(57)【要約】  本発明は、全体として、粘液および上皮細胞に対する細菌の付着の検出、特定、測定を行う方法に関する。特に、本発明は、細菌が存在する可能性のある動物の粘液、上皮細胞（例えば、腸に存在する）、または他の部分に対する細菌の付着の有無を、検出および特定するためのアッセイ、並びに、細菌が存在する可能性のある動物の粘液、上皮細胞、または他の部分に対する細菌の付着を調節する因子（例えば、調節する因子の有効性）を特定および特性付ける方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
粘液および／または上皮細胞への細菌の付着および非付着を評価するための、非放射性の固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）を包含するキットであって、
粘液および／または上皮細胞でコーティングされている固相の支持体と、
細菌を含むサンプルと、
上記細菌に対して特異的な一次抗体と、
上記細菌へ結合した上記一次抗体に対して特異的な、検出可能に標識されている二次抗体と、を備えていることを特徴とするキット。
【請求項２】
さらに、上記検出可能に標識されている二次抗体を視覚化するための基質を備えていることを特徴とする請求項１に記載のキット。
【請求項３】
上記検出可能に標識されている二次抗体は、酵素標識を含むことを特徴とする請求項２に記載のキット。
【請求項４】
上記基質は、上記酵素標識の存在下で、比色シグナル、蛍光シグナル、または化学発光シグナルを発する組成物であることを特徴とする請求項３に記載のキット。
【請求項５】
上記検出可能に標識されている二次抗体は、ペルオキシダーゼに結合されているブタ抗ＩｇＧイムノグロブリンを含むことを特徴とする請求項１に記載のキット。
【請求項６】
上記比色組成物は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンであることを特徴とする請求項４に記載のキット。
【請求項７】
上記固相の支持体は、９６ウェルプレートであることを特徴とする請求項１に記載のキット。
【請求項８】
上記細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌であることを特徴とする請求項１に記載のキット。
【請求項９】
上記粘液は、ブタ近位側回腸粘液、ブタ遠位結腸粘液、ブロイラー十二指腸粘液、およびブロイラー盲腸粘液からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のキット。
【請求項１０】
上記一次抗体は、Ｅ．ｃｏｌｉのＯ抗原血清型およびＫ抗原血清型に対して特異的な、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が結合したポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項１に記載のキット。
【請求項１１】
上記一次抗体は、Ｅ．ｃｏｌｉのＯ抗原血清型およびＫ抗原血清型に対して特異的な、ポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項１に記載のキット。
【請求項１２】
上記二次抗体は、アフィニティー精製されたウサギ抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰであることを特徴とする請求項１に記載のキット。
【請求項１３】
上記二次抗体は、アフィニティー精製されたウサギ抗ヤギＩｇＧ−ＡＰであることを特徴とする請求項１に記載のキット。
【請求項１４】
上記二次抗体は、ＦＩＴＣが結合した、ポリクローナルな抗ヤギＩｇＧ抗体であることを特徴とする請求項１に記載のキット。
【請求項１５】
上記二次抗体は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉに由来する、ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼであることを特徴とする請求項１に記載のキット。
【請求項１６】
上記二次抗体は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉに由来する、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼであることを特徴とする請求項１に記載のキット。
【請求項１７】
細菌と、粘液および／または上皮細胞との間の付着および非付着を測定するための方法であって、以下のａ）およびｂ）を含むことを特徴とする方法：
ａ）以下のｉ）およびｉｉ）を準備する工程、
ｉ）細菌を含むサンプル、
ｉｉ）粘液および／もしくは上皮細胞、または他の細胞、
および、
ｂ）上記細菌と、上記粘液および／または上皮細胞との間の付着および非付着を測定できる条件下で、非放射性の比色アッセイの中で、上記細菌を含むサンプルと、上記粘液および／または上皮細胞とを混ぜ合わせる工程。
【請求項１８】
上記非放射性の比色アッセイは、ＥＬＩＳＡアッセイであることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
上記条件は、粘液および／または上皮細胞へ結合した上記細菌に対して特異的な一次抗体を加えることを包含していることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
上記条件は、上記細菌へ結合した上記一次抗体に対して特異的な二次抗体であって、検出可能に標識されている二次抗体を加えることを包含していることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
上記条件は、上記一次抗体へ結合した上記検出可能に標識されている二次抗体を視覚化するための基質を加えることを包含していることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
上記粘液および／または上皮細胞は、マイクロタイタープレート上にコーティングされていることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
上記検出可能に標識されている二次抗体は、酵素標識を含むことを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
上記基質は、上記酵素標識の存在下で、比色シグナル、蛍光シグナル、または化学発光シグナルを発する組成物であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
上記検出可能に標識されている二次抗体は、ペルオキシダーゼに結合されているブタ抗ＩｇＧイムノグロブリンを含むことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
上記比色組成物は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンであることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
上記細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌であることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項２８】
上記粘液は、ブタ近位側回腸粘液、ブタ遠位結腸粘液、ブロイラー十二指腸粘液、およびブロイラー盲腸粘液からなる群から選択されることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項２９】
上記一次抗体は、Ｅ．ｃｏｌｉのＯ抗原血清型およびＫ抗原血清型に対して特異的な、ＨＲＰが結合したポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
上記一次抗体は、Ｅ．ｃｏｌｉのＯ抗原血清型およびＫ抗原血清型に対して特異的な、ポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
上記二次抗体は、アフィニティー精製されたウサギ抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰであることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
上記二次抗体は、アフィニティー精製されたウサギ抗ヤギＩｇＧ−ＡＰであることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
上記二次抗体は、ＦＩＴＣが結合した、ポリクローナルな抗ヤギＩｇＧ抗体であることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項３４】
上記二次抗体は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉに由来する、ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼであることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項３５】
上記二次抗体は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉに由来する、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼであることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項３６】
細菌と、粘液および／または上皮細胞との間の付着を調節する薬剤を同定するための方法であって、以下のａ）〜ｄ）を含むことを特徴とする方法：
ａ）以下のｉ）〜ｉｉｉ）を準備する工程、
ｉ）細菌を含むサンプル、
ｉｉ）粘液および／または上皮細胞、および、
ｉｉｉ）薬剤
並びに、
ｂ）上記細菌と、上記粘液および／または上皮細胞との間の付着を測定できる条件下で、非放射性の比色アッセイの中で、上記細菌を含むサンプルと、上記粘液および／または上皮細胞と、上記薬剤とを混ぜ合わせる工程、
ｃ）上記薬剤の存在下および非存在下で、上記細菌の付着を比較する工程、
並びに、
ｄ）上記薬剤の非存在下における、上記細菌と、上記粘液および／または上皮細胞との間の付着に比べて、上記測定された付着のレベルが高い場合または低い場合に、上記薬剤を、上記細菌と、上記粘液および／または上皮細胞との間の付着を調節する因子として同定する工程。
【請求項３７】
上記非放射性の比色アッセイは、ＥＬＩＳＡアッセイであることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
上記条件は、上記粘液および／または上皮細胞へ結合した上記細菌に対して特異的な一次抗体を加えることを包含していることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
上記条件は、上記細菌へ結合した上記一次抗体に対して特異的な二次抗体であって、検出可能に標識されている二次抗体を加えることを包含していることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
上記条件は、上記一次抗体へ結合した上記検出可能に標識されている二次抗体を視覚化するための基質を加えることを包含していることを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
上記粘液は、マイクロタイタープレート上にコーティングされていることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
上記検出可能に標識されている二次抗体は、酵素標識を含むことを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
上記基質は、上記酵素標識の存在下で、比色シグナル、蛍光シグナル、または化学発光シグナルを発する組成物であることを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
上記検出可能に標識されている二次抗体は、ペルオキシダーゼに結合されているブタ抗ＩｇＧイムノグロブリンを含むことを特徴とする請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
上記比色組成物は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンであることを特徴とする請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
上記細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌であることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項４７】
上記粘液および／または上皮細胞は、ブタ近位側回腸粘液、ブタ遠位結腸粘液、ブロイラー十二指腸粘液、およびブロイラー盲腸粘液からなる群から選択されることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項４８】
上記一次抗体は、Ｅ．ｃｏｌｉのＯ抗原血清型およびＫ抗原血清型に対して特異的な、ＨＲＰが結合したポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
【請求項４９】
上記一次抗体は、Ｅ．ｃｏｌｉのＯ抗原血清型およびＫ抗原血清型に対して特異的な、ポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
【請求項５０】
上記二次抗体は、アフィニティー精製されたウサギ抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰであることを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項５１】
上記二次抗体は、アフィニティー精製されたウサギ抗ヤギＩｇＧ−ＡＰであることを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項５２】
上記二次抗体は、ＦＩＴＣが結合した、ポリクローナルな抗ヤギＩｇＧ抗体であることを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項５３】
上記二次抗体は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉに由来する、ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼであることを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項５４】
上記二次抗体は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉに由来する、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼであることを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項５５】
上記薬剤は、天然に存在する分子、合成によって派生した分子、および組み換えによって派生した分子からなる群から選択されることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項５６】
薬剤を含む組成物であって、
上記薬剤は、粘液および／または上皮細胞に対する細菌の付着を調節する因子であり、
上記薬剤は、以下のａ）〜ｄ）を含む工程によって同定されることを特徴とする組成物：
ａ）以下のｉ）〜ｉｉｉ）を準備する工程、
ｉ）細菌を含むサンプル、
ｉｉ）粘液および／または上皮細胞、および、
ｉｉｉ）薬剤
並びに、
ｂ）上記細菌と、上記粘液および／または上皮細胞との間の付着を測定できる条件下で、非放射性の比色アッセイの中で、上記細菌を含むサンプルと、上記粘液および／または上皮細胞と、上記薬剤とを混ぜ合わせる工程、
ｃ）上記薬剤の存在下および非存在下で、上記細菌の付着を比較する工程、
並びに、
ｄ）上記薬剤の非存在下における、上記細菌と、上記粘液および／または上皮細胞との間の付着に比べて、上記測定された付着のレベルが高い場合または低い場合に、上記薬剤を、上記細菌と、上記粘液および／または上皮細胞との間の付着を調節する因子として同定する工程。
【請求項５７】
上記組成物は、家畜、動物、魚、および貝からなる群から選択される対象によって消費されるために作られる食品の中に含まれることを特徴とする請求項５６に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔関連出願との相互参照〕
本願は、米国特許仮出願第６１／２２３、７５５号（出願日２００９年７月８日）に基づいて優先権を主張し、当該特許仮出願の内容は全て参照によって本明細書中に引用されるものとする。
【０００２】
〔発明の分野〕
本発明は、全体として、粘液および上皮細胞に対する細菌の付着の検出、特定、測定を行う方法に関する。特に、本発明は、細菌が存在する可能性のある動物の粘液、上皮細胞（例えば、腸に存在する）、または他の部分に対する細菌の付着の有無を、検出および特定するためのアッセイ、並びに、細菌が存在する可能性のある動物の粘液、上皮細胞、または他の部分に対する細菌の付着を調節する因子（例えば、調節する因子の有効性）を特定および特性付ける方法を提供する。
【０００３】
〔発明の背景〕
小腸、気道、尿道、および生殖器官の上皮細胞は、比較的厚い粘液の層に覆われており、当該粘液は、ムチン、多くの小さな付随タンパク質、糖タンパク質、脂質、および糖脂質を含む。上記上皮細胞および粘液は、特定の細菌の接着タンパク質を認識する受容体を含む。上皮細胞への細菌の付着または密接な会合は、細菌の病原性と同様にコロニー形成にも寄与し得る。さらに、腸粘液および上皮に対する細菌の付着は、微生物フロラ（microbial flora）内の個々の安定性に重要であると考えられている。
【０００４】
〔発明の概要〕
本発明は、全体として、粘液および細胞（例えば、上皮細胞）に対する細菌の付着および非付着の検出、特定、測定を行う方法に関する。特に、本発明は、粘液（例えば、腸粘膜内層）および上皮細胞に対する細菌の付着を、検出および特定するためのアッセイ、並びに、粘液および上皮細胞に対する細菌の付着を調節する因子を特定するための方法を提供する。上記アッセイは、安定していて、輸送しやすく、保存しやすいだけでなく、非放射性であり、微生物学的に安全である。
【０００５】
従って、いくつかの実施形態では、本発明は、粘液および／または上皮細胞への細菌の付着のアッセイのための、非放射性の固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）を包含するキットを提供する。上記キットは、特定の構成要素に限定されるものではない。いくつかの実施形態では、上記キットは、粘液および／または上皮細胞でコーティングされている固相の支持体と、細菌を含むサンプルと、上記細菌に対して特異的な一次抗体と、上記細菌へ結合した上記一次抗体に対して特異的な、検出可能に標識されている二次抗体と、を備えている。いくつかの実施形態では、上記キットは、上記検出可能に標識されている二次抗体を視覚化するための基質を備えている。いくつかの実施形態では、上記検出可能に標識されている二次抗体は、酵素標識を含む。いくつかの実施形態では、上記基質は、上記酵素標識の存在下で、比色シグナル、蛍光シグナル、または化学発光シグナルを発する組成物である。いくつかの実施形態では、上記検出可能に標識されている二次抗体は、ペルオキシダーゼに結合されているブタ抗ＩｇＧイムノグロブリンを含む。いくつかの実施形態では、上記比色組成物は、３、３’、５、５’−テトラメチルベンジジンである。いくつかの実施形態では、上記固相の支持体は、９６ウェルプレートである。いくつかの実施形態では、上記細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌である。粘液の例としては、ブタ近位側回腸粘液、ブタ遠位結腸粘液、ブロイラー十二指腸粘液、およびブロイラー盲腸粘液が挙げられるが、上記の例に限定されるものではない。一次抗体の例としては、Ｅ．ｃｏｌｉのＯ抗原血清型およびＫ抗原血清型に対して特異的な、ＨＲＰが結合したポリクローナル抗体、Ｅ．ｃｏｌｉのＯ抗原血清型およびＫ抗原血清型に対して特異的なポリクローナル抗体が挙げられるが、上記の例に限定されるものではない。二次抗体の例としては、アフィニティー精製されたウサギ抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰ、アフィニティー精製されたウサギ抗ヤギＩｇＧ−ＡＰ、ＦＩＴＣが結合した、ポリクローナルな抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｈ＆Ｌ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉに由来する、ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉに由来する、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼが挙げられるが、上記の例に限定されるものではない。
【０００６】
ある実施形態では、本発明は、細菌と粘液との間の、および細菌と上皮細胞との間の付着および非付着を測定するための方法を提供する。上記方法は、細菌と粘液との間の、および細菌と上皮細胞との間の付着および非付着を測定するための特定の技術に限定されるものではない。いくつかの実施形態では、上記方法は、細菌を含むサンプル、および粘液を準備する工程、並びに、上記細菌と上記粘液との間の付着を測定できる条件下で、非放射性の比色アッセイの中で、上記細菌を含むサンプルと上記粘液とを混ぜ合わせる工程を含む。いくつかの実施形態では、上記非放射性の比色アッセイは、ＥＬＩＳＡアッセイである。いくつかの実施形態では、上記条件は、粘液、上皮細胞、または他の細胞へ結合した上記細菌に対して特異的な一次抗体を加えること、および、上記細菌へ結合した上記一次抗体に対して特異的な二次抗体であって、検出可能に標識されている二次抗体を加えることを包含している。いくつかの実施形態では、上記方法は、上記一次抗体へ結合した上記検出可能に標識されている二次抗体を視覚化するための基質を加える工程を包含している。いくつかの実施形態では、粘液がマイクロタイタープレート上にコーティングされている。いくつかの実施形態では、上記検出可能に標識されている二次抗体は、酵素標識を含む。いくつかの実施形態では、上記基質は、上記酵素標識の存在下で、比色シグナル、蛍光シグナル、または化学発光シグナルを発する組成物である。いくつかの実施形態では、上記検出可能に標識されている二次抗体は、ペルオキシダーゼに結合されているブタ抗ＩｇＧイムノグロブリンを含む。いくつかの実施形態では、上記比色組成物は、３、３’、５、５’−テトラメチルベンジジンである。いくつかの実施形態では、上記細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌である。上記方法は、特定の一次抗体、または二次抗体に限定されるものではない。いくつかの実施形態では、一次抗体の例として、Ｅ．ｃｏｌｉのＯ抗原血清型およびＫ抗原血清型に対して特異的な、ＨＲＰが結合したポリクローナル抗体、並びに、Ｅ．ｃｏｌｉのＯ抗原血清型およびＫ抗原血清型に対して特異的なポリクローナル抗体が挙げられるが、上記の例に限定されるものではない。二次抗体の例としては、アフィニティー精製されたウサギ抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰ、アフィニティー精製されたウサギ抗ヤギＩｇＧ−ＡＰ、ＦＩＴＣが結合した、ポリクローナルな抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｈ＆Ｌ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉに由来する、ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉに由来する、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼが挙げられるが、上記の例に限定されるものではない。
【０００７】
ある実施形態では、本発明は、細菌と粘液との間の付着を調節する薬剤を同定するための方法であって、細菌を含むサンプル、粘液、および薬剤を準備する工程、並びに、上記細菌と上記粘液との間の付着を測定できる条件下で、非放射性の比色アッセイの中で、上記細菌を含むサンプルと、上記粘液と、上記薬剤とを混ぜ合わせる工程を含む方法を提供する。上記方法は、さらに、上記薬剤の存在下および非存在下で、上記細菌の付着を比較する工程、並びに、上記薬剤の非存在下における、上記細菌と上記粘液との間の付着に比べて、上記測定された付着のレベルが高い場合または低い場合に、上記薬剤を、上記細菌と上記粘液との間の付着を調節する因子として同定する工程、を含む。いくつかの実施形態では、上記非放射性の比色アッセイは、ＥＬＩＳＡアッセイである。いくつかの実施形態では、上記条件は、上記粘液へ結合した上記細菌に対して特異的な一次抗体を加えることを包含している。いくつかの実施形態では、上記条件は、上記細菌へ結合した上記一次抗体に対して特異的な二次抗体であって、検出可能に標識されている二次抗体を加えることを包含している。いくつかの実施形態では、上記条件は、上記一次抗体へ結合した上記検出可能に標識されている二次抗体を視覚化するための基質を加えることを包含している。いくつかの実施形態では、粘液がマイクロタイタープレート上にコーティングされている。いくつかの実施形態では、上記検出可能に標識されている二次抗体は、酵素標識を含む。いくつかの実施形態では、上記基質は、上記酵素標識の存在下で、比色シグナル、蛍光シグナル、または化学発光シグナルを発する組成物である。いくつかの実施形態では、上記検出可能に標識されている二次抗体は、ペルオキシダーゼに結合されているブタ抗ＩｇＧイムノグロブリンを含む。いくつかの実施形態では、上記比色組成物は、３、３’、５、５’−テトラメチルベンジジンである。いくつかの実施形態では、上記細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌である。上記方法は、特定の一次抗体、または二次抗体に限定されるものではない。いくつかの実施形態では、一次抗体の例として、Ｅ．ｃｏｌｉのＯ抗原血清型およびＫ抗原血清型に対して特異的な、ＨＲＰが結合したポリクローナル抗体、Ｅ．ｃｏｌｉのＯ抗原血清型およびＫ抗原血清型に対して特異的なポリクローナル抗体が挙げられるが、上記の例に限定されるものではない。二次抗体の例としては、アフィニティー精製されたウサギ抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰ、アフィニティー精製されたウサギ抗ヤギＩｇＧ−ＡＰ、ＦＩＴＣが結合した、ポリクローナルな抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｈ＆Ｌ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉに由来する、ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉに由来する、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼが挙げられるが、上記の例に限定されるものではない。いくつかの実施形態では、上記薬剤は、天然に存在する分子、合成によって派生した分子、および組み替えによって派生した分子からなる群から選択される。
【０００８】
ある実施形態では、薬剤を含む組成物であって、上記薬剤は、粘液に対する細菌の付着を調節する因子であり、上記薬剤は、ｉ）細菌を含むサンプル、ｉｉ）粘液および／または上皮細胞、ｉｉｉ）薬剤、を準備する工程；上記細菌と上記粘液との間の付着を測定できる条件下で、非放射性の比色アッセイの中で、上記細菌を含むサンプルと、上記粘液と、上記薬剤とを混ぜ合わせる工程；上記薬剤の存在下および非存在下で、上記細菌の付着を比較する工程；並びに、上記薬剤の非存在下における、上記細菌と上記粘液との間の付着に比べて、上記測定された付着のレベルが高い場合または低い場合に、上記薬剤を、上記細菌と上記粘液との間の付着を調節する因子として同定する工程、を含む工程によって同定されることを特徴とする組成物を提供する。いくつかの実施形態では、上記組成物は、家畜、ペットとなる動物、魚、および貝からなる群から選択される対象によって消費されるために作られる食品の中に含まれる。
【０００９】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＬＩ８４およびＡＬＩ４４６の付着に対する、粘液濃度（ｍｇタンパク質／ｍｌ）の効果を示し、放射活性物質で標識されている細菌によって測定した。
【００１０】
図２は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＬＩ８４の付着に対する、一次抗体の効果を示し、放射活性物質で標識されている細菌を用いて、シンチレーションカウンターによって測定した。一次抗体：ＨＲＰ＝ＨＲＰが結合した抗Ｅ．ｃｏｌｉ抗体；ＢＰ２０２２＝非結合抗Ｅ．ｃｏｌｉ抗体、ビオチン＝ビオチンが結合した抗Ｅ．ｃｏｌｉ抗体。
【００１１】
図３は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＬＩ４４６の付着に対する、一次抗体の効果を示し、放射活性物質で標識した細菌を用いて、シンチレーションカウンターによって測定した。一次抗体：ＨＲＰ＝ＨＲＰが結合した抗Ｅ．ｃｏｌｉ抗体；ＢＰ２０２２＝非結合抗Ｅ．ｃｏｌｉ抗体、ビオチン＝ビオチンが結合した抗Ｅ．ｃｏｌｉ抗体。
【００１２】
図４は、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌（ＡＬＩ８４株およびＡＬＩ４４６株）とともに培養した場合の、３つの異なる３、３’、５、５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）ＥＬＩＳＡ基質の着色を示す。
【００１３】
図５は、Ｅ．ｃｏｌｉのＡＬＩ８４株およびＡＬＩ４４６株とともに培養した場合の、ｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）および２、２−アジノ−ビス（３エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡｚＢＴＳ）ＥＬＩＳＡ基質の着色を示す。Ｅ＝ＡＢＴＳマイクロウェルエンハンサー。
【００１４】
図６は、粘液でコーティングしたウェル中で培養した場合の、異なるＥＬＩＳＡ基質の着色を示す。写真は６０分の時点で撮影した。１５分の時点で、弱いシグナルが６つの陽性の（黄色の）ウェル中で観察された。
【００１５】
図７は、粘液またはプレートに対する抗体の非特異的な結合について調べた場合の、プレートのレイアウトを示す。ＢＰ２０２２＝抗Ｅ．ｃｏｌｉ一次抗体；ＢＰ２０２２ＨＲＰ＝ペルオキシダーゼが結合した抗Ｅ．ｃｏｌｉ一次抗体；ビオチン＝ビオチンが結合した抗Ｅ．ｃｏｌｉ一次抗体。ＨＲＰ＝ペルオキシダーゼが結合した二次抗体；ＳｔｒＨＲＰ＝ペルオキシダーゼが結合したストレプトアビジン。ＡＰ＝アルカリフォスファターゼが結合した二次抗体；ＳｔｒＡＰ＝ストレプトアビジンが結合した二次抗体。本実験では、細菌は使用していない。
【００１６】
図８は、粘液またはプレートに対する抗体の結合を示す。プレートのレイアウトは図７に記載されている。
【００１７】
図９は、一次抗体および二次抗体を用いた非特異的な結合試験を示す。一次抗体：ＨＲＰ＝ＨＲＰが結合した一次抗体、ＢＰ２０２２＝何も結合していないポリクローナル抗Ｅ．ｃｏｌｉ一次抗体；ビオチン＝ビオチンが結合した抗Ｅ．ｃｏｌｉ一次抗体。二次抗体：ＨＲＰ＝ＨＲＰが結合したＩｇＧ；ＳｔｒＨＲＰ＝ＨＲＰで標識されているストレプトアビジン。本実験では、細菌は使用していない。
【００１８】
図１０は、一次抗体および二次抗体を用いた非特異的な結合試験を示す。プレートのレイアウトは図９に記載されている。一次抗体：ＨＲＰ＝ＨＲＰが結合した一次抗体、ＢＰ２０２２＝何も結合していないポリクローナル抗Ｅ．ｃｏｌｉ一次抗体；ビオチン＝ビオチンが結合した抗Ｅ．ｃｏｌｉ。二次抗体：ＨＲＰ＝ＨＲＰが結合したＩｇＧ；ＳｔｒＨＲＰ＝ＨＲＰで標識されているストレプトアビジン。
【００１９】
図１１は、抗体の希釈および細菌の数／ウェルを最適化するために利用する条件を記載した表を示す。一次抗体：ＨＲＰが結合した一次抗体。二次抗体は用いていない。
【００２０】
図１２は、抗体の希釈および最適な細菌の数／ウェルの試験から得られたデータを示す。一次抗体：ＨＲＰが結合した一次抗体。二次抗体は用いていない。プレートのレイアウトは図１１に記載されている。
【００２１】
図１３は、抗体の希釈および細菌の数／ウェルを最適化するために利用する条件を記載した表を示す。一次抗体：ビオチンが結合した抗Ｅ．ｃｏｌｉ抗体。二次抗体：ＨＲＰが結合したストレプトアビジン。
【００２２】
図１４は、抗体の希釈および最適な細菌の数／ウェルの試験から得られたデータを示す。一次抗体：ビオチンが結合した抗Ｅ．ｃｏｌｉ抗体。二次抗体：ＨＲＰが結合したストレプトアビジン。
【００２３】
図１５は、１０６〜１０８個の細菌をウェルに加えた場合のＥＬＩＳＡ吸光度を示す。対数近似曲線を追加している。
【００２４】
図１６は、０〜１０６個の細菌をウェルに加えた場合のＥＬＩＳＡ吸光度を示す。
【００２５】
図１７は、Ａ）細菌の付着に対する、異なる濃度のＢｉｏ−Ｍｏｓの効果であり、効果はＢｉｏ−Ｍｏｓを加えない場合の吸光度の割合として示される；Ｂ）Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＬＩ８４株の付着に対する、異なる濃度のＢｉｏ−Ｍｏｓの効果であり、放射活性物質で標識されている細菌を用いたシンチレーションカウンターによって測定した。
【００２６】
図１８は、付着／接着を変化させた効果を検出するために最適なレベルを見つけるために、細菌の数／ウェルを調べた実験から得られたデータを示す（例えばＢｉｏ−Ｍｏｓを用いる）。
【００２７】
図１９は、付着／接着を変化させた効果を検出するために最適なレベルを見つけるために、細菌の数／ウェルを調べた実験から得られたデータを示す（例えばＢｉｏ−Ｍｏｓを用いる）。
【００２８】
図２０は、異なる濃度のＢｉｏ−Ｍｏｓ間の違いを検出するための、一次抗体の希釈に関するデータを示す。
【００２９】
図２１は、異なるタイプの粘液および複数の濃度のＢｉｏ−Ｍｏｓを用いたＥＬＩＳＡでの、Ｂｉｏ−Ｍｏｓの効果を示す。
【００３０】
図２２は、放射活性物質付着アッセイおよびＥＬＩＳＡ処理での、Ｂｉｏ−Ｍｏｓの効果の比較を示す。反復したサンプル間の平均の標準誤差は、エラーバーで示す。
【００３１】
図２３は、異なる方法で不活性化された細菌の、粘液でコーティングされたプレートへの付着を示す。付着は、Ｂｉｏ−Ｍｏｓがある場合とＢｉｏ−Ｍｏｓがない場合とについて測定した。ＵＶ不活性化細菌およびＤＭＳＯ不活性化細菌のデータは示していない。
【００３２】
図２４は、ＥＬＩＳＡ法に従い、新しくコーティングされたプレートへの、細菌の付着を示す。
【００３３】
図２５は、粘液に対する細菌の付着における、Ｅ．ｃｏｌｉ保存液中のエタノール濃度の効果を示す。
【００３４】
図２６は、異なる方法で保存した、粘液でコーティングしたプレートに対する、Ｂｉｏ−Ｍｏｓがある場合とＢｉｏ−Ｍｏｓがない場合との細菌の付着を示す。
【００３５】
図２７は、粘液でコーティングし、風乾したプレートに対する、エタノールで不活性化されたＥ．ｃｏｌｉの付着における、Ｂｉｏ−Ｍｏｓの効果を示す。反復（replicates）間の平均の標準誤差は、エラーバーで示す。
【００３６】
図２８は、異なるＢｉｏ−Ｍｏｓ試験レベルでの、絶対的なプレート間の変動を示す。同じサンプルを用いて反復したアッセイ（ウェル）は、バーのグループとして示す。
【００３７】
図２９は、異なるＢｉｏ−Ｍｏｓ試験レベルでの、絶対的なプレート間の変動を示す。図中の４つのパネルは、異なる４つの日に実施されたアッセイを表すが、１つのバッチのＥ．ｃｏｌｉを用いている。同じサンプルを用いて反復したアッセイ（ウェル）は、バーのグループとして示す。
【００３８】
図３０は、異なるパネル中に、異なるＢｉｏ−Ｍｏｓ試験レベルでの、絶対的なプレート間の変動を示す。各パネル中の４セットのカラムは、異なる４つの日に実施されたアッセイを表すが、１つのバッチのＥ．ｃｏｌｉを用いている。
【００３９】
図３１は、異なるＢｉｏ−Ｍｏｓ試験レベルでの、相対的なプレート間の変動を示す。カラムは、反復試験ウェルの平均を表し、バーは平均の標準誤差を示す。アッセイは異なる４つの日に実施されたが、１つのバッチのＥ．ｃｏｌｉを用いている。２つのパネルは同じデータを示すが、プレート間の変動（上側のパネル）またはＢｉｏ−Ｍｏｓの効果（下側のパネル）のどちらかを、強調するように別々に表されている。
【００４０】
図３２は、Ｂｉｏ−Ｍｏｓの効果における、相対的なバッチ間の変動を示す。上側のパネルのカラムは反復試験ウェルの平均を表し、バーは平均の標準誤差を示す。アッセイは、培地およびバッファーの調製、並びにＥ．ｃｏｌｉの培養から、全て独立して実施した。上側のパネルは、測定されたシグナルを示し、下側のパネルはコントロールウェルと比較した値を示す。
【００４１】
図３３は、発展させたアッセイを用いた試験処理間で示された差を検出するために必要な、反復ウェルの数を示す。
【００４２】
図３４は、Ｂｉｏ−Ｍｏｓ（２ｎｇ／ｍｌ）がある場合、および、ない場合での、細菌調製物の５つの独立したバッチにおいて、測定されたシグナルを示す。
【００４３】
図３５は、Ｂｉｏ−Ｍｏｓ（２ｎｇ／ｍｌ）がある場合、および、ない場合での、粘液プレートの５つの独立したバッチにおいて、測定されたシグナルを示す。
【００４４】
図３６は、保存１週間後および２週間後の試験のシグナルを示す。
【００４５】
図３７は、本発明の一実施形態における、真空包装されたプレートおよびアンプルを示す。
【００４６】
〔定義〕
本発明の理解を容易にするために、多数の用語を以下に定義する。
【００４７】
本明細書で用いられる場合、用語「粘液」は、消化管の一部によって生産され、当該消化管の一部を覆う（例えば、腸の上皮細胞によって生産され、当該腸を覆う）、比較的厚い分泌物を指す。粘液は、ムチン、タンパク質、糖タンパク質、脂質、および糖脂質等の一つ以上の成分を含んでいてもよい。また、粘液は、一つ以上の種類の受容体を含んでいてもよい（例えば、特定の接着タンパク質を認識する受容体）。粘液および／または上皮細胞に対する細菌の付着および／または密接な会合（例えば、粘液層を介した付着および／または密接な会合）は、腸粘液および／または腸上皮に対する細菌の付着に寄与して得る（例えば、上記付着および／または密接な会合によって、腸に生息する細菌集団において、役割を果たす）。本発明は、いかなる特定の種類の粘液、または、いかなる特定の供給源（例えば、動物の種類）もしくは場所（例えば消化管の部分（例えば、回腸（例えば、近位、遠位等）、十二指腸、盲腸、結腸、または当該消化管の他の部分））から得られる粘液に限定されるものではない。
【００４８】
本明細書で用いられる場合、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は、全て、電子対を共有する「ペプチド結合」によって結合されている、アミノ酸の一次配列を指す。一般的に、ペプチドは、数個のアミノ酸（典型的には２〜５０個のアミノ酸）からなり、タンパク質よりも短い。用語「ポリペプチド」は、ペプチドおよびタンパク質を包含する。いくつかの実施形態では、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、合成されたものであり、一方、他の実施形態では、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、組み換えられたもの、または天然に存在するものである。合成ペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで人工的な方法によって生産された（すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏでは生産されなかった）ペプチドである。
【００４９】
用語「サンプル」および「標本」は、広範な意味で用いられ、あらゆる供給源から得られたサンプルまたは標本を包含する。本明細書で用いられる場合、用語「サンプル」は、動物（ヒトを含む）から得られる生物学的サンプルを指し、液体、固体、組織、および気体を包含する。本発明のいくつかの実施形態では、生物学的サンプルは、脳脊髄液（ＣＳＦ）、漿液、尿、唾液、血液、および血漿、血清等の血液産物を含む。しかし、上記の例は、本発明において用いられるサンプルの種類を限定するように解釈されるものではない。
【００５０】
本明細書で用いられる場合、用語「ホスト」および「対象」は、研究、分析、試験、診断、または治療される、ヒトおよび非ヒトである動物（例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、家禽、魚、甲殻類等）を含むが、上記の例に限定されない、あらゆる動物を指す。本明細書で用いられる場合、用語「ホスト」、「対象」、および「患者」は、特に示されない限り、同義的に用いられる。
【００５１】
本明細書で用いられる場合、用語「抗体」（または「複数の抗体」）は、抗原決定基に対して特異的に結合し、当該抗体の生産を刺激する抗原決定基と同一、または構造的に関連しているタンパク質と特異的に結合する、あらゆるイムノグロブリンを指す。従って、抗体は、当該抗体の生産を刺激する抗原を検出するためのアッセイに利用することができる。モノクローナル抗体は、Ｂリンパ球（すなわち、Ｂ細胞）の単一クローンに由来し、一般的に、構造および抗原特異性において均一である。ポリクローナル抗体は、抗体産生細胞の多数の異なるクローンに由来する。従って、当該ポリクローナル抗体は、構造およびエピトープ特異性において不均一であるが、全て同一の抗原を認識する。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体は、精製されていない調製物として用いられ、一方、好ましい実施形態では、上記抗体は精製される。例えば、いくつかの実施形態では、未精製の血清中に含まれるポリクローナル抗体が用いられる。また、用語「抗体」は、あらゆる供給源（例えば、ヒト、げっ歯類、非ヒトである霊長類、ウサギ目、ヤギ、ウシ亜科、ウマ科、ヒツジ等）から得られる、あらゆるイムノグロブリン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ等）を包含するものである。
【００５２】
本明細書で用いられる場合、用語「抗原」は、抗体によって認識できる、あらゆる物質に関して用いられる。当該用語は、あらゆる抗原、および「免疫原」（すなわち、抗体の形成を誘導する物質）を包含する。従って、免疫原性の反応においては、抗体は、抗原、または抗原の一部の存在に応じて、生産される。用語「抗原」および「免疫原」は、個々の高分子、または、抗原高分子の均一または不均一な集団を指して用いられる。用語、抗原および免疫原は、一つ以上のエピトープを含む、タンパク分子、またはタンパク分子の一部を包含する。多くの場合、抗原は、免疫原であり、従って、「抗原」は、しばしば用語「免疫原」と同義的に用いられる。いくつかの好ましい実施形態では、免疫性を与えられた動物の血清における、適切な抗体の存在を検出するためのアッセイにおいて、免疫原物質が抗原として用いられる。
【００５３】
本明細書で用いられる場合、用語「抗原断片」および「抗原の一部」等は、抗原の一部に関して用いられる。抗原断片または一部は、抗原全体の小さな割合を占めるものから、大きな割合を占めるものまで、一般的にサイズが幅広いが、１００％の抗原ではない。しかし、抗原の「少なくとも一部」を特定する場合には、抗原全体が存在してもよいことを意図している（例えば、試験に用いられるサンプルが、抗原の一部のみを含んでいるわけではない）。いくつかの実施形態では、抗原断片および／または抗原の一部は、抗体によって認識されるエピトープを含む。一方、他の実施形態では、当該断片および／または一部は、抗体によって認識されるエピトープを含まない。さらに、いくつかの実施形態では、抗原断片および／または一部は、免疫原性ではなく、一方、好ましい実施形態では、抗原断片および／または一部は、免疫原性である。
【００５４】
本明細書で用いられる場合、用語「抗原決定基」および「エピトープ」は、特定の抗体の可変領域と接触する、抗原の一部を指す。タンパク質、またはタンパク質の断片（一部）が、ホスト動物に免疫を与えるために用いられる場合、当該タンパク質は、当該タンパク質の所定の領域、または立体構造（当該領域および／または構造が、「抗原決定基」と呼ばれる）と特異的に結合する抗体の生産を誘導する可能性がある。いくつかの設定では、抗原決定基は、抗体との結合において、通常の抗原（すなわち、免疫反応をもたらすために用いられる「免疫原」）と競合する。
【００５５】
用語「特異的結合」および「特異的な結合」は、抗体と抗原との間の相互作用に関して用いられる場合、抗原の特定の構造（すなわち、抗原決定基、またはエピトープ）の存在に依存した相互作用を表す。換言すれば、抗体は、抗原に固有のタンパク質構造を認識し、当該タンパク質構造と結合するものであり、一般的に全てのタンパク質と結合する（すなわち、非特異的結合）ものではない。
【００５６】
本明細書で用いられる場合、用語「免疫学的アッセイ」は、抗原の検出または定量のために、少なくとも一つ以上の特定の抗体を用いる、あらゆるアッセイを指す。免疫学的アッセイは、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、放射免疫アッセイ、および免疫蛍光アッセイを含むが、上記の例に限定されるものではない。
【００５７】
本明細書で用いられる場合、用語「ＥＬＩＳＡ」は、固相酵素免疫検定法（またはＥＩＡ）を指す。多数のＥＬＩＳＡ法、およびＥＬＩＳＡの適用が当業者によって知られており、多数の参照文献に記載されている（例えば、Ｃｒｏｗｔｈｅｒ、  “Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ （ＥＬＩＳＡ）、”  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｍｅｔｈｏｄｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、  Ｒａｐｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．）、  ｐｐ．  ５９５−６１７、  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、  Ｉｎｃ．、  Ｔｏｔｏｗａ、  Ｎ．Ｊ．  （１９９８）；  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  （ｅｄｓ．）、  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８８）；  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．）、  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、  Ｃｈ．  １１、  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、  Ｉｎｃ．、  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９４）参照）。さらに、多数の商業的に利用可能なＥＬＩＳＡ試験システムがある。
【００５８】
本明細書で用いられる場合、用語「レポーター試薬」、「レポーター分子」、「検出基質」および「検出試薬」は、抗原と結合した抗体の検出および／または定量を可能にする試薬に関して用いられる。例えば、いくつかの実施形態では、レポーター試薬は、抗体に結合されている酵素に対する、比色基質である。抗体と酵素との結合物に対して適切な基質を加えることで、比色シグナルまたは蛍光シグナルを発する（例えば、興味のある抗原に対して、結合物である抗体を結合させた後）。他のレポーター試薬としては、放射活性化合物が挙げられるが、当該放射活性化合物に限定されるものではない。上記の定義は、検出系の一部としてのビオチンおよびアビジンをベースとする化合物（例えば、ニュートラアビジンおよびストレプトアビジンを含むが、上記の例に限定されない）の使用も包含する。
【００５９】
本明細書で用いられる場合、用語「シグナル」は、一般的に、反応が起こったこと（例えば、抗原に対する抗体の結合）を示す、あらゆる検出可能なプロセスに関して用いられる。放射活性、蛍光、または比色産物／試薬の形態のシグナルが、本発明で使用され得ることが意図されている。本発明の種々の実施形態では、上記シグナルは、定性的に評価され、一方、別の実施形態では、上記シグナルは定量的に評価される。
【００６０】
本明細書で用いられる場合、用語「固相の支持体」は、抗体、抗原、および他の試験成分等の試薬が取り付けられる、あらゆる固形物または固定物に関して用いられる。例えば、ＥＬＩＳＡ法では、マイクロタイタープレートのウェルが固相の支持体を提供する。固相の支持体の他の例には、顕微鏡用スライド、カバースリップ、ビーズ、粒子、細胞培養フラスコが、他の多数の好適な器具と同様に含まれる。
【００６１】
本明細書で用いられる場合、用語「効果的な量」は、有益または所望の結果をもたらすために十分な、組成物の量を指す。効果的な量は、１回以上の投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、使用（ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）または、服用（ｄｏｓａｇｅ）によって、投与されてもよいし、および／または、別の物質と組み合わされてもよいが、特定の剤形または投与経路に限定されるものではない。
【００６２】
本明細書で用いられる場合、用語「投与」および「投与する」は、対象（例えば、対象、または、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ  ｖｉｖｏの細胞、組織、および器官）に対して、薬物、プロドラッグ、もしくは他の薬剤、または、治療上の処置（例えば、本発明に係る方法の使用を介して、粘液に対する細菌の付着を調節する因子として特定された薬剤）を与える行為を指す。投与経路の代表例としては、目（点眼）、口（経口）、皮膚（局所的または経皮）、鼻（点鼻）、肺（吸入）、口腔粘膜（口腔投与）、耳、直腸、膣、注射（静脈内、皮下、腫瘍内、腹腔内等）等を介するものが挙げられる。
【００６３】
本明細書で用いられる場合、用語「共投与」および「共投与する」は、少なくとも２つの薬剤の投与を指す（本発明に係る方法の使用を介して、粘液に対する細菌の付着を調節する因子として特定された薬剤、並びに、対象および／または物質（例えば、食料（例えば、動物の飼料）に対する、１つ以上の他の薬剤（例えば、病原菌による疾患を治療することで知られている治療））。いくつかの実施形態では、２つ以上の薬剤または治療の共投与は、同時に行われる。他の実施形態では、第一の薬剤／治療が、第二の薬剤／治療に先行して行われる。当業者であれば、使用される種々の薬剤または治療の剤形および／または投与経路が変更可能であることを理解できる。共投与における適切な投与量は、当業者によって、容易に決定できる。いくつかの実施形態では、薬剤または治療が共投与される場合、それぞれの薬剤または治療は、単独での投与および／または処方に適切な量よりも、少ない投与量で投与および／または処方される。従って、共投与が特に望ましいのは、薬剤または治療の共投与／共処方によって、潜在的に有害（例えば、有毒）な薬剤の必要量を低減させることができる場合、および／または、２つ以上の薬剤の共投与によって、他の薬剤の共投与を介した一方の薬剤の有益な効果に対する、対象の感作がもたらされる場合である。
【００６４】
本明細書で用いられる場合、「コロニー形成後処置（post-colonization treatment）」または「後から使用する（post-application）」は、感染症を除去した後の処置を指す。
【００６５】
本明細書で用いられる場合、「事前に使用する（pre-application）」および／または「予防処置」は、予防策として用いられる処置を指す（例えば、感染および／または疾患を防ぐ）。
【００６６】
本明細書で用いられる場合、用語「疾患」および「病的状態」は、生きている動物、または当該動物のあらゆる組織、もしくは器官が通常の状態を損ない、通常の機能の実行を妨害または修正するものと関連する状態、徴候、および／または症状であって、環境要因（栄養失調、工業災害、または気候等）、特定の感染体（寄生虫、細菌、またはウイルス等）、生物の内在的な欠陥（種々の遺伝子異常、または上記の例と他の因子との組み合わせ）に対する反応であり得る状態、徴候、および／または症状を表すために同義的に用いられる。
【００６７】
本明細書で用いられる場合、用語「罹患している」は、特定の疾患を経験している対象（例えば、動物、またはヒトである対象）を指す。本発明は、特定の徴候、もしくは症状、または疾患に限定されるものではない。従って、本発明はあらゆる範囲の疾患（例えば、潜在的な臨床症状（sub-clinical manifestation）から、完全に症状の出ている疾患まで）を経験している対象を含み、上記対象は、特定の疾患に関連する、少なくともいくつかの証拠（indicia）（例えば、徴候、および症状）を示している。
【００６８】
本明細書で用いられる場合、用語「有毒」は、毒物を投与する前の同じ細胞または組織と比較した場合に、対象、細胞または組織に現れる、あらゆる不利益および有害な効果を指す。
【００６９】
本明細書で用いられる場合、用語「機能的な飼料成分」または「機能的な飼料添加物」は、活性薬剤（例えば、粘液に対する細菌の付着を調節する因子として特定された薬剤）と不活性または活性な担体との組み合わせを指し、上記組み合わせは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、またはｅｘ  ｖｉｖｏでの診断または治療における使用に特に適した組成物を形成する。
【００７０】
本明細書で用いられる場合、用語「担体」は、あらゆる標準的な担体を指し、当該標準的な担体としては、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルジョン（例えば、油／水、または水／油のエマルジョン等）、および様々な種類の湿潤剤、ありとあらゆる溶媒、分散媒、被覆剤、ラウリル硫酸ナトリウム、等張剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ  ａｇｅｎｔｓ）および吸収遅延剤、崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプン、またはデンプングリコール酸ナトリウム）、トウモロコシの穂軸、乾燥させた醸造かす、ふすま、酵母（例えば、全使用済み酵母（ｗｈｏｌｅ  ｓｐｅｎｔ  ｙｅａｓｔ））、酵母成分（例えば、酵母細胞壁の抽出物）等が挙げられるが、上記の例に限定されるものではない。上記組成物は、安定剤および保存剤を含んでいてもよい。担体の例としては、安定剤および補助剤が挙げられる（例えば、Ｍａｒｔｉｎ、  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、  １５ｔｈ  Ｅｄ．、  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．  Ｃｏ．、  Ｅａｓｔｏｎ、  Ｐａ．  （１９７５）参照。本明細書中で参照によって引用される）。
【００７１】
本明細書で用いられる場合、用語「消化物」は、食品、飼料、または他の有機化合物が吸収できる形態に変化したものを指し、熱および水分、または化学作用によって、軟化、分解、または崩壊したものである。
【００７２】
本明細書で用いられる場合、用語「消化系」は、消化が起こり得る、または消化が起こる系（胃腸系を含む）を指す。
【００７３】
本明細書で用いられる場合、用語「飼料」は、動物によって消費され、エネルギーおよび／または栄養分を動物の食事に与えるものを指す。飼料の例としては、完全混合飼料（Ｔｏｔａｌ  Ｍｉｘｅｄ  Ｒａｔｉｏｎ（ＴＭＲ））、まぐさ、ペレット、濃縮物、プレミックス、副産物、穀物、醸造かす、糖蜜、繊維、飼い葉、草、干草、穀粒、葉、粗びき粉、可溶物、および栄養補助食品が挙げられるが、上記の例に限定されるものではない。
【００７４】
本明細書で用いられる場合、用語「動物」は動物界に属する動物を指す。当該動物には、家畜（ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ、ｆａｒｍ  ａｎｉｍａｌｓ、ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｉｍａｌｓ）、ペット、海生および淡水性の動物、並びに野生動物が挙げられるが、上記の例に限定されるものではない。
【００７５】
本明細書で用いられる場合、用語「薬学的に許容可能な塩」は、本発明の化合物（例えば、生存している酵母細胞、または、本発明の細胞壁成分を含む）のあらゆる塩（例えば、酸と塩基の反応によって得られる）を指し、上記塩は、目的となる対象（例えば、哺乳類、ヒト、鳥類、ウシ亜科、ブタ、ウマ科、ヒツジ、ヤギ、イヌ科、ネコ科、魚、ラクダ科、げっ歯類の種、魚および貝である対象、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏ、もしくはｅｘ  ｖｉｖｏの細胞、組織、もしくは器官）において生理学的に許容されるものである。本発明の化合物の「塩」は、無機または有機の酸および塩基に由来してもよい。酸の例としては、塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン−ｐ−スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、スルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸等が挙げられるが、上記の例に限定されるものではない。シュウ酸等の他の酸は、それ自体は薬学的に許容可能ではないが、本発明の化合物およびそれらの薬学的に許容可能な酸付加塩を得るために、中間体として利用される塩の調製に用いられてもよい。
【００７６】
塩基の例としては、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）水酸化物、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）水酸化物、アンモニア、およびＮＷ４＋の式で表される化合物（式中、ＷはＣ１−４のアルキルである）等が挙げられるが、上記の例に限定されるものではない。
【００７７】
塩の例としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、カンファー酸塩（ｃａｍｐｈｏｒａｔｅ）、カンファースルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、硫酸ドデシル、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、フルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パルモ酸塩（ｐａｌｍｏａｔｅ）、ペクチン酸塩、過硫酸塩、フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、ウンデカン酸塩等が挙げられるが、上記の例に限定されるものではない。塩の他の例としては、Ｎａ＋、ＮＨ４＋、およびＮＷ４＋等の式で表される適切なカチオン（式中、ＷはＣ１−４のアルキル基である）と混合された、本発明の化合物のアニオン等が挙げられる。治療における使用のために、本発明の化合物の塩は、薬学的に許容可能であることが意図されている。しかし、薬学的に許容可能でない酸および塩基の塩を、たとえば、薬学的に許容可能な化合物の調製または精製に用いてもよい。
【００７８】
治療および／または予防における使用のために、本発明の化合物の塩は、薬学的に許容可能であることが意図されている。しかし、薬学的に許容可能でない酸および塩基の塩を、たとえば、薬学的に許容可能な化合物の調製または精製に用いてもよい。
【００７９】
本明細書で用いられる場合、用語「細胞培養物」は、細胞のあらゆるｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物を指す。上記用語には、連続継代細胞系（例えば、不死化した表現型を有する）、初代細胞系、形質転換細胞系、有限である細胞系（例えば、非形質転換細胞）、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持される、他のあらゆる細胞集団が含まれる。
【００８０】
本明細書で用いられる場合、用語「真核生物」は、「原核生物」と区別される生物を指す。上記用語は、真核生物の通常の特性を示す細胞を有する全ての生物を包含し、当該特性には、核膜によって包まれた真核（中には染色体が存在する）の存在、膜に包まれたオルガネラの存在、および真核生物に共通して観察される他の特性が挙げられる。従って、上記用語は、菌類、原生動物、および動物（例えば、ヒト）を含むが、上記の例に限定されるものではない。
【００８１】
本明細書で用いられる場合、用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」は、人工的な環境を指し、人工的な環境中で起こる工程または反応を指す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏな環境は、試験管および細胞培養物からなるものであってもよいが、上記の例に限定されるものではない。用語「ｉｎ  ｖｉｖｏ」は、天然の環境（例えば、動物、または細胞）を指し、天然の環境中で起こる工程または反応を指す。
【００８２】
本明細書で用いられる場合、用語「サンプル」は広範な意味で用いられる。一つの意味では、生物学的サンプルおよび環境サンプルと同様に、あらゆる供給源から得られる標本または培養物を含むことを意味する。生物学的サンプルは、動物（ヒトを含む）から得られるもので、液体、固体、組織、および気体を包含する。生物学的サンプルは、血漿、血清等の血液産物を含む。環境サンプルは、表面物質、土壌、水、結晶、および工業サンプル等の環境物質を含む。しかし、上記の例は、本発明に適用可能なサンプルの種類を制限するものではない。
【００８３】
本明細書で用いられる場合、用語「キット」は、パッケージ化された材料のセットを指す。
【００８４】
本明細書で用いられる場合、用語「非付着を調節する因子（ａｎｔｉ−ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ、および／またはａｎｔｉ−ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）」は付着をブロックする（例えば、化合物が線毛に付着するのをブロック、並びに／または、粘液上皮細胞および／もしくは他の種類の細胞に対する細菌の付着をブロックする）調節因子を指す。
【００８５】
〔発明の詳細な説明〕
放射活性物質結合アッセイは、腸粘液に対する細菌の付着、およびある薬剤が当該付着を効果的に防ぐことを測定するために行われる（例えば、Ｃｏｎｗａｙ、  ｅｔ  ａｌ．、  １９９０、  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ５８：３１７８−３１８２参照。全て参照によって本明細書中に引用される）。特に、腸粘液に対する細菌の付着を測定するために行われる、放射活性物質結合アッセイは、さらに細菌の付着の阻害におけるＢｉｏ−ｍｏｓ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの細胞壁に由来するマンノプロテイン）の効果を示す。しかし、非放射性の決まりきった方法は、粘液に対する細菌の付着の検出、特定、および測定に利用できない。本発明に係る方法および組成物は、粘液に対する細菌の付着の検出、特定、および測定のための非放射性の方法を提供することで、上記の制限を克服している。
【００８６】
特に、本発明は、粘液に対する細菌の付着の測定、および、付着を調節する（例えば、阻害する、促進する）産物の効果の試験のための、簡潔および正確な免疫アッセイを提供する。いくつかの実施形態では、上記免疫アッセイは、ウェスタンブロットである。いくつかの実施形態では、上記免疫アッセイは、放射免疫アッセイである。いくつかの実施形態では、上記免疫アッセイは、免疫蛍光アッセイである。いくつかの実施形態では、上記免疫アッセイは、ＥＬＩＳＡをベースとするアッセイである。ＥＬＩＳＡをベースとする方法は、一次抗体および二次抗体の様々な組み合わせ、並びに、異なる微生物種に対する種々の比色検出系の使用において、柔軟性を有するため、放射性アッセイに代わる魅力的な手段である。従って、本発明は、粘液（例えば、腸粘膜内層）に対する細菌の付着の検出および特定のためのＥＬＩＳＡをベースとする方法を提供する。
【００８７】
従って、いくつかの実施形態では、本発明は、粘液と細菌細胞との間の相互作用（例えば、結合、付着、親和性等）のモニタリングおよび／または特性付けを行うための、非放射性の比色アッセイを提供する。いくつかの実施形態では、非放射性のアッセイは、同様のモニタリングおよび／または特性付けに利用される放射性のアッセイと比較して、同程度の感度、および／または、より優れた感度を有する。いくつかの実施形態では、本発明の非放射性の比色アッセイは、１つ以上の検査薬が有する、粘液と細菌細胞との相互作用（例えば、結合、付着、親和性等）を変化させる（例えば、阻害する、および／または促進する）能力の、モニタリングおよび／または特性付けを行うために利用される。
【００８８】
例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、実施例１〜１６に記載されるように、粘液と細菌細胞との間の相互作用（例えば、結合、付着、親和性等）のモニタリングおよび／または特性付けを行うための固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）を提供する。いくつかの実施形態では、上記検定法は、室温で行われる。いくつかの実施形態では、上記検定法は、３７℃で行われる。いくつかの実施形態では、上記検定法は、実施例２〜１５に記載されるように最適化される。いくつかの実施形態では、プレート（例えば、マイクロタイタープレート（例えば、ＭＡＸＩＳＯＲＰプレート（例えば、６、１２、２４、４８、９６、１２８、またはそれ以上のウェルを含む）を粘液でコーティングする。いくつかの実施形態では、利用される上記粘液は、動物の粘液である。いくつかの実施形態では、粘液は、ブタ、ニワトリ、ウシ、ウマ科、イヌ科、ネコ科、または他の種類の動物から得られるものである。いくつかの実施形態では、上記粘液は、消化管の１つ以上の部分から得られる。例えば、いくつかの実施形態では、粘液は、回腸（例えば、近位側回腸、遠位回腸等）、十二指腸、盲腸、結腸、または当該消化管の他の部分から得られる。本発明は、上記プレートをコーティングするために利用される粘液の量（例えば、プレート上のウェルの数および／またはサイズに依存する）によって制限されるものではない。いくつかの実施形態では、粘液をコーティングバッファー中に希釈し、その後、プレートをコーティングするために利用する。いくつかの実施形態では、上記コーティングバッファーは、１リットルの水に、１．６ｇのＮａ２ＣＯ３、２．９４ｇのＮａＨＣＯ３、および０．２ｇのＮａ−アジドが溶解しており、ｐＨが９．６に調節されている水溶液、または同様のバッファーである。いくつかの実施形態では、コーティングバッファー１ｍｌあたりに約０．００１ｇから０．２ｇの間の粘液タンパク質を含むコーティングバッファーが、プレート上の各ウェルをコーティングするために用いられる。上記コーティングバッファーは、より多い量（例えば、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．７５ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、またはそれを超える値）、または、より少ない量（例えば、０．０００５ｍｇ／ｍｌ、またはそれを下回る値）が用いられてもよい。いくつかの実施形態では、約３００μｌのコーティング懸濁液が、各ウェルをコーティングするために用いられ、より多い体積（例えば、４００μｌ、５００μｌ、６００μｌ、７００μｌ、またはそれを超える値）、または、より少ない体積（例えば、２００μｌ、１００μｌ、５０μｌ、２５μｌ、またはそれを下回る値）が用いられてもよい（例えば、ウェルのサイズ、所望のシグナルの量、または他の要因（例えば、細菌の付着）に応じて）。一旦、上記コーティング溶液がウェルに加えられれば、粘液を各ウェルに一定時間（例えば、約１時間、約２時間、約３時間、約６時間、約１２時間、約２４時間、またはそれを越える時間）、一定の温度（例えば、４℃、室温、またはさらに温かい温度（例えば３７℃））でコーティングすることができる。いくつかの実施形態では、培養の間、プレートをカバーする（例えば、上記コーティング溶液の蒸発を防ぐために）。コーティング期間内のある時間、検査薬（例えば、粘液に対する細菌の結合を変化させる（例えば、阻害する、および／または、促進する）能力について検査される）を調製する。上記検査薬は、いずれの適切なバッファー（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（例えば、８．０ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＣｌ、１．４ｇのＮａ２ＨＰＯ４×２Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＫＨ２ＰＯ４を１Ｌの水に溶解させ、ｐＨ７．４に調整したＰＢＳ溶液））中に希釈されてもよい。本発明は、検査薬の種類によって限定されるものではない。実際に、種々の検査薬について、本明細書中に記載されている方法を含む（しかし、当該方法に限定されない）、本発明に係る方法を用いて、モニタリングおよび／または特性付けを行うことができる。
【００８９】
コーティングが完了した後、上記コーティング溶液をウェルから除去し（例えば、ウェルの内容物を混合せずに）、適切な体積（例えば、１００ｍｌ、２００ｍｌ、３００ｍｌ、４００ｍｌ、またはそれを超える体積）の洗浄液（例えば、ＰＢＳ）を用いて、各ウェルを洗浄する。
【００９０】
粘液との相互作用についてモニタリングおよび／または特性付けが行われる細菌は、細菌を破壊しない条件下で、細菌を採集することで調製される。本発明では、いかなる特定の種類の細菌、または、細菌のいかなる特定の増殖期にも限定されるものではない。実際に、本発明に係るアッセイ中で、種々の細菌についてモニタリングおよび／または特性付けを行ってもよく、本発明には、本明細書中に記載されている細菌の種類が包含される（しかし、当該細菌の種類に限定されない）。一旦、細菌を採集すれば（例えば、遠心分離して、細菌を沈殿させる）、ウェルあたりの望ましい細菌の数に応じて、上記細菌をバッファー（例えば、ＰＢＳ）中で、所望の濃度になるまで再懸濁させる。いくつかの実施形態では、ウェルに加える細菌の数は、ウェルあたり約１０７個であり、より多い数（例えば、１０８、１０９、１０１０）、または、より少ない数（例えば、１０６、１０５、１０４）の細菌を各ウェルに加えてもよい。プレートの最後の洗浄の後、細菌をウェルに加える。いくつかの実施形態では、検査薬溶液を、各ウェルに加える直前に、細菌懸濁液に加える。検査薬の量および細胞の量は、本明細書中で記載されているように、変更が可能である。細菌および／または細菌に検査薬を加えたものを、一旦ウェルに加えれば、設定された時間の間（例えば、１時間、２時間、４時間、８時間、またはそれを越える時間）、ウェル中で培養することができる。培養後に、ウェルを洗浄する（例えば、ＰＢＳを用いて、１回、２回、３回、またはそれ以上の回数）。洗浄後、ブロッキングバッファー（例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ミルク、または他の適切なブロッキング剤（例えば、ＰＢＳ中に１０％のＦＢＳを希釈したもの））を各ウェルに加える（例えば、ウェルを粘液でコーティングするために用いたブロッキングバッファーと同じ体積を用いる）。上記ブロッキング溶液を、ウェル中で、設定された時間の間（例えば、１時間、２時間、３時間、またはそれを越える時間）、一定温度（例えば、４℃、室温、またはさらに温かい温度（例えば３７℃））でインキュベートする。ブロッキングバッファーを除去し、その後、一次抗体（例えば、モニタリングおよび／または特性付けが行われる細菌に対して特異的な親和性を有する）をウェル中に加える。上記一次抗体をブロッキングバッファー中に希釈する（例えば、１：５００、１：１０００、１：２５００、１：５０００、またはそれを超える値で）。希釈した一次抗体の、ウェルに加える体積は、約１００ｍｌ〜約４００ｍｌであり（例えば、２００ｍｌ）、ウェル中で、設定された時間の間（例えば、１時間、２時間、３時間、またはそれを越える時間）、一定温度（例えば、４℃、室温、またはさらに温かい温度（例えば３７℃））でインキュベートされる。本発明は、用いられる一次抗体によって限定されるものではない。実際に、モニタリングおよび／または特性付けが行われる細菌に対して特異的な親和性を有していれば、いずれの抗体を用いてもよい。いくつかの実施形態では、上記一次抗体は、ポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、上記一次抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、上記一次抗体は、抗体の断片である。いくつかの実施形態では、上記一次抗体は、結合した抗体である。例えば、いくつかの実施形態では、上記一次抗体には、ビオチンが結合されている。いくつかの実施形態では、上記一次抗体は、ビオチンが結合したポリクローナルな抗Ｅ．ｃｏｌｉ抗体である。一次抗体をインキュベートした後、洗浄バッファー（例えば、ＰＢＳ）を用いて、各ウェルを洗浄する（１回、２回、３回、またはそれ以上の回数）。洗浄バッファーを除去し、その後、二次抗体（例えば、上記一次抗体に対して、特異的な親和性を有する）をウェルに加える。二次抗体も同様に、ブロッキングバッファー中に希釈する（例えば、１：５００、１：１０００、１：２５００、１：５０００、またはそれを超える値で）。本発明は、用いられる二次抗体の種類によって限定されるものではない。いくつかの実施形態では、上記二次抗体は、ポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、上記二次抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、上記二次抗体は、抗体の断片である。いくつかの実施形態では、上記二次抗体は、結合した抗体である。いくつかの実施形態では、上記二次抗体は、ストレプトアビジンに結合されている。いくつかの実施形態では、上記二次抗体は、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、フォスファターゼ等）に結合されている。希釈した二次抗体の、ウェルに加える体積は、約１００ｍｌ〜約４００ｍｌであり（例えば、２００ｍｌ）、ウェル中で、設定された時間の間（例えば、１時間、２時間、３時間、またはそれを越える時間）、一定温度（例えば、４℃、室温、またはさらに温かい温度（例えば３７℃））でインキュベートされる。インキュベートした後、洗浄バッファー（例えば、ＰＢＳ）を用いて、各ウェルを洗浄する（１回、２回、３回、４回、５回、またはそれ以上の回数）。最後の洗浄の後、比色基質をウェルに加える。本発明は、用いられる基質の種類によって限定されるものではない。基質の例には、３、３’、５、５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（例えば、ペルオキシダーゼが結合した二次抗体に対して）、ｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）（例えば、フォスファターゼが結合した抗体）等が挙げられるが、上記の例に限定されるものではない。ウェル中で発色が起こり、検出および／または定量を行う（例えば、分光光度計を用いる）。発色は、酸性バッファー（例えば、２ＭのＨ２ＳＯ４）を用いて、いずれの時点でも止めることができる（例えば、強い発色シグナルの発生を防ぐために（例えば、細菌の付着を定量化するために））。
【００９１】
本発明は、粘液に対する細菌の付着を検出、特定、および測定するための、ＥＬＩＳＡをベースとする特定の方法に限定されるものではない。いくつかの実施形態では、以下の１）〜６）を含む方法を提供する。１）ＥＬＩＳＡをベースとするアッセイで用いるために構成されたプレートを、粘液サンプルを用いてコーティングする。２）粘液でコーティングされたプレートに、細菌を加える。３）細菌に対する一次抗体を加える。４）一次抗体に対する二次抗体を加える。５）液体の基質を加える。６）細菌の付着を測定する。いくつかの実施形態では、洗浄する工程を、１つ以上の工程の間に適用する。いくつかの実施形態では、ブロッキング溶液を、１つ以上の工程の間で加える。上記方法は、細菌の付着を測定するための、特定の種類の、粘液のサンプル、細菌、一次抗体、二次抗体、液体の基質、および／または技術に限定されるものではない。
【００９２】
粘液に対する細菌の付着を検出、特定、および測定するための上記方法は、特定の細菌の種類に限定されるものではない。実際に、あらゆる種類の細菌を、本発明で用いることができる。細菌の例としては、Acidobacteria、Actinobacteria、Aquificae、Bacteroidetes/Chlorobi、Chlamydiae/Verrucomicrobia、Chloroflexi、Chrysiogenetes、Cyanobacteria、Deferribacteres、Deinococcus-Thermus、Dictyoglomi、Fibrobacteres、Firmicutes、Fusobacteria、Gemmatimonadetes、Nitrospirae、Planctomycetes、Proteobacteria、Spirochaetes、Synergistetes、Tenericutes、Thermodesulfobacteria、およびThermotogaeが挙げられるが、上記の例に限定されるものではない。いくつかの実施形態では、上記細菌は、病原性の細菌であり、例えば、Bordetella(例えば、Bordetella pertussis)、Borrelia(例えば、Borrelia burgdorferi)、Brucella(例えば、Brucella abortus、Brucella canis、 Brucella melitensis、 Brucella suis)、Campylobacter (例えば、Campylobacter jejuni)、Chlamydia(例えば、Chlamydia pneumoniae、Chlamydia psittaci、Chlamydia trachomatis)、Clostridium(例えば、Clostridium botulinum、Clostridium difficile、Clostridium perfringens、Clostridium tetani)、Corynebacterium(例えば、Corynebacterium diphtheriae)、Enterococcus(例えば、Enterococcus faecalis、Enterococcus faecum)、Escherichia(例えば、Escherichia coli)、Francisella(例えば、Francisella tularensis)、Haemophilus(例えば、Haemophilus influenzae)、Helicobacter(例えば、Helicobacter pylori)、Legionella(例えば、Legionella pneumophila)、Leptospira(例えば、Leptospira interrogans)、Listeria(例えば、Listeria monocytogenes)、Mycobacterium(例えば、Mycobacterium leprae、Mycobacterium tuberculosis)、Mycoplasma(例えば、Mycoplasma pneumoniae)、Neisseria(例えば、Neisseria gonorrhoeae、Neisseria meningitidis)、Pseudomonas(例えば、Pseudomonas aeruginosa)、Rickettsia(例えば、Rickettsia rickettsii)、Salmonella(例えば、Salmonella typhi、Salmonella typhimurium)、Shigella(例えば、Shigella sonnei)、Staphylococcus(例えば、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、Staphylococcus saprophyticus)、Streptococcus(例えば、Streptococcus agalactiae、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus pyogenes)、Treponema(例えば、Treponema pallidum)、Vibrio(例えば、Vibrio cholerae)、およびYersinia(例えば、Yersinia pestis)が挙げられる。いくつかの実施形態では、上記細菌は、ブタの粘液に対して強い付着を示すことが知られているＥ．ｃｏｌｉの特定の株から選択される（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのＡＬＩ８４および／またはＡＬＩ４４６）。
【００９３】
本発明は、粘液に対する細菌の付着を検出、特定、および測定するための、ＥＬＩＳＡをベースとする方法の中で、細菌を調製および／または利用する方法について、特定の様式に限定されるものではない。いくつかの実施形態では、上記細菌を、利用する前に不活性化させ（例えば、保存する目的で）、試験の間、活性化させる。上記方法は、細菌を不活性化させるための方法について、特定の様式に限定されるものではない。細菌を不活性化させる方法の例には、細菌を冷凍する方法、エタノールを用いて細菌を懸濁する方法、グルタルアルデヒドを用いて細菌を懸濁する方法、ホルマリンを用いて細菌を懸濁する方法、細菌に紫外線を照射する方法、ジメチルスルホキシドを用いて細菌を懸濁する方法、および、保存のための冷却の前に細菌を加熱する方法が挙げられるが、上記の例に限定されるものではない。上記方法は、不活性化された細菌を、試験のために活性化させる方法について、特定の様式に限定されるものではない。いくつかの実施形態では、上記細菌を、遠心分離技術によって活性化させる（例えば、回収する）。
【００９４】
上記方法は、エタノールを用いて細菌を不活性化させる方法について、特定の様式に限定されるものではない。いくつかの実施形態では、上記細菌を、エタノールを用いて不活性化させる前に（例えば、不活性化させる１日前に）、増殖させ、未使用の培地中に移す（例えば、１０％の接種（inoculums））。次に、細菌培養物に対して直接エタノールを加えることで、上記細菌を不活性化させ、保存する（例えば、最終的な濃度がおよそ４０％ｖｏｌ／ｖｏｌ（例えば、２０％ｖｏｌ／ｖｏｌ；３０％ｖｏｌ／ｖｏｌ；３３％ｖｏｌ／ｖｏｌ；３５％ｖｏｌ／ｖｏｌ；３７％ｖｏｌ／ｖｏｌ；４０％ｖｏｌ／ｖｏｌ；４２％ｖｏｌ／ｖｏｌ；４５％ｖｏｌ／ｖｏｌ；５０％ｖｏｌ／ｖｏｌ；６０％ｖｏｌ／ｖｏｌ）になるように）。いくつかの実施形態では、エタノール（例えば、最終的な濃度がおよそ４０％ｖｏｌ／ｖｏｌ）を用いて不活性化させた細菌を、およそ＋４℃（例えば、２℃；３℃；４℃；５℃；６℃）で保存する。いくつかの実施形態では、エタノール（例えば、最終的な濃度がおよそ４０％ｖｏｌ／ｖｏｌ）（およそ＋４℃で保存した）を用いて不活性化させた細菌を、遠心分離によって活性化（例えば、回収）させる。いくつかの実施形態では、上記細菌をリン酸緩衝生理食塩水（例えば、ＰＢＳ）（例えば、８．０ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＣｌ、１．４ｇのＮａ２ＨＰＯ４×２Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＫＨ２ＰＯ４、ａｄ. １０００ｍｌのＭｉｌｌｉＱ  Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．４）に懸濁する。
【００９５】
粘液に対する細菌の付着を検出、特定、および測定する方法は、特定の粘液の種類に限定されるものではない。実際に、いずれの種類の粘液を本発明に用いてもよい。いくつかの実施形態では、使用する粘液は、ブタに由来するものである（例えば、ブタ結腸粘液）（例えば、ブタ回腸粘液（例えば、およそ１歳のブタの近位側結腸からこすり取る））。
【００９６】
本発明は、粘液に対する細菌の付着を検出、特定、および測定するための、ＥＬＩＳＡをベースとする方法の中で、粘液サンプル（例えばブタに由来する粘液）を調製および／または利用する方法について、特定の様式に限定されるものではない。いくつかの実施形態では、コーティングバッファーを用いて、粘液サンプルを懸濁する。上記方法は、コーティングバッファーについて、特定の構成に限定されるものではない。いくつかの実施形態では、上記コーティングバッファーは、１．６ｇのＮａ２ＣＯ３（乾燥）、２．９４ｇのＮａＨＣＯ３、０．２ｇのＮａ−アジド、ｐＨ９．６の１１Ｈ２Ｏを含む（成分を混合することで、最終的にｐＨ９．７になる）。
【００９７】
いくつかの実施形態では、ＥＬＩＳＡをベースとするアッセイで用いるために構成されたプレート（例えば、ウェル）（例えば、９６ウェルプレート）（例えば、９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐプレート）上に、上記粘液サンプルをコーティングする。上記粘液サンプルは、ＥＬＩＳＡをベースとするアッセイで用いるために構成されたプレート上へコーティングする方法について、特定の様式に限定されるものではない。いくつかの実施形態では、試験の直前に、上記粘液サンプルを直接プレート上にコーティングする。いくつかの実施形態では、試験前の長期的な保存を可能にするために、上記粘液サンプルをプレート上にプレコーティングする。上記方法は、ＥＬＩＳＡをベースとするアッセイで用いるために構成されたプレート上へ粘液サンプル（例えば、ブタ回腸に由来する粘液）をプレコーティングする方法について、特定の方法に限定されるものではない。いくつかの実施形態では、粘液が事前にコーティングされた、ＥＬＩＳＡをベースとするアッセイで用いるために構成されたプレートは、プレートを粘液サンプルでコーティングし、続いて、コーティングしたプレートを凍結させることで得られる。いくつかの実施形態では、粘液が事前にコーティングされた、ＥＬＩＳＡをベースとするアッセイで用いるために構成されたプレートは、プレートを粘液サンプルでコーティングし、続いて、コーティングしたプレートを空気乾燥させることで得られる。上記方法は、ＥＬＩＳＡをベースとするアッセイで用いるために構成されたプレート上で、粘液サンプルに水分を含ませて元に戻す方法について、特定の様式に限定されるものではない。いくつかの実施形態では、上記サンプルをリン酸緩衝生理食塩水（例えば、ＰＢＳ）（例えば、８．０ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＣｌ、１．４ｇのＮａ２ＨＰＯ４×２Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＫＨ２ＰＯ４、ａｄ. １０００ｍｌのＭｉｌｌｉＱ  Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．４）に曝すことで、水分を含ませて元に戻す。
【００９８】
粘液に対する細菌の付着を検出、特定、および測定する方法は、特定の一次抗体の種類に限定されるものではない。いくつかの実施形態では、粘液の付着について調べる細菌に対して、上記一次抗体を直接加える。いくつかの実施形態では、上記一次抗体は、Ｅ．ｃｏｌｉのＯ抗原血清型およびＫ抗原血清型に対する、ＨＲＰが結合したポリクローナル抗体である（Ａｃｒｉｓカタログ番号ＢＰ２０２２ＨＲＰ）。いくつかの実施形態では、上記一次抗体は、Ｅ．ｃｏｌｉのＯ抗原血清型およびＫ抗原血清型に対する、ポリクローナル抗体である（Ａｃｒｉｓカタログ番号ＢＰ２０２２）。いくつかの実施形態では、上記一次抗体は、Ｅ．ｃｏｌｉのＯ抗原血清型およびＫ抗原血清型に対する、ビオチンが結合したポリクローナル抗体である（Ａｃｒｉｓカタログ番号ＢＰ１０２１Ｂ）。
【００９９】
粘液に対する細菌の付着を検出、特定、および測定する方法は、特定の二次抗体の種類に限定されるものではない。いくつかの実施形態では、二次抗体は、粘液に結合した細菌に対する一次抗体の結合を検出するために構成されている。従って、いくつかの実施形態では、上記二次抗体を一次抗体に対して直接加える。いくつかの実施形態では、上記二次抗体は、アフィニティー精製されたウサギ抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰである（Ａｃｒｉｓカタログ番号Ｒ１３１７ＨＲＰ）。いくつかの実施形態では、上記二次抗体は、アフィニティー精製されたウサギ抗ヤギＩｇＧ−ＡＰである（Ａｃｒｉｓカタログ番号Ｒ１３１７ＡＰ）。いくつかの実施形態では、上記二次抗体は、ＦＩＴＣが結合した、ポリクローナルな抗ヤギＩｇＧ抗体である（Ｈ＆Ｌ）（Ａｃｒｉｓカタログ番号Ｒ１３  １７Ｆ）。いくつかの実施形態では、上記二次抗体は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉに由来する、ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼである（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｓ２８９０）。いくつかの実施形態では、上記二次抗体は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉに由来する、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼである（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｓ５５１２）。
【０１００】
いくつかの実施形態では、上記一次抗体および二次抗体は、ブロッキング溶液に希釈されている。上記方法は、特定のブロッキング溶液の種類に限定されるものではない。いくつかの実施形態では、上記ブロッキング溶液は、ミルクである。いくつかの実施形態では、上記ブロッキング溶液は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）である。いくつかの実施形態では、上記ブロッキング溶液は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。
【０１０１】
粘液に対する細菌の付着を検出、特定、および測定する方法は、特定の種類の液体基質に限定されるものではない。いくつかの実施形態では、上記液体基質は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｔ４３１９）を用いたアッセイの中で、一次抗体および／または二次抗体の結合の検出を容易にするために構成されている。いくつかの実施形態では、上記液体基質は、ＴＭＢスローキネティック型（ｓｌｏｗ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ｆｏｒｍ）（以下、ＴＭＢスロー）（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｔ０４４０）である。いくつかの実施形態では、上記液体基質は、ＴＭＢスーパーセンシティブ（ｓｕｐｅｒ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）（以下、ＴＭＢスーパー）（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｔ４４４４）である。いくつかの実施形態では、上記液体基質は、Ｐ−ニトロフェニルリン酸（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｎ７６５３）である。いくつかの実施形態では、上記液体基質は、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡｚＢＴＳ；Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ３２１９）＋ＡＢＴＳマイクロウェルエンハンサー（Ｓｉｇｍａカタログ番号ＡＩ２２７）である。
【０１０２】
粘液に対する細菌の付着を検出、特定、および測定する方法は、当該粘液に対する細菌の付着の測定のための、特定の技術に限定されるものではない。いくつかの実施形態では、粘液に対する細菌の付着を、視覚的に測定する（例えば、イメージ（ｉｍａｇｅｒｙ）および／または写真を用いる）。いくつかの実施形態では、粘液に対する細菌の付着を、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて測定する。いくつかの実施形態では、粘液に対する細菌の付着を測定するために用いられる技術によって、例えば、吸光度、蛍光強度、発光、時間分解蛍光（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）、および／または蛍光偏光を、検出、測定および定量する。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、粘液に対する細菌の付着を検出、特定、および測定する方法（例えば、ＥＬＩＳＡをベースとした方法）は、粘液に対する細菌の付着を調節する薬剤を同定するために用いられる。いくつかの実施形態では、本発明における細菌の付着を検出、特定、および／または測定する方法は、最適化された（例えば、第２、第３、第４世代、またはそれを上回る世代）組成物（例えば、前の世代の組成物に比べて、より大きな効能（例えば、細菌の付着を防ぐ効果において）を示す組成物）を作成および／または同定するために用いられる。上記方法は、粘液および／または細胞（例えば、上皮細胞）に対する細菌の付着を調節する薬剤を同定するための、特定の技術に限定されるものではない。いくつかの実施形態では、粘液および／または細胞（例えば、上皮細胞）に対する細菌の付着を調節する潜在的な因子は、細菌サンプルとともに、粘液および／または細胞（例えば、上皮細胞）（例えば、ブタ回腸粘液および／または上皮細胞）によってコーティングしたプレートに、加えられ、続けて、一次抗体および二次抗体、並びに液体基質が加えられる。いくつかの実施形態では、上記薬剤の、調節における活性の特性付けを、上記薬剤の存在下および非存在下での細菌の付着を比較することによって行う。例えば、粘液および／または細胞（例えば、上皮細胞）に対する細菌の付着を増加させる薬剤は、例えば、特定の種類の細菌と、特定の種類の粘液および／または細胞（例えば、上皮細胞）との間の付着を促進する因子として、特性付けされる。粘液および／または細胞（例えば、上皮細胞）に対する細菌の付着を減少させる薬剤は、例えば、特定の種類の細菌と、特定の種類の粘液および／または細胞（例えば、上皮細胞）との間の付着を阻害する因子として、特性付けされる。上記方法は、特定のタイプまたは種類の潜在的な薬剤に限定されるものではない。いくつかの実施形態では、上記薬剤は、例えば、天然に存在する分子、合成によって派生した分子、および組み替えによって派生した分子である。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、上記方法は、予防策または防止策として、粘液および／または上皮細胞との間の付着を調節することで知られている、１つ以上の薬剤を事前に使用する工程を含む。例えば、いくつかの実施形態では、上記方法は、粘液に対する細菌の付着を阻害することで知られている、１つ以上の薬剤を事前に使用する工程を含む。本発明に係る方法は、粘液および／または細胞（例えば、上皮細胞）に対する細菌の付着を阻害することで知られている、特定の種類の薬剤に限定されるものではない。例えば、いくつかの実施形態では、粘液に対する細菌の付着を阻害することで知られている薬剤は、本発明を限定するものではないが、Ｂｉｏ−Ｍｏｓ（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの細胞壁に由来するマンノプロテイン）である。いくつかの実施形態では、粘液に対する細菌の付着を阻害することで知られている薬剤は、本発明に係る、ＥＬＩＳＡをベースとする方法の使用によって同定される。いくつかの実施形態では、上記方法は、粘液に対する細菌の付着を促進することで知られている、１つ以上の薬剤を、共に使用する工程を含む。上記方法は、粘液に対する細菌の付着を促進することで知られている、特定の種類の薬剤に限定されるものではない。いくつかの実施形態では、粘液に対する細菌の付着を促進することで知られている薬剤は、本発明に係る、ＥＬＩＳＡをベースとする方法の使用によって同定される。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、上記方法は、粘液に対する細菌の付着を調節することが知られている、１つ以上の薬剤を、共に使用する工程を含む。例えば、いくつかの実施形態では、上記方法は、粘液に対する細菌の付着を阻害することが知られている、１つ以上の薬剤を共に使用する工程を含む。上記方法は、粘液に対する細菌の付着を阻害することが知られている、特定の種類の薬剤に限定されるものではない。いくつかの実施形態では、粘液に対する細菌の付着を阻害することが知られている薬剤は、Ｂｉｏ−Ｍｏｓ（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの細胞壁に由来するマンノプロテイン）である。いくつかの実施形態では、粘液に対する細菌の付着を阻害することが知られている薬剤は、本発明に係る、ＥＬＩＳＡをベースとする方法の使用によって同定される。いくつかの実施形態では、上記方法は、粘液に対する細菌の付着を促進することが知られている、１つ以上の薬剤を、共に使用する工程を含む。上記方法は、粘液に対する細菌の付着を促進することが知られている、特定の種類の薬剤に限定されるものではない。いくつかの実施形態では、粘液に対する細菌の付着を促進することが知られている薬剤は、本発明に係る、ＥＬＩＳＡをベースとする方法の使用によって同定される。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、上記方法は、感染性の疾患を除去した後に、粘液または上皮細胞に対する細菌の付着を調節することが知られている、１つ以上の薬剤を使用する工程を含む。例えば、いくつかの実施形態では、上記方法は、粘液および／または細胞（例えば、上皮細胞）に対する細菌の付着を阻害することが知られている１つ以上の薬剤を、後から使用する工程を含む。上記方法は、粘液に対する細菌の付着を阻害することが知られている、特定の種類の薬剤に限定されるものではない。いくつかの実施形態では、粘液に対する細菌の付着を阻害することが知られている薬剤は、Ｂｉｏ−Ｍｏｓ（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの細胞壁に由来するマンノプロテイン）である。いくつかの実施形態では、粘液に対する細菌の付着を阻害することが知られている薬剤は、本発明に係る、ＥＬＩＳＡをベースとする方法の使用によって同定される。いくつかの実施形態では、上記方法は、粘液に対する細菌の付着を促進することが知られている、１つ以上の薬剤を、共に使用する工程を含む。上記方法は、粘液に対する細菌の付着を促進することが知られている、特定の種類の薬剤に限定されるものではない。いくつかの実施形態では、粘液に対する細菌の付着を促進することが知られている薬剤は、本発明に係る、ＥＬＩＳＡをベースとする方法の使用によって同定される。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、本発明に係るアッセイは、回腸および／または尿道の細菌（例えば、回腸および／または尿道の粘膜表面にコロニーを形成する細菌）に対する非付着化合物の同定および／または特性付けを行うために用いられる。いくつかの実施形態では、非付着化合物は、同一の疾患および／または徴候および／または症状（（例えば、動物（例えば、乳牛、ブタ等の繁殖力を有する動物）の）例えば、サルモネラ症、子宮筋層炎）を、予防および／または治療するために用いられることで、特定される。いくつかの実施形態では、本発明に係るアッセイは、マイクロプレートリーダーが利用できる場所であれば、いずれの場所でも行うことができ、研究室内（例えば、大学、民間、公立、または他の種類の研究室）、野外（例えば、大農場、農場、またはアッセイを行うユーザーがいる場所）等が挙げられるが、上記の例に限定されるものではない。いくつかの実施形態では、アッセイおよび／またはアッセイの構成要素は、商業的に販売されており、エンドユーザー（例えば、アッセイの購入者）によって、エンドユーザー自身の研究室で利用される（例えば、産物（例えば、非付着化合物）の効能、性能、および／または濃度を調べるために）。従って、本発明は、アッセイのユーザーが、ユーザーのいる場所で（例えば、非付着化合物（例えば、Ｂｉｏ−Ｍｏｓ）を用いる場所で）、化合物（例えば、非付着化合物）の品質特性付けを行うことができる、組成物および方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明に係るアッセイを用いて作成した非付着化合物に関する情報（例えば、効能、品質、濃度等）が収集される。いくつかの実施形態では、情報は、データベース（例えば、オンラインのデータベース）または郵送で収集される。いくつかの実施形態では、非付着化合物に関して収集された上記情報および／またはデータ（例えば、効能、品質、濃度等）は、品質管理計画において利用される。いくつかの実施形態では、非付着化合物に関して収集された上記情報および／またはデータ（例えば、効能、品質、濃度等）は、非付着化合物の提供者および／または製造者によって、当該化合物の活性をモニタリングするために利用される。いくつかの実施形態では、非付着化合物に関して収集された上記情報および／またはデータ（例えば、効能、品質、濃度等）は、非付着化合物が使用される場所において収集された、動物の健康データとともに用いられる（例えば、動物の行動に関する情報を提供するために）。いくつかの実施形態では、本発明に係る、ＥＬＩＳＡをベースとする方法の使用によって同定された薬剤（例えば、粘液に対する細菌の付着を調節する因子として同定された薬剤）の好ましい物理的形状は、動物の餌に直接含有させる、または、動物に直接供給させるために好適な粉末であって、乾燥した、自由に流動する粉末（free-flowing powder）である。他の実施形態では、本発明に係る、ＥＬＩＳＡをベースとする方法の使用によって同定された薬剤（例えば、粘液に対する細菌の付着を調節する因子として同定された薬剤）の好ましい物理的形状は、沈殿させて、または飲料水を介して、投与することができる、液体または沈殿物である。
【０１０８】
本発明に係る、ＥＬＩＳＡをベースとする方法の使用によって同定された薬剤（例えば、粘液に対する細菌の付着を調節する因子として同定された薬剤）を含む、本発明に係る組成物は、家畜、ペット動物、魚、および貝を対象とした、商業的に利用可能なあらゆる飼料に加えることができる。上記飼料の例としては、完全混合飼料（Ｔｏｔａｌ  Ｍｉｘｅｄ  Ｒａｔｉｏｎ（ＴＭＲ））、まぐさ、ペレット、濃縮物、プレミックス、副産物、穀物、醸造かす、糖蜜、繊維、飼い葉、草、干草、穀粒、葉、粗びき粉、可溶物、および栄養補助食品が挙げられるが、上記の例に限定されるものではない。本発明に係る、ＥＬＩＳＡをベースとする方法の使用によって同定された薬剤（例えば、粘液に対する細菌の付着を調節する因子として同定された薬剤）を含む、本発明に係る組成物は、動物の餌（例えば、商業的に利用可能な沈殿した餌）に直接組み込まれる。動物の餌に直接組み込まれる場合、本発明に係る、ＥＬＩＳＡをベースとする方法の使用によって同定された薬剤を含む組成物は、動物、魚、または貝の飼料に対して、餌の約０．０１２５重量％〜約０．４重量％の量で加えられてもよい。いくつかの実施形態では、上記化合物は、動物、魚、または貝の飼料に対して、餌の約０．０２５重量％〜約０．２重量％の量で加えられてもよい。または、本発明に係る組成物を、栄養補助食品として、動物に直接与えてもよい（例えば、１日あたりの動物１匹あたりに約２．５〜約２０グラムの量で与える）。当業者であれば、動物の種、サイズ、および、本発明に係る組成物が加えられる飼料の種類に応じて、与える組成物の量を変更できることを、十分に理解できる。
【０１０９】
本発明に係る、ＥＬＩＳＡをベースとする方法の使用によって同定された薬剤（例えば、粘液に対する細菌の付着を調節する因子として同定された薬剤）を含む、本発明に係る組成物は、あらゆる動物に与えることができる。上記動物の例としては、反芻動物およびウマ科の動物が挙げられるが、上記の例に限定されるものではない。餌に混合される場合、または栄養補助食品として与えられる場合、本発明に係る、ＥＬＩＳＡをベースとする方法の使用によって同定された薬剤（例えば、粘液に対する細菌の付着を調節する因子として同定された薬剤）を含む、本発明に係る組成物は、動物の体内で、粘液に対する細菌の付着を調節し（例えば、薬剤に応じて増加または減少させ）、行動および健康を改善し、疾患の発生率を低減させる。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、本発明は、粘液に対する細菌の付着を調節する（例えば、阻害する、促進する）ことで知られる薬剤を対象に投与することで、病原菌によって引き起こされる疾患を治療するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、上記薬剤は、本発明に係る、ＥＬＩＳＡをベースとする方法の使用によって同定される。いくつかの実施形態では、上記疾患は、Bacillus anthracisによって引き起こされ（例えば、皮膚炭そ、肺炭そ、胃腸炭そ）、いくつかの実施形態では、上記方法は、ペニシリン、ドキシサイクリン、および／またはシプロフロキサシンの共投与を含む。いくつかの実施形態では、上記疾患は、Bordetella pertussisによって引き起こされ（例えば、百日咳、続発性細菌性肺炎）、いくつかの実施形態では、上記方法は、マクロライド系抗生物質（例えば、アジスロマイシン、エリスロマイシン、クラリスロマイシン）の共投与を含む。いくつかの実施形態では、上記疾患は、Borrelia burgdorferiによって引き起こされ（例えば、ライム病）、いくつかの実施形態では、上記方法は、セファロスポリン、アモキシシリン、および／またはドキシサイクリンの共投与を含む。いくつかの実施形態では、上記疾患は、ブルセラ病原菌（例えば、Brucella abortus、Brucella canis、Brucella melitensis、Brucella suis）によって引き起こされ（例えば、ブルセラ症）、いくつかの実施形態では、上記方法は、ドキシサイクリン、ストレプトマイシン、および／またはゲンタマイシンの共投与を含む。いくつかの実施形態では、上記疾患は、Campylobacter jejuniによって引き起こされ（例えば、急性腸炎）、いくつかの実施形態では、上記方法は、シプロフロキサシンの共投与を含む。いくつかの実施形態では、上記疾患は、Chlamydia pneumoniaeによって引き起こされ（例えば、市中呼吸器感染）、いくつかの実施形態では、上記方法は、ドキシサイクリン、および／またはエリスロマイシンの共投与を含む。いくつかの実施形態では、上記疾患は、Chlamydia psittaciによって引き起こされ（例えば、オウム病）、いくつかの実施形態では、上記方法は、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、および／またはエリスロマイシンの共投与を含む。いくつかの実施形態では、上記疾患は、Chlamydia trachomatisによって引き起こされ（例えば、非淋菌性尿道炎（ＮＧＵ）、トラコーマ、新生児の封入体性結膜炎（ＩＣＮ）、鼠径リンパ肉芽腫（ＬＧＶ））、いくつかの実施形態では、上記方法は、アジスロマイシン、エリスロマイシン、テトラサイクリン、および／またはドキシサイクリンの共投与を含む。いくつかの実施形態では、上記疾患は、Clostridium botulinum（例えば、ボツリヌス中毒症）、Clostridium difficile、Clostridium perfringens、clostridium tetani（例えば、破傷風）、Corynebacterium diphteriae（例えば、ジフテリア）、Enterococcus faecalis、Enterococcus faecum、Escherichia coli、Francisella tularensis（例えば、ツラレミア）、Haemophilus influenzae、Helicobacter pylori、Legionella pneumophila（例えば、レジオネラ症）、Leptospira interrogans、Listeria monocytogenes、Mycobacterium leprae（例えば、ハンセン病）、Mycobacterium tuberculosis（例えば、結核）、Mycoplasma pneumoniae、Neisseria gonorrhoeae、Neisseria meningitidis、Pseudomonas aeruginosa、Rickettsia rickettsii、Salmonella typhi、Shigella sonnei、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、Staphylococcus saprophyticus、Streptococcus agalactiae、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus pyogenes、Treponema pallidum、Vibrio cholerae、およびYersinia pestis（例えば、ペスト）によって引き起こされる。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、本発明は、ユーザーによる本発明に係る方法（例えば、粘液に対する細菌の付着を検出、特定、および測定するための方法）の実行を可能にするために構成されたキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、以下に示す１つ以上の構成要素を含む。当該構成要素としては、粘液サンプル、粘液サンプルによってコーティングされたプレート、細菌、一次抗体、二次抗体、液体基質、洗浄液、ＥＬＩＳＡをベースとするアッセイを読み取るために構成された装置、取扱説明書、粘液に対する細菌の付着を減少させることが知られている薬剤（例えば、Ｂｉｏ−Ｍｏｓ）（例えば、本発明に係る、ＥＬＩＳＡをベースとする方法の使用によって同定された薬剤）、粘液に対する細菌の付着を増加させることが知られている薬剤（例えば、本発明に係る、ＥＬＩＳＡをベースとする方法の使用によって同定された薬剤）、および追加の治療薬（additional treatment agent）（例えば、抗生物質）が挙げられる。
【０１１２】
〔実験〕
以下の実施例は、ある好ましい実施形態および本発明の側面を、実証、および、さらに例証するために提供されるものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【０１１３】
＜実施例１、腸内物質（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍａｔｔｅｒ）に対する細菌の付着における、比色ＥＬＩＳＡ、および、放射活性物質による検出において用いられる材料および方法の比較＞
細菌株。２つのＥ．ｃｏｌｉ株（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＬＩ８４およびＡＬＩ４４６）を発達計画（development project）のために選択した。前者は元々、疾患の鳥から単離されたものであり、後者の株は、下痢のブタから単離されたものである。上記の株は、ブタの粘液に対して付着を示すため、選択された。上記細菌をＬＢ培地中で増殖させ、実験の前日に未使用の培地に移した（培養物：培地＝１：１０）。細菌の数は、培養時間に従って推定した。
【０１１４】
抗体。抗体は、ドイツのＡｃｒｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ＧｍｂＨ、およびドイツのＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。一次抗体には、Ｅ．ｃｏｌｉのＯ抗原血清型およびＫ抗原血清型に対して特異的な、ＨＲＰが結合したポリクローナル抗体（Ａｃｒｉｓカタログ番号ＢＰ２０２２ＨＲＰ）；Ｅ．ｃｏｌｉのＯ抗原血清型およびＫ抗原血清型に対して特異的なポリクローナル抗体（Ａｃｒｉｓカタログ番号ＢＰ２０２２）；および、Ｅ．ｃｏｌｉのＯ抗原血清型およびＫ抗原血清型に対して特異的な、ビオチンが結合したポリクローナル抗体（Ａｃｒｉｓカタログ番号ＢＰ１０２１Ｂ）が含まれる。
【０１１５】
二次抗体には、アフィニティー精製されたウサギ抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ａｃｒｉｓカタログ番号Ｒ１３１７ＨＲＰ）；アフィニティー精製されたウサギ抗ヤギＩｇＧ−ＡＰ（Ａｃｒｉｓカタログ番号Ｒ１３１７ＡＰ）；ＦＩＴＣが結合した、ポリクローナルな抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｈ＆Ｌ）（Ａｃｒｉｓカタログ番号Ｒ１３  １７Ｆ）；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉに由来する、ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｓ２８９０）；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉに由来する、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｓ５５１２）が含まれる。ＥＬＩＳＡ基質は、ドイツのＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから、すぐに使える溶液として購入した：３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｔ４３１９）；ＴＭＢスローキネティック型（以下、ＴＭＢスロー）（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｔ０４４０）；ＴＭＢスーパーセンシティブ（（以下、ＴＭＢスーパー）（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｔ４４４４）；Ｐ−ニトロフェニルリン酸（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｎ７６５３）；２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡｚＢＴＳ；Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ３２１９）＋ＡＢＴＳマイクロウェルエンハンサー（Ｓｉｇｍａカタログ番号ＡＩ２２７）。
【０１１６】
バッファー。最後の洗浄以外では、ＨＥＰＥＳ−Ｈａｎｋｓバッファー（ｐＨ７．４）をウェルの洗浄のために用いた。最後の洗浄では、ＥＬＩＳＡにおいて赤く着色したＨＥＰＥＳ−Ｈａｎｋｓによるかく乱を避けるため、ＰＢＳを用いた。いくつかの実施形態では、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）は、ＨＥＰＥＳ−Ｈａｎｋｓバッファーの代わりに、全ての工程に含まれる。
【０１１７】
プレート。ＥＬＩＳＡ実験には、９６ウェル免疫プレートが用いられる（ＭａｘｉＳｏｒｐ、Ｎｕｎｃ、デンマーク、本報告では、以下「ＭａｘｉＳｏｒｐプレート」）。シンチレーション実験には、シンチレーションカウンターにおいて用いるために、ポリエチレンテレフタレートマイクロタイタープレートが用いられる（９６ウェルＰＥＴサンプルプレート、１４５０−４０１；Ｗａｌｌａｃ  Ｏｙ、Ｔｕｒｋｕ；本明細書では「ソフトプレート」と呼ぶ）。
【０１１８】
以下に記載する、従来型の放射活性物質結合／付着アッセイは、比色ＥＬＩＳＡに対するコントロールとして用いられる。
【０１１９】
放射活性物質付着アッセイのための、放射活性物質による細菌の標識。細菌を＋３７℃で、一晩かけて増殖させ、細菌懸濁液をＬＢの新しいバッチ中に１：１０で希釈し、メチル−１，−２，３Ｈチミジン（１１７  Ｉ−ｌＣｉ／ｍｍｏｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）を加えた。上記細菌を、＋３７℃で２時間培養し、５分間の３０００ｇでの遠心分離によって採集した。細菌の沈殿物を、ＨＥＰＥＳ−ＨａｎｋｓバッファーまたはＰＢＳに再び懸濁し、付着アッセイに用いた。
【０１２０】
放射活性物質付着アッセイ。２００ｕｌの希釈した細菌懸濁液を、マイクロタイターウェルに加え、上記プレートを＋３７℃で１時間培養した。結合しなかった細菌は、３００μｌのＨＥＰＥＳ−ＨａｎｋｓバッファーまたはＰＢＳで３回洗浄して取り除いた。２５０ｕｌのシンチレーション液を加え、シンチレーションカウンターを用いて放射活性を測定した。
【０１２１】
粘液の単離および固定化。上記プレートを、異なる動物に由来する、異なる濃度の粘液を用いてコーティングした。他に記載がない場合は、１歳のブタの近位側回腸に由来する粘液を用いた。上記粘液を、腸の表面からこすり取り、洗浄した。精製していない粘液抽出物を、使用するまでの間、−８０℃で保存した。コーティングのために、炭酸ナトリウムバッファー（コーティングバッファー、ｐＨ９．６）を用いて、粘液のタンパク質濃度を０．０〜０．２ｍｇ／ｍｌに調整し、細菌の付着に最適な粘液濃度を調べた。３００μｌまたは２００μｌの粘液を、各３５０ｕｌのウェルに導入することで、粘液溶液をプレートに固定化した。その後、上記プレートを＋４℃で一晩かけてインキュベートした。余分な粘液は、３００μｌのＨＥＰＥＳ−ＨａｎｋｓバッファーまたはＰＢＳで２回洗浄して、マイクロタイタープレートから取り除いた。
【０１２２】
ＥＬＩＳＡ基質を用いた、Ｅ．ｃｏｌｉによる非特異的な発色を調べるために用いるマイクロチューブ法。Ｅ．ｃｏｌｉの新鮮な培養物（〜１０８の細菌／ｍｌ）を、マイクロチューブに分注した（〜１０７／チューブ）。上記チューブを５分／３０００ｇで遠心分離し、上清を除去した。上記細菌を７００μｌのＥＬＩＳＡ基質に懸濁した。５分後から１５分ごとに、３時間経過するまで、３７０、４０５、および６３０ｎｍにおける上記懸濁液の吸光度を、分光光度計を用いて読み取った。
【０１２３】
一次抗体の特異性を調べるために用いたＦＩＴＣ法。蛍光顕微鏡を用いて、一次抗体（ＦＩＴＣが結合した二次抗体に適合する、ポリクローナル抗Ｅ．ｃｏｌｉ抗体、ＢＰ２０２２）の特異性を調べた。１０８の細菌を、各マイクロチューブに導入し、１ｍｌのＰＢＳで３回洗浄した（各洗浄の間に、３０００ｇ／５分の遠心分離を行った）。１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に１：１００、１：５００、１：１０００で希釈した一次抗体を、各チューブに導入し、室温で４５分間インキュベートした。ネガティブコントロールとして、１％ＢＳＡ／ＰＢＳを用いた。上記細菌を、ＰＢＳを用いて３回洗浄し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に１：１００、１：５００、および１：１０００で希釈した液中に、二次抗体（ＦＩＴＣが結合したウサギ抗ヤギＩｇＧ）を導入した。上記チューブを、室温で１時間インキュベートした。上記細菌を、ＰＢＳを用いて２回洗浄し、Ｗｈａｔｍａｎ  ＢＬＡＣＫ  ＮＵＣＬＥＰＯＲＥメンブレン（孔径０．２μｍ）を用いて濾過した。上記フィルターを、ＰＢＳを用いて２回洗浄し、顕微鏡用スライドに移動させ、液浸油の液滴を用いて密封した。上記スライドは、暗所に保存した。
【０１２４】
基本的なＥＬＩＳＡプロトコル。基本的なプロトコルを以下に示すが、各実験における正確な条件は、以下に記載される結果の文脈中で示される。バッファーに懸濁した０〜１０７の細菌を、粘液でコーティングしたウェルに導入した。他に記載がない限り、０．１ｍｇ／ｍｌの粘液濃度、および１０７の細菌／ウェルを用いた。いくつかの実験では、以下に示す濃度でＰＢＳ中に希釈した細菌とともに、Ｂｉｏ−Ｍｏｓ（Ａｌｌｔｅｃｈ、Ｎｉｃｈｏｌａｓｖｉｌｌｅ、ＫＹ）を加えた。
【０１２５】
上記プレートを、＋３７℃または室温で１時間培養した。上記プレートを、バッファー（ＰＢＳまたはＨＥＰＥＳ−Ｈａｎｋｓ、３００ｕｌ）を用いて、３回洗浄した。ＰＢＳ中に、ミルク、ウシ胎仔血清、またはＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）のいずれかを加えることで、非特異的な結合をブロックした。上記プレートを、＋３７℃または室温で１時間培養した。上記ブロッキングバッファーを除去し、１：２００から１：１０００００の間の希釈液中に、一次抗体を導入した。上記抗体を、ブロッキングバッファー中に希釈した。上記プレートを、再度＋３７℃または室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳまたはＨＥＰＥＳ−Ｈａｎｋｓを用いて、３回洗浄した。二次抗体を、ブロッキングバッファー中に１：１０００から１：１０００００の間で希釈した液中に加えた。上記プレートを、＋３７℃または室温で１時間インキュベートした。最後の培養の後、結合していない全ての二次抗体を完全に除去することを保証するために、上記プレートを、ＰＢＳ（３００ｕｌ／ウェル）を用いて５回洗浄した。基質を加え、上記プレートについて、ＥＬＩＳＡリーダーを用いた読み取り、および／または、撮影を行った。
【０１２６】
＜実施例２、腸粘液の濃度＞
上記コーティング懸濁液における粘液の濃度を特定するために、異なる粘液濃度の懸濁液を用いて、ウェルをコーティングした。粘液濃度は、アッセイの信頼性にとって重要であると特定された変量（variable）であった（例えば、粘液濃度が低すぎる場合、粘液の代わりに、細菌がプレートに結合する可能性がある）。基本的な方法：放射活性物質付着アッセイ（上記材料および方法を参照）。プレート：９６ウェルＰＥＴプレート（ソフトプレート）；粘液：ブタ近位側回腸、０．０〜０．２ｍｇタンパク質／ｍｌコーティングバッファー；細菌：一方のプレート上にはＥ．ｃｏｌｉ  ＡＬＩ８４株、もう一方のプレート上にはＥ．ｃｏｌｉ  ＡＬＩ４４６株；１０７の細菌／ウェル。バッファー：ＨＥＰＥＳ−Ｈａｎｋｓ；ブロッキング：ブロッキングなし；一次抗体：なし；二次抗体：なし；培養温度：＋３７℃。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＬＩ８４およびＡＬＩ４４６の粘液濃度の効果を、図１に示す放射活性物質で標識されている細菌によって測定した。
【０１２７】
図１は、上記細菌が、粘液でコーティングされていないウェルに対して最適な付着を示したことを示している。上記細菌が粘液に対して付着し、プレートに対して付着しないことを検証するために、比較的高い粘液濃度（０．１ｍｇタンパク質／ｍｌコーティングバッファー）を特定し、当該粘液濃度を次の実験のために選択した。従って、いくつかの実施形態では、本発明は、ウェルをコーティングするために好適な粘液濃度（例えば、プレートのウェルに対する細菌の結合を低減および／または排除できる量）を用いる。
【０１２８】
＜実施例３、細菌の付着に対する、一次抗体の阻害効果の分析＞
一次抗体が、細菌の付着に対して影響を与えるかどうかを調べるために、粘液でコーティングしたウェル中の細菌を、抗体なし〜１：２００である抗体希釈液を用いて培養した。基本的な方法：放射活性物質付着アッセイ（材料および方法を参照）。プレート：９６ウェルＰＥＴプレート（ソフトプレート）；粘液：ブタ近位側回腸；細菌：一方のプレート上にはＥ．ｃｏｌｉ  ＡＬＩ８４株、もう一方のプレート上にはＥ．ｃｏｌｉ  ＡＬＩ４４６株。１０７の細菌／ウェル；バッファー：ＨＥＰＥＳ−Ｈａｎｋｓ；ブロッキング：ブロッキングなし；一次抗体：ＨＲＰ＝ＨＲＰが結合した抗Ｅ．ｃｏｌｉ抗体；ＢＰ２０２２＝非結合の抗Ｅ．ｃｏｌｉ抗体、ビオチン＝ビオチンが結合した抗Ｅ．ｃｏｌｉ抗体；二次抗体：二次抗体なし；培養温度：＋３７℃。
【０１２９】
図２および３に示されているように、最も低い濃度（１：２００００の希釈）では、異なる最初の２つの一次抗体によって、粘液に対する細菌の付着が促進されたが、１：２００の希釈では、付着がわずかに低減された。最初の２つの抗体のＦｃ領域は、粘液に結合しておらず、一方、粘液に対する当該領域の結合は、３番目の抗体中のビオチンによってブロックされた可能性がある。低い濃度では、最初の２つの抗体は、細菌および粘液と結合する可能性がある（細菌と結合するＦａｂ領域、および粘液と結合するＦｃ領域）。高い濃度では（１：２００の希釈）、細菌の表面上の、粘液に結合する部位（すなわち、粘液に対する細菌の結合部位）が、抗体によって明らかにブロックされているので、粘液に対する細菌の付着が低減される。ビオチンが結合した抗体は、非常に小さい効果を有し、付着を促進すると考えられる。さらに、本実験では、一次抗体を細菌とともに加えたが、本明細書中で記載される比色付着ＥＬＩＳＡ法では、まず細菌のみを１時間培養する。従って、いくつかの実施形態では、細菌が粘液に付着する場合には、細菌の付着／結合に対する一次抗体の効果（例えば、抗体が、実際に細菌の付着を増加または減少させる）は、低減および／または排除されている（例えば、抗体が存在しない）。また、いくつかの実施形態では、非特異的な結合をブロックするために、ウシ胎仔血清、または他のブロッキング剤を利用することができる。従って、いくつかの実施形態では、本発明によって、従来の放射活性物質付着アッセイにおいて、ＨＲＰが結合した一次抗体、および何も結合していない一次抗体は、粘液に対する細菌の付着を変化させる（例えば、促進または阻害する）こと、並びに、本発明に係る比色アッセイでは、当該変化をもたらさないことが示される。さらに、調べた全ての抗体は、本明細書中で記載される方法に好適であると考えられるので、本発明によって、本発明に係る結合／付着アッセイは、幅広い抗体（例えば、何も結合していない抗体、および結合した抗体）に好適であることが示される。
【０１３０】
＜実施例４、ＥＬＩＳＡ基質における、Ｅ．ｃｏｌｉによる非特異的発色＞
２つの選択されたＥ．ｃｏｌｉの株における、ＥＬＩＳＡ基質における非特異的呈色反応を生ずる能力を調べた。上記実験は、基質とともに細菌を培養したマイクロチューブ中で行われた。マイクロチューブ法（実施例１の材料および方法を参照）を用いた。
【０１３１】
図４および５に示されているように、細菌によって生じた色はごくわずかであり、基質のみの発色と同程度であった。約５分〜３０分の時間内では、いずれの基質も、大幅な呈色反応を生じなかった。従って、いくつかの実施形態では、本発明によって、本発明書で記載される、それぞれのＥＬＩＳＡ基質は、本発明に係る付着アッセイにおける使用に好適であることが示される。
【０１３２】
＜実施例５、ＥＬＩＳＡ基質における、粘液による非特異的発色＞
１歳のブタに由来する５つの粘液サンプルを、ＥＬＩＳＡ基質における非特異的呈色を生じる能力について調べた。実施例１の材料および方法に記載されているように、ＥＬＩＳＡを行った。プレート：ソフトプレート；粘液：ブタ近位側回腸、回腸中央部および遠位回腸、並びに、近接結腸および遠位結腸；細菌：細菌なし；抗体：抗体なし；バッファー：ＰＢＳ；ブロッキング：１％ＢＳＡ／ＰＢＳで１時間；培養温度：＋３７℃；基質：図６に示されている６つの基質全て。
【０１３３】
図６に示されているように、ブタ回腸は、パラ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）によって、呈色反応を生じたが、ブタ結腸は呈色反応を生じなかった。他の基質は、粘液とは反応しなかった。ｐＮＰＰによる発色は、回腸粘液中に元々存在するリン酸によるものである可能性がある。従って、本発明によって、いくつかの実施形態では、ブタ回腸は、パラ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）によって呈色反応を生じるが、ブタ結腸は呈色反応を生じないことが示される。
【０１３４】
＜実施例６、一次抗体の特異性の実験＞
蛍光顕微鏡を用いて、一次抗体の特異性を調べた。端的に述べると、細菌をＢＳＡによってブロックし、最初に一次抗体とともにインキュベートし、その後ＦＩＴＣが結合した二次抗体とともにインキュベートした。蛍光は、蛍光顕微鏡を用いて、視覚化した。実施例１の材料および方法に記載されているＦＩＴＣ法を用いた。
【０１３５】
二次抗体を加えた全てのサンプルは、一次抗体が存在しない場合でも、ある程度の蛍光を示し、上記二次抗体の濃度は、サンプル間で最も顕著な差をもたらした。従って、本発明によって、いくつかの実施形態では、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および／またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いることで、非特異的な結合を減衰および／または阻害できることが示される。
【０１３６】
＜実施例７、粘液またはプレートに対する抗体の非特異的結合＞
細菌が存在しない場合に、プレートまたは粘液に対して抗体が非特異的に結合するかどうか調べるため、粘液でコーティングしたプレートに、一次抗体および二次抗体を加えた。実施例１に記載されているＥＬＩＳＡ法を用いた。非特異的な結合をブロックするためにＢＳＡを用いた。プレート：ＭａｘｉＳｏｒｐプレート；粘液：ブタ近位側回腸；細菌：細菌なし；ブロッキング：ＰＢＳに１％ＢＳＡを加えたもの；バッファー：ＰＢＳ；一次抗体：表１参照；ＰＢＳに１％ＢＳＡを加えたものにおいて、異なる希釈率で２００ｕｌ；二次抗体：表１参照；ＰＢＳに１％ＢＳＡを加えたものにおいて、異なる希釈率で２００ｕｌ；培養温度：＋３７℃；基質：ＴＭＢ（ＨＲＰが結合した二次抗体を対象とする）、ｐＮＰＰ（ＡＰが結合した二次抗体を対象とする）。図７および８には、粘液またはプレートに対する抗体の非特異的な結合を調べるためのプレートのレイアウト、および非特異的な結合の結果がそれぞれ示されている。本実験には細菌を使用しなかった。従って、いくつかの実施形態では、本発明によって、粘液またはプレートに対する、抗体の強い非特異的な結合が示される。いくつかの実施形態では、ＢＳＡは、本発明に係る付着アッセイにおいて適切なブロッキング剤ではない。
【０１３７】
＜実施例８、抗体の非特異的な結合を防ぐブロッキング剤の実験＞
細菌または一次抗体を加えない場合、二次抗体は、粘液／プレートに対して強く結合した（図８参照）。そこで、ＢＳＡの代わりに非特異的な結合をブロックするものとして、ミルクおよびウシ胎仔血清を調べた。実施例１に記載されている基本的なＥＬＩＳＡ法を用いた。プレート：ＭａｘｉＳｏｒｐプレート；粘液：ブタ近位側回腸；ブロッキング：ＰＢＳに５％脱脂粉乳を加えたもの、またはＰＢＳに１０％ウシ胎仔血清を加えたもの、＋３７℃で１時間；バッファー：ＰＢＳ；一次抗体：表２参照；ブロッキングバッファーにおいて、異なる希釈率で２００ｕｌ；二次抗体：表２参照；ブロッキングバッファーにおいて、異なる希釈率で２００ｕｌ；ストレプトアビジンが結合した二次抗体は、製造者の推奨に従って、１：１０００および１：１００００の希釈率で用いた。培養温度：＋３７℃；基質：ＴＭＢ。図９は本アッセイのためのプレートのレイアウトを示している。一次抗体：ＨＲＰ＝ＨＲＰが結合した一次抗体、ＢＰ２０２２＝何も結合していないポリクローナル抗Ｅ．ｃｏｌｉ一次抗体；ビオチン＝ビオチンが結合した抗Ｅ．ｃｏｌｉ一次抗体。二次抗体：ＨＲＰ＝ＨＲＰが結合したＩｇＧ；ＳｔｒＨＲＰ＝ＨＲＰで標識されているストレプトアビジン。本実験では、細菌を使用していない。
【０１３８】
図１０に示されているように、ミルクに比べて、ウシ胎仔血清は、より効率的に非特異的な結合をブロックした。非特異的な結合は、ビオチン−ストレプトアビジン複合体を用いた場合、ごくわずかであったが、ＢＰ２０２２一次抗体を用いた場合、最も強かった。本実験に基づき、ＰＢＳに１０％ウシ胎仔血清を加えたものが、実験でのブロッキングのために選択された。従って、本発明によって、ＰＢＳに１０％ウシ胎仔血清を加えたものが、本発明に係る付着アッセイに好適なブロッキング剤であることが示される。
【０１３９】
＜実施例９、粘液でコーティングしたプレートに対する細菌の結合＞
抗体の希釈および細菌の数／ウェルを最適化することによって、ＥＬＩＳＡのプロトコル全体の最適化（粘液および細菌の両方を含む）を行った。実施例１に記載されている基本的なＥＬＩＳＡ法を用いた。プレート：ＭａｘｉＳｏｒｐプレート；粘液：ブタ近位側回腸；細菌：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＬＩ８４株、およびＡＬＩ４４６株、細菌の数／ウェルは図１１に示されている。バッファー：ＨＥＰＥＳ−Ｈａｎｋｓ／ＰＢＳ；ブロッキング：ＰＢＳに１０％ウシ胎仔血清を加えたもの；一次抗体：表２参照；ブロッキングバッファーにおいて、異なる希釈率で２００ｕｌ（図１１および１３）；二次抗体：表２参照；ブロッキングバッファーにおいて、異なる希釈率で２００ｕｌ（図１３）；培養温度：＋３７℃；基質：ＴＭＢ。
【０１４０】
図１２および１４に示されているように、ビオチン−ストレプトアビジン複合体は、ＨＲＰが結合した一次抗体に比べて、より特異的であった。非特異的な結合は、全く観察されなかった（図１４、コントロール、２つの分離した列を参照）。上記結果によって、実施例８で得られた結果が確かめられた。
【０１４１】
従って、ビオチン−ストレプトアビジンの組み合わせのみを用いて続けることが決定された。図１４は、１：１０００の希釈によって、より少ない数の細菌でも反応を起こすことができることを示しており、それゆえ、当該希釈が、さらなる実験のために選択された。一次抗体の希釈も、同様に最適化した。図１４では、二次抗体（ストレプトアビジン−ＨＲＰ）を１：１００００に希釈すると、少ない数の細菌を検出するためには薄すぎることを示している（従って、いくつかの実施形態では、１：１０００の希釈を用いた）。
【０１４２】
ビオチン−ストレプトアビジンの組み合わせは、他の抗体に比べて、より特異的であり、次の実験で用いられた。従って、本発明によって、いくつかの実施形態では、１０７の細菌／ウェルが、本発明に係る付着アッセイで利用するのに最適な数であり、より多い数（例えば、１０７の細菌／ウェルを上回る数（例えば、１０８の細菌、１０９の細菌、１０１０の細菌、またはそれを上回る数））、または、より少ない数（例えば、１０７の細菌／ウェルを下回る数（例えば、１０６の細菌、１０５の細菌、１０４の細菌、またはそれを下回る数））でも利用できることが示される。本実験においては、１：１０００から１：１００００の一次抗体の希釈が最適であったが、一次抗体の量は、当該範囲を上回る、または、下回るものであってもよい。いくつかの実施形態では、一次抗体の量は、呈色反応を制限しないように選択される。
【０１４３】
＜実施例１０、細菌の数の検出における、ＥＬＩＳＡの線形性＞
ＥＬＩＳＡ法における、線形性を示す範囲（ｌｉｎｅａｒ  ｒａｎｇｅ）を推定するために、異なる細菌の数／ウェルで、ＥＬＩＳＡを行った。実施例１に記載されている基本的なＥＬＩＳＡ法を用いた。プレート：ＭａｘｉＳｏｒｐプレート；粘液：ブタ近位側回腸；細菌：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＬＩ８４株、１０７の細菌／ウェル；バッファー：ＰＢＳ；Ｂｉｏ−Ｍｏｓ：なし；ブロッキング：１０％ウシ胎仔血清；一次抗体：ビオチンを結合した一次抗体、ブロッキングバッファー中で１：１０００の希釈；二次抗体：ＨＲＰが結合したストレプトアビジン、ブロッキングバッファー中で１：１０００の希釈；培養温度：一方のプレートは＋３７℃、もう一方のプレートは室温；室温で試薬；基質：ＴＭＢ。
【０１４４】
６２０ｎｍにおける吸光度を、細菌の数と対比してプロットした。細菌の数が、１０６の細菌／ウェルまでは、関係性は線形であるが（図１６参照）、１０６から１０８までは、最も適合する近似曲線は対数曲線であった（図１５参照）。したがって、本発明によって、ある細菌の数／ウェル、細菌に対して結合する粘液の能力は、結合部位が飽和するにつれて減少することが示される。
【０１４５】
従って、いくつかの実施形態では、本発明に係るアッセイは、細菌の細胞数／ウェルの範囲（例えば、１つのウェルあたり０から約１０６の細菌）において、線形性を示す。いくつかの実施形態では、本発明は、１つのウェルあたりに付着する細菌についての高感度の計算を提供する。いくつかの実施形態では、本発明に係る方法は標準化される（例えば、再現可能な比較結果を得るため）。
【０１４６】
＜実施例１１、細菌の付着に対するＢｉｏ−Ｍｏｓの効果＞
ＥＬＩＳＡ法の線形性および分解能（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）を調べるために、異なる濃度のＢｉｏ−Ｍｏｓを用いて、粘液に対する細菌細胞の付着をブロックした。実施例１に記載されている基本的な比色ＥＬＩＳＡを用いて得られた結果を、同様に実施例１に記載されている放射活性物質付着アッセイを用いて得られた結果を比較した。プレート：ＭａｘｉＳｏｒｐプレートおよびソフトプレート；粘液：ブタ近位側回腸；細菌：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＬＩ８４株およびＡＬＩ４４６株、〜１０７の細菌／ウェル。プレートが同一のものであるということを保証するために、両方のプレートに対して、同一の放射活性物質で標識されている細菌の懸濁液を用いた；バッファー：ＨＥＰＥＳ−Ｈａｎｋｓ、ＰＢＳ；Ｂｉｏ−Ｍｏｓ：濃度０〜２０ｇ／ｌ、ＰＢＳ中に希釈；ブロッキング（ＭａｘｉＳｏｒｐプレートのみ）：ＰＢＳ中に１０％ウシ胎仔血清を加えたもの；一次抗体（ＭａｘｉＳｏｒｐプレートのみ）：ビオチンを結合した一次抗体（ブロッキングバッファー中で１：１０００）；二次抗体（ＭａｘｉＳｏｒｐプレートのみ）：ＨＲＰが結合したストレプトアビジン（ブロッキングバッファー中で１：１０００）；培養温度：＋３７℃；基質：ＴＭＢ。
【０１４７】
図１７Ａおよび１７Ｂに示されているように、放射性アッセイでは、異なる濃度のＢｉｏ−Ｍｏｓを用いた場合の、細菌の付着における差が検出された。ＥＬＩＳＡを行った後、シンチレーションカウンターを用いて、両方のプレートを測定した（５分／ウェル）。図１７Ｂは、ＥＬＩＳＡを行った後はシンチレーション計数がより低いことを示しており、ＥＬＩＳＡの間に細菌が洗い流されたことを示唆している。しかし、Ｂｉｏ−Ｍｏｓの明らかな効果が観察された。
【０１４８】
細菌が存在しないウェル（コントロール）と、最大濃度のＢｉｏ−Ｍｏｓを含むウェル（最も少ない数の細菌）との間の差を検出できたが（図１７Ａ参照）、一方、最大濃度のＢｉｏ−Ｍｏｓを含むウェル（最も少ない数の細菌）のシンチレーション計数は、細菌が存在しないコントロールと近いという点において、比色ＥＬＩＳＡ法の予測されなかった特徴が特定された。従って、本発明は、いくつかの実施形態では、最大濃度のＢｉｏ−Ｍｏｓを含むウェル（最も少ない数の細菌）と、細菌が存在しないウェル（コントロール）との間の付着／付着の差を検出することができるＥＬＩＳＡ法を提供する（例えば、当該濃度の範囲において、放射性アッセイに比べて、比色アッセイはより感度が高い）。
【０１４９】
＜実施例１２、付着を変化させる効果を検出するために重要な細菌の数＞
本実験の目的は、Ｂｉｏ−Ｍｏｓの効果を検出するための細菌の数／ウェルを見つけることである。基本的な方法；ＥＬＩＳＡ（材料および方法を参照）；プレート：ＭａｘｉＳｏｒｐプレート；粘液：ブタ近位側回腸；細菌：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＬＩ８４株およびＡＬＩ４４６株、０〜１０８／ウェル；Ｂｉｏ−Ｍｏｓ：濃度０〜２０ｇ／ｌ、ＰＢＳ中に希釈；バッファー：ＰＢＳ；ブロッキング：１０％ウシ胎仔血清；一次抗体：ビオチンを結合した一次抗体、ブロッキングバッファー中で１：１０００の希釈；二次抗体：ＨＲＰが結合したストレプトアビジン、ブロッキングバッファー中で１：１０００の希釈；培養温度：＋３７℃；基質：ＴＭＢ。
【０１５０】
図１８〜１９に示されているように、いくつかの実施形態では、検出可能な差を得るためには、細菌の数／ウェルは１０５を超えるべきであると考えられた。１０７の細菌／ウェルを用いた場合は、明らかな差が見られた。１０８の細菌／ウェルを用いた場合でも、明らかな差が得られるが、非常に速く反応が終点に達し、従って、全てのウェルに同時に基質を加えることができないため、変化が生じうる。同様に、非常に多数の細菌／ウェルを用いる可能性もあるが、抗体濃度、もしくは基質濃度、または粘液の結合部位は、制限される。それゆえ、次の実験は、１０７までの細菌／ウェルを用いて行った。どちらのＥ．ｃｏｌｉ株においても、非常に低い濃度のＢｉｏ−Ｍｏｓは、粘液に対する細菌の付着を促進すると考えられる。従って、いくつかの実施形態では、本発明に係るアッセイにより、比較的低いレベル（例えば、約０．１〜１．０ｇ／ｌ）の阻害剤（例えば、Ｂｉｏ−Ｍｏｓ）は、多量の薬剤に比べて、より効果的に細菌を除去することが確認された。
【０１５１】
＜実施例１３、改善された洗浄方法＞
これまで、洗浄工程には、Ｎｕｎｃ免疫洗浄装置が用いられていたが、反復ウェル間のかなりの変動のため、粗雑な方法であると考えられる。それゆえ、サンプル間の変動を最小化するために、異なる洗浄方法を調べた。新しい方法は、液体を振り落とすことをベースにした。基本的な方法；ＥＬＩＳＡ（材料および方法を参照）；プレート：ＭａｘｉＳｏｒｐプレート；粘液：ブロイラー十二指腸；細菌：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＬＩ８４株、０〜１０７の細菌／ウェル；バッファー：ＰＢＳ；Ｂｉｏ−Ｍｏｓ：濃度０、０．１、１および１０、細菌と共に加える；ブロッキング：１０％ウシ胎仔血清；一次抗体：ビオチンを結合した一次抗体、ブロッキングバッファー中で１：１０００；二次抗体：ＨＲＰが結合したストレプトアビジン、ブロッキングバッファー中で１：１０００；培養温度：＋３７℃；基質：ＴＭＢ。図２０に示されているように、新しい洗浄方法（振動洗浄（ｓｈａｋｅ  ｗａｓｈ））によって、ＥＬＩＳＡ法において、優れた結果が得られた。全体のシグナルはより大きくなり、異なるＢｉｏ−Ｍｏｓ濃度間で、より大きな差が検出された。また、新しい方法は、より速く、同時にいくつかのプレートを扱うことを可能にする。しかし、上記方法は、ウェルの内容物の混和を避けることができる条件下で行われることが重要である。従って、本発明は、従来の洗浄方法と比べて優れた、新しい振動洗浄法を提供する。振動洗浄法では、ピペットを用いて洗浄バッファーをウェルに加え、その後、プレートを上下逆さまにして穏やかに振り、溶液が１つのウェルから別のウェルに移動しないように、ウェルを空にする。上記工程は、必要に応じて何度でも行う。
【０１５２】
＜実施例１４、一次抗体の濃度＞
これまで、抗体の濃度がＥＬＩＳＡの感度を制限するものではないことを保証するために、放射性アッセイにおいては、一次抗体について１：１０００の希釈が従来用いられてきた。従って、本発明に係るアッセイが大規模な設定で用いられる場合、抗体の希釈は、当該アッセイの展開において重要な役割を果たす可能性がある。上記アッセイの大規模な展開の実現可能性を判断するため、一次抗体の希釈を調べた。実施例１に記載されている基本的なＥＬＩＳＡ法を用いた；プレート：ＭａｘｉＳｏｒｐプレート；粘液：ブタ近位側回腸；Ｂｉｏ−Ｍｏｓ：濃度０、５、および１０ｇ／ｌ、ＰＢＳ中に希釈；細菌：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＬＩ８４株、〜１０７の細菌／ウェル；ブロッキング：ＰＢＳ中に１０％ウシ胎仔血清を加えたもの；一次抗体：ビオチンを結合した一次抗体２００μｌ（ブロッキングバッファー中で（１：１０００〜１：１００００の範囲））；二次抗体：ＨＲＰが結合したストレプトアビジン２００μｌ（ブロッキングバッファー中で１：１０００）；培養温度：室温；基質：ＴＭＢ。
【０１５３】
１：１０００の希釈によって、Ｂｉｏ−Ｍｏｓのレベル間でのよい分解能を得ることができ、より少ない希釈でも同様によく作用した。従って、いくつかの実施形態では、本発明に係るアッセイにおいて認識可能な分解能の差を提供するために、１：１０００の希釈、または、より少ない希釈（例えば、１：９００、１：７５０、１：５００、またはさらに少ない）を利用する。従って、いくつかの実施形態では、一次抗体の希釈は、アッセイにおいて調べる、細菌の全ての結合部位を飽和させることができるように選択される。いくつかの実施形態では、非常に少ない量（例えば、約０．０００１ｇ／ｌ〜約１．０ｇ／ｌの濃度）の付着阻害剤（例えば、Ｂｉｏ−Ｍｏｓ）の効果を検出するために、本発明に係るアッセイを利用する場合、一次抗体をより小さい希釈で用いてもよい（例えば、１：７５０、１：５００、またはさらに少ない値（例えば、抗体の濃度が発色を制限するものではないことを保証するために））。
【０１５４】
＜実施例１５、アッセイにおける反応体積＞
ウェル中に多数の細菌が存在する場合、比色シグナルは極端に速く発達した。それゆえ、より小さい粘液の領域（例えば、より少ない数の細菌を結合できる（例えば、それゆえ、シグナル強度を低減する））では、シグナル強度が低減されるのかどうかについて判断した。また、コーティングされたウェルを満たすために必要な体積を低減することによって、試薬の量を減らすことが可能なのかどうかについても、判断した。小さい粘液の領域を有するウェルはよく作用し、細菌の数／ウェルの検出限界は、上述の実施例で得られた結果と同様であった。発色は、上述の実施例に比べ、ゆっくりと発達した。従って、本発明によって、いくつかの実施形態では、１つのウェル中の粘液の体積は、約２００μｌから約３００μｌの間であればよいということが示される（例えば、所望のシグナルの強さに依存する）。いくつかの実施形態では、粘液の体積は、２００μｌよりも少ない量（例えば、１５０μｌ、１００μｌ、またはそれを下回る量）、または３００μｌよりも多い量（例えば、３５０μｌ、４００μｌ、またはそれを上回る量）であってもよい。いくつかの実施形態では、本発明によって、コーティングに用いる粘液の量をより少なくすることによって、アッセイの感度および機能性（例えば、検出可能なシグナル）を損なうことなく、使用する試薬の量を少なくする（例えば、３００μｌの粘液を含むウェルに必要な量と比較すると、２００μｌの粘液を含むウェルでは、約半分の量の試薬で十分である）ことが可能になるということが示される。従って、本発明は、アッセイの感度および機能性を維持し、かつ、試薬の消耗に関するコストを削減するための方法およびアッセイを提供する。
【０１５５】
＜実施例１６、粘液の供給源＞
これまでに実施された実験（実施例１〜１５）では、ブタ近位側回腸を用いていた。他の粘液の供給源についても、比色検出が可能であるかどうか判断するため、実施例１に記載されているＥＬＩＳＡアッセイにおいて、他の複数の粘液の供給源を調べた（例えば、ブタ近位側回腸、ブタ遠位結腸、ブロイラー十二指腸、およびブロイラー盲腸）。プレート：ＭａｘｉＳｏｒｐプレート；粘液：ブタ近位側回腸および遠位結腸、ブロイラー十二指腸および盲腸；細菌：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＬＩ８４株、１０７の細菌／ウェル；バッファー：ＰＢＳ；Ｂｉｏ−Ｍｏｓ：濃度０、０．１、１および１０、細菌と共に加える；ブロッキング：１０％ウシ胎仔血清；一次抗体：ビオチンを結合した一次抗体、ブロッキングバッファー中で１：１０００の希釈；二次抗体：ＨＲＰが結合したストレプトアビジン、ブロッキングバッファー中で１：１０００の希釈；培養温度：＋３７℃；基質：ＴＭＢ。
【０１５６】
図２１に示されているように、使用した粘液の種類によって、細菌は、異なるレベル（例えば、強さおよび／または親和性）の付着を示した。例えば、試験を行った細菌は、ブタ回腸およびブタ結腸から得られた粘液に比べて、ブロイラー十二指腸およびブロイラー盲腸から得られた粘液に対して、ほぼ２倍の付着を示した。しかし、比色アッセイは、ブロッキング剤の濃度の範囲において、ブロッキング剤（例えば、Ｂｉｏ−Ｍｏｓ）が粘液に対する細菌の付着を阻害する能力と同様に、異なるレベルの細菌の付着を捉えるために十分な感度を有し、かつ頑強であった。従って、いくつかの実施形態では、本発明は、種々の粘液の種類および／または供給源（例えば、異なる動物に由来、および、消化管（例えば、腸）の異なる部分に由来）に対して利用できる、非放射性の比色結合アッセイを提供する。
【０１５７】
＜実施例１７、放射性アッセイと比色アッセイとの比較＞
本発明に係る比色アッセイで用いられる材料および方法と、従来の放射性アッセイで用いられる材料および方法とを比較し、それぞれのアッセイについて、Ｂｉｏ−Ｍｏｓによって誘導した細菌の付着における差を検出する能力を評価するために、比較実験を行った。プレート：ＭａｘｉＳｏｒｐプレートおよびソフトプレート；粘液：ブタ近位側回腸；Ｂｉｏ−Ｍｏｓ：異なる濃度で５０μｌ／ウェル、ＰＢＳ中に希釈；細菌：〜１０７の細菌／ウェル。プレートが同一のものであるということを保証するため、両方のプレートに対して、同一の放射活性物質で標識されている細菌の懸濁液を用いた；ブロッキング（ＭａｘｉＳｏｒｐプレートのみ）：ＰＢＳ中に１０％ウシ胎仔血清を加えたもの；一次抗体（ＭａｘｉＳｏｒｐプレートのみ）：１００μｌの、ビオチンを結合した一次抗体（ブロッキングバッファー中で１：１０００）；二次抗体（ＭａｘｉＳｏｒｐプレートのみ）：１００μｌの、ＨＲＰが結合したストレプトアビジン（ブロッキングバッファー中で１：１０００）；培養温度：室温；基質：ＴＭＢ。ＥＬＩＳＡを行った後、両方のプレートにシンチレーション液を満たし、シンチレーションカウンターを用いて、放射活性を測定した。
【０１５８】
両方のアッセイの材料および方法を用いた場合、Ｂｉｏ−Ｍｏｓの効果が非常に似ていることが観察された。低濃度のＢｉｏ−Ｍｏｓは、粘液に対する細菌の付着を促進すると考えられる。本発明を実施するために機序は必要なく、本発明は、特定の作用機序に限定されるものではないが、いくつかの実施形態では、低濃度のＢｉｏ−Ｍｏｓまたは他の種類の阻害剤が、細菌の凝集物の形成に用いられる。従って、本アッセイによって測定されたように、最も低い濃度で付着が増加した場合でも、（例えば、消化管腔において）凝集物は、より容易に消化管から洗い流される可能性がある。従って、低濃度のＢｉｏ−Ｍｏｓまたは他の阻害剤（例えば、本明細書中で記載される、本発明に係る方法によって特定および／また特性付けされた）は、実際に、高濃度の場合に比べて、より効率的、および／または、高濃度の場合と同様に効率的に、細菌を除去できる。
【０１５９】
図２２に見られるように、非常に低濃度のＢｉｏ−Ｍｏｓでは、２つの方法における吸光度は少し異なった。ＥＬＩＳＡの線の傾向は、ごく初期の時点で、すでに同様であり（低い吸光度）、従って、１．０ｇ／ｌから０．１ｇ／ｌまでの減少傾向は、ＥＬＩＳＡリーダーの能力の限界による結果である可能性は低い。抗体または基質の濃度によって、発色が制限されている可能性があるが、上記の仮説では、１．０ｇ／ｌから０．１ｇ／ｌまでのわずかな減少傾向を説明することができない。
【０１６０】
上記の結果および他の実施例での結果は、０．１ｇ／ｌまたは１．０ｇ／ｌのどちらかにおいて、高い吸光度が得られることを示している。従って、本発明によって、いくつかの実施形態では、実験間の細菌の数の差によって変動が引き起こされることが示される。従って、いくつかの実施形態では、比較結果において、並行する実験で元々の細菌の数が等しいことを確実にするために、同一の細菌懸濁液を用いるか、または、培養方法を標準化すればよい。従って、いくつかの実施形態では、細菌の数／ウェルを減らすことで、粘液の結合部位の数、または、抗体もしくは基質の濃度の代わりに、Ｂｉｏ−Ｍｏｓおよび／または他のブロッキング剤（例えば、検査薬）の濃度が、最大の限定要因となっていることが確かめられる。
【０１６１】
＜実施例１８、非放射性の細菌結合アッセイ＞
本発明に係る実施形態を発展させる過程で、病原体の付着を測定するために本明細書中で作成した比色ＥＬＩＳＡの使用について、さらに調べるため、および、検査薬による付着の変化の程度を評価するために、実験を実施した。従って、実験は、粘液に対する細菌の付着を変化させる（例えば、阻害する）可能性がある、または、可能性がない検査薬を選別するために、本アッセイを利用することができるかどうか判断するために行われた。従って、実験は、粘液に対する細菌の付着を変化させる（例えば、阻害する）可能性がある、または、可能性がない検査薬を選別するために、本アッセイを利用することができるかどうか判断するために行われた。つまり、本発明は、放射活性物質が結合した、生きている病原体の代わりに用いることができるものを提供し（例えば、本発明に係るアッセイは、生きている細菌または放射活性物質が結合した細菌の使用を必要としない（例えば、本発明によって、エタノールによって不活性化された細菌を、付着アッセイに用いることができることが示された））、同様に、空気乾燥されたプレートであって粘液でコーティングされたプレートを提供する。従って、いくつかの実施形態において、本明細書中で提供された方法によって、生きている細菌および／または放射活性物質が結合した細菌（例えば、病原菌）を使用する必要性を排除し、かつ、アッセイを行うたびに細菌の密度を調整する必要性を排除することができるという点で、本発明に係る実施形態を発展させる過程で発展させた方法は、従来の方法と比べて、大きな利点を提供する。
【０１６２】
細菌の調製物の保存および均一性。実施例９、１０、および１２に記載されているように、本付着アッセイで用いられる細菌の調製物の密度は、反応において重要な変量として特定された。細菌密度が低い場合、シグナルは弱く、一方、細菌密度が高い場合、シグナルは線形性を示す範囲を超えた。上記データから、一連のアッセイの精度、感度および比較可能性には、固定された細菌密度が必要であると判断した。また、標準的な細菌懸濁液（例えば、同時には行わない（例えば、異なる日に、または、異なる週、もしくは月に）、一連のアッセイにおける使用のため）を作成することができるかどうかについても判断した（例えば、保存、使用が容易であり、非病原性である細菌懸濁液）。複数の細菌保存方法および不活性化方法を特定し、調べた。上記保存方法および不活性化方法には、化学固定剤（例えば、エタノール、グルタルアルデヒド、ホルマリン、ＤＭＳＯ）による保存および不活性化、ＵＶ照射による不活性化、および、凍結させた、生きている細菌の懸濁液の使用が含まれる。
【０１６３】
粘液でコーティングされたプレートの保存。これまでに記載されたアッセイ（例えば、実施例１〜１５）では、アッセイを実行するたびに、９６ウェルプレートに粘液を用いたコーティングを行った。記載したように、上記処理には、一晩かけた培養が必要とされる。そこで、上記の時間を消費する工程を置き換える（例えば、事前にコーティングした、長期保存可能な、粘液でコーティングされたプレートによって）ことができるかどうか判断するために、実験を実施した。プレートを空気乾燥し、長期保存後に用いる方法と同様に、コーティングしたプレートを凍結する方法を含む、種々の方法を調べた（例えば、異なる種類の粘液を用いて）。
【０１６４】
方法。
【０１６５】
細菌の培養および不活性化。細菌を、Ｌｕｒｉａ培地中で、３７度で増殖させ、所望の実験の１日前に新しい培地（１０％接種材料）に移した。
【０１６６】
凍結：増殖させた細菌培養物は、−２０℃で凍結させた。使用前に、当該培養物を室温で解凍した。１つのバッチは、凍結中の細胞の損傷を防ぐために、グリセロールを加えて凍結させた。しかし、グリセロールから細菌を採集する工程には問題があり、利用できない結果をもたらすため、上記アプローチを中断した。
【０１６７】
エタノール：Ｌｕｒｉａ培地中の細菌培養物に対して、１：１の割合で９９％エタノールを加え、５０％エタノール溶液を作成した。当該懸濁液を４℃で保存した。
【０１６８】
グルタルアルデヒド：最終濃度が４％になるように、グルタルアルデヒドを用いた。当該懸濁液を４℃で保存した。
【０１６９】
ホルマリン：最終濃度が４％になるように、ホルムアルデヒドを用いた。当該懸濁液を４℃で保存した。
【０１７０】
ＵＶ：３０分間または６０分間、ＵＶランプの下で上記培養物にＵＶを照射した。当該懸濁液を４℃で保存した。
【０１７１】
ジメチルスルホキシド：ＤＭＳＯを、１０％の濃度で上記培養物中に加えた。当該懸濁液を４℃で保存した。
【０１７２】
熱：上記培養物を、７０℃で３０分間加熱し、その後、４℃で保存した。
【０１７３】
使用直前に、遠心分離によって細菌を回収した。
【０１７４】
粘液でコーティングしたプレートの調製および保存。子豚の腸からこすり取った粘液を、ＮａＣＯ３バッファー（ｐＨ９．６）中に希釈し、０．１〜０．３ｍｇ粘液タンパク質／ｍｌの懸濁液を作成した。３００μｌの当該懸濁液を９６ウェルＩｇＡプレートの各ウェル中に導入した。当該プレートは４℃で一晩かけてインキュベートした。
【０１７５】
空気乾燥においては、ＰＢＳを用いて、上記プレートを２回洗浄し、層流キャビネット中で一晩かけて乾燥させた。上記プレートを、室温で、プラスチックバッグ中に保存した。使用前に、３００μｌのＰＢＳを各ウェルに導入し、１０分間粘液に水分を含ませて元に戻した。その後、上記プレートを上下逆さまにして穏やかに振り、ＰＢＳを除去した。
【０１７６】
凍結については、上記プレートを、粘液懸濁液とともに−２０℃で凍結させた。使用前に、上記プレートを室温で解凍し、ＰＢＳを用いて３回洗浄した。
【０１７７】
上記新しいプレートは、粘液でコーティングして一晩置いた後、ＰＢＳを用いて３回洗浄した。
【０１７８】
結果
放射性アッセイを用いた細菌保存方法の最初の選別。保存した細菌を用いた３つの方法は、新鮮な細菌を用いたアッセイと比べて、満足できるものであると考えられた（図２３参照）。上記の方法は、エタノール、ＵＶ照射、および凍結である（他の方法は、本アッセイに好適ではないと判断された）。ＵＶおよびＤＭＳＯによって不活性化させた細菌のデータは、異なる細菌懸濁物を用いたので、図２３には示されていない。ＤＭＳＯによる不活性化は、細菌の付着を劇的に阻害したが、一方、試験に用いた細菌に対するＵＶ照射は、比較的良好な付着結果をもたらした。
【０１７９】
絶対的な付着に加えて、上記方法における、検査薬が付着を阻害する効果を検出する能力についても、特性付けを行った。ＤＭＳＯおよびＵＶ照射以外の細菌保存方法の結果を、図２３に示す。選択した方法に関わらず、本アッセイによって、Ｂｉｏ−ＭｏｓがＥ．ｃｏｌｉの付着を阻害することを明らかにできた。
【０１８０】
選択された細菌保存方法を用いたＥＬＩＳＡアッセイ。上記結果に基づいて、ＥＬＩＳＡ細菌検出系において、３つの細菌不活性化方法を調べた。本発明は特定の作用機序に限定されるものではなく、本発明を実施するために作用機序の理解は必要ないが、上述の方法によって細菌を固定した場合、細菌の抗原特性を変化させ、抗体をベースとする方法において、調節された細菌の検出の失敗を引き起こす可能性がある。しかし、ＥＬＩＳＡ法は試験を行う細菌調製物に対して作用すると考えられる。図２４に示すように、絶対的な細菌の付着効率を考慮すると、細菌不活性化方法の中で、ＵＶ照射および凍結は、エタノール保存に比べて、より良好であった。しかし、上記方法は、使用における実用性を考慮した場合、大きな欠点を有する。ＵＶによって不活性化させた細菌懸濁液は、未開封の状態でのみ安定しており、環境中の細菌に曝された場合、他の細菌によって容易に損なわれる。一方、凍結した細菌は、まだ生きており、解凍後に増殖を開始する可能性または代謝的に活性である可能性がある。上記の点は、本アッセイの精度および再現性に影響するであろう。さらに、生きている細菌を用いて作業を行う場合、安全性の問題が考えられる。
【０１８１】
細菌懸濁液中のエタノール濃度の最適化。エタノールによる細菌の保存は理想的ではないと考えられるが、上記方法が提供する他の利点のため、上記アプローチを発展させる試みを継続することを決定した。まず、殺菌する能力に基づいて、５０％の濃度のエタノールを用いた。しかし、細菌の付着に対するアルコール濃度の効果を判断するために、他のアルコール濃度についても調べた。エタノール濃度は、細菌の付着効率に対して、大いに影響を与えると考えられる。本発明はいずれの作用機序に限定されるものでもなく、本発明を実施するために作用機序の理解は必要ないが、いくつかの実施形態では、本発明によって、エタノールが、結合に必須である線毛を分離もしくは破壊、または細菌の他の抗原特性を変化させることが示される。付着の効率を考えた場合、５０％エタノールと比べて、４０％の濃度であるエタノールは、大幅に良好であると考えられる。図２５に示されている、驚くべき非線形の傾向が繰り返し観察された。
【０１８２】
粘液でコーティングしたプレートの保存。空気乾燥および凍結によって保存された、粘液でコーティングしたプレートに対する、細菌の付着能力を、コーティングしたばかりのプレートを比較することで調べた。放射活性物質で標識されている細菌を用いた試験では、空気乾燥したプレートは、コーティングしたばかりのプレートと同等であったが、一方、凍結したプレートは少し高い計数を示した。各方法は、本発明に係る、非放射性のＥＬＩＳＡ法を用いて、調べた。
【０１８３】
図２６に示されているように、空気乾燥したプレートは、凍結保存されたプレートおよびコーティングしたばかりのプレートに比べて、弱いシグナルを発した。しかし、細菌の付着に対するＢｉｏ−Ｍｏｓの効果は、使用した全ての方法において明らかであった。従って、本発明は、事前に作成され、保存された、粘液でコーティングしたプレート（例えば、空気乾燥したプレートまたは凍結保存したプレート）を使用する方法を提供する。
【０１８４】
乾燥したプレートに水分を含ませて元に戻す時間。アッセイを実行する前に、空気乾燥したプレートに水分を含ませて元に戻すために、１分から１２時間までのタイムスパンについて調べた。水分を含ませて元に戻す時間は、本アッセイの結果にあまり影響しないが、同等の結果を得るために、続く全てのアッセイにおいて、一定の（例えば、１０分）水分を含ませて元に戻す時間を用いた。
【０１８５】
ウェル中の粘液濃度。ウェル中の粘液濃度は前に調べたが、細菌の付着が、高い粘液濃度によって促進されるかどうかについて調べることを決定した。コーティングバッファー中の３つのレベルの粘液について調べた。上記レベルはそれぞれ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、および０．３ｍｇ／ｍｌのタンパク質に相当する。粘液濃度が増加した場合、細菌の付着は明らかに改善され、０．３ｍｇタンパク質／ｍｌで最も高いレベルの付着がもたらされた。
【０１８６】
検査薬（例えば、Ｂｉｏ−Ｍｏｓ）を用いた、細菌の付着における変化の検出。予備のシンチレーションおよびＥＬＩＳＡ実験に基づいて、検査薬（例えば、Ｂｉｏ−Ｍｏｓ）の効果、および当該検査薬の、粘液に対する細菌の付着を変化させる能力を調べるために、エタノールで不活性化させた細菌および空気乾燥したプレートを用いた。得られたデータは、結果の曲線が、新鮮な細菌およびプレートを用いてＥＬＩＳＡを行った場合に得られる曲線と、非常に似ていることを示した。
【０１８７】
他の種類の粘液への適用。他の種類の粘液を用いて、ＥＬＩＳＡ（保存したプレートおよびＥｔＯＨで不活性化させた細菌を用いた）について調べた。ＥＬＩＳＡによって、ブタ近位側回腸粘液、ブタ遠位結腸粘液、ブロイラー十二指腸粘液、およびブロイラー盲腸粘液を含む、複数の種類の粘液を用いた有用なデータが提供された。本発明によって、保存したプレート、および、ＥｔＯＨで不活性化させ、保存した細菌を用いたＥＬＩＳＡは、粘液の供給源に関する有用なデータを提供すること、並びに、検査薬が細菌の付着をブロックする能力の効果（例えば、Ｂｉｏ−Ｍｏｓ）は、粘液の供給源に関わらず同様であること、が示される。従って、本発明は、扱うのが容易で、安全で、かつ、材料を容易に保存および輸送できる、粘液に対する細菌細胞の付着／結合のモニタリングおよび特性付けを行うために有用である組成物（例えば、エタノールで不活性化させた細菌、および空気乾燥した、粘液でコーティングしたプレート）および方法（例えば、非放射性のＥＬＩＳＡ）を提供する。
【０１８８】
非放射性の細菌結合アッセイについての、さらなる特性付け。本明細書中で提供される非放射性のアッセイが信頼でき、再現可能であり、かつ、ばらつきが最小化されているかどうかを判断するために、本発明を発展させる過程で、実験を行った。異なる細菌のバッチ間および異なるプレート間における変動を調べ、アッセイの再現性について判断した（例えば、異なる日に実行し（プレート間の変動）、反復したサンプルのプレート変動をモニタリングすることによって）。
【０１８９】
方法
細菌の培養および不活性化。Ｌｕｒｉａ培地中で３７℃で細菌を増殖させ、エタノールで不活性化させる前日に、新鮮な培地（１０％接種材料）に移した。一晩かけて増殖させた培養物中に直接、最終濃度が４０％ｖｏｌ／ｖｏｌになるようにエタノールを加えることで、細菌を不活性化させ、保存した。上記懸濁液は４℃で保存し、使用直前に遠心分離で回収した。沈殿物を、元の体積のＬｕｒｉａ培地に懸濁し、およそ１０８の細菌／ｍｌの懸濁液を得た。
【０１９０】
粘液でコーティングしたプレートの調製および保存。子豚の腸からこすり取った粘液を、ＮａＣＯ３バッファー（ｐＨ９．６）中に希釈し、０．３ｍｇ粘液タンパク質／ｍｌの懸濁液を作成した。３００μｌの当該懸濁液を９６ウェルＩｇＡプレートの各ウェル中に導入した。当該プレートは４℃で一晩かけてインキュベートした。ＰＢＳを用いて、上記プレートを２回洗浄し、ラミナーフローキャビネット中で一晩かけて乾燥させ、室温で、プラスチックバッグ中に保存した。使用前に、３００μｌのＰＢＳを各ウェルに導入し、１０分間粘液に水分を含ませて元に戻す。その後、上記プレートを上下逆さまにして穏やかに振り、ＰＢＳを除去した。
【０１９１】
ＥＬＩＳＡ法。粘液でコーティングした、空気乾燥したプレートは、ＰＢＳを用いて１０分間、水分を含ませて元に戻し、その後、１００μｌの細菌懸濁液、並びに、ＰＢＳ中にＢｉｏ−Ｍｏｓを加えたもの、もしくは純粋なＰＢＳ１００μｌを加えた。処理のサンプルは、系統誤差を避けるために、ランダムにウェルに配置した。上記プレートを室温で１時間インキュベートし、光および蒸発から保護した。インキュベートした後、ＰＢＳを用いて、上記プレートを３回洗浄し、ブロッキングバッファー（１０％ウシ胎仔血清）を加えた。上記プレートを上述のようにインキュベートし、空にした。一次抗体を加え、プレートをインキュベートし、上述のように洗浄した。二次抗体を加え、プレートをインキュベートし、上述のように洗浄した。最後に、ＴＭＢ基質をウェルに加え、１５〜３０分間発色させた。上記反応は、硫酸を用いて停止させ、４５０ｎｍにおいて吸光度を測定した。
【０１９２】
統計分析。各プレートにおいて平均がゼロとなるサンプルが１００％になるように調節された値について、変動係数を推定した。その後、処理間および処理内の一元配置ＡＮＯＶＡのＭＳＥを分散の推定値として用いて、水準１および２の上記調節された値について、プレート内およびプレート間の変動係数の推定値を求めた。上記の推定は、異なるレベルのＢｉｏ−Ｍｏｓについて別々に行った。検出力分析を行い、２つの処理間の差を検出するために必要な反復数についての推定値を求めた。リスクレベル（ｒｉｓｋ  ｌｅｖｅｌ）ｕ＝０．０５および検出力＝０．８または０．９を用いた。
【０１９３】
結果
同じプレート内で分析された、反復したサンプルから測定した変動。製品評価の目的のためには、同じプレート内にいくつかの反復がある状態でアッセイを行う場合、当該アッセイが再現可能であり、従って、信頼できる試験、アッセイの実用性において十分であると知られている、および考えられている検出の限界を提供することが重要である。上記目的のために、１つのバッチの細菌調製物を用いて、同質の粘液でコーティングしたプレートで本アッセイを実行した。図２８は、いくらかのウェル間の変動が存在するが、加えたＢｉｏ−Ｍｏｓによる、付着を阻害する効果は明らかであり、再現性があることを示しいている。コントロールウェルとの比較により、Ｂｉｏ−Ｍｏｓの水準１ｍｇ／ｍｌおよび２ｍｇ／ｍｌは、ｐ値＜０．０００１においてコントロールと差があることが示された。しかし、図２８に示されているように、Ｂｉｏ−Ｍｏｓの２つの水準は、互いに差がなかった。変動係数は、各処理について別々に求めた。
【０１９４】
４つの異なる粘液プレートから測定した変動
製品評価の目的のためには、アッセイが再現可能であることが重要である。アッセイが再現可能であるかどうか（例えば、同一の薬剤を用いて、異なる時間に）判断するために、図２８にデータが示されている実験を、４つの異なる日に４回繰り返した。試験の各セットは、異なる日に、異なる粘液プレートについて、１つの細菌調製物を用いて行った。図２９の４つのパネルに結果を示す。異なるプレート内での変動の平均は、それぞれ、プレート１で１４％、プレート２で１４％、プレート３で１３％であり、プレート４では２２％もの高さであった。下記の表１は、各プレート内での各試験について計算されたＣＶを示している。Ｂｉｏ−Ｍｏｓを加えたウェルに比べて、コントロールウェルではＣＶが低い傾向が見られた。全ての４つの試験プレートおよび全ての処理から計算された、平均のＣＶは１６％であった（表１）。
【０１９５】
【表１】
2012533068.tif 000002
【０１９６】
４つの異なる粘液プレートから測定された絶対的なシグナルの差。図３０は、図２９のデータを示しているが、異なる試験における絶対的なシグナルの大きさを強調するために、図２９とは異なる方法で示している。プレートは同じように扱ったが、別々に扱った。ウェルの位置等の要因による系統誤差を避けるため、サンプルはランダムにウェルに配置した。注目すべきことは、上記の試みでは、正確に同じ方法で、本アッセイの全ての工程を繰り返したが、絶対的なシグナルのレベルは日によって変化したことである。本発明はいずれの作用機序に限定されるものでもなく、本発明を実施するために作用機序の理解は必要ないが、いくつかの実施形態では、上記変動は、以下の１つ以上の工程を含む。１．粘液が結合する工程、２．ウェルを洗浄する工程、３．細菌が結合する工程、４．結合していない細菌を洗い流す工程、５．一次抗体を結合させる工程、６．洗浄する工程、７．二次抗体を結合させる工程、８．発色反応。しかし、本発明によって、発色にはいくらかの変動があるが、当該変動は限定的であり、有用なデータの作成を妨げるものではないことが示される（例えば、１つ以上の検査薬における、粘液に対する細菌の付着を変化させる（例えば、阻害する）能力に関して）。
【０１９７】
相対的なシグナルを用いた場合の、プレート間の変動の比較。試験を行う製品と同じプレートに、関連するコントロール処理が存在する場合、プレート間のシグナルの変動は問題ない。全てのコントロールウェルの平均に１という値を与え、試験化合物を加えたウェルには上記コントロールウェルを基準として正規化した値を与えることで、全てのシグナルを相対的な値に変換した。正規化した結果を図３１に示す。相対的なシグナルとして示した場合、検出されたＢｉｏ−Ｍｏｓの効果の大きさは、全てのプレートでほぼ一致した。
【０１９８】
細菌のバッチ間の変動。細菌のバッチおよびプレート間の変動を調べるために、複数の、独立して増殖させた細菌培養物を作成し、同様に、複数の、独立して製造した粘液でコーティングしたプレートを作成した。異なるバッチのＰＢＳ、Ｌｕｒｉａ培地を用いて、新しい凍結保存ビーズ（frozen storage bead）から各培養物を増殖させ、完全に独立して上記バッチを作成した。独立したプレートおよび培養物のそれぞれに対して、同様のＥＬＩＳＡアッセイを行った。上記実験の結果を図３２に示す。
【０１９９】
図３２に示すように、シグナルの絶対的なレベルは実験ごとに変動したが、コントロール試験のシグナルと比較した場合、完全に独立した試験によって、付着に対するＢｉｏ−Ｍｏｓの効果はほぼ一致するということを示すデータが提供された（図３２参照）。
【０２００】
検出力分析。実験データを用いて、所望の検出力を得るために必要な反復数を推定することができた。検出力とは、２つの試験化合物の反応間、または、２つの処理の反応間における差の割合であって、互いに統計的に有意に異なることを示す差の割合を意味する。図３３および下記の表２は、検出力と反復数との間の関係を示す。
【０２０１】
本発明によって、検査薬のバッチを比較する場合、例えば、製品Ａが付着を５０％阻害し、製品Ｂが６６％阻害した場合に、２つの薬剤には差があるとするには、わずか５反復（またはさらに少ない反復数）で十分であることが示される。従って、５反復で十分である。
【０２０２】
【表２】
2012533068.tif 000003
【０２０３】
＜実施例１９、安定した、機能的な細菌調製物および粘液でコーティングされたプレートの作成＞
本発明に係る実施形態を発展させる過程で、下記の特徴を備えている細菌懸濁液を調製するために実験を行った：調製した細菌に存在および／または保持されており、粘液に対する細菌の付着を仲介する線毛であって、上記線毛は多数存在し、構造的には変化せずに、高い親和性で、粘液に対する細菌の結合および／または付着を可能にする；免疫特性を保有しており、当該免疫特性によって、ＥＬＩＳＡで用いられる一次抗体の効率的な結合、並びに、抗体の結合を変化させない方法での細菌の殺菌および／または不活性化を可能にする、細菌表面の抗原；並びに／または、寿命が長く、ＥＬＩＳＡにおいて簡潔で即座に用いることができる組成をもたらすために実行される細菌の調製。
【０２０４】
実施例１８の細菌接種材料の調製物を含む、非放射性の細菌結合アッセイの修正を行った。より刺激が少なく、より穏やかな（例えば、線毛および／または細菌表面の抗原を保存するために（例えば、抗体の結合のために））二重殺菌処理（dual-kill procedure）を用いて、実験を行った。以下に示すように、凍結保存処理によって、接種材料の長期保存が容易になった。例えば、いくつかの実施形態では、凍結保存処理によって、正しい数の細菌を正確に含む、使い捨てのアンプルの作成が可能になった（アッセイにおいて、粘液でコーティングしたプレートとともに用いるため（例えば、キットでの使用のため））。上記の新しい方法および組成物は、技術者側の潜在的な誤りを低減し（正確な接種材料のサイズを決定しなければならない点において）、接種材料の汚染の危険性を低減し、かつ、時間の経過に伴う細菌調製物の劣化を最小化する。凍結乾燥したアンプルは、室温で安定的であり、機能性を損なう危険性もなく輸送可能（例えば、世界的に）である。
【０２０５】
細菌の調製方法。Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地中で、３７℃で細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｆ４＋（かつてのＫ８８）株）を増殖させた。培養物を遠心分離によって回収し、食塩水中に再び懸濁し、即座に、顕微鏡による計数にて数え上げた。細菌懸濁液を、６５℃で４５分間加熱し、続いて４５分間のＵＶ照射によって殺菌した。細菌のバッチをアンプルに分注した。各アンプルは１×１０９の細菌細胞を含み、−８０℃で凍結させた。アンプルは、２４時間凍結させた後、凍結乾燥させ、密封した。上記アンプルは＋４℃で保存した。アンプル中の生きているＥ．ｃｏｌｉは、２つの異なるアプローチ（すなわち、ダイレクトプレーティング（direct plating）および最確数（Most Probable Number：ＭＰＮ）を用いる方法）によって決定した。ダイレクトプレーティングのために、１０倍ごとの連続した希釈液を、各細菌のバッチから５つの反復で調製した。使用した培地は、栄養分に富んだ、非選択性のＬｕｒｉａ  Ｂｅｒｔｈａｎｉである。３７℃で２日間培養した後、コロニーを数えた。ＭＰＮは、栄養分に富み、非選択性の培地中に、直接、アンプルの内容物を連続して希釈することで行った。ＭＰＮは、３反復で行った（３テーブルＭＰＮ）。ＭＰＮチューブにおける増殖は、まず３７℃で２日後に記録し、２週間後に再び記録した。ＭＰＮ法においては、細菌アンプル（〜１０９個の細胞）の全内容物を、最初の、最も少ない希釈率のチューブに懸濁した。従って、ＭＰＮでは、単一の生きている細菌を検出することになっている。プレートでの計数では、アンプルの内容物を１０ｍｌの希釈剤中に懸濁し、当該懸濁液のうちの０．１ｍｌをプレートに広げた。従って、増殖しないということは、上記アンプルが、１００個よりも少ない生きているＥ．ｃｏｌｉ細胞を含んでいることを表している。細菌調製物（アンプル）の５つの異なるバッチについて、生存可能性を調べた。ダイレクトプレーティングおよびＭＰＮ計数の両方の試験方法の結果は、生存している痕跡を示さなかった。従って、本発明は、高度に再現可能であり、一貫性のある細菌調製物を提供する、新しい二重殺菌法を提供する（例えば、粘液付着アッセイ中で決定されたように（例えば、図３４参照））。
【０２０６】
粘液でコーティングしたプレートの作成および安定化。本発明を発展させる過程で、下記の特徴を備えている、粘液でコーティングしたプレートを調製するために、実験を行った：各プレートのウェル間、および異なるプレート間で均一な品質を有している粘液コーティング；細菌、および／または、プレート上にコーティングされた粘液の結合特性を破壊しない方法で安定化された粘液プレート（結合する細菌に関する、粘液表面の特性を保存する）；並びに／または、使用する（例えば、ＥＬＩＳＡで）準備ができるまでの長期間（例えば、日、週、月、１年、またはそれを上回る期間）、安定している（例えば、室温、またはより低い温度で）、粘液でコーティングしたプレート。
【０２０７】
粘液でコーティングしたマイクロタイタープレート。新鮮な解体されたブタの遠位小腸（回腸）から粘液をこすり取ることで、粘液を回収した。実施例１８に記載されているように、粘液を洗浄し、遠心分離によって不純物を除去した。ＳＩＧＭＡ製のＢｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｔ（Ｂ９６４３）を用いて、粘液タンパク質を定量した。０．１ｍｇ粘液タンパク質／ｍｌコーティングバッファーを含んでいる粘液バッファー液を用いて、Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（９６ウェル型）をコーティングした。マイクロタイタープレートのバッチは、異なる日に別々に調製し、試験の日まで＋４℃で保存した。プレート間の変動を調べるために、上記プレートにおいて、Ｂｉｓ−Ｍｏｓを含む、および、Ｂｉｓ−Ｍｏｓを含まない細菌付着アッセイを実行した。プレート間での阻害の平均は８１．９％であったことから、それぞれのバッチは平均して１．５％ずれていた（例えば、図３５参照）。
【０２０８】
本発明を発展させる過程で、粘液バッファー液の下で、真空包装用パッケージ中に４℃で１週間または２週間保存した場合の粘液プレートの安定性を調査するために、追加実験を行った。２週間の保存の後、細菌調製物を用いた付着アッセイに使用することができるかどうかを判断するために、粘液プレートについて調べた。結果を図３６に示す。アッセイの絶対的なシグナルは、わずかな強度の低下を示した。しかし、前述の研究では、プレート間の変動に関して、強度について変動が観察され、上記変動はプレートの保存とは関係ない可能性がある。非付着製品Ｂｉｏ−Ｍｏｓの適用により、およそ８０％の阻害が観察されたことが実証された。従って、本発明は、保存が可能であり、より後の時点で使用することが可能な（例えば、付着アッセイのために）、粘液でコーティングされたプレートを作成する方法、および粘液でコーティングされたプレートそのものを提供する。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、別々に、または、共に保存可能である（例えば、真空包装用のパッケージ中に（例えば、図３７参照））、粘液でコーティングされたプレートおよび／また細菌調製物（例えば、アンプル中に保存されている）を提供する。上記粘液でコーティングされたプレートおよび／また細菌調製物は、購入および／または使用のために商業的に利用可能に作られてもよい。
【０２０９】
上記明細書中で述べられた全ての出願および特許は、本明細書中で参照によって引用される。本発明に係る、記載された組成物および方法についての種々の修正および変更は、当業者にとって明らかであって、本発明の範囲および精神から逸脱しないものである。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して記載されているが、請求項に係る発明は、上記の特定の実施形態に、不当に限定されるものではないと理解されるべきである。実際に、本発明を実施するために、記載された様式について種々の修正を行うことは、当業者にとって明らかであり、本発明の範囲内に含まれるものである。
【図面の簡単な説明】
【０２１０】
【図１】Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＬＩ８４およびＡＬＩ４４６の付着に対する、粘液濃度（ｍｇタンパク質／ｍｌ）の効果を示し、放射活性物質で標識されている細菌によって測定した。
【図２】Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＬＩ８４の付着に対する、一次抗体の効果を示し、放射活性物質で標識されている細菌を用いて、シンチレーションカウンターによって測定した。一次抗体：ＨＲＰ＝ＨＲＰが結合した抗Ｅ．ｃｏｌｉ抗体；ＢＰ２０２２＝非結合抗Ｅ．ｃｏｌｉ抗体、ビオチン＝ビオチンが結合した抗Ｅ．ｃｏｌｉ抗体。
【図３】Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＬＩ４４６の付着に対する、一次抗体の効果を示し、放射活性物質で標識した細菌を用いて、シンチレーションカウンターによって測定した。一次抗体：ＨＲＰ＝ＨＲＰが結合した抗Ｅ．ｃｏｌｉ抗体；ＢＰ２０２２＝非結合抗Ｅ．ｃｏｌｉ抗体、ビオチン＝ビオチンが結合した抗Ｅ．ｃｏｌｉ抗体。
【図４】Ｅ．ｃｏｌｉ細菌（ＡＬＩ８４株およびＡＬＩ４４６株）とともに培養した場合の、３つの異なる３、３’、５、５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）ＥＬＩＳＡ基質の着色を示す。
【図５】Ｅ．ｃｏｌｉのＡＬＩ８４株およびＡＬＩ４４６株とともに培養した場合の、ｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）および２、２−アジノ−ビス（３エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡｚＢＴＳ）ＥＬＩＳＡ基質の着色を示す。Ｅ＝ＡＢＴＳマイクロウェルエンハンサー。
【図６】粘液でコーティングしたウェル中で培養した場合の、異なるＥＬＩＳＡ基質の着色を示す。写真は６０分の時点で撮影した。１５分の時点で、弱いシグナルが６つの陽性の（黄色の）ウェル中で観察された。
【図７】粘液またはプレートに対する抗体の非特異的な結合について調べた場合の、プレートのレイアウトを示す。ＢＰ２０２２＝抗Ｅ．ｃｏｌｉ一次抗体；ＢＰ２０２２ＨＲＰ＝ペルオキシダーゼが結合した抗Ｅ．ｃｏｌｉ一次抗体；ビオチン＝ビオチンが結合した抗Ｅ．ｃｏｌｉ一次抗体。ＨＲＰ＝ペルオキシダーゼが結合した二次抗体；ＳｔｒＨＲＰ＝ペルオキシダーゼが結合したストレプトアビジン。ＡＰ＝アルカリフォスファターゼが結合した二次抗体；ＳｔｒＡＰ＝ストレプトアビジンが結合した二次抗体。本実験では、細菌は使用していない。
【図８】粘液またはプレートに対する抗体の結合を示す。プレートのレイアウトは図７に記載されている。
【図９】一次抗体および二次抗体を用いた非特異的な結合試験を示す。一次抗体：ＨＲＰ＝ＨＲＰが結合した一次抗体、ＢＰ２０２２＝何も結合していないポリクローナル抗Ｅ．ｃｏｌｉ一次抗体；ビオチン＝ビオチンが結合した抗Ｅ．ｃｏｌｉ一次抗体。二次抗体：ＨＲＰ＝ＨＲＰが結合したＩｇＧ；ＳｔｒＨＲＰ＝ＨＲＰで標識されているストレプトアビジン。本実験では、細菌は使用していない。
【図１０】一次抗体および二次抗体を用いた非特異な結合試験を示す。プレートのレイアウトは図９に記載されている。一次抗体：ＨＲＰ＝ＨＲＰが結合した一次抗体、ＢＰ２０２２＝何も結合していないポリクローナル抗Ｅ．ｃｏｌｉ一次抗体；ビオチン＝ビオチンが結合した抗Ｅ．ｃｏｌｉ。二次抗体：ＨＲＰ＝ＨＲＰが結合したＩｇＧ；ＳｔｒＨＲＰ＝ＨＲＰで標識されているストレプトアビジン。
【図１１】抗体の希釈および細菌の数／ウェルを最適化するために利用する条件を記載した表を示す。一次抗体：ＨＲＰが結合した一次抗体。二次抗体は用いていない。
【図１２】抗体の希釈および最適な細菌の数／ウェルの試験から得られたデータを示す。一次抗体：ＨＲＰが結合した一次抗体。二次抗体は用いていない。プレートのレイアウトは図１１に記載されている。
【図１３】抗体の希釈および細菌の数／ウェルを最適化するために利用する条件を記載した表を示す。一次抗体：ビオチンが結合した抗Ｅ．ｃｏｌｉ抗体。二次抗体：ＨＲＰが結合したストレプトアビジン。
【図１４】抗体の希釈および最適な細菌の数／ウェルの試験から得られたデータを示す。一次抗体：ビオチンが結合した抗Ｅ．ｃｏｌｉ抗体。二次抗体：ＨＲＰが結合したストレプトアビジン。
【図１５】１０６〜１０８個の細菌をウェルに加えた場合のＥＬＩＳＡ吸光度を示す。対数近似曲線を追加している。
【図１６】０〜１０６個の細菌をウェルに加えた場合のＥＬＩＳＡ吸光度を示す。
【図１７】Ａ）細菌の付着に対する、異なる濃度のＢｉｏ−Ｍｏｓの効果であり、効果はＢｉｏ−Ｍｏｓを加えない場合の吸光度の割合として示される；Ｂ）Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＬＩ８４株の付着に対する、異なる濃度のＢｉｏ−Ｍｏｓの効果であり、放射活性物質で標識されている細菌を用いたシンチレーションカウンターによって測定した。
【図１８】付着／接着を変化させた効果を検出するために最適なレベルを見つけるために、細菌の数／ウェルを調べた実験から得られたデータを示す（例えばＢｉｏ−Ｍｏｓを用いる）。
【図１９】付着／接着を変化させた効果を検出するために最適なレベルを見つけるために、細菌の数／ウェルを調べた実験から得られたデータを示す（例えばＢｉｏ−Ｍｏｓを用いる）。
【図２０】異なる濃度のＢｉｏ−Ｍｏｓ間の違いを検出するための、一次抗体の希釈に関するデータを示す。
【図２１】異なるタイプの粘液および複数の濃度のＢｉｏ−Ｍｏｓを用いたＥＬＩＳＡでの、Ｂｉｏ−Ｍｏｓの効果を示す。
【図２２】放射活性物質付着アッセイおよびＥＬＩＳＡ処理での、Ｂｉｏ−Ｍｏｓの効果の比較を示す。反復したサンプル間の平均の標準誤差は、エラーバーで示す。
【図２３】異なる方法で不活性化された細菌の、粘液でコーティングされたプレートへの付着を示す。付着は、Ｂｉｏ−Ｍｏｓがある場合とＢｉｏ−Ｍｏｓがない場合とについて測定した。ＵＶ不活性化細菌およびＤＭＳＯ不活性化細菌のデータは示していない。
【図２４】ＥＬＩＳＡ法に従い、新しくコーティングされたプレートへの、細菌の付着を示す。
【図２５】粘液に対する細菌の付着における、Ｅ．ｃｏｌｉ保存液中のエタノール濃度の効果を示す。
【図２６】異なる方法で保存した、粘液でコーティングしたプレートに対する、Ｂｉｏ−Ｍｏｓがある場合とＢｉｏ−Ｍｏｓがない場合の細菌の付着を示す。
【図２７】粘液でコーティングし、風乾したプレートに対する、エタノールで不活性化されたＥ．ｃｏｌｉの付着における、Ｂｉｏ−Ｍｏｓの効果を示す。反復間の平均の標準誤差は、エラーバーで示す。
【図２８】異なるＢｉｏ−Ｍｏｓ試験レベルでの、絶対的なプレート間の変動を示す。同じサンプルを用いて反復したアッセイ（ウェル）は、バーのグループとして示す。
【図２９】異なるＢｉｏ−Ｍｏｓ試験レベルでの、絶対的なプレート間の変動を示す。図中の４つのパネルは、異なる４つの日に実施されたアッセイを表すが、１つのバッチのＥ．ｃｏｌｉを用いている。同じサンプルを用いて反復したアッセイ（ウェル）は、バーのグループとして示す。
【図３０】異なるパネル中に、異なるＢｉｏ−Ｍｏｓ試験レベルでの、絶対的なプレート間の変動を示す。各パネル中の４セットのカラムは、異なる４つの日に実施されたアッセイを表すが、１つのバッチのＥ．ｃｏｌｉを用いている。
【図３１】異なるＢｉｏ−Ｍｏｓ試験レベルでの、相対的なプレート間の変動を示す。カラムは、反復試験ウェルの平均を表し、バーは平均の標準誤差を示す。アッセイは異なる４つの日に実施されたが、１つのバッチのＥ．ｃｏｌｉを用いている。２つのパネルは同じデータを示すが、プレート間の変動（上側のパネル）またはＢｉｏ−Ｍｏｓの効果（下側のパネル）のどちらかを、強調するように別々に表されている。
【図３２】Ｂｉｏ−Ｍｏｓの効果における、相対的なバッチ間の変動を示す。上側のパネルのカラムは反復試験ウェルの平均を表し、バーは平均の標準誤差を示す。アッセイは、培地およびバッファーの調製、並びにＥ．ｃｏｌｉの培養から、全て独立して実施した。上側のパネルは、測定されたシグナルを示し、下側のパネルはコントロールウェルと比較した値を示す。
【図３３】発展させたアッセイを用いた試験処理間で示された差を検出するために必要な、反復ウェルの数を示す。
【図３４】Ｂｉｏ−Ｍｏｓ（２ｎｇ／ｍｌ）がある場合、および、ない場合での、細菌調製物の５つの独立したバッチにおいて、測定されたシグナルを示す。
【図３５】Ｂｉｏ−Ｍｏｓ（２ｎｇ／ｍｌ）がある場合、および、ない場合での、粘液プレートの５つの独立したバッチにおいて、測定されたシグナルを示す。
【図３６】保存１週間後および２週間後の試験のシグナルを示す。
【図３７】本発明の一実施形態における、真空包装されたプレートおよびアンプルを示す。
【図３７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【国際調査報告】
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