【誤訳訂正書】
【提出日】令和2年8月19日(2020.8.19)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に両凹型円板形状を有するナノ粒子であって、前記ナノ粒子は、水性コア部、正電荷の両親媒性ポリマー含有二層状シェル、及びナノ粒子の内部にペイロードを含み、
前記二層状シェルは、親水性外層、親水性内層、及び前記層間の疎水性領域を有し、
前記両親媒性ポリマーは、
平均分子量が５，０００Ｄａ〜５０，０００Ｄａ、または１０，０００Ｄａ〜５０，０００Ｄａ、または１０，０００Ｄａ〜２５，０００Ｄａであって、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ポリマーの遊離反応性基の少なくとも４０％が脂質に結合している分岐ＰＥＩポリマー、または
平均分子量が５，０００Ｄａ〜５０，０００Ｄａ、または１０，０００Ｄａ〜５０，０００Ｄａ、または１０，０００Ｄａ〜２５，０００Ｄａであって、ＰＡＭＡＭポリマーの遊離反応性基の少なくとも２５％が脂質に結合しているＰＡＭＡＭポリマー
であり、
前記両親媒性ポリマーの表面反応性基の少なくとも約３０％は、約１個〜約６個のエチレンオキシドモノマーを有するポリエチレングリコール鎖を含む二官能性リンカーで、架橋しており；
前記ペイロードは、合成ヘモグロビン及び天然ヘモグロビンから選択される酸素運搬剤、酸素運搬剤のＯ２親和性を変化させるヘテロトロピックアロステリック調節因子、及び還元剤を含む、前記ナノ粒子。
【請求項２】
前記ナノ粒子の平均直径は、約１５０ｎｍ〜約３００ｎｍであって、前記ナノ粒子の平均高さは、約３０ｎｍ〜約８０ｎｍである、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
前記ナノ粒子は、貫通孔またはくぼみを含む、請求項１または２に記載のナノ粒子。
【請求項４】
前記アロステリック調節因子は、２，３−ジホスホグリセリン酸（２，３−ＤＰＧ）、イノシトール六リン酸（ＩＨＰ）、ピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）、及び２−［４−［［（３，５−ジメチルアニリノカルボニル］メチル］−フェノキシ］−２−メチルプロピオン酸からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項５】
前記還元剤は、ロイコメチレンブルー、グルタチオン及びアスコルビン酸塩からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項６】
前記ナノ粒子は、約３０００〜約１０，０００のヘモグロビン分子を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項７】
前記ナノ粒子は、約２０％〜約６０％（ｗ／ｖ）のヘモグロビンまたは約３０％〜約６０％（ｗ／ｖ）のヘモグロビンを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項８】
前記ナノ粒子は、実質的に、一酸化窒素を隔離することはない、請求項１〜７のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項９】
前記ナノ粒子は、前記ナノ粒子中のヘモグロビン全濃度の約１０％以下まで酸化を制限する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１０】
前記脂質は脂肪酸である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１１】
前記脂肪酸は、１０，１２−ペンタコサジイン酸、ヘキサデシルオクタデカン酸、コラン酸、リノール酸、Ｃ２４−ペンタコサジイン酸及びパルミチン酸からなる群から選択される、請求項１０に記載のナノ粒子。
【請求項１２】
前記アミン含有分岐ポリマーが、ＰＡＭＡＭポリマーであり、前記ＰＡＭＡＭポリマーの遊離反応性基の少なくとも４０％が脂質に結合している、請求項１〜１１いずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１３】
前記アミン含有分岐ポリマーが、ＰＥＩポリマーまたはＰＡＭＡＭポリマーであり、前記ＰＥＩポリマーまたはＰＡＭＡＭポリマーの遊離反応性基の少なくとも５５％が脂質に結合している、請求項１〜１１いずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１４】
ナノ粒子の調製方法であって、前記ナノ粒子は、実質的に両凹型円板状を有し、前記ナノ粒子は、水性コア部、両親媒性ポリマーを含む二層状シェル、及びナノ粒子の内部にペイロードを含み、前記ペイロードは、酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤を含み、前記方法は、
（ａ）脂質を分岐ポリマーの遊離反応性基の少なくとも２５％に共有結合より共役することによって、前記分岐ポリマーを疎水的修飾し、正電荷の両親媒性ポリマーを形成すること、ここで、前記分岐ポリマーは、
平均分子量が５，０００Ｄａ〜５０，０００Ｄａ、または１０，０００Ｄａ〜５０，０００Ｄａ、または１０，０００Ｄａ〜２５，０００Ｄａであって、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ポリマーの遊離反応性基の少なくとも４０％が脂質に結合している分岐ＰＥＩポリマー、または
平均分子量が５，０００Ｄａ〜５０，０００Ｄａ、または１０，０００Ｄａ〜５０，０００Ｄａ、または１０，０００Ｄａ〜２５，０００Ｄａであって、ＰＡＭＡＭポリマーの遊離反応性基の少なくとも２５％が脂質に結合しているＰＡＭＡＭポリマー
から選択され；そして、
前記両親媒性ポリマーの表面反応性基の少なくとも約３０％は、約１個〜約６個のエチレンオキシドモノマーを有するポリエチレングリコール鎖を含む二官能性リンカーで、分子内架橋しており；
（ｂ）前記正電荷の両親媒性ポリマーを非極性溶媒と混合すること、及び前記混合物を攪拌して、前記正電荷の両親媒性ポリマーを含む複数の反転ミセルを形成すること；
（ｃ）前記ペイロードを極性溶媒と混合すること、及び前記ペイロード混合物を（ｂ）の前記混合物に添加して、二相混合物を形成すること、及び前記二相混合物を攪拌し、前記ペイロードを前記反転ミセルに移行すること；
（ｄ）熱及び水性溶媒の存在下において前記ペイロード含有前記反転ミセルを攪拌して、前記ペイロード含有前記両凹型円板状ナノ粒子を形成すること；
を含む前記方法。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のナノ粒子を含む、血液代用組成物。
【請求項１６】
前記組成物は、溶液または凍結乾燥粉末である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のナノ粒子を含む、対象者の血液の酸素運搬能力を補充するための医薬。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１１】
【図１】ヘモグロビン含有ナノ粒子の調製及び種々の特性を示す図である。（Ａ）ナノ粒子の調製の略図及びナノ粒子の略図である。（Ｂ）ナノ粒子の調製におけるナノ粒子径の変動を示すプロットである。（Ｃ）時間の経過に伴う様々な凍結乾燥ナノ粒子径及び非凍結乾燥ナノ粒子径の変動を示すプロットである。（Ｄ）ニッケルグリッド上に堆積させたナノ粒子滴の透過型電子顕微鏡画像である。（Ｅ）Ｄにおけるナノ粒子の透過型電子顕微鏡画像の方形化部分の拡大図である。（Ｆ）ナノ粒子の原子間力顕微鏡画像である。
【図２】ｐＨ１０（濃青色曲線）、ｐＨ９（緑色の曲線）、ｐＨ８．５（マゼンタ色の曲線）、ｐＨ８（薄青色の曲線）及びｐＨ６（赤色の曲線）にて計測されたナノ粒子の酸素結合−分離曲線を示す図である。（Ａ）ロイコベンジルメチレンブルーで標識した酸素運搬ナノ粒子の酸素結合−解離曲線。（Ｂ）約５日間保管後の（Ａ）の酸素運搬ナノ粒子の酸素結合−解離曲線。（Ｃ）非標識酸素運搬ナノ粒子の酸素結合−解離曲線。（Ｄ）約５日間保管後の（Ｃ）の非標識酸素運搬ナノ粒子の酸素結合−解離曲線。
【図３】ナノ粒子のレオロジー特性（Ａ）及び薬物動態学特性（Ｂ）示すグラフである。（Ａ）ナノ粒子：少なくとも１０％トルク（ウエルズ−ブルックフィールド・コーン／プレート型粘度計）に相当するデータポイントを使用して、血漿懸濁液対ＮＺＷ（ウサギ）血漿の体積比１：９及び１：１０について、３７．１℃で試験を行った。せん断速度に対する粘度のプロットにより、ナノ粒子は、血漿粘度にいかなる影響も及ぼさないことが明らかになった。（Ｂ）ナノ粒子ヘモグロビンは、９９ｍＴｃトレーサー投与量（５０μＣｉ／ｋｇ）により放射線標識し、ラット（ｎ＝３）に投与した。ヘパリン化マイクロキャピラリーチューブに投与後、０分、５分、２０分、４０分、６０分、９０分、１２０分、１５０分の時点で血液サンプルを取り、密封して、マイクロシリンジ内に入れたアリコート１０μｌをプラスチックチューブに入れ、キャップを付け、オートウェルガンマカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｗｉｚａｒｄ３）を使用してカウントした。所見から、こうした特定の粒径範囲のナノ粒子にとって典型的な二項指数クリアランスが判明する。
【図４】表２に記載されている４つの異なるナノ粒子配合物のＮＯ隔離アッセイの代表的なトレースを図示する。差し込み図では、サンプルＦ−３を除き、その他の応答のより鮮明な画像が得られる。サンプル注入は、ヘムと等モルであり、データが正規化され、重複してもよい。
【図５】ＲＢＣ、無細胞Ｈｂ及び２つの異なるナノ粒子製剤Ｆ−３及びＦ−４のＮＯ隔離アッセイの代表的トレースを図示する（表２を参照されたい）。サンプルは、ヘムと等モルである。データが正規化され、重複し得る。挿入：各サンプルの初期隔離速度（データの最初の１０秒までにフィットさせる傾向線）。
【図６】生理学的対照（ＲＢＣ及び無細胞Ｈｂ）と比較して４つのナノ粒子配合物（Ｆ−１、Ｆ−２、Ｆ−３及びＦ−４；表２を参照されたい）について、除去されたすべてのＮＯを示す棒グラフである。曲線下面積（ＡＵＣ）は、隔離された全ＮＯを表す。いずれのサンプルも、ヘムと等モルである。＊ｐ＜０．０５；一元配置ＡＮＯＶＡ（ｎ＝５）。ナノ粒子配合物は、いずれも、ＲＢＣサンプル及びＨｂサンプルとは異なる。
【図７】生理学的対照（ＲＢＣ及び無細胞Ｈｂ）と比較して、４つのナノ粒子配合物（Ｆ−１、Ｆ−２、Ｆ−３及びＦ−４；表２を参照されたい）のＮＯ隔離速度を示す棒グラフである。ＮＯ除去の初期速度は、サンプル投与後の最初の１分までのデータに対して、トレッド（ｔｒｅａｄ）線のフィッティングにより計算した：＊ｐ＜０．０５；一元配置ＡＮＯＶＡ（ｎ＝５）。無細胞Ｈｂにより、無処置ＲＢＣよりも、ＮＯがさらに活発に隔離され（周知のとおり）、すべてのナノ粒子配合において、ＮＯの隔離は、ＲＢＣより少ない。ただし、Ｆ−３（ＲＢＣと当量）は除く。
【図８】全身及び組織のＨＩＦレベルがＨＩＦ−α（ＯＤＤ）中の［Ｈｂ］の関数に応じて変化することを示すグラフ及び画像である（ルシフェラーゼマウス）。（Ａ−Ｂ）全身ＨＩＦ−ルシフェラーゼレベルは、希釈性貧血症中において有意に増加した。（Ａ）は、ＨＩＦ−ルシフェラーゼレベルを図示し、（Ｂ）は、動物の全身を示す画像である。（Ｃ〜Ｅ）類似の方法で組織特異的ＨＩＦ−ルシフェラーゼルミネセンスを変更して行った；脳（Ｃ）、腎臓（Ｄ）及び肝臓（Ｅ）。（Ｆ〜Ｇ）（Ｃ〜Ｅ）と同様に、ウェスタンブロット法による脳ＨＩＦ−１αタンパク質発現の測定結果であり、血液希釈が比例的に増大している。（Ｆ）は、ＨＩＦ−αと対照（α−チュブリン）とのウェスタンブロットイメージを示し、；（Ｇ）では、ＨＩＦ−αタンパク質のレベルを図示する。（Ｈ〜Ｊ）同様に、選択されたＨＩＦ−依存性ｍＲＮＡレベルも同様に上昇している：（Ｈ）ＧＬＵＴ１、（Ｉ）ＰＤＫ１、（Ｊ）ＭＣＴ４。（Ｋ−Ｌ）Ｈｂレベルと動物全身のＨＩＦルシフェラーゼとの関係を示す画像及びグラフを示す。具体的には、貧血が発現しているかまたは貧血から回復している間のＨＩＦルシフェラーゼシグナルは、Ｈｂと逆相関している。（Ｋ）全身の画像及び（Ｌ）正規化全身放射輝度（左ｙ軸）またはヘモグロビン濃度（右ｙ軸）対貧血（ｘ軸）。ＮＢ：急性血液希釈中の脳ｐＯ２のペア測定結果（リン光クエンチによる）は、［Ｈｂ］と相関し、解析、ＨＩＦ発現傾向の分析を確認する。以下の（［Ｈｂ］（ｇ／Ｌ）＆ｐＯ２（ｍｍＨｇ）（平均±標準偏差））、Ｎは、８匹（マウス）の測定値である：Ｈｂ  １２５．１±８．３−＞ｐＯ２  ６５．０±８．３；Ｈｂ  ８８．３±５．４−＞ｐＯ２  ５６．４±９．５；Ｈｂ  ７２．５±７．４−＞ｐＯ２  ５２．１±１０．３；Ｈｂ  ５２．４±３．９−＞ｐＯ２  ４０．６±６．８。
【図９】げっ歯類出血性ショックモデルにおけるナノ粒子の有効性を示すグラフを示す。グラフ（Ａ）及び（Ｂ）は、血を抜いたことで、予測されるＡＶＯ２差の顕著な増大（２４から６７％へ増大）が、（Ａ）生理食塩水による蘇生後はその状態が持続し、（Ｂ）血液代用剤により蘇生後は解消した（６７から３１％へ正常化）ことを示す。（Ｃ）いずれかの蘇生流体（生理食塩水＝ＮＳ、ナノ粒子溶液＝ＮＰ）による血行力学的効果に差が観察されず、これは、血液代用剤のＯ２送達における有益性は、血圧の回復に加えて、改善されたＯ２含量によるものであることが示唆される。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１３６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１３６】
本明細書で使用するとき、語句「ナノ粒子の内部」とは、ナノ粒子外側部ではないナノ粒子の任意の部分を指す。ナノ粒子の内部は、ナノ粒子シェルの内層、ナノ粒子シェルの内層と外層との間の疎水性領域、水性コア部及びペイロードを含む。また、ナノ粒子の内部は、任意の分子を含んでもよい。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１５２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１５２】
他の方法のなかでもＴＥＭ、ＤＬＳ及びＡＦＭによってナノ粒子径、形状及び形態を測定した。ナノ粒子は、再懸濁後、流体力学的径１５０〜１８０ｎｍまたは１７３±１０ｎｍ、多分散度０．２６±０．０１及びゼータ電位約１２±２ｍＶであった。Ｐａｎ  Ｄ，  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ＳＤ，  Ｈｕ  Ｇ，  Ｓｅｎｐａｎ  Ａ，  Ｓｃｏｔｔ  ＭＪ，  Ｇａｆｆｎｅｙ  ＰＪ，  Ｗｉｃｋｌｉｎｅ  ＳＡ，  Ｌａｎｚａ  ＧＭ．Ｌｉｇａｎｄ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｎａｎｏｂｉａｌｙｓ  ａｓ  ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ  ａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｍａｎｇａｎｅｓｅ−ｂａｓｅｄ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔｓ.Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．  ２００８；１３０：９１８６−９１８７に記載されているように、分析を行った。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１５３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１５３】
自己組織化後、Ｓｕｌｆｏ−ＥＧＳ（エチレングリコールビス［スルホスクシンイミジルスクシネート］、ＰＢＳ、ｐＨ８．５）を用いて、ヒドロキシルアミンと組み合わせて、５時間、３７℃にて表面化学的架橋を行う。架橋は、粒径及びゼータ電位（それぞれ、１６７±５６ｎｍ、＋７±２ｍＶ）に対して限定的な影響を有する。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１６９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１６９】
実施例８  ナノ粒子のＯ２送達有効性の測定
ＨＩＦ−１αが安定化を示すことは、組織への不十分なＯ２送達のゴールドスタンダード測定である。これを達成するために、新規の動的な動物個体ＨＩＦレポーティングモデルを使用して、本開示の酸素運搬ナノ粒子が、未修飾Ｈｂの段階的低減中に組織へのＯ２送達を維持する能力を特定することができる。正常血液の希釈は、この分野において、急性外傷性失血及び急速輸液を促進するための１つの手段であり、この方法により、低血圧を制御し、血液Ｏ２含量減少の交絡因子として、低潅流を消失させる。対象の主要転帰：１）生存；２）組織ＰＯ２及び３）ＨＩＦ（ＯＤＤ）−ルシフェラーゼシグナル。ＨＩＦ−α（ＯＤＤ）ルシフェラーゼマウスにおける、全動物生物発光の定量化による急性貧血中のＨＩＦ発現／安定化及びその分解の非侵襲性監視方法が記述され、妥当性確認が行われた。例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｓａｆｒａｎ  Ｍ，Ｋｉｍ  ＷＹ，Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ  Ｆ，Ｆｌｉｐｐｉｎ  Ｌ，Ｇｕｎｚｌｅｒ  Ｖ，Ｈｏｒｎｅｒ  ＪＷ，Ｄｅｐｉｎｈｏ  ＲＡ，Ｋａｅｌｉｎ  ＷＧ，Ｊｒ．Ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｈｉｆ  ｐｒｏｌｙｌ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ：Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ｏｒａｌ  ａｇｅｎｔ  ｔｈａｔ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ.Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００６；１０３：１０５−１１０；またはＴｓｕｉ  ＡＫ，Ｍａｒｓｄｅｎ  ＰＡ，Ｍａｚｅｒ  ＣＤ，Ａｄａｍｓｏｎ  ＳＬ，Ｈｅｎｋｅｌｍａｎ  ＲＭ，Ｈｏ  ＪＪ，Ｗｉｌｓｏｎ  ＤＦ，Ｈｅｘｉｍｅｒ  ＳＰ，Ｃｏｎｎｅｌｌｙ  ＫＡ，Ｂｏｌｚ  ＳＳ，Ｌｉｄｉｎｇｔｏｎ  Ｄ，Ｅｌ−Ｂｅｈｅｉｒｙ  ＭＨ，Ｄａｔｔａｎｉ  ＮＤ，Ｃｈｅｎ  ＫＭ，Ｈａｒｅ  ＧＭ．Ｐｒｉｍｉｎｇ  ｏｆ  ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｙ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｎｅｍｉａ.Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１１；１０８：１７５４４−１７５４９；を参照されたい。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１７４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１７４】
実施例１０  げっ歯類出血性ショックモデルにおけるナノ粒子の有効性評価
げっ歯類出血性ショックモデルにおけるナノ粒子の有効性を評価した。ナノ粒子は、実施例９に記載されているように産生した。ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，４００ｇ，Ｎ＝３）は、麻酔下（イソフルラン）にて、人工換気施設にて気管切開（ＲＡ）を行い、頚静脈及び大腿静脈並びに頚動脈及び大腿動脈のカニューレーションを行った。血液Ｏ２含量及びＡＶＯ２差のベースライン値を制定後、血液量の２５％を脱血し、新しい値を得て、等量の血液代用剤（Ｎ＝２）または標準生理食塩水（Ｎ＝１）でラットを蘇生した。ナノ粒子（ＮＰ）を懸濁液［Ｈｂ］４ｍＭで４０ｗｔ／ｖｏｌ％にて懸濁した。図９に実験結果を示す。プロットは、血を抜いたことで予期されるＡＶＯ２差の著明な増大（２４％から６７％へ上昇）が、（Ａ）生理食塩水で蘇生した後は持続し、（Ｂ）血液代用剤で蘇生した後は解消した（６７％から３１％へ正常化）ことを示す。（Ｃ）では、いずれかの蘇生流体による血行力学的効果に差は、観察されず、これは、血液代用剤のＯ２送達における有益性は、血圧の回復に加えて改善されたＯ２含量から生じていることが示唆される。さらに、ＮＯ隔離により、血管収縮及び高血圧を引き起こすことが知られている他のヘモグロビン系血液代用剤とは異なり、ＮＰ系血液代用剤により、正常血行動態を再構築した。これにより、ＮＰが有意なＮＯ隔離を生じさせることはないことを示すインビトロデータが更に裏付けられる。