(57)【要約】  ＤＮＡ，ＲＮＡ等の核酸を溶解させる核酸溶解用溶媒として、例えば、アンモニウムカチオン、イミダゾリウムカチオン、ピリジニウムカチオン等を有するイオン性液体からなるものを用い、この溶媒に核酸を溶解させて保存する。これにより、ＤＮＡおよびＲＮＡ等の核酸を容易に溶解できるとともに、それらの長期保存が可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を溶解することのできるイオン性液体からなることを特徴とする核酸溶解用溶媒。
【請求項２】
前記イオン性液体を構成するカチオンが、アンモニウムカチオン、イミダゾリウムカチオンおよびピリジニウムカチオンから選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１記載の核酸溶解用溶媒。
【請求項３】
前記イオン性液体を構成するアニオンが、ハロゲン化物イオンまたは総炭素数１〜３のカルボン酸イオンであることを特徴とする請求項１または２記載の核酸溶解用溶媒。
【請求項４】
前記イオン性液体が、中和型イオン性液体であることを特徴とする請求項１記載の核酸溶解用溶媒。
【請求項５】
核酸保存用または核酸反応用であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸溶解用溶媒。
【請求項６】
核酸をイオン性液体に溶解させてなることを特徴とする核酸含有溶液。
【請求項７】
核酸をイオン性液体中に溶解させた状態で保存することを特徴とする核酸保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸溶解用溶媒、核酸含有溶液および核酸保存方法に関し、さらに詳述すると、イオン性液体からなるＤＮＡ，ＲＮＡ等の核酸溶解用溶媒、およびこの溶媒を用いた核酸含有溶液、核酸保存方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡおよびＲＮＡは、遺伝を司る遺伝情報物質である。そのゲノム情報を解読し、遺伝子配列を組み換える等のバイオテクノロジー技術を用い、遺伝子レベルでの生物種の機能改善が多方面で試みられている。
また、これらＤＮＡおよびＲＮＡの用途は、上記バイオテクノロジー分野に留まらず、ＤＮＡやＲＮＡの遺伝情報を活用した遺伝子診断、遺伝子治療、疾病原因の解明等の医療分野における新規診断・治療法としての応用も急速に進展している。【０００３】
一方で、核酸は、生物であれば必ず持っている生体高分子であり、天然に大量に存在することや、生分解性があることなど、材料として特筆すべき点が多い。しかも、ＤＮＡやＲＮＡは、化学的な手法により、さらなる高機能化が可能な材料でもある。このため、ＤＮＡおよびＲＮＡを工業的な材料として利用するための研究が進展している。【０００４】
ところで、ＤＮＡは、プリンまたはピリミジンの誘導体である含窒素複素環式塩基、すなわち、核酸塩基を１分子、デオキシリボースを１分子、リン酸を１分子含むデオキシリボヌクレオチドモノマー単位からなる鎖状の高分子である。一方、ＲＮＡも、核酸塩基を１分子、リボースを１分子、リン酸を１分子含むリボヌクレオチドモノマー単位の共有結合鎖からなる。
このように、ＤＮＡおよびＲＮＡは、親水性のリン酸および糖を主骨格として有する高分子化合物であるため、極めて親水性が高い物質である。【０００５】
ＤＮＡおよびＲＮＡの取り扱いは、これらが極めて高い親水性を有することから、従来、水を溶媒とする系でのみ取り扱われていた。
水は、核酸を溶解するのに好適な溶媒ではあるものの、使用可能な温度範囲は０〜１００℃程度と狭く、また水中では取り扱うことができない試薬などを用いた反応を起こすことができないなど、核酸を工業的に応用する際の条件が限られてしまうという問題があった。このため、使用可能な温度範囲が広く、水中では進行し難い、または水中では不可能な反応を行うことのできる溶媒が求められている。【０００６】
また、ＤＮＡ，ＲＮＡは、それぞれＤＮＡ分解酵素、ＲＮＡ分解酵素により水中では容易に加水分解を受けることが知られており、ＤＮＡおよびＲＮＡの保存に際しては、ＤＮＡ分解酵素やＲＮＡ分解酵素を除去した水中に溶存させる必要がある。
しかし、水は蒸発し易い溶媒であるため、保存容器に工夫が必要となる。しかも、生体から直接抽出した核酸試料中にＤＮＡ，ＲＮＡの分解酵素が含まれている場合や、生物の唾液中に存在している、または皮膚に付着している核酸分解酵素が外部から系内に混入した場合は、系内に存在または混入した酵素の活性によりＤＮＡまたはＲＮＡが容易に分解されることから、水を溶媒として長期的にＤＮＡ、ＲＮＡを保存することは不可能であった。【０００７】
ＤＮＡおよびＲＮＡ分解酵素を失活させる試薬を利用してＤＮＡおよびＲＮＡの長期保存を可能とする方法も知られているが、使用する試薬によっては、細胞毒性や癌原性を有するものもあり、さらには、核酸塩基を化学修飾する可能性もあるため、簡便な保存法とまではなっていない。
一方、核酸を含む試料を凍結乾燥することにより、水の非存在下において、核酸を保存することも可能であるが、この方法は、凍結乾燥機のある場所でなければ実施することができず、また乾燥後、０℃以下で保存しなければならないことから、簡便な保存法とはなり得ない。【０００８】
ＤＮＡおよびＲＮＡ分解酵素は、高濃度の無機塩を含む水溶液中では高次構造が壊れ、変性することが報告されている（非特許文献１：P.J. von Hippel, J. Biol. Chem., 10, 3913(1965)）。
この技術を応用し、ＤＮＡおよびＲＮＡを高塩濃度の水溶液に溶解させることが簡便な長期保存法となり得ると考えられる。
しかし、溶媒として水を使用することに変わりはないため、その蒸発を防止する工夫が必要であるのみならず、保存後に、ＤＮＡおよびＲＮＡを脱塩するための複雑な操作が必要となることから、長期保存法として適当なものであるとはいえない。
このように、ＤＮＡおよびＲＮＡを簡便に長期間保存し得る手法の確立が求められている。【０００９】
【非特許文献１】P.J. von Hippel, J. Biol. Chem., 10, 3913 (1965)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、ＤＮＡおよびＲＮＡ等の核酸を容易に溶解できるとともに、それらの長期保存が可能な核酸溶解用溶媒、およびこの溶媒を用いた核酸含有溶液、核酸保存方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討を重ねた結果、室温で液状の塩、すなわちイオン性液体が、ＤＮＡ，ＲＮＡを容易に溶解し得ることを見出すとともに、ＤＮＡ，ＲＮＡをイオン性液体中に溶解させた状態で長期保存が可能となることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
１．核酸を溶解することのできるイオン性液体からなることを特徴とする核酸溶解用溶媒、
２．前記イオン性液体を構成するカチオンが、アンモニウムカチオン、イミダゾリウムカチオンおよびピリジニウムカチオンから選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする１の核酸溶解用溶媒、
３．前記イオン性液体を構成するアニオンが、ハロゲン化物イオンまたは総炭素数１〜３のカルボン酸イオンであることを特徴とする１または２の核酸溶解用溶媒、
４．前記イオン性液体が、中和型イオン性液体であることを特徴とする１の核酸溶解用溶媒、
５．核酸保存用または核酸反応用であることを特徴とする１〜４のいずれかの核酸溶解用溶媒、
６．核酸をイオン性液体に溶解させてなることを特徴とする核酸含有溶液、
７．核酸をイオン性液体中に溶解させた状態で保存することを特徴とする核酸保存方法
を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の核酸溶解用溶媒は、核酸可溶のイオン性液体からなるものであるため、ＤＮＡ，ＲＮＡを容易に溶解し得るだけでなく、ＤＮＡ，ＲＮＡをイオン性液体中に溶解させた状態で長期間保存することができる。
すなわち、イオン性液体は、高イオン密度であり、また水と同様に極性が高い液体であるため、多数の親水性基を有するＤＮＡ，ＲＮＡ等を溶解することができる。
また、イオン性液体は、極めて高いイオン強度を有しており、この液体中では核酸分解酵素が失活するためか、ＤＮＡ，ＲＮＡをイオン性液体中に溶解させることで、長期間安定的な保存が可能となる。しかも、イオン性液体は、蒸気圧が極めて低いか、全く無いため、高温・減圧下でも蒸発しない。このため、保存に際して容器等に工夫をこらさなくとも、長期に亘りイオン性液体の基本性能を維持することができ、この点からしても長期保存に最適である。
さらに、イオン性液体は、広い温度域で液状を示す物質であるため、核酸の反応溶媒としてイオン性液体を使用した場合、従来の水と異なり、広い温度域での反応が可能となるだけでなく、水中で取り扱いが不可能な試薬を用いた反応を行うことも可能となるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例９，１０の可視紫外吸収スペクトルを示す図である。
【図２】実施例１１，１２の可視紫外吸収スペクトルを示す図である。
【図３】実施例１３の可視紫外吸収スペクトルを示す図である。
【図４】実施例１３のＣＤスペクトルを示す図である。
【図５】実施例１４の可視紫外吸収スペクトルを示す図である。
【図６】実施例１４のＣＤスペクトルを示す図である。
【図７】合成例８で得られたイオン性液体ＥＭＩｍ−ＨＣＯＯのＮＭＲチャートを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明についてさらに詳しく説明する。
本発明に係る核酸溶解用溶媒は、イオン性液体からなるものである。
イオン性液体としては、核酸を溶解することのできる（核酸可溶な）ものであれば、特に限定されるものではない。また、本発明においては、中和型のイオン性液体も用いることが可能である。
ここで、中和型のイオン性液体とは、酸−塩基の中和反応により得られる塩からなるイオン性液体（イオン性液体−開発の最前線と未来−、１９〜２１頁、（株）シーエムシー出版（２００３）参照）であり、プロトンが付加してなるカチオンを有することを特徴とする。【００１５】
上記イオン性液体の中では核酸の溶解性に優れているという点から、それを構成するカチオンが、アンモニウムカチオン、イミダゾリウムカチオンおよびピリジニウムカチオンから選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。中でも核酸の溶解性に著しく優れ、高濃度の核酸含有溶液を調製できることから、特にイミダゾリウムカチオンであることが好ましい。
なお、本発明において、「核酸を溶解することのできる（核酸可溶な）」とは、溶媒中に核酸を１０質量％以下、好ましくは５．０質量％以下程度の量で添加してなる白濁液を、加熱する等により核酸を溶解させて均一透明溶液とした後、室温（２０℃程度）まで冷却しても析出してこない性状をいう。【００１６】
イミダゾリウムカチオンとしては、特に限定はなく、例えば、モノアルキルイミダゾリウムカチオン、ジアルキルイミダゾリウムカチオン、トリアルキルイミダゾリウムカチオン等が挙げられ、具体例としては、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムイオン、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムイオン、１−プロピル−３−メチルイミダゾリウムイオン、１−（１，２または３−ヒドロキシプロピル）−３−メチルイミダゾリウムイオン、１，２，３−トリメチルイミダゾリウムイオン、１，２−ジメチル−３−エチルイミダゾリウムイオン、１，２−ジメチル−３−プロピルイミダゾリウムイオン、１−ブチル−２，３−ジメチルイミダゾリウムイオン、イミダゾリウムイオン、１−メチルイミダゾリウムイオン、１−エチルイミダゾリウムイオン、１，２−ジメチルイミダゾリウムイオンなどが挙げられる。
ピリジニウムカチオンとしては、特に限定されるものではなく、例えば、Ｎ−プロピルピリジニウムイオン、Ｎ−ブチルピリジニウムイオン、１−ブチル−４−メチルピリジニウムイオン、１−ブチル−２，４−ジメチルピリジニウムイオン、２−メチルピリジニウムイオン、３−メチルピリジニウムイオン、４−メチルピリジニウムイオンなどが挙げられる。【００１７】
アンモニウムカチオンとしては、特に限定されるものではないが、脂肪族または脂環式のアンモニウムイオンをカチオン成分とするものであることが好ましい。
これらの脂肪族および脂環式のアンモニウムイオンとしても、特に限定されるものではなく、例えば、ジエチルアンモニウムイオン、トリエチルアンモニウムイオン、メトキシエチルアンモニウムイオン、ジエチル（２−メトキシエチル）アンモニウムイオン、トリメチルプロピルアンモニウムイオン、トリメチルヘキシルアンモニウムイオン、テトラペンチルアンモニウムイオン、ジエチルメチル（２−メトキシエチル）アンモニウムイオン等の種々の１〜４級アルキルアンモニウムイオン、Ｎ−メチルピロリジニウムイオン、Ｎ−ブチル−Ｎ−メチルピロリジニウムイオンなどが挙げられる。【００１８】
また、イオン性液体を構成するアニオンとしては、例えば、ＢＦ4-、ＰＦ6-、ＡｓＦ6-、ＳｂＦ6-、ＡｌＣｌ4-、ＨＳＯ4-、ＣｌＯ4-、ＣＨ3ＳＯ3-、ＣＦ3ＳＯ3-、ＣＦ3ＣＯ2-、（ＣＦ3ＳＯ2）2Ｎ-、Ｃ2Ｈ5ＣＯ2-、ＣＨ3ＣＯ2-、ＨＣＯ2-、Ｃｌ-、Ｂｒ-、Ｉ-等の各種アニオンを用いることができるが、核酸の溶解性を高めるという点からハロゲン化物イオンまたは総炭素数１〜３のカルボン酸イオンが好ましく、中でもＣｌ-、Ｂｒ-、ＨＣＯ2-であることが好ましい。【００１９】
イオン性液体は、加熱真空脱水されたものであることが好ましく、その含水量としては、１．０質量％以下、好ましくは０．５質量％以下程度であることが好ましい。なお、脱水時の加熱温度、減圧度等はイオン性液体の種類に応じて適宜選定すればよい。また、含水量は、カールフィッシャー水分計による測定値である。【００２０】
本発明に係る核酸含有溶液は、上述したイオン性液体からなる核酸溶解用溶媒に核酸を溶解させてなるものである。
この場合、イオン性液体中における核酸含有量としては、使用するイオン性液体の種類によって溶解度が変動するものであるため、一概には規定できないが、通常１０質量％以下、好ましくは１．０〜５．０質量％程度である。【００２１】
イオン性液体中に、核酸を溶解させる手法としては、特に限定されるものではないが、イオン性液体中に所定量の核酸を添加した後、７０〜１２０℃程度に加熱して核酸を溶解させる方法を用いることができる。この場合、核酸がイオン性液体中に溶解したか否かは、核酸を添加した時点では白濁状の溶液が、加熱後に均一透明になることから判断できる。
本発明の核酸溶解用溶媒を用いた核酸含有溶液は、これを一旦加熱して、核酸を溶解させて均一透明状態とした後、再び１０〜２５℃程度に冷却しても、核酸が析出して白濁を呈することはない。【００２２】
以上で説明した核酸溶解用溶媒および核酸含有溶液は、ＤＮＡ，ＲＮＡ等の核酸を溶存させる必要がある全ての用途に適用可能である。
具体例としては、核酸溶解用溶媒を核酸の保存に用い、核酸含有溶液とした状態で保存することで、核酸分解酵素が失活する環境下で核酸を保存することができ、極めて簡便に核酸の長期安定保存が可能となる。この場合、保存温度としては特に限定されるものではないが、一般的な環境温度である０〜４０℃程度での保存が可能であり、特殊な環境下でなく室温にて長期間保存することができる。
また、核酸溶解用溶媒を核酸の反応に用い、この溶媒中でＤＮＡ，ＲＮＡの化学修飾反応等を行うことで、従来溶媒である水中では取り扱うことのできなかった試薬を用いた反応や、水中では進行し難い反応を、０〜１００℃の温度範囲の制限を受けることなく行うことができる。
【実施例】
【００２３】
以下、合成例および実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明するが、本発明は、下記の実施例に限定されるものではない。なお、下記実施例におけるイオン性液体の構造確認は、1Ｈ−ＮＭＲ（Ａｌｐｈａ−５００、日本電子（株）製）を用いて行った。また、合成例６〜８において、生成物中にハロゲン化物が混入していないことは０．１Ｍ硝酸銀水溶液（関東化学（株）製）を添加した際にハロゲン化銀の生成に伴う溶液の白濁が起こらないことにより確認した。さらに、イオン性液体中にＤＮＡおよびＲＮＡが溶解したことは、白濁状態から均一透明溶液になることで判断した。【００２４】
［合成例１］
Ｎ−メチルイミダゾール（アルドリッチ社製）１０ｇと３−クロロ−１−プロパノール（東京化成工業（株）製）１２ｇとを混合し、窒素雰囲気下、６０℃で還流しながら７日間攪拌した後、反応生成物をジエチルエーテル（関東化学（株）製）３００ｍｌ中に滴下し、沈殿した液体を回収した。沈殿物をメタノール（和光純薬工業（株）製）１０ｍｌに溶解させた溶液を、ジエチルエーテル３００ｍｌ中に滴下し、沈殿した液体を回収した。得られた液体をエタノール（和光純薬工業（株）製）３００ｍｌに溶解し、活性炭素粉末（和光純薬工業（株）製）２０ｇを添加し、２４時間攪拌した。その後、活性炭素粉末を濾別し、溶媒を減圧下にて留去することにより、イオン性液体ＨＯ（ＣＨ2）3ＭＩＮ−Ｃｌを得た。【００２５】
［合成例２］
Ｎ−メチルイミダゾール５ｇと３−ブロモ−１−プロパノール（アルドリッチ社製）８．５ｇとを混合し、窒素雰囲気下、６０℃で還流しながら３日間攪拌した後、反応生成物をジエチルエーテル２５０ｍｌ中に滴下し、沈殿した液体を回収した。沈殿物をメタノール１０ｍｌに溶解させた溶液を、ジエチルエーテル３００ｍｌ中に滴下し、沈殿した液体を回収した。得られた液体をメタノール３００ｍｌに溶解し、活性炭素粉末２０ｇを添加し、２４時間攪拌した。その後、活性炭素粉末を濾別し、溶媒を減圧下にて留去することにより、イオン性液体ＨＯ（ＣＨ2）3ＭＩＮ−Ｂｒを得た。【００２６】
［合成例３］
Ｎ−メチルイミダゾール１０ｇと１−クロロプロパン（東京化成工業（株）製）５０ｇとを混合し、窒素雰囲気下、４５℃で還流しながら７日間攪拌した後、未反応の１−クロロプロパンを留去し、反応生成物をジエチルエーテル３００ｍｌ中に滴下し、沈殿した液体を回収した。沈殿物をメタノール１０ｍｌに溶解させた溶液を、ジエチルエーテル３００ｍｌ中に滴下し、沈殿した液体を回収した。得られた液体をアセトニトリル（和光純薬工業（株）製）３００ｍｌに溶解し、活性炭素粉末２０ｇを添加し、２４時間攪拌した。その後、活性炭素粉末を濾別し、溶媒を減圧下にて留去することにより、イオン性液体ＰＭＩＮ−Ｃｌを得た。【００２７】
［合成例４］
Ｎ−メチルイミダゾール１０ｇと１−ブロモプロパン（関東化学（株）製）５０ｇとを混合し、窒素雰囲気下、５０℃で還流しながら４日間攪拌した後、反応生成物をジエチルエーテル３００ｍｌ中に滴下し、沈殿した液体を回収した。沈殿物をメタノール１０ｍｌに溶解させた溶液を、ジエチルエーテル３００ｍｌ中に滴下し、沈殿した液体を回収した。得られた液体をアセトニトリル３００ｍｌに溶解し、活性炭素粉末２０ｇを添加し、２４時間攪拌した。その後、活性炭素粉末を濾別し、溶媒を減圧下にて留去することにより、イオン性液体ＰＭＩＮ−Ｂｒを得た。【００２８】
［合成例５］
Ｎ−メチルイミダゾール（アルドリッチ社製）１０ｇとブロモエタン（関東化学（株）製）２０ｍｌとを混合し、窒素雰囲気下、０℃で２日間反応させた後、反応生成物をジエチルエーテル（関東化学（株）製）３００ｍｌ中に滴下し、沈殿した白色固体を回収した。沈殿物にジエチルエーテル３００ｍｌを添加して２時間攪拌した後、沈殿した白色固体を回収した。残存する溶媒を減圧下にて留去することにより、ＥＭＩｍ−Ｂｒを得た。【００２９】
［合成例６］
合成例５で得たＥＭＩｍ−Ｂｒ２ｇを脱イオン水６０ｍｌに溶解した溶液を、陰イオン交換樹脂アンバーライト ＩＲＡ−４００ （ＯＨ）（Ｓｐｅｒｃｏ社製）１５０ｍｌを充填したカラムに通し、ＥＭＩｍ−ＯＨの水溶液を得た。【００３０】
［合成例７］
合成例６で得たＥＭＩｍ−ＯＨ水溶液６０ｍｌと、プロピオン酸（関東化学（株）製）０．８ｇとを混合し、２４時間氷浴中で攪拌した後、水を減圧下にて留去し、反応生成物を得た。反応生成物をジエチルエーテル（関東化学（株）製）３００ｍｌ中に滴下し、沈殿した液体を回収した。沈殿物をメタノール（和光純薬工業（株）製）５ｍｌに溶解させた溶液を、ジエチルエーテル３００ｍｌ中に滴下し、沈殿した液体を回収した。減圧下、回収した沈殿物から残存溶媒を留去してイオン性液体ＥＭＩｍ−Ｃ2ＣＯＯを得た。【００３１】
［合成例８］
合成例６で得たＥＭＩｍ−ＯＨ水溶液６０ｍｌと、ぎ酸（和光純薬工業（株）製）０．５ｇとを混合し、２４時間氷浴中で攪拌した後、水を減圧下にて留去し、反応生成物を得た。反応生成物をジエチルエーテル（関東化学（株）製）３００ｍｌ中に滴下し、沈殿した液体を回収した。沈殿物をメタノール（和光純薬工業（株）製）５ｍｌに溶解させた溶液を、ジエチルエーテル３００ｍｌ中に滴下し、沈殿した液体を回収した。減圧下、回収した沈殿物から残存溶媒を留去してイオン性液体ＥＭＩｍ−ＨＣＯＯを得た。【００３２】
［合成例９］
Ｎ−メチルイミダゾール（ＡＣＲＯＳ  ＯＲＧＡＮＩＣＳ製）５ｇ（６１ｍｍｏｌ）と塩酸（和光純薬工業（株）製）を蒸留水にて２ｍｏｌ／ｌに希釈した塩酸水溶液３０．５ｍｌを混合し、２４時間氷浴中で攪拌した。その後、凍結乾燥および減圧することで水を留去し、イオン性液体ＭＩｍ−Ｃｌを得た。【００３３】
［合成例１０］
Ｎ−メチルイミダゾール（ＡＣＲＯＳ  ＯＲＧＡＮＩＣＳ製）５ｇ（６１ｍｍｏｌ）とギ酸（和光純薬工業（株）製）２．３ｍｌ（６１ｍｍｏｌ）を混合し、２４時間氷浴中で攪拌した。その後、水を減圧下で留去し、イオン性液体ＭＩｍ−ＨＣＯＯを得た。【００３４】
［実施例１］
合成例１で作製したイオン性液体ＨＯ（ＣＨ2）3ＭＩＮ−Ｃｌ  １ｇを１１０℃で２４時間加熱真空乾燥し、窒素雰囲気下でＤＮＡ（大和化成（株）製）１０ｍｇと混合し、密封した後、加熱しながらＤＮＡの溶解温度を記録した。その結果、ＤＮＡ１０ｍｇがイオン性液体ＨＯ（ＣＨ2）3ＭＩＮ−Ｃｌ  １ｇに完全に溶解する温度は７０℃であった。【００３５】
［実施例２］
合成例１で作製したイオン性液体ＨＯ（ＣＨ2）3ＭＩＮ−Ｃｌ  １ｇを１１０℃で２４時間加熱真空乾燥し、窒素雰囲気下でＲＮＡ（東京化成工業（株）製）１０ｍｇと混合し、密封した後、加熱しながらＲＮＡの溶解温度を記録した。その結果、ＲＮＡ１０ｍｇがイオン性液体ＨＯ（ＣＨ2）3ＭＩＮ−Ｃｌ  １ｇに完全に溶解する温度は６０℃であった。【００３６】
［実施例３］
合成例２で作製したイオン性液体ＨＯ（ＣＨ2）3ＭＩＮ−Ｂｒ  １ｇを１１０℃で２４時間加熱真空乾燥し、窒素雰囲気下でＤＮＡ１０ｍｇと混合し、密封した後、加熱しながらＤＮＡの溶解温度を記録した。その結果、ＤＮＡ１０ｍｇがイオン性液体ＨＯ（ＣＨ2）3ＭＩＮ−Ｂｒ  １ｇに完全に溶解する温度は８７℃であった。【００３７】
［実施例４］
合成例２で作製したイオン性液体ＨＯ（ＣＨ2）3ＭＩＮ−Ｂｒ  １ｇを１１０℃で２４時間加熱真空乾燥し、窒素雰囲気下でＲＮＡ１０ｍｇと混合し、密封した後、加熱しながらＲＮＡの溶解温度を記録した。その結果、ＲＮＡ１０ｍｇがイオン性液体ＨＯ（ＣＨ2）3ＭＩＮ−Ｂｒ  １ｇに完全に溶解する温度は８２℃であった。【００３８】
［実施例５］
合成例３で作製したイオン性液体ＰＭＩＮ−Ｃｌ  １ｇを１１０℃で２４時間加熱真空乾燥し、窒素雰囲気下でＤＮＡ１０ｍｇと混合し、密封した後、加熱しながらＤＮＡの溶解温度を記録した。その結果、ＤＮＡ１０ｍｇがイオン性液体ＰＭＩＮ−Ｃｌ  １ｇに完全に溶解する温度は８０℃であった。【００３９】
［実施例６］
合成例３で作製したイオン性液体ＰＭＩＮ−Ｃｌ  １ｇを１１０℃で２４時間加熱真空乾燥し、窒素雰囲気下でＲＮＡ１０ｍｇと混合し、密封した後、加熱しながらＲＮＡの溶解温度を記録した。その結果、ＲＮＡ１０ｍｇがイオン性液体ＰＭＩＮ−Ｃｌ  １ｇに完全に溶解する温度は７０℃であった。【００４０】
［実施例７］
合成例４で作製したイオン性液体ＰＭＩＮ−Ｂｒ  １ｇを１１０℃で２４時間加熱真空乾燥し、窒素雰囲気下でＤＮＡ１０ｍｇと混合し、密封した後、加熱しながらＤＮＡの溶解温度を記録した。その結果、ＤＮＡ１０ｍｇがイオン性液体ＰＭＩＮ−Ｂｒ  １ｇに完全に溶解する温度は９０℃であった。【００４１】
［実施例８］
合成例４で作製したイオン性液体ＰＭＩＮ−Ｂｒ  １ｇを１１０℃で２４時間加熱真空乾燥し、窒素雰囲気下でＲＮＡ１０ｍｇと混合し、密封した後、加熱しながらＤＮＡの溶解温度を記録した。その結果、ＲＮＡ１０ｍｇがイオン性液体ＰＭＩＮ−Ｂｒ  １ｇに完全に溶解する温度は８２℃であった。【００４２】
上記各実施例１〜８において使用したイオン性液体の構造、ＤＮＡおよびＲＮＡの各イオン性液体に対する溶解温度を表１に示す。【００４３】
【表１】
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【００４４】
［実施例９，１０］
合成例１で作製したイオン性液体ＨＯ（ＣＨ2）3ＭＩＮ−Ｃｌ  ２．５ｇを１１０℃で２４時間加熱真空乾燥した。このイオン性液体２．５ｇと、ＤＮＡ１ｍｇ（実施例９）、１．５ｍｇ（実施例１０）とを混合し、それぞれ８４℃で加熱溶解し、さらに常温で４８時間放置した。
得られた各ＤＮＡ含有溶液を、光路長１ｍｍ角型石英セルに入れ、室温で可視紫外吸収スペクトルを測定した（ＵＶ−２５００ＰＣ、（株）島津製作所製）。得られたスペクトルを図１に示す。【００４５】
図１に示されるように、得られた可視紫外吸収スペクトルは、核酸塩基に由来する２６０ｎｍ付近の吸収がＤＮＡの添加量に応じて変化し、また吸収を持たない３２０ｎｍ以上の波長域での吸光度がゼロであったことから、イオン性液体中にＤＮＡが常温においても溶存していることがわかる。【００４６】
［実施例１１，１２］
合成例１で作製したイオン性液体ＨＯ（ＣＨ2）3ＭＩＮ−Ｃｌ  ２．５ｇを１１０℃で２４時間加熱真空乾燥した。このイオン性液体２．５ｇと、ＲＮＡ１ｍｇ（実施例１１）、１．５ｍｇ（実施例１２）とを混合し、それぞれ７４℃で加熱溶解し、さらに常温で４８時間放置した。得られた各ＲＮＡ含有溶液について、実施例９と同様にして可視紫外吸収スペクトルを測定した。得られたスペクトルを図２に示す。
図２に示されるように、得られた可視紫外吸収スペクトルは、核酸塩基に由来する２６０ｎｍ付近の吸収がＲＮＡの添加量に応じて変化し、また吸収を持たない３２０ｎｍ以上の波長域での吸光度がゼロであったことから、イオン性液体中にＲＮＡが常温においても溶存していることがわかる。【００４７】
［実施例１３］
実施例１で調製したＤＮＡ含有溶液を１２０時間保存した後、これに２−プロパノール（東京化成工業（株）製）３ｍｌを混合した。この混合溶液を室温下、遠心分離器（ＫＡ−１０００、（株）久保田製作所製）により３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行った後、上澄み溶液を除去した。沈殿物にエタノール３ｍｌを加え、さらに３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行った後、上澄み溶液を除去した。
沈殿物を０．２ｍｌの蒸留水に溶解し、塩化ナトリウム（和光純薬工業（株）製）１０ｍｇを添加した後、エタノール２ｍｌを添加した。得られた溶液を、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行い、上澄み溶液を除去した。沈殿物に、８５質量％エタノール水溶液２ｍｌを混合し、３０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離を行った。上澄み溶液を除去し、沈殿物に、再び８５質量％エタノール水溶液２ｍｌを混合して３０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離を行った後、上澄み溶液を除去し、最終的に得られた沈殿物を常温で真空乾燥した。【００４８】
乾燥して得られた白色粉末状のＤＮＡ２ｍｇを蒸留水５ｍｌに溶解し、実施例９と同様にして可視紫外吸収スペクトルを測定した。得られたスペクトルを図３に示す。
図３に示されるように、核酸塩基に由来する２６０ｎｍの吸収があり、対照ＤＮＡと同様の吸収スペクトルが得られたことから、保存後に単離した白色粉末はＤＮＡであることが確認された。【００４９】
さらに白色粉末状のＤＮＡ２ｍｇを蒸留水５ｍｌに溶解した溶液を光路長１ｍｍの角形石英セルにしれ、室温下、ＣＤスペクトルを測定した（Ｊ−７２０、日本分光（株）製）。得られたスペクトルを図４に示す。
図４に示されるように、対照ＤＮＡと同様のスペクトルが得られたことから、保存後に単離した白色粉末は、天然ＤＮＡと同様に右巻き２重らせん構造を保持していることが確認された。【００５０】
［実施例１４］
実施例２で得られたＲＮＡ含有溶液を用いた以外は、実施例１３と同様にして白色粉末状のＲＮＡを単離した。
この白色粉末ＲＮＡについて、実施例１３と同様にして可視紫外吸収スペクトルおよびＣＤスペクトルを測定した。得られたスペクトルをそれぞれ図５，６に示す。
図５に示されるように、核酸塩基に由来する２６０ｎｍの吸収があり、対照ＲＮＡと同様の吸収スペクトルが得られたことから、保存後に単離した白色粉末はＲＮＡであることが確認された。図６に示されるように、対照ＲＮＡと同様のスペクトルが得られたことから、保存後に単離した白色粉末は、天然ＲＮＡと同様に右巻き２重らせん構造を保持していることが確認された。【００５１】
［実施例１５］
合成例７で作製したイオン性液体ＥＭＩｍ−Ｃ2ＣＯＯ  １ｇを、９０℃で３６時間加熱真空乾燥し、窒素雰囲気下でＤＮＡ（大和化成（株）製）５ｍｇと混合し、密封した後、加熱しながらＤＮＡの溶解温度を記録した。その結果、ＤＮＡ５ｍｇがイオン性液体ＥＭＩｍ−Ｃ2ＣＯＯ  １ｇに完全に溶解する温度は７０℃であった。【００５２】
［実施例１６］
合成例７で作製したイオン性液体ＥＭＩｍ−Ｃ2ＣＯＯ  １ｇを、９０℃で３６時間加熱真空乾燥し、窒素雰囲気下でＲＮＡ（東京化成工業（株）製）５ｍｇと混合し、密封した後、加熱しながらＲＮＡの溶解温度を記録した。その結果、ＲＮＡ５ｍｇがイオン性液体ＥＭＩｍ−Ｃ2ＣＯＯ  １ｇに完全に溶解する温度は６０℃であった。【００５３】
［実施例１７］
合成例８で作製したイオン性液体ＥＭＩｍ−ＨＣＯＯ  １ｇを、９０℃で３６時間加熱真空乾燥し、窒素雰囲気下でＤＮＡ５ｍｇと混合し、密封した後、加熱しながらＤＮＡの溶解温度を記録した。その結果、ＤＮＡ５ｍｇがイオン性液体ＥＭＩｍ−ＨＣＯＯ  １ｇに完全に溶解する温度は６０℃であった。【００５４】
［実施例１８］
合成例８で作製したイオン性液体ＥＭＩｍ−ＨＣＯＯ  １ｇを、９０℃で３６時間加熱真空乾燥し、窒素雰囲気下でＲＮＡ５ｍｇと混合し、密封した後、加熱しながらＲＮＡの溶解温度を記録した。その結果、ＲＮＡ５ｍｇがイオン性液体ＥＭＩｍ−ＨＣＯＯ  １ｇに完全に溶解する温度は４８℃であった。
上記実施例１５〜１８において使用したイオン性液体の構造、ＤＮＡおよびＲＮＡの各イオン性液体に対する溶解温度を表２に示す。【００５５】
【表２】
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【００５６】
［実施例１９］
合成例９で作製したイオン性液体ＭＩｍ−Ｃｌ  １ｇを７０℃で１６時間加熱真空乾燥し、窒素雰囲気下でＤＮＡ（（株）ニチロ製）１０ｍｇと混合し、密封した後、加熱しながらＤＮＡの溶解温度を記録した。その結果、ＤＮＡ１０ｍｇがイオン性液体ＭＩｍ−Ｃｌ  １ｇに完全に溶解する温度は７６℃であった。【００５７】
［実施例２０］
合成例１０で作製したイオン性液体ＭＩｍ−ＨＣＯＯ  １ｇを７０℃で１６時間加熱真空乾燥し、窒素雰囲気下でＤＮＡ（（株）ニチロ製）１０ｍｇと混合し、密封した後、加熱しながらＤＮＡの溶解温度を記録した。その結果、ＤＮＡ１０ｍｇがイオン性液体ＭＩｍ−ＨＣＯＯ  １ｇに完全に溶解する温度は８５℃であった。【００５８】
上記各実施例１９および２０において使用したイオン性液体の構造、ＤＮＡの各イオン性液体に対する溶解温度を表３に示す。【００５９】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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