(57)【要約】本発明は、アグロバクテリウム属に属する微生物を用いた遺伝子導入法によるアイスプラントの形質転換方法、及び形質転換アイスプラントの作出方法を提供する。また本発明は、安定な形質転換アイスプラントを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アイスプラントの子葉節を、所望の遺伝子を含有するアグロバクテリウム属に属する微生物により形質転換する工程を含むことを特徴とする、アイスプラントの形質転換方法。
【請求項２】
前記子葉節は幼体の子葉節である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記幼体は播種してから４〜１０日後のものである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１から３までのいずれかに記載の方法により得られた子葉節を植物ホルモンの存在下で生育させることを特徴とする、形質転換アイスプラントの作出方法。
【請求項５】
前記植物ホルモンはチジアズロン、ホルクロロフェニュロン、ベンジルアデニン、及びナフタレン−１−酢酸からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記植物ホルモンの合計濃度が０．１〜１０ｍｇ／Ｌである、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記チジアズロンの濃度が０．１〜５ｍｇ／Ｌである、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
請求項４から７までのいずれかに記載の方法により得られる形質転換アイスプラント。
【請求項９】
ゲノム中に所望の外来遺伝子が組み込まれたものである、請求項８に記載の形質転換アイスプラント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、アイスプラントの形質転換方法、アイスプラントの形質転換体の作出方法、及び形質転換アイスプラントに関する。
【背景技術】  アイスプラント（Ｍｅｓｅｍｂｒｙａｎｔｈｅｍｕｍ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｕｍ  Ｌ．）は、ザクロソウ科マツバギク属に属する１年生草本であり、海水を含む土壌でも生育できる塩生植物である。一般に、塩生植物とは、通常の植物では生育できない１００ｍＭのＮａＣｌ水溶液を吸収させる条件下でも生育し得る、耐塩性の高い特殊な植物を言う。アイスプラントは、Ｃｄ及びＣｕ等の金属、並びにＮａＣｌ等の無機塩類を吸収する能力が高く、例えば、ＮａＣｌについては、１個体当たり約１５ｇ吸収することができると言われており、これは１ｍ２当たり２００ｇ、１ｈａ当たりでは２ｔという驚くべき吸収量に相当する。
現在、世界の耕地面積の約１０％において、塩類の集積のために農耕が困難であることが問題となっており、我が国日本も同様の問題を抱えている。特に佐賀県においては、約６５％もの耕地がもともと干拓地であるという事情のため、問題は深刻である。
ところで、アイスプラントは、塩、強光、又は乾燥等の一般に良好でないとされる環境下におかれると、その光合成様式を、ダイズやイネ等にみられるＣ３型から、サボテン等でみられるＣＡＭ型に変換する。このため、このような光合成様式の変換メカニズムや、前述した無機塩類等の耐性メカニズムを解明するためのモデル植物として、アイスプラントは多くの研究の対象となっている。そこで、近年、イネやシロイヌナズナ等の周知のモデル植物と同様に、アイスプラントについても、そのゲノムＤＮＡの全塩基配列を決定するための解析が行われようとしている。したがって、今後、決定された塩基配列をもとに種々の遺伝子の機能解析や改良個体の作出等を行うに当たっては、他のモデル植物の場合と同様に、アイスプラントにおいてもその形質転換が必須となる。また、このような目的のためには、迅速かつ高効率に形質転換できることが極めて重要となる。
一般に、植物の形質転換法としては、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法などの直接的な方法と、アグロバクテリウム属に属する微生物（以下「アグロバクテリウム属細菌」と言うことがある。）細菌を用いた遺伝子導入法などの間接的な方法とが知られている。しかし、パーティクルガン法においては、（ｉ）遺伝子導入が表層細胞に限られる、（ｉｉ）最終的な導入断片に組換えや欠失が起こりやすい、（ｉｉｉ）形質転換体がキメラになりやすい、（ｉｖ）高価な機器が必要である、（ｖ）微細な金属微粒子の飛散のため人体への危険性がある等の問題があり、エレクトロポレーション法においては、（ｉ）ＤＮＡ導入に際し細胞壁を通過させることが細菌ほど容易ではないため、導入効率の低下や細胞損傷等が不可避である、（ｉｉ）プロトプラストを導入対象とするためプロトプラストからの個体再生系が確率されていない植物種には適用できず、利用頻度が極めて低い、（ｉｉｉ）長期の培養期間を要するため、変異率が高くなり目的の正常な形質転換体を得る確率が低下する等の問題があり、ＰＥＧ法においては、エレクトロポレーション法と同様の問題（例えば、導入効率の低下（実際にはさらに低くなる）や細胞損傷等が不可避であること）がある。従って、現時点では、アグロバクテリウム属細菌を用いた遺伝子導入法が最も確実かつ有用であると考えられている。この方法では、アグロバクテリウム属細菌そのものを生物学的なベクターとして、それ自身の持つ組換え配列（Ｔ−ＤＮＡ領域）及び組換え酵素を利用することにより目的のＤＮＡ（組換え遺伝子等）を植物ゲノムに組み込むことができる。
アグロバクテリウム属細菌を用いた遺伝子導入法は、現在までに、様々な植物種で確立されており、安定な形質転換植物が数多く作出されている。
しかしながら、アイスプラントに関しては、アグロバクテリウム属細菌の感染が可能であること（すなわち外来遺伝子の導入が可能であること）は、根端細胞や培養細胞に遺伝子を導入した例から示唆されるものの（Ａｎｄｏｌｆａｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．，ｖｏｌ．９０，ｐ．７０８−７１４（１９９４）；Ｉｓｈｉｍａｒｕ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，ｖｏｌ．５７，ｐ．６１−６３（１９９９））、その後の再分化率が極めて低く（Ｃｕｓｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，ｖｏｌ．１９，ｐ．４５９−４６３（２０００））、安定な形質転換体が得られるまでには至っていない。
【発明の開示】
そこで、本発明が解決しようとする課題は、アグロバクテリウム属に属する微生物を用いた遺伝子導入法によるアイスプラントの形質転換方法、及び形質転換アイスプラントの作出方法を提供すること、並びに安定な形質転換アイスプラントを提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。その結果、アイスプラントにおける特定の組織の再分化活性が、他の組織又はカルスに比べ極めて高いことを発見し、この特定の組織をアグロバクテリウム属に属する微生物の感染対象として用いれば、アイスプラントを容易に形質転換でき、また形質転換アイスプラントを容易に作出できることを見出して、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）アイスプラントの子葉節を、所望の遺伝子を含有するアグロバクテリウム属に属する微生物により形質転換する工程を含むことを特徴とする、アイスプラントの形質転換方法。
上記形質転換方法においては、上記子葉節は、例えば、幼体の子葉節であってもよく、また当該幼体は、例えば、播種してから４〜１０日後のものであってもよい。
（２）上記（１）の形質転換方法により得られた子葉節を植物ホルモンの存在下で生育させることを特徴とする、形質転換アイスプラントの作出方法。
上記作出方法において、上記植物ホルモンとしては、例えば、チジアズロン（ＴＤＺ）、ホルクロロフェニュロン（ＣＰＰＵ）、ベンジルアデニン（ＢＡ）、及びナフタレン−１−酢酸（ＮＡＡ）からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられる。また上記植物ホルモンの濃度（合計濃度）は、例えば、０．１〜１０ｍｇ／Ｌとすることができ、特に上記チジアズロンの濃度については、例えば、０．１〜５ｍｇ／Ｌとすることができる。
（３）上記（２）の作出方法により得られる形質転換アイスプラント。
【図面の簡単な説明】  図１は、実施例１における、アグロバクテリウムを用いたアイスプラントの形質転換体の作出方法の手順の概略図である。
図２は、実施例１における、ＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す写真である。なお、レーン１は、形質転換体から抽出した染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行った場合であり、レーン２は、非形質転換体から抽出した染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行った場合であり、レーンＭは、ＤＮＡサイズマーカーである。
図３は、実施例２における、前培養培地中の植物ホルモン組成がアイスプラントの形質転換効率（生存率、苗条分化率）に及ぼす影響を調べた結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。また、本発明の説明のために引用する文献は、すべて参照として本明細書全体に組込まれるものとする。
１．概要
本発明は、アイスプラントの形質転換方法、及びアイスプラントの形質転換体の作出方法に関するものであり、安定した形質転換アイスプラントを作出することを本発明において初めて可能にした極めて利用価値の高い方法である。これまで、アイスプラントの形質転換体が得られなかったのは、アグロバクテリウム属細菌が感染した組織から個体への再分化が効率よくかつ確実に行われなかったことが理由となっている。
通常、植物の種類により、アグロバクテリウム属細菌で形質転換するための材料（感染対象となる組織等）は異なり、中にはモデル植物のシロイヌナズナのように花器又は傷をつけた生長点に感染させる特殊な場合がある。しかし、一般には、脱分化過程にあるか又は脱分化した培養組織（いわゆるカルス）が上記材料として使用されることが多い。このような培養組織を用いる場合は、通常、感染前に当該組織を作製するために３〜４週間の脱分化誘導期間が必要となり、感染後は、完全な個体に再分化させるためにさらに数週間必要となるため、迅速性に欠ける。また脱分化過程、及びカルスから再分化個体を誘導する過程において、体細胞変異が起きる危険性がある。
またこれまでに、アイスプラントでは、カルス以外に、胚軸（幼植物の茎部分）や根等の各種組織及び器官から個体に再分化する試みがなされてきたが、いずれも、その再分化効率は非常に低いものであり、確実に形質転換体を得ることは極めて困難であった。
そこで本発明者は、アイスプラントの各種組織及び器官（根、茎及び葉等）の中で個体への再分化能に特に優れたものがないか、改めて実験及び検討を繰り返した結果、特定の組織（例えば子葉節、好ましくは幼体の子葉節）の再分化活性が極めて高いこと、及びこれを感染対象として用いて形質転換処理を行えばアイスプラントの形質転換体を容易に得ることができることを見出した。本発明はこのような知見に基づき完成されたものである。
また本発明者は、上記特定の組織の培養（少なくとも感染後の培養）を、特定の植物ホルモン（すなわちチジアズロン等）の存在下で行うようにすれば、より一層、当該組織の再分化活性を向上させ効率的にアイスプラントの形質転換体が得られることも見出した。
２．アイスプラントの形質転換方法
本発明のアイスプラントの形質転換方法は、前述したように、アイスプラントの子葉節を、所望の遺伝子を含有するアグロバクテリウム属に属する微生物（アグロバクテリウム属細菌）により形質転換する工程を含むことを特徴とする。詳しくは、取得したアイスプラントの子葉節に、所望の遺伝子を含有するアグロバクテリウム属細菌を感染させ、その後、当該細菌（微生物）の共存下で子葉節を培養することを特徴とする。
以下、本発明の形質転換方法の一実施形態について、各工程ごとに順を追って例示説明するが、当該方法は、これらの工程のみからなるものに限定はされず、当業者の技術常識及び創作能力の範囲内で、さらに他の工程を含むものであってもよい。
（１）子葉節の取得
本発明の形質転換方法においては、アイスプラントの子葉節を、アグロバクテリウム属細菌の感染対象組織として形質転換を行うことが重要である。子葉節とは、双子葉植物（アイスプラントも含む）の２枚の子葉が合わさっている部分を言い、新しい葉の生長点を含む部分である。
子葉節の取得に当たっては、まずアイスプラントを播種し、発芽させることが必要である。発芽させるための培地としては、公知の培地を用いることができ、限定はされないが、例えば、ＭＳ寒天培地等のほか、場合により、水で湿らせた濾紙も好ましく用いることができる。
培養容器としては、公知のものであればよく、限定はされないが、例えば、ガラス製やプラスチック製のシャーレ等を用いることができ、後述するいずれの培養工程においても同様である。
本発明の形質転換方法に用いる子葉節としては、限定はされないが、アイスプラントの幼体の子葉節であることが好ましい。具体的には、アイスプラントを播種してから４〜１０日後の幼体であることが好ましく、より好ましくは５〜７日後である。上記範囲を満たす幼体であれば、より再分化活性の高い子葉節が得られる点で好ましい。
子葉節の取得方法は、限定はされないが、アイスプラント苗条の子葉展開時に、例えば、ガラス製等のシャーレ中で、顕微鏡で観察しながら、ピンセット及びメス等を用いて、子葉節部分を切除し（好ましくは、子葉節部分を含む状態で一方の子葉ごと切除し）取得することが好ましい。
子葉節の取得数（次の前培養工程に用いる数）は、限定はされないが、２０〜１００個とすることが好ましく、より好ましくは４０〜５０個である。上記範囲を満たす取得数であれば、次の工程でシャーレ中の子葉節間に適当な間隔を空けて培養できるという点で好ましい。
（２）子葉節の前培養
前培養工程は、上述のようにして取得した子葉節（詳しくは子葉節を含む子葉）を、次の感染工程に用い得る適当な培養組織となるよう培養することを目的とする。本工程では、一般には、取得した子葉節が、小さな苗条を形成した状態となるまで培養することが好ましい。
前培養に用いる培地としては、公知の培地を用いることができ、限定はされないが、例えば、播種に用いた培地（例えばＭＳ寒天培地）等が好ましく挙げられる。
また上記培地は、植物ホルモンを含むものであることが好ましく、具体的には、チジアズロン（ＴＤＺ）、ホルクロロフェニュロン（ＣＰＰＵ）、ベンジルアデニン（ＢＡ）、及びナフタレン−１−酢酸（ＮＡＡ）からなる群より選ばれる少なくとも１種を含むものであることが好ましく、より好ましくはチジアズロンを含むものであり、特に好ましくはチジアズロンとナフタレン−１−酢酸とを含むものである。これら植物ホルモン、特にチジアズロンを含むことにより、苗条分化数が増加し、苗条の健全性が保たれ、結果として再分化が促進される等の効果が得られる。
上記植物ホルモンの濃度（合計濃度）は、培地全体に対して、０．１〜１０ｍｇ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは０．５〜１０ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは１〜１０ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは１〜６ｍｇ／Ｌである。特に、ＴＤＺについては、その濃度は、培地全体に対して、０．１〜５ｍｇ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは０．５〜５ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは１〜５ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは２．５〜５ｍｇ／Ｌである。また、ＣＰＰＵの濃度は、培地全体に対して、０．１〜５．０ｍｇ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは１．０〜５．０ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは２．５〜５ｍｇ／Ｌであり、ＢＡの濃度は、培地全体に対して、０．１〜２０ｍｇ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは１．０〜１０ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは１．０〜５ｍｇ／Ｌであり、ＮＡＡの濃度は、培地全体に対して、０．１〜１０ｍｇ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは０．１〜５ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．１〜１ｍｇ／Ｌである。
前培養は、光照射条件下で行うことが好ましい。その明るさは限定はされないが、植物が健全に生育できる強さの光であればよく、例えば、５０〜１００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１であることが好ましい。
前培養における培養温度は、例えば、２０〜３３℃であることが好ましく、より好ましくは２５〜３０℃である。
前培養に要する期間は、例えば、１〜１０日であることが好ましく、より好ましくは３〜５日であるが、限定はされず、次の感染工程に用い得る培養組織が得られた段階又はそれ以降の任意の段階（通常は３日）で適宜培養を終了することができる。
（３）子葉節へのアグロバクテリウム属細菌の感染
感染工程では、前培養工程で得られた培養組織（詳しくは当該培養組織の細胞）に、所望の遺伝子を含有するアグロバクテリウム属に属する微生物（アグロバクテリウム属細菌）を感染させることを目的とする。
感染工程で使用するアグロバクテリウム属細菌としては、Ｔｉプラスミド又はＲｉプラスミドを有し、従来から双子葉植物の形質転換に常用されているものが好ましく挙げられ、中でもアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）がより好ましい。これらアグロバクテリウム属細菌の多くは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のＴｉプラスミドのｖｉｒ領域（又はそれに由来するＤＮＡ）を含むプラスミドベクターを有しており、植物に付与しようとする形質を担う所望の遺伝子（形質転換遺伝子）は、このベクター中に挿入されるか、又はこのベクターとは別のプラスミドベクター（例えばｐＢＲ３２２等）中に存在し相同組換え等によりＴｉプラスミド中にｉｎ  ｖｉｖｏで挿入され得る。よって、本発明では、培養組織細胞のゲノムに導入しようとする所望の遺伝子は、従来と同様にＴ領域の境界配列の間に挿入（配置）される。この場合、所望の遺伝子は、アグロバクテリウム属細菌中のＴｉプラスミドに挿入されてもよいし、他のプラスミドに挿入されてもよく、限定はされない。各種プラスミドへの所望の遺伝子の挿入は、例えばＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号等の情報を基にし、当業者において周知の遺伝子組換え技術を適宜採用して行うことができる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８９を参照）。
なお本発明において「所望の遺伝子」とは、アイスプラントの細胞内で発現させようとする所望のタンパク質をコードするＤＮＡ、及び当該ＤＮＡの転写及び翻訳等に必要なＤＮＡを含むＤＮＡであることが好ましいが、限定はされず、上記所望のタンパク質をコードするＤＮＡのみであってもよいし、任意のオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドであってもよい。また、一般に、「所望の遺伝子」としては、後述する本発明の作出方法における選択培養工程において、形質転換体とそうでないものとを容易に選別するために、所定の抗生物質に対して耐性を示すよう選択マーカー遺伝子（例えば、Ｈｙｇｒ、及びＫｍｒ等）を含有させることが好ましい。
アグロバクテリウム属細菌へのプラスミドの導入は、従来公知の遺伝子組換え技術を用いた方法により行うことができ、例えば、細菌の三系交雑手法（Ｄｉｔｔａ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．７７，ｐ．７３４７−７３５１（１９８０））等が好ましく挙げられる。
感染工程に用いるアグロバクテリウム属細菌の培養は、従来公知の培養方法により行うことができ、限定はされないが、例えば、当該細菌のストック（例えばグリセロールストック（−８０℃））から滅菌した白金耳等で菌体を取り、適当な培地（例えばＡＢ培地）に塗布し、暗所下で培養する（例えば２８℃で３日間）方法が好ましい。
子葉節にアグロバクテリウム属細菌を感染させる方法としては、限定はされないが、例えば、（ｉ）培養したアグロバクテリウム属細菌を、ＴＤＺ、アセトシリンゴン、及びＭＳ培地用無機塩類を含む感染処理用液体培地に懸濁し、この懸濁液に前培養後の子葉節を浸漬させて超音波処理（ソニケーション処理）する方法、（ｉｉ）上記（ｉ）の方法において超音波処理の代わりに減圧浸潤処理を行う方法、（ｉｉｉ）上記（ｉ）又は（ｉｉ）の方法において、超音波処理又は減圧浸潤処理を行わずに、感染処理用液体培地に界面活性剤を添加し、この培地に一定時間浸漬させる方法、及び、（ｉｖ）上記（ｉ）又は（ｉｉ）の方法において、超音波処理又は減圧浸潤処理を行わずに、感染処理用液体培地（界面活性剤の添加無し）に一定時間浸漬させる方法等が好ましく、中でも本発明においては上記（ｉ）の方法がより好ましい。
上記（ｉ）の方法においては、超音波の照射時間は、限定はされないが、０．２〜６０秒が好ましく、より好ましくは２秒である。照射時間が上記範囲内のときは、外植体組織が破壊されない点で好ましい。また浸漬させる時間（超音波処理の時間も含む）は、限定はされないが、５〜２０分であることが好ましく、より好ましくは５〜６分である。浸漬時間が上記範囲内のときは、アグロバクテリウムの付着量が適当量となる点で好ましい。
（４）感染後の共存培養
共存培養工程では、感染工程後の子葉節を、アグロバクテリウム属細菌の共存下で培養することを目的とする。先に述べた感染工程と本工程とにより、培養組織としての子葉節の細胞のゲノム中に所望の遺伝子（外来遺伝子）を組み込むこと、すなわちアイスプラントの形質転換を行うことができる。
本工程では、共存培養を実際に行うに先立ち、まず感染工程後の懸濁液を子葉節とともに乾燥させた滅菌ろ紙上に注ぎ、次いで、子葉節のみを新しい滅菌ろ紙上に移す等して、余分な菌体や水分を除去しておくことが好ましい。
共存培養に用いる培地としては、公知の培地を用いることができ、限定はされないが、例えば、前培養工程で用いた培地（ＭＳ寒天培地等）にアセトシリンゴンを添加した培地や、上記培地に適当な濃度の植物ホルモンとアセトシリンゴンを添加した培地のほか、アセトシリンゴンと水のみを含む寒天培地等が好ましく挙げられる。
共存培養は、光照射条件下及び暗所下のいずれの条件下で行ってもよく、限定はされないが、光照射条件下で行う場合、例えば、光合成を行うことができるため子葉節の健全性が保たれ、アグロバクテリウムの感染による障害が抑えられる等の効果が得られるため好ましい。共存培養時の光照射条件としては、限定はされないが、上記効果がより有効に得られる点で、例えば、５０〜２００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１であることが好ましく、より好ましくは５０〜７０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１である。
共存培養における培養温度は、例えば、１８〜３３℃であることが好ましく、より好ましくは２５〜３０℃である。
共存培養に要する期間は、例えば、３〜１０日であることが好ましく、より好ましくは３〜５日であるが、限定はされず、例えば、子葉節組織の肥大がわずかに認められた段階又はそれ以降の任意の段階（通常は３〜７日）で適宜培養を終了することができる。
ここで、上述した本発明の形質転換方法において、特に好ましい実施形態としては、例えば、前培養を３日間行った培養組織（子葉節）に、超音波処理を施すことによってアグロバクテリウム属細菌を感染させ、その後、共存培養をアセトシリンゴンと水のみを含む培地を用いて光照射下で３日間行う態様が挙げられ、多くの形質転換体を得ることができる。
３．形質転換アイスプラントの作出方法
本発明の形質転換アイスプラントの作出方法は、前述したように、上記本発明の形質転換方法により得られた子葉節を植物ホルモンの存在下で生育させることを特徴とする方法である。すなわち本発明の方法は、形質転換アイスプラントの製造方法でもある。以下、本発明の作出方法の一実施形態について、各工程ごとに順を追って例示説明するが、当該方法は、これらの工程のみからなるものに限定はされず、当業者の技術常識及び創作能力の範囲内で、さらに他の工程を含むものであってもよい。
（１）除菌培養
除菌培養工程では、まず上記本発明の形質転換方法により得られた子葉節を適当な抗生物質を含む培地で培養し、共存しているアグロバクテリウム属細菌を除菌して、形質転換処理後の子葉節を選択的に取得することを目的とする。
除菌培養に用いる培地としては、公知の培地を用いることができ、限定はされないが、例えば、前培養工程で用いた培地（ＭＳ寒天培地等）等が好ましく挙げられる。
当該培地に含有させる抗生物質としては、形質転換に用いたアグロバクテリウム属細菌の増殖及び／又は生育を阻害する作用を有するが、アイスプラントの子葉節の生育には実質的に悪影響を与えないものが好ましく、具体的には、例えば、カルベニシリン、バンコマイシン、クラフォラン、及びオーグペニン等が好ましく挙げられ、中でも、カルベニシリン、及びバンコマイシンがより好ましい。なお、各種抗生物質の使用濃度は、限定はされず、公知の有効濃度範囲内で適宜設定できる。
また当該培地には、植物ホルモンとして、例えば、チジアズロン（ＴＤＺ）、ホルクロロフェニュロン（ＣＰＰＵ）、ベンジルアデニン（ＢＡ）、及びナフタレン−１−酢酸（ＮＡＡ）からなる群より選ばれる少なくとも１種を含有させることが好ましく、チジアズロンがより好ましい。
上記植物ホルモンの濃度（合計濃度）は、例えば、培地全体に対して、０．１〜１０ｍｇ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは０．５〜１０ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは１〜１０ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは１〜６ｍｇ／Ｌである。特にＴＤＺについては、その濃度は、培地全体に対して、０．１〜５ｍｇ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは０．５〜５ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは１〜５ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは２．５〜５ｍｇ／Ｌである。また、ＣＰＰＵの濃度は、培地全体に対して、０．１〜５．０ｍｇ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは１．０〜５．０ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは２．５〜５ｍｇ／Ｌであり、ＢＡの濃度は、培地全体に対して、０．１〜２０ｍｇ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは１．０〜１０ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは１．０〜５ｍｇ／Ｌであり、ＮＡＡの濃度は、培地全体に対して、０．１〜１０ｍｇ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは０．１〜５ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．１〜１ｍｇ／Ｌである。
除菌培養工程において使用する植物ホルモンの濃度、特にチジアズロンの濃度を、上記範囲内とすることにより、歪な形態をもつ組織の発達を抑えることができるため、植物体の発育が良好に保たれ、結果として除菌を効率よく行うことができる等の効果を得ることができる。
除菌培養における培養温度は、例えば、２０〜３３℃であることが好ましく、より好ましくは２０〜２５℃である。
除菌培養に要する期間は、例えば、２〜７日であることが好ましく、より好ましくは３〜５日であるが、限定はされず、例えば、子葉節が接している培地上、あるいは植物体上にアグロバクテリウムの増殖がない等の状態が認められた段階又はそれ以降の任意の段階（通常は３〜５日）で適宜培養を終了することができる。
（２）選択培養
選択培養工程では、除菌培養工程で得られた形質転換処理後の子葉節を、さらに適当な抗生物質を含む培地で培養し、所望の遺伝子（選択マーカーとしての所定の抗生物質耐性遺伝子を含む）の導入により形質転換がなされているもの（形質転換体）を選択的に取得することを目的とする。
選択培養に用いる培地としては、公知の培地を用いることができ、限定はされないが、例えば、前培養工程で用いた培地（ＭＳ寒天培地等）等が好ましく挙げられる。
当該培地に含有させる抗生物質のうち、上記選択マーカーに対応する抗生物質としては、例えば、ハイグロマイシン、及びカナマイシン等が挙げられ、中でもハイグロマイシンが好ましく、その他の抗生物質としては、除菌培養の際に用いた抗生物質を好ましく併用することができる。なお、各種抗生物質の使用濃度は、限定はされず、公知の有効濃度範囲内で適宜設定できる。
また当該培地には、植物ホルモンとして、例えば、チジアズロン（ＴＤＺ）、ホルクロロフェニュロン（ＣＰＰＵ）、ベンジルアデニン（ＢＡ）、及びナフタレン−１−酢酸（ＮＡＡ）からなる群より選ばれる少なくとも１種を含有させることが好ましく、チジアズロンがより好ましい。
上記植物ホルモンの濃度（合計濃度）は、例えば、培地全体に対して、０．１〜１０ｍｇ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは０．５〜１０ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは１〜１０ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは１〜６ｍｇ／Ｌである。特にＴＤＺについては、その濃度は、培地全体に対して、０．１〜５ｍｇ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは０．５〜５ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは１〜５ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは２．５〜５ｍｇ／Ｌである。また、ＣＰＰＵの濃度は、培地全体に対して、０．１〜５．０ｍｇ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは１．０〜５．０ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは２．５〜５ｍｇ／Ｌであり、ＢＡの濃度は、培地全体に対して、０．１〜２０ｍｇ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは１．０〜１０ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは１．０〜５ｍｇ／Ｌであり、ＮＡＡの濃度は、培地全体に対して、０．１〜１０ｍｇ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは０．１〜５ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．１〜１ｍｇ／Ｌである。
選択培養工程において使用する植物ホルモンの濃度、特にチジアズロンの濃度を、上記範囲内とすることにより、苗条分化数が増加し、苗条の健全性が保たれ、結果として再分化が促進される等の効果が得られる。
選択培養は、光照射条件下及び暗所下のいずれの条件下で行ってもよく、限定はされないが、光照射条件下で行う場合、例えば、光合成を行えるため、抗生物質やアグロバクテリウムに対して耐性の高い、健全な植物体を得ることができる等の効果が得られるため好ましい。選択培養時の光照射条件としては、限定はされないが、上記効果がより有効に得られる点で、例えば、５０〜２００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１であることが好ましく、より好ましくは５０〜７０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１である。
選択培養における培養温度は、例えば、２０〜３３℃であることが好ましく、より好ましくは２０〜２５℃である。
選択培養に要する期間は、例えば、３〜６週であることが好ましく、より好ましくは４〜５週であるが、限定はされず、例えば、生存個体と枯死個体の区別が明確になる等の状態が認められた段階又はそれ以降の任意の段階（通常は３〜４週）で適宜培養を終了することができる。
（３）再分化
再分化工程では、選択培養工程で得られた子葉節をさらに培養し、その高い再分化活性を利用して、不定芽誘導及び発根等の各種器官形成又は組織形成を促進させ、安定な完全個体（幼体又は成体）としての形質転換アイスプラントを得ることを目的とする。
再分化のための培養に用いる培地としては、不定芽の形成、及び発根のいずれに対しても公知の培地を用いることができ、限定はされないが、例えば、前培養工程で用いた培地（ＭＳ寒天培地等）等が好ましく挙げられる。
当該培養は、一般には、抗生物質を用いず無菌的に行うことが好ましいが、限定はされず、適宜、公知の有効濃度で各種抗生物質、例えば、ハイグロマイシン、及びカナマイシン等を使用してもよい。
不定芽の形成には、除菌培養や選択培養と同様に、植物ホルモンとして、例えば、チジアズロン（ＴＤＺ）、ホルクロロフェニュロン（ＣＰＰＵ）、ベンジルアデニン（ＢＡ）、及びナフタレン−１−酢酸（ＮＡＡ）からなる群より選ばれる少なくとも１種を含有させることが好ましく、チジアズロンがより好ましい。
上記植物ホルモンの濃度（合計濃度）は、例えば、培地全体に対して、０．１〜１０ｍｇ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは０．５〜１０ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは１〜１０ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは１〜６ｍｇ／Ｌである。特にＴＤＺについては、その濃度は、培地全体に対して、０．１〜５ｍｇ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは０．５〜５ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは１〜５ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは２．５〜５ｍｇ／Ｌである。また、ＣＰＰＵの濃度は、培地全体に対して、０．１〜５．０ｍｇ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは１．０〜５．０ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは２．５〜５ｍｇ／Ｌであり、ＢＡの濃度は、培地全体に対して、０．１〜２０ｍｇ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは１．０〜１０ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは１．０〜５ｍｇ／Ｌであり、ＮＡＡの濃度は、培地全体に対して、０．１〜１０ｍｇ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは０．１〜５ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．１〜１ｍｇ／Ｌである。
再分化工程において使用する植物ホルモンの濃度、特にチジアズロンの濃度を、上記範囲内とすることにより、細胞の分裂が早く、歪な形態の組織を少なく抑え、細胞のガラス化の少ない健全な苗条が数多く得られる等の効果を得ることができる。
なお、発根のための培地には、これらの植物ホルモンは添加しないのが一般的ではあるが、限定はされない。
再分化のための培養は、不定芽の形成、及び発根のいずれも、光照射条件下及び暗所下のどちらの条件下で行ってもよく、限定はされないが、光照射条件下で行う場合、例えば、光合成を行うことができるため新たな組織の形成が促進され、健全な植物体の発育を促す等の効果が得られるため好ましい。当該培養時の光照射条件としては、限定はされないが、上記効果がより有効に得られる点で、例えば、５０〜２００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１であることが好ましく、より好ましくは５０〜７０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１である。
再分化のための培養における培養温度は、例えば、２０〜３３℃であることが好ましく、より好ましくは２５〜３０℃である。
不定芽形成のための培養に要する期間は、１０〜１４日ごとに新しい培地へ継代する操作を２〜３回繰り返した後（つまり再分化培地への移植後）、３〜８週であることが好ましく、より好ましくは３〜４週であるが、限定はされず、例えば、新たに生じた組織の表面に、通常条件の個体にみられるブラッダー細胞が形成される等の状態が認められた段階又はそれ以降の任意の段階（通常は４〜５週）で、適宜培養を終了し、発根用の培養系に移すことができる。
発根のための培養に要する期間は、１０〜１４日ごとに新しい培地へ継代する操作を２〜３回繰り返した後（つまり発根用培地移植後）、２〜５週であることが好ましく、より好ましくは２〜３週であるが、限定はされず、例えば、１ｃｍ程度の根が発根している等の状態が認められた段階又はそれ以降の任意の段階（通常は２〜３週）で適宜培養を終了することができる。
（４）その他の工程
本発明の作出方法においては、その他の工程として、例えば、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に説明する工程を含むことができる。
（ｉ）馴化
再分化工程の後、形質転換アイスプラントを馴化培地（ならし培地）に移して培養し（いわゆる馴化培養）、安定した形質転換体として生育させることが好ましい。
馴化培地としては、公知の培地を用いることができ、限定はされないが、例えば、滅菌したバーミキュライト、あるいはフロリアライト５５２（日清紡社製）にＭＳ用無機塩類をふくませたもの等が好ましく挙げられる。
馴化培養では、一般には、抗生物質や植物ホルモンを積極的に培地に添加して行うことは要しないが、限定はされず、必要に応じ適宜添加してもよい。
馴化培養は、一般には、光照射条件下で行うことが好ましく、光照射量は適宜設定すればよい。
馴化培養における培養温度は、限定はされず、例えば、２０〜３３℃であることが好ましく、より好ましくは２０〜２５℃である。
馴化培養に要する期間は、限定はされず、例えば、１０日〜４週であることが好ましく、より好ましくは１０日〜２週である。
馴化培養の方法は、限定はされないが、例えば以下のとおりである。すなわち、再分化過程で発根した不定芽を、上述した馴化用培地に移植する。発根を促した後、根の繁茂した個体を、滅菌水を含ませたバーミキュライトを入れたプラスチックボックス（例えば、幅３０ｃｍ×奥行き５０ｃｍ×高さ１５ｃｍ）等に移植する。これにサランラップ等で蓋をして上述した光条件、及び温度条件の下におく。移植してから適当な期間経過後（例えば移植から２日後）に蓋に穴を開け、さらに適当な期間経過後（例えば移植から４日後）に蓋をとり外す。その後（例えば移植から５日後）、適当な光強度（例えば３５０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１）に調整した人口気象室に移し、所定の時間（例えば２４時間）強光に馴化させ、その後、市販の培養土（例えば、商品名：花と野菜の土、江北産業社製）に定植する。
（ｉｉ）遺伝子の導入確認
得られた形質転換アイスプラントについて、実際にそのゲノム中に所望の遺伝子（外来遺伝子）が導入されているか否かを直接的に確認することができる。具体的には、例えば、（ａ）導入した所望の遺伝子配列又はその一部の領域に対応する適当なプライマーを用いてＰＣＲを行い、電気泳動等によりその増幅断片の存在を確認する方法のほか、（ｂ）導入遺伝子のＤＮＡ断片をプローブにして、形質転換体から単離した染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で消化しメンブレンに固定したものとハイブリダイズし、遺伝子の有無を確認する方法（ジェノミックサザンブロッティング法）等により確認することができる。なお、上記確認方法は、いずれも当業者において公知の手段及び条件等を適宜採用して行うことができる。
４．形質転換アイスプラント
本発明の形質転換アイスプラントは、ゲノム中に所望の遺伝子（外来遺伝子）が組み込まれているアイスプラントの形質転換体である。
本発明の形質転換アイスプラントを作出する方法としては、アイスプラントのゲノム中に所望の外来遺伝子が組み込まれた形質転換体を得る方法であれば何れの方法であってもよく、限定はされないが、例えば、前述した本発明の作出方法が好ましく適用できる。したがって、本発明の形質転換アイスプラントは、前述した本発明の作出方法により得られるものと言うこともできる。
本発明の形質転換アイスプラントは、安定な完全個体としてのアイスプラントの形質転換体であるため、例えば、アイスプラントの遺伝子の機能解析や、アイスプラントの改良種の作出等に関して、極めて有用性の高いものである。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】  図１に示す手順（概略）で、アイスプラントの子葉節を、所望の遺伝子（カナマイシン耐性遺伝子（Ｋｍｒ：ｎｐｔ  ＩＩ））を含有するアグロバクテリウム属細菌により形質転換して、上記遺伝子が導入された形質転換アイスプラントを作出した。以下に、具体的な方法及び手順並びに条件等を説明する。
（１）子葉節の取得
アイスプラントの種子を２％次亜塩素酸で１０分間殺菌し、３％ショ糖及び０．８％寒天を添加したＭＳ寒天培地に無菌的に播種した。播種してから７日後、発芽した苗条の子葉展開時に子葉節を切除した。子葉節は５０個体分取得した。なお上記「ＭＳ寒天培地」としては、下記の組成のものを使用した（以下同様）。
2006112034.tif 000002
（２）子葉節の前培養
取得した子葉節を、チジアズロン（ＴＤＺ；２．５ｍｇ／Ｌ）を含むＭＳ寒天培地に置床し、３日間培養した。
（３）子葉節へのアグロバクテリウム属細菌の感染
（ｉ）アグロバクテリウム属細菌の形質転換体の作製
子葉節への感染に用いるアグロバクテリウムとして、カナマイシン耐性遺伝子（Ｋｍｒ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｙｇｒ）、及びＥＧＦＰ蛍光タンパク質発現遺伝子を連結したバイナリーベクター（ｐＢＩ）を有するＥＨＡ１０１株を用いた。具体的には、凍結融解法に従い、アグロバクテリウムを形質転換した。すなわち、上述したベクター１μｇ（２〜１０μＬ）を、１．５ｍＬエッペンドルフチューブ内にある凍結状態のアグロバクテリウムコンピテントセルに加えた。このチューブに蓋をし、３７℃のウォーターバス中で５分間インキュベートした。その後チューブを氷中に移し１分間冷却した。５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＹＥＰ培地１ｍＬを加え、２６℃で２時間培養した。室温で３０秒間遠心分離（７５００ｒｐｍ）して集菌した。その後、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＹＥＰ培地１００μＬを加え菌体を溶解し、全量をカナマシンとハイグロマイシンをそれぞれ５０μｇ／ｍＬの濃度で含むＹＥＰ固形培地に塗布した。培地全体に菌体を広げて、２６℃暗所で単一コロニーができるまで４８〜７２時間培養した。
（ｉｉ）形質転換されたアグロバクテリウム属細菌の培養
形質転換したアグロバクテリウムの単一コロニーを５ｍＬのＹＥＰ培地に植菌し、２８℃で１晩振盪培養した。この培養液１ｍＬと、滅菌した５０％グリセロール水溶液１ｍＬとを混合し、−８０℃で凍結させ保存した。このストックを白菌耳でＹＥＰ寒天培地に画線し、２５℃、暗所下で２日間培養した。その後、超音波処理に用いた処理液３０ｍＬにコロニーを懸濁し、波長６００ｎｍにおける濁度が０．２になるよう調整した。
（ｉｉｉ）子葉節への感染
アグロバクテリウムを、ＴＤＺ（２．５ｍｇ／Ｌ）、アセトシリンゴン（１０ｍｇ／Ｌ）、及びＭＳ培地用無機塩類（日本製薬社製、４．６ｇ／Ｌ）を含む感染処理用液体培地に懸濁して、６００ｎｍにおける濁度が０．２になるよう調整した。容積１５ｍＬ（φ１５ｍｍ）のポリプロピレン製チューブに、上記懸濁液を２．５ｍＬ入れ、さらに前培養後の子葉節（外植体）を５０個体分入れた後、ソニケーター（井内社製、製品名：ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ  ＣＬＥＡＮＥＲ  ＡＳ−１５０）に２秒間浸漬して超音波処理した。
（４）感染後の共存培養
超音波処理後、５分間そのまま懸濁液に浸漬させ、その後、滅菌ろ紙上で余分なアグロバクテリウム懸濁液を除去した子葉節（外植体）を、アセトシリンゴン（１０ｍｇ／Ｌ）の寒天培地（寒天：８ｇ／Ｌ）を用い、約６０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１の光照射条件下で３日間培養した。
（５）除菌培養
共存培養後の子葉節（外植体）を、ＴＤＺ（２．５ｍｇ／Ｌ）、カルベニシリン（Ｃｂ；１００ｍｇ／Ｌ）、及びバンコマイシン（Ｖｍ；３００ｍｇ／Ｌ）を含むＭＳ寒天培地に移植し、３日間培養した。
（６）選択培養
除菌培養後の子葉節（外植体）を、ＴＤＺ（２．５ｍｇ／Ｌ）、Ｃｂ（１００ｍｇ／Ｌ）、Ｖｍ（３００ｍｇ／Ｌ）、及びハイグロマイシン（Ｈｙｇ；２０ｍｇ／Ｌ）を含むＭＳ寒天培地に移植して、約２週間に一度の割合で継代し、合計４週間培養した。
（７）再分化
選択培養で生存した個体を、ＴＤＺ（２．５ｍｇ／Ｌ）を含むＭＳ寒天培地上に置床し、１０〜１４日後、新しい培地へ継代培養することを２〜３回繰り返した後、不定芽を誘導した。さらに植物ホルモンを含まない上記培地に移植し、１０〜１４日間隔で新しい培地に継代することを２〜３回繰り返し根を誘導した。
（８）馴化
発根した不定芽は、滅菌したバーミキュライト（又は、フロリアライト５５２（日清紡社製）に滅菌水をふくませたものでもよい）に移植し、徐々に乾燥、強光に馴化させた。
（９）ＰＣＲによる導入遺伝子の確認
得られた形質転換アイスプラントの染色体ＤＮＡをＣＴＡＢ法により抽出した。この染色体ＤＮＡを鋳型にし、Ｋｍｒ遺伝子（ｎｐｔ  ＩＩ）の塩基配列に基づく下記のプライマーを用いて、アグロバクテリウム属細菌により導入された遺伝子（ｎｐｔ  ＩＩ）の有無を、ＰＣＲ法、及びＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動により確認した。この電気泳動の結果（写真）を図２に示す。
Ｆプライマー：
ＧＴＧＧＡＧＡＧＧＣＴＡＴＴＣＧＧＣＴＡＴＧＡＣＴＧＧＧＣＡ    （配列番号１）
Ｒプライマー：
ＴＣＡＴＡＧＡＡＧＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＡＡＴＣＧＡＡＡＴＣＴ    （配列番号２）
なお、ＰＣＲは、以下の反応組成液を用い、９４℃で３０秒の熱変性、６５℃で６０秒のアニーリング、７２℃で６０秒間の伸長のサイクルを１サイクルとして、これを３０サイクル行った。
2006112034.tif 000003
図２より、形質転換体から抽出した染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲした場合には、導入遺伝子（ｎｐｔ  ＩＩ）の存在を示すＰＣＲ産物のバンドが検出されたが（レーン１）、非形質転換体ではそのバンドは検出されず（レーン２）、形質転換体に目的の遺伝子が導入されたことが確認された。
【実施例２】  実施例１における子葉節の前培養工程において、使用する培地を、チジアズロン（ＴＤＺ；２．５ｍｇ／Ｌ）を含むＭＳ寒天培地から、チジアズロン（ＴＤＺ；５ｍｇ／Ｌ）及びナフタレン−１−酢酸（ＮＡＡ；０．１ｍｇ／Ｌ）の２種の植物ホルモンを含むＭＳ寒天培地に変えた以外は、実施例１と同様にして、アイスプラントの形質転換体を作出した。
形質転換に用いた子葉節の数（５０個体分）に対し、形質転換後の生存率（％）、及び苗条分化率（％）を、実施例１の場合（２．５ｍｇ／Ｌ  ＴＤＺ）と、実施例２の場合（５ｍｇ／Ｌ  ＴＤＺ，０．１ｍｇ／Ｌ  ＮＡＡ）とで比較した。その結果を図３（グラフ）に示す。
図３より、前培養の培地に用いる植物ホルモンの種類を、実施例２のごとく特定の種類の組合せ及び濃度とすることにより、生存率及び苗条分化率のいずれについても向上することが確認された。
【産業上の利用可能性】  本発明によれば、従来不可能であった、アグロバクテリウム属に属する微生物を用いた遺伝子導入法によるアイスプラントの形質転換方法、及び形質転換アイスプラントの作出方法を提供することができ、安定な完全個体としての形質転換アイスプラントを提供することができるため、例えば、アイスプラントの遺伝子の機能解析、及びアイスプラントの改良種の作出等に関し、極めて有用性の高いものと言える。
【配列表フリーテキスト】  配列番号１：プライマー
配列番号２：プライマー
【図１】
2006112034.tif 000004
【図２】
2006112034.tif 000005
【図３】
2006112034.tif 000006
【配列表】
2006112034000001.xml
【国際調査報告】
2006112034.tif 000008
2006112034.tif 000009