(57)【要約】【課題】アシドテレストリスを迅速に検出でき、かつ、アシドテレストリスをアシドカルダリウスと判別して確認しやすいアリシクロバチルス・アシドテレストリス菌検出用試薬、検出用培地および検出方法を提供する。【解決手段】塩化−２，３，５−トリフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムを含むアリシクロバチルス・アシドテレストリス菌検出用培地に果汁を含む試料を表面塗沫した後、４０℃乃至５０℃の温度で保ち、培地のコロニーによる赤色の発色に基づいてアシドテレストリス菌を検出する。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩化−２，３，５−トリフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムから成ることを特徴とするアリシクロバチルス・アシドテレストリス菌検出用試薬。
【請求項２】
塩化−２，３，５−トリフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムを含むことを特徴とするアリシクロバチルス・アシドテレストリス菌検出用培地。
【請求項３】
塩化−２，３，５−トリフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムを含むアリシクロバチルス・アシドテレストリス菌検出用培地に試料を加えた後、アリシクロバチルス・アシドテレストリス菌の培養条件で保ち、前記培地のコロニーによる色の変化に基づいて前記菌を検出することを、
特徴とするアリシクロバチルス・アシドテレストリス菌検出方法。
【請求項４】
塩化−２，３，５−トリフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムを含むアリシクロバチルス・アシドテレストリス菌検出用培地に果汁を含む試料を表面塗沫した後、４０℃乃至５０℃の温度で保ち、前記培地のコロニーによる赤色の発色に基づいて前記菌を検出することを、
特徴とするアリシクロバチルス・アシドテレストリス菌検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アリシクロバチルス・アシドテレストリス菌を検出するための検出用試薬、検出用培地および検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
土壌中には、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス(Alicyclobacillus acidocaldarius)（以下、「アシドカルダリウス」という）や、アリシクロバチルス・アシドテレストリス(Alicyclobacillus acidoterrestris)（以下、「アシドテレストリス」という）などのアリシクロバチルス属の菌が広く存在する。アリシクロバチルス属の菌は、高温好酸性芽胞形成グラム陽性桿菌であり、通常のパスツール殺菌では死滅しない。アリシクロバチルス属の菌のうち、アシドテレストリスは、臭気成分を発生し、変敗の原因になるため、混入の有無を検出することが重要がある。【０００３】
従来、アシドテレストリスの混入を検査するため、４０〜５０℃の温度と６０〜７０℃の温度の２種類の温度で同時に１４〜２４時間培養した後、それぞれの菌コロニー生育状況を目視比較する検査方法がある（例えば、特許文献１参照）。【０００４】
しかしながら、アシドテレストリスの増殖可能な温度帯は２５℃付近から５０℃の範囲で、アシドカルダリウスの増殖可能な温度帯は４０℃から６５℃付近の範囲のため、特許文献１記載の検査方法では、４０〜５０℃の温度で培養したとき、生育したコロニーがアシドカルダリウスであるか、アシドテレストリスであるか判別しにくいという問題があった。
そこで、従来、寒天培地の培養温度を３０℃付近に設定して、アシドカルダリウスの増殖を抑制することによりアシドテレストリスを選択的に検出していた。【０００５】
【特許文献１】特開２００４−４１１０４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来の検査方法では、アシドテレストリスを選択的に検出可能であるが、アシドテレストリスの至適増殖温度は４５℃付近のため、３０℃付近の温度では増殖が遅れ、検出に４８時間以上を要するという課題があった。また、培地上で増殖したアシドテレストリスは、白いコロニーとして観察されるが、半透明の培地上では確認しにくいという課題もあった。【０００７】
本発明は、このような課題に着目してなされたもので、アシドテレストリスを迅速に検出でき、かつ、アシドテレストリスをアシドカルダリウスと判別して確認しやすいアリシクロバチルス・アシドテレストリス菌検出用試薬、検出用培地および検出方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明に係るアリシクロバチルス・アシドテレストリス菌検出用試薬は、塩化−２，３，５−トリフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムから成ることを特徴とする。
本発明に係るアリシクロバチルス・アシドテレストリス菌検出用培地は、塩化−２，３，５−トリフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムを含むことを特徴とする。
本発明に係るアリシクロバチルス・アシドテレストリス菌検出方法は、塩化−２，３，５−トリフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムを含むアリシクロバチルス・アシドテレストリス菌検出用培地に試料を加えた後、アリシクロバチルス・アシドテレストリス菌の培養条件で保ち、前記培地のコロニーによる色の変化に基づいて前記菌を検出することを、特徴とする。【０００９】
本発明に係るアリシクロバチルス・アシドテレストリス菌検出方法は、塩化−２，３，５−トリフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムを含むアリシクロバチルス・アシドテレストリス菌検出用培地に果汁を含む試料を表面塗沫した後、４０℃乃至５０℃の温度で保ち、前記培地のコロニーによる赤色の発色に基づいて前記菌を検出することが好ましい。【００１０】
塩化−２，３，５−トリフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム（Triphenyl Tetrazoium Chloride、以下、「ＴＴＣ」という）は、酸化された状態では無色であるが、発育しつつある細菌に取り込まれて細菌内で還元されると、不溶性で赤色のフォルマザン（formazon）となる。ＴＴＣの還元は、不可逆的で、フォルマザンとなると、空気中で再び酸化されることはなく、無色の状態に戻ることはない。【００１１】
ＴＴＣを培地に加えることにより、アシドテレストリスは、赤色に発色し、確認が容易となる。一方、アシドカルダリウスは、ＴＴＣを培地に加えても、発色しない。このため、色により、アシドテレストリスとアシドカルダリウスとを容易に判別することができる。【００１２】
ＴＴＣは、赤く発色することでグラム陰性菌などの菌の判定作業を容易にすることが既に知られており、乳酸菌やグラム陽性球菌などでは発色しにくいことも知られている。しかしながら、同じ属の細菌で発色する種と発色しない種とがあることは知られておらず、アシドテレストリスとアシドカルダリウスとで前者のみが発色し、後者は発色しないことは知られていなかった。
本発明は、その発見に基づいてなされたものである。【００１３】
ＴＴＣは、培地に対し２０ｍｇ／リットル乃至５０ｍｇ／リットルの範囲で含まれることが好ましく、２０ｍｇ／リットル乃至４０ｍｇ／リットルの範囲が特に好ましく、３０ｍｇ／リットル前後の範囲がさらに好ましい。ＴＴＣの量が２０ｍｇ／リットルより少なくなると、発色の確認がしにくくなり、ＴＴＣの量が４０ｍｇ／リットルを超えると、アシドテレストリスの増殖速度に影響し、５０ｍｇ／リットルを超えると増殖速度への影響が大きいためである。【００１４】
培地は、酵母エキス、デンプン、グルコースを主要成分とするＹＳＧ培地が好ましく、ｐＨを３．７±０．２に調整することが好ましい。ｐＨ調整剤としては、硫酸が好ましい。クエン酸または乳酸は、ｐＨの調整に使用できるが好ましくはない。クエン酸または乳酸は、アシドテレストリスの増殖に影響するためである。培地は、液体培地でもよいが、寒天培地が好ましい。培地として寒天培地を使用する場合、試料は表面塗沫により培地に加えられることが好ましく、混釈法の適用は好ましくない。混釈法では、発色しにくいためである。試料はアシドテレストリスの検出が望まれるいかなる試料であってもよいが、オレンジジュースまたはその他の果汁や、清涼飲料水、ブドウ酒、みかん缶詰またはその他の果実缶詰が試料として適している。【００１５】
アシドテレストリスの培養条件としては、温度は４０℃乃至５０℃の温度、特に４２℃乃至４５℃の温度で保つことが好ましく、ｐＨは３．７±０．２の酸性に設定することが好ましい。【００１６】
ＴＴＣを加えた培地でアシドテレストリスの至適培養条件に保つことにより、アシドテレストリスを２４時間以内に肉眼で検出可能である。検出機器を使用した場合には、１５時間で検出することも可能である。培地にＴＴＣを加えることにより、アシドテレストリスは増殖速度にほとんど影響を受けないが、アシドカルダリウスは影響を受け、増殖速度が遅くなる。すなわち、ＴＴＣを加えない培地では、３５時間程度で検出可能であるが、ＴＴＣを加えた培地では、４５時間以上に検出時間が延びる。このため、ＴＴＣを加えた培地では、アシドテレストリスを赤色の発色でアシドカルダリウスと識別して確認しやすいという利点と、アシドカルダリウスの増殖を抑制し、アシドテレストリスのみを確認しやすいという利点がある。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、アシドテレストリスを迅速に検出でき、かつ、アシドテレストリスをアシドカルダリウスと判別して確認しやすいアリシクロバチルス・アシドテレストリス菌検出用試薬、検出用培地および検出方法を提供することができる。
【実施例】
【００１８】
以下、図面に基づき、本発明の実施例について説明する。
水１リットルに酵母エキス２ｇ、デンプン２ｇ、グルコース１ｇ、乾燥寒天１５ｇ、塩化−２，３，５−トリフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム（ＴＴＣ）３０ｇを加え、１Ｎ硫酸によりｐＨ３．７に調整し、シャーレに入れて、ＴＴＣ入りＹＳＧ寒天培地を準備した。そのアリシクロバチルス・アシドテレストリス菌検出用培地に試料を表面塗沫した後、４５℃の温度で保ち、４８時間培養した。試料は、（ａ）アシドテレストリスを含む水、（ｂ）アシドカルダリウスを含む水を用いた。また、対照として、ＴＴＣを加えない点を除き同様に調製したＹＳＧ寒天培地を準備し、同じ試料で同様に４８時間培養した。【００１９】
その結果を図１乃至図４に示す。
図１は、ＴＴＣ入りＹＳＧ寒天培地に（ａ）アシドテレストリスを含む水を表面塗沫したときの培養時間によるコロニー数の変化を示すグラフおよび培養時間４８時間後の培地上のコロニーを示す図面である。なお、コロニーは、赤色で示されている。
図２は、対照としてＴＴＣを入れないＹＳＧ寒天培地に（ａ）アシドテレストリスを含む水を表面塗沫したときの培養時間によるコロニー数の変化を示すグラフおよび培養時間４８時間後の培地上のコロニーを示す図面である。なお、コロニーは、緑色で示されている。【００２０】
図３は、ＴＴＣ入りＹＳＧ寒天培地に（ｂ）アシドカルダリウスを含む水を表面塗沫したときの培養時間によるコロニー数の変化を示すグラフおよび培養時間４８時間後の培地上のコロニーを示す図面である。なお、コロニーは、緑色で示されている。
図４は、対照としてＴＴＣを入れないＹＳＧ寒天培地に（ｂ）アシドカルダリウスを含む水を表面塗沫したときの培養時間によるコロニー数の変化を示すグラフおよび培養時間４８時間後の培地上のコロニーを示す図面である。なお、コロニーは、緑色で示されている。【００２１】
図１および図２のコロニーの図に示すように、アシドテレストリスは、ＴＴＣにより赤色に発色し、検出が容易となる。また、図１および図２のグラフから、アシドテレストリスはＴＴＣを加えても増殖速度に影響を受けないことがわかる。これに対し、図３および図４のコロニーの図に示すように、アシドカルダリウスは、ＴＴＣを加えても発色しない。また、図１および図２のグラフに示すように、アシドテレストリスはＴＴＣを加えると、増殖速度に影響を受け、検出時間はＴＴＣを加えない場合の３５時間程度に比べて、４５時間以上に延びることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】実施例のＴＴＣ入りＹＳＧ寒天培地に（ａ）アシドテレストリスを含む水を表面塗沫したときの培養時間によるコロニー数の変化を示すグラフおよび培養時間４８時間後の培地上のコロニーを示す図面である。
【図２】実施例の、対照としてＴＴＣを入れないＹＳＧ寒天培地に（ａ）アシドテレストリスを含む水を表面塗沫したときの培養時間によるコロニー数の変化を示すグラフおよび培養時間４８時間後の培地上のコロニーを示す図面である。
【図３】実施例のＴＴＣ入りＹＳＧ寒天培地に（ｂ）アシドカルダリウスを含む水を表面塗沫したときの培養時間によるコロニー数の変化を示すグラフおよび培養時間４８時間後の培地上のコロニーを示す図面である。
【図４】実施例の、対照としてＴＴＣを入れないＹＳＧ寒天培地に（ｂ）アシドカルダリウスを含む水を表面塗沫したときの培養時間によるコロニー数の変化を示すグラフおよび培養時間４８時間後の培地上のコロニーを示す図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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