(57)【要約】  確実なアレルギー（アトピー）性疾患の病態の診断法を確立し、それにあわせた個々の患者へのテーラーメイド予防、治療法の適応を行うことを可能とする。  ロイコトリエンＣ４合成酵素遺伝子のコーディング領域における多型を検出することにより、被験者のアレルギー素因を検出する、遺伝子の検出方法を提供する。当該検出方法は、気管支喘息患者に対する治療薬の選別指標を与える方法でもある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロイコトリエンＣ４合成酵素遺伝子のコーディング領域における多型を検出することにより、被験者のアレルギー素因を検出する、遺伝子の検出方法。
【請求項２】
ロイコトリエンＣ４合成酵素遺伝子のコーディング領域における多型が、ロイコトリエンＣ４合成酵素における４番目のグルタミン酸残基をコードする塩基における遺伝子多型である、請求項１記載の遺伝子の検出方法。
【請求項３】
前記遺伝子多型が、ロイコトリエンＣ４合成酵素遺伝子の１０番目の塩基であるグアニンが、他の塩基と置き換わることにより規定される遺伝子多型である、請求項２記載の遺伝子の検出方法。
【請求項４】
前記他の塩基がアデニンである、請求項３記載の遺伝子の検出方法。
【請求項５】
前記遺伝子の検出方法において用いる方法が、インベーダー・アッセイ法を行って遺伝子多型を検出する方法である、請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子の検出方法。
【請求項６】
ロイコトリエンＣ４合成酵素遺伝子のコーディング領域における多型を検出することによる、被験者のアレルギー素因の検出方法。
【請求項７】
被験者である気管支喘息患者の検体に対して、請求項１〜５のいずれかに記載の遺伝子の検出方法を行い、ロイコトリエンＣ４合成酵素遺伝子において多型遺伝子が検出された場合に、当該被験者に対する喘息治療薬からロイコトリエン受容体拮抗薬を除外して選別する、喘息治療薬の選別方法。
【請求項８】
ロイコトリエンＣ４合成酵素における４番目のグルタミン酸残基をコードする塩基における遺伝子多型を検出するための要素が備わっている、遺伝子検出用キット。
【請求項９】
前記遺伝子検出用キットが、インベーダー・アッセイ法を行って、遺伝子多型を検出するキットである、請求項８記載の遺伝子検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトの遺伝子の検出方法に関し、より具体的には、ヒトのアレルギー素因を検出するための指標となり得る遺伝子多型の検出方法に関する発明である。また、本発明は、当該検出方法を用いた喘息治療薬の選別方法に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
アレルギーは、アレルゲンの侵入により応答して生ずる、生体にとっては不利益な免疫反応の総称であり、その機序の違いにより、Ｉ型からＶ型までの、大きく５つに分類される。また、アトピー（異型の疾患の意味）とは、抗原と抗体による免疫反応のうち、IgE抗体が関与するＩ型の反応を示す遺伝的な素質を意味する用語である。そして、このアトピーがかかわって発症する疾患が、アトピー性疾患である。アレルギー疾患の多くは、このアトピー性疾患であることが知られている。かかるアレルギー（アトピー）性疾患は、遺伝的な素因と、環境要因（アレルゲンの存在）によって発症するといわれている。【０００３】
このように、アレルギー（アトピー）性疾患の発症要素として、アレルゲンは最も本質的なものであり、例えば、アトピー性喘息のアレルゲンは、ハウスダスト、ダニ、カンジダ等である場合が多く、アレルギー性鼻炎では、スギやブタクサの花粉である場合が多い。また、食物性アレルゲンとしては、鶏卵、ミルク、大豆等が挙げられる。【０００４】
アレルギー（アトピー）性疾患の発症には、まず、生体に、アレルギー（アトピー）の素因が存在することが前提となり、その生体が、アレルゲンと接触することにより、様々な要因によって、アレルギー（アトピー）性疾患が発症する。例えば、上記のＩ型アレルギーは、即時型アレルギーとして知られており、アレルゲンが、アレルギー（アトピー）の素因を有する生体内に侵入することにより、IgE抗体が産生される。このIgE抗体はFcεレセプターを介してマスト細胞や好塩基球上に結合する。ここにアレルゲンが結合することにより、２分子のIgE抗体が架橋し、その結果、細胞内顆粒に貯蔵されているヒスタミン、セロトニン、ヘパリン、アリルサルファターゼ、NCF（neutrophil chmotactic factor）、ECP（eosinophil cationic protein）などが脱顆粒により放出される。さらに、アラキドン酸から新たに産生されるロイコトリエンC4、D4、E4、プロスタグランジンE2、F2α、I2、トロンボキサンA2や、血小板活性化因子(PAF)などの化学伝達物質が放出される。これら放出されたヒスタミンやロイコトリエンなどの化学伝達物質（メディエーター）は、好酸球、好中球、リンパ球、単球、マクロファージなどの炎症細胞を刺激し、平滑筋の収縮、血管透過性の亢進、粘液分泌亢進などを引き起こし、アレルギーが発症する。【０００５】
このように、アレルギー（アトピー）性疾患の発症に際しては、まず、アレルギー（アトピー）の素因が必要であり、この素因を有する生体が、アレルゲンに感作されて免疫アレルギー反応が惹起され、さらに種々の生体内で合成された化学伝達物質等のアレルギー促進（増悪）因子が加わることでアレルギー（アトピー）性疾患が発症し、さらに当該増悪因子により重症化する。【０００６】
現在、本邦の３０％（およそ３６００万人）の人に、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー等、何らかのアレルギー（アトピー）性疾患が認められ、さらに、７０％の人が、それらの素因をもつと報告されている。さらに、近年の著しいアレルギー（アトピー）性疾患の患者数の増加による、個々の患者のＱＯＬの低下も報告され、大きな問題となっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
アレルギー（アトピー）性疾患は、遺伝的要因と環境的要因が絡み合って発症する、多因子が原因となる疾患であり、その確実な予防、治療法の確立は極めて重要な課題である。すなわち、確実なアレルギー（アトピー）性疾患の病態の診断法を確立し、それにあわせた個々の患者へのテーラーメイド予防、治療法の適応が急務となっている。【０００８】
上述したように、アレルギー（アトピー）は、（１）抗原提示、（２）IgE産生、（３）メディエーター産生、（４）標的臓器、の段階を経ることにより発症することが知られている。【０００９】
本発明の目的は、この一連のアレルギー（アトピー）の発症の過程に関連する遺伝子とアレルギー（アトピー）の素因とを関連づけ、これを利用した、アレルギー（アトピー）の素因の解析手段を提供することで、アレルギー（アトピー）性疾患の発症の予防や、アレルギー（アトピー）性疾患の治療に寄与する途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
アレルギーを規定する、最も基本的で、かつ、重要な蛋白質であるIgEの産生は、Ｔ細胞（Th2）により分泌されるインターロイキン４(IL-4)等が、B細胞を刺激することにより起こる。このように、IgEの産生は、I L-4を中心とする情報伝達により誘導され、活性化される。【００１１】
一方、このIL-4によるB細胞からのIgE産生は、T細胞（TH1）より分泌されるインターフェロンγ(IFN-γ)を中心とする情報伝達により制御され、IFN-γ産生は、その情報伝達の上流で、さらにインターロイキン１２(IL-12)やインターロイキン１８(IL-18)等の、サイトカインによるT細胞への刺激により、その産生が誘導される。【００１２】
このように、アレルギー反応の主役であるIgEの産生は、IL-4による産生誘導と、IFN-γによる産生抑制とのバランスによってコントロールされており、このバランスが崩れることによって、IgEの産生のバランスも崩れることとなる。IgE産生促進系のシステムは、IL-4が、そのレセプターであるIL-4レセプター（IL-4R）に結合することによりIgE産生が促されるシステムであり、IgE産生抑制系のシステムは、IL-12 あるいはIL-18が、それぞれのレセプターであるIL-12レセプター（IL-12R）あるいはIL-18レセプター（IL-18R）に結合することによりIFN-γが分泌され、IgE産生が抑制されるシステムである。【００１３】
また、細胞膜のIgEにアレルゲンが結合すると、その情報が細胞内に伝達される。この細胞内への情報伝達により、アラキドン酸カスケードが活性化される。つまり、細胞膜リン脂質であるアラキドン酸が、細胞質ホスホリパーゼＡ2  によって細胞内において遊離する。そして、このアラキドン酸は、さらに、シクロキシゲナーゼ、リポキシゲナーゼの修飾を受け、新たな生理活性物質となる。また、トロンボキサンＡ2合成酵素（ＴＸＡ2Synthase）により、トロンボキサンＡ2  （ＴＸＡ2）が産生され、５-リポキシゲナーゼ（５-ＬＯ）を第一段階とする反応により、ロイコトリエン（ＬＴｓ）が産生される。代謝・合成されたＬＴＣ４、ＬＴＤ４、ＬＴＥ４は、シスチニルロイコトリエン（ＣｙｓＬＴ）と呼ばれ、主に気管支や肺に分布するロイコトリエン受容体に作用することで、強力な気管支収縮を惹き起こし、アレルギー（アトピー）の増悪因子と考えられている。【００１４】
本発明者は、上記のアレルギー（アトピー）の発症のステップ（１）〜（４）のうち、（３）のメディエーター産生段階に着目し、メディエーター産生に関与するロイコトリエンＣ４合成酵素のコーディング領域に、アレルギー（アトピー）の発症と関連する遺伝子多型を見出し、当該多型を指標として用いることによってアレルギー（アトピー）の素因の解析を行うことが可能であることを明らかにした。【００１５】
すなわち、本発明は、ロイコトリエンＣ４合成酵素遺伝子のコーディング領域における多型を検出することにより、被験者のアレルギー素因を検出する、遺伝子の検出方法（以下、本検出方法ともいう）を提供する発明である。本検出方法は、いいかえれば、ロイコトリエンＣ４合成酵素遺伝子のコーディング領域における多型を検出することによる、被験者のアレルギー素因の検出方法である。【００１６】
なお、「遺伝子多型」とは、遺伝子が、その塩基配列において、個体毎に異なる特異的な部位を保有していることを意味する。遺伝子多型は、第１に、特定の遺伝子のコーディング領域の多型で、当該コーディング領域によりコードされるアミノ酸残基の多型として規定される多型を含む。このタイプの多型には、ゲノムＤＮＡにおいては認められず、ゲノムＤＮＡから、ｍＲＮＡ前駆体を経て、ｍＲＮＡになる過程（主に、ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングの過程）で生ずる多型（この多型は、主にｃＤＮＡにおける多型として特定され得る）も、含まれる。また、第２に、遺伝子多型には、特定の遺伝子の非コーディング領域（典型的には、プロモーター領域、イントロン領域等）の塩基における多型も含まれる。この場合の多型は、主に、ゲノムＤＮＡにおいて規定される多型である。遺伝子多型は、その遺伝子の多型頻度、そのｍＲＮＡの発現量、蛋白発現量、あるいは蛋白の機能等の多角的な解析により、同定される。【００１７】
また、本明細書において、「野生型」とは、遺伝子多型が認められる塩基またはアミノ酸残基において、具体的には、データベース等において公開されている遺伝子の塩基配列に基づく塩基またはアミノ酸残基である。また、多型塩基または多型アミノ酸残基とは、多型が認められる塩基またはアミノ酸残基における、野生型の塩基またはアミノ酸残基以外の塩基またはアミノ酸残基である。【００１８】
また、「遺伝子多型の検出」とは、被験者の検体において、遺伝子多型が認められる塩基またはアミノ酸残基が、野生型塩基またはアミノ酸残基であるか、あるいは、多型塩基またはアミノ酸残基であるかを検出することを意味することとする。【００１９】
ところで、本明細書におけるアミノ酸の表記方法は、三文字法及び一文字法による。念のために、かかる表記内容をここに記載する。【００２０】
『アラニン〔Ａｌａ（三文字法、以下同様）、Ａ（一文字法、以下同様）〕、バリン〔Ｖａｌ、Ｖ〕、ロイシン〔Ｌｅｕ、Ｌ〕、イソロイシン〔Ｉｌｅ、Ｉ〕、プロリン〔Ｐｒｏ、Ｐ〕、フェニルアラニン〔Ｐｈｅ、Ｆ〕、トリプトファン〔Ｔｒｐ、Ｗ〕、メチオニン〔Ｍｅｔ、Ｍ〕、グリシン〔Ｇｌｙ、Ｇ〕、セリン〔Ｓｅｒ  Ｓ〕、スレオニン〔Ｔｈｒ、Ｔ〕、システイン〔Ｃｙｓ、Ｃ〕、グルタミン〔Ｇｌｎ、Ｑ〕、アスパラギン〔Ａｓｎ、Ｎ〕、チロシン〔Ｔｙｒ、Ｙ〕、リジン〔Ｌｙｓ、Ｋ〕、アルギニン〔Ａｒｇ、Ｒ〕、ヒスチジン〔Ｈｉｓ、Ｈ〕、アスパラギン酸〔Ａｓｐ、Ｄ〕、グルタミン酸〔Ｇｌｕ、Ｅ〕』【００２１】
また、本明細書中のアミノ酸残基についての表記で、例えば、「Ｇｌｕ４Ｌｙｓ」とは、「対象となるペプチドのアミノ酸配列における４番目の、野生型のアミノ酸残基であるグルタミン酸と、多型アミノ酸残基であるリジンにより規定される、遺伝子多型」を示すこととする。【００２２】
また、同じく本明細書中の遺伝子の塩基配列についての表記で、例えば、「１０００Ｃ／Ｔ」とは、「対象となる遺伝子の塩基配列における１０００番目の、野生型の塩基であるシトシンと、多型塩基であるチミンにより規定される、遺伝子多型」を示すこととする。【００２３】
また、遺伝子多型を特定する基となる、野生型の遺伝子配列における配列表記は、特に断らない限り、全て、ｃＤＮＡの塩基配列番号である。よって、本願発明に係る遺伝子多型は、全て、少なくともｃＤＮＡにおいて認められる多型であるが、かかるｃＤＮＡの多型に対応するゲノムＤＮＡにおける多型や、ｍＲＮＡにおける多型、に基づくアレルギー素因の検出にかかわる遺伝子の検出方法も、本検出方法の技術的範囲に包含されるものである。【００２４】
さらに、本願発明に係る遺伝子多型を特定する基となる、野生型の遺伝子配列における配列表記は、ロイコトリエンＣ４合成酵素遺伝子の配列として、公開データベースにおいて登録されている配列（Gene Bank Accession Number）に基づいて行うこととする。この標記は、本願明細書に添付する配列表における番号とは異なる番号である。【００２５】
また、本発明においては、本検出方法を、気管支喘息患者の検体に対して行い、ロイコトリエンＣ４合成酵素遺伝子において多型遺伝子（多型塩基又は多型アミノ酸残基）が検出された場合に、当該検体提供者に対する喘息治療薬からロイコトリエン受容体拮抗薬を除外して選別する、喘息治療薬の選別方法が提供される。【００２６】
現在、ロイコトリエン受容体拮抗薬は、気管支喘息治療の中心となりつつある。しかし、ロイコトリエン受容体拮抗薬の治療効果が有効である者は、気管支喘息患者の７０％程度であり、残りの３０％は無効であると報告されている。後述するように、ロイコトリエン受容体拮抗薬無効群においては、ロイコトリエンＣ４合成酵素遺伝子のロイコトリエンＣ４合成酵素遺伝子多型遺伝子の存在（LTC4S  Glu4Lys等）している者が含まれると考えられる。そこで、予め、本検出方法を用いて、ロイコトリエンＣ４合成酵素遺伝子の多型を指標として、ロイコトリエン受容体拮抗薬による治療効果を予測することになり、事前に投薬無効群を選別することにより、気管支喘息の治療効率を大幅に向上させることができると考えられる。
【発明の効果】
【００２７】
本発明により、アレルギーに関連する遺伝子多型を指標として、アレルギー素因を検出可能な、遺伝子の検出方法が提供される。さらに、本発明により、当該検出方法を用いた喘息治療薬の選別方法に関する発明が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】インベーダー・アッセイ法のあらましを略図化した図面である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
上述したように、本発明は、ロイコトリエンＣ４合成酵素遺伝子のコーディング領域における多型を検出することにより、被験者のアレルギー素因を検出する、遺伝子の検出方法である。【００３０】
ロイコトリエンＣ４合成酵素遺伝子と、これがコードするロイコトリエンＣ４合成酵素蛋白質については、すでに解析がなされている。このロイコトリエンＣ４合成酵素遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列と、それに対応するアミノ酸配列は、配列番号１〜２に示した（Gene Bank Accession Number: U50136）。【００３１】
特定の遺伝子の多型と、これらの多型遺伝子がコードして産生される多型蛋白質により惹起されると考えられる現象、すなわち、種々のアレルギー性疾患（例えば、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー等）との関係を具体的に解析することにより、本検出方法において利用し得る、ロイコトリエンＣ４合成酵素遺伝子の遺伝子多型を見出すことができる。すなわち、アレルギー（アトピー）性疾患と健常人等の組み合わせにおいて、ロイコトリエンＣ４合成酵素遺伝子の多型部位と多型頻度、あるいは、その多型により生ずる蛋白の機能を解析することにより、所望する遺伝子多型を見出すことができる。かかる作業の実際については、後述する実施例において、具体的に記載する。【００３２】
本発明者は、前述したように、現在までに、ロイコトリエンＣ４合成酵素遺伝子のコーディング領域におけるアレルギー素因と関連が認められる遺伝子多型として、当該合成酵素における４番目のグルタミン酸残基をコードする塩基における遺伝子多型［例えば、ロイコトリエンＣ４合成酵素遺伝子の１０番目の塩基が、グアニン（野生型塩基）、又は他の塩基（多型塩基）、例えば、アデニンとして規定される遺伝子多型（当該多型塩基がアデニンである場合には、上記グルタミン酸残基に対する多型アミノ酸残基はリジンとして規定される）］を見出した。【００３３】
なお、ロイコトリエンＣ４合成酵素遺伝子のプロモーター部位においては、既に多型の報告(Kedda MA, et al., J Allergy Clin Immunol, 2004;113:889-895)がなされ、ロイコトリエン産生量に影響を与えることが報告されている。【００３４】
遺伝子多型部位における遺伝子多型の検出方法としては、通常公知の方法、例えば、サザンブロット法を用いたＲＦＬＰ法や、ＰＣＲ-ＲＦＬＰ法、ＨＥＴ(hetero duplex analysis)法、ＤＧＧＥ法(denaturing gradient gel electrophoresis) 法、ＤＳ(direct sequence) 法、ＣＣＭ(chemical cleavage mismatch)法、ＣＤＩ(carbodiimid modification)法、さらにはＰＣＲ法を用いた一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析法〔ＰＣＲ-ＳＳＣＰ(single-stranded conformation polymorphism) 法、以下、本明細書においてはＳＳＣＰ法という〕、ＰＣＲ/ ＧＣ-clamp 法、インベーダー・アッセイ法〔Third Wave Technologies 社（米国）〕等を用いることができる〔例えば、バイオマニュアルシリーズ１，遺伝子工学の基礎技術，山本  雅編，羊土社（1993）等を参照のこと、特に、ＰＣＲ/ ＧＣ-clamp 法については、Myers,R.M.,Shefield,V.,and Cox,D.R.(1988) in Genomic Analysis:A Practical Approach.K.Davies,ed.IRL Press Limited,Oxford,pp.95-139 等を参照のこと〕が、簡便かつ正確に遺伝子多型を特定し得るという点において、インベーダー・アッセイ法を選択することが好ましい。【００３５】
図１は、このインベーダー・アッセイ法のあらましを略図化した図面である。【００３６】
図１において、鋳型ヌクレオチド鎖１１［野生型遺伝子（ゲノムＤＮＡの塩基配列であっても、ｃＤＮＡの塩基配列であってもよい）］に対して、まず、第１のヌクレオチド鎖１２をハイブリダイズさせる。【００３７】
第１のヌクレオチド鎖１２は、鋳型ヌクレオチド鎖１１における、多型検出対象塩基〔本図では、野生型がＴ（チミン）〕に相補的な塩基〔本図では、Ａ（アデニン）〕が３’末端に位置する、鋳型ヌクレオチド鎖１１に対して相補的なヌクレオチド鎖である（なお、この例では、第１のヌクレオチド鎖１２の３’末端の塩基は、多型検出対象塩基に対して相補的であるが、たとえ相補的塩基ではなくても、その塩基が、多型検出対象塩基と第２のヌクレオチド鎖の会合反応に干渉することにより、部分的三重鎖構造が形成され得る）。【００３８】
次いで、この鋳型ヌクレオチド鎖１１と第１のヌクレオチド鎖１２との部分的２本鎖に対して、さらに、第２のヌクレオチド鎖１３をハイブリダイズさせる。【００３９】
第２のヌクレオチド鎖１３は、鋳型ヌクレオチド鎖１１に対して相補的な「相補的部分」１３１が、３’側にあり、これと連続して、検出要素が設けられた、鋳型ヌクレオチド鎖に対して非相補的な「検出用部分」１３２が、５’側にある、複合的ヌクレオチド鎖であり、「相補的部分」１３１の最も５’側の塩基は、多型検出対象塩基（Ｔ）に対して相補的な塩基（Ａ）となっている。【００４０】
この第２のハイブリダイズ反応によって、鋳型ヌクレオチド鎖１１の多型検出対象塩基部分（Ｔ）は、第１のヌクレオチド鎖１２の３’末端塩基と、第２のヌクレオチド鎖の「相補的部分」１３１の最も５’側の塩基（Ａ）との、部分的三重鎖構造が形成されることとなる。【００４１】
次いで、この部分的三重鎖構造を、その３’側で特異的に切断する活性を有するヌクレアーゼ１４を作用させて、このヌクレアーゼにより切断された、第２のヌクレオチド鎖１３の検出用部分１３２’〔３’末端が、多型検出対象塩基（Ｔ）に対して相補的塩基（Ａ）となっている〕を検出することにより、鋳型ヌクレオチド鎖１１が、野生型であることを検出することができる。【００４２】
本図においては、５’末端近傍に蛍光色素１５１とその３’側の近傍に蛍光消光物質（クエンチャー）１５２を標識した、ヘアピン型プローブ（ヌクレオチド鎖）１５を、上記のハイブリダイズ系と共存させることにより、上記の野生型の検出が可能である。【００４３】
ヘアピン型プローブ１５の３’側の一本鎖部分は、第２のヌクレオチド鎖１３の検出用部分１３２に対して相補的に設計されており、かつ、かかる一本鎖部分の最も５’側の塩基に隣り合うさらに５’側の一塩基は、多型検出対象塩基（Ｔ）となっている。そして、検出用部分１３２’が、ヘアピン型プローブ１５の一本鎖部分とハイブリダイズすると、検出用部分１３２’の３’末端の塩基（Ａ）が、ヘアピン型プローブ１５の二本鎖部分の先端において、再び、部分的三重鎖構造を形成する。これに対し、再度、ヌクレアーゼ１４が作用して、ヘアピン型プローブ１５における、蛍光色素１５１と蛍光消光物質１５２の間が切断され、蛍光色素１５１が遊離し、蛍光消光物質１５２による蛍光消光作用から開放されて、本来の蛍光が検出可能な状態となる。この蛍光を検出することにより、鋳型ヌクレオチド鎖１１が、多型検出対象塩基において多型塩基が認められない野生型遺伝子であることを検出することができる。【００４４】
これに対して、鋳型ヌクレオチド１１の多型検出対象塩基が、野生型の塩基（Ｔ）ではなく、例えば、Ｇ（グアニン）であるＳＮＰ塩基であり、これをポジティブに検出する場合には、第１のヌクレオチド鎖１２と第２のヌクレオチド鎖１３における、相補的塩基を、上記のＡから、Ｇに相補的なＣ（シトシン）として、さらに、ヘアピン型プローブ１５における蛍光色素１５１と蛍光消光物質１５２を、上記の系とは異なる蛍光を発色する蛍光色素と、これに対する蛍光消光物質とすることにより、鋳型ヌクレオチド鎖１１におけるＳＮＰｓを、異なる蛍光色素の蛍光によって検出することが可能である。【００４５】
また、鋳型ヌクレオチド１１が、野生型塩基と多型塩基を有するものが、混在する場合（ヘテロ型）は、上記の２種類の蛍光の混合型蛍光として、ポジティブに検出することも可能である。【００４６】
なお、ここには、ヘアピン型プローブを用いた検出システムを例示したが、これ以外にも、例えば、検出用部分１３２に、直接、蛍光標識やアイソトープ標識を行って、直接、検出用部分を検出することにより、遺伝子多型を検出することも可能である。さらに、ここでは、多型塩基を有する場合も、そうでない場合も、ポジティブに検出する例を示したが、いずれかの場合においては、蛍光等の標識が検出されない、ネガティブな検出を行うことも可能である。【００４７】
上述したインベーダー・アッセイ法は、技術的には、反応の進行に伴い、部分的三重鎖構造を特異的に切断するヌクレアーゼが、第２のヌクレオチド鎖の「検出用部分」を切り出す段階において（ヘアピン型プローブを用いる場合には、標識された蛍光物質を蛍光消光物質と切り離す段階においても）、連続的に働くため、蛍光等の、インベーダー・アッセイ法において用いる標識が増感される、極めて鋭敏な液相反応である。【００４８】
ＰＣＲ/ ＧＣ-clamp 法は、ＤＧＧＥ法（ＤＮＡ変性剤の直線的な濃度勾配をつけたポリアクリルアミドゲルにおける、塩基置換を含む二本鎖ＤＮＡ断片と含まない二本鎖ＤＮＡ断片の、ＤＮＡを変性させるべきＤＮＡ変性剤濃度の相違に基づく移動度の差異を利用して、ＤＮＡの塩基置換を検出する方法）の変法であり、ＤＧＧＥ法における、「複数の塩基置換がある場合に、ポリアクリルアミドゲルにおいて、最後に融解するドメインの塩基置換を検出することができない」という欠点を、ＧＣ含量の高い領域（ＧＣ-clamp ）を、塩基置換の検出対象であるＤＮＡ断片につなげることにより克服した方法である〔Shefield,V.C. et al. (1989) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:232-236等を参照のこと〕。【００４９】
よって、ＰＣＲ/ ＧＣ-clamp 法の基本的操作等は、ＤＧＧＥ法に準ずるが、塩基置換検出の対象となるＤＮＡ断片に、ＧＣ-clamp を付加する工程が必要となる。【００５０】
本検出方法における、ロイコトリエンＣ４合成酵素遺伝子の多型の検出の対象となるＤＮＡの出所は、特に限定されるべきものではなく、被験者の体細胞であれば、特に限定されない。例えば、末梢血や白血球等の血液検体を、本発明において好適に選択することができる。【００５１】
すなわち、被験者の検体細胞（分離後、培養したものを用いることもできる）から、公知の方法を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、このゲノムＤＮＡにおいて、特定の遺伝子部位における遺伝子多型（具体的には、特定の遺伝子部位における塩基の置換、欠失、挿入等）を検出することができる。また、被験者の検体細胞（分離後、培養したものを用いることもできる）から、公知の方法を用いて、ｍＲＮＡを抽出し、このｍＲＮＡを鋳型として得られるｃＤＮＡにおける多型を検出することも可能である。【００５２】
そして、この検出作業の結果、上述した特定の遺伝子部位に多型塩基が認められた場合、この遺伝子部位の変化と、アレルギー（アトピー）の素因と関連付けて、被験者が発症する可能性の高いアレルギー（アトピー）疾患の種類や、現に発症しているアレルギー（アトピー）疾患の原因を特定することができる。【００５３】
本検出方法を行う態様は、特に限定されず、選択する遺伝子多型の検出方法に応じて適宜選択することができる。典型的には、本検出方法を行うための要素が備わっている、遺伝子多型検出用キットを用いて行うことが可能である。具体的には、例えば、ウェルが設けられているマイクロプレートの個々のウェルに、本検出方法を行うために必要な材料や試薬を組み合わせて、遺伝子多型の検出反応を行い、かかる検出反応により、ロイコトリエンＣ４合成酵素の遺伝子多型を検出することができる。また、マイクロプレートに代えて、いわゆるマイクロアレイを用いて、ロイコトリエンＣ４合成酵素の遺伝子多型の検出を、さらに集約的に行うことも可能である。このように、この遺伝子多型検出用キットは、マイクロプレートやマイクロアレイ等の遺伝子検出を行う器具、試薬、希釈液等を、必要に応じて組み合わせて、その構成要素とすることができる。【００５４】
本検出方法を行うことによって、例えば、ロイコトリエンＣ４合成酵素遺伝子に多型塩基またはアミノ酸残基が認められる場合には、被験者において、アレルギー（アトピー）の素因が認められ、現時点で、被験者に異常がなくても、アレルギー（アトピー）疾患を発症するリスクが高いことを明らかにすることができる。このような場合、環境因子対策（例えば、ハウスダスト対策や、非アレルゲン食物の摂取等）を行うことによって、アレルギー（アトピー）疾患の発症を予防することが可能である。【００５５】
また、既にアレルギー（アトピー）疾患を発症している被験者に対して、本検出方法を行うことにより、その疾患に対する原因を遺伝子レベルで、高い確度で推定することが可能である。このような場合、特定されたロイコトリエンＣ４合成酵素遺伝子の多型に対応した治療方法を選択することにより、より効果的なアレルギー（アトピー）疾患の治療を行うことができる。【００５６】
さらに、ロイコトリエンＣ４合成酵素遺伝子の多型がアレルギー（アトピー）疾患を惹起するメカニズムを明らかにすることにより、かかるメカニズムに対応した、アレルギー（アトピー）の治療薬の開発の途を提供することも可能である。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例により、本発明を、さらに具体的に説明するが、これにより、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。【００５８】
本実施例においては、シクロキシゲナーゼ系酵素及びリポキシゲナーゼ系酵素が関わって産生される最終代謝産物である、ロイコトリエンＥ４（ＬＴＥ４）及び11-デオキシトロンボキサンＢ２の測定を行った。アレルギー（アトピー）性疾患では、尿中のＬＴＥ４排泄量が高値である傾向が認められるが、あえて、尿中のＬＴＥ４排泄量が低値であるアレルギー患者を抽出し、当該患者群におけるロイコトリエンＣ４合成酵素遺伝子の解析を行った。
【００５９】
［尿中のロイコトリエンＥ４と11-デヒドロトロンボキサンＢ２の定量］
尿サンプルは、随時、新鮮尿を採取後、測定までの間、−８０℃にて保存した。尿中ロイコトリエンＥ４（ＬＴＥ４）は、ロイコトリエンＣ４/Ｄ４/Ｅ４エンザイムイムノアッセイシステム（アマシャム社製）を用いて定量した。尿サンプルは、予めＣ１８逆相カラム（資生堂社製）を結合した高速液体クロマトグラフィーにより、低分子量物質を抽出した。当該抽出物に、一定量のバッファーを添加し、上記測定キットを用いて定量した。また、同時に尿中のクレアチニン濃度を定量し、当該クレアチニン濃度で補正した測定値を、被験検体の尿中ＬＴＥ４排泄濃度（pg/mg クレアチニン）とした。【００６０】
尿中11-デヒドロトロンボキサンＢ２（11ＤＴＸＢ２）排泄量は、先ず、ボンドエルートＣ１８カラム（ＧＬサイエンス社製）を用いて、尿中の低分子量物質を抽出し、抽出した低分子量物質を一定量のアッセイバッファーにて溶解し、11-デヒドロトロンボキサンＢ２［１２５Ｉ］ＲＩＡキット（パーキンエルマーライフアンドアナリティカルサイエンス社製）を用いて測定した。ＬＴＥ４の場合と同様に、尿中11ＤＴＸＢ２排泄量は、尿中クレアチニン濃度で補正した値を、被験検体の尿中11ＤＴＸＢ２排泄量（pg/mg クレアチニン）とした。【００６１】
なお、本実施例における尿中クレアチニン濃度は、クレアチニン測定キット（ピュアオートＳ  ＣＲＥ-Ｌ、第一化学薬品株式会社製）を用いて定量した。【００６２】
アレルギー患者１３６名における、尿中11-デヒドロトロンボキサンＢ２排泄量は、４０〜６０７０（平均１２９４．８）（pg/mg  クレアチニン）であり、尿中ＬＴＥ４排泄量は、８６．９〜１８４０（平均３６４）（pg/mg  クレアチニン）であった。非アレルギー患者における、尿中11-デヒドロトロンボキサンＢ２排泄量は２３９〜２８３２（平均９７７．１）（pg/mg  クレアチニン）であり、尿中ＬＴＥ４排泄量は、１０３〜３４７（平均１９０．４）（pg/mg  クレアチニン）であった。しかしながら、アレルギー患者３名においては、尿中ＬＴＥ４排泄量は２５０（pg /mg  クレアチニン）以下と低値を示していた。【００６３】
［ロイコトリエンＣ４合成酵素遺伝子の解析］
ゲノムＤＮＡは、アレルギー患者、又は、非アレルギー患者の末梢血白血球より、ＤＮＡ抽出キット（セパジーンキット、三光純薬社製）を用いて抽出した。ロイコトリエンＣ４合成酵素遺伝子（ＬＴＣ４S）（配列番号１〜２：Gene Bank Accession Number: U50136）の各エクソンは、各エクソンを含むイントロン領域に相補的な配列のプライマーセット（配列番号２〜１１）を、常法により合成し、これらのプライマーセットを用いたＰＣＲ反応により合成した。ＰＣＲ反応は94℃で1分間、54℃で1分間、72℃で1分間のサイクルで、４０サイクル行なった。塩基配列は、このＰＣＲ反応で増幅した増幅産物を、蛍光色素ラベリングキット（ＰＥバイオシステムズ社製）にて標識し、ＡＢＩ3100ＤＮＡシークエンサーにて決定した。【００６４】
（プライマーシーケンス）
LTC4S exon 1 Forward:5'-aggctgctcttcctctcctg-3'（配列番号３）
LTC4S exon 1 Reverse:5'-cttcctagataggaaccagc-3'（配列番号４）
LTC4S exon 2 Forward:5'-ccttagggagaggacacg-3'（配列番号５）
LTC4S exon 2 Reverse:5'-ctcactgggctcggtagacg-3'（配列番号６）
LTC4S exon 3 Forward:5'-caccgcagggtgaactgcag-3'（配列番号７）
LTC4S exon 3 Reverse:5'-accttcatgaaagaagatgccg-3'（配列番号８）
LTC4S exon 4 Forward:5'-tgcgtacctctcgcaggcgc-3'（配列番号９）
LTC4S exon 4 Reverse:5'-ctcacctgagctgcgcggagcg-3'（配列番号１０）
LTC4S exon 5 Forward:5'-gcaggctggcaccgctgtac-3'（配列番号１１）
LTC4S exon 5 Reverse:5'-ggtctcggtcactagaac-3'（配列番号１２）【００６５】
各遺伝子増幅産物における多型の解析はシーケンスにより同定した。ＬＴＣ４SとGlu4Lys多型の解析は、ＰＣＲ-ＲＦＬＰ（ＰＣＲ-restriction fragment length polymorphism）により行った。すなわち、ＰＣＲ法を行うことにより得た各遺伝子増幅産物を、制限酵素Mnl I（１０units）と共に、３７℃で１時間反応させ、当該反応後に、１２％ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を行い、制限酵素で消化されたフラグメントをエチジウムブロマイドで染色し、多型の分析を行った。【００６６】
上記の解析の結果、アレルギー群１３６名のうち、５名に、当該合成酵素遺伝子の１０番目の野生型塩基であるグアニンが、アデニンに置換されている（LTC4S  Glu4Lys多型）ことが判明した。これに対して、非アレルギー群１１０名のうち、ロイコトリエンＣ４合成酵素遺伝子における上記の多型は、全く認められなかった。【００６７】
このように、ロイコトリエンＣ４合成酵素遺伝子によってコードされる、当該合成酵素蛋白質の４番目の野生型アミノ酸残基であるグルタミン酸残基が、リジン残基に置換する多型は、被験者のアレルギー素因と関連する遺伝子多型であることが明らかになった。【００６８】
［インベーダー・アッセイによるLTC4S  Glu4Lys多型の解析］
上述した、アレルギー群１３６名と非アレルギー群１１０名に対して、LTC4S  Glu4Lys多型の解析を、合成して得た下記のオリゴヌクレオチドを用いて、前述したインベーダー・アッセイ法により行った。【００６９】
（インベーダー・アッセイ法に用いたオリゴヌクレオチド）
LTC4S-A/野生型プローブ：cgcgccgaggGAGGTAGCTCTACTGGC(27mer：配列番号１３)
LTC4S-A/変異型プローブ：acggacgcggagAAGGTAGCTCTACTGGC(29mer：配列番号１４)
LTC4S-A/インベーダーオリゴヌクレオチド：
CCACCACACCGACGGTACCATGAAGGACt(29mer：配列番号１５)【００７０】
384ウェルプレートに、ゲノムDNA(20 ng/μl)、及び、陰性・陽性コントロール用合成オリゴヌクレオチド（配列番号１５：150 ng/3.0μl/ウェル）を加えた。さらに、各ウェルにミネラルオイルを6.0μl/ウェルで加え、プレートを95℃で10分間インキュベート後、3.0μlのプローブ/クリーベース（上述したヌクレアーゼ１４の商品名）/塩化マグネシウム溶液（PPIミックス1.2μl＋クリーベース/塩化マグネシウム溶液 0.4μl）を各ウェルに加え、サーマルサイクラーPTC-100（エムジェイジャパン株式会社製）で、63℃・４時間の反応を行った。反応後、各ウェルの蛍光強度をサイトフロー4000（アプライドバイオシステム社製）を用いて、FAM(Excitation 485nm/Emission 530nm)、及び、REDの蛍光強度を、下記式を用いてアレル比を求め、被験者の遺伝子多型についての決定を行った。【００７１】
【数１】
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上記式により得られた被検サンプルの遺伝子型は、以下のように求められる。【００７２】
【表１】
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【００７３】
上記のインベーダー・アッセイ法による解析の結果、アレルギー群１３６名のうち、５名に、当該合成酵素遺伝子の１０番目の野生型塩基であるグアニンが、アデニンに置換されている（LTC4S  Glu4Lys多型）ことが判明した。これに対して、非アレルギー群１１０名のうち、ロイコトリエンＣ４合成酵素遺伝子における上記の多型は、全く認められなかった。以上のように、インベーダー・アッセイ法によっても、上述したＲＦＬＰ法による解析と同様の結果が得られた。【００７４】
［ロイコトリエン受容体拮抗薬に対する反応性］
気管支喘息の治療薬であるロイコトリエン受容体拮抗薬〔モンテルカスト（シングレア（登録商標)）〕に対する反応性について、LTC4S  Glu4Lys多型における薬剤効果（薬剤投薬前後の喘息症状の改善度）の差異について検討した。その結果、LTC4S  Glu4Lys多型の多型アミノ酸残基が認められる気管支喘息の症例４例全てにおいて、投薬後における喘息症状の改善が認められなかった。【００７５】
従って、LTC4S  Glu4Lys多型の多型アミノ酸残基が認められるアレルキー（アトピー）性患者における治療薬として、ロイコトリエン受容体拮抗薬は適さないことが示された。【００７６】
現在、ロイコトリエン受容体拮抗薬は、気管支喘息治療の中心となりつつある。しかし、ロイコトリエン受容体拮抗薬の治療効果が有効である者は、気管支喘息患者の７０％程度であり、残りの３０％は無効であると報告されている。すなわち、ロイコトリエン受容体拮抗薬無効群の中に、LTC4S  Glu4Lys多型に起因する症例が含まれると考えられる。そこで、予め、本検出方法を用いて、LTC4S  Glu4Lys多型を指標として、ロイコトリエン受容体拮抗薬による治療効果を予測し、事前に投薬無効群を選別することにより、気管支喘息の治療効率を大幅に向上させることができると考えられる。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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