(57)【要約】標的細胞が樹状細胞等の非分裂性細胞である場合であっても、目的物質を標的細胞の核内に効率よく送達することができる非ウイルス性ベクターを提供することを目的とし、この目的を達成するために、本発明は、外側から順に第１の脂質膜及び第２の脂質膜を有する２枚膜リポソームであって、前記第１の脂質膜が膜融合能を有し、前記第２の脂質膜がその表面に核移行性ペプチドを有する前記２枚膜リポソームを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
外側から順に第１の脂質膜及び第２の脂質膜を有する２枚膜リポソームであって、前記第１の脂質膜が膜融合能を有し、前記第２の脂質膜がその表面に核移行性ペプチドを有する前記２枚膜リポソーム。
【請求項２】
前記第１の脂質膜がその構成成分として膜融合性脂質を含有する請求項１記載の２枚膜リポソーム。
【請求項３】
前記第１の脂質膜に含有される膜融合性脂質量が、前記第１の脂質膜に含有される総脂質量の５０％（モル比）以上である請求項２記載の２枚膜リポソーム。
【請求項４】
前記第１の脂質膜に含有される膜融合性脂質のうち、アニオン性脂質の割合が５〜５０％（モル比）である請求項２又は３記載の２枚膜リポソーム。
【請求項５】
標的細胞の核内に送達すべき目的物質が、前記第２の脂質膜の内側に封入されている請求項１〜４のいずれかに記載の２枚膜リポソーム。
【請求項６】
前記目的物質を前記標的細胞の核内に送達するためのベクターである請求項５記載の２枚膜リポソーム。
【請求項７】
前記標的細胞が非分裂性細胞である請求項６記載の２枚膜リポソーム。
【請求項８】
脂質膜の構成成分として膜融合性脂質を含有し、脂質膜の表面に核移行性ペプチドを有する複数の負帯電性ＳＵＶ型リポソームを正帯電性粒子に接触させ、正帯電性粒子に静電的に結合した負帯電性ＳＵＶ型リポソーム同士を膜融合させることにより得られる請求項１〜７のいずれかに記載の２枚膜リポソーム。
【請求項９】
前記正帯電性粒子が、標的細胞の核内に送達すべき目的物質の凝集体である請求項８記載の２枚膜リポソーム。
【請求項１０】
脂質膜の構成成分として膜融合性脂質を含有し、脂質膜の表面に核移行性ペプチドを有する複数の正帯電性ＳＵＶ型リポソームを負帯電性粒子に接触させ、負帯電性粒子に静電的に結合した正帯電性ＳＵＶ型リポソーム同士を膜融合させることにより得られる請求項１〜７のいずれかに記載の２枚膜リポソーム。
【請求項１１】
前記負帯電性粒子が、標的細胞の核内に送達すべき目的物質の凝集体である請求項１０記載の２枚膜リポソーム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、非ウイルス性ベクター、特にリポソームに関する。
【背景技術】
【０００２】  近年、薬物、核酸、ペプチド、タンパク質、糖等の目的物質を標的部位に確実に送達するためのベクターの開発が盛んに行われている。例えば、目的の遺伝子を標的細胞へ導入するためのベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス等のウイルス性ベクターが開発されている。しかしながら、ウイルス性ベクターは、大量生産の困難性、抗原性、毒性等の問題があるため、このような問題点が少ない非ウイルス性ベクター（例えば、リポソームベクター）が注目を集めており、目的物質の細胞内送達効率を向上させるために、様々な機能性分子が導入された非ウイルス性ベクターの開発が盛んに行われている。【０００３】  例えば、リポソーム膜の外表面に親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコール）が導入されたリポソームが開発されている（特許文献１、特許文献２、特許文献３及び特許文献４参照）。このリポソームによれば、リポソームの血中滞留性を向上させることにより、腫瘍細胞に対するリポソームの指向性を向上させることができる。【０００４】  また、リポソーム膜の外表面に、細胞膜の表面上に存在する受容体又は抗原と結合できる物質（例えば、トラスフェリン、インシュリン、葉酸、ヒアルロン酸、抗体又はその断片、糖鎖）が導入されたリポソームが開発されている（特許文献３及び特許文献４参照）。このリポソームによれば、リポソームのエンドサイトーシス効率を向上させることができる。【０００５】  また、リポソーム膜の外表面にステアリル化オクタアルギニンが導入されたリポソームが開発されている（非特許文献１）。このリポソームによれば、リポソームに封入された目的物質の細胞内送達効率を向上させることができる。
【特許文献１】特開平１−２４９７１７号公報
【特許文献２】特開平２−１４９５１２号公報
【特許文献３】特開平４−３４６９１８号公報
【特許文献４】特開２００４−１０４８１号公報
【非特許文献１】Ｋｏｇｕｒｅ，Ｋ．等．，「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ」，２００４年，第９８巻，ｐ．３１７−３２３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  本発明者は、従来の非ウイルス性ベクターを使用した目的物質の標的細胞内へのデリバリーシステムにおいて、標的細胞が樹状細胞等の非分裂性細胞である場合、標的細胞が分裂性細胞である場合と比較して、目的物質の核内送達効率（目的物質が核酸である場合には核酸の細胞内発現効率）が著しく低下することを見出した（参考例１参照）。【０００７】  そこで、本発明は、標的細胞が樹状細胞等の非分裂性細胞である場合であっても、目的物質を標的細胞の核内に効率よく送達することができる非ウイルス性ベクターを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】  上記目的を達成するために、本発明は、下記（１）〜（１１）の２枚膜リポソームを提供する。
（１）外側から順に第１の脂質膜及び第２の脂質膜を有する２枚膜リポソームであって、前記第１の脂質膜が膜融合能を有し、前記第２の脂質膜がその表面に核移行性ペプチドを有する前記２枚膜リポソーム。
（２）前記第１の脂質膜がその構成成分として膜融合性脂質を含有する前記（１）記載の２枚膜リポソーム。
（３）前記第１の脂質膜に含有される膜融合性脂質量が、前記第１の脂質膜に含有される総脂質量の５０％（モル比）以上である前記（２）記載の２枚膜リポソーム。
（４）前記第１の脂質膜に含有される膜融合性脂質のうち、アニオン性脂質の割合が５〜５０％（モル比）である前記（２）又は（３）記載の２枚膜リポソーム。
（５）標的細胞の核内に送達すべき目的物質が、前記第２の脂質膜の内側に封入されている前記（１）〜（４）のいずれかに記載の２枚膜リポソーム。
（６）前記目的物質を前記標的細胞の核内に送達するためのベクターである前記（５）記載の２枚膜リポソーム。
（７）前記標的細胞が非分裂性細胞である前記（６）記載の２枚膜リポソーム。
（８）脂質膜の構成成分として膜融合性脂質を含有し、脂質膜の表面に核移行性ペプチドを有する複数の負帯電性ＳＵＶ型リポソームを正帯電性粒子に接触させ、正帯電性粒子に静電的に結合した負帯電性ＳＵＶ型リポソーム同士を膜融合させることにより得られる前記（１）〜（７）のいずれかに記載の２枚膜リポソーム。
（９）前記正帯電性粒子が、標的細胞の核内に送達すべき目的物質の凝集体である前記（８）記載の２枚膜リポソーム。
（１０）脂質膜の構成成分として膜融合性脂質を含有し、脂質膜の表面に核移行性ペプチドを有する複数の正帯電性ＳＵＶ型リポソームを負帯電性粒子に接触させ、負帯電性粒子に静電的に結合した正帯電性ＳＵＶ型リポソーム同士を膜融合させることにより得られる前記（１）〜（７）のいずれかに記載の２枚膜リポソーム。
（１１）前記負帯電性粒子が、標的細胞の核内に送達すべき目的物質の凝集体である前記（１０）記載の２枚膜リポソーム。
【発明の効果】
【０００９】  本発明により、標的細胞が樹状細胞等の非分裂性細胞である場合であっても、目的物質を標的細胞の核内に効率よく送達することができる２枚膜リポソームが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ルシフェラーゼ遺伝子発現活性（ＲＬＵ／ｍｇタンパク質）の測定結果を示す図である。
【図２】共焦点レーザー顕微鏡観察結果を示す図である。
【図３】共焦点レーザー顕微鏡観察結果を示す図である。
【図４】（ａ）は、各フラクションにおけるＤＮＡ含量の測定結果を示す図であり、（ｂ）は、各フラクションにおけるローダミン含量の測定結果を示す図である。
【図５】（ａ）は、本発明の２枚膜リポソームの電子顕微鏡観察結果を示す図であり、（ｂ）は、本発明の２枚膜リポソームの模式図である。
【図６】ＣＴＬ活性の測定結果を示す図である。
【図７】ルシフェラーゼ遺伝子発現活性（ＲＬＵ／ｍｇタンパク質）の測定結果を示す図である。
【図８】共焦点レーザー顕微鏡観察結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】  以下、本発明について詳細に説明する。
本発明のリポソームは、外側から順に第１の脂質膜及び第２の脂質膜を有する２枚膜リポソームである。
本発明のリポソームのサイズは特に限定されるものではないが、通常は直径５０〜５００ｎｍ、好ましくは直径１００〜３００ｎｍ、さらに好ましくは直径１００〜２００ｎｍである。【００１２】  本発明のリポソームにおいて、第１及び第２の脂質膜はそれぞれ脂質二重層構造を有する。第１及び第２の脂質膜の構成成分は、脂質二重層構造の形成を阻害しない限り特に限定されるものではなく、例えば、脂質、膜安定化剤、抗酸化剤、荷電物質、膜タンパク質等が挙げられる。【００１３】  脂質は脂質膜の必須の構成成分であり、各脂質膜に含有される脂質量は、各脂質膜に含有される総物質量の通常３０〜１００％（モル比）、好ましくは５０〜１００％（モル比）、さらに好ましくは７０〜１００％（モル比）である。【００１４】  脂質としては、例えば、リン脂質、糖脂質、ステロール、飽和又は不飽和の脂肪酸等が挙げられる。【００１５】  リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン（例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン等）、ホスファチジルグリセロール（例えば、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジグリセロール等）、ホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジエタノールアミン等）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、これらの水素添加物等が挙げられる。【００１６】  糖脂質としては、例えば、グリセロ糖脂質（例えば、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド）、スフィンゴ糖脂質（例えば、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシド）等が挙げられる。【００１７】  ステロールとしては、例えば、動物由来のステロール（例えば、コレステロール、コレステロールコハク酸、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール）、植物由来のステロール（フィトステロール）（例えば、スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール）、微生物由来のステロール（例えば、チモステロール、エルゴステロール）等が挙げられる。【００１８】  飽和又は不飽和の脂肪酸としては、例えば、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸等の炭素数１２〜２０の飽和又は不飽和の脂肪酸が挙げられる。【００１９】  脂質は、中性脂質、カチオン性脂質（塩基性脂質）及びアニオン性脂質（酸性脂質）に分類され、中性脂質としては、例えば、ジアシルホスファチジルコリン��ジアシルホスファチジルエタノールアミン、コレステロール、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、セレブロシド等が挙げられ、カチオン性脂質としては、例えば、ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド（ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ：ＤＯＤＡＣ）、Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（Ｎ−（２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ：ＤＯＴＭＡ）、ジドデシルアンモニウムブロミド（ｄｉｄｏｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ：ＤＤＡＢ）、１，２−ジオレオイルオキシ−３−トリメチルアンモニオプロパン（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ  ｐｒｏｐａｎｅ：ＤＯＴＡＰ）、３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’，−ジメチル−アミノエタン）−カルバモルコレステロール（３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’，−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅ）−ｃａｒｂａｍｏｌ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ：ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、１，２−ジミリストイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロオキシエチルアンモニウム（１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ：ＤＭＲＩＥ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミネカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミウムトリフルオロアセテート（２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ−Ｎ−［２（ｓｐｅｒｍｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｅｔｈｙｌ］−Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｒｏｐａｎａｍｉｎｕｍ  ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ：ＤＯＳＰＡ）等が挙げられ、アニオン性脂質としては、例えば、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン（Ｎ−スクシニルＰＥ）、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエチレングリコール、コレステロールコハク酸等が挙げられる。【００２０】  膜安定化剤は、脂質膜を物理的又は化学的に安定させたり、脂質膜の流動性を調節したりするために含有させることができる、脂質膜の任意の構成成分であり、各脂質膜に含有される膜安定化剤量は、各脂質膜に含有される総物質量の通常１０〜５０％（モル比）、好ましくは２０〜５０％（モル比）、さらに好ましくは３０〜５０％（モル比）である。【００２１】  膜安定化剤としては、例えば、ステロール、グリセリン又はその脂肪酸エステル等が挙げられる。ステロールとしては、上記と同様の具体例が挙げられ、グリセリンの脂肪酸エステルとしては、例えば、トリオレイン、トリオクタノイン等が挙げられる。【００２２】  抗酸化剤は、脂質膜の酸化を防止するために含有させることができる、脂質膜の任意の構成成分であり、各脂質膜に含有される抗酸化剤量は、各脂質膜に含有される総物質量の通常５〜３０％（モル比）、好ましくは１０〜３０％（モル比）、さらに好ましくは２０〜３０％（モル比）である。【００２３】  抗酸化剤としては、例えば、トコフェロール、没食子酸プロ��ル、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシトルエン等が挙げられる。【００２４】  荷電物質は、脂質膜に正荷電又は負荷電を付与するために含有させることができる、脂質膜の任意の構成成分であり、各脂質膜に含有される荷電物質量は、各脂質膜に含有される総物質量の通常５〜３０％（モル比）、好ましくは１０〜２０％（モル比）、さらに好ましくは１０〜１５％（モル比）である。【００２５】  正荷電を付与する荷電物質としては、例えば、ステアリルアミン、オレイルアミン等の飽和又は不飽和脂肪族アミン；ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン等の飽和又は不飽和カチオン性合成脂質等が挙げられ、負電荷を付与する荷電物質としては、例えば、ジセチルホスフェート、コレステリルヘミスクシネート、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸等が挙げられる。【００２６】  膜タンパク質は、脂質膜の構造を維持したり、脂質膜に機能性を付与したりするために含有させることができる、脂質膜の任意の構成成分であり、各脂質膜に含有される膜タンパク質量は、各脂質膜に含有される総物質量の通常０．１〜２％（モル比）、好ましくは０．５〜２％（モル比）、さらに好ましくは１〜２％（モル比）である。【００２７】  膜タンパク質としては、例えば、膜表在性タンパク質、膜内在性タンパク質等が挙げられる。【００２８】  本発明のリポソームにおいて、第１の脂質膜は膜融合能を有する。【００２９】  第１の脂質膜が膜融合可能な脂質膜は、脂質二重層構造を有する限り特に限定されるものではない。第１の脂質膜が膜融合可能な脂質膜としては、例えば、細胞膜、エンドソーム膜等の生体膜が挙げられる。【００３０】  第１の脂質膜に膜融合能を付与する方法は特に限定されるものではない。
例えば、第１の脂質膜に、その構成成分として膜融合性脂質を含有させることにより、第１の脂質膜に膜融合能を付与することができる。膜融合性脂質としては、例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン等の中性脂質；コレステロールコハク酸、カルジオリピン等のアニオン性脂質（酸性脂質）；ジアルキルアンモニウムブロミド等のカチオン性脂質（塩基性脂質）が挙げられる。【００３１】  中性脂質が膜融合能を発揮できるｐＨは、通常６．０〜７．５、好ましくは６．０〜７．０であり、アニオン性脂質が膜融合能を発揮できるｐＨは、通常５．０〜６．５、好ましくは５．５〜６．０であり、カチオン性脂質が膜融合能を発揮できるｐＨは、通常７．５〜８．５、好ましくは８．０〜８．５である。酸性環境下に置かれると膜融合能を発揮できるアニオン性脂質及びアルカリ性環境下に置かれると膜融合能を発揮できるカチオン性脂質は、ｐＨ感受性脂質とも呼ばれる。【００３２】  第１の脂質膜に含有される膜融合性脂質量は、第１の脂質膜に膜融合能を付与できる限り特に限定されるものではない。第１の脂質膜に含有される膜融合性脂質量は、第１の脂質膜に含有される総脂質量の通常５０〜１００％（モル比）、好ましくは６０〜１００％（モル比）、さらに好ましくは７０〜１００％（モル比）である。第１の脂質膜に含有される膜融合性脂質量が上記範囲にあると、第１の脂質膜は細胞膜、エンドソーム膜等の生体膜と効率よく膜融合することができるので、本発明のリポソームを細胞内に効率よく導入することができる。【００３３】  第１の脂質膜に含有される膜融合性脂質のうち、アニオン性脂質の割合が５〜５０％（モル比）であることが好ましく、１０〜３０％（モル比）であることがさらに好ましい。アニオン性脂質の割合が上記範囲にあると、本発明のリポソームが酸性環境下に置かれたときに、第１の脂質膜が細胞膜、エンドソーム膜等の生体膜と効率よく膜融合することができる。第１の脂質膜に含有されるアニオン性脂質以外の膜融合性脂質は、中性脂質及びカチオン性脂質のうちのいずれか一方であってもよいし両方であってもよい。【００３４】  また、第１の脂質膜表面を膜融合性分子で修飾することにより、第１の脂質膜に膜融合能を付与することができる。第１の脂質膜表面を修飾する膜融合性分子としては、例えば、スクシニル化ポリグリシドール、膜融合性ペプチド（例えば、Ｈ２ペプチド、ＧＭ２２５．１）等が挙げられる。【００３５】  第１の脂質膜には、その構成成分として、血中滞留性機能、温度変化感受性機能等を有する脂質又は脂質誘導体を含有させてもよい。これにより、上記機能のうち１種又は２種以上の機能を本発明のリポソームに付与することができる。本発明のリポソームに血中滞留性機能を付与することにより、本発明のリポソームの血液中での滞留性を向上させ、肝臓、脾臓等の細網内皮系組織による捕捉率を低下させることができる。また、本発明のリポソームに温度変化感受性機能を付与することにより、本発明のリポソームに封入された目的物質の放出性を高めることができる。【００３６】  血中滞留性機能を付与することができる血中滞留性脂質又は脂質誘導体としては、例えば、グリコフォリン、ガングリオシドＧＭ１、ホスファチジルイノシトール、ガングリオシドＧＭ３、グルクロン酸誘導体、グルタミン酸誘導体、ポリグリセリンリン脂質誘導体、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００｝−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−５０００｝−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−７５０｝−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００｝−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−５０００｝−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン等のポリエチレングリコール誘導体等が挙げられ、温度変化感受性機能を付与することができる温度変化感受性脂質又は脂質誘導体としては、例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン等が挙げられる。【００３７】  本発明のリポソームにおいて、第２の脂質膜は、その表面に核移行性ペプチドを有する。【００３８】  核移行性ペプチドは、細胞質から核内への移行能を有する限り特に限定されるものではなく、例えば、核移行シグナルを有するペプチド等が挙げられる。核移行シグナルは、核内に選択的に輸送されるタンパク質又はペプチドが有する特異的なアミノ酸配列であり、例えば、シミアンウイルス４０由来核移行シグナル（ＳＶ４０−ＮＬＳ）（配列番号２）、アデノウイルス由来コアペプチドｍｕ（配列番号３）、シミアンウイルス４０のラージＴ（Ｌａｒｇｅ  Ｔ）抗原由来核移行シグナル（配列番号４）、これらの繰り返し配列（例えば、配列番号１（シミアンウイルス４０のラージＴ抗原由来核移行シグナルの繰り返し配列））等が挙げられる。核移行性ペプチドは、核移行シグナルを有する天然型のペプチドであってもよいし、核移行シグナルを融合させた変異型のペプチドであってもよい。核移行性ペプチドを構成するアミノ酸残基の総数は特に限定されるものではないが、通常５〜３０個、好ましくは５〜２５個、さらに好ましくは５〜２０個である。【００３９】  第２の脂質膜表面に存在する核移行性ペプチド量は特に限定されるものではないが、第２の脂質膜に含有される総物質量の通常１〜５％（モル比）、好ましくは１〜３％（モル比）、さらに好ましくは１〜２％（モル比）である。第２の脂質膜表面に存在する核移行性ペプチド量が上記範囲にあると、本発明のリポソームに封入された目的物質を効率よく核内に送達することができる。【００４０】  核移行性ペプチドは第２の脂質膜の外表面に存在する限り、第２の脂質膜の内表面に存在していてもよい。なお、第２の脂質膜の表面のうち、第１の脂質膜側の表面が外表面であり、それと反対側の表面が内表面である。また、核移行性ペプチドは第１の脂質膜の外表面及び／又は内表面に存在していてもよい。【００４１】  第２の脂質膜表面における核移行性ペプチドの存在態様としては、例えば、核移行性ペプチドが脂質膜の構成成分となり得る官能基又は化合物（例えば、疎水性基、疎水性化合物等）で修飾されており、当該官能基又は化合物が第２の脂質膜内に挿入され、核移行性ペプチドが第２の脂質膜から露出した態様が挙げられる。この態様において、核移行性ペプチドが細胞質から核内への移行能を発揮できる限り、核移行性ペプチドの全体が第２の脂質膜から露出していてもよいし、核移行性ペプチドの一部が第２の脂質膜から露出していてもよい。【００４２】  核移行性ペプチドを修飾する、脂質膜の構成成分となり得る官能基又は化合物は特に限定されるものではなく、例えば、ステアリル基等の飽和又は不飽和の脂肪酸基；コレステロール基又はその誘導体；リン脂質、糖脂質又はステロール；長鎖脂肪族アルコール（例えば、ホスファチジルエタノールアミン、コレステロール等）；ポリオキシプロピレンアルキル；グリセリン脂肪酸エステル等が挙げられるが、これらのうち特に、炭素数１０〜２０の脂肪酸基（例えば、パルミトイル基、オレイル基、ステアリル基、アラキドイル基等）が好ましい。【００４３】  本発明のリポソームの作製方法は特に限定されるものではないが、例えば、脂質膜の構成成分として膜融合性脂質を含有し、脂質膜の表面に核移行性ペプチドを有する複数の負帯電性ＳＵＶ型リポソームを正帯電性粒子に接触させ、正帯電性粒子に静電的に結合した負帯電性ＳＵＶ型リポソーム同士を膜融合させることにより、本発明のリポソームを作製することができる。また、脂質膜の構成成分として膜融合性脂質を含有し、脂質膜の表面に核移行性ペプチドを有する複数の正帯電性ＳＵＶ型リポソームを負帯電性粒子に接触させ、負帯電性粒子に静電的に結合した正帯電性ＳＵＶ型リポソーム同士を膜融合させることにより、本発明のリポソームを作製することができる。【００４４】  正帯電性粒子のゼータ電位は正である限り特に限定されるものではないが、通常１０〜６０ｍＶ、好ましくは２０〜５０ｍＶ、さらに好ましくは２０〜４０ｍＶである。負帯電性粒子のゼータ電位は負である限り特に限定されるものではないが、通常−１０〜−６０ｍＶ、好ましくは−２０〜−５０ｍＶ、さらに好ましくは−２０〜−４０ｍＶである。正帯電性粒子及び負帯電性粒子のゼータ電位が上記範囲にあると、本発明のリポソームを効率よく作製することができる。なお、ゼータ電位の測定条件は特に限定されるものはないが、温度条件は通常２５℃である。【００４５】  正帯電性粒子及び負帯電性粒子の粒径は特に限定されるものではないが、粒径の下限値は、好ましくは５０ｎｍ、さらに好ましくは７０ｎｍであり、粒径の上限値は、好ましくは５００ｎｍ、さらに好ましくは２００ｎｍである。正帯電性粒子及び負帯電性粒子の粒径が上記範囲にあると、本発明のリポソームを効率よく作製することができる。【００４６】  正帯電性粒子は、全体として正に帯電する限り、カチオン性物質に加え、中性物質及び／又はアニオン性物質を含んでいてもよい。負帯電性粒子は、全体として負に帯電する限り、アニオン性物質に加え、中性物質及び／又はカチオン性物質を含んでいてもよい。【００４７】  正帯電性又は負帯電性粒子としては、例えば、標的細胞の核内に送達すべき目的物質の凝集体を使用することができる。正帯電性又は負帯電性粒子として目的物質の凝集体を使用すれば、第２の脂質膜の内側に目的物質が封入された２枚膜リポソームを作製することができる。目的物質の凝集体は、目的物質のみから構成されていてもよいし、目的物質以外の物質（例えば、目的物質を保持する担体）を含んでいてもよい。【００４８】  目的物質が正に帯電している場合、例えば、目的物質とアニオン性物質とを静電的に結合させて複合体化することにより、目的物質の凝集体を調製することができる。目的物質が負に帯電している場合、例えば、目的物質とカチオン性物質とを静電的に結合させて複合体化することにより、目的物質の凝集体を調製することができる。目的物質が負及び正のいずれにも帯電していない場合、目的物質とカチオン性物質とを適当な様式（例えば、物理的吸着、疎水結合、化学結合等）で結合させて複合体化することにより、目的物質の凝集体を調製することができる。複合体化の際、目的物質とカチオン性物質又はアニオン性物質との混合比率を調整することにより、全体として正又は負に帯電する目的物質の凝集体を調製することができる。【００４９】  目的物質は特に限定されるものではなく、例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、薬物、糖、これらの複合体等が挙げられる。なお、「核酸」には、ＤＮＡ又はＲＮＡに加え、これらの類似体又は誘導体（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡ等）が含まれる。また、核酸は一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよいし、線状又は環状のいずれであってもよい。【００５０】  目的物質が核酸である場合、核酸とカチオン性物質と静電的に結合させて複合体化することにより、核酸の凝集体を調製することができる。複合体化の際、核酸とカチオン性物質との混合比率を調整することにより、全体として正又は負に帯電する核酸の凝集体を調製することができる。【００５１】  目的物質の凝集体を調製する際に使用するカチオン性物質は、分子中にカチオン性基を有する物質である限り特に限定されるものではない。カチオン性物質としては、例えば、カチオン性脂質（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製））；カチオン性基を有する高分子；ポリリジン、ポリアルギニン、リジンとアルギニンの共重合体等の塩基性アミノ酸の単独重合体若しくは共重合体又はこれらの誘導体（例えばステアリル化誘導体）；ポリエチレンイミン、ポリ（アリルアミン）、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロライド）、グルコサミン等のポリカチオン性ポリマー；プロタミン又はその誘導体（例えば硫酸プロタミン）等が挙げられるが、この中でも特にプロタミン又はその誘導体が好ましい。プロタミン又はその誘導体を使用して調製した目的物質の凝集体は非常に柔らかな構造を有しているため、目的物質の凝集体は核膜孔を効率よく通過することができる。カチオン性物質が有するカチオン性基の数は特に限定されるものではないが、好ましくは２個以上である。カチオン性基は正に荷電し得る限り特に限定されるものではなく、例えば、アミノ基；メチルアミノ基、エチルアミノ基等のモノアルキルアミノ基；ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基等のジアルキルアミノ基；イミノ基；グアニジノ基等が挙げられる。【００５���】  目的物質の凝集体を調製する際に使用するアニオン性物質は、分子中にアニオン性基を有する物質である限り特に限定されるものではない。アニオン性物質としては、例えば、アニオン性脂質；アニオン性基を有する高分子；ポリアスパラギン酸等の酸性アミノ酸の単独重合体若しくは共重合体又はこれらの誘導体；キサンタンガム、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースポリスチレンスルホン酸塩、ポリサッカライド、カラギーナン等のポリアニオン性ポリマー等を使用することができる。アニオン性物質が有するアニオン性基の数は特に限定されるものではないが、好ましくは２個以上である。アニオン性基は負に荷電し得る限り特に限定されるものではなく、例えば、末端カルボキシル基を有する官能基（例えば、コハク酸残基、マロン酸残基等）、リン酸基、硫酸基等が挙げられる。【００５３】  ＳＵＶ（ｓｍａｌｌ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）型リポソームは、粒径（直径）が１００ｎｍ以下である１枚膜リポソームである。ＳＵＶ型リポソームの粒径（直径）は１００ｎｍ以下である限り特に限定されるものではないが、通常３０〜１００ｎｍ、好ましくは３０〜８０ｎｍ、さらに好ましくは３０〜６０ｎｍである。【００５４】  多重膜リポソーム（ＭＬＶ）、ＳＵＶ以外の１枚膜リポソーム（例えばＬＵＶ（ｌａｒｇｅ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）、ＧＵＶ（ｇｉａｎｔ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）等）は、粒子径が１００ｎｍ以上であるため（一般的に１００ｎｍ以上の粒子径を有する脂質膜は平面膜として考えられる）、脂質膜の曲率及び表面エネルギーが小さく、リポソーム同士の凝集が生じ難い。これに対して、ＳＵＶ型リポソームは、粒子径が１００ｎｍ未満であるため、脂質膜の曲率及び表面エネルギーが大きく、リポソーム同士の凝集が生じ易い。したがって、脂質膜の構成成分として膜融合性脂質を含有するＳＵＶ型リポソーム同士は効率よく膜融合することができる。【００５５】  脂質膜の構成成分として膜融合性脂質を含有し、脂質膜の表面に核移行性ペプチドを有するＳＵＶ型リポソームは、例えば、次のようにして作製することができる。脂質膜の構成成分（膜融合性脂質を含む）と、脂質膜の構成成分となり得る官能基又は化合物で修飾された核移行性ペプチドとを有機溶剤に溶解した後、有機溶剤を蒸発除去することにより脂質膜を得る。この際、有機溶剤としては、例えば、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン等の炭化水素類；塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；メタノール、エタノール等の低級アルコール類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；アセトン等のケトン類等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。次いで、脂質膜を水和させ、攪拌又は超音波槽を用いた超音波処理により多重膜リポソームを作製する。次いで、多重膜リポソームをさらにプローブ型超音波装置によって超音波処理し、小さい１枚膜リポソームであるＳＵＶ型リポソームを調製する。こうして、脂質膜の構成成分となり得る官能基又は化合物が脂質膜内に挿入され、核移行性ペプチドが脂質膜表面��ら露出したＳＵＶ型リポソームを作製することができる。【００５６】  また、脂質膜の表面に核移行性ペプチドを有しないＳＵＶ型リポソームを作製した後、その外液に、脂質膜の構成成分となり得る官能基又は化合物で修飾された核移行性ペプチドを添加することにより、脂質膜の構成成分となり得る官能基又は化合物が脂質膜内に挿入され、核移行性ペプチドが脂質膜表面から露出したＳＵＶ型リポソームを作製することができる。【００５７】  正帯電性ＳＵＶ型リポソームの脂質膜構成成分の種類及び量は、ＳＵＶ型リポソームが全体として正に帯電するように調節され、負帯電性ＳＵＶ型リポソームの脂質膜構成成分の種類及び量は、ＳＵＶ型リポソームが全体として負に帯電するように調節される。正の電荷を付与する脂質膜構成成分としては、例えば、カチオン性脂質、カチオン性膜安定化剤等が挙げられ、負の電荷を付与する脂質膜構成成分としては、アニオン性脂質、アニオン性膜安定化剤等が挙げられる。正帯電性ＳＵＶ型リポソームは、全体として正に帯電する限り、正の電荷を付与する脂質膜構成成分に加え、負の電荷を付与する脂質膜構成成分及び／又は中性の脂質膜構成成分を含んでいてもよく、負帯電性ＳＵＶ型リポソームは、全体として負に帯電する限り、負の電荷を付与する脂質膜構成成分に加え、正の電荷を付与する脂質膜構成成分及び／又は中性の脂質膜構成成分を含んでいてもよい。正帯電性ＳＵＶ型リポソームが正の電荷を付与する脂質膜構成成分としてカチオン性脂質を含む場合、カチオン性脂質の含有量は総脂質量の通常５〜３０％（モル比）、好ましくは１０〜２５％（モル比）、さらに好ましくは１０〜２０％（モル比）である。負帯電性ＳＵＶ型リポソームが負の電荷を付与する脂質膜構成成分としてアニオン性脂質を含む場合、アニオン性脂質の含有量は総脂質量の通常５〜３０％（モル比）、好ましくは１０〜２５％（モル比）、さらに好ましくは１０〜２０％（モル比）である。【００５８】  ＳＵＶ型リポソームにおいて脂質膜に含有される膜融合性脂質の種類及び量は、本発明のリポソームにおいて第２の脂質膜に含有される膜融合性脂質の種類及び量と同様である。ＳＵＶ型リポソームにおいて脂質膜表面に存在する核移行シグナルの種類及び量は、本発明のリポソームにおいて第２の脂質膜表面に存在する核移行シグナルの種類及び量と同様である。【００５９】  正帯電性ＳＵＶ型リポソームのゼータ電位は正である限り特に限定されるものではないが、通常１０〜６０ｍＶ、好ましくは２０〜５０ｍＶ、さらに好ましくは２０〜３０ｍＶであり、負帯電性ＳＵＶ型リポソームのゼータ電位は負である限り特に限定されるものではないが、通常−１０〜−６０ｍＶ、好ましくは−２０〜−５０ｍＶ、さらに好ましくは−２０〜−３０ｍＶである。正帯電性ＳＵＶ型リポソーム及び負帯電性ＳＵＶ型リポソームのゼータ電位が上記範囲にあると、本発明のリポソームを効率よく作製することができる。なお、ゼータ電位の測定条件は特に限定されるものはないが、温度条件は通常２５℃である。【００６０】  正帯電性又は負帯電性粒子にそれぞれ負帯電性又は正帯電性ＳＵＶ型リポソームを接触させる条件は特に限定されるものではないが、温度は通常１０〜���０℃、好ましくは２０〜３０℃であり、ｐＨは通常６．５〜８．０、好ましくは７．０〜７．５であり、時間は通常１〜２０分間、好ましくは５〜１０分間である。接触させる際に用いる溶媒は特に限定されるものではないが、例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液、生理食塩水、ショ糖溶液等を用いることができる。溶媒中に分散させる負帯電性又は正帯電性ＳＵＶ型リポソームの量は、通常、正帯電性又は負帯電性粒子に対して過剰量であり、例えば、正帯電性又は負帯電性粒子の封入に理論上最低限必要な負帯電性又は正帯電性ＳＵＶ型リポソーム量の２〜４倍量である。【００６１】  正帯電性粒子に負帯電性ＳＵＶ型リポソームを接触させると、負帯電性ＳＵＶ型リポソームが正帯電性粒子に静電的に結合し、正帯電性粒子に静電的に結合した負帯電性ＳＵＶ型リポソーム同士が膜融合し、正帯電性粒子が２枚の脂質膜で被覆される。また、負帯電性粒子に正帯電性ＳＵＶ型リポソームを接触させると、正帯電性ＳＵＶ型リポソームが負帯電性粒子に静電的に結合し、負帯電性粒子に静電的に結合した正帯電性ＳＵＶ型リポソーム同士が膜融合し、負帯電性粒子が２枚の脂質膜で被覆される。これにより、正帯電性又は負帯電性粒子の外側には、正帯電性又は負帯電性粒子を被覆する２枚の脂質膜が形成され、本発明のリポソームが作製される。こうして作製された本発明のリポソームにおいて、第１及び第２の脂質膜は、その構成成分として膜融合性脂質を含有し、その表面に核移行シグナルを有する。正帯電性又は負帯電性粒子として目的物質の凝集体を使用した場合、目的物質の凝集体が第２の脂質膜の内側に封入された２枚膜リポソームが作製される。【００６２】  負帯電性ＳＵＶ型リポソームの脂質膜に含有される膜融合性脂質のうち、中性脂質の割合が５０％（モル比）以上、好ましくは７０％（モル比）以上であると、正帯電性粒子に負帯電性ＳＵＶ型リポソームを接触させた後、正帯電性粒子に静電的に結合した負帯電性ＳＵＶ型リポソーム同士の膜融合を迅速かつ効率よく誘起させることができる。正帯電性ＳＵＶ型リポソームについても同様である。【００６３】  第２の脂質膜の内側に目的物質が封入された２枚膜リポソームは、目的物質を標的細胞の核内に送達するためのベクターとして使用することができる。
標的細胞は、分裂性細胞及び非分裂性細胞のいずれであってもよいが、第２の脂質膜の内側に目的物質が封入された２枚膜リポソームは、標的細胞が非分裂性細胞である場合に特に有用である。分裂性細胞としては、例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ７細胞等が挙げられ、非分裂性細胞としては、例えば、樹状細胞、脳神経細胞等が挙げられる。【００６４】  本発明のリポソームは、エンドサイトーシスを介して標的細胞内に移行することができる。エンドサイトーシスを介して標的細胞内に移行した本発明のリポソームは、エンドソーム内に取り込まれるが、エンドソーム膜と第１の脂質膜とが膜融合することにより、エンドソームから脱出することができる。第１の脂質膜に含有される膜融合性脂質のうち、アニオン性脂質の割合が５〜５０％（モル比）である場合、エンドソーム内が酸性（ｐＨ５．５〜６．５）に変化することにより、第１の脂質膜とエンドソーム膜とは効率よく膜融合することができる。エンドソームから脱出したリポソームにおいて、第１の脂質膜は消失しているが、第２の脂質膜は保持されている。エンドソームから脱出したリポソームが第２の脂質膜表面に有する核移行性ペプチドは、インポーチンα，βとともに核膜孔ターゲッティング複合体を形成し、核内に運搬される。この際、第２の脂質膜が壊れて、第２の脂質膜の内側に封入されていた目的物質は放出され、核内に送達される。第２の脂質膜の内側に目的物質の凝集体が封入されている場合、目的物質の核内送達効率は向上する。プロタミン又はその誘導体を使用して調製された目的物質の凝集体が封入されている場合、目的物質の凝集体は核膜孔を効率よく通過することができるので、目的物質の核内送達効率は特に向上する。【００６５】  また、本発明のリポソームは、第１の脂質膜と細胞膜との膜融合を介して標的細胞内に移行することができる。第１の脂質膜に含有される膜融合性脂質のうち、アニオン性脂質の割合が５〜５０％（モル比）である場合、酸性条件下で本発明のリポソームと標的細胞とを接触させることにより、第１の脂質膜と細胞膜とは効率よく膜融合することができる。標的細胞内に移行したリポソームにおいて、第１の脂質膜は消失しているが、第２の脂質膜は保持されている。標的細胞内に移行したリポソームが第２の脂質膜表面に有する核移行性ペプチドは、インポーチンα，βとともに核膜孔ターゲッティング複合体を形成し、核内に運搬される。これに伴って、第２の脂質膜が壊れ、第２の脂質膜の内側に封入されていた目的物質は放出され、核内に送達される。第２の脂質膜の内側に目的物質の凝集体が封入されている場合、目的物質の核内送達効率は向上する。プロタミン又はその誘導体を使用して調製された目的物質の凝集体が封入されている場合、目的物質の凝集体は核膜孔を効率よく通過することができるので、目的物質の核内送達効率は特に向上する。【００６６】  目的物質を送達すべき細胞が由来する生物種は特に限定されるものではなく、動物、植物、微生物等のいずれであってもよいが、動物であることが好ましく、哺乳動物であることがさらに好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラ���ト、マウス、モルモット等が挙げられる。また、目的物質を送達すべき細胞の種類は特に限定されるものではなく、例えば、体細胞、生殖細胞、幹細胞又はこれらの培養細胞等が挙げられる。【００６７】  本発明のリポソームは、常法に従って製剤化し、医薬組成物として使用することができる。本発明のリポソームは、例えば、分散液の状態で使用することができる。分散溶媒としては、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝液，クエン緩衝液，酢酸緩衝液等の緩衝液を使用することができる。分散液には、例えば、糖類、多価アルコール、水溶性高分子、非イオン界面活性剤、抗酸化剤、ｐＨ調節剤、水和促進剤等の添加剤を添加して使用してもよい。【００６８】  本発明のリポソームは、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれにおいても使用することもできる。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて使用する場合、投与経路としては、例えば、静脈、腹腔内、皮下、経鼻等の非経口投与が挙げられ、投与量及び投与回数は、リポソームに封入された目的物質の種類や量等に応じて適宜調節することができる。
【実施例】
【００６９】〔実施例１〜２，比較例１〜１１〕
１．各種ベクターの調製
プラスミドＤＮＡとして、ルシフェラーゼ遺伝子発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｌｕｃを使用して、プラスミドＤＮＡを含有する各種ベクターを調製した。なお、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｌｕｃは、ＣＭＶプロモーター及びその下流に連結されたルシフェラーゼ遺伝子を含有する全長約７ｋｂｐのプラスミドＤＮＡであり、ｐＧＬ３プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）から制限酵素によって切り出したルシフェラーゼ遺伝子をプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に挿入することによって作製した。【００７０】（１）ベクター１（従来の１枚膜リポソーム）
硫酸プロタミン溶液０．１５ｍＬ（硫酸プロタミン濃度：０．１ｍｇ／ｍＬ，溶媒：１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４））に、プラスミドＤＮＡ溶液０．１ｍＬ（プラスミドＤＮＡ濃度：０．１ｍｇ／ｍＬ，溶媒：１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４））をボルテックス条件下で滴下し、硫酸プロタミンとプラスミドＤＮＡとを静電的に相互作用させ、プラスミドＤＮＡを凝縮化させた。凝集化プラスミドＤＮＡの粒子径は約１０６ｎｍであり、ゼータ電位は約３９ｍＶであった。なお、流体力学的直径は準弾性光散乱方法によって測定し、ゼータ電位は、電気泳動的光散乱分光測光器（ＥＬＳ−８０００）によって分析した（以下同様）。【００７１】  脂質混合物（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｏｌｅｏｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ  ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ：ＤＯＰＥ）：コレステロールコハク酸（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ  ｈｅｍｉｓｕｃｃｉｎａｔｅ：ＣＨＥＭＳ）＝９：２（モル比））をクロロホルムに溶解した後、クロロホルムを蒸発除去することにより脂質膜を得た。脂質膜（１３７．５ｎモル）に、凝縮化プラスミドＤＮＡ懸濁液０．２５ｍＬ（凝集化プラスミドＤＮＡ濃度：０．０４ｍｇ／ｍＬ，溶媒：１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４））を添加して水和することにより、脂質膜表面に凝縮化プラスミドを静電的に結合させた。次いで、穏やかな超音波で処理し、凝縮化プラスミドＤＮＡを脂質膜で被覆することにより、プラスミドＤＮＡが内部に封入された１枚膜リポソーム（以下「ベクター１」という）を調製した。【００７２】（２）ベクター２（従来のキャリアペプチド）
ステアリル化オクタアルギニン溶液０．０９ｍＬ（ステアリル化オクタアルギニン濃度：０．１ｍｇ／ｍＬ，溶媒：１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４））に、プラスミドＤＮＡ溶液０．１８ｍＬ（プラスミドＤＮＡ濃度：０．１ｍｇ／ｍＬ，溶媒：１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４））をボルテックス条件下で滴下し、ステアリル化オクタアルギニンとプラスミドＤＮＡとを静電的に相互作用させ、凝集化プラスミドＤＮＡ（以下「ベクター２」という）を調製した。【００７３】（３）ベクター３（従来の１枚膜リポソーム）
ステアリル化オクタアルギニン溶液０．０９ｍＬ（ステアリル化オクタアルギニン濃度：０．１ｍｇ／ｍＬ，溶媒：１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４））に、プラスミドＤＮＡ溶液０．１８ｍＬ（プラスミドＤＮＡ濃度：０．１ｍｇ／ｍＬ，溶媒：１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４））をボルテックス条件下で滴下し、ステアリル化オクタアルギニンとプラスミドＤＮＡとを静電的に相互作用させ、プラスミドＤＮＡを凝縮化させた。こうして調製した凝集化プラスミドＤＮＡを上記（１）と同様にして脂質膜で被覆することにより、プラスミドＤＮＡが内部に封入された１枚膜リポソーム（以下「ベクター３」という）を調製した。【００７４】（４）ベクター４（従来の１枚膜リポソーム）
脂質混合物（ＤＯＰＥ：コレステロール＝７：３（モル比））をクロロホルムに溶解した後、クロロホルムを蒸発除去することにより脂質膜を得た。こうして得た脂質膜を使用し、上記（１）と同様にして凝縮化プラスミドＤＮＡを脂質膜で被覆し、プラスミドＤＮＡ封入リポソームを調製した。プラスミドＤＮＡ封入リポソーム懸濁液に、ステアリル化核移行性ペプチド（Ｎ末端をステアリル化した核移行性ペプチド（配列番号１）溶液０．０５ｍＬ（ステアリル化核移行性ペプチド濃度：１ｍｇ／ｍＬ，溶媒：１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４））を添加し、室温で一定時間インキュベートすることにより、リポソーム表面にステアリル化オクタアルギニンを分配させた（ステアリル化オクタアルギニンの分配量：脂質量の２モル％）。このようにして、オクタアルギニンを表面に有し、プラスミドＤＮＡが内部に封入された１枚膜リポソーム（以下「ベクター４」という）を調製した。【００７５】（５）ベクター５（従来の１枚膜リポソーム）
ステアリル化核移行性ペプチド（Ｎ末端をステアリル化した核移行性ペプチド（配列番号１））溶液０．０９ｍＬ（ステアリル化核移行性ペプチド濃度：０．１ｍｇ／ｍＬ，溶媒：１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４））に、プラスミドＤＮＡ溶液０．１８ｍＬ（プラスミドＤＮＡ濃度：０．１ｍｇ／ｍＬ，溶媒：１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４））をボルテックス条件下で滴下し、ステアリル化核移行性ペプチドとプラスミドＤＮＡとを静電的に相互作用させ、凝集化プラスミドＤＮＡを調製した。こうして調製した凝集化プラスミドＤＮＡを上記（１）と同様にして脂質膜で被覆することにより、プラスミドＤＮＡが内部に封入された１枚膜リポソーム（以下「ベクター５」という）を調製した。【００７６】（６）ベクター６（従来の１枚膜リポソーム）
脂質混合物（ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ＝１：１（モル比））をクロロホルムに溶解した後、クロロホルムを蒸発除去することにより脂質膜を得た。脂質膜を１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で水和した後、超音波槽で超音波処理することにより、リポソームを調製した。リポソーム懸濁液（脂質量１３７．５ｎモル）に、プラスミドＤＮＡ溶液０．１２５ｍＬ（プラスミドＤＮＡ濃度：０．１ｍｇ／ｍＬ，溶媒：１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４））を添加することにより、プラスミドＤＮＡと複合体形成した１枚膜リポソーム（以下「ベクター６」という）を調製した。【００７７】（７）ベクター７（従来の１枚膜リポソーム）
脂質混合物（ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ＝９：２（モル比））をクロロホルムに溶解した後、クロロホルムを蒸発除去することにより脂質膜を得た。こうして得た脂質膜を使用し、上記（１）と同様にして凝縮化プラスミドＤＮＡを脂質膜で被覆し、プラスミドＤＮＡ封入リポソームを調製した。プラスミドＤＮＡ封入リポソーム懸濁液に、ステアリル化オクタアルギニン溶液０．１２ｍＬ（ステアリル化オクタアルギニン濃度：１ｍｇ／ｍＬ，溶媒：１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４））を添加し、室温で一定時間インキュベートすることにより、リポソーム表面にステアリル化オクタアルギニンを分配させた（ステアリル化オクタアルギニンの分配量：脂質量の５モル％）。このようにして、オクタアルギニンを表面に有し、プラスミドＤＮＡが内部に封入された１枚膜リポソーム（以下「ベクター７」という）を調製した。【００７８】（８）リポソーム８（本発明の２枚膜リポソーム）
脂質混合物（ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ＝９：２（モル比））に、ステアリル化核移行性ペプチド（Ｎ末端をステアリル化した核移行性ペプチド（配列番号１））を添加し（添加量：脂質量の２モル％）、クロロホルム０．２５ｍＬに溶解した後、溶解液をガラス試験管に収容した。窒素ガスの吹き付けにより溶媒を除去した後、デシケーター内に１時間収納して乾燥させた。得られた脂質膜（２７５ｎモル）を、予め２５℃まで温めておいたＨＥＰＥＳ緩衝液０．２５ｍＬを用いて水和させ、超音波槽で超音波処理することにより脂質膜を剥離した。さらにプローブ型超音波装置により１０分間超音波処理を行うことによって、脂質膜に膜融合性脂質を含有し、脂質膜表面に核移行性ペプチドを有するＳＵＶ型リポソームを調製した。こうして調製されたＳＵＶ型リポソームの粒径は約５８ｎｍであり、ゼータ電位は約−２ｍＶ（この測定値は不正確である可能性が高い。脂質膜表面に核移行性ペプチドを有しない場合、ＳＵＶ型リポソームのゼータ電位は約−４０ｍＶであることから、脂質膜表面に核移行性ペプチドを有する場合、ＳＵＶ型リポソームのゼータ電位は約−１０〜−２０ｍＶであると考えられる。）であった。【００７９】  上記（１）と同様にして調製した凝集化プラスミドＤＮＡ溶液０．２５ｍＬ（凝集化プラスミドＤＮＡ濃度：０．０４ｍｇ／ｍＬ，溶媒：１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４））に、ＳＵＶ型リポソーム溶液０．２５ｍＬ（ＳＵＶ型リポソーム濃度：１．１μモル／ｍＬ，溶媒：１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４））を添加し、室温（約２５℃）で１０分間放置した。この過程において、複数のＳＵＶ型リポソームが凝集化プラスミドＤＮＡに静電的に結合し、ＳＵＶ型リポソーム同士が膜融合し、凝集化プラスミドが脂質膜で被覆されることにより、凝集化プラスミドが内部に封入されたリポソームが調製される。こうして調製したプラスミドＤＮＡ封入リポソーム（以下「リポソーム８」という）の粒径は約１６０ｎｍであり、ゼータ電位は約４ｍＶであった。【００８０】（９）リポソーム９
脂質混合物にステアリル化核移行性ペプチドを添加しない点を除き、上記（８）と同様にしてプラスミドＤＮＡ封入リポソーム（以下「リポソーム９」という）を調製した。【００８１】２．樹状細胞へのトランスフェクション
Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスの骨髄前駆体細胞をＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）存在下で６〜７日間培養し、未成熟樹状細胞を誘導した。４８ウェルプレートに未成熟樹状細胞を２×１０５細胞／ウェルの密度で播き、０．８μｇＤＮＡ相当のベクターを添加し、無血清培地（ＲＰＭＩ１６４０培地）０．２ｍＬ又は弱酸性緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／２．５％グルコース（ｐＨ６．０）０．２ｍＬ中、３７℃で１時間培養した後、血清含有培地０．５ｍＬを添加し、さらに３７℃で２３時間培養した。培養後、細胞を回収して溶解し、細胞溶解液にルシフェラーゼ活性測定試薬（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を加え、ルシフェラーゼ活性をルミノメーター（ＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒＰＳＮ、ＡＴＴＯ）を用いて測定した。細胞溶解液中のタンパク質量はＢＣＡタンパク質定量キット（ＰＩＥＲＣＥ、ロックフォード（ＩＬ））を使用して測定した。【００８２】  実施例１では、ベクターとしてベクター８を使用し、培養には弱酸性緩衝液を使用した。実施例２では、ベクターとしてベクター８を使用し、培養には無血清培地を使用した。なお、実施例１では、コレステロールコハク酸が細胞膜と膜融合することにより、ベクター８が細胞内に導入され、実施例２では、エンドサイトーシスによりベクター８が細胞内に導入される。【００８３】  比較例１では、ベクターとしてベクター１を使用し、培養には弱酸性緩衝液を使用した。比較例２では、ベクターとしてベクター１を使用し、培養にはリポ多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：ＬＰＳ）を添加した弱酸性緩衝液を使用した。比較例３では、ベクターとしてベクター２を使用し、培養には無血清培地を使用した。比較例４では、ベクターとしてベクター３を使用し、培養には無血清培地を使用した。比較例５では、ベクターとしてベクター３を使用し、培養には弱酸性緩衝液を使用した。比較例６では、ベクターとしてベクター４を使用し、培養には無血清培地を使用した。比較例７では、ベクターとしてベクター５を使用し、培養には弱酸性緩衝液を使用した。比較例８では、ベクターとしてベクター６を使用し、培養には無血清培地を使用した。比較例９では、ベクターとしてベクター７を使用し、培養には無血清培地を使用した。比較例１０では、ベクターとしてベクター９を使用し、培養には弱酸性緩衝液を使用した。比較例１１では、ベクターとしてベクター９を使用し、培養には無血清培地を使用した。【００８４】  実施例１〜２及び比較例１〜１０におけるルシフェラーゼ遺伝子発現活性（ＲＬＵ／ｍｇタンパク質）の測定結果を図１に示す。図１に示すように、実施例１における遺伝子発現活性（すなわち、遺伝子の核内送達効率）は、比較例１〜１０における遺伝子発現活性よりも約１００倍以上高かった。なお、実施例２における遺伝子発現活性は、実施例１における遺伝子発現活性よりも低かったが、これは、リポソーム８のエンドサイトーシス効率が低いことが原因であると考えられる。したがって、リポソーム８の脂質膜表面を適当な機能性分子で修飾してエンドサイトーシス効率を向上させれば、遺伝子発現活性（すなわち、遺伝子の核内送達効率）を��上させることができると考えられる。【００８５】〔実施例３，比較例１２〕
ローダミン（赤色）標識化プラスミドＤＮＡを使用してベクターを調製し、核をＣＹＴＯ２４（緑色）で染色した未成熟樹状細胞にトランスフェクションし、３時間後に共焦点レーザー顕微鏡による観察を行った。
実施例３では、ベクター８を実施例１と同様にして未成熟樹状細胞にトランスフェクションした。比較例１２では、ベクター７を比較例９と同様にして未成熟樹状細胞にトランスフェクションした。【００８６】  実施例３における共焦点レーザー顕微鏡観察結果を図２及び図３に示す。図２に示すように、核内（緑色）にプラスミドＤＮＡ（赤色）が粒子として存在する細胞が確認された。また、図３に示すように、核内（緑色）にプラスミドＤＮＡ（赤色）が分散した細胞も確認された。一方、比較例１２では、細胞質内にプラスミドＤＮＡ（赤色）が存在する細胞は確認されたが、核内（緑色）にプラスミドＤＮＡ（赤色）が存在する細胞は確認されなかった。【００８７】〔実施例４〕
ＮＢＤ（４−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏ−２−ｏｘａ−１，３−ｄｉａｚｏｌｅ）標識化プラスミドＤＮＡを使用した点、ポリＬ−リジンを使用して凝集化プラスミドＤＮＡを調製した点、及び、ＳＵＶ型リポソームを調製する際、脂質膜の水和に使用するＨＥＰＥＳ緩衝液に水相マーカーとしてローダミンを添加した（すなわち、ローダミンを含有する内水相を保持するＳＵＶ型リポソームを調製した）点を除き、上記（８）と同様にしてリポソーム８を調製した。【００８８】  リポソーム懸濁液を不連続ショ糖密度勾配（０〜６０％）上に重層し、２０℃、１６０，０００ｇの条件で２時間、超遠心分離を行った。上部から１ｍＬずつ画分を回収した。各フラクションにおけるＤＮＡ含量をアガロースゲル電気泳動によって測定するとともに、各フラクションにおけるローダミンの蛍光強度を測定してローダミン含量（％）を算出した。【００８９】  各フラクションにおけるＤＮＡ含量の測定結果を図４（ａ）に示し、各フラクションにおけるローダミン含量の測定結果を図４（ｂ）に示す。
リポソーム８を含有するフラクションと考えられる、ＤＮＡ含量が多いフラクション６〜９には、ＤＮＡとともにローダミンが共存していた。このことから、凝集化プラスミドＤＮＡに静電的に結合したＳＵＶ型リポソーム同士が、ローダミンを含有する内水相を保持したまま融合することによりリポソーム８が調製され、リポソーム８の内部には、ローダミンを含有する内水相が保持する空間が存在することが示された。【００９０】  また、フラクション６〜９において、ＮＢＤとローダミンとの間の蛍光エネルギー移動は観察されなかった。このことから、リポソーム８において、ＮＢＤ標識化プラスミドＤＮＡとローダミンを含有する内水相とは接触していないこと、すなわち、リポソーム８において、ローダミンを含有する内水相が保持されている空間と、凝集化プラスミドＤＮＡが保持されている空間とは脂質膜を介して隔離されていることが示された。したがって、リポソーム８は、１枚膜リポソームではないと考えられる。仮に、リポソーム８が１枚膜リポソームであるとすれば、ローダミンを含有する内水相及び凝集化プラスミドＤＮＡは同一の空間に保持され、ＮＢＤとローダミンとの間に蛍光エネルギー移動が観察されるはずである。【００９１】  さらに、ベクター８を電子顕微鏡で観察した結果、図５（ａ）に示すように、コアとして存在する凝集化プラスミドＤＮＡを取り巻く２枚の脂質膜が観察された。【００９２】  以上の結果から、凝集化プラスミドＤＮＡに静電的に結合したＳＵＶ型リポソーム同士の膜融合により、凝集化プラスミドＤＮＡは２枚の脂質膜で被覆され、ローダミンを含有する内水相は、凝集化プラスミドＤＮＡの外側に新たに形成された２枚の脂質膜の間の空間に保持されることが示された（図５（ｂ）参照）。【００９３】〔実施例５〕
実施例１と同様にして、未成熟樹状細胞にベクター８を導入し、導入６時間後にリポ多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：ＬＰＳ）で１時間処理し、同系列マウスの皮下に投与した（投与量：１×１０５細胞）。同一のマウスに毎週投与を繰り返し、５週間後に細胞傷害（ＣＴＬ）活性を測定した。
また、比較例９と同様にして、未成熟樹状細胞にベクター７を導入し、上記と同様にしてＣＴＬ活性を測定した。【００９４】  ＣＴＬ活性の測定は次のようにして行った。免疫５週間後、Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスから脾臓を摘出し、脾細胞を採取した。採取した細胞の濃度を５×１０５細胞／ｍＬに調整して１２ｗｅｌｌプレートに播き、抗原タンパク質（ルシフェラーゼ）５０μｇ／ｍＬを添加し、４日間３７℃で培養し、脾細胞中に存在するＴ細胞を活性化した（エフェクター細胞）。予め抗原タンパク質（ルシフェラーゼ）を発現させたマウス由来Ｐ８１５細胞に放射性同位元素５１Ｃｒを取り込ませたものを標的細胞として、種々の比率でエフェクター細胞を添加し、エフェクター細胞による抗原特異的な標的細胞からの５１Ｃｒ漏出をカウントすることによって、特異的殺細胞活性（ＣＴＬ活性）を評価した。【００９５】  ＣＴＬ活性の測定結果を図６に示す。図６に示すように、ベクター８を導入した場合には、ベクター７を導入した場合よりも有意に高いＣＴＬ活性が誘導された。【００９６】〔実施例６〕
脂質混合物にＮＢＤ（４−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏ−２−ｏｘａ−１，３−ｄｉａｚｏｌｅ）（緑色）標識化ＤＯＰＥを添加した点（添加量：総脂質の０．４５％モル）、及びローダミン（赤色）標識化プラスミドＤＮＡを使用した点を除き、上記（８）と同様にしてリポソーム８を調製した。【００９７】  未成熟樹状細胞をエネルギー代謝阻害剤（Ａｎｔｉｍｙｃｉｎｅ  Ａ、ＮａＮ３及びＮａＦをそれぞれ最終濃度が１μｇ／ｍＬ、０．１％及び１０ｍＭになるように添加）存在下で３０分間インキュベートした後、エネルギー代謝阻害剤で処理した未成熟樹状細胞（核をヘキスト（青色）で染色）にベクター８をトランスフェクションし（実施例１参照）、共焦点レーザー顕微鏡による観察を行った。また、エネルギー代謝阻害剤で処理していない未成熟樹状細胞にも同様にベクター８をトランスフェクションし、共焦点レーザー顕微鏡による観察を行った。【００９８】  共焦点レーザー顕微鏡観察結果を図８に示す。なお、図８中、（ａ）はエネルギー代謝阻害剤で処理していない未成熟樹状細胞の結果を、（ｂ）はエネルギー代謝阻害剤で処理した未成熟樹状細胞の結果を示す。また、図８中、白枠は核の外縁を表し、白色矢印はプラスミドＤＮＡ（赤色）を表す。【００９９】  図８に示すように、エネルギー代謝阻害剤で処理していない未成熟樹状細胞においては、核内（青色）にプラスミドＤＮＡ（赤色）が存在していた。但し、核内（青色）に脂質（緑色）は存在しなかった。一方、エネルギー代謝阻害剤で処理した未成熟樹状細胞においては、核内（青色）にプラスミドＤＮＡ（赤色）も脂質（緑色）も存在しておらず、プラスミドＤＮＡ（赤色）及び脂質（緑色）は細胞質に存在していた。この結果から、ベクター８による遺伝子の核内送達は、エネルギーに依存した現象であること、すなわち、核膜に存在する核膜孔複合体を介した能動的な現象であることが示唆された。【０１００】〔参考例１〕
比較例９と同様にして、ベクター７を未成熟樹状細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞又はＨｅＬａ細胞にトランスフェクションし、ルシフェラーゼ遺伝子発現活性（ＲＬＵ／ｍｇタンパク質）を測定した。結果を図７に示す。図７に示すように、非分裂性細胞である樹状細胞における遺伝子発現活性（すなわち、遺伝子の核内送達効率）は、分裂性細胞であるＮＩＨ３Ｔ３細胞又はＨｅＬａ細胞における遺伝子発現活性（すなわち、遺伝子の核内送達効率）よりも著しく低かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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