(57)【要約】  本発明は、Δ９−エロンガーゼをコードする単離ポリヌクレオチド、前記単離ポリヌクレオチドによりコードされるΔ９−エロンガーゼ、前記単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記発現ベクターを含む宿主細胞、並びにΔ９−エロンガーゼ及びポリ不飽和脂肪酸の産生方法に関する。
2012533303.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離ヌクレオチド配列を含む、またはそれに対して相補的な単離核酸またはその断片であって、前記ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１８及び配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６８％の配列同一性を有する、前記単離核酸またはその断片。
【請求項２】
配列番号１７及び配列番号１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも６８％を含む、またはそれに対して相補的な、単離ヌクレオチド配列またはその断片。
【請求項３】
ポリ不飽和脂肪酸を基質として利用する、機能的に活性なエロンガーゼをコードする請求項１または２に記載の単離ヌクレオチド配列。
【請求項４】
ミドリムシ属（Ｅｕｇｌｅｎｏｉｄ  ｓｐ．）由来である、請求項１または２に記載の単離ヌクレオチド配列。
【請求項５】
ユーグレナ・デセス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｄｅｓｅｓ）Ｅｈｒ．ＣＣＭＰ  ２９１６由来である、請求項４に記載の単離ヌクレオチド配列。
【請求項６】
請求項１または２に記載の単離ヌクレオチド配列によりコードされる、精製ポリペプチド。
【請求項７】
炭素９位に不飽和を含むポリ不飽和脂肪酸を延長させ、且つ配列番号１８及び配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６８％のアミノ酸同一性を有する、精製ポリペプチド。
【請求項８】
調節配列に機能し得る形で連結されたヌクレオチド配列を含む発現ベクターであって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号１７及び配列番号１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも６８％を含む、またはそれに対して相補的である、前記発現ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１０】
真核細胞及び原核細胞からなる群から選択される、請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞及び真菌細胞からなる群から選択される、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
ダイズ、アブラナ科植物、サフラワー、ヒマワリ、トウモロコシ、ワタ及びアマからなる群から選択される油糧種子植物由来である、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
請求項８に記載の発現ベクターを含む、植物細胞、植物種子、植物または植物組織であって、前記発現ベクターのヌクレオチド配列を発現させると、前記植物細胞、植物種子、植物または植物組織により、少なくとも１つのポリ不飽和脂肪酸が産生される、前記植物細胞、植物種子、植物または植物組織。
【請求項１４】
ポリ不飽和脂肪酸が、ω６−エイコサジエン酸（ω６−ＥＤＡ）、ω３−エイコサトリエン酸（ω３−ＥＴｒＡ）及びその組合せからなる群から選択される、請求項１３に記載の植物細胞、植物種子、植物または植物組織。
【請求項１５】
ａ）配列番号１７及び配列番号１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも６８％を含む、またはそれに対して相補的な、ヌクレオチド配列を単離するステップ；
ｂ）ｉｉ）調節配列に機能し得る形で連結されたｉ）単離ヌクレオチド配列を含む、発現ベクターを構築するステップ；及び
ｃ）Δ９−エロンガーゼの産生のために十分な時間及び条件下で発現ベクターを宿主細胞に導入するステップ；
を含む、Δ９−エロンガーゼの産生方法。
【請求項１６】
宿主細胞が、真核細胞及び原核細胞からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
真核細胞が、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞及び真菌細胞からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
植物細胞が、ダイズ、アブラナ科植物、サフラワー、ヒマワリ、トウモロコシ、ワタ及びアマからなる群から選択される油糧種子植物由来である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ａ）配列番号１７及び配列番号１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも６８％を含む、またはそれに対して相補的な、ヌクレオチド配列を単離するステップ；
ｂ）ｉｉ）調節配列に機能し得る形で連結されたｉ）単離ヌクレオチド配列を含む発現ベクターを構築するステップ；
ｃ）Δ９−エロンガーゼの発現のために十分な時間及び条件下で発現ベクターを宿主細胞に導入するステップ；及び
ｄ）基質ポリ不飽和脂肪酸を第１産物ポリ不飽和脂肪酸に変換させるため、発現させたΔ９−エロンガーゼを基質ポリ不飽和脂肪酸に曝すステップ；
を含む、ポリ不飽和脂肪酸の産生方法。
【請求項２０】
基質ポリ不飽和脂肪酸が、リノール酸（ＬＡ）であり、第１産物ポリ不飽和脂肪酸が、ω６−エイコサジエン酸（ω６−ＥＤＡ）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
基質ポリ不飽和脂肪酸が、α−リノレン酸（ＡＬＡ）であり、第１産物ポリ不飽和脂肪酸が、ω３−エイコサトリエン酸（ω３−ＥＴｒＡ）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
第１産物ポリ不飽和脂肪酸を、第２またはその次の産物ポリ不飽和脂肪酸に変換させるために、第１産物ポリ不飽和脂肪酸を、少なくとも１つのデサチュラーゼ、少なくとも１つの追加エロンガーゼまたはその組合せに曝すステップを更に含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
第２またはその次の産物ポリ不飽和脂肪酸が、ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）、ω３−エイコサテトラエン酸（ω３−ＥＴＡ）、アラキドン酸（ＡＲＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びその組合せからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ａ）配列番号１７及び配列番号１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも６８％を含む、またはそれに対して相補的な、ヌクレオチド配列を単離するステップ；
ｂ）ｉｉ）調節配列に機能し得る形で連結されたｉ）単離ヌクレオチド配列を含む発現ベクターを構築するステップ；
ｃ）ｉ）発現ベクター及びｉｉ）Δ８−デサチュラーゼをコードし、且つ少なくとも１つの調節配列に機能し得る形で連結された単離ヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの追加組換えＤＮＡ構築物を、宿主細胞にΔ９−エロンガーゼ及びΔ８−デサチュラーゼの発現に十分な時間及び条件下で導入するステップ；及び
ｄ）リノール酸（ＬＡ）、α−リノレン酸（ＡＬＡ）及びその組合せからなる群から選択される基質ポリ不飽和脂肪酸を第１産物ポリ不飽和脂肪酸に変換させるため、発現させたΔ９−エロンガーゼ及びΔ８−デサチュラーゼを、前記基質ポリ不飽和脂肪酸に曝すステップ；
を含む、宿主細胞におけるポリ不飽和脂肪酸の産生方法。
【請求項２５】
第１産物ポリ不飽和脂肪酸が、ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）、ω３−エイコサテトラエン酸（ω３−ＥＴＡ）及びその組合せからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
第１産物ポリ不飽和脂肪酸を、第２またはその次のポリ不飽和脂肪酸に変換させるために、第１産物ポリ不飽和脂肪酸を少なくとも１つの追加デサチュラーゼまたは少なくとも１つの追加エロンガーゼに曝すステップを更に含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
第２またはその次のポリ不飽和脂肪酸が、アラキドン酸（ＡＲＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びその組合せからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
宿主細胞が、原核細胞及び真核細胞からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
真核細胞が、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞及び真菌細胞からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
植物細胞が、ダイズ、アブラナ科植物、サフラワー、ヒマワリ、トウモロコシ、ワタ及びアマからなる群から選択される油糧種子植物由来である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
宿主細胞にｉｉ）調節配列に機能し得る形で連結されたｉ）Δ５−デサチュラーゼをコードする単離ヌクレオチド配列を更に含む、組換えＤＮＡ構築物を導入することを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
植物細胞を、請求項２に記載の少なくとも１つの単離ヌクレオチド配列またはその断片で形質転換し、形質転換した植物細胞からトランスジェニック植物を再生させることを含む、トランスジェニック植物の作成方法。
【請求項３３】
植物細胞が、ダイズ、アブラナ科植物、サフラワー、ヒマワリ、トウモロコシ、ワタ及びアマからなる群から選択される油糧種子植物由来である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
請求項３２に記載の方法により作成したトランスジェニック植物から得た、トランスジェニック種子。
【請求項３５】
請求項８に記載の発現ベクターを含む、トランスジェニック種子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Δ９−エロンガーゼをコードする単離ポリヌクレオチド、前記単離ポリヌクレオチドによりコードされるΔ９−エロンガーゼ、前記単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記発現ベクターを含む宿主細胞、並びにΔ９−エロンガーゼ及びポリ不飽和脂肪酸の産生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）は生活形の適切な機能において多くの役割を発揮する。例えば、ＰＵＦＡは細胞の血漿膜の重要な成分であり、血漿膜でＰＵＦＡはリン脂質の形態で存在している。ＰＵＦＡは哺乳動物のプロスタサイクリン、エイコサノイド、ロイコトリエン及びプロスタグランジンに対する前駆体としても役立つ。更に、ＰＵＦＡは発達中の乳児の脳を適切に発達させるために、及び組織の形成及び修復のために必要である。ＰＵＦＡの生物学的重要性にてらして、ＰＵＦＡ及びＰＵＦＡの産生につながる中間体を効率的に産生するための試みがなされている。
【０００３】
多数の酵素、最も注目すべきデサチュラーゼ及びエロンガーゼがＰＵＦＡ生合成に関与している（図１を参照されたい）。デサチュラーゼは基質の脂肪酸アルキル鎖内の炭素原子間への不飽和（例えば、二重結合）の導入を触媒する。エロンガーゼは２−炭素単位の脂肪酸基質への付加を触媒する。例えば、リノール酸（ＬＡ，１８：２  ｎ−６）はオレイン酸（ＯＡ，１８：１  ｎ−９）からΔ１２−デサチュラーゼにより産生される。エイコサジエン酸（ＥＤＡ、２０：２  ｎ−６）はリノール酸（ＬＡ、１８：２  ｎ−６）からΔ９−エロンガーゼにより産生される。ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ，２０：３ｎ−６）はエイコサジエン酸（ＥＤＡ，２０：２  ｎ−６）からΔ８−デサチュラーゼにより産生される。アラキドン酸（ＡＲＡ，２０：４  ｎ−６）はジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ，２０：３ｎ−６）からΔ５−デサチュラーゼにより産生される（図１を参照されたい）。
【０００４】
エロンガーゼはγ−リノレン酸（ＧＬＡ，１８：３ｎ−６）のジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ，２０：３ｎ−６）への変換及びステアリドン酸（ＳＤＡ，１８：４  ｎ−３）のエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ，２０：４  ｎ−３）への変換を触媒する。エロンガーゼをアラキドン酸（ＡＲＡ，２０：４  ｎ−６）のアドレン酸（ＡＤＡ，２２：４  ｎ−６）への変換及びエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ，２０：５  ｎ−３）のω３−ドコサペンタエン酸（２２：５  ｎ−３）への変換も触媒する。Δ９−エロンガーゼは炭素９位に不飽和を含むポリ不飽和脂肪酸を延長させる。例えば、Δ９−エロンガーゼはリノール酸（ＬＡ，１８：２  ｎ−６）のエイコサジエン酸（ＥＤＡ，２０：２  ｎ−６）への変換及びα−リノレン酸（ＡＬＡ，１８：３  ｎ−３）のエイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ，２０：３  ｎ−３）への変換を触媒する。その後、ω３−ＥＴｒＡはΔ８−デサチュラーゼによりω３−ＥＴＡに変換され得る。その後、ω３−ＥＴＡは、医薬組成物、栄養組成物、動物飼料、及び化粧品のような他の製品に添加され得る他のポリ不飽和脂肪酸（例えば、ω３−ＥＰＡ）の製造に使用され得る。
【０００５】
今までに同定されたエロンガーゼは該エロンガーゼが作用する基質の点で異なる。更に、エロンガーゼは動物及び植物の両方に存在する。哺乳動物中に存在するエロンガーゼは飽和、モノ不飽和及びポリ不飽和脂肪酸に作用する能力を有する。対照的に、植物中に存在するエロンガーゼは飽和またはモノ不飽和脂肪酸に対して特異的である。よって、植物中でポリ不飽和脂肪酸を生成するためにはＰＵＦＡ特異的エロンガーゼが必要である。
【０００６】
植物及び動物において、延長プロセスは４ステップメカニズムの結果であると考えられる（Ｌａｓｓｎｅｒら，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，８：２８１−２９２（１９９６））。ＣｏＡはアシル担体である。ステップ１は、二酸化炭素及びアシル部分が２個の炭素原子により延長されたβ−ケトアシル−ＣｏＡを得るためのマロニル−ＣｏＡと長鎖アシル−ＣｏＡの縮合を含む。後続の反応は、延長アシル−ＣｏＡを得るためのβ−ヒドロキシアシル−ＣｏＡへの還元、エノイル−ＣｏＡへの脱水及び第２還元を含む。最初の縮合反応は基質特異的ステップだけでなく、律速ステップでもある。
【０００７】
動物はΔ９位を超えて脱飽和することができず、従ってオレイン酸（ＯＡ，１８：１  ｎ−９）をリノール酸（ＬＡ，１８：２  ｎ−６）に変換させることができないことに注目すべきである。同様に、哺乳動物はΔ１５−デサュラーゼ活性を持っていないので、α−リノレン酸（ＡＬＡ，８：３  ｎ−３）は哺乳動物により合成され得ない。しかしながら、α−リノレン酸は哺乳動物及び藻類においてΔ６−デサチュラーゼによりステアリドン酸（ＳＤＡ，１８：４  ｎ−３）に変換され（ＷＯ  ９６／１３５９１及び米国特許Ｎｏ．５，５５２，３０６も参照されたい）、その後エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ，２０：４  ｎ−３）に延長され得る。その後、このポリ不飽和脂肪酸（すなわち、ＥＴＡ，２０：４  ｎ−３）はΔ５−デサチュラーゼによりエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ，２０：５  ｎ−３）に変換され得る。真菌及び植物を含めた他の真核細胞は炭素１２（ＷＯ  ９４／１１５１６及び米国特許Ｎｏ．５，４４３，９７４を参照されたい）及び炭素１５（ＷＯ  ９３／１１２４５を参照されたい）で脱飽和する酵素を有している。従って、動物の主要ポリ不飽和脂肪酸は食餌に由来し及び／またはリノール酸またはα−リノレン酸の脱飽和及び延長により誘導される。哺乳動物がこれらの必須長鎖脂肪酸を産生できないことにてらして、ＰＵＦＡ生合成に関与する遺伝子を本来上記脂肪酸を産生する種から単離し、これらの遺伝子を大量の１つ以上のＰＵＦＡを産生するように改変され得る微生物、植物または動物系において発現させることが非常に興味深い。従って、エロンガーゼ酵素、前記酵素をコードする遺伝子及び前記酵素を産生する組換え方法に対する明確な要望がある。
【０００８】
上記した検討に照らして、天然に存在するレベルを超えるレベルのＰＵＦＡを含有する油及び新規ＰＵＦＡに富む油に対する明確な要望もある。前記油はエロンガーゼ遺伝子を単離し、発現させることにより作成され得る。
【０００９】
最も重要な長鎖ＰＵＦＡの１つはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）である。ＥＰＡは真菌及び魚油中に存在している。ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）も別の重要な長鎖ＰＵＦＡである。ＤＨＡは最も多くの場合魚油中に存在し、また哺乳動物脳組織から精製され得る。アラキドン酸（ＡＲＡ）は第３の重要な長鎖ＰＵＦＡである。ＡＲＡは糸状菌中に存在し、また肝臓や副腎を含めた哺乳動物組織からも精製され得る。
【００１０】
例えば、ＡＲＡ、ＥＰＡ及び／またはＤＨＡは交互Δ８−デサチュラーゼ／Δ９−エロンガーゼ経路または従来のΔ６経路を介して産生され得る（図１を参照されたい）。長鎖ＰＵＦＡ、特にＡＲＡ、ＥＰＡ及びＤＨＡを産生するための従来のΔ６経路において基質脂肪酸に対して活性であるエロンガーゼは既に同定されている。ＬＡをＤＧＬＡに変換するため及びＡＬＡをω３−ＥＴＡに変換するための従来のΔ６経路は、ＬＡをＧＬＡに、ＡＬＡをステアリドン酸（ＳＤＡ）に変換するためにΔ６−デサチュラーゼ酵素、及びＧＬＡをＤＧＬＡに、ＳＤＡをω３−ＥＴＡに変換するためにΔ６−エロンガーゼ酵素を利用している。しかしながら、ある例では、交互Δ８−デサチュラーゼ／Δ９−エロンガーゼ経路が従来のΔ６経路より好ましいことがある。例えば、ＧＬＡまたはＳＤＡのような特定の残留ω−６またはω−３脂肪酸中間体がＤＧＬＡ、ω３−ＥＴＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ω３−ドコサペンタエン酸、ω６−ドコサペンタエン酸、ＡＤＡ及び／またはＤＨＡの産生中に望ましくないならば、ＧＬＡ及びＳＤＡ形成を回避するために従来のΔ６経路の代わりに交互Δ８−デサチュラーゼ／Δ９−エロンガーゼ経路を使用し得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第９６／１３５９１号
【特許文献２】米国特許第５，５５２，３０６号明細書
【特許文献３】国際公開第９４／１１５１６号
【特許文献４】米国特許第５，４４３，９７４号明細書
【特許文献５】国際公開第９３／１１２４５号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｌａｓｓｎｅｒら，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，８：２８１−２９２（１９９６）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明では、Δ９−エロンガーゼの新規なソースが長鎖ＰＵＦＡ、特にＤＧＬＡ、ＥＴＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ω３−ドコサペンタエン酸、ω６−ドコサペンタエン酸、ＡＤＡ及び／またはＤＨＡの産生のために同定された。本発明のΔ９−エロンガーゼ酵素は、例えばＬＡをω６−ＥＤＡに、ＡＬＡをω３−ＥＴｒＡに変換する。その後のω６−ＥＤＡからのＤＧＬＡの産生及びＤＧＬＡからのＡＲＡの産生はそれぞれΔ８−デサチュラーゼ及びΔ５−デサチュラーゼにより触媒される。
【００１４】
１つの態様で、本発明は、エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離ヌクレオチド配列を含むまたはそれに対して相補的な単離核酸分子またはその断片に関し、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１８及び配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６８％の配列同一性を有している。
【００１５】
別の態様で、本発明は、配列番号１７及び配列番号１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも６８％を含むまたはそれに対して相補的な単離ヌクレオチド配列またはその断片に関する。前記単離ヌクレオチド配列またはその断片は基質としてポリ不飽和脂肪酸を用いる機能的に活性なエロンガーゼ、特に機能的に活性なΔ９−エロンガーゼをコードする。
【００１６】
ヌクレオチド配列は例えばミドリムシ属（Ｅｕｇｌｅｎｏｉｄ  ｓｐ．）由来であり得、具体的には例えばユーグレナ・デセス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｄｅｓｅｓ）Ｅｈｒ．ＣＣＭＰ  ２９１６から単離され得る。
【００１７】
別の態様で、本発明は、上記単離ヌクレオチド配列によりコードされる精製ポリペプチド、並びに炭素９位に不飽和を含むポリ不飽和脂肪酸を延長させ且つ配列番号１８及び配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６８％のアミノ酸同一性を有している精製ポリペプチドに関する。
【００１８】
もっと別の態様で、本発明は発現ベクターに関する。この発現ベクターは調節配列に機能し得る形で連結されたヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列は配列番号１７及び配列番号１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも６８％を含むまたはそれに対して相補的である。本発明はこの発現ベクターを含む宿主細胞にも関する。この宿主細胞は例えば真核細胞または原核細胞であり得る。適当な真核細胞及び原核細胞は本明細書中に記載されている。本発明は発現ベクターを含むトランスジェニック種子にも関する。
【００１９】
別の態様で、本発明は、上記発現ベクターを含む植物細胞、植物種子、植物または植物組織に関し、発現ベクターのヌクレオチド配列を発現させると植物細胞、植物または植物組織により少なくとも１つのポリ不飽和脂肪酸が産生される。ポリ不飽和脂肪酸は例えばω６−ＥＤＡ、ω３−ＥＴｒＡ及びその組合せからなる群から選択され得る。本発明は上記した植物細胞、植物種子、植物または植物組織により発現させた１つ以上の植物油または脂肪酸をも包含する。
【００２０】
更に、本発明はΔ９−エロンガーゼの産生方法に関する。この方法は、ａ）配列番号１７及び配列番号１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも６８％を含むまたはそれに対して相補的なヌクレオチド配列を単離するステップ；ｂ）ｉｉ）調節配列に機能し得る形で連結されたｉ）単離ヌクレオチド配列を含む発現ベクターを構築するステップ；及びｃ）発現ベクターを宿主細胞にΔ９−エロンガーゼの発現のために適宜十分な時間及び条件下で導入するステップ；を含む。宿主細胞は例えば真核細胞または原核細胞であり得る。特に、真核細胞は例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞または真菌細胞であり得る。植物細胞はダイズ、アブラナ科植物、サフラワー、ヒマワリ、トウモロコシ、ワタ及びアマからなる群から選択される油糧種子植物由来であり得る。
【００２１】
加えて、本発明は、ａ）配列番号１７及び配列番号１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも６８％を含むまたはそれに対して相補的なヌクレオチド配列を単離するステップ；ｂ）調節配列に機能し得る形で連結された単離ヌクレオチド配列を含む発現ベクターを構築するステップ；ｃ）発現ベクターを宿主細胞にΔ９−エロンガーゼの発現のために十分な時間及び条件下で導入するステップ；及びｄ）発現させたΔ９−エロンガーゼを基質ポリ不飽和脂肪酸に曝して、基質ポリ不飽和脂肪酸を第１産物ポリ不飽和脂肪酸に変換するステップ；を含むポリ不飽和脂肪酸の産生方法に関する。「基質」ポリ不飽和脂肪酸は例えばＬＡまたはＡＬＡであり、「第１産物」ポリ不飽和脂肪酸は、例えばω６−ＥＤＡまたはω３−ＥＴｒＡである。この方法は更に、第１産物ポリ不飽和脂肪酸を少なくとも１つのデサチュラーゼ、少なくとも１つの追加エロンガーゼまたはその組合せに曝して、第１産物ポリ不飽和脂肪酸を第２またはその次のポリ不飽和脂肪酸に変換するステップを含み得る。第２またはその次の産物ポリ不飽和脂肪酸は、例えばＤＧＬＡ、またはω３−ＥＴＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、ＤＨＡまたはその組合せであり得る。
【００２２】
別の態様で、本発明は、ａ）配列番号１７及び配列番号１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも６８％を含むまたはそれに対して相補的なヌクレオチド配列を単離するステップ；ｂ）調節配列に機能し得る形で連結された単離ヌクレオチド配列を含む発現ベクターを構築するステップ；ｃ）ｉ）発現ベクター及びｉｉ）Δ８−デサチュラーゼをコードし且つ調節配列に機能し得る形で連結された少なくとも１つの単離ヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの追加組換えＤＮＡ構築物を宿主細胞にΔ９−エロンガーゼ及びΔ８−デサチュラーゼの発現のために十分な時間及び条件下で導入するステップ；及びｄ）発現させたΔ９−エロンガーゼ及びΔ８−デサチュラーゼをＬＡ、ＡＬＡ及びその組合せからなる群から選択される基質ポリ不飽和脂肪酸に曝して、基質ポリ不飽和脂肪酸を第１産物ポリ不飽和脂肪酸に変換するステップ；を含む宿主細胞におけるポリ不飽和脂肪酸の産生方法に関する。第１産物ポリ不飽和脂肪酸は、例えばＤＧＬＡ、ω３−ＥＴＡまたはその組合せであり得る。この方法は更に、第１産物ポリ不飽和脂肪酸を少なくとも１つのデサチュラーゼ、少なくとも１つの追加エロンガーゼまたはその組合せに曝して、第１産物ポリ不飽和脂肪酸を第２またはその次のポリ不飽和脂肪酸に変換するステップを含み得る。第２またはその次の産物ポリ不飽和脂肪酸は、例えばＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、ＤＨＡまたはその組合せであり得る。１つの態様で、この方法は更に、宿主細胞にｉｉ）調節配列に機能し得る形で連結されたｉ）Δ５−デサチュラーゼをコードする単離ヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ構築物を導入することを含み得る。宿主細胞は上記した通りであり得る。
【００２３】
別の態様で、本発明は、植物細胞を配列番号１７及び配列番号１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも６８％を含むまたはそれに対して相補的な少なくとも１つの単離ヌクレオチド配列またはその断片で形質転換し、この形質転換した植物細胞からトランスジェニック植物を再生することを含むトランスジェニック植物の作成方法に関する。植物細胞はダイズ、アブラナ科植物、サフラワー、ヒマワリ、トウモロコシ、ワタ及びアマからなる群から選択される油糧種子植物由来であり得る。別の態様で、本発明は、本方法により作成されるトランスジェニック植物から得た種子に関する。
【００２４】
本明細書中で言及されている各ヌクレオチド及びアミノ酸配列に特定の配列識別番号が割り当てられていることにも注目されるべきである。参照により本明細書に組み入れられる配列表（本明細書に添付されている）は前記した各配列及びその対応する番号をリストしている。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】脂肪酸生合成経路及びこの経路におけるΔ９−エロンガーゼの役割を示す。
【図２Ａ】実施例３で検討されているベクターｐＹＸ２４２のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローン化される、それぞれＥｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１０及びＥｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１４バリアントのヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列配列番号２６及び配列番号２７のアラインメントを示す。バリアントは四角に囲まれている。
【図２Ｂ】実施例３で検討されているベクターｐＹＸ２４２のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローン化される、それぞれＥｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１０及びＥｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１４バリアントのヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列配列番号２６及び配列番号２７のアラインメントを示す。バリアントは四角に囲まれている。
【図３Ａ】ユーグレナ・デセス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｄｅｓｅｓ）Ｅｈｒ．ＣＣＭＰ  ２９１６（Ｅｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１０）由来のΔ９−エロンガーゼのアミノ酸配列（配列番号１８）とユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉａｌｉｓ）（配列番号４）、ハブト藻（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）（配列番号２）、マウスＥｌｏｖｌ４エロンガーゼ（受託番号ＡＡＧ４７６６７；配列番号２１）、ヒトＥＬＯＶＬ２エロンガーゼ（受託番号ＮＰ ０６０２４０；配列番号２２）及びシー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）エロンガーゼ（受託番号ＡＦ２４４３５６；配列番号２３）由来の公知のΔ９−エロンガーゼのアミノ酸配列のアラインメントを示す。インバリアント残基に陰影が付けられている。
【図３Ｂ】ユーグレナ・デセス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｄｅｓｅｓ）Ｅｈｒ．ＣＣＭＰ  ２９１６（Ｅｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１０）由来のΔ９−エロンガーゼのアミノ酸配列（配列番号１８）とユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉａｌｉｓ）（配列番号４）、ハブト藻（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）（配列番号２）、マウスＥｌｏｖｌ４エロンガーゼ（受託番号ＡＡＧ４７６６７；配列番号２１）、ヒトＥＬＯＶＬ２エロンガーゼ（受託番号ＮＰ ０６０２４０；配列番号２２）及びシー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）エロンガーゼ（受託番号ＡＦ２４４３５６；配列番号２３）由来の公知のΔ９−エロンガーゼのアミノ酸配列のアラインメントを示す。インバリアント残基に陰影が付けられている。
【図４Ａ】パブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓａｌｉｎａ）由来のΔ９−エロンガーゼアミノ酸配列（受託番号ＡＡＹ１５１３５；配列番号１）を示す。
【図４Ｂ】ハブト藻（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）由来のΔ９−エロンガーゼアミノ酸配列（受託番号ＡＦ３９０１７４；配列番号２）を示す。
【図４Ｃ】ユートレプティエラ属（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｓｐ．）由来のΔ９−エロンガーゼアミノ酸配列（配列番号３）を示す。
【図４Ｄ】ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉａｌｉｓ）由来のΔ９−エロンガーゼアミノ酸配列（受託番号ＣＡＴ１６６８７；配列番号４）を示す。
【図４Ｅ】ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂｅｎａ）由来のＡ９−エロンガーゼアミノ酸配列（配列番号５）を示す。
【図５Ａ】実施例１に記載されているように得たクローンプレート２ ＭＯ７のヌクレオチド配列（配列番号６）を示す。
【図５Ｂ】実施例１に記載されているように得たクローンプレート２ ＭＯ７の推定アミノ酸配列（配列番号７）を示す。
【図６Ａ】実施例２に記載されているように得たプレート２ ＭＯ７遺伝子断片推定上の３’末端のヌクレオチド配列（配列番号１３）を示す。
【図６Ｂ】実施例２に記載されているように得たプレート２ ＭＯ７遺伝子断片推定上の３’末端の予測アミノ酸配列（配列番号１４及び３０〜３２）を示す。配列番号１４及び３０〜３２は終止コドンを表す“＊”で分かれている。
【図６Ｃ】配列番号１４を示す。
【図６Ｄ】配列番号３０を示す。
【図６Ｅ】配列番号３１を示す。
【図６Ｆ】配列番号３２を示す。
【図７Ａ】実施例３に記載されているように得たユーグレナ・デセス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｄｅｓｅｓ）Ｅｈｒ．ＣＣＭＰ  ２９１６由来の推定上のΔ９−エロンガーゼ（Ｅｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１０）のヌクレオチド配列（配列番号１７）を示す。
【図７Ｂ】実施例３に記載されているように得たユーグレナ・デセス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｄｅｓｅｓ）Ｅｈｒ．ＣＣＭＰ  ２９１６の推定上のΔ９−エロンガーゼ（Ｅｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１０）のヌクレオチド配列（配列番号１７）によりコードされる予測アミノ酸配列（配列番号１８）を示す。
【図８Ａ】実施例３に記載されているように得たユーグレナ・デセス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｄｅｓｅｓ）Ｅｈｒ．ＣＣＭＰ  ２９１６由来のバリアントΔ９−エロンガーゼ（Ｅｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１４）のヌクレオチド配列（配列番号１９）を示す。
【図８Ｂ】実施例３に記載されているように得たユーグレナ・デセス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｄｅｓｅｓ）Ｅｈｒ．ＣＣＭＰ  ２９１６由来のバリアントΔ９−エロンガーゼ（Ｅｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１４）のヌクレオチド配列（配列番号１９）によりコードされる予測アミノ酸配列（配列番号２０）を示す。
【図９Ａ】マウスＥｌｏｖｌ４エロンガーゼ由来のアミノ酸配列（受託番号ＡＡＧ４７６６７；配列番号２１）を示す。
【図９Ｂ】ヒトＥＬＯＶＬ２エロンガーゼ由来のアミノ酸配列（受託番号ＮＰ ０６０２４０；配列番号２２）を示す。
【図９Ｃ】シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）エロンガーゼ由来のアミノ酸配列（受託番号ＡＦ２４４３５６；配列番号２３）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、ミドリムシ属（Ｅｕｇｌｅｎｏｉｄ  ｓｐ．）、例えばユーグレナ・デセス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｄｅｓｅｓ）Ｅｈｒ．、具体的にはユーグレナ・デセス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｄｅｓｅｓ）Ｅｈｒ．ＣＣＭＰ  ２９１６由来のΔ９−エロンガーゼ遺伝子のヌクレオチド（例えば、遺伝子）及び翻訳アミノ酸配列に関する。更に、本発明は、前記遺伝子及び前記遺伝子によりコードされる酵素の使用をも含む。例えば、遺伝子及び対応する酵素は、医薬組成物、栄養組成物及び他の有用な製品に添加され得るポリ不飽和脂肪酸（例えば、ω６−ＥＤＡ、ω３−ＥｔｒＡ、ＤＧＬＡ、ω３−ＥＴＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ω３−ドコサペンタエン酸、ω６−ドコサペンタエン酸、ＡＤＡ、ＤＨＡまたはその組合せ）を産生する際に使用され得る。
【００２７】
定義
本明細書中で使用されている単数形“ａ”、“ａｎ”及び“ｔｈｅ”は、文脈上明確な断りがない限り複数を含む。本明細書中の数値範囲の記述に関して、同じ程度の精度でその間に介在する各々の数が明白に考えられる。例えば、範囲６〜９の場合６及び９に加えて数７及び８が考えられ、範囲６．０〜７．０の場合数６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９及び７．０が明白に考えられる。
【００２８】
キメラ構築物：本明細書中で使用されているフレーズ「キメラ構築物」は通常自然界には一緒に存在しない核酸分子の組合せを指す。従って、キメラ構築物は異なるソース由来の調節配列及びコード配列、または同一ソースに由来するが通常自然界に存在する様式とは異なる様式で配置され得る調節配列及びコード配列を含む。
【００２９】
コード配列：本明細書中で使用されている用語「コード配列」は特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、その中またはその下流（３’非コード配列）に位置し、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を指す。調節配列にはプロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン及びポリアデニル化認識配列が含まれるが、これらに限定されない。
【００３０】
相補性：本明細書中で使用されている用語「相補性」は２つのＤＮＡセグメント間の関連度を指す。相補性は、適切な条件下で１つのＤＮＡセグメントのセンス鎖が他のＤＮＡセグメントのアンチセンス鎖とハイブリダイズして二重らせんを形成する能力を測定することにより調べられる。二重らせん中、アデニンは１本の鎖中に存在し、チミンは他の鎖中に存在している。同様に、グアニンが１本の鎖中に存在している場合にはシトシンは他の鎖中に存在している。２つのＤＮＡセグメントのヌクレオチド配列の関連性が大きければ、２つのＤＮＡセグメントの鎖間でハイブリッド二本鎖を形成する能力が高くなる。
【００３１】
によりコードされる、ハイブリダイゼーション、及びストリンジェントな条件：本明細書中で使用されているフレーズ「によりコードされる」はポリペプチド配列をコードする核酸配列を指し、前記ポリペプチド配列またはその一部は核酸配列によりコードされるポリペプチド由来の少なくとも３個の連続アミノ酸、より好ましくは少なくとも８個の連続アミノ酸、更により好ましくは少なくとも１５個の連続アミノ酸のアミノ酸配列を含む。
【００３２】
本発明は、ＰＵＦＡエロンガーゼ活性を有する酵素をコードし、中程度のストリンジェントな条件下で配列番号１７または配列番号１９（それぞれ図７Ａ及び８Ａに示す）からなるヌクレオチド配列を含むまたはそれに対して相補的なヌクレオチド配列を有する核酸にハイブリダイズし得る単離ヌクレオチド配列をも包含する。核酸分子は、一本鎖形の核酸分子が適切な温度及びイオン強度条件下で他の核酸分子にアニールし得るときには別の核酸分子にハイブリダイズし得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照されたい）。温度及びイオン強度の条件がハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決める。「ハイブリダイゼーション」は２つの核酸が相補配列を含んでいることが必要である。しかしながら、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチが生ずる恐れがある。核酸をハイブリダイズするための適切なストリンジェンシーは核酸の長さ及び相補度に依存する。これらの変数は当業者に公知である。より具体的には、２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が高いほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッドのＴｍの値が大きくなる。長さが１００を超えるヌクレオチドのハイブリッドの場合、Ｔｍを計算するための式が誘導されている（上掲のＳａｍｂｒｏｏｋらを参照されたい）。より短い核酸とのハイブリダイゼーションの場合、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決める（上掲のＳａｍｂｒｏｏｋらを参照されたい）。
【００３３】
典型的には、ストリンジェントな条件とは、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３で約１．５Ｍ  Ｎａイオン未満、典型的には約０．０１〜１．０Ｍ  Ｎａイオン濃度（または他の塩）であり、温度が短プローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）の場合には少なくとも約３０℃、長プローブ（例えば、５０を超えるヌクレオチド）の場合には少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件は不安定化剤（例えば、ホルムアミド）を添加しても得られ得る。低ストリンジェンシー条件の例には、３７℃での３０〜３５％  ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％  ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）のバッファー溶液を用いるハイブリダイゼーション及び５０〜５５℃での１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ  ＮａＣｌ／０．３Ｍ  クエン酸トリナトリウム）中での洗浄が含まれる。中ストリンジェンシー条件の例には、３７℃での４０〜４５％  ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％  ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション及び５５〜６０℃での０．５×〜１×ＳＳＣ中での洗浄が含まれる。高ストリンジェンシー条件の例には、３７℃での５０％  ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％  ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション及び６０〜６５℃での０．１×ＳＳＣでの洗浄が含まれる。
【００３４】
エキソン：本明細書中で使用されている用語「エキソン」は、転写され、遺伝子由来の成熟メッセンジャーＲＮＡ中に存在するが、必ずしも最終遺伝子産物をコードする配列の一部でない遺伝子の配列の部分を指す。
【００３５】
発現、アンチセンス阻害、及びコサプレッション：本明細書中で使用されている用語「発現」は機能性最終産物の産生を指す。遺伝子の発現は遺伝子の転写及びｍＲＮＡの前駆体または成熟タンパク質への翻訳を含む。
【００３６】
本明細書中で使用されているフレーズ「アンチセンス阻害」は、標的タンパク質の発現を抑えることができるアンチセンスＲＮＡ転写物の産生を指す。
【００３７】
本明細書中で使用されている用語「コサプレッション」は、同一または実質的に類似の外因性または内因性遺伝子の発現を抑えることができるセンスＲＮＡ転写物の産生を指す（米国特許Ｎｏ．５，２３１，０２０を参照されたい）。
【００３８】
機能的に均等である断片またはサブ断片：本明細書中で互換可能に使用されている用語「機能的に均等である断片またはサブ断片」及び「機能的に均等な断片またはサブ断片」は、断片またはサブ断片が活性酵素をコードしてもしなくても遺伝子発現を変化させたりある表現型を生ずる能力が保持されている単離核酸分子の部分またはサブ配列を指す。例えば、断片またはサブ断片は形質転換植物において所望の表現型を生ずるためのキメラ構築物の設計において使用され得る。キメラ構築物は、活性酵素をコードしてもしなくても核酸断片またはそのサブ断片を植物プロモーター配列に対して適切な方向に連結させることによるコサプレッションまたはアンチセンス阻害において使用するために設計され得る。
【００３９】
遺伝子、天然遺伝子、外因性遺伝子及びトランスジーン：本明細書中で使用されている用語「遺伝子」は、コード配列の前の調節配列（５’非コード配列）及び後の調節配列（３’非コード配列）を含む特定タンパク質を発現させる核酸分子を指す。
【００４０】
本明細書中で使用されているフレーズ「天然遺伝子」はそれ自身の調節配列を有する自然界に存在する遺伝子を指す。
【００４１】
「外因性」遺伝子は、通常宿主生物中に存在しないが、遺伝子導入により宿主生物に導入される遺伝子を指す。外因性遺伝子は非天然生物中に挿入される天然遺伝子またはキメラ構築物を含み得る。
【００４２】
本明細書中で使用されている用語「トランスジーン」は形質転換手順によりゲノムに導入した遺伝子を指す。
【００４３】
ワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）：本明細書中で使用されているフレーズ「ワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）」は、キダチワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ａｒｂｏｒｅｕｍ）、カイトウメン（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）、アジアワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｅｒｂａｃｅｕｍ）、リクチワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、ゴシピウム・ヒルスツム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）ｖａｒ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ、ゴシピウム・ヒルスツム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）ｖａｒ  ｍａｒｉｅ−ｇａｌａｎｔｅ、ゴシピウム・ラピデウム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｌａｐｉｄｅｕｍ）、スタート・デザート・ローズ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｓｔｕｒｔｉａｎｕｍ）、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｔｈｕｂｅｒｉ、アリゾナ・ワイルド・コットン（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｔｈｕｒｂｅｒｉ）、ハワイアンコットン（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｔｏｍｅｎｔｏｓｕｍ）またはＧｏｓｓｙｐｉｕｍ ｔｏｒｍｅｎｔｏｓｕｍの植物を指す。
【００４４】
相同性：用語「相同性」、「相同的」、「実質的に類似」及び「実質的に対応する」は本明細書中で互換可能に使用されており、１つ以上のヌクレオチド塩基の変化が核酸分子の遺伝子発現を媒介するまたはある表現型を生ずる能力に影響を与えない核酸分子を指す。これらの用語は、生じた核酸分子の機能的特性を初期の未修飾分子に比して実質的に変化させない１つ以上のヌクレオチドの欠失または挿入のような本発明の核酸分子の修飾をも指す。従って、当業者が認識しているように、本発明は具体的に例示されている配列以上を包含すると理解される。
【００４５】
宿主細胞：本明細書中で使用されているフレーズ「宿主細胞」は本発明の単離核酸配列またはその断片を含む細胞を意味する。宿主細胞は、原核細胞（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シアノバクテリア及び枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ））または真核細胞（例えば、真菌、昆虫、植物または哺乳動物細胞）であり得る。
【００４６】
使用し得る真菌細胞の例は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．）、リポミセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐｐ．）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐｐ．）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｓｐｐ．）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．）及びピチア属（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．）である。特に好ましい真菌細胞はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【００４７】
植物細胞は単子葉または双子葉植物細胞であり得る。特に好ましい植物細胞は、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）（例えば、ダイズ）、アブラナ科植物、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ  Ｌ．）（例えば、サフラワー）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）（例えば、ヒマワリ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）（例えば、トウモロコシ）、ワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）（ワタ）及びアマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｉｔｍ）（例えば、アマ）のような油糧種子植物由来である。
【００４８】
同一性、配列同一性及び配列同一性のパーセンテージ（％同一性）：本明細書中で互換可能に使用されている用語「同一性」または「配列同一性」は、ヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関連して使用されているときには、特定の比較ウィンドウにわたる最大対応性についてアラインしたときに同一である２つの配列中の核酸塩基またはアミノ酸残基を指す。よって、同一性は２つのＤＮＡまたはポリペプチドセグメントの同一鎖（センスまたはアンチセンスのいずれか）間の同一性、対応性または同等性の程度として定義される。
【００４９】
「配列同一性のパーセンテージ」または「％同一性」は、２つの最適にアラインさせた配列を特定領域にわたって比較し、同一塩基が両配列中に存在する位置の数を調べて一致した位置の数を求め、その位置の数を比較対象のセグメント中の位置の総数で割り、結果に１００を掛けることにより計算される。配列の最適アラインメントは、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２（１９８１）のアルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３（１９７０）のアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８５：２４４４（１９８８）の方法により、及び関連アルゴニズム（例えば、Ｈｉｇｇｉｎｓら，ＣＡＢＩＯＳ，５Ｌｌ５１−１５３（１９８９）、ＦＡＳＴＤＢ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５：３３８９−３４０２（１９９７））、ＰＩＬＥＵＰ（ウィスコンシン州マジソンに所在のＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）またはＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０，ウィスコンシン州マジソンに所在のＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ））を実行するコンピュータープログラムにより実施され得る（米国特許Ｎｏ．５，９１２，１２０を参照されたい）。配列同一性の％の有用な例には６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％が含まれるが、これらに限定されない。これらの同一性は本明細書中に記載されているプログラムを用いて調べることができる。
【００５０】
間接的または直接：本明細書中で使用されている用語「間接的」は、ポリ不飽和脂肪酸の産生における遺伝子及びその対応する酵素の使用に関連して使用されているときには、第１の酸を第１の酵素により第２の酸（すなわち、経路中間体）に（例えば、ＬＡを例えばΔ９−エロンガーゼによりω６−ＥＤＡに）変換し、その後第２の酸を第２の酵素を用いて第３の酸に（例えば、ω６−ＥＤＡを例えばΔ８−デサチュラーゼによりＤＧＬＡに）変換する状況を包含する。
【００５１】
本明細書中で使用されている用語「直接」は、ポリ不飽和脂肪酸の産生における遺伝子及びその対応する酵素の使用に関連して使用されているときには、酵素が直接第１の酸を第２の酸に変換し、その後第２の酸を組成物中に利用する状況（例えば、ＬＡの例えばΔ９−エロンガーゼによるω６−ＥＤＡへの変換、またはω３−ＥＴｒＡの例えばΔ８−デサチュラーゼによるω３−ＥＴＡへの変換）を包含する。
【００５２】
イントロン：本明細書中で使用されている用語「イントロン」は、タンパク質配列の一部をコードしない遺伝子中の介在配列を指す。よって、前記配列はＲＮＡに転写されるが、その後切出され、翻訳されない。この用語は切出されたＲＮＡ配列に対しても使用される。
【００５３】
単離（された）：本明細書中で使用されている用語「単離」は、当業界で公知のルーチンの技術を用いて天然に存在する環境またはソースから（例えば、細菌、藻類、真菌、植物、脊椎動物、哺乳動物等から）除去される核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、或いはタンパク質またはその生物学的に活性な部分を指す。単離された核酸分子またはタンパク質は天然環境中の核酸分子またはタンパク質を通常伴うまたはそれと相互作用する成分を実質的または本質的に含んでいない。
【００５４】
単離核酸断片または単離核酸配列：本明細書中で使用されているフレーズ「単離核酸断片」または「単離核酸配列」は、場合により合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を含有する一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを指す。ＤＮＡのポリマーの形の単離核酸断片はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントから構成され得る。（特定のポリヌクレオチドの「断片」は、具体的ヌクレオチド配列の領域に対して同一またはそれに対して相補的なだいたい少なくとも約６個の連続ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８個の連続ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０個の連続ヌクレオチド、少なくとも約１５個の連続ヌクレオチド、少なくとも約２０個の連続ヌクレオチド、少なくとも約２５個の連続ヌクレオチドの隣接配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。）ヌクレオチド（通常その５’モノホスフェートの形で存在している）は以下のようにその一文字表記により言及される：アデニル酸またはデオキシアデニル酸（それぞれ、ＲＮＡまたはＤＮＡに対して）に対して“Ａ”、シチジル酸またはデオキシシチジル酸に対して“Ｃ”、グアニル酸またはデオキシグアニル酸に対して“Ｇ”、ウリジル酸に対して“Ｕ”、デオキシチミジル酸に対して“Ｔ”、プリン（ＡまたはＧ）に対して“Ｒ”、ピリミジン（ＣまたはＴ）に対して“Ｙ”、ＧまたはＴに対して“Ｋ”、ＡまたはＣまたはＴに対して“Ｈ”、イノシンに対して“Ｉ”、及びヌクレオチドに対して“Ｎ”。
【００５５】
成熟及び前駆体：本明細書中で使用されている用語「成熟」は、用語「タンパク質」に関連して使用されているときには、翻訳後プロセシングされたポリペプチド、すなわち一次翻訳産物中に存在するプレ−またはプロペプチドが除去されているものを指す。本明細書中で使用されている用語「前駆体」は、用語「タンパク質」に関連して使用されているときには、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物、すなわちプレ−及びプロペプチドがなお存在するものを指す。プレ−及びプロペプチドは、非限定的に細胞内局在化シグナルであり得る。
【００５６】
３’非コード配列：本明細書中で使用されているフレーズ「３’非コード配列」はコード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指し、ポリアデニル化認識配列及びｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響を与え得る調節シグナルをコードする他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは通常ポリアデニル酸部分のｍＲＮＡ前駆体の３’末端への付加に影響を与えることにより特徴づけられる。各種３’非コード配列の使用がＩｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔら，（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１：６７１−６８０に例示されている。
【００５７】
非天然：本明細書中で使用されているフレーズ「非天然」は人工であり、通常天然に存在するものと一致しないものを指す。
【００５８】
機能し得る形で連結された：本明細書中で使用されているフレーズ「機能し得る形で連結された」は、１つの配列の機能が他の配列により調節されるような単一の核酸分子上の核酸配列の結合を指す。例えば、コード配列の発現を調節することができる（すなわち、コード配列がプロモーターの転写コントロール下にある）ときプロモーターはコード配列に対して機能し得る形で連結されている。コード配列はセンスまたはアンチセンス方向で調節配列に機能し得る形で連結され得る。別の例では、本発明の相補的ＲＮＡ領域は標的ｍＲＮＡに対して５’、標的ｍＲＮＡに対して３’、標的ｍＲＮＡ内に直接または間接的に機能し得る形で連結され得、第１相補的領域は標的ｍＲＮＡに対して５’、その補体は３’である。
【００５９】
植物：本明細書中で使用されている用語「植物」は全植物、植物器官、植物組織、種子、植物細胞、その種子及び子孫を指す。植物細胞には、非限定的に種子、懸濁培養物、胚、分裂組織的領域、カルス組織、葉、根、茎、配偶体、胞子体、花粉及び小胞子由来の細胞が含まれる。
【００６０】
ポリメラーゼ連鎖反応またはＰＣＲ：本明細書中で使用されているフレーズ「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は、一連の反復サイクルから構成される大量の特定のＤＮＡセグメントを合成するための技術を指す（コネチカット州ノーウォークに所在のＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）。典型的には、二本鎖ＤＮＡを熱変性し、標的セグメントの３’境界に対して相補的な２つのプライマーを低温でアニールした後、中間温度で延長させる。これら３つの連続ステップの１組をサイクルと称する。
【００６１】
ＰＣＲは、鋳型を反復複製することにより短時間にＤＮＡを数百万倍に増幅させるために使用される強力な技術である（Ｍｕｌｌｉｓら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５１：２６３−２７３（１９８６）；Ｅｒｌｉｃｈら，欧州特許出願５０，４２４；欧州特許出願８４，７９６；欧州特許出願２５８，０１７、欧州特許出願２３７，３６２、Ｍｕｌｌｉｓら，欧州特許出願２０１，１８４、Ｍｕｌｌｉｓら，米国特許Ｎｏ．４，６８３，２０２；Ｅｒｌｉｃｈ，米国特許Ｎｏ．４，５８２，７８８；及びＳａｉｋｉら，米国特許Ｎｏ．４，６８３，１９４）。この方法はＤＮＡ合成をプライムさせるために特定のインビトロで合成したオリゴヌクレオチドの複数の組を用いている。プライマーの設計は分析したいＤＮＡの配列に依存する。この技術は、鋳型を高温で融解し、プライマーを鋳型内の相補的配列に対してアニーリングした後、鋳型をＤＮＡポリメラーゼを用いて複製するサイクルを複数回（通常２０〜５０回）行うことにより実施される。ＰＣＲ反応の産物はアガロースゲルを用いて分離した後、臭化エチジウム染色し、ＵＶ透照で可視化することにより分析される。或いは、産物中に標識を取込むために放射性ｄＮＴＰをＰＣＲに添加してもよい。この場合、ＰＣＲ産物はゲルをＸ線フィルムに曝すことにより可視化される。放射標識ＰＣＲ産物の更なる効果は個々の増幅産物のレベルを定量し得ることである。
【００６２】
プロモーター及びエンハンサー：本明細書中で使用されている用語「プロモーター」は、コード配列または機能ＲＮＡの発現をコントロールすることができるＤＮＡ配列を指す。プロモーター配列は近位及びより遠位の上流要素から構成され、後者要素がしばしばエンハンサーと称されている。
【００６３】
本明細書中で使用されている用語「エンハンサー」はプロモーター活性を刺激することができるＤＮＡ配列を指し、プロモーターの組織特異性のレベルを高めるために挿入されるプロモーターの生来の要素または異質要素であり得る。プロモーター配列はまた遺伝子の転写された部分内に及び／または転写された配列の下流に位置し得る。プロモーターは完全に天然遺伝子に由来し得、或いは天然に存在する各種プロモーターに由来する各種要素から構成され得、または合成ＤＮＡセグメントを含むことさえある。各種プロモーターが遺伝子の発現を各種組織または細胞型中で、または各種発生段階で、または各種環境条件に応答して指向させ得ることを当業者は理解している。遺伝子を多くの細胞型において大抵発現させるプロモーターは「構成的プロモーター」と称される。植物細胞において有用な各種タイプの新規プロモーターが絶えず発見されている。多数の例がＯｋａｍｕｒｏ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，１５：１−８２による編集物中に見つけることができる。更に、多くの場合調節配列の正確な境界が完全に規定されていないので、幾つかの変異のＤＮＡ分子が同一のプロモーター活性を有し得ることも認識されている。
【００６４】
組換え体：本明細書中で使用されている用語「組換え体」は例えば化学合成により、または核酸の単離セグメントを遺伝子工学技術により操作することにより配列の２つのそうでなければばらばらのセグメントの人工的組合せを指す。
【００６５】
組換え構築物、発現構築物及び組換え発現構築物：フレーズ「組換え構築物」、「発現構築物」及び「組換え発現構築物」は本明細書中で互換可能に使用されており、当業者に公知の標準方法を用いて細胞のゲノムに挿入され得る遺伝物質の機能性単位を指す。前記構築物はそれ自体であり得、またはベクターと一緒に使用され得る。ベクターを使用する場合、ベクターの選択は当業者に公知のように宿主植物を形質転換するために使用される方法に依存する。例えば、プラスミドベクターを使用し得る。当業者は、本発明の単離核酸分子を含む宿主細胞をうまく形質転換させ、選択し、増殖させるためにベクター上に存在させなければならない遺伝要素を周知している。当業者は異なる独立形質転換事象により発現のレベル及びパターンが異なり（Ｊｏｎｅｓら，（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．，４：２４１１−２４１８；ＤｅＡｌｍｅｉｄａら，（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２１８：７８−８６）、よって所望の発現レベル及びパターンを示す株を得るためには複数の事象をスクリーニングにかけなければならないことも認識している。前記スクリニングはＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現のウェスタン分析または表現型分析によりなし得る。
【００６６】
ＲＮＡ転写物、メッセンジャーＲＮＡ、ｃＤＮＡ、機能ＲＮＡ及び内因性ＲＮＡ：本明細書中で使用されているフレーズ「ＲＮＡ転写物」は、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒転写から生ずる産物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全相補的コピーであるときには一次転写物と称され、または一次転写物の転写後プロセシング由来のＲＮＡ配列であり得、成熟ＲＮＡと称される。
【００６７】
本明細書中で使用されているフレーズ「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、イントロンを含まず、細胞によりタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを指す。
【００６８】
本明細書中で使用されている用語「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡ鋳型に対して相補的であり、酵素逆転写酵素を用いてｍＲＮＡ鋳型から合成されるＤＮＡを指す。ｃＤＮＡは一本鎖であり得、またはＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ分子を用いて二本鎖の形に変換され得る。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含み、細胞内またはインビトロでタンパク質に翻訳され得るＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部または一部に対して相補的であり、標的遺伝子の発現を阻止するＲＮＡ転写物を指す（米国特許Ｎｏ．５，１０７，０６５）。アンチセンスＲＮＡの相補性は特定遺伝子転写物の一部、すなわち５’非コード配列、３’非コード配列、イントロンまたはコード配列であり得る。
【００６９】
本明細書中で使用されているフレーズ「機能ＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、または翻訳され得ないが細胞プロセスに対してなお影響を有する他のＲＮＡを指す。
【００７０】
用語「補体」及び「逆補体」はｍＲＮＡ転写物に関して本明細書中で互換可能に使用されており、メッセージのアンチセンスＲＮＡを規定することを意味する。
【００７１】
本明細書中で使用されているフレーズ「内因性ＲＮＡ」は、本発明の組換え構築物で形質転換する前に、天然に存在するまたは存在せず、すなわち組換え手段、変異誘発等により導入される宿主のゲノム中に存在する核酸配列によりコードされるＲＮＡを指す。
【００７２】
類似性：２つのアミノ酸配列、タンパク質またはポリペプチド間の「類似性」を指すとき、用語「類似性」は両配列中の一連の同一及び保存アミノ酸残基の存在を指す。２つのアミノ酸配列間の類似度が高ければ、２つの配列の対応性、類似性または同等性が高くなる。
【００７３】
安定な形質転換、一過性形質転換及び形質転換：本明細書中で使用されているフレーズ「安定な形質転換」は、遺伝的に安定な遺伝を生ずる核及び細胞小器官ゲノムを含めた宿主生物のゲノムへの核酸分子の転移を指す。
【００７４】
対照的に、本明細書中で使用されているフレーズ「一過性形質転換」は、組込みまたは安定な遺伝なしに遺伝子発現を生ずる核酸分子の宿主生物の核またはＤＮＡ含有細胞小器官への転移を指す。形質転換させた核酸分子を含む宿主生物を「トランスジェニック」生物と称する。コメ、ワタ及び他の単子葉植物を細胞形質転換するための好ましい方法は粒子加速または「遺伝子銃」形質転換技術（Ｋｌｅｉｎら，（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），３２７：７０−７３；米国特許Ｎｏ．４，９４５，０５０）、またはトランスジーンを含有する適切なＴｉプラスミドを用いるアグロバクテリウム媒介方法（Ｉｓｈｉｄａ  Ｙ．ら，（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１４：７４５−７５０）を使用する。
【００７５】
本明細書中で使用されている用語「形質転換」は安定な形質転換及び一過性形質転換の両方を指す。
【００７６】
翻訳リーダー配列：本明細書中で使用されているフレーズ「翻訳リーダー配列」は、遺伝子のプロモーター配列とコード配列の間に位置するＤＮＡ配列を指す。翻訳リーダー配列は翻訳開始配列の上流の完全にプロセシングされたｍＲＮＡ中に存在する。翻訳リーダー配列は一次転写物のｍＲＮＡへのプロセシング、ｍＲＮＡ安定性または翻訳効率に影響を及ぼし得る。翻訳リーダー配列の例は記載されている（Ｔｕｒｎｅｒ，Ｒ．ａｎｄ  Ｆｏｓｔｅｒ，Ｇ．Ｄ．（１９９５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３：２２５）。
【００７７】
本明細書中で引用されている特許、特許公開明細書及び優先権書類のすべてが参照により本明細書に組み入れられる。
【００７８】
Ａ９−エロンガーゼ遺伝子及び該遺伝子によりコードされる酵素
本発明のΔ９−エロンガーゼ遺伝子によりコードされる酵素は、交互Δ８−デサチュラーゼ／Δ９−エロンガーゼ経路を介する２０個以上の炭素の長さを有する長鎖ポリ不飽和脂肪酸（ＬＣ−ＰＵＦＡ）の産生において必須である。単離ユーグレナ・デセス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｄｅｓｅｓ）Ｅｈｒ．ＣＣＭＰ  ２９１６  Δ９−エロンガーゼ遺伝子のヌクレオチドの配列を図７Ａに示し、対応するタンパク質の予測アミノ酸配列を図７Ｂに示す。
【００７９】
Δ９−エロンガーゼ酵素及びΔ８−デサチュラーゼ酵素を用いるＬＡのＤＧＬＡへの変換及びＡＬＡのω３−ＥＴＡへの変換を交互Δ８−デサチュラーゼ／Δ９−エロンガーゼ経路と称する。ＬＡのＤＧＬＡへの変換及びＡＬＡのω３−ＥＴＡへの変換のための従来のΔ６経路はそれぞれＬＡをＧＬＡに、ＡＬＡをＳＤＡに変換させるためにΔ６−デサチュラーゼ酵素；及びＧＬＡをＤＧＬＡに、ＳＤＡをω３−ＥＴＡに変換させるためにΔ６−エロンガーゼを使用している。いずれの経路でも、その後ＡＲＡまたはＥＰＡの産生は例えばΔ５−デサチュラーゼにより触媒される。例えば、ＤＨＡは例えばそれぞれΔ５−エロンガーゼ及びΔ４−デサチュラーゼを用いてＥＰＡをω３−ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）に、ω３−ドコサペンタエン酸をＤＨＡに変換させる際に産生され得る。
【００８０】
例えばＤＧＬＡ、ω３−ＥＴＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ω３−ドコサペンタエン酸、ω６−ドコサペンタエン酸、ＡＤＡ及び／またはＤＨＡは交互Δ８−デサチュラーゼ／Δ９−エロンガーゼ経路または従来のΔ６経路を介して産生され得るが、ある例では交互Δ８−デサチュラーゼ／Δ９−エロンガーゼ経路が従来のΔ６経路よりも好ましいことがある。例えば、ＤＧＬＡ、ω３−ＥＴＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ω３−ドコサペンタエン酸、ω６−ドコサペンタエン酸、ＡＤＡ及び／またはＤＨＡの産生中に特定の残留ω−６またはω−３脂肪酸中間体（例えば、ＧＬＡまたはＳＤＡ）が望ましくないならば、ＧＬＡ及びＳＤＡ形成を回避するために交互Δ８−デサチュラーゼ／Δ９−エロンガーゼ経路を従来のΔ６経路の代替として使用し得る。
【００８１】
先に検討したように、Δ９−エロンガーゼは交互Δ８−デサチュラーゼ／Δ９−エロンガーゼ経路における必須酵素である。例えば、ＥＰＡはΔ９−エロンガーゼ遺伝子及びΔ９−エロンガーゼによりコードされる酵素なしでは交互Δ８−デサチュラーゼ／Δ９−エロンガーゼ経路を介して合成され得ない。図１に示すように、本発明の単離Δ９−エロンガーゼ酵素は例えばＡＬＡをω３−ＥＴｒＡに、ＬＡをω６−ＥＤＡに変換させる。その後、ω３−ＥＴｒＡからのω３−ＥＴＡ及びω３−ＥＴＡからのＥＰＡの産生はそれぞれ例えばΔ８−デサチュラーゼ及びΔ５−デサチュラーゼにより触媒される。交互Δ８−デサチュラーゼ／Δ９−エロンガーゼ経路を使用する結果として、中間体ＧＬＡ及びＳＤＡ脂肪酸が回避される。
【００８２】
本発明は、配列番号１７（すなわち、ユーグレナ・デセス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｄｅｓｅｓ）Ｅｈｒ．ＣＣＭＰ  ２９１６のΔ９−エロンガーゼ遺伝子の単離ヌクレオチド配列）または配列番号１９（すなわち、ユーグレナ・デセス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｄｅｓｅｓ）Ｅｈｒ．ＣＣＭＰ  ２９１６のバリアントΔ９−エロンガーゼ遺伝子）（に対して配列同一性を有する）配列中のヌクレオチドの少なくとも６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を含む、それから構成される、またはそれに対して相補的な配列を有するヌクレオチド配列（及び対応するコード化タンパク質）をも包含することに注目すべである。前記配列はヒトソース及び他の非ヒトソース（例えば、シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）またはマウス）由来であり得る。
【００８３】
更に、本発明は、配列番号１７（図７Ａに示す）または配列番号１９（図８Ａに示す）のヌクレオチド配列及び他のソース由来の配列を含みまたはそれから構成され、上記相補性または対応性を有する断片及び誘導体をも包含する。上記配列（すなわち、Δ９−エロンガーゼ活性を有する配列）の機能均等物も本発明に包含される。
【００８４】
配列番号１７または配列番号１９由来の断片は、１０〜約７８０ヌクレオチド、１０〜約７００ヌクレオチド、１０〜約６５０ヌクレオチド、１０〜約５００ヌクレオチド、１０〜約２５０ヌクレオチド、１０〜約１００ヌクレオチド、１０〜約５０ヌクレオチドまたは１５〜４０ヌクレオチドを含むまたはそれから構成される長さを有し得る。１つの態様で、配列番号１７及び配列番号１９の断片はΔ９−エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。別の態様で、配列番号１７及び配列番号１９の断片はプライマー及びプローブとして使用され得る。プライマー及びプローブの作製方法は当業者に公知である。前記プライマー及びプローブは１０〜５０ヌクレオチド、好ましくは１５〜４０ヌクレオチドの長さを有し得る。
【００８５】
配列番号１７または配列番号１９のヌクレオチド配列のバリアントも本発明において考えられる。前記バリアントは１つ以上の塩基対付加、置換または欠失を含み得る。本発明に包含される配列番号１７のヌクレオチドバリアントの非限定例を下表Ａに示す。配列番号１７のバリアントの１つの具体例は配列番号１９（図８Ａを参照されたい）である。
【００８６】
【表１】
2012533303.tif 000003
【００８７】
本発明は、他のソース由来であり且つ配列番号１７または配列番号１９に対して上記した相補性または対応性を有するヌクレオチド配列をも包含する。配列番号１７または配列番号１９の機能的均等物（すなわち、Δ９−エロンガーゼ活性を有する配列）も本発明に包含される。
【００８８】
本発明は、Δ９−エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはその断片をも包含し、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１８または配列番号２０を含むアミノ酸配列に対して少なくとも６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。前記配列はヒトソース及び他の非ヒトソース（例えば、シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）またはマウス）由来であり得る。
【００８９】
本発明は、炭素９位に不飽和を含むポリ不飽和脂肪酸を延長させ（すなわち、Δ９−エロンガーゼ活性を有する）且つアミノ酸配列（すなわち、配列番号１８（図７Ｂに示す）または配列番号２０（図８Ｂに示す）に対して少なくとも６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の類似性または同一性を有する単離及び／または精製ポリペプチドをも包含する。具体的には、本発明は配列番号１８または配列番号２０のアミノ酸配列を有する精製ポリペプチドを包含する。
【００９０】
配列番号１８または配列番号２０の配列を有するポリペプチドの断片も本発明において考えられている。前記断片は１０〜約２６０連続アミノ酸、１０〜約２００連続アミノ酸、１０〜約１００連続アミノ酸、１０〜約５０連続アミノ酸、１０〜約４０連続アミノ酸、１０〜約３０連続アミノ酸または１０〜約２０連続アミノ酸を含むまたはそれから構成される長さを有し得る。
【００９１】
配列番号１８または配列番号２０の配列を有するポリペプチドのバリアントも本発明において考えられている。前記バリアントは１つ以上のアミノ酸付加、置換または欠失を含み得る。本発明により包含される配列番号１８のアミノ酸バリアントの非限定例を下表Ｂに示す。配列番号１８のバリアントの１つの具体例は配列番号２０（図８Ｂを参照されたい）である。
【００９２】
【表２】
2012533303.tif 000004
【００９３】
Δ９−エロンガーゼ酵素の産生
Δ９−エロンガーゼ酵素をコードする核酸（例えば、遺伝子）を単離及び／または精製したら、その核酸をベクターまたは構築物を用いて原核または真核宿主細胞に導入し得る。ベクター、例えばバクテリオファージ、コスミドまたはプラスミドは、Δ９−エロンガーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列及び宿主細胞において機能的であり且つヌクレオチド配列によりコードされるΔ９−エロンガーゼの発現を引き出すことができる調節配列（例えば、プロモーター）を含み得る。調節配列はヌクレオチド配列と機能し得る形で関係しており、ヌクレオチド配列に対して機能し得る形で連結されている。（上述したように、調節配列がコード配列の転写または発現に影響を与えるならば、調節は「機能し得る形で連結されている」と言われる。）適当なプロモーターには例えばアルコールデヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグロコイソメラーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、酸ホスファターゼ、Ｔ７、ＴＰ１、ラクターゼ、メタロチオネイン、サイトメガロウイルス前初期、ホエー酸性タンパク質、グルコアミラーゼ、及びガラクトース（例えば、ＧＡＬ１及びＧＡＬ１０）の存在下で活性化されるプロモーターをコードする遺伝子由来のものが含まれる。加えて、他のタンパク質、オリゴ糖、脂質等をコードするヌクレオチド配列はベクター内、及びポリアデニル化シグナル（例えば、ＳＶ−４０Ｔ−抗原、オボアルブミンまたはウシ成長ホルモンのｐｏｌｙ−Ａシグナル）のような他の調節配列内にも含まれ得る。構築物中に存在させる配列の選択は所望する発現産物及び宿主細胞の種類に依存する。
【００９４】
上述したように、ベクターを構築したら、そのベクターを例えばトランスフェクション、形質転換及びエレクトロポレーションを含めた当業者に公知の方法により選択した宿主細胞に導入し得る（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｖｏｌ．１−３，Ｓａｍｂｒｏｏｋら編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照されたい）。次いで、宿主細胞を所望のＰＵＦＡの産生をもたらす遺伝子を発現させることができる適当な条件下で培養し、前記ＰＵＦＡは当業界で公知のルーチンの技術を用いて回収、精製される。
【００９５】
適当な原核宿主細胞の例には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような細菌、及びスピルリナ属（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｓｐｐ．）（すなわち、らん藻類）のようなシアノバクテリアが含まれるが、これらに限定されない。真核細胞は例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞または真菌細胞であり得る。真菌細胞は例えばサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．）、リポミセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐｐ．）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｓｐｐ．）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐｐ．）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．）及びピチア属（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．）であり得る。特に、真菌細胞は、酵母細胞、例えばサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐｐ．）及びピチア属（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．）であり得る。酵母細胞はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）でもあり得る。植物細胞には、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）（例えば、ダイズ）、アブラナ科植物、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍυｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ  Ｌ．）（例えば、サフラワー）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｔｉｕｓ）（例えば、ヒマワリ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）（例えば、トウモロコシ）、ワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）（ワタ）及びアマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）（例えば、アマ）のような油糧種子植物由来の植物細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【００９６】
宿主細胞における発現は一過性または安定的に実施され得る。一過性発現は、宿主細胞において機能的な発現シグナルを含む導入構築物から生じ得るが、前記構築物は宿主細胞において複製せず、まれにしか組込まれず、または宿主細胞は増殖性でない。一過性発現は当該遺伝子に対して機能し得る形で連結された調節可能なプロモーターの活性を誘導することによっても実施され得るが、この誘導可能な系はしばしば発現の低い基礎レベルしか示さない。安定発現は宿主ゲノムに組込まれ得るかまたは宿主細胞において自律的に複製する構築物を導入することにより達成され得る。当該遺伝子の安定発現は、発現構築物上に位置するかまたは発現構築物をトランスフェクトした選択可能なマーカーを使用した後、前記マーカーを発現する細胞を選択することにより選択され得る。組込みから安定発現が生ずる場合には、構築物の組込みの部位は宿主ゲノム内にランダムに存在し得、または宿主遺伝子座との組換えを標的とするのに十分な宿主ゲノムとの相同性の領域を含む構築物を使用することにより標的化され得る。構築物が内因性遺伝子座に対して標的化される場合には、転写及び翻訳調節領域の全部または一部は内因性遺伝子座により与えられ得る。
【００９７】
トランスジェニック哺乳動物はΔ９−エロンガーゼ酵素、最終的には当該ＰＵＦＡを発現するためにも使用され得る。より具体的には、上記構築物を作成したら、その構築物を胚の前核に挿入し得る。次いで、胚をレシピエントの雌に移植し得る。或いは、核移植方法も利用し得る（Ｓｃｈｎｉｅｋｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８：２１３０−２１３３（１９９７））。次いで、妊娠し、出生させる（例えば、米国特許Ｎｏ．５，７５０，１７６及び米国特許Ｎｏ．５，７００，６７１を参照されたい）。この場合、子孫からの乳、組織または他の流体サンプルは、非トランスジェニック動物中で通常見られるＰＵＦＡレベルに比較して変化したＰＵＦＡレベルを含有すべきである。後続の世代をＰＵＦＡの変化したまたは向上したレベルの生成、よって所望のデサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子のそのゲノムへの取込みについてモニターし得る。宿主として用いられる哺乳動物は例えばマウス、ラット、家兎、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ及びウシからなる群から選択され得る。しかしながら、当該酵素をコードするＤＮＡをそのゲノムに取込む能力を有しているならば、いずれの哺乳動物も使用し得る。
【００９８】
Δ９−エロンガーゼポリペプチドの発現の場合、機能的転写及び翻訳の開始または終止領域はエロンガーゼポリペプチドをコードするＤＮＡに対して機能し得る形で連結されている。転写及び翻訳の開始及び終止領域は、発現させようとするＤＮＡ、所望の系において発現し得ることが公知であるかまたは疑われる遺伝子、発現ベクター、化学合成を含めた各種の非排他的ソース、または宿主細胞中の内因性遺伝子座に由来する。植物組織及び／または植物部分における発現は幾つかの有効性を、特に前記組織または部分が種子、葉、果実、花、根等のような早期に収穫されるものの場合に与える。発現は、米国特許Ｎｏｓ．５，４６３，１７４、４，９４３，６７４、５，１０６，７３９、５，１７５，０９５、５，４２０，０３４、５，１８８，９５８及び５，５８９，３７９の調節配列のような特定の調節配列を用いて植物とその位置に標的化され得る。
【００９９】
或いは、発現タンパク質は、直接または更なる修飾時に宿主植物由来の流体画分に取込まれ得る産物を産生する酵素であり得る。Δ９−エロンガーゼ遺伝子またはアンチセンスΔ９−エロンガーゼ転写物を発現させると、植物部分及び／または植物組織中に存在する特定のＰＵＦＡまたはその誘導体のレベルが変化し得る。
【０１００】
Δ９−エロンガーゼポリペプチドコード領域は、所望のＰＵＦＡを高比率で含有する組織及び／または植物部分を産生するためにそれ自身、または他の遺伝子（例えば、Δ８−デサチュラーゼをコードする遺伝子、Δ５−デサチュラーゼをコードする遺伝子、Δ１７−デサチュラーゼをコードする遺伝子、Δ５−エロンガーゼをコードする遺伝子及び／またはΔ４−デサチュラーゼをコードする遺伝子）と一緒に発現され得、または前記ＰＵＦＡ組成はヒト母乳の組成に非常に似ている（ＷＯ  ９５／２４４９４を参照されたい）。終止領域は開始領域を得た遺伝子の３’領域または異なる遺伝子に由来し得る。多数の終止領域が公知であり、同一または異なる属及び種由来の各種宿主において満足であることが判明している。終止領域は通常具体的特性の理由よりはむしろ便宜的に選択される。
【０１０１】
上述したように、植物（例えば、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）（ダイズ）またはセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）（カノーラ））、或いは植物組織もそれぞれΔ９−エロンガーゼ酵素の発現のための宿主または宿主細胞としても使用され得、Δ９−エロンガーゼ酵素はポリ不飽和脂肪酸の産生においても利用され得る。より具体的には、所望のＰＵＦＡＳを種子において発現させ得る。種子油の単離方法は当業界で公知である。よって、ＰＵＦＡソースを与える以外に、種子油成分は栄養組成物、医薬組成物、動物飼料及び化粧品に添加され得る種子油を提供するためにΔ９−エロンガーゼ遺伝子、並びに多分デサチュラーゼ遺伝子（例えば、Δ８−デサチュラーゼ、Δ１７−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ４−デサチュラーゼ等）及び他のエロンガーゼ遺伝子（例えば、Δ５−エロンガーゼ等）の発現により操作され得る。ここでも、プロモーターに対して機能し得る形で連結されたΔ９−エロンガーゼをコードするＤＮＡ配列を含むベクターを植物組織または植物にΔ９−エロンガーゼの発現のために十分な時間及び条件下で導入する。ベクターは他の酵素、例えばΔ４−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ１０−デサチュラーゼ、Δ１２−デサチュラーゼ、Δ１５−デサチュラーゼ、Δ１７−デサチュラーゼ、Δ１９−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ及び／またはΔ５−エロンガーゼをコードする１つ以上の遺伝子をも含み得る。植物組織または植物は酵素が作用する関連基質を産生し得、または前記基質を産生する酵素をコードするベクターを植物組織、植物細胞または植物に導入し得る。加えて、基質を適切な酵素を発現する植物組織に噴霧する。これらの各種技術を用いると、植物細胞、植物組織または植物を用いることによりＰＵＦＡを産生し得る。本発明は上記ベクターを含むトランスジェニック植物をも包含し、ベクターのヌクレオチド配列を発現させると例えばトランスジェニック植物の種子中でポリ不飽和脂肪酸が産生することにも注目すべきである。
【０１０２】
単一植物プロトプラスト形質転換体または各種形質転換外植片からの植物の再生、発育及び栽培は当業界で公知である（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９８８））。この再生及び成長プロセスは、典型的には形質転換細胞を選択するステップ、個々の細胞を胚性発生から根づいた小植物の段階までの通常の段階を経て培養するステップを含む。トランスジェニック胚及び種子も同様に再生される。生じたトランスジェニック根づいた苗をその後土壌のような適切な植物成長培地に植える。
【０１０３】
当該タンパク質をコードする外因性外来遺伝子を含む植物の発育または再生は当業界で公知である。ホモ接合性トランスジェニック植物を提供すべく再生植物が自家受粉されることが好ましい。さもなければ、再生植物から得た花粉を農業上重要な株の種子成長させた植物に交雑させる。逆に、重要な株の植物からの花粉を使用して再生植物を受粉させる。所望のポリペプチドを含む本発明のトランスジェニック植物は当業者に公知の方法を用いて栽培される。
【０１０４】
植物の植物組織からの再生方法は多数ある。具体的な再生方法は出発植物組織及び再生させようとする具体的植物種に依存している。
【０１０５】
双子葉植物を主にアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を使用することにより形質転換し、トランスジェニック植物を得る方法は、ワタ（米国特許Ｎｏ．５，００４，８６３、米国特許Ｎｏ．５，１５９，１３５、米国特許Ｎｏ．５，５１８，９０８）；ダイズ（米国特許Ｎｏ．５，５６９，８３４、米国特許Ｎｏ．５，４１６，０１１、ＭｃＣａｂｅら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：９２３（１９８８）、Ｃｈｒｉｓｔｏｕら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，８７：６７１−６７４（１９８８））；アブラナ属（米国特許Ｎｏ．５，４６３，１７４）；落花生（Ｃｈｅｎｇら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，１５：６５３−６５７（１９９６）、ＭｃＫｅｎｔｌｙら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，１４：６９９−７０３（１９９５））：パパヤ；及びエンドウ（Ｇｒａｎｔら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，１５：２５４−２５８（１９９５））について記載されている。
【０１０６】
単子葉植物のエレクトロポレーション、粒子衝撃及びアグロバクテリウムを用いる形質転換も報告されている。形質転換及び植物再生は、アスパラガス（Ｂｙｔｅｂｉｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（ＵＳＡ），８４：５３５４（１９８７））；オオムギ（Ｗａｎ  ａｎｄ  Ｌｅｍａｕｘ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０４：３７（１９９４））；トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）（Ｒｈｏｄｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：２０４（１９８８）、Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，２：６０３−６１８（１９９０）、Ｆｒｏｍｍら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：８３３（１９９０）、Ｋｏｚｉｅｌら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：１９４（１９９３）、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら，Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５：５５０−５５７（１９９５））；オートムギ（Ｓｏｍｅｒｓら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｌｎｏｌｏｇｙ，１０：１５−８９（１９９２））；オーチャードグラス（Ｈｏｒｎら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，７：４６９（１９８８））；コメ（Ｔｏｒｉｙａｍａら，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，２０５：３４（１９８６）、Ｐａｒｔら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３２：１１３５−１１４８（１９９６）、Ａｂｅｄｉｎｉａら，Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２４：１３３−１４１（１９９７）、Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，７６：８３５（１９８８）、Ｚｈａｎｇら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，７：３７９（１９８８）、Ｂａｔｔｒａｗ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．，８６：１９１−２０２（１９９２）、Ｃｈｒｉｓｔｏｕら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９５７（１９９１））；ライムギ（Ｄｅ  ｌａ  Ｐｅｎａら，Ｎａｔｕｒｅ，３２５：２７４（１９８７））；サトウキビ（Ｂｏｗｅｒ  ａｎｄ  Ｂｉｒｃｈ，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，２：４０９（１９９２））；ヒロハノウシノケグサ（Ｗａｎｇら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：６９１（１９９２））及び小麦（Ｖａｓｉｌら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：６６７（１９９２）；米国特許Ｎｏ．５，６３１，１５２）で達成されている。
【０１０７】
クローン化核酸構築物の一時的発現に基づく遺伝子発現のためのアッセイは、核酸分子をポリエチレングリコール処理、エレクトロポレーションまたは粒子衝撃により植物細胞に導入することにより開発された（Ｍａｒｃｏｔｔｅら，Ｎａｔｕｒｅ，３３５：４５４−４５７（１９８８）；Ｍａｒｃｏｔｔｅら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１：５２３−５３２（１９８９）；ＭｃＣａｒｔｙら，Ｃｅｌｌ，６６：８９５−９０５（１９９１）；Ｈａｔｔｏｒｉら，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，６：６０９−６１８（１９９２）；Ｇｏｆｆら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，９：２５１７−２５２２（１９９０））。
【０１０８】
遺伝子構築物を機能的に精査するために一過性発現システムを使用し得る（概略的に、Ｍａｌｉｇａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）を参照されたい）。本発明の核酸分子を他の遺伝子要素（例えば、ベクター、プロモーター、エンハンサー等）と一緒に植物細胞に恒久的または一時的に導入し得ると理解される。
【０１０９】
先に検討した手順に加えて、専門家は、マクロ分子（例えば、ＤＮＡ分子、プラスミド等）の構築、操作及び単離、組換え生物の作成、並びにクローンのスクリーニング及び単離のための具体的条件及び手順を記載している標準リソースマテリアルを周知している（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｍａｌｉｇａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ｂｉｒｒｅｎら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｅｎｅｓ，１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）：Ｂｉｒｒｅｎら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ＤＮＡ，２，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）；Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｌａｒｋ編．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９７）を参照されたい）。
【０１１０】
宿主細胞により自然にまたはトランスジェニック的に産生され得る基質及びその後宿主細胞に導入されるベクター中に存在するＤＮＡ配列によりコードされ得る酵素を図１に示す。
【０１１１】
上記にてらして、本発明は、１）Δ９−エロンガーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号１７及び配列番号１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列）の少なくとも６８％を含むまたはそれに対して相補的なヌクレオチド配列を単離するステップ：２）調節配列に機能し得る形で連結されたヌクレオチド配列を含む発現ベクターを構築するステップ：及び３）ベクターを宿主細胞にΔ９−エロンガーゼ酵素の産生に十分な時間及び条件下で導入するステップを含むΔ９−エロンガーゼ酵素の産生方法を包含する。
【０１１２】
本発明はポリ不飽和脂肪酸の産生方法をも包含する。１つの態様において、この方法は、１）Δ９−エロンガーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号１７及び配列番号１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列）の少なくとも６８％を含むまたはそれに対して相補的なヌクレオチド配列を単離すること；２）調節配列に機能し得る形で連結されたヌクレオチド配列を含む発現ベクターを構築すること；３）発現ベクターを宿主細胞にΔ９−エロンガーゼ酵素の産生のために十分な時間及び条件下で導入すること；及び４）発現させたΔ９−エロンガーゼを基質ポリ不飽和脂肪酸に曝して、基質ポリ不飽和脂肪酸を第１産物ポリ不飽和脂肪酸に変換させること；を含む。基質ＰＵＦＡの例にはＬＡ、ＡＬＡ及びその組合せが含まれる。本方法により産生され得る第１産物ポリ不飽和脂肪酸の例はω６−ＥＤＡ、ω３−ＥＴｒＡ、またはω６−ＥＤＡとω３−ＥＴｒＡの両方である。例えば、ＬＡをΔ９−エロンガーゼ酵素に曝すと、ＬＡはω６−ＥＤＡに変換される。別の例では、ＡＬＡをΔ９−エロンガーゼ酵素に曝すと、ＡＬＡはω３−ＥＴｒＡに変換される。
【０１１３】
方法は更に、第１産物ポリ不飽和脂肪酸を少なくとも１つのデサチュラーゼ、少なくとも１つの追加エロンガーゼまたはその組合せに曝すステップ及び場合によりこのステップを繰り返すステップ（すなわち、第２またはその次の産物ポリ不飽和脂肪酸をデサチュラーゼまたはエロンガーゼ（前に使用したデサチュラーゼまたはエロンガーゼと同一でも異なっていてもよい）に曝して、第１産物ポリ不飽和脂肪酸を第２またはその次の（例えば、第３、第４、第５、第６等）産物ポリ不飽和脂肪酸に変換するステップを含み得る。このステップを所望産物ポリ不飽和脂肪酸が得られるまで必要なだけ何度繰り返してもよい。例えば、第１産物ポリ不飽和脂肪酸がω６−ＥＤＡであるならば、方法は更にω６−ＥＤＡを例えばω６−ＥＤＡをＤＧＬＡ（第２産物ポリ不飽和脂肪酸）に変換させるΔ８−デサチュラーゼに曝すことを含み得る。次いで、場合によりＤＧＬＡを例えばΔ５−デサチュラーゼに曝すことによりＤＧＬＡをＡＲＡ（第３産物ポリ不飽和脂肪酸）に変換し得る。次いで、ＡＲＡをΔ１７−デサチュラーゼに曝すと、ＥＰＡ（第４産物ポリ不飽和脂肪酸）が産生され得る。さらに、場合によりＥＰＡをΔ５−エロンガーゼに曝すと、ＤＰＡ（第５産物ポリ不飽和脂肪酸）が産生され得る。次いで、場合によりＤＰＡをΔ４−デサチュラーゼに曝すと、ＤＨＡ（第６産物ポリ不飽和脂肪酸）が産生され得る。別の例では、第１産物ポリ不飽和脂肪酸がω３−ＥＴｒＡであるならば、方法は更にω３−ＥＴｒＡを例えばω３−ＥＴｒＡをＥＴＡ（第２産物ポリ不飽和脂肪酸）に変換させるΔ８−デサチュラーゼに曝すことを含み得る。次いで、ＥＴＡを例えばΔ５−デサチュラーゼに曝すことによりＥＴＡをＥＰＡ（第３産物ポリ不飽和脂肪酸）に変換され得る。ＥＰＡは更に上記した他のポリ不飽和脂肪酸に変換され得る。
【０１１４】
別の態様で、方法は、１）Δ９−エロンガーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号１７及び配列番号１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列）の少なくとも６８％を含むまたはそれに対して相補的なヌクレオチド配列を単離すること；２）調節配列に機能し得る形で連結された単離ヌクレオチド配列を含む発現ベクターを構築すること；３）発現ベクター及びΔ８−デサチュラーゼをコードし且つ少なくとも１つの調節配列に機能し得る形で連結された単離ヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの追加組換えＤＮＡ構築物を宿主細胞にΔ９−エロンガーゼ及びΔ８−デサチュラーゼの発現のために十分な時間及び条件下で導入すること；及び４）発現させたΔ９−エロンガーゼ及びΔ８−デサチュラーゼをＬＡ、ＡＬＡ及びその組合せからなる群から選択される基質ポリ不飽和脂肪酸に曝して、基質ポリ不飽和脂肪酸を第１産物ポリ不飽和脂肪酸に変換させることを含む。第１産物ポリ不飽和脂肪酸の例にはＤＧＬＡ、ω３−ＥＴＡ及びその組合せが含まれる。更に、この方法は更に、第１産物ポリ不飽和脂肪酸を少なくとも１つの追加デサチュラーゼまたは少なくとも１つの追加エロンガーゼに曝すステップ及び場合によりこのステップを繰り返す（すなわち、第２またはその次の産物ポリ不飽和脂肪酸をデサチュラーゼまたはエロンガーゼ（前に使用したデサチュラーゼまたはエロンガーゼと同じでも異なっていてもよい）に曝して、第１産物ポリ不飽和脂肪酸（例えば、ＤＧＬＡ及び／またはω３−ＥＴＡ）を第２またはその次の（例えば、第３、第４，第５、第６等）産物ポリ不飽和脂肪酸に変換するステップを含む）。このステップを所望産物ポリ不飽和脂肪酸が得られるまで必要なだけ何度繰り返してもよい。１つの態様で、方法は更に、調節配列に機能し得る形で連結されたΔ５−デサチュラーゼをコードする単離ヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ構築物を宿主細胞に導入することを含む。
【０１１５】
よって、Δ９−エロンガーゼはポリ不飽和脂肪酸の産生において使用され得、ポリ不飽和脂肪酸は特定の有用な目的のために使用され得、または他のＰＵＦＡの産生において使用され得る。
【０１１６】
Δ９−エロンガーゼ遺伝子の使用
上述したように、Δ９−単離エロンガーゼ遺伝子及び該遺伝子によりコードされるΔ９−エロンガーゼ酵素は多くの用途を有し得る。例えば、遺伝子及び対応する酵素はポリ不飽和脂肪酸の産生において間接的にまたは直接使用され得る。例えば、Δ９−エロンガーゼはω６−ＥＤＡ、ω３−ＥＴｒＡ、ＤＧＬＡ、ω３−ＥＴＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ω３−ドコサペンタエン酸、ω６−ドコサペンタエン酸、ＡＤＡ及び／またはＤＨＡの産生において使用され得る。「直接」は、酵素が直接酸を組成物中に利用される別の酸に変換する（例えば、ＬＡをω６−ＥＤＡに変換する）状況を包含すると意味する。「間接的に」は、酸が酵素により別の酸（すなわち、経路中間体）に変換され（例えば、ＬＡがω６−ＥＤＡに変換される）、その後後者の酸が非エロンガーゼ酵素により別の酸に変換される（例えば、ω６−ＥＤＡが例えばΔ８−デサチュラーゼによりＤＧＬＡに変換される）状況を包含することを意味する。これらのポリ不飽和脂肪酸（すなわち、Δ９−エロンガーゼ酵素の活性により直接または間接的に産生されるもの）は、例えばいずれも本発明に包含される栄養組成物、医薬組成物、化粧品及び動物飼料に添加され得る。これらの用途を以下に詳記する。
【０１１７】
栄養組成物
本発明は栄養組成物を包含する。本発明の目的の栄養組成物は、体内に取り入れたときに（ａ）組織に栄養分を与えたり組織を強化したり、またはエネルギーを供給するのに役立ち及び／または（ｂ）十分な栄養状態または代謝機能を維持、回復またはサポートする経腸または非経口消費を含めたヒトが消費するための食物または製剤を含む。
【０１１８】
本発明の栄養組成物は、本明細書中に記載されているΔ９−エロンガーゼ遺伝子を使用することにより直接または間接的に産生される少なくとも１つの油または酸を含み、固体または液体形態のいずれかであり得る。加えて、組成物が具体的用途のために所望する量の食用多量栄養素、ビタミン及びミネラルを含んでいてもよい。前記成分の量は、組成物を幾つかの代謝状態（例えば、代謝障害）を伴っているような特別の要求を有している正常で健康な乳児、小児または成人で使用するために意図されているかに応じて異なる。
【０１１９】
組成物に添加され得る多量栄養素の例には食用脂、炭水化物及びタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。食用脂の例にはココナツ油、大豆油、及びモノ−及びジグリセリドが含まれるが、これらに限定されない。炭水化物の例にはグルコース、食用ラクトース及び加水分解澱粉が含まれるが、これらに限定されない。加えて、本発明の栄養組成物中に利用され得るタンパク質の例には大豆タンパク質、電気透析したホエー、電気透析したスキムミルク、ミルクホエーまたはこれらのタンパク質の加水分解物が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２０】
ビタミン及びミネラルに関して、カルシウム、リン、カリウム、ナトリウム、クロリド、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、セレン、ヨウ素、並びにビタミンＡ、Ｅ、Ｄ、Ｃ及びＢ複合体が本発明の栄養組成物に添加され得る。他のビタミン及びミネラルを添加してもよい。
【０１２１】
本発明の栄養組成物中に利用される成分は半精製または精製起源のものである。半精製または精製とは天然材料を精製することにより、または合成により製造した材料を意味する。
【０１２２】
本発明の栄養組成物の例には乳児用調合乳、栄養サプリメント、栄養代用品及び再水和組成物が含まれるが、これらに限定されない。特に興味深い栄養組成物には乳児用の経腸及び非経口サプリメント、特殊な乳児用調合乳、高齢者用サプリメント、並びに胃腸障害及び／または吸収不良を有する人のためのサプリメンのために利用されるものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２３】
本発明の栄養組成物は、食事の補給を必要としないときでも食物に添加してもよい。例えば、組成物は任意のタイプの食物に添加され、前記食物にはマーガリン、調整バター、チーズ、牛乳、ヨーグルト、チョコレート、キャンディー、スナック、サラダ油、調理油、食用油、肉類、魚類及び飲料が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２４】
本発明の好ましい実施形態において、栄養組成物は経腸栄養製品、より好ましくは成人または小児用経腸栄養製品である。この組成物は、ストレスを経験したり、或いは慢性または急性の病的状態のために特別の要求を有している成人または小児に対して投与され得る。組成物は、本発明に従って産生されるポリ不飽和脂肪酸に加えて、上記した多量栄養素、ビタミン及びミネラルを含み得る。多量栄養素は母乳中に存在する量に等しい量で、またはエネルギー基準で（すなわち、カロリーベースあたりの基準で）存在させ得る。
【０１２５】
液体または固体の経腸及び非経口栄養剤を処方するための方法は当業界で公知である。
【０１２６】
経腸剤は例えば滅菌され、その後すぐに供給できる（ＲＴＦ）状態で利用され得、または濃縮した液体または粉末の形態で保存され得る。粉末は上記したように調製した処方物を噴霧乾燥し、濃厚物を再水和することにより処方物を再構成することにより作成され得る。成人及び小児の栄養剤は当業界で公知であり、市販されている（例えば、オハイオ州コロンバスに所在のＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｏｓｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ製のＳｉｍｉｌａｃ（登録商標）、Ｅｎｓｕｒｅ（登録商標）、Ｊｅｖｉｔｙ（登録商標）及びＡｌｉｍｅｎｔｕｍ（登録商標））。本発明に従って産生される油または酸をこれらの栄養剤に添加してもよい。
【０１２７】
本発明の栄養組成物のエネルギー密度は、液体形態の場合約０．６〜約３Ｋｃａｌ／ｍｌの範囲であり得る。固体または粉末形態の場合には、栄養サプリメントは約１．２〜９Ｋｃａｌ／ｇ以上、好ましくは約３〜７Ｋｃａｌ／ｇを含有し得る。通常、液体製品のオスモル度は７００ｍＯｓｍ未満、より好ましくは６６０ｍＯｓｍ未満でなければならない。
【０１２８】
栄養剤は、本発明に従って産生されるＰＵＦＡに加えて、上記した多量栄養素、ビタミン及びミネラルを含み得る。これらの追加成分を存在させると、個人が前記要素の最小１日必要量を摂取するのが助けられる。ＰＵＦＡを提供することに加えて、組成物に亜鉛、銅、葉酸及び抗酸化剤を添加することが望ましいこともある。これらの物質はストレスを受けた免疫系を高め、従って組成物を服用している個人に対して更なる効果を与えると考えられる。医薬組成物にこれらの要素を補充してもよい。
【０１２９】
より好ましい実施形態において、栄養組成物は、抗酸化剤及び少なくとも１つのＰＵＦＡに加えて、少なくとも５重量％が非消化性オリゴ糖である炭水化物ソースを含む。より好ましい実施形態において、栄養組成物は更にタンパク質、タウリン及びカルニチンを含む。
【０１３０】
上述したように、本発明に従って産生されるＰＵＦＡまたはその誘導体は、経静脈栄養を受けている患者のため、或いは栄養不良、または他の状態または病的状態を予防または治療するための栄養代用品またはサプリメント、特に乳児用調合乳に添加され得る。背景として、ヒトの母乳はＤＨＡとして約０．１５％〜約０．３６％、ＥＰＡとして約０．０３％〜約０．１３％、ＡＲＡとして約０３０％〜約０．８８％、ＤＧＬＡとして約０．２２％〜約０．６７％及びＧＬＡとして約０．２７％〜約１．０４％を含む脂肪酸プロフィールを有していることに注目すべきである。よって、本発明に従って産生されるＡＲＡ、ＥＰＡ及び／またはＤＨＡのような脂肪酸は、例えばヒト母乳のＰＵＦＡ含量をよりうまく模写すべく乳児用調合乳の組成を変化させるために、または非ヒト哺乳動物の乳中に通常存在するＰＵＦＡの存在を変化させるために使用され得る。特に、医薬または食物サプリメント、特に母乳代用品またはサプリメント中に使用するための組成物が１つ以上のＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＧＬＡ及びＤＨＡを含むことが好ましい。より好ましくは、油は約０．３〜３０％のＡＲＡ及び約０．２〜３０％のＤＧＬＡを含む。
【０１３１】
トリグリセリドとして計算して約２〜約３０重量％の脂肪酸を含む非経口栄養組成物が本発明に包含される。場合により、他のビタミン、特に脂溶性ビタミン（例えば、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、及びＬ−カルニチン）を配合することもできる。所望により、α−トコフェロールのような保存剤を約０．１重量％の量添加してもよい。
【０１３２】
加えて、ＡＲＡ及びＤＧＬＡの比は特別の所与の最終用途のために適合され得る。母乳サプリメントまたは代用品として製剤化する場合、１つ以上のＡＲＡ、ＤＧＬＡ及びＧＬＡを含む組成物はそれぞれ約１：１９：３０〜約６：１：０．２の比で提供される。例えば、動物の母乳は１：１９：３０〜６：１：０．２の範囲のＡＲＡ：ＤＧＬＡ：ＧＬＡの比で変動し得、これには好ましくは約１：１：１、１：２：１、１：１：４である中間の比が含まれる。宿主細胞において一緒に産生する場合、ＰＵＦＡ比を正確にコントロールためには前駆体基質（例えば、ＥＤＡ及びＤＧＬＡ）のＡＲＡへの変換率及びパーセントの調節が使用され得る。例えば、ＤＧＬＡからＡＲＡへの５〜１０％の変換率を使用すると約１：１９のＡＲＡ対ＤＧＬＡ比が生じ得、約７５〜８０％の変換率を使用すると約６：１のＡＲＡ対ＤＧＬＡ比が生じ得る。従って、細胞培養系中であっても宿主動物中であっても、エロンガーゼ発現のタイミング、程度及び特異性、並びにデサチュラーゼ（例えば、非限定的にΔ８−デサチュラーゼ）及び他のエロンガーゼの発現の調節がＰＵＦＡレベル及び比を調節するために使用され得る。この場合、本発明に従って産生されるＰＵＦＡ／酸（例えば、ＡＲＡ及びＥＰＡ）を他のＰＵＦＡ／酸（例えば、ＤＧＬＡ）と所望の濃度及び比で組合わされ得る。
【０１３３】
加えて、本発明に従って産生されるＰＵＦＡまたはＰＵＦＡを含む宿主細胞は、動物組織または乳の脂肪酸組成をヒトまたは動物消費のためにより所望される組成に変化させるための動物飼料サプリメントとしても使用され得る。
【０１３４】
本発明に従って産生されるポリ不飽和脂肪酸を用いる栄養サプリメント、乳児用製剤、栄養代用品及び他の栄養溶液の幾つかの例を以下に記載する。
【０１３５】
乳児用製剤：乳児用製剤の例には、いずれもオハイオ州コロンバスに所在のＡｂｂｏｔｔ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎから市販されているＩｓｏｍｉｌ（登録商標）Ｓｏｙ  Ｆｏｒｍｕｌａ  ｗｉｔｈ  Ｉｒｏｎ、Ｉｓｏｍｉｌ（登録商標）ＤＦ  Ｓｏｙ  Ｆｏｒｍｕｌａ  Ｆｏｒ  Ｄｉａｒｒｈｅａ、Ｉｓｏｍｉｌ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅ（登録商標）Ｓｏｙ  Ｆｏｒｍｕｌａ  ｗｉｔｈ  Ｉｒｏｎ、Ｉｓｏｍｉｌ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅ（登録商標）２０  Ｓｏｙ  Ｆｏｒｍｕｌａ  Ｗｉｔｈ  Ｉｒｏｎ  Ｒｅａｄｙ  Ｔｏ  Ｆｅｅｄ、Ｓｉｍｉｌａｃ（登録商標）Ｉｎｆａｎｔ  Ｆｏｒｍｕｌａ、Ｓｉｍｉｌａｃ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅ（登録商標）Ｉｎｆａｎｔ  Ｆｏｒｍｕｌａ  ｗｉｔｈ  Ｉｒｏｎ、Ｓｉｍｉｌａｃ（登録商標）ＮｅｏＳｕｒｅ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅ（登録商標）Ｉｎｆａｎｔ  Ｆｏｒｍｕｌａ  Ｗｉｔｈ  Ｉｒｏｎ、Ｓｉｍｉｌａｃ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｃａｒｅ  Ａｄｖａｎｃｅ  Ｌｏｗ−Ｉｒｏｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｉｌｋ  Ｆｏｒｔｉｆｉｅｒ  Ｒｅａｄｙ  Ｔｏ  Ｕｓｅが含まれるが、これらに限定されない。本発明の各種ＰＵＦＡを本明細書中に記載されている乳児用調合乳及び当業者に公知の他の乳児用調合乳に代用及び／または添加してもよい。
【０１３６】
栄養剤：栄養剤の例には、いずれもオハイオ州コロンバスに所在のＡｂｂｏｔｔ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎから市販されているＥＮＳＵＲＥ（登録商標）、ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＨＩＧＨ  ＰＲＯＴＥＩＮ、ＥＮＳＵＲＥ  ＰＬＵＳ（登録商標）、ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＰＯＷＤＥＲ、ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＰＵＤＤＩＮＧ、ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＷＩＴＨ  ＦＩＢＥＲ、Ｏｘｅｐａ（商標）Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔが含まれるが、これらに限定されない。上記し、当業者に公知の各種栄養サプリメントを本発明に従って産生されるＰＵＦＡで代用及び／または補充してもよい。
【０１３７】
医薬組成物
本発明は、本明細書中に記載されている方法に従って明細書中に記載されているΔ９−エロンガーゼ遺伝子を用いて産生される１つ以上の酸及び／または得られる油を含む医薬組成物をも包含する。より具体的には、医薬組成物は、１つ以上の酸及び／または油、並びに標準で公知の非毒性医薬的に許容され得る担体、佐剤または賦形剤、例えばリン酸緩衝食塩水、水、エタノール、ポリオール、植物油、湿潤剤またはエマルジョン（例えば、水／油エマルジョン）を含み得る。組成物は液体または固体のいずれかの形態でもよい。例えば、組成物は錠剤、カプセル剤、摂取可能な液剤または粉末剤、注射剤、或いは局所用軟膏剤またはクリーム剤の形態であり得る。適切な流動性は、例えば分散液の場合には所要の粒度を維持することにより、界面活性剤を使用することにより維持され得る。等張剤（例えば、糖、塩化ナトリウム等）を配合することが望ましいことがある。組成物は、不活性希釈剤の他に佐剤、例えば湿潤剤、乳化及び懸濁剤、甘味剤、矯香剤及び芳香剤をも含み得る。
【０１３８】
サスペンジョン剤は、活性化合物に加えて、懸濁化剤（例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、結晶セルロース、アルミニウムメタハイドロオキシド、ベントナイト、寒天及びトラガカント、並びにこれらの物質の混合物）を含み得る。
【０１３９】
固体剤形、例えば錠剤及びカプセル剤は当業界で公知の技術を用いて製造され得る。例えば、本発明に従って産生されるＰＵＦＡは慣用の錠剤基剤（例えば、ラクトース、スクロース及びトウモロコシ澱粉）を結合剤（例えば、アカシア、トウモロコシ澱粉またはゼラチン）、崩壊剤（例えば、ジャガイモ澱粉またはアルギン酸）及び滑沢剤（例えば、ステアリン酸またはステアリン酸マグネシウム）と一緒に用いて錠剤化され得る。これらの賦形剤を抗酸化剤及び当該ＰＵＦＡと一緒にゼラチンカプセルに入れることによりカプセル剤が製造され得る。抗酸化剤及びＰＵＦＡ成分は上に挙げたガイドラインの範囲内で適合していなければならない。
【０１４０】
静脈内投与の場合、本発明に従って産生されるＰＵＦＡまたはその誘導体を市販製剤、例えばＩｎｔｒａｌｉｐｉｄｓ（商標）中に配合してもよい。典型的な正常な成人の血漿の脂肪酸プロフィールは６．６４〜９．４６％のＡＲＡ、１．４５〜３．１１％のＤＧＬＡ及び０．０２〜０．０８％のＧＬＡを含む。これらのＰＵＦＡまたはその代謝前駆体は患者の脂肪酸プロフィールを正常とするために単独でまたは他のＰＵＦＡと一緒に投与され得る。所望により、製剤の個々の成分は１回または複数回使用するためにキットの形態で個別に提供され得る。特定脂肪酸の典型的な用量は１日あたり０．１ｍｇ〜２０ｇ（最高１００ｇ）であり、好ましくは１日あたり１０ｍｇ〜１、２、５または１０ｇである。
【０１４１】
本発明の医薬組成物の考えられる投与ルートには例えば経腸（例えば、経口及び直腸）及び非経口が含まれる。例えは、液体製剤は例えば経口または経腸的に投与され得る。加えて、スプレーまたは吸入剤を形成するために均質混合物を水中に完全に分散させ、滅菌条件下で生理学的に許容され得る希釈剤、保存剤、バッファーまたは噴射剤と混合され得る。
【０１４２】
投与ルートは勿論所望効果に依存する。例えば、荒れた、乾燥したまたは老化した皮膚を治療するために、傷ついたまたは火傷した皮膚を治療するために、または病気または状態により悪影響を受けている皮膚または毛髪を治療するために組成物を使用しようとするならば、組成物は多分局所的に適用され得る。
【０１４３】
患者に対して投与しようとする組成物の用量は当業者により決定され得、患者の体重、患者の年齢、患者の免疫状態等の各種要因に依存する。
【０１４４】
剤形に関して、組成物は例えば溶液、分散液、サスペンジョン、エマルジョン、またはその後再構成される滅菌粉末であり得る。
【０１４５】
本発明は、本明細書中に記載されている医薬及び／または栄養組成物を使用することによる各種障害の治療をも含む。特に、本発明の組成物は血管形成術後の再狭窄を治療するために使用され得る。更に、炎症、関節リウマチ、喘息及び乾せんの症状も本発明の組成物を用いて治療され得る。ＰＵＦＡがカルシウム代謝に関与し得ることを示す証拠がある。よって、本発明の組成物は多分骨粗しょう症、及び腎臓または尿管結石の治療または予防において利用され得る。
【０１４６】
加えて、本発明の組成物は癌の治療においても使用され得る。悪性細胞が変化した脂肪酸組成を有していることが判明している。脂肪酸を添加すると、悪性細胞の増殖を遅らせ、細胞死を生起させ、その化学療法剤への感受性を高めることが判明している。更に、本発明の組成は癌に関連する悪疫質を治療するためにも有用であり得る。
【０１４７】
本発明の組成物は糖尿病を治療するためにも使用され得る（米国特許Ｎｏ．４，８２６，８７７及びＨｏｒｒｏｂｉｎら，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．（１９９３），Ｖｏｌ．５７（Ｓｕｐｐｌ．）７３２Ｓ−７３７Ｓを参照されたい）。変化した脂肪酸代謝及び組成が糖尿病動物で立証されている。
【０１４８】
更に、Δ９−エロンガーゼ酵素を用いて直接または間接的に産生されるＰＵＦＡを含む本発明の組成物は湿疹の治療において、血圧の降下において、及び数学の試験の点数の向上においても使用され得る。加えて、本発明の組成物は血小板凝集の抑制、血管拡張の誘導、コレステロールレベルの低下、血管壁平滑筋及び線維組織の増殖の抑制（Ｂｒｅｎｎｅｒら，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．（１９７６）Ｖｏｌ．８３，ｐ．８５−１０１）、非ステロイド系抗炎症薬の胃腸出血及び他の副作用の減少または予防（米国特許Ｎｏ．４，６６６，７０１を参照されたい）、子宮内膜症及び月経前症候群の予防及び治療（米国特許Ｎｏ．４，７５８，５９２を参照されたい）、並びにウイルス感染後の筋痛性脳脊髄炎及び慢性疲労の治療（米国特許Ｎｏ．５，１１６，８７１を参照されたい）において使用され得る。
【０１４９】
本発明の組成物の更なる使用はＡＩＤＳ、多発性硬化症及び炎症性皮膚障害の治療における並びに全身健康状態を維持するための使用を含む。
【０１５０】
加えて、本発明の組成物は化粧目的で利用され得る。この組成物は、混合物を形成したり、または単一組成物として使用し得るように既存の化粧品組成物に添加され得る。
【０１５１】
獣医用途
動物はヒトと同じ要求及び状態の多くを経験するので、上記した医薬及び栄養組成物は動物（すなわち、家畜または非家畜）及びヒトと関連させて利用され得ることを注目すべきである。例えば、本発明の油または酸は動物または水産養殖飼料サプリメント、動物飼料代用品、動物ビタミンまたは動物局所軟膏中に利用され得る。
【０１５２】
本発明は以下の非限定的実施例を用いて説明され得る。
【実施例１】
【０１５３】
ユーグレナ・デセス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｄｅｓｅｓ）Ｅｈｒ．ＣＣＭＰ  ２９１６からのｃＤＮＡライブラリー構築及び推定上のΔ９−エロンガーゼ候補を単離するための配列分析
幾つかの海藻類の脂肪酸組成の分析は、ユーグレナ・デセス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｄｅｓｅｓ）Ｅｈｒ．ＣＣＭＰ  ２９１６中にかなりの量のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ，２２：６  ｎ−３）（総脂質の１５重量％）が存在することを明らかにした（表１を参照されたい）。加えて、この生物は交互Δ８−デサチュラーゼ／Δ９−エロンガーゼ経路（図１を参照されたい）の中間体を与え、この経路がこの生物において活性であることを示している。よって、この生物がリノール酸（ＬＡ，１８：２  ｎ−６）をω６−エイコサジエン酸（ω６−ＥＤＡ，２０：２  ｎ−６）に、またはα−リノレン酸（ＡＬＡ，１８：３  ｎ−３）をω３−エイコサトリエン酸（ω３−ＥＴｒＡ，２０：３  ｎ−３）に変換させることができる活性Δ９−エロンガーゼ；及びω６−エイコサジエン酸（ω６−ＥＤＡ，２０：２  ｎ−６）をジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ，２０：３  ｎ−６）に、またはω３−エイコサトリエン酸（ω３−ＥｔｒＡ，２０：３  ｎ−３）をω３−エイコサテトラエン酸（ω３−ＥＴＡ，２０：４  ｎ−３）に変換させる活性Δ８−デサチュラーゼを含むと予測される（図１を参照されたい）。
【０１５４】
【表３】
2012533303.tif 000005
【０１５５】
この研究の目的は、ユーグレナ・デセス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｄｅｓｅｓ）Ｅｈｒ．ＣＣＭＰ  ２９１６から完全長Δ９−エロンガーゼ遺伝子を単離し、異種宿主サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での発現により酵素活性を特徴づけることであった。
【０１５６】
ユーグレナ・デセス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｄｅｓｅｓ）Ｅｈｒ．ＣＣＭＰ  ２９１６から完全長遺伝子を単離するために、ミクロ−ｃＤＮＡライブラリーを生物から単離した全ＲＮＡを用いて構築した。このために、ユーグレナ・デセス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｄｅｓｅｓ）Ｅｈｒ．ＣＣＭＰ  ２９１６の細胞ペレットをＰｒｏｖａｓｏｌｉ−Ｇｕｉｌｌａｒｄ−Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｐｈｙｔｏｐｌａｎｋｔｏｎ（メーン州ウェスト・ブースベイに所在のＣＣＭＰ−Ｂｉｇｅｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から入手し、全ＲＮＡをＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍａｘｉキット（カリフォルニア州バレンシアに所在のＱｉａｇｅｎ）を用いて製造業者のプロトコルに従って単離した。簡単に説明すると、凍結細胞ペレットを液体窒素中で乳鉢及び乳棒を用いて粉砕し、ＲＬＴバッファー（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉキット）中に懸濁し、ＱｉａＳｈｒｅｄｄｅｒに通した。ＲＮＡをＲＮｅａｓｙマキシカラムを用いて製造業者のプロトコルに従って精製した。
【０１５７】
ミクロ−ｃＤＮＡライブラリーは、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（マサチュセッツ州ウォルサムに所在）により５０μｇのユーグレナ・デセス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｄｅｓｅｓ）Ｅｈｒ．ＣＣＭＰ  ２９１６由来のＲＮＡを用いて特許技術により構築した。Ａｇｅｎｃｏｕｒｔは、第１鎖中に幾つかの独自の特許ステップを使用して、一般的に使用されている技術に比して最終的に効率を２５〜３０％増加させる。特許方法中、ＲＮＡを内部プライミング事象を減少または排除するように設計した条件を用いてｓｓＤＮＡに逆転写する。このプログラム及び特別のサイクリングプログラムの組合せにより完全長さクローンの数が増加する。第２鎖合成後、ｃＤＮＡクローンを小さい末端切断型ｃＤＮＡの優先的クローニングを減らすために１．２ｋｂ以上でサイズ選択する。大きいインサートライブラリーの場合、より大きいインサートクローンに対して選択したインサートサイズは＞４ｋｂである。サイズ選択後、ｃＤＮＡ末端を磨き、ｃＤＮＡをレアカッター酵素を用いて消化する。次いで、その部位がｃＤＮＡプライミングステップ中にクローンに導入される「レアカッター」制限酵素を使用して、ｐＡＧＥＮベクターへの定方向クローニングのためのクローンを作成する。「レアカッター」制限酵素はおそらくｃＤＮＡクローン内で２０倍切断しにくく、よってクローンに沿ってランダムな間隔で切断するより一般的な制限酵素を利用する他のｃＤＮＡライブラリー構築方法に比して多くのより完全長さのクローンが生ずる。その結果はレアカッター制限酵素から生じた５’平滑末端及び３’突出部を有するインサートである。このプロセスのために、定方向クローニングを確実とするために追加のアダプター連結反応は必要でない。このことはクローニングプロセスの全体的効率を向上させる。ベクターは５’アダプターを使用することなく定方向クローニングのために特別に工学操作されており、クローニング中のｃＤＮＡの操作の数が減るために形質転換効率が更に高められる。一次ｃＤＮＡライブラリーが完成した後、独立クローンの数、組換えクローンの％及び平均インサートサイズについて調べた。
【０１５８】
次いで、クローンをＤＨ１０Ｂ大腸菌（Ｔ１ファージ耐性細菌細胞）に形質転換する。生じたライブラリーの力価は３．２×１０６ｃｆｕ／ｍｌであり、１．３ｋｂの平均インサートサイズを有する独立コロニーの数は３．５２×１０７であった。
【０１５９】
このｃＤＮＡライブラリーからの４２２４クローンを配列決定し、ベクターを切り取った配列をＢＬＡＳＴを用いて分析して、公知のΔ９−エロンガーゼ配列に対して相同性を有する配列を同定した。ＢＬＡＳＴ分析は、ユーグレナ・デセス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｄｅｓｅｓ）Ｅｈｒ．ＣＣＭＰ  ２９１６  ｃＤＮＡライブラリーからパブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓａｌｉｎａ）（受託番号ＡＡＹ１５１３５；配列番号１；図４Ａ）、ハブト藻（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）（受託番号ＡＦ３９０１７４；配列番号２：図４Ｂ）、ユートレプティエラ属（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｓｐ．）（ＷＯ  ２００７／０６１８４５  Ａ２；配列番号３；図４Ｃを参照されたい）、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉａｌｉｓ）（受託番号ＣＡＴ１６６８７；配列番号４；図４Ｄ）及びユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂｅｎａ）（ＷＯ  ２００８／０１９４６８５  Ａｌ；配列番号５；図４Ｅを参照されたい）由来の公知のΔ９−エロンガーゼ配列に対して相同性を有する５つの推定上のヒットを明らかにした。
【０１６０】
ユーグレナ・デセス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｄｅｓｅｓ）Ｅｈｒ．ＣＣＭＰ  ２９１６  ｃＤＮＡライブラリーからのクローンを配列決定して得た‘プレート２＿ＭＯ７’（配列番号６；図６）と命名した１つのＥＳＴクローンは、既に同定されているΔ９−エロンガーゼに対して高い配列相同性を示した。このＤＮＡ断片は７４４ｂｐ長であり、その推定アミノ酸配列（配列番号７：図５Ｂ）はユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉａｌｉｓ）由来のΔ９−エロンガーゼ（配列番号４）と最高の配列同一性（６６％のアミノ酸配列同一性）を示した。プレート２＿ＭＯ７遺伝子断片は、他のΔ９−エロンガーゼとのアラインメントに基づいて遺伝子の‘ＡＴＧ’開始部位を含んでいるようであるが、推定上のユーグレナ・デセス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｄｅｓｅｓ）Ｅｈｒ．ＣＣＭＰ  ２９１６  Δ９−エロンガーゼの遺伝子の３’末端を含んでいなかった。
【実施例２】
【０１６１】
ユーグレナ・デセス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｄｅｓｅｓ）Ｅｈｒ．ＣＣＭＰ  ２９１６由来のプレート２  ＭＯ７エロンガーゼの３’末端の単離
実施例１からのプレート２ ＭＯ７クローン配列をその３’末端を単離するための鋳型として使用した。
【０１６２】
第１鎖ｃＤＮＡをＳＭＡＲＴ（商標）ＲＡＣＥキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて製造業者の指示に従って合成した。３’ＲＡＣＥレディｃＤＮＡを合成するために、１．５μｇのユーグレナ・デセス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｄｅｓｅｓ）Ｅｈｒ．ＣＣＭＰ  ２９１６由来の全ＲＮＡ及び１μｌの３’ＣＤＳプライマー（５’−ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣ（Ｔ）３０ＶＮ−３’（ここで、Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ；Ｖ＝Ａ、ＧまたはＣ（配列番号８））（１２μＭ）をヌクレアーゼ非含有ＰＣＲチューブにおいて５μｌの全容量で混合し、７０℃で２分間インキュベートし、氷上でスナップ冷却した。短時間遠心した後、２μｌの５×第１鎖バッファー［２５０ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ−８．３），３７５ｍＭ  ＫＣｌ及び３０ｍｍ  ＭｇＣｌ２］、１μｌの０．１Ｍ  ＤＴＴ及び１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰミックスをチューブに添加した。４２℃で２分間インキュベートした後、１μｌの逆転写酵素（ＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をチューブに添加し、４２℃で９０分間インキュベートした。第１鎖ｃＤＮＡを１００μｌのトリシン−ＥＤＴＡバッファー［１０ｍＭ  トリシン−ＫＯＨ（ｐＨ８．５），１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ］で希釈し、酵素を７２℃で７分間熱不活化した。
【０１６３】
ミドリムシ属（Ｅｕｇｌｅｎｏｉｄ  ｓｐ．）エロンガーゼ遺伝子断片（すなわち、プレート２ ＭＯ７クローン配列）の３’末端を単離するために、プライマーをプレート２ ＭＯ７の部分遺伝子配列からの配列情報に基づいて設計した。一次ＰＣＲ増幅は鋳型として３’−ＲＡＣＥレディｃＤＮＡ及び以下のプライマーを用いて実施した：Ｅｕｇ  Ｅｌｏ  ＭＯ−７  ＦＰｌ（遺伝子特異的プライマー）（５’−ＡＧＧ  ＣＧＣ  ＴＧＴ  ＧＧＡ  ＴＣＴ  ＴＣＧ  ＴＣＴ  ＴＣＣ−３’）（配列番号９）及びＲＡＣＥプライマーＵｎｉｖｅｒａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘ  Ａ（ＵＰＭ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
【０１６４】
長プライマー（０．４μＭ）：５’−ＣＴＡ  ＡＴＡ  ＣＧＡ  ＣＴＣ  ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＧＣＡ  ＡＧＣ  ＡＧＴ  ＧＧＴ  ＡＴＣ  ＡＡＣ  ＧＣＡ  ＧＡＧ  Ｔ−３’（配列番号１０）；及び
短プライマー（２μＭ）：５’−ＣＴＡ  ＡＴＡ  ＣＧＡ  ＣＴＣ  ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＧＧＧ  Ｃ−３’（配列番号１１）。
【０１６５】
増幅は、０．２５μｌ（１００ｍＭ）の遺伝子特異的プライマー、０．２５μｌ（１００ｍＭ）のＵＰＭプライマー、２．５μｌのｃＤＮＡ鋳型、２．５μｌの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、５μｌの５×ＰＣＲバッファー（Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）ＧＣ  ＩＩポリメラーゼバッファー（Ｃｌｏｎｔｃｃｈ），２００ｍＭ  トリシン−ＫＯＨ（ｐＨ９．２），７５ｍＭ  酢酸カリウム，１７．５ｍＭ  酢酸マグネシウム，２５％  ＤＭＳＯ，１８．７５μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ，０．００５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０，０．００５％  Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０）、２．５μｌのＧＣ  Ｍｅｌｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、０．５μｌの５×Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）ＧＣ  １  ポリマラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）及び１１．５μＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて２５μＬの最終反応容量で実施した。サンプルをまず９４℃で３分間、その後９４℃で３０秒間、６４℃で３０秒間及び６８℃で１．３分間のサイクルを２回；９４℃で３０秒間、６２℃で３０秒間及び６８℃で１．３０分間のサイクルを３回；９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間及び６８℃で１．３０分間のサイクルを４回；及び９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間及び６８℃で１．３０分間のサイクルを２６回実施して変性した。６８℃で１０分間の最終延長サイクルを実施した後、反応を４℃で停止させた。
【０１６６】
ＰＣＲ産物の分析は、多分細胞中のエロンガーゼ遺伝子転写物のレベルが低いために非常に弱いバンドを示した。すなわち、ネストＰＣＲ反応を１μｌの上記一次ＰＣＲ反応由来の産物を鋳型として用いて実施した。ネストＰＣＲのために使用したプライマーはＥｕｇ  Ｅｌｏ  ＭＯ−７  ＦＰ２（遺伝子特異的プライマー）：５−ＴＣＣ  ＣＣＧ  ＴＧＣ  ＣＧＡ  ＡＧＴ  ＣＧＴ  ＴＣＡ  ＴＣＡ  ＣＣ−３’（配列番号１２）及びＵｎｉｖｅｒａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘ  Ａ（ＵＰＭ）プライマー（配列番号１０及び１１）であった。ＰＣＲ反応条件及びサイクリングパラメーターは一次ＰＣＲ反応のために使用したものと同一であった。
【０１６７】
ネストＰＣＲにより得た５４８ｂｐアンプリコン（配列番号１３；図６Ａ）をＱｉａｇｅｎゲル精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲル精製し、ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔベクター（Ｔ／Ａクローニングベクター，ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）にクローン化し、配列決定した。配列決定は、この断片（配列番号１３）がプレート２＿ＭＯ７エロンガーゼ断片の完全３’末端を‘ＴＡＧ’終止コドン及びポリＡ尾部を含有する下流領域と一緒に含んでいたことを明らかにした。この断片の予測アミノ酸配列（配列番号１４及び３０〜３２）を図６Ｂに示す。最初の星印はプレート２ ＭＯ７コード化タンパク質の終止部位を指す。
【実施例３】
【０１６８】
ユーグレナ・デセス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｄｅｓｅｓ）Ｅｈｒ．ＣＣＭＰ  ２９１６由来の完全長プレート２  ＭＯ７エロンガーゼ遺伝子の単離
プレート２ ＭＯ７エロンガーゼの完全長遺伝子配列を、鋳型としてユーグレナ・デセス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｄｅｓｅｓ）Ｅｈｒ．ｃＤＮＡライブラリー、及び実施例１及び実施例２で得た配列情報に基づいてプレート２ ＭＯ７遺伝子の５’及び３’末端を含むように設計したプライマーを用いてＰＣＲ増幅により単離した。加えて、遺伝子の酵母発現ベクターｐＹＸ２４２のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位へのクローニングを助けるためにＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位をプライマー（下線）に取込んだ。以下のプライマー配列を使用した：
ＭＯ７−Ｅｌｏ順方向プライマー：５’−ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＣ  ＧＴＣ  ＧＣＧ  ＡＣＴ  ＡＣＧ  ＣＴＧ  Ｇ−３’（配列番号１５）、及び
ＭＯ７−Ｅｌｏ逆方向プライマー：５’−ＡＣＧ  ＣＧＴ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＣＴＡ  ＧＴＣ  ＣＡＣ  ＴＴＴ  ＣＴＴ  ＣＴＣ  ＡＴＣ  ＣＴＴ  Ｃ−３’（配列番号１６）。
【０１６９】
増幅は、０．５μｌ（１００μＭ）の各プライマー、鋳型として１μｌ（〜１１０ｎｇ）のユーグレナ・デセス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｄｅｓｅｓ）Ｅｈｒ．ｃＤＮＡライブラリープラスミドプール、５μｌの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、１０μｌの５×Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＧＣバッファー（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）、５μＬのＤＭＳＯ、０．５μＬ（１Ｕ）のＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）及び２７．５μＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて実施した。サンプルをまず９４℃で３分間、その後９８℃で８秒間、６０℃で１２秒間及び７２℃で４５秒間のサイクルを２回；及び９８℃で８秒間、５８℃で１２秒間及び７２℃で４５秒間のサイクルを２８回実施して変性した。７２℃で３分間の最終延長サイクルを実施した後、反応を４℃で停止させた。
【０１７０】
ＰＣＲにより〜７８９ｂｐ産物が生じ、この産物をｐＹＸ２４２ベクターのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローン化し、大腸菌ＤＨ５α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。こうして得たプラスミドＤＮＡを配列決定して、‘Ｅｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１０’（配列番号１７：図７Ａ）と命名した７８９ｂｐ遺伝子の完全長遺伝子配列を得た。配列番号１７はブダペスト条約の条件下で２００９年７月１０日に（２０１１０−２２０９）バージニア州マナッサスに所在のＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託し、受託番号ＡＴＣＣ が付与された。この遺伝子は、２６２アミノ酸の予測長さ（配列番号１８；図７Ｂ）を有するユーグレナ・デセス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｄｅｓｅｓ）Ｅｈｒ．ＣＣＭＰ  ２９１６由来の推定上のΔ９−エロンガーゼをコードすると考えられた。この遺伝子をその酵素活性を特徴づけるための発現研究のために使用した。
【０１７１】
配列決定中に、Ｅｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１０クローンに加えて完全長遺伝子の特定領域に幾つかの配列変化を示した追加バリアントクローンが同定された。これらの配列変化は多分ＰＣＲ増幅のプロセス中に生じた。１つの前記バリアントＥｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１４の配列分析は、オリジナルＥｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１０クローンと比較したとき多数のヌクレオチド及び対応アミノ酸変化を明らかにした（表２、並びに図２Ａ及び２Ｂを参照されたい）。Ｅｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１４のヌクレオチド（配列番号１９）及び予測アミノ酸配列（配列番号２０）をそれぞれ図８Ａ及び８Ｂに示す。オリジナルＥｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１０クローン及びバリアントＥｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１４の両方を発現分析のために使用した。
【０１７２】
【表４】
2012533303.tif 000006
【０１７３】
ＢＬＡＳＴ‘ｎｒ’データベース中に含まれている配列に対する類似性についてクエリーとしてＥｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１０を用いるＢｌａｓｔ調査は、Ｅｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１０によりコードされる予測アミノ酸配列（配列番号１８）がハブト藻（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）Δ９−エロンガーゼ（配列番号２）と最高のアミノ酸配列同一性（３６％配列同一性）を示したことを明らかにした。配列番号１８とユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉａｌｉｓ）由来の公知Δ９−エロンガーゼ（受託番号ＣＡＴ  １６６８７；配列番号４）のペアワイズ・アラインメントは非常により高いアミノ酸配列同一性（６６％同一性）を明らかにした。ここでは、ペアワイズ・アラインメントのためにＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（登録商標）ＡｌｉｇｎＸプログラムのデフォルトパラメーターを使用した。パブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓａｌｉｎａ）Δ９−エロンガーゼ（配列番号１）とのペアワイズ・アラインメントはたった〜１５％の配列同一性を明らかにした。
【０１７４】
デサチュラーゼとは異なり、エロンガーゼ酵素は高度に保存されたモチーフを非常に少数しか示さない。これらの酵素は、膜貫通領域であると予測される疎水性ストレッチを４〜５個含む非常に疎水性のタンパク質である。加えて、高度に保存されたヒスチジンボックス（ＨＸＸＨＨ）（配列番号２８）が第４膜貫通領域に埋め込まれて存在し、酵素活性のために必須である（Ｌｅｏｎａｒｄら，“Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｎｇ−ｃｈａｉｎ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ”，Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，（２００４）Ｖｏｌ．４３，ｐ．３６−５４を参照されたい）。幾つかのエロンガーゼ中に、‘ＨＸＸＨＨ’モチーフ（配列番号２８）の第１ヒスチジン残基がグルタミン（Ｑ）と置換されて、保存モチーフとして‘ＱＸＸＨＨ’（配列番号２９）が生じる。このＱＸＸＨＨ（配列番号２９）モチーフはＥｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１０を含めたΔ９−エロンガーゼの多くに存在している。加えて、Ｅｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１０エロンガーゼは、Ｌｅｏｎａｒｄら，“Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｎｇ−ｃｈａｉｎ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ”，Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，（２００４）Ｖｏｌ．４３，ｐ．３６−５４に記載されているように現在まで多くのエロンガーゼ中に存在している他のインバリアント残基を含んでいる。
【０１７５】
図３Ａ及び３Ｂは、Ｅｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１０エロンガーゼ由来のアミノ酸配列と異なる基質特異性を有している他の公知エロンガーゼのアラインメントを示す。これらには、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉａｌｉｓ）由来のΔ９−エロンガーゼ（配列番号４）及びハブト藻（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）由来のΔ９−エロンガーゼ（配列番号２）に加えて、マウスＥｌｏｌ４エロンガーゼ（受託番号ＡＡＧ４７６６７；配列番号２１；図９Ａ）、ヒトＥＬＯＶＬ２エロンガーゼ（受託番号＃ＮＰ ０６０２４０；配列番号２２：図９Ｂ）及びシー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）エロンガーゼ（受託番号ＡＦ２４４３５６；配列番号２３）が含まれる。アラインメント中のインバリアントアミノ酸に陰影が付けられている。これらのインバリアント残基は種間の高度の保存のためにこれらの延長酵素の機能性に対する重要な決定要素であると推定される。アラインメントは修飾ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを用いるＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩソフトウェアを用いて実施した。
【実施例４】
【０１７６】
遺伝子Ｅｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１０によりコードされる推定上のΔ９−エロンガーゼの酵素活性の特徴づけ
推定上のΔ９−エロンガーゼをコードするＥｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１０及びＥｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１４バリアントをそれぞれ酵母発現ベクターｐＹＸ２４２（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローン化した。これらの構築物をコンピテントなサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＳＣ３３４細胞に形質転換させた。酵母形質転換は製造業者が特定している条件に従ってアルカリ−カチオン酵母形質転換キット（ＱＢｉｏＧｅｎｅ）を用いて実施した。形質転換体をロイシンを欠く培地（ＤＯＢ［−Ｌｅｕ］）に対するロイシン栄養要求性に関して選択した。
【０１７７】
Ｅｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１０及びＥｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１４によりコードされる酵素のエロンガーゼ活性を特徴づけるために、形質転換体を５０μＭの特定脂肪酸基質（以下にリストする）の存在下で増殖させ、特定産物への変換を基質特異性を調べるために使用した。
【０１７８】
Δ９−エロンガーゼ活性について：
リノール酸（１８：２  ｎ−６）→エイコサジエン酸（ＥＤＡ，２０：２  ｎ−６）
α−リノレン酸（１８：３  ｎ−３）→エイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ，２０：３  ｎ−３）。
【０１７９】
Ｃ１８−エロンガーゼ活性について：
γ−リノレン酸（ＧＬＡ，１８：３  ｎ−６）→ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ，２０：３  ｎ−６）
ステアリドン酸（ＳＤＡ，１８：４  ｎ−３）→ω３−エイコサテトラエン酸（ω３−ＥＴＡ，２０：４  ｎ−３）。
【０１８０】
Ｃ２０−エロンガーゼ活性について：
アラキドン酸（ＡＲＡ，２０：４  ｎ−６）→アドレン酸（ω６−ＡＤＡ，２２：４  ｎ−６）
エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ，２０：５  ｎ−３）→ω３−ドコサペンタエン酸（ω３−ＤＰＡ，２２：５  ｎ−３）。
【０１８１】
負の対照株はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３３４において発現させたｐＹＸ２４２ベクターから構成した。
【０１８２】
選択ＤＯＢ［−Ｌｅｕ］培地から単離した形質転換コロニーをＹＰＤ液体ブロス（１０ｍｌ）中で激しく攪拌しながら３０℃で一晩増殖させた。次いで、この一晩培養物（５ｍｌ）を５０μＭ（最終濃度）の（特定されている通りの）脂肪酸基質を含有する選択培地（ＤＯＢ［−Ｌｅｕ］）（４５ｍｌ）に添加し、これらを２４℃で４８〜７２時間（指定されている通り）激しく攪拌した（２５０ｒｐｍ）。
【０１８３】
全脂質抽出のために、酵母細胞を２０００ｒｐｍで１５分間スピンダウンし、水（０．５ｍｌ）を添加し、サンプルをかきまぜた後、やさしく回転させながらメタノール（１０ｍｌ）を添加した。次いで、クロロホルム（２０ｍｌ）を添加し、サンプルを高温で１分間かきまぜた後、室温で２時間放置した。次いで、サンプルに食塩水（６ｍｌ）を添加した後、２２００ｒｐｍで１０分間遠心した。上のクロロホルム層を清潔な乾いている３０ｍｌ容量のバイアルに移し、クロロホルムを窒素流下４０℃で蒸発乾固させた。溶媒を完全に蒸発させたら、クロロホルム（２ｍｌ）を各バイアルに添加し、サンプルを誘導体化した。
【０１８４】
脂質の脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）への誘導体化のために、各チューブに内部標準（１７．２１６μｇ／１００μｌ）トリヘプタデカノイン（１００μｌ）を加えた。クロロホルムを窒素下４０℃で蒸発乾固させ、１４％  メタノール中の三フッ化ホウ素（２ｍｌ）を添加した後、トルエン（２滴）（〜５０μｌ）を添加した。各バイアルに窒素をフラッシュし、９５℃で１５分間加熱した。バイアルを冷却した後、食塩水（２ｍｌ）を添加し、脂質を１分間激しくかきまぜることによりヘキサン（４ｍｌ）で抽出した。ヘキサン抽出物を２０ｍｌ容量の清潔な乾いているスクリューキャップチューブに移し、ｄｉ−Ｈ２Ｏ（５ｍｌ）を添加し、サンプルをかきまぜ、１５００ｒｐｍで４分間遠心した。次いで、洗浄したヘキサンを２０ｍｌ容量の試薬チューブに移した。ヘキサンを蒸発乾固させ、各サンプルを新鮮なヘキサン（０．５ｍｌ）で再構成した。再構成した最終ヘキサンをかきまぜて、脂質を分散させた。次いで、全サンプルをＧＣオートサンプラーバイアルに充填し、分析のために４μｌを注入した。ＧＣをＮｕＣｈｅｋ  Ｓｔｄ．４６１で較正した。
【０１８５】
基質の産物への変換％を式を用いて計算した。
【０１８６】
【数１】
2012533303.tif 000007
【０１８７】
表３は、添加した基質の変換％に基づくＥｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１０及びＥｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１４コード化タンパク質の酵素活性を表す。Ｅｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１０コード化タンパク質は、ＬＡ（１８：２  ｎ−６）の１０．５％をＥＤＡ（２０：２  ｎ−６）に変換し、ＡＬＡ（１８：３  ｎ−３）の２３．２％をＥＴｒＡ（２０：３  ｎ−３）に変換した。このことは、Ｅｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１０遺伝子がｎ−６及びｎ−３脂肪酸基質の両方を認識し得るΔ９−エロンガーゼをコードすることを示した。バリアントクローンＥｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１４コード化タンパク質もΔ９−エロンガーゼ活性を示し、ＬＡ（１８：２  ｎ−６）の７．８４％をＥＤＡ（２０：２  ｎ−６）に変換し、ＡＬＡ（１８：３  ｎ−３）の１１．１５％をＥＴｒＡ（２０：３  ｎ−３）に変換した。しかしながら、この活性はオリジナルＥｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１０コード化タンパク質の活性よりも低かった。このことは、Ｅｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃ｌ４とＥｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１０間の異なる残基がこの酵素のΔ９−延長活性の重要な決定因子であることを示している。
【０１８８】
非常に低いバックグラウンド（基質の非特異的変換）活性がベクターのみの対照で検出された（表３を参照されたい）。Ｅｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１０及びＥｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１４コード化酵素のいずれもが試験した他のＰＵＦＡ基質に対して活性を持っていなかった（表４を参照されたい）。このことから、この酵素は交互Δ８−デサチュラーゼ／Δ９−エロンガーゼ経路（図１を参照されたい）に関与する基質に対して特異的であることを示している。
【０１８９】
【表５】
2012533303.tif 000008
【０１９０】
【表６】
2012533303.tif 000009
【実施例５】
【０１９１】
Δ９−エロンガーゼ‘Ｅｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１０’の植物種子における発現
Ｅｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１０エロンガーゼのコード配列を、対応する遺伝子を含むプラスミドから以下のセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマー（付加した制限酵素部位に下線を付した）を用いてＰＣＲにより増幅させた：
【０１９２】
【化１】
2012533303.tif 000010
【０１９３】
ＰＣＲ反応は高忠実度Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて実施した。ＰＣＲ増幅遺伝子を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化し、生じた産物をその５’末端でダイズ由来の種子特異的グリシニン−１プロモーターに、その３’末端でバイナリーベクターｐ０３０８−ＤｓＲｅｄ中のグリシニン−１  ３’非翻訳領域に連結して、プラスミド‘ｐＥｕｇＥＬＯ’を作製した。グリシニン−１調節要素は既にＮｉｅｌｓｅｎら，“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｌｙｃｉｎｉｎ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｉｎ  ｓｏｙｂｅａｎ”，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ（１９８９）Ｖｏｌ．１，ｐ．３１３−３２８に記載されている。このベクターは、形質転換種子の蛍光による選択のためにキャッサバモザイクウイルスプロモーターの制御下でＤｓ−Ｒｅｄトランスジーン及び細菌選択のためにカナマイシン耐性マーカーをも含んでいる。これらの実験の対照として、ハブト藻（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）Δ９−エロンガーゼ遺伝子（配列番号２）をｐ０３０８−Ｄｓ−Ｒｅｄ中にグリシニン−１プロモーターの制御下でＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ断片としてクローン化して、プラスミド‘ｐＩｓｏＤ９’を作製した。
【０１９４】
ｐＥｕｇＥＬＯ及びｐＩｓｏＤ９をアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株Ｃ５８  ＭＰ９０にエレクトロポレーションにより導入した。次いで、カナマイシン耐性アグロバクテリウムをフローラル・ディップ方法（Ｃｌｏｕｇｈら、“Ｆｌｏｒａｌ  ｄｉｐ：ａ  ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ”，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，（１９９８）Ｖｏｌ．１６，ｐ．７３５−７４３）によりシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）生態型Ｃｏｌ−０を形質転換するために使用した。アグロバクテリウムフローラル・ディップ後、成熟及びドライダウンに達するまで植物を２２℃で１６時間日長で維持した。これらの実験のために、種子油中にα−リノレン酸及び非常に長鎖の脂肪酸（≧Ｃ２０）を低レベルでしか含有しないがリノール酸を高レベルで含有しているシロイヌナズナのｆａｄ３／ｆａｅ１変異体を使用した（Ｃａｈｏｏｎら，“Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｓ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｅ  ｔｏ  ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ  ｏｆ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｓｏｙｂｅａｎ  ａｎｄ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｓｅｅｄｓ”，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００６）Ｖｏｌ．６７，ｐ．１１６６−１１７６）。この遺伝的背景はサフラワー及び低リノレン酸ダイズのような作物由来の種子油の脂肪酸プロフィールに近似している。アグロバクテリウムをディップしたシロイヌナズナ植物から得たトランスジェニック種子をＰｉｄｋｏｗｉｃｈら，“Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｓｅｅｄ  ｂｅｔａ−ｋｅｔｏａｃｙｌ−ａｃｙｌ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ＩＩ  ｌｅｖｅｌ  ｃｏｎｖｅｒｔｓ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｅｍｐｅｒａｔｅ  ｓｅｅｄ  ｏｉｌ  ｔｏ  ｔｈａｔ  ｏｆ  ａ  ｐａｌｍ−ｌｉｋｅ  ｔｒｏｐｉｃａｌ  ｏｉｌ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００７）Ｖｏｌ．１０４，ｐ．４７４２−４７４７により記載されている方法を用いてＤｓＲｅｄマーカータンパク質の蛍光により同定した。単トランスジェニック及び非トランスジェニック対照種子をＣａｈｏｏｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｎｋｌｉｎ，“Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｕｔａｎｔ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｓｅｌｅｃｔ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｆｏｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｐｌａｎｔ  ｓｅｅｄ  ｏｉｌｓ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００）Ｖｏｌ．９７．ｐ．１２３５０−１２３５５に記載されているように水酸化トリメチルスルホニウム（ＴＭＳＨ）試薬を用いることによりトリアシルグリセロールを含めた成分脂質の直接エステル交換反応にかけた。単種子から得た脂肪酸メチルエステルを、ＩＮＮＯＷａｘカラム（長さ３０ｍ×内径０．２５ｍｍ）を取り付けたＡｇｉｌｅｎｔ  ６８９０ガスクロマトグラフを用いることにより、７℃／分で１８５℃（１分保持）から２３０℃（２分間保持）にプログラムするオーブン温度でフレームイオン化検出を含むガスクロマトグラフィーにより分析した。成分脂肪酸メチルエステルは、野生型シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｏｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）Ｃｏｌ−０の種子由来の公知の身元を有する脂肪酸メチルエステルに対する保持時間に基づいて、保持時間を標準脂肪酸メチルエステルの保持時間と比較することにより同定した。
【０１９５】
ｐＥｕｇＥＬＯ構築物で形質転換した植物からの６つの独立した形質転換事象由来の単Ｔｌ種子の脂肪酸組成を表５に示す。ｐｌｓｏＤ９構築物、対照Δ９−エロンガーゼで形質転換した植物由来の独立した事象に相当する単Ｔｌ種子の脂肪酸組成も示す（表６を参照されたい）。非形質転換ｆａｄ３／ｆａｅ１種子（表７を参照されたい）に対するｐＥｕｇＥＬＯ形質転換由来のトランスジェニック種子の脂肪酸組成の大きな変化は高レベルのＥＤＡ（２０：２  ｎ−６，Δ１１，１４）の存在であった。これらの種子中で、２０：２の相対量は全脂肪酸の４０％〜４９％（ｗ／ｗ）の範囲であった。比較することにより、２０：２は非トランスジェニックｆａｄ３／ｆａｅ１種子の全脂肪酸の＞０．５％を占めた（表７を参照されたい）。これは、ＬＡ（１８：２  ｎ−６，Δ９，１２）の相対量を非トランスジェニックｆａｄ３／ｆａｅ１種子中の約５０％（表７を参照されたい）からｐＥｕｇＥＬＯ中の１４％くらいまで同時に減らすことによりなされた。このことは、Ｅｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１０エロンガーゼにより与えられる２０：２合成のための主要基質として役立つ１８：２と一致している。エイコサエン酸（２０：１，Δ１１）及びエイコサン酸（２０：０）も非トランスジェニックｆａｄ３／ｆａｅ１種子に比してｐＥｕｇＥＬＯ−形質転換種子中で高かったが、これらの脂肪酸の各々はトランスジェニック種子中の全脂肪酸の＜３％を構成した。これらの所見は、Ｅｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１０エロンガーゼがＬＡ（１８：２  ｎ−６）のようなＣ１８ＰＵＦＡに対して植物において基質優先性を有し、ＬＡ（１８：２  ｎ−６）に富む種子中での２０：２の産生のための有効な酵素であることを示している。比較のために、ハブト藻（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）Δ９−ＥＬＯ（ｐＩｓｏＤ９）を発現するように工学操作した種子は２０：２を全脂肪酸の３０〜４０％の量まで、２０：０及び２０：１の各々を全脂肪酸の＜３％の量まで蓄積した（表６を参照されたい）。
【０１９６】
【表７】
2012533303.tif 000011
【０１９７】
【表８】
2012533303.tif 000012
【０１９８】
【表９】
2012533303.tif 000013
【実施例６】
【０１９９】
Δ９−エロンガーゼ‘Ｅｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１０’とΔ８−デサチュラーゼの共発現
ＡＲＡ産生をもたらす交互Δ８−デサチュラーゼ／Δ９−エロンガーゼ経路を再構築するためにＥｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１０をΔ８−デサチュラーゼと一緒に共発現させることが可能である。加えて、油糧種子植物や油性酵母のような異種宿主において３つの遺伝子、すなわちΔ９−エロンガーゼ‘Εｕｇ−ＭＯ７−ＥＬＯ＃１０’、Δ８−デサチュラーゼ及びΔ５−デサチュラーゼを共発現させて、前記異種宿主におけるＡＲＡ産生をもたらすＡＲＡ生合成経路を再構築することが可能である。
【０２００】
上記にてらして、本発明の幾つかの目的が達成され、他の有利な効果が得られることが分かるであろう。
【０２０１】
本発明の範囲を逸脱することなく上記事項に各種変更を加え得るので、先の記載に含まれるすべての事項は例示として、狭い意味でなく解釈されると意図される。
【図１】
2012533303.tif 000014
【図２Ａ】
2012533303.tif 000015
【図２Ｂ】
2012533303.tif 000016
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2012533303.tif 000020
【図４Ｃ】
2012533303.tif 000021
【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年5月17日(2011.5.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離ヌクレオチド配列を含む、またはそれに対して相補的な単離核酸またはその断片であって、前記ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１８及び配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６８％の配列同一性を有する、前記単離核酸またはその断片。
【請求項２】
配列番号１７及び配列番号１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも７５％を含む、またはそれに対して相補的な、単離ヌクレオチド配列またはその断片。
【請求項３】
ポリ不飽和脂肪酸を基質として利用する、機能的に活性なエロンガーゼをコードする、請求項１または２に記載の単離ヌクレオチド配列。
【請求項４】
ミドリムシ属（Ｅｕｇｌｅｎｏｉｄ  ｓｐ．）由来である、請求項１または２に記載の単離ヌクレオチド配列。
【請求項５】
ユーグレナ・デセス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｄｅｓｅｓ）Ｅｈｒ．ＣＣＭＰ  ２９１６由来である、請求項４に記載の単離ヌクレオチド配列。
【請求項６】
請求項１または２に記載の単離ヌクレオチド配列によりコードされる、精製ポリペプチド。
【請求項７】
炭素９位に不飽和を含むポリ不飽和脂肪酸を延長させ、且つ配列番号１８及び配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６８％のアミノ酸同一性を有する、精製ポリペプチド。
【請求項８】
調節配列に機能し得る形で連結されたヌクレオチド配列を含む発現ベクターであって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号１７及び配列番号１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも７５％を含む、またはそれに対して相補的である、前記発現ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１０】
真核細胞及び原核細胞からなる群から選択される、請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞及び真菌細胞からなる群から選択される、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
ダイズ、アブラナ科植物、サフラワー、ヒマワリ、トウモロコシ、ワタ及びアマからなる群から選択される油糧種子植物由来である、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
請求項８に記載の発現ベクターを含む、植物細胞、植物種子、植物または植物組織であって、前記発現ベクターのヌクレオチド配列を発現させると、前記植物細胞、植物種子、植物または植物組織により、少なくとも１つのポリ不飽和脂肪酸が産生される、前記植物細胞、植物種子、植物または植物組織。
【請求項１４】
ポリ不飽和脂肪酸が、ω６−エイコサジエン酸（ω６−ＥＤＡ）、ω３−エイコサトリエン酸（ω３−ＥＴｒＡ）及びその組合せからなる群から選択される、請求項１３に記載の植物細胞、植物種子、植物または植物組織。
【請求項１５】
ａ）配列番号１７及び配列番号１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも７５％を含む、またはそれに対して相補的な、ヌクレオチド配列を単離するステップ；
ｂ）ｉｉ）調節配列に機能し得る形で連結されたｉ）単離ヌクレオチド配列を含む、発現ベクターを構築するステップ；及び
ｃ）Δ９−エロンガーゼの産生のために十分な時間及び条件下で発現ベクターを宿主細胞に導入するステップ；
を含む、Δ９−エロンガーゼの産生方法。
【請求項１６】
宿主細胞が、真核細胞及び原核細胞からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
真核細胞が、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞及び真菌細胞からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
植物細胞が、ダイズ、アブラナ科植物、サフラワー、ヒマワリ、トウモロコシ、ワタ及びアマからなる群から選択される油糧種子植物由来である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ａ）配列番号１７及び配列番号１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも７５％を含む、またはそれに対して相補的な、ヌクレオチド配列を単離するステップ；
ｂ）ｉｉ）調節配列に機能し得る形で連結されたｉ）単離ヌクレオチド配列を含む発現ベクターを構築するステップ；
ｃ）Δ９−エロンガーゼの発現のために十分な時間及び条件下で発現ベクターを宿主細胞に導入するステップ；及び
ｄ）基質ポリ不飽和脂肪酸を第１産物ポリ不飽和脂肪酸に変換させるため、発現させたΔ９−エロンガーゼを基質ポリ不飽和脂肪酸に曝すステップ；
を含む、ポリ不飽和脂肪酸の産生方法。
【請求項２０】
基質ポリ不飽和脂肪酸が、リノール酸（ＬＡ）であり、第１産物ポリ不飽和脂肪酸が、ω６−エイコサジエン酸（ω６−ＥＤＡ）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
基質ポリ不飽和脂肪酸が、α−リノレン酸（ＡＬＡ）であり、第１産物ポリ不飽和脂肪酸が、ω３−エイコサトリエン酸（ω３−ＥＴｒＡ）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
第１産物ポリ不飽和脂肪酸を、第２またはその次の産物ポリ不飽和脂肪酸に変換させるために、第１産物ポリ不飽和脂肪酸を、少なくとも１つのデサチュラーゼ、少なくとも１つの追加エロンガーゼまたはその組合せに曝すステップを更に含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
第２またはその次の産物ポリ不飽和脂肪酸が、ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）、ω３−エイコサテトラエン酸（ω３−ＥＴＡ）、アラキドン酸（ＡＲＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びその組合せからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ａ）配列番号１７及び配列番号１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも７５％を含む、またはそれに対して相補的な、ヌクレオチド配列を単離するステップ；
ｂ）ｉｉ）調節配列に機能し得る形で連結されたｉ）単離ヌクレオチド配列を含む発現ベクターを構築するステップ；
ｃ）ｉ）発現ベクター及びｉｉ）Δ８−デサチュラーゼをコードし、且つ少なくとも１つの調節配列に機能し得る形で連結された単離ヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの追加組換えＤＮＡ構築物を、宿主細胞にΔ９−エロンガーゼ及びΔ８−デサチュラーゼの発現に十分な時間及び条件下で導入するステップ；及び
ｄ）リノール酸（ＬＡ）、α−リノレン酸（ＡＬＡ）及びその組合せからなる群から選択される基質ポリ不飽和脂肪酸を第１産物ポリ不飽和脂肪酸に変換させるため、発現させたΔ９−エロンガーゼ及びΔ８−デサチュラーゼを、前記基質ポリ不飽和脂肪酸に曝すステップ；
を含む、宿主細胞におけるポリ不飽和脂肪酸の産生方法。
【請求項２５】
第１産物ポリ不飽和脂肪酸が、ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）、ω３−エイコサテトラエン酸（ω３−ＥＴＡ）及びその組合せからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
第１産物ポリ不飽和脂肪酸を、第２またはその次のポリ不飽和脂肪酸に変換させるために、第１産物ポリ不飽和脂肪酸を少なくとも１つの追加デサチュラーゼまたは少なくとも１つの追加エロンガーゼに曝すステップを更に含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
第２またはその次のポリ不飽和脂肪酸が、アラキドン酸（ＡＲＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びその組合せからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
宿主細胞が、原核細胞及び真核細胞からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
真核細胞が、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞及び真菌細胞からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
植物細胞が、ダイズ、アブラナ科植物、サフラワー、ヒマワリ、トウモロコシ、ワタ及びアマからなる群から選択される油糧種子植物由来である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
宿主細胞にｉｉ）調節配列に機能し得る形で連結されたｉ）Δ５−デサチュラーゼをコードする単離ヌクレオチド配列を更に含む、組換えＤＮＡ構築物を導入することを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
植物細胞を、請求項２に記載の少なくとも１つの単離ヌクレオチド配列またはその断片で形質転換し、形質転換した植物細胞からトランスジェニック植物を再生させることを含む、トランスジェニック植物の作成方法。
【請求項３３】
植物細胞が、ダイズ、アブラナ科植物、サフラワー、ヒマワリ、トウモロコシ、ワタ及びアマからなる群から選択される油糧種子植物由来である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
請求項３２に記載の方法により作成したトランスジェニック植物から得た、トランスジェニック種子。
【請求項３５】
請求項８に記載の発現ベクターを含む、トランスジェニック種子。
【国際調査報告】
2012533303.tif 000039
2012533303.tif 000040
2012533303.tif 000041
2012533303.tif 000042