【手続補正書】
【提出日】令和2年9月14日(2020.9.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、
（ａ）（ｉ）アレイで配置されている複数のレザバ―であって、各々のレザバ―が宿主細胞および前記宿主細胞内に導入しようとする外因性物質を各々が含む、レザバー、および（ｉｉ）音響放射を発生および指向させるための音響放射発生器を含むシステムを提供するステップ、
（ｂ）前記音響放射発生器を前記レザバーの他のいかなるものとも同時に音響的に接続せずに、前記音響放射発生器を前記レザバーのうちの第１のレザバーと音響的に接続するステップ、
（ｃ）前記音響放射発生器を作動させて、音響放射を発生させ、前記宿主細胞のソノポレーションが誘導される様式で前記第１のレザバー内へと指向させ、それによりソノポレートされた前記宿主細胞内への前記外因性物質の導入を促進するステップ、
（ｄ）前記音響放射発生器を前記第１のレザバーから音響的に分離するステップ、
（ｅ）前記音響放射発生器を前記レザバーの他のいかなるものとも同時に音響的に接続せずに、前記音響放射発生器を前記レザバーのうちの第２のレザバーと音響的に接続するステップ、
（ｆ）前記第２のレザバーにつき、ステップ（ｃ）を繰り返すステップ、ならびに
（ｇ）前記音響放射発生器を前記第２のレザバーから音響的に分離し、その後、前記複数のレザバーの追加のレザバーにつき、ステップ（ｂ）〜（ｆ）を繰り返すステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記複数のレザバーが、９６個のレザバー、３８４個のレザバー、１５３６個のレザバー、３４５６個のレザバー、または３４５６個よりも多くのレザバーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記レザバーが、一体型多重レザバーユニットを含む担体内に含まれている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記一体型多重レザバーユニットが、ウェルプレートを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｇ）が、最大で約０．５秒のレザバー間移行時間で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記レザバー間移行時間が、最大で約０．１秒である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記レザバー間移行時間が、最大で約０．００１秒である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
各レザバー間移行が、前記レザバーを前記音響放射発生器に対して移動させることにより実施される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
各レザバー間移行が、前記音響放射発生器を前記レザバーに対して移動させることにより実施される、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記音響放射発生器が、集束素子を含み、ステップ（ｃ）が、前記レザバー内へと指向させた音響放射が集束音響放射になるように、ステップ（ｃ）で発生させた音響放射を集束させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記宿主細胞および前記外因性物質が、流体媒体内に含まれている、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記宿主細胞のソノポレーションを誘導するための様式が、発生させた前記音響放射を前記宿主細胞に付与するための手段を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
音響放射を前記宿主細胞に付与するための手段が、トランスフェクション刺激物質を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記トランスフェクション刺激物質が、前記流体媒体内に複数の音響活性化可能な部分を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記音響活性化可能な部分が、局所化流体容積を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記局所化流体容積が、取り囲まれた流体容積である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記取り囲まれた容積が、気体充填マイクロバブルを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｃ）で発生させ、前記レザバー内へと指向させた音響放射は、前記マイクロバブルが、前記マイクロバブルの平均共鳴周波数から約１５％以内の、または前記マイクロバブルの平均共鳴周波数の高調波から約１５％以内の波長を有する励起放射を受け取るようなものである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｃ）で発生させ、前記レザバー内へと指向させた音響放射は、前記マイクロバブルが、前記マイクロバブルの平均共鳴周波数から約５％以内の、または前記マイクロバブルの平均共鳴周波数の高調波から約５％以内の波長を有する励起放射を受け取るようなものである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記システムが、前記マイクロバブルから前記細胞への音響放射の移転を可能にするように、前記マイクロバブルが前記宿主細胞と十分に接近することを確実にするための手段をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記手段が、ステップ（ｂ）の前に、前記マイクロバブルを前記宿主細胞にコンジュゲートすることを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、
（ａ）（ｉ）各々のレザバ―が音響活性化可能な気体充填マイクロバブルにコンジュゲートされた宿主細胞、および前記宿主細胞内に導入しようとする外因性物質を含む少なくとも２つのレザバーであって、前記宿主細胞および外因性物質が流体媒体内に包まれている、レザバー、および（ｉｉ）音響放射を発生および指向させるための音響放射発生器を含むシステムを提供するステップ、
（ｂ）前記音響放射発生器を前記レザバーの他のいかなるものとも同時に音響的に接続せずに、前記音響放射発生器を前記レザバーのうちの第１のレザバーと音響的に接続するステップ、
（ｃ）前記音響放射発生器を作動させて、音響放射を発生させ、前記マイクロバブルを音響的に活性化させる様式で前記第１のレザバー内へと指向させ、ここで、音響放射が前記マイクロバブルから前記宿主細胞へと移転されて、ソニポレートされた宿主細胞を提供し、それによりソノポレートされた前記宿主細胞内への前記外因性物質の導入を促進するステップ、
（ｄ）前記音響放射発生器を前記第１のレザバーから音響的に分離するステップ、
（ｅ）前記音響放射発生器を前記レザバーの他のいかなるものとも同時に音響的に接続せずに、前記音響放射発生器を前記レザバーのうちの第２のレザバーと音響的に接続するステップ、
（ｆ）前記第２のレザバーにつき、ステップ（ｃ）を繰り返すステップ
を含む、方法。
【請求項２３】
各レザバー中の前記流体媒体の容積が、約０．５μＬ〜約５００μＬの範囲である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２４】
前記流体媒体が、等張性緩衝液を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞が、前記レザバーの表面で平板培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が、非接着性である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記外因性物質が、核酸、プラスミド、ペプチド、タンパク質、脂質、ポリサッカリド、小型分子、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記外因性物質が、ＤＮＡプラスミドを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記外因性物質が、リボ核タンパク質を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記リボ核タンパク質が、宿主細胞核酸を変更することが可能である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記リボ核タンパク質が、ガイドＲＮＡ、およびＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡ−プログラム可能な（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ）ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレアーゼタンパク質またはタンパク質複合体を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記リボ核タンパク質が、ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記リボ核タンパク質が、ガイドＲＮＡ、および触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡ−プログラム可能なＤＮＡまたはＲＮＡヌクレアーゼタンパク質またはタンパク質複合体を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ステップ（ｃ）では、ソノポレートすることが、前記レザバーを、約１５秒間〜約４０秒間にわたって毎秒約１０〜約２５トーンバーストの速度の音響トーンバーストで照射することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
各周期的音響トーンバーストが、およそ５サイクル〜１０サイクルのトーンバーストである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、
（ａ）（ｉ）宿主細胞および前記宿主細胞内に導入しようとする外因性物質を各々が含む少なくとも２つのレザバーであって、前記宿主細胞および外因性物質が流体媒体内に包まれている、レザバー、および（ｉｉ）音響放射を発生および指向させるための音響放射発生器を含むシステムを提供するステップ、
（ａ’）音響的に活性化可能な気体充填マイクロバブルを前記流体媒体に添加し、前記マイクロバブルを前記宿主細胞にコンジュゲートさせるステップ、
（ｂ）前記音響放射発生器を前記レザバーの他のいかなるものとも同時に音響的に接続せずに、前記音響放射発生器を前記レザバーのうちの第１のレザバーと音響的に接続するステップ、
（ｃ）前記音響放射発生器を作動させて、音響放射を発生させ、前記マイクロバブルを音響的に活性化させる様式で前記第１のレザバー内へと指向させ、ここで、音響放射が前記マイクロバブルから前記宿主細胞へと移転されて、ソニポレートされた宿主細胞を提供し、それによりソノポレートされた前記宿主細胞内への前記外因性物質の導入を促進するステップ、
（ｄ）前記音響放射発生器を前記第１のレザバーから音響的に分離するステップ、
（ｅ）前記音響放射発生器を前記レザバーの他のいかなるものとも同時に音響的に接続せずに、前記音響放射発生器を前記レザバーのうちの第２のレザバーと音響的に接続するステップ、ならびに
（ｆ）前記第２のレザバーにつき、ステップ（ｃ）を繰り返すステップ
を含む、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
さらなる実施形態では、細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、音響放射発生器を、宿主細胞、宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、流体媒体、および複数の音響活性化可能な局所化流体容積を含むトランスフェクション刺激物質を含む選択されたレザバーと音響的に接続するステップ；ならびに音響放射発生器を作動させて音響放射を発生させ、局所化流体容積が音響的に活性化される様式で音響放射をレザバー内へと指向させ、それにより音響的に活性化された局所化流体容積の近傍にある宿主細胞内への外因性物質の組込みを促進するステップを含み、発生される音響放射は、局所化流体容積の少なくとも５０％が照射後に依然としてインタクトのままであることを確実にするように選択された音響ソノポレーション圧力におけるものである、方法が提供される。この実施形態の一態様では、音響ソノポレーションは、局所化流体容積のキャビテーションをもたらすことになる最低音圧の約５０％〜約９０％の範囲である。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、
（ａ）（ｉ）宿主細胞および前記宿主細胞内に導入しようとする外因性物質を各々が含む少なくとも２つのレザバー、および（ｉｉ）音響放射を発生および指向させるための音響放射発生器を含むシステムを提供するステップ、
（ｂ）前記音響放射発生器を前記レザバーの他のいかなるものとも同時に音響的に接続せずに、前記音響放射発生器を前記レザバーのうちの第１のレザバーと音響的に接続するステップ、
（ｃ）前記音響放射発生器を作動させて、音響放射を発生させ、前記宿主細胞のソノポレーションが誘導される様式で前記第１のレザバー内へと指向させ、それによりソノポレートされた前記宿主細胞内への前記外因性物質の導入を促進するステップ、
（ｄ）前記音響放射発生器を前記第１のレザバーから音響的に分離するステップ、
（ｅ）前記音響放射発生器を前記レザバーの他のいかなるものとも同時に音響的に接続せずに、前記音響放射発生器を前記レザバーのうちの第２のレザバーと音響的に接続するステップ、ならびに
（ｆ）前記第２のレザバーにつき、ステップ（ｃ）を繰り返すステップ
を含む、方法。
（項目２）
前記少なくとも２つのレザバーが、複数のレザバー内に含まれており、前記方法が、（ｇ）前記音響放射発生器を前記第２のレザバーから音響的に分離し、その後、前記複数のレザバーの追加のレザバーにつき、ステップ（ｂ）〜（ｇ）を繰り返すステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記複数のレザバーが、９６個のレザバー、３８４個のレザバー、１５３６個のレザバー、３４５６個のレザバー、または３４５６個よりも多くのレザバーを含む、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記レザバーが、アレイで配置されている、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記レザバーが、一体型多重レザバーユニットを含む担体内に含まれている、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記一体型多重レザバーユニットが、ウェルプレートを含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
ステップ（ｃ）〜（ｅ）が、最大で約０．５秒のレザバー間移行時間で実施される、項目１に記載の方法。
（項目８）
ステップ（ｂ）〜（ｇ）の反復が、最大で約０．５秒のレザバー間移行時間で実施される、項目２に記載の方法。
（項目９）
前記レザバー間移行時間が、最大で約０．１秒である、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記レザバー間移行時間が、最大で約０．００１秒である、項目８に記載の方法。
（項目１１）
各レザバー間移行が、前記レザバーを前記音響放射発生器に対して移動させることにより実施される、項目８に記載の方法。
（項目１２）
各レザバー間移行が、前記音響放射発生器を前記レザバーに対して移動させることにより実施される、項目８に記載の方法。
（項目１３）
前記音響放射発生器が、集束素子を含み、ステップ（ｃ）が、前記レザバー内へと指向させた音響放射が集束音響放射になるように、ステップ（ｃ）で発生させた音響放射を集束させることをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記宿主細胞および前記外因性物質が、流体媒体内に含まれている、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記宿主細胞のソノポレーションを誘導するための様式が、発生させた前記音響放射を前記宿主細胞に付与するための手段を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
音響放射を前記宿主細胞に付与するための手段が、トランスフェクション刺激物質を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記トランスフェクション刺激物質が、前記流体媒体内に複数の音響活性化可能な部分を含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記音響活性化可能な部分が、局所化流体容積を含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記局所化流体容積が、取り囲まれた流体容積である、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記取り囲まれた容積が、気体充填マイクロバブルを含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
ステップ（ｃ）で発生させ、前記レザバー内へと指向させた音響放射は、前記マイクロバブルが、前記マイクロバブルの平均共鳴周波数から約１５％以内の、または前記マイクロバブルの平均共鳴周波数の高調波から約１５％以内の波長を有する励起放射を受け取るようなものである、項目１６に記載の方法。
（項目２２）
ステップ（ｃ）で発生させ、前記レザバー内へと指向させた音響放射は、前記マイクロバブルが、前記マイクロバブルの平均共鳴周波数から約５％以内の、または前記マイクロバブルの平均共鳴周波数の高調波から約５％以内の波長を有する励起放射を受け取るようなものである、項目１９に記載の方法。
（項目２３）
前記システムが、前記マイクロバブルから前記細胞への音響放射の移転を可能にするように、前記マイクロバブルが前記宿主細胞と十分に接近することを確実にするための手段をさらに含む、項目２０に記載の方法。
（項目２４）
前記手段が、ステップ（ｂ）の前に、前記マイクロバブルを前記宿主細胞にコンジュゲートすることを含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
ステップ（ａ）で提供された前記システム中の前記宿主細胞が、前記マイクロバブルにコンジュゲートされる、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
各レザバー中の前記流体媒体の容積が、約０．５μＬ〜約５００μＬの範囲である、項目１４に記載の方法。
（項目２７）
前記流体媒体が、等張性緩衝液を含む、項目１４に記載の方法。
（項目２８）
前記細胞が、前記レザバーの表面で平板培養される、項目１に記載の方法。
（項目２９）
前記細胞が、非接着性である、項目１に記載の方法。
（項目３０）
前記外因性物質が、核酸、プラスミド、ペプチド、タンパク質、脂質、ポリサッカリド、小型分子、またはそれらの組み合わせを含む、項目１に記載の方法。
（項目３１）
前記外因性物質が、ＤＮＡプラスミドを含む、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記外因性物質が、リボ核タンパク質を含む、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記リボ核タンパク質が、宿主細胞核酸を変更することが可能である、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記リボ核タンパク質が、ガイドＲＮＡ、およびＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡ−プログラム可能な（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ）ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレアーゼタンパク質またはタンパク質複合体を含む、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記リボ核タンパク質が、ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質を含む、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記リボ核タンパク質が、ガイドＲＮＡ、および触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡ−プログラム可能なＤＮＡまたはＲＮＡヌクレアーゼタンパク質またはタンパク質複合体を含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
ステップ（ｃ）では、ソノポレートすることが、前記レザバーを、約１５秒間〜約４０秒間にわたって毎秒約１０〜約２５トーンバーストの速度の音響トーンバーストで照射することを含む、項目１に記載の方法。
（項目３８）
各周期的音響トーンバーストが、およそ５サイクル〜１０サイクルのトーンバーストである、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
宿主細胞をトランスフェクトするための方法であって、
（ａ）前記宿主細胞と適合する流体媒体に、第１の結合部分で表面機能化された複数の気体充填マイクロバブルを懸濁することにより、マイクロバブル組成物を調製するステップ、
（ｂ）前記マイクロバブルを、前記宿主細胞のタイプに特異的であり、かつ前記第１の結合部分に連結する第２の結合部分で機能化されている抗体と、前記流体媒体中で前記マイクロバブルを前記抗体と混合することによりコンジュゲートし、それによりマイクロバブル−抗体コンジュゲートを生成するステップ、
（ｃ）前記マイクロバブル−抗体コンジュゲートを、前記宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質と混合することにより、負荷マイクロバブル−抗体コンジュゲートを調製するステップ、
（ｄ）任意選択で、前記負荷マイクロバブル−抗体コンジュゲートを宿主細胞適合性流体媒体で希釈して、それによりトランスフェクション効率の最適化に有効な負荷マイクロバブル−抗体コンジュゲート濃度を有する希釈物を提供するステップ、
（ｅ）レザバー中の宿主細胞を前記希釈物と接触させるステップ、および
（ｆ）前記マイクロバブルを、それらの平均共鳴周波数から約１５％以内の、またはそれらの平均共鳴周波数の高調波から約１５％以内の周波数で共鳴させる条件下で、音響放射を前記レザバーに照射することにより、（ｅ）で提供した前記宿主細胞−希釈物混合物をソノポレートするステップ
を含む、方法。
（項目４０）
細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、
音響放射発生器を、宿主細胞、前記宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、および流体媒体を含むレザバーと音響的に接続するステップ；ならびに
前記音響放射発生器を作動させて、音響放射を発生させ、約１０℃よりも大きな前記流体媒体の温度上昇をもたらさずに、前記宿主細胞のソノポレーションが誘導される様式で、前記音響放射を前記レザバー内へと指向させるステップ
を含む、方法。
（項目４１）
前記宿主細胞のソノポレーションが、約５℃よりも大きな前記流体媒体の温度上昇をもたらさない、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記宿主細胞のソノポレーションが、約２℃よりも大きな前記流体媒体の温度上昇をもたらさない、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
ソノポレーションが、前記流体媒体の温度を約４０℃よりも高く上昇させない、項目４０に記載の方法。
（項目４４）
前記レザバー内へと指向される音響放射が、集束音響放射である、項目４０に記載の方法。
（項目４５）
細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、
音響放射発生器を、少なくとも１５３６個のレザバーを含む一体型多重レザバーユニット内に含まれる選択されたレザバーと音響的に接続するステップであって、前記選択されたレザバーが、宿主細胞、前記宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、および流体媒体を含む、ステップ；ならびに
前記音響放射発生器を作動させて、音響放射を発生させ、前記音響放射を、前記宿主細胞のソノポレーションが誘導される様式で前記レザバー内へと指向させ、それによりソノポレートされた前記宿主細胞内への前記外因性物質の組込みを促進するステップ
を含む、方法。
（項目４６）
前記レザバー内へと指向される音響放射が、集束音響放射である、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、
音響放射発生器を、宿主細胞、前記宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、流体媒体、および複数の音響活性化可能な局所化流体容積で構成されているトランスフェクション刺激物質を含むレザバーと音響的に接続するステップ；ならびに
前記音響放射発生器を作動させて音響放射を発生させ、前記局所化流体容積が、前記局所化流体容積の平均共鳴周波数から約１５％以内のまたは前記局所化流体容積の平均共鳴周波数の高調波から約１５％以内の周波数で振動するように音響的に活性化される様式で、前記音響放射を前記レザバー内へと指向させ、それにより音響的に活性化された前記局所化流体容積の近傍にある宿主細胞内への前記外因性物質の組込みを促進するステップ
を含む、方法。
（項目４８）
音響的に活性化された前記局所化流体容積が、前記局所化流体容積の平均共鳴周波数から約５％以内であるかまたは前記局所化流体容積の平均共鳴周波数の高調波から約５％以内である周波数で振動される、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、
音響放射発生器を、宿主細胞、前記宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、流体媒体、およびサイズ分布を有する複数の音響活性化可能な局所化流体容積で構成されているトランスフェクション刺激物質を含むレザバーと音響的に接続するステップ；ならびに
前記音響放射発生器を作動させて音響放射を発生させ、選択されたサイズから約１５％以内のサイズを有する前記局所化流体容積が音響的に活性化される様式で、前記音響放射を前記レザバー内へと指向させ、それにより音響的に活性化された前記局所化流体容積の近傍にある宿主細胞内への前記外因性物質の組込みを促進するステップ
を含む、方法。
（項目５０）
細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、
（ａ）音響放射発生器を、宿主細胞、前記宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、流体媒体、および多峰形サイズ分布を有する複数の音響活性化可能な局所化流体容積で構成されているトランスフェクション刺激物質を含むレザバーと音響的に接続するステップ；
（ｂ）前記音響放射発生器を作動させて音響放射を発生させ、第１のモーダルピークから約１５％以内であるサイズを有する局所化流体容積が音響的に活性化される様式で、前記音響放射を前記レザバー内へと指向させ、それにより音響的に活性化された前記局所化流体容積の近傍にある宿主細胞内への前記外因性物質の組込みを促進するステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）を繰り返して、第２のモーダルピークから約１５％以内であるサイズを有する局所化流体容積を音響的に活性化するステップ；ならびに
（ｄ）任意選択で、ステップ（ｂ）を繰り返して、１つまたは複数の追加のモーダルピークから約１５％以内であるサイズを有する局所化流体容積を音響的に活性化するステップ
を含む、方法。
（項目５１）
細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、
音響放射発生器を、宿主細胞、前記宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、流体媒体、およびサイズ分布を有する複数の音響活性化可能な局所化流体容積で構成されているトランスフェクション刺激物質を含むレザバーと音響的に接続するステップ；ならびに
前記音響放射発生器を作動させて、選択された周波数成分を有する音響放射を発生させ、発生させた前記音響放射を、前記宿主細胞のソノポレーションが誘導される様式で前記レザバー内へと指向させ、それによりソノポレートされた前記宿主細胞内への前記外因性物質の組込みを促進するステップであって、発生させた前記音響放射の周波数成分が、前記音響活性化可能な局所化流体容積のサイズ分布と関連するように選択される、ステップを含む、方法。
（項目５２）
細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、
音響放射発生器を、宿主細胞、前記宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、流体媒体、およびトランスフェクション刺激物質を含むレザバーと音響的に接続するステップであって、前記トランスフェクション刺激物質は、前記レザバー内で空間分布を有する複数の音響活性化可能な局所化流体容積で構成されている、ステップ；ならびに
前記音響放射発生器を作動させて、選択された周波数成分を有する音響放射を発生させ、発生させた前記音響放射を、前記宿主細胞のソノポレーションが誘導される様式で前記レザバー内へと指向させ、それによりソノポレートされた前記宿主細胞内への前記外因性物質の組込みを促進するステップであって、発生させた前記音響放射の周波数成分が、前記音響活性化可能な局所化流体容積の空間分布と関連するように選択される、ステップ
を含む、方法。
（項目５３）
細胞をトランスフェクトするための音響的方法であって、
音響放射発生器を、宿主細胞、前記宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質、流体媒体、および複数の音響活性化可能な局所化流体容積を含むトランスフェクション刺激物質を含む選択されたレザバーと音響的に接続するステップ；ならびに
前記音響放射発生器を作動させて音響放射を発生させ、前記音響放射を、前記局所化流体容積が音響的に活性化される様式で前記レザバー内へと指向させ、それにより音響的に活性化された前記局所化流体容積の近傍にある宿主細胞内への前記外因性物質の組込みを促進するステップであって、発生させた前記音響放射が、前記局所化流体容積の少なくとも５０％が照射後に依然としてインタクトのままであることを確実にするように選択された音響ソノポレーション圧力におけるものである、ステップ
を含む、方法。
（項目５４）
前記音響ソノポレーション圧力が、前記局所化流体容積のキャビテーションをもたらすことになる最低音圧の約５０％〜９０％の範囲である、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
宿主細胞をトランスフェクトするための方法であって、宿主細胞を、宿主細胞適合性流体媒体中にマイクロバブル−抗体コンジュゲートおよび前記宿主細胞内にトランスフェクトしようとする外因性物質を含むレザバー中で接触させるステップ、ならびにこのようにして提供した宿主細胞−希釈物混合物を、協同して、ただし異なる周波数で作動する２つの変換器により発生された音響放射で前記レザバーを照射することによりソノポレートするステップを含み、前記変換器の一方が、環状変換器であり、周囲に作動可能に設置され、標準的変換器を封入する、方法。
（項目５６）
前記環状変換器が、約１ＭＨｚ〜約２．５ＭＨｚの範囲の周波数で作動する、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記標準的変換器が、約６ＭＨｚ〜約２０ＭＨｚの範囲の周波数で作動する、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記２つの変換器の一方が、主に、ソノポレーションのための音響エネルギーを供給するように機能し、他方の変換器が、ソノポレートされた細胞の前記流体媒体からの音響射出を可能にするように音響エネルギーを送達する、項目５５に記載の方法。
（項目５９）
前記２つの変換器の一方が、主に、ソノポレーションのための音響エネルギーを供給するように機能し、他方の変換器が、前記宿主細胞に対する前記マイクロバブルの相対的位置を変化させるための音響エネルギーを送達する、項目５５に記載の方法。
（項目６０）
前記宿主細胞に対する前記マイクロバブルの相対的位置を、前記マイクロバブルおよび前記宿主細胞が互いに接近してソノポレーションが促進されるように変化させる、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記マイクロバブルおよび前記宿主細胞が、ソノポレーションを引き起こすのに有効な音響強度の領域中で互いに接近して位置決めされる、項目５８に記載の方法。
（項目６２）
ソノポレーションを使用して宿主細胞をトランスフェクトするための方法において、以下：ソノポレーション事象後にトランスフェクション効率を評価すること、トランスフェクション効率を向上させるための候補解決策として少なくとも１つのソノポレーションパラメーターを調整すること、追加のソノポレーション事象を実施すること、および前記追加のソノポレーション事象のトランスフェクション効率を評価して、前記候補解決策の有効性を評価することを含む、向上。
（項目６３）
前記追加のソノポレーション事象のトランスフェクション効率に基づき、ソノポレーションパラメーターを変化させるステップをさらに含む、項目６１に記載の方法。
（項目６４）
前記ソノポレーションパラメーターが、音響強度、変換器出力周波数、およびトーンバーストプロファイルの少なくとも１つから選択される、項目６２に記載の方法。