【誤訳訂正書】
【提出日】令和1年12月10日(2019.12.10)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程(1)-(4)を含む、胚盤胞培養液で胚の染色体異常を検出する方法；
(1)単精子注射方法によって受精卵を取得し、それを3日目の卵割球に培養した後に、新しく調製された胚盤胞培養のための微小滴に移して胚盤胞の培養を行い、その胚盤胞になった胚を吸い取り、新しい胚盤胞培養に移すか又はガラス化冷凍保存プロセスに供し、残った元の胚盤胞培養液を検出用サンプルに供する工程、
(2)工程(1)で得られた胚盤胞培養液を溶解液と混合する工程、
(3)工程(2)で得られた混合物にタンパク質分解酵素を添加した後にインキュベートし、その後、該分解酵素を不活性化させ、その分解物をPCR反応管に入れてＰＣＲ反応により全ゲノム増幅反応を行う工程、及び
(4)工程(3)で得られた増幅ゲノムを、第2世代シーケンシング、核酸チップまたは免疫蛍光検出を使用して、胚の染色体異常を検出する工程。
【請求項２】
工程(2)における溶解液の成分が、pHが7.0〜8.0のTris-HCl 25〜45 mM、EDTA 0.5〜3mM、KCl 10〜25mMおよび濃度が0.05％〜5％の界面活性剤で、前記界面活性剤は、Triton X-100、Triton X-114、Tween20、NP40およびSDSから選択される1種類または複数種類であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
溶解液の成分は、好ましくはpHが7.2のTris-HCl 40 mM、EDTA 1mM、KCl 15mMおよび3％のTriton X-100であることを特徴とする、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
工程(3)におけるタンパク質分解酵素は、プロテイナーゼK、QIAGEN Protease、ペプシン、パパイン、トリプターゼおよびリゾチームから選択される1種類または複数種類であり、その濃度は1〜25μg/mlであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質分解酵素の濃度は、20μg/mlであることを特徴とする、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
工程(3)において、インキュベートは温度30〜60℃で、1分〜12時間行い、不活性化は温度75〜95℃で、1〜15分処理することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
工程(3)において、インキュベートは温度40℃で、3時間で行い、不活性化は温度90℃で、5分処理することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
工程(3)において、PCR反応を行う時のPCR反応管に、増幅混合液、0.5％〜20％のPCR阻害物質拮抗剤、5〜20mMのdNTP、5〜100μMのNGおよびNTプライマー、50〜200μMの増幅プライマー、0.5〜10単位の核酸ポリメラーゼが含まれ、前記PCR阻害物質拮抗剤は、DMSO、ベタイン、ホルムアミド、グリセリンおよびアルブミンからなる群より選択される1種類または複数種類であり、前記核酸ポリメラーゼは、Phi29 DNAポリメラーゼ、Bst DNA ポリメラーゼ、Vent ポリメラーゼ、Deep Vent ポリメラーゼ、Klenow Fragment DNAポリメラーゼI、MMLV逆転写酵素、AMV逆転写酵素、HIV逆転写酵素、Phusion（商標）ハイフィデリティーDNAポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、E.coli DNAポリメラーゼ、LongAmp Taq DNAポリメラーゼおよびOneTaq DNAポリメラーゼから選択される1種類または複数種類であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記増幅混合液の成分は、10〜25mMのTris-HCl、5〜25mMの(NH4)2SO4、5〜30mMのKCl、0.5〜5mMのMgSO4、0.1％〜20％のDMSOおよび0.05〜5％のTriton X-100であることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記増幅混合液の成分は、15mMのTris-HCl、15mMの(NH4)2SO4、20mMのKCl、1mMのMgSO4、5％のDMSOおよび2％のTriton X-100であることを特徴とする、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記NGおよびNTプライマーは、5'末端から3'末端まで共通配列と可変配列を含み、ここで、前記共通配列はG、A、CおよびTの4種類の塩基のうちの3種類または2種類からなり、条件は前記共通配列が異なる場合GおよびCを含むことで、前記増幅プライマーは前記共通配列を含み、かつ前記可変配列を含まないことを特徴とする、請求項8に記載の方法。
【請求項１２】
前記可変配列は、(N)nGGG、(N)nTTT、(N)mTNTNG、及び(N)xGTGG(N)yからなる群から選ばれ、ここで、Nは、任意の天然核酸と塩基対合するヌクレオチドで、nは、3〜17の正の整数から、mは、3〜15の正の整数から、xおよびyは、それぞれ3〜13の正の整数から選ばれることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記NGおよびNTプライマーは、
配列番号1[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNNNN]、
配列番号2[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNGGG]、
配列番号3[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNTTT]、
配列番号4[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNTNTNG]、又は
配列番号5[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNGTGGNN]の配列を含み、ここで、Nは、任意の天然核酸と塩基対合するヌクレオチドで、前記増幅プライマーは、5'から3'配列番号6[GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAG]の配列を有することを特徴とする、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
工程（3）における全ゲノム増幅の熱サイクルプログラムは、
(1)5〜20秒間、90〜98℃の第1の変性温度で反応させ、
(2)5〜60秒間、5〜15℃の第1のアニーリング温度で反応させ、5〜60 秒間、15〜25℃の第2のアニーリング温度で反応させ、30〜80 秒間、25〜35℃の第3のアニーリング温度で反応させ、5〜60秒間、35〜45℃の第4のアニーリング温度で反応させ、5〜60秒間、45〜55℃の第5のアニーリング温度で反応させ、
(3)10〜150分間、55〜80℃の第1の伸長温度で反応させ、
(4)5〜30秒間、90〜98℃の第2の変性温度で反応させ、
(5)10〜30秒間、45〜70℃の第6のアニーリング温度で反応させ、
(6)1〜10分間、60〜80℃の第2の伸長温度で反応させ、
(7)工程(4)〜(6)を5〜50サイクル繰り返し、
(8)1〜10分間、60〜80℃の温度で続いて伸長反応させ、
(9)増幅された産物を0〜5℃で冷蔵保存するものである、
ことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
工程（3）における全ゲノム増幅の熱サイクルプログラムは、
(1)10秒間、95℃の第1の変性温度で反応させ、
(2)45秒間、第1のアニーリング温度10℃で反応させ、45秒間、第2のアニーリング温度20℃で反応させ、60秒間、第3のアニーリング温度30℃で反応させ、45秒間、第4のアニーリング温度40℃で反応させ、45秒間、第5のアニーリング温度50℃で反応させ、
(3)90分間、62℃の第1の伸長温度で反応させ、
(4)20秒間、95℃の第2の変性温度で反応させ、
(5)第6のアニーリング温度59℃で20秒間反応させ、
(6)第2の伸長温度72℃で3分間反応させ、
(7)工程(4)〜(6)を10〜30サイクル繰り返し、
(8)続いて、5秒間、72℃で伸長反応させ、
(9)増幅された産物を4℃で冷蔵保存するものである、
ことを特徴とする、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
工程（3）のＰＣＲ反応で使用されるプライマーは、NGプライマー、NTプライマーおよび増幅プライマーを含み、
ここで、前記のNGプライマーおよびNTプライマーは、5'末端から3'末端まで共通配列と可変配列を含み、ここで、前記共通配列は、G、A、CおよびTの4種類の塩基のうちの3種類または2種類からなり、条件は前記共通配列が異なる場合GおよびCを含むことで、
前記NGプライマーの可変配列は、(N)nGGG、(N)xGTGG(N)y及びその組み合わせからなる群から選ばれ、前記NTプライマーの可変配列は、(N)nTTT、(N)mTNTNG、及びその組み合わせからなる群から選ばれ、ここで、Nは、任意の天然核酸と塩基対合するヌクレオチドで、各nは、独立に3〜17の正の整数から、各mは、独立に3〜15の正の整数から、xおよびyは、それぞれ3〜13の正の整数から選ばれ、
前記増幅プライマーは、前記共通配列を含み、かつ前記可変配列を含まない、
ことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
胚盤胞培養液で胚の染色体異常を検出する検出キットであって、
（i）NGプライマー、NTプライマーおよび増幅プライマーを含む、PCR増幅に使用されるプライマーと、
（ii）任意の胚盤胞培養液とを含み、
ここで、前記のNGプライマーおよびNTプライマーは、5'末端から3'末端まで共通配列と可変配列とを含み、ここで、前記共通配列はG、A、CおよびTの4種類の塩基のうちの3種類または2種類からなり、条件は前記共通配列が異なる場合GおよびCを含み、
前記NGプライマーの可変配列は、(N)nGGG、(N)xGTGG(N)y、及びその組み合わせからなる群から選ばれ、前記NTプライマーの可変配列は、(N)nTTT、(N)mTNTNG、及びその組み合わせからなる群から選ばれ、ここで、Nは、任意の天然核酸と塩基対合するヌクレオチドで、各nは、独立に3〜17の正の整数から、各mは、独立に3〜15の正の整数から、xおよびyは、それぞれ3〜13の正の整数から選ばれ、
前記増幅プライマーは、前記共通配列を含み、かつ前記可変配列を含まない、
ことを特徴とするキット。
【請求項１８】
前記のNGプライマー、NTプライマーおよび増幅プライマーは、同様の共通配列を有することを特徴とする、請求項17に記載のキット。
【請求項１９】
前記の共通配列の長さは、20〜35nt、好ましくは25〜30ntであることを特徴とする、請求項17に記載のキット。
【請求項２０】
請求項17に記載の検出キットの使用であって、胚盤胞の培養液を用いて胚の染色体異常を検出する製品の製造に使用されることを特徴とする使用。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１５】
上記目的を果たすために、本発明は胚盤胞培養液で胚の染色体異常を検出する方法であって、
(1)胚盤胞培養液の獲得：単精子注射方法によって受精卵を得、それを3日目の卵割球に培養したら新しく調製された胚盤胞培養小滴に移して胚盤胞の培養を行い、この時3日目に液置換が必要で、目的は脱落した顆粒球および未受精精子の汚染を除去することで、
胚盤胞になった胚を吸い取り、新しい胚盤胞培養に移すかガラス化冷凍保存プロセスに入り、残った元の胚盤胞培養液は約1μL〜500μL、好ましくは10μL〜200μLで、すなわち、着床前遺伝学的スクリーニング(PGS)のために収集されるサンプルになる工程と、
(2)胚盤胞培養液の採取：工程(1)で得られた元の胚盤胞培養液を溶解液に移し、遠心後、サンプルが次の全ゲノム増幅工程に入る工程と、
(3)胚盤胞培養液における微量DNAの全ゲノム増幅：工程(2)で得られた胚盤胞培養液と溶解液の混合物に分解酵素を入れ、均一に混合した後インキュベートし、その後分解酵素を不活性化させ、分解物を取ってPCR反応管に入れてPCR反応を行う工程と、
(4)全ゲノム増幅後のDNA産物の分析による胚の染色体の状態の正常かの同定：分析時第2世代シーケンシング、核酸チップまたは免疫蛍光検出を使用する工程と、
を含む方法を提供する。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１７】
ここで、工程(2)における溶解液の成分は、pHが7.0〜8.0のTris-HCl 25〜45mM、EDTA 0.5〜3mM、KCl 10〜25mMおよび濃度が0.05％〜5％の汚染除去剤で、前記界面活性剤はTriton X-100、Triton X-114、ツイン20、NP40およびSDSのうちの1種類または複数種類である。好ましくは、溶解液の成分は、pHが7.2のTris-Cl 40mM、EDTA 1mM、KCl 15mMおよび3％のTriton X-100である。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３４】
もう一つの好適な例において、前記キットは、さらに、溶解液または分解酵素を含む。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４３】
一つの実施形態において、前記検出方法は、
(1)胚盤胞培養液の獲得：単精子注射方法によって受精卵を得、それを3日目の卵割球に培養したら新しく調製された胚盤胞培養小滴に移して胚盤胞の培養を行い、この時3日目に液置換が必要で、目的は脱落した顆粒球および未受精精子の汚染を除去することで、
胚盤胞になった胚を吸い取り、新しい胚盤胞培養に移すかガラス化冷凍保存プロセスに入り、残った元の胚盤胞培養液は約1μL〜500μL、好ましくは10μL〜200μLで、すなわち、着床前遺伝学的スクリーニング(PGS)のために収集されたサンプルである工程と、
(2)胚盤胞培養液の採取：工程(1)で得られた元の胚盤胞培養液を溶解液に移し、遠心後、サンプルが次の全ゲノム増幅工程に入る工程と、
(3)胚盤胞培養液における微量DNAの全ゲノム増幅：工程(2)で得られた胚盤胞培養液と溶解液の混合物に分解酵素を入れ、均一に混合した後インキュベートし、その後分解酵素を不活性化させ、分解物を取ってPCR反応管に入れてPCR反応を行う工程と、
(4)全ゲノム増幅後のDNA産物の分析による胚の染色体の状態の正常かの同定：分析時第2世代シーケンシング、核酸チップまたは免疫蛍光検出を使用する工程と、
を含む。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５１】
2．胚盤胞培養液の採取
1）10μLの溶解液(pHが7.2のTris-HCl 40mM、EDTA 1mM、KCl 15mMおよび3％のTriton X-100)を入れた採取管を室温で2min置き、溶解液が解凍した後、サンプル採取管をミニ遠心機にセットし、分解液が全部管の底に集まるように30s遠心した。
2）工程1のステップ2）における元の胚盤胞培養液をピペットで全部溶解液に移した。
3）マーカーペンで採取管にサンプルの名称を表記し、ミニ遠心機で30s遠心し、サンプルをすぐ次の全ゲノム増幅工程に供したか、あるいは-20℃または-80℃で冷凍保存した。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５２】
3．胚盤胞培養液における微量DNAの全ゲノム増幅
1）胚盤胞培養液と溶解液の混合物を室温で溶解させた。
2）管にプロテイナーゼを入れ、上下に吹いて均一に混合した。
3）管を40℃で3hインキュベートした。
4）管を90℃で5min置いて分解酵素を不活性化させた。
5）管から分解産物を取ってPCR反応管に入れた。
6）PCR反応管に増幅混合液(15mM Tris-HCl、15mM (NH4)2SO4、20mM KCl、1mM MgSO4、5％ DMSOおよび2％ Triton X-100)、5％ DMSO、10 mM dNTP、50μM NG (5′-GT GAG TGA TGG TTG AGG TAG TGT GGA  GNNNNNGGG-3′)およびNT (5′-GT GAG TGA TGG TTG AGG TAG TGT GGA  GNNNNNTTT-3′ )プライマー、100μM増幅プライマー(5′-GT GAG TGA TGG TTGAGG TAG TGT GGA G-3′)、1単位のBstDNAポリメラーゼ、1単位のDeepVentRを入れた。
7）PCR反応管をPCR装置にセットして全ゲノム増幅を行ったが、熱サイクルプログラムは以下の通りである。