(57)【要約】本発明は、ストレプトミセス属に属し、Ｋ０１−０５０９−Ａ１物質および／またはＫ０１−０５０９−Ａ２物質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養液中にＫ０１−０５０９−Ａ１物質および／またはＫ０１−０５０９−Ａ２物質を蓄積せしめ、該培養物からＫ０１−０５０９−Ａ１物質および／またはＫ０１−０５０９−Ａ２物質を採取する。得られた物質はタイプＩＩＩ型分泌装置を有する病原性グラム陰性細菌に選択的で有効な医薬品としての効果が期待される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式［Ｉ］
2005090384.tif 000009
で表されるＫ０１−０５０９−Ａ１物質。
【請求項２】
下記式［ＩＩ］
2005090384.tif 000010
で表されるＫ０１−０５０９−Ａ２物質（Ａ１物質の立体異性体）。
【請求項３】
特に下記式［Ｉ］
2005090384.tif 000011
で表されるＫ０１−０５０９−Ａ１物質及び／又は特に下記式［ＩＩ］
2005090384.tif 000012
で表されるＫ０１−０５０９−Ａ２物質（Ａ１物質の立体異性体）からなるＫ０１−０５０９組成物。
【請求項４】
ストレプトミセス属に属し、Ｋ０１−０５０９−Ａ１物質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養液中にＫ０１−０５０９−Ａ１物質を蓄積せしめ、該培養物からＫ０１−０５０９−Ａ１物質を採取する請求項１記載のＫ０１−０５０９−Ａ１物質の製造法。
【請求項５】
ストレプトミセス属に属し、Ｋ０１−０５０９−Ａ２物質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養液中にＫ０１−０５０５−Ａ２物質を蓄積せしめ、該培養物からＫ０１−０５０９−Ａ２物質を採取する請求項２記載のＫ０１−０５０９−Ａ２物質の製造法。
【請求項６】
ストレプトミセス属に属し、Ｋ０１−０５０９−Ａ１物質および／またはＫ０１−０５０９−Ａ２物質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養液中にＫ０１−０５０９−Ａ１物質および／またはＫ０１−０５０９−Ａ２物質を蓄積せしめ、該培養物からＫ０１−０５０９−Ａ１物質および／またはＫ０１−０５０９−Ａ２物質を採取する組成物の製造法。
【請求項７】
ストレプトミセス属に属し、Ｋ０１−０５０９−Ａ１物質を生産する能力を有する微生物が、ストレプトミセス・エスピー  Ｋ０１−０５０９（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．Ｋ０１−０５０９）ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５０４である請求項４記載のＫ０１−０５０９−Ａ１物質の製造法。
【請求項８】
ストレプトミセス属に属し、Ｋ０１−０５０９−Ａ２物質を生産する能力を有する微生物が、ストレプトミセス・エスピー  Ｋ０１−０５０９（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．Ｋ０１−０５０９）ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５０４である請求項５記載のＫ０１−０５０９−Ａ２物質の製造法。
【請求項９】
ストレプトミセス属に属し、Ｋ０１−０５０９−Ａ１物質および／またはＫ０１−０５０９−Ａ２物質を生産する能力を有する微生物が、ストレプトミセス  エスピー  Ｋ０１−０５０９（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．Ｋ０１−０５０９）ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５０４であるＫ０１−０５０９−Ａ１物質および／またはＫ０１−０５０９−Ａ２物質からなる請求項６記載の組成物の製造法。
【請求項１０】
微生物がストレプトミセス・エスピー  Ｋ０１−０５０９（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．Ｋ０１−０５０９）ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５０４。
【請求項１１】
ストレプトミセス・エスピー  Ｋ０１−０５０９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５０４）の変異株である請求の範囲１０記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】    本発明は、細菌のＩＩＩ型分泌機構を阻害するＫ０１−０５０９物質およびその製造法に関し、該Ｋ０１−０５０９物質はＫ０１−０５０９−Ａ１物質及び／又はＫ０１−０５０９−Ａ２物質からなる抗感染治療薬、あるいは予防薬として有用な物質に関するものである。
【背景技術】    細菌の病原因子を菌体外に放出する機能を持つＩＩＩ型分泌機構は、例えばサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、腸管病原性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅ．ｃｏｌｉ、以下ＥＰＥＣと略称することもある）、腸管出血性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  Ｅ．ｃｏｌｉ）、そしてボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）属に高度に保存されていることが既に報告されている（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｊｕｎｅ，１９９８，ｐ３８１）。
前述のＩＩＩ型分泌機構を保持する細菌は、この分泌機構を通して病原因子を菌体外に放出し、放出された病原因子の一部は宿主細胞へと移行すること、さらに宿主細胞に移行した病原因子は細菌の病原性に大きく関与していることが既に報告されている（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｊｕｎｅ  １９９８，ｐ３８２〜）。
一方、ＩＩＩ型分泌機構によって分泌される蛋白質（以下ＩＩＩ型分泌蛋白質と略称することもある）を欠損させたＥＰＥＣ株においては、病原性を消失することがウサギの感染実験（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｗｄ．Ｖｏｌｕｍｅ  １８８，Ｎｕｍｂｅｒ  １０，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １６，１９９８  ｐ１９０７−１９１６）、及びヒトをボランティアとした感染実験（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｊｕｎｅ  ２０００，ｐ３６８９−３６９５）により明らかにされている。このような事実から、ＩＩＩ型分泌機構ならびにその分泌蛋白質の機能を阻害する物質は、細菌を死滅させるのではなく、その病原性のみを消失させるという新しい概念の抗感染治療薬、あるいは予防薬としてその効果が期待される。
【発明の開示】
かかる実情において、病原細菌に対してその病原性を消失させる新しい抗感染症薬を見いだすことが本発明が解決しようとする課題である。
本発明者らは上記のごとき課題を解決すべく微生物の生産する代謝産物について種々研究を続けた結果、奄美大島の土壌より新たに分離されたＫ０１−０５０９菌株の培養物中にＩＩＩ型分泌機構阻害活性を有する物質が産生されることを見いだした。次いで、該培養物中からＩＩＩ型分泌機構阻害活性を示す物質を分離精製した結果、後記の式［Ｉ］および［ＩＩ］で示される化学構造を有する物質を見いだした。このような化学構造を有する物質は従来まったく知られていないことから、各々本物質をＫ０１−０５０９−Ａ１物質およびＫ０１−０５０９−Ａ２物質と称することにし、その総称をＫ０１−０５０９物質と称することにした。
本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものであって、下記式［Ｉ］
2005090384.tif 000002
で表されるＫ０１−０５０９−Ａ１物質を提供するものである。
本発明は下記式［ＩＩ］
2005090384.tif 000003
で表されるＫ０１−０５０９−Ａ２物質（Ａ１物質の立体異性体）を提供するものである。
本発明は特に下記式［Ｉ］
2005090384.tif 000004
で表されるＫ０１−０５０９−Ａ１物質及び特に下記式［ＩＩ］
2005090384.tif 000005
で表されるＫ０１−０５０９−Ａ２物質（Ａ１物質の立体異性体）からなるＫ０１−０５０９組成物を提供するものである。
本発明は更に、ストレプトミセス属に属し、Ｋ０１−０５０９−Ａ１物質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養液中にＫ０１−０５０９−Ａ１物質を蓄積せしめ、該培養物からＫ０１−０５０９−Ａ１物質を採取するＫ０１−０５０９−Ａ１物質の製造法を提供するものである。
本発明は更に、ストレプトミセス属に属し、Ｋ０１−０５０９−Ａ２物質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養液中にＫ０１−０５０９−Ａ２物質を蓄積せしめ、該培養物からＫ０１−０５０９−Ａ２物質を採取するＫ０１−０５０９−Ａ２物質の製造法を提供するものである。
本発明は更に、ストレプトミセス属に属し、Ｋ０１−０５０９−Ａ１物質およびＫ０１−０５０９−Ａ２物質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養液中にＫ０１−０５０９−Ａ１物質およびＫ０１−０５０９−Ａ２物質を蓄積せしめ、該培養物からＫ０１−０５０９−Ａ１物質およびＫ０１−０５０９−Ａ２物質からなる組成物の製造法を提供するものである。
本発明は更に、ストレプトミセス属に属し、Ｋ０１−０５０９−Ａ１物質を生産する能力を有する微生物が、ストレプトミセス・エスピー  Ｋ０１−０５０９（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．Ｋ０１−０５０９）ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５０４であるＫ０１−０５０９−Ａ１物質の製造法を提供するものである。
本発明は更に、ストレプトミセス属に属し、Ｋ０１−０５０９−Ａ２物質を生産する能力を有する微生物が、ストレプトミセス・エスピー  Ｋ０１−０５０９（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．Ｋ０１−０５０９）ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５０４であるＫ０１−０５０９−Ａ２物質の製造法を提供するものである。
本発明は更に、ストレプトミセス属に属し、Ｋ０１−０５０９−Ａ１物質およびＫ０１−０５０９−Ａ２物質を生産する能力を有する微生物が、ストレプトミセス  エスピー  Ｋ０１−０５０９（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．Ｋ０１−０５０９）ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５０４であるＫ０１−０５０９−Ａ１物質およびＫ０１−０５０９−Ａ２物質からなる組成物の製造法を提供するものである。
本発明は更に、ストレプトミセス・エスピー  Ｋ０１−０５０９（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．Ｋ０１−０５０９）ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５０４である微生物を提供するものである。
前記の式［Ｉ］および［ＩＩ］で表される本発明のＫ０１−０５０９−Ａ１物質およびＫ０１−０５０９−Ａ２物質またはこれら物質からなる組成物を生産する能力を有する微生物（以下「Ｋ０１−０５０９物質生産菌」と称する）は、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に属するが、例えば本発明者らが新たに分離したストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）Ｋ０１−０５０９菌株が、本発明において最も有効に使用される菌株の一例である。
本発明のストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）Ｋ０１−０５０９菌株の菌学的性状を示すと、以下のとおりである。
（Ｉ）形態的性質
栄養菌糸は各種寒天培地上でよく発達し、分断は観察されない。気菌糸はイースト・麦芽エキス寒天培地やグリセロール・アスパラギン寒天培地で豊富に着生し、ホワイトからグレーの色調を呈する。顕微鏡下の観察では、気菌糸上に２０ケ以上の胞子の連鎖が認められ、その形態は直線状で、胞子の大きさは約０．６〜０．８×１．０〜１．８μｍの円筒状である。胞子の表面は平滑でる。菌核、胞子のうおよび遊走子は見いだされない。
（ＩＩ）各種培地上での性状
イー・ビー・シャーリング（Ｅ．Ｂ．Ｓｈｉｒｌｉｎｇ）とデー・ゴットリーブ（Ｄ．Ｇｏｔｔｌｉｅｂ）の方法（インターナショナル・ジャーナル・オブ・システィマティック・バクテリオロジー、１６巻、３１３頁、１９６６年）によって調べた本生産菌の培養性状を次表に示す。色調は標準色として、カラー・ハーモニー・マニュアル第４版（コンテナー・コーポレーション・オブ・アメリカ・シカゴ、１９５８年）を用いて決定し、色票名とともに括弧内にそのコードを併せて記した。以下は特記しない限り、２７℃、２週間目の各培地における観察の結果である。
培養性状
2005090384.tif 000006
2005090384.tif 000007
2005090384.tif 000008
（ＩＩＩ）生理学的諸性質
（１）メラニン色素の生成
（イ）チロシン寒天                                  陰性
（ロ）ペプトン・イースト・鉄寒天                    陰性
（ハ）トリプトン・イースト液                        陰性
（ニ）単純ゼラチン培地（２１〜２３℃）              擬陽性
（２）硝酸塩の還元                                        陰性
（３）ゼラチンの液化（２１〜２３℃）（単純ゼラチン培地）  陰性
（４）スターチの加水分解                                  陽性
（５）脱脂乳の凝固（３７℃）                              陽性
（６）脱脂乳のペプトン化（３７℃）                        陽性
（７）生育温度範囲                                      １０〜３８℃
（８）炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリーブ寒天培地）
利用する  ：Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース
利用しない：Ｄ−キシロース、Ｄ−マンニトール、Ｌ−ラムノース、
Ｄ−フラクトース、ｍｙｏ−イノシトール、ラフィノー
ス、メリビオース、シュークロース
（９）セルロースの分解                                    陰性
（ＩＶ）細胞壁組成
細胞壁のジアミノピメリン酸はＬＬ型であり、主要メナキノンはＭＫ−９（Ｈ８）である。
（Ｖ）結論
以上、本菌の菌学的性状を要約すると次のとおりである。細胞壁中のジアミノピメリン酸はＬＬ型、主要メナキノンはＭＫ−９（Ｈ６）とＭＫ−９（Ｈ８）である。胞子連鎖の形態は直鎖状で、長い胞子鎖を形成し、胞子の表面は平滑である。培養上の諸性質としては、栄養菌糸は褐色の色調を呈し、気菌糸はホワイトからグレー系の色調を呈する。トリプトン・イースト液でメラニン色素を産生する。
これらの結果から、バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー、４巻、１９８９年に基づくストレプトミセス属に属する菌種であると考えられる。
本菌株は特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づき、ストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）Ｋ０１−０５０９として、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）〔ＡＩＳＴ  Ｔｓｕｋｕｂａ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ６，１−１，Ｈｉｇａｓｈｉ  １−Ｃｈｏｍｅ  Ｔｓｕｋｕｂａ−ｓｈｉ，Ｉｂａｒａｋｉ−ｋｅｎ，３０５−８５６６  Ｊａｐａｎ〕に所在する独立行政法人産業技術相好研究所  特許生物寄託センター〔Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ〕に寄託されている。寄託日は平成１５年（２００３）１０月６日、受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５０４が付与された。
本発明で使用されるＫ０１−０５０９物質生産菌としては、前述のストレプトマイセス  エスピー  Ｋ０１−０５０９菌株が好ましい例として挙げられるが、菌は一般的性状として菌学上の性状は極めて変異し易く、一定したものではなく、自然的にあるいは通常行われる紫外線照射または変異誘導体、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネート等を用いる人工的変異手段により変異することは周知の事実であり、このような人工変異株は勿論、自然変異株も含め、ストレプトミセス属に属し、前記の式［Ｉ］及び［ＩＩ］で表されるＫ０１−０５０９物質またはその物質の組成物を生産する能力を有する菌株はすべて本発明に使用することができる。
本発明のＫ０１−０５０９物質を製造するにあたっては、先ずストレプトミセス属に属するＫ０１−０５０９物質生産菌を培地に培養することにより行われる。本発明のＫ０１−０５０９物質生産に適した栄養源としては、微生物が同化し得る炭素源、消化し得る窒素源、さらに必要に応じて無機塩、ビタミン等を含有させた栄養培地が使用される。炭素源としては、グルコース、フラクトース、マルトース、ラクトース、ガラクトース、デキストリン、澱粉などの糖類、大豆油等の植物性油脂類が単独または組み合わせて用いられる。
窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粉、綿実粉、コーン・スチープ・リカー、麦芽エキス、カゼイン、アミノ酸、尿素、アンモニウム塩類、硝酸塩類などが単独または組み合わせて用いられる。その他必要に応じてリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩などの塩類、鉄塩、マンガン塩、銅塩、コバルト塩、亜鉛塩などの重金属塩類やビタミン類、その他Ｋ０１−０５０９物質の生産に好適なものが添加される。
培養するに当たり、発泡の激しいときには、必要に応じて液体パラフィン、動物油、植物油、シリコン油、界面活性剤などの消泡剤を添加してもよい。上記の培養は、上記の栄養源を含有すれば、培地は液体でも固体でもよいが、通常は液体培地を用い、培養するのがよい、少量生産の場合にはフラスコを用いる培養が好適である。
培養を大きなタンクで行う場合は、生産工程において、菌の生育遅延を防止するため、はじめに比較的少量の培地に生産菌を接種培養した後、次に培養物を大きなタンクに移して、そこで生産培養するのが好ましい。この場合、前培養に使用する培地および生産培養に使用する培地の組成は、両者ともに同一であってもよいし、必要があれば両者を変えてもよい。
培養を通気攪拌条件で行う場合は、例えばプロペラやその他機械による攪拌、ファメーターの回転または振とう、ポンプ処理、空気の吹き込みなど既知の方法が適宜使用される。通気用の空気は、滅菌したものを使用する。培養温度は、本Ｋ０１−０５０９物質生産菌が本物質を生産する範囲内で適宜変更し得るが、通常は２０〜３０℃、好ましくは２７℃前後で培養するのがよい。培養ｐＨは、通常は５〜８、好ましくは７前後で培養するのがよい。培養時間は、培養条件によっても異なるが、通常は３日程度である。
このようにして得られた培養物に蓄積されるＫ０１−０５０９物質は、通常は培養上清中に存在する。培養上清から目的とするＫ０１−０５０９物質を採取するには、通常の微生物の培養物から代謝産物を採取するに用いられる手段を単独あるいは任意の順序に組み合わせて、または反復して用いられる。
本Ｋ０１−０５０９物質を分離、採取するには培養上清から採取すればよい。培養上清を水溶性物質の採取に用いられる公知の方法、例えば吸着クロマトグラフイー、ゲルろ過クロマトグラフイー、高速液体クロマトグラフイーなどを組合せ、あるいは繰り返すことにより、本Ｋ０１−０５０９物質を単離することができる。
次に、本発明のＫ０１−０５０９物質の理化学的性状について説明する。
１．Ｋ０１−０５０９−Ａ１物質
（１）性状  ：白色粉末
（２）分子式：Ｃ２３Ｈ４０Ｎ８  Ｏ８
ＨＲＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ＋Ｈ］＋
計算値５５７．３０４７、実測値５５７．３０５２
（３）分子量：５５６
ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）で［Ｍ＋Ｈ］＋５５７、［Ｍ＋Ｎａ］＋
５７９を観測
（４）紫外部吸収スペクトル
：水溶液中で測定した紫外部吸収スペクトルは第１図に示すとお
りであり、末端吸収を示す。
（５）赤外部吸収スペクトル
：臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは第２図
に示すとおりであり、λｍａｘ１５６４、１６８２ｃｍ−１に特
徴的な吸収極大を示す。
（６）比旋光度
：［α］Ｄ２７−５．００°（ｃ＝０．１、メタノール）
（７）溶剤に対する溶解性
：水、ジメチルスルフォキサイド（ＤＭＳＯ）、メタノールに可
溶。
：アセトニトリル、酢酸エチル、クロロホルム、アセトンに不溶
（８）塩基性、酸性、中性の区別
：塩基性物質
（９）アミノ酸分析
：Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン（１：１）が存在する。
（１０）１Ｈ−プロトン核磁気共鳴スペクトル（重水中）の測定には、バリアン社製４００ＭＨｚ核磁気共鳴スペクトロメータを用いて測定（第３図）した。その化学シフト（ｐｐｍ）は０．９２（３Ｈ）、０．９２（３Ｈ）、１．３９（３Ｈ）、１．４４，１．５５（３Ｈ）、１．５７、１．７１、１．７６、１．７７、１．９３、２．１１、３．４８、３．６１、３．７９、３．９７、４．０７、４．１７、４．２３、４．２７、４．４３、４．４４。
（１１）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル（重水中）の測定には、バリアン社製１００ＭＨｚ核磁気共鳴スペクトロメータを用いて測定（第４図）した。その化学シフト（ｐｐｍ）は１８．２、１９．１、２０．１、２１．１、２９．６、３０．３、３２．５、３８．８、５２．２、５３．１、５３．３、５３．８、５４．０、５６．０、６２．４、７４．１、７６．７、１５８．９、１５８．９、１６８．４、１７２．１、１７６．６、１７９．２。
以上のように、Ｋ０１−０５０９−Ａ１物質の各種理化学性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、Ｋ０１−０５０９−Ａ１物質は式［Ｉ］で表される化学構造であることが決定された。
２．Ｋ０１−０５０９−Ａ２物質
（１）性状  ：白色粉末
（２）分子式：Ｃ２３Ｈ４０Ｎ８  Ｏ８
ＨＲＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ＋Ｈ］＋
計算値５５７．３０４７、実測値５５７．３０２３
（３）分子量：５５６
ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）で［Ｍ＋Ｈ］＋５５７、［Ｍ＋Ｎａ］＋
５７９を観測
（４）紫外部吸収スペクトル
：水溶液中で測定した紫外部吸収スペクトルは第５図に示すとお
りであり、末端吸収を示す。
（５）赤外部吸収スペクトル
：臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは第６図
に示すとおりであり、λｍａｘ１５６４、１６８２ｃｍ−１に特
徴的な吸収極大を示す。
（６）比旋光度
：［α］Ｄ２６−７．４°（ｃ＝０．１、メタノール）
（７）溶剤に対する溶解性
：水、ジメチルスルフォキサイド（ＤＭＳＯ）、メタノールに可
溶。
：アセトニトリル、酢酸エチル、クロロホルム、アセトンに不溶
（８）塩基性、酸性、中性の区別
：塩基性物質
（９）アミノ酸分析
：Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン（１：１）が存在する。
（１０）１Ｈ−プロトン核磁気共鳴スペクトル（重水中）の測定には、バリアン社製４００ＭＨｚ核磁気共鳴スペクトロメータを用いて測定した（第７図）。その化学シフト（ｐｐｍ）は０．９２（３Ｈ）、０．９２（３Ｈ）、１．３９（３Ｈ）、１．４４，１．５３（３Ｈ）、１．５７、１．７１、１．７６、１．７７、１．９３、２．１２、３．４８、３．６１、３．７９、３．９９、４．０７、４．０９、４．２３、４．２７、４．４４、４．５０。
（１１）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル（重水中）の測定には、バリアン社製１００ＭＨｚ核磁気共鳴スペクトロメータを用いて測定（第８図）した。その化学シフト（ｐｐｍ）は１７．０、１９．２、２０．１、２１．１、３０．１、３０．４、３２．６、３８．８、５２．２、５３．２、５３．８、５４．０、５４．９、５９．８、６２．４、７４．２、７６．８、１５８．９、１５８．９、１６８．３、１７２．１、１７６．６、１７９．０。
以上のように、Ｋ０１−０５０９−Ａ２物質の各種理化学性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、Ｋ０１−０５０９−Ａ２物質は式［ＩＩ］で表される化学構造であることが決定された。
次に、本発明のＫ０１−０５０９物質の生物学的性状について以下に述べる。Ｋ０１−０５０９物質の病原性グラム陰性細菌に対するＩＩＩ型分泌機構の阻害活性及び抗菌活性は以下の方法で測定した。
（１）腸管病原性大腸菌ＩＩＩ型分泌機構に依存した溶血阻害活性の測定
本活性試験は、大村らによって確立されたバクテリアのタイプＩＩＩ分泌機構およびその分泌蛋白質の機能を阻害する物質の検出法（国際公開番号ＷＯ０２／０５７７６０Ａ１、対応の米国特許第６５８６２００Ｂ２）に従って行った。すなわち、腸管病原性大腸菌ＣｅｓＴ欠損株（ＷＯ０２／０５７７６０Ａ１）を、エル・ビー液体培地（エル．ビー・メディア２．５％、フナコシ社製、日本国）５ｍＬに１白金耳植菌し、３７℃で１２時間静置培養する。その培養液をカザミノ酸含有Ｍ９培地〔リン酸水素二ナトリウム０．６８％（関東化学社製、日本国）、リン酸二水素カリウム０．３％（和光純薬社製、日本国）、塩化ナトリウム０．０５％（関東化学社製、日本国）、塩化アンモニウム０．１％（和光純薬社製、日本国）、グルコース０．４％（和光純薬社製、日本国）、カザミノ酸０．１％（三光純薬社製、日本国）、硫酸マグネシウム０．０１２％（関東化学社製、日本国）〕に１％植菌して３７℃で４時間静置培養する。その培養液を３５００ｒｐｍで１５分間遠心し、得られた菌体ペレットを５ｍＬのカザミノ酸含有Ｍ９培地で再懸濁した。
一方、赤血球溶液は、ヒツジ赤血球（日本生物材料センター、日本国）８ｍＬに４℃の生理食塩水４０ｍＬを加えて２５００ｒｐｍ、５分間、４℃で遠心分離することで３回洗浄した後に、赤血球ペレットの重さを測定する。ペレット１ｇに対して２ｍＬの割合でカザミノ酸含有Ｍ９培地を加えて懸濁させた。このように調製した大腸菌懸濁液と赤血球懸濁液を等量混合し、この混合液９０μＬを、あらかじめサンプル５μＬおよびカザミノ酸含有Ｍ９培地１０μＬを添加した９６穴マイクロプレート（コーニング社製、米国）に添加した。次に、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、これを３７℃で９０〜１５０分間加温し溶血反応を開始させた。反応後直ちに冷却したＰＢＳ（−）（塩化ナトリウム０．８％、（関東化学社製、日本国）、リン酸水素二ナトリウム０．１１５％（関東化学社製、日本国）、リン酸二水素カリウム０．０２％（和光純薬社製、日本国）、塩化カリウム０．０２％（関東化学社製、日本国）１５０μＬを加えて懸濁後、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。遠心後上清１００μＬを新たな９６穴マイクロプレートに移し、ヘモグロビンの溶出と自動マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製、米国）を用いて波長５５０ｎｍで吸光度を測定した。溶血阻害活性は次式に従い計算した。
溶血阻害活性（％）＝１００−〔（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）×１００〕
Ａ：サンプルを添加した時のＯＤ５５０ｎｍ測定値
Ｂ：赤血球・腸管病原性大腸菌ＣｅｓＴ欠損株混合液のみでのＯＤ５５
０ｎｍ測定値
Ｃ：赤血球のみでのＯＤ５５０ｎｍ測定値
その結果、Ｋ０１−０５０９−Ａ１物質の溶血阻害活性はＩＣ５０値で４．２μｇ／ｍＬ、Ｋ０１−０５０９−Ａ２物質のＩＣ５０は３．２μｇ／ｍＬと測定され、両物質ともＩＩＩ型分泌機構を阻害することが明らかとなった。
（２）ペーパーディスク法による腸管病原性大腸菌及び各種検定菌に対する抗菌活性の測定
検定菌としてＥｎｔｅｒｏｐａｔｈｇｅｎｉｃ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｅ２３４８／６９（野性株）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ６６３３、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ  ＡＴＣＣ９３４１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＮＩＨＪ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｏｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．ｏｒｙｚａｅ  ＫＢ８８を用い、培地は栄養寒天培地〔ペプトン０．５％（極東製薬社製、日本国）、肉エキス０．５％（極東製薬社製、日本国）、寒天０．８％（清水食品社製、日本国）、ｐＨ７，０に調製〕を用いた。活性はペーパーディスク法（直径６ｍｍ：アドバンテック社製、日本国）により評価し、２４時間培養後に阻止円を測定した。
その測定結果によれば、Ｋ０１−０５０９−Ａ１物質は１０μｇ／ディスクで、Ｋ０１−０５０９−Ａ２物質は１０μｇ／ディスクで全ての検定菌に阻止円を示さなかった。
以上に詳しく述べたように、本発明のＫ０１−０５０９物質は、それ自身では抗菌活性を示すことなく、病原性グラム陰性細菌の有するＩＩＩ型分泌装置を選択的に阻害する新しい抗感染症薬として有用である。
【図面の簡単な説明】    第１図は本Ｋ０１−０５０９−Ａ１物質の紫外部吸収スペクトル（水溶液中）を示したものである。
第２図は本Ｋ０１−０５０９−Ａ１物質の赤外部吸収スペクトル（臭化カリウム法）を示したものである。
第３図は本Ｋ０１−０５０９−Ａ１物質のプロトン核磁気共鳴スペクトル（重水中）を示したものである。
第４図は本Ｋ０１−０５０９−Ａ１物質のカーボン核磁気共鳴スペクトル（重水中）を示したものである。
第５図は本発明のＫ０１−０５０９−Ａ２物質の紫外部吸収スペクトル（水溶液中）を示したものである。
第６図は本Ｋ０１−０５０９−Ａ２物質の赤外部吸収スペクトル（臭化カリウム法）を示したものである。
第７図は本Ｋ０１−０５０９−Ａ２物質のプロトン核磁気共鳴スペクトル（重水中）を示したものである。
第８図は本Ｋ０１−０５０９−Ａ２物質のカーボン核磁気共鳴スペクトル（重水中）を示したものである。
【発明を実施するための最良の形態】    次に、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれのみに限定されるものでない。
寒天斜面培地〔スターチ１．０％、和光純薬社製、日本国）、エヌ・ゼット・アミン０・３％（和光純薬社製、日本国）：肉エキス０−１％（極東製薬社製、日本国）、寒天１．２％（清水食品社製、日本国）、炭酸カルシウム０・３％（関東化学社製、日本国）、ｐＨ７．０に調製〕で培養したＫ０１−０５０９株を、種培地〔スターチ２．４％（和光純薬社製、日本国）、グルコース０．１％（和光純薬社製、日本国）、ペプトン０．３％（極東製薬社製、日本国）、酵母エキス０．５％（オリエンタル酵母社製、日本国）、炭酸カルシウム（関東化学社製、日本国）、ｐＨ７．０に調製〕１００ｍＬを分注した５００ｍＬ容三角フラスコに１白金耳ずつ接種し、２７℃で３日間ロータリーシェイカー（２１０ｒｐｍ）で培養した後、生産培地〔スターチ２．４％（和光純薬社製、日本国）、グルコース０．１％（和光純薬社製、日本国）、ペプトン０．３％（極東製薬社製、日本国）、肉エキス０．３％（極東製薬、日本国）、酵母エキス０．５％（オリエンタル酵母社製、日本国）、炭酸カルシウム０．４％（関東化学社製、日本国）、硫酸鉄・七水和物５．０×１０−４％（関東化学社製、日本国）、塩化マグネシウム・四水和物５．０×１０−４％（和光純薬社製、日本国）、硫酸銅・五水和物５．０×１０−４％（関東化学社製、日本国）、塩化コバルト・六水和物５．０×１０−４％（和光純薬社製、日本国）、ｐＨ７．０に調製〕２０Ｌを入れた３０Ｌ容ジャーファーメンターに１％植菌し、３７℃で４日間培養した。
４日間培養した培養液（５４Ｌ）をシャープレス遠心機で遠心して上清と菌体とに分け、上清を活性炭カラム（φ７５×１５０ｍｍ、和光純薬社製）にかけ、水１．５Ｌで洗浄後、活性成分を２０、４０％アセトン各１．５Ｌで溶出し、減圧下濃縮して凍結乾燥した。得られた粗物質２１．５ｇを少量の水に溶解してアンバーライトＩＲＣ−５０（Ｈ＋）カラム（φ４６×１１０ｍｍ、オルガノ社製、日本国）にかけ、水３００ｍＬで洗浄後、活性成分を１Ｎ  ＨＣｌ  ６００ｍＬで溶出し、中和後、電気透析装置で脱塩し、減圧下濃縮して凍結乾燥した。
得られた粗物質８２３ｍｇのうち２００ｍｇを少量の水に溶解し、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液で平衡化したＯＤＳカラム（φ１０×３０ｍｍ、センシュー科学社製、日本国）にかけ、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液１０ｍＬで洗浄後、活性成分を２０％メタノール  ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液５ｍＬで溶出し、減圧下濃縮して凍結乾燥した。残りの６２３ｍｇを同様の操作により分離することで得られた粗物質１０３ｍｇを少量の水に溶解し、分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ３０−ＵＧ−５、φ２０×２５０ｍｍ、野村科学社製、日本国）により精製を行った。８％メタノール  ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液のアイソクラティックを移動相とし、５ｍＬ／ｍｉｎの流速において、ＵＶ２１０ｎｍの吸収をモニターした。保持時間８８分に活性を示すピークを観察し、このピークを分取して分取液を減圧濃縮し凍結乾燥した。
得られた活性画分８．３ｍｇを少量の水に溶解し分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ３０−ＵＧ−５、φ２０×２５０ｍｍ、野村科学社製、日本国）により精製を行った。３％アセトニトリル  ０．０５％リン酸水溶液のアイソクラティックを移動相とし、５ｍＬ／ｍｉｎの流速において、ＵＶ２１０ｎｍの吸収をモニターした。保持時間２７分及び３０分に活性を示すピークを観察し、このピークを分散して分取液を減圧下濃縮し、続いて脱塩するために、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液で平衡化したＯＤＳカラム（φ５×１０ｍｍ、センシュー科学社製、日本国）にかけ、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液５ｍＬで洗浄後、活性物質を１００％メタノール０．１％トリフルオロ酢酸水溶液５ｍＬで溶出し、減圧濃縮して凍結乾燥することにより白色粉末状のＫ０１−０５０９−Ａ１物質を収量１．１ｍｇ、Ｋ０１−０５０９−Ａ２物質を収量１．５ｍｇでそれぞれ単離した。
【産業上の利用可能性】    以上に説明したように、Ｋ０１−０５０９−Ａ１物質およびＫ０１−０５０９−Ａ２物質を生産する能力を有するストレプトマイセス属に属するＫ０１−０５０９株を代表する微生物を培地に培養して、その培養液中からタイプＩＩＩ型分泌機構阻害活性を有するＫ０１−０５０９−Ａ１物質およびＫ０１−０５０９−Ａ２物質を採取することにより、タイプＩＩＩ型分泌装置を有する病原性グラム陰性細菌に選択的で有効な医薬品としての効果が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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