【手続補正書】
【提出日】令和1年11月29日(2019.11.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
この出願の明細書に記載された発明。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
一態様では、腫瘍は前立腺腫瘍であり、1つまたは複数の検出可能なマーカーはアンドロゲン受容体（ＡＲ）に結合するかそれを同定する。
[本発明1001]
（a）生物学的サンプルを、
（i）ヒドロゲルサブユニットの存在下で前記サンプルを固定すること;
（ii）前記ヒドロゲルサブユニットを重合させてヒドロゲル包埋サンプルを形成すること;
（iii）前記ヒドロゲル包埋サンプルを透明化すること;および
（iv）前記透明化されたヒドロゲル包埋サンプルを1つまたは複数の第1の検出可能なマーカーで標識すること
により処理する工程;
（b）前記生物学的サンプルの少なくとも1つの第1の画像を生成するために、および/または前記生物学的サンプル中の前記第1の検出可能なマーカーの量を判定するために、前記処理されたサンプルを顕微鏡で、任意で光学顕微鏡法で画像化する工程
を含む、生物学的サンプルを分析するための方法であって、
前記生物学的サンプルが、腫瘍組織サンプル、予め凍結された生物学的サンプル、または細胞株である、前記方法。
[本発明1002]
前記生物学的サンプルが20ミクロンを超える長さおよび20ミクロンを超える厚さを有する、本発明1001の方法。
[本発明1003]
（a）対象から得られた腫瘍組織サンプルを、
（i）ヒドロゲルサブユニットの存在下で前記腫瘍組織サンプルを固定すること;
（ii）前記ヒドロゲルサブユニットを重合させてヒドロゲル包埋サンプルを形成すること;
（iii）前記ヒドロゲル包埋サンプルを透明化すること;および
（iv）前記透明化されたヒドロゲル包埋サンプルを1つまたは複数の第1の検出可能なマーカーで標識すること
により処理する工程;
（b）前記第1の検出可能なマーカーの少なくとも1つの腫瘍画像を生成するために、および/または前記第1の検出可能なマーカーの量を判定するために、前記処理されたサンプルを画像化する工程;ならびに
（c）正常な組織、腫瘍組織、良好な予後に関連する腫瘍組織、または不良な予後に関連する腫瘍組織から得られた1つまたは複数の対照画像または量または所定の画像または量と前記腫瘍画像または量とを比較する工程であって、
それにより、腫瘍の存在または腫瘍の予後を判定する、工程
を含む、対象における腫瘍を診断するまたは腫瘍の予後を判定するための方法。
[本発明1004]
（a）第1の時点で対象から得られた第1の腫瘍組織サンプルを、
（i）ヒドロゲルサブユニットの存在下で前記腫瘍組織サンプルを固定すること;
（ii）前記ヒドロゲルサブユニットを重合させてヒドロゲル包埋サンプルを形成すること;
（iii）前記ヒドロゲル包埋サンプルを透明化すること;および
（iv）前記透明化されたヒドロゲル包埋サンプルを1つまたは複数の第1の検出可能なマーカーで標識すること
により処理する工程;
（b）治療処置後の第2の時点で前記対象から得られた第2の腫瘍組織サンプルを、
（i）ヒドロゲルサブユニットの存在下で前記腫瘍組織サンプルを固定すること;
（ii）前記ヒドロゲルサブユニットを重合させてヒドロゲル包埋サンプルを形成すること;
（iii）前記ヒドロゲル包埋サンプルを透明化すること;および
（iv）前記透明化されたヒドロゲル包埋サンプルを1つまたは複数の第1の検出可能なマーカーで標識すること
により処理する工程;
（c）（a）および（b）の前記処理されたサンプルを画像化して、（a）の前記処理されたサンプルの第1の腫瘍画像および（b）の前記処理されたサンプルの第2の腫瘍画像を生成し、かつ/または（a）の前記処理されたサンプル中の前記1つまたは複数の第1の検出可能なマーカーの第1の量および（b）の前記処理されたサンプル中の前記1つまたは複数の第1の検出可能なマーカーの第2の量を判定する工程;ならびに
（d）前記第1の腫瘍画像と前記第2の腫瘍画像とを比較する、または前記1つまたは複数の検出可能なマーカーの前記第1の量と前記第2の量とを比較する工程であって、前記第2の腫瘍画像または第2の量が前記第1の腫瘍画像または量よりも少ない腫瘍特徴を示す場合、前記腫瘍は前記治療処置に好都合に応答しており、かつ前記第2の腫瘍画像または量が前記第1の腫瘍画像または量よりも多い腫瘍特徴を示す場合、前記腫瘍は前記治療処置に不良に応答している、工程
を含む、治療処置に対する対象における腫瘍の応答性を判定するための方法。
[本発明1005]
前記対象が哺乳動物である、本発明1003または1004の方法。
[本発明1006]
前記対象がヒトである、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記対象がヒトの疾患の動物モデルである、本発明1005の方法。
[本発明1008]
前記画像化が、
（a）の前記処理されたサンプルを光学的に均質なサンプル操作構成要素に置く工程;
（a）の前記処理されたサンプル内の複数の位置で、顕微鏡装置の1つまたは複数の光シートおよび1つまたは複数の検出焦点面を位置合わせする工程;
（a）の前記処理されたサンプルで前記複数の位置のそれぞれから画像を収集するように画像化処理を実行する工程;ならびに
前記複数の位置のそれぞれからの前記収集された画像に基づいて前記第1の腫瘍画像を生成する工程
を含む、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記画像化が、
前記位置合わせパラメータを各位置に適用する工程;
前記位置を光シートで同時に照らし、かつ前記位置の画像を取込む工程;および
各位置からの前記画像を用いて前記サンプルの3次元画像を構築する工程
をさらに含む、本発明1008の方法。
[本発明1010]
前記サンプルを固定することが、前記サンプルをパラホルムアルデヒドと接触させることを含む、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記ヒドロゲルサブユニットが、アクリルアミドを含む、本発明1001〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記サンプルを重合することが熱架橋を含む、本発明1001〜1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
前記サンプルを透明化することが、前記サンプルを電気泳動することを含む、本発明1001〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記電気泳動することが、イオン性界面活性剤、任意でドデシル硫酸ナトリウムを含む緩衝液を用いて行われる、本発明1013の方法。
[本発明1015]
（a）前記サンプルが、約10〜約60ボルトの範囲の電圧を用いて電気泳動される;および/または
（b）前記サンプルが、約15分間〜約10日間の範囲の時間、電気泳動される、
本発明1013または1014の方法。
[本発明1016]
前記透明化されたサンプルを、前記透明化されたサンプルの屈折率と実質的に一致する屈折率を有する封入剤中でインキュベートすることをさらに含む方法であって、前記封入剤は、前記サンプルの光学的透明度を増加させ、かつ前記封入剤は任意でグリセロールを含む、本発明1001〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
（a）画像化後に得られた前記処理されたサンプルを洗浄して、前記1つまたは複数の第1の検出可能な標識を除去する工程;
（b）前記洗浄されたサンプルを1つまたは複数の第2の検出可能な標識で再標識する工程;
（c）第2の画像を得るために、前記再標識されたサンプルを顕微鏡で、任意で光学顕微鏡で画像化する工程;および
（d）任意で、本発明1003の工程（c）または本発明1004の工程（d）に記載の通りに前記第2の画像を検査する工程
をさらに含む、本発明1001〜1014のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記標識することおよび/または再標識することが、前記透明化されたヒドロゲル包埋サンプルを、前記サンプル内の細胞または細胞外構成要素に結合する1つまたは複数の検出可能なマーカーと接触させることを含む、本発明1001〜1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
前記細胞または細胞外構成要素が、以下からなる群より選択される、本発明1018の方法:
（a）免疫細胞マーカー;
（b）癌幹細胞マーカー;
（c）細胞外マトリックスタンパク質;
（d）血管マーカー;
（e）アポトーシスマーカー;および
（f）腫瘍マーカー。
[本発明1020]
前記検出可能なマーカーが、ポリペプチド、核酸、または小分子を含む、本発明1001〜1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
前記検出可能なマーカーが、前記検出可能なマーカーに結合する検出可能な第2の作用物質の使用の有無にかかわらず検出可能である、本発明1020の方法。
[本発明1022]
前記腫瘍が、副腎皮質癌、肛門癌、再生不良性貧血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨転移、脳腫瘍、脳癌、乳癌、小児癌、原発不明癌、キャッスルマン病、子宮頸癌、結腸/直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイングファミリー腫瘍、眼癌、胆嚢癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、頭頸部癌、カポジ肉腫、腎細胞癌、喉頭および下咽頭癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、皮膚リンパ腫、悪性中皮腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽腔癌、神経芽細胞腫、口腔および口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、成人軟部組織の肉腫、基底および扁平上皮細胞癌、黒色腫、小腸癌、胃癌、精巣癌、咽喉癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰部癌、ワルデンストレームマクログロブリン血症、およびウィルムス腫瘍からなる群より選択される、本発明1001〜1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
前記腫瘍が乳癌腫瘍であり、かつ前記1つまたは複数の検出可能なマーカーが、HER2、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、パンサイトケラチン、Ki67、CD3、CD4、CD8、CD20、CD68、またはFoxp3、PD-L1、PD-1、PD-L2、CTLA-4、およびアンドロゲン受容体の1つまたは複数に結合するかまたはそれを同定する、本発明1022の方法。
[本発明1024]
前記腫瘍が肺腫瘍であり、かつ前記1つまたは複数の検出可能なマーカーが、その感作および耐性突然変異を含む上皮増殖因子受容体、ALK/ROS/RET再編成、BRAF突然変異、およびPD-L1、PD-1、PD-L2、CTLA4、CD4、CD8、CD20、パンサイトケラチンの1つまたは複数に結合するかまたはそれを同定する、本発明1022の方法。
[本発明1025]
前記腫瘍が黒色腫であり、かつ前記1つまたは複数の検出可能なマーカーが、BRAF、NRAS、KIT、GNA11/GNAQ、CDK4、およびMEK突然変異の1つまたは複数に結合するかまたはそれを同定するか、またはPD-L1、PD-1、CTLA-4 CD4、CD8、CD20、およびパンサイトケラチンの1つまたは複数に結合するかまたはその発現を同定する、本発明1022の方法。
[本発明1026]
前記腫瘍が結腸癌であり、かつ前記1つまたは複数の検出可能なマーカーが、KRAS突然変異および上皮増殖因子受容体の1つまたは複数に結合するかまたはそれを同定する、本発明1022の方法。
[本発明1027]
前記腫瘍が前立腺腫瘍であり、かつ前記1つまたは複数の検出可能なマーカーがアンドロゲン受容体に結合するかまたはそれを同定する、本発明1022の方法。
[本発明1028]
前記腫瘍が乳癌腫瘍であり、かつ前記1つまたは複数の検出可能なマーカーが、HER2/neuに結合するかまたはそれを同定する、本発明1022の方法。
[本発明1029]
前記腫瘍が乳癌腫瘍であり、かつ前記1つまたは複数の検出可能なマーカーがKi-67に結合する、本発明1022の方法。
[本発明1030]
前記腫瘍が肺癌であり、かつ前記1つまたは複数の検出可能なマーカーがCD-31に結合する、本発明1022の方法。