【手続補正書】
【提出日】令和2年5月25日(2020.5.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＲＡＤ５１リコンビナーゼ（ＲＡＤ５１）上のＲＡＤ５１関連タンパク質１（ＲＡＤ５１ＡＰ１）の結合部位と相互作用する、天然に存在しない合成ペプチドであって、前記天然に存在しない合成ペプチドは、細胞透過性ペプチド配列を含み、前記天然に存在しない合成ペプチドは、ヒトＲＡＤ５１の残基２０２、２０５および２０６のうちの少なくとも１つと相互作用し、前記ペプチドは、３０個よりも少ないアミノ酸残基を有し、前記ペプチドは、式Ｉまたはそのレトロ−インベルソ：
［Ｔ／Ｋ／Ｒ／Ｑ］１〜３−［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ／Ｍ／Ｗ／Ｙ］−［Ｒ／Ｇ／Ｓ］−［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ／Ｍ／Ｗ／Ｙ］（式Ｉ、配列番号７０）に従うアミノ酸配列を含む、天然に存在しない合成ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドは、式ＩＩまたはそのレトロ−インベルソ：
［Ｒ／Ｋ］−［Ｌ］−［Ｇ］−［Ｍ／Ｖ］（式ＩＩ、配列番号７１）
に従うアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸のうち任意の１つまたは複数が、必要に応じて、非天然のアミノ酸または（Ｄ）−アミノ酸である、請求項１に記載の天然に存在しない合成ペプチド。
【請求項３】
前記細胞透過性ペプチドが、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８を含む、請求項１または２に記載の天然に存在しない合成ペプチド。
【請求項４】
ヒトＲＡＤ５１の残基１８７と相互作用することをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の天然に存在しない合成ペプチド。
【請求項５】
前記合成ペプチドが、１０−４Ｍまたはそれ未満のＫｄ値の、ＲＡＤ５１への結合定数を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の天然に存在しない合成ペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドが、天然に存在しないアミノ酸を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の天然に存在しない合成ペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドが、（Ｌ）−アミノ酸および（Ｄ）−アミノ酸の両方を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の天然に存在しない合成ペプチド。
【請求項８】
前記ペプチドが、少なくとも１つの（Ｄ）−アミノ酸を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の天然に存在しない合成ペプチド。
【請求項９】
前記ペプチドが、配列番号１、配列番号５、配列番号１０、配列番号６６または配列番号６７のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸のうちのいずれかが、必要に応じて、Ｄ−アミノ酸である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の天然に存在しない合成ペプチド。
【請求項１０】
前記ペプチドが、配列番号１、配列番号５、配列番号１０、配列番号６６または配列番号６７のアミノ酸配列からなり、前記アミノ酸のうちのいずれかが、必要に応じて、Ｄ−アミノ酸である、請求項９に記載の天然に存在しない合成ペプチド。
【請求項１１】
前記ペプチドが、細胞中のＲＡＤ５１へと結合すると、以下の特徴：
（ａ）ＤＮＡ上でのＲＡＤ５１モノマーのアセンブリの阻害；
（ｂ）細胞内での相同組換えの阻害；
（ｃ）ＲＡＤ５１  ＡＴＰａｓｅ活性の阻害の欠如；または
（ｄ）Ｃａ２＋に対するＲＡＤ５１親和性の低下
のうちの少なくとも１つを示す、請求項１から１０のいずれか一項に記載の天然に存在しない合成ペプチド。
【請求項１２】
前記ペプチドが、
Ａｃ−ｌｍｒｓｖｒｌｒｖＧｌｒｋｒｒｒｒｒｒｒ−ＮＨ２、
Ａｃ−Ｋ（Ｃ６＿５ＦＡＭ）−ＱＳＬＲＬＧＬＳＲＬＡＲＶＫＲＬＨＰＧＡＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＮＨ２、
Ａｃ−Ｋ（Ｃ６＿５ＦＡＭ）−ＲＲＲＲＲＲＲＫＲＬＧＶＲＬＲＶＳＲＭＬ−ＮＨ２、
Ａｃ−ＲＲＲＲＲＲＲＫＲＬＧＶＲＬＲＶＳＲＭＬ−ＮＨ２または
Ａｃ−ＲＱＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＲＬＧＶＲＬＲＶＳＲＭＬ−ＮＨ２
であり、Ａｃは、アルファアミンアセチル化を表し、ＮＨ２は、カルボキシ末端のアミド化を指し、Ｋ（Ｃ６＿５ＦＡＭ）は、６炭素鎖を介してリジンのイプシロンアミノ基に連結された５ＦＡＭ（フルオレセインアミダイト）標識を指し、小文字は（Ｄ）−アミノ酸を表す、請求項１から３のいずれか一項に記載の天然に存在しない合成ペプチド。
【請求項１３】
前記ペプチドが、Ａｃ−ｌｍｒｓｖｒｌｒｖＧｌｒｋｒｒｒｒｒｒｒ−ＮＨ２であり、Ａｃは、アルファアミンアセチル化を表し、ＮＨ２は、カルボキシ末端のアミド化を指し、小文字は（Ｄ）−アミノ酸を表す、請求項１から３のいずれか一項に記載の天然に存在しない合成ペプチド。
【請求項１４】
がんの処置における使用のための請求項１から１３のいずれか一項に記載の天然に存在しない合成ペプチド。
【請求項１５】
前記処置が化学療法剤を投与することをさらに含む、請求項１４に記載の使用のための天然に存在しない合成ペプチド。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
さらなる態様では、本発明は、ａ）ＤＮＡ結合部分を含む第１の融合タンパク質；ｂ）遺伝子活性化部分を含む第２の融合タンパク質；ｃ）その発現が、ＤＮＡ結合部分に特異的なＤＮＡ結合配列の制御下にある、細胞毒性レポーター；およびｄ）６０またはそれ未満のアミノ酸のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡであって、このｍＲＮＡが、ポリペプチドに対して３’側の３’ＵＴＲを含み、このポリペプチドが、ペプチド安定化のためのＮ末端配列をコードする、ｍＲＮＡを発現する宿主細胞に関する。一実施形態では、この宿主細胞は、真菌または細菌である。別の実施形態では、この宿主細胞は一倍体酵母細胞である。別の実施形態では、この宿主細胞は二倍体酵母細胞である。別の実施形態では、この二倍体酵母細胞は、第１のキメラ遺伝子および第２のキメラ遺伝子をコードするＤＮＡ配列を含む第１の宿主細胞を、細胞毒性レポーター、およびポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む第２の宿主細胞と接合させることによって産生される。別の実施形態では、この宿主細胞は哺乳動物である。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
ヒトＲＡＤ５１上のＲＡＤ５１ＡＰ１の結合部位と相互作用する、天然に存在しない化合物。
（項目２）
ヒトＲＡＤ５１の残基２０２、２０５および２０６のうちの少なくとも１つと相互作用する、項目１に記載の天然に存在しない化合物。
（項目３）
ヒトＲＡＤ５１の残基１８７と相互作用することをさらに含む、項目１に記載の天然に存在しない化合物。
（項目４）
１０−４Ｍまたはそれ未満のＫｄ値の、ＲＡＤ５１への結合定数を有する、項目１に記載の天然に存在しない化合物。
（項目５）
ポリペプチドを含む、項目１に記載の天然に存在しない化合物。
（項目６）
前記ポリペプチドが、天然に存在しないアミノ酸を含む、項目５に記載の天然に存在しない化合物。
（項目７）
前記ポリペプチドが、（Ｌ）−アミノ酸および（Ｄ）−アミノ酸の両方を含む、項目５に記載の天然に存在しない化合物。
（項目８）
前記ポリペプチドが、少なくとも１つの（Ｄ）−アミノ酸を含む、項目５に記載の天然に存在しない化合物。
（項目９）
式Ｉまたはその反転体：
［Ｔ／Ｋ／Ｒ／Ｑ］１〜３−［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ／Ｍ／Ｗ／Ｙ］−［Ｒ／Ｇ／Ｓ］−［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ／Ｍ／Ｗ／Ｙ］（式Ｉ、配列番号７０）
に従うアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸のうち任意の１つまたは複数が、必要に応じて、非天然のアミノ酸または（Ｄ）−アミノ酸である、項目５に記載の天然に存在しない化合物。
（項目１０）
式ＩＩ〜ＩＶのうちのいずれか１つまたはその反転体：
［Ｒ／Ｋ］−［Ｌ］−［Ｇ］−［Ｍ／Ｖ］（式ＩＩ、配列番号７１）、
［Ｒ］−［Ｌ］−［Ｇ］−［Ｖ］−［Ｍ／Ｖ］−［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ／Ｍ／Ａ／Ｗ／Ｙ］（式ＩＩＩ、配列番号７２）または
［Ｔ／Ｋ／Ｒ／Ｑ］１〜２−［Ｒ］−［Ｌ］−［Ｇ］−［Ｖ］−［Ｍ／Ｖ］−［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ／Ｍ／Ａ／Ｗ／Ｙ］（式ＩＶ、配列番号７３）
に従うアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸のうち任意の１つまたは複数が、必要に応じて、非天然のアミノ酸または（Ｄ）−アミノ酸である、項目９に記載の天然に存在しない化合物。
（項目１１）
配列番号１、配列番号５、配列番号１０、配列番号６６または配列番号６７のアミノ酸配列を含む、項目９に記載の天然に存在しない化合物。
（項目１２）
前記ポリペプチドが抗体ではない、項目５に記載の天然に存在しない化合物。
（項目１３）
前記ポリペプチドが、３０個よりも少ないアミノ酸残基からなる、項目９に記載の天然に存在しない化合物。
（項目１４）
前記ポリペプチドが、細胞透過性ペプチド配列をさらに含む、項目９に記載の天然に存在しない化合物。
（項目１５）
細胞中のＲＡＤ５１へと結合すると、以下の特徴：
（ａ）ＤＮＡ上でのＲＡＤ５１モノマーのアセンブリの阻害；
（ｂ）細胞内での相同組換えの阻害；
（ｃ）ＲＡＤ５１  ＡＴＰａｓｅ活性の阻害の欠如；または
（ｄ）Ｃａ２＋に対するＲＡＤ５１親和性の低下
のうちの少なくとも１つを示す、項目１に記載の天然に存在しない化合物。
（項目１６）
細胞死を誘導する方法であって、前記細胞を、細胞中の真核生物リコンビナーゼに結合するポリペプチドと接触させることを含み、前記真核生物リコンビナーゼへの前記ポリペプチドの前記結合が、前記細胞中のタンパク質への前記真核生物リコンビナーゼの結合を阻害し、前記細胞は、前記真核生物リコンビナーゼへと前記ポリペプチドが結合すると、細胞内遊離カルシウム濃度の増加を示す、方法。
（項目１７）
前記ポリペプチドが、式Ｉまたはその反転体：
［Ｔ／Ｋ／Ｒ／Ｑ］１〜３−［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ／Ｍ／Ｗ／Ｙ］−［Ｒ／Ｇ／Ｓ］−［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ／Ｍ／Ｗ／Ｙ］（式Ｉ；配列番号７０）
に従うアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸のうち任意の１つまたは複数が、必要に応じて、非天然のアミノ酸または（Ｄ）−アミノ酸である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記真核生物リコンビナーゼがＲＡＤ５１である、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
前記タンパク質がＢＲＣＡ２である、項目１６に記載の方法。
（項目２０）
前記タンパク質がＲＡＤ５１ＡＰ１である、項目１６に記載の方法。
（項目２１）
前記細胞死がアポトーシス細胞死である、項目１６に記載の方法。
（項目２２）
前記細胞中の真核生物リコンビナーゼへの前記ポリペプチドの前記結合が、前記細胞を化学療法剤に対して増感させる、項目１６に記載の方法。
（項目２３）
化学療法剤を投与することをさらに含む、項目１６に記載の方法。
（項目２４）
前記化学療法剤が、ＰＤ−Ｌ１、抗ＰＤ１剤またはＰＡＲＰ阻害剤である、項目１６に記載の方法。
（項目２５）
前記真核生物細胞ががん細胞である、項目１６に記載の方法。
（項目２６）
前記細胞がヒト細胞である、項目１６に記載の方法。
（項目２７）
前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドの非存在下よりも、少なくとも１０倍大きい速度で、前記細胞の死を誘導する、項目１６に記載の方法。
（項目２８）
異常なＲＡＤ５１活性と関連する状態を処置する方法であって、ヒトＲＡＤ５１上のＲＡＤ５１ＡＰ１の結合部位と相互作用するポリペプチドの治療有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む、方法。
（項目２９）
前記ポリペプチドが、ヒトＲＡＤ５１の残基２０２、２０５および２０６のうちの少なくとも１つと相互作用する、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記ポリペプチドが、式Ｉ：
［Ｔ／Ｋ／Ｒ／Ｑ］１〜３−［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ／Ｍ／Ｗ／Ｙ］−［Ｒ／Ｇ／Ｓ］−［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ／Ｍ／Ｗ／Ｙ］（式Ｉ、配列番号７０）
に従うアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸のうち任意の１つまたは複数が、必要に応じて、非天然のアミノ酸または（Ｄ）−アミノ酸である、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
前記状態がブルーム症候群である、項目２８に記載の方法。
（項目３２）
細胞における薬物耐性を低減させる方法であって、前記細胞を、ヒトＲＡＤ５１上のＲＡＤ５１ＡＰ１の結合部位と相互作用するポリペプチドと接触させることを含む、方法。
（項目３３）
前記ポリペプチドが、ヒトＲＡＤ５１の残基２０２、２０５および２０６のうちの少なくとも１つと相互作用する、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記ポリペプチドが、式Ｉまたはその反転体：
［Ｔ／Ｋ／Ｒ／Ｑ］１〜３−［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ／Ｍ／Ｗ／Ｙ］−［Ｒ／Ｇ／Ｓ］−［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ／Ｍ／Ｗ／Ｙ］（式Ｉ、配列番号７０）
に従うアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸のうち任意の１つまたは複数が、必要に応じて、非天然のアミノ酸または（Ｄ）−アミノ酸である、項目３２に記載の方法。
（項目３５）
前記薬物が、ＰＤ−Ｌ１、抗ＰＤ１剤またはＰＡＲＰ阻害剤である、項目３２に記載の方法。
（項目３６）
宿主細胞において第１の試験タンパク質と第２の試験タンパク質との間の相互作用を検出するための方法であって、
ａ）前記第１の試験タンパク質およびＤＮＡ結合部分を含む第１の融合タンパク質を、前記宿主細胞において発現させること；
ｂ）前記第２の試験タンパク質および遺伝子活性化部分を含む第２の融合タンパク質を、前記宿主細胞において発現させること；ならびに
ｃ）細胞死因子を前記宿主細胞において発現させることであって、細胞毒性レポーターが、前記ＤＮＡ結合部分に特異的なプロモーターＤＮＡ配列によって活性化される、ことを含み、
前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質との間の相互作用が、前記遺伝子活性化部分に、前記細胞毒性レポーターの発現を活性化させる、方法。
（項目３７）
前記宿主細胞が、前記ＤＮＡ結合部分に特異的な前記プロモーターＤＮＡ配列によって活性化される１つよりも多い細胞毒性レポーターを含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記宿主細胞が、ａ）前記第１の融合タンパク質をコードするゲノムＤＮＡおよび前記第２の融合タンパク質をコードするゲノムＤＮＡ；ならびにｂ）前記細胞毒性レポーターをコードするプラスミドＤＮＡを含む、項目３６に記載の方法。
（項目３９）
前記ＤＮＡ結合部分が、ＬｅｘＡ、ｃＩ、グルココルチコイド受容体、ＴｅｔＲまたはＵｍｅ６に由来する、項目３６に記載の方法。
（項目４０）
前記遺伝子活性化部分が、ＧＡＬ４、Ｂ４２またはＤｏｆ１に由来する、項目３６に記載の方法。
（項目４１）
前記細胞毒性レポーターが、リボソーム性にコードされる生体異物剤、リボソーム性にコードされる毒物、軽度に過剰発現されると重度の成長欠損を生じる、リボソーム性にコードされる内因性もしくは外因性の遺伝子、生存能にとって必須の遺伝子を切除する、リボソーム性にコードされるリコンビナーゼ、毒性二次代謝物の合成に関与する制限因子、またはそれらの任意の組合せである、項目３６に記載の方法。
（項目４２）
前記細胞毒性レポーターが、コレラ毒素、ＳｐｖＢ毒素、ＣＡＲＤＳ毒素、ＳｐｙＡ毒素、ＨｏｐＵ１、Ｃｈｅｌｔ毒素、Ｃｅｒｔｈｒａｘ毒素、ＥＦＶ毒素、ＥｘｏＴ、ＣｄｔＢ、ジフテリア毒素、ＥｘｏＵ／ＶｉｐＢ、ＨｏｐＰｔｏＥ、ＨｏｐＰｔｏＦ、ＨｏｐＰｔｏＧ、ＶｏｐＦ、ＹｏｐＪ、ＡｖｒＰｔｏＢ、ＳｄｂＡ、ＳｉｄＧ、ＶｐｄＡ、Ｌｐｇ０９６９、Ｌｐｇ１９７８、ＹｏｐＥ、ＳｐｔＰ、ＳｏｐＥ２、ＳｏｐＢ／ＳｉｇＤ、ＳｉｐＡ、ＹｐｋＡ、ＹｏｐＭ、アマトキシン、ファラシジン、キラー毒素ＫＰ１、キラー毒素ＫＰ６、キラー毒素Ｋ１、キラー毒素Ｋ２８（ＫＨＲ）、キラー毒素Ｋ２８（ＫＨＳ）、炭疽致死因子エンドペプチダーゼ、志賀毒素、リシン毒素、またはそれらの任意の組合せである、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記宿主細胞が、真菌または細菌である、項目３６に記載の方法。
（項目４４）
ランダム化ポリペプチドライブラリーをコードするＤＮＡ配列を含む試験遺伝子を、前記宿主細胞において発現させることをさらに含む、項目３６に記載の方法。
（項目４５）
前記ランダム化ポリペプチドライブラリーが、６０またはそれ未満のアミノ酸長のポリペプチドを含む、項目３６に記載の方法。
（項目４６）
試験遺伝子が、短いタンパク質の３’ＵＴＲを含む、項目４４に記載の方法。
（項目４７）
前記３’ＵＴＲが、ｓＯＲＦ１の３’ＵＴＲである、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
ランダム化ポリペプチドライブラリーをコードする前記ＤＮＡ配列が、メチオニン−バリン−アスパラギンの共通Ｎ末端配列をコードする、項目４４に記載の方法。
（項目４９）
前記ランダム化ペプチドライブラリーによってコードされるポリペプチドが、前記宿主細胞中で環状ペプチドへとプロセシングされる、項目４４に記載の方法。
（項目５０）
配列番号６３のヌクレオチド配列を含むプラスミドベクター。
（項目５１）
第１のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、ＴｅｔＲ−ＤＢＤとインフレームで挿入され、第２のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、Ｄｏｆ１−ＡＤとインフレームで挿入される、項目５０に記載のプラスミドベクター。
（項目５２）
項目５０または５１に記載のプラスミドベクターを含む宿主細胞。
（項目５３）
各プラスミドベクターが、
ａ）第１の切り替え可能なプロモーターに作動可能に連結した異なるペプチド配列をコードするＤＮＡ配列；および
ｂ）第２の切り替え可能なプロモーターの制御下の細胞毒性レポーターをコードするＤＮＡ配列
を含む、プラスミドベクターのライブラリー。
（項目５４）
前記異なるペプチド配列が、共通Ｎ末端安定化配列をコードする、項目５３に記載のプラスミドベクターのライブラリー。
（項目５５）
異なるペプチド配列をコードする前記ＤＮＡ配列が、３’ＵＴＲをさらにコードする、項目５３に記載のプラスミドベクターのライブラリー。
（項目５６）
前記異なるペプチド配列が、６０またはそれ未満のアミノ酸長である、項目５３に記載のプラスミドベクターのライブラリー。
（項目５７）
前記異なるペプチド配列がランダムである、項目５３に記載のプラスミドベクターのライブラリー。
（項目５８）
前記異なるペプチド配列が、標的への結合のために予め富化されている、項目５３に記載のプラスミドベクターのライブラリー。
（項目５９）
０または１コピーの項目５３に記載のプラスミドベクターを各々が含む、宿主細胞のライブラリー。
（項目６０）
宿主細胞であって、
ａ）ＤＮＡ結合部分を含む第１の融合タンパク質；
ｂ）遺伝子活性化部分を含む第２の融合タンパク質；
ｃ）その発現が、前記ＤＮＡ結合部分に特異的なＤＮＡ結合配列の制御下にある、細胞毒性レポーター；および
ｄ）６０またはそれ未満のアミノ酸のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡであって、前記ｍＲＮＡが、前記ポリペプチドに対して３’側の３’ＵＴＲを含み、前記ポリペプチドが、ペプチド安定化のためのＮ末端配列をコードする、ｍＲＮＡを発現する宿主細胞。
（項目６１）
前記宿主細胞が、真菌または細菌である、項目６０に記載の宿主細胞。
（項目６２）
前記宿主細胞が一倍体酵母細胞である、項目６１に記載の宿主細胞。
（項目６３）
前記宿主細胞が二倍体酵母細胞である、項目６１に記載の宿主細胞。
（項目６４）
前記二倍体酵母細胞が、第１のキメラ遺伝子および第２のキメラ遺伝子をコードするＤＮＡ配列を含む第１の宿主細胞を、前記細胞毒性レポーター、およびポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む前記ｍＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む第２の宿主細胞と接合させることによって産生される、項目６３に記載の宿主細胞。
（項目６５）
ａ）項目５０に記載のプラスミドベクター；および
ｂ）項目５３に記載のプラスミドベクターのライブラリー
を含むキット。