(57)【要約】ウイルス（例えばセンダイウイルス（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  Ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ，ＨＶＪ））エンベロープの工業的精製方法を提供する。具体的には、不活性化されたウイルスエンベロープをイオン交換クロマトグラフィーと疎水性クロマトグラフィーを併用して精製することにより、ウイルスの細胞融合活性を保ちつつ、かつ高回収率で精製する方法を提供する。精製されたウイルスエンベロープは遺伝子などの生体高分子を細胞や生体内に導入するベクターとして使用され得る。またこの方法は弱毒型のエンベロープウイルスの精製にも用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスエンベロープの精製において、疎水性クロマトグラフィーを用いることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記疎水性クロマトグラフィーの官能基が弱疎水性基である、請求の範囲１記載の方法。
【請求項３】
前記疎水性クロマトグラフィーの官能基がオリゴエチレングリコール基またはフェニル基である、請求の範囲１または２記載の方法。
【請求項４】
前記疎水性クロマトグラフィーの官能基がオリゴエチレングリコール基である、請求の範囲１ないし３記載の方法。
【請求項５】
前記疎水性クロマトグラフィーとイオン交換樹脂クロマトグラフィーおよび／またはゲルろ過クロマトグラフィーを組み合わせることを特徴とする、請求の範囲１ないし４記載の方法。
【請求項６】
イオン交換クロマトグラフィーと疎水性クロマトグラフィーを組み合わせることを特徴とする、請求の範囲５記載の方法。
【請求項７】
第一のクロマトグラフィーにイオン交換樹脂、第二のクロマトグラフィーに疎水性樹脂を用いる、請求の範囲５または６記載の方法。
【請求項８】
イオン交換クロマトグラフィーが陰イオン交換クロマトグラフィーである、請求の範囲５ないし７記載の方法。
【請求項９】
イオン交換クロマトグラフィーが弱陰イオン交換クロマトグラフィーである、請求の範囲５ないし８記載の方法。
【請求項１０】
イオン交換クロマトグラフィーの官能基がジエチルアミノプロピル（ＤＥＡＰ）基である、請求の範囲５ないし９記載の方法。
【請求項１１】
イオン交換クロマトグラフィーの官能基が低密度置換型（Ｌｏｗ  Ｓｕｂ）である、請求の範囲５ないし１０記載の方法。
【請求項１２】
クロマトグラフィーのバッファーがｐＨ７〜９である、請求の範囲１ないし１１記載の方法。
【請求項１３】
クロマトグラフィーのバッファーがｐＨ７．８〜８．５である請求の範囲１ないし１２記載の方法。
【請求項１４】
イオン交換クロマトグラフィーに用いるバッファーが塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含む、請求の範囲５ないし１３記載の方法。
【請求項１５】
イオン交換クロマトグラフィーの試料吸着時のバッファーが塩化ナトリウム０．０１〜１５０ｍＭを含む、請求の範囲５ないし１４記載の方法。
【請求項１６】
イオン交換クロマトグラフィーの試料吸着時のバッファーが塩化ナトリウム３０〜７０ｍＭを含む、請求の範囲５ないし１５記載の方法。
【請求項１７】
イオン交換クロマトグラフィーの洗浄時のバッファーが塩化ナトリウム１５０ｍＭ〜２５０ｍＭを含む、請求の範囲５ないし１６記載の方法。
【請求項１８】
イオン交換クロマトグラフィーの洗浄時のバッファーが塩化ナトリウム１９０〜２３０ｍＭを含む、請求の範囲５ないし１７記載の方法。
【請求項１９】
イオン交換クロマトグラフィーの溶出時のバッファーが塩化ナトリウム１００ｍＭ〜１０００ｍＭを含む、請求の範囲５ないし１８記載の方法。
【請求項２０】
イオン交換クロマトグラフィーの溶出時のバッファーが塩化ナトリウム２９０〜３３０ｍＭを含む、請求の範囲５ないし１９記載の方法。
【請求項２１】
疎水性クロマトグラフィーに用いるバッファーが硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムまたは塩化ナトリウムを含む、請求の範囲１ないし２０記載の方法。
【請求項２２】
疎水性クロマトグラフィーの吸着時のバッファーが硫酸アンモニウム１．０Ｍ〜２．５Ｍを含む、請求の範囲１ないし２１記載の方法。
【請求項２３】
疎水性クロマトグラフィーの吸着時のバッファーが硫酸アンモニウム１．８〜２．２Ｍを含む、請求の範囲１ないし２２記載の方法。
【請求項２４】
疎水性クロマトグラフィーの洗浄時のバッファーが硫酸アンモニウム１．０〜１．６Ｍを含む、請求の範囲１ないし２３記載の方法。
【請求項２５】
疎水性クロマトグラフィーの洗浄時のバッファーが硫酸アンモニウム１．２〜１．５Ｍを含む、請求の範囲１ないし２４記載の方法。
【請求項２６】
疎水性クロマトグラフィーの溶出時のバッファーが硫酸アンモニウム０．０１〜１．５Ｍを含む、請求の範囲１ないし２５記載の方法。
【請求項２７】
疎水性クロマトグラフィーの溶出時のバッファーが硫酸アンモニウム０．６〜１．０Ｍを含む、請求の範囲１ないし２６記載の方法。
【請求項２８】
疎水性クロマトグラフィーの溶出時のバッファーが親水性有機溶媒を含む請求の範囲１ないし２７記載の方法。
【請求項２９】
親水性有機溶媒が多価アルコールまたは低級アルコールである請求の範囲２８記載の方法。
【請求項３０】
多価アルコールがエチレングリコールである請求の範囲２８または２９記載の方法。
【請求項３１】
エチレングリコールの濃度が０．０１〜５０％である、請求の範囲２８ないし３０記載の方法。
【請求項３２】
エチレングリコールの濃度が２〜１０％である、請求の範囲２８ないし３１記載の方法。
【請求項３３】
エチレングリコールの濃度が３〜７％である、請求の範囲２８ないし３２記載の方法。
【請求項３４】
疎水性クロマトグラフィーの溶出時のバッファーが界面活性剤を含む、請求の範囲１ないし３３記載の方法。
【請求項３５】
前記界面活性剤が、ツィーン８０（Ｔｗｅｅｎ８０）またはトライトンＸ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ）である、請求の範囲１ないし３４記載の方法。
【請求項３６】
疎水性クロマトグラフィーの溶出時のバッファーがツィーン８００．００１〜１％を含む、請求の範囲１ないし３５記載の方法。
【請求項３７】
疎水性クロマトグラフィーの溶出時のバッファーがツィーン８００．０１〜０．１％を含む、請求の範囲１ないし３６記載の方法。
【請求項３８】
疎水性クロマトグラフィーにおいて、試料吸着後、吸着時温度から５℃以上温度を下げることによって溶出させることを特徴とする、請求の範囲１ないし３７記載の方法。
【請求項３９】
溶出時の温度が（室温−５）℃〜４℃の範囲である、請求の範囲３８記載の方法。
【請求項４０】
疎水性クロマトグラフィーにおいて、試料吸着後、吸着時バッファーのｐＨを０．５以上上げることによって溶出させることを特徴とする、請求の範囲１ないし３９記載の方法。
【請求項４１】
溶出時のｐＨが６〜１０の範囲である、請求の範囲４０記載の方法。
【請求項４２】
疎水性クロマトグラフィーに続き、ゲルろ過クロマトグラフィーを行う、請求の範囲１ないし４１記載の方法。
【請求項４３】
ゲルろ過クロマトグラフィーの担体がセファロースである、請求の範囲１ないし４２記載の方法。
【請求項４４】
ゲルろ過クロマトグラフィーに用いるバッファーに２価の金属イオンを添加する、請求の範囲１ないし４３記載の方法。
【請求項４５】
２価の金属イオンがカルシウムまたはマグネシウムである、請求の範囲４４記載の方法。
【請求項４６】
２価の金属イオン濃度が０．１〜１０ｍＭである、請求の範囲４４または４５記載の方法。
【請求項４７】
２価の金属イオン濃度が１〜２ｍＭである、請求の範囲４４ないし４６記載の方法。
【請求項４８】
ウイルスがフィロウイルス科、ブニヤウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、アレナウイルス科、オルトミクソウイルス科、レトロウイルス科、ヘパドナウイルス科、レオウイルス科、デルタウイルス科の群から選択される科に属するウイルスである請求の範囲１ないし４７記載の方法。
【請求項４９】
ウイルスがエボラ出血熱ウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ハンターウイルス、単純ヘルペスウイルス、ＥＢウイルス、天然痘ウイルス、牛痘ウイルス、風疹ウイルス、ＳＡＲＳウイルス（ヒトコロナウイルス）、Ｃ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、デング熱ウイルス、西ナイルウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、ブタコレラウイルス、狂犬病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、センダイウイルス（ＨＶＪ）、はしかウイルス、おたふく風邪ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、ＲＳウイルス、ラッサ熱ウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴ細胞白血病Ｉ型ウイルス（ＨＴＬＶ−１）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、レオウイルス、Ｄ型肝炎ウイルスの群から選択されるウイルスである請求の範囲１ないし４８記載の方法。
【請求項５０】
ウイルスがＨＶＪである請求の範囲１ないし４９記載の方法。
【請求項５１】
ウイルスエンベロープが弱毒型または不活性化ウイルスエンベロープである請求の範囲１ないし５０記載の方法。
【請求項５２】
ウイルスエンベロープが不活性化ウイルスエンベロープである請求の範囲１ないし５１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ウイルス（例えばセンダイウイルス（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  Ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ，以下ＨＶＪ））エンベロープの工業的精製方法に関する。精製されたウイルスエンベロープは、遺伝子などの生体高分子を細胞や生体内に導入するベクターとして使用され得る。
【背景技術】  遺伝子機能解析や遺伝子治療のために、培養細胞や生体組織に遺伝子を導入する目的で、多くのウイルス法、非ウイルス法が開発されてきた（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０，９２６〜９３２，１９９３年およびＬｅｄｌｅｙ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，第６巻、１１２９〜１１４４、１９９５年）。一般に細胞へ遺伝子を導入するためには、ウイルス法が効果的である。しかし、ウイルスベクターを用いる方法は、親ウイルス由来の遺伝子導入とその発現の可能性、免疫原性、および宿主ゲノム構造の改変の可能性があり、安全性の面で問題がある。一方、リポソーム等を用いる非ウイルス法の多くは、細胞障害性および免疫原性はウイルス法より低いが、培養細胞や生体組織内への遺伝子導入効率においてはウイルスベクターに比べて劣る傾向にある。
ＨＶＪは、エンベロープを有し、その表面にはヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼを有する、パラミクソウイルス科に属するウイルスである。ＨＶＪはエーリッヒ腫瘍細胞を融合させるとして注目され（岡田、微研ジャーナル、１、１０３−１１０，１９５８年）、細胞膜融合活性（以下融合活性とする）の解析が進められるとともに遺伝子導入ベクターとしての利用が検討されてきた。ＨＶＪは免疫原性が高く、特にＮＰタンパク質が大量に生産されるとＣＴＬを誘導することが知られており（Ｃｏｌｅ  Ｇ．Ａ．ら  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５８，４３０１〜４３０９，１９９７年）、さらに宿主のタンパク質合成が阻害される懸念もある。そこで遺伝子やタンパク質を封入したリポソームと予め紫外線照射により不活性化しておいたＨＶＪとを融合することで、融合粒子（ＨＶＪ−リポソーム）を作製する方法が考案され、これにより細胞や生体への非侵襲の遺伝子導入が可能となった（米国特許第５，６３１，２３７号、Ｄｚａｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，１１４２１〜１１４２５，１９９６年および金田ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｔｏｄａｙ，５，２９８〜３０３，１９９９年）。しかし、この方法はウイルスとリポソームという二つの異なるベシクルを調製しなければならないという煩雑性があり、またＨＶＪ−リポソームはＨＶＪ粒子より平均直径が１．３倍大きくなり、ＨＶＪ単独より融合活性が十分の一以下に低下することが明らかとなった。
金田は細胞に高効率で遺伝子を導入し、かつ高い安全性を持つＨＶＪベクターを開発した（ＷＯ０１／５７２０４号公報）。即ち、ＨＶＪをはじめとするエンベロープウイルスのゲノムを不活性化し、そのエンベロープ中に遺伝子等の生体高分子を封入し、それを細胞や生体内へのベクターとして用いるものである。しかしこの段階ではＨＶＪエンベロープの効率のよい精製方法は確立されていなかった。
さらに金田は鶏卵でＨＶＪを産生し、それをろ過、膜濃縮、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、限外濾過というステップで精製する方法を開発した（ＷＯ０３／０１４３３８号公報）。しかしながらこの方法はカラムの前にろ過と膜濃縮という二つの処理が入り、この物理的な刺激によってＨＶＪの活性が落ち、またこの段階で捕捉されることによる回収率の低下が避けられなかった。
ＷＯ９６／２７６７７号公報では、ウイルスの精製方法としてはイオン交換樹脂と固定化金属親和性樹脂を利用したアデノウイルスの精製法が開発されている。しかしアデノウイルスはエンベロープを持たないため、この方法はエンベロープウイルスの精製方法として使用できなかった。さらにアデノウイルスの精製法において、イオン交換樹脂と疎水性樹脂を併用する方法も提案しているが具体的な実施例は開示されていなかった。
また、ＷＯ９１／００１０４号公報はエンベロープウイルスのＨＮタンパク質、Ｆタンパク質をアフィニティクロマトグラフィーで精製する方法を開示しているが、これは多くのタンパク質の集合体であるウイルスエンベロープを精製する方法には適用できない。
したがって、上記のような問題を解決し、ウイルスエンベロープを効率よく製造するために、ＨＶＪの活性を保ちながらさらに高回収率を有する精製法の開発が望まれていた。
【発明の開示】
本発明の課題は、より高い回収率で、かつウイルスの融合活性を保持したままウイルスエンベロープを精製する方法を開発することである。
ＨＶＪを含むエンベロープ型ウイルスは、数種のタンパク質、脂質、糖鎖からなる複合タンパク質で、一般的に直径数１００ナノメートルの大きな粒子であり、それゆえ表面電荷が複雑で、非常に高い疎水性を有すると予想された。したがって、比較的小さな分子を分離するために設計された、細孔径（担体表面にある多孔の一つあたりの口径）がより小さく、単体あたりの表面積を小さくした、高分離能を謳っている最近のクロマトグラフィー担体では、ＨＶＪと担体表面の種々の相互作用を十分に生かすことができなかった。つまり、ＨＶＪのような大きく、疎水性の高い分子を分離するには、ＨＶＪが担体内部を分配可能なルーズな細孔径または十分な表面積と、ＨＶＪが結合できる十分な官能基間の距離、十分な結合定数と適切な解離定数を有する相互作用が必要であった。
培養上清は、ＨＶＪ以外の様々な不純物を含んでいる。しかしそのほとんどはＨＶＪより小さい分子あるいは粒子である。今日のクロマトグラフィー用担体では、そのほとんどが、小サイズの分子側に選択性を持たせてあるため、それらでは培養上清からのＨＶＪの適切な分離ができなかった。従って、ＨＶＪに適した精製法を検討する必要があった。本発明者はこれらの問題を解決するため鋭意検討を重ねた。その結果、疎水性クロマトグラフィーから成る精製法、好ましくは疎水性クロマトグラフィーと陰イオン交換クロマトグラフィーおよび／またはゲルろ過クロマトグラフィーを組み合わせた精製法を確立するに至った。
即ち、本発明は課題の解決手段として、ウイルスエンベロープの細胞融合活性を有したまま、かつ高回収率で、効率よく精製する方法を提供するものである。
その要旨は、
（１）ウイルスエンベロープの精製において、疎水性クロマトグラフィーを用いることを特徴とする方法、
（２）前記疎水性クロマトグラフィーの官能基が弱疎水性基である、（１）記載の方法、
（３）前記疎水性クロマトグラフィーの官能基がオリゴエチレングリコール基またはフェニル基である、（１）または（２）記載の方法、
（４）前記疎水性クロマトグラフィーの官能基がオリゴエチレングリコール基である、（１）〜（３）記載の方法、
（５）前記疎水性クロマトグラフィーとイオン交換樹脂クロマトグラフィーおよび／またはゲルろ過クロマトグラフィーを組み合わせることを特徴とする、（１）〜（４）記載の方法、
（６）イオン交換クロマトグラフィーと疎水性クロマトグラフィーを組み合わせることを特徴とする、（５）記載の方法、
（７）第一のクロマトグラフィーにイオン交換樹脂、第二のクロマトグラフィーに疎水性樹脂を用いる、（５）または（６）記載の方法、
（８）イオン交換クロマトグラフィーが陰イオン交換クロマトグラフィーである、（５）〜（７）記載の方法、
（９）イオン交換クロマトグラフィーが弱陰イオン交換クロマトグラフィーである、（５）〜（８）記載の方法、
（１０）イオン交換クロマトグラフィーの官能基がジエチルアミノプロピル（ＤＥＡＰ）基である、（５）〜（９）記載の方法、
（１１）イオン交換クロマトグラフィーの官能基が低密度置換型（Ｌｏｗ  Ｓｕｂ）である、（５）〜（１０）記載の方法、
（１２）クロマトグラフィーのバッファーがｐＨ７〜９である、（１）〜（１１）記載の方法、
（１３）クロマトグラフィーのバッファーがｐＨ７．８〜８．５である（１）〜（１２）記載の方法、
（１４）イオン交換クロマトグラフィーに用いるバッファーが塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含む、（５）〜（１３）記載の方法、
（１５）イオン交換クロマトグラフィーの試料吸着時のバッファーが塩化ナトリウム０．０１〜１５０ｍＭを含む、（５）〜（１４）記載の方法、
（１６）イオン交換クロマトグラフィーの試料吸着時のバッファーが塩化ナトリウム３０〜７０ｍＭを含む、（５）〜（１５）記載の方法、
（１７）イオン交換クロマトグラフィーの洗浄時のバッファーが塩化ナトリウム１５０ｍＭ〜２５０ｍＭを含む、（５）〜（１６）記載の方法、
（１８）イオン交換クロマトグラフィーの洗浄時のバッファーが塩化ナトリウム１９０〜２３０ｍＭを含む、（５）〜（１７）記載の方法、
（１９）イオン交換クロマトグラフィーの溶出時のバッファーが塩化ナトリウム１００ｍＭ〜１０００ｍＭを含む、（５）〜（１８）記載の方法、
（２０）イオン交換クロマトグラフィーの溶出時のバッファーが塩化ナトリウム２９０〜３３０ｍＭを含む、（５）〜（１９）記載の方法、
（２１）疎水性クロマトグラフィーに用いるバッファーが硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムまたは塩化ナトリウムを含む、（１）〜（２０）記載の方法、
（２２）疎水性クロマトグラフィーの吸着時のバッファーが硫酸アンモニウム１．０Ｍ〜２．５Ｍを含む、（１）〜（２１）記載の方法、
（２３）疎水性クロマトグラフィーの吸着時のバッファーが硫酸アンモニウム１．８〜２．２Ｍを含む、（１）〜（２２）記載の方法、
（２４）疎水性クロマトグラフィーの洗浄時のバッファーが硫酸アンモニウム１．０〜１．６Ｍを含む、（１）〜（２３）記載の方法、
（２５）疎水性クロマトグラフィーの洗浄時のバッファーが硫酸アンモニウム１．２〜１．５Ｍを含む、（１）〜（２４）記載の方法、
（２６）疎水性クロマトグラフィーの溶出時のバッファーが硫酸アンモニウム０．０１〜１．５Ｍを含む、（１）〜（２５）記載の方法、
（２７）疎水性クロマトグラフィーの溶出時のバッファーが硫酸アンモニウム０．６〜１．０Ｍを含む、（１）〜（２６）記載の方法、
（２８）疎水性クロマトグラフィーの溶出時のバッファーが親水性有機溶媒を含む（１）〜（２７）記載の方法、
（２９）親水性有機溶媒が多価アルコールまたは低級アルコールである（２８）記載の方法、
（３０）多価アルコールがエチレングリコールである（２８）または（２９）記載の方法、
（３１）エチレングリコールの濃度が０．０１〜５０％である、（２８）〜（３０）記載の方法、
（３２）エチレングリコールの濃度が２〜１０％である、（２８）〜（３１）記載の方法、
（３３）エチレングリコールの濃度が３〜７％である、（２８）〜（３２）記載の方法、
（３４）疎水性クロマトグラフィーの溶出時のバッファーが界面活性剤を含む、（１）〜（３３）記載の方法、
（３５）前記界面活性剤が、ツィーン８０（Ｔｗｅｅｎ８０）またはトライトンＸ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ）である、（１）〜（３４）記載の方法、
（３６）疎水性クロマトグラフィーの溶出時のバッファーがツィーン８００．００１〜１％を含む、（１）〜（３５）記載の方法、
（３７）疎水性クロマトグラフィーの溶出時のバッファーがツィーン８００．０１〜０．１％を含む、（１）〜（３６）記載の方法、
（３８）疎水性クロマトグラフィーにおいて、試料吸着後、吸着時温度から５℃以上温度を下げることによって溶出させることを特徴とする、（１）〜（３７）記載の方法、
（３９）溶出時の温度が（室温−５）℃〜４℃の範囲である、（３８）記載の方法、
（４０）疎水性クロマトグラフィーにおいて、試料吸着後、吸着時バッファーのｐＨを０．５以上上げることによって溶出させることを特徴とする、（１）〜（３９）記載の方法、
（４１）溶出時のｐＨが６〜１０の範囲である、（４０）記載の方法、
（４２）疎水性クロマトグラフィーに続き、ゲルろ過クロマトグラフィーを行う、（１）〜（４１）記載の方法、
（４３）ゲルろ過クロマトグラフィーの担体がセファロースである、（１）〜（４２）記載の方法、
（４４）ゲルろ過クロマトグラフィーに用いるバッファーに２価の金属イオンを添加する、（１）〜（４３）記載の方法、
（４５）２価の金属イオンがカルシウムまたはマグネシウムである、（４４）記載の方法、
（４６）２価の金属イオン濃度が０．１〜１０ｍＭである、（４４）または（４５）記載の方法、
（４７）２価の金属イオン濃度が１〜２ｍＭである、（４４）〜（４６）記載の方法、
（４８）ウイルスがフィロウイルス科、ブニヤウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、アレナウイルス科、オルトミクソウイルス科、レトロウイルス科、ヘパドナウイルス科、レオウイルス科、デルタウイルス科の群から選択される科に属するウイルスである（１）〜（４７）記載の方法、
（４９）ウイルスがエボラ出血熱ウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ハンターウイルス、単純ヘルペスウイルス、ＥＢウイルス、天然痘ウイルス、牛痘ウイルス、風疹ウイルス、ＳＡＲＳウイルス（ヒトコロナウイルス）、Ｃ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、デング熱ウイルス、西ナイルウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、ブタコレラウイルス、狂犬病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、センダイウイルス（ＨＶＪ）、はしかウイルス、おたふく風邪ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、ＲＳウイルス、ラッサ熱ウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴ細胞白血病Ｉ型ウイルス（ＨＴＬＶ−１）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、レオウイルス、Ｄ型肝炎ウイルスの群から選択されるウイルスである（１）〜（４８）記載の方法、
（５０）ウイルスがＨＶＪである（１）〜（４９）記載の方法、
（５１）ウイルスエンベロープが弱毒型または不活性化ウイルスエンベロープである（１）〜（５０）記載の方法、
（５２）ウイルスエンベロープが不活性化ウイルスエンベロープである（１）〜（５１）記載の方法、
に関する。
また、本発明により精製されたウイルスエンベロープは、細胞や生体に低分子あるいは高分子化合物を導入するベクターとして広く利用することが出来る。例えばＷＯ２００４／０３９４０６に開示されているように、化学療法剤を封入して抗がん剤として用いることができる。またＷＯ２００４／０４６３５３で示されているように、任意の核酸を封入して目的遺伝子やタンパク質のスクリーニングに用いることもできる。
【図面の簡単な説明】図１は、カラム１の陰イオン交換クロマトグラムを示す図である（実施例１）。
図２は、カラム２の疎水性クロマトグラムを示す図である（実施例１）。
図３は、カラム３のゲルろ過クロマトグラムを示す図である（実施例１）。
図４は、精製されたＨＶＪエンベロープのＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動像を示す図である（実施例３）。レーン１：分子量マーカー、レーン２：細胞由来ＨＶＪ（還元）、レーン３：鶏卵由来ＨＶＪ（還元）、レーン４：細胞由来ＨＶＪ（非還元）、レーン５：鶏卵由来ＨＶＪ（非還元）。
【発明を実施するための最良の形態】  本明細書で使用される場合、「遺伝子導入」とは、生体内またはインビトロにおいて、標的細胞内に、天然、合成または組み換えの所望の遺伝子または遺伝子断片を、導入された遺伝子がその機能を維持するように導入することを言う。本発明において導入される遺伝子または遺伝子断片は、特定の配列を有するＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらの合成アナログである核酸を包含する。また、本明細書において使用される場合、遺伝子導入、トランスフェクション、およびトランスフェクトは、同意味（義）に使用される。
本明細書で使用される場合、「遺伝子ベクター」、「遺伝子導入ベクター」、または「ウイルスエンベロープベクター」とはウイルスエンベロープ中に外来遺伝子を封入したベクターをいう。遺伝子導入ベクターの調製のために使用されるウイルスとしては、野生型ウイルスであっても、組み換え型ウイルスであってもよい。
本発明の一つの局面において、使用されるウイルスは、フィロウイルス科、ブニヤウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、アレナウイルス科、オルトミクソウイルス科、レトロウイルス科、ヘパドナウイルス科、レオウイルス科、およびデルタウイルス科からなる群から選択される科に属するウイルスである。
また、好ましくはそれらのウイルスはエボラ出血熱ウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ハンターウイルス、単純ヘルペスウイルス、ＥＢウイルス、天然痘ウイルス、牛痘ウイルス、風疹ウイルス、ＳＡＲＳウイルス（ヒトコロナウイルス）、Ｃ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、デング熱ウイルス、西ナイルウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、ブタコレラウイルス、狂犬病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、センダイウイルス（ＨＶＪ）、はしかウイルス、おたふく風邪ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、ＲＳウイルス、ラッサ熱ウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴ細胞白血病Ｉ型ウイルス（ＨＴＬＶ−１）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、レオウイルス、Ｄ型肝炎ウイルスからなる群から選択されるウイルスである。
さらに好ましくはそのウイルスは、ＨＶＪである。
本明細書で使用される場合、「不活性化ウイルス」とは、ゲノムを不活性化したウイルスをいう。この不活性化ウイルスは、複製欠損である。好ましくは、この不活性化は、ＵＶ処理またはアルキル化剤による処理によってなされる。
本明細書で使用される場合、「弱毒型ウイルス」とは、宿主に感染しても全くあるいはほとんど宿主に病原性を示さないウイルスをいう。
本明細書で使用される場合、「外来遺伝子」とは、遺伝子導入ベクター内に含まれる、ウイルス以外由来の核酸配列をいう。本発明の一つの局面において、この外来遺伝子は、遺伝子導入ベクターによって導入された遺伝子が発現するために適切な調節遺伝子（例えば、転写に必要なプロモーター、エンハンサー、ターミネーター、およびポリＡ付加シグナル、ならびに翻訳に必要なリポゾームの結合部位、開始コドン、終止コドンなど）と作動可能に連結される。本発明の別の局面において、外来遺伝子は、この外来遺伝子の発現のための調節配列を含まない。本発明のさらなる局面において、外来遺伝子は、オリゴヌクレオチドまたはデコイ核酸である。遺伝子導入ベクター内に含まれる外来遺伝子は、代表的にはＤＮＡまたはＲＮＡの核酸分子であるが、導入される核酸分子は、核酸アナログ分子を含んでもよい。遺伝子導入ベクター内に含まれる分子種は、単一の遺伝子分子種であってもよく、複数の異なる遺伝子分子種であってもよい。
本明細書において「ＨＶＪ」および「センダイウイルス」は同意味（義）に用いられる。
本明細書において、「ＨＡＵ」とは、ニワトリ赤血球０．５％を凝集可能なウイルスの活性をいい、１ＨＡＵは、ほぼ２４００万ウイルス粒子に相当する（Ｏｋａｄａ，Ｙら、Ｂｉｋｅｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ４，２０９〜２１３、１９６１）。
本発明の精製法は、疎水性クロマトグラフィーのみでも可能であるが、好ましくは疎水性クロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィーおよび／またはゲルろ過クロマトグラフィーであり、具体的には以下の組み合わせのいずれかを含む。
（１）疎水性クロマトグラフィー
（２）疎水性クロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィーの組み合わせ（順不同）
（３）疎水性クロマトグラフィーとゲルろ過クロマトグラフィーの組み合わせ（順不同）
（４）疎水性クロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィーとゲルろ過クロマトグラフィーの組み合わせ（順不同）
また、最も好ましくは三ステップのカラムクロマトグラフィーを用いる。ただし第三ステップは脱塩と濃縮を目的としているので、必要に応じて行う。クロマトグラフィーに用いるバッファーのｐＨは通常ｐＨ７〜９を用いる。好ましくはｐＨ７．８〜８．５を用いる。
通常、カラム１には陰イオン交換クロマトグラフィーを用いることができる。理論上はほぼ全ての陰イオン交換体（ＤＥＡＰ、Ｑ、ＱＡＥ、ＤＥＡＥなど）が使用可能である（ＤＥＡＰ；ｄｉｅｔｈｙｌ  ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ、Ｑ；ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ  ａｍｉｎｅ、ＱＡＥ；ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ  ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ、ＤＥＡＥ；ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）。好ましい具体例としては、例えばＤＥＡＰを持ったＡＮＸ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦ（ＧＥアマシャムバイオサイエンス社、Ｃａｔ．Ｎｏ．１７−１２８６−０１）を挙げることができる。この交換体は比較的大きな細孔径と、ＤＥＡＰ基のプロピル基がスペーサーとなり担体と官能基との距離が伸びることで、高分子を捕捉するのに特化した担体である。またＡＮＸ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦ  Ｌｏｗ  Ｓｕｂは官能基を低密度にすることで、小さい分子から、大きな分子へ選択性を高めている。その理由は、通常クロマトグラフィーの相互作用は、タンパク質１分子に対して、複数の官能基が結合するためである。一般的なクロマトグラフィー担体は、大過剰の官能基を結合するため、非常に高密度な環境になる。担体は紐が絡まりあったような構造であるので、空間的により多くポイントで結合できる低分子に有利な環境となる。つまり官能基の立体空間を高分子用に改善したのがＡＮＸ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦである。イオン交換クロマトグラフィーに用いるバッファーとしては、ｐＨ６〜９のバッファーが使用でき、例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等が挙げられる。
次にカラム２には通常疎水性クロマトグラフィーを用いることができる。疎水性クロマトグラフィーに用いる担体の例としては、市販されている疎水性担体の中でも、疎水性の弱いものが好ましく、例えば、Ｅｔｈｅｒ基、Ａｌｋｙｌ基等を有する疎水性担体が挙げられ、とりわけＥｔｈｅｒ基を有する担体が好ましい。好ましい具体例としては、東ソー製Ｅｔｈｅｒ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ６５０Ｍ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１６１７３）は、その官能基にオリゴエチレングリコール基を有している。オリゴエチレングリコール基は、炭素鎖中にＯＨ基の側鎖を持つために、疎水性が弱められていると考えられている。これは高い疎水性を持つタンパク質は、一般的に使用される疎水性クロマトグラフィー担体であるＢｕｔｙｌ基やＰｈｅｎｙｌ基では互いの結合力が強すぎるため分離が不十分になり、結果として回収率が下がるために開発された担体である。またトヨパールの官能基は、スペーサーを介さない方法で結合しているため、他社の製品より疎水性がさらに低くなっていると思われる。これはＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（スペーサーあり）とＰｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬを比較した時のデータからも予想できる。なお通常は、Ｂｕｔｙｌ基やＰｈｅｎｙｌ基等を有する疎水性クロマトグラフィーでウイルスを精製することは難しいが、通常品（市販品）よりも官能基を低密度化した場合には、より小さなウイルスでも精製可能となる。疎水性クロマトグラフィーのバッファーとしては、ｐＨ６〜９のバッファーが使用でき、例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン／ＨＣｌ、トリエタノールアミン／ＨＣｌ、トリエタノールアミン／酢酸、Ｎ−メチルジエタノールアミン／ＨＣｌ、Ｎ−メチルジエタノールアミン／酢酸、ジエタノールアミン／ＨＣｌ、１，３−ジアミノプロパン／ＨＣｌ、ピペラジン／ＨＣｌ、トリメチルアミン／ＨＣｌ、エタノールアミン／ＨＣｌ、ｎ−メチルモルホリン／ＨＣｌ等が挙げられる。オリゴエチレングリコール基に結合したＨＶＪは、バッファー中の硫酸アンモニウムの濃度を下げることで溶出するが、それだけではピークがシャープではなく、完全に溶出するまでにかなりの液量を要する。そこで溶液の極性を上げるために親水性有機溶媒を添加することが有効である。親水性有機溶媒は、０．０１〜５０％範囲で添加することができる。この濃度は限定されないが、通常は２％〜１０％であり、好ましくは３〜７％であり、最も好ましくは５％である。親水性有機溶媒は好ましくは多価アルコールまたは低級アルコールを用いる。本発明における低級アルコールとしては、炭素数１〜６の低級炭化水素に水酸基が１つ付加したアルコールであれば限定されないが、具体的には、例えばメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｉ−プロパノール、ｎ−ブタノール、ｉ−ブタノール、ｔ−ブタノール等を挙げることができる。また多価アルコールも炭素数２〜６の炭化水素に水酸基が２つ以上付加したアルコールであれば限定されないが、具体的には、例えばエチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチレングリコール、グリセリン等を挙げることができる。さらに好ましくは多価アルコールを用いる。最も好ましくはエチレングリコールを用いる。エチレングリコールは０．０１〜５０％範囲で添加することができる。この濃度は限定されないが、通常は２％〜１０％であり、好ましくは３〜７％であり、最も好ましくは５％である。エチレングリコールを添加するとピークがシャープになり、溶出体積はカラム体積の半分程度になり、精製と濃縮を同時に行えるようになる。また、このステップでは高い硫酸アンモニウム濃度で精製しているため、ＨＶＪ同士が結合する可能性がある。この結合を防止するため、溶出バッファーには界面活性剤を添加することが有効である。界面活性剤は、０．００１〜１％の範囲、好ましくは０．０１〜０．１％の範囲で添加することができる。界面活性剤はツイーン（Ｔｗｅｅｎ）やトライトンＸ（Ｔｒｉｔｏｎ）を用いることが出来る。より好ましくはＴｗｅｅｎ８０を用いる。Ｔｗｅｅｎ８０は０．００１〜１％の範囲で添加することが出来る。Ｔｗｅｅｎ８０は好ましくは０．０１〜０．１％添加する。最も好ましくは０．０５％添加する。
さらにカラム３には通常ゲルろ過クロマトグラフィーを用いることができる。このステップは濃縮と脱塩のために行うので、汎用されているゲルろ過クロマトグラフィーを使用できる。例えばＧＥアマシャムバイオサイエンス社のＳｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１７−０１４９−０１）やＳｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦＦ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１７−０１５９−０１）を用いることができる。ゲルろ過に用いるバッファーとしては、ｐＨ６〜９のバッファーが使用でき、例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン／ＨＣｌ、トリエタノールアミン／ＨＣｌ、トリエタノールアミン／酢酸、Ｎ−メチルジエタノールアミン／ＨＣｌ、Ｎ−メチルジエタノールアミン／酢酸、ジエタノールアミン／ＨＣｌ、１，３−ジアミノプロパン／ＨＣｌ、ピペラジン／ＨＣｌ、トリメチルアミン／ＨＣｌ、エタノールアミン／ＨＣｌ、ｎ−メチルモルホリン／ＨＣｌ等が挙げられる。なお、バッファーには親水性有機溶媒を添加してもよく、添加可能な親水性有機溶媒としては、上記と同様のものが挙げられる。
また、ゲルろ過クロマトグラフィーに用いるバッファーおよび／または最終精製物にノイラミニダーゼの安定剤として２価の金属イオンを添加することが有効である。２価の金属イオンは好ましくはカルシウムまたはマグネシウムである。通常これらの金属イオンは０．１〜１０ｍＭの範囲で添加する。好ましくは１〜２ｍＭの濃度になるように添加する。
【実施例】  続いて本発明を具体的に説明するため、以下に実施例を掲げるが、本発明はこれらに限定されない。
実施例１．カラムクロマトグラフィーによるＨＶＪの精製
浮遊細胞培養系により産生したＨＶＪを遠心分離により除細胞処理を行って得られた細胞培養上清から、３段階のクロマトグラフィー工程により精製した。
まず、各カラムはエンドトキシンの不活化をするために、使用前に０．２５Ｍ水酸化ナトリウム溶液を通液して、８時間以上保持した後に使用した。
（１）イオン交換樹脂クロマトグラフィー
遠心分離した培養上清を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．８で等倍に希釈した。これを５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．８で平衡化したカラム１に通液して吸着させた。カラム１には陰イオン交換クロマトグラフィー用担体であるＡＮＸ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦ  Ｌｏｗ  Ｓｕｂ（ＧＥアマシャムバイオサイエンス社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．１７−１２８６−０１）をＢＰＧ２００／５００空カラム（ＧＥアマシャムバイオサイエンス社製）に直径２０センチ、高さ９センチに充填した３Ｌのものを使用した。線流速は９６ｃｍ／ｈで行った。さらにカラム体積の３倍容の平衡化バッファーを通液した後、カラム体積の８倍容の２１０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．８を通液して洗浄した。カラム１からのＨＶＪの溶出は３１０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．８を通液した。このときカラム通過液のＵＶ２８０ｎｍにおける吸光度が上昇するのでその部分を回収した。これをカラム１溶出画分とした。最後に２Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液を通液してカラム１を再生した。（図１参照）
（２）疎水性樹脂クロマトグラフィー
次いでカラム１溶出画分に４Ｍ硫酸アンモニウム溶液を等容添加して２Ｍ硫酸アンモニウムを含む溶液を調整した。これを２Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．８で平衡化したカラム２に通液して吸着させた。カラム２には疎水性相互作用クロマトグラフィー用担体であるＥｔｈｅｒ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ（東ソー社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．１６１７３）をＢＰＧ１００／５００空カラム（ＧＥアマシャムバイオサイエンス社製）に直径１０センチ、高さ１２．５センチに充填した１Ｌのものを使用した。線流速は１９０ｃｍ／ｈで行った。さらにカラム体積の３倍容の平衡化バッファーを通液した後、カラム体積の５倍容の１．４Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液を通液して洗浄した。カラム２からのＨＶＪの溶出には０．８Ｍ硫酸アンモニウム、５％エチレングリコール、および０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．８を通液した。このときカラム通過液のＵＶ２８０ｎｍにおける吸光度が上昇するのでその部分を回収した。これをカラム２溶出画分とした。最後に５％エチレングリコール溶液を通液してカラム２を再生した。（図２参照）
（３）ゲルろ過クロマトグラフィー
さらに、カラム２溶出画分を１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．８で平衡化したカラム３に通液した。カラム３にはゲルろ過クロマトグラフィー用担体であるＳｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦ（ＧＥアマシャムバイオサイエンス社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．１７−０１４９−０１）をＸＫ５０／６０空カラム（ＧＥアマシャムバイオサイエンス社製）に直径５センチ、高さ４０センチで充填した０．８Ｌのものを使用した。線流速は１２０ｃｍ／ｈで行った。カラム溶出画分に次いで平衡化バッファーを通液した。このときカラム通過液のＵＶ２８０ｎｍにおける吸光度が上昇するのでその部分を回収した。これをカラム３溶出画分とした。（図３参照）
カラム３溶出画分に０．５％メチルセルロースを１／４容相当量を添加して、最終濃度０．１％メチルセルロース含有ＨＶＪ溶液を調製した。これを０．４５ミクロンの無菌ろ過フィルターでろ過した。これを液体窒素で急速凍結して、−８０℃で保存することで、高純度のＨＶＪを長期間、安定的に保存できた。
バッファー等に使用した主な試薬で、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、塩化ナトリウム、塩化カルシウム２水和物、塩化マグネシウム６水和物、水酸化ナトリウム、エチレングリコール、硫酸アンモニウム、およびＴｗｅｅｎ８０は和光純薬製、またはシグマ社製の特級品を使用した。塩酸は和光純薬社製の６規定規格品を使用した。精製品の安定化剤として添加した０．５％メチルセルロースは、和光純薬社製のものを使用した。精製品の無菌ろ過には孔径０．４５ミクロンの親水化ろ過フィルターＭｉｌｌｉｐａｋ  Ｇａｍｍａ  Ｇｏｌｄ（日本ミリポア社）を使用した。
比較例１．膜濃縮および、カラムクロマトグラフィーによるＨＶＪの精製
浮遊細胞培養系により産生したＨＶＪを遠心分離により除細胞処理を行って得られた細胞培養上清を、限外膜濃縮と３段階のクロマトグラフィー工程により精製した。
まず、膜濃縮装置、および各カラムはエンドトキシンの不活化をするために使用前に０．２５Ｍ水酸化ナトリウム溶液を通液して、８時間以上保持した後に使用した（一般的に一週間程度の保持により、生菌ならびにエンドトキシンを完全に除去できる）。
（１）ろ過と膜濃縮
遠心分離した培養上清を１．２μｍのミリガードフィルターでろ過して粒子を除去した。これをペリコン膜濃縮装置を用いて６００ｍＬに濃縮した。
（２）ゲルろ過クロマトグラフィー（カラム１）
１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．８で平衡化したカラム１に（１）で得られた濃縮培養上清を通液した。カラム１にはゲルろ過クロマトグラフィー用担体であるＳｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦＦ（ＧＥアマシャムバイオサイエンス社製）をＢＰＧ１００／５００空カラム（ＧＥアマシャムバイオサイエンス社製）に直径１０センチ、高さ３３センチに充填した２．５Ｌのものを使用した。線流速は１５０ｃｍ／ｈで行った。次いで平衡化バッファーを通液した。このときカラム通過液のＵＶ２８０ｎｍにおける吸光度が上昇するのでその部分を回収した。これをカラム１溶出画分とした。
（３）イオン交換クロマトグラフィー（カラム２）
次いでカラム１溶出画分１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．８で平衡化したカラム２に通液して吸着させた。カラム２にはイオン交換クロマトグラフィー用担体であるＱ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（ＧＥアマシャムバイオサイエンス社製）をＢＰＧ２００／５００空カラム（ＧＥアマシャムバイオサイエンス社製）に直径２０センチ、高さ６．５センチに充填した２Ｌのものを使用した。線流速は７０ｃｍ／ｈで行った。さらにカラム体積の５倍容の平衡化バッファーを通液した。カラム２からのＨＶＪの溶出には０．４５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．８を通液した。このときカラム通過液のＵＶ２８０ｎｍにおける吸光度が上昇するのでその部分を回収した。これをカラム２溶出画分とした。最後に２Ｍ塩化ナトリウムを通液してカラム２を再生した。
（４）ゲルろ過クロマトグラフィー（カラム３）
カラム２溶出画分を１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．８で平衡化したカラム３に通液した。カラム３にはゲルろ過クロマトグラフィー用担体であるＳｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦＦ（ＧＥアマシャムバイオサイエンス社製）をＢＰＧ１００／５００空カラム（ＧＥアマシャムバイオサイエンス社製）に直径１０センチ、高さ３３センチで充填した２．５Ｌのものを使用した。線流速は１５０ｃｍ／ｈで行った。カラム溶出画分に次いで平衡化バッファーを通液した。このときカラム通過液のＵＶ２８０ｎｍにおける吸光度が上昇するのでその部分を回収した。これをカラム３溶出画分とした。
カラム３溶出画分に０．５％メチルセルロースを１／４容相当量を添加して、最終濃度０．１％メチルセルロース含有ＨＶＪ溶液を調製した。これを０．４５ミクロンの無菌ろ過フィルターでろ過した。
バッファー等に使用した主な試薬で、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、塩化ナトリウム、塩化カルシウム２水和物、塩化マグネシウム６水和物、水酸化ナトリウムは和光純薬製、またはシグマ社製の特級品を使用した。塩酸は和光純薬社製の６規定規格品を使用した。精製品の安定化剤として添加した０．５％メチルセルロースは、和光純薬社製のものを使用した。精製品の無菌ろ過には孔径０．４５ミクロンの親水化ろ過フィルターＭｉｌｌｉｐａｋ  Ｇａｍｍａ  Ｇｏｌｄ（日本ミリポア社）を使用した。
実施例２．精製したＨＶＪの活性測定と回収率
ＨＶＪの活性は、シアル酸分解酵素（ノイラミニダーゼ、ＮＡ）活性と、ニワトリ赤血球の凝集活性（ヘマグルチニン活性、ＨＡ）により測定した。いずれも、回収したウイルスの濃度、量に対して比例関係にあり定量性もある。この２つの方法による本発明実施例１におけるＨＶＪの残存活性と、ＮＡ活性値による回収率を表１に示した。比較例を用いた場合の回収率を表２に示した。表１、２の比較により、本発明による優れた効果が明らかである。
【表１】
2006011580.tif 000002
【表２】
2006011580.tif 000003
実施例３．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製ＨＶＪの純度分析
ＨＶＪの電気泳動は、４−１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで行った。ウイルスに適した膜タンパク質の可溶化剤（シグマ社  ＣｅｌＬｙｔｉｃ−Ｍ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ２９７８）を用いてＨＶＪを可溶化して、そのまま電気泳動したものを非還元処理サンプル、可溶化後に２−メルカプトエタノールを添加して９５℃で１０分加熱処理を施したものを還元処理サンプルとした。また一般的手法との比較として受精鶏卵で培養後にしょう尿液を陰イオン交換クロマトグラフィーで精製したＨＶＪも同様の処理をした。これを１００Ｖの定電圧で２．５時間電気泳動して、ＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙ蛍光染色液（バイオラッド社  ＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｃａｔ．  Ｎｏ．１７０−３１２５）にて染色後、蛍光イメージングシステムでゲルを解析した。電気泳動の結果を図４に示した。従来の鶏卵から精製する方法と比較しても同純度のＨＶＪエンベロープを得ることができた。
【産業上の利用可能性】  ウイルスエンベロープをその細胞融合活性を保ちつつ、かつ高回収率で精製する方法を提供できる。精製されたウイルスエンベロープは遺伝子などの生体高分子を細胞や生体内に導入するベクターとして使用され得る。
本発明の方法を用いれば、従来方法に比較して高い回収率で不活性ウイルスエンベロープ（例えばＨＶＪ）をその融合活性を保持したまま精製することができる。従って、ウイルスエンベロープを工業的に製造する際に有用である。また、本発明の方法は不活性化されていないエンベロープウイルスの精製にも適用することができる。
本出願は、日本で出願された特願２００４−２１９３８１（出願日：２００４年７月２７日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
2006011580.tif 000004
【図２】
2006011580.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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