(57)【要約】  ｉｎ  ｖｉｔｒｏで多能性または多分化能細胞を培養するための方法であって、多能性または多分化能細胞を複数のマイクロキャリアーに付着させて、マイクロキャリアー−細胞複合体を形成し、そしてＲＯＣＫ阻害剤の存在下で、懸濁培養中、マイクロキャリアー−細胞複合体を培養する工程を含む、前記方法を開示する。【選択図】図１
2012520672.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで多能性または多分化能細胞を培養する方法であって：
（ｉ）多能性または多分化能細胞を複数のマイクロキャリアーに付着させて、マイクロキャリアー−細胞複合体を形成し、そして
（ｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で、懸濁培養中、マイクロキャリアー−細胞複合体を培養する
工程を含む、前記方法。
【請求項２】
ＲＯＣＫ阻害剤が：Ｙ−２７６３２、ＨＡ−１０７７（ファスジル）、ＨＡ−１１００（ヒドロキシファスジル）、Ｈ−１１５２、３−（４−ピリジル）−１Ｈ−インドール、Ｎ−（４−ピリジル）−Ｎ’−（２，４，６−トリクロロフェニル）尿素、アウロチオグルコース、ＬＹ２９４００２あるいはその塩、塩基、エステルまたはプロドラッグより選択される、請求項１の方法。
【請求項３】
方法が（ｉｉ）由来の培養細胞を継代する工程をさらに含み、継代後の細胞が多能性または多分化能である、請求項１または２の方法。
【請求項４】
方法がさらに：
（ｉｉｉ）（ｉｉ）由来の培養細胞を継代し；そして
（ｉｖ）少なくとも２回の継代に渡って、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を反復する
工程を含み、
工程（ｉｖ）後の培養中の細胞が多能性または多分化能である、請求項１または２の方法。
【請求項５】
マイクロキャリアーがマトリックスコーティングを持たない、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
マイクロキャリアー表面が、マトリックスでコーティングされている、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
マトリックスが細胞外マトリックス構成要素を含む、請求項６の方法。
【請求項８】
マトリックスが、ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒアルロン酸、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、エラスチン、ヘパラン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸の１またはそれより多くを含む、請求項６の方法。
【請求項９】
マトリックスが、ラミニン、コラーゲンＩ、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン１の混合物を含む、請求項６の方法。
【請求項１０】
細胞が幹細胞である、請求項１〜９のいずれか一項の方法。
【請求項１１】
細胞が胚性幹細胞である、請求項１〜９のいずれか一項の方法。
【請求項１２】
細胞が人工多能性幹細胞である、請求項１〜９のいずれか一項の方法。
【請求項１３】
細胞が成体幹細胞である、請求項１〜９のいずれか一項の方法。
【請求項１４】
細胞が哺乳動物、霊長類またはヒトのものである、請求項１〜１３のいずれか一項の方法。
【請求項１５】
工程（ｉｖ）において、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を：少なくとも３回の継代、少なくとも４回の継代、少なくとも５回の継代、少なくとも６回の継代、少なくとも７回の継代、少なくとも８回の継代、少なくとも９回の継代、少なくとも１０回の継代、少なくとも１１回の継代、少なくとも１２回の継代、少なくとも１３回の継代、少なくとも１４回の継代、少なくとも１５回の継代、少なくとも１６回の継代、少なくとも１７回の継代、少なくとも１８回の継代、少なくとも１９回の継代、少なくとも２０回の継代、少なくとも２１回の継代、少なくとも２２回の継代、少なくとも２３回の継代、少なくとも２４回の継代、少なくとも２５回の継代、少なくとも３０回の継代、少なくとも４０回の継代、少なくとも５０回の継代、少なくとも６０回の継代、少なくとも７０回の継代、少なくとも８０回の継代、少なくとも９０回の継代、少なくとも１００回の継代、の１つに渡って反復する、請求項４〜１４のいずれか一項の方法。
【請求項１６】
マイクロキャリアーが、セルロース、デキストラン、ヒドロキシル化メタクリレート、コラーゲン、ゼラチン、ポリスチレン、プラスチック、ガラス、セラミック、シリコーンの１またはそれより多くを含むかまたはこれらからなる、請求項１〜１５のいずれか一項の方法。
【請求項１７】
マイクロキャリアーがマクロ多孔性またはミクロ多孔性カルボシード（carboseed）マイクロキャリアーである、請求項１〜１５のいずれか一項の方法。
【請求項１８】
マイクロキャリアーをプロタミンまたはポリリジンとカップリングさせる、請求項１〜１７のいずれか一項の方法。
【請求項１９】
マイクロキャリアーが正に荷電している、請求項１〜１８のいずれか一項の方法。
【請求項２０】
マイクロキャリアーが正の表面電荷を有する、請求項１〜１９のいずれか一項の方法。
【請求項２１】
マイクロキャリアーが親水性である、請求項１〜２０のいずれか一項の方法。
【請求項２２】
マイクロキャリアーが棒の形状である、請求項１〜２１のいずれか一項の方法。
【請求項２３】
マイクロキャリアーが実質的に球形である、請求項１〜２１のいずれか一項の方法。
【請求項２４】
工程（ｉｉ）において、培養中の細胞数が拡大するために十分な期間、細胞を培養する、請求項１〜２４のいずれか一項の方法。
【請求項２５】
工程（ｉｖ）後、培養中の細胞の少なくとも６０％が多能性または多分化能である、請求項４〜２４のいずれか一項の方法。
【請求項２６】
工程（ｉｖ）後、培養中の細胞の少なくとも６０％が、Ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０およびＭａｂ８４の１つ、２つ、３つまたはすべてを発現する、請求項４〜２５のいずれか一項の方法。
【請求項２７】
血清不含培地、または幹細胞馴化培地、またはフィーダー細胞不含条件中で細胞を培養する工程を含む、請求項１〜２６のいずれか一項の方法。
【請求項２８】
フィーダー細胞もまた、マイクロキャリアーに付着している、請求項１〜２７のいずれか一項の方法。
【請求項２９】
培養が、多能性または多分化能細胞が付着しているマイクロキャリアーとは異なるマイクロキャリアーに付着しているフィーダー細胞をさらに含む、請求項１〜２７のいずれか一項の方法。
【請求項３０】
培養から得られる多能性または多分化能細胞の分化を誘導する工程をさらに含む、請求項１〜２９のいずれか一項の方法。
【請求項３１】
マイクロキャリアー−細胞複合体を、細胞分化を誘導する条件下に置く工程を含む、請求項３０の方法。
【請求項３２】
培養法から得られた多能性または多分化能細胞をマイクロキャリアーから分離し、そして分離した細胞を、細胞分化を誘導する条件下、非マイクロキャリアー培養中で培養する工程を含む、請求項１〜３０のいずれか一項の方法。
【請求項３３】
培養法から得られた多能性または多分化能細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化をさらに含み：
（ａ）培養法から得られた多能性または多分化能細胞を複数の第二のマイクロキャリアーに付着させて、マイクロキャリアー−細胞複合体を形成し、
（ｂ）（ａ）由来のマイクロキャリアー−細胞複合体を、細胞分化を誘導する条件下、懸濁培養中で培養する
工程を含む、請求項１〜２９のいずれか一項の方法。
【請求項３４】
さらに：
（ｃ）工程（ｂ）から得られた分化した細胞を複数の第三のマイクロキャリアーに付着させて、マイクロキャリアー−細胞複合体を形成し；そして
（ｂ）（ｃ）由来のマイクロキャリアー−細胞複合体を、すでに分化している細胞のさらなる分化を誘導する条件下、懸濁培養中で培養する
工程を含む、請求項３３の方法。
【請求項３５】
分化のための培養条件が、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で、細胞を培養する工程を含む、請求項３０〜３４のいずれか一項の方法。
【請求項３６】
分化のための培養条件が、ＲＯＣＫ阻害剤の非存在下で、細胞を培養する工程を含む、請求項３０〜３４のいずれか一項の方法。
【請求項３７】
請求項１〜２９のいずれか一項の方法によって得られる多能性または多分化能細胞（単数または複数）。
【請求項３８】
請求項３０〜３６のいずれか一項の方法によって得られる分化した細胞（単数または複数）。
【請求項３９】
分化した細胞を培養して胚様体を形成する、請求項３０〜３６のいずれか一項の方法。
【請求項４０】
請求項３９の方法によって得られる胚様体。
【請求項４１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで多能性または多分化能細胞を分化させる方法であって、多能性または多分化能細胞を複数のマイクロキャリアーに付着させて、マイクロキャリアー−細胞複合体を形成し、ここでマイクロキャリアー表面はコーティングされていないか、またはマトリックスコーティングされ、そしてＲＯＣＫ阻害剤の存在下、および細胞分化を誘導する条件下、懸濁培養中でマイクロキャリアー−細胞複合体を培養する工程を含む、前記方法。
【請求項４２】
細胞を複数のマイクロキャリアーに付着させ、それによってマイクロキャリアー−細胞複合体を形成し、そして懸濁培地がＲＯＣＫ阻害剤を含有する、多能性または多分化能細胞の懸濁培養物。
【請求項４３】
ＲＯＣＫ阻害剤が少なくとも１μＭの濃度で培地中に存在する、請求項４２の懸濁培養。
【請求項４４】
ＲＯＣＫ阻害剤が少なくとも１０μＭの濃度で培地中に存在する、請求項４２の懸濁培養。
【請求項４５】
ＲＯＣＫ阻害剤が：  Ｙ−２７６３２、ＨＡ−１０７７（ファスジル）、ＨＡ−１１００（ヒドロキシファスジル）、Ｈ−１１５２、３−（４−ピリジル）−１Ｈ−インドール、Ｎ−（４−ピリジル）−Ｎ’−（２，４，６−トリクロロフェニル）尿素、アウロチオグルコース、ＬＹ２９４００２あるいはその塩、塩基、エステルまたはプロドラッグより選択される、請求項４２〜４４のいずれか一項の懸濁培養。
【請求項４６】
細胞がマイクロキャリアー−細胞複合体の形である、多能性または多分化能細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ懸濁培養中のＲＯＣＫ阻害剤の使用。
【請求項４７】
細胞がマイクロキャリアー−細胞複合体の形である、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで懸濁培養中、多能性または多分化能細胞の分化におけるＲＯＣＫ阻害剤の使用。
【請求項４８】
ＲＯＣＫ阻害剤が：  Ｙ−２７６３２、ＨＡ−１０７７（ファスジル）、ＨＡ−１１００（ヒドロキシファスジル）、Ｈ−１１５２、３−（４−ピリジル）−１Ｈ−インドール、Ｎ−（４−ピリジル）−Ｎ’−（２，４，６−トリクロロフェニル）尿素、アウロチオグルコース、ＬＹ２９４００２あるいはその塩、塩基、エステルまたはプロドラッグより選択される、請求項４６または請求項４７の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下、マイクロキャリアー上の多能性および多分化能細胞の培養に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、分化した細胞とは異なり、分裂し、そして自己再生するかまたは表現型的にそして機能的に異なる娘細胞に分化するかいずれかの能力を有する（Keller, Genes Dev. 2005;19:1129-1155; WobusおよびBoheler, Physiol Rev. 2005;85:635-678; Wiles, Methods in Enzymology. 1993;225:900-918; Choiら, Methods Mol Med. 2005;105:359-368）。
【０００３】
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、多様な幹細胞タイプに分化する能力を持つ多能性細胞である。胚性幹細胞（ＥＳＣ）などの幹細胞が多能性であり、そして３つの胚葉すべての細胞に分化可能であることから、これらは多くの疾患および組織傷害のための再生療法に用いる細胞の理想的な供給源となっている（Keller, Genes Dev. 2005;19:1129-1155; WobusおよびBoheler, Physiol Rev. 2005;85:635-678）。
【０００４】
１回以上の継代を必要とする、幹細胞の多くの量への拡大は、細胞療法に必須である。
【０００５】
現在、コロニーとして増殖する幹細胞（ヒト胚性幹細胞、ｈＥＳＣを含む）は、ルーチンに、２次元（２Ｄ）増殖で、プラスチック培養表面上に維持される。２Ｄ培養上でより多くの量へと拡大するには、広い表面積の使用が必要となるであろう。これらの２Ｄコロニーをより小さいサイズに分散させるために、反復ピペッティングまたは酵素処理によって手動で細胞を継代するのは、現実的ではなくなるだろう。広い表面積に植え付けるため、多くのプレートを調製すると、取り扱いエラーが生じやすくなりうる。さらに、例えばＮｕｎｃトレーなどの非常に広い表面積が必要だろう。
【０００６】
したがって、コーティングされたプラスチック表面上の２Ｄコロニー培養として幹細胞を増殖させる現在の方法は、スケールアップには不向きであり、そして培養を行う実験条件は、一般的に、優れた制御には不向きである。先行技術には、懸濁培養中のマイクロキャリアー上などの、３次元（「３Ｄ」）環境において幹細胞を培養するいくつかの試みが含まれる。マイクロキャリアー上のマウス胚性幹細胞（Fernandesら, 2007; Abranchesら, 2007; KingおよびMiller, 2007）および肺葉体として懸濁培養中で分化しているｈＥＳＣ（Dangら, 2004; FokおよびZandstra, 2005; Cameronら, 2006）のいくつかの研究を除いて、懸濁培養中のｈＥＳＣを長期に連続培養する頑強な方法はない。
【０００７】
当該技術分野において、胚性幹細胞が懸濁培養中で「胚様体」として分化することが知られる。こうした胚様体は、すでに分化した細胞の塊を含む。例えば、Ｇｅｒｅｃｈｔ  Ｎｉｒら（２００４）は、胚様体を培養するための回転壁バイオリアクターの使用を記載した。胚様体培養はまた、Ｚａｎｄｓｔｒａら（２００３）、Ｄａｎｇら（２００４）およびＷａｒｔｅｎｂｅｒｇら（１９９８）によっても、攪拌系を用いて示された。胚様体懸濁培養はまた、ＤａｎｇおよびＺａｎｄｓｔｒａ（２００５）ならびにＫｉｎｇおよびＭｉｌｌｅｒ（２００７）によっても報告されてきている。こうした技術は、分化した幹細胞を含むこれらの組織様胚様体凝集体を培養するのに適しているが、未分化幹細胞には適していない。
【０００８】
ＦｏｋおよびＺａｎｄｓｔｒａ（２００５）は、未分化マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）増殖のための攪拌懸濁培養系を記載した。攪拌懸濁培養系は、マイクロキャリアーおよび凝集体培養を含んだ。ガラス・マイクロキャリアー上で培養されたマウス胚性幹細胞は、組織培養フラスコ対照に匹敵する集団倍加時間を有した。白血病阻害因子を除去すると、ｍＥＳＣ凝集体は、多系譜分化が可能な胚様体（ＥＢ）に発達した。マウスＥＳＣの懸濁培養はまた、ＫｉｎｇおよびＭｉｌｌｅｒ（２００５）にも記載された。しかし、ＫｉｎｇおよびＭｉｌｌｅｒ（２００５）は、「未分化ヒトＥＳＣ（ｈＥＳＣ）の拡大はｍＥＳＣよりも困難であり、そして攪拌培養中ではまだ報告されてきていない」と述べている。
【０００９】
ＵＳ２００７／０２６４７１３（Terstegge）は、マイクロキャリアー上でヒト胚性幹細胞を培養する試みを開示する。ヒト胚性幹細胞をＣｙｔｏｄｅｘ３（Amersham）マイクロキャリアーとともに、多様な体積の馴化培地を含むスピナーまたはバイオリアクター内に導入する。培養を２０〜３０ｒｐｍで３０分から１時間攪拌する。培養を１０日間〜６週間の間の多様な期間、維持する。しかし、幹細胞の大規模連続産生に本質的に必要である、培養の継代または継代培養が行われることは、決してなかった。幹細胞の大規模産生には、マイクロキャリアー上での連続継代および「優れた」（指数関数的な）増殖速度を伴う継代培養能の立証が本質的に必要である。Tersteggeらの研究ではこれは示されなかった。
【００１０】
ＷＯ２００８／００４９９０は、フィーダー細胞の非存在下で幹細胞を培養する試みを記載し、そしてマイクロキャリアーの使用を熟考する。これはＭａｔｒｉｇｅｌを用いない培養に関する。ＷＯ２００８／００４９９０は、幹細胞分化の阻害における正荷電表面の影響を記載する。
【００１１】
Ｐｈｉｌｌｉｐｓら，  ２００８（Journal of Biotechnology 138(2008)24-32）において、凝集体ならびに単細胞を植え付けることによって、マイクロキャリアー上でｈＥＳＣを培養する試みが報告されている。最初に、５日間に渡って３倍拡大が達成されたが、各連続継代に伴って、細胞拡大は減少し、第６週を超えると細胞は継代不能であった。
【００１２】
Ｃｙｔｏｄｅｘ  １および３などの商業的に入手可能なマイクロキャリアーを用いて、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の培養をスケールアップする以前の試みは成功しなかった。ｈＥＳＣ培養は死ぬか、またはキャリアー上で分化し、そして増殖不能であった（ＯｈおよびＣｈｏｏ，  ２００６）。
【００１３】
ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２は、２Ｄ培養において、解離したヒト胚性幹細胞の生存を許容可能にする因子として、ＷａｔａｎａｂｅらおよびＨａｒｂらによって提唱されてきている（Watanabeら A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology Vol.25 No.6 p681-686 June 2007. WO 2008/035110. Harbら The Rho-Rock-Myosin Signaling Axis Determines Cell-Cell Integrity of Self-Renewing Pluripotent Stem Cells. PLoS ONE 3(8): e3001. doi:10:1371/journal.pone.0003001）。
【００１４】
ＲＯＣＫ阻害剤は、ヒト胚性幹細胞の凍結保存を改善しうる剤としてもまた研究されてきている（Xiangyun Liら ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Human Reproduction, Vol.24, No.3 pp.580-589, 2009. Martin-Ibanezら Novel cryopreservation method for dissociated human embryonic stem cells in the presence of a ROCK inhibitor. Human Reproduction. Vol. 23. No.12 pp.2744-2754, 2008. Claassenら ROCK Inhibition Enhances the Recovery and Growth of Cryopreserved Human Embryonic Stem Cells and Human Induced Pluripotent Stem Cells. Molecular Reproduction & Development 2009）。しかし、すべての場合において、Ｍａｔｒｉｇｅｌ上でのヒト胚性幹細胞の２Ｄ培養の背景においての使用が示される。
【００１５】
Ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングしたマイクロキャリアーを用いて、本発明者らは先に、ヒト胚性幹細胞およびヒト人工多能性細胞を含む、霊長類由来の未分化多能性細胞の懸濁中での安定したそして連続する増殖を連続的な継代をを通して達成した（部分的に、Ｏｈら  ２００９に報告し、そしてさらに、米国特許出願、２００９年３月１７日出願のＵＳ  ６１／０６９，６９４、２００８年１０月３１日出願のＵＳ  ６１／１１０，２５６、２００９年１月２９日出願のＵＳ  ６１／１４８，０６４、および２００９年２月２７日出願のＵＳ  ６１／１５５，９４０にさらに記載する）。しかしこれまで、細胞外マトリックス由来物質の表面コーティングを持たないマイクロキャリアーを用いては、この結果は得られてきていない。
【００１６】
それ以来、Ｌｏｃｋらは、Ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングしたマイクロキャリアー上でのｈＥＳＣの増殖を記載してきているが、継代は伴わず（Lockら expansion and Differentiation of Human Embyronic Stem Cells to Endoderm Progeny in a Microcarrier Stirred-Suspension Culture. Tissue Engineering: Part A Vol.15, No.00, 2009）、そしてＮｉｅらはマトリックスコーティングまたはフィーダー細胞層を有するマイクロキャリアー上のｈＥＳＣの増殖を調べてきている（Nieら Scalable Culture and Cryopreservation of Human Embyronic Stem Cells on Microcarriers. Biotechnol. Prog., 2009, Vol.25, No.1）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】ＵＳ２００７／０２６４７１３（Ｔｅｒｓｔｅｇｇｅ）
【特許文献２】ＷＯ２００８／００４９９０
【特許文献３】ＷＯ  ２００８／０３５１１０
【特許文献４】ＵＳ  ６１／０６９，６９４
【特許文献５】ＵＳ  ６１／１１０，２５６
【特許文献６】ＵＳ  ６１／１４８，０６４
【特許文献７】ＵＳ  ６１／１５５，９４０
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｋｅｌｌｅｒ，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ２００５；１９：１１２９−１１５５
【非特許文献２】ＷｏｂｕｓおよびＢｏｈｅｌｅｒ，  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．  ２００５；８５：６３５−６７８
【非特許文献３】Ｗｉｌｅｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．  １９９３；２２５：９００−９１８
【非特許文献４】Ｃｈｏｉら，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．  ２００５；１０５：３５９−３６８
【非特許文献５】Ｆｅｒｎａｎｄｅｓら，  ２００７
【非特許文献６】Ａｂｒａｎｃｈｅｓら，  ２００７
【非特許文献７】ＫｉｎｇおよびＭｉｌｌｅｒ，  ２００７
【非特許文献８】Ｄａｎｇら，  ２００４
【非特許文献９】ＦｏｋおよびＺａｎｄｓｔｒａ，  ２００５
【非特許文献１０】Ｃａｍｅｒｏｎら，  ２００６
【非特許文献１１】Ｇｅｒｅｃｈｔ  Ｎｉｒら（２００４）
【非特許文献１２】Ｚａｎｄｓｔｒａら（２００３）
【非特許文献１３】Ｗａｒｔｅｎｂｅｒｇら（１９９８）
【非特許文献１４】ＤａｎｇおよびＺａｎｄｓｔｒａ（２００５）
【非特許文献１５】ＫｉｎｇおよびＭｉｌｌｅｒ（２００５）
【非特許文献１６】Ｐｈｉｌｌｉｐｓら，  ２００８（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３８（２００８）２４−３２）
【非特許文献１７】ＯｈおよびＣｈｏｏ，  ２００６
【非特許文献１８】Ｗａｔａｎａｂｅら、  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．２５  Ｎｏ．６  ｐ６８１−６８６  Ｊｕｎｅ  ２００７
【非特許文献１９】Ｈａｒｂら、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ３（８）：  ｅ３００１．  ｄｏｉ：１０：１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００３００１
【非特許文献２０】Ｘｉａｎｇｙｕｎ  Ｌｉら、Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，  Ｖｏｌ．２４，  Ｎｏ．３  ｐｐ．５８０−５８９，  ２００９
【非特許文献２１】Ｍａｒｔｉｎ−Ｉｂａｎｅｚら、Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．  Ｖｏｌ．  ２３．  Ｎｏ．１２  ｐｐ．２７４４−２７５４，  ２００８
【非特許文献２２】Ｃｌａａｓｓｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２００９
【非特許文献２３】Ｏｈら  ２００９
【非特許文献２４】Ｌｏｃｋら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：  Ｐａｒｔ  Ａ  Ｖｏｌ．１５，  Ｎｏ．００，  ２００９
【非特許文献２５】Ｎｉｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｐｒｏｇ．，  ２００９，  Ｖｏｌ．２５，  Ｎｏ．１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らはここで、マトリックスコーティングを持たないマイクロキャリアー上、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で、培養しそして継代する細胞の多能性状態を維持しつつ、多能性幹細胞を首尾よく培養し、そして継代することが可能であることを見出した。
【００２０】
本発明は、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養中で、多能性および多分化能細胞を安定して、そして長期に培養するための方法を提供する。
【００２１】
この方法を用いて、ヒト胚性幹細胞を拡大しそして継代し、そして拡大しそして継代するヒト胚性幹細胞集団の多能性を、少なくとも９回の継代を超えて維持してきている。
【００２２】
したがって、本発明の１つの側面は、懸濁培養中、マイクロキャリアー上の、多能性または多分化能細胞の成長および増殖に関する。方法は、培養中の細胞のそれぞれの多能性または多分化能状態を保持しながら、１回または複数回の継代を通じて培養する工程を含んでもよい。培養補助剤または添加剤として培地に添加可能なＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養を行う。
【００２３】
培養中にＲＯＣＫ阻害剤を含めることによって、本発明者らは、マトリックス、例えば細胞外マトリックス物質でマイクロキャリアー表面をコーティングする必要がないことを見出した。今日まで、これは、懸濁マイクロキャリアー培養多能性または多分化能細胞、特にヒトまたは霊長類胚性幹細胞およびヒトまたは霊長類人工多能性細胞の多能性または多分化能状態を維持するのに本質的に必要であると見なされてきた。
【００２４】
マイクロキャリアーに多能性または多分化能細胞を植え付ける。次いで、マイクロキャリアー−細胞複合体を懸濁培養中で培養して、好ましくは培養中の多能性または多分化能細胞の数を拡大する。培養細胞を継代してもよく、そして継代細胞をまた、例えばさらなる培養のためまたは分化のため、マイクロキャリアー上に植え付けてもよい。
【００２５】
この方式で、多能性または多分化能細胞は、複数回の継代、例えば少なくとも２回の継代を経ることも可能であり、ここで、培養されそして継代される細胞は、それぞれの多能性または多分化能状態を保持する。この方法を用いると、継代間の各培養周期中に、多能性または多分化能細胞の増殖が見られ、そして多くの（少なくとも９回の）継代に渡ってこれが維持されうる。
【００２６】
この培養法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養中の多能性または多分化能細胞の連続増殖および継代を可能にし、それによって、多能性または多分化能細胞を、療法的に有用な数まで拡大するための方法を提供する。
【００２７】
マイクロキャリアー上の多能性または多分化能細胞の連続継代がしばしば好ましいが、本発明の方法の一部として、多能性または多分化能細胞をマイクロキャリアー上の培養から、他の培養系、例えば２Ｄコロニー培養にトランスファーし、その後、懸濁マイクロキャリアー培養に戻してもよい。
【００２８】
いくつかの態様において、マイクロキャリアーを、マトリックス、好ましくは細胞外構成要素を有するマトリックスでコーティングする。いくつかの態様において、マイクロキャリアーは正に荷電される。方法は、好ましくは、継代前の各培養周期中、多能性または多分化能細胞をマイクロキャリアーに付着させる工程を伴う。コーティングされていないマイクロキャリアー上でいくつかの培養周期を行い、そしてマトリックスでコーティングされたマイクロキャリアー上で他の周期を行うことも許容されうる。
【００２９】
マイクロキャリアー上の多能性または多分化能細胞の連続継代がしばしば好ましいが、本発明の方法の一部として、培養細胞をマイクロキャリアー上の培養から、他の培養系、例えば２Ｄコロニー培養にトランスファーし、その後、懸濁マイクロキャリアー培養に戻してもよい。
【００３０】
本発明のさらなる側面は、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下、懸濁培養中の、マイクロキャリアーに付着した多能性および多分化能細胞の分化に関する。
【００３１】
いくつかの態様において、上述のマイクロキャリアー培養法を使用することによって、多能性または多分化能細胞を分化に必要な細胞密度まで増殖させてもよい。必要な細胞密度が得られたら、培養条件を変化させて、マイクロキャリアーに付着した多能性または多分化能細胞の分化を誘導してもよい。分化のため、多能性または多分化能細胞の増殖のために用いたものと比較して同じまたは異なるマイクロキャリアーを用いてもよい。同様に、マトリックスコーティングを用いる場合、同じまたは異なるマトリックスコーティングを用いてもよい。例えば、多能性または多分化能細胞の成長および増殖のため、第一のコーティングを有する第一のマイクロキャリアーを用いてもよく、そしてこれらの細胞の分化のため、第二のコーティングを有する第二のマイクロキャリアーを用いてもよい。第二のマイクロキャリアーはコーティングされていなくてもよいし、またはマトリックスで表面コーティングされていてもよい。
【００３２】
多能性または多分化能細胞の増殖およびその分化の両方のためのマイクロキャリアー培養の使用は、増殖培養を分化培養に再植え付けする必要を回避する利点を有し、分化させる多能性または多分化能細胞を多数提供し、そして培養条件を変化させることによって、増殖から分化に変化させる利便性を提供する。
【００３３】
他の態様において、他の培養法、例えば２Ｄコロニー培養によって、分化させる多能性または多分化能細胞を、必要な細胞密度に増殖させてもよい。次いで、細胞をマイクロキャリアーに付着させ、そしてＲＯＣＫ阻害剤の存在下、多能性または多分化能細胞の分化を誘導する条件下で、懸濁培養中で培養する。
【００３４】
いくつかの態様において、すでに分化を経ている（が、好ましくは最終分化はしていない）多能性または多分化能細胞をマイクロキャリアーに付着させて、そしてＲＯＣＫ阻害剤の存在下、細胞分化を誘導する条件下で、懸濁培養中で培養してもよい。
【００３５】
本発明の方法において、ＲＯＣＫ阻害剤は、好ましくは、培養するかまたは分化させる細胞との接触を可能にされる。ＲＯＣＫ阻害剤はまた、好ましくは、細胞が付着しているかまたは付着されようとしているマイクロキャリアーとの接触も可能にされる。こうした接触を可能にするため、液体、流体、ジェルまたは他の流動可能培地が好ましい。
【００３６】
本発明の１つの側面において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで多能性または多分化能細胞を培養する方法であって：
（ｉ）多能性または多分化能細胞を複数のマイクロキャリアーに付着させて、マイクロキャリアー−細胞複合体を形成し、そして
（ｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で、懸濁培養中、マイクロキャリアー−細胞複合体を培養する
工程を含む、前記方法を提供する。
【００３７】
いくつかの態様において、該方法は、（ｉｉ）由来の培養細胞をさらに継代する工程をさらに含み、ここで継代後の細胞は多能性または多分化能である。
【００３８】
いくつかの態様において、方法はさらに：
（ｉｉｉ）（ｉｉ）由来の培養細胞を継代し；そして
（ｉｖ）少なくとも２回の継代に渡って、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を反復する
工程を含み、
工程（ｉｖ）後の培養中の細胞は多能性または多分化能である。いくつかの態様において、各反復周期において、工程（ｉ）の幹細胞は、先行する反復周期の工程（ｉｉｉ）の継代細胞から得られる。
【００３９】
工程（ｉｖ）において、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を：少なくとも３回の継代、少なくとも４回の継代、少なくとも５回の継代、少なくとも６回の継代、少なくとも７回の継代、少なくとも８回の継代、少なくとも９回の継代、少なくとも１０回の継代、少なくとも１１回の継代、少なくとも１２回の継代、少なくとも１３回の継代、少なくとも１４回の継代、少なくとも１５回の継代、少なくとも１６回の継代、少なくとも１７回の継代、少なくとも１８回の継代、少なくとも１９回の継代、少なくとも２０回の継代、少なくとも２１回の継代、少なくとも２２回の継代、少なくとも２３回の継代、少なくとも２４回の継代、少なくとも２５回の継代、少なくとも３０回の継代、少なくとも４０回の継代、少なくとも５０回の継代、少なくとも６０回の継代、少なくとも７０回の継代、少なくとも８０回の継代、少なくとも９０回の継代、少なくとも１００回の継代の１つに渡って反復する。
【００４０】
いくつかの態様において、工程（ｉｉ）において、培養中の細胞数が拡大するために十分な期間、細胞を培養する。いくつかの態様において、工程（ｉｖ）後、培養中の細胞の少なくとも６０％は多能性または多分化能である。いくつかの態様において、工程（ｉｖ）後、培養中の細胞の少なくとも６０％は、Ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０およびＭａｂ８４の１つ、２つ、３つまたはすべてを発現する。
【００４１】
いくつかの態様において、増殖した細胞は、好ましくは、言及した回数の継代後、多能性または多分化能細胞の少なくとも１つの生物学的活性を保持する。（ｉ）多能性マーカーの発現、（ｉｉ）細胞生存度；（ｉｉｉ）正常核型；（ｉｖ）内胚葉、外胚葉または中胚葉に分化する能力；からなる群より、生物学的活性を選択してもよい。生物学的活性は：  ＯＣＴ−４、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０およびＭａｂ８４からなる群より選択される多能性マーカーの発現を含んでもよい。
【００４２】
いくつかの態様において、方法は、血清不含培地、または幹細胞馴化培地、またはフィーダー細胞不含条件中で細胞を培養する工程を含む。フィーダー細胞不含培地には、懸濁培養中に存在するマイクロキャリアー上にコーティングされたフィーダー細胞の非存在、および／または懸濁培養からのフィーダー細胞の完全な非存在が含まれうる。
【００４３】
いくつかの態様において、フィーダー細胞もまた、マイクロキャリアーに付着している。いくつかの態様において、培養が、多能性または多分化能細胞が付着しているマイクロキャリアーとは異なるマイクロキャリアーに付着しているフィーダー細胞をさらに含む。
【００４４】
本発明記載の方法は、別の培養系、例えば２Ｄ培養へのまたは該培養からの継代を含んでもよい。培養系間のトランスファーを容易にするため、細胞を保存して、例えば凍結融解してもよい。
【００４５】
いくつかの態様において、多能性または多分化能細胞を、制限された期間、他の粒子／表面上で培養してもよい。例えば、工程（ｉｉ）または（ｉｉｉ）由来の多能性または多分化能細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下でのマイクロキャリアー上の培養に戻す前に、制限された回数の継代（例えば５回未満、より好ましくは３回未満、より好ましくは１回）に渡って、別の培養系（例えば２Ｄ培養上）で培養してもよい。
【００４６】
他の態様において、本発明にしたがって懸濁培養に戻す前に、培養法から多能性または多分化能細胞を除去してそして保存（例えば凍結細胞として）してもよい。細胞をＲＯＣＫ阻害剤の存在下で保存（例えば凍結）してもよい。
【００４７】
こうした態様において、本発明にしたがって懸濁培養に戻す際、同じ培養に戻す必要はない。本発明にしたがった懸濁培養を、例えば細胞を凍結し、そして輸送した後、異なる地理的位置で続けることさえ可能である。
【００４８】
本発明にしたがった方法は、マイクロキャリアーからヒト胚性幹細胞を分離する工程をさらに含んでもよい。
【００４９】
いくつかの態様において、方法は、培養から得られる多能性または多分化能細胞の分化を誘導する工程をさらに含む。したがって、いくつかの態様において、方法は、マイクロキャリアー−細胞複合体を、細胞分化を誘導する条件下に置く工程を含む。
【００５０】
いくつかの態様において、方法は、培養法から得られる多能性または多分化能細胞をマイクロキャリアーから分離し、そして分離した細胞を、細胞分化を誘導する条件下、非マイクロキャリアー培養中で培養する工程を含む。
【００５１】
いくつかの態様において、方法は、培養法から得られる多能性または多分化能細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化をさらに含み：
（ａ）培養法から得られる多能性または多分化能細胞を複数の第二のマイクロキャリアーに付着させて、マイクロキャリアー−細胞複合体を形成し：
（ｂ）（ａ）由来のマイクロキャリアー−細胞複合体を、細胞分化を誘導する条件下、懸濁培養中で培養する
工程を含む。
【００５２】
該方法はさらに：
（ｃ）工程（ｂ）から得られる分化した細胞を複数の第三のマイクロキャリアーに付着させて、マイクロキャリアー−細胞複合体を形成し；そして
（ｄ）（ｃ）由来のマイクロキャリアー−細胞複合体を、すでに分化している細胞のさらなる分化を誘導する条件下、懸濁培養中で培養する
工程を含んでもよい。
【００５３】
いくつかの態様において、分化のための培養条件は、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下、細胞を培養する工程を含む。
【００５４】
他の態様において、分化のための培養条件は、ＲＯＣＫ阻害剤の非存在下、細胞を培養する工程を含む。
【００５５】
本発明の方法によって得られる多能性または多分化能細胞（単数または複数）を提供する。本発明の方法によって得られる分化した細胞（単数または複数）もまた提供する。いくつかの態様において、本発明の方法によって得られる分化した細胞を培養して胚様体を形成する。したがって、こうして得られる胚様体もまた提供する。
【００５６】
本発明の１つの側面において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで多能性または多分化能細胞を分化させる方法であって、多能性または多分化能細胞を複数のマイクロキャリアーに付着させて、マイクロキャリアー−細胞複合体を形成し、ここでマイクロキャリアー表面はコーティングされていないかまたはマトリックスでコーティングされ、そしてＲＯＣＫ阻害剤の存在下、および細胞分化を誘導する条件下、懸濁培養中でマイクロキャリアー−細胞複合体を培養する工程を含む、前記方法を提供する。
【００５７】
本発明の別の側面において、細胞を複数のマイクロキャリアーに付着させ、それによってマイクロキャリアー−細胞複合体を形成し、そして懸濁培地がＲＯＣＫ阻害剤を含有する、多能性または多分化能細胞の懸濁培養を提供する。
【００５８】
いくつかの態様において、懸濁培養を含む多能性または多分化能細胞を増殖させるための容器、例えばバイオリアクター、またはデバイスを提供する。懸濁培養はスピナー懸濁培養であってもよい。
【００５９】
いくつかの態様において、ＲＯＣＫ阻害剤は：少なくとも１μＭ、少なくとも２μＭ、少なくとも３μＭ、少なくとも４μＭ、少なくとも５μＭ、少なくとも６μＭ、少なくとも７μＭ、少なくとも８μＭ、少なくとも９μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも１５μＭ、少なくとも２０μＭ、少なくとも３０μＭ、少なくとも４０μＭ、または少なくとも５０μＭの１つの濃度で培地中に存在する。ＲＯＣＫ阻害剤は、場合によって：１００μＭ、９０μＭ、８０μＭ、７０μＭ、または６０μＭの１つ未満の濃度で培地中に存在してもよい。
【００６０】
本発明のさらなる側面において、多能性または多分化能細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ懸濁培養におけるＲＯＣＫ阻害剤の使用であって、細胞がマイクロキャリアー−細胞複合体の形である、前記使用を提供する。
【００６１】
本発明のさらに別の側面において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの懸濁培養中の多能性または多分化能細胞の分化におけるＲＯＣＫ阻害剤の使用であって、細胞がマイクロキャリアー−細胞複合体の形である、前記使用を提供する。
【００６２】
本発明のさらなる側面において、多能性または多分化能細胞を増殖させる方法であって：
（ａ）マイクロキャリアーを提供し；
（ｂ）多能性または多分化能細胞がマイクロキャリアーに付着するのを可能にし；そして
（ｃ）多能性または多分化能細胞が付着したマイクロキャリアーを凝集して、それによって多能性または多分化能細胞を増殖させる
工程を含み、
工程（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の１もしくはそれより多くまたはすべてにおいて、マイクロキャリアーおよび／または細胞をＲＯＣＫ阻害剤と接触させる
前記方法を提供する。
【００６３】
本発明の別の側面において、多能性または多分化能細胞を増殖させる方法であって：
（ａ）第一のマイクロキャリアーに付着した第一の多能性または多分化能細胞を提供し；
（ｂ）第二のマイクロキャリアーに付着した第二の多能性または多分化能細胞を提供し；
（ｃ）第一の多能性または多分化能細胞が第二の多能性または多分化能細胞に接触するのを可能にして、細胞凝集体を形成し；そして
（ｄ）ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で凝集体を培養して、少なくとも１回の継代に関して、多能性または多分化能細胞を増殖させる
工程を含む、前記方法を提供する。
【００６４】
本発明のさらに別の側面において、多能性または多分化能細胞を増殖させる方法であって：
（ａ）多能性または多分化能細胞が付着した第一のマイクロキャリアーを提供し；
（ｂ）付着した第二の多能性または多分化能細胞を含む第二のマイクロキャリアーと、第一のマイクロキャリアーが接触するのを可能にして、凝集体を形成し；そして
（ｃ）ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で凝集体を培養する
工程を含む、前記方法を提供する。
【００６５】
本発明の別の側面において、多能性または多分化能細胞を増殖させる方法であって：
（ａ）多能性または多分化能細胞が付着した複数のマイクロキャリアーを提供し；
（ｂ）複数のマイクロキャリアーを凝集させて、凝集体を形成し；そして
（ｃ）ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で凝集体を培養する
工程を含む、前記方法を提供する。
【００６６】
記載する側面および態様において、ＲＯＣＫ阻害剤は、好ましくは：Ｙ−２７６３２、ＨＡ−１０７７（ファスジル）、ＨＡ−１１００（ヒドロキシファスジル）、Ｈ−１１５２、３−（４−ピリジル）−１Ｈ−インドール、Ｎ−（４−ピリジル）−Ｎ’−（２，４，６−トリクロロフェニル）尿素、アウロチオグルコース、ＬＹ２９４００２あるいはその塩、塩基、エステルまたはプロドラッグより選択される。
【００６７】
好ましい態様において、マイクロキャリアーはマトリックスコーティングを持たない。
【００６８】
他の態様において、マイクロキャリアー表面は、マトリックスでコーティングされていてもよい。マトリックスは細胞外マトリックス構成要素を含んでもよく、そしてＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ（BD Biosciences）、ヒアルロン酸、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、エラスチン、ヘパラン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸の１またはそれより多くであってもよい。マトリックスは、ラミニン、コラーゲンＩ、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン１の混合物を含んでもよい。
【００６９】
いくつかの態様において、多能性または多分化能細胞は幹細胞であり、そして胚性幹細胞、人工多能性幹細胞または成体幹細胞であってもよい。細胞は、哺乳動物（例えばウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他のげっ歯類（げっ歯目（Rodentia）中の任意の動物由来の細胞を含む）、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、非ヒト哺乳動物、非ヒト霊長類）、霊長類またはヒトであってもよい。
【００７０】
記載する側面および態様において、マイクロキャリアーは、セルロース、デキストラン、ヒドロキシル化メタクリレート、コラーゲン、ゼラチン、ポリスチレン、プラスチック、セラミック、シリコーンの１またはそれより多くを含むかまたはこれらからなることも可能である。あるいは、マイクロキャリアーは、マクロ多孔性またはミクロ多孔性カルボシード（carboseed）マイクロキャリアーであってもよい。
【００７１】
いくつかの態様において、マイクロキャリアーをプロタミンまたはポリリジンとカップリングさせる。いくつかの態様において、マイクロキャリアーは正に荷電している。いくつかの態様において、マイクロキャリアーは正の表面電荷を有する。いくつかの態様において、マイクロキャリアーは親水性である。いくつかの態様において、マイクロキャリアーは棒の形状である。他の態様において、マイクロキャリアーは実質的に球形である。
【００７２】
本発明記載の方法は、例えば約５〜約２００ｒｐｍ、約５〜約１５０ｒｐｍ、約５〜約１００ｒｐｍ、約３０ｒｐｍ以上または約５０ｒｐｍ以上、あるいは約１００ｒｐｍ以上の細胞培養の連続または断続的な攪拌を含んでもよい。あるいは、方法は静置培養を含んでもよい。
【００７３】
いくつかの態様において、攪拌の速度または量の増加を用いて、細胞の分化を誘導してもよく、一方、有意な分化を誘導することなく、多能性または多分化能細胞集団を拡大するため、攪拌のより低い速度または量を用いてもよい。
【００７４】
有意な分化を誘導することなく、多能性または多分化能細胞集団を培養するため、培養を約５ｒｐｍ〜約１００ｒｐｍ、約５ｒｐｍ〜約５０ｒｐｍ、約５ｒｐｍ〜約４０ｒｐｍ、約５ｒｐｍ〜約３０ｒｐｍ、約５ｒｐｍ〜約２５ｒｐｍ、約５ｒｐｍ〜約２０ｒｐｍ、約５ｒｐｍ〜約１５ｒｐｍ、約５ｒｐｍ〜約１０ｒｐｍで攪拌してもよい。
【００７５】
有意な分化を誘導するため、培養を約２５ｒｐｍ〜約２００ｒｐｍ以上、例えば約３０ｒｐｍ〜約２００ｒｐｍ以上、約３５ｒｐｍ〜約２００ｒｐｍ以上、約４０ｒｐｍ〜約２００ｒｐｍ以上、約４５ｒｐｍ〜約２００ｒｐｍ以上、約５０ｒｐｍ〜約２００ｒｐｍ以上、約７５ｒｐｍ〜約２００ｒｐｍ以上、約１００ｒｐｍ〜約２００ｒｐｍ以上で攪拌してもよい。
【００７６】
有意な細胞分化には、培養中の細胞の少なくとも約１０％が分化する状況が含まれる。あるいは、これは、培養中の細胞の少なくとも約１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％の１つが分化するものであってもよい。
【００７７】
したがって、本発明の方法は、細胞を培養しつつ、その多能性または多分化能状態を維持するための攪拌の第一の速度または量での方法の第一部に続いて、細胞が培養中で分化するのを可能にするための攪拌の第二の速度または量で細胞を培養する第二部を行うことを含んでもよい。第一の速度または量は、好ましくは、第二の速度または量より少ない。方法の第一の部分は、したがって、多能性または多分化能細胞集団を拡大可能であり、そして方法の第二の部分は、内胚葉、外胚葉または中胚葉系譜に向かう、これらの細胞のいくつかまたはすべての分化のプロセスを開始してもよい。
【００７８】
本発明のさらなる側面において、治療が必要な個体において、疾患を治療する方法であって、本明細書記載の方法にしたがって多能性または多分化能細胞を増殖させ、分化した細胞または胚様体を産生し、そして多能性または多分化能幹細胞、分化した細胞または胚様体を個体に投与する工程を含む、前記方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
本発明の原理を例示する態様および実験は、ここで、付随する図に言及して論じられるであろう：
【図１】Ｍａｔｒｉｇｅｌを含まないが、Ｒｏｃｋ阻害剤Ｙ−２７６３２を含み、ＤＥ５３セルロースマイクロキャリアー上でｈＥＳＣを継代した連続９週間の結果を示すチャート。ＲＯＣＫ阻害剤を含まないと、ｈＥＳＣは４週以降、継代不能である。
【図２】ＦＡＣＳ分析。Ｍａｔｒｉｇｅｌを含まないがＲＯＣＫ阻害剤を含む、マイクロキャリアー培養中、３週間に渡る、多能性マーカーＯｃｔ４およびｍＡｂ８４の安定発現、ＲＯＣＫ阻害剤を含まない場合はマーカーの下方制御が示される。
【図３】Ｍａｔｒｉｇｅｌを含まないが、ＲＯＣＫ阻害剤を含むマイクロキャリアー培養中、９週間に渡る、多能性マーカーＯｃｔ４、ｍＡｂ８４およびＴｒａ−１−６０の安定発現を示すチャート。
【図４】Ｍａｔｒｉｇｅｌを含まないが、Ｒｏｃｋ阻害剤Ｙ−２７６３２を含み、球状ポリリジンコーティングＴｏｓｏｈマイクロキャリアー上でｈＥＳＣを継代した連続６週間の結果を示すチャートおよびＦＡＣＳ分析。ＲＯＣＫ阻害剤を含まないと、ｈＥＳＣは２週以降、継代不能である。
【図５】Ｍａｔｒｉｇｅｌを含まないが、Ｒｏｃｋ阻害剤Ｙ−２７６３２を含み、セルロースＤＥ５３、Ｔｏｓｏｈ、Ｃｙｔｏｄｅｘ１およびＣｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアー上でｈＥＳＣを継代した連続５週間の結果を示すチャート。
【図６】Ｍａｔｒｉｇｅｌを含まないが、Ｒｏｃｋ阻害剤Ｙ−２７６３２を含む、セルロースＤＥ５３、Ｔｏｓｏｈ、Ｃｙｔｏｄｅｘ１およびＣｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアー上のｈＥＳＣの顕微鏡写真。
【図７】ＦＡＣＳ分析。Ｍａｔｒｉｇｅｌを含まないが、Ｒｏｃｋ阻害剤Ｙ−２７６３２を含み、セルロース、Ｔｏｓｏｈ、Ｃｙｔｏｄｅｘ１およびＣｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアー上で培養した５継代目のｈＥＳＣにおける、Ｏｃｔ４およびｍＡｂ８４発現。
【図８】Ｍａｔｒｉｇｅｌを含まないが、Ｒｏｃｋ阻害剤Ｙ−２７６３２を含む、セルロースマイクロキャリアー上のｈＥＳＣの走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）。
【図９】Ｍａｔｒｉｇｅｌを含まないが、Ｒｏｃｋ阻害剤Ｙ−２７６３２を含むｈＥＳＣセルロースマイクロキャリアーのＳＥＭ。
【図１０】それぞれ８継代目および７継代目の、ＤＥ５３およびＱＡ５２セルロースマイクロキャリアー上で培養したｈＥＳＣの安定核型。
【図１１】それぞれ１０継代目および５継代目の、球状ＴｏｓｏｈおよびＣｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアー上で培養したｈＥＳＣの安定核型。
【図１２】０継代目および１継代目で、阻害剤ＨＡ１０７７およびアウロチオグルコースが、Ｍａｔｒｉｇｅｌを含まないセルロースマイクロキャリアー上のｈＥＳＣの増殖を補助することを示すチャート。
【図１３】ＦＡＣＳ分析。０継代目での阻害剤ＨＡ１０７７およびアウロチオグルコースを含むｈＥＳＣ培養の多能性マーカーＯｃｔ４およびｍＡｂ８４の安定発現。
【図１４】ＦＡＣＳ分析。１継代目での阻害剤ＨＡ１０７７およびアウロチオグルコースを含むｈＥＳＣ培養の多能性マーカーＯｃｔ４およびｍＡｂ８４のＦＡＣＳの安定発現。
【図１５】別のＲＯＣＫ阻害剤を含む、マイクロキャリアー上のｈＥＳＣの集密培養の顕微鏡写真。
【図１６】ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２を含むセルロースマイクロキャリアー上の長期ｈＥＳＣ培養の影響を示すチャート。ＲＯＣＫ阻害剤を含まない場合、Ｏｃｔ４およびｍＡｂ８４が下方制御され、そしてＲＯＣＫ阻害剤を含む場合、９週間に渡って、Ｏｃｔ４およびｍＡｂ８４が安定発現する。
【図１７】ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ−２７６３２）を含むおよび含まない、セルロースＤＥ５３、Ｔｏｓｏｈ、Ｃｙｔｏｄｅｘ１およびＣｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアー上のｈＥＳＣ培養の比較を示すチャート。
【図１８】胚性幹細胞において基本的細胞−細胞相互作用を制御するＲｈｏ−Ｒｏｃｋ−ミオシン経路の概要を示す略図。点線は、細胞完全性および細胞再生経路内または該経路間の潜在的な機械的作用を示す（Harbら The Rho-Rock-Myosin Signaling Axis Determines Cell-Cell Integrity of Self-Renewing Pluripotent Stem Cells. PLoS ONE 3(8): e3001. doi:10:1371/journal.pone.0003001より）。
【図１９】０継代目〜４継代目の、アウロチオグルコースの添加を伴う、ＭａｔｒｉｇｅｌでコーティングされたセルロースＤＥ５３マイクロキャリアー対コーティングされていないマイクロキャリアー上のｈＥＳＣの細胞密度（１００万細胞／ウェル）を示すチャート。
【図２０】ＦＡＣＳ分析。１、３および４継代目でのアウロチオグルコースを含むｈＥＳＣ培養の多能性マーカーＯｃｔ４およびｍＡｂ８４の発現。
【図２１Ａ】ファスジル、ヒドロキシファスジルおよびアウロチオグルコースを毎日９週間連続添加した際の、ｈＥＳＣ細胞拡大の補助に対する影響。（Ａ）ファスジル、ヒドロキシファスジルおよびアウロチオグルコースを毎日９週間連続添加した際、対照ＤＥ５３マイクロキャリアーと類似の細胞密度までｈＥＳＣ細胞拡大を補助する影響があることを示すチャート。
【図２１Ｂ】ファスジル、ヒドロキシファスジルおよびアウロチオグルコースを毎日９週間連続添加した際の、ｈＥＳＣ細胞拡大の補助に対する影響。（Ｂ）多能性マーカーＴｒａ−１−６０の発現が、９週後、対照が９０％であることと比較して、ファスジルおよびヒドロキシファスジルに関して約８０％であり、そしてアウロチオグルコースでは６０％であることを示すチャート。
【図２１Ｃ】ファスジル、ヒドロキシファスジルおよびアウロチオグルコースを毎日９週間連続添加した際の、ｈＥＳＣ細胞拡大の補助に対する影響。（Ｃ）多能性マーカーＯｃｔ４の発現が、９週後、対照が５５％であることと比較して、ファスジルおよびヒドロキシファスジルに関して約３０〜４０％であり、そしてアウロチオグルコースでは５０％であることを示すチャート。
【図２２】対照マイクロキャリアー対ヒドロキシファスジル処理マイクロキャリアーで培養されたｈＥＳＣにおける胚様体形成後の分化マーカーに関するゲル電気泳動の結果を示す写真。多能性遺伝子ＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４の発現を含める。
【図２３】ファスジルおよびアウロチオグルコース処理マイクロキャリアーで培養されたｈＥＳＣにおける胚様体形成後の分化マーカーに関するゲル電気泳動の結果を示す写真。多能性遺伝子ＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４の発現を含める。
【図２４】（Ａ）ファスジル、ヒドロキシファスジル、アウロチオグルコースおよびＹ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤の６週間（週あたり１回継代、Ｐ）の単回用量添加（１０μＭ）が、対照ＤＥ５３マイクロキャリアーと類似の細胞密度（５００万／ウェル）までのｈＥＳＣ細胞拡大の補助を可能にすることを示すチャート。（Ｂ）多能性マーカーＴｒａ−１−６０の発現が、６週後（Ｐ６−週あたり１回の継代（Ｐ））、ファスジルおよびＹ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤に関して約８０％であり、アウロチオグルコースに関して７０％であり、そしてヒドロキシファスジルでは５０％であることを示すチャート。
【図２５】多能性マーカーＯｃｔ４の発現が、６週後（Ｐ６−週あたり１回の継代（Ｐ））、ファスジルおよびヒドロキシファスジル、アウロチオグルコースおよびＹ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤に関して６０％で非常に類似であることを示すチャート。
【図２６】Ｃｙｔｏｄｅｘ１（５ｍｇ／ウェル、１ｍｇ／ｍｌ）およびＤＥ５３（２０ｍｇ／ウェル、４ｍｇ／ｍｌ）マイクロキャリアー上で培養されたｈＥＳＣ細胞株ＨＥＳ−２（植え付け密度０．８ｘ１０５細胞／ｍｌ）由来の細胞が、対照（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）培養と比較して類似の細胞濃度を有することを示すチャート。
【図２７】対照（Ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングマイクロキャリアー）培養に比較した、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ−２７６３２（１０μＭ））を含み、Ｃｙｔｏｄｅｘ１（５ｍｇ／ウェル、１ｍｇ／ｍｌ）およびＤＥ５３（２０ｍｇ／ウェル、４ｍｇ／ｍｌ）マイクロキャリアー上で培養された、ｈＥＳＣ細胞株ＨＥＳ−２（植え付け密度０．８ｘ１０５細胞／ｍｌ）由来の細胞における多能性マーカー発現（Ｔｒａ−１−６０）。（Ａ）５継代目のＣｙｔｏｄｅｘ１＋Ｙ−２７６３２（１０μＭ）上のＴｒａ−１−６０発現は〜９４％であり、（Ｂ）５継代目のＤＥ５３＋Ｍａｔｒｉｇｅｌ上では〜８８％であり、そして（Ｃ）５継代目のＤＥ５３＋Ｙ−２７６３２（１０μＭ）上では〜９２％であることを示すＦＡＣＳ分析。
【図２８】血清不含培地ｍＴｅＳＲ１中、Ｙ−２７６３２（１０μＭ）を含み、ＤＥ５３マイクロキャリアー上で培養されたヒトｉＰＳ細胞（ＩＭＲ９０）の１２継代に渡る細胞密度を示すチャート。
【図２９】ｍＴｅＳＲ１培地中、Ｙ−２７６３２（１０μＭ）を含み、ＤＥ５３マイクロキャリアー上で培養されたヒトｉＰＳ細胞（ＩＭＲ９０）の１２継代に渡る、多能性マーカー（Ａ）Ｏｃｔ４および（Ｂ）Ｔｒａ−１−６０の発現を示すチャート。
【図３０】１２継代目での、ｍＴｅＳＲ１培地中、Ｙ−２７６３２（１０μＭ）を含み、ＤＥ５３マイクロキャリアー上で培養されたヒトｉＰＳ細胞（ＩＭＲ９０）における（Ａ）Ｏｃｔ４および（Ｂ）Ｔｒａ−１−６０のＦＡＣＳ分析。
【発明を実施するための形態】
【００８０】
例として、本発明を実施するために本発明者らが意図する最適な様式の特定の詳細を含めて、本発明の１以上の態様の詳細を、以下の付随する説明に示す。当業者には、これらの特定の詳細に限定されることなく、本発明を実施可能であることが明らかであろう。
【００８１】
結果の要約
本発明者らは、ＲＯＣＫ阻害剤補充（例えばＹ２７６３２、ＨＡ１０７７（ファスジル）またはアウロチオグルコース）の存在下で、多様なマイクロキャリアー（ＤＥ５３、ＱＡ５２、Ｔｏｓｏｈ、Ｃｙｔｏｄｅｘ１、Ｃｙｔｏｄｅｘ３）を用いて、連続５回を超える継代に渡り、マトリックスコーティング、例えばＭａｔｒｉｇｅｌ非存在下で、マイクロキャリアー上、ｈＥＳＣを培養する方法を開発した。ｈＥＳＣは、５回以上の継代後、その増殖、最終細胞密度、多能性マーカーＯｃｔ４、Ｍａｂ８４、およびＴＲＡ−１−６０の発現、ならびに正常核型を維持した。
【００８２】
これは、ある範囲のマイクロキャリアーコーティングを用いた多能性および多分化能細胞を培養するためのマイクロキャリアーの使用に関する本発明者らの以前の研究を改良する（部分的に、Ｏｈら  ２００９に報告し、そしてさらに、米国特許出願、２００９年３月１７日出願のＵＳ  ６１／０６９，６９４、２００８年１０月３１日出願のＵＳ  ６１／１１０，２５６、２００９年１月２９日出願のＵＳ  ６１／１４８，０６４、および２００９年２月２７日出願のＵＳ  ６１／１５５，９４０に記載する。これらの文献はすべて本明細書に援用される）。
【００８３】
本発明の方法は、多能性ｈＥＳＣの拡大および分化を達成するため、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、動物由来マトリックス、または他の細胞外マトリックス構成要素でマイクロキャリアーをコーティングする必要を回避することから、特に有望である。これは、研究、療法および診断適用で使用するための、ｈＥＳＣ、ならびに他の多能性および多分化能細胞を拡大しそして分化させる、ＧＭＰに準拠した方法を開発するのを補助するであろう。
【００８４】
特に、本発明者らは：
１．  ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２を用いた、９週間（９回の継代）のセルロースＤＥ５３マイクロキャリアー上のｈＥＳＣの長期培養（図１）。
【００８５】
２．  ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２を用いた、６週間（６回の継代）の球状Ｔｏｓｏｈマイクロキャリアー上のｈＥＳＣの長期培養（図４）。
【００８６】
３．  ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２を用いた、５週間（５回の継代）のセルロースＤＥ５３、Ｔｏｓｏｈ、Ｃｙｔｏｄｅｘ１およびＣｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアー上のｈＥＳＣの長期培養の比較（図５）。
【００８７】
４．  ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２を用いた、５〜１０週の間のセルロースＤＥ５３、ＱＡ５２、Ｔｏｓｏｈ、およびＣｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアー上のｈＥＳＣの正常核型（図１０および１１）。
【００８８】
５．  別のＲＯＣＫ阻害剤、ＨＡ１０７７（ファスジル）およびアウロチオグルコースを用いた、２週間のセルロースＤＥ５３マイクロキャリアー上のｈＥＳＣの培養（図１２〜１４）。
を示した。
【００８９】
懸濁培養および幹細胞の継代
本発明者らは、マトリックスコーティングを有する粒子上で、霊長類およびヒト幹細胞およびｉＰＳ細胞を培養し、増殖させ、そして継代することが可能であることを先に立証した。特に、本発明者らは、懸濁培養中、マトリックスコーティングしたマイクロキャリアー上で、幹細胞を連続して増殖させ、そして継代することも可能であることを示した。
【００９０】
本発明者らは、ここで、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下、懸濁中で幹細胞を増殖させる方法を記載する。増殖法は、幹細胞を成長させるか、繁殖させるか、増殖させるか、培養するか、拡大するかまたは増加させることを含んでもよい。増殖している幹細胞を、以下に記載するように、１回以上の継代に渡って継代することが可能である。こうした増殖は、特定の特性を持つマイクロキャリアーまたは粒子を使用することによって達成可能である。マイクロキャリアーまたは粒子は電荷を含んでもよい。マイクロキャリアーまたは粒子は、場合によって、コーティングを含んでもよい。さらなる特性はサイズを含んでもよい。
【００９１】
幹細胞を増殖させる方法は、粒子を提供する工程を含んでもよい。粒子はコーティングされていなくてもよいし、または上にコーティングされたマトリックスを含んでもよい。これらは正電荷を有してもよい。粒子は付着した霊長類またはヒト幹細胞の凝集を可能にするサイズを有してもよい。幹細胞が粒子に付着することを可能にする。異なる粒子上で増殖する細胞が互いに接触し、そして凝集体を形成することを可能にする。培養を少なくとも１回の継代に関して継代する。幹細胞はキャリアーに付着しても、あるいはキャリアーから引き離されてもまたは分離されてもよい。これらを未分化もしくは多能性状態または両方で用いてもよく、あるいは望ましい細胞タイプに分化させてもよい。これらを用いて胚様体を形成してもよい。
【００９２】
粒子が連続増殖を補助するため、これらは霊長類またはヒト幹細胞の寸法に適合するサイズ、例えば１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、１１０μｍ、１２０μｍ、１３０μｍ、１４０μｍ、１５０μｍ、１６０μｍ、１７０μｍ、１８０μｍ、１９０μｍ、２００μｍ、２１０μｍ、２２０μｍ、２３０μｍ、２４０μｍ、２５０μｍ程度を有するべきである。この桁のサイズを有するこうした粒子上の霊長類またはヒト幹細胞の培養は、その上で増殖する細胞が互いに凝集するのを可能にし、そして連続増殖を補助するであろう。粒子の適切な組成、形状およびサイズを、以下にさらに詳細に記載する。
【００９３】
実施例は、ヒト胚性幹細胞２Ｄコロニー培養などの幹細胞培養をマイクロキャリアー粒子上に接種し、そして１回以上の継代を伴って、数世代に渡り、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で増殖させうることを示す。機械的または酵素的解離、あるいは両方の方法の組み合わせなどの任意の手段により、表面から除去することによって、幹細胞を継代してもよい。
【００９４】
マイクロキャリアー粒子培養を粒子上で世代から世代に増殖させてもよい。あるいは、またはさらに、間に１以上の世代に渡って、慣用的な２Ｄ培養上で培養を増殖させてもよい。マイクロキャリアー上で増殖しているヒト幹細胞を２Ｄコロニー培養に戻してもよいし、そして逆を行ってもよい。
【００９５】
本明細書記載の方法は、未分化型の幹細胞を効率的に増殖させるための方法を利用可能にする。１対２および１対１０の間のスプリット比で、機械的にまたは酵素的に解離させることによって、マイクロキャリアー培養をマイクロキャリアー上に継代することも可能であり、この比は、慣用的な２Ｄ培養に関して可能であるよりも高い。これによって、より迅速に培養をスケールアップしつつ、バイオマテリアルのより効率的な利用が可能になる。
【００９６】
マイクロキャリアー培養中の細胞の体積収量は、ルーチンに、２Ｄコロニー対照の２〜４倍である。本明細書に記載する方法によって増殖するヒト幹細胞の体積収量は、最大２００万細胞／ｍｌ以上である可能性もある。
【００９７】
本明細書記載の方法は、以下にさらに詳細に記載するように、９回以上の継代に関して、粒子から粒子にヒト幹細胞を継代することを可能にする。
【００９８】
本明細書記載の方法は、その多能性特性を保持する幹細胞の増殖を可能にする。実施例は、本明細書に記載する方法および組成物にしたがって増殖させたヒト胚性幹細胞が、幹細胞の１以上の生物学的特性を維持可能であることを示す。したがって、増殖幹細胞は、２Ｄコロニー培養として増殖する幹細胞と同等の多能性マーカー、Ｏｃｔ−４、Ｔｒａ−１−６０およびｍＡｂ８４の発現を、５回以上の継代に渡って示し、正常核型を保持する。
【００９９】
重要なことに、マイクロキャリアー上に幹細胞を係留することによって、より大規模なスピナーフラスコ中で細胞を連続継代することが可能である。
【０１００】
本明細書記載の方法を用いて、任意の幹細胞を増殖させてもよい。これらは、霊長類幹細胞、例えば、サル、類人猿またはヒト幹細胞を含んでもよい。幹細胞は胚性幹細胞または成体幹細胞を含んでもよい。幹細胞は、人工多能性幹細胞を含んでもよい。例えば、幹細胞はヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を含んでもよい。本明細書記載の方法および組成物で使用するのに適したこれらのおよび他の幹細胞を、以下にさらに詳細に記載する。本明細書記載の方法および組成物は、既知の「２Ｄ」培養法に勝る多様な利点を有する。粒子は、２Ｄコロニー培養支持体よりも、幹細胞を付着させるのにより効率的である。このためそして他の理由のため、懸濁培養細胞は、より効率的に継代可能である。本明細書記載の方法は、数サイクルに渡って、幹細胞を凍結融解することを可能にする。該細胞をマイクロキャリアー上で直接凍結し、そして増殖培地上（伝統的なプレート培養または微粒子マイクロキャリアー上のいずれであっても）で融解してもよい。マイクロキャリアー上で増殖させた幹細胞を、ＧＭＰ準拠の血清不含培地中で増殖させてもよい。
【０１０１】
本明細書に記載する方法は、本質的に、未分化状態で、胚性幹細胞などの幹細胞を培養し、そして維持することを可能にする。増殖幹細胞は、培養中（例えばマイクロキャリアー上）で、またはそこから引き離されて、部分的に、または完全に分化させることも可能である。
【０１０２】
増殖幹細胞を用いて、さらなる使用のため、胚様体を形成してもよい。胚様体形成前に、２Ｄ増殖表面から細胞を除去するさらなる工程を必要とする以前の方法とは対照的に、マイクロキャリアー上で増殖する幹細胞を、単に、分化培地にトランスファーして、直接、胚様体を形成することも可能である。
【０１０３】
したがって、本明細書記載の方法および組成物は、増殖表面または支持体から除去することなく、それらの上で幹細胞の分化を導くことを可能にする。
【０１０４】
本明細書記載の方法および組成物は、より多量に、培養幹細胞の拡大およびスケールアップを可能にする。バイオリアクターまたは産業スケールへのスケールアップによって、幹細胞のより生産的な培養が可能になる。攪拌培養中、マイクロキャリアー上で幹細胞を増殖させることが可能であれば、つまり、培養を懸濁状態でスケールアップすることも可能である。Ｗａｖｅバイオリアクターなどの制御バイオリアクターまたは攪拌培養を用いてもよい。これによって、係留依存性の２次元コロニー培養の現在の制限に比較して、細胞をより多量に拡大することが可能になる。最大数百リットルのバイオリアクター中での大規模懸濁培養が可能である。
【０１０５】
ＲＯＣＫ阻害剤
本発明記載の方法は、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下での多能性または多分化能細胞の培養、成長、繁殖、増殖、集団拡大および／または分化に関する。
【０１０６】
セリン／スレオニンキナーゼであるＲｈｏキナーゼ（Ｒｈｏ関連コイルドコイルキナーゼまたはＲＯＣＫ；  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：  ＮＭ ００５４０６）は、Ｒｈｏ（３つのアイソフォームＲｈｏＡ、ＲｈｏＢおよびＲｈｏＣが存在する）のターゲットタンパク質として働き、そしてＲｈｏＡ誘導性ストレスファイバーおよび接着点の形成の仲介因子として特徴付けられてきている。
【０１０７】
ＲＯＣＫ  Ｉ（またはＲＯＫ  ｂと呼ばれる）およびＲＯＣＫ  ＩＩ（ＲｈｏキナーゼまたはＲＯＫ  ａとしてもまた知られる）は、元来、ＲｈｏＡ−ＧＴＰ相互作用タンパク質として単離された。２つのキナーゼはヒトにおいて６４％の全体同一性を有し、触媒性キナーゼドメインでは８９％同一性を有する。どちらのキナーゼもコイルドコイル領域（５５％同一性）、およびＣ１保存領域によって分けられたプレクストリン相同性（ＰＨ）ドメイン（８０％同一性）を含有する。ＲＯＣＫキナーゼ阻害の概説に関しては、Ｏｌｓｏｎら（Current Opinion in Cell Biology 2008, 20:242-248、本明細書に援用される）を参照されたい。
【０１０８】
ＲＯＣＫは、下流ターゲットタンパク質のリン酸化を通じて、アクチン−ミオシン仲介性収縮力生成を促進する。ＲＯＣＫは、ＬＩＭキナーゼ−１およびキナーゼ−２（ＬＩＭＫ１およびＬＩＭＫ２）を、活性化ループ中で保存されるスレオニンでリン酸化し、ＬＩＭＫ活性、およびそれに続くコフィリンタンパク質のリン酸化を増加させ、これがＦアクチン（Factin）切断活性を遮断する。ＲＯＣＫはまた、制御性ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）およびＭＬＣホスファターゼのミオシン結合サブユニット（ＭＹＰＴ１）を直接リン酸化して、触媒活性を阻害する。ＲＯＣＫ活性化によって、力生成および形態学的変化を促進する一連の事象が導かれる。これらの事象は、いくつかのアクチン−ミオシン仲介プロセスに直接寄与し、こうしたプロセスには、例えば細胞運動、接着、平滑筋収縮、神経突起退縮、および食作用がある。さらに、ＲＯＣＫキナーゼは、増殖、分化、アポトーシス、および発癌性トランスフォーメーションにおいて役割を果たすが、これらの反応は細胞タイプ依存性でありうる。
【０１０９】
本明細書において、「ＲＯＣＫ阻害剤」は、ＲＯＣＫ  Ｉおよび／またはＲＯＣＫ  ＩＩを阻害することが可能な分子、化合物、物質または組成物であり、そして好ましくは１００μＭ未満、より好ましくは１０μＭ未満、さらにより好ましくは１μＭ未満、そしてさらにより好ましくは９００ｎＭ未満、あるいは約８００ｎＭ、７００ｎＭ、６００ｎＭ、または５００ｎＭの１つ未満であるかまたはこれらに同等であるＩＣ５０を有する。本発明で有用なＲＯＣＫキナーゼは、同じＲＯＣＫキナーゼアッセイで測定した際、Ｙ−２７６３２のＩＣ５０と実質的に同じかまたはそれより優れた（すなわちそれ未満の）、またはＹ−２７６３２のＩＣ５０の５００ｎＭ以内のＩＣ５０を有してもよい。
【０１１０】
本明細書において、「ＲＯＣＫ阻害剤」はまた、アウロチオグルコースおよびＬＹ２９４００２も指し、これらは主に、ＮＦカッパＢおよびＰＩ３キナーゼの阻害剤として知られる。こうしたものとして、本明細書記載の側面および態様におけるＲＯＣＫ阻害剤の使用には、ＮＦカッパＢおよび／またはＰＩ３キナーゼの阻害剤の使用が含まれる。
【０１１１】
ＲＯＣＫキナーゼ阻害アッセイは、当該技術分野に周知である。例えば、ＨＴＳｃａｎ（登録商標）ＲＯＣＫ２キナーゼアッセイキット♯７５０８（Cell Signaling Technology, Inc.）、ならびにＲＯＣＫ−ＩＩアッセイキット、製品番号Ｒ８１６３およびＲ８１６４（Molecular Devices）がある。
【０１１２】
本発明の方法において、培養に添加されるＲＯＣＫ阻害剤の量は、通常、製造者の指示および培養サイズを考慮する。例えば、ＲＯＣＫ阻害剤の典型的な濃度は、１０〜５０μＭの範囲であろう。ＲＯＣＫ阻害剤を培地に定期的に、例えば毎日、添加して、所望の濃度を維持してもよい。
【０１１３】
培地中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度が；少なくとも１μＭ、少なくとも２μＭ、少なくとも３μＭ、少なくとも４μＭ、少なくとも５μＭ、少なくとも６μＭ、少なくとも７μＭ、少なくとも８μＭ、少なくとも９μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも１５μＭ、少なくとも２０μＭ、少なくとも３０μＭ、少なくとも４０μＭ、または少なくとも５０μＭの１つになるように、ＲＯＣＫ阻害剤を培地に添加してもよい。場合によって、ＲＯＣＫ阻害剤は：１００μＭ、９０μＭ、８０μＭ、７０μＭ、または６０μＭの１つ未満の濃度で培地中に存在してもよい。
【０１１４】
ＲＯＣＫ阻害剤を、活性剤の塩、塩基、エステルまたはプロドラッグとして提供してもよい。
【０１１５】
ＲＯＣＫ阻害剤の例には、以下が含まれる：
（Ａ）Ｙ−２７６３２
Ｙ−２７６３２は、ＲＯＣＫ  ＩおよびＲＯＣＫ  ＩＩの非常に強力で細胞浸透性の選択的およびＡＴＰ競合性阻害剤であり、約８００ｎＭのＩＣ５０を有し、そして以下のような構造（１）を有する：
【０１１６】
【化１】
2012520672.tif 000003
【０１１７】
Ｙ−２７６３２は、二塩酸塩［（Ｒ）−（＋）−トランス−Ｎ−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド．２ＨＣｌ］として一般的に製造されそして販売されている。
【０１１８】
Ｙ−２７６３２は、以下の公表される論文に概説され、該論文はすべて、本明細書に援用される：
【０１１９】
【化２】
2012520672.tif 000004
【０１２０】
（Ｂ）ＨＡ−１０７７（ファスジル）
ＨＡ−１０７７は、ミオシン軽鎖キナーゼおよびＣａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩの阻害剤である。該分子は、ＰＫＣβＩ、ＰＫＣβＩＩおよびＰＫＣζの転位置を阻害し、そして抗血管攣縮特性を持つ細胞浸透性Ｃａ２＋アンタゴニストである。該分子は、〜２９１．３６の分子量を有する。該分子は、ＡＴＰと競合することによってＲＯＣＫを阻害する。ＲＯＣＫ１に関するＩＣ５０は１．２ｍｍｏｌ／ｌであり、そしてＲＯＣＫ２に関するＩＣ５０は０．８２ｍｍｏｌ／ｌである。該分子は、他のセリン／スレオニンキナーゼに対してもまた非特異的阻害効果を持ち、例えばＰＫＡに対するＩＣ５０は５．３ｍｍｏｌ／ｌであり、そしてＰＫＣａに対するＩＣ５０は＞１００ｍｍｏｌ／ｌである。二塩酸塩は、以下のような構造（２）を有する：
【０１２１】
【化３】
2012520672.tif 000005
【０１２２】
ＨＡ−１０７７は、以下の公表される論文に概説され、該論文はすべて、本明細書に援用される：
【０１２３】
【化４】
2012520672.tif 000006
【０１２４】
（Ｃ）ＨＡ−１１００（ヒドロキシファスジル）
ＨＡ−１１００は、ＨＡ−１０７７の細胞浸透性ヒドロキシル化代謝産物であり、ＭＬＣＫ、ＭＲＣＫβおよびＰＫＣよりも〜１００倍高い選択性を持つ、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）のＡＴＰ競合性および可逆的阻害剤として作用する。分子量は〜３４３．８である。該分子は、ファスジルよりも、ＲＯＣＫに対するより選択的な阻害効果を有する：  ＲＯＣＫ１に対するＩＣ５０は０．７３ｍｍｏｌ／ｌであり、そしてＲＯＣＫ２に対するＩＣ５０は０．７２ｍｍｏｌ／ｌである。他のセリン／スレオニンキナーゼに対しても非特異的な阻害効果を有し、例えばＰＫＡに対するＩＣ５０は３７ｍｍｏｌ／ｌであり、そしてＰＫＣａに対するＩＣ５０は＞１００ｍｍｏｌ／ｌである。塩酸塩は、以下のような構造（３）を有する：
【０１２５】
【化５】
2012520672.tif 000007
【０１２６】
ＨＡ−１１００は、以下の公表される論文に概説され、該論文はすべて、本明細書に援用される：
【０１２７】
【化６】
2012520672.tif 000008
【０１２８】
（Ｄ）Ｈ−１１５２（Ｒｈｏキナーゼ阻害剤Ｉ）
Ｈ−１１５２［（Ｓ）−（＋）−２−メチル−１−［（４−メチル−５−イソキノリニル）スルホニル］ホモピペラジン］は、細胞浸透性の非常に特異的で強力な、そしてＡＴＰ競合性のＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤である（Ｋｉ＝１．６ｎＭ）。該分子は、Ｙ−２７６３２より強力でそして選択的である。Ｋｉ  ＲＯＣＫ  １．６ｎＭ（Ｋｉ  ＰＫＡ：  ６３０ｎＭ、Ｋｉ  ＰＫＣ：  ９．２７μＭ、Ｋｉ  ＭＬＣＫ：  １０．１μＭ）。分子量は〜３９２．３である。Ｈ−１１５２の二塩酸塩は、以下のような構造（４）を有する：
【０１２９】
【化７】
2012520672.tif 000009
【０１３０】
ＨＡ−１１５２は、以下の公表される論文に概説され、該論文はすべて、本明細書に援用される：
【０１３１】
【化８】
2012520672.tif 000010
【０１３２】
（Ｅ）３−（４−ピリジル）−１Ｈ−インドール
３−（４−ピリジル）−１Ｈ−インドールは、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）の細胞浸透性、選択的、およびＡＴＰ競合性阻害剤であり（ＩＣ５０＝２５μＭ）、Ｙ−２７６３２より強力でないことが示されており、そして以下のような構造（５）を有する：
【０１３３】
【化９】
2012520672.tif 000011
【０１３４】
３−（４−ピリジル）−１Ｈ−インドールは、以下の公表される論文に概説され、該論文はすべて、本明細書に援用される：
【０１３５】
【化１０】
2012520672.tif 000012
【０１３６】
（Ｆ）Ｎ−（４−ピリジル）−Ｎ’−（２，４，６−トリクロロフェニル）尿素（Ｒｈｏキナーゼ阻害剤ＩＩ）
Ｎ−（４−ピリジル）−Ｎ’−（２，４，６−トリクロロフェニル）尿素は、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）の強力で、選択的な、そしてＡＴＰ競合性の阻害剤であり（ＩＣ５０＝０．２μＭ）、以下のような構造（６）を有する：
【０１３７】
【化１１】
2012520672.tif 000013
【０１３８】
Ｎ−（４−ピリジル）−Ｎ’−（２，４，６−トリクロロフェニル）尿素は、以下の公表される論文に概説され、該論文は、本明細書に援用される：
【０１３９】
【化１２】
2012520672.tif 000014
【０１４０】
（Ｇ）アウロチオグルコース
アウロチオグルコースはまた金チオグルコースとしても知られ、式ＡｕＳＣ６Ｈ１１Ｏ５を有する：
【０１４１】
【化１３】
2012520672.tif 000015
【０１４２】
アウロチオグルコースは、ＰＫＣイオタ−Ｐａｒ６相互作用阻害剤である。この相互作用を破壊すると、非小細胞肺癌の形質転換増殖に必要なＲａｃ１シグナル伝達経路が破壊される。ＩＣ５０：  １μＭ。
【０１４３】
アウロチオグルコースは、ＩＬ−１機能アンタゴニストとして作用することによって、誘導されるＮＦ−κＢおよびＡＰ−１活性を阻害する。
【０１４４】
アウロチオグルコースは、関節炎による炎症および腫脹を減少させる際の作用に関して知られる。そして該分子は、成人または若年性関節リウマチの初期段階の治療に用いられてきている。
【０１４５】
アウロチオグルコース（ＡＴＧ）を含む金（Ｉ）含有化合物は、いくつかのセレノシステイン含有酵素の強力なｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害剤である（Smithら J Nutr. 1999 Jan;129(1):194-8）。アウロチオグルコースは、プロテインキナーゼＣが仲介する阻害に関連付けられる（Stallings-Mann Mら A novel small-molecule inhibitor of protein kinase C blocks transformed growth of non-small cell lung cancer cells. Cancer Res 2006; 66:1767-74およびBeverly A.Teicher. Protein Kinase C as a Therapeutic Target. Clin Cancer Res 2006;12(18) 2006年9月15日）。
【０１４６】
アウロチオグルコースは、ＩＬ−１機能アンタゴニストとして作用することによって、誘導されるＮＦ−κＢおよびＡＰ−１活性を阻害することが示されてきている（Williams, D H : Jeffery, L J : Murray, E J Biochim-Biophys-Acta. 1992 Oct 13; 1180(1): 9-14）。
【０１４７】
アウロチオグルコースはまた、ＴＰＡが誘導するＮＦ−カッパＢ核転座を阻害することも示されてきている（Yamashita Mら Inhibition of TPA-induced NF-kappaB nuclear translocation and production of NO and PGE2 by the anti-rheumatic gold compounds. J Pharm Pharmacol. 2003 Feb;55(2):245-51）。
【０１４８】
（Ｈ）ＬＹ２９４００２
ＬＹ２９４００２は、以下のような構造（７）を有する：
【０１４９】
【化１４】
2012520672.tif 000016
【０１５０】
ＬＹ２９４００２（ホスファチジルイノシトール３キナーゼ阻害剤）は、ホスファチジルイノシトール３（ＰＩ３）キナーゼの非常に選択的な阻害剤としてｉｎ  ｖｉｖｏで作用することが示されてきている。５０μＭの濃度で用いると、ＰＩ３キナーゼ活性を特異的に消失させる（ＩＣ５０＝０．４３μｇ／ｍｌ；  １．４０μＭ）が、他の脂質およびプロテインキナーゼ、例えばＰＩ４キナーゼ、ＰＫＣ、ＭＡＰキナーゼまたはｃ−Ｓｒｃを阻害しなかった（Vlahos, C.(1994) J. Biol. Chem. 269, 5241-5248）。
【０１５１】
他のＲＯＣＫ阻害剤には、Ｗｆ−５３６（Nakajimaら, Cancer Chemother Pharmacol. 52(4): 319-324(2003)）およびＹ−３０１４１（ＵＳ  ５４７８８３８を参照されたい）、ならびにＲＯＣＫのアンチセンス核酸、ＲＯＣＫのＲＮＡ干渉核酸（例えばｓｉＲＮＡ）が含まれる。
【０１５２】
正電荷
粒子またはマイクロキャリアーは、例えば中性ｐＨまたは生理学的に適切なｐＨ、例えばｐＨ７．４またはｐＨ７．２で、正電荷を含んでもよい。粒子は、陰イオン交換樹脂などのクロマトグラフィー樹脂を含んでもよい。
【０１５３】
正電荷の量は多様であることも可能であるが、いくつかの態様において、細胞が粒子に付着するのを可能にするために十分に高いことが意図される。例えば、粒子がアミン、例えば三級または四級アミンとカップリングすることによって荷電される場合、粒子上の電荷は、グラム乾燥物質（粒子の）あたり、約０．５〜４ミリ当量、例えばグラム乾燥物質（粒子の）あたり、約１〜３．５ミリ当量の間、またはグラム乾燥物質（粒子の）あたり、約１〜２ミリ当量の間の小イオン交換容量に対応しうる。
【０１５４】
正電荷は、粒子のｐＫａが７より大きく（例えば７．４より大きく、例えば７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５またはそれより大きく）なるようなものであってもよい。
【０１５５】
最大２０ｍｇ／ｍｌ粒子の濃度で、例えば硫酸プロタミンまたは臭化水素酸ポリ−Ｌ−リジンにカップリングすることによって、粒子を誘導体化してもよい。
【０１５６】
理論によって束縛されることは望ましくないが、本発明者らは、粒子上の正電荷の存在が、粒子への細胞の付着を補助すると考えている。
【０１５７】
粒子は、当該技術分野に知られる任意の手段を通じて正電荷を所持してもよい。粒子は、正荷電基を含んでもよいし、またはこれらを所持するように誘導体化されてもよい。
【０１５８】
粒子は、ジエチルアミノエチル−セルロース（ＤＥＡＥ−セルロース）またはその誘導体を含んでもよい。ＤＥＡＥ−セルロースは、炭水化物の−ＣＨ２ＯＨ基がイオン化可能三級アミン基に変換されているように、化学的に修飾されている、微小顆粒セルロースを含む。該粒子は中性ｐＨで正に荷電される。
【０１５９】
粒子は、Ｓｅｐｈａｄｅｘビーズ、例えばＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘを含んでもよい。粒子は、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅなどの共有架橋されていてもよいアガロースビーズ（すなわちＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）を含んでもよい。粒子は、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌを含んでもよい。ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｃｅｌおよびＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能である。粒子は、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  ＦｌｏｗまたはＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを含んでもよい。Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅの荷電基は、滴定不能正電荷を所持する四級アミンである。
【０１６０】
粒子が正電荷を所持するように粒子を誘導体化してもよい。例えば、粒子はそれに付着したアミン基を含んでもよい。アミン基は、一級アミン基、二級アミン基、三級アミン基または四級アミン基であってもよい。粒子をアミン含有化合物にカップリングすることによって、アミン基を粒子に付着させてもよい。カップリング法は当該技術分野に周知である。例えば、臭化シアンを使用することによって、アミンを粒子にカップリングしてもよい。架橋剤もまた使用可能である。これらは、２つの同一反応基を含有するホモ二官能性架橋剤、または２つの異なる反応基を含有するヘテロ二官能性架橋剤に分けられる。ヘテロ二官能性架橋剤は、連続コンジュゲート化を可能にし、重合を最小限にする。カップリングおよび架橋試薬は、いくつかの製造者から、例えばCalbiochemまたはPierce Chemical Companyから得られうる。カップリング前に粒子を活性化して、その反応性を増加させてもよい。クロロ酢酸を用いてコンパクトな粒子を活性化した後、ＥＤＡＣ／ＮＨＳ−ＯＨを用いてカップリングしてもよい。また、ジイソシアン酸ヘキサンを用いて粒子を活性化して、一級アミノ基を得てもよい。こうして活性化された粒子を、任意のヘテロ二官能性架橋剤と組み合わせて用いてもよい。特定の態様において、ジビニルスルホンを用いて、コンパクトな粒子を活性化する。こうして活性化されたコンパクトな粒子は、例えば、ペプチド上のアミノ基またはチオール基と反応可能な部分を含む。
【０１６１】
また、塩化トレシルを用いて粒子を活性化して、アミノ基またはチオール基と反応可能な部分を得てもよい。また、塩化シアンを用いて粒子を活性化して、アミノ基またはチオール基と反応可能な部分を得てもよい。
【０１６２】
Ｃｙｔｏｄｅｘ１は、正に荷電されたＮ，Ｎ−ジエチルアミノエチル基で置換される架橋デキストランマトリックスに基づく。荷電基は、マイクロキャリアーマトリックス全体に分布する。
【０１６３】
非荷電粒子
粒子またはマイクロキャリアーは、例えば中性ｐＨまたは生理学的に適切なｐＨ、例えばｐＨ７．４またはｐＨ７．２で、非荷電であるか、または電荷中性であってもよい。
【０１６４】
非荷電粒子の例には、ゼラチンまたはコラーゲン粒子が含まれる。例えば、Ｃｙｔｏｄｅｘ３は、架橋デキストランのマトリックスに化学的にカップリングされた変性コラーゲンの薄層からなる。
【０１６５】
マトリックスコーティング
ＲＯＣＫ阻害剤の使用が、マイクロキャリアー上のマトリックスコーティングの非存在下で、マイクロキャリアー上、多能性および多分化能細胞の培養および継代の成功を可能にすることを本発明者らが見出したことが、本発明の中心である。今日まで、多能性および多分化能細胞のマイクロキャリアー培養は、マトリックスコーティングを有する必要があると考えられてきており、そして本発明は、よりＧＭＰ準拠しやすい、コーティングされていないマイクロキャリアー培養への扉を開く。したがって、多くの態様において、マイクロキャリアーはコーティングされないか、またはマトリックスコーティングを持たないが、別の方式でコーティングされるかまたは誘導体化されて、マイクロキャリアー表面に電荷を提供してもよい。しかし、他の態様において、以下に記載するように、マトリックスコーティングを含むことが可能である。
【０１６６】
したがって、粒子をマトリックスでコーティングしてもよく、本文書の文脈では、マトリックスは、表面上などで、粒子に付着する物質の層（例えば薄層またはフィルム）を指す。マトリックスは、細胞の増殖を補助することが可能な生物学的に適合したまたは生理学的に適切なマトリックスを含んでもよい。マトリックスは、細胞増殖のための支持体を含んでもよい。
【０１６７】
マトリックスは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の構成要素を含んでもよい。幹細胞増殖を補助可能であるものなどのＥＣＭの任意の既知の構成要素を用いてもよい。細胞外マトリックスの構成要素が当該技術分野に知られ、そして例えば、Ａｌｂｅｒｔｓら（２００２），Molecular Biology of the Cell，第ＩＶ章、および該文献に引用される参考文献に記載される。
【０１６８】
慣用的な手段を通じて、ＥＣＭ構成要素を粒子に付着させるかまたはカップリングするかまたはコーティングしてもよい。例えば、上述の任意のカップリング試薬および架橋剤を用いて、粒子にＥＣＭ構成要素をカップリングしてもよい。
【０１６９】
ＥＣＭ構成要素は、巨大分子、例えば多糖、タンパク質、プロテオグリカン、糖タンパク質、通常はプロテオグリカンの形でタンパク質に共有結合して見出されるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、エラスチン、フィブロネクチン、およびラミニンを含む線維状タンパク質、コラーゲン（例えばコラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶ）などを含んでもよい。
【０１７０】
マトリックスコーティングは、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を含んでもよい。グリコサミノグリカンは、反復二糖単位で構成される、非分枝多糖鎖を含む。この反復二糖中の２つの糖の一方は、常に、アミノ糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）であり、大部分の場合、硫酸化されている。第二の糖は通常、ウロン酸（グルクロン酸またはイズロン酸）である。
【０１７１】
マトリックスコーティングは、ヒアルロナン（ヒアルロン酸またはヒアルロネートとも呼ばれる）またはその誘導体を含んでもよい。ウシ硝子体液などの、いくつかの供給源のいずれからヒアルロン酸を得てもよい。ヒアルロン酸ナトリウムなどのヒアルロン酸の塩または塩基を使用してもよい。これは連鎖球菌由来であってもよい。
【０１７２】
マトリックスコーティングは、ラミニンを含んでもよい。マトリックスコーティングは、フィブロネクチンを含んでもよい。マトリックスコーティングは、ビトロネクチンを含んでもよい。
【０１７３】
マトリックスコーティングは、例えば、プロテオグリカンとしてタンパク質に連結されるような、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸およびケラタン硫酸などのＧＡＧを含んでもよい。ＥＣＭ構成要素は、アグリカン、デコリン等を含んでもよい。
【０１７４】
マトリックスコーティングは、ヘパランあるいは塩基または塩などのその誘導体を含んでもよい。マトリックスコーティングは、ヘパラン硫酸プロテオグリカンを含んでもよい。ウシ腎臓などのいくつかの供給源のいずれからヘパラン硫酸プロテオグリカンを得てもよい。
【０１７５】
マトリックスコーティングは、デキストラン、例えばデキストラン硫酸またはデキストラン硫酸ナトリウムを含んでもよい。マトリックスコーティングは、フィブロネクチン、ラミニン、ナイドジェンまたはタイプＩＶコラーゲンを含んでもよい。マトリックスコーティングは、コンドロイチン硫酸を含んでもよい。
【０１７６】
マトリックスは、ゼラチン、ポリオルニチン、またはフィブロネクチンのＲＧＤ結合ドメインの結合モチーフを含んでもよい。
【０１７７】
マトリックスコーティングは、多様な比率で、これらの構成要素の任意の２以上の混合物を含んでもよい。マトリックスコーティングは、ＥＣＭの精製されたかまたは実質的に精製された構成要素を含んでもよい。マトリックス構成要素は、ＥＣＭの部分的に精製された構成要素を含んでもよい。マトリックスはＭａｔｒｉｇｅｌなどのＥＣＭ抽出物を含んでもよい。
【０１７８】
細胞培養は、異なるマトリックスコーティングを有する粒子を含んでもよい。例えば、第一の粒子集団は、上述のものより選択される第一のマトリックスコーティングを有し、そして第二の粒子集団は、上述のものより選択される第二のマトリックスコーティングを有する。
【０１７９】
Ｍａｔｒｉｇｅｌ
Ｍａｔｒｉｇｅｌを含むマトリックスコーティングで粒子をコーティングしてもよい。
【０１８０】
Ｍａｔｒｉｇｅｌは、マウス腫瘍細胞によって分泌され、そしてＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（米国マサチューセッツ州ベッドフォード）によって販売される、ゼラチン性タンパク質混合物の商用名（trade name）である。この混合物は、多くの組織で見られる複雑な細胞外環境に似ており、そして細胞生物学者によって、細胞培養支持体として用いられている。
【０１８１】
ＢＤ  ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭマトリックスは、ＥＣＭタンパク質が豊富な腫瘍であるＥＨＳマウス肉腫から抽出された可溶化基底膜調製物である。主な構成要素は、ラミニン（約５６％）、続いてコラーゲンＩＶ（約３１％）、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン１（約８％）である。室温では、ＢＤ  ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭマトリックスは重合して、哺乳動物細胞性基底膜に似た、生物学的に活性であるマトリックス物質を産生する。
【０１８２】
一般的な実験室法は、少量の冷却（４℃）Ｍａｔｒｉｇｅｌをプラスチック組織培養実験機器などの表面上に分配するものである。３７℃（体温）でインキュベーションした際、Ｍａｔｒｉｇｅｌタンパク質は自己アセンブリして、表面を覆う薄いフィルムを生じる。
【０１８３】
Ｍａｔｒｉｇｅｌは、細胞形態、生化学的機能、遊走または浸潤、および遺伝子発現に関して生理学的に適切な環境を提供する。
【０１８４】
Ｍａｔｒｉｇｅｌが複雑な細胞の振る舞いを刺激する能力は、不均一な組成を有することによるものである。Ｍａｔｒｉｇｅｌの主な構成要素は、ラミニンおよびコラーゲンなどの構造タンパク質であり、これらは、培養細胞が天然環境で出会う接着性のペプチド配列を、培養細胞に提示する。多くの細胞タイプの分化および増殖を促進する増殖因子もまた存在する。Ｍａｔｒｉｇｅｌは、以下の増殖因子を含む（濃度範囲、平均濃度）：  ＥＧＦ（０．５〜１．３ｎｇ／ｍｌ、０．７ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（＜０．１〜０．２ｐｇ／ｍｌ、未知）、ＮＧＦ（＜０．２ｎｇ／ｍｌ、未知）、ＰＤＧＦ（５〜４８ｐｇ／ｍｌ、１２ｐｇ／ｍｌ）、ＩＧＦ−１（１１〜２４ｎｇ／ｍｌ、１６ｎｇ／ｍｌ）、ＴＧＦ−β（１．７〜４．７ｎｇ／ｍｌ、２．３ｎｇ／ｍｌ）。Ｍａｔｒｉｇｅｌは、少量の中に多数の他のタンパク質を含有する。
【０１８５】
代替マトリックスコーティング
いくつかの態様において、細胞を１回以上の継代（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回以上の継代）に関して、第一のマトリックスコーティングを有する粒子上で培養し、その後、１回以上の継代（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回以上の継代）に関して、異なる（第二の）マトリックスコーティングを有する粒子にトランスファーしてもよい。場合によって、次いで、細胞を、第二のコーティングとは異なるマトリックスコーティングを有する粒子に、例えば第一のマトリックスコーティングに戻して、または別のマトリックスコーティングに、あるいはコーティングされていない粒子にトランスファーしてもよい。
【０１８６】
粒子組成
本明細書に記載する方法および組成物において、幹細胞を粒子またはマイクロキャリアー上で増殖させる。この文書において該用語を用いる場合、「粒子」は、幹細胞がそれに付着するかまたはその上で増殖することが可能な任意の支持体を含む。粒子は、以下に記載するように、任意の形状または配置であってもよい。
【０１８７】
粒子は、IUPAC Compendium of Chemical Terminology（第２版，１９９２，Ｖｏｌ．６４，ｐ．１６０）に記載されるようなマイクロキャリアーを含んでもよい。
【０１８８】
粒子は例えば付着ポイントまたは幹細胞の支持体として、上述のような目的を果たすことが可能である物理的特性を有する限り、任意の物質を含んでもよい。したがって、粒子は、この目的のため、硬直性、剛性、可鍛性、固体、多孔性または別の性質の物質を含んでもよい。粒子は固体物質、または半固体、ゲル等の物質を含んでもよい。
【０１８９】
物質は、正電荷および／またはマトリックスコーティングの付着を可能にするために、少なくとも反応性であるか、あるいはアクチベーターによって反応性にされることが可能であるが、別の方式で、一般的に不活性の物質を含んでもよい。粒子は、１より多い物質が粒子を構成可能であるように、複合体を含んでもよい。例えば、粒子のコアは表面部分とは異なる物質を含んでもよい。したがって、粒子コアは、一般的に不活性の物質を含んでもよく、一方、表面部分は、マトリックスまたは正電荷の付着または化学的カップリングに関して反応性である物質を含んでもよい。粒子は天然起源であってもよいし、または合成でもよい。天然および合成物質、ならびにこれらを得るための供給源は、当該技術分野に周知である。粒子は、少なくともある程度の機械的耐性、化学的攻撃または熱処理に対する少なくともある程度の耐性、あるいはこれらの任意の組み合わせを有してもよい。
【０１９０】
別の態様において、粒子は、「非生物学的」物体を含んでもよく、この用語によって、本発明者らは、細胞性物質を含まないかまたは実質的に含まない粒子を意味する。したがって、こうした非生物学的または非細胞性粒子は、合成物質、または非天然存在物質を含んでもよい。多様な形状の多様な粒子が当該技術分野に知られ、そしてこれらには、例えば多様な種類のビーズが含まれる。粒子の態様には、マイクロビーズ、例えばアガロースビーズ、ポリアクリルアミドビーズ、シリカゲルビーズ等が含まれる。例えば、粒子を作製する物質は、プラスチック、ガラス、セラミック、シリコーン、ゼラチン、デキストラン、セルロース、ヒドロキシル化メタクリレート、ポリスチレン、コラーゲンまたはその他のものを含んでもよい。例えば、粒子は、セルロースまたは誘導体、例えばＤＥＡＥ−セルロース（以下に記載するとおり）で作製されてもよい。粒子は、セルロース、修飾親水性ビーズおよび炭素に基づくマイクロキャリアーを含んでもよい。
【０１９１】
粒子は、商業的に入手可能なマトリックスまたはキャリアー、例えばビーズまたはマイクロビーズを含んでもよい。粒子は、クロマトグラフィーマトリックスとして使用するために販売されている樹脂、例えば陰イオン交換樹脂を含んでもよい。
【０１９２】
粒子は、セルロースマイクロキャリアーを含んでもよい。粒子は、ＤＥ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）、ＤＥ−５３（Ｗｈａｔｍａｎ）またはＱＡ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）を含んでもよい。粒子は、親水性マイクロキャリアー、ヒドロキシル化メタクリル酸マトリックスマイクロキャリアーまたは誘導体化親水性ビーズ化マイクロキャリアーを含んでもよい。粒子は、ＴＳＫゲル・トレシル−５Ｐｗ（Ｔｏｓｏｈ）またはＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＡＦ−トレシル−６５０（Ｔｏｓｏｈ）を含んでもよい。粒子はマクロ多孔性またはミクロ多孔性Ｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリアー、例えばＳＭ１０１０（Ｂｌｕｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）またはＳＨ１０１０（Ｂｌｕｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）を含んでもよい。
【０１９３】
粒子は、デキストランに基づくマイクロキャリアーであってもよい。粒子は、Ｃｙｔｏｄｅｘ  １（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）またはＣｙｔｏｄｅｘ  ３（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含んでもよい。Ｃｙｔｏｄｅｘ１は、正に荷電したＮ，Ｎ−ジエチルアミノエチル基で置換された架橋デキストランマトリックスに基づく。荷電基は、マイクロキャリアーマトリックス全体に分布する。Ｃｙｔｏｄｅｘ  ３は、架橋デキストランのマトリックスに化学的にカップリングした変性コラーゲンの薄層からなる。
【０１９４】
粒子はポリスチレンに基づくマイクロキャリアーであってもよい。粒子は、ＨｉｌｌｅｘまたはＨｉｌｌｅｘ  ＩＩ（SoloHill Engineering, Inc.）を含んでもよい。ＨｉｌｌｅｘおよびＨｉｌｌｅｘ  ＩＩは、陽イオン性トリエチルアンモニウムコーティングを有する、修飾ポリスチレンマイクロキャリアーである。
【０１９５】
細胞増殖を可能にする前に、粒子を処理してもよい。本文書の別の箇所に記載するように、より強い接着、電荷の利用可能性、生物学的適合性などを達成するため、こうした処理を試みてもよい。
【０１９６】
ＤＥ−５３、ＤＥ−５２およびＱＡ−５２などのセルロースマイクロキャリアーは棒の形状であってもよい。
【０１９７】
細胞培養は、１より多いタイプの粒子の混合物を含んでもよい。例えば、第一の粒子集団（例えばコンパクトな形状の粒子）および第二の粒子集団（例えば伸長した形状の粒子）。いくつかの態様において、第一の細胞タイプ、例えばフィーダー細胞を第一の粒子に付着させてもよく、そして第二の細胞タイプ、例えばｈＥＳＣを第二の粒子に付着させてもよい。各粒子タイプは、同じまたは異なるマトリックスコーティングを有してもよい。場合によって一方または両方の粒子タイプがマトリックスコーティングを持たなくてもよい。
【０１９８】
ビーズ
使用に適したビーズまたはマイクロビーズには、ゲルクロマトグラフィーに用いるもの、例えばゲルろ過媒体、例えばＳｅｐｈａｄｅｘが含まれる。この種類の適切なマイクロビーズには、本文書の別の箇所に説明するように、サイズに関して適合する限り、４０〜１２０のビーズサイズを有するＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２７、１０３−９）、４０〜１２０μｍのビーズサイズを有するＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１５（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２７、１０４−７）、２０〜５０μｍのビーズサイズを有するＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２７、１０６−３）、２０〜８０μｍのビーズサイズを有するＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２７、１０７−１）、５０〜１５０μｍのビーズサイズを有するＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２７、１０９−８）、１００〜３００μｍのビーズサイズを有するＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２７、１１０−１）、２０〜５０μｍのビーズサイズを有するＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２７、１１２−８）、２０〜８０μｍのビーズサイズを有するＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２７、１１３−６）、５０〜１５０μｍのビーズサイズを有するＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２７、１１４−４）、１００〜３００μｍのビーズサイズを有するＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２７、１１５−２）、２０〜５０μｍのビーズサイズを有するＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２７、１１６−０）、４０〜１２０μｍのビーズサイズを有するＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２７、１１７−９）、２０〜５０μｍのビーズサイズを有するＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１００（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２７、１１８−７）、４０〜１２０μｍのビーズサイズを有するＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１００（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２７、１１９−５）、４０〜１２０μｍのビーズサイズを有するＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１５０（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２７、１２１−７）、および４０〜１２０μｍのビーズサイズを有するＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２００（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２７、１２３−３）が含まれる。
【０１９９】
例えば液体クロマトグラフィーで用いられるようなＳｅｐｈａｒｏｓｅビーズもまた使用可能である。例は、例えば、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ（カタログ番号１７−５０７２−０１）、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ（カタログ番号１７−５０７２−０４）、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ（カタログ番号１７−５０７２−６０）、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ（カタログ番号１７−５０７３−０１）、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ（カタログ番号１７−５０７３−０４）およびＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ（カタログ番号１  １７−５０７３−６０）などのＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ（ドイツ・フライベルグ）より入手可能な、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｓ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅおよびＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズである。
【０２００】
粒子形状
粒子は細胞増殖に適した任意の形状、例えばコンパクトな形状または伸長した形状を含んでもよい。
【０２０１】
コンパクトな形状
コンパクトな形状の例は、一般的に球状粒子、楕円形粒子、または顆粒形粒子である。
【０２０２】
「コンパクトな」によって、本発明者らは、一般的に伸長していない形状を意味する。言い換えると、「コンパクトな」形状は、一般的に、伸長していないかまたは伸展しておらず、あるいはいかなる１つの方向にも伸展していない。コンパクトな形状は、一般的に広がっていないか、あるいは長くもまたは細長くもないものであってもよい。したがって、こうした「コンパクトな形状」は、一般的に類似であるか、または大きくは異ならない線寸法（linear dimensions）を一般的に所持する。
【０２０３】
したがって、コンパクトな形状の任意の２つの寸法の比は、５：１以下、例えば４：１以下、例えば３：１、２．５：１、２．４：１、２．３：１、２．２：１、２．１：１、２：１、１．９：１、１．８：１、１．７：１、１．６：１、１．５：１、１．４：１、１．３：１、１．２：１、１．１：１以下であってもよい。例えば、いかなる２対の寸法も、５：１以上の比を持ちえない。
【０２０４】
いくつかの態様において、コンパクトな形状の最長の寸法は、コンパクトな形状の最短の寸法の５倍未満である。他の態様において、コンパクトな形状の最長の寸法は、最短の寸法より有意に長くなく、すなわち形状は比較的均一である。
【０２０５】
「最長の寸法」は、本文書で用いた際、主軸、すなわち粒子を通じて引くことが可能な最長の線を含有する軸の長さを意味するよう解釈されるべきである。同様に、「最短の寸法」は、本文書で用いた際、短軸、すなわち粒子を通じて引くことが可能な最短の線を含有する軸の長さである。
【０２０６】
線寸法がほぼ同じであるかまたは匹敵するか、あるいは最長の寸法対最短の寸法の比が５：１未満である、均一な形状が、本明細書に記載するコンパクトな粒子に含まれる。上記の比は、したがって、最長の寸法対最短の寸法の比に関する。いくつかの態様において、２寸法の比（例えば最長の寸法対最短の寸法）は、１．１：１未満、例えば１：１（すなわち均一なまたは一律な形状）である。
【０２０７】
したがって、適用可能な場合、粒子の長さは、その幅または直径の５ｘ未満、例えばその幅または直径の４ｘ未満、例えば３ｘ未満、例えば２ｘ未満、またはそれより小さくてもよい。
【０２０８】
コンパクトな形状は、正多面体（regular solid）、球体、スフェロイド、偏球、扁平スフェロイド、楕円体、立方体、円錐体、円柱、または多面体であってもよい。多面体には、単純多面体または正多面体（regular polyhedra）が含まれる。多面体には、例えば六面体、ホリヘドロン（holyhedron）、キュボイド、デルタ多面体、五面体、十四面体、多面体、テトラフレクサゴン（tetraflexagon）、ねじれ双角錐、一部切除（truncated）多面体、ジオデシックドーム、七面体および六十面体が含まれる。上に提供する定義にしたがって、「コンパクト」であるような、上記形状のいずれを用いてもよい。例えば、形状が扁平スフェロイドを含む場合、これは、スフェロイドがコンパクトであり、そして伸長していないように、適切な扁平さを有する。
【０２０９】
いくつかの態様において、コンパクトな形状は、寸法が上に提供するとおりである限り、バルーン形、葉巻形、ソーセージ形、ディスク形、涙形、ボール形または楕円形を含んでもよい。コンパクトな形状はまた、球形、立方体形、キュボイド形、タイル形、卵形、楕円形、ディスク形、セル形、ピル形、カプセル形、平たい円柱形、豆形、ドロップ形、球状形、エンドウ豆形、ペレット形も含んでもよい。
【０２１０】
伸長した形状
粒子は、一般的に伸長した形状を有してもよい。伸長した形状の例には、一般的に、棒の形状の粒子、円柱の形状の粒子、またはスティックの形状の粒子がある。伸長した粒子は、ホロー・ファイバーを含んでもよい。
【０２１１】
「伸長した」によって、本発明者らは、一般的にコンパクトでない形状を意味する。言い換えると、「伸長した」形状は、一般的に、別のものに比較して、１つの寸法が伸展しているものである。伸長した形状は、広がっているか、長いかまたは細長いものであってもよい。したがって、こうした「伸長した形状」は、一般的に、多かれ少なかれ、互いに異なる線寸法を所持する。
【０２１２】
したがって、伸長した形状の任意の２つの寸法の比は、５：１以上、４：１以下、例えば、１．１：１以上、１．２：１以上、１．３：１以上、１．４：１以上、１．５：１以上、１．６：１以上、１．７：１以上、１．８：１以上、１．９：１以上、２：１以上、２．１：１以上、２．２：１以上、２．３：１以上、２．４：１以上、２．５：１以上、３：１以上、４：１以上、または５：１以上であってもよい。
【０２１３】
例えば、任意の２対の寸法が５：１以上の比を有してもよい。したがって、いくつかの態様において、伸長した形状の最長の寸法は、伸長した形状の最短の寸法の５倍より大きい。
【０２１４】
したがって、適用可能な場合、粒子の長さは、その幅または直径の２ｘより大きく、例えばその幅または直径の３ｘより大きく、例えば４ｘより大きく、例えば５ｘより大きく、または１０ｘより大きくてもよい。
【０２１５】
伸長したまたは棒の形状のマイクロキャリアーが、本発明の方法で使用するのに特に好ましい。これらは、細胞−マイクロキャリアー凝集体生成のため、より優れた付着マトリックスを提供することが観察されている。理論によって限定されず、または束縛されないが、棒の形状のマイクロキャリアーの長軸は、攪拌中に安定である、数時間以内の細胞−キャリアー凝集を可能にする、付着に利用可能な広い表面積を有するため、ビーズ（球状）マイクロキャリアーに比較して、優れた付着を提供する。
【０２１６】
粒子サイズ
粒子が連続増殖を補助するため、これらは細胞が粒子上で増殖することを可能にするサイズを有してもよい。粒子サイズはまた、他の粒子上で増殖している他の細胞と、細胞が凝集することも可能にする。例えば、粒子サイズが、少なくとも１つの寸法が霊長類またはヒト幹細胞の寸法と適合するものである必要がある。
【０２１７】
粒子サイズを選択し、幹細胞が付着しそして増殖するのを可能にし、そして増殖、生存度、幹細胞の生物学的性質の保持、核型などの任意のいくつかのパラメーターをアッセイすることによって、実験的に粒子サイズを選択してもよい。
【０２１８】
例として、粒子は、一般的に球状または顆粒状の形状を有するコンパクトなマイクロキャリアーを含んでもよい。これが当てはまる場合、コンパクトなマイクロキャリアーは、約２０μｍ〜約２５０μｍの間の範囲の寸法を有してもよい。
【０２１９】
コンパクトなマイクロキャリアーに関する寸法範囲の上限は、約２５０μｍ、約２４０μｍ、約２３０μｍ、約２２０μｍ、約２１０μｍ、約２００μｍ、約１９０μｍ、約１８０μｍ、約１７０μｍ、約１６０μｍ、約１５０μｍ、約１４０μｍ、約１３０μｍ、約１２０μｍ、約１１０μｍ、約１００μｍ、約９０μｍ、約８０μｍ、約７０μｍ、約６０μｍ、約５０μｍ、約４０μｍまたは約３０μｍであってもよい。
【０２２０】
コンパクトなマイクロキャリアーの寸法範囲の下限は、約２０μｍ、約３０μｍ、４０μｍ、約５０μｍ、約６０μｍ、約７０μｍ、約８０μｍ、約９０μｍ、約１００μｍまたは約１１０μｍであってもよい。
【０２２１】
コンパクトなマイクロキャリアーは、１２０μｍ〜２０μｍ、１１０μｍ〜３０μｍ、１００μｍ〜４０μｍ、９０μｍ〜５０μｍ、８０μｍ〜４０μｍ、７０μｍ〜５０μｍの間または９０〜３０μｍ、８０〜４０μｍ、７０〜４０μｍ、７０〜３０μｍ、６０〜４０μｍ、６０〜３０μｍ、６０〜５０μｍ、５０〜４０μｍ、５０〜３０μｍ、５０〜５μｍ、５０〜１０μｍ、６０〜１０μｍ、７０〜１０μｍ、６０〜２０μｍ、７０〜２０μｍの間の寸法を有してもよい。
【０２２２】
コンパクトなマイクロキャリアーは、約２０μｍ、約３０μｍ、４０μｍ、約５０μｍ、約６０μｍ、約６５μｍ、約７０μｍ、約８０μｍ、約９０μｍ、約１００μｍ、約１１０μｍまたは約１２０μｍの寸法を有してもよい。
【０２２３】
コンパクトなマイクロキャリアーの寸法は、例えば、約６５μｍであってもよい。
【０２２４】
寸法はマイクロキャリアーの直径であってもよい。
【０２２５】
コンパクトな粒子は、例えば、親水性マイクロキャリアー、ヒドロキシル化メタクリル酸マトリックスマイクロキャリアーまたは誘導体化親水性ビーズ化マイクロキャリアー、例えばＴＳＫゲル・トレシル−５Ｐｗ（Ｔｏｓｏｈ）またはＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＡＦ−トレシル−６５０（Ｔｏｓｏｈ）を含んでもよい。
【０２２６】
ＴＳＫゲル・トレシル−５Ｐｗに関する情報は：
http://www.separations.us.tosohbioscience.com/Products/HPLCColumns/ByMode/Affinity/TSKgel+Tresyl-5PW.htm
に見出されうる。
【０２２７】
Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＡＦ−トレシル−６５０に関する情報は：
http://www.separations.us.tosohbioscience.com/Products/ProcessMedia/ByMode/AFC/ToyopearlAF-Tresyl-650.htm
に見出されうる。
【０２２８】
別の例として、粒子は、一般的に棒または円柱形状を有する伸長したマイクロキャリアーを含んでもよい。これが当てはまる場合、伸長したマイクロキャリアーは、約４００μｍ〜約５０μｍの間の範囲の最長の寸法を有してもよい。
【０２２９】
伸長したマイクロキャリアーに関する最長の寸法範囲の上限は、約２０００μｍ、約１９００μｍ、約１８００μｍ、約１７００μｍ、約１６００μｍ、約１５００μｍ、約１４００μｍ、約１３００μｍ、約１２００μｍ、約１１００μｍ、約１０００μｍ、約９００μｍ、約８００μｍ、約７００μｍ、約６００μｍ、約５００μｍ、約４００μｍ、約３９０μｍ、約３８０μｍ、約３７０μｍ、約３６０μｍ、約３５０μｍ、約３４０μｍ、約３３０μｍ、約３２０μｍ、約３１０μｍ、約３００μｍ、約２９０μｍ、約２８０μｍ、約２７０μｍ、約２６０μｍ、約２５０μｍ、約２４０μｍ、約２３０μｍ、約２２０μｍ、約２１０μｍ、約２００μｍ、約１９０μｍ、約１８０μｍ、約１７０μｍ、約１６０μｍ、約１５０μｍ、約１４０μｍ、約１３０μｍ、約１２０μｍ、約１１０μｍ、約１００μｍ、約９０μｍ、約８０μｍ、約７０μｍ、約６０μｍまたは約５０μｍであってもよい。
【０２３０】
伸長したマイクロキャリアーの最長の寸法範囲の下限は、約２０μｍ、約３０μｍ、約４０μｍ、約５０μｍ、約６０μｍ、約７０μｍ、約８０μｍ、約９０μｍ、約１００μｍ、約１１０μｍ、約１２０μｍ、約１３０μｍ、約１４０μｍ、約１５０μｍ、約１６０μｍ、約１７０μｍ、約１８０μｍ、約１９０μｍ、約２００μｍ、約２１０μｍ、約２２０μｍ、約２３０μｍ、約２４０μｍ、約２５０μｍ、約２６０μｍ、約２７０μｍ、約２８０μｍ、約２９０μｍ、約３００μｍ、約３１０μｍ、約３２０μｍ、約３３０μｍ、約３４０μｍ、約３５０μｍ、約３６０μｍ、約３７０μｍ、約３８０μｍまたは約３９０μｍであってもよい。
【０２３１】
伸長したマイクロキャリアーは、２０００μｍ〜２０μｍの間、例えば４００μｍ〜５０μｍ、３９０μｍ〜６０μｍ、３８０μｍ〜７０μｍ、３７０μｍ〜８０μｍ、３６０μｍ〜９０μｍ、３５０μｍ〜１００μｍ、３４０μｍ〜１１０μｍ、３３０μｍ〜１２０μｍ、３２０μｍ〜１３０μｍ、３１０μｍ〜１４０μｍ、３００μｍ〜１５０μｍ、２９０μｍ〜１６０μｍ、２８０μｍ〜１７０μｍ、２７０μｍ〜１８０μｍ、２６０μｍ〜１９０μｍ、２５０μｍ〜２００μｍ、２４０μｍ〜２１０μｍまたは２３０μｍ〜２２０μｍの間の最長の寸法を有してもよい。伸長したマイクロキャリアーの最長の寸法は、例えば、約１９０μｍ、２００μｍ、２１０μｍ、２２０μｍ等であってもよい。
【０２３２】
伸長したマイクロキャリアーは、１０μｍ〜５０μｍの間の範囲の最短の寸法を有してもよい。伸長したマイクロキャリアーは、約１０μｍ、約１５μｍ、約２０μｍ、約２５μｍ、約３０μｍ、約３５μｍ、約４０μｍまたは約４５μｍの最短の寸法を有してもよい。
【０２３３】
伸長したマイクロキャリアーは、ほぼ円形または楕円形の横断面を有する円柱または棒の形状であってもよく、その最短の直径は、約５μｍ〜約５０μｍの範囲、例えば、約１０μｍ、約１５μｍ、約２０μｍ、約２５μｍ、約３０μｍ、約３５μｍ、約４０μｍ、または約４５μｍの１つであってもよい。直径は：約５μｍ〜２０μｍ、約１０μｍ〜２５μｍ、約１５μｍ〜３０μｍ、約２０μｍ〜３５μｍ、約２５μｍ〜４０μｍ、約３０μｍ〜４５μｍ、約３５μｍ〜５０μｍの１つの間であってもよい。
【０２３４】
伸長した粒子は、例えば、セルロース円柱状マイクロキャリアー、例えばＤＥ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）、ＤＥ−５３（Ｗｈａｔｍａｎ）またはＱＡ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）を含んでもよい。
【０２３５】
任意の所定のマイクロキャリアーのサイズおよび寸法は、バッチ内でまたはバッチ間で多様でありうる。例えばＤＥ−５３棒形状セルロースマイクロキャリアーに関して、本発明者らはバッチ内でマイクロキャリアーの長さおよび直径を測定し、そしてキャリアーの長さが５０〜２５０μｍの間（１３０±５０μｍの平均の長さ）であり、そしてキャリアーの直径が１７μｍ〜少なくとも５０μｍの間（３５±７μｍの平均直径）でありうることを見出した。
【０２３６】
粒子は、多孔性または非多孔性であってもよい。多孔性粒子は、培地が増殖領域内をそして該領域全体を循環することを可能にし、そしてこれが細胞成長を補助しうる。例えば、粒子は、マクロ多孔性またはミクロ多孔性ｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリアーを含んでもよい。粒子は、ＳＭ１０１０（Ｂｌｕｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）またはＳＨ１０１０（Ｂｌｕｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）を含んでもよい。
【０２３７】
幹細胞培養
例えば実施例に示すように、幹細胞を培養する任意の適切な方法を、本明細書に記載する方法および組成物において用いてもよい。
【０２３８】
任意の適切な容器を用いて、本明細書に記載する方法および組成物にしたがって、幹細胞を増殖させてもよい。適切な容器には、米国特許公報ＵＳ２００７／０２６４７１３（Terstegge）に記載されるものが含まれる。
【０２３９】
容器には、例えば、バイオリアクターおよびスピナーが含まれてもよい。本文書で用いる際、用語「バイオリアクター」は、真核細胞、例えば動物細胞または哺乳動物細胞を、例えば大規模に培養するのに適した容器である。制御バイオリアクターの典型的な培養体積は、２０ｍｌ〜５００ｍｌの間である。
【０２４０】
バイオリアクターは、１以上の条件、例えば酸素分圧を調節または監視可能な、制御バイオリアクターを含んでもよい。これらの条件を測定しそして制御するためのデバイスが当該技術分野に知られる。例えば、酸素分圧に関して、酸素電極を用いてもよい。選択するガス混合物（例えば空気、あるいは空気および／または酸素および／または窒素および／または二酸化炭素の混合物）の量および組成を通じて、酸素分圧を制御してもよい。酸素分圧を測定しそして制御するのに適したデバイスは、Bailey, J E.(Bailey, J E., Biochemical Engineering Fundamentals, 第2版, McGraw-Hill, Inc. ISBN 0-07-003212-2 Higher Education, (1986)）またはJackson A T. Jackson A T., Verfahrenstechnik in der Biotechnologie, Springer, ISBN 3540561900(1993)）に記載される。
【０２４１】
他の適切な容器にはスピナーが含まれる。スピナーは、ガラスボール攪拌装置、羽根車攪拌装置、および他の適切な攪拌装置などの多様な攪拌機構を用いて攪拌可能な、制御または非制御バイオリアクターである。スピナーの培養体積は、典型的には２０ｍｌ〜５００ｍｌの間である。回転ボトルは、４００〜２０００ｃｍ２の間の培養面積を有するプラスチックまたはガラス製の丸い細胞培養フラスコである。これらのフラスコの全内表面に沿って、細胞を培養する；細胞は培地で覆われ、これは「回転」運動によって達成され、すなわちボトルをそれ自体の個々の軸の周りに回転させる。
【０２４２】
あるいは、培養は静的であってもよく、すなわち培養／培地の能動的な攪拌を使用しなくてもよい。培養の攪拌を減少させることによって、細胞／マイクロキャリアーの凝集塊の形成が可能になりうる。何らかの攪拌を使用して、培養細胞上への培地の分布および流動を促してもよいが、凝集塊形成を実質的に妨害しないようにこの攪拌を適用してもよい。例えば、低いｒｐｍ、例えば３０ｒｐｍ未満または２０ｒｐｍ未満の攪拌を使用してもよい。
【０２４３】
継代による増殖
本明細書に記載する方法および組成物は、培養中の継代または分割を含んでもよい。該方法は、連続的なまたは継続的な継代を伴ってもよい。
【０２４４】
「継続的な」または「連続的な」によって、本発明者らは、幹細胞が継代される、例えば増殖中のマイクロキャリアーから剥がされ、そして他のマイクロキャリアーまたは粒子にトランスファーされるのを可能にする方式で該細胞のマイクロキャリアー上での増殖を、本発明者らの方法が可能にすることを意味し、そしてこのプロセスを少なくとも１回、例えば２回、３回、４回、５回等、反復してもよいことを意味する（以下に示すとおり）。いくつかの場合、これを任意の回数、例えば不確定にまたは無限に反復してもよい。最も好ましくは、プロセスを５回以上、例えば６回以上、７回以上、８回以上、９回以上、１０回以上、１１回以上、１２回以上、１３回以上、１４回以上、１５回以上、１６回以上、１７回以上、１８回以上、１９回以上、２０回以上、２１回以上、２２回以上、２３回以上、２４回以上、２５回以上、反復する。また、用語「継続的な」または「連続的な」を用いて、事象、例えば細胞増殖の実質的に中断されない延長を意味してもよい。例えば、本発明者らの方法は、増殖または培養を終結させる必要を伴わずに、幹細胞を任意の望ましい世代数まで拡大することを可能にする。
【０２４５】
培養中の細胞を、支持体またはフラスコから解離させ、そして組織培地内に希釈しそして再プレーティングすることによって、「分割する」か、継代培養するか、または継代してもよい。
【０２４６】
粒子上で増殖している細胞を、粒子培養に継代し直してもよい。あるいは、これらを慣用的な（２Ｄ）培養に継代し直してもよい。プレート上で増殖している組織培養細胞を粒子培養に継代してもよい。これらの方法を各々、以下により詳細に記載する。
【０２４７】
用語「継代」は、一般的に、細胞培養のアリコットを取り、細胞を完全にまたは部分的に解離させ、希釈し、そして培地に接種するプロセスを指してもよい。継代を１回以上反復してもよい。アリコットは、細胞培養のすべてまたは一部を含んでもよい。アリコットの細胞は、完全に集密、部分的に集密、または集密でなくてもよい。継代は、工程の以下の順列の少なくともいくつかを含んでもよい：吸引、リンス、トリプシン処理、インキュベーション、除去、急冷（quenching）、再植え付けおよびアリコット。ＵＣサンディエゴ校のＨｅｄｒｉｃｋ研究室によって公表されたプロトコルを用いてもよい（http://hedricklab.ucsd.edu/Protocol/COSCell.html）。
【０２４８】
当該技術分野に知られる機械的または酵素的手段などの任意の適切な手段によって、細胞を解離させてもよい。機械的解離によって、例えば細胞スクレーパーまたはピペットを用いて、細胞を破壊してもよい。１００ミクロンまたは５００ミクロン篩を通じるなど、適切な篩サイズを通じて篩にかけることによって、細胞を解離させてもよい。酵素的解離によって、例えばコラゲナーゼまたはｔｒｙｐＬＥでの処理によって採取し、分割してもよい。解離は完全であってもまたは部分的であってもよい。
【０２４９】
希釈は任意の適切な希釈であってもよい。細胞培養中の細胞を任意の適切な比で分割してもよい。例えば、細胞を１：２以上、１：３以上、１：４以上または１：５以上の比で分割してもよい。細胞を１：６以上、１：７以上、１：８以上、１：９以上または１：１０以上の比で分割してもよい。分割比は１：１０以上であってもよい。これは、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９または１：２０以上であってもよい。分割比は１：２１、１：２２、１：２３、１；２４、１：２５または１：２６以上であってもよい。
【０２５０】
したがって、幹細胞を１回以上、継代してもよい。例えば、幹細胞を２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５回またはそれ以上、継代してもよい。幹細胞を２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５回またはそれ以上、継代してもよい。幹細胞を無期限に培養中で継代してもよい。
【０２５１】
継代を細胞増殖の世代として表してもよい。本発明者らの方法および組成物は、幹細胞が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５世代またはそれ以上、増殖することを可能にする。幹細胞を２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５世代またはそれ以上、増殖させてもよい。
【０２５２】
また、継代を細胞倍加の回数として表してもよい。本発明者らの方法および組成物は、幹細胞が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５細胞倍加またはそれ以上、増殖することを可能にする。幹細胞を２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５細胞倍加またはそれ以上、増殖させてもよい。
【０２５３】
幹細胞を５より多く、１０より多く、１５より多く、２０より多く、２５より多く、３０より多く、４０より多く、４５より多く、５０より多く、１００より多く、２００より多く、５００より多く、または８００より多い継代、世代または細胞倍加に渡って、培養してもよい。幹細胞を１００、２００、５００以上の継代、世代または細胞倍加に渡って維持してもよい。
【０２５４】
増殖および生産性
本明細書記載の方法および組成物は、幹細胞を多量に産生することを可能にする。
【０２５５】
該方法は、培養中の幹細胞の指数関数的な増殖を可能にしうる。指数関数的増殖には、遅滞期が付随してもまたはしなくてもよい。指数関数的増殖は、培養中の細胞増殖の一部またはかなりの期間を形成してもよい。指数関数的な増殖を評価する方法が当該技術分野に知られる。
【０２５６】
例えば、細胞の特異的増殖速度は：
【０２５７】
【化１５】
2012520672.tif 000017
【０２５８】
式中、ｘ＝細胞濃度であり、そしてｔ＝時間である
に一致する。
【０２５９】
本明細書記載の方法および組成物は、伝統的な２Ｄ培養法（例えばプレート上の培養）に比較して、細胞増殖の、より大きい生産性を可能にしうる。例えば、本発明者らの方法の体積生産性は、１ｘ１０６細胞／ウェル以上、例えば２．５ｘ１０６細胞／ウェル以上、例えば３、４、５、６、または７ｘ１０６細胞／ウェル以上でありうる。ウェルは、約３．５ｃｍの直径または約９．５ｃｍ２の面積を有してもよい。本発明者らの方法の体積生産性は、１００万細胞／ｍｌ以上、例えば２００万細胞／ｍｌ以上、２５０万細胞／ｍｌ以上、３００万細胞／ｍｌ以上、３５０万細胞／ｍｌ以上、１００万細胞／ｍｌ以上、例えば４００万細胞／ｍｌ以上、４５０万細胞／ｍｌ以上、５００万細胞／ｍｌ以上でありうる。
【０２６０】
幹細胞特性の維持
増殖した幹細胞は、哺乳動物、霊長類またはヒト幹細胞の少なくとも１つの特性を維持しうる。幹細胞は、１回以上の継代後、該特性を維持しうる。幹細胞は、複数回の継代後、その特性を維持しうる。幹細胞は、上述のような言及する回数の継代後、該特性を維持しうる。
【０２６１】
特性は、形態学的特性、免疫組織化学的特性、分子生物学的特性等を含んでもよい。特性は、生物学的活性を含んでもよい。
【０２６２】
幹細胞特性
本発明者らの方法によって増殖する幹細胞は、以下の幹細胞特性のいずれを示してもよい。
【０２６３】
幹細胞は、Ｏｃｔ４および／またはＳＳＥＡ−１および／またはＴＲＡ−１−６０および／またはＭａｂ８４の発現増加を示しうる。自己再生性である幹細胞は、自己再生性でない幹細胞に比較して短くなった細胞周期を示しうる。
【０２６４】
幹細胞は定義される形態を示しうる。例えば、標準的顕微鏡画像の二次元において、ヒト胚性幹細胞は、画像平面における高い核／細胞質比、顕著な仁、および細胞接合がほとんど認識不能なコンパクトなコロニー形成を示す。
【０２６５】
幹細胞はまた、以下にさらに詳細に記載するような、発現細胞マーカーによっても特徴付け可能である。
【０２６６】
多能性マーカーの発現
維持される生物学的活性は、１以上の多能性マーカーの発現を含んでもよい。
【０２６７】
ステージ特異的胎児抗原（ＳＳＥＡ）は、特定の胚性細胞タイプに特徴的である。ＳＳＥＡマーカーに対する抗体は、Developmental Studies Hybridoma Bank（メリーランド州ベセスダ）より入手可能である。他の有用なマーカーは、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１と称される抗体を用いて検出可能である（Ａndrewsら, Cell Lines from Human Germ Cell Tumors, E. J. Robertson, 1987, 上記中）。ヒト胚性幹細胞は、典型的には、ＳＳＥＡ−１陰性およびＳＳＥＡ−４陽性である。ｈＥＧ細胞は、典型的には、ＳＳＥＡ−１陽性である。霊長類多能性幹細胞（ｐＰＳ）細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化は、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、およびＴｒａ−１−８１発現の喪失、ならびにＳＳＥＡ−１発現増加を生じる。ｐＰＳ細胞はまた、アルカリホスファターゼ活性の存在によっても特徴付け可能であり、これは、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、そして次いで、製造者によって記載されるように、基質としてＶｅｃｔｏｒ  Ｒｅｄで現像することによって検出可能である（Vector Laboratories、カリフォルニア州バーリンゲーム）。
【０２６８】
胚性幹細胞はまた、典型的には、テロメラーゼ陽性およびＯＣＴ−４陽性である。テロメラーゼ活性は、商業的に入手可能なキット（ＴＲＡＰｅｚｅ．ＲＴＭ．ＸＫテロメラーゼ検出キット、カタログ番号ｓ７７０７；  Ｉｎｔｅｒｇｅｎ  Ｃｏ．、ニューヨーク州パーチェス；またはＴｅｌｏＴＡＧＧＧ．ＴＭ．テロメラーゼＰＣＲ  ＥＬＩＳＡプラス、カタログ番号２，０１３，８９；  Roche Diagnostics，インディアナポリス）を用い、ＴＲＡＰ活性アッセイ（Kimら, Science 266:2011, 1997）を用いて決定可能である。また、ＲＴ−ＰＣＲによって、ｍＲＮＡレベルでｈＴＥＲＴ発現を評価してもよい。LightCycler TeloTAGGG.TM. hTERT定量化キット（カタログ番号３，０１２，３４４；  Roche Diagnostics）が、研究目的のため、商業的に入手可能である。
【０２６９】
ＦＯＸＤ３、ＰＯＤＸＬ、アルカリホスファターゼ、ＯＣＴ−４、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０およびＭａｂ８４等を含む、これらの多能性マーカーの任意の１以上が、増殖幹細胞によって保持されうる。
【０２７０】
マーカーの検出は、当該技術分野に知られる任意の手段を通じて、例えば免疫学的に達成可能である。組織化学染色、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）、ウェスタンブロット、酵素連結イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）等が使用可能である。
【０２７１】
フロー免疫細胞化学を用いて、細胞表面マーカーを検出してもよい。細胞内または細胞表面マーカーに関して、免疫組織化学（例えば固定細胞または組織切片の）を用いてもよい。細胞抽出物に対してウェスタンブロット分析を行ってもよい。細胞抽出物または培地内に分泌される産物に関して、酵素連結イムノアッセイを用いてもよい。
【０２７２】
この目的のため、商業的供給源から入手可能であるような、多能性マーカーに対する抗体を用いてもよい。
【０２７３】
ステージ特異的胎児抗原１および４（ＳＳＥＡ−１およびＳＳＥＡ−４）ならびに腫瘍拒絶抗原１−６０および１−８１（ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１）を含む幹細胞マーカーの同定のための抗体は、例えばChemicon International, Inc（米国カリフォルニア州テメキュラ）より得られうる。モノクローナル抗体を用いたこれらの抗原の免疫学的検出は、多能性幹細胞を特徴付けるために広く用いられてきている（Ｓhamblott M.J.ら(1998) PNAS 95:13726-13731; Schuldiner M.ら(2000). PNAS 97:11307-11312; Thomson J.A.ら(1998). Science 282:1145-1147; Reubinoff B.E.ら(2000). Nature Biotechnology 18:399-404; Henderson J.K.ら(2002). Stem Cells 20:329-337; Pera M.ら(2000). J. Cell Science 113:5-10.）。
【０２７４】
組織特異的遺伝子産物の発現はまた、ノーザンブロット分析、ドットブロットハイブリダイゼーション分析によって、あるいは標準的増幅法において配列特異的プライマーを用いた逆転写酵素開始ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって、ｍＲＮＡレベルで検出可能である。本開示に列挙する特定のマーカーに関する配列データは、ＧｅｎＢａｎｋ（ＵＲＬ  www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez）などの公的データベースから得られうる。さらなる詳細に関しては、米国特許第５，８４３，７８０号を参照されたい。
【０２７５】
実質的にすべての増殖細胞、またはそのかなりの部分が、マーカー（単数または複数）を発現しうる。例えば、単数または複数のマーカーを発現する細胞の割合は、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または実質的に１００％でありうる。
【０２７６】
細胞生存度
生物学的活性は、言及する回数の継代後の細胞生存度を含んでもよい。細胞生存度は、例えばトリパンブルー排除によるなど、多様な方式でアッセイされうる。生存染色のプロトコルは以下のとおりである。適切な試験管に、適切な体積の細胞懸濁物（２０〜２００μＬ）を入れ、等体積の０．４％トリパンブルーを添加し、そして穏やかに混合し、室温で５分間放置する。１０μｌの染色細胞を血球計数板に入れ、そして生存（未染色）および死亡（染色）細胞の数を計数する。各象限の未染色細胞の平均数を計算し、そして２ｘ１０４を乗じて、細胞／ｍｌを見出す。生存細胞の割合は、生存細胞数を死亡細胞および生存細胞の数で割ったものである。
【０２７７】
細胞生存度は、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または実質的に１００％でありうる。
【０２７８】
核型
増殖幹細胞は、増殖中または増殖後、正常な核型を保持しうる。「正常な」核型は、幹細胞が由来する親幹細胞の核型と同一であるか、類似であるかまたは実質的に類似である核型、あるいは親幹細胞と異なるが、いかなる実質的な意味でも異ならないものである。例えば、転座、染色体の喪失、欠失等のいかなる全体的な異常もあってはならない。
【０２７９】
核型は、いくつかの方法によって、例えば光学顕微鏡法のもとで視覚的に評価可能である。核型は、ＭｃＷｈｉｒら（２００６）、Ｈｅｗｉｔｔら（２００７）、ならびにＧａｌｌｉｍｏｒｅおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ（１９７３）に記載されるように、調製および分析可能である。また、標準的なＧバンド形成技術（カリフォルニア州オークランドのCytogenetics Labなどの、ルーチンの核型決定サービスを提供する多くの臨床診断実験室で利用可能）を用いて細胞の核型を決定し、そして公表される幹細胞核型と比較してもよい。
【０２８０】
増殖細胞のすべてまたはかなりの部分が正常な核型を保持しうる。この比率は、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または実質的に１００％でありうる。
【０２８１】
多能性
増殖幹細胞は、３つの細胞系譜すべて、すなわち内胚葉、外胚葉および中胚葉に分化する能力を保持しうる。幹細胞を誘導して、これらの細胞系譜の各々に分化させる方法が当該技術分野に知られ、そしてこれを用いて、増殖幹細胞の能力をアッセイしてもよい。
【０２８２】
増殖細胞のすべてのまたはかなりの部分がこの能力を保持しうる。これは、増殖幹細胞の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または実質的に１００％でありうる。
【０２８３】
共培養およびフィーダー
本発明者らの方法は、共培養の存在下または非存在下で、幹細胞を培養する工程を含んでもよい。用語「共培養」は、一緒に増殖する２以上の異なる種類の細胞混合物、例えば間質フィーダー細胞の混合物を指す。２以上の異なる種類の細胞を、同じ表面上で、例えば粒子または細胞容器表面上で、または異なる表面上で、増殖させてもよい。異なる種類の細胞を異なる粒子上で増殖させてもよい。
【０２８４】
本文書で用いる場合、用語、フィーダー細胞は、異なるタイプの細胞の培養のために用いられるかまたは必要とされる細胞を意味しうる。幹細胞培養の状況において、フィーダー細胞は、生存、増殖、およびＥＳ細胞多能性の維持を確実にする機能を有する。ＥＳ細胞多能性は、フィーダー細胞を直接共培養することによって達成されうる。あるいは、またはさらに、フィーダー細胞を培地中で培養して、培地を馴化させてもよい。馴化培地を用いて、幹細胞を培養してもよい。
【０２８５】
培養ディッシュなどの容器の内表面を、分裂しないように処理してあるマウス胚性皮膚細胞のフィーダー層でコーティングしてもよい。フィーダー細胞は、ＥＳ細胞増殖に必要な栄養分を培地内に放出する。したがって、粒子上で増殖する幹細胞は、こうしたコーティングされた容器中で増殖可能である。
【０２８６】
フィーダー細胞自体が粒子上で増殖可能である。幹細胞に関して記載するのと類似の方式で、これらを粒子上に植え付けてもよい。増殖させようとする幹細胞を、こうしたフィーダー粒子と一緒にまたは別個に増殖させてもよい。したがって、幹細胞はこうしたフィーダー細胞コーティング粒子上の層上で増殖可能である。一方、幹細胞を別個の粒子上で増殖させてもよい。これらの任意の設定の任意の組み合わせもまた可能であり、例えば粒子上で増殖するフィーダー細胞、フィーダー細胞および幹細胞を含む粒子、ならびに増殖する幹細胞を含む粒子を含む培養も可能である。これらの組み合わせを、フィーダー層を含むまたは含まない容器中で増殖させてもよい。フィーダー細胞をその上に増殖させる粒子は、マトリックスコーティングでコーティングされてもまたはコーティングされなくてもいずれでもよい。
【０２８７】
フィーダー細胞が存在しないか、または必要とされない設定もまた可能である。例えば、フィーダー細胞または幹細胞によって馴化された培地（馴化培地）中で細胞を増殖させてもよい。
【０２８８】
培地およびフィーダー細胞
多能性幹細胞を単離しそして増殖させるための培地は、得られる細胞が望ましい特性を有し、そしてさらに増殖可能である限り、いくつかの異なる配合のいずれを有してもよい。
【０２８９】
適切な供給源は以下のとおりである：  Ｄｕｌｂｅｃｃｏの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ＃１１９６５−０９２；ノックアウトＤｕｌｂｅｃｃｏの修飾イーグル培地（ＫＯ  ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ＃１０８２９−０１８；  ２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ＃１５０３９−０２７；非必須アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ  １１１４０−０５０；ベータ−メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ＃Ｍ７５２２；ヒト組換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、Ｇｉｂｃｏ＃１３２５６−０２９。例示的な血清含有胚性幹（ＥＳ）培地は、８０％  ＤＭＥＭ（典型的にはＫＯ  ＤＭＥＭ）、熱不活化されていない２０％定義ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および０．１ｍＭベータ−メルカプトエタノールで作製される。培地をろ過し、そして４℃で２週間まで保存する。血清不含胚性幹（ＥＳ）培地は、８０％  ＫＯ  ＤＭＥＭ、２０％血清代用品（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および０．１ｍＭベータ−メルカプトエタノールで作製される。有効な血清代用品は、Ｇｉｂｃｏ＃１０８２８−０２８である。培地をろ過し、そして４℃で２週間以内、保存する。使用直前、ヒトｂＦＧＦを最終濃度４ｎｇ／ｍＬまで添加する（Ｂｏｄｎａｒら、Ｇｅｒｏｎ  Ｃｏｒｐ、国際特許公報ＷＯ  ９９／２０７４１）。培地は、１０％血清置換培地（Invitrogen-Gibco、ニューヨーク州グランドアイランド）、５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ２（Invitrogen-Gibco、ニューヨーク州グランドアイランド）および５ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦ  ＡＢ（Peprotech、ニュージャージー州ロッキーヒル）を補充したノックアウトＤＭＥＭ培地（Invitrogen-Gibco、ニューヨーク州グランドアイランド）を含んでもよい。
【０２９０】
フィーダー細胞（用いる場合）は、９０％  ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ＃１１９６５−０９２）、１０％  ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ＃３００７１−０３）、および２ｍＭグルタミンを含有するｍＥＦ培地中で増殖可能である。ｍＥＦをＴ１５０フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃４３０８２５）中で増殖させ、トリプシンを用いて、１日おきに１：２で細胞を分割し、細胞を集密以下に維持する。フィーダー細胞層を調製するため、増殖を阻害するが、ヒト胚性幹細胞を補助する、重要な因子の合成を可能にする線量（約４０００ｒａｄガンマ照射）で、細胞を照射する。６ウェル培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ＃３０４など）を、ウェルあたり１ｍＬの０．５％ゼラチンと、３７℃で一晩インキュベーションすることによってコーティングし、そしてウェルあたり３７５，０００の照射ｍＥＦをプレーティングする。フィーダー細胞層は、典型的には、プレーティング５時間後〜４日後に用いられる。ｐＰＳ細胞を植え付ける直前に、培地を新鮮なヒト胚性幹（ｈＥＳ）培地に交換する。
【０２９１】
他の幹細胞を培養するための条件が知られ、そして細胞タイプに応じて、適切に最適化可能である。先のセクションに言及される特定の細胞タイプのための培地および培養技術は、引用する参考文献中に提供される。
【０２９２】
血清不含培地
本明細書に記載する方法および組成物には、血清不含培地中の幹細胞の培養が含まれてもよい。
【０２９３】
用語「血清不含培地」は、血清タンパク質、例えばウシ胎児血清を含まない細胞培地を含んでもよい。血清不含培地は、当該技術分野に知られ、そして例えば、米国特許５，６３１，１５９および５，６６１，０３４に記載される。血清不含培地は、例えば、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から商業的に入手可能である。
【０２９４】
血清不含培地は、タンパク質、加水分解物、および未知の組成の構成要素を欠いていてもよいという点で、タンパク質不含であってもよい。血清不含培地は、すべての構成要素が既知の化学構造を有する、化学的に定義された培地を含んでもよい。化学的に定義される血清不含培地は、変動を排除し、改善された再現性およびより一貫した性能を可能にし、そして不定の剤による混入の可能性を減少させる、完全に定義された系を提供するため、好適である。それはまた、動物由来の成分を含まないものであってもよい。
【０２９５】
血清不含培地は、ノックアウトＤＭＥＭ培地（Invitrogen-Gibco、ニューヨーク州グランドアイランド）を含んでもよい。
【０２９６】
血清不含培地に、例えば５％、１０％、１５％等の濃度で、血清置換培地などの１以上の構成要素を補充してもよい。血清不含培地に、Invitrogen-Gibco（ニューヨーク州グランドアイランド）の血清置換培地を１０％補充してもよい。
【０２９７】
解離または脱凝集された胚性幹細胞を培養する血清不含培地は、１以上の増殖因子を含んでもよい。ＦＧＦ２、ＩＧＦ−２、ノギン、アクチビンＡ、ＴＧＦベータ１、ＨＲＧ１ベータ、ＬＩＦ、Ｓ１Ｐ、ＰＤＧＦ、ＢＡＦＦ、Ａｐｒｉｌ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３リガンド、Ｗｎｔ３Ａおよびその他を含む、いくつかの増殖因子が当該技術分野に知られる。増殖因子（単数または複数）を、１ｐｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌの間などの任意の適切な濃度で用いてもよい。
【０２９８】
培地補充物
培地に１以上の添加物を補充してもよい。例えばこれらは：脂質混合物、ウシ血清アルブミン（例えば０．１％  ＢＳＡ）、大豆タンパク質の加水分解物の１以上から選択可能である。
【０２９９】
幹細胞
本文書で用いる際、用語「幹細胞」は、分裂に際して、２つの発生オプションに直面する細胞を指す：娘細胞は、元来の細胞に同一であってもよく（自己再生）、またはこれらはより特殊化された細胞タイプの前駆体であってもよい（分化）。したがって、幹細胞は一方または他方の経路を採用可能である（各細胞タイプの１つを形成可能であるさらなる経路が存在する）。したがって、幹細胞は、最終分化しておらず、そして他のタイプの細胞を産生可能である細胞である。
【０３００】
本文書で言及されるような幹細胞には、全能性幹細胞、多能性幹細胞、および多分化能幹細胞が含まれてもよい。
【０３０１】
一般的に、本明細書における（複数の）幹細胞への言及には、単数の幹細胞が含まれうる。特に、幹細胞を培養し、そして分化させる方法には、単細胞および凝集体培養技術が含まれてもよい。
【０３０２】
本発明において、幹細胞培養は、凝集体または単細胞のものであってもよい。
【０３０３】
全能性幹細胞
用語「全能性」細胞は、成人の体の任意の細胞タイプ、または胚体外膜（例えば胎盤）の任意の細胞になる潜在能力を有する細胞を指す。したがって、全能性細胞は受精卵およびその分裂によって産生される最初の４つ程度の細胞のみである。
【０３０４】
多能性幹細胞
「多能性幹細胞」は真の幹細胞であり、体の中で任意の分化した細胞を作製する潜在能力を持つ。しかし、これらは胚体外膜を作製するのに寄与できず、該膜は栄養膜に由来する。いくつかのタイプの多能性幹細胞が見出されてきている。
【０３０５】
胚性幹細胞
胚性幹（ＥＳ）細胞は、胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）から単離可能であり、胚盤胞は着床が起こる胚発生段階である。
【０３０６】
胚性生殖細胞
中絶胎児における生殖腺の前駆体から胚性生殖（ＥＧ）細胞を単離してもよい。
【０３０７】
胚性癌腫細胞
胎児の生殖腺にしばしば生じる腫瘍である奇形癌腫から胚性癌腫（ＥＣ）細胞を単離してもよい。最初の２つとは異なり、これらは通常、異数体である。これらの３つのタイプの多能性幹細胞はすべて、胚性または胎児組織からのみ単離可能であり、そして培養中で増殖可能である。これらの多能性細胞が分化するのを防ぐ方法が当該技術分野に知られる。
【０３０８】
成体幹細胞
成体幹細胞は、骨髄移植において活性構成要素である神経、皮膚および血液形成幹細胞を含む、非常に多様なタイプを含む。これらの後者の幹細胞タイプはまた、臍帯由来幹細胞の主な特徴でもある。成体幹細胞は、実験室および体内の両方において、機能する、より特殊化された細胞タイプに成熟可能であるが、細胞タイプの実際の数は、選択した幹細胞タイプによって限定される。例えば、成体幹細胞は、間葉系幹細胞、造血幹細胞、乳腺幹細胞、内皮幹細胞、または神経幹細胞であってもよい。成体幹細胞は多分化能である可能性もある。
【０３０９】
多分化能幹細胞
多分化能幹細胞は、真の幹細胞であるが、限定された数のタイプにのみ分化可能である。例えば、骨髄は、血液の細胞すべてを生じさせるが、他のタイプの細胞を生じない、多分化能幹細胞を含有する。多分化能幹細胞は、成体動物に見られる。死んだまたは損傷を受けた細胞を置換可能な体のすべての臓器（脳、肝臓）は、該細胞を含有すると考えられる。
【０３１０】
幹細胞を特徴付ける方法が当該技術分野に知られ、そしてこれには、クローンアッセイ、フローサイトメトリー、長期培養、ならびに分子生物学技術、例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲおよびサザンブロッティングなどの標準的アッセイ法の使用が含まれる。
【０３１１】
形態学的相違に加えて、ヒトおよびネズミ多能性幹細胞は、いくつかの細胞表面抗原（幹細胞マーカー）の発現が異なる。幹細胞マーカーおよびその検出法は、本文書の別の箇所に記載される（「幹細胞特性の維持」以下）。
【０３１２】
幹細胞の供給源
米国特許第５，８５１，８３２号は、脳組織から得られる多分化能神経幹細胞を報告する。米国特許第５，７６６，９４８号は、新生大脳半球からの神経芽細胞産生を報告する。米国特許第５，６５４，１８３号および第５，８４９，５５３号は、哺乳動物神経冠細胞の使用を報告する。
【０３１３】
米国特許第６，０４０，１８０号は、哺乳動物多分化能ＣＮＳ幹細胞培養からの、分化したニューロンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成を報告する。ＷＯ  ９８／５０５２６およびＷＯ  ９９／０１１５９は、神経上皮幹細胞、オリゴデンドロサイト−アストロサイト前駆体、および細胞系譜制限神経前駆体の生成および単離を報告する。
【０３１４】
米国特許第５，９６８，８２９号は、胚性前脳から得られ、そしてグルコース、トランスフェリン、インスリン、セレン、プロゲステロン、およびいくつかの他の増殖因子を含む培地で培養される、神経幹細胞を報告する。
【０３１５】
初代肝細胞培養は、コラゲナーゼおよびヒアルロニダーゼの適切な組み合わせを用いた灌流によって、ヒト生検または外科的に切除された組織から得られうる。あるいは、ＥＰ  ０  ９５３  ６３３  Ａ１は、刻んだヒト肝臓組織を用意し、増殖培地中に濃縮組織細胞を再懸濁し、そして培養中で細胞を拡大することによって、肝細胞を単離する工程を報告する。増殖培地は、グルコース、インスリン、トランスフェリン、Ｔ３、ＦＣＳ、および悪性形質転換を伴わずに、肝細胞が増殖するのを可能にする、多様な組織抽出物を含む。
【０３１６】
肝臓中の細胞は、肝臓実質細胞、クッパー細胞、類洞内皮、および胆管上皮を含む特殊化細胞、ならびに成熟肝細胞または胆管上皮細胞の両方に分化する能力を有する前駆細胞（「肝芽細胞」または「卵円形細胞」と称される）を含有すると考えられる（L. E. Rogler, Am. J. Pathol. 150:591 , 1997; M. Alison, Current Opin. Cell Biol. 10:710, 1998; Lazaroら, Cancer Res. 58:514, 1998）。
【０３１７】
米国特許第５，１９２，５５３号は、ヒト新生または胎児造血幹細胞または前駆細胞を単離するための方法を報告する。米国特許第５，７１６，８２７号は、Ｔｈｙ−１陽性前駆体であるヒト造血細胞、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでこれらを再生するのに適した増殖培地を報告する。米国特許第５，６３５，３８７号は、ヒト造血細胞およびその前駆体を培養するための方法およびデバイスを報告する。米国特許第６，０１５，５５４号は、ヒトリンパ系細胞および樹状細胞を再構成する方法を記載する。
【０３１８】
米国特許第５，４８６，３５９号は、１より多い結合組織タイプ、例えば骨、軟骨、腱、靱帯、および真皮の細胞に分化可能な、ヒト間葉系幹細胞の均一な集団を報告する。これらは骨髄または骨膜より得られる。やはり報告されるのは、間葉系幹細胞を拡大するために用いられる培養条件である。ＷＯ  ９９／０１１４５は、Ｇ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦなどの増殖因子で処置された個体の末梢血から単離される、ヒト間葉系幹細胞を報告する。ＷＯ  ００／５３７９５は、実質的に脂肪細胞および赤血球を含まない、脂肪由来幹細胞および格子を報告する。報告によれば、これらの細胞を拡大し、そして培養して、ホルモンおよび馴化培地を産生することも可能である。
【０３１９】
任意の脊椎動物種の幹細胞を用いてもよい。含まれるのは、ヒト；ならびに非ヒト霊長類、飼育動物、家畜、および他の非ヒト哺乳動物、例えばげっ歯類、マウス、ラット等由来の幹細胞である。
【０３２０】
本明細書に記載する方法および組成物で使用するのに適した幹細胞の中には、妊娠後に形成される組織に由来する霊長類またはヒト多能性幹細胞、例えば胚盤胞、あるいは妊娠中の任意の時点に採取される胎児または胚性組織がある。限定されない例は、胚性幹細胞の初代培養または樹立された株である。
【０３２１】
胚性幹細胞
胚性幹細胞は、霊長類種のメンバーの胚盤胞から単離可能である（Thomsonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844, 1995）。Ｔｈｏｍｓｏｎら（米国特許第５，８４３，７８０号； Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998）およびReubinoffら, Nature Biotech. 18:399, 2000によって記載される技術を用いて、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞をヒト胚盤胞細胞から調製することも可能である。
【０３２２】
簡潔には、ヒト胚盤胞は、ヒトｉｎ  ｖｉｖｏ着床前胚から得られうる。あるいは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精（ＩＶＦ）胚を用いてもよいし、または一細胞ヒト胚を胚盤胞段階まで拡大してもよい（Bongsoら, Hum Reprod 4: 706, 1989）。ヒト胚をＧ１．２およびＧ２．２培地中で胚盤胞段階まで培養する（Gardnerら, Fertil. Steril. 69:84, 1998）。胚性幹細胞単離のため、発生する胚盤胞を選択する。プロナーゼ（Ｓｉｇｍａ）に短時間曝露することによって、胚盤胞から透明帯を除去する。１：５０希釈のウサギ抗ヒト脾臓細胞抗血清に胚盤胞を３０分間曝露して、次いで、ＤＭＥＭで５分間３回洗浄し、そして１：５希釈のモルモット補体（Ｇｉｂｃｏ）に３分間曝露する、免疫手術によって、内部細胞塊を単離する（Solterら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:5099, 1975を参照されたい）。ＤＭＥＭでさらに２回洗浄した後、穏やかにピペッティングすることによって、溶解した栄養外胚葉細胞を損なわれていない内部細胞塊（ＩＣＭ）から除去し、そしてＩＣＭをｍＥＦフィーダー層上にプレーティングする。
【０３２３】
９〜１５日後、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むカルシウムおよびマグネシウム不含リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に曝露するか、ディスパーゼまたはトリプシンに曝露するか、あるいはマイクロピペットで機械的に解離させるか、いずれかによって、内部細胞塊由来外植を凝集塊に解離させ；そして次いで、新鮮な培地中、ｍＥＦ上に再プレーティングする。解離細胞を、新鮮な胚性幹（ＥＳ）培地中、ｍＥＦフィーダー層上に再プレーティングし、そしてコロニー形成に関して観察する。未分化形態を示すコロニーをマイクロピペットによって個々に選択し、機械的に凝集塊に解離させ、そして再プレーティングする。胚性幹細胞様形態は、見かけ上の高い核対細胞質比および顕著な仁を持つコンパクトなコロニーとして特徴付けられる。次いで、短時間のトリプシン処理、ダルベッコのＰＢＳ（カルシウムまたはマグネシウムを含まず、そして２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）への曝露、タイプＩＶコラゲナーゼ（約．２００Ｕ／ｍＬ；  Ｇｉｂｃｏ）への曝露によって、あるいはマイクロピペットによる個々のコロニーの選択によって、１〜２週間ごとに、生じる胚性幹細胞をルーチンに分割する。約５０〜１００細胞の凝集塊のサイズが最適である。
【０３２４】
胚性生殖細胞
ヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞は、最後の月経期間の約８〜１１週後に採取されるヒト胎児材料中に存在する始原生殖細胞より調製可能である。適切な調製法は、Shamblottら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998および米国特許第６，０９０，６２２号に記載される。
【０３２５】
簡潔には、生殖隆起を等張緩衝液でリンスし、次いで、０．１ｍＬの０．０５％トリプシン／０．５３ｍＭナトリウムＥＤＴＡ溶液（ＢＲＬ）に入れ、そして＜１ｍｍ３のぶつ切りに切る。次いで、組織を１００／μＬチップを通じてピペッティングして、細胞をさらに脱凝集させる。３７℃で約５分間インキュベーションし、次いで、約３．５ｍＬのＥＧ増殖培地を添加する。ＥＧ増殖培地は、ＤＭＥＭ、４５００ｍｇ／Ｌ  Ｄ−グルコース、２２００ｍｇ／Ｌ  ｍＭ重炭酸ナトリウム；  １５％胚性幹（ＥＳ）品質ウシ胎児血清（ＢＲＬ）；  ２ｍＭグルタミン（ＢＲＬ）；  １ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＢＲＬ）；  １０００〜２０００Ｕ／ｍＬヒト組換え白血病阻害因子（ＬＩＦ、Ｇｅｎｚｙｍｅ）；  １〜２ｎｇ／ｍｌヒト組換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、Ｇｅｎｚｙｍｅ）；および１０μＭフォルスコリン（１０％ＤＭＳＯ中）である。別のアプローチにおいて、ヒアルロニダーゼ／コラゲナーゼ／ＤＮアーゼを用いて、ＥＧ細胞を単離する。生殖腺原基または生殖隆起を腸間膜とともに胎児材料から切除し、生殖隆起をＰＢＳ中でリンスし、次いで０．１ｍｌ  ＨＣＤ消化溶液（ＥＧ増殖培地中で調製された、すべてＳｉｇｍａ由来の０．０１％ヒアルロニダーゼ・タイプＶ、０．００２％ＤＮアーゼＩ、０．１％コラゲナーゼ・タイプＩＶ）に入れる。組織を刻み、そして３７℃で１時間または一晩インキュベーションし、１〜３ｍＬのＥＧ増殖培地中に再懸濁し、そしてフィーダー層上にプレーティングする。
【０３２６】
ＬＩＦ、ｂＦＧＦまたはフォルスコリンを含まない修飾ＥＧ増殖培地中、３日間培養し、５０００ラドのγ照射で不活性化したフィーダー細胞の集密以下の層を用いて、９６ウェル組織培養プレートを調製する。適切なフィーダーは、ＳＴＯ細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ  １５０３）である。０．２ｍＬの初代生殖細胞（ＰＧＣ）懸濁物を各ウェルに添加する。第一の継代をＥＧ増殖培地中、７〜１０日後に行い、照射したＳＴＯマウス線維芽細胞を用いてあらかじめ調製した２４ウェル培養ディッシュの１つのウェルに、各ウェルをトランスファーする。ＥＧ細胞と一致する細胞形態が観察されるまで、典型的には７〜３０日後、または１〜４回の継代後まで、培地を毎日交換しながら細胞を培養する。
【０３２７】
人工多能性幹細胞
本明細書記載の方法および組成物を人工多能性幹細胞の増殖に用いてもよい。
【０３２８】
一般的にはｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと略される人工多能性幹細胞は、特定の遺伝子を挿入することによって、非多能性細胞、典型的には成体体細胞、例えば線維芽細胞、肺またはＢ細胞から人工的に得られる多能性幹細胞の一種である。
【０３２９】
ｉＰＳ細胞は、すべて本明細書に援用される、Ｔａｋａｈａｓｈｉ，  Ｋ．  ＆  Ｙａｍａｎａｋａ（Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 2006;126:663-676）、Ｙａｍａｎａｋａ  Ｓら（Yamanaka Sら Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. doi:10.1016/j.cell.2007.11.019、およびYamanaka Sら Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature 2007;448:313-7）、Ｗｅｒｎｉｇ  Ｍら（In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature 2007;448:318-24）、Ｍａｈｅｒａｌｉ  Ｎら（Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell 2007;1:55-70）およびＴｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ，  Ｙｕ  Ｊら（Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells. Science DOI: 10.1126/science.1151526）およびＴａｋａｈａｓｈｉら（Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell.(2007)131(5):861-72.）に概説され、そして論じられる。
【０３３０】
ｉＰＳ細胞は、典型的には、非多能性細胞、例えば成体線維芽細胞内に特定の幹細胞関連遺伝子をトランスフェクションすることによって得られる。トランスフェクションは、典型的には、レトロウイルスなどのウイルスベクターを通じて達成される。トランスフェクション遺伝子には、マスター転写制御因子Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕｆ５１）およびＳｏｘ２が含まれるが、他の遺伝子が誘導効率を増進させると示唆される。３〜４週間後、少数のトランスフェクション細胞が、形態学的におよび生化学的に多能性幹細胞と類似となり始め、そして典型的には、形態学的選択、倍加時間を通じて、またはレポーター遺伝子および抗生物質感染を通じて単離される。
【０３３１】
多能性幹細胞の供給源
本発明のいくつかの側面および態様は、多能性細胞の使用に関する。胚性幹細胞および人工多能性幹細胞は、こうした細胞の例として記載される。
【０３３２】
胚性幹細胞は、伝統的に、胚盤胞段階の胚の内部細胞塊（ＩＣＭ）に由来している（Evans, M.J.およびKaufman, M.H.(1981). Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature 292, 154-156. Martin, G.R.(1981). Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7634-7638. Thomson, J.A., Itskovitz-EIdor, J., Shapiro, S.S., Waknitz, M.A., Swiergiel, J.J., Marshall, V.S.およびJones, J.M.(1998). Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282, 1145-1147）。胚性幹細胞を単離する際、これらの方法は胚を破壊しうる。
【０３３３】
現在、胚の破壊につながらない、例えば成体体細胞または生殖細胞の形質転換による、多能性幹細胞の単離のためのいくつかの方法が提供されてきている。これらの方法には、以下が含まれる：
１．核トランスファーによる再プログラミング。この技術は、体細胞から卵母細胞または接合子内への核のトランスファーを伴う。いくつかの状況において、これは、動物−ヒト・ハイブリッド細胞の生成を導きうる。例えば、ヒト体細胞と動物卵母細胞または接合子の融合、あるいはヒト卵母細胞または接合子と動物体細胞の融合によって、細胞を生成することも可能である。
【０３３４】
２．胚性幹細胞との融合による再プログラミング。この技術は、体細胞と胚性幹細胞の融合を伴う。この技術はまた、上記１におけるように、動物−ヒト・ハイブリッド細胞の生成を導きうる。
【０３３５】
３．培養による自発的再プログラミング。この技術は、長期培養後の非多能性細胞からの多能性細胞の生成を伴う。例えば、始原生殖細胞（ＰＧＣ）の長期培養によって、多能性胚性生殖（ＥＧ）細胞が生成されてきている（参照により本明細書に援用される、Matsuiら, Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture. Cell 70, 841-847, 1992）。骨髄由来細胞の長期培養後の多能性幹細胞の発生もまた報告されてきている（参照により本明細書に援用される、Jiangら, Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature 418, 41-49, 2002）。彼らは、これらの細胞を多分化能成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）と称した。Ｓｈｉｎｏｈａｒａらもまた、新生マウス精巣由来の生殖系列幹（ＧＳ）細胞の培養経過中に多能性幹細胞が生成可能であることを示し、これを多分化能生殖系列幹（ｍＧＳ）細胞と称した（参照により本明細書に援用される、Kanatsu-Shinoharaら, Generation of pluripotent stem cells from neonatal mouse testis. Cell 119, 1001-1012, 2004）。
【０３３６】
４．定義される因子による再プログラミング。例えば、レトロウイルスが仲介する、例えば上述のような、マウス胚性または成体線維芽細胞内への転写因子（例えばＯｃｔ−３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫＬＦ４）の導入による、ｉＰＳ細胞の生成。Ｋａｊｉら（本明細書に援用される、Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature. Online publication 1 March 2009）はまた、２Ａペプチドと連結されたｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２のコード配列を含む、単一の多タンパク質発現ベクターの非ウイルストランスフェクションを記載し、これは、マウスおよびヒト線維芽細胞をどちらも再プログラミング可能であった。この非ウイルスベクターで産生されたｉＰＳ細胞は、多能性マーカーの頑強な発現を示し、再プログラミング状態が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化アッセイおよび成体キメラマウスの形成によって、機能的に確認されることを示した。彼らは、胚性線維芽細胞から、多能性マーカーを頑強に発現する、再プログラミングされたヒト細胞株を確立するのに成功した。
【０３３７】
方法１〜４は、本明細書に援用される、山中伸弥による、Strategies and New Developments in the Generation of Patient-Specific Pluripotent Stem Cells（Cell Stem Cell 1, July 2007a2007 Elsevier Inc）に記載され、そして論じられる。
【０３３８】
５．単一卵割球または生検卵割球由来のｈＥＳＣ株の誘導。すべて本明細書に援用される、Klimanskaya I, Chung Y, Becker S, Lu SJ, Lanza R. Human embryonic stem cell lines derived from single blastomeres. Nature 2006; 444:512、Leiら Xeno-free derivation and culture of human embryonic stem cells: current status, problems and challenges. Cell Research(2007)17:682-688、Chung Y, Klimanskaya I, Becker Sら Embryonic and extraembryonic stem cell lines derived from single mouse blastomeres. Nature. 2006;439:216-219. Klimanskaya I, Chung Y, Becker Sら Human embryonic stem cell lines derived from single blastomeres. Nature. 2006;444:481-485. Chung Y, Klimanskaya I, Becker Sら Human embryonic stem cell lines generated without embryo destruction. Cell Stem Cell. 2008;2:113-117およびDusko Ilicら(Derivation of human embryonic stem cell lines from biopsied blastomeres on human feeders with a minimal exposure to xenomaterials. Stem Cells And Development−公表前の論文）を参照されたい。
【０３３９】
６．  ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、卵割を停止し、そして桑実胚および胚盤胞まで発生するのに失敗した停止胚から得られるｈＥＳＣ株。どちらも本明細書に援用される、Zhang X, Stojkovic P, Przyborski SらDerivation of human embryonic stem cells from developing and arrested embryos. Stem Cells 2006;24:2669-2676およびLeiら Xeno-free derivation and culture of human embryonic stem cells: current status, problems and challenges. Cell Research(2007)17:682-688を参照されたい。
【０３４０】
７．単為生殖（または単為発生）。この技術は、未受精卵を化学的または電気的に刺激して、胚性幹細胞を得られうる割球に発生させる工程を伴う。例えば、幹細胞を産生するために未受精中期ＩＩ卵母細胞の化学的活性化を使用した、Linら Multilineage potential of homozygous stem cells derived from metaphase II oocytes. Stem Cells. 2003;21(2):152-61を参照されたい。
【０３４１】
８．胎児起源の幹細胞。これらの細胞は、可能性の観点からは胚性および成体幹細胞の間に位置し、そして該細胞を用いて、多能性または多分化能細胞を得ることも可能である。多能性マーカー（Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｒｅｘ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、およびＴｒａ−１−８１、β−ガラクトシダーゼ染色によって示されるような老化の証拠が最小限であること、およびテロメラーゼ活性の一貫した発現を含む）を発現するヒト臍帯由来胎児間葉系幹細胞（ＵＣ  ｆＭＳＣ）が、Ｃｈｒｉｓ  Ｈ．  Ｊｏら（本明細書に援用される、Fetal mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord sustain primitive characteristics during extensive expansion. Cell Tissue Res(2008)334:423-433）によって成功裡に得られている。Ｗｉｎｓｔｏｎ  Ｃｏｓｔａ  Ｐｅｒｅｉｒａら（本明細書に援用される、Reproducible methodology for the isolation of mesenchymal stem cells from human umbilical cord and its potential for cardiomyocyte generation J Tissue Eng Regen Med 2008;2:394-399）は、ヒト臍帯のＷｈａｒｔｏｎゼリーから、間葉系幹細胞の純粋な集団を単離した。Ｗｈａｒｔｏｎゼリー由来の間葉系幹細胞はまた、Ｔｒｏｙｅｒ  ＆  Ｗｅｉｓｓ（本明細書に援用される、Concise Review: Wharton’s Jelly-Derived Cells Are a primitive Stromal Cell Population. Stem Cells 2008:26:591-599）にも概説されている。Ｋｉｍら（本明細書に援用される、Ex vivo characteristics of human amniotic membrane-derived stem cells. Cloning Stem Cells 2007 Winter;9(4):581-94）は、ヒト羊膜からヒト羊膜由来間葉系細胞を単離することに成功した。臍帯は、通常廃棄される組織であり、そしてこの組織由来の幹細胞は、道徳的または倫理的な反対を招かない傾向がある。
【０３４２】
本発明には、これらの供給源のいずれかによって得られるか、またはこれらの方法のいずれかによって生成される多能性または多分化能幹細胞の使用が含まれる。いくつかの態様において、本発明の方法で用いる多能性または多分化能細胞は胚の破壊を引き起こさない方法によって得られてきている。より好ましくは、いくつかの態様において、本発明の方法で用いられる多能性または多分化能細胞は、ヒトまたは哺乳動物胚の破壊を引き起こさない方法によって得られてきている。こうしたものとして、こうした細胞が得られうるヒト胚の破壊を必然的に伴う方法のみによって調製されたのではない細胞を用いることによって、本発明の方法を実行可能である。この場合による限定は、欧州特許庁拡大審判廷の２００８年１１月２５日の決定Ｇ０００２／０６を考慮に入れることが特に意図される。
【０３４３】
分化／胚様体
当業者に知られる分化技術を用いることによって、培養した幹細胞を、任意の適切な細胞タイプに分化させることも可能である。
【０３４４】
本発明者らは、分化した細胞を産生するためのプロセスであって、本明細書に記載するような方法によって幹細胞を増殖させ、そして次いで、既知の技術にしたがって幹細胞を分化させる工程を含む、前記方法を記載する。例えば、本発明者らは、外胚葉、中胚葉および内胚葉、ならびに心筋細胞、脂肪細胞、軟骨細胞および骨細胞等に分化させる方法を提供する。本発明者らはさらに、こうした方法によって得られうる胚様体および分化した細胞を提供する。こうした幹細胞および分化した細胞から作製される細胞株もまた提供する。
【０３４５】
幹細胞を分化させる方法は当該技術分野に知られ、そして例えば、Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ（J Itskovitz-Eldor, M Schuldiner, D Karsenti, A Eden, O Yanuka, M Amit, H Soreq, N Benvenisty. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 2000 Feb ;6 (2):88-95）およびＧｒａｉｃｈｅｎら（２００７）、Ｋｒｏｏｎら（２００８）およびＨａｙら（２００８．  Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signalling. PNAS Vol.105. No.34 12310-12306.）、ＷＯ  ２００７／０３０８７０、ＷＯ  ２００７／０７０９６４、Ｎｉｅｂｒｕｇｇｅら（Generation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Mesoderm and Cardiac Cells Using Size-Specified Aggregates in an Oxygen-Controlled Bioreactor. Biotechnology and Bioengineering. Vol.102, no.2, February 1 , 2009.）、Ｒ  Ｐａｓｓｉｅｒら（Serum free media in cocultures(FBS inhibits cardiomyocytes differentiation). Curr Opin Biotechnol. 2005 Oct;16(5):498-502. Review. Stem Cells. 2005 Jun-Jul;23(6):772-80）、Ｐ  Ｗ  Ｂｕｒｒｉｄｇｅら（Defined Medium with polyvinyl alcohol(PVA), Activin A and bFGF. Stem Cells. 2007 Apr;25(4):929-38. Epub 2006年12月21日.）、Ｍ  Ａ  Ｌａｆｌａｍｍｅら（Culture sequentially supplemented with Activin A for 24 h, and BMP 4 for 4 days. Nat Biotechnol. 2007 Sep;25(9):1015-24. Epub 2007年8月26日.）、Ｌ  Ｙａｎｇら（Defined medium supplemented with BMP4(1 day), BMP4, Activin A and bFGF(days 1-4), Activin A and bFGF(days 4-8), and DKK1 and VEGF. Nature. 2008 May 22;453(7194):524-8. Epub 2008年4月23日.）、ならびにＸ  Ｑ  Ｘｕら（SB203580(p38 MAP kinase inhibitor) PGI2(prostaglandin member accumulated in END2-CM). Differentiation. 2008 Nov;76(9):958-70. Epub 2008年6月13日）に記載される。
【０３４６】
また、胚様体を形成するために培養幹細胞を用いてもよい。胚様体、および胚様体を作製するための方法が、当該技術分野に知られる。用語「胚様体」は、懸濁中で胚性幹細胞を増殖させることによって産生される、培養中に見られる球状コロニーを指す。胚様体は、細胞タイプが混合されたものであり、そして特定の細胞タイプの分布および出現タイミングは、胚内で観察されるものに対応する。半固形培地などの培地上に胚性幹細胞をプレーティングすることによって、胚様体を生成することも可能である。Limら, Blood. 1997;90:1291-1299に記載されるように、メチルセルロース培地を用いてもよい。
【０３４７】
例えばＩｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ（２０００）に記載される方法を用いて、胚性幹細胞を誘導して胚様体を形成してもよい。胚様体は、３つの胚性胚葉すべての細胞を含有する。
【０３４８】
例えば適切な誘導因子または環境変化への曝露によって、胚様体をさらに誘導して、異なる細胞系譜に分化させることも可能である。Ｇｒａｉｃｈｅｎら（２００７）は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ経路の操作によって、ヒト胚性幹細胞からの心筋細胞の形成を記載する。Ｇｒａｉｃｈｅｎは、１０マイクロモル未満のＳＢ２０３５８０などのｐ３８  ＭＡＰキナーゼの特異的阻害剤に曝露することによって、幹細胞から心筋細胞形成が誘導されることを示す。
【０３４９】
当該技術分野に知られるような、再生療法などの、任意の適切な目的のために、分化した細胞を使用してもよい。
【０３５０】
本発明記載の培養法および技術を通じて得られる幹細胞を用いて、医学的治療法で用いるための別の細胞タイプに分化させてもよい。したがって、分化した細胞タイプは、本明細書記載の培養法および技術によって得られ、続いて分化を許されている幹細胞に由来しうる。分化した細胞タイプは、本明細書記載の培養法および技術によって得られ、続いて分化を許されている幹細胞の産物と見なされうる。場合によって薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバントまたは希釈剤と一緒に、こうした分化した細胞を含む薬学的組成物を提供してもよい。こうした薬学的組成物は、医学的治療法において有用でありうる。
【０３５１】
マイクロキャリアー上での分化
本発明者らの以前の発見（米国特許出願、２００９年３月１７日出願のＵＳ  ６１／０６９，６９４、２００８年１０月３１日出願のＵＳ  ６１／１１０，２５６、２００９年１月２９日出願のＵＳ  ６１／１４８，０６４、および２００９年２月２７日出願のＵＳ  ６１／１５５，９４０）にしたがって、マイクロキャリアー上での懸濁培養中、幹細胞、特に胚性幹細胞およびｉＰＳを誘導して、分化させてもよい。
【０３５２】
胚性幹細胞を誘導して、３つの一次胚葉：外胚葉、内胚葉および中胚葉、ならびにその誘導体に分化させてもよい。胚性幹細胞を誘導して胚様体を形成してもよい。したがって、ある範囲の細胞タイプまたは組織、例えば心筋細胞、心臓中胚葉、肝細胞、肝臓内胚葉、膵島細胞、膵臓内胚葉、インスリン産生細胞、神経組織、神経外胚葉、上皮組織、表面外胚葉、骨、軟骨、筋肉、靱帯、腱または他の結合組織が得られうる。
【０３５３】
幹細胞の分化および胚様体の形成のための方法は上記のとおりであり、そしてこれはマイクロキャリアー培養中の幹細胞の分化に適用可能である。
【０３５４】
ＲＯＣＫ阻害剤の存在下または非存在下で、マイクロキャリアー培養中に幹細胞を分化させる方法を実行してもよい。例えば、分化を誘導する培養条件に細胞（およびマイクロキャリアー）を曝露することによって、本発明にしたがって、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下、マイクロキャリアー上で増殖させた幹細胞を、誘導して、分化させてもよい。こうした培養条件には、幹細胞をＲＯＣＫ阻害剤（細胞の増殖に用いたＲＯＣＫ阻害剤と同じでもまたは異なってもよい）に引き続き曝露することが含まれてもよいし、または培養条件はＲＯＣＫ阻害剤を排除してもよい。
【０３５５】
マイクロキャリアー培養中で幹細胞を分化させる方法は、上述のように、マイクロキャリアーをコーティングしないか、またはマトリックスコーティングでコーティングする必要がありうる。例えば、適切なコーティングには：  Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ヒアルロン酸の１以上が含まれてもよい。
【０３５６】
マイクロキャリアー培養中で幹細胞を分化させる方法には、培地への補助剤の添加が含まれてもよい。例えば、補助剤には、ウシ血清アルブミン、脂質またはＨｙ−Ｓｏｙ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ−これは大豆タンパク質の酵素的加水分解物である）が含まれてもよい。
【０３５７】
マイクロキャリアー培養中で幹細胞を分化させる方法は、２Ｄ培養中または３Ｄ懸濁マイクロキャリアー培養中のいずれかでの幹細胞の初期培養および増殖、その後、マイクロキャリアー培養中の分化誘導を伴ってもよい。
【０３５８】
使用
本明細書記載の方法および組成物を多様な手段に用いてもよい。
【０３５９】
例えば、本明細書記載の粒子を、より単純な幹細胞培養のための研究ツールまたは実験室試薬として提供してもよい。分化した細胞を生成するために、マイクロキャリアー上の未分化幹細胞の拡大のため、これらを用いてもよい。これを委託製造能に発展させてもよい。幹細胞を拡大し、そして薬剤試験で使用するために場合によって分化させてもよい。異なる培地条件下で、幹細胞を組み合わせ分化させるため、粒子またはマイクロキャリアーを標識してもよい。本明細書記載の方法によって増殖させた幹細胞を、多様な商業的に重要な研究、診断、および療法目的のため、用いてもよい。これらの目的のため、幹細胞を直接用いてもよいし、または当該技術分野に知られる方法を用いて、任意の選択した細胞タイプに分化させてもよい。また、幹細胞から前駆細胞を得てもよい。分化した細胞または前駆細胞、あるいはその両方を、同じ目的のため、幹細胞の代わりに、または幹細胞と組み合わせて用いてもよい。したがって、幹細胞に関して本文書に記載する任意の使用は、幹細胞から得られる前駆細胞および分化した細胞に等しく適用される。同様に、分化した細胞の任意の使用は、これらが前駆体または前駆細胞である幹細胞に等しく適用されるであろう。
【０３６０】
幹細胞等の使用は当該技術分野に一般的に周知であるが、本明細書に簡単に記載する。
【０３６１】
療法使用
本明細書記載の方法および組成物を用いて、再生療法のため、幹細胞を増殖させてもよい。幹細胞を拡大して、そして患者に直接投与してもよい。外傷後の損傷組織の再増殖のために、これらを用いてもよい。胚性幹細胞を、再生療法のため直接用いてもよいし、あるいは該細胞を用いて外胚葉、中胚葉または内胚葉前駆細胞集団を生成してもよい。ｅｘ  ｖｉｖｏ拡大によって前駆細胞を作製してもよいし、または患者に直接投与してもよい。また、外傷後の損傷組織の再増殖のために、これらを用いてもよい。
【０３６２】
したがって、骨髄置換のために造血前駆細胞を用いてもよいし、一方、心臓不全患者のために心臓前駆細胞を用いてもよい。患者のための皮膚移植片を増殖させるために皮膚前駆細胞を使用してもよく、そしてステントまたは人工心臓などの人工装具の内皮化（endothelization）のために内皮前駆細胞を使用してもよい。
【０３６３】
糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病などの変性疾患の治療のために、外胚葉、中胚葉または内胚葉前駆細胞の供給源として、胚性幹細胞を用いてもよい。癌の免疫療法のために、ＮＫまたは樹状細胞の中胚葉または内胚葉前駆体の供給源として、胚性幹細胞を用いてもよい。
【０３６４】
本明細書記載の方法および組成物は、外胚葉、中胚葉または内胚葉前駆細胞の産生を可能にし、もちろん、当該技術分野に知られる方法を用いて、これらの細胞を最終分化細胞タイプにさらに分化させることも可能である。
【０３６５】
したがって、供給源である内胚葉、中胚葉または外胚葉前駆細胞（または幹細胞）には、最終分化細胞のいかなる使用も等しく伴うであろう。
【０３６６】
本明細書記載の方法および組成物によって産生される幹細胞、外胚葉、中胚葉または内胚葉前駆細胞および分化した細胞は、疾患の治療のため、または疾患の治療のための薬学的組成物の調製のために使用可能である。こうした疾患は、再生療法によって治療可能な疾患を含んでもよく、心不全、骨髄疾患、皮膚疾患、火傷、糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病などの変性疾患、および癌が含まれる。
【０３６７】
ライブラリー
例えば、未分化細胞および分化細胞の集団を用いて、分化した表現型に特異的な抗体およびｃＤＮＡライブラリーを調製してもよい。抗体を作製し、精製し、そして修飾するのに用いられる一般的な技術、ならびにイムノアッセイおよび免疫単離法におけるその使用が、Handbook of Experimental Immunology（Weir ＆ Blackwell監修）；  Current Protocols in Immunology（Coliganら監修）；およびMethods of Immunological Analysis（Masseyeffら監修， Weinheim: VCH Verlags GmbH）に記載される。ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡライブラリーの調製に関与する一般的な技術が、RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization（R. E. Farrell, Academic Press, 1998）；  cDNA Library Protocols（CowellおよびAustin監修， Humana Press）；およびFunctional Genomics（HuntおよびLivesey監修， 2000）に記載される。薬剤スクリーニングおよび療法適用で使用するには、比較的均一な細胞集団が特に適している。
【０３６８】
薬剤スクリーニング
また、幹細胞および分化した細胞を用いて、幹細胞または分化した細胞の特性に影響を及ぼす因子（例えば溶媒、小分子薬剤、ペプチド、ポリヌクレオチド等）または環境条件（例えば培養条件または操作）をスクリーニングしてもよい。
【０３６９】
幹細胞を用いて、多分化能または分化を促進する因子に関してスクリーニングしてもよい。いくつかの適用において、分化した細胞を用いて、成熟を促進するか、または長期培養中でのこうした細胞の増殖および維持を促進する因子をスクリーニングする。例えば、これらを異なるウェル中の細胞に添加し、そして次いで、さらなる培養および細胞の使用に関する所望の規準にしたがって、生じるいかなる表現型的変化も決定することによって、候補成熟因子または増殖因子を試験する。
【０３７０】
特定のスクリーニング適用は、薬剤研究において、薬学的化合物を試験することに関する。一般的に、標準的な教科書、“In vitro Methods in Pharmaceutical Research”， Academic Press, 1997、および米国特許第５，０３０，０１５号、ならびに本文書の別の箇所の薬剤スクリーンの一般的な説明を参照されたい。候補薬学的化合物の活性の評価には、一般的に、候補化合物と幹細胞または分化した細胞を合わせ、化合物に起因しうる、細胞の形態、マーカー表現型、または代謝活性のいかなる変化も測定し（未処理細胞または不活性化合物で処理した細胞と比較して）、そして次いで、観察される変化と化合物の効果を相関させる工程を伴う。
【０３７１】
例えば、特定の細胞タイプに対する薬理学的効果を有するように化合物を設計するため、または他の箇所で影響を有するように設計された化合物は、意図されない副作用を有しうるため、スクリーニングを行ってもよい。２以上の薬剤を組み合わせて（同時にまたは連続してのいずれかで細胞と組み合わせることによって）試験して、ありうる薬剤−薬剤相互作用効果を検出してもよい。いくつかの適用において、化合物をまず、潜在的な毒性に関してスクリーニングする（Castellら, pp. 375-410  “In vitro Methods in Pharmaceutical Research”中, Academic Press, 1997）。まず、細胞生存度、生存、形態、および特定のマーカー、受容体または酵素の発現または放出に対する効果によって、細胞傷害性を決定してもよい。ＤＮＡ合成または修復を測定することによって、染色体ＤＮＡに対する薬剤の効果を決定してもよい。特に細胞周期中のスケジュールされない時点での、または細胞複製に必要なレベルを超える、［３Ｈ］チミジンまたはＢｒｄＵ取り込みは、薬剤の影響と一致する。望ましくない影響にはまた、中期スプレッドによって決定される、異常な率の娘染色分体交換も含まれうる。さらなる詳細に関しては、Ａ．  Ｖｉｃｋｅｒｓ（PP 375-410 “In vitro Methods in Pharmaceutical Research”中, Academic Press, 1997）を参照されたい。
【０３７２】
組織再生
本明細書記載の方法および組成物にしたがって増殖する幹細胞（および該幹細胞から得られる分化した細胞）を、療法、例えば必要がある個々の患者における組織再構成または再生に用いてもよい。細胞が意図される組織部位に移植され、そして機能的に欠陥がある領域を再構成するかまたは再生するのを可能にする方式で、細胞を投与してもよい。
【０３７３】
増殖幹細胞または該幹細胞から得られる分化した細胞を、組織操作のため、例えば皮膚移植片の増殖のため、用いてもよい。人工臓器または組織のバイオエンジニアリングのため、あるいはステントなどの装具のため、これらを用いてもよい。
【０３７４】
また、その必要があるヒト患者における組織再構成または再生のため、分化した細胞を用いてもよい。細胞が意図される組織部位に移植され、そして機能的に欠陥がある領域を再構成するかまたは再生するのを可能にする方式で、細胞を投与する。例えば、本明細書記載の方法および組成物を用いて、幹細胞の分化を調節してもよい。分化した細胞を、組織操作のため、例えば皮膚移植片の増殖のため、用いてもよい。人工臓器または組織のバイオエンジニアリングのため、あるいはステントなどの装具のため、幹細胞分化の調節を用いてもよい。別の例において、治療中の疾患に応じて、中枢神経系の実質部位またはクモ膜下腔内部位に、神経幹細胞を直接移植する。μＬあたり２５，０００〜５００，０００細胞の密度で単細胞懸濁物または小凝集塊を用いて、移植を行う（米国特許第５，９６８，８２９号）。ＭｃＤｏｎａｌｄら（Nat. Med. 5:1410, 1999）によって記載されるように、急性脊髄傷害のラットモデルにおいて、神経細胞移植の有効性を評価してもよい。成功した移植は、２〜５週間後に、病変中に移植片由来細胞が存在し、アストロサイト、オリゴデンドロサイトおよび／またはニューロンに分化し、そして病変端から脊髄に沿って移動し、そしてゲート、協調および荷重付加が改善していることを示すであろう。
【０３７５】
神経系に対する急性または慢性損傷の治療のため、特定の神経前駆細胞を設計する。例えば、癲癇、脳卒中、虚血、ハンチントン病、パーキンソン病およびアルツハイマー病を含む多様な状態において、興奮毒性が関連付けられてきている。本明細書に記載する方法にしたがって作製するような特定の分化細胞はまた、ペリツェウス・メルツバッヘル病、多発性硬化症、白質ジストロフィー、神経炎および神経疾患などのミエリン形成不全障害（dysmyelinating disorders）を治療するのにもまた適切でありうる。これらの目的に適しているのは、再ミエリン形成を促進する、オリゴデンドロサイトまたはオリゴデンドロサイト前駆体が濃縮された細胞培養である。
【０３７６】
本発明者らの方法を用いて調製した肝細胞および肝細胞前駆体が肝臓損傷を修復する能力に関して、動物モデルにおいて評価してもよい。１つのこうした例は、Ｄ−ガラクトサミンの腹腔内注射によって引き起こされる損傷である（Dabevaら, Am. J. Pathol. 143:1606, 1993）。肝臓細胞マーカーに関する免疫組織化学染色、増殖中の組織において毛細胆管構造が形成されるかどうかの微視的決定、および治療が肝臓特異的タンパク質の合成を回復する能力によって、治療有効性を決定してもよい。直接投与によって、または被験体の肝臓組織が、劇症肝不全後に再生する間、一時的な肝機能を提供する生体補助（bioassist）デバイスの一部として、療法において肝細胞を用いてもよい。
【０３７７】
例えば、Ｇｒａｉｃｈｅｎら（２００７）に記載されるような、特異的ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ阻害剤であるＳＢ２０３５８０を用いて、ＭＡＰキナーゼ経路を調節することにより、幹細胞の分化を誘導することによって、心筋細胞を調製してもよい。治療を伴わないと左心室壁組織の５５％を瘢痕組織にする、心臓凍結傷害（cryoinjury）の動物モデルにおいて、こうした心筋細胞の有効性を評価してもよい（Liら, Ann. Thorac. Surg. 62:654, 1996; Sakaiら, Ann. Thorac. Surg. 8:2074, 1999、 Sakaiら, J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 118:715, 1999）。治療が成功すると、瘢痕面積が減少し、瘢痕拡大が限定され、そして収縮期圧、拡張期圧、および最大圧によって決定されるように、心臓機能が改善されるであろう。また、左前下行枝の遠位部分において塞栓コイルを用いて、心臓傷害をモデリングしてもよく（Watanabeら, Cell Transplant. 7:239, 1998）、そして組織学および心臓機能によって、治療有効性を評価してもよい。療法において、心筋細胞調製物を用いて、心筋を再生し、そして不十分な心臓機能を治療してもよい（米国特許第５，９１９，４４９号およびＷＯ  ９９／０３９７３）。
【０３７８】
癌
本明細書記載の方法および組成物にしたがって増殖させた幹細胞およびそこから得られる分化した細胞を癌治療に用いてもよい。
【０３７９】
用語「癌」および「癌性」は、典型的には、制御されない細胞増殖によって特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態を指すかまたは記載する。癌の例には、限定されるわけではないが、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病が含まれる。こうした癌のより特定の例には、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、膵臓癌、グリア細胞腫瘍、例えば神経膠芽腫および神経線維腫症、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、腎癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、ならびに多様なタイプの頭部および頸部癌が含まれる。さらなる例は、結腸癌、乳癌、肺癌および前立腺癌を含む固形腫瘍癌、白血病およびリンパ腫を含む造血悪性疾患、ホジキン病、再生不良性貧血、皮膚癌および家族性大腸ポリポーシスがある。さらなる例には、脳新生物、結腸直腸新生物、乳房新生物、子宮頸部新生物、目の新生物、肝臓新生物、肺新生物、膵臓新生物、卵巣新生物、前立腺新生物、皮膚新生物、精巣新生物、新生物、骨新生物、栄養膜細胞新生物、卵管新生物、直腸新生物、結腸新生物、腎臓新生物、胃新生物、および副甲状腺新生物が含まれる。乳癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、悪性黒色腫、白血病、リンパ腫、卵巣癌、子宮頸癌および胆管癌もまた含まれる。また、本明細書記載の方法および組成物にしたがって増殖され、そして場合によって分化される幹細胞を、抗癌剤、例えばエンドスタチンおよびアンギオスタチンまたは細胞傷害性剤または化学療法剤と組み合わせて用いてもよい。例えば薬剤、例えば、アドリアマイシン、ダウノマイシン、シスプラチン、エトポシド、タキソール、タキソテールおよびアルカロイド、例えばビンクリスチン、ならびに代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート。用語「細胞傷害性剤」は、本明細書において、細胞の機能を阻害するかまたは防止し、そして／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。該用語は、放射性同位体（例えばＩ、Ｙ、Ｐｒ）、化学療法剤、および毒素、例えば細菌、真菌、植物または動物起源の酵素的に活性である毒素、あるいはその断片を含むよう意図される。
【０３８０】
また、該用語には、癌遺伝子産物／チロシンキナーゼ阻害剤、例えばＷＯ  ９４／２２８６７に開示される二環性アンサマイシン；  ＥＰ  ６００８３２に開示される１，２−ビス（アリールアミノ）安息香酸誘導体；  ＥＰ  ６００８３１に開示される６，７−ジアミノ−フタラジン−１−オン誘導体；  ＥＰ  ５１６５９８に開示されるような４，５−ビス（アリールアミノ）−フタルイミド誘導体；またはＳＨ２含有基質タンパク質へのチロシンキナーゼの結合を阻害するペプチド（例えば、ＷＯ  ９４／０７９１３を参照されたい）が含まれる。「化学療法剤」は、癌治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、アドリアマイシン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、シトキシン、タキソール、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ＶＰ−１６、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、ニコチンアミド、エスペラミシン（米国特許第４，６７５，１８７号を参照されたい）、メルファランおよび他の関連ナイトロジェンマスタード、ならびに内分泌療法（例えば、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、タモキシフェン、ＬＨＲＨ拮抗薬剤、プロゲスチン、抗プロゲスチン等）が含まれる。
【０３８１】
本発明の実施は、別に示さない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の慣用的技術を使用し、これらは一般の当業者の能力内である。こうした技術は文献中に説明される。例えば、J. Sambrook, E.F. Fritsch, およびT. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 第1-3巻, Cold Spring Harbor Laboratory Press；  Ausubel, F.M.ら（１９９５および定期的な改訂； Current Protocols in Molecular Biology, 第9、13、および16章, John Wiley & Sons, New York, N.Y.）； B. Roe, J. CrabtreeおよびA. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons； J.M. PolakおよびJames O’D. McGee, 1990, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press； D.M.J. LilleyおよびJ.E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press； Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO.1 Edward Harlowによる， David Lane, Ed Harlow（1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7）；Antibodies: A Laboratory Manual  Ed Harlow（監修）， David Lane（監修）（1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2），1855；ならびにLab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench， Jane RoskamsおよびLinda Rodgers監修， 2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3を参照されたい：これらの一般的な教科書は本明細書に援用される。
【０３８２】
本発明には、記載する側面および好ましい特徴の組み合わせが含まれるが、こうした組み合わせが明らかに許容しえないかまたは明確に回避される場合を除く。
【０３８３】
本明細書で用いるセクション見出しは、構成目的のみのためであり、そして記載する主題を限定すると見なされないものとする。
【０３８４】
本発明の側面および態様を、例として、付随する図に言及しながら例示する。さらなる側面および態様は、当業者には明らかであろう。本テキストに言及されるすべての文書は、本明細書に援用される。
【実施例】
【０３８５】
以下の実施例は、細胞外マトリックスの使用を伴わないが、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ−２７６３２、ＨＡ１０７７またはファスジル、およびアウロチオグルコース）の補充を伴う、多様なマイクロキャリアー（ＤＥ５３、ＱＡ５２、Ｔｏｓｏｈ、Ｃｙｔｏｄｅｘ１、Ｃｙｔｏｄｅｘ３）上の安定した長期のヒト胚性幹細胞の増殖の証拠を提供する。ｈＥＳＣは、５回以上の継代後、これらの増殖、最終細胞密度、多能性マーカーＯｃｔ４、ｍＡｂ８４およびＴＲＡ−１−６０の発現、ならびに正常核型を保持した。
【０３８６】
実施例１  ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）
ヒト胚性幹細胞株、ＨＥＳ−２（４６  Ｘ、Ｘ）、およびＨＥＳ−３（４６  Ｘ、Ｘ）をES Cell Internationalから得る。２Ｄコロニー培養から得られる２００ｘ２００μｍ細胞塊の懸濁物として、またはマイクロキャリアー培養から得られる細胞−マイクロキャリアー凝集体として、細胞を凍結し、そして液体窒素中で保存する。
【０３８７】
実施例２  細胞培養：  ２Ｄコロニー培養
ｈＥＳＣを維持するため、Ｍａｔｒｉｇｅｌコーティング培養ディッシュ上（冷ＫＯ−ＤＭＥＭ、１：３０希釈中で希釈したＭａｔｒｉｇｅｌ（Becton Dickinson）と４℃で一晩インキュベーションする）で細胞を３７℃／５％ＣＯ２で培養してもよい。１ｍｌの培地を含む臓器培養ディッシュ（ＯＣＤ）中で細胞をルーチンに維持する。
【０３８８】
用いる培地は、ＭＥＦフィーダー由来の馴化培地（ＣＭ）、ＳｔｅｍＰｒｏ  ｈＥＳＣ血清不含培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｍＴｅＳＲ−１血清不含培地（Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のいずれかである。培地を毎日交換する。コラゲナーゼ（Ｃｈｏｏら、２００４）またはｔｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）での酵素処理によって、あるいはＳｔｅｍＰｒｏ  ＥＺＰａｓｓａｇｅ幹細胞継代ツール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた機械的解離によって、静置コロニー培養を毎週継代する。
【０３８９】
実施例３  細胞培養：３Ｄマイクロキャリアー培養
分散２Ｄコロニー培養から得たかまたは液体窒素保存から直接得た細胞懸濁物（２Ｄコロニー培養から得た２００ｘ２００μｍ組織または細胞−マイクロキャリアー凝集体として）を、マイクロキャリアー懸濁物（４ｍｇ／ｍｌ）上、０．１〜０．３ｘ１０６／ｍｌの濃度で植え付ける。
【０３９０】
いくつかの実験において、より均一な培養を確実にするため、マイクロキャリアー懸濁物に添加する前に、１００および５００μｍメッシュ篩を通じて、細胞接種物をスクリーニングする。静置条件下で、あるいは１００または１５０ｒｐｍ（ＩＫＡ軌道振盪装置）で攪拌して、非付着６ウェルディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上、３７℃／５％ＣＯ２で細胞を培養する。用いる培地は、ＭＥＦ−ＣＭまたは定義する培地のいずれかである。培地を毎日交換する。コラゲナーゼまたはｔｒｙｐＬＥでの酵素処理後、あるいは１：２〜１：１０の分割比での反復ピペッティングによる機械的解離後、培養を毎週継代する。８ｍｌの培地を含む、Ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングした６ｃｍ組織培養ペトリディッシュ上に、集密細胞−マイクロキャリアー凝集体を置き、そして細胞を７日間培養することによって、２Ｄコロニー培養に対するマイクロキャリアー培養の再プレーティングを行う。
【０３９１】
実施例４  スピナー培養
シリコーン処理した（Sigmacote、SL2 Sigma-Aldrich）１００ｍｌ  Ｂｅｌｌｃｏスピナーフラスコに、３ｘ１０５細胞／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌマイクロキャリアーの密度で、最初の体積を２５ｍｌとして、攪拌を伴わず、制御インキュベーター中、３７℃および５％  ＣＯ２で、ｈＥＳＣを植え付ける。
【０３９２】
新鮮な馴化培地を用いて反応容器体積を５０ｍｌに増加させ、そして接種後１２時間、３０ｒｐｍで攪拌する。８０％の消費した培地を毎日取り除き、そして新鮮な馴化培地と交換する。細胞計数および代謝産物分析のため、毎日の試料を採取する。
【０３９３】
実施例５  Ｍａｔｒｉｇｅｌの非存在下およびＲＯＣＫ阻害剤の存在下でのマイクロキャリアー上での培養
材料および方法
マイクロキャリアー上のｈＥＳＣ培養のための馴化培地の調製
本発明者らの公表したプロトコルにしたがって、馴化培地を調製した−Ｃｈｏｏら，  ２００７（Identification of proteins from feeder conditioned medium that support human embryonic stem cells. J. Biotechnol. 130, 320-328）。
【０３９４】
ＤＥ５３、ＱＡ５２、Ｔｏｓｏｈ、Ｃｙｔｏｄｅｘ１およびＣｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアー上のｈＥＳＣの植え付け
コーティングされていないマイクロキャリアー上にｈＥＳＣを植え付け、そして実施例３のプロトコル、およびＯｈら，  ２００９（Long term microcarrier suspension cultures of human embryonic stem cells， Stem Cell Research(2009)）のプロトコルにしたがって、毎週継代した。
【０３９５】
ＲＯＣＫ阻害剤の調製
Ｙ−２７６３２−１０ｍＭストック：  ５ｍｇを１．４８ｍｌの水に溶解する。
【０３９６】
ＨＡ１０７７（ファスジル）−  １０ｍＭストック：  ５ｍｇを１．３７ｍｌの水に溶解する。
【０３９７】
アウロチオグルコース（ＡｕＴＧ）−  １０ｍＭストック：  ５ｍｇを１．２８ｍｌの水に溶解する。
【０３９８】
すべての化学薬品をＣａｌｂｉｏｃｈｅｍより購入した。マイクロキャリアー上のｈＥＳＣに供給する前に、すべての阻害剤を馴化培地中でその最終作業濃度に希釈した。
【０３９９】
多能性マーカーのＦＡＣＳ性質決定
Ｏｈら，  ２００９（Long term microcarrier suspension cultures of human embryonic stem cells， Stem Cell Research(2009)）による本発明者らの最近の研究にしたがって、性質決定を行った。
【０４００】
簡潔には、フローサイトメトリーを用いて、免疫蛍光によって、ｈＥＳＣ集団における細胞外抗原ＴＲＡ−１−６０、および細胞内転写因子、Ｏｃｔ４の発現レベルを評価する。トリプシンまたはｔｒｙｐＬＥ  ｅｘｐｒｅｓｓを用い、単細胞懸濁物として、細胞を採取し、４０μｍ篩（ＢＤ）を通じてろ過し、固定し、浸透処理し（Ｃａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、そしてＴＲＡ−１−６０（１：５０希釈、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、ＭＡＢ４３６０／４３８１）およびＯｃｔ−４（１：２０希釈、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）に対する一次抗体とインキュベーションする。
【０４０１】
次いで、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで細胞を洗浄し、そして暗所で、１：５００希釈のヤギα−マウス抗体ＦＩＴＣ−コンジュゲート化（ＤＡＫＯ）とインキュベーションする。インキュベーション後、細胞を再び洗浄し、そしてＦＡＣＳｃａｎ（Becton Dickinson FACS Calibur）上での分析のため、１％ＢＳＡ／ＰＢＳに再懸濁する。すべてのインキュベーションを室温で１５分間行う。
【０４０２】
核型決定
活発に増殖しているｈＥＳＣ培養を、１ｍｌ  ＫＯ−培地中で希釈したコルセミド溶液と１５〜１６時間、３７℃／５％ＣＯ２でインキュベーションした後、中期で停止させる。細胞遺伝学分析を、KK Women’s and Children’s Hospital,  シンガポールのCytogenetics Laboratoriesに委託する。
【０４０３】
ＳＥＭ
SEM Unit, Institute of Molecular Cell Biology，  シンガポールで、走査型電子顕微鏡法を行った。
【０４０４】
結果
以下の議論において、Ｍａｔｒｉｇｅｌ不含マイクロキャリアー上でのｈＥＳＣの培養を、以下の見出し以下に提示する：
１．  ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２を含む、９週間のセルロースＤＥ５３マイクロキャリアー上でのｈＥＳＣ長期培養。
【０４０５】
２．  ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２を含む、６週間の球状Ｔｏｓｏｈマイクロキャリアー上でのｈＥＳＣ長期培養。
【０４０６】
３．  ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２を含む、５週間のセルロースＤＥ５３、Ｔｏｓｏｈ、Ｃｙｔｏｄｅｘ１およびＣｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアー上でのｈＥＳＣ長期培養の比較。
【０４０７】
４．  ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２を含む、セルロースＤＥ５３上のｈＥＳＣの走査型電子顕微鏡法。
【０４０８】
５．  ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２を含む、５〜１０週の間のセルロースＤＥ５３、ＱＡ５２、Ｔｏｓｏｈ、およびＣｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアー上のｈＥＳＣの核型。
【０４０９】
６．  別のＲＯＣＫ阻害剤、ＨＡ１０７７（ファスジル）およびアウロチオグルコースを含む、２週間のセルロースＤＥ５３マイクロキャリアー上でのｈＥＳＣ培養。
【０４１０】
ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２を含む、９週間のセルロースＤＥ５３マイクロキャリアー上でのｈＥＳＣ長期培養
図１は、１０μＭで補充したＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２を含むセルロースＤＥ５３マイクロキャリアー上で、ｈＥＳＣを連続９週間継代可能であることを示す。達成される細胞密度は、６ウェルプレート中（各ウェル体積は４ｍｌである）、３００万〜７５０万／ウェルで多様である。しかし、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２を含まないと、細胞数は急速に減少し、そして４週を超えては、継代不能である。ｈＥＳＣは、マイクロキャリアー周囲に集密凝集体を形成する。図２は、Ｍａｔｒｉｇｅｌを含まないがＲＯＣＫ阻害剤を含む、マイクロキャリアー培養中、３週間に渡る多能性マーカーＯｃｔ４およびｍＡｂ８４の安定発現を示すが、ＲＯＣＫ阻害剤を含まない場合はマーカーの有意な下方制御が示される。９週目までに、Ｍａｔｒｉｇｅｌを含まないがＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２を含むマイクロキャリアー培養中、多能性マーカーＯｃｔ４、ｍＡｂ８４およびＴｒａ−１−６０の発現はなお頑強である（図３）。
【０４１１】
ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２を含む、６週間の球状Ｔｏｓｏｈマイクロキャリアー上でのｈＥＳＣ長期培養
図４は、Ｍａｔｒｉｇｅｌを含まないが、Ｒｏｃｋ阻害剤Ｙ−２７６３２を補充し、ポリリジンで正に荷電している球状Ｔｏｓｏｈ  ６５ミクロン・マイクロキャリアー上での連続６週間のｈＥＳＣ継代を示す。細胞数は３００万〜５００万／ウェルの範囲である。多能性マーカーＯｃｔ４、およびＴｒａ−１−６０は、４継代目で強く発現される。しかし、Ｒｏｃｋ阻害剤Ｙ−２７６３２の非存在下では、２継代目で細胞数が劇的に低下し、そして残された細胞は、多能性マーカーＴｒａ−１−６０の有意な下方制御を示す。
【０４１２】
ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２を含む、５週間のセルロースＤＥ５３、Ｔｏｓｏｈ、Ｃｙｔｏｄｅｘ１およびＣｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアー上でのｈＥＳＣ長期培養の比較
図５は、Ｍａｔｒｉｇｅｌを含まないが、Ｒｏｃｋ阻害剤Ｙ−２７６３２を含むセルロース、Ｔｏｓｏｈ、Ｃｙｔｏｄｅｘ１およびＣｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアー上での連続５週間のｈＥＳＣ継代を示す。特に、Ｃｙｔｏｄｅｘ１およびＣｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアー上で達成される細胞数は、５００万〜７００万／ウェルでより高い範囲であるようであり、一方、セルロースおよびＴｏｓｏｈマイクロキャリアーは、５継代目で４００万／ウェルを達成した。Ｍａｔｒｉｇｅｌを含まないが、Ｒｏｃｋ阻害剤Ｙ−２７６３２を含むセルロース、Ｔｏｓｏｈ、Ｃｙｔｏｄｅｘ１およびＣｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアー上のｈＥＳＣの写真を示す（図６）。ｈＥＳＣクラスターは、これらのマイクロキャリアー培養すべての上で集密に見える。図７は、Ｍａｔｒｉｇｅｌを含まないが、Ｒｏｃｋ阻害剤Ｙ−２７６３２を含む、Ｃｙｔｏｄｅｘ１、Ｃｙｔｏｄｅｘ３、セルロース、およびＴｏｓｏｈマイクロキャリアー上で培養した５継代目のｈＥＳＣによって、多能性マーカーＯｃｔ４およびｍＡｂ８４の頑強な発現があることを示す。
【０４１３】
ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２を含む、セルロースＤＥ５３上のｈＥＳＣの走査型電子顕微鏡法
図８は、Ｍａｔｒｉｇｅｌを含まないが、Ｒｏｃｋ阻害剤Ｙ−２７６３２を含む、セルロースマイクロキャリアー上のｈＥＳＣの走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）を示す。ｈＥＳＣは、セルロースマイクロキャリアーを取り巻く、緊密でそして集密な細胞凝集体を形成する。図９は、Ｍａｔｒｉｇｅｌを含まないが、Ｒｏｃｋ阻害剤Ｙ−２７６３２を含む、セルロースマイクロキャリアー上のｈＥＳＣのＳＥＭの第二の例を示す。
【０４１４】
ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２を含む、５〜１０週の間のセルロースＤＥ５３、ＱＡ５２、Ｔｏｓｏｈ、およびＣｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアー上のｈＥＳＣの核型
図１０は、それぞれ８継代目および７継代目の、ＤＥ５３およびＱＡ５２セルロースマイクロキャリアー上で培養したｈＥＳＣが、安定な核型を保持することを示す。同様に、図１１は、それぞれ１０継代目および５継代目の、球状ポリリジンコーティングＴｏｓｏｈおよびＣｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアー上で培養したｈＥＳＣの安定な核型を示す。
【０４１５】
別のＲＯＣＫ阻害剤、ＨＡ１０７７（ファスジル）およびアウロチオグルコースを含む、２週間のセルロースＤＥ５３マイクロキャリアー上でのｈＥＳＣ培養
以下を含む、他のタイプのＲＯＣＫ阻害剤を評価した：
１．  ＨＡ１０７７（ファスジル）：  ＲＯＣＫ阻害剤
２．  アウロチオグルコース：  ＮＦ−κＢ阻害剤
３．  ＬＹ  ２９４００２：  Ｐ１３Ｋ阻害剤
４．  ヒドロキシファスジル：  ＲＯＣＫ阻害剤
５．  Ｒｈｏキナーゼ阻害剤Ｉ：  ＲＯＣＫ阻害剤
６．  Ｒｈｏキナーゼ阻害剤ＩＩ：  ＲＯＣＫ阻害剤
用いた対照は、ＭａｔｒｉｇｅｌでコーティングされたＤＥ５３マイクロキャリアーであった。０．０２μｌ  ＤＭＳＯをスパイク処理したコーティングされていないＤＥ５３を含むブランクもまた用いた。
【０４１６】
阻害剤ＨＡ１０７７（１０および４０μＭで補充）およびアウロチオグルコース（１０μＭ）は、０継代目および１継代目で、Ｍａｔｒｉｇｅｌを含まないセルロースマイクロキャリアー上のｈＥＳＣの頑強な増殖を補助する（図１２）。細胞数は、６００万〜９００万／ウェルに到達し、これは、１継代目で８００万／ウェルを達成した、Ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングを含む対照培養に同等である。図１３および１４は、Ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングを含む対照に比較した、０継代目および１継代目の、阻害剤ＨＡ１０７７およびアウロチオグルコースを含むｈＥＳＣ培養の多能性マーカーＯｃｔ４およびｍＡｂ８４の安定発現を示す。図１５は、別のＲＯＣＫ阻害剤、アウロチオグルコースおよびＨＡ１０７７（ファスジル）を含むマイクロキャリアー上のｈＥＳＣの集密培養の写真を示す。
【０４１７】
今日まで、本発明者らは、４継代目まで、アウロチオグルコースの存在下でのｈＥＳＣ継代に成功してきており、多能性マーカーＯｃｔ４およびｍＡｂ８４の強い発現が連続している（図１９および２０を参照されたい）。
【０４１８】
このデータは、５タイプのマイクロキャリアー：すべてコーティングされていないセルロースＤＥ５３、ＱＡ５２、Ｔｏｓｏｈ、Ｃｙｔｏｄｅｘ１およびＣｙｔｏｄｅｘ３が、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２を含む長期培養中でｈＥＳＣを補助しうることを立証する。ＨＡ１０７７（ファスジル）およびアウロチオグルコースなどの他の阻害剤もまた、Ｍａｔｒｉｇｅｌを含まないｈＥＳＣ培養を補助しうる。
【０４１９】
実施例６
マトリックス不含セルロースＤＥ５３マイクロキャリアー上でのｈＥＳＣ（ＨＥＳ−２）細胞培養を可能にする能力に関して、ある範囲のＲＯＣＫ阻害剤（１０μＭ）を試験した。これらには、ファスジル、ヒドロキシファスジルおよびアウロチオグルコースが含まれ、そしてこれらを対照（ＭａｔｒｉｇｅｌでコーティングされたＤＥ５３マイクロキャリアー）に比較した。
【０４２０】
連続して添加したＲＯＣＫ阻害剤を９週間（週あたり１回の継代）に渡って試験し、図２１（Ａ〜Ｃ）に結果を示した。ファスジル、ヒドロキシファスジルおよびアウロチオグルコースを毎日９週間連続添加すると、対照ＤＥ５３マイクロキャリアーと類似の細胞密度までのｈＥＳＣ細胞拡大を補助することが可能であった（図２１Ａ）。多能性マーカーＴｒａ−１−６０の発現は、対照の９０％と比較して、９週後、ファスジルおよびヒドロキシファスジルに関して約８０％であり、そしてアウロチオグルコースでは６０％であった（図２１Ｂ）。多能性マーカーＯｃｔ４の発現は、対照の５５％と比較して、９週後、ファスジルおよびヒドロキシファスジルに関して約３０〜４０％であり、そしてアウロチオグルコースでは５０％であった（図２１Ｃ）。
【０４２１】
ファスジル、ヒドロキシファスジル、アウロチオグルコースおよびＹ２７６３２の６週間の単回用量添加は、対照ＤＥ５３マイクロキャリアーと類似の細胞密度（５００万／ウェル）までのｈＥＳＣ（ＨＥＳ−２）細胞拡大補助を可能にした（図２４Ａ）。多能性マーカーＴｒａ−１−６０の発現は、６週後、ファスジルおよびＹ２７６３２に関して約８０％であり、アウロチオグルコースに関しては７０％であり、そしてヒドロキシファスジルでは５０％であった（図２４Ｂ）。多能性マーカーＯｃｔ４の発現は、６週後、ファスジルおよびヒドロキシファスジル、アウロチオグルコースおよびＹ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤に関して６０％で非常に類似であった（図２５）。
【０４２２】
実施例７  マイクロキャリアー上のＲＯＣＫ阻害剤を含まないｉＰＳ細胞の培養
Ｙ−２７６３２（１０μＭ）を含む、Ｃｙｔｏｄｅｘ１およびＤＥ５３マイクロキャリアー上で培養したＨＥＳ−２細胞は、対照培養（ＭａｔｒｉｇｅｌでコーティングされたＣｙｔｏｄｅｘ１またはＤＥ５３）と類似の細胞濃度および多能性マーカー発現（Ｔｒａ−１−６０）を示した（図２６および２７）。
【０４２３】
実施例８  マイクロキャリアー上のＲＯＣＫ阻害剤を含むｉＰＳ細胞の培養
ｉＰＳ  ＩＭＲ９０細胞（１．６ｘ１０５細胞／ｍｌ）を、２０ｍｇのコーティングされていないＤＥ５３、５ｍｌの血清不含培地ｍＴｅＳＲ１、４μｌのＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ−２７６３２）［１０μＭ］を含む６ウェルプレートのウェル中で培養した。毎日、８０％の培地を新鮮にし、そして阻害剤を添加した。
【０４２４】
細胞密度は１２回の継代に渡って安定であった（図２８）。Ｏｃｔ４およびＴｒａ−１−６０発現は１２回の継代に渡って安定であった（図２９および図３０）。
【０４２５】
実施例９  ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｍａｔｒｉｇｅｌの非存在下で、どのようにｈＥＳＣおよびｈｉＰＳマイクロキャリアー培養を維持するか？
本発明者らは、２つのｈＥＳＣ（ＨＥＳ２およびＨＥＳ３）および２つのヒトｉＰＳ（ＩＭＲ９０および包皮）細胞株の多能性を保持しつつ、多様なマイクロキャリアー（ＤＥ５３、ＣｙｔｏｄｅｘおよびＴｏｓｏｈ）上、Ｍａｔｒｉｇｅｌの非存在下で１０週間より長く、これらの細胞株を維持可能であることを立証した。
【０４２６】
ＲＯＣＫ阻害剤を含むｈＥＳＣの長期培養のこの独特の現象を調べつつ、本発明者らは、マイクロアレイ研究によって、Ｍａｔｒｉｇｅｌを含まないＲＯＣＫ阻害剤マイクロキャリアー培養対Ｍａｔｒｉｇｅｌを含むマイクロキャリアー培養の遺伝子発現を比較し、そして１４１遺伝子の共通のセットが、ＲＯＣＫ阻害剤での処理に際して、２倍を超えて示差的に上方または下方制御されていることを見出した（結果は示さない）。
【０４２７】
Ｐａｎｔｈｅｒデータベース（http://www.pantherdb.org/）中の１６２経路に対する経路に基づく分析によって、示差的に発現される遺伝子が濃縮された、５つの適切な経路が明らかになった。これらの経路内では、インテグリン／コラーゲン合成と関連するいくつかの遺伝子、ＦＯＸ転写因子およびＴＧＦ−ベータ遺伝子が上方制御され、一方、いくつかのカドヘリン遺伝子が下方制御されていた。
【０４２８】
参考文献
【０４２９】
【化１６】
2012520672.tif 000018
【０４３０】
出願および特許各々の手続き遂行中のものを含む、本文書で言及する出願および特許各々、ならびに上記出願および特許各々に引用されるかまたは言及される各文書（「出願に引用される文書」）、ならびに出願および特許各々に、そして任意の出願に引用される文書に、引用されるかまたは言及される任意の製品に関する任意の製造者の使用説明書またはカタログが、本明細書に援用される。さらに、本テキストに引用するすべての文書、および本テキストに引用する文書に引用されるかまたは言及されるすべての文書、ならびに本テキストに引用するかまたは言及する任意の製品に関する任意の製造者の使用説明書またはカタログが、本明細書に援用される。
【０４３１】
本発明の範囲および精神から逸脱することのない、本発明に記載する方法および系の多様な修飾および変型が、当業者には明らかであろう。本発明は、特定の好ましい態様と関連して記載されてきているが、請求するような本発明が、こうした特定の態様に、過度に限定されてはならず、そしてこれに対する多くの修飾および付加を、本発明の範囲内で行いうることが理解されなければならない。実際、分子生物学または関連分野の当業者に明らかである、本発明を実行するための記載する様式の多様な修飾は、請求の範囲内であるように意図される。さらに、本発明の範囲から逸脱することなく、独立クレームの特徴を持つ、以下の従属クレームの特徴の多様な組み合わせを行うことも可能である。
【図１】
2012520672.tif 000019
【図２】
2012520672.tif 000020
【図３】
2012520672.tif 000021
【図４】
2012520672.tif 000022
【図５】
2012520672.tif 000023
【図６】
2012520672.tif 000024
【図７】
2012520672.tif 000025
【図８】
2012520672.tif 000026
【図９】
2012520672.tif 000027
【図１０】
2012520672.tif 000028
【図１１】
2012520672.tif 000029
【図１２】
2012520672.tif 000030
【図１３】
2012520672.tif 000031
【図１４】
2012520672.tif 000032
【図１５】
2012520672.tif 000033
【図１６】
2012520672.tif 000034
【図１７】
2012520672.tif 000035
【図１８】
2012520672.tif 000036
【図１９】
2012520672.tif 000037
【図２０】
2012520672.tif 000038
【図２１Ａ】
2012520672.tif 000039
【図２１Ｂ】
2012520672.tif 000040
【図２１Ｃ】
2012520672.tif 000041
【図２２】
2012520672.tif 000042
【図２３】
2012520672.tif 000043
【図２４】
2012520672.tif 000044
【図２５】
2012520672.tif 000045
【図２６】
2012520672.tif 000046
【図２７】
2012520672.tif 000047
【図２８】
2012520672.tif 000048
【図２９】
2012520672.tif 000049
【図３０】
2012520672.tif 000050
【国際調査報告】
2012520672.tif 000051
2012520672.tif 000052