【手続補正書】
【提出日】令和2年3月2日(2020.3.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端配列（ＩＴＲ）が隣接する異種核酸インサートを含む閉鎖型直鎖状二重鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）であって、ＩＴＲ配列は、互いに非対称であり、各配列は、作動性末端分解部位（ｔｒｓ）およびローリングサークル複製タンパク質結合要素（ＲＢＥ）を有し、ここで第１のＩＴＲ配列は、２つの対向する縦方向対称ステムループを形成する交差アーム配列により分断され、対向する縦方向対称ステムループの各々は、長さが５〜１５塩基対の範囲のステム部分と、２〜５個の不対のデオキシリボヌクレオチドを有するループ部分とを有し、第２のＩＴＲ配列は、切断された交差アーム配列により分断されている、前記閉鎖型直鎖状二重鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）。
【請求項２】
ＩＴＲ配列が、４０〜１０００ヌクレオチド長の範囲であり、任意に、ＩＴＲ配列が、１００〜１６０ヌクレオチド長の範囲であり、
交差アーム配列が、−１２ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜−３０ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲の生理学的条件下でアンフォールディングのギブス自由エネルギー（ΔＧ）を有し、任意に、交差アーム配列が、−２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜−２５ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲の生理学的条件下でアンフォールディングのギブス自由エネルギー（ΔＧ）を有し、
対向する縦方向対称ステムループの各々が、長さが３〜１５塩基対の範囲のステム部分を有し、任意に、対向する縦方向対称のステムループの各々が、長さが８〜１０塩基対の範囲のステム部分を有し、
各ループ部分が、２〜５個の不対のデオキシリボヌクレオチドを有し、任意に、各ループ部分が、３個のデオキシリボヌクレオチドを有し、さらに任意に、１つのループ部分が３個のデオキシチミジンを有し、もう１つのループ部分が３個のデオキシアデノシンを有し、
ローリングサークル複製タンパク質結合要素が、Ｒｅｐ結合要素（ＲＢＥ）であり、任意に、ＲＢＥが、配列５’−ＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’を含み、
作動性末端分解部位が、配列５’−ＴＴ−３’を含み、
作動性末端分解部位の３’末端が、ローリングサークル複製タンパク質結合要素の５’末端から１５〜２５ヌクレオチドであり、
切断された交差アーム配列が、２つの対向する縦方向非対称ステムループを形成し、任意に、対向する縦方向非対称ステムループの１つが、長さが８〜１０塩基対の範囲のステム部分と２〜５個の不対のデオキシリボヌクレオチドを有するループ部分とを有し、さらに任意に、１つの縦方向非対称ステムループが、３個以下のデオキシリボヌクレオチドを有するループ部分を有し、さらに任意に、１つの縦方向非対称ステムループが、８塩基対未満の長さのステム部分と２〜５個のデオキシリボヌクレオチドを有するループ部分とを有し、任意に、１つの縦方向非対称ステムループが、３塩基対未満の長さのステム部分を有し、さらに任意に、切断された交差アーム配列が、０ｋｃａｌ／ｍｏｌから−２２ｋｃａｌ／ｍｏｌを超える範囲の生理学的条件下で、アンフォールディングのギブス自由エネルギー（ΔＧ）を有する、請求項１に記載のｃｅＤＮＡ。
【請求項３】
異種核酸インサートが、タンパク質または機能性ＲＮＡを発現するように操作されており、異種核酸インサートが、遺伝子編集用基質としての無プロモーター構築物であり、任意に、無プロモーター構築物が、ＴＡＬＥＮＳ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、Ｃａｓ９、および他の遺伝子編集タンパク質のための基質を提供する、請求項１または２に記載のｃｅＤＮＡ。
【請求項４】
核酸が、５００〜５０，０００ヌクレオチド長の範囲である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡ。
【請求項５】
ベクター内に含有される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の複数のｃｅＤＮＡを含む、組成物。
【請求項７】
複数のｃｅＤＮＡが、エンド・ツー・エンドで連結されている、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡおよび薬学的に許容し得る担体を含む、組成物。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡを含む、宿主細胞であって、任意に、宿主細胞がさらに、ｃｅＤＮＡのローリングサークル複製タンパク質結合要素に選択的に結合するローリングサークル複製タンパク質を含む、前記宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡを含む、異種核酸を細胞に送達するための医薬組成物。
【請求項１１】
異種核酸を対象に送達するための医薬組成物であって、組成物が、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡを含み、ここで、ｃｅＤＮＡの送達が、免疫応答をもたらさない、前記組成物。
【請求項１２】
免疫応答が体液性応答または細胞性応答である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項９に記載の宿主細胞を含む、異種核酸を対象に送達するための医薬組成物であって、任意に、宿主細胞が血液細胞である、前記組成物。
【請求項１４】
ｃｅＤＮＡをインビトロで生成する方法であって、方法が、
（ｉ）許容細胞に、２つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端配列（ＩＴＲ）が隣接する異種核酸インサートを含む閉鎖型直鎖状二重鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）をインビトロで導入すること、ＩＴＲ配列は、互いに非対称であり、各配列は、作動性末端分解部位（ｔｒｓ）およびローリングサークル複製タンパク質結合要素（ＲＢＥ）を有し、ここで第１のＩＴＲ配列は、２つの対向する縦方向対称のステムループを形成する交差アーム配列により分断され、対向する縦方向対称ステムループの各々は、長さが５〜１５塩基対の範囲のステム部分と、２〜５個の不対デオキシリボヌクレオチドを有するループ部分とを有し、第２のＩＴＲ配列は、切断された交差アーム配列により分断されている；および
（ｉｉ）許容細胞を、許容細胞中のローリングサークル複製タンパク質が核酸の複数コピーの生成を開始する条件下で、インビトロで維持すること、ここで許容細胞は、核酸の複製可能コピーをウイルス粒子にパッケージング可能なウイルスカプシドタンパク質を発現しない、
を含む、前記方法。
【請求項１５】
許容細胞が哺乳動物細胞ではないか、または、許容細胞が、昆虫細胞株、酵母細胞株、または細菌細胞株である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ローリングサークル複製タンパク質が、ヘルパーウイルスベクターによりコードされ、任意にここで、ヘルパーウイルスベクターが、Autograph californica核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）ベクターまたはバキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）である、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
核酸をインビトロで調製する方法であって、方法が、
（ｉ）許容細胞に、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡをインビトロで導入すること、ここで許容細胞は、ローリングサークル複製タンパク質を発現するが、核酸の複製可能コピーをウイルス粒子にパッケージング可能なウイルスカプシドタンパク質を発現しない；および、
（ｉｉ）許容細胞を、許容細胞中のローリングサークル複製タンパク質が核酸を複製する条件下で、インビトロで維持すること、
を含む、前記方法。
【請求項１８】
核酸を分析する方法であって、方法が、
ｉ）許容細胞から単離された核酸複製生成物を含む、核酸調製物を得ること、ここで許容細胞は、２つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端配列（ＩＴＲ）が隣接する異種核酸インサートを含む閉鎖型直鎖状二重鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）を含み、ＩＴＲ配列は、互いに非対称であり、各配列は、作動性末端分解部位（ｔｒｓ）およびローリングサークル複製タンパク質結合要素（ＲＢＥ）を有し、ここで第１のＩＴＲ配列は、２つの対向する縦方向対称のステムループを形成する交差アーム配列により分断され、対向する縦方向対称ステムループの各々は、長さが５〜１５塩基対の範囲のステム部分と、２〜５個の不対のデオキシリボヌクレオチドを有するループ部分とを有し、ここで第２のＩＴＲ配列は、切断された交差アーム配列により分断され、ここで許容細胞は、ローリングサークル複製タンパク質を発現するが、核酸の複製可能コピーをウイルス粒子にパッケージング可能なウイルスカプシドタンパク質を発現せず、およびここで、ローリングサークル複製タンパク質は、核酸のローリングサークル複製タンパク質結合要素に結合し、核酸を複製して核酸複製生成物を生成する；および、
ｉｉ）１つ以上の複製生成物の、生理化学的特性を決定すること、
を含む、前記方法。
【請求項１９】
生理化学的特性が、
１つまたはそれぞれの自己相補的配列のヌクレオチド配列、
１つ以上の複製生成物の多量体化の程度、
核酸調製物中の複製生成物の単量体形態および／または多量体形態の化学量論、
１つ以上の複製生成物の、制限エンドヌクレアーゼによる消化に対する感受性、
複製生成物の、二量体形態における単量体の極性、ここで極性が、head-to-head、head-to-tail、またはtail-to-tailの極性である、あるいは、
１つ以上の複製生成物または複製生成物の断片の分子量である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
分子量が、電気泳動移動度に基づいて決定される、
分子量が、質量分析に基づいて決定される、
分子量が、１つ以上の複製生成物の断片のものであり、ここで分子量を決定する前に、断片が、ポリメラーゼによるプライマー伸長を含む反応によって増幅される、あるいは、
プライマー伸長を含む反応が、ポリメラーゼ連鎖反応である、請求項１８に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
いくつかの態様において、本明細書に記載の核酸（例えば、ｃｅＤＮＡ）は、肝臓組織を標的とすることができる。したがって、いくつかの態様において、本明細書に記載の核酸（例えば、ｃｅＤＮＡ）は、肝疾患の処置に有用であり得る。本明細書で使用される「肝疾患」は、肝臓の疾患または状態である。肝疾患は遺伝的起源のものであり得、体細胞突然変異によって遺伝するかまたは獲得される。肝疾患は肝臓のがんであり得、これには、限定はされないが、肝細胞癌（ＨＣＣ）、線維層状肝癌、胆管癌、血管肉腫および肝芽細胞腫を含む。肝疾患のさらなる非限定的例には、アラジール症候群、α１アンチトリプシン欠乏症、自己免疫性肝炎、胆道閉鎖症、肝硬変、肝臓の嚢胞性疾患、脂肪肝疾患、ガラクトース血症、胆石症、ギルバート症候群、ヘモクロマトーシス、妊娠中の肝疾患、新生児肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、ポルフィリン症、ライ症候群、サルコイドーシス、毒性肝炎、１型糖原病、チロシン血症、Ａ、Ｂ、Ｃ型ウイルス性肝炎、ウィルソン病および住血吸虫症を含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
いくつかの態様において、本明細書に記載の核酸（例えば、ｃｅＤＮＡ）は、腎臓組織を標的とすることができる。したがって、いくつかの態様において、本明細書に記載の核酸（例えば、ｃｅＤＮＡ）は、腎疾患の処置に有用であり得る。本明細書で使用される「腎疾患」は、腎臓の疾患または状態である。腎疾患は遺伝的起源のものであり得、体細胞突然変異によって遺伝するかまたは獲得される。腎疾患は腎臓のがんであり得、これには、限定はされないが、腎細胞がん、明細胞がん、乳頭状がん１型、乳頭状がん２型、色素嫌性がん、膨大細胞がん、集合管がん、腎盂およびウィルムス腫瘍の転移性細胞がんを含む。腎疾患のさらなる非限定的例としては、以下を含む：Abderhalden-Kaufmann-Lignac症候群（腎障害シスチン症）、急性腎不全／急性腎障害、急性巣状細菌性腎炎、急性リン酸腎症、急性細尿管壊死、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損症、アデノウイルス腎炎、アルポート症候群、アミロイドーシス、血管筋脂肪腫、鎮痛薬性腎症、アンジオテンシン抗体および巣状分節性糸球体硬化症、抗リン脂質抗体症候群、抗ＴＮＦ−α療法関連糸球体腎炎、ＡＰＯＬ１突然変異、見かけの鉱質コルチコイド過剰症候群、アリストロキア酸腎症、バルカン風土病腎症、バーター症候群、ビート尿、βサラセミア腎疾患、胆汁円柱腎症、ＢＫポリオーマ、Ｃ１ｑ腎症、心腎症候群、ＣＦＨＲ５腎症、コレステロール塞栓症、チャーグ・ストラウス症候群、乳び尿、糸球体虚脱症、ＣＭＶ関連糸球体虚脱症、先天性ネフローゼ症候群、腎錐体症候群（Mainzer-Saldino症候群またはSaldino-Mainzer病）、造影剤腎症、硫酸銅中毒、皮質壊死、