【手続補正書】
【提出日】令和2年6月15日(2020.6.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のＲＮＡを含む試料における一本鎖標的ＲＮＡを検出する方法であって、
ａ）前記試料を、
（ｉ）標識された検出ＲＮＡ、
（ｉｉ）前記標識された検出ＲＮＡを切断するＣ２ｃ２タンパク質、及び
（ｉｉｉ）前記一本鎖標的ＲＮＡとハイブリダイズするＣ２ｃ２ガイドＲＮＡ
と接触させること、ならびに、
ｂ）前記標識された検出ＲＮＡの切断によって生じる検出可能なシグナルを測定すること、
を含み、
前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、前記Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡが前記一本鎖標的ＲＮＡとハイブリダイズする際の接触の１時間内に、４０分間内に、５分間内に、または１分間内に、前記試料中に存在するＲＮＡの少なくとも５０％を切断する、
方法。
【請求項２】
前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、配列番号２または配列番号６に記述されているアミノ酸配列と８０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、配列番号２に記述されているアミノ酸配列と９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、配列番号６に記述されているアミノ酸配列と９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記一本鎖標的ＲＮＡは、１０ｆＭ〜１ｎＭの範囲の前記試料中に存在する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記検出可能なシグナルを測定することの前に、前記試料を、２時間以下、１時間以下、３０分以下、２０分以下、１０分以下、５分以下、または１分以下接触させる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、２つの高等真核生物及び原核生物ヌクレオチド結合（ＨＥＰＮ）ドメインを有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記試料中に存在する前記一本鎖標的ＲＮＡの量を決定することを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記複数のＲＮＡは、配列において互いに異なる５〜１０7 のＲＮＡを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
検出可能なシグナルを測定することは、金ナノ粒子に基づく検出、蛍光偏光、コロイド相転移／分散、電気化学的検出、蛍光シグナル検出、及び半導体に基づく感知の１つ以上を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記標識された検出ＲＮＡは、蛍光−発光染料対、または消光剤／蛍光体対を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記標識された検出ＲＮＡは、非天然ヌクレオシド間結合、核酸模倣物、修飾された糖部分、修飾された核酸塩基、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸、及びシクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）の１つ以上を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記一本鎖標的ＲＮＡは、
ａ）ウイルスであって、任意で、ジカウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、肝炎Ｂウイルス、肝炎Ｃウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、単純ヘルペスウイルスＩＩ、パピローマウイルス、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、ヒト血清パルボ様ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、はしかウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、マウス白血病ウイルス、ｍｕｍｐｓウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ性脈絡髄膜炎ウイルス、いぼウイルス、ブルータングウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、シミアンウイルス４０、マウス乳癌ウイルス、デング熱ウイルス、風疹ウイルス、西ナイルウイルス、及び黄熱病ウイルスから選択されるウイルス、
ｂ）寄生生物、蠕虫、真菌、原虫、もしくは細菌、任意で、細菌は病原性細菌であり、任意で、病原性細菌は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、メチシリン耐性のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、肺炎球菌、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、ライム病スピロヘータ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、及びＢｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓから選択され、または
ｃ）ヒト細胞、動物細胞、植物細胞、癌細胞、感染細胞、もしくは病的な細胞
から由来する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記一本鎖標的ＲＮＡは、インフルエンザから由来する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
複数のＲＮＡを含む試料における少なくとも２つの異なる一本鎖標的ＲＮＡを検出する方法であって、
ａ）前記試料を、
（ｉ）少なくとも１つのＡを含む一本鎖ＲＮＡを切断する第１のＣ２ｃ２タンパク質、
（ｉｉ）少なくとも１つのＵを含む一本鎖ＲＮＡを切断する第２のＣ２ｃ２タンパク質、
（ｉｉｉ）第１の一本鎖標的ＲＮＡとハイブリダイズする第１のヌクレオチド配列及び前記第１のＣ２ｃ２タンパク質に結合する第２のヌクレオチド配列を含む第１のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡ、
（ｉｖ）第２の一本鎖標的ＲＮＡとハイブリダイズする第１のヌクレオチド配列及び前記第２のＣ２ｃ２タンパク質に結合する第２のヌクレオチド配列を含む第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡ、
（ｖ）少なくとも１つのＡを含む第１の標識された検出ＲＮＡ、及び
（ｖｉ）少なくとも１つのＵを含む第２の標識された検出ＲＮＡ
と接触させること、
前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、前記第２の一本鎖標的ＲＮＡとハイブリダイズする前記第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡによって活性化されず、
前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、前記第１の一本鎖標的ＲＮＡとハイブリダイズする前記第１のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡによって活性化されず、ならびに
ｂ）前記第１及び第２のＣ２ｃ２タンパク質によって媒介されるＲＮＡ切断によって生じる検出可能なシグナルを測定すること
を含み、
第１の検出可能なシグナルは、前記第１のＣ２ｃ２タンパク質の活性化及び前記第１の標識された検出ＲＮＡの切断の際に生じ、第２の検出可能なシグナルは、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質の活性化及び前記第２の標識された検出ＲＮＡの切断の際に生じ、前記第１の検出可能なシグナルの検出は、第１の一本鎖標的ＲＮＡの前記試料中の存在を示し、前記第２の検出可能なシグナルの検出は、第２の一本鎖標的ＲＮＡの前記試料中の存在を示す、方法。
【請求項１６】
前記第１の標識された検出ＲＮＡはウラシルを欠き、前記第２の標識された検出ＲＮＡはアデニンを欠いている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１及び第２のＣ２ｃ２タンパク質は、配列番号１〜６のいずれか１つに記述されているアミノ酸配列と８０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１または第２の一本鎖標的ＲＮＡは、１０ｆＭ〜１ｎＭの範囲の前記試料中に存在する、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記検出可能なシグナルを測定することの前に、前記試料を、２時間以下、１時間以下、３０分以下、２０分以下、１０分以下、５分以下、または１分以下接触させる、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、前記第１のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡが前記第１の一本鎖標的ＲＮＡとハイブリダイズする際の接触の１時間内に、４０分間内に、５分間内に、もしくは１分間内に、前記試料中に存在する前記第１の標識された検出ＲＮＡの少なくとも５０％を切断する、及び／または、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、前記第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡが前記第２の一本鎖標的ＲＮＡとハイブリダイズする際の接触の１時間内に、４０分間内に、５分間内に、もしくは１分間内に、前記試料中に存在する前記第２の標識された検出ＲＮＡの少なくとも５０％を切断する、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１のＣ２ｃ２タンパク質及び前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、２つの高等真核生物及び原核生物ヌクレオチド結合（ＨＥＰＮ）ドメインを有する、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記試料中に存在する前記第１の一本鎖標的ＲＮＡ及び／または前記第２の一本鎖標的ＲＮＡの量を決定することを含む、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記複数のＲＮＡは、配列において互いに異なる５〜１０7 のＲＮＡを含む、請求項１５〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
検出可能なシグナルを測定することは、金ナノ粒子に基づく検出、蛍光偏光、コロイド相転移／分散、電気化学的検出、蛍光シグナル検出、及び半導体に基づく感知の１つ以上を含む、請求項１５〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１の標識された検出ＲＮＡ及び／または前記第２の標識された検出ＲＮＡは、蛍光−発光染料対、または消光剤／蛍光体対を含む、請求項１５〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１の標識された検出ＲＮＡ及び／または前記第２の標識された検出ＲＮＡは、非天然ヌクレオシド間結合、核酸模倣物、修飾された糖部分、修飾された核酸塩基、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸、及びシクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）の１つ以上を含む、請求項１５〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１の一本鎖標的ＲＮＡ及び／または前記第２の一本鎖標的ＲＮＡは、
ａ）ウイルスであって、任意で、ジカウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、肝炎Ｂウイルス、肝炎Ｃウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、単純ヘルペスウイルスＩＩ、パピローマウイルス、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、ヒト血清パルボ様ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、はしかウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、マウス白血病ウイルス、ｍｕｍｐｓウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ性脈絡髄膜炎ウイルス、いぼウイルス、ブルータングウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、シミアンウイルス４０、マウス乳癌ウイルス、デング熱ウイルス、風疹ウイルス、西ナイルウイルス、及び黄熱病ウイルスから選択されるウイルス、
ｂ）寄生生物、蠕虫、真菌、原虫、もしくは細菌、任意で、細菌は病原性細菌であり、任意で、病原性細菌は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、メチシリン耐性のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、肺炎球菌、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、ライム病スピロヘータ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、及びＢｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓから選択され、または
ｃ）ヒト細胞、動物細胞、植物細胞、癌細胞、感染細胞、もしくは病的な細胞
から由来する、請求項１５〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１の一本鎖標的ＲＮＡ及び／または前記第２の一本鎖標的ＲＮＡは、インフルエンザから由来する、請求項１５〜２７のいずれか１項に記載の方法。