【手続補正書】
【提出日】令和2年3月12日(2020.3.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのＦｃ間ジスルフィド結合により二量体化された２つのポリペプチド鎖を含む、Ｆｃ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドの単一変異ポリペプチド鎖であって、
前記変異鎖は１組の３つのヒトＴＲＡＩＬ単量体部分にペプチド結合されたヒトＩｇＧ  Ｆｃ部分を含み、アミノ末端からカルボキシル末端の順で、Ｆｃ部分、ＴＲＡＩＬ−Ｆｃリンカー、第１のＴＲＡＩＬ単量体、ＴＲＡＩＬ単量体間リンカー、第２のＴＲＡＩＬ単量体、第２のＴＲＡＩＬ単量体間リンカー、および第３のＴＲＡＩＬ単量体を含む単一非分枝ポリペプチドが形成され、
前記各リンカーは１５−２０アミノ酸から構成され、前記２つのＴＲＡＩＬ単量体間リンカーの各々は３つのＧ４Ｓドメインを含み、
前記３つのＴＲＡＩＬ単量体の少なくとも２つは、天然の野生型ヒトＴＲＡＩＬで見出されない、少なくとも１つの安定化変異を含み、
前記変異ポリペプチド鎖の２つのコピーの二量体化により形成された前記Ｆｃ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドは６５℃超または６５℃に等しい融解温度を示す、単一変異ポリペプチド鎖。
【請求項２】
前記少なくとも１つの安定化変異は、野生型ＴＲＡＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）の２４７位に対応する位置にあり、野生型ＴＲＡＩＬにおいてこの位置に位置するイソロイシン以外のアミノ酸である、請求項１に記載のポリペプチド鎖。
【請求項３】
前記イソロイシン以外のアミノ酸はグリシン、アラニン、バリンまたはロイシンである、請求項２に記載のポリペプチド鎖。
【請求項４】
前記イソロイシン以外のアミノ酸はバリン（Ｉ２４７Ｖ）である、請求項２に記載のポリペプチド鎖。
【請求項５】
前記少なくとも１つの安定化変異はＲ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５Ｄ、Ｎ２２８ＳおよびＩ２４７Ｖから選択される、請求項１に記載のポリペプチド鎖。
【請求項６】
前記少なくとも１つの安定化変異は下記６つの組み合わせから選択される少なくとも２つの安定化変異の組み合わせを含む、請求項１に記載のポリペプチド鎖：
１）Ｒ１２１ＩおよびＩ２４７Ｖ；
２）Ｎ２２８ＳおよびＩ２４７Ｖ；
３）Ｒ１３０ＧおよびＩ２４７Ｖ；
４）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５ＤおよびＩ２４７Ｖ；
５）Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５ＤおよびＩ２４７Ｖ；ならびに
６）Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５Ｄ、Ｎ２２８ＳおよびＩ２４７Ｖ。
【請求項７】
ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドの単一変異ポリペプチド鎖であって、
前記変異鎖は１組の３つのヒトＴＲＡＩＬ単量体部分にペプチド結合されたヒト血清アルブミン部分を含み、アミノ末端からカルボキシル末端の順で、Ｆｃ部分、ＴＲＡＩＬ−Ｆｃリンカー、第１のＴＲＡＩＬ単量体、ＴＲＡＩＬ単量体間リンカー、第２のＴＲＡＩＬ単量体、第２のＴＲＡＩＬ単量体間リンカー、および第３のＴＲＡＩＬ単量体を含む単一非分枝ポリペプチドが形成され、
前記各リンカーは１５−２０アミノ酸から構成され、前記２つのＴＲＡＩＬ単量体間リンカーの各々は３つのＧ４Ｓドメインを含み、
前記３つのＴＲＡＩＬ単量体の少なくとも２つは、天然の野生型ヒトＴＲＡＩＬで見出されない、少なくとも１つの安定化変異を含み、
前記変異ポリペプチド鎖の２つのコピーの二量体化により形成された、前記Ｆｃ−ＴＲ
ＡＩＬ融合ポリペプチドは６５℃超または６５℃に等しい融解温度を示す、単一変異ポリペプチド鎖。
【請求項８】
前記少なくとも１つの安定化変異は野生型ＴＲＡＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）の２４７位に対応する位置にあり、野生型ＴＲＡＩＬにおいてこの位置に位置するイソロイシン以外のアミノ酸である、請求項７に記載のポリペプチド鎖。
【請求項９】
前記イソロイシン以外のアミノ酸はグリシン、アラニン、バリンまたはロイシンである、請求項８に記載のポリペプチド鎖。
【請求項１０】
前記イソロイシン以外のアミノ酸はバリン（Ｉ２４７Ｖ）である、請求項８に記載のポリペプチド鎖。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの安定化変異はＲ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５Ｄ、Ｎ２２８ＳおよびＩ２４７Ｖから選択される、請求項７に記載のポリペプチド鎖。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの安定化変異は下記６つの組み合わせから選択される少なくとも２つの安定化変異の組み合わせを含む、請求項７に記載のポリペプチド鎖：
１）Ｒ１２１ＩおよびＩ２４７Ｖ；
２）Ｎ２２８ＳおよびＩ２４７Ｖ；
３）Ｒ１３０ＧおよびＩ２４７Ｖ；
４）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５ＤおよびＩ２４７Ｖ；
５）Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５ＤおよびＩ２４７Ｖ；ならびに
６）Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５Ｄ、Ｎ２２８ＳおよびＩ２４７Ｖ。
【請求項１３】
ヒト患者において癌を治療するための組成物であって、請求項１−１２のいずれか一項に記載の変異ポリペプチド鎖の２つのコピーの二量体化により形成されたＦｃ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドを含む、組成物。
【請求項１４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基９５−２８１、１１４−２８１、または１２０−２８１に少なくとも９５％同一であり、１２１、１３０、２２８、および２４７位の１つまたはそれより多く以上での置換を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項１５】
Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖからなる群より選択される少なくとも１つの置換を含む、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
Ｉ２４７Ｇ、Ｉ２４７Ａ、Ｉ２４７Ｖ、およびＩ２４７Ｌからなる群より選択される少なくとも１つの置換を含む、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
２１３および２１５位の一方または両方での置換をさらに含む、請求項１４−１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
Ｙ２１３ＷおよびＳ２１５Ｄからなる群より選択される少なくとも１つの置換をさらに含む、請求項１４−１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
下記からなる群より選択される１組の置換を含む、請求項１４に記載のポリペプチド：（ｉ）Ｒ１２１ＩおよびＩ２４７Ｖ；（ｉｉ）Ｎ２２８ＳおよびＩ２４７Ｖ；（ｉｉｉ）Ｒ１３０ＧおよびＩ２４７Ｖ；（ｉｖ）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５ＤおよびＩ２４７Ｖ；（ｖ）Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５ＤおよびＩ２４７Ｖ；ならびに（ｖｉ）Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５Ｄ、Ｎ２２８ＳおよびＩ２４７Ｖ。
【請求項２０】
２つのポリペプチド鎖を含むタンパク質であって、各ポリペプチド鎖は抗体定常領域の一部および単鎖ＴＲＡＩＬ三量体を含み、前記タンパク質は約６０℃を超える融解温度を有する、タンパク質。
【請求項２１】
各ポリペプチド鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基９５−２８１、１１４−２８１、または１２０−２８１に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、１２１、１３０、２２８、および２４７位の１つまたはそれより多くでの置換を含む、請求項２０に記載のタンパク質。
【請求項２２】
２つのポリペプチド鎖を含むタンパク質であって、各ポリペプチド鎖は抗体定常領域の一部および単鎖ＴＲＡＩＬ三量体を含み、前記タンパク質は、９０％マウス血清中、１μＭの最終濃度で７日間３７℃でのインキュベーション後、初期活性の少なくとも１０％を保持する、タンパク質。
【請求項２３】
各ポリペプチド鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基９５−２８１、１１４−２８１、または１２０−２８１に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、１２１、１３０、２２８、および２４７位の１つまたはそれより多くでの置換を含む、請求項２２に記載のタンパク質。
【請求項２４】
２つのポリペプチド鎖を含むタンパク質であって、各ポリペプチド鎖は抗体定常領域の一部および単鎖ＴＲＡＩＬ三量体を含み、前記タンパク質はマウス循環において１０時間以上の終末相半減期を有する、タンパク質。
【請求項２５】
各ポリペプチド鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基９５−２８１、１１４−２８１、または１２０−２８１に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、１２１、１３０、２２８、および２４７位の１つまたはそれより多くでの置換を含む、請求項２４に記載のタンパク質。
【請求項２６】
前記少なくとも１つの安定化変異は、下記からなる群より選択される安定化変異の組み合わせを含む、請求項１に記載のポリペプチド鎖：
１）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、およびＩ２４７Ｖ；
２）Ｒ１３０Ｇ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；
３）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；
４）Ｒ１２１Ｉ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；
５）Ｒ１２１ＩおよびＲ１３０Ｇ；
６）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、およびＮ２２８Ｓ；
７）Ｒ１２１ＩおよびＮ２２８Ｓ；ならびに
８）Ｒ１３０ＧおよびＮ２２８Ｓ。
【請求項２７】
前記少なくとも１つの安定化変異は、下記からなる群より選択される安定化変異の組み合わせを含む、請求項７に記載のポリペプチド鎖：
１）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、およびＩ２４７Ｖ；
２）Ｒ１３０Ｇ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；
３）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；
４）Ｒ１２１Ｉ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；
５）Ｒ１２１ＩおよびＲ１３０Ｇ；
６）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、およびＮ２２８Ｓ；
７）Ｒ１２１ＩおよびＮ２２８Ｓ；ならびに
８）Ｒ１３０ＧおよびＮ２２８Ｓ。
【請求項２８】
下記からなる群より選択される１組の置換を含む、請求項１４に記載のポリペプチド：１）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、およびＩ２４７Ｖ；
２）Ｒ１３０Ｇ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；
３）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；
４）Ｒ１２１Ｉ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；
５）Ｒ１２１ＩおよびＲ１３０Ｇ；
６）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、およびＮ２２８Ｓ；
７）Ｒ１２１ＩおよびＮ２２８Ｓ；ならびに
８）Ｒ１３０ＧおよびＮ２２８Ｓ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
本明細書ではｓｃＴＲＡＩＬに融合されたＭＯＣ３１  ＩｇＧ（抗ＥｐＣＡＭ）の重鎖を含むポリペプチドもまた提供される。１つの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基９５−２８１、１１４−２８１、または１２０−２８１に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。１つの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ：２８の１２１、１３０、２２８、および２４７位の１つまたはそれより多くでの置換を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のＲ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖからなる群より選択される少なくとも１つの置換を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、Ｉ２４７Ｇ、Ｉ２４７Ａ、Ｉ２４７Ｖ、およびＩ２４７Ｌからなる群より選択される少なくとも１つの置換を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ：２８の２１３および２１５位の一方または両方での置換を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、Ｙ２１３ＷおよびＳ２１５Ｄからなる群より選択される少なくとも１つの置換を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは下記からなる群より選択される１組の置換を含む：（ｉ）Ｒ１２１ＩおよびＩ２４７Ｖ；（ｉｉ）Ｎ２２８ＳおよびＩ２４７Ｖ；（ｉｉｉ）Ｒ１３０ＧおよびＩ２４７Ｖ；（ｉｖ）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５ＤおよびＩ２４７Ｖ；（ｖ）Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５ＤおよびＩ２４７Ｖ；ならびに（ｖｉ）Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５Ｄ、Ｎ２２８ＳおよびＩ２４７Ｖ。別の実施形態では、ポリペプチドは下記からなる群より選択される１組の置換を含む：（ｉ）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、およびＩ２４７Ｖ；（ｉｉ）Ｒ１３０Ｇ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；（ｉｉｉ）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；（ｉｖ）Ｒ１２１Ｉ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；（ｖ）Ｒ１２１ＩおよびＲ１３０Ｇ；（ｖｉ）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、およびＮ２２８Ｓ；（ｖｉｉ）Ｒ１２１ＩおよびＮ２２８Ｓ；ならびに（ｖｉｉｉ）Ｒ１３０ＧおよびＮ２２８Ｓ。別の実施形態では、ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９を含む。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
少なくとも１つのＦｃ間ジスルフィド結合により二量体化された２つのポリペプチド鎖を含む、Ｆｃ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドの単一変異ポリペプチド鎖であって、
前記変異鎖は１組の３つのヒトＴＲＡＩＬ単量体部分にペプチド結合されたヒトＩｇＧ  Ｆｃ部分を含み、アミノ末端からカルボキシル末端の順で、Ｆｃ部分、ＴＲＡＩＬ−Ｆｃリンカー、第１のＴＲＡＩＬ単量体、ＴＲＡＩＬ単量体間リンカー、第２のＴＲＡＩＬ単量体、第２のＴＲＡＩＬ単量体間リンカー、および第３のＴＲＡＩＬ単量体を含む単一非分枝ポリペプチドが形成され、
前記各リンカーは１５−２０アミノ酸から構成され、前記２つのＴＲＡＩＬ単量体間リンカーの各々は３つのＧ４Ｓドメインを含み、
前記３つのＴＲＡＩＬ単量体の少なくとも２つは、天然の野生型ヒトＴＲＡＩＬで見出されない、少なくとも１つの安定化変異を含み、
前記変異ポリペプチド鎖の２つのコピーの二量体化により形成された前記Ｆｃ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドは６５℃超または６５℃に等しい融解温度を示す、単一変異ポリペプチド鎖。
（項目２）
前記少なくとも１つの安定化変異は、野生型ＴＲＡＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）の２４７位に対応する位置にあり、野生型ＴＲＡＩＬにおいてこの位置に位置するイソロイシン以外のアミノ酸である、項目１に記載のポリペプチド鎖。
（項目３）
前記イソロイシン以外のアミノ酸はグリシン、アラニン、バリンまたはロイシンである、項目２に記載のポリペプチド鎖。
（項目４）
前記イソロイシン以外のアミノ酸はバリン（Ｉ２４７Ｖ）である、項目２に記載のポリペプチド鎖。
（項目５）
前記少なくとも１つの安定化変異はＲ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５Ｄ、Ｎ２２８ＳおよびＩ２４７Ｖから選択される、項目１に記載のポリペプチド鎖。
（項目６）
前記少なくとも１つの安定化変異は下記６つの組み合わせから選択される少なくとも２つの安定化変異の組み合わせを含む、項目１に記載のポリペプチド鎖：
１）Ｒ１２１ＩおよびＩ２４７Ｖ；
２）Ｎ２２８ＳおよびＩ２４７Ｖ；
３）Ｒ１３０ＧおよびＩ２４７Ｖ；
４）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５ＤおよびＩ２４７Ｖ；
５）Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５ＤおよびＩ２４７Ｖ；ならびに
６）Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５Ｄ、Ｎ２２８ＳおよびＩ２４７Ｖ。
（項目７）
ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドの単一変異ポリペプチド鎖であって、
前記変異鎖は１組の３つのヒトＴＲＡＩＬ単量体部分にペプチド結合されたヒト血清アルブミン部分を含み、アミノ末端からカルボキシル末端の順で、Ｆｃ部分、ＴＲＡＩＬ−Ｆｃリンカー、第１のＴＲＡＩＬ単量体、ＴＲＡＩＬ単量体間リンカー、第２のＴＲＡＩＬ単量体、第２のＴＲＡＩＬ単量体間リンカー、および第３のＴＲＡＩＬ単量体を含む単一非分枝ポリペプチドが形成され、
前記各リンカーは１５−２０アミノ酸から構成され、前記２つのＴＲＡＩＬ単量体間リンカーの各々は３つのＧ４Ｓドメインを含み、
前記３つのＴＲＡＩＬ単量体の少なくとも２つは、天然の野生型ヒトＴＲＡＩＬで見出されない、少なくとも１つの安定化変異を含み、
前記変異ポリペプチド鎖の２つのコピーの二量体化により形成された、前記Ｆｃ−ＴＲ
ＡＩＬ融合ポリペプチドは６５℃超または６５℃に等しい融解温度を示す、単一変異ポリペプチド鎖。
（項目８）
前記少なくとも１つの安定化変異は野生型ＴＲＡＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）の２４７位に対応する位置にあり、野生型ＴＲＡＩＬにおいてこの位置に位置するイソロイシン以外のアミノ酸である、項目７に記載のポリペプチド鎖。
（項目９）
前記イソロイシン以外のアミノ酸はグリシン、アラニン、バリンまたはロイシンである、項目８に記載のポリペプチド鎖。
（項目１０）
前記イソロイシン以外のアミノ酸はバリン（Ｉ２４７Ｖ）である、項目８に記載のポリペプチド鎖。
（項目１１）
前記少なくとも１つの安定化変異はＲ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５Ｄ、Ｎ２２８ＳおよびＩ２４７Ｖから選択される、項目７に記載のポリペプチド鎖。
（項目１２）
前記少なくとも１つの安定化変異は下記６つの組み合わせから選択される少なくとも２つの安定化変異の組み合わせを含む、項目７に記載のポリペプチド鎖：
１）Ｒ１２１ＩおよびＩ２４７Ｖ；
２）Ｎ２２８ＳおよびＩ２４７Ｖ；
３）Ｒ１３０ＧおよびＩ２４７Ｖ；
４）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５ＤおよびＩ２４７Ｖ；
５）Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５ＤおよびＩ２４７Ｖ；ならびに
６）Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５Ｄ、Ｎ２２８ＳおよびＩ２４７Ｖ。
（項目１３）
ヒト患者において癌を治療する方法であって、前記患者に、有効量の、項目１−１２のいずれか一項に記載の変異ポリペプチド鎖の２つのコピーの二量体化により形成されたＦｃ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドを投与することを含む、方法。
（項目１４）
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基９５−２８１、１１４−２８１、または１２０−２８１に少なくとも９５％同一であり、１２１、１３０、２２８、および２４７位の１つまたはそれより多く以上での置換を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（項目１５）
Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖからなる群より選択される少なくとも１つの置換を含む、項目１４に記載のポリペプチド。
（項目１６）
Ｉ２４７Ｇ、Ｉ２４７Ａ、Ｉ２４７Ｖ、およびＩ２４７Ｌからなる群より選択される少なくとも１つの置換を含む、項目１４に記載のポリペプチド。
（項目１７）
２１３および２１５位の一方または両方での置換をさらに含む、項目１４−１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目１８）
Ｙ２１３ＷおよびＳ２１５Ｄからなる群より選択される少なくとも１つの置換をさらに含む、項目１４−１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目１９）
下記からなる群より選択される１組の置換を含む、項目１４に記載のポリペプチド：（ｉ）Ｒ１２１ＩおよびＩ２４７Ｖ；（ｉｉ）Ｎ２２８ＳおよびＩ２４７Ｖ；（ｉｉｉ）Ｒ１３０ＧおよびＩ２４７Ｖ；（ｉｖ）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５ＤおよびＩ２４７Ｖ；（ｖ）Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５ＤおよびＩ２４７Ｖ；ならびに（ｖｉ）Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５Ｄ、Ｎ２２８ＳおよびＩ２４７Ｖ。
（項目２０）
２つのポリペプチド鎖を含むタンパク質であって、各ポリペプチド鎖は抗体定常領域の一部および単鎖ＴＲＡＩＬ三量体を含み、前記タンパク質は約６０℃を超える融解温度を有する、タンパク質。
（項目２１）
各ポリペプチド鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基９５−２８１、１１４−２８１、または１２０−２８１に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、１２１、１３０、２２８、および２４７位の１つまたはそれより多くでの置換を含む、項目２０に記載のタンパク質。
（項目２２）
２つのポリペプチド鎖を含むタンパク質であって、各ポリペプチド鎖は抗体定常領域の一部および単鎖ＴＲＡＩＬ三量体を含み、前記タンパク質は、９０％マウス血清中、１μＭの最終濃度で７日間３７℃でのインキュベーション後、初期活性の少なくとも１０％を保持する、タンパク質。
（項目２３）
各ポリペプチド鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基９５−２８１、１１４−２８１、または１２０−２８１に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、１２１、１３０、２２８、および２４７位の１つまたはそれより多くでの置換を含む、項目２２に記載のタンパク質。
（項目２４）
２つのポリペプチド鎖を含むタンパク質であって、各ポリペプチド鎖は抗体定常領域の一部および単鎖ＴＲＡＩＬ三量体を含み、前記タンパク質はマウス循環において１０時間以上の終末相半減期を有する、タンパク質。
（項目２５）
各ポリペプチド鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基９５−２８１、１１４−２８１、または１２０−２８１に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、１２１、１３０、２２８、および２４７位の１つまたはそれより多くでの置換を含む、項目２４に記載のタンパク質。
（項目２６）
前記少なくとも１つの安定化変異は、下記からなる群より選択される安定化変異の組み合わせを含む、項目１に記載のポリペプチド鎖：
１）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、およびＩ２４７Ｖ；
２）Ｒ１３０Ｇ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；
３）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；
４）Ｒ１２１Ｉ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；
５）Ｒ１２１ＩおよびＲ１３０Ｇ；
６）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、およびＮ２２８Ｓ；
７）Ｒ１２１ＩおよびＮ２２８Ｓ；ならびに
８）Ｒ１３０ＧおよびＮ２２８Ｓ。
（項目２７）
前記少なくとも１つの安定化変異は、下記からなる群より選択される安定化変異の組み合わせを含む、項目７に記載のポリペプチド鎖：
１）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、およびＩ２４７Ｖ；
２）Ｒ１３０Ｇ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；
３）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；
４）Ｒ１２１Ｉ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；
５）Ｒ１２１ＩおよびＲ１３０Ｇ；
６）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、およびＮ２２８Ｓ；
７）Ｒ１２１ＩおよびＮ２２８Ｓ；ならびに
８）Ｒ１３０ＧおよびＮ２２８Ｓ。
（項目２８）
下記からなる群より選択される１組の置換を含む、項目１４に記載のポリペプチド：１）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、およびＩ２４７Ｖ；
２）Ｒ１３０Ｇ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；
３）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；
４）Ｒ１２１Ｉ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；
５）Ｒ１２１ＩおよびＲ１３０Ｇ；
６）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、およびＮ２２８Ｓ；
７）Ｒ１２１ＩおよびＮ２２８Ｓ；ならびに
８）Ｒ１３０ＧおよびＮ２２８Ｓ。