【手続補正書】
【提出日】令和2年4月6日(2020.4.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボ核酸（ＲＮＡ）を生合成する無細胞的方法であって、該方法が：
（ａ）ＲＮＡと、リボヌクレアーゼ、耐熱性キナーゼ、および耐熱性ＲＮＡポリメラーゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素とを含む細胞ライセート混合物をインキュベートして、解重合したヌクレオシド一リン酸を含む細胞ライセート混合物を生産すること；
（ｂ）ステップ（ａ）において生産された細胞ライセート混合物を、耐熱性キナーゼおよび耐熱性ＲＮＡポリメラーゼを不活性化することなしに内在性ヌクレアーゼおよびホスファターゼを不活性化または部分的に不活性化する温度に加熱して、熱不活性化されたヌクレアーゼおよびホスファターゼを含む細胞ライセート混合物を生産すること；および
（ｃ）（ｂ）において生産された細胞ライセート混合物を、エネルギー供給源と関心のＲＮＡをコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）鋳型との存在下においてインキュベートして、関心のＲＮＡを含む細胞ライセート混合物を生産すること、
を含む、
前記方法。
【請求項２】
細胞ライセート混合物が、単一の細胞ライセートまたは少なくとも２つの細胞ライセートを含み、少なくとも２つの細胞ライセートのうちの少なくとも１つの細胞ライセートが、ＲＮＡを含む細胞から得られ、少なくとも２つの細胞ライセートのうちの少なくとも１つの細胞ライセートが、リボヌクレアーゼ、キナーゼ、および／またはＲＮＡポリメラーゼを発現する細胞から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
リボヌクレアーゼが、Ｓ１ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＰ１、ＲＮａｓｅ  ＩＩ、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ  Ｒ、ＲＮａｓｅ  ＪＩ、ＮｕｃＡ、ＰＮＰａｓｅ、ＲＮａｓｅ  Ｔ、ＲＮａｓｅ  Ｅ、ＲＮａｓｅＧおよびEscherichia coli  ＲＮａｓｅ  Ｒからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
耐熱性キナーゼが、耐熱性ヌクレオシド一リン酸キナーゼ、耐熱性ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、および耐熱性ポリリン酸キナーゼからなる群から選択され、任意に、耐熱性ヌクレオシド一リン酸キナーゼが、耐熱性ウリジル酸キナーゼ、耐熱性シチジル酸キナーゼ、耐熱性グアニル酸キナーゼ、および耐熱性アデニル酸キナーゼからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
耐熱性ヌクレオシド一リン酸キナーゼが、耐熱性Pyrococcus furiosusウリジル酸キナーゼ（ＰｆＰｙｒＨ）、耐熱性Thermus thermophilusアデニル酸キナーゼ（ＴｔｈＡｄｋ）、耐熱性Thermus thermophilusシチジル酸キナーゼ（ＴｔｈＣｍｋ）、および耐熱性Thermotoga maritimaグアニル酸キナーゼ（ＴｍＧｍｋ）からなる群から選択され、および／または、耐熱性ヌクレオシド二リン酸キナーゼが、耐熱性Aquifex aeolicusヌクレオシド二リン酸キナーゼからなる群から選択され、および／または、耐熱性ポリリン酸キナーゼが、耐熱性ポリリン酸キナーゼ１（ＰＰＫ１）酵素および耐熱性ポリリン酸キナーゼ２（ＰＰＫ２）酵素からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
耐熱性ＰＰＫ１酵素が、耐熱性Thermosynechococcus elongatus ＰＰＫ１酵素からなる群から選択され、および／または、耐熱性ＰＰＫ２酵素が、耐熱性クラスＩＩＩ ＰＰＫ２酵素からなる群から選択され、任意に、耐熱性クラスＩＩＩ  ＰＰＫ２酵素が、Meiothermus ruber、Meiothermus silvanus、Deinococcus geothermalis、Thermosynechococcus elongates、Anaerolinea thermophile、Caldilinea aerophila、Chlorobaculum tepidum、Oceanithermus profundus、Roseiflexus castenholzii、Roseiflexus sp.、およびTruepera radiovctrix ＰＰＫ２酵素からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
耐熱性クラスＩＩＩ  ＰＰＫ２酵素が、配列番号８〜１８のいずれか１つによって同定されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む耐熱性クラスＩＩＩ  ＰＰＫ２酵素からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
細胞ライセート混合物が、少なくとも１つのリボヌクレアーゼ、少なくとも１つの耐熱性ヌクレオシド一リン酸キナーゼ、少なくとも１つの耐熱性ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、および少なくとも１つのポリリン酸キナーゼを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つの耐熱性ＲＮＡポリメラーゼが、耐熱性ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼからなる群から選択され、任意に、耐熱性ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが、耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、耐熱性ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ、および耐熱性Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
エネルギー供給源が、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）またはＡＴＰ再生系であり、任意に、ＡＴＰ再生系が、ポリリン酸、任意にヘキサメタリン酸、ヌクレオシド一リン酸、およびポリリン酸キナーゼを含み、さらに任意に、エネルギー供給源、またはエネルギー供給源の少なくとも１つのコンポーネントがステップ（ｃ）の細胞ライセート混合物に追加される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つの精製された酵素または融合酵素がステップ（ａ）および／またはステップ（ｃ）の細胞ライセート混合物に追加され、該少なくとも１つの精製された酵素または融合酵素は、リボヌクレアーゼ、耐熱性キナーゼ、および／または耐熱性ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
（ｉ）ステップ（ａ）の細胞ライセート混合物が、関心のＲＮＡをコードするＤＮＡ鋳型を含む、および／または、
（ｉｉ）ステップ（ａ）の細胞ライセート混合物が、さらにＭｇ２＋キレート剤を含み、任意に、Ｍｇ２＋キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）であるか、または、さらに塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）および／または硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）を含む、および／または、
（ｉｉｉ）ステップ（ｂ）の温度が、５０℃〜８０℃である、および／または、
（ｉｖ）関心のＲＮＡをコードするＤＮＡ鋳型がステップ（ｃ）の細胞ライセート混合物に追加される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
関心のＲＮＡが、一本鎖ＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡであり、任意に、一本鎖ＲＮＡが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、または、ヒンジドメインによって互いに連結された相補的なドメインを含有する一本鎖ＲＮＡであり、任意に、二本鎖ＲＮＡが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり、さらに任意に、関心のＲＮＡが、少なくとも１ｇ／Ｌ、少なくとも５ｇ／Ｌ、少なくとも１０ｇ／Ｌの濃度で生産される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
任意に、熱不活性化された細胞ライセート混合物と蛋白質沈殿剤とを組み合わせること、および沈殿した蛋白質、脂質、およびＤＮＡを除去することによって、関心のＲＮＡを精製することをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
細胞が、細菌細胞または酵母であり、任意に、細菌細胞が、Escherichia coli細胞である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
細胞培養培地中で、（ａ）ＲＮＡを含む細胞と、（ｂ）少なくとも１つのリボヌクレアーゼ、少なくとも１つの耐熱性キナーゼ、および少なくとも１つの耐熱性ＲＮＡポリメラーゼを含む細胞とを培養することを含む、方法であって、任意に、以下：
（ｉ）（ａ）および（ｂ）の細胞を溶解して細胞ライセートを生産することおよび該細胞ライセートを組み合わせて複数の酵素を含有する混合物を生産すること；あるいは
（ｉｉ）（ａ）および（ｂ）の細胞を組み合わせること、および組み合わせられた細胞を溶解して複数の酵素を含有する混合物を生産することをさらに含み、任意に、
細胞ライセートを、耐熱性キナーゼを完全に不活性化することなしに内在性ヌクレアーゼおよびホスファターゼを不活性化または部分的に不活性化する温度に加熱して、熱不活性化された細胞ライセートを生産することをさらに含み、および、任意に、
熱不活性化された細胞ライセートを、エネルギー供給源および関心のＲＮＡをコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）鋳型の存在下、ヌクレオシド三リン酸の生産およびヌクレオシド三リン酸の重合をもたらす条件下でインキュベートして、関心のＲＮＡを含む細胞ライセート混合物を生産することをさらに含む、前記方法。
【請求項１７】
少なくとも１つの耐熱性ヌクレオシド一リン酸キナーゼ、少なくとも１つの耐熱性ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、および少なくとも１つのポリリン酸キナーゼを含み、任意に、少なくとも１つのリボヌクレアーゼおよび／または少なくとも１つの熱安定性ＲＮＡポリメラーゼをさらに含む、改変細胞。
【請求項１８】
ヌクレオシド三リン酸、関心のリボ核酸（ＲＮＡ）をコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、少なくとも１つのリボヌクレアーゼ、少なくとも１つの耐熱性キナーゼ、および少なくとも１つの耐熱性ＲＮＡポリメラーゼを含み、任意に、エネルギー供給源、ヌクレオシド一リン酸、および５’−ヌクレオシド一リン酸から５’−ヌクレオシド三リン酸への変換を直接的または間接的に触媒するキナーゼをさらに含み、および／または、任意に、
該細胞ライセートおよび／または該細胞ライセートの少なくとも１つのコンポーネントは改変細胞および／または細菌細胞から得られ、任意に細菌細胞が、Escherichia coli細胞である、前記細胞ライセート。
【請求項１９】
（ｉ）少なくとも１つのリボヌクレアーゼが、Ｓ１ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＰ１、ＲＮａｓｅ  ＩＩ、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ  Ｒ、ＲＮａｓｅ  ＪＩ、ＮｕｃＡ、ＰＮＰａｓｅ、ＲＮａｓｅ  Ｔ、ＲＮａｓｅ  Ｅ、およびＲＮａｓｅＧからなる群から選択され、および／または、
（ｉｉ）少なくとも１つのキナーゼが、ヌクレオシド一リン酸キナーゼ、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、およびポリリン酸キナーゼからなる群から選択され、および／または、
（ｉｉｉ）少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ、およびＴ３  ＲＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、請求項１８に記載の細胞ライセート。