【手続補正書】
【提出日】令和2年6月15日(2020.6.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
1または複数のMYC含有ポリペプチドを含む生物活性ナノ粒子の集団を含む組成物であって、
a. 該生物活性ナノ粒子の平均直径が約80nm〜約150nmであり；
b. 該製剤のpHが少なくとも約pH6.0でありかつ約pH8以下であり；かつ
c. T細胞増殖に適した条件下で抗CD3活性化または抗CD28活性化T細胞をMYC含有ポリペプチドナノ粒子組成物と接触させることによって、該T細胞の活性化、生存、または増殖のうちの一つまたは複数が、該MYCポリペプチド含有組成物と接触していない抗CD3活性化または抗CD28活性化T細胞と比較して増大し、かつ
該MYC含有ポリペプチドが、MYCポリペプチドに連結されたタンパク質形質導入ドメインを含むMYC融合タンパク質を含む、
該組成物。
【請求項２】
前記ナノ粒子が、約90〜140nmの平均直径を有する、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
前記ナノ粒子が約100nm〜約110nmの平均直径を有する、請求項1に記載の組成物。
【請求項４】
前記ナノ粒子が、約104〜106ダルトンの分子量を有する、請求項1に記載の組成物。
【請求項５】
前記ナノ粒子が、約200個のMYC含有ポリペプチド分子を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項６】
前記MYCポリペプチドがアセチル化されている、請求項1に記載の組成物。
【請求項７】
前記MYC融合ペプチドが、前記タンパク質形質導入ドメインと前記MYCポリペプチドとを連結する1または複数のリンカーをさらに含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項８】
前記MYC含有ポリペプチドが、以下の一般構造：
タンパク質形質導入ドメイン−X−MYC配列
を有するMYC融合ペプチドを含み、
ここで、−X−が、該タンパク質形質導入ドメインと該MYC配列とを連結するリンカーである、請求項1に記載の組成物。
【請求項９】
前記タンパク質形質導入ドメイン配列がTATタンパク質形質導入ドメイン配列である、請求項1に記載の組成物。
【請求項１０】
前記TATタンパク質形質導入ドメイン配列が、TAT[48〜57]およびTAT[57〜48]からなる群より選択される、請求項9に記載の組成物。
【請求項１１】
前記MYCポリペプチドが、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:10を含むMYC融合ペプチドである、請求項1に記載の組成物。
【請求項１２】
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項１３】
局所投与、経口投与、非経口投与、鼻腔内投与、頬側投与、直腸投与、または経皮投与のために製剤化されている、請求項1に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
例示的な態様において、1種類または複数種類のMYC含有ポリペプチドを含む生物活性ナノ粒子の集団の調製のための方法が、本明細書中に提供され、該方法は、（a）変性したMYC含有ポリペプチドを提供するために、6〜8M尿素を含む緩衝可溶化溶液中でMYC含有ポリペプチドを変性させる工程；（b）第1のポリペプチド混合物を提供するために、約3M尿素と約500mM NaClとを含む第1のリフォールド緩衝液を用いて、変性したMYC含有ポリペプチドに対して第1のリフォールディング工程を少なくとも約120分間実施する工程；（c）第2のポリペプチド混合物を提供するために、約1.5M尿素と約500mM NaClとを含む第2のリフォールド緩衝液を用いる緩衝液交換によって、第1のポリペプチド混合物に対して第2のリフォールディング工程を少なくとも約120分間実施する工程；（d）約500mM NaClを含む第3のリフォールド緩衝液を用いる緩衝液交換によって、第2のポリペプチド混合物に対して第3のリフォールディング工程を少なくとも約120分間実施する工程；ならびに（f）約80nm〜約150nmの数平均直径を有する生物活性ナノ粒子を作製するために十分な時間、第3のリフォールド緩衝液中にMYC含有ポリペプチドを維持する工程を含み、T細胞増殖に適した条件下で抗CD3活性化または抗CD28活性化T細胞を生物活性ナノ粒子と接触させることによって、T細胞の活性化、生存、または増殖のうちの一つまたは複数が、生物活性ナノ粒子と接触していない抗CD3活性化または抗CD28活性化T細胞と比較して増大する。
[本発明1001]
1種類または複数種類のMYC含有ポリペプチドを含む生物活性ナノ粒子の集団を含む組成物であって、
a. 該生物活性ナノ粒子の平均直径が約80nm〜約150nmであり；
b. 該製剤のpHが少なくとも約pH6.0でありかつ約pH8以下であり；かつ
c. T細胞増殖に適した条件下で抗CD3活性化または抗CD28活性化T細胞をMYC含有ポリペプチドナノ粒子組成物と接触させることによって、該T細胞の活性化、生存、または増殖のうちの一つまたは複数が、該MYCポリペプチド含有組成物と接触していない抗CD3活性化または抗CD28活性化T細胞と比較して増大する、該組成物。
[本発明1002]
前記MYCポリペプチドがアセチル化されている、本発明1001の組成物。
[本発明1003]
前記MYC含有ポリペプチドが、MYCポリペプチドに連結されたタンパク質形質導入ドメインを含むMYC融合ペプチドを含む、本発明1001の組成物。
[本発明1004]
前記MYC融合ペプチドが、前記タンパク質形質導入ドメインと前記MYCポリペプチドとを連結する1種類または複数種類の分子をさらに含む、本発明1003の組成物。
[本発明1005]
前記MYC含有ポリペプチドが、以下の一般構造：
タンパク質形質導入ドメイン−X−MYC配列
を有するMYC融合ペプチドを含み、
ここで、−X−が、該タンパク質形質導入ドメインと該MYC配列とを連結する分子である、本発明1001の組成物。
[本発明1006]
前記タンパク質形質導入ドメイン配列がTATタンパク質形質導入ドメイン配列である、本発明1003または本発明1005の組成物。
[本発明1007]
前記TATタンパク質形質導入ドメイン配列が、TAT[48〜57]およびTAT[57〜48]からなる群より選択される、本発明1006の組成物。
[本発明1008]
前記MYCポリペプチドが、SEQ ID NO:1または10を含むMYC融合ペプチドである、本発明1001の組成物。
[本発明1009]
前記ナノ粒子が約100nm〜約110nmの平均直径を有する、本発明1001の組成物。
[本発明1010]
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、本発明1001〜1009のいずれかの組成物。
[本発明1011]
局所投与、経口投与、非経口投与、鼻腔内投与、頬側投与、直腸投与、または経皮投与のために製剤化されている、本発明1001〜1010のいずれかの組成物。
[本発明1012]
それを必要とする対象において、本発明1001の製剤の治療的に有効な量を投与することによって、1種類もしくは複数種類の免疫細胞の活性化、生存、もしくは増殖のうちの一つもしくは複数を増大させるか、または免疫応答を増大させる方法。
[本発明1013]
前記1種類または複数種類の免疫細胞が、1種類または複数種類のアネルギー性免疫細胞を含む、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記1種類または複数種類の免疫細胞がT細胞である、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記T細胞が、ナイーブT細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、メモリーT細胞、活性化T細胞、アネルギー性T細胞、寛容T細胞、キメラB細胞、および抗原特異的T細胞からなる群より選択される、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記1種類または複数種類の免疫細胞がB細胞である、本発明1015の方法。
[本発明1017]
前記B細胞が、ナイーブB細胞、形質B細胞、活性化B細胞、メモリーB細胞、アネルギー性B細胞、寛容B細胞、キメラB細胞、および抗原特異的B細胞からなる群より選択される、本発明1016の方法。
[本発明1018]
造血幹細胞の移植の前に1個または複数個の該造血幹細胞を本発明1001の組成物とインビトロで接触させる工程
を含む、造血幹細胞移植（HSCT）後の生着を増強するために造血幹細胞を予備刺激する方法。
[本発明1019]
1種または複数種のMYC含有ポリペプチドを含む生物活性ナノ粒子の集団の調製のための方法であって、
（a）可溶化されたMYC含有ポリペプチドを提供するために、ある濃度の変性剤を含む可溶化溶液中にMYC含有ポリペプチドを可溶化する工程；
（b）第1のポリペプチド混合物を提供するために、約0.35〜約0.65倍濃度の工程（a）の変性剤と約100mM〜約1Mのアルカリ金属塩および/またはアルカリ金属塩とを含む第1のリフォールド緩衝液を用いて、可溶化された該MYC含有ポリペプチドに対して第1のリフォールディング工程を少なくとも約30〜180分間実施する工程；
（c）第2のポリペプチド混合物を提供するために、約0.10〜約0.30倍濃度の工程（b）の変性剤と約100mM〜1Mのアルカリ金属塩および/またはアルカリ金属塩とを含む第2のリフォールド緩衝液を用いて、該第1のポリペプチド混合物に対して第2のリフォールディング工程を少なくとも約30〜180分間実施する工程；ならびに
（e）約100mM〜1Mのアルカリ金属塩および/またはアルカリ金属塩を含む第3のリフォールド緩衝液を用いて、該第2のポリペプチド混合物に対して第3のリフォールディング工程を少なくとも約30〜180分間実施する工程；
（f）約80nm〜約150nmの数平均直径を有する生物活性ナノ粒子を作製するために十分な時間、該第3のリフォールド緩衝液中に該MYC含有ポリペプチドを維持する工程
を含み、
T細胞増殖に適した条件下で抗CD3活性化または抗CD28活性化T細胞を該生物活性ナノ粒子と接触させることによって、該T細胞の活性化、生存、または増殖のうちの一つまたは複数が、該生物活性ナノ粒子と接触していない抗CD3活性化または抗CD28活性化T細胞と比較して増大する、該方法。
[本発明1020]
前記第1のリフォールディング工程、前記第2のリフォールディング工程、および/または前記第3のリフォールディング工程が、緩衝液交換によって該工程を実施することを含む、本発明1019の方法。
[本発明1021]
タンジェンシャルフロー濾過を使用して緩衝液交換を実施する、本発明1020の方法。
[本発明1022]
前記アルカリ金属塩が、ナトリウム塩、リチウム塩、およびカリウム塩のうちの1種類または複数種類を含む、本発明1019〜1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
前記アルカリ金属塩が、塩化ナトリウム（NaCl）、臭化ナトリウム、硫酸水素ナトリウム、硫酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、塩化リチウム、臭化リチウム、硫酸水素リチウム、硫酸リチウム、炭酸水素リチウム、炭酸リチウム、塩化カリウム、臭化カリウム、硫酸水素カリウム、硫酸カリウム、炭酸水素カリウム、および炭酸カリウムのうちの1種類または複数種類を含む、本発明1019〜1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記アルカリ塩が、マグネシウム塩およびカルシウム塩のうちの1種類または複数種類を含む、本発明1019〜1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
前記アルカリ金属塩が、塩化マグネシウム、臭化マグネシウム、硫酸水素マグネシウム、硫酸マグネシウム、炭酸水素マグネシウム、炭酸マグネシウム、塩化カルシウム、臭化カルシウム、硫酸水素カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸水素カルシウム、および炭酸カルシウムのうちの1種類または複数種類を含む、本発明1019〜1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
前記アルカリ金属塩が塩化ナトリウム（NaCl）を含む、本発明1019〜1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
前記第1のリフォールド緩衝液、前記第2のリフォールド緩衝液、および/または前記第3のリフォールド緩衝液が約500mM NaClを含む、本発明1019〜1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
工程（a）における変性剤の濃度が約1M〜約10Mである、本発明1019〜1027のいずれかの方法。
[本発明1029]
前記変性剤が、グアニジン、塩酸グアニジン、塩化グアニジン、チオシアン酸グアニジン、尿素、チオ尿素、過塩素酸リチウム、塩化マグネシウム、フェノール、ベタイン、サルコシン、カルバモイルサルコシン、タウリン、ジメチルスルホキシド（DMSO）；プロパノール、ブタノール、およびエタノールなどのアルコール；ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、N-ラウロイルサルコシン、Zwittergent、非界面活性型スルホベタイン（NDSB）、TRITON X-100、NONIDET（商標）P-40、TWEEN（商標）シリーズ、およびBRIJ（商標）シリーズなどの界面活性剤；水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムなどの水酸化物のうちの1種類または複数種類を含む、本発明1019〜1028のいずれかの方法。
[本発明1030]
前記第1のリフォールド緩衝液、前記第2のリフォールド緩衝液、および/または前記第3のリフォールド緩衝液が各々独立して緩衝剤を含む、本発明1019〜1029のいずれかの方法。
[本発明1031]
前記緩衝剤が、TRIS（トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン）、HEPPS（N-[2-ヒドロキシエチル]ピペラジン-N'-[3-プロパン-スルホン酸]）、CAP SO（3-[シクロヘキシルアミノ]-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホン酸）、AMP（2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール）、CAPS（3-[シクロヘキシルアミノ]-1-プロパンスルホン酸）、CHES（2-[N-シクロヘキシルアミノ]エタンスルホン酸）、アルギニン、リジン、およびホウ酸ナトリウムのうちの1種類または複数種類を含む、本発明1030の方法。
[本発明1032]
各緩衝剤が独立して約1mM〜約1Mの濃度で存在する、本発明1030または本発明1031の方法。
[本発明1033]
前記第1のリフォールド緩衝液、前記第2のリフォールド緩衝液、および/または前記第3のリフォールド緩衝液が各々独立して酸化剤および還元剤を含み、酸化剤と還元剤のモル比が約2:1〜約20:1である、本発明1019〜1032のいずれかの方法。
[本発明1034]
前記酸化剤が、システイン、グルタチオンジスルフィド（「酸化型グルタチオン」）、または両方を含む、本発明1033の方法。
[本発明1035]
前記酸化剤が約0.1mM〜約10mMの濃度で含まれる、本発明1033または本発明1034の方法。
[本発明1036]
前記還元剤が、βメルカプトエタノール（BME）、ジチオスレイトール（DTT）、ジチオエリトリトール（DTE）、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン（TCEP）、シスチン、システアミン、チオグリコール酸、グルタチオン、および水素化ホウ素ナトリウムのうちの1種類または複数種類を含む、本発明1033〜1035のいずれかの方法。
[本発明1037]
前記還元剤が約0.02mM〜約2mMの濃度で含まれる、本発明1036の方法。
[本発明1038]
前記変性剤が尿素を含む、本発明1019〜1037のいずれかの方法。
[本発明1039]
前記変性剤が6〜8M尿素を含む、本発明1019〜1038のいずれかの方法。
[本発明1040]
前記第1のリフォールド緩衝液、前記第2のリフォールド緩衝液、および/または前記第3のリフォールド緩衝液が、グルタチオンおよび/または酸化型グルタチオンを含む、本発明1019〜1039のいずれかの方法。
[本発明1041]
前記第1のリフォールド緩衝液、前記第2のリフォールド緩衝液、および/または前記第3のリフォールド緩衝液が、5mMグルタチオンおよび/または1mM酸化型グルタチオンを含む、本発明1019〜1040のいずれかの方法。
[本発明1042]
前記第1のリフォールド緩衝液、前記第2のリフォールド緩衝液、および/または前記第3のリフォールド緩衝液がグリセロールを含む、本発明1019〜1041のいずれかの方法。
[本発明1043]
工程（f）を少なくとも5時間実施する、本発明1019〜1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
工程（f）を少なくとも10時間実施する、本発明1019〜1042のいずれかの方法。
[本発明1045]
工程（f）を10〜12時間実施する、本発明1019〜1042のいずれかの方法。
[本発明1046]
工程（f）が、前記第3のリフォールド緩衝液中の前記MYC含有ポリペプチドを1000rpm未満で撹拌することをさらに含む、本発明1019〜1045のいずれかの方法。
[本発明1047]
MYC含有ポリペプチドが組換えポリペプチドである、本発明1019〜1046のいずれかの方法。
[本発明1048]
組換えMYC含有ポリペプチドを微生物宿主細胞から単離する工程をさらに含む、本発明1047の方法。
[本発明1049]
前記微生物宿主細胞が大腸菌（E.coli）である、本発明1048の方法。
[本発明1050]
組換えMYC含有ポリペプチドを微生物宿主細胞から単離する工程が、誘導性プロモーターから該MYC含有ポリペプチドを発現させることを含む、本発明1048または本発明1049の方法。
[本発明1051]
組換えMYC含有ポリペプチドを微生物宿主細胞から単離する工程が、アフィニティクロマトグラフィおよび/または陰イオン交換クロマトグラフィを使用して該MYC含有ポリペプチドを精製することを含む、本発明1048〜1050のいずれかの方法。
[本発明1052]
前記MYC含有ポリペプチドがアセチル化されている、本発明1019〜1051のいずれかの方法。
[本発明1053]
前記MYC含有ポリペプチドが、MYCポリペプチドに連結されたタンパク質形質導入ドメインを含むMYC融合ペプチドを含む、本発明1019〜1052のいずれかの方法。
[本発明1054]
前記MYC融合ペプチドが、前記タンパク質形質導入ドメインと前記MYCポリペプチドとを連結する1個または複数個の分子をさらに含む、本発明1053の方法。
[本発明1055]
前記MYC含有ポリペプチドが、以下の一般構造：
タンパク質形質導入ドメイン−X−MYC配列
を有するMYC融合ペプチドを含み、
ここで、−X−が、該タンパク質形質導入ドメインと該MYC配列とを連結する分子である、本発明1019〜1054のいずれかの方法。
[本発明1056]
前記タンパク質形質導入ドメイン配列がTATタンパク質形質導入ドメイン配列である、本発明1053〜1055のいずれかの方法。
[本発明1057]
前記TATタンパク質形質導入ドメイン配列が、TAT[48〜57]およびTAT[57〜48]からなる群より選択される、本発明1056の方法。
[本発明1058]
前記MYC含有ポリペプチドが、SEQ ID NO:1または10を含むMYC融合ペプチドである、本発明1019〜1057のいずれかの方法。
[本発明1059]
前記ナノ粒子が約100nm〜約110nmの平均直径を有する、本発明1019〜1058のいずれかの組成物。
[本発明1060]
1種または複数種のMYC含有ポリペプチドを含む生物活性ナノ粒子の集団の調製のための方法であって、
（a）変性したMYC含有ポリペプチドを提供するために、6〜8M尿素を含む緩衝可溶化溶液中でMYC含有ポリペプチドを変性させる工程；
（b）第1のポリペプチド混合物を提供するために、約3M尿素と約500mM NaClとを含む第1のリフォールド緩衝液を用いて、変性した該MYC含有ポリペプチドに対して第1のリフォールディング工程を少なくとも約120分間実施する工程；
（c）第2のポリペプチド混合物を提供するために、約1.5M尿素と約500mM NaClとを含む第2のリフォールド緩衝液を用いる緩衝液交換によって、該第1のポリペプチド混合物に対して第2のリフォールディング工程を少なくとも約120分間実施する工程；
（d）約500mM NaClを含む第3のリフォールド緩衝液を用いる緩衝液交換によって、該第2のポリペプチド混合物に対して第3のリフォールディング工程を少なくとも約120分間実施する工程；ならびに
（f）約80nm〜約150nmの数平均直径を有する生物活性ナノ粒子を作製するために十分な時間、該第3のリフォールド緩衝液中に該MYC含有ポリペプチドを維持する工程
を含み、
T細胞増殖に適した条件下で抗CD3活性化または抗CD28活性化T細胞を該生物活性ナノ粒子と接触させることによって、該T細胞の活性化、生存、または増殖のうちの一つまたは複数が、該生物活性ナノ粒子と接触していない抗CD3活性化または抗CD28活性化T細胞と比較して増大する、該方法。