【手続補正書】
【提出日】令和2年3月9日(2020.3.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養からの組換え７型コラーゲン生成物を捕捉する方法において、
ａ）細胞培養から採取された上清をデプスフィルタに供するステップであって、上清は組換えヒト７型コラーゲンを含有する、上清をデプスフィルタに供するステップと、
ｂ）デプスフィルタを通り抜ける溶液を収集するステップと、
ｃ）ステップｂ）からの溶液を限外濾過ステップに供するステップであって、組換えヒト７型コラーゲンは限外濾過膜に隣接する層の中に集積する、溶液を限外濾過ステップに供するステップと、
ｄ）第１の保持液を廃棄するステップであって、第１の保持液は、ステップｂ）からの溶液中に含まれた不純物を含んでなる、第１の保持液を廃棄するステップと、
ｅ）組換えヒト７型コラーゲンを回収し、かつ組換えヒト７型コラーゲンを含んでなる第２の保持液を得るために、限外濾過膜に隣接する層を可溶化剤及び界面活性剤のうち少なくともいずれか一方に供するステップと、
ｆ）組換え７型コラーゲンを含んでなる未精製バルク液体を得るために第２の保持液を透析濾過ステップに供するステップと、
ｇ）任意選択で未精製バルク液体を凍結するステップと
を備え、
前記可溶化剤は尿素、チオ尿素、アルギニン、ブタノール、エタノール、過塩素酸リチウム、酢酸リチウム、酢酸マグネシウム、フェノール、プロパノール、硫酸ドデシルナトリウム、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスコルビン酸、グルタミン、アスパラギン、及びグアニジンのうち少なくとも１つを含有する、方法。
【請求項２】
ステップａ）の前に：
Ｉ）組換えヒト７型コラーゲンを生産する宿主細胞を培養するステップ；及び
ＩＩ）培養された宿主細胞から上清を採取するステップ
をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
未精製バルク液体は、ステップＩＩ）から収集された上清中の組換えヒト７型コラーゲンのうち４０〜８０％を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
細胞培養は、少なくとも２００リットルの量を用いてバイオリアクタ中で宿主細胞を培養することを含んでなる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
バイオリアクタは灌流バイオリアクタ又は流加培養式バイオリアクタである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
未精製バルク液体は５０グラムを上回る組換えヒト７型コラーゲンを含有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
可溶化剤は、アルギニンを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
組換えヒト７型コラーゲンを精製する方法において、
ａ）組換えヒト７型コラーゲンを含有する試料を、混合モードのフロースルー式樹脂に供するステップであって、混合モードのフロースルー式樹脂はリガンド活性化コア及び不活性シェルを含んでなり、不活性シェルは組換えヒト７型コラーゲンがリガンド活性化コアに入るのを防止し、かつ十分に小さい不純物は不活性シェルを通り抜けてリガンド活性化コアに結合する、試料を混合モードのフロースルー式樹脂に供するステップと、
ｂ）混合モードのフロースルー式樹脂を通り抜け、かつ組換えヒト７型コラーゲンを含有する、第１の流出液を収集するステップと、
ｃ）ステップｂ）からの第１の流出液を、組換えヒト７型コラーゲンが陽イオン交換クロマトグラフィ樹脂に結合することを可能にする条件下で陽イオン交換クロマトグラフィ樹脂に供するステップと、
ｄ）陽イオン交換クロマトグラフィ樹脂から組換えヒト７型コラーゲンを溶出させるステップと、
ｅ）ステップｄ）からの溶出した組換えヒト７型コラーゲンを、フロースルーモードの疎水性相互作用クロマトグラフィ樹脂に供し、疎水性相互作用クロマトグラフィ樹脂を通り抜ける第２の流出液を収集するステップと、
ｆ）ステップｇ）に先立ち、ステップｅ）からの第２の流出液に可溶化剤及び界面活性剤のうち少なくともいずれか一方を添加するステップと、
ｇ）ステップｆ）の第２の流出液を、組換えヒト７型コラーゲンを濃縮するために限外濾過ステップに供するステップと、
ｈ）ステップｇ）からの濃縮された組換えヒト７型コラーゲンを、少なくとも１つの塩と、可溶化剤と、糖と含有するバッファーを用いて透析濾過するステップと、
ｉ）精製された組換えヒト７型コラーゲンを回収するステップと
を含んでなり、
１以上のウイルス低減ステップ及びエンドヌクレアーゼ処理ステップを含んでなる方法。
【請求項９】
限外濾過ステップは接線流フィルタを含んでなり、接線流フィルタは親水性膜を含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
１以上のウイルス低減ステップは、ステップａ）に先立ち組換えヒト７型コラーゲンを含有する試料に放射線照射するステップ、ステップｂ）からの第１の流出液に界面活性剤を添加するステップ、及びステップｅ）からの第２の流出液を多孔質フィルタに供するステップ、を含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
エンドヌクレアーゼ処理ステップは、ステップｄ）からの溶出された組換えヒト７型コラーゲンを、エンドヌクレアーゼで処理することを含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
バッファーは、少なくとも１つの塩、可溶化剤、及び糖質を含んでなり、前記可溶化剤は尿素、チオ尿素、アルギニン、ブタノール、エタノール、過塩素酸リチウム、酢酸リチウム、酢酸マグネシウム、フェノール、プロパノール、硫酸ドデシルナトリウム、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスコルビン酸、グルタミン、アスパラギン、及びグアニジンのうち少なくとも１つを含有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１つの塩は、塩化ナトリウム、クエン酸塩、及びリン酸ナトリウムのうち１以上であり、可溶化剤はアルギニンであり、糖質はスクロースである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップｉ）の精製された組換えヒト７型コラーゲンは、ステップａ）からの試料中の組換えヒト７型コラーゲンの量の平均１５〜３０％を含有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ステップａ）における試料は少なくとも２５グラムの組換えヒト７型コラーゲンを含有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも４．０グラムの精製された組換えヒト７型コラーゲンがステップｉ）において回収される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ステップｉ）の精製された組換えヒト７型コラーゲンは、宿主細胞タンパク質を組換えヒト７型コラーゲン１ｍｇあたり６００ｎｇ／ｍｇ以下しか含有しない、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ステップｉ）の精製された組換えヒト７型コラーゲンは、宿主細胞ＤＮＡを組換えヒト７型コラーゲン１ｍｇあたり１５ｐｇ／ｍｇ以下しか含有しない、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ステップｉ）の精製された組換えヒト７型コラーゲンは、エンドトキシンを組換えヒト７型コラーゲン１ｍｇあたり０．５０ＥＵ／ｍｇ以下しか含有しない、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ステップＩ）の前に：
Ｉ）細胞培養から採取された上清をデプスフィルタに供するステップであって、上清は組換えヒト７型コラーゲンを含有する、上清をデプスフィルタに供するステップと、
ＩＩ）デプスフィルタを通り抜ける溶液を収集するステップと、
ＩＩＩ）ステップＩＩ）からの溶液を限外濾過ステップに供するステップであって、組換えヒト７型コラーゲンは限外濾過膜に隣接する層の中に集積する、ステップＩＩ）からの溶液を限外濾過ステップに供するステップと、
ＩＶ）第１の保持液を廃棄するステップであって、第１の保持液は、ステップＩＩ）からの溶液中に含まれた不純物を含んでなる、第１の保持液を廃棄するステップと、
Ｖ）組換えヒト７型コラーゲンを回収し、かつ組換えヒト７型コラーゲンを含んでなる第２の保持液を得るために、限外濾過膜に隣接する層を可溶化剤及び界面活性剤のうち少なくともいずれか一方に供するステップと、
ＶＩ）組換えヒト７型コラーゲンを含んでなる未精製バルク液体を得るために第２の保持液を透析濾過ステップに供するステップと、
ＶＩＩ）任意選択で未精製バルク液体を凍結するステップと
をさらに備え、
前記可溶化剤は、尿素、チオ尿素、アルギニン、ブタノール、エタノール、過塩素酸リチウム、酢酸リチウム、酢酸マグネシウム、フェノール、プロパノール、硫酸ドデシルナトリウム、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスコルビン酸、グルタミン、アスパラギン、及びグアニジンのうち少なくとも１つを含んでなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記可溶化剤はアルギニンを含んでなる、請求項２０に記載の方法。