(57)【要約】  ヒトの個体で細胞内遊離マグネシウム欠乏の有無を決定するin vitroの方法が開示される。前記方法は、その発現率と細胞内遊離マグネシウムイオン濃度[Mg2+]iとの間で直接的相関関係を示す少なくとも1つの細胞Mg2+トランスポーター遺伝子の発現率を前記個体の細胞サンプルで測定する工程、および得られた発現率を参照値と比較する工程によって実施され、参照値と比較して発現率の増加は、当該個体が細胞内遊離マグネシウム欠乏に罹患していることを示す。適切なMg2+トランスポーター遺伝子にはCNNM2、SLC41A1およびSLC41A3が含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの個体における細胞内遊離マグネシウム欠乏の有無を決定するin vitroの方法であって、前記方法が、前記個体の細胞サンプルにおいて、その発現率と細胞内遊離マグネシウムイオン濃度[Mg2+]iとの間で直接的相関関係を示す少なくとも1つの細胞Mg2+トランスポーター遺伝子の発現率を測定する工程、および、得られた発現率を参照値と比較する工程によって実施され、参照値と比較した際の発現率の増加が、当該個体が細胞内遊離マグネシウム欠乏に罹患していることを示す、前記方法。
【請求項２】
a）個体の有核血液細胞サンプル、好ましくは白血球サンプルで、細胞Mg2+トランスポーター遺伝子のmRNAについて定量的PCRを実施する工程；
b）工程a）で得られた値を、細胞内遊離マグネシウム欠乏を示さない健常なヒトのサンプルから得た参照値と比較する工程；
を含む請求項１に記載の方法であって、参照値と比較した際の細胞Mg2+トランスポーター遺伝子の発現率の増加が、当該個体が細胞内遊離マグネシウム欠乏に罹患していることを示す、前記方法。
【請求項３】
細胞内遊離マグネシウム欠乏が、0.5mmol/L未満の細胞内遊離マグネシウムイオン濃度[Mg2+]iを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
参照値と比較した際の細胞Mg2+トランスポーター遺伝子の発現率の増加が少なくとも2倍である、請求項1−3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも2つの細胞マグネシウムトランスポーター遺伝子の発現率を測定する工程を含み、少なくとも1つの発現率の増強が細胞内遊離マグネシウム欠乏であることを示す、請求項1−4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
細胞内遊離マグネシウム欠乏が、真性糖尿病2型、インスリン耐性を伴うメタボリック症候群、肥満、本態性高血圧、アテローム硬化症、心筋症、急性心筋梗塞、脳卒中、精神病および他の精神医学疾患並びに神経変性疾患から成る群から選択される疾患または症状によって引き起こされる、請求項1−5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
その発現率と細胞内遊離マグネシウムイオン濃度[Mg2+]iとの間で直接的相関関係を示す細胞Mg2+トランスポーター遺伝子の発現率を測定することよりマグネシウム化合物の生体利用性を細胞で評価するin vitroの方法であって、
a）細胞内マグネシウム欠乏を有し、かつ細胞Mg2+トランスポーター遺伝子を発現する細胞を、マグネシウム化合物と接触させる工程、および
b）前記細胞Mg2+トランスポーター遺伝子の発現率を測定し、得られた値を参照値と比較する工程、
を含み、前記マグネシウム化合物との接触後における発現率の低下が、前記マグネシウム化合物の生体利用性を示す、前記方法。
【請求項８】
細胞内マグネシウム欠乏を有し、かつ細胞Mg2+トランスポーター遺伝子を発現する細胞が、マグネシウム枯渇細胞培養から得られた細胞および細胞内マグネシウム欠乏に罹患している哺乳動物、特にヒトから得られた細胞サンプルから選択される、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
細胞内マグネシウム欠乏を有し、かつ細胞Mg2+トランスポーター遺伝子を発現する細胞が、有核血液細胞、特に白血球である、請求項7または8に記載の方法。
【請求項１０】
細胞内遊離マグネシウムイオン濃度[Mg2+]iを調節することができる化合物を同定するin vitroの方法であって、
a）その発現率と細胞内遊離マグネシウムイオン濃度[Mg2+]iとの間で直接的相関関係を示す細胞Mg2+トランスポーター遺伝子を発現する細胞を提供する工程、および
b）前記細胞を候補化合物と接触させる工程、および
c）前記細胞Mg2+トランスポーター遺伝子の発現率を測定する工程を含み、
前記候補化合物との接触後における発現率の上昇または低下が細胞内[Mg2+]iの調節物質であることを示す、前記方法。
【請求項１１】
細胞Mg2+トランスポーター遺伝子を発現し、候補化合物と接触させる細胞が、前記候補化合物と接触させた細胞培養に由来する培養細胞である、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
細胞Mg2+トランスポーター遺伝子を発現し、候補化合物と接触させる細胞が、前記候補化合物を投与された哺乳動物、特にヒト由来の有核血液細胞サンプル、特に白血球サンプルから得られる、請求項10に記載の方法。
【請求項１３】
細胞Mg2+トランスポーター遺伝子が、CNNM2、SLC41A1およびSLC41A3から成る群から選択される、請求項1−12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項1−13のいずれか1項に記載の方法を実施するためのキットであって、その発現率と細胞内遊離マグネシウムイオン濃度[Mg2+]iとの間で直接的相関関係を示す少なくとも1つまたは2つ以上のMg2+トランスポーターマーカー遺伝子（特にCNNM2、SLC41A1およびSLC41A3から選択される）、および任意で少なくとも1つのコントロール遺伝子の定量的PCRを実施するための試薬、並びに任意でさらに別の試薬および／または緩衝剤を含む、前記キット。
【請求項１５】
Mg2+トランスポーターマーカー遺伝子（特にCNNM2、SLC41A1およびSLC41A3から選択される）、および任意で少なくとも1つのコントロール遺伝子の参照cDNA、並びに前記参照cDNAのPCR増幅のための対応するプライマー（フォワードおよびリバース）を含む、請求項14に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
マグネシウムは、細胞内の400を超える重要な分子プロセス、さらにまた組織、器官および生物レベルにおける多様な生理学的プロセスのために必須の微小成分である。マグネシウムの多様な機能を維持するために、細胞外および細胞内マグネシウムの両方の濃度が、複雑な制御メカニズムによって調節される。主として、細胞内マグネシウムの恒常性は、マグネシウムイオンを外部から細胞内へまたは細胞内から外部へマグネシウムイオンを運搬する種々の輸送系によって維持される。
細胞レベルおよび生物レベルの両方で、マグネシウム欠乏は多様な疾患（いわゆる“西洋”病を含む）の進行および／または症状に密接に関係する。これらは特に、インスリン耐性を伴うメタボリック症候群、真性糖尿病2型（DM2；患者のほぼ30%がマグネシウム欠乏である）、肥満、本態性高血圧、アテローム硬化症および心筋症、急性心筋梗塞、脳卒中、精神病および多様な精神医学疾患、並びに神経変性疾患である。
【０００２】
これまでのところ、マグネシウム欠乏の臨床検査は、血漿総マグネシウム（BPM；結合マグネシウムおよび遊離マグネシウムの合計）の測定または液の同様な測定に限られている。しかしながら、細胞内の総マグネシウム含有量の測定は非常に有益というわけではない。なぜならば、マグネシウムの大半は結合しているが、自由に利用できる（マグネシウムイオンとして）部分のみが生化学系の活性に影響を及ぼすからである。以下の従来技術は主として細胞のMg2+濃度の測定を可能にする：（1）迅速フィルターmag-fura2分光測光法（mag-fura2 FFS；比率測定式蛍光測定）、（2）NMR利用31P-NMR分光器および（3）Mg特異的イオン選択電極（ISE；電気生理学的技術）。これらの技術の欠点は、その運転コストの高さおよび得られたデータの評価のために特に訓練された人員を必要とする技術の複雑さである。結果として、それらは大半が研究目的のためにのみ用いられ、細胞内遊離Mg2+の判定のための日常的な臨床検査は現在のところ利用可能ではない。
したがって、本発明の主要目的は、細胞内マグネシウム欠乏の罹患が疑われる個体、特にヒトの個体の細胞内遊離マグネシウムの状態を評価するための比較的簡単で迅速な方法を提供することである。関連する目的は、哺乳動物、特にヒトでマグネシウム化合物の生体利用性を評価する方法、および細胞内遊離マグネシウム濃度の調節物質を同定する方法を提供することである。
これらの目的は、細胞Mg2+トランスポーター遺伝子の発現率を測定することを含む本発明の方法によって達成される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
ヒトの個体で細胞内遊離マグネシウム欠乏の有無を決定するin vitroの方法が開示される。本方法は、その発現率と細胞内遊離マグネシウムイオン濃度[Mg2+]iとの間で直接的相関関係を示す少なくとも1つの細胞Mg2+トランスポーター遺伝子の発現率を前記個体の細胞サンプルで測定する工程、および得られた発現率を参照値と比較する工程によって実施され、参照値と比較して発現率の増加は、当該個体が細胞内遊離マグネシウム欠乏に罹患していることを示す。適切なMg2+トランスポーター遺伝子にはCNNM2、SLC41A1およびSLC41A3が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】図1は、表1の4つの過剰発現遺伝子のGED発現レベルを示す。
【図２】図2は、表1に列挙した9遺伝子全ての参照白血球およびDM2白血球における発現の直接比較を示す（ゲル電気泳動後のPCR生成物）。
【図３】図3は、DM2グループの患者について得られた血漿[Mg]Tおよび[Mg2+]iデータの個々の値を記した図を示す。
【図４】前記4つの遺伝子の各々について、それぞれ[Mg2+]i（上図）および血漿[Mg]T（下図）の対応セットのGED値間における相関性解析を示す：（4A）CNNM2、（4B）SLC41A1、（4C）SLC41A2、（4D）SLC41A3。
【図５】300mgのMg2+の補充前および補充後におけるDM2患者の前記遺伝子の各々についてのGED値を示す：（5A）CNNM2、（5B）SLC41A2、（5C）SLC41A1、および（5D）SLC41A3。
【図６】補充前および補充後におけるDM2患者の血漿総マグネシウム濃度[Mg]Tを示す。
【図７】マルチミネラル調製物を補充した健常ドナーにおけるCNNM2、SLC41A1、SLC41A2、およびSLC41A3のGED値を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
ヒトの個体で細胞内遊離マグネシウムの状態を評価する、特に細胞内遊離マグネシウム欠乏の有無を決定する本発明の方法は、一般的には、その発現率(expression rate)と細胞内遊離マグネシウムイオン濃度[Mg2+]iとの間で直接的相関関係を示す少なくとも1つの細胞Mg2+トランスポーター遺伝子の発現率を前記個体の細胞サンプルで測定する工程、および得られた発現率を参照値と比較する工程を含み、参照値と比較して発現率の増加は、当該個体が細胞内遊離マグネシウム欠乏に罹患していることを示す。
より具体的には、本方法は以下の工程、
a）個体の有核血液細胞サンプル、好ましくは白血球サンプルで、その発現率と細胞内遊離マグネシウムイオン濃度[Mg2+]iとの間で直接的相関関係を示す細胞Mg2+トランスポーター遺伝子のmRNAについて定量的PCRを実施する工程、
b）細胞内遊離マグネシウム欠乏を示さない健常なヒトの有核血液細胞サンプル、好ましくは白血球サンプルから得られた参照値と工程a）で得られた値を比較する工程を含み、参照値と比較して細胞Mg2+トランスポーター遺伝子の発現率の増加は、当該個体が細胞内遊離マグネシウム欠乏に罹患していることを示す。
【０００６】
好ましくは、細胞内遊離マグネシウム欠乏を示す、参照値と比較した細胞Mg2+トランスポーター遺伝子の発現率の増加は少なくとも2倍である。
本発明のある具体的な実施態様では、本方法は、少なくとも2つの細胞マグネシウムトランスポーター遺伝子、好ましくは3つまたは4つ以上の細胞マグネシウムトランスポーター遺伝子の発現率を測定する工程を含み、少なくとも1つの発現率の増強により細胞内遊離マグネシウム欠乏が示される。
Mg2+トランスポーターおよび／または恒常性因子をコードするいくつかの遺伝子が、最近動物で同定され（下記参考文献1−10を比較されたい、表1に要約する）、それらの発現は、遺伝子N33（Caco-2細胞のMg2+飢餓実験で同定された（本発明者らの未公表の結果））を除いて食事によるマグネシウム摂取と関係する（細胞内Mg2+濃度に反映される）ことがマウスで示された（Goytain and Quamme；2005-2007；腎皮質細胞）。
【０００７】
【表１】
2012520662.tif 000002
【０００８】
本発明者らは、これら9遺伝子のホモローグがヒトの白血球で発現されることを示すことができた。多様な培養細胞を用いたさらに別の実験は、前記ヒト遺伝子のいくつかの発現がマグネシウムを含まない培養液中で細胞をインキュベートした場合に相当に増加することを示した。このことは、マグネシウムの存在しない培養液によって引き起こされた細胞のマグネシウム欠乏をいくつかのMg2+トランスポーターの産生増加によって代償しようとする傾向が細胞レベルで存在することを示唆している。
これらの観察によって、そのようなMg2+トランスポーター遺伝子の発現は臨床的なMg2+欠乏に密接に関係するマーカーとして用いることができるという仮説に帰着し、この仮説の確認または否定に適した検査系を確立するために広範囲の実験シリーズを実施した。驚くべきことには、本発明者らは最終的にいくつかのヒト遺伝子を同定することができ、これら遺伝子は、通常の方法で測定したとき、転写レベルにおける前記遺伝子の発現率と細胞内Mg2+濃度との間で直接的相関関係を示した。本明細書で用いられる”直接的相関関係”という用語は、前記相関関係が、相関する事柄（すなわち発現率と細胞内Mg2+濃度）間において直接的依存性または因果関係を伴うことを意味する。
【０００９】
候補遺伝子の発現率は、定量的リアルタイムPCR（今日では中程度から大きい病院で一般的に利用可能な標準的分析技術）によって測定した。この目的のために、表1に列挙したMg2+トランスポーターをコードする遺伝子の公知のヒト配列に対して特異的なプライマーを設計した。この方法では、市販ソフトのプログラムを用い、ヘアピン構造の形成およびプライマーのダイマー形成のリスクを最小限にした。表2は、それぞれのmRNAまたはその対応する部分の増幅のために用いたそのような最適化プライマー配列の編集物を示す。しかしながら、基本的には他の適切なプライマーも同様に構築し使用することができる。
好ましくは、細胞内遊離マグネシウムの状態の評価のために新しく単離した白血球が本発明の検査方法でサンプル細胞として用いられる。これとは対照的に、通常では筋肉生検由来の赤血球または筋細胞が、細胞内遊離マグネシウムイオン濃度を細胞で測定するために検査で用いられてきた。筋肉細胞とは対照的に白血球の使用は有利である。なぜならば、白血球は容易で安全で臨床的に標準化され、さらに侵襲性が最も少ないサンプル物質の採集方法（血液サンプリング）を伴うからである。赤血球は本発明の方法で使用するには適切ではない。なぜならば、赤血球は核を含まず結果として転写レベルの調節が不可能であるからである。
【００１０】
真性糖尿病2型（DM2；インスリン非依存性糖尿病）の患者はマグネシウム要求が上昇することが確認されている。広範囲の疫学調査および介入実験によって、DM2はマグネシウム恒常性障害と連関していることを示す多くの証拠が提供されている。したがって、DM2を細胞内遊離マグネシウム欠乏の症状のモデルとして選択し、DM2患者由来の白血球サンプルを用いて本発明の検査方法で使用する適切なマーカーとして多数のMg2+トランスポーター遺伝子を同定した。しかしながら一般的には、本発明は、特に真性糖尿病2型、インスリン耐性を伴うメタボリック症候群、肥満、本態性高血圧、アテローム硬化症、心筋症、急性心筋梗塞、脳卒中、精神病および他の精神医学疾患並びに神経変性疾患から成る群から選択される疾患または症状によって引き起こされる細胞内遊離マグネシウム欠乏の任意の症状に適用することができる。好ましくは、本明細書で用いられる“細胞内遊離マグネシウム欠乏”という用語は、0.5mmol/L未満の細胞内遊離マグネシウムイオン濃度[Mg2+]iに対応する。
【００１１】
下記の実施例１で詳細に輪郭を示した実験では、表1の全9遺伝子のヒトホモローグの発現レベルを56人のDM2患者由来の白血球サンプルおよび5人の健常個体由来の参照サンプルで解析した。これらの実験は、遺伝子CNNM2、SLC41A1、SLC41A2、およびSLC41A3がDM2患者の大きな亜集団で有意に過剰発現されることを示したが、遺伝子TRPM6、TRPM7、MagT1、NIPA1およびN33は参照グループに対して差異がないことを示した。この結果は、特に遺伝子TRPM6について驚くべきことであった（前記は、マウスモデルの結果を基にして同様に顕著に過剰発現されると予想された）。有意な過剰発現の閾値は、2またはそれより高いGED値（Gene Expression’s CT Difference）、すなわち参照値と比較して少なくとも2倍の発現増加であった。
重要なことには、これらの患者は正常な血漿総マグネシウム濃度[Mg]T（一般的に用いられる低マグネシウム血症の臨床パラメータ）を有したが、マーカー遺伝子の過剰発現が検出されてなかったDM2サンプルで測定した値と比較したとき細胞内イオン化マグネシウム濃度[Mg2+]iは低下していた。
【００１２】
これらのマーカー遺伝子の発現上昇は、Magnesium-Diasporal(商標)300の補充によってその投与から30日以内に抑制することができる（実施例2）。全てのサンプルにおける被検遺伝子の発現レベルを、参照サンプル中のこれらの遺伝子の発現レベルに対応して標準化させた。マグネシウムの補充は、試験の前後に測定した血漿総マグネシウム濃度値に影響を与えなかった（図6）。他方[Mg2+]iは全解析サンプル（n=7）で有意に増加し、[Mg2+]iの増加は実際には対象遺伝子の“正常な”発現をもたらすことを示した。
健常ドナーのコントロールグループ（マグネシウムを含むマルチミネラルサプリメントを規則的に摂取した）由来のサンプルを用いたさらに別の実験は、CNNM2、SLC41A1、およびSLC41A3遺伝子の正常な発現を示したが、SLC41A2はまたこれらの健常な個体で過剰発現した（実施例3）。この驚くべき観察は、コントロールグループのプロバンドのマルチミネラル補充と関係があるかもしれない。しかしながら。その分子的背景は現時点では単に推測できるだけである。SLC41A2の発現は、白血球でMg2+濃度以外の他の因子と負の態様でより良好に反応するようであるので、この遺伝子は本発明のマーカー遺伝子として用いるにはあまり適切ではないであろう。
【００１３】
要約すれば、いくつかのヒトMg2+トランスポーター遺伝子、特にCNNM2、SLC41A1、およびSLC41A3を同定することが可能であった。これらの遺伝子は、通常の方法で測定したとき前記遺伝子の転写レベルにおける発現率と細胞内Mg2+濃度との間で直接的相関関係を示し、日常の臨床的応用で患者のマグネシウム欠乏の決定のための転写マーカーとして用いることができる。
しかしながら、同じ特性を示すさらに別のMg2+トランスポーター遺伝子がおそらく存在し、それらは本明細書に開示する技術と同じまたは類似する技術を用いて同定できることは当業者には理解されよう。特に、当業者は、ヒトまたは他の哺乳動物でMg2+トランスポーター遺伝子と同定された候補遺伝子を、それらの発現と細胞内遊離マグネシウムイオンレベルとの間の推定的相関関係について下記実施例1で開示した態様と同様な態様でスクリーニングし、さらに下記実施例2および3で概略したようなコントロール実験を実施して、細胞内Mg2+濃度の変化以外の因子に強く応答する候補遺伝子を排除することができるであろう。
【００１４】
したがって、本発明の方法は上記で例証した特定のマーカー遺伝子に限定されず、遺伝子の転写レベルにおける発現率と細胞内Mg2+濃度との間で直接的相関関係／依存性を示す任意のMg2+トランスポーター遺伝子が基本的に本発明に適している。
好ましくは、本発明での使用に適したMg2+トランスポーター遺伝子にはTRPM6、TRPM7、MagT1、NIPA1、N33および／またはSLC41A2は含まれず、より好ましくは、マーカー遺伝子はCNNM2、SCL41A1およびSLC41A3から成る群から選択される。もっとも好ましくは、マーカー遺伝子はCNNM2である。
本明細書で提示した実験はヒトの検査対象者で実施され、ヒトのマーカー遺伝子の同定をもたらした。結果として、細胞内遊離マグネシウムの状態を評価する、特に細胞内遊離マグネシウム欠乏の有無を決定する本発明のin vitroの方法は、好ましくは、ヒトの個体の細胞内遊離マグネシウムの状態を評価する方法に関する。しかしながら、同様な方法を上記マーカー遺伝子のホモローグが発現される他の哺乳動物に応用できることは当業者には理解されよう。
【００１５】
本明細書で用いられる“個体の細胞内遊離マグネシウムの状態を評価する”とは、一般的に細胞内Mg2+レベルに関して正常であると思われる個体について測定された参照値と比較して前記細胞内Mg2+レベルのいずれの増減も測定されることを意味する。特にこの用語は、個体で細胞内遊離マグネシウム欠乏の有無を決定することを含む。“正常”とは、好ましくは0.5mmol/L以上の細胞内遊離マグネシウムイオン濃度を意味する。
本発明の重要な利点には本提唱技術の高い標準化レベルが含まれ、これによって高い再現性、高処理性、消費時間の短縮および材料の経費削減がもたらされる。
さらにまた、本発明のアプローチは、それが、各マーカー遺伝子について測定されたGED値は被験者の個々の生理的状態を反映し、[Mg2+]i値に関してそれぞれ別個に解釈されえるという事実を利用するという点においてぬきんでている。このことは、上述の解析技術の１つおよび患者の[Mg2+]iと（患者の試験の統計的評価により）人為的に存在する閾値との相関関係を用いて[Mg2+]iの解析決定を実施する必要性を排除し、従来技術を超える大きな進歩を提示する。
【００１６】
そのようなマーカー遺伝子の同定の成功は、上記に概略した、細胞内遊離マグネシウム欠乏に罹患していると思われる個体の細胞内遊離マグネシウムの状態を評価する改善方法のための基礎だけでなく、また別の関連する応用、例えば哺乳動物におけるマグネシウム化合物の生体利用性を評価する新規な方法および細胞内遊離マグネシウム濃度の調節物質を細胞で同定する新規な方法のための基礎も提供する。
したがって、本発明のさらに別の特徴は、その発現率と細胞内遊離マグネシウムイオン濃度[Mg2+]iとの間で直接的相関関係を示す細胞Mg2+トランスポーター遺伝子の発現率を測定することによって、哺乳動物におけるマグネシウム化合物の生体利用性(bioavailability)を評価するin vitroの方法に関し、前記方法は、a）細胞内マグネシウム欠乏を有し、さらに細胞Mg2+トランスポーター遺伝子を発現する細胞をマグネシウム化合物と接触させる工程、およびb）前記細胞Mg2+トランスポーター遺伝子の発現率を測定し、さらに得られた値を参照値と比較する工程を含み、前記マグネシウム化合物との接触後の前記発現率の低下は前記マグネシウム化合物の生体利用性を示す。
【００１７】
好ましくは、本方法では、前記発現率の低下の量は、前記マグネシウム化合物の生体利用性の程度と直接的に相関する。
本発明の具体的な実施態様では、細胞内マグネシウム欠乏を有し、さらに細胞Mg2+トランスポーター遺伝子を発現する細胞は、マグネシウム枯渇細胞培養から得られた細胞および細胞内マグネシウム欠乏に罹患している哺乳動物、特にヒトから得られた細胞サンプルから選択される。
別の具体的な実施態様では、細胞内マグネシウム欠乏を有し、さらに細胞Mg2+トランスポーター遺伝子を発現する細胞は、有核血液細胞、特に白血球である。
好ましくは、細胞Mg2+トランスポーター遺伝子は、CNNM2、SLC41A1およびSLC41A3から成る群から選択される。
上記の方法は、これら具体的な実施態様に限定されず、さらに別の実施態様および前記方法の改変を当業者は容易に知りえよう。
【００１８】
本発明のさらにまた別の特徴は、細胞内遊離マグネシウムイオン濃度[Mg2+]iを調節することができる化合物を同定するin vitroの方法に関し、前記方法は、a）その発現率と細胞内遊離マグネシウムイオン濃度[Mg2+]iとの間で直接的相関関係を示す細胞Mg2+トランスポーター遺伝子を発現する細胞を提供する工程、およびb）細胞を候補化合物と接触させる工程、およびc）細胞Mg2+トランスポーター遺伝子の発現率を測定する工程を含み、前記候補化合物との接触後の前記発現率の上昇または低下は、細胞内[Mg2+]iの調節物質であることを示す。
本発明の具体的な実施態様では、細胞Mg2+トランスポーター遺伝子を発現し、さらに候補化合物と接触させられる細胞は、前記候補化合物と接触させた細胞培養に由来する培養細胞である。
また別の具体的な実施態様では、細胞Mg2+トランスポーター遺伝子を発現し、さらに候補化合物と接触させられる細胞は、前記候補化合物を投与された哺乳動物由来の細胞サンプルである。
好ましくは、細胞Mg2+トランスポーター遺伝子は、CNNM2、SLC41A1およびSLC41A3から成る群から選択される。
本方法の具体的な実施態様では、細胞Mg2+トランスポーター遺伝子を発現する細胞はヒトの細胞である。好ましくは、細胞Mg2+トランスポーター遺伝子を発現する細胞は有核血液細胞、特に白血球である。
上記の方法は、これら具体的な実施態様に限定されず、さらに別の実施態様および前記方法の改変を当業者は容易に知りえよう。
【００１９】
本発明のさらに別の特徴は、本発明の方法を実施するためのキットに関する。例えば、そのようなキットは、1つまたは2つ以上のマグネシウムトランスポーターマーカー遺伝子（特にCNNM2（ACDP2）、SLC41A1およびSLC41A3）、および場合によって1つまたは2つ以上のコントロール遺伝子、例えばハウスキーピング遺伝子（例えば下記表2のACTBまたはTUBA1B）の定量的PCRを実施するための試薬、並びに任意でさらに別の試薬、緩衝剤などを含む。
具体的には、例示的なキットは以下を含むことができる：
1）参照cDNA*SLC41A1……..1バイアル1−50反応
2）参照cDNA*SLC41A3……..1バイアル1−50反応
3）参照cDNA*CNNM2..……..1バイアル1−50反応
4）プライマーセット*（フォワード；リバース）SLC41A1……..1バイアル1−50反応
5）プライマーセット*（フォワード；リバース）SLC41A3……..1バイアル1−50反応
6）プライマーセット*（フォワード；リバース）CNNM2..……..1バイアル1−50反応
*参照cDNAバイアルは、典型的には約300塩基の長さの合成cDNAフラグメントを含むであろう。フラグメントの配列は、例えばSLC41A1またはSLC41A3またはCNNM2（ACDP2）のプライマー標的配列と同一であろう。鋳型cDNA-フラグメントのコピー数は、好ましくは以前に実施した定量的PCR実験の参照コントロールサンプルにより経験的に決定した鋳型コピー数と一致するであろう。
以下の非限定的実施例は本発明をより詳細に例証する。
【実施例１】
【００２０】
DM2患者由来の白血球サンプルおよび健常個体由来の参照サンプルにおけるMg2+トランスポーター遺伝子の発現レベルの解析
真性糖尿病2型（DM2；インスリン非依存性糖尿病）の患者はマグネシウム要求が上昇することが確認されている。広範囲の疫学調査および介入実験は、DM2はマグネシウム恒常性障害と連関していることを示す豊富な証拠を提供する。したがって、白血球サンプルが入手される検査対象者としてDM2患者および健常個体を選択した。
DM2グループ：検査対象者（56人）はいずれも真性糖尿病2型（DM2）に罹患していた。いずれも抗糖尿病薬で治療されていた。患者はいずれもインスリンまたは混合（インスリン／抗糖尿病薬）治療を受けていなかった。患者は40から80歳であった。
コントロールグループ：検査対象者（17人）は健常な血液ドナーであり、20から55歳であった。
参照グループ：検査対象者（5人）はDM2の家族歴をもたない健常な個体であり、年齢は25から46歳であった。
DM2グループおよびコントロールグループの各患者／プロバンドについて得られた遺伝子増幅効率（GED）は、常に参照グループの対象者について得られたGEDに対して評価された。
【００２１】
工程1）白血球の単離
血液（25−40mL）をVacutainer(商標)システムを用いることによって採取し、15mLのヘパリン被覆試験管に集めた（ヘパリンリチウム170I.U.；両方ともにBD（Plymouth, UK））。採取後、予めFicoll-PaqueTMPlus（Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany）を満たしたLeucosep(商標)50mLチューブに血液サンプルを移した。白血球分画を製造業者のプロトコルにしたがって調製した。
工程2）RNAの単離
全RNAを製造業者のプロトコルにしたがいNucleospin(商標) RNA IIミニキット（Macherey & Nagel, Deuren, Germany）によって白血球分画から精製した。続いて精製RNAを分光法（260/280nm）によって分析し、その完全性をAgilent 2100 Bioanalyzer/RNA 6000Nano LabChip（Agilent, Santa Clara, CA, USA）によってチェックした。RIN（RNA完全性数）6以上を示すRNAサンプルのみを更なる処理のために採用した。
工程3）cDNA合成
mRNAの逆転写をiScript cDNA合成キット（BioRad, Hercules, CA, USA）を用いて実施した。最終反応混合物（20μL）は以下を含んでいた：4μLの即席反応混合物（提供されたランダムヘキサマーおよびオリゴ(dT)プライマーを含む）、1μLの逆転写酵素、サンプル（100ngのRNAを含み体積は変動しえる）および分子生物学等級のRNAse非汚染水（サンプルの体積に応じて体積は変動しえる）。cDNAを合成するために、3工程プロトコル（25℃/5分；42℃/30分および85℃/5分）をCyclone25サーマルサイクラー（PEQLAB Biotechnologie, Erlangen, Germany）で用いた。
注釈：RNAの輸送および保存は-70℃から-80℃で実施した。実験室で操作するときは、サンプルアリコットは氷上で保存し、融解凍結サイクルは最大1回に抑えた。
工程4）定量的PCRのためのプライマーの設計
プライマーはPrimer 3ソフトウェアによって設計した。ヘアピン構造形成およびプライマーのダイマー形成のリスクは、OligoAnalyzerソフトを用いて解析した。プライマーについての基礎的な情報は表1に要約されている。プライマーの長さは19-merから24-merである。GC含有量は45%から60%で、予想されるPCR生成物の長さは141bpから234bpの範囲である。遺伝子発現を解析するための標準化スタンダードとして、一般的に用いられる2つのハウスキーピング遺伝子（ACTBおよびTUBA1B）を選択した。オリゴヌクレオチド合成はMWG Biotech AG（Ebersberg, Germany）によって実施した。凍結乾燥プライマーは、100pm/μLの最終濃度を生じるようにDEPC水に溶解させた。
【００２２】
【表２】
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【００２３】
工程5）定量的PCR
定量的PCRの前に、プライマー特異性を通常的PCRによって試験した。PCR生成物を2%アガロースゲルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色し、UB光で可視化した（Bioimage; AlphaInnotech, San Leonardo, CA, USA）。必要な場合には、プライマーのアニーリング温度を温度グラディエントPCR（Primus 96 advanced, PEQLAB）によって試験した。
定量的PCRはSYBR(商標)系ミックス（iQ SYBR Green Supermix; BioRad）を用いて実施した。前記ミックスは、SYBR Green I色素、ホットスタートiTaq DNAポリメラーゼ、緩衝剤およびdNTPを含んでいた。最終反応体積は25μLであった：iQ SYBR Green Supermix（13μL）、DEPC水（7.5μL）、フォワードプライマー（0.5μL）、リバースプライマー（0.5μL）および鋳型DNA（25μL）。増幅（各サンプルについてトリプリケート）はiCycler（BioRad）を用い96ウェルプレートで実施した。
3つの最適化リアルタイムPCRプログラムを、以前に実施した各々対応する遺伝子の融解温度解析にしたがって用いた。SLC41A1、A2、A3並びにMAGT1、N33およびCNNM2については2工程プロトコルを利用した[(95℃/30”‐58℃/120”)ｘ35]。TRPM6/7フラグメントは3工程プロトコル：[(95℃/30”‐58℃/120”‐78℃/10”)ｘ35] 、NIPA1フラグメントは3工程プロトコル：[(95℃/30”‐58℃/120”‐80℃/10”)ｘ35]を用いて増幅した。
データはiQ5シグナル検出ソフト（BioRad）を用いて入手し、Schefeら（2006）のGED法（Gene Expression’s CT Difference）にしたがって解析したが、ただしFC-KW.01（Katarina Wolf, FU Berlin）を、Schefeら（2006）が用いたlinReg PCRソフトの代わりに用いた。その理由は、FC-KW.01はサンプルトリプレットの代わりにサンプルシングレットを処理することができるそのアルゴリズム改善性にあるが、基本的にはこれらのプログラムの各々または従来技術の同様なデータ解析プログラムもこの工程に適している。
増幅生成物は2%アガロースゲルでサイズについて再度解析した。
【００２４】
工程6）血漿総[Mg]AAS解析
血漿総マグネシウム濃度の判定は、炎光原子吸収分光法（AAS；iCE3300, Thermo Scientific）によって各サンプルについて実施した。総マグネシウム濃度はSOLAAR AASソフト（Thermo Scientific）によって計算した。
工程7）細胞内イオン化[Mg2+]iFFS比率測定解析
採集した白血球を再懸濁させ、PBSで2回洗浄し（細胞は1700rpmで5分間遠心した）、さらにKolisekら（2008）が記載したものと同じローディングプロトコルにしたがって、PluronicF-127（Invitrogen）の存在下で二価イオン非含有HBS（ハンクス緩衝溶液）中のmag-fura2（比率測定Mg2+感受性蛍光色素；Invitrogen）とともにローディングした。[Mg2+]の測定は、迅速フィルター付属物およびバイオカイネティックヘッドを搭載したLS55分光光度計（いずれもPerkin Elmerより購入）を用いて実施した。各測定時間は100秒に設定した。技術に関する詳細および測定の目盛合わせはKolisekら（2008）、Schweigelら（2006）およびKolisekら（2003）が記載したとおりであった。入手したデータはGrynkiewiczの等式（Grynkiewicz et al. 1985）を用いて処理し、最終的な細胞内[Mg2+]を算出した（FL WinLab, Perkin Elmer）。
【００２５】
結果の要旨：遺伝子CNNM2、SLC41A1、SLC41A2およびSLC41A3は、DM2患者の亜集団の白血球で有意に過剰発現され、それらの発現増加はこれらの細胞の[Mg2+]iの減少と相関関係を示したが、[Mg2+]Tとは相関しなかった。
詳細な結果：9遺伝子（表1）全ての発現レベルを解析し、4つの過剰発現遺伝子のレベルを一緒に図に記入した（図1；GED閾値/赤線=2）。試験によって、56人のプロバンドの中で、16人（全患者の29%、GED閾値=2）が有意な過剰発現（17.5倍まで）を示すCNNM2遺伝子を有していた。これらの患者の5人（全患者の9%、GED閾値=2）が有意な過剰発現（8.1倍まで）を示すSLC41A1遺伝子を有していた。DM2グループの患者では、我々はまた、SLC41A2遺伝子を過剰発現する（2.6倍まで）5人の患者（全患者の9%、GED閾値=2）およびSLC41A3遺伝子を過剰発現する（5.3倍まで）3人の患者（全患者の5%、GED閾値=2）を同定した。GED値は、参照グループのプロバンド（n=5）でこれらの遺伝子について得られた発現値に対して標準化された。遺伝子TRPM6、TRPM7、MagT1、NIPA1およびN33もまた単離白血球で発現されたが（図2）、それらはDM2グループおよび参照グループで弁別的に発現されているようには見えなかった（リアルタイムPCR解析）。したがって、それらを更なる調査から除外した（図2、PCR生成物のサイズは表2に記されている）。DM2患者の中で、CNNM2の過剰発現がもっとも有意であった。図1および表3に示されているように、それぞれの遺伝子（CNNM2、SLC41A1、SLC41A2およびSLC41A3）間で相関関係は存在せず、DM2グループではこれら遺伝子間で共通の過剰発現パターンも全く認められなかった（表3）。
DM2グループ患者のサンプルで測定した血漿総[Mg]の平均値は、0.95±0.07（SD）mmol/L（n=56；最小値=0.78、最大値=1.12）であった。血漿中のこのマグネシウム濃度は十分とみなされ（一般的に用いられる臨床検査では）、0.8より低いBPM値をもつただ1人の患者が血漿マグネシウム濃度に関してわずかにマグネシウム欠乏であるとみなすことができた。
DM2血液サンプルの白血球分画で測定した[Mg2+]iの平均値は、0.68±0.2（SD）mmol/L（n=56；最小値=0.35、最大値=1.10）であった。細胞内イオン化マグネシウム濃度は相当に変動し、全DM2サンプルの32.1%で0.5mmol/L（ミリモル/リットル）より低いと測定された。
興味深いことに、CNNM2遺伝子の発現が増加した全ての患者が0.5mmol/Lより低いまたはその近辺の[Mg2+]iを示した。図4から明白なように、低下した[Mg2+]iからこの値以下の患者がいずれもSLC41A1、SLC41A2またはSLC41A3の発現でもまた増加を示していたというわけではなかった。DM2グループの患者について得られた血漿[Mg]Tおよび[Mg2+]iデータの個々の値は図3に記入されている。
図4（上図）に記入されたデータは、[Mg2+]iの低下は4遺伝子全ての事例で発現レベルの増加と相関関係を有することを示しているが、CNNM2遺伝子の事例がもっとも有意である。4遺伝子の各々についてのGED値と対応する血漿[Mg]Tセット（図4；下図）との間の相関関係を解析することによって、これらのパラメータの間には正または負の関係が存在しないことが示された。
GED値と対応する[Mg2+]i値セットの間の相関関係を示す図（図4；上図）もまた、これらの遺伝子の各々について[Mg2+]iが0.5 mmol/L未満であるがGEDが増加しない患者が存在することを示唆している（CNNM2について5人の患者；SLC41A1、SLC41A2またはSLC41A3の事例では10人以上の患者）。この観察は、さらに別の（まだ同定されていないが）、その[Mg2+]i値の低下と相関して発現率を増加させるMgトランスポーター遺伝子が存在していることを示しているのかもしれない。さらにまた、血漿[Mg]Tだけでなくいくつかの例では[Mg2+]i値さえもそれぞれの患者の個々の生理学に必ずしも影響を与えないということも、さらに患者の“真の”マグネシウム欠乏は、それが細胞のマグネシウム恒常性に関与する遺伝子の転写または翻訳パラメータの変化に反映されるときにのみ決定することができるということもありえよう。
【００２６】
【表３】
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【実施例２】
【００２７】
マグネシウムDiasporal(商標)を補充されたDM2患者のCNNM2、SLC41A1、SLC41A2およびSLC41A3遺伝子の発現レベル
通常の血漿Mg濃度を有する17人のDM2患者のグループを選択した。彼らはいずれもCNNM2遺伝子を過剰発現し、1人の患者はCNNM2およびSLC41A1遺伝子を過剰発現し、1人の患者はCNNM2、SLC41A1およびSLC41A2遺伝子を過剰発現し、さらに2人の患者は4遺伝子（CNNM2、SLC41A1、SLC41A2およびSLC41A3）のいずれの発現レベルも上昇していた。これらの患者に30日間の間マグネシウム-Disporal(商標)300（クエン酸マグネシウム1830mg、約300mgの有効Mg濃度に匹敵する；Protina Pharm. GmbH）を補充した（1日に1回投与）。この試験の第2週後、患者の1人が重篤な下痢および無力症（全身的衰弱）を発症した。彼女は、マグネシウムの補充がその症状の主要な理由と考えたのでマグネシウム補充の停止を決めた。他の患者はいずれも類似の症状を示さなかった。この試験を終了した16人の患者が血液サンプルを提供し、そのうちの14人でCNNM2、SLC41A1、SLC41A2およびSLC41A3のGED値を測定し、この試験の開始時に得た対応する値と比較した。Leukosep(商標)チューブのフィルターが遠心工程中に破損したために2つのサンプルが失われ、白血球をもはや回収できなかった。
図5に要約したグラフは、試験の終了後に採集した14のサンプルの4遺伝子全てについて測定したGED値を示している。全サンプルの調査遺伝子の発現レベルは、参照サンプルにおけるこれら遺伝子の発現レベルを用いて標準化した。マグネシウムの補充は、試験の前後で測定した血漿総マグネシウム濃度値に影響を与えなかった（図6）。他方、[Mg2+]iは全解析サンプルで有意に増加した（n=7）。試験の前に測定した平均[Mg2+]i値と比較したとき、平均[Mg2+]iは約30%まで増加した：試験前平均[Mg2+]iは0.43±0.06（SD）mmol/L（n=14；最小値=0.35、最大値=0.55）および試験後平均[Mg2+]iは0.66±0.09（SD）mmol/L（n=7；最小値=0.58、最大値=0.84）。これらのデータは、[Mg2+]iの増加は、我々の問題の遺伝子の“正常な”発現をもたらすという前提に完全に一致する。
【実施例３】
【００２８】
マルチミネラル調製物を補充された健常な血液ドナー（コントロールグループ）のCNNM2、SLC41A1、SLC41A2およびSLC41A3遺伝子の発現レベル
我々のアプローチのための、さらにまたプロバンドの参照グループ選別のための正の相互コンロトールとして、我々は、17人の健常な血液ドナーの白血球における４遺伝子全てのGED値を測定した。彼らは全員規則的にマルチミネラルサプリメント（マグネシウム含有量は約100mg）を摂取した。コントロールサンプルで測定した平均BPM値は、0.93±0.07（SD）mmol/L（n=17）で、最小値0.79 mmol/Lから最大値1.03 mmol/Lの範囲であった。このBPM値の範囲は臨床的に正常と考えられる。
図7に示されるように、コントロールサンプルにおける遺伝子CNNM2、SLC41A1およびSLC41A3の発現レベル（GED）は、参照サンプルと有意に異なる。しかしながらSLC41A2はコントロールグループのサンプルの58.8%で有意に過剰発現され、最大GED値は、DM2グループでのSLC41A2の最大GED値の3倍の高さであった。この驚くべき観察は、コントロールグループにおけるプロバンドのマルチミネラルサプリメント補充と関係があるかもしれない。しかしながら、その分子的背景は現時点では推測することができるだけである。したがってSLC41A2の発現は、白血球のMg2+濃度の変化以外の因子に負の態様でより強く応答し、したがってこの遺伝子は本発明の遺伝子マーカーとして使用するにはそれほど適切ではないように思われる。
【００２９】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2012520662.tif 000014
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
2012520662.tif 000016
【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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