【手続補正書】
【提出日】令和2年4月17日(2020.4.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’から３’の方向に、第一のリコンビナーゼ認識部位（ＲＲＳ）、第一の軽鎖断片（ＬＣＦ）をコードするヌクレオチド配列を備えた第一の核酸、および第三のＲＲＳを備えた第一のベクター、
５’から３’の方向に、前記第三のＲＲＳ、第一の重鎖断片（ＨＣＦ）をコードするヌクレオチド配列を備えた第二の核酸、および第二のＲＲＳを備えた第二のベクター、を備えたベクターセットであって、
前記第一または前記第二の核酸は、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列をさらに備え、ならびに、
前記第一および第二のＨＣＦ、ならびに前記第一のＬＣＦが、二特異性抗原結合タンパク質をコードする、ベクターセット。
【請求項２】
ａ）前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記第一の核酸中に含まれ、その結果、前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、前記第一のＬＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列の上流または下流に配置される；
ｂ）前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記第二の核酸中に含まれる；
ｃ）前記第一のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第一のＣＨ３ドメインをコードし、前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、前記第二のＣＨ３ドメインをコードし、例えば、
ｉ）前記第一および第二のＣＨ３ドメインが、少なくとも１つのアミノ酸位置で異なっている：
ｉｉ）前記第一および第二のＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧのＣＨ３ドメインであり、前記２つのＣＨ３ドメインの内の１つが、少なくとも１つのアミノ酸位置で改変され、それにより前記非改変ＣＨ３ドメインとは異なるプロテインＡ結合特性が生じる；もしくは
ｉｉｉ）前記第一および第二のＣＨドメインをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記ヌクレオチド配列のうちの１つがコドン改変されているという点で互いに異なっている；
ｄ）前記第一のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第一のＶＨをコードし、前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第二の重鎖ＶＨをコードする；
ｅ）前記第一のＬＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第一のＶＬをコードする；または
ｆ）第一の軽鎖ＬＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第一のプロモーターに動作可能に連結され、第一のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第二のプロモーターに動作可能に連結され、第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第三のプロモーターに動作可能に連結され、その結果、前記第一、第二、および第三のプロモーターは、同一または異なるプロモーターである、
請求項１に記載のベクターセット。
【請求項３】
前記第一の核酸は、
ａ）前記第一のベクター中の前記第三のＲＲＳに対し５’に位置付けられる第二のプロモーターをさらに備え、前記第二の核酸は、前記第二のベクター中の前記第三のＲＲＳに対し３’に位置付けられる前記選択マーカー遺伝子をさらに備える；または
ｂ）選択マーカー遺伝子の５’部分に対し５’に位置付けられる、前記第一のベクター中の第二のプロモーターをさらに備え、前記第二のベクター中の前記選択マーカーの３’部分は、前記選択マーカー遺伝子の前記５’部分の相同アームに対し３’に存在する、
請求項１に記載のベクターセット。
【請求項４】
前記第一のベクターが、５’から３’の方向に、前記第一のＲＲＳ、前記第一の核酸、および前記第三のＲＲＳを備え、
前記第二のベクターが、５’から３’の方向に、前記第三のＲＲＳ、前記第二の核酸を備え、前記第二の核酸は、第一の重鎖またはその断片をコードする前記ヌクレオチド配列、および第二の重鎖またはその断片をコードする前記ヌクレオチド配列を備える、
請求項１に記載のベクターセット。
【請求項５】
前記第一のベクターが、５’から３’の方向に、前記第一のＲＲＳ、前記第一の核酸であって、第一のＬＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列と第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列を備える第一の核酸、および前記第三のＲＲＳを備え、
前記第二のベクターが、５’から３’の方向に、前記第三のＲＲＳ、前記第二の核酸を備え、前記第二の核酸は、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備える、
請求項１に記載のベクターセット。
【請求項６】
前記第一の核酸は、前記第一のベクター中の前記第三のＲＲＳに対し５’に位置付けられる、選択マーカー遺伝子の５’部分をさらに備え、前記第二の核酸は、前記第二のベクター中の前記第三のＲＲＳに対し３’に位置付けられる、前記選択マーカー遺伝子の残りの３’部分をさらに備え、任意で、前記第一のベクター中の前記第三のＲＲＳは、前記選択マーカー遺伝子のイントロンの５’部分内に存在し、前記第二のベクター中の前記第三のＲＲＳは、前記選択マーカー遺伝子のイントロンの３’部分内に存在する、請求項４または請求項５に記載のベクターセット。
【請求項７】
ａ）１つ以上のＲＲＳ、および第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列を備える第三のベクターをさらに備える；または
ｂ）前記ＲＲＳを認識するリコンビナーゼを１つ以上コードする第三のベクターをさらに備える、
請求項１に記載のベクターセット。
【請求項８】
細胞およびベクターセットを備えるシステムであって、
前記細胞は、５’から３’の方向に、そのゲノムの発現強化座位内に統合された、第一のリコンビナーゼ認識部位（ＲＲＳ）、第一の外因性核酸、第三のＲＲＳ、第二の外因性核酸、および第二のＲＲＳを備え、前記３つのＲＲＳは互いに異なり、
前記ベクターセットが、
５’から３’の方向に、前記第一のＲＲＳ、第一の軽鎖断片（ＬＣＦ）をコードするヌクレオチド配列を備えた第一の核酸、および前記第三のＲＲＳを備えた第一ベクターと、
前記第三のＲＲＳ、第一の重鎖断片（ＨＣＦ）をコードするヌクレオチド配列を備えた第二の核酸、および前記第二のＲＲＳを備えた第二のベクターと、を備え、
前記第一の核酸または前記第二の核酸のいずれかは、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列をさらに備え、
前記ベクターが前記細胞内に導入されると、前記ベクター中の前記第一および第二の核酸が、前記第一、第二および第三のＲＲＳにより介在される組み換えを介して前記発現強化座位内に統合する、システム。
【請求項９】
前記第一の外因性核酸が、第一の選択マーカー遺伝子を備え、前記第二の外因性核酸が、第二の選択マーカー遺伝子を備え、前記第一と第二の選択マーカー遺伝子は異なる、請求項８に記載のシステム。
【請求項１０】
前記第一のベクターが、５’から３’の方向に、前記第一のＲＲＳ、前記第一のＬＣＦを備える前記第一の核酸、および前記第三のＲＲＳを備え、および
前記第二のベクターが、５’から３’の方向に、前記第三のＲＲＳ、前記第二の核酸であって、前記第一のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列、および前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列の両方を備える第二の核酸、および第二のＲＲＳを備える、請求項８に記載のシステム。
【請求項１１】
前記第一のベクターが、５’から３’の方向に、前記第一のＲＲＳ、前記第一のＬＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列と前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列を備える前記第一の核酸、および前記第三のＲＲＳを備え、
前記第二のベクターが、５’から３’の方向に、前記第三のＲＲＳ、前記第一のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列を備えた前記第二の核酸、および前記第二のＲＲＳを備える、請求項８に記載のシステム。
【請求項１２】
前記第一のベクター中の前記第一の核酸は、前記第三のＲＲＳに対し５’に位置付けられる、選択マーカー遺伝子の５’部分をさらに備え、前記第二のベクター中の前記第二の核酸は、前記第三のＲＲＳに対し３’に位置付けられる、前記選択マーカー遺伝子の残りの３’部分をさらに備える、請求項１０または１１に記載のシステム。
【請求項１３】
ａ）前記第一のベクター中の前記第三のＲＲＳは、前記選択マーカー遺伝子のイントロンの５’部分内に存在し、前記第二のベクター中の前記第三のＲＲＳは、前記選択マーカー遺伝子のイントロンの３’部分内に存在する；または
ｂ）前記ＬＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第一のプロモーターに動作可能に連結され、前記第一のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第二のプロモーターに動作可能に連結され、および前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第三のプロモーターに動作可能に連結され、前記第一、第二、および第三のプロモーターは同一または異なるプロモーターであり、ならびに／または前記プロモーターは、前記選択マーカー遺伝子が動作可能に連結されるプロモーターと同一または異なる、
請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記第一のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第一のＣＨ３ドメインをコードし、前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第二のＣＨ３ドメインをコードし、必要に応じて、前記第一および第二のＣＨ３ドメインの内の１つは、ヒトＩｇＧの前記ＣＨ３ドメインであり、他方は、少なくとも１つのアミノ酸位置の改変を備える前記ヒトＩｇＧの改変型ＣＨ３ドメインであり、例えば、前記改変型ＣＨ３ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列は、
ａ）前記第一のベクター中にある；または
ｂ）前記第二のベクター中にあり、前記非改変型ＣＨ３ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列の上流にある、
請求項８に記載のシステム。
【請求項１５】
方法であって、
（ｉ）請求項８〜１４のいずれか１項に記載のシステムを提供すること、
（ｉｉ）前記細胞内に、前記ベクターを、トランスフェクションにより同時に導入すること、および、
（ｉｉｉ）前記ベクター中の前記第一および第二の核酸が、前記第一、第二、および第三のＲＲＳにより介在される組み換えを介して前記細胞の前記発現強化座位内に統合されたトランスフェクト細胞を選択すること、を含む、方法。
【請求項１６】
（ｉｖ）前記選択されたトランスフェクト細胞中の前記第一のＬＣＦ、前記第一のＨＣＦ、および前記第二のＨＣＦを発現させること、および、
（ｖ）前記選択されたトランスフェクト細胞から、前記第一のＬＣＦ、前記第一のＨＣＦ、および前記第二のＨＣＦを備えた前記二特異性抗原結合タンパク質を取得すること、をさらに含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法によって取得することができる細胞。
【請求項１８】
二特異性抗原結合タンパク質を作製する方法であって、
（ｉ）請求項１７に記載の細胞を提供すること、
（ｉｉ）前記外因性核酸配列から、前記二特異性抗原結合タンパク質を発現させること、および
（ｉｉｉ）前記細胞から、前記二特異性抗原結合タンパク質を取得すること、を含む、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
一部の実施形態では、当該方法は、発現強化座位内に統合された二特異性抗原結合タンパク質をコードする外因性核酸配列を含有する細胞、当該外因性核酸から二特異性抗原結合タンパク質を発現させること、および細胞から二特異性抗原結合タンパク質を取得することを含んでもよい。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
発現強化座位内の特定の部位で統合される外因性核酸を備えた細胞であって、前記外因性核酸配列は二特異性抗原結合タンパク質をコードしている、前記細胞。
（項目２）
前記外因性核酸配列は、第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列を備えた第一の外因性核酸、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備えた第二の外因性核酸、および第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備えた第三の外因性核酸を備える、項目１に記載の細胞。
（項目３）
前記第一のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第一のＣＨ２ドメインおよび第一のＣＨ３ドメインをコードし、前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第二のＣＨ２ドメインおよび第二のＣＨ３ドメインをコードする、項目２に記載の細胞。
（項目４）
前記第一および第二のＣＨ３ドメインが、少なくとも１つのアミノ酸位置で異なっている、項目３に記載の細胞。
（項目５）
前記第一および第二のＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧのＣＨ３ドメインであり、前記２つのＣＨ３ドメインの内の１つが、少なくとも１つのアミノ酸位置で改変され、それにより非改変ＣＨ３ドメインとは異なるプロテインＡ結合特性が生じる、項目３に記載の細胞。
（項目６）
前記第一および第二のＣＨドメインをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記ヌクレオチド配列のうちの１つがコドン改変されているという点で互いに異なっている、項目３に記載の細胞。
（項目７）
前記第一のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第一のＶＨをコードし、前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第二のＶＨをコードする、項目２に記載の細胞。
（項目８）
前記第一のＬＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第一のＶＬをコードする、項目２に記載の細胞。
（項目９）
前記外因性核酸配列が、第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列を備える追加の外因性核酸をさらに備える、項目１に記載の細胞。
（項目１０）
前記第二のＬＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第二のＶＬをコードする、項目９に記載の細胞。
（項目１１）
前記第一の外因性核酸は、第一のＬＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列に動作可能に連結された第一のプロモーターをさらに備え、前記第二の外因性核酸は、第一のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列に動作可能に連結された第二のプロモーターをさらに備え、第三の外因性核酸は、第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列に動作可能に連結された第三のプロモーターを備え、前記第一、第二、および第三のプロモーターは、同一、または異なるプロモーターである、項目２に記載の細胞。
（項目１２）
前記第一の外因性核酸は、前記第二および第三の外因性核酸に対し、上流に配置される、項目２に記載の細胞。
（項目１３）
前記第一の外因性核酸に対し５’に位置付けられた第一のリコンビナーゼ認識部位（ＲＲＳ）、ならびに前記第二および第三の外因性核酸の両方に対し３’に位置付けられた第二のリコンビナーゼ認識部位（ＲＲＳ）をさらに備え、前記第一および第二のＲＲＳは異なる、項目１２に記載の細胞。
（項目１４）
前記第一の外因性核酸に対し３’に、ならびに前記第二および第三の外因性核酸の１つ、または両方に対し５’に位置付けられる第三のＲＲＳをさらに備え、前記第三のＲＲＳは、前記第一および第二のＲＲＳとは異なる、項目１２に記載の細胞。
（項目１５）
選択マーカー遺伝子を備える第四の外因性核酸をさらに備える、項目１３に記載の細胞。
（項目１６）
前記第四の外因性核酸が、第三のＲＲＳをさらに備え、前記第一の外因性核酸に対し３’に位置付けられる、項目１５に記載の細胞。
（項目１７）
前記第二の外因性核酸は、前記第一および第三の外因性核酸に対し、上流に配置される、項目２に記載の細胞。
（項目１８）
前記座位での前記外因性核酸の順序が、５’から３’の方向に、前記第一の外因性核酸、前記第四の外因性核酸、前記第二の外因性核酸、および前記第三の外因性核酸であり、前記第二の外因性核酸は、ヒトＩｇＧの改変型ＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列を備え、前記第三の外因性核酸は、前記ヒトＩｇＧの天然型ＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列を備える、項目１６に記載の細胞。
（項目１９）
前記座位での前記外因性核酸の順序が、５’から３’の方向に、前記第一の外因性核酸、前記第二の外因性核酸、前記第四の外因性核酸、および前記第三の外因性核酸であり、前記第二の外因性核酸は、ヒトＩｇＧの前記天然型ＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列を備え、前記第三の外因性核酸は、前記ヒトＩｇＧの改変型ＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列を備える、項目１６に記載の細胞。
（項目２０）
前記第一、第二、および第三のプロモーターが同一のプロモーターであり、前記選択マーカー遺伝子が動作可能に連結される前記プロモーターとは異なる、項目１８または１９に記載の細胞。
（項目２１）
前記二特異性抗原結合タンパク質は、Ｔ細胞抗原および腫瘍細胞抗原に特異的に結合する、項目１に記載の細胞。
（項目２２）
前記強化発現座位は、配列番号１に対し少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列を備えた座位、および配列番号２に対し少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列を備えた座位からなる群から選択される、項目１に記載の細胞。
（項目２３）
前記細胞が、ＣＨＯ細胞である、項目１〜２２のいずれかに記載の細胞。
（項目２４）
５’から３’の方向に、第一のＲＲＳ、第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列を備えた第一の核酸、および第三のＲＲＳを備えた第一のベクター、
５’から３’の方向に、前記第三のＲＲＳ、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備えた第二の核酸、および第二のＲＲＳを備えた第二のベクター、を備えたベクターセットであって、
前記第一または前記第二の核酸は、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列をさらに備え、ならびに、
前記第一および第二のＨＣＦ、ならびに前記第一のＬＣＦが、二特異性抗原結合タンパク質をコードする、ベクターセット。
（項目２５）
前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記第一の核酸中に含まれる、項目２４に記載のベクターセット。
（項目２６）
前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、前記第一のＬＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列の上流または下流に配置される、項目２５に記載のベクターセット。
（項目２７）
前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記第二の核酸中に含まれる、項目２４に記載のベクターセット。
（項目２８）
前記第一のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第一のＣＨ３ドメインをコードし、前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、前記第二のＣＨ３ドメインをコードする、項目２４に記載のベクターセット。
（項目２９）
前記第一および第二のＣＨ３ドメインが、少なくとも１つのアミノ酸位置で異なっている、項目２８に記載のベクターセット。
（項目３０）
前記第一および第二のＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧのＣＨ３ドメインであり、前記２つのＣＨ３ドメインの内の１つが、少なくとも１つのアミノ酸位置で改変され、それにより前記非改変ＣＨ３ドメインとは異なるプロテインＡ結合特性が生じる、項目２８に記載のベクターセット。
（項目３１）
前記第一および第二のＣＨドメインをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記ヌクレオチド配列のうちの１つがコドン改変されているという点で互いに異なっている、項目２８に記載のベクターセット。
（項目３２）
前記第一のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第一のＶＨをコードし、前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第二の重鎖ＶＨをコードする、項目２４に記載のベクターセット。
（項目３３）
前記第一のＬＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第一のＶＬをコードする、項目２４に記載のベクターセット。
（項目３４）
第一の軽鎖ＬＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第一のプロモーターに動作可能に連結され、第一のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第二のプロモーターに動作可能に連結され、第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第三のプロモーターに動作可能に連結される、項目２４に記載のベクターセット。
（項目３５）
前記第一、第二、および第三のプロモーターは、同一または異なるプロモーターである、項目３４に記載のベクターセット。
（項目３６）
前記第一の核酸は、前記第一のベクター中の前記第三のＲＲＳに対し５’に位置付けられる第二のプロモーターをさらに備え、前記第二の核酸は、前記第二のベクター中の前記第三のＲＲＳに対し３’に位置付けられる前記選択マーカー遺伝子をさらに備える、項目２４に記載のベクターセット。
（項目３７）
前記第一の核酸は、選択マーカー遺伝子の５’部分に対し５’に位置付けられる、前記第一のベクター中の第二のプロモーターをさらに備え、前記第二のベクター中の前記選択マーカーの３’部分は、前記選択マーカー遺伝子の前記５’部分の相同アームに対し３’に存在する、項目２４に記載のベクターセット。
（項目３８）
前記第一のベクターが、５’から３’の方向に、前記第一のＲＲＳ、前記第一の核酸、および前記第三のＲＲＳを備え、
前記第二のベクターが、５’から３’の方向に、前記第三のＲＲＳ、前記第二の核酸を備え、前記第二の核酸は、第一の重鎖またはその断片をコードする前記ヌクレオチド配列、および第二の重鎖またはその断片をコードする前記ヌクレオチド配列を備える、項目２４に記載のベクターセット。
（項目３９）
前記第一のベクターが、５’から３’の方向に、前記第一のＲＲＳ、前記第一の核酸であって、第一のＬＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列と第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列を備える第一の核酸、および前記第三のＲＲＳを備え、
前記第二のベクターが、５’から３’の方向に、前記第三のＲＲＳ、前記第二の核酸を備え、前記第二の核酸は、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備える、項目２４に記載のベクターセット。
（項目４０）
前記第一の核酸は、前記第一のベクター中の前記第三のＲＲＳに対し５’に位置付けられる、選択マーカー遺伝子の５’部分をさらに備え、前記第二の核酸は、前記第二のベクター中の前記第三のＲＲＳに対し３’に位置付けられる、前記選択マーカー遺伝子の残りの３’部分をさらに備え、任意で、前記第一のベクター中の前記第三のＲＲＳは、前記選択マーカー遺伝子のイントロンの５’部分内に存在し、前記第二のベクター中の前記第三のＲＲＳは、前記選択マーカー遺伝子のイントロンの３’部分内に存在する、項目３８または３９に記載のベクターセット。
（項目４１）
１つ以上のＲＲＳ、および第二のＬＣＦをコードするヌクレオチドを備える第三のベクターをさらに備える、項目２４に記載のベクターセット。
（項目４２）
前記ＲＲＳを認識するリコンビナーゼを１つ以上コードする第三のベクターをさらに備える、項目２４に記載のベクターセット。
（項目４３）
二特異性抗原結合タンパク質をコードし、細胞の発現強化座位内への統合用の５’相同アームと３’相同アームに隣接される外因性核酸を備えるベクター。
（項目４４）
細胞およびベクターセットを備えるシステムであって、
前記細胞は、５’から３’の方向に、そのゲノムの発現強化座位内に統合された、第一のＲＲＳ、第一の外因性核酸、第三のＲＲＳ、第二の外因性核酸、および第二のＲＲＳを備え、前記３つのＲＲＳは互いに異なり、
前記ベクターセットが、
５’から３’の方向に、前記第一のＲＲＳ、第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列を備えた第一の核酸、および前記第三のＲＲＳを備えた第一ベクターと、
前記第三のＲＲＳ、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備えた第二の核酸、および前記第二のＲＲＳを備えた第二のベクターと、を備え、
前記第一の核酸または前記第二の核酸のいずれかは、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列をさらに備え、
前記ベクターが前記細胞内に導入されると、前記ベクター中の前記第一および第二の核酸が、前記第一、第二および第三のＲＲＳにより介在される組み換えを介して前記発現強化座位内に統合する、システム。
（項目４５）
前記第一の外因性核酸が、第一の選択マーカー遺伝子を備え、前記第二の外因性核酸が、第二の選択マーカー遺伝子を備え、前記第一と第二の選択マーカー遺伝子は異なる、項目４４に記載のシステム。
（項目４６）
前記第一のベクターが、５’から３’の方向に、前記第一のＲＲＳ、前記第一のＬＣＦを備える前記第一の核酸、および前記第三のＲＲＳを備え、および
前記第二のベクターが、５’から３’の方向に、前記第三のＲＲＳ、前記第二の核酸であって、前記第一のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列、および前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列の両方を備える第二の核酸、および第二のＲＲＳを備える、項目４４に記載のシステム。
（項目４７）
前記第一のベクターが、５’から３’の方向に、前記第一のＲＲＳ、前記第一のＬＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列と前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列を備える前記第一の核酸、および前記第三のＲＲＳを備え、
前記第二のベクターが、５’から３’の方向に、前記第三のＲＲＳ、前記第一のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列を備えた前記第二の核酸、および前記第二のＲＲＳを備える、項目４４に記載のシステム。
（項目４８）
前記第一のベクター中の前記第一の核酸は、前記第三のＲＲＳに対し５’に位置付けられる、選択マーカー遺伝子の５’部分をさらに備え、前記第二のベクター中の前記第二の核酸は、前記第三のＲＲＳに対し３’に位置付けられる、前記選択マーカー遺伝子の残りの３’部分をさらに備える、項目４６または４７に記載のシステム。
（項目４９）
前記第一のベクター中の前記第三のＲＲＳは、前記選択マーカー遺伝子のイントロンの５’部分内に存在し、前記第二のベクター中の前記第三のＲＲＳは、前記選択マーカー遺伝子のイントロンの３’部分内に存在する、項目４８に記載のシステム。
（項目５０）
前記ＬＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第一のプロモーターに動作可能に連結され、前記第一のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第二のプロモーターに動作可能に連結され、および前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第三のプロモーターに動作可能に連結され、前記第一、第二、および第三のプロモーターは同一または異なるプロモーターであり、ならびに／または前記プロモーターは、前記選択マーカー遺伝子が動作可能に連結されるプロモーターと同一または異なる、項目４８に記載のシステム。
（項目５１）
前記第一のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第一のＣＨ３ドメインをコードし、前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第二のＣＨ３ドメインをコードする、項目４４に記載のシステム。
（項目５２）
前記第一および第二のＣＨ３ドメインの内の１つは、ヒトＩｇＧの前記ＣＨ３ドメインであり、他方は、少なくとも１つのアミノ酸位置の改変を備える前記ヒトＩｇＧの改変型ＣＨ３ドメインである、項目５１に記載のシステム。
（項目５３）
前記改変型ＣＨ３ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列は、前記第一のベクター中にある、項目５２に記載のシステム。
（項目５４）
前記改変型ＣＨ３ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列は、前記第二のベクター中にあり、前記非改変型ＣＨ３ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列の上流にある、項目５２に記載のシステム。
（項目５５）
方法であって、
（ｉ）項目４４〜５４のいずれか１項に記載のシステムを提供すること、
（ｉｉ）前記細胞内に、前記ベクターを、トランスフェクションにより同時に導入すること、および、
（ｉｉｉ）前記ベクター中の前記第一および第二の核酸が、前記第一、第二、および第三のＲＲＳにより介在される組み換えを介して前記細胞の前記発現強化座位内に統合されたトランスフェクト細胞を選択すること、を含む、方法。
（項目５６）
（ｉｖ）前記選択されたトランスフェクト細胞中の前記第一のＬＣＦ、前記第一のＨＣＦ、および前記第二のＨＣＦを発現させること、および、
（ｖ）前記選択されたトランスフェクト細胞から、前記第一のＬＣＦ、前記第一のＨＣＦ、および前記第二のＨＣＦを備えた前記二特異性抗原結合タンパク質を取得すること、をさらに含む項目５５に記載の方法。
（項目５７）
二特異性抗原結合タンパク質を作製する方法であって、
（ｉ）項目１〜２３のいずれか１項に記載の細胞を提供すること、
（ｉｉ）前記外因性核酸配列から、前記二特異性抗原結合タンパク質を発現させること、および
（ｉｉｉ）前記細胞から、前記二特異性抗原結合タンパク質を取得すること、を含む、方法。