(57)【要約】  本発明は、核酸プローブの塩基配列の設計に制限を受けない、核酸検出方法を提供する。  多段階での洗浄及び検出を繰り返すことにより、段階的に配列特異的ハイブリダイゼーションの厳密性を向上させ、核酸プローブ設計における制約条件、特にＴｍ（核酸二本鎖の解離温度）や核酸プローブ配列長での制約条件の緩和を可能とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む核酸検出方法；
（１）複数の核酸プローブをそれぞれ独立に固定化した核酸マイクロアレイに、核酸試料を含む溶液を接触させ、前記プローブと、前記核酸試料中の核酸とをハイブリダイゼーション反応させる工程、及び
（２）核酸マイクロアレイ上に形成された核酸ハイブリッドを、洗浄効果の弱い条件から強い条件まで洗浄条件を変えながら複数回洗浄し、洗浄操作毎に核酸ハイブリッドを検出する工程。
【請求項２】
洗浄条件の変化が、洗浄液の塩濃度の変化である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
洗浄条件の変化が、洗浄液の温度の変化である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
洗浄条件の変化が、洗浄液の塩濃度の変化および洗浄液の温度の変化である、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸マイクロアレイによるハイブリダイゼーション技術を利用した核酸検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸マイクロアレイとは、担体上に多数の核酸プローブをそれぞれ独立に固定化したものである。核酸プローブとしてはｃＤＮＡや合成オリゴ核酸が用いられることが多い。従来は、表面加工を施したガラスやシリコンなどの担体上に、核酸プローブを固定化したマイクロアレイが利用されているが、近年ではゲル担体など、他の手法による担体の改質も行われている。
ハイブリダイゼーション技術を利用した核酸検出方法とは、核酸マイクロアレイに固定されている核酸プローブに対して、検査対象となる核酸試料を配列特異的にハイブリダイズさせ、配列特異的に形成したハイブリッドを蛍光物質等により検出し、複数の核酸プローブに対応する試料中の核酸塩基配列を含む分子を、定量的又は定性的に調べる方法である。この方法は、複数の核酸塩基配列に関する発現量又は特定の核酸塩基配列の配列自体等を解析するのに利用されている。
核酸を検出する際、従来は予め設定した適切な条件下でハイブリダイゼーション反応を実施し、次いで洗浄工程により、アレイ表面に残存した核酸試料又はその他不要物の除去を行い、核酸プローブと特異的なハイブリッドを形成している核酸試料を検出する。核酸プローブは、配列解析、機能解析等、検出対象となる所望の核酸塩基配列と相補又は同一に設計されることが多い。核酸プローブとしては、ｃＤＮＡ等の比較的長鎖の核酸又は短鎖の合成オリゴ核酸等が使用される。合成オリゴ核酸を核酸プローブとして使用する場合、ヒトやマウスなど、遺伝子情報の知見が蓄積している生物については、それらの塩基配列情報を用い、各配列の相同性や機能などに着目した上で、合成オリゴ核酸の配列を設計し、核酸プローブを作製することが可能である。
【発明の開示】
【０００３】
同一マイクロアレイに搭載する核酸プローブについては、それぞれの核酸プローブが、核酸試料とのハイブリダイゼーション及び洗浄条件に適合するようＴｍ（核酸二本鎖の解離温度）を揃える必要がある。しかし、生物の持つ核酸塩基配列には、複数の類似配列が含まれている場合があり、そのような配列特異性が低い領域やＧＣ含量の偏った領域内を検出するための核酸プローブの設計は困難であり、仮に核酸プローブを設計したとしても、それら核酸プローブが搭載された核酸マイクロアレイを使用して正確なデータを得ることは困難であった。
一方、上記問題点を克服するために、最適なハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件等で検出操作を行うことも検討されている（特開２００３−０００３００号公報）。その検出操作は、同一塩基配列をもつ核酸プローブを複数種類、核酸マイクロアレイに搭載し、マイクロアレイ自体に温度のグラデーションをかけて、同一塩基配列をもつ複数の核酸プローブのシグナル強度を比較するものである。しかし、この方法では、ハイブリダイゼーション条件を決定する因子として、温度のみをパラメーターとして扱っていること、また、特殊な装置を用いる必要があり、簡便とは言えない。
本発明は、核酸プローブの塩基配列の設計に制限を受けない、核酸検出方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を克服するために、鋭意検討を行った結果、多段階での洗浄及び検出を繰り返すことにより、段階的に配列特異的ハイブリダイゼーションの厳密性を向上させ、核酸プローブ設計における制約条件、特にＴｍや核酸プローブ配列長での制約条件の緩和を可能に出来ることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下の工程を含む核酸検出方法である。
（１）複数の核酸プローブをそれぞれ独立に固定化した核酸マイクロアレイに、核酸試料を含む溶液を接触させ、前記プローブと、前記核酸試料中の核酸とをハイブリダイゼーション反応させる工程、及び
（２）核酸マイクロアレイ上に形成された核酸ハイブリッドを、洗浄効果の弱い条件から強い条件まで洗浄条件を変えながら複数回洗浄し、洗浄操作毎に核酸ハイブリッドを検出する工程。
ここで、洗浄条件の変化として、洗浄液の塩濃度の変化、洗浄液の温度の変化またはこれらの変化の組み合わせを挙げることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、繊維配列体を製造する配列固定器具の図である。
図２は、核酸マイクロアレイのデザインを示す図である。
図３は、核酸マイクロアレイを１×ＳＳＣ中、７５℃で２０分間洗浄した後の核酸検出のシグナル強度を示した図である。
図４は、核酸マイクロアレイをさらに０．７×ＳＳＣ中、７５℃で２０分間洗浄した後の核酸検出のシグナル強度を示した図である。
【符号の説明】
【０００５】
１１・・・・孔
２１・・・・多孔板
３１・・・・中空繊維
４１・・・・板状物
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明するが、本実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定させるものではない。なお、本明細書において引用した文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
本発明は、複数の核酸プローブをそれぞれ独立に固定化した核酸マイクロアレイに、核酸試料を含む溶液を接触させ、前記プローブと、前記核酸試料中において当該プローブに相補的な塩基配列を含む核酸とをハイブリダイゼーション反応させる第１の工程と、核酸マイクロアレイ上に形成された核酸ハイブリッドを、洗浄効果の弱い条件から強い条件まで洗浄条件を変えながら複数回洗浄し、洗浄操作毎に核酸ハイブリッドを検出する第２の工程を含む核酸検出方法である。
第１の工程では、複数の核酸プローブをそれぞれ独立に固定化した核酸マイクロアレイに、核酸試料を含む溶液を接触させ、前記プローブと、前記核酸試料中の核酸（例えば、当該プローブに相補的な塩基配列を含む核酸）とをハイブリダイゼーション反応させる。
「核酸プローブ」とは、検出すべき遺伝子配列に相補的な塩基配列を含む核酸を示す。核酸プローブは、例えば、市販のプローブ設計ソフト等を使用し設計することができる。設計した核酸プローブは、その種類や製造方法を問わないが、ハイブリダイゼーションの配列特異性、検出正確性、安定性を鑑みると、合成オリゴ核酸を用いることが好ましい。
調製された各核酸プローブは、適当な担体にそれぞれ独立に配置される。「独立に」とは、各プローブが物理的に隔離されて配置されている状態をいう。例えば、担体が平面基板の場合、各プローブが平面基板上にある一定の間隔を以って配置されている状態をいう。また、担体がストリップ状物の集束物である場合、１本のストリップに１種類のプローブが配置されている状態をいう。
担体としては、例えばガラス、シリコン、樹脂等の平面基板が挙げられる。平面基板を使用する場合には、例えばフォトリソグラフィー法、スポッティング法により核酸プローブを固定することができる。
また、担体として、平面基板の他に、貫通孔基板も使用することができる。その場合、核酸プローブは、貫通孔の内壁に固定することができる。また、貫通孔にゲルを保持し、ゲル内に核酸プローブを保持することも可能である。
ここで、貫通孔を形成する材料として中空繊維を使用し、その中空部にゲルが保持され、そのゲル内に核酸プローブを保持されている核酸マイクロアレイについて詳しく説明する。この核酸マイクロアレイは、例えば、下記のａ）〜ｄ）の工程を経て作製することができる。
ａ）複数本の中空繊維を、中空繊維の長手方向が同一方向となるように３次元に配列し配列体を製造する工程。
ｂ）前記配列体を包埋し、ブロック体を製造する工程。
ｃ）核酸プローブを含むゲル前駆体重合性溶液を該ブロック体の各中空繊維の中空部に導入し、重合反応を行い、核酸プローブを含むゲル状物を中空部に保持する工程。
ｄ）中空繊維の長手方向と交叉する方向で、切断してブロック体を薄片化する工程。
中空繊維材料としては、例えば、ナイロン６、ナイロン６６、芳香族ポリアミド等のポリアミド系中空繊維、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカーボネート等のポリエステル系中空繊維、ポリアクリロニトリル等のアクリル系中空繊維、ポリエチレンやポリプロピレン等のポリオレフィン系中空繊維、ポリメタクリル酸メチル等のポリメタクリレート系中空繊維、ポリビニルアルコール系中空繊維、ポリ塩化ビニリデン系中空繊維、ポリ塩化ビニル系中空繊維、ポリウレタン系中空繊維、フェノール系中空繊維、ポリフッ化ビニリデンやポリテトラフルオロエチレン等からなるフッ素系中空繊維、ポリアルキレンパラオキシベンゾエート系中空繊維等が挙げられる。
上記中空繊維は、その長手方向が同一となるように３次元に配列される。配列方法としては、例えば、粘着シート等のシート状物に複数本の中空繊維を所定の間隔をもって平行に配置し、シート状とした後、このシートを螺旋状に巻き取る方法（特開平１１−１０８９２８号公報参照）が挙げられる。また、複数の孔が所定の間隔をもって設けられた多孔板２枚を孔部が一致するように重ねあわせ、それらの孔部に、中空繊維を通過させ、２枚の多孔板の間隔を開き、２枚の多孔板間の、中空繊維の周辺に硬化性樹脂原料を充満させ硬化させる方法（特開２００１−１３３４５３号公報参照）が挙げられる。
次に配列体はその配列が乱れないように包埋される。包埋の方法としては、ポリウレタン樹脂、エポキシ樹脂等を繊維間の隙間に流し込む方法、繊維同士を熱融着により接着する方法等が挙げられる。
次に包埋された配列体の各中空繊維の中空部に、核酸プローブを含むゲル前駆体重合性溶液を導入し、中空部内で重合反応を行う。これにより中空部にゲルが保持され、ゲルには核酸プローブが固定される。
ゲル前駆体溶液としては、例えば、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルアミノエトキシエタノール、Ｎ−アクリロイルアミノプロパノール、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、ヒドロキシエチルメタクリレート、（メタ）アクリル酸、アリルデキストリン等の単量体の一種類以上と、架橋性モノマーとしてメチレンビス（メタ）アクリルアミド、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等を含むものである。予め核酸プローブの末端を不飽和官能基で修飾しておけば、核酸プローブの末端を介してゲル前駆体と共重合することにより、ゲルの構成に核酸プローブが化学結合する（特開２００４−１６３２１１号公報参照）。
次に、中空繊維の長手方向と交叉する方向で、切断してブロック体を薄片化する。ここで作製された薄片は、本発明において核酸マイクロアレイとして使用できる。核酸マイクロアレイの厚みは、０．１ｍｍ〜１ｍｍ程度である。切断は、例えばミクロトーム、レーザー等により行うことができる。
次に、上記のごとく調製した核酸マイクロアレイを、核酸試料を含む溶液に接触させ、核酸プローブと、前記核酸試料中において当該プローブと相補的な塩基配列を含む核酸とをハイブリダイゼーション反応させる。
核酸試料としては、核酸プローブとの相補配列を含む核酸、核酸プローブとの相補配列を含まない核酸、もしくはその混合物を挙げることができる。その核酸試料は、ＤＮＡやＲＮＡなどの種類やその由来を問わず、ＰＣＲや逆転写反応、転写反応などを利用して調製することが出来るが、調製方法はこれらに限定されるものではない。一般に公知の手法で核酸試料を調製する場合、例えば、市販の教本「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＣＳＨＬ  ＰＲＥＳＳ）」記載の調製方法で行うことが出来る。これら核酸試料は、検出のための適当な標識を施すことができる。標識としては、例えば、蛍光物質、ラジオアイソトープ、酵素等が挙げられる。標識方法は、例えば、「核酸マイクロアレイと最新ＰＣＲ法（秀潤社）」記載の手法を用いることが出来る。
接触とは、マイクロアレイに配置されているプローブの全部又は一部を、核酸試料を含むハイブリダイゼーション溶液に浸漬している状態にすることをいう。ハイブリダイゼーション反応は、核酸試料を含むハイブリダイゼーション溶液を調製し、これを核酸プローブの固定化された核酸マイクロアレイに接触させることにより行う。例えば、市販教本「核酸マイクロアレイと最新ＰＣＲ法（秀潤社）」記載の手法を用いて行うことが出来る。
ハイブリダイゼーション反応時の条件を決める要素としては、該反応時の温度、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度及びｐＨなどが挙げられる。ハイブリダイゼーション温度及び塩濃度は、核酸プローブに対して相補的な塩基配列を含む特異的核酸及び当該塩基配列を含まない非特異的核酸が含まれる試料溶液中で、少なくとも、特異的核酸が核酸プローブと核酸ハイブリッドを形成するに十分な条件を選択することが好ましい。条件の選択は、例えば、核酸試料が溶解している溶液の塩濃度を指標にして、対応する核酸プローブ配列情報からＴｍを計算し決定することができる。具体的には、Ｂａｌｄｉｎｏ  Ｆ．Ｊらによって提唱された計算式（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１６８：７６１−７７７）によって、適当な温度条件をハイブリダイゼーション反応液中の塩濃度とともに計算することができる。ハイブリダイゼーション反応は、反応温度がＴｍ以下になるような条件で行うことが好ましい。
第２の工程では、核酸マイクロアレイ上に形成された核酸ハイブリッドを、洗浄効果の弱い条件から強い条件まで洗浄条件を変えながら複数回の洗浄を行う。
通常、ハイブリダイゼーションの後の核酸マイクロアレイ上には、特異的核酸と核酸プローブとの核酸ハイブリッドの他に、核酸プローブと非特異結合をしている非特異的ハイブリッドや試料中に混入している酵素類などの共雑物が存在する。特異的核酸ハイブリッドのみを検出するには、これらを除去する洗浄操作が必要になる。洗浄液としては、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム等から調製されたＳＳＣ溶液やＳＤＳ溶液及びその混合物を用いることができる。これらの洗浄液の調製方法は、例えば「バイオ実験イラストレイテッド（秀潤社）」に記載されている。
洗浄操作は、一定の塩濃度、温度、ｐＨで最適化された、核酸試料を含まない溶液を洗浄液として用い、核酸マイクロアレイをその溶液中に浸漬する方法、核酸マイクロアレイの表面もしくは核酸プローブ結合部位に洗浄液を通過、滞留させる方法等が用いられる。また、その際に使用される洗浄液については、適切な塩濃度、温度、ｐＨである必要があるが、これらは前述のＴｍの計算式を指標にして決定されることが好ましい。
好ましい洗浄形態としては、核酸マイクロアレイよりも大きな容器中に洗浄液を注入し、恒温槽や温度制御装置を用い、洗浄液温度を一定に保持した上で、洗浄液の注入された容器中に核酸マイクロアレイを浸漬することにより実施する。この洗浄操作は、理想的には、特異的核酸ハイブリッドのみを残し、非特異的ハイブリッドや共雑物をすべて洗い流すことが望ましい。
洗浄操作の際、洗浄効果の度合いを洗浄条件の弱い条件から強い条件へと段階的に変えていく（段階的洗浄）。ここで、洗浄効果は、核酸試料と核酸プローブとの核酸ハイブリッドを解離させる作用を意味する。「洗浄効果が強い」とは、対照の洗浄条件よりも、例えば、洗浄液の塩濃度が相対的に低い条件、洗浄液の温度が相対的に高い条件、またはこれらを組み合わせた条件で得られる洗浄効果である。「洗浄効果が弱い」とは、対照の洗浄条件よりも、例えば、洗浄液の塩濃度が相対的に高い条件、洗浄液の温度が相対的に低い条件、またはこれらを組み合わせた条件で得られる洗浄効果である。
具体的には、まず、マイクロアレイに搭載している核酸プローブの中で、Ｔｍが最も低いものに洗浄条件を合わせ、洗浄及び検出を行う。次に、核酸プローブの中でＴｍが最も高いものの洗浄条件まで、段階的に洗浄及び検出を行う。ただし、目的の核酸の検出が確認できれば、Ｔｍが最も高いものの洗浄条件まで段階的に洗浄および検出を行う必要はなく、途中の段階で操作を終了することができる。このような複数回の洗浄及び検出を行うことにより、例えば、洗浄条件とハイブリッドの解離条件とが近接している核酸ハイブリットを分割して検出することが可能となる。
洗浄効果は、洗浄液の塩濃度、洗浄液温度、洗浄液量、洗浄時間などに依存する。特に、洗浄効果に対する塩濃度及び温度の影響は、核酸プローブの塩基構成との関係によって定まる。
洗浄条件を段階的に変更する方法としては、例えば、塩濃度を一定にして、洗浄液の温度を段階的に変えていく方法がある。具体的には、はじめに塩濃度を任意に選ぶ（ただし、Ｔｍ計算式の適用範囲内の値を選ぶ）。次いで核酸マイクロアレイ上に搭載されている全ての核酸プローブの内、Ｔｍが最小となるプローブをＴｍ計算式から算出する。その最小のＴｍ値、好ましくは、最小値よりも１℃以上低い洗浄液の温度を第一段階の洗浄条件として選ぶ。その後、洗浄液温度を段階的に高くした条件で、１回以上の洗浄操作を行う。この場合、第二段階以降の洗浄液温度は、一段階前の洗浄液温度よりも高ければよく、温度上昇の程度は特に限定されない。洗浄液温度は、例えば、同じくアレイ上に搭載されているプローブの内の最大Ｔｍ値以上、好ましくは最大値よりも１℃以上高い温度まで高くすることができる。
また、洗浄液の温度を一定にして、洗浄液中の塩濃度を段階的に変える方法を用いることも出来る。具体的には、はじめに洗浄温度を任意に選ぶ（ただし、Ｔｍ計算式の適用範囲内の塩濃度から求められうる値を選ぶ）。次いで核酸マイクロアレイ上に搭載されている全ての核酸プローブの内、Ｔｍが最小となるプローブをＴｍ計算式から算出し、その最小Ｔｍ値が、規定された洗浄液温度に比べて、同じかもしくは、好ましくは１℃以上高くなるように計算される洗浄液の塩濃度を第一段階の洗浄条件として選び、その後、洗浄液の塩濃度を段階的に低くした条件で、１回以上の洗浄操作を行う。この場合、第二段階以降の洗浄液の塩濃度は、一段階前の塩濃度よりも低ければよく、塩濃度低下の程度は特に限定されない。洗浄液の塩濃度は、例えば、同じくマイクロアレイ上に搭載されているプローブの内の最大Ｔｍ値が、規定された洗浄液温度に比べて好ましくは１℃以上低くなるように計算される塩濃度まで低くすることができる。
また、洗浄条件を洗浄効果の強い条件に段階的に変更する方法としては、前述の洗浄液の温度と洗浄液の塩濃度とを組み合わせて変化させる方法を用いることもできる。この場合、洗浄液の温度と塩濃度は、洗浄効果が段階的に変化する限り、洗浄操作の一段階において、いずれか一方のみを変化させてもよいし、または両方とも変化させてもよい。
洗浄液中の塩濃度の制御は、洗浄液温度の制御よりも容易であるため、この点から言えば、洗浄液中の塩濃度を段階的に変える方法が好ましい。洗浄液中の塩濃度を段階的に変える方法の具体例を実施例１に示し、洗浄液温度を段階的に変える方法の具体例を実施例２に示した。
尚、塩濃度を固定した際の各プローブのＴｍ、及び各プローブのＴｍを固定した際の塩濃度は、各プローブのＧＣ含量、塩基配列長を基に、公知の計算式で算出することが出来る。しかしながらこの計算式は特定の計算式に限定されるものではない。
また別途、界面活性剤や変性剤等の添加も洗浄度合いの変更に使用が可能である。
第２の工程では、上記の洗浄操作毎に核酸ハイブリッドを検出する。洗浄後の検出方法としては、種々の検出方法を用いることが出来る。例えば、蛍光ラベル化検出法、化学発光法、ラジオアイソトープ等の手法が利用出来る。蛍光ラベル化検出法では、予めラベル化した核酸試料、あるいは、ハイブリダイゼーションの後にインターカレーターで標識した核酸の蛍光シグナルを検出する方法がある。
検出手段としては、例えば冷却ＣＣＤカメラ、励起光のみを通過させるフィルター、蛍光のみを通過させるフィルター、励起光源、適切な光学系、その他のマイクロアレイにおける蛍光の検出に適した機器を供えた蛍光顕微鏡により、蛍光を検出する方法が挙げられる。それ以外の検出装置としては、レーザースキャナーなどが利用できる。
また、検出の際には、核酸マイクロアレイ表面又はマイクロアレイ全体の乾燥を防ぐため、少なくとも、水分蒸発の少ない環境下で検出することが望ましい。乾燥を防ぐ方法としては、例えば、検出対象の洗浄後の核酸マイクロアレイ自体を、溶液の入ったケースに浸漬させて、液相中で検出する方法、又は水分の蒸発のない飽和水蒸気雰囲気にした密閉容器中に検出対象を封入して検出する方法等が挙げられる。
上述した検出方法は、例えば、転写産物の発現量の解析、遺伝子の塩基配列の解析、核酸修飾の解析等に使用することができる。
転写産物の発現量解析とは、生体の生死を問わず、細胞中、もしくは細胞外に存在するＲＮＡの量を解析する手法である。単一又は複数の核酸試料を、それぞれ独立に標識物質によって標識し、単独又は混合状態でハイブリダイゼーションすることにより、ＲＮＡの複数の核酸試料間における相対量比を調べる方法である。その際に、本発明の検出方法を使用することにより、各核酸プローブにおける上記の相対量比の正確性を向上することができる。
遺伝子の塩基配列解析とは、核酸塩基配列における多型や変異などの同定もしくは塩基配列自体の決定を行う方法である。その際に、本発明の検出方法を使用することにより、各核酸プローブにおける上記の同定性能、又は決定性能を向上することができる。
核酸修飾の解析とは、たとえば、ＣｐＧアイランドにおけるメチル化の有無を調べる方法が挙げられる。その際に、本発明の検出方法を使用することにより、調査対象となる部位のメチル化の有無等を各核酸プローブにおいてより正確に決定することができる。
また、本発明の検出方法は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などの短い核酸をマイクロアレイを用いて解析するのに有用である。ｍｉＲＮＡの核酸長は約２０ｍｅｒであるため、ｍｉＲＮＡ用マイクロアレイの核酸プローブのＴｍ値を揃えるのは困難である。また、Ｔｍ値を揃えるために、プローブにリンカーを導入する方法があるが、リンカーの導入はコスト高となってしまう。したがって、洗浄強度を段階的に変化させ、洗浄条件毎に核酸ハイブリッドを検出する本発明の検出方法は、ｍｉＲＮＡなどの短い核酸の解析に有用である。
以下、実施例を用いて本発明を具体的に説明するが、本実施例はモデルとして本発明の整合性を明確にしたものであり、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０００７】
１．核酸試料の調製
下記の配列番号１〜１０に示す配列のＣｙ５標識オリゴヌクレオチドを合成後、これらを等量に含むオリゴヌクレオチド核酸試料溶液をそれぞれ作製した。各溶液は、各Ｃｙ５標識オリゴヌクレオチドを１０ｆｍｏｌ／μｌ、２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム３３．３ｍＭ、クエン酸ナトリウム３３．３ｍＭ、ｐＨ７．０）及び０．２％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む組成とした。以上のオリゴヌクレオチドをモデル核酸試料として使用した。
配列番号１：
ｃｇｇａｔｔａｇｇｇ  ｃｇｔｔｔｔｔｔａｔ  ｔｔｔｃｇｔｃｇｇｇ  ａｇｔｔｃｇｔｃｇａ  ｔｔｇｇｔｔｇｇｇｔ  ｇｔｇｇｇｃｇｔａｃ  ｇｔｇａｔｃ
配列番号２：
ｃｇｔｔｔｔｔｇｇｔ  ｇａｇｃｇｔｃｇｔｃ  ｇｔｔａｇｔｔａａｔ  ｃｇｃｇｇｇｇｃｇｔ  ａｇａｇｇｔｔｔｔｔ  ｇｇｔｔｔｃｇｔｔｔ  ｃｇｃ
配列番号３：
ｃｇｇｃｇｔｇｇｇｔ  ｇｔｇｇｇｇｃｇａｇ  ｔｇｇｇｔｇｔｇｔｇ  ｃｇｇｇｇｔｇｔｇｃ  ｇｃｇｇｔａｇａｇｃ  ｇｃｇｔｔａｇｃ
配列番号４：
ｃｇｇｇｇｇｇｃｇｇ  ｔｇｔｔｔｃｇｇｇｇ  ｔｔｔａｔｔｔｇｇｔ  ｔｇｔａｇｔｔａｃｇ  ｔａｔｔｔｔｔｔｔｔ  ｔａｇｔｇｇｃｇｔｃ
配列番号５：
ｃｇｃｇｃｇｔｔｃｇ  ｔｃｇｔｔｃｇｔｔａ  ｔａｔａｔｃｇｔｔｃ  ｇｔａｇｔａｔｔｃｇ  ｔｇｔｔｔａｇｔｔｔ  ｃｇｔａｇｔｇｇｃｇ  ｔｔｔｇａｃｇｔｃｇ  ｃｇｔｔｃｇｃ
配列番号６：
ｃｇｇａｔｃｇａｇｔ  ｇｃｇｔｔｃｇｇｃｇ  ｇｔｔｇｃｇｇａｇａ  ｇｇｇｇｔａｇａｇｔ  ａｇｇｔａｇｃｇｇｇ  ｃｇｇｃ
配列番号７：
ｃｇｃｇｔｇｇｔｇｔ  ｔｔｔｇｃｇｇｔｃｇ  ｔｃｇｔｃｇｔｔｇｔ  ｇｇｔｃｇｔｔｃｇｇ  ｇｇｔｇｇｇｇｔｇｔ  ｇａｇｇａｇｇｇｇａ  ｃ
配列番号８：
ｃｇｇｔｔｇｇｇｇｔ  ｔｔｃｇｃｇｔｔｔａ  ｔａｃｇｇｔｔｔｔｔ  ｇｇｃｇｇｇｇｇｔｔ  ｃｇｃｇｃｇｔｔｔｃ  ｇｇｇａｇｔｔｔｃｇ  ｃ
配列番号９：
ｃｇｇａｇｃｇａｃｇ  ｃｇｔｃｇｔａｔａｇ  ｔｔａａｔｃｇｇｃｇ  ｇａｇｔｔｔｔｔａｔ  ｃｇｃｇｇｇｔａｔｔ  ｔｃｇｇｔｇｇｃｇｔ  ｔｃｇｃ
配列番号１０：
ｃｇｃｇｇｇｃｇｇｃ  ｇｔｃｇｔｃｇａａｃ  ｇｔｔａｇｃｇｔｔａ  ｇｇｇｇｇｃｇｇｇｇ  ｔｇｇｇｇｇａｇｇｇ  ａｇｃｇａｇｇｔｔｔ  ｔｔｃ
２．核酸プローブの調製
上述のＣｙ５標識オリゴヌクレオチド１０種（配列番号１〜１０）と同一鎖長、且つ完全相補配列である核酸プローブ１０種（配列番号１１〜２０）を合成した。
配列番号１１：
ｇａｔｃａｃｇｔａｃ  ｇｃｃｃａｃａｃｃｃ  ａａｃｃａａｔｃｇａ  ｃｇａａｃｔｃｃｃｇ  ａｃｇａａａａｔａａ  ａａａａｃｇｃｃｃｔ  ａａｔｃｃｇ
配列番号１２：
ｇｃｇａａａｃｇａａ  ａｃｃａａａａａｃｃ  ｔｃｔａｃｇｃｃｃｃ  ｇｃｇａｔｔａａｃｔ  ａａｃｇａｃｇａｃｇ  ｃｔｃａｃｃａａａａ  ａｃｇ
配列番号１３：
ｇｃｔａａｃｇｃｇｃ  ｔｃｔａｃｃｇｃｇｃ  ａｃａｃｃｃｃｇｃａ  ｃａｃａｃｃｃａｃｔ  ｃｇｃｃｃｃａｃａｃ  ｃｃａｃｇｃｃｇ
配列番号１４：
ｇａｃｇｃｃａｃｔａ  ａａａａａａａａｔａ  ｃｇｔａａｃｔａｃａ  ａｃｃａａａｔａａａ  ｃｃｃｃｇａａａｃａ  ｃｃｇｃｃｃｃｃｃｇ
配列番号１５：
ｇｃｇａａｃｇｃｇａ  ｃｇｔｃａａａｃｇｃ  ｃａｃｔａｃｇａａａ  ｃｔａａａｃａｃｇａ  ａｔａｃｔａｃｇａａ  ｃｇａｔａｔａｔａａ  ｃｇａａｃｇａｃｇａ  ａｃｇｃｇｃｇ
配列番号１６：
ｇｃｃｇｃｃｃｇｃｔ  ａｃｃｔａｃｔｃｔａ  ｃｃｃｃｔｃｔｃｃｇ  ｃａａｃｃｇｃｃｇａ  ａｃｇｃａｃｔｃｇａ  ｔｃｃｇ
配列番号１７：
ｇｔｃｃｃｃｔｃｃｔ  ｃａｃａｃｃｃｃａｃ  ｃｃｃｇａａｃｇａｃ  ｃａｃａａｃｇａｃｇ  ａｃｇａｃｃｇｃａａ  ａａｃａｃｃａｃｇｃ  ｇ
配列番号１８：
ｇｃｇａａａｃｔｃｃ  ｃｇａａａｃｇｃｇｃ  ｇａａｃｃｃｃｃｇｃ  ｃａａａａａｃｃｇｔ  ａｔａａａｃｇｃｇａ  ａａｃｃｃｃａａｃｃ  ｇ
配列番号１９：
ｇｃｇａａｃｇｃｃａ  ｃｃｇａａａｔａｃｃ  ｃｇｃｇａｔａａａａ  ａｃｔｃｃｇｃｃｇａ  ｔｔａａｃｔａｔａｃ  ｇａｃｇｃｇｔｃｇｃ  ｔｃｃｇ
配列番号２０：
ｇａａａａａｃｃｔｃ  ｇｃｔｃｃｃｔｃｃｃ  ｃｃａｃｃｃｃｇｃｃ  ｃｃｃｔａａｃｇｃｔ  ａａｃｇｔｔｃｇａｃ  ｇａｃｇｃｃｇｃｃｃ  ｇｃｇ
また、上述のＣｙ５標識オリゴヌクレオチド１０種（配列番号１〜１０）と同一鎖長、且つ部分相補配列である核酸プローブ１０種（配列番号２１〜３０）をそれぞれ合成した。
この核酸プローブは、配列番号１１〜２０の塩基配列の内、グアニン塩基がアデニン塩基に置換された配列である。同置換部位においてのみモデル核酸試料のオリゴヌクレオチドと非相補塩基対を形成するものである。
配列番号２１：
ａａｔｃａｃａｔａｃ  ａｃｃｃａｃａｃｃｃ  ａａｃｃａａｔｃａａ  ｃａａａｃｔｃｃｃａ  ａｃａａａａａｔａａ  ａａａａｃａｃｃｃｔ  ａａｔｃｃａ
配列番号２２：
ａｃａａａａｃａａａ  ａｃｃａａａａａｃｃ  ｔｃｔａｃａｃｃｃｃ  ａｃａａｔｔａａｃｔ  ａａｃａａｃａａｃａ  ｃｔｃａｃｃａａａａ  ａｃａ
配列番号２３：
ａｃｔａａｃａｃａｃ  ｔｃａｔｃｃａｃａｃ  ａｃａｃｃｃｃａｃａ  ｃａｃａｃｃｃａｃｔ  ｃａｃｃｃｃａｃａｃ  ｃｃａｃａｃｃａ
配列番号２４：
ａａｃａｃｃａｃｔａ  ａａａａａａａａｔａ  ｃａｔａａｃｔａｃａ  ａｃｃａａａｔａａａ  ｃｃｃｃａａａａｃａ  ｃｃａｃｃｃｃｃｃａ
配列番号２５：
ａｃａａａｃａｃａａ  ｃａｔｃａａａｃａｃ  ｃａｃｔａｃａａａａ  ｃｔａａａｃａｃａａ  ａｔａｃｔａｃａａａ  ｃａａｔａｔａｔａａ  ｃａａａｃａａｃａａ  ａｃａｃａｃａ
配列番号２６：
ａｃｃａｃｃｃａｃｔ  ａｃｃｔａｃｔｃｔａ  ｃｃｃｃｔａｔｃｃａ  ｃａａｃｃａｃｃａａ  ａｃａｃａｃｔｃａａ  ｔｃｃａ
配列番号２７：
ａｔｃｃｃｃｔｃｃｔ  ｃａｃａｃｃｃｃａｃ  ｃｃｃａａａｃａａｃ  ｃａｃａａｃａａｃａ  ａｃａａｃｃａｃａａ  ａａｃａｃｃａｃａｃ  ａ
配列番号２８：
ａｃａａａａｃｔｃｃ  ｃａａａａｃａｃａｃ  ａａａｃｃｃｃｃａｃ  ｃａａａａａｃｃａｔ  ａｔａａａｃａｃａａ  ａａｃｃｃｃａａｃｃ  ａ
配列番号２９：
ａｃａａａｃａｃｃａ  ｃｃａａａａｔａｃｃ  ｃａｃａａｔａａａａ  ａｃｔｃｃａｃｃａａ  ｔｔａａｃｔａｔａｃ  ａａｃａｃａｔｃａｃ  ｔｃｃａ
配列番号３０：
ａａａａａａｃｃｔｃ  ａｃｔｃｃｃｔｃｃｃ  ｃｃａｃｃｃｃａｃｃ  ｃｃｃｔａａｃａｃｔ  ａａｃａｔｔｃａａｃ  ａａｃａｃｃａｃｃｃ  ａｃａ
配列番号１〜３０で示される塩基配列において、例えば、配列番号１の完全な相補配列が配列番号１１であり、配列番号１１の塩基配列の内、グアニン塩基をアデニン塩基に置換した塩基配列が配列番号２１である。以下、配列番号２〜１０、配列番号１２〜２０及び配列番号２２〜３０に対応する配列の関係も同様である。
３．核酸マイクロアレイの製造
図１に示す配列固定器具を利用して中空繊維（３１）束を製造した。なお、図中のｘ、ｙ、ｚは直交の３次元軸であり、ｘ軸は繊維の長手方向と一致する。
まず、直径０．３２ｍｍの孔が、孔（１１）の中心間距離を０．４２ｍｍとして、縦横各１２列で合計１４４個設けられた厚さ０．１ｍｍの多孔板（２１）２枚を準備した。これらの多孔板を重ね合わせて、そのすべての孔に、ポリカーボネート中空繊維（３１）（三菱エンジニアリングプラスチック社製  カーボンブラック１質量％添加）を１本づつ、通過させた。
Ｘ軸方向に各繊維に０．１Ｎの張力をかけた状態で２枚の多孔板の位置を移動させて、中空繊維の一方の端部から２０ｍｍの位置と１００ｍｍの位置の２ヶ所に固定した。即ち、２枚の多孔板の間隔を８０ｍｍとした。
次いで、多孔板間の空間の周囲３面を板状物（４１）で囲った。このようにして上部のみが開口状態にある容器を得た。
次に、この容器の上部から容器内に樹脂原料を流し込んだ。樹脂としては、ポリウレタン樹脂接着剤（日本ポリウレタン工業（株）ニッポラン４２７６、コロネート４４０３）の総重量に対し、２．５質量％のカーボンブラックを添加したものを使用した。２５℃で１週間静置して樹脂を硬化させた。次いで多孔板と板状物を取り除き、中空繊維束を得た。
次に、表１に示す質量比で混合した単量体及び開始剤を含むゲル前駆体重合性溶液を調製した。
【表１】
2006083040.tif 000002
次に、各核酸プローブを含むゲル前駆体重合性溶液をデシケーター内に設置した。デシケーター内を減圧状態にしたのち、中空繊維束の繊維束が固定されていない一方の端部をこの溶液中に浸漬した。デシケーター内に窒素ガスを封入し、中空繊維の中空部にキャプチャープローブを含むゲル前駆体重合性溶液を導入した。次いで、容器内を７０℃とし、３時間かけて重合反応を行った。
このようにして核酸プローブがゲル状物を介して中空繊維の中空部に保持された中空繊維束を得た。
次に得られた中空繊維束を、ミクロトームを用いて繊維の長手方向と直交する方向でスライスし、厚さ０．５ｍｍの薄片シート（ＤＮＡマイクロアレイ）を５０枚得た。なお、各中空部に存在している核酸プローブの濃度は、５０ｆｍｏｌ／ｓｐｏｔである。得られた核酸マイクロアレイのデザインは、図２に示す。図２中の数字は、核酸プローブの配列番号を示し、Ｂはブランクゲル（核酸プローブを含まないゲル）を示す。
４．ハイブリダイゼーション反応、洗浄及び検出操作
上記３．で作製した核酸マイクロアレイに、上記１．で調製した各標識オリゴヌクレオチド溶液を接触させ、恒温槽中で、７５℃で３時間ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイを１×ＳＳＣ中、７５℃で２０分間洗浄を行い、上記マイクロアレイを１×ＳＳＣ中に浸漬し、カバーガラスをかぶせた後に、冷却ＣＣＤカメラ方式の核酸マイクロアレイ自動検出装置を用いて、標識核酸試料分子の蛍光シグナル強度を測定した。測定結果を図３に示した。
さらに０．７×ＳＳＣ中、７５℃で２０分間洗浄を行い、上記マイクロアレイを０．７×ＳＳＣ中に浸漬し、カバーガラスをかぶせた後に、冷却ＣＣＤカメラ方式の核酸マイクロアレイ自動検出装置で標識核酸試料分子の蛍光シグナル強度を測定した。測定結果を図４に示した。
本実施例においては、核酸試料に含まれる配列番号１〜１０の核酸は、全て配列番号１１〜２０の核酸プローブと相補的であり、配列番号２１〜３０の核酸プローブと部分相補的である。よって、配列番号１１〜２０の核酸プローブが固定されている区画の蛍光シグナルは、配列番号２１〜３０の核酸プローブが固定されている区画のものよりも強いことが予測される。より詳しくは、配列番号１１〜２０の核酸プローブが固定されている区画で蛍光シグナルが検出され、配列番号２１〜３０の核酸プローブが固定されている区画で蛍光シグナルが検出されないか、あるいは、配列番号２１〜３０の核酸プローブが固定されている区画の蛍光シグナル強度が、配列番号１１〜２０の核酸プローブが固定されている区画の蛍光シグナル強度よりも非常に小さいことが予測される。
実施例において、１×ＳＳＣ中、７５℃で２０分間での洗浄では、配列番号２１〜３０の核酸プローブが固定されている区画の蛍光シグナル強度はやや強かったが（図３参照）、さらに０．７×ＳＳＣ中、７５℃で２０分間洗浄を行うことにより、配列番号２１〜３０の核酸プローブが固定されている区画の蛍光シグナル強度は大幅に低下した（図４参照）。また、洗浄による配列番号１１〜２０の核酸プローブが固定されている区画の蛍光強度の変化は少なかった。
以上より、繰り返し洗浄を行うことにより、目的とする検出対象の蛍光強度を低下させることなく、クロスハイブリダイズした核酸の除去に有効であることが実証された。
【実施例２】
【０００８】
１．核酸試料の調製
下記の配列番号３１〜３６に示す配列のオリゴヌクレオチドを合成した。各オリゴヌクレオチドは、ＰｌａｔｉｎｕｍＢｒｉｇｈｔＴＭ：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＫＲＥＡＴＥＣＨ社製）により、キットに付属プロトコールに従い、標識、精製し、２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム３３．３ｍＭ、クエン酸ナトリウム３３．３ｍＭ、ｐＨ７．０）及び０．２％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む１０ｆｍｏｌ／μｌ溶液となるように調製した。
配列番号３１：
ｔｇａｇｇｔａｇｔａ  ｇｇｔｔｇｔｇｔｇｇｔｔ
配列番号３２：
ｔｇａｇｇｔａｇｔａ  ｇｇｔｔｇｔａｔｇｇ  ｔｔ
配列番号３３：
ａｇａｇｇｔａｇｔａ  ｇｇｔｔｇｃａｔａｇ  ｔ
配列番号３４：
ｔｇａｇｇｔａｇｇａ  ｇｇｔｔｇｔａｔａｇ  ｔ
配列番号３５：
ｔｇａｇｇｔａｇｔａ  ｇａｔｔｇｔａｔａｇ  ｔ
配列番号３６：
ｔｇａｇｇｔａｇｔａ  ｇｔｔｔｇｔａｃａｇ  ｔ
２．核酸プローブの調製
上述の標識オリゴヌクレオチド６種（配列番号３１〜３６）と完全相補配列である核酸プローブ６種（配列番号３７〜４２）を合成した。配列番号３７は配列番号３１と完全に相補的な配列である。配列番号３８〜４２、配列番号３２〜３６に対応する配列の関係も同様である。Ｔｍ値は以下の式１に従い、２×ＳＳＣの塩濃度条件下における値を算出した。
［式１］
８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％［Ｇ＋Ｃ］）−６００／ｎ
なお、各核酸プローブは、非常に短い配列からなり、且つ各々の相補性の高いため、同一の核酸試料に対して、容易にクロスハイブリダイゼーションする可能性がある。
配列番号３７（Ｔｍ＝６６℃）：
ａａｃｃａｃａｃａａ  ｃｃｔａｃｔａｃｃｔ  ｃａ
配列番号３８（Ｔｍ＝６４℃）：
ａａｃｃａｔａｃａａ  ｃｃｔａｃｔａｃｃｔ  ｃａ
配列番号３９（Ｔｍ＝６４℃）：
ａｃｔａｔｇｃａａｃ  ｃｔａｃｔａｃｃｔｃ  ｔ
配列番号４０（Ｔｍ＝６４℃）：
ａｃｔａｔａｃａａｃ  ｃｔｃｃｔａｃｃｔｃ  ａ
配列番号４１（Ｔｍ＝６０℃）：
ａａｃｔａｔａｃａａ  ｔｃｔａｃｔａｃｃｔ  ｃａ
配列番号４２（Ｔｍ＝６２℃）：
ａｃｔｇｔａｃａａａ  ｃｔａｃｔａｃｃｔｃ  ａ
３．核酸マイクロアレイの製造
実施例１の表１に記載の核酸プローブを配列番号３７〜４２の配列の核酸プローブに変更した以外は、実施例１と同様の方法に従って、核酸マイクロアレイを製造した。
４．ハイブリダイゼーション反応、洗浄及び検出操作
上記３．で作製した核酸マイクロアレイに、上記１．で調製した各標識オリゴヌクレオチド溶液を接触させ、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションの条件は、５０℃で実施した。５０℃に到達した後、１６時間、保温し、その後、洗浄操作を行った。洗浄は、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ溶液中、５０℃下２０分間浸漬し、これを二回繰り返した後、２×ＳＳＣ、５０℃で１０分間浸漬した。洗浄後、上記マイクロアレイを２×ＳＳＣ中に浸漬し、カバーガラスをかぶせた後に、冷却ＣＣＤカメラ方式の核酸マイクロアレイ自動検出装置を用いて、標識核酸試料分子の蛍光シグナル強度を測定した。測定結果を表２に示した。なお、各核酸マイクロアレイにおいて、完全に相補的なハイブリッドからの蛍光検出強度の値を１００とし、その他の値は相対値で示した。また、検出限界以下はＮＤとして示した。
【表２】
2006083040.tif 000003
次に２×ＳＳＣの温度を５５℃に昇温し、核酸マイクロアレイを３０分間浸漬し、再度上述と同様にして蛍光シグナル強度を測定した。結果は表３に示す。
【表３】
2006083040.tif 000004
表２と表３を比較すると、段階的洗浄を行うことで、目的以外の区画でのハイブリッド、すなわちクロスハイブリダイズした核酸が除去されつつあることが分かる。
さらに、温度を６０℃及び６５℃として操作を行った、６０℃の結果は表４に、６５℃の結果は表５に示した。
【表４】
2006083040.tif 000005
【表５】
2006083040.tif 000006
各プローブのＴｍ値を指標として洗浄条件を設定することにより、互いに相同性の高いプローブにおいても、クロスハイブリダイゼーションの影響をほぼ除去して測定することができた。
本核酸マイクロアレイの場合、配列番号３５番の標識オリゴヌクレオチドと４１番のプローブとのハイブリダイゼーション（Ｔｍ＝６０℃）の場合は、５５℃洗浄において、クロスハイブリダイズする他の核酸の影響がほとんど検出されないことがわかる（表３）。
また、配列番号３３番の標識オリゴヌクレオチドと３９番のプローブ、および３４番の標識オリゴヌクレオチドと４０番のプローブとのハイブリダイゼーション（Ｔｍ＝６４℃および６４℃）の場合は、６０℃の洗浄条件に置いて、他のクロスハイブリダイゼーションの影響が検出されないことがわかる（表４）。
さらに、配列番号３１番の標識オリゴヌクレオチドと３７番のプローブとのハイブリダイゼーション（Ｔｍ＝６６℃）の場合は、６５℃の洗浄条件において、他のクロスハイブリダイゼーションの影響がなくなることがわかる（表５）。
つまり、非常に高い相同性を持ったサンプルをそれぞれに検出する場合においても、各プローブ−検体間の組み合わせのＴｍに沿って段階的な洗浄を行うことにより、相同性の高い個々のプローブを、クロスハイブリダイゼーションの影響をほとんど受けない状態で検出することが可能となった。
本発明の方法は、核酸マイクロアレイのプローブ設計において、ターゲットとなる配列が非常に短く、互いに相同性が高いターゲットが含まれるために、プローブの特異性を発揮することが困難である場合（例えば、マイクロＲＮＡの検出）に、特に活用することができる。
【産業上の利用可能性】
【０００９】
本発明を利用することにより、同一マイクロアレイ上に搭載できる遺伝子の配列長やＧＣ含量の著しい差異、及びそれに基づいて推算されるＴｍ値の各核酸プローブ間でのばらつきが認められる場合においても、核酸プローブの塩基配列の設計に制限を受けることなく、核酸を検出することが可能となった。本発明において、核酸の検出過程における洗浄操作のみを段階的に行うことにより、Ｔｍ別の複数種マイクロアレイの使用や、ハイブリダイゼーション条件の異なる実験を複数回行うことなく、簡便に配列特異的なハイブリダイゼーション由来のシグナルを検出することが可能である。すなわち、本発明の方法は、多段階での洗浄及び検出を繰り返すことにより、段階的に配列特異的ハイブリダイゼーションの厳密性を向上させ、核酸プローブ設計における制約条件、特にＴｍ（核酸二本鎖の解離温度）や核酸プローブ配列長での制約条件の緩和を可能とする。
また本発明は、核酸プローブ配列設計において設計対象となる核酸試料が容易にＴｍ値をそろえることが困難である用途、例えば、解析対象の遺伝子を数百から数十種類まで絞り込んだフォーカスドアレイにおける発現解析とそれに基づく疾病等の診断及びｍｉＲＮＡなどの短い核酸の解析、核酸のメチル化検出、疾病関連遺伝子の多型解析とそれに基づく遺伝子診断、病原菌やウィルスのタイピング等に利用でき、さらにこれらの応用手法におけるデータ信頼性の向上が可能となる。
【配列表フリーテキスト】
【００１０】
配列番号１〜４２：合成ＤＮＡ
［配列表］
2006083040.tif 000007
2006083040.tif 000008
2006083040.tif 000009
2006083040.tif 000010
2006083040.tif 000011
2006083040.tif 000012
2006083040.tif 000013
2006083040.tif 000014
2006083040.tif 000015
2006083040.tif 000016
2006083040.tif 000017
2006083040.tif 000018
2006083040.tif 000019
2006083040.tif 000020
2006083040.tif 000021
【図１】
2006083040.tif 000022
【図２】
2006083040.tif 000023
【図３】
2006083040.tif 000024
【図４】
2006083040.tif 000025
【国際調査報告】
2006083040.tif 000026
2006083040.tif 000027