(57)【要約】【課題】  従来のがんワクチンはキラーＴ細胞のみ、もしくはキラーＴ細胞とヘルパーＴ細胞の活性化にとどまり、それらと同時に抗原提示細胞を活性化する明らかな能力を有する実用的ながんワクチン製剤は達成されていなかった。【解決手段】  がん抗原と疎水化多糖類との複合体と、Ｔｏｌｌ様受容体に結合する抗原提示細胞刺激薬剤、例えば溶連菌抽出物とを組合わせてなる製剤は、がん細胞に対する抗原特異的な免疫を誘導し活性化する際の主要な担当細胞である抗原提示細胞、キラーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞のいずれをも活性化して強いワクチン効果を発揮する。本発明のワクチン製剤は、がん抗原に対する免疫応答、特に細胞傷害性Ｔ細胞及びヘルパーＴ細胞の活性化及び誘導作用を有しており、がんの治療または予防用ワクチンとして用いることができる。【選択図】        図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん抗原たんぱくと疎水化多糖類との複合体である薬剤と、Ｔｏｌｌ様受容体に結合して抗原提示細胞を刺激する薬剤とを組合わせてなるがんワクチン製剤。
【請求項２】
前記Ｔｏｌｌ様受容体に結合して抗原提示細胞を刺激する薬剤が、溶連菌抽出物またはＣｐＧ  ＤＮＡであることを特徴とする請求項１に記載のがんワクチン製剤。
【請求項３】
前記疎水化多糖類の構成多糖類がプルランまたはマンナンであり、疎水基がコレステロールであることを特徴とする請求項１または２に記載のがんワクチン製剤。
【請求項４】
前記がん抗原たんぱくがＨＥＲ２，ＮＹ−ＥＳＯ−１あるいはＭＡＧＥ  Ａ４のいずれかであることを特徴とする請求項１〜３の何れかに記載のがんワクチン製剤。
【請求項５】
前記がん抗原たんぱくがＨＥＲ２，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ  Ａ４のうちのいずれか２つまたは３つの混合物であることを特徴とする請求項１〜４の何れかに記載のがんワクチン製剤。
【請求項６】
がん抗原たんぱくと疎水化多糖類との複合体である薬剤と、Ｔｏｌｌ様受容体に結合して抗原提示細胞を刺激する薬剤とを各々個別に製剤化してなる２剤キット。
【請求項７】
前記Ｔｏｌｌ様受容体に結合して抗原提示細胞を刺激する薬剤が、溶連菌抽出物またはＣｐＧ  ＤＮＡであることを特徴とする請求項６に記載の２剤キット。
【請求項８】
前記疎水化多糖類の構成多糖類がプルランまたはマンナンであり、疎水基がコレステロールであることを特徴とする請求項６または７に記載のがん２剤キット。
【請求項９】
前記がん抗原たんぱくがＨＥＲ２，ＮＹ−ＥＳＯ−１あるいはＭＡＧＥ  Ａ４のいずれかであることを特徴とする請求項６〜８の何れかに記載の２剤キット。
【請求項１０】
前記がん抗原たんぱくがＨＥＲ２，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ  Ａ４のうちのいずれか２つまたは３つの混合物であることを特徴とする請求項６〜９の何れかに記載の２剤キット。
【請求項１１】
がん抗原たんぱくと疎水化多糖類との複合体である薬剤と、Ｔｏｌｌ様受容体に結合して抗原提示細胞を刺激する薬剤とを実質的に同時にまたは連続して投与することを特徴とするがんワクチンの効果増強方法。
【請求項１２】
Ｔｏｌｌ様受容体に結合して抗原提示細胞を刺激する薬剤が溶連菌抽出物であることを特徴とする請求項１１に記載のがんワクチン効果増強方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんワクチン製剤に関する。さらに詳しくは、抗原たんぱくと疎水化多糖類との複合体微粒子とＴｏｌｌ様受容体に結合して抗原提示細胞を刺激する薬剤とを組合わせてなるがんワクチン製剤に関する。本発明のがんワクチン製剤は、抗原に対して特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（以下、「キラーＴ細胞」と称する）及びヘルパーＴ細胞を活性化及び誘導し、また、樹状細胞などの抗原提示細胞（以下、「ＡＰＣ」と称する）を活性化する作用を有しているために、がんワクチンとして極めて有用である。
【背景技術】
【０００２】
永年にわたるがんに対する免疫応答の解析は、宿主の腫瘍拒絶における細胞性免疫の重要性を明らかにしてきた。ＣＤ８陽性キラーＴ細胞が多くの腫瘍系で直接腫瘍を破壊するエフェクター細胞であること、その働きを調節するＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞の重要性、および両者のＴ細胞に抗原を提示し、さまざまな接着分子やサイトカインなどで刺激活性化する樹状細胞を中心とした抗原提示細胞の役割と位置づけが明らかとなってきた。【０００３】
生体内でがんを直接駆逐する役割を担うキラーＴ細胞は、抗原認識レセプターががん細胞の細胞表面に存在しているＭＨＣクラス１分子と結合した８〜１０アミノ酸の抗原ペプチドと反応することにより活性化される。１９８０年代末に、がんに特異的に反応するキラーＴ細胞の認識する抗原ペプチドとその支配遺伝子が初めて報告され、その後多くのヒト及び実験動物のがん細胞で、キラーＴ細胞の認識抗原ペプチドとその支配遺伝子が同定、報告されてきた。【０００４】
一方、キラーＴ細胞は、別のＴリンパ球集団であるヘルパーＴ細胞の助けを必要とする。ヘルパーＴ細胞はＭＨＣクラス２分子に、１５〜２０アミノ酸のペプチドが結合したものを抗原として認識する。ヘルパーＴ細胞はＩＬ−２のようなサイトカインの働きを中心として、付近に存在するキラーＴ細胞を活性化するとともに、重要な抗原提示細胞である樹状細胞と反応してそれらを活性化し、その結果樹状細胞が有効にキラーＴ細胞を刺激するという機構の存在も報告された。このようにキラーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞そして樹状細胞は、細胞間相互作用によりお互いに刺激され、その結果がんに対する免疫応答が増強されていく機構が明らかになりつつある。【０００５】
がん細胞を直接的に攻撃するキラーＴ細胞をより効果的に活性化するためには、上述のようにヘルパーＴ細胞の役割が重要である。活性化されたヘルパーＴ細胞は、サイトカイン産生や樹状細胞の活性化を通じて、がん抗原特異的キラーＴ細胞の活性化と増殖を増幅する。それとともに、抗原特異的なキラーＴ細胞の活性の維持にも重要な貢献をすることが示されている。さらに、ヘルパーＴ細胞の存在がキラーＴ細胞の腫瘍局所への集積にも重要であるという報告もあり、キラーＴ細胞の認識抗原ばかりでなく、ヘルパーＴ細胞の認識抗原も含む多価性がんワクチンの開発が期待されてきた（非特許文献１）。【０００６】
発明者らは、キラーＴ細胞の活性化をより有効に誘導するべく、ヘルパーＴ細胞の活性化をあわせて目指せるようながんワクチンの開発に取り組み、その一つとして、キラーＴ細胞及びヘルパーＴ細胞のおのおのの抗原ペプチドが存在しているＨＥＲ２の遺伝子組換えたんぱくを大腸菌で作製し、疎水化多糖類との複合体（ＣＨＰ−ＨＥＲ２）を作製した。この複合体は樹状細胞にエンドサイトーシスにより取り込まれた後に、組換えたんぱくか複合体自身が細胞質に入り、内在性たんぱくと同様のプロセスを経てＭＨＣクラス１分子結合抗原ペプチドとして細胞表面に提示されることが明らかとなった。【０００７】
さらにこの複合体を取り込んだ樹状細胞はＭＨＣクラス２分子結合抗原ペプチドも効率よく産生し、ヘルパーＴ細胞を特異的に活性化しうることもわかっている。このように疎水化多糖類は抗原たんぱく分子との複合体として、Ｔ細胞性免疫誘導のための優れた抗原デリバリーシステムとなりうる（特許文献１、非特許文献２）。現実に発明者らは組換えＨＥＲ２たんぱくと疎水化多糖類の複合体をクリニカルグレードで作製し、ＨＥＲ２陽性の難治性がんの患者を対象として、がんワクチンの臨床試験を実施して、抗原特異的な抗体産生及びキラーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞の活性化を観察した。【０００８】
上述のように樹状細胞で代表されるＡＰＣは、がんワクチンの作用機構において重要な役割を果たすが、本来は病原微生物などの感染初期に迅速に対応するシステムとしての自然免疫の担い手と考えられてきた。しかし、近年ＡＰＣも外来抗原を認識するシステムを有することが明らかとなり、その認識に必須の機能分子としてＴｏｌｌ様受容体（以下、「ＴＬＲ」と称する）が複数見出されてその機能が注目されている。すなわち、未成熟の樹状細胞が微生物などの外来抗原を捕捉して刺激されるとＴＬＲを通したシグナルによって成熟し、同時にＣＤ８０，ＣＤ８３，ＣＤ８６，ＭＨＣクラス１及びＭＨＣクラス２等の分子の発現を増強する。これらの分子はＴ細胞に抗原を提示するに当って必須の分子であったり、また共刺激分子であって、抗原特異的なＴ細胞の活性化と増殖を大いに促進する分子である。また、ＴＬＲからのシグナルはヘルパーＴ細胞の分化を１型ヘルパーＴ細胞に方向づけると考えられている（非特許文献３、非特許文献４）。このことはＴＬＲを通した樹状細胞の刺激伝達はがんに対するキラーＴ細胞およびヘルパーＴ細胞の抗原特異的活性化と増殖に極めて大きな効果を及ぼすことを示唆する。【０００９】
【特許文献１】米国特許６６５６４８１号
【非特許文献１】珠玖  洋、実験医学  22:pp.2016-2022, 2004.
【非特許文献２】Ikuta Y et al., Blood 99:pp.3717-3724. 2002.
【非特許文献３】Takeuchi O ＆ Akira S, Int. Immunopharmacol. 1:pp.625-635, 2001.
【非特許文献４】Steinman RM & Pope M, J Clin. Invest. 109:pp.1519-1526, 2002.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
発明者らはがん抗原たんぱくＨＥＲ２と疎水化多糖類ＣＨＰからなるワクチンＣＨＰ−ＨＥＲ２の研究開発の過程でがん細胞を攻撃するＴ細胞をより活性化し、より多くすることでワクチンの効果を高めることを目的として、様々な試みを行った。その内、顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因子（以下これらを総称して、「ＧＭ−ＣＳＦ」と略称する）は、骨髄細胞を顆粒球やマクロファージなどの貪食細胞に分化させ、遊走を促す作用を有し、抗原提示細胞の成熟と機能発現に有効であると考えられた。そこで上述のワクチン効果増強作用の有無を調べたところ、ＣＨＰ−ＨＥＲ２に比してＧＭ−ＣＳＦ併用ではＨＥＲ２特異的キラーＴ細胞が高頻度で検出された。しかしながら、ＧＭ−ＣＳＦの製造あるいは入手は容易ではなく、極めて高価であるという問題点を有している。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、すでに永年にわたってがん治療に使われ副作用など安全性についても充分に判明している薬剤に着目し検討した結果、溶連菌抽出物がＧＭ−ＣＳＦと同等もしくはそれ以上にがん抗原―疎水化多糖類複合体微粒子のワクチン効果を増強することを初めて見出した。【００１２】
ところで、溶連菌抽出物は最近の研究報告において、複数のＴＬＲに作用し、樹状細胞を活性化する可能性が示唆されていたが、樹状細胞による抗原取り込みや抗原提示及びＴ細胞の活性化と活性維持において抗原―疎水化多糖類複合体が有すると考えられる効果を増強するか否かは明らかでなかった。しかしながら、本発明により、抗原―疎水化多糖類複合体と溶連菌抽出物とを組み合わせた薬剤は、がん抗原―疎水化多糖類複合体のみから成る薬剤をはるかに凌ぐワクチン効果を示し、安全かつ強力ながんワクチンとして用いることを可能とした。
こうして、第１の発明に係るがんワクチン製剤は、がん抗原たんぱくと疎水化多糖類との複合体である薬剤と、Ｔｏｌｌ様受容体に結合して抗原提示細胞を刺激する薬剤とを組合わせてなる。【００１３】
また、第２の発明に係る２剤キットは、がん抗原たんぱくと疎水化多糖類との複合体である薬剤と、Ｔｏｌｌ様受容体に結合して抗原提示細胞を刺激する薬剤とを各々個別に製剤化してなる。
上記第１の発明、または第２の発明においては、Ｔｏｌｌ様受容体に結合して抗原提示細胞を刺激する薬剤が、溶連菌抽出物またはＣｐＧ  ＤＮＡであることが好ましい。
また、疎水化多糖類の構成多糖類がプルランまたはマンナンであり、疎水基がコレステロールであることが好ましい。
また、がん抗原たんぱくがＨＥＲ２，ＮＹ−ＥＳＯ−１あるいはＭＡＧＥ  Ａ４のいずれかであることが好ましい。【００１４】
また、がん抗原たんぱくがＨＥＲ２，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ  Ａ４のうちのいずれか２つまたは３つの混合物であることが好ましい。
第３の発明に係るがんワクチンの効果増強方法は、がん抗原たんぱくと疎水化多糖類との複合体である薬剤と、Ｔｏｌｌ様受容体に結合して抗原提示細胞を刺激する薬剤とを実質的に同時にまたは連続して投与することを特徴とする。この発明において、Ｔｏｌｌ様受容体に結合して抗原提示細胞を刺激する薬剤が溶連菌抽出物であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は、抗原たんぱくと疎水化多糖類との複合体微粒子と、Ｔｏｌｌ様受容体に結合して抗原提示細胞を刺激する薬剤とを組合わせてなるがんワクチン製剤を提供するものである。これを投与することにより、体内でがん抗原に対する抗体の産生やがん細胞を傷害する細胞性免疫が強化され、がん患者の病態や生活の質を改善する有効ながん治療剤の一つとして医療に大きく貢献することが期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
次に、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は、下記の実施形態によって限定されるものではなく、その要旨を変更することなく、様々に改変して実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。【００１７】
本発明において用いる抗原たんぱく、疎水化多糖類及びＴｏｌｌ様受容体に結合して抗原提示細胞を刺激する薬剤としては以下のものが挙げられる。
本発明において用いる抗原たんぱくとしては、ＭＡＧＥ，ＢＡＧＥ，ＧＡＧＥ，ＮＹ−ＥＳＯ−１などのがん精巣抗原、ＣＤＫ−１，ＭＵＭ−１，ＣＡＳＰ−８などのがん特異的変異抗原、ＭＡＲＴ−１，ＴＲＰ,チロシナーゼ、ｇｐ１００,ＰＳＡ,プロテイナーゼ３などの組織特異的抗原、ＨＥＲ２／ｎｅｕ，ＣＥＡ，ＳＡＲＴ１などのがん高発現たんぱく質抗原、ＥＢウイルス、パピローマウイルス、成人白血病ウイルスなどのウイルスのたんぱく質抗原が挙げられる。【００１８】
本発明に用いる疎水化多糖類における多糖類は、糖残基がグリコシド結合した高分子であれば特に限定されることはないが、好ましくはプルランまたはマンナンが用いられる。疎水基としては、例えば、１本鎖及び２本鎖のアルキル基またはステロール残基を１００単糖あたり１〜５個（質量比で５％以下）導入したものが望ましい。疎水基がステロール基の場合は好ましくはコレステロールを用いることができ、アルキル基の場合は好ましくは炭素数１０〜１８のアルキル基を用いることができる。
疎水化多糖類と抗原たんぱくとの複合体は、疎水化多糖類の集合体微粒子と抗原たんぱくとを室温で混合した後に、ゲルクロマトグラフ法で処理することにより単離・精製できる。【００１９】
本発明に用いる、Ｔｏｌｌ様受容体に結合して抗原提示細胞を刺激する薬剤としては、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌などの微生物死菌やその構成成分、例えばリポ多糖、ペプチドグリカン、核酸、脂質たんぱく、脂質ペプチドなどが挙げられるが、好ましくは溶連菌抽出物（ストレプトコッカス・ピオゲネスのペニシリン処理凍結乾燥粉末、商品名ピシバニール）あるいはＣｐＧ  ＤＮＡが用いられる。【００２０】
本発明のワクチン製剤は、通常、上記有効成分、すなわち抗原たんぱくと疎水化多糖類との複合体及び溶連菌抽出物などの抗原提示細胞刺激薬剤、を薬理学的に許容されうる担体とともに混合し、あるいは抗原―疎水化多糖類複合体と溶連菌抽出物などの抗原提示細胞刺激薬剤とを別個に製剤したキットとして皮下、静脈内、筋肉内への非経口投与に適した剤型の製剤とすることができる。免疫感作に必要な本発明のワクチン製剤の投与量は適宜決定できるが、例えば、通常投与量としては抗原たんぱくとして５０μｇ／回〜１５０μｇ／回程度の量を目安とし、これに相当する抗原―疎水化多糖類複合体と溶連菌抽出物を乾燥菌体として０.０１ｍｇ〜１.０ｍｇ相当とを一つの剤型として、あるいは別個の製剤として投与する。別個の製剤として投与する際には投与部位において実質的に両製剤の有効成分が同時に共存することが肝要であり、したがって実質的に同時にまたは連続して両製剤を投与することが望ましい。投与は２〜２０回行うのが適当である。
【実施例１】
【００２１】
＜溶連菌抽出物（ＯＫ４３２、商品名ピシバニール）によるＣＨＰ−ＨＥＲ２がんワクチンのＨＥＲ２抗原特異的免疫反応増強効果＞
６週令の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、以下のように４種の異なる方法で免疫を行った。
１．ＣＨＰ−ＨＥＲ２の２０μｇを単独皮下注射した。
２．ＣＨＰ−ＨＥＲ２の２０μｇにＧＭ−ＣＳＦ１μｇを混じたものを皮下注射した。
３．ＣＨＰ−ＨＥＲ２の２０μｇにＯＫ４３２０．１ＫＥ（乾燥菌体として０．０１ｍｇに相当）を混じたものを皮下注射した。
４．ＣＨＰ−ＨＥＲ２の２０μｇに同量の不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を混じたものを皮下注射した。【００２２】
ここで皮下注射は全量１００μｌとし、マウス背部に１週間間隔で２回の免疫を行った。免疫終了１週間後に、マウス脾細胞を回収し、ＣＤ８陽性細胞に単離し、ＥＬＩＳＰＯＴ（Enzyme-linked immunospot）アッセイを行った。標的細胞は、ＨＥＲ２由来のＣＴＬエピトープであるｐ６３−７１ペプチドと、コントロールとしてＥＲＫ２由来９ｍペプチドを用いそれぞれＰ１．ＨＲＴ細胞にパルスし標的とした。図１に示すようにＣＨＰ−ＨＥＲ２単独投与に比較し、ＧＭ−ＣＳＦ併用群、ＯＫ４３２併用群ではＨＥＲ２特異的ＣＤ８陽性T細胞が３〜４倍の高頻度で検出された。一方、不完全フロイントアジュバント併用群は約２倍の増強効果にとどまった。【００２３】
以上のように、本実施例によれば、ＢＡＬＢ／Ｃマウスを対象として、ＣＨＰ−ＨＥＲ２皮下注射によるＨＥＲ２抗原特異的Ｔ細胞免疫反応をマウス脾細胞中のＣＤ８陽性Ｔ細胞のγインタフェロン放出能をシングルセルレベルで観察するＥＬＩＳＰＯＴ法で評価した結果、ＯＫ４３２によるインビボ実験での免疫増強効果が明らかとなった。
【実施例２】
【００２４】
腎盂腫瘍術後経過中に膀胱に再発が認められた患者について、再発部位の腫瘍細胞が免疫組織染色法（HercepTest, DAKO社、米国）によってＨＥＲ２が２＋と発現していることが確認された患者にＣＨＰ−ＨＥＲ２を投与した。ＣＨＰ−ＨＥＲ２はＨＥＲ2蛋白３００μｇ相当量を２週間隔で皮下に接種した。４回目接種以後はＣＨＰ−ＨＥＲ２の接種と当時に０.０２ｍｇのＯＫ４３２（中外製薬、日本）を投与した。初回接種前、４回目、６回目、９回目及び１１回目の接種から１４日後に、末梢血５０ｍＬを採取し、ＨＥＲ２抗原に対する免疫反応を、特異的抗体価とＣＤ４＋陽性Ｔリンパ球、ＣＤ８＋陽性Ｔリンパ球について実施した。
１１回目接種後までの全期間を通じて、有害事象としてはグレードＩの皮膚反応が接種部位にみられたのみであった。また、腫瘍部位の増悪傾向はみられず病勢コントロールが可能であった。【００２５】
血中抗体の量は次のようにＥＬＩＳＡ法によって測定した。すなわち、アミノ末端から１４６番目のアミノ酸までを含む部分ＨＥＲ２たんぱく（以下、「１４６ＨＥＲ２」）をイミュノプレート（Nunc社、デンマーク）の１ウェル当り１０ｎｇ(液量として５０μＬ)吸着させ、洗浄及びブロッキング操作を行った後、１：１００〜１：６２５００の割合で希釈した患者血清を各ウェルに加えて１０時間インキュベートした。洗浄後抗ヒトＩｇＧ（H+L chain)パーオキシダーゼ  ヤギ抗体（MBL社、日本）とＴＭＢ基質（ピアース社、米国）を加えて発色させ、マイクロプレートリーダー  モデル５５０（バイオラッド社、米国）で４５０ｎｍにおける吸光度ＯＤ４５０を測定した。その結果、ＯＤ４５０が０.２を超える吸光度を示す希釈倍率が、接種前から２回目接種後までは５００倍以下、３回目接種後は５００倍、４回目接種後は２，５００倍、５回目接種以降は１２，５００倍と血中抗体価が上昇することが観察された。【００２６】
活性化リンパ球の測定に供するＨＥＲ２抗原提示自己細胞は以下のようにして調整した。すなわち、患者末梢血からＭＡＣＳ  ＣＤ４マイクロビーズ（ミルテニ  バイオテック社、米国）を使ってＣＤ４＋Ｔリンパ球を分離し、１０％ヒト血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ社、米国）に１ウェル当り１〜２ｘ１０６細胞の密度で接種し、１０μｇ／ｍＬのフィトヘマグルチニン（シグマ社、米国）を加えた。３日後に組換えヒトＩＬ−２（武田薬品、日本）とＩＬ−７とを各ウェルに添加してインキュベートし、培養開始から１４日〜２１日の間に自己抗原提示細胞Ｔ−ＡＰＣとして使用した。２.５〜５ｘ１０６個のＴ−ＡＰＣを１４６ＨＥＲ２−ｍＲＮＡと混合し、電気穿孔装置ＥＣＭ８３０（ＢＴＸ社、米国）を使って、ｍＲＮＡをＴ−ＡＰＣに電気穿孔法で導入して、ＨＥＲ２抗原提示自己細胞１４６ＨＥＲ２−ｍＲＮＡ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  Ｔ−ＡＰＣを作製した。【００２７】
一方、患者末梢血からＭＡＣＳ  ＣＤ８又はＭＡＣＳ  ＣＤ４マイクロビーズ（ミルテニ  バイオテック社、米国）を用いてＣＤ８＋Ｔリンパ球またはＣＤ４＋Ｔリンパ球を分離した。これらのＴリンパ球を１４６ＨＥＲ２−ｍＲＮＡ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  Ｔ−ＡＰＣとともに培養し、刺激した。８日目からはＩＬ−２（１０Ｕ／ｍＬ）添加培地にて培養を行った。【００２８】
ＨＥＲ２抗原特異的Ｔリンパ球の測定は、次のようにＥＬＩＳＰＯＴ法を用いて行った。９６ウェルＥＬＩＳＰＯＴプレート（ＭＡＨＡ  Ｓ４５１０、ミリポア社、米国）を抗ヒトインターフェロンγモノクローナル抗体（１−Ｄ１Ｋ、マブテック社、スエーデン）でコートし洗浄後、１０％ヒト血清を含むＲＰＭＩ１６４０でプレートをブロックした。感作したＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔリンパ球５ｘ１０４細胞とＨＥＲ２抗原提示Ｔ−ＡＰＣの１ｘ１０５細胞とを各ウェルに入れて２２時間共培養後、洗浄し、ビオチン化抗ヒトインターフェロンγモノクローナル抗体（７−Ｂ６−１、マブテック社、スエーデン）を加えた。一晩インキュベートした後、ストレプトアビディン・アルカリフォスファターゼ複合体（マブテック社、スエーデン）と９０分間反応させた。プレートは洗浄後、アルカリフォスファターゼ複合体基質キット（バイオラッド社）で染色し、洗浄乾燥してスポットをＥＬＩＳＰＯＴリーダー（カールツァイス社、ドイツ）で計数した。【００２９】
その結果、接種前、１回接種後及び４回接種後には、抗原反応性インターフェロンγ産生リンパ球は認められなかったが、６回接種後にはインターフェロンγを産生するＣＤ８＋Ｔリンパ球が有意に認められ、９回接種後及び１１回接種後にはインターフェロンγ産生ＣＤ８＋Ｔリンパ球とＣＤ４＋Ｔリンパ球がともに検出されるようになった。
以上のように、本実施例によれば、がん患者にＣＨＰ−ＨＥＲ２とＯＫ４３２とを同時接種してＨＥＲ２抗原特異的免疫反応を解析した結果、ＨＥＲ２特異的抗体の産生もＨＥＲ２特異的Ｔリンパ球活性化も接種回数とともに増加していることが明らかとなった。【００３０】
このように、本実施形態によれば、抗原たんぱくと疎水化多糖類との複合体微粒子と、Ｔｏｌｌ様受容体に結合して抗原提示細胞を刺激する薬剤とを組合わせて接種することにより、体内でがん抗原に対する抗体の産生増強、およびがん細胞を傷害する細胞性免疫の強化を図り、がん患者の病態や生活の質を改善する有効ながん治療剤の一つとして医療に大きく貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ＣＨＰ−ＨＥＲ２がんワクチン接種時のがん抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔリンパ球免疫増強効果を示すグラフである。グラフ中、ＣＨＰ−ＨＥＲ２は疎水化多糖類・短縮型ＨＥＲ２蛋白複合体を、ＧＭ−ＣＳＦは顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor）を、ＯＫ４３２はピシバニールを、ＩＦＡは不完全フロイントアジュバント（Incomplete Freunds' adjuvant）を、ぞれぞれ意味している。
【図１】
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【国際調査報告】
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