えＦａｂ′断片を、約０．１ｇ／Ｌ以上と極めて高効率で培養液中へ分泌生産させる。また、ブレビバチルス・ブレビスにより発現された組換えＦａｂ′蛋白質は、その細胞壁蛋白質の分泌シグナルペプチドにより培養液へ分泌され、直接培養液から活性型Ｆａｂ′断片を容易に精製回収できることを示す。しかし、特許文献４は、正確なフォーム形成が必要とされる完全長抗体のような蛋白質の生産を開示していない。加えて、特許文献４で使用される、２つの翻訳ユニット間に介在するスペーサー配列は比較的短い。
【特許文献１】国際公開第０３／０１８７７１号パンフレット
【特許文献２】特開昭６３−５６２７７号公報
【特許文献３】特開２０００−２３８７４０号公報
【特許文献４】特開平７−２６５０９４号公報
【特許文献５】米国特許第５６６５５７０Ａ号明細書
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ．１９７５．２５６：４９５−４９７
【非特許文献２】Ｃｈｕ，Ｌ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ｄ．Ｋ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００．１２：１８０−１８７
【非特許文献３】Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ．Ｄ．Ｐ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｄｅｖ．２００３．６：１８８−１９６
【非特許文献４】Ｓｉｍｍｏｎｓ．Ｌ  Ｃ．ら．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ  ２００２．２６３：１３３−１４７
【非特許文献５】Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ら．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１９９２．  １０：１６３−１６７
【非特許文献６】Ｉｎｏｕｅ，Ｙら  Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７．４８：４８７−４９２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
Ｆａｂ′型抗体のような低分子抗体断片においては、特殊な発現方法を有せずとも、公知の発現方法、すなわち目的とする抗体分子のＬ鎖及びＦｄ鎖を適当なプロモーター下流にタンデムに、スペーサー配列を使用せず、直接連結させる方法により発現可能である。しかし、正確なフォーム形成が必要な蛋白質（例えば完全長抗体）の分泌発現のための、新規な生産方法の開発が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、正確なフォーム形成が必要な２種類以上のポリペプチドから構成される蛋白質を宿主で生産させるためには、各ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列間に、ブレビバチルス属細菌の細胞壁蛋白質オペロン中の、ｍｉｄｄｌｅ  ｗａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＷＰ）遺伝子の終止コドンの直後からｏｕｔｅｒ  ｗａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＯＷＰ）のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列の直前までのＤＮＡ配列を含む、比較的長いヌクレオチド長のスペーサー配列を要することを発見した。【００１５】
本発明は、スペーサー配列を含むＤＮＡ構築体であって、該スペーサー配列が以下の（１）または（２）のＤＮＡ配列を含む、ＤＮＡ構築体を提供する。
（１）ブレビバチルス属細菌の細胞壁蛋白質オペロン中の、ＭＷＰ（ｍｉｄｄｌｅ  ｗａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子の終止コドンの直後からＯＷＰ（ｏｕｔｅｒ  ｗａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列の直前までのＤＮＡ配列のうちの、任意の２０ヌクレオチド長以上からなるＤＮＡ配列。
（２）（１）のＤＮＡ配列中に、１または数個のヌクレオチドの置換、欠失および／または付加を有するＤＮＡ配列であって、かつ（１）のＤＮＡ配列と同等の機能を有するＤＮＡ配列。【００１６】
本発明は、好ましくは、さらに以下の１または複数の特徴を有する。
本発明は、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、および２種類以上のポリペプチドから構成される蛋白質のいずれか１つのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む翻訳ユニットの２種類以上が、該スペーサー配列を介して連結され、かつ単一のプロモーター配列に作動可能に連結されている、上記ＤＮＡ構築体を提供する。【００１７】
本発明は前記翻訳ユニットが２個であり、かつ前記蛋白質のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のそれぞれが完全長抗体を構成する軽鎖（Ｌ鎖）又は重鎖（Ｈ鎖）をコードするものである、上記ＤＮＡ構築体を提供する。【００１８】
本発明は、１の翻訳ユニットが、ブレビバチルス属細菌のＭＷＰのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、および完全長抗体の軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡ配列を含み、かつ、他の翻訳ユニットが、ブレビバチルス属細菌のＯＷＰのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、および完全長抗体の重鎖（Ｈ鎖）をコードするＤＮＡ配列を含む、上記ＤＮＡ構築体を提供する。
本発明は、１の翻訳ユニットが、ブレビバチルス属細菌のＭＷＰのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、および完全長抗体の重鎖（Ｈ鎖）をコードするＤＮＡ配列を含み、かつ、他の翻訳ユニットが、ブレビバチルス属細菌のＯＷＰのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、および完全長抗体の軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡ配列を含む、上記のＤＮＡ構築体を提供する。【００１９】
本発明は、上記のいずれかのＤＮＡ構築体を含むベクターを提供する。本発明は、上記いずれかのベクターを宿主に導入して得られる形質転換体を提供する。
本発明は、前記宿主がブレビバチルス属またはバチルス属細菌である、上記いずれかの形質転換体を提供する。
本発明は、異種蛋白質を生産し、かつ分泌する、上記いずれかの形質転換体を提供する。
本発明は、前記ブレビバチルス属細菌がブレビバチルス・ブレビス、ブレビバチルス・ボルステレンシス又はブレビバチルス・チョウシネンシスである、上記のいずれかの形質転換体を提供する。【００２０】
本発明は、２種類以上のポリペプチドから構成される蛋白質の製造方法であって、上記いずれかの形質転換体を培養し、上記いずれかの蛋白質を生産させる工程、および生産された該蛋白質を回収する工程を含む製造方法を提供する。
本発明は、上記製造方法によって得られる蛋白質を提供する。本発明は、上記製造方法によって得られる蛋白質、および製薬的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。【００２１】
本発明によれば、例えば、２種類以上のポリペプチドから構成される蛋白質を宿主（細菌宿主を含む）で生産する際、正しい構造を有する目的蛋白質を効率良く得ることができる。例えば、Ｙ字型構造を有する完全長抗体を、ほぼ均一な状態で培養液中に生産蓄積させることができる。【００２２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書において、「ＤＮＡ構築体」とは、組み換えＤＮＡ技法を使用して、任意のＤＮＡを連結させたものをいう。そのようなＤＮＡ構築体の調製は、当業者にとって公知の技術を利用して行うことができる。【００２３】
本明細書において、ＤＮＡ構築体に含まれる「スペーサー配列」とは、任意の翻訳ユニットの間に介在するＤＮＡ配列を意味する。本発明の目的のためには、該スペーサー配列は、例えば２０〜３００ヌクレオチド長、好ましくは５０〜２００ヌクレオチド長である。
該スペーサー配列は、以下の（１）または（２）のＤＮＡ配列を含む、ＤＮＡ構築体である。
（１）ブレビバチルス属細菌の細胞壁蛋白質オペロン中の、ｍｉｄｄｌｅ  ｗａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子の終止コドンの直後からｏｕｔｅｒ  ｗａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列の直前までのＤＮＡ配列のうちの、任意の２０ヌクレオチド長以上からなるＤＮＡ配列。
（２）（１）のＤＮＡ配列中に、１または数個のヌクレオチドの置換、欠失および／または付加を有するＤＮＡ配列であって、かつ（１）のＤＮＡ配列と同等の機能を有するＤＮＡ配列。
本明細書において、以下では、上記（１）又は（２）のＤＮＡ配列を「ＤＮＡ配列（１）又は（２）」と記載することがある。【００２４】
本発明のスペーサー配列に含まれる「ＤＮＡ配列（１）又は（２）」は、２０ヌクレオチド長以上、望ましくは２７ヌクレオチド長以上、より望ましくは３０ヌクレオチド以上、更に望ましくは４０ヌクレオチド長、特に望ましくは５１ヌクレオチド長以上、好ましくは６０ヌクレオチド長以上、より好ましくは８０ヌクレオチド長以上、更に好ましくは１００ヌクレオチド長以上、特に好ましくは１１０ヌクレオチド長以上、より特に好ましくは１２０ヌクレオチド長以上である。また、好ましくは２０以上１２７ヌクレオチド長以下であり、具体的には、例えば３６ヌクレオチド長、または５１ヌクレオチド長、または１１２ヌクレオチド長、または１２７ヌクレオチド長である。
また、本発明のスペーサー配列に含まれる「ＤＮＡ配列（１）又は（２）」の起源となるブレビバチルス属細菌としては、ブレビバチルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ  Ｐ−７２２４）が好ましい。なお、ブレビバチルス・ブレビス４７株は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室（ＪＣＭ）に「ＪＣＭ６２８５株」として保存されており、入手することができる。【００２５】
本発明のＤＮＡ構築体のスペーサー配列に含まれる「ブレビバチルス属細菌の細胞壁蛋白質オペロン中の、ＭＷＰ遺伝子の終止コドンの直後からＯＷＰのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列の直前までのＤＮＡ配列のうちの、任意の２０ヌクレオチド長以上からなるＤＮＡ配列」の例示として、配列番号１４に、ブレビバチルス・ブレビス４７の細胞壁蛋白質オペロン中のＭＷＰ遺伝子の終止コドンの直後からＯＷＰのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列の直前までのＤＮＡ配列を示した（図３参照）。【００２６】
「同等の機能を有するＤＮＡ配列」とは、スペーサー配列の一部として使用した際、適当なプロモーター配列の制御下で、当該スペーサー配列を介して連結された２種類以上の翻訳ユニットの各々に含まれるＤＮＡ配列によってコードされる２種類以上のポリペプチドを、宿主において発現せしめる機能を有するＤＮＡ配列であって、さらに、２種類以上のポリペプチドの発現量比が、当該２種類以上のポリペプチドが相互に結合し、本来の正確な高次構造（または本来の高次構造に類似する構造）を有する１個の蛋白質を構成するのに適した量比となるＤＮＡ配列を意味する。
上記「同等の機能を有するＤＮＡ配列」は、前記スペーサー配列に相補的なＤＮＡ配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列であり得る。該ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーション条件の例は、望ましくは約７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、約０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡ中で約５０℃でハイブリダイゼーション、および約２ＸＳＳＣ、約０．１％のＳＤＳ中で５０℃の洗浄；より望ましくは約７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、約０．５ＭのＮａＰＯ４、約１ｍＭのＥＤＴＡ中で５０℃でハイブリダイゼーション、および約１ＸＳＳＣ、約０．１％のＳＤＳで約５０℃の洗浄；更に望ましくは約７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、約０．５ＭのＮａＰＯ４、約１ｍＭのＥＤＴＡ中で約５０℃でハイブリダイゼーション、および約０．５ＸＳＳＣ、約０．１％のＳＤＳで約５０℃の洗浄；好ましくは約７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、約０．５ＭのＮａＰＯ４、約１ｍＭのＥＤＴＡ中で約５０℃でハイブリダイゼーション、および約０．１ＸＳＳＣ、約０．１％のＳＤＳで約５０℃の洗浄；より好ましくは約７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、約０．５ＭのＮａＰＯ４、約１ｍＭのＥＤＴＡ中で約５０℃でハイブリダイゼーション、および、約０．１ＸＳＳＣ、約０．１％のＳＤＳで約６５℃の洗浄である。もっとも、該条件は、ＤＮＡ鎖の長さ、該配列、および異なる環境パラメーターに依存して異なり得る。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの詳細なガイドは、例えばＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｐａｒｔ  Ｉ  ｃｈａｐｔｅｒ  ２’’Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔａｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙ’’Ｅｌｓｖｉｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに見出される。【００２７】
本発明のスペーサー配列に含まれる「ＤＮＡ配列」として、上記ブレビバチルス属細菌の細胞壁蛋白質オペロン中の所定範囲のＤＮＡ配列（１）又は（２）に限らず、ブレビバチルス属細菌における、前記細胞壁蛋白質オペロンと同様の機能を有するオペロン中の所定範囲のＤＮＡ配列を用いてもよい。【００２８】
本発明の「ＤＮＡ構築体」は、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、および２種類以上のポリペプチドから構成される蛋白質のいずれか１つのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む翻訳ユニットの２種類以上が、前記スペーサー配列を介して連結され、かつ単一のプロモーター配列に作動可能に連結されているものが好ましい。
本発明のＤＮＡ構築体に使用される「シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列」は、宿主で機能する分泌シグナルペプチドをコードするものであれば特に制限はない。上記ＤＮＡ配列としては、ブレビバチルス属細菌のＭＷＰおよび／またはＯＷＰのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列が好ましく、ブレビバチルス・ブレビス、特にブレビバチルス・ブレビス４７の、ＭＷＰおよび／またはＯＷＰのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列がより好ましい。ブレビバチルス・ブレビス４７のＯＷＰのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を、図３および配列番号１１〜１３に示した。また、分泌効率を高めるため、従来のシグナルペプチドのアミノ酸配列を改良したものをコードするＤＮＡ配列でも構わない。具体的に言えば、ブレビバチルス・ブレビス４７のＭＷＰのシグナルペプチド、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ（配列番号２１）を利用するほか、このアミノ酸配列の改良例として、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ（配列番号２２）（Ｓａｇｉｙａ．  Ｙら．  １９９４．  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ４２：３５８−３６３；特許第３４３３８０７号）の下線部（Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ、およびＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ）のように塩基性や疎水性アミノ酸残基などを付加または消失させたシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を用いても構わない。使用するＤＮＡ配列は、コドンが縮重コドンで置換されていても、宿主内で翻訳されたときに同一のアミノ酸をコードしている限り、クローニングにより得られたＤＮＡ配列と同一である必要は無い。【００２９】
本明細書において「ポリペプチド」とは、複数のペプチド結合を有するペプチド鎖を言い、アミノ酸残基数が１０以上のものを指す。【００３０】
本明細書において「２種類以上のポリペプチドから構成される蛋白質」とは、２種類以上のポリペプチドが結合して生成した蛋白質であり、それぞれのポリペプチドの構成比が異なる場合も等しい場合も、これに包含される。当該蛋白質を構成するポリペプチドの種類の数は、２以上であれば特に限定されないが、好ましくは２から４、より好ましくは２または３、最も好ましくは２である。当該蛋白質の例として、完全長抗体が含まれる【００３１】
上記「２種類以上のポリペプチド」は、同じ遺伝子起源であってよいが、通常、抗体や蛋白質ホルモンＬＨ（黄体形成ホルモン）、ＦＳＨ（卵胞刺激ホルモン）、ＨＣＧ（ヒト絨毛ゴナドトロピン）、およびＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン）の場合のように異なる遺伝子によってコードされる。本明細書において、「２種類以上のポリペプチドから構成される蛋白質」は、蛋白質が生物学的機能を発現するために２以上の異なるポリペプチドの結合を必要とする限り、いくつかの同じポリペプチドを含んでいてもよい。２種類の異なるポリペプチドからなる蛋白質は、ヘテロダイメリック蛋白質として知られる。そのような蛋白質のさらなる例は、例えばヘルグリン、インテグリン、アクチビン、およびインヒビンのような蛋白質である。【００３２】
本明細書において「完全長抗体」とは、動物個体への抗原刺激の結果、免疫応答によって動物個体内に産生される蛋白質で、免疫源（抗原）と特異的に結合する活性を持つものを言う。即ち、蛋白質、多糖類、核酸、脂質などのうち、抗原性を示す物質または、その集合体を含むものと特異的に結合する活性を有する蛋白質であればよい。「完全長抗体」としては、例えば、〔背景技術〕で述べた抗体構造（Ｙ字型の基本構造）を有しているものだけでなく、抗原と特異的に結合する活性はもちろんのこと、〔背景技術〕で記載した、抗体の定常部が持つ生体内での生物学的活性を有するものも含まれる。本明細書に記載の「完全長抗体」は、分子量の小さなＦｖ、Ｆａｂ、またはＦａｂ′、さらにはｓｃＦｖまたはｄｓＦｖといった１本鎖抗体などの低分子抗原結合性フラグメントとは異なるものを指す。【００３３】
ここで示す「完全長抗体」は、抗原との結合活性や生物学的活性を消失させない範囲内にて、構造アミノ酸配列中に１または数個、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０個またはそれ以上のアミノ酸置換、欠失及び／又は付加のような変異導入を行ったものでもよく、具体的にはマウス抗体やヒト化抗体、さらには二重特異性抗体、トキシン融合抗体、または、これらの組み合わせによってマウス抗体をヒト抗体へ近づけたマウス・ヒトキメラ抗体などが挙げられる。更に具体的にはマウス・ヒトキメラ抗ヒト腫瘍壊死因子抗体や、マウス・ヒトキメラ抗ヒトＣＤ２０抗体が挙げられる（以下、「ヒト腫瘍壊死因子」を「ヒトＴＮＦα」、「マウス・ヒトキメラ抗ヒト腫瘍壊死因子抗体」を「抗ヒトＴＮＦα抗体」と略す）。もっとも、組み換えを有するか有しないかは、本発明にとって重要な問題ではない。【００３４】
完全長抗体をコードするＤＮＡ配列は、通常用いられる公知の方法で取得し、クローニングもしくは公知のポリメラーゼ・チェーン・リアクション（以下、ＰＣＲと略す）法で特異的に増やすことにより取得できる。また公知の化学合成法から合成することも可能であり（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  第１２巻４３５９頁（１９８４年））、ｃＤＮＡライブラリーから得ることもできる。完全長抗体をコードするＤＮＡ配列は、コドンが縮重コドンで置換されていても、宿主内で翻訳されたときに同一のアミノ酸をコードしている限り、クローニングにより得られたＤＮＡと同一である必要は無い。【００３５】
本明細書において、「翻訳ユニット」とは、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列および隣接制御領域を含む遺伝的エレメントを意味する。隣接制御領域は例えば、宿主内で機能するＳＤ配列を意味する。ＳＤ配列（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）とは、原核生物のｍＲＮＡにおいて、開始コドンの上流に見られる共通配列であり、通常、−ＡＧＧＡＧＧ−のようにプリン塩基（アデニン・グアニン）に富んだ３から９塩基（平均４．８塩基）のＤＮＡ配列からなる。本発明においては、ブレビバチルス属細菌、特に、ブレビバチルス・ブレビス由来のＳＤ配列の使用が好ましく、ブレビバチルス・ブレビス４７株の、ＭＷＰおよび／またはＯＷＰ遺伝子に由来するＳＤ配列の使用がより好ましい。本発明のＤＮＡ構築体において、翻訳ユニットの数は任意であり、該数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上でありうる。該数は、好ましくは２から４、より好ましくは２または３、およびもっとも好ましくは２である。【００３６】
本明細書において、「プロモーター」とは、任意の構成的または誘導可能プロモーターを含む。原核生物宿主での使用のために好適なプロモーターは、ｐｏｌＩＩプロモーター、ｐｏｌＩＩＩプロモーター、ＰｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターおよびハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃまたはｔｒｃプロモーターを含む。プロモーターとしては宿主で機能するものであればいずれでも使用できる。好ましくは、ブレビバチルス属細菌由来のプロモーターを使用する。より好ましくは、ブレビバチルス・ブレビス、特にブレビバチルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ  Ｐ−７２２４）由来のＭＷＰプロモーター領域（特公平１−５８９５０号公報、特公平７−１０８２２４公報）、あるいはブレビバチルス・チョウシネンシス、特にブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８７）（バチルス・ブレビスＨ１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８７）と同一菌株）由来のＨＷＰプロモーター領域（特開平４−２７８０９１号公報、特開平６−１３３７８２号公報）に含まれるプロモーター、例えばＰ２プロモーターを挙げることができる。本発明の目的のために、プロモーター数は、任意の数であり得るが、好ましくは単一のプロモーターを使用する。【００３７】
本明細書において、「作動可能に連結」とは、２以上のＤＮＡ配列が物理的におよび／又は機能的に関連可能な状態で連結していることを意味する。例えば、プロモーターと翻訳ユニットとが適当なＤＮＡ配列を介して連結されており、当該プロモーターが、当該翻訳ユニットの一部がコードするポリペプチドの発現レベルに影響を及ぼす場合には、両者は「作動可能に連結」されているといえる。【００３８】
上記のスペーサー配列、プロモーター配列、ＳＤ配列、およびシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列は、例えばブレビバチルス属細菌、またはブレビバチルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ  Ｐ−７２２４）の染色体ＤＮＡを鋳型として、公知のＰＣＲ法で特異的に増やすことにより取得できる。【００３９】
本発明の「ＤＮＡ構築体」の一実施形態は、前記翻訳ユニットが２個であり、１の翻訳ユニットが完全長抗体を構成するＬ鎖をコードするＤＮＡ配列を含み、他の翻訳ユニットが完全長抗体を構成するＨ鎖をコードするＤＮＡ配列を含むものである。本発明の「ＤＮＡ構築体」の好適な一実施形態は、前記翻訳ユニットが２個であり、１の翻訳ユニットがブレビバチルス属細菌のＭＷＰのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、および完全長抗体のＬ鎖をコードするＤＮＡ配列を含み、他の翻訳ユニットがブレビバチルス属細菌のＯＷＰのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、および完全長抗体のＨ鎖をコードするＤＮＡ配列を含むものである。また、本発明の「ＤＮＡ構築体」の好適な一実施形態は、前記翻訳ユニットが２個であり、１の翻訳ユニットがブレビバチルス属細菌のＭＷＰのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、および完全長抗体のＨ鎖をコードするＤＮＡ配列を含み、他の翻訳ユニットがブレビバチルス属細菌のＯＷＰのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、および完全長抗体のＬ鎖をコードするＤＮＡ配列を含むものである。【００４０】
特に好ましい本発明の「ＤＮＡ構築体」の例は、ブレビバチルス・ブレビスのＭＷＰプロモーター領域の下流（３’末端）に、同ＭＷＰ遺伝子由来のＳＤ配列、同ＭＷＰのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、および完全長抗体のＬ鎖をコードするＤＮＡ配列からなる翻訳ユニットを配置し、その下流に、本発明のスペーサー配列を介して、ブレビバチルス・ブレビスのＯＷＰ遺伝子由来のＳＤ配列、同ＯＷＰのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、および完全長抗体のＨ鎖をコードするＤＮＡ配列からなる翻訳ユニットを配置した構造からなる。【００４１】
本発明のＤＮＡ構築体を導入するベクターとしては、適当な宿主細胞内で自律複製可能なＤＮＡ分子であって、当業者に公知のものを用いることができる。当該ベクターは、所望によりマーカー配列を含んでいてもよい。マーカーとしては、ペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシンなどの抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。【００４２】
本発明で用いるベクターは、本発明のＤＮＡ構築体を導入することができ、更にそれを宿主内に導入する機能を有する限り特に限定されないが、ｐＨＹ５００（特開平２−３１６８２号公報）、ｐＮＵ２００（鵜高重三、日本農芸化学会誌６１，６６９−６７６（１９８７））、ｐＮＨ３０１（Ｓｈｉｇａ．Ｙら  １９９２．Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，５８：５２５−５３１．）、ｐＮＨ４００（Ｉｓｈｉｈａｒａ，Ｔら、１９９５．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１７７：７４５−７４９）、ｐＮＹ７００（特開平４−２７８０９１号公報）、ｐＨＴ系プラスミド（特許第２７２７３９１号）、ｐＮＣＯ２（特開２００２−２３８５６９号公報）、またはこれらの誘導体が好ましい。また、宿主としてブレビバチルス属細菌を用いる場合、宿主細胞内で自立複製可能なプラスミドベクターなどを利用することなく、本発明のＤＮＡ構築体を染色体中へ直接組み込み、発現させる方法（特開平９−１３５６９３号公報）を用いても良い。【００４３】
本発明の「形質転換体」は、本発明のベクターで適当な宿主を形質転換することにより得られる。本発明で使用される宿主は、細菌、動物細胞、植物細胞、または菌類その他を含み、特に限定されないが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バチルス属細菌またはブレビバチルス属細菌が好適に使用され、ブレビバチルス属細菌がより好適に使用され得る。【００４４】
上記バチルス属細菌としては、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂ．ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ｐａｓｔｅｕｒｉｉ、Ｂ．ｐａｎｔｏｔｈｅｎｔｉｃｕｓ、Ｂ．ｐａｓｔｅｕｒｉｉ、Ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｅｓ、Ｂ．ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｂ．ｉｎｓｏｌｉｔｕｓ、Ｂ．ｍａｒｉｎｕｓ、Ｂ．ｍａｃｑｕａｒｉｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｂ．ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂ．ｓｃｈｌｅｇｅｌｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｂ．ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｐａｓｔｅｕｒｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｂ．ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｂ．ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂ．ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌａｒｖａｅ、Ｂ．ｌｅｎｔｉｍｏｒｂｉｓ、Ｂ．ｐｏｐｉｌｌｉａｅ、Ｂ．ｌａｒｖａｅおよびＢ．ｌｅｎｔｉｍｏｒｂｉｓを挙げることができる。上記ブレビバチルス属細菌としては、例えば、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇｒｉ、Ｂ．ｂｏｒｓｔｅｌｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｃｅｎｔｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｂ．ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｆｏｒｍｏｓｕｓ、Ｂ．ｉｎｖｏｃａｔｕｓ、Ｂ．ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｂ．ｌｉｍｎｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｒｅｕｓｚｅｒｉ、およびＢ．ｔｈｅｒｍｏｒｕｂｅｒを挙げることができ、それらの中でも、ブレビバチルス・ブレビス、ブレビバチルス・ボルステレンシス、およびブレビバチルス・チョウシネンシスが好適に、ブレビバチルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ  Ｐ−７２２４）、ブレビバチルス・ブレビス４７−５Ｑ（Ｕｄａｋａ，Ｓ．ら，１９９３．Ｍｅｔｈｏｄ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，２１７：２３−３３）、およびブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８７）がより好適に使用され得る。また生産量の向上などの目的に応じて、上記ブレビバチルス属細菌のプロテアーゼ欠損株や高発現株のような変異株を使用しても良い。具体的に挙げればブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１由来のプロテアーゼ変異株であるブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ（特開平６−２９６４８５号公報、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４５７３）や、ヒト唾液アミラーゼ高生産株として取得されたブレビバチルス・ブレビス４７Ｋ（Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｈ．ら．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４；２９７−３０２，１９９０）が使用され得る。【００４５】
本発明において用いられる宿主の形質転換は、例えば、公知のＴａｋａｈａｓｈｉらの方法（Ｔａｋａｈａｓｈｉ．Ｗら．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８３．１５６：１１３０−１１３４）、Ｔａｋａｇｉらの方法（Ｔａｋａｇｉ．Ｈら．１９８９．Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，５３：３０９９−３１００）、またはＯｋａｍｏｔｏらの方法（Ｏｋａｍｏｔｏ．Ａら  １９９７．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：２０２−２０３）により実施することができるが、方法は特に限定されない。【００４６】
微生物において異種真核生物蛋白質を高発現させた場合、当該蛋白質が細胞質内および／または外で結合し、生物学的に不活性な不溶性体と呼ばれるアグリゲートを形成することがある。特に、システイン残基を多く含み、ジスルフィド結合の多い蛋白質は、アグリゲートを形成することが多い。一方で、目的とする蛋白質を発現させる際、シャペロン蛋白質やジスルフィド結合異性化酵素やプロリン異性化酵素などを作用させることによって、目的蛋白質のアグリゲートや分泌効率の低下を抑え得ることが知られている。広く試みられている方法は、ＦｋｐＡなどのＰＰＩａｓｅ（ペプチジルシストランスイソメラーゼ）（Ｍｉｓｓｉａｋａｓ  ＤらＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２１（４），８７１−８８４，１９９６）及びＰＤＩ（プロテインジスルフィドイソメラーゼ）やＤｓｂＡなどのジスルフィド酸化還元活性を有する蛋白質を作用させる方法（特開昭６３−２９４７９６号公報、特開平５−３３６９８６号公報等）である。さらにまた、ジスルフィド酸化還元活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を宿主生物に導入し、目的とする組換え蛋白質とジスルフィド酸化還元活性を有する蛋白質を同時に発現させて正しいジスルフィド結合を有する蛋白質を製造する方法も知られている（特開２０００−８３６７０号公報、特表２００１−５１４４９０号公報等）。本発明においても、例えば、完全長抗体を発現させる際、数種類のシャペロン蛋白質やジスルフィド結合酸化還元酵素やジスルフィド異性化酵素のようなフォールディングを促進する酵素を同時に発現させることもできる。具体的に挙げれば、大腸菌のＤｓｂＡ（Ｂａｒｄｗｅｌｌ，Ｊ．Ｃ．Ａ．ら，１９９１．Ｃｅｌｌ，６７：５８２−５８９、Ｋａｍｉｔａｎｉ，Ｓ．ら，ＥＭＢＯ．Ｊ．１１：５７−６２（１９９２））、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ（特開平９−１８０５５８号公報）、ＦｋｐＡなどのＰＰＩａｓｅ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７５（２２），１７１００−１７１０５，２０００）、プロテインジスルフイドイソメラ−ゼ（国際公開第０１／０６８８８４号パンフレット）、および、ジスルフィド酸化還元酵素（特開２００３−１６９６７５号公報）の群から選ばれる１つ以上を同時に発現させ、目的とする蛋白質の分泌効率を上昇させることができる。【００４７】
本発明のベクターにより形質転換された形質転換体は、目的とする蛋白質を構成する２以上のポリペプチドを適切な量比で発現し、その蛋白質本来またはそれと類似の立体構造（および／または、その蛋白質本来の活性またはそれと類似の活性）を有する蛋白質として生産することができる。例えば完全長抗体を目的蛋白質とする場合、正確なＹ字型構造を有する完全長抗体をほぼ均一な状態で培養液中に生産蓄積させることができる。【００４８】
本発明はまた、本発明の形質転換体を培養し該蛋白質を生産させる工程、および生産された該蛋白質を回収する工程を含む、蛋白質の製造方法である。
本発明の細菌形質転換体の培養に用いる培地は、目的とする２種類以上のポリペプチドから構成される蛋白質を高効率、高収量で分泌発現するものであれば制限は無い。具体的にはグルコース、蔗糖、グリセロール、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、またはカザミノ酸などの炭素源や窒素源を使用することが出来る。その他、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、または鉄塩等の無機塩類が必要に応じて添加される。また、もし栄養要求性を付与している宿主を用いる場合は、生育に要求される栄養物質を添加すればよい。また必要であればペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、またはネオマイシンなどの抗生物質が添加されても良い。培養温度は約１５−４２℃、好ましくは約２８−３２℃であり、通気攪拌条件で好気的に培養を行うことが望ましいが、もし必要であれば通気を遮断し嫌気的に培養してもよい。【００４９】
本発明によれば、例えば細菌形質転換体を培養することにより、２種類以上のポリペプチドから構成される蛋白質が該細菌形質転換体の菌体内または外、すなわち培養液中に大量に蓄積されるため、当該培養液から当該蛋白質を採取し、所望により精製することが出来る。当該蛋白質が菌体内に蓄積された場合、通常の方法、例えば超音波やフレンチプレス、アルカリまたはＳＤＳ処理などを利用した方法により菌を破砕し、抽出することが出来る。得られた当該蛋白質は、通常の蛋白質精製方法、例えば硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムなどを用いた塩析、ゲル濾過、イオン交換、ハイドロキシアパタイト、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、または抗原結合アフィニティーなどの担体を用いたカラムクロマトグラフィーなどを用いて精製することができる。【００５０】
本発明は、「２種類以上のポリペプチドから構成される蛋白質」中に同一のポリペプチドが少なくとも２つ以上含まれる場合には、その２つ以上含まれるポリペプチドの分泌量を増加させる効果も有しうる。
また、本発明は、２種類以上のポリペプチドから構成される蛋白質の発現のみでなく、１種類のポリペプチドから構成される蛋白質のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む翻訳ユニットを、スペーサー配列を介して２個以上連結して作製したＤＮＡ構築体を用いて形質転換することにより、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を１組含有する形質転換体と比較して、蛋白質の生産量を倍増させる効果を有し得る。【００５１】
本発明の医薬組成物は、本発明の方法によって製造された蛋白質を含むものである。当該医薬組成物は、本発明の方法に従い製造した２以上のポリペプチドから構成される蛋白質を、製薬的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤と混合することによって製造し得る。希釈剤、担体、または賦形剤は、経口、経腸、経皮、皮下、非経腸（例えば静脈内）または腹腔内投与等の各投与形態に適した任意の有機または無機材料であり得る。希釈剤、担体、および賦形剤は特に限定されないが、例えば、水、ゼラチン、アラビアガム、ラクトース、微結晶性セルロース、スターチ、ナトリウムスターチグリコレート、燐酸水素カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはコロイド性二酸化ケイ素などである。また、本発明の医薬組成物は、他の薬理的に活性な薬剤、および／または慣行の添加物、例えば、安定剤、湿潤剤、乳化剤、香味剤、または緩衝剤などを含み得る。
【発明の効果】
【００５２】
本発明によれば、例えば、２種類以上のポリペプチドから構成される蛋白質を宿主で生産する際、その蛋白質本来またはそれと類似の立体構造（および／または、その蛋白質本来の活性またはそれと類似の活性）を有する蛋白質を効率良く得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
以下に参考例及び実施例により本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものでない。本発明の実施にあたり、組換えＤＮＡの作製、組換え体の動物細胞や微生物などへの導入は、特に断わらない限り下記の実験書に従って実施した。（１）Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ著、「モレキュラー・クローニング／ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ／Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、第２版（１９８９）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ刊（米国）。（２）村松正實編著「ラボマニュアル遺伝子工学」、第３版（１９９６）、丸善株式会社刊。【００５４】
図１〜１２に使用されている略語について、以下に説明する。
ｋｂｐ：キロ塩基対
ＭＷＰ：ブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＭＷＰ
ＯＷＰ：ブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＯＷＰ
ＭＷＰ−Ｐ：ブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＭＷＰプロモーター領域
ＳＤＭ：ブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＭＷＰのＳＤ配列
ＳＤＯ：ブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＯＷＰのＳＤ配列
ＳＰＭ：ブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＭＷＰのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列
ＳＰＯ：ブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＯＷＰのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列
ＭＣＳ：マルチクローニングサイト
Ｎｍ：ネオマイシン耐性遺伝子コード領域
Ｔ：ターミネーター領域
ＶＬ：Ｌ鎖可変領域
ＣＬ：Ｌ鎖定常領域
ＶＨ：Ｈ鎖可変領域
ＣＨ１：Ｈ鎖定常領域
ＣＨ２：Ｈ鎖定常領域
ＣＨ３：Ｈ鎖定常領域
ｈ：ヒンジ領域
Ｍ：分子量マーカー
Ｓ：抗ヒトＴＮＦα抗体標準品（インフリキシマブ）【００５５】
図８〜１０に使用されている略語等について、以下に説明する。
Ｍは分子量マーカー（２０１，１２０，１００，５５，３８，２９，２０ｋＤａ）、ｐＮＨ３０１／３１ＯＫはｐＮＨ３０１を有する形質転換株からの培養液上清を示す。ＯＷＰＴはＬ−ＯＷＰＴ−Ｈ／ｐＮＨ３０１を有する形質転換株からの培養液上清を示す。ＯＷＰＳＤはＬ−ＯＷＰＳＤ−Ｈ／ｐＮＨ３０１を有する形質転換株からの培養液上清を示す。ＬＨはＬＨ２５／ｐＮＨ３０１を有する形質転換株からの培養液上清を示す。ＬｐＨはＬｐＨ２５／ｐＮＨ３０１を有する形質転換株からの培養液上清を示す。Ｓは抗ヒトＴＮＦα抗体標準品（３ナノグラム）のレーンを示す。矢印は発現された完全長抗ヒトＴＮＦα抗体の移動度を示す。【００５６】
実施例１：抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖発現ベクターＬ／ｐＮＨ３０１、および抗ヒトＴＮＦα抗体Ｈ鎖発現ベクターＨ／ｐＮＨ３０１の構築
米国特許ＵＳ５６９８１９５号記載の抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖Ｈ鎖の遺伝子配列に従って取得、作製されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ・抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖及びＨ鎖を鋳型にし、合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−ＬＦ１：５’−ＧＣＴＣＣＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣＧＣＴＧＡＣＡＴＣＴＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴ−３’（配列番号１）及びＴＮＦ−ＬＲ１：５’−ＴＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴ−３’（配列番号２）をプライマーとしてＰＣＲを行い、抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖をコードする約０．６５ｋｂｐの断片を得た。得られたＬ鎖コード遺伝子断片は制限酵素ＮｃｏＩとＰｓｔＩで処理を行った。同様に合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−ＨＦ１：５’−ＧＣＴＣＣＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣＧＣＴＧＡＡＧＴＧＡＡＡＣＴＴＧＡＧＧＡＧＴＣＴ−３’（配列番号３）及びＴＮＦ−ＨＲ１：５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡ−３’（配列番号４）をプライマーとしてＰＣＲを行い、抗ヒトＴＮＦα抗体Ｈ鎖をコードする約１．４５ｋｂｐの断片を得た。得られたＨ鎖コード遺伝子断片は制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで処理を行った。それぞれ制限酵素により消化された抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖、Ｈ鎖コード遺伝子断片は２％アガロースで分離後、ゲルから抽出し遺伝子断片を取得した。別に、図１に示した発現ベクターｐＮＨ３０１は制限酵素ＮｃｏＩとＰｓｔＩ、及びＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩでそれぞれ消化後、アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）処理を行い、先に得られた抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖、Ｈ鎖コード遺伝子断片に対しＴ４リガーゼを用いて連結し、それぞれＬ／ｐＮＨ３０１及びＨ／ｐＮＨ３０１を得た〔図２〕。【００５７】
実施例２：完全長抗ヒトＴＮＦα抗体発現ベクターＬ−ＯＷＰＴ−Ｈ／ｐＮＨ３０１の構築
ブレビバチルス・ブレビスのＭＷＰのストップコドン以降からＯＷＰのＳＤ配列を含めたシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を得るため、ブレビバチルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ  Ｐ−７２２４）株から定法に従い染色体ＤＮＡ約１μｇを抽出、精製した。この染色体ＤＮＡを鋳型として、合成オリゴヌクレオチドプライマーＯＷＰＴ−Ｆ１：５’−ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＡＴＡＣＡＧＴＴＡＡＴＴＡＧＴＴＡＧＡＡＧ−３’（配列番号５）と、抗ヒトＴＮＦα抗体のＨ鎖のＮ末端Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ（配列番号２３）をコードするＤＮＡ配列を３’末端に付加した合成オリゴヌクレオチドプライマーＯＷＰＴ−Ｒ１：５’−ＡＧＡＣＴＣＣＴＣＡＡＧＴＴＴＣＡＣＴＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＣＡＧＡＴＧＣＴＧＣＡＡＣ−３’（配列番号６）とを用いてＰＣＲを行い、約０．２２ｋｂｐの遺伝子断片を得た。この遺伝子断片は、ブレビバチルス・ブレビスが有するＭＷＰ及びＯＷＰオペロン構造内の、ＭＷＰ終止コドンＴＡＡ以降のターミネーターと、ＯＷＰのＳＤ配列と、シグナルペプチド（Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ：配列番号２４）をコードするＤＮＡ配列と、上記抗ヒトＴＮＦα抗体のＨ鎖のＮ末端Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ（配列番号２３）をコードするＤＮＡ配列とを含んでいる（図３参照）。
一方、実施例１により得られた抗ヒトＴＮＦα抗体のＨ鎖をコードするＨ／ｐＮＨ３０１を鋳型として、合成オリゴヌクレオチドプライマーＴＮＦ−ＨＦ２：５’−ＧＴＴＧＣＡＧＣＡＴＣＴＧＣＡＴＴＴＧＣＡＧＡＡＧＴＧＡＡＡＣＴＴＧＡＧＧＡＧＴＣＴ−３’（配列番号７）と、実施例１で使用されたプライマーＴＮＦ−ＨＲ１：５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡ−３’（配列番号４）とを用いＰＣＲを行った。得られた１．５ｋｂｐのＰＣＲ断片は、抗ヒトＴＮＦα抗体のＨ鎖をコードする配列、及び５’側にはＯＷＰのシグナルペプチドの一部（Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ：配列番号２５）をコードするＤＮＡ配列を含んでいる。
この１．５ｋｂｐの断片と、上記遺伝子断片（ＭＷＰのターミネーター、ＯＷＰのＳＤ配列及びシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む約０．２２ｋｂｐ遺伝子断片）とを鋳型とし、合成オリゴヌクレオチドプライマーＯＷＰ−Ｆ１：５’−ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＡＴＡＣＡＧＴＴＡＡＴＴＡＧＴＴＡＧＡＡＧ−３’（配列番号５）とＴＮＦ−ＨＲ１：５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡ−３’（配列番号４）とを用い、公知のオーバーラップ伸長法（Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら、１９９７．Ｉｎ  Ｂｒｕｃｅ  Ａ．Ｗｈｉｔｅ（ｅｄｓ），ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒｍ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｔｏ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．１４１−１４９．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ．）により再度ＰＣＲを行った。その結果、ＭＷＰのターミネーターと、ＯＷＰのＳＤ配列及びシグナルペプチドをコードする配列と、抗ヒトＴＮＦα抗体Ｈ鎖全長鎖をコードする配列とを含んだ遺伝子断片約１．７ｋｂｐを得た。
この遺伝子断片を、制限酵素ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより消化、０．８％アガロースゲルにより抽出精製後、Ｔ４ライゲースを用い実施例１にて得られたＬ／ｐＮＨ３０１のＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの間に連結し、Ｌ−ＯＷＰＴ−Ｈ／ｐＮＨ３０１を得た（図４、図１１）（配列番号１５〜１７）。
実施例２における、本発明の「スペーサー配列」に対応する配列は、「ctgcaggatccgtcgactctctaggactcgaggaattcggtaccgaaatacagttaattagttagaagttagtatcgggttactaggtacagctagaggggagttatcccctctaactcttattacccaaacaatagagaacttcctatcaaacat」（配列番号２６）となる。また、本発明のスペーサー配列に含まれる「ＤＮＡ配列（１）又は（２）」は、「gaaatacagttaattagttagaagttagtatcgggttactaggtacagctagaggggagttatcccctctaactcttattacccaaacaatagagaacttcctatcaaacat」（配列番号２７）となる。この配列番号２７は、ブレビバチルス・ブレビス４７の細胞壁蛋白質オペロン中のＭＷＰ遺伝子の終止コドンの直後からＯＷＰのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列の直前までのＤＮＡ配列（配列番号１４）のうちの、１１２ヌクレオチド長からなるＤＮＡ配列に相当する。【００５８】
実施例３：完全長抗ヒトＴＮＦα抗体発現ベクターＬ−ＯＷＰＳＤ−Ｈ／ｐＮＨ３０１の構築
実施例２と同様に、ブレビバチルス・ブレビス４７の染色体ＤＮＡを鋳型にして、合成オリゴヌクレオチドプライマーＯＷＰ−Ｆ２：５’−ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＴＡＴＴＡＣＣＣＡＡＡＣＡＡＴＡＧＡＧＡＡＣＴＴ−３’（配列番号８）と、合成オリゴヌクレオチドプライマーＯＷＰＴ−Ｒ１：５’−ＡＧＡＣＴＣＣＴＣＡＡＧＴＴＴＣＡＣＴＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＣＡＧＡＴＧＣＴＧＣＡＡＣ−３’（配列番号６）とを用いＰＣＲを行い、０．１２ｋｂｐの断片を得た。この断片は、ブレビバチルス・ブレビスが有するＭＷＰ及びＯＷＰのオペロン構造内の、ＭＷＰストップコドン（ＴＡＡ）３’下流に存在するＯＷＰのＳＤ配列からＯＷＰのシグナルペプチドと、抗ヒトＴＮＦα抗体のＮ末端Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ（配列番号２３）をコードするＤＮＡ配列とを含んでいる。ただし、実施例２で得られたようなＭＷＰのターミネーター配列は含んでいない（ＰＣＲで得られるＤＮＡ断片の範囲につき、図３参照）。
一方、実施例２と同様に、抗ヒトＴＮＦα抗体のＨ鎖をコードするＨ／ｐＮＨ３０１を鋳型とし、合成オリゴヌクレオチドプライマーＴＮＦ−ＨＦ２：５’−ＧＴＴＧＣＡＧＣＡＴＣＴＧＣＡＴＴＴＧＣＡＧＡＡＧＴＧＡＡＡＣＴＴＧＡＧＧＡＧＴＣＴ−３’（配列番号７）と、先のプライマーＴＮＦ−ＨＲ１：５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡ−３’（配列番号４）とを用いてＰＣＲを行い、抗ヒトＴＮＦα抗体のＨ鎖をコードする配列、及び５’側にＯＷＰのシグナルペプチドの一部（Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ：配列番号２５）をコードする配列を含む１．５ｋｂｐの遺伝子断片を得た。
このＨ鎖を含む１．５ｋｂｐの断片と、先のＯＷＰのＳＤ配列を含む０．１２ｋｂｐの遺伝子断片とを用い、実施例２で記載した方法と同様に合成オリゴヌクレオチドプライマーＯＷＰ−Ｆ２：５’−ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＴＡＴＴＡＣＣＣＡＡＡＣＡＡＴＡＧＡＧＡＡＣＴＴ−３’（配列番号８）とプライマーＴＮＦ−ＨＲ１：５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡ−３’（配列番号４）とによるオーバーラップ伸長法により、ＯＷＰのＳＤ配列とＯＷＰシグナルペプチドをコードする配列と、抗ヒトＴＮＦα抗体のＨ鎖をコードする配列とを含む遺伝子断片約１．６ｋｂｐを得た。この断片は、制限酵素ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、０．８％アガロースゲルにより抽出、精製した後、Ｔ４ライゲースを用い実施例１にて得られたＬ／ｐＮＨ３０１のＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩの間に連結しＬ−ＯＷＰＳＤ−Ｈ／ｐＮＨ３０１を得た（図５、図１２）（配列番号１８〜２０）。
実施例３における、本発明の「スペーサー配列」に対応する配列は、「ctgcaggatccgtcgactctctaggactcgaggaattcggtacctattacccaaacaatagagaacttcctatcaaacat」（配列番号２８）となる。また、本発明のスペーサー配列に含まれる「ＤＮＡ配列（１）又は（２）」は、「tattacccaaacaatagagaacttcctatcaaacat」（配列番号２９）となる。この配列番号２９は、ブレビバチルス・ブレビス４７の細胞壁蛋白質オペロン中のＭＷＰ遺伝子の終止コドンの直後からＯＷＰのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列の直前までのＤＮＡ配列（配列番号１４）のうちの、３６ヌクレオチド長からなるＤＮＡ配列に相当する。【００５９】
比較例１：ブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質オペロン構造を含まない抗ヒトＴＮＦα抗体発現ベクターＬＨ２５／ｐＮＨ３０１の構築
スペーサー配列中に「ブレビバチルス属細菌の細胞壁蛋白質オペロン中の、ＭＷＰ遺伝子の終止コドンの直後からＯＷＰのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列の直前までのＤＮＡ配列のうちの、任意の２０ヌクレオチド長以上からなるＤＮＡ配列」を含む、本発明の「ＤＮＡ構築体」の１実施例を用いた発現方法と、スペーサー配列の中に上記「ＤＮＡ配列」を含まないものを用いた発現方法との間で、完全長抗体形成能を比較検討する。Ｈ／ｐＮＨ３０１を鋳型とし合成オリゴヌクレオチドプライマーＴＮＦ−ＨＦ３：５’−ＴＡＧＣＴＧＣＡＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＡＣＡＡＧ−３’（配列番号９）及びＴＮＦ−ＨＲ１：５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡ−３’（配列番号４）を用いＰＣＲを行った。ＰＣＲにより得られた１．５ｋｂｐの遺伝子断片は、Ｈ／ｐＮＨ３０１の発現プラスミドに由来するＭＷＰのＳＤ配列からＭＷＰのシグナルペプチド及びＨ鎖のストップコドンまでをコードしている。この１．５ｋｂｐの遺伝子断片は制限酵素ＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、別にＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩにより消化したＬ／ｐＮＨ３０１の制限酵素サイト内へＴ４ライゲースを用いて連結し、ＬＨ２５／ｐＮＨ３０１を得た〔図６〕。【００６０】
比較例２：ブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質オペロン構造を含まない抗ヒトＴＮＦα抗体発現ベクターＬｐＨ２５／ｐＮＨ３０１の構築
スペーサー配列中に「ブレビバチルス属細菌の細胞壁蛋白質オペロン中の、ＭＷＰ遺伝子の終止コドンの直後からＯＷＰのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列の直前までのＤＮＡ配列のうちの、任意の２０ヌクレオチド長以上からなるＤＮＡ配列」を含む、本発明の「ＤＮＡ構築体」の１実施例を用いた発現方法と、スペーサー配列の中に上記「ＤＮＡ配列」を含まないものであって、Ｌ鎖及びＨ鎖を個々にプロモーター支配下に配置させたＴｗｏシストロン型の発現方法〔図７〕との間で、完全長抗体形成能を比較検討する。実施例１で構築したＨ／ｐＮＨ３０１を鋳型とし、合成オリゴヌクレオチドプライマーＴＮＦ−ＨＦ４：５’−ＴＴＴＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＡＴＡＣＴＡＧＡＧＡＴＴＴＴＴＡＡ−３’（配列番号１０）及びＴＮＦ−ＨＲ１：５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡ−３’（配列番号４）を用いＰＣＲを行った。ＰＣＲより得られた約１．７ｋｂｐの遺伝子断片は、Ｈ／ｐＮＨ３０１の発現プラスミドに由来するＭＷＰプロモーターＰ５、ＭＷＰのＳＤ配列からシグナルペプチド及びＨ鎖のストップコドンまでをコードしている。この約１．７ｋｂｐの遺伝子断片は制限酵素ＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、別にＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩにより消化されたＬ／ｐＮＨ３０１内へＴ４ライゲースを用いて連結しＬｐＨ２５／ｐＮＨ３０１を得た（図７）。【００６１】
実施例４：ブレビバチルス・チョウシネンシス完全長抗ヒトＴＮＦα抗体発現株の取得
ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１（特開昭６３−５６２７７号公報、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８７）から、公知の変異処理を施し菌体外プロテアーゼ活性の低い株として得られたブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４５７３）を宿主として用いた。実施例２、３及び比較例１、２にて構築したＬ−ＯＷＰＴ−Ｈ／ｐＮＨ３０１、Ｌ−ＯＷＰＳＤ−Ｈ／ｐＮＨ３０１、ＬＨ２５／ｐＮＨ３０１及びＬｐＨ２５／ｐＮＨ３０１の４つの完全長抗ヒトＴＮＦα抗体をコードしている発現ベクターを用い、それぞれブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株に対し形質転換を行った。ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株の形質転換は、公知のエレクトロポレーション法にて行った。エレクトロポレーションは、ジーンパルサー（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて１．５ｋＶ、１０００オーム、２５μＦの条件で印加した後、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含んだＴ２培地［ポリペプトンＳ  １％、酵母エキス０．２％、カツオ由来肉エキス０．５％、グルコース１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０１％、ＣａＣｌ２・７Ｈ２Ｏ  ０．０１％、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ  ０．００１％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．００１％、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０００１％  ｐＨ７．０］１ｍｌを直ちに添加し、３０℃で２時間振とう培養を行った。この培養液の一部をネオマイシン６０ｍｇ／Ｌ含有Ｔ２寒天培地（Ｔ２培地に１．５％の寒天を含む）に塗布し３０℃で２日間培養を行い、出現したコロニーを形質転換体として用いた。発現プラスミドＬ−ＯＷＰＴ−Ｈ／ｐＮＨ３０１、Ｌ−ＯＷＰＳＤ−Ｈ／ｐＮＨ３０１、ＬＨ２５／ｐＮＨ３０１、ＬｐＨ２５／ｐＮＨ３０１によって形質転換されたブレビバチルス・チョウシネンシス形質転換株はそれぞれＯＷＰＴ、ＯＷＰＳＤ、ＬＨ、ＬｐＨ株とした。【００６２】
実施例５：ブレビバチルス・チョウシネンシス形質転換体株による完全長抗ヒトＴＮＦα抗体の発現試験
得られた形質転換体ＯＷＰＴ株、ＯＷＰＳＤ株、ＬＨ株、ＬｐＨ株及びそれらの対照となるｐＮＨ３０１プラスミドのみを有するブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株を生産培地３ＹＣ（ポリペプトンＳ  ３％、酵母エキス０．５％、グルコース３％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０１％、ＣａＣｌ２・７Ｈ２Ｏ  ０．０１％、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ  ０．００１％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．００１％、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０００１％、ｐＨ７．０）及びネオマイシン６０ｍｇ／Ｌからなる培地にて３０℃、好気的条件下、３−４日間培養を行った。培養液は遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）後、抗ヒトＩｇＧ抗体を用いたウエスタンブロット法に供した。【００６３】
実施例６：形質転換株から得られた培養液上清中の完全長抗ヒトＴＮＦα抗体の検出
遠心回収したそれぞれの培養液上清は、非還元処理、還元処理を行った。非還元処理においては培養上清０．０９ｍｌに１００ｍＭヨード酢酸０．０１ｍｌ加えた後、２ｘＳＤＳサンプルバッファー（還元剤を含まない）を０．１ｍｌ加えた。還元処理サンプル調整の場合、同様に上清０．０９ｍｌに１Ｍジチオトレイトールを０．０１ｍｌ加えた後、２ｘＳＤＳサンプルバッファーを０．１ｍｌ加えた。両処理を行った上清液は、沸騰水浴上にて５分間加熱を行った。各上清液０．００５−０．０１ｍｌは５−２０％グラジエントポリアクリルアミドゲルより分離した後、ウエスタンブロットにより培養液中に存在する完全長抗ヒトＴＮＦα抗体の検出を行った。検出には還元型処理培養液の場合、西洋ワサビペルオキシダ−ゼ（ＨＲＰ）標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）を用い、非還元型処理培養液の場合はウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）及び二次抗体としてＨＰＲ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）を用い、それぞれ適当な濃度に希釈し検出を行った。シグナルの検出は、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＷｅｓｔＰｉｃｏ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いた化学発光法により行った。また抗ヒトＴＮＦα抗体の標準品として、ヒト胚腎臓由来の培養細胞により取得された抗ヒトＴＮＦα抗体［インフリキシマブ（遺伝子組換え）・田辺製薬社製］を用い実験に供した。非還元処理下、ＯＷＰＴ株、ＯＷＰＳＤ株の形質転換株の培養上清中にはいずれもＬ鎖及びＨ鎖が結合しているとされる分子量約１９０ｋＤａ付近に位置するシグナルが確認され、これらのシグナルの位置は標準品インフリキシマブとほぼ同じ移動度を示した。一方、比較例１、２で構築された発現ベクターによる形質転換体ＬＨ株やＬｐＨ株では１９０ｋＤａ付近のシグナルはほとんど認められず、代わりにＬ鎖及びＨ鎖のモノマー、Ｌ鎖及びＨ鎖同士の多量体化、またはＬ鎖及びＨ鎖同士がダイマー化したと推定される同定不明のシグナルが目立ち、比較例１、２で構築された発現ベクターにより形質転換された株においては完全長抗体の生産効率が悪く、また形成不能であることが明らかとなった。加えて、ブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質オペロン構造様式を用い発現させた形質転換体ＯＷＰＴ株やＯＷＰＳＤ株は、ＬＨ株やＬｐＨ株と比較して、培養液上清中に存在するＬ鎖及びＨ鎖のモノマーやダイマーといった夾雑するバンドが減り、分子量１９０ｋＤａ付近のバンドが特異的に増加し完全長抗体分子形成が促進される結果となった〔図８〕。還元処理を行った各株のウエスタンブロットによる結果では、すべての形質転換株に抗ヒトＴＮＦα抗体のＬ鎖（分子量約２６ｋＤａ）及びＨ鎖（分子量約５１ｋＤａ）に相当する位置にバンドを検出することが出来たが、ＬＨ株やＬｐＨ株の培養液上清においてはＬ鎖及びＨ鎖の量的比の極端な不均一性が認められた〔図９〕。加えてウエスタンブロットによるシグナルの強度によりＯＷＰＴ株やＯＷＰＳＤ株のＬ鎖及びＨ鎖の量的比率はほぼ同程度であることが明らかとなり、Ｌ鎖及びＨ鎖の等しい発現量比（ほぼ等しい発現量比である場合を含む）が完全長抗体フォーム形成において重要であることが推察された〔図９��。これらの結果は、ブレビバチルス属細菌における完全長抗体蛋白質の発現では、スペーサー配列中にブレビバチルス属細菌の細胞壁蛋白質オペロン中の所定のＤＮＡ配列を含まないベクターによる発現方法（上記比較例１参照）や、個々のプロモーターによりＬ鎖Ｈ鎖を別々に発現させるようなＴｗｏシストロン型の発現方法（上記比較例２参照）よりも、本発明の１実施例としての、スペーサー配列中に細胞壁蛋白質オペロン構造の少なくとも１部分のＤＮＡ配列を含むベクターを用いた発現様式のほうが、蛋白質の発現に関して効果的な技術であることを示していた。【００６４】
実施例７：ブレビバチルス・チョウシネンシス形質転換体からの完全長抗ヒトＴＮＦα抗体の精製
実施例４にて得られた形質転換体ＯＷＰＴ株、ＯＷＰＳＤ株のそれぞれを３ＹＣ培地２００ｍｌにて３日間３０℃で培養後、遠心分離により上清培養液を回収し、硫酸アンモニウム５０％、７５％飽和画分を用いて塩析後、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析を行った。この透析物は酸性ｐＨへ調整後、高速遠心分離により酸性沈殿画分を除去し、上清を陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ：アマシャムバイオサイエンス社製）に供し０−１Ｍ  ＮａＣｌの濃度勾配により分離した。次に完全長抗体画分を回収し、ゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ：アマシャムバイオサイエンス社製）に供し、高分子画分を採取し限外ろ過膜により濃縮後、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（アマシャムバイオサイエンス社製）により精製を行った。以上の精製操作により、約１ｍｇの完全長抗ヒトＴＮＦα抗体を精製、回収することが出来た。【００６５】
実施例８：組み換え抗ヒトＴＮＦα抗体を構成するＬ鎖及びＨ鎖のＮ末端アミノ酸配列の確認
実施例７で得られた完全長抗ヒトＴＮＦα抗体を、実施例６と同様の方法で還元処理した後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。当該ゲルから、分子量２５ｋＤａ、および５０ｋＤａに相当する分子量のバンドを切り出し、常法に従って、それらのＮ末端アミノ酸配列を５残基まで解析した。その結果、分子量２５ｋＤａのバンドが抗ヒトＴＮＦα抗体のＬ鎖と、また分子量５０ｋＤａのバンドが抗ヒトＴＮＦα抗体のＨ鎖と、それぞれ同一のＮ末端アミノ酸配列を有していた。【００６６】
実施例９：組み換え抗ヒトＴＮＦα抗体のヒトＴＮＦαへの結合活性評価
実施例７で精製品として得られた組み換え抗ヒトＴＮＦα抗体を用いて、ヒトＴＮＦαに対する結合能を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）に従って行った。ＥＬＩＳＡの測定法としては、９６穴のマイクロプレートの各ウェルに５−１０ｎｇの組換えヒトＴＮＦα（Ｓｅｒｏｔｅｃ社製）を含むＰＢＳ緩衝液を加え４℃にて一夜放置後、２５％ブロックエース（和光純薬社製）を含むＰＢＳ緩衝液でブロックした反応プレートを使用した。ＰＢＳ緩衝液にて適当な希釈した精製抗ヒトＴＮＦα抗体を加え、３７℃にて１時間反応後、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（物質名：ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ＩＣＩ社製）を含むＰＢＳで洗浄した。適当な濃度にＰＢＳで希釈したウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を上記と同様に反応させた後、洗浄を繰り返し、二次抗体として適当な濃度へ希釈したＨＰＲ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を加え、上記同様に反応を行った。洗浄後、発色基質［２，２’−アジノジ（３−エチルベンゾチアゾリンー６−スルフォン酸）アンモニウム塩（Ａ．Ｂ．Ｔ．Ｓ）］溶液を加え暗所にて２０分間反応後、４０５ｎｍにおける吸光度を測定しＴＮＦα結合定数を測定した。その結果、ブレビバチルス・ブレビスにより生産された抗ヒトＴＮＦα抗体は、標準品であるインフリキシマブと同程度以上の値を示した〔図１０〕。【００６７】
以上説明した本発明の実施例に従えば、例えば医薬品や医療診断薬として利用されうる、２以上のポリペプチドから構成される蛋白質（例えば完全長抗体）の製造において、生産量及び収率を有意に増大させることが可能になる。特に、本発明の実施例に従えば、細菌宿主を用いる従来の方法では問題となっていた、２以上のポリペプチドから構成される蛋白質のアグリゲーションや多量体化を解消できるだけでなく、２以上のポリペプチドから構成される蛋白質を直接活性体として得ることが可能である。したがって、本発明の実施例は、安価、かつ大量の該蛋白質を必要とする医薬品製造等において、極めて有効である。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明は、２以上のポリペプチドから構成される蛋白質を含む製品（例えば医薬品または医療診断薬）の製造において、極めて有効な手段となる。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】実施例１に記載のブレビバチルス・ブレビス蛋白質分泌発現ベクター（ｐＮＨ３０１）の構造を示す。
【図２】実施例１で構築した抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖及びＨ鎖分泌発現ベクターの構造を示す。
【図３】実施例２で記載したブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質（ＯＷＰ、ＭＷＰ）オペロン構造の配列を示す（配列番号１１）。
【図４】実施例２で構築した抗ヒトＴＮＦα抗体分泌発現ベクター（Ｌ−ＯＷＰＴ−Ｈ／ｐＮＨ３０１）を示す。
【図５】実施例３で構築した抗ヒトＴＮＦα抗体分泌発現ベクター（Ｌ−ＯＷＰＳＤ−Ｈ／ｐＮＨ３０１）を示す。
【図６】比較例１で構築した抗ヒトＴＮＦα抗体分泌発現ベクター（ＬＨ２５／ｐＮＨ３０１）を示す。
【図７】比較例２で構築した抗ヒトＴＮＦα抗体分泌発現ベクター（ＬｐＨ２５／ｐＮＨ３０１）を示す。
【図８】実施例５で得られた抗ヒトＴＮＦα抗体発現株の培養液上清（非還元処理）の抗体の様相を示す。
【図９】実施例５で得られた抗ヒトＴＮＦα抗体発現株の培養液上清（還元処理）の抗体の様相を示す。
【図１０】実施例７で得られた抗ヒトＴＮＦα抗体発現ＯＷＰＴ株及びＯＷＰＳＤ株培養上清から得た精製抗体のヒトＴＮＦαへの結合活性測定を示す。
【図１１】図４に示す完全長抗ヒトＴＮＦα抗体発現ベクターＬ−ＯＷＰＴ−Ｈ／ｐＮＨ３０１における、配列番号１５に対応する部分を示す。
【図１２】図５に示す完全長抗ヒトＴＮＦα抗体発現ベクターＬ−ＯＷＰＳＤ−Ｈ／ｐＮＨ３０１における、配列番号１８に対応する部分を示す。
【図１】
2006001179.tif 000002
【図２】
2006001179.tif 000003
【図３】
2006001179.tif 000004
【図４】
2006001179.tif 000005
【図５】
2006001179.tif 000006
【図６】
2006001179.tif 000007
【図７】
2006001179.tif 000008
【図８】
2006001179.tif 000009
【図９】
2006001179.tif 000010
【図１０】
2006001179.tif 000011
【図１１】
2006001179.tif 000012
【図１２】
2006001179.tif 000013
【配列表】
2006001179000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年3月29日(2006.3.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
該スペーサー配列は、以下の（１）または（２）のＤＮＡ配列を含む、ＤＮＡ構築体である。
（１）ブレビバチルス属細菌の細胞壁蛋白質オペロン中の、ｍｉｄｄｌｅ  ｗａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子の終止コドンの直後からｏｕｔｅｒ  ｗａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列の直前までのＤＮＡ配列のうちの、任意の２０ヌクレオチド長以上からなるＤＮＡ配列。
（２）（１）のＤＮＡ配列中に、１または数個のヌクレオチドの置換、欠失および／または付加を有するＤＮＡ配列であって、かつ（１）のＤＮＡ配列と同等の機能を有するＤＮＡ配列。
本明細書において、以下では、上記（１）又は（２）のＤＮＡ配列を「ＤＮＡ配列（１）又は（２）」と記載することがある。
［００２４］本発明のスペーサー配列に含まれる「ＤＮＡ配列（１）又は（２）」は、２０ヌクレオチド長以上、望ましくは２７ヌクレオチド長以上、より望ましくは３０ヌクレオチド以上、更に望ましくは４０ヌクレオチド長、特に望ましくは５１ヌクレオチド長以上、好ましくは６０ヌクレオチド長以上、より好ましくは８０ヌクレオチド長以上、更に好ましくは１００ヌクレオチド長以上、特に好ましくは１１０ヌクレオチド長以上、より特に好ましくは１２０ヌクレオチド長以上である。また、好ましくは２０以上１２７ヌクレオチド長以下であり、具体的には、例えば３６ヌクレオチド長、または５１ヌクレオチド長、または１１２ヌクレオチド長、または１２７ヌクレオチド長である。
また、本発明のスペーサー配列に含まれる「ＤＮＡ配列（１）又は（２）」の起源となるブレビバチルス属細菌としては、ブレビバチルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１２２３）が好ましい。なお、ブレビバチルス・ブレビス４７株は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室（ＪＣＭ）に「ＪＣＭ６２８５株」として保存されており、入手することができる。
［００２５］本発明のＤＮＡ構築体のスペーサー配列に含まれる「ブレビバチルス属細菌の細胞壁蛋白質オペロン中の、ＭＷＰ遺伝子の終止コドンの直後からＯＷＰのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列の直前までのＤＮＡ配列のうちの、任意の２０ヌクレオチド長以上からなるＤＮＡ配列」の例示として、配列番号１４に、ブレビバチルス・ブレビス
８
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上でありうる。該数は、好ましくは２から４、より好ましくは２または３、およびもっとも好ましくは２である。
［００３６］本明細書において、「プロモーター」とは、任意の構成的または誘導可能プロモーターを含む。原核生物宿主での使用のために好適なプロモーターは、ｐｏｌＩＩプロモーター、ｐｏｌＩＩＩプロモーター、ＰｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターおよびハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃまたはｔｒｃプロモーターを含む。プロモーターとしては宿主で機能するものであればいずれでも使用できる。好ましくは、ブレビバチルス属細菌由来のプロモーターを使用する。より好ましくは、ブレビバチルス・ブレビス、特にブレビバチルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１２２３）由来のＭＷＰプロモーター領域（特公平１−５８９５０号公報、特公平７−１０８２２４公報）、あるいはブレビバチルス・チョウシネンシス、特にブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８７）（バチルス・ブレビスＨ１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８７）と同一菌株）由来のＨＷＰプロモーター領域（特開平４−２７８０９１号公報、特開平６−１３３７８２号公報）に含まれるプロモーター、例えばＰ２プロモーターを挙げることができる。本発明の目的のために、プロモーター数は、任意の数であり得るが、好ましくは単一のプロモーターを使用する。
［００３７］本明細書において、「作動可能に連結」とは、２以上のＤＮＡ配列が物理的におよび／又は機能的に関連可能な状態で連結していることを意味する。例えば、プロモーターと翻訳ユニットとが適当なＤＮＡ配列を介して連結されており、当該プロモーターが、当該翻訳ユニットの一部がコードするポリペプチドの発現レベルに影響を及ぼす場合には、両者は「作動可能に連結」されているといえる。
［００３８］上記のスペーサー配列、プロモーター配列、ＳＤ配列、およびシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列は、例えばブレビバチルス属細菌、またはプレビバチルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１２２３）の染色体ＤＮＡを鋳型として、公知のＰＣＲ法で特異的に増やすことにより取得できる。
［００３９］本発明の「ＤＮＡ構築体」の一実施形態は、前記翻訳ユニットが２個であり、１の翻訳ユニットが完全長抗体を構成するＬ鎖をコードするＤＮＡ配列を含み、他の翻訳ユニットが完全長抗体を構成するＨ鎖をコードするＤＮＡ配列を含むものである。本発明
１３
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
号）、ｐＮＣＯ２（特開２００２−２３８５６９号公報）、またはこれらの誘導体が好ましい。また、宿主としてブレビバチルス属細菌を用いる場合、宿主細胞内で自立複製可能なプラスミドベクターなどを利用することなく、本発明のＤＮＡ構築体を染色体中へ直接組み込み、発現させる方法（特開平９−１３５６９３号公報）を用いても良い。
［００４３］本発明の「形質転換体」は、本発明のベクターで適当な宿主を形質転換することにより得られる。本発明で使用される宿主は、細菌、動物細胞、植物細胞、または菌類その他を含み、特に限定されないが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バチルス属細菌またはブレビバチルス属細菌が好適に使用され、ブレビバチルス属細菌がより好適に使用され得る。
［００４４］上記バチルス属細菌としては、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂ．ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ｐａｓｔｅｕｒｉｉ、Ｂ．ｐａｎｔｏｔｈｅｎｔｉｃｕｓ、Ｂ．ｐａｓｔｅｕｒｉｉ、Ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｅｓ、Ｂ．ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｂ．ｉｎｓｏｌｉｔｕｓ、Ｂ．ｍａｒｉｎｕｓ、Ｂ．ｍａｃｑｕａｒｉｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｂ．ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂ．ｓｃｈｌｅｇｅｌｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｂ．ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｐａｓｔｅｕｒｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｂ．ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｂ．ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂ．ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌａｒｖａｅ、Ｂ．ｌｅｎｔｉｍｏｒｂｉｓ、Ｂ．ｐｏｐｉｌｌｉａｅ、Ｂ．ｌａｒｖａｅおよびＢ．ｌｅｎｔｉｍｏｒｂｉｓを挙げることができる。上記ブレビバチルス属細菌としては、例えば、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇｒｉ、Ｂ．ｂｏｒｓｔｅｌｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｃｅｎｔｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｂ．ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｆｏｒｍｏｓｕｓ、Ｂ．ｉｎｖｏｃａｔｕｓ、Ｂ．ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｂ．ｌｉｍｎｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｒｅｕｓｚｅｒｉ、およびＢ．ｔｈｅｒｍｏｒｕｂｅｒを挙げることができ、それらの中でも、ブレビバチルス・ブレビス、ブレビバチルス・ボルステレンシス、およびブレビバチルス・チョウシネンシスが好適に、ブレビバチルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１２２３）、ブレビバチルス・ブレビス４７−５Ｑ（Ｕｄａｋａ，Ｓ．ら，１９９３．Ｍｅｔｈｏｄ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，２１７：２３−３３）、およびブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８７）がより好適に使用され得る。また生産量の向上などの目的に応じて、上記ブレビバチルス属細菌のプロテアーゼ欠損株や高発現株のような変異株を使用しても良い。具体的に挙げればブレビバチルス・チ
１５
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
より消化された抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖、Ｈ鎖コード遺伝子断片は２％アガロースで分離後、ゲルから抽出し遺伝子断片を取得した。別に、図１に示した発現ベクターｐＮＨ３０１は制限酵素ＮｃｏＩとＰｓｔＩ、及びＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩでそれぞれ消化後、アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）処理を行い、先に得られた抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖、Ｈ鎖コード遺伝子断片に対しＴ４リガーゼを用いて連結し、それぞれＬ／ｐＮＨ３０１及びＨ／ｐＮＨ３０１を得た〔図２〕。
【実施例２】
［００５７］完全長抗ヒトＴＮＦα抗体発現ベクターＬ−ＯＷＰＴ−Ｈ／ｐＮＨ３０１の構築
ブレビバチルス・ブレビスのＭＷＰのストップコドン以降からＯＷＰのＳＤ配列を含めたシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を得るため、ブレビバチルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１２２３）株から定法に従い染色体ＤＮＡ約１μｇを抽出、精製した。この染色体ＤＮＡを鋳型として、合成オリゴヌクレオチドプライマーＯＷＰＴ−Ｆ１：５’−ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＡＴＡＣＡＧＴＴＡＡＴＴＡＧＴＴＡＧＡＡＧ−３’（配列番号５）と、抗ヒトＴＮＦα抗体のＨ鎖のＮ末端Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ（配列番号２３）をコードするＤＮＡ配列を３’末端に付加した合成オリゴヌクレオチドプライマーＯＷＰＴ−Ｒ１：５’−ＡＧＡＣＴＣＣＴＣＡＡＧＴＴＴＣＡＣＴＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＣＡＧＡＴＧＣＴＧＣＡＡＣ−３’（配列番号６）とを用いてＰＣＲを行い、約０．２２ｋｂｐの遺伝子断片を得た。この遺伝子断片は、ブレビバチルス・ブレビスが有するＭＷＰ及びＯＷＰオペロン構造内の、ＭＷＰ終止コドンＴＡＡ以降のターミネーターと、ＯＷＰのＳＤ配列と、シグナルペプチド（Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ：配列番号２４）をコードするＤＮＡ配列と、上記抗ヒトＴＮＦα抗体のＨ鎖のＮ末端Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ（配列番号２３）をコードするＤＮＡ配列とを含んでいる（図３参照）。
一方、実施例１により得られた抗ヒトＴＮＦα抗体のＨ鎖をコードするＨ／ｐＮＨ３０１を鋳型として、合成オリゴヌクレオチドプライマーＴＮＦ−ＨＦ２：５’−ＧＴＴＧＣＡＧＣＡＴＣＴＧＣＡＴＴＴＧＣＡＧＡＡＧＴＧＡＡＡＣＴＴＧＡＧＧＡＧＴＣＴ−３’（配列番号７）と、実施例１で使用されたプライマ−ＴＮＦ−ＨＲ１：５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡ−３’（配列番号４）とを用いＰＣＲを行った。得られた１．５ｋｂｐ
２１
【手続補正書】
【提出日】平成18年3月29日(2006.3.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
該スペーサー配列は、以下の（１）または（２）のＤＮＡ配列を含む、ＤＮＡ構築体である。
（１）ブレビバチルス属細菌の細胞壁蛋白質オペロン中の、ｍｉｄｄｌｅ  ｗａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子の終止コドンの直後からｏｕｔｅｒ  ｗａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列の直前までのＤＮＡ配列のうちの、任意の２０ヌクレオチド長以上からなるＤＮＡ配列。
（２）（１）のＤＮＡ配列中に、１または数個のヌクレオチドの置換、欠失および／または付加を有するＤＮＡ配列であって、かつ（１）のＤＮＡ配列と同等の機能を有するＤＮＡ配列。
本明細書において、以下では、上記（１）又は（２）のＤＮＡ配列を「ＤＮＡ配列（１）又は（２）」と記載することがある。
［００２４］本発明のスペーサー配列に含まれる「ＤＮＡ配列（１）又は（２）」は、２０ヌクレオチド長以上、望ましくは２７ヌクレオチド長以上、より望ましくは３０ヌクレオチド以上、更に望ましくは４０ヌクレオチド長、特に望ましくは５１ヌクレオチド長以上、好ましくは６０ヌクレオチド長以上、より好ましくは８０ヌクレオチド長以上、更に好ましくは１００ヌクレオチド長以上、特に好ましくは１１０ヌクレオチド長以上、より特に好ましくは１２０ヌクレオチド長以上である。また、好ましくは２０以上１２７ヌクレオチド長以下であり、具体的には、例えば３６ヌクレオチド長、または５１ヌクレオチド長、または１１２ヌクレオチド長、または１２７ヌクレオチド長である。
また、本発明のスペーサー配列に含まれる「ＤＮＡ配列（１）又は（２）」の起源となるブレビバチルス属細菌としては、ブレビバチルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１２２３）が好ましい。なお、ブレビバチルス・ブレビス４７株は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室（ＪＣＭ）に「ＪＣＭ６２８５株」として保存されており、入手することができる。
［００２５］本発明のＤＮＡ構築体のスペーサー配列に含まれる「ブレビバチルス属細菌の細胞壁蛋白質オペロン中の、ＭＷＰ遺伝子の終止コドンの直後からＯＷＰのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列の直前までのＤＮＡ配列のうちの、任意の２０ヌクレオチド長以上からなるＤＮＡ配列」の例示として、配列番号１４に、ブレビバチルス・ブレビス
８
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上でありうる。該数は、好ましくは２から４、より好ましくは２または３、およびもっとも好ましくは２である。
［００３６］本明細書において、「プロモーター」とは、任意の構成的または誘導可能プロモーターを含む。原核生物宿主での使用のために好適なプロモーターは、ｐｏｌＩＩプロモーター、ｐｏｌＩＩＩプロモーター、ＰｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターおよびハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃまたはｔｒｃプロモーターを含む。プロモーターとしては宿主で機能するものであればいずれでも使用できる。好ましくは、ブレビバチルス属細菌由来のプロモーターを使用する。より好ましくは、ブレビバチルス・ブレビス、特にブレビバチルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１２２３）由来のＭＷＰプロモーター領域（特公平１−５８９５０号公報、特公平７−１０８２２４公報）、あるいはブレビバチルス・チョウシネンシス、特にブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８７）（バチルス・ブレビスＨ１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８７）と同一菌株）由来のＨＷＰプロモーター領域（特開平４−２７８０９１号公報、特開平６−１３３７８２号公報）に含まれるプロモーター、例えばＰ２プロモーターを挙げることができる。本発明の目的のために、プロモーター数は、任意の数であり得るが、好ましくは単一のプロモーターを使用する。
［００３７］本明細書において、「作動可能に連結」とは、２以上のＤＮＡ配列が物理的におよび／又は機能的に関連可能な状態で連結していることを意味する。例えば、プロモーターと翻訳ユニットとが適当なＤＮＡ配列を介して連結されており、当該プロモーターが、当該翻訳ユニットの一部がコードするポリペプチドの発現レベルに影響を及ぼす場合には、両者は「作動可能に連結」されているといえる。
［００３８］上記のスペーサー配列、プロモーター配列、ＳＤ配列、およびシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列は、例えばブレビバチルス属細菌、またはブレビバチルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１２２３）の染色体ＤＮＡを鋳型として、公知のＰＣＲ法で特異的に増やすことにより取得できる。
［００３９］本発明の「ＤＮＡ構築体」の一実施形態は、前記翻訳ユニットが２個であり、１の翻訳ユニットが完全長抗体を構成するＬ鎖をコードするＤＮＡ配列を含み、他の翻訳ユニットが完全長抗体を構成するＨ鎖をコードするＤＮＡ配列を含むものである。本発明
１３
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
号）、ｐＮＣＯ２（特開２００２−２３８５６９号公報）、またはこれらの誘導体が好ましい。また、宿主としてブレビバチルス属細菌を用いる場合、宿主細胞内で自立複製可能なプラスミドベクターなどを利用することなく、本発明のＤＮＡ構築体を染色本中へ直接組み込み、発現させる方法（特開平９−１３５６９３号公報）を用いても良い。
［００４３］本発明の「形質転換体」は、本発明のベクターで適当な宿主を形質転換することにより得られる。本発明で使用される宿主は、細菌、動物細胞、植物細胞、または菌類その他を含み、特に限定されないが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バチルス属細菌またはブレビバチルス属細菌が好適に使用され、ブレビバチルス属細菌がより好適に使用され得る。
［００４４］上記バチルス属細菌としては、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂ．ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ｐａｓｔｅｕｒｉｉ、Ｂ．ｐａｎｔｏｔｈｅｎｔｉｃｕｓ、Ｂ．ｐａｓｔｅｕｒｉｉ、Ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｅｓ、Ｂ．ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｂ．ｉｎｓｏｌｉｔｕｓ、Ｂ．ｍａｒｉｎｕｓ、Ｂ．ｍａｃｑｕａｒｉｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｂ．ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂ．ｓｃｈｌｅｇｅｌｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｂ．ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｐａｓｔｅｕｒｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｂ．ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｂ．ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂ．ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌａｒｖａｅ、Ｂ．ｌｅｎｔｉｍｏｒｂｉｓ、Ｂ．ｐｏｐｉｌｌｉａｅ、Ｂ．ｌａｒｖａｅおよびＢ．ｌｅｎｔｉｍｏｒｂｉｓを挙げることができる。上記ブレビバチルス属細菌としては、例えば、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇｒｉ、Ｂ．ｂｏｒｓｔｅｌｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｃｅｎｔｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｂ．ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｆｏｒｍｏｓｕｓ、Ｂ．ｉｎｖｏｃａｔｕｓ、Ｂ．ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｂ．ｌｉｍｎｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｒｅｕｓｚｅｒｉ、およびＢ．ｔｈｅｒｍｏｒｕｂｅｒを挙げることができ、それらの中でも、ブレビバチルス・ブレビス、ブレビバチルス・ボルステレンシス、およびブレビバチルス・チョウシネンシスが好適に、ブレビバチルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１２２３）、ブレビバチルス・ブレビス４７−５Ｑ（Ｕｄａｋａ，Ｓ．ら、１９９３．Ｍｅｔｈｏｄ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，２１７：２３−３３）、およびブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８７）がより好適に使用され得る。また生産量の向上などの目的に応じて、上記ブレビバチルス属細菌のプロテアーゼ欠損株や高発現株のような変異株を使用しても良い。具体的に挙げればブレビバチルス・チ
１５
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
より消化された抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖、Ｈ鎖コード遺伝子断片は２％アガロースで分離後、ゲルから抽出し遺伝子断片を取得した。別に、図１に示した発現ベクターｐＮＨ３０１は制限酵素ＮｃｏＩとＰｓｔＩ、及びＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩでそれぞれ消化後、アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）処理を行い、先に得られた抗ヒトＴＮＦα抗体Ｌ鎖、Ｈ鎖コード遺伝子断片に対しＴ４リガーゼを用いて連結し、それぞれＬ／ｐＮＨ３０１及びＨ／ｐＮＨ３０１を得た〔図２〕。
【実施例２】
［００５７］完全長抗ヒトＴＮＦα抗体発現ベクターＬ−ＯＷＰＴ−Ｈ／ｐＮＨ３０１の構築
ブレビバチルス・ブレビスのＭＷＰのストップコドン以降からＯＷＰのＳＤ配列を含めたシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を得るため、ブレビバチルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１２２３）株から定法に従い染色体ＤＮＡ約１μｇを抽出、精製した。この染色体ＤＮＡを鋳型として、合成オリゴヌクレオチドプライマーＯＷＰＴ−Ｆ１：５’−ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＡＴＡＣＡＧＴＴＡＡＴＴＡＧＴＴＡＧＡＡＧ−３’（配列番号５）と、抗ヒトＴＮＦα抗体のＨ鎖のＮ末端Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ（配列番号２３）をコードするＤＮＡ配列を３’末端に付加した合成オリゴヌクレオチドプライマーＯＷＰＴ−Ｒ１：５’−ＡＧＡＣＴＣＣＴＣＡＡＧＴＴＴＣＡＣＴＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＣＡＧＡＴＧＣＴＧＣＡＡＣ−３’（配列番号６）とを用いてＰＣＲを行い、約０．２２ｋｂｐの遺伝子断片を得た。この遺伝子断片は、ブレビバチルス・ブレビスが有するＭＷＰ及びＯＷＰオペロン構造内の、ＭＷＰ終止コドンＴＡＡ以降のターミネーターと、ＯＷＰのＳＤ配列と、シグナルペプチド（Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ：配列番号２４）をコードするＤＮＡ配列と、上記抗ヒトＴＮＦα抗体のＨ鎖のＮ末端Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ（配列番号２３）をコードするＤＮＡ配列とを含んでいる（図３参照）。
一方、実施例１により得られた抗ヒトＴＮＦα抗体のＨ鎖をコードするＨ／ｐＮＨ３０１を鋳型として、合成オリゴヌクレオチドプライマーＴＮＦ−ＨＦ２：５’−ＧＴＴＧＣＡＧＣＡＴＣＴＧＣＡＴＴＴＧＣＡＧＡＡＧＴＧＡＡＡＣＴＴＧＡＧＧＡＧＴＣＴ−３’（配列番号７）と、実施例１で使用されたプライマーＴＮＦ−ＨＲ１：５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡ−３’（配列番号４）とを用いＰＣＲを行った。得られた１．５ｋｂｐ
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【国際調査報告】
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