【手続補正書】
【提出日】令和2年10月2日(2020.10.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親糸状菌細胞由来の変異糸状菌細胞であって、配列番号６のＡｃｅ３タンパク質に対して約９０％の配列同一性を有するＡｃｅ３タンパク質をコードする、導入されたポリヌクレオチドコンストラクトを含み、親細胞と類似の条件下で培養した場合、前記親細胞と比較して、誘導基質の非存在下で目的タンパク質（ＰＯＩ）を産生する変異細胞。
【請求項２】
前記変異細胞は、前記親細胞と類似の条件下で培養した場合、前記親細胞と比較して、誘導基質の存在下でより多くの量の目的タンパク質（ＰＯＩ）をさらに産生するか、または前記変異細胞は、異種ＰＯＩをコードする導入されたポリヌクレオチドコンストラクトを含む、請求項１に記載の変異細胞。
【請求項３】
前記ＰＯＩは、内因性ＰＯＩまたは異種ＰＯＩである、請求項１または２に記載の変異細胞。
【請求項４】
前記内因性ＰＯＩは、リグノセルロース分解酵素である、請求項３に記載の変異細胞。
【請求項５】
前記リグノセルロース分解酵素は、（ａ）セルラーゼ酵素、ヘミセルラーゼ酵素、またはそれらの組み合わせからなる群、または（ｂ）ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｅｇｌ３、ｅｇｌ４、ｅｇｌ５、ｅｇｌ６、ｂｇｌ１、ｂｇｌ２、ｘｙｎ１、ｘｙｎ２、ｘｙｎ３、ｂｘｌ１、ａｂｆ１、ａｂｆ２、ａｂｆ３、ａｘｅ１、ａｘｅ２、ａｘｅ３、ｍａｎ１、ａｇｌ１、ａｇｌ２、ａｇｌ３、ｇｌｒ１、ｓｗｏ１、ｃｉｐ１およびｃｉｐ２からなる群から選択される、請求項４に記載の変異細胞。
【請求項６】
前記異種ＰＯＩは、α−アミラーゼ、アルカリα−アミラーゼ、β−アミラーゼ、セルラーゼ、デキストラナーゼ、α−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペントサナーゼ、キシラナーゼ、インベルターゼ、ラクターゼ、ナリンガナーゼ、ペクチナーゼ、プルラナーゼ、酸プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、ブロメライン、中性プロテアーゼ、パパイン、ペプシン、ペプチダーゼ、レンネット、レニン、キモシン、スブチリシン、テルモリシン、アスパラギン酸プロテイナーゼ、トリプシン、リパーゼ、エステラーゼ、ホスホリパーゼ、ホスファターゼ、フィターゼ、アミダーゼ、イミノアシラーゼ、グルタミナーゼ、リゾチーム、ペニシリンアシラーゼ；イソメラーゼ、オキシドレダクターゼ、カタラーゼ、クロロペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、リアーゼ、アスパラギン酸β−デカルボキシラーゼ、フマラーゼ、ヒスタダーゼ、トランスフェラーゼ、リガーゼ、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ラッカーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、リボヌクレアーゼおよびトランスグルタミナーゼからなる群から選択される、請求項２または３に記載の変異細胞。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドコンストラクトは、前記真菌細胞のゲノムに組み込まれている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の変異細胞。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドコンストラクトは、前記真菌細胞のゲノムのテロメア部位またはグルコアミラーゼ（ｇｌａ１）遺伝子座に組み込まれている、請求項７に記載の変異細胞。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドコンストラクトは、配列番号４、配列番号１１または配列番号１３に対して約９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、または前記コードされたＡｃｅ３タンパク質は、配列番号６、配列番号１２または配列番号１４に対して９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の変異細胞。
【請求項１０】
配列番号６、配列番号１２または配列番号１４に対して、約９０％の配列同一性を有するＡｃｅ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドＯＲＦ。
【請求項１１】
誘導基質の非存在下、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種の真菌細胞中で、内因性の目的タンパク質を産生する方法であって、
（ｉ）５’から３’の方向に、（ａ）プロモーターを含む第１の核酸配列、および（ｂ）前記第１の核酸配列に作動可能に連結した第２の核酸配列（前記第２の核酸配列は、配列番号６に対して約９０％の配列同一性を有するＡｃｅ３タンパク質をコードし、最後の４つのＣ末端アミノ酸として「Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ」を含む）、または（ｃ）前記第１の核酸配列に作動可能に連結した第２の核酸配列（前記第２の核酸配列は、配列番号１２に対して約９０％の配列同一性を有するＡｃｅ３タンパク質をコードする）を含むポリヌクレオチドコンストラクトを前記真菌細胞に導入する工程と、
（ｉｉ）真菌細胞の増殖およびタンパク質の産生に好適な条件下（このような好適な増殖条件は誘導基質を含まない）で工程（ｉ）の前記細胞を発酵させる工程と
を含む方法。
【請求項１２】
誘導基質の非存在下、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種の真菌細胞中で、異種の目的タンパク質を産生する方法であって、
（ｉ）５’から３’の方向に、（ａ）構成的プロモーターを含む第１の核酸配列、および（ｂ）前記第１の核酸配列に作動可能に連結した第２の核酸配列（前記第２の核酸配列は、配列番号６に対して約９０％の配列同一性を有するＡｃｅ３タンパク質をコードし、最後の４つのＣ末端アミノ酸として「Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ」を含む）、または（ｃ）前記第１の核酸配列に作動可能に連結した第２の核酸配列（前記第２の核酸配列は、配列番号１２に対して約９０％の配列同一性を有するＡｃｅ３タンパク質をコードする）を含むポリヌクレオチドコンストラクトを前記真菌細胞に導入する工程と、
（ｉｉ）真菌細胞の増殖およびタンパク質の産生に好適な条件下（このような好適な増殖条件は誘導基質を含まない）で工程（ｉ）の前記細胞を発酵させる工程と
を含む方法。
【請求項１３】
（ａ）前記真菌細胞は、異種ＰＯＩをコードする、導入されたポリヌクレオチドコンストラクトを含み、前記コンストラクトは、工程（ｉ）の前、工程（ｉ）の間、または工程（ｉ）の後に前記真菌細胞に導入され；
（ｂ）前記異種ＰＯＩをコードする前記ポリヌクレオチドコンストラクトは、セルロース誘導性遺伝子プロモーターの制御下で発現され；および／または
（ｃ）前記異種ＰＯＩは、α−アミラーゼ、アルカリα−アミラーゼ、β−アミラーゼ、セルラーゼ、デキストラナーゼ、α−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペントサナーゼ、キシラナーゼ、インベルターゼ、ラクターゼ、ナリンガナーゼ、ペクチナーゼ、プルラナーゼ、酸プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、ブロメライン、中性プロテアーゼ、パパイン、ペプシン、ペプチダーゼ、レンネット、レニン、キモシン、スブチリシン、テルモリシン、アスパラギン酸プロテイナーゼ、トリプシン、リパーゼ、エステラーゼ、ホスホリパーゼ、ホスファターゼ、フィターゼ、アミダーゼ、イミノアシラーゼ、グルタミナーゼ、リゾチーム、ペニシリンアシラーゼ；イソメラーゼ、オキシドレダクターゼ、カタラーゼ、クロロペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、リアーゼ、アスパラギン酸β−デカルボキシラーゼ、フマラーゼ、ヒスタダーゼ、トランスフェラーゼ、リガーゼ、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ラッカーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、リボヌクレアーゼおよびトランスグルタミナーゼからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）前記ポリヌクレオチドコンストラクトは、前記第２の核酸の３’に作動可能に連結した第３の核酸配列を含み、前記第３の核酸配列は天然のａｃｅ３ターミネーター配列を含み；
（ｂ）前記ポリヌクレオチドコンストラクトは、前記真菌細胞のゲノムに組み込まれ；  
（ｃ）前記ポリヌクレオチドコンストラクトは、前記真菌細胞のゲノムのテロメア部位に組み込まれ；
（ｄ）前記ポリヌクレオチドコンストラクトは、前記真菌細胞のゲノムのグルコアミラーゼ（ｇｌａ１）遺伝子座に組み込まれ； 
（ｅ）前記ポリヌクレオチドコンストラクトは、配列番号４、配列番号１１または配列番号１３に対して約９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み；
（ｆ）前記コードされたＡｃｅ３タンパク質は、配列番号６、配列番号１２または配列番号１４に対して９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；  
（ｇ）前記プロモーターは、ｒｅｖ３プロモーター（配列番号１５）、ｂｘｌプロモーター（配列番号１６）、ｔｋｌ１プロモーター（配列番号１７、ＰＩＤ１０４２９５プロモーター（配列番号１８）、ｄｌｄ１プロモーター（配列番号１９）、ｘｙｎ４プロモーター（配列番号２０）、ＰＩＤ７２５２６プロモーター（配列番号２１）、ａｘｅ１プロモーター（配列番号２２）、ｈｘｋ１プロモーター（配列番号２３）、ｄｉｃ１プロモーター（配列番号２４）、ｏｐｔプロモーター（配列番号２５）、ｇｕｔ１プロモーター（配列番号２６）およびｐｋｉ１プロモーター（配列番号２７）からなる群から選択される、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１５】
誘導基質の非存在下、内因性タンパク質の産生を増加させるために、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）株を遺伝子的に改変する方法であって、
（ｉ）配列番号３のＡｃｅ３−Ｓタンパク質、配列番号８のＡｃｅ３−ＳＣタンパク質、または配列番号１０のＡｃｅ３−ＬＣタンパク質をコードするａｃｅ３遺伝子のゲノムコピーを含むＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株をスクリーニングし、同定する工程（前記同定されたＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株は、配列番号６のＡｃｅ３−Ｌタンパク質、配列番号１４のＡｃｅ３−ＬＮタンパク質、または配列番号１２のＡｃｅ３−ＥＬタンパク質をコードするａｃｅ３遺伝子のゲノムコピーを含まない）と、
（ｉｉ）工程（ｉ）で同定された前記Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株に、５’から３’の方向に、（ａ）プロモーターを含む第１の核酸配列、および（ｂ）前記第１の核酸配列に作動可能に連結した第２の核酸配列を含むポリヌクレオチドコンストラクトを導入する工程（前記第２の核酸配列は、配列番号６に対して約９０％の配列同一性を有するＡｃｅ３タンパク質をコードし、最後の４つのＣ末端アミノ酸として「Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ」を含む、または前記第２の核酸配列は、配列番号１２に対して約９０％の配列同一性を有するＡｃｅ−３タンパク質をコードする）と、
（ｉｉｉ）真菌細胞の増殖およびタンパク質産生に好適な条件下（このような好適な増殖条件は誘導基質を含まない）で前記工程（ｉｉ）の細胞を発酵させる工程と
を含む方法。
【請求項１６】
親糸状菌細胞に由来する変異糸状菌細胞であって、代替プロモーターで置換された天然のａｃｅ３遺伝子プロモーターを含み、親細胞と類似の条件下で培養した場合、前記親細胞と比較して、誘導基質の非存在下でより多くの量の目的タンパク質（ＰＯＩ）を産生する変異細胞。
【請求項１７】
前記代替プロモーターは、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）プロモーターである、請求項１６に記載の変異細胞。
【請求項１８】
前記代替プロモーターは、ｒｅｖ３プロモーター（配列番号１５）、ｂｘｌプロモーター（配列番号１６）、ｔｋｌ１プロモーター（配列番号１７、ＰＩＤ１０４２９５プロモーター（配列番号１８）、ｄｌｄ１プロモーター（配列番号１９）、ｘｙｎ４プロモーター（配列番号２０）、ＰＩＤ７２５２６プロモーター（配列番号２１）、ａｘｅ１プロモーター（配列番号２２）、ｈｘｋ１プロモーター（配列番号２３）、ｄｉｃ１プロモーター（配列番号２４）、ｏｐｔプロモーター（配列番号２５）、ｇｕｔ１プロモーター（配列番号２６）およびｐｋｉ１プロモーター（配列番号２７）からなる群から選択されるプロモーターである、請求項１７に記載の変異細胞。