(57)【要約】  本発明は、工業的バイオプロセシング、より具体的には溶剤生産における、シュードモナス種ＮＤ１３７のセルラーゼ、その機能的断片及び／又は変異体及び改変形態の適用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロースを含む物質から溶剤、燃料又は化学中間物を生産する方法であって、
ａ）組み換え宿主細胞において、シュードモナス種ＮＤ１３７のＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体、又は前記ＡＣＬＡポリペプチド若しくは前記相同体の機能的断片及び／又は変異体を発現させること、並びに
ｂ）前記物質を前記ＡＣＬＡポリペプチドと接触させること、
を含む、方法。
【請求項２】
前記組み換え宿主細胞から前記ＡＣＬＡ酵素又は活性断片を分離する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
シュードモナス種ＮＤ１３７のＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体、又は前記ＡＣＬＡポリペプチド若しくは前記相同体の機能的断片及び／又は変異体を発現する組み換え微生物であって、セルロースを分解することが可能である、組み換え微生物。
【請求項４】
溶剤生産微生物である、請求項３に記載の組み換え微生物。
【請求項５】
エタノール生産微生物である、請求項４に記載の組み換え溶剤生産微生物。
【請求項６】
溶剤生産細菌である、請求項４又は５に記載の組み換え溶剤生産微生物。
【請求項７】
クロストリジウム・アセトブチリカムである、請求項６に記載の組み換え溶剤生産細菌。
【請求項８】
前記物質を、請求項３〜７のいずれか一項に記載の組み換え微生物と接触させることを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９】
セルロースを含む物質を分解する方法であって、前記物質を、請求項３〜７のいずれか一項に記載の組み換え微生物と接触させることを含む、方法。
【請求項１０】
前記物質が結晶性セルロースを含んでいるか、又はそれについて濃縮されている、請求項１、２、８又は９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）シュードモナス種ＮＤ１３７のＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体、又は前記ＡＣＬＡポリペプチド若しくは前記相同体の機能的断片及び／又は変異体、並びに
（ｂ）前記ＡＣＬＡポリペプチド以外の１つ又は複数のさらなる外来セルロース分解酵素、
を発現する組み換え微生物。
【請求項１２】
シュードモナス種ＮＤ１３７のＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体、又は前記ＡＣＬＡポリペプチド若しくは前記相同体の機能的断片及び／又は変異体、並びに前記ＡＣＬＡポリペプチド以外の１つ又は複数のセルロース分解酵素を含む酵素混合物。
【請求項１３】
セルロースを含む物質からの溶剤、燃料又は化学中間物の生産に対する、
（ｉ）シュードモナス種ＮＤ１３７のＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体、又は前記ＡＣＬＡポリペプチド若しくは前記相同体の機能的断片及び／又は変異体、
（ｉｉ）シュードモナス種ＮＤ１３７のＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体、又は前記ＡＣＬＡポリペプチド若しくは前記相同体の機能的断片及び／又は変異体をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）シュードモナス種ＮＤ１３７のＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体、又は前記ＡＣＬＡポリペプチド若しくは前記相同体の機能的断片及び／又は変異体をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターであって、前記核酸配列が宿主細胞中での発現を可能にする調節配列に操作可能に結合する、発現ベクター、
（ｉｖ）シュードモナス種ＮＤ１３７のＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体、又は前記ＡＣＬＡポリペプチド若しくは前記相同体の機能的断片及び／又は変異体を発現する宿主細胞、
（ｖ）シュードモナス種ＮＤ１３７のＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体、又は前記ＡＣＬＡポリペプチド若しくは前記相同体の機能的断片及び／又は変異体をコードするヌクレオチド配列によって形質転換した宿主細胞、又は
（ｖｉ）請求項３〜７及び１１のいずれか一項に記載の組み換え微生物、
の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジー及び遺伝子工学の分野に関し、特に好適な酵素物質（enzymatic agents）及びそれを発現する微生物を用いて、セルロース系材料及びリグノセルロース系材料を利用する戦略に関する。より具体的には、本発明はセルロース分解ポリペプチドの適用、及び溶剤生産においてそれを直接、又は溶剤生産微生物で発現させて使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロース系材料及びリグノセルロース系材料は植物バイオマスの主成分であり、その中に見られるセルロースポリマーはエタノール、アセトン又はブタノール等の溶剤の生産において使用されるグルコース又は他の発酵性単糖類及びオリゴ糖類の重要な供給源をもたらすことができる。
【０００３】
セルロースポリマーは、一般にセルロース分解酵素又はセルラーゼとして知られるセルロース脱重合酵素によって加水分解することができる。例えば、天然セルロースの加水分解は主に以下の４つのセルラーゼ型が関与する：セロビオヒドロラーゼ（１，４−β−Ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼ、ＥＣ  ３．２．１．９１）、エンド−β−１，４−グルカナーゼ（エンド−１，４−β−Ｄ−グルカン４−グルカノヒドロラーゼ、ＥＣ  ３．２．１．４）、エンド−プロセッシブ（endo-processive）セルラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４．／３．２．１．９１）及びβ−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２１）。セルラーゼ及び関連酵素は、食品産業、ビール産業、ワイン産業、動物飼料産業、織物の生産及び洗浄産業、紙パルプ工業、農産業等を含む様々なバイオテクノロジーの分野で広く利用されている（概要については、非特許文献１を参照されたい）。
【０００４】
セルラーゼは、その特性の点で異なる場合がある（例えば特に、エンドグルカナーゼとして働く場合も又はプロセッシブエキソグルカナーゼとして働く場合もあり、様々な長さのモノマー又はオリゴマーを生成することがあり、結晶性セルロース、半結晶性セルロース、非結晶性セルロース又はヘミセルロース等といった異なるセルロース形態を加水分解する点で様々な（contrasting）能力を有することがあり、さらに異なる強さのセルロース基質への結合、異なる動態パラメータ等を示すことがある）。したがって、強力な酵素を同定し、酵素の組み合わせを最適化するために、さらなるセルラーゼのさらなる特性決定に対する変わらぬ必要性がある。
【０００５】
溶剤生産微生物中でのセルラーゼの組み換え発現により、有用な溶剤、特にエタノールをこれらの微生物によってセルロース含有材料から直接生産することが可能となる。これまでは、主にセルロース分解クロストリジウム種に由来する酵素がこの目的で使用されてきた。しかしながら、依然としてより強力な酵素活性を有する酵素を同定する必要性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Bhat 2000. Biotechnical Advances 18: 355-383
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らは、以前にクロストリジウム・セルロリティカム（Clostridium cellulolyticum）又はクロストリジウム・テルモセルム（Clostridium thermocellum）から同定されたもののような他の細菌セルラーゼ酵素と比べて上昇した活性を有するために、溶剤、燃料及び化学中間物の工業的生産（industrial s production）において使用するのに特に好適な酵素としてセルロース分解酵素（本明細書中で「ＡＣＬＡ」と称される）を同定した。
【０００８】
したがって、ＡＣＬＡは、発酵性糖を、より具体的には溶剤を生産する（溶剤生産）微生物中で生産することを目的として、セルロースのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分解及び微生物中での異種生産（heterologous production）において直接使用するのに有益である。
【０００９】
一態様では、本発明はセルロース分解、特に発酵性糖の工業的生成、より具体的には溶剤生産におけるＡＣＬＡポリペプチド又はその機能的断片、相同体若しくは変異体の使用を提供する。具体的には、本発明はセルロースを含む物質、例えばリグノセルロース系材料若しくはセルロース系材料又はバイオマスを分解する方法であって、物質をＡＣＬＡポリペプチド又はその機能的断片、相同体若しくは変異体、又は本明細書中で教示されるようなＡＣＬＡ又はその機能的断片、相同体若しくは変異体を発現する組み換え微生物と接触させることを含む、方法を提供する。特定の実施の形態では、該物質は結晶性セルロースを含んでいるか、又はそれについて濃縮されている。
【００１０】
したがって、本発明は、本発明によるセルロースを含む物質を分解する方法を適用すること、すなわち上記物質を本明細書中で教示されるようなＡＣＬＡ、又はＡＣＬＡポリペプチドの機能的断片、相同体、変異体を発現する組み換え微生物、及び／又はＡＣＬＡ、又はＡＣＬＡポリペプチドの機能的断片、相同体、変異体と接触させることを含む、セルロースを含む物質から溶剤、燃料又は化学中間物を生産する方法を提供する。特定の実施の形態では、該物質は結晶性セルロースを含んでいるか、又はそれについて濃縮されている。本発明の特定の実施の形態は、セルロースを含む物質から溶剤、燃料又は化学中間物を生産する方法であって、
ａ）組み換え宿主細胞において、シュードモナス種ＮＤ１３７のＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体、又は上記ＡＣＬＡポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体を発現させること、並びに
ｂ）上記物質を上記ＡＣＬＡポリペプチドと接触させること、
を含む、方法を提供する。
【００１１】
さらなる特定の実施の形態では、上記方法は、組み換え宿主細胞からＡＣＬＡ酵素又は活性断片を分離する工程をさらに含み得る。
【００１２】
本発明者らは、ＡＣＬＡがセルロース含有材料（リグノセルロース系バイオマスを含む）の工業的分解に特に好適であることを見出した。したがって、本発明は同時糖化発酵（ＳＳＦ）又は逐次（分離）加水分解発酵（ＳＨＦ）におけるＡＣＬＡの使用を提供する。かかる方法は、管理条件下でのセルロース含有材料のバッチ分解を含む。
【００１３】
したがって、本発明の一態様はＡＣＬＡポリペプチド、ＡＣＬＡポリペプチドの機能的断片、相同体又は変異体を発現する、セルロースを発酵性糖へと分解することが可能な微生物を提供する。すなわち酵素は、それが接触するセルロース含有材料を分解することができるように微生物によって分泌される。かかる微生物は、本明細書中で記載されるような溶剤、燃料及び化学中間物を生産する工業的方法において有用である。
【００１４】
また、ポリペプチドを細胞内で発現させる実施の形態も企図される。例えば、本発明はＡＣＬＡポリペプチドを、それが微生物によって取り込まれたセルロースポリマーに作用するように発現する微生物を提供する。或いは、ＡＣＬＡポリペプチドが、それを発現する微生物の少なくとも一部分の溶解の際に放出されることが想定される。
【００１５】
特定の実施の形態では、本発明によるセルロースを含む物質から溶剤、燃料又は化学中間物を生産する方法は、本明細書中で記載されるような組み換え微生物を、結晶性セルロース、半結晶性セルロース若しくは非結晶性セルロースを含んでいるか、又はそれについて濃縮されているセルロース基質上で増殖させることを含み、それにより化学物質、化学中間物、燃料又は溶剤（エタノール等）の生産において使用することのできる、セルロース含有基質からの発酵性糖の直接生産が確実となる。
【００１６】
本発明のさらなる態様は、シュードモナス種ＮＤ１３７株の単離ＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体、又はＡＣＬＡポリペプチド若しくは相同体の機能的断片及び／又は変異体、並びにセルロースの工業的分解におけるそれらの使用を提供する。より具体的には、ＡＣＬＡポリペプチドは、本明細書中で提示される配列によって特徴付けられる。
【００１７】
本発明のまたさらなる態様は、統合（consolidated）バイオプロセシングに使用することのできる、すなわちセルロース材料の分解産物を溶剤、燃料又は化学中間物等の工業製品に直接変換することが可能である、ＡＣＬＡポリペプチド、その機能的断片、相同体若しくは変異体を発現する組み換え微生物を提供する。かかる微生物は、ＡＣＬＡポリペプチド、その機能的断片、相同体又は変異体をコードする遺伝子に加えて、燃料、溶剤又は他の化学物質若しくは化学中間物の生産を確実にする他の導入遺伝子を含有していてもよい。
【００１８】
本発明の特定の実施の形態によると、組み換え微生物は、微生物による発現を可能とする調節配列及び／又は微生物による分泌を可能とする分泌シグナル配列に操作可能に結合した、ＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体をコードするか、又はＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体の機能的断片及び／又は変異体をコードする組み換え核酸分子を含み、発酵性糖からの対象となる製品の生産に関与する１つ又は複数の組み換え核酸分子を含有する。
【００１９】
特定の実施の形態では、本発明は、シュードモナス種ＮＤ１３７のＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体、又は上記ＡＣＬＡポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体を発現する溶剤生産微生物を提供する。
【００２０】
組み換え溶剤生産微生物は、上記微生物中での発現を可能とする調節配列に操作可能に結合した、ＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体をコードするか、又は上記ＡＣＬＡポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体をコードする組み換え核酸分子を含み得る。
【００２１】
特定の実施の形態では、組み換え溶剤生産微生物はエタノール、アセトン、ブタノール、プロピオン酸、酪酸、エーテル及びグリセリンから選択される１つ又は複数の溶剤を生産し得る。
【００２２】
さらなる実施の形態では、組み換え溶剤生産微生物は、少なくとも又は主にエタノールを生産するものであっても、又は生産するように改変されていてもよい。エタノールの工業的重要性は、主に環境的に許容可能な燃料としてのその有用性のために急増している。したがって、一実施の形態では、組み換え溶剤生産微生物はエタノール生産微生物であり得る。
【００２３】
本発明の特定の実施の形態では、組み換え溶剤生産微生物は細菌である。より具体的な実施の形態では、組み換え溶剤生産細菌はエタノール生産細菌である。代替的には、組み換え溶剤生産微生物は酵母、より具体的にはエタノール生産酵母である。
【００２４】
さらなる特定の実施の形態では、本発明において使用される溶剤生産細菌はグラム陰性細菌、例えばザイモモナス種の細菌等である。別の実施の形態では、細菌はグラム陽性細菌、例えばクロストリジウム種の細菌等である。したがって、本発明には、以前は提案されていなかった、グラム陰性細菌に由来するセルラーゼをグラム陽性細菌に導入することも含まれる。
【００２５】
特定の実施の形態では、組み換え溶剤生産（好ましくはエタノール生産）微生物はクロストリジウム種、より具体的には（partiuclarly）クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）である。他の実施の形態では、組み換え溶剤生産（特にエタノール生産）微生物はザイモモナス種、より具体的にはザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）である。これらの細菌は特に溶剤（特にエタノール）を生産する細菌として秀でている。
【００２６】
本発明の特定の実施の形態によると、組み換え溶剤生産微生物は、微生物による発現を可能とする調節配列及び／又は微生物による分泌を可能とする分泌シグナル配列に（to to）操作可能に結合した、ＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体をコードするか、又はＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体の機能的断片及び／又は変異体をコードする組み換え核酸分子を含む。
【００２７】
したがって、本発明はセルロースを含む物質、例えばリグノセルロース系材料若しくはセルロース系材料又はバイオマス等から溶剤、燃料、化学物質又は化学中間物を生産する方法であって、上記物質を１つ又は複数の微生物、より具体的には本明細書中で教示されるような溶剤生産微生物で処理することを含む、方法を提供する。特定の実施の形態では、該物質は結晶性セルロースを含んでいるか、又はそれについて濃縮されている。最も具体的な実施の形態では、溶剤はエタノールであり、微生物はエタノール生産微生物である。
【００２８】
上述の本発明の態様及び実施の形態は、主に組み換え微生物に関連して開示されているが、組み換え微生物を得るのに有用な組み換え手段及び試薬、かかる組み換え手段及び試薬を用いて組み換え微生物を得る方法、組み換え微生物において所望のポリペプチドを発現させる方法、並びに発現させたポリペプチド及びそれ自体の組み合わせ、及びそれを調製する方法に関する態様も本発明に包含されることも理解されよう。
【００２９】
さらなる（furher）態様では、本発明は、ＡＣＬＡの相同体並びにかかる相同体の機能的断片及び／又は変異体、並びに酵素的セルロース分解における、及び／又は溶剤生産微生物等の組み換え微生物中での発現のためのそれらの使用を教示する。より具体的には、本明細書中で企図されるようなＡＣＬＡ相同体は、ＡＣＬＡのＤＸドメインに相同なドメインを含む。
【００３０】
本発明の特定の実施の形態は、ＡＣＬＡポリペプチドの相同体がサッカロファガス・デグラダンス（Saccharophagus degradans）２−４０株のＣｅｌ５Ｈポリペプチドである、本明細書中で教示されるような組み換え溶剤生産微生物を提供する。
【００３１】
本発明者らは、ＧＨ５−ＤＰＲ−ＣＢＭ６−ＰＳＬ−ＤＺ（ここで、ＧＨ５はそのグリコシドヒドロラーゼファミリー５ドメインを表し、ＤＰＲはアスパラギン酸−プロリンリッチ領域を表し、ＣＢＭ６は炭水化物結合モジュールファミリー６ドメインを表し、ＰＳＬはポリセリンリンカーを表し、また、この解釈に限定されるものではないが、ＤＺは本発明者らによって推定上の炭水化物結合モジュールとして同定されたＣ末端ドメインを表す）として略述することができる、天然ＡＣＬＡポリペプチドのドメイン構造をさらに同定した。
【００３２】
したがって、特定の実施の形態では、本発明はＰＳＬ−ＤＺ、ＣＢＭ６−ＰＳＬ−ＤＺ又はＤＰＲ−ＣＢＭ６−ＰＳＬ−ＤＺ（ここで、ＰＳＬはポリセリンリンカーを表し、ＤＰＲはアスパラギン酸−プロリンリッチ領域を表す）という構造を有する、ＡＣＬＡポリペプチド又はその相同体若しくは変異体の単離断片を提供する。
【００３３】
したがって、本発明のさらなる態様はＡＣＬＡ酵素の機能的断片、並びに微生物による酵素的セルロース分解及び／又は発酵におけるそれらの使用を提供する。特定の実施の形態によると、ＡＣＬＡのＧＨ５ドメイン、ＣＢＭ６ドメイン及びＤＺドメインから選択されるか、又はそれに相当する１つ又は複数のドメインを含むＡＣＬＡ酵素の機能的断片を発現する組み換え微生物が提供される。断片中に１つ又は複数の上記ドメインが存在することによって、それぞれのドメインに起因する機能性が断片に与えられ得る。
【００３４】
本発明のさらなる態様は、炭水化物ポリマー代謝、特にセルロース代謝において有用なさらなる機能及び活性（セルロース脱重合活性、セルロース結合活性、セルロソーム形成活性又は他の活性等）を与えることのできる１つ又は複数の非相同ドメインと融合した、ＡＣＬＡポリペプチドの改変形態、その相同体、断片及び／又は変異体を提供する。したがって、特定の実施の形態は、ＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体、又は上記ＡＣＬＡポリペプチド若しくは相同体の機能的断片及び／又は変異体が、ＡＣＬＡポリペプチド又はその相同体と非相同の１つ又は複数のドメイン（グリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）触媒ドメイン、炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）ドメイン、ドッケリンドメイン等のコヒーシン結合ドメイン、及びセルロソームスキャフォルディン（scaffoldin）タンパク質の親水性（Ｘモジュール）ドメインから選択される）と融合した、本明細書中で教示されるような組み換え微生物を提供する。付加的又は代替的には、Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくはその相同体、又は上記Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体が、非相同シグナルペプチド又はその天然シグナルペプチドと融合する。
【００３５】
本発明のさらなる態様は、ＡＣＬＡ酵素と、炭水化物ポリマー代謝、特にセルロース代謝に有用な他のポリペプチド又は酵素（セルロース脱重合酵素、セルロース結合酵素又はセルロース（celloluse）分解酵素等）との併用に関する。さらなる特定の実施の形態では、本発明はセルロース分解、例えば限定されるものではないが、溶剤生産におけるＡＣＬＡ酵素と、他の酵素（他のセルロース分解酵素を含む）との併用を提供する。特定の実施の形態では、本発明は、セルロースの酵素分解に使用されるセルラーゼの混合物（「カクテル」とも称される）を提供する。
【００３６】
したがって、特定の実施の形態によると、ＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体、又は上記ＡＣＬＡポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体を含み、任意でキシラナーゼと組み合わせた、炭水化物ポリマー代謝、特にセルロース代謝に関与する１つ又は複数のポリペプチド、好ましくはリグノセルロース系材料を分解することが可能な１つ又は複数の酵素、より好ましくは本明細書中で教示されるような１つ又は複数のセルラーゼをさらに含む単離組成物が提供される。かかる混合物は、具体的には２種以上、より具体的には３種以上、最も具体的には４種以上、典型的には５種若しくは６種、又はそれ以上の酵素を含有する。上記組成物の特定の実施の形態では、列挙された成分は別個の又は遊離したポリペプチドとして存在する。他の実施の形態では、列挙されたポリペプチドは、ハイブリッド及び／又は共有結合セルロソームに含まれる。
【００３７】
代替的な実施の形態では、本発明によって、ＡＣＬＡ又は関連ポリペプチドを、炭水化物ポリマー代謝、特にセルロース代謝において有用な他のポリペプチド又は酵素、好ましくは組み換えポリペプチド又は酵素、例えばセルロース脱重合ポリペプチド、セルロース結合ポリペプチド、セルロソーム形成ポリペプチド（例えばスキャフォルディン等）又は他のポリペプチドと共発現させることの利点が企図される。かかる共発現（及び任意で、具体的には共分泌）によって付加的又は補足的な活性及び機能が提供され、本発明において想定される微生物によるセルロースの脱重合及び利用がより効率的となる。したがって、特定の実施の形態は、ＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体、又は上記ＡＣＬＡポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体を、１つ又は複数のポリペプチド（本明細書中で「共発現ポリペプチド」とも称される）、最も具体的には炭水化物ポリマー代謝（特にセルロース代謝）に関与する組み換えポリペプチド、具体的にはリグノセルロース系材料を分解することが可能な１つ又は複数の酵素、より具体的には１つ又は複数のグリコシドヒドロラーゼ、さらにより具体的には１つ又は複数のセルラーゼと共発現し、任意で共分泌する組み換え微生物（本明細書中で教示される溶剤生産微生物を含むが、これに限定されない）を提供する。より具体的な実施の形態では、本発明は、（ａ）シュードモナス種ＮＤ１３７のＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体、又は上記ＡＣＬＡポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体、並びに（ｂ）ＡＣＬＡポリペプチド以外の１つ又は複数のさらなる外来セルロース分解酵素を発現する組み換え微生物を提供する。特定の実施の形態では、酵素は微生物中で活性を有するか、又は別個の若しくは遊離したポリペプチドとして分泌される。他の実施の形態では、列挙されたポリペプチドは、ハイブリッド及び／又は共有結合セルロソームに含まれる。
【００３８】
特定の実施の形態では、１つ又は複数の共発現ポリペプチド、例えば共発現酵素、より具体的には共発現セルラーゼの触媒作用が、ＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体、又はＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体の機能的断片及び／又は変異体の酵素活性に追加又は補足、好ましくは補足される。
【００３９】
さらなる実施の形態では、１つ又は複数の共発現セルラーゼは、ファミリー５、６、８、９及び４８セルラーゼから選択され得る。さらなる特定の実施の形態では、１つ又は複数の共発現セルラーゼは、クロストリジウム・セルロリティカムのセルラーゼＣｅｌ４８Ｆ、Ｃｅｌ９Ｇ、Ｃｅｌ９Ｒ、Ｃｅｌ９Ｐ、Ｃｅｌ９Ｅ、Ｃｅｌ９Ｈ、Ｃｅｌ９Ｊ、Ｃｅｌ９Ｍ、Ｃｅｌ８Ｃ、Ｃｅｌ５Ｎ及びＣｅｌ５Ａ、並びにサッカロファガス・デグラダンス２−４０株のセルラーゼＣｅｌ５Ｈ、Ｃｅｌ９Ａ、Ｃｅｌ９Ｂ、Ｃｅｌ５Ｊ、Ｃｅｌ５Ｉ、Ｃｅｌ５Ｆ、Ｃｅｌ５Ｄ、Ｃｅｌ５Ｂ、Ｃｅｌ９Ｇ、Ｃｅｌ５Ｅ、Ｃｅｌ５Ａ、Ｃｅｌ５Ｃ及びＣｅｌ６Ａ、並びに上記セルラーゼのいずれか１つの機能的断片及び／又は変異体から選択され得る。
【００４０】
さらなる実施の形態は、ＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体、又は上記ＡＣＬＡポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体、並びに任意で１つ又は複数の共発現ポリペプチド、より具体的には１つ又は複数の上記で教示されるような共発現セルラーゼが、ハイブリッド及び／又は共有結合セルロソーム、又はミニセルロソーム（どちらも本明細書全体を通して「セルロソーム」の総称表現（genericreference）に包含される）に含まれる、本明細書中で教示されるような溶剤生産微生物を提供する。セルロソームは、特にセルロース結合活性及びセルロース脱重合活性の超分子構成をもたらすことができ、それにより炭水化物ポリマー代謝、特にセルロース代謝の効率の向上を達成する。
【００４１】
別の態様は、ＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体をコードするか、又は上記ＡＣＬＡポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体をコードする組み換え核酸配列を提供する。
【００４２】
本発明のこの態様のさらなる実施の形態は、対象となる宿主微生物中での発現を可能とする調節配列に操作可能に結合した、ＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体をコードするか、又は上記ＡＣＬＡポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体をコードする組み換え核酸配列を提供する。特定の実施の形態では、ＡＣＬＡポリペプチドは宿主微生物によって分泌される。特定の実施の形態では、宿主は、セルロースの分解産物（複数可）を対象となる産物へと変換することが可能な微生物である。さらなる特定の実施の形態では、宿主は溶剤生産微生物である。より具体的な実施の形態では、上記宿主は本明細書の他の部分で教示されるようなエタノール生産微生物である。本明細書中で提供される組み換え核酸分子の特定の実施の形態では、ＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体をコードするか、又は上記ＡＣＬＡポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体をコードする核酸配列は、宿主微生物のコドンバイアスに適合している。
【００４３】
さらなる実施の形態は、対象となる宿主微生物、特に溶剤生産微生物、より好ましくは本明細書の他の部分で教示されるようなエタノール生産微生物中での分泌を可能とする分泌シグナル配列に操作可能に結合した、ＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体をコードするか、又は上記ＡＣＬＡポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体をコードする組み換え核酸配列を提供する。
【００４４】
さらなる実施の形態は、対象となる宿主微生物中での分泌を可能とする分泌シグナル配列に操作可能に結合し、かつ対象となる宿主微生物、特に溶剤生産微生物、より具体的には本明細書の他の部分で教示されるようなエタノール生産微生物中での発現を可能とする調節配列に操作可能に結合した、ＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体をコードするか、又は上記ＡＣＬＡポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体をコードする組み換え核酸分子を提供する。
【００４５】
本発明のさらなる態様は、上記で開示されるような組み換え核酸を１つ又は複数含むベクター、例えばクローニングベクター、シャトルベクター及び／又は発現ベクター等に関する。
【００４６】
さらなる態様は、組み換え核酸の１つ又は複数、又は上記に記載されるようなベクターによって形質転換した対象となる宿主微生物を提供する。一実施の形態では、微生物は細菌、より具体的には大腸菌（Escherichia coli）、サルモネラ・チンフィムリウム（Salmonella tymphimurium）、霊菌（Serratia marcescens）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）及び枯草菌（Bacillus subtilis）であり得る。かかる細菌は、例えば精製を目的とした組み換えポリペプチドの過剰生産に特に好適である。特定の実施の形態では、宿主微生物は溶剤生産微生物、好ましくは本明細書の他の部分で教示されるようなエタノール生産微生物である。さらなる態様は、そのように形質転換した微生物から直接得られるか、又は得ることができる細胞溶解物又は細胞抽出物を提供する。
【００４７】
したがって、本発明による組み換え微生物（溶剤生産微生物を含むが、これに限定されない）を得る方法も提供される。特定の実施の形態では、本明細書の他の部分で教示されるようなエタノール生産微生物を得る方法であって、宿主微生物を組み換え核酸又は本明細書中で教示されるようなベクターによって形質転換することを含む、方法が提供される。
【００４８】
１つ又は複数のＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体、又は上記ＡＣＬＡポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体を産生させる（及び任意で、最も具体的には分泌させる）方法であって、宿主微生物を、それぞれの組み換え核酸又は本明細書中で教示されるようなベクターの１つ又は複数によって形質転換すること、及びそのように形質転換した微生物を、それぞれのポリペプチドの発現を引き起こすのに効果的な条件下で培養又は維持することを含む、方法がさらに提供される。有益には、それぞれのポリペプチドは生物学的に活性な形態で産生される。該方法は任意でそれぞれのポリペプチドを単離する工程を含み得る。
【００４９】
したがって、ＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体、又は上記ＡＣＬＡポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体の産生（及び任意で、具体的には分泌）に対する、本明細書中で開示されるような組み換え核酸、ベクター又は宿主細胞の使用も企図される。好ましくは、それぞれのポリペプチドは生物学的に活性な形態で産生される。
【００５０】
したがって、さらなる態様では、本発明はセルロースを含む物質からの溶剤、燃料又は化学中間物の生産に対する、
（ｉ）シュードモナス種ＮＤ１３７のＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体、又は上記ＡＣＬＡポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体、
（ｉｉ）シュードモナス種ＮＤ１３７のＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体、又は上記ＡＣＬＡポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）シュードモナス種ＮＤ１３７のＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体、又は上記ＡＣＬＡポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターであって、上記核酸配列が宿主細胞中での発現を可能にする調節配列に操作可能に結合する、発現ベクター、
（ｉｖ）シュードモナス種ＮＤ１３７のＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体、又は上記ＡＣＬＡポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体を発現する宿主細胞、
（ｖ）シュードモナス種ＮＤ１３７のＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体、又は上記ＡＣＬＡポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体をコードするヌクレオチド配列によって形質転換した宿主細胞、又は
（ｖｉ）請求項１〜６のいずれか一項に記載の組み換え溶剤生産微生物、
の使用を提供する。
【００５１】
上記のポリペプチドの特定の実施の形態では、組み換え核酸、ベクター、形質転換した宿主微生物、方法及び使用は、以下の特徴の１つ又は複数によって特徴付けられる：
ＡＣＬＡ相同体がＡＣＬＡのＤＺドメインに相同なドメインを含む；及び／又は
ＡＣＬＡ相同体がサッカロファガス・デグラダンス１−４０株のＣｅｌ５Ｈポリペプチドである；及び／又は
機能的断片がＡＣＬＡのＧＨ５ドメイン、ＣＢＭ６ドメイン及びＤＺドメインから選択されるか、又はそれに相当する１つ又は複数のドメインを含む；及び／又は
１つ又は複数のＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体、又は１つ又は複数のＡＣＬＡポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体が、ＡＣＬＡポリペプチド又はその相同体と非相同の１つ又は複数のドメイン（ＧＨ触媒ドメイン、ＣＢＭドメイン、ドッケリンドメイン等のコヒーシン結合ドメイン、及びセルロソームスキャフォルディンタンパク質のＸモジュールドメインから選択される）と融合している；及び／又は
１つ又は複数のＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体、又は上記１つ又は複数のＡＣＬＡポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体が、炭水化物ポリマー代謝、特にセルロース代謝に関与する１つ又は複数のポリペプチド、好ましくは組み換えポリペプチド又は酵素、好ましくはリグノセルロース系材料を分解することが可能な１つ又は複数の酵素、より好ましくは本明細書中で教示されるような１つ又は複数の非相同セルラーゼと共発現され、任意で共分泌され得る；及び／又は
１つ又は複数のＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体、又は上記ＡＣＬＡポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体、並びに任意で１つ又は複数の共発現ポリペプチド、より具体的には上記で教示されるような共発現セルラーゼが、ハイブリッド及び／又は共有結合セルロソームに含まれる。
【００５２】
本発明者らは、ＡＣＬＡポリペプチドの構造及び構成の徹底解析をさらに行い、ＡＣＬＡポリペプチドのＣ末端付近に、これまでにそれ自体は同定されていない新たなドメイン（以下で「ＤＺドメイン（domainDZ）」と称される）の存在を同定した。限定されるものではないが、本発明者のデータから、ＤＺドメインに対する推定上の炭水化物結合モジュール（及び／又はオリゴマー形成モジュール機能）が示唆され、その存在が少なくとも部分的に、結晶性セルロースを脱重合するＡＣＬＡの優れた能力に関与し得ることが示される。したがって、ＤＺドメイン、又はＤＺドメインを含むＡＣＬＡポリペプチドの一部を様々な酵素系において利用して、結晶性セルロースを消化及び分解するその能力を改善することができることは、本発明のさらなる実現例（realisation）である。
【００５３】
したがって、さらなる態様は、シュードモナス種ＮＤ１３７のＡＣＬＡポリペプチドのアミノ酸４６５〜アミノ酸５５８（例えば、典型的には、図１Ｃに示される成熟ＡＣＬＡポリペプチド配列番号３等）に由来する上記ＡＣＬＡポリペプチドの単離ドメイン（ＤＺドメイン）、若しくはそれに相同な単離ドメイン、又は上記ＤＺドメイン若しくは上記相同ドメインの機能的断片及び／又は変異体である。
【００５４】
特定の実施の形態では、ＡＣＬＡ  ＤＺに相同なドメインは、サッカロファガス・デグラダンス２−４０のＣｅｌ５Ｈポリペプチドのアミノ酸４９６からアミノ酸５９６へ延びるドメイン（例えば、典型的には、図１Ｅに示される成熟Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド配列番号５等）。
【００５５】
特定の実施の形態は、ＰＳＬ−ＤＺ、ＣＢＭ６−ＰＳＬ−ＤＺ又はＤＰＲ−ＣＢＭ６−ＰＳＬ−ＤＺ（ここでＤＰＲ、ＣＢＭ６及びＰＳＬは、本明細書の他の部分で説明されるような意味を有する）という構造を有するＡＣＬＡポリペプチド又はその相同体若しくは変異体の単離断片を提供する。かかる断片は、その有益な機能をもたらすＤＺドメインを含み、かかる断片は任意で、結晶性セルロース又はヘミセルロース系基質を分解する能力をさらに刺激し得るＡＣＬＡの炭水化物結合モジュールＣＢＭ６を含んでいてもよい。さらに、内因性リンカー配列は、ＤＺドメイン及び任意でＣＢＭ６ドメインを、その構造及び機能を保持した上で他のポリペプチドと融合させる有益な手段を提供し得る。
【００５６】
したがって、特定の実施の形態は、ＡＣＬＡのＤＺドメインに相同なドメインを含むＣｅｌ５Ｈポリペプチドの単離断片を提供する。
【００５７】
単離ＤＺドメイン若しくはその機能的断片及び／又は変異体、又は上記で教示されるような単離断片の炭水化物結合モジュールとしての使用がさらに企図される。かかる使用によって、様々な酵素系に対する新規の炭水化物結合特性又はセルロース結合特性が与えられ得る。
【００５８】
別の態様は、（最も具体的にはＡＣＬＡ又はその機能的断片及び／又は変異体の）単離ＤＺドメインを含むか、又はＤＺドメインを含むＡＣＬＡの単離断片を含み、ＡＣＬＡポリペプチド又はその相同体と非相同の１つ又は複数のドメイン（ＧＨ触媒ドメイン、ＣＢＭドメイン、ドッケリンドメイン等のコヒーシン結合ドメイン、及びセルロソームスキャフォルディンタンパク質のＸモジュールドメインから選択される）をさらに含むキメラポリペプチドに関する。このようなモジュールの組み合わせによって、結晶性セルロース又はヘミセルロース系基質に対して有用な活性を有する新規のセルロース分解酵素の生成が可能となる。
【００５９】
他の態様は、ＡＣＬＡポリペプチド又はその相同体と非相同の、炭水化物ポリマー代謝、特にセルロース代謝に関与する１つ又は複数のポリペプチド、好ましくはリグノセルロース系材料を分解することが可能な１つ又は複数の酵素、より好ましくは１つ又は複数のグリコシドヒドロラーゼ、さらにより好ましくは１つ又は複数のセルラーゼと融合した、単離ＤＺドメイン若しくはその機能的断片及び／又は変異体、又はＤＺドメインを含むＡＣＬＡの単離断片を含むキメラポリペプチドを提供する。ただし、さらなるＤＺドメイン（複数可）と、ＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体、又は本明細書中で記載されるようなその断片及び／又は変異体との融合も企図される。
【００６０】
さらなる態様は、単離ＤＺドメイン若しくはそれに相同な単離ドメイン、又はその機能的断片及び／又は変異体をコードするか、又はＤＺドメイン若しくはその相同体を含むＡＣＬＡの単離断片をコードするか、又は上記に記載されるようなキメラポリペプチドをコードする組み換え核酸分子を提供する。
【００６１】
この態様の特定の実施の形態は、対象となる宿主微生物、好ましくは溶剤生産微生物、より好ましくは本明細書の他の部分で教示されるようなエタノール生産微生物中での発現を可能とする調節配列に操作可能に結合した、単離ＤＺドメイン若しくはそれに相同な単離ドメイン、又はその機能的断片及び／又は変異体をコードするか、又はＤＺドメイン若しくはその相同体を含むＡＣＬＡの単離断片をコードするか、又は上記に記載されるようなキメラポリペプチドをコードする組み換え核酸分子を提供する。
【００６２】
さらなる実施の形態は、対象となる宿主微生物、好ましくは溶剤生産微生物、より好ましくは本明細書の他の部分で教示されるようなエタノール生産微生物中での分泌を可能とする分泌シグナル配列に操作可能に結合した、単離ＤＺドメイン若しくはそれに相同な単離ドメイン、又はその機能的断片及び／又は変異体をコードするか、又はＤＺドメイン若しくはその相同体を含むＡＣＬＡの単離断片をコードするか、又は上記に記載されるようなキメラポリペプチドをコードする組み換え核酸分子を提供する。
【００６３】
この態様のまたさらなる実施の形態は、対象となる宿主微生物中での分泌を可能とする分泌シグナル配列に操作可能に結合し、かつ対象となる宿主微生物、好ましくは溶剤生産微生物、より好ましくは本明細書の他の部分で教示されるようなエタノール生産微生物中での発現を可能とする調節配列に操作可能に結合した、単離ＤＺドメイン若しくはそれに相同な単離ドメイン、又はその機能的断片及び／又は変異体をコードするか、又はＤＺドメイン若しくはその相同体を含むＡＣＬＡの単離断片をコードするか、又は上記に記載されるようなキメラポリペプチドをコードする組み換え核酸分子を提供する。
【００６４】
さらなる態様は、上記の組み換え核酸分子のいずれかを含むベクター、例えばクローニングベクター、シャトルベクター及び／又は発現ベクター等を提供する。
【００６５】
さらなる態様は、上記に記載される組み換え核酸分子又はベクターによって形質転換した、対象となる宿主微生物を提供する。特定の実施の形態では、微生物は細菌、より好ましくは大腸菌、サルモネラ・チンフィムリウム、霊菌、ネズミチフス菌及び枯草菌から選択される細菌である。特定の実施の形態では、微生物は溶剤生産微生物であってもよく、好ましくは本明細書の他の部分で教示されるようなエタノール生産微生物である。さらなる態様は、そのように形質転換した微生物から直接得られるか、又は得ることができる細胞溶解物又は細胞抽出物を提供する。
【００６６】
特定の実施の形態では、単離ＤＺドメイン若しくはそれに相同な単離ドメイン、又はその機能的断片及び／又は変異体、又はＤＺドメイン若しくはその相同体を含むＡＣＬＡの単離断片、又は上記に記載されるようなキメラポリペプチド、及び任意で、炭水化物ポリマー代謝、特にセルロース代謝に関与する１つ又は複数の共発現ポリペプチドが、ハイブリッド及び／又は共有結合セルロソームに含まれていてもよい。
【００６７】
さらなる態様では、本発明は、リグノセルロース系材料若しくはセルロース系材料又はバイオマス等のセルロースを含む物質を分解する方法であって、上記物質を単離ＤＺドメイン若しくはそれに相同な単離ドメイン、又はその機能的断片及び／又は変異体、又はＤＺドメイン若しくはその相同体を含むＡＣＬＡの単離断片、又は上記に記載されるようなキメラポリペプチド、又はそれらを発現する組み換え微生物と接触させることを含む、方法を提供する。一実施の形態では、該物質は結晶性セルロース、半結晶性セルロース又は非結晶性セルロースを含んでいても、又はそれについて濃縮されていてもよい。
【００６８】
関連の態様は、リグノセルロース系材料若しくはセルロース系材料又はバイオマス等のセルロースを含む物質から溶剤を生産する方法であって、上記物質を単離ＤＺドメイン若しくはそれに相同な単離ドメイン、又はその機能的断片及び／又は変異体、又はＤＺドメイン若しくはその相同体を含むＡＣＬＡの単離断片、又は上記に記載されるようなキメラポリペプチド、又はそれらを発現する組み換え溶剤生産微生物で処理することを含む、方法を提供する。一実施の形態では、該物質は結晶性セルロースを含んでいても、又はそれについて濃縮されていてもよい。好ましくは、溶剤はエタノールであり、微生物はエタノール生産微生物であり得る。
【００６９】
さらなる態様は、本明細書に記載される方法によって得られるか、又は得ることができるセルロース分解産物及び／又は溶剤、より具体的にはエタノールを含む組成物を提供する。かかる組成物は粗培養媒体であっても、又はＡＣＬＡポリペプチド（又はその相同体若しくは断片）の産物について（少なくとも）部分的に濃縮及び／又は精製されていても、又は溶剤について部分的に濃縮及び／又は精製されていてもよい。特定の実施の形態では、かかる組成物はグルコース、セロビオース及びセロトリオースの含量が増大していることによって特徴付けられる。さらなる特定の実施の形態では、グルコース、セロビオース及び／又はセロトリオースの含量が１０ｗｔ％超、２０ｗｔ％超、３０ｗｔ％超、４０ｗｔ％超、５０ｗｔ％超、６０ｗｔ％超、７０ｗｔ％超、８０ｗｔ％超、９０ｗｔ％超、又はそれ以上である組成物が提供される。
【００７０】
さらなる特定の実施の形態では、かかる組成物は溶剤含量が高いことによって特徴付けられる。さらなる特定の実施の形態では、溶剤含量が１０ｗｔ％超、２０ｗｔ％超、３０ｗｔ％超、４０ｗｔ％超、５０ｗｔ％超、６０ｗｔ％超、７０ｗｔ％超、８０ｗｔ％超、９０ｗｔ％超、９０ｗｔ％超、又は９６ｗｔ％〜９９．９ｗｔ％である組成物が提供される。特定の実施の形態では、組成物の溶剤濃度は約１０ｇ／Ｌ超、好ましくは約１５ｇ／Ｌ超である。
【００７１】
ここで、本発明のこれら及び他の態様及び実施形態を、下記及び添付の特許請求の範囲においてさらに説明し、非限定的な実施例によって示す。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１Ａ】Ｎ末端分泌シグナル配列を含有する、シュードモナス種ＮＤ１３７の天然ＡＣＬＡタンパク質の典型的なアミノ酸配列を示す図である。
【図１Ｂ】Ｎ末端分泌シグナル配列を含有しない、シュードモナス種ＮＤ１３７の天然ＡＣＬＡタンパク質の典型的なアミノ酸配列を示す図である。
【図１Ｃ】サッカロファガス・デグラダンス２−４０株の天然Ｃｅｌ５Ｈポリペプチドの典型的なコード核酸配列を示す図である。
【図１Ｄ】Ｎ末端分泌シグナル配列を含有する、サッカロファガス・デグラダンス２−４０株の天然Ｃｅｌ５Ｈポリペプチドの典型的なアミノ酸配列を示す図である。
【図１Ｅ】Ｎ末端分泌シグナル配列を含有しない、サッカロファガス・デグラダンス２−４０株の天然Ｃｅｌ５Ｈポリペプチドの典型的なアミノ酸配列を示す図である。
【図１Ｆ】シュードモナス種ＮＤ１３７の天然ＡＣＬＡタンパク質の典型的なコード核酸配列を示す図である。
【図２】ＡＣＬＡ及びＣｅｌ５Ｈのドメインの比較を概略的に示す図である。図中英語は、シュードモナス種ＮＤ１３７、サッカロファガス・デグラダンス、ＣＨ５触媒ドメインを意味する。
【図３】ＡＣＬＡの一般的構成をＣｅｌ５Ｈの一般的構成と比較した図である。ＡＣＬＡは（酵素のＮ末端からＣ末端に向かって）以下の構成を有する：シグナル配列／触媒モジュール（ＧＨファミリー５）／アスパラギン酸−プロリンリンカー／ＣＢＭファミリー６に属する炭水化物結合モジュール／セリンリッチリンカー（他の表し方では、シグナル配列−ＧＨ５−ＤＰＲ−ＣＢＭ６−ＰＳＬ）。図中英語は、同一性（％）（% d'identit&eacute;）（相同性（％）（% d'homologie））を意味する。
【図４】３７℃でのリン酸膨潤セルロースに対するＡＣＬＡ及びＣｅｌ５Ｈの活性を比較した図である。図中、横軸は時間(ふん）、縦軸は放出された可溶性糖を意味する。
【図５】３７℃でのＡｖｉｃｅｌ  ＰＨ１０１に対するＡＣＬＡ及びＣｅｌ５Ｈの活性を比較した図である。図中、横軸は時間(ふん）、縦軸は放出された可溶性糖を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
本明細書中で使用される場合、単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈上明らかに他の指示がない限り、単数及び複数の両方の指示対象を含む。
【００７４】
「含む（comprising）」、「含む（comprises）」及び「から構成される（comprised of）」という用語は、本明細書中で使用される場合、「含む（including）」、「含む（includes）」又は「含有する（containing）」、「含有する（contains）」と同義であり、包括的又はオープンエンドであり、列挙されていないさらなる成員、要素又は方法工程を排除するものではない。
【００７５】
端点による数値範囲の列挙は、それぞれの範囲内に含まれる全ての数値及び分数値、並びに列挙された端点を含む。
【００７６】
「約」という用語は、本明細書中で使用される場合、パラメータ、量、期間等といった測定可能な値に言及するときには、指定の値からの（of and from）±１０％以下、好ましくは±５％以下、より好ましくは±１％以下、さらにより好ましくは±０．１％以下の変動を、かかる変動が開示された発明において機能するのに適切である限り、包含することが意図される。「約」という修飾語が指す値自体も、具体的かつ好適に開示されていることが理解されよう。
【００７７】
他に規定のない限り、本発明を開示する際に使用される全ての用語（技術用語及び科学用語を含む）は、本発明が属する技術分野の通常の技術を有する者（当業者）によって一般に理解される意味を有する。本発明の教示をより良く理解するために、さらなる指針を用いて用語の定義が記載される。
【００７８】
本明細書中で使用される場合、「ＡＣＬＡ」、「ＡＣＬＡポリペプチド」又は「ＡＣＬＡタンパク質」という用語は、シュードモナス種ＮＤ１３７株のポリペプチド又はタンパク質を指す。上記の呼称は、特に天然配列を有するかかるポリペプチド、すなわち一次配列が天然に見られるか、又は天然に由来するシュードモナス種ＮＤ１３７株のＡＣＬＡタンパク質と同じポリペプチドを指す。ＡＣＬＡの天然配列が遺伝的多様性又は自然突然変異（複数可）のために、シュードモナス種ＮＤ１３７株の種々の亜株又は継代培養株（sub-cultures）間で異なり得ることが当業者には理解される。ＡＣＬＡの天然配列は、転写後修飾又は翻訳後修飾によってさらに相違し得る。したがって、天然に見られるか、又は天然に由来する全てのＡＣＬＡ配列は「天然」であると見なされる。
【００７９】
上記の呼称は、生きた生物、微生物又は細胞中に存在するＡＣＬＡポリペプチド、及びかかる供給源から少なくとも部分的に単離したＡＣＬＡポリペプチドを包含する。この用語は、組み換え手段又は合成手段によって産生された場合のＡＣＬＡポリペプチドも包含する。
【００８０】
ＡＣＬＡポリペプチドは通常は分泌性であるが、切断可能なＮ末端分泌シグナル配列を含む前駆体形態、又は上記シグナル配列を欠いた成熟形態で存在していてもよい。当業者によって容易に理解される文脈に応じて、本明細書中でのＡＣＬＡポリペプチドへの言及は上記成熟形態及び／又は上記前駆体形態を包含し得る。
【００８１】
典型的なＡＣＬＡポリペプチドとしては、図１Ａ（配列番号１）にも転載されている、Ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ８ＶＵＴ３（２００２年３月１日に登録された配列バージョン１）で注記される（annotated）配列が挙げられるが、これに限定されない。この配列はシグナル配列を含むＡＣＬＡ前駆体に相当する。典型的な成熟（すなわちシグナル配列がプロセシングによって除かれた）ＡＣＬＡポリペプチドは、図１Ｂ（配列番号２）に例示として転載されるように、それぞれの前駆体のアミノ酸位置２８〜５８５によって表される。
【００８２】
当業者によって容易に理解される文脈に応じて、本明細書中でのＡＣＬＡポリペプチドへの言及は上記成熟形態及び／又は上記前駆体形態を包含し得る。さらに、明示的に又は文脈によって他に指定されない限り、ＡＣＬＡのドメイン又は他のモチーフは本明細書中でアミノ酸位置への言及によって特定される場合には、かかる言及は、例えば特に配列番号５に示されるようなＡＣＬＡの成熟形態に対するものである。
【００８３】
さらに、明示的に又は文脈によって他に指定されない限り、ＡＣＬＡのドメイン又は他のモチーフは本明細書中でアミノ酸位置への言及によって特定される場合には、かかる言及は、例えば特に配列番号２に示されるようなＡＣＬＡの成熟形態に対するものである。
【００８４】
本明細書中で使用される場合、「相同性」という用語は、同じか又は異なる分類群に由来する２つの高分子、特に２つのポリペプチド又はポリヌクレオチド間の構造的類似性を表すが、上記類似性は共通の祖先に起因するものである。したがって、「相同体」という用語は、上記構造的類似性を有するそのように関連した高分子を表す。好ましくは、本明細書中で意図されるようなＡＣＬＡポリペプチドの相同体は、天然配列を有する上記相同体を包含する。
【００８５】
ＡＣＬＡポリペプチドのポリペプチド相同体は、ＡＣＬＡポリペプチドに対して好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、例えば非常に好ましくは少なくとも８０％又は少なくとも９０％又は少なくとも９５％の本明細書の他の部分で規定されるような配列同一性を示し得る。代替的に又は好ましくは付加的に、ＡＣＬＡポリペプチドのポリペプチド相同体は、ＡＣＬＡポリペプチドに対して少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば非常に好ましくは少なくとも９５％の本明細書の他の部分で規定されるような配列類似性を示し得る。さらに好ましくは、ＡＣＬＡポリペプチドのポリペプチド相同体は、ＡＣＬＡポリペプチドのドメインに相当する１つ又は複数の機能ドメイン、好ましくはＧＨファミリー５触媒ドメイン、ＣＢＭファミリー６ドメイン及びＤＺドメインの１つ又は複数を含み得る。好ましくは、上記ドメインは、通常はリンカーを介して、ＡＣＬＡに類似した構成、特にＧＨ５−ＣＢＭ６−ＤＺを有し得る。
【００８６】
先述のように、ＡＣＬＡポリペプチドの好ましい相同体は、サッカロファガス・デグラダンス２−４０のＣｅｌ５Ｈポリペプチドである。典型的なＣｅｌ５Ｈポリペプチドとしては、図１Ｃ（配列番号３）にも転載される、ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gene）遺伝子座タグＳｄｅ＿３２３７（遺伝子番号：３９６５７１０）及びＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html）アクセッション番号ＮＣ  ００７９１２（配列バージョン１、２００８年７月２０日にアップデートされたデータベースエントリ）で注記される核酸コード配列によってコードされるポリペプチド、並びに図１Ｄ（配列番号４）に例示として転載される、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＹＰ  ５２８７０６（配列バージョン１、２００８年７月２０日にアップデートされたデータベースエントリ）及びＵｎｉｐｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ（http://www.expasy.org/）アクセッション番号Ｑ２１ＦＮ５（２００６年４月１８日に登録された配列バージョン１）で注記されるＣｅｌ５Ｈポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
この配列はシグナル配列を含むＣｅｌ５Ｈ前駆体に相当する。典型的な成熟（すなわちシグナル配列がプロセシングによって除かれた）Ｃｅｌ５Ｈポリペプチドは、図１Ｅ（配列番号５）に例示として転載されるように、上記前駆体配列のアミノ酸位置３５〜６３０として表される。
【００８８】
シグナルペプチダーゼによる実際の切断が、図１Ｄに示されるような前駆体Ｃｅｌ５Ｈのアミノ酸位置３４と３５との間の予測切断部位に近接するペプチド結合で起こる可能性があることが理解されるだろう。例えば、実際の切断は、図１Ｂに示されるような前駆体Ｃｅｌ５Ｈのアミノ酸位置３０〜４０、好ましくは３１〜３９、より好ましくは３２〜３８、さらにより好ましくは３２〜３７、さらにより好ましくは３３〜３６というアミノ酸領域内のペプチド結合のいずれかで起こり得る。
【００８９】
ＡＣＬＡ等の所与のポリペプチド若しくはその相同体、又はＡＣＬＡのＤＺドメイン若しくはその相同体に関連する「断片」という用語は概して、上記ＡＣＬＡ等の上記ポリペプチド若しくはその相同体、又は上記ドメインと比べて１つ又は複数のアミノ酸残基のＮ末端欠失及び／又はＣ末端欠失を有する、上記ポリペプチドの短縮形態を指すが、断片の残りの一次配列は、上記ＡＣＬＡ等の上記ポリペプチド若しくはその相同体、又は上記ドメインのアミノ酸配列中の対応する位置と同一である。
【００９０】
例えば、ＡＣＬＡ等の所与のポリペプチド又はその相同体の断片は、上記ＡＣＬＡ等の上記ポリペプチド又はその相同体の約５個以上の連続アミノ酸、好ましくは１０個以上の連続アミノ酸、より好ましくは２０個以上の連続アミノ酸、さらにより好ましくは３０個以上の連続アミノ酸、例えば４０個以上の連続アミノ酸、最も好ましくは５０個以上の連続アミノ酸、例えば６０個以上、７０個以上、８０個以上、９０個以上、１００個以上、２００個以上又は５００個以上の連続アミノ酸を含み得る。
【００９１】
例えば、ＡＣＬＡのＤＺドメイン又はその相同体の断片は、上記ＤＺドメイン又はその相同体の約５個以上の連続アミノ酸、好ましくは１０個以上の連続アミノ酸、より好ましくは２０個以上の連続アミノ酸、さらにより好ましくは３０個以上の連続アミノ酸、例えば４０個以上の連続アミノ酸、最も好ましくは５０個以上の連続アミノ酸、例えば６０個以上、７０個以上、８０個以上又は９０個以上の連続アミノ酸を含み得る。
【００９２】
さらに、ＡＣＬＡ等の所与のポリペプチド若しくはその相同体、又はＤＺドメインの断片は、少なくとも約３０％、例えば少なくとも５０％又は少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、又はさらには約９９％の上記ＡＣＬＡ等の上記ポリペプチド若しくはその相同体、又はＤＺドメインのアミノ酸配列を示し得る。
【００９３】
ＡＣＬＡ等の所与のポリペプチド若しくはその相同体、又はＤＺドメインの「変異体」という用語は、アミノ酸配列が上記ＡＣＬＡ等の上記ポリペプチド若しくはその相同体、又はＤＺドメインの天然配列と実質的に同一の（すなわちほとんどが同一であるが完全にではない）ポリペプチドを指す。「実質的に同一の」とは、少なくとも約８５％同一、例えば好ましくは少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９１％同一、９２％同一、より好ましくは少なくとも９３％同一、例えば９４％同一、さらにより好ましくは少なくとも９５％同一、例えば少なくとも９６％同一、さらにより好ましくは少なくとも９７％同一、例えば少なくとも９８％同一、最も好ましくは少なくとも９９％同一であることを指す。
【００９４】
２つのポリペプチド間の配列同一性は、ポリペプチドのアミノ酸配列を最適にアラインメントすること（２つのタンパク質配列の最適アラインメントとは、挿入したギャップに対する任意のペナルティを差し引いたペアスコア（pair-scores）の合計を最大限にしたアラインメントであり、好ましくはコンピュータ化されたアルゴリズム（例えばAccelrysのＧＣＧ（商標）ｖ．  １１．１．２パッケージで利用可能である、Needlemanand Wunsch 1970（J Mol Biol 48: 443-453）のアルゴリズムを用いた「Ｇａｐ」、又はSmith and Waterman 1981（J Mol Biol 147:195-197）のアルゴリズムを用いた「Ｂｅｓｔｆｉｔ」等）の実行によって行うことができる）、及び一方でアラインメントにおける同じアミノ酸残基を含有するポリペプチドの位置の数をスコアリングし、他方でアラインメントにおける２つのポリペプチドの配列が異なる位置の数をスコアリングすることによって決定することができる。アラインメントにおいて２つのポリペプチドの配列が所与の位置で異なるというのは、それらのポリペプチドがその位置で異なるアミノ酸残基を含有する場合（アミノ酸の置換）、又は一方のポリペプチドがその位置でアミノ酸残基を含有し、他方が含有しないか、若しくはその逆の場合（アミノ酸の挿入又は欠失）である。配列同一性は、アラインメントにおける位置の総数に対する、アラインメントにおいてポリペプチドが同じアミノ酸残基を含有する位置の割合（百分率）として算出される。配列アラインメント及び配列同一性の決定を行うのにさらに好適なアルゴリズムとしては、Tatusova and Madden 1999（FEMS Microbiol Lett174: 247-250）によって記載される「Ｂｌａｓｔ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」アルゴリズム等といった、Altschulet al. 1990（J Mol Biol 215: 403-10）によって初めて記載されたＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）に基づく、例えばそのデフォルト設定を用いたアルゴリズムが挙げられる。
【００９５】
ＡＣＬＡ等の所与のポリペプチド若しくはその相同体、又はＤＺドメインの変異体は、本明細書中で使用される場合、上記ＡＣＬＡ等の上記ポリペプチド若しくはその相同体、又はＤＺドメインと或る程度の類似性を有するポリペプチドも具体的に包含する。好ましくは、かかる変異体は、少なくとも約９０％類似、例えば好ましくは少なくとも９１％類似、例えば少なくとも９２％類似、９３％類似、より好ましくは少なくとも９４％類似、例えば９５％類似、さらにより好ましくは少なくとも９６％類似、例えば少なくとも９７％類似、さらにより好ましくは少なくとも９８％類似、例えば少なくとも９９％類似であり得る。
【００９６】
２つのポリペプチド間の配列類似性は、ポリペプチドのアミノ酸配列を最適にアラインメントすること（上記参照）、及び一方でアラインメントにおいてポリペプチドが同じか又は類似の（すなわち保存的に置換された）アミノ酸残基を含有する位置の数をスコアリングし、他方でアラインメントにおいて２つのポリペプチドの配列が別の形で（otherwise）異なるの位置の数をスコアリングすることによって決定することができる。アラインメントにおいて２つのポリペプチドの配列が所与の位置で別の形で異なるというのは、それらのポリペプチドがその位置で非保存的なアミノ酸残基を含有する場合、又は一方のポリペプチドがその位置でアミノ酸残基を含有し、他方が含有しないか、若しくはその逆の場合（アミノ酸の挿入又は欠失）である。配列類似性は、アラインメントにおける位置の総数に対する、アラインメントにおいてポリペプチドが同じか又は類似のアミノ酸残基を含有する位置の割合（百分率）として算出される。
【００９７】
断片及び／又は変異体へ言及する場合に、本明細書がＡＣＬＡ等の所与のポリペプチド若しくはその相同体、又はＤＺドメインの変異体の断片、及びかかるポリペプチドの断片の変異体を広く企図することが理解されよう。
【００９８】
ＡＣＬＡ等の所与のポリペプチド若しくはその相同体、又はＤＺドメインの断片及び／又は変異体に関連する「機能的」という用語は、かかる断片及び変異体が、対応する上記ＡＣＬＡ等のポリペプチド若しくはその相同体、又はＤＺドメイン等のドメインの生物学的活性又は機能性を少なくとも部分的に保持することを表す。好ましくは、かかる機能的断片及び／又は変異体は、対応する上記ＡＣＬＡ等のポリペプチド若しくはその相同体、又はＤＺドメインの活性を少なくとも約２０％、例えば少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、又はさらには１００％保持し得る。場合によっては、かかる機能的断片及び／又は変異体は、対応する上記ＡＣＬＡ等のポリペプチド又はその相同体、又はＤＺドメインよりも高い活性を有する可能性さえある。
【００９９】
ＡＣＬＡ等の所与のポリペプチド若しくはその相同体、又はＤＺドメインの機能的断片及び／又は変異体は、その生物学的活性又は機能の少なくとも１つ、好ましくは複数又は全ての側面について上記ポリペプチドと機能的に等価であり得る。関連する上記ＡＣＬＡ又はその相同体の生物学的機能の側面としては、特にセルロース脱重合活性又はセルラーゼ活性、異なるセルロース基質（例えば、結晶性、半結晶性又は非結晶性のセルロース又はヘミセルロース）に対する活性プロフィール、結晶性セルロース基質を分解する能力又は選択性、及びセルロース基質と相互作用又は結合する能力が挙げられるが、これらに限定されない。関連する上記ＡＣＬＡ又はその相同体のＤＺドメインの生物学的機能の側面としては、特にセルロース結合（特に結晶性セルロース結合）活性、及び／又はオリゴマー形成活性が挙げられるが、これらに限定されない。かかる活性の上記の側面を含む、ＡＣＬＡ若しくはその相同体又はＤＺドメインの所与の断片及び／又は変異体の生物学的活性は、標準試験、例えば実施例の項に示される酵素活性試験等によって決定することができる。
【０１００】
「溶剤生産」又は「溶剤を生産する」という用語は、その技術分野で確立された（art-established）意味を有し、特に細菌（すなわち溶剤生産細菌）等の微生物の、炭水化物供給源、例えばヘキソース、ペントース又はオリゴ糖類等から１つ又は複数の非ガス状有機液体又は溶剤（特にエタノール、アセトン、ブタノール、プロピオン酸、酪酸、エーテル又はグリセリン等）を生産する能力を表す。特に、この用語は自然発生の溶剤生産生物、自然発生突然変異又は誘発突然変異を有する溶剤生産生物、及び遺伝子操作された溶剤生産生物を包含する。したがって、本発明において、「非溶剤生産」微生物という用語は、炭水化物供給源から溶剤を生産することが可能でない細菌等の微生物を指す。天然の非溶剤生産微生物としては、組み換え生産に使用される大抵の微生物、例えば大腸菌、メタノール資化酵母（Pichia pastoris）、出芽酵母（Saccharomycescerevisiae）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０１】
「エタノール生産」又は「エタノールを生産する」という用語は、細菌（すなわちエタノール生産細菌）等の微生物の、炭水化物供給源、例えばヘキソース、ペントース又はオリゴ糖類等から少なくとも、又は好ましくは主にエタノールを生産する、より好ましくは最も豊富な非ガス状発酵産物である炭水化物からエタノールを生産する能力を表すことが意図される。特に、この用語は自然発生のエタノール生産生物、自然発生突然変異又は誘発突然変異を有するエタノール生産生物、及び遺伝子操作されたエタノール生産生物を包含する。好適なこの溶剤生産微生物の例としては、クロストリジウム及びザイモモナスの株、例えば本明細書中で例示される株が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０２】
特定の成分に関連する「単離する」という用語は概して、その成分を少なくとも１つの組成物の他の成分から分離することを表し、それにより前者の成分はそこから「単離した」ものとなる。特に、「単離する」及び「単離した」という用語は、本明細書中で、試料中の所望のタンパク質（複数可）又はポリペプチド（複数可）の量の増大を指す場合もある。相対量は、単離される所望のタンパク質（複数可）又はポリペプチド（複数可）の濃度又は量と、試料中の全タンパク質の濃度又は量との比として表すことができる。さらに、この用語は、所望のタンパク質（複数可）又はポリペプチド（複数可）を非タンパク質細胞成分（例えば細胞壁、脂質、核酸等）から分離することを包含し得る。
【０１０３】
「組み換え核酸」又は「組み換え核酸分子」という用語は、本明細書中で使用される場合、概して組み換えＤＮＡ技術（例えば分子クローニング及び核酸増幅等）を用いて生成した、及び／又は結合させたセグメントを含む核酸分子（例えばＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子等）を指す。通常、組み換え核酸分子は１つ又は複数の非自然発生の配列を含み、及び／又は修飾されていない供給源ゲノムにおいて配置され得るようには配置されていない、自然発生の配列に相当するセグメントを含み得る。組み換え核酸分子は、それが導入された宿主生物において複製する場合、子孫核酸分子（複数可）も「組み換え核酸分子」という用語に包含される。
【０１０４】
特定の実施形態では、組み換え核酸分子は、例えば１つ又は複数のランダムな位置で組み込むか、若しくは例えば相同組み換えを用いて標的化された形で組み込むといったように、宿主生物のゲノムに安定して組み込むことができるか、又は組み換え核酸分子は、自己複製する（auto-replicating）ことのできる染色体外要素として存在するか、若しくはそれに含まれていてもよい。
【０１０５】
組み換えＤＮＡ技術の一般的原理を説明する標準的な参照文献としては、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed.Sambrook el al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989、Current Protocols in Molecular Biology, ed.Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992（定期的に更新される）、Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications,Academic Press: San Diego, 1990が挙げられる。微生物学の一般的原理は、例えばDavis,B. D. et al., Microbiology, 3d edition, Harper & Row, publishers, Philadelphia, Pa.(1980)に説明されている。
【０１０６】
「組み換えポリペプチド」という用語は、本明細書中で使用される場合、宿主生物又はその祖先に挿入した、ポリペプチド又はタンパク質をコードする配列を含む組み換え核酸分子の発現を通じて上記宿主生物によって産生される上記ポリペプチド又はタンパク質を指す。
【０１０７】
さらに、宿主生物、微生物又は細胞に関連する「組み換え」又は「形質転換した」という用語は、本明細書中で使用される場合、組み換え核酸分子を導入したかかる宿主生物、微生物又は細胞、及びかかる宿主生物、微生物又は細胞の組み換え子孫を包含する。
【０１０８】
したがって、「形質転換」という用語は、宿主生物、微生物又は細胞への組み換え核酸等の外来核酸の導入又は移入を包含する。そのように挿入した核酸は、好ましくは上記宿主生物、微生物又は細胞のさらなる増殖及び細胞分裂の間中維持され得る。形質転換を達成するために、エレクトロポレーション、電気透過（electropermeation）、化学的形質転換、リポフェクション、ウイルス又はバクテリオファージ媒介性トランスフェクション等の（これらに限定されない）従来の任意の遺伝子移入方法を使用することができる。
【０１０９】
「コードする」とは、核酸配列又はその一部分（複数可）が、問題の生物の遺伝子コードに基づいて、特定のアミノ酸配列、例えば所望のポリペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列に対応することを意味する。例としては、特定のポリペプチド又はタンパク質を「コードする」核酸は、ゲノム核酸、ｈｎＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、組み換え核酸又は合成核酸を包含し得る。
【０１１０】
好ましくは、特定のポリペプチド又はタンパク質をコードする核酸は、上記ポリペプチド又はタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み得る。「オープンリーディングフレーム」すなわち「ＯＲＦ」とは、翻訳開始コドンから開始して、それ自体が既知の翻訳終止コドンで終了し、いかなる内部インフレーム翻訳終止コドンも含有せず、潜在的にポリペプチドをコードすることが可能である一連のコードヌクレオチドトリプレット（コドン）を指す。したがって、この用語は当該技術分野で使用される「コード配列」と同義であり得る。
【０１１１】
一実施形態では、本発明のポリペプチド（複数可）をコードする核酸配列又はＯＲＦは、対象となる特定の生物、例えば微生物、より具体的には細菌中での発現についてそれ自体が既知であるように最適化されたコドンであり得る。様々な生物からのコドン使用バイアス及びコドン頻度が、例えばNakamura et al. 2000 (Nucl Acids Res 28: 292)によって記載されるコドン使用データベース（http://www.kazusa.or.jp/codon/）を用いて利用可能である。
【０１１２】
本明細書中で教示されるような組み換え微生物中での対象となるポリペプチドの発現は、上記ポリペプチドをコードする核酸配列又はＯＲＦ（複数可）を、上記微生物中での発現を可能とする調節配列と操作可能に結合することによって達成することができる。これに関し、組み換え生物に言及する場合のポリペプチドを「発現する」という用語は、例えば好適な培養条件下で、又は（例えば誘導性の調節配列を使用する場合）誘導因子の添加によってポリペプチドを発現することが可能な組み換え生物を包含する。
【０１１３】
「操作可能な結合」とは、調節核酸配列と発現させることが求められる配列とが上記発現が可能となるように結合した結合である。例えば、配列、例えばプロモーター及びＯＲＦ等は、上記配列間の結合の性質が、（１）フレームシフト突然変異の導入を引き起こさない、（２）ＯＲＦの転写を指示するプロモーターの能力を妨げない、（３）プロモーター配列から転写されるＯＲＦの能力を妨げない場合に操作可能に結合すると言うことができる。
【０１１４】
発現に必要とされる調節配列又は調節要素の正確な性質は、生物間で異なり得るが、典型的にはプロモーター及び転写ターミネーター、任意でエンハンサーを含むことである。
【０１１５】
「プロモーター」又は「エンハンサー」への言及は、その最も広い文脈で解釈され、正確な転写開始、並びに適用可能な場合、遺伝子発現の正確な空間的及び／又は時間的制御、又は例えば内的若しくは外的（例えば外因性）刺激へのその応答を含む。より具体的には、「プロモーター」はＲＮＡポリメラーゼが結合し、転写を開始する核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子上の領域を表す場合がある。プロモーターは必ずではないが、それが転写を制御する配列の上流、すなわち５’に位置するのが好ましい。典型的には、原核生物では、プロモーター領域はプロモーター自体、及びＲＮＡへと転写された場合に、タンパク質合成の開始を合図する配列（例えばシャイン・ダルガノ配列）の両方を含有し得る。
【０１１６】
実施形態では、本明細書中で企図されるプロモーターは、構成的又は誘導性であり得る。
【０１１７】
例としては、ザイモモナス・モビリス等のザイモモナス種中での発現に好適な構成的プロモーターとしては、ザイモモナス・モビリスのピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子のプロモーター（Ｐｐｄｃプロモーター）、並びにｔｒｐプロモーター及びｌａｃプロモーターに由来する人工Ｐｔａｃプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１８】
例としては、クロストリジウム・アセトブチリカム等のクロストリジウム種中での発現に好適な構成的プロモーターとしては、クロストリジウム・アセトブチリカムのチオラーゼ遺伝子のプロモーター（Ｐｔｈｌプロモーター）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子のプロモーター（Ｐａｄｃプロモーター）、ホスホトランスブチリラーゼ（phosphotransbutyrylase）遺伝子のプロモーター（Ｐｐｔｂプロモーター）、スタフィロコッカス・キシローサス（Staphylococcus xylosus）キシロースオペロンのキシロース誘導性プロモーター（Ｐｘｙｌプロモーター）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１９】
したがって、特定の実施形態では、オペレーターによって制御されるプロモーターであるプロモーターが提供される。本明細書中で使用される場合、「オペレーター」という用語は、プロモーターからの配列の転写の開始及び／又は維持を制御するヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡ配列を指す。典型的には、オペレーターは概して、プロモーターと、プロモーターが転写を制御する下流の配列との間に位置し得る。通常、オペレーターはリプレッサーポリペプチドに結合することが可能であり、それにより上記プロモーターからの転写を低減する。有用なリプレッサーは、オペレーターに結合している状態と、結合していない状態とを繰り返すことができ、かかる交替は外的条件、例えば外部物質又は特定の代謝産物によって有利に制御され得る。したがって、適合するリプレッサーを含む宿主細胞では、オペレーターを本発明の核酸に組み入れることによって、プロモーターの活性及びプロモーターからの発現を制御することが可能となり得る。オペレーター配列は概して、細菌染色体に由来し得る。
【０１２０】
本発明の核酸が、対象となる１つ又は２つ以上のポリペプチドをコードし得ることも理解されよう。さらに、２つ以上のポリペプチドの発現が意図される場合、上記発現は、独立した発現単位に由来するものであっても、又は共通の調節要素によって制御される２つ以上の連続ＯＲＦを含む単一の発現単位（すなわち多シストロン性（multi-cistronic）発現）に由来するものであってもよい。例としては、２つ以上のポリペプチドをコードする発現単位は、それぞれのＯＲＦの翻訳開始コドンを、翻訳開始を制御する配列（例えばリボソーム侵入配列）と結合させることによって生成され得る。
【０１２１】
「ターミネーター」又は「転写ターミネーター」という用語は概して、転写単位の終わりにある、転写の終止を合図する配列要素を指す。例えば、ターミネーターは通常、対象となるポリペプチドをコードするＯＲＦ（複数可）の下流、すなわち３'に位置している。例えば、組み換え核酸が、例えば連続して並んだ、一緒に多シストロン性転写単位を形成する２つ以上のＯＲＦを含有する場合、転写ターミネーターは有利には最も下流のＯＲＦの３'に位置し得る。
【０１２２】
好ましい実施形態では、本明細書中で教示されるようなポリペプチド（複数可）の発現を制御する調節配列が、有利には本発明の微生物を形質転換するのに使用される組み換え核酸上に与えられ得る。しかしながら、組み換え核酸が１つ又は複数の調節配列を欠いたコード配列（複数可）を与える一方で、必要とされる調節配列は形質転換した微生物によって与えられる実施形態（例えば、組み換え核酸が、好適な調節配列を含む染色体領域又はエピソーム領域に挿入される場合）も企図される。
【０１２３】
「クロストリジウム」及び「クロストリジウム・アセトブチリカム」は、本明細書中で使用される場合、当該技術分野でそのようなものとして知られる細菌分類群を指し、特に上記分類群に属する細菌、細菌種、株、亜種及び培養株、並びに修飾又は改変した、例えば突然変異又は遺伝子操作した天然又は野生型の標本の誘導体を包含する。指針としては、限定するものではないが、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能なクロストリジウムの単離株を、特にクロストリジウム・アセトブチリカムについてはアクセッション番号ＡＴＣＣ  ８２４、ＡＴＣＣ  ４２５９、ＡＴＣＣ  ３９２３６又はＡＴＣＣ  ４３０８４で注文することができる。クロストリジウム・ベエイジェリンキー（Clostridium beijerinckii）は、例えば特にアクセッション番号ＡＴＣＣ  ８５８及びＡＴＣＣ  ２５７５２で注文することができる。
【０１２４】
「ザイモモナス」及び「ザイモモナス・モビリス」は、本明細書中で使用される場合、当該技術分野でそのようなものとして知られる細菌分類群を指し、特に上記分類群に属する細菌、細菌種、株、亜種及び培養株、並びに修飾又は改変した、例えば突然変異又は遺伝子操作した天然又は野生型の標本の誘導体を包含する。指針としては、限定するものではないが、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能なザイモモナス・モビリスの単離株を、特にアクセッション番号ＡＴＣＣ  ２９１９１、ＡＴＣＣ  １０９８８、ＡＴＣＣ  ３９６７６又はＡＴＣＣ  ３１８２１で注文することができる。
【０１２５】
先述のように、本発明の溶剤生産微生物によって発現させたポリペプチドを分泌の標的とすることができる。分泌を達成するために、ポリペプチドをコードする核酸配列を、分泌シグナル配列をコードする配列に操作可能に結合することができる。これに関連して、「操作可能に結合する」とは、シグナル配列をコードする配列と、分泌されるポリペプチドをコードする配列とがインフレーム又はインフェーズ（in phase）で結合している（これにより、発現時にシグナルペプチドがシグナルペプチドにそのように結合したポリペプチドの分泌を促進する）ことを表す。
【０１２６】
好適なシグナル配列は、分泌が所望される微生物の種類によって異なり得ることが理解されよう。例えば、グラム陽性細菌とグラム陰性細菌とで異なるシグナル配列が必要とされ得る。
【０１２７】
例としては、限定するものではないが、グラム陽性細菌、特にクロストリジウム・アセトブチリカム等のクロストリジウムにおける分泌は、クロストリジウム・セルロリティカムのＣｅｌ５Ａ前駆体ポリペプチドのシグナル配列（典型的な配列：Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ５１４４４、１９９４年１０月３１日に改訂された配列バージョン１）、又はクロストリジウム・セルロリティカムのＣｉｐＣ前駆体足場タンパク質のシグナル配列（典型的な配列：Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ２８８９９、２００５年１２月５日に改訂された配列バージョン２）、又はクロストリジウム・アセトブチリカムのＣｉｐＡ前駆体足場タンパク質のシグナル配列（典型的な配列：Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＫ７８８８６、２００６年１月１９日に改訂された配列バージョン１）を用いて達成することができる。
【０１２８】
さらに、限定されるものではないが、グラム陰性細菌、特にザイモモナス・モビリス等のザイモモナスにおける分泌は、分泌経路（Sec pathway）を介して、例えばザイモモナス・モビリスのグルコノラクトナーゼ前駆体ポリペプチドのシグナル配列（典型的な配列：Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ４７６３７、２００６年１０月１９日に改訂された配列バージョン１）、若しくは炭水化物選択的ポリン（porine）ＯｐｒＢのシグナル配列（典型的な配列：Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＶ８８６８８、２００５年１月２５日に改訂された配列バージョン１）、又はツインアルギニン（twin-arginine）転座（Ｔａｔ）経路を介して、例えばザイモモナス・モビリスのグルコースフルクトースオキシドレダクターゼ（gluco fructose oxidoreductase）前駆体ポリペプチドのシグナル配列（典型的な配列：Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＢ０２４９６、２００６年１０月１９日に改訂された配列バージョン１）を用いて達成することができる。
【０１２９】
本明細書中で教示されるような微生物によって発現させるポリペプチドの天然（又は相同、内因性）シグナルペプチドを、それらが上記微生物中で機能的である限りにおいて利用してもよい。したがって、例としては、ＡＣＬＡ又は関連ポリペプチドの分泌を、ＡＣＬＡ前駆体ポリペプチドの内因性又は相同分泌シグナル配列を用いて達成することができる。特に、シュードモナス種ＮＤ１３７株はグラム陰性細菌であるため、ＡＣＬＡの内因性又は相同シグナル配列は、特に他のグラム陰性細菌、例えばザイモモナス、より具体的にはザイモモナス・モビリスにおけるＡＣＬＡの分泌に適している。他の実施形態では、ＡＣＬＡ及び関連ポリペプチド等のポリペプチドを非相同シグナル配列を用いて分泌させることができる。
【０１３０】
天然ＡＣＬＡポリペプチドのドメイン構造は、ＧＨ５−ＤＰＲ−ＣＢＭ６−ＰＳＬ−ＤＺとして略述することができ、成熟ＡＣＬＡにおけるドメイン境界の概略は図２に示される。ＡＣＬＡ又はその相同体の機能的断片は、好ましくはＧＨ５ドメイン、ＣＢＭ６ドメイン及びＤＺドメインの１つ又は複数、又はそれに相当するドメイン（例えば、ＡＣＬＡの相同体及び／又は変異体中の類似ドメイン）を含有する。好ましくは、かかる断片に含まれるドメインは本明細書中で意図されるように機能的であり得る。したがって、特定の実施形態では、本発明は以下のドメイン構成に相当するもののような断片を企図する：ＧＨ５、ＧＨ５−ＤＰＲ、ＧＨ５−ＤＰＲ−ＣＢＭ６、ＧＨ５−ＤＰＲ−ＣＢＭ６−ＰＳＬ、ＤＰＲ−ＣＢＭ６、ＤＰＲ−ＣＢＭ６−ＰＳＬ、ＤＰＲ−ＣＢＭ６−ＰＳＬ−ＤＺ、ＣＢＭ６、ＣＢＭ６−ＰＳＬ、ＣＢＭ６−ＰＳＬ−ＤＺ及びＰＳＬ−ＤＺ、ＤＺ。本発明は、ＰＳＬ−ＤＺ−ＰＳＬ−ＤＺ等（これらに限定されない）といった成熟ＡＣＬＡのドメインの組み合わせに相当する断片をさらに想定する。
【０１３１】
先述のように、本発明はＡＣＬＡ及び関連ポリペプチドと、有用な非相同ドメインとの様々な融合体にも関する。この文脈で、「非相同」という用語は、上記ドメイン（複数可）がＡＣＬＡポリペプチド又はその相同体以外のポリペプチドに由来することを表す。したがって、ドメインの組み合わせに言及する場合の「非相同」は、これらの種々のドメインが同じタンパク質に由来しない（又はその中で自然に発生しない）という事実を指す。しかし、さらなるＡＣＬＡ由来ドメイン（複数可）と、ＡＣＬＡポリペプチド若しくはその相同体、又はその断片及び／又は変異体との融合も企図され得る。
【０１３２】
「融合」という用語は、特に遺伝子融合（すなわち種々の部分を単一のオープンリーディングフレームへと融合させること）、並びに化学的及び／又は物理的手段（例えば、化学的架橋又は光カップリング（photo-coupling））によって誘発した融合を包含することが本明細書中で広く企図される。さらに、融合には直接融合、又はリンカーを介した融合が含まれる。好適なリンカーとしては、好ましくは非荷電アミノ酸（好ましくはグリシン、セリン、システイン、アスパラギン、チロシン、グルタミン、アラニン、バリン、プロリン、トレオニン、より好ましくはグリシン又はセリンから選択される）を含むか、それらについて濃縮されているか、又はそれらからなる、少なくとも３、好ましくは少なくとも４又は５、より好ましくは少なくとも７、さらにより好ましくは少なくとも１２アミノ酸、例えば３〜１５アミノ酸のペプチド配列を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１３３】
典型的なグリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）触媒ドメインは、それ自体が既知であるか、又は特に確立された手順を用いて将来同定及び単離されるグリコシドヒドロラーゼ（グリコシダーゼ）に由来し得る。典型的なグリコシダーゼとしては、ＮＣ−ＩＵＢＭＢのＥＣ  ３．２．１．「グリコシダーゼ」の分類に分けられるもの、より好ましくはセルロース系基質及びリグノセルロース系（lingo-cellulosic）基質を脱重合することが可能なグリコシダーゼ、例えばセルラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４．）、セルロース１，４−β−セロビオシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９１）及びプロセッシブエンドセルラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４．／ＥＣ  ３．２．１．９１．）が挙げられる。
【０１３４】
「炭水化物結合モジュール（複数可）（ＣＢＭ）」という用語は当該技術分野で既知であり、一般にグリコシドヒドロラーゼ中に見られるか、又はそれに由来する全ての非触媒糖又は炭水化物結合モジュールを広く包含する。本明細書中で好ましいＣＢＭモジュールとしては、セルロース又はセルロース系基質に特異的に結合するもの（代替的にはセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）と称される）を挙げることができる。ＣＭＢ、並びにその構造的特性及び機能的特性は、特にTomme et al. 1995 ("Cellulose-binding domains: classificationand properties", in Enzymatic Degradation of Insoluble Polysaccharides,Saddler JN & Penner M, eds., pp. 142-163, American Chemical Society,Washington)、及びBoraston et al. 2004("Carbohydrate-binding modules: fine tuning polysacchariderecognition". Biochem J 382: 769-81)において概説されている。
【０１３５】
「コヒーシン結合ドメイン」は、本明細書中で使用される場合、概してセルロソームスキャフォルディンサブユニットの１つ又は複数の受容体（コヒーシン）ドメインに特異的に結合することが可能な全てのポリペプチドドメインを指す。典型的なコヒーシン結合ドメインとしては、セルロソームを構築するグリコシドヒドロラーゼ中に見られるか、又はそれに由来するドッケリンドメインが挙げられる。タイプＩ及びタイプＩＩの両方のドッケリンドメインが本明細書中で企図される。ドッケリンドメインは、特にLytle et al. 2001 ("Solution structure of a type I dockerindomain, a novel prokaryotic, extracellular calcium-binding domain". J MolBiol 307: 745-753)、Adams et al. 2005 ("Structuralcharacterization of type II dockerin module from the cellulosome of Clostridiumthermocellum: calcium-induced effects on conformation and targetrecognition". Biochemistry 44: 2173-82)、及びBayer etal. 1998 ("Cellulosomes-structure and ultrastructure". J Struct Biol124: 221-234)に記載されている。本明細書中で好適なドッケリンドメインの選択の指針となるような、ドッケリン−コヒーシン相互作用を決定する好適なアッセイは、特にHaimovitz et al. 2008 ("Cohesin-dockerin microarray: Diversespecificities between two complementary families of interacting proteinmodules". Proteomics 8: 968-979)に記載されている。
【０１３６】
本明細書中で教示されるポリペプチドと、炭水化物ポリマー代謝、特にセルロース代謝に有用な他のポリペプチド又は酵素、好ましくは組み換えポリペプチド又は酵素との共発現、及び任意で共分泌がさらに企図される。「共発現」という用語は概して、同じ微生物、特に上記微生物の同じ細胞による２つ以上のタンパク質又はポリペプチドの発現（「共発現した」と言われる）に関する。２つ以上のポリペプチドの共発現を達成するのに好適な系は、それ自体が既知である。限定されるものではないが、共発現ポリペプチドは、同じか又は異なる調節要素によって制御される別個のシストロンによってコードされ得るか、又は単一の多シストロン性要素によってコードされ得る。かかるシストロンは染色体上にあっても、又は同じか若しくは異なる後成的要素上にあっても、又はその組み合わせ等であってもよい。
【０１３７】
セルロース分解に使用されるＡＣＬＡポリペプチド、その断片、変異体又は相同体を含む酵素の混合物も企図される。より具体的には、混合物は、ＡＣＬＡポリペプチドに加えて、他のセルラーゼ酵素を含み得る。本発明による混合物中では、セルラーゼ酵素は補足的な活性又は付加的な活性を有し得る。
【０１３８】
本発明による混合物は、ＡＣＬＡポリペプチド、その断片、変異体又は相同体を種々の量で含有し得る。特定の実施形態では、ＡＣＬＡポリペプチド、その断片、変異体又は相同体は酵素混合物中に、全酵素に対して約１５％〜約９９％の量で存在する。より具体的には、酵素混合物中のＡＣＬＡ、その断片、変異体又は相同体の量は約５０％〜約９９％である。より具体的には、酵素混合物中のＡＣＬＡポリペプチド、その断片、変異体又は相同体の量は約８０％〜約９９％である。
【０１３９】
「グリコシドヒドロラーゼ」又は「グリコシダーゼ」という用語は概して、グリコシド結合、より具体的にはＯ−、Ｎ−又はＳ−グリコシド結合、さらにより好ましくはオリゴ糖び／又は多糖基質中のかかる結合を加水分解することが可能な酵素及び酵素複合体を包含する。この用語は、エキソグリコシダーゼ及びエンドグリコシダーゼを包含する。この用語は、特にＮＣ−ＩＵＢＭＢのＥＣ  ３．２．１．「グリコシダーゼ」の分類に分けられるグリコシダーゼを包含する。
【０１４０】
「セルラーゼ」という用語は概して、セルロース及びセルロース含有基質を加水分解することが可能な酵素及び酵素複合体を包含する。この用語は以下のセルラーゼ型を包含するが、これらに限定されない：セロビオヒドロラーゼ（１，４−β−Ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼ、ＥＣ  ３．２．１．９１）、エンド−β−１，４−グルカナーゼ（エンド−１，４−β−Ｄ−グルカン４−グルカノヒドロラーゼ、ＥＣ  ３．２．１．４）、プロセッシブエンドセルラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４．／ＥＣ  ３．２．１．９１．）及びβ−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２１）。セルラーゼは、エンドグルカナーゼ及び（プロセッシブ）エキソグルカナーゼをさらに包含し、様々な長さのモノマー及び／又はオリゴマーを産生する酵素を包含する。この用語はセロビアーゼ、酸化的（oxidative）セルラーゼ、グルコシダーゼ、セルロースホスホリラーゼ、及びそれにより一般に表される他の酵素も包含し得る。この用語は、結晶性セルロース、半結晶性セルロース、非結晶性セルロース、ヘミセルロース及び／又は化学的若しくは生物学的に修飾したセルロース形態等（これらに限定されない）の様々な形態のセルロースを分解することが可能な酵素を包含する。
【０１４１】
例としては、限定するものではないが、第１及び第２のセルラーゼが異なる基質（例えば、結晶性セルロース、半結晶性セルロース、非結晶性セルロース又はヘミセルロース等）に選択的に作用するか、又は第１及び第２のセルラーゼが異なる産物（例えば、糖モノマー及び／又はオリゴマーの異なる集団）を産生するか、又は第１のセルラーゼが第２のセルラーゼの反応産物に作用するか、若しくはその逆である等といった場合、第１のセルラーゼは第２のセルラーゼに対して補足的な活性を有すると見なされ得る。
【０１４２】
例としては、限定するものではないが、クロストリジウム・セルロリティカムのセルロース分解系は、Belaichet al. 1997 ("The cellulolytic system of Clostridium cellulolyticum".J Biotechnol 57: 3-14)において概説されており、サッカロファガス・デグラダンスのセルロース分解系は、Taylor et al. 2006（上掲）に概説されている。
【０１４３】
本発明は、ポリペプチド、特にＡＣＬＡ及び関連ポリペプチド（例えば、ＤＺドメイン及びそれを含むポリペプチド）を含む、本明細書中で教示されるような改変セルロソームをさらに企図する。当該技術分野で既知のように、天然セルロソームは、或る特定の細菌分類群、特にクロストリジウム及びバクテロイデスの細胞外の多酵素セルロース分解複合体を表す。天然セルロソームの基本構成には、一般に１つ又は複数の同じか又は異なる炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）、並びにグリコシダーゼ又はセルロース分解酵素のセルロソーム複合体への組み込みを、上記酵素中の同族ドッケリンドメインとの相互作用によって促進する、１つ又は複数の同じか又は異なる受容体（コヒーシン）ドメインを含む組織化（organising）ポリペプチド（スキャフォルディン）が含まれる。
【０１４４】
天然セルロソームのこれらの構造的特徴を改変セルロソームにおいても利用することができ、それにより所望の炭水化物結合活性及び炭水化物脱重合活性を改変セルロソームに組み込むことができる。改変セルロソームを作製する技法は当該技術分野で確立されている（例えば、Fierobe et al. 2002 ("Degradation of cellulose substrates bycellulosome chimeras. Substrate targeting versus proximity of enzymecomponents". J Biol Chem 277: 49621-30)、Fierobe etal. 2005 ("Action of designer cellulosomes on homogeneous versus complexsubstrates: controlled incorporation of three distinct enzymes into a definedtrifunctional scaffoldin". J Biol Chem 280: 16325-34、及びPerret et al. 2004 ("Production of heterologous and chimericscaffoldins by Clostridium acetobutylicum ATCC 824". J Bacteriol 186:253-7)を参照されたい）。
【０１４５】
一般に、改変セルロソームは、炭水化物基質特異性が同じか又は相違する１つ又は複数のＣＢＭモジュール、及び同じか又は相違する同族ドッケリンドメインに結合することが可能な１つ又は複数のコヒーシンドメインを含むハイブリッド又はキメラスキャフォルディンポリペプチドを含有し得る。特にグリコシダーゼ又はセルロース分解酵素等の酵素は、スキャフォルディンポリペプチド中に見られるコヒーシンドメインについて同族のドッケリンモジュール（通常は上記酵素中に存在する、及び／又はそれに組み込まれている）を用いて、セルロソーム中に組み入れることができる。上記酵素はＣＢＭ又は他の非触媒ドメインを含み得る。かかる改変セルロソームは、当該技術分野で「キメラ」又は「ハイブリッド」セルロソーム又は「ミニセルロソーム」として一般に知られている。
【０１４６】
代替的又は付加的には、グリコシダーゼ又はセルロース分解酵素等の１つ又は複数の酵素をスキャフォルディン骨格と、例えば同じポリペプチド鎖の一部として発現させること（すなわち遺伝子融合）によって共有結合させることができる。かかるセルロソームは一般に、「共有結合」セルロソームとして知られている（Mingardon et al. 2007, "Exploration of new geometries incellulosome-like chimeras" Appl. Environ. Microbiol. 73: 7138-7149）。
【０１４７】
したがって、ハイブリッドセルロソーム、キメラセルロソーム、ミニセルロソーム若しくは共有結合セルロソーム等の改変セルロソーム、又はこれらの様相（modalities）の任意の組み合わせ、又は任意の他の改変セルロソーム形態を、本明細書中で教示されるポリペプチドと共に使用することが企図される。
【０１４８】
「セルロース」という用語は当該技術分野でそれ自体が既知である。限定するものではないが、さらなる説明によると、この用語は自然発生及び非自然発生のセルロース形態、例えば結晶性セルロース、半結晶性セルロース、微結晶性セルロース、非結晶性セルロース、ヘミセルロース、再生セルロース、及び／又は化学的若しくは生物学的に修飾若しくは誘導体化されたセルロース形態、例えばそのエーテルもしくはエステル等といったセルロースの全ての形態を包含し得る。
【０１４９】
結晶性セルロースについて濃縮されている物質は、少なくとも約１％（ｗ／ｗ）、例えば５％（ｗ／ｗ）以上、好ましくは少なくとも約１０％（ｗ／ｗ）以上、例えば２０％以上、３０％（ｗ／ｗ）以上又は４０％（ｗ／ｗ）以上、より好ましくは少なくとも約５０％（ｗ／ｗ）、例えば６０％（ｗ／ｗ）以上又は７０％（ｗ／ｗ）以上、さらにより好ましくは少なくとも約８０％（ｗ／ｗ）、例えば９０％（ｗ／ｗ）以上の当該技術分野で理解されるような結晶性セルロース、半結晶性及び／又は微結晶性セルロース、より好ましくは結晶性セルロースを含み得るが、これに限定されない。セルロース含有物質を、本明細書中で記載されるＡＣＬＡ酵素、その断片、変異体及び相同体、又は本明細書中で教示されるような組み換え微生物で処理するか、又はそれと接触させる方法及びプロセスは当該技術分野で一般に知られており、様々な規模の工業的酵素分解又は発酵プロセスを含み得るが、これに限定されない。そのように分解及び／又は発酵させる材料は、例えば固体、半固体、液体若しくは可溶性の形態で、又はホモジネート若しくは抽出物として、又は（水性）分散液若しくは懸濁液として、又は（部分的に）単離若しくは精製した、及び／又は（例えば希酸前処理、水酸化ナトリウム前処理、石灰前処理、有機溶剤と水とを用いた前処理、熱水プロセス又はＡＦＥＸによって）前処理したリグノセルロース系基質若しくはセルロース系基質若しくはセルロースとして、又はそれ自体がセルロース系材料及びバイオマスの脱重合及び／又は発酵に使用される他の好適な形態で提供され得る。したがって、本発明は、任意で１つ又は複数の他の酵素又は微生物とそれぞれ組み合わせた、本発明のポリペプチド又は微生物を含むスターター培養物も企図する。
【０１５０】
セルロースの前処理は当業者に既知であり、例えばセルロース系基質の繊維構造を破壊するため、及びセルロース系基質の続く酵素的加水分解を増進するための熱的方法、機械的方法、化学的方法、又はこれらの方法の組み合わせを含む（inclused）方法によって行われる。クラフトパルプ化、亜硫酸パルプ化、機械的パルプ化、熱的パルプ化及び化学熱機械的（chemi-thermal-mechanical）パルプ化等のパルプ化を含むが、これらに限定されない任意の前処理プロセスを、本発明の方法と組み合わせて利用することができる。代替的には、前処理プロセスは、リグノセルロース系原料からのリグニン、セルロース及びヘミセルロースの分別を助ける有機溶剤の添加も含み得る。
【０１５１】
セルロース利用のためのバイオテクノロジー的手法は、特にLynd et al. 2002 ("Microbial cellulose utilization:fundamentals and biotechnology". Microbiol Mol Biol Rev 66: 506-77)、及びHimmel et al. 2007 ("Biomass recalcitrance: engineering plantsand enzymes for biofuels production" Science 315: 804-807)において概説されている。
【０１５２】
「化学中間物」という用語は、本明細書中で使用される場合、幾つかの反応物質の産物への変換の間に生じる任意の化学物質を指す。本発明においては、プロセシングは、一連の工程を経たバイオマスの分解産物（グルコース又は別の発酵性糖等）の幾つかの所望の産物への転換を伴う。したがって、本発明によるＡＣＬＡポリペプチドによるバイオマスの分解によって生成される、バイオプロセシングの後続工程に使用することのできる全ての物質は中間物と見なされる。
【０１５３】
化学中間物を生産する方法は、化学中間物が大量に生成される方法（物理的に分離されたさらなるバイオプロセシング方法に使用される）、及び中間物が単離されず、即座に最終産物へと変換される統合バイオプロセシングの方法の両方を含み得る。
【０１５４】
セルロース含有物質をＡＣＬＡ酵素、その断片、変異体及び相同体、又は本発明による（非溶剤生産）微生物と接触させることによってセルロースを分解することを含む、本発明による溶剤、燃料又は化学中間物を生産する方法は、典型的には、セルロース又はセルロース含有材料への分解産物の変換、より具体的には溶剤、燃料又は化学中間物へのグルコースの変換を伴う工程をさらに含む。特定の実施形態では、これは本発明によるセルロース分解方法によって得られる分解産物を、グルコースを所望の溶剤へと変換することが可能な溶剤生産微生物と接触させることによって確実に行われる。かかる溶剤生産微生物には、天然で溶剤生産性である微生物、及び炭水化物供給源から溶剤を生産する能力を高めるように遺伝子操作された生物が含まれる。溶剤生産微生物は当業者に既知であり、本明細書中で記載されるものが挙げられるが、これに限定されない。さらなる特定の実施形態では、分解産物は微生物又は化学的プロセシングによって他の産物へと変換される。
【０１５５】
本明細書中で記載されるように、本発明は工業的セルロース分解、より具体的には溶剤、燃料又は化学中間物の生産におけるＡＣＬＡポリペプチド、又はその機能的断片、相同体若しくは変異体の使用をさらに提供する。実際に、単離ＡＣＬＡ酵素が他の細菌セルロース分解酵素と比べて特に高いセルロース分解活性を有することが見出された。したがって、この酵素はセルロースの大量分解、バイオリアクターにおけるセルロース含有バイオマスの大規模分解での適用に特に好適である。
【０１５６】
より具体的には、本発明は、リグノセルロース系材料若しくはセルロース系材料又はバイオマス等のセルロースを含む物質を分解する方法であって、該物質をＡＣＬＡポリペプチド又はその機能的断片、相同体若しくは変異体、又は本明細書中で教示されるようなＡＣＬＡ又はその機能的断片、相同体若しくは変異体を発現する組み換え微生物と接触させることを含む、方法を提供する。ＡＣＬＡがエンドプロセシング（endo-processing）活性を有することが観察されたが、このことはＡＣＬＡをバイオマスの工業的分解における使用に関して特に興味深いものにしている。ＡＣＬＡ酵素がセルロースをその結晶形態、すなわちその自然発生形態で直接分解することが可能であるというさらなる利点を有するということも見出されている。したがって、特定の実施形態では、本発明は結晶性セルロースを含む物質を分解する方法であって、該物質をＡＣＬＡポリペプチド又はその機能的断片、相同体若しくは変異体、又は本明細書中で教示されるようなＡＣＬＡ又はその機能的断片、相同体若しくは変異体を発現する組み換え微生物と接触させることを含む、方法を提供する。
【０１５７】
上記の態様及び実施形態は以下の非限定的な実施例によってさらに支持される。
【実施例】
【０１５８】
実施例１：ＡＣＬＡのＤＺドメインの同定
ＡＣＬＡは、シュードモナス種ＮＤ１３７に由来する遺伝子ａｃｌＡによってコードされる。図３では、ＡＣＬＡの一般的構成をＣｅｌ５Ｈの一般的構成と比較している。ＡＣＬＡは（酵素のＮ末端からＣ末端に向かって）以下の構成を有する：シグナル配列／触媒モジュール（ＧＨファミリー５）／アスパラギン酸−プロリンリンカー／ＣＢＭファミリー６に属する炭水化物結合モジュール／セリンリッチリンカー（他の表し方では、シグナル配列−ＧＨ５−ＤＰＲ−ＣＢＭ６−ＰＳＬ）。
【０１５９】
ＡＣＬＡをコードする遺伝子は既にクローニングされ、大腸菌において過剰発現されているが、対応する酵素は完全に特性決定されていない（Aoki & Kamei 2006. European Journal of Phycology 41 : 321-328）。ＡＣＬＡのコード配列は図１Ｆ（配列番号６）に示す。
【０１６０】
ＡＣＬＡは、サッカロファガス・デグラダンスに由来し、同様にＤＺドメインを有するＣｅｌ５Ｈと重要な全体的（overall）相同性を示す。
【０１６１】
実施例２：大腸菌におけるＡＣＬＡの産生及び精製
分子生物学の技法を用いて、ＡＣＬＡの成熟形態（シグナル配列を有しない）をコードする合成ＤＮＡを、大腸菌発現ベクター（ｐＥＴ２２ｂ（＋）、Novagen）にクローニングした。得られたベクターを使用して、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Novagen）を形質転換する。同様に、ＡＣＬＡの短縮形態又は改変形態をコードする修飾遺伝子をＰＣＲによって得て、ｐＥＴ２２ｂ（＋）にクローニングした後、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換する。
【０１６２】
精製を促進する目的で、４つのＨｉｓコドンを組み換えタンパク質のＣ末端（C-terminus extremity）に結合させ、ニッケル樹脂（Ｎｉ−ＮＴＡ、Qiagen）での精製を促進した。
【０１６３】
組み換え株をルリア−ベルターニ培地中で増殖させ、クローニングした遺伝子の発現を誘導因子としてＩＰＴＧを用いて誘発させた。培養物を遠心分離し、採取した細胞をフレンチプレスで破壊した。
【０１６４】
産生されたＡＣＬＡタンパク質をニッケル樹脂で精製することのできる可溶性形態で得るためには、（尿素を用いた）変性及び続く再生工程が必要であった。
【０１６５】
組み換えＡＣＬＡの合成を、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって検証した。
【０１６６】
ニッケル樹脂及び陰イオン交換ＦＰＬＣでの精製によって、純度７０％のタンパク質バッチが得られることが観察された（幾つかの分解物質も観察された）。
【０１６７】
実施例３：ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビオシド（ｐＮＰＣ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、リン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）、Ａｖｉｃｅｌ、及び未加工基質（raw substrate）である細断わら（hatched straw）を含む様々な基質に対するＡＣＬＡの活性の評価
精製したＡＣＬＡ酵素の活性を、標準条件（３７℃）を用いて様々な基質に対して試験して、同じ基質に対する精製した組み換えＣｅｌ５Ｈの活性と比較した。
【０１６８】
ＡＣＬＡの酵素活性を、可溶性発色基質であるｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビオシド（ｐＮＰＣ）に対して試験し、Ｃｅｌ５Ｈ（純度９５％）の活性と比較した。ｐ−ニトロフェニル基とセロビオースとの間の結合が酵素によって切断されると、ｐ−ニトロフェノール及びセロビオースが遊離するが、その濃度は分光学的解析を用いて直接決定することができる。ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビオシドに対するＡＣＬＡの酵素活性は１７．９ｕｉ／μｍｏｌであったが、同じ基質に対するＣｅｌ５Ｈの酵素活性は１８．２ｕｉ／μｍｏｌであった。したがって、ＡＣＬＡはｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビオシド基質に対して、Ｃｅｌ５Ｈと比べて９８％の酵素活性を示した。
【０１６９】
ＰＡＳＣ（非結晶性セルロース）に対する活性の試験については、使用される酵素濃度は５ｎＭであり、基質濃度は３．５ｇ／Ｌであった（ｐＨ６．０）。ＰＡＳＣに対するＡＣＬＡの酵素活性は７８０ｕｉ／μｍｏｌであったが、同じ基質に対するＣｅｌ５Ｈの酵素活性は１６００ｕｉ／μｍｏｌであった。したがって、ＡＣＬＡはＰＡＳＣに対して、Ｃｅｌ５Ｈと比べて４９％の酵素活性を示した。ＰＡＳＣを基質として用いた場合の時間に応じた糖の遊離を、ＡＣＬＡ及びＣｅｌ５Ｈの両方について図４に示す。
【０１７０】
Ａｖｉｃｅｌ（結晶性セルロース）に対する活性の試験については、酵素濃度は１００ｎＭであり、基質濃度は３．５ｇ／Ｌである（ｐＨ６．０）。Ａｖｉｃｅｌに対するＡＣＬＡの酵素活性は５６μＭ／２４時間であったが、同じ基質に対するＣｅｌ５Ｈの酵素活性は１４０μＭ／２４時間であった。したがって、ＡＣＬＡはＡｖｉｃｅｌに対してＣｅｌ５Ｈと比べて４０％の酵素活性を示した。Ａｖｉｃｅｌを基質として用いた場合の時間に応じた糖の遊離を、ＡＣＬＡ及びＣｅｌ５Ｈの両方について図５に示す。
【０１７１】
ＣＭＣに対する活性の試験については、酵素濃度は１ｎＭであり、基質は８ｇ／ＬのＣＭＣである（ｐＨ６．０）。
【０１７２】
実施例４：ＡＣＬＡのアビセラーゼ活性とクロストリジウム・セルロリティカムに由来する野生型及び改変セルラーゼの活性との比較
実施例３に記載されるアッセイ設計を用いて、ＡＣＬＡのアビセラーゼ活性を、クロストリジウム・セルロリティカムに由来する野生型及び改変セルラーゼの活性と比較する。
【０１７３】
酵素濃度は１００ｎＭであり、基質濃度は３．５ｇ／Ｌである（ｐＨ６．０）。
【０１７４】
ＡＣＬＡ（ＡＣＬＡｗｔ）の活性を、細断わらに対しても試験した（酵素及び基質の濃度はそれぞれ１００ｎＭ及び３．５ｇ／Ｌである）。上記に記載される速度実験は全て、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−マレイン酸（ｐＨ６．０）、１ｍＭ  ＣａＣｌ２（アジ化物は０．０１％（ｗ／ｖ））バッファー中、３７℃で行う。ＡＣＬＡのアビセラーゼ活性も、同じバッファー中で１％塩化ナトリウム（１７１ｍＭ  ＮａＣｌ）の存在下で測定する。ＡＣＬＡ酵素が、クロストリジウム・セルロリティカムに由来する野生型及び改変セルラーゼよりも有意に活性が高いことが観察される。
【０１７５】
実施例５：結晶性セルロースに対する他のセルラーゼの活性と組み合わせたＡＣＬＡの活性
純粋な結晶性セルロースの分解におけるＡＣＬＡの活性が、他のセルラーゼ酵素の活性に対して補足的又は付加的であるかを調べる速度実験を行う。
【０１７６】
これらの実験においては、以下の酵素を試験する：
クロストリジウム・セルロリティカムに由来する野生型酵素：Ｃｅｌ５Ａ（エンド）、Ｃｅｌ９Ｇ（エンド）、Ｃｅｌ９Ｍ（エンド）、Ｃｅｌ９Ｐ（エンド）、Ｃｅｌ４８Ｆ（プロセッシブ）及び（et）Ｃｅｌ９Ｅ（プロセッシブ）；
クロストリジウム・セルロリティカムに由来する修飾酵素：Ｃｉｐ０−Ｇ（エンド）；
クロストリジウム・セルロリティカム以外の生物から単離した酵素：ネオカリマスチクス・パトリシアラム（Neocallimastix patriciarum）（真菌）に由来する（de）Ｃｅｌ６Ａ（エキソ）。
【０１７７】
他のセルラーゼと組み合わせたＡＣＬＡの活性は少なくとも付加的であることが観察される。これにより、ＡＣＬＡと他の酵素との組み合わせをセルロースの分解に使用することの可能性が示される。
【０１７８】
実施例６：クロストリジウム・アセトブチリカムによるＡＣＬＡの産生及び分泌
ＡＣＬＡをコードする野生型遺伝子を、シュードモナス種の株からＰＣＲによって増幅し、大腸菌−クロストリジウム・アセトブチリカムｐＳＯＳ９５２シャトルベクターにクローニングする。このプラスミドは、クロストリジウム・アセトブチリカムに対する発現ベクターである（Perret et al. 2004. J Bacteriol 186: 253-7）。対象となる遺伝子の発現は、チオラーゼ酵素をコードする遺伝子の強力な構成的プロモーター（ｐｔｈｌ）によって制御されている。大腸菌におけるこの遺伝子のいかなる発現をも妨げるために、２つのｌａｃオペレーターをｐｔｈｌの上流及び下流に挿入する。ベクターを続いてメチル化し（ｉｎ  ｖｉｖｏではＥＲ２２７５［ｐＡＮ１］株を用い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏではメチラーゼＣｐＧを用いる）、先述したクロストリジウム・アセトブチリカム株の電気的形質転換に使用する。組み換えクローンが得られ、コロニーに対するＰＣＲ試験によって、ベクターが溶剤生産クロストリジウムにおいて無傷のままであることが示された。幾つかのクローンを２ＹＴＣ培地中で増殖させても、培養上清中では、「空の」ｐＳＯＳ９５２を保有する対照株と比べて、ｐ−ニトロフェニルセロビオシドに対するさらなる活性は検出されない（プレート上でのＣＭＣａｓｅ試験）。
【０１７９】
この新たなベクターによるクロストリジウム・アセトブチリカムの形質転換（メチル化後）によって、組み換えコロニーを生成する。シュードモナス種は２つの膜（外膜及び細胞膜）を示すグラム陰性細菌であり、一方でクロストリジウム・アセトブチリカム（グラム陽性細菌）は細胞膜しか有しない。クロストリジウム・セルロリティカムに由来するＣｅｌ５Ａのシグナル配列はクロストリジウム・アセトブチリカムによってよく分泌されるため（最大で５ｍｇ／Ｌ）、或る構築物ではＡＣＬＡの天然シグナル配列をそれに置き換える。クロストリジウム・アセトブチリカムを、このハイブリッド遺伝子を含有するベクターによって形質転換する。Ｃｅｌ５Ａシグナル配列を用いるＡＣＬＡの分泌収率を調べる。
【０１８０】
組み換え細菌株の培養株を発酵槽において、ｐＨを５．５に固定した３ｇ／Ｌの２ＹＴ−ＰＡＳＣ環境下で増殖させる。ＰＡＳＣの分解、残留セロビオースの消費（consummation）及び細菌増殖を測定する。
【０１８１】
組み換え細菌株の第２の培養株を、発酵槽において、ｐＨを５．５に固定した２ＹＴ（ただし、いかなるＰＡＳＣも含有しない）環境下で増殖させる。この実験の目的は、細菌増殖とＰＡＳＣの消費との間の相関関係を確認することである。さらに、第３の培養株を準備し、観察される細菌増殖がＡＣＬＡの活性によるものであり、クロストリジウム・アセトブチリカムの内因性酵素系の活性によるものではないかを確認する。したがって、空ベクター（ｐＳＯＳ）を含有する株の培養株を発酵槽において、ｐＨを５．５に固定した３ｇ／Ｌの２ＹＴ−ＰＡＳＣ環境下で増殖させる。
【０１８２】
最後に、第４の培養株を発酵槽において、ｐＨを５．５に固定した５ｇ／Ｌの２ＹＴ−ＰＡＳＣ環境下で増殖させ、ＰＡＳＣ濃度が細菌増殖の律速因子でないかを確認する。それによると、より高濃度のＰＡＳＣがより高いＯＤ値（すなわち以前の実験において観察された０．４５という最大ＯＤ値よりも高い）をもたらす可能性があると考えられる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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