(57)【要約】  本発明は、ｒｃｋ/ｐ５４蛋白質の役割を解明する過程において得られた知見をもとに、各種細胞の増殖および分化の段階を検出するとともに、各種細胞の増殖・分化を評価する手段を提供する。  ｒｃｋ/ｐ５４蛋白質の部分配列であるペプチドを抗原として抗体を作成し、ｒｃｋ/ｐ５４蛋白質と特異的に反応性を有する抗体を用いて、各種細胞に対するｒｃｋ/ｐ５４蛋白質の役割について検討を加えた結果、各種細胞の増殖及び分化を評価する手段を確立した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のアミノ酸配列を有する低分子ペプチド
（ａ）STARTENPVI (1-10)
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され、または、モノヨード酢酸等で化学修飾したアミノ酸を含むアミノ酸配列。
【請求項２】
請求項１記載のペプチドを抗原として得られたことを特徴とする抗体。
【請求項３】
請求項１記載のペプチドを抗原として得られた抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする抗体。
【請求項４】
請求項２又は３で得られた抗体を用いることを特徴とする各種細胞の増殖及び分化を検査する方法。
【請求項５】
請求項２又は３で得られた抗体を含有することを特徴とする各種細胞の増殖及び分化を検査するキット。
【請求項６】
請求項２又は３で得られた抗体を用いることを特徴とする精子の増殖及び分化を検査する方法。
【請求項７】
請求項２又は３で得られた抗体を含有することを特徴とする精子の増殖及び分化を検査するキット。
【請求項８】
請求項２又は３で得られた抗体を用いることを特徴とする不妊症の診断方法。
【請求項９】
請求項２又は３で得られた抗体を含有することを特徴とする不妊症診断用のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｒｃｋ/ｐ５４由来の低分子ペプチドを抗原として調製した抗体を用いて各種細胞の増殖及び分化を測定する方法に関わる。
【背景技術】
【０００２】
ｒｃｋ/ｐ５４は、RNAヘリカーゼ活性を有することが確認され、Xenopus卵形成において、効率的なｍRNAの翻訳に必須であることが確認された蛋白である。ヒトｒｃｋ/ｐ５４は、ヒトＢリンパ腫細胞株ＲＣ−Ｋ８における染色体転座の転位点ｔ（１１；１４）（ｑ２３；ｑ３２）の第１１番染色体バンドｑ２３よりクローニングされた遺伝子産物である。ｒｃｋ/ｐ５４蛋白は、４７２個のアミノ酸からなる分子量５４ｋＤａの細胞質限局の蛋白質であって、正常細胞では全ての組織に認められるが、脳、骨格筋及び肺組織ではその発現は低下している。しかし、これらの組織から発生した腫瘍では、ｒｃｋ/ｐ５４の発現は亢進しており、ｒｃｋ/ｐ５４は、腫瘍細胞では他の翻訳開始因子と協同して細胞増殖及び悪性化に関わる遺伝子のｍＲＮＡ（ｓ）の翻訳を促進しているものと推測されている（一般文献１）。【０００３】
特許文献１においては、前記ｒｃｋ/ｐ５４、及びそれと実質的に同一のホモログ蛋白又はそれと実質的に同一の作用を有する蛋白質を開示している。このような蛋白質を用いて、蛋白合成効率を高める方向にｍＲＮＡ分子の構造を変化させることができるように構成されたＲＮＡ修飾蛋白を提供すると共に、蛋白合成効率を容易に高めるように構成された蛋白合成促進剤、導入遺伝子の翻訳効率を高めることができるように構成された遺伝子治療薬、及び癌の治療を効果的に行うことができるように構成された癌治療薬を提供することを目的としている。【０００４】
本発明においては、ｒｃｋ/ｐ５４蛋白質の部分配列であるペプチドを抗原として得られる抗体を調製し、得られたｒｃｋ/ｐ５４蛋白質と特異的に反応する抗体を用いて、各種細胞の増殖及び分化の段階を検出するとともに、ｒｃｋ/ｐ５４の役割を解明しようとするものである。
【特許文献１】特開２００３−２８９８６０号公報
【非特許文献１】Cancer Research,55,3444-3449,1995
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ｒｃｋ/ｐ５４蛋白質の役割を解明する過程において得られた知見をもとに、各種細胞の増殖及び分化の段階を検出するとともに、各種細胞の増殖及び分化を検査する手段を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ｒｃｋ/ｐ５４蛋白質の部分配列であるペプチドを抗原として抗体を作成し、ｒｃｋ/ｐ５４蛋白質と特異的に反応性を有する抗体を用いて、各種細胞に対するｒｃｋ/ｐ５４蛋白質の役割について、鋭意研究を重ねた結果、各種細胞の増殖及び分化を検査する手段を確立した。【０００７】
本発明の特徴は、以下のアミノ酸配列を有する低分子ペプチド
（ａ）STARTENPVI (1-10)であって、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され、または、モノヨード酢酸等で化学修飾したアミノ酸を含むアミノ酸配列である。ｒｃｋ/ｐ５４蛋白の部分配列である上記（ａ）配列を用いて以下の実験を行った。【０００８】
本発明の別の特徴は、請求項１記載のペプチドを抗原として得られたことを特徴とする抗体である。ｒｃｋ／ｐ５４蛋白質のアミノ酸配列より、STARTENPVI (1-10)のアミノ酸配列を種々の実験に用いた。【０００９】
本発明の別の特徴は、請求項１記載のペプチドを抗原として得られた抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする抗体である。請求項１のアミノ酸配列（ａ）を有するペプチドを抗原として用いることによって、ｒｃｋ／ｐ５４蛋白質に特異的に反応性を有する抗体が得られた。【００１０】
本発明の別の特徴は、請求項２又は３で得られた抗体を用いることを特徴とする各種細胞の増殖及び分化を検査する方法である。請求項１のアミノ酸配列（ａ）を有するペプチドを抗原として用いることによって、ｒｃｋ／ｐ５４蛋白質に特異的に反応性を有するモノクローナル抗体が得られた。【００１１】
本発明の別の特徴は、請求項２又は３で得られた抗体を含有することを特徴とする各種細胞の増殖及び分化を検査するキットである。【００１２】
本発明の別の特徴は、請求項２又は３で得られた抗体を用いることを特徴とする精子の増殖及び分化を検査する方法である。【００１３】
本発明の別の特徴は、請求項２又は３で得られた抗体を含有することを特徴とする精子の増殖及び分化を検査するキットである。【００１４】
本発明の別の特徴は、請求項２又は３で得られた抗体を用いることを特徴とする不妊症の診断方法である。【００１５】
本発明の別の特徴は、請求項２又は３で得られた抗体を含有することを特徴とする不妊症診断用のキットである。
【発明の効果】
【００１６】
ｒｃｋ／ｐ５４蛋白質のアミノ酸配列より、STARTENPVI (1-10)のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として免疫した結果、ｒｃｋ／ｐ５４蛋白質に特異的に反応性を有する抗体が得られた。この抗体を用いて、種々の細胞の増殖及び分化の段階を検出することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１はｒｃｋ／ｐ５４蛋白質のウェスタンブロット法による抗ｒｃｋ／ｐ５４抗体との反応を示す。
【図２】図２は、蛍光抗体法による卵巣におけるｒｃｋ／ｐ５４蛋白質の検出とその局在を示す。
【図３】図３は、蛍光抗体法による精巣におけるｒｃｋ／ｐ５４蛋白質の検出とその局在を示す。
【図４】図４は、蛍光抗体法による副睾丸におけるｒｃｋ／ｐ５４蛋白質の検出とその局在を示す。
【図５】図５は、ｒｃｋ／ｐ５４蛋白質の発現量に及ぼすプロゲステロン投与の影響を調べた結果を示す。
【図６】図６は、受精とｒｃｋ／ｐ５４遺伝子の発現量の関係を調べた結果を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、ＣｏｎーＡ処理細胞における細胞の増殖を調べた結果を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＣｏｎーＡ処理細胞におけるｒｃｋ／ｐ５４蛋白質の発現を調べた結果を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、ＴＰＡ処理細胞におけるＵ９３７細胞の増殖を調べた結果を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＴＰＡ処理細胞におけるＵ９３７細胞のＣＤ３８の発現を示す。
【図８Ｃ】図８Ｃは、ＴＰＡ処理細胞におけるＵ９３７細胞のｒｃｋ／ｐ５４蛋白質の発現を調べた結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
ペプチドの合成
本発明のペプチドの合成はよく知られている方法、例えば、連続するアミノアシル基を２つずつ順次所定の順序で縮合させるか、あるいはアミノアシル基と予め形成され既に数個のアミノアシル基を有するフラグメントとを適当な順序で縮合させるか、あるいはこのように予め形成された数個のフラグメントを縮合させることにより合成することにより得ることが出来る。その際、通常ペプチド結合が形成される一方のアミン官能基と他方のカルボキシル基（あるいはその反対）以外、これらのアミノアシル基又はフラグメントが有する全ての反応性官能基を、特にカルボキシル官能基の活性化後においては、ペプチド合成で公知の方法に従って予め保護しておくように注意を払う。又、カルボジイミドタイプ、例えば１−エチルー３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドなどの通常のカップリング試薬を使用するカップリング反応を使用することも出来る。使用されるアミノアシル基が、さらにアミン官能基（例えばリジンの場合）るいは別の酸官能基（例えばグルタミン酸の場合）を有する場合、これらの官能基は、例えばアミン官能基についてはカルボベンゾオキシあるいはｔ−ブチルオキシカルボニル基により保護され、カルボキシ官能基についてはｔ−ブチルエステル基で保護される。これらの操作は、他の任意の反応性官能基の保護と同様である。例えば、使用されるアミノアシル基（例えばシスティンの場合、アセトアミドメチル基あるいはパラメトキシベンジル基を使用することができる。アミノ酸ごとに漸進的に合成する場合には、合成は、Ｃ−末端アミノ酸と、所望の配列における隣接のアミノアシル基に対応するアミノ酸との縮合により開始させ、一つひとつ段階的にＮー末端アミノ酸に至るまで続けるのが好ましい。【００１９】
本発明のペプチドの別の好ましい合成方法として、Ｒ．Ｄ．メリフィールドによる固相ペプチド合成法が挙げられる。メリフィールドの方法は、極めて多孔性の重合体樹脂が使用され、それにペプチド鎖の最初のＣ−末端アミノ酸が固定される。このアミノ酸は、樹脂にそのカルボキシル基を介して固定され、そのアミン官能基は、例えばｔ−ブチルオキシカルボニル基などにより保護されている。最初のＣ−末端アミノ酸が、このように樹脂に固定されると、アミン官能基の保護基は、酸で樹脂を洗浄することにより除去される。アミン官能基の保護基がｔ−ブチルオキシカルボニル基である場合には、樹脂をトリフルオロ酢酸で処理することにより除去することが出来る。次いで、第２のアミノ酸がカップリングされ、これはＣ−末端アミノアシル基から鎖に固定された最初のＣ−末端アミノ酸の脱保護されたアミン官能基に至る所望の配列の、第２のアミノアシル基を与える。好ましくはこの第２のアミノ酸のカルボキシル基は、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドにより活性化され、アミン官能基は、例えばｔ−ブチルオキシカルボニルにより保護されているのがよい。このようにして、所望のペプチド鎖の第１の部分が得られ、それは２つのアミノ酸よりなり、その末端アミン官能基は保護されている。前記と同様にアミン官能基を脱保護し、次いで第２のＣ−末端アミノ酸の付加の条件と同様な条件下で、第３のアミノアシル基の固定化を行うことが可能となる。このようにして、次々と、ペプチド鎖を構成するアミノ酸を、既に形成された樹脂に付着しているペプチド鎖の一部分の、毎回予め脱保護されたアミノ基に固定する。所望のペプチド鎖が全部形成されると、ペプチド鎖を形成する異なったアミノ酸の保護基を除去し、ペプチドを樹脂から例えばフッ化水素酸を用いて脱着して所望のペプチドを得ることが出来る。【００２０】
抗体の調製
ポリクローナル抗体の調製は、上記のようにして得られたｒｃｋ/ｐ５４の部分配列のペプチド１００μｇ/bodyを等量のコンプリートアジュバントと混合して５匹のウサギに２週間おきに４回免疫した。最終免疫１週間後常法に従って、充分な力価の抗血清を産生したウサギの全血液を採取し、続いてこれを３７℃にて１時間、その後４℃にて一夜放置し、３０００r.p.m.で遠心分離することにより血清を得て、これをアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより吸着、脱離して精製後、抗ｒｃｋ／ｐ５４ポリクローナル抗体を得た。【００２１】
本発明で得られたｒｃｋ/ｐ５４の部分配列のペプチドを用いてモノクローナル抗体を得る方法は、公知の方法に従って得ることができる。すなわち、免疫するための哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、羊、山羊等が例示できる。これらのうちでもマウスまたはラットが取り扱いやすく好ましい。免疫に際しての抗原の投与経路は特に限定されない。例えば皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内等の何れの経路でも投与することが出来る。具体的には、例えばBALB/cマウスにペプチド抗原を数日〜数週間おきに数回投与する。投与量は一匹当たり、一回につき０．１μｇ〜１００μｇを投与する。このように免疫されたマウスより脾臓を摘出し、遠心分離により脾臓細胞を得る。この細胞は増殖力がないので、自己増殖力を有する細胞と融合させる。自己増殖力を有する細胞としては、ミエローマ細胞等のリンパ球様細胞が望ましい。ミエローマ細胞としては、抗体産生細胞を得た動物と同種のもので抗体を分泌しないミエローマ細胞を用いるのが好ましい。かかるミエローマ細胞としては、例えばマウスミエローマ細胞の場合、Ｓｐ２／０−ａｑ１４、Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｑ４−１、Ｐ３Ｘ６３Ａｑ８Ｕ．１等が例示できる。抗体産生細胞とミエローマ細胞等との融合は、常法に従い、例えばこれらの細胞をポリエチレングリコール等の細胞融合剤を含む溶液（または懸濁液）で処理することにより実施できる。抗体産生細胞とミエローマ細胞の使用割合は、細胞数比で約３：１〜１０：１とするのが好ましい。【００２２】
得られた融合細胞を限界希釈法により分離し、分離した融合細胞を増殖させ、マイクロプレート上の各ウェルにおいて産生される抗体を、本発明ペプチドを固相化したプレートを使用してエライザ法によって抗体産生の高い細胞を選別する。さらに免疫組織染色法によって、ｒｃｋ/ｐ５４蛋白質との反応性を調べ、反応性の高い所望の抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。このようにして得られたハイブリドーマ細胞は適当な培地を用いて培養して得られる培養上清、あるいはマウス等の腹腔内に接種した腹水、血清等から、モノクローナル抗体を得て、これを硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、プロティンＡ等を用いるアフィニティクロマトグラフィー等により容易に精製抗体を得ることができる。【００２３】
抗体を用いたｒｃｋ/ｐ５４蛋白質の測定
上記のようにして得られた抗体を用いて、ｒｃｋ／ｐ５４蛋白質との反応性をウェスタンブロット法により調べた結果を図１に示す。すなわち、定法にしたがって、卵巣と精巣、副睾丸等の組織抽出検体１μｇにドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の変性剤を加えた後、１０％のポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。電気泳動後、ナイロンメンブランに転写した後、抗体の３０００倍希釈液を用いて可視化することによって、ｒｃｋ/ｐ５４蛋白質のみを検出することができた。【００２４】
さらに、ｒｃｋ／ｐ５４蛋白質の卵巣での局在性、あるいは分化段階における発現を検討した結果を図２に示す。卵巣の免疫組織染色は組織切片の載ったプレートを内因性ペルオキシダーゼをブロックするため、３０％Ｈ２Ｏ２とメチルアルコールを１対１００の割合で混合させたもので２０分間処理する。次いで、ＰＢＳ（生理食塩水）にて３回洗浄し、１％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）を含むＰＢＳで１０倍に希釈した正常馬血清でインキュベートした後、抗体を加えた。抗体は１％ＢＳＡを含むＰＢＳで３０００倍に希釈したものを使用した。室温で１時間あるいは４℃で一晩放置した後、ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、ペルオキシダーゼが結合したアビジンービオチン結合物を加えた。濃度はＰＢＳにて１０００倍に希釈したものを、加える少なくとも３０分前に調製する。室温で３０分間反応させた後、ＰＢＳで３回洗浄を行った。発色は、０．２Ｍトリスアミノメタン２５ｍｌ、０．２Ｎ塩酸１９．２ｍｌに蒸留水を加えて１０００ｍｌとしたものに、ジアミノベンチジン塩酸塩２０ｍｇを溶解させて、さらに、Ｈ２Ｏ２を０．０３ｍｌを加えた。上記の液にプレートを７分間反応させた、その後、発色を停止した。核染色はヘマトキシリンで行った。ここでｒｃｋ／ｐ５４蛋白質は卵細胞で多く染まっている。特に、細胞質に多く染まっていることが認められる。一番表面にある卵母細胞が濾胞を作り、分化してゆくが、排卵前、幼若細胞は中の方に存在しており、排卵をすると白体となる。この結果、ｒｃｋ／ｐ５４蛋白質は卵細胞に高発現していることが明らかである。【００２５】
図３は、図２と同様の手法で精巣におけるｒｃｋ／ｐ５４蛋白質の局在性、あるいは分化段階における発現を検討した結果を図３に示す。この結果、抗体と反応したｒｃｋ/ｐ５４蛋白質は精巣細胞における局在性を示している。【００２６】
図４は、図２と同様の手法で副睾丸におけるｒｃｋ／ｐ５４蛋白質の局在性、あるいは分化段階における発現を検討した結果を図４に示す。この結果、抗体と反応したｒｃｋ/ｐ５４蛋白質は副睾丸細胞における局在性を示している。この結果、精祖細胞に高発現し、精子の手前から核に出現し、幼若から成熟に従って、細胞質から核に移行することを示している。さらに、精巣上体は精子がさらに成熟すると核に高発現している。【００２７】
図５は、馬血清から分離した発情期にでるホルモン（ＰＭＳＧ；プロゲステロン）をマウスに投与した場合のｒｃｋ／ｐ５４蛋白質の変化を示している。ｒｃｋ/ｐ５４蛋白質はプロゲステロン投与によって、有意に増加していることを示す。この結果、ｒｃｋ／ｐ５４蛋白質はホルモン依存性であることが分かる。【００２８】
受精した場合は図６Ａに示すように、転写産物をｃＤＮＡに変換しＲＣＫプライマーにてＰＣＲを検討すると、その産物は２７サイクルから加速度的に増加する。ｒｃｋ／ｐ５４はエロンゲイション  ファクター１をコントロールしている。また、図６Ｂに示すように、高発現の受精卵は合体、分割、桑実胚の順にｒｃｋ/ｐ５４蛋白質の発現が低下してくる。【００２９】
表１は受精した卵にｒｃｋ/ｐ５４遺伝子をマイクロインジェクションして子宮に戻すと、胎児の死亡数の増加、出生数の減少が認められた。このようにｒｃｋ/ｐ５４遺伝子を導入してｒｃｋ／ｐ５４蛋白質の発現異常は受胎が異常になることを示している。【００３０】
【表１】
2005090399.tif 000002
【００３１】
以上の結果から、ｒｃｋ／ｐ５４蛋白質の部分配列のペプチドを用いて作成された抗ｒｃｋ／ｐ５４抗体は細胞の増殖及び分化の段階を検出するための試薬として、また、不妊症を検出するための試薬として用いることが可能である。【００３２】
上記検出試薬の組成としては、上記抗ｒｃｋ/ｐ５４抗体、すなわち、上記したポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の少なくとも一方を含んでいればよいが、より好ましくは、添加剤として各種の防腐剤（アジ化ナトリウム及びペルオキシダーゼの反応を抑制するものは除く）、非特異的反応を抑制する試薬として、高濃度の牛血清アルブミン、ブロックエース（雪印乳業製）、ゼラチン、スキムミルク、等を用いることが望ましい。このような添加剤を用いることで、本発明の抗ｒｃｋ/ｐ５４抗体を用いるｒｃｋ/ｐ５４蛋白質の検出方法の精度を上げることが出来るだけでなく、検出用試薬の利便性や保存性等を向上させることが出来る。【００３３】
細胞増殖と分化におけるｒｃｋ／ｐ５４発現レベル
全RNAはRNAｑｕｅｏｕｓ−４ＰＣＲ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）を用いて単離した。RNAはＳｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＡａｓｅ  Ｈ−ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）とｏｌｉｇｏ（ｄＴ）ｐｒｉｍｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写を行った。調製したｃDNAはPCR  精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製し、PCRに使用した。βーアクチンは内部標準コントロールとして用いた。ＲＣＫのプライマーは次のものを利用した、Ｔ−ＲＣＫフォワードは、５’−ＧＧＣＴＧＧＧＡＡＡＡＧＣＣＡＴＣＴ−３’；Ｔ−ＲＣＫのリバース、ｃ−ｍｙｃフォワード、５’−ＡＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＣＡＧＧＡＣＴＧ−３’；ｃ−ｍｙｃリバース、５’−ＴＴＴＡＧＣＴＣＧＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴＧ−３’。ＰＣＲの産生量は寒天電気泳動で展開し、そのバンドの強度をデンシトメーターで測定した。【００３４】
細胞培養、分化処理、ＦＡＣＳ、形態学的検討、細胞の生存率
ヒト末梢血リンパ球が健常ボランティアからFicol-paque(Amersham Biosciences AB,Uppsala,Sweden)を用いて採取された。RPMI1640培地を用いて８時間培養し、その後、細胞にCon-A(Sigma,St. Louis,MO,USA)を１５μｇ／ｍｌ加えて４８時間刺激した。U937(T-lymphoma)細胞は１０％(v/v)加熱胎児牛血清（SIgma,Tokyo)と２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含むRPMI-1640培地中で、９５％空気と５％の炭酸ガスを含む条件下、３７℃培養した。【００３５】
結果
細胞の増殖と分化におけるｒｃｋ／ｐ５４の発現レベルを測定した。Ｃｏｎ−Ａで末梢血リンパ球を刺激すると、図７Ａに示すように細胞数は無処置群は増加しなかったが、Ｃｏｎ−Ａ処理後４８時間では直線的に増加した。ｒｃｋ／ｐ５４の発現レベルは、図７Ｂの上段に示すように顕著に増加していた。ＲＣＫの全ｍＲＮＡレベルを表すＴ−ＲＣＫのレベルも蛋白発現と相関していた。ｃ−ｍｙｃ  ｍＲＮＡと蛋白のレベルはｒｃｋ／ｐ５４の高い発現に伴って増加していた。この結果から、ｒｃｋ／ｐ５４の高い発現は成長因
子に仲介されたマイトジェン刺激に対して細胞増殖にポジティブに働いていることを示している。【００３６】
Ｕ９３７細胞をプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の刺激剤であるＴＰＡで処理をした細胞の分化におけるｒｃｋ／ｐ５４の発現レベルについて検討した。図８Ａに示すように、生細胞数はＴＰＡの処理６時間後から減少し、図８Ｂに示すように、分化マーカーのＣＤ３８の発現が処理２４時間後に現れた。さらに、図８Ｃに示すように、ｃ−ｍｙｃの発現はＴＰＡ処理６時間後から減少した。ｒｃｋ／４５とＴ−ＲＣＫのレベルは処理４８時間後に著明に減少した。  
【産業上の利用可能性】
【００３７】
以上の結果から、ｒｃｋ／ｐ５４蛋白質の部分配列のペプチドを用いて作成された抗ｒｃｋ／ｐ５４抗体は細胞の増殖及び分化の段階を検出するための試薬として、また、不妊症を検出するための試薬として用いることが可能である。
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年8月24日(2005.8.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】特許請求の範囲【請求項１】以下のアミノ酸配列を有するペプチドＳＴＡＲＴＥＮＰＶＩ（１−１０）【請求項２】請求項１記載のペプチドを抗原として得られたことを特徴とする抗体。【請求項３】請求項１記載のペプチドを抗原として得られた抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする抗体。【請求項４】請求項２又は３で得られた抗体を用いることを特徴とする各種細胞の増殖及び分化を検査する方法。【請求項５】請求項２又は３で得られた抗体を含有することを特徴とする各種細胞の増殖及び分化を検査するキット。【請求項６】請求項２又は３で得られた抗体を用いることを特徴とする精子の増殖及び分化を検査する方法。【請求項７】請求項２又は３で得られた抗体を含有することを特徴とする精子の増殖及び分化を検査するキット。【請求項８】（削除）【請求項９】請求項２又は３で得られた抗体を含有することを特徴とする不妊症診断用のキット。【国際調査報告】
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