(57)【要約】  本発明者らは、作製したユーカリESTデータベースを用いて、マイクロアレイ解析によるユーカリ木繊維形成組織において細胞壁合成に関与する遺伝子群とそれらの発現を制御する転写因子群の抽出と、それらの地上高・種の違いによる発現解析を行った。その結果、ユーカリ木繊維形成組織で発現している細胞壁合成遺伝子群と転写因子群を特定し、それらが協調的に地上高・種の違いで優位に発現変動することを同定した。さらに、それら群のプロモーターDNAを取得した。上記遺伝子群と発現情報・プロモーターDNAは、木繊維形成組織の細胞壁合成および形態形成の制御に利用できると考えられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の植物樹幹の木繊維細胞壁を形成する機能を有するタンパク質をコードするDNA。
（ａ）配列番号：３５〜６８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１〜３４のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：３５〜６８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：１〜３４のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｅ）配列番号：３５〜６８のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
【請求項２】
植物がユーカリである、請求項１に記載のDNA。
【請求項３】
請求項１または２に記載のDNAの部分DNA。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のDNAが固定化された基板。
【請求項５】
植物の樹幹の師部側および木部側において、以下の（ａ）〜（ｅ）に記載の少なくとも１つのDNAの発現レベルを検出し、師部側および木部側における該DNAの発現レベルを比較する工程を含む、植物の樹幹木部の生長状態を検査する方法。
（ａ）配列番号：３５〜６４または６６〜６８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１〜３０または３２〜３４のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：３５〜６４または６６〜６８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：１〜３０または３２〜３４のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｅ）配列番号：３５〜６４または６６〜６８のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
【請求項６】
異なる２つの樹幹木部において、以下の（ａ）〜（ｅ）に記載の少なくとも１つのDNAの発現レベルを検出し、異なる２つの樹幹木部における該DNAの発現レベルを比較する工程を含む、異なる２つの樹幹木部の生長状態を検査する方法。
（ａ）配列番号：３５〜４０、４２、４８、５０、５１、５３〜５６、５８、５９、６２、６４、６６、または６７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１〜６、８、１４、１６、１７、１９〜２２、２４、２５、２８、３０、３２、または３３のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：３５〜４０、４２、４８、５０、５１、５３〜５６、５８、５９、６２、６４、６６、または６７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：１〜６、８、１４、１６、１７、１９〜２２、２４、２５、２８、３０、３２、または３３のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｅ）配列番号：３５〜４０、４２、４８、５０、５１、５３〜５６、５８、５９、６２、６４、６６、または６７のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
【請求項７】
植物の樹幹の師部側および木部側において、以下の（ａ）〜（ｅ）に記載の少なくとも１つのDNAの発現レベルを検出し、師部側および木部側における該DNAの発現レベルを比較する工程を含む、植物の樹幹木部の生長状態を検査する方法。
（ａ）配列番号：３５〜４０、４２、４３、４５〜４８、５０、５１、５３〜５９、６１、６２、６４、６６、または６７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１〜６、８、９、１１〜１４、１６、１７、１９〜２５、２７、２８、３０、３２、または３３のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：３５〜４０、４２、４３、４５〜４８、５０、５１、５３〜５９、６１、６２、６４、６６、または６７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：１〜６、８、９、１１〜１４、１６、１７、１９〜２５、２７、２８、３０、３２、または３３のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｅ）配列番号：３５〜４０、４２、４３、４５〜４８、５０、５１、５３〜５９、６１、６２、６４、６６、または６７のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
【請求項８】
異なる２つの樹幹木部において、以下の（ａ）〜（ｃ）に記載の少なくとも１つのDNAの発現レベルを検出し、異なる２つの樹幹木部における該DNAの発現レベルを比較する工程を含む、異なる２つの樹幹木部の生長状態を検査する方法。
（ａ）配列番号：４５、４６、５１、５５、または５６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１１、１２、１７、２１、または２２のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：４５、４６、５１、５５、または５６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：１１、１２、１７、２１、または２２のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｅ）配列番号：４５、４６、５１、５５、または５６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
【請求項９】
請求項１または２に記載のDNAによりコードされるタンパク質。
【請求項１０】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列からなるプロモーターDNA。
（ａ）配列番号：９３〜１００のいずれかに記載の塩基配列
（ｂ）（ａ）の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつ、（ａ）のDNAからなるプロモーターと実質的に同一のプロモーターとしての機能を有する塩基配列
（ｃ）（ａ）の塩基配列の一部を含み、かつ、（ａ）のDNAからなるプロモーターと実質的に同一のプロモーターとしての機能を有する塩基配列
【請求項１１】
さらに、植物の木繊維形成組織に特異的発現に関与する転写因子を認識する塩基配列を機能的に結合させた、請求項１０に記載のプロモーターDNA。
【請求項１２】
以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のDNA。
（ａ）請求項１に記載のDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNA
（ｂ）請求項１に記載のDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA
（ｃ）RNAi効果により、請求項１に記載のDNAの発現を抑制するRNAをコードするDNA
（ｄ）共抑制効果により、請求項１に記載のDNAの発現を抑制するRNAをコードするDNA
（ｅ）請求項１に記載のDNAの転写産物に対してドミナントネガティブな形質を有するタンパク質をコードするDNA
【請求項１３】
以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の植物の転写因子をコードするDNA。
（ａ）配列番号：１１２〜１２２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１０１〜１１１のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：１１２〜１２２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：１０１〜１１１のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｅ）配列番号：１１２〜１２２のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
【請求項１４】
植物がユーカリである、請求項１３に記載のDNA。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載のDNAの部分DNA。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれかに記載のDNAが固定化された基板。
【請求項１７】
植物の樹幹の師部側および木部側において、以下の（ａ）〜（ｅ）に記載の少なくとも１つのDNAの発現レベルを検出し、師部側および木部側における該DNAの発現レベルを比較する工程を含む、植物の樹幹木部の生長状態を検査する方法。
（ａ）配列番号：１１２〜１１８または１２０〜１２２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１０１〜１０７または１０９〜１１１のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：１１２〜１１８または１２０〜１２２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：１０１〜１０７または１０９〜１１１のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｅ）配列番号：１１２〜１１８または１２０〜１２２のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
【請求項１８】
異なる２つの樹幹木部において、以下の（ａ）〜（ｅ）に記載の少なくとも１つのDNAの発現レベルを検出し、異なる２つの樹幹木部における該DNAの発現レベルを比較する工程を含む、異なる２つの樹幹木部の生長状態を検査する方法。
（ａ）配列番号：１１３または１１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１０２または１０３に記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：１１３または１１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：１０２または１０３に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｅ）配列番号：１１３または１１４に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
【請求項１９】
植物の樹幹の師部側および木部側において、以下の（ａ）〜（ｅ）に記載の少なくとも１つのDNAの発現レベルを検出し、師部側および木部側における該DNAの発現レベルを比較する工程を含む、植物の樹幹木部の生長状態を検査する方法。
（ａ）配列番号：１１３〜１１７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１０２〜１０６のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：１１３〜１１７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：１０２〜１０６のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｅ）配列番号：１１３〜１１７のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
【請求項２０】
異なる２つの樹幹木部において、以下の（ａ）〜（ｃ）に記載の少なくとも１つのDNAの発現レベルを検出し、異なる２つの樹幹木部における該DNAの発現レベルを比較する工程を含む、異なる２つの樹幹木部の生長状態を検査する方法。
（ａ）配列番号：１１６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１０５に記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：１１６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：１０５に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｅ）配列番号：１１６に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
【請求項２１】
請求項１３または１４に記載のDNAによりコードされるタンパク質。
【請求項２２】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列からなるプロモーターDNA。
（ａ）配列番号：１５６〜１６６のいずれかに記載の塩基配列
（ｂ）（ａ）の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつ、（ａ）のDNAからなるプロモーターと実質的に同一のプロモーターとしての機能を有する塩基配列
（ｃ）（ａ）の塩基配列の一部を含み、かつ、（ａ）のDNAからなるプロモーターと実質的に同一のプロモーターとしての機能を有する塩基配列
【請求項２３】
さらに、植物の木繊維形成組織に特異的発現に関与する転写因子を認識する塩基配列を機能的に結合させた、請求項２２に記載のプロモーターDNA。
【請求項２４】
請求項１〜３、１０〜１５、２２または２３のいずれかに記載のDNAを有する組換えベクター。
【請求項２５】
請求項２４に記載のベクターを含むプラスミドを保持する微生物。
【請求項２６】
請求項２４に記載のベクターが導入された形質転換植物細胞。
【請求項２７】
請求項２６に記載の形質転換植物細胞から再分化した形質転換植物体。
【請求項２８】
請求項２７に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
【請求項２９】
請求項２７または２８に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物樹幹の木繊維細胞壁を形成する機能を有するタンパク質をコードするDNA、そのプロモーターDNA、並びにその利用に関する。
本発明はまた、植物の転写因子をコードするDNA、プロモーターDNA断片、並びにその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
人類は長い間、樹幹・根・葉・枝等の木質バイオマスを、製紙、建築、飼料、燃料等の多岐にわたる産業分野で利用してきた。世界の木質バイオマス消費量は毎年増加傾向にあり、用途別にみると、薪炭用材の消費が過半数を占め、開発途上地域では今でも増加傾向を示している。製材、製紙用の木材チップなどの産業用材も、先進地域の消費量は若干の減少に転じたものの、開発途上国地域における消費量は増加している。先進地域では文明の発達とともに、森林の農地への転用や資材としての利用等により森林を大きく減少させてきたが、最近植林活動によってわずかながら増加している。しかし、開発途上地域では、かつては先進国の商業伐採により、近年は人口増加にともなって、生活燃料や農地の需要が拡大し、世界全体における森林面積が急激に減少しつづけている。こうしたことから、二酸化炭素固定化能の低下による地球温暖化などの問題が挙げられるようにもなってきた。これらの問題を解決しつつ、近年、産業的に製材、製紙用木材チップの安定供給などを目指した植林事業が世界各地で盛んに行われている。【０００３】
木質バイオマスを利用した産業は、将来的にも、持続的利用可能な資源を活用できるとして地球環境問題改善の観点から再認識されており、現行の化石資源に替わるカーボンソースの利用による循環型産業として期待されている。具体的事例を示すと、我が国の製紙会社では、原料である木質バイオマスの持続的かつ安定的確保達成のため、ユーカリ属、アカシア属等の熱帯早生樹を中心とした植林事業を精力的に進めている。その植林事業規模の例として、王子製紙では2010年度までに30万ｈａの植林面積を目指し、オセアニア、東南アジアなどの環太平洋を中心に広い地域で行っている。このことは、事業レベルでの大規模植林を行うことによるバイオマスの工業利用、再生という循環型の物質生産（バイオマスのリサイクル）を他の産業分野に先駆けて進めていることに他ならない。【０００４】
さらに、このような植林事業の進展にあわせ、主要な木質バイオマスである樹幹における木繊維形成を人為的に制御することで、その構成要素である細胞壁の成分量（セルロース・ヘミセルロース・リグニン）並びに質を可変すること、さらに繊維形態（木繊維細胞の伸長）を自由に可変することが可能となれば、木質バイオマスの量的な増大並びに質的な改良が見込まれ、これによって将来のエネルギー利用や工業原料としての用途拡張も見込まれる。【０００５】
樹幹における木質バイオマスの大部分は木繊維と呼ばれる組織細胞で構成されている。木繊維組織の比重・細胞壁構造や成分（セルロース・ヘミセルロース・リグニン）等は、木繊維の性質を決める主要要素であり、工業原材料として利用する場合、各製品仕様にあった多様な性質が求められる。例えば、高い比重の木繊維から製造した紙は、低い比重のそれと比較して、叩解に対する抵抗性、引裂き強さなどは高いが、反面、パルプシートの密度、引張り、破裂および耐折強度などは低い。【０００６】
この木繊維細胞の性質は、広葉樹・針葉樹を問わず、地上高・樹齢・種により変動することが知られている（非特許文献１、非特許文献２）。樹齢による木繊維性質の変動現象については古くから成熟材・未成熟材として、また地上高による変動現象については材質の樹幹内垂直変動として、そして種による変動現象については樹種間変動として知られる。例えば、成熟材と未成熟材を相互比較すると、成熟材では細胞壁成分については、セルロースが増大し、リグニン、ヘミセルロースが減少する。また、形態的観察では、導管分布密度が少なく、繊維長は増加が認められる。同様の違いが、地上高や種の違い（非特許文献１〜３）でも発生する。詳細は不明であるが、各木繊維形成組織での細胞壁合成が異なるため、形成される木繊維性質の差が発生しているものと考えられている。このような異なる性質の細胞壁合成を担う各遺伝子群の特定はなされていない。【０００７】
近年、草本を中心としたモデル植物等を用いたゲノムレベルでの遺伝子解析研究が盛んに行われている。草本では、特定時期に特定器官において、わずかな木繊維しか形成しない。例えば、主要なモデルであるシロイヌナズナの場合、栄養成長期には木繊維はほとんど形成されず、生殖成長期の花茎内のごく一部に形成される（非特許文献４）。樹木の繊維細胞は、形成層組織から分化し木繊維（wood fiber）と呼ばれるのに対し、草本の繊維細胞は主として維管束と維管束の間の柔細胞から分化し、束間繊維（interfascicular fiber）と呼ばれる。このように、草本の繊維細胞は、多年にわたって肥大成長する木本の木繊維細胞とは同一でない。したがって、真に木繊維形成に必要な遺伝子群を同定するためには、樹木を用いて解析しなければならない。【０００８】
植物の木繊維形成関連遺伝子群やその制御因子は、単に既知の制御因子との相同性検索やモチーフ検索では区別・同定できない。例えば、木繊維細胞壁の主成分であるセルロースやリグニンの合成経路には多数の酵素が関わっており、それらの遺伝子は植物ゲノム中で大きなファミリーを形成している（非特許文献５）。さらにファミリー内では、一次細胞壁の合成に関わるものや二次細胞壁の合成に関わるものなどがあり、機能する場所や役割が様々に分担されている。配列モチーフや相同性検索からでは、単に高い相同性が示されるだけで、役割等を特定することはできない。例えば、セルロース合成に関わる酵素cellulose synthase (CesA) は、シロイヌナズナゲノム中に４０個程度予想されている。その中で一次壁のセルロース合成に必須なCesAとしてRSW1（非特許文献６）が同定されており、二次壁セルロース合成に必須なCesAとしてIRX3（非特許文献７）が同定されている。両者のアミノ酸配列の相同性は、全体で６５％であり部分的には９０％を超え大変高い。このように、単純に配列の相同性スコアだけでは役割を同定できないため、木繊維細胞壁合成遺伝子群を特定するためには、詳細な発現解析等が必要である。【０００９】
セルロース・リグニン合成系の遺伝子が、ゲノム中に多数のファミリーを形成し、多様なレベルの群に分かれて発現しているのと同様に、それらの制御因子もまた多数のファミリーを形成し多様なレベルの群に分かれて発現しており、配列上のモチーフや相同性検索だけでは役割を区別できない。例えば、シロイヌナズナゲノム中の制御因子は５０以上のファミリー、１５００以上の遺伝子が同定されている（非特許文献８）。その中でも、例えばMYBファミリーに属する制御因子は約１９０個にもおよび、詳細な発現解析等によりそれぞれが特有な生命現象に関与していることが少しずつ明らかにされつつある。また、例えば、木繊維に含まれるリグニンに代表されるフェニルプロパノイド生合成系の制御因子としてタバコで同定された制御因子NtLIM1（特許文献１）と相同なものを、公知の検索サイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）にて検索すると、多数のLIMタンパク質と高い相同性を示す。木繊維を形成しないラットのLIMタンパク質とさえ、高い相同性スコアでヒットする。シロイヌナズナでは、少なくとも１０個以上のLIMタンパク質と高いスコア（５６〜８７％）でヒットするが、その中でどのLIMタンパク質がシロイヌナズナのリグニン合成系の制御に関わっているか不明である。このように、制御因子の役割は既知の制御因子との相同性だけでは同定できないため、詳細な発現解析等を行わなければならない。しかしながら、樹木における制御因子の網羅的な発現解析の知見はない。【００１０】
前述のように、草本では木本と同一の木繊維は形成されない。また、単に既知の遺伝子との相同性だけで、木繊維細胞壁のセルロース・リグニン合成関連遺伝子群を特定することはできない。つまり、草本の繊維形成に関わる情報を、そのまま樹木の木繊維形成に利用することはできない。真に木繊維細胞壁合成に関わるセルロース・リグニン合成系の遺伝子を特定するのは、草本では困難である。樹木を用いて木繊維形成部位の発現解析を行うことで、木繊維細胞壁のセルロース・リグニン合成に必要な遺伝子群を同定できる。しかしながら、樹木を用いて木繊維細胞壁合成に関わるセルロース・リグニン合成系の遺伝子の特定を行った例は少ない（非特許文献９と１０）。【００１１】
草本と木本間における繊維形成時に働く遺伝子群の違いだけでなく、木本植物においても、多様な木繊維細胞壁合成遺伝子群の存在が予想されている。例えば、若年と壮年では葉や樹幹の形態等が違うことから、年齢によって異なる複数の木繊維細胞壁合成遺伝子群が機能していることが予想されている。また、前述のように樹高による垂直変動や、樹種による樹種間変動が生じることから、同一個体内や種間でも異なる複数の木繊維細胞壁合成遺伝子群が、各々で特有に機能していることが予想される。これらの各木繊維細胞壁合成遺伝子群は、配列上は互いに高い相同性を示すだけで、どれがどのレベルの木繊維細胞壁合成遺伝群に属するかは区別できない。この区別を行うためには、木繊維形成部位での詳細な発現解析が必要である。しかしながら、そのような知見はない。【００１２】
木本植物においても、ポプラやマツを用いてゲノムレベルでの樹木解析研究がなされている（非特許文献７と９）。しかしながら、用いられている材料は、根や葉・形成層といった別々の器官や組織単位であり、それらにおける遺伝子発現情報を報告しているにすぎない。異なる地上高・種の木繊維形成組織での発現解析を行い、多様なレベルの木繊維細胞壁合成に関わる遺伝子群やそれらのプロモーター情報・発現情報に関するゲノムレベルでの網羅的な知見はない。【００１３】
ところで、植林事業の現場では、植林木の生長状態は外見で判断しており、またパルプ原料としての質を知るためには、伐採後に化学的な手法でパルプ原料である樹幹の木繊維の分析（材質分析）を行っている。生長状態については、経験と勘に頼っているため、外見では判別できない栄養分の不足等の問題点は把握できない。そして、伐採後にしかその材質が分からないため、生長中の植林木の木繊維形成（材質）がどのような状況であるのか、将来どのような木繊維が形成されるのか等はわからず、良い材質を作り出すための施業（施肥や間伐等）方針もたたない。また、優良な植林木を選抜する場合、生長中であれば外見上判断できる生長量（樹高・直径）を指標にするしかなく、材質を予測して選抜することができない。このように、樹幹の木繊維形成（材質）を生長中に予測することは、植林地での施業や選抜・育種、質の良い製紙原料の確保を考える上で大変重要である。【００１４】
前述のように、植物は同じ種・同じ個体内でも木繊維形成状態等の生長状態に関して違いがあり、それは外見上判別できない。そのため、生長中に木繊維形成（材質）を予測するための検査マーカーが必要とされてきた。しかしながら、これまでに生長状態や木繊維形成状態の検査マーカーは開発されていなかった。【００１５】
なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に記す。
【特許文献１】特許第３４４４１９１号
【非特許文献１】島地謙・須藤彰司・原田浩著「木材の組織」、森北出版、1976、111-215
【非特許文献２】古野毅・澤辺攻著「木材科学講座2・組織と材質」、海青社、1994、109-137
【非特許文献３】Wood Science and Technology. 2001;35:229-243.
【非特許文献４】Plant Physiology, 2001, 126:477-479.
【非特許文献５】Plant Physiology, 2000, 124: 495-498.
【非特許文献６】Science 1998, 279:717-720.
【非特許文献７】Plant Cell 1999, 11:769-780.
【非特許文献８】岩淵雅樹・篠崎一雄編「植物ゲノム機能のダイナミズム」シュープリンガー・フェアラーク東京、2001、1-34
【非特許文献９】GenomeBiol. 2002;3(12):REVIEWS1033.
【非特許文献１０】Proc Natl Acad Sci U S A 2001 Dec 4;98(25):14732-7.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
木質バイオマスの性質は、木繊維の細胞壁及び形態等によって変動する。この木繊維の細胞壁及び形態等の形成を人為的に制御することで、効果的かつ効率的に工業原材料としての木質バイオマスの生産を行うことができる。また、世界はいまだ大量の石油、天然ガスなどの化石資源に依存している。今、新しい技術を持ってこの現状を変えていくためには、木質バイオマスとしての樹木の効率的な活用こそが、その切り札となる。海外諸国においては、樹木バイオマスの有効活用に関する技術確立は、今世紀初頭における重要課題と位置づけられている。実際、米国では針葉樹のマツ、広葉樹のポプラ、カナダでは同じくトウヒ、ポプラが、北欧ではポプラがその対象樹種として、国家プロジェクトとしてゲノム科学的な解析により研究を開始している。地球規模での木質バイオマスのより効果的かつ効率的生産を担うためにも、植物における木繊維細胞形成を制御する遺伝子を同定する必要性は非常に高い。【００１７】
本発明の課題は、植物樹幹の木繊維細胞壁を形成する機能を有するタンパク質をコードするDNA、植物の転写因子をコードするDNA、そのプロモーターDNA、並びにこれらを含むプラスミド、ならびに、そのプラスミドにより形質転換されてなる植物細胞、微生物もしくは植物体を提供することにある。また、植物樹幹の木繊維細胞壁を形成する機能を有するタンパク質と植物の転写因子をコードするDNAに関し、植物の樹幹木部の検査用マーカーとしての用途を提供することも課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、本課題を解決するためには、ゲノム科学的なアプローチによる、ユーカリ木繊維細胞壁を形成する遺伝子群の取得と、発現・機能に関する包括的な解析を行うべきとの結論にいたった。すなわち、木繊維形成組織を含む発現遺伝子データベース（ＥＳＴデータベース）を作製し、異なる地上高・種の木繊維形成部位における発現解析を行うことで、配列の相同性検索では区別できない目的の遺伝子群を網羅的に同定・取得し、それら遺伝子のプロモーターDNA断片を取得、解析する方法を用いることが望ましいとの結論にいたった。さらに、遺伝子工学技術を使用した改良遺伝子の人為的発現制御によって、人類が利用する上で有用な特性を植物に与える為には、新しい特性が適当な植物組織で選択的に発現される様々な組織に特異的な遺伝子群の同定が必要であるとの結論にいたった。【００１９】
本研究の遂行に当たり、ユーカリにおける解析リソースの整備を行い、具体的には各種遺伝子ライブラリー、樹幹部、葉部、根部の各組織毎にESTデータベースを作製した。これに加え、モデル植物として世界中で広く活用されているシロイヌナズナについても、遺伝子ライブラリーや細胞壁生合成に関わる突然変異体を保有すると共に、これらの原因遺伝子については既に解析済みである。【００２０】
本発明者らは、作製したユーカリESTデータベースを用いて、マイクロアレイ解析によるユーカリ木繊維形成組織において細胞壁合成に関与する遺伝子群の抽出と、それらの地上高・種の違いによる発現変動を調べた。その結果、地上高・種の違いで優位に発現が変動するユーカリ木繊維形成組織の細胞壁合成遺伝子群を特定した。さらにそれらのプロモーターDNAを取得した。上記遺伝子群とプロモーターDNAは、木繊維形成組織の細胞壁合成および形態形成の制御や木繊維特異的な遺伝子発現制御に利用できると考えられる。【００２１】
本発明の遺伝子群は、詳細な発現様式から、「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹基部および樹幹中央部において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇している遺伝子群」、「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹基部において、師部側と比較して木部側で発現レベルが減少し、樹幹中央部において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇している遺伝子群」、「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹中央部において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇し、樹幹基部において、師部側と木部側で発現レベルが同等な遺伝子群」、「ユーカリ属カマルドレンシスおよびユーカリ属グロブルスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇している遺伝子群」、「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇し、ユーカリ属グロブルスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが減少している遺伝子群」、「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇し、ユーカリ属グロブルスの樹幹において、師部側と木部側で発現レベルが同等な遺伝子群」の６グループに大別された。この遺伝子群の発現（レベル）情報は、植物体の生長状態や木繊維形成状態、材質の量的・質的な事前予測に利用できると考えられる。このことにより、植林事業において、生長状態をもとに適切な施業（除草・間伐等）を適切な時期に施すことができ、ひいてはパルプ製造の効率化、コストの削減、新規な特性を持った紙の製造が可能になる。【００２２】
本発明によって得られたユーカリ樹幹の木繊維細胞壁を形成する機能を有するタンパク質をコードするDNA、並びにそれらを統括的に制御する技術と発現情報・プロモーターDNAについては、その１つの成果として、これらの遺伝子群を用いて得られた遺伝子組換えユーカリ新品種の特性による、高セルロース、低リグニン、細胞壁の厚いもの、薄いもの、繊維長の長いもの、短いもの等様々な量的かつ質的な変化が期待される。また、発現情報に基づき地上高、種などの材質や生長状態の判別に使用することが期待される。【００２３】
即ち、本発明は、植物樹幹の木繊維細胞壁を形成する機能を有するタンパク質をコードするDNA、そのプロモーターDNA断片、並びにその利用に関し、以下の〔１〕〜〔１８〕を提供するものである。
〔１〕以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の植物樹幹の木繊維細胞壁を形成する機能を有するタンパク質をコードするDNA。
（ａ）配列番号：３５〜６８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１〜３４のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：３５〜６８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：１〜３４のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｅ）配列番号：３５〜６８のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
〔２〕植物がユーカリである、〔１〕に記載のDNA。
〔３〕〔１〕または〔２〕に記載のDNAの部分DNA。
〔４〕〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のDNAが固定化された基板。
〔５〕植物の樹幹の師部側および木部側において、以下の（ａ）〜（ｅ）に記載の少なくとも１つのDNAの発現レベルを検出し、師部側および木部側における該DNAの発現レベルを比較する工程を含む、植物の樹幹木部の生長状態を検査する方法。
（ａ）配列番号：３５〜６４または６６〜６８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１〜３０または３２〜３４のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：３５〜６４または６６〜６８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：１〜３０または３２〜３４のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｅ）配列番号：３５〜６４または６６〜６８のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
〔６〕異なる２つの樹幹木部において、以下の（ａ）〜（ｅ）に記載の少なくとも１つのDNAの発現レベルを検出し、異なる２つの樹幹木部における該DNAの発現レベルを比較する工程を含む、異なる２つの樹幹木部の生長状態を検査する方法。
（ａ）配列番号：３５〜４０、４２、４８、５０、５１、５３〜５６、５８、５９、６２、６４、６６、または６７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１〜６、８、１４、１６、１７、１９〜２２、２４、２５、２８、３０、３２、または３３のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：３５〜４０、４２、４８、５０、５１、５３〜５６、５８、５９、６２、６４、６６、または６７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：１〜６、８、１４、１６、１７、１９〜２２、２４、２５、２８、３０、３２、または３３のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｅ）配列番号：３５〜４０、４２、４８、５０、５１、５３〜５６、５８、５９、６２、６４、６６、または６７のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
〔７〕植物の樹幹の師部側および木部側において、以下の（ａ）〜（ｅ）に記載の少なくとも１つのDNAの発現レベルを検出し、師部側および木部側における該DNAの発現レベルを比較する工程を含む、植物の樹幹木部の生長状態を検査する方法。
（ａ）配列番号：３５〜４０、４２、４３、４５〜４８、５０、５１、５３〜５９、６１、６２、６４、６６、または６７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１〜６、８、９、１１〜１４、１６、１７、１９〜２５、２７、２８、３０、３２、または３３のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：３５〜４０、４２、４３、４５〜４８、５０、５１、５３〜５９、６１、６２、６４、６６、または６７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：１〜６、８、９、１１〜１４、１６、１７、１９〜２５、２７、２８、３０、３２、または３３のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｅ）配列番号：３５〜４０、４２、４３、４５〜４８、５０、５１、５３〜５９、６１、６２、６４、６６、または６７のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
〔８〕異なる２つの樹幹木部において、以下の（ａ）〜（ｃ）に記載の少なくとも１つのDNAの発現レベルを検出し、異なる２つの樹幹木部における該DNAの発現レベルを比較する工程を含む、異なる２つの樹幹木部の生長状態を検査する方法。
（ａ）配列番号：４５、４６、５１、５５、または５６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１１、１２、１７、２１、または２２のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：４５、４６、５１、５５、または５６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：１１、１２、１７、２１、または２２のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｅ）配列番号：４５、４６、５１、５５、または５６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
〔９〕〔１〕または〔２〕に記載のDNAによりコードされるタンパク質。
〔１０〕以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列からなるプロモーターDNA。
（ａ）配列番号：９３〜１００のいずれかに記載の塩基配列
（ｂ）（ａ）の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつ、（ａ）のDNAからなるプロモーターと実質的に同一のプロモーターとしての機能を有する塩基配列
（ｃ）（ａ）の塩基配列の一部を含み、かつ、（ａ）のDNAからなるプロモーターと実質的に同一のプロモーターとしての機能を有する塩基配列
〔１１〕さらに、植物の木繊維形成組織に特異的発現に関与する転写因子を認識する塩基配列を機能的に結合させた、〔１０〕に記載のプロモーターDNA。
〔１２〕以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のDNA。
（ａ）〔１〕に記載のDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNA
（ｂ）〔１〕に記載のDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA
（ｃ）RNAi効果により、〔１〕に記載のDNAの発現を抑制するRNAをコードするDNA
（ｄ）共抑制効果により、〔１〕に記載のDNAの発現を抑制するRNAをコードするDNA
（ｅ）〔１〕に記載のDNAの転写産物に対してドミナントネガティブな形質を有するタンパク質をコードするDNA
〔１３〕〔１〕〜〔３〕または〔１０〕〜〔１２〕のいずれかに記載のDNAを有する組換えベクター。
〔１４〕〔１３〕に記載のベクターを含むプラスミドを保持する微生物。
〔１５〕〔１４〕に記載のベクターが導入された形質転換植物細胞。
〔１６〕〔１５〕に記載の形質転換植物細胞から再分化した形質転換植物体。
〔１７〕〔１６〕に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
〔１８〕〔１６〕または〔１７〕に記載の形質転換植物体の繁殖材料。【００２４】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、本課題を解決するためには、ゲノム科学的なアプローチによる、ユーカリ木繊維細胞壁を形成する遺伝子群の発現を制御する転写因子群の取得と、発現・機能に関する包括的な解析を行うべきとの結論にいたった。すなわち、木繊維形成組織を含む発現遺伝子データベース（ＥＳＴデータベース）を作製し、異なる地上高・種の木繊維形成部位における発現解析を行うことで、配列の相同性検索では区別できない目的の遺伝子群を網羅的に同定・取得し、それら遺伝子のプロモーターDNA断片を取得、解析する方法を用いることが望ましいとの結論にいたった。さらに、遺伝子工学技術を使用した改良遺伝子の人為的発現制御によって、人類が利用する上で有用な特性を植物に与える為には、新しい特性が適当な植物組織で選択的に発現される様々な組織に特異的な遺伝子群の同定が必要であるとの結論にいたった。【００２５】
本研究の遂行に当たり、ユーカリにおける解析リソースの整備を行い、具体的には各種遺伝子ライブラリー、樹幹部、葉部、根部の各組織毎にESTデータベースを作製した。これに加え、モデル植物として世界中で広く活用されているシロイヌナズナについても、遺伝子ライブラリーや細胞壁生合成に関わる突然変異体を保有すると共に、これらの原因遺伝子については既に解析済みである。【００２６】
本発明者らは、作製したユーカリESTデータベースを用いて、マイクロアレイ解析によるユーカリ木繊維細胞壁形成に関与する転写因子群の抽出と、それらの地上高・種の違いによる発現変動を調べた。その結果、地上高・種の違いで優位に発現が変動する、ユーカリ木繊維細胞壁形成遺伝子群の発現を制御する転写因子群を特定した。さらにそれらのプロモーターDNAを取得した。【００２７】
本発明の遺伝子群は、詳細な発現様式から、「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹基部および樹幹中央部において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇している遺伝子群」、「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹中央部において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇し、樹幹基部において、師部側と木部側で発現レベルが同等な遺伝子群」、「ユーカリ属カマルドレンシスおよびユーカリ属グロブルスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇している遺伝子群」、「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇し、ユーカリ属グロブルスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが減少している遺伝子群」、「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇し、ユーカリ属グロブルスの樹幹において、師部側と木部側で発現レベルが同等な遺伝子群」の５グループに大別された。この遺伝子群の発現（レベル）情報は、植物体の生長状態や木繊維形成状態、材質の量的・質的な事前予測に利用できると考えられる。このことにより、植林事業において、生長状態をもとに適切な施業（除草・間伐等）を適切な時期に施すことができ、ひいてはパルプ製造の効率化、コストの削減、新規な特性を持った紙の製造が可能になる。【００２８】
本発明によって得られたユーカリの転写因子をコードするDNA、並びにそれらを統括的に制御する技術と発現情報・プロモーターDNAについては、その１つの成果として、これらの遺伝子群を用いて得られた遺伝子組換えユーカリ新品種の特性による、高セルロース、低リグニン、細胞壁の厚いもの、薄いもの、繊維長の長いもの、短いもの等様々な量的かつ質的な変化が期待される。また、発現情報に基づき地上高、種などの材質や生長状態の判別に使用することが期待される。【００２９】
即ち、本発明は、植物の転写因子をコードするDNA、そのプロモーターDNA断片、並びにその利用に関し、以下の〔１〕〜〔１７〕を提供するものである。
〔１〕以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の植物の転写因子をコードするDNA。
（ａ）配列番号：１１２〜１２２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１０１〜１１１のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：１１２〜１２２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：１０１〜１１１のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｅ）配列番号：１１２〜１２２のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
〔２〕植物がユーカリである、〔１〕に記載のDNA。
〔３〕〔１〕または〔２〕に記載のDNAの部分DNA。
〔４〕〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のDNAが固定化された基板。
〔５〕植物の樹幹の師部側および木部側において、以下の（ａ）〜（ｅ）に記載の少なくとも１つのDNAの発現レベルを検出し、師部側および木部側における該DNAの発現レベルを比較する工程を含む、植物の樹幹木部の生長状態を検査する方法。
（ａ）配列番号：１１２〜１１８または１２０〜１２２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１０１〜１０７または１０９〜１１１のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：１１２〜１１８または１２０〜１２２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：１０１〜１０７または１０９〜１１１のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｅ）配列番号：１１２〜１１８または１２０〜１２２のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
〔６〕異なる２つの樹幹木部において、以下の（ａ）〜（ｅ）に記載の少なくとも１つのDNAの発現レベルを検出し、異なる２つの樹幹木部における該DNAの発現レベルを比較する工程を含む、異なる２つの樹幹木部の生長状態を検査する方法。
（ａ）配列番号：１１３または１１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１０２または１０３に記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：１１３または１１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：１０２または１０３に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｅ）配列番号：１１３または１１４に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
〔７〕植物の樹幹の師部側および木部側において、以下の（ａ）〜（ｅ）に記載の少なくとも１つのDNAの発現レベルを検出し、師部側および木部側における該DNAの発現レベルを比較する工程を含む、植物の樹幹木部の生長状態を検査する方法。
（ａ）配列番号：１１３〜１１７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１０２〜１０６のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：１１３〜１１７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：１０２〜１０６のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｅ）配列番号：１１３〜１１７のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
〔８〕異なる２つの樹幹木部において、以下の（ａ）〜（ｃ）に記載の少なくとも１つのDNAの発現レベルを検出し、異なる２つの樹幹木部における該DNAの発現レベルを比較する工程を含む、異なる２つの樹幹木部の生長状態を検査する方法。
（ａ）配列番号：１１６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１０５に記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：１１６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：１０５に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｅ）配列番号：１１６に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
〔９〕〔１〕または〔２〕に記載のDNAによりコードされるタンパク質。
〔１０〕以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列からなるプロモーターDNA。
（ａ）配列番号：１５６〜１６６のいずれかに記載の塩基配列
（ｂ）（ａ）の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつ、（ａ）のDNAからなるプロモーターと実質的に同一のプロモーターとしての機能を有する塩基配列
（ｃ）（ａ）の塩基配列の一部を含み、かつ、（ａ）のDNAからなるプロモーターと実質的に同一のプロモーターとしての機能を有する塩基配列
〔１１〕さらに、植物の木繊維形成組織に特異的発現に関与する転写因子を認識する塩基配列を機能的に結合させた、〔１０〕に記載のプロモーターDNA。
〔１２〕〔１〕〜〔３〕、〔１０〕または〔１１〕のいずれかに記載のDNAを有する組換えベクター。
〔１３〕〔１２〕に記載のベクターを含むプラスミドを保持する微生物。
〔１４〕〔１２〕に記載のベクターが導入された形質転換植物細胞。
〔１５〕〔１４〕に記載の形質転換植物細胞から再分化した形質転換植物体。
〔１６〕〔１５〕に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
〔１７〕〔１５〕または〔１６〕に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
【発明の効果】
【００３０】
本発明のDNAを利用することにより、植物の木繊維形成を人為的に制御し、特にはその本質である細胞壁成分（セルロース・ヘミセルロース・リグニン）の量並びに質を可変すること、さらに繊維形態（木繊維細胞の伸長・細胞壁の厚さ）を自由に可変すること、さらに木繊維特異的な遺伝子発現制御が可能となった。即ち、木質バイオマスの量的な増大並びに質的な改良が見込まれ、これによってパルプ生産と製紙の効率化や新規な特性を持った紙の製造が期待できる。加えて、将来のエネルギー利用や工業原料としての活用における用途の拡張も期待できる。【００３１】
また、本発明のDNAは、植物の樹幹木部の検査用マーカーとして利用することができる。本発明のDNAを用いることで、植物の樹幹木部の生長状態、木繊維の形成状態、パルプ品質の検査、および有用な形質を有する植物の選抜ができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明は、植物樹幹の木繊維細胞壁を形成する機能を有するタンパク質（セルロース合成に関与するタンパク質、およびリグニン合成に関与するタンパク質）をコードするDNAとプロモーターDNAを提供する。【００３３】
本発明における植物樹幹の木繊維細胞壁を形成する機能を有するタンパク質をコードするDNAは、植物の木繊維細胞形成の制御に利用できると考えられる。一方、該DNAのプロモーターDNAは、木繊維組織あるいは木繊維形成時期特異的発現の制御に利用できると考えられる。また、植物樹幹の木繊維細胞壁を形成する機能を有するタンパク質をコードするDNAの発現（レベル）情報は、植物体の生長状態や木繊維形成状態、材質の量的・質的な事前予測に利用できると考えられる。従って、これらを用いることで、人為的な木繊維細胞形態形成の改変や任意の遺伝子・タンパク質の木繊維細胞特異的発現、植物体の生長状態や木繊維形成状態、材質の量的・質的な事前予測に利用することができると考えられる。その結果、パルプ製造の効率化、コストの削減、新規な特性を持った紙の製造が可能になる。【００３４】
植物において木繊維形成を制御することは、工業や農業の分野において、様々な重要な意義を有する。例えば、ユーカリ属カマルドレンシス種の木繊維性質の改変は、繊維長を長くすることによりパルプ等繊維原材料の繊維特性の向上などの点で有意義である。またユーカリ属グロブルス種のセルロース・ヘミセルロース含量を高めることによるパルプ等の収量増大や、蒸解効率の向上などをもたらし、経済性や収益性の点で有意義である。【００３５】
本発明のDNAの由来する植物としては、特に制限はなく、例えば、穀類、野菜、果樹等の有用農作物（飼料作物を含む）、パルプ等の繊維原材料植物、観葉植物等の鑑賞用植物等が挙げられる。該植物としては特に制限はなく、ユーカリ、マツ、アカシア、ポプラ、スギ、ヒノキ、タケ、イチイ、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ジャガイモ、タバコ、サトウダイコン、サトウキビ、ナタネ、ダイズ、ヒマワリ、ワタ、オレンジ、ブドウ、モモ、ナシ、リンゴ、トマト、ハクサイ、キャベツ、ダイコン、ニンジン、カボチャ、キュウリ、メロン、パセリ、ラン、キク、ユリ、サフラン等を例示することができる。【００３６】
本発明において、植物樹幹の木繊維細胞壁を形成する機能を有するタンパク質をコードするDNAとしては、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のDNAが挙げられる。
（ａ）配列番号：３５〜６８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１〜３４のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：３５〜６８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：１〜３４のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｅ）配列番号：３５〜６８のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA【００３７】
本発明において、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、0.1xSSC溶液中にて、60℃、一晩放置の条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件が挙げられる。このような条件において、配列番号：１〜３４のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとハイブリダイズするDNAが単離できる。【００３８】
具体的には、植物より、DNAを抽出し、遺伝子ライブラリーを構築し、同様の条件によりスクリーニングを行うか、もしくは、抽出したDNAに対して、配列番号：１〜３４のいずれかに記載の塩基配列より、任意の20mer程度の配列をプライマーに用いて、劉らによって確立されたTAIL-PCR法により、連続する近傍配列を容易に取得できる。【００３９】
また、本発明は、配列番号：３５〜６８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNAも提供する。このようなDNAは、当業者においては、一般的に公知の方法により単離することが可能である。例えば、ハイブリダイゼーション技術（Southern, EM., J Mol Biol, 1975, 98, 503.）やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術（Saiki, RK. et al., Science, 1985, 230, 1350.、Saiki, RK. et al., Science 1988, 239, 487.）を利用する方法が挙げられる。すなわち、配列番号：１〜３４のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAもしくはその一部をプローブとして、また、配列番号：１〜３４のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、植物から配列番号：１〜３４のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAと高い相同性を有するDNAを単離することは、当業者にとって通常行い得ることである。【００４０】
このようなDNAを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、6M 尿素、0.4％ SDS、0.5×SSCの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M 尿素、0.4％ SDS、0.1×SSCの条件下では、より相同性の高いDNAを単離できると期待される。こうして単離されたDNAは、アミノ酸レベルにおいて配列番号：１〜３４のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAからコードされるアミノ酸配列と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で少なくとも50％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、さらにより好ましくは95％以上、最も好ましくは98％以上の配列の同一性を指す。【００４１】
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 2264-2268.、Karlin, S. & Altschul, SF., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 5873.）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul, SF. et al., J Mol Biol, 1990, 215, 403.）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。【００４２】
また、本発明のDNAには、配列番号：３５〜６８のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNAが含まれる。【００４３】
上記のDNAを調製するために、当業者によく知られた方法としては、例えば、DNAに対し、site-directed mutagenesis法（Kramer, W. & Fritz, HJ., Methods Enzymol, 1987, 154, 350.）により変異を導入する方法が挙げられる。【００４４】
タンパク質におけるアミノ酸の改変は、通常、全アミノ酸の50アミノ酸以内であり、好ましくは30アミノ酸以内であり、さらに好ましくは10アミノ酸以内であり、さらに好ましくは3アミノ酸以内である。アミノ酸の改変は、例えば、変異や置換であれば「Transformer Site-directed Mutagenesis Kit」や「ExSite PCR-Based Site-directed Mutagenesis Kit」（Clontech社製）を用いて行うことが可能であり、また、欠失であれば「Quantum leap Nested Deletion Kit」（Clontech社製）などを用いて行うことが可能である。【００４５】
また、塩基配列が変異していても、その変異がタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わない場合（縮重変異）があり、このような縮重変異DNAも本発明に含まれる。【００４６】
本発明のDNAは、本発明のタンパク質をコードし得るものであれば特に制限はなく、ゲノムDNA、cDNA、化学合成DNAなどが含まれる。ゲノムDNAは、例えば、文献（Rogers and Bendich, Plant Mol. Biol., 1985, 5, 69.）記載の方法に従って調製したゲノムDNAを鋳型として、本発明のDNAの塩基配列（例えば、配列番号：１〜３４のいずれかに記載の塩基配列）を基に作製したプライマーを用いてPCR（Saiki et al. Science, 1988, 239, 487.）を行うことにより調製することが可能である。また、cDNAであれば、常法（Maniatis et al. Molecular Cloning Cold Spring harbor Laboratry Press）により植物からmRNAを調製し、逆転写反応を行い、上記と同様のプライマーを用いてPCRを行うことにより調製することが可能である。また、ゲノムDNAやcDNAは、常法によりゲノムDNAライブラリーまたはcDNAライブラリーを作製し、このライブラリーに対し、例えば本発明のDNAの塩基配列（例えば、配列番号：１〜３４のいずれかに記載の塩基配列）を基に合成したプローブを用いてスクリーニングすることによっても調製することが可能である。なお、得られたDNAの塩基配列は、例えば「シークエンサーModel373」（ABI社製）を利用することにより容易に決定することが可能である。【００４７】
本発明において、植物樹幹の木繊維細胞壁を形成する機能を有するタンパク質をコードするDNAには、後述の「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹基部および樹幹中央部において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇しているDNA」、「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹基部において、師部側と比較して木部側で発現レベルが減少し、樹幹中央部において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇しているDNA」、「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹中央部において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇し、樹幹基部において、師部側と木部側で発現レベルが同等なDNA」、「ユーカリ属カマルドレンシスおよびユーカリ属グロブルスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇しているDNA」、「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇し、ユーカリ属グロブルスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが減少しているDNA」、「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇し、ユーカリ属グロブルスの樹幹において、師部側と木部側で発現レベルが同等なDNA」が含まれる。【００４８】
樹幹において、師部と木部では、木部側でのみ木繊維形成が行われることが知られている。よって、「師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇または減少しているDNA」は、「木繊維形成部位で発現レベルが上昇または減少しているDNA」と表現することもできる。また、樹幹基部の木部と樹幹中央部の木部では、樹幹基部の木部と比較して樹幹中央部の木部の方が、木繊維形成（性質）のうち木繊維長は長く、直径は太く、細胞壁は厚く、フィブリル傾角は緩く、木繊維率と比重は高くなる（成熟材である）ことが知られている。また、樹幹中央部の木部と比較して樹幹基部の木部の方が、木繊維形成のうち木繊維長は短く、直径は細く、細胞壁は薄く、フィブリル傾角は急で、木繊維率と比重は低くなる（未熟材である）ことが知られている。よって、「ユーカリの樹幹基部において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇または減少しているDNA」は、「未熟材形成部位で発現レベルが上昇または減少しているDNA」と表現することもできる。また、「ユーカリの樹幹中央部において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇または減少しているDNA」は、「成熟材形成部位で発現レベルが上昇または減少しているDNA」と表現することもできる。【００４９】
さらに、カマルドレンシス樹幹の木部とグロブルス樹幹の木部では、カマルドレンシス樹幹の木部よりグロブルス樹幹の木部の方が、木繊維形成（パルプ品質）のうち木繊維長は長く、直径は太く、細胞壁は厚く、フィブリル傾角は緩く、木繊維率と比重は高くなることが知られている。また、グロブルス樹幹の木部よりカマルドレンシス樹幹の木部の方が、木繊維長は短く、直径は細く、細胞壁は薄く、フィブリル傾角は急で、木繊維率と比重は低くなることが知られている。よって、「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇または減少しているDNA」は、「木繊維長は短く、直径は細く、細胞壁は薄く、フィブリル傾角は急で、木繊維率と比重は低い、という低品質なパルプ特性を有する木繊維形成部位で発現レベルが上昇または減少しているDNA」と表現することもできる。また、「ユーカリ属グロブルスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇または減少しているDNA」は、「木繊維長は長く、直径は太く、細胞壁は厚く、フィブリル傾角は緩く、木繊維率と比重は高い、という高品質なパルプ特性を有する木繊維を形成する部位で発現レベルが上昇または減少しているDNA」と表現することもできる。【００５０】
本発明において、師部側とは分裂組織である維管束形成層より外側を意味し、好ましくは師部側の樹皮形成部位を意味する。ここで、樹皮形成部位とは師細胞、師管、柔細胞、じん皮細胞等へ分化中またはその分化能力を有する部位である。また、本発明において、木部側とは維管束形成層より内側を意味し、好ましくは木部側の木繊維形成部位を意味する。ここで、木繊維形成部位とは木繊維細胞、仮導管、導管、柔細胞等へ分化中またはその分化能力を有する部位である。【００５１】
本発明において、樹幹基部とは、一般的にいわれる胸高部未満を指し、例えば、ユーカリの５年生の植物体の場合、地上高約１ｍ未満を指す。また、樹幹中央部とは、一般的に樹高の中間部付近を指し、例えば、樹高１０ｍ以上のユーカリの５年生の植物体の場合、地上高約５ｍ付近を指す。【００５２】
本発明のDNAまたはその部分DNAは、植物の樹幹木部（好ましくは樹幹基部または樹幹中央部の木部）の生長状態の検査用マーカーとして利用できる。すなわち、上記DNAまたはその部分DNAを少なくとも１つ利用することで、植物の樹幹木部（好ましくは樹幹基部または樹幹中央部の木部）の生長状態を検査することができる。【００５３】
より具体的には、以下の（１）〜（４）の場合に、植物の樹幹木部が、木繊維形成が盛んな木部であると判定される。さらに、（２）の場合に、植物の樹幹木部が、未熟材が形成されている木部、または将来的に未熟材が形成される木部であると判定される。ここで、未熟材とは、未熟な形成層組織から分化・形成される木繊維を意味し、同様な条件で採取された樹幹中央部の木部と比較して、木繊維長は短く、直径は細く、細胞壁は薄く、フィブリル傾角は急で、木繊維率と比重は低いという特徴を有する。また、（３）または（４）の場合に、植物の樹幹木部が、成熟材が形成されている木部、または将来的に成熟材が形成される木部であると判定される。ここで、成熟材とは、成熟した形成層組織から分化して形成される木繊維を意味し、同様な条件で採取された樹幹基部の木部と比較して、木繊維長は長く、直径は太く、細胞壁は厚く、フィブリル傾角は緩く、木繊維率と比重は高いという特徴を有する。【００５４】
本発明の検査に用いられる植物は、好ましくはユーカリ、より好ましくはユーカリ属カマルドレンシス種またはユーカリ属グロブルス種である。【００５５】
また、本発明の検査方法を利用することで材質の量的・質的な事前予測が可能となる。また、植林事業において、生長状態をもとに適切な施業（除草・間伐等）を適切な時期に施すことができる。例えば、本発明における樹幹基部の師部と木部での発現パターンと本発明の検査方法で得られた発現パターンに相関があれば（好ましくはピアソンの相関係数0.5以上、より好ましくは0.7以上、以下同じ）、被検樹幹木部に、質的には未熟な繊維（未熟材：短繊維、直径は細く、細胞壁は薄く、フィブリル傾角は急で、低木繊維率と低比重）が形成されている、もしくは将来的に形成される状態であり、木繊維量（容積重）も少ないもしくは将来的に少なくなる（平均的な容積重450〜500kg/m3以下）という予測ができる。一方、本発明における樹幹中央部の師部と木部での発現パターンと本発明の検査方法で得られた発現パターンに相関があれば、被検樹幹木部に、質的には成熟した繊維（成熟材：長繊維、直径は太く、細胞壁は厚く、フィブリル傾角は緩く、高木繊維率と高比重）が形成されている、もしくは将来的に形成される状態であり、木繊維量（容積重）も多いもしくは将来的に多くなる（平均的な容積重450〜500kg/m3以上）という予測ができる。さらに、上記のような材質予測により、植物の生長状態の善し悪しが明らかとなるため、悪いと判断されれば、貧栄養地では施肥を行ったり、雑草が茂っていれば除草作業を早期に行ったり、植裁密度が高ければ間伐を行ったり、といった施業を迅速かつ適切に行うことが可能になる。現在、前述のような材質予測や施業方針の決定は、多分に現場の経験や勘、もしくは事後の化学分析等に頼っており、本願で示すような事前に判別できる科学的指標は無い。【００５６】
（１）植物の樹幹（好ましくは樹幹基部または樹幹中央部）の師部側および木部側において、「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹基部および樹幹中央部において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇しているDNA」のうち少なくとも１つ（好ましくは複数、より好ましくは全て。以下同じ）のDNAの発現レベルを検出し、師部側および木部側における該DNAの発現レベルを比較した結果、植物の樹幹における該DNAの発現レベルが、師部側と比較して木部側で上昇している場合
本発明において、「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹基部および樹幹中央部において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇しているDNA」としては、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のDNAが挙げられる。
（ａ）配列番号：３５〜４０、４２、４３、４５〜４８、５０、５１、５３〜５９、６１、６２、６４、６６または６７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１〜６、８、９、１１〜１４、１６、１７、１９〜２５、２７、２８、３０、３２または３３のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：３５〜４０、４２、４３、４５〜４８、５０、５１、５３〜５９、６１、６２、６４、６６または６７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：１〜６、８、９、１１〜１４、１６、１７、１９〜２５、２７、２８、３０、３２または３３のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｅ）配列番号：３５〜４０、４２、４３、４５〜４８、５０、５１、５３〜５９、６１、６２、６４、６６または６７のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
「配列番号：１〜６、８、９、１１〜１４、１６、１７、１９〜２５、２７、２８、３０、３２または３３のいずれかに記載の塩基配列からなるDNA」としては、配列番号：１〜６、９、１１〜１４、１６、１７、１９、２０、２２、２５、２７または３０のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAが好ましく、配列番号：１、３〜６、９、１１〜１４、１６、１７、１９、２２、２５または３０のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAがより好ましいが、これらに限定されるものではない。【００５７】
（２）植物の樹幹（好ましくは樹幹基部）の師部側および木部側において、「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹基部において、師部側と比較して木部側で発現レベルが減少し、樹幹中央部において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇しているDNA」のうち少なくとも１つのDNAの発現レベルを検出し、師部側および木部側における該DNAの発現レベルを比較した結果、植物の樹幹における該DNAの発現レベルが、師部側と比較して木部側で減少している場合
本発明において、「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹基部において、師部側と比較して木部側で発現レベルが減少し、樹幹中央部において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇しているDNA」としては、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のDNAが挙げられる。
（ａ）配列番号：４９に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１５に記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：４９に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：１５に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｅ）配列番号：４９に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA【００５８】
（３）植物の樹幹（好ましくは樹幹中部）の師部側および木部側において、上記「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹基部において、師部側と比較して木部側で発現レベルが減少し、樹幹中央部において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇しているDNA」のうち少なくとも１つのDNAの発現レベルを検出し、師部側および木部側における該DNAの発現レベルを比較した結果、植物の樹幹における該DNAの発現レベルが、師部側と比較して木部側で上昇している場合【００５９】
（４）植物の樹幹（好ましくは樹幹中央部）の師部側および木部側において、「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹中央部において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇し、樹幹基部において、師部側と木部側で発現レベルが同等なDNA」のうち少なくとも１つのDNAの発現レベルを検出し、師部側および木部側における該DNAの発現レベルを比較した結果、植物の樹幹における該DNAの発現レベルが、師部側と比較して木部側で上昇している場合
本発明において、「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹中央部において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇し、樹幹基部において、師部側と木部側で発現レベルが同等なDNA」としては、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のDNAが挙げられる。
（ａ）配列番号：４１、４４、５２、６０、６３または６８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：７、１０、１８、２６、２９または３４のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：４１、４４、５２、６０、６３または６８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：７、１０、１８、２６、２９または３４のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｅ）配列番号：４１、４４、５２、６０、６３または６８のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
「配列番号：７、１０、１８、２６、２９または３４のいずれかに記載の塩基配列からなるDNA」としては、配列番号：７、１０、１８、２６または２９のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAが好ましく、配列番号：１８、２６または２９のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAがより好ましいが、これらに限定されるものではない。
さらに、本発明においては、異なる２つの樹幹木部の生長状態（成熟度）を検査する方法を提供する。すなわち、異なる２つの樹幹木部うち、どちらが成熟しているのか、または未熟であるのかを検査する方法を提供する。本発明において、「異なる２つの樹幹木部」には、異なる２つの植物における樹幹木部、および、１つの植物における異なる２つの樹幹木部が含まれる。上記方法は、複数の樹幹木部から、成熟した、または未熟な樹幹木部を選別することにも使用できる。
より具体的には、以下の（５）または（６）の場合に、異なる２つの樹幹木部のうち、片方の樹幹木部（以下、樹幹木部Aと称す）と比較して他方の樹幹木部（以下、樹幹木部Bと称す）は、成熟している木部であり、樹幹木部Bと比較して樹幹木部Aは、未熟な木部であると判定される。従って、以下の（５）または（６）は、例えば育種現場において、エリート木やプラスツリーと呼ばれる優良系統を選抜するときの指標になる。現在、エリート木等の選抜は、樹高や直径などの外見上の数値や伐採後の材質分析値を指標に行われており、上記指標で選抜する技術（概念）は無い。【００６０】
（５）異なる２つの樹幹木部において、「ユーカリの樹幹中央部の木部側と比較して樹幹基部の木部側で発現レベルが上昇しているDNA」のうち少なくとも１つのDNAの発現レベルを検出し、異なる２つの樹幹木部における該DNAの発現レベルを比較した結果、該DNAの発現レベルが、樹幹木部Bと比較して樹幹木部Aで上昇している場合
本発明において、「ユーカリの樹幹中央部の木部側と比較して樹幹基部の木部側で発現レベルが上昇しているDNA」としては、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のDNAが挙げられる。
（ａ）配列番号：６７または６８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：３３または３４に記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：６７または６８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：３３または３４に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｅ）配列番号：６７または６８に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
「配列番号：３３または３４に記載の塩基配列からなるDNA」としては、配列番号：３３に記載の塩基配列からなるDNAが好ましいが、これらに限定されるものではない。【００６１】
（６）異なる２つの樹幹木部において、「ユーカリの樹幹中央部の木部側と比較して樹幹基部の木部側で発現レベルが減少しているDNA」のうち少なくとも１つのDNAの発現レベルを検出し、異なる２つの樹幹木部における該DNAの発現レベルを比較した結果、該DNAの発現レベルが、樹幹木部Bと比較して樹幹木部Aで減少している場合
本発明において、「ユーカリの樹幹中央部の木部側と比較して樹幹基部の木部側で発現レベルが減少しているDNA」としては、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のDNAが挙げられる。
（ａ）配列番号：３５〜４０、４２、４８、５０、５１、５３〜５６、５８、５９、６２または６４のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１〜６、８、１４、１６、１７、１９〜２２、２４、２５、２８または３０のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：３５〜４０、４２、４８、５０、５１、５３〜５６、５８、５９、６２または６４のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：１〜６、８、１４、１６、１７、１９〜２２、２４、２５、２８または３０のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｅ）配列番号：３５〜４０、４２、４８、５０、５１、５３〜５６、５８、５９、６２または６４のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
「配列番号：１〜６、８、１４、１６、１７、１９〜２２、２４、２５、２８または３０のいずれかに記載の塩基配列からなるDNA」としては、配列番号：１〜６、１４、１６、１７、１９、２０、２２、２５または３０のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAが好ましく、配列番号：１、３〜６、１４、１６、１７、２２または２５のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAがより好ましいが、これらに限定されるものではない。
また本発明においては、以下の（７）〜（１０）の場合に、植物の樹幹木部が、木繊維形成が盛んな木部であると判定される。さらに、（８）または（９）の場合に、植物の樹幹木部が、同様な条件で採取されたグロブルスの樹幹の木部と比較して、木繊維長は短く、直径は細く、細胞壁は薄く、フィブリル傾角は急で、木繊維率と比重は低い、というパルプ特性を有する木繊維が形成されている木部、または将来的に該パルプ特性を有する木繊維が形成される木部であると判定される。また、（１０）の場合に、植物の樹幹木部が、同様な条件で採取されたカマルドレンシス樹幹の木部と比較して、木繊維長は長く、直径は太く、細胞壁は厚く、フィブリル傾角は緩く、木繊維率と比重は高い、という優れたパルプ特性を有する木繊維が形成されている木部、または将来的に該パルプ特性を有する木繊維が形成される木部であると判定される。
また、本発明の検査方法を利用することで材質の量的・質的な事前予測が可能となる。また、植林事業において、生長状態をもとに適切な施業（除草・間伐等）を適切な時期に施すことができる。例えば、本発明におけるユーカリ属カマルドレンシス樹幹の師部と木部での発現パターンと本発明の検査方法で得られた発現パターンに相関があれば（好ましくはピアソンの相関係数0.5以上、より好ましくは0.7以上、以下同じ）、被検樹幹木部に、質的には低レベルな木繊維（低品質パルプ：短繊維、直径は細く、細胞壁は薄く、フィブリル傾角は急で、低木繊維率と低比重）が形成されている、もしくは将来的に形成される状態であり、木繊維量（容積重）も少ないもしくは将来的に少なくなる（平均的な容積重450〜500kg/m3以下）という予測ができる。一方、本発明におけるユーカリ属グロブルス樹幹の師部と木部での発現パターンと本発明の検査方法で得られた発現パターンに相関があれば、被検樹幹木部に、質的には優れた繊維（高品質パルプ：長繊維、直径は太く、細胞壁は厚く、フィブリル傾角は緩く、高木繊維率と高比重）が形成されている、もしくは将来的に形成される状態であり、木繊維量（容積重）も多いもしくは将来的に多くなる（平均的な容積重450〜500kg/m3以上）という予測ができる。さらに、上記のような材質予測により、植物の生長状態の善し悪しが明らかとなるため、悪いと判断されれば、貧栄養地では施肥を行ったり、雑草が茂っていれば除草作業を早期に行ったり、植裁密度が高ければ間伐を行ったり、といった施業を迅速かつ適切に行うことが可能になる。現在、前述のような材質予測や施業方針の決定は、多分に現場の経験や勘、もしくは事後の化学分析等に頼っており、本願で示すような事前に判別できる科学的指標は無い。【００６２】
（７）植物の樹幹（好ましくは樹幹基部または樹幹中央部）の師部側および木部側において、「ユーカリ属カマルドレンシスおよびユーカリ属グロブルスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇しているDNA」のうち少なくとも１つのDNAの発現レベルを検出し、師部側および木部側における該DNAの発現レベルを比較した結果、植物の樹幹における該DNAの発現レベルが、師部側と比較して木部側で上昇している場合
本発明において、「ユーカリ属カマルドレンシスおよびユーカリ属グロブルスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇しているDNA」としては、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のDNAが挙げられる。
（ａ）配列番号：４５、４６、５１、５５、５６または６４のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１１、１２、１７、２１、２２または３０のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：４５、４６、５１、５５、５６または６４のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：１１、１２、１７、２１、２２または３０のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｅ）配列番号：４５、４６、５１、５５、５６または６４のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
「配列番号：１１、１２、１７、２１、２２または３０のいずれかに記載の塩基配列からなるDNA」としては、配列番号：１１、１２、１７、２２または３０のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAが好ましく、配列番号：１１、１２、１７または２２のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAがより好ましいが、これらに限定されるものではない。【００６３】
（８）植物の樹幹（好ましくは樹幹基部または樹幹中央部）の師部側および木部側において、「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇し、ユーカリ属グロブルスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが減少しているDNA」のうち少なくとも１つのDNAの発現レベルを検出し、師部側および木部側における該DNAの発現レベルを比較した結果、植物の樹幹における該DNAの発現レベルが、師部側と比較して木部側で上昇している場合
本発明において、「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇し、ユーカリ属グロブルスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが減少しているDNA」としては、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のDNAが挙げられる。
（ａ）配列番号：４２、４７、５３、５７〜５９または６７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：８、１３、１９、２３〜２５または３３のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：４２、４７、５３、５７〜５９または６７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：８、１３、１９、２３〜２５または３３のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｅ）配列番号：４２、４７、５３、５７〜５９または６７のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
「配列番号：８、１３、１９、２３〜２５または３３のいずれかに記載の塩基配列からなるDNA」としては、配列番号：８、１３、１９、２４、２５または３３のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAが好ましく、配列番号：１３、１９または２５のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAがより好ましいが、これらに限定されるものではない。【００６４】
（９）植物の樹幹（好ましくは樹幹基部または樹幹中央部）の師部側および木部側において、「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇し、ユーカリ属グロブルスの樹幹において、師部側と木部側で発現レベルが同等なDNA」のうち少なくとも１つのDNAの発現レベルを検出し、師部側および木部側における該DNAの発現レベルを比較した結果、植物の樹幹における該DNAの発現レベルが、師部側と比較して木部側で上昇している場合
本発明において、「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇し、ユーカリ属グロブルスの樹幹において、師部側と木部側で発現レベルが同等なDNA」としては、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のDNAが挙げられる。
（ａ）配列番号：３５〜４０、４３、４８、５０、５４、６１、６２または６６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１〜６、９、１４、１６、２０、２７、２８または３２のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：３５〜４０、４３、４８、５０、５４、６１、６２または６６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：１〜６、９、１４、１６、２０、２７、２８または３２のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｅ）配列番号：３５〜４０、４３、４８、５０、５４、６１、６２または６６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
「配列番号：１〜６、９、１４、１６、２０、２７、２８または３２のいずれかに記載の塩基配列からなるDNA」としては、配列番号：１〜６、９、１４、１６、２０または２７のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAが好ましく、配列番号：１、３〜６、１４または１６のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAがより好ましいが、これらに限定されるものではない。【００６５】
（１０）植物の樹幹（好ましくは樹幹基部）の師部側および木部側において、上記「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇し、ユーカリ属グロブルスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが減少しているDNA」のうち少なくとも１つのDNAの発現レベルを検出し、師部側および木部側における該DNAの発現レベルを比較した結果、植物の樹幹における該DNAの発現レベルが、師部側と比較して木部側で減少している場合
さらに、本発明においては、異なる２つの植物（好ましくはユーカリ）の樹幹木部の生長状態（パルプ品質）を検査する方法を提供する。すなわち、異なる２つの植物の樹幹木部うち、どちらが優れたパルプ品質なのか、または劣るのかを検査する方法を提供する。この方法は、複数の植物の樹幹木部から、優れた、または劣った樹幹木部を選別することにも使用できる。
より具体的には、以下の（１１）または（１２）の場合に、異なる２つの植物の樹幹木部のうち、片方の植物（以下、植物Aと称す）の樹幹木部と比較して他方の植物（以下、植物Bと称す）の樹幹木部は、優れたパルプ品質を有する木部であり、樹幹木部Bと比較して樹幹木部Aは、劣ったパルプ品質を有する木部であると判定される。従って、以下の（１１）または（１２）は、例えば育種現場において、エリート木やプラスツリーと呼ばれる優良系統を選抜するときの指標になる。現在、エリート木等の選抜は、樹高や直径などの外見上の数値や伐採後の材質分析値を指標に行われており、上記指標で選抜する技術（概念）は無い。【００６６】
（１１）異なる２つの植物の樹幹木部（好ましくは樹幹基部または樹幹中央部の木部）において、「ユーカリ属グロブルスの樹幹の木部側と比較してユーカリ属カマルドレンシスの樹幹の木部側で発現レベルが上昇しているDNA」のうち少なくとも１つのDNAの発現レベルを検出し、異なる２つの植物の樹幹木部における該DNAの発現レベルを比較した結果、該DNAの発現レベルが、植物Bと比較して植物Aで上昇している場合
本発明において、「ユーカリ属グロブルスの樹幹の木部側と比較してユーカリ属カマルドレンシスの樹幹の木部側で発現レベルが上昇しているDNA」としては、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のDNAが挙げられる。
（ａ）配列番号：４５、４６、５１または５６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１１、１２、１７または２２のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：４５、４６、５１または５６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：１１、１２、１７または２２のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｅ）配列番号：４５、４６、５１または５６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
「配列番号：１１、１２、１７または２２のいずれかに記載の塩基配列からなるDNA」としては、配列番号：１２または１７に記載の塩基配列からなるDNAが好ましく、配列番号：１２のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAがより好ましいが、これらに限定されるものではない。【００６７】
（１２）異なる２つの植物の樹幹木部（好ましくは樹幹基部または樹幹中央部の木部）において、「ユーカリ属グロブルスの樹幹の木部側と比較してユーカリ属カマルドレンシスの樹幹の木部側で発現レベルが減少しているDNA」のうち少なくとも１つのDNAの発現レベルを検出し、異なる２つの植物の樹幹木部における該DNAの発現レベルを比較した結果、該DNAの発現レベルが、植物Bと比較して植物Aで減少している場合
本発明において、「ユーカリ属グロブルスの樹幹の木部側と比較してユーカリ属カマルドレンシスの樹幹の木部側で発現レベルが減少しているDNA」としては、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のDNAが挙げられる。
（ａ）配列番号：５５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：２１に記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：５５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：２１に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｅ）配列番号：５５に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA【００６８】
本発明の検査方法を利用することで、上記（１）〜（１２）のいずれかに該当する木部または該木部を有する植物を選択し、選択された木部または該木部を有する植物から均一なパルプを作製することが可能であり、パルプ製造の効率化、コストの削減、新規な特性を持った紙の製造が可能となる。なお、以下の（１）〜（１２）のいずれかに該当する木部または該木部を有する植物を選択後、当業者に周知の方法に従って、選択された木部間または該木部を有する植物間で木繊維状態が均一であるかを確認した後に、パルプを作製することもできる。また、以下の（１）〜（１２）のいずれかに該当しない木部または該木部を有する植物を集めて、任意の配合のパルプを作製することもできる。【００６９】
本発明はまた、植物の転写因子をコードするDNAとプロモーターDNAを提供する。
本発明における植物の転写因子をコードするDNAは、植物の木繊維細胞形成の制御に利用できると考えられる。一方、該DNAのプロモーターDNAは、木繊維組織あるいは木繊維形成時期特異的発現の制御に利用できると考えられる。また、植物樹幹の木繊維細胞形成を制御する機能を有するタンパク質をコードするDNAの発現（レベル）情報は、植物体の生長状態や木繊維形成状態、材質の量的・質的な事前予測に利用できると考えられる。従って、これらを用いることで、人為的な木繊維細胞形態形成の改変や任意の遺伝子・タンパク質の木繊維細胞特異的発現、植物体の生長状態や木繊維形成状態、材質の量的・質的な事前予測に利用することができると考えられる。その結果、パルプ製造の効率化、コストの削減、新規な特性を持った紙の製造が可能になる。【００７０】
植物において木繊維形成を制御することは、工業や農業の分野において、様々な重要な意義を有する。例えば、ユーカリ属カマルドレンシス種の木繊維性質の改変は、繊維長を長くすることによりパルプ等繊維原材料の繊維特性の向上などの点で有意義である。またユーカリ属グロブルス種のセルロース・ヘミセルロース含量を高めることによるパルプ等の収量増大や、蒸解効率の向上などをもたらし、経済性や収益性の点で有意義である。【００７１】
本発明のDNAの由来する植物としては、特に制限はなく、例えば、穀類、野菜、果樹等の有用農作物（飼料作物を含む）、パルプ等の繊維原材料植物、観葉植物等の鑑賞用植物等が挙げられる。該植物としては特に制限はなく、ユーカリ、マツ、アカシア、ポプラ、スギ、ヒノキ、タケ、イチイ、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ジャガイモ、タバコ、サトウダイコン、サトウキビ、ナタネ、ダイズ、ヒマワリ、ワタ、オレンジ、ブドウ、モモ、ナシ、リンゴ、トマト、ハクサイ、キャベツ、ダイコン、ニンジン、カボチャ、キュウリ、メロン、パセリ、ラン、キク、ユリ、サフラン等を例示することができる。【００７２】
本発明において、植物の転写因子をコードするDNAとしては、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のDNAが挙げられる。
（ａ）配列番号：１１２〜１２２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１０１〜１１１のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：１１２〜１２２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：１０１〜１１１のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｅ）配列番号：１１２〜１２２のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA【００７３】
本発明において、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、0.1xSSC溶液中にて、60℃、一晩放置の条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件が挙げられる。このような条件において、配列番号：１０１〜１１１のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとハイブリダイズするDNAが単離できる。【００７４】
具体的には、植物より、DNAを抽出し、遺伝子ライブラリーを構築し、同様の条件によりスクリーニングを行うか、もしくは、抽出したDNAに対して、配列番号：１０１〜１１１のいずれかに記載の塩基配列より、任意の20mer程度の配列をプライマーに用いて、劉らによって確立されたTAIL-PCR法により、連続する近傍配列を容易に取得できる。【００７５】
また、本発明は、配列番号：１１２〜１２２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNAも提供する。このようなDNAは、実施例に記載の構造的特徴を有するタンパク質をコードするDNAであることが好ましい。【００７６】
配列番号：１１２〜１２２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNAは、当業者においては、一般的に公知の方法により単離することが可能である。例えば、ハイブリダイゼーション技術（Southern, EM., J Mol Biol, 1975, 98, 503.）やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術（Saiki, RK. et al., Science, 1985, 230, 1350.、Saiki, RK. et al., Science 1988, 239, 487.）を利用する方法が挙げられる。すなわち、配列番号：１０１〜１１１のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAもしくはその一部をプローブとして、また、配列番号：１０１〜１１１のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、植物から配列番号：１０１〜１１１のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAと高い相同性を有するDNAを単離することは、当業者にとって通常行い得ることである。【００７７】
このようなDNAを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、6M 尿素、0.4％ SDS、0.5×SSCの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M 尿素、0.4％ SDS、0.1×SSCの条件下では、より相同性の高いDNAを単離できると期待される。こうして単離されたDNAは、アミノ酸レベルにおいて配列番号：１０１〜１１１のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAからコードされるアミノ酸配列と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で少なくとも50％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、さらにより好ましくは95％以上、最も好ましくは98％以上の配列の同一性を指す。【００７８】
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1990, 87, 2264-2268.、Karlin, S. & Altschul, SF., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1993, 90, 5873.）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul, SF. et al., J Mol Biol, 1990, 215, 403.）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。【００７９】
また、本発明のDNAには、配列番号：１１２〜１２２のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNAが含まれる。【００８０】
上記のDNAを調製するために、当業者によく知られた方法としては、例えば、DNAに対し、site-directed mutagenesis法（Kramer, W. & Fritz, HJ., Methods Enzymol, 1987, 154, 350.）により変異を導入する方法が挙げられる。【００８１】
タンパク質におけるアミノ酸の改変は、通常、全アミノ酸の50アミノ酸以内であり、好ましくは30アミノ酸以内であり、さらに好ましくは10アミノ酸以内であり、さらに好ましくは3アミノ酸以内である。アミノ酸の改変は、例えば、変異や置換であれば「Transformer Site-directed Mutagenesis Kit」や「ExSite PCR-Based Site-directed Mutagenesis Kit」（Clontech社製）を用いて行うことが可能であり、また、欠失であれば「Quantum leap Nested Deletion Kit」（Clontech社製）などを用いて行うことが可能である。【００８２】
また、塩基配列が変異していても、その変異がタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わない場合（縮重変異）があり、このような縮重変異DNAも本発明に含まれる。【００８３】
本発明のDNAは、本発明のタンパク質をコードし得るものであれば特に制限はなく、ゲノムDNA、cDNA、化学合成DNAなどが含まれる。ゲノムDNAは、例えば、文献（Rogers and Bendich, Plant Mol. Biol., 1985, 5, 69.）記載の方法に従って調製したゲノムDNAを鋳型として、本発明のDNAの塩基配列（例えば、配列番号：１０１〜１１１のいずれかに記載の塩基配列）を基に作製したプライマーを用いてPCR（Saiki et al. Science, 1988, 239, 487.）を行うことにより調製することが可能である。また、cDNAであれば、常法（Maniatis et al. Molecular Cloning Cold Spring harbor Laboratry Press）により植物からmRNAを調製し、逆転写反応を行い、上記と同様のプライマーを用いてPCRを行うことにより調製することが可能である。また、ゲノムDNAやcDNAは、常法によりゲノムDNAライブラリーまたはcDNAライブラリーを作製し、このライブラリーに対し、例えば本発明のDNAの塩基配列（例えば、配列番号：１０１〜１１１のいずれかに記載の塩基配列）を基に合成したプローブを用いてスクリーニングすることによっても調製することが可能である。なお、得られたDNAの塩基配列は、例えば「シークエンサーModel373」（ABI社製）を利用することにより容易に決定することが可能である。【００８４】
本発明において、植物の転写因子をコードするDNAには、後述の「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹基部および樹幹中央部において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇しているDNA」、「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹中央部において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇し、樹幹基部において、師部側と木部側で発現レベルが同等なDNA」、「ユーカリ属カマルドレンシスおよびユーカリ属グロブルスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇しているDNA」、「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇し、ユーカリ属グロブルスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが減少しているDNA」、「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇し、ユーカリ属グロブルスの樹幹において、師部側と木部側で発現レベルが同等なDNA」が含まれる。【００８５】
樹幹において、師部と木部では、木部側でのみ木繊維形成が行われることが知られている。よって、「師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇または減少しているDNA」は、「木繊維形成部位で発現レベルが上昇または減少しているDNA」と表現することもできる。また、樹幹基部の木部と樹幹中央部の木部では、樹幹基部の木部と比較して樹幹中央部の木部の方が、木繊維形成（性質）のうち木繊維長は長く、直径は太く、細胞壁は厚く、フィブリル傾角は緩く、木繊維率と比重は高くなる（成熟材である）ことが知られている。また、樹幹中央部の木部と比較して樹幹基部の木部の方が、木繊維形成のうち木繊維長は短く、直径は細く、細胞壁は薄く、フィブリル傾角は急で、木繊維率と比重は低くなる（未熟材である）ことが知られている。よって、「ユーカリの樹幹基部において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇または減少しているDNA」は、「未熟材形成部位で発現レベルが上昇または減少しているDNA」と表現することもできる。また、「ユーカリの樹幹中央部において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇または減少しているDNA」は、「成熟材形成部位で発現レベルが上昇または減少しているDNA」と表現することもできる。【００８６】
さらに、カマルドレンシス樹幹の木部とグロブルス樹幹の木部では、カマルドレンシス樹幹の木部よりグロブルス樹幹の木部の方が、木繊維形成（パルプ品質）のうち木繊維長は長く、直径は太く、細胞壁は厚く、フィブリル傾角は緩く、木繊維率と比重は高くなることが知られている。また、グロブルス樹幹の木部よりカマルドレンシス樹幹の木部の方が、木繊維長は短く、直径は細く、細胞壁は薄く、フィブリル傾角は急で、木繊維率と比重は低くなることが知られている。よって、「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇または減少しているDNA」は、「木繊維長は短く、直径は細く、細胞壁は薄く、フィブリル傾角は急で、木繊維率と比重は低い、という低品質なパルプ特性を有する木繊維形成部位で発現レベルが上昇または減少しているDNA」と表現することもできる。また、「ユーカリ属グロブルスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇または減少しているDNA」は、「木繊維長は長く、直径は太く、細胞壁は厚く、フィブリル傾角は緩く、木繊維率と比重は高い、という高品質なパルプ特性を有する木繊維を形成する部位で発現レベルが上昇または減少しているDNA」と表現することもできる。【００８７】
本発明において、師部側とは分裂組織である維管束形成層より外側を意味し、好ましくは師部側の樹皮形成部位を意味する。ここで、樹皮形成部位とは師細胞、師管、柔細胞、じん皮細胞等へ分化中またはその分化能力を有する部位である。また、本発明において、木部側とは維管束形成層より内側を意味し、好ましくは木部側の木繊維形成部位を意味する。ここで、木繊維形成部位とは木繊維細胞、仮導管、導管、柔細胞等へ分化中またはその分化能力を有する部位である。【００８８】
本発明において、樹幹基部とは、一般的にいわれる胸高部未満を指し、例えば、ユーカリの５年生の植物体の場合、地上高約１ｍ未満を指す。また、樹幹中央部とは、一般的に樹高の中間部付近を指し、例えば、樹高１０ｍ以上のユーカリの５年生の植物体の場合、地上高約５ｍ付近を指す。【００８９】
本発明のDNAまたはその部分DNAは、植物の樹幹木部（好ましくは樹幹基部または樹幹中央部の木部）の生長状態の検査用マーカーとして利用できる。すなわち、上記DNAまたはその部分DNAを少なくとも１つ利用することで、植物の樹幹木部（好ましくは樹幹基部または樹幹中央部の木部）の生長状態を検査することができる。【００９０】
より具体的には、以下の（１）または（２）の場合に、植物の樹幹木部が、木繊維形成が盛んな木部であると判定される。さらに、（２）の場合に、植物の樹幹木部が、成熟材が形成されている木部、または将来的に成熟材が形成される木部であると判定される。ここで、成熟材とは、成熟した形成層組織から分化して形成される木繊維を意味し、同様な条件で採取された樹幹基部の木部と比較して、木繊維長は長く、直径は太く、細胞壁は厚く、フィブリル傾角は緩く、木繊維率と比重は高いという特徴を有する。また、未熟材とは、未熟な形成層組織から分化・形成される木繊維を意味し、同様な条件で採取された樹幹中央部の木部と比較して、木繊維長は短く、直径は細く、細胞壁は薄く、フィブリル傾角は急で、木繊維率と比重は低いという特徴を有する。【００９１】
本発明の検査に用いられる植物は、好ましくはユーカリ、より好ましくはユーカリ属カマルドレンシス種またはユーカリ属グロブルス種である。【００９２】
また、本発明の検査方法を利用することで材質の量的・質的な事前予測が可能となる。また、植林事業において、生長状態をもとに適切な施業（除草・間伐等）を適切な時期に施すことができる。例えば、本発明における樹幹基部の師部と木部での発現パターンと本発明の検査方法で得られた発現パターンに相関があれば（好ましくはピアソンの相関係数0.5以上、より好ましくは0.7以上、以下同じ）、被検樹幹木部に、質的には未熟な繊維（未熟材：短繊維、直径は細く、細胞壁は薄く、フィブリル傾角は急で、低木繊維率と低比重）が形成されている、もしくは将来的に形成される状態であり、木繊維量（容積重）も少ないもしくは将来的に少なくなる（平均的な容積重450〜500kg/m3以下）という予測ができる。一方、本発明における樹幹中央部の師部と木部での発現パターンと本発明の検査方法で得られた発現パターンに相関があれば、被検樹幹木部に、質的には成熟した繊維（成熟材：長繊維、直径は太く、細胞壁は厚く、フィブリル傾角は緩く、高木繊維率と高比重）が形成されている、もしくは将来的に形成される状態であり、木繊維量（容積重）も多いもしくは将来的に多くなる（平均的な容積重450〜500kg/m3以上）という予測ができる。さらに、上記のような材質予測により、植物の生長状態の善し悪しが明らかとなるため、悪いと判断されれば、貧栄養地では施肥を行ったり、雑草が茂っていれば除草作業を早期に行ったり、植裁密度が高ければ間伐を行ったり、といった施業を迅速かつ適切に行うことが可能になる。現在、前述のような材質予測や施業方針の決定は、多分に現場の経験や勘、もしくは事後の化学分析等に頼っており、本願で示すような事前に判別できる科学的指標は無い。【００９３】
（１）植物の樹幹（好ましくは樹幹基部または樹幹中央部）の師部側および木部側において、「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹基部および樹幹中央部において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇しているDNA」のうち少なくとも１つ（好ましくは複数、より好ましくは全て。以下同じ）のDNAの発現レベルを検出し、師部側および木部側における該DNAの発現レベルを比較した結果、植物の樹幹における該DNAの発現レベルが、師部側と比較して木部側で上昇している場合
本発明において、「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹基部および樹幹中央部において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇しているDNA」としては、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のDNAが挙げられる。
（ａ）配列番号：１１３〜１１７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１０２〜１０６のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：１１３〜１１７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：１０２〜１０６のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｅ）配列番号：１１３〜１１７のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
「配列番号：１０２〜１０６のいずれかに記載の塩基配列からなるDNA」としては、配列番号：１０２、１０５または１０６のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAが好ましく、配列番号：１０５または１０６に記載の塩基配列からなるDNAがより好ましいが、これらに限定されるものではない。【００９４】
（２）植物の樹幹（好ましくは樹幹中央部）の師部側および木部側において、「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹中央部において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇し、樹幹基部において、師部側と木部側で発現レベルが同等なDNA」のうち少なくとも１つのDNAの発現レベルを検出し、師部側および木部側における該DNAの発現レベルを比較した結果、植物の樹幹における該DNAの発現レベルが、師部側と比較して木部側で上昇している場合
本発明において、「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹中央部において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇し、樹幹基部において、師部側と木部側で発現レベルが同等なDNA」としては、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のDNAが挙げられる。
（ａ）配列番号：１１２、１１８または１２０〜１２２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１０１、１０７または１０９〜１１１のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：１１２、１１８または１２０〜１２２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：１０１、１０７または１０９〜１１１のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｅ）配列番号：１１２、１１８または１２０〜１２２のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
「配列番号：１０１、１０７または１０９〜１１１のいずれかに記載の塩基配列からなるDNA」としては、配列番号：１０７または１０９〜１１１のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAが好ましく、配列番号：１０７または１０９に記載の塩基配列からなるDNAがより好ましいが、これらに限定されるものではない。
さらに、本発明においては、異なる２つの樹幹木部の生長状態（成熟度）を検査する方法を提供する。すなわち、異なる２つの樹幹木部うち、どちらが成熟しているのか、または未熟であるのかを検査する方法を提供する。本発明において、「異なる２つの樹幹木部」には、異なる２つの植物における樹幹木部、および、１つの植物における異なる２つの樹幹木部が含まれる。上記方法は、複数の樹幹木部から、成熟した、または未熟な樹幹木部を選別することにも使用できる。
より具体的には、以下の（３）の場合に、異なる２つの樹幹木部のうち、片方の樹幹木部（以下、樹幹木部Aと称す）と比較して他方の樹幹木部（以下、樹幹木部Bと称す）は、成熟している木部であり、樹幹木部Bと比較して樹幹木部Aは、未熟な木部であると判定される。従って、以下の（３）は、例えば育種現場において、エリート木やプラスツリーと呼ばれる優良系統を選抜するときの指標になる。現在、エリート木等の選抜は、樹高や直径などの外見上の数値や伐採後の材質分析値を指標に行われており、上記指標で選抜する技術（概念）は無い。【００９５】
（３）異なる２つの樹幹木部において、「ユーカリの樹幹中央部の木部側と比較して樹幹基部の木部側で発現レベルが減少しているDNA」のうち少なくとも１つのDNAの発現レベルを検出し、異なる２つの樹幹木部における該DNAの発現レベルを比較した結果、該DNAの発現レベルが、樹幹木部Bと比較して樹幹木部Aで減少している場合
本発明において、「ユーカリの樹幹中央部の木部側と比較して樹幹基部の木部側で発現レベルが減少しているDNA」としては、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のDNAが挙げられる。
（ａ）配列番号：１１３または１１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１０２または１０３に記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：１１３または１１４のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：１０２または１０３のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｅ）配列番号：１１３または１１４のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
「配列番号：１０２または１０３に記載の塩基配列からなるDNA」としては、配列番号：１０２に記載の塩基配列からなるDNAが好ましいが、これらに限定されるものではない。
また本発明においては、以下の（４）〜（７）の場合に、植物の樹幹木部が、木繊維形成が盛んな木部であると判定される。さらに、（５）または（６）の場合に、植物の樹幹木部が、同様な条件で採取されたグロブルスの樹幹の木部と比較して、木繊維長は短く、直径は細く、細胞壁は薄く、フィブリル傾角は急で、木繊維率と比重は低い、というパルプ特性を有する木繊維が形成されている木部、または将来的に該パルプ特性を有する木繊維が形成される木部であると判定される。また、（７）の場合に、植物の樹幹木部が、同様な条件で採取されたカマルドレンシス樹幹の木部と比較して、木繊維長は長く、直径は太く、細胞壁は厚く、フィブリル傾角は緩く、木繊維率と比重は高い、という優れたパルプ特性を有する木繊維が形成されている木部、または将来的に該パルプ特性を有する木繊維が形成される木部であると判定される。
また、本発明の検査方法を利用することで材質の量的・質的な事前予測が可能となる。また、植林事業において、生長状態をもとに適切な施業（除草・間伐等）を適切な時期に施すことができる。例えば、本発明におけるユーカリ属カマルドレンシス樹幹の師部と木部での発現パターンと本発明の検査方法で得られた発現パターンに相関があれば（好ましくはピアソンの相関係数0.5以上、より好ましくは0.7以上、以下同じ）、被検樹幹木部に、質的には低レベルな木繊維（低品質パルプ：短繊維、直径は細く、細胞壁は薄く、フィブリル傾角は急で、低木繊維率と低比重）が形成されている、もしくは将来的に形成される状態であり、木繊維量（容積重）も少ないもしくは将来的に少なくなる（平均的な容積重450〜500kg/m3以下）という予測ができる。一方、本発明におけるユーカリ属グロブルス樹幹の師部と木部での発現パターンと本発明の検査方法で得られた発現パターンに相関があれば、被検樹幹木部に、質的には優れた繊維（高品質パルプ：長繊維、直径は太く、細胞壁は厚く、フィブリル傾角は緩く、高木繊維率と高比重）が形成されている、もしくは将来的に形成される状態であり、木繊維量（容積重）も多いもしくは将来的に多くなる（平均的な容積重450〜500kg/m3以上）という予測ができる。さらに、上記のような材質予測により、植物の生長状態の善し悪しが明らかとなるため、悪いと判断されれば、貧栄養地では施肥を行ったり、雑草が茂っていれば除草作業を早期に行ったり、植裁密度が高ければ間伐を行ったり、といった施業を迅速かつ適切に行うことが可能になる。現在、前述のような材質予測や施業方針の決定は、多分に現場の経験や勘、もしくは事後の化学分析等に頼っており、本願で示すような事前に判別できる科学的指標は無い。【００９６】
（４）植物の樹幹（好ましくは樹幹基部または樹幹中央部）の師部側および木部側において、「ユーカリ属カマルドレンシスおよびユーカリ属グロブルスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇しているDNA」のうち少なくとも１つのDNAの発現レベルを検出し、師部側および木部側における該DNAの発現レベルを比較した結果、植物の樹幹における該DNAの発現レベルが、師部側と比較して木部側で上昇している場合
本発明において、「ユーカリ属カマルドレンシスおよびユーカリ属グロブルスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇しているDNA」としては、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のDNAが挙げられる。
（ａ）配列番号：１１４または１１６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１０３または１０５に記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：１１４または１１６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：１０３または１０５に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｅ）配列番号：１１４または１１６に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
「配列番号：１０３または１０５に記載の塩基配列からなるDNA」としては、配列番号：１０５に記載の塩基配列からなるDNAが好ましいが、これらに限定されるものではない。【００９７】
（５）植物の樹幹（好ましくは樹幹基部または樹幹中央部）の師部側および木部側において、「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇し、ユーカリ属グロブルスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが減少しているDNA」のうち少なくとも１つのDNAの発現レベルを検出し、師部側および木部側における該DNAの発現レベルを比較した結果、植物の樹幹における該DNAの発現レベルが、師部側と比較して木部側で上昇している場合
本発明において、「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇し、ユーカリ属グロブルスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが減少しているDNA」としては、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のDNAが挙げられる。
（ａ）配列番号：１１５または１１７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１０４または１０６に記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：１１５または１１７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：１０４または１０６に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｅ）配列番号：１１５または１１７に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA【００９８】
「配列番号：１０４または１０６に記載の塩基配列からなるDNA」としては、配列番号：１０６に記載の塩基配列からなるDNAが好ましいが、これらに限定されるものではない。【００９９】
（６）植物の樹幹（好ましくは樹幹基部または樹幹中央部）の師部側および木部側において、「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇し、ユーカリ属グロブルスの樹幹において、師部側と木部側で発現レベルが同等なDNA」のうち少なくとも１つのDNAの発現レベルを検出し、師部側および木部側における該DNAの発現レベルを比較した結果、植物の樹幹における該DNAの発現レベルが、師部側と比較して木部側で上昇している場合
本発明において、「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇し、ユーカリ属グロブルスの樹幹において、師部側と木部側で発現レベルが同等なDNA」としては、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のDNAが挙げられる。
（ａ）配列番号：１１３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１０２に記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：１１３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：１０２に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｅ）配列番号：１１３に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA【０１００】
（７）植物の樹幹（好ましくは樹幹中央部）の師部側および木部側において、上記「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇し、ユーカリ属グロブルスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが減少しているDNA」のうち少なくとも１つのDNAの発現レベルを検出し、師部側および木部側における該DNAの発現レベルを比較した結果、植物の樹幹における該DNAの発現レベルが、師部側と比較して木部側で減少している場合
さらに、本発明においては、異なる２つの植物（好ましくはユーカリ）の樹幹木部の生長状態（パルプ品質）を検査する方法を提供する。すなわち、異なる２つの植物の樹幹木部うち、どちらが優れたパルプ品質なのか、または劣るのかを検査する方法を提供する。この方法は、複数の植物の樹幹木部から、優れた、または劣った樹幹木部を選別することにも使用できる。【０１０１】
より具体的には、以下の（１１）の場合に、異なる２つの植物の樹幹木部のうち、片方の植物（以下、植物Aと称す）の樹幹木部と比較して他方の植物（以下、植物Bと称す）の樹幹木部は、優れたパルプ品質を有する木部であり、樹幹木部Bと比較して樹幹木部Aは、劣ったパルプ品質を有する木部であると判定される。従って、以下の（１１）は、例えば育種現場において、エリート木やプラスツリーと呼ばれる優良系統を選抜するときの指標になる。現在、エリート木等の選抜は、樹高や直径などの外見上の数値や伐採後の材質分析値を指標に行われており、上記指標で選抜する技術（概念）は無い。【０１０２】
（８）異なる２つの植物の樹幹木部（好ましくは樹幹基部または樹幹中央部の木部）において、「ユーカリ属グロブルスの樹幹の木部側と比較してユーカリ属カマルドレンシスの樹幹の木部側で発現レベルが減少しているDNA」のうち少なくとも１つのDNAの発現レベルを検出し、異なる２つの植物の樹幹木部における該DNAの発現レベルを比較した結果、該DNAの発現レベルが、植物Bと比較して植物Aで減少している場合
本発明において、「ユーカリ属グロブルスの樹幹の木部側と比較してユーカリ属カマルドレンシスの樹幹の木部側で発現レベルが減少しているDNA」としては、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のDNAが挙げられる。
（ａ）配列番号：１１６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１０５に記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：１１６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と50％以上の相同性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｄ）配列番号：１０５に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｅ）配列番号：１１６に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA【０１０３】
本発明の検査方法を利用することで、上記（１）〜（８）のいずれかに該当する木部または該木部を有する植物を選択し、選択された木部または該木部を有する植物から均一なパルプを作製することが可能であり、パルプ製造の効率化、コストの削減、新規な特性を持った紙の製造が可能となる。なお、以下の（１）〜（８）のいずれかに該当する木部または該木部を有する植物を選択後、当業者に周知の方法に従って、選択された木部間または該木部を有する植物間で木繊維状態が均一であるかを確認した後に、パルプを作製することもできる。また、以下の（１）〜（８）のいずれかに該当しない木部または該木部を有する植物を集めて、任意の配合のパルプを作製することもできる。【０１０４】
本発明の検査は、公知の種々の方法で実施することができる。例えば、まず、被検植物の所望の組織からRNA試料を調製する。次いで、該RNA試料に含まれるターゲットRNAの量を測定する。次いで、測定されたRNAの量を対照と比較する。このような方法としては、ノーザンブロッティング法、または、RT-PCR法等を例示することができる。【０１０５】
本発明の検査は、DNAアレイ法によっても実施することができる。本発明において、ヌクレオチドの固定（アレイ）方法として、Affymetrix社開発によるオリゴヌクレオチドを基本としたアレイが例示できる。オリゴヌクレオチドのアレイにおいて、オリゴヌクレオチドは通常in situで合成される。例えば、photolithographicの技術（Affymetrix社）、および化学物質を固定させるためのインクジェット(Rosetta Inpharmatics社)技術等によるオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成法が既に知られており、いずれの技術も本発明の基板の作製に利用することができる。【０１０６】
本発明において「基板」とは、ヌクレオチドプローブを固定することが可能な板状の材料を意味する。本発明の基板は、ヌクレオチドプローブを固定することができれば特に制限はないが、一般にDNAアレイ技術で使用される基板を好適に用いることができる。一般にDNAアレイは、高密度に基板にプリントされた何千ものヌクレオチドで構成されている。通常これらのDNAは非透過性(non- porous)の基板の表層にプリントされる。基板の表層は、一般的にはガラスであるが、透過性(porous)の膜、例えばニトロセルロースメンブレムを使用することができる。【０１０７】
基板に固定するヌクレオチドプローブは、本発明のDNAの発現を検出することができるものであれば、特に制限されない。即ち該プローブは、本発明のDNAにハイブリダイズするようなプローブである。特異的なハイブリダイズが可能であれば、ヌクレオチドプローブは、本発明のDNAに対し、完全に相補的である必要はない。本発明において基板に結合させるヌクレオチドプローブの長さは、特に制限されないが、通常10〜100bpであり、好ましくは10〜50bpであり、さらに好ましくは15〜25bpである。【０１０８】
本方法においては、本発明のDNAと該基板を接触させる。この過程により、上記ヌクレオチドプローブに対し、本発明のDNAをハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの反応液および反応条件は、基板に固定するヌクレオチドプローブの長さ等の諸要因により変動しうるが、一般的に当業者に周知の方法により行うことができる。【０１０９】
本方法においては、次いで、本発明のDNAと該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出する。この検出は、例えば、本発明のDNAに標識した蛍光色素の蛍光シグナルをスキャナー等によって読み取ることによって行うことができる。【０１１０】
また、本発明は、本発明のDNAのプロモーターDNAを提供する。本発明のプロモーターDNAとしては、本発明によって得られた植物、特に樹木の空間的位置において発現差のある遺伝子に連なるプロモーターDNAが挙げられる。ここで、「プロモーターDNA」とは、DNAを鋳型としたmRNAの合成（転写）の開始に必要な特定塩基配列を含むDNAを意味し、これには自然界に存在するDNAの他、組換えなどの人工的な改変操作により作成されたDNAが含まれる。【０１１１】
本発明のプロモータDNAとしては、より具体的には、植物樹幹の木繊維細胞壁を形成する機能を有するタンパク質（セルロース合成に関与するタンパク質、およびリグニン合成に関与するタンパク質）をコードするDNAのプロモーターDNA、及び植物の転写因子をコードするDNAのプロモーターDNAが挙げられる。植物樹幹の木繊維細胞壁を形成する機能を有するタンパク質（セルロース合成に関与するタンパク質、およびリグニン合成に関与するタンパク質）をコードするDNAのプロモーターDNAを配列番号：９３〜１００に示す。植物樹幹の木繊維細胞壁を形成する機能を有するタンパク質（セルロース合成に関与するタンパク質、およびリグニン合成に関与するタンパク質）をコードするDNAと、そのプロモーターDNAとの関係は、実施例に記載の通りである。また、植物の転写因子をコードするDNAのプロモーターDNAを、配列番号：１５６〜１６６に示す。植物の転写因子をコードするDNAとそのプロモータDNAの関係もまた、実施例に記載の通りである。【０１１２】
本発明のプロモーターは、例えば、以下のようにして製造し、利用することができる。目的とするユーカリ植物の組織よりDNAを抽出し精製する。DNAの調製に際しては、各種の方法を用いることができ、市販のキット、例えば、ISOPLANTキット（ニッポンジーン社製）などを用いることが可能である。【０１１３】
得られたDNAを材料として、本発明者らが既に単離に成功しているユーカリcDNAの塩基配列を基に、任意の2箇所よりオリゴヌクレオチドを作製し、これをプライマーに用いたPCR法により、選んだユーカリcDNAに対応するゲノムDNAを簡単に製造することが可能である。該遺伝子の上流域DNAは、該遺伝子の塩基配列を基に作成したオリゴヌクレオチドプライマーを利用するPCR法（Inverse-PCR法やアンカーPCR法・TAIL-PCR法（島本功ら監修、「新版植物のPCR実験プロトコール」（植物細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ７）秀潤社1997年７月発行）、あるいは該遺伝子のDNA配列をプローブに用いるハイブリダイゼ−ション法により、単離することが可能である。【０１１４】
ユーカリのDNAには、ゲノムDNAライブラリーを利用することも可能である。ゲノムDNAライブラリーは、ユーカリから抽出したDNAをλDNA由来の各種ベクターの他、コスミドベクター、TACベクター（Liuら（1999）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol96 :p6535）などのクローニングベクターに挿入し、大腸菌を形質転換して得られる。【０１１５】
ゲノムDNAライブラリーのスクリーニングには、ハイブリダイゼーション技術を用いることができる。プローブには、本発明者らが既に単離に成功しているユーカリcDNAの配列を用いることができる。このプローブを用いて上記のゲノムDNAライブラリーをスクリーニングして、該遺伝子と相同なDNA配列が含まれるクローンを単離する。制限酵素切断地図の作成や、塩基配列の決定などを行い、クローン化されたDNAの構造を明らかにし、該遺伝子の上流に存在する配列を特定する。この上流配列はTATAボックス配列を含み、少なくとも数百bpから数kbpの大きさのものであることが望ましい。この配列を適当な制限酵素によって切り出し、必要に応じて他のプラスミドベクター等にサブクローニングする。【０１１６】
上記の配列のプロモーター活性については、以下のようにして解析することが可能である。例えば、pBI101などレポーター遺伝子を含むベクターを用い、そのレポーター遺伝子の上流に上記の配列を連結するようにサブクローニングする。pBI101ベクターにはレポーター遺伝子として、大腸菌のβグルクロニダーゼ（GUS）が使用されている。この遺伝子産物は基質として5-bromo-4-chloro-3-β-D-glucronic acid（X-gluc）を用いると、これを分解して青色の沈澱物であるindigotinを生ずるため、遺伝子発現を組織レベルでモニターすることが可能である。また、基質として4-methyl-umbelliferyl-β-D-glucronide（4MUG）を用いると、遺伝子産物の働きによって生じる蛍光によって遺伝子発現を定量することが可能である。なお、レポーター遺伝子としては、GUS遺伝子の他にクロラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼ遺伝子や、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーンフルオロセインプロテイン遺伝子なども利用が可能である。【０１１７】
上記のようにして作成されたキメラ遺伝子構築物は、例えば、アグロバクテリウムを介してシロイヌナズナなどの植物に導入してその機能を解析することが可能である。pBI101をベクターとして用いた場合は、キメラ遺伝子を含む組換えプラスミドを、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのMP90株にエレクトロポレーション法を用いて導入し、得られた形質転換菌を、例えば、フローラルディップ法（島本功ら監修、「モデル植物の実験プロトコール」（植物細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ４）秀潤社1996年4月発行）によりシロイヌナズナ植物体に感染させる。感染処理した植物より得られた種子を、用いたベクターに基づいてカナマイシンなどの薬剤を含む培地に播種し、遺伝子導入により薬剤耐性となった形質転換植物体を得る。この形質転換植物体を用いてレポーターGUS遺伝子の発現について解析する。本発明のプロモーターまたはそれを含む発現ベクターは、以下のようにして利用することが可能である。本発明のプロモーターの下流に目的の遺伝子、例えば、ある種の二次代謝産物生合成に関わる遺伝子を連結したキメラ遺伝子を、例えば、pBI101ベクターに挿入し発現ベクターを構築する。このベクターをアグロバクテリウムを介して、例えば、タバコ植物体に導入する。得られた形質転換植物においては、本発明のプロモーターの働きにより、該遺伝子が木繊維形成部位に発現し、任意の二次代謝物生産が可能となるものと期待される。この場合、35Sプロモーターのように不要な組織においても発現する現象がないため、他の好ましくない形質が現れないことが期待される。【０１１８】
本発明のプロモーターで制御可能な遺伝子としては、上述した特定の遺伝子に限定されない。また、本発明のプロモーターに他の発現制御配列を連結して本発明のプロモーターの機能を改変することも可能である。このような発現制御配列としては、エンハンサー配列やレプレッサー配列、インスレーター配列などが挙げられる。本発明のプロモーターには、機能特性として、樹幹の地上高位置特異的ならびに細胞壁生合成にかかる遺伝子の発現を制御する幾つかのシスエレメント配列が含まれる。本発明のプロモーターに含まれるシスエレメント配列の利用を目的として、他のプロモーターに本発明のプロモーターの一部を挿入連結し、そのプロモーターの機能を改変することも可能である。【０１１９】
また、本発明は、植物の木繊維細胞壁形成に関わるタンパク質をコードするDNAの発現を抑制するためのDNAを提供する。内在性遺伝子の発現を抑制するためのDNAの好ましい態様としては、本発明のDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNA、本発明のDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA、RNAi効果または共抑制効果により、本発明のDNAの発現を抑制するRNAをコードするDNA、本発明のDNAの転写産物に対してドミナントネガティブな形質を有するタンパク質をコードするDNA等を例示することができる。上記「内在性遺伝子の発現抑制」には、遺伝子の転写の抑制、および／または該遺伝子からコードされるタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、該遺伝子の発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。【０１２０】
植物における特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者に最もよく利用されている。植物細胞におけるアンチセンス効果は、電気穿孔法で導入したアンチセンスRNAが植物においてアンチセンス効果を発揮することをエッカーらが示したことで初めて実証された（Ecker, JR. & Davis, RW., Proc Natl Acad Sci USA, 1986, 83, 5372.）。その後、タバコやペチュニアにおいてもアンチセンスRNAの発現により標的遺伝子の発現が低下した例が報告されており（van der Krol AR. et al., Nature, 1988, 333, 866.）、現在では、アンチセンス技術は植物における遺伝子発現を抑制させる手段として確立している。【０１２１】
アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害、キャッピング部位やポリ(A)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を抑制する（平島および井上, 新生化学実験講座2 核酸IV遺伝子の複製と発現, 日本生化学会編, 東京化学同人, 1993, 319-347.）。【０１２２】
本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用により標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むDNAも、本発明で利用されるアンチセンスDNAに含まれる。使用されるアンチセンスDNAは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製されたDNAは、公知の方法を用いることで、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンスDNAの配列は、形質転換される植物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて標的遺伝子の発現を効果的に抑制するには、アンチセンスDNAの長さは少なくとも15塩基以上であり、好ましくは100塩基以上であり、さらに好ましくは500塩基以上である。通常用いられるアンチセンスDNAの長さは5kbよりも短く、好ましくは2.5kbよりも短い。【０１２３】
また、内在性遺伝子の発現の抑制は、リボザイム、またはリボザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子のことを指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、RNAを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループIイントロン型やRNase Pに含まれるM1 RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子, 蛋白質核酸酵素, 1990, 35, 2191.）。【０１２４】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15という配列のC15の3'側を切断するが、その活性にはU14とA9との塩基対形成が重要とされ、C15の代わりにA15またはU15でも切断され得ることが示されている（Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 228, 228.）。基質結合部位が標的部位近傍のRNA配列と相補的なリボザイムを設計すれば、標的RNA中のUC、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切断リボザイムを作出することができる（Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 239, 285.、小泉誠および大塚栄子, 蛋白質核酸酵素, 1990, 35, 2191.、Koizumi, M. et al., Nucl Acids Res, 1989, 17, 7059.）。例えば、植物体の木繊維細胞壁形成に関わるタンパク質をコードするDNAのコード領域中には、標的となり得る部位が複数存在する。【０１２５】
また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見出される（Buzayan, JM., Nature, 1986, 323, 349.）。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なRNA切断リボザイムを作出できることが示されている（Kikuchi, Y. & Sasaki, N., Nucl Acids Res, 1991, 19, 6751.、菊池洋, 化学と生物, 1992, 30, 112.）。【０１２６】
標的を切断できるように設計されたリボザイムは、植物細胞中で転写されるように、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。このとき、転写されたRNAの5'端や3'端に余分な配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われることがあるが、こういった場合は、転写されたリボザイムを含むRNAからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の5'側や3'側にシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である（Taira, K. et al., Protein Eng, 1990, 3, 733.、Dzianott, AM. & Bujarski, JJ., Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86, 4823.、Grosshans, CA. & Cech, TR., Nucl Acids Res, 1991, 19, 3875.、Taira, K. et al., Nucl Acids Res, 1991, 19, 5125.）。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにすることで、より効果を高めることもできる（Yuyama, N. et al., Biochem Biophys Res Commun, 1992, 186, 1271.）。このように、リボザイムを用いて本発明における標的遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を抑制することができる。【０１２７】
内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖RNAを用いたRNA干渉（RNA interferance；RNAi）によっても行うことができる。RNAiとは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖RNAを細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。RNAiの機構の詳細は明らかではないが、最初に導入した二本鎖RNAが小片に分解され、何らかの形で標的遺伝子の指標となることにより、標的遺伝子が分解されると考えられている。RNAiは植物においても効果を奏することが知られている（Chuang, CF. & Meyerowitz, EM., Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97, 4985.）。例えば、ユーカリ種間の木繊維性質の違いを制御するタンパク質をコードするDNAの発現をRNAiにより抑制するためには、配列番号：１〜３４のいずれかに記載の塩基配列、または、これらと類似した配列を有する二本鎖RNAを目的の植物へ導入すればよい。RNAiに用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の配列の同一性を有する。また、配列の同一性は上述した手法により決定できる。【０１２８】
内在性遺伝子の発現の抑制は、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するDNAの形質転換によって起こる共抑制によっても達成できる。「共抑制」とは、植物に標的内在性遺伝子と同一もしくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。共抑制の機構の詳細は明らかではないが、少なくともその機構の一部はRNAiの機構と重複していると考えられている。共抑制も植物において観察される（Smyth, DR., Curr Biol, 1997, 7, R793.、Martienssen, R., Curr Biol, 1996, 6, 810.）。例えば、植物体における木繊維形成を制御するタンパク質をコードするDNAが共抑制された植物体を得るためには、該DNA、または、これらと類似した配列を有するDNAを発現できるように作製したベクターDNAを目的の植物へ形質転換すればよい。共抑制に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の配列の同一性を有する。また、配列の同一性は上述した手法により決定できる。【０１２９】
さらに、本発明における内在性遺伝子の発現の抑制は、標的遺伝子がコードするタンパク質に対してドミナントネガティブの形質を有するタンパク質をコードする遺伝子を、植物へ形質転換することによっても達成することができる。「ドミナントネガティブの形質を有するタンパク質をコードする遺伝子」とは、該遺伝子を発現させることによって、植物体が本来持つ内在性の野生型タンパク質の活性を消失もしくは低下させる機能を有する遺伝子のことを指す。【０１３０】
また、本発明は、上記DNAを含む組換えベクターを提供する。本発明のベクターとしては、植物細胞で転写可能なプロモーター配列と転写産物の安定化に必要なポリアデニレーション部位を含むターミネーター配列を含んでいれば特に制限されず、例えば、pUC誘導体などの大腸菌で増幅可能なベクター、pBI101（クロンテック社）などのように大腸菌とアグロバクテリウムの双方で増幅可能なシャトルベクターなどが挙げられる。また、植物ウイルス、例えば、カリフラワーモザイクウイルスをベクターとして利用することもできる。【０１３１】
本発明のベクターは、例えば、ベクターの所定の部分に本発明のプロモーターDNAや所望の遺伝子を恒常的または誘導的に発現させるためのプロモーターDNAを結合あるいは挿入して得ることができる。なお、プロモーターをベクターに挿入する方法は、通常の遺伝子をベクターに挿入する方法に従う。この組換えベクターのプロモーターに所望の遺伝子を機能的に接続することで遺伝子発現用の発現ベクターを得ることができる。【０１３２】
恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター（Odell et al., Nature, 1985, 313, 810.）、イネのアクチンプロモーター（Zhang et al., Plant Cell, 1991, 3, 1155.）、トウモロコシのユビキチンプロモーター（Cornejo et al., Plant Mol. Biol., 1993, 23, 567.）などが挙げられる。また、誘導的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化合物の散布などの外因によって発現することが知られているプロモーターなどが挙げられる。このようなプロモーターとしては、例えば、糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入によって発現するイネキチナーゼ遺伝子のプロモーター（Xu et al., Plant Mol．Biol．, 1996, 30, 387.）やタバコのPRタンパク質遺伝子のプロモーター（Ohshima et al., Plant Cell, 1990, 2, 95.）、低温によって誘導されるイネの「lip19」遺伝子のプロモーター（Aguan et al., Mol. Gen Genet., 1993, 240,1.）、高温によって誘導されるイネの「hsp80」遺伝子と「hsp72」遺伝子のプロモーター（Van Breusegem et al., Planta, 1994, 193, 57.）、乾燥によって誘導されるシロイヌナズナの「rab16」遺伝子のプロモーター（Nundy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 1406.）、紫外線の照射によって誘導されるパセリのカルコン合成酵素遺伝子のプロモーター（Schulze-Lefert et al., EMBO J., 1989, 8, 651.）、嫌気的条件で誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 6624.）などが挙げられる。また、イネキチナーゼ遺伝子のプロモーターとタバコのPRタンパク質遺伝子のプロモーターはサリチル酸などの特定の化合物によって、「rab16」は植物ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導される。【０１３３】
また、本発明のDNAの導入により形質転換した細胞を効率的に選択するために、上記組み換えベクターは、適当な選抜マーカー遺伝子を含む、もしくは選抜マーカー遺伝子を含むプラスミドベクターと共に細胞へ導入するのが好ましい。この目的に使用する選抜マーカー遺伝子は、例えば抗生物質ハイグロマイシンに耐性であるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、カナマイシンまたはゲンタマイシンに耐性であるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、および除草剤ホスフィノスリシンに耐性であるアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。【０１３４】
また、本発明は、本発明のベクターが導入された形質転換植物細胞を提供する。本発明のベクターが導入される細胞としては特に制限はなく、例えば、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ジャガイモ、タバコ、サトウダイコン、サトウキビ、ナタネ、ダイズ、ヒマワリ、ワタ、オレンジ、ブドウ、モモ、ナシ、リンゴ、トマト、ハクサイ、キャベツ、ダイコン、ニンジン、カボチャ、キュウリ、メロン、パセリ、ラン、キク、ユリ、サフラン、などの植物の細胞が挙げられるが、ユーカリ、マツ、アカシヤ、ポプラ、スギ、ヒノキ、タケ、イチイなどの樹木が望ましい。また、本発明の植物細胞には、培養細胞の他、植物体中の細胞も含まれる。また、プロトプラスト、苗条原基、多芽体、毛状根も含まれる。【０１３５】
上記発現ベクターを宿主植物細胞中に導入するために、さまざまな手法を用いることができる。これらの手法には、形質転換因子としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)または、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を用いたT-DNAによる植物細胞の形質転換方法のほかに、プロトプラストへの直接導入(プロトプラストに電気パルス処理してDNAを植物細胞へ導入するエレクトロポレーション法や、リポソームなどとプロトプラストとの融合法、マイクロインジェクション法、ポリエチレングリコール法など)、パーティクルガン法などが挙げられる。【０１３６】
また、植物ウイルスをベクターとして利用することによって、目的遺伝子を植物体に導入することができる。利用可能な植物ウイルスとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスが挙げられる。すなわち、まず、ウイルスゲノムを大腸菌由来のベクターなどに挿入して組換え体を調製した後、ウイルスのゲノム中に、これらの目的遺伝子を挿入する。このようにして修飾されたウイルスゲノムを制限酵素によって該組換え体から切り出し、植物体に接種することによって、これらの目的遺伝子を植物体に導入することができる（Hohnら（1982）、Molecular Biology of Plant Tumors（Academic Press、New York）pp549、米国特許第4,407,956号明細書）。植物細胞や植物体へのベクター導入の手法は、これらのみに限定されず、その他の可能性も含まれる。【０１３７】
プロトプラストへの直接導入では、必要とされるベクターに制限はない。例えば、pUC誘導体のような単純なプラスミドを用いることができる。目的の遺伝子を植物細胞に導入する方法によっては、他のDNA配列が必要になることもある。例えば、TiまたはRiプラスミドを植物細胞の形質転換に用いる場合には、TiおよびRiプラスミドのT-DNA領域の少なくとも右の端の配列、大抵は両側の端の配列を、導入されるべき遺伝子の隣接領域となるように接続しなければならない。【０１３８】
アグロバクテリウム属菌を形質転換に用いる場合には、導入すべき遺伝子を、特別のプラスミド、すなわち中間ベクターまたはバイナリーベクターの中にクローニングする必要がある。中間ベクターはアグロバクテリウム属菌の中では複製されない。中間ベクターは、ヘルパープラスミドあるいはエレクトロポレーションによってアグロバクテリウム属菌の中に移行される。中間ベクターは、T-DNAの配列と相同な領域をもつため、相同的組換えによって、アグロバクテリウム属菌のTiまたはRiプラスミド中に取り込まれる。宿主として使われるアグロバクテリウム属菌には、vir領域が含まれている必要がある。通常TiまたはRiプラスミドにvir領域が含まれており、その働きにより、T-DNAを植物細胞に移行させることができる。【０１３９】
一方、バイナリーベクターはアグロバクテリウム属菌の中で複製、維持され得るので、ヘルパープラスミドあるいはエレクトロポレーション法によってアグロバクテリウム属菌中に取り込まれると、宿主のvir領域の働きによって、バイナリーベクター上のT-DNAを植物細胞に移行させることができる。【０１４０】
なお、このようにして得られた中間ベクターまたはバイナリーベクター、及びこれを含む大腸菌やアグロバクテリウム属菌等の微生物も本発明の対象である。【０１４１】
また、本発明は、上記の形質転換植物細胞から再分化した形質転換植物体、該形質転換植物体の子孫またはクローンである形質転換植物体、および該形質転換植物体の繁殖材料を提供する。このような形質転換植物体は、植物種によって細胞壁成分や細胞形態形成が改変された有用な形質転換植物体である。本発明における細胞壁成分の改変としては、特に制限されるものではなく、例えば、高セルロース、低リグニン、細胞壁の厚いもの、薄いもの、繊維長の長いもの、短いもの等様々な量的かつ質的な変化が挙げられる。また、細胞形態の改変としては、細胞伸長の変化、細胞の大きさの変化（体積の量的変化）などが例示できるが、これらに限定されるものではない。【０１４２】
本発明における形質転換植物体は、例えば、植物種によって細胞壁合成量増大による植物の成長量の増加、繊維細胞形態の変化、農作物の有用成分の増加などの新たな価値を有する植物として有用である。また、細胞壁合成制御による新素材の開発、飼料作物の消化吸収効率の増加、繊維細胞形態の変化などの新たな価値を有する植物として有用である。【０１４３】
本発明において「形質転換植物体」とは、上述した形質転換植物細胞を有する植物体であり、例えば、上記形質転換細胞から再生された形質転換植物体がこれに含まれる。形質転換された植物細胞から個体を再生する方法は植物細胞の種類により異なるが、例えばイネではFujimuraら（Fujimura et al., Plant Tissue Culture Lett., 2,74,1995）の方法、トウモロコシでは、Shillitoら（Shillito et al., Bio/Technology, 7, 581,1989）の方法、ジャガイモでは、Visserら（Visser et al., Theor. Appl. Genet., 78, 589, 1989）の方法、シロイヌナズナではAkamaらの方法（Akama et al., Plant Cell Rep., 12, 7, 1992）ユーカリでは土肥らの方法（特願平11-127025）が挙げられる。これらの方法により作出された形質転換植物体またはその繁殖媒体（例えば種子、塊茎、切穂など）から得た形質転換植物体は本発明の対象である。【０１４４】
本発明は、植物、特に樹木の木繊維細胞壁形成に関わる遺伝子群と、或いはこれらの相同体、或いはこれらの遺伝子に連なるプロモーター領域を有する発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換細胞を得て、該形質転換細胞から形質転換植物体を再生し、得られた形質転換植物体から植物種子を得て、該植物種子から植物体を生産する工程を含む。【０１４５】
形質転換植物体から植物種子を得る工程とは、例えば、形質転換植物体を発根培地から採取し、水を含んだ土を入れたポットに移植し、一定温度下で生育させて、花を形成させ、最終的に種子を形成させる工程を指す。また、種子から植物体を生産する工程とは、例えば、形質転換植物体上で形成された種子が成熟したところで、単離して、水を含んだ土に播種し、一定温度、照度下で生育させることにより、植物体を生産する工程をいう。【０１４６】
なお、形質転換植物体中の導入された外来DNAまたは核酸の存在は、公知のPCR法やサザンハイブリダイゼーション法によって、または植物体中の核酸の塩基配列を解析することによって確認することができる。この場合、形質転換植物体からのDNAまたは核酸の抽出は、公知のJ.Sambrookらの方法（Molecular Cloning, 第2版, Cold SpringHarbor laboratory Press, 1989）に準じて実施することができる。【０１４７】
植物体中に存在する本発明のDNAを、PCR法を用いて解析する場合には、上記のように再生植物体から抽出した核酸を鋳型として増幅反応を行う。また、本発明のDNAの塩基配列に従って適当に選択された塩基配列をもつ合成したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、これらを混合させた反応液中おいて増幅反応を行うこともできる。増幅反応においては、DNAの変性、アニーリング、伸張反応を数十回繰り返すと、本発明のDNA配列を含むDNA断片の増幅生成物を得ることができる。増幅生成物を含む反応液を、例えばアガロース電気泳動にかけると、増幅された各種のDNA断片が分画されて、そのDNA断片が本発明のDNAに対応することを確認することが可能である。【０１４８】
一旦、染色体内に本発明のDNAが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。【０１４９】
また本発明は、配列番号：１〜３４、１０１〜１１１に記載の塩基配列の全部又は一部を増幅するプライマーを提供する。本発明のプライマーは、本発明の検査方法に使用することが可能である。本発明のプライマーは、本発明のDNAまたはその相補鎖の少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されるものではないが、その長さは通常15bp〜100bpであり、好ましくは16bp〜31bpであり、さらに好ましくは、例えば、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、31ヌクレオチドである。本発明のプライマーは、3'側の領域は相補的とし、5'側には制限酵素認識配列やタグなどを付加してもよい。【０１５０】
さらに本発明は、配列番号：１〜３４、１０１〜１１１に記載の塩基配列の全部又は一部を増幅するプライマーセットを提供する。具体的には、本発明のプライマーセットとしては、
（ａ）配列番号：６９に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：７０に記載の塩基配列からなるDNA（配列番号：３に記載の塩基配列の全部または一部を検出するプライマーセット）、
（ｂ）配列番号：７１に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：７２に記載の塩基配列からなるDNA（配列番号：６に記載の塩基配列の全部または一部を検出するプライマーセット）、
（ｃ）配列番号：７３に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：７４に記載の塩基配列からなるDNA（配列番号：１１に記載の塩基配列の全部または一部を検出するプライマーセット）、
（ｄ）配列番号：７５に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：７６に記載の塩基配列からなるDNA（配列番号：１４に記載の塩基配列の全部または一部を検出するプライマーセット）、
（ｅ）配列番号：７７に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：７８に記載の塩基配列からなるDNA（配列番号：１９に記載の塩基配列の全部または一部を検出するプライマーセット）、
（ｆ）配列番号：７９に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：８０に記載の塩基配列からなるDNA（配列番号：２３に記載の塩基配列の全部または一部を検出するプライマーセット）、
（ｇ）配列番号：８１に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：８２に記載の塩基配列からなるDNA（配列番号：２４に記載の塩基配列の全部または一部を検出するプライマーセット）、
（ｈ）配列番号：８３に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：８４に記載の塩基配列からなるDNA（配列番号：２５に記載の塩基配列の全部または一部を検出するプライマーセット）、
（ｉ）配列番号：１２３に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：１２４に記載の塩基配列からなるDNA（配列番号：１０１に記載の塩基配列の全部または一部を検出するプライマーセット）、
（ｊ）配列番号：１２５に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：１２６に記載の塩基配列からなるDNA（配列番号：１０２に記載の塩基配列の全部または一部を検出するプライマーセット）、
（ｋ）配列番号：１２７に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：１２８に記載の塩基配列からなるDNA（配列番号：１０３に記載の塩基配列の全部または一部を検出するプライマーセット）、
（ｌ）配列番号：１２９に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：１３０に記載の塩基配列からなるDNA（配列番号：１０４に記載の塩基配列の全部または一部を検出するプライマーセット）、
（ｍ）配列番号：１３１に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：１３２に記載の塩基配列からなるDNA（配列番号：１０５に記載の塩基配列の全部または一部を検出するプライマーセット）、
（ｎ）配列番号：１３３に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：１３４に記載の塩基配列からなるDNA（配列番号：１０６に記載の塩基配列の全部または一部を検出するプライマーセット）、
（ｏ）配列番号：１３５に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：１３６に記載の塩基配列からなるDNA（配列番号：１０７に記載の塩基配列の全部または一部を検出するプライマーセット）、
（ｐ）配列番号：１３７に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：１３８に記載の塩基配列からなるDNA（配列番号：１０８に記載の塩基配列の全部または一部を検出するプライマーセット）、
（ｑ）配列番号：１３９に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：１４０に記載の塩基配列からなるDNA（配列番号：１０９に記載の塩基配列の全部または一部を検出するプライマーセット）、
（ｒ）配列番号：１４１に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：１４２に記載の塩基配列からなるDNA（配列番号：１１０に記載の塩基配列の全部または一部を検出するプライマーセット）、
（ｓ）配列番号：１４３に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：１４４に記載の塩基配列からなるDNA（配列番号：１１１に記載の塩基配列の全部または一部を検出するプライマーセット）、
を例示することが出来る。【０１５１】
また上記のプライマー以外にも、当業者であれば、配列番号：１〜３４、１０１〜１１１に記載の塩基配列を利用して、同様の機能を有するプライマーセットを作成することが可能である。本発明のプライマーには、このようなプライマーもまた含まれる。本発明のPCRプライマーは、当業者においては、例えば、自動オリゴヌクレオチド合成機等を利用して作製することができる。【０１５２】
本発明はまた、上記プライマーセットを含む試薬を提供する。本発明の試薬は、本発明の検査方法に使用することが可能である。このような試薬には、上記に記載の検査方法に使用されるものを含みうる。例えば、本発明の遺伝子、プライマー、染色液等を挙げることができる。その他、蒸留水、塩、緩衝液、タンパク質安定剤、保存剤等が含まれていてもよい。【０１５３】
本発明における形質転換植物体をクローン植林により大規模に育成することによって、セルロースを核にしたバイオマスの安定的供給が可能となる。現在、化石資源は工業生産において、原材料や燃料（エネルギー）として大量に使われている。特にエネルギー代替については、木質バイオマスを直接燃焼する（薪利用）ことが発展途上国で日常的に行われているが、これをさらに利用しやすい形態（アルコール：エチルアルコール）に変換することにより有効な対応が可能であると考えられる。実際、エタノールはブラジルなどでサトウキビの絞り汁等に由来する廃糖蜜からアルコール発酵により生産され、自動車燃料として用いられており、アメリカ、EUにおいてもサツマイモやトウモロコシのデンプンをいったん加水分解させブドウ糖にしてからアルコール発酵を行っている事例が増えている。アメリカでは1999年8月、「2010年までにバイオマスのエネルギー活用を一次エネルギー全体の10％に高める」と発表し、その目的のひとつが、バイオマスから精製したエタノールをガソリンに混ぜて使う方法である。具体的事例としては、トウモロコシを原料とするgasohol（ガソリンへのエタノールのブレンド割合が10％）というエタノール燃料であり、コーンベルト地帯を中心とする20州で使用され、米国の自動車燃料全体の約１％を占めており、砂糖キビの採れる特定の州ではガソリンの40％のシェアを占めており、アメリカ国内自動車全メーカーがgasoholを燃料として保証し、具体的にはゼネラルモーター社やクライスラー社はこの利用を推奨している。EUでは2010年に1990年レベルの８％の温室効果ガス削減をめざし、再生可能エネルギーのシェアを全エネルギーの12％にする計画が進行しており、自動車代替燃料については、2005年までに化石燃料の５％をバイオ燃料（生物資源由来の燃料）で代替するという目標を設定している。EUのエネルギー利用計画をみると、太陽電池（貢献度１％）、風力発電（同19％）、バイオマス・コージェネ（同80％）となっており、バイオマスに大きな期待が寄せられている。また、2015年にはエネルギー用のバイオ作物の栽培が、土地の最大利用面積を占める見込みとなっている。しかしながら、一方では食料増産の観点から、今後穀類やイモ類を大量に工業原料向けに消費することには限界がある。従って、本発明により例えば、セルロース含量が高いユーカリを大量に育成できれば、これから得られるリグノセルロースを原料に、酸加水分解あるいは酵素分解（セルラーゼ）工程によりグルコースを得、次いでアルコール発酵によりエタノールを大量に生産することが可能であり、このような工程の基礎技術は既に確立されている。さらに、グルコースを原料に生分解性プラスチック（ポリ乳酸）を生産する技術は既に確立されており、イモ類のデンプンを用いて工業生産規模での実用化が進展している。しかしながら、将来的には食糧である穀類に替わり、樹木由来のバイオマスが主流になることが予想される。尚、リグニンについても、実用化に関しては今後技術的な課題を克服する必要があるものの、プラスチックや接着剤などの用途が見込まれている。また、エネルギーの観点から述べると、リグニンは製紙産業のパルプ製造工程で化学的に分解され廃液（黒液と呼ばれる）中に含まれるが���廃液中より必要な薬品を抽出した後に、工場内の燃料として活用しており、別の言い方をすると既に燃料の一部を木質バイオマスに依存していることに他ならない。【０１５４】
本発明において木質バイオマスを安定的にかつ大規模に育成し、植林による循環を行うことによって、従来の原料としての活用に加え、バイオマス変換による石油代替エネルギー、さらにはセルロースあるいはヘミセルロースから新規なプラスチックを創出する（こちらも技術的には可能）ことも充分考えられる。さらに、木質バイオマスの普及は、エネルギーセキュリティや環境問題の解決策になると同時に、農林業を始め新たな産業の開発や就労機会の創出にもつながる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１５５】
以下実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、実験手法に関しては、特に記載のない限り、「クローニングとシークエンス」（渡辺格監修、杉浦昌弘編集、農村文化社（1989年））や、「Molecular Cloning（Sambrookら(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press）」などの実験書に従った。【０１５６】
（実施例１）ユーカリESTデータベースの作製
（１）ユーカリからのRNA抽出
抽出の対象となるユーカリ組織については、幹の肥大成長部（２次壁肥厚帯；形成層に富む組織）、葉、根とし、傾斜刺激、塩溶液暴露によるストレス付与等様々な状況からの遺伝子発現を想定している。抽出の基本的な方法は、日尾野らの方法（特願平6−219187）に記載の方法である。下記にはその実施例として、水耕栽培によるユーカリの根を材料に用いたRNAの抽出方法を詳細に説明する。【０１５７】
２ヶ月間生育したユーカリ（Eucalyptus camaldulensis）幼植物体を水耕培養槽に移植した。水耕栽培はHoagland-Arnonらの培養液を用いて行った。水耕培養液の組成は、5.0mM KNO3、3.0mM Ca(NO3)2、2.0 mM NH4H2PO4、2.0 mM MgSO4、47μM H3BO3、9.0μM MnCl2、36μM FeSO4、3.1μM ZnSO4、0.16μM CuSO4、75nM (NH4)6Mo7O24であり、脱塩水を用いて調製し、pHは毎日0.1MのNaOHあるいはKOHで6.0に調整した。更に、１週間毎に培養液すべてを交換した。ストレス処理を行う場合は、この培養液に栽培１日目以降４日目まで最終濃度が順次50,100,200,300mMになるようにNaClを添加した培養液をストレス処理区、NaCl無添加培養液をコントロールとした。４日目に根10gを小片にし、液体窒素中で磨砕した。これを50ml遠心チューブ（NUNC社製）に移し、ガラスビーズを10g加えた後、ホモジナイザーで５分間摩砕した。これにジチオスレイトール（１mg/ml）を含むメタノール溶液を用いて上清に着色が認められなくなるまで（３回程度）摩砕試料の溶媒抽出を繰り返した。抽出終了後、試料を凍結乾燥させた。この凍結乾燥試料を25mlのpH 9 100mM CHES 緩衝液（使用直前に20ミリグラムのジチオスレイトール、10mMバナジルリボヌクレオシド化合物溶液を添加）と混合し65℃で30分間保温した。保温終了後の試料溶液中に、５M塩化ナトリウム溶液及び10%CTAB溶液を添加した。この際、添加後の試料溶液中における塩化ナトリウム濃度は1.4M、CTAB濃度は１％（w/v）となるようにした。試料溶液をよく混合した後65℃で10分間保温した後、等量のクロロホルム：イソアミルアルコール（＝２４：１）溶液を添加し、緩やかに、かつ充分に混合した。混合後、遠心操作により上清を回収した。上清に対し、55%容のイソプロパノールを添加し、１時間氷冷した。遠心操作により沈殿を得、これを水に溶解させた後、フェノール抽出を行った。フェノール抽出後の上清に10%容の3M酢酸ナトリウム溶液および60%容のイソプロパノールを添加し、よく混合した後、遠心操作により沈殿を回収した。沈殿を滅菌水にて溶解した後、終濃度3Mとなるように12M 塩化リチウム溶液を添加し、よく混合した後、１時間氷冷した。遠心操作によりRNA沈殿を回収し、洗浄、乾燥を経て、最終的に水100μLに溶解させ、totalRNA画分を得た。この結果、ストレス処理区の根、コントロールの根から、それぞれ610μgの全RNAを得ることが出来た。全RNA画分からのmRNAの精製はPolyATtract mRNA Isolation SystemIII &IVキット（Cat.# Z5300& Z5310 プロメガ社製 USA）を用いた。この結果、610μgのtotalRNAからストレス処理区サンプルからは1.3μg、コントロールサンプルからは1.8μgのmRNAを得た。【０１５８】
（２）cDNAライブラリーの構築
（１）で示した方法により得られた各種組織、状況由来のユーカリmRNAを、クロンテック社のSmart cDNA library construction kitを用いてcDNAを合成し、最終的にファージミドライブラリーとした。こうして作成されたcDNAライブラリーは、各々が1×106pfu以上の独立のクローンからなるものであった。尚、ライブラリーの増幅は作製した一部に対して行い、クローンの解析には増幅をかけずに供した。【０１５９】
（３）cDNAクローンの解読とデータベース構築
各組織由来のユーカリファージミドcDNAライブラリーより、クローンをランダムに選抜し、プラスミドを精製後、アマシャム社のダイターミネーターシークエンスキットによる酵素反応を経て、同社の大規模高速シーケンサーを用いて、塩基配列データの取得を行った。
データ解析は、プラスミド由来の既知配列を削除した後、解析ソフトウェアにより、クラスタリング操作により相同配列の抽出を行った。その後、遺伝子情報データベースの１つである米国・GenBankの全データベースとの比較検索により、おおよその機能予測（アノテーション）をおこなった。【０１６０】
（実施例２）細胞壁形成への関与が推定される遺伝子群の選抜
得られたアノテーション情報を用いて、セルロースやリグニン合成に関わる遺伝子（Proc Natl Acad Sci U S A 2001 Dec 4;98(25):14732-7.、特開2000-41685、特開2002-95482、特開2003-180372）と高い相同性を持つクローンの検索を行った。その結果、５９クローンを特定した。しかしながら、これらのクローンの中には木繊維形成だけでなく、樹皮組織等の形成に関わるものや細胞壁合成とは関係ないものも含まれている。【０１６１】
（実施例３）木繊維細胞壁形成に関わる遺伝子群の抽出
（１）ユーカリ樹幹特異的オリゴマイクロアレイの作製
上述のユーカリESTデータベースより、ユーカリオリゴマイクロアレイの作製を行った。なお、実際の作製は、アジレントテクノロジー社（日本国内代理店は、横河アナリティカルシステムズ）に委託した。詳細については下記ホームページに記述されている。http://www.chem.agilent.com/cag/country/JP/products/PCol494.htm
このようにして作製したユーカリオリゴマイクロアレイは、8400個のオリゴDNAを収録しており、ユーカリ樹幹部で発現を認める遺伝子の大部分を網羅可能である。【０１６２】
（２）マイクロアレイ解析によるユーカリ樹幹の木繊維細胞壁形成に関わる遺伝子群の抽出
樹幹における木質バイオマスの大部分は木繊維と呼ばれる組織細胞で構成されている。この木繊維の性質を決める主要要素として、木繊維組織の比重・細胞壁構造や成分（セルロース・ヘミセルロース・リグニン）等がある。これらは、単一の遺伝子やタンパク質で規定されるものではなく、多数の遺伝子が群となり協調して働くことで形成される。一方、木繊維の性質は、広葉樹・針葉樹を問わず、地上高・種により変動することが知られている。このような材料に対し、ＥＳＴデータ解析とマイクロアレイによる遺伝子発現解析を行うことで、木繊維形成時において協調して働く一連の遺伝子を総括的に捉えることが可能となり、各構成遺伝子の発現状態を捉えることも可能である。【０１６３】
アノテーション情報をもとに選抜された５９クローンの中には、木繊維形成だけでなく、樹皮組織等の形成に関わるものや細胞壁合成とは関係ないものも含まれている。そこで、異なる地上高や種のユーカリ樹幹を用いて、マイクロアレイによる発現解析により、これらの中から木繊維細胞壁形成に関わる遺伝子群を抽出した。【０１６４】
本発明者らは、実施例1に示したRNA抽出方法に従って、５年生のカマルドレンシス種の樹幹基部と中央部、グロブルス種を材料に全RNAを抽出した。この際、各植物体の樹皮側（師部）と木繊維形成組織側（木部）を用いた。各個体から得られた全RNAから、プロメガ社製のPolyATract mRNA Isolation Systemにより、mRNAを精製した。このようにして得られた合計4種のmRNAを鋳型に合成した各cRNAを、各々2種の蛍光色素（cy3.cy5）により標識し、オリゴマイクロアレイ解析におけるプローブとして用い、ハイブリダイゼーションを行った（図１〜３）。標識を含むハイブリダイゼーションの方法はアジレントテクノロジーより提示の解析プロトコルに従った。スキャンして得られた画像から蛍光強度を算出し、ロゼッタ社製の解析ソフトウェア(Luminator Ver. 1.0)にて解析し、反復実験全てを統計的信頼度99.999%にて統合し、５年生のカマルドレンシス種の樹幹基部と樹幹中央部、グロブルス種の樹幹基部における選抜した５９クローンの発現情報を得た。【０１６５】
ユーカリの木繊維細胞壁の形成に関わる遺伝子の発現は、樹皮側（師部）と比較して木繊維形成組織側（木部）で有意に発現が強くなると予想される。選抜した５９クローンの中で、有意に木繊維形成組織側で強い発現を示すクローンを選抜した結果、３４クローンをユーカリの木繊維細胞壁形成に関与している遺伝子群として同定した（表１〜４）。【０１６６】
【表１】
2006109424.tif 000002
上記Sequence IDは上から順に、配列番号：１〜３４に対応する。
CesA:Cellulose synthase, SuSy:Sucrose Synthase, EGase: endo-1,4-beta-glucanase, DL:Dynamin-like protein, CAD: cinnamyl alcohol dehydrogenase, OMT: O-methyltransferase, 4CL: 4-coumarate CoA ligase, CCR: Cinnamoyl CoA reductase, C4H: cinnamate 4-hydroxylase【０１６７】
マイクロアレイ実験5y-cam5 X vs Pは、５年生ユーカリ・カマルドレンシス樹幹中央部の木部と師部を比較した実験を、5y-cam1 X vs Pは５年生ユーカリ・カマルドレンシス基部の木部と師部を比較した実験を、5y-glo X vs Pは、５年生ユーカリ・グロブルス基部の木部と師部を比較した実験を表す。実験結果は、木繊維形成組織側と樹皮側を比較して、前者で強い場合は正の倍数で、樹皮側で強い場合は負の倍数で表している。【０１６８】
34個の遺伝子群は、５年生のカマルドレンシス種の樹幹基部と中央部における詳細な発現様式から、以下の（１）〜（３）に大別された（表２、４）。【０１６９】
【表２】
2006109424.tif 000003
（１）26個の「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹基部および樹幹中央部において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇している遺伝子群」（配列番号：１〜６、８、９、１１〜１４、１６、１７、１９〜２５、２７、２８、３０、３２、３３）
26個の遺伝子群には、樹幹基部または樹幹中央部のいずれかにおいて、師部側と比べ木部側での発現差が3倍以上である遺伝子群（配列番号：１〜６、９、１１〜１４、１６、１７、１９、２０、２２、２５、２７、３０）、樹幹基部または樹幹中央部のいずれかにおいて、師部側と比べ木部側での発現差が4倍以上である遺伝子群（配列番号：１、３〜６、９、１１〜１４、１６、１７、１９、２２、２５、３０）、樹幹基部または樹幹中央部のいずれかにおいて、師部側と比べ木部側での発現差が5倍以上である遺伝子群（配列番号：１、３〜６、１１、１２、１４、１６、１７、２２、２５）、樹幹基部または樹幹中央部のいずれかにおいて、師部側と比べ木部側での発現差が10倍以上である遺伝子群（配列番号：１、３、５、１２、２５）が含まれる。【０１７０】
26個の遺伝子について、樹幹基部と樹幹中央部の木部側での遺伝子発現を直接比較した結果、2個（表４の垂直変動分類グループA-1）の「樹幹中央部の木部側と比較して樹幹基部の木部側で発現が上昇している遺伝子群」（配列番号：３３、３４）、6個（表４の垂直変動分類グループA-2）の「樹幹基部の木部側と樹幹中央部の木部側での発現が同等な遺伝子群」（配列番号：９、１１〜１３、２３、２７）、18個（表４の垂直変動分類グループA-3）の「樹幹基部の木部側と比較して樹幹中央部の木部側で発現が上昇している遺伝子群」（配列番号：１〜６、８、１４、１６、１７、１９〜２２、２４、２５、２８、３０）に大別された。より具体的には、実験によって得られた平均蛍光強度の数値を、樹幹基部／中央部または中央部／樹幹基部の式により計算した。有意である各遺伝子の発現情報から、樹幹基部／中央部の式によって得られる数値が1.1以上かつP<=0.001であるものを「樹幹中央部の木部側と比較して樹幹基部の木部側で発現が上昇している遺伝子群」と、中央部／樹幹基部の式によって得られる数値が1.1以上かつP<=0.001であるものを「樹幹基部の木部側と比較して樹幹中央部の木部側で発現が上昇している遺伝子群」と、有意でないもしくは平均強度がほぼ同じもの（中央部の木部と基部の木部の蛍光強度比が1.0〜1.1倍未満またはP>0.001）を「樹幹基部の木部側と樹幹中央部の木部側での発現が同等な遺伝子群」と判断し、分類した。【０１７１】
2個の遺伝子群には、樹幹基部の木部と樹幹中央部の木部での発現差が1.5倍以上である遺伝子群（配列番号：３３）が含まれる。
18個の遺伝子群には、樹幹基部の木部と樹幹中央部の木部での発現差が1.5倍以上である遺伝子群（配列番号：１〜６、１４、１６、１７、１９〜２２、２５、２８、３０）、樹幹基部の木部と樹幹中央部の木部での発現差が2倍以上である遺伝子群（配列番号：１〜６、１４、１６、１７、２２、２５、３０）、樹幹基部の木部と樹幹中央部の木部での発現差が3倍以上である遺伝子群（配列番号：３、５、２５、３０）が含まれる。【０１７２】
（２）1個（表４の垂直変動分類グループD）の「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹基部において、師部側と比較して木部側で発現レベルが減少し、樹幹中央部において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇している遺伝子群」（配列番号：１５）【０１７３】
（３）6個（表４の垂直変動分類グループG）の「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹中央部において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇し、樹幹基部において、師部側と木部側で発現レベルが同等な遺伝子群」（配列番号：７、１０、１８、２６、２９、３４）
6個の遺伝子群には、樹幹中央部において、師部側と比べて木部側での発現差が2倍以上である遺伝子群（配列番号：７、１０、１８、２６、２９）、樹幹中央部において、師部側と比べて木部側での発現差が2.5倍以上である遺伝子群（配列番号：１８、２６、２９）が含まれる。
34個の遺伝子群は、５年生のカマルドレンシス種の樹幹基部または樹幹中央部と５年生のグロブルス種の樹幹基部における詳細な発現様式から、以下の（１）〜（３）に大別された（表３、４）。【０１７４】
【表３】
2006109424.tif 000004
【０１７５】
【表４】
2006109424.tif 000005
（１）6個の「ユーカリ属カマルドレンシスおよびユーカリ属グロブルスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇している遺伝子群」（配列番号：１１、１２、１７、２１、２２、３０）
6個の遺伝子群には、ユーカリ属カマルドレンシスおよびユーカリ属グロブルスの樹幹のいずれかにおいて、師部側と比べ木部側での発現差が4倍以上である遺伝子群（配列番号：１１、１２、１７、２２、３０）、ユーカリ属カマルドレンシスおよびユーカリ属グロブルスの樹幹のいずれかにおいて、発現差が6倍以上である遺伝子群（配列番号：１１、１２、１７、２２）、ユーカリ属カマルドレンシスおよびユーカリ属グロブルスの樹幹のいずれかにおいて、発現差が8倍以上である遺伝子群（配列番号：１１、１２、１７）、ユーカリ属カマルドレンシスおよびユーカリ属グロブルスの樹幹のいずれかにおいて、発現差が10倍以上である遺伝子群（配列番号：１２）が含まれる。【０１７６】
6個の遺伝子について、ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹基部または樹幹中央部の木部側とユーカリ属グロブルスの樹幹基部の木部側での遺伝子発現を直接比較した結果、4個（表４の樹種間変動分類グループA-1）の「ユーカリ属グロブルスの樹幹の木部側と比較してユーカリ属カマルドレンシスの樹幹の木部側で発現が上昇している遺伝子群」（配列番号：１１、１２、１７、２２）、1個（表４の樹種間変動分類グループA-3）の「ユーカリ属グロブルスの樹幹の木部側と比較してユーカリ属カマルドレンシスの樹幹の木部側で発現が減少している遺伝子群」（配列番号：２１）に大別された。より具体的には、実験によって得られた平均蛍光強度の数値を、ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹（基部または中央部）の木部／ユーカリ属グロブルスの樹幹（基部）の木部の式またはユーカリ属グロブルスの樹幹（基部）の木部／ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹（基部または中央部）の木部の式により計算した。各遺伝子の発現情報から、ユーカリ属カマルドレンシス／ユーカリ属グロブルスの樹幹の木部の式によって得られる数値が1.1以上かつP<=0.001であるものを「ユーカリ属グロブルスの樹幹の木部側と比較してユーカリ属カマルドレンシスの樹幹の木部側で発現が上昇している遺伝子群」と、ユーカリ属グロブルスの樹幹／ユーカリ属カマルドレンシスの木部の式によって得られる数値が1.1以上かつP<=0.001であるものを「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹の木部側と比較してユーカリ属グロブルスの樹幹の木部側で発現が上昇している遺伝子群」と、有意でないもしくは平均強度がほぼ同じもの（ユーカリ属グロブルスの樹幹の木部に比べてユーカリ属カマルドレンシスの樹幹の木部の蛍光強度比が1.0〜1.1倍未満またはP>0.001）を「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹の木部側とユーカリ属グロブルスの樹幹の木部側での発現が同等な遺伝子群」と判断し、分類した。【０１７７】
4個の遺伝子群には、ユーカリ属カマルドレンシスの木部とユーカリ属グロブルスの木部での発現差が5倍以上である遺伝子群（配列番号：１２、１７）、ユーカリ属カマルドレンシスの木部とユーカリ属グロブルスの木部での発現差が9倍以上である遺伝子群（配列番号：１２）が含まれる。【０１７８】
（２）7個（表４の樹種間変動分類グループC）の「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇し、ユーカリ属グロブルスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが減少している遺伝子群」（配列番号：８、１３、１９、２３〜２５、３３）
7個の遺伝子群には、ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹において、師部側と比べ木部側での発現差が2.5倍以上、またはユーカリ属グロブルスの樹幹において、木部側と比べ師部側での発現差が2.5倍以上である遺伝子群（配列番号：８、１３、１９、２４、２５、３３）、ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹において、師部側と比べ木部側での発現差が4倍以上、またはユーカリ属グロブルスの樹幹において、木部側と比べ師部側での発現差が4倍以上である遺伝子群（配列番号：１３、１９、２５）ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹において、師部側と比べ木部側での発現差が10倍以上、またはユーカリ属グロブルスの樹幹において、木部側と比べ師部側での発現差が10倍以上である遺伝子群（配列番号：２５）が含まれる。【０１７９】
（３）13個（表４の樹種間変動分類グループE）の「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇し、ユーカリ属グロブルスの樹幹において、師部側と木部側で発現レベルが同等な遺伝子群」（配列番号：１〜６、９、１４、１６、２０、２７、２８、３２）
13個の遺伝子群には、ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹において、師部側と比べて木部側での発現差が3倍以上である遺伝子群（配列番号：１〜６、９、１４、１６、２０、２７）、ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹において、師部側と比べて木部側での発現差が2倍以上である遺伝子群（配列番号：１、３〜６、１４、１６）、ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹において、師部側と比べて木部側での発現差が10倍以上である遺伝子群（配列番号：１、３、５）が含まれる。【０１８０】
（実施例４）木繊維細胞壁形成に関わる遺伝子群のゲノムクローンとプロモーターDNAの取得
（１） ユーカリＢＡＣゲノムライブラリーのスクリーニング
ユーカリＢＡＣゲノムライブラリー作製は、D. PetersonらのJ. Agricultural Genomics 5 (http://www.ncgr.orc/research/jag)の方法に従った。作製したライブラリーは、個別クローン毎に384ウェルプレート１２０枚に分別した。これらのプレートから、プレート毎、全プレートの各列、各行のDNAを調製し、ＰＣＲによる３Ｄスクリーニング用のDNAプールとした。ｃDNA配列情報を基に合成した配列番号：６９〜８４のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号：６９〜８４の奇数番号はフォワードプライマー、偶数番号はリバースプライマー）を用い、DNAプールを鋳型にPCR法により各遺伝子のゲノムクローンのスクリーニングを行った。【０１８１】
（２）ゲノム配列の決定
ＢＡＣクローンのインサート配列は、実施例１に示す方法で決定した。得られた塩基配列を用い、cDNA配列をもとに各遺伝子のゲノム領域を決定した（配列番号：３、６、１１、１４、１９、２３、２４、２５に記載のcDNA配列をもとに決定されたゲノム配列を、それぞれ、配列番号：８５〜９２に示す）。また、翻訳開始コドンATG（アミノ酸ではメチオニンをコード）を含む全長のcDNA配列であったクローンに関しては、その配列をもとにプロモーター領域を決定した。決定されたプロモーター配列を配列番号：９３〜１００に示した。具体的には、全長ｃＤＮＡの５‘末端塩基から上流の配列を、遺伝情報処理ソフトウェア「GENETYX」（ソフトウェア開発株式会社）により解析し、TATA-box配列を決定した。高等真核生物のプロモーター領域には、転写開始点より通常約10〜25塩基上流側にTATA-box配列があることがよく知られている。決定されたTATA-boxの位置から全長ｃＤＮＡ５‘末端塩基までが近接している（約100bp程度）場合、ｃＤＮＡはほぼ完全長であり、その末端塩基上流側がプロモーター領域であると判断した。プロモーターの長さは、モデル植物で知られている最大の長さ（約3kb）を参考に、ｃＤＮＡ５‘末端塩基から上流側最大3kbまでとした。【０１８２】
配列番号：１によって示される塩基配列では、第１位〜第６６０位がアミノ酸コード領域（配列番号：３５）である。
配列番号：２によって示される塩基配列では、第１位〜第６０２位がアミノ酸コード領域（配列番号：３６）である。
配列番号：３によって示される塩基配列では、第３３７位〜第３２７３位がアミノ酸コード領域（配列番号：３７）である。
配列番号：４によって示される塩基配列では、第１位〜第１４０７位がアミノ酸コード領域（配列番号：３８）である。
配列番号：５によって示される塩基配列では、第１位〜第４６５位がアミノ酸コード領域（配列番号：３９）である。
配列番号：６によって示される塩基配列では、第８７位〜第３２２１位がアミノ酸コード領域（配列番号：４０）である。
配列番号：７によって示される塩基配列では、第１位〜第６９９位がアミノ酸コード領域（配列番号：４１）である。
配列番号：８によって示される塩基配列では、第１位〜第１４０７位がアミノ酸コード領域（配列番号：４２）である。
配列番号：９によって示される塩基配列では、第１位〜第１１２２位がアミノ酸コード領域（配列番号：４３）である。
配列番号１０によって示される塩基配列では、第１位〜第１００５位がアミノ酸コード領（配列番号：４４）域である。
配列番号：１１によって示される塩基配列では、第３１３位〜第１３０５位がアミノ酸コード領域（配列番号：４５）である。
配列番号：１２によって示される塩基配列では、第１位〜第４６５位がアミノ酸コード領域（配列番号：４６）である。
配列番号：１３によって示される塩基配列では、第１位〜第７６２位がアミノ酸コード領域（配列番号：４７）である。
配列番号：１４によって示される塩基配列では、第３７５位〜第１４４２位がアミノ酸コード領域（配列番号：４８）である。
配列番号：１５によって示される塩基配列では、第１位〜第７７４位がアミノ酸コード領域（配列番号：４９）である。
配列番号：１６によって示される塩基配列では、第１位〜第４９８位がアミノ酸コード領域（配列番号：５０）である。
配列番号：１７によって示される塩基配列では、第６８位〜第１１６５位がアミノ酸コード領域（配列番号：５１）である。
配列番号：１８によって示される塩基配列では、第１１７位〜第８５７位がアミノ酸コード領域（配列番号：５２）である。
配列番号：１９によって示される塩基配列では、第８４位〜第９６８位がアミノ酸コード領域（配列番号：５３）である。
配列番号：２０によって示される塩基配列では、第１位〜第２０７位がアミノ酸コード領域（配列番号：５４）である。
配列番号：２１によって示される塩基配列では、第５６位〜第２２３位がアミノ酸コード領域（配列番号：５５）である。
配列番号：２２によって示される塩基配列では、第１位〜第６２１位がアミノ酸コード領域（配列番号：５６）である。
配列番号：２３によって示される塩基配列では、第３２３位〜第１３３０位がアミノ酸コード領域（配列番号：５７）である。
配列番号：２４によって示される塩基配列では、第２４０位〜第１８４７位がアミノ酸コード領域（配列番号：５８）である。
配列番号：２５によって示される塩基配列では、第２７３位〜第１９２８位がアミノ酸コード領域（配列番号：５９）である。
配列番号：２６によって示される塩基配列では、第１位〜第１１３４位がアミノ酸コード領域（配列番号：６０）である。
配列番号：２７によって示される塩基配列では、第１位〜第５２５位がアミノ酸コード領域（配列番号：６１）である。
配列番号：２８によって示される塩基配列では、第１位〜第１１１６位がアミノ酸コード領域（配列番号：６２）である。
配列番号：２９によって示される塩基配列では、第１位〜第１９５位がアミノ酸コード領域（配列番号：６３）である。
配列番号：３０によって示される塩基配列では、第１位〜第１３８位がアミノ酸コード領域（配列番号：６４）である。
配列番号：３１によって示される塩基配列では、第１位〜第５６４位がアミノ酸コード領域（配列番号：６５）である。
配列番号：３２によって示される塩基配列では、第１位〜第７１１位がアミノ酸コード領域（配列番号：６６）である。
配列番号：３３によって示される塩基配列では、第８４位〜第５６９位がアミノ酸コード領域（配列番号：６７）である。
配列番号：３４によって示される塩基配列では、第１位〜第２４９位がアミノ酸コード領域（配列番号：６８）である。
配列番号：８５によって示される塩基配列の第１位〜第２０１３位がプロモーター領域（配列番号：９３）であり、第２３５０位〜第２５２７位、第３１０５位〜第３１８１位、第３３７１位〜第３４２２位、第３５３９位〜第３６８０位、第４２９５位〜第４５６１位、第４９２４位〜第５２６９位、第５４１２位〜第５５４９位、第５７９３位〜第５９１８位、第６００１位〜第６２１３位、第６６４９位〜第６９０７位、第６９９３位〜第７１９２位、第７４３１位〜第７７８４位、第８０６９位〜第８６５０位がコード領域内のエクソンであり、第２５２８位〜第３１０４位、第３１８２位〜第３３７０位、第３４２３位〜第３５３８位、第３６８１位〜第４２９４位、第４５６２位〜第４９２３位、第５２７０位〜第５４１１位、第５５５０位〜第５７９２位、第５９１９位〜第６０００位、第６２１４位〜第６６４８位、第６９０８位〜第６９９２位、第７１９３位〜第７４３０位、第７７８５位〜第８０６８位、がイントロン領域である。
配列番号：８６によって示される塩基配列の第１位〜第２９２０位がプロモーター領域（配列番号：９４）であり、第３０６８位〜第３１３９位、第３９４１位〜第４１４１位、第４２７５位〜第４３９６位、第４４８８位〜第４５５４位、第４６７０位〜第４８０８位、第５２９１位〜第５９０３位、第６０００位〜第６１３７位、第６４２６位〜第６５５１位、第６７９２位〜第７００４位、第７０９１位〜第７６０６位、第７９９８位〜第８３４８位、第８６９５位〜第９２７６位がコード領域内のエクソンであり、第３１４０位〜第３９４０位、第４１４２位〜第４２７４位、第４３９７位〜第４４８７位、第４５５５位〜第４６６９位、第４８０９位〜第５２９０位、第５９０４位〜第５９９９位、第６１３８位〜第６４２５位、第６５５２位〜第６７９１位、第７００５位〜第７０９０位、第７６０７位〜第７９９７位、第８３４９位〜第８６９４位がイントロン領域である。
配列番号：８７によって示される塩基配列の第１位〜第２７００位がプロモーター領域（配列番号：９５）であり、第３０１３位〜第３４１５位、第３５０８位〜第３６６７位、第４６１０位〜第５０３９位がコード領域内のエクソンであり、第３４１６位〜第３５０７位、第３６６８位〜第４６０９位がイントロン領域である。
配列番号：８８によって示される塩基配列の第１位〜第２７０７位がプロモーター領域（配列番号：９６）であり、第３０８２位〜第３１７０位、第３３６５位〜第３４７８位、第３５６５位〜第３７９２位、第４３８９位〜第４８２８位、第５１２４位〜第５３２０位がコード領域内のエクソンであり、第３１７１位〜第３３６４位、第３４７９位〜第３５６４位、第３７９３位〜第４３８８位、第４８２９位〜第５１２３位がイントロン領域である。
配列番号：８９によって示される塩基配列の第１位〜第２８３５位がプロモーター領域（配列番号：９７）であり、第２９２０位〜第３０１１位、第３１４２位〜第３２２１位、第３３４５位〜第３４８９位、第３６４３位〜第３７７４位、第４３３３位〜第４６２３位がコード領域内のエクソンであり、第３０１２位〜第３１４１位、第３２２２位〜第３３４４位、第３４９０位〜第３６４２位、第３７７５位〜第４３３２位がイントロン領域である。
配列番号：９０によって示される塩基配列の第１位〜第２４６９位がプロモーター領域（配列番号：９８）であり、第２７９２位〜第２９２４位、第３０２７位〜第３１８１位、３８５０第位〜第４０３５位、第４２０２位〜第４５５４位、第５５０４位〜第５６８４位がコード領域内のエクソンであり、第２９２５位〜第３０２６位、第３１８２位〜第３８４９位、第４０３６位〜第４２０１位、第４５５５位〜第５５０３位がイントロン領域である。
配列番号：９１によって示される塩基配列の第１位〜第１２４２位がプロモーター領域（配列番号：９９）であり、第１４８２位〜第２３４７位、第２４５２位〜第３１９３位がコード領域内のエクソンであり、第２３４８位〜第２４５１位がイントロン領域である。
配列番号：９２によって示される塩基配列の第１位〜第２９９７位がプロモーター領域（配列番号：１００）であり、第３２７０位〜第３３３５位、第３６０６位〜第３７５７位、第４０３４位〜第４２７８位、第４５６２位〜第４６９０位、第４７９７位〜第５７３２位、第５８４４位〜第５９７１位がコード領域内のエクソンであり、第３３３６位〜第３６０５位、第３７５８位〜第４０３３位、第４２７９位〜第４５６１位、第４６９１位〜第４７９６位、第５７３３位〜第５８４３位がイントロン領域である。【０１８３】
（実施例５）転写因子群の選抜
実施例１に示すデータベースから得られたアノテーション情報を用いて、遺伝子発現制御に関わる転写因子遺伝子（J. L. RiechmannらSCIENCE VOL 290 15 DECEMBER 2000、岩淵雅樹・篠崎一雄編、植物ゲノム機能のダイナミズム）と高い相同性を持つクローンの検索を行った。その結果、７１クローンを特定した。しかしながら、これらのクローンの中には木繊維形成だけでなく、樹皮組織等の形成に関わる転写因子も含まれている。【０１８４】
（実施例６）木繊維形成に関わる転写因子群の抽出
アノテーション情報をもとに選抜された７１クローンの中には、木繊維形成だけでなく、樹皮組織等の形成に関わるものも含まれている。そこで、異なる地上高・種のユーカリ樹幹を用いて、マイクロアレイによる発現解析により、これらの中から木繊維形成に関わる転写因子群を抽出した。【０１８５】
本発明者らは、実施例1に示したRNA抽出方法に従って、５年生のカマルドレンシス種の樹幹基部と樹幹中央部、グロブルス種の樹幹基部を材料に全RNAを抽出した。この際、各植物体の樹皮側（師部）と木繊維形成組織側（木部）を用いた。各個体から得られた全RNAから、プロメガ社製のPolyATract mRNA Isolation Systemにより、mRNAを精製した。このようにして得られた合計4種のmRNAを各々2種の蛍光色素（cy3.cy5）により標識し、実施例１に示すオリゴマイクロアレイ解析におけるプローブとして用い、ハイブリダイゼーションを行った（図１〜３）。標識を含むハイブリダイゼーションの方法はアジレントテクノロジーより提示の解析プロトコルに従った。スキャンして得られた画像から蛍光強度を算出し、ロゼッタ社製の解析ソフトウェア(Luminator Ver. 1.0)にて解析し、反復実験全てを統計的信頼度99.999%にて統合し、５年生のカマルドレンシス種の樹幹基部と樹幹中央部、グロブルス種の樹幹基部における選抜した７１クローンの発現情報を得た。【０１８６】
ユーカリの木繊維形成に関わる転写因子群は、樹皮側（師部）と比較して木繊維形成組織側（木部）で有意に発現が強くなると予想される。選抜した７１クローンの中で、有意に木繊維形成組織側で強い発現を示すクローンを選抜した結果、１１クローンをユーカリの木繊維細胞壁形成に関与している遺伝子群を同定した（表５〜８）。【０１８７】
本明細書では、同定されたcDNA配列を配列番号：１０１〜１１１に示し、それぞれのcDNAからコードされるアミノ酸配列を配列番号：１１２〜１２２に示す。なお、配列番号：１１２〜１２２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNAは、以下に示す構造的特徴（ドメイン）を有する。
配列番号：１１２に記載のアミノ酸配列はCBFドメイン、HAP2ドメイン、
配列番号：１１３に記載のアミノ酸配列はホメオドメイン、
配列番号：１１４に記載のアミノ酸配列はCoprinus_matingドメイン、
配列番号：１１５に記載のアミノ酸配列はLIM ドメイン、
配列番号：１１６に記載のアミノ酸配列はbZIPドメイン、
配列番号：１１７に記載のアミノ酸配列はSANTドメイン、Myb DNA bindingドメイン、REB1ドメイン、
配列番号：１１８に記載のアミノ酸配列はWRKYドメイン、
配列番号：１１９に記載のアミノ酸配列はホメオドメイン、leucine zipperドメイン、
配列番号：１２０に記載のアミノ酸配列はUPF0023ドメイン、leucine zipperドメイン、
配列番号：１２１に記載のアミノ酸配列はSANTドメイン、Myb DNA bindingドメイン、REB1ドメイン
配列番号：１２２に記載のアミノ酸配列はSinaドメイン。【０１８８】
【表５】
2006109424.tif 000006
上記Sequence IDは上から順に、配列番号１０１〜１１１に対応する。【０１８９】
マイクロアレイ実験5y-cam5 X vs Pは、５年生ユーカリ・カマルドレンシス樹幹中央部の木部と師部を比較した実験を、5y-cam1 X vs Pは５年生ユーカリ・カマルドレンシス基部の木部と師部を比較した実験を、5y-glo X vs Pは、５年生ユーカリ・グロブルス基部の木部と師部を比較した実験を表す。実験結果は、木繊維形成組織側と樹皮側を比較して、前者で強い場合は正の倍数で、樹皮側で強い場合は負の倍数で表している。【０１９０】
11個の遺伝子群は、５年生のカマルドレンシス種の樹幹基部と中央部における詳細な発現様式から、以下の（１）と（２）に大別された（表６、８）。【０１９１】
【表６】
2006109424.tif 000007
【０１９２】
（１）5個の「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹基部および樹幹中央部において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇している遺伝子群」（配列番号：１０２〜１０６）【０１９３】
5個の遺伝子群には、樹幹基部または樹幹中央部のいずれかにおいて、師部側と比べ木部側での発現差が2倍以上である遺伝子群（配列番号：１０２、１０５、１０６）、樹幹基部または樹幹中央部のいずれかにおいて、師部側と比べ木部側での発現差が4倍以上である遺伝子群（配列番号：１０５、１０６）が含まれる。【０１９４】
5個の遺伝子群について、樹幹基部と樹幹中央部の木部側での遺伝子発現を直接比較した結果、3個（表８の垂直変動分類グループA-2）の「樹幹基部の木部側と樹幹中央部の木部側での発現が同等な遺伝子群」（配列番号：１０４〜１０６）、2個（表８の垂直変動分類グループA-3）の「樹幹基部の木部側と比較して樹幹中央部の木部側で発現が上昇している遺伝子群」（配列番号：１０２、１０３）に大別された。より具体的には、実験によって得られた平均蛍光強度の数値を、樹幹基部／中央部または中央部／樹幹基部の式により計算した。有意である各遺伝子の発現情報から、樹幹基部／中央部の式によって得られる数値が1.1以上かつP<=0.001であるものを「樹幹中央部の木部側と比較して樹幹基部の木部側で発現が上昇している遺伝子群」と、中央部／樹幹基部の式によって得られる数値が1.1以上かつP<=0.001であるものを「樹幹基部の木部側と比較して樹幹中央部の木部側で発現が上昇している遺伝子群」と、有意でないもしくは平均強度がほぼ同じもの（中央部の木部と基部の木部の蛍光強度比が1.0〜1.1倍未満またはP>0.001）を「樹幹基部の木部側と樹幹中央部の木部側での発現が同等な遺伝子群」と判断し、分類した。【０１９５】
2個の遺伝子群には、樹幹基部の木部と樹幹中央部の木部での発現差が2倍以上である遺伝子群（配列番号：１０２、１０３）が含まれる。【０１９６】
（２）5個（表８の垂直変動分類グループG）の「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹中央部において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇し、樹幹基部において、師部側と木部側で発現レベルが同等な遺伝子群」（配列番号：１０１、１０７、１０９〜１１１）【０１９７】
5個の遺伝子群には、樹幹中央部において、師部側と比べて木部側での発現差が1.5倍以上である遺伝子群（配列番号：１０７、１０９〜１１１）、樹幹中央部において、師部側と比べて木部側での発現差が2倍以上である遺伝子群（配列番号：１０７、１０９）が含まれる。【０１９８】
11個の遺伝子群は、５年生のカマルドレンシス種の樹幹基部と樹幹中央部、５年生のグロブルス種の樹幹基部における詳細な発現様式から、以下の（１）〜（３）に大別された（表７、８）。【０１９９】
【表７】
2006109424.tif 000008
【０２００】
【表８】
2006109424.tif 000009
【０２０１】
（１）2個の「ユーカリ属カマルドレンシスおよびユーカリ属グロブルスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇している遺伝子群」（配列番号：１０３、１０５）【０２０２】
2個の遺伝子群には、ユーカリ属カマルドレンシスおよびユーカリ属グロブルスの樹幹のいずれかにおいて、師部側と比べ木部側での発現差が10倍以上である遺伝子群（配列番号：１０５）が含まれる。【０２０３】
2個の遺伝子について、ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹基部または中央部の木部側とユーカリ属グロブルスの樹幹基部の木部側での遺伝子発現を直接比較した結果、1個（表８の樹種間変動分類グループA-2）の「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹の木部側とユーカリ属グロブルスの樹幹の木部側での発現が同等な遺伝子」（配列番号：１０３）、1個（表８の樹種間変動分類グループA-3）の「ユーカリ属グロブルスの樹幹の木部側と比較してユーカリ属カマルドレンシスの樹幹の木部側で発現レベルが減少している遺伝子」（配列番号：１０５）に大別された。より具体的には、実験によって得られた平均蛍光強度の数値を、ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹（基部または中央部）の木部／ユーカリ属グロブルスの樹幹（基部）の木部の式またはユーカリ属グロブルスの樹幹（基部）の木部／ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹（基部または中央部）の木部の式により計算した。各遺伝子の発現情報から、ユーカリ属カマルドレンシス／ユーカリ属グロブルスの樹幹の木部の式によって得られる数値が1.1以上かつP<=0.001であるものを「ユーカリ属グロブルスの樹幹の木部側と比較してユーカリ属カマルドレンシスの樹幹の木部側で発現が上昇している遺伝子群」と、ユーカリ属グロブルスの樹幹／ユーカリ属カマルドレンシスの木部の式によって得られる数値が1.1以上かつP<=0.001であるものを「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹の木部側と比較してユーカリ属グロブルスの樹幹の木部側で発現が上昇している遺伝子群」と、有意でないもしくは平均強度がほぼ同じもの（ユーカリ属グロブルスの樹幹の木部に比べてユーカリ属カマルドレンシスの樹幹の木部の蛍光強度比が1.0〜1.1倍未満またはP>0.001）を「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹の木部側とユーカリ属グロブルスの樹幹の木部側での発現が同等な遺伝子群」と判断し、分類した。【０２０４】
（２）2個（表８の樹種間変動分類グループC）の「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇し、ユーカリ属グロブルスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが減少している遺伝子群」（配列番号：１０４、１０６）【０２０５】
2個の遺伝子群には、ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹において、師部側と比べ木部側での発現差が4倍以上、またはユーカリ属グロブルスの樹幹において、木部側と比べ師部側での発現差が4倍以上である遺伝子（配列番号：１０６）が含まれる。【０２０６】
（３）1個（表８の樹種間変動分類グループE）の「ユーカリ属カマルドレンシスの樹幹において、師部側と比較して木部側で発現レベルが上昇し、ユーカリ属グロブルスの樹幹において、師部側と木部側で発現レベルが同等な遺伝子群」（配列番号：１０２）【０２０７】
（実施例７）木繊維形成に関わる転写因子群のゲノムクローンとプロモーターDNAの取得
（１） ユーカリＢＡＣゲノムライブラリーのスクリーニング
ユーカリＢＡＣゲノムライブラリーのスクリーニングは、実施例４に示す方法で行った。ＰＣＲによる３Ｄスクリーニング用のDNAプールを鋳型に、ｃDNA配列情報を基に合成した配列番号：１２３〜１４４のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号：１２３〜１４４の奇数番号はフォワードプライマー、偶数番号はリバースプライマー）を用い、PCR法により各遺伝子のゲノムクローンのスクリーニングを行った。【０２０８】
ＢＡＣクローンのインサート配列は、実施例１に示す方法で決定した。得られた塩基配列を用い、cDNA配列をもとに各遺伝子のゲノム領域とプロモーター領域を決定した（配列番号：１０１〜１１１に記載のcDNA配列をもとに決定されたゲノム配列を、それぞれ、配列番号：１４５〜１５５に示す）。また、翻訳開始コドンATG（アミノ酸ではメチオニンをコード）を含む全長のcDNA配列をもとにプロモーター領域を決定した。決定されたプロモーター配列を配列番号：１５６〜１６６に示した。具体的には、全長ｃＤＮＡの５‘末端塩基から上流の配列を、遺伝情報処理ソフトウェア「GENETYX」（ソフトウェア開発株式会社）により解析し、TATA-box配列を決定した。高等真核生物のプロモーター領域には、転写開始点より通常約10〜25塩基上流側にTATA-box配列があることがよく知られている。決定されたTATA-boxの位置から全長ｃＤＮＡ５‘末端塩基までが近接している（約100bp程度）場合、ｃＤＮＡはほぼ完全長であり、その末端塩基上流側がプロモーター領域であると判断した。プロモーターの長さは、モデル植物で知られている最大の長さ（約3kb）を参考に、ｃＤＮＡ５’末端塩基から上流側最大3kbまでとした。【０２０９】
配列番号：１０１によって示される塩基配列では、第８７位〜第６６２位がアミノ酸コード領域（配列番号：１１２）である。
配列番号：１０２によって示される塩基配列では、第２６２位〜第１１８８位がアミノ酸コード領域（配列番号：１１３）である。
配列番号：１０３によって示される塩基配列では、第２５７位〜第１５４９位がアミノ酸コード領域（配列番号：１１４）である。
配列番号：１０４によって示される塩基配列では、第１５９位〜第７２２位がアミノ酸コード領域（配列番号：１１５）である。
配列番号：１０５によって示される塩基配列では、第１０１位〜第１４４４位がアミノ酸コード領域（配列番号：１１６）である。
配列番号：１０６によって示される塩基配列では、第１６３位〜第９２７位がアミノ酸コード領域（配列番号：１１７）である。
配列番号：１０７によって示される塩基配列では、第４８位〜第２３００位がアミノ酸コード領域（配列番号：１１８）である。
配列番号：１０８によって示される塩基配列では、第２３位〜第７７８位がアミノ酸コード領域（配列番号：１１９）である。
配列番号：１０９によって示される塩基配列では、第４０位〜第１１０１位がアミノ酸コード領域（配列番号：１２０）である。
配列番号：１１０によって示される塩基配列では、第１２８位〜第７９０位がアミノ酸コード領域（配列番号：１２１）である。
配列番号：１１１によって示される塩基配列では、第２６９位〜第１２３４位がアミノ酸コード領域（配列番号：１２２）である。
配列番号：１４５によって示される塩基配列の第１位〜第２６８０位がプロモーター領域（配列番号：１５６）であり、第２７６７位〜第２７９６位、第２８８４位〜第２９４９位、第２９８４位〜第３１４２位、第３２６５位〜第３５８５位がコード領域内のエクソンであり、第２７９７位〜第２８８３位、第２９５０位〜第２９８３位、第３１４３位〜第３２６４位、がイントロン領域である。
配列番号：１４６によって示される塩基配列の第１位〜第３０００位がプロモーター領域（配列番号：１５７）であり、第３２６２位〜第３６０６位、第３９２０位〜第４０４０位、第５４３６位〜第５６２６位、第５８２９位〜第５９６０位、第６２４６位〜第６３８３位、がコード領域内のエクソンであり、第３６０７位〜第３９１９位、第４０４１位〜第５４３５位、第５６２７位〜第５８２８位、第５９６１位〜第６２４５位がイントロン領域である。
配列番号：１４７によって示される塩基配列の第１位〜第１５６９位がプロモーター領域（配列番号：１５８）であり、第１８２６位〜第２５３３位、第４８４７位〜第４９６７位、第５４３９位〜第５６３２位、第５７０９位〜第５８４０位、第５９３６位〜第６０７２位、第６１５８位がコード領域内のエクソンであり、第２５３４位〜第４８４６位、第４９６８位〜第５４３８位、第５６３３位〜第５７０８位、第５８４１位〜第５９３５位、第６０７３位〜第６１５７位がイントロン領域である。
配列番号：１４８によって示される塩基配列の第１位〜第２９７９位がプロモーター領域（配列番号：１５９）であり、第３２４１位〜第３３７５位、第３９６７位〜第４０６３位、、第４１５９位〜第４２０２位、第４２９３位〜第４２８２位、第４５３９位〜第４７３６位がコード領域内のエクソンであり、第３３７６位〜第３９６６位、第４０６４位〜第４１５８位、第４２０３位〜第４２９２位、第４２８３位〜第４５３８位がイントロン領域である。
配列番号：１４９によって示される塩基配列の第１位〜第１２８８位がプロモーター領域（配列番号：１６０）であり、第１４０９位〜第１９６４位、第３７５５位〜第３９５９位、第４５１０位〜第４５８５位、第４５６４位〜第４８０９位、第５０６６位〜第５４４６位がコード領域内のエクソンであり、第１９６５位〜第３７５４位、第３９６０位〜第４５０９位、第４５８６位〜第４５６３位、第４８１０位〜第５０６５位がイントロン領域である。
配列番号：１５０によって示される塩基配列の第１位〜第１５３６位がプロモーター領域（配列番号：１６１）であり、第１７２３位〜第１９８５位、第２２１７位〜第２７１８位がコード領域内のエクソンであり、第１９８６位〜第２２１６位がイントロン領域である。
配列番号：１５１によって示される塩基配列の第１位〜第１６５８位がプロモーター領域（配列番号：１６２）であり、第１７０６位〜第２１６７位、第２４０７位〜第２５８９位、第２７６７位〜第３６４７位、第３７４７位〜第３９０５位、第４１０８位〜第４６７５位がコード領域内のエクソンであり、第２１６８位〜第２４０６位、第２５９０位〜第２７６６位、第３６４８位〜第３７４６位、第３９０６位〜第４１０７位がイントロン領域である。
配列番号：１５２によって示される塩基配列の第１位〜第１９７９位がプロモーター領域（配列番号：１６３）であり、第２００２位〜第２４２７位、第２７１４位〜第２７９３位、第２９８４位〜第３２３３位がコード領域内のエクソンであり、第２４２８位〜第２７１３位、第２７９４位〜第２９８３位がイントロン領域である。
配列番号：１５３によって示される塩基配列の第１位〜第５９６位がプロモーター領域（配列番号：１６４）であり、第６３７位〜第７７０位、第１１４３位〜第１２７２位、第１３９３位〜第１５９３位、第２０４２位〜第２２０９位、第２９３９位〜第３３６７位がコード領域内のエクソンであり、第７７１位〜第１１４２位、第１２７３位〜第１３９２位、第１５９４位〜第２０４１位、第２２１０位〜第２９３８位がイントロン領域である。
配列番号：１５４によって示される塩基配列の第１位〜第２９７３位がプロモーター領域（配列番号：１６５）であり、第３１０１位〜第３２２１位、第３３３９位〜第３４６８位、第４３２４位〜第４７３５位がコード領域内のエクソンであり、第３２２２位〜第３３３８位、第３４６９位〜第４３２３位がイントロン領域である。
配列番号：１５５によって示される塩基配列の第１位〜第１７８３位がプロモーター領域（配列番号：１６６）であり、第２０５２位〜第２２７０位、第３３３９位〜第３７２５位、第４２６６位〜第４６２５位がコード領域内のエクソンであり、第２２７１位〜第３３３８位、第３７２６位〜第４２６５位がイントロン領域である。【０２１０】
（実施例８）木部特異的プロモーター活性の解析
（１） 活性解析用コンストラクトの構築
実施例３と６に示した木部形成組織で発現している遺伝子（配列番号：１〜３４、１０１〜１１１）は、それらの各々のプロモーターによって木部での発現が制御されている。従って、各プロモーター領域は、任意の遺伝子の木部での発現制御に当然用いることができる。そこで、それらのプロモーター下流にレポーター遺伝子をつなぎ、植物に導入し木部での発現活性を確認した。本実施例では、セルロース合成酵素遺伝子（配列番号：３）のプロモーター領域（配列番号：９３）の活性を、パーティクルガン法により解析した例を示す。
木部特異的プロモーターとしての活性を確認するため、セルロース合成酵素遺伝子（配列番号：３）のプロモーター領域下流にレポーターとしてＧＵＳ遺伝子をつなげユーカリへ導入した。具体的には、配列番号：８５に記載のゲノム配列情報を基に合成した配列番号：１６７、１６８のオリゴヌクレオチドプライマーを用い、BACクローンDNAを鋳型にPCR法により５’非翻訳領域を含むプロモーター領域を増幅し、平滑末端化後35Sプロモーターを除いたバイナリーベクターpBI121ベクター (Bevan, M., Nucleic Acids Res. 12, 8711-8721, 1984)のGUS遺伝子上流へサブクローニングした。【０２１１】
（２）木部特異的プロモーター活性の解析
プロモーター活性の解析として、前述の導入用プラスミドを木部形成組織にパーティクルガンで導入し、GUS遺伝子の活性を解析した。旺盛に生育中の５年生ユーカリ樹幹の樹皮を剥いだ面に露出している木部形成組織（図４A）から木部ブロック（図４B）を切除し、パーティクルガン導入用ターゲットとした。導入用プラスミドの金粒子へのコーティングは、後述のように行った。金粒子50μlにプラスミドDNAを5μl（0.5μg/μl）と2.5M CaCa2を50μl加えすぐに混合し、次に0.1Mスペルミジンを20μl加えさらに混合後、遠心機で金粒子を沈殿させた。100%エタノールで洗浄した後、100%エタノール60μlに懸濁し、１回分（5-10μl）ずつマクロキャリアーに分注し乾燥させて用いた。導入条件は、真空度:27-28 inches Hg、ラプチャーディスク：1800psi、金粒子径：1.6μm、試料距離：4-8cmで行った。木部形成組織ブロックに導入処理（ボンバードメント）後、２５℃暗所にて一晩培養し、組織化学的方法（X-glu溶液にて３７℃２４時間インキュベート、Kosugi et al., 1990, Plant Sci., 70:133-140）にてGUS活性（青い発色）の検出を行った。その結果、図４B〜Dに示すように、セルロース合成酵素遺伝子プロモーターによるGUS遺伝子の発現を示す青いスポットが観察された。従って、本プロモーターは、マイクロアレイ実験の結果の通り、木部形成部位で発現する活性を持つことが示された。
この例からも示されるように、マイクロアレイ実験により木部に発現が認められた配列番号：１〜３４、１０１〜１１１に記載の遺伝子のプロモーター配列は、任意の遺伝子の木部での発現制御に用いることができる。【０２１２】
（実施例９）木繊維形成遺伝子プロモーターと転写因子との相互作用解析
転写因子は、その制御下にある遺伝子のプロモーター領域に結合することで、発現のon/offを制御している（J. L. RiechmannらSCIENCE VOL 290 15 DECEMBER 2000、岩淵雅樹・篠崎一雄編、植物ゲノム機能のダイナミズム）。したがって、遺伝子のプロモーター領域との相互作用（結合）の有無を解析することで、制御・被制御の関係が分かる。【０２１３】
そこで、木細胞壁形成を制御する配列番号：１０１〜１１１（配列番号：１１２〜１２２）に記載の転写因子と、配列番号１〜３４（配列番号３５〜６８）に記載の木部細胞壁形成に関わる遺伝子のプロモーターとの相互作用を解析した。本実施例では、例として配列番号：１１７のMYB転写因子タンパク質と配列番号：１１９のホメオドメイン(HD-ZIP)転写因子タンパク質について、セルロース合成に関わる遺伝子（CesA）のプロモーター領域（配列番号：９３）とリグニン合成に関わる遺伝子（CAD、OMT、C4H）のプロモーター（それぞれ配列番号：９６、９７、９９）との相互作用の結果を示す。【０２１４】
（１）無細胞翻訳系によるタンパク質発現と精製
無細胞翻訳系によりMYB転写因子タンパクを発現させるため、配列番号：１６９、１７０に記載のプライマーを用いて、MYBのcDNA（配列番号：１０６）を鋳型にＰＣＲした。増幅した断片を制限酵素NdeIとsmaIで処理し、pIVEX1.3ベクター(Roche)に挿入し、無細胞翻訳系（小麦胚芽タンパク質合成系キットRTS100;Roche)を用いて、24℃、24時間反応させた。この反応液1ulをSDS-PAGEで泳動し、anti-His抗体を用いたウェスタンブロッティングにより、目的タンパク質の発現を確認した。【０２１５】
（２）大腸菌によるタンパク質発現と精製
大腸菌によりHD-ZIP転写因子タンパクを発現させるため、配列番号：１７１、１７２に記載のプライマーを用いて、HD-ZIPのcDNA（配列番号：１０８）を鋳型にＰＣＲした。増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素EcoRVとSalIで処理後、pET32aベクター(Novagen)に挿入し、大腸菌BL21系統にトランスフォーメーションした。タンパク質を発現させる場合は、LB培地に植菌しOD600=0.8になるまで37℃で培養し、1mM IPTGを加え25℃、4時間で培養した。集菌後、HisTrap HP (GE Healthcare)を用いて精製を行い、50mM イミダゾールで洗浄し、400mM イミダゾールで溶出した。この精製タンパク質をHiTrap Desalting (GE Healthcare)を用いて脱塩した。【０２１６】
（３）プローブ作製
各プロモーターの転写開始点に近い側から900bpの領域を30bpづつ区切って、オリゴDNAプローブの配列とした。その際、各プローブとも両隣のプローブ配列と5bpのオーバーラップを持たせて設計したので、１つのプロモーターあたり合計４０種（組）のプローブペア（センス・アンチセンス）を人工合成した。この際、センス側のDNAをTAMRA（蛍光色素）標識した。相互作用の解析には、センス・アンチセンス鎖をアニーリングさせた２本鎖DNAを用いた。アニーリングは、TAMRA標識センスオリゴDNA(配列番号：１７３〜３３２)と未標識アンチセンスオリゴDNA（配列番号：３３３〜４９２）を、0.1M NaCl/TE(pH8.0)で1uMになるように調整し、95℃で5分変性処理後、1時間かけて徐々に室温に戻しながら行った。次に、未反応の1本鎖オリゴDNAを除くため、10ｍM MgCl2とExonuclease Iを加え37℃、1時間反応させMERmaid SPIN Kit (Qbiogene)を用いてプローブを精製した。センス・アンチセンス鎖の対応は、配列番号：１７３の相補鎖が配列番号：３３３であり（Probe No.1）、以降配列番号：１７４と３３４（Probe No.2）〜配列番号：３３２と４９２（Probe No.160）のように順番に対応する。【０２１７】
（４）DNA-タンパク質結合反応の測定
DNA-タンパク質の結合反応は、30ulの反応液中（25mM Hepes/KOH (pH7.9)、50mM KCl、0.5mM DTT、5% glycerol、2mg/ml BSA、0.05mg/ml poly(dI-dC)・(dI-dC)、タンパク質 1ul、3nM プローブ）で室温20分間行った。分子間相互作用解析機器「一分子蛍光分析システムMF20（オリンパス）」を用いたFCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy)計測により、標準Dyeを10秒×5回、反応液を15秒×5回計測した。この測定値から並進時間を算出し、結合の有無を検証した。結合が認められる場合は、標識プローブの分子量が大きくなるため、並進時間がコントロールより長くなる。コントロールとなる並進時間は、空ベクターを発現させ反応液にそれぞれのプローブを加えたものの測定値を用いた。【０２１８】
（５）木繊維形成遺伝子プロモーターと転写因子との相互作用（結合）
２種の転写因子と４種のプロモーターの相互作用解析結果を図５に示す。コントロール実験の結果から、少なくとも２０％以上の並進時間の延長がある場合に、相互作用（結合）があると結論できる。解析結果より、MYBではCesAプロモーターの２ヶ所（配列番号：１８１と３４１の２本鎖DNA、１９９と３５９の２本鎖DNA）、CADプロモーターの１ヶ所（配列番号：２４６と４０６）、OMTプロモーターの１ヶ所（配列番号：２７４と４３４）、C4Hプロモーターの２ヶ所（配列番号：２９６と４５６、３２６と４８６）に結合することが示された。HD-ZIPでは、CesAプロモーターの８ヶ所（配列番号：１７６と３３６、１８４と３４４、１８７と３４７、１８９と３４９、１９１と３５１、１９３と３５３、１９４と３５４、１９６と３５６）、CADプロモーターの４ヶ所（配列番号：２１６と３７６、２１７と３７７、２２０と３８０、２２３と３８３）、OMTプロモーターの５ヶ所（配列番号：２５８と４１８、２６４と４２４、２７５と４３５、２７６と４３６、２８１と４４１）、C4Hプロモーターの７ヶ所（配列番号：３０１と４６１、３０７と４６７、３１３と４７３、３１５と４７５、３１８と４７８、３１９と４７９、３２９と４８９）に結合することが示された。
以上の結果から、本発明の木繊維形成に関わる転写因子群は、木繊維細胞壁形成に関わる遺伝子群の発現を制御していることが示された。【０２１９】
（実施例１０）転写因子を用いた材質の改変
木繊維細胞壁形成遺伝子群の発現を制御する配列番号：１０１〜１１１（配列番号：１１２〜１２２）に記載の転写因子による材質改変効果を確認するため、形質転換タバコの作出を行った。タバコは草本に分類されるが、基本的な組織構造は樹木と非常に似ており、樹木の遺伝子解析や導入効果の検証などに一般的に用いられている（Gray-Mitsumune et al., Plant Mol. Biol. 1999, 39:657-669、Patzlaff et al., 2003, Plant Journal 36: 743-754）。本実施例では、例として配列番号：１０６のMYB転写因子遺伝子と配列番号：１０８のホメオドメイン(HD-ZIP)転写因子遺伝子について、形質転換体の材質改変結果を示す。【０２２０】
（１）材質改変形質転換タバコの作出
導入用コンストラクト構築のため、配列番号：１６９〜１７２に記載のプライマーにて、それぞれのcDNA（配列番号：１０６、１０８）を鋳型にＰＣＲした。増幅された断片の末端をリン酸化・平滑末端化し、予め制限酵素にてGUS遺伝子部分を除き平滑末端化したpBI121ベクター (Bevan, M., Nucleic Acids Res. 12, 8711-8721, 1984)の、35Sプロモーター下流にライゲーションし、導入用コンストラクトとした。これらのコンストラクトを、アグロバクテリウム（LBA4404株）へエレクトロポレーションにより導入し、LB寒天培地（カナマイシン、ハイグロマイシン 各25μg/ml、1.0％Agar）で形質転換体を選抜した。形質転換したアグロバクテリウムのプレートからシングルコロニーを取り、それぞれ抗生物質（カナマイシン、ハイグロマイシン 各25μg/m）を含むＬＢ液体培地中で一晩培養した（28.5℃, 240rpm）。培養後、アグロバクテリウム培養液を遠心（5℃ 8000rpm 5min）して集菌し、上清を除きMS液体培地を加え、穏やかに沈殿を懸濁した。懸濁液を50mlチューブに集め、懸濁液のOD550が0.5となるようにMS液体培地で希釈した。この懸濁液を感染操作に用いた。【０２２１】
感染用の試料としては、生育用培地（MS 3%Sucrose N7B5* 1%Agar pH5.6）にて無菌で育てたタバコの若い葉を用いた。滅菌水を入れたシャーレ内に葉を置き、メスで葉の周囲と主葉脈を除き、残りの部分を約7mm角に切った。それらの切片を滅菌キムタオルにはさんで軽く脱水し、葉の裏面を上にして前培養培地（MS, 3%Sucrose, NAA 10-7mM,  BA = 10-5mM, 1%Agar, pH5.6 ）に並べ、25℃にて一晩前培養した。【０２２２】
前培養した葉の切片をアグロの懸濁液に浸し、20分間軽く振とう培養した後、切片を滅菌キムタオルではさんで軽く水分を除き、葉の裏面を上にして共存培地に並べ、暗黒下25℃で2〜3日共存培養した。共存培養した切片をピンセットで選択培地に移し、明所25℃で培養した。培養開始以降、2週間ごとに新しい選択培地に移植し、シュートが再分化してきたらホルモンフリーの発根培地（1/2MS 1.5%Sucrose 1%Agar pH5.6 Clf200μg/ml Hyg30μg/ml）に移植し、形質転換体の選抜を行った。【０２２３】
（２）材質改変形質転換タバコの解析
配列番号：１０６のMYB転写因子遺伝子と配列番号：１０８のホメオドメイン(HD-ZIP)転写因子遺伝子を過剰発現した形質転換タバコ植物体を図６に示す。形質転換体の材質分析として、リグニン含量と繊維長の測定を行った。リグニンの定量（酸可溶性・不溶性リグニンの総量）はKlason法（木材化学実験書II.化学編 P150-155、Patzlaff et al., 2003, Plant Journal）で、繊維長の測定はJefrey法（Han et al., 1999, Kenaf Properties, Processing and Products. P149-167）で行った。その結果、MYB転写因子導入個体では、リグニンの絶乾重量あたりの割合が平均14.7±1.8%（５個体平均）でコントロール（野生株）の19.3±1.1%と比べ減少していた。また、繊維長はコントロールの560.6±50.9umであるのに対し、MYB導入個体では620.3±42.1umと長くなっていた。絶乾重量に対するリグニン割合の低下は、相対的にセルロース割合の増加を示す。従って、MYB転写因子を過剰発現することにより、セルロースが多く長い繊維長の材質に改変することができた。このことは、RNAi等の技術を用いて、本転写因子の発現を抑制すれば、逆の材質（セルロースが少なく短い繊維長）に改変できることも示された。【０２２４】
一方、HD-ZIP転写因子導入個体では、リグニンの割合が平均23.1±2.5%（５個体平均）で増加していたが、繊維長は534.6±34.3umで短くなっていた。このように、HD-ZIP転写因子を過剰発現することにより、セルロースが少なく短い繊維長の材質に改変できた。同時に、本転写因子の発現を抑制すれば、逆の材質（セルロースが多く長い繊維長）に改変できることも示された。
以上の結果から、本願で示された転写因子による植物の材質改変効果が示された。【０２２５】
（実施例１１）木繊維細胞壁形成遺伝子群を用いた植物樹幹木部の生長状態と種の検査
（１）ユーカリ樹幹の地上高による材質の変動（垂直変動）
木繊維性質の主要要素である細胞壁成分・導管分布密度・繊維長等については、広葉樹・針葉樹を問わず、地上高により変動する組織形成を行うことが知られている。この地上高による木繊維性質の変動現象については、古くから樹幹内の材質の垂直変動として知られる。各地上高（基部・中央部・樹冠部）を相互比較すると、中央部（胸高部以上〜樹冠部未満）では細胞壁成分については、セルロースが増大し、リグニン、ヘミセルロースが減少する。また、形態的観察では、導管分布密度が少なく、繊維長は約２０％の増加が認められる。さらに、細胞壁の厚さは、樹冠部から基部に向かって増加していく。詳細は不明であるが、各地上高の木繊維形成組織の成熟度合いにより、形成される木繊維性質の差が発生しているものと考えられている（島地謙・須藤彰司・原田浩著「木材の組織」、古野毅・澤辺攻著「木材科学講座2・組織と材質」）。【０２２６】
本発明者らは、一般的に言われている材質の垂直変動を確認するため、ユーカリ属カマルドレンシス種の５年生クローン系統（CPT1）を材料に、以下に示す実施例のように材質分析を行った。一般的に、5年生のカマルドレンシスは、樹幹基部では低生長で未熟な木繊維（未熟材：短繊維、直径は細く、細胞壁は薄く、フィブリル傾角は急で、低木繊維率と低比重）を形成すること、中央部では高生長で成熟した木繊維（成熟材：長繊維、直径は太く、細胞壁は厚く、フィブリル傾角は緩く、高木繊維率と高比重）を形成することが知られている。この特徴は、伐採される５〜１０年生のカマルドレンシスに共通している。【０２２７】
５年生の植物体の基部（地上高１ｍ未満）と中央部（地上高約５ｍ）の樹幹を用いた。それぞれの樹幹から樹皮を除き、厚さ２５ｍｍのディスクに切り分け十分に乾燥させた後、粉砕してチップにしチップミキサーで３分間よく混合し分析に用いた。パルプ精製と材質分析の方法は、基本的に紙パルプ技術協会発行［紙パルプ製造技術シリーズ］第１巻「クラフトパルプ」、第３巻「パルプの洗浄・精選・漂白」、第９巻「紙パルプの試験法」に記載されている常法に従った。蒸解は、13.2%のNa2Sにて１７０℃で９０分間行い、カッパー価１８を基準としてパルプデータを補正した。【０２２８】
前述の方法によって得られた材質分析の結果、５年生ユーカリ植物体の基部では、容積重が432kg/m2、パルプ収率が43.8％、繊維長が0.66mmであった。一方、中央部では容積重が525kg/m2、パルプ収率が53.4％、繊維長が0.86mmであった。これらの結果から、一般的に言われている垂直変動が、本実施例のサンプルでも確認された。また、材質としては高容積重・高パルプ収率で長い繊維を持つ中央部の方が優れていることも確認された。【０２２９】
（２）地上高による発現プロファイル差に基づいた材質の検査（発現プロファイルの比較）
実施例３によって示された３４遺伝子と実施例６によって示された１１遺伝子の、地上高の違いによる発現プロフィール分類表に従い、被検サンプルの材質検査を行った。被検サンプルとしては、２個体（Ｓ１、２）の７年生ユーカリカマルドレンシスの樹幹中央部を用いた。RNAの抽出、マイクロアレイ実験は実施例１〜３に、材質分析は前述の方法に従った。得られた各サンプルの発現プロフィールを表２の分類群と比較し、基部側のプロフィールに似ているのか中央部側のに似ているのかを調べることで、被検サンプルの材質が未熟材に近い（質が劣る）のか、成熟材に近い（質が優れている）のかが判別できる。被検サンプル部位は、樹幹基部でも中央部でもそれ以外のどこでも良い。樹幹中央部を使った場合、その部分が個体内で最も優れた材質を持っていると一般的に予想されるので、判別された材質はその個体内の最良の材質であると言える。樹幹基部の場合は、その逆である。【０２３０】
（３）サンプル１（Ｓ１）の検査（木部 vs 師部のプロフィール）
表２と６で逆相関、cam5特異的に分類された１２遺伝子の、Ｓ１での発現プロフィールは以下のようであった。
逆相関を示す１遺伝子のプロフィール：基部的なプロフィール（X>P）を示した。
cam5（中央部）特異的にX>Pを示す１１遺伝子：基部的なプロフィール（X=P）の遺伝子９個、中央部的なプロフィール（X>P）の遺伝子は２個であった。【０２３１】
総合すると、基部的なプロフィールの遺伝子の総数は全体の83.3%にあたる１１個で、中央部的なプロフィールの遺伝子の総数は、16.7%にあたる２個であった。以上の結果から、Ｓ１のプロフィールは基部に非常に近いがやや中央部的であることがわかった。したがって、Ｓ１の材質はcam1（基部）よりも少し優れていると判別される。【０２３２】
（４）サンプル２（Ｓ２）の検査（木部 vs 師部のプロフィール）
表２と６で逆相関、cam5特異的に分類された１２遺伝子の、Ｓ２での発現プロフィールは以下のようであった。
逆相関を示す１遺伝子のプロフィール：基部的なプロフィール（X>P）を示した。
cam5（中央部）特異的にX>Pを示す１１遺伝子：基部的なプロフィール（X=P）の遺伝子６個、中央部的なプロフィール（X>P）の遺伝子は５個であった。【０２３３】
総合すると、基部的なプロフィールの遺伝子の総数は、全体の58.3%にあたる７個で、中央部的なプロフィールの遺伝子の総数は、41.7%のあたる５個であった。この結果から、Ｓ２のプロフィールは基部的ではあるがかなり中央部的な要素が含まれていることがわかった。したがって、Ｓ２の材質はcam1（基部）とcam5（中央部）のほぼ中間程度と判別される。【０２３４】
（５）サンプル１と２の相対比較（木部 vs 木部のプロフィール）
Ｓ１とＳ２の材質を相対比較するため、Ｓ１とＳ２の木部間でマイクロアレイ実験を行った。その結果、表２と６で木部間で差があった２２遺伝子(2+18+2)の発現プロフィールは、以下のようであった。
X>P でかつ1>5である２遺伝子のプロフィール：cam1（材質が悪い方）で発現が強い本グループの遺伝子は、２遺伝子ともS1>S2でＳ１の方が強発現であった。
X>P でかつ1<5である２０遺伝子：cam5（材質が良い方）で発現が強い本グループでは、S1>S2の遺伝子が１個、S1=S2の遺伝子は５個、S1<S2の遺伝子は１４個で、S2で多く発現していた。【０２３５】
全体としてcam1（材質が悪い方）で発現が強い遺伝子群はＳ１で、cam5（材質が良い方）で発現が強い遺伝子群はＳ２で多く発現していたことから、Ｓ２の方がＳ１よりも優れた材質を持っていると判別される。（３）（４）の検査では、Ｓ１に比べより中央部に近いと判断されたＳ２が材質的に優れているという結果であった。木部同士の直接比較の結果も、それを支持する結果であった。【０２３６】
（６）被検サンプルの材質分析
Ｓ１とＳ２の材質を、実施例１１（１）に記載の方法で分析した。その結果、容積重がＳ１で449kg/m2、Ｓ２で488kg/m2、パルプ収率がＳ１で45.7％、Ｓ２で50.1％、繊維長がＳ１で0.69mm、Ｓ２で0.75mmであった。したがって、材質は前述の検査結果に基づく予想通り、Ｓ１は基部に近い材質であり、Ｓ２は基部的ではあるがやや中央部的な材質であった。また、両方を比較すると、予想通りＳ２の方が相対的に優れていた。このように、本願で示された発現プロフィールに基づく比較により、生きたまま被検サンプルの材質を判別することができる。【０２３７】
（７）ユーカリ樹幹の種による材質の変動（樹種間変動）
木繊維性質の主要要素である細胞壁成分・導管分布密度・繊維長等については、広葉樹・針葉樹を問わず、種により変動する組織形成を行うことが知られている（島地謙・須藤彰司・原田浩著「木材の組織」、古野毅・澤辺攻著「木材科学講座2・組織と材質」）。この種による木繊維性質の変動現象については、古くから材質の樹種間変動として知られる。【０２３８】
例えば、ユーカリ属・カマルドレンシス種とグロブルス種を比較すると、一般的に、グロブルス種の方が、セルロースが増大し、リグニン、ヘミセルロースが減少する。また、形態的観察では、導管分布密度が少なく、繊維長は増加が認められる。さらに、細胞壁は厚い。詳細は不明であるが、種によって木繊維形成組織の性質が異なり、形成される木繊維性質の差が発生しているものと考えられている。【０２３９】
本発明者らは、一般的に言われている材質の樹種間変動を確認するため、５年生のユーカリ属カマルドレンシス種クローン系統（CPT1）とグロブルス種クローン系統（GAL1）を材料に、実施例２に示す方法で材質分析を行った。一般的に、５年生のカマルドレンシスの樹幹では、グロブルスに比べ劣った木繊維（低品質パルプ：短繊維、直径は細く、細胞壁は薄く、フィブリル傾角は急で、低木繊維率と低比重）を形成すること、5年生のグロブルスの樹幹では、優れたパルプ（長繊維、直径は太く、細胞壁は厚く、フィブリル傾角は緩く、高木繊維率と高比重）を形成することが知られている。この特徴は、伐採される５〜１０年生のカマルドレンシスおよびグロブルスも同じである。【０２４０】
本発明においては、前述の５年生のユーカリ属カマルドレンシスの樹幹基部とユーカリ属グロブルスの樹幹基部（共に地上高１ｍ未満）を用い、前述に記載のクラフトパルプ精製の定法に従った。材質分析の結果、５年生カマルドレンシス植物体の基部では、容積重が432kg/m2、パルプ収率が43.8％、繊維長が0.66mmであった。一方、グロブルスの樹幹基部では容積重が574kg/m2、パルプ収率が57.1％、繊維長が0.95mmであった。これらの結果から、一般的に言われている樹種間変動が、本実施例のサンプルでも確認された。また、材質としては高容積重で長い繊維を持つグロブルス樹幹基部の方が優れていることも確認された。【０２４１】
（８）種間での発現プロファイル差に基づいた材質の検査（発現プロファイルの比較）
実施例３によって示された３４遺伝子と実施例６によって示された１１遺伝子の、種の違いによる発現プロフィール分類表に従い、被検サンプルの材質検査を行った。被検サンプルとしては、７年生ユーカリカマルドレンシス（Ｃ１：実施例１１（３）のＳ１と同じ）と７年生ユーカリグロブルス（Ｇ１）を各１個体用いた。RNAの抽出、マイクロアレイ実験は実施例１〜３に、材質分析は実施例１１（１）の方法に従った。得られた各サンプルの発現プロフィールを表３と７の分類群と比較し、カマルドレンシスのプロフィールに似ているのか、グロブルスのそれに似ているのかを調べることで、被検サンプルの種と材質（カマルドレンシス的かグロブルス的か）が判別できる。被検サンプル部位は、樹幹基部でも中央部でもそれ以外のどこでも良い。【０２４２】
（９）カマルドレンシスサンプル（Ｃ１）の検査（木部 vs 師部のプロフィール）
表３と７で逆相関、cam特異的に分類された２３遺伝子のＣ１での発現プロフィールは以下のようであった。
逆相関を示す９遺伝子のプロフィール：カマルドレンシス的なプロフィール（X>P）を示す遺伝子は８個、グロブルス的なプロフィール（X<P）を示す遺伝子は１個であった。
カマルドレンシス特異的にX>Pを示す１４遺伝子：カマルドレンシス的（X>P）な遺伝子は１２個、グロブルス的（X=P）な遺伝子は２個であった。【０２４３】
総合すると、カマルドレンシス的なプロフィールの遺伝子の総数は、全体の約87.0%にあたる２０個で、グロブルス的なプロフィールの遺伝子の総数は、13.0%のあたる３個であった。この結果から、Ｃ１のプロフィールはカマルドレンシス的ではあるが、若干グロブルス的な要素も多く含むことがわかった。したがって、Ｃ１の種は確かにカマルドレンシスであるが、材質は一般的なカマルドレンシスよりもややグロブルス的（良質）であると判別される。【０２４４】
（１０）グロブルスサンプル（Ｇ１）の検査（木部 vs 師部のプロフィール）
表３と７で逆相関、cam特異的に分類された２３遺伝子のＧ１での発現プロフィールは以下のようであった。
逆相関を示す９遺伝子のプロフィール：カマルドレンシス的なプロフィール（X>P）を示す遺伝子は１個、グロブルス的なプロフィール（X<P）を示す遺伝子は８個であった。
カマルドレンシス特異的にX>Pを示す１４遺伝子：カマルドレンシス的（X>P）な遺伝子は４個、グロブルス的（X=P）な遺伝子は１０個であった。【０２４５】
総合すると、カマルドレンシス的なプロフィールの遺伝子の総数は、全体の21.7%にあたる５個で、グロブルス的なプロフィールの遺伝子の総数は、78.3%のあたる１８個であった。この結果から、Ｇ１のプロフィールはグロブルス的であることがわかった。したがって、Ｇ１の種は確かにグロブルスであるが、材質は一般的なグロブルスよりもカマルドレンシス的（低質）であると判別される。【０２４６】
（１１）Ｃ１とＧ１の相対比較（木部 vs 木部のプロフィール）
Ｃ１とＧ１の木部のプロフィールを直接比較するため、Ｃ１とＧ１の木部間でマイクロアレイ実験を行った。その結果、表３と７で木部間で差があった６遺伝子(4+1+1)の発現プロフィールは、以下のようであった。
X>P でかつcam>gloである４遺伝子：C1>G1の遺伝子は5個、C1=G1の遺伝子は1個、C1<G1の遺伝子は2個で、カマルドレンシスで発現が強い本グループの遺伝子は、Ｃ１で多く発現していた。
X>P でかつcam<gloである２遺伝子：グロブルスで発現が強い本グループの遺伝子は、２遺伝子ともC1<G1の遺伝子で、Ｇ１で多く発現していた。【０２４７】
全体としてカマルドレンシスで発現が強い遺伝子群はＣ１で、グロブルスで発現が強い遺伝子群はＧ１で多く発現していたことから、木部同士の直接比較の結果も、（９）（１０）の検査と同様に、Ｃ１はカマルドレンシスで、Ｇ１がグロブルスであると判別された。したがって、材質もグロブルスであるＧ１が優れていると推定できる。【０２４８】
（１２）材質の分析
Ｃ１とＧ１の材質を、実施例１１（１）に記載の方法で分析した。その結果、容積重がＣ１で449kg/m2、Ｇ１で534kg/m2、パルプ収率がＣ１で45.7％、Ｇ１で53.6％、繊維長がＣ１で0.69mm、Ｇ１で0.86mmであった。したがって、材質は前述の検査結果に基づく予想通り、Ｃ１がカマルドレンシス的な材質であり、Ｇ１はグロブルス的な材質であった。また、両方を比較すると、予想通りＧ１の方が相対的に優れていた。このように、本願で示された発現プロフィールに基づく比較により、生きたまま被検サンプルの種と材質を判別することができる。【０２４９】
本発明者らは、作製したユーカリESTデータベースを用いて、マイクロアレイ解析によるユーカリ木繊維形成組織において細胞壁合成に関与する遺伝子群の抽出と、それらの地上高・種の違いによる発現変動を調べた。その結果、ユーカリ木繊維形成組織で発現している細胞壁合成遺伝子群を特定し、地上高・種の違いで優位に発現が変動する遺伝子群を同定した。さらに、それらのプロモーターDNAを取得し、木部発現用プロモーターとして機能することを確認した。上記遺伝子群と発現情報・プロモーターDNAは、木繊維形成組織の細胞壁合成および形態形成の制御に利用できる。【０２５０】
また、本発明者らは、作製したユーカリESTデータベースを用いて、マイクロアレイ解析による木繊維形成に関わる転写因子群の抽出と、それらの地上高・種の違いによる発現変動を調べた。その結果、ユーカリ木繊維形成に関わる転写因子群を特定し、地上高・種の違いで優位に発現が変動する遺伝子群を同定しそれらのプロモーターDNAを取得した。さらに、それらの転写因子を導入することで、植物の材質の改変できることを示した。上記遺伝子セットと発現情報・プロモーターDNAは、木繊維形成（材質）の制御に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０２５１】
【図１】ユーカリ属カマルドレンシス種の５年生樹幹基部の遺伝子発現強度を示す図である。樹幹基部の師部側、および木部側より抽出した2種のmRNAを鋳型に合成した各cRNAを、各々2種の蛍光色素（cy3.cy5）により標識し、オリゴマイクロアレイ解析におけるプローブとして用い、ハイブリダイゼーションを行った。スキャンして得られた画像から蛍光強度を算出し、ロゼッタ社製の解析ソフトウェア(Luminator Ver. 1.0)にて解析し、反復実験全てを統計的信頼度99.999%にて統合し、ユーカリ樹幹基部における主要遺伝子群の発現相対強度を表した。図中2本の検量線のうち上の線付近またはその上の領域にある+（黒）は木繊維形成部位で発現上昇が有意に認められるもの、2本の検量線のほぼ中間にある＋（薄いグレー）は発現減少が有意に認められるもの、2本の検量線のうち下の線付近またはその下の領域にある＋（濃いグレー）は発現に変化が認められないものを示す。
【図２】ユーカリ属カマルドレンシス種の５年生樹幹中央部の遺伝子発現強度を示す図である。樹幹中央部の師部側、および木部側より抽出した2種のmRNAを鋳型に合成した各cRNAを、各々2種の蛍光色素（cy3.cy5）により標識し、オリゴマイクロアレイ解析におけるプローブとして用い、ハイブリダイゼーションを行った。スキャンして得られた画像から蛍光強度を算出し、ロゼッタ社製の解析ソフトウェア(Luminator Ver. 1.0)にて解析し、反復実験全てを統計的信頼度99.999%にて統合し、ユーカリ樹幹中央部における主要遺伝子群の発現相対強度を表した。図中2本の検量線のうち上の線付近またはその上の領域にある+（黒）は木繊維形成部位で発現上昇が有意に認められるもの、2本の検量線のほぼ中間にある＋（薄いグレー）は発現減少が有意に認められるもの、2本の検量線のうち下の線付近またはその下の領域にある＋（濃いグレー）は発現に変化が認められないものを示す。
【図３】ユーカリ属グロブルス種樹幹の遺伝子発現強度を示す図である。樹幹の師部側、および木部側より抽出した2種のmRNAを鋳型に合成した各cRNAを、各々2種の蛍光色素（cy3.cy5）により標識し、オリゴマイクロアレイ解析におけるプローブとして用い、ハイブリダイゼーションを行った。スキャンして得られた画像から蛍光強度を算出し、ロゼッタ社製の解析ソフトウェア(Luminator Ver. 1.0)にて解析し、反復実験全てを統計的信頼度99.999%にて統合し、グロブルス種樹幹における主要遺伝子群の発現相対強度を表した。図中2本の検量線のうち上の線付近またはその上の領域にある+（黒）は木繊維形成部位で発現上昇が有意に認められるもの、2本の検量線のほぼ中間にある＋（薄いグレー）は発現減少が有意に認められるもの、2本の検量線のうち下の線付近またはその下の領域にある＋（濃いグレー）は発現に変化が認められないものを示す。
【図４】木繊維形成に関わる遺伝子群のプロモーター活性を示す図である。Aは、パーティクルガン導入用ターゲットとなる木部形成組織ブロックを切除した樹幹を示す。Bは、パーティクルガンによる遺伝子導入後に、組織化学的GUSアッセイした木部形成組織ブロックを示す。CとDは、GUS遺伝子が発現した青いスポット部分（○で囲った中心部分）の拡大写真である。
【図５−ａ】木繊維形成に関わる細胞壁形成遺伝子群のプロモーターと転写因子群の相互作用（結合）を示す図である。各グラフは、MYB転写因子と４種のプロモーターとの解析結果を示す。各グラフの横軸は２本鎖DNAプローブの番号を、縦軸はコントロール（プローブと空ベクター反応液）に対する並進時間の伸び率を％で表している。各グラフ横軸のプローブ No.の小さい方がプロモーター５’側上流域であり、大きい方が転写開始点に近いプロモーター３’側下流域である。※印は相互作用が認められたプローブを表している。
【図５−ｂ】木繊維形成に関わる細胞壁形成遺伝子群のプロモーターと転写因子群の相互作用（結合）を示す図である。各グラフは、HD-ZIP転写因子と４種のプロモーターとの解析結果を示す。各グラフの横軸は２本鎖DNAプローブの番号を、縦軸はコントロール（プローブと空ベクター反応液）に対する並進時間の伸び率を％で表している。各グラフ横軸のプローブ No.の小さい方がプロモーター５’側上流域であり、大きい方が転写開始点に近いプロモーター３’側下流域である。※印は相互作用が認められたプローブを表している。
【図６】転写因子を導入した形質転換タバコ植物体を示す図である。AはMYB転写因子を導入した形質転換体で、Ｂはホメオドメイン転写因子を導入した形質転換体である。
【図５−ａ】
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【図５−ｂ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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