【手続補正書】
【提出日】令和2年9月25日(2020.9.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロウェルのアレイを画定する上面を有する少なくとも１つのマイクロ加工デバイスを使用して生物学的実体の集団を含む試料を分析する方法であって、前記マイクロウェル・アレイの複数のマイクロウェルが：
（１）前記マイクロウェル中に存在し得る１つ以上の目的の生物学的実体の標的核酸フラグメントにアニーリングするための標的特異的ヌクレオチド配列、および（２）前記微細加工デバイス上の前記マイクロウェルの位置を同定するための位置特異的ヌクレオチド配列である固有のタグ核酸分子を含み、
前記複数のマイクロウェルのうちの少なくともいくつかのマイクロウェルが、生物学的実体の１つより多くの細胞およびある量の栄養素をそれぞれ含むように、前記微細加工デバイス上にサンプルを充填するステップ；
前記微細加工された装置を所定の条件でインキュベートするステップ；
個々のマイクロウェルにおいて、前記複数のマイクロウェル中での前記インキュベーションから得られた生物学的実体の細胞の選択された遺伝物質を増幅し、それにより前記複数のマイクロウェルの少なくともサブセット中の第一アンプリコンを獲得するステップ； 
前記複数のマイクロウェルのサブセットから収集された前記第１のアンプリコンの集合体の配列を決定して配列決定データを獲得するステップ；および、
前記配列決定データおよび複数のマイクロウェルのそれぞれに含まれる前記固有のタグ核酸分子に基づいて、前記少なくとも１つの微細加工デバイスの前記複数のマイクロウェルのサブセットのそれぞれに存在する生物学的実体の識別を獲得するステップからなる方法。
【請求項２】
前記複数のマイクロウェルのサブセットの各々に存在する生物学的実体の識別に基づいて、前記サンプルに含まれる生物学的実体の集団における少なくとも２つの異なる種類の生物学的実体の間の関係の有無を決定するステップをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記関係が、従属関係、共生関係、および破壊的関係を含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記関係の有無が、インキュベーション後に前記同じマイクロウェル内にどの種類の生物学的実体が存在するか存在しないかを前記複数のマイクロウェルにわたって比較することによって決定されるステップをさらに含む請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記微細加工デバイス上への前記サンプルの充填が、平均して、ここでＮは２以上の数である前記任意の生物学的実体のうちのＮ個の細胞を含むように実行するステップを含む請求項２に記載の方法。
【請求項６】
Ｎが２０以下であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記生物学的実体が細菌を含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記２つの異なる種類の生物学的実体が、２つの異なる株、２つの異なる種、または２つの異なる属の細菌を含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記サンプル中の前記生物学的実体の集団が、特定の環境に自然に存在する微生物のコレクションを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記生物学的実体が真核細胞を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
インキュベーションの前に、前記微細加工デバイスの上面に膜を適用して、前記生物学的実体を前記複数のマイクロウェル内に保持するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記栄養素が前記マイクロウェルに予め充填され、前記膜によって保持されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプルを充填することが、前記少なくとも１つの微細加工デバイスの前記マイクロウェルにわたって複数の異なる栄養素を充填するステップを含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記試料を装填することが、前記少なくとも１つの微細加工デバイスの前記マイクロウェルにわたって複数の異なる栄養素を充填することを含み、少なくとも２つのタイプの生物学的実体の間の関係の有無が異なる栄養素に依存するものかについて決定するステップを含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記栄養素が、前記膜上および前記マイクロウェルの外部に設けられた貯蔵部に含まれ、前記膜が前記栄養分に対して透過性であり、前記栄養分が前記貯蔵部から前記膜を通して前記マイクロウェルに移動することを可能にすることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞の選択された遺伝物質が前記細胞のゲノムＤＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記インキュベーションから得られた前記生物学的実体の細胞の少なくともいくつかを標的位置に移すステップにおいて、前記増幅および配列決定は、前記標的位置に移されない細胞または前記標的位置に移される細胞のいずれかに対して行われることをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記複数のマイクロウェルのそれぞれの中の固有のタグ核酸分子が、前記増幅に使用されるPCRプライマーの一部を構成することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも1つの微細加工デバイスのマイクロウェルアレイの表面密度が、cm２あたり少なくとも150マイクロウェル、cm２あたり少なくとも250マイクロウェル、cm２あたり少なくとも400マイクロウェル、cm２あたり少なくとも500マイクロウェル、cm２あたり少なくとも750マイクロウェル、cm２あたり少なくとも1,000マイクロウェル、cm２あたり少なくとも2,500マイクロウェル、cm2あたり少なくとも5,000マイクロウェル、cm２あたり少なくとも7,500マイクロウェル、cm２あたり少なくとも10,000マイクロウェル、cm２あたり少なくとも50,000マイクロウェル、cm２あたり当たり100,000マイクロウェル、またはcm２あたり少なくとも160,000であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも1つの微細加工デバイスのマイクロウェルの前記アレイのそれぞれのマイクロウェルが、約5μｍから約500μｍ、約10μｍから約300μｍ、または約20μｍから約200μｍまでの直径を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
マイクロウェルのアレイを画定する上面を有する少なくとも１つの微細加工デバイスを使用して生物学的実体の集団を含む試料を分析する方法であって、
前記マイクロウェルの前記アレイの複数のマイクロウェルのそれぞれには、（１）前記マイクロウェルに存在する１つ以上の目的の生物学的実体の標的核酸フラグメントにアニーリングするための標的特異的ヌクレオチド配列、および、（２）前記少なくとも微細加工デバイス上の前記マイクロウェルの位置を識別するための位置特異的ヌクレオチド配列である固有のタグ核酸分子が充填され、
前記複数のマイクロウェルのうちの少なくともいくつかのマイクロウェルがそれぞれ、生物学的実体の１つより多い細胞およびある量の栄養素を含むように、前記微細加工されたデバイス上にサンプルを装填するステップ；
前記微細加工された装置を所定の条件でインキュベートするステップ；
前記少なくとも１つの微細加工デバイスの前記複数のマイクロウェルの少なくともサブセットにおけるインキュベーションから得られた生物学的実体の細胞の選択された遺伝物質を増幅し、それによって複数のマイクロウェル中の第１の単位複製配列を獲得するステップ；
前記複数のマイクロウェルのサブセットから収集された前記第１のアンプリコンの集合体を配列決定して配列決定データを取得するステップ、および、
配列決定データおよび前記複数のマイクロウェルのそれぞれに含まれる固有のタグ核酸分子に基づいて、前記少なくとも１つのマイクロ加工デバイスの複数のマイクロウェルのサブセットのそれぞれに存在する生物学的実体の識別を獲得するステップからなる方法。
【請求項２２】
マイクロウェルのアレイを画定する上面を有する少なくとも１つのマイクロ加工デバイスを使用して、特定の環境から収集された微生物のマイクロバイオームを分析する方法であって、
（１）前記マイクロウェル中に存在し得る１つ以上の目的の生物学的実体の標的核酸フラグメントにアニーリングするための標的特異的ヌクレオチド配列、および（２）前記マイクロウェルの位置を同定するための位置特異的ヌクレオチド配列を含み、
前記マイクロバイオームから調製されたサンプルを前記少なくとも１つの微細加工デバイス上に充填して、前記複数のマイクロウェルがそれぞれ平均して２〜２０個のマイクロバイオームの任意の微生物の細胞ならびにある量の栄養素を含むようにするステップ；
前記微細加工された装置を所定の条件でインキュベートするステップ；
前記インキュベーションから得られた微生物の選択された遺伝物質を前記少なくとも１つの微細加工デバイス中の前記複数のマイクロウェルの少なくともサブセット中で増幅し、それによって複数のマイクロウェル中の第１のアンプリコンを獲得するステップ；
配列決定データを得るために、前記複数のマイクロウェルの前記サブセットから収集された第１のアンプリコンの凝集体を配列決定するステップ、および、
前記配列決定データおよび前記複数のマイクロウェルのそれぞれに含まれる固有のタグ核酸分子に基づいて、前記少なくとも１つのマイクロ加工デバイスの複数のマイクロウェルのサブセットのそれぞれに存在する微生物の識別を取得し、
前記複数のマイクロウェル中に存在する微生物の同定に基づいて、マイクロバイオーム中の少なくとも２つの異なる種類の微生物間の関係の有無を決定するステップからなる方法。
【請求項２３】
特定の環境から収集されたマイクロバイオームの微生物間の関係を分析する方法であって、
前記マイクロバイオームの微生物を複数の部分に分けるステップにおいて、それぞれ平均して２〜２０細胞のマイクロバイオームの微生物が含まれ；
前記微生物の複数の部分の各部分を、前記栄養素の存在下で、所定の条件で別々の区画でインキュベートするステップ；
インキュベーション後、前記単離された区画の少なくともサブセットのそれぞれに存在する微生物を同定するステップ；および、
前記識別された微生物の種類が前記同じマイクロウェルに存在するか存在しないかの区画のサブセットにわたる比較に基づいて、前記マイクロバイオーム中の少なくとも２つの異なる種類の微生物間の関係の有無を決定するステップからなる方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
複数の実施形態において、生物学的実体の個体群を含む標本の分析方法を提供する。この方法は、マイクロウェルのアレイが定められた（または含まれた）上面を有する少なくとも一つの微細加工されたデバイスを用いることができ、マイクロウェルのアレイの複数のマイクロウェルのアレイには、固有のタグ核酸分子であり、（１）マイクロウェルの中に存在する一つまたはそれ以上の生物学的実体の標的となる核酸フラグメントにアニーリングするための標的特異性核酸配列（a target-specific nucleic sequence）および（２）マイクロウェルの位置を同定するための位置特異性ヌクレオチド配列を含む。この方法は、複数のマイクロウェルのうちの少なくともいくつかのマイクロウェルがそれぞれ１つ以上の細胞の生物学的実体およびある量の栄養素をそれぞれ含むように、微細加工デバイス上にサンプルを装填することを含み、微細加工された装置を所定の条件でインキュベートし、個々のマイクロウェルの中で、複数のマイクロウェル中でのインキュベーションから得られた生物学的実体の細胞の選択された遺伝物質（例えば、細胞のゲノムＤＮＡ）を増幅し、それにより複数のマイクロウェルの少なくともサブセット中の第一アンプリコンを得て、複数のマイクロウェルのサブセットから収集された第１のアンプリコンの集合体を配列決定して配列決定データを得て、配列決定データおよび複数のマイクロウェルのそれぞれに含まれる固有のタグ核酸分子に基づいて、少なくとも１つのマイクロ加工デバイスの複数のマイクロウェルのサブセットのそれぞれに存在する生物学的実体の識別を得る。