【手続補正書】
【提出日】令和2年7月2日(2020.7.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、関心対象の複数のポリヌクレオチドを含むライブラリを構築する方法:
(a) 単離されたポックスウイルスゲノムを切断して第1のウイルス断片および第2のウイルス断片を産生する段階であって、該第1の断片が該第2の断片と非相同的である、段階;
(b) 5'隣接領域および3'隣接領域と隣接している関心対象のポリヌクレオチドを各々が含むトランスファープラスミドの集団を提供する段階であって、該5'隣接領域が該第1のウイルス断片の3'末端と相同な領域を含み、かつ該3'隣接領域が該第2のウイルス断片の5'末端と相同な領域を含み、かつ該トランスファープラスミドが、生存可能なポックスウイルスゲノムが形成されるように該第1のウイルス断片および該第2のウイルス断片と相同組み換えすることができる、段階;
(c) ポックスウイルス感染性を許容する哺乳動物宿主細胞に該トランスファープラスミドならびに該第1のウイルス断片および該第2のウイルス断片をトランスフェクションする段階であって、該宿主細胞がトランスフェクション後に細胞培地中で維持される、段階;
(d) ポックスウイルスアセンブリ阻害剤を添加する段階;
(e) 該トランスファープラスミドならびに該第1のウイルス断片および該第2のウイルス断片に相同組み換えを起こさせ、それによって異種核酸を各々が含む生存可能な改変ポックスウイルスゲノムのライブラリを生成する段階; ならびに
(f) 該ライブラリを回収する段階。
【請求項２】
ポックスウイルスアセンブリ阻害剤が、リファンピシン(リファンピン)またはその誘導体である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
リファンピシンまたはその誘導体が、トランスフェクション後、約6時間、約12時間、約18時間、約24時間、約30時間、約36時間、約42時間、約48時間、約54時間、または約60時間の時点で、トランスフェクションされた細胞を含む細胞培地に添加される、請求項2記載の方法。
【請求項４】
リファンピシンまたはその誘導体が、約30 μg/ml、約40 μg/ml、約50 μg/ml、約60 μg/ml、約70 μg/ml、約80 μg/ml、約90 μg/ml、約100 μg/ml、約110 μg/ml、約120 μg/ml、または約130 μg/mlの濃度で細胞培地に添加される、請求項2または3記載の方法。
【請求項５】
リファンピシンまたはその誘導体を、約1日間、約2日間、約3日間、約4日間または約5日間、細胞培地に存在させ、リファンピシンまたはその誘導体での処理後に細胞培地が交換され、トランスフェクションされた宿主細胞が、約1日間、約2日間または約3日間、リファンピシンなしでさらに培養される、請求項2〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記ライブラリが、ポックスウイルスアセンブリ阻害剤の非存在下で構築されたライブラリよりも増加した数の独立した改変ポックスウイルスゲノムを含み、かつ
独立した改変ポックスウイルスゲノムの数が、少なくとも約1倍、約5倍、約10倍、約15倍、約20倍、約25倍もしくは約30倍増加するか、または
該ライブラリが、ポックスウイルスアセンブリ阻害剤の非存在下で構築されたライブラリよりも増加したウイルス力価を含む、
請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
単離されたポックスウイルスゲノムが単離されたワクシニアウイルスゲノムである、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
単離されたワクシニアウイルスゲノムが、WRゲノムもしくはその改変型誘導体、または改変ワクシニアウイルスアンカラ(MVA)ゲノムもしくはその改変型誘導体である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
単離されたポックスウイルスゲノムが、第1の制限エンドヌクレアーゼの第1の認識部位および第2の制限エンドヌクレアーゼの第2の認識部位を含み、かつ第1のウイルス断片および第2のウイルス断片が、該ウイルスゲノムを該第1の制限エンドヌクレアーゼおよび該第2の制限エンドヌクレアーゼで消化して該第1のウイルス断片および該第2のウイルス断片を単離することによって産生される、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
第1の制限酵素がNotIでありかつ第2の制限酵素部位がApaIである、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
単離されたワクシニアウイルスゲノムがv7.5/tkウイルスゲノムまたはvEL/tkウイルスゲノムである、請求項7〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
哺乳動物宿主細胞が、改変ワクシニアウイルスゲノムを感染性ワクシニアウイルス粒子へとパッケージングすることができる、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
トランスファープラスミドならびに第1のウイルス断片および第2のウイルス断片が、ヘルパーウイルスと共に哺乳動物宿主細胞中に導入され、該宿主細胞は、該ヘルパーウイルスの感染性ウイルス粒子の産生を許容しないが、感染性ワクシニアウイルス粒子への改変ワクシニアウイルスゲノムのパッケージングを支持する、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
トランスファープラスミドの5'隣接領域および3'隣接領域が、ワクシニアウイルスチミジンキナーゼ遺伝子またはワクシニアウイルスHindIII J断片と相同組み換えすることができ、かつ該トランスファープラスミドが、pVHE、pVLEおよびpVKEからなる群より選択されるプラスミド中にライゲーションされた挿入核酸を含む、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
複数の関心対象のポリヌクレオチドが各々、ワクシニアウイルス感染細胞中で発現することができる関心対象のポリペプチドのコード領域を含み、該トランスファープラスミドが、関心対象のポリヌクレオチドと機能的に結合しているポックスウイルスプロモーターをさらに含み、かつ該ポックスウイルスプロモーターが、ワクシニアウイルス感染細胞の細胞質中で機能する、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
複数の関心対象のポリヌクレオチドが各々、抗体重鎖可変領域もしくはその抗原結合断片、抗体軽鎖可変領域もしくはその抗原結合断片、またはそれらの組み合わせを含む抗体サブユニットポリペプチドをコードする、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
抗体サブユニットポリペプチドが、定常領域もしくはその断片、該抗体サブユニットポリペプチドの細胞表面発現もしくは分泌を指令することができるシグナルペプチド、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項16記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
本明細書において提供される方法の特定の局面において、宿主細胞は、改変ワクシニアウイルスゲノムを感染性ワクシニアウイルス粒子へとパッケージングすることができる。この局面によれば、トランスファープラスミドならびに第1および第2のウイルス断片は、ヘルパーウイルスを含むかまたは含むように感染させた哺乳動物宿主細胞中に導入することができ、宿主細胞は、ヘルパーウイルスの感染性ウイルス粒子の産生を許容しないが、感染性ワクシニアウイルス粒子への改変ワクシニアウイルスゲノムのパッケージングを支持する。
[本発明1001]
以下の段階を含む、関心対象の複数のポリヌクレオチドを含むライブラリを構築する方法:
(a) 単離されたポックスウイルスゲノムを切断して第1のウイルス断片および第2のウイルス断片を産生する段階であって、該第1の断片が該第2の断片と非相同的である、段階;
(b) 5'隣接領域および3'隣接領域と隣接している関心対象のポリヌクレオチドを各々が含むトランスファープラスミドの集団を提供する段階であって、該5'隣接領域が該第1のウイルス断片の3'末端と相同な領域を含み、かつ該3'隣接領域が該第2のウイルス断片の5'末端と相同な領域を含み、かつ該トランスファープラスミドが、生存可能なポックスウイルスゲノムが形成されるように該第1および第2のウイルス断片と相同組み換えすることができる、段階;
(c) ポックスウイルス感染性を許容する哺乳動物宿主細胞に該トランスファープラスミドならびに該第1および第2のウイルス断片を導入する段階;
(d) ポックスウイルスアセンブリ阻害剤を添加する段階; ならびに
(e) 該トランスファープラスミドならびに該第1および第2のウイルス断片に相同組み換えを起こさせ、それによって異種核酸を各々が含む生存可能な改変ポックスウイルスゲノムのライブラリを生成する段階。
[本発明1002]
(f) 前記ライブラリを回収する段階
をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
段階(c)が、哺乳動物宿主細胞にトランスファープラスミドならびに第1および第2のウイルス断片をトランスフェクションする段階を含み、かつ該宿主細胞がトランスフェクション後に細胞培地中に維持される、本発明1001または本発明1002の方法。
[本発明1004]
ポックスウイルスアセンブリ阻害剤が、リファンピシン(リファンピン)またはその誘導体である、本発明1003の方法。
[本発明1005]
リファンピシンまたはその誘導体が、トランスフェクション後約6時間、約12時間、約18時間、約24時間、約30時間、約36時間、約42時間、約48時間、約54時間、または約60時間の時点で、トランスフェクションされた細胞を含む細胞培地に添加される、本発明1004の方法。
[本発明1006]
リファンピシンまたはその誘導体が、約30 μg/ml、約40 μg/ml、約50 μg/ml、約60 μg/ml、約70 μg/ml、約80 μg/ml、約90 μg/ml、約100 μg/ml、約110 μg/ml、約120 μg/ml、または約130 μg/mlの濃度で細胞培地に添加される、本発明1004または本発明1005の方法。
[本発明1007]
リファンピシンまたはその誘導体を、約1日間、約2日間、約3日間、約4日間または約5日間、細胞培地にとどまらせる、本発明1004〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
細胞培地が、リファンピシンまたはその誘導体での処理後に交換され、トランスフェクションされた宿主細胞が約1日間、約2日間、または約3日間、リファンピシンなしでさらに培養される、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記ライブラリが、ポックスウイルスアセンブリ阻害剤の非存在下で構築されたライブラリよりも増加した数の独立した改変ポックスウイルスゲノムを含む、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
独立した改変ポックスウイルスゲノムの数が、ポックスウイルスアセンブリ阻害剤の非存在下で構築されたライブラリと比較して、少なくとも約1倍、約5倍、約10倍、約15倍、約20倍、約25倍、または約30倍増加する、本発明1009の方法。
[本発明1011]
前記ライブラリが、ポックスウイルスアセンブリ阻害剤の非存在下で構築されたライブラリよりも増加したウイルス力価を含む、本発明1001〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
単離されたポックスウイルスゲノムが、第1の制限エンドヌクレアーゼの第1の認識部位および第2の制限エンドヌクレアーゼの第2の認識部位を含み、かつ第1および第2のウイルス断片が、該ウイルスゲノムを該第1の制限エンドヌクレアーゼおよび該第2の制限エンドヌクレアーゼで消化して該第1および第2のウイルス断片を単離することによって産生される、本発明1001〜1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
単離されたポックスウイルスゲノムが単離されたワクシニアウイルスゲノムである、本発明1001〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
単離されたワクシニアウイルスゲノムが、WRゲノムまたはその改変型誘導体である、本発明1013の方法。
[本発明1015]
単離されたワクシニアウイルスゲノムが、改変ワクシニアウイルスアンカラ(MVA)ゲノムまたはその改変型誘導体である、本発明1013の方法。
[本発明1016]
第1および第2の制限酵素認識部位が、ワクシニアウイルスHindIII J断片中に位置する、本発明1012の方法。
[本発明1017]
第1の制限酵素がNotIである、本発明1013の方法。
[本発明1018]
第2の制限酵素部位がApaIである、本発明1013の方法。
[本発明1019]
単離されたワクシニアウイルスゲノムがv7.5/tkウイルスゲノムである、本発明1013の方法。
[本発明1020]
単離されたワクシニアウイルスゲノムがvEL/tkウイルスゲノムである、本発明1013の方法。
[本発明1021]
宿主細胞が、改変ワクシニアウイルスゲノムを感染性ワクシニアウイルス粒子へとパッケージングすることができる、本発明1013〜1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
トランスファープラスミドならびに第1および第2のウイルス断片が、ヘルパーウイルスを含む哺乳動物宿主細胞中に導入され、該宿主細胞は、該ヘルパーウイルスの感染性ウイルス粒子の産生を許容しないが、感染性ワクシニアウイルス粒子への改変ワクシニアウイルスゲノムのパッケージングを支持する、本発明1021の方法。
[本発明1023]
ヘルパーウイルスが鶏痘ウイルスである、本発明1022の方法。
[本発明1024]
トランスファープラスミドの5'隣接領域および3'隣接領域が、ワクシニアウイルスチミジンキナーゼ遺伝子と相同組み換えすることができる、本発明1013〜1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
トランスファープラスミドの5'隣接領域および3'隣接領域が、ワクシニアウイルスHindIII J断片と相同組み換えすることができる、本発明1024の方法。
[本発明1026]
トランスファープラスミドが、
(a) pVHE、
(b) pVLE、
(c) pVKE
からなる群より選択されるプラスミド中にライゲーションされた挿入核酸を含む、本発明1025の方法。
[本発明1027]
複数の関心対象のポリヌクレオチドが各々、ワクシニアウイルス感染細胞中で発現することができる関心対象のポリペプチドのコード領域を含む、本発明1013〜1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
トランスファープラスミドが、関心対象のポリヌクレオチドと機能的に結合している転写制御領域をさらに含み、かつ該転写制御領域がワクシニアウイルス感染細胞の細胞質中で機能する、本発明1027の方法。
[本発明1029]
転写制御領域がポックスウイルスプロモーターを含む、本発明1027または本発明1028の方法。
[本発明1030]
プロモーターがワクシニアp7.5プロモーター、ワクシニアpELプロモーター、またはワクシニアMH-5プロモーターである、本発明1029の方法。
[本発明1031]
複数の関心対象のポリヌクレオチドが各々、抗体重鎖可変領域もしくはその抗原結合断片、抗体軽鎖可変領域もしくはその抗原結合断片、またはそれらの組み合わせを含む抗体サブユニットポリペプチドをコードする、本発明1027〜1030のいずれかの方法。
[本発明1032]
抗体サブユニットポリペプチドが、定常領域もしくはその断片、該抗体サブユニットポリペプチドの細胞表面発現もしくは分泌を指令することができるシグナルペプチド、またはそれらの組み合わせをさらに含む、本発明1031の方法。