【手続補正書】
【提出日】令和1年12月16日(2019.12.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞由来ベシクルを産生する幹細胞を低酸素条件および低血清条件下において培養することによって調製された細胞由来ベシクルの高度に精製された集団であって、該集団の前記細胞由来ベシクルは、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１３２、又はｍｉＲ−２９６のうちの少なくとも１つを含み、任意選択で前記細胞由来ベシクルがエキソソームおよび／または微小小胞体を含む、精製された集団。
【請求項２】
前記細胞由来ベシクルが、成体幹細胞、胚性幹細胞、胚様幹細胞、神経幹細胞または人工多能性幹細胞の群の１つ以上の幹細胞から単離され、好ましくは前記幹細胞が成体幹細胞、任意選択で間葉系幹細胞である、請求項１に記載の精製された集団。
【請求項３】
前記集団の細胞由来ベシクルが、少なくとも１つのタンパク質をさらに含む、請求項１又は２に記載の精製された集団。
【請求項４】
前記集団の細胞由来ベシクルがさらにｌｅｔ−７をコードする核酸である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の精製された集団。
【請求項５】
前記タンパク質が、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、コラーゲンタイプ１アルファ２（ＣＯＬ１Ａ２）、コラーゲンタイプＶＩアルファ３（ＣＯＬ６Ａ３）、ＥＧＦ様リピートおよびジスコイジンｉ様ドメイン含有タンパク質３（ＥＤＩＬ３）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）、フィブロネクチン（ＦＮ１）、乳脂肪球−ＥＧＦ因子８（ＭＦＧＥ８）、レクチン、ガラクトシド結合可溶性３結合タンパク質（ＬＧＡＬＳ３ＢＰ）、核内因子カッパーＢ（ＮＦκＢ）及びトランスフェリン（ＴＦ）のうちの１つ以上である、請求項３に記載の精製された集団。
【請求項６】
前記集団の細胞由来ベシクルが、さらにｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２９６、およびｍｉＲ−４２４のうちの１つ以上を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の精製された集団。
【請求項７】
前記集団の細胞由来ベシクルが、さらに３，６−アンヒドロ−Ｄ−ガラクトース、４−アミノ酪酸、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシン、５−メトキシトリプタミン、ｓ−アデノシルメチオニン、ｓ−アデノシルホモシステイン、アジピン酸、アミノマロネート、アラビノース、アスパラギン酸、ベータ−アラニン、コレステロール、クエン酸、クレアチニン、システイン、シチジン−５−一リン酸、エリトリトール、フルクトース、フマル酸、ガラクツロン酸、グルコース、グルコース−１−リン酸、グルコース−６−リン酸、グルタミン、グリセリン酸、グリセロール−アルファ−リン酸、グリシン、グアノシン、ヘキシトール、ヘキスロン酸、イノシン、イソヘキソン酸、イソマルトース、ラクトアミド、乳酸、ラクトース、ロイシン、レボグルコサン、マレイミド、リンゴ酸、マルトトリオース、マンノース、リン酸メタノール、メチオニン、Ｎ−アセチルアスパラギン酸、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、ニコチンアミド、Ｎ−メチルアラニン、オキソプロリン、パントテン酸、ペンタデカン酸、フェノール、プトレッシン、ピルビン酸、リビトール、リボース、ソルビトール、スクアレン、コハク酸、トレイトール、トレオン酸、トレオニン、チミン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、トレハロース、尿素、ウリジン、バリンおよびキシリトールのうちの１つ以上を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の精製された集団。
【請求項８】
前記集団の細胞由来ベシクルが、さらに
セラミド（ｄ３２：１）、セラミド（ｄ３３：１）、セラミド（ｄ３４：０）、セラミド（ｄ３４：１）、セラミド（ｄ３４：２）、セラミド（ｄ３４：２）、セラミド（ｄ３６：１）、セラミド（ｄ３８：１）、セラミド（ｄ３９：１）、セラミド（ｄ４０：０）、セラミド（ｄ４０：１）、セラミド（ｄ４０：２）、セラミド（ｄ４１：１）、セラミド（ｄ４２：１）、セラミド（ｄ４２：２）Ｂ、セラミド（ｄ４４：１）、脂肪酸（２０：４）、脂肪酸（２２：０）、脂肪酸（２２：６）、脂肪酸（２４：０）、脂肪酸（２４：１）、グルコシルセラミド（ｄ４０：１）、グルコシルセラミド（ｄ４１：１）、グルコシルセラミド（ｄ４２：１）、グルコシルセラミド（ｄ４２：２）、リゾホスファチジルコリン（１６：０）、リゾホスファチジルコリン（１８：０）Ａ、リゾホスファチジルコリン（１８：１）、リゾホスファチジルエタノールアミン（２０：４）、ホスファチジルコリン（３２：１）、ホスファチジルコリン（３３：１）、ホスファチジルコリン（３４：０）、ホスファチジルコリン（３４：１）、ホスファチジルコリン（３４：２）、ホスファチジルコリン（３５：２）、ホスファチジルコリン（３６：１）、ホスファチジルコリン（３６：２）、ホスファチジルコリン（３６：３）、ホスファチジルコリン（３８：２）、ホスファチジルコリン（３８：３）、ホスファチジルコリン（３８：５）、ホスファチジルコリン（３８：６）、ホスファチジルコリン（４０：５）、ホスファチジルコリン（４０：６）、ホスファチジルコリン（４０：７）、ホスファチジルコリン（ｐ−３４：０）、ホスファチジルコリン（ｏ−３４：１）、ホスファチジルエタノールアミン（３４：１）、ホスファチジルエタノールアミン（３４：２）、ホスファチジルエタノールアミン（３６：３）、ホスファチジルエタノールアミン（３６：４）、ホスファチジルエタノールアミン（３８：４）、Ｂ  ホスファチジルエタノールアミン（３８：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３４：１）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３４：２）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３６：１）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３６：２）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３６：４）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３６：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３８：４）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３８：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３８：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３８：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−３８：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−３８：７）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：４）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：５）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：６）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：７）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐ−４０：７）、ホスファチジルエタノールアミン（ｏ−４０：８）、スフィンゴミエリン（ｄ３０：１）、スフィンゴミエリン（ｄ３２：０）、スフィンゴミエリン（ｄ３２：���）、スフィンゴミエリン（ｄ３３：１）、スフィンゴミエリン（ｄ３４：０）、スフィンゴミエリン（ｄ３６：１）、スフィンゴミエリン（ｄ３６：２）、スフィンゴミエリン（ｄ３８：１）、スフィンゴミエリン（ｄ４０：１）、スフィンゴミエリン（ｄ４０：２）、スフィンゴミエリン（ｄ４１：１）、スフィンゴミエリン（ｄ４１：２）、スフィンゴミエリン（ｄ４２：２），及びＢ  スフィンゴミエリン（ｄ４２：３）のうちの１つ以上を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の精製された集団。
【請求項９】
前記集団の細胞由来ベシクルが、さらにＣＤ９、ＨＳＰＡ８、ＰＤＣＤ６ＩＰ、ＧＡＰＤＨ、ＡＣＴＢ、ＡＮＸＡ２、ＣＤ６３、ＳＤＣＢＰ、ＥＮＯ１、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＴＳＧ１０１、ＰＫＭ、ＬＤＨＡ、ＥＥＦ１Ａ１、ＹＷＨＡＺ、ＰＧＫ１、ＥＥＦ２、ＡＬＤＯＡ、ＡＮＸＡ５、ＦＡＳＮ、ＹＷＨＡＥ、ＣＬＴＣ、ＣＤ８１、ＡＬＢ、ＶＣＰ、ＴＰＩ１、ＰＰＩＡ、ＭＳＮ、ＣＦＬ１、ＰＲＤＸ１、ＰＦＮ１、ＲＡＰ１Ｂ、ＩＴＧＢ１、ＨＳＰＡ５、ＳＬＣ３Ａ２、ＧＮＢ２、ＡＴＰ１Ａ１、ＷＨＡＱ、ＦＬＯＴ１、ＦＬＮＡ、ＣＬＩＣ１、ＣＤＣ４２、ＣＣＴ２、Ａ２Ｍ、ＹＷＨＡＧ、ＲＡＣ１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＨＳＰＡ１Ａ、ＧＮＡＩ２、ＡＮＸＡ１、ＲＨＯＡ、ＭＦＧＥ８、ＰＲＤＸ２、ＧＤＩ２、ＥＨＤ４、ＡＣＴＮ４、ＹＷＨＡＢ、ＲＡＢ７Ａ、ＬＤＨＢ、ＧＮＡＳ、ＴＦＲＣ、ＲＡＢ５Ｃ、ＡＮＸＡ６、ＡＮＸＡ１１、ＫＰＮＢ１、ＥＺＲ、ＡＮＸＡ４、ＡＣＬＹ、ＴＵＢＡ１Ｃ、ＲＡＢ１４、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ、ＧＮＢ１、ＵＢＡ１、ＴＨＢＳ１、ＲＡＮ、ＲＡＢ５Ａ、ＰＴＧＦＲＮ、ＣＣＴ５、ＣＣＴ３、ＢＳＧ、ＲＡＢ５Ｂ、ＲＡＢ１Ａ、ＬＡＭＰ２、ＩＴＧＡ６、ＧＳＮ、ＦＮ１、ＹＷＨＡＨ、ＴＫＴ、ＴＣＰ１、ＳＴＯＭ、ＳＬＣ１６Ａ１、及びＲＡＢ８Ａタンパク質のうちの１つ以上を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の精製された集団。
【請求項１０】
前記集団の細胞由来ベシクルが、ＦＮ１、ＥＤＩＬ３、ＴＦ、ＩＴＧＢ１、ＶＣＡＮ、
ＡＮＸＡ２、ＭＦＧＥ８、ＴＧＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＢＦＲ２、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢＲＡＰ１、ＢＡＳＰ１、ＣＯＬ１、ＣＯＬ６、ＧＡＰＤＨ、ＩＴＧＡ３、ＦＢＮ１、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＢ５、ＮＯＴＣＨ２、ＳＤＣＢＰ、ＨＳＰＡ２、ＨＳＰＡ８、ＮＴ５Ｅ、ＭＲＧＰＲＦ、ＲＴＮ４、ＮＥＦＭ、ＩＮＡ、ＮＲＰ１、ＨＳＰＡ９、ＦＢＮ１、ＢＳＧ、ＰＲＰＨ、ＦＢＬＮ１、ＰＡＲＰ４、ＦＬＮＡ、ＹＢＸ１、ＥＶＡ１Ｂ、ＡＤＡＭ１０、ＨＳＰＧ２、ＭＣＡＭ、ＰＯＳＴＮ、ＧＮＢ２、ＧＮＢ１、ＡＮＰＥＰ、ＡＤＡＭ９、ＡＴＰ１Ａ１、ＣＳＰＧ４、ＥＨＤ２、ＰＸＤＮ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＣＡＶ１、ＰＫＭ、ＧＮＢ４、ＮＰＴＮ、ＣＣＴ２、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、及びＭＶＰタンパク質のうちの１つ以上を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の精製された集団。
【請求項１１】
前記集団の細胞由来ベシクルが、血管新生に関連するＦＢＬＮ２、ＴＩＭＰ１、ＮＩＤ１、ＩＧＦＢＰ３、ＬＴＢＰ１、ＤＵＳＰ３、ＩＴＧＡＶ、ＬＡＭＡ５、ＣＯＬ１Ａ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＲＧ１、ＥＲＢＢ２、ＣＯＬ４Ａ２、ＬＤＬＲ、ＴＳＢ、ＭＭＰ２、ＴＩＭＰ２、ＴＰＩ１、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＩＮＨＢＡ、ＥＧＦＲ、ＡＰＨ１Ａ、ＮＣＳＴＮ、ＴＧＦＢ２、ＳＰＡＲＣ、ＴＧＦＢ１、Ｆ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＤＣ４、ＳＤＣ３、ＡＣＡＮ、ＩＦＩ１６、ＭＭＰ１４、ＰＬＡＴ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＮＯＴＣＨ３、ＤＳＰ、ＰＫＰ４、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＳＲＧＮ、ＮＲＰ２、ＥＰＨＡ２、ＩＴＧＡ５、ＮＲＰ１、ＰＬＡＵ、ＳＥＲＰＩＮＢ６、ＣＬＥＣ３Ｂ、ＣＤ４７、ＳＤＣ１、ＰＳＭＡ７、ＥＮＧ、Ｓ１００Ａ１３、ＴＩＭＰ３、ＴＭＥＤ１０、ＴＧＦＢＩ、ＣＴＧＦ、ＤＣＮ、ＩＴＧＢ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＪＡＧ１、ＴＧＦＢＲ２、ＰＬＡＵＲ、ＰＤＧＦＲＢ、ＦＹＮ、ＴＨＹ１、ＨＳＰＧ２、ＴＥＮＣ１、ＴＧＦＢＲ１、ＰＬＸＮＡ１、ＬＲＰ１、ＳＴＡＴ１、ＣＸＣＬ１２、ＶＣＡＮ、ＭＥＴ、ＦＮ１、ＣＤ３６、ＳＴＡＴ３、ＴＨＢＳ１、ＦＧＦＲ１、ＧＲＢ１４、ＦＧＢ、ＡＰＩ５、ＨＡＰＬＮ１、ＲＥＣＫ、ＬＡＭＣ１、ＣＹＲ６１、ＧＰＣ１、ＩＧＦＢＰ４、ＩＴＧＡ４、ＭＦＡＰ２、ＳＤＣ２、ＥＦＮＢ２、ＦＧＡ、ＰＬＸＮＤ１、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ９、ＡＮＰＥＰ、ＥＰＨＢ１、ＰＰＰ２Ｒ５Ｄ、ＡＮＴＸＲ２、ＩＧＦＢＰ７、ＣＯＬ６Ａ３、ＬＡＭＢ３、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭ１０、Ａ２Ｍ、ＥＦＮＢ１、ＩＴＧＡ３、ＣＬＵ、ＫＨＳＲＰ、及びＥＦＥＭＰ１タンパク質のうちの１つ以上を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の精製された集団。
【請求項１２】
前記集団の細胞由来ベシクルが、さらに免疫調節に関連する、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢＲＡＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＡＲＧ１、ＣＤ２７４、ＥＩＦ２Ａ、ＥＰＨＢ２、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＥＬＡＶＬ１、ＩＲＡＫ１、ＬＧＡＬＳ１、ＰＳＭＥ４、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３タンパク質のうちの１つ以上を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の精製された集団。
【請求項１３】
前記集団の細胞由来ベシクルが、ＥＤＩＬ３、ＴＦ、ＩＴＧＢ１、ＡＮＸＡ２、ＭＦＧＥ８、ＴＧＢ１、ＴＧＢＦＲ２、ＢＡＳＰ１、ＣＯＬ１、ＣＯＬ６、ＧＡＰＤＨ、ＦＢＮ１、ＩＴＧＢ５、ＳＤＣＢＰ、ＨＳＰＡ２、ＨＳＰＡ８、ＮＴ５Ｅ、ＭＲＧＰＲＦ、ＲＴＮ４、ＮＥＦＭ、ＩＮＡ、ＨＳＰＡ９、ＦＢＮ１、ＢＳＧ、ＰＲＰＨ、ＦＢＬＮ１、ＰＡＲＰ４、ＦＬＮＡ、ＹＢＸ１、ＥＶＡ１Ｂ、ＭＣＡＭ、ＰＯＳＴＮ、ＧＮＢ２、ＧＮＢ１、ＡＴＰ１Ａ１、ＣＳＰＧ４、ＥＨＤ２、ＰＸＤＮ、ＣＡＶ１、ＰＫＭ、ＧＮＢ４、ＮＰＴＮ、ＣＣＴ２、ＬＧＡＬＳ３ＢＰおよびＭＶＰ治療的タンパク質のうちの１つ以上を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の精製された集団。
【請求項１４】
前記集団中の前記細胞由来ベシクルの濃度が、
（ｉ）およそ１０６個の細胞につき回収される約０．５マイクログラム〜５０００マイクログラムのエキソソームおよび／または微小小胞体タンパク質を含む、
（ｉｉ）およそ１０６個の細胞につき回収される約３００マイクログラム未満のエキソソームおよび／または微小小胞体タンパク質を含む、または
（ｉｉｉ）１０６個の細胞につき約２００マイクログラム未満である、
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の精製された集団。
【請求項１５】
前記集団中の細胞由来ベシクルの平均直径が、約０．１ｎｍ〜約１０００ｎｍ、好ましくは１００ｎｍ未満、より好ましくは５０ｎｍ未満、更に好ましくは４０ｎｍ未満である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の精製された集団。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の細胞由来ベシクルの精製された集団およびキャリア、ならびに任意選択でさらなる治療薬を含み、好ましくは前記キャリアが薬物学的に許容されるキャリアである、組成物。
【請求項１７】
単離された幹細胞をさらに含み、好ましくは前記幹細胞が成体幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、胚様幹細胞、間葉系幹細胞、及び神経幹細胞からなる群より選ばれる、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
血管新生の促進のため、または末梢動脈疾患もしくは脳卒中の処置のためであって、任意選択で追加の治療薬とともに用いられる、または
皮膚損傷を処置するためであって、任意選択で追加の治療薬ととともに用いられる、
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の精製された集団。
【請求項１９】
少なくとも１用量としておよそ０．１ｍｇ〜２００ｍｇ、好ましくは５０ｍｇの前記細胞由来ベシクルタンパク質の投与を含む、請求項１８に記載の精製された集団。
【請求項２０】
細胞由来ベシクルの集団を精製するための方法であって、該方法は、
（ａ）単離された幹細胞の集団によって生成された条件培地にタンジェンシャルフロー濾過を適用して、細胞由来ベシクル含有画分を単離する工程；および
（ｂ）該細胞由来ベシクル含有画分を濃縮して、請求項１に記載の細胞由来ベシクルの精製された集団を得る工程
を含む、方法。
【請求項２１】
工程（ａ）の後、工程（ｂ）の前に、細胞残屑および他の夾雑物が、前記細胞由来ベシクル含有画分から除去される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
工程（ａ）を行う前に、前記幹細胞の集団を低酸素かつ低血清条件下で最大約７２時間培養され、好ましくは工程（ａ）がおよそ２００ｎｍのフィルターを用いて行われ、好ましくは前記低酸素条件がおよそ１％〜１５％ＣＯ２かつ０．０５％〜２０％酸素分圧であり、好ましくは前記低血清条件が無血清条件である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法によって入手可能な細胞由来ベシクルの集団。
【請求項２４】
乾燥された、凍結乾燥された、または凍結された、請求項１〜１５又は２３のいずれか一項に記載の細胞由来ベシクルの精製された集団。
【請求項２５】
請求項２３に記載の集団、および使用するための指示書を含む、キット。
【請求項２６】
細胞由来ベシクルの集団の大規模精製のための方法であって、該方法は、
（ａ）バイオリアクターにおいて培養された単離された幹細胞の集団によって生成された条件培地にタンジェンシャルフロー濾過を適用して、細胞由来ベシクル含有画分を単離する工程；および
（ｂ）該細胞由来ベシクル含有画分を濃縮して、請求項１に記載の細胞由来ベシクルの精製された集団を得る工程
を含む、方法。