(57)【要約】本発明は、シノビオリンの一部を認識しうるモノクローナル抗体を提供するための、シノビオリンの自己ユビキチン化を阻害することができる、シノビオリンに対する抗体又はその断片に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シノビオリンの自己ユビキチン化を阻害することができる、シノビオリンに対する抗体又はその断片。
【請求項２】
シノビオリンの基質タンパク質のユビキチン化には影響しないことを特徴とする、請求項１記載の抗体又はその断片。
【請求項３】
抗体がモノクローナル抗体である請求項１又は２記載の抗体又はその断片。
【請求項４】
配列番号３〜５に示されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として免疫された動物の抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合によって得られるハイブリドーマにより産生される、シノビオリンに対するモノクローナル抗体又はその断片であって、シノビオリンの自己ユビキチン化を阻害することができる前記抗体又はその断片。
【請求項５】
配列番号３〜５に示されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として免疫された動物の抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合によって得られるハイブリドーマであって、シノビオリンの自己ユビキチン化を阻害することができるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項６】
シノビオリンの自己ユビキチン化を阻害することができる、シノビオリンに対するモノクローナル抗体の製造方法であって、配列番号３〜５に示されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として免疫された動物の抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合細胞を培養し、得られる培養物から前記モノクローナル抗体を採取することを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体又はその断片を含有する医薬組成物。
【請求項８】
関節リウマチ、癌、線維症、動脈硬化、キャッスルマン病、多発骨髄腫、クローン病、全身型若年特発性関節炎、脳腫瘍、舌癌、咽頭癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆道癌、胆嚢癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、線維肉腫、骨肉種、軟骨肉腫、皮膚癌、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ球白血病、成人型Ｔ細胞白血病、悪性リンパ腫の治療又は予防のための請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体又はその断片を含有する、シノビオリンの自己ユビチキン化阻害剤。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体又はその断片を含有する、シノビオリン含有細胞検出用試薬。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体又はその断片を含有する、シノビオリンによる細胞増殖性疾患の検出用試薬。
【請求項１２】
細胞増殖性疾患が、関節リウマチ、癌、線維症、動脈硬化、キャッスルマン病、多発骨髄腫、クローン病、全身型若年特発性関節炎、脳腫瘍、舌癌、咽頭癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆道癌、胆嚢癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、線維肉腫、骨肉種、軟骨肉腫、皮膚癌、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ球白血病、成人型Ｔ細胞白血病、悪性リンパ腫からなる群から選ばれる少なくとも１つである、請求項１１記載の試薬。
【請求項１３】
細胞が、滑膜細胞、破骨細胞、角化上皮細胞、血液細胞、癌細胞、骨髄細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、真皮細胞、筋細胞、神経細胞、リンパ球、血管平滑筋細胞、肝細胞、色素細胞、脂肪細胞、子宮内皮細胞、肺胞上皮細胞、未分化間葉系細胞、外胚葉頂堤からなる群から選択されるいずれかの細胞である、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体又はその断片と、シノビオリンとを反応させることを特徴とする、シノビオリンの自己ユビキチン化を阻害する方法。
【請求項１５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体又はその断片と、生体試料とを反応させることを特徴とする、シノビオリンの発現細胞を検出する方法。
【請求項１６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体又はその断片と、被験者から採取された生体試料とを反応させることを特徴とする、シノビオリンによる細胞増殖性疾患の検出方法。
【請求項１７】
細胞増殖性疾患が、関節リウマチ、癌、線維症、動脈硬化、キャッスルマン病、多発骨髄腫、クローン病、全身型若年特発性関節炎、脳腫瘍、舌癌、咽頭癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆道癌、胆嚢癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、線維肉腫、骨肉種、軟骨肉腫、皮膚癌、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ球白血病、成人型Ｔ細胞白血病、悪性リンパ腫からなる群から選ばれる少なくとも１つである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
細胞が、滑膜細胞、破骨細胞、角化上皮細胞、血液細胞、癌細胞、骨髄細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、真皮細胞、筋細胞、神経細胞、リンパ球、血管平滑筋細胞、肝細胞、色素細胞、脂肪細胞、子宮内皮細胞、肺胞上皮細胞、未分化間葉系細胞、外胚葉頂堤からなる群から選択されるいずれかの細胞である、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、抗シノビオリン抗体に関する。より詳しくは、シノビオリンの自己ユビキチン化を阻害することができる抗体、上記抗体を含有する医薬組成物、上記抗体を用いて、シノビオリンが発現している細胞を検出する方法に関する。
【背景技術】  関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ、以下、ＲＡと省略する）は、関節の滑膜組織に異常な増殖が見られる全身性の炎症性疾患である。滑膜細胞（ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｃｅｌｌ）は、関節の滑膜で１〜６層の上皮様層を形成する繊維芽細胞様の細胞であり、滑液にプロテオグリカンやヒアルロン酸を供給するものとされている。ＲＡ患者の関節では、滑膜組織の増殖、その結果として引き起こされる多層構造、滑膜細胞の他の組織への浸潤といったような症状が観察される。また、ＲＡ患者の血清中には自己の免疫グロブリン（ＩｇＧ）のＦｃ領域に対する自己抗体が存在する。ＲＡ因子ともよばれるこの自己抗体は、ＲＡの特徴的な診断指標として古くから利用されてきた。
しかしながら、自己免疫疾患のひとつとして考えられているＲＡの病因は、未解明のままである。ＲＡ因子の検出に基づくＲＡの診断には、疾患に対する特異性および抗体が生じるシステムの解明もなされておらず、このため病因との関連がはっきりしていない。
ＲＡの病態を、（ａ）生体内における多彩な免疫反応、及び（ｂ）骨破壊を伴った関節滑膜の増殖という２つの側面からとらえた場合、前者の免疫反応に関しては多くの研究がなされ、その分子レベルの実体が明らかにされつつある。しかし、後者の関節滑膜細胞の研究に関しては、それがＲＡの主座であるにも拘らず、その細胞生物学的な特徴すら明らかにされていない。
そこでＲＡの病態解明のために、本発明者らは、慢性・難治性疾患の発症や進展の背後にある分子機序を調べた。まずＲＡ患者の培養ヒト滑膜細胞を免疫原として抗ヒト滑膜細胞抗体を得て、滑膜細胞のｃＤＮＡライブラリーをイムノスクリーニングしたところ、ＲＡ患者の滑膜組織で発現している新規な遺伝子を見出した。この遺伝子の単離にも成功し、それがコードするタンパク質を、発現している組織である滑膜細胞（ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｃｅｌｌ）にちなみ、シノビオリン（ｓｙｎｏｖｉｏｌｉｎ）と名づけ、その生理的意義を明らかにした（国際公開第ＷＯ０２／０５２００７号パンフレット）。発明者らが発見したシノビオリンは、ＲＡ疾患の主因である滑膜組織の異常増殖に密接に関連しており、診断においてきわめて重要な情報を与えることが期待される。また、シノビオリンは、タンパク質構造予測システムから、ＲＩＮＧフィンガーモチーフを有するＥ３ユビキチンライゲースをコードすることが分かっている。このモチーフは、タンパク質のユビキチン化に重要な役割を果たすが、実際、自己ユビキチン化活性を有することが証明されており、これによりタンパク質機能の制御も行なっていると推測される。
本発明者らは、シノビオリンによるシグナル伝達に関する研究を進めたところ、シノビオリンが自己ユビキチン化（ｓｅｌｆ−ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ）を起こすユビキチンリガーゼ作用を有することを初めて見出した。
【発明の開示】
上記のように、これまで、シノビオリンの自己ユビキチン化反応を阻害することができる抗体、上記抗体を含有する医薬組成物等の開発が望まれていた。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行なった結果、シノビオリンが自己ユビキチン化（ｓｅｌｆ−ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ）を起こすユビキチンリガーゼ作用を有することに基づき、シノビオリンの自己ユビキチン化を阻害する抗シノビオリン抗体を見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）シノビオリンの自己ユビキチン化を阻害することができる、シノビオリンに対する抗体又はその断片。この抗体又はその断片はシノビオリンの基質タンパク質のユビキチン化には影響しない場合もありうる。また、この抗体はモノクローナル抗体であってもよい。
（２）配列番号３〜５に示されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として免疫された動物の抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合によって得られるハイブリドーマにより産生される、シノビオリンに対するモノクローナル抗体又はその断片であって、シノビオリンの自己ユビキチン化を阻害することができる前記抗体又はその断片。
（３）配列番号３〜５に示されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として免疫された動物の抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合によって得られるハイブリドーマであって、シノビオリンの自己ユビキチン化を阻害することができるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
（４）シノビオリンの自己ユビキチン化を阻害することができる、シノビオリンに対するモノクローナル抗体の製造方法であって、配列番号３〜５に示されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として免疫された動物の抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合細胞を培養し、得られる培養物から前記モノクローナル抗体を採取することを特徴とする方法。
（５）（１）又は（２）に記載の抗体又はその断片を含有する医薬組成物。この医薬組成物は、例えば細胞増殖性疾患である、関節リウマチ、癌、線維症、動脈硬化、キャッスルマン病、多発骨髄腫、クローン病、全身型若年特発性関節炎、脳腫瘍、舌癌、咽頭癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆道癌、胆嚢癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、線維肉腫、骨肉種、軟骨肉腫、皮膚癌、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ球白血病、成人型Ｔ細胞白血病、悪性リンパ腫の治療又は予防のために使用することができる。
（６）（１）又は（２）に記載の抗体又はその断片を含有する、シノビオリンの自己ユビチキン化阻害剤。
（７）（１）又は（２）記載の抗体又はその断片を含有する、シノビオリン含有細胞検出用試薬。
（８）（１）又は（２）記載の抗体又はその断片を含有する、シノビオリンによる細胞増殖性疾患の検出用試薬。細胞増殖性疾患としては、例えば、関節リウマチ、癌、線維症、動脈硬化、キャッスルマン病、多発骨髄腫、クローン病、全身型若年特発性関節炎、脳腫瘍、舌癌、咽頭癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆道癌、胆嚢癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、線維肉腫、骨肉種、軟骨肉腫、皮膚癌、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ球白血病、成人型Ｔ細胞白血病、悪性リンパ腫などが挙げられる。
また、上記細胞は、滑膜細胞、破骨細胞、角化上皮細胞、血液細胞、癌細胞、骨髄細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、真皮細胞、筋細胞、神経細胞、リンパ球、血管平滑筋細胞、肝細胞、色素細胞、脂肪細胞、子宮内皮細胞、肺胞上皮細胞、未分化間葉系細胞、外胚葉頂堤からなる群から選択されてもよい。
（９）（１）又は（２）に記載の抗体又はその断片と、シノビオリンとを反応させることを特徴とする、シノビオリンの自己ユビキチン化を阻害する方法。
（１０）（１）又は（２）に記載の抗体又はその断片と、生体試料とを反応させることを特徴とする、シノビオリンの発現細胞を検出する方法。
（１１）（１）又は（２）に記載の抗体又はその断片と、被験者から採取された生体試料とを反応させることを特徴とする、シノビオリンによる細胞増殖性疾患の検出方法。細胞増殖性疾患及び細胞の種類は、前記と同様である。
また、上記細胞は、滑膜細胞、破骨細胞、角化上皮細胞、血液細胞、癌細胞、骨髄細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、真皮細胞、筋細胞、神経細胞、リンパ球、血管平滑筋細胞、肝細胞、色素細胞、脂肪細胞、子宮内皮細胞、肺胞上皮細胞、未分化間葉系細胞、外胚葉頂堤からなる群から選択されるいずれかの細胞であってもよい。
なお本明細書において引用されたすべての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＳＬ−１抗体による、関節リウマチ患者（ＲＡ：２検体）および変形性関節症患者（ＯＡ：２検体）患者由来滑膜細胞のウェスタンブロッティングの結果の写真を表す図である。
図２は、ＳＬ−１抗体によるＲＡ患者由来滑膜細胞の蛍光免疫染色結果の写真を表す図である。
図３は、ＳＬ−１抗体によるＲＡ患者由来滑膜組織の免疫染色結果及びヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色像を示す図である。
図４は、ＭＢＰ−ｄＴＭ  Ｓｙｎｏ−Ｈｉｓ融合タンパク質の自己ユビキチン化がＳＬ−１抗体により阻害されたことを示すウェスタンブロッティング解析の写真である。
図５は、ＧＳＴ−Ｐ４ＨＡ１融合タンパク質のシノビオリンによるユビキチン化がＳＬ−１抗体では影響されなかったことを示すウェスタンブロッティング解析の写真である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を詳細に説明する。
１．概要
本発明の抗体は、シノビオリンの自己ユビキチン化を阻害することができる、シノビオリンに対する抗体であり、シノビオリンのＲＩＮＧフィンガー領域の一部のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として免疫することにより得られたものである。
ユビキチン化とは、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）およびユビキチンリガーゼ（Ｅ３）などの酵素が協同して、基質となるタンパク質にユビキチンを次々と結合させていく過程である。このユビキチン化の生理的意義は、プロテオソーム系のタンパク質分解機構へ送られるためのタグ修飾として、従来認識されていた。そして、その後の研究により、現時点でのユビキチン化の意義は、タンパク質機能を制御する可逆的タンパク質修飾システムとして位置づけられている。
本明細書において「自己ユビキチン化（ｓｅｌｆ−ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ，ａｕｔｏ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ）」とは、シノビオリンがユビキチンリガーゼ活性を有することにより、シノビオリン自体がユビキチン化の基質タンパク質となり、他のユビキチンリガーゼによることなく自らユビキチンを結合させるものである。シノビオリンの自己ユビキチン化は、本発明者によりシノビオリンがユビキチンリガーゼ活性を有することが見出されて明らかとなった。すなわち、マウスにおいてシノビオリンを過剰発現することにより滑膜細胞の増殖を伴う関節症が自然発症する（国際公開第ＷＯ０２／０５２００７号パンフレット）（Ａｍａｎｏ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１７（１９）：２４３６−４９，２００３）。その一方、Ｅ３ユビキチンリガーゼのＲＩＮＧフィンガーモチーフは酵素の活性中心であり、同モチーフ中の１アミノ酸が置換されただけでもまったく酵素活性が失活してしまう。実際に、シノビオリンの酵素活性中心の１アミノ酸変異体（Ｃ３０７Ｓ）を発現させたマウスではまったく関節炎を呈さない（上掲、Ａｍａｎｏ．Ｔら）。このことはシノビオリンの機能発現には自己ユビキチン化が重要であり、シノビオリンの自己ユビキチン化こそがシノビオリンの代表的機能となりうることを示す。しかも、その自己ユビキチン化は、内在性のシノビオリンの完全長の分子で観察されるだけでなく、シノビオリンの細胞内部分のみとタグタンパク質の融合したシノビオリンにおいても生起することが明らかにされている。本発明者は以上の知見に基づいて鋭意研究を行い、本発明の抗体を完成させた。
本発明において「抗体」とは、抗原であるシノビオリン又はその部分断片に結合し得る抗体分子全体（ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい）を意味するが、さらに、その断片、すなわち抗原抗体反応活性を有する活性フラグメント、具体的には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、組換えＦｖ体、１本鎖Ｆｖも含まれる。
２．シノビオリン
（１）シノビオリンおよびその等価なタンパク質
シノビオリンに対する抗体を得るため、免疫原として、シノビオリンそのものの他に、それと同等の又は等価なタンパク質、それらのフラグメント又は部分ペプチドなどを用いることができる。そのいずれも抗シノビオリン抗体の抗原となり得る。その理由は、抗体は、一般に抗原がそのタンパク質構造全体の包括的な認識により誘導されるというよりは、むしろエピトープ部位として知られるタンパク質表面の小さい領域の認識により誘導されるものだからである。このようなエピトープ部位は、ポリペプチド鎖の連続した部分又は不連続部分によって形成される。したがって、シノビオリンに対する１種類の抗体について、エピトープとして作用する部位は、シノビオリンの限定されたあるペプチド部位に対応している。
本発明において使用するシノビオリンの種は、ヒト、マウス、ラットなどの由来のものであってもよく、特に限定されるものではない。シノビオリンとしては、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを使用することができる。
さらにシノビオリンと同等又は等価であるタンパク質もまた、抗原として用いることができる（後述）。
（２）生体材料からの調製
シノビオリンは、ＲＡ患者の滑膜組織から得ることができる。滑膜細胞はインビトロで培養することができるため、この培養物からシノビオリンを回収することが可能である。具体的には、ＲＡ患者から滑膜切除術（ｓｙｎｏｖｅｃｔｏｍｙ）により外科的に切除された滑膜組織等をもとに、この組織から滑膜細胞を分離する。分離した細胞を培養すれば、滑膜細胞を付着性細胞として回収することができる（Ｎａｋａｊｉｍａ  Ｔ  ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１８６−１９３，１９９３）。回収した細胞からは、公知のタンパク質精製技術を組み合わせてシノビオリンを抽出・精製する。得られたシノビオリン又はそのフラグメントは、抗体を得るための免疫原として用いることができる。
（３）遺伝子工学的手法による調製
シノビオリンは、生体材料のみならず、シノビオリンをコードする遺伝子を適当な発現系に組み込んで遺伝子組み換え体の発現産物として入手することもできる。
シノビオリンをコードするポリヌクレオチドは、その由来を問わない。すなわち、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡのほか、合成によって得ることもできる。また、核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。さらにシノビオリンをコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するポリヌクレオチド、あるいは修飾されたヌクレオチドを含有するものも含まれる。
シノビオリンをコードするポリヌクレオチドを単離するには、前記ＲＡ患者の滑膜細胞から抽出したｍＲＮＡをもとにｃＤＮＡライブラリーを得て、クローニングすればよい。すなわち、ｃＤＮＡライブラリーをＰＣＲなどで増幅して、ハイブリダイズするクローンをスクリーニングすることにより、所望するポリヌクレオチドを得ることができる（Ｓｈｏｒｔ  Ｊ．Ｍ，ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１６：７５８３−７６００，１９８８）。配列番号２で表されるポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号１に示す。シノビオリンをコードするポリヌクレオチドを適当な発現系に組み込むための好適なホスト／ベクター系として、発現ベクターｐＧＥＸと大腸菌を例示することができる。
この他にも、細菌をホストに利用する場合には、ヒスチジンタグ、ＨＡタグ、ＦＬＡＧタグ等を利用した融合タンパクの発現用ベクターが市販されている。ホスト／ベクター系として、Ｐｉｃｈｉａ属酵母を利用する発現系、あるいは昆虫細胞をホストとするバキュロウイルスベクターを利用した発現系は、糖鎖を備えたタンパク質の発現に有効である。さらに、哺乳動物の細胞を利用して、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、あるいはＳＶ４０等のプロモーターを利用したベクターのトランスフェクションが行われている。
また、本発明においては、上記シノビオリン遺伝子又は上記ベクターからシノビオリンを採取することも可能である。すなわち、本発明においては、生細胞を全く使用することなく無細胞タンパク質合成系を採用して、シノビオリンを産生することが可能である。
無細胞タンパク質合成系とは、細胞抽出液を用いて試験管などの人工容器内でタンパク質を合成する系である。なお、本発明において使用される無細胞タンパク質合成系には、ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成する無細胞転写系も含まれる。
この場合、上記の宿主に対応する生物は、下記の細胞抽出液の由来する生物に相当する。ここで、上記細胞抽出液は、真核細胞由来又は原核細胞由来の抽出液、例えば、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、マウスＬ−細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、出芽酵母、大腸菌などの抽出液を使用することができる。なお、これらの細胞抽出液は濃縮されたものであっても濃縮されないものであってもよい。
細胞抽出液は、例えば限外濾過、透析、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿等によって得ることができる。さらに本発明において、無細胞タンパク質合成は、市販のキットを用いて行うこともできる。そのようなキットとしては、例えば試薬キットＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ（東洋紡）、ＴＮＴＴＭ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）、合成装置のＰＧ−ＭａｔｅＴＭ（東洋紡）、ＲＴＳ（ロシュ・ダイアグノスティクス）などが挙げられる。
上記のように細胞タンパク質合成によって得られるシノビオリンは、前述のように適宜クロマトグラフィーを選択して、精製することができる。
（４）シノビオリンと「機能的に同等なタンパク質」
抗シノビオリン・モノクローナル抗体を調製する際の抗原となり得るタンパク質には、滑膜細胞から抽出されるヒト・シノビオリンのみならず、シノビオリンと機能的に同等な種々のタンパク質も含まれる。このようなタンパク質は、人工的であると自然に生じたものであるとを問わず、ヒト・シノビオリンのアミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入などにより変異したタンパク質、あるいはアミノ酸側鎖などが修飾されている修飾タンパク質、他のタンパク質との融合タンパク質も含まれる。
これらタンパク質におけるアミノ酸の変異又は修飾の数、あるいは変異又は修飾の部位は、シノビオリンの機能が保持される限り制限はない。例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１個若しくは複数個（例えば１個又は数個）のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入などにより変異したタンパク質、又はアミノ酸側鎖などが修飾されている修飾タンパク質を使用することができる。
具体的には、
（ｉ）配列番号２に示すアミノ酸配列のうち１個又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば１個〜１０個、さらに好ましくは１個〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号２に示すアミノ酸配列のうち１個又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば１個〜１０個、さらに好ましくは１個〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換したアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号２に示すアミノ酸配列のうち１個又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば１個〜１０個、さらに好ましくは１個〜５個））の他のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列、又は
（ｉｖ）上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）を組み合わせたアミノ酸配列からなり、かつ上記シノビオリンと同様の作用を有する変異型のシノビオリンポリペプチドを使用することもできる。
また、本発明で用いられるポリペプチドは、シノビオリンと同等の機能を有する限り、上記のシノビオリンのアミノ酸配列とホモロジーを有するポリペプチドでもよい。上記シノビオリンポリペプチドのアミノ酸配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
このような配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９８７−１９９７）、Ｋｕｎｋｅｌ  Ｔ．Ａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−９２，１９８５、等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。
また、ポリヌクレオチドに変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。
上記「機能的に同等なタンパク質」として、第１にシノビオリンと免疫学的に同等なタンパク質を示すことができる。すなわちシノビオリンと機能的に同等なタンパク質として、シノビオリンを特異的に認識し、ＲＡ患者の血清中に存在する抗体と反応するものであれば、シノビオリンのドメインを含むものである。
第２に、シノビオリンと機能的に同等なタンパク質は、シノビオリンに結合するリガンドタンパク質との結合特性に基づいても定義される。例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ３（Ｈｒｄ３）、プロコラーゲン−プロリン、２−オキソグルタル酸  ４−ジオキシゲナーゼ（プロリン  ４  ヒドラキシラーゼ（ｈｙｄｒａｘｙｌａｓｅ））、α  ポリペプチド  Ｉ（Ｐ４ＨＡ１）、Ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｉｎｄｕｓｉｂｌｅ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｓｉｂｌｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｍｅｍｂｅｒ  １（Ｈｅｒｐ）などである（特願２００３−２９５９５１、特願２００４−０７６９３１、特願２００３−３５０７０４）。
第３に、ヒト・シノビオリンと機能的に同等なタンパク質として、滑膜増生を促進する活性を有するタンパク質が挙げられる。ヒト・シノビオリン遺伝子が導入されたトランスジェニックマウスでは、有意な頻度で関節炎を伴う指の膨脹が観察され、組織学的には、これらの指関節で滑膜増生を伴う骨破壊と異常な骨新生が認められた。
第４に、ヒト・シノビオリンと機能的に同等なタンパク質として、正常な骨形成または四肢の発達に貢献する活性を有するタンパク質が挙げられる。シノビオリンは発生において頭頂骨、四肢、耳などの骨および軟骨が形成される部位に強く発現しており、四肢形成期においてはＡｐｉｃａｌ  Ｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ  Ｒｉｄｇｅ（ＡＥＲ；外胚葉頂堤）および軟骨・骨原基に強い発現が観察されている。
第５に、本発明によるシノビオリンと機能的に同等なタンパク質は、シノビオリンが有する生化学的な活性、たとえばユビキチンリガーゼ活性に基づいて定義することもできる。これらの生化学的な活性は、シノビオリンに見出された各種のモチーフ、実験結果などに裏付けられている。
（５）シノビオリンとの融合タンパク質または修飾タンパク質
シノビオリンと機能的に同等なタンパク質には、アミノ酸残基の修飾、保存的置換、欠失、付加または挿入、糖鎖等の生理的または人為的な修飾、蛍光や放射性物質のような標識、あるいは他のタンパク質との融合といった各種の修飾を加えたタンパク質も含まれる。たとえば上述の遺伝子組み換え体においては、発現させる宿主によって糖鎖による修飾に差異が生じる可能性がある。しかし、たとえ糖鎖の修飾に違いを持っていても、シノビオリンと同様の性状を示すものであれば、いずれもシノビオリンまたはそれと機能的に同等なタンパク質である。
他のタンパク質との融合タンパク質の例として、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、あるいはヒスチジンタグなどの付加的なアミノ酸配列が付加され、前記シノビオリンに機能的に同等なタンパク質として少なくとも一つの性状を維持したタンパク質がある。あるいはシノビオリンとは異なる活性を有していても、シノビオリンが有する少なくとも一つの機能を維持している融合タンパク質も挙げられる。
シノビオリンは、その細胞内ドメインだけであっても、自己ユビキチン化されることから、本発明に用いるシノビオリンは、細胞膜貫通部位を除いたシノビオリンｄＴＭであってもよい。例えば、当該ｄＴＭに上記のタグタンパク質を融合させたＭＢＰ−シノビオリンｄＴＭ−Ｈｉｓも本発明において用いることができる。
あるいはシノビオリンとは異なる活性を有していても、シノビオリンが有する少なくとも一つの機能を維持している融合タンパク質も挙げられる。
３．抗原の調製
抗シノビオリン抗体を作製するための抗原として、上述したようにシノビオリン又はそれと同等なタンパク質を用いることができる。しかしながら、抗体の検出においては、抗原分子そのもの（すなわち、シノビオリン又はそれと等価なタンパク質）のみならず、それらのタンパク質のフラグメント、断片ペプチド、化学的に合成したオリゴペプチドを適切な担体とともに含む複合体を抗原として用いる方法が採用されることも多い。その理由は、とくに優勢なエピトープ、あるいは臨床的になんらかの意味を持つエピトープに特異的である分析系としたほうが非特異的な反応の影響を受けにくくなるためである。すなわち、後述するハイブリドーマのクローニングおよびクローン選別が効率的に実施でき、しかも抗体価の高い抗シノビオリン・モノクローナル抗体を得ることができるためである。エピトープ部位として抗原タンパク質の高次構造における多数の領域を認識させるよりは、それより低次でも特定のしかも少数の特定構造を認識させるようにするのが好ましい。
シノビオリンに対し特異性および親和性が高いモノクローナル抗体を得る場合においても、このようなアプローチは有効である。具体的には、後述する免疫学的に活性なドメインペプチドを得る方法に基づいて、エピトープとして機能するドメインを決定することができる。
エピトープは少なくとも３アミノ酸残基で構成できる場合のあることが知られている。また他のタンパク質との免疫学的な識別は、少なくとも８アミノ酸残基で可能となるといわれている。したがって、シノビオリン又はそれと等価なタンパク質のアミノ酸配列から選択された少なくとも連続した８アミノ酸残基、通常９アミノ酸残基、好ましくは１０アミノ酸残基、より好ましくは１１〜１５アミノ酸残基からなり、とくに患者血清中の抗体と反応する断片は、本発明における抗体検出用の抗原として望ましい。
さらに、エピトープを構成するオリゴペプチドに対して、様々な修飾を加えて免疫学的な反応性を向上させる方法も当業者には公知である。たとえば、ヒト血清アルブミンのような不活性タンパク質、あるいは無意味なアミノ酸配列の付加といった修飾が免疫学的な反応性の向上に寄与する。
シノビオリンの断片は、トリプシン、キモトリプシン、ペプシンなどのプロテアーゼを使った酵素消化又はブロモシアンなどを用いる化学的切断、あるいはそれらを組み合わせることにより得ることができる。生成したペプチド混合物から、目的のペプチドを分離精製するには、クロマトグラフィー、電気泳動法などの公知の分離技術を利用すればよい。
別の方法として、シノビオリンをコードするＤＮＡをランダムに切断し、それをファージベクターに挿入してドメインペプチドを提示したファージライブラリーを作成することによっても得ることができる。これらのライブラリーを、シノビオリンを認識する抗体でイムノスクリーニングすれば、免疫学的に活性なドメインを決定することができる。
上述の戦略的観点から、シノビオリンの親水性プロファイルとその他の抗原性指標を検索する解析法によって、まずアミノ酸残基数１４個以上の好適と想定されるペプチド部分が決定される。免疫原候補としてのこれらのペプチドは、公知技術である液相法または固相法によるペプチド合成技術により合成することができる。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ法に代表される固相合成法が、簡便で短時間に行うことができる。
α−アミノ保護基として、標準的には第三ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）が用いられるが、Ｓｈｅｐｐａｒｄらが開発した９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基（Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ｅ  ＆  Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｒ．Ｃ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．１６５，１９８５）も利用可能である（泉屋信夫、他著「ペプチド合成の基礎と実験」１９４〜２３３ページ、丸善、１９８５年を参照）。
本発明においては、固相合成法に基づく自動化ペプチド合成機を利用してもよい。合成されたペプチドは、トリフルオロ酢酸などの存在下で樹脂から切り離し、次いで逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製する。精製ペプチドは８５％以上の純度を有することが望ましい。
上記候補ペプチドのうち、免疫感作動物から採取されるポリクローナル抗体とシノビオリンとを反応させ、酵素標識抗ＩｇＧ抗体による検出反応で陽性を示すペプチドを、本発明の抗体作出用の免疫抗原とする。
免疫原として、とくに有用なシノビオリンの断片として、以下のアミノ酸配列を含む少なくとも１つのペプチドが挙げられる。
Ｓｙｎｏ−Ｐ３（ＳＬＡＬＴＧＡＶＶＡＨＡＹＹＣ／配列番号：３）、
Ｓｙｎｏ−Ｐ２（ＴＣＲＭＤＶＬＲＡＳＬＰＡＱＳ／配列番号：４）、および
Ｓｙｎｏ−Ｐ１（ＧＡＡＴＴＴＡＡＧＴＳＡＴＡＣ／配列番号：５）
これらのペプチドを担体タンパク質と結合させて調製された免疫原は、シノビオリンに対して特異的で、かつ十分な結合親和性を有する抗体を与える。免疫原として有用なシノビオリンの上記ペプチドをスカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）を担体タンパク質として結合させてから、動物に感作させる。
免疫原を得るために使用できるその他の担体物質として、ツベルクリン精製タンパク質誘導体、破傷風変性毒素、コレラ毒素およびそのＢサブユニット、ジフテリア毒素、オボアルブミン、ウシ血清アルブミン、大豆トリプシンインヒビター、ムラミルジペプチド、ブラウンのリポタンパク質などが挙げられる。ペプチドを担体タンパク質に結合させるための反応、試薬などは公知の文献に記載されている（例えば、大海忍、他著  細胞工学別冊  実験プロトコールシリーズ  新版  抗ペプチド抗体実験プロトコール「遺伝子産物の同定からタンパク質機能解析まで」秀潤社  １９９４年；Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１，ｐ．９．４．１−９．４．１１，１９９１）。
４．免疫
（１）シノビオリンに対するポリクローナル抗体の作製
上記の通り作製した抗原を哺乳動物に投与する。哺乳動物は特に限定されるものではなく、例えばラット、マウス、ウサギなどが挙げられるが、ウサギが好ましい。
抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは、ウサギで１〜１０ｍｇであり、アジュバントを用いるときは０．１〜１ｍｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内等に注入することにより行う。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日〜数週間間隔、好ましくは２〜５週間間隔で、１〜１０回、好ましくは２〜５回免疫を行う。そして、最終の免疫日から６〜６０日後に、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）又はＥＩＡ（ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ））、放射性免疫測定法（ＲＩＡ；ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ  ａｓｓａｙ）等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。
その後は、これらタンパク質に対する抗血清中のポリクローナル抗体の反応性をＥＬＩＳＡ法などで測定する。
（２）シノビオリンに対するモノクローナル抗体の作製
（ｉ）抗体産生細胞の採取
モノクローナル抗体の調製のためには、免疫用抗原となるシノビオリンもしくは免疫学的に同等のタンパク質、またはそのフラグメントもしくは断片ペプチドを免疫原として哺乳動物の抗体産生が可能な部位に、単独で、または担体および希釈剤とともに投与する。その際、抗体産生能力を高めるため、アジュバントなどを混ぜて投与してもよい（Ａｄｖ．Ｔｕｂｅｒｃｌ．Ｒｅｓ．，１：１３０−１４８，１９５６）。アジュバントとしては、ＦＣＡ、ＦＩＡ、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。
モノクローナル抗体は、免疫担当細胞（具体的には抗体産生細胞）と骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）との間に融合細胞を形成させ、当該細胞をクローニングし、シノビオリンに特異的な抗体を産生するクローンを選択することにより得ることができる（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−７，１９７５）。
免疫には、免疫原として上記ペプチドを含む複合体（またはシノビオリンもしくはそれと免疫学的に同等なタンパク質、またはそれらの断片）を用い、１回当たり、たとえば２０μｇ〜１ｍｇ、適当なアジュバントと溶解もしくは混和して免疫動物に免疫感作する。
免疫動物として用いる哺乳動物は、マウス、モルモット、ウサギ、ラット、ヒツジ、ヤギ、サル、イヌなどが挙げられるが、一般に扱いやすさなどから、とくにマウスまたはウサギが好ましく用いられる。抗体産生細胞と骨髄腫細胞とは同種動物由来であるほうが望ましい。投与は、通常３〜６ヶ月間の期間において、２〜６週ごとに１回ずつ２〜１０回程度行なわれる。
抗体産生細胞の採取は、抗原感作された上記動物から抗体価が認められた個体を選択し、最終免疫の２〜５日後に脾臓細胞、リンパ節細胞またはＢ−リンパ球を採取する。それらに含まれる抗体産生細胞と自立増殖能を有する骨髄腫細胞とを融合させる。生成するハイブリドーマから本発明の抗シノビオリン・モノクローナル抗体を産生するクローンを選択することにより、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを調製することができる。その手順は、基本的には、ケーラーの方法に準じて行えばよい（”Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，３９１，１９７９）。
（ｉｉ）細胞融合
融合操作は公知の技術を使用することができ、たとえば、上記ケーラーとミルスタインの方法が挙げられる。骨髄腫細胞（ミエローマ）として、Ｐ３Ｕ１、ＮＳ−１、ＳＰ２／０といったマウス骨髄腫由来の細胞株またはその変異株などが挙げられるが、とくにＰ３Ｕ１が好ましく用いられる。融合促進剤としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルスなどが挙げられ、好ましくは、ＰＥＧが用いられる。融合は、血清を含有しないＲＰＭＩ１６４０培地などに骨髄腫細胞を浮遊させ、この浮遊液に上記で調製した脾細胞などの抗体産生細胞を含む液を加えてしばらく静置する。軽く遠心分離して細胞を回収し、ＰＥＧを含むＲＰＭＩ１６４０培地を加えて、３７℃で２〜４分間インキュベートすることにより細胞融合は完了する。
反応物を遠心分離して回収したハイブリドーマは、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）培地に移し、たとえば９６ウェルマイクロプレートに分注したのち、所定期間培養する。培養は、通常５％の炭酸ガス下、インキュベータ中で、２０〜４０℃、好ましくは３４〜３８℃である。通常１週間後には、ハイブリドーマが生育してコロニー形成が観察される。培養の期間は通常、５日〜３週間、好ましくは１〜２週間である。
（ｉｉｉ）抗体スクリーニングおよびクローニング
モノクローナル抗体の選別は、通常はＨＡＴを添加した動物細胞培養基などで行うことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものであればとくに制限はない。たとえばハイブリドーマ培養用無血清培地、牛胎仔血清（ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ；ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ培地、ＧＩＴ培地などを用いることができる。
増殖の見られたウェルの培養上清中のペプチドに対する抗体価を酵素抗体法などによって測定し、たとえば限界希釈法によってハイブリドーマのクローニングを行って本発明のハイブリドーマのクローンを得る。
形成された本発明のハイブリドーマをスクリーニングする操作は、一般に次のとおりである。免疫原として用いたペプチドを直接にまたは担体とともに吸着させたマイクロプレートなどの固相へ、ハイブリドーマ培養上清を添加し、次いで放射性物質、酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法が便利である。あるいは抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、次いで標識抗原を加えて、固相に結合したモノクローナル抗体を検出してもよい。
上記操作により陽性ウェルを選択し、数日してから、一株につき９６ウェルプレート１枚に、たとえば１００細胞／プレートとなるように撒き、１０〜１４日間培養する。コロニーを判定し、培養上清を上記スクリーニング用抗原固相化プレートに適用して、検定を同様に行なう。選択したコロニーは、培養後、リクローニングし、１０〜１４日間培養してコロニー判定および培養上清の検定を上記と同様に実施する。親株別にウェルを選択し、２４ウェルプレートで培養し、上清を回収してクローンのチェックを行い、抗体のサブクラスおよび抗体産生を検定する。
（ｉｖ）モノクローナル抗体の産生およびその分離
上記のようにして選別されたクローンＳＬ−１を生体内外で培養すると、本発明のモノクローナル抗体であるＳＬ−１抗体が産生される。その培養には、当該技術分野において慣用されている方法を使用することができる。
ハイブリドーマＳＬ−１を生体外の培養培地で培養した場合、その培養物からＳＬ−１抗体を分離すればよい。増殖速度、抗体産生効率の向上には、培地の種類の選択と維持、培養条件の管理（たとえば培地内酸素濃度、撹拌速度、汚染）が求められる。
ヒトを除く温血動物を利用してクローンを培養した場合、その腹水および／または血液からモノクローナル抗体を採取する。たとえば所定の細胞密度になるようにクローンを、ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地などに接種したのち、インキュベータ中、５％炭酸ガスの存在下、３７℃で培養する。次いでその培養物を、予めプリスタンを投与しておいたマウスの腹腔内に接種し、所期の期間、通常の方法で飼育する。通常１〜２週間してから、腹水を採取し、これに硫酸アンモニウムを添加して塩析沈殿を得る。その分画からクロマトグラフィーなどを利用してモノクローナル抗体を分離精製する。
培養物または腹水および／または血液からモノクローナル抗体を単離する方法は、通常のポリクローナル抗体の精製方法と同じであり、免疫グロブリンの分離精製法による。すなわち、塩析法、透析法、濾過法、濃縮、アルコール沈殿法，等電点沈殿法、各種電気泳動法、イオン交換体（ＤＥＡＥ樹脂など）による吸脱着法、超遠心法、ゲル濾過法、特異的アフィニティ精製法などを適宜組合わせて利用することによる。生成したモノクローナル抗体は、その後濃縮、乾燥し、用途に応じて液状または固体状とする。
（ｉｖ）ヒト化又はヒト型化抗体
本発明において、抗体は、ヒト型化又はヒト化されたものも含まれる。
ヒト抗体は、免疫系をヒトのものと入れ換えた哺乳動物を免疫すれば、通常のモノクローナル抗体と同様にして作製することができる。
ヒト型化抗体は、定常領域と可変領域の一部がヒト型の抗体であり、可変領域において、フレームワーク領域（ＦＲ）はヒト由来のものを、ＣＤＲと呼ばれる相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）はマウス由来のものからなる再構成した抗体である。ヒト型化抗体を作製する場合は、マウス抗体の可変領域からＣＤＲをヒト可変領域に移植して、次にこれらのヒト型化された再構成ヒト可変領域をヒト定常領域に連結する。ヒト型化抗体の作製法は、遺伝子工学的手法により得ることができ、当分野において確立されている（杉村和久「本格化する抗体医療！抗体エンジニアリングと抗体医薬のすべて」ＢｉｏベンチャーＶｏｌ．２  Ｎｏ．４  羊土社  ２００２年）。
（３）本発明の抗体の特徴
（ｉ）シノビオリンの自己ユビキチン化を阻害することができる。
すなわち、シノビオリンの自己ユビキチン化が原因となる疾患の治療に用いることができる。
（ｉｉ）シノビオリンの基質タンパク質Ｐ４ＨＡ１のユビキチン化には影響しない。
すなわち、Ｐ４ＨＡ１のユビキチン化に関わる生理機能には影響を及ぼさない。
（ｉｉｉ）本発明の抗体のアイソタイプはＩｇＧ１である。
５．本発明のモノクローナル抗体の用途
本発明の抗体（例えばＳＬ−１抗体）は、シノビオリン又はその部分ペプチドを特異的に認識することができるため、様々な利用形態が考えられる。以下に、ＳＬ−１抗体を例にして、典型的な利用の態様をいくつか示す。
（１）シノビオリンの自己ユビキチン化反応の阻害
ユビキチン化は、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）およびユビキチンリガーゼ（Ｅ３）が共同して基質タンパク質にユビキチンを次々と結合させていく過程である。上述のように、シノビオリンの自己ユビキチン化とは、シノビオリンがユビキチンリガーゼ活性を有することにより、シノビオリン自体がユビキチン化の基質タンパク質となり、他のユビキチンリガーゼではなく自らユビキチンを結合させるものである。
上記のユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）などの酵素類は、市販されており、これらを適宜使用することができる。９６マイクロプレートのウェル当たり、Ｅ１は、１０〜５０ｎｇの範囲、好ましくは２０〜４０ｎｇの範囲で、Ｅ２は、０．１〜０．５μｇの範囲、好ましくは０．２〜０．３μｇの範囲で用いられる。
ユビキチン化に必要な低分子反応因子として、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４などのＭｇ塩、ＡＴＰ、ＥＤＴＡ、ＮＡＦ、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、オカダ酸などを適宜選択して使用することができる。これらの化合物も市販されており、入手は容易である。
さらに酵素類又は試薬を溶解する緩衝液、洗浄用緩衝液、測定用緩衝液、反応停止緩衝液などは、酵素を失活させ、あるいは反応を阻害しないものであれば、任意の公知緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）を使用することができる。
Ｈｉｓタグ融合タンパク質ＭＢＰ−ｄＴＭ  Ｓｙｎｏ−Ｈｉｓを用い、上記のように作製したモノクローナル抗体、抗ＦＬＡＧ抗体またはマウスＩｇＧと混合させ、４℃で１．５時間、抗原抗体反応を行う。
その後、自己ユビキチン化反応を行う。シノビオリンの自己ユビキチン化反応は、通常以下の条件で行うことができる。反応溶媒となる緩衝液（ｐＨ６〜８）の一定量に、シノビオリンの自己ユビキチン化に必要な反応物質（シノビオリンまたはその活性誘導体を除く）をそれぞれ上記の所定量加え、室温で５〜３０分間インキュベートする。次いでシノビオリンまたはその活性誘導体、あるいは固定化されたシノビオリンの活性誘導体を添加して、シノビオリンの自己ユビキチン化反応を開始する。室温〜３７℃の一定温度のもとで、２０〜１２０分の一定時間のインキュベーションを行い、停止緩衝液（０．２Ｍホウ酸緩衝液、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００およびＥＤＴＡを含有する）を一定量加えることにより反応を停止させる。そして、シノビオリンに結合したユビキチンまたは結合しなかったユビキチンの量を測定して、自己ユビキチン化の程度を求める。
（２）検査・診断、治療効果又は薬効の判定への利用
シノビオリンはＲＡ患者の滑膜組織において強発現している。また、ＲＡ患者の血中においては、シノビオリンを認識する抗体（自己抗体）が高い頻度で検出される。他方、健常者の血中では、シノビオリンの抗体は実質的に検出することができない。さらにシノビオリンは、インビトロにおいて培養滑膜細胞の増殖を抑制する。これは、滑膜細胞の増殖を促進するリガンドに対して、シノビオリンが競合するためであると考えられる。これらの情報を基に、次のような分子的機序が想定できる。すなわち、シノビオリンの滑膜細胞における強発現が、滑膜細胞に対して増殖促進作用を持つシノビオリンのリガンドとの結合を促し、結果として滑膜細胞の増殖が促進される。そしてこの滑膜細胞の異常増殖こそがＲＡの病態に他ならない。
このような知見に基づいて、ＳＬ−１抗体の免疫学的な特性を利用することにより、細胞増殖性疾患の検出方法または診断方法が提供される。細胞増殖性疾患は、例えば、関節リウマチ、癌、線維症、動脈硬化、キャッスルマン病、多発骨髄腫、クローン病、全身型若年特発性関節炎、脳腫瘍、舌癌、咽頭癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆道癌、胆嚢癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、線維肉腫、骨肉種、軟骨肉腫、皮膚癌、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ球白血病、成人型Ｔ細胞白血病、悪性リンパ腫などが挙げられるがこれらに限定されない。また、癌に関しては原発性、転移性を問わない。また、細胞は、滑膜細胞、破骨細胞、角化上皮細胞、血液細胞、癌細胞、骨髄細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、真皮細胞、筋細胞、神経細胞、リンパ球、血管平滑筋細胞、肝細胞、色素細胞、脂肪細胞、子宮内皮細胞、肺胞上皮細胞、未分化間葉系細胞、外胚葉頂堤などが挙げられるがこれらに限定されない。
これらの方法は、
（ｉ）被検者の生体試料と本発明の抗体とを反応させて、試料中に存在する疾患のマーカーを検出する工程、および
（ｉｉ）工程（ｉ）の検出結果を、疾患と関連付ける工程
を含む。
上記マーカーは、以下の（ａ）〜（ｄ）に示すいずれかのマーカーを用いることができる。これらのマーカーの測定方法は、後述する。
（ａ）シノビオリンまたはシノビオリンと機能的に同等なタンパク質、
（ｂ）シノビオリンまたはシノビオリンと機能的に同等なペプチド、
（ｃ）シノビオリンまたはシノビオリンと機能的に同等なタンパク質に結合する抗体、および
（ｄ）シノビオリンまたはシノビオリンと機能的に同等なペプチドに結合する抗体
たとえば、被検者から採取された血液試料中に、シノビオリンまたはシノビオリンと機能的に同等なタンパク質もしくはペプチドと反応する抗体が見出されれば、その被検者はＲＡである可能性が高い。
あるいは、患者から採取された滑膜組織におけるシノビオリンまたはシノビオリンと機能的に同等なタンパク質の発現は、ＲＡに起因する滑膜組織の増成を示している。タンパク質の発現は、一般にタンパク質自体またはその情報を担うｍＲＮＡの存在を指標として検出することができる。シノビオリンの検出のためには、本発明のＳＬ−１抗体が、好ましく利用される。滑膜細胞、滑膜組織等、または体液中におけるシノビオリンが検出される場合には、ＲＡが進行していると考えられる。
本発明の抗体を含む免疫学的分析用試薬は、ＲＡの診断のほかに、治療効果もしくは薬効の判定にも有用である。ＲＡの治療効果もしくは薬効の判定もまた、基本的にはＲＡの診断と同様の方法で行われる。滑膜組織や血液中におけるシノビオリンまたはその抗体のレベルが、それらのタンパク質をコードする遺伝子の発現消長に関係しており、それらの検出は、症状の推移、疾患の寛解を示す指標としての意義を有するからである。
さらに本発明のＳＬ−１抗体は、シノビオリンを発現する細胞の分離あるいは検出に利用することができる。滑膜細胞、破骨細胞、角化上皮細胞、血液細胞、癌細胞、骨髄細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、真皮細胞、筋細胞、神経細胞、リンパ球、血管平滑筋細胞、肝細胞、色素細胞、脂肪細胞、子宮内皮細胞、肺胞上皮細胞、未分化間葉系細胞、外胚葉頂堤などが挙げられるがこれらに限定されない。シノビオリンは、発生においては外胚葉頂堤で発現が見られるほか、リウマチ滑膜細胞、並びに滑膜、骨・軟骨および肢の原基となる未分化間葉系細胞において強く発現している。したがってシノビオリンは、特に、外胚葉頂堤、リウマチ滑膜細胞及び未分化間葉系細胞のマーカーとして使用するのが好ましい。
すなわち、シノビオリンの発現を指標に、滑膜細胞、破骨細胞、角化上皮細胞、血液細胞、癌細胞、骨髄細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、真皮細胞、筋細胞、神経細胞、リンパ球、血管平滑筋細胞、肝細胞、色素細胞、脂肪細胞、子宮内皮細胞、肺胞上皮細胞、未分化間葉系細胞、外胚葉頂堤、特に、外胚葉頂堤、リウマチ滑膜細胞および未分化間葉系細胞を検出又は分離することができる。例えば、シノビオリンに対する抗シノビオリン・モノクローナル抗体を、適宜蛍光等により標識して細胞と反応させ、セルソーティング等によりシノビオリンを発現する細胞を分離することができる。分離された未分化間葉系細胞は、インビトロまたはインビボにおいて、組織、例えば、筋、腱、脂肪、及び骨髄等の間質（ｓｔｒｏｍａ）、骨・軟骨の形成、あるいは関節の再構築に有用である。再構築された組織や器官は、基礎的研究の利用のほか、再生医学的応用が期待される。
本発明の抗体は、シノビオリンを精製するための抗体カラムの作成、精製時の各分画中に存在する該タンパク質の検出に利用してもよい。もっとも、本発明に係る特異的な抗シノビオリン・モノクローナル抗体の利用は、これらの用途のみに限定されるものではない。
（３）免疫学的分析用試薬を用いた分析
次に、ＳＬ−１抗体を含む免疫学的分析用試薬は、上記の用途のためにどのような態様で使用されるかについて具体的に述べる。
サンプル中の抗原もしくは抗体に対する免疫学的分析方法には多くの手法が一般に普及している。シノビオリンまたはそのフラグメントなどに対してモノクローナル抗体を用いる測定法は、とくに特定の方法に限定されるものではなく、検体中の抗原量、すなわちシノビオリンの量に対応した抗体又は抗原・抗体複合体の量を化学的又は物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準溶液を用いて作成した検量線から算出する測定方法であれば、いずれの方法を用いてもよい。抗原・抗体複合体の量の検出方法として、具体的には競合法、イムノメトリック法、ネフェロメトリー（ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｙ）、サンドイッチ法などが好適に用いられるが、感度および特異性の見地から、次のサンドイッチ法がとくに好ましい。
サンドイッチ法（例えばＥＬＩＳＡ法）では、固相化した本発明のＳＬ−１抗体に検体（定量対象であるシノビオリンを含有）を反応させ（１次反応）、さらに標識化した抗シノビオリン抗体を反応させた（２次反応）のち、固相化担体上の標識剤の活性を測定することにより、検体中のシノビオリンなどの量を定量できる。この場合、１次反応と２次反応は逆順序におこなってもよく、同時に行なってもよいし、時間をずらして行なってもよい。２次反応に用いられる抗体は、シノビオリンの結合する部位が本発明のＳＬ−１抗体と相異なる抗体が好ましく用いられる。
本発明のモノクローナル抗体を使用するイムノメトリック法では、検体中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化モノクローナル抗体に対して競合反応をさせた後に、固相と液相とを分離する。あるいは検体中の抗原と過剰量の標識化モノクローナル抗体とを反応させ、次いで固相化抗原を加えて未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相とを分離する。次に何れかの相の標識量を測定し検体中の抗原量を定量する。
競合法では、検体中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原（Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ、Ｆのいずれかの標識量を測定し検体中の抗原量を定量する。別の方法として、抗体には可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、上記抗体に対する第２抗体などを使用する液相法、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは第１抗体は可溶性のものを用い、第２抗体として固相化抗体を用いてもよい。たとえば、担体上に固相化した本発明の抗シノビオリン・モノクローナル抗体および標識化された抗体と検体とを同時又は連続的に競合反応させた後、固相化担体上の標識剤の活性を測定することも可能である。
ネフェロメトリーでは、ゲル内または溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物量を測定する。検体中の抗原量が少量であるため微量の沈降物しか得られない場合には、レーザー散乱を利用するレーザーネフェロメトリーなどが好ましく用いられる。
サンプル中の抗体を検出・分析するためには、抗原感作プレートをサンプル中の抗体と反応させ、プレート表面に捕捉される検出対象となる抗体を、特異的な抗原とする標識抗体で検出する方法が、抗体の免疫学的分析方法としてもっともポピュラーな方法である（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，８：８７１−８７９，１９７１）。あるいはプレート上の未結合抗原を検出するための標識抗体として、本発明のＳＬ−１抗体を使用してもよい。また抗原を吸着させたラテックス粒子をサンプルと混合し、免疫学的な凝集反応として抗体を検出する方法も公知である（Ｐｌｏｔｚ  Ｃ．Ｍ  ＆  Ｓｉｎｇｅｒ  Ｊ．Ｍ，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２１：８８８−８９２，１９５６）。免疫学的粒子凝集反応は１試薬で迅速な分析が可能な方法であり、大規模なスクリーニングには好適な方法である。
本発明のＳＬ−１抗体を細胞の分離又は検出用試薬として用いる場合には、抗シノビオリン・モノクローナル抗体を他の溶媒や溶質と組み合わせて組成物とすることができる。たとえば、蒸留水、ｐＨ緩衝試薬、塩、タンパク質、界面活性剤などを組み合わせることができる。
反応試薬は適当な化学的または物理的検出手段により検出可能な標識を有する。そのような標識物質を用いる測定法に使用される標識剤として、たとえば蛍光物質、酵素、放射性同位元素、発光物質などが用いられる。標識にとくに酵素を用いた場合は、ＥＬＩＳＡ法と呼ばれ、広く利用されている。
蛍光物質として、フルオレスカミン、フルオレッセインイソチオシアネートなど、酵素として、パーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸脱水酵素、α−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼなど、放射性同位元素として、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃなど、発光物質として、ルシフェリン、ルシゲニン、ルミノール、ルミノール誘導体などが例示される。
さらに本発明のＳＬ−１抗体または抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いてもよい。抗原またはモノクローナル抗体の固相化には、物理的吸着を用いてもよく、あるいは通常タンパク質または酵素などを固相化、固定化するために用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体として、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコンなどの合成樹脂、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、あるいはガラスなどが用いられる。
反応媒体として、反応の至適条件を与えるか、反応生成物質の安定化などに有用な緩衝液、反応物質の安定化剤などが含まれる。
検出手段としては、分光器、放射線検出器、光散乱検出器といった上記標識を検出可能なものである。
（４）検査診断用キット
本発明のＳＬ−１抗体を免疫学的測定方法に適用する場合、特別の条件、操作などは必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作に準じて行なわれ、必要であれば若干の修飾を加えて好適な測定系が構築できる。
そのためのもっとも簡便かつ効率的に測定を行なうことを可能とするのは、上記試薬をキット化することである。そうしたキット化により、通常の検査室または実験室で、特殊な分析機器、熟練した操作、高度の知識は必要とせずに、効率的に定量を行なうことができる。上記の各種診断方法または治療の判定方法を実施するためのアッセイキットの構成および形態は、とくに限定されるものでなく所定の目的を達成できるものであればその内容は限定されない。一般には上記検体試料について、アッセイ方法を実行し得られた結果を解釈するための使用説明書、反応試薬、反応が行なわれる場となる反応媒体、アッセイの場を提供する基材などから構成される。さらに所望により、比較基準とするためのあるいは検量線を作成するための照合サンプル、検出器なども含んでもよい。
（５）医薬組成物
本発明の抗体は、細胞増殖性疾患の治療又は予防用医薬組成物として有用である。細胞増殖性疾患としては、例えば、関節リウマチ、癌、線維症、動脈硬化、キャッスルマン病、多発骨髄腫、クローン病、全身型若年特発性関節炎、脳腫瘍、舌癌、咽頭癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆道癌、胆嚢癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、線維肉腫、骨肉種、軟骨肉腫、皮膚癌、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ球白血病、成人型Ｔ細胞白血病、悪性リンパ腫などが挙げられるがこれらに限定されない。また、癌に関しては原発性、転移性を問わない。
本発明の医薬組成物は、本発明の抗体又はその断片を有効成分として含み、さらに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物の形態で提供することが好ましい。
ここで「薬学的に許容され得る担体」とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。そのような担体の一つ以上を用いることにより、注射剤、液剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。これらの医薬組成物は、経口あるいは非経口的に投与することができる。非経口投与のためのその他の形態としては、一つまたはそれ以上の活性物質を含み、常法により処方される注射剤などが含まれる。
本発明の薬剤の投与量は、患者の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該薬剤に含有される活性成分である高親和性抗体の種類などにより異なるが、通常成人一人当たり、一回につき６００μｇ〜６０００ｍｇ、好ましくは６〜６００ｍｇの範囲で投与することができるが、この範囲に限定されるものではない。
例えば、注射剤の場合には、例えば生理食塩水又は市販の注射用蒸留水等の薬学的に許容される担体中に１ｍｇ抗体／ｍｌ担体〜１００ｍｇ抗体／ｍｌ担体の濃度となるように溶解または懸濁することにより製造することができる。このようにして製造された注射剤は、処置を必要とするヒト患者に対し、１回の投与において１ｋｇ体重あたり、１０μｇ〜１００ｍｇの割合で、好ましくは１００μｇ〜１０ｍｇの割合で、１日あたり１回〜数回投与することができる。投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注射などが挙げられるが、好ましくは静脈内注射である。また、注射剤は、場合により、非水性の希釈剤（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類など）、懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。そのような注射剤の無菌化は、フィルターによる濾過滅菌、殺菌剤の配合等により行うことができる。注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することができる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。これらの実施例は、当業者にとり多種多様に改変可能であるが、本発明は、これらの実施例のみに限定されるものではない。なお、特に断らない限り、％は重量％を示す。
【実施例１】  本実施例は、抗シノビオリン・モノクローナル抗体の作製を目的とする。
抗シノビオリン・モノクローナル抗体の調製のために、免疫用のペプチドとして、以下に示すヒト・シノビオリンの部分アミノ酸配列を含む３種類のペプチドを合成した。これらのアミノ酸配列は、抗原性を有すると推測された領域から選択されたものである。
Ｓｙｎｏ−Ｐ３（ＳＬＡＬＴＧＡＶＶＡＨＡＹＹＣ）（配列番号３）、
Ｓｙｎｏ−Ｐ２（ＴＣＲＭＤＶＬＲＡＳＬＰＡＱＳ）（配列番号４）、および
Ｓｙｎｏ−Ｐ１（ＧＡＡＴＴＴＡＧＴＳＡＴＡＣ）（配列番号５）
各合成ペプチドに、アミノ酸配列中のＣｙｓを介して、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）を結合させた。ＫＬＨを結合した各合成ペプチドの５０μｇを０．１ｍｌ生理食塩水に溶解し、フロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）０．１ｍｌを加えて免疫原を作製した。各免疫原をそれぞれ８匹のマウス（ＢＡＬＢ／ｃメス、５週齢）背部皮下に０．２ｍｌ注射し免疫した。免疫は２週間ごとに計４回行い、その１週間後にさらに１回免疫した。最終免疫の８日後に、心臓から採血し血清２００μｌ以上を分取した。ＥＬＩＳＡによって抗体価の上昇を確認できた個体から脾細胞を採取し、細胞融合を行った。
各免疫原につき３個体のマウス血清について、ＥＬＩＳＡによる抗体価の測定をおこなった。いずれの免疫原を用いた場合にも、抗体価が上昇した個体が確認された。これらの免疫原がいずれもシノビオリンの免疫原として有用であることが確認された。
ミエローマ細胞株（Ｐ３Ｕ１）とマウス脾細胞を１：１０で混和し、５０％のＰＥＧ（和光純薬社ＰＥＧ１５４０）存在下で細胞融合させた。融合後、脾細胞数が５×１０５個／ｍｌとなるように９６ウェルプレートに播いた。ＨＡＴ培地中で１０〜１４日培養した後、細胞の増殖を確認し、培養上清の検定をおこなった。
培養上清の検定には、各合成ペプチドを固相化したＥＬＩＳＡプレートを用いた。検定の操作は次のとおりである。ＥＬＩＳＡプレートに培養上清を反応させた後、抗マウスＩｇＧヤギ−ペルオキシダーゼ（ＰＯＸ）を用いて陽性ウェルを選択した。クローニングに供するウェルを選択し、他の陽性ウェルの細胞については凍結保存した。
数日後、一株につき９６ウェルプレート１枚、１００細胞／プレート（２０細胞／ｍｌ）となるように撒き、１０〜１４日間培養した。コロニーを判定し、培養上清の検定を行った。培養上清の検定は、上清５０μｌを上記スクリーニング用抗原固相化ＥＬＩＳＡプレートに適用して行った。第２抗体は、抗マウスＩｇＧヤギ−ＰＯＸを使用した。選択したコロニーは、培養後、リクローニングし、１０〜１４日間培養してコロニー判定および培養上清の検定を上記と同様に実施した。親株別にウェルを選択し、２４ウェルプレートで培養し、上清を回収してクローンのチェックを行い、抗体のサブクラスおよび抗体産生を検定した。クローニングの結果、シノビオリンに対して、きわめて高い親和性を有するモノクローナル抗体を高い効率で産生するハイブリドーマとして、Ｓｙｎｏ−Ｐ２を免疫原として得られたクローンＳＬ−１が選択された。
【実施例２】  本実施例は、抗シノビオリン・モノクローナル抗体を用いた患者試料のシノビオリンの検出を目的とする。
（１）抗シノビオリン・モノクローナル抗体による患者由来滑膜細胞のウェスタンブロッティング
実施例１で得られた、Ｓｙｎｏ−Ｐ２を認識するＳＬ−１抗体を用いて、慢性関節リウマチ患者（ＲＡ）由来滑膜細胞のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ウェスタンブロッティング法を行った。ウェスタンブロッティング法の操作は、抗体として実施例１のＳＬ−１抗体を、そして標識抗体として抗マウスＩｇＧヒツジ−ＨＲＰを用いた。
対照として、変形性関節症患者（ＯＡ）由来の滑膜細胞も解析した。その結果、ＲＡ患者由来の滑膜細胞で特異的なシグナルが検出された（図１「ＲＡ」レーン１、２の８５ｋＤａ付近のバンド）。実施例１で得られたＳＬ−１抗体は、シノビオリンをより特異的に認識することが確認された。
（２）抗シノビオリン・モノクローナル抗体によるＲＡ患者由来滑膜細胞の蛍光免疫染色
ＳＬ−１抗体を用いて、ＲＡ患者由来滑膜細胞の蛍光免疫細胞化学解析を行った。免疫染色の操作は、抗体として実施例１のＳＬ−１抗体を、そして標識抗体として抗マウスＩｇＧヒツジ−ＦＩＴＣを用いる他は、国際公開第ＷＯ０２／０５２００７号パンフレットの実施例９に記載のとおりである。シノビオリンのシグナルは、ＲＡ患者由来滑膜細胞で強く検出された（図２上パネル）が、二次抗体のみを反応させた対照では検出されなかった（図２下パネル）。
（３）抗シノビオリン・モノクローナル抗体によるＲＡ患者由来滑膜組織の免疫染色
ＳＬ−１抗体を用いて、ＲＡ患者から採取した滑膜組織切片の免疫染色を行った。免疫染色の操作は、抗体として実施例１のＳＬ−１抗体を、そして標識抗体として抗マウスＩｇＧヒツジ−ＨＲＰを用いる他は、国際公開第ＷＯ０２／０５２００７号パンフレットの実施例９に記載のとおりである。シノビオリンは、ＲＡ患者由来滑膜組織で強く発現していた（図３ＳＬ−１抗体のパネル）。同時に行ったＨＥ染色により、滑膜細胞の増殖層が観察され、その部分がモノクローナル抗体で染色されていることが確認された。これらの結果から、本発明のＳＬ−１抗体は、ＲＡ患者の滑膜組織中のシノビオリンを特異的に認識することが確認された（図３、ＨＥ染色のパネル）。
以上のように、抗シノビオリン抗体を用いて患者試料中のシノビオリンを検出することにより、ＲＡの検査および診断を実施することができる。
【実施例３】  本実施例は、シノビオリン検出用ＥＬＩＳＡ法検査薬を開発することを目的とする。
実施例１の方法により得られたＳＬ−１抗体を適量とり、ＰＢＳに２０μｇ／ｍｌとなるように溶解した。溶液をエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）用９６ウェル平底マイクロプレートに１００μｌ／ウェルずつ分注し、室温下で数時間、静置した。ウェルから溶液を除去し、０．０５（Ｖ／Ｖ）％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄し、１（Ｖ／Ｖ）％−牛胎仔アルブミン（ＢＦＡ）を含むＰＢＳ、１００μｌ／ウェルを加えて、４℃で一晩静置してモノクローナル抗体をブロックした後、ＰＢＳを除去して抗体プレートを得た。
これとは別に、常法に基づいてシノビオリンによるウサギの免疫感作によりポリクローナル抗体を調製した。このポリクローナル抗体を、過ヨウ素酸酸化方法により西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識し、ＰＢＳで予備平衡化したセファクリルＳ−３００ＨＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いるゲルろ過クロマトグラフィーにより精製して標識抗体を得た。この二次標識抗体は、塩、安定化剤、防腐剤などを含む緩衝試薬の組成物とした。
このようにして得られた固相ＳＬ−１抗体を有する、上記９６ウェルマイクロプレートに、通常のＥＩＡに準じて、適宜希釈した患者の血液、尿などの体液または組織などを分注して室温で１時間、作用させた。このとき、希釈液だけを加えてウェルを対照とした。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液で洗浄後、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧウサギ抗体を加えて、室温で３０分間反応させた。未反応の二次標識抗体を０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液で洗浄後、基質緩衝液として０．０１５％過酸化水素を含有する０．１Ｍクエン酸緩衝液、ならびに染色剤としてＯ−フェニレンジアミン−クエン酸塩緩衝液（１０ｍｇ／ｍｌ）を各ウェルに加えて、室温で３０分間反応させた後、２Ｍ硫酸を添加して発色反応を停止させた。次いで呈色は、４９２ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定することにより被検体中のシノビオリン量を求めた。
【実施例４】  本実施例は、シノビオリンの自己ユビキチン化を検討することを目的とする。
シノビオリンはＲＩＮＧフィンガーモチーフを持つＥ３ユビキチン−蛋白質リガーゼであり、ＲＩＮＧフィンガーモチーフはＥ２ユビキチン結合酵素の結合部位と考えられている。また、Ｅ３ユビキチン−蛋白質リガーゼは、自己ユビキチン化をすることが知られており、シノビオリンの自己ユビキチン化に関しても実験的に確認されている。
マウスモノクローナル抗体であるＳＬ−１は、シノビオリン蛋白質のＲＩＮＧフィンガー領域の３２８〜３４２番目のアミノ酸に対応するペプチドを抗原として作製した（実施例１）。Ｈｉｓタグ融合タンパク質ＭＢＰ−ｄＴＭ  Ｓｙｎｏ−Ｈｉｓを用いて、一定濃度のＳＬ−１抗体、抗ＦＬＡＧ抗体またはマウスＩｇＧと混合させ、４℃で１．５時間、抗原抗体反応を行った。
その後、インビトロでのユビキチン化反応系を用いてシノビオリンの自己ユビキチン化を検討した。Ｅ１（酵母由来）、Ｅ２（ＵｂｃＨ５ｃ）、ＡＴＰ、ＧＳＴ−ＨＡ−ユビキチンそしてあらかじめ抗体と反応した各ＭＢＰ−ｄＴＭ  Ｓｙｎｏ−Ｈｉｓを混合し、３７℃、１２０分間反応させた。反応後の各サンプルに４ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液を加え、５分間沸騰させた後、１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で展開させた。そして、ウェスタンブロッティング解析法で、シノビオリンのユビキチン化されたバンドをＳＬ−１抗体を用いて検出した。
結果として、ＳＬ−１抗体の量に依存して２５０ｋＤａのバンドが阻害されていることから、ＭＢＰ−ｄＴＭ  Ｓｙｎｏ−Ｈｉｓの自己ユビキチン化が２μｇのＳＬ−１抗体により阻害されることが観察された。しかし、同量の抗ＦＬＡＧ抗体やマウスＩｇＧでは２５０ｋＤａのバンドの阻害作用が見出されなかった（図４上パネル）。また、同様の実験で、ＳＬ−１抗体量を８〜４４μｇ／Ｌまで検討した場合も、２５０ｋＤａ付近のバンドが阻害され、ＳＬ−１抗体によってＭＢＰ−ｄＴＭ  Ｓｙｎｏ−Ｈｉｓの自己ユビキチン化が阻害されることが示された（図４下パネル）。従って、ＭＢＰ−ｄＴＭ  Ｓｙｎｏ−Ｈｉｓの自己ユビキチン化はＳＬ−１抗体により特異的に阻害されることが明らかとなった。
【実施例５】  本実施例は、ＳＬ−１抗体がシノビオリンによるユビキチン化に対しても影響を与えるかどうかについて検討することを目的とする。
ユビキチンは活性化酵素（Ｅ１）、結合酵素（Ｅ２）、リガーゼ（Ｅ３）からなるユビキチン系により標的蛋白質（基質）に共有結合し、この反応が繰り返されることにより形成されるポリユビキチン鎖が、基質のプロテアソームによる分解マーカーとして作用する。コラーゲン産生において必須であるコラーゲンのプロリン残基の水酸化を触媒する酵素であるプロリルヒドロキシラーゼのαサブユニットであるＰ４ＨＡ１はシノビオリンの基質であることが見出されている。ＳＬ−１抗体がシノビオリンの自己ユビキチン化活性を阻害する作用が見い出されているため、この抗体がＰ４ＨＡ１のシノビオリンによるユビキチン化に対しても影響を与えるかどうかについて検討した。
まず、ＭＢＰ−ｄＴＭ  Ｓｙｎｏ−Ｈｉｓを一定濃度のＳＬ−１抗体、抗ＦＬＡＧ抗体またはマウスＩｇＧと混合させ、４℃で１．５時間、抗原抗体反応を行った。その後、インビトロのユビキチン化反応系において、２μｇのＧＳＴ融合Ｐ４ＨＡ１タンパク質ＧＳＴ−Ｐ４ＨＡ１をＥ１（酵母由来）、Ｅ２（ＵｂＣＨ５ｃ）、ＡＴＰ、ＧＳＴ−ＨＡ−ユビキチンそしてあらかじめ抗体と反応した各ＭＢＰ−ｄＴＭ  Ｓｙｎｏ−Ｈｉｓと混合させ、３７℃、１２０分間反応させた。反応後の各サンプルに４ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液を加え、５分間沸騰させた後、１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で展開させた。そして、ウェスタンブロッティング解析法で、Ｐ４ＨＡ１のユビキチン化されたバンドを抗ＧＳＴ抗体により検出した。
結果として、ＭＢＰ−ｄＴＭ  Ｓｙｎｏ−Ｈｉｓの自己ユビキチン化が４μｇのＳＬ−１抗体により明らかに阻害されたが、ＧＳＴ−Ｐ４ＨＡ１のユビキチン化では８μｇのＳＬ−１抗体によってもほとんど阻害されないことが明らかになった（図５）。ここで、図５において、−Ｅ３はシノビオリンを含まないサンプル、α−ＳＬ１は抗体を添加したサンプル、ＩｇＧはネガティブコントロールとしておいたサンプルをそれぞれ示しており、ＧＳＴ−Ｐ４ＨＡ１−Ｕｂｎに示した２５０ｋＤａ付近のバンドが、ユビキチン化されたＧＳＴ−Ｐ４ＨＡ１を示している。従って、ＳＬ−１抗体はシノビオリンの自己ユビキチン化を特異的に阻害し、ＧＳＴ−Ｐ４ＨＡ１のユビキチン化には影響を与えないことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】  本発明の抗体によれば、シノビオリンの自己ユビキチン化を調節することができる。
また、ＲＡ患者の血中に、シノビオリンを認識する自己抗体が見出されることで、ＲＡの診断上まったく新しいアプローチがもたらされる。従って、本発明の抗体を含有する医薬組成物は、ＲＡの治療方法等の開発においても、今までにない新しいアプローチを提示することができる。
また、本発明により、上記抗体を産生する細胞、及び上記モノクローナル抗体を利用したシノビオリン含有細胞検出キットも提供される。
滑膜の発達ならびに骨・軟骨および四肢の発達に関与するシノビオリンの遺伝子はＲＡの病態に関与しており、ＲＡ患者ではこの遺伝子産物に対する抗体が産生されている。本発明のＳＬ−１抗体は、ＲＡの診断に有用なマーカーとなるシノビオリンならびに患者血清中に高頻度で見出されるその抗体の特異的な検出、定量に利用することができ、ＲＡ疾患の診断や治療効果の判定に貢献するものである。
本発明のＳＬ−１抗体は、その高い特異性を利用することにより、シノビオリンを細胞マーカーとして用いて、胚の細胞などから未分化間葉系細胞を回収することができ、その再生医学的な応用にも資することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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