(57)【要約】本発明は、クロストリジウムのようなＡＢ毒素を産生する細菌性病原体に対するワクチンの生産方法であって、（ａ）ＡＢ毒素が産生される条件下で該病原体を培養し、そしてその培養を収穫し；（ｂ）好ましくは補因子としてイノシトール六リン酸を使用して、ＡＢ毒素をインビトロで酵素的に開裂させ；そして、（ｃ）工程（ｂ）の組成物を薬学的に許容される担体と合せる、ことを含む方法に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＢ毒素を産生する細菌性病原体に対するワクチンの生産方法であって、
（ａ）ＡＢ毒素が産生される条件下で該病原体を培養し、そしてその培養を収穫し；
（ｂ）ＡＢ毒素をインビトロで酵素的に開裂させ；そして、
（ｃ）工程（ｂ）の組成物を薬学的に許容される担体と合せる、
ことを含む方法。
【請求項２】
酵素的開裂の補因子としてリン酸イノシトール、好ましくはイノシトール六リン酸を使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
収穫後に培養培地から細胞を分離し、そして培養培地中のＡＢ毒素を開裂させる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＡＢ毒素を開裂前に収穫物、好ましくは培養培地から精製する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
病原体が、クロストリジウム属、好ましくはクロストリジウム・ディフィシレ（C. difficile）、クロストリジウム・ソルデリイ（C. sordellii）、クロストリジウム・ボツリヌム（C. botulinum）、クロストリジウム・ペルフリンゲンス（C. perfringens）、クロストリジウム・テタニ（C. tetani）、もしくはクロストリジウム ・ノヴイ（C. novyi）、またはビブリオ属、好ましくはビブリオ・コレラエ（V. cholerae）、ビブリオ・パラヘモリティクス（V. parahaemolyticus）、ビブリオ・ブルニフィクス（V. vulnificus）、ビブリオ・スプレンディダス（V. splendidus）、もしくはビブリオ・アングイラルム（V. anguillarum）、またはゼノラブダス属、好ましくはゼノラブダス・ネマトフィラ（X. nematophila）、ゼノラブダス・ボヴィエニイ（X. bovienii）、またはエルシニア属、好ましくはエルシニア・シュードツベルクローシス（Y. pseudotuberculosis）、エルシニア・ペスティス（Y. pestis）、エルシニア・エンテロコリティカ（Y. enterocolitica）、もしくはエルシニア・モラレッティ（Y. mollaretti）、またはボルデテラ属、好ましくはボルデテラ・ペルトゥッシス（B. pertussis）、ボルデテラ・パラペルトゥッシス（B. parapertussis）、もしくはボルデテラ・ブロンキセプティカ（B. bronchiseptica）、またはアクチノバシラス属、好ましくはアクチノバシラス・プルロニューモニアエ（A. pleuropneumoniae）、もしくはアクチノバシラス・スイス（A. suis）、および大腸菌（E. coli）である、請求項１〜４に記載の方法。
【請求項６】
病原体がクロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）であり、そして開裂前に毒素Ａを毒素Ｂから精製する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
アジュバントが組成物に添加される、請求項１〜６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７に記載の方法によって生産されるワクチン。
【請求項９】
クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）のトキソイドＡおよび／またはトキソイドＢを含む、請求項８に記載のワクチン。
【請求項１０】
クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）のトキソイドＡおよび／またはトキソイドＢ、ここで、前記トキソイドＡおよび／またはトキソイドＢは自己触媒的開裂によって毒素Ａおよび／または毒素Ｂから生成されるを、場合により薬学的に許容される担体と共に含む、クロストリジウムにより誘発される下痢症に対するワクチン。
【請求項１１】
ＡＢ毒素を産生する病原体の感染に対する、ヒトを包含する動物のワクチン接種のための、前記請求項のいずれか１項に従って生産されるワクチンの使用。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１項に従って生産されるワクチンの有効量を、ヒトを包含する動物に投与することを含む、ＡＢ毒素を産生する病原体の感染に対するワクチンを、ヒトを包含する動物に接種する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチンの生産方法、およびそれに従って生産されるワクチンに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
芽胞形成性グラム陰性菌クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）は、抗生物質関連下痢症の症例の６０％、そして偽膜性腸炎罹患患者のほぼ１００％の原因である。この疾患発生の原因となるメカニズムはまだ完全には理解されていない。クロストリジウム・ディフィシレ（C. difficile）に感染した全ての患者がこの疾患を発症する訳ではないことから、宿主および菌株因子の両者に関連しているのではないかと思われる。感染患者の臨床症状は、無症候性から生命を脅かす中毒性巨大結腸症に至るまでの範囲があり得る。
【０００３】
人間を包含する動物に疾患を引き起こすその他多くの病原体と同様クロストリジウム・ディフィシレ（C. difficile）は毒素を産生する。毒素とは、生きている細胞または生物によって産生される、ごく低濃度で活性な毒性物質である。毒素は、小分子、ペプチド、または蛋白であってよく、身体組織に接触または吸収されると、酵素または細胞レセプターといった生体高分子との相互作用により疾患を引き起こすことができる。クロストリジウム・ディフィシレ（C. difficile）は、抗生物質関連下痢症または偽膜性腸炎の原因物質である毒素Ａ（ＴｃｄＡ）および毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）という２種類の毒素を産生する。これらは極めて大きな（３０８kDaおよび２６９kDa）細菌性蛋白であり、クロストリジウム ・ソルデリイ（C. sordellii）のＴｃｓＨおよびＴｃｓＬならびにクロストリジウム・ノヴイ（C. novyi）のＴｃｎαと共に、いわゆる大クロストリジウム細胞毒（ＬＣＴ）ファミリーの一部である。これらの毒素は全て高度の配列相同性、類似のドメイン構造を示し、グリコシルトランスフェラーゼ部分を有する。ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢは、三部から成る機能組織を特徴とする一本鎖蛋白である。それらのＣ末端ドメインは標的細胞の細胞膜への結合に必要であり、疎水性の中間部分は推定的トランスロケーションドメインであり、そして該蛋白のＮ末端触媒ドメインはグリコシルトランスフェラーゼ部位を担持する。標的細胞のサイトゾルへの取り込みプロセスは、まだ完全に特性解明されていない。しかしながら、毒素は細胞表面レセプターとの結合後にエンドサイトーシスで取り込まれるということが一般的に受け入れられている。エンドソームの酸性化の後、その毒素のＮ末端ドメインのみがサイトゾル内へと輸送される。ＴｃｄＡは低いｐＨにおいて人工膜に小孔を形成することから、この輸送プロセスは小孔形成により仲介されると推定される。毒素の活性化にはアミノ酸Ｌｅｕ５４３およびＧｌｙ５４４間の蛋白分解的開裂が必要であり、それが、Ｎ末端触媒ドメインを有する６３kDaの小フラグメントを遊離させ、サイトゾル内へと導く。より大きな、ＴｃｄＢの２０７kDaＣ末端部分は膜画分にとどまる。Ｎ末端６３kDaフラグメントは完全な細胞毒性を表す。遊離すると、このＮ末端グリコシルトランスフェラーゼドメインはサイトゾル内を自由に動くことができ、その標的蛋白であるＲｈｏ／ＲａｃファミリーのＧＴＰアーゼを不活性化する。これらの蛋白は数多くの細胞機能、例えばアクチン細胞骨格の統合、転写調節、細胞極性および増殖に関与している。Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼは、病原体防御反応、サイトカイン発現および免疫細胞のシグナル伝達を包含する免疫系の多くの機能において重要な役割を演じているため、それらは細菌性毒素の最適な標的を構成する。
【０００４】
近年、クロストリジウム・ディフィシレ（C. difficile）毒素の活性化が自己触媒的開裂によって起こることが示された（Reineke et al., Nature 2007, 446:415-419）。さらに、このような毒素Ｂの自己触媒的開裂の強力なアクチベーターおよび補因子としてイノシトール六リン酸（Ｉｎｓ６Ｐ、ＩＰ６、ＣＡＳ番号［８３−８６−３］）の役割が解明された（Reineke et al., 上記）。この多価分子は幾つかの機能を遂行しているように見受けられ、この毒素のコンホメーションの安定化に関わっていると思われる。自己触媒的開裂による毒素の活性化は、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）のＬＣＴ毒素Ａ（ＴｃｄＡ）およびＢ（ＴｃｄＢ）、クロストリジウム・ソルデリイ（Clostridium sordellii）の致死性（ＴｃｓＬ）および出血性毒素（ＴｃｓＨ）、ならびにクロストリジウム・ノヴイ（Clostridium novyi）のα毒素（Ｔｃｎα）、ビブリオ・コレラエ（Vibrio cholerae）（ＶｃＲＴＸ）、ビブリオ・ブルニフィクス（V. vulnificus）（ＶｖＲｔｘ）、ビブリオ・スプレンディダス（V. splendidus）（ＶｓＲｔｘ）、ゼノラブダス・ネマトフィラ（Xenorhabdus nematophila）（ＸｎＲｔｘ）、ゼノラブダス・ボビエニイ（X. bovienii）（ＸｂＲｔｘ）、エルシニア・シュードツベルクローシス（Yersinia pseudotuberculosis）（ＹｐＲｔｘ）、エルシニア・モラレッティ（Y. mollaretti）（ＹｍＭｆｐ２）ならびにボルデテラ・ペルトゥッシス（Bordetella pertussis）（ＦｈａＬ１−４）（Sheahan KL et al. EMBO J 2007, 26(10):2552-2561）、リストネラ・アングイラルム（Listonella anguillarum）、フォトラブダス・ルミネセンス（Photorhabdus luminescens）、アエロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）およびエルシニア・エンテロコリティカ（Yersinia enterocolitica）（Lupardus PJ et al. SCIENCE 2008, 322(5899):265-268）のＲＴＸ毒素といった他の生物の類似毒素でも起こる。これらの毒素は全て後に概説する「ＡＢ毒素」に分類できる。
【０００５】
国際特許出願ＷＯ２００８０１４７３３はクロストリジウム感染症の処置方法を開示しており、そこでは自己触媒活性のインヒビターまたはアクチベーター（ＩＰ６）を患者に投与している。
【０００６】
幾つかの刊行物がクロストリジウム・ディフィシレ（C. difficile）のワクチンを開示している。化学物質ホルマリンによりＴｃｄＡおよびＴｃｄＢを不活性化してあるワクチンが、Sougioultzis S. L. et al., Gastroenterology (2005), 128:764-770；Kotloff, Infect. Immun. 2001；ＷＯ９９２０３０４、およびGhose et al., Infect. Immun. (2007), 75(6), 2826-2832に開示されている。ＴｃｄＡまたはＴｃｄＢのＣ末端リガンドドメインを表す組換え発現ポリペプチドを含むワクチンが、ＷＯ９８５９０５３、ＷＯ００６１７６１、ＷＯ００６１７６２、ＷＯ９７０２８３６、Pavliakova et al., Infect Immun (2000), 68(4), 2161-2166；Ward et al., Infect Immun (1999), 67(10), 5124-5132；およびLyerly et al., Current Microbiol 21:29-32に開示されている。ＷＯ２００７１４６１３９は、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢのレセプター結合ドメインをコードしているコドン最適化ＤＮＡ分子およびＤＮＡワクチンとしてのその使用を開示している。ＷＯ２００４０４１８５７は、ＴｃｄＢの非毒性突然変異体およびワクチン接種のためのその使用を開示している。Genth, H. et al., Infect. Immun. (2000), 68:1094-1101は、免疫付与のための抗原として酵素欠損クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）毒素Ｂを生成する方法を開示している。
【０００７】
ワクチンは、典型的には、このような病原体の抗原成分を含む調製物を作製し、それらを薬学的に許容される担体と混合することにより製造する。有効な免疫反応を達成するため、そして経済的理由のため、加工または分画工程の少ない細菌培養から得られた調製物を使用するのが望ましい。毒素産生生物の場合、問題は、係る調製物に含まれる毒素が、不活性化されない限りそれを投与することを妨げることである。故に、先行技術のアプローチは、毒素の化学的不活性化、毒素の非毒性ドメイン（Ｃ末端レセプター結合ドメインまたは「Ｂ」ドメイン）の組換え発現、または毒素の非毒性突然変異体を作製することにより、クロストリジウム・ディフィシレ（C. difficile）のようなＡＢ毒素を産生する細菌性病原体に対するワクチンを作製することを示唆してきた。しかしながらこれらの手段は全て、ワクチンの有効性に影響を及ぼし得る、そして／または高価となる、その病原性生物の抗原性エピトープの喪失に繋がる。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、ＡＢ毒素を産生する細菌性病原体に対するワクチンの生産方法であって、
（ａ）ＡＢ毒素が産生される条件下で該病原体を培養し、そしてその培養を収穫し；
（ｂ）ＡＢ毒素をインビトロで酵素的に開裂させ；そして、
（ｃ）工程（ｂ）の組成物を薬学的に許容される担体と合せる、
ことを含む方法に関するものである。
【０００９】
好ましい局面では、酵素的開裂は自己触媒性である。好ましい局面では、リン酸イノシトール、好ましくはイノシトール六リン酸を酵素的開裂の補因子として使用する。
【００１０】
さらなる好ましい局面では、本発明は、収穫物、および培養培地中のＡＢ毒素が開裂した後に細胞を培養培地から分離する、前記のような方法に関するものである。
【００１１】
本発明方法は、クロストリジウム属、好ましくはクロストリジウム・ディフィシレ（C. difficile）、クロストリジウム・ソルデリイ（C. sordellii）、クロストリジウム・ボツリヌム（C. botulinum）、クロストリジウム・ペルフリンゲンス（C. perfringens）、クロストリジウム・テタニ（C. tetani）、もしくはクロストリジウム ・ノヴイ（C. novyi）、またはビブリオ属、好ましくはビブリオ・コレラエ（V. cholerae）、ビブリオ・パラヘモリティクス（V. parahaemolyticus）、ビブリオ・ブルニフィクス（V. vulnificus）、もしくはビブリオ・スプレンディダス（V. splendidus）、もしくはビブリオ・アングイラルム（V. anguillarum）またはゼノラブダス属、好ましくはゼノラブダス・ネマトフィラ（X. nematophila）、ゼノラブダス・ボヴィエニイ（X. bovienii）、またはエルシニア属、好ましくはエルシニア・シュードツベルクローシス（Y. pseudotuberculosis）、エルシニア・ペスティス（Y. pestis）、エルシニア・エンテロコリティカ（Y. enterocolitica）、もしくはエルシニア・モラレッティ（Y. mollaretti）、またはボルデテラ属、好ましくはボルデテラ・ペルトゥッシス（B. pertussis）、ボルデテラ・パラペルトゥッシス（B. parapertussis）、もしくはボルデテラ・ブロンキセプティカ（B. bronchiseptica）、またはアクチノバシラス属、好ましくはアクチノバシラス・プルロニューモニアエ（A. pleuropneumoniae）、もしくはアクチノバシラス・スイス（A. suis）ならびに大腸菌（E. coli）の病原体に対するワクチンの生産に利用できる。
【００１２】
ワクチン組成物にはアジュバントを加えることができる。
【００１３】
さらなる局面では、本発明は前記のような方法を用いて生産されたワクチンに関するものである。
【００１４】
本発明の別の局面は、ヒトを包含する動物に、ＡＢ毒素を産生する細菌性病原体の感染に対するワクチンを接種するための、開示されたような方法に従って生産されたワクチンの使用に関するものである。
【００１５】
本発明の別の局面は、ヒトを包含する動物に、ＡＢ毒素を産生する細菌性病原体の感染に対するワクチンを接種する方法であって、本発明方法に従って生産されたワクチンの有効量をヒトを包含する動物に投与することを含む方法に関するものである。
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、ＡＢ型の毒素（ＡＢ毒素）を産生する細菌性病原体に対するワクチンを生産する改良法に関するものである。本発明は、このような毒素に内在する蛋白分解活性を利用してインビトロ自己触媒的酵素法によりＡＢ毒素を不活性化する洗練された方法を提供する。この目的のため、毒素を含有する組成物を、そのような酵素的開裂が起こり得る条件に調節する。特に、リン酸イノシトールのような必要な補因子の添加がＡＢ毒素の蛋白分解的不活性化を誘発できる。この蛋白分解的開裂により、毒性のＡドメインがトランスポータードメインＢから分離され、毒性効果を発揮するためにそこに存在する必要がある場所である細胞のサイトゾルに侵入する能力を緩める。事実、得られた組成物は、生命体に適用した場合、もはや毒性ではないか、一本鎖ＡＢ毒素よりずっと毒性が低い。一方で、この種の不活性化は天然コンホメーションおよびワクチンの有効性にとって重要な蛋白の抗原エピトープを温存する。
【００１７】
本発明の文脈において「ＡＢ毒素」という語は、ＬＣＴのように、触媒ドメイン（Ａドメイン）およびレセプター結合／トランスロケーションドメイン（Ｂドメインまたはトランスポータードメイン）を含む一本鎖細菌性毒素に対して用いられ、ここで触媒ドメインのインビボ活性化が自己触媒的開裂によって起こり、触媒ドメインをサイトゾル内に放出する。ＡＢ毒素は例えば、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）の毒素Ａ（ＴｃｄＡ）およびＢ（ＴｃｄＢ）、クロストリジウム・ソルデリイ（Clostridium sordellii）の致死性（ＴｃｓＬ）および出血性毒素（ＴｃｓＨ）、ならびにクロストリジウム・ノヴイ（Clostridium novyi）のα毒素（Ｔｃｎα）を包含するＬＣＴである。さらに、ＡＢ毒素には、ビブリオ・コレラエ（Vibrio cholerae）（ＶｃＲＴＸ）、ビブリオ・ブルニフィクス（Vibrio vulnificus）（ＶｖＲｔｘ）、ビブリオ・スプレンディダス（V. splendidus）（ＶｓＲｔｘ）、ゼノラブダス・ネマトフィラ（Xenorhabdus nematophila）（ＸｎＲｔｘ）、ゼノラブダス・ボビエニイ（X. bovienii）（ＸｂＲｔｘ）、エルシニア・シュードツベルクローシス（Yersinia pseudotuberculosis）（ＹｐＲｔｘ）、エルシニア・モラレッティ（Y. mollaretti）（ＹｍＭｆｐ２）エルシニア・エンテロコリティカ（Y. enterocolitica）（ＹＳＴ）、リストネラ・アングイラルム（Listonella anguillarum）（ＶａＲｔｘ）およびボルデテラ・ペルトゥッシス（Bordetella pertussis）（ＦｈａＬ１−４）のＲＴＸ毒素がある。
【００１８】
したがって本発明方法は、上に列挙した細菌のような、ＡＢ毒素を産生する細菌性病原体による感染症に対するワクチンの製造に適用できる。ワクチンとは、ヒトを包含する動物において特定の疾患に対する免疫を改善するために使用される薬学的調製物である。ワクチンは、予防的（例えば任意の天然または「野生」病原体による将来の感染症の影響を防止または改善する）であっても治療的（即ち宿主が既に、疾患の臨床症状を伴ってまたは伴わずに該病原体に感染している状況で適用される）であってもよい。ワクチンは、殺滅した微生物、修飾した生きている（弱毒化）微生物、微生物の抗原性サブユニット調製物（例えば画分または組換え発現されたポリペプチド）、または、本発明の状況において好ましいものとして、トキソイド（即ち、これらが主に疾病を惹起する場合には、不活性化された毒性化合物）を含有し得る。ワクチンは、自体特別な抗原性作用を持たずに免疫系を刺激してワクチンに対する反応を増強することのできる物質である、アジュバントを含有させることができる。一般的に使用されるアジュバントの例は、ミョウバン（水和硫酸アルミニウムカリウム）、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、スクアレン、または油性アジュバントである。好ましいアジュバントは市販のカルボポール（登録商標）９３４Ｐ（カルボマー９３４Ｐ；Noveon, Inc., Pedricktown, NJ, USA）であり、これを約２ml/lの量で存在させることができる。カルボポールはポリアリルスクロースで架橋したアクリル酸ポリマーである。
【００１９】
この方法の第一工程は、ＡＢ毒素が産生される条件下で病原体を培養することである。細菌細胞の培養は当分野で充分に確立されている。様々な種のための標準法が知られており、微生物の適当な標本を公的収集機関から入手することができる。リストに記載された微生物をそれらの特別な要件に従って培養する。クロストリジウムは嫌気的雰囲気下に培養し、一方エルシニア、ゼノラブダス、ボルデテラおよびビブリオは好気的に培養できる。エルシニアは耐寒性であって、これらの生物は通常２８℃で培養する。各々の生物は成育に特別な培地組成を必要とし、それは当分野で周知である。
【００２０】
ＡＢ毒素は通常、培養の静止期後期に培地中に放出される。ＡＢ毒素は充分な濃度で培地に存在するため、収穫後、細胞を培地から分離するのがしばしば好都合である。これは遠心分離によって実施できる。細胞を遠心分離によって分離したならば、それらを廃棄し上清をさらに処理する。次に培地中の毒素を、それらの自己触媒性を利用して酵素的開裂により不活性化する。開裂を達成するため、酵素活動が可能となるよう、条件を適切に調節せねばならない。最も重要なことには、酵素活性を促進する補因子を添加しなければならない。リン酸イノシトール、特にイノシトール六リン酸を補因子として１μmol/l〜１０mmol/l、より好ましくは１０〜１００μmol/lの濃度範囲で使用できる。他の類似体または誘導体、例えば１，３，４−もしくは３，４，６−三リン酸塩、１，２，３，４−、１，３，４，５−、３，４，５，６もしくは１，４，５，６−四リン酸塩、または１，２，３，４，５−、１，２，３，５，６−、１，２，４，５，６−、２，３，４，５，６−五リン酸塩も同様に働くが、より高濃度を必要とするかも知れない。ｐＨは６．５〜８．５の範囲とすべきであり、培地のｐＨは通常既にその範囲内にある。そうでない場合、緩衝液、例えばトリスＨＣｌ（ｐＨ８．５）を添加するか、または例えば透析もしくは限外濾過により緩衝液を交換できる。好適な温度範囲は２０〜４０℃である。開裂は通常１〜２４時間以内に完了し、それを、残留毒性を回避するため、実施例に開示したようなアッセイで検証すべきである。
【００２１】
不活性化に先立ち、収穫物および／または培地から毒素種を精製できる。病原体が１種類以上の毒素を産生する場合、これらの毒素種を不活性化前に相互に単離することができる。例えば、クロストリジウム・ディフィシレ（C. difficile）は、上に概説したように２つの毒素 毒素Ａ（ＴｃｄＡ）および毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）を産生する。これら２つの蛋白は、不活性化前に本明細書の実施例４に例示したように分離でき、次いで個別に、または組み合わせてワクチン調製に利用できる。クロストリジウム・ディフィシレ（C. difficile）のトキソイドＡおよび／またはトキソイドＢ、即ち本発明に従って不活性化された毒素Ａおよび／または毒素Ｂは、ワクチン接種のための好ましい抗原である。このトキソイドを自己触媒的開裂の後さらに精製し、より大きなＣ末端開裂フラグメントを富化できる（例えば、ホロトキシンのアミノ酸５４３〜２７１０、またはホロトキシンＢのアミノ酸５４４〜２６６６もしくは５４５〜２６６６）。本発明に係る精製トキソイドは、さらに、ワクチン調製において他の病原体の不活性化ＡＢ毒素と合せることができる。
【００２２】
次いで、得られた調製物を、適切と考えられるワクチンとして使用するための最終製剤とする。例えばそれを、現状の水性状態が薬学的に許容される担体である状態で、そのまま使用することができる。その状態を、例えば、希釈、透析、限外濾過またはアフィニティークロマトグラフィーのようなさらなる精製工程によって変化させることもできる。抗原調製物は、使用前に水で再構成するため、保存用に凍結乾燥できる。適切ならばアジュバントを添加できる。考えられるアジュバントは、例えば油中水、水中油、多相、または非鉱油エマルジョン、アルミニウムに基づくアジュバント、カルボポール（登録商標）のようなポリマーアジュバント、スクアレン、リポソーム、微粒子、免疫刺激性複合体およびトール様レセプターカスケード活性化アジュバントである。ワクチンは、皮下、皮内、筋肉内、静脈内または腹腔内注射で投与する。注射の頻度および用量は標的種による。感受性種は、ヒト、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、魚、齧歯類およびウマである。このワクチン接種は予防的処置であり、母親に接種することにより子孫の防護が達成できる。ワクチン接種の時期は母親由来抗体が消失した後に開始し、４週間後およびより遅い時点でブースター接種が必要であるかも知れない。
【００２３】
したがってさらなる局面では、本発明は、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）のトキソイドＡおよび／またはトキソイドＢ［ここで、前記トキソイドＡおよび／またはトキソイドＢは、自己触媒的開裂により毒素Ａおよび／または毒素Ｂから生成される］を、場合により薬学的に許容される担体と共に含む、クロストリジウムの誘発する下痢症に対するワクチンに関するものである。幾つかの態様では、トキソイドＡは、受理番号ＹＰ＿００１０８７１３７、ＺＰ＿０５３４９８２７、またはＹＰ＿００３２１３６４１の下に公的データベース（ＥＭＢＬ、ＮＣＢＩ）に寄託された配列のアミノ酸５４３〜２７１０で構成される。さらなる態様では、トキソイドＢは、受理番号ＹＰ＿００１０８７１３５、ＺＰ＿０５３４９８２４、ＺＰ＿０５３２８７４４、ＹＰ＿００３２１７０８６、またはＹＰ＿００３２１３６３９の下に公的データベース（ＥＭＢＬ、ＮＣＢＩ）に寄託された配列のアミノ酸５４４〜２６６６または５４５〜２６６６で構成される。このワクチンはさらにアジュバントを含み得る。
【００２４】
実施例
実施例１：クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）ワクチンの製造
クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）の試料は、公的収集機関、例えばAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）（Manassas, VA, USA）から受理番号ＡＴＣＣ９６８９、ＡＴＣＣ４３２５５の下に入手できる。それをＢＨＩ培地（ブレイン・ハート・インフュージョン・ブロス、Becton Dickinson, Heidelberg, Germany；American Pharmaceutical Association. 1950. The national formulary, 9th
ed., APA, Washington, D.C.を参照されたい）中、３７℃の嫌気性条件下に発酵槽で３〜４日間増殖させる。２種類の大細胞毒ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢが静止期後期に放出される。この時点で培養を収穫し、８０００ｘｇで１０分間遠心分離することにより細菌を沈殿させる。上清をそのまま使用するか、またはゲル透過クロマトグラフィー（例えばＳ３００セファクリルによる）、アフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび／または限外濾過によって毒素を濃縮する。次に、上清、または毒素が濃縮された調製物に対して最終濃度１〜５０mmol/lとなるよう還元剤ジチオトレイトールを添加し、続いてキレート形成剤エチレンジアミン四酢酸を最終濃度１０〜１００mmol/lとなるよう加える。次いでイノシトール六リン酸（ＩＰ６）を最終濃度１μmol/l〜１０mmol/l、例えば１０μmol/lまたは１００μmol/lで加え、この組成物をトリス−ＨＣｌのような適当な緩衝液中、ｐＨ６．５〜８．５で２〜２４時間の間３７℃でインキュベートする。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）および蛋白染色によって開裂の完全性を検証できる。
【００２５】
次いで、得られた調製物を、適切と考えられるワクチンとして使用するための最終製剤とする。例えばそれを、現状の水性状態が薬学的に許容される担体である状態で、そのまま使用することができる。その状態を、例えば、希釈、透析、限外濾過またはアフィニティークロマトグラフィーのようなさらなる精製工程によって変化させることもできる。適切ならばアジュバントを添加できる。考えられるアジュバントは、例えば油中水、水中油、多相、または非鉱油エマルジョン、アルミニウムに基づくアジュバント、カルボポールのようなポリマーアジュバント、スクアレン、リポソーム、微粒子、免疫刺激性複合体およびトール様レセプターカスケード活性化アジュバントである。ワクチンは、皮下、皮内、筋肉内、静脈内または腹腔内注射で投与する。注射の頻度および用量は標的種による。感受性種は、ヒト、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシおよびウマである。このワクチン接種は予防的処置であり、母親に接種することにより子孫の防護もまた達成できる。ワクチン接種の時期は母親由来抗体が消失した後に開始し、４週間後およびより遅い時点でブースター接種が必要であるかも知れない。
【００２６】
実施例２：活性アッセイ
ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣、例えばＤＳＭ ＡＣＣ１１０、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany）を、例えば５％ＦＣＳ（牛胎児血清）を添加した、例えばハムＦ１０培地を入れた、９６または２４ウェルマイクロタイタープレート（ウェルあたり１００μl）に撒き、コンフルエンスに達するまで湿潤雰囲気中３７℃で一夜インキュベートする。これらをマグネシウムまたはカルシウムのような二価イオンを含まないリンゲル液で洗浄し、次いでＭｇおよびＣａを含まないリンゲル液１００μl（９６ウェルプレート）または４００μl（２４ウェルプレート）でウェルを満たす。次に、実施例１のワクチン調製物および各々の希釈系列（１０−１〜１０−８）それぞれ１００または４００μlを、各試料につき二重値でウェルにピペッティングする。ワクチン調製物と同じ方法で処置したＢＨＩ培地を負の対照とする。正の対照として非処置クロストリジウム・ディフィシレ（C. difficile）上清を使用する。プレートを湿潤雰囲気中３７℃で３〜２４時間インキュベートし、次いで細胞を顕微鏡で調べる。
【００２７】
ワクチン調製物で処置した細胞は負の対照のように形態学的変化を示すべきでない。非処置培養上清で処置した細胞は、主として、円形となり「星状細胞様」形態になるという特徴を有する細胞変性効果を示す。ワクチンで処置された細胞が正の対照と類似の細胞変性効果を示すならば、酵素的開裂は完結しておらず、開裂を反復させねばならない。
【００２８】
実施例３：動物のワクチン接種
クロストリジウム・ディフィシレ（C. difficile）感染の標準化動物モデルとしてシリアンゴールデンハムスターを使用できる。体重６０〜１００ｇの動物を実験に使用する。動物に異なる濃度（１〜１００μg）のワクチン調製物を腹腔内または皮下注射によって投与する。ワクチンは、アジュバントを含有しないか、または完全フロイントアジュバント（ワクチン調製物と１：１）またはＲｉｂｉ（モノホスホリル脂質Ａおよびトレハロースジコリノミコラートエマルジョン）をアジュバントとして含有する。ワクチンと同じように処置したＢＨＩ培地を負の対照に使用する。最後のワクチン接種の２週間後、動物に１０〜１００mg/kgのクリンダマイシンを腹腔内または経口投与する。２４時間後、経管栄養管またはボールエンドカニューラを介して動物あたり少なくとも１０４のクロストリジウム・ディフィシレ（C. difficile）生菌または１００ｃ．ｆ．ｕ．（コロニー形成単位）をそれぞれ接種する。ワクチンの防御有効性を下痢または死亡率の臨床的監視により決定する。
【００２９】
実施例４：動物のクロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）ワクチン接種
これらの研究では、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）のＡＢ毒素をそれらに内在する自己触媒的開裂機能を利用して不活性化し、ワクチンとして動物に使用した。
【００３０】
毒素産生のため、クロストリジウム・ディフィシレ（C. difficile）（リファレンス菌株ＶＰＩ１０４６３、ＡＴＣＣ４３２５５）の試験用培養株１mlを、０．９％ＮａＣｌ ２００mlを入れた前処置および滅菌した透析袋に移した。この透析袋を１．３ｌのＢＨＩ培地に入れ、嫌気性チェンバー内で３７℃で５日間インキュベートした。５日後、透析袋の内容物を遠心分離し（５０００rpm、４℃、１５分間）、上清の過硫酸アンモニウム分別沈殿を実施した。４５％（ＮＨ）４ＳＯ４を添加し４℃で３時間攪拌することにより第一沈殿工程（毒素Ａ）を実施した。この後溶液を遠心分離し（５０００rpm、４℃、３０分間）、（ＮＨ）４ＳＯ４を最終含有量７０％まで加えることにより第二沈殿工程（毒素Ｂ）を遂行した。第二画分を４℃で３時間攪拌し、その後再度遠心分離した（５０００rpm、４℃、３０分間）。沈殿工程で得られたペレットを５０mMトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）５mlに懸濁した。（ＮＨ）４ＳＯ４沈殿化から得られた二つの画分（毒素ＡおよびＢ）をスクロース密度勾配遠心分離でさらに精製した。よって、以下のスクロース溶液４．５mlを増加順に超遠心分離管の底に積層することによりスクロース密度勾配を作製した：５０mMトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中１０％、１８．７５％、２７．５％、３６．２５％および４５％スクロース。毒素画分を一番上に加え、管を４℃、１００．０００ｇで３．５時間遠心した。得られた勾配を２mlアリコートで収集した。試料の毒素含有量をＣＨＯ−Ｋ１細胞による細胞毒性アッセイによって測定した。よってＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）を、１０％ＦＣＳ、０．５％Ｌ−グルタミンおよび０．５％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１０培地で増殖させた。９６ウェルマイクロタイタープレートに細胞単層（ウェルあたり約４０００）を作製し、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。インキュベーション時間の後、毒素含有試料の１０倍希釈液を作製した。細胞から培地を除去した後、毒素希釈液を加えた。２４時間後、細胞毒性効果を倒立顕微鏡で調べた。
【００３１】
以下のスキームを使用して細胞毒性を評価した：
陽性（＋）：＞９０％の円形細胞
陰性（−）：＜９０％の円形細胞
【００３２】
スクロース密度勾配遠心の毒素含有画分をプールし（毒素Ａおよび毒素Ｂ各々について）、５０mMトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で１：２に希釈した。試料（毒素Ａまたは毒素Ｂのいずれか）をイオン交換カラムにロードし、５０mMトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中５０mMＮａＣｌから５０mMトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中７００mMＮａＣｌに至る範囲のＮａＣｌ勾配を行って（△ＮａＣｌ ５mM/ml）毒素を溶離した。２mlの画分を収集した。試料の毒素含有量をＣＨＯ−Ｋ１細胞による細胞毒性アッセイにより測定した。毒素を含有する画分をプールし、４℃および５０００rpmの超遠心分離工程で１５分間濃縮した。得られた毒素溶液に２０％グリセリンを加え、試料を−２０℃で保存した。
【００３３】
精製工程もまたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって監視した。クマシー染色により蛋白を可視化した。ＳＤＳゲル中で毒素の量をＢＳＡ標準と比較することにより、最終毒素試料の濃度を決定した。比較は光学的調整およびコンピューター解析により実施した。
【００３４】
ＤＴＴおよびＩＰ６を添加して毒素の自己触媒的開裂を誘導することによりワクチン調製物を製造した。毒素Ａの開裂は、３mMＩＰ６および５０mMＤＴＴの添加によりＨ２Ｏ中、最終容量５０μlで実施した。毒素Ｂの開裂は、１mMＩＰ６および１５０mMＤＴＴの添加によりＨ２Ｏ中、最終容量１００μlで実施した。回転培養機上３７℃で一夜自己開裂を実施した。
【００３５】
得られた開裂生成物を細胞毒性アッセイおよびＳＤＳ ＰＡＧＥ分析で分析した。Ｃａｃｏ細胞は毒素Ａに対してより高い感受性を示したため、細胞毒性アッセイはＣＨＯ−Ｋ１細胞およびＣａｃｏ細胞で実施した。Ｃａｃｏ細胞を、１０％ＦＣＳおよび０．５％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＭＥＭ培地を入れた、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートする９６のマイクロタイターウェル上で増殖させた。細胞毒性アッセイは、２４時間後、毒素Ａでは少なくとも１０３倍、そして毒素Ｂでは１０４倍の細胞毒性低下を示した。開裂効率をクマシー染色ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析で可視化した。
【００３６】
各々の不活性化毒素（トキソイド）を含むワクチン用量を、シグマ・アジュバント・システム（モノホスホリル脂質Ａおよび合成トレハロースジコリノミコラートを含む水中油エマルジョン）で製造した。ＳＤＳゲル中での毒素量をＢＳＡ標準と比較することにより、トキソイド濃度を決定した。比較は光学的調整およびコンピューター解析により実施した。アジュバントは製造者が記載したとおりにＰＢＳで再構成し、各々のトキソイド試料と１：１に混合した。
【００３７】
クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）感染の古典的モデル生物はシリアンハムスターである。シリアンハムスターはこの感染に極めて鋭敏に反応し、ヒトと類似の臨床徴候および病理変化を発現する。したがってハムスター感染モデルは、感染動物の１００％死亡で終わる非常に厳密なモデルである。
【００３８】
この試験では、体重６０〜８０ｇ（これらの数値を含む）のシリアンハムスターをCharles River（D-97633, Sulzfeld, Germany）から購入した。動物を、試験施設到着時に各群に無作為に分け、少なくとも５日間の充分な馴化期間を与えた。２週間間隔で３回ワクチン接種した。最後の免疫付与の１４日後、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）による感染を実施した。クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）の経口チャレンジの２４時間前に各動物にクリンダマイシン２mgを経口投与した。抗生物質クリンダマイシンの投与は、正常な腸内細菌叢を攪乱することにより、その動物をクロストリジウム・ディフィシレ（C. difficile）に感染し易くさせる。
【００３９】
チャレンジ後７日間にわたり毎日注意深く臨床検査を行い、臨床所見を記録した。この調査中、幾つかの時点で血液試料を採取し、血清を、培養細胞において毒素Ａおよび毒素Ｂの細胞毒性を阻害する抗体について分析した。故に、５０００細胞／ウェルのＣＨＯ−Ｋ１細胞を、１０％ＦＣＳ、０．５％Ｌ−グルタミンおよび０．５％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１０培地を入れた９６ウェルプレートに撒き、３７℃５％ＣＯ２で一夜インキュベートした。培地でハムスター血清の希釈液を調製し、毒素ＡおよびＢの希釈液と共に３７℃で１時間インキュベートした。毒素は、３時間および２４時間後に＞９０％細胞の円形化を惹起する濃度に希釈しておいた。細胞の円形化は、前記のように３時間および２４時間後に顕微鏡で決定した。中和価は、２４時間後に細胞の円形化を完全に阻害する最大血清希釈の逆数として定義した。
【００４０】
この試験の目的は、異なる用量の不活性化毒素ＡおよびＢの組み合わせによる反復皮下免疫付与が生体適合性であるかどうか、そして、クロストリジウム・ディフィシレ（C. difficile）感染に対する防御が誘導され得るかどうかを決定することである。故に、雄性シリアンハムスター１２匹を使用し、試験施設到着時に無作為に４群に分けた。各群は３匹の動物で構成された。ワクチン接種後の潜在的毒性効果に反応できるよう、これらの群に、異なる日に漸増用量でワクチン接種した。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
試験概要：
【００４３】
【表２】
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【００４４】
皮下ワクチン接種後、全動物が臨床徴候を示さなかったので、毒素の用量を毒素ＡおよびＢ各々について４μgまで増量できた。さらに、対照群の動物は皮下ワクチン接種に対して反応を示さず、このことは、皮下適用された場合にシグマアジュバントシステムが良好に忍容されることを証明するものである。試験中の数日における体重測定もまた、このワクチン接種の良好な忍容性を裏付けた。全ての動物は、チャレンジされるまで体重が増加した。毒素をワクチン接種された動物の体重増加は、対照群の体重増加に匹敵するものであった。さらに、毒素をワクチン接種された動物のチャレンジ前最終測定体重（平均値：第１群：１４０．３ｇ；第２群：１３６．３ｇ；第３群：１４４ｇ）は、対照動物の体重（第４群の平均値：１４１ｇ）の範囲にあった。
【００４５】
試験の４４日目のチャレンジ後、対照群の動物は２〜３日以内に死亡した。対照的に、開裂させた毒素をワクチン接種した動物は全て、より長く生存し、２匹は試験終了時まで殆ど臨床徴候を示さなかった（第１群の動物Ｎｏ．１；第３群の動物Ｎｏ．１）。
【００４６】
第１群の動物Ｎｏ．１は試験の４７日目にやや軟便を発現したが速やかに回復し、翌日および試験終了時まで臨床所見が無かった。試験終了時まで生存した他の動物（第３群のＮｏ．１）は、試験の４７日目以降５０日目まで、やや軟便、僅かに湿って汚れた下腹部、および自発活動の僅かな低下を示した。試験の５１日目には臨床徴候はなかった。
【００４７】
【表３】
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【００４８】
これらの結果に基づくと、トキソイドＡ／Ｂによる免疫付与は、免疫原性および部分的防御を誘導した：全てのワクチン接種動物は対照動物より長く生存した。チャレンジは全対照動物にとって致死的であったが、２／９のワクチン接種動物が試験終了時まで生存した。さらに、細胞毒性中和アッセイにおけるハムスター血清の分析は、免疫反応の発現を裏付けた。
【００４９】
【表４】
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【００５０】
毒素ＡまたはＢに対する細胞毒性中和抗体は、ワクチン接種前の血清には検出できず、対照群の動物は、試験の３８日目に最後の血液試料採取を行うまで中和抗体が検出されないままであった。ワクチン接種動物は全て、３回のワクチン接種後に両方の毒素に対する中和抗体を生成し（試験の３８日目）、これは、不活性化毒素調製物の免疫原性を明確に示すものである。また、この感受性ハムスターモデルにおいてチャレンジ力価が高過ぎたかも知れず、さらなる適応が必要であるかも知れない。異なるワクチン群の生存率を見ると、用量依存効果は観察され得ない。これは適用されたトキソイド濃度の僅かな相違に相関している可能性があり、したがって全てのワクチン接種動物は、むしろ１つのワクチン群として考えることができる。
【００５１】
総合すると、この試験の結果は、不活性化毒素が自己触媒的開裂によって良好に忍容され、この感染症に対する免疫反応および部分的防御を誘発できるということを立証する。
【国際調査報告】
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