(57)【要約】  本発明は、ウロン酸残基（ウロン酸は、イズロン酸又はグルクロン酸を示す。以下、ウロン酸において同じ。）とグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合もしくはβ１，４−グリコシド結合してなる２糖、又はウロン酸残基とグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合もしくはβ１，４−グリコシド結合によって交互に繰返し結合した構造を有する３乃至１６糖のオリゴ糖又はその塩であって、ウロン酸残基及びグルコサミン残基の少なくとも１つのヒドロキシル基が硫酸化、アルキル化、アシル化又はアミノ化されていてもよく、少なくとも１つのグルコサミン残基の２位のアミノ基が硫酸化、アルキル化又はアシル化されていてもよいオリゴ糖又はその塩を有効成分として含有するＨＧＦ産生促進薬剤を提供することを目的とする。本発明のＨＧＦ産生促進薬剤は、生体の組織、器官等の障害の治癒促進に有用である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウロン酸残基（ウロン酸は、イズロン酸又はグルクロン酸を示す。以下、ウロン酸において同じ。）とグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合もしくはβ１，４−グリコシド結合してなる２糖、又はウロン酸残基とグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合もしくはβ１，４−グリコシド結合によって交互に繰返し結合した構造を有する３乃至１６糖のオリゴ糖又はその塩であって、
ウロン酸残基及びグルコサミン残基の少なくとも１つのヒドロキシル基が硫酸化、アルキル化、アシル化又はアミノ化されていてもよく、少なくとも１つのグルコサミン残基の２位のアミノ基が硫酸化、アルキル化又はアシル化されていてもよいオリゴ糖又はその塩を有効成分として含有するＨＧＦ産生促進薬剤。
【請求項２】
少なくとも１つのウロン酸残基の２位及び／又は少なくとも１つのグルコサミン残基の３位及び／又は６位のヒドロキシル基が硫酸化されていてもよいことを特徴とする請求の範囲第１項に記載のＨＧＦ産生促進薬剤。
【請求項３】
少なくとも１つのグルコサミン残基において、６位のヒドロキシル基及び／又は２位のアミノ基が硫酸化されていることを特徴とする請求の範囲第１又は２項に記載のＨＧＦ産生促進薬剤。
【請求項４】
２乃至１０糖からなるオリゴ糖であることを特徴とする請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のＨＧＦ産生促進薬剤。
【請求項５】
オリゴ糖が、高分子ヘパリン又は高分子ヘパラン硫酸のヘパリナーゼ又はヘパリチナーゼ分解物であることを特徴とする請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載のＨＧＦ産生促進薬剤。
【請求項６】
オリゴ糖が、高分子ヘパリン又は高分子ヘパラン硫酸の亜硝酸分解法、過酸化水素分解法又はβ脱離のいずれかによる分解物であることを特徴とする請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載のＨＧＦ産生促進薬剤。
【請求項７】
オリゴ糖が、次の（ａ）〜（ｈ）で表される化合物のいずれかであることを特徴とする請求の範囲第１項に記載のＨＧＦ産生促進薬剤：
（ａ）  式（Ｉ）
【化１】
2005092348.tif 000021
（式中、Ｒ１は、水素、硫酸基、アルキル基、アシル基又は置換基を有していてもよいアミノ基を示し、Ｒ２は、水素、硫酸基、アルキル基又はアシル基を示し、Ｒ３及びＲ４は異なって、水素又は置換基を有していてもよいカルボキシル基を示し、ｎは０〜７を示す。）
（ｂ）  式（ＩＩ）
【化２】
2005092348.tif 000022
（式中、各記号は上記と同じである。）
（ｃ）  式（ＩＩＩ）
【化３】
2005092348.tif 000023
（式中、各記号は上記と同じである。）
（ｄ）  式（ＩＶ）
【化４】
2005092348.tif 000024
（式中、各記号は上記と同じである。）
（ｅ）  式（Ｖ）
【化５】
2005092348.tif 000025
（式中、ｍは０〜６を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は上記と同じである。）
（ｆ）  式（ＶＩ）
【化６】
2005092348.tif 000026
（式中、ｍは０〜６を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は上記と同じである。）
（ｇ）  式（ＶＩＩ）
【化７】
2005092348.tif 000027
（式中、ｍは０〜６を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は上記と同じである。）、又は
（ｈ）  式（ＶＩＩＩ）
【化８】
2005092348.tif 000028
（式中、ｍは０〜６を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は上記と同じである。）
【請求項８】
ウロン酸残基とグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合又はβ１，４−グリコシド結合によって交互に繰返し結合した構造を有する糖鎖化合物（但し、糖鎖化合物中、少なくとも１つのグルコサミン残基の６位のヒドロキシル基が硫酸化されている。）又はその塩を有効成分として含有することを特徴とするＨＧＦ産生促進薬剤。
【請求項９】
ウロン酸残基とグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合又はβ１，４−グリコシド結合によって交互に繰返し結合した構造を有する糖鎖化合物（但し、糖鎖化合物中、少なくとも１つのグルコサミン残基の２位のアミノ基が硫酸化されている。）又はその塩を有効成分として含有することを特徴とするＨＧＦ産生促進薬剤。
【請求項１０】
ウロン酸残基と、６位のヒドロキシル基又は２位のアミノ基が硫酸化されているグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合又はβ１，４−グリコシド結合してなる２糖化合物又はその塩を有効成分として含有することを特徴とするＨＧＦ産生促進薬剤。
【請求項１１】
糖鎖化合物又はその塩が、抗血液凝固作用及びリポプロテインリパーゼ放出作用を有さないか、それらの作用が抑制されていることを特徴とする請求の範囲第１〜１０項のいずれかに記載のＨＧＦ産生促進薬剤。
【請求項１２】
ウロン酸残基（ウロン酸は、イズロン酸又はグルクロン酸を示す。以下、ウロン酸において同じ。）とグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合もしくはβ１，４−グリコシド結合してなる２糖、又はウロン酸残基とグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合もしくはβ１，４−グリコシド結合によって交互に繰返し結合した構造を有する３乃至１６糖のオリゴ糖又はその塩であって、
ウロン酸残基及びグルコサミン残基の少なくとも１つのヒドロキシル基が硫酸化、アルキル化、アシル化又はアミノ化されていてもよく、少なくとも１つのグルコサミン残基の２位のアミノ基が硫酸化、アルキル化又はアシル化されていてもよいオリゴ糖又はその塩の有効量を、哺乳動物に投与することを特徴とするＨＧＦ産生促進方法。
【請求項１３】
少なくとも１つのウロン酸残基の２位及び／又は少なくとも１つのグルコサミン残基の３位及び／又は６位のヒドロキシル基が硫酸化されていてもよいことを特徴とする請求の範囲第１２項に記載のＨＧＦ産生促進方法。
【請求項１４】
少なくとも１つのグルコサミン残基において、６位のヒドロキシル基及び／又は２位のアミノ基が硫酸化されていることを特徴とする請求の範囲第１２項に記載のＨＧＦ産生促進方法。
【請求項１５】
２乃至１０糖からなるオリゴ糖であることを特徴とする請求の範囲第１２項に記載のＨＧＦ産生促進方法。
【請求項１６】
オリゴ糖が、高分子ヘパリン又は高分子ヘパラン硫酸のヘパリナーゼ又はヘパリチナーゼ分解物であることを特徴とする請求の範囲第１２項に記載の産生促進方法。
【請求項１７】
オリゴ糖が、高分子ヘパリン又は高分子ヘパラン硫酸の亜硝酸分解法、過酸化水素分解法又はβ脱離のいずれかによる分解物であることを特徴とする請求の範囲第１２項に記載のＨＧＦ産生促進方法。
【請求項１８】
オリゴ糖が、次の（ａ）〜（ｈ）で表される化合物のいずれかであることを特徴とする請求の範囲第１２項に記載のＨＧＦ産生促進方法；
（ａ）  式（Ｉ）
【化１】
2005092348.tif 000029
（式中、Ｒ１は、水素、硫酸基、アルキル基、アシル基又は置換基を有していてもよいアミノ基を示し、Ｒ２は、水素、硫酸基、アルキル基又はアシル基を示し、Ｒ３及びＲ４は異なって、水素又は置換基を有していてもよいカルボキシル基を示し、ｎは０〜７を示す。）；
（ｂ）  式（ＩＩ）
【化２】
2005092348.tif 000030
（式中、各記号は上記と同じである。）；
（ｃ）  式（ＩＩＩ）
【化３】
2005092348.tif 000031
（式中、各記号は上記と同じである。）；
（ｄ）  式（ＩＶ）
【化４】
2005092348.tif 000032
（式中、各記号は上記と同じである。）；
（ｅ）  式（Ｖ）
【化５】
2005092348.tif 000033
（式中、ｍは０〜６を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は上記と同じである。）；
（ｆ）  式（ＶＩ）
【化６】
2005092348.tif 000034
（式中、ｍは０〜６を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は上記と同じである。）；
（ｇ）  式（ＶＩＩ）
【化７】
2005092348.tif 000035
（式中、ｍは０〜６を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は上記と同じである。）、又は
（ｈ）  式（ＶＩＩＩ）
【化８】
2005092348.tif 000036
（式中、ｍは０〜６を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は上記と同じである。）。
【請求項１９】
ウロン酸残基とグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合又はβ１，４−グリコシド結合によって交互に繰返し結合した構造を有する糖鎖化合物（但し、糖鎖化合物中、少なくとも１つのグルコサミン残基の６位のヒドロキシル基が硫酸化されている。）又はその塩の有効量を、哺乳動物に投与することを特徴とするＨＧＦ産生促進方法。
【請求項２０】
ウロン酸残基とグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合又はβ１，４−グリコシド結合によって交互に繰返し結合した構造を有する糖鎖化合物（但し、糖鎖化合物中、少なくとも１つのグルコサミン残基の２位のアミノ基が硫酸化されている。）又はその塩の有効量を、哺乳動物に投与することを特徴とするＨＧＦ産生促進方法。
【請求項２１】
ウロン酸残基と、６位のヒドロキシル基又は２位のアミノ基が硫酸化されているグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合又はβ１，４−グリコシド結合してなる２糖化合物又はその塩の有効量を、哺乳動物に投与することを特徴とするＨＧＦ産生促進方法。
【請求項２２】
糖鎖化合物又はその塩が、抗血液凝固作用及びリポプロテインリパーゼ放出作用を有さないか、それらの作用が抑制されていることを特徴とする請求の範囲第１２〜２１項のいずれかに記載のＨＧＦ産生促進方法。
【請求項２３】
ＨＧＦ産生促進医薬を製造するための、ウロン酸残基（ウロン酸は、イズロン酸又はグルクロン酸を示す。以下、ウロン酸において同じ。）とグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合もしくはβ１，４−グリコシド結合してなる２糖、又はウロン酸残基とグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合もしくはβ１，４−グリコシド結合によって交互に繰返し結合した構造を有する３乃至１６糖のオリゴ糖又はその塩であって、
ウロン酸残基及びグルコサミン残基の少なくとも１つのヒドロキシル基が硫酸化、アルキル化、アシル化又はアミノ化されていてもよく、少なくとも１つのグルコサミン残基の２位のアミノ基が硫酸化、アルキル化又はアシル化されていてもよいオリゴ糖又はその塩の使用。
【請求項２４】
少なくとも１つのウロン酸残基の２位及び／又は少なくとも１つのグルコサミン残基の３位及び／又は６位のヒドロキシル基が硫酸化されていてもよいことを特徴とする請求の範囲第２３項に記載の使用。
【請求項２５】
少なくとも１つのグルコサミン残基において、６位のヒドロキシル基及び／又は２位のアミノ基が硫酸化されていることを特徴とする請求の範囲第２３項に記載の使用。
【請求項２６】
２乃至１０糖からなるオリゴ糖であることを特徴とする請求の範囲第２３項に記載の使用。
【請求項２７】
オリゴ糖が、高分子ヘパリン又は高分子ヘパラン硫酸のヘパリナーゼ又はヘパリチナーゼ分解物であることを特徴とする請求の範囲第２３項に記載の使用。
【請求項２８】
オリゴ糖が、高分子ヘパリン又は高分子ヘパラン硫酸の亜硝酸分解法、過酸化水素分解法又はβ脱離のいずれかによる分解物であることを特徴とする請求の範囲第２３項に記載の使用。
【請求項２９】
オリゴ糖が、次の（ａ）〜（ｈ）で表される化合物のいずれかであることを特徴とする請求の範囲第２３項に記載の使用；
（ａ）  式（Ｉ）
【化１】
2005092348.tif 000037
（式中、Ｒ１は、水素、硫酸基、アルキル基、アシル基又は置換基を有していてもよいアミノ基を示し、Ｒ２は、水素、硫酸基、アルキル基又はアシル基を示し、Ｒ３及びＲ４は異なって、水素又は置換基を有していてもよいカルボキシル基を示し、ｎは０〜７を示す。）；
（ｂ）  式（ＩＩ）
【化２】
2005092348.tif 000038
（式中、各記号は上記と同じである。）；
（ｃ）  式（ＩＩＩ）
【化３】
2005092348.tif 000039
（式中、各記号は上記と同じである。）；
（ｄ）  式（ＩＶ）
【化４】
2005092348.tif 000040
（式中、各記号は上記と同じである。）；
（ｅ）  式（Ｖ）
【化５】
2005092348.tif 000041
（式中、ｍは０〜６を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は上記と同じである。）；
（ｆ）  式（ＶＩ）
【化６】
2005092348.tif 000042
（式中、ｍは０〜６を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は上記と同じである。）；
（ｇ）  式（ＶＩＩ）
【化７】
2005092348.tif 000043
（式中、ｍは０〜６を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は上記と同じである。）；又は
（ｈ）  式（ＶＩＩＩ）
【化８】
2005092348.tif 000044
（式中、ｍは０〜６を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は上記と同じである。）。
【請求項３０】
ＨＧＦ産生促進医薬を製造するための、ウロン酸残基とグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合又はβ１，４−グリコシド結合によって交互に繰返し結合した構造を有する糖鎖化合物（但し、糖鎖化合物中、少なくとも１つのグルコサミン残基の６位のヒドロキシル基が硫酸化されている。）又はその塩の使用。
【請求項３１】
ＨＧＦ産生促進医薬を製造するための、ウロン酸残基とグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合又はβ１，４−グリコシド結合によって交互に繰返し結合した構造を有する糖鎖化合物（但し、糖鎖化合物中、少なくとも１つのグルコサミン残基の２位のアミノ基が硫酸化されている。）又はその塩の使用。
【請求項３２】
ＨＧＦ産生促進医薬を製造するための、ウロン酸残基と、６位のヒドロキシル基又は２位のアミノ基が硫酸化されているグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合又はβ１，４−グリコシド結合してなる２糖化合物又はその塩の使用。
【請求項３３】
糖鎖化合物又はその塩が、抗血液凝固作用及びリポプロテインリパーゼ放出作用を有さないか、それらの作用が抑制されていることを特徴とする請求の範囲第２３〜３２項のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘパリン骨格を有する低分子オリゴ糖等の糖鎖化合物又はその塩を含有するＨＧＦ産生促進薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生因子・治療因子としてＨＧＦ（肝細胞増殖因子）が注目を浴びている。ＨＧＦは肝実質細胞の増殖を指標として発見された蛋白質であるが、その後の研究により、ＨＧＦは肝実質細胞以外にも多くの上皮系細胞や一部の間葉系細胞にも増殖作用を示すことが明らかとなっている。また、ＨＧＦの示す活性は細胞増殖活性のみならず、細胞遊走促進、形態形成促進、細胞死抑制、血管新生作用等多様な活性を示すことも知られている（非特許文献１）。ＨＧＦはその薬理作用から肝硬変治療剤、腎疾患治療剤、上皮細胞増殖促進剤、抗ガン剤、ガン療法用副作用防止剤、肺障害治療剤、胃・十二指腸損傷治療剤、脳神経障害治療剤、免疫抑制副作用防止剤、コラーゲン分解促進剤、軟骨障害治療剤、動脈疾患治療剤、肺線維症治療剤、肝臓疾患治療剤、血液凝固異常治療剤、血漿低蛋白治療剤、創傷治療剤、神経障害改善薬、造血幹細胞増加剤、育毛促進剤等（特許文献１〜１４参照）としての開発が期待されている。【０００３】
ＨＧＦは主に間葉系の細胞によって産生されるが、その産生量は臓器の傷害に応じて上昇する。例えば、肝臓に傷害が起こると、肝臓の血管内皮細胞やクッパー細胞、伊東細胞等の肝非実質細胞でＨＧＦの産生が高まる。一方、この時、無傷の肺、脾臓、腎臓等の他の臓器でもＨＧＦの発現が上昇し、血中のＨＧＦレベルが上昇する。このことは、臓器の傷害に応じてＨＧＦの発現を誘導する因子が血中に存在することを示すが、そのような因子はインジュリンと総称される（非特許文献２）。
インジュリンは単一の物質ではなく、例えばインターロイキン−１、ＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）、ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）等のサイトカインに加え、プロスタグランジン等のオータコイドがインジュリンとして同定されている。これらの因子は、ＨＧＦのｍＲＮＡの発現を上昇させることにより、ＨＧＦの産生を高める。一方、インジュリンの探索過程でヘパリン及びヘパラン硫酸にもＨＧＦ産生促進活性があることが見出された（非特許文献３）。
ヘパリン及びヘパラン硫酸はＨＧＦのｍＲＮＡの発現を上昇させずに、翻訳過程以後のステップに作用することが示唆されているが、詳細な機構は不明である。【０００４】
ヘパリン及びヘパラン硫酸は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）として知られる一群の多糖類のメンバーである。ヘパリン及びヘパラン硫酸は、Ｄ−グルコサミンとウロン酸からなる二糖を基本単位とし、該二糖の繰り返しによって構成される多糖である（非特許文献４）。
ヘパリン及びヘパラン硫酸の分子量は不均一で、５０００から３００００程度のものが混在している。Ｄ−グルコサミン残基の６位の炭素は部分的にＯ−硫酸化を受けており、また、アミノ基は部分的にＮ−アセチル化もしくはＮ−硫酸化を受けている。ウロン酸残基としてはＬ−イズロン酸又はＤ−グルクロン酸の２種類をとりうるが、ヘパリンではほとんどがＬ−イズロン酸であり、ヘパラン硫酸ではほとんどがＤ−グルクロン酸である。ウロン酸残基の２位の炭素は部分的にＯ−硫酸化を受けている。さらに、その他の部位でも硫酸化が起こる場合があり、これらの硫酸化の位置の多様性が分子に多様性を与えている。ヘパリンの方がヘパラン硫酸よりも全体的に高度に硫酸化を受けている。しかしながら、組織から分離されるヘパリン又はヘパラン硫酸の調製物は不均一であり、両者の明確な区別は困難である。【０００５】
ヘパリンは、従来より主に抗血液凝固剤として臨床の場で用いられている。例えば、ヘパリンは血液体外循環時の凝固防止や、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、心筋梗塞をはじめとする血栓性疾患の治療・予防等に用いられている。ヘパリンはそれ自体に抗血液凝固作用はないが、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）やヘパリンコファクタ−ＩＩと結合し、血液凝固因子である各種のセリンプロテアーゼを不活性化することで強力な血液凝固阻害作用を示す（非特許文献５）。
このように既に医薬品として使用されているヘパリンの新たな用途として、ＨＧＦ産生促進薬としての利用が考えられる（特許文献１５）。
ヘパリンをＨＧＦ産生促進薬として用いることができれば、前述のＨＧＦの薬理作用を介した各種疾患の治療効果を向上させることが期待できる。しかしながら、ＨＧＦの産生を促進する目的でヘパリンを用いる上では、従来から利用されてきたヘパリンの抗血液凝固作用は出血傾向につながり、副作用となることが考えられる。ヘパリンを人体に投与する際は、投与中の出血を防止するために、抗血液凝固作用をモニターしながら投与量を慎重にコントロールしなければならない。特に、未分画の高分子ヘパリンは抗血液凝固作用が強く、使用に当たっては細心の注意が必要である。このように、ヘパリンの抗血液凝固作用は、ＨＧＦ産生促進薬として用いる際には欠点となる。【０００６】
また、ヘパリンは血管壁に存在するリポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）を遊離させることによって血漿中のＬＰＬ活性を上昇させる作用も有している（非特許文献６）。
ＬＰＬ活性の上昇は脂肪の分解によって血液清澄化を促すが、持続的なＬＰＬ活性の上昇は血中の遊離脂肪酸レベルを上昇させ、不整脈を引き起こす恐れがある。
そこで、抗血液凝固作用及びＬＰＬ放出活性は有しておらず、ＨＧＦ産生促進作用のみを有するヘパリン又はヘパラン硫酸を調製する方法が切望された。【０００７】
ヘパリンの抗血液凝固作用を低下させる方法として、ヘパリンを低分子化することが知られている（非特許文献７）。前述のように、未分画の高分子ヘパリンは抗血液凝固作用が強く、使用に当たっては細心の注意が必要である。このような高分子ヘパリンの欠点を克服するものとして低分子ヘパリンが利用されている。前述のごとく、ヘパリンの抗血液凝固作用はヘパリン−ＡＴＩＩＩ複合体の形成によるものである。ヘパリン−ＡＴＩＩＩ複合体はトロンビン（血液凝固因子ＩＩａ）やその他の凝固因子（Ｘａ、ＸＩＩａ、ＸＩａ、ＩＸａ等）に結合してそれらを不活性化する。ＩＩａの抑制には１７糖以上のヘパリン構造が必要であり、高分子ヘパリンでは特にＩＩａとＸａの不活性化が主な作用である。一方、ヘパリンを１６糖以下のサイズに低分子化すると、１７糖以上で見られるＩＩａ阻害活性が抑制されるため、抗血液凝固活性が低下することが知られている（非特許文献８、９）。
また、低分子ヘパリンではＬＰＬ放出活性も低下することが知られている。（非特許文献１０）。【０００８】
このように、ヘパリンを低分子化することで抗血液凝固作用とＬＰＬ放出活性を低下させることが可能であるが、ここで、ヘパリンを低分子化させた場合に、ＨＧＦ産生促進活性が保持されるかが問題となる。低分子ヘパリンとして知られるダルテパリンナトリウム（フラグミン静注；キッセイ薬品工業株式会社製）にはＨＧＦ産生促進活性があることが知られている（非特許文献１１）。
しかし、ダルテパリンナトリウムは平均分子量では５０００であるものの、分子量の分布幅は２０００〜９０００と広く、このうちどの分子サイズがＨＧＦ産生促進活性を担っているのか不明である。特に、血液凝固因子ＩＩａに対する阻害活性が低下する１６糖以下の分子サイズ（分子量５０００以下）にＨＧＦ産生促進活性が保持されているのかが重要であるが、この点は全く不明であった。
一方、ヘパリンを低分子化せずに抗血液凝固作用やＬＰＬ放出活性を低下させつつＨＧＦ産生促進活性を維持するような方法は全く知られていない。
【特許文献１】特開平４−１８０２８号公報
【特許文献２】特開平４−４９２４６号公報
【特許文献３】ヨーロッパ公開第  ４９２６１４号公報
【特許文献４】特開平６−２５０１０号公報
【特許文献５】国際公開第３／８８２１号パンフレット
【特許文献６】特開平６−１７２２０７号公報
【特許文献７】特開平７−８９８６９号公報
【特許文献８】特開平６−４０９３４号公報
【特許文献９】国際公開第９４／２１６５号パンフレット
【特許文献１０】特開平６−４０９３５号公報
【特許文献１１】特開平６−５６６９２号公報
【特許文献１２】特開平７−４１４２９号公報
【特許文献１３】国際公開第９３／３０６１号パンフレット
【特許文献１４】特開平５−２１３７２１号公報
【特許文献１５】特開平６−３１２９４１号公報
【非特許文献１】マツモト・ケー（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｋ）他１名、キドニー・インターナショナル（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．）、２００１年、第５９巻、ｐ．２０２３−２０３８
【非特許文献２】マツモト・ケー（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｋ）ら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステート・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．）、１９９２年、第８９巻、ｐ．３８００−３８０４
【非特許文献３】マツモト・ケー（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｋ）ら、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１９９３年、第１１４巻、ｐ．８２０−８２６
【非特許文献４】スガハラ・ケー（Ｓｕｇａｈａｒａ  Ｋ）他１名、アイ・ユー・ビー・エム・ビー・ライフ（ＩＵＢＭＢ  Ｌｉｆｅ）、２００２年、第５４巻、ｐ．１６３−１７５
【非特許文献５】ボーリン・エム・シー（Ｂｏｕｒｉｎ，Ｍ．Ｃ）他１名、ザ・バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．）、１９９３年、第２８９巻（Ｐｔ２）、ｐ．３１３−３３０
【非特許文献６】オリベクロナ・ティー（Ｏｌｉｖｅｃｒｏｎａ，Ｔ．）ら、ハーモステイシス（Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ）、１９９３年、２３巻（Ｓｕｐｐｌ．１）、ｐ．１５０−１６０
【非特許文献７】リンハート・アール・ジェイ（Ｌｉｎｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｊ．）他１名、セミナーズ・イン・トロンボシス・ヘモスタシス（Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．）、１９９９年、第２５巻、Ｓｕｐｐｌ．３、ｐ．５−１６
【非特許文献８】ホルマー・イー（Ｈｏｌｍｅｒ，Ｅ．）ら、ハーモステイシス（Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ）、１９８６年、第１６巻、ｓｕｐｐｌ．２、ｐ．１−７
【非特許文献９】レイン・ディー・エー（Ｌａｎｅ  Ｄ．Ａ．）ら、ザ・バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．）、１９８４年、第２１８、巻、ｐ．７２５−７３２
【非特許文献１０】ナストロン・ビー（Ｎａｓｓｔｒｏｍ，Ｂ．）ら、ザ・ジャーナル・オブ・ラボラトリー・アンド・クリニカル・メディシン（Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．）、２００３年、第１４２巻、ｐ．９０−９９
【非特許文献１１】（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｋ．）ら、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１９９３年、第１１４巻、ｐ．８２０−８２６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、ヘパリン骨格を有し、ヘパリン又はヘパラン硫酸の抗血液凝固作用及びＬＰＬ放出活性を有さないか抑制されているオリゴ糖等の糖鎖化合物又はその塩を含むＨＧＦ産生促進薬剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決すべくヘパリン及びヘパラン硫酸のＨＧＦ産生促進機能に関する研究を鋭意重ねた。その結果、ヘパリン又はヘパラン硫酸を低分子化したウロン酸残基とグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合又はβ１，４−グリコシド結合によって交互に繰返し結合した構造を有する２乃至１６糖のオリゴ糖が、ＨＧＦ産生促進作用を有することを見出した。また、前記オリゴ糖は、抗血液凝固作用及びリポプロテイン放出活性が低下していることを見出した。ヘパリン又はヘパラン硫酸を１６糖以下に低分子化しても、ＨＧＦ産生促進活性が保持されていることは従来全く知られていなかった。特に、ウロン酸残基とグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合又はβ１，４−グリコシド結合してなる２糖化合物であってもＨＧＦ産生促進活性を有することは驚くべき発見であった。さらに本発明者らは、ヘパリン及びヘパラン硫酸においてグルコサミン残基の６位のヒドロキシル基又はグルコサミン残基の２位のアミノ基が硫酸化されていることがＨＧＦ産生促進活性を発揮する効果を高めることを見出し、ヘパリン又はヘパラン硫酸を低分子化せずとも、グルコサミン残基の６位のヒドロキシル基のみが硫酸化されている構造、又はグルコサミン残基の２位のアミノ基のみが硫酸化されている構造に変換すればＨＧＦ産生促進作用を保持したまま、抗血液凝固作用及びリポプロテイン放出活性を低下させられることを見出した。かかる知見に基づき本発明者らはさらに研究をすすめ、本発明の完成に至った。【００１１】
すなわち本発明は、
（１）  ウロン酸残基（ウロン酸は、イズロン酸又はグルクロン酸を示す。以下、ウロン酸において同じ。）とグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合もしくはβ１，４−グリコシド結合してなる２糖、又はウロン酸残基とグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合もしくはβ１，４−グリコシド結合によって交互に繰返し結合した構造を有する３乃至１６糖のオリゴ糖又はその塩であって、
ウロン酸残基及びグルコサミン残基の少なくとも１つのヒドロキシル基が硫酸化、アルキル化、アシル化又はアミノ化されていてもよく、少なくとも１つのグルコサミン残基の２位のアミノ基が硫酸化、アルキル化又はアシル化されていてもよいオリゴ糖又はその塩を有効成分として含有するＨＧＦ産生促進薬剤、
（２）  少なくとも１つのウロン酸残基の２位及び／又は少なくとも１つのグルコサミン残基の３位及び／又は６位のヒドロキシル基が硫酸化されていてもよいことを特徴とする上記（１）に記載のＨＧＦ産生促進薬剤。
（３）  少なくとも１つのグルコサミン残基において、６位のヒドロキシル基及び／又は２位のアミノ基が硫酸化されていることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載のＨＧＦ産生促進薬剤。
（４）  ２乃至１０糖からなるオリゴ糖であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載のＨＧＦ産生促進薬剤、
（５）  オリゴ糖が、高分子ヘパリン又は高分子ヘパラン硫酸のヘパリナーゼ又はヘパリチナーゼ分解物であることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれかに記載のＨＧＦ産生促進薬剤、
（６）  オリゴ糖が、高分子ヘパリン又は高分子ヘパラン硫酸の亜硝酸分解法、過酸化水素分解法又はβ脱離のいずれかによる分解物であることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれかに記載のＨＧＦ産生促進薬剤、
（７）  オリゴ糖が、次の（ａ）〜（ｈ）で表される化合物のいずれかであることを特徴とする上記（１）に記載のＨＧＦ産生促進薬剤；
（ａ）  式（Ｉ）
【化１】
2005092348.tif 000002
（式中、Ｒ１は、水素、硫酸基、アルキル基、アシル基又は置換基を有していてもよいアミノ基を示し、Ｒ２は、水素、硫酸基、アルキル基又はアシル基を示し、Ｒ３及びＲ４は異なって、水素又は置換基を有していてもよいカルボキシル基を示し、ｎは０〜７を示す。）
（ｂ）  式（ＩＩ）
【化２】
2005092348.tif 000003
（式中、各記号は上記と同じである。）；
（ｃ）  式（ＩＩＩ）
【化３】
2005092348.tif 000004
（式中、各記号は上記と同じである。）；
（ｄ）  式（ＩＶ）
【化４】
2005092348.tif 000005
（式中、各記号は上記と同じである。）；
（ｅ）  式（Ｖ）
【化５】
2005092348.tif 000006
（式中、ｍは０〜６を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は上記と同じである。）；
（ｆ）  式（ＶＩ）
【化６】
2005092348.tif 000007
（式中、ｍは０〜６を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は上記と同じである。）；
（ｇ）  式（ＶＩＩ）
【化７】
2005092348.tif 000008
（式中、ｍは０〜６を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は上記と同じである。）；又は
（ｈ）  式（ＶＩＩＩ）
【化８】
2005092348.tif 000009
（式中、ｍは０〜６を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は上記と同じである。）、【００１２】
（８）  ウロン酸残基とグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合又はβ１，４−グリコシド結合によって交互に繰返し結合した構造を有する糖鎖化合物（但し、糖鎖化合物中、少なくとも１つのグルコサミン残基の６位のヒドロキシル基が硫酸化されている。）又はその塩を有効成分として含有することを特徴とするＨＧＦ産生促進薬剤、
（９）  ウロン酸残基とグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合又はβ１，４−グリコシド結合によって交互に繰返し結合した構造を有する糖鎖化合物（但し、糖鎖化合物中、少なくとも１つのグルコサミン残基の２位のアミノ基が硫酸化されている。）又はその塩を有効成分として含有することを特徴とするＨＧＦ産生促進薬剤、
（１０）  ウロン酸残基と、６位のヒドロキシル基又は２位のアミノ基が硫酸化されているグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合又はβ１，４−グリコシド結合してなる２糖化合物又はその塩を有効成分として含有することを特徴とするＨＧＦ産生促進薬剤、及び
（１１）  糖鎖化合物又はその塩が、抗血液凝固作用及びリポプロテインリパーゼ放出作用を有さないか、それらの作用が抑制されていることを特徴とする請求の範囲第１〜１０項のいずれかに記載のＨＧＦ産生促進薬剤
に関する。【００１３】
また、本発明は、
（１２）  ウロン酸残基とグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合もしくはβ１，４−グリコシド結合してなる２糖、又はウロン酸残基とグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合もしくはβ１，４−グリコシド結合によって交互に繰返し結合した構造を有する３乃至１６糖のオリゴ糖又はその塩であって、
ウロン酸残基及びグルコサミン残基の少なくとも１つのヒドロキシル基が硫酸化、アルキル化、アシル化又はアミノ化されていてもよく、少なくとも１つのグルコサミン残基の２位のアミノ基が硫酸化、アルキル化又はアシル化されていてもよいオリゴ糖又はその塩の有効量を、哺乳動物に投与することを特徴とするＨＧＦ産生促進方法、
（１３）  少なくとも１つのウロン酸残基の２位及び／又は少なくとも１つのグルコサミン残基の３位及び／又は６位のヒドロキシル基が硫酸化されていてもよいことを特徴とする上記（１２）に記載のＨＧＦ産生促進方法、
（１４）  少なくとも１つのグルコサミン残基において、６位のヒドロキシル基及び／又は２位のアミノ基が硫酸化されていることを特徴とする上記（１２）に記載のＨＧＦ産生促進方法、
（１５）  ２乃至１０糖からなるオリゴ糖であることを特徴とする上記（１２）に記載のＨＧＦ産生促進方法、
（１６）  オリゴ糖が、高分子ヘパリン又は高分子ヘパラン硫酸のヘパリナーゼ又はヘパリチナーゼ分解物であることを特徴とする上記（１２）に記載の産生促進方法、
（１７）  オリゴ糖が、高分子ヘパリン又は高分子ヘパラン硫酸の亜硝酸分解法、過酸化水素分解法又はβ脱離のいずれかによる分解物であることを特徴とする上記（１２）に記載のＨＧＦ産生促進方法、
（１８）  オリゴ糖が、次の（ａ）〜（ｈ）で表される化合物のいずれかであることを特徴とする上記（１２）に記載のＨＧＦ産生促進方法；
（ａ）  上記式（Ｉ）；
（ｂ）  上記式（ＩＩ）；
（ｃ）  上記式（ＩＩＩ）；
（ｄ）  上記式（ＩＶ）；
（ｅ）  上記式（Ｖ）；
（ｆ）  上記式（ＶＩ）；
（ｇ）  上記式（ＶＩＩ）；又は
（ｈ）  上記式（ＶＩＩＩ）、
（１９）  ウロン酸残基とグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合又はβ１，４−グリコシド結合によって交互に繰返し結合した構造を有する糖鎖化合物（但し、糖鎖化合物中、少なくとも１つのグルコサミン残基の６位のヒドロキシル基が硫酸化されている。）又はその塩の有効量を、哺乳動物に投与することを特徴とするＨＧＦ産生促進方法、
（２０）  ウロン酸残基とグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合又はβ１，４−グリコシド結合によって交互に繰返し結合した構造を有する糖鎖化合物（但し、糖鎖化合物中、少なくとも１つのグルコサミン残基の２位のアミノ基が硫酸化されている。）又はその塩の有効量を、哺乳動物に投与することを特徴とするＨＧＦ産生促進方法、
（２１）  ウロン酸残基と、６位のヒドロキシル基又は２位のアミノ基が硫酸化されているグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合又はβ１，４−グリコシド結合してなる２糖化合物又はその塩の有効量を、哺乳動物に投与することを特徴とするＨＧＦ産生促進方法、及び
（２２）  糖鎖化合物又はその塩が、抗血液凝固作用及びリポプロテインリパーゼ放出作用を有さないか、それらの作用が抑制されていることを特徴とする上記（１２）〜（２１）のいずれかに記載のＨＧＦ産生促進方法、
に関する。【００１４】
また、本発明は、
（２３）  ＨＧＦ産生促進医薬を製造するための、ウロン酸残基とグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合もしくはβ１，４−グリコシド結合してなる２糖、又はウロン酸残基とグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合もしくはβ１，４−グリコシド結合によって交互に繰返し結合した構造を有する３乃至１６糖のオリゴ糖又はその塩であって、
ウロン酸残基及びグルコサミン残基の少なくとも１つのヒドロキシル基が硫酸化、アルキル化、アシル化又はアミノ化されていてもよく、少なくとも１つのグルコサミン残基の２位のアミノ基が硫酸化、アルキル化又はアシル化されていてもよいオリゴ糖又はその塩の使用、
（２４）  少なくとも１つのウロン酸残基の２位及び／又は少なくとも１つのグルコサミン残基の３位及び／又は６位のヒドロキシル基が硫酸化されていてもよいことを特徴とする上記（２３）に記載の使用、
（２５）  少なくとも１つのグルコサミン残基において、６位のヒドロキシル基及び／又は２位のアミノ基が硫酸化されていることを特徴とする上記（２３）に記載の使用、
（２６）  ２乃至１０糖からなるオリゴ糖であることを特徴とする上記（２３）に記載の使用、
（２７）  オリゴ糖が、高分子ヘパリン又は高分子ヘパラン硫酸のヘパリナーゼ又はヘパリチナーゼ分解物であることを特徴とする上記（２３）に記載の使用、
（２８）  オリゴ糖が、高分子ヘパリン又は高分子ヘパラン硫酸の亜硝酸分解法、過酸化水素分解法又はβ脱離のいずれかによる分解物であることを特徴とする上記（２３）に記載の使用、
（２９）  オリゴ糖が、次の（ａ）〜（ｈ）で表される化合物のいずれかであることを特徴とする上記（２３）に記載の使用；
（ａ）  上記式（Ｉ）；
（ｂ）  上記式（ＩＩ）；
（ｃ）  上記式（ＩＩＩ）；
（ｄ）  上記式（ＩＶ）；
（ｅ）  上記式（Ｖ）；
（ｆ）  上記式（ＶＩ）；
（ｇ）  上記式（ＶＩＩ）；又は
（ｈ）  上記式（ＶＩＩＩ）、
（３０）  ＨＧＦ産生促進医薬を製造するための、ウロン酸残基とグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合又はβ１，４−グリコシド結合によって交互に繰返し結合した構造を有する糖鎖化合物（但し、糖鎖化合物中、少なくとも１つのグルコサミン残基の６位のヒドロキシル基が硫酸化されている。）又はその塩の使用、
（３１）  ＨＧＦ産生促進医薬を製造するための、ウロン酸残基とグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合又はβ１，４−グリコシド結合によって交互に繰返し結合した構造を有する糖鎖化合物（但し、糖鎖化合物中、少なくとも１つのグルコサミン残基の２位のアミノ基が硫酸化されている。）又はその塩の使用、
（３２）  ＨＧＦ産生促進医薬を製造するための、ウロン酸残基と、６位のヒドロキシル基又は２位のアミノ基が硫酸化されているグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合又はβ１，４−グリコシド結合してなる２糖化合物又はその塩の使用、及び
（３３）  糖鎖化合物又はその塩が、抗血液凝固作用及びリポプロテインリパーゼ放出作用を有さないか、それらの作用が抑制されていることを特徴とする上記（２３）〜（３２）のいずれかに記載の使用、
に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のＨＧＦ産生促進薬剤に使用されるオリゴ糖等の糖鎖化合物は、ウロン酸残基とグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合又はβ１，４−グリコシド結合してなる２糖の繰り返しのヘパリン骨格を有するにもかかわらず、出血傾向の副作用を有さないか、抑制しながらＨＧＦの産生を促進することができ、生体の組織、器官等の傷害の治癒を促進することができる等の効果、より具体的には、肝疾患、腎疾患、皮膚疾患、血液疾患、眼疾患、肺疾患、胃十二指腸疾患、癌及びその関連疾患、骨疾患、中枢疾患等の治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ヘパリン分解産物のゲル濾過クロマトグラフィーによる分離を示す図である。
【図２】ヘパリン断片のＨＧＦ産生促進活性を示す図である。
【図３】ヘパリン１０糖断片の陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによる分離を示す図である。
【図４】陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによって分離したヘパリン１０糖断片のＨＧＦ産生促進活性を示す図である。
【図５】陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによって分離したヘパリン１０糖断片のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ解析結果を示す図である。
【図６】硫酸基の位置の異なる2糖化合物のＨＧＦ産生促進活性を示す図である。
【図７】ヘパリン断片の抗血液凝固活性を活性化部分トロンボプラスチン時間（以下、ＡＰＴＴと略記する。）によって評価した結果を示す図である。
【図８】ヘパリン断片のＬＰＬ放出活性を示す図である。
【図９】硫酸基の位置の異なる2糖化合物の抗血液凝固活性をＡＰＴＴによって評価した結果を示す図である。
【図１０】硫酸基の位置の異なる2糖化合物のリポプロテインリパーゼ（以下、ＬＰＬと略記する。）放出活性を示す図である。
【図１１】グルコサミン残基の２位のアミノ基のみが硫酸化されている修飾ヘパリンのＨＧＦ産生促進活性を示す図である。
【図１２】グルコサミン残基の２位のアミノ基のみが硫酸化されている修飾ヘパリンの抗血液凝固活性をＡＰＴＴによって評価した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明においてヘパリン骨格とは、ウロン酸残基とグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合又はβ１，４−グリコシド結合によって交互に繰り返し結合した構造を有する骨格をいう。
本発明においてウロン酸残基は、Ｌ−イズロン酸残基（以下、ＩｄｏＡと略記する。）及びＤ−グルクロン酸残基（以下、ＧｌｃＡと略記する。）のいずれであってもよい。また、ＩｄｏＡ又はＧｌｃＡのみで存在してもよく、あるいはＩｄｏＡとＧｌｃＡが混在していてもよく、ＩｄｏＡとＧｌｃＡの存在比は特に制限はない。【００１８】
また、本発明においてオリゴ糖というときは、ウロン酸とグルコサミンの異なる二糖から構成されるヘテロオリゴ糖をいい、具体的には、ウロン酸残基とグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合又はβ１，４−グリコシド結合してなる２糖化合物、ウロン酸残基又はグルコサミン残基と前記２糖化合物とがα１，４−グリコシド結合又はβ１，４−グリコシド結合してなる３糖化合物、或いはウロン酸残基とグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合又はβ１，４−グリコシド結合によって交互に繰り返し結合した構造を有する４〜１６糖の糖鎖化合物をいう。【００１９】
また、本発明においてアルキル化とは、ウロン酸残基のヒドロキシル基又は／及びグルコサミン残基のヒドロキシル基又は／及びアミノ基の水素がアルキル基、好ましくは低級アルキル基で置換されることをいう。【００２０】
本発明においてアシル化とは、ウロン酸残基のヒドロキシル基又は／及びグルコサミン残基のヒドロキシル基又は／及びアミノ基の水素が、式−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ５、−（Ｃ＝Ｏ）−ＯＲ５、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲ５Ｒ６、−（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨＲ５、−ＳＯ−Ｒ５、−ＳＯ２−Ｒ５又は−ＳＯ２−ＮＨＲ５（式中、Ｒ５及びＲ６は水素原子又は炭化水素基を示す。）で表されるアシル基に置換されることをいう。前記式中、Ｒ５及びＲ６で示される炭化水素基としては、例えば、鎖状炭化水素基（例、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基等）などが挙げられる。アルキル基としては低級アルキル基が好ましい。アルケニル基としては、例えばＣ２−６アルケニル基（例、ビニル、アリル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、２−メチル−２−プロペニル、１−メチル−２−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル等）などが好ましい。アルキニル基としては、例えばＣ２−６アルキニル基（例、エチニル、プロパルギル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ヘキシニル等）などが好ましい。【００２１】
本発明においてアミノ化とは、ウロン酸残基のヒドロキシル基又は／及びグルコサミン残基のヒドロキシル基の水素が、アミノ基に置換されることをいう。該アミノ基は更に硫酸基、アルキル基、アシル基で置換されていてもよい。
なお、本発明において低級アルキル基とは、炭素数１〜６のアルキル基、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、２−メチルブチル、ネオペンチル、ヘキシル、４−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２−メチルペンチル、１−メチルペンチル、３，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル等をいう。【００２２】
本発明のＨＧＦ産生促進薬剤に使用されるオリゴ糖等の糖鎖化合物を構成するウロン酸残基は、２位及び３位のヒドロキシル基のうち少なくとも１つのヒドロキシル基が硫酸化、アルキル化、アシル化又はアミノ化されていてもよいが、硫酸化がより好ましく、とりわけ２位のヒドロキシル基の硫酸化が好ましい。【００２３】
本発明のＨＧＦ産生促進薬剤に使用されるオリゴ糖等の糖鎖化合物を構成するグルコサミン残基は、２位のアミノ基が硫酸化、アルキル化又はアシル化されていてもよいが、硫酸化又はアシル化が好ましい。とりわけ硫酸化が好ましい。アシル化の場合は、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ５でアシル化されていることがより好ましく、とりわけアセチルでアシル化されていることが好ましい。
また、グルコサミン残基は、３位及び６位のヒドロキシル基のうち少なくとも１つのヒドロキシル基が硫酸化、アルキル化、アシル化又はアミノ化されていてもよいが、硫酸化が好ましく、とりわけ６位のヒドロキシル基の硫酸化が好ましい。【００２４】
本発明においてオリゴ糖を構成するウロン酸残基とグルコサミン残基の２糖の繰り返し構造は、繰り返し数が多いとＨＧＦ産生活性は高くなる。一方、糖の繰り返し数が少ないと、抗血液凝固作用及びＬＰＬ放出活性が低下するという特徴を有する。このため、本発明においてオリゴ糖は、ＨＧＦ産生促進活性を有しかつ、抗血液凝固作用及びＬＰＬ放出活性という副作用が低減されているという点で、２乃至１６糖が好ましく、２乃至１０糖がより好ましい。
本発明のＨＧＦ産生促進薬剤に使用される２乃至１６糖のオリゴ糖は、分子全体の硫酸化の程度が高いと、ＨＧＦ産生活性が高くなる。好ましい硫酸化の程度は、２残基当たりに硫酸基が約１〜３個である。
２乃至１６糖のオリゴ糖において、硫酸基の位置に特に限定はないが、糖鎖化合物の中の少なくとも１つのグルコサミン残基の６位のヒドロキシル基又は２位のアミノ基が硫酸化されていることが好ましく、このような硫酸化がなされていれば、糖鎖化合物の他の部位での硫酸化はなくてもよい。２糖化合物の場合においても、少なくともグルコサミン残基の６位のヒドロキシル基及び２位のアミノ基のいずれかが硫酸化されていることが好ましい。【００２５】
本発明のＨＧＦ産生促進薬剤に使用される好ましいオリゴ糖としては、例えば以下で表される化合物及びそれらの塩が例示される。
（ａ）  式（Ｉ）
【化９】
2005092348.tif 000010
（式中、Ｒ１は、水素、硫酸基、アルキル基、アシル基又は置換基を有していてもよいアミノ基を示し、Ｒ２は、水素、硫酸基、アルキル基又はアシル基を示し、Ｒ３及びＲ４は異なって、水素又は置換基を有していてもよいカルボキシル基を示し、ｎは０〜７を示す。）【００２６】
（ｂ）  式（ＩＩ）
【化１０】
2005092348.tif 000011
（式中、各記号は上記と同じである。）【００２７】
（ｃ）  式（ＩＩＩ）
【化１１】
2005092348.tif 000012
（式中、各記号は上記と同じである。）【００２８】
（ｄ）  式（ＩＶ）
【化１２】
2005092348.tif 000013
（式中、各記号は上記と同じである。）【００２９】
（ｅ）  式（Ｖ）
【化１３】
2005092348.tif 000014
（式中、ｍは０〜６を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は上記と同じである。）【００３０】
（ｆ）  式（ＶＩ）
【化１４】
2005092348.tif 000015
（式中、ｍは０〜６を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は上記と同じである。）【００３１】
（ｇ）  式（ＶＩＩ）
【化１５】
2005092348.tif 000016
（式中、ｍは０〜６を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は上記と同じである。）【００３２】
（ｈ）  式（ＶＩＩＩ）
【化１６】
2005092348.tif 000017
（式中、ｍは０〜６を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は上記と同じである。）【００３３】
（ｉ）  ウロン酸残基と、６位のヒドロキシル基のみが硫酸化されているグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合又はβ１，４−グリコシド結合してなる２糖化合物、又は
（ｊ）  ウロン酸残基と、２位のアミノ基のみが硫酸化されているグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合又はβ１，４−グリコシド結合してなる２糖化合物。【００３４】
上記式（Ｉ）〜（ＶＩＩＩ）で示されるＲ１及びＲ２で示されるアルキル基としては、炭素数１〜６の低級アルキル基が好ましく、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、２−メチルブチル、ネオペンチル、ヘキシル、４−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２−メチルペンチル、１−メチルペンチル、３，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル等が挙げられる。Ｒ１及びＲ２で示されるアシル基としては、式−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ３、−（Ｃ＝Ｏ）−ＯＲ３、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲ３Ｒ４、−（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨＲ３、−ＳＯ−Ｒ５、−ＳＯ２−Ｒ５又は−ＳＯ２−ＮＨＲ３〔式中、Ｒ３及びＲ４は水素原子、炭化水素基、Ｒ４は水素原子、炭素数１〜６の低級アルキル基、Ｒ５は置換基を有していてもよい炭化水素基を示す〕で表されるアシル基等が挙げられる。アシル基の中でも、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ３が好ましく、アセチルがとりわけ好ましい。前記式中、Ｒ３及びＲ５で示される炭化水素基としては、例えば、鎖状炭化水素基（例、アルキル基、アルケニル、アルキニル等）などが挙げられる。アルキル基としては炭素数１〜６の低級アルキル基（例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、２−メチルブチル、ネオペンチル、ヘキシル、４−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２−メチルペンチル、１−メチルペンチル、３，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル等）などが好ましい。アルケニルとしては、例えばＣ２−６アルケニル（例、ビニル、アリル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、２−メチル−２−プロペニル、１−メチル−２−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル等）などが好ましい。アルキニルとしては、例えばＣ２−６アルキニル（例、エチニル、プロパルギル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ヘキシニル等）などが好ましい。【００３５】
上記式（Ｉ）〜（ＶＩＩＩ）で示されるＲ２で示されるアミノ基に、置換してもよい置換基としては、硫酸基、アルキル基、アシル基が挙げられるが、硫酸基又はアシル基が好ましい。特に硫酸基が好ましい。アシル基は、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ５がより好ましく、とりわけアセチルが好ましい。該アルキル基及びアシル基は上述のＲ１及びＲ２のアルキル基及びアシル基と同義である。
Ｒ１とＲ２の好ましい組み合わせとしては、Ｒ１が水素又は硫酸基であり、Ｒ２が水素、硫酸基又はアシル基が好ましい。この場合、アシル基は−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ３が好ましく、とりわけアセチルが好ましい。
ｎは０〜７、好ましくは０〜４である。ｍは０〜６、好ましくは０〜４である。【００３６】
上記オリゴ糖、例えば上記式（Ｉ）〜（ＶＩＩＩ）で示される化合物の塩としては、例えばリチウム、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、例えばカルシウム等のアルカリ土類金属塩、例えば無機酸塩（例えば、塩酸塩、硫酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩等）、有機酸塩（例えば、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、プロピオン酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩等）等の酸付加塩等が挙げられる。【００３７】
本発明のＨＧＦ産生促進薬剤に使用されるオリゴ糖又はその塩は、通常ヘパリン又はヘパラン硫酸から製造される。ヘパリンは、高分子ヘパリンでも低分子ヘパリンでもよく、ヘパラン硫酸は、高分子ヘパラン硫酸でも低分子ヘパラン硫酸でもよい。本発明で使用されるオリゴ糖又はその塩は、高分子ヘパリン又は高分子ヘパラン硫酸を断片化して得られる。原料となる高分子ヘパリン又は高分子ヘパラン硫酸は、生体材料から抽出して得られるものであってもよく、化学合成によって製造されたヘパリン又はヘパラン硫酸及びそれらの類似物質であってもよい。【００３８】
原料となる高分子ヘパリン又は高分子ヘパラン硫酸を生体材料から抽出して得る場合は、ヒト組織を含む種々の哺乳動物組織（例えば、脾臓、肺臓、筋肉等）から得ることができるが、一般にはブタやヒツジの腸粘膜又はウシの肺起源のものが用いられる。好ましいヘパリン供給源は、ブタの腸粘膜である。一般にヘパリンは、材料となる組織を自己分解させ、該組織をアルカリで抽出し、次いで蛋白を凝固させ、次いで酸化により上清からヘパリン−蛋白コンプレックスを沈澱させることによって選択した組織供給源から製造される。該コンプレックスはエタノールやアセトンもしくはその混合物のような極性非水性溶媒を用いて再沈澱させることによって回収され、エタノールのような有機溶媒で抽出して脂肪を除去し、例えばトリプシンのような蛋白分解酵素で処理して蛋白を除去する。ヘパリンを調製する方法は、例えば第１４改正日本薬局方解説書、Ｃｈａｒｌｅｓ，Ａ．Ｆ．らの論文（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９３６年，第３０巻，ｐ．１９２７−１９３３）に記載されており、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｈｅｐａｒｉｎ（１９８１年）（Ｌｕｎｄｂｌａｄ，Ｒ．Ｌ．ら編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｏｒｔｈ  Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）中に開示されているような基本的方法を改良したものが知られている。一般には、ヘパリンを抗血液凝固剤として製造するための通常の方法で組織から得ることができる（非特許文献７）。【００３９】
上記のように、生体材料から抽出して得られる高分子ヘパリン又は高分子ヘパラン硫酸は、ウロン酸（ＩｄｏＡ又はＧｌｃＡ）とグルコサミンからなる二糖を構成単位として、該二糖の繰り返しからなる多糖である。ＧｌｃＡとＩｄｏＡはヘパリン及びヘパラン硫酸のいずれにも存在する。ヘパリンでは、ウロン酸としてＩｄｏＡが多く含まれ、ヘパラン硫酸ではＧｌｃＡが多い。ＧｌｃＡとＩｄｏＡが混在するのは、一部のＧｌｃＡ残基の５炭素がエピマー化し、ＩｄｏＡに変換されるためである。ヘパラン硫酸がよりヘパリン様になるにつれてＩｄｏＡ／ＧｌｃＡ比は上昇する。【００４０】
また、原料となる高分子ヘパリン又は高分子ヘパラン硫酸は化学的に合成されたヘパリン又はヘパラン硫酸類似物質でもよく、この場合は上記のような天然の組成ではないことがあるが、一般にヘパリン又はヘパラン硫酸類似物質と称されるものは本発明のＨＧＦ産生促進薬剤に使用されるオリゴ糖又はその塩の原料として用いることができる。
また、本発明では、分子量が３０００−６０００の低分子ヘパリン又は低分子ヘパラン硫酸を原料とすることもできる。分子量が３０００−６０００の低分子ヘパリンは、第Ｘａ因子抑制作用が強い一方、抗トロンビン作用は弱く、出血リスクの少ない低分子ヘパリンとして臨床に応用されている．分子量が３０００−６０００の低分子ヘパリンは、血小板凝集作用は弱く、またＬＰＬ等を血管壁から遊離させる作用も弱く、皮下注射での吸収もよい等の点から近年利用が進んでいる。本発明のＨＧＦ産生促進薬剤に使用されるオリゴ糖又はその塩は、分子量が３０００−６０００の低分子のヘパリン又は低分子ヘパラン硫酸よりもさらに低分子でもよく、従来一般に低分子ヘパリン又は低分子ヘパラン硫酸と呼ばれているものであっても、本発明のＨＧＦ産生促進薬剤に使用されるオリゴ糖又はその塩の原料とすることができる。【００４１】
高分子ヘパリン又は高分子ヘパラン硫酸あるいは分子量が３０００−６０００の低分子ヘパリンを断片化する方法としては、酵素的にグリコシド結合を分解するか又は化学的に分解する方法が挙げられる。酵素的に分解する場合は、ヘパリナーゼ又はヘパリチナーゼ等の酵素が用いられ、例えばヘパリチナーゼＩ、ヘパリチナーゼＩＩ、及びヘパリナーゼ等のヘパリン骨格を低分子化するヘパリン分解酵素を用いて高分子ヘパリン又は高分子ヘパラン硫酸を分解する方法で調製することができる。通常は、消化前の高分子ヘパリン又は高分子ヘパラン硫酸１００ｍｇに対して約０．０２〜２．０Ｕ、好ましくは約０．１〜１．０Ｕの酵素を用いて約２０〜４５℃、好ましくは約３０〜４０℃で３時間以上、好ましくは６時間以上、より好ましくは約８〜１２時間反応させることで調製することができるが、上記条件に限定はされず条件は適宜選択することが可能である。化学的に分解する場合は、例えば亜硝酸分解法、過酸化水素分解法、β脱離法等の公知の方法が用いられる（非特許文献７）。【００４２】
断片化された高分子ヘパリン又は高分子ヘパラン硫酸の混合物から、本発明で使用されるオリゴ糖又はその塩を取得、精製するためには、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等を単独又は組み合わせて行うことができる。例えばゲル濾過クロマトグラフィーに、例えばアマシャムバイオサイエンス社製のＳｕｐｅｒｄｅｘ３０ｐｇカラム（カラム１．６ｃｍ×６０ｃｍ、流速０．４ｍＬ／分）を用いる場合には、１６糖画分は約１３５〜１３８分、１４糖画分は約１４０〜１４４分、１２糖画分は約１４６〜１５１分、１０糖画分は約１５４〜１６１分、８糖画分は約１６３〜１７２分、６糖画分は約１７５〜１８８分、４糖画分は約１９０〜２０９分、２糖画分は約２１６〜２４９分で溶出されうる。例えば上記の分画によって得られたオリゴ糖をイオン交換クロマトグラフィー等によりさらに分離することで均一構造の物質からなる画分を得ることが可能である。イオン交換クロマトグラフィーを用いる場合は、溶液中の塩濃度が高くなることが多いため、得られた画分を常法により脱塩することが好ましい。
なお、精製のプロセス中にアンチトロンビンＩＩＩを固定化したカラム等の工程を組み込むと、該カラムに非吸着の画分を回収することにより、Ｘａ因子抑制活性を有する画分が除去された画分を得ることができ、抗血液凝固活性が完全に除去されたオリゴ糖を調製することができるのでより好ましい。アンチトロンビンＩＩＩ非吸着のオリゴ糖であってもＨＧＦ産生促進は保持されているため、本発明に適用できる。
また、上記方法により、得られたオリゴ糖を自体公知の方法に従い、硫酸化、アルキル化、アシル化又はアミノ化することもできる。【００４３】
本発明のＨＧＦ産生促進薬剤に使用されるオリゴ糖又はその塩は、化学合成によって人工的に合成してもよい。例えば、ＩｄｏＡ又はＧｌｃＡあるいはそれらの誘導体と、グルコサミンあるいはその誘導体等から単位２糖を合成し、これを重合させて合成することができる（Ｋａｒｓｔ，Ｎ．Ａ．ａｎｄ  Ｌｉｎｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｊ．，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００３年，第１０巻，ｐ．１９９３−２０３１、Ｌｅｅ，Ｊ．Ｃ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００４年，第１２６巻，ｐ．４７６−７）。あるいは、酵素反応を組み合わせたｃｈｅｍｏｅｎｚｙｍａｔｉｃな合成を行ってもよい（Ｋｕｂｅｒａｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３年，第２７８巻，ｐ．５２６１３−２１）。このような化学合成やｃｈｅｍｏｅｎｚｙｍａｔｉｃな合成は、特にグルコサミン残基の６位のヒドロキシル基又はグルコサミン残基の２位のアミノ基を選択的に硫酸化する上で有効である。【００４４】
また、本発明のＨＧＦ産生活性促進薬剤は、上記のようにして得られるオリゴ糖に限られない。ウロン酸残基とグルコサミン残基とがα１，４−グリコシド結合又はβ１，４−グリコシド結合によって交互に結合した構造を有する１７糖以上の糖鎖化合物であって、該糖鎖化合物中、少なくとも１つのグルコサミン残基の６位のヒドロキシル基が硫酸化されているか、或いは少なくとも１つのグルコサミン残基の２位のアミノ基が硫酸化されており、他のヒドロキシル基やアミノ基が硫酸化されていない糖鎖化合物は、ＨＧＦ産生促進活性を保持している一方で、抗血液凝固作用及びＬＰＬ放出活性はヘパリンに比べて低下していることから、本発明のＨＧＦ産生活性促進薬剤に使用できる。そのような糖鎖化合物は上記のヘパリン又はヘパラン硫酸を例えば化学的に修飾することによって調製することができる。
１７糖以上の糖鎖化合物の糖鎖としては、通常５００糖以下、好ましくは３００糖以下、より好ましくは２００糖以下である。
１７糖以上の糖鎖化合物の塩としては、上記オリゴ糖の塩として例示したものが挙げられる。【００４５】
本発明のＨＧＦ産生促進薬剤によるＨＧＦ産生促進活性の測定は、上記オリゴ糖等の糖鎖化合物又はその塩をＨＧＦ産生細胞に添加して培養した場合と、上記オリゴ糖等の糖鎖化合物又はその塩を加えないで培養した培養液中のＨＧＦ濃度をＥＬＩＳＡ法で測定し、それらの値を比較することで判定できる。ＨＧＦ産生細胞としては、ヒト胎児肺線維芽細胞であるＭＲＣ−５やＭＲＣ−９等の細胞株を用いることができる。【００４６】
本発明のＨＧＦ産生促進薬剤に使用されるオリゴ糖等の糖鎖化合物又はその塩における抗血液凝固作用は、従来の低分子ヘパリンの抗血液凝固活性を測定するために実施されている方法に従って、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）あるいは抗Ｘａ活性を測定することで評価できる。
本発明のＨＧＦ産生促進薬剤に使用されるオリゴ糖等の糖鎖化合物又はその塩におけるＬＰＬ放出活性は上記オリゴ糖等の糖鎖化合物又はその塩をマウス又はラット等に投与して一定時間後に血漿を採取し、該血漿中のＬＰＬ量を測定することで評価できる。血漿中のＬＰＬ量の測定は、ＬＰＬ活性を測定するか、又はＥＬＩＳＡによってＬＰＬタンパク質量として測定することができる。【００４７】
本発明のＨＧＦ産生促進薬剤は、ＨＧＦの産生を促進することから、ＨＧＦの薬理作用を介して、各種疾患の予防・治療に有効である。本発明のＨＧＦ産生促進薬剤は、例えば、肝疾患治療剤、腎疾患治療剤、創傷治療剤、皮膚潰瘍治療剤、毛根細胞増殖剤、制ガン剤、肺傷害治療剤、ガン療法用副作用防止剤等の用途を有し、より具体的には、例えば、肝疾患（例えば、肝炎、肝硬変、肝不全、外科手術後の肝再生等）、腎疾患（例えば、糸球体腎炎、腎不全、腎性貧血症、糖尿病性腎症、薬剤投与後の腎傷害等）、皮膚疾患（例えば、白斑病、熱傷、床擦れ、皮膚潰瘍、禿頭症等）、血液疾患（例えば、血小板減少症、骨髄移植等）、眼疾患（例えば、角膜潰瘍等）、肺疾患（例えば、肺炎、肺気腫、肺結核、慢性閉塞性肺疾患、塵肺、肺線維症等）、胃十二指腸疾患（例えば、胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍等）、癌疾患及びその関連疾患（例えば、各種癌、癌療法による副作用、例えば肝毒性、腎毒性、悪心、嘔吐、血小板減少、脱毛等の予防等）、骨疾患（例えば、骨粗鬆症、骨異形成症、変形性関節炎等）、中枢疾患（例えば、神経分化異常症等）などの疾患の予防・治療に有用である。【００４８】
本発明のＨＧＦ産生促進薬剤は種々の製剤形態（例えば、注射剤、固形剤、カプセル剤等）をとりうるが、上記オリゴ糖等の糖鎖化合物又はその塩又は慣用の担体と共に注射剤とされるのが好ましい。当該注射剤は常法により調製することができ、注射剤中の上記オリゴ糖等の糖鎖化合物又はその塩の濃度は、０．０００１〜５Ｗ／Ｖ％程度の範囲から適宜調整される。注射剤は、例えば、上記のオリゴ糖等の糖鎖化合物又はその塩を適切な溶剤（例えば、滅菌水、緩衝液、生理食塩水等）に溶解した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。慣用の担体としては、好ましくは安定化剤が挙げられる。安定化剤としては、例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、マンニトール、グルコース、デキストラン、エチレングリコール等が挙げられる。さらに、製剤化に必要な医薬上許容される添加剤、例えば等張化剤（塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコール等）、緩衝剤（リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、イプシロンアミノカプロン酸緩衝液等）、保存剤（パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等）、増粘剤（ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等）、安定化剤（亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等）、ｐＨ調整剤（塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等）などを適宜添加した溶液に、上記オリゴ糖等の糖鎖化合物又はその塩を溶解した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。また適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン界面活性剤（ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０等）などを使用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプル又はバイアルに充填される。なお、注射剤等の液状製剤は、凍結保存又は凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水等を加え、再溶解して使用される。【００４９】
また、本発明のＨＧＦ産生促進薬剤は、外用剤、例えば軟膏状、ゲル状、液状等に製剤化される。外用剤は、例えば軟膏基剤（吸水軟膏、浸水軟膏、マクロゴール、精製ラノリン等）にオリゴ糖等の糖鎖化合物又はその塩を練合して調製される。また、硬化剤（セタノール、ステアリルアルコール等）や、ゲル状とする場合には、増粘剤（カルメロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポピドン等）などを使用することができる。外用剤中の有効成分含量は、外用薬の適用疾患、適用部位等に応じて０．０００１〜５Ｗ／Ｗ％程度の範囲から適宜調整することができる。
本発明のＨＧＦ産生促進薬剤は、該製剤の形態に応じた適当な投与経路により哺乳動物（例えば、ヒト、イヌ、ラット、マウス、ウサギ等）に投与され得る。例えば、注射剤の形態にして静脈、動脈、皮下、筋肉内等に投与することができる。その投与量は、患者の症状、年齢、体重等により適宜調整される。その投与量は、患者の症状、年齢、体重等により適宜調整されるが、通常０．００１ｍｇ〜５００ｍｇ、好ましくは０．０１ｍｇ〜１００ｍｇであり、これを１日１回ないし数回に分けて投与するのが適当である。【００５０】
本発明のＨＧＦ産生促進薬剤は、上記オリゴ糖等の糖鎖化合物又はその塩とＨＧＦの混合製剤であってもよい。ＨＧＦをヘパリン又はヘパラン硫酸との複合体として生体に投与すると、ＨＧＦの血中半減期が延長されることが知られている（Ｋａｔｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１９９４年，第２０巻，ｐ．４１７−４２４）ことから、上記オリゴ糖等の糖鎖化合物又はその塩とＨＧＦを混合製剤とすることにより、製剤中に含まれるＨＧＦの血中半減期が延長される。この場合、オリゴ糖等の糖鎖化合物又はその塩とＨＧＦの配合比は、ＨＧＦ１質量に対し、通常０．００００２〜５００００（Ｗ／Ｗ）、好ましくは０．０１〜５００（Ｗ／Ｗ）である。この際、製剤中のオリゴ糖等の糖鎖化合物又はその塩は、同時に生体中の内在性ＨＧＦの産生を促進するので、ＨＧＦの作用を介した疾患治療・予防においてより効果的である。同様の理由から、本発明のＨＧＦ産生促進薬剤を生体に投与する際、別の製剤として同時にＨＧＦを投与することも可能である。【００５１】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
なお、実施例で使用する各略号の意味は、次のとおりである。
ＨＧＦ：肝細胞増殖因子
ＦＣＳ：牛胎児血清
ＤＭＥＭ培地：ダルベッコ改変イーグル培地
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水
ＥＬＩＳＡ：エンザイム−リンクド・イムノソルベント・アッセイ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ：Ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−Ｔｉｍｅ  ｏｆ  ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  
ＬＰＬ：リポプロテインリパーゼ
ＡＰＴＴ：活性化部分トロンボプラスチン時間
ＵＡ：ウロン酸残基
ＧｌｃＮ：グルコサミン残基
Ａｃ：アセチル
Ａｒｇ：アルギニン
Ｇｌｙ：グリシン
Ｓａｃ：糖
２Ｓ：２−ｏ−硫酸
６Ｓ：６−ｏ−硫酸
ＮＳ：Ｎ−硫酸
【実施例１】
【００５２】
高分子のヘパリンＮａ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）１００ｍｇを５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（３ｍＭ酢酸カルシウムを含む）（ｐＨ７．０）２ｍＬに溶解し、ヘパリナーゼ（生化学工業）を０．５ｕｎｉｔ添加して３７℃で１０時間反応させた。反応液を１００℃で２分間加熱して反応を停止させた。反応液上清の０．３ｍＬをＳｕｐｅｒｄｅｘ  ３０ｐｇカラム（φ１．６ｃｍ×６０ｃｍ）（アマシャムバイオサイエンス）に供してゲル濾過クロマトグラフィーを行った。移動相に２００ｍＭ  重炭酸アンモニウム水溶液を用い、０．４ｍＬ／ｍｉｎの流速で通液した。溶出液の２３０ｎｍにおける吸光度をモニターし、フラクション（画分）を分画した。溶出されたヘパリン断片を分子サイズごとに回収した。ヘパリン断片は２糖、４糖、６糖、８糖、１０糖、１２糖、１４糖、１６糖のオリゴ糖分画画分として得られた（図１）。
【実施例２】
【００５３】
実施例１で得られたヘパリン断片（オリゴ糖）を用いてＨＧＦ産生促進活性を測定した。活性測定のためには、ヒト胎児肺線維芽細胞であるＭＲＣ−９細胞を用い、ヘパリン断片（オリゴ糖）添加時の該細胞のＨＧＦ産生量を比較した。まず、ＭＲＣ−９細胞を５×１０４個／ｃｍ２の密度で４８ｗｅｌｌプレートに播種し、１０Ｖ／Ｖ％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で１日培養した。次に、該細胞の培地を吸引除去し、ＰＢＳ０．５ｍＬで２回洗浄した後培地を、１０Ｖ／Ｖ％ＣＳを含むＤＭＥＭ培地に交換して培養を継続した。この際、培地中に実施例１で得られたヘパリン断片を１μｇ／ｍｌとなるように添加した。２４時間後に培養上清を回収し、培養上清中に分泌されたＨＧＦ量を測定した。ＨＧＦの定量はＥＬＩＳＡ法にて行った。市販の低分子ヘパリン（フラグミン、キッセイ薬品工業株式会社製）を添加した場合、ＨＧＦ産生量は高分子のヘパリン（未分画ヘパリンと呼ぶ）を添加した場合と同等であり、ヘパリン無添加の場合の５倍程度にＨＧＦ産生を促進した。実施例１で調製した１６糖以下のサイズのヘパリン断片においても、６糖以上のサイズのヘパリン断片においてＨＧＦ産生量はヘパリン無添加の場合に比べて上昇していた（図２）。
【実施例３】
【００５４】
実施例１で得られたヘパリン断片の１０糖画分（以下、ヘパリン１０糖断片という。）を凍結乾燥した後、Ｈ２Ｏに溶解した。これをＭｉｎｉＱ４．５／５０カラム（アマシャムバイオサイエンス）に供して陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを行い、ヘパリン１０糖断片をさらに分離した。溶離液にはＮａＣｌ水溶液（流速  ０．５ｍｌ／ｍｉｎ）を用い、ＮａＣｌ濃度を０Ｍから１Ｍまで直線的に上昇させ、リニアグラジエント溶出法によってヘパリン１０糖断片を分離した。このとき、溶出液の２３０ｎｍにおける吸光度をモニターし、フラクション（画分）を分画した（図３）。ヘパリン１０糖断片は多数のピークとして分離されたが、これは硫酸基の数と配置のバリエーションによるものと考えられた。ピークごとに回収し、画分１から３８とした。それぞれの画分について実施例２と同様にＨＧＦ産生促進活性を測定した（図４）。その結果、ＨＧＦ産生促進活性はほとんどの画分で認められた。このことから、ＨＧＦ産生促進活性を発揮する上でヘパリン１０糖断片中の何らかの特定の構造が必須の機能を果たしているとは考えにくく、ウロン酸とグルコサミンの繰り返しからなるヘパリン１０糖断片の基本構造に硫酸基が適度に配置されていればよいと考えられた。しかしながら、後半の画分（画分Ｎｏ．２４〜３６）ほどＨＧＦ産生促進活性が高い傾向にあることから、硫酸基の数は多い方が、ＨＧＦ産生促進活性が高いと考えられた。【００５５】
画分Ｎｏ．２４、２６、２８、３１、３３に含まれるヘパリン１０糖断片について硫酸基の数を求めるため、質量分析装置（ＵｌｒｔａＦｌｅｘ；ブルカー社）を用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ分析を行った。各画分は透析膜（分画分子量１０００）を用いた透析によって脱塩を行った後、凍結乾燥し、Ｈ２Ｏに溶解してサンプルとした。ヘパリン断片の硫酸基による陰性荷電を中和するため、塩基性ペプチド（Ａｒｇ−Ｇｌｙ）１９Ａｒｇ（［Ｍ（質量）＋Ｈ］＋＝４２２６．８（理論値））をサンプルに混合し、カフェイン酸をマトリクスに用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ解析を行った（図５）。この解析法では、ヘパリン断片は（Ａｒｇ−Ｇｌｙ）１９Ａｒｇとのコンプレックスとして検出されるので、検出されるｍ／ｚ（質量／電荷）値から（Ａｒｇ−Ｇｌｙ）１９Ａｒｇの分子量を差し引くことによりヘパリン断片の分子量が算出される。いずれの画分においても複数のｍ／ｚシグナルが検出され、複数の成分が混在していることが判明した。画分Ｎｏ．が２４から３３と後になるほど、ｍ／ｚシグナルのパターンが高分子側にシフトしており、後のフラクションほど硫酸基の数が多いことが確認された。分子量から推定される画分Ｎｏ．２４から３３の組成を表１に示した。【００５６】
【表１】
2005092348.tif 000018
【実施例４】
【００５７】
硫酸基の位置の異なる２糖化合物、２−Ｓａｃ−２Ｓ（Ｈｅｐａｒｉｎ  ｄｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ＩＩＩ−Ｈ；Ｓｉｇｍａ社製）、２−Ｓａｃ−６Ｓ（△ＤｉＨＳ−６Ｓ；生化学工業株式会社製）、２−Ｓａｃ−ＮＳ（△ＤｉＨＳ−ＮＳ；生化学工業株式会社製）（表２）について、ＨＧＦ産生促進活性を測定した（図６）。実施例２と同様にしてＭＲＣ−９細胞を用いてＨＧＦ産生促進活性を測定した。この際、２糖化合物の添加濃度を０〜５０μｇ／ｍｌの間で変化させた。硫酸基の位置によってＨＧＦ産生促進効果が異なり、また、ＨＧＦ産生促進活性を示すためには、未分画ヘパリンに比べると高い濃度で添加する必要があるが、これらの２糖化合物のいずれにおいてもＨＧＦ産生が促進されることが見出された。２−Ｓａｃ−６Ｓと２−Ｓａｃ−ＮＳのＨＧＦ産生促進活性は２−Ｓａｃ−２Ｓよりも高く、グルコサミン残基の６位のヒドロキシル基の硫酸化、又はグルコサミン残基の２位のアミノ基の硫酸化はＨＧＦ産生促進活性を発揮する上で重要であることが見出された。【００５８】
【表２】
2005092348.tif 000019
【実施例５】
【００５９】
実施例１で得られたヘパリン断片（オリゴ糖）について、分子サイズごとに抗血液凝固活性とＬＰＬ放出活性を測定した。抗血液凝固活性は活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を比較することで評価した。ＡＰＴＴの測定には、ウィスターラット（雄）から採取した新鮮血漿を用い、エラジン酸による活性化を利用したデータファイ・ＡＰＴＴキット（シスメックス社）を用いた。ラット血漿にヘパリン断片を９μｇ／ｍＬ又は３μｇ／ｍＬとなるように添加し、ＡＰＴＴの値（秒）を比較した。
ＡＰＴＴの測定結果を図７に示す。ヘパリンの代わりに生理食塩水を添加した場合、ＡＰＴＴは約２０秒であり、血液は急速に凝固した。血液に未消化の高分子ヘパリン（未分画ヘパリン）を９μｇ／ｍＬの濃度で加えると、ＡＰＴＴが２００秒以上に延長され、血液凝固が阻止された。未分画ヘパリンを３μｇ／ｍＬの濃度で添加しても、ＡＰＴＴの延長は１６０秒以上であり、血液凝固阻害が見られた。市販の低分子ヘパリン（フラグミン、キッセイ薬品工業株式会社製）では、未分画ヘパリンよりもＡＰＴＴの延長は抑制されたが、ＡＰＴＴの延長は無視できないレベルであった。実施例１の１６糖ヘパリン断片を９μｇ／ｍＬの濃度で加えた場合では、ＡＰＴＴは約４６秒であり、ヘパリン無添加の場合よりＡＰＴＴが延長されたものの、ＡＰＴＴの延長の程度はフラグミンよりも短く、抗血液凝固活性は大幅に低下した。さらに、分子サイズが低下するほどＡＰＴＴが短縮され、４糖以下では９μｇ／ｍＬ又は３μｇ／ｍＬのいずれの添加濃度においても生理食塩水添加の場合のＡＰＴＴと同等であった。【００６０】
ＬＰＬ放出活性の測定のためには、ウィスターラット（３週齢、雄）の尾静脈からヘパリン断片をラットの体重１ｇあたり０．３μｇ投与し、１０分後に腋下静脈巣から採血を行って得られる血漿中のＬＰＬ量をＥＬＩＳＡ（第一化学薬品株式会社製）によって測定した。ＬＰＬ放出量の測定結果を図８に示す。未分画ヘパリンでは２５０ｎｇ／ｍＬ程度のＬＰＬが放出されたが、低分子ヘパリン（フラグミン、キッセイ薬品工業株式会社製）ではＬＰＬ放出量が高分子ヘパリンの場合の３０％程度に低下していた。また実施例１で調製したヘパリン断片でもＬＰＬ放出量が低下しており、分子サイズが低下するほどＬＰＬ放出量は低下していた。特に８糖以下ではＬＰＬ放出量の低下が顕著であった。
【実施例６】
【００６１】
実施例１で調製したヘパリン断片の１０糖画分について、抗ファクターＸａ活性と抗ファクターＩＩａ活性を測定し、抗血液凝固活性をさらに詳細に検討した。
抗ファクターＸａ活性測定のためには、サンプル（２２．５μＬ）に２．５μＬのアンチトロンビンＩＩＩ（２．５Ｕ）を加え、３７℃にて３分間インキュベートした後、血液凝固因子であるファクターＸａ（７．１ｎｋａｔ Ｓ−２２２２／ｍＬ）を１２．５μＬ加えた。これにファクターＸａの基質となるＳ−２２２２（第一化学薬品株式会社製）（０．７５ｍｇ／ｍＬ）を２．５μＬ加え、３７℃で３分間反応させた。その後、５０Ｖ／Ｖ％酢酸水溶液を３７．５μＬ添加して反応を停止し、発色量を４０５ｎｍの吸光度で測定した。この発色は、ファクターＸａの反応によってＳ−２２２２から遊離したｐ−ニトロアニリンによるものである。サンプル中に抗ファクターＸａ活性を有する物質が含まれている場合の発色量は、サンプル中にファクターＸａ活性を有する物質が含まれていない場合の発色量に比べて低下する。すなわち、この発色低下量ΔＡ４０５はサンプル中の抗ファクターＸａ活性を反映する。低分子ヘパリン標準品（国立医薬品食品衛生研究所、抗ファクターＸａ活性１７５Ｕ／ｍｇ、抗ファクターＩＩａ活性６９／ｍｇ）を用いて抗ファクターＸａ活性とΔＡ４０５の検量線を作製し、これをもとに非検サンプルの抗ファクターＸａ活性を求めた。抗ファクターＩＩａ活性の測定は、Ｓ−２２２２、ファクターＸａ及び５０Ｖ／Ｖ％酢酸の代わりにそれぞれＳ−２２３８（第一化学薬品株式会社製）（０．６２５ｍｇ／ｍＬ）、血液凝固因子であるファクターＩＩａ（０．４Ｕ／ｍＬ）及び０．０１Ｍクエン酸を用いて同様に行った。
抗ファクターＸａ活性と抗ファクターＩＩａ活性の測定結果を表３に示した。市販の低分子ヘパリンであるフラグミンの抗ファクターＸａ活性とファクター抗ＩＩａ活性は、それぞれ未分画ヘパリンの７５％、３２％に低下していた。一方、ヘパリン１０糖断片の抗ファクターＸａ活性と抗ファクターＩＩａ活性は、それぞれ未分画ヘパリンの１２％、４％と著しく低下していた。【００６２】
【表３】
2005092348.tif 000020
【実施例７】
【００６３】
実施例４に記載の硫酸基の位置の異なる２糖化合物、２−Ｓａｃ−２Ｓ（Ｓｉｇｍａ社製）、２−Ｓａｃ−６Ｓ（生化学工業株式会社製）、２−Ｓａｃ−ＮＳ（生化学工業株式会社製）について、実施例５と同様の方法で抗血液凝固活性とＬＰＬ放出活性を測定した（図９、図１０）。いずれの２糖化合物においても、抗血液凝固活性とＬＰＬ放出活性は検出されなかった。
【実施例８】
【００６４】
グルコサミンの２位のアミノ基のみが硫酸化（Ｎ-硫酸化のみ）されている修飾ヘパリン（ＣＤＳＮＳ−Ｈｅｐａｒｉｎ；生化学工業株式会社製）について、実施例２と同様にしてＭＲＣ−９細胞を用いてＨＧＦ産生促進活性を測定した（図１１）。この際、グルコサミンの２位のアミノ基のみが硫酸化されている修飾ヘパリンの添加濃度を０〜５０μｇ／ｍｌの間で変化させた。グルコサミンの２位のアミノ基のみが硫酸化されている修飾ヘパリンは、通常の未分画ヘパリンに比べるとＨＧＦ産生が少し弱いが、最大活性は通常の未分画ヘパリンと同等であった。また、グルコサミンの２位のアミノ基のみが硫酸化されている修飾ヘパリンの抗血液凝固活性を調べるため、実施例５と同様の方法でＡＰＴＴを測定した（図１２）。グルコサミンの２位のアミノ基のみが硫酸化されている修飾ヘパリンではＡＰＴＴの延長は認められず、抗血液凝固活性は検出されなかった。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明のＨＧＦ産生促進薬剤は、出血傾向の副作用を抑制しながらＨＧＦの産生を促進することができ、生体の組織、器官等の傷害の治癒促進に有用である。
【図１】
2005092348.tif 000045
【図２】
2005092348.tif 000046
【図３】
2005092348.tif 000047
【図４】
2005092348.tif 000048
【図５】
2005092348.tif 000049
【図６】
2005092348.tif 000050
【図７】
2005092348.tif 000051
【図８】
2005092348.tif 000052
【図９】
2005092348.tif 000053
【図１０】
2005092348.tif 000054
【図１１】
2005092348.tif 000055
【図１２】
2005092348.tif 000056
【国際調査報告】
2005092348.tif 000057
2005092348.tif 000058
2005092348.tif 000059
2005092348.tif 000060
2005092348.tif 000061
2005092348.tif 000062
2005092348.tif 000063
2005092348.tif 000064