【手続補正書】
【提出日】令和2年2月28日(2020.2.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外マトリックスに由来する単離されたナノベシクルと、薬学的に許容されるキャリアとを含む組成物。
【請求項２】
前記ナノベシクルが、ＣＤ６３もしくはＣＤ８１を発現しないか、またはＣＤ６３ｌｏＣＤ８１ｌｏである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記細胞外マトリックスが、哺乳動物細胞外マトリックスである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記哺乳動物細胞外マトリックスが、ヒト細胞外マトリックスである、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記細胞外マトリックスが、食道組織、膀胱、小腸粘膜下組織、真皮、臍帯、心膜、心組織、腫瘍組織または骨格筋に由来する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ナノベシクルが、ｍｉＲ−１４５および／またはｍｉＲ−１８１を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記細胞外マトリックスが、酵素により消化される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記酵素が、ペプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼまたはプロテイナーゼＫである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記キャリアが、バッファー、ゲル、保存料および／または安定化剤を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
外因性治療剤をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記治療剤が、化学化合物、核酸分子、ポリペプチド、成長因子、サイトカインまたは小分子である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記治療剤が、マイクロＲＮＡまたはタンパク質である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
細胞外マトリックスからナノベシクルを単離する方法であって、
該細胞外マトリックスを酵素により消化して、消化された細胞外マトリックスを産生するステップと、
該消化された細胞外マトリックスを遠心分離して、コラーゲン原線維レムナントを除去し、これによって、原線維不含上清を産生するステップと、
該原線維不含上清を遠心分離して、固体材料を単離するステップと、
該固体材料をキャリアに懸濁させ、
これにより、該細胞外マトリックスからナノベシクルを単離するステップと
を含む方法。
【請求項１４】
前記酵素が、ペプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼまたはプロテイナーゼＫである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記消化された細胞外マトリックスを遠心分離するステップが、約３００〜約１０００ｇで約１０〜約１５分間、約２０００ｇ〜約３０００ｇで約２０〜約３０分間および約１０，０００〜約１５，０００ｇで約２５〜約４０分間の遠心分離を含む、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記消化された細胞外マトリックスを遠心分離するステップが、約５００ｇで約１０分間の遠心分離、約２，５００ｇで約２０分間の遠心分離および／または約１０，０００ｇで約３０分間の遠心分離を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記消化された細胞外マトリックスを遠心分離するステップが、少なくとも２または３回反復される、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
線維不含上清を遠心分離するステップが、約１００，０００ｇ〜約１５０，０００ｇで約６０〜約９０分間の遠心分離を含む、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記線維不含上清を遠心分離するステップが、約１００，０００ｇで約７０分間の遠心分離を含む、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞外マトリックスが、哺乳動物細胞外マトリックスである、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記哺乳動物細胞外マトリックスが、ヒト細胞外マトリックスである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞外マトリックスが、食道組織、膀胱、小腸粘膜下組織、真皮、臍帯、心膜、心組織または骨格筋から単離される、請求項１３〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
目的の細胞外マトリックスにおける細胞増殖、遊走および／または分化を変更するための組成物であって、
第２の細胞外マトリックスに由来する単離されたナノベシクルを含み、該組成物は、該目的の細胞外マトリックスに導入され、
これにより、該マトリックスにおける細胞増殖、遊走および／または分化が変更されることを特徴とする、組成物。
【請求項２４】
前記目的の細胞外マトリックスおよび前記第２の細胞外マトリックスが、同じ種に由来する、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記目的の細胞外マトリックスおよび前記第２の細胞外マトリックスが、異なる種に由来する、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
前記目的の細胞外マトリックスおよび前記第２の細胞外マトリックスが、異なる組織に由来する、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記目的の細胞外マトリックスおよび前記第２の細胞外マトリックスが、同じ組織に由来する、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記目的の細胞外マトリックスおよび前記第２の細胞外マトリックスが、ヒトのものである、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
前記目的の細胞外マトリックスが、ブタのものである、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記細胞が、幹細胞または前駆細胞である、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
前記細胞が、マクロファージ、筋芽細胞、血管周囲幹細胞またはニューロブラストーマ細胞である、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
前記目的の細胞外マトリックスが、ｅｘ  ｖｉｖｏのものである、請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
前記目的の細胞外マトリックスが、医療デバイス上またはその内部に存在する、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記目的の細胞外マトリックスが、ｉｎ  ｖｉｖｏのものである、請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
細胞外マトリックスに由来するナノベシクルと、異種細胞外マトリックスとを含む生体足場。
【請求項３６】
前記ナノベシクルが、哺乳動物細胞外マトリックスに由来する、請求項３５に記載の生体足場。
【請求項３７】
前記哺乳動物細胞外マトリックスが、ヒトまたはブタ細胞外マトリックスである、請求項３６に記載の生体足場。
【請求項３８】
前記細胞外マトリックスが、食道細胞、膀胱細胞、小腸粘膜下組織または真皮に由来する、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の生体足場。
【請求項３９】
前記異種細胞外マトリックスが、前記ナノベシクルとは異なる組織に由来する、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の生体足場。
【請求項４０】
前記異種細胞外マトリックスが、前記ナノベシクルとは異なる種に由来する、請求項３５〜３９のいずれか一項に記載の生体足場。
【請求項４１】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物もしくは請求項３５〜４０のいずれか一項に記載の生体足場を含むまたはこれでコーティングされた医療デバイス。
【請求項４２】
外科用メッシュ、ステント、ペースメーカー、カテーテル、心臓弁、バイオセンサー、薬物送達デバイスまたは整形外科インプラントである、請求項４１に記載の医療デバイス。
【請求項４３】
細胞外マトリックスからナノベシクルを単離する方法であって、
ａ）細胞外マトリックスを約０．１Ｍ超の塩濃度でインキュベートするステップと、
ｂ）消化された該細胞外マトリックスを遠心分離して、コラーゲン原線維レムナントを除去し、上清を単離するステップと、
ｃ）該上清を遠心分離して、固体材料を単離するステップと、
ｄ）該固体材料をキャリアに懸濁させ、これにより、該細胞外マトリックスからナノベシクルを単離するステップと
を含む方法。
【請求項４４】
前記塩が、塩化カリウム、塩化ナトリウムまたは塩化マグネシウムである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
細胞外マトリックスからナノベシクルを単離する方法であって、
ａ）該細胞外マトリックスを等張性緩衝食塩水溶液に懸濁させて、懸濁液を形成するステップと、
ｂ）限外濾過を行って、該懸濁液から直径約１０ｎｍ〜約１０，０００ｎｍの間の粒子を単離し、
これにより、該細胞外マトリックスからナノベシクルを単離するステップと
を含む方法。
【請求項４６】
限外濾過を行って、前記懸濁液から直径約１０ｎｍ〜約３００ｎｍの間の粒子を単離するステップを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞外マトリックスが、哺乳動物細胞外マトリックスである、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記哺乳動物細胞外マトリックスが、ヒト細胞外マトリックスである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞外マトリックスが、食道組織、膀胱、小腸粘膜下組織、真皮、臍帯、心膜、心組織または骨格筋から単離される、請求項４３〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
腫瘍細胞の増殖を低下させ、腫瘍細胞のアポトーシスを増加させ、および／または腫瘍細胞の遊走を減少させるための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物であって、
該腫瘍細胞は、有効量の該組成物と接触させられ、これにより、該腫瘍細胞の増殖が低下させられ、該腫瘍細胞のアポトーシスが増加させられ、および／または該腫瘍細胞の遊走が減少させられることを特徴とする、組成物。
【請求項５１】
前記腫瘍細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏのものである、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
前記腫瘍細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのものである、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５３】
前記腫瘍細胞が、神経膠腫細胞または食道腺癌細胞である、請求項５０〜５２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５４】
前記細胞外マトリックスが、膀胱または食道に由来する、請求項５０〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５５】
腫瘍を有する被験体を処置するための請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物であって、治療有効量の該組成物が該被験体に投与され、これにより、該被験体における該腫瘍が処置されることを特徴とする、組成物。
【請求項５６】
前記腫瘍が、神経膠腫または食道腺癌である、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
前記細胞外マトリックスが、食道組織または膀胱に由来する、請求項５５または５６に記載の組成物。
【請求項５８】
被験体におけるＭ２マクロファージを増加させるための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物であって、
治療有効量の該組成物が該被験体に投与され、これにより、該被験体におけるＭ２マクロファージが増加させられることを特徴とする、組成物。
【請求項５９】
前記被験体が、創傷を有する、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６０】
前記治療有効量の前記組成物が、前記被験体における前記創傷に局所的に投与されることを特徴とする、請求項５９に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
本発明の前述および他の目的、特色および利点は、添付の図面を参照しつつ続ける次の詳細な説明から、さらに明らかになる。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
細胞外マトリックスに由来する単離されたナノベシクルと、薬学的に許容されるキャリアとを含む組成物。
（項目２）
前記ナノベシクルが、ＣＤ６３もしくはＣＤ８１を発現しないか、またはＣＤ６３ｌｏＣＤ８１ｌｏである、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記細胞外マトリックスが、哺乳動物細胞外マトリックスである、項目１に記載の組成物。
（項目４）
前記哺乳動物細胞外マトリックスが、ヒト細胞外マトリックスである、項目２に記載の組成物。
（項目５）
前記細胞外マトリックスが、食道組織、膀胱、小腸粘膜下組織、真皮、臍帯、心膜、心組織、腫瘍組織または骨格筋に由来する、項目１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６）
前記ナノベシクルが、ｍｉＲ−１４５および／またはｍｉＲ−１８１を含む、項目１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７）
前記細胞外マトリックスが、酵素により消化される、項目１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８）
前記酵素が、ペプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼまたはプロテイナーゼＫである、項目７に記載の組成物。
（項目９）
前記キャリアが、バッファー、ゲル、保存料および／または安定化剤を含む、項目１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０）
外因性治療剤をさらに含む、項目１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１１）
前記治療剤が、化学化合物、核酸分子、ポリペプチド、成長因子、サイトカインまたは小分子である、項目９に記載の組成物。
（項目１２）
前記治療剤が、マイクロＲＮＡまたはタンパク質である、項目１１に記載の組成物。
（項目１３）
細胞外マトリックスからナノベシクルを単離する方法であって、
該細胞外マトリックスを酵素により消化して、消化された細胞外マトリックスを産生するステップと、
該消化された細胞外マトリックスを遠心分離して、コラーゲン原線維レムナントを除去し、これによって、原線維不含上清を産生するステップと、
該原線維不含上清を遠心分離して、固体材料を単離するステップと、
該固体材料をキャリアに懸濁させ、
これにより、該細胞外マトリックスからナノベシクルを単離するステップと
を含む方法。
（項目１４）
前記酵素が、ペプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼまたはプロテイナーゼＫである、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記消化された細胞外マトリックスを遠心分離するステップが、約３００〜約１０００ｇで約１０〜約１５分間、約２０００ｇ〜約３０００ｇで約２０〜約３０分間および約１０，０００〜約１５，０００ｇで約２５〜約４０分間の遠心分離を含む、項目１３または１４に記載の方法。
（項目１６）
前記消化された細胞外マトリックスを遠心分離するステップが、約５００ｇで約１０分間の遠心分離、約２，５００ｇで約２０分間の遠心分離および／または約１０，０００ｇで約３０分間の遠心分離を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記消化された細胞外マトリックスを遠心分離するステップが、少なくとも２または３回反復される、項目１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
線維不含上清を遠心分離するステップが、約１００，０００ｇ〜約１５０，０００ｇで約６０〜約９０分間の遠心分離を含む、項目１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記線維不含上清を遠心分離するステップが、約１００，０００ｇで約７０分間の遠心分離を含む、項目１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記細胞外マトリックスが、哺乳動物細胞外マトリックスである、項目１３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記哺乳動物細胞外マトリックスが、ヒト細胞外マトリックスである、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記細胞外マトリックスが、食道組織、膀胱、小腸粘膜下組織、真皮、臍帯、心膜、心組織または骨格筋から単離される、項目１３〜２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
目的の細胞外マトリックスにおける細胞増殖、遊走および／または分化を変更する方法であって、
第２の細胞外マトリックスに由来する単離されたナノベシクルを該目的の細胞外マトリックスに導入し、
これにより、該マトリックスにおける細胞増殖、遊走および／または分化を変更するステップ
を含む方法。
（項目２４）
前記目的の細胞外マトリックスおよび前記第２の細胞外マトリックスが、同じ種に由来する、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記目的の細胞外マトリックスおよび前記第２の細胞外マトリックスが、異なる種に由来する、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
前記目的の細胞外マトリックスおよび前記第２の細胞外マトリックスが、異なる組織に由来する、項目２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記目的の細胞外マトリックスおよび前記第２の細胞外マトリックスが、同じ組織に由来する、項目２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記目的の細胞外マトリックスおよび前記第２の細胞外マトリックスが、ヒトのものである、項目２３〜２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記目的の細胞外マトリックスが、ブタのものである、項目２３〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記細胞が、幹細胞または前駆細胞である、項目２３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記細胞が、マクロファージ、筋芽細胞、血管周囲幹細胞またはニューロブラストーマ細胞である、項目２３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記目的の細胞外マトリックスが、ｅｘ  ｖｉｖｏのものである、項目２３〜３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記目的の細胞外マトリックスが、医療デバイス上またはその内部に存在する、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記目的の細胞外マトリックスが、ｉｎ  ｖｉｖｏのものである、項目２３〜３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
細胞外マトリックスに由来するナノベシクルと、異種細胞外マトリックスとを含む生体足場。
（項目３６）
前記ナノベシクルが、哺乳動物細胞外マトリックスに由来する、項目３５に記載の生体足場。
（項目３７）
前記哺乳動物細胞外マトリックスが、ヒトまたはブタ細胞外マトリックスである、項目３６に記載の生体足場。
（項目３８）
前記細胞外マトリックスが、食道細胞、膀胱細胞、小腸粘膜下組織または真皮に由来する、項目３５〜３７のいずれか一項に記載の生体足場。
（項目３９）
前記異種細胞外マトリックスが、前記ナノベシクルとは異なる組織に由来する、項目３５〜３８のいずれか一項に記載の生体足場。
（項目４０）
前記異種細胞外マトリックスが、前記ナノベシクルとは異なる種に由来する、項目３５〜３９のいずれか一項に記載の生体足場。
（項目４１）
項目１〜１１のいずれか一項に記載の組成物もしくは項目３０〜３６のいずれか一項に記載の生体足場を含むまたはこれでコーティングされた医療デバイス。
（項目４２）
外科用メッシュ、ステント、ペースメーカー、カテーテル、心臓弁、バイオセンサー、薬物送達デバイスまたは整形外科インプラントである、項目４１に記載の医療デバイス。
（項目４３）
細胞外マトリックスからナノベシクルを単離する方法であって、
ａ）細胞外マトリックスを約０．１Ｍ超の塩濃度でインキュベートするステップと、
ｂ）消化された該細胞外マトリックスを遠心分離して、コラーゲン原線維レムナントを除去し、上清を単離するステップと、
ｃ）該上清を遠心分離して、固体材料を単離するステップと、
ｄ）該固体材料をキャリアに懸濁させ、これにより、該細胞外マトリックスからナノベシクルを単離するステップと
を含む方法。
（項目４４）
前記塩が、塩化カリウム、塩化ナトリウムまたは塩化マグネシウムである、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
細胞外マトリックスからナノベシクルを単離する方法であって、
ａ）該細胞外マトリックスを等張性緩衝食塩水溶液に懸濁させて、懸濁液を形成するステップと、
ｂ）限外濾過を行って、該懸濁液から直径約１０ｎｍ〜約１０，０００ｎｍの間の粒子を単離し、
これにより、該細胞外マトリックスからナノベシクルを単離するステップと
を含む方法。
（項目４６）
限外濾過を行って、前記懸濁液から直径約１０ｎｍ〜約３００ｎｍの間の粒子を単離するステップを含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記細胞外マトリックスが、哺乳動物細胞外マトリックスである、項目４３〜４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記哺乳動物細胞外マトリックスが、ヒト細胞外マトリックスである、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記細胞外マトリックスが、食道組織、膀胱、小腸粘膜下組織、真皮、臍帯、心膜、心組織または骨格筋から単離される、項目４３〜４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
腫瘍細胞の増殖を低下させ、腫瘍細胞のアポトーシスを増加させ、および／または腫瘍細胞の遊走を減少させるための方法であって、
有効量の項目１〜１１のいずれか一項に記載の組成物と該腫瘍細胞とを接触させ、これにより、該腫瘍細胞の増殖を低下させ、該腫瘍細胞のアポトーシスを増加させ、および／または該腫瘍細胞の遊走を減少させるステップ
を含む方法。
（項目５１）
前記腫瘍細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏのものである、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記腫瘍細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのものである、項目５０に記載の方法。
（項目５３）
前記腫瘍細胞が、神経膠腫細胞または食道腺癌細胞である、項目５０〜５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
前記細胞外マトリックスが、膀胱または食道に由来する、項目５０〜５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
腫瘍を有する被験体を処置する方法であって、治療有効量の項目１〜１１のいずれか一項に記載の組成物を該被験体に投与し、これにより、該被験体における該腫瘍を処置するステップを含む方法。
（項目５６）
前記腫瘍が、神経膠腫または食道腺癌である、項目２２に記載の方法。
（項目５７）
前記細胞外マトリックスが、食道組織または膀胱に由来する、項目５６または５７に記載の方法。
（項目５８）
被験体におけるＭ２マクロファージを増加させる方法であって、
治療有効量の項目１〜１１のいずれか一項に記載の組成物を被験体に投与し、これにより、該被験体におけるＭ２マクロファージを増加させるステップ
を含む方法。
（項目５９）
前記被験体が、創傷を有する、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記治療有効量の前記組成物が、前記被験体における前記創傷に局所的に投与される、項目５９に記載の方法。