【手続補正書】
【提出日】令和2年7月31日(2020.7.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞にてリガンドと結合するアプタマーを選択する方法であって、以下のステップ：
（ａ）アプタマーのライブラリを提供することと、
（ｂ）レポーター遺伝子の発現であって前記リガンドが介在する発現のためのポリヌクレオチドカセットに、前記アプタマーのライブラリのメンバーを導入してリボスイッチのライブラリを作り出すことと、
（ｃ）真核細胞に前記リボスイッチのライブラリを導入することと、
（ｄ）前記真核細胞をリガンドに接触させることと、
（ｅ）前記レポーター遺伝子の発現を測定することとを含み、
前記ポリヌクレオチドカセットは、５’イントロン及び３’イントロンが隣接する選択的にスプライシングされるエキソンと、（ｉ）前記３’イントロンの５’スプライス部位配列を含むステムを含むエフェクター領域及び（ｉｉ）アプタマーを含むリボスイッチとを含み、
前記選択的にスプライシングされるエキソンは、前記選択的にスプライシングされるエキソンが前記レポーター遺伝子のｍＲＮＡにスプライシングされる際、前記レポーター遺伝子とインフレームである終止コドンを含む、前記方法。
【請求項２】
以下のステップを含む、前記ポリヌクレオチドカセットに導入する前に前記アプタマーのライブラリをさらに小さなアプタマーライブラリに分割する、請求項１に記載の方法：
（ａ）無作為化アプタマーライブラリであって、前記ライブラリにおける前記アプタマーが複数の５’及び３’の定常領域と１以上の無作為化されたヌクレオチドとを含む、前記無作為化アプタマーライブラリを提供すること、
（ｂ）鋳型としての前記無作為化アプタマーライブラリと、前記５’及び３’の定常領域に相補的である第１のプライマーと第２のプライマーとを用いて２サイクルＰＣＲを行うこと、
（ｃ）前記２サイクルＰＣＲの産物を単離すること、及び
（ｄ）固有の５’及び３’の定常領域のサブセットに相補的であるプライマーを用いて２サイクルＰＣＲの単離された産物のサブセットをＰＣＲで増幅すること。
【請求項３】
前記リボスイッチのライブラリが、前記真核細胞に導入される前にリボスイッチの１以上のサブライブラリに分割され、任意で、前記リボスイッチのライブラリが、以下のステップを含んで、サブライブラリにさらに分割される、請求項１または２に記載の方法：
（ａ）前記リボスイッチライブラリを細菌に導入すること、
（ｂ）細菌クローンを回収し、プラスミドＤＮＡを抽出してリボスイッチのプラスミドサブライブラリを得、１以上の一次サブライブラリを生成すること、
（ｃ）任意で、一次サブライブラリを細菌に導入し、細菌クローンを回収し、プラスミドＤＮＡを単離することによってリボスイッチの一次プラスミドサブライブラリからリボスイッチの二次サブライブラリを生成すること。
【請求項４】
真核細胞にてアプタマーと結合するリガンドを選択する方法であって、
以下のステップ：
（ａ）リガンドのライブラリを提供することと、
（ｂ）レポーター遺伝子の発現であって前記リガンドが介在する発現のためのポリヌクレオチドカセットを提供することと、
（ｃ）前記真核細胞に前記ポリヌクレオチドカセットを導入することと、
（ｄ）前記真核細胞の個々のグループをリガンドの前記ライブラリのメンバーに接触させることと、
（ｅ）前記レポーター遺伝子の発現を測定することとを含み、
前記ポリヌクレオチドカセットは、５’イントロン及び３’イントロンが隣接する選択的にスプライシングされるエキソンと、（ｉ）前記３’イントロンの５’スプライス部位配列を含むステムを含むエフェクター領域及び（ｉｉ）アプタマーを含むリボスイッチとを含み、
前記選択的にスプライシングされるエキソンは、前記選択的にスプライシングされるエキソンが前記レポーター遺伝子のｍＲＮＡにスプライシングされる際、前記レポーター遺伝子とインフレームである終止コドンを含む、前記方法。
【請求項５】
前記リガンドが
（ａ）小分子である、または
（ｂ）代謝産物、核酸、ビタミン、補因子、脂質、単糖類及びセカンドメッセンジャーから成る群から選択される、真核細胞によって産生される分子である、
請求項１、３及び４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記真核細胞が哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞及び酵母細胞から成る群から選択される、請求項１、３及び４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記レポーター遺伝子が、
（ａ）蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ及び西洋ワサビペルオキシダーゼ、または
（ｂ）サイトカイン、シグナル伝達分子、成長ホルモン、抗体、調節性ＲＮＡ、治療用のタンパク質またはペプチド
から成る群から選択される、請求項１、３及び４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記レポーター遺伝子の前記発現が、前記リガンドが存在しない場合の前記レポーター遺伝子の発現レベルよりも、前記リガンドが特異的に前記アプタマーと結合する場合の方が約１０倍を超えて高い、請求項１、３及び４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記５’及び３’イントロンが、
（ａ）ヒトβ−グロビン遺伝子のイントロン２に由来する、
（ｂ）それぞれ独立して約５０〜約３００ヌクレオチドの長さである、または
（ｃ）それぞれ独立して約１２５〜約２４０ヌクレオチドの長さである、
請求項１、３及び４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記エフェクター領域のステムが、
（ａ）約７〜約２０塩基対の長さである、または
（ｂ）８〜１１塩基対の長さである、
請求項１、３及び４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記選択的にスプライシングされるエキソンが、
（ａ）ヒトのジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子のエキソン２、変異体ヒトウィルムス腫瘍１のエキソン５、マウスのカルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩデルタのエキソン１６及びＳＩＲＴ１のエキソン６から成る群に由来する、
（ｂ）ヒトＤＨＦＲに由来する修飾されたエクシン２である、
（ｃ）合成のものである、または
（ｄ）エキソンスプライスエンハンサーの配列を変えること、エキソンスプライスサイレンサーの配列を変えること、エキソンスプライスエンハンサーを付加すること、及びエキソンスプライスサイレンサーを付加することから成る群の１以上によって修飾されている、
請求項１、３及び４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
以下のステップを含む、無作為化アプタマーライブラリをさらに小さなアプタマーサブライブラリに分ける方法：
（ａ）無作為化アプタマーライブラリであって、前記ライブラリにおける前記アプタマーが複数の５’及び３’の定常領域と１以上の無作為化したヌクレオチドとを含む、前記無作為化アプタマーライブラリを提供すること、
（ｂ）鋳型としての前記無作為化アプタマーライブラリと、前記５’及び３’の定常領域に相補的である第１のプライマーと第２のプライマーとを用いて２サイクルＰＣＲを行うこと、
（ｃ）前記２サイクルＰＣＲの産物を単離すること、及び
（ｄ）固有の５’及び３’の定常領域のサブセットに相補的であるプライマーを用いて前記２サイクルＰＣＲの前記単離された産物のサブセットをＰＣＲで増幅することと。
【請求項１３】
前記無作為化アプタマーライブラリが１以上の無作為化したヌクレオチドを有するアプタマーを含む、請求項１、３及び１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記無作為化アプタマーライブラリが約１００，０００を超えるアプタマーを含む、または、前記無作為化アプタマーライブラリが約１，０００，０００を超えるアプタマーを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記２サイクルＰＣＲにおける第１のプライマーまたは第２のプライマーが、ビオチン、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）、蛍光色素分子、及びクリック化学で使用される化学基から成る群から選択される標識を含む、請求項２、３及び１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜３、５〜１１、１３及び１５のいずれか一項に記載の方法によって選択されるアプタマー、または、請求項４〜１１のいずれか一項に記載の方法によって選択されるリガンド。
【請求項１７】
配列番号１４〜２７の配列、好ましくは配列番号２４の配列を含む配列によってコードされるアプタマー。