(57)【要約】  要約書：本発明は、ヘルパーウィルスの存在下で線状発現コンストラクトを使用するマイナス鎖の分節化したＲＮＡウィルスの作製方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイナス鎖の分節化したＲＮＡウィルスの生産方法であって、
ａ）いかなる増幅及び／又は選択配列も含まない線状発現コンストラクトを提供する工程、このコンストラクトは、ＲＮＡポリメラーゼＩ（polI）プロモーター及びpolＩ終結シグナルを含み、両者はＲＮＡポリメラーゼＩＩ（polII）プロモーター及びポリアデニル化シグナルの間に挿入されており、このコンストラクトはさらに、polＩプロモーター及びpolＩ終結シグナルの間に挿入されたＨＡ及び／又はＮＡ遺伝子分節を含有する、
ｂ）宿主細胞を前記線状発現コンストラクトでトランスフェクションする工程、
ｃ）前記宿主細胞を、ヘルパーウィルスＨＡ及び／又はＮＡタンパク質を有するヘルパーウィルスで感染させる工程、
ｄ）前記宿主細胞を、ウィルス粒子を増殖させるために培養する工程、
ｅ）ウィルス粒子を選択する工程、これは、
（ｉ）前記線状発現コンストラクト由来の前記ＨＡ及び／又はＮＡタンパク質を含有するが、
（ｉｉ）前記ヘルパーウィルスＨＡ及びＮＡタンパク質、又はこの分節を含有しない、
その際、前記選択は、前記ＨＡ及び／又はＮＡタンパク質のフェノタイプの、ゲノタイプの又は抗原の特性に基づく、及び場合により
（ｆ）ヘルパーウィルスＨＡ及びＮＡタンパク質の非存在が、核酸又はアミノ酸配列の分析により決定される工程
を含む生産方法。
【請求項２】
宿主細胞が、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＳ、Ｍ及びＮＰからなる群から選択されるタンパク質をコードする線状コンストラクトでトランスフェクションされる請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ヘルパーウィルス由来のＨＡタンパク質を含有する子孫ウィルス粒子が、子孫ウィルス粒子をプロテアーゼで処理することにより候補ウィルス粒子から分離され、その際、前記プロテアーゼは、ヘルパーウィルス由来のＨＡタンパク質を切断しないが、前記候補ウィルス粒子のＨＡタンパク質を切断する請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記プロテアーゼが、トリプシン、エラスターゼ、キモトリプシン、パパインからなる群から選択される請求項１から３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
ヘルパーウィルスのＨＡタンパク質が、プロテアーゼにより切断されるように改変され、その際、前記プロテアーゼがトリプシンでない請求項１又は２記載の方法。
【請求項６】
ヘルパーウィルス起源のＨＡ及びＮＡタンパク質を含有する子孫ウィルス粒子が、低ｐＨ条件を提供することにより候補ウィルス粒子から分離される請求項１又は３記載の方法。
【請求項７】
ヘルパーウィルス起源のＨＡ及び／又はＮＡタンパク質を含有する子孫ウィルス粒子が、この子孫ウィルスと、前記ＨＡ及び／又はＮＡタンパク質に結合する抗体とを接触させることにより候補ウィルス粒子から分離される請求項１から６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記ヘルパーウィルス粒子が、減少した活性を有するＮＡタンパク質を含有するか、又は機能的ＮＡタンパク質を欠損する請求項１から７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
ヘルパーウィルスが、インフルエンザＣウィルスのＨＥＦタンパク質を含有する請求項１から８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
ヘルパーウィルスのＨＥＦタンパク質が、プロテアーゼにより切断されるように改変され、その際、前記プロテアーゼがトリプシンでない請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ヘルパーウィルスが、コロナウィルスのＨＡタンパク質を含有する請求項１から８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記ウィルス粒子が、インフルエンザウィルス粒子である請求項１から１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
前記ウィルス粒子が、弱毒したインフルエンザウィルス粒子である請求項１から１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
前記ウィルスが、ＮＳ１遺伝子内で欠失又は改変を含む請求項１から１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
前記ヘルパーウィルスが、改変したか又は欠失したＮＳ遺伝子を含有し、かつ、インターフェロンコンピテント細胞において成長不全である請求項１から１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
前記ヘルパーウィルスが、生産すべきウィルスに対して同一である、少なくとも４、好ましくは少なくとも５、好ましくは６の分節を含有する請求項１から１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
以下の配列ＰＳＩＱＰＩＧＬＦＧＡ（配列番号７）を含有するＨＡポリペプチドフラグメント。
【請求項１８】
配列ＣＣＡＴＣＣＡＴＴＣＡＡＣＣＣＡＴＴＧＧＴＴＴＧＴＴＴＧＧＡＧＣＣ（配列番号９）を含有するＨＡヌクレオチド配列フラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘルパーウィルスの存在下で線状発現コンストラクトを使用するマイナス鎖の分節化したＲＮＡウィルスの作製方法を提供する。
【０００２】
背景技術
マイナス鎖ＲＮＡウィルスは、インフルエンザ、はしか、ムンプス、狂犬病、ＲＳウィルス、エボラ及びハンタウィルスを含むいくつかの重要なヒトの病原体を包含する動物ウィルスの一群である。
【０００３】
これらＲＮＡウィルスのゲノムは、単分子であるか又は分節化していてよく、（−）極性の単鎖である。２つの本質的な要求が、これらウィルス間で共有されている：そのゲノムＲＮＡｓはウィルスＲＮＡ中へと効率的にコピー導入されなくてはならず、この形態は、子孫ウィルス粒子中への組み込みのために使用され、かつ、ウィルスタンパク質へと翻訳されるｍＲＮＡへと転写されることができる。真核性宿主細胞は典型的には、ＲＮＡテンプレートの複製のための又はマイナス鎖のＲＮＡテンプレートからのポリペプチドの翻訳のための機構を含まない。したがって、マイナス鎖のＲＮＡウィルスは、子孫ウィルスへのアセンブリーのために新規ゲノムＲＮＡの、及び、ウィルスタンパク質への翻訳のためにｍＲＮＡｓの、合成を触媒作用するために、ＲＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードしかつ所有する。
【０００４】
ゲノムウィルスＲＮＡは、ウィルスが伝達されるように、ウィルス粒子中へとパッケージされなくてはならない。子孫ウィルス粒子がアセンブリー化されるプロセス及びアセンブリーの間に生じるタンパク質／タンパク質相互作用は、ＲＮＡウィルス間で類似している。ウィルス粒子の形成は、ＲＮＡゲノムを１の宿主細胞から別の宿主細胞へと単一の宿主内で又は異なる宿主生物間で効率的に伝達することを保証する。
【０００５】
ネガティブ−センスゲノムを有する、エンベロープ付きの、単鎖ＲＮＡを含むウィルス科は、分節化してないゲノムを有する群（パラミクソウィルス科（Paramyxoviridae）、ラブドウィルス科（Rhabdoviridae）、フィロウィルス科（Filoviridae）及びボルナ病ウィルス（Borna Disease Virus）、トガウィルス科（Togaviridae））、そして、分節化ゲノムを有する群（オルトミクソウィルス科（Orthomyxoviridae）、ブンヤウィルス科（Bunyaviridae）及びアレナウィルス科（Arenavihdae））に分類される。オルトミクソウィルス科は、インフルエンザ、タイプＡ、Ｂ及びＣウィルス、また同様にトゴト（Thogoto）及びドリウィルス（Dhori viruse）及び感染性サケ貧血ウィルスのウィルスを含む。
【０００６】
インフルエンザビリオンは、単鎖ＲＮＡゲノムを含む内側リボ核タンパク質コア（ヘリックス状ヌクレオキャプシド）及びマトリックスタンパク質（Ｍ１）により内部で裏打ちされている外側リポタンパク質エンベロープからなる。インフルエンザＡウィルスの分節化したゲノムは、８つの分子の、線状の、負の極性の、単鎖のＲＮＡｓからなり、このＲＮＡｓは次のものを含めた１１つのポリペプチドをコードする（いくつかのインフルエンザＡ株においては１０つ）：ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼタンパク質（ＰＢ２、ＰＢ１及びＰＡ）及び核タンパク質（ＮＰ）、これはヌクレオキャプシドを形成する；マトリックス膜タンパク質（Ｍ１、Ｍ２）；２の表面糖タンパク質、これは脂質含有エンベロープから放出される：ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）；非構造タンパク質（ＮＳ１）及び核輸送タンパク質（ＮＥＰ）。大抵のインフルエンザＡ株は、アポトーシス促進特性を有すると思われている第１１番目のタンパク質（ＰＢ１−Ｆ２）をもコードする。
【０００７】
ウィルスゲノムの転写及び複製は、核中で生じ、アセンブリーは形質膜上での出芽を介して生じる。ウィルスは、混合した感染の間に遺伝子をリアソート（reassort）することができる。インフルエンザウィルスは、ＨＡを介して、細胞膜糖タンパク質及び糖脂質中のシアリルオリゴ糖に吸着する。ビリオンのエンドサイトーシスに続き、ＨＡ分子中のコンフォメーション変化が細胞エンドソーム内で生じ、これは、膜融合を容易にし、このようにして脱外被を引き起こす。ヌクレオキャプシドは、ウィルスＲＮＡが転写される核へと移動する。ウィルスｍＲＮＡは、ウィルスエンドヌクレアーゼが細胞の非相同ｍＲＮＡｓ（heterologous mRNAs）からキャップ化５′末端を切断する独特の機構により転写され、このｍＲＮＡｓは次いで、ウィルストランスクリプターゼによるウィルスＲＮＡテンプレートの転写のためのプライマーとして機能する。転写産物は、そのテンプレート末端から１５〜２２塩基の部位で終結し、ここではオリゴ（Ｕ）配列がポリ（Ａ）領域（poly(A) tract）の付加のためのシグナルとして機能する。このように生産される８つのウィルスＲＮＡ分子のうち、６つがモノシストトニックメッセージであり、これはＨＡ、ＮＡ、ＮＰを示すタンパク質、及びウィルスポリメラーゼタンパク質ＰＢ２、ＰＢ１及びＰＡ中に直接的に翻訳される。他の２つの転写物はスプライスングを受け、それぞれ２つのｍＲＮＡｓを生じ、これは、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１及びＮＥＰを生産するための異なるリーディングフレームに翻訳される。言い換えると、８つのウィルスＲＮＡ分節は、１１つのタンパク質をコードする：９つの構造的タンパク質及び２つの非構造的タンパク質（ＮＳ１及び最近発見されたＰＢ１−Ｆ２）である。
【０００８】
インフルエンザウィルスのための、特に高病原性トリインフルエンザウィルスのための現代のワクチンの作製は、リバースジェネティクスの使用に頼っており、これは、ＤＮＡからのインフルエンザウィルスの生産を可能にする。マイナス鎖のＲＮＡインフルエンザウィルスの構築のための第１のリバースジェネティクスシステムは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ再構成したリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体と混合した単独ウィルス遺伝子のトランスフェクション及び引き続くインフルエンザヘルパーウィルスでの感染を伴った。ＲＮＰ複合体は、合成ＲＮＡ転写物を精製ＮＰ及びポリメラーゼタンパク質（ＰＢ１、ＰＢ２及びＰＡ）（インフルエンザウィルス由来）でインキュべーションすることにより作成されており、ヘルパーウィルスは、ウィルスタンパク質の、及び、他のｖＲＮＡｓの、細胞内供給源として使用された（Luytjes et al., 1989, 0611, 59, 1107-1113）。
【０００９】
Neumann et al.(1994, Virology, 202, 477-479)は、マウスＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター応答性プラスミドからのＲＮＡの発現後にインフルエンザ−感染させた細胞中でのウィルスモデルＲＮＡｓのＲＮＰ形成を達成した。Pleschka et al.(1996, J. Virol., 4188-4192)は、ＲＮＰ複合体がプラスミドベースの発現ベクターから再構成された方法を説明した。ウィルスＲＮＡ様転写物の発現は、短縮したヒトポリメラーゼＩ（polI）プロモーター及びリボザイム配列を含有するプラスミドから達成され、これは自己触媒切断により３′末端で作成された。polＩ駆動されたプラスミドを、ヒト２９３細胞中にpolＩＩ応答性プラスミドで共トランスフェクションし、これはウィルス性ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ及びＮＰタンパク質を発現した。トランスフェクション効率は極めて低かったが、トランスフェクションにつき約１０つのトランスフェクタントウィルス粒子を伴う。さらに、このプラスミドをベースとする戦略は、ヘルパーウィルスの助けに依存する。
【００１０】
ＷＯ０１／０４３３３においては、分節化したマイナス鎖ＲＮＡウィルスを、ゲノム性ｖＲＮＡ分節及びＲＮＰタンパク質を発現するための１セットの１２つの発現プラスミドを使用して構築した。ＷＯ０１／０４３３３に説明されたベクターは、良く知られているｐＵＣ１９又はｐＵＣ１８プラスミドをベースとした。発明の詳細な説明によれば、このシステムは、インフルエンザウィルスの８つの分節全てを発現する８つのプラスミド１セットを、核タンパク質及びＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼ（ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ及びＮＰ）のサブユニットを発現する４つのプラスミドの付加的な１セットと一緒に必要とする。
【００１１】
ＷＯ００／６００５０は、１セットの、インフルエンザウィルス分節ｃＤＮＡ（ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、Ｍ）に操作可能に連結された、及び、転写終結配列に連結されたプロモーターを含有する少なくとも２つのベクター、及びインフルエンザウィルス分節ＤＮＡ（ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ）に操作可能に連結されたプロモーターを含有する少なくとも２つのベクターを包含する。このシステムは、１つのプラスミドに組み合わせられた４つのウィルスＲＮＡ合成のための８つのＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセットを有するプラスミドを用いることにより、多数の異なるベクターを使用することの困難性を克服することを試みた。
【００１２】
ＷＯ０１／８３７９４は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（polII）プロモーター及びポリアデニル化シグナルの間に挿入された、ＲＮＡポリメラーゼＩ（polI）プロモーター及びpolＩ終結シグナルを含有する環状発現プラスミドを開示する。本願により、ベクターとの用語は、一般的に、付加的な外来ＤＮＡを許容できる二重鎖ＤＮＡの自蔵式分子（a self-contained molecule）であり、かつ、適した宿主細胞中に容易に導入されることができるプラスミドとして説明される。
【００１３】
ＷＯ２００９／００８９１は、インフルエンザウィルス遺伝子分節の発現のための線状発現コンストラクト及びその使用を説明する。
【００１４】
Ozawa M. et al(J.Virol, 2007, vol. 81 , pp. 9556-9559)は、アデノウィルスベクターを使用するインフルエンザＡウィルス作製のためのリバースジェネティクスシステムを説明する。Hoffmann E. et al(Virology, 2000, 267, pp. 310-317)は、両方向性転写コンストラクトを使用する１のテンプレートからのウィルスＲＮＡ及びｍＲＮＡの作製によるインフルエンザウィルスの作出のためのシステムを開示する。８つのプラスミドからのインフルエンザＢウィルスのレスキューもHoffmann et al.(Proc.Natl.Acad.Sci., 2002, 99, pp. 11411 -11416)に開示されている。
【００１５】
ウィルス疾病により引き起こされるエピデミック及びパンデミックは、未だヒト生命を奪うものであり、かつ、世界経済に影響を及ぼす。インフルエンザは、数百万の仕事休み日及び医師の診察、世界的に数十万の入院患者（Couch 1993, Ann. NY. Acad. Sci 685;803）、数万の超過死亡（Collins & Lehmann 1953 Public Health Monographs 213:1 ; Glezen 1982 AmJ. Public Health 77:712）及び数十億ユーロのヘルスケアコスト（Williams et al. 1988, Ann. Intern. Med. 108:616）の原因である。健康な成年が免疫化すると、現在入手可能なワクチンは７０〜９０％の場合に臨床的疾病を予防する。このレベルは、６５歳を超える場合に３０〜７０％に減少し、ナーシングホームで暮らす６５歳以上ではさらに一層減少する（Strategic Perspective 2001 : The Antiviral Market. Datamonitor. p. 59）。このウィルスの低頻度抗原変化はさらに、より多数の死亡者数に寄与し、というのも、年間のワクチン接種でさえ保護を保証できないからである。このようにして、Ｕ．Ｓ．死亡者数は、１９７６／７７の１６３６３名から１９９８／９９には４倍も増加した（Wall Street Journal, Flu-related deaths in US despite vaccine researches. January 7, 2003）。
【００１６】
特にパンデミックウィルス疾病の大発生の場合には、ワクチン接種又は処置をこの疾病の大発生の直後に提供することが最も重要になる可能性がある。ウィルス性疾病の効率的な保護及び処置を提供するとの緊急の必要性の観点において、未だに高い需要が、当該発現技術の欠点及び困難性を克服でき、かつ、ウィルス発現のための代替的方法を提供する、ウィルス生産のために経済的な、迅速かつ効率的な発現システムの開発について存在する。この課題は、本願の実施態様の提供により達成される。
【００１７】
発明の簡単な概要
本発明は、ヘルパーウィルスの存在下でＲＮＡウィルスの発現のために線状発現コンストラクトが使用される代替技術を提供する。
【００１８】
意外なことに、ＲＮＡポリメラーゼＩ（polI）プロモーター及びpolＩ終結シグナルであってＲＮＡポリメラーゼＩＩ（polII）プロモーター及びポリアデニル化シグナルの間に挿入されたものを含み、ＨＡ及び／又はＮＡ遺伝子分節であってpolＩプロモーター及びpolＩ終結シグナルの間に挿入されたものを含有する、いかなる増幅及び／又は選択配列も含まない少なくとも１の線状発現コンストラクトの使用が、ヘルパーウィルスの存在下で、ウィルス粒子の迅速なレスキューのための効率的なツールを提供することが見出された。知られている技術により使用される方法とは対照的に、細菌細胞中でのクローニング工程は必要でなく、宿主細胞はウィルスゲノムの全分節でトランスフェクションされる必要はない。具体的には、１又は２だけの分節、すなわち、ＨＡ及び／又はＲＡをコードする遺伝子でのトランスフェクションが、ウィルス全体の発現のために十分であることができる。したがって、ウィルス粒子の十分な量のトランスフェクション及び発現のために必要な時間が極めて減少される。
【００１９】
例えば、ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５８１８２（これは参照により本願に取り込まれる）に説明されるような線状発現コンストラクトは、ヘルパーウィルスの存在下で、ＲＮＡウィルス、具体的には、野生型、突然変異体又はリアソータント株のいずれかのインフルエンザウィルスを含有するワクチンの開発のために使用されることができる。これは、インフルエンザエピデミック又はパンデミックの発生の場合に必要とされる任意のウィルスワクチンの迅速な作成のためのツールを提供する。
【００２０】
さらに、本発明は、ヘルパーウィルスの除去のための改善された方法を提供し、かつ、改善された選択及び精製目的のために改変された切断部位を有するＨＡ分節を提供する。
【００２１】
図
図１ａ及び１ｂは、線状両方向性発現コンストラクトの作製を描写する概要図である。図１ａは、フラグメントＦ１、Ｆ２及びＦ３を示し、これはＰＣＲ増幅により別個に作製されている。図１ｂは、フラグメントＦ４を示し、これはオリゴヌクレオチドＰ４及びＰ６を使用するオーバーラップＰＣＲにより作製されている。
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明は、マイナス鎖の分節化したＲＮＡウィルスの生産方法であって、
ａ）いかなる増幅及び／又は選択配列も含まない線状発現コンストラクトを提供する工程、このコンストラクトは、ＲＮＡポリメラーゼＩ（polI）プロモーター及びpolＩ終結シグナルを含み、両者はＲＮＡポリメラーゼＩＩ（polII）プロモーター及びポリアデニル化シグナルの間に挿入されており、このコンストラクトはさらに、polＩプロモーター及びpolＩ終結シグナルの間に挿入されたＨＡ及び／又はＮＡ遺伝子分節を含有する、
ｂ）宿主細胞を前記線状発現コンストラクトでトランスフェクションする工程、
ｃ）前記宿主細胞を、ヘルパーウィルスＨＡ及び／又はＮＡタンパク質を有するヘルパーウィルスで感染させる工程、
ｄ）前記宿主細胞を、ウィルス粒子を増殖させるために培養する工程、
ｅ）ウィルス粒子を選択する工程、これは、
（ｉ）前記線状発現コンストラクト由来の前記ＨＡ及び／又はＮＡタンパク質を含有するが、
（ｉｉ）前記ヘルパーウィルスＨＡ及びＮＡタンパク質、又はこの分節を含有しない、
その際、前記選択は、前記ＨＡ及び／又はＮＡタンパク質のフェノタイプの、ゲノタイプの又は抗原の特性に基づく、及び場合により
その際、ヘルパーウィルスＨＡ及びＮＡタンパク質の非存在が、核酸又はアミノ酸配列の分析により決定される工程、
を含む生産方法に関する。
【００２３】
より具体的には、マイナス鎖の分節化したＲＮＡウィルス粒子の生産方法は、
増幅配列、選択配列、又は増幅配列及び選択配列の両方を含まない線状発現コンストラクトを提供する工程、その際、このコンストラクトは、ＲＮＡポリメラーゼＩ（polI）プロモーター及びpolＩ終結シグナルを含み、このpolＩプロモーター及びpolＩ終結シグナルは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（polII）プロモーター及びポリアデニル化シグナルの間に挿入されており、その際、この線状発現コンストラクトはさらに、polＩプロモーター及びpolＩ終結シグナルの間に挿入されたＨＡ遺伝子分節、ＮＡ遺伝子分節、又はＨＡ遺伝子分節及びＮＡ遺伝子分節の両方を含有する、
宿主細胞を前記線状発現コンストラクトでトランスフェクションする工程、
前記宿主細胞を、ヘルパーウィルスで感染させる工程、その際、このヘルパーウィルスはＨＡタンパク質、ＮＡタンパク質、又はＨＡタンパク質及びＮＡタンパク質の両方をコードするゲノムＲＮＡを含有する；
前記宿主細胞を培養する工程、これにより、子孫ウィルス粒子を生産し、その際、少なくともいくつかの子孫ウィルス粒子は前記線状発現コンストラクト由来のＨＡタンパク質又はＮＡタンパク質を含有する；及び、候補ウィルス粒子を前記子孫ウィルス粒子のうちから選択する工程
を含むことができ、その際、前記候補ウィルス粒子は、
ｉ）前記線状発現コンストラクトがＨＡ遺伝子分節を含有する場合には、前記線状発現コンストラクト由来のＨＡタンパク質を含有するが、前記ヘルパーウィルス由来のＨＡタンパク質を含有しない、
ｉｉ）前記線状発現コンストラクトがＮＡ遺伝子分節を含有する場合には、前記線状発現コンストラクト由来のＮＡタンパク質を含有するが、前記ヘルパーウィルス由来のＮＡタンパク質を含有しない。
【００２４】
本発明によれば、前記宿主細胞は、ＨＡ又はＮＡ遺伝子分節を含有する少なくとも１の線状発現コンストラクトでトランスフェクションされる。好ましくは、前記宿主細胞は、少なくとも２つの線状発現コンストラクトでトランスフェクションされ、その際、１の線状コンストラクトはＨＡ遺伝子分節を含有し、第２の線状コンストラクトはＮＡ遺伝子分節を含有する。
【００２５】
候補ウィルス粒子の選択の工程は、さらに、前記候補ウィルス粒子がヘルパーウィルスのＨＡアミノ酸配列又はＮＡアミノ酸配列を含まないことを決定するために前記候補ウィルス粒子のアミノ酸配列の分析又は前記候補ウィルス粒子がヘルパーウィルスのＨＡヌクレオチド配列又はＮＡヌクレオチド配列を含まないことを決定するために候補ウィルス粒子の核酸分子の分析を含むことができる。
【００２６】
本発明により、「線状発現コンストラクト」は、いかなる増幅及び／又は選択配列も含まず、かつ、ＲＮＡポリメラーゼＩ（polI）プロモーター及びpolＩ終結シグナルを含み、これはＲＮＡポリメラーゼＩＩ（polII）プロモーター及びポリアデニル化シグナルの間に挿入されており、かつ、遺伝子分節を含み、これはpolＩプロモーター及びpolＩ終結シグナルの間に挿入されているもの、と定義される。
【００２７】
好ましくは、前記線状発現コンストラクトは、細菌細胞におけるプラスミドの増幅に必要とされるいかなる選択又は増幅配列も含まない。ori（複製起点）配列も抗生物質耐性遺伝子又はいかなる他の選択マーカーも含まれる必要がない。必要とされる場合には、短いリンカー配列を用いてこの線状発現コンストラクトは環化されることができる。
【００２８】
本発明の特定の一実施態様によれば、この線状発現コンストラクトは、ＤＮＡ分子の他の分子、例えば、更なる保護配列をこのコンストラクトのＮ及び／又はＣ末端に含有することができる。例えば、これら保護配列は、ＷＯ００／５６９１４に説明されるペプチド核酸配列（ＰＮＡｓ）であることができる。これらＰＮＡｓは、全体的なデオキシリボースホスファート骨格が化学的に完全に異なるが、構造的に相同性である、２−アミノエチルグリシン単位を含有するポリアミド（ペプチド）骨格で交換されている、核酸アナログである。ＰＮＡ「クランプ」は、安定性を増加させることも示されており、その際、２つの同一ＰＮＡ配列が、３つの８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸単位を含有するフレキシブルなヘアピンリンカーにより連結される。ＰＮＡが相補的ホモプリン又はホモピリミジンＤＮＡターゲット配列と混合される場合には、ＰＮＡ−ＤＮＡ−ＰＮＡトリプレックスハイブリッドが形成されることができ、これは極端に安定である（Bentin et al., 1996, Biochemistry, 35, 8863-8869, Egholm et al., 1995, Nucleic Acids Res., 23, 217-222, Nielsen et al., Science, 1991 , 254, 1497-1500, Demidov et al., Proc.Natl.Acad.Sci., 1995, 92, 2637-2641）。これらは、ヌクレアーゼ及びプロテアーゼ消化に対して抵抗性であることが示されている（Demidov et al., Biochem.Pharm., 1994, 48, 1010-1013）。このウィルス遺伝子分節とは、前記分節のｃＤＮＡコピー又はＲＴ−ＰＣＲ増幅産物であることができる。
【００２９】
具体的には、本発明は、ＲＮＡウィルスの発現及び生産方法であって、
ａ）宿主細胞を、ＨＡ遺伝子分節を含有する線状発現コンストラクト及び／又はＮＡ遺伝子分節を含有する線状発現コンストラクト、
及び場合により、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＳ、Ｍ、ＮＰから選択されるさらなる遺伝子分節又はその少なくとも一部を含有する線状発現コンストラクト
でトランスフェクションする工程、
ｂ）前記宿主細胞をヘルパーウィルスで感染させる工程、
ｃ）前記の感染した宿主細胞を、ウィルス粒子を増殖させるために培養する工程、
ｄ）前記線状発現コンストラクト由来の少なくともＨＡ及び／又はＮＡタンパク質を含有するウィルス粒子を選択する工程
を含む方法を提供する。
【００３０】
前記選択は、非ヘルパーウィルス起源のＨＡ又はＮＡタンパク質のゲノタイプの、フェノタイプの又は抗原の特性に基づいて実施されることができる。任意の選択法が、異なる配列、異なるフェノタイプ特徴又は異なる抗原特徴を含むタンパク質間を区別するために知られているとおりに使用されることができる。具体的には、選択尺度が、本発明に説明されているとおりに使用されることができる。ヘルパーウィルス起源及び非ヘルパーウィルス起源からのＨＡ及びＮＡタンパク質は、ヌクレオチド及びアミノ酸配列において変動し、したがって、この分野において知られている配列比較法も前記線状発現コンストラクト由来のＨＡ又はＮＡ配列を含むウィルスの同定のために使用されることができる。発現コンストラクト又はウィルス「由来」の核酸分子は、発現コンストラクト又はウィルスのヌクレオチド配列又は相補配列を含むものであり、一般的には発現コンストラクト又はウィルスの存在の結果として細胞培地又はこの分子の生産のための他の媒体中で生産される。発現コンストラクト又はウィルス「由来」のタンパク質は、発現コンストラクト又はウィルスのヌクレオチド配列又は相補配列から翻訳されるものであり、一般的には発現コンストラクト又はウィルスの存在の結果として細胞培地又はこのタンパク質の生産のための他の媒体中で生産される。
【００３１】
少なくとも１の線状発現コンストラクトの使用に加えて、リバースジェネティクス技術の実施のためにこの分野において知られているプラスミドが、ウィルスタンパク質及び／又はウィルスゲノムの更なる分節の発現のために使用されることができる。これらプラスミドは例えば、Hoffmann et al.（Vaccine 2002, 20(25-26), 3165-3170, これは参照により組み込まれる）に記載されている。具体的には、これら発現プラスミドは、次のものをコードする分節：ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＳ、ＮＡ、ＨＡ、Ｍ又はＮＰ又はその部分を含む。
【００３２】
「ＨＡタンパク質及びＮＡタンパク質」との用語は、本発明により、ＨＡ又はＮＡタンパク質それぞれの完全アミノ酸配列又は前記配列の部分として定義され、その際、前記部分は、野生型ＨＡ又はＮＡタンパク質により生じる応答に類似して又はこれに等しく前記ＨＡ又はＮＡタンパク質に対する免疫応答を誘発するのに十分である。好ましくは、前記ＨＡ又はＮＡタンパク質は少なくとも７０％の、この完全タンパク質の前記ＨＡ又はＮＡアミノ酸配列を含有し、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％である。
【００３３】
免疫原性の観点で機能的等価とは、例えばLu et al.(J. Virol., 1999, 5903-5911)又はBoyd M. R. and Beeson M. F.(J. Antimicrobial Chemotherapy, 1975, 43-47)に説明される動物モデルについて試験されることができる。
【００３４】
ヘルパーウィルスは、ヘルパー依存性ウィルスベクターのコピーを生産する場合に使用されるウィルスであり、これは、自体で複製する能力を有しない。このヘルパーウィルスは、ウィルスベクターと一緒に細胞を共感染させるのに使用され、かつ、ウィルスベクターのゲノムの複製のために必要な酵素を提供する。
【００３５】
「ヘルパーウィルス」との用語は、生産すべきウィルスに対して同一な少なくとも１の遺伝子分節を含有し、かつ、完全ウィルス粒子の生産のために必要とされる少なくとも１のウィルス分節及び／又は少なくとも１のウィルスタンパク質を提供することによりウィルス作製を支持することができる任意のウィルスとして定義される。
【００３６】
ヘルパーウィルスは、一般的に、本発明の方法においては、線状発現コンストラクトでのトランスフェクション後に宿主細胞に添加されるが、代替的方法によれば、ヘルパーウィルスは感染のために宿主細胞へと、この宿主細胞がＨＡ及び／又はＮＡ遺伝子分節を含有する発現コンストラクトによりトランスフェクションされる前に添加されることができる。
【００３７】
前記方法により発現されることができるＲＮＡウィルスは、ＨＡ及び／又はＮＡ遺伝子分節又はこれら構造に機能的等価な構造を含有する任意のＲＮＡウィルスであることができる。「機能的等価な構造」との用語は、レセプター結合及び融合活性を有するウィルスタンパク質を意味する。
【００３８】
ＲＮＡウィルスは、インフルエンザウィルス、具体的にはインフルエンザＡ、Ｂ又はＣウィルス、コロナウィルス、ＲＳウィルス、ニューカッスル病ウィルスからなる群から選択されることができる。
【００３９】
ウィルスの培養のために本発明による方法において使用されることができる細胞は、培養されることができ、エンベロープ付きウィルス、具体的にはインフルエンザウィルスで感染されることができる任意の所望のタイプの細胞であることができる。具体的には、これは、ＢＳＣ−１細胞、ＬＬＣ−ＭＫウィルス、ＣＶ−１細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、マウス細胞、ヒト細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＣＥＫ（トリ胚性腎臓）、ＣＥＦ（トリ胚性繊維芽細胞）、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＴＣＭＫ細胞、ＬＬＣ−ＰＫ細胞、ＰＫ１５細胞、ＷＩ−３８細胞、ＭＲＣ−５細胞、Ｔ−ＦＬＹ細胞、ＢＨＫ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＮＳＯ、ＰｅｒＣ６（ヒト網膜細胞）であることができる。
【００４０】
本発明により、宿主細胞は知られている方法により、例えば電気穿孔によりトランスフェクションされることができる。
【００４１】
この宿主細胞培養物は、この分野において前記ウィルスを複製することが知られている標準的条件下で培養されることができ、特に、最大細胞変性効果又は最大量のウィルス抗原が検出されることができるまでである。この回収は、代わりに培養の間の任意の時間点であることができる。
【００４２】
宿主細胞の培養のためのｐＨは、例えば６．５〜７．５であることができる。培養のためのｐＨは、培養のために使用される宿主細胞のｐＨ安定性に依存する。これは、異なるｐＨ条件下での宿主細胞の生存性の試験により決定されることができる。
【００４３】
この分野においては、エピデミックインフルエンザに対する年間（annual）のワクチン接種のためのワクチン株の調製において使用される野生型ウィルスが、世界保健機構（ＷＨＯ）により毎年勧告されることが良く知られている。これら株は次に、リアソータントウィルス株（reassortant vaccine strain）の生産のために使用されてよく、これは一般的には、野生型ウィルスのＮＡ及び／又はＨＡ遺伝子を、ドナーウィルス（しばしば、マスタードナーウィルス又はＭＤＶとも呼ばれる）由来のこの残りの遺伝子分節と組み合わせ、これは特定の所望される特徴を有するものである。例えば、ＭＶＤ株は冷温適合され（cold-adapted）、かつ／又は温度感受性、かつ／又は弱毒化され、かつ／又は高い成長速度を有してよい。本発明によれば、このウィルス粒子は好ましくは、季節性ワクチン接種目的のために勧告されるウィルス株の、又は、高度に免疫原性を示しているウィルス株（特にパンデミックウィルスの場合には）の、ＨＡ及び／又はＮＡタンパク質を含有する。
【００４４】
前記表面タンパク質を含有するウィルスの選択は、フェノタイプの、ゲノタイプの又は抗原の特性に基づくことができ、これは、ヘルパーウィルス起源のＨＡ及びＮＡタンパク質から前記タンパク質を区別する。
【００４５】
ヘルパーウィルス起源のＨＡ及びＮＡタンパク質のフェノタイプ特性であって非ヘルパーウィルス起源のＨＡ及びＮＡタンパク質から前記タンパク質を区別する特性は、選択されたウィルスと同様に、例えば、ＨＡの活性化のための切断部位における相違を有するか、又は低ｐＨに対する安定性において相違する。このヘルパーウィルスＨＡは、ワクチンウィルスのＨＡを活性化させるプロテアーゼとは異なるプロテアーゼによるタンパク質加水分解活性化に依存する切断部位を含んでよい。このヘルパーウィルスは、ワクチンウィルスに比較して低ｐＨ条件に対する低安定性を示してもよい。
【００４６】
ワクチンウィルスのＨＡ及びＮＡを含有するウィルスの選択は、抗原特性を基礎としてもよい。ワクチンウィルス（例えば、Ｈ１Ｎ１）とは異なるサブタイプ（例えば、Ｈ３Ｎ２）のヘルパーウィルスの使用により、ヘルパーウィルスの成長は、ヘルパーウィルスサブタイプ、例えばＨ３Ｎ２に特異的な抗血清により抑制されることができる。
【００４７】
選択のために活用されてよいゲノタイプ特徴は、ヘルパーウィルス起源のＨＡ及び／又はＮＡ分節及び非ヘルパーウィルス起源のＨＡ及びＮＡタンパク質の間の核酸又はアミノ酸配列差異を含む。配列分析をするための方法はこの分野で良く知られている。
【００４８】
ヌクレオチド配列差異に基づいて、例えばｓｉＲＮＡｓ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヘルパーウィルスのＨＡ及び／又はＮＡについて特異的に設計されることができる。これらｓｉＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドのトランスフェクションにより、ヘルパーウィルス成長は抑制されることができた。
【００４９】
１の選択肢は、ヘルパーウィルス起源のＨＡタンパク質を含むウィルス粒子をこの候補ウィルス粒子からプロテアーゼを用いた処理により分離することであってよく、これは、ヘルパーウィルス起源のＨＡタンパク質を切断しないが、このリアソータントウィルスのＨＡタンパク質を切断し、これにより活性化させる。例えば、このプロテアーゼは、トリプシン、エラスターゼ、キモトリプシン、パパイン又はサーモリシンからなる群から選択されることができる。
【００５０】
例えば、ヘルパーウィルスのＨＡタンパク質は、活性化するように改変でき、これは例えば切断であり、プロテアーゼにより行われ、その際、前記プロテアーゼはトリプシンでなく、その一方で、最終的なワクチンウィルスのＨＡタンパク質はトリプシンにより切断される。これにより、単純かつ適用可能な選択システムが提供される。これは、切断部位の改変により実施されることができる。ヘルパーウィルスとして有用なウィルス株のＨＡ分節は、突然変異生成、例えばＰＣＲ突然変異生成により、トリプシンの代わりにエラスターゼによりタンパク質加水分解的に活性化される切断部位を含むよう変更させることができる。例えば、この切断部位を取り囲むアミノ酸配列は、ＰＳＩＱＰＩ／ＧＬＦＧＡ（切断部位は／により示される）であることができる。
【００５１】
必要とされない先祖返り事象（reversion event）を最小限にするために、コドンが、コドンにつき少なくとも２のヌクレオチド変化が好ましくは当初アミノ酸への先祖返りを引き起こすために必要であるように選択される。
【００５２】
代替的に、ヘルパーウィルス起源のＨＡ及びＮＡタンパク質を含有するウィルス粒子が、低ｐＨ条件を提供することにより線状コンストラクトから発現されるＮＡ又はＨＡタンパク質を含有する候補ウィルス粒子から分離されることができる。いくつかの継代のために細胞培養において、具体的にはＶｅｒａ細胞培養において培養されるウィルス粒子は、野生型ＨＡ及び／又はＮＡタンパク質を含有する臨床的単離物からの株に比較してＨＡタンパク質内での改変のために低ｐＨに向かって減少した安定性を示す。このようにして、低ｐＨ条件、すなわち、ｐＨ５．２〜６．２下でのヘルパーウィルスの処理は、ヘルパーウィルスの減少した増殖速度を生じ、ひいては、改変していないＨＡ及び／又はＮＡタンパク質を含有する候補ウィルス粒子の選択を生じる。
【００５３】
本発明の更なる代替的一実施態様として、ヘルパーウィルス起源のＨＡ及び／又はＮＡタンパク質を含有するウィルス粒子は、ヘルパーウィルス起源のＨＡ及び／又はＮＡタンパク質を中和するか又はこれに結合する抗体を含有する抗血清を用いた処理により候補ウィルス粒子から分離される。
【００５４】
必要とされないＨＡ及びＮＡタンパク質を除去するための様々な方法の組み合わせも、本発明により実施されることができる。
【００５５】
本発明の特定の一実施態様によれば、ヘルパーウィルス粒子は、野生型ウィルスのＮＡタンパク質に比較して減少した活性を有するＮＡタンパク質を含有することができる。この実施態様においてヘルパーウィルスは、機能的ＮＡタンパク質、すなわち、宿主細胞からウィルスが放出されることを可能にするＮＡタンパク質を欠損することができるか、又は、ＮＡタンパク質を全体的に欠損することができる。
【００５６】
更なる代替的な一実施態様によれば、ヘルパーウィルスは、インフルエンザＣウィルスのＨＥＦタンパク質を含有する。インフルエンザＣウィルスは、たった１つの主要表面糖タンパク質、ＨＥＧ（ヘマグルチニンエラスターゼ融合）を有し、これはＨＡタンパク質に機能的等価である。ＨＥＦタンパク質は、例えばトリプシン又はＴＰＣＫトリプシンを用いて活性化されることができ、これはGao et al.(J.Virol., 2008, 6419-6426)に説明されるとおりであり、これは参照により本願に組み込まれる。
【００５７】
代替的に、ウィルス糖タンパク質ＨＥＦを含有する改変したインフルエンザウィルスは、外来プロテアーゼ切断部位、例えばエラスターゼ切断部位の導入により改変されることができるが、本発明により具体的に請求される。
【００５８】
本発明の更なる代替的な一実施態様として、ヘルパーウィルス起源のＨＥＦタンパク質を含有するウィルス粒子は、前記ＨＥＦタンパク質を中和するか又はこれに結合する抗体での処理により除去される。
【００５９】
更なる代替策として、ヘルパーウィルスは、コロナウィルスのＨＡタンパク質を含有できる。インフルエンザＡウィルスの生産においては、代替的にインフルエンザＢ起源のＨＡ及び／又はＮＡタンパク質が使用されることができる。
【００６０】
ワクチン製造のためのウィルスまた同様にヘルパーウィルスは具体的にはインフルエンザウィルス起源であることができ、より具体的にはこれは弱毒化したインフルエンザウィルスであることができる。
【００６１】
具体的な一実施態様によれば、インフルエンザウィルスは弱毒化したインフルエンザウィルスである。具体的には、インフルエンザウィルスは、宿主細胞の生得免疫応答を阻害する病原性因子内での欠失又は改変を含む。弱毒は例示的に、低温適合されたウィルス株由来であるか又はＮＳ１遺伝子内の欠失又は改変（ΔＮＳ１ウィルス）のためであってよく、これはＷＯ９９／６４５７１及びＷＯ９９／６４０６８に説明されるとおりであり、これは参照により全体が本願に組み込まれる。「改変」とは、野生型ＮＳ１配列に比較した１又は複数の核酸の置換又は欠失を指す。ＮＳ遺伝子内の改変は、インターフェロンコンピテント細胞において成長不全（Growth deficient）であるウィルス粒子を生じることができる。成長不全とは、動物の気道において不稔複製を経るのでこれらウィルスが複製不全であることを意味する。代替的に、ウィルスは、ＰＢ１−Ｆ２遺伝子の欠失又は改変を含むことができる。
【００６２】
本発明による方法は、具体的には、機能的ＮＳ１タンパク質の欠失を含むインフルエンザウィルスの生産のために特に使用されることができる。
【００６３】
本発明によれば、ヘルパーウィルスは、生産すべきウィルスと同一である少なくとも４、好ましくは少なくとも５、好ましくは６の分節を含むことができる。具体的には、これは断片はＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳである。
【００６４】
ヘルパーウィルスは、知られているリバースジェネティクス技術により又はウィルスリアソートメントのような代替技術により生産されることができる。
【００６５】
「リアソート」との用語は、ウィルスに関する場合には、このウィルスが、１より多い親ウィルス株又は供給源由来の遺伝的及び／又はポリペプチド成分を含むことを示す。例えば、７：１リアソータントは、第１の親ウィルス由来の、７つのウィルスのゲノム分節（又は遺伝子分節）と、第２の親ウィルス由来の、単独の相補ウィルスゲノム分節（これは例えば、ヘマグルチニン又はノイラミニダーゼをコードする）を含む。６：２リアソータントは、６つのゲノム分節、最も一般的には６つの内部遺伝子を第１の親ウィルス由来で、そして、２つの相補分節、例えばヘマグルチニン及びノイラミニダーゼを異なる親ウィルス由来で、含む。
【００６６】
ＮＳ１欠失を含むヘルパーウィルスの生産方法は、Egorov et al.(1998 J. Virol. 1998 Aug; 72(8):6437-41 ; Egorov et al., Vopr. Virusol., 39:201 -205)により説明されている。これにより、Ｈ１インフルエンザＡウィルスは、温度感受性突然変異をＮＳ遺伝子内で含有する基本ウィルスとして使用されることができ、これはさらに改変されて、インターフェロン欠失細胞においてだけ成長することができる完全に欠失されたＮＳ遺伝子を生じる。
【００６７】
本発明は、ＰＳＩＱＰＩＧＬＦＧＡ（配列番号７）の配列を含有するＨＡポリペプチドをも包含する。
【００６８】
以下の配列又はその部分を含むＨＡヌクレオチド配列も本発明によって包含される：
2012510283.tif 000002
【００６９】
特に、以下の配列を含むＨＡヌクレオチドは、本発明において含められる：
2012510283.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、線状両方向性発現コンストラクトの作製の概略図を示す図である。
【００７１】
実施例：
実施例１：線状Ｈ３Ｎ２  ＨＡ発現コンストラクトの作製
Ｖｅｒｏ細胞培養由来のインフルエンザＡ  Ｈ３Ｎ２ウィルスのＨＡ分節を、オリゴヌクレオチドＰ１及びＰ２を使用してＰＣＲ増幅した（図１ａ中のＦ１）。引き続き、ｐＨＷ２０００（Hoffmann et al. 2000, Proc Natl Acad Sci U S A. 97:6108-13）由来の２つのＤＮＡフラグメント（Ｆ２及びＦ３、図１中）を、オーバーラップＰＣＲを利用してＨＡ  ＰＣＲ産物に融合した（図１ｂ参照のこと）。この第１のＤＡＮフラグメント（Ｆ２）は、ＣＭＶプロモーター及びPolＩターミネーターを含み、この第２のもの（３）は、ヒトのPolＩプロモーター及びＢＧＨポリＡシグナルを含む。オーバーラップＰＣＲ産物の作製を容易にするために、ＨＡ増幅のために使用されるオリゴヌクレオチドをその５′末端で、Ｐ１がPolＩターミネーターに相補的な配列を含み、かつ、Ｐ２がPolＩプロモーターに相補的な配列を含むように伸長した（図１ａ参照のこと）。同様に、フラグメントＦ１及びＦ２の作製のために使用されるプライマーＰ３及びＰ５をその５′末端で、ＨＡの５′及び３′末端に相補的な配列を含むように伸長した（図１ａ参照のこと）。
【００７２】
フラグメントＦ２及びＦ３は、ｐＨＷ２０００骨格において説明された配列由来の保護配列を含有する。これら配列はｍＲＮＡ及びｖＲＮＡの転写に直接かかわらないが、しかし、エキソヌクレアーゼによる両方向性発現カセットの分解を減少させる。
【００７３】
ウィルスＲＮＡは、Ｖｅｒｏ細胞培養由来のインフルエンザＡ  Ｈ３Ｎ２ウィルスから、Qiagen ViralAmpキットを用いて抽出され、かつ、Uni12オリゴヌクレオチドを用いて逆転写され、これは以前説明されているとおりである（Hoffmann et al.2001 , Arch Virol. 146:2275-89）。ＨＡ分節は、第１表に示されるオリゴヌクレオチドで、Pfu Turbo DNAポリメラーゼ及びTaq DNAポリメラーゼの混合物を用いて増幅された。
【００７４】
第１表：
【表１】
2012510283.tif 000004
【００７５】
Ｈ３配列に相応するヌクレオチドはイタリック太字で示され、PolＩターミネーター（Ｐ１）及びPolＩプロモーター（Ｐ２）に相同性であるヌクレオチドは標準的な大文字で示されている。
【００７６】
このＨＡ  Ｆ４  ＰＣＲ産物を、Qiaquick PCR Purification kit (Qiagen)を用いて精製した。ＰＣＲフラグメントＦ２及びＦ３を、ｐＨＷ２０００プラスミドＤＮＡからプライマー対Ｐ３＋Ｐ４及びＰ５＋Ｐ６（第２表及び図１ａ参照のこと）を用いて増幅し、それぞれ、Pfu Turbo DNAポリメラーゼ及びTaq DNAポリメラーゼの混合物を使用した。ＰＣＲ産物  Ｆ２及びＦ３を、Qiaquick PCR Purification kit (Qiagen)を用いて精製した。
【００７７】
第２表：
【表２】
2012510283.tif 000005
【００７８】
Ｈ３配列に相応するＰ３及びＰ５ヌクレオチドについてはイタリック太字で示され、ｐＨＷ２０００に相補的なヌクレオチドは標準の大文字で示されている。
【００７９】
Ｐ４及びＰ６については全てのヌクレオチドは、５′末端にある４つのヌクレオチドを除き、ｐＨＷ２０００に相応する。
【００８０】
ＨＡ、ＣＭＶプロモーター、PolＩターミネーター、PolＩプロモーター及びＢＧＨポリＡシグナルを含有する完全長ＰＣＲ産物（Ｆ４）の作製のために、フラグメントＦ１、Ｆ２及びＦ３を組み合わせ、プライマーＰ４及びＰ６を用いたオーバーラップＰＣＲにより、Pfu Turbo DNAポリメラーゼ及びTaq DNAポリメラーゼの混合物を使用して増幅した。
【００８１】
図１は、線状両方向性発現コンストラクトの作製の概略図を示す。
【００８２】
図１ａは、図により、フラグメントＦ１、Ｆ２及びＦ３を開示し、これはＰＣＲ増幅により別個に作製されている。
【００８３】
フラグメントＦ１は、それぞれウィルス分節を含み、かつ、PolＩターミネーター及びPolＩプロモーターに相補的な伸長部を含む。フラグメントＦ２は、ＣＭＶプロモーター及びPolＩターミネーターまた同様にそれぞれのウィルス分節に相補的な伸長部を含む。フラグメントＦ３は、PolＩプロモーター及びＢＧＨポリアデニル化シグナルまた同様にそれぞれのウィルス分節に相補的な伸長部を含む。Ｆ１フラグメントのＰＣＲ増幅のために使用されるオリゴヌクレオチドＰ１及びＰ２は、それぞれのウィルス分節に相補的である。Ｐ１は、PolＩターミネーターに相補的な５′末端を、Ｐ２は、PolＩプロモーターに相補的な５′末端を含む。
【００８４】
オリゴヌクレオチドＰ３及びＰ４は、Ｆ２フラグメントのＰＣＲ増幅のために使用され、これは、それぞれのウィルス分節に相補的な５′伸長部を含むＰ３を有する。オリゴヌクレオチドＰ５及びＰ６は、Ｆ３フラグメントのＰＣＲ増幅のために使用され、これは、それぞれのウィルス分節に相補的な５′伸長部を含むＰ５を有する。保護配列は、ｐＨＷ２０００骨格由来であり、ｍＲＮＡ又はｖＲＮＡ転写に直接的に関連する配列を含まない。
【００８５】
実施例２：エラスターゼ依存的ヘルパーウィルスの作製
インフルエンザＡ／ニューカレドニア／２０／９９−様（Ｈ１Ｎ１）株のＨＡ分節は、ＰＣＲ突然変異生成により変更されて、トリプシンの代わりにエラスターゼによりタンパク質加水分解的に活性化される切断部位を含むようになっている。この切断部位を取り囲むアミノ酸配列は、ＰＳＩＱＳＲ／ＧＬＦＧＡからＰＳＩＱＰＩ／ＧＬＦＧＡへと変更されている（この切断部位は／により示されている）。実施例１と同様に、１０〜２０μｇの線状両方向性発現コンストラクトＦ４をＰＣＲにより作成し、Qiaquick kit (Qiagen)を用いて、そして引き続きQiagen Endofree Plasmid kitを介して精製した。
【００８６】
Ｖｅｒｏ細胞は、１０％のウシ胎児血清及び１％のGlutamax-I補給を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で３７℃及び５％ＣＯ２で維持される。
【００８７】
ウィルス作製のために、この改変されたＦ４  ＨＡ  ＤＮＡフラグメントは単独で又はＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ及びＮＰをコードする４つのタンパク質発現プラスミドと一緒に、Ｖｅｒｏ細胞のトランスフェクションのために使用された。トランスフェクション２４ｈ後に、細胞をＭＯＩ０．００１〜１でインフルエンザＡ  ＩＶＲ１１６株で感染させ、これは、機能的ＮＳ１を発現しない（ＩＶＲ−１１６−ｄｅｌＮＳ１）。
【００８８】
感染後に、ウィルス複製を支持するために、Ｖｅｒｏ細胞を血清不含培地（Opti-Pro; Invitrogen）中で、５μｇ／ｍｌエラスターゼの存在下で培養した。５０〜１００％のＣＰＥが観察されるとすぐに、このレスキューされたエラスターゼ依存性ＩＶＲ−１１６−ｄｅｌＮＳ１ウィルス（ＩＶＲ１１６−ｄｅｌＮＳ１  −ＥＬ）を凍結させるか又はＶｅｒｏ細胞上でプラーク精製した。
【００８９】
実施例３：エラスターゼ依存性Ｈ１Ｎ１ヘルパーウィルスを使用することによるインフルエンザＡ  Ｈ３Ｎ２リアソータントウィルスの作製
Ａ／ブリスベン／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）−様ウィルスのＨＡ及びＮＡ分節のための線状両方向性発現コンストラクト（Ｆ４）を、実施例１に説明されるとおりＰＣＲにより作製した。実施例２に説明されるとおりの精製に引き続き、ＨＡ及びＮＡ  Ｆ４  ＰＣＲ産物を単独で又はＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ及びＮＰをコードする４つのタンパク質発現プラスミドと一緒に、Ｖｅｒｏ細胞のトランスフェクションのために使用した。トランスフェクション２４ｈ後に、細胞をＭＯＩ０．００１〜１でインフルエンザＡ  ＩＶＲ−１１６−ｄｅｌＮＳ１−ＥＬウィルス（ヘルパーウィルス）で感染させた。感染後に、細胞を血清不含培地（Opti-Pro; Invitrogen）中で５μｇ／ｍｌトリプシンの存在下でインキュベーションした。１０〜１００％ＣＰＥが観察されるとすぐにウィルスを回収した。選択的継代（selective passage）をウィルス回収物を２４ｈ４℃で適当な濃度（例えば１０％ｖ／ｖ）の抗血清（コレラ菌からのノイラミニダーゼで前処理されている）又は精製したＩｇＧ調製物（これは、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９ＨＡ及びＮＡに対して特異的である）（ヘルパーウィルスを中和するために）を用いて処理することにより実施した。次いでＶｅｒｏ細胞を３０分間ＲＴで前処理されたウィルスを用いてインキュベーションし、ＰＢＳで洗浄し、引き続き３７℃で５μｇ／ｍｌトリプシンを含有する血清不含培地中でインキュベーションした。選択的に、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９ＨＡ及びＮＡに特異的な精製したＩｇＧが、この培養培地に添加されてよい。１０〜１００％ＣＰＥが観察されるとすぐに、ウィルスを回収し、第２の選択的継代を実施する。ＣＰＥが発達すると、ウィルスを凍結させるか又はプラーク精製する。
【００９０】
実施例４：低ｐＨ処理と組み合わせた、エラスターゼ依存性Ｈ１Ｎ１ヘルパーウィルスを使用することによるインフルエンザＡ  Ｈ３Ｎ２リアソータントウィルスの作製
Ａ／ブリスベン／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）−様ウィルスのＨＡ及びＮＡ分節のための線状両方向性発現コンストラクト（Ｆ４）を、実施例１に説明されるとおりＰＣＲにより作製した。実施例２に説明されるとおりの精製に引き続き、ＨＡ及びＮＡ  Ｆ４  ＰＣＲ産物を単独で又はＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ及びＮＰをコードする４つのタンパク質発現プラスミドと一緒に、Ｖｅｒｏ細胞のトランスフェクションのために使用した。トランスフェクション２４ｈ後に、細胞をＭＯＩ０．００１〜１でインフルエンザＡ  ＩＶＲ−１１６−ｄｅｌＮＳ１−ＥＬウィルス（ヘルパーウィルス）で感染させた。感染後に、細胞を血清不含培地（Opti-Pro; Invitrogen）中で５μｇ／ｍｌトリプシンの存在下でインキュベーションした。１０〜１００％ＣＰＥが観察されるとすぐにウィルスを回収した。ウィルス回出物を次いで、１：１に、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．４〜６．２を有する緩衝液で希釈し、３０分間３７℃で優先的にヘルパーウィルスＨＡを不活性化するためにインキュベーションした。ｐＨ中和後に、選択的継代を次いで、ウィルス回収物を２４ｈ４℃で適当な濃度（例えば１０％ｖ／ｖ）の抗血清（コレラ菌からのノイラミニダーゼで前処理されている）又は精製したＩｇＧ調製物（これは、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９ＨＡ及びＮＡに対して特異的である）（ヘルパーウィルスを中和するために）を用いてインキュベーションすることにより実施できる。次いでＶｅｒｏ細胞を３０分間ＲＴで前処理されたウィルスを用いてインキュベーションし、ＰＢＳで洗浄し、引き続き３７℃で５μｇ／ｍｌトリプシンを含有する血清不含培地中でインキュベーションした。選択的に、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９ＨＡ及びＮＡに特異的な精製したＩｇＧは、この培養培地に添加されてよい。１０〜１００％ＣＰＥが観察されるとすぐに、ウィルスを回収し、第２の選択的継代を実施する。
【００９１】
ＣＰＥが発達すると、ウィルスを凍結させるか又はプラーク精製する。
【００９２】
実施例５：エラスターゼ依存性Ｈ３Ｎ２ヘルパーウィルスを使用することによるインフルエンザＡ  Ｈ１Ｎ１リアソータントウィルスの作製
Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）−様ウィルスのＨＡ及びＮＡ分節のための線状両方向性発現コンストラクト（Ｆ４）を、実施例１に説明されるとおりＰＣＲにより作製した。実施例２に説明されるとおりの精製に引き続き、ＨＡ及びＮＡ  Ｆ４  ＰＣＲ産物を単独で又はＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ及びＮＰをコードする４つのタンパク質発現プラスミドと一緒に、Ｖｅｒｏ細胞のトランスフェクションのために使用した。トランスフェクション２４ｈ後に、細胞をＭＯＩ０．００１〜１でエラスターゼ依存性インフルエンザＡ／ウィスコンシン６７／０５（Ｈ３Ｎ２）様ウィルス（ヘルパーウィルス）で感染させた。感染後に、細胞を血清不含培地（Opti-Pro; Invitrogen）中で５μｇ／ｍｌトリプシンの存在下でインキュベーションする。１０〜１００％ＣＰＥが観察されるとすぐにウィルスを回収した。選択的継代をウィルス回収物を２４ｈ４℃で適当な濃度（例えば１０％ｖ／ｖ）の抗血清（コレラ菌からのノイラミニダーゼで前処理されている）又は精製したＩｇＧ調製物（これは、Ａ／ウィスコンシン／６７／０５ＨＡ及びＮＡに対して特異的である）（ヘルパーウィルスを中和するために）を用いて処理することにより実施した。次いでＶｅｒｏ細胞を３０分間ＲＴで前処理されたウィルスを用いてインキュベーションし、ＰＢＳで洗浄し、引き続き３７℃で５μｇ／ｍｌトリプシンを含有する血清不含培地中でインキュベーションした。選択的に、Ａ／ウィスコンシン／６７／０５ＨＡ及びＮＡに特異的な精製したＩｇＧは、この培養培地中に添加されてよい。１０〜１００％ＣＰＥが観察されるとすぐに、ウィルスを回収し、第２の選択的継代を実施する。
【００９３】
ＣＰＥが発達すると、ウィルスを凍結させるか又はプラーク精製する。
【図１】
2012510283.tif 000006
【配列表】
2012510283000001.app
【国際調査報告】
2012510283.tif 000007
2012510283.tif 000008
2012510283.tif 000009