(57)【要約】  本発明では、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞を肝細胞に分化誘導する方法、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞を肝内胚葉細胞に分化誘導する方法、及び胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞を肝前駆細胞に分化誘導する方法が開示されている。本発明は更にこれらの方法によって得られた肝細胞、肝内胚葉細胞、及び肝前駆細胞、並びにこれらの細胞の用途を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）胚性幹細胞（ＥＳＣ）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）を、アクチビンＡを含有する細胞用基礎培地で培養するステップ；
２）ステップ１）から得られた細胞を、インスリン−トランスフェリン−セレニウム塩（亜セレン酸ナトリウムが好ましい）と、アクチビンＡとを含有する細胞用基礎培地に移して培養するステップ；
３）ステップ２）から得られた細胞を、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）と、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）とを含有する肝細胞用培地（ＨＣＭ）で培養し、肝前駆細胞を得るステップ；及び
４）ステップ３）から得られた肝前駆細胞の成熟を促進し、肝細胞を得るステップ
を含む、胚性幹細胞（ＥＳＣ）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）を肝細胞に分化誘導する方法であって、
ここで、好ましくは前記胚性幹細胞（ＥＳＣ）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）は哺乳動物細胞であり、より好ましくはマウス又はヒト細胞であり、最も好ましくはヒト細胞であり、ここで、前記細胞がヒト細胞である場合、好ましくは前記アクチビンＡがヒトアクチビンＡであり、前記線維芽細胞増殖因子がヒト線維芽細胞増殖因子であり、前記骨形成タンパク質がヒト骨形成タンパク質である、方法。
【請求項２】
前記細胞用基礎培地が、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＢＭＥ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０、及びＦｉｓｃｈｅｒ’ｓからなる群より選ばれるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞用基礎培地における前記アクチビンＡの含有量が、１０〜５００ｎｇ／ｍｌである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記インスリン−トランスフェリン−セレニウム塩が、混合補充液として加えられ、前記細胞用基礎培地との体積比が、０．０１〜２０％である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記線維芽細胞増殖因子が、酸性線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子２、又は線維芽細胞増殖因子４であり、前記骨形成タンパク質が、骨形成タンパク質２、又は骨形成タンパク質４である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の量が、５〜１００ｎｇ／ｍｌ前記肝細胞用培地であり、且つ前記骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の量が、５〜１００ｎｇ／ｍｌ前記肝細胞用培地である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記肝細胞の成熟を促進することが、前記肝細胞を、肝細胞増殖因子、好ましくはヒト肝細胞増殖因子、と、ケラチノサイト成長因子、好ましくはヒトケラチノサイト成長因子とを含有する肝細胞用培地で培養し、増幅された肝前駆細胞を得て、更にオンコスタチンＭとデキサメタゾンとを含有する肝細胞用培地に移して培養し、その後、（０．１−１０）ｍｌ／１００ｍｌのＮ２と、（０．１−２０）ｍｌ／１００ｍｌのＢ２７と、０．５−２ｍＭのグルタミンと、（０．１−１０）ｍｌ／１００ｍｌの非必須アミノ酸と、０．０５−０．２ｍＭのβ−メルカプトエタノールと、１−１００ｎｇ／ｍｌのオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）と、０．０５−１μＭのデキサメタゾン（Ｄｅｘ）とを含有する基礎培地であり、且つｐＨが７．２−７．６である分化培地Ｖに移して培養し、成熟の肝細胞を得ることである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記肝細胞増殖因子の含有量が、５〜１００ｎｇ／ｍｌ前記肝細胞用培地であり、前記ケラチノサイト成長因子の含有量が、５〜１００ｎｇ／ｍｌ前記肝細胞用培地であり、前記オンコスタチンＭの含有量が、１〜１００ｎｇ／ｍｌ前記肝細胞用培地であり、前記肝細胞用培地における前記デキサメタゾンの濃度が、０．０５〜１μＭである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の方法により得られた肝細胞であって、好ましくは前記肝細胞が、肝細胞のマーカー分子であるＡＦＰ、Ａｌｂ、ＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ１９、ＨＮＦ４α、及び／又はＧＡＰＤＨを発現し、より好ましくは前記肝細胞が、グリコーゲンの合成と貯蔵機能、尿素合成機能、アルブミンの分泌機能及び／又は薬物誘発に応じるＰ４５０酵素活性を有する、肝細胞。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれかに記載の方法により得られた肝細胞の人工肝臓の製造、薬物の毒性試験又は薬物スクリーニングにおける、使用。
【請求項１１】
１）胚性幹細胞（ＥＳＣ）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）を、アクチビンＡを含有する細胞用基礎培地で培養するステップ；
２）ステップ１）から得られた細胞を、インスリン−トランスフェリン−セレニウム塩（亜セレン酸ナトリウムが好ましい）と、アクチビンＡとを含有する細胞用基礎培地に移して培養するステップ；及び
３）ステップ２）から得られた細胞を、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）と、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）とを含有する肝内胚葉細胞の誘導培地で培養し、肝内胚葉細胞を得るステップ
を含む、胚性幹細胞（ＥＳＣ）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）を肝内胚葉細胞に分化誘導する方法であって、
ここで、好ましくは前記胚性幹細胞（ＥＳＣ）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）は哺乳動物細胞であり、より好ましくはマウス又はヒト細胞であり、最も好ましくはヒト細胞であり、ここで、前記細胞がヒト細胞である場合、好ましくは前記アクチビンＡがヒトアクチビンＡであり、前記線維芽細胞増殖因子がヒト線維芽細胞増殖因子であり、前記骨形成タンパク質がヒト骨形成タンパク質である、方法。
【請求項１２】
ステップ１）及び２）における前記細胞用基礎培地が、ウシ血清アルブミン成分Ｖを更に含み、好ましくは前記線維芽細胞増殖因子が、酸性線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子２、又は線維芽細胞増殖因子４であり、前記骨形成タンパク質が、骨形成タンパク質２、又は骨形成タンパク質４である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ２）において、先ずステップ１）から得られた細胞を、アクチビンＡと、第一濃度のインスリン−トランスフェリン−セレニウム塩とを、含有する細胞用基礎培地に移して培養し、更に得られた細胞をアクチビンＡと、前記第一濃度より高い第二濃度のインスリン−トランスフェリン−セレニウム塩とを含有する細胞用基礎培地で培養する、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ１）で使用される培地が、質量百分率０．０２％−１％のウシ血清アルブミン成分Ｖと、５０−２００ｎｇ／ｍｌのヒトアクチビンＡとを含有する細胞用基礎培地であり、ステップ２）で使用される培地が、それぞれ質量百分率０．０２％−１％のウシ血清アルブミン成分Ｖと、体積百分率０．０５％−０．５％のインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムの混合補充液と、５０−２００ｎｇ／ｍｌのヒトアクチビンＡとを含有する細胞用基礎培地、及び質量百分率０．０２％−１％のウシ血清アルブミン成分Ｖと、体積百分率０．５％−２％のインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムの混合補充液と、５０−２００ｎｇ／ｍｌのヒトアクチビンＡとを含有する細胞用基礎培地であり、前記肝内胚葉細胞の誘導培地が、２０−６０ｎｇ／ｍｌのヒト線維芽細胞増殖因子−４と、１０−３０ｎｇ／ｍｌのヒト骨形成タンパク質−２とを含有する肝細胞用培地である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞用基礎培地が、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＢＭＥ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０、及びＦｉｓｃｈｅｒ’ｓからなる群より選ばれるものである、請求項１１−１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ステップ３）の後に、フローサイトメトリーでＮ−カドヘリン蛋白の表面蛋白を発現する細胞を選別するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ１）、２）及び３）における細胞培養の時間が、それぞれ２４時間、４８時間および５日である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記胚性幹細胞（ＥＳＣ）が、ヒト胚性幹細胞であり、前記ヒト胚性幹細胞が、市販で入手可能なヒト胚性幹細胞系であり、好ましくはＮＩＨの番号がＢＧ０１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＢＧ０４、ＳＡ０１、ＳＡ０２、ＳＡ０３、ＥＳ０１、ＥＳ０２、ＥＳ０３、ＥＳ０４、ＥＳ０５、ＥＳ０６、ＴＥ０３、ＴＥ３２、ＴＥ３３、ＴＥ０４、ＴＥ０６、ＴＥ６２、ＴＥ０７、ＴＥ７２、ＵＣ０１、ＵＣ０６、ＷＡ０１、ＷＡ０７、ＷＡ０９、ＷＡ１３及びＷＡ１４であるいずれかの細胞系である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１１−１８のいずれかに記載の方法により、ヒト胚性幹細胞又はヒト人工多能性幹細胞から分化して得られた、好ましくは少なくともα−フェトプロテイン、肝細胞核因子４Ａ、及びＮ−カドヘリン蛋白という三種類のマーカー蛋白を発現する、肝内胚葉細胞。
【請求項２０】
α−フェトプロテイン、アルブミン、肝細胞核因子４Ａ、肝細胞核因子３Ｂ、及びＮ−カドヘリン蛋白を発現する、請求項１９に記載の肝内胚葉細胞。
【請求項２１】
請求項１９又は２０に記載の肝内胚葉細胞の肝実質細胞様細胞又は胆管細胞の製造における、使用。
【請求項２２】
１）胚性幹細胞（ＥＳＣ）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）を、アクチビンＡを含有する細胞用基礎培地で培養するステップ；
２）ステップ１）から得られた細胞を、インスリン−トランスフェリン−セレニウム塩（亜セレン酸ナトリウムが好ましい）と、アクチビンＡとを含有する細胞用基礎培地に移して培養するステップ；
３）ステップ２）から得られた細胞を、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）と、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）とを含有する肝内胚葉細胞の誘導培地で培養し、肝内胚葉細胞を得るステップ；及び
４）ステップ３）から得られた肝内胚葉細胞を、ＳＴＯ細胞のフィーダー層の上で肝前駆細胞培地で培養し、肝前駆細胞を得るステップ
を含む、胚性幹細胞（ＥＳＣ）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）を肝前駆細胞に分化誘導する方法であって、
ここで、好ましくは前記胚性幹細胞（ＥＳＣ）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）は哺乳動物細胞であり、より好ましくはマウス又はヒト細胞であり、最も好ましくはヒト細胞であり、ここで、前記細胞がヒト細胞である場合、好ましくは前記アクチビンＡはヒトアクチビンＡであり、前記線維芽細胞増殖因子はヒト線維芽細胞増殖因子であり、前記骨形成タンパク質はヒト骨形成タンパク質である、方法。
【請求項２３】
ステップ１）及び２）における前記細胞用基礎培地が、ウシ血清アルブミン成分Ｖを更に含み、好ましくは前記線維芽細胞増殖因子が、酸性線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子２、又は線維芽細胞増殖因子４であり、前記骨形成タンパク質が、骨形成タンパク質２、又は骨形成タンパク質４である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ステップ２）において、先ずステップ１）から得られた細胞を、アクチビンＡと、第一濃度のインスリン−トランスフェリン−セレニウム塩とを含有する細胞用基礎培地に移して培養し、更に得られた細胞を、アクチビンＡと、前記第一濃度より高い第二濃度のインスリン−トランスフェリン−セレニウム塩とを含有する細胞用基礎培地で培養する請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
ステップ１）で使用される培地が、質量百分率０．０２％−１％のウシ血清アルブミン成分Ｖと、５０−２００ｎｇ／ｍｌのヒトアクチビンＡとを含有する細胞用基礎培地であり、ステップ２）で使用される培地が、それぞれ質量百分率０．０２％−１％のウシ血清アルブミン成分Ｖと、体積百分率０．０５％−０．５％のインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムの混合補充液と、５０−２００ｎｇ／ｍｌのヒトアクチビンＡとを含有する細胞用基礎培地、及び質量百分率０．０２％−１％のウシ血清アルブミン成分Ｖと体積百分率０．５％−２％のインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムの混合補充液と、５０−２００ｎｇ／ｍｌのヒトアクチビンＡとを含有する細胞用基礎培地であり、前記肝内胚葉細胞の誘導培地は、２０−６０ｎｇ／ｍｌのヒト線維芽細胞増殖因子−４と、１０−３０ｎｇ／ｍｌのヒト骨形成タンパク質−２とを含有する肝細胞用培地であり、前記肝前駆細胞培地は、５−２５ｍＭのＨＥＰＥＳと、体積比百分率０．５％−２％のインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムの混合補充液と、質量百分率０．０２％−１％のウシ血清アルブミン成分Ｖと、２−２０ｍＭのニコチンアミド、０．２−２ｍＭの二重リン酸化アスコルビン酸と、０．０２−０．２μＭのデキサメタゾンと、５−４０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦとを含有する細胞用基礎培地である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞用基礎培地が、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＢＭＥ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０、及びＦｉｓｃｈｅｒ’ｓからなる群より選ばれるものである、請求項２２−２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
ステップ３）の後に、フローサイトメトリーで、Ｎ−カドヘリン蛋白の表面蛋白を発現する細胞を選別するステップをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
ステップ１）、２）及び３）における細胞培養の時間はそれぞれ２４時間、４８時間および５日である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
肝前駆細胞の継代のステップをさらに含む前記方法であり、肝前駆細胞の継代方法は、前記肝前駆細胞を膵酵素−ＥＤＴＡ消化液で消化した後、ＳＴＯ細胞をフィーダー層とする肝前駆細胞培地で培養することである、請求項２２−２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記胚性幹細胞（ＥＳＣ）が、ヒト胚性幹細胞であり、前記ヒト胚性幹細胞が、市販で入手可能なヒト胚性幹細胞系であり、好ましくはＮＩＨの番号がＢＧ０１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＢＧ０４、ＳＡ０１、ＳＡ０２、ＳＡ０３、ＥＳ０１、ＥＳ０２、ＥＳ０３、ＥＳ０４、ＥＳ０５、ＥＳ０６、ＴＥ０３、ＴＥ３２、ＴＥ３３、ＴＥ０４、ＴＥ０６、ＴＥ６２、ＴＥ０７、ＴＥ７２、ＵＣ０１、ＵＣ０６、ＷＡ０１、ＷＡ０７、ＷＡ０９、ＷＡ１３及びＷＡ１４であるいずれかの細胞系である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２２−３０のいずれかに記載の方法により、ヒト胚性幹細胞又はヒト人工多能性幹細胞から分化して得られた、好ましくはα−フェトプロテイン、ケラチン１９及びケラチン７を発現する肝前駆細胞であって、増殖能、及び肝実質細胞様細胞と胆管細胞様細胞の双方向へ分化する潜在能力を有する肝前駆細胞。
【請求項３２】
請求項３１に記載の肝前駆細胞の肝実質細胞様細胞又は胆管細胞の製造における、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）を肝細胞に分化誘導する方法、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞を肝内胚葉細胞に分化誘導する方法、及び、胚性幹細胞（ＥＳＣ）又は人工多能性幹細胞を肝前駆細胞に分化誘導する方法に関する。また、本発明は、これらの方法により得られた肝細胞、肝内胚葉細胞、及び肝前駆細胞、並びにこれらの細胞の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
人工多能性幹細胞
人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cells、ｉＰＳ細胞）は胚性幹細胞（embryonic stem cells）と性質が非常に類似しており、体外で各種の細胞に分化される潜在能力を持つ。このような細胞は、細胞分裂により、自身の細胞群の大きさを維持し、又は増幅することができ、さらに各種の特異的な細胞型に分化することもできる。第一株の哺乳動物ｉＰＳ細胞は２００６年８月に樹立され、４つの遺伝子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４和ｃ−Ｍｙｃ）の導入により、マウス体細胞を“人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）”に転換できることが日本Ｙａｍａｎａｋａ教授の研究室により報告されていた（Takahashi, K.Cell 2006;126, 663-676.）。これらの人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、胚盤胞に統合され、正常な胚発生及び組織器官の形成に参加し、かつ特定の条件でキメラマウスを形成することができることが証明された。２００７年、Ｔｈｏｍｓｏｎ研究室、及びＹａｍａｎａｋａ研究室は、ほぼ同時にヒトｉＰＳ細胞系の樹立を報告した（Yu J, et al.Science 2007;318:1917-1920, Takahashi K.Cell 2007;131:861-872.）。このような細胞は胚性幹細胞と類似する性質を持ち、特定の誘導条件下で、内、中、外の３つの胚葉へ分化することができ、かつ奇形腫を形成することができる。今まで、既に多くの国及び地域の研究者が、ヒトｉＰＳ細胞系を樹立した。
【０００３】
ｉＰＳ細胞が体外で無限に増幅し、多数の方向へ分化する潜在能力を維持することができるため、ｉＰＳ細胞の一定方向への分化により、十分な数の細胞が得られ、細胞移植治療及び遺伝子治療に用いられる。患者の体細胞を得て、患者と同じ遺伝的背景を持つｉＰＳ細胞系を樹立し、患者に必要とされる細胞型に分化誘導して、最終的に患者体内に戻すことができれば、外因性の移植による免疫拒絶を免れることができる。このような治療的なクローニング法が実現できれば、多くの今まで治癒しにくい疾患、例えば、糖尿病、白血病、及び心臓血管疾患などの治療に新しい方法を提供することになる。また、ヒトｉＰＳ細胞の研究は、薬物スクリーニング、薬理学的解析、及び毒性評価等に、動物モデルが比べるものにならない実験プラットフォームを提供することに有利である。研究により、ヒトｉＰＳ細胞は体外で複数種類の細胞型、例えば、神経細胞（Dimos JT.Science 2008;321:1218-1221;Chambers SM.Nat Biotechnol 2009;27:275-280;Karumbayaram S. Stem Cells 2009;27:806-811;Hirami Y.Neurosci Lett 2009;458:126-131.）、骨芽細胞（Karner E.J Cell Physiol 2009;218:323-333.）、心筋細胞（Zhang J.Circ Res 2009;104:e30-41.）、脂肪細胞（Taura D.FEBS Lett 2009;583:1029-1033.）、膵臓細胞（Tateishi K.J Biol Chem 2008;283:31601-31607;Zhang D.Cell Res 2009;19:429-438.）、及び造血系細胞（Taura D.Arterioscler Thromb Vasc Biol 2009;Choi KD.Stem Cells 2009;27:559-567.）に分化できることが証明された。
【０００４】
ｉＰＳ細胞をいかに有効的に特定組織の細胞へ分化させるかということは、治療的なクローニングを実現する重要な一環である。現在まで、胚性幹細胞及びｉＰＳ細胞の分化は既に多くの経験が積みあがっており、また、胚性幹細胞から肝細胞への分化も、ある程度の進展が見られ、肝細胞の特定的な蛋白を発現する細胞が得られ、且つ、この細胞はグリコーゲンを合成し、アルブミンを分泌する機能等を持つ（Cai J. Hepatology 2007;45:1229-1239.）。
【０００５】
ヒト胚性幹細胞及び肝前駆細胞
ヒト胚性幹細胞は、無限の増殖能と分化万能性を有し、適宜な条件でヒトの各種の細胞型に分化することができる。従って、ヒト胚性幹細胞は、各種の細胞の起源を提供する潜在力があり、巨大な応用潜在能力を持っている。例えば、発育過程における細胞系譜決定の機構の研究に用いられ、或いは各種の退行性疾患に対して行われた細胞移植に応用できる。ヒト胚性幹細胞が分化して産生される各種の系譜において、肝細胞が格別に注目されている。これは、肝臓がヒト体内の代謝過程において主要な役割を果たしており、グリコーゲンの合成、赤血球の分解、血漿蛋白の合成、及び解毒等を含む重要な多様な機能を持っているからである。近年、数多くの研究グループはヒト又はマウス胚性幹細胞を肝臓系譜へ成功に分化させた。
【０００６】
早期の肝臓組織の生成の過程において、肝前駆細胞は肝臓の実質的な主要な組成部分である。マウス及びヒトの成長学の研究により、これらの肝前駆細胞は成熟の肝実質細胞と肝内の胆管上皮細胞との共通の前駆体であることが分かった。肝前駆細胞から肝臓と胆管との２つの系譜への分化は、大体妊娠中期に徐々に確定される。ヒトとマウス胎児肝臓から肝前駆細胞を分離し、体外培養する方法により、肝前駆細胞の特性に対して初歩的な研究がした。体外培養において、ヒト肝前駆細胞は強力な増殖能、かつ安定な表現型を示す。適合な条件下に置く場合、肝前駆細胞は、ＡＬＢを発現し、グリコーゲンを貯蔵する肝実質細胞様細胞、又はＫＲＴ１９を発現する胆管細胞に分化することができる。
【０００７】
肝前駆細胞の増殖能、及び肝臓と胆管との双方向へ分化する潜在能力は実証されたが、これらの肝前駆細胞の起源と機能は、現在はまだ論議がある分野である。この主な原因はおそらく、現在は肝臓から直接的に分離し肝前駆細胞を得ることしかできなく、早期の胚胎の欠乏は当該領域の研究を大きく制限することにある。
【発明の概要】
【０００８】
先行技術の上記状況に鑑みて、本発明は以下の各項を提供する：
【０００９】
１．  １）胚性幹細胞（ＥＳＣ）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）を、アクチビンＡを含有する細胞用基礎培地で培養するステップ；
２）ステップ１）から得られた細胞を、インスリン−トランスフェリン−セレニウム塩（亜セレン酸ナトリウムが好ましい）と、アクチビンＡとを含有する細胞用基礎培地に移して培養するステップ；
３）ステップ２）から得られた細胞を、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）と、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）とを含有する肝細胞用培地（ＨＣＭ）で培養し、肝前駆細胞を得るステップ；及び
４）ステップ３）から得られた肝前駆細胞の成熟を促進し、肝細胞を得るステップを含む胚性幹細胞（ＥＳＣ）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）を肝細胞に分化誘導する方法。
（但し、好ましくは前記胚性幹細胞（ＥＳＣ）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）は哺乳動物細胞であり、より好ましくはマウス又はヒト細胞であり、最も好ましくはヒト細胞である。この中、前記細胞がヒト細胞である場合、好ましくは前記アクチビンＡがヒトアクチビンＡであり、前記線維芽細胞増殖因子がヒト線維芽細胞増殖因子であり、前記骨形成タンパク質がヒト骨形成タンパク質である。）
【００１０】
２．  前記細胞用基礎培地は、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＢＭＥ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０、及びＦｉｓｃｈｅｒ’ｓからなる群より選ばれるものである１に記載の方法。
【００１１】
３．  前記細胞用基礎培地における前記アクチビンＡの含有量が１０〜５００ｎｇ／ｍｌである１又は２に記載の方法。
【００１２】
４．  前記インスリン−トランスフェリン−セレニウム塩は混合補充液として加えられ、前記細胞用基礎培地との体積比は０．０１〜２０％である３に記載の方法。
【００１３】
５．  前記線維芽細胞増殖因子は、酸性線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子２、又は線維芽細胞増殖因子４であり、前記骨形成タンパク質は、骨形成タンパク質２、又は骨形成タンパク質４である４に記載の方法。
【００１４】
６．  前記線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の量は５〜１００ｎｇ／ｍｌ前記肝細胞用培地であり、且つ前記骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の量は５〜１００ｎｇ／ｍｌ前記肝細胞用培地である５に記載の方法。
【００１５】
７．  前記肝細胞の成熟を促進することは、前記肝細胞を肝細胞増殖因子（ヒト肝細胞増殖因子が好ましい）と、ケラチノサイト成長因子（ヒトケラチノサイト成長因子が好ましい）とを含有する肝細胞用培地で培養し、増幅された肝前駆細胞を得て、更にオンコスタチンＭとデキサメタゾンとを含有する肝細胞用培地に移して培養し、その後、（０．１−１０）ｍｌ／１００ｍｌのＮ２、（０．１−２０）ｍｌ／１００ｍｌのＢ２７、０．５−２ｍＭのグルタミン、（０．１−１０）ｍｌ／１００ｍｌの非必須アミノ酸、０．０５−０．２ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１−１００ｎｇ／ｍｌのオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、及び０．０５−１μＭのデキサメタゾン（Ｄｅｘ）を含有する基礎培地であり、且つｐＨが７．２−７．６である分化培地Ｖに移して培養し、成熟の肝細胞を得ることである６に記載の方法。
【００１６】
８．  前記肝細胞増殖因子の含有量は５〜１００ｎｇ／ｍｌ前記肝細胞用培地であり、前記ケラチノサイト成長因子の含有量は５〜１００ｎｇ／ｍｌ前記肝細胞用培地であり、前記オンコスタチンＭの含有量は１〜１００ｎｇ／ｍｌ前記肝細胞用培地であり、前記肝細胞用培地における前記デキサメタゾンの濃度は０．０５〜１μＭである７に記載の方法。
【００１７】
９．  上記の１〜８のいずれかに記載の方法により得られた肝細胞であり、好ましくは前記肝細胞が、肝細胞のマーカー分子であるＡＦＰ、Ａｌｂ、ＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ１９、ＨＮＦ４α、及び／又はＧＡＰＤＨを発現し、より好ましくは前記肝細胞が、グリコーゲンの合成と貯蔵機能、尿素合成機能、アルブミンの分泌機能及び／又は薬物誘発に応じるＰ４５０酵素活性を有する肝細胞である。
【００１８】
１０．  上記の１〜８のいずれかに記載の方法により得られた肝細胞の人工肝臓の製造、薬物の毒性試験又は薬物スクリーニングにおける用途。
【００１９】
１１．  １）胚性幹細胞（ＥＳＣ）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）を、アクチビンＡを含有する細胞用基礎培地で培養するステップ；
２）ステップ１）から得られた細胞を、インスリン−トランスフェリン−セレニウム塩（亜セレン酸ナトリウムが好ましい）と、アクチビンＡとを含有する細胞用基礎培地に移して培養するステップ；及び
３）ステップ２）から得られた細胞を、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）と、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）とを含有する肝内胚葉細胞の誘導培地で培養し、肝内胚葉細胞を得るステップを含む胚性幹細胞（ＥＳＣ）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）を肝内胚葉細胞に分化誘導する方法。
（但し、好ましくは前記胚性幹細胞（ＥＳＣ）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）は哺乳動物細胞であり、より好ましくはマウス又はヒト細胞であり、最も好ましくはヒト細胞である。この中、前記細胞がヒト細胞である場合、好ましくは前記アクチビンＡがヒトアクチビンＡであり、前記線維芽細胞増殖因子がヒト線維芽細胞増殖因子であり、前記骨形成タンパク質がヒト骨形成タンパク質である。）
【００２０】
１２．  ステップ１）及び２）における前記細胞用基礎培地がウシ血清アルブミン成分Ｖを更に含み、好ましくは前記線維芽細胞増殖因子が、酸性線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子２、又は線維芽細胞増殖因子４であり、前記骨形成タンパク質が、骨形成タンパク質２、又は骨形成タンパク質４である１１に記載の方法。
【００２１】
１３．  ステップ２）において、先ずステップ１）から得られた細胞を、アクチビンＡと、第一濃度のインスリン−トランスフェリン−セレニウム塩とを含有する細胞用基礎培地に移して培養し、更に得られた細胞をアクチビンＡと、前記第一濃度より高い第二濃度のインスリン−トランスフェリン−セレニウム塩とを含有する細胞用基礎培地で培養する１１又は１２に記載の方法。
【００２２】
１４．  ステップ１）で使用される培地は、質量百分率０．０２％−１％のウシ血清アルブミン成分Ｖと、５０−２００ｎｇ／ｍｌのヒトアクチビンＡとを含有する細胞用基礎培地であり、ステップ２）で使用される培地は、それぞれ質量百分率０．０２％−１％のウシ血清アルブミン成分Ｖと、体積百分率０．０５％−０．５％のインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムの混合補充液と、５０−２００ｎｇ／ｍｌのヒトアクチビンＡとを含有する細胞用基礎培地、及び質量百分率０．０２％−１％のウシ血清アルブミン成分Ｖと、体積百分率０．５％−２％のインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムの混合補充液と、５０−２００ｎｇ／ｍｌのヒトアクチビンＡとを含有する細胞用基礎培地であり、前記肝内胚葉細胞の誘導培地は２０−６０ｎｇ／ｍｌのヒト線維芽細胞増殖因子−４と、１０−３０ｎｇ／ｍｌのヒト骨形成タンパク質−２とを含有する肝細胞用培地である１３に記載の方法。
【００２３】
１５．  前記細胞用基礎培地は、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＢＭＥ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０、及びＦｉｓｃｈｅｒ’ｓからなる群より選ばれるものである１１−１４のいずれかに記載の方法。
【００２４】
１６．  ステップ３）の後に、フローサイトメトリーでＮ−カドヘリン蛋白の表面蛋白を発現する細胞を選別するステップをさらに含む１１に記載の方法。
【００２５】
１７．  ステップ１）、２）及び３）における細胞培養の時間は、それぞれ２４時間、４８時間和５日である１１に記載の方法。
【００２６】
１８．  前記胚性幹細胞（ＥＳＣ）はヒト胚性幹細胞であり、前記ヒト胚性幹細胞は市販で入手可能なヒト胚性幹細胞系であり、好ましくはＮＩＨの番号がＢＧ０１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＢＧ０４、ＳＡ０１、ＳＡ０２、ＳＡ０３、ＥＳ０１、ＥＳ０２、ＥＳ０３、ＥＳ０４、ＥＳ０５、ＥＳ０６、ＴＥ０３、ＴＥ３２、ＴＥ３３、ＴＥ０４、ＴＥ０６、ＴＥ６２、ＴＥ０７、ＴＥ７２、ＵＣ０１、ＵＣ０６、ＷＡ０１、ＷＡ０７、ＷＡ０９、ＷＡ１３及びＷＡ１４であるいずれかの細胞系である１１に記載の方法。
【００２７】
１９．  上記の１１−１８のいずれかに記載の方法により、ヒト胚性幹細胞又はヒト人工多能性幹細胞から分化して得られた、好ましくは少なくともα−フェトプロテイン、肝細胞核因子４Ａ、及びＮ−カドヘリン蛋白という三種類のマーカー蛋白を発現する肝内胚葉細胞。
【００２８】
２０．  α−フェトプロテイン、アルブミン、肝細胞核因子４Ａ、肝細胞核因子３Ｂ、及びＮ−カドヘリン蛋白を発現する１９に記載の肝内胚葉細胞。
【００２９】
２１．  上記の１９又は２０に記載の肝内胚葉細胞の肝実質細胞様細胞又は胆管細胞の製造における用途。
【００３０】
２２．  １）胚性幹細胞（ＥＳＣ）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）を、アクチビンＡを含有する細胞用基礎培地で培養するステップ；
２）ステップ１）から得られた細胞を、インスリン−トランスフェリン−セレニウム塩（亜セレン酸ナトリウムが好ましい）と、アクチビンＡとを含有する細胞用基礎培地に移して培養するステップ；
３）ステップ２）から得られた細胞を、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）と、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）とを含有する肝内胚葉細胞の誘導培地で培養し、肝内胚葉細胞を得るステップ；及び
４）ステップ３）から得られた肝内胚葉細胞を、ＳＴＯ細胞のフィーダー層の上で肝前駆細胞培地で培養し、肝前駆細胞を得るステップを含む、胚性幹細胞（ＥＳＣ）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）を肝前駆細胞に分化誘導する方法。
（但し、好ましくは前記胚性幹細胞（ＥＳＣ）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）は哺乳動物細胞であり、より好ましくはマウス又はヒト細胞であり、最も好ましくはヒト細胞である。この中、前記細胞がヒト細胞である場合、好ましくは前記アクチビンＡがヒトアクチビンＡであり、前記線維芽細胞増殖因子がヒト線維芽細胞増殖因子であり、前記骨形成タンパク質がヒト骨形成タンパク質である。）
【００３１】
２３．  ステップ１）及び２）における前記細胞用基礎培地がウシ血清アルブミン成分Ｖを更に含み、好ましくは前記線維芽細胞増殖因子が酸性線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子２、又は線維芽細胞増殖因子４であり、前記骨形成タンパク質が骨形成タンパク質２、又は骨形成タンパク質４である２２に記載の方法。
【００３２】
２４．  ステップ２）において、先ずステップ１）から得られた細胞を、アクチビンＡと、第一濃度のインスリン−トランスフェリン−セレニウム塩とを含有する細胞用基礎培地に移して培養し、更に得られた細胞をアクチビンＡと、前記第一濃度より高い第二濃度のインスリン−トランスフェリン−セレニウム塩とを含有する細胞用基礎培地で培養する２２又は２３に記載の方法。
【００３３】
２５．  ステップ１）で使用される培地は、質量百分率０．０２％−１％のウシ血清アルブミン成分Ｖと、５０−２００ｎｇ／ｍｌのヒトアクチビンＡとを含有する細胞用基礎培地であり、ステップ２）で使用される培地は、それぞれ質量百分率０．０２％−１％のウシ血清アルブミン成分Ｖと、体積百分率０．０５％−０．５％のインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムの混合補充液と、５０−２００ｎｇ／ｍｌのヒトアクチビンＡとを含有する細胞用基礎培地、及び質量百分率０．０２％−１％のウシ血清アルブミン成分Ｖと、体積百分率０．５％−２％のインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムの混合補充液と、５０−２００ｎｇ／ｍｌのヒトアクチビンＡとを含有する細胞用基礎培地であり、前記肝内胚葉細胞の誘導培地は、２０−６０ｎｇ／ｍｌのヒト線維芽細胞増殖因子−４と、１０−３０ｎｇ／ｍｌのヒト骨形成タンパク質−２とを含有する肝細胞用培地であり、前記肝前駆細胞培地は、５−２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、体積比百分率０．５％−２％のインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムの混合補充液、質量百分率０．０２％−１％のウシ血清アルブミン成分Ｖ、２−２０ｍＭのニコチンアミド、０．２−２ｍＭの二重リン酸化アスコルビン酸、０．０２−０．２μＭのデキサメタゾン、及び５−４０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦを含有する細胞用基礎培地である２４に記載の方法。
【００３４】
２６．  前記細胞用基礎培地は、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＢＭＥ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０、及びＦｉｓｃｈｅｒ’ｓからなる群より選ばれるものである２２−２５のいずれかに記載の方法。
【００３５】
２７．  ステップ３）の後に、フローサイトメトリーで、Ｎ−カドヘリン蛋白の表面蛋白を発現する細胞を選別するステップをさらに含む２２に記載の方法。
【００３６】
２８．  ステップ１）、２）及び３）における細胞培養の時間はそれぞれ２４時間、４８時間和５日である２２に記載の方法。
【００３７】
２９．  肝前駆細胞の継代のステップをさらに含む前記方法であり、肝前駆細胞の継代方法は、前記肝前駆細胞を膵酵素−ＥＤＴＡ消化液で消化した後、ＳＴＯ細胞をフィーダー層とする肝前駆細胞培地で培養することである２２−２８のいずれかに記載の方法。
【００３８】
３０．  前記胚性幹細胞（ＥＳＣ）はヒト胚性幹細胞であり、前記ヒト胚性幹細胞は市販で入手可能なヒト胚性幹細胞系であり、好ましくはＮＩＨの番号がＢＧ０１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＢＧ０４、ＳＡ０１、ＳＡ０２、ＳＡ０３、ＥＳ０１、ＥＳ０２、ＥＳ０３、ＥＳ０４、ＥＳ０５、ＥＳ０６、ＴＥ０３、ＴＥ３２、ＴＥ３３、ＴＥ０４、ＴＥ０６、ＴＥ６２、ＴＥ０７、ＴＥ７２、ＵＣ０１、ＵＣ０６、ＷＡ０１、ＷＡ０７、ＷＡ０９、ＷＡ１３及びＷＡ１４であるいずれかの細胞系である２２に記載の方法。
【００３９】
３１．  上記の２２−３０のいずれかに記載の方法により、ヒト胚性幹細胞又はヒト人工多能性幹細胞から分化して得られた、好ましくはα−フェトプロテイン、ケラチン１９及びケラチン７を発現する肝前駆細胞であって、増殖能、及び肝実質細胞様細胞と胆管細胞様細胞の双方向へ分化する潜在能力を有する肝前駆細胞。
【００４０】
３２．  上記の３１に記載の肝前駆細胞の肝実質細胞様細胞又は胆管細胞の製造における用途。
【００４１】
本発明の一つの目的は、人工多能性幹細胞を肝細胞に分化させる方法、及びこの方法により得られた肝細胞を利用して薬物スクリーニングを行う可能性を提供することである。
【００４２】
本発明が提供する人工多能性幹細胞を肝細胞に分化させる方法は、人工多能性幹細胞を分化培地Ｉで培養し、更にインスリン−トランスフェリン−セレニウム塩を含む分化培地Ｉに移して培養し、その後、線維芽細胞増殖因子と、骨形成タンパク質とを含む肝細胞用培地（ＨＣＭ）で培養して肝前駆細胞を得て、前記肝前駆細胞の成熟を促進して、肝細胞を得ることである。前記分化培地ＩはアクチビンＡを含む細胞用基礎培地である。
【００４３】
その中、前記細胞用基礎培地は、先行技術で公知公用のＭＥＭ（Minimum Essential Medium）、ＤＭＥＭ、ＢＭＥ（Basal Medium Eagle）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０又はＦｉｓｃｈｅｒ’ｓ（Fischer's Medium）であり、これらの培地は、例えばＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｉｂｃｏ等の会社から購入できる。
【００４４】
前記分化培地Ｉにおける前記アクチビンＡの量は１０−５００ｎｇ／ｍｌであってもよい。前記インスリン−トランスフェリン−セレニウム塩（亜セレン酸ナトリウムが好ましい）と前記分化培地Ｉとの体積比は０．０１−２０％である。
【００４５】
前記線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は、酸性線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子２、又は線維芽細胞増殖因子４であり、前記骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、骨形成タンパク質２、又は骨形成タンパク質４である。
【００４６】
前記線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の量は５−１００ｎｇ／ｍｌ前記肝細胞用培地であってもよく、前記骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の量は５−１００ｎｇ／ｍｌ前記肝細胞用培地であってもよい。
【００４７】
前記肝前駆細胞の成熟を促進するのには従来の方法を使用してもよく、前記肝前駆細胞を肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）と、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）とを含む肝細胞用培地で培養して、増幅された肝前駆細胞を得て、更にオンコスタチンＭと、デキサメタゾンとを含む肝細胞用培地に移して培養した後、分化培地Ｖに移して培養し、成熟した肝細胞を得てもよい。前記分化培地Ｖは、０．１−１０％（体積百分率）のＮ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入、商品番号：１７５０２−０４８）、０．１−２０％（体積百分率）のＢ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入、商品番号：１７５０４−０４４）、０．５−２ｍＭのグルタミン、０．１−１０％（体積百分率）の非必須アミノ酸、０．０５−０．２ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１−１００ｎｇ／ｍｌのオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、及び０．０５−１μＭのデキサメタゾン（Ｄｅｘ）を含む肝細胞用培地又は基礎培地である。
【００４８】
前記肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の量は５−１００ｎｇ／ｍｌ前記肝細胞用培地であり、前記ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）の量は５−１００ｎｇ／ｍｌ前記肝細胞用培地であり、前記オンコスタチンＭの量は１−１００ｎｇ／ｍｌ前記肝細胞用培地又は基礎培地であり、前記肝細胞用培地又は基礎培地における前記デキサメタゾン（Ｄｅｘ）の濃度は０．０５−１μＭであることができる。
【００４９】
上記方法により得られた、正常肝細胞のマーカー分子、例えば、ＡＦＰ（α−フェトプロテイン）、Ａｌｂ（アルブミン（ＡＬＢ））、ＣＫ１８（サイトケラチン（角質）１８）、ＣＫ８（サイトケラチン（角質）８）、ＣＫ１９（サイトケラチン（角質）１９）、ＡＡＴ（α−アンチトリプシン）、ＣＹＰ３Ａ４（肝薬物代謝酵素）、肝細胞核因子４Ａ（ＨＮＦ４Ａ、又はＨＮＦ４α）、ＧＡＰＤＨ（グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）等を発現する、或いは正常肝細胞の機能、例えば、グリコーゲン合成と貯蔵、尿素合成、アルブミンの分泌等の機能を持つ肝細胞も本発明の請求範囲に属する。
【００５０】
従って、本発明の第一形態は以下の各項を提供する：
【００５１】
１．  人工多能性幹細胞を分化培地Ｉで培養し、更にインスリン−トランスフェリン−セレニウム塩を含む分化培地Ｉに移して培養し、その後、線維芽細胞増殖因子と、骨形成タンパク質とを含む肝細胞用培地で培養し肝前駆細胞を得て、前記肝前駆細胞の成熟を促進し、肝細胞を得る方法であり、前記分化培地ＩはアクチビンＡを含む細胞用基礎培地である人工多能性幹細胞を肝細胞に分化させる方法。
【００５２】
２．  前記細胞用基礎培地は、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＢＭＥ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０、及びＦｉｓｃｈｅｒ’ｓからなる群より選ばれることを特徴とする上記１に記載の方法。
【００５３】
３．  前記分化培地Ｉにおける前記アクチビンＡの量は１０〜５００ｎｇ／ｍｌであることを特徴とする上記１又は２に記載の方法。
【００５４】
４．  前記インスリン−トランスフェリン−セレニウム塩と前記分化培地Ｉとの体積比は（０．０１〜２０）％であることを特徴とする上記３に記載の方法。
【００５５】
５．  前記線維芽細胞増殖因子は、酸性線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子２、又は線維芽細胞増殖因子４であり、前記骨形成タンパク質は、骨形成タンパク質２、又は骨形成タンパク質４であることを特徴とする上記４に記載の方法。
【００５６】
６．  前記線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の量は５〜１００ｎｇ／ｍｌ前記肝細胞用培地であり、前記骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の量は５〜１００ｎｇ／ｍｌ前記肝細胞用培地であることができる上記５に記載の方法。
【００５７】
７．  前記肝細胞の成熟を促進することは、前記肝細胞を肝細胞増殖因子と、ケラチノサイト成長因子とを含む肝細胞用培地で培養し、増幅された肝前駆細胞を得て、更にオンコスタチンＭとデキサメタゾンとを含む肝細胞用培地に移して培養し、その後、（０．１−１０）ｍｌ／１００ｍｌのＮ２、（０．１−２０）ｍｌ／１００ｍｌのＢ２７、０．５−２ｍＭのグルタミン、（０．１−１０）ｍｌ／１００ｍｌの非必須アミノ酸、０．０５−０．２ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１−１００ｎｇ／ｍｌのオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、及び０．０５−１μＭのデキサメタゾン（Ｄｅｘ）を含む基礎培地で、且つｐＨが７．２−７．６である分化培地Ｖに移して培養し、成熟した肝細胞を得ることである上記６に記載の方法。
【００５８】
８．  前記肝細胞増殖因子の量は５〜１００ｎｇ／ｍｌ前記肝細胞用培地、前記ケラチノサイト成長因子の量は５〜１００ｎｇ／ｍｌ前記肝細胞用培地、前記オンコスタチンＭの量は１〜１００ｎｇ／ｍｌ前記肝細胞用培地、前記デキサメタゾンの量は０．０５〜１μＭ前記肝細胞用培地であることを特徴とする上記７に記載の方法。
【００５９】
９．  上記１〜８のいずれかに記載の方法により得られる肝細胞。
【００６０】
１０．  上記１〜８のいずれかに記載の方法の肝細胞の人工肝臓の製造、又は薬物スクリーニングにおける応用。
【００６１】
本発明の人工多能性幹細胞を肝細胞に分化させる方法において、アクチビンＡを用いてヒトｉＰＳ細胞を内胚葉（definitive endoderm）細胞へ効率的に分化させた後、線維芽細胞増殖因子と骨形成タンパク質との共同作用で、さらにアルブミンを発現する早期の肝細胞に分化させ、肝細胞増殖因子とケラチノサイト成長因子との共同作用で、分化された早期の肝細胞が増幅し続けることを促すことができ、ＯＳＭ、ＤｅｘとＮ２、Ｂ２７との共同作用で、分化された早期の肝細胞が成熟することを更に促すことができる。得られた分化細胞は、比較的に典型的な肝細胞の形態を持っており、且つ、約６０％以上の細胞が早期の肝細胞のマーカー蛋白であるＣＫ８（サイトケラチン（角質）８）、Ａｌｂ、ＣＫ１８及びＡＦＰを発現する。同時にｉＰＳ細胞から分化された肝細胞も成熟の肝細胞のマーカー分子であるＡＡＴ及びＣＹＰ３Ａ４を発現する。全分化過程は肝臓の早期発育とは非常に似ており、しかも本方法により得られた肝細胞は誘導可能なＣＹＰ４５０酵素の活性を持ち、薬物の誘導に応じることができる。本発明の人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を肝細胞に分化させる方法は、周期が短く、分化効率が高く、安全・安定である利点があり、分化して得られた肝細胞は、細胞移植による肝疾患の治療、人工肝臓及び薬物の毒性試験等に用いられ、また、全分化過程はヒト類の早期胚胎の肝臓発育の研究に利用することもでき、応用前景が広い。
【００６２】
本発明の別の目的は、肝内胚葉細胞並びにその製造及び純化の方法を提供することである。
【００６３】
本発明が提供する肝内胚葉細胞は、ヒト胚性幹細胞（ヒトＥＳ細胞）又はヒト人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cells、ヒトｉＰＳ細胞）から分化して得られた、少なくともα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、肝細胞核因子４Ａ（ＨＮＦ４Ａ）及びＮ−カドヘリン蛋白の三種類のマーカー蛋白を発現する肝内胚葉細胞である。
【００６４】
前記肝内胚葉細胞は、さらにアルブミン（ＡＬＢ）及び肝細胞核因子３Ｂ（ＦＯＸＡ２）を発現できる。
【００６５】
具体的には、前記ヒト胚性幹細胞は表１で示される市販で入手可能なヒト胚性幹細胞系であってもよい。
【００６６】
【表１】
2012533310.tif 000002
【００６７】
また、本発明の別の目的は、肝内胚葉細胞の製造及び純化方法を提供することである。
【００６８】
本発明が提供する肝内胚葉細胞の製造及び純化方法は、以下のようなステップを含む：
１）ヒト胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞を、内胚葉誘導培地Ｉで培養するステップ；
２）ステップ１）で得られた細胞を、内胚葉誘導培地ＩＩで培養するステップ；
３）ステップ２）で得られた細胞を、内胚葉誘導培地ＩＩＩで培養するステップ；
４）ステップ３）で得られた細胞を、肝内胚葉細胞の誘導培地で培養するステップ。
【００６９】
前記内胚葉誘導培地Ｉは、質量百分率０．０２％−１％のウシ血清アルブミン成分Ｖと、５０−２００ｎｇ／ｍｌのヒトアクチビンＡとを含む細胞用基礎培地である。その中、ウシ血清アルブミン成分Ｖの質量百分率は、好ましくは０．０２％−０．１％であり、特に好ましくは０．０５％である。ヒトアクチビンＡの含有量は、好ましくは８０−１５０ｎｇ／ｍｌであり、特に好ましくは１００ｎｇ／ｍｌである。
【００７０】
前記内胚葉誘導培地ＩＩは、質量百分率０．０２％−１％のウシ血清アルブミン成分Ｖと、体積百分率０．０５％−０．５％のインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムの混合補充液と、５０−２００ｎｇ／ｍｌのヒトアクチビンＡとを含む細胞用基礎培地である。その中、ウシ血清アルブミン成分Ｖの含有量は、好ましくは０．０２％−０．１％であり、特に好ましくは０．０５％である。ヒトアクチビンＡの含有量は、好ましくは８０−１５０ｎｇ／ｍｌであり、特に好ましくは１００ｎｇ／ｍｌである。インスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムの混合補充液の含有量は、好ましくは０．０５％−０．１５％であり、特に好ましくは０．１％である。
【００７１】
前記内胚葉誘導培地ＩＩＩは、０．０２％−１％のウシ血清アルブミン成分Ｖと、体積百分率０．５％−２％のインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムの混合補充液と、５０−２００ｎｇ／ｍｌのヒトアクチビンＡとを含む細胞用基礎培地である。その中、ウシ血清アルブミン成分Ｖの含有量は、好ましくは０．０２％−０．１％であり、特に好ましくは０．０５％である。ヒトアクチビンＡの含有量は、好ましくは８０−１５０ｎｇ／ｍｌであり、特に好ましくは１００ｎｇ／ｍｌである。インスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムの混合補充液の含有量は、好ましくは０．８％−１．５％であり、特に好ましくは１％である。
【００７２】
前記肝内胚葉細胞の誘導培地は２０−６０ｎｇ／ｍｌのヒト線維芽細胞増殖因子−４と、１０−３０ｎｇ／ｍｌのヒト骨形成タンパク質−２とを含む肝細胞用培地である。その中、ヒト線維芽細胞増殖因子−４の含有量が好ましくは３０ｎｇ／ｍｌであり、ヒト骨形成タンパク質−２の含有量が好ましくは２０ｎｇ／ｍｌである。
【００７３】
上記内胚葉誘導培地Ｉ、内胚葉誘導培地ＩＩ、内胚葉誘導培地ＩＩＩ、及び肝内胚葉細胞誘導培地のｐＨはいずれも、哺乳動物細胞を培養する通常のｐＨ、例えばｐＨ７．２−７．６であることができる。
【００７４】
その中、前記方法は、フローサイトメトリーでＮ−カドヘリン蛋白（Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）の表面蛋白を発現する細胞を選別することを更に含む。
【００７５】
得られた肝内胚葉細胞はＥＤＴＡを含まない、２ｍＭのカルシウムイオンを添加した膵酵素で消化処理を行い、次いでフローサイトメトリーでＮ−カドヘリン蛋白の表面蛋白を発現する細胞を選別する。
【００７６】
前記ヒト胚性幹細胞は表１の通りである。前記細胞用基礎培地は、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＢＭＥ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０又はＦｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地であってもよい。
【００７７】
前記方法において、ヒト胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞は内胚葉誘導培地Ｉで、２４ｈ培養する。前記方法において、ステップ１）より得られた細胞は内胚葉誘導培地ＩＩで２４ｈ培養する。前記方法において、ステップ２）より得られた細胞は内胚葉誘導培地ＩＩＩで２４ｈ培養する。前記方法において、ステップ３）より得られた細胞は肝内胚葉細胞誘導培地で５日間培養する。
【００７８】
ヒト胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞から肝内胚葉細胞を製造する培地も、本発明の請求範囲に属する。当該ヒト胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞から肝内胚葉細胞を製造するための培地は、上記内胚葉誘導培地Ｉ、上記内胚葉誘導培地ＩＩ、上記内胚葉誘導培地ＩＩＩ、及び上記肝内胚葉細胞の誘導培地からなる。
【００７９】
発明において、ヒト胚性幹細胞の肝臓系譜への分化の過程が測定され、且つこの分化過程における肝内胚葉細胞の産生を確認した。表面マーカー蛋白のＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎを発見し、これは分化過程で最初に産生されたＡＦＰ＋の肝内胚葉細胞を有効に代表することができる。よって、フローサイトメトリーで選別する方法により、混じり合ったヒト胚性幹細胞分化産物から肝内胚葉細胞を分離及び純化することができる。
【００８０】
従って、本発明の第二形態は、以下の各項を提供する：
【００８１】
１．  ヒト胚性幹細胞又はヒト人工多能性幹細胞から分化して得られた、少なくともα−フェトプロテイン、肝細胞核因子４Ａ、及びＮ−カドヘリン蛋白の三種類のマーカー蛋白を発現する肝内胚葉細胞。
【００８２】
２．  α−フェトプロテイン、アルブミン、肝細胞核因子４Ａ、肝細胞核因子３Ｂ、及びＮ−カドヘリン蛋白を発現する上記１に記載の肝内胚葉細胞。
【００８３】
３．  前記ヒト胚性幹細胞はヒト胚性幹細胞系である上記１又は２に記載の肝内胚葉細胞。
【００８４】
４．  前記ヒト胚性幹細胞系はＮＩＨの番号がＢＧ０１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＢＧ０４、ＳＡ０１、ＳＡ０２、ＳＡ０３、ＥＳ０１、ＥＳ０２、ＥＳ０３、ＥＳ０４、ＥＳ０５、ＥＳ０６、ＴＥ０３、ＴＥ３２、ＴＥ３３、ＴＥ０４、ＴＥ０６、ＴＥ６２、ＴＥ０７、ＴＥ７２、ＵＣ０１、ＵＣ０６、ＷＡ０１、ＷＡ０７、ＷＡ０９、ＷＡ１３及びＷＡ１４であるいずれかの細胞系である上記３に記載の方法。
【００８５】
５．  上記１〜４のいずれかに記載の肝内胚葉細胞の製造方法であって、該方法は、以下のようなステップを含む：
１）ヒト胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞を内胚葉誘導培地Ｉで培養するステップ；
２）ステップ１）で得られた細胞を、内胚葉誘導培地ＩＩで培養するステップ；
３）ステップ２）で得られた細胞を、内胚葉誘導培地ＩＩＩで培養するステップ；
４）ステップ３）で得られた細胞を、肝内胚葉細胞の誘導培地で培養し、肝内胚葉細胞を得るステップ。
（前記内胚葉誘導培地Ｉは質量百分率０．０２％−１％のウシ血清アルブミン成分Ｖと、５０−２００ｎｇ／ｍｌのヒトアクチビンＡとを含む細胞用基礎培地であり、前記内胚葉誘導培地ＩＩは質量百分率０．０２％−１％のウシ血清アルブミン成分Ｖと、体積百分率０．０５％−０．５％のインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムの混合補充液と、５０−２００ｎｇ／ｍｌのヒトアクチビンＡとを含む細胞用基礎培地であり、前記内胚葉誘導培地ＩＩＩは、質量百分率０．０２％−１％のウシ血清アルブミン成分Ｖと、体積百分率０．５％−２％のインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムの混合補充液と、５０−２００ｎｇ／ｍｌのヒトアクチビンＡとを含む細胞用基礎培地であり、前記肝内胚葉細胞の誘導培地は２０−６０ｎｇ／ｍｌのヒト線維芽細胞増殖因子−４と、１０−３０ｎｇ／ｍｌのヒト骨形成タンパク質−２とを含む肝細胞培地である。）
【００８６】
６．  フローサイトメトリーで、Ｎ−カドヘリン蛋白の表面蛋白を発現する細胞を選別するステップをさらに含む上記５に記載の方法。
【００８７】
７．  前記細胞用基礎培地が、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＢＭＥ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０又はＦｉｓｃｈｅｒ’ｓである上記５又は６に記載の方法。
【００８８】
８．  前記方法において、ヒト胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞は内胚葉誘導培地Ｉで２４ｈ培養すること、前記方法において、ステップ１）で得られた細胞は内胚葉誘導培地ＩＩで２４ｈ培養すること、前記方法において、ステップ２）で得られた細胞は内胚葉誘導培地ＩＩＩで２４ｈ培養すること、前記方法において、ステップ３）で得られた細胞は肝内胚葉細胞の誘導培地で５日間培養することを特徴とする上記５−７のいずれかに記載の方法。
【００８９】
９．  前記ヒト胚性幹細胞は市販で入手可能なヒト胚性幹細胞系であり、好ましくは前記市販で入手可能なヒト胚性幹細胞系はＮＩＨの番号がＢＧ０１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＢＧ０４、ＳＡ０１、ＳＡ０２、ＳＡ０３、ＥＳ０１、ＥＳ０２、ＥＳ０３、ＥＳ０４、ＥＳ０５、ＥＳ０６、ＴＥ０３、ＴＥ３２、ＴＥ３３、ＴＥ０４、ＴＥ０６、ＴＥ６２、ＴＥ０７、ＴＥ７２、ＵＣ０１、ＵＣ０６、ＷＡ０１、ＷＡ０７、ＷＡ０９、ＷＡ１３及びＷＡ１４であるいずれかの細胞系である上記５−８のいずれかに記載の方法。
【００９０】
１０．  内胚葉誘導培地Ｉ、内胚葉誘導培地ＩＩ、内胚葉誘導培地ＩＩＩ、及び肝内胚葉細胞の誘導培地からなるヒト胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞から肝内胚葉細胞を製造する培地であり、前記内胚葉誘導培地Ｉは、質量百分率０．０２％−１％のウシ血清アルブミン成分Ｖと、５０−２００ｎｇ／ｍｌのヒトアクチビンＡとを含む細胞用基礎培地であり、前記内胚葉誘導培地ＩＩは、質量百分率０．０２％−１％のウシ血清アルブミン成分Ｖと、体積百分率０．０５％−０．５％のインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムの混合補充液と、５０−２００ｎｇ／ｍｌのヒトアクチビンＡとを含む細胞用基礎培地であり、前記内胚葉誘導培地ＩＩＩは、質量百分率０．０２％−１％のウシ血清アルブミン成分Ｖと、体積百分率０．５％−２％のインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムの混合補充液と、５０−２００ｎｇ／ｍｌのヒトアクチビンＡとを含む細胞用基礎培地であり、前記肝内胚葉細胞の誘導培地は２０−６０ｎｇ／ｍｌのヒト線維芽細胞増殖因子−４と、１０−３０ｎｇ／ｍｌのヒト骨形成タンパク質−２とを含む肝細胞用培地である。
【００９１】
１１．  上記１−４のいずれかに記載の細胞、上記５−９のいずれかに記載の方法又は上記１０に記載の培地の肝実質細胞様細胞又は胆管細胞の製造における用途。
【００９２】
本発明の肝内胚葉細胞は、ヒト胚性幹細胞又はヒト人工多能性幹細胞から分化して得られた、少なくともα−フェトプロテイン、肝細胞核因子４Ａ、及びＮ−カドヘリン蛋白という三種類のマーカー蛋白を発現する肝内胚葉細胞である。本発明の肝内胚葉を培養し続けると、肝前駆細胞が得られる。これらの肝前駆細胞は、体外で肝実質及び胆管に分化する潜在能力を持つ。
【００９３】
また、本発明の別の目的は、肝前駆細胞並びにその製造方法及ぶ用途を提供することである。
【００９４】
本発明が提供する肝前駆細胞は、ヒト胚性幹細胞（ヒトＥＳ細胞）又はヒト人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cells、ヒトｉＰＳ細胞）から分化して得られた、早期の肝臓マーカー蛋白であるα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）を発現し、胆管のマーカー蛋白であるケラチン１９（ＫＲＴ１９）及びケラチン７（ＫＲＴ７）を発現する細胞であり、増殖能、及び肝実質細胞様細胞と胆管細胞様細胞の双方向へ分化する潜在能力を持つ細胞である。
【００９５】
本発明の別の目的は、肝前駆細胞を製造する方法を提供することである。
【００９６】
本発明に係わる肝前駆細胞を製造する方法は、以下のステップを含む：
１）ヒト胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞を、内胚葉誘導培地Ｉで培養するステップ；
２）ステップ１）で得られた細胞を、内胚葉誘導培地ＩＩで培養するステップ；
３）ステップ２）で得られた細胞を、内胚葉誘導培地ＩＩＩで培養するステップ；
４）ステップ３）で得られた細胞を、肝内胚葉の誘導培地で培養し、肝内胚葉細胞を得るステップ；
５）ＳＴＯ細胞のフィーダー層の上に肝前駆細胞培地で前記肝内胚葉細胞を培養し、肝前駆細胞を得るステップ。
【００９７】
前記内胚葉誘導培地Ｉは、質量百分率０．０２％−１％のウシ血清アルブミン成分Ｖと、５０−２００ｎｇ／ｍｌのヒトアクチビンＡとを含む細胞用基礎培地である。その中、ウシ血清アルブミン成分Ｖの含有量は、好ましくは０．０２％−０．１％であり、特に好ましくは０．０５％である。ヒトアクチビンＡの含有量は、好ましくは８０−１５０ｎｇ／ｍｌであり、特に好ましくは１００ｎｇ／ｍｌである。
【００９８】
前記内胚葉誘導培地ＩＩは、質量百分率０．０２％−１％のウシ血清アルブミン成分Ｖと、体積百分率０．０５％−０．５％のインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムの混合補充液と、５０−２００ｎｇ／ｍｌのヒトアクチビンＡとを含む細胞用基礎培地である。その中、ウシ血清アルブミン成分Ｖの含有量は、好ましくは０．０２％−０．１％であり、特に好ましくは０．０５％である。ヒトアクチビンＡの含有量は、好ましくは８０−１５０ｎｇ／ｍｌであり、特に好ましくは１００ｎｇ／ｍｌである。インスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムの混合補充液の含有量は、好ましくは０．０５％−０．１５％であり、特に好ましくは０．１％である。
【００９９】
前記内胚葉誘導培地ＩＩＩは、質量百分率０．０２％−１％のウシ血清アルブミン成分Ｖと、体積百分率０．５％−２％のインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムの混合補充液と、５０−２００ｎｇ／ｍｌのヒトアクチビンＡとを含む細胞用基礎培地である。その中、ウシ血清アルブミン成分Ｖの含有量は、好ましくは０．０２％−０．１％であり、特に好ましくは０．０５％である。ヒトアクチビンＡの含有量は、好ましくは８０−１５０ｎｇ／ｍｌであり、特に好ましくは１００ｎｇ／ｍｌである。インスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムの混合補充液の含有量は、好ましくは０．８％−１．５％であり、特に好ましくは１％である。
【０１００】
前記肝内胚葉の誘導培地は、２０−６０ｎｇ／ｍｌのヒト線維芽細胞増殖因子−４と、１０−３０ｎｇ／ｍｌのヒト骨形成タンパク質−２とを含む肝細胞用培地である。その中、ヒト線維芽細胞増殖因子−４の含有量は、好ましくは３０ｎｇ／ｍｌであり、ヒト骨形成タンパク質−２の含有量は、好ましくは２０ｎｇ／ｍｌである。
【０１０１】
前記肝前駆細胞培地は、５−２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、体積比百分率含有量０．５％−２％のインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムの混合補充液、質量百分率０．０２％−１％のウシ血清アルブミン成分Ｖ、２−２０ｍＭのニコチンアミド、０．２−２ｍＭの二重リン酸化アスコルビン酸、０．０２−０．２μＭのデキサメタゾン、及び５−４０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦを含む細胞用基礎培地である。その中、ＨＥＰＥＳの含有量は、好ましくは９−１２ｍＭであり、特に好ましくは１０ｍＭである。インスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムの混合補充液の含有量は、好ましくは０．８％−１．５％であり、特に好ましくは１％であり、ウシ血清アルブミン成分Ｖの含有量は、好ましくは０．０２％−０．１％である、特に好ましくは０．０５％である。ニコチンアミドの含有量は、好ましくは８−１４ｍＭである、特に好ましくは１１ｍＭである。二重リン酸化アスコルビン酸の含有量は好ましくは０．８−１．５ｍＭであり、特に好ましくは１ｍＭである。デキサメタゾンの含有量は、好ましくは０．０８−０．１５μＭであり、特に好ましくは０．１μＭである。ＥＧＦの含有量は、好ましくは８−１５ｎｇ／ｍｌであり、特に好ましくは１０ｎｇ／ｍｌである。
【０１０２】
上記内胚葉誘導培地Ｉ、内胚葉誘導培地ＩＩ、内胚葉誘導培地ＩＩＩ、肝内胚葉の誘導培地、及び肝前駆細胞培地のｐＨはいずれも、哺乳動物細胞を培養する通常のｐＨ、例えばｐＨ７．２−７．６であることができる。
【０１０３】
前記方法は、前記ステップ３）とステップ４）との間に、フローサイトメトリーでＮ−カドヘリン蛋白（Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）の表面蛋白を発現する細胞を選別するステップをさらに含む。前記ヒト胚性幹細胞は表１の通りである。前記細胞用基礎培地は、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＢＭＥ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０又はＦｉｓｃｈｅｒ’ｓであることができる。
【０１０４】
前記方法において、ヒト胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞は内胚葉誘導培地Ｉで２４ｈ培養する。前記方法において、ステップ１）より得られた細胞は内胚葉誘導培地ＩＩで２４ｈ培養する。前記方法において、ステップ２）より得られた細胞は内胚葉誘導培地ＩＩＩで２４ｈ培養する。前記方法において、ステップ３）より得られた細胞は肝内胚葉の誘導培地で５日間培養する。前記方法において、ステップ４）で前記肝内胚葉細胞はＳＴＯ細胞であるフィーダー層の上に肝前駆細胞培地で培養し、肝前駆細胞を得る。
【０１０５】
前記方法は、肝前駆細胞の継代方法をさらに含む。肝前駆細胞の継代方法は、前記肝前駆細胞を膵酵素−ＥＤＴＡ消化液（米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ会社）で消化した後、ＳＴＯ細胞をフィーダー層とする肝前駆細胞培地の上で培養する。
【０１０６】
上記内胚葉誘導培地Ｉ、上記内胚葉誘導培地ＩＩ、上記内胚葉誘導培地ＩＩＩ、上記肝内胚葉の誘導培地、及び上記肝前駆細胞培地からなるヒト胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞から肝前駆細胞を製造するための培地も、本発明の請求範囲に属する。
【０１０７】
本発明において、ヒト胚性幹細胞の肝臓系譜への分化の過程が測定され、且つこの分化過程における肝前駆細胞の産生が確認された。表面マーカー蛋白であるＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎを発見し、これは分化過程で最初に産生されたＡＦＰ＋の肝内胚葉細胞を有効に代表することができる。よって、フローサイトメトリーで選別する方法により、混じり合ったヒト胚性幹細胞分化産物から肝内胚葉細胞を分離及び純化することができる。本発明の肝内胚葉細胞はクローン状で成長し、以前に報道された肝内胚葉細胞とは異なり、強い増殖能を表す。これらの肝内胚葉を培養し続けると、肝前駆細胞が得られる。これらの肝前駆細胞は、体外で肝実質又は胆管への二種類の分化の潜在能力を有する。誘導後、肝前駆細胞は肝実質細胞様細胞に分化し、その特異的な機能蛋白、例えば、ＡＬＢ、ＡＡＴ等を発現し、グリコーゲンを貯蔵することができる。また、肝前駆細胞は胆管細胞様細胞に分化し、ＫＲＴ７、ＫＲＴ１９を発現し、胆管様の構造に形成され、且つ上皮極性が得られる。
【０１０８】
従って、本発明の第三形態は、以下の各項を提供する。
【０１０９】
１．  ヒト胚性幹細胞又はヒト人工多能性幹細胞から分化して得られた、α−フェトプロテイン、ケラチン１９及びケラチン７を発現し、増殖能、及び肝実質細胞様細胞と胆管細胞様細胞の双方向へ分化する潜在能力を持つ肝前駆細胞。
【０１１０】
２．  前記ヒト胚性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞系である上記１に記載の肝前駆細胞。
【０１１１】
３．  前記ヒト胚性幹細胞はＮＩＨの番号がＢＧ０１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＢＧ０４、ＳＡ０１、ＳＡ０２、ＳＡ０３、ＥＳ０１、ＥＳ０２、ＥＳ０３、ＥＳ０４、ＥＳ０５、ＥＳ０６、ＴＥ０３、ＴＥ３２、ＴＥ３３、ＴＥ０４、ＴＥ０６、ＴＥ６２、ＴＥ０７、ＴＥ７２、ＵＣ０１、ＵＣ０６、ＷＡ０１、ＷＡ０７、ＷＡ０９、ＷＡ１３及びＷＡ１４であるいずれかの細胞系である上記２に記載の肝前駆細胞。
【０１１２】
４．  上記１−３のいずれかに記載の肝前駆細胞を製造する方法であって、前記方法は、以下のステップを含む：
１）ヒト胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞を、内胚葉誘導培地Ｉで培養するステップ；
２）ステップ１）で得られた細胞を、内胚葉誘導培地ＩＩで培養するステップ；
３）ステップ２）で得られた細胞を、内胚葉誘導培地ＩＩＩで培養するステップ；
４）ステップ３）で得られた細胞を、肝内胚葉の誘導培地で培養し、肝内胚葉細胞を得るステップ；
５）前記肝内胚葉細胞を、ＳＴＯ細胞からなるフィーダー層の上に肝前駆細胞培地で培養し、肝前駆細胞を得るステップ。
（前記内胚葉誘導培地Ｉは、質量百分率０．０２％−１％のウシ血清アルブミン成分Ｖと、５０−２００ｎｇ／ｍｌのヒトアクチビンＡと含む細胞用基礎培地であり、前記内胚葉誘導培地ＩＩは、質量百分率０．０２％−１％のウシ血清アルブミン成分Ｖと、体積百分率０．０５％−０．５％のインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムの混合補充液と、５０−２００ｎｇ／ｍｌのヒトアクチビン−Ａとを含む細胞用基礎培地であり、前記内胚葉誘導培地ＩＩＩは、質量百分率０．０２％−１％のウシ血清アルブミン成分Ｖと、体積百分率０．５％−２％のインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムの混合補充液と、５０−２００ｎｇ／ｍｌのヒトアクチビン−Ａとを含む細胞用基礎培地であり、前記肝内胚葉の誘導培地は、２０−６０ｎｇ／ｍｌのヒト線維芽細胞増殖因子−４と、１０−３０ｎｇ／ｍｌのヒト骨形成タンパク質−２とを含む肝細胞用培地である。
前記肝前駆細胞培地は、５−２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、体積比百分率含有量０．５％−２％のインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムの混合補充液、質量百分率０．０２％−１％のウシ血清アルブミン成分Ｖ、２−２０ｍＭのニコチンアミド、０．２−２ｍＭの二重リン酸化アスコルビン酸、０．０２−０．２μＭのデキサメタゾン、及び５−４０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦを含む細胞用基礎培地である。）
【０１１３】
５．  フローサイトメトリーで、Ｎ−カドヘリン蛋白の表面蛋白を発現する細胞を選別することをさらに含む上記４に記載の方法。
【０１１４】
６．  前記細胞用基礎培地が、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＢＭＥ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０又はＦｉｓｃｈｅｒ’ｓである上記４又は５に記載の方法。
【０１１５】
７．  前記方法において、ヒト胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞は内胚葉誘導培地Ｉで２４ｈ培養すること、前記方法において、ステップ１）で得られた細胞は内胚葉誘導培地ＩＩで２４ｈ培養すること、前記方法において、ステップ２）で得られた細胞を内胚葉誘導培地ＩＩＩで２４ｈ培養すること、前記方法において、ステップ３）で得られた細胞を、肝内胚葉の誘導培地で５日間培養することを特徴とする上記４−６のいずれかに記載の方法。
【０１１６】
８．  肝前駆細胞の継代のステップをさらに含む前記方法であり、肝前駆細胞の継代方法は、前記肝前駆細胞を膵酵素−ＥＤＴＡ消化液で消化した後、ＳＴＯ細胞をフィーダー層とする肝前駆細胞培地の上で培養することである上記４−７のいずれかに記載の方法。
【０１１７】
９．  前記ヒト胚性幹細胞は、市販で入手可能なヒト胚性幹細胞系であり、好ましくはＮＩＨの番号がＢＧ０１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＢＧ０４、ＳＡ０１、ＳＡ０２、ＳＡ０３、ＥＳ０１、ＥＳ０２、ＥＳ０３、ＥＳ０４、ＥＳ０５、ＥＳ０６、ＴＥ０３、ＴＥ３２、ＴＥ３３、ＴＥ０４、ＴＥ０６、ＴＥ６２、ＴＥ０７、ＴＥ７２、ＵＣ０１、ＵＣ０６、ＷＡ０１、ＷＡ０７、ＷＡ０９、ＷＡ１３及びＷＡ１４であるいずれかの細胞系である上記４−８のいずれかに記載の方法。
【０１１８】
１０．  内胚葉誘導培地Ｉ、内胚葉誘導培地ＩＩ、内胚葉誘導培地ＩＩＩ、肝内胚葉の誘導培地、及び肝前駆細胞培地からなり、前記内胚葉誘導培地Ｉは、質量百分率０．０２％−１％のウシ血清アルブミン成分Ｖと、５０−２００ｎｇ／ｍｌのヒトアクチビンＡとを含む細胞用基礎培地であり、前記内胚葉誘導培地ＩＩは、質量百分率０．０２％−１％のウシ血清アルブミン成分Ｖと、体積百分率０．０５％−０．５％のインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムの混合補充液と、５０−２００ｎｇ／ｍｌのヒトアクチビンＡとを含む細胞用基礎培地であり、前記内胚葉誘導培地ＩＩＩは、質量百分率０．０２％−１％のウシ血清アルブミン成分Ｖと、体積百分率０．５％−２％のインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムの混合補充液と、５０−２００ｎｇ／ｍｌのヒトアクチビンＡとを含む細胞用基礎培地であり、前記肝内胚葉の誘導培地は２０−６０ｎｇ／ｍｌのヒト線維芽細胞増殖因子−４と、１０−３０ｎｇ／ｍｌのヒト骨形成タンパク質−２とを含む肝細胞用培地であり、前記肝前駆細胞培地は、５−２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、体積比百分率０．５％−２％のインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムの混合補充液、質量百分率０．０２％−１％のウシ血清アルブミン成分Ｖ、２−２０ｍＭのニコチンアミド、０．２−２ｍＭの二重リン酸化アスコルビン酸、０．０２−０．２μＭのデキサメタゾン、及び５−４０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦを含む細胞用基礎培地であるヒト胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞から肝内胚葉細胞を製造する培地。
【０１１９】
１１．  上記１−３のいずれかに記載の細胞、上記４−９のいずれかに記載の方法又は上記１０に記載の培地の肝実質細胞様細胞又は胆管細胞の製造における用途。
【０１２０】
本発明の肝前駆細胞は、ヒト胚性幹細胞又はヒト人工多能性幹細胞から分化して得られた、早期肝臓マーカー遺伝子であるα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）を発現し、胆管のマーカー遺伝子であるケラチン１９（ＫＲＴ１９）とケラチン７（ＫＲＴ７）を発現する細胞であり、強い増殖能、及び肝実質細胞様細胞と胆管細胞様細胞の双方向へ分化する潜在能力を持つ細胞である。本発明の肝前駆細胞は、体外で肝実質と胆管に分化する潜在能力を有する。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】図１はｉＰＳ細胞が肝細胞へ初期分化した免疫蛍光及びＲＴ−ＰＣＲ検出の結果（Ｈ１：分化したＥＳ細胞Ｈ１；３Ｕ１：分化したｈＡＦＦ−４Ｕ−Ｍ−ｉＰＳ−１；３Ｕ２：分化したｈＡＦＦ−４Ｕ−Ｍ−ｉＰＳ−３。以下同様）を示すものである。
【図２】図２は分化細胞に対する成熟の肝細胞マーカー分子であるＡＡＴ及びＣＹＰ３Ａ４の検出の結果を示すものである。
【図３】図３は分化細胞のグリコーゲンの合成機能の検出結果を示すものである。ａ、ヒト肝細胞；ｂ、ｃ、ｄ、それぞれ分化したＥＳ細胞Ｈ１、ｈＡＦＦ−４Ｕ−Ｍ−ｉＰＳ−１、及びｈＡＦＦ−４Ｕ−Ｍ−ｉＰＳ−３；ｅ、フィーダー層細胞；ｆ、ｇ、ｈ、それぞれ細胞因子を添加しない場合の、自発的に分化したＥＳ細胞Ｈ１、ｈＡＦＦ−４Ｕ−Ｍ−ｉＰＳ−１、及びｈＡＦＦ−４Ｕ−Ｍ−ｉＰＳ−３細胞。
【図４】図４は分化細胞に対する尿素合成機能の検出結果を示すものである。
【図５】図５は分化細胞に対するアルブミン分泌機能の検出結果を示すものである。コントロール：ヒト肝細胞；１８：１８日間分化した細胞；２１：２１日間分化した細胞。
【図６】図６は分化細胞の誘導可能なＣＹＰ４５０酵素活性の検出結果を示すものである。コントロール：ヒト肝細胞；投与：２００μｇ／ｍｌ  フェノバルビタールナトリウム。
【図７】図７は時間に対する肝内胚葉に関連する遺伝子の発現量を示すものである。
【図８】図８は免疫蛍光でＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎとＡＦＰ、ＡＬＢ、ＨＮＦ４Ａ、ＧＡＴＡ４及びＦＯＸＡ２との共発現を示すものである。１：ＡＦＰとＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎとの共発現（ＡＦＰ  緑色、Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ  赤色）；２：ＡＦＰとＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎとの共発現（ＡＦＰ  赤色、Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ  緑色）；３：ＡＬＢとＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎとの共発現；４：ＨＮＦ４ＡとＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎとの共発現；５：ＧＡＴＡ４とＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎとの共発現；６：ＦＯＸＡ２とＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎとの共発現。
【図９】図９は細胞内のフローサイトメトリー解析により、Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎとＡＦＰとが同じ細胞で発現することを示すものである。Ａ：同型抗体のコントロール  Ｂ：肝内胚葉細胞におけるＮ−カドヘリン蛋白とα−フェトプロテインの発現状態。
【図１０】図１０は分化８日目の細胞をＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎによる選別を行った結果を示すものである。Ａ：膵酵素による消化；Ｂ：膵酵素とＥＤＴＡにによる消化；Ｃ：膵酵素とカルシウムイオンによる消化。
【図１１】図１１は選別した後のＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎ＋の細胞群とＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎ−の細胞群のＡＦＰの発現を示すものである。Ａ：Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ＋の細胞群；  Ｂ：Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ−細胞群。
【図１２】図１２は定量ＲＴ−ＰＣＲにより、選別した後のＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎ＋の細胞群に肝臓特異な蛋白が豊富に集積されていることを示すことを表すものである。
【図１３】図１３はＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎ＋細胞がＡＬＢ、ＡＡＴ、陽性の肝実質細胞様細胞へ分化する能力を持ちながら、ＫＲＴ７陽性細胞へ分化する能力も持つことを示すものである。
【図１４】図１４は肝内胚葉細胞が弱い増殖能しか持っていないことを示すものである。上欄、少量の肝内胚葉細胞のみがＫｉ６７を発現する。下列、少量の肝内胚葉細胞のみがＢｒｄＵと共染される。注意すべきことは、大多数のＡＦＰ＋の細胞はＢｒｄＵ陰性である。細胞核は、ＤＡＰＩで対比染色を行った（青色）。標尺は５０μｍである。
【図１５】図１５は肝前駆細胞の対応的形態変化を示すものである。Ａ  ヒト胚性幹細胞；Ｂ  内胚葉細胞（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ）；Ｃ  肝内胚葉細胞；Ｄ  肝前駆細胞。
【図１６】図１６はヒト細胞核に対する特異な染色を示すものである。ＳＴＯフィーダー層上のクローン（上欄）はヒト細胞由来であることを示す。下欄：ＳＴＯフィーダー層はヒト細胞核抗原を発現しない。細胞核はＤＡＰＩで対比染色を行った（青色）。標尺は５０μｍである。
【図１７】図１７は肝前駆細胞のクローンにおける大部分の細胞がＫｉ６７を発現することを示すものである。細胞核は、ＤＡＰＩで対比染色を行った（青色）。標尺は５０μｍである。
【図１８】図１８は肝前駆細胞の増殖能を示すものである。
【図１９】図１９は肝前駆細胞の遺伝子発現の特性を示すものである。
【図２０】図２０はフローサイトメトリーによる肝前駆細胞のＥｐＣＡＭ及びＣＤ１３３の発現の解析を示すものである。Ａ  同型のコントロール；Ｂ  ＳＴＯ細胞コントロール；Ｃ  肝前駆細胞。
【図２１】図２１は肝前駆細胞が自発的に肝実質細胞へ分化できることを示すものである。
【図２２】図２２は肝前駆細胞を肝実質細胞へと一定方向に分化誘導することを示すものである。
【図２３】図２３は肝前駆細胞が分化して得られた肝実質細胞のｍＲＮＡの発現状態を示すものである。
【図２４】図２４はＥＬＩＳＡによるヒトアルブミン分泌状態の検出を示すものである。図２４中、１：培地；２：ヒト胚性幹細胞が分化して得られた肝前駆細胞；３：肝前駆細胞の分化により得られた肝実質細胞；４：ヒト胚性幹細胞から直接的に分化して得られた肝実質細胞。
【図２５】図２５は肝前駆細胞が分化して得られた肝実質細胞様細胞の機能解析を示すものである。
【図２６】図２６は肝前駆細胞がＫＲＴ７陽性およびＫＲＴ１９陽性の細胞に分化したことを示すものである。
【図２７】図２７は三次元培養系における肝前駆細胞の胆管細胞様細胞への分化を示すものである。
【図２８】図２８は胆管の輸送と分泌に参与するキー蛋白であるＭＤＲの機能を示すものである。（左）ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １２３を中間空洞に輸送する。（右）ＭＤＲの抑制剤であるＶｅｒａｐａｍｉｌがｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １２３の輸送を抑制できる。標尺は５０μｍである。
【図２９】図２９は人工多能性幹細胞が分化して得られた肝内胚葉細胞を示すものである。左図、ＡＦＰとＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎとの共発現（ＡＦＰ  赤色、Ｎ−ＣＡＤ  緑色）；右図、ＨＮＦ４ＡとＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎとの共発現（ＨＮＦ４Ａ  赤色、Ｎ−ＣＡＤ  緑色）。
【図３０】図３０は人工多能性幹細胞が分化して形成された肝前駆細胞を示すものである。ＡＦＰ  緑色、ＫＲＴ１９  赤色。
【図３１】図３１は人工多能性幹細胞がさらに肝実質細胞に分化することを示すものである。Ｈ１：ヒト胚性肝細胞系；３Ｕ１及び３Ｕ２：人工多能性幹細胞系ｈＡＦＦ−４Ｕ−Ｍ−ｉＰＳ−１及びｈＡＦＦ−４Ｕ−Ｍ−ｉＰＳ−３。
【発明を実施するための形態】
【０１２２】
以下、実施例を参照して本発明を詳細に説明するが、下記実施例は、例を挙げて本発明を説明することのみを意図しており、本発明の範囲を制限するものではない。本発明の範囲は請求項により具体的に限定される。
【０１２３】
下記実施例において、特別な説明がなければ、用いられる方法はいずれも通常方法であり、用いられる試薬はいずれも市販で入手可能なものである。その中、ウシ血清アルブミン成分Ｖ（米国Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ会社、１２６５７９）、ヒトアクチビンＡ（Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ、米国Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ会社、１２０−１４Ｅ）、インスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムの混合補充液（米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ会社、５１３００−０４４）、ＨＣＭ培地（米国Ｌｏｎｚａ会社、ＣＣ−３１９８）、ヒト線維芽細胞増殖因子−４（ＦＧＦ４、米国Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ会社、１００−３１）、ヒト骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ２、米国Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ会社、１２０−０２）、ＨＥＰＥＳ（米国Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ会社、３９１３３８）、ニコチンアミド（米国Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ会社、Ｎ０６３６−１００Ｇ）、アスコルビン酸（Ａｓｃ−２Ｐ、米国Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ会社、４９７５２−１０Ｇ）及びＥＧＦ（米国Ｒ＆Ｄ会社、２３６−ＥＧ−２００）が挙げられる。
【０１２４】
実施例において、ヒト胚性幹細胞系Ｈ１（ＮＩＨの番号：ＷＡ０１）から得られる対応の細胞が、ヒト胚性幹細胞系Ｈ７（ＮＩＨの番号：ＷＡ０７）及びヒト胚性幹細胞系Ｈ９（ＮＩＨの番号：ＷＡ０９）それぞれから得られる対応の細胞とはほぼ同じであり、実質的な差別がない。
【０１２５】
実施例１  ヒトＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞から肝細胞への分化誘導及びその検出
一、ヒトＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞の通常培養
（１）試薬
ＰＢＳ：８ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＣｌ、１．４４ｇのＮａ２ＨＰＯ４、及び０．２４ｇのＫＨ２ＰＯ４を取り、ｄｄＨ２Ｏ（再蒸留水）を加え溶解させ、溶液の体積を１０００ｍｌにした。ＨＣｌで溶液のｐＨ値を７．４に調整した。
２Ｍ  β−メルカプトエタノール（２００００×）：１ｍＬの１４．３Ｍのβ−メルカプトエタノールを取り、６．１５ｍＬのＰＢＳを加え希釈し、濾過・滅菌した。
ヒトｉＰＳ細胞培地（ＨＥＳＭ）：２０％の血清代替物質（Ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、ＫＳＲ）、１ｍＭのグルタミン（米国Ｇｉｂｃｏ会社）、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１％の非必須アミノ酸（Ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓ、米国Ｇｉｂｃｏ会社）、１０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ会社）で溶液の体積を１０００ｍｌにした。
０．５ｍｇ／ｍＬ  Ｄｉｓｐａｓｅ（米国Ｇｉｂｃｏ会社）：１０ｍｇのＤｉｓｐａｓｅ粉末を取り、２０ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に溶解させ、濾過・滅菌した。
１ｍｇ／ｍＬ  コラゲナーゼＩＶ（米国Ｇｉｂｃｏ会社）：２０ｍｇのコラゲナーゼＩＶの粉末を取り、２０ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に溶解させ、濾過・滅菌した。
ＭＥＦ培地：１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ（米国Ｇｉｂｃｏ会社）。
マイトマイシンＣ使用液：２ｍｇのマイトマイシンＣを、１０％ウシ胎児血清を含む２００ｍＬのＤＭＥＭに溶解させ、その終濃度を１０μｇ／ｍＬとし、濾過・滅菌した。
０．１％ゼラチン：０．１ｇのゼラチン粉末を取り、１００ｍＬの再蒸留水に溶解させ、高圧・滅菌した。
【０１２６】
（２）フィーダー層（ｆｅｅｄｅｒ）の調製
下記の方法により、マウスの胚性線維芽細胞（ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ＭＥＦ）を処理し、ヒトｉＰＳ細胞を培養するフィーダー層とした：
１）成長状態が良好な接着ＭＥＦ細胞を取り、ＭＥＦ培地を捨て、１０μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣを含むマイトマイシンＣ使用液を加えた；
２）３７℃で、３時間培養した。培養の間に０．１％ゼラチンで、播種しようとするＭＥＦ細胞の培養皿を処理し、室温で２時間以上放置（又は３７℃で３０分以上放置）し、使用前にゼラチン溶液を吸引し除去した；
３）ＭＥＦ細胞を取り出し、マイトマイシンＣを含む使用液を除去し、残存のマイトマイシンを徹底的に洗い流すように、ＰＢＳで５回洗浄した（マイトマイシンは有糸分裂阻害剤であり、ＩＰＳ細胞に対する毒性を持つ可能性があるからである）；
４）膵酵素−ＥＤＴＡ（米国Ｇｉｂｃｏ会社）を加えて消化を行い、その後ＭＥＦ培地で反応を停止させた；
５）１０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨て、ＭＥＦ培地で細胞ペレットを再懸濁し、細胞数をカウントした；
６）１．６×１０５個細胞／３．５ｃｍ培養皿の密度になるように、上記ステップの処理を経たＭＥＦ細胞を、０．１％ゼラチンをコートした培養皿に播種し、３７℃のインキュベーターに置き１２−２４時間培養して、ヒトＥＳ細胞又はヒトｉＰＳ細胞の培養に用いるフィーダー層を得た。
【０１２７】
（３）ヒトＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞の通常培養
ステップ１で得られたＭＥＦフィーダー層の上で、ヒトｉＰＳ細胞培地（ＨＥＳＭ）を用いてヒトＥＳ細胞Ｈ１又はｉＰＳ細胞系であるｈＡＦＦ−４Ｕ−Ｍ−ｉＰＳ−１及びｈＡＦＦ−４Ｕ−Ｍ−ｉＰＳ−３（趙揚、Two supporting factors greatly improve the efficiency of human iPSC generation. Cell Stem Cell, 2008; 3:475-479.）（北京大学）を培養し、その具体的培養方法は、以下のステップを含む：
１）４℃の冷蔵庫から培養に必要な試薬及び培地（ＨＥＳＭ）を取り出し、室温で１５分間程度予熱する；
２）細胞を取り出し、ＨＥＳＭを吸い除き、細胞をＰＢＳで一回洗浄する；
３）０．５ｍｇ／ｍＬのＤｉｓｐａｓｅ（又は１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＩＶ）を加え、消化を行い（１ｍＬ／３．５ｃｍ培養皿）、３７℃のインキュベーターに置いて１０−１５分間インキュベーションした後、細胞を取り出して位相差顕微鏡で観察し、クローンの辺縁にクリンプ（中国語：
【化１】
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）が生じた場合には、消化が停止できる；若しそうではない場合には、インキュベーターに戻して、消化時間を延長する。消化し過ぎてクローンが脱落することを防ぐために、随時に取り出して観察する。
４）消化終止後、Ｄｉｓｐａｓｅ又はコラゲナーゼＩＶを吸い除き、ＰＢＳとＤＭＥＭ／Ｆ１２培地をそれぞれ用いて一回洗浄した後、適量のＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（２ｍＬ／３．５ｃｍ培養皿）を加える；
５）無菌の先端ストレート又は先端曲がりのガラスピペットで、すべての細胞クローンを培養皿の底部から優しく剥がし、無菌の１５ｍＬ底部円錐型の遠心管に移して、ピペットで何回で穏やかにピペッティングし、細胞クローンをサイズが比較的に均一な細胞集団にする；
６）１０００ｒｐｍで３−４分間遠心し、注意深く上清を吸い除き、ガラスピペットで新鮮なＨＥＳＭ培地を吸い取り、ペレットを再懸濁させる；
７）上記（２）で得られたＭＥＦフィーダー層を使い、ＰＢＳで三回洗浄してから、細胞の小さい塊をＭＥＦフィーダー層上に播種し、３７℃の細胞インキュベーターに放置して１２−２４時間培養する。細胞が接着した後には新鮮なＨＥＳＭ培地を交換してもよい。培地は一日一回交換し、通常、５−７日間で一回継代する。以下の状況の一つが現れた場合、即時に継代を行わなければならない：（１）ＭＥＦフィーダー層の放置時間が二週間になった場合；（２）細胞クローンが緻密になりすぎたか又は面積が大きすぎた場合；（３）細胞に明らかな自発分化が現れた場合。
【０１２８】
二、ヒトＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞から肝細胞への分化誘導
分化培地Ｉ−１：１０ｎｇ／ｍｌのヒトアクチビンＡ（Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ）と、０．０１％（体積百分率）のインスリン−トランスフェリン−セレニウム塩（亜セレン酸ナトリウム）（ＩＴＳ）の混合補充液（米国Ｇｉｂｃｏ会社）とを含むＲＰＭＩ  １６４０培地（米国Ｇｉｂｃｏ会社）、ｐＨ７．２−７．６。
分化培地Ｉ−２：５００ｎｇ／ｍｌのヒトアクチビンＡ（Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ）と、２０％（体積百分率）のＩＴＳとを含むＲＰＭＩ  １６４０培地（米国Ｇｉｂｃｏ会社）、ｐＨ７．２−７．６。
分化培地Ｉ−３：１００ｎｇ／ｍｌのヒトアクチビンＡ（Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ）と、１％（体積百分率）のＩＴＳとを含むＲＰＭＩ  １６４０培地（米国Ｇｉｂｃｏ会社）、ｐＨ７．２−７．６。
分化培地Ｉ−４：１００ｎｇ／ｍｌのヒトアクチビンＡ（Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ）と、０．１％（体積百分率）のＩＴＳとを含むＲＰＭＩ  １６４０培地（米国Ｇｉｂｃｏ会社）、ｐＨ７．２−７．６。
分化培地ＩＩ−１：５ｎｇ／ｍｌのヒト線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ２）と、５ｎｇ／ｍｌのヒト骨形成タンパク質（ＢＭＰ４）（米国Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ会社）とを含む肝細胞用培地（ＨＣＭ）（Ｃａｍｂｒｅｘ会社から購入）、ｐＨ７．２−７．６。
分化培地ＩＩ−２：１００ｎｇ／ｍｌのヒト線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ２）と、１００ｎｇ／ｍｌのヒト骨形成タンパク質（ＢＭＰ４）（米国Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ会社）とを含む肝細胞用培地（ＨＣＭ）（Ｃａｍｂｒｅｘ会社から購入）、ｐＨ７．２−７．６。
分化培地ＩＩ−３：３０ｎｇ／ｍｌのヒト線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ２）と、２０ｎｇ／ｍｌのヒト骨形成タンパク質（ＢＭＰ４）（米国Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ会社）とを含む肝細胞用培地（ＨＣＭ）（Ｃａｍｂｒｅｘ会社から購入）、ｐＨ７．２−７．６。
分化培地ＩＩＩ−１：５ｎｇ／ｍｌのヒト肝細胞増殖因子（ＨＧＦ、米国Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ会社、１００−３９）と、５ｎｇ／ｍｌのヒトケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ、米国Ａｍｇｅｎ会社）とを含むＨＣＭ培地、ｐＨ７．２−７．６。
分化培地ＩＩＩ−２：１００ｎｇ／ｍｌのヒト肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）と、１００ｎｇ／ｍｌのヒトケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）とを含むＨＣＭ培地、ｐＨ７．２−７．６。
分化培地ＩＩＩ−３：２０ｎｇ／ｍｌのヒト肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）と、２０ｎｇ／ｍｌのヒトケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）とを含むＨＣＭ培地、ｐＨ７．２−７．６。
分化培地ＩＶ−１：１ｎｇ／ｍｌのオンコスタチン  Ｍ（ＯＳＭ）（米国Ｒ＆Ｄ会社）と、０．０５μＭのデキサメタゾン（Ｄｅｘ）とを含むＨＣＭ培地、ｐＨ７．２−７．６。
分化培地ＩＶ−２：１００ｎｇ／ｍｌのオンコスタチン  Ｍ（ＯＳＭ）（米国Ｒ＆Ｄ会社）と、１μＭのデキサメタゾン（Ｄｅｘ）とを含むＨＣＭ培地、ｐＨ７．２−７．６。
分化培地ＩＶ−３：１０ｎｇ／ｍｌのオンコスタチン  Ｍ（ＯＳＭ）（米国Ｒ＆Ｄ会社）と、０．１μＭのデキサメタゾン（Ｄｅｘ）とを含むＨＣＭ培地、ｐＨ７．２−７．６。
分化培地Ｖ−１：０．１％（体積百分率）のＮ２と、０．１％のＢ２７と、０．５ｍＭのグルタミンと、０．１％の非必須アミノ酸と、０．０５ｍＭのβ−メルカプトエタノールと、１ｎｇ／ｍｌのオンコスタチン  Ｍ（ＯＳＭ）と、及び０．０５μＭのデキサメタゾン（Ｄｅｘ）とを含む基礎培地、ｐＨ７．２−７．６。
分化培地Ｖ−２：１０％（体積百分率）のＮ２と、２０％のＢ２７と、２ｍＭのグルタミンと、１０％の非必須アミノ酸と、０．２ｍＭのβ−メルカプトエタノールと、１００ｎｇ／ｍｌのオンコスタチン  Ｍ（ＯＳＭ）と、１μＭのデキサメタゾン（Ｄｅｘ）とを含む基礎培地、ｐＨ７．２−７．６。
分化培地Ｖ−３：１％（体積百分率）のＮ２と、２％のＢ２７と、１ｍＭのグルタミンと、１％の非必須アミノ酸と、０．１  ｍＭのβ−メルカプトエタノールと、１０ｎｇ／ｍｌのオンコスタチン  Ｍ（ＯＳＭ）と、０．１μＭのデキサメタゾン（Ｄｅｘ）とを含む基礎培地、ｐＨ７．２−７．６。
【０１２９】
ヒトｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞を肝細胞へ分化誘導する方法は、以下のステップを含む：
１）内胚葉細胞（definitive endoderm）への誘導：上記から得られた、ＭＥＦフィーダー層上で培養されたヒトｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞Ｈ１を取り、培地を捨て、ＰＢＳで２回洗浄してから、分化培地Ｉ−１、分化培地Ｉ−２、分化培地Ｉ−３又は分化培地Ｉ−４を加え、３７℃の細胞インキュベーターに置いて１日（２４時間）培養した。その後、培地を捨て、０．１％（体積百分率）のインスリン−トランスフェリン−セレニウム塩（ＩＴＳ）（米国Ｇｉｂｃｏ会社）を含む分化培地Ｉ−１、分化培地Ｉ−２、分化培地Ｉ−３又は分化培地Ｉ−４に交換し、同じ条件で１日培養した。前記培養した後、さらに培地を捨て、１％（体積百分率）ＩＴＳを含む分化培地Ｉ−１又は分化培地Ｉ−２に交換し、同じ条件で１日培養した；
【０１３０】
２）肝細胞分化の開始：ＩＴＳを含む分化培地Ｉ−１、分化培地Ｉ−２、分化培地Ｉ−３又は分化培地Ｉ−４を捨て、ＰＢＳで１回洗浄してから、分化培地ＩＩ−１、分化培地ＩＩ−２又は分化培地ＩＩ−３を加え、３７℃の細胞インキュベーターに置いて４日培養し、一日一回で液を交換し、分化したＩＰＳ細胞又はＥＳ細胞を得た；
【０１３１】
３）分化したＩＰＳ細胞又はＥＳ細胞の増幅：分化培地ＩＩ−１、分化培地ＩＩ−２又は分化培地ＩＩ−３を捨て、ＰＢＳで１回洗浄してから、分化培地ＩＩＩ−１、分化培地ＩＩＩ−２又は分化培地ＩＩＩ−３を加え、３７℃の細胞インキュベーターに置いて６日培養し、一日一回で液を交換した；
【０１３２】
４）分化したＩＰＳ細胞又はＥＳ細胞の成熟の促進：分化培地ＩＩＩ−１、分化培地ＩＩＩ−２又は分化培地ＩＩＩ−３を捨て、ＰＢＳで１回洗浄してから、分化培地ＩＶ−１、分化培地ＩＶ−２又は分化培地ＩＶ−３を加え、３７℃の細胞インキュベーターに置いて５日培養し、一日一回で液を交換した。その後、分化培地ＩＶ−１、分化培地ＩＶ−２又は分化培地ＩＶ−３を捨て、ＰＢＳで１回洗浄してから、分化培地ＩＶ−１、分化培地ＩＶ−２又は分化培地ＩＶ−３を加え、３７℃の細胞インキュベーターに置いて３日培養し、一日一回で液を交換した。
【０１３３】
三、ＩＰＳ細胞又はＥＳ細胞の肝細胞への初期分化の検出
（１）免疫蛍光染色の検出
ＰＢＳＴ：０．２％（体積百分率）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を含むＰＢＳ溶液。
ブロッキングバッファー：２％ヤギ血清（又は馬血清）を含むＰＢＳＴ溶液。
二次抗体の希釈液（０．１％ＢＳＡ溶液）：０．１ｇのウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ、ＢＳＡ）を取り、１００ｍＬのＰＢＳに溶解した。
７日間分化誘導したＥＳ及びｉＰＳ細胞は、早期の肝細胞マーカー分子であるＡＦＰ、Ａｌｂ（ＡＬＢ）及びＣＫ１８を発現した。
【０１３４】
免疫蛍光染色の方法のよりステップ二２）で得られた細胞の分化状態を検出した。検出方法は以下のステップを含む：
１）培地を捨て、取り出した細胞をＰＢＳで２回洗浄する；
２）４％のパラホルムアルデヒドを加え、室温で１５分間固定する（或いは無水メタノールを加え、室温で５−１０分間固定する）；
３）ＰＢＳで毎回５分間で３回洗浄する；
４）室温下、１０分間でＰＢＳＴ溶液を用いて透過処理を行う；
４）ＰＢＳで５分間で１回洗浄する；
６）ブロッキングバッファーを加え、室温で３０−６０分間ブロッキングする；
７）ブロッキングバッファーを除去し、一次抗体（Polyclonal Rabbit Anti-Human Alb、ＤＡＫＯ会社から購入）、マウス抗ヒトα−Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（北京中杉金橋生物技術有限会社）、マウス抗ヒトサイトケラチン１８（ＣＫ１８）モノクローナル抗体（北京中杉金橋生物技術有限会社）、ウサギ抗ヒトＡＡＴモノクローナル抗体（北京中杉金橋生物技術有限会社）又はウサギ抗ヒトＣＹＰ３Ａ４ポリクローナル抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ会社から購入）を加え、４℃で１２−２４時間放置する（又は３７℃で２時間インキュベーションする）。上記抗体は１：５０の比例でブロッキングバッファーで希釈される；
８）ＰＢＳで毎回５分間で３回洗浄する；
９）二次抗体（ＦＩＴＣ又はＴＲＩＴＣ標識のヤギ抗マウスＩｇＧ又はＴＲＩＴＣ（tetraethyl rhodamine isothiocyanate）標識のヤギ抗ウサギＩｇＧ）（北京中杉金橋生物技術有限会社）（使用前には、まず二次抗体を１：５０−１５０の比例で二次抗体希釈液に希釈する）を加え、遮光する条件で４℃で１２時間放置する（或いは３７℃で１時間遮光放置する）；
１０）ＰＢＳで毎回５分間、３回洗浄する；
１１）終濃度が１ｍｇ／ｍＬになるようにＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（4',6-diamidino-2-phenylindole））溶液（米国Ｒｏｃｈｅ会社）を加え、室温で５分間放置する；
１２）ＰＢＳで毎回５分間、３回洗浄する；
１３）５００μｌのＰＢＳ（又はＰＢＳ：グリセリン（１：１、ｖ／ｖ））を加え、蛍光顕微鏡下で観察し、写真を取る。
【０１３５】
（２）ＲＴ−ＰＣＲ検出
Ｔｒｉｚｏｌ（米国ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ会社）で７日間分化したｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞を処理し、サンプルの総ＲＮＡを抽出し、逆転写してｃＤＮＡを得た（米国ｐｒｏｍｅｇａ会社の逆転写キット）。このｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ検定を行った。プライマーの配列は以下の通りである：
ＡＦＰセンスプライマー：ＴＴＴＴＧＧＧＡＣＣＣＧＡＡＣＴＴＴＣＣ；（配列番号１）
ＡＦＰアンチセンスプライマー：ＣＴＣＣＴＧＧＴＡＴＣＣＴＴＴＡＧＣＡＡＣＴＣＴ。（配列番号２）
Ａｌｂセンスプライマー：ＧＧＴＧＴＴＧＡＴＴＧＣＣＴＴＴＧＣＴＣ；（配列番号３）
Ａｌｂアンチセンスプライマー：ＣＣＣＴＴＣＡＴＣＣＣＧＡＡＧＴＴＣＡＴ。（配列番号４）
ＣＫ８センスプライマー：ＧＧＡＧＧＣＡＴＣＡＣＣＧＣＡＧＴＡＣ；（配列番号５）
ＣＫ８アンチセンスプライマー：ＴＣＡＧＣＣＣＴＴＣＣＡＧＧＣＧＡＧＡＣ。（配列番号６）
ＣＫ１８センスプライマー：ＧＧＴＣＴＧＧＣＡＧＧＡＡＴＧＧＧＡＧＧ；（配列番号７）
ＣＫ１８アンチセンスプライマー：ＧＧＣＡＡＴＣＴＧＧＧＣＴＴＧＴＡＧＧＣ。（配列番号８）
ＨＮＦ４αセンスプライマー：ＣＣＡＣＧＧＧＣＡＡＡＣＡＣＴＡＣＧＧ；（配列番号９）
ＨＮＦ４αアンチセンスプライマー：ＧＧＣＡＧＧＣＴＧＣＴＧＴＣＣＴＣＡＴ。（配列番号１０）
ＧＡＰＤＨ  センスプライマー：ＡＡＴＣＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＣ；  （配列番号１１）
ＧＡＰＤＨ  アンチセンスプライマー：ＣＡＴＣＡＣＧＣＣＡＣＡＧＴＴＴＣＣ。（配列番号１２）
ＣＫ１９  センスプライマー：ＡＡＴＡＡＡＴＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＡＧ
ＣＫ１９  アンチセンスプライマー：ＴＴＴＴＡＡＴＧＡＡＴＴＣＡＧＴＡＧＡＴ
【０１３６】
分化したｉＰＳとＥＳ細胞は肝細胞のマーカー分子であるＡＦＰ、Ａｌｂ、ＣＫ１８、ＡＡＴ及びＣＹＰ３Ａ４を発現した。ＲＴ−ＰＣＲ検出結果からも分かるように、７日間分化したｉＰＳとＥＳ細胞は、肝細胞のマーカー分子であるＡＦＰ、Ａｌｂ、ＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ１９、ＨＮＦ４α及びＧＡＰＤＨ（グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）を発現した（図１及び２）。
【０１３７】
四、肝細胞のグリコーゲン合成機能の検出
ＰＡＳ染色（Periodic Acid-Schiff Stain）により行った。実施ステップは肝細胞グリコーゲン合成機能の検出キットの説明書を参照する（米国Ｓｉｇｍａ会社）。
分化したｉＰＳとＥＳ細胞は、肝細胞と類似するグリコーゲンの合成及び貯蔵の機能を持つことが確認された（図３）。
【０１３８】
五、肝細胞の尿素合成機能の検出
尿素窒素の検出キットにより行った。実施ステップは説明書を参照（米国ＳＴＡＮＢＩＯ会社）する。
分化したｉＰＳとＥＳ細胞は、肝細胞と類似する尿素合成の機能を持つことが確認された（図４）。
【０１３９】
六、肝細胞のアルブミン分泌機能の検出
ＥＬＩＳＡキットにより行った。実施ステップは説明書を参照（米国Ｂｅｔｈｙｌ会社）する。
分化したｉＰＳとＥＳ細胞は、肝細胞と類似するアルブミンを分泌する機能を持つことは確認された（図５）。
【０１４０】
七、肝細胞のＣＹＰ４５０酵素活性の検出
ＣＹＰ４５０の蛍光検出キットにより行った。実施ステップは説明書を参照（米国Ｓｉｇｍａ会社）する。
分化したｉＰＳとＥＳ細胞が、肝細胞と類似する薬物誘発に応じて誘導されるＰ４５０酵素の活性を持つことが確認された（図６）。
上記結果より、ヒトｉＰＳ細胞は肝細胞に分化誘導されたことが分かった。
【０１４１】
実施例２  肝の内胚葉細胞の製造及び同定
一、肝の内胚葉細胞の調製
１日目：
１）ヒト胚性幹細胞Ｈ１、Ｈ７又はＨ９を継代した後、２−３日目から誘導が始まり、成長状態が良好な細胞を選択し分化実験に用いた；
２）ヒト胚性幹細胞の培地（細胞用基礎培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２に２０％の血清代替物質（Knock-out Serum Replacement、ＫＳＲ、米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ会社、１０８２８０２８）と、１ｍＭのグルタミン（米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ会社、２５０３０−０８１）と、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール（米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ会社、２１９８５−０２３）と、１％の非必須アミノ酸（Non-essential AminoAcids）（米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ会社、１１１４０−０７６）と、４ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、米国Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ会社、１００−１８Ｂ）とを添加して得られたもの）を捨て、ＰＢＳで２回洗浄した；
３）内胚葉誘導培地Ｉに交換した。内胚葉誘導培地Ｉは、ＲＰＭＩ１６４０培地に、ウシ血清アルブミン成分Ｖ（米国Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ会社、１２６５７９）と、ヒトアクチビンＡ（Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ、米国Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ会社、１２０−１４Ｅ）とを加えて得られたものである。当該培地のｐＨは７．２−７．６であった。内胚葉誘導培地Ｉにおいて、ウシ血清アルブミン成分Ｖの終濃度は０．０５％（質量百分率）であり、ヒトアクチビンＡ（Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ）の終濃度は１００ｎｇ／ｍｌであった。
【０１４２】
２日目：
４）前日の培地を捨て、内胚葉誘導培地ＩＩに交換した。内胚葉誘導培地ＩＩは、ＲＰＭＩ１６４０培地に、ウシ血清アルブミン成分Ｖ（米国Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ会社、１２６５７９）、ヒトアクチビンＡ（Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ）及びインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムの混合補充液（米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ会社、５１３００−０４４）を加えて得られたものである。この培地のｐＨは７．２−７．６であった。内胚葉誘導培地ＩＩにおいて、ウシ血清アルブミン成分Ｖの終濃度は０．０５％（質量百分率）であり、ヒトアクチビンＡ（Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ）の終濃度は１００ｎｇ／ｍｌであり、インスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムの混合補充液の終濃度は０．１％（体積百分率）であった。
【０１４３】
３日目：
５）前日の培地を捨て、内胚葉誘導培地ＩＩＩに交換した。内胚葉誘導培地ＩＩＩは、ＲＰＭＩ１６４０培地に、ウシ血清アルブミン成分Ｖ、ヒトアクチビンＡ（Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ）及びインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムの混合補充液（米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ会社、５１３００−０４４）を加えて得られたものである。この培地のｐＨは７．２−７．６であった。内胚葉誘導培地ＩＩＩにおいて、ウシ血清アルブミン成分Ｖの終濃度は０．０５％（質量百分率）であり、ヒトアクチビンＡ（Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ）の終濃度は１００ｎｇ／ｍｌであり、インスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムの混合補充液の終濃度は１％（体積百分率）であった。
【０１４４】
４−８日目には、毎日以下のようなステップを繰り返した：
１）前日の培地を捨て、ＰＢＳで一回洗浄する；
２）肝内胚葉細胞誘導培地に交換し、培養を行う。
【０１４５】
８日目に肝内胚葉細胞が得られた。肝内胚葉細胞誘導培地は、ＨＣＭ培地（米国Ｌｏｎｚａ会社、ＣＣ−３１９８）に、ヒト線維芽細胞増殖因子−４（ＦＧＦ４、米国Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ会社、１００−３１）と、ヒト骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ２、米国Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ会社、１２０−０２）とを添加して得られたものである。この培地のｐＨは７．２−７．６であった。肝内胚葉細胞誘導培地において、ヒト線維芽細胞増殖因子−４（ＦＧＦ４）の終濃度は３０ｎｇ／ｍｌであり、ヒト骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ２）の終濃度は２０ｎｇ／ｍｌであった。
【０１４６】
ＲＴ−ＰＣＲの方法により、ＡＦＰ、ＡＬＢ（即Ａｌｂ）、ＨＮＦ４Ａ、ＣＥＢＰＡなどの時間に対する早期の肝臓関連遺伝子の発現状況を検出した。
プライマー（左から右に：５’から３’の方向）：
ＡＦＰ：上流ＣＣＣＧＡＡＣＴＴＴＣＣＡＡＧＣＣＡＴＡ（配列番号１３）、
下流ＴＡＣＡＴＧＧＧＣＣＡＣＡＴＣＣＡＧＧ（配列番号１４）；
ＡＬＢ：上流ＧＣＡＣＡＧＡＡＴＣＣＴＴＧＧＴＧＡＡＣＡＧ（配列番号１５）、
下流ＡＴＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＴＧＴＴＴＣＡＧＣＡ（配列番号１６）；
ＨＮＦ４Ａ：上流ＡＣＴＡＣＡＴＣＡＡＣＧＡＣＣＧＣＣＡＧＴ（配列番号１７）、
下流ＡＴＣＴＧＣＴＣＧＡＴＣＡＴＣＴＧＣＣＡＧ（配列番号１８）；
ＣＥＢＰＡ：上流ＡＣＡＡＧＡＡＣＡＧＣＡＡＣＧＡＧＴＡＣＣＧ（配列番号１９）、
下流ＣＡＴＴＧＴＣＡＣＴＧＧＴＣＡＧＣＴＣＣＡ（配列番号２０）。
【０１４７】
分化の過程においてＡＦＰ、ＡＬＢ、ＨＮＦ４Ａ、ＣＥＢＰＡのこれらの遺伝子はいずれも類似する発現パータンが示された。即ち、５日目くらいから発現し始め、８日目に最大値に達することであった（図７）。肝内胚葉細胞が産生されたことを示した。
【０１４８】
ヒト胚性幹細胞の分化産物において、Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎはＡＦＰ発現のすべての細胞に特異的に発現し、且つＡＦＰ発現の細胞のみに発現した。重複実験及びレーザー共焦点顕微鏡による観察により、Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎとＡＦＰとの共発現の特異性が確認された（図８）。図８における図面１は蛍光顕微鏡より撮影されたものであり、他の図面はレーザー共焦点顕微鏡により撮影されたものである。標尺は５０μｍである。細胞核はＤＡＰＩ（米国Ｒｏｃｈｅ会社、１０２３６２７６００１）で対比染色を行った（青色）。
【０１４９】
細胞内のフローサイトメトリー解析によっても類似の結果が示された。即ち、Ｎ−ｃａｄｈｅｉｒｎとＡＦＰとは同一の細胞で発現した（図８）。さらなる免疫蛍光実験により、Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎは、他の肝内胚葉のマーカー蛋白、例えばＡＬＢ、ＨＮＦ４Ａ、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４等と同時に共発現することが確認された。Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎは肝内胚葉の特異的な表面マーカー蛋白であることが示されている。
【０１５０】
Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎは、カルシウム依存性細胞−細胞接着蛋白であり、膵酵素の処理に対して高い感受性を持つが、カルシウムイオンによりそれの膵酵素による消化を防止できる（Yoshida and Takeichi, Cell. 1982 Feb; 28(2):217-24.）。分化８日目の肝内胚葉細胞を通常の膵酵素−ＥＤＴＡ消化液（米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ会社、２５２００１１４）で消化した場合、大量のＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎの全ての細胞外フラグメントは膵酵素により分解されたため、フロー選別で使用されるＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎの抗体（クローン番号ＧＣ４、米国Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ会社から購入）はＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎ蛋白を識別できなかった（図１０Ｂ）。肝内胚葉をＥＤＴＡフリーの膵酵素（米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ会社、２７２５００１８）で処理するとともに、２ｍＭのカルシウムイオンを添加すれば、Ｎ−ｃａｈｅｒｉｎ蛋白の完璧を効率的に保護することができる（Reiss 等, EMBO J. 2005 Feb 23; 24, 742‐752）。
【０１５１】
フローサイトメトリーでＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎ＋細胞群を分離し、同時にコントロールとしてＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎ−の細胞群を収集した。
【０１５２】
フロー選別により、分化８日目の産物からＮ−ｃａｄｈｅｉｒｎ陽性の細胞群を選別した（６０．９％±９．１％、図１０Ｃ）。
【０１５３】
選別して得られたＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎの細胞に対して免疫細胞化学染色を行ったところ、Ｎ−ｃａｄｈｅｉｒｎ＋の細胞群では、９０％を超える細胞がＡＦＰを発現するが、Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ−の細胞群では、ＡＦＰ陽性の細胞がほとんどないことが示された（図１１）。Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ＋の細胞群はＡＦＰを発現した（緑色）。
【０１５４】
さらに、選別して得られた細胞に対して定量ＲＴ−ＰＣＲ解析を行ったところ、Ｎ−ｃａｄｈｅｉｒｎ＋の細胞群が、肝臓に特異的に発現する遺伝子であるα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、肝細胞核因子４Ａ（ＨＮＦ４Ａ）、及び肝細胞核因子３Ｂ（ＦＯＸＡ２）（図１２）を豊富に集積することが分かった。用いられた上流と下流プライマーはそれぞれ以下の通りである：
ＡＦＰ：上流ＣＣＣＧＡＡＣＴＴＴＣＣＡＡＧＣＣＡＴＡ（配列番号２１）、下流ＴＡＣＡＴＧＧＧＣＣＡＣＡＴＣＣＡＧＧ（配列番号２２）；
ＡＬＢ：上流ＧＣＡＣＡＧＡＡＴＣＣＴＴＧＧＴＧＡＡＣＡＧ（配列番号２３）、下流ＡＴＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＴＧＴＴＴＣＡＧＣＡ（配列番号２４）；
ＨＮＦ４Ａ：上流ＡＣＴＡＣＡＴＣＡＡＣＧＡＣＣＧＣＣＡＧＴ（配列番号２５）、下流ＡＴＣＴＧＣＴＣＧＡＴＣＡＴＣＴＧＣＣＡＧ（配列番号２６）；
ＦＯＸＡ２：上流ＣＴＧＡＧＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＣＡＧＴＧＧＡ（配列番号２７）、下流ＣＡＧＴＣＧＴＴＧＡＡＧＧＡＧＡＧＣＧＡＧＴ。（配列番号２８））。
【０１５５】
それぞれの定量ＰＣＲ結果はいずれも３回重複して得られたものであり、毎組の遺伝子におけるＮ−ｃａｄ＋とＮ−ｃａｄ−との発現量の有意差はいずれも０．０１より小さかった。
【０１５６】
二、肝内胚葉細胞の成熟な肝実質細胞への分化誘導
１）ステップ  一で得られたＮ−ｃａｄｈｅｉｒｎ＋の細胞又はＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎ−の細胞をＰＢＳで一回洗浄し、肝実質細胞培地Ｉに交換した。毎日上記ステップを一回繰り返し、計５日間培養した。前記肝実質細胞培地Ｉは２０ｎｇ／ｍｌのヒト肝細胞増殖因子（ＨＧＦ、米国Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ会社、１００−３９）を含むＨＣＭ培地（米国Ｌｏｎｚａ会社、ＣＣ−３１９８）であった；
【０１５７】
２）肝実質細胞培地Ｉを捨て、ＰＢＳで一回洗浄し、１０ｎｇ／ｍｌのオンコスタチンＭ（ＯＳＭ、米国Ｒ＆Ｄ会社、２９５−ＯＭ−０５０）と、０．１μＭのデキサメタゾン（米国Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ会社、Ｄ８８９３）とを含むＨＣＭ培地である肝実質細胞培地ＩＩに換えた。
【０１５８】
Ｎ−ｃａｄｈｅｉｒｎ＋の細胞は、ＡＬＢとＡＡＴを発現する肝実質細胞様細胞に、及びＫＲＴ７を発現する胆管細胞様細胞に分化し続けることができる（図１３）。図７におけるＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎ＋の細胞は、ＡＬＢ（図１３Ａ）、ＡＡＴ（図１３Ｂ）陽性の肝実質細胞様細胞へ分化し続ける能力を持ち、ＫＲＴ７（図１３Ｃ）陽性の細胞へ分化する能力も持つ。
【０１５９】
一方、Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ−の細胞は、肝胆系譜への分化ができない。以上の実験より、Ｎ−ｃａｄｈｅｉｒｎ＋の細胞はヒト胚性幹細胞が分化して得られた肝内胚葉細胞であることが示された。
【０１６０】
人工多能性幹細胞（ｉｐｓ）の細胞系であるｈＡＦＦ−４Ｕ−Ｍ−ｉＰＳ−１及びｈＡＦＦ−４Ｕ−Ｍ−ｉＰＳ−３（趙揚、Two supporting factors greatly improve the efficiency of human iPSC generation. Cell Stem Cell, 2008;3:475-479.）（北京大学）を用いて、同じ方法で分化を行ったところ、同様に肝内胚葉細胞を得た。当該肝内胚葉細胞は、ＡＦＰとＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎとを共発現し、ＨＮＦ４ＡとＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎとを共発現した（図３０）。当該肝内胚葉細胞は、同時にＡＬＢ、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４等の遺伝子も発現した。上記の方法に従って、さらに成熟な肝実質細胞に分化誘導されることができ、ＡＬＢ及びＡＡＴ等の蛋白を発現するが（図３１）、ＫＲＴ７陽性の胆管細胞様細胞に分化することもできる。
【０１６１】
実施例３  ヒト胚性幹細胞由来の肝内胚葉細胞による肝前駆細胞の製造
一、肝内胚葉細胞から肝前駆細胞の産生
Ａ）肝前駆細胞の獲得
１）実施例２で得られた肝の内胚葉細胞をＰＢＳで一回洗浄する。
２）Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎによる選別を行わない場合には、膵酵素−ＥＤＴＡ溶液で、室温で約１分間消化した；  Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎによる選別が必要である場合には、ＥＤＴＡフリーの膵酵素（膵酵素溶液、２ｍＭ  ＣａＣｌ２を添加）で、３７℃で約０．５時間消化した。
３）体積百分率１０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を加え終止させ、細胞を懸濁し１５ｍｌの遠心管に移した。
４）１０００回転／分で５分間遠心し、肝前駆細胞培地で再懸濁した。肝前駆細胞培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２基礎培地に、ＨＥＰＥＳ（米国Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ会社、３９１３３８）と、インスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムの混合補充液（米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ会社、５１３００−０４４）と、ウシ血清アルブミン成分Ｖと、ニコチンアミド（米国Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ会社、Ｎ０６３６−１００Ｇ）と、アスコルビン酸（Ａｓｃ−２Ｐ、米国Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ会社、４９７５２−１０Ｇ）と、デキサメタゾンと、ＥＧＦ（米国Ｒ＆Ｄ会社、２３６−ＥＧ−２００）とを添加して得られたものである。この培地のｐＨは７．２−７．６であった。肝前駆細胞培地において、ＨＥＰＥＳの終濃度は１０ｍＭであり、インスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムの混合補充液の終濃度は１％（体積百分率）であり、ウシ血清アルブミン成分Ｖの終濃度は０．０５％（質量百分率）であり、ニコチンアミドの終濃度は１１ｍＭであり、アスコルビン酸（Ａｓｃ−２Ｐ）の終濃度は１ｍＭであり、デキサメタゾンの終濃度は０．１μＭであり、及びＥＧＦの終濃度は１０ｎｇ／ｍｌであった。
５）Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎに対して実施例２と同じ方法で肝内胚葉細胞を選別・純化し、Ｎ−ｃａｄｈｅｉｒｎ＋の細胞を得た。
６）ＳＴＯフィーダー層細胞を製造した。成長状態が良好で、約９０％のコンフルエンスのマウス胚線維芽細胞系（ＳＴＯ）細胞（中国細胞庫典蔵細胞中心）に対して、１０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ（米国Ｒｏｃｈｅ会社、１０１０７４０９００１）で４−６時間処理した。０．１％のゼラチン（米国Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ会社、Ｇ１８９０−１００Ｇ）で培養皿を処理し、３７摂氏度で３０分間又は室温で２時間放置した。残存のマイトマイシンを徹底的に洗い流すように、ＰＢＳ溶液でマイトマイシンＣで処理した細胞を５回洗浄した。膵酵素での消化後、１：３の密度で、ゼラチンで処理された培養皿に播種し、一晩培養後に使用に用いた。
７）製造されたＳＴＯフィーダー層細胞を、ＰＢＳで２回洗浄した。
８）Ｎ−ｃａｄｈｅｉｒｎ＋の細胞をＳＴＯフィーダー層細胞に播種し、肝前駆細胞培地を補足し、ＣＯ２インキュベーターに入れて培養した。
９）毎日液を換え、約７−１０日間で明らかなクローンの産生が見られた。
【０１６２】
Ｂ）肝前駆細胞の継代
１）Ａ）で得られた細胞の肝前駆細胞培地を捨て、ＰＢＳを加え一回洗浄した。
２）膵酵素−ＥＤＴＡ消化液（米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ会社、２５２００１１４）を加え、室温で３−５分間消化した。顕微鏡下で細胞が収縮し丸くなることを観察し、即時に個々に分離することができた。
３）体積百分率１０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を加え、消化を終止させた。
４）細胞を懸濁させ１５ｍｌの遠心管に移し、１０００回転／分で５分間遠心した。
５）肝前駆細胞培地で細胞を再懸濁した。
６）製造されたＳＴＯフィーダー層細胞を、ＰＢＳで２回洗浄した。
７）その後ＳＴＯフィーダー層細胞に播種し、肝前駆細胞培地を補足した。
８）ＣＯ２インキュベーターに入れて培養し、毎日液を換えた。
【０１６３】
Ｃ）肝前駆細胞の維持培養
ステップＢ）の細胞を、ＳＴＯフィーダー層上で、肝前駆細胞培地で培養し、１日１回培地を交換し、通常７〜１０日間に一回継代した。フィーダー層の放置時間が二週間に達した場合又は状態が悪くなった場合、或いは肝前駆細胞のクローンが緻密すぎた場合又は面積が大きすぎた場合には、即時に継代する。
【０１６４】
胎児肝臓の発育の過程において、一旦肝臓の運命特定が完成し、肝芽が発生すれば、最終的に相応の肝臓組織の体積になるまでに、肝前駆細胞が大量に増幅し始める。しかしながら、ヒト胚性幹細胞由来の肝内胚葉細胞を分析したところ、これらの肝内胚葉細胞の増殖能が非常に低いことが見られた。肝内胚葉細胞に対して免疫蛍光し、ＡＦＰ及びＫｉ６７の発現（ＡＦＰ及びＫｉ６７の抗体は
【化２】
2012533310.tif 000004
から購入）を測定したところ、ＡＦＰ陽性の細胞とＫｉ６７との共染がほとんどないことが観測された（図１４）。肝内胚葉を産生する過程において全５日間で培地にＢｒｄＵを添加した場合、分析の結果により５％未満のＡＦＰ陽性細胞のみがＢｒｄＵを発現したことが分かった（図１４）。これらの研究から分かるように、ヒト胚性幹細胞由来の肝内胚葉細胞が速やかに分化し始め、増殖する能力を失った。
【０１６５】
肝臓の前駆細胞を産生する過程は以下の通りである：
【０１６６】
【化３】
2012533310.tif 000005
【０１６７】
ヒト胚性幹細胞由来の肝内胚葉細胞は上記方法を採用して培養される場合、実質的な細胞クローンがいくつか産生された（図１５）。図１５により、ヒト胚性幹細胞のクローンは扁平な円形を呈し、完全な細胞辺縁を有すること、および内胚葉細胞はうろこ状を呈し、扁平な単層細胞であることが分かった。肝内胚葉細胞は単層又は多層を呈する。肝前駆細胞は緊密なクローンを形成し、辺縁は滑らかで完全である。標尺は５０μｍである。これらのクローンは完全で滑らかな辺縁を有する。継代できない肝内胚葉細胞と異なり、これらのクローンは増幅し続けることができる。ヒト細胞核に対する特異的な免疫蛍光（抗体は米国Ｃｈｅｍｉｃｏｎ会社から購入）により、これらの細胞はヒト細胞由来であり、ＳＴＯ細胞由来ではないことが示された（図１６）。従って、これらのクローンはヒト胚性幹細胞由来の肝前駆細胞であることが分かった。クローンの中の主要な細胞はいずれもＫｉ６７を発現していた（図１７）。その増殖能をさらに証明するために、これらのクローンの成長を伴うそのサイズの変化状況を調べた。クローンをＳＴＯフィーダー層細胞に移してから７日目になる時、これらの肝前駆細胞が形成されたクローンの直径は６２．０±１５．４μｍであり、培養して第２０日目の時に、これらのクローンは２２５．４±９２．０μｍに達することができるので、緩慢であるが確実的な細胞増殖が示された。これらの肝前駆細胞に対して１：２又は１：３で継代が行われ、体外で１２代を超えて培養され、且つ凍結保存と解凍を繰り返すことができる（図１８）。コントロールとして単独に培養したマイトマイシン処理されたフィーダー層細胞は、同様な条件下でクローンを産生しなかった。
【０１６８】
図１８において、左：肝前駆細胞のクローンは培養日数の増加につれて、その大きさも徐々に増加する。ｎ＝３。中：肝前駆細胞の成長曲線図である。右：Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ＋群のクローンを産生する能力はＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎ−群のクローンを産生する能力より大きい。この実験を３回繰り返したが、類似した結果が示され、ここで示されたのはある典型的な結果である。
【０１６９】
肝前駆細胞をさらに確認するために、免疫蛍光方法によりα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、サイトケラチン１９（ＫＲＴ１９）及びサイトケラチン７（ＫＲＴ７）の発現を検出した（ＡＦＰ、ＫＲＴ１９及びＫＲＴ７の抗体は中杉金橋会社から購入、ＡＬＢの抗体は米国ＤＡＫＯ会社から購入）。これらの肝前駆細胞は、早期の肝臓マーカー遺伝子であるＡＦＰを発現するが、成熟の肝細胞マーカーＡＬＢを微弱に発現するか或いは発現しない。これらのクローンは同時に胆管のマーカー遺伝子ＫＲＴ１９和ＫＲＴ７を発現する（図１９）。図１９Ａは肝前駆細胞がＡＦＰとＫＲＴ７とを共発現することを示すものであり、図１９ＢはＫＲＴ１９の発現を示すものであり、図１９ＣはＡＬＢの発現を示すものである。図１９Ｄは陰性コントロールであり、細胞核はＤＡＰＩで対比染色（青色）を行った。標尺は５０μｍである。また、これらは仮定の肝前駆細胞マーカーであるＥｐＣＡＭとＣＤ１３３を発現する（図２０）（Ｓｃｈｍｅｌｚｅｒ等、J Exp Med. 2007 Aug 6;204(8):1973-87）。
【０１７０】
肝臓の運命特定後のＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎ＋肝内胚葉細胞とＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎ−細胞群との肝前駆細胞を産生する能力を比較するために、同じ方法に従ってＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎ−の細胞群を培養したところ、Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ−の細胞群から産生されたクローンの数は、Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ＋群より少なくとも６倍低いことが分かった（図１８）。しかも、これらのクローンは継代後に速やかに消失したことから、その増殖能が低下し、上記の肝前駆細胞ではないことが示された。このような結果からも分かるように、特異的な表面マーカー蛋白としてＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎはヒト胚性幹細胞分化系における肝内胚葉細胞の分離純化に用いられ、肝前駆細胞を分化産生させるために使用できる。
【０１７１】
二、肝前駆細胞の肝胆の二つの系譜への分化
Ａ）ヒト胚性幹細胞由来の肝前駆細胞の肝実質細胞様細胞への分化
１日目：
１）（一）からの肝前駆細胞に対し、培地を除去した。
２）ＰＢＳで一回洗浄した。
３）２０ｎｇ／ｍｌの肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を含むＨＣＭ培地である肝実質細胞培地Ｉを加えた。
【０１７２】
第２−５日には毎日以下のようなステップを繰り返した：
４）前日の培地を捨て、新鮮な肝実質細胞培地Ｉを加える。
第６−１０には毎日以下のようなステップを繰り返した：
５）前日の培地を捨てる。
６）１０ｎｇ／ｍｌのＯＳＭと、０．１μＭのデキサメタゾンとを含むＨＣＭ培地である肝実質細胞培地ＩＩに換えた。
【０１７３】
ヒト胚性幹細胞由来の肝前駆細胞を増幅培養したところ、若干の細胞が厳密なクローンの辺縁から遊出することが見られた。ＡＦＰ＋ＫＲＴ７＋の前駆細胞と異なり、これらのクローン辺縁の細胞はＡＦＰ＋ＫＲＴ７−の細胞になり、それらが自発的に肝実質細胞へ分化していることを意味する（図２１）。矢印で指される細胞はＡＦＰ＋ＫＲＴ７−である。細胞核はＤＡＰＩで対比染色を行った（青色）。標尺は５０μｍである。
【０１７４】
肝前駆細胞から肝実質細胞へ分化する潜在能力をさらに確認するために、ＨＧＦとＯＳＭを用いて前駆細胞の肝実質細胞への一定方向の分化を促進した。まず、肝前駆細胞を２０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦを含む肝実質細胞培地（ＨＣＭ）で５日間培養した。次いで再び１０ｎｇ／ｍｌのＯＳＭ及び０．１μＭのデキサメタゾンを含む肝実質細胞培地（ＨＣＭ）で５日間培養し続けた。分化後の細胞に対して免疫蛍光技術により肝実質細胞のマーカー蛋白が検出された。分化した細胞のコロニーはＫＲＴ７を発現しなくなり、逆にＡＬＢを発現するが、ＡＬＢは肝前駆細胞では非常に微量的に発現する。また、これらのＡＬＢを発現する細胞は、ＡＡＴも発現する（図２２）。肝前駆細胞はＫＲＴ７陰性（上欄）、ＡＬＢ（中欄と下欄）及びＡＡＴ（下欄）陽性の肝実質細胞様細胞に誘導された。細胞核は、ＤＡＰＩで対比染色を行った（青色）。標尺は５０μｍである。
【０１７５】
ＲＴ−ＰＣＲ解析により、多くの成熟の肝実質細胞の特異的遺伝子、例えばＡＬＢ、ＡＡＴ、ＴＡＴ、ＫＲＴ８、ＫＲＴ１８、及びシトクロムＰ４５０ファミリーのＣＹＰ３Ａ７とＣＹＰ２Ａ６も誘導細胞で発現していた（図２３）。同時に、分化した細胞は多能性マーカー遺伝子であるＯＣＴ４とＮａｎｏｇの発現を失ったことから、分化した細胞群には未分化のヒト胚性幹細胞を含まないことが分かり、今後細胞移植実験に用いられる可能性がある（図２３）。（プライマーは表２を参照）
【０１７６】
図２３において、１：ヒト胚性幹細胞；２：ヒト胚性幹細胞が分化して得られた肝前駆細胞；３：肝前駆細胞を経由して分化して得られた肝実質細胞；４：直接ヒト胚性幹細胞から分化して得られた肝実質細胞；５：ヒト胚性肝細胞；６：逆転写していないｃＤＮＡ。
【０１７７】
【表２】
2012533310.tif 000006
【０１７８】
これらの肝実質細胞様細胞が肝臓の機能を持つか否かをさらに確認するために、分化して得られた細胞に対して一連の機能検出を行った。
【０１７９】
ＥＬＩＳＡ検出（ＥＬＩＳＡ検出キットは米国ＢＥＴＨＹＬ会社から購入）により、前駆細胞を経由し、分化して得られた肝実質細胞様細胞は、アルブミン分泌量が４３９ｎｇ／日／百万細胞に達し、胚性幹細胞から直接的に分化して得られた肝実質細胞様細胞のアルブミン分泌量（４３９ｎｇ／日／百万細胞）に近いことが示された（図２４）。
【０１８０】
Periodic acid Schiff（ＰＡＳ）染色により、細胞に貯蔵されているグリコーゲンの状況を解析した。その結果、分化したコロニーは特異的に赤色に染色され、これらの肝実質細胞様細胞はグリコーゲンを貯蔵する機能を持つことが示された（図２５Ａ）。
【０１８１】
さらに、分化して得られた肝実質細胞様細胞がインドシアニングリーンに対する吸収と放出情况を検出した。ＩＣＧを吸収・放出できることは肝実質細胞の特異的な機能であり、胚性幹細胞の分化過程において肝実質細胞の同定に広く用いられている。
【０１８２】
検出方法：１ｍｇ／ｍｌのインドシアニングリーン（米国Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ会社から購入、Ｉ２６３３−２５ＭＧ）を含む培地を用いて、細胞を３７度で１５分間インキュベーションした。その後、インドシアニングリーンを含む培地を除去し、ＰＢＳで三回洗浄し、新鮮な培地に交換してから、インドシアニングリーンの吸収状況を観察した。その後、細胞を６時間培養し続け、新鮮な培地に交換し、顕微鏡下でインドシアニングリーンの放出情况を観察した。
【０１８３】
前駆細胞を経由し、分化して得られた肝実質細胞様細胞は、培地中のインドシアニングリーンを吸収でき、緑色を呈し、且つ６時間後に細胞に吸収されたインドシアニングリーンを放出することができる。コントロールとした未分化の前駆細胞は、インドシアニングリーンを吸収できない（図２５Ｂ）。
【０１８４】
さらに、前駆細胞分化して得られた肝実質細胞様細胞が低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）を吸収できることが検出された（図２５Ｃ）。
【０１８５】
検出方法：培養の細胞に、１０μｇ／ｍｌのＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ（米国Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ会社から購入、ＢＴ−９０２）を加え、３７度で４時間培養した。その後、Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬを含む培地を捨て、ＰＢＳで三回洗浄し、新鮮な培地に交換してから蛍光顕微鏡下で観察した。
【０１８６】
ＰＲＯＤ検出により分化細胞のシトクロムｐ４５０の活性状況を解析した。フェノバルビタールの誘導がない場合には、分化して得られた細胞は微弱なＰＲＯＤ活性しかなかった。フェノバルビタールの誘導は分化細胞のＰＲＯＤの活性を向上させることができた。これは分化した細胞が確実にシトクロムｐ４５０の活性を持つことを証明した。コントロールとした未分化の前駆細胞のＰＲＯＤ活性はとても低かった（図２５Ｄ）。
【０１８７】
以上の機能性実験により、前駆細胞が分化して一定機能を持つ肝実質細胞様細胞が得られることが示された。
【０１８８】
図２５Ａには、ＰＡＳ染色解析により、分化して得られた肝実質細胞様細胞の細胞質は赤色に着色され、それにグリコーゲンが貯蔵されていることが示される。図２５Ｂには、分化細胞はＩＣＧを吸収できること（左）、６時間後に放出すること（中）、前駆細胞はＩＣＧを吸収できないこと（右）が示される。図２５Ｃには、分化して得られた肝実質細胞様細胞はｄｉｌ標識のＬＤＬを吸収できることが示される。図２５Ｄには、フェノバルビタールが存在しない場合には、分化細胞は微弱なＰＲＯＤ活性しか持っていないことが示される（中）。フェノバルビタールの誘導によって、ＰＲＯＤ活性が増加する（左）。前駆細胞は微弱なＰＲＯＤ活性しか示さない（右）。（中）、フェノバルビタール。標尺は５０μｍである。
【０１８９】
Ｂ）肝前駆細胞の胆管細胞様細胞への分化
１）１６０μｌのＭａｔｒｉｇｅｌ（米国ＢＤ会社、３５４２３０）を取り、４．６４ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ−１２基礎培地を加え、均一に混合し、混合液を培養皿に加え、揺らして混合液を皿底全体に覆わせ、３７℃で１時間放置し、使用前にＭａｔｒｉｇｅｌ溶液を除去した。
２）ステップＡ）で成長状態がよい肝前駆細胞を取り、培地を捨て、ＰＢＳを加え一回洗浄した。
３）膵酵素−ＥＤＴＡ消化液を加え、室温で３−５分間消化した。顕微鏡下で細胞が収縮し丸くなったことを観察し、互いに分離させる程度でよい。
４）体積百分率１０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を加え、消化を終止させた。
５）細胞を懸濁させ、１５ｍｌの遠心管に移し、１０００回転／分で５分間遠心した。
６）適量のＷｉｌｌｉａｍ  Ｅ培地（米国Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ会社、Ｗ４１２８）で再懸濁させた。
７）肝前駆細胞をステップ１）におけるＭａｔｒｉｇｅｌでコートされた培養皿に播種した。
８）２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１７ｍＭのＮａＨＣＯ３、５ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．２ｍＭのＡｓｃ−２Ｐ、１４ｍＭのグルコース、体積百分率１％のＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉジペプチド（米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ会社、３５０５０−０６１）、０．１μＭのデキサメタゾン、体積百分率１％のインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムの混合補充液（米国Ｇｉｂｃｏ会社）、質量百分率０．０５％のウシ血清アルブミン成分Ｖ、５．３５μｇ／ｍｌのリノレン酸（米国ＢＤ会社、３５４２２７）、及び２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦを含む胆管分化培地を補足した。
９）ＣＯ２インキュベーターに入れて培養し、毎日液を換えた。
【０１９０】
Ｍａｔｒｉｇｅｌは胎児肝臓から直接的に分離して得られた肝前駆細胞を胆管細胞へ分化誘導させる作用を持つことが報道されている（Tanimizu and Miyajima, J Cell Sci. 2004 Jul 1;117,  3165‐3174）。免疫蛍光により、誘導を経た後にＫＲＴ１９、ＫＲＴ７を発現し、ＡＦＰを発現しない細胞が現れたことが示された（図２６）。図２６Ａにおいて、赤色はＫＲＴ７陽性細胞であり、図２６Ｂにおける赤色はＫＲＴ１９陽性である。標尺は５０μｍである。これにより肝前駆細胞が胆管細胞へ分化する潜在能力を持つことが分かった。
【０１９１】
Ｃ）三次元培養条件における肝前駆細胞の胆管細胞様細胞への分化
１）成長状態がよい肝前駆細胞を取り、培地を捨て、ＰＢＳを加え一回洗浄した。
２）膵酵素−ＥＤＴＡ消化液を加え、室温で３−５分間消化した。顕微鏡下で細胞が収縮し丸くなったことを観察し、即時に個々に分離することができた；
３）体積百分率１０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を加え消化を終止し、細胞を懸濁させ、１５ｍｌの遠心管に移し、１０００回転／分で５分間遠心した。
４）適量の胆管分化培地で再懸濁した。
５）混合ゲルを用意した：ゲル１ｍｌ当たりは４００μｌのＭａｔｒｉｇｅｌ、２４０μｌのＩ型コラーゲン（米国Ｒ＆Ｄ会社、３４４２−１００−０１）、及び３６０μｌの胆管分化培地を含み；
６）混合ゲルを均一に混合してから、手のひら型の遠心機で軽く遠心し、気泡の生成を防止した；
７）混合ゲルを１００μｌ／ｃｍ２で細胞培養皿に注意深く加えた；
８）３７℃のインキュベーターに入れてゲルが凝固するまでに１−２時間培養した；
９）既に凝固したゲル上に等体積の胆管分化培地を補足し、３７℃のインキュベーターに入れて、毎日ゲル上の胆管分化培地を交換した。
【０１９２】
上記方法に従って肝前駆細胞を７日分化培養した後、分化した細胞は、中央が空洞で、外層が単層細胞からなるベシクル構造に形成された。免疫蛍光検出により、二つの伝統的な胆管細胞マーカー蛋白であるＫＲＴ７及びＫＲＴ１９がベシクルの単層細胞で発現したが、肝臓系譜の特異的な蛋白ＡＦＰは発現しなかったことが観測された。
【０１９３】
さらに、免疫蛍光方法を用いて、β−ｃａｔｅｎｉｎ、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、ｉｎｔｅｇｒｉｎ  α６及びＦ−ａｃｔｉｎ等の蛋白の細胞内局在性を検出することにより、分化した細胞が胆管細胞のように頂端側−基底側の極性を持つか否かの判断を行った。
【０１９４】
検出により、β−ｃａｔｅｎｉｎは細胞の基底側のみに局在するが、Ｆ−ａｃｔｉｎはベシクルの内層、即ち、頂端に豊富に集積することが観測された。従って、このベシクル構造を構成する分化細胞は頂端側−基底側の上皮極性を持つことが証明された。また、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎとｉｎｔｅｇｒｉｎα６とも基底側に特異的に発現する（図２７）。図２７Ａには、胆管細胞様細胞が胆管状構造を形成したことが示される。図２７Ｂには、免疫蛍光により胆管細胞様細胞がＫＲＴ１９（赤色）を発現することが示される。図２７Ｃには、免疫蛍光により胆管細胞様細胞がＫＲＴ７（赤色）を発現するが、ＡＦＰ（緑色）を発現しないことが示される。図２７Ｄには上皮極性のマーカー蛋白であるβ−ｃａｔｅｎｉｎの局在性が示される。図２７Ｇには上皮極性のマーカー蛋白であるＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの局在性が示される。図２７ＪにはＩｎｔｅｇｒｉｎ  α６の局在性が示される。β−ｃａｔｅｎｉｎ（Ｄ）、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ（Ｇ）及びＩｎｔｅｇｒｉｎα６（Ｊ）は細胞の基底側に局在し、Ｆ−ａｃｔｉｎ（図２７Ｅ及び図２７Ｈ）は細胞の頂端側に局在する。胆管細胞マーカーであるＫＲＴ１９は同時に頂端側と基底側に局在する（図２７Ｋ）。図２７Ｆ、Ｉ、Ｌに示されているのはマージ図である。青色はＤＡＰＩ標識の細胞核である。標尺は５０μｍである。
【０１９５】
分化して得られた胆管細胞様細胞が正常の胆管細胞のように輸送と分泌の機能を持つか否かを解析し、胆管の輸送と分泌に関わるキー蛋白ＭＤＲの機能の状況を解析した。ＭＤＲは、ＡＴＰ依存性の膜貫通輸送ポンプであり、胆汁中のカチオン物質の分泌に関与する可能性があると文献に報道されている（Ｇｉｇｌｉｏｚｚｉ等、Gastroenterology. 2000 Oct; 119, 1113‐1122）。分化して得られたベシクルと蛍光染料であるｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １２３（米国Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ会社、８３７０２−１０ＭＧ）とを一緒にインキュベーションした。ベシクル内の空洞部分の蛍光強度は周辺細胞内の蛍光強度より遥かに高かった。１０ｍＭのＭＤＲ蛋白の抑制剤であるＶｅｒａｐａｍｉｌ（米国Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ会社、Ｖ１０６−５ＭＧ）で処理すると、ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １２３がベシクル外周の細胞中に制限され、ベシクル内の空洞に輸送する能力を失った（図２８）。これによりｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １２３の輸送は確かに細胞頂端側に局在する機能性のＭＤＲ蛋白に依存することが示された。以上の結果より、これらの肝前駆細胞から分化して得られた細胞と胆管細胞とはとても強い類似性を持つことが示された。
【０１９６】
人工多能性幹細胞（ｉｐｓ）細胞系であるｈＡＦＦ−４Ｕ−Ｍ−ｉＰＳ−１とｈＡＦＦ−４Ｕ−Ｍ−ｉＰＳ−３（趙揚、Two supporting factors greatly improve the efficiency of human iPSC generation. Cell Stem Cell, 2008;3:475-479.）（北京大学）を用いて、同じ方法で分化を行えば、同様に肝前駆細胞を得ることができる。この肝前駆細胞は同様的にクローン形態、長期にわたる増殖能を持ち、且つＡＦＰ、ＫＲＴ１９（図３０）、ＫＲＴ７、及び仮の肝前駆細胞マーカーであるＥｐＣＡＭとＣＤ１３３を発現する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１２】
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【図１８】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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