【手続補正書】
【提出日】令和2年4月20日(2020.4.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト細胞におけるＢ細胞リンパ腫１１Ａ（ＢＣＬ１１Ａ）遺伝子をゲノム編集によって編集する方法であって、
前記ヒト細胞に１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子または前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で１つ以上の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）を起こし、その結果前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列の永続的な欠失、修飾、または不活性化をもたらすステップを含み、任意に、前記転写制御配列が前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の２番目のイントロンまたは前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の＋５８  ＤＮＡ高感受性部位（ＤＨＳ）中に位置する、前記方法。
【請求項２】
ｅｘ  ｖｉｖｏの方法であって、
対象特異的人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を創出するステップ、または前記対象から間葉系幹細胞を単離するステップと、
ＢＣＬ１１Ａ遺伝子または前記ｉＰＳＣまたは前記間葉系幹細胞の前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で編集するステップと、
前記ゲノム編集されたｉＰＳＣまたは間葉系幹細胞を造血前駆細胞に分化させるステップと、
前記造血前駆細胞を前記対象に植え込むステップと、を含む、前記方法。
【請求項３】
前記創出するステップが、
前記対象から体細胞を単離するステップであって、任意には、前記体細胞が線維芽細胞であるか、または、前記単離するステップが骨髄の吸引及び密度勾配遠心分離媒体を用いた間葉系細胞の単離を含む、ステップと、
前記体細胞に多能性関連遺伝子のセットを導入して、前記体細胞が多能性幹細胞になるように誘導するステップであって、任意には、前記多能性関連遺伝子のセットが、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌｉｎ２８、ＮＡＮＯＧ、及びｃＭＹＣからなる群から選択される１つ以上の遺伝子である、ステップとを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（ｉ）前記編集するステップが、前記ｉＰＳＣまたは前記間葉系幹細胞に１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子または前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で１つ以上の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）を起こし、その結果前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列の永続的な欠失、修飾、または不活性化をもたらすことを含み；
（ｉｉ）前記分化させるステップが、前記ゲノム編集されたｉＰＳＣまたは間葉系幹細胞を造血前駆細胞に分化させるために以下：低分子の組合せを用いた処置、主要転写因子の送達、主要転写因子をコードするｍＲＮＡの送達、または転写因子をコードするｍＲＮＡの送達のうちの１つ以上を含み；及び／または
（ｉｉｉ）前記植え込むステップが、移植、局所注射、全身注入、またはこれらの組合せによって前記造血前駆細胞を前記患者に植え込むことを含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
ｅｘ  ｖｉｖｏの方法であって、
前記対象から造血前駆細胞を単離するステップと、
ＢＣＬ１１Ａ遺伝子または前記造血前駆細胞の前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で編集するステップと、
前記ゲノム編集された造血前駆細胞を前記患者に植え込むステップと、を含む、前記方法。
【請求項６】
（ｉ）前記方法が、前記単離するステップの前に、任意にはプレリキサフォルとの組み合わせにおいて、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）を投与することをさらに含み；
（ｉｉ）前記単離するステップがＣＤ３４＋細胞を単離することを含み；
（ｉｉｉ）前記編集するステップが、前記造血前駆細胞に１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子または前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で１つ以上の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）を起こし、その結果前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列の永続的な欠失、修飾、または不活性化をもたらすことを含み；及び／または
（ｉｖ）前記植え込むステップが、移植、局所注射、全身注入、またはこれらの組合せによって前記ゲノム編集された造血前駆細胞を前記患者に植え込むことを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼがＣａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、これらの相同体、これらの天然分子の組換え、これらのコドン最適化、またはこれらの改変バージョン、及びこれらの組合せである、請求項１、４または６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
（ｉ）前記細胞に、前記１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを導入すること；または
（ｉｉ）前記細胞に、前記１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つ以上のリボ核酸（ＲＮＡ）を導入することを含み、任意には、前記１つ以上のポリヌクレオチドまたは１つ以上のＲＮＡが、１つ以上の改変ポリヌクレオチドまたは１つ以上の改変ＲＮＡである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼが１つ以上のタンパク質またはポリペプチドであり、任意には、前記１つ以上のタンパク質またはポリペプチドが、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方で１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）に隣接しており、任意には、前記１つ以上のＮＬＳがＳＶ４０  ＮＬＳである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法が、前記細胞に１つ以上のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を導入することをさらに含み、任意には、前記１つ以上のｇＲＮＡが単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡが、１つ以上の改変ｇＲＮＡまたは１つ以上の改変ｓｇＲＮＡであり、任意には、前記１つ以上の改変ｓｇＲＮＡが、３つの２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオアート残基を、それぞれの５’及び３’末端に、またはその付近に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記改変ｓｇＲＮＡが配列番号７１，９５９の核酸配列を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼが１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡと予め複合体化されて１つ以上のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成し、任意には、前記ＲＮＰ内のｓｇＲＮＡ：ＤＮＡエンドヌクレアーゼの重量比が１：１である、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｓｇＲＮＡが配列番号７１，９５９の核酸配列を含み、前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼがＮ末端ＳＶ４０  ＮＬＳ及びＣ末端ＳＶ４０  ＮＬＳを含むＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９であり、ｓｇＲＮＡ：ＤＮＡエンドヌクレアーゼの重量比が１：１である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法が、前記細胞に、改変転写制御配列を含む野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはｃＤＮＡを含むポリヌクレオチドドナーテンプレートを導入することをさらに含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
（ｉ）前記方法が、前記細胞に、１つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と、改変転写制御配列を含む野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはｃＤＮＡを含むポリヌクレオチドドナーテンプレートとを導入することをさらに含み、前記１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、１つ以上のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであって、前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子または前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近の座位に１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）を起こし、前記座位で前記ポリヌクレオチドドナーテンプレートからの新たな配列を染色体ＤＮＡに挿入することを容易にして、その結果、前記座位に近接する前記染色体ＤＮＡの前記転写制御配列の永続的な挿入、修飾、または不活性化をもたらす、前記１つ以上のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり、前記ｇＲＮＡが前記座位のセグメントに対し相補的であるスペーサー配列を含み；または
（ｉｉ）前記方法が、前記細胞に、１つ以上のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と、改変転写制御配列を含む野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはｃＤＮＡを含むポリヌクレオチドドナーテンプレートとを導入することをさらに含み、前記１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、１つ以上のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであって、前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子または前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で、一対の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）を、第１の切断を５’座位で、第２の切断を３’座位で起こしまたは創出し、前記５’座位と前記３’座位との間で前記ポリヌクレオチドドナーテンプレートからの新たな配列を染色体ＤＮＡに挿入することを容易にして、その結果、前記５’座位と前記３’座位との間で前記染色体ＤＮＡの前記転写制御配列における永続的な挿入、修飾、または不活性化をもたらす、前記１つ以上のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼである、
請求項１、４または６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記１つまたは２つのｇＲＮＡが１つまたは２つの単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であり、任意には、前記１つもしくは２つのｇＲＮＡまたは１つもしくは２つのｓｇＲＮＡが、１つもしくは２つの改変ｇＲＮＡ、または１つもしくは２つの改変ｓｇＲＮＡであり、そして任意には、前記１つの改変ｓｇＲＮＡが配列番号７１，９５９の核酸配列である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記１つ以上のＣａｓ９エンドヌクレアーゼが１つもしくは２つのｇＲＮＡまたは１つもしくは２つのｓｇＲＮＡと予め複合体化されて１つ以上のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成し、任意には、前記ＲＮＰ内のｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの重量比が１：１である、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
（ｉ）前記ドナーテンプレートが１本鎖または２本鎖であり、及び／または
（ｉｉ）前記改変転写制御配列が前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の２番目のイントロン中に位置するか、または、前記改変転写制御配列が前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の＋５８  ＤＮＡ高感受性部位（ＤＨＳ）中に位置する、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
（ｉ）前記Ｃａｓ９またはＣｐｆ１  ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、及びドナーテンプレートが、それぞれが別々の脂質ナノ粒子に製剤化されるか、または全てが１つの脂質ナノ粒子に同時に製剤化されるか；または
（ｉｉ）前記Ｃａｓ９またはＣｐｆ１  ｍＲＮＡが１つの脂質ナノ粒子に製剤化され、前記ｇＲＮＡ及びドナーテンプレートの両方がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターによって前記細胞に送達されるか；または
（ｉｉｉ）前記Ｃａｓ９またはＣｐｆ１  ｍＲＮＡが１つの脂質ナノ粒子に製剤化され、前記ｇＲＮＡがエレクトロポレーションによって前記細胞に送達され、ドナーテンプレートがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターによって前記細胞に送達される、請求項１、４または６〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記１つ以上のＲＮＰがエレクトロポレーションによって前記細胞に送達される、請求項１、４または６〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
ヘモグロビン異常症を有する患者からの細胞内のＢＣＬ１１Ａ遺伝子を編集するための１つ以上のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）であって、配列表の配列番号１〜７１，９４７における核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、前記１つ以上のガイドリボ核酸。
【請求項２３】
１つ以上の単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であり、任意には、前記１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡが、１つ以上の改変ｇＲＮＡまたは１つ以上の改変ｓｇＲＮＡであり、任意には、前記１つ以上の改変ｓｇＲＮＡが、３つの２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオアート残基を、それぞれの５’及び３’末端に、またはその付近に含み、そして任意には、前記１つ以上の改変ｓｇＲＮＡが、配列番号７１，９５９の核酸配列を含む、請求項２２に記載の１つ以上のｇＲＮＡ。
【請求項２４】
配列番号７１，９５９の核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）。
【請求項２５】
ヒト細胞に１つ以上のＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ及び１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を導入してＢ細胞リンパ腫１１Ａ（ＢＣＬ１１Ａ）遺伝子または前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で１つ以上の２本鎖切断（ＤＳＢ）を起こし、その結果前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列の永続的な欠失、修飾、または不活性化をもたらすステップを含む方法により得ることができることを特徴とする、遺伝子改変細胞であって、前記１つ以上のｇＲＮＡが、配列番号７１，９５９の単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む、遺伝子改変細胞。
【請求項２６】
遺伝子突然変異を含むことを特徴とする遺伝子改変細胞であって、前記遺伝子突然変異が、Ｂ細胞リンパ腫１１Ａ（ＢＣＬ１１Ａ）遺伝子の転写制御配列の永続的な欠失、修飾、または不活性化のうちの１つであり、ここで、前記遺伝子突然変異が、配列番号７１，９５９の単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含むｇＲＮＡにより標的とされる部位において生じる、遺伝子改変細胞。