(57)【要約】  Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−（Ｘ）ｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＮＨ２で表される化合物又はその薬学的に許容される塩は、ＧＰＲ７に選択的なリガンドである。［式中、ｎは２〜１０の整数を表し、Ｘは独立して、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯ−（ここで、ｍは２〜６の整数を表す。）で表される基や置換基を有していてもよい式2006054641.tif 000042（ここで、ｌは０又は１を表す。）で表される基などを表す。］【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−（Ｘ）ｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＮＨ２で表される化合物又はその薬学的に許容される塩。
［式中、ｎは２〜１０の整数を表し、
Ｘは独立して、
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯ−（ここで、ｍは２〜６の整数を表す。）で表される基、
置換基群Ａから選択される置換基を有していてもよい式
【化１】
2006054641.tif 000032
（ここで、ｌは０又は１を表す。）で表される基、
置換基群Ａから選択される置換基を有していてもよい式
【化２】
2006054641.tif 000033
で表される基、
置換基群Ａから選択される置換基を有していてもよい式
【化３】
2006054641.tif 000034
（ここで、ｐは０〜２の整数を表し、ｑは０又は１を表す。）で表される基、又は
置換基群Ａから選択される置換基を有していてもよい式
【化４】
2006054641.tif 000035
（ここで、ｒは０又は１を表す。）で表される基
を表し、
置換基群Ａは、ハロゲン、メチル基、エチル基、ヒドロキシル基、メトキシ基及びニトロ基からなる。］
【請求項２】
Ｘが−ＮＨ−（ＣＨ２）４−ＣＯ−で表される基である、請求項１に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
ｎが２〜５の整数である、請求項２に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項４】
ｎが３である、請求項２に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項５】
ｎが３であり、Ｘのうち２つが−ＮＨ−（ＣＨ２）４−ＣＯ−で表される基であり、
残りのＸが、
置換基群Ａから選択される置換基を有していてもよい式
【化５】
2006054641.tif 000036
（ここで、ｌは０又は１を表す。）で表される基、
置換基群Ａから選択される置換基を有していてもよい式
【化６】
2006054641.tif 000037
で表される基、
置換基群Ａから選択される置換基を有していてもよい式
【化７】
2006054641.tif 000038
（ここで、ｐは０〜２の整数を表し、ｑは０又は１を表す。）で表される基、又は
置換基群Ａから選択される置換基を有していてもよい式
【化８】
2006054641.tif 000039
（ここで、ｒは０又は１を表す。）で表される基
であり、
置換基群Ａが、ハロゲン、メチル基、エチル基、ヒドロキシル基、メトキシ基及びニトロ基からなる、
請求項１に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項６】
ｎが３であり、Ｘのうち２つが−ＮＨ−（ＣＨ２）４−ＣＯ−で表される基であり、
残りのＸが、ハロゲン、メチル基、エチル基、ヒドロキシル基、メトキシ基及びニトロ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい式
【化９】
2006054641.tif 000040
（ここで、ｌは０又は１を表す。）で表される基である、
請求項１に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項７】
ｎが３であり、Ｘのうち２つが−ＮＨ−（ＣＨ２）４−ＣＯ−で表される基であり、
残りのＸが式
【化１０】
2006054641.tif 000041
で表される基である、請求項１に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩からなるＧＰＲ７選択的リガンド。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩からなるＧＰＲ７選択的アゴニスト。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする医薬。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする、肥満、糖尿病又は過食症の予防・治療剤。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする、食欲増進剤。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする、下垂体ホルモンの分泌不全の予防・治療剤。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする、睡眠障害の予防・治療剤。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする、鎮痛剤。
【請求項１６】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする、ストレスの予防・治療剤。
【請求項１７】
ＧＰＲ７に結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）候補化合物が存在する条件及び存在しない条件の下で、ＧＰＲ７と請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩とを接触させ、ＧＰＲ７と請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩との結合量を測定する工程と、
（ｂ）ＧＰＲ７と請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩との結合量を変化させる候補化合物を選択する工程と、
を備える方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＧＰＲ７に選択的なリガンド及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
オーファン受容体であるＧＰＲ７及びＧＰＲ８の内在性リガンドとして、ニューロペプチドＷ（ＮＰＷ）及びニューロペプチドＢ（ＮＰＢ）が報告され、これらのペプチドが摂食、エネルギー代謝及び内分泌調節に関与していることが示唆されている（特許文献１及び非特許文献１〜４）。【０００３】
ＧＰＲ７及びＧＰＲ８の生体内における局在は異なり、各々独自の生理学的機能を有していると推察される。したがって、各受容体の機能を検討する上で、各受容体に対する選択性が高いリガンドは非常に有用である。【０００４】
【特許文献１】特開２００４−４９００３号公報
【非特許文献１】Mondal MS.ら、Endcrinology、144巻、4729-4733頁（2003年）
【非特許文献２】Tanaka H.ら、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America、100巻、6251-6256頁（2003年）
【非特許文献３】Fujii R.ら、The Journal of Biological Chemistry、277巻、34010-34016頁（2002年）
【非特許文献４】Shimomura Y.ら、The Journal of Biological Chemistry、277巻、35826-35832頁（2002年）
【非特許文献５】Winsky-Sommerer R.ら、SLEEP、26巻、Abstract Supplement、0118.A（2003年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、内在性リガンドであるＮＰＷ及びＮＰＢは、ＧＰＲ７に対する選択性は高くない。ＧＰＲ７に対する選択性の高いリガンドは、ＧＰＲ７の機能を解明する上で有用なツールであると考えられる。【０００６】
また、ＧＰＲ７及びＧＰＲ７のリガンドは、様々な疾患や症状と関連していることが知られている。例えば、（１）肥満、糖尿病、摂食障害等への関連、下垂体ホルモンの分泌不全への関連（特許文献１）；（２）睡眠及び覚醒への影響（非特許文献５）；（３）痛覚への影響（非特許文献２）；及び（４）ストレスへの影響（非特許文献２）などが挙げられる。したがって、ＧＰＲ７のリガンドはこれらの疾患の予防・治療薬となり得る。【０００７】
さらに、ＧＰＲ７に対する選択性の高いリガンドは、上記疾患の予防・治療薬などの医薬品候補化合物のスクリーニングに応用することも可能である。【０００８】
したがって、本発明の目的は、ＧＰＲ７に選択的なリガンド及びその用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明者らはＮＰＢのアナログを種々合成したところ、ＧＰＲ７に対する選択性が非常に高い化合物を見出し、本発明を完成するに至った。【００１０】
すなわち、本発明は、Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−（Ｘ）ｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＮＨ２で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を提供する。
［式中、ｎは２〜１０の整数を表し、
Ｘは独立して、
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯ−（ここで、ｍは２〜６の整数を表す。）で表される基、
置換基群Ａから選択される置換基を有していてもよい式
【化１】
2006054641.tif 000002
（ここで、ｌは０又は１を表す。）で表される基、
置換基群Ａから選択される置換基を有していてもよい式
【化２】
2006054641.tif 000003
で表される基、
置換基群Ａから選択される置換基を有していてもよい式
【化３】
2006054641.tif 000004
（ここで、ｐは０〜２の整数を表し、ｑは０又は１を表す。）で表される基、又は
置換基群Ａから選択される置換基を有していてもよい式
【化４】
2006054641.tif 000005
（ここで、ｒは０又は１を表す。）で表される基
を表し、
置換基群Ａは、ハロゲン、メチル基、エチル基、ヒドロキシル基、メトキシ基及びニトロ基からなる。］【００１１】
ここで、Ｘは−ＮＨ−（ＣＨ２）４−ＣＯ−で表される基であることが好ましく、その場合、ｎは２〜５の整数、特に３であることが好ましい。【００１２】
また、ｎが３であり、Ｘのうち２つが−ＮＨ−（ＣＨ２）４−ＣＯ−で表される基であり、
残りのＸが、
置換基群Ａから選択される置換基を有していてもよい式
【化５】
2006054641.tif 000006
（ここで、ｌは０又は１を表す。）で表される基、
置換基群Ａから選択される置換基を有していてもよい式
【化６】
2006054641.tif 000007
で表される基、
置換基群Ａから選択される置換基を有していてもよい式
【化７】
2006054641.tif 000008
（ここで、ｐは０〜２の整数を表し、ｑは０又は１を表す。）で表される基、又は
置換基群Ａから選択される置換基を有していてもよい式
【化８】
2006054641.tif 000009
（ここで、ｒは０又は１を表す。）で表される基
であることが好ましい。【００１３】
特に、ｎが３であり、Ｘのうち２つが−ＮＨ−（ＣＨ２）４−ＣＯ−で表される基であり、残りのＸが、ハロゲン、メチル基、エチル基、ヒドロキシル基、メトキシ基及びニトロ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい式
【化９】
2006054641.tif 000010
（ここで、ｌは０又は１を表す。）で表される基であることが好ましい。【００１４】
さらには、ｎが３であり、Ｘのうち２つが−ＮＨ−（ＣＨ２）４−ＣＯ−で表される基であり、残りのＸが式
【化１０】
2006054641.tif 000011
で表される基であることが好ましい。【００１５】
上記化合物又はその薬学的に許容される塩は、ＧＰＲ７に選択的なリガンドであり、ＧＰＲ７に選択的なアゴニストである。【００１６】
本発明は、また、上記化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする医薬を提供する。より具体的には、本発明は、肥満、糖尿病又は過食症の予防・治療剤、食欲増進剤、下垂体ホルモンの分泌不全の予防・治療剤、睡眠障害の予防・治療剤、鎮痛剤、ストレスの予防・治療剤を提供する。【００１７】
本発明は、また、ＧＰＲ７に結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）候補化合物が存在する条件及び存在しない条件の下で、ＧＰＲ７と本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩とを接触させ、ＧＰＲ７と本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩との結合量を測定する工程と、
（ｂ）ＧＰＲ７と本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩との結合量を変化させる候補化合物を選択する工程と、
を備える方法を提供する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の化合物は、ＧＰＲ７に対する選択性が非常に高いため、ＧＰＲ７の機能を解明する上で有用なツールとなる。また、本発明の化合物は摂食障害をはじめとする様々な疾患の予防・治療剤となり、さらに、様々な疾患に対する予防・治療剤となる医薬品候補化合物のスクリーニングに応用することも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（化合物）
以下、本発明の化合物について説明する。本発明の化合物は、Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−（Ｘ）ｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＮＨ２で表される。この化合物は、ｄｅｓＢｒ−ｈＮＰＢ（１−２３）の４〜１３残基目のアミノ酸を、アミノ基及びカルボキシル基を有するｎ個の基（Ｘに相当）に置換した、ｈＮＰＢ（ヒト  ニューロペプチドＢ）のアナログである。Ｌｅｕ−ＮＨ２は、Ｃ末端であるロイシン残基のカルボキシル基がアミド化されていることを表す。また、Ｌｙｓ−（Ｘ）ｎ−Ｇｌｙは、リジン残基（ｈＮＰＢの３残基目に相当）のカルボキシル基と１番目（Ｎ末端であるトリプトファンから数える。以下同様。）のＸのアミノ基とが結合してアミド結合を形成し、ｉ番目のＸのアミノ基とｉ＋１番目のＸのカルボキシル基とが結合してアミド結合を形成し、ｎ番目のＸのカルボキシル基とグリシン残基（ｈＮＰＢの１４残基目に相当）のアミノ基とが結合してアミド結合を形成していることを表す。【００２０】
ここで、ｎは２〜１０の整数を表す。【００２１】
また、Ｘは独立して、以下の（１）〜（５）の基を表す：
（１）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯ−（ここで、ｍは２〜６の整数を表す。）で表される基、
（２）置換基群Ａから選択される置換基を有していてもよい式
【化１１】
2006054641.tif 000012
（ここで、ｌは０又は１を表す。）で表される基、
（３）置換基群Ａから選択される置換基を有していてもよい式
【化１２】
2006054641.tif 000013
で表される基、
（４）置換基群Ａから選択される置換基を有していてもよい式
【化１３】
2006054641.tif 000014
（ここで、ｐは０〜２の整数を表し、ｑは０又は１を表す。）で表される基、又は
（５）置換基群Ａから選択される置換基を有していてもよい式
【化１４】
2006054641.tif 000015
（ここで、ｒは０又は１を表す。）で表される基。【００２２】
「置換基群Ａから選択される置換基を有していてもよい」とは、環（ベンゼン環、ピリジン環、アゼチジン、ピロリジン環、ピペリジン環及びシクロヘキサン環）上の任意の１又は複数の水素原子が置換基群Ａ（ハロゲン、メチル基、エチル基、ヒドロキシル基、メトキシ基及びニトロ基）から選択される置換基に置換されていてもよいことをいう。【００２３】
式
【化１５】
2006054641.tif 000016
（ここで、ｌは０又は１を表す。）で表される基とは、ベンゼン環の任意の水素原子が−ＮＨ−（ＣＨ２）ｌ−及び−ＣＯ−に置換された２価の基を表し、具体的には、以下の式で表される基を表す。
【化１６】
2006054641.tif 000017
【００２４】
また、式
【化１７】
2006054641.tif 000018
で表される基とは、ピリジン環の任意の水素原子が−ＮＨ−及び−ＣＯ−に置換された２価の基を表し、具体的には、以下の式で表される基を表す。
【化１８】
2006054641.tif 000019
【００２５】
また、式
【化１９】
2006054641.tif 000020
（ここで、ｐは０〜２の整数を表し、ｑは０又は１を表す。）で表される基とは、アゼチジン−１−イル基、ピロリジン−１−イル基及びピペリジン−１−イル基の任意の水素原子が−（ＣＨ２）ｑ−ＣＯ−に置換された２価の基を表し、具体的には以下の式で表される基を表す。
【化２０】
2006054641.tif 000021
【００２６】
また、式
【化２１】
2006054641.tif 000022
（ここで、ｒは０又は１を表す。）で表される基とは、シクロヘキサン環の任意の水素原子が−ＮＨ−及び−（ＣＨ２）ｒ−ＣＯ−に置換された２価の基を表し、具体的には以下の式で表される基を表す。
【化２２】
2006054641.tif 000023
【００２７】
本発明の化合物は、例えば、公知のペプチド合成法を応用して合成することが可能である。公知のペプチド合成法としては、Ｆｍｏｃ法又はＢｏｃ法による固相合成法又は液相合成法などがある。特に、Ｆｍｏｃ法による固相合成法が収率等の観点から優れている。Ｆｍｏｃ法による固相合成法で使用するＦｍｏｃ基で保護されたアミノ酸又はＸは、市販されているものを利用することができ、また、必要に応じて公知の方法で合成することもできる。Ｎ末端（トリプトファン）まで伸長した後、トリフルオロ酢酸などで処理することにより脱保護を行い、本発明の化合物を固相（樹脂）から切断し、必要に応じて精製（例えば、ＯＤＳカラムなどを用いた逆相ＨＰＬＣ等）を行う。【００２８】
本発明の化合物は、Ｘが−ＮＨ−（ＣＨ２）４−ＣＯ−で表される基であることが好ましく（５−アミノ吉草酸（Ａｖａと略す）に相当する）、その場合、ｎは２〜５の整数であることが特に好ましく、ｎが３であることが最も好ましい。ＸがＡｖａの場合、本発明の化合物は適度な柔軟性と鎖長を備え、ＧＰＲ７にフィットすると考えられる。また、ｎが２〜５の整数の場合、本発明の化合物はＧＰＲ７に対する特異性が高く、特にｎが３である本発明の化合物は、ＧＰＲ７の選択性はＧＰＲ８の約２９００倍である。【００２９】
また、本発明の化合物は、ｎが３であり、Ｘのうち２つが−ＮＨ−（ＣＨ２）４−ＣＯ−で表される基であり、残りのＸが、置換基群Ａから選択される置換基を有していてもよい式
【化２３】
2006054641.tif 000024
（ここで、ｌは０又は１を表す。）で表される基、
置換基群Ａから選択される置換基を有していてもよい式
【化２４】
2006054641.tif 000025
で表される基、
置換基群Ａから選択される置換基を有していてもよい式
【化２５】
2006054641.tif 000026
（ここで、ｐは０〜２の整数を表し、ｑは０又は１を表す。）で表される基、又は
置換基群Ａから選択される置換基を有していてもよい式
【化２６】
2006054641.tif 000027
（ここで、ｒは０又は１を表す。）で表される基
であることが好ましい。−ＮＨ−（ＣＨ２）４−ＣＯ−で表される基を２つ有することにより、本発明の化合物は適度な柔軟性と鎖長を備え、ベンゼン環、ピリジン環、アゼチジン、ピロリジン環、ピペリジン環又はシクロヘキサン環を１つ有することにより、本発明の化合物は適度な剛直性を備え、ＧＰＲ７にフィットすると考えられる。【００３０】
適度な剛直性という観点から、Ｘはベンゼン環又はピリジン環であることが好ましく、特にベンゼン環であることが好ましい。すなわち、Ｘは、ハロゲン、メチル基、エチル基、ヒドロキシル基、メトキシ基及びニトロ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい式
【化２７】
2006054641.tif 000028
（ここで、ｌは０又は１を表す。）で表される基であることが好ましい。中でも、Ｘが式
【化２８】
2006054641.tif 000029
で表される基（２−、３−及び４−アミノ安息香酸（それぞれ、２−Ａｂｚ、３−Ａｂｚ及び４−Ａｂｚと略す）に相当する）である場合には、本発明の化合物はＧＰＲ７に対する特異性が高いため、Ｘはこれらの基であることが好ましい。特に、Ｘが２−Ａｂｚである場合には、ＧＰＲ７の選択性はＧＰＲ８の約１７００倍である。【００３１】
本発明の化合物の薬学的に許容される塩も本発明の範囲に包含される。薬学的に許容される酸としては、酸付加塩及び塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、フッ化水素酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩等のハロゲン化水素酸塩；硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、燐酸塩、炭酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩等の低級アルキルスルホン酸塩；ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩等のアリ−ルスルホン酸塩；及びフマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩を挙げることができる。塩基付加塩としては、例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩；カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属塩；及びアンモニウム塩、グアニジン、トリエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン等の有機塩基による塩が挙げられる。本発明の化合物は、常法に従って薬学的に許容される塩に変換され得る。【００３２】
（ＧＰＲ７選択的リガンド及びＧＰＲ７選択的アゴニスト）
本発明のＧＰＲ７選択的リガンド及びＧＰＲ選択的アゴニストは、本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩からなる。リガンド及びアゴニストがＧＰＲ７選択的であるとは、ＧＰＲ８よりもＧＰＲ７に対してリガンド等がより強く結合すること（結合定数が大きい）やＧＰＲ８よりもＧＰＲ７に対するリガンド等のＥＣ５０（５０％有効濃度）が低いことをいう。【００３３】
本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩はＧＰＲ７に対する選択性が高い。例えば、実施例に示したように、結合阻害実験（ＩＣ５０（５０％阻害濃度）の比較）の結果から約１５〜２９００倍選択的であることが分かっている（表１及び表２）。また、ＥＣ５０の測定結果から約４〜１６５倍選択的であることが分かっている（表１）。したがって、本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩は、ＧＰＲ７選択的なリガンド及びＧＰＲ７選択的なアゴニストとして機能する。【００３４】
（医薬）
本発明の医薬は、本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する。ＧＰＲ７及びＧＰＲ７リガンドが関与する疾患や症状に対して本発明の医薬は適用可能であるが、具体的な医薬としては、肥満、糖尿病又は過食症の予防・治療剤、食欲増進剤、下垂体ホルモンの分泌不全の予防・治療剤、睡眠障害（不眠等）の予防・治療剤、鎮痛剤、ストレス（ストレス性の過食・不眠等）の予防・治療剤などである。【００３５】
本発明の医薬は、その投与形態に合わせ、本発明の化合物に薬剤学的に許容される添加剤を加えて各種製剤化することができる。添加剤としては、製剤分野において通常用いられる各種の添加剤が使用可能であり、例えばゼラチン、乳糖、白糖、酸化チタン、デンプン、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、トウモロコシデンプン、マイクロクリスタリンワックス、白色ワセリン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、無水リン酸カルシウム、クエン酸、クエン酸三ナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ソルビトール、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリソルベート、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン、硬化ヒマシ油、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸マグネシウム、軽質無水ケイ酸、タルク、植物油、ベンジルアルコール、アラビアゴム、プロピレングリコール、ポリアルキレングリコール、シクロデキストリン及びヒドロキシプロピルシクロデキストリン等が挙げられる。【００３６】
これらの添加剤との混合物として製剤化される剤形としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤若しくは坐剤等の固形製剤；シロップ剤、エリキシル剤若しくは注射剤等の液体製剤等が挙げられる。これらは、製剤分野における通常の方法に従って調製することができる。なお、液体製剤にあっては、用時に水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁させる様式であってもよい。また、特に注射剤の場合、必要に応じて生理食塩水又はブドウ糖液に溶解又は懸濁させてもよく、更に緩衝剤や保存剤を添加してもよい。【００３７】
本発明の化合物を例えば臨床の場で使用する場合、その投与量及び投与回数は、患者の性別、年齢、体重、症状の程度及び目的とする処置効果の種類と範囲等により異なるが、一般に経口投与の場合、成人１日あたり、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０３〜１ｍｇ／ｋｇを１〜数回に分けて、また非経口投与の場合は、０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．００１〜０．１ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．０１〜０．１ｍｇ／ｋｇを１〜数回に分けて投与するのが好ましい。通常の内科医、獣医又は臨床医は病状進行を阻止し、抑制し又は停止させるに必要な効果的薬物量を容易に決定し処理することができる。【００３８】
本発明の医薬は、本発明の化合物を全薬剤１．０〜１００重量％、好ましくは１．０〜６０重量％の割合で含有することができる。これらの製剤は、また、治療上有効な他の化合物を含んでいてもよい。【００３９】
（スクリーニング方法）
ＧＰＲ７に結合する化合物をスクリーニングする本発明の方法は以下の工程を備える：
（ａ）候補化合物が存在する条件及び存在しない条件の下で、ＧＰＲ７と本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩とを接触させ、ＧＰＲ７と本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩との結合量を測定する工程及び
（ｂ）ＧＰＲ７と本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩との結合量を変化させる候補化合物を選択する工程。【００４０】
ＧＰＲ７は様々な疾患や症状に関連することから、ＧＰＲ７に結合する化合物（アゴニスト及びアンタゴニスト）は、ＧＰＲ７が関与する疾患等の予防・治療薬となり得る。具体的には、肥満、糖尿病又は過食症の予防・治療剤、食欲増進剤、下垂体ホルモンの分泌不全の予防・治療剤、睡眠障害（不眠等）の予防・治療剤、鎮痛剤、ストレス（ストレス性の過食・不眠等）の予防・治療剤などである。本発明のスクリーニング方法によれば、これらの医薬の候補化合物を選別することが可能である。【００４１】
本発明のスクリーニング方法に用いるＧＰＲ７は、ＧＰＲ７発現細胞の膜画分を利用することができる。ＧＰＲ７は哺乳動物、特にヒト由来のＧＰＲ７であることが好ましい。ＧＰＲ７発現細胞の膜画分は特開２００４−４９００３号公報に記載の方法に従って調製することができる。具体的な調製方法は次の通りである。公知の配列情報に基づいて、ＧＰＲ７のｃＤＮＡをＰＣＲ法等により増幅し、増幅したｃＤＮＡを適切な発現ベクターにクローニングする。ＧＰＲ７が挿入された発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトして、ＧＰＲ７発現細胞を得る。ＧＰＲ７発現細胞を破砕し、細胞破砕液から分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などによって膜画分を調製する。膜画分には、発現したＧＰＲ７及びリン脂質や膜タンパク質などの膜成分が多く含まれる。このようなＧＰＲ７発現細胞の膜画分の調製は、公知の方法を用いて当業者は容易に行うことができる。なお、本発明のスクリーニング方法に用いるＧＰＲ７は、ＧＰＲ７発現細胞の膜画分ではなくＧＰＲ７発現細胞そのものであってもよい。【００４２】
本発明のスクリーニング方法に用いる本発明の化合物は、ＧＰＲ７との結合量を測定するために、標識されていることが好ましい。標識及び標識方法は特に制限されず、当業者にとって公知の標識及び標識方法を利用することができる。具体的には、［３Ｈ］、［１２５Ｉ］、［１４Ｃ］及び［３５Ｓ］などで放射標識を利用することができ、特に［１２５Ｉ］による放射標識が好ましい。【００４３】
工程（ａ）は、候補化合物が存在する条件及び存在しない条件の下で、ＧＰＲ７と本発明の化合物とを接触させ、その結合量を測定する工程である。ここで、ＧＰＲ７と本発明の化合物との接触は、適切なバッファー中で行う。好ましくはｐＨ６〜８のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどを使用するが、ＧＰＲ７、本発明の化合物及び候補化合物の結合を阻害しない限りバッファーの種類は特に限定されない。必要に応じて、ＧＰＲ７、本発明の化合物及び候補化合物間の非特異的結合を低減させる目的のために、界面活性剤などをバッファーに加えてもよい。また、必要に応じて、ＧＰＲ７、本発明の化合物及び候補化合物の分解を抑制する目的のために、プロテアーゼ阻害剤をバッファーに加えてもよい。候補化合物が存在しない条件下又は存在する条件下（例えば、１０−１０Ｍ〜１０−７Ｍの濃度範囲で）、一定量の標識された本発明の化合物（例えば、５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐｍの範囲内で設定する）とＧＰＲ７とを含んだバッファーをインキュベートする。インキュベーション温度は４℃〜３７℃が好ましく、インキュベーション時間は３０分〜３時間が好ましい。インキュベーション後、グラスフィルター等で濾過し、適量のバッファーで洗浄し、グラスフィルター上の標識の量を測定して（液体シンチレーションカウンターやγ−カウンターで放射活性を測定する）、ＧＰＲ７と本発明の化合物との結合量を測定する。【００４４】
工程（ｂ）は、ＧＰＲ７と本発明の化合物との結合量を変化させる候補化合物を選択する工程である。工程（ａ）で測定した結合量が、候補化合物の存在下及び非存在下で結合量に変化がないかどうかを調べる。例えば、候補化合物の非存在下の結合量（Ｂ０）から非特異的な結合量（ＮＳＢ）を引いた数値（Ｂ０−ＮＳＢ）を１００％としたとき、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が５０％以下になる候補化合物をＧＰＲ７に結合する化合物として選択することができる。あるいは、ＩＣ５０が所定値（例えば、１〜１００ｎＭ）以下の候補化合物をＧＰＲ７に結合する化合物として選択してもよい。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例を挙げて本発明について更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００４６】
（合成例１）  ｈＮＰＷ：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐの合成
Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＮｏｖａＳｙｎ（商標）  ＴＧＡ  ｒｅｓｉｎ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社）を出発原料とし、ペプチド合成機Ｐｉｏｎｅｅｒ（商標）モデル９０１０を用いて、ＨＡＴＵ（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロリン酸）を縮合試薬としたＦｍｏｃ法で、ペプチド合成を行った。具体的には、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ，Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ，Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）の順で縮合を行い、Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＮｏｖａＳｙｎ（商標）  ＴＧＡ  ｒｅｓｉｎを得た。この樹脂にＴＦＡ／チオアニソール／エタンジチオール／ｍ−クレゾール（９５／２．５／１．５／１）を加え室温で１時間３０分振盪した後、樹脂をろ去した。このろ液に冷却したエーテルを加え、粗Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐを沈殿として得た。この粗ペプチドをＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＱ，Ｓ−５，１２０Ａカラム（２０×２５０ｍｍ）を用いた逆相分取ＨＰＬＣで精製し、目的物を含む分画を回収、凍結乾燥することにより目的物を得た。【００４７】
ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
Ａ液：０．１％ＴＦＡを含む水
Ｂ液：０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル
グラジエント：Ａ／Ｂ＝９５／５で１分間溶出した後、Ａ／Ｂ＝７５／２５〜６０／４０（リニアー）で１５分間溶出
流速：１０ｍＬ／分【００４８】
（合成例２）  ｄｅｓＢｒ−ｈＮＰＢ：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａの合成
出発原料にＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＮｏｖａＳｙｎ（商標）  ＴＧＡ  ｒｅｓｉｎを用いて、合成例１と同様の方法により、ｄｅｓＢｒ−ｈＮＰＢを合成した。ＨＰＬＣのグラジエントは、Ａ／Ｂ＝９５／５で１分間溶出した後、Ａ／Ｂ＝８０／２０〜６５／３５（リニアー）で１５分間溶出するという条件で行った。【００４９】
（合成例３）  ［Ｐｈｅ２，２８］−ｈＮＰＷ：Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐの合成
合成例１と同様の方法により、［Ｐｈｅ２，２８］−ＮＰＷを合成した。逆相分取ＨＰＬＣのグラジエントは、Ａ／Ｂ＝９５／５で１分間溶出した後、Ａ／Ｂ＝７０／３０〜５５／４５で１５分間溶出するという条件で行った。【００５０】
（合成例４）  ｄｅｓＢｒ−ｈＮＰＢ（１−２３）−ＮＨ２：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＮＨ２の合成
出発原料にＮｏｖａＳｙｎ（商標）  ＴＧＲ  ｒｅｓｉｎを用いて、合成例１と同様の方法により、ｄｅｓＢｒ−ｈＮＰＢ（１−２３）−ＮＨ２を合成した。逆相分取ＨＰＬＣのグラジエントは、Ａ／Ｂ＝９５／５で１分間溶出した後、Ａ／Ｂ＝７８／２２〜５８／４２（リニアー）で１０分間溶出するという条件で行った。【００５１】
（合成例５）  ［ｄｅｓ４−１３，Ａｖａ１］−ｄｅｓＢｒ−ｈＮＰＢ（１−２３）−ＮＨ２：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｖａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＮＨ２の合成
合成例４と同様の方法により、［ｄｅｓ４−１３，Ａｖａ１］−ｄｅｓＢｒ−ｈＮＰＢ（１−２３）−ＮＨ２を合成した。逆相分取ＨＰＬＣのグラジエントは、Ａ／Ｂ＝９５／５で２分間溶出した後、Ａ／Ｂ＝８０／２０〜６０／４０（リニアー）で１５分間溶出するという条件で行った。【００５２】
（合成例６）  ［ｄｅｓ４−１３，Ａｖａ２］−ｄｅｓＢｒ−ｈＮＰＢ（１−２３）−ＮＨ２：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｖａ−Ａｖａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＮＨ２の合成
合成例５と同様の方法により、［ｄｅｓ４−１３，Ａｖａ２］−ｄｅｓＢｒ−ｈＮＰＢ（１−２３）−ＮＨ２を合成した。【００５３】
（合成例７）  ［ｄｅｓ４−１３，Ａｖａ３］−ｄｅｓＢｒ−ｈＮＰＢ（１−２３）−ＮＨ２：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｖａ−Ａｖａ−Ａｖａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＮＨ２の合成
合成例５と同様の方法により、［ｄｅｓ４−１３，Ａｖａ３］−ｄｅｓＢｒ−ｈＮＰＢ（１−２３）−ＮＨ２を合成した。【００５４】
（合成例８）  ［ｄｅｓ４−１３，Ａｖａ４］−ｄｅｓＢｒ−ｈＮＰＢ（１−２３）−ＮＨ２：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｖａ−Ａｖａ−Ａｖａ−Ａｖａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＮＨ２の合成
合成例５と同様の方法により、［ｄｅｓ４−１３，Ａｖａ４］−ｄｅｓＢｒ−ｈＮＰＢ（１−２３）−ＮＨ２を合成した。【００５５】
（合成例９）  ［ｄｅｓ４−１３，Ａｖａ５］−ｄｅｓＢｒ−ｈＮＰＢ（１−２３）−ＮＨ２：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｖａ−Ａｖａ−Ａｖａ−Ａｖａ−Ａｖａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＮＨ２の合成
合成例５と同様の方法により、［ｄｅｓ４−１３，Ａｖａ５］−ｄｅｓＢｒ−ｈＮＰＢ（１−２３）−ＮＨ２を合成した。【００５６】
（合成例１０）  ［ｄｅｓ４−１３，Ａｖａ−Ａｖａ−２Ａｂｚ］−ｄｅｓＢｒ−ｈＮＰＢ（１−２３）−ＮＨ２：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｖａ−Ａｖａ−２Ａｂｚ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＮＨ２の合成
合成例５と同様の方法により、［ｄｅｓ４−１３，Ａｖａ−Ａｖａ−２Ａｂｚ］−ｄｅｓＢｒ−ｈＮＰＢ（１−２３）−ＮＨ２を合成した。粗ペプチドの精製は、Ｃｏｍｂｉ  ＨＴ  ＳＢ−Ｃ１８，Ｓ−５，１２０Ａカラム（２１．１×１５０ｍｍ）を用いた逆相分取ＨＰＬＣで行った。【００５７】
ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
Ａ液：０．１％ＴＦＡを含む水
Ｂ液：０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル
グラジエント：Ａ／Ｂ＝９５／５で１分間溶出した後、Ａ／Ｂ＝９５／５〜４０／６０（リニアー）で８分間溶出
流速：２０ｍＬ／分【００５８】
（合成例１１）  ［ｄｅｓ４−１３，Ａｖａ−Ａｖａ−３Ａｂｚ］−ｄｅｓＢｒ−ｈＮＰＢ（１−２３）−ＮＨ２：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｖａ−Ａｖａ−３Ａｂｚ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＮＨ２の合成
合成例１０と同様の方法により、［ｄｅｓ４−１３，Ａｖａ−Ａｖａ−３Ａｂｚ］−ｄｅｓＢｒ−ｈＮＰＢ（１−２３）−ＮＨ２を合成した。【００５９】
（合成例１２）  ［ｄｅｓ４−１３，Ａｖａ−Ａｖａ−４Ａｂｚ］−ｄｅｓＢｒ−ｈＮＰＢ（１−２３）−ＮＨ２：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｖａ−Ａｖａ−４Ａｂｚ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＮＨ２の合成
合成例１０と同様の方法により、［ｄｅｓ４−１３，Ａｖａ−Ａｖａ−４Ａｂｚ］−ｄｅｓＢｒ−ｈＮＰＢ（１−２３）−ＮＨ２を合成した。【００６０】
（合成例１３）  ［ｄｅｓ４−１３，Ａｖａ−２Ａｂｚ−Ａｖａ］−ｄｅｓＢｒ−ｈＮＰＢ（１−２３）−ＮＨ２：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｖａ−２Ａｂｚ−Ａｖａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＮＨ２の合成
合成例１０と同様の方法により、［ｄｅｓ４−１３，Ａｖａ−２Ａｂｚ−Ａｖａ］−ｄｅｓＢｒ−ｈＮＰＢ（１−２３）−ＮＨ２を合成した。【００６１】
（合成例１４）  ［ｄｅｓ４−１３，Ａｖａ−３Ａｂｚ−Ａｖａ］−ｄｅｓＢｒ−ｈＮＰＢ（１−２３）−ＮＨ２：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｖａ−３Ａｂｚ−Ａｖａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＮＨ２の合成
合成例１０と同様の方法により、［ｄｅｓ４−１３，Ａｖａ−３Ａｂｚ−Ａｖａ］−ｄｅｓＢｒ−ｈＮＰＢ（１−２３）−ＮＨ２を合成した。【００６２】
（合成例１５）  ［ｄｅｓ４−１３，Ａｖａ−４Ａｂｚ−Ａｖａ］−ｄｅｓＢｒ−ｈＮＰＢ（１−２３）−ＮＨ２：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｖａ−４Ａｂｚ−Ａｖａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＮＨ２の合成
合成例１０と同様の方法により、［ｄｅｓ４−１３，Ａｖａ−４Ａｂｚ−Ａｖａ］−ｄｅｓＢｒ−ｈＮＰＢ（１−２３）−ＮＨ２を合成した。【００６３】
（合成例１６）  ［ｄｅｓ４−１３，２Ａｂｚ−Ａｖａ−Ａｖａ］−ｄｅｓＢｒ−ｈＮＰＢ（１−２３）−ＮＨ２：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−２Ａｂｚ−Ａｖａ−Ａｖａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＮＨ２の合成
合成例１０と同様の方法により、［ｄｅｓ４−１３，２Ａｂｚ−Ａｖａ−Ａｖａ］−ｄｅｓＢｒ−ｈＮＰＢ（１−２３）−ＮＨ２を合成した。【００６４】
（合成例１７）  ［ｄｅｓ４−１３，３Ａｂｚ−Ａｖａ−Ａｖａ］−ｄｅｓＢｒ−ｈＮＰＢ（１−２３）−ＮＨ２：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−３Ａｂｚ−Ａｖａ−Ａｖａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＮＨ２の合成
合成例１０と同様の方法により、［ｄｅｓ４−１３，３Ａｂｚ−Ａｖａ−Ａｖａ］−ｄｅｓＢｒ−ｈＮＰＢ（１−２３）−ＮＨ２を合成した。【００６５】
（合成例１８）  ［ｄｅｓ４−１３，４Ａｂｚ−Ａｖａ−Ａｖａ］−ｄｅｓＢｒ−ｈＮＰＢ（１−２３）−ＮＨ２：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−４Ａｂｚ−Ａｖａ−Ａｖａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＮＨ２の合成
合成例１０と同様の方法により、［ｄｅｓ４−１３，４Ａｂｚ−Ａｖａ−Ａｖａ］−ｄｅｓＢｒ−ｈＮＰＢ（１−２３）−ＮＨ２を合成した。【００６６】
（合成例１９）  ［Ｐｈｅ２］−ｈＮＰＷ（１−２３）：Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕの合成
出発原料にＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＮｏｖａＳｙｎ（商標）  ＴＧＡ  ｒｅｓｉｎ（ｎｏｖａｂｕｏｃｈｅｍ社）を用いて、合成例１と同様の方法により、［Ｐｈｅ２］−ＮＰＷ（１−２３）を合成した。ＨＰＬＣのグラジエントは、Ａ／Ｂ＝９５／５で２分間溶出した後、Ａ／Ｂ＝８０／２０〜６０／４０（リニアー）で１５分間溶出するという条件で行った。【００６７】
試験例１
（１）  ラクトペルキシダーゼ法を用いた放射ヨード標識ｈＮＰＷ（［１２５Ｉ］−［Ｐｈｅ２］−ｈＮＰＷ（１−２３））の作製【００６８】
１ｎｍｏｌの［Ｐｈｅ２］−ｈＮＰＷ（１−２３）（合成例１９で調製）を５μＬの無水ＤＭＳＯに溶かし、５μＬの０．１Ｍ塩化ニッケルと混合した。続いて、１０μＬの０．００１％過酸化水素水、１０μＬの酵素液（０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液で１０μｇ/ｍＬに調整したラクトパーオキシダーゼ（シグマ社））およびＩｏｄｉｎｅ−１２５（アマシャム）３７Ｍｂｑ／１０μＬと混合した後、室温で６０分間反応させた。１０μＬの１％アジ化ナトリウムを加えて反応を停止した後、ＰＤ−１０ゲルろ過カラム（アマシャム社）により、放射標識ペプチド画分を分取し、［１２５Ｉ］−［Ｐｈｅ２］−ｈＮＰＷ（１−２３）を得た。【００６９】
（２）  結合阻害試験
ヒトＧＰＲ７又はＧＰＲ８をコードするｃＤＮＡ配列［Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２８巻、８４頁（１９９５年）参照］をＰＣＲ法にて増幅し、発現ベクターｐＩＲＥＳ−ｈｙｇｒｏ（クロンテック社）にクローニングした。得られた発現ベクターをカチオン性脂質法［Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎａｔｉｏｎａｌ  ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｎｉｔｅｄ  ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ、８４巻、７４１３頁（１９８７年）参照］を用いてＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ＢＬＡ細胞（ＡＵＲＯＲＡ社）にトランスフェクトし、ＧＰＲ７又はＧＰＲ８発現細胞を得た。【００７０】
ＧＰＲ７又はＧＰＲ８を発現する細胞から調製した膜標品を被検化合物及び２８、０００ｃｐｍの［１２５Ｉ］−［Ｐｈｅ２］−ｈＮＰＷ（１−２３）とともに、アッセイ緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、  ｐＨ７．４）中で室温にて１時間インキュベーションした後、グラスフィルターＧＦ／Ｃにて濾過した。２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）にて洗浄後、グラスフィルター上の放射活性を測定した。非特異的結合は１μＭ  ｈＮＰＷ（合成例１で調製）存在下で測定し、［Ｐｈｅ２］−ｈＮＰＷ（１−２３）特異的結合に対する被験化合物の５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）を算出した［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、５５巻、１１０１頁（１９９９年）参照］。【００７１】
試験例２  各種合成ペプチドのＧＰＲ７及びＧＰＲ８の活性化能の測定
Ｚｌａｋａｒｍｉｋの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８年，２７９巻，８４頁参照）に従い、各種合成ペプチドのＧＰＲ７又はＧＰＲ８に対する活性を測定した。ＧＰＲ７又はＧＰＲ８を発現させたＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ＢＬＡ細胞（試験例１の（２）において調製）を、ＰＢＳ（−）緩衝液（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）で２回洗浄した後、Ｃｅｌｌ−ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）を添加し、ＣＯ２インキュベーター内にて３７℃で３分間保温し、培養フラスコを軽くたたいて細胞をフラスコから遊離させた。遠心操作により細胞を回収後、０．１％ＢＳＡ（シグマ社）を含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）に懸濁して細胞数を計測し、８×１０５細胞／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。終濃度の５０倍濃度の各被検化合物を含むＤＭＳＯ溶液２μＬに、終濃度１μＭになるようにフォルスコリン（シグマ社）を加えた０．１％ＢＳＡを含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地５０μＬを添加し、反応溶液とした。この反応溶液に、上記細胞懸濁液５０μＬを添加して反応を開始し、ＣＯ２インキュベーター内にて３７℃で３時間保温した。【００７２】
次に、ＢＬＡアッセイキット（ＡＵＲＯＲＡ社）を用いて、Ａ液［１ｍＭ  ＣＣＦ２−ＡＭ／無水ＤＭＳＯ溶液］１２μＬ、Ｂ液［１００ｍｇ／ｍＬ  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ１２７，０．１％酢酸／ＤＭＳＯ溶液］１２０μＬ、Ｃ液［２４％（ｗ／ｗ）  ＰＥＧ−４００，１８％  ＴＲ４０／Ｈ２Ｏ］２ｍＬの割合で混ぜた色素導入緩衝液を調製し、色素導入緩衝液２０μＬを上記細胞反応液に添加し、細胞内にβラクタマーゼ基質（ＣＣＦ２−ＡＭ）を導入した。室温で１時間放置した後、励起波長４０９ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍ（ＣＣＦのβラクタマーゼ水解産物）及び５３０ｎｍ（ＣＣＦ）におけるサンプルの蛍光強度を測定した。βラクタマーゼ活性（４６０ｎｍでの蛍光強度／５３０ｎｍでの蛍光強度）を指標に、各種ペプチドのＧＰＲ７又はＧＰＲ８に対する活性を測り、被験化合物の５０％有効濃度（ＥＣ５０）を算出した。【００７３】
合成例４〜９で得られたペプチドを用いた場合のＩＣ５０及びＥＣ５０を表１に、合成例１０〜１８及び１で得られたペプチドを用いた場合のＩＣ５０を表２に示す。【００７４】
【表１】
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【００７５】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明の化合物は、ＧＰＲ７に選択的なリガンドであり、摂食、エネルギー代謝及び内分泌調節に関連した疾患の治療・予防に有効である。
【配列表】
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【国際調査報告】
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