【手続補正書】
【提出日】令和2年10月21日(2020.10.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の抗原に特異的に結合する抗体を発現するＢ細胞リンパ球を検出する方法であって、
Ｂ細胞リンパ球を含む試料をマイクロ流体デバイスに導入することであって、
前記マイクロ流体デバイスが、
フロー領域及び隔離ペンを有する囲い
を備え、
前記隔離ペンが、単一の開口部を有する分離領域及び接続領域を含み、前記接続領域が、前記分離領域と前記フロー領域との間に流体接続を提供し、前記隔離ペンの前記分離領域が、前記マイクロ流体デバイスの非掃引領域であり、
Ｂ細胞リンパ球を前記試料から前記隔離ペンの前記分離領域に装填することと、
前記対象の抗原が前記Ｂ細胞リンパ球の近くにあるように、前記対象の抗原を前記囲いの前記フロー領域に導入することと、
前記Ｂ細胞リンパ球によって発現される前記抗体への前記対象の抗原の結合を監視することと、
を含み、
前記隔離ペンの前記分離領域が、少なくとも１つの調整表面を含む、
方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの調整表面が、共有結合で連結された親水性分子の層を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記親水性分子が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）含有ポリマーを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記マイクロ流体デバイスの前記囲いが、抗体生成細胞（ＤＥＰ）構成を更に含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｂ細胞リンパ球を含む試料が、末梢血の試料、脾臓生検、骨髄生検、リンパ節生検、又は腫瘍生検である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｂ細胞リンパ球が、血漿Ｂ細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｂ細胞リンパ球を含む試料が、ヒト、マウス、ラット、モルモット、アレチネズミ、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ラマ、又はニワトリから得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｂ細胞リンパ球を含む試料が哺乳動物から得られており、
前記哺乳動物が、前記対象の抗原に対して免疫化されているか、
前記哺乳動物が、前記対象の抗原に関連付けられた病原体に露出されているか又はそれに対して免疫化されているか、
前記哺乳動物ががんを有し、前記がんが前記対象の抗原に関連付けられるか、又は
前記哺乳動物が自己免疫疾患を有し、前記自己免疫疾患が前記対象の抗原に関連付けられる、
請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｂ細胞リンパ球を含む試料が、前記マイクロ流体デバイスに導入される前にデオキシリボヌクレアーゼに接触されており、Ｂ細胞リンパ球以外の細胞タイプが枯渇している、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｂ細胞リンパ球を含む試料が、ＣＤ１３８を発現するＢ細胞リンパ球について富化されている、請求項１又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｂ細胞リンパ球を、成長誘導剤に接触させることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｂ細胞リンパ球に培地を提供することをさらに含み、前記培地が、ＩＬ−６及び／又はＡｐｒｉｌを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｂ細胞リンパ球が、３日から５日の期間にわたって培地に提供される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｂ細胞リンパ球を前記隔離ペンの前記分離領域に装填することが、ＤＥＰ力を使用して、前記Ｂ細胞リンパ球を前記フロー領域から前記分離領域に移動させることを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１５】
前記対象の抗原を提供することが、対象の可溶性抗原を含む溶液を、前記フロー領域内に又は前記フロー領域を通して流すことを含み、前記対象の抗原が、第１の検出可能な標識に共有結合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
第１の抗体結合剤を含む微小物体を提供することを更に含み、前記第１の抗体結合剤が、前記Ｂ細胞リンパ球によって発現される前記抗体への対象の抗原の結合を阻害することなく、前記Ｂ細胞リンパ球によって発現される前記抗体に結合し、前記Ｂ細胞リンパ球によって発現される前記抗体への前記対象の抗原の結合を監視することが、前記対象の抗原の前記微小物体への間接的な結合を検出することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の抗体結合剤が、前記Ｂ細胞リンパ球によって発現される前記抗体のＦｃドメインに結合する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記微小物体を提供することが、前記微小物体を含む溶液を前記フロー領域に流し、且つ前記微小物体が前記隔離ペンの近くに配置されると前記流れを停止させることを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記微小物体を含む前記溶液及び前記対象の可溶性抗原を含む前記溶液が、同じ溶液である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
第２の抗体結合剤を提供することと、
前記微小物体への前記第２の抗体結合剤の間接的な結合を監視することと、
を更に含み、
前記第２の抗体結合剤が、第２の検出可能な標識を含み、
前記第１の検出可能な標識が、前記第２の検出可能な標識と異なる、
請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２の抗体結合剤が、ＩｇＧ抗体に結合する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象の抗原を提供することが、
前記対象の抗原を含む微小物体を提供することと、
前記対象の抗原の前又は前記対象の抗原と同時に、標識された抗体結合剤を提供することと、
を含み、
前記微小物体が、細胞、リポソーム、脂質ナノラフト、又はビーズであり、
前記Ｂ細胞リンパ球によって発現される前記抗体への前記対象の抗原の結合を前記監視することが、前記対象の抗原への前記標識された抗体結合剤の間接的な結合を検出することを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記標識された抗体結合剤が、抗ＩｇＧ抗体に結合する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｂ細胞リンパ球によって発現される前記抗体への前記対象の抗原の結合を監視することが、前記マイクロ流体デバイスの前記隔離ペンの全て又は一部を撮像することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記撮像することが、蛍光撮像することを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記撮像することが、複数の画像を撮影することを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記マイクロ流体デバイスが、複数の前記隔離ペンを含み、各隔離ペンが、分離領域及び接続領域を有し、前記接続領域のそれぞれが、前記分離領域と前記フロー領域との間に流体接続を提供し、
当該方法が、
前記複数のＢ細胞リンパ球の１つ又は複数を前記複数のうちの２つ以上の隔離ペンのそれぞれの前記分離領域に装填することと、
前記対象の抗原が、１つ又は複数のＢ細胞リンパ球が装填された前記２つ以上の隔離ペンのそれぞれの近くにあるように、前記対象の抗原を前記マイクロ流体デバイスに導入することと、
前記装填されたＢ細胞リンパ球のそれぞれによって発現される前記抗体への前記対象の抗原の結合を監視することとと、
前記装填されたＢ細胞リンパ球又は前記装填されたＢ細胞リンパ球のうちのＢ細胞リンパ球によって発現される前記抗体への前記対象の抗原の結合を検出することと、
前記対象の抗原に特異的に結合する抗体を発現するものとして、前記装填されたＢ細胞リンパ球又は前記装填されたＢ細胞リンパ球のうちの前記Ｂ細胞リンパ球を識別することと、
を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
対象の抗原に特異的に結合する抗体を特徴付ける方法であって、
前記対象の抗原に特異的に結合する抗体を発現するＢ細胞リンパ球を識別することであって、前記識別することが、請求項２７に記載の方法に従って実行される、識別することと、
前記Ｂ細胞リンパ球から、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）及び／又は免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を分離することと、
前記免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする前記核酸の少なくとも一部及び／又は前記免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする前記核酸の少なくとも一部を配列決定することと、
を含む方法。
【請求項２９】
前記免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を配列決定することが、
前記識別されたＢ細胞リンパ球を溶解させることと、
前記Ｂ細胞リンパ球から単離された、前記免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするｍＲＮＡを逆転写し、ＶＨ  ｃＤＮＡを形成することと、
前記ＶＨ  ｃＤＮＡの少なくとも一部を配列決定することと、
を含む、
請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を配列決定することが、
前記識別されたＢ細胞リンパ球を溶解させることと、
前記Ｂ細胞リンパ球から単離された、前記免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするｍＲＮＡを逆転写し、ＶＬ  ｃＤＮＡを形成することと、
前記ＶＬ  ｃＤＮＡの少なくとも一部を配列決定することとと、
を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記ｍＲＮＡを逆転写することが、前記ｍＲＮＡを捕捉／プライミングオリゴヌクレオチドに接触させることを含む、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記逆転写することが、転写スイッチオリゴヌクレオチドの存在下で実行される、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記識別されたＢ細胞リンパ球が、溶解される前に前記マイクロ流体デバイスから搬出され、
前記識別されたＢ細胞リンパ球を搬出することが、
前記識別されたＢ細胞リンパ球を前記隔離ペンの前記分離領域から前記マイクロ流体デバイスの前記フロー領域に移動させることと、
前記識別されたＢ細胞リンパ球を、前記フロー領域を通して且つ前記マイクロ流体デバイスから流すことと、
を含む、
請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記識別されたＢ細胞リンパ球を前記隔離ペンの前記分離領域から移動させることが、ＤＥＰ力を使用して、前記識別されたＢ細胞リンパ球を捕捉し且つ移動させることを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＶＨ  ｍＲＮＡ及び／又は前記ＶＬ  ｍＲＮＡに結合することが可能なオリゴヌクレオチドをそれぞれ含む、１つ又は複数の捕捉ビーズを、前記識別されたＢ細胞リンパ球の近傍に提供することと、
前記識別されたＢ細胞リンパ球を溶解させることと、
前記溶解されたＢ細胞リンパ球からの前記ＶＨ  ｍＲＮＡ及び／又は前記ＶＬ  ｍＲＮＡを前記１つ又は複数の捕捉ビーズに結合させることと、
を更に含み、
前記識別されたＢ細胞リンパ球が、前記マイクロ流体デバイス内で溶解される、
請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記結合されたＶＨ  ｍＲＮＡ及び／又は前記結合されたＶＬ  ｍＲＮＡが、前記１つ又は複数の捕捉ビーズに結合されている間、ＶＨ  ｃＤＮＡ及び／又はＶＬ  ｃＤＮＡに逆転写される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＶＨ  ｃＤＮＡ及び／又はＶＬ  ｃＤＮＡが、前記１つ又は複数の捕捉ビーズに結合されている間、前記マイクロ流体デバイスから搬出される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記配列決定前に前記ＶＨ  ｃＤＮＡ及び／又は前記ＶＬ  ｃＤＮＡを増幅することを更に含み、
前記増幅することが、前記Ｂ細胞リンパ球から単離された前記逆転写されたｍＲＮＡにおいて、ＶＨ  ｃＤＮＡ及び／又はＶＬ  ｃＤＮＡ又はその断片の表現を増大させることを含む、
請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３９】
前記増幅することが、
前記Ｂ細胞リンパ球から単離された前記逆転写されたｍＲＮＡにおいて、ＶＨ  ｃＤＮＡ及び／又はＶＬ  ｃＤＮＡ又はその断片の前記表現を増大させる増幅の第１のラウンドと、
前記第１のラウンドにおいて増幅されたＶＨ  ｃＤＮＡ及び／又はＶＬ  ｃＤＮＡ又はその断片にバーコード配列を導入する増幅の第２のラウンドと、
を含む、請求項３８に記載の方法。