(57)【要約】クロスハイブリダイゼーションを確実に防止する（１）基板と、（２）ハイブリダイズに寄与しない塩基配列からなる非相補領域と、ハイブリダイズに寄与する塩基配列からなり、検出対象の核酸ターゲット群のうち特定の核酸ターゲットに対して特異的にハイブリダイズする選択領域及び検出対象の核酸ターゲットが共通して有するリンカー配列の全部または一部に対して相補的な調節領域からなる相補領域とを含み、上記基板上に固定された複数の核酸プローブとを備え、上記調節領域の長さは、上記複数の核酸プローブにおける相補領域のＴｍ値を近づけるように設計されたことを特徴とする核酸マイクロアレイ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と、
ハイブリダイズに寄与しない塩基配列からなる非相補領域と、ハイブリダイズに寄与する塩基配列からなり、検出対象の核酸ターゲット群のうち特定の核酸ターゲットに対して特異的にハイブリダイズする選択領域及び検出対象の核酸ターゲットが共通して有するリンカー配列の全部または一部に対して相補的な調節領域からなる相補領域とを含み、上記基板上に固定された複数の核酸プローブとを備え、
上記調節領域の長さは、上記複数の核酸プローブにおける相補領域のＴｍ値を近づけるように設計されたことを特徴とする核酸マイクロアレイ。
【請求項２】
上記選択領域がｎ個の塩基からなり、アデニン、グアニン、チミン及びシトシンの全ての組合せに相当する４ｎ種類の選択領域を有することを特徴とする請求項１記載の核酸マイクロアレイ。
【請求項３】
上記核酸プローブは、上記調節領域が上記選択領域を挟み込み、上記非相補領域が上記相補領域を挟み込むように構成されたことを特徴とする請求項１記載の核酸マイクロアレイ。
【請求項４】
上記選択領域の３’末端側に位置する調節領域の長さと、上記選択領域の５’末端側に位置する調節領域の長さとが異なることを特徴とする請求項３記載の核酸マイクロアレイ。
【請求項５】
上記複数の核酸プローブは全て同じ長さであることを特徴とする請求項１記載の核酸マイクロアレイ。
【請求項６】
上記リンカー配列は配列番号１記載の塩基配列における２５〜３２番目の領域を除く塩基配列であることを特徴とする請求項１記載の核酸マイクロアレイ。
【請求項７】
請求項１、３、４、５及び６のいずれか一項記載のＤＮＡチップにおける選択領域がｎ個の塩基からなり、アデニン、グアニン、チミン及びシトシンの全ての組合せに相当する４ｎ種類の選択領域の一部を有する、複数の核酸マイクロアレイから構成され、
上記４ｎ種類の選択領域は、上記複数の核酸マイクロアレイのうちいずれか１の核酸マイクロアレイに含まれていること特徴とする核酸マイクロアレイセット。
【請求項８】
生体試料由来のユニーク配列と、他の核酸ターゲットと共通するリンカー配列とを含む核酸ターゲットに対してハイブリダイズする核酸プローブであって、ハイブリダイズに寄与しない塩基配列からなる非相補領域と、ハイブリダイズに寄与する塩基配列からなり、上記ユニーク配列に特異的にハイブリダイズする選択領域及び上記リンカー配列の全部または一部に対して相補的な調節領域からなる相補領域とを含む核酸プローブを設計する方法であって、
複数の核酸プローブにおける上記選択領域の塩基配列を、各核酸プローブにおける選択領域が異なる塩基配列を有するように設計する工程と、
異なる選択領域を有する複数の核酸プローブにおける、各相補領域のＴｍ値が近づくように上記調節領域の長さを設計する工程とを含む核酸プローブの設計方法。
【請求項９】
上記選択領域の塩基配列を設計する工程では、ｎ個の塩基からなる選択領域に対して、アデニン、グアニン、チミン及びシトシンの全ての組合せに相当する４ｎ種類の塩基配列を設計することを特徴とする請求項８記載の核酸プローブの設計方法。
【請求項１０】
上記調節領域の長さを設計する工程は、複数の核酸プローブにおける各選択領域のグアニン及びシトシン含量（ＧＣ含量）を算出する工程を含み、選択領域のＧＣ含量が高い場合には調節領域の長さを短く設計し、選択領域のＧＣ含量が低い場合には調節領域の長さを長く設計することを特徴とする請求項８記載の核酸プローブの設計方法。
【請求項１１】
上記調節領域の長さを設計する工程は、上記ＧＣ含量を算出する工程の後、算出したＧＣ含量が同じである複数の選択領域の全てについてＴｍ値を算出し、Ｔｍ値の平均値よりも高いＴｍ値を示す選択領域については調節領域の長さを短く設計し、Ｔｍ値の平均値よりも低いＴｍ値を示す選択領域については調節領域の長さを長く設計することを特徴とする請求項１０記載の核酸プローブの設計方法。
【請求項１２】
上記調節領域の長さを設計する工程は、複数の核酸プローブにおける各選択領域のグアニン及びシトシン含量（ＧＣ含量）の偏りを評価する工程を含み、選択領域のＧＣ含量に偏りがある場合には、当該選択領域の３’末端側に設計する調節領域の長さと、当該選択領域の５’末端側に設計する調節領域の長さとを異ならせるように設計することを特徴とする請求項８記載の核酸プローブの設計方法。
【請求項１３】
生体試料から核酸を抽出する工程と、
抽出した核酸又は当該核酸を用いて合成されたｃＤＮＡを第１の制限酵素により切断する工程と、
ＴｙｐｅＩＩｓ制限酵素認識配列を有する第１のリンカーを、上記第１の制限酵素による処理で形成された核酸又はｃＤＮＡの端部に結合する工程と、
第１のリンカーを結合した核酸又はｃＤＮＡを、認識部位から一定の長さ離れた箇所を切断できるＴｙｐｅＩＩｓ制限酵素により切断して、当該第１のリンカー及び上記核酸又はｃＤＮＡの一部を育する核酸断片を調製する工程と、
上記核酸断片におけるＴｙｐｅＩＩｓ制限酵素処理末端に第２のリンカーを結合する工程とを含み、
生体試料由来のユニーク配列と第１のリンカー及び第２のリンカーからなるリンカーとを含む核酸ターゲットを調製する核酸ターゲットの調製方法。
【請求項１４】
上記第１の制限酵素により切断する工程に先立って、生体試料から抽出した核酸又は当該核酸を用いて合成されたｃＤＮＡにおける一方端部を担体に付着する工程と、
上記第１の制限酵素により切断する工程の後、上記担体に付着した核酸又はｃＤＮＡを分離する工程とを更に含み、
上記第１のリンカーを、上記担体に付着した核酸又はｃＤＮＡの端部に結合することを特徴とする請求項１３記載の核酸ターゲットの調製方法。
【請求項１５】
上記第２のリンカーを結合する工程に先立って、上記核酸又はｃＤＮＡを付着した担体を除去する工程を更に含むことを特徴とする請求項１３記載の核酸ターゲットの調製方法。
【請求項１６】
上記第２のリンカーに含まれるプロモータからの転写により蛍光標識ＲＮＡ鎖を合成する工程を更に含むことを特徴とする請求項１３記載の核酸ターゲットの調製方法。
【請求項１７】
生体試料由来のユニーク配列と、他の核酸ターゲットと共通するリンカー配列とを含む核酸ターゲットを含む溶液を、ハイブリダイズに寄与しない塩基配列からなる非相補領域と、ハイブリダイズに寄与する塩基配列からなり、上記ユニーク配列に特異的にハイブリダイズする選択領域及び上記リンカー配列の全部または一部に対して相補的な調節領域からなる相補領域とを含む核酸プローブを基板上に固定してなる核酸マイクロアレイに対して接触させる工程と、
上記核酸マイクロアレイの核酸プローブにハイブリダイズした核酸ターゲットを検出する工程とを含む遺伝子検出方法。
【請求項１８】
上記選択領域がｎ個の塩基からなり、アデニン、グアニン、チミン及びシトシンの全ての組合せに相当する４ｎ種類の選択領域を有することを特徴とする請求項１７記載の遺伝子検出方法。
【請求項１９】
上記核酸プローブは、上記調節領域が上記選択領域を挟み込み、上記非相補領域が上記相補領域を挟み込むように構成されたことを特徴とする請求項１７記載の遺伝子検出方法。
【請求項２０】
上記複数の核酸プローブは全て同じ長さであることを特徴とする請求項１７記載の遺伝子検出方法。
【請求項２１】
上記リンカー配列は配列番号１記載の塩基配列における２５〜３２番目の領域を除く塩基配列であることを特徴とする請求項１７記載の遺伝子検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、検出対象の核酸ターゲットにハイブリダイズする核酸プローブを固定した核酸マイクロアレイ（チップ）、核酸プローブの設計方法及び核酸ターゲットの調製方法並びに当該核酸マイクロアレイを用いた遺伝子検出方法に関する。
【背景技術】  所謂、核酸マイクロアレイは、基板上に複数のオリゴ核酸（核酸プローブ）を固定してなり、当該オリゴＤＮＡと相補的な核酸ターゲットを検出することができる。なお、本明細書において使用する用語“核酸マイクロアレイ”は、一般に使用されている用語“ＤＮＡアレイ”、“ＤＮＡマイクロアレイ”、“ＤＮＡマクロアレイ”及び“ＤＮＡチップ”の総称を意味する。よって、本明細書において使用する用語“核酸マイクロアレイ”は、半導体集積回路製造用のフォトリソグラフィー技術を応用した高密度ＤＮＡアレイのみを意味するものではない。
核酸マイクロアレイとしては、従来、既知の遺伝子の発現レベルを検出することを目的として、当該既知の遺伝子由来の核酸ターゲットに特異的にハイブリダイズする核酸プローブを固定化したものが知られている。この核酸マイクロアレイを用いた遺伝子検出方法では、先ず、ある生体試料からｍＲＮＡを抽出し、当該ｍＲＮＡを鋳型とする逆転写反応により蛍光標識を取り込んだ核酸ターゲット群を調製し、次に、調製した核酸ターゲット群を核酸マイクロアレイに接触させる。このとき、核酸ターゲット群に検出対象の遺伝子に由来する核酸ターゲットが含まれていれば、核酸マイクロアレイ上の核酸プローブと目的の核酸ターゲットとがハイブリダイズすることとなる。よって、核酸マイクロアレイ上の蛍光をスキャンすることによって、生体試料における検出対象の遺伝子に関して発現の有無及び発現レベルを検出することができる。
一方、近年、汎用マイクロアレイシステム（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）と称される転写解析プラットホームが紹介されている（非特許文献１）。この非特許文献１には、６塩基長の領域を有し、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）及びシトシン（Ｃ）からなる塩基の全ての組合せ（４６＝４０９６）からなる４０９６種類の核酸プローブを固定化した核酸マイクロアレイが開示されている。非特許文献１に開示された核酸マイクロアレイにおいて、核酸プローブは、基板に固定化する末端側から順に、Ｃ６アミノ酸修飾リンカー、Ｃ１８スペーサー及び上記６塩基長の領域を有している。また、上記６塩基長の領域は、Ｃ１８スペーサーの端部と７番目の塩基（Ｃ／Ｔ混合）を介して結合されている。なお、この７番目の塩基はＣ１８スペーサーと共有結合によって結合している。
以上のように構成された核酸マイクロアレイによれば、遺伝子が未知であっても、遺伝子の発現の有無や発現レベルを解析することができる。ところが、非特許文献１に開示された核酸マイクロアレイにおいては、上記６塩基長の領域のみが核酸ターゲットとのハイブリダイズに寄与する。核酸マイクロアレイにおいて上記６塩基長の領域には、ＧＣ含量の高い配列もあれば、ＣＧ含量の低い配列もある。ＣＧ含量の相違は、ハイブリダイズにおけるＴｍ値に大きく影響することが知られている。したがって、非特許文献１に開示された核酸マイクロアレイにおいては、上記６塩基長の領域のＴｍ値の違いに起因するクロスハイブリダイゼーションを確実に防止することができない。言い換えると、非特許文献１に開示されたＤＮＡチップにおいては、クロスハイブリダイゼーションが生じるため、未知或いは既知の遺伝子を正確に検出することができないといった問題がある。
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．４，４１８−４２６，２００４
【発明の開示】
そこで、本発明は上述したような実状に鑑み、クロスハイブリダイゼーションを確実に防止し、検出感度に優れた核酸マイクロアレイを提供することを目的とする。また、本発明は、クロスハイブリダイゼーションを確実に防止できる核酸プローブの設計方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、クロスハイブリダイゼーションを確実に防止できる核酸ターゲットの調製方法を提供することを目的とする。さらにまた、本発明は、クロスハイブリダイゼーションを確実に防止し、検出感度に優れた遺伝子検出方法を提供することを目的とする。
上述した目的を達成した本発明は、以下を包含する。
（１）  基板と、
ハイブリダイズに寄与しない塩基配列からなる非相補領域と、ハイブリダイズに寄与する塩基配列からなり、検出対象の核酸ターゲット群のうち特定の核酸ターゲットに対して特異的にハイブリダイズする選択領域及び検出対象の核酸ターゲットが共通して有するリンカー配列の全部または一部に対して相補的な調節領域からなる相補領域とを含み、上記基板上に固定された複数の核酸プローブとを備え、
上記調節領域の長さは、上記複数の核酸プローブにおける相補領域のＴｍ値を近づけるように設計されたことを特徴とする核酸マイクロアレイ。
上記（１）の核酸マイクロアレイにおいて、上記複数の核酸プローブにおける相補領域のＴｍ値はほぼ一定の範囲内であることが好ましい。また、上記（１）の核酸マイクロアレイにおいて、上記選択領域がｎ個の塩基からなり、アデニン、グアニン、チミン及びシトシンの全ての組合せに相当する４ｎ種類の選択領域を有することが好ましい。さらに、上記（１）の核酸マイクロアレイにおいて、上記核酸プローブは、上記調節領域が上記選択領域を挟み込み、上記非相補領域が上記相補領域を挟み込むように構成されたものであることが好ましい。また、上記調節領域が上記選択領域を挟み込むように構成された核酸プローブにおいて、上記選択領域の３’末端側に位置する調節領域の長さと、上記選択領域の５’末端側に位置する調節領域の長さとが異なっていてもよい。上記（１）の核酸マイクロアレイにおいて、上記複数の核酸プローブは全て同じ長さであることが好ましい。上記（１）の核酸マイクロアレイにおいて、上記リンカー配列は例えば、配列番号１記載の塩基配列とすることができる。
また、本発明は以下を包含する。
（２）  生体試料由来のユニーク配列と、他の核酸ターゲットと共通するリンカー配列とを含む核酸プローブに対してハイブリダイズする核酸プローブであって、ハイブリダイズに寄与しない塩基配列からなる非相補領域と、ハイブリダイズに寄与する塩基配列からなり、上記ユニーク配列に特異的にハイブリダイズする選択領域及び上記リンカー配列の全部または一部に対して相補的な調節領域からなる相補領域とを含む核酸プローブの塩基配列を設計する方法であって、
複数の核酸プローブにおける上記選択領域の塩基配列を、各核酸プローブにおける選択領域が異なる塩基配列を有するように設計する工程と、
異なる選択領域を有する複数の核酸プローブにおける、各相補領域のＴｍ値が近づくように上記リンカー配列の塩基配列及び上記調節領域の長さを設計する工程とを含む核酸プローブの設計方法。
上記（２）の設計方法において、上記選択領域の塩基配列を設計する工程では、ｎ個の塩基からなる選択領域に対して、アデニン、グアニン、チミン及びシトシンの全ての組合せに相当する４ｎ種類の塩基配列を設計し、４ｎ種類の核酸プローブにおける相補領域のＴｍ値がほぼ一定の範囲になるように、調節領域の長さを核酸プローブ毎に決定することが好ましい。また、上記（２）の設計方法において、上記調節領域の長さを設計する工程は、複数の核酸プローブにおける各選択領域のグアニン及びシトシン含量（ＧＣ含量）の偏りを評価する工程を含み、選択領域のＧＣ含量に偏りがある場合には、当該選択領域の３’末端側に設計する調節領域の長さと、当該選択領域の５’末端側に設計する調節領域の長さとを異ならせるように設計することもできる。
さらに、本発明は以下を包含する。
（３）  生体試料由来のユニーク配列と、他の核酸ターゲットと共通するリンカー配列とを含む核酸ターゲットを含む溶液を、ハイブリダイズに寄与しない塩基配列からなる非相補領域と、ハイブリダイズに寄与する塩基配列からなり、上記ユニーク配列に特異的にハイブリダイズする選択領域及び上記リンカー配列の全部または一部に対して相補的な調節領域からなる相補領域とを含む核酸プローブを基板上に固定してなる核酸マイクロアレイに対して接触させる工程と、
上記核酸マイクロアレイの核酸プローブにハイブリダイズした核酸ターゲットを検出する工程とを含む遺伝子検出方法。
上記（３）の遺伝子検出方法において、上記複数の核酸プローブにおける相補領域のＴｍ値はほぼ一定の範囲内であることが好ましい。また、上記（３）の遺伝子検出方法において、上記選択領域がｎ個の塩基からなり、アデニン、グアニン、チミン及びシトシンの全ての組合せに相当する４ｎ種類の選択領域を有することが好ましい。さらに、上記（３）の遺伝子検出方法において、上記核酸プローブは、上記調節領域が上記選択領域を挟み込み、上記非相補領域が上記相補領域を挟み込むように構成されたものであることが好ましい。上記（３）の遺伝子検出方法において、上記複数の核酸プローブは全て同じ長さであることが好ましい。上記（３）の遺伝子検出方法において、上記リンカー配列は例えば、配列番号１記載の塩基配列における２５〜３２番目の領域を除く塩基配列とすることができる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００４−２７８１２２号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明に係る核酸マイクロアレイを模式的に示す要部断面図である。
図２は、本発明に係る核酸マイクロアレイを模式的に示す斜視図である。
図３は、本発明に係る核酸マイクロアレイを模式的に示す要部断面図である。
図４は、核酸ターゲットの構成を模式的に示す構成図である。
図５は、本発明に係る核酸マイクロアレイを模式的に示す要部断面図である。
図６は、２９７種類の核酸プローブにおけるハイブリダイズを核酸ターゲット１０の蛍光標識から検出した結果を示す写真である。
図７は、本発明に係る核酸ターゲットの調製方法のフローチャートである。
図８−１は、本発明に係る核酸ターゲットの調製方法を説明するための模式図である。
図８−２は、本発明に係る核酸ターゲットの調製方法を説明するための模式図である。
図９Ａ、Ｂ及びＣは、実施例１の実験結果。全酵母のＯＲＦに由来するユニーク配列のチップを用いコントロール酵母、エタノールストレス酵母を用いた実施例におけるスキャン画像の一部とシグナル強度の散布図である。
図１０Ａ、Ｂ及びＣは、実施例２の実験結果。４８個のユニーク配列のチップを用いコントロール酵母、エタノールストレス酵母を用いた実施例におけるスキャン画像の一部とシグナル強度の散布図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る核酸マイクロアレイは、図１に示すように、基板１と、基板１上に種類毎に固定化された核酸プローブ２とから構成され、核酸プローブ２の種類毎に区画されたスポット３を有している。スポット３は、図２に示すように、基板１の一主面においてマトリックス状に配されている。
基板１としては、核酸プローブを固定化できれば特に限定されず、ガラス板及び樹脂板等を使用することができる。樹脂板としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ナイロン及びシリコーン等のプラスティク板、ニトロセルロース及びセルロースアセテート等のセルロース板等を使用することができる。なお、核酸プローブ２の固定化方法によっては、一主面に表面処理を施した基板１を使用することもできる。例えば、一主面をポリＬ−リシンでコーティングしたガラス板を使用することができる。また、基板の形状は、板状のものに限定したものではなく、球状のもの（ビーズ）などがある。
核酸プローブ２は、図３に示すように、ハイブリダイズに寄与しない塩基配列からなる非相補領域４と、ハイブリダイズに寄与する塩基配列からなり、核酸ターゲットに対して特異的にハイブリダイズする選択領域５及び検出対象の核酸ターゲットが共通して有するリンカー配列の全部または一部に対して相補的な調節領域６からなる相補領域７とを含む。また、核酸プローブ２は、非相補領域４及び相補領域７以外に、基板１との間に配されるスペーサー領域８を有するような構成であっても良い。
本発明に係る核酸マイクロアレイにおいて、選択領域５がｎ個の塩基からなる場合、アデニン、グアニン、チミン及びシトシンの全ての組合せに相当する４ｎ種類の選択領域５を設計することができる。すなわち、核酸プローブ２としては、４ｎ種類の選択領域５に対応して４ｎ種類を設計することができる。一例として図３に示すように、選択領域５が８塩基の長さからなる場合、６５５３６通りの塩基配列を設計することができ、６５５３６通りの核酸プローブ２を設計することができる。なお、選択領域の塩基長は８個に限定されず、如何なる数でもよい。但し、選択領域５が５塩基長では１０２４種類しか設計できないこととなり、核酸マイクロアレイを用いた遺伝子の発現解析には不十分であると考えられる。一方、選択領域５が１０塩基長では１０４８５７６種類を設計することとなり、ヒトの遺伝子が約３２０００種類であると推定されていることからすると、約９０％の遺伝子を一意的に選択することができると考えられる。したがって、選択領域５は、６〜１０塩基長であることが望ましい。
なお、本発明に係る核酸マイクロアレイは、核酸プローブ２として、選択領域５の全ての組合せに相当する種類を有することが望ましいが、必ずしも全ての組合せに相当する種類を有していなくても良い。例えば、選択領域５が８塩基長からなる場合、６５５３６通りの核酸プローブ２のうち９５％、好ましくは９７％、より好ましくは９９％の核酸プローブ２を有していれば、核酸マイクロアレイとしては、優れた検出能で遺伝子発現解析を行うことができる。より具体的に、選択領域５が８塩基長からなる場合、選択領域５が全てアデニンのみからなる核酸プローブ２や、他の核酸プローブ２と比較して選択領域５の末端１塩基のみが相違する核酸プローブ２等を除いた、核酸プローブ２を有する核酸マイクロアレイであっても、優れた検出能で遺伝子発現解析を行うことができる。
また、核酸プローブ２に含まれる調節領域６は、詳細を後述する核酸ターゲットが共通して有するリンカー配列の全部または一部に対して相補的な塩基配列を有している。ここで、核酸ターゲットの一例として、図４に示すように、核酸ターゲット１０を例示して説明する。核酸ターゲット１０は、細胞や組織等の生体試料から抽出したｍＲＮＡに由来するユニーク配列１１と、ユニーク配列１１を挟み込む第１のリンカー１２及び第２のリンカー１３（まとめて単に「リンカー」と称する場合もある。）とを備えている。核酸ターゲット１０において、ユニーク配列１１は、生体試料に由来する多種類のｍＲＮＡに由来しているため、ｍＲＮＡの種類毎に異なる配列となる。一方、リンカー配列は、全ての核酸ターゲット１０において共通する配列である。
リンカーの塩基配列は、特に限定されずいかなる配列であってもよい。また、リンカーにおけるＧＣ含量は３５〜６５％が好ましく、４０〜６０％がより好ましく、４５〜５５％が最も好ましい。第１のリンカー１２の一例としては配列番号１の塩基配列、第２のリンカー１３の一例としては配列番号２の塩基配列を挙げることができる。リンカー配列としては、例えば、配列番号１記載の塩基配列における２５〜３２番目の領域を除く塩基配列を例示することができる。なお、核酸ターゲットの調製方法及びリンカーの塩基配列設計方法については後述する。
調節領域６は、第１のリンカー１２及び第２のリンカー１３に相補的な塩基配列からなり、選択領域５を挟み込むように分割されている。すなわち、調節領域６の一方は第１のリンカー１２に相補的な塩基配列からなり、調節領域６の他方は第２のリンカー１３に相補的な塩基配列からなる。
また、図５に示すように、調節領域６は異なる長さである場合がある。すなわち、調節領域６は、リンカーの一部と相補的な塩基配列からなる場合がある。本発明に係る核酸マイクロアレイにおいては、調節領域６及び選択領域５からなる相補領域７のＴｍ値が、複数の核酸プローブ２において、近くなるように、調節領域６の長さが決定されている。
仮に、上述したように予め決定されている選択領域５のみを核酸ターゲット１０とハイブリダイズさせ、核酸ターゲット１０のユニーク配列１１を検出することを想定した場合、各ハイブリダイズにおいて、選択領域５の塩基配列に応じて異なるＴｍ値となる。一方で、核酸マイクロアレイは、各スポット３を同一条件（温度、塩濃度、ｐＨ等）で処理するため、各スポット３におけるハイブリダイズを安定して形成することができない。
これに対して、本発明に係る核酸マイクロアレイにおいては、調節領域６の長さを適宜調節して設計することで、ハイブリダイズに寄与する相補領域７のＴｍ値を全ての核酸プローブ２において近くすることができる。これにより、本発明に係る核酸マイクロアレイによれば、選択領域５の塩基配列が異なる場合でも、核酸プローブ２と核酸ターゲット１０とのハイブリダイズを安定して形成することができ、クロスハイブリダイゼーションを確実に防止することができる。
以下、調節領域６の長さを設計する方法について説明する。調節領域６の長さを設計する際には、先ず、設計した複数の核酸プローブ２における各選択領域５のグアニン及びシトシン含量（ＧＣ含量）を算出する。次に、算出したＧＣ含量に基づいて、ＧＣ含量と最適な調節領域６の長さとを関連付けたデータベースから、各選択領域５に最適な調節領域６の長さを検索する。このデータベースによれば、選択領域５のＧＣ含量が高い場合には調節領域６の長さを短く設計し、選択領域５のＧＣ含量が低い場合には調節領域６の長さを長く設計することとなる。
ここで、ＧＣ含量と最適な調節領域６の長さとを関連付けたデータベースの作製方法の一例を、実験例とともに説明する。本例では、選択領域５が８塩基長、すなわちユニーク配列１１が８塩基長である場合を例示する。本実験では、表１に示す塩基配列を有する１１種類の核酸断片を合成し、これら核酸断片を鋳型としてＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いたＲＮＡ鎖合成反応を行い、得られたＲＮＡ鎖を核酸ターゲット１０としている。なお、得られた核酸ターゲット１０は、蛍光標識ＣＴＰを用いたＲＮＡ鎖合成により蛍光標識されている。
【表１】
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一方、核酸プローブ２としては、表１に示したユニーク配列に相補的な選択領域５を有し、選択領域５の両端にリンカーに相補的な２〜１０塩基の調節領域６を有するものを準備する。すなわち、上記１１種類のユニーク配列に対応する１１種類の選択領域５から選ばれる１の選択領域５について、２〜１０塩基の調節領域６を有する９種類の核酸プローブ２を準備する。よって、上記１１種類のユニーク配列に対応する１１種類の選択領域５について、９９種類の核酸プローブ２を準備することとなる。さらに、これら９９種類の核酸プローブ２全てについて、１塩基ミスマッチを有する２種類の核酸プローブ２も準備する。よって、上記１１種類のユニーク配列に対応する１１種類の選択領域５について、合計で２９７種類の核酸プローブ２を準備することとなる。
そして、これら２９７種類の核酸プローブ２を固定した核酸マイクロアレイに上記１１種類の核酸ターゲット１０を接触させ、核酸プローブ２と核酸ターゲット１０とのハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションの条件はＢｕｆｆｅｒ；６ｘＳＳＣ＋５０％ホルムアミド、２５度である。２９７種類の核酸プローブにおけるハイブリダイズを核酸ターゲット１０の蛍光標識から検出した結果を図６に示す。
図６中、横軸は選択領域５のＧＣ含量を意味しており、縦軸は調節領或６の長さを意味している。例えば図６中「ＧＣＯ」は、表１中ＧＣ含量０／８のユニーク配列に相補的な選択配列５を有する核酸プローブの列を意味する。図６中「ＧＣ４ｍｉｎ」は表１における「ＧＣ４ｍｉｎｔａｒｇ」のユニーク配列に相補的な選択配列５を有する核酸プローブの列を意味し、「ＧＣ４ｍｅｄ」は表１における「ＧＣ４ｍｅｄｔａｒｇ」のユニーク配列に相補的な選択配列５を有する核酸プローブの列を意味し、「ＧＣ４ｍａｘ」は表１における「ＧＣ４ｍａｘｔａｒｇ」のユニーク配列に相補的な選択配列５を有する核酸プローブの列を意味する。「ＧＣ４ｍｉｎ」、「ＧＣ４ｍｅｄ」及び「ＧＣ４ｍａｘ」は、選択領域５におけるＧＣ含量が４／８と同じ値であるが、グアニンとシトシンの存在位置により異なるＴｍ値を示すものである。「ＧＣ４ｍｉｎ」はＧＣ含量が４／８であり、最も低いＴｍ値を示すものであり、「ＧＣ４ｍａｘ」はＧＣ含量が４／８であり、最も高いＴｍ値を示すものである。「ＧＣ４ｍｅｄ」はＧＣ含量が４／８であり、中間程度のＴｍ値を示すものである。
また、図６中、所定のＧＣ含量の核酸プローブを意味する列に３つのスポットがあるが、左側のスポットが核酸ターゲット１０と完全にマッチする核酸プローブのスポットであり、中心及び右側のスポットは核酸ターゲット１０と１塩基ミスマッチする核酸プローブのスポットである。
よって、図６中、所定のＧＣ含量の選択配列５を意味する列において、左側のスポットが強く検出されるとともに中央及び右側のスポットが検出されない長さ（縦軸）が、当該ＧＣ含量の選択配列５にとって最適であることが判明する。図６に示したスポット検出結果に基づいて、完全マッチ核酸プローブの蛍光シグナルを１塩基ミスマッチ核酸プローブの蛍光シグナルで割って相対化した結果を表２に示す。
【表２】
2006033484.tif 000003
表２中、太枠で囲ったセルは、所定のＧＣ含量の選択領域５を有する完全マッチ核酸プローブにおいて、相対シグナルが最も高い値を示したセルを意味する。また、影付きのセルは、太枠で囲ったセルの値より劣るが、所定のＧＣ含量の選択領域５を有する完全マッチ核酸プローブにおいて、相対シグナルが比較的に優れた値を示したセルを意味する。
図６及び表２に示した結果から、８塩基長からなる選択領域５に含まれるＧＣ含量と最適な調節領域６の長さとを関連付けたデータベースを構築することができる。データベースは例えば表３のように表すことができる。
【表３】
2006033484.tif 000004
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表３に示したデータベースを用いれば、設計した複数の核酸プローブ２における８塩基長からなる各選択領域５のＧＣ含量に基づいて、調節領域６の長さを具体的に設計することができる。なお、核酸プローブ２における選択領域５が８塩基長以外であっても同様にデータベースを構築し、調節領域６の長さを具体的に設計することができる。
ところで、選択領域５におけるＧＣ含量が同じ値であっても、グアニンとシトシンの存在位置によっては大きく異なるＴｍ値を示す場合がある。例えば、選択領域５におけるＧＣ含量が４の配列の組合せは、１７９２０種類あり、Ｎｅａｒｅｓｔ−Ｎｅｉｇｈｂｏｒ法（ＲＮＡ−ＤＮＡ  ｈｙｂｒｉｄ）にてＴｍ値を計算すると２５．０２〜５７．９４という広がりを持っている。
したがって、調節領域６の長さを設計する方法においては、上述したように、選択領域５のＧＣ含量を算出した後、算出したＧＣ含量が同じである複数の選択領域５の全てについてＴｍ値を算出し、Ｔｍ値の平均値よりも高いＴｍ値を示す選択領域５については調節領域６の長さを短く設計し、Ｔｍ値の平均値よりも低いＴｍ値を示す選択領域５については調節領域６の長さを長く設計するように処理することが好ましい。
ここで、Ｔｍ値の算出方法としては、特に限定されず公知の算出方法を適宜使用することができるが、正確性が高いと評価されているＮｅａｒｅｓｔ−Ｎｅｉｇｈｂｏｒ法で計算することが好ましい。Ｎｅａｒｅｓｔ−Ｎｅｉｇｈｂｏｒ法によればＴｍ値は下記式により与えられる。
【数１】
2006033484.tif 000006
ここで、ΔＳはハイブリットにおける隣接エントロピー変化の合計（ｃａｌ／ｍｏｌ・Ｋ）を意味し、ΔＨはハイブリットにおける隣接エンタルピー変化の合計（Ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を意味し、Ｒは気体定数（１．９８７ｃａｌ／ｄｅｇ・ｍｏｌ）を意味し、Ｃｔはオリゴのｔｏｔａｌ  ｍｏｌ濃度（ｍｏｌ／ｌ）を意味し、Ｎａ＋はＮａ＋のモル濃度を意味する。本例では、Ｃｔ＝０．５μＭ、［Ｎａ＋］＝５０ｍＭとして計算している。また、ΔＳ及びΔＨは表４で与えられる。
【表４】
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例えば、塩基配列“ＡＧＣＴＡＴＧＣ”のＴｍは、Ｎｅａｒｅｓｔ−Ｎｅｉｇｈｂｏｒ法で以下のように計算される。まずこの塩基配列を隣接２塩基ずつにすると、“ＡＧ”、“ＧＣ”、“ＣＴ”、“ＴＡ”、“ＡＴ”、“ＴＧ”及び“ＧＣ”となる。よって、ΔＨ及びΔＳは以下のように算出される。
ΔＨ＝−７．８−１１．１−７．８−６．０−８．６−５．８−１１．１＝−５８．２ｋｃａｌ／ｍｏｌ
ΔＳ＝−２０．８−２６．７−２０．８−１６．９−２３．９−１２．９−２６．７＝−１４８．７ｃａｌ／ｍｏｌ・ｋ
これを上記式に代入するとＴｍ＝９．８３℃となる。
このようにして、上記式及び表３から選択領域５のＴｍ値を算出することができる。そして、同じＧＣ含量である複数の選択領域５の全Ｔｍ値から平均値（中央値）を算出する。その後、各選択領域５のＴｍ値と当該平均値（中央値）とを比較し、各選択領域５のＴｍ値が平均値（中央値）よりも高い場合には調節領域６の長さを短く設計し、逆に低い場合には調節領域６の長さを長く設計する。より具体的に、表３に示した８塩基長からなる選択領域５に含まれるＧＣ含量と最適な調節領域６の長さとを関連付けたデータベースは、例えば、表５に示すようになる。
【表５】
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表５に示すデータベースを使用して調節領域の長さを設計することによって、選択領域５及び調節領域６からなる相補領域のＴｍ値を、複数の核酸プローブ２においてより近づけることができる。
以上のように、調節領域６の長さを設計することができる。例えば、選択領域５の長さが８塩基で、選択領域５の塩基配列として全ての組合せ（６５５３６通り）を設計した場合には、第１のリンカー１２として配列番号１における１〜２４番目の塩基配列、第２のリンカー１３として配列番号１における３３〜４５番目の塩基配列を例示することができる。
非相補領域４は、核酸ターゲット１０と相補鎖を形成しない塩基配列から構成される。非相補領域４の塩基配列としては、核酸ターゲット１０と相補鎖を形成しなければ特に限定されない。また、非相補領域４としては、ターゲットのリンカー配列と同一の塩基になるように非相補領域を設定すれば、最もハイブリッド鎖を形成しにくいので、より好ましい。
また、調節領域６の長さを設計する際には、先ず、核酸プローブ２における各選択領域５のＧＣ含量の偏りを評価する。具体的には、選択領域５の中央から３’末端側の領域におけるＧＣ含量と選択領域５の中央から５’末端側の領域におけるＧＣ含量とを比較して、２倍以上の差がある場合には、その選択領域５にはＧＣ含量の偏りがあると評価する。例えば、選択領域５の塩基配列が”ＧＣＧＣＡＴＡＴＡ”である場合、選択領域５の中央から３’末端側の領域におけるＧＣ含量が小さく、選択領域５の中央から５’末端側の領域におけるＧＣ含量が高くなっており、この選択領域５にＧＣ含量の偏りがあると評価する。
そして、ＧＣ含量に偏りがあると評価された選択領域５については、ＧＣ含量が高い側の調節領域６の長さを短くするように設計する。これによって、よりＧＣ含量のバランスを考えた精密なハイブリダイゼーションを行うことも可能である。
一方、上述したように設計された核酸プローブ２は、核酸合成装置によって化学的に合成することができる。核酸合成装置としては、ＤＮＡシンセサイザー、全自動核酸合成装置、核酸自動合成装置等と呼ばれる装置を使用することができる。核酸プローブ２を合成した後、いわゆるスポッター装置を用いて、基板１上に核酸プローブ２を固定化することができる。本発明に係る核酸マイクロアレイにおいては、基板１上への核酸プローブ２の固定化には何ら限定されないため、従来公知のスポッター装置いずれも使用することができる。ここで、核酸プローブの固定化密度は、スポッター装置の性能に依存して適宜調節することができる。例えば、１インチ×３インチ（２５ｍｍ×７５ｍｍ）のスライドガラス型の基板１上に数百万個のスポット３を配置することができる。
例えば、上述したように、選択領域５を８塩基長とした場合には６５５３６種類の核酸プローブ２を合成し、各核酸プローブ２に対して６５５３６個のスポット３が必要となる。１枚の基板１上にこれら全てのスポット３を形成できない場合には、複数枚の基板１を用いて全てのスポット３を形成すればよい。すなわち、選択領域５の全ての組合せは、複数の核酸マイクロアレイのうちいずれか１の核酸マイクロアレイに含まれていることとなる。この場合には、全てのスポット３が形成された複数の核酸マイクロアレイを核酸マイクロアレイセットとして、一連の遺伝子解析試験に使用することができる。
次に、上述した核酸マイクロアレイに使用される核酸ターゲットの調製方法について、図７に示すフローチャートを参照して説明する。また、核酸ターゲットの調製方法を図８−１及び図８−２に模式的に示す。
先ずステップ１（図７において「Ｓ１」と表記する。以下のステップも同様に表記する。）において、生体試料から解析対象を抽出する。
生体試料としては、例えば特定の疾患に罹患している患者から採取したヒト細胞、特定の条件下に置かれた生体由来の細胞、ゲノムのシーケンスが未知な生体由来の細胞、及び、これら細胞に対する対照となる細胞を挙げることができる。対象とする生物は真核生物のみならず原核生物も含めたすべての生物となる。生体試料としては、何ら限定されるものではない。
解析対象は生体試料に含まれる核酸である。これにはＤＮＡとＲＮＡが含まれる。ＤＮＡにはゲノムＤＮＡやミトコンドリアといった細胞小器官がもつＤＮＡ等が含まれ、何ら限定されるものではない。また、ＲＮＡにはｍＲＮＡやｔＲＮＡ、リボソームＲＮＡやｍｉＲＮＡ等がすべて含まれるものであり、機能上の分類には何ら制約されるものではない。
生体試料から解析対象を抽出する手法としては、何ら限定されず、公知の手法を使用することができる。例えば解析対象をｍＲＮＡとした場合、抽出方法としてはグアニジンー塩化セシウム超遠心法、ＡＧＰＣ法（Ａｃｉｄ  ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ法）、ＩＳＯＧＥＮ法（ＲＮＡ抽出用キット、ニッポンジーン社製）等を挙げることができる。ＲＮＡ試料にはリボソームＲＮＡが多量に含まれるが、これが解析対象でない場合には除去することが望ましい。この場合、生体試料が真核生物のものであればＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０（第一化学薬品社製）やＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５（ＤＹＮＡＬ社製）を使用したｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ精製法等を挙げることができる。生体試料が原核生物由来であれば、ＭＩＣＲＯＢＥｘｐｒｅｓｓ（Ａｍｂｉｏｎ社製）等を使用した精製法が挙げることができる。
なお、以下においては、一例として、生体試料が真核生物であり、解析対象をｍＲＮＡとする場合を説明する。しかしながら、本発明では、ＤＮＡや、ｍＲＮＡ以外のＲＮＡを含む核酸を解析対象とすることができる。特に、生体試料が原核生物である場合には、解析対象としてトータルＲＮＡを抽出することとなる。生体試料が原核生物である場合には、以下の説明においてｍＲＮＡがトータルＲＮＡとなる以外は、同様な工程を採ることができる。
次に、ステップ２において、抽出したｍＲＮＡを逆転写酵素にてｃＤＮＡにし、さらにＤＮＡポリメラーゼ等を用いて二本鎖のＤＮＡにする。この二本鎖ＤＮＡを第１の制限酵素で処理し、この断片の一方端部は制限酵素認識配列となる。ここで、ステップ１で抽出したｍＲＮＡの一方端部（例えば、３’末端側の端部）を、第１の制限酵素処理に先立って担体に付着させておくことが好ましいが、逆転写後のｃＤＮＡの一方端部（例えば、３’末端側の端部）あるいは二本鎖合成後のｃＤＮＡの一方端部（例えば、３’末端側の端部）、第一の制限酵素処理後の断片における一方端部（例えば、３’末端側の端部）を担体に付着させても今後の処理上、同様の効果を得ることができる。ステップ１で抽出した核酸の一方端部を担体に付着させておくことによって、その後の操作において、一方端部側の核酸断片を容易に分離することができる。担体としては、特に限定されないが、例えば、ストレプトアビジンビーズ、磁性ビーズ等を使用することができる。
ステップ２において使用する第１の制限酵素としては、４塩基を認識配列とする制限酵素を使用することが好ましい。４塩基を認識配列とする制限酵素は、認識配列の出現頻度が５塩基以上を認識とする制限酵素より高いため、より多くの種類の核酸ターゲットを準備することが可能となり、より詳細な遺伝子発現解析を行うことができる。第１の制限酵素としては、特に限定されないが、ＴａｑＩ（Ｔ↓ＣＧＡ）、ＮｌａＩＩＩ（ＣＡＴＧ↓）、ＭｂｏＩ（↓ＧＡＴＣ）、ＡｌｕＩ（ＡＧ↓ＣＴ）、ＲｓａＩ（ＧＴ↓ＡＣ）、ＭｓｅＩ（Ｔ↓ＴＡＡ）、ＭｓｐＩ（Ｃ↓ＣＧＧ）、ＡｃｉＩ（Ｃ↓ＣＧＣ）などがある。また、第１の制限酵素を複数種類用いても構わない。
また、望ましくはステップ２において、担体に付着したｍＲＮＡ断片を除くｍＲＮＡ断片を除去する。あるいは担体に付着した二本鎖合成後のｃＤＮＡ断片を除く、核酸の断片、例えば、第１の制限酵素による処理を行った後、担体を回収し、回収した担体を洗浄液で洗浄することによって、担体に付着した二本鎖合成後のｃＤＮＡ断片を除く、核酸の断片を除去することができる。
次に、ステップ３において、一方端部に第１の制限酵素認識配列を有するｃＤＮＡ断片に対して、第１のリンカー１２を結合（ライゲーション）する。ここで、第１のリンカー１２は、上述したように、一方端に第１の制限酵素認識配列、中途部にＴｙｐｅＩＩｓ制限酵素の認識配列を有するように設計した後、核酸合成装置によって合成して準備しておくことができる。本ステップ３によって、一方端部に第１のリンカー１２を結合したｃＤＮＡ断片が作製されることとなる。なお、ステップ２において担体を使用した場合には、ｍＲＮＡにおける担体を付着した端部とは反対側の端部に第１のリンカー１２を結合したｃＤＮＡ断片が作製されることとなる。
次に、ステップ４においては、ステップ３で作製した第１のリンカー１２を有するｃＤＮＡ断片を、ＴｙｐｅＩＩｓ制限酵素により切断する。第１のリンカー１２には所定の位置にＴｙｐｅＩＩｓ制限酵素の認識配列が存在するため、ＴｙｐｅＩＩｓ制限酵素で処理すると、生体試料由来のｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡが所定の位置で切断されることとなる。ここで、ＴｙｐｅＩＩｓ制限酵素とは、認識配列の外側の数塩基〜十数塩基の位置を切断する制限酵素であり、例えば、ＦｏｋＩ（ＧＧＡＴＧ  ９／１３）、ＭｂｏＩＩ（ＧＡＡＧＡ  ８／７）、ＢｓｍＦＩ（ＧＧＧＡＣ  １０／１４）などがある。また、同様に離れたところ切断するＴｙｐｅＩＩＧの制限酵素であるＭｍｅＩ（ＴＣＣＲＡＣ  ２０／１８）、ＢｓｇＩ（ＧＴＧＣＡＧ  １６／１４）なども使用することができる。認識部位から一定の長さ離れた箇所を切断できる制限酵素であれば、限定してものではない。
また、ステップ４では、第１のリンカー１２を有するｍＲＮＡ断片を除いて、担体に付着したｃＤＮＡを含むｃＤＮＡ断片を除去する。例えば、ＴｙｐｅＩＩｓ制限酵素処理を行った後の溶液から、担体を回収することによって、第１のリンカー１２を有するｃＤＮＡ断片以外のｃＤＮＡ断片を除去することができる。
さらに、ステップ４では、ＴｙｐｅＩＩｓ制限酵素により切断された部分が突出末端となる場合には平滑化処理を行う。平滑化処理としては、公知の手法を使用することができるが、例えば、３’末端の突出が生じる場合にはＫｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔを用いた平滑化処理、また５’末端の突出が生じる場合にはＴ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて突出部分を削ることで平滑化する方法を使用することができる。
次に、ステップ５において、平滑化した末端に対して第２のリンカー１３を結合（ライゲーション）する。ここで、第２のリンカー１３には、調節領域６に対応する塩基配列の他にプロモータ領域が結合していてもよい。プロモータ領域としては、特に限定されないが、Ｔ７ＲＮＡプロモータを使用することができる。このステップ５によって、第１のリンカー１２、生体試料由来のｃＤＮＡの一部（生体試料由来のユニーク配列１１）、第２のリンカー１３及びプロモータ領域を含む核酸断片を合成することができる。この核酸断片において、ユニーク配列１１は解析対象の細胞における遺伝子に由来する配列であり、第１のリンカー１２及び第２のリンカー１３はユニーク配列１１の種類に拘わらず共通する配列である。また、ユニーク配列１１は、解析対象の細胞における遺伝子の発現の有無及び／又は発現レベルを反映している。
次に、ステップ６では、第２のリンカー１３に結合したプロモータ領域を利用して、蛍光標識ＲＮＡ鎖を合成する。具体的には、ステップ５で得られた第１のリンカー１２、生体試料由来のユニーク配列１１及び第２のリンカー１３からなる核酸断片を鋳型とし、リボヌクレオチド、蛍光標識リボヌクレオチド及びＲＮＡポリメラーゼを含む溶液中でＲＮＡ鎖を合成（転写反応）する。これにより、ステップ５で得られた核酸断片の一方の差に相補的で、蛍光標識されたＲＮＡ鎖を得ることができる。すなわち、本ステップ６によって、第１のリンカー１２、ユニーク配列１１及び第２のリンカー１からなる核酸ターゲット１０が蛍光標識ＲＮＡ鎖として合成されることとなる。
ここで、蛍光標識ヌクレオチドとしては、一般的に使用されている、Ｃｙ３−ＵＴＰ或いはＣｙ５−ＵＴＰを使用することができる。例えば、Ｃｙ３−ＵＴＰを使用して解析対象の細胞由来の蛍光標識ＲＮＡ断片を合成し、Ｃｙ５−ＵＴＰを使用して対照となる細胞由来の蛍光標識ＲＮＡ断片を合成することもできる。ただし、蛍光はＣｙ３やＣｙ５に限定したものではなく、蛍光標識ヌクレオチドは、ＵＴＰだけではなく、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰでも構わない。あるいは複数種類の標識リボヌクレオチを用いても構わない。上述したように、核酸ターゲット１０を蛍光標識ＲＮＡ鎖とすることによって、収量の増加及びシグナルの改善を達成することができる。
または、蛍光標識リボヌクレオチドを用いずに未標識リボヌクレオチドまたはビオチン標識、アミノアリル標識リボヌクレチドを用いてＲＮＡを合成し、合成後に化学反応、酵素反応等によって蛍光を標識し核酸ターゲットとしてもよい。Ｌａｂｅｌ  ｉｔＴＭなどの核酸標識キットを使えば可能である。
以上で説明した核酸ターゲット１０の調製方法では、ステップ６において合成した蛍光標識ＲＮＡ鎖を核酸ターゲット１０とする例である。しかしながら、ステップ６において蛍光標識ＤＮＡ鎖を合成して、得られた蛍光標識ＤＮＡ鎖を核酸ターゲット１０としてもよい。
また、ステップ５において得られた核酸断片のうち一方の鎖を核酸ターゲット１０として使用することもできる。この場合、予め蛍光標識ヌクレオチドを含有するように第１のリンカー１２及び／又は第２のリンカー１３を調製しておく。そして、ステップ５で得られた核酸断片を熱処理によって一本鎖とし、得られた一本鎖の核酸断片を核酸ターゲット１０として使用することができる。
一方、本発明に係る遺伝子検出方法は、核酸ターゲット１０を含む溶液を、核酸プローブ２を有する核酸マイクロアレイに対して接触させる工程と、その後、核酸マイクロアレイの核酸プローブ２にハイブリダイズした核酸ターゲット１０を検出する工程とを含む。ここで遺伝子検出方法とは、遺伝子の発現の有無を検出する方法、遺伝子の発現レベルを解析する方法、遺伝子の発現変化を解析する方法等を含む包括的な意味である。また、遺伝子としては、機能及び／又は塩基配列が既知の遺伝子に限定されず、機能及び／又は塩基配列が未知の遺伝子を含む意味である。
また、本遺伝子検出方法は、如何なる生物由来の遺伝子を検出対象とすることができる。言い換えると、遺伝子検出方法においては、上述した核酸マイクロアレイを用いることによって、生物種を何ら限定することなく、如何なる生物由来の遺伝子を検出対象とすることができる。
本発明に係る遺伝子検出方法では、例えば、ある生物種の２つの状態における遺伝子の発現レベルを比較するといった遺伝子発現解析を行うことができる。生物種の２つの状態としては、例えば、ヒト健常者と及び所定の疾患を患った患者、癌細胞及び正常細胞、所定の条件下にある細胞及び当該条件下にない細胞等を挙げることができる。
具体的には、各状態にある生物種から核酸ターゲット１０をそれぞれ、上述したように調製する。このとき、各核酸ターゲット１０は、互いに異なる蛍光標識、例えばＣｙ３及びＣｙ５をそれぞれ有するように調製される。そして、これら２種類の核酸ターゲット１０を含む溶液を核酸マイクロアレイに接触させて、核酸プローブ２に対して２種類の核酸ターゲット２がいわゆる競合的ハイブリダイゼーションする条件下におく。
特に、本発明に係る核酸マイクロアレイにおいては、核酸ターゲット１０とハイブリダイズする核酸プローブ２の相補領域７のＴｍ値が、複数の核酸プローブ２において近くなるように構成されている。したがって、核酸プローブ２に対して２種類の核酸ターゲット２をハイブリダズする際に、クロスハイブリダイゼーションを確実に防止することができる。これにより、本遺伝子検出方法によれば、生物種の２つの状態における遺伝子の発現レベルを正確に比較することができる。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】  本実施例では、全酵母遺伝子のゲノムデータベースから全ＯＲＦ（オープン・リーディング・フレーム）に関してユニーク配列を検索し、当該ユニーク配列と相補的な塩基配列からなる選択領域を有する核酸プローブを設計した。本実施例では、作製した核酸マイクロアレイを用いて、酵母におけるエタノールストレス下での遺伝子発現解析を行った。
先ず、酵母の全てのＯＲＦデータベースから、ＯＲＦ内に存在する制限酵素ＴａｑＩの認識配列（ＴＣＧＡ）の中で最も３’側にある認識配列の場所、その場所から３’側の８塩基（認識部位を含むと１２塩基、ユニーク配列に相当する）を、コンピューターを用いて集計し、酵母のユニーク配列データベースを作成した。すなわち、酵母のユニーク配列データベースには、制限酵素ＴａｑＩの認識配列（ＴＣＧＡ）と、当該認識配列に続く８塩基とからなる、計１２塩基のユニーク配列が含まれている。
また、ＯＲＦ内にＴａｑＩ認識配列がない遺伝子については、３’ＵＴＲ（ＯＲＦの３’側の非翻訳領域）２００ｂｐ以内にＴａｑＩ認識配列があるものについてはこれらもタグとして、ユニーク配列データーベースに格納した。ユニーク配列の集計は、独自にプログラミングしたユニーク配列設計プログラミングである。このプログラミングは、指定した制眼酵素（今回はＴａｑＩ）をもとにＯＲＦの塩基配列を切断し、ＯＲＦ内の認識配列のうち最も３’側に位置する認識配列を検索し、検索された認識配列から所定の塩基数（今回は８塩基）を塩基配列から抜き出し、データとして格納する基本プログミグからなり、一度に数万個の配列を処理が可能で、得られたデータを市販のデータベースソフトで処理を行った。ＯＲＦ内にＴａｑＩ認識部位がない９１０遺伝子のうち、３５５遺伝子については３‘ＵＴＲの２００ｂｐ以内にＴａｑＩ認識部位があり、これらがタグである可能性もあることから、今回のチップに加えることとした。実際には、タグ配列に重複があるため、今回のチップには、５３３５種類のタグ配列（６１２０遺伝子に相当）を配置した。
次に、ユニーク配列データーベースから、独自に作成したプローブ設計プログラミングによってプローブの設計を行った。このプログラミングはユニーク配列から、配列中のＧＣ含量を計算し、ＧＣ含量ごとに、表３に従いユニーク配列ごとに調節領域の長さを決定すると同時に非調節領域の長さ、全体の配列の設計、調節領域＋ユニーク配列のＴｍ値の計算も同時に設計する。これをもとにプローブ配列データベースを作成した。
次に、プローブ配列データベースの配列全てを核酸自動合成機にて合成オリゴヌクレオチドを作成し、これらの全てを１枚のスライドグラス上にスポットした。スポットの方法は、アジレント社によるインクジェット方式にて行った。
一方、核酸ターゲットを調製するため、酵母は何も刺激を与えないコントロール酵母とエタノールストレス酵母を用いた。エタノールストレスは対数増幅期にある酵母をエタノール濃度７％下で３０分曝露する条件を加えた。各々の酵母を遠心分離し回収し、ホットフェノール法にてＲＮＡを分離した。得られたＲＮＡをオリゴｄＴダイナビーズにてｍＲＮＡを回収した後、クロンテック社のｓｍａｒｔ  ｃＤＮＡ合成キットにて３’ビオチン化ｃＤＮＡの合成を行い、制限酵素ＴａｑＩで切断を行った。切断後ストレプトアビジン磁気ビーズを加え、３’ビオチン化断片を回収した。第１のリンカーをライゲーションし、ＴｙｐｅＩＩｓ制限酵素ＦｏｋＩにて処理し、第１のリンカーとｍＲＮＡ由来の配列（ユニーク配列）を含む断片が得られ、その断片を平滑末端化した後、第２のリンカーをライゲーションする。第１のリンカーと第２のリンカーをライゲーションした産物（タグ）をリンカー上に配置したプライマーを用いたＰＣＲ反応にて増幅し、ポリアクリルアミドゲルに電気泳動し、タグのサイズの確認及びタグに相当するバンドを切り出し、精製を行う。次に、この精製した断片を鋳型にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ反応を行う。この反応はａｍｂｉｏｎ社のＲＮＡ合成キット（ＭｅｇａｓｃｒｉｐｔＴＭ）を用いて行った。合成時に、Ｃｙ３及びＣｙ５標識ＵＴＰを未標識ＵＴＰの１／３モル量加えること蛍光標識を行った。合成した蛍光標識ＲＮＡは、カラムを用いて精製し、チップへのハイブリダイゼーションに用いた。
次に、作成した蛍光標識ＲＮＡの濃度を測定し、それぞれ１ｎｍｏｌを５０μｌのハイブリダイゼーションバッファーに溶解した。ハイブリダイゼーションのバッファーは最終濃度が、６ｘＳＳＣ、５０％ホルムアミドの濃度からなる。７０度で５分熱変性後、室温になったのち、ＤＮＡチップ上に５０μｌのこの蛍光標識ＲＮＡ溶液を加え、カバーグラスをかけた。密封できるハイブリダイゼーションチャンバー内にＤＮＡチップを静置し、２５度、１６時間、ハイブリダイゼーションを行った。１６時間後、ＤＮＡチップを２ｘＳＳＣ＋０．２％ＳＤＳ溶液、室温、洗浄１５分、次いで０．２ｘＳＳＣ＋０．２％ＳＤＳ溶液、室温、洗浄１５分、次いで０．２ｘＳＳＣ＋０．２％ＳＤＳ溶液、３７度、洗浄１５分、次いで、０．２ｘＳＳＣ、室温、洗浄４分行った。ＤＮＡチップを遠心し、水分を飛ばして乾燥後、フジフィルムのＤＮＡチップスキャナーで観察を行った。
次に、フジフィルムのＤＮＡチップスキャナーにてチップのスキャンを行った。取り込んだ画像は、１６ビットのＴＩＦＦ画像に変換し、ＤＮＡチップ解析ソフトにて、シグナルの数値化を行った。ＤＮＡチップ解析ソフトは米国スタンフォード大学のＭｉｃｈａｅｌ  Ｅｉｓｅｎの開発したＳｃａｎ  Ａｌｙｚｅを用いた。得られたデータは標準化を行いｔｏｔａｌ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ法にて行った。Ｔｏｔａｌ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ法は、比較対象となる２群間の遺伝子について、半分が発現上昇し、半分が発現低下すると仮定して標準化を行う。標準化を行った後、コントロール群とエタノールストレス群とで、シグナルの比をもって、遺伝子発現の比とした。３倍以上遺伝子が変動したものを変動していると評価した。（図９Ａ、Ｂ及びＣに結果を示す。）
その結果、エタノールストレスに応答して発現が特異的に変化する約２００個の遺伝子を同定することができた。エタノールストレスに応答して発現が特異的に上昇した遺伝子のなかでこれまでの報告と合致した遺伝子を表６に示す。
【表６】
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エタノールストレスに応答して発現が特異的に低下した遺伝子のなかでこれまでの報告と合致した遺伝子を表７に示す。
【表７】
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また、これまで報告されたエタノールストレス応答性遺伝子とは合致しなかったが、エタノールストレスに対して発現量が有意に変化した遺伝子のユニーク配列を表８に示す。
【表８】
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表８に示したユニーク配列を有する遺伝子は、エタノールストレス応答性遺伝子としては報告されていないが、新規なエタノールストレス応答性遺伝子の候補となりうる。表８に示したユニーク配列をプローブとして、当該ユニーク配列を有する遺伝子を同定することができる。同定した遺伝子は、遺伝子の機能解析実験に供されることで、その機能を詳細に解析することができる。
【実施例２】  本実施例では、８塩基長の選択領域を有する核酸プローブを、全ての組合せについて設計し、６５５３６種類の核酸プローブを固定した核酸マイクロアレイを作製した。
プローブの設計
４８種類（６５５３６種類）のユニーク配列をコンピューター用いて準備し、各ユニーク配列ごとにＧＣ含量を計算し、表３に従い、調節領域の長さ（リンカー長）、非調節領域の長さを決定し、プローブの配列を設計した。これらはすべて独自に設計したプログミングに基づくプローブ設計ソフトを用いて行った。プローブ設計時に各配列のＴｍ値も計算した。
チップの設計
Ｔｍ値が小さい順に、チップ上に配置するように設計した。今回のチップは１枚に２２０００スポットしか配置できないため、３枚のチップを用い、Ｔｍ値の順に配置した。これらの配置に関するプログラムも設計し、チップ上のユニーク配列とスポットの場所（座標）、対象としている生物（今回の実験では酵母）のユニーク配列、遺伝子、機能などの情報を有機的に結びつけるデータベースも同時に作成した。
酵母からのターゲット作成
酵母は何も刺激を与えないコントロール酵母とエタノールストレス酵母を用いた。
エタノールストレスは対数増幅期にある酵母をエタノール濃度７％下で３０分曝露する条件を加えた。各々の酵母を遠心分離し回収し、ホットフェノール法にてＲＮＡを分離した。得られたＲＮＡをオリゴｄＴダイナビーズにてｍＲＮＡを回収した後、クロンテック社のｓｍａｒｔ  ｃＤＮＡ合成キットにて３’ビオチン化ｃＤＮＡの合成を行い、制限酵素ＴａｑＩで切断を行った。切断後ストレプトアビジン磁気ビーズを加え、３’ビオチン化断片を回収した。第一リンカーをライゲーションし、ＴｙｐｅＩＩｓ制限酵素ＦｏｋＩにて処理し、第１のリンカーとｍＲＮＡ由来の配列（ユニーク配列）を含む断片が得られ、その断片を平滑末端化した後、第２のリンカーをライゲーションした。第１のリンカーと第２のリンカーをライゲーションした産物（タグ）をリンカー上に配置したプライマーを用いたＰＣＲ反応にて増幅し、ポリアクリルアミドゲルに電気泳動し、タグのサイズの確認及びタグに相当するバンドを切り出し、精製を行った。
次に、この精製した断片を鋳型にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ反応を行う。この反応はａｍｂｉｏｎ社のＲＮＡ合成キット（ＭｅｇａｓｃｒｉｐｔＴＭ）を用いて行った。合成時に、Ｃｙ３及びＣｙ５標識ＵＴＰを未標識ＵＴＰの１／３モル量加えることで蛍光標識を行った。合成した蛍光標識ＲＮＡは、カラムを用いて精製し、チップへのハイブリダイゼーションに用いた。
チップを用いたハイブリ実験の手順
作成した蛍光標識ＲＮＡの濃度を測定し、それぞれ１ｎｍｏｌを５０μｌのハイブリダイゼーションバッファーに溶解した。ハイブリダイゼーションのバッファーは最終濃度が、６ｘＳＳＣ、５０％ホルムアミドの濃度からなる。７０度で５分熱変性後、室温になったのち、ＤＮＡチップ上に５０μｌのこの蛍光標識ＲＮＡ溶液を加え、カバーグラスをかけた。密封できるハイブリダイゼーションチャンバー内にＤＮＡチップを静置し、２５度、１６時間、ハイブリダイゼーションを行う。１６時間後、ＤＮＡチップを２ｘＳＳＣ＋０．２％ＳＤＳ溶液、室温、洗浄１５分、次いで０．２ｘＳＳＣ＋０．２％ＳＤＳ溶液、室温、洗浄１５分、次いで０．２ｘＳＳＣ＋０．２％ＳＤＳ溶液、３７度、洗浄１５分、次いで、０．２ｘＳＳＣ、室温、洗浄４分行った。ＤＮＡチップを遠心し、水分を飛ばして乾燥後、フジフィルムのＤＮＡチップスキャナーで観察を行った。
シグナルの検出、基準の設定と検出結果の評価
フジフィルムのＤＮＡチップスキャナーにてチップのスキャンを行った。取り込んだ画像は、１６ビットのＴＩＦＦ画像に変換し、ＤＮＡチップ解析ソフトにて、シグナルの数値化を行った。ＤＮＡチップ解析ソフトは米国スタンフォード大学のＭｉｃｈａｅｌ  Ｅｉｓｅｎの開発したＳｃａｎ  Ａｌｙｚｅを用いた。得られたデータは標準化を行いｔｏｔａｌ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ法にて行った。Ｔｏｔａｌ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ法は、比較対象となる２群間の遺伝子について、半分が発現上昇し、半分が発現低下すると仮定して標準化を行う。標準化を行った後、コントロール群とエタノールストレス群とで、シグナルの比をもって、遺伝子発現の比とした。３倍以上遺伝子が変動したものを変動していると評価した。遺伝子の同定は、チップ設計時に作成したデータベースを用いて行った。（図１０Ａ、Ｂ及びＣに結果を示す。）
【産業上の利用可能性】  本発明に係る核酸マイクロアレイでは、クロスハイブリダイゼーションを確実に防止することができ、優れた検出感度を達成することができる。また、本発明に係る核酸プローブの設計方法では、検出感度に優れた核酸マイクロアレイに固定化することができる、クロスハイブリダイゼーションを確実に防止できる核酸プローブを設計することができる。さらに、本発明に係る遺伝子検出方法では、クロスハイブリダイゼーションを確実に防止でき、優れた検出感度で遺伝子を検出することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年7月24日(2006.7.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】請求の範囲
【請求項１】  基板と、
ハイブリダイズに寄与しない塩基配列からなる非相補領域と、ハイブリダイズに寄与する塩基配列からなり、検出対象の核酸ターゲット群のうち特定の核酸ターゲットに対して特異的にハイブリダイズする選択領域及び検出対象の核酸ターゲットが共通して有するリンカー配列の全部または一部に対して相補的な調節領域からなる相補領域とを含み、上記基板上に固定された複数の核酸プローブとを備え、
上記調節領域の長さは、上記複数の核酸プローブにおける相補領域のＴｍ値を近づけるように設計されたことを特徴とする核酸マイクロアレイ。
【請求項２】  上記選択領域がｎ個の塩基からなり、アデニン、グアニン、チミン及びシトシンの全ての組合せに相当する４ｎ種類の選択領域を有することを特徴とする請求項１記載の核酸マイクロアレイ。
【請求項３】  上記核酸プローブは、上記調節領域が上記選択領域を挟み込み、上記非相補領域が上記相補領域を挟み込むように構成されたことを特徴とする請求項１記載の核酸マイクロアレイ。
【請求項４】  上記選択領域の３’末端側に位置する調節領域の長さと、上記選択領域の５’末端側に位置する調節領域の長さとが異なることを特徴とする請求項３記載の核酸マイクロアレイ。
【請求項５】  上記複数の核酸プローブは全て同じ長さであることを特徴とする請求項１記載の核酸マイクロアレイ。
【請求項６】  上記リンカー配列は配列番号１記載の塩基配列における２５〜３２番目の領域を除く塩基配列であることを特徴とする請求項１記載の核酸マイクロアレイ。
【請求項７】  請求項１、３、４、５及び６のいずれか一項記載のＤＮＡチップにおける選択領域がｎ個の塩基からなり、アデニン、グアニン、チミン及びシトシンの全ての組合せに相当する４ｎ種類の選択領域の一部を有する、複数の核酸マイクロアレイから構成され、
上記４ｎ種類の選択領域は、上記複数の核酸マイクロアレイのうちいずれか１の核酸マイクロアレイに含まれていること特徴とする核酸マイクロアレイセット。
【請求項８】  生体試料由来のユニーク配列と、他の核酸ターゲットと共通するリンカー配列とを含む核酸ターゲットに対してハイブリダイズする核酸プローブであって、ハイブリダイズに寄与しない塩基配列からなる非相補領域と、ハイブリダイズに寄与する塩基配列からなり、上記ユニーク配列に特異的にハイブリダイズする選択領域及び上記リンカー配列の全部または一部に対して相補的な調節領域からなる相補領域とを含む核酸プローブを設計する方法であって、
複数の核酸プローブにおける上記選択領域の塩基配列を、各核酸プローブにおける選択領域が異なる塩基配列を有するように設計する工程と、
上記調節領域の長さは上記相補領域のＴｍ値に依存して異なり、一対の相補領域のＴｍ値を比較したときにＴｍ値が高い方の相補領域に含まれる調節領域は、Ｔｍ値が低い方の相補領域に含まれる調節領域よりも長くなるように上記調節領域の長さを設計する工程とを含む核酸プローブの設計方法。
【請求項９】  上記選択領域の塩基配列を設計する工程では、ｎ個の塩基からなる選択領域に対して、アデニン、グアニン、チミン及びシトシンの全ての組合せに相当する４ｎ種類の塩基配列を設計することを特徴とする請求項８記載の核酸プローブの設計方法。
【請求項１０】  上記調節領域の長さを設計する工程は、複数の核酸プローブにおける各選択領域のグアニン及びシトシン含量（ＧＣ含量）を算出する工程を含み、一対の選択領域についてＧＣ含量を比較したときにＧＣ含量が高い方の選択領域については調節領域の長さを短く設計し、ＧＣ含量が低い方の選択領域については調節領域の長さを長く設計することを特徴とする請求項８記載の核酸プローブの設計方法。
【請求項１１】  上記調節領域の長さを設計する工程は、上記ＧＣ含量を算出する工程の後、算出したＧＣ含量が同じである複数の選択領域の全てについてＴｍ値を算出し、Ｔｍ値の平均値よりも高いＴｍ値を示す選択領域については調節領域の長さを短く設計し、Ｔｍ値の平均値よりも低いＴｍ値を示す選択領域については調節領域の長さを長く設計することを特徴とする請求項１０記載の核酸プローブの設計方法。
【請求項１２】  上記調節領域の長さを設計する工程は、複数の核酸プローブにおける各選択領域のグアニン及びシトシン含量（ＧＣ含量）の偏りを評価する工程を含み、選択領域のＧＣ含量に偏りがある場合には、当該選択領域の３’末端側に設計する調節領域の長さと、当該選択領域の５’末端側に設計する調節領域の長さとを異ならせるように設計することを特徴とする請求項８記載の核酸プローブの設計方法。
【請求項１３】（削除）
【請求項１４】（削除）
【請求項１５】（削除）
【請求項１６】（削除）
【請求項１７】  生体試料由来のユニーク配列と、他の核酸ターゲットと共通するリンカー配列とを含む核酸ターゲットを含む溶液を、ハイブリダイズに寄与しない塩基配列からなる非相補領域と、ハイブリダイズに寄与する塩基配列からなり、上記ユニーク配列に特異的にハイブリダイズする選択領域及び上記リンカー配列の全部または一部に対して相補的な調節領域からなる相補領域とを含む核酸プローブを基板上に固定してなる核酸マイクロアレイに対して接触させる工程と、
上記核酸マイクロアレイの核酸プローブにハイブリダイズした核酸ターゲットを検出する工程とを含む遺伝子検出方法。
【請求項１８】  上記選択領域がｎ個の塩基からなり、アデニン、グアニン、チミン及びシトシンの全ての組合せに相当する４ｎ種類の選択領域を有することを特徴とする請求項１７記載の遺伝子検出方法。
【請求項１９】  上記核酸プローブは、上記調節領域が上記選択領域を挟み込み、上記非相補領域が上記相補領域を挟み込むように構成されたことを特徴とする請求項１７記載の遺伝子検出方法。
【請求項２０】  上記複数の核酸プローブは全て同じ長さであることを特徴とする請求項１７記載の遺伝子検出方法。
【請求項２１】  上記リンカー配列は配列番号１記載の塩基配列における２５〜３２番目の領域を除く塩基配列であることを特徴とする請求項１７記載の遺伝子検出方法。
【国際調査報告】
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