(57)【要約】  複数種類のタンパク質を、それをコードする核酸と対応付けて一度に供給することができるとともに、複数種類のタンパク質の供給後、直ちに当該複数種類のタンパク質の解析を並列して行なうことができ、しかも変性や失活を起こしたタンパク質を容易に再生することができる核酸ライブラリーであって、その作製の際に核酸とタンパク質捕獲体との位置関係を対応付ける必要がなく、効率的な作製が可能である核酸ライブラリーを提供することを目的とし、この目的を達成するために、第１の固体支持体２と、第１の固体支持体２の所定表面領域に互いに離反した状態で固定された複数の核酸群３と、第１の固体支持体２に螺旋状に巻装された第２の固体支持体４と、第２の固体支持体４の所定表面領域に高密度で固定された複数のタンパク質捕獲体５とを備えた核酸ライブラリー１を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の固体支持体と、
前記第１の固体支持体の所定表面領域に固定された、in vitro転写・翻訳系又はin vitro翻訳系において互いに異なる種類のタンパク質を発現できる複数の核酸群と、
第２の固体支持体と、
前記第２の固体支持体の所定表面領域に高密度で固定された、前記複数の核酸群から発現されるいずれのタンパク質をも捕獲できる複数のタンパク質捕獲体と
を備えた核酸ライブラリーであって、
前記複数の核酸群は、それぞれ、前記所定表面領域に互いに離反して存在する複数の部分領域のうち一の部分領域に固定されており、
前記複数のタンパク質捕獲体が固定された前記所定表面領域が、前記複数の核酸群が固定された前記所定表面領域に近接するように、前記第１の固体支持体に対して前記第２の固体支持体が配置された核酸ライブラリー。
【請求項２】
前記複数のタンパク質捕獲体のうち隣接するタンパク質捕獲体間の距離が、前記複数の部分領域のうち隣接する部分領域間の距離の１００分の１以下となるような密度で、前記複数のタンパク質捕獲体が前記所定表面領域に固定された請求項１記載の核酸ライブラリー。
【請求項３】
前記複数のタンパク質捕獲体が固定された前記所定表面領域と、前記複数の核酸群が固定された前記所定表面領域との距離が、前記複数の部分領域のうち隣接する部分領域間の距離の５分の１以下となるように、前記第１の固体支持体に対して前記第２の固体支持体が配置された請求項１又は２記載の核酸ライブラリー。
【請求項４】
前記第２の固体支持体が可撓性長尺部材からなり、前記第２の固体支持体が前記第１の固体支持体に螺旋状に巻装された請求項１〜３のいずれかに記載の核酸ライブラリー。
【請求項５】
前記複数の部分領域の巻き軸方向の長さのうち、最も短い長さを巻き軸方向単位長さとしたときに、前記巻き軸方向単位長さあたりの前記第２の固体支持体の巻き数が１回以上である請求項４記載の核酸ライブラリー。
【請求項６】
前記第１の固体支持体の表面における各核酸群の位置と各核酸群に含まれる核酸の種類とが対応付けられている請求項１〜５のいずれかに記載の核酸ライブラリー。
【請求項７】
各核酸群から発現されるタンパク質が、核酸群間で種類が異なる標的タンパク質と核酸群間で種類が同一のタグタンパク質との融合タンパク質であり、各タンパク質捕獲体が前記タグタンパク質に結合できる請求項１〜６のいずれかに記載の核酸ライブラリー。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の核酸ライブラリーを作製する方法であって、
前記第１の固体支持体の所定表面領域のうち前記複数の部位領域に、それぞれ、前記複数の核酸群のうち一の核酸群を固定する工程、
前記第２の固体支持体の所定表面領域に、前記複数のタンパク質捕獲体を高密度で固定する工程、及び、
前記複数のタンパク質捕獲体が固定された前記所定表面領域が、前記複数の核酸群が固定された前記所定表面領域に近接するように、前記第１の固体支持体に対して前記第２の固体支持体が配置する工程を含む方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかに記載の核酸ライブラリーをin vitro転写・翻訳系又はin vitro翻訳系に供して、前記核酸ライブラリーに含まれる複数の核酸群を一度に発現させることにより得られるタンパク質ライブラリー。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれかに記載の核酸ライブラリーをin vitro転写・翻訳系又はin vitro翻訳系に供して、前記核酸ライブラリーに含まれる複数の核酸群を一度に発現させる工程を含むタンパク質ライブラリーの作製方法。
【請求項１１】
固体支持体と、前記固体支持体の所定表面領域に互いに離反した状態で固定された、in vitro転写・翻訳系又はin vitro翻訳系において互いに異なる種類のタンパク質を発現できる複数の核酸群と、前記所定表面領域に各核酸群に近接した状態で固定されたタンパク質捕獲体とを含む核酸ライブラリーを作製する方法であって、
前記所定表面領域全体に、前記複数の核酸群から発現されるいずれのタンパク質をも捕獲できる複数のタンパク質捕獲体を高密度で固定する工程、及び、
前記所定表面領域に互いに離反して存在する複数の部分領域に、それぞれ、前記複数の核酸群のうち一の核酸群を固定する工程を含む方法。
【請求項１２】
前記複数のタンパク質捕獲体を、前記複数のタンパク質捕獲体のうち隣接するタンパク質捕獲体間の距離が、前記複数の部分領域のうち隣接する部分領域間の距離の１００分の１以下となるような密度で固定する、請求項１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固体支持体の表面に固定された複数の核酸を含む核酸ライブラリー（核酸の集合物）、及び固体支持体の表面にディスプレイ（提示）された複数のタンパク質を含むタンパク質ライブラリー（タンパク質の集合物）に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテオミックスにおいては、複数種類のタンパク質に関して、その構造、機能等に関する多種多様な解析を並列して行なうこと（すなわちハイスループット解析）が必要となる。複数種類のタンパク質の解析を並列して行なう上で、固体支持体表面に複数種類のタンパク質が固定されたプロテインアレイ（プロテインチップ）の有用性が注目されている。プロテインアレイは、複数種類のタンパク質が固体支持体表面の所定領域に固定されており、タンパク質の種類をタンパク質の固定位置によって識別できるようになっている。プロテインアレイは、例えば、複数種類のタンパク質の中から、標的物質（例えばタンパク質、ＤＮＡ等）と結合できるタンパク質をスクリーニングする際に有用である。【０００３】
しかしながら、従来のプロテインアレイにおいては、固体支持体表面にタンパク質を固定する際、固体支持体表面へのタンパク質の非効率的なスポッティングを行う必要があった。【０００４】
また、従来のプロテインアレイにおいては、固体支持体表面に固定されたタンパク質が乾燥により変性及び失活を生じやすく、固体支持体表面に固定されたタンパク質が一旦変性や失活を起こすと、そのタンパク質を再生させるのは困難であるため、長期間にわたる保存や使用が困難であった。【０００５】
さらに、従来のプロテインアレイを用いたアッセイ系では、供給されたタンパク質を固体支持体表面に固定して初めて解析を行なうことができるので、タンパク質の供給後直ちに解析を開始することはできず、タンパク質の供給から解析開始に至るまでに多大な時間と労力を必要としていた。すなわち、タンパク質の供給とタンパク質のアッセイ系とが別個独立した技術となっていたため、タンパク質の解析を効率的に進めることが困難であった。【０００６】
このような状況の下、互いに離反した状態で存在する２種類以上のライブラリーユニットを有する核酸ライブラリーであって、各ライブラリーユニットが、in vitro転写・翻訳系又はin vitro翻訳系において１種類以上のタンパク質を発現し得る核酸と、該核酸に近接して設けられたタンパク質捕獲体とを含んで構成されており、各ライブラリーユニットが固体支持体の表面に設けられ、各ライブラリーユニットに含まれる核酸が、各ライブラリーユニットが設けられた固体支持体の表面に固定されている核酸ライブラリーが開発されている（特許文献１参照）。【０００７】
上記核酸ライブラリーにおいては、異なる種類のライブラリーユニットが互いに離反した状態で存在するとともに、各ライブラリーユニットにおいてタンパク質捕獲体が核酸に近接して設けられているので、異なる種類のライブラリーユニットに含まれる核酸とタンパク質捕獲体との距離は、同一のライブラリーユニットに含まれる核酸とタンパク質捕獲体との距離よりも圧倒的に大きくなっている。したがって、各ライブラリーユニットに含まれる核酸から発現されるタンパク質は、異なる種類のライブラリーユニットに含まれるタンパク質捕獲体よりも、同一のライブラリーユニットに含まれるタンパク質捕獲体に優先的に捕獲され、異なる種類のライブラリーユニットで発現されるタンパク質のクロスコンタミネーションを効果的に防止することができる。よって、上記核酸ライブラリーが有する２種類以上のライブラリーユニットをin vitro転写・翻訳系又はin vitro翻訳系に供すると、各ライブラリーユニットに含まれる核酸から発現されたタンパク質は、同一のライブラリーユニットに含まれるタンパク質捕獲体に捕獲された状態で固体支持体上にディスプレイ（提示）される。すなわち、上記核酸ライブラリーによれば、複数種類のタンパク質を、それをコードする核酸と対応付けた状態で、かつ固体支持体上にディスプレイされた状態で一度に供給でき、これにより複数種類のタンパク質の解析を並列して効率よく行なうことができる。【０００８】
また、上記核酸ライブラリーは、各ライブラリーユニットをin vitro転写・翻訳系又はin vitro翻訳系に供することにより直ちにタンパク質ライブラリーに変換される。すなわち、上記核酸ライブラリーにおいては、タンパク質の供給とタンパク質のアッセイ系とが一体となっているので、複数種類のタンパク質の供給後、直ちに当該複数種類のタンパク質の解析を行なうことができる。【０００９】
さらに、上記核酸ライブラリーにおいては、固体支持体上にディスプレイされたタンパク質が変性や失活を起こしたとしても、そのタンパク質に対応する核酸を再度発現させることにより、タンパク質を容易に再生することができる。
【特許文献１】国際公開ＷＯ０３／０８３１１１号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
特許文献１では、例えば、ライブラリーユニットごとに核酸とタンパク質捕獲体とを近接して設けるために、核酸の一端を固体支持体に固定し、核酸の他端にタンパク質捕獲体を設け、核酸とタンパク質捕獲体との位置関係を対応付けている。このように、ライブラリーユニットごとに核酸とタンパク質捕獲体との位置関係を対応付けてライブラリーユニットを形成すると、核酸ライブラリーの作製効率が低くなる。【００１１】
そこで、本発明は、複数種類のタンパク質を、それをコードする核酸と対応付けて一度に供給することができるとともに、複数種類のタンパク質の供給後、直ちに当該複数種類のタンパク質の解析を並列して行なうことができ、しかも変性や失活を起こしたタンパク質を容易に再生することができる核酸ライブラリーであって、その作製の際に核酸とタンパク質捕獲体との位置関係を対応付ける必要がなく、効率的な作製が可能である核酸ライブラリー及びその作製方法を提供することを目的とする。【００１２】
また、本発明は、本発明の核酸ライブラリーを利用して作製されたタンパク質ライブラリー、及び本発明の核酸ライブラリーを利用したタンパク質ライブラリーの作製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決するために、本発明は、第１の固体支持体と、前記第１の固体支持体の所定表面領域に固定された、in vitro転写・翻訳系又はin vitro翻訳系において互いに異なる種類のタンパク質を発現できる複数の核酸群と、第２の固体支持体と、前記第２の固体支持体の所定表面領域に高密度で固定された、前記複数の核酸群から発現されるいずれのタンパク質をも捕獲できる複数のタンパク質捕獲体とを備えた核酸ライブラリーであって、前記複数の核酸群は、それぞれ、前記所定表面領域に互いに離反して存在する複数の部分領域のうち一の部分領域に固定されており、前記複数のタンパク質捕獲体が固定された前記所定表面領域が、前記複数の核酸群が固定された前記所定表面領域に近接するように、前記第１の固体支持体に対して前記第２の固体支持体が配置された核酸ライブラリーを提供する。【００１４】
本発明の核酸ライブラリーでは、複数のタンパク質捕獲体が高密度で固定された第２の固体支持体の所定表面領域（以下「タンパク質捕獲体固定表面領域」という場合がある）が、複数の核酸群が互いに離反した状態で固定された第１の固体支持体の所定表面領域（以下「核酸固定表面領域」という場合がある）に近接しているので、各核酸群には、核酸群ごとに異なるタンパク質捕獲体が近接しており、一の核酸群と一の核酸群に近接するタンパク質捕獲体との距離は、他の核酸群と一の核酸群に近接するタンパク質捕獲体との距離よりも圧倒的に小さくなっている。なお、各タンパク質捕獲体は、各核酸群から発現されるいずれのタンパク質をも捕獲できるので、各核酸群には、いずれのタンパク質捕獲体が近接していてもよい。【００１５】
したがって、本発明の核酸ライブラリーをin vitro転写・翻訳系又はin vitro翻訳系に供すると、各核酸群から発現されたタンパク質は、各核酸群に近接するタンパク質捕獲体に優先的に捕獲されるので、各核酸群から発現されたタンパク質のクロスコンタミネーションは防止される。すなわち、本発明の核酸ライブラリーによれば、複数種類のタンパク質を、それをコードする核酸と対応付けた状態で第２の固体支持体上にディスプレイでき、これにより、複数種類のタンパク質の解析を並列して効率よく行なうことができる。【００１６】
また、本発明の核酸ライブラリーは、in vitro転写・翻訳系又はin vitro翻訳系に供することにより直ちにタンパク質ライブラリーに変換される。すなわち、本発明の核酸ライブラリーにおいては、タンパク質の供給とタンパク質のアッセイ系とが一体となっている。したがって、本発明の核酸ライブラリーによれば、複数種類のタンパク質の供給後、直ちに当該複数種類のタンパク質の解析を行なうことができる。【００１７】
さらに、本発明の核酸ライブラリーによれば、第２の固体支持体上にディスプレイされたタンパク質が変性や失活を起こしたとしても、そのタンパク質に対応する核酸群を再度発現させることにより、タンパク質を容易に再生することができる。【００１８】
さらに、本発明の核酸ライブラリーの作製にあたり、第１の固体支持体の所定表面領域に複数の核酸群を互いに離反した状態で固定する工程により核酸固定表面領域を形成させ、第２の固体支持体の所定表面領域に複数のタンパク質捕獲体を高密度で固定する工程によりタンパク質捕獲体固定表面領域を形成させ、タンパク質捕獲体固定表面領域が核酸固定表面領域に近接するように、第１の固体支持体に対して第２の固体支持体を配置すればよい。すなわち、タンパク質捕獲体を各核酸群の位置と対応付けて配列させる必要はなく、各核酸群の位置に関係なくランダムに配列させればよい。したがって、本発明の核酸ライブラリーは効率的に作製することができる。【００１９】
本発明の核酸ライブラリーにおいて、タンパク質捕獲体は、隣接するタンパク質捕獲体間の距離が、互いに離反して存在する複数の部分領域のうち隣接する部分領域間の距離よりも圧倒的に小さくなるような密度で第２の固体支持体の所定表面領域に固定され、第２の固体支持体は、核酸固定表面領域とタンパク質捕獲体固定表面領域との距離が、互いに離反して存在する複数の部分領域のうち隣接する部分領域間の距離よりも圧倒的に小さくなるように、第１の固体支持体に対して配置される。これにより、各核酸群から発現されたタンパク質のクロスコンタミネーションを効果的に防止することができる。【００２０】
互いに離反して存在する複数の部分領域のうち隣接する部分領域間の距離は特に限定されるものではないが、通常０．０１ｍｍ以上、好ましくは０．１ｍｍ以上、さらに好ましくは１ｍｍ以上である。隣接する部分領域間の距離の上限値は特に限定されるものではなく、第１の固体支持体の所定表面領域の大きさ等に応じて適宜調節することができるが、通常１０ｍｍである。なお、「部分領域間の距離」とは、２つの部分領域の周縁のうち最も近接する２点間の距離を意味する。【００２１】
タンパク質捕獲体は、隣接するタンパク質捕獲体間の距離が、互いに離反して存在する複数の部分領域のうち隣接する部分領域間の距離の１００分の１以下となるような密度で、第２の固体支持体の所定表面領域に固定されていることが好ましい。隣接するタンパク質捕獲体間の距離は、互いに離反して存在する複数の部分領域のうち隣接する部分領域間の距離の１００分の１以下、１０００分の１以下、１万分の１以下、１０万分の１以下、１００万分の１以下、１０００万分の１以下というように、小さくなればなるほど好ましい。【００２２】
第２の固体支持体は、タンパク質捕獲体固定表面領域と核酸固定表面領域との距離が、互いに離反して存在する複数の部分領域のうち隣接する部分領域間の距離の５分の１以下となるように、第１の固体支持体に対して配置されていることが好ましい。タンパク質捕獲体固定表面領域と核酸固定表面領域との距離は、互いに離反して存在する複数の部分領域のうち隣接する部分領域間の距離の５分の１以下、５０分の１以下、５００分の１以下、５０００分の１以下というように、小さくなればなるほど好ましい。なお、タンパク質捕獲体固定表面領域と核酸固定表面領域との距離の下限値は０である。【００２３】
本発明の核酸ライブラリーにおいて、第１及び第２の固体支持体の形状、第１の固体支持体に対する第２の固体支持体の配置の仕方等は、タンパク質捕獲体固定表面領域を核酸固定表面領域に近接させることができる限り特に限定されるものではないが、本発明の核酸ライブラリーの好ましい態様においては、第２の固体支持体が可撓性長尺部材からなり、第２の固体支持体が第１の固体支持体に螺旋状に巻装されている（本態様を以下「第１の態様」という）。【００２４】
第１の態様によれば、第２の固体支持体の巻き数を調節することにより、核酸固定表面領域に対するタンパク質捕獲体の配列密度を調節することができ、各核酸群から発現されたタンパク質のクロスコンタミネーションを効果的に防止することができる。なお、第１の態様においては、第２の固体支持体の表面におけるタンパク質捕獲体の固定密度よりも、核酸固定表面領域に対するタンパク質捕獲体の配列密度の方が大きくなっている。【００２５】
また、第１の態様によれば、隣接する核酸群間に介在する第２の固体支持体が障壁となり、各核酸から発現されたタンパク質のクロスコンタミネーションを効果的に防止することができる。【００２６】
第１の態様において、可撓性長尺部材の形状は長尺状である限り特に限定されるものではなく、例えば、糸状、紐状、テープ状等が挙げられる。【００２７】
第１の態様において、第１の固体支持体の形状は可撓性長尺部材を巻装できる限り特に限定されるものではなく、例えば、平板状、円柱状、円筒状、角柱状、角筒状、棒状、糸状、紐状、テープ状等が挙げられる。【００２８】
第１の態様において、第２の固体支持体の巻き数は、タンパク質固定表面領域が各核酸群に近接する限り特に限定されるものではないが、例えば、互いに離反して存在する複数の部分領域の巻き軸方向の長さのうち、最も短い長さを巻き軸方向単位長さとしたとき、巻き軸方向単位長さあたりの第２の固体支持体の巻き数は、好ましくは１回以上、さらに好ましくは２回以上である。巻き軸方向単位長さあたりの第２の固体支持体の巻き数の上限値は特に限定されるものではなく、第２の固体支持体の幅に応じて適宜調節することができる。各部分領域の巻き軸方向の長さは特に限定されるものではないが、通常０．０５ｍｍ以上、好ましくは２ｍｍ以上である。各部分領域の巻き軸方向の長さの上限値は特に限定されるものではなく、第１の固体支持体の大きさ等に応じて適宜調節することができるが、通常１０ｍｍである。第２の固体支持体の幅は巻き軸方向単位長さ以下とし、タンパク質固定表面領域のうち異なる領域同士が重ならないように第２の固体支持体を第１の固体支持体に巻装することが好ましい。なお、「巻き軸」とは、第１の固体支持体に巻装された第２の固体支持体によって形成される螺旋の中心を通る線を意味する。【００２９】
本発明の核酸ライブラリーにおいて、第２の固体支持体が第１の固体支持体に対して配置された状態のまま、第２の固体支持体上にディスプレイされたタンパク質の解析を行おうとすると、第２の固体支持体の形状、第１の固体支持体に対する第２の固体支持体の配置の仕方等によっては、第２の固体支持体がタンパク質解析の障害となる場合がある。例えば、核酸固定表面領域の全体が第２の固体支持体によって覆われている場合、第２の固体支持体が第１の固体支持体に対して配置された状態のままでは、第２の固体支持体上にディスプレイされたタンパク質へのアクセスが困難である。このような場合には、タンパク質ライブラリーの作製からタンパク質ライブラリーを利用したタンパク質の解析に至る一連の操作の自動化を図ることが困難である。【００３０】
本発明の核酸ライブラリーにおいて、核酸固定表面領域全体が第２の固体支持体によって覆われている場合としては、例えば、第２の固体支持体が中空部を有する部材（例えば、円筒状、角筒状、「Ｃ」の字状、「コ」の字状等に湾曲又は曲折した可撓性シート状部材）からなり、第１の固体支持体が第２の固体支持体の中空部に収容されている場合が挙げられる。【００３１】
これに対して、第１の態様においては、第２の固体支持体が第１の固体支持体に対して配置された状態のままでも、第２の固体支持体上にディスプレイされたタンパク質へのアクセスが容易である。したがって、第１の態様によれば、タンパク質ライブラリーの作製からタンパク質ライブラリーを利用したタンパク質の解析に至る一連の操作の自動化を容易に図ることができる。【００３２】
本発明の核酸ライブラリーにおいて、第１の固体支持体の表面に固定された核酸の種類を識別する方法は特に限定されるものでないが、本発明の核酸ライブラリーの好ましい態様においては、第１の固体支持体の表面における各核酸群の位置と各核酸群に含まれる核酸の種類とが対応付けられている（本態様を以下「第２の態様」という）。【００３３】
第２の態様によれば、各核酸群に含まれる核酸の種類及び各核酸群から発現されたタンパク質の種類を各核酸群の位置に基づいて容易に識別することができる。また、各核酸群から発現されたタンパク質は各核酸群に近接するタンパク質捕獲体に捕獲されるので、タンパク質捕獲体に捕獲されたタンパク質の種類は、タンパク質捕獲体に近接する核酸群の位置に基づいて容易に識別することができる。【００３４】
本発明の核酸ライブラリーにおいて、タンパク質捕獲体の種類は、各核酸群から発現されるいずれのタンパク質をも捕獲できる限り特に限定されるものでないが、本発明の好ましい態様においては、各核酸群から発現されるタンパク質が、核酸群間で種類が異なる標的タンパク質と、核酸群間で種類が同一のタグタンパク質との融合タンパク質であり、各タンパク質捕獲体がタグタンパク質に結合することができる（本態様を以下「第３の態様」という）。【００３５】
第３の態様によれば、各核酸群から発現されるタンパク質とタンパク質捕獲体との結合が確実なものとなる。なお、「標的タンパク質」とは、第２の固体支持体上にディスプレイされ、解析対象となるタンパク質を意味する。【００３６】
第３の態様において、各核酸群から発現された融合タンパク質は、向きが同一となるようにタンパク質捕獲体と結合することが好ましい。各核酸群から発現された融合タンパク質の向きが同一となることにより、第２の固体支持体上にディスプレイされた融合タンパク質の反応性を均一化及び最適化することができる。【００３７】
本発明は、本発明の核酸ライブラリーを作製する方法であって、前記第１の固体支持体の所定表面領域のうち前記複数の部位領域に、それぞれ、前記複数の核酸群のうち一の核酸群を固定する工程、前記第２の固体支持体の所定表面領域に、前記複数のタンパク質捕獲体を高密度で固定する工程、及び、前記複数のタンパク質捕獲体が固定された前記所定表面領域が、前記複数の核酸群が固定された前記所定表面領域に近接するように、前記第１の固体支持体に対して前記第２の固体支持体が配置する工程を含む方法を提供する。【００３８】
本発明の方法によれば、核酸固定表面領域及びタンパク質捕獲体固定表面領域をそれぞれ第１の固体支持体及び第２の固体支持体に別個に形成させ、タンパク質捕獲体固定表面領域が核酸固定表面領域に近接するように、第１の固体支持体に対して第２の固体支持体を配置することにより、本発明の核酸ライブラリーを作製することができる。すなわち、本発明の核酸ライブラリーの作製にあたり、タンパク質捕獲体を核酸の位置と対応付けて配列させる必要はなく、核酸の位置に関係なくランダムに配列させればよい。したがって、本発明の核酸ライブラリーによれば、本発明の核酸ライブラリーを効率的に作製することができる。【００３９】
本発明は、本発明の核酸ライブラリーをin vitro転写・翻訳系又はin vitro翻訳系に供して、前記核酸ライブラリーに含まれる複数の核酸群を一度に発現させることにより得られるタンパク質ライブラリーを提供する。【００４０】
本発明の核酸ライブラリーをin vitro転写・翻訳系又はin vitro翻訳系に一度に供しても、各核酸群から発現されたタンパク質のクロスコンタミネーションは防止されるので、複数種類のタンパク質は、それをコードする核酸と対応付けた状態で第２の固体支持体上に一度にディスプレイされる。したがって、本発明のタンパク質ライブラリーによれば、複数種類のタンパク質の解析を並列して効率的に行なうことができる。【００４１】
また、本発明のタンパク質ライブラリーは、本発明の核酸ライブラリーに含まれる核酸群を発現させることによって直ちに作製されるので、複数種類のタンパク質の供給後、直ちに当該複数種類のタンパク質の解析を行なうことができる。【００４２】
さらに、本発明のタンパク質ライブラリーにおいては、固体支持体上にディスプレイされたタンパク質が変性や失活を起こしたとしても、そのタンパク質に対応する核酸群を再度発現させることにより、そのタンパク質を容易に再生することができる。【００４３】
さらに、本発明のタンパク質ライブラリーは、核酸ライブラリーの状態で保存しておき、必要なときにタンパク質ライブラリーを再生させることにより、長期間にわたり繰り返し使用することができる。【００４４】
本発明は、本発明の核酸ライブラリーをin vitro転写・翻訳系又はin vitro翻訳系に供して、前記核酸ライブラリーに含まれる複数の核酸群を一度に発現させる工程を含むタンパク質ライブラリーの作製方法を提供する。【００４５】
本発明のタンパク質ライブラリーの作製方法によれば、各核酸群から発現されたタンパク質のクロスコンタミネーションを防止した状態で、本発明のタンパク質ライブラリーを作製することができる。【００４６】
本発明は、固体支持体と、前記固体支持体の所定表面領域に互いに離反した状態で固定された、in vitro転写・翻訳系又はin vitro翻訳系において互いに異なる種類のタンパク質を発現する複数の核酸群と、前記所定表面領域に各核酸群に近接した状態で固定されたタンパク質捕獲体とを含む核酸ライブラリーを作製する方法であって、前記所定表面領域全体に、前記複数の核酸群から発現されるいずれのタンパク質をも捕獲できる複数のタンパク質捕獲体を高密度で固定する工程、及び、前記所定表面領域に互いに離反して存在する複数の部分領域に、それぞれ、前記複数の核酸群のうち一の核酸群を固定する工程を含む方法を提供する。【００４７】
本発明の方法によれば、同一の固体支持体の表面に核酸及びタンパク質捕獲体を固定する際、タンパク質捕獲体を核酸の位置と対応付けて配列させる必要はなく、核酸の位置に関係なくランダムに配列させればよいので、核酸ライブラリーを効率的に作製することができる。【００４８】
本発明の方法において、固体支持体の所定表面領域への核酸及びタンパク質捕獲体の固定順序は特に限定されるものではなく、タンパク質捕獲体を固定した後に核酸を固定してもよいし、核酸を固定した後にタンパク質捕獲体を固定してもよい。【００４９】
本発明の方法において、複数のタンパク質捕獲体を、複数のタンパク質捕獲体のうち隣接するタンパク質捕獲体間の距離が、複数の部分領域のうち隣接する部分領域間の距離の１００分の１以下となるような密度で固定することが好ましい。これにより、各核酸群から発現されたタンパク質のクロスコンタミネーションを効果的に防止することができる。隣接するタンパク質捕獲体間の距離は、互いに離反して存在する複数の部分領域のうち隣接する部分領域間の距離の１００分の１以下、１０００分の１以下、１万分の１以下、１０万分の１以下、１００万分の１以下、１０００万分の１以下というように、小さくなればなるほど好ましい。【００５０】
本発明の方法において、固体支持体は多孔質であることが好ましい。固体支持体の細孔内は液体（例えばin vitro転写・翻訳系又はin vitro翻訳系の溶液）の流動性が低いので、固体支持体の細孔の内部表面に固定された核酸群から発現されるタンパク質は細孔内から放出され難い。したがって、当該核酸群から発現されるタンパク質をタンパク質捕獲体で確実に捕獲することができ、各核酸群から発現されたタンパク質のクロスコンタミネーションを効果的に防止することができる。
【発明の効果】
【００５１】
本発明によれば、複数種類のタンパク質を、それをコードする核酸と対応付けて一度に供給することができるとともに、複数種類のタンパク質の供給後、直ちに当該複数種類のタンパク質の解析を並列して行なうことができ、しかも変性や失活を起こしたタンパク質を容易に再生することができる核酸ライブラリーであって、その作製の際に核酸とタンパク質捕獲体との位置関係を対応付ける必要がなく、効率的な作製が可能である核酸ライブラリーが提供される。また、本発明によれば、本発明の核酸ライブラリーを利用して作製されたタンパク質ライブラリーが提供される。さらに、本発明によれば、本発明の核酸ライブラリーを利用したタンパク質ライブラリーの作製方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】本発明の一実施形態に係る核酸ライブラリーの斜視図である。
【図２】各種鋳型DNAの構造の模式図である。
【図３】（ａ）は複合糸に固定化されたタンパク質を抗His6抗体及び抗GFP抗体を用いて検出した結果を示す図であり、（ｂ）は複合糸の模式図である。
【図４】（ａ）は複合糸に固定化されたタンパク質を抗His6抗体、抗GFP抗体及び抗GST抗体を用いて検出した結果を示す図であり、（ｂ）は複合糸の模式図である。
【図５】綿糸に固定化されたタンパク質を、Cy5標識抗ウサギIgG(H+L)抗体及びAF488標識抗ネズミIgG(H+L)抗体を用いて検出した結果を示す図である。
【図６】（ａ）はニッケルキレート及び鋳型DNAが固定化された綿糸の模式図であり、（ｂ）は綿糸に固定化されたタンパク質を蛍光標識抗体を用いて検出した結果を示す図である。
【図７】各種鋳型DNAの構造の模式図である。
【図８】（ａ）はGSTタンパク質のグルタチオン結合能の検出結果を示す図、（ｂ）はアルカリフォスファターゼ活性の検出結果を示す図、（ｃ）は抗βgalactosidase ScFvの抗体活性の検出結果を示す図である。
【図９】セルロース膜に固定化されたタンパク質を抗体を用いて検出した結果を示す図である。
【符号の説明】
【００５３】
１・・・核酸ライブラリー
２・・・第１の固体支持体
３・・・核酸群３
４・・・第２の固体支持体
５・・・タンパク質捕獲体
【発明を実施するための最良の形態】
【００５４】
以下、本発明の実施形態を図面に基づいて説明する。
図１に示すように、本実施形態に係る核酸ライブラリー１は、第１の固体支持体２と、第１の固体支持体２の所定表面領域に互いに離反した状態で固定された複数の核酸群３と、第１の固体支持体２に螺旋状に巻装された第２の固体支持体４と、第２の固体支持体４の所定表面領域に高密度で固定された複数のタンパク質捕獲体５とを備えている。【００５５】
図１に示すように、固体支持体２の形状は円柱状であるが、固体支持体２の形状は、固体支持体４を巻装可能な形状である限り円柱状に限定されるものではなく、例えば、平板状、円筒状、角柱状、角筒状、棒状、紐状、糸状、テープ状等の形状であってもよい。【００５６】
図１に示すように、固体支持体４の形状は糸状又は紐状であるが、固体支持体４の形状は長尺状である限り糸状又は紐状に限定されるものではなく、例えば、テープ状であってもよい。固体支持体４の太さ（直径）は通常０．０５〜２ｍｍ、好ましくは０．２〜１ｍｍである。【００５７】
固体支持体２を構成する材料は、核酸ライブラリー１が供される液体（例えば、in vitro転写・翻訳系又はin vitro翻訳系の溶液）に対して不溶性である限り特に限定されるものではない。また、固体支持体４を構成する材料は、核酸ライブラリー１が供される液体に対して不溶性であり、かつ固体支持体４に可撓性を付与できる限り特に限定されるものではない。なお、固体支持体２を構成する材料は、固体支持体２に可撓性を付与できる材料及び付与できない材料のいずれであってもよい。【００５８】
固体支持体２又は４を構成する材料としては、例えば、ガラス；シリコーン；セラミックス；ポリスチレン等のポリスチレン系樹脂、ポリメチルメタクリレート等の（メタ）アクリル樹脂、ナイロン６、ナイロン６６等のポリアミド樹脂、ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル、ポリカーボネート等の合成樹脂；アガロース、デキストラン、セルロース等の多糖類；ゼラチン、コラーゲン、カゼイン等のタンパク質が挙げられ、これらのうち１種類の材料を単独で又は２種類以上の材料を組み合わせて使用することができる。【００５９】
固体支持体２又は４は多孔質及び無孔質のいずれであってもよいが、多孔質であることが好ましい。多孔質である固体支持体としては、例えば、ナイロン等の合成樹脂製の固体支持体の表面を塩酸等の酸で処理したもの、繊維の集合体（例えば繊維を撚ったもの）等が挙げられる。固体支持体２又は４が多孔質である場合、固体支持体２又は４の表面積が増加するので、より多くの核酸群３又はタンパク質捕獲体５を表面に固定することができる。【００６０】
図１に示すように、固体支持体２の所定表面領域には、互いに離反して存在する複数の部分領域が存在しており、複数の核酸群３は、それぞれ、複数の部分領域のうち一の部分領域に固定されている。これにより、複数の核酸群３は、固体支持体２の所定表面領域に互いに離反した状態で固定されている。【００６１】
固体支持体２の表面には、液体（例えばin vitro転写・翻訳系又はin vitro翻訳系の溶液）と接触する限り、固体支持体２の外面（外部表面）に加え、液体が浸潤する固体支持体２の内面（内部表面）（例えば、固体支持体２が有する細孔の内部表面）も含まれる。【００６２】
互いに離反して存在する複数の部分領域のうち隣接する部分領域間の距離は、通常０．０１ｍｍ以上、好ましく０．１ｍｍ以上、さらに好ましくは１ｍｍ以上である。なお、互いに離反して存在する複数の部分領域のうち隣接する部分領域間の距離の上限値は特に限定されるものではなく、複数の核酸群３が固定される所定表面領域の面積等に応じて適宜調節することができるが、通常１０ｍｍである。【００６３】
各核酸群３は、in vitro転写・翻訳系又はin vitro翻訳系において互いに異なる種類のタンパク質を発現する。なお、一の核酸群３から発現されるタンパク質（一の核酸群３から２種類以上のタンパク質が発現される場合には、少なくとも１種類のタンパク質）が他の核酸群３から発現されない場合、一の核酸群３と他の核酸群３とは互いに異なる種類のタンパク質を発現するということができる。一の核酸群３から発現されるタンパク質が他の核酸群３から発現されない場合、各核酸群３から発現されるタンパク質のクロスコンタミネーションの問題が生じ得るが、核酸ライブラリー１ではこの問題が解決されている。【００６４】
固体支持体２の所定表面領域には、互いに異なる種類のタンパク質を発現する複数の核酸群３の他、一の核酸群３と同一種類のタンパク質のみを発現する核酸群が固定されていてもよい。一の核酸群３と同一種類のタンパク質のみを発現する核酸群は、一の核酸群３と近接した状態で固体支持体２の所定表面領域に固定されていてもよいし、一の核酸群３と離反した状態で固体支持体２の所定表面領域に固定されていてもよい。【００６５】
各核酸群３には、各核酸群３から１種類又は２種類以上のタンパク質が発現されるように、同一種類のタンパク質のみを発現する複数の核酸及び／又は異なる種類のタンパク質を発現する複数の核酸が含まれる。同一種類のタンパク質のみを発現する複数の核酸は、同一構造及び異なる構造のいずれを有しいてもよい。異なる構造としては、例えば、オープンリーディングフレームは同一であるが、転写調節領域又は翻訳調節領域は異なる構造が挙げられる。【００６６】
タンパク質解析を効率的に行う点からは、各核酸群３から発現されるタンパク質は１種類であることが好ましい。各核酸群３から発現されるタンパク質が１種類である場合、各核酸群３には、通常、同一種類のタンパク質のみを発現する複数の核酸が含まれるが、異なる種類のタンパク質を発現する複数の核酸が含まれる場合もある。例えば、ある核酸群３から発現されるタンパク質が複数の異なるサブユニットからなる場合、当該核酸群３には、各サブユニットを発現する複数の核酸が含まれる。【００６７】
各核酸群３がin vitro転写・翻訳系又はin vitro翻訳系において発現するタンパク質は、標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質である。【００６８】
標的タンパク質は、固体支持体４上にディスプレイされ、解析対象となるタンパク質であり、標的タンパク質の種類は核酸群３間で異なる。【００６９】
タグタンパク質は、例えば、アビジン、ストレプトアビジン等のビオチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、ポリヒスチジンペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、カルモジュリン、ＡＴＰ結合タンパク質、受容体タンパク質等であり、タグタンパク質の種類は核酸群３間で同一である。【００７０】
in vitro転写・翻訳系においてタンパク質を発現する核酸群には、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡが含まれ、in vitro翻訳系においてタンパク質を発現する核酸群には、ＲＮＡが含まれる。【００７１】
in vitro転写・翻訳系は、in vitroにおいてＤＮＡからｍＲＮＡへの転写を行なうことができるin vitro転写系と、in vitroにおいてｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を行なうことができるin vitro翻訳系とからなり、in vitro転写・翻訳系には、転写及び翻訳に必要な全ての要素（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ、リボソーム、ｔＲＮＡ等）が含まれる。in vitro転写・翻訳系としては、例えば、真核細胞及び原核細胞の抽出液から調製された無細胞転写・翻訳系が挙げられ、無細胞転写・翻訳系としては、例えば、大腸菌（例えば大腸菌Ｓ３０）、小麦胚芽、ウサギ網赤血球、マウスＬ−細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、出芽酵母等の細胞抽出液から調製された無細胞転写・翻訳系が挙げられる。【００７２】
各核酸群３に含まれる核酸の構造は、in vitro転写・翻訳系又はin vitro翻訳系において、核酸群３間で種類が異なる標的タンパク質と、核酸群３間で種類が同一のタグタンパク質との融合タンパク質を発現できる限り特に限定されるものではない。in vitro転写・翻訳系において目的のタンパク質を発現する核酸としては、例えば、転写調節領域と、翻訳調節領域と、目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、オープンリーディングフレームの３'側に設けられた終止コドンとを含んで構成されたＤＮＡが挙げられる。in vitro翻訳系において目的のタンパク質を発現する核酸としては、例えば、in vitro転写・翻訳系において目的のタンパク質を発現するＤＮＡと、チミン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）である点を除き同様の構造を有するＲＮＡが挙げられる。但し、ＲＮＡの場合には転写調節領域は不要である。【００７３】
転写調節領域及び翻訳調節領域は、それぞれＤＮＡからｍＲＮＡへの転写及びｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を可能とする限り特に限定されるものではなく、転写調節領域としては、例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー等が挙げられ、翻訳調節領域としては、例えば、コザック（ｋｏｚａｋ）配列、シャイン・ダルガーノ（ＳＤ）配列等が挙げられ、in vitro転写系の種類、in vitro翻訳系の種類等に応じて適宜選択することができる。転写調節領域及び翻訳調節領域は、別個の領域として存在していてもよいし重なり合って存在していてもよい。【００７４】
目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）には、標的タンパク質をコードするオープンリーディングフレームと、タグタンパク質をコードするオープンリーディングフレームとが連結された状態で含まれる。【００７５】
各核酸群３に含まれる核酸の具体的な構造としては、例えば、オープンリーディングフレームの５'側にプロモーター及びＳＤ配列を有し、オープンリーディングフレームの３'側に終止コドン及びターミネーターを有する構造が挙げられる。【００７６】
各核酸群３に含まれる核酸は二本鎖及び一本鎖のいずれの状態で固体支持体２の表面に固定されていてもよいが、核酸がＤＮＡである場合、二本鎖の状態で固体支持体２の表面に固定されていることが好ましい。ポリメラーゼによるＤＮＡの転写は二本鎖ＤＮＡを基質として効率的に行なわれるからである。【００７７】
各核酸群３において、核酸のどの部分が固体支持体２の表面に固定されていてもよいが、核酸の３'末端又は５'末端が固体支持体２の表面に固定されていることが好ましい。核酸の３'末端又は５'末端が固体支持体２の表面に固定されている場合、核酸からタンパク質を効率よく発現させることができる。【００７８】
各核酸群３の位置は、各核酸群３に含まれる核酸の種類と対応付けられており、各核酸群３に含まれる核酸の種類及び各核酸群３から発現されるタンパク質の種類は、各核酸群３の位置に基づいて識別することができる。【００７９】
図１に示すように、固体支持体４の所定表面領域には、複数のタンパク質捕獲体５が高密度で固定されている。【００８０】
固体支持体４の表面には、液体（例えばin vitro転写・翻訳系又はin vitro翻訳系の溶液）と接触する限り、固体支持体４の外面（外部表面）に加え、液体が浸潤する固体支持体４の内面（内部表面）（例えば、固体支持体４が有する細孔の内部表面）も含まれる。【００８１】
タンパク質捕獲体５は、各核酸群３から発現される融合タンパク質に含まれるタグタンパク質に結合することができる。タグタンパク質／タンパク質捕獲体の組み合わせとしては、例えば、アビジン、ストレプトアビジン等のビオチン結合タンパク質／ビオチン、マルトース結合タンパク質／マルトース、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルやコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合タンパク質／ＡＴＰ、受容体タンパク質／リガンド等が挙げられる。各核酸群３から発現される融合タンパク質には核酸群３間で種類が同一のタグタンパク質が含まれるので、タンパク質捕獲体５は、タグタンパク質との結合を介して、各核酸群３から発現されるいずれの融合タンパク質をも捕獲することができる。【００８２】
タンパク質捕獲体５としては、正電荷体又は負電荷体を使用してもよい。タンパク質は等電点より高いｐＨでは負に荷電し、等電点より低いｐＨでは正に荷電するから、タンパク質捕獲体５として正電荷体又は負電荷体を使用することにより、タンパク質捕獲体５は、電気的結合（静電的相互作用）を介して、各核酸群３から発現されるいずれの融合タンパク質をも捕獲することができる。【００８３】
正電荷体及び負電荷体としては、例えば、正荷電基（例えば、アミノ基、グアニジル基、イミダゾール基）を有する物質、負荷電基（例えば、カルボキシル基、スルホニル基、リン酸基）を有する物質等が挙げられる。【００８４】
タンパク質捕獲体５としては、アルキル基又はその誘導基、フェニル基又はその誘導基等の疎水性基を有する物質を使用してもよい。タンパク質捕獲体５として疎水性基を有する物質を使用することにより、タンパク質捕獲体５は、疎水性相互作用を介して、各核酸群３から発現されるいずれの融合タンパク質をも捕獲することができる。【００８５】
タンパク質捕獲体５として、正電荷体若しくは負電荷体、又は疎水性基を有する物質を使用する場合、各核酸群３から発現されるタンパク質が標的タンパク質とタグタンパク質との融合タンパク質であるか否かに関わらず、タンパク質捕獲体５は各核酸群３から発現されるいずれのタンパク質をも捕獲することができるので、各核酸群３から発現されるタンパク質は、例えば、タグタンパク質と融合していない標的タンパク質、タグタンパク質以外のタンパク質と融合した標的タンパク質等であってもよい。【００８６】
タンパク質捕獲体５は、隣接するタンパク質捕獲体間の距離が、互いに離反して存在する複数の部分領域のうち隣接する部分領域間の距離よりも圧倒的に小さくなるような密度で固体支持体４の所定表面領域に固定されている。隣接するタンパク質捕獲体間の距離は、互いに離反して存在する複数の部分領域のうち隣接する部分領域間の距離の１００分の１以下となるような密度で、固体支持体４の所定表面領域に固定されていることが好ましい。隣接するタンパク質捕獲体間の距離は、互いに離反して存在する複数の部分領域のうち隣接する部分領域間の距離の１００分の１以下、１０００分の１以下、１万分の１以下、１０万分の１以下、１００万分の１以下、１０００万分の１以下というように、小さくなればなるほど好ましい。【００８７】
図１に示すように、固体支持体４が固体支持体２に螺旋状に巻装されている。【００８８】
固体支持体４は、複数の核酸群３が固定された固体支持体２の所定表面領域（核酸固定表面領域）と複数のタンパク質捕獲体５が固定された固体支持体４の所定表面領域（タンパク質捕獲体固定表面領域）との距離が、互いに離反して存在する複数の部分領域のうち隣接する部分領域間の距離よりも圧倒的に小さくなるように、固体支持体２に対して巻装されている。核酸固定表面領域とタンパク質捕獲体固定表面領域との距離は、互いに離反して存在する複数の部分領域のうち隣接する部分領域間の距離の５分の１以下であることが好ましい。核酸固定表面領域とタンパク質捕獲体固定表面領域との距離は、互いに離反して存在する複数の部分領域のうち隣接する部分領域間の距離の５分の１以下、５０分の１以下、５００分の１以下、５０００分の１以下というように、小さくなればなるほど好ましい。なお、タンパク質捕獲体固定表面領域と核酸固定表面領域との距離の下限値は０である。【００８９】
巻き軸方向単位長さあたりの固体支持体４の巻き数は、タンパク質捕獲体固定表面領域が各核酸群３に近接する限り特に限定されるものではないが、複数の部分領域の巻き軸方向の長さのうち、最も短い長さを巻き軸方向単位長さとしたときに、巻き軸方向単位長さあたりの固体支持体４の巻き数は、好ましくは１回／ｍｍ以上、さらに好ましくは２回／ｍｍ以上である。巻き軸方向単位長さあたりの固体支持体４の巻き数の上限値は特に限定されるものではなく、固体支持体４の幅に応じて適宜調節することができる。各部分領域の巻き軸方向の長さは特に限定されるものではないが、通常０．０５ｍｍ以上、好ましくは２ｍｍ以上である。各部分領域の巻き軸方向の長さの上限値は特に限定されるものではなく、第１の固体支持体の大きさ等に応じて適宜調節することができるが、通常１０ｍｍである。固体支持体４の幅は巻き軸方向単位長さ以下であり、固体支持体４は、タンパク質固定表面領域のうち異なる領域同士が重ならないように第１の固体支持体に巻装されている。なお、「巻き軸」とは、固体支持体２に巻装された固体支持体４によって形成される螺旋の中心を通る線を意味する。【００９０】
複数の部分領域の巻き軸方向の長さのうち、最も短い長さを巻き軸方向単位長さとしたときに、巻き軸方向単位長さあたりの固体支持体４の巻き数が１回／ｍｍ以上であると、タンパク質捕獲体固定表面領域のうち異なる領域が各核酸群３に近接するので、各核酸群３から発現されたタンパク質のクロスコンタミネーションを効果的に防止することができる。【００９１】
核酸ライブラリー１において、タンパク質捕獲体５は、核酸群３が固定された固体支持体２の所定表面領域に近接して高密度に配列しているので、各核酸群３には、核酸群３ごとに異なるタンパク質捕獲体５が近接している。また、各核酸群３は互いに離反した状態で固体支持体２の表面に固定されているので、一の核酸群３と一の核酸群３に近接するタンパク質捕獲体５との距離は、他の核酸群３と一の核酸群３に近接するタンパク質捕獲体５との距離よりも圧倒的に小さくなっている。したがって、核酸ライブラリー１をin vitro転写・翻訳系又はin vitro翻訳系に供して、核酸ライブラリーに含まれる複数の核酸群３を一度に発現させると、各核酸群３から発現されたタンパク質は、各核酸群３に近接するタンパク質捕獲体５に優先的に捕獲されるので、各核酸群３から発現されたタンパク質のクロスコンタミネーションは防止される。特に核酸ライブラリー１においては、核酸群３間に介在する固体支持体４が障壁となり、各核酸群３から発現されたタンパク質のクロスコンタミネーションは効果的に防止される。【００９２】
すなわち、核酸ライブラリー１をin vitro転写・翻訳系又はin vitro翻訳系に供して、核酸ライブラリー１に含まれる複数の核酸群３を一度に発現させることにより、各核酸群３から発現された複数種類のタンパク質が、それをコードする核酸と対応付けた状態で固体支持体４上にディスプレイされたタンパク質ライブラリーを作製することができる。このとき、一度に発現させる核酸群３は２種類以上である限り、核酸ライブラリー１が有する全ての核酸群３であってもよいし、核酸ライブラリー１が有する一部の核酸群３であってもよい。【００９３】
核酸ライブラリー１はin vitro転写・翻訳系又はin vitro翻訳系に供すると直ちにタンパク質ライブラリーに変換されるので、タンパク質の供給とタンパク質のアッセイ系とが一体となっており、複数種類のタンパク質の供給後、直ちに当該複数種類のタンパク質解析を開始することができる。【００９４】
核酸ライブラリー１から作製されたタンパク質ライブラリーにおいては、固体支持体４が固体支持体２に巻装された状態のままでも、固体支持体４上にディスプレイされたタンパク質へのアクセスが容易であるので、タンパク質ライブラリーの作製からタンパク質ライブラリーを利用したタンパク質の解析に至る一連の操作の自動化を容易に図ることができる。【００９５】
核酸ライブラリー１から作製されたタンパク質ライブラリーにおいて、タンパク質ライブラリーに含まれるタンパク質が、タンパク質解析途中に変性や失活を起こしたとしても、そのタンパク質をコードする核酸を再度発現させることにより、そのタンパク質の再生が可能である。【００９６】
タンパク質解析の終了後は、次回使用するときまで核酸ライブラリー１の状態で保存しておき、必要なときにタンパク質ライブラリーを再生させることにより、長期間にわたり繰り返し使用することができる。【００９７】
核酸ライブラリー１は、固体支持体２の所定表面領域のうち互いに離反して存在する複数の部位領域に、それぞれ、複数の核酸群３のうち一の核酸群を固定し、固体支持体４の所定表面領域に、複数のタンパク質捕獲体５を高密度で固定し、複数のタンパク質捕獲体５が固定された所定表面領域が、複数の核酸群３が固定された所定表面領域に近接するように、固体支持体２に対して固体支持体４を巻装することにより作製することができる。【００９８】
固体支持体の表面への核酸又はタンパク質捕獲体の固定方法は特に限定されるものではなく、例えば、特定物質間の特異的相互作用、共有結合（例えば、アミド結合、ジスルフィド結合、チオエーテル結合）の形成等を利用することができる。【００９９】
特定物質間の特異的相互作用としては、例えば、アビジン又はその誘導体（例えば、ストレプトアビジン、エクストラアビジン（ExtraAvidin）、ニュートロアビジン（NeutrAvidin））／ビオチン又はその誘導体（例えば、イミノビオチン、カルボビオチン、ビオチンヒドラジド）；マルトース結合タンパク質／マルトース；ポリヒスチジンペプチド／ニッケル、コバルト等の金属イオン；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン；カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド；ＡＴＰ結合タンパク質／ＡＴＰ；核酸／相補的核酸；受容体タンパク質／リガンド；酵素／基質；抗体／抗原；ＩｇＧ／プロテインＡ又はＧ等の特異的相互作用を利用することができる。特異的相互作用を生じる物質は常法に従って核酸、タンパク質捕獲体又は固体支持体に結合させることができる。【０１００】
共有結合は、核酸群３に含まれる核酸又はタンパク質捕獲体５が有する官能基（核酸又はタンパク質捕獲体に人為的に導入された官能基を含む。）と、固体支持体２又は４が有する官能基（固体支持体２又は４に人為的に導入された官能基を含む。）とを反応させることにより形成させることができる。共有結合を形成する官能基としては、例えば、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、スルフヒドリル基、アルデヒド基等が挙げられる。【０１０１】
共有結合の形成には、架橋剤を利用することができる。架橋剤としては、例えば、N-スクシンイミジル(4-イオードアセチル)アミノベンゾエート（N-succinimidyl(4-iodoacetyl)aminobenzoate）（SIAB）、ジマレイミド（dimaleimide）、ジチオ-ビス-ニトロ安息香酸（dithio-bis-nitrobenzoic acid）（DTNB）、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセテート（N-succinimidyl-S-acetyl-thioacetate）（SATA）、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート（N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate）（SPDP）、スクシンイミジル 4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート（succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate）（SMCC）、6-ヒドラジノニコチミド（6-hydrazinonicotimide）（HYNIC）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester）（MBC）等の多官能性試薬が挙げられる。【０１０２】
固体支持体２の表面への核酸を固定する際に、特定物質（物質Ａ及びＢ）間の特異的相互作用を利用する場合、例えば、固体支持体表面の所定の部位領域に物質Ａを固定し、物質Ｂを結合させた核酸を含有する溶液を所定の部位領域にスポットする。この際、固体支持体２の材質が、核酸溶液が浸透可能な材質であると、隣接する部位領域にスポットされた核酸溶液間でコンタミネーションが生じるおそれがある。そこで、固体支持体２の材質が、核酸溶液が浸透可能な材質である場合には、核酸溶液がスポットされる部位領域のうち隣接する部位領域の間に、核酸の通過を防止することができる物質を含有する溶液を予めスポットしておくことが好ましい。このような溶液を予めスポットしておくことにより、固体支持体２の内部に障壁が形成され、隣接する部位領域にスポットされた核酸溶液間でコンタミネーションが生じることを防止することができる。核酸の通過を防止することができる物質としては、例えば、カゼイン、スキムミルク、ゼラチン、ＢＳＡ等のタンパク質性物質、グルコース、ショ糖、ラフィノース、デキストリン、スターチ等の糖類、デキストランサルフェート、ＰＶＰ、グリセリン、ＰＥＧ等の粘性物質、固体支持体２から遊離した物質Ａ等が挙げられる。【０１０３】
また、核酸溶液がスポットされる部位領域のうち、隣接する部位領域の間に、カゼイン、スキムミルク、ゼラチン、ＢＳＡ等のタンパク質性物質、各核酸群３から発現される融合タンパク質に含まれるタグタンパク質に結合することができるタンパク質捕獲体等を含有する溶液を予めスポットしておくことにより、各核酸群３から発現されたタンパク質が固体支持体２に非特異的に吸着することを防止することができる。【０１０４】
固体支持体２に対して固体支持体４を巻装する際、タンパク質捕獲体５が固定された固体支持体２の所定表面領域を、核酸群３が固定された固体支持体４の所定表面領域に近接させればよい。すなわち、タンパク質捕獲体５を核酸群３の位置と対応付けて配列させる必要はなく、核酸群３の位置に関係なくランダムに配列させればよい。したがって、核酸ライブラリー１は効率的に作製することができる。
【実施例】
【０１０５】
〔実施例１〕
実施例１は、鋳型DNA固定化ナイロン糸と、該ナイロン糸に巻き付けたニッケルキレート固定化綿糸とからなる複合糸をin vitro転写・翻訳系に供し、鋳型DNAから発現したHis6タグ標識タンパク質をニッケルキレート固定化綿糸上に固定化した実施例である。【０１０６】
１．ニッケルキレート固定化綿糸の作製
（１）綿糸の活性化
30cmに切断した60番綿糸（直径：約0.2mm）を6本用意し、蒸留水中でオートクレーブにより滅菌（120℃，15分間）した後、30% アセトン3mlで3回洗浄した。以下の反応は特記しない限り4℃で行った。70% アセトン3mlで3回の洗浄、100% アセトン3mlで3回の洗浄、無水アセトン3mlで3回の洗浄、及び無水アセトニトリル3mlで3回の洗浄を行った後、0.33M p-ニトロフェニルクロロフォルマート／無水アセトニトリルを2ml加え、次いで、1.0M ジメチルアミノピリジン／無水アセトニトリルを2ml加え、1時間放置した。その後、100% アセトン3mlで3回の洗浄、5% 酢酸／ジオキサン3mlで3回の洗浄、メタノール3mlで3回の洗浄、及び無水2-プロパノール3mlで3回の洗浄を行い、無水2-プロパノール中、4℃で使用するまで保存した。【０１０７】
（２）ニッケルキレート化
活性化した糸を3本用意し、蒸留水3mlで3回洗浄（4℃）した後、10mg/mlのAB-NTA/0.1M リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.4）を1ml加え、室温で48時間反応させた。その後、0.1M リン酸緩衝液（pH 7.5）3mlで3回洗浄し、0.1M モノエタノールアミン（pH 7.5）50mlを加え、室温で24時間反応させた。その後、0.1M リン酸緩衝液（pH 7.5）3mlで3回洗浄し、0.1M モノエタノールアミン（pH 7.5）50mlを加え、室温で24時間反応させた。その後、0.1M リン酸緩衝液（pH 7.5）3mlで3回洗浄し、1% 酢酸ニッケル水溶液に室温で2時間浸漬し、蒸留水3mlで3回洗浄した。【０１０８】
以上のようにして、ニッケルキレートが表面に高密度で固定された綿糸を作製した。綿糸に固定された多量のニッケルキレートのうち、隣接するニッケルキレート間の距離は約2〜20nm（推測値）と予想される。なお、後述するように、ナイロン糸に固定された複数の鋳型DNA群のうち、隣接する鋳型DNA群間の距離は約5mmであるので、隣接するニッケルキレート間の距離は、隣接する鋳型DNA群間の距離の約250万分の1（約0.000004倍）となっており、隣接するニッケルキレート間の距離は、隣接する鋳型DNA群間の距離よりも圧倒的に小さくなっている。【０１０９】
２．鋳型DNA固定化ナイロン糸の作製
（１）鋳型DNAの調製
ストレプトアビジン遺伝子の5'末側にHis6タグ（6個のヒスチジンからなるタグタンパク質）コード配列を連結し、さらに、5'末端にT7プロモーター配列及びリボソーム結合配列（RBS）を、3'末端にT7配列をそれぞれ付加し、プラスミドベクター（pGEM-Teasy）にクローニングし、His6-アビジン融合タンパク質をコードする鋳型DNA（以下「His6-アビジン鋳型DNA」という。）を作製した（配列番号３参照）。【０１１０】
GFP(green fluorescent protein)-His6をコードする鋳型DNA（以下「GFP-His6鋳型DNA」という。）は、Rapid Translation System（ロシュ）用コントロールプラスミドpIVEX control vector GFPを用いて作製した（配列番号４参照）。このプラスミドは、GFPのC末端側にHis6タグが融合されたタンパク質を発現する構造を有している。【０１１１】
GST(glutathione s-transferase)-His6をコードする鋳型DNA（以下「GST-His6鋳型DNA」という。）は、ロシュ社製のLinear template generation set, His-tagを用いてGST遺伝子の3'末端側にHis6タグコード配列を融合することにより作製した（配列番号５参照）。【０１１２】
各鋳型DNAの構造の模式図を図２に示す。
各鋳型DNAを鋳型として、PCRにより各鋳型DNAの増幅と5'末端側へのジゴキシゲニン(DIG)配列の付加を行った。PCR反応液の組成及び反応条件は以下の通りである。PCR反応液の組成は、10ng/μl DNA 4.0μl、20μM forward primer (DIG-17f，配列番号１参照) 8.0μl、20μM reverse primer (11r，配列番号２参照) 8.0μl、10×Ex Taq 緩衝液 20μl、2.5mM dNTPs 20μl、LA Taq (5U/μl) 2.0μl、dH2O 138μl（総量200μl）である。反応条件は、(i) 94℃で1分間、(ii) 94℃で1分間、94℃で30秒間、55℃で30秒間及び72℃で1分間の反応サイクルを30サイクルであり、PCR産物は使用するまで4℃で保存した。【０１１３】
（２）鋳型DNAの精製
MicroSpin S-400 HR カラムを用い、100μlずつゲル濾過精製を行った。次いで、7.5M 酢酸アンモニウムを60μl加え、EtoHを500μl加え、-80℃で20分間放置し、4℃、15000rpmで15分間遠心し、上清を捨てた。次いで、70% EtoHを800μl加え、4℃、15000rpmで5分間遠心し、上清を捨て、減圧下で乾燥した。使用する際には、40μlのTEで溶解した。【０１１４】
（３）ナイロン糸への鋳型DNAの固定化
ナイロン糸としては、表面を４〜６Ｎの塩酸で処理し（20〜25℃，0.5〜15秒）、表面を多孔質化したものを使用した。ナイロン糸に5mm間隔にて200μg/mlの抗DIG抗体（ロシュ）0.4μlをスポットし、室温で40分間乾燥させた。抗体をスポットした上に、精製したDIG標識鋳型DNAを0.4μlスポットし、室温で90分間乾燥させた。
以上のようにして、複数の鋳型DNA群（1つのスポットが1つの鋳型DNA群に対応する）が表面に固定されたナイロン糸を作製した。【０１１５】
３．複合糸の作製
ニッケルキレートが表面に高密度で固定された綿糸を、鋳型DNAが表面に固定されたナイロン糸に巻き付け、複合糸を作製した。このとき、綿糸の直径は0.2mmであるので、ニッケルキレートが固定された綿糸表面と鋳型DNAが固定されたナイロン糸表面との距離は、約0〜0.2mmの範囲にある。綿糸の巻き数は、ナイロン糸5mmあたり3回とした。
複合糸は、1% SDS/1xSSCで洗浄し、10mM Tris-HCl(pH7.5)で洗浄した後、使用した。【０１１６】
４．in vitro転写・翻訳系によるタンパク質の発現
複合糸を2本同様に作製し、ガラスキャピラリー中のRapid Translation System（RTS）（ロシュ）反応液に入れ、in vitro転写・翻訳系によりタンパク質を発現させた。反応液はロシュ社のキット付属プロトコルに従って調製し、30℃で2時間反応させた。RTS反応後の複合糸を洗浄した後、peroxidase(POD)標識抗His6抗体及び抗GFP抗体による検出を行った。【０１１７】
（１）複合糸に固定化されたタンパク質の検出（化学発光法）
RTS反応後の複合糸を20mMイミダゾール/PBS緩衝液で洗浄し、0.5% blocking reagent（ロシュ）に30分間浸漬し、PBS緩衝液で洗浄した。次いで、PBSにて希釈したPOD(peroxidase)標識抗His6抗体、抗GFP抗体及び抗GST抗体に30分間浸漬し、PBS緩衝液で洗浄した後、ECL Detection Reagents（アマシャム）10μlを加え、CCD撮影装置ARGUS（浜松ホトニクス）により発光を検出した。【０１１８】
（２）複合糸に固定化されたタンパク質の検出（蛍光法）
上記（１）と同様にRTS反応を行った複合糸をほどいて綿糸のみを取り出し、綿糸に固定化されたタンパク質を、蛍光標識抗体を用いて検出した。綿糸は、20mM イミダゾール/PBSで洗浄し、1% block ace/PBSに30分間浸漬した後、PBSで洗浄し、1% block ace/PBSにて100倍希釈した抗GFP抗体及び抗GST抗体の混合液に30分間浸漬した。PBSで洗浄した後、2.5% block ace/PBSにて100倍希釈したCy5標識抗ウサギIgG(H+L)抗体、AF488標識抗ネズミIgG(H+L)抗体に30分間浸漬した。PBSで洗浄した後、蛍光スキャナ(STORM, FL595: ABI)で綿糸の蛍光を測定した。【０１１９】
（３）結果
His6-アビジン鋳型DNA又はGFP-His6鋳型DNAを固定化した複合糸の模式図を図３（ｂ）に示す。この複合糸において、図３（ｂ）に示すように、GFP-His6鋳型DNA（スポット1,3,5,7,9）及びHis6-アビジン鋳型DNA（スポット2,4,6,8）は、それぞれ5ヶ所及び4ヶ所に交互にスポットされている。この複合糸に固定化されたタンパク質を抗His6抗体及び抗GFP抗体を用いて検出した結果、図３（ａ）に示すように、抗His6抗体で検出した場合には9ヶ所のスポット（スポット1〜9）が確認され、抗GFP抗体で検出した場合には1ヶ所おきに5ヶ所のスポット（スポット1,3,5,7,9）が確認された。また各シグナルが独立して検出されていることから、各スポット間でのタンパク質のコンタミネーションは無い又は非常に低いことが予測された。【０１２０】
GFP-His6鋳型DNA又はGST-His6鋳型DNAを固定化した複合糸の模式図を図４（ｂ）に示す。この複合糸において、図４（ｂ）に示すように、GFP-His6鋳型DNA（スポット1,3,5,7,9）及びGST-His6鋳型DNA（スポット2,4,6,8）は、それぞれ5及び4ヶ所に交互にスポットされている。この複合糸に固定化されたタンパク質を抗His6抗体、抗GFP抗体及び抗GST抗体を用いて検出した結果、図４（ａ）に示すように、抗His6抗体で検出した場合には9ヶ所のスポット（スポット1〜9）が確認され、抗GFP抗体で検出した場合には一カ所おきに5ヶ所のスポット（スポット1,3,5,7,9）が確認され、抗GST抗体で検出した場合には一カ所おきに4ヶ所のスポット（スポット2,4,6,8）が確認された。また各シグナルが独立して検出されていることから、各スポット間でのタンパク質のコンタミネーションは無い又は非常に低いことが予測された。【０１２１】
綿糸に固定化されたタンパク質を、Cy5標識抗ウサギIgG(H+L)抗体及びAF488標識抗ネズミIgG(H+L)抗体を用いて検出した結果、図５（ａ）及び（ｂ）に示すように、GFP-His6及びGST- His6の両タンパク質を同時に検出できることが確認された。すなわち、複合糸に固定されたタンパク質の検出系のマルチプレックス化が可能であることが確認された。【０１２２】
〔実施例２〕
実施例２は、ニッケルキレート及び鋳型DNAが固定化された一本の綿糸をin vitro転写・翻訳系に供し、鋳型DNAから発現したHis6タグ標識タンパク質を綿糸上に固定化した実施例である。【０１２３】
１．ニッケルキレート及び鋳型DNA固定化綿糸の作製
綿糸の活性化は実施例１と同様に行い、キレート化及び抗体のカップリングは以下のように行った。【０１２４】
（１）キレート化及び抗体のカップリング
活性化した糸を3本用意し、蒸留水3mlで3回洗浄(4℃)した後、10mg/mlのAB-NTA/0.1M リン酸緩衝液(pH 7.5)を1ml加え、室温で24時間反応させた。0.1M リン酸緩衝液(pH 7.5) 3mlで3回洗浄した後、10mgの抗ジゴキシゲニン(DIG)抗体を含む0.1M リン酸緩衝液(pH 7.5)を100μl加え、室温で24時間反応させた。0.1M リン酸緩衝液(pH 7.5) 3mlで3回洗浄した後、0.1M モノエタノールアミン(pH 7.5) 50mlを加え、室温で24時間反応させた。0.1M リン酸緩衝液(pH 7.5) 3mlで3回洗浄した後、0.1M モノエタノールアミン(pH 7.5) 50mlを加え、室温で24時間反応させた。0.1 M リン酸緩衝液(pH 7.5) 3mlで3回洗浄した後、1% 酢酸ニッケル水溶液に室温で2時間浸漬し、蒸留水3mlで3回洗浄した。
以上のようにして、抗DIG抗体及びニッケルキレートが表面に固定された綿糸を作製した。【０１２５】
（２）綿糸への鋳型DNAの固定化
抗DIG抗体及びニッケルキレートが表面に固定された綿糸に6-10mm間隔にて10% Block ace, 10% Ficollを0.2μlスポットし、室温で30分間乾燥させた。Block ace, Ficollをスポットした間にDIG標識鋳型DNAを0.2μlスポットした後、室温で30分間乾燥させ、PBSで洗浄し、10mM Tris-HCl(pH7.5)で洗浄した。なお、DIG標識鋳型DNAをスポットすると、各鋳型DNA溶液は綿糸にしみ込み、鋳型DNA溶液間のコンタミネーションが生じるおそれがあるが、Block ace, Ficollをスポットした間にDIG標識鋳型DNAをスポットすることにより、各鋳型DNA溶液のコンタミネーションは防止される。【０１２６】
以上のようにして、ニッケルキレート及び鋳型DNAが固定化された綿糸を作製した（図６（ａ）参照）。なお、図６（ａ）は、ニッケルキレート及び鋳型DNAが固定化された綿糸の模式図を示す。【０１２７】
２．in vitro転写・翻訳系によるタンパク質の発現
ニッケルキレート及び鋳型DNAが固定化された綿糸を、実施例１と同様にRTSを用いたin vitro転写・翻訳系により供し、タンパク質を発現させた。反応液はロシュ社のキット付属プロトコルに従って調製し、37℃で2時間反応させた。反応後実施例１と同様の方法で、蛍光標識抗体による検出を行った。【０１２８】
その結果、図６（ｂ）に示すように、同一糸上にニッケルキレート及び鋳型DNAが存在している状態であっても、鋳型DNAから発現したGFP-His6及びGST-His6タンパク質は糸上に各スポットとして固定化された。なお、各鋳型DNAの間隔を6mmまで狭めても、タンパク質のスポットの識別は可能であった。【０１２９】
〔実施例３〕
実施例３は、ニッケルキレート及び鋳型DNAが固定化された一本の綿糸をin vitro転写・翻訳系に供し、鋳型DNAから発現したHis6タグ標識タンパク質を綿糸上に固定化し、綿糸上に固定化されたタンパク質の各種活性を検出した実施例である。【０１３０】
綿糸の活性化、キレート化及び抗体のカップリングは実施例２と同様に行った。実施例３で用いた各鋳型DNAの構造の模式図を図７に示す。His6-GST鋳型DNA（配列番号６参照）、βgal-His6鋳型DNA（配列番号８参照）, βgal(H)-His6鋳型DNA（配列番号９参照）, βgal(L)-His6鋳型DNA（配列番号10参照）は、それぞれ、glutathione s-transferase遺伝子を発現ベクターpIVEX2.4cに、抗βgalactosidaseScFv及び抗βgalactosidaseScFvのH鎖及びL鎖をpIVEX2.3にクローニングすることにより作製した。His6-BAP鋳型DNA（配列番号７参照）は、ロシュ社製のLinear template generation set, His-tagを用いて大腸菌のalkaline phosphataseのN末端側にHis6タグを融合発現する様に構築した。綿糸への鋳型DNAの固定化、及びin vitro転写・翻訳系によるタンパク質の発現は実施例２と同様にして行った。【０１３１】
（１）GSTタンパク質のグルタチオン結合能の検出
RTS反応後、PBS洗浄したHis6-GST鋳型DNA固定糸を1% block aceでブロッキングし、2μg/mlのPOD標識グルタチオンに30分浸漬した。PBS緩衝液で洗浄した後、ECL Detection Reagentsを10 μl加え、ARGUS（浜松ホトニクス）にて測定した。【０１３２】
（２）アルカリフォスファターゼ活性の検出
RTS反応後、PBS洗浄したHis6-BAP鋳型DNA固定糸にCDP-star試薬（ロッシュ）を加え、ARGUSにて測定した。【０１３３】
（３）抗βgalactosidase ScFvの抗体活性の検出
RTS反応後、PBS洗浄したβgal-His6及びβgal(H)-His6+βgal(L)-His6鋳型DNA固定糸を1% block aceでブロッキングし、50μg/mlのβgalactosidaseに30分間浸漬した。PBS緩衝液で洗浄した後、100倍希釈した抗βgalactosidase抗体に30分間浸漬し、PBS緩衝液で洗浄した。その後、100倍希釈したPOD標識抗ウサギIgG抗体に30分間浸漬した。PBS緩衝液で洗浄した後、ECL Detection Reagentsを10μl加え、ARGUSにて測定した。【０１３４】
（４）結果
綿糸から発現し、同じ綿糸上に固定化されたHis6-GSTタンパク質のグルタチオン結合能について、POD-グルタチオンを用いて結合実験を行った結果、図８（ａ）に示すように、His6-GSTの鋳型DNAを固定化した位置にのみPOD-グルタチオン由来の発光シグナルが検出された。【０１３５】
綿糸から発現し、同じ綿糸上に固定化されたHis6-BAPタンパク質のアルカリフォスファターゼ活性について、発光基質を含むCDP-Star試薬を加え、発光シグナルを測定した結果、図８（ｂ）に示すように、His6-BAP鋳型DNA特異的に発光シグナルが観察された。BAPタンパク質は二量体として活性を有することから、発現したタンパク質は糸上でホモ二量体を形成しうることが示唆された。【０１３６】
綿糸から発現し、同じ綿糸上に固定化された抗βgalactosidase ScFvの抗体活性について、抗原との特異結合能の検出を試みた結果、図８（ｃ）に示すように、抗βgalactosidase ScFvは、βgalactosidaseと特異的に結合したのみでなく、H鎖、L鎖を個別のHis6タグ融合遺伝子として構築した鋳型DNAを混合し、スポットした場合でも、糸上でヘテロ二量体を形成し、抗体活性を有することが確認された。【０１３７】
〔実施例４〕
実施例４は、綿糸と同様のセルロースを原料としたセルロース膜（セロファン）からなる平面状の担体を用いた場合の、タンパク質の発現及び固定化について検討を行った実施例である。【０１３８】
セルロース膜の活性化、キレート化及び抗体のカップリングは実施例２と同様に行った。
セルロース膜への鋳型の固定及びin vitro転写・翻訳系によるタンパク質の発現は、10％Block ace, 10%Ficollのスポットを除き、実施例２と同様の方法で行った。また、RTS反応は、膜上に1cm2当たり25μlのRTS反応液を加え、乾燥を防ぐため表面をパラフィルムで被った後、湿度を保った状態で行った。
セルロース膜に固定化されたタンパク質の検出は、実施例２と同様の方法で行った。【０１３９】
セルロース膜にGFP-His6鋳型DNA及びGST- His6鋳型DNAを固定化し、RTS反応を行った後、抗体を用いて各タンパク質を検出した結果、図９（ａ）に示すように、セルロース膜上ではGFP-His6由来のシグナルは検出されたが、GST-His6のシグナルは検出されなかった。また、RTSの反応温度（37℃→30℃）を変えた場合、図９（ｂ）に示すように、綿糸ではどちらの温度でもGFPのシグナルが検出されたが、セルロース膜では37℃でGFPのシグナルが検出されたものの、30℃では検出されなかった。我々は、ウエスタンブロッティング等の解析によりGFPはGSTよりRTSでの発現効率が高いことを確認しているが、実施例１、２で示したように糸上での発現実験ではこの2種の鋳型DNA由来のタンパク質はほとんど同様のシグナル強度で検出されている。このことより、セルロース膜より複雑な表面構造を持つ綿糸は、発現したタンパク質を効率よく固定化すると予想され、RTSにおけるタンパク質発現量効率の違いによる影響を受けにくいことが示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図７】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2006062200.tif 000012
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