【手続補正書】
【提出日】令和2年8月26日(2020.8.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標識ヌクレオチドを組み込む方法であって：
ａ）ｉ）複数の核酸プライマーおよびテンプレート分子、
ｉｉ）ポリメラーゼ、
ｉｉｉ）ゲンチジン酸、およびプロトカテク酸エチルエステルからなる群から選択される抗酸化物質を含む化合物の光防護性混合物を含むイメージング試薬、ならびに
ｉｖ）複数のヌクレオチドアナログであって、該ヌクレオチドアナログの少なくとも一部が、切断可能なリンカーを介して塩基へと取り付けられた標識により標識されているヌクレオチドアナログ、
を提供することと；
ｂ）ハイブリダイズされたプライマーを作り出すために、該プライマーの少なくとも一部を該テンプレート分子の少なくとも一部へとハイブリダイズすることと；
ｃ）組み込まれた標識ヌクレオチドアナログを含む伸長プライマーを作り出すために、第１の標識ヌクレオチドアナログを、該ポリメラーゼを用いて、該ハイブリダイズされたプライマーの少なくとも一部へと組み込むことと；
ｄ）該組み込まれた標識ヌクレオチドアナログを、該イメージング試薬の存在下でイメージングすることと
を含む、方法。
【請求項２】
前記光防護性混合物が、少なくとも１つの蛍光消光阻害剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの蛍光消光阻害剤が、ｔｒｏｌｏｘである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記光防護性混合物が、少なくとも１つのラジカル捕捉化合物をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つのラジカル捕捉化合物が、カルニチンである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｅ）第２のヌクレオチドアナログを、前記ポリメラーゼを用いて、前記伸長プライマーの少なくとも一部へと組み込むこと、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ゲンチジン酸、およびプロトカテク酸エチルエステルからなる群から選択される少なくとも１つの抗酸化物質、少なくとも１つの蛍光消光阻害剤、および緩衝液を含む、イメージング試薬。
【請求項８】
少なくとも１つのラジカル捕捉剤をさらに含む、請求項７に記載のイメージング試薬。
【請求項９】
前記少なくとも１つのラジカル捕捉剤が、カルニチンである、請求項８に記載のイメージング試薬。
【請求項１０】
前記蛍光消光阻害剤が、ｔｒｏｌｏｘである、請求項７に記載のイメージング試薬。
【請求項１１】
フローセルを含むシステムであって、該フローセルが、切断可能な標識を取り付けられた複数のヌクレオチドアナログを含むテンプレートへとハイブリダイズされるプライマーの溶液と、ゲンチジン酸、およびプロトカテク酸エチルエステルからなる群から選択される少なくとも１つの抗酸化物質、少なくとも１つの蛍光消光阻害剤、および緩衝液を含むイメージング試薬とを含む、システム。
【請求項１２】
前記ハイブリダイズされるプライマーおよび前記テンプレートが、固定されている、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記イメージング試薬が、少なくとも１つのラジカル捕捉剤をさらに含む、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１４】
前記少なくとも１つのラジカル捕捉剤が、カルニチンである、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの蛍光消光阻害剤が、ｔｒｏｌｏｘである、請求項１１に記載のシステム。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
本明細書における用語「発光」および／または「蛍光」は、電磁放射（光）を物体、化学物質、および／または化合物から放射させる、任意のプロセスを指す。発光および／または蛍光は、光子の形でのエネルギーの開放に相当し、励起状態からより低い状態へと「リラックス」させる系に起因する。これらの状態は、電子的、振電的、回転的、またはこれら３つの任意の組み合わせであり得る。発光の原因となる遷移は、系内部で化学的に蓄えられたエネルギー、または外部供給源から系に加えられたエネルギーの開放を介して刺激され得る。エネルギーの外部供給源は、様々なタイプであり得る（例えば、化学的、熱的、電気的、磁気的、電磁的、物理的、または系を基底状態より高い状態へと励起させ得る任意の他のタイプが挙げられるが、これらに限定されない）。例えば系は、光の光子の吸収、磁場内への設置、または化学的な酸化還元反応を介して励起され得る。発光の間に放出される光子のエネルギーは、低エネルギーなマイクロ波放射から高エネルギーなＸ線放射までの範囲内であり得る。典型的には、発光はＵＶからＩＲ放射の範囲内の光子を指す。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
標識ヌクレオチドを組み込む方法であって：
ａ）ｉ）複数の核酸プライマーおよびテンプレート分子、
ｉｉ）ポリメラーゼ、
ｉｉｉ）化合物の光防護性混合物を含むイメージング試薬、ならびに
ｉｖ）複数のヌクレオチドアナログであって、該ヌクレオチドアナログの少なくとも一部が、切断可能なリンカーを介して塩基へと取り付けられた標識により標識されているヌクレオチドアナログ、
を提供することと；
ｂ）ハイブリダイズされたプライマーを作り出すために、該プライマーの少なくとも一部を該テンプレート分子の少なくとも一部へとハイブリダイズすることと；
ｃ）組み込まれた標識ヌクレオチドアナログを含む伸長プライマーを作り出すために、第１の標識ヌクレオチドアナログを、該ポリメラーゼを用いて、該ハイブリダイズされたプライマーの少なくとも一部へと組み込むことと；
ｄ）該組み込まれた標識ヌクレオチドアナログを、該イメージング試薬の存在下でイメージングすることと
を含む、方法。
（項目２）
前記光防護性混合物が、少なくとも１つの蛍光消光阻害剤を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記少なくとも１つの蛍光消光阻害剤が、ｔｒｏｌｏｘである、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記光防護性混合物が、少なくとも１つの抗酸化物質および少なくとも１つのラジカル捕捉化合物をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記少なくとも１つの抗酸化物質が、ゲンチジン酸、プロトカテク酸、およびプロトカテク酸エチルエステルからなる群から選択される、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記少なくとも１つのラジカル捕捉化合物が、カルニチンである、項目４に記載の方法。
（項目７）
ステップ（ｅ）第２のヌクレオチドアナログを、前記ポリメラーゼを用いて、前記伸長プライマーの少なくとも一部へと組み込むこと、をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記標識が蛍光性である、項目１に記載の方法。
（項目９）
少なくとも１つの抗酸化物質、少なくとも１つの蛍光消光阻害剤、および緩衝液を含む、イメージング試薬。
（項目１０）
前記少なくとも１つの抗酸化物質が、ゲンチジン酸、プロトカテク酸、およびプロトカテク酸エチルエステルからなる群から選択される化合物を含む、項目９に記載のイメージング試薬。
（項目１１）
少なくとも１つのラジカル捕捉剤をさらに含む、項目９に記載のイメージング試薬。
（項目１２）
前記少なくとも１つのラジカル捕捉剤が、カルニチンである、項目１１に記載のイメージング試薬。
（項目１３）
前記蛍光消光阻害剤が、ｔｒｏｌｏｘである、項目９に記載のイメージング試薬。
（項目１４）
前記緩衝液が、ＴＲＩＳ緩衝液である、項目９に記載のイメージング試薬。
（項目１５）
前記緩衝液が、ＨＥＰＥＳ緩衝液である、項目９に記載のイメージング試薬。
（項目１６）
ｉ）少なくとも１つの抗酸化物質、少なくとも1つの蛍光消光阻害剤、および緩衝液を含
むイメージング試薬を含む第１の容器、ならびに
ｉｉ）複数のヌクレオチドアナログを含む第２の容器であって、該ヌクレオチドアナログの少なくとも一部が、切断可能なリンカーを介して塩基へと取り付けられた標識により標識されている、第２の容器、
を含むキット。
（項目１７）
前記第１の容器が、少なくとも１つのラジカル捕捉剤をさらに含む、項目１６に記載のキット。
（項目１８）
前記少なくとも１つのラジカル捕捉剤が、カルニチンである、項目１７に記載のキット。
（項目１９）
前記少なくとも１つの蛍光消光阻害剤が、ｔｒｏｌｏｘである、項目１６に記載のキット。
（項目２０）
前記緩衝液が、ＴＲＩＳ緩衝液である、項目１６に記載のキット。
（項目２１）
前記緩衝液が、ＨＥＰＥＳ緩衝液である、項目１６に記載のキット。
（項目２２）
切断可能な標識を取り付けられた複数のヌクレオチドアナログを含むテンプレートへとハイブリダイズされるプライマーの溶液と、少なくとも１つの抗酸化物質、少なくとも１つの蛍光消光阻害剤、および緩衝液を含むイメージング試薬とを含む、システム。
（項目２３）
前記ハイブリダイズされるプライマーおよび前記テンプレートが、固定されている、項目２２に記載のシステム。
（項目２４）
前記ハイブリダイズされるプライマーおよび前記テンプレートが、フローセル内にある、項目２２に記載のシステム。
（項目２５）
前記イメージング試薬が、少なくとも１つのラジカル捕捉剤をさらに含む、項目２２に記載のシステム。
（項目２６）
前記少なくとも１つのラジカル捕捉剤が、カルニチンである、項目２５に記載のシステム。
（項目２７）
前記少なくとも１つの蛍光消光阻害剤が、ｔｒｏｌｏｘである、項目２２に記載のシステム。
（項目２８）
前記緩衝液が、ＴＲＩＳ緩衝液である、項目２２に記載のシステム。
（項目２９）
前記緩衝液が、ＨＥＰＥＳ緩衝液である、項目２２に記載のシステム。
（項目３０）
ｉ）ＴＲＩＳ  ＨＣｌ緩衝液；
ｉｉ）およそ５〜５０ｍＭの範囲内の濃度のカルニチン；
ｉｉｉ）およそ５〜１５ｍＭの範囲内の濃度のｔｒｏｌｏｘ；
ｉｖ）およそ１０〜５０ｍＭの範囲内の濃度の２，５−ジヒドロキシ安息香酸；および
ｖ）およそ１０〜２０ｍＭの範囲内の濃度の３，４−ジヒドロキシ安息香酸エチルエステル、
を含むイメージング試薬。