(57)【要約】【課題】【解決手段】  本発明はアブスクリプション、不完全転写技術に基づくバイオマーカーの検出方法を提供する。特には、本発明はＤＮＡの少量サンプルからのＣｐＧアイランドのメチル化を検出するための、亜硫酸塩を使用しない方法を提供する。本発明方法はマルチプレックスに適し、一つのサンプルから短時間で複数のＣｐＧアイランドを分析するために使用できる。【選択図】図４
2012520086.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドを検出するための方法であって：
ａ）    少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むサンプルと、該少なくとも１つのポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズして、標的配列を増幅するプライマー対とを接触する工程、ここで該プライマー対は以下から成る；
ｉ）（１）  該ポリヌクレオチドの標的配列にフランキングする第１の配列に相補的な３’配列、および
（２）  ５’キャプチャータグ、を含む第１のプライマー、並びに
ｉｉ）（１）  該ポリヌクレオチドの標的配列にフランキングする第２の配列に相補的な３’配列、および
（２）  アブスクリプションを導く手段を提供する５’配列を含む第２のプライマー、
ｂ）  該第１および第２のプライマーから該標的配列を増幅する工程；
ｃ）  前記増幅された標的配列を、５’キャプチャータグに結合された固定された分子と接触させ、それにより該ポリヌクレオチドの増幅された標的配列を捕獲する工程；
ｄ）  前記アブスクリプションを導く手段から少なくとも１つのアブスクリプトを転写する工程；並びに
ｅ）  工程ｄ）の少なくとも１つの転写されたアブスクリプトを検出する工程。
【請求項２】
結合していない試薬、プライマー、およびポリヌクレオチドが、次の工程の前に、固定され捕獲されたポリヌクレオチドから洗浄される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記の増幅はポリメラーゼ連鎖反応を実行することから成る、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記のポリメラーゼ連鎖反応が、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよび熱安定性ＲＮＡポリメラーゼの少なくとも１つとともに実行される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記５’キャプチャータグはビオチンであり、前記５’キャプチャータグに結合する分子がストレプトアビジンである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記５’キャプチャータグに結合する分子が、磁性ビーズおよびミクロタイタープレートから選択された固形担体に固定される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
検出可能なラベルづけられたヌクレオチドが、工程ｄ）の間に、少なくとも１つのアブスクリプトに組み入れられる、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記の検出可能なラベルづけられたヌクレオチドが蛍光ヌクレオチドである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記の少なくとも１つのアブスクリプトの検出が、マススペクトル法、毛細管電気泳動法または薄層クロマトグラフィ法を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記の少なくとも１つのアブスクリプトの長さが３−２０のヌクレオチドである、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記の少なくとも１つのアブスクリプトの長さが３ヌクレオチドである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
アブスクリプションを導く手段がＡＰＣを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記アブスクリプションを導く手段が、
ｉ）  ユニークなＣｐＧアイランドを特定する５’α−ＴＡＰ配列；および
ｉｉ）  前記５’α−ＴＡＰ配列と、標的配列にフランキングする第２の配列に相補的な３’配列の間に非天然型ヌクレオチドを含み、
前記工程ｄ）が、
ｉ）  前記増幅された標的配列にプローブをハイブリダイズすること、ここでは該プローブがα−ＴＡＰ配列に相補的な５’ＴＡＰ配列と３’ＡＰＣを含む、および
ｉｉ）  該ＡＰＣから少なくとも１つのアブスクリプトを転写することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記非天然型ヌクレオチドは増幅の間、α−ＴＡＰの複製を防ぎ、それによりα−ＴＡＰ配列は工程ａ）からｃ）の間、１本鎖なままである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記非天然型ヌクレオチドがエテノ−デオキシアデノシンである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドが、複数の異なった標的ポリヌクレオチドを含み、工程ａ）からｅ）が同時に、複数の第１および第２のプライマー対と共に行われ、それぞれのプライマー対が異なった標的に特異的にハイブリダイズする、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
前記アブスクリプションを導く手段が、前記複数の標的のそれぞれのためにユニークなアブスクリプトを生成する、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記ユニークなＡＰＣｓが分子量またはヌクレオチド配列に基づいてお互いに区別可能である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記の複数の異なった標的が少なくとも１０個の異なった標的を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドが、メチル化されたＣｐＧアイランドであり、前記サンプルが単離されたメチル化ゲノムＤＮＡ断片を含む、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
前記メチル化ゲノムＤＮＡ断片が、
ａ）    少なくとも１つのメチル化された標的ポリヌクレオチドを含むゲノムＤＮＡのサンプルを、標的ポリヌクレオチドＣｐＧアイランドを切断しない制限酵素で切断すること、
ｂ）    前記切断されたゲノムＤＮＡを固定されたＭＢＤと接触させ、それによりサンプルからメチル化ゲノムＤＮＡを固定すること、および
ｃ）  任意に、前記メチル化ゲノムＤＮＡを固定されたＭＢＤから回収し、それによりメチル化ゲノムＤＮＡ断片を分離すること、を含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記ＭＢＤがＧＳＴ−ＭＢＤ２融合たんぱく質である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記ＧＳＴ−ＭＢＤ２融合たんぱく質が、グルタチオン含有固形担体に固定される、請求項２２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２００９年３月１５日に出願した米国の仮出願番号６１／１６０，３３５について、米国特許法第１１９条に基づき、優先権を請求し、その開示の全体は本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
発明の背景
癌腫は細胞分裂サイクルを規制して、細胞間相互作用を仲介する多数のがん抑制遺伝子の発現を通して積極的に回避できる。良性および悪性の腫瘍の研究は、癌腫は、ランダムで蓄積された、プロトオンコジーンの発現の向上、または腫瘍抑制剤およびＤＮＡ修復遺伝子の発現または機能の減少の多段階の過程を通して発症することを示した。体細胞突然変異が、腫瘍抑制剤およびＤＮＡ修復遺伝子におけるこれらの変化の幾分かを説明する。しかしながら、また、ＤＮＡの過剰メチル化や低メチル化などの後成的変化が腫瘍抑制剤またはプロトオンコジーンの不活性化または増大を介して癌の発生において大きい役割を果たすことが、最近、明らかになった。ＣｐＧプロモーターアイランドの高メチル化は、癌発生の初期に起こって、ほとんどすべての腫瘍で見られ、それは診断マーカーとして非常に役に立つ潜在性を有し、癌腫が治療が最も効果的である初期のときに非観血的に検出されることを許容する。例えば、ＤＡＰキナーゼ、ｐ１６、およびＭＧＭＴなどの遺伝子のプロモータ領域の高メチル化は、扁平上皮細胞肺癌の診断の最大３年前に喫煙者の痰に検出されたことが報告された（Ｂｅｌｉｎｓｋｙ他、（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６：３３３８−４４、Ｐａｌｍｉｓａｎｏ他、２０００．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ６０：５９５４−８）。同様に、遺伝子の小さいパネルの高メチル化は非小細胞肺癌のための貴重な早期検出インディケータであるかもしれない。遺伝子の小さいパネルの高メチル化は、早めのステージの乳癌で検出されたが、正常であるかまたは良性の胸部組織では検出されなかった（Ｋｒａｓｓｅｎｓｔｅｉｎ他、（２００４）．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０：２８−３２）。
【０００３】
ＣｐＧアイランド(CpG island)でのシトシンのメチル化は、ほとんどの癌腫でがん抑制遺伝子を含む多くの遺伝子の減少した発現に通じる初期事象である。腫瘍細胞ＤＮＡにおけるＣｐＧアイランドのメチル化の調査は、この後成的変化が癌進行において突然変異の衝撃に匹敵するほど一般的であると示唆する。異常なメチル化の早期検出は、定期的スクリーニングと治療が最も効果的である早期診断につながることができる。初期の後成的変化は腫瘍組織自体だけで検出可能であるのではなく、血清または他の体液（尿、痰、唾液）でしばしば検出可能である。これは、これらの流体を使用して後成的変化診断検査を非観血的にできることを意味する。また、医薬品開発、これらの薬に応じる患者集団の識別、および治療後モニターに、ＣｐＧアイランドのメチル化に基づく診断検査法は利用できる。
【０００４】
具体的癌腫のためのメチル化検出の感度とメチル化シグネチャー（methylation signature）の解明における最近の改良により、体液からＤＮＡをサンプリングすることにより腫瘍のためにアッセイを行うことが可能になった。腫瘍細胞は疾病の比較的早めのステージから血液中にＤＮＡを放出する。癌患者の血液中のＤＮＡの３％から９０％以上までは、腫瘍由来であることがわかった。（Ｋｉｍ他、（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２２：２３６３−７０）。ＰＣＲベースのメチル化アッセイの発達で、血液、痰、および尿から非観血的に腫瘍の存在を検出することが可能になった。１つの研究では、メチル化検出は異常な前癌状態の細胞を検出することにおける尿細胞診より敏感であった。臨床の敏感さ（検出された確認事例の比率）は単独のメチル化マーカーを使用する血液試料の調査では典型的には低い。しかしながら、血液試料からの臨床の特異性（検査で陰性と出る正常対照の比率）は１００％に近い。単一のＣｐＧアイランドよりも多くを評価するメチル化テストにより、臨床の敏感さが増加されるべきである。
【０００５】
体液中の異常にメチル化されたＤＮＡの見た目は、それ自体ではどの臓器が腫瘍で影響を受けているかを正確に指摘することを助けない。腫瘍の由来する組織を確立するのに驚くほど少しの情報しか必要でない。多くのメチル化スクリーニング研究はメチル化シグネチャーを確立した。特定の臓器から癌腫に強く関連づけられるメチル化されたＣｐＧアイランドが収集された。１つの調査では、３から４の候補ＣｐＧアイランドの異常メチル化は、１５の癌型の７０−９０％を特定するために十分であった（Ｅｓｔｅｌｌｅｒ他、（２００１）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：３２２５−９）。正確にそれらの親腫瘍の組織起源を特定するために原発腫瘍のために開発されたメチル化プロフィールは腫瘍細胞系に適用できた（Ｇｒａｚｉａｎｏ他、（２００４）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ１０：２７８４）。この結果は、異なった腫瘍型のメチル化シグネチャーが、培養での成長に関連している選択圧力で大きな影響を受けないことを示唆する。メチル化プロフィールの有用性は、簡単な血液検査で、アクセスできない臓器の癌を発見する能力を大いに高める。
【０００６】
臨床標本におけるメチル化の検出はがんの早期発見を可能にするだろう。単純で敏感なマルチプレックス検出分析の発達は、小さい臨床標本が多数のＣｐＧアイランドの状態をプロファイルすることを許容するだろう。この種類の情報は診断と診療で貴重になるだろう。
【０００７】
ＤＮＡメチル化の検出方法
多くの方法が、標的ＤＮＡの中のメチル化されたＣｐＧ（ｍＣｐＧ）を検出するのに使用された。現在使用される３つの主要な方法が以下で詳述される。
【０００８】
亜硫酸水素塩法
最も一般的に使用されたメチル化検出方法はＤＮＡの亜硫酸水素塩修飾に基づいている。これでは、メチル化シトシンを変わりがないままにしつつ、シトシン残基を脱アミノしてウラシルにする。ＰＣＲ増幅の際に、メチル化シトシンはシトシンにコピーされ、ウラシルはチミンにコピーされる。その結果、特定位置のシトシンの保持はメチル化されていることを示す。次に、修飾ＤＮＡは分析される。例えば、配列分析、メチル化特異性ＰＣＲ（ＭＳＰ）（Ｈｅｒｍａｎ他（１９９６）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．米国９３：９８２１−２６）、またはハイブリダイゼーション（例えば、マイクロアレイまたはブロット）によりおこなうことができる。ＭＳＰでは、１組のメチル化特定オリゴヌクレオチドプライマは亜硫酸水素塩処理されたＤＮＡに加えられて、ＰＣＲが標的ＤＮＡを増幅するために実行される。また、亜硫酸水素塩修飾ＤＮＡに蛍光に基づく定量的なリアルタイムＰＣＲを実行できる（Ｅａｄｓ他、（２０００）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：３２Ｅ；Ｚｅｓｃｈｎｉｇｋ他、（２００４）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：ｅｌ２５）。
【０００９】
較正され、ＭＳＰの蛍光に基づく変異体は、サンプル中のメチル化ＤＮＡの量の定量化を提供するためにリアルタイムＰＣＲを利用する。これらのＰＣＲに基づく方法の重要な基本的な仮定は、プライマー／プローブにより認識されるわずかなＣｐＧ部位が、標的ＣｐＧアイランドの総合的な状態を反映するということである。大きくメチル化されているか、または完全に非メチル化であるアイランドについては上記は真実であるが、部分的にメチル化された標的では、メチル化または非メチル化部分の特異的反応は容易に得られない。
【００１０】
亜硫酸水素塩修飾の利点は、非メチル化部位とメチル化部位とを異なるようにマークして、メチル化パターンを検出するシーケンシング方法を許容するということである。亜硫酸水素塩処理されたクローンのＤＮＡのシーケンシングは、メチル化検出のための最も一般的に使用される方法である。ＭＳＰに基づく方法より大きい数のＣｐＧ部位を抽出することに加えて、それは亜硫酸水素塩処理の成功の情報を提供する。しかしながらその複雑さと費用のため、亜硫酸水素塩シーケンシングは臨床診断よりマーカー発見により適当である。亜硫酸水素塩処理は入力ＤＮＡの大きな割合を破壊するため、大量のＤＮＡを必要とし、また限られた感度に帰結する。紛らわしい結果を避けるために、検出分析を実行する前に、亜硫酸水素塩で処理されたＤＮＡの品質管理評価が必要である。亜硫酸水素塩処理の間の不完全なシトシン脱アミノのため、ＭＳＰベースの検定方法について擬陽性の結果の可能性がある。亜硫酸水素塩で処理されたＤＮＡの増幅は、非メチル化ＤＮＡのＰＣＲバイアスにより影響を受ける。通常、プライマーアニール条件の最適化によりこの問題を修正できるが、それはプライマーデザインおよび試験を複雑にする。デジタル亜硫酸水素塩ＰＣＲの使用でテンプレートバイアスを排除できる。１反応あたり平均で１回未満のコピーへのＤＮＡ試料の希釈は、テンプレート間での競争を排除する。クローニングによってもたらされるバイアスなしで個別分子をシーケンシングできる。
【００１１】
ｍＣｐＧ分析のための亜硫酸水素塩処理を使う、市販キット、試薬、およびシステムは、利用可能である。Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ（ベルリン）は、定量的なリアルタイムＰＣＲに適合するメチルライト（ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ）アッセイの、定量的メチルライト（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（ＱＭ））とヘビーメチル（Ｈｅａｖｙ  Ｍｅｔｈｙｌ（ＨＭ））と呼ばれる２つの変法を提案する。ＱＭは蛍光シグナルを発生させるためにＴａｑｍａｎ（登録商標）を利用する。増幅の間、Ｔａｑｍａｎプローブからの流出物の分解によりリアルタイムに検出できる蛍光を発生する（Ｗｏｊｄａｃｚ＆Ｄｏｂｒｏｖｉｃ、（２００７）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３５：ｅ４１）。ＨＭは遮断薬オリゴヌクレオチドが反応に加えられるＱＭの適合系である。これらの遮断薬オリゴヌクレオチドは非メチル化ＤＮＡの増幅を防ぎ、向上した分析評価感度をもたらす（Ｃｏｔｔｒｅｌｌ他、（２００４）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：ｅ１０）。また、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（登録商標）は亜硫酸水素塩修飾ＤＮＡからメチル化定量化に利用され、ＢｉｏｔａｇｅのＰｙｒｏ  Ｑ−ＣｐＧ（登録商標）によって例示される（Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン；Ｔｏｓｔ他（２００３）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ３５：１５２−５６）。
【００１２】
亜硫酸水素塩修飾法は広範に使用されているが、増幅されるのに十分長い分子鎖がほとんど無い場合には、大きなＤＮＡ分解が生じ、サンプリング誤差を生じる（Ｅｈｒｉｃｈ他、（２００７）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３５：ｅ２９）。さらに、検定方法は時間がかかり、厳しい塩基変性工程を必要とし、亜硫酸水素塩処理の間、不完全なシトシン脱アミノのために擬陽性結果を与える高い確率がある。
【００１３】
メチル化感受性制限酵素消化法
ＤＮＡ中のｍＣｐＧを検出するための２番目のタイプの方法は、制限エンドヌクレアーゼによる特異的な切断に依存する。ＤＮＡは、ＭＳＲＥ（メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ：methylation-sensitive restriction endonuclease）またはＭＤＲＥ（メチル化依存性制限エンドヌクレアーゼ：methylation dependent restriction endonuclease））のどちらかで処理されて、増幅されて、次にマイクロアレイまたはゲル電気泳動によって分析される。ＨｐａＩＩやＡｃｉＩなどのＭＳＲＥｓは、それが非メチル化である場合にだけＤＮＡ配列を切断する。ＭＤＲＥｓは、切断のためにＤＮＡ配列のメチル化を必要とする制限エンドヌクレアーゼである。これらの酵素類のどちらかでＤＮＡのサンプルを処理し、対照試料と比較することによって、ＤＮＡ試料のメチル化状態が決定できる。特定のＤＮＡサンプルの消化がＭＤＲＥの処理の後に起こるなら、ＤＮＡはメチル化されていると想定することができる。逆に、ＭＳＲＥで処理された時にＤＮＡが切断されていないなら、サンプルはメチル化されていると想定することができる。切断されていないＤＮＡに対して切断されたＤＮＡの量を比較することによって、メチル化のレベルを見積もることができる。このタイプのメチル化分析のための一般的な読み出しは、消化されたＤＮＡの引き続く増幅と蛍光ラベル化である。そして、断片はライブラリマイクロアレイとハイブリダイズして分析されるか、または電気泳働で簡単に決定できる。
【００１４】
商業的に利用可能な制限エンドヌクレアーゼベースのシステムとしては、オリオンのＭｅｔｈｙｌＳｃｏｐｅ（ＭｅｔｈｙｌＳｃｏｐｅはマイクロアレイ読み出し（Ｌｉｐｐｍａｎ他（２００４）、ネイチャー４３０：４７１−７６）を利用する）、およびＭｅｔｈｙＳｃｒｅｅｎ（ＭｅｔｈｙＳｃｒｅｅｎは定量的なリアルタイムＰＣＲ（Ｏｒｄｗａｙ他（２００６）、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ２７：２４０９−２３）を利用する）があげられる。
【００１５】
ＭＳＲＥ／ＭＤＲＥ消化の利点は、ＤＮＡの前処理が必要でないということである。しかし、しばしばＣＯＢＲＡと呼ばれる手順で、ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理により前処理が実行される（Ｘｉｏｎｇ＆Ｌａｉｒｄ、（１９９７）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：２５：３２−３４）。この手順によるいくつかの不利益は、それは長く、標的ＤＮＡ中のＭＳＲＥ／ＭＤＲＥ認識配列の存在に依存しているということである。その上、このアプローチは比較的効率が悪く、結果の信頼度を減少させることがある。評価される唯一のＣｐＧ部位は、少ない数の制限酵素認識部位の中のものであり、そしてそれらの部位の状態は、該部位が存在するＣｐＧアイランドの全体の状態を反映できない。特に開裂反応が引き続く増幅工程に供されるとき、不完全な消化は、頻繁な擬陽性診断につながる。制限エンドヌクレアーゼ切断アッセイは、ＭＳＰなどのような亜硫酸水素塩方法に比較して感受性が低く、サンプル中の１０％以上のメチル化ＤＮＡの検出を許容する（Ｓｉｎｇｅｒ−Ｓａｍ他、１９９０．１８：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．６８７；Ｙｅｇｎａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（２００６）３４：ｅｌ９）
【００１６】
クロマチン免疫沈降法
ｍＣｐＧの検出に一般的に使われる３番目の方法は、クロマチン免疫沈降法（ＣｈＩＰ）である。典型的には細胞は固定され、次いでメチル化ＤＮＡが、メチル結合蛋白質に特異的な抗体の使用により免疫沈降される。得られたＤＮＡは増幅され、ラベルされ、マイクロアレイアッセイでハイブリダイゼーションされて分析される。この方法の利点は、ＤＮＡ精製がほとんどまたは全く必要でなく生きた細胞から分析評価を実行できるということである。分析の前に望まれていない汚染物ＤＮＡが取り除かれるので、分析は大きな感度を有する。しかしながら、ＣｈＩＰ手順は、非常に手間がかかって、数工程を要し、高価な試薬を必要とする。いつくかの検定方法は、終了まで５日間かかることがある。
【００１７】
メチル結合蛋白質を使用する方法
非メチル化ＤＮＡからメチル化ＤＮＡを分離する代替手段であって、より敏感なアプローチは、メチルＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）タンパク質または５−メチル−Ｃに対する抗体の使用を伴う。ＭＢＤタンパク質は、メチル化されたＣｐＧ部位に対して高親和性を有し、非メチル化ＤＮＡに対して非常に低い親和性を有する（Ｆｒａｇａ他、（２００３）３１、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ：１７６５−７４）。サンプルは固定されたＭＢＤタンパク質で、さまざまなフォーマット（磁性ビーズ、カラム、ＰＣＲチューブの壁）でインキュベートされる。メチル化ＤＮＡの捕獲に続いて、通常、捕獲されたＤＮＡの増幅が行われる。ＭＢＤベースのＤＮＡ検出は、メチル化された部位のすべてが結合に寄与できる大きな利点がある。その結果、全体のアイランドがメチル−ＣｐＧｓのためのサンプルになることを許容する。この特徴のため、結合アッセイは、部分的にメチル化されたアイランド中の非メチル化部位がプライミング／プローブ部位に対応するとき、ＭＳＰおよび制限エンドヌクレアーゼベースの検定方法において影響する擬陰性の脆弱性がほとんどない（Ｙｅｇｎａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２００６）３４：ｅｌ９）。この状況は、部分的にメチル化されたＣｐＧアイランドを含む初期腫瘍細胞を含む臨床標本で一般的である傾向がある。ＭＢＤに基づく結合アッセイは非常に敏感であり、１６０ｐｇのメチル化ＤＮＡ（２５細胞と同等）、または５００の非メチル化分子中の１個のメチル化された分子の検出を許容する（Ｇｅｂｈａｒｄ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（２００６）３４：ｅ８２５６）。これはＭＳＰの感度に近い（１メチル化分子／１，０００の非メチル化分子）。ＣＯＭＰＡＲＥ  ＭＢＤ分析評価は、結合工程の前にＨｐａＩＩ（ＭＳＲＥ）での消化を含むことにより、リアルタイムＭＳＰ（１メチル化分子／１０，０００非メチル化分子）と同じくらい敏感にすることができる。ＰＣＲプライミング部位の間の位置での非メチル化ＤＮＡの分裂は、人工的に完全にメチル化されたメチル化ＤＮＡを含むＤＮＡ混合物質について高感度を与える（Ｙｅｇｎａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（２００６）３４：ｅｌ９）。しかしながら、いくつかの部分的にメチル化されたアイランドが臨床標本では非メチル化物として得られるという、制限エンドヌクレアーゼの使用に関連している不都合をこの戦略は受けるかもしれない（Ｙｅｇｎａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ他、上掲）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
癌発生と進行におけるＣｐＧメチル化の重要さを考慮し、メチル化されたＣｐＧ  ＤＮＡのための迅速で、信頼でき、高感度の試験は癌スクリーニングのための重要で役に立つツールを提供するだろう。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
発明の要約
本発明はサンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。方法は一般に、ポリヌクレオチドの標的配列に特異的にハイブリダイズして、増幅するプライマー対と、標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを接触することを含む。この工程のために、プライマー対は標的ポリヌクレオチド配列にフランキング(flanking)する第１の配列に相補的な３’配列と、５’キャプチャータグ(capture tag)を有する第１のプライマーを含む。プライマー対の第２のプライマーは、反対の鎖の上の標的ポリヌクレオチド配列にフランキングする第２の配列に相補的な３’配列と、アブスクリプション(Abscription)を導く手段を提供する５’配列を有する。このプライマー対を使用した増幅（例えば、ＰＣＲ）に続き、増幅された標的配列は５’キャプチャータグに結合した固定された分子と接触され、増幅された標的配列を捕獲する。ついで、少なくとも１つのアブスクリプト(Abscript)がアブスクリプションを導く手段から転写され、アブスクリプトが標的ポリヌクレオチドの存在のしるしとして検出される。
【００２０】
親和性試薬または、固形担体へ結合されたかもしくは結合されることのできる結合対を介して通常捕獲が起こるであろう。例えば、５’キャプチャータグはビオチンであることができ、これは容易にオリゴヌクレオチドプライマーに組み入れることができ、５’キャプチャータグに結合する分子は、固形担体に固定されたストレプトアビジンであることができる。さまざまな固形担体が本発明の方法における使用に適しており、たとえばビーズ、チューブ、およびミクロタイタープレートが使用できる。好都合なものは、溶液中の結合していない試薬から固相の迅速な分離を可能にする磁性ビーズと結合することができるストレプトアビジンおよび他の結合対分子である。本発明のある実施態様では、結合していない試薬、プライマー、およびポリヌクレオチドは、引き続く工程の前に、固定されて捕獲されているポリヌクレオチドから洗浄でき、これは方法の効率を増加させることができる。しかしながら、分離工程なしでひとつのポットまたはチューブの中で方法の全体を実行できるので、これは必ずしも必要ではない。
【００２１】
ＰＣＲは例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼまたは熱安定性ＲＮＡポリメラーゼを使用して、増幅工程に通常使用される。しかしながら、当技術分野で知られているさまざまな標的物増幅方法が、本発明の方法における使用に適している。
【００２２】
さまざまな方法が本明細書に記載されるアブスクリプト検出のために使用でき、これらに限定されるものではないが、マススペクトル法、毛細管電気泳動または薄層クロマトグラフィが利用可能である。ある態様では、感度を増加させるか、または使用できる検出方法を広くするために、本発明方法によって発生するアブスクリプトシグナルに検出可能な標識ヌクレオチドまたは他の標識を組み入れることができる。例えば、検出可能な標識ヌクレオチドは蛍光ヌクレオチドであることができる。
【００２３】
一般に、本発明で発生されるアブスクリプトは、例えば長さは３−２０ヌクレオチドである。長さが最小で３ヌクレオチドまでのアブスクリプトが、本明細書に記載された方法で通常使用される。
【００２４】
増幅の間に使用されるプライマー対の第２のプライマーは、反対側の鎖のポリヌクレオチドの標的配列にフランキングする第２の配列と相補的な３’配列、およびアブスクリプションに導く手段を提供する５’配列を有する。
【００２５】
ある実施態様では、前記手段は標的にタグ付けをするか、または特定するのに使用されるα−ＴＡＰ(Target Attachment Probe:TAP)配列によって提供される。α−ＴＡＰはＴＡＰ配列に相補的であるように設計され、不完全プロモーターカセット（APC(Abortive Promoter Cassette))の付加を可能にする。ＴＡＰ配列のハイブリダイゼーションに利用可能な一本鎖としてα−ＴＡＰを維持するために、５’α−ＴＡＰ配列と、プライマー中の標的にフランキングする配列に相補的な３’配列の間に非天然型ヌクレオチドを含めることができる。エテノ−デオキシアデノシン(etheno-deoxyadenosine)などの非天然型ヌクレオチドは、増幅の間、ポリメラーゼによって認識されない。したがって、プライマー中の非天然型ヌクレオチドの川下配列は複製されず、それらの配列は１本鎖のままで残る。
【００２６】
形成されるＴＡＰ−α−ＴＡＰハイブリッドを通して、ＡＰＣがいったん増幅された標的に結合されると、アブスクリプトは標的の存在を検出するための表示またはシグナルとしてＡＰＣから転写される。結合されたＡＰＣは、二本鎖領域であるかまたはプローブのハイブリダイゼーションにより二本鎖にされる。
【００２７】
本発明のある実施態様では、ＡＰＣの一本鎖を含んでいるプライマー配列からの増幅反応の間、完全に二本鎖のＡＰＣが発生できる。好都合なことに、増幅の間、反応に熱安定性ＲＮＡポリメラーゼとヌクレオチドを含むことによって、アブスクリプションを実行できる。したがって、これらの実施態様では、増幅反応のための第２のプライマーはＡＰＣ配列を含んでいる。二本鎖のＡＰＣが生成される際（例えば、ＰＣＲで）、アブスクリプトはＡＰＣから転写され、それらが生成された時に（例えば、リアルタイムで）検出されることができ、または本明細書に記載されたアブスクリプト検出方法で後に分析されることができる。
【００２８】
本発明は迅速で、感受性の、ＤＮＡとＲＮＡ標的を含む対象となるさまざまな標的ポリヌクレオチドを検出するための具体的方法であって、ＰＣＲと比較して検出方法の拡張されたレパートリーを有する方法を提供する。ＰＣＲと異なり、本発明の方法はメチル化ＤＮＡ標的などのような修飾されたポリヌクレオチド標的の検出に適している。そのような方法によると、メチル化されたゲノムＤＮＡ断片は、最初にメチル化標的ポリヌクレオチド（ＣｐＧアイランドなど）を含むゲノムＤＮＡのサンプルを、標的ポリヌクレオチドを切断しない制限酵素により切断することによって分離するか、または切断の間に標的の適当な代表的断片を発生させる。次に、切断されたゲノムＤＮＡは、本明細書に記載されたＧＳＴ−ＭＢＤ２融合たんぱく質などのような固定されたメチル結合領域と接触される。このようにして、メチル化ゲノムＤＮＡ断片は、固定されて、したがって、サンプル中の非メチル化ＤＮＡ断片から分離される。任意に、メチル化されたゲノムＤＮＡ断片を固定されたＭＢＤから溶出され、分析の前に回収できる。たとえば、ＧＳＴ−ＭＢＤ２融合たんぱく質が、メチル化されたＣｐＧアイランド標的を固定するのに使用される場合、融合たんぱく質のＧＳＴ部分をグルタチオン樹脂に（ＤＮＡとの相互作用の前または後に）結合することができて、結合されたメチル化ＤＮＡ断片とグルタチオンとを溶出させることができる。
【００２９】
本発明の方法はマルチプレキシング(multiplexing)にも適当である。本発明のある実施態様では、複数の異なった標的ポリヌクレオチドが、複数の第１および第２のプライマー対を反応中に含むことによって同時に処理される。ここでそれぞれのプライマー対は、異なった標的ポリヌクレオチドを特異的にハイブリダイズするように設計されている。それぞれの標的のために、プライマーによる増幅により（本明細書に記載されるようなＡＰＣを含むプライマーの一部またはＴＡＰα−ＴＡＰハイブリッドを介して）標的に付加したそれぞれの標的について異なるユニークなＡＰＣを設計することにより、複数の標的のそれぞれの存在を生成したＡＰＣのシグナルを介して特定できる。例えば、それぞれのＡＰＣは、分子量またはヌクレオチド配列に基づいて区別可能になるように設計されることができる。本発明の実施態様によれば、ただ一つのアッセイで少なくとも５、１０、２０、５０、１００またはそれ以上の標的を検出できる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は本発明のアブスクリプション法が利用された不完全転写(abortive transcription)の過程を示す。ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）がプロモーターに繰り返し捕らえられるとき、短い不完全転写（通常２〜１２ｎｔ長さ）が、ほとんどのプロモーターに現れる。不完全転写の間、ＲＮＡＰはトランスロケートもしないし、プロモーターから離れもしない。通常の転写の間、ＲＮＡＰは最終的にプロモータエスケープ(promoter escape)と呼ばれるプロセスである安定な、発展的伸長複合体(processive elongation complex)への立体配座変化を受けて、終結シグナルに達するまで、転写を続ける。人工のプロモーター、または不完全プロモーターカセット（ＡＰＣｓ）は不完全複合体の中にＲＮＡＰをトラップし、反復して１分あたり何千もの同じ短鎖オリゴヌクレオチドを合成する。それぞれのＡＰＣは、特定の長さと配列の異なったアブスクリプトであり、分離され定量化できるものを作るように設計されている。
【００３１】
【図２】図２は、アブスクリプションを使用したタンパク質、ＲＮＡ、およびＤＮＡ標的の検出を示す。ＡＰＣｓはターゲット  アタッチメント  プローブに付加される。これは分子標的に特異的に結合する（図２Ａ）。ＤＮＡとＲＮＡの検出のために、ＴＡＰｓはそれが特異的に核酸標的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドまたは特異的に核酸標的に結合するタンパク質を含んでいる（図２Ｂ）。タンパク質検出において、たとえば抗体またはリガンドのような、蛋白質標的に結合する任意の分子にＡＰＣｓを付けることができる。図２ＣはＡＰＣが抗体に付加された本発明の実施態様を示す。酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）に使用される戦略と同様に、蛋白質標的の捕獲と検出のために、ＡＰＣ抗体複合体と固形担体の上に固定された第二の抗体の間で標的たんぱく質を「サンドイッチ」にすることができる。
【００３２】
【図３】図３はアブスクリプションのジヌクレオチド開始と、１つのＮＴＰの付加の後の停止を示す。表現されるようにＮＴＰｓ停止鎖（Ｒ３に３’−Ｏ−Ｍｅ−ＮＴＰｓ）を含むことにより、または反応から１種以上のＮＴＰｓを省略することによって、アブスクリプトの長さを制限できる。  Ｒｌは親和性タグ、蛍光タグ；Ｒ２はＯＨ，ＯＭｅ，Ｈ；Ｒ３はＯＨ，ＯＭｅ，Ｈ；Ｒ４はＯＨ，ＯＭｅ，Ｈ。
【００３３】
【図４】図４Ａと４Ｂはマススペクトル法によるアブスクリプトの検出を示す。イニシエーターＧｐＡとＧＴＰに含まれたアブスクリプション反応が、逆相ＨＰＬＣによって分画された。カラムの排出物を質量分析計に導入した。図４Ａはリテンションタイムの関数として、総イオンカウント数によるカラムプロファイルを示す。図４Ｂはトリヌクレオチドアブスクリプト  ＧＡＧピークのイオンスペクトルを示している（５．４分のリテンションタイム）。単独、および二重に荷電されたＧＡＧは、それぞれ９５６．１と４７７．６のｍ／ｚ値を有する。二重荷電種のナトリウム付加物は、９７８．２のｍ／ｚ値を有する。
【００３４】
【図５】図５は本発明のメチル化検出方法で使用されるＧＳＴ−ＭＢＤ  タンパク質の構造のイラストである。図５ＡはＧＳＴドメインのカルボキシル末端へのＭＢＤドメインの結合を示している。ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）にリンクするアミノ酸配列は、矢で示したトロンビン切断部位を含んでいる。図５ＢはマウスＭＢＤ２ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）のＤＮＡ結合領域のアミノ酸配列を示している。アンダーラインを引かれたアミノ酸はＭＢＤタンパク質のＤＮＡ結合領域の中の保存残基に対応している（Ｏｈｋｉ他、（１９９９）ＥＭＢＯ  Ｊ．１８：６６５３−６１）。図５Ｃは、固定化されたＧＳＴ−ＭＢＤのメチル化ＤＮＡ分画を示している。Ｓ（上澄）画分は増幅された非メチル化ＳＮＲＰＮ  ＣｐＧ  アイランド  ＤＮＡを含んでいる。Ｅ１は固定化されたタンパク質から溶出した増幅されたメチル化されたＳＮＲＰＮ  ＣｐＧ  アイランド  ＤＮＡを含んでいる。画分Ｅ２とＥ３は同じ固定化されたタンパク質からの２つのさらなる連続した溶離分である。図５Ｄはヒーラ細胞中で非メチル化されたＰＴＧＳ２  ＤＮＡの分画を示している。ＰＴＧＳ２  ＤＮＡのすべてが非結合性上清画分Ｓの中に回収される。
【００３５】
【図６】図６は、標的ＣｐＧアイランドの増幅された断片にＴＡＰ−ＡＰＣを結合することを含む、α−ＴＡＰ  アブスクリプションベースのＣｐＧメチル化検出のための戦略を示すフローチャートである。プロセス中の工程は数字により示す。図６Ａはメチル化されたＣｐＧ含有ＤＮＡの初期の捕獲を示す。工程１：メチル化ＤＮＡ断片は固定されたＧＳＴ−ＭＢＤタンパク質で非メチル化ＤＮＡ断片から分離される。工程２：メチル化ＤＮＡ断片は熱処理またはプロテアーゼまたはグルタチオンへの暴露で解離される。図６Ｂは、増幅タグ付けおよびタグ付けをされたＤＮＡ断片の捕獲を示している。工程３：たとえばビオチン（Ｂ）のような親和性標識で標的ＣｐＧアイランドはタグ付けをされ、ＰＣＲの間に、ビオチン化されたプライマーと、プライマー配列と反ＴＡＰ配列（α−ＴＡＰ）の間に非コーディングヌクレオチドを含むプライマーとを加えて、一本鎖伸長がされる。工程４：ビオチン化されたアンプリコンはストレプトアビジン磁性ビーズに結合される。工程５：ＡＰＣはＴＡＰ配列とα−ＴＡＰ配列の間でハイブリダイゼーションによってアンプリコンに結合される。ＡＰＣｓを含むビーズ固定化された複合体と、ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）に接触させることによって、アブスクリプションが実行される。
【００３６】
【図７】図７Ａ−７Ｃは、例示の標的特異性増幅プライマーと反ＴＡＰ（α−ＴＡＰ）プライマー／プローブの間の相互作用を示す。図７ＡはＣｐＧアイランド増幅に使用されたＰＣＲプライマーと、それらのアンプリコン内の相対的位置を示す。図７Ｂと７Ｃは不適当に設計されたα−ＴＡＰプライマー／プローブによる好ましくないアッセイ結果を示す。
【００３７】
【図８】図８はＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＰＣＲによるものと、図６に記載されたアブスクリプション／ＰＣＲによるものの、ＤＮＡ検出の相対感度を示している。分画されていないメチル化されたＨｅＬａ  ＤＮＡからのＧＳＴＰｌ  ＣｐＧ  アイランドの断片は、９０００から３０の開始コピー数／ＰＣＲで増幅された。図８ＡはＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ結果を示している。ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲプライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４であった。９０００コピーの検出は２８ＰＣＲサイクルを必要とした。図８Ｂは２９ＰＣＲサイクルに続くアブスクリプション／ＰＣＲ検出の結果を示している。アブスクリプション／ＰＣＲプライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２  およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３であった。ＴＡＰ−ＡＰＣはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２にアニーリングすることによって作られた。ＡＰＣはアブスクリプト  ＧＡＧをコード化した。アブスクリプトは薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）とＵＶシャドウイングを使用して検出された。面積は、アブスクリプトを含むクロマトグラフピークの面積をいう。
【００３８】
【図９】図９は、示した量の入力ＤＮＡのＰＣＲ増幅とその後の２時間と８時間のアブスクリプションの後の、ＴＬＣを使用したＣＹ５（登録商標）でラベルされたアブスクリプトの検出を示す。
【００３９】
【図１０】図１０は、ＡＰＣプライマーを使用して、アンプリコンの中へのＡＰＣの直接結合を使用したメチル化ＤＮＡ検出のための戦略を示しているフローチャートである。数字は戦略での工程を示す。工程１と２は、図６Ａに示すような、固定化されたＧＳＴ−ＭＢＤタンパク質を使用したメチル化ＤＮＡの分画について表現する。工程３はＡＰＣをアンプリコンに付けるのに使用されたプライマーと、標的配列との間の相関を示している。左側のプライマーは従来のＰＣＲプライマーである。右側のプライマーは、３’プライミング配列と、５’末端での１本鎖ＡＰＣを有する。工程４と５は標的のＰＣＲ増幅を表す。工程６はアブスクリプション  工程と引き続くＰＣＲ工程を示す。ＰＣＲ反応ではＲＮＡポリメラーゼ、イニシエーター、および１種以上のＮＴＰｓが補われる。
【００４０】
【図１１】図１１はＧＡＰＤＨ  ＣｐＧ  アイランドのためのＡＰＣプロモーター対の有効性を示す。図１１Ａは、ＡＰＣプライマーＣ４４３によるセルフプライミング（self-priming)による背景シグナル、およびＣ４４３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）とリバースプライマー(reverse primer)Ｃ４４６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）の間のプライマー−二量体の形成による背景を示す。Ｃ４４３のみを含むラッキングＤＮＡ、またはＣ４４３とＣ４４６の組み合わせを含むＰＣＲ反応が、５６．４℃から６８．５℃のアニーリング温度で行われ、次いで１時間のアブスクリプションが実行された。アブスクリプトの生産はＴＬＣ−ＵＶシャドウイングで検査された。ＨｅＬａ  ＤＮＡを含む正の対照だけがアブスクリプト  ＧＡＧを製造した。図１１Ｂは同じサンプルの組からのアブスクリプトのＬＣ−ＭＳ検出の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
上述の一般的な説明および以下の詳細な説明は両方とも例示および説明であり、特許請求される本発明を制限するものではないことが理解されるべきである。本明細書において使用される時、特記の無い限り単数の表記は複数のものを含んでいる。本明細書において使用される時、特記の無い限り“または”は「および／または」を意味する。本明細書において使用される時、「含む」、「含有する」、またはそれのすべての他の変化も、非排他的な包含を意味し、たとえばある要素のリストを含むプロセス、方法、組成物、反応混合物、キット、または装置は、それらの要素だけを含むものではなく、そのようなプロセス、方法、組成物、反応混合物、キット、または装置に明白に記載されなかったか、または固有の他の要素を含むことができる。本明細書に使用された項目の見出しは、構成上の目的だけのためにあって、説明した内容を限定するものとは解釈されない。
【００４２】
具体的定義が提供されるが、分子生物、生化学、および有機化学の実験法とテクニックに関連して使用される本明細書に記載した専門用語は、当技術分野で知られていたものである。標準的な化学および生物学的なシンボルと略語はそのようなシンボルと略語によって表されるフルネームと共に互換性を持って使用される。したがって、例えば、用語「デオキシリボ核酸」と「ＤＮＡ」には同じ意味があるのが理解される。例えば、化学合成、分析化学、組換えＤＮＡ方法論、およびオリゴヌクレオチド合成には標準的方法を使用できる。反応と精製のテクニックは、例えば、メーカーによるキットは、本明細書に記載されるように、または一般的に行われるように、製造者の使用説明書にしたがって実行される。一般に、当技術分野で周知の従来法、および本願明細書に引用され議論される種々の一般書およびより具体的な参考文献にしたがって、以下に記載されるテクニックと手順を実行できる。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ他、分子クローニング：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））；Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．（２００３））を参照されたい。これらはその内容の全体について任意の目的のため本明細書に参考として援用される。
【００４３】
本明細書で使用される“約”は、“約”が付された数の＋／−  １−１０％を範囲の数を意味する。例えば、“約”５０ヌクレオチドは、状況に応じて４５−５５のヌクレオチドまたは４９−５１のヌクレオチドを意味する。本明細書において、たとえば「４５−５５」などの数字の範囲は、その範囲内のそれぞれの整数を含む。例えば、「４５−５５のヌクレオチド」は、核酸が４５のヌクレオチド、４６のヌクレオチドなどを含むことができ、最大５５のヌクレオチドを含むことができることを意味する。
【００４４】
本明細書に使用される時、「転写」は、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ）によって触媒された一本鎖のＤＮＡ（すなわちテンプレート）のＲＮＡコピーの酵素的合成を示す。
【００４５】
「不完全転写(abortive transcription)」は、相補核酸テンプレート配列の少なくとも１つの部分に対応するオリゴヌクレオチドを反復的に合成し、合成を終了するＲＮＡポリメラーゼ媒介プロセスである。生体内で合成された不完全オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの長さにおいて異なって、転写開始点、または転写開始点近くの配列に相補的である。
【００４６】
「アブスクリプション」（"Abscription"（登録商標））は、インビトロ分析用途に最適化された不完全転写の型であり、合成または天然のプロモーター配列から短くて、均一なＲＮＡ転写産物または「不完全転写産物（アブスクリプト（abscripts)）」を反復して生産するために使用される。用語「アブスクリプト(Abscripts)」（カタカナで書かれる、英語では大文字から始まる）は、アブスクリプション反応またはアッセイで生産された最適化された合成の転写産物を、より一般的な用語「不完全転写産物(abscripts)」（これは、自然に起こるとき、通常の転写の間に製造される短い不完全転写を包含する）から区別するために本明細書において使用される。
【００４７】
「反復」は対象となる配列の複数同一(multiple identical)であるかまたは実質的に同じコピーの反復した合成をいう。
【００４８】
本明細書に使用される「ターミネーター」または「転写ターミネータ」は、ＲＮＡチェーンターミネーティング化合物、複合物またはプロセスをいう。例えば、本発明のターミネータはヌクレオチド類似体である場合がある。ＲＮＡチェーンへの付加的ヌクレオチドの添加を防ぐためにＲＮＡ合成の間、そのヌクレオチド類似体をＲＮＡチェーンに組み入れることができる。
【００４９】
本明細書に使用される「増幅」は、ＤＮＡ断片または領域のような、ポリヌクレオチドの同一の複製物を作るプロセスをいう。増幅は一般にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により実行されるが、当技術分野で知られている他の方法も、本発明のＤＮＡ断片を増幅するために適当である場合がある。
【００５０】
「標的ＤＮＡ配列」または「標的ＤＮＡ」は、検出、キャラクタリゼーションまたは定量化が望ましい対象となるＤＮＡ配列をいう。標的ＤＮＡの実際のヌクレオチド配列は知ることができるか、または知ることができない。典型的には、標的ＤＮＡはＣｐＧメチル化の状態が調べられるＤＮＡである。「標的ＤＮＡ断片」は、標的ＤＮＡ配列を含むＤＮＡの断片である。例えば、剪断または超音波処理を含む任意の方法で標的ＤＮＡ断片を製造できるが、最も典型的には１種以上の制限エンドヌクレアーゼによる消化で生産する。
【００５１】
本明細書において使用される時、「テンプレート」はそれから相補的オリゴまたはポリヌクレオチドコピーが合成されるポリヌクレオチドである。
【００５２】
一般に、「合成」は化学的または酵素的方法で核酸を製造するプロセスを示す。化学合成は、使用できる一本鎖の核酸、プライマー、およびプローブを製造するのに通常使用される。酵素媒介性「合成」はテンプレートからの複製と転写の両方を包含する。合成は、標的の単一コピーまたは多重コピーを作ることを包含する。「多重コピー」は少なくとも２つのコピーを意味する。「コピー」はテンプレート配列と完全な相補性配列または同一の配列であることを意味しない。例えば、コピーはヌクレオチド類似体、意図的な配列変化（たとえばハイブリダイズ可能であるが相補的でない配列を含むプライマーがテンプレートに導入されたことによる配列変化）、および／または、合成の間に発生する配列エラーを含むことができる。
【００５３】
「ポリヌクレオチド」および「核酸（分子）」という用語は、すべての長さのヌクレオチドの重合型について言及するように互換性を持って使用される。ポリヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはそれらの類似物を含むことができる。ヌクレオチドは、修飾されているか、または修飾されておらず、任意の三次元構造も持つことができ、公知または未知の全ての機能を発揮することができる。「ポリヌクレオチド」という用語は１本鎖、二本鎖、および三重螺旋状の分子類を含む。以下はポリヌクレオチドの非限定的な実施態様である：遺伝子または遺伝子フラグメント、エクソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム類、ｃＤＮＡ、組換え型のポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の遊離ＤＮＡ、任意の配列の遊離ＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。
【００５４】
「オリゴヌクレオチド」は、−本鎖または二本鎖の核酸の２から１００の間のヌクレオチドのポリヌクレオチドをいい、典型的にはＤＮＡである。オリゴヌクレオチドはオリゴマーまたはオリゴ(oligos)として知られ、遺伝子および他の生物物質から分離でき、または当技術分野で知られている方法で化学的に合成される。「プライマー」は少なくとも６つのヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを示す。通常１本鎖であり、酵素媒介性核酸合成の開始のために３’ヒドロキシル末端を提供する。「ポリヌクレオチドプローブ」または「プローブ」は、特異的に相補ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。本明細書において使用される時、「特異的に結合する」または「特異的にハイブリダイズする」とは、所定の条件下で他の分子と結合し、二本鎖分子となり、またはハイブリダイズすることをいう。したがって、プローブまたはプライマーは所定の条件下で、意図する標的ポリヌクレオチドだけに「特異的にハイブリダイズする」。そして、抗体は特定の結合条件下で意図する標的抗原だけに「特異的に結合する」。所定の条件は、結合またはハイブリダイゼーションのために示されたものであり、バッファ、イオン強度、温度、および他の要素を含み、当業者には公知である。また、当業者は特異結合が中断されるか、または解離され、その結果、たとえば抗体抗原、受容体リガンド、およびプライマー標的ポリヌクレオチド組み合わせを溶出するか、または融解する条件に関して知識を有する。
【００５５】
「核酸配列」はＤＮＡまたはＲＮＡのようなオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのヌクレオチド塩基の配列を示す。二本鎖分子においては、両方のストランドを表すのに一本鎖を使用できる。相補スタンドはワトソン・クリック型塩基対によって推論される。
【００５６】
用語「相補」または「相補性」は第２のポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチドであることができる）と「逆平行会合（antiparallel association)」である第１のポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチドであることができる）に関して使用される。本明細書において使用される時、「逆平行会合」という用語は、２つのポリヌクレオチドの配列が、実質的にワトソン・クリック塩基対ルールにしたがって、２つの会合するポリヌクレオチドの個々のヌクレオチドまたは塩基が対にされる配列をいう。相補性は、塩基対ルールに従ってポリヌクレオチドの塩基のいくつかのみが対応する、「部分的」な相補性であることができる。または、ポリヌクレオチドの間は、「完全」または「全部」が相補性であってもよい。核酸技術の当業者は、多くの変数を考えることによって、二本鎖の安定性を実証的に決定できる。該変数としては、例えばオリゴヌクレオチドであることができる第１のポリヌクレオチドの長さ、第１のポリヌクレオチドの塩基組成と配列、イオン強度と不適正塩基対の発生があげられる。
【００５７】
本明細書において使用される時、「ハイブリダイゼーション」という用語は、６以上のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドとオリゴヌクレオチドを含む相補性核酸の塩基のペアリングに関して使用される。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸の間の会合の強度）は、核酸の間の相補性の度合い、かかわる反応条件の厳しさ、形成されたハイブリットの融解温度（Ｔｍ）、二重鎖核酸の中のＧ：Ｃ比のような因子によって影響を与えられる。一般に、「ハイブリダイゼーション」方法は、相補ポリヌクレオチドを標的核酸（すなわち、直接または間接的な手段で検出されるべき配列）にアニーリングすることを含む。お互いに配置されて、塩基ペアリング相互作用を通してお互いにアニーリングする相補的配列を含む２つのポリヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドの能力はよく認識された現象である。
【００５８】
「複合体」は成分の集合体である。複合体は、安定あるかまたは安定でないことができ、直接または間接的に検出できる。たとえば、本明細書に記載されるように、所定の反応成分と反応の生産物のタイプにより、複合体の存在を推論できる。例えば、本明細書に記載された上記の不完全転写方法では、一般に、複合体は最終的な反復合成生成物、たとえば最終的な不完全転写産物または複製生成物に対する中間体である。
【００５９】
「メチル化」はメチル基（−ＣＨ３）の分子への付加を示す。該分子は典型的にはＤＮＡまたはＲＮＡにおけるヌクレオチド塩基である。”ｍＣｐＧ”は５位置のＣがメチル化された５’−ＣＧ−３’ジヌクレオチド（５−メチルシトシンまたは５Ｍｅ  Ｃ）を示す。「ＣｐＧアイランド」は、高頻度のＣｐＧジヌクレオチドを含むゲノム領域である。
ＣｐＧアイランドは哺乳類遺伝子のプロモーターの約４０％にあり、ヒト遺伝子のプロモーターの約７０％は高いＣｐＧ含有量を示す。例えばＦａｔｅｍｉ他、（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ。３３：ｅｌ７６ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｎｉｌ８０．ＰＭＩＤ１６３１４３０７を参照。
【００６０】
本明細書に使用される「プロモーター」は、隣接遺伝子の転写を容易にするＤＮＡ領域を示す。プロモーターは典型的には５’および遺伝子内の転写開始の開始部位の近傍であり、ＲＮＡポリメラーゼおよび関連転写要素を遺伝子の転写のための正しい位置に導く。
【００６１】
「マイクロアレイ」および「アレイ」は、オリゴまたはポリヌクレオチドなどの化合物、サンプル、または分子の集団の配置について言及するのに互換性を持って使用される。アレイは典型的には「アドレス可能(addressable)」であり、集団の個個の要素が配置の中でユニークで、同一だと識別できる位置(identifiable position)にある。アレイはガラススライドのような固体基体、またはニトロセルロース膜などのような半個体基体、またはチューブまたはミクロタイタープレートウェルのような容器の中に形成できる。アレイのための典型的な配置はミクロタイタープレートなどの８列の１２カラム配置であるが、当業者の知識の中には本発明の方法における使用に適した他の配置があるであろう。
【００６２】
「固形担体」という用語は、例えば捕獲プローブ、他のオリゴ−またはポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、他の希望の分子または複合体を固定するのに使用できるすべての固相をいう。適当な固形担体は当技術分野で周知であり、ミクロタイタープレートのような反応トレーのウェルの壁、試験管の壁、ポリスチレンビーズ、常磁性または非磁性ビーズ、ガラススライド、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、ラテックス粒子などのミクロ粒子などを含むが、これらに限定されない。固形担体のための典型的な材料は、塩化ビニル樹脂（ＰＶＣ）、ポリスチレン、セルロース、アガロース、デキストラン、ガラス、ナイロン、ラテックスおよびそれらの誘導体を含むが、これらに限定されない。さらに、固形担体をコーティングするか、誘導体とするかまたは他の方法で変成して希望の分子の結合を促進し、および／または非特異性の結合または他の望ましくない相互作用を防止することができる。具体的「固相」の選択は、通常重要ではなく、使われる方法と検定方法に応じて当業者は選択できる。好都合なことに、固形担体は様々な検出方法に対応するよう選択できる。たとえば、９６または３８４ウエルプレートがたとえばロボットワークステーションで自動化された検定方法に使用でき、例えばプレートリーダーを使用して検出することができる。フィルムベースの視覚化を利用するオートラジオグラフィー検出工程を含むことができる本発明の方法のために、固形担体は薄膜であることができ、たとえばニトロセルロース膜、ナイロン膜、ゲルまたは薄層クロマトグラフィープレートなどであることができる。固相に分子を固定するための適切な方法としては、イオン性、疎水性、または共有結合による相互作用など、およびそれの組み合わせがあげられる。しかしながら、固定化の方法は、通常重要でなく、キャラクタライズされない吸着機構であることができる。本明細書で使用される「固形担体」は、不溶性であるか又は後の反応で不溶性にしうる任意の物質を意味する。固有担体が捕獲試薬を引き付けて、固定するように、固形担体を選ぶことができる。あるいはまた、固形担体は引き付けて、固定する能力を有する追加の分子、例えば「捕獲」試薬を保持できる。
【００６３】
「抗体」または「抗体類」は、本明細書に使用されるように、ポリクロナールやモノクローン抗体などの天然存在種、並びに天然存在分子の任意の抗原結合部分、断片またはサブユニット、例えば、抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ）２断片を含む。また、本発明の方法における使用のために想定されているものとしては、組換え型の、トランケートされた単一鎖、キメラ、ハイブリッド抗体、たとえばヒト化および霊長類化抗体、他の非天然存在抗体があげられるが、これらに限定されない。
【００６４】
本発明はアブスクリプションと呼ばれる分子検出技術に基づいており、不完全転写性（図１）として知られている自然現象に基づいている。アブスクリプションは、タンパク質、核酸、ＳＮＰｓおよびＣｐＧメチル化をはじめとするさまざまな標的を検出して定量化するための確固とした等温方法である（米国特許出願第１０／６０２，０４５、１０／７９０，７６６、１０／４８８，９７１、米国特許番号７，０４５，３１９、および７，２２６，７３８）。アブスクリプションはＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）が反復的に短いＲＮＡｓを生成する転写のイニシエーション期の間、またはプロモーターにしっかりと結合しているアブスクリプツ（Ａｂｓｃｒｉｐｔｓ）で発生する（Ｈｓｕ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（２００２）１５７７：１９１−２０７；  Ｈｓｕ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００３）４２：３７７７−８６；Ｖｏ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００３）４２：３７９８−８１１；Ｖｏ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００３）４２：３７８７−９７；Ｈｓｕ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００６）４５：８８４１−５４）。プロモーターの配列と初期転写セグメントは支配的なアブスクリプトの長さ、およびそれらの合成速度に有意な効果を持っている（Ｈｓｕ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００６）４５：８８４１−５４．２８）。不完全プロモーターカセットと呼ばれる多発性の最適な高度に不完全なプロモーターが開発され、非常に大きな速度で異なった配列および長さ（３と１２ｎｔの間）のアブスクリプトを生産するために最適化された。
【００６５】
ＲＮＡＰがＲＮＡ合成のラウンドにプロモーターから解離しないので、短いアブスクリプトの生産は非常に効率的である。それぞれの完全な長さの転写を製造した後にそれは起こり、基体が減耗されるまで高いターンオーバー速度でアブスクリプトを製造し続けるからである。これは、毎分、ＡＰＣあたり何千アブスクリプトの非常に急速な生産をもたらす。アブスクリプションは標的増幅プロセス(target amplification process)ではなくむしろシグナル増幅(signal amplification)である。
【００６６】
本発明は最適化されたメチル結合領域（ＭＢＤ）ポリペプチドを含む、ｍＣｐＧ標的部位プローブを介してＤＮＡにおけるＣｐＧメチル化の検出のための単純で、感受性の高い方法を提供する。直接または間接的にシグナル発生部位とｍＣｐＧ標的部位プローブを結合できる。シグナル発生器は、ＣｐＧメチル化のインディケータとして測定できる検出可能なシグナルを発生する。
【００６７】
本発明のある実施態様では、シグナル発生はアブスクリプションプロセスに基づいている。ここで不完全プロモーターカセット（ＡＰＣｓ）シグナル発生部位はｍＣｐＧ標的特異性プローブを通して標的ｍＣｐＧ部位に結合する。ＲＮＡポリメラーゼは、メチル化されたＣｐＧｓの存在のシグナル（インジケータ）として、ＡＰＣｓにおける合成の、または天然の不完全プロモーターから一定の、短いＲＮＡ分子を製造する。本発明の他の実施態様では、シグナル発生カセットは、ＰＣＲまたは他の複製、および／または増幅方法により、検出可能なＲＮＡまたはＤＮＡシグナルを発生できる。
【００６８】
亜硫酸水素塩処理が必要でないので、本発明の方法は現在のＣｐＧメチル化検出方法に比較して顕著な利点を示す。したがって、本発明のある実施態様では標的ＤＮＡの化学的処理に関連している配列の複雑性の減少と大規模なＤＮＡ分解を避けることができる。本発明の方法は、迅速であり、１日で通常実行できる。さらに、多様な自動化された用途に本発明を適合させることができる。
【００６９】
本発明のある種のアブスクリプションに基づくメチル化検出分析は、標的増幅過程（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応またはＰＣＲ）で、直線的で、確固とした(robust)シグナル増幅プロセス（アブスクリプション）を結合する独特な能力を提供する。これは、非常に高い感度に加えて、出発物質の少量だけを使用するテストを許容する。さらに、サンプルのそれぞれの標的から同じシグナル分子を発生させる西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼなどの他のシグナル増幅方法と異なり、それぞれの標的から異なったシグナルを発生させるようにアブスクリプションに基づく増幅をフォーマットできる。短鎖オリゴヌクレオチドの形で、さまざまな方法でこれらのシグナルを検出できる。アブスクリプションに基づく検定方法は他のＤＮＡメチル化検出分析よりもより少ない時間と労働力を必要とする。試薬費用は非常に競争力があり、設備費用は低い。さらに、陽性および陰性の対照テンプレートを含むことによって、これらの検定方法は高度に特異的な検出と標的検出のための他の方法より少ない擬陽性結果をもたらす。
【００７０】
アブスクリプション技術
アブスクリプション技術は、全長ＲＮＡ転写産物が作られる前に、多くの短い、不完全転写産物がＲＮＡポリメラーゼによって合成されるという観察に基づいている。以下で説明するように、不完全転写は転写プロセスの通常の副産物であるが、全長ＲＮＡ転写産物（転写プロセスの機能上有益な生成物である）からサイズとそれらが作られている方法による両方で区別可能である。
【００７１】
転写プロセス
転写は、真正核細胞と原始核細胞の両方によって利用され、ＤＮＡテンプレート（すなわち、遺伝子）からＲＮＡ転写産物を選択的に合成する複雑で非常に規制されたプロセスである（Ｒｅｃｏｒｄ他、（１９９６）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，（Ｎｅｉｄｈａｒｔ，ｅｄ．；ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）；ｄｅＨａｓｅｔｈ他、（１９９８）Ｊ．Ｂａｃｔ．１８０：３０１９−２５；Ｈｓｕ（２００２）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１５７７：１９１−２０７；Ｍｕｒａｋａｍｉ＆Ｄａｒｓｔ（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１３：３１−３９；Ｙｏｕｎｇ他、（２００２）．Ｃｅｌｌ．１０９：４１７＾２０）でレビューされた）。
細胞環境における転写は５つのステージを含んでいる：
１．開始剤、  転写装置（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）と転写因子）がプロモーターにリクルートされる。
２．開始、この間にＲＮＡの合成が始まる。
３．プロモーターエスケープ、この間にＲＮＡポリメラーゼはプロモーターから離れ、不完全開始停止（通常約１２−ｍｅｒリボ核酸の合成の後）する。
４．伸張、この間にＲＮＡＰはテンプレートＤＮＡ鎖に沿って前進的に進み、その結果、全長ＲＮＡ転写産物を合成する。
５．終結、この間にＲＮＡ合成は停止し、ＲＮＡＰはテンプレートＤＮＡから解離する。
【００７２】
全長ＲＮＡ転写の前の不完全転写産物の生産
典型的にはＲＮＡＰは、最初の試みのときにプロモーターエスケープに失敗し、代わりに不完全転写と呼ばれる短いＲＮＡ生産物の合成と解離の多発性不完全サイクルにとらわれる。ＲＮＡＰが閾値長さのＲＮＡ生成物を合成するのに成功したときだけ、ＲＮＡＰは取消不能にプロモータＤＮＡとの相互作用を壊し、ＤＮＡテンプレートに沿ってトランスロケートし始め、前進的に全長ＲＮＡ転写産物を合成する（Ｈｓｕ（２００２）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１５７７：１９１−２０７；Ｈｓｕ他、（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：３７７７−８６；Ｖｏ他、（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：３７８７−９７；Ｖｏ他、（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：４２：３７９８−１１を参照）。プロモータエスケープ（上記のステージ３）の前に、ＲＮＡＰはプロモータ領域においてまたはプロモータ領域の近くでテンプレートＤＮＡに結合し、その結果短い時間で、不完全合成の多数のラウンドを許容する。
【００７３】
アブスクリプション技術
アブスクリプション技術は、多くの検出可能な不完全転写（アブスクリプト：Ａｂｓｃｒｉｐｔｓ）を製造するのに不完全ＲＮＡ合成の自然現象を利用する。アブスクリプションは等温性の、不完全転写に基づく確固とした直線的なシグナル発生システムである。アブスクリプション方法では、不完全プロモーターカセット（ＡＰＣｓ）は、標的部位プローブ(Target Site Probes(TSPs))を介して標的分子に結合される。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼは、ついでＡＰＣを、短くて均一なＲＮＡ分子またはアブスクリプト（不完全転写）の形で、１標的あたり多くのシグナルを発生させるためにテンプレートとして使用する。
【００７４】
アブスクリプション検出方法は、対象となるさまざまな分子類（すなわち、標的）を検出するために適合させることができる３つの基本工程を有する。最初に、ＡＰＣは標的部位プローブ（ＴＳＰ）を通して対象となる標的分子に配置される。２番目に、アブスクリプトは配置されたＡＰＣｓから合成される。最終的に、アブスクリプトは標的検出手段として検出され、標的分子存在量の表示として定量化できる。ＲＮＡＰが不完全ＲＮＡ合成のラウンドの間、プロモーターから離れて動きもしないし、解離もしないので、プロセスは非常に効率的である。プロモーターからの解離はそれぞれの全長転写産物を製造した後に行われる。さらに、均一な短いＲＮＡシグナルだけが合成されるので、より長いオリゴ−およびポリヌクレオチドよりもより迅速に、より少ない努力で製造できる。
【００７５】
プロモータエスケープ（したがって、不完全合成の終わり）に必要である要因と条件は、不完全にしか理解されていないが、十分な知識が不完全転写合成に有利で、全長ＲＮＡ産物を排除する人工的環境を作成するために利用可能である。１つの実施態様では、図３の非限定的な例に示すように、定義されたジヌクレオチド開始剤で開始されて、次に１種以上のＮＴＰｓの付加の後に停止してアブスクリプトを製造するよう合成ステージで制御される。鎖停止ＮＴＰｓ（例えば、３’−Ｏ−Ｍｅ−ＮＴＰｓ）の使用、または反応から１種以上のＮＴＰｓを省略することによって、３つのヌクレオチド（ｎｔ）とまで短くアブスクリプトの長さを制限できる。
【００７６】
他の実施態様では、アブスクリプトの長さはプロモーター／テンプレートステージで、停止シグナルの前に転写に利用可能なヌクレオチドの数が個個に制御された合成のテンプレートを提供することによって制御できる。１つのアブスクリプション反応中のただ一つのＡＰＣからのアブスクリプト生産の均一性は、存在する標的の量に直接比例するアブスクリプトシグナルに帰結する。したがって、アブスクリプションはｍＣｐＧなどの標的を測定する定性的かつ定量的なシステムである。
【００７７】
不完全プロモーター(abortive promotor)は、標的増幅プロセスを介してＤＮＡに組み入れるか、または第２のストランドのハイブリダイゼーションによって一本鎖ＤＮＡ上に形成することができる。しかしながらより一般的には、ＡＰＣｓをそれらの標的に結合することによりさまざまな標的分子を検出するのにアブスクリプションを使用できる（図２）。タンパク質、ＲＮＡまたはＤＮＡの検出において、ＡＰＣｓは分子標的に結合するターゲントアタッチメントプローブに接続される（図２Ａ）。ＤＮＡおよびＲＮＡの検出のために、ＴＡＰｓは特異的に標的核酸に結合するオリゴヌクレオチドまたはタンパク質を含んでいる（図２Ｂ）。タンパク質検出において、標的蛋白質に結合するすべてのものにＡＰＣｓを付加することができる。同じ標的に導かれる２つの抗体であって、１つは標的の捕獲のためであり、もう１つはＡＰＣの付加のためのものを用いる、ＥＬＩＳＡに類似するいくつかのアッセイが開発されている（図２Ｃ）。
【００７８】
トリヌクレオチド合成
鎖停止ＮＴＰｓの包含または１種以上のＮＴＰを省略することによって、トリヌクレオチド  アブスクリプトを作ることができる。アブスクリプトは、アブスクリプションの間、修飾されたジヌクレオチドにより、検出または捕獲のためにラベルされることができる（ＤｉｓｓｉｎｇｅｒとＨａｎｎａ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ（１９９０）２６５：７６６２−８：ＤｉｓｓｉｎｇｅｒとＨａｎｎａ（Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ）、（１９９１）２１９：１１−２５；Ｈａｎｎａ（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ）、（１９８９）１８０：３８３−４０９；Ｈａｎｎａ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８９）２８：５８１４−２０；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９８３）８０：４２３８−４２；Ｈａｎｎａ＆Ｍｅａｒｅｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８３）２２：３５４６−５１．２９−３４），またはＮＴＰｓ（Ｈａｎｎａ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９９）２７：１３６９−７６；Ｈｅ他，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９９５）２３：１２３１−８）。明細書に使用される「ラベル」は、分子中に存在する部位であって、直接または間接的に検出して、区別できるものをいう。ラベルは典型的には、天然のラベルされていない種を検出するよりも、高い効率でおよび／または特異的に、容易に検出される。本発明の方法における使用のために適合するラベルとしては、蛍光基、親和性標識（たとえばビオチン）、および電荷または質量が変成されたヌクレオチドがあげられる。
【００７９】
１つの実施態様では、本明細書に記載された検定方法は、分子量または移動性で異なる異なったトリヌクレオチドアブスクリプトの生産に関する。トリヌクレオチドは、ジヌクレオチド開始剤とヌクレオチド三りん酸を加え、ＡＰＣｓで毎分１０００から２０００の速度で、ＲＮＡＰによって作られる。迅速ＴＬＣおよびＵＶシャドウイングまたはマススペクトル法により、ラベルせずに、トリフクレオチド  アブスクリプトを検出できる。あるいはまた、ジヌクレオチド開始剤に組み入れられたラベル（例えば、蛍光部位）を通してアブスクリプトを検出できる。
【００８０】
本発明は、ポリヌクレオチドについて特異的にハイブリダイズして、標的配列を増幅するプライマー対と、ポリヌクレオチドを含むサンプルを接触させることによって、サンプル中のポリヌクレオチドを検出するための方法を提供する。プライマー対はポリヌクレオチドに相補的で、標的配列にフランク(flank)し、５’キャプチャータグを含む第１のプライマーを含む。第２のプライマーは、３つの領域を含む：最初のプライマーからの標的配列の反対側の標的配列にフランクするポリヌクレオチドに相補的な３’配列；増幅に続いて、ＡＰＣに付加するために使用される５’α−ＴＡＰ配列；典型的にはエテノ−デオキシアデノシンである、３’と５’配列の間の非天然型ヌクレオチド。
【００８１】
次に、１番目と２番目のプライマーを使用してポリヌクレオチドの標的配列を（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応で）増幅し、５’キャプチャータグに結合する分子を含む固形担体に増幅された標的配列を捕獲する。この工程に任意の利用可能なＰＣＲ技術または適当な核酸増幅方法を使うことができ、たとえば熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよび／またはＲＮＡポリメラーゼ酵素を使用するＰＣＲ法などを使用できる。例えば、キャプチャータグはビオチンであることができ、固形担体は磁性ビーズなどのストレプトアビジンビーズであることができる。次に、捕らわれているアンプリコンは、非結合性プライマーを取り除くために洗浄され、所望であれば、固形担体から溶出される。
【００８２】
標的ポリヌクレオチド配列の検出において、プローブはアンプリコンにハイブリダイズされる。このプローブはα−ＴＡＰ配列に相補的な５’ＴＡＰ配列を含んでいる。第２ＰＣＲプライマーの非天然型ヌクレオチドの包含のため、α−ＴＡＰ配列はＰＣＲの間にコピーされず、増幅の間に一本鎖を保持し、その結果、プローブのＴＡＰ配列が増幅された標的の特性を奪わずにハイブリダイズすることを許容する。非天然型ヌクレオチドとしてエテノ−デオキシアデノシンを使用できるが、当業者は複製を終える適当な非天然型ヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド類似体）を追加でき、その結果、エテノ−デオキシアデノシンを置換できることに気がつくであろう。また、プローブは、上で説明したアブスクリプションを使用する方法でアブスクリプトを合成するためのテンプレートを提供するＡＰＣも含む。最終的に、アブスクリプトは任意の適切な方法でも検出される。特にはアブスクリプト検出のために本明細書に記載した、マススペクトル法、毛細管電気泳動または薄層クロマトグラフィなどが使用できる。典型的にはアブスクリプトは、３〜２０のヌクレオチドの長さを持ち、アブスクリプションの間、識別可能なラベル（例えば、蛍光の）を有するヌクレオチドを取り入れることによって、ラベルできる。
【００８３】
本発明の他の実施態様では、第２の増幅プライマーの５’末端にＡＰＣ配列を含ませ、非天然発現ヌクレオチドを省略することによって、ＴＡＰ／α−ＴＡＰ工程を省くことができる。そのような実施態様では、増幅の間、増幅された標的配列に隣接して二本鎖ＡＰＣが発生し、標的配列は、ＲＮＡＰとヌクレオチドの添加のときにアブスクリプションを導くだろう。これらのアブスクリプション試薬が増幅の間存在している場合、アブスクリプションおよび増幅は、同じチューブの中で同時に実行できる。
【００８４】
反応においてそれぞれのポリヌクレオチドへ特異的なプライマー対を含むことによって、本発明の方法はマルチプレクシング（すなわち、同時の複数のポリヌクレオチドの検出）のために適合させることができる。本発明のこの実施態様によれば、それぞれのプライマー対は、ポリヌクレオチドのユニークな標的配列について、特異的にハイブリダイズして、増幅するように設計される。また、それぞれのプライマー対に対するα−ＴＡＰ配列もユニークであり、その結果、標的配列のための識別子として機能する。ユニークなＡＰＣ特定を含む相補ＴＡＰとのハイブリダイズと引き続くＰＣＲ増幅により、マルチプレックス反応で製造されたアブスクリプトに基づいてそれぞれのポリヌクレオチドの存在を調べることができる。したがって、ユニークなＡＰＣがそれぞれの増幅された標的ポリヌクレオチドに付加され、ＡＰＣから製造された区別可能なアブスクリプトシグナルは、標的ポリヌクレオチドの存在の表示として検出し、測定できる。例えば、それぞれのＡＰＣは、分子量またはヌクレオチド配列に基づいて区別可能なアブスクリプトを発生させるように設計されることができる。単一反応では、５、１０、２０または、より多くのユニークな標的配列を検出できる。
【００８５】
また、本発明は亜硫酸水素塩での脱アミノを使用せずに、ＣｐＧアイランドのメチル化状態を決定するための方法を提供する。そのような方法は、線形シグナル増幅過程による標的の増幅、アブスクリプション、それを非常に感受性にすることを組み合わせる。
【００８６】
本発明のある実施態様では、一つまたは複数の標的ポリヌクレオチドは、メチル化されたＣｐＧアイランドまたは複数のＣｐＧアイランド（すなわち、マルチプレキシング）である。これらの実施態様では、最初に、メチル化されたＣｐＧアイランドを含むゲノムＤＮＡは、マルチプレックスアッセイでいずれのアイランドも切らない予定された制限酵素を使用することで分解する。そして、固定されたＭＢＤ試薬を使用してゲノムＤＮＡからメチル化されたＤＮＡ断片を得、対象となる具体的ＣｐＧ配列について、捕獲断片を調べる。本発明の１つの方法によれば、メチル化ＤＮＡ富化プロセスを使用して、断片化しているゲノムＤＮＡからのメチル化ＤＮＡの単離によりプロセスが始まる。本発明の１つの態様では、富化方法はマウスＭＢＤ２からのメチル結合領域を含むグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合たんぱく質を使用する。これはメチル化ＤＮＡに対して非常に特異的である。ＭＢＤ２−融合たんぱく質に結合したメチル化ＤＮＡは、グルタチオン磁性ビーズによって急速に捕らえられて、ポリメラーゼ連鎖反応による直接増幅のためにバッファに溶出する。対象となるＣｐＧアイランドは、１対の修飾ＰＣＲプライマーを使用して増幅される。１番目はストレプトアビジン磁性ビーズへの標的ＣｐＧアイランドの次の捕獲のためのビオチン基を含む。２番目のプライマーは特異的ＡＰＣの付加のためにアンプリコンを「マークする」アイランド特異性配列を含む。いったん増幅すると、ストレプトアビジンビーズにアイランドは捕獲される。ユニークなＡＰＣｓはハイブリダイゼーションによって付加され、アブスクリプションが開始される。その結果、それぞれのＣｐＧアイランドは異なったアブスクリプトを発生させる。そのため、それぞれの反応で複数のＣｐＧアイランドを調べることができる。
【００８７】
あるいはまた、２番目の増幅プライマー、および増幅の間に発生するＡＰＣ二本鎖分子にＡＰＣ配列を組み入れることができる。このアプローチは増幅反応にＲＮＡＰとヌクレオチドを含むことによって、アブスクリプションと増幅を同時に実行することを可能にする。この方法は標的増幅とシグナル増幅を組み合わせるので、ほとんどのメチル化ＤＮＡ検出方法に比較して、より少ないスターティングＤＮＡしか必要とされず、メチル化ＤＮＡの分離の初期段階では２ｎｇ以下のゲノムＤＮＡで十分である。全体のアッセイは非常に迅速であり、ほとんどの競合するアッセイよりも操作時間が短い。前記のようにアッセイは磁性ビーズを使用できて、ミクロタイタープレート形式における高スループットスクリーニングのためにフォーマットできる。
【００８８】
実施例
実施例１
アブスクリプション方法
アブスクリプションはすでに説明されている。例えば米国特許出願第０９／９８４，６６４（２００１年１０月３０日出願、現在は米国特許第７，０４５，３１９）；１０／４２５，０３７（２００３年４月２９日出願）；１０／６００，５８１（２００３年６月２３日出願）；１０／６０２，０４５（２００３年６月２４日出願）；１０／６０７，１３６（２００３年６月２７日出願、現在は米国特許第７，２２６，７３８）；１０／６８６，７１３（１０月１７日、２００３出願）；１０／９７６，２４０（２００４年１０月２９日出願）；１０／７９０，７６６（２００４年３月３日出願）；１０／４８８，９７１（２００４年１０月１８日出願）；および１０／５５１，７７５（２００６年９月１４日出願；を参照。それぞれのそれの内容全体が本明細書に参考として援用される。
【００８９】
実施例２
アブスクリプトの質量分析検出
トリヌクレオチド  アブスクリプトはマススペクトル法による検出に続いて、ＨＰＬＣによるジヌクレオチド開始剤から分画される。図４に示すように、分画の出力が総イオンカウントとして、クロマトグラフリテンションタイムに対してプロットされた。同様にすべてのイオンのためのクロマトグラフィープロフィルがプロットされた。特定のリテンションタイムにおける特定のｍ／ｚ種の寄与をまとめ、クロマトグラフピークの下の面積としてアブスクリプトの量を与えることができる。図４Ｂには、アブスクリプト  ＧＡＧ（５．４分のリテンションタイム）に関連づけたイオンスペクトルが示される。ＧＡＧの収量は４７７．６、９５６．１、および９７８．２のｍ／ｚ値を有する種の合計であるだろう。これらの種は、二重荷電、単一荷電、およびナトリウム付加物をそれぞれ説明する。
【００９０】
実施例３
ＧＳＴ−ＭＢＤ  タンパク質の調製
マウスＭＢＤ２からのメチル結合領域（ＭＢＤ）を含むＧＳＴ融合たんぱく質は、図５に示すように構成された。ＭＢＤドメインのコドンは大腸菌中での発現のために最適化された。構成はＧＳＴとＭＢＤドメインの間にトロンビン切断部位を含んでいる。また、ＧＳＴタンパク質はＡＰＣｓまたはビオチンの付加に使用された４つの表面システイン残基を含んでいる。ＧＳＴ−ＭＢＤタンパク質の詳細は米国特許出願Ｎｏ．６１／０５３，６４８（２００８年５月１５日出願）に示され、その内容は参考として本出願に援用される。特に実施例２−１１はＭＢＤ融合たんぱく質の調製と使用について説明する。
【００９１】
ＧＳＴドメインは融合たんぱく質またはそのメチル化ＤＮＡとの複合体が、グルタチオン樹脂またはビーズの上に分離され、グルタチオンで溶出するか、またはＧＳＴを認識する抗体で捕獲されるかまたは検出されることを許容する。
【００９２】
ＭＢＤ２ｂタンパク質からのＭＢＤが最終的な構造に選ばれた。なぜなら、ＭＢＤ２ｂがＭｅ  ＣｐＧ部位のための知られているメチルＣｐＧ結合蛋白質の間で最も高い親和性を有し、かつ非メチル化ＣｐＧｓとの最も低い交差反応性を有するからである。それはＭｅＣＰ２よりも、Ｍｅ  ＣｐＧ部位に対して２５から１００倍大きな親和性を有し、ＭｅＣＰ２よりも９．７から４３倍大きなメチル化ＤＮＡに対する選択性を有する（Ｆｒａｇａ他、（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、３１：１７６５−７４）。さらにＭＢＤ２  ＣｐＧ認識への配列関係効果(sequence context effects)が全くない。ＭｅＣｐ２にはそれがあり、ＣｐＧ部位の近くに４Ａ−Ｔｓを必要とする。したがって、ＭｅＣＰ２より大きい数のｍＣｐＧ部位がＭＤＢ２によって認識される。
【００９３】
実施例４
２ｎｇ以下のインプット  ＤＮＡであっても、固定化されたＧＳＴ−ＭＢＤ２はメチル化ＤＮＡに対して高い特異性を保持するＧＳＴ−ＭＢＤタンパク質は、グルタチオン磁性ビーズに付加され、各種の量のメチル化ＤＮＡを分離するために使用され、高特異性で回収できた最小のスターティングＤＮＡサンプルサイズを決定する。ＳｓｓＩメチラーゼによって人工的にメチル化されたＨｅＬａ  ゲノムＤＮＡまたはＨｅＬａ  ＤＮＡが、１時間、２２℃で、１０００ｒｐｍで、横型ロータリー撹はん機によりインキュベートされた。結合されたＤＮＡは、未結合のＤＮＡを含む上澄を除去した後、１０００ｒｐｍで横型ロータリー撹はん機で１０分間、８０℃でインキュベートして、ビーズから溶出された。溶出されたＤＮＡ試料は、ＰＴＧＳ２（ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ：３４５７６９１７）ＤＮＡの存在についてプライマー対５’−ｇｇｔａｃｇａａａａｇｇｃｇｇａａａｇａ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）と５’−ｔｇｔｇｇｇａａａｇｃｔｇｇａａｔａｔｃ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）を使用し、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン染料を検出のため使用して、ｑＰＣＲによってテストされた。ＰＴＧＳ２はＨｅＬａ中ではメチル化されず、結合反応の上澄に残っていると予想された。人工的にメチル化されたＤＮＡの２ｎｇのゲノムＤＮＡインプットの９４％が溶出画分中に回収された。一方、ＨｅＬａからの修飾されていないＰＴＧＳ２  ＤＮＡの１００％が予想されるように上清画分中に回収された。メチル化されたＨｅＬａ  ＤＮＡの１ｎｇのインプットと、７３％のＰＴＧＳ２  ＤＮＡは結合され、熱溶出で回収された。修飾されていないＨｅＬａからの非メチル化物の結合は検出されなかった。アガロースゲル電気泳動法染色で視覚化できた中で最も低いＤＮＡ量（２ｎｇ）は約３００の細胞に対応している。さらに少ないＤＮＡを、アンプリコン検出にアブスクリプションを使用して分離検出できる。
【００９４】
実施例５
アブスクリプションに基づくＣｐＧメチル化アッセイ
図６は、複数のＣｐＧアイランドのメチル化状態を決定するための総合的な実験計画書を示す。簡潔にいえば、ゲノムＤＮＡのサンプルからの断片化されたメチル化ＤＮＡは単離され、メチル化状態が調査中である特異的ＣｐＧアイランドの増幅があとに続く。増幅のために、１個のプライマーがビオチンなどのような親和性タグを含み、アイランドの検索と不動化を許容する。２番目のプライマーは不完全プロモーターカセットの付加のための配列を含んでいる。
【００９５】
コンパチブルＰＣＲプライマーが設計できるように、この方法はサンプルの多くのＣｐＧアイランドの増幅と単離を可能にする。「ｄＵ」への「Ｃ」ｓの変換に至る、ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理による脱アミノが行われないので、脱アミノにより引き起こされる配列の不均一性の欠失に関連している高水準マルチプレクシングの問題が避けられる。プライマー部位が標的の特定配列に厳格に制限されないので、プライマー配置に十分な柔軟性があり、複数のコンパチブルプライマーセットのデザインを許容する（Ｈｅｎｅｇａｒｉｕ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９７）２３：５０４−１１；Ｏｎｉｓｈｉ他、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ（２００５）５３：９７１３）。異なったＡＰＣはそれぞれの標的ＣｐＧアイランドに付加され、その結果、それぞれのための異なったアブスクリプトシグナルを発生させる。したがって、単一試料からの複数のＣｐＧアイランドの同時検出を達成できる。
【００９６】
簡潔には、自然なゲノムＤＮＡは断片化されて、次に実施例３で説明したグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）メチル結合ドメイン（ＭＢＤ）融合たんぱく質を含むグルタチオンビーズに結合される。メチル化ＤＮＡだけが結合する（図６Ａ、工程１）。洗浄後、メチル化ＤＮＡがビーズから溶出して（図６Ａ、工程２）、ＰＣＲによって問い合わせられるべきアイランドが増幅された（図６Ｂ、工程３）。プライマーの１つは、５’末端にキャプチャータグ（例えば、ビオチン）を含む（図７Ａ）。２番目のプライマーは２つの領域を含んでいる。１番目は標的ＤＮＡに相補的なポリヌクレオチド配列である。２番目の領域は標的ＤＮＡまたは他のアイランドと異なった任意の配列である（図７Ａ）。この２番目の配列は不完全プロモーターカセット（ＡＰＣ）にリンクされるターゲントアタッチメントプローブ配列に相補的である。ＴＡＰ配列に相補的な配列は反ＴＡＰ配列（α−ＴＡＰ）と呼ばれる。標的にハイブリダイズするプライマー配列とα−ＴＡＰ配列の間の合流点に非天然型ヌクレオチド（図７ＡのεＡヌクレオチド）を含むため、標的ＤＮＡのＰＣＲ増幅の間、α−ＴＡＰ配列は一本鎖を保持する。増幅の後に、アイランドは例えばストレプトアビジンビーズ上に固定されて（図６Ｂ、工程４）、ゲノムＤＮＡを保持し、プライマーは洗浄除去される。次に、ＴＡＰ−ＡＰＣポリヌクレオチドは増幅された標的ＤＮＡと接触され、一本鎖反ＴＡＰ配列にハイブリダイズされる（図６Ｃ、工程５）。遊離のＴＡＰ−ＡＰＣは洗浄除去され、アブスクリプション試薬が加えられ、アブスクリプトシグナルを発生させる（図６Ｃ、工程５）。方法の詳細を以下に記載する。
【００９７】
工程１：
ゲノムＤＮＡの切断
初期の消化工程は、ＣｐＧアイランドまたはそれの大半を含む断片を発生させるように設計された。制限部位は、分析される領域の外に当たるように選ばれて、メチル化依存性でなく、またメチル化感受性でない。４つの塩基認識配列を有する制限酵素が使用された。異なるメチル化の６つのＣｐＧアイランドのサンプルについて、ＭｓｅＩまたはＤｄｅＩで発生された断片サイズを表１に示す。３マイクログラムまでのゲノムＤＮＡはベンダーの制限バッファ（ＮＥＢバッファ４）内で２０単位のＭｓｅＩ（ＮＥＢ、ベヴァリー、ＭＡ）でルーチン的に消化された。切断反応は少なくとも８時間３７℃でインキュベートされた。切断の程度は、ＭｓｅＩ配列を含むプライマーを使用して消化されたサンプルにＰＣＲを実行することによって、測定された。陽性の対照はＭｓｅＩで処理されないゲノムＤＮＡであり、ＭｓｅＩで処理されたＤＮＡの増幅反応はＭｓｅＩ消化で影響を受けないプライマーを使用した。
【００９８】
消化の目的は、通常、メチル化される隣接しているＣｐＧ配列から標的アイランドを切り離し、それにより非メチル化アイランドのメチル化ＤＮＡ画分への転送を引き起こすことである。多くの場合、ＭｓｅＩまたはＤｄｅ  Ｉのどちらかが、多くの隣接している配列を含まずにアイランド配列のバルクを説明する単一断片を製造した。例外はＤｄｅ  ＩによるＭＧＭＴの過度の切断であった。この場合、代替の酵素は、十分な効果を収めた。ＣｐＧアイランドが数個の断片に断片化される場合では、それ自身のプライマーセットでそれぞれのセグメントを分析できる。
【００９９】
【表１】
2012520086.tif 000003
【０１００】
工程２：
メチル化ＤＮＡの単離および回収
メチル化ＤＮＡ捕獲工程はグルタチオンを保持する磁性ビーズについてフォーマットされた。ＧＳＴ−ＭＢＤタンパク質は過剰のＧＳＴ−ＭＢＤタンパク質を取り除いた後に、ＤＮＡ試料の中に懸濁されたビーズにプレロードされた。ＤＮＡ結合は１時間懸濁された状態でビーズを維持するために混合しつつ、室温（２２−２４℃）で実行された（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ、１０００ｒｐｍ）。ＤＮＡ試料は、結合バッファーの５０マイクロリットルの容積中に、ゲノムＤＮＡの１ｎｇから５０ｎｇが通常含まれる。結合工程の完了時、希土磁石でビーズはチューブの側面でペレットにされ、非メチル化ＤＮＡ含有上澄を取り除いた。ビーズは、結合バッファと同じ塩化ナトリウム濃度（１６０ｍＭ）を有する洗浄バッファの４００マイクロリットルで二度洗浄した。それぞれの洗浄は５分間、室温で撹はん（１０００ｒｐｍ）しつつインキュベートされた。最終的な洗浄はＴＥバッファ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で実行された。ビーズは４００マイクロリットルのＴＥ中に懸濁され、磁石で直ちにペレット化された。ＴＥ洗浄バッファは捨てられ、ビーズは５０マイクロリットルの溶出バッファ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に懸濁された。
【０１０１】
メチル化ＤＮＡはビーズからいくつかの別法で溶出できる。ＴＥバッファ中のビーズは１０分間、８０℃で撹はん（１０００ｒｐｍ）しながらインキュベートすることができる。ビーズは磁石でペレットにされ、溶出されたＤＮＡは回収される。別法では、０．１％のＳＤＳを含む溶出培地中にビーズを懸濁する。結合されたメチル化ＤＮＡの完全な溶出は、２０分間の５０℃での一回のインキュベートで達成された。トゥイーン−２０などの非イオン性界面活性剤がＰＣＲバッファに含まれている場合には、溶出されたＤＮＡはそれ以上の処理をすることなくＰＣＲすることができる（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇｅｒ他、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ（１９９５）４：３６８−７０）。また、最低で２０ｍＭの還元グルタチオンを含む溶出バッファに、ｐＨ８で１０分間、ビーズを暴露することにより溶出を実行できる。図５ＣはＨｅＬａ  ＤＮＡのＳＮＲＰＮ  ＣｐＧ  アイランドの分画の結果を示している。メチル化ＤＮＡは熱処理で解離された。ＳＮＲＰＮはインプリンティング遺伝子である。１つのコピーは完全にメチル化され、通常、他方のコピーは非メチル化である。予想されたようにＳＮＲＰＮコピーの半分は上澄に見いだされ（図５Ｃ、画分Ｓ、非メチル化画分）、半分のコピーはビーズから最初の溶出で溶出した（図５Ｃ、画分Ｅｌ、メチル化画分）。メチル化ＤＮＡのすべてが最初の溶出で抽出された。最初の溶出後の２つの引き続く溶出物（Ｅ２とＥ３）は、ＳＮＲＰＮ  ＤＮＡを含んでいなかった。ＰＴＧＳ２  遺伝子のＣｐＧアイランド（ＨｅＬａでは非メチル化）は、陰性の対照として使用された（図５Ｄ）。ＰＴＧＳ２  ＤＮＡのすべてが上清画分の中に現れた。
【０１０２】
工程３：
タグ付けをされたプライマーによるＰＣＲ増幅
ＣｐＧアイランドセグメントは、増幅されて、ビオチン親和性タグ、および不完全プロモーターカセット（ＡＰＣ）の付加のために使用される一本鎖オリゴヌクレオチド配列でラベルされた。ＰＣＲ反応は、Ｉｘ  ホットスタートタック（Hot Start Taq）バッファ（Fermentas）０．８ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（それぞれ０．２ｍＭ）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを含んだ。ビオチン化プライマーおよびα−ＴＡＰプライマーは、それぞれ１マイクロモルづつ存在していた。増幅はＴｒｕｅＳｔａｒｔホットスタートＴａｑＤＮＡポリメラーゼ(Fermentas)の２ユニット／２０マイクロリットルの反応で実行された。１個のユニットは３０分、７４℃でｄＮＴＰｓの１０ナノモルの混合と等しい。サイクリング条件は９５℃で１分の後、３０秒の９５℃、３０秒の６２℃、および３０秒の７２℃の最大３２サイクルであった。最終的な伸張工程は５分間、７２℃であった。完成した反応系は４℃で保持された。図５Ｃと５Ｄはアガロースゲル電気泳動法による、断片化され、増幅されたＤＮＡの検出を示している。
【０１０３】
α−ＴＡＰプライマー配列デザイン
プライマーは、ＰＣＲ反応で存在している３つのオリゴヌクレオチドプライマー／α−ＴＡＰ配列の中で相互作用を最小にすることによって、高シグナル強度のために最適化された。ビオチン化ＰＣＲプライマーとα−ＴＡＰの３’末端は、増幅の間、ＤＮＡ合成を準備するために使用されて、プライマー：プライマー相互作用と、プライマーヘアピンループの形成を最小にするために、プライマーソフトウェア（オリゴエクスプローラー１．２）を使用して設計された。２番目のプライマーの５’末端のα−ＴＡＰは、アンプリコンに組み入れられて、非コーディングヌクレオチドの、α−ＴＡＰからプライマー配列を分離するエテノＡ（ｅｔｈｅｎｏＡ（εＡ））の存在のため一本鎖のままで残るように設計された。Ｔａｑポリメラーゼを含むほとんどのＤＮＡポリメラーゼは、εＡを相手にｄＮＴＰを組み込んで、合成を終えることができない（図７）（Ｐａｔｅｌ 他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ（２００１）２７６：５０４４−５１）。ヌクレオチド類似体は、α−ＴＡＰ配列がＰＣＲの間、コピーされるのを防ぐ。α−ＴＡＰ配列とどちらかのプライマー配列の間の潜在的な相互作用は最低限にされ、ＰＣＲの阻害と、完全に１本鎖のα−ＴＡＰの非特異性の不動化からの擬陽性結果を防止する。
【０１０４】
プライマーデザインは３つの工程を経る。
まず最初に、プライマー配列は以下の評価基準で最適化された：
１）    １６〜２０ｎｔの間のプライマーの長さ；
２）    ６０℃の近くのＴｍ；
３）    ３’末端と対にされた塩基とのプライマー−プライマー相互作用が排除された；
４）    他のプライマー−プライマー相互作用は、Ｔｍ＜１６℃を有さなければならない；および
５）  Ｔｍ＞８℃を有するヘアピン構造は拒絶された。
６つのＣｐＧアイランドのためのプライマー対がこれらの評価基準を使用して開発された。
【０１０５】
プライマー最適化における２番目の工程は、ＴＡＰ−ＡＰＣの付加またはＰＣＲを妨げるかもしれないα−ＴＡＰプライマーオリゴヌクレオチド内のヘアピン構造を排除することであった。６つのα−ＴＡＰ候補配列の収集は、ＲＮＡファージＭＳ２、ｆｒ、およびＱβ配列に基づいて設計された。α−ＴＡＰのそれぞれの候補は  ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでテストされ、我々のＴＡＰ−アニール条件でＴｍ＞２６℃で形成されたヘアピンは変成され、ヘアピンは排除され、再テストされた（Ｚｕｋｅｒ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（２００３）３１：３４０６−１５）。α−ＴＡＰ配列を変更することにおける唯一の制限は、それらがプライミング配列と顕著な相補性を取得しないということであった。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでα−ＴＡＰと結合されたプライマー配列の間の潜在的なヘアピン相互作用をテストした。そして必要であれば、ヘアピン安定性を最小にし、および／または、ヘアピンからのプライマー伸長を防ぐために、α−ＴＡＰ配列を変えた。例示されるプライマーα−ＴＡＰオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）は、使用されるＰＣＲ条件下で４１℃のＴｍを有するが、増幅されたＣＤＫＮ２Ａ  ＤＮＡは、リバースプライマーＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３と組み合わせたα−ＴＡＰ伸張を欠いているプライマーと同じくらい効率的であった。最後に、α−ＴＡＰとビオチン化プライマーの間の相互作用は、ファイルの端に追加されたα−ＴＡＰを有するＣｐＧアイランド配列ファイルを使用して、プライマー設計ソフトウェアでテストされ、ビオチン化プライマー配列と共にプライマーとしてそれを選び、α−ＴＡＰおよびリバースプライマー対が、ファイルの端に追加されたα−ＴＡＰを有するＣｐＧアイランドのために開発され、ビオチン化プライマー配列と共にプライマーとしてそれを選んだ。α−ＴＡＰおよびリバースプライマー対が以下の表２に示されるようにＣｐＧアイランドのために開発された。
【０１０６】
【表２】
2012520086.tif 000004
【０１０７】
ＴＡＰ−ＡＰＣデザイン
ＴＡＰ−ＡＰＣｓが非テンプレート鎖であるＴＡＰ−ＡＰＣと相補的ＡＰＣテンプレート鎖をハイブリダイズすることによって作られた。ＡＰＣ部分は二本鎖であった。そして、ＴＡＰセグメントは非テンプレート鎖から伸びる一本鎖であった。ＴＡＰ−ＡＰＣｓは、ＡＰＣｓのコレクションがシングルプレックス反応において使用するための同じアブスクリプトをコード化するか、またはマルチプレックス検出を許容するためにＴＡＰ−ＡＰＣのコレクションのそれぞれが異なったアブスクリプトをコード化するように設計された。一本鎖シングルプレックスＴＡＰ−ＡＰＣｓは、以下の表３に示されるようにα−ＴＡＰｓについて設計された。
【０１０８】
【表３】
2012520086.tif 000005
【０１０９】
１本鎖シングルプレックス  ＴＡＰ−ＡＰＣｓは、同じアブスクリプト（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）をコード化する一般的なテンプレート鎖にアニールされた。
【０１１０】
マルチプレックス相溶性ＴＡＰ−ＡＰＣｓはそれぞれ、ユニークなアブスクリプトをコード化するそれら自身のテンプレート鎖と対にされた。表４に記載されたＣｐＧアイランドを検出するためにマルチプレックスＴＡＰ−ＡＰＣｓ（表４）のコレクションを一緒に使用できた。
【０１１１】
【表４】
2012520086.tif 000006
【０１１２】
工程４および５
ストレプトアビジンビーズへのアンプリコンの付加およびＴＡＰ−ＡＰＣｓの結合
ビオチン化アンプリコンは、遊離のプローブと結合していないＡＰＣｓをアッセイの引き続く工程で除去するためにストレプトアビジンビーズに結合された。
【０１１３】
最適化実験では、ビオチン化プライマーの１０ピコモルの存在下で、ストレプトアビジン磁性ビーズへのアンプリコンの完全な結合が見られ、ビオチン化オリゴヌクレオチドの４０ピコモルの全結合量容量で観測された。結合時間は、結合反応のバッファフェーズからアンプリコンの除去を測定するのにアガロースゲル電気泳動法を使用することで、アッセイのタイムコースを最小にするために最適化された。ビオチン化アンプリコンの定量的結合はビーズとＤＮＡ試料を混合した後５分以内に観測された。
【０１１４】
アンプリコンへのＴＡＰ−ＡＰＣの付加は、ストレプトアビジンビーズの添加の前に溶液で遊離させるか、またはビーズにアンプリコンを結合した後に遊離のプライマーαＴＡＰオリゴヌクレオチドを除去するための洗浄により成功裏に行われた。アニール条件（１５０ｍＭ  Ｎａ＋）での５５．８−６４℃の間の範囲のＴＡＰｓについてのＴｍが使用された。ＴＡＰ−ＡＰＣは０．５マイクロモルで添加され、最低１５分間、５１℃でインキュベートされた。高い厳密性は、効率的な結合を達成するのに必要でなかった。ＴＡＰｓとα−ＴＡＰｓの分析は、ヘアピン形成がこれらのアニール条件の下でわずかであることを示した。反応の配列複雑性は複合ＰＣＲにかけられた生成物でさえ低かった。最大３組のα−ＴＡＰｓとＴＡＰｓがトリプレックス反応で存在し、クロスハイブリダイゼーションを防ぐために任意にこれらの配列を変えることができる。このアニーリング工程はグラジエントサーモサイクラー(gradient thermocycler)内の温度に関して最適化され、終点としてアンプリコンの電気泳動移動度シフトを使用することで最も短いアニーリング時間を決定した。
【０１１５】
ＰＣＲ反応はＤＮＡ結合バッファーで１：１に希釈され、１５０ｍＭの最終的な塩化ナトリウム濃度を与えるた。適切なＴＡＰ−ＡＰＣはそれぞれのＤＮＡ試料に加えられ、０．５マイクロモルの最終濃度にされ、ついで最低１５分間５１℃でインキュベートされた。
【０１１６】
ストレプトアビジン磁性ビーズはＰＣＲチューブにアリコートされた。ビーズは５０％（ｖ／ｖ）の結合バッファーの１００ミクロリットルで洗浄された。洗浄されたビーズはＤＮＡ試料の中に懸濁され、ついで最低５分間５１℃でインキュベートされた。
【０１１７】
結合反応は、磁石でビーズをペレット化し、結合バッファーを取り除くことによって終了した。ビーズは５０％（ｖ／ｖ）の結合バッファー（１５０ｍＭ）と同じ塩化ナトリウム濃度を含む洗浄バッファの１８０ミクロリットルで２度洗浄された。それぞれの洗浄工程は、結合反応の厳密性を模写するために５１℃での５分間のインキュベーションを含み、次に、ビーズは磁石で急速にペレットにされた。３番目の洗浄は４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、４０ｍＭ  ＫＣｌであった。ビーズは、冷蔵され貯蔵されるか、または直ちにアブスクリプションにかけられることができる。
【０１１８】
工程６：
アブスクリプション
結合されたアンプリコン：ＴＡＰ−ＡＰＣｓを含むビーズは磁石でペレットにされ、貯蔵バッファを取り除いて、１ｍＭジヌクレオチド開始剤（ＧｐＡ）、１ｍＭ  ＮＴＰ（ＧＴＰ）と０．４ユニットのＲＮＡポリメラーゼを含むアブスクリプションバッファの１０マイクロリットルに懸濁された。１ユニットは６５℃で６０分の、ＮＴＰの１ｎｍｏｌの組み入れを触媒する。アブスクリプション反応は１時間７７℃でインキュベートされた。
【０１１９】
アブスクリプトは蛍光を含むシリカゲルＴＬＣプレートに１．５マイクロリットルのサンプルをスポットし、ＵＶシャドウイングで検出された。ＴＬＣｓは１００ｍｌの溶媒（イソプロパノール：水酸化アンモニウム：活性剤溶液、６：３：１）を含む気密室で現像された。アブスクリプトは図８Ｂ（ＵＶシャドウイング）に示すように、短波長紫外線光の下のダークスポットとして検出された。
【０１２０】
ＬＣ−ＭＳ検出において、１０マイクロリットルのアブスクリプション反応物は３８４ウエルプレート中のＨＰＬＣグレード水の２０マイクロリットルに希釈された。図８Ｃに示すように、１０マイクロリットルが、ＬＣ−ＭＳによって処理され、定量化された。
【０１２１】
【表５】
2012520086.tif 000007
【０１２２】
ＴａｑＭａｎおよびアブスクリプション検定の感度
図８は、両方の方法に同じプライミング部位を使用して、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲと比較した、滴定されたＨｅＬａのα−ＴＡＰ  アブスクリプションに基づく検出の結果を示している。５’−ｇｃｇｇｇａｃｃｃｔｃｃａｇａａ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）と５’−ａｃｔｃａｃｔｇｇｔｇｇｃｇａａｇａｃｔ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）はｑＰＣＲ増幅に使用された。５’−ＦＡＭ−ａｃｃａｃｃｃｔｔａｔａａｇｇｃｔｃｇｇａｇｇｃｃ−ＩｏｗａはＢｌａｃｋ（登録商標）ＦＱ  クエンチャー−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）は蛍光プローブであった。５’−ａｃｔｃａｃｔｇｇｔｇｇｃｇａａｇａｃｔ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）および５’−ｃｃｔｃｃａｔｃｃｃａａａｇｔａ［εＡ］ｇｃｇｇｇａｃｃｃｔｃｃａｇａａ−３’（ＳＥＱ  ＩＤＮＯ：１２）はα−ＴＡＰプライマー対であった。図８ＢはＴＬＣ検出の結果を示している。アブスクリプション／ＰＣＲプライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３であった。ＴＡＰ−ＡＰＣはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２のアニーリングによって作られた。ＡＰＣはアブスクリプトＧＡＧをコード化した。アブスクリプトは薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）およびＵＶシャドウイングを使用して検出された。ＵＶシャドウイングを使用した２９サイクルでの検出限界（ＬＯＤ）は１００コピーであった。図８Ｃは、図８Ｂで分析されたものと同じサンプルのＬＣ−ＭＳ検出結果を示す。ＰＣＲ反応のためのＤＮＡインプットは３０から９０００のゲノムコピーであった。２９サイクルのＬＣ−ＭＳのＬＯＤは３０コピーであった。面積はアブスクリプト（ＧＡＧ）を含むクロマトグラフピークの面積をいう。
【０１２３】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲは１００コピーの検出のために３５サイクルを必要とし、３０コピーの検出のための３７サイクルを必要とした（図８Ａおよび表５）。アブスクリプションに基づく検出は、ＴＬＣおよびＵＶシャドイングでもＴａｑＭａｎよりも感受性であった。
【０１２４】
ＵＶシャドウイングを蛍光アブスクリプトの検出に取り替えるなら、ＴＬＣベースの検出は、より感受性である。ビオチン基（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）と反ＴＡＰ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）を含むプライマーで、ＣＤＫＮ２Ａ  ＣｐＧ  アイランドでメチル化されたゲノムＤＮＡが増幅された。始めのゲノムＤＮＡの量は、１０ｎｇ、２．５ｎｇ、６４０ｐｇ、および１６０ｐｇであった。これは３０００、７５０、１８８、または４７のゲノムＤＮＡのコピーに対応する。ＡＵＣをコード化するＴＡＰ−ＡＰＣの添加の後に、Ｃｙ５でラベルされたジヌクレオチドＡｐＵおよびＣＴＰの存在下で、アブスクリプションが４５℃で行われた。サンプルは回収され（１マイクロリットル）、迅速ＴＬＣによって分析された。２時間のアブスクリプションの後に始めのＤＮＡの２．５ｎｇからのアブスクリプトを視覚化し、８時間のアブスクリプションの後に図９に示されているように、容易に４７コピーを検出できた。
【０１２５】
この実験では、アブスクリプション生成物は、Ｃｙ５でラベルされたトリヌクレオチドＡＵＣであった。他のいくつかの蛍光染料と比べて、Ｃｙ５は実際にかなり不良な開始剤であり、トリヌクレオチド合成の収率を、ラベルされていないジヌクレオチドの約８％まで減少させる。この理由のため、Ｃｙ５はこれらの検定方法のために好適に選択される染料でないかもしれず、他の染料、たとえばフルオレセインまたはＤｙＬｉｇｈｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）などに置き換えることができる。これらはどちらもラベルされていない開始剤のほぼ３５％の収量を与える。ほぼ４倍の高い効率の染料を使用することにより、対応して時間が低減され、２時間で５０コピー未満のスターティングＤＮＡの検出を可能にする。フルオレセインには、低価格で、長波長紫外線で検出可能であるという追加の利点がある。
【０１２６】
実施例６
ＡＰＣプライマーによる２段階ＣｐＧアイランドメチル化検出
２段階検出方法を使用して、メチル化ＤＮＡは三段階α−ＴＡＰ方法（実施例５）のように、断片化されたゲノムＤＮＡのサンプルから分離された。メチル化ＤＮＡ断片は、上で説明したように、固定されたＧＳＴ−ＭＢＤタンパク質に結合された（図１０；工程１）。メチル化された断片は洗浄により非メチル化ＤＮＡを取り除いた後に、熱またはグルタチオンへの暴露により解離された（図１０；工程２）。
【０１２７】
標的ＣｐＧアイランドは、５’−末端にＡＰＣ配列を含むプライマーを使用することでタグ付けをされ増幅された（図１０；工程３）。ＡＰＣの１本鎖形態は不活発であるが、それが標的の増幅の間二本鎖の型に変換されると、活性になる（図１０；工程４）。したがって、開始剤ＮＴＰ（ｓ）とＲＮＡＰが含まれているなら、ＰＣＲ反応の間、アブスクリプションを実行できる（図１０；工程６）。
【０１２８】
実施例７
ＡＰＣプライマーのデザインと変化
ＡＰＣプライマーは、セルフプライミングとリバースプライマーとのプライマー二量体化の形成を避けるように設計された。少なくともこれらの事象のいくつかが、背景アブスクリプションの高水準を形成する傾向がある活性の二本鎖プロモーターを製造するようである。潜在的プライマー配列は、実施例５で述べたように、プライマー二量体およびセルフプライミングの潜在性についてスクリーニングされた。ＡＰＣプライマーのＡＰＣ部分は、長さ４４ｎｔであり、その３３ｎｔがアブスクリプション活性に有意に影響することなく変えることができる。多くの場合、潜在的なセルフプライミングおよびプライマー二量体相互作用は、ＡＰＣプライマーのＡＰＣセグメントの配列を変えることにより排除できる。
【０１２９】
潜在的な相互作用がないと予測されたプライマー対は、アニーリング温度範囲でＤＮＡが非存在下でＰＣＲ反応を実行することによって、プライマー単独で背景シグナルを生成するかどうか決定するために、テストされた。最初に、ＡＰＣプライマーは、セルフプライミングのレベルを決定するために検査された。次に、ＤＮＡのないＰＣＲ反応が、プライマー二量体効果について、ＡＰＣプライマーとリバースプライマーの両方について実行された。終了したＰＣＲ反応系に、１ｍＭのジヌクレオチド開始剤、１ｍＭ  ＮＴＰ、０．４ユニットのＲＮＡポリメラーゼが補われて、アブスクリプションによって分析された。図１１はＧＡＰＤＨ  ＣｐＧ  アイランドを標的として設計されたプライマー対（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）のアブスクリプション結果を示している。図１１Ａは、ＡＰＣプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）単独のＴＬＣデータ、およびＨｅＬａ  ゲノムＤＮＡを含む陽性対照とともにあるプライマー対のＴＬＣデータを示している。コード化されたアブスクリプト  ＧＡＧは、陽性対照でのみ検出できた。図１１Ｂは同じサンプルのＬＣ−ＭＳデータを示している。陽性対照だけがアブスクリプトを生成した。ＤＮＡを欠いている反応は、有意のシグナルを広範囲のアニーリング温度で生成しなかった。ＣｐＧアイランドのために開発されたＡＰＣプライマー／リバースプライマー対を以下の表６に示す。
【０１３０】
【表６】
2012520086.tif 000008
【０１３１】
実施例８
α−ＴＡＰを有する腫瘍細胞系からのメチル化ＤＮＡとＡＰＣプライマー方法の検出の比較
２ｍＭ  ＭｇＣ１２、０．８ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（それぞれ０．２ｍＭ）、および５％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯを含むベンダーのＩＸのバッファ中で、０．４ユニットのＨｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｔａｑ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）でＰＣＲ反応が実行された。Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｔａｑの１ユニットが３０分、７４℃で、ｄＮＴＰｓの１０ナノモルを取り入れた。
ＡＰＣプライマーとリバースプライマーはそれぞれ１マイクロモルであった。サイクリング条件は９５℃、１分と、最大３２サイクルの９５℃、３０秒、６２℃、３０秒、および７２℃、３０秒であった。最終的な伸張工程は５分間、７２℃であった。終了した反応系は４℃で保持された。終了したＰＣＲ反応物（１０マイクロリットル）に、１ｍＭジヌクレオチド開始剤、１ｍＭ  ＮＴＰと０．４ユニットのＲＮＡポリメラーゼが補われた。そして、アブスクリプションは７７℃で、１時間実行された。
【０１３２】
ジヌクレオチド開始剤とＮＴＰがそれぞれ１ｍＭでＰＣＲ反応に含まれている場合には、ＰＣＲの間、アブスクリプションが実行できる。熱安定性ＲＮＡポリメラーゼは２０マイクロリットルの反応物あたり０．４ユニットで加えられた。１ユニットは６５℃、６０分でＮＴＰの１ナノモルの組み込みを触媒する。アブスクリプション反応は１時間７７℃でインキュベートされた。実施例２と５に記載されているように、アブスクリプトを検出できた。
【０１３３】
【表７】
2012520086.tif 000009
【０１３４】
表７は腫瘍細胞ラインからのメチル化ＤＮＡのアブスクリプションベースの検出の結果を示している。多発性分画実験からの一度測定されたサンプルについて、ほとんどの複製測定をした。ＧＡＰＤＨ  ＣｐＧ  アイランドはメチル化されず、これは腫瘍がこのアイランドの中で正常なメチル化状態を維持したことが予想される。ＳＮＲＰＮ  ＣｐＧ  アイランドはインプリンティング遺伝子のための予測に合った。他のアイランドは不一致の結論がメチル化状態についてあるＬＮＣａＰのＤＡＰＫｌ以外は、発表された結果と一致していた（Ｙｅｇｎａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ他、（２００４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４：１９７５−８６；Ｌｉｎ他、（２００１）Ａｍ  Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５９：１８１５−２６；Ｐａｚ他、（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：１１１４−２１；Ｔｏｙｏｔａ他、（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０−４０４４−４８；Ｌｏｄｙｇｉｎ他、（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５：４２１８−２７）。
【図１】
2012520086.tif 000010
【図２】
2012520086.tif 000011
【図３】
2012520086.tif 000012
【図４】
2012520086.tif 000013
【図５】
2012520086.tif 000014
【図６】
2012520086.tif 000015
【図７】
2012520086.tif 000016
【図８】
2012520086.tif 000017
【図９】
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【図１０】
2012520086.tif 000019
【図１１】
2012520086.tif 000020
【配列表】
2012520086000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年3月21日(2012.3.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドを検出するための方法であって：
ａ）    少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むサンプルと、該少なくとも１つのポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズして、標的配列を増幅するプライマー対とを接触する工程、ここで該プライマー対は以下から成る；
ｉ）（１）  該ポリヌクレオチドの標的配列にフランキングする第１の配列に相補的な３’配列、および
（２）  ５’キャプチャータグ、を含む第１のプライマー、並びに
ｉｉ）（１）  該ポリヌクレオチドの標的配列にフランキングする第２の配列に相補的な３’配列、および
（２）  アブスクリプションを導く手段を提供する５’配列を含む第２のプライマー、
ｂ）  該第１および第２のプライマーから該標的配列を増幅する工程；
ｃ）  前記増幅された標的配列を、５’キャプチャータグに結合された固定された分子と接触させ、それにより該ポリヌクレオチドの増幅された標的配列を捕獲する工程；
ｄ）  前記アブスクリプションを導く手段から少なくとも１つのアブスクリプトを転写する工程；並びに
ｅ）  工程ｄ）の少なくとも１つの転写されたアブスクリプトを検出する工程。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３４】
表７は腫瘍細胞ラインからのメチル化ＤＮＡのアブスクリプションベースの検出の結果を示している。多発性分画実験からの一度測定されたサンプルについて、ほとんどの複製測定をした。ＧＡＰＤＨ  ＣｐＧ  アイランドはメチル化されず、これは腫瘍がこのアイランドの中で正常なメチル化状態を維持したことが予想される。ＳＮＲＰＮ  ＣｐＧ  アイランドはインプリンティング遺伝子のための予測に合った。他のアイランドは不一致の結論がメチル化状態についてあるＬＮＣａＰのＤＡＰＫｌ以外は、発表された結果と一致していた（Ｙｅｇｎａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ他、（２００４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４：１９７５−８６；Ｌｉｎ他、（２００１）Ａｍ  Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５９：１８１５−２６；Ｐａｚ他、（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：１１１４−２１；Ｔｏｙｏｔａ他、（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０−４０４４−４８；Ｌｏｄｙｇｉｎ他、（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５：４２１８−２７）。
本願発明はその実施態様として以下を含む。
第１項：  サンプル中の少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドを検出するための方法であって：
ａ）    少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むサンプルと、該少なくとも１つのポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズして、標的配列を増幅するプライマー対とを接触する工程、ここで該プライマー対は以下から成る；
ｉ）（１）  該ポリヌクレオチドの標的配列にフランキングする第１の配列に相補的な３’配列、および
（２）  ５’キャプチャータグ、を含む第１のプライマー、並びに
ｉｉ）（１）  該ポリヌクレオチドの標的配列にフランキングする第２の配列に相補的な３’配列、および
（２）  アブスクリプションを導く手段を提供する５’配列を含む第２のプライマー、
ｂ）  該第１および第２のプライマーから該標的配列を増幅する工程；
ｃ）  前記増幅された標的配列を、５’キャプチャータグに結合された固定された分子と接触させ、それにより該ポリヌクレオチドの増幅された標的配列を捕獲する工程；
ｄ）  前記アブスクリプションを導く手段から少なくとも１つのアブスクリプトを転写する工程；並びに
ｅ）  工程ｄ）の少なくとも１つの転写されたアブスクリプトを検出する工程。
第２項：  結合していない試薬、プライマー、およびポリヌクレオチドが、次の工程の前に、固定され捕獲されたポリヌクレオチドから洗浄される、第１項記載の方法。
第３項：  前記の増幅はポリメラーゼ連鎖反応を実行することから成る、第１項記載の方法。
第４項：  前記のポリメラーゼ連鎖反応が、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよび熱安定性ＲＮＡポリメラーゼの少なくとも１つとともに実行される、第３項記載の方法。
第５項：  前記５’キャプチャータグはビオチンであり、前記５’キャプチャータグに結合する分子がストレプトアビジンである、第１項記載の方法。
第６項：  前記５’キャプチャータグに結合する分子が、磁性ビーズおよびミクロタイタープレートから選択された固形担体に固定される、第１項記載の方法。
第７項：  検出可能なラベルづけられたヌクレオチドが、工程ｄ）の間に、少なくとも１つのアブスクリプトに組み入れられる、第１項記載の方法。
第８項：  前記の検出可能なラベルづけられたヌクレオチドが蛍光ヌクレオチドである、第７項記載の方法。
第９項：  前記の少なくとも１つのアブスクリプトの検出が、マススペクトル法、毛細管電気泳動法または薄層クロマトグラフィ法を含む、第１項記載の方法。
第１０項：  前記の少なくとも１つのアブスクリプトの長さが３−２０のヌクレオチドである、第１項記載の方法。
第１１項：  前記の少なくとも１つのアブスクリプトの長さが３ヌクレオチドである、第１０項記載の方法。
第１２項：  アブスクリプションを導く手段がＡＰＣを含む、第１項記載の方法。
第１３項：  前記アブスクリプションを導く手段が、
ｉ）  ユニークなＣｐＧアイランドを特定する５’α−ＴＡＰ配列；および
ｉｉ）  前記５’α−ＴＡＰ配列と、標的配列にフランキングする第２の配列に相補的な３’配列の間に非天然型ヌクレオチドを含み、
前記工程ｄ）が、
ｉ）  前記増幅された標的配列にプローブをハイブリダイズすること、ここでは該プローブがα−ＴＡＰ配列に相補的な５’ＴＡＰ配列と３’ＡＰＣを含む、および
ｉｉ）  該ＡＰＣから少なくとも１つのアブスクリプトを転写することを含む、第１項記載の方法。
第１４項：  前記非天然型ヌクレオチドは増幅の間、α−ＴＡＰの複製を防ぎ、それによりα−ＴＡＰ配列は工程ａ）からｃ）の間、１本鎖なままである、第１３項記載の方法。
第１５項：  前記非天然型ヌクレオチドがエテノ−デオキシアデノシンである、第１４項記載の方法。
第１６項：  前記少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドが、複数の異なった標的ポリヌクレオチドを含み、工程ａ）からｅ）が同時に、複数の第１および第２のプライマー対と共に行われ、それぞれのプライマー対が異なった標的に特異的にハイブリダイズする、第１項記載の方法。
第１７項：  前記アブスクリプションを導く手段が、前記複数の標的のそれぞれのためにユニークなアブスクリプトを生成する、第１６項記載の方法。
第１８項：  前記ユニークなＡＰＣｓが分子量またはヌクレオチド配列に基づいてお互いに区別可能である、第１７項記載の方法。
第１９項：  前記の複数の異なった標的が少なくとも１０個の異なった標的を含む、第１６項記載の方法。
第２０項：  前記少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドが、メチル化されたＣｐＧアイランドであり、前記サンプルが単離されたメチル化ゲノムＤＮＡ断片を含む、第１項記載の方法。
第２１項：  前記メチル化ゲノムＤＮＡ断片が、
ａ）    少なくとも１つのメチル化された標的ポリヌクレオチドを含むゲノムＤＮＡのサンプルを、標的ポリヌクレオチドＣｐＧアイランドを切断しない制限酵素で切断すること、
ｂ）    前記切断されたゲノムＤＮＡを固定されたＭＢＤと接触させ、それによりサンプルからメチル化ゲノムＤＮＡを固定すること、および
ｃ）  任意に、前記メチル化ゲノムＤＮＡを固定されたＭＢＤから回収し、それによりメチル化ゲノムＤＮＡ断片を分離すること、を含む、第２０項記載の方法。
第２２項：  前記ＭＢＤがＧＳＴ−ＭＢＤ２融合たんぱく質である、第２１項記載の方法。
第２３項：  前記ＧＳＴ−ＭＢＤ２融合たんぱく質が、グルタチオン含有固形担体に固定される、第２２項記載の方法。
【国際調査報告】
2012520086.tif 000021
2012520086.tif 000022
2012520086.tif 000023