(57)【要約】  本出願は、リラキシンが介在する疾患の処置用のヒトリラキシンＢ鎖を合成する方法を開示している。本出願は、特に、固相および溶液相（「ハイブリッド」）アプローチを用いる、ヒトリラキシンのＢ鎖を合成する方法を開示している。一般に、このアプローチは、固相化学を用いる３種の異なるペプチド中間体断片を合成することを含む。次いで、溶液相化学が断片をカップリングさせるのに使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
ａ）Z-Met-Ser-Thr-Trp-OH（配列番号３）（式中、Ｚは、Ｎ末端保護基である）のアミノ酸配列を含むペプチド断片を導入する；
ｂ）Z-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OtBu（配列番号４）（式中、Ｚは、Ｎ末端保護基である）のアミノ酸配列を含むペプチド断片を得るために、溶液中の工程ａ）のペプチド断片をH-Ser-OtBuにカップリングする；および
ｃ）Ｎ末端保護基を除去して、Z-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OtBu（配列番号４）（式中、Ｚは、Ｈである）のアミノ酸配列を含むペプチド断片を得る；
ｄ）Z-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys-Gly-OH（配列番号２）（式中、Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−である）のアミノ酸配列を含むペプチド断片を導入する；
ｅ）Z-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OtBu（配列番号５）（式中、Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃである）のアミノ酸配列を含むペプチド断片を得るために、ハロゲン化アルカリ金属の存在下に、溶液中の工程ｄ）のペプチド断片を工程ｃ）のペプチド断片にカップリングする；
ｆ）Ｎ末端保護基を除去して、Z-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OtBu（配列番号５）（式中、Ｚは、Ｈである）のアミノ酸配列を含むペプチド断片を得る；
ｇ）Z-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys-Gly-OH（配列番号１）（式中、Ｚは、Ｎ末端保護基Ｂｏｃ−である）のアミノ酸配列を含むペプチド断片を導入する；
ｈ）Z-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys-Gly-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OtBu（配列番号６）（式中、Ｚは、Ｎ末端保護基Ｂｏｃ−である）のアミノ酸配列を含むペプチド断片を得るために、ハロゲン化アルカリ金属の存在下に、溶液中の工程ｆ）のペプチド断片を工程ｇ）のペプチド断片にカップリングする；
ｉ）Ｎ末端保護基を除去するために、工程ｈ）から得られるペプチドを酸に接触させて、Z-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys-Gly-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OH（配列番号６）（式中、Ｚは、Ｈである）の脱保護されたリラキシンＢ鎖アミノ酸配列を得る；
を含む、リラキシンＢ鎖ペプチドの製造方法。
【請求項２】
ペプチドが、側鎖保護基、好ましくはＯｔブチル（ＯｔＢｕ）、ｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）、トリチル（ｔｒｔ）、ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホンアミド（Ｐｂｆ）およびｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）からなる群より選択されるものを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程ａ）のペプチド断片が、Z-Met-Ser(OtBu)-Thr(OtBu)-Trp-OH（配列番号３）（式中、Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−である）のアミノ酸配列および側鎖保護基を含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
工程ｄ）のペプチドが、Z-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Ile-Ala-Ile-Cys(Trt)-Gly-OH（配列番号２）のアミノ酸配列および側鎖保護基を含む、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
工程ｇ）のペプチドが、Z-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Lys(Boc)-Leu-Cys(Trt)-Gly-OH（配列番号１）のアミノ酸配列および側鎖保護基を含む、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
工程ｉ）が、アミノ酸側鎖を脱保護して脱保護された配列番号６のリラキシンＢ鎖アミノ酸配列を得る工程を含む、請求項２〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
以下の工程：
ａ）Fmoc-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Ile-Ala-Ile-Cys(Trt)-Gly-OH（配列番号２）（式中、Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−である）のアミノ酸配列および側鎖保護基を含むペプチド断片を導入する；
ｂ）H-Met-Ser(OtBu)-Thr(OtBu)-Trp-Ser(OtBu)-OtBu（配列番号４）のアミノ酸配列および側鎖保護基を含むペプチド断片を導入する；
ｃ）Fmoc-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Ile-Ala-Ile-Cys(Trt)-Gly-Met-Ser(OtBu)-Thr(OtBu)-Trp-Ser(OtBu)-OtBu（配列番号５）のアミノ酸配列および側鎖保護基を含むペプチド断片を得るために、ハロゲン化アルカリ金属の存在下に、溶液中の工程ａ）のペプチド断片を工程ｂ）の断片にカップリングする；
ｄ）Ｎ末端保護基を除去して、Z-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Ile-Ala-Ile-Cys(Trt)-Gly-Met-Ser(OtBu)-Thr(OtBu)-Trp-Ser(OtBu)-OtBu（配列番号５）（式中、Ｚは、Ｈである）のアミノ酸配列および側鎖保護基を含むペプチド断片を得る；
ｅ）Z-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Lys(Boc)-Leu-Cys(Trt)-Gly-OH（配列番号１）（式中、Ｚは、Ｎ末端保護基Ｂｏｃ−である）のアミノ酸配列および側鎖保護基を含むペプチド断片を導入する；
ｆ）Z-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Lys(Boc)-Leu-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Ile-Ala-Ile-Cys(Trt)-Gly-Met-Ser(OtBu)-Thr(OtBu)-Trp-Ser(OtBu)-OtBu（配列番号６）（式中、Ｚは、Ｎ末端保護基Ｂｏｃである）のアミノ酸配列を含むペプチドを得るために、ハロゲン化アルカリ金属の存在下に、溶液中の工程ｅ）のペプチド断片を工程ｄ）のペプチド断片にカップリングする；
を含む、リラキシンＢ鎖ペプチドの製造方法。
【請求項８】
Z-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Lys(Boc)-Leu-Cys(Trt)-Gly-OH（配列番号１）（式中、Ｚは、ＨまたはＮ末端保護基Ｂｏｃである）のアミノ酸配列および側鎖保護基を有するペプチド。
【請求項９】
Z-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Ile-Ala-Ile-Cys(Trt)-Gly-OH（配列番号２）（式中、Ｚは、ＨまたはＮ末端保護基Ｆｍｏｃである）のアミノ酸配列および側鎖保護基を有するペプチド。
【請求項１０】
Z-Met-Ser(OtBu)-Thr(OtBu)-Trp-OH（配列番号３）（式中、Ｚは、ＨまたはＮ末端保護基Ｆｍｏｃである）のアミノ酸配列および側鎖保護基を有するペプチド。
【請求項１１】
Z-Met-Ser(OtBu)-Thr(OtBu)-Trp-Ser(OtBu)-OtBu（配列番号４）（式中、Ｚは、ＨまたはＮ末端保護基Ｆｍｏｃである）のアミノ酸配列および側鎖保護基を有するペプチド。
【請求項１２】
Z-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Ile-Ala-Ile-Cys(Trt)-Gly-Met-Ser(OtBu)-Thr(OtBu)-Trp-Ser(OtBu)-OtBu（配列番号５）（式中、Ｚは、ＨまたはＮ末端保護基Ｆｍｏｃである）のアミノ酸配列および側鎖保護基を有するペプチド。
【請求項１３】
Z-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Lys(Boc)-Leu-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Ile-Ala-Ile-Cys(Trt)-Gly-Met-Ser(OtBu)-Thr(OtBu)-Trp-Ser(OtBu)-OtBu（配列番号６）（式中、Ｚは、ＨまたはＮ末端保護基ＢｏｃもしくはＦｍｏｃである）のアミノ酸配列および側鎖保護基を有するペプチド。
【請求項１４】
実質的に前記明細書に記載の、方法およびペプチドならびにこのようなペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド合成の分野において、ヒトリラキシンが介在する疾患、例えば血管収縮の処置、ならびに特にリラキシンのＢ鎖を合成する方法およびリラキシンが介在する疾患の処置におけるその使用に関するものである。
【０００２】
発明の背景
リラキシン（ＲＬＸ）は、女性における月経周期の黄体期の間および妊娠の間中循環するインスリン−成長因子ファミリーに属する約６０００Ｄａの低分子量タンパク質である。それはまた、男性の前立腺によっても産生される。ＲＬＸは、ラットにおける妊娠ホルモンでもある。双方の種において、循環濃度は、黄体に由来する。リラキシンは、ＡおよびＢと呼ばれて、インスリンのそれと類似の方法でＡ鎖における鎖内のジスルフィドループとジスルフィド結合により結合されている、２本のペプチド鎖からなる。リラキシンは、妊娠中、卵巣の黄体中で合成され、分娩の前に血流に放出される。卵巣組織の入手性によって、豚（Jamesら(1977), Nature, 267, 554-546）、ラット（Johnら(1981), Endocrinology, 108, 726-729）、およびサメ（Schwabeら(1982) Ann. N.Y. Acad. Sci., 380, 6-12）からのリラキシンの単離およびアミノ酸配列決定が可能であった。
【０００３】
３種の別個のヒトリラキシン遺伝子が同定されており、Ｈ１（Hudsonら(1983)、Nature, 301, 628-631）、Ｈ２（Hudsonら(1984) Embo. J, 3, 2333-2339）、およびＨ３（R. A. Bathgateら、J. Bio. Chem. 277 (2002), pp. 1148-1157）と表されている。Ｈ２遺伝子でコードされているペプチドは、ヒトにおいて、主要な貯蔵され、循環している形態であるので、「リラキシン」と称されている（Winslowら(1992) Endocrinology, 130, 2660-2668）。
【０００４】
リラキシンは、妊娠のホルモンを超えるものであり、女性の生殖システムのもの以外の細胞および組織に作用する（E. D. Lekgabeら、Endocrinology 147 (2006), pp. 5575-5583; I. Mookerjeeら、Endocrinology 147 (2006), pp. 754-761）との証拠が蓄積されてきた。リラキシンは、腎臓、盲腸間膜、肺および末梢血管において血管の拡張（血管拡張）を引き起こし、これは、これらの組織において血流量または灌流量を増大させ、心拍数および冠血流量の増加を促し、糸球体濾過量および腎血漿流量の双方を増大させる（T. D. Hewitsonら、Endocrinology 148 (2007), pp. 660-669; Baniら(1997) Gen. Pharmacol. 28, 13-22）。脳は、リラキシンの他の標的組織であり、ここでは、脳室周囲器官においてそのペプチドが受容体（Oscheroffら(1991) Proc. Nal. Acad. Sci. U.S.A. 88, 6413-6417; Tanら(1999) Br. J. Pharmacol 127, 91-98）と結合して、血圧および飲酒に影響を与えることが示されている（Parryら(1990) J Neurodendocrinol 2, 53-58; Summerleeら(1998) Endocrinology 139, 2322-2328; Sinnahayら(1999) Endocrinology 140, 5082-5086）。
【０００５】
リラキシンには、重要な臨床的用途が、血管拡張を受けて、種々の疾患、例えば冠動脈疾患、末梢血管疾患、動脈硬化に関連する腎疾患もしくは他の腎毛細血管狭窄、または体内、例えば眼内もしくは末梢指、盲腸間膜、肺および末梢血管内での他の毛細血管狭窄において生じている（C. S. Samuelら、Pharmacol. Ther. 112 (2006), pp. 529-552; S. Nistriら、Cardiovasc. Hematol. Agents Med. Chem. 5 (2007), pp. 101-108; D. BaniとM. Bigazzi, Curr. Med. Chem. -IEMA 5 (2005), pp. 403-410; T. Dschietzigら、Pharmacol. Ther. 112 (2006), pp. 38-56）。
【０００６】
高血圧性血管症に関連する進行中の課題に鑑みて、この技術分野で、高血圧性血管症を処置するさらなる手段への必要が存在することは明らかである。本発明は、この必要に対処するものであり、関連する長所をも提供するものである。
【０００７】
発明の概要
本出願は、リラキシンが介在する疾患の処置用のヒトリラキシンＢ鎖を合成する方法を開示している。本出願は、特に、固相および溶液相（「ハイブリッド」）アプローチを用いる、ヒトリラキシンのＢ鎖を合成する方法を開示している。一般に、このアプローチは、固相化学を用いる３種の異なるペプチド中間体断片を合成することを含む。次いで、溶液相化学が断片をカップリングさせるのに使用される。
【０００８】
一つの局面において、本出願は、以下の工程：
ａ）Z-Met-Ser-Thr-Trp-OH（配列番号３）（式中、Ｚは、Ｎ末端保護基である）のアミノ酸配列を含むペプチド断片を導入する；
ｂ）Z-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OtBu（配列番号４）（式中、Ｚは、Ｎ末端保護基である）のアミノ酸配列を含むペプチド断片を得るために、溶液中の工程ａ）のペプチド断片をH-Ser-OtBuにカップリングする； 
ｃ）Ｎ末端保護基を除去して、Z-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OtBu（配列番号４）（式中、Ｚは、Ｈである）のアミノ酸配列を含むペプチド断片を得る；
ｄ）Z-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys-Gly-OH（配列番号２）（式中、Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−である）のアミノ酸配列を含むペプチド断片を導入する；
ｅ）Z-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OtBu（配列番号５）（式中、Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃである）のアミノ酸配列を含むペプチド断片を得るために、ハロゲン化アルカリ金属の存在下に、溶液中の工程ｄ）のペプチド断片を工程ｃ）のペプチド断片にカップリングする；
ｆ）Ｎ末端保護基を除去して、Z-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OtBu（配列番号５）（式中、Ｚは、Ｈである）のアミノ酸配列を含むペプチド断片を得る；
ｇ）Z-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys-Gly-OH（配列番号１）（式中、Ｚは、Ｎ末端保護基Ｂｏｃ−である）のアミノ酸配列を含むペプチド断片を導入する；
ｈ）Z-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys-Gly-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OtBu（配列番号６）（式中、Ｚは、Ｎ末端保護基Ｂｏｃ−である）のアミノ酸配列を含むペプチド断片を得るために、ハロゲン化アルカリ金属の存在下に、溶液中の工程ｆ）のペプチド断片を工程ｇ）のペプチド断片にカップリングする；そして
ｉ）Ｎ末端保護基を除去するために、工程ｈ）から得られるペプチドを酸に接触させて、Z-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys-Gly-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OH（配列番号６）（式中、Ｚは、Ｈである）の脱保護されたリラキシンＢ鎖アミノ酸配列を得る；
を含む、リラキシンＢ鎖ペプチドの製造方法を提供する。
【０００９】
本発明の方法の好ましい態様において、ペプチドは、側鎖保護基、好ましくはＯｔブチル（ＯｔＢｕ）、ｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）、トリチル（ｔｒｔ）、ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホンアミド（Ｐｂｆ）およびｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）から選択されるものを含む。
【００１０】
本発明の方法の好ましい態様において、工程ｉ）は、アミノ酸側鎖を脱保護して配列番号６の脱保護されたリラキシンＢ鎖アミノ酸配列を得る工程を含む。
【００１１】
本発明の方法の好ましい態様において、工程ａ）のペプチド断片は、Z-Met-Ser(OtBu)-Thr(OtBu)-Trp-OH（配列番号３）（式中、Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−である）のアミノ酸配列および側鎖保護基を含む。
【００１２】
本発明の方法の好ましい態様において、工程ｄ）のペプチド断片は、Z-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Ile-Ala-Ile-Cys(Trt)-Gly-OH（配列番号２）のアミノ酸配列および側鎖保護基を含む。
【００１３】
本発明の方法の好ましい態様において、工程ｇ）のペプチド断片は、Z-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Lys(Boc)-Leu-Cys(Trt)-Gly-OH（配列番号１）のアミノ酸配列および側鎖保護基を含む。
【００１４】
第二の局面において、本出願は、以下の工程：
ａ）Fmoc-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Ile-Ala-Ile-Cys(Trt)-Gly-OH（配列番号２）（式中、Ｚは、Ｎ末端保護基Ｆｍｏｃ−である）のアミノ酸配列および側鎖保護基を含むペプチド断片を導入する；
ｂ）H-Met-Ser(OtBu)-Thr(OtBu)-Trp-Ser(OtBu)-OtBu（配列番号４）のアミノ酸配列および側鎖保護基を含むペプチド断片を導入する；
ｃ）Fmoc-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Ile-Ala-Ile-Cys(Trt)-Gly-Met-Ser(OtBu)-Thr(OtBu)-Trp-Ser(OtBu)-OtBu（配列番号５）のアミノ酸配列および側鎖保護基を含むペプチド断片を得るために、ハロゲン化アルカリ金属の存在下に、溶液中の工程ａ）のペプチド断片を工程ｂ）の断片にカップリングする；
ｄ）Ｎ末端保護基を除去して、Z-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Ile-Ala-Ile-Cys(Trt)-Gly-Met-Ser(OtBu)-Thr(OtBu)-Trp-Ser(OtBu)-OtBu（配列番号５）（式中、Ｚは、Ｈである）のアミノ酸配列および側鎖保護基を含むペプチド断片を得る；
ｅ）Z-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Lys(Boc)-Leu-Cys(Trt)-Gly-OH（配列番号１）（式中、Ｚは、Ｎ末端保護基Ｂｏｃ−である）のアミノ酸配列および側鎖保護基を含むペプチド断片を導入する；
ｆ）Z-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Lys(Boc)-Leu-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Ile-Ala-Ile-Cys(Trt)-Gly-Met-Ser(OtBu)-Thr(OtBu)-Trp-Ser(OtBu)-OtBu（配列番号６）（式中、Ｚは、Ｎ末端保護基Ｂｏｃである）のアミノ酸配列を含むペプチドを得るために、ハロゲン化アルカリ金属の存在下に、溶液中の工程ｅ）のペプチド断片を工程ｄ）のペプチド断片にカップリングする；
を含む、リラキシンＢ鎖ペプチドの製造方法を提供する。
【００１５】
さらなる局面において、本出願は、Z-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Lys(Boc)-Leu-Cys(Trt)-Gly-OH（配列番号１）（式中、Ｚは、ＨまたはＮ末端保護基Ｂｏｃである）のアミノ酸配列および側鎖保護基を有するペプチドを提供する。
【００１６】
さらなる局面において、本出願は、Z-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Ile-Ala-Ile-Cys(Trt)-Gly-OH（配列番号２）（式中、Ｚは、ＨまたはＮ末端保護基Ｆｍｏｃである）のアミノ酸配列および側鎖保護基を有するペプチドを提供する。
【００１７】
さらなる局面において、本出願は、Z-Met-Ser(OtBu)-Thr(OtBu)-Trp-OH（配列番号３）（式中、Ｚは、ＨまたはＮ末端保護基Ｆｍｏｃである）のアミノ酸配列および側鎖保護基を有するペプチドを提供する。
【００１８】
さらなる局面において、本出願は、Z-Met-Ser(OtBu)-Thr(OtBu)-Trp-Ser(OtBu)-OtBu（配列番号４）（式中、Ｚは、ＨまたはＮ末端保護基Ｆｍｏｃである）のアミノ酸配列および側鎖保護基を有するペプチドを提供する。
【００１９】
さらなる局面において、本出願は、Z-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Ile-Ala-Ile-Cys(Trt)-Gly-Met-Ser(OtBu)-Thr(OtBu)-Trp-Ser(OtBu)-OtBu（配列番号５）（式中、Ｚは、ＨまたはＮ末端保護基Ｆｍｏｃである）のアミノ酸配列および側鎖保護基を有するペプチドを提供する。
【００２０】
さらなる局面において、本出願は、Z-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Met-Glu-(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Lys(Boc)-Leu-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Ile-Ala-Ile-Cys(Trt)-Gly-Met-Ser(OtBu)-Thr(OtBu)-Trp-Ser(OtBu)-OtBu（配列番号６）（式中、Ｚは、ＨまたはＮ末端保護基ＢｏｃもしくはＦｍｏｃである）のアミノ酸配列および側鎖保護基を有するペプチドを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、リラキシンＢ鎖ペプチドおよびそれらの対応物を合成するための例証的スキームを示す。
【００２２】
詳細な説明
本明細書に記載の本発明の態様は、完全に網羅することあるいは以下に記載の説明に記載のまさにその形態に本発明を限定することを意図するものではない。むしろ、その態様は、当業者が本発明の原理および実施を認識し且つ理解できるように選択され、記載されている。
【００２３】
本発明は、リラキシンＢ鎖ペプチドを合成するための新規な方法に関する。リラキシンＢ鎖ペプチドは、以下の式（配列番号６）を有する。
【００２４】
H-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys-Gly-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OH
【００２５】
定義
本明細書において使用する用語「ａ」または「ａｎ」の実体（"a" or "an" entity）は１つ以上のその実体を指し；例えば化合物（a compound）は１つ以上の化合物または少なくとも１つの化合物を指す。それで、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」、および「少なくとも１つ」は本明細書において互換的に使用され得る。
【００２６】
本明細書（移行句においてもまたは特許請求の範囲の本文においても）において使用する用語「含む」は、制限のない意味を有すると解釈されるべきである。すなわち、この用語は、用語「少なくとも有する」または「少なくとも含む」と同義であると解釈されるべきである。方法に関連して使用する場合、用語「含む」は、方法が少なくとも記載される工程を含むが、さらなる工程を含み得ることを意味する。化合物または組成物に関連して使用する場合、用語「含む」は化合物または組成物が少なくとも記載される特徴または成分を含むが、さらなる特徴または成分も含み得ることを意味する。
【００２７】
本明細書において使用する用語「または」は、別段具体的に示さない限り、「および／または」の「包括的」意味で使用され、「いずれか／または」の「排他的」意味では使用されない。
【００２８】
用語「独立して」は本明細書において、変数が、同じ化合物内でその同じかまたは異なる定義を有する変数の存在または非存在に関係なく、任意１個の例で適用されることを示すように使用される。従って、Ｒが２回出現し、そして「独立して炭素または窒素」と定義される化合物において、両方のＲが炭素であり得るか、両方のＲが窒素であり得るか、または一方のＲが炭素であり、かつ他方が窒素であり得る。
【００２９】
任意の変数が、本発明において用いられるか特許請求される化合物を表しそして記載する任意の部分または式において１回より多く出現する場合、各出現についてのその定義は、全ての他の出現におけるその定義から独立している。また、置換基および／または変数の組み合わせはそのような場合にのみ許容される。
【００３０】
本明細書において使用する用語「場合による」または「場合により」は、後に記載される事象または状況が生じ得るが、必ずしもそうではないこと、そしてその記載がその事象または状況が生じる場合および生じない場合を含むことを意味する。例えば、「場合により置換されている」は、場合により置換されている部分が水素または置換基を組み入れ得ることを意味する。
【００３１】
用語「約」は本明細書において、おおよそ、見当、概略、または近くを意味する。用語「約」が数値範囲との組み合わせで使用される場合、それは記載される数値の上および下に境界を拡張することによってその範囲を修正する。一般に、用語「約」は本明細書において、数値を、記載される値の上および下に２０％の変動で修正するように使用される。
【００３２】
本明細書において使用する用語「アミノ酸配列を含む」は、好ましくは、「アミノ酸配列を有する」を意味する。
【００３３】
本明細書において使用する用語「ハロゲン化アルカリ金属」は、Ｌｉ＋またはＣｓ＋のようなアルカリ金属イオンとＦ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、またはＩ−のようなハロゲン化物イオンを含む塩を意味する。好ましい態様において、ハロゲン化アルカリ金属はＬｉＢｒである。
【００３４】
一般に、ペプチドが由来するアミノ酸は、天然由来のアミノ酸残基、非天然由来のアミノ酸残基、またはこれらの組み合わせであり得る。２０種の一般的な天然由来のアミノ酸残基は以下のとおりである：Ａ（Ａｌａ、アラニン）、Ｒ（Ａｒｇ、アルギニン）；Ｎ（Ａｓｎ、アスパラギン）；Ｄ（Ａｓｐ、アスパラギン酸）、Ｃ（Ｃｙｓ、システイン）Ｑ（Ｇｌｎ、グルタミン）、Ｅ（Ｇｌｕ、グルタミン酸）；Ｇ（Ｇｌｙ、グリシン）；Ｈ（Ｈｉｓ、ヒスチジン）；Ｉ（Ｉｌｅ、イソロイシン）；Ｌ（Ｌｅｕ、ロイシン）；Ｋ（Ｌｙｓ、リジン）；Ｍ（Ｍｅｔ、メチオニン）；Ｆ（Ｐｈｅ、フェニルアラニン）；Ｐ（Ｐｒｏ、プロリン）；Ｓ（Ｓｅｒ、セリン）；Ｔ（Ｔｈｒ、スレオニン）；Ｗ（Ｔｒｐ、トリプトファン）；Ｙ（Ｔｙｒ、チロシン）；およびＶ（Ｖａｌ、バリン）。
【００３５】
保護基の性質と使用はこの技術分野で周知である。一般に、好適な保護基は、それに結合している原子、典型的には酸素または窒素が、処理および合成中に望ましくない反応に関与しないようにするのに役立つことができる任意の種類の基である。保護基としては、側鎖保護基およびアミノまたはＮ末端保護基が挙げられる。保護基は、また、カルボン酸、チオールなどの反応または結合を妨げることもできる。
【００３６】
側鎖保護基は、側鎖の部分がペプチド合成、処理などの工程において使用される化学物質と反応することを妨げるのに役立つ、アミノ酸の側鎖（一般的なアミノ酸式Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｒ）（Ｈ）−ＣＯＯＨにおけるＲ基）にカップリングした化学的部分をいう。側鎖保護基の選択は、種々の要素、例えばなされる合成の種類、ペプチドが供される処理、所望の中間体生成物または最終生成物に依存し得る。側鎖保護基は、また、アミノ酸それ自体の性質に依存する。一般に、側鎖保護基は、合成の間、α−アミノ基の脱保護中に除去されないものが選択される。したがって、α−アミノ保護基および側鎖保護基は、典型的には同一ではない。
【００３７】
いくつかの場合においては、また固相合成および他のペプチド処理において使用される試薬のタイプによっては、アミノ酸は、側鎖保護基の存在を必要としない。このようなアミノ酸は、典型的には、側鎖中に反応性酸素または窒素を含まない。
【００３８】
側鎖保護基の例としては、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、tert ブチル、トリフェニルメチル（トリチル）、テトラヒドロピラニル、ベンジルエーテル（Ｂｚｌ）、２，６−ジクロロベンジル（ＤＣＢ）、ｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホンアミド（Ｐｂｆ）、ニトロ、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）、アダマンチルオキシカルボニル、キサンチル（Ｘａｎ）、べンジル、メチル、エチル、およびｔ−ブチルエステル、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−Ｃｌ−Ｚ）、ｔ−アミルオキシカルボニル（Ａｏｃ）、ならびに芳香族または脂肪族ウレタン型保護基、ニトロベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）のような光解離性基、およびトリメチルシリルエチルオキシカルボニル（ＴＥＯＣ）のようなフッ化物解離性基が挙げられる。
【００３９】
例えば、ペプチド断片のアミノ酸残基の側鎖は、標準的な保護基、例えばＯｔブチル（ＯｔＢｕ）、ｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）、トリチル（ｔｒｔ）、およびｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）で保護することができる。本発明において、好ましい側鎖保護基としては、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、およびＴｈｒに対してはＯｔＢｕ基、Ｓｅｒに対してはｔＢｕ基およびＯｔＢｕ基、ＣｙｓおよびＧｌｎに対してはＴｒｔ基、Ａｒｇに対してはＰｂｆ基、ならびにＴｒｐおよびＬｙｓに対してはＢｏｃ基が挙げられる。
【００４０】
アミノ末端保護基は、アミノ酸のα−アミノ基にカップリングされた化学部分を包含する。典型的には、アミノ末端保護基は、成長するペプチド鎖に付加される次のアミノ酸が付加される前に、脱保護反応において除去されるが、ペプチドが支持体から開裂されるときには保持されていることができる。アミノ末端保護基の選択は、例えばなされる合成の種類および所望の中間体生成物または得られる最終生成物に依存し得る。
【００４１】
アミノ末端保護基の例としては、（１）アシル型保護基、例えばホルミル、アシルオキシ（Ａｃｒ）、ベンゾイル（Ｂｚ）およびアセチル（Ａｃ）；（２）芳香族ウレタン型保護基、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｚ）および置換されているＺ、例えばｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル；（３）脂肪族ウレタン保護基、例えばｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル；（４）シクロアルキルウレタン型保護基、例えば９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、およびシクロヘキシルオキシカルボニル；ならびに（５）チオウレタン型保護基、例えばフェニルチオカルボニルが挙げられる。好ましい保護基としては、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、２−（４−ビフェニリル）−プロピル（２）オキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）、２−フィエンルプロピル（２）−オキシカルボニル（Ｐｏｃ）、およびｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）が挙げられる。
【００４２】
ペプチドがＳＰＰＳ手法を用いて作製される、代表的な方法の態様を、ここでより詳細に説明する。ＳＰＰＳの実施において好適な任意のタイプの支持体を、本発明の方法に従って使用することができる。好ましい態様において、支持体としては、１種以上のポリマー、コポリマー、またはポリアミド、ポリスルファミド、置換ポリエチレン、ポリエチレングリコール、フェノール樹脂、多糖類、またはポリスチレンのようなポリマーの組み合わせから作製できる樹脂が挙げられる。ポリマー支持体は、また、ペプチド合成において使用される溶媒に十分に不溶性であり不活性である任意の固体であり得る。固体支持体は、典型的には、合成中に成長するペプチドがカップリングし、所望の条件下に開裂されて支持体からペプチドを放出できる結合部分を含む。好適な固体支持体は、光開裂性の、ＴＦＡ開裂性の、ＨＦ開裂性の、フッ素イオン開裂性の、還元的に開裂性の、Ｐｄ（０）開裂性の、求核的に開裂性の、またはラジカル的に開裂性のリンカーを含むことができる。好ましい結合部分は、開裂されたペプチドがなお実質的に側鎖保護基で保護されているような条件下で開裂され得る。
【００４３】
好ましい固体支持体としては、酸感受性固体支持体、例えば、ヒドロキシメチルポリスチレン−ジビニルベンゼンポリマー樹脂（「Ｗａｎｇ」樹脂、Wang, S. S. 1973, J. Am. Chem. Soc., 95: 1328-33参照）、２−クロロトリチルクロリド樹脂（Barlosら(1989) Tetrahedron Letters 30(30): 3943-3946参照）、および４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸樹脂（Richterら(1994), Tetrahedron Letters 35(27): 4705-4706参照）、ならびに官能基化され、架橋されたポリＮ−アクリロイルピリドン樹脂、およびクロロメチルポリスチレンジビニルベンゼンポリマー樹脂が挙げられる。これらのタイプの固体支持体は、例えば、Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, Calif.から市販されている。
【００４４】
ＳＰＰＳが利用されるとき、合成されたペプチドは、好ましくは、本明細書に記載の本発明の方法を利用する前に、固体支持体（例えば樹脂）から開裂される。ＳＰＰＳ手法により合成されたペプチドは、当業者に周知の手法を用いて開裂させることができる。例えば、ＤＣＭ中の１％もしくは２％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の溶液またはＤＣＭ中のＴＦＡの１％および２％溶液の組み合わせを、ペプチドを開裂するために使用することができる。あるいは、酢酸（ＨＯＡＣ）を用いてぺプチドを開裂することができる。開裂のために選択される具体的な開裂試薬、溶媒および時間は、開裂される特定のペプチドに依存する。これらのパラメーターは、当該技術分野の技能の範囲内である。
【００４５】
ＳＰＰＳにおいて利用することができる樹脂の製造および装着のための一般的な手順は、"Principles and Practice of Solid Phase Peptide Synthesis"（Greagory A.
Grant編、1992, W. H. Freeman and Company）およびその中の参照文献に記載されており、当業者に周知である。Ｗａｎｇ樹脂のローディングのための具体的な手順は、例えばSieber(1987) Tet. Lett. 28: 6147-50およびGranadasら(1989), Int. J. Pept. Protein Res. 33: 386-90に記載されている。
【００４６】
本明細書に記載のように、Ｆｍｏｃは、アミノ酸のα−アミノ部分の保護のために特定の態様において使用される保護基である。どのアミノ酸が装着されるかによって、またそれがペプチド断片中間体のどのポイントで結合されるかによって、アミノ酸の側鎖が保護されるかまたは保護されない。
【００４７】
いくつかの態様において、本発明のペプチド断片中間体は、標準的なＦｍｏｃプロトコルを用いるＳＳＰＳ手法により合成される。例えば、Carpinら(1970), J. Am. Chem. Soc. 92(19): 5748-5749; Carpinら(1972), J. Org. Chem. 37(22): 3404-3409, "Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis," Weng C. ChanとPeter D. White編(2000) Oxford University Press Oxford Eng.を参照されたい。樹脂の装着においておよびペプチド合成において使用される、所望により側鎖保護基を有するまたは有しないＦｍｏｃ保護アミノ酸は、Genzyme Pharmaceuticals Inc., Cambridge, Mass.; Bachem Biosciences inc., Torrance, Calif.; Senn Chemicals, Dielsdorf, Switzerland; およびOrpegen Pharma, Heidelberg, Germanyより市販されているか、またはこの技術分野において周知の物質および方法を用いて容易に合成される。上記の手順の代替として、樹脂は、例えば、適切なＦｍｏｃ−α−Ｎ−保護アミノ酸が予め装着されて、購入することができる（例えば、Bachem Biosciences Inc.またはSenn Chemicalsより）。
【００４８】
装着された樹脂は、ＮＭＰのような溶媒で洗浄される。次いで、樹脂を、窒素を吹き込みながら、膨潤溶媒中で攪拌して、樹脂ビーズを膨潤させる。Ｆｍｏｃ基は、ＮＭＰ中のピペリジンを用いて、末端アミンから除去する。脱保護された樹脂を、その後、ＮＭＰで洗浄して、Ｆｍｏｃ副生物および残留ピペリジンを除去する。
【００４９】
カップリングさせるアミノ酸残基または断片は、そのカルボキシル末端で反応のために活性化し、カップリングさせる。カップリングサイクルを、ペプチド断片中間体の引き続くアミノ酸残基の各々について繰り返す。最後のカップリングサイクルの後に、樹脂をＮＭＰのような溶媒で洗浄し、その後、ＤＣＭのような不活性な第二の溶媒で洗浄する。ＳＰＰＳ手法により合成されたペプチド断片中間体は、当業者に周知の手法を用いて、例えば、ＤＣＭ中のＴＦＡのような酸の溶液を添加することにより、樹脂から開裂させることができる。開裂されたペプチド中間体は、次いで、単離することができる。
【００５０】
本発明は、固相および／または溶液相の手法を用いるペプチドリラキシン（ＲＬＸ）Ｂ鎖を作製する合成方法に関する。本発明のペプチド分子は、保護されていても、保護されていなくても、または部分的に保護されていてもよい。保護は、Ｎ末端保護、側鎖保護、および／またはＣ末端保護を含みうる。本発明は、一般に、リラキシンＢ鎖、その対応物、断片およびそれらの対応物、ならびにこれらの融合生成物およびそれらの対応物の合成に関するものであるが、本明細書中の本発明の教示は、また、他のペプチド、特に、固相および溶液相アプローチの組み合わせを用いて合成されるものの合成に適用することができる。本発明は、また、不純物、特にピログルタメート不純物に関連するペプチド中間体断片の合成に適用可能である。本発明の実施において有用である好ましいリラキシンＢ鎖分子としては、天然および非天然リラキシンＢ鎖およびその対応物が挙げられる。
【００５１】
本明細書において使用する「対応物（counterpart）」は、ペプチドの天然および非天然類似体、誘導体、融合化合物、塩などをいう。本明細書において使用するペプチド類似体は、一般に、他のペプチドまたはペプチド対応物に対する例えば１個以上のアミノ酸置換、欠失、逆位、および／または付加による修飾アミノ酸配列を有するペプチドをいう。置換は、１個以上の天然または非天然アミノ酸を伴って生じうる。置換は、好ましくは、保存的または高度に保存的でありうる。保存的な置換は、一般に同じ正味の電荷および一般に同じサイズと形状を有する他方のものでのアミノ酸の置換をいう。例えば、脂肪族または置換脂肪族アミノ酸側鎖を有するアミノ酸は、それらの側鎖中の炭素とヘテロ原子の合計数がたかだか約４個までしか異なっていなければ、ほぼ同じサイズを有している。それらの側鎖中の分岐の数が、たかだか約１個または２個までしか異なっていなければ、それらはほぼ同じ形状を有している。それらの側鎖中にフェニルまたは置換フェニル基を有するアミノ酸は、ほぼ同じサイズと形状を有すると考えられる。以下に列挙するものは、アミノ酸の５つのグループである。化合物中のアミノ酸を同じグループからの他のアミノ酸で置き換えると、保存的置換が結果として生じる。グループＩ：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニンおよびＣ１〜Ｃ４脂肪族またはＣ１〜Ｃ４ヒドロキシ置換脂肪族側鎖（直鎖または一分岐）を有する非天然由来のアミノ酸。グループＩＩ：グルタミン酸、アスパラギン酸およびカルボン酸置換Ｃ１〜Ｃ４脂肪族側鎖（非分岐または一分岐点）を有する非天然由来のアミノ酸。グループＩＩＩ：リジン、オルニチン、アルギニンおよびアミンまたはグアニジノ置換Ｃ１〜Ｃ４脂肪族側鎖（非分岐または一分岐点）を有する非天然由来のアミノ酸。グループＩＶ：グルタミン、アスパラギンおよびアミド置換Ｃ１〜Ｃ４脂肪族側鎖（非分岐または一分岐点）を有する非天然由来のアミノ酸。グループＶ：フェニルアラニン、フェニルグリシン、チロシンおよびトリプトファン。
【００５２】
「高度に保存的な置換」は、側鎖に同じ官能基を有し、ほぼ同じサイズおよび形状の他のアミノ酸でのアミノ酸の置換である。脂肪族または置換脂肪族アミノ酸側鎖を有するアミノ酸は、それらの側鎖中の炭素とヘテロ原子の合計数が２個までしか異なっていなければ、ほぼ同じサイズを有している。それらの側鎖中に同数の分岐を有しているとき、それらはほぼ同じ形状を有している。高度に保存的な置換の例として、ロイシンに換えてバリン、セリンに換えてスレオニン、グルタミン酸に換えてアスパラギン酸およびフェニルアラニンに換えてフェニルグリシンが挙げられる。
【００５３】
ペプチド誘導体は、一般に、ペプチド、ペプチド類似体、あるいは、その側鎖、α炭素原子、末端アミノ基、および／または末端カルボン酸基の１個または複数個の化学的な修飾を有する他のペプチド対応物をいう。例として、化学的修飾として、化学的部分の付加、新たな結合の創出、および／または化学的部分の除去が挙げられるが、これらに限定されない。アミノ酸側鎖での修飾として、リジンｅ−アミノ基のアシル化、アルギニン、ヒスチジン、またはリジンのＮ−アルキル化、グルタミン酸またはアスパラギン酸のカルボン酸基のアルキル化、およびグルタミンまたはアスパラギンの脱アミド化が挙げられるが、これらに限定されない。末端アミノ基の修飾として、脱アミノ、Ｎ−低級アルキル、Ｎ−ジ低級アルキル、およびＮ−アシル（例えば、−ＣＯ−低級アルキル）修飾が挙げられるが、これらに限定されない。末端カルボキシ基の修飾として、アミド、低級アルキルアミド、ジアルキルアミド、および低級アルキルエステル修飾が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、部分的にまたは全体的に保護されたペプチドは、ペプチド誘導体を構成する。
【００５４】
好ましい態様において、本発明は、以下の式（配列番号６）を有する合成リラキシンＢ鎖を合成する方法を提供する。
【００５５】
Z-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys-Gly-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OH（式中、Ｚは、ＨまたはＮ末端保護基Ｂｏｃ−またはＦｍｏｃ−である）
【００５６】
好ましい態様において、（配列番号６）は、式：H-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys-Gly-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OHを有する。
【００５７】
本発明は、側鎖が保護されたバージョンを含むリラキシンＢ鎖ペプチド、例えば式（配列番号６）：Z-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys-Gly-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OtBu（式中、Ｚは、ＨまたはＮ末端保護基Ｂｏｃ−またはＦｍｏｃ−であり；この配列の１個以上の残基は、場合により側鎖保護を含む）を作製する改良された方法を提供する。
【００５８】
好ましい態様において、（配列番号６）は、式：Boc-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Lys(Boc)-Leu-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Ile-Ala-Ile-Cys(Trt)-Gly-Met-Ser(OtBu)-Thr(OtBu)-Trp-Ser(OtBu)-OtBuを有する。
【００５９】
本発明は、その断片の側鎖が保護されたバージョンを含むリラキシンＢ鎖ペプチド、例えば式（配列番号５）：Z-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OtBu（式中、Ｚは、ＨまたはＮ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；この配列の１個以上の残基は、場合により側鎖保護を含む）を有するペプチドを作製する改良された方法を提供する。
【００６０】
好ましい態様において、（配列番号５）は、式：H-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Ile-Ala-Ile-Cys(Trt)-Gly-Met-Ser(OtBu)-Thr(OtBu)-Trp-Ser(OtBu)-OtBuを有する。
【００６１】
好ましい態様において、（配列番号５）は、式：Fmoc-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Ile-Ala-Ile-Cys(Trt)-Gly-Met-Ser(OtBu)-Thr(OtBu)-Trp-Ser(OtBu)-OtBuを有する。
【００６２】
本発明は、その断片の側鎖が保護されたバージョンを含むリラキシンＢ鎖ペプチド、例えば式（配列番号４）：Z-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OtBu（式中、Ｚは、ＨまたはＮ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；この配列の１個以上の残基は、場合により側鎖保護を含む）を作製する改良された方法を提供する。
【００６３】
好ましい態様において、（配列番号４）は、式：H-Met-Ser(OtBu)-Thr(OtBu)-Trp-Ser(OtBu)-OtBuを有する。
【００６４】
好ましい態様において、（配列番号４）は、式：Fmoc-Met-Ser(OtBu)-Thr(OtBu)-Trp-Ser(OtBu)-OtBuを有する。
【００６５】
本発明は、その断片の側鎖が保護されたバージョンを含むリラキシンＢ鎖ペプチド、例えば式（配列番号３）：Z-Met-Ser-Thr-Trp-OH（式中、Ｚは、ＨまたはＮ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；この配列の１個以上の残基は、場合により側鎖保護を含む）を作製する改良された方法を提供する。
【００６６】
好ましい態様において、（配列番号３）は、式：H-Met-Ser(OtBu)-Thr(OtBu)-Trp-OHを有する。
【００６７】
好ましい態様において、（配列番号３）は、式：Fmoc-Met-Ser(OtBu)-Thr(OtBu)-Trp-OHを有する。
【００６８】
本発明は、その断片の側鎖が保護されたバージョンを含むリラキシンＢ鎖ペプチド、例えば式（配列番号２）：Z-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys-Gly-OH（式中、Ｚは、ＨまたはＮ末端保護基Ｆｍｏｃ−であり；この配列の１個以上の残基は、場合により側鎖保護を含む）を作製する改良された方法を提供する。
【００６９】
好ましい態様において、（配列番号２）は、式：H-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Ile-Ala-Ile-Cys(Trt)-Gly-OHを有する。
【００７０】
好ましい態様において、（配列番号２）は、式：Fmoc-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Ile-Ala-Ile-Cys(Trt)-Gly-OHを有する。
【００７１】
本発明は、側鎖が保護されたバージョンを含むリラキシンＢ鎖ペプチド、例えば式（配列番号１）：Z-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys-Gly-OH（式中、Ｚは、ＨまたはＮ末端保護基Ｂｏｃ−またはＦｍｏｃ−であり；この配列の１個以上の残基は、場合により側鎖保護を含む）を有するペプチドを作製する改良された方法を提供する。
【００７２】
好ましい態様において、（配列番号１）は、式：Boc-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Lys(Boc)-Leu-Cys(Trt)-Gly-OHを有する。
【００７３】
ＬｉＢｒのようなハロゲン化アルカリ金属は、断片の溶解性を増大させることにより、上記の断片２および３’ならびに１および２＋３’のカップリングを容易にする。好ましい態様において、ＬｉＢｒは、断片の溶解性を増大させるため、溶液相でのカップリングに使用される。濃度は、当量の断片に対して約５〜２０当量のＬｉＢｒでありうる。
【００７４】
例として、図１は、リラキシンＢ鎖ペプチドおよびそれらの対応物を合成するための例証的スキームを示す。図１は、リラキシンＢ鎖ペプチドのスケールアップ合成に特に好適であると思われる。スケールアップ手順は、典型的には、市場での流通に有用なペプチドの量を提供するために行われる。例えば、スケールアップ手順でのペプチドの量は、１バッチあたり５００ｇまたは１ｋｇ、より典型的には１バッチあたり、数十ｋｇから数百ｋｇ以上であることができる。好ましい態様において、本発明の方法は、処理（合成）時間の短縮のような改良、生成物の収率の改善、生成物純度の改善、および／または必要とされる試薬および出発原料の量の削減をもたらすことができる。
【００７５】
図１に示されている合成は、ペプチド生成物を調製するための、固相および溶液相の手法の組み合わせを使用している。
【実施例】
【００７６】
実施例１
リラキシンＢ鎖断片２+３’（H-AA(13-29)-OtBu）の合成
リラキシンＢ鎖断片２（Fmoc-AA(13-24)-OH）（１０．８８ｇ）と断片３’（H-AA(25-29)-OtBu）（４．４４ｇ）を、２５℃の浴付きの５００ｍＬの三つ口丸底フラスコ中で混合した。ＴＨＦ（１２０ｍＬ）とＮＭＰ（８０ｍＬ）中のＬｉＢｒ（３．５ｇ）の溶液を、その混合物を含むフラスコに攪拌しながら入れた。ポット温度は、２４℃から２７℃に急上昇した。１０分間の攪拌後、ＨＯＢｔ水和物（０．６４ｇ）およびＢＯＰ（２．０ｇ）を、ＴＨＦ（２０ｍＬ）でリンスしながらこの溶液に入れた。その後、ＤＩＥＡ（１．６ｍＬ）を反応混合物に入れた。反応物を２５℃の浴で攪拌し、ＨＰＬＣでモニターした。一晩の反応の完結をチェックしたが、反応は完結しなかったことが示された。２種のキッカーチャージを行った（最初に、０．３０４ｇの断片２／０．０９９ｇのＢＯＰ／０．１６ｍＬのＤＩＥＡ、そしてその後、０．６０５ｇの断片２／０．２０ｇのＢＯＰ／０．３２ｍＬのＤＩＥＡ）。全体で２０時間の反応後に、カップリングは完結した。ピペリジン（５．０ｍＬ）を反応混合物に入れた。２時間の攪拌後、Ｆｍｏｃ除去を行った。次いで、ピリジン塩酸塩（１０．０１ｇ）を、２．５℃の温度上昇を伴って反応混合物に入れた。３５分間攪拌後、反応混合物を、次いで、１５℃の浴で水（８００ｍＬ）中でクエンチした。２０分間の攪拌後、固体をろ過により単離し、水（２ｘ１００ｍＬ）で洗浄し、一晩乾燥して、１６．３７ｇの固体を得た。単離された固体（１５．４ｇ）を、次いで、３５℃で１．５時間および２５℃で３時間、２５０ｍＬのＭＴＢＥ／ｎ−ヘプタン（５０／５０）の混合物中で再スラリー化した。その後、固体をろ過により単離し、ｎ−ヘプタン（２ｘ２０ｍＬ）で洗浄し、週末の間乾燥して、４８．６％ＡＮの純度の１４．６６ｇの固体生成物を得た。収率：１０４．４％（断片２に対して）。
【００７７】
実施例２
リラキシンＢ鎖断片１＋２+３’（Boc-AA(1-29)-OtBu）の合成
リラキシンＢ鎖断片２＋３’（H-AA(13-29)-OtBu）（１３．４６ｇ）と断片１（Boc-AA(1-12)-OH）（６．０７ｇ）を、２５℃の浴付きの５００ｍＬの三つ口丸底フラスコ中で混合した。ＴＨＦ（１２０ｍＬ）とＮＭＰ（８０ｍＬ）中のＬｉＢｒ（３．５ｇ）の溶液を、その混合物を含むフラスコに攪拌しながら入れた。反応温度は、２８℃に急上昇した。１５分間の攪拌後、ＨＯＢｔ水和物（０．６５ｇ）、ＢＯＰ（２．０ｇ）およびＤＩＥＡ（１．６ｍＬ）を、ＮＭＰ（５ｍＬ）でリンスしながらこの溶液に入れた。反応物を２５℃の浴で攪拌し、ＨＰＬＣでモニターした。ＨＰＬＣの結果に基づいて、２種のキッカーチャージを行った（最初に、１．１７ｇの断片１／０．４４ｇのＢＯＰ／０．３ｍＬのＤＩＥＡ／５ｍＬのＴＨＦリンス、そしてその後、１．５０ｇの断片１／０．４３ｇのＢＯＰ／０．３ｍＬのＤＩＥＡ／５ｍＬのＴＨＦリンス）。一晩の反応の完結をチェックすると、さらに１種のキッカーチャージが必要であることが示された（０．２ｇのＢＯＰ／０．２ｍＬのＤＩＥＡ）。全体で２０時間の反応後に、カップリングは完結した。反応混合物を、次いで、１０℃の浴で水（８００ｍＬ）中でクエンチした。２５℃で６０分間の攪拌後、固体をろ過により単離し、水（４ｘ５０ｍＬ）で洗浄し、一晩乾燥して、５６．４％ＡＮの純度の２０．７７ｇの固体生成物を得た。収率：９３．２％（断片２＋３’に対して）。
【００７８】
実施例３
粗製リラキシンＢ鎖（H-AA(1-29)-OH）の合成
ＤＣＭ（８０ｍＬ）中のリラキシンＢ鎖断片１＋２+３’（Boc-AA(1-29)-OtBu）（２０．２５ｇ）のスラリーを、２５℃の浴で、ＴＦＡ（２９３ｍＬ）、ＤＴＴ（１３ｇ）および水（１３ｍＬ）を含む脱保護カクテルと混合した。３時間攪拌後、反応混合物を−５℃に冷却し、反応温度を＜１８℃に維持しながら、１５分間で冷（−２０℃）ＭＴＢＥ（１２００ｍＬ）をそれに入れることによりクエンチした。クエンチした反応混合物を、１５℃の浴で４５分間攪拌した。固体生成物をろ過し、ＭＴＢＥ（５ｘ５０ｍＬ）で洗浄し、真空オーブン中で一晩乾燥した。１５．６８ｇの粗製リラキシンＢ鎖（２１．８％ｗｔ／ｗｔ）が、１９．４％ＡＮの純度で得られた。収率：１２７．４％（断片１＋２＋３’に対して）。
【００７９】
リラキシンＢ鎖、H-AA(1-29)-OHの合成
H-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys-Gly-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OH
【００８０】
実施例４
リラキシンＢ鎖断片１、Boc-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Lys(Boc)-Leu-Cys(Trt)-Gly-OHの合成
Fmoc-AA(1-12)-O-2CT樹脂の固相合成は、３Ｌのガラスフリット樹脂フラスコ中で行った。０．４３ｍｍｏｌ／ｇの装着量のＨ−Ｇｌｙ−２−ＣＴ樹脂（１００．００ｇ）を樹脂フラスコに入れ、周囲温度で３０分間、ＤＣＭ（１０００ｍＬ）中で膨潤した。ジクロロメタン（ＤＣＭ）溶媒を抜き取り、樹脂をＮ−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）（３ｘ１０００ｍＬ）で洗浄した。
【００８１】
樹脂の全てのＦｍｏｃ脱保護は、樹脂を２０％ピペリジン／４０％ＮＭＰ／４０％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ／ｖ）（２ｘ１０００ｍＬ）で処理することによって行った。２回目のピペリジン／ＮＭＰ／ＤＭＳＯ処理後、樹脂を、ＮＭＰ（１０００ｍＬ）、ＩＰＡ（２ｘ１０００ｍＬ）、ＤＣＭ（１０００ｍＬ）、ＩＰＡ（２ｘ１０００ｍＬ）、ＮＭＰ（１０００ｍＬ）、ＩＰＡ（２ｘ１０００ｍＬ）、および５０％ＮＭＰ／５０％ＤＭＳＯ（３ｘ１０００ｍＬ）で連続的に洗浄した。
【００８２】
活性エステル溶液を調製するために、フラスコ中、アミノ酸および６−クロロ−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（６−Ｃｌ ＨＯＢＴ）を量り、ＮＭＰに溶解し、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）で処理し、ＤＭＳＯで希釈した。得られた溶液を樹脂フラスコに加え、調製フラスコをＤＭＳＯでリンスして樹脂フラスコに入れ、次いで、周囲温度で１９０〜２９５分間、樹脂と攪拌した。試料を、ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）試験のために取り、反応の完結を確認した。カップリング反応が完結した後、カップリング溶液を抜き取り、樹脂を、ＮＭＰ（１０００ｍＬ）、ＩＰＡ（２ｘ１０００ｍＬ）、および５０％ＮＭＰ／５０％ＤＭＳＯ（２ｘ１０００ｍＬ）で連続的に洗浄した。
【００８３】
Ｆｍｏｃ基の除去および次のアミノ酸のカップリングの手順を、断片中の残りのアミノ酸について繰り返した（すなわち、Cys(Trt)→Leu→Lys(Boc)→Ile→Val→Glu(OtBu)→Glu(OtBu)→Met→Trp(Boc)→Ser(tBu)→Boc-Asp(OtBu)の順で）。
【００８４】
完全に構築したペプチドを、周囲温度で１５．５時間、５０％ＴＦＥ（トリフルオロエタノール）／５０％ＤＣＭ（ｖ／ｖ）（１０００ｍＬ）中で樹脂を攪拌することにより樹脂から開裂させた。開裂溶液を抜き出し、樹脂をＤＣＭ（６ｘ１０００ｍＬ）で洗浄した。合わせたろ液から２０℃〜２５℃で真空下に溶媒を除去すると、収率９８．４％のＢ鎖断片１（７８．８％純度、ＡＮ）が得られた。
【００８５】
この実施例で使用した全ての試薬量を以下の表に列挙する：
【００８６】
【表１】
2012510486.tif 000002
【００８７】
実施例５
リラキシンＢ鎖断片２；Fmoc-AA(13-24)-OH; Fmoc-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Ile-Ala-Ile-Cys(Trt)-Gly-OHの合成
Fmoc-AA(13-24)-O-2CT樹脂の固相合成は、１．５Ｌのガラスフリット樹脂フラスコ中で行った。０．４３ｍｍｏｌ／ｇの装着量のＨ−Ｇｌｙ−２−ＣＴ樹脂（８５．００ｇ）を樹脂フラスコに入れ、周囲温度で３０分間、ＤＣＭ（８５０ｍＬ）中で膨潤した。ＤＣＭ溶媒を抜き出し、樹脂をＮＭＰ（３ｘ５１０ｍＬ）で洗浄した。
【００８８】
樹脂の全てのＦｍｏｃ脱保護は、樹脂を２０％ピペリジン／８０％ＮＭＰ（ｖ／ｖ）（２ｘ５９５ｍＬ）で３０分ずつ処理することによって行った。２回目のピペリジン／ＮＭＰ処理後、樹脂を、ＮＭＰ（３ｘ８５０ｍＬ）、ＤＣＭ（２ｘ８５０ｍＬ）、およびＮＭＰ（２ｘ８５０ｍＬ）で連続的に洗浄した。
【００８９】
活性エステル溶液を調製するために、フラスコ中、アミノ酸および６−Ｃｌ ＨＯＢＴを量り、ＮＭＰに溶解し、ＤＩＣで処理し、ＤＭＳＯで希釈した。得られた溶液を樹脂フラスコに加えた。調製フラスコをＤＭＳＯでリンスして樹脂フラスコに入れ、次いで、周囲温度で３〜６７時間、樹脂と攪拌した。試料を、カイザー試験のために取り、反応の完結を確認した。カップリング反応が完結した後、カップリング溶液を抜き取り、樹脂を、ＮＭＰ（３ｘ８５０ｍＬ）で洗浄した。Ｆｍｏｃ基の除去および次のアミノ酸のカップリングの手順を、断片中の残りのアミノ酸について繰り返した（すなわち、Cys(Trt)→Ile→Ala→Ile→Gln(Trt)→Ala→Arg(Pbf)→Val→Leu(R)Glu(OtBu)(R)Fmoc-Arg(Pbf)の順で）。
【００９０】
完全に構築したペプチドの大部分を、周囲温度で１８時間、５０％ＴＦＥ／５０％ＤＣＭ（ｖ／ｖ）（８５０ｍＬ）中で樹脂を攪拌することにより樹脂から開裂させた。開裂溶液を抜き出し、樹脂をＤＣＭ（４ｘ８５０ｍＬ）で洗浄した。合わせたろ液から２０℃〜２５℃で真空下に溶媒を除去した。ＴＦＥの最後の痕跡を除去するために、生成物を、ＤＣＭ（９１０ｍＬ）とトルエン（２００ｍＬ）中でスラリー化し、ロータリーエバポレーターで低容量までストリップした。トルエンを加え、そのスラリーを低容量までストリップした。生成物を、周囲温度で１１ｍｍＨｇの真空オーブン中で乾燥し、収率８１．０％のＢ鎖断片２（９１．９％純度、ａ．ｎ．）を得た。
【００９１】
この実施例で使用した全ての試薬量を以下の表に列挙する：
【００９２】
【表２】
2012510486.tif 000003
【００９３】
実施例６
リラキシンＢ鎖断片３；Fmoc-AA(25-28)-OH; Fmoc-Met-Ser(OtBu)-Thr(OtBu)-Trp-OHの合成
Fmoc-AA(25-28)-O-2CT樹脂の固相合成は、１．５Ｌのガラスフリット樹脂フラスコ中で行った。０．６５ｍｍｏｌ／ｇの装着量のＨ−Ｔｒｐ−２−ＣＴ樹脂（１００．００ｇ）を樹脂フラスコに入れ、周囲温度で３０分間、ＤＣＭ（１０００ｍＬ）中で膨潤した。ＤＣＭ溶媒を抜き出し、樹脂をＮＭＰ（３ｘ１０００ｍＬ）で洗浄した。
【００９４】
樹脂の全てのＦｍｏｃ脱保護は、樹脂を２０％ピペリジン／８０％ＮＭＰ（ｖ／ｖ）（２ｘ６００ｍＬ）で２０分ずつ処理することによって行った。２回目のピペリジン／ＮＭＰ処理後、樹脂を、ＮＭＰ（６ｘ１０００ｍＬ）で洗浄した。
【００９５】
活性エステル溶液を調製するために、フラスコ中、アミノ酸および６−Ｃｌ ＨＯＢＴを量り、ＮＭＰに溶解し、ＤＩＣで処理し、ＤＭＳＯで希釈した。得られた溶液を樹脂フラスコに加えた。調製フラスコをＤＭＳＯでリンスして樹脂フラスコに入れ、次いで、周囲温度で２．５〜７時間、樹脂と攪拌した。試料を、カイザー試験およびＢＰＢ試験のために取り、反応の完結を確認した。カップリング反応が完結した後、カップリング溶液を抜き出し、樹脂を、ＮＭＰ（３ｘ１０００ｍＬ）で洗浄した。Ｆｍｏｃ基の除去および次のアミノ酸のカップリングの手順を、断片中の残りのアミノ酸について繰り返した（すなわち、Thr(OtBu)→Ser(OtBu)→Fmoc-Met-OHの順で）。
【００９６】
完全に構築したペプチドを、周囲温度で２３．５時間、５０％ＴＦＥ／５０％ＤＣＭ（ｖ／ｖ）（１５００ｍＬ）中で樹脂を攪拌することにより樹脂から開裂させた。開裂溶液を抜き出し、樹脂をＤＣＭ（４ｘ１０００ｍＬ）で洗浄した。ろ液から２０℃〜２５℃で真空下にロータリーエバポレーターで、溶媒を除去した。先のストリップが完了した後、ＤＣＭ洗浄液を蒸留容器に順次加えた。生成物を周囲温度で１９ｍｍＨｇで一晩乾燥すると、収率１０４．０％のＢ鎖断片３（９５．２％純度、ａ．ｎ．）が得られた。
【００９７】
この実施例で使用した全ての試薬量を以下の表に列挙する：
【００９８】
【表３】
2012510486.tif 000004
【００９９】
実施例７
リラキシンＢ鎖Ｆｍｏｃ−断片３’；Fmoc-AA(25-29)-OtBu；Fmoc-Met-Ser(OtBu)-Thr(OtBu)-Trp-Ser(OtBu)-OtBuの合成
リラキシンＢ鎖Ｆｍｏｃ−断片３（６２．０９ｇ、６４．８０ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（７００ｍＬ）に溶解した。H-Ser(tBu)-OtBu（２８．３４ｇ、１３０．４ｍｍｏｌ、２．０当量）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（２９．８３ｇ，２５９．２ｍｍｏｌ、４．０当量）、および４−メチルモルホリン（２９．２ｍＬ、２６５．５ｍｍｏｌ、４．１当量）を、順次加えた。反応溶液を０℃に冷却し、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ・ＨＣｌ）（４９．９０ｇ、２６０．３ｍｍｏｌ、４．０当量）を加えた。６４時間後、Ｆｍｏｃ３／Ｆｍｏｃ３’の比は、ＨＰＬＣで２０．４／６７．２であった。全ての試薬のキッカーチャージ、１当量のＮ−ヒドロキシコハク酸イミド、４−メチルモルホリン、およびＥＤＡＣ・ＨＣｌならびに０．５当量のH-Ser(tBu)-OtBuを加えた。反応物は、０℃でさらに１５時間攪拌した。キッカーチャージの後、Ｆｍｏｃ３／Ｆｍｏｃ３’の比は、１，４／８５．８であり、反応が完結したことを示していた。溶液を８％ＮａＨＣＯ３（３ｘ３１０ｍＬ）で抽出した。有機層は、５０％クエン酸（３００ｍＬ）で洗浄した。溶媒をストリップして低容量とし、ＴＦＥで置換した。生成物を、脱イオン（ＤＩ）水（１５００ｍＬ）を加えることにより、溶液から析出させ、ろ過し、ＤＩ水（２５００ｍＬ）で洗浄し、周囲温度で一晩乾燥した。重量８１．０４ｇ（１０８．０％）のＢ鎖Ｆｍｏｃ−断片３’（Fmoc-AA(25-29)-OtBu）が、ＨＰＬＣで８７．３％ａ．ｎ．の純度で得られた。
【０１００】
実施例８
リラキシンＢ鎖断片３’；H AA(25-29)-OtBu; H-Met-Ser(OtBu)-Thr(OtBu)-Trp-Ser(OtBu)-OtBuの合成
リラキシンＢ鎖断片Ｆｍｏｃ−３’（４８．０１ｇ，４１．４７ｍｍｏｌ）とジエチルアミン（２５ｍＬ、１７．６８ｇ、２４２ｍｍｏｌ）を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１２５ｍＬ）に溶解し、室温で４時間攪拌した。反応溶液を１０〜１２℃に冷却し、ヘプタン（３０００ｍＬ）を加えた。生成物がＤＭＦ層中でオイルアウトしたので、ヘプタンをデカンテーションした。断片３’を、１８℃でヘプタン（５５００ｍＬ）を加えることにより、析出させ、３０分間攪拌した。生成物をろ過し、周囲温度で一晩乾燥し、３２．７ｇ（８４．３％）の粗製３’を得たが、これは８５．７％ａ．ｎ．のＨＰＬＣ純度を有していた。この粗生成物をＴＨＦ（２５０ｍＬ）に再溶解し、ＤＩ水（３０００ｍＬ）で析出させ、これをろ過し、ＤＩ水（１０００ｍＬ）で洗浄し、周囲温度で週末の間乾燥して、ＨＰＬＣで８７．１％ａ．ｎ．の純度の２９．０８ｇ（Ｆｍｏｃ−断片３’から７５．０％）を得た。
【０１０１】
実施例９
リラキシンＢ鎖断片２＋３’；H-AA(13-29)-OtBu; H-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Ile-Ala-Ile-Cys(Trt)-Gly-Met-Ser(OtBu)-Thr(OtBu)-Trp-Ser(OtBu)-OtBuの合成
リラキシンＢ鎖断片３’（４３．８３ｇ，４６．８７ｍｍｏｌ）と断片２（１１７．４８ｇ、４５．２５ｍｍｏｌ）を、反応フラスコに入れた。混合物をゆっくり攪拌した。臭化リチウム（ＬｉＢｒ）（３５．００ｇ、４０３．０ｍｍｏｌ）とＴＨＦ（１２００ｍＬ）をＮＭＰ（８００ｍＬ）に溶解した。この溶液を、２２℃で、ゆっくり攪拌してあるペプチドに加え、ペプチドが溶解するまで攪拌した。ヘキサフルオロリン酸（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム（ＢＯＰ試薬）（２３．４２ｇ、５２．９５ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ・Ｈ２Ｏ）（６．９３ｇ、５１．２９ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（１９．８ｍＬ、１４．６９ｇ、１１３．７ｍｍｏｌ）およびＴＨＦ（１１０ｍＬ）を加え、溶液を周囲温度で一晩攪拌した。ピペリジン（５０ｍＬ）を加え、２時間攪拌した。ピリジン塩酸塩（１２５．５３ｇ、１０．９ｍｏｌ）を加え、１５分間攪拌した。反応溶液を、迅速に攪拌してある冷（１０〜１５℃）ＤＩ水（８１００ｍＬ）に〜３分で加え、さらに２０分間攪拌し、ろ過し、ＤＩ水で洗浄し、周囲温度で一晩乾燥して、１５３．７０ｇ（９５．３％）の断片２，３’を得た。
【０１０２】
実施例１０
リラキシンＢ鎖断片１＋２＋３’；Boc-AA(1-29)-OtBu; Boc-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Lys(Boc)-Leu-Cys(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Ile-Ala-Ile-Cys(Trt)-Gly-Met-Ser(OtBu)-Thr(OtBu)-Trp-Ser(OtBu)-OtBuの合成
リラキシンＢ鎖断片２＋３’（１３１．２２ｇ）と断片１（８６．９２ｇ）を、反応フラスコに入れた。混合物をゆっくり攪拌した。臭化リチウム（３５．００ｇ、４０３．０ｍｍｏｌ）とＴＨＦ（１２００ｍＬ）をＮＭＰ（８００ｍＬ）に溶解した。この溶液を、２２℃で、ゆっくり攪拌しているペプチドに加え、ペプチドが溶解するまで攪拌した。ＢＯＰ試薬（２４．８８ｇ、５６．２５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ・Ｈ２Ｏ（７．０３ｇ、５２．０２ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（２４．５ｍＬ、１８．１８ｇ、１４０．７ｍｍｏｌ）を加え、周囲温度で一晩攪拌した。反応の完結をＨＰＬＣで追った。反応が完結するまで、キッカーチャージ（それぞれ〜５％ＢＯＰ試薬および〜５％ＤＩＥＡを含む）を加えた。反応溶液を、迅速に攪拌しているＤＩ水（８１００ｍＬ）に加え、１．５時間攪拌し、ろ過し、ＤＩ水で洗浄し、周囲温度で乾燥して、２１６．７２ｇ（９９．３％）のＢｏｃ−断片１，２，３’を得た。
【０１０３】
実施例１１
リラキシンＢ鎖；H-AA(1-29)-OH; H-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys-Gly-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OHの合成
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（２８８０ｍＬ）、ＤＣＭ（３６０ｍＬ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）（１８１．０ｇ、１．１７ｍｏｌ）、およびＤＩ水（１８０ｍＬ）の溶液を調製し、リラキシンＢ鎖Ｂｏｃ−断片１，２，３’（２１３．１２ｇ（３９．１１ｍｍｏｌ）に加えた。反応混合物を室温で５時間攪拌した。反応物を−５〜−１０℃に冷却し、ポット温度を−５〜−１０℃に保ちながら、ｔ−ブチルメチルエーテル（ＭＴＢＥ）（１２．０Ｌ）を７５分間かけてゆっくり加えた。スラリーをろ過し、ＭＴＢＥで洗浄し、周囲温度で乾燥して、１４８．３８ｇ（４４．７９ｍｍｏｌ、１１４．５％）のリラキシンＢ鎖を得た。
【０１０４】
上記の発明を、明確さおよび理解の目的で、説明および例としていくぶん詳細に記載した。添付の特許請求の範囲の範囲内で変更および改変を行い得ることは当業者に明らかである。それゆえ、上記の記載は説明を意図し、限定を意図するものではないことが理解されるべきである。それゆえ、本発明の範囲は、上記の記載を参照して決定されるべきではなく、代わりに以下の添付の特許請求の範囲を、その特許請求の範囲に権利が与えられる等価物の全範囲とともに、参照して決定されるべきである。
【０１０５】
本願に引用されている全ての特許、特許出願および刊行物は、各々の個々の特許、特許出願および刊行物が個々に示されているのと同じように全てに対して、その全体が参照してここに組み入れられる。
【図１】
2012510486.tif 000005
【配列表】
2012510486000001.app
【国際調査報告】
2012510486.tif 000006
2012510486.tif 000007
2012510486.tif 000008
2012510486.tif 000009
2012510486.tif 000010