(57)【要約】  本発明の目的は、熱安定性に加え、且つ基質であるニトリル化合物や生成物であるアミド化合物の高濃度存在下でも高い活性を保つニトリルヒドラターゼを用いたアミド化合物の製造方法を提供することである。本発明では、自然界より目的のニトリルヒドラターゼを発現する新規な微生物を探索し、該酵素遺伝子を遺伝子導入したロドッカス属の形質転換菌体およびその菌体処理物を製造に用いる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）又は（Ｂ）の何れかに記載のＤＮＡにより形質転換されたロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物。
（Ａ）ニトリルヒドラターゼのαサブユニットに対応する配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列と、ニトリルヒドラターゼのβサブユニットに対応する配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列、又は配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列とを含有するＤＮＡであって、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｂ）ニトリルヒドラターゼのαサブユニットをコードする塩基配列に対応する配列表の配列番号３の６９５〜１３１２番目の塩基配列、又は当該塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列と、ニトリルヒドラターゼのβサブユニットをコードする塩基配列に対応する配列表の配列番号３の１〜６８１番目の塩基配列、又は当該塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列とを含有するＤＮＡであって、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
形質転換により下記の理化学的性質を有するタンパク質を生産することができるロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物。
（ａ）ニトリルヒドラターゼ活性を有する。
（ｂ）基質特異性：アクリロニトリル、アジポニトリル、アセトニトリル、イソブチロニトリル、n-バレロニトリル、n-ブチロニトリル、ベンゾニトリル、ヘキサンニトリルを基質として、活性を示す。
（ｃ）分子量：少なくとも下記の2種類のサブユニットから構成されるタンパク質であって、各サブユニットの還元型SDS-ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が以下の通りである。
サブユニットα分子量：２５０００±２０００
サブユニットβ分子量：２８０００±２０００
（ｄ）熱安定性：水液中の酵素を70℃の温度で30分加熱後に、加熱前の35％以上の活性を残存する。
（ｅ）６重量％のアクリロニトリルを基質としても、それ以下の基質濃度の時に比べ、活性が減少しない。
（ｆ）３５重量％のアクリルアミド水溶液中でもアクリロニトリルを基質とした活性を有する。
【請求項３】
形質転換により下記の理化学的性質を有するタンパク質を生産することができる、請求項１に記載の微生物。
（ａ）ニトリルヒドラターゼ活性を有する。
（ｂ）基質特異性：アクリロニトリル、アジポニトリル、アセトニトリル、イソブチロニトリル、n-バレロニトリル、n-ブチロニトリル、ベンゾニトリル、ヘキサンニトリルを基質として、活性を示す。
（ｃ）分子量：少なくとも下記の2種類のサブユニットから構成されるタンパク質であって、各サブユニットの還元型SDS-ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が以下の通りである。
サブユニットα分子量：２５０００±２０００
サブユニットβ分子量：２８０００±２０００
（ｄ）熱安定性：水液中の酵素を70℃の温度で30分加熱後に、加熱前の35％以上の活性を残存する。
（ｅ）６重量％のアクリロニトリルを基質としても、それ以下の基質濃度の時に比べ、活性が減少しない。
（ｆ）３５重量％のアクリルアミド水溶液中でもアクリロニトリルを基質とした活性を有する。
【請求項４】
ロドコッカス属に属する微生物がロドコッカス・ロドクロウスM33（Rhodococcus rhodochrous M33）株（VKM Ac-1515DあるいはKCCM-10635）及び／又はその変異体である、請求項１から３の何れかに記載の微生物。
【請求項５】
ニトリルヒドラターゼ遺伝子により形質転換されたロドコッカス・ロドクロウスM33（Rhodococcus rhodochrous M33）株（VKM Ac-1515DあるいはKCCM-10635）及び／又はその変異体のいずれかの微生物。
【請求項６】
下記（Ａ）又は（Ｂ）の何れかに記載のＤＮＡによりロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物を形質転換することを含む、請求項１から５の何れかに記載の微生物の製造方法。
（Ａ）ニトリルヒドラターゼのαサブユニットに対応する配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列と、ニトリルヒドラターゼのβサブユニットに対応する配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列、又は配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列とを含有するＤＮＡであって、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｂ）ニトリルヒドラターゼのαサブユニットをコードする塩基配列に対応する配列表の配列番号３の６９５〜１３１２番目の塩基配列、又は当該塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列と、ニトリルヒドラターゼのβサブユニットをコードする塩基配列に対応する配列表の配列番号３の１〜６８１番目の塩基配列、又は当該塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列とを含有するＤＮＡであって、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項７】
請求項１から５の何れかに記載の微生物を、培地において培養することを含む、ニトリルヒドラターゼまたはそれを含有する菌体処理物の製造方法。
【請求項８】
請求項７に記載の製造方法により製造される、ニトリルヒドラターゼまたはそれを含有する菌体処理物。
【請求項９】
請求項８に記載のニトリルヒドラターゼまたはそれを含有する菌体処理物にニトリル化合物に作用させて、該ニトリル化合物からアミド化合物を合成することを含む、アミド化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニトリルヒドラターゼ遺伝子で形質転換されたロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物、並びに上記微生物が保持するニトリルヒドラターゼの酵素触媒作用を用いてニトリル化合物からアミド化合物を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニトリル化合物のニトリル基を水和してアミド基に変換し対応するアミド化合物を製造する技術においては、従来の銅触媒による化学的な方法に代えて、微生物の酵素を触媒として用いる方法が主流となってきている。そのような酵素は一般にニトリルヒドラターゼと呼ばれるが、初めての報告以来、多数の酵素が様々な微生物より発見されている。例えば、アルスロバクター（Arthrobacter）属（Agricultural and Biological Chemistry Vol.44 p.2251-2252,1980）、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属（特開平０５−１０３６８１）、アシネトバクター（Acinetobacter）属（特開昭６１−２８２０８９）、エアロモナス(Aeromonas)属（特開平０５−０３０９８３）、エンテロバクター(Enterobacter)属（特開平０５−２３６９７５）、エルウィニア(Erwinia)属（特開平０５−１６１４９６）、キサントバクター(Xanthobacter)属（特開平０５−１６１４９５）、クレブシエラ(Klebsiella)属（特開平０５−０３０９８２）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属（特開昭５４−１２９１９０，後にロドコッカス属と判明）、シュードモナス(Pseudomonas)属（特開昭５８−８６０９３）、シトロバクター（Citrobacter）属（特開平０５−０３０９８４）ストレプトマイセス(Streptomyces)属（特開平０５−２３６９７６）、バチルス(Bacillus)属（特開昭５１−８６１８６、及び特開平７−２５５４９４）、フザリウム属（特開平０１−０８６８８９）、ロドコッカス(Rhodococcus)属（特開昭６３−１３７６８８、特開平０２−２２７０６９、特開２００２−３６９６９７、及び特開平２−４７０）、リゾビウム(Rhizobium)属（特開平０５−２３６９７７）、シュードノカルディア(Pseudonocardia)属（特開平８−５６６８４）等が挙げられる。これらの酵素はそのアミノ酸配列の多様性に基づき、その理化学的性質も多様であり、各種目的に沿って研究が進められて来た。理化学的性質の中でも、熱、あるいはアミド化合物およびニトリル化合物等への安定性に関する解明が進んでいる例としては、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)J１株に関する文献（European Journal of Biochemistry Vol.196 p.581-589, 1991.  Applied and Microbiology Biotechnology Vol.40 p.189-195, 1993、特開２００４−２１５５１３、及び特開２００４−２２２５３８）、シュードノカルディア・サーモフィラ(Pseudonocardia  thermophila)JCM３０９５株に関する文献（特開平８−１８７０９２、及びJournal of Fermentation and Bioengineering Vol.83 p.474-477,1997）、バチルス（Bacillus）属ＢＲ４４９株に関する文献(ＷＯ ９９/５５７１９、及びApplied Biochemistry and Biotechnology Vol.77-79 P.671-679, 1999)、バチルス（Bacillus）属ＲＡＰｃ８株に関する文献（Enzyme and Microbial Technology Vol.26 p.368-373, 2000、及びExtremophiles Vol.2 p.347-357, 1998）、バチルス・パリダス（Bacillus palidus）Ｄａｃ５２１株に関する文献(Biochimica et Biophysica Acta Vol.1431 p.249-260, 1999）、ＳＣ−Ｊ０５−１株に関する文献(Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology Vol.20 220-226,1998)、コマモナス・テストステロニ（Comamonas testosteroni）５−ＭＧＡＭ−４Ｄ株に関する文献（ＷＯ２００４／１０１７６８）、ロドコッカス・ピリディノボランス（Rhodococcus pyridinovorans）ＭＷ３株に関する文献（Biotechnology Letters 26: 1379-1384, 2004）が挙げられる。【０００３】
一方、これらユニークなニトリルヒドラターゼは酵素自体としては優秀であっても、工業的に製造に用いる際には、酵素を生産する微生物に欠点があることも多く、遺伝子工学の手法により宿主を変更する必要がある。その第一段階として、遺伝子のクローニングする試みが多数、検討されている。例えば、シュードモナス属（特開平３−２５１１８４）、ロドコッカス属（特開平２−１１９７７８、特開平４−２１１３７９、特開平０９−００９７３、特開平０７−０９９９８０、及び特開２００１−０６９９７８）、リゾビウム属（特開平６−２５２９６）、クレブシエラ属（特開平６−３０３９７１）、アクロモバクター属（特開平０８−２６６２７７）、シュードノカルディア属（特開平９−２７５９７８）、バチルス属（特開平０９−２４８１８８）等を挙げることができる。次のステップとして、工業的な生産に最適な宿主で、該遺伝子を発現させる必要があるが、多くの試みは遺伝子操作系が確立した大腸菌等での発現であり、この際には微生物を培養後、菌体内より酵素を精製や固定化するという余分な工程が必要となる。ロドコッカス属やコリネバクテリウム属のように細胞壁が堅く、高濃度のアミド化合物やニトリル化合物中でも細胞内の酵素の活性を維持できる微生物中で発現することで、この問題を解決できるが、個々の微生物において、遺伝子操作系を開発するのは困難をともなう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
発現させる酵素の理化学的性質としては熱安定性や基質であるニトリル化合物や生成物であるアミド化合物の高濃度存在下でも高い活性を保つニトリルヒドラターゼが望ましく、同目的の報告もあるが、反応に用いる酵素の実施形態、ニトリル化合物の種類によりそれらの絶対値は変動することもあり、すべてを兼ね備えた酵素は見出されていない。【０００５】
また、ニトリル化合物よりアミド化合物を工業的に製造する際には、アミド化合物の製造コストに占める該酵素の製造コストが重要な問題であり、より安価でより単純な培地における培養法の確立した微生物を用いて生産を行うことが望ましく、これらの微生物を宿主として用いた遺伝子組換え菌の作製が望まれる。【０００６】
該酵素の製造コストという課題の点では、培養が容易なだけでなく、菌体あたりの該酵素の発現量が高い遺伝子操作系を開発することも必須となる。【０００７】
さらに、宿主微生物の内部に存在するニトリルヒドラターゼ酵素が、高濃度のアミド化合物やニトリル化合物の中でも安定に存在することができるなら、該酵素を内部に保持する固定化担体として微生物をみなすことができる。その場合、高濃度の基質（ニトリル化合物）中での反応が可能になり、最終的なアミド化合物の蓄積濃度も上昇する。さらには、酵素の取り出しや、固定化担体への結合といった操作を省略し、微生物自体を反応の触媒として用いることができる。【０００８】
すなわち、本発明の目的は、熱や高濃度化合物に対する安定性の高いニトリルヒドラターゼを自然界より単離し、その酵素のアミノ酸配列および遺伝子配列を提供し、該遺伝子を含む組換えプラスミド、該組換えプラスミドを用いて、生産時のコスト的な優位性を持つ宿主においても、類稀な酵素の発現量を達成する形質転換体を提供することである。さらに本発明の別の目的は、上記形質転換体を培養・増殖させることによる該形質転換体を用いた該酵素の産生方法、並びに該形質転換体を用いたニトリル化合物からの対応するアミド化合物の安価な製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、埼玉県の温泉近傍にある土壌よりニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物として、ジオバチルス・サーモグルコシデシウス（Geobacillus thermoglucosidasius ）を見出した。なお、ジオバチルス属の微生物がニトリルヒドラターゼを有し、ニトリルヒドラターゼ活性を示すことはこれまで知られておらず、さらに本微生物の培養に通常用いる６５℃という温度は、従来のニトリルヒドラターゼを持つ好熱菌の通常の培養温度（４５℃〜６０℃）を越えるものであり、酵素としてアミド化合物やニトリル化合物に対しての安定性を併せ持つ。【００１０】
また、該微生物よりニトリルヒドラターゼ酵素を精製し、そのニトリルヒドラターゼ活性が熱や高濃度のニトリル化合物、及びアミド化合物に対して高い安定性を兼ね備えることを示した。また、精製した酵素の各サブユニットのＮ末端のアミノ酸配列をもとに該微生物の染色体DNAよりニトリルヒドラターゼ遺伝子を単離し、そのアミノ酸配列および遺伝子配列を初めて明らかにした結果、既存のニトリルヒドラターゼとの相同性は非常に低いことが判明した。また、その遺伝子下流に存在する活性化タンパク質と推定される遺伝子配列とともに、発現することにより、該酵素を大量に発現する遺伝子組換え菌株を作出することにも成功した。また、これをさらに完成度の高い発明とするために、細胞壁が硬く、微生物自体を酵素の固定化担体のように使えるロドコッカス属に属する微生物に着目し、さらには安価な培地での培養も可能であり、工業生産に適した微生物であるロドコッカス・ロドクロウスM33（Rhodococcus rhodochrous M33）株（VKM Ac-1515D）を宿主として、該酵素を類稀に大量発現する遺伝子組換え株を作製することにも成功した。一方、この結果より、ロドコッカス・ロドクロウスM33株は異種生物のニトリルヒドラターゼを発現する宿主として普遍的な価値を持つとも証明できた。【００１１】
すなわち、本発明によれば、以下の（１）から（９）に記載の発明が提供される。
（１）  下記（Ａ）又は（Ｂ）の何れかに記載のＤＮＡにより形質転換されたロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物。
（Ａ）ニトリルヒドラターゼのαサブユニットに対応する配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列と、ニトリルヒドラターゼのβサブユニットに対応する配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列、又は配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列とを含有するＤＮＡであって、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｂ）ニトリルヒドラターゼのαサブユニットをコードする塩基配列に対応する配列表の配列番号３の６９５〜１３１２番目の塩基配列、又は当該塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列と、ニトリルヒドラターゼのβサブユニットをコードする塩基配列に対応する配列表の配列番号３の１〜６８１番目の塩基配列、又は当該塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列とを含有するＤＮＡであって、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。【００１２】
（２）  形質転換により下記の理化学的性質を有するタンパク質を生産することができるロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物。
（ａ）ニトリルヒドラターゼ活性を有する。
（ｂ）基質特異性：アクリロニトリル、アジポニトリル、アセトニトリル、イソブチロニトリル、n-バレロニトリル、n-ブチロニトリル、ベンゾニトリル、ヘキサンニトリルを基質として、活性を示す。
（ｃ）分子量：少なくとも下記の2種類のサブユニットから構成されるタンパク質であって、各サブユニットの還元型SDS-ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が以下の通りである。
サブユニットα分子量：２５０００±２０００
サブユニットβ分子量：２８０００±２０００
（ｄ）熱安定性：水液中の酵素を70℃の温度で30分加熱後に、加熱前の35％以上の活性を残存する。
（ｅ）６重量％のアクリロニトリルを基質としても、それ以下の基質濃度の時に比べ、活性が減少しない。
（ｆ）３５重量％のアクリルアミド水溶液中でもアクリロニトリルを基質とした活性を有する。【００１３】
（３）  形質転換により下記の理化学的性質を有するタンパク質を生産することができる、（１）に記載の微生物。
（ａ）ニトリルヒドラターゼ活性を有する。
（ｂ）基質特異性：アクリロニトリル、アジポニトリル、アセトニトリル、イソブチロニトリル、n-バレロニトリル、n-ブチロニトリル、ベンゾニトリル、ヘキサンニトリルを基質として、活性を示す。
（ｃ）分子量：少なくとも下記の2種類のサブユニットから構成されるタンパク質であって、各サブユニットの還元型SDS-ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が以下の通りである。
サブユニットα分子量：２５０００±２０００
サブユニットβ分子量：２８０００±２０００
（ｄ）熱安定性：水液中の酵素を70℃の温度で30分加熱後に、加熱前の35％以上の活性を残存する。
（ｅ）６重量％のアクリロニトリルを基質としても、それ以下の基質濃度の時に比べ、活性が減少しない。
（ｆ）３５重量％のアクリルアミド水溶液中でもアクリロニトリルを基質とした活性を有する。【００１４】
（４）  ロドコッカス属に属する微生物がロドコッカス・ロドクロウスM33株（Rhodococcus rhodochrous M33）株（VKM Ac-1515D あるいはKCCM-10635）及び／又はその変異体である、（１）から（３）の何れかに記載の微生物。【００１５】
（５）  ニトリルヒドラターゼ遺伝子により形質転換されたロドコッカス・ロドクロウスM33株（Rhodococcus rhodochrous M33）株（VKM Ac-1515DあるいはKCCM-10635）及び／又はその変異体のいずれかの微生物。【００１６】
（６）  下記（Ａ）又は（Ｂ）の何れかに記載のＤＮＡによりロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物を形質転換することを含む、（１）から（５）の何れかに記載の微生物の製造方法。
（Ａ）ニトリルヒドラターゼのαサブユニットに対応する配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列と、ニトリルヒドラターゼのβサブユニットに対応する配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列、又は配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列とを含有するＤＮＡであって、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｂ）ニトリルヒドラターゼのαサブユニットをコードする塩基配列に対応する配列表の配列番号３の６９５〜１３１２番目の塩基配列、又は当該塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列と、ニトリルヒドラターゼのβサブユニットをコードする塩基配列に対応する配列表の配列番号３の１〜６８１番目の塩基配列、又は当該塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列とを含有するＤＮＡであって、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ【００１７】
（７）  （１）から（５）の何れかに記載の微生物を、培地において培養することを含む、ニトリルヒドラターゼまたはそれを含有する菌体処理物の製造方法。
（８）  （７）に記載の製造方法により製造される、ニトリルヒドラターゼまたはそれを含有する菌体処理物。
（９）  （８）に記載のニトリルヒドラターゼまたはそれを含有する菌体処理物にニトリル化合物に作用させて、該ニトリル化合物からアミド化合物を合成することを含む、アミド化合物の製造方法。【００１８】
本発明の微生物を用いることにより、熱や高濃度のニトリル、アミド化合物に対して高い安定性を示すニトリルヒドラターゼを製造することが可能になり、これを利用することによってニトリル化合物を対応するアミド化合物に効率良く、安価に変換することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
先ず、本発明で発現させるニトリルヒドラターゼに関して説明する。本発明においてニトリルヒドラターゼ活性を有するとは、アセトニトリルではアセトアミド、ｎ−プロピオニトリルではｎ−プロピオアミド、アクリロニトリルではアクリルアミドのように、ニトリル化合物に水分子を付加させて、アミド化合物に変換する活性を有することを意味する。また、生成した化合物は液体クロマトグラフィーで分取した後、ガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）、赤外吸収スペクトル（ＩＲ）および核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）を用いて同定することができる。【００２０】
本発明においてニトリルヒドラターゼ活性を測定するに際しては、例えば、０．１重量％のニトリル化合物溶液（０.０５Ｍ−リン酸バッファーpH７. ７）１ｍｌにニトリルヒドラターゼ酵素溶液１０μｌを加え、反応温度２７℃から６０℃にて１０から６０分間保温後、０．１mlの１規定塩酸を加えることにより反応を停止し、反応液の一部を液体クロマトグラフィーにて分析し、アミド化合物の生成の有無を検定することができる。【００２１】
本発明において基質となるニトリル化合物とは、例えば、アセトニトリル、ｎ−プロピオニトリル、ｎ−ブチロニトリル、イソブチロニトリル、ｎ−バレロニトリル、ｎ−ヘキサンニトリル等の脂肪族ニトリル化合物、２−クロロプロピオニトリル等のハロゲン原子を含むニトリル化合物、アクリロニトリル、クロトノニトリル、メタクリロニトリル等の不飽和結合を含む脂肪族ニトリル化合物、ラクトニトリル、マンデロニトリル等のヒドロキシニトリル化合物、２−フェニルグリシノニトリル等のアミノニトリル化合物、ベンゾニトリル、シアノピリジン等の芳香族ニトリル化合物、マロノニトリル、スクシノニトリル、アジポニトリル等のジニトリル化合物等およびトリニトリル化合物を挙げることができる。【００２２】
本発明におけるニトリルヒドラターゼの基質特異性は、上述の測定条件において、基質を各種変更してそれぞれの基質に対しニトリルヒドラターゼ活性を有するか否かを測定することにより判断することができる。基質特異性が広ければ、製造できる対応するアミド化合物の種類も増え、好ましいが、本酵素は少なくとも、アクリロニトリル、アジポニトリル、アセトニトリル、イソブチロニトリル、n−バレロニトリル、n−ブチロニトリル、ベンゾニトリル、ヘキサンニトリルを基質とすることができる。【００２３】
本発明におけるニトリルヒドラターゼとして、より好ましくは、配列表の配列番号１に示される２０５個のアミノ酸配列により示されるαサブユニットおよび配列表の配列番号２に示される２２６個のアミノ酸配列により示されるβサブユニットにより構成されることが好ましい例として挙げられる。この二つのサブニット以外にも、金属や他のペプチド等を含有してもよい。金属としては、特に鉄やコバルトを含有することが多い。さらに、このサブユニットのどちらか一方を含有する蛋白質でもよい。また、個々のサブユニットのアミノ酸配列としては、他のサブユットと複合体を形成してニトリルヒドラターゼ活性を有する限り、上記した配列表の配列番号１又は２に記載したアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失または挿入を有していてもよく、宿主の種類により、翻訳後に修飾を受けることも当然予想される。特に、ニトリルヒドラターゼのαサブユニットにおいてはシステイン残基が翻訳後、システインスルフィン酸またはシステインスルフェン酸に修飾されることが多い。該アミノ酸配列のうちの１〜３０個アミノ酸が置換、欠失、挿入、または翻訳後修飾されているアミノ酸配列も好ましい例として挙げられ、置換、欠失、挿入、または翻訳後修飾を受けるアミノ酸の個数は、より好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜５個、最も好ましくは１〜３個である。なお、このような置換、欠失、または挿入を有するアミノ酸配列を有するニトリルヒドラターゼ酵素は、公知の部位特異的変異導入法、例えばMolecular Cloning 2nd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)に記載の方法により、塩基配列の対応する部位に置換、欠失、または挿入を導入せしめたＤＮＡを用い、後述の通り、宿主微生物に導入し発現させることにより得ることができ、熱安定性や有機溶媒耐性の向上や基質特異性の変化等の産業上望ましい性質を付加した変異酵素を作出する試みも可能である。かかる技術水準に鑑み、それらがニトリルヒドラターゼ活性を有している場合は本発明に包含されるものとする。【００２４】
本発明におけるニトリルヒドラターゼとしては、還元型ＳＤＳ（ソディウムードデシルーサルフェイト）−ポリアクリルアミド電気泳動法により、分子量２５０００±２０００と  分子量２８０００±２０００の二つのサブユニットがクマシーブリリアントブルーによる染色によって検出されるものが例示され、前者をαサブユニット、後者をβサブユニットと呼ぶ。【００２５】
ニトリルヒドラターゼは、活性測定に先立ち、有機酸等の安定化剤のない状態で７０℃で３０分間加熱処理した後も、加熱前の活性の３５％の活性を保持することができる。【００２６】
また、高濃度のニトリル基質は化学的に酵素を失活させることが報告されているが、本発明におけるニトリルヒドラターゼは６重量％のアクリロニトリルを基質として用いても、そのような現象が観察されない。【００２７】
さらに、高濃度の反応生成物であるアミド化合物が反応を阻害することが報告され、高濃度な反応産物を得る際に大きな問題となるが、該ニトリルヒドラターゼは３５重量％のアクリルアミドを活性測定溶液に加えても、基質であるアクリロニトリル濃度の減少が有意にみられ、活性を保持する。【００２８】
上記のような理化学的性質を有するニトリルヒドラターゼは、例えば、ジオバチルス属に属する微生物を培養することにより取得することができ、ジオバチルス属に属する微生物としては、ジオバチルス・カルドキシロシリティカス（Geobacillus caldoxylosilyticus）、ジオバチルス・カウストフィラス（Geobacillus kaustophilus）、ジオバチルス・リツアニカス（Geobacillus lituanicus）、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス（Geobacillus stearothermophilus）、 ジオバチルス・サブテラネウス（Geobacillus subteraneus）、ジオバチルス・サーモカテヌラタス（Geobacillus thermocatenulatus）、ジオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）、ジオバチルス・サーモグルコシデシウス（Geobacillus thermoglucosidasius）、ジオバチルス・サーモレオボランス（Geobacillus thermoleovorans）、ジオバチルス・トエビー（Geobacillus toebii）、ジオバチルス・ユゼネンシス（Geobacillus uzenensis）が挙げられる。また、ジオバチルス属由来の微生物に特に限定されるものではなく、他の微生物株由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子も含まれる。そのような微生物株としては、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、アクロモバクター(Achromobacter)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、エアロモナス(Aeromonas)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、エルウィニア(Erwinia)属、キサントバクター(Xanthobacter)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、シノリゾビウム（sinorhizobium）属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、ノカルディア（Nocardia）属、バチルス(Bacillus)属、ミクロコッカス(Micrococcus)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、リゾビウム(Rhizobium)属、シュードノカルディア(Pseudonocardia)属等が挙げられる。具体的には、本発明では下記の手法でスクリーニングを行った。まず、様々な場所で採取した土壌を少量とって、水または生理食塩水をいれた試験管内に入れて、２日から１４日の間、６５℃の振とう培養器の中で振とう培養する。この培養液の一部を取り、汎用的な微生物生育用培地、例えばグリセロール、ポリペプトン、酵母エキス等を主成分とした液体培地に入れ、６５℃の培養温度にて、１日から７日間程度の間培養する。これにより得られる培養液の一部を、前述の微生物生育用培地成分を含む寒天平板培地に広げて６５℃でさらに培養しコロニーを形成させることによって、微生物を単離することができる。このようにして得られた微生物を、前記培地成分にさらにｎ−バレロニトリル等のニトリル化合物あるいはメタクリルアミド等のアミド化合物を加えた液体培地を入れた試験管あるいはフラスコを用い適当な期間、例えば約１２時間から７日程度の間、６５℃の培養温度で振とう培養することによって増殖させ、上記のニトリルヒドラターゼ活性測定法に基づいて、目的の微生物を選択する。そのような微生物の代表的菌株の同定を１６ＳｒＲＮＡ及び下記の生化学的性質から行った所、ジオバチルス・サーモグルコシデシウス（Geobacillus thermoglucosidasius）であることが判明した。この菌株は、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６（Geobacillus thermoglucosidasius Q-6）の名称で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１中央第６���郵便番号３０５−８５６６））に番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３５１(受理日平成１５年５月１６日)として寄託され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６５８としてブタペスト条約に基づく寄託へ移管された（受領日平成１６年３月１１日）。様々な特許・文献調査を行ったが、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスに属する微生物に関して、ニトリルヒドラターゼ活性を有する事に関しては何の記載もなかった。このことからジオバチルス・サーモグルコシデシウス  Ｑ−６株は新菌株と認められる。なお、ジオバチルス・サーモグルコシデシウス  Ｑ−６株の性質は下記のとおりである。【００２９】
（ａ）形態的性質
培養条件：Nutrient Agar（Oxoid, England, UK）培地  ６０℃
１．細胞の形および大きさ
形 ：桿菌
大きさ ：0.8×2.0〜3.0μm 
２．細胞の多形性の有無 ：−
３．運動性の有無 ：＋
鞭毛の着生状態：周毛
４．胞子の有無 ： −
胞子の部位：端立【００３０】
（ｂ）培養的性質
培養条件：Nutrient Agar（Oxoid, England, UK）培地  ６０℃
１．色：クリーム色
２．光沢：＋
３．色素生産：−【００３１】
培養条件：Nutrient broth（Oxoid, England, UK）培地  ６０℃
１．表面発育の有無：−
２．培地の混濁の有無：＋【００３２】
培養条件：ゼラチン穿刺培養  ６０℃
１．生育状態：＋
２．ゼラチン液化：＋【００３３】
培養条件：リトマス・ミルク  ６０℃
１．凝固：−
２．液化：−【００３４】
（ｃ）生理学的性質
１．グラム染色 ： 不定
２．硝酸塩の還元 ： −
２．脱窒反応 ： −
３．ＭＲテスト ： −
４．ＶＰテスト ： −
５．インドールの生成 ： −
６．硫化水素の生成 ： −
７．デンプンの加水分解 ： −
８．クエン酸の利用
Koser：−
Christensen： −【００３５】
９．無機窒素源の利用
硝酸塩： −
アンモニウム塩 ： ＋
10. 色素の生成：−
11. ウレアーゼ活性：−
12. オキシダーゼ：＋
13. カタラーゼ： ＋
14. 生育の範囲
ｐＨ ： ５.５〜８.０
温度 ：４５℃〜７２℃
15. 酸素に対する態度 ：通性嫌気性
16. Ｏ−Ｆテスト ： −／−【００３６】
（ｄ）糖類からの酸産生／ガス産生
１．Ｌ−アラビノース  −／−
２．Ｄ−キシロース  ＋／−
３．Ｄ−グルコース  ＋／−
４．Ｄ−マンノース  ＋／−
５．Ｄ−フルクトース  ＋／−
６．Ｄ−ガラクトース  −／−
７．マルトース  ＋／−
８．サークロース  ＋／−
９．ラクトース  −／−
１０．トレハロース  ＋／−
１１．Ｄ−ソルビトール  −／−
１２．Ｄ−マンニトール  ＋／−
１３．イノシトール  −／−
１４．グリセリン  −／−【００３７】
（ｅ）その他の性質
１．β−ガラクトシターゼ活性：−
２．アルギニンジヒドロラーゼ活性：−
３．リジンデカルボキシラーゼ活性：−
４．トリプトファンデアミナーゼ活性：−
５．ゼラチナーゼ活性：＋【００３８】
本発明におけるニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列情報を取得するためには、該酵素を微生物より精製後、還元型ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動により各サブユニットを分離後、ゲルより各バンドを切り出し、タンパク質シークエンサーによりアミノ酸配列の一部を決定することができる。【００３９】
具体的には、配列表の配列番号３の塩基配列の６９５−１３１２位を含むDNAと配列表の配列番号３の塩基配列の１−６８１位を含むDNAが例示され、各々がαサブユニットとβサブユニットをコードするが、これに限定されるものではなく、この塩基配列を含むＤＮＡであればよい。またこれらの配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡに対して、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズすることができるＤＮＡであっても、ニトリルヒドラターゼ活性を有する限り、本発明に包含される。すなわち、これらのＤＮＡを用いて本発明のニトリルヒドラターゼを発現することができる。ストリンジェントな条件下としては、例えばECL direct nucleic acid labeling and detection system（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて、マニュアル記載の条件（ｗａｓｈ：４２℃、０．５ｘＳＳＣを含むprimary wash buffer）が例示される。ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、例えば、前述のストリンジェントな条件下、配列表の配列番号３の塩基配列の６９５−１３１２位を含むDNAとまたは配列表の配列番号３の塩基配列の１−６８１位を含むDNAにおける相補的な塩基配列の任意の、通常は少なくとも２０個、好ましくは少なくとも５０個、特に好ましくは少なくとも１００個の連続した塩基配列を検出試料として、これにハイブリダイズするＤＮＡが例示される。【００４０】
本発明に用いるニトリルヒドラターゼをコードするＤＮＡは、以下の方法によって得ることができる。本明細書において、特に記載がない限り当該分野で公知である遺伝子組換え技術、組み換えタンパク質の生産技術、分析法が採用される。【００４１】
本発明に用いるニトリルヒドラターゼをコードするＤＮＡは、本願明細書において開示される塩基配列、またはアミノ酸配列、場合によれば前記した精製酵素から決定したアミノ酸配列等の配列情報にしたがって、本発明のニトリルヒドラターゼを含有する微生物、例えば・サーモグルコシデシウスＱ−６株から取得することができる。アミノ酸配列にしたがって合成されたオリゴヌクレオチドをプローブとして用い、ニトリルヒドラターゼを含有する微生物の染色体ＤＮＡを制限酵素により消化したＤＮＡ断片をファージやプラスミドに導入し、宿主を形質転換して得られるライブラリーから、プラークハイブリダイゼーションやコロニーハイブリダイゼーションなどにより本発明のニトリルヒドラターゼをコードするＤＮＡを得ることもできる。また、オリゴヌクレオチドをプローブとせず、前記した精製酵素から決定した両サブユニットのＮ末端のアミノ酸配列情報等にしたがってプライマーを作製し、ニトリルヒドラターゼ遺伝子の一部をPCR反応により増幅したものをプローブとして、同様の過程を行うこともできる。得られたＤＮＡは、プラスミドベクター、たとえばpUC118に挿入しクローニングし、ジデオキシ・ターミネーター法(Proceedings of the National Academy of Sciences. USA, 74: 5463-5467, 1977)等の周知の方法により塩基配列の決定を行うことができる。このようにして調製された遺伝子は、該遺伝子を用いて形質転換した大腸菌宿主中の発現産物を前記記載の活性測定法を用いることにより、ニトリルヒドラターゼをコードするＤＮＡであることを確認することができる。【００４２】
このような性質を持つニトリルヒドラターゼをコードするDNAを用いて、工業生産に適した微生物を形質転換する。より生産に適した工業微生物としてはロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物が好ましい。形質転換には上記のＤＮＡがベクターに連結されていることを特徴とする組換えベクターを用いる。【００４３】
本発明に用いる組換えベクターとしては、宿主微生物に適したプロモーター領域の下流に、上記方法で得られたＤＮＡの５’末端側が機能し得るように連結して、必要に応じてその下流に転写終結配列を挿入し、適切な発現用ベクターに組み込み調製することができる。【００４４】
適切な発現ベクターとしては、宿主微生物内で複製可能であれば、特に限定されない。ベクターとしては、ｐK4、pRF30、ｐBS305、pRE−７など、通常ロドコッカスで使用されるベクターの中から選択できる。発現ベクターに用いるプロモータとしてはニトリラーゼ遺伝子、ニトリルヒドラターゼ遺伝子等の高い発現量を期待できるプロモーターが望ましいが、これに限定されない。また、染色体に遺伝子挿入が可能な宿主であれば、該宿主における自律複製可能な領域を有する必要はない。また、αサブユニット遺伝子及びβサブユニット遺伝子が各々のプロモーターより独立のシストロンとして発現されてもよいし、共通のプロモーターによりポリシストロンとして発現されてもよい。さらには、独立のシストロンの場合、各々のサブユニット遺伝子が別のベクター上にあってもよい。この場合には、αサブユニット遺伝子を含む第一の発現ベクターとβサブユニット遺伝子を含む第二の発現ベクターの２種類の発現ベクターを用いて宿主の形質転換を行うことになる。さらに上記の組換えベクターに、必要に応じてニトリルヒドラターゼの活性化に必要なアミノ酸配列（特許第3408737号、及びJournal of Biochemistry  125：696−704（１９９９））を発現するDNAを共存させる場合もある。具体的には、上記と同様に発現に必要なプロモーターや転写終結因子等を含むプラスミドベクターを用い、ニトリルヒドラターゼの活性化に関与するタンパク質をコードする遺伝子、ニトリルヒドラターゼのαサブユニット遺伝子及びβサブユニット遺伝子が各々独立のシストロンとして発現されていてもよいし、共通の制御領域によりポリシストロンとして発現されていてもよい。同様に、各々の遺伝子が別のベクター上にあってもよい。【００４５】
上記方法にて作成した発現ベクターを用い、宿主微生物を形質転換することにより、目的のニトリルヒドラターゼ発現させることができる。宿主微生物への遺伝子の導入法としては、たとえば、形質転換、形質導入、接合伝達、またはエレクトロポレーションなどの当技術分野で周知の任意の常法によって、好ましい宿主に導入することができる。【００４６】
さらに、ニトリルヒドラターゼまたはそれを含有する菌体処理物の製造方法としては、前述の通り、該ニトリルヒドラターゼを生産し得る形質転換された微生物、即ち、ロドコッカス属の微生物、特に好ましくは、ロドコッカス・ロドクロウスM33（Rhodococcus rhodochrous M33）株（VKM Ac-1515DあるいはKCCM-10635）を培養により増殖させ、その培養物中よりニトリルヒドラターゼまたはそれを含有する菌体処理物を取得することができる。【００４７】
本発明の形質転換体は、これらの微生物が資化可能な栄養源を含む培地で培養することが好ましく、例えば、酵素や抗生物質などを生産する通常の方法で培養することができる。培養は、通常、液体培養でも固体培養でもよい。例えば、グルコース、シュークロース等の炭水化物；ソルビトール、グリセロール等のアルコール；クエン酸、酢酸等の有機酸；大豆油等の炭素源またはこれらの混合物；酵母エキス、肉エキス、硫安、アンモニア等の含窒素無機有機窒素源；リン酸塩、マグネシウム、鉄、コバルト、マンガン、カリウム等の無機栄養源；およびビオチン、チアミン等のビタミン類を適宜混合した培地が用いられる。より好ましくはそのような培地成分にＦｅイオンあるいはＣｏイオンを０．１μｇ／ｍｌ以上存在させるとよい。培養条件は、通常、好気条件下で行うことが好ましい。培養温度は、宿主微生物が生育し得る温度であれば特に制限はないが、通常、５℃〜８０℃、好ましくは２０〜７０℃、さらに好ましくは約３７℃で行うことが例示される。また、培養途中のｐＨは宿主微生物が生育し得るｐＨであれば特に制限はないが、通常、ｐＨ３〜９、好ましくはｐＨ５〜８、さらに好ましくはｐＨ６〜７で行うことが例示される。【００４８】
本発明においては、宿主微生物としてロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物を使用する。宿主微生物として使用するロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物の種類は特に限定されず、例えば、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous） 、ロドコッカス・ルーバー（Rhodococcus ruber）、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）、ロドコッカス・ルブロペルチンクタス（Rhodococcus rubropertinctus）などを挙げることができる。【００４９】
ロドコッカス・ロドクロウスM33（Rhodococcus rhodochrous M33）株（VKM Ac-1515DあるいはVKPM S-1268）を使用することが特に好ましい。宿主微生物としてロドコッカス・ロドクロウスM33株（Rhodococcus rhodochrous M33）株（VKM Ac-1515DあるいはVKPM S-1268）が特に好ましい理由としてはロドコッカス属全般の特徴として細胞壁が厚く、上記のアミド化合物の製造において、培養で得た菌体をそのままにニトリル化合物と反応させることにより、同菌の持つニトリルヒドラターゼの作用で４６%（重量／液量）のアクリルアミドの蓄積が報告されている（米国特許第5,827,699号）。さらに、ロドコッカス・ロドクロウスJ1株をはじめ、通常の微生物は、酵母エキス、肉エキス、ビタミンといった高価な栄養素を含む培地を十分な生育に必要とするのに対しロドコッカス・ロドクロウスM33株は簡単で安価な合成培地で培養できるという大きな利点を有している。なお、便宜上、本特許ではInstitute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of The Russian Academy of Science (IBFM)に寄託時（１９９３年１２月６日）のロドコッカス・ロドクロウスという名称をM33株に用いているが、DNA-DANハイブリダイゼーション（日本細菌学会誌  55(3)  545-584、2000）の結果、本株はロドコッカス・ロドクロウス種でなく、ロドコッカス・ルーバー種に近い新種である可能性が高い。本株は、韓国微生物培養所（Korean Culture Center of Microorganisms）（大韓民国 120-091 ソウル スダエムン ホンジェ １ ユリムビル 361-221）（361-221, Yurim Bldg., Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seoul 120-091, Republic of Korea）に受託番号ＫＣＣＭ−１０６３５（受領日：２００４年１２月１０日）としてブタペスト条約に基づき寄託された。【００５０】
本発明では、ロドコッカス・ロドクロウスM33株（Rhodococcus rhodochrous M33）株（VKM Ac-1515D、VKPM S-1268あるいはKCCM-10635）の変異体を宿主微生物として使用することもできる。変異体としては、ニトリルヒドラターゼ遺伝子による形質転換を行った場合に、導入されたニトリルヒドラターゼ遺伝子を発現して、ニトリルヒドラターゼを産生することができる限り、上記ロドコッカス・ロドクロウスM33株から誘導される任意の変異体を使用することができる。具体的には、自然変異、あるいは化学的変異剤又は紫外線等による人工変異を受けた変異体などが挙げられる。【００５１】
また、本発明では、本発明の形質転換体を、培地において培養することによって製造されるニトリルヒドラターゼまたはそれを含有する菌体処理物を、ニトリル化合物に作用させ、該ニトリル化合物からアミド化合物を合成することができる。この場合、前述の酵素を用いるに際しては、当該酵素の作用を阻害しないかぎり、特別に精製程度等は限定されず、精製された本発明の酵素の他、その酵素含有物が用いられ、さらには、その酵素を生産する微生物やその酵素の遺伝子を導入して形質転換された形質転換体等を使用してもよい。微生物や形質転換体等を使用する場合には、菌体を利用してもよく、菌体としては、生菌体、もしくはアセトンやトルエン等の溶媒処理または凍結乾燥等の処理を施して、化合物の透過性を増した菌体を使用することができる。場合によっては、菌体破砕物や菌体抽出物等の酵素含有物となっていてもよい。該酵素を含有する菌体処理物の作成方法を例示すれば、まず培養物を固液分離し、得られる湿菌体を必要に応じてリン酸緩衝液やトリス塩酸緩衝液などの緩衝液に懸濁せしめ、次いで超音波処理、フレンチプレス処理やガラスビーズを用いる粉砕処理、あるいはリゾチームやプロテアーゼ等の細胞壁溶解酵素による処理などの菌体破砕処理を適宜組み合わせて、菌体内から該酵素を抽出し、粗製のニトリルヒドラターゼ含有液を得ることができる。この粗製の酵素含有液を、必要により、公知のタンパク質、酵素などの単離、精製手段を用いることにより、さらに精製することができる。例えば、粗製の酵素含有液に、アセトン、エタノールなどの有機溶媒を加えて分別沈殿せしめるか、硫安などを加えて塩析せしめるかして、水溶液からニトリルヒドラターゼを含有する区分を沈殿せしめ回収する方法が例示される。またさらに、陰イオン交換、陽イオン交換、ゲル濾過、抗体やキレートを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて精製することができる。勿論、酵素や菌体、酵素を含有する菌体処理物等は、公知の方法により、カラムにおいて充填されていてもよく、担体に固定化されていてもよく、特に菌体の場合はポリアクリルアミドゲル等の高分子中に抱埋されていてもよい。菌体または菌体処理物を水またはリン酸緩衝液等の緩衝液等の水性水溶液に懸濁し、これにニトリル化合物を加えることにより、反応を進行させる。使用する菌体もしくは菌体処理物の濃度は、０.０１重量％〜２０重量％、好ましくは、０.１重量％〜１０重量％である。反応温度の上限は、好ましくは９０℃、さらに好ましくは８５℃、一層好ましくは７０℃を、反応温度の下限は、例えば１℃、好ましくは４℃、さらに好ましくは１０℃を、反応ｐＨは、例えば、５〜１０、好ましくは、６〜８ を、反応時間は、例えば、１０分間〜７２時間を挙げることができる。また、ニトリル化合物を徐々に滴下することによって、アミド化合物を高濃度に生成蓄積させることもできる。反応液からのアミド化合物を回収するには、菌体や菌体処理物等をろ過や遠心分離等で取り除いた後、晶析などの手法で取り出す方法等がある。
【実施例】
【００５２】
以下に、実施例をあげて本発明を詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。【００５３】
実施例１：菌体分離
埼玉県の温泉近傍で採取した土壌を少量（約１ｇ）とって、生理食塩水を５ｍｌ入れた試験管内に入れて、３日間、６５℃の振とう培養器の中で振とう培養した。この培養液の一部（０．５ｍｌ）を取り、グルコース１.０重量 ％、ポリペプトン０.５重量％、イーストエキストラクト０.３重量％からなる培地（ｐＨ7.０）に加え、２日間６５℃で往復振とう培養した。これにより得られる培養液の一部（０.１ｍｌ）を、前述の培地成分を含む寒天平板培地に広げて６５℃でさらに２日間培養しコロニーを形成させることによって、微生物を単離した。単離した微生物を、上記と同組成の培地に０.１重量％のｎ−バレロニトリルを添加した液体培地に接種した後、６５℃で２４時間培養することにより、ニトリル資化性の高い微生物を有する培養液を得た。この培養液１mlを９mlの１.１重量％のアクリロニトリル溶液（０.０５Ｍ−リン酸バッファーpH７. ７）に加えて、反応温度２７℃にて反応を開始した。１０分後、１mlの１規定塩酸を加えることにより反応を停止した。反応液の一部を液体クロマトグラフィー（HPLC）にて分析し、アクリルアミド生成の有無を検定することによって、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物をスクリーニングした。このようにしてニトリル化合物をアミド化合物に変換させる水和活性を有する微生物としてジオバチルス・サーモグルコシデシウス  Ｑ−６株を得た。【００５４】
（液体クロマトグラフィー分析条件）
本体：HITACHI D-7000(日立社製)
カ ラ ム ；Inertsil ODS-3（ＧＬサイエンス社製）
長さ；２００ｍｍ
カラム温度 ；３５℃
流量；１ml/ min
サンプル注入量 ；１０μｌ
溶液：０.１ｗｔ％リン酸水溶液【００５５】
実施例２：ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株菌体中のニトリルヒドラターゼ活性の測定とその温度依存性
グリセロール０.２重量％、クエン酸３ナトリウム２水和物０.２重量％、リン酸２水素カリウム０.１重量％、リン酸水素２カリウム０.１重量％、ポリペプトン０.１重量％、 酵母エキス０.１重量％、塩化ナトリウム０.１重量％、ｎ−バレロニトリル０.１重量％、硫酸マグネシウム７水和物０.０２重量％、硫酸鉄（II）７水和物０.００３重量％、塩化コバルト６水和物０．０００２％を含む滅菌済培地（pH７.０）１００mlを５００ml三角フラスコに入れたものにあらかじめ同培地で培養したジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株の培養液１mlを植菌した。これを６５℃で１日間、２００stroke/minで回転振とう培養し、菌体培養液を得た。このジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株の菌体培養液３００mlから遠心分離(１００００×ｇ, １５分) によって菌体を集め、０.０５Ｍリン酸緩衝液（pH７.５）にて洗浄後、同緩衝液５０mlに懸濁した。こうして調製した菌体懸濁液について、表１に揚げた反応温度でニトリル化合物をアミド化合物に変換させる水和活性を測定した。酵素活性の単位（ユニット）を、１分間に１μmol のアクリロニトリルをアクリルアミドに変換する活性を１ユニット（以下、Ｕと記す）と定めると、２７℃における湿菌体重量当たりのニトリルヒドラターゼ活性（Ｕ／ｍｇ）は９．３７Ｕ／ｍｇであった。さらに１０℃において、５Ｕ／ｍｌになるように０.５重量％のアクリロニトリルを含む菌体懸濁液を調整し、この菌体懸濁液を用いて、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃の条件で同様にニトリルヒドラターゼ活性を求め、表１に示した。その結果、菌体を反応に用いた時の至適温度は６０℃近傍にあり、高温域において特に高い活性を示した。【００５６】
【表１】
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【００５７】
実施例３：ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株菌体中のニトリルヒドラターゼの熱安定性
ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株の菌体中にあるニトリルヒドラターゼの活性の熱安定性を調べるために、実施例２の培養法で得た菌体を１０Ｕ／ｍｌとなるように蒸留水に懸濁し、３０分、所定温度での保温処理を行い、残存活性を測定した。0．5ｍLの１重量％アクリロニトリル溶液(０．０５Mリン酸カリウム緩衝液、pH７．５)に０．５ｍｌの保温処理後の菌体液を加えて、２７℃にて攪拌しながら反応を開始した。５分後、１００μLの1規定塩酸を加えることにより反応を停止した。保存処理前の活性に対する保存処理後の活性を算出し、保存処理前の活性を基準(１００)とした換算値として表２に示す。この結果より、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株の菌体中のニトリルヒドラターゼの酵素活性は、高温下においても安定に保持されるといえ、７０℃という高温下においても８０％以上の活性を保持することができ、８０℃の高温下においても３０％以上の活性を保持することができる。【００５８】
【表２】
2006062189.tif 000003
【００５９】
実施例４：各種ニトリル化合物に対する反応
下記表３に記載している各種ニトリル化合物を対応するアミド化合物に変換させるニトリルヒドラターゼ活性について調べた。９ｍLの１.１％ニトリル溶液(0.05Mリン酸カリウム緩衝液、pH7.5)に１ｍLの菌体懸濁液を加えて、反応温度３０℃にて反応を開始した。１０分後、１ｍLの1規定塩酸を加えることにより反応を停止した。その結果、すべてニトリルヒドラターゼ活性を有していた。【００６０】
【表３】
2006062189.tif 000004
【００６１】
実施例５以降に記載のジオバチルス・サーモグルコシデシウスQ−6株由来のニトリルヒドラターゼαサブユニット（ＯＲＦ２）、βサブユニット（ＯＲＦ１）及びニトリルヒドラターゼ活性化因子（ＯＲＦ３）のアミノ酸配列及び塩基配列を解明するに至った本発明の流れを以下に要約した。【００６２】
ジオバチルス・サーモグルコシデシウスQ−６株を培養して得られた菌体を破砕後、硫安沈殿、陰イオン交換カラムロマトグラフィー、DEAEカラム、ハイドロキシアパタイトカラムに供し、ゲルろ過クロマトグラフィー、透析を行い、ニトリルヒドラターゼ酵素を精製した。【００６３】
精製したニトリルヒドラターゼのαサブユニット及びβサブユニットのN末約３０残基のアミノ酸配列を決定し、該菌の属に基づくアミノ酸のコドン使用を考慮して遺伝子増幅用オリゴヌクレオチド縮重プライマーを作製し、該菌体から抽出した染色体DNAを鋳型として縮重PCRを行い、増幅DNA断片を取得した。増幅されたDNA断片をクローニングし、挿入断片の塩基配列を決定した。該塩基配列より推定されるアミノ酸配列と、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスQ−６株より精製したニトリルヒドラターゼαサブユニット及びβサブユニットのＮ末端アミノ酸配列を比較し、クローニングされた配列がニトリルヒドラターゼをコードしていることを確認した。【００６４】
その結果、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスQ−６株において、５’末端側上流よりニトリルヒドラターゼ遺伝子はβサブユニット、αサブユニットの順に隣接して存在することが明らかになった。【００６５】
公知の様々なニトリルヒドラターゼαサブユニットの下流遺伝子における相同性の高い配列から、遺伝子増幅用オリゴヌクレオチド縮重プライマーを作製し、該菌体から抽出した染色体DNAを鋳型として縮重PCRを行い、増幅DNA断片を取得した。得られた該菌のαサブユニット部分の増幅DNA断片をクローニングし塩基配列を決定した。【００６６】
以上より取得されたジオバチルス・サーモグルコシデシウスQ−６株のニトリルヒドラターゼαサブユニット及びβサブユニットを適当な発現ベクターに導入した。構築した発現プラスミドを用いて、適当な宿主菌を形質転換した。宿主の例としては、ロドコッカス属、コリネ属、大腸菌などが挙げられる。好ましくはアミダーゼを有していない宿主が良い。更に、得られた形質転換体を培養して得た菌体とアクリロニトリルを水性媒体中で接触させることによりアクリルアミドが生成することを確認し、その生成効率及びニトリルヒドラターゼ活性を比較した。【００６７】
次に、上記より得られたDNA断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーションを行い、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスQ6株のニトリルヒドラターゼαサブユニット及びβサブユニットの下流遺伝子を含む周辺遺伝子をクローニングした。【００６８】
下流遺伝子をニトリルヒドラターゼαサブユニット及びβサブユニットと共発現させ、ニトリルヒドラターゼ活性を比較した。その結果、下流遺伝子がニトリルヒドラターゼ活性を顕著に上昇させる活性化に関与する遺伝子であることを見出した。【００６９】
実施例５：精製酵素の理化学的性質
〔工程１〕ニトリルヒドラターゼ酵素の精製
ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株を培養し、種々のカラムに供することでニトリルヒドラターゼ活性画分を精製した。
クロマトグラフィーにおけるニトリルヒドラターゼ活性画分の測定方法は以下のように行った。ＨＥＰＥＳバッファー（１００ｍＭ、ｐＨ７．２）により希釈した各画分の溶出液に１重量％のアクリロニトリルを添加して２７℃で１分間反応させた。１N  HCｌを１０液量％反応液に添加することにより反応を停止させ、生成したアクリルアミド濃度を上述のＨＰＬＣ分析法により測定した。【００７０】
ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株由来ニトリルヒドラターゼ酵素を精製するために、まず０．1重量％のｎ−バレロニトリルを含有するＶ／Ｆ培地（グリセロール０.２重量％、クエン酸３ナトリウム２水和物０.２重量％、リン酸２水素カリウム０.１重量％、リン酸水素２カリウム０.１重量％、ポリペプトン０.１重量％、酵母エキス０.１重量％、塩化ナトリウム０.１重量％、ｎ−バレロニトリル０.１重量％、硫酸マグネシウム７水和物０.０２重量％、硫酸鉄（II）７水和物０.００３重量％、塩化コバルト６水和物０．０００２重量％）にジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株 を植菌し、６５℃で２４時間培養した。培養には、９６穴２ｍｌの深底プレート（ＣＯＳＴＡＲ社）を用いた。培養終了後、８０００ｇ、１０分間の遠心分離により集菌し、得られた湿菌体３ｇを２０ｍＬのＨＥＰＥＳバッファー（１００ｍＭ、ｐＨ７．２）に再懸濁した。菌体を冷却下で超音波破砕機を用いて破砕し、菌体破砕液に硫酸アンモニウム（３０重量％飽和濃度）を加えて４℃で３０分間緩やかに攪拌し、２００００ｇ、１０分間の遠心分離を行い、上清を得た。遠心上清液に硫酸アンモニウム（７０重量％飽和濃度）加え４℃で３０分間緩やかに攪拌した後、２００００ｇ、１０分間の遠心分離により得られた沈殿物を９ｍｌのＨＥＰＥＳバッファー（１００ｍＭ、ｐＨ７．２）に再溶解し、１Ｌの同液中において４℃で２４時間透析し、陰イオン交換クロマトグラフィー（アマシャムバイオサイエンセス社；ＨｉＴｒａｐ  ＤＥＡＥ  ＦＦ（カラム体積５ｍＬ×５本））に供した。展開液はＨＥＰＥＳバッファー（１００ｍＭ、ｐＨ７．２）を用い、塩化カリウム濃度を０．０Ｍから０．５Ｍまで直線的に増加させることにより分画を溶出し、ニトリルヒドラターゼ活性を含む画分を得た。その画分をアパタイトカラムクロマトグラフィー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製；ＣＨＴ２−Ｉ（カラム体積２ｍＬ））に供した。０．０１Ｍリン酸カリウム水溶液（ｐＨ７．２）を展開液とし、リン酸カリウムを０．０１Ｍから０．３Ｍまで直線的に増加させることにより分画を溶出し、ニトリルヒドラターゼ活性を含む画分を得た。その画分を０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む０．０５Ｍリン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．２）を展開液としたゲルろ過クロマトグラフィー（アマシャムバイオサイエンセス社；Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨＲ  １０／３０）に供し、ニトリルヒドラターゼ活性画分を取得した。こうして得られたゲルろ過クロマトグラフィーのニトリルヒドラターゼ活性画分を用いて以下の実施例を行った。【００７１】
〔工程２〕  精製したニトリルヒドラターゼの反応温度依存性
ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株由来のニトリルヒドラターゼ活性画分溶液（３．２ｍｇ／ｍＬ、０.０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５））について、表４に示した反応温度でニトリル化合物をアミド化合物に変換させるニトリルヒドラターゼ活性を測定した。１ｍLの０．５重量％アクリロニトリル溶液(０．０５Mリン酸カリウム緩衝液、pH７．５)にニトリルヒドラターゼ活性画分溶液を加えて、各温度にて攪拌しながら反応を開始した。２分後、１００μLの1Ｎ塩酸を加えることにより反応を停止した。酵素活性の単位（ユニット）は、１分間に１μmolのアクリロニトリルをアクリルアミドに変換する活性を１ユニット（以下、Ｕと記す）と定めて、酵素重量当たりの水和活性（Ｕ／ｍｇ）を表４に示した。この結果より、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株より精製したニトリルヒドラターゼ活性画分におけるニトリルヒドラターゼの活性は６０℃という高温まで、反応温度の上昇に伴い上昇している。最適温度は菌体を反応に用いた時と同様に６０℃近傍にあると考えられ、７０度という高温下においても大変高いニトリルヒドラターゼ活性を示している。【００７２】
【表４】
2006062189.tif 000005
【００７３】
〔工程３〕精製したニトリルヒドラターゼの熱安定性
ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株より精製したニトリルヒドラターゼの活性の熱安定性を調べるために、ニトリルヒドラターゼ活性画分溶液（３．２ｍｇ／ｍｌ、０.０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５））を３０分、所定温度での保温処理を行い、残存活性を測定した。１ｍLの０．５重量％アクリロニトリル溶液(０．０５Mリン酸カリウム緩衝液、pH７．５)に保温処理後のニトリルヒドラターゼ溶液を５μｌ加えて、２７℃にて攪拌しながら反応を開始した。２分後、１００μLの1規定塩酸を加えることにより反応を停止した。保存処理前の活性に対する保存処理後の活性（残存活性）を算出し、保存処理前の活性を基準(１００)とした換算値として表５に示す。この結果より、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株より精製したニトリルヒドラターゼ活性画分における水溶液中のニトリルヒドラターゼの酵素活性は、高温下においても安定に保持されるといえ、６０℃という高温下においても６０％以上の活性を保持することができ、７０℃の高温下においても３５％以上の活性を保持することができる。【００７４】
【表５】
2006062189.tif 000006
【００７５】
〔工程４〕精製したニトリルヒドラターゼのアクリロニトリル濃度依存性と濃度耐性
ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株より精製したニトリルヒドラターゼに関して、基質であるアクリロニトリル濃度への依存性と耐性を調べるために、４μlのニトリルヒドラターゼ活性画分溶液（３．２ｍｇ／ｍＬ、０.０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５））を各種重量％のアクリロニトリルを含む５ｍｌ溶液(０．０５Mリン酸カリウム緩衝液、pH７．５)に加えて、２７℃にて攪拌しながら反応を開始した。５分、１０分、２０分、４０分後に１ｍｌを取り出し、１００μLの1規定塩酸を加えることにより反応を停止し、生成したアクリルアミドの濃度をHPLCにより定量し、表６に示した。この結果より、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株より精製したニトリルヒドラターゼ活性画分における水溶液中のニトリルヒドラターゼの酵素活性は、高いアクリロニトリル濃度においても安定に保持される。６％という高濃度のアクリロニトリル溶液中において４０分反応させても、より低いアクリロニトリル濃度の場合に比べての活性の低下は観察されず、逆に基質濃度の上昇に伴って活性は上昇した。【００７６】
【表６】
2006062189.tif 000007
【００７７】
〔工程５〕ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株より精製したニトリルヒドラターゼのアクリルアミド濃度耐性
ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株より精製したニトリルヒドラターゼに関して、生成物であるアクリルアミドの阻害を調べるために、１０μlのニトリルヒドラターゼ活性画分溶液（３．２ｍｇ／ｍＬ、０.０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５））を０．５重量％アクリロニトリルと３５重量％アクリルアミドを含む溶液(０．０５Mリン酸カリウム緩衝液、pH７．５)１ｍｌに対して加えて、２７℃にて攪拌しながら１０分間反応を行い、反応後の液中のアクリロニトリル濃度をHPLCで定量したところ、すべてのアクリロニトリルがアクリルアミドに変換されていた。この結果より、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株より精製したニトリルヒドラターゼ活性画分における水溶液中のニトリルヒドラターゼの酵素活性は、３５％という高いアクリルアミド濃度においても活性が保持されるといえる。【００７８】
実施例６：ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株由来のニトリルヒドラターゼβサブユニット、αサブユニットおよびORF3部分の遺伝子のクローニング
〔工程１〕ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株由来のニトリルヒドラターゼ酵素の確認及びＮ末アミノ酸配列決定
実施例５により得られたゲルろ過クロマトグラフィーでのニトリルヒドラターゼ活性画分溶出液を還元条件下において還元型ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供した。泳動後、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）による蛋白質染色を行い、脱色した結果、約２５Ｋダルトン及び約２８Ｋダルトンの分子量を有する２本の主要なバンドが確認された。この２本の主要な精製蛋白質を、ブロッティング装置（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いてＰＶＤＦ膜（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）に転写し、ＣＢＢ染色し、目的の２本のバンドが吸着している部分をＰＶＤＦ膜から切り出した。次に、全自動タンパク質一次構造分析装置PPSQ-23A（島津製作所）を用いて２種類の蛋白質のＮ末端アミノ酸配列を解読した。その結果、分子量２５Ｋダルトンの蛋白質のＮ末アミノ酸配列は、配列表の配列番号２３に記載のアミノ酸配列であり、分子量２８Ｋダルトンの蛋白質のＮ末アミノ酸配列は、配列表の配列番号２４に記載のアミノ酸配列であった。【００７９】
既知のニトリルヒドラターゼ酵素のアミノ酸配列と比較した結果、２５Ｋダルトンのポリペプチド鎖がニトリルヒドラターゼαサブユニット、２８Ｋダルトンのポリペプチド鎖がニトリルヒドラターゼβサブユニットと低いながらもホモロジーを示し、該蛋白質をコードすることが示唆された。【００８０】
〔工程２〕N末端アミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチドプライマーの合成
上記で解読した２種類の蛋白質のＮ末端のアミノ酸配列から、該菌属のコドン使用に基づいて縮重ＰＣＲ用オリゴヌクレオチドプライマーを以下の１２種類合成した。配列表の配列番号５に記載のプライマー１（αＦ１）、配列表の配列番号６に記載のプライマー２（αＦ２）、配列表の配列番号７に記載のプライマー３（αＦ３）、配列表の配列番号８に記載のプライマー４（αＲ１）、配列表の配列番号９に記載のプライマー５（αＲ２）、配列表の配列番号１０に記載のプライマー６（αＲ３）、配列表の配列番号１１に記載のプライマー７（βＦ１）、配列表の配列番号１２に記載のプライマー８（βＦ２）、配列表の配列番号１３に記載のプライマー９（βＦ３）、配列表の配列番号１４に記載のプライマー１０（βＲ１）、配列表の配列番号１５に記載のプライマー１１（βＲ２）、配列表の配列番号１６に記載のプライマー１２（βＲ３）である。尚、ｙはｃまたはｔを表し、ｒはａまたはｇを表し、ｍはａまたはｃを表し、ｋはｇまたはｔを表し、ｓはｃまたはｇを表し、ｗはａまたはｔを表し、ｄはａ、ｇまたはｔを表し、ｎは、ａ、ｃ、ｇまたはｔを表している。αサブユニット及びβサブユニットをコードする遺伝子の染色体上での位置を考慮し、プライマーを作成した。【００８１】
〔工程３〕ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株より染色体DNAの抽出及び縮重PCR
ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株を実施例２と同様の方法により培養、回収し、ＱＩＡＧＥＮ社のＧｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（５００/Ｇ）キットを用いて菌体から染色体ＤＮＡを抽出した。ＴＥ溶液に溶解させたジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株の染色体ＤＮＡ０．１μｇを鋳型として縮重ＰＣＲを行った。縮重ＰＣＲ反応は、配列表の配列番号５から１０に記載のプライマー１から６と、配列表の配列番号１１から１６に記載のプライマー７から１２の組み合わせ３６通りを行った。１００ｐｍｏｌのプライマー２種類を各々、５ＵのＴａｋａｒａ社のＥｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ及びバッファーを含む全量１００μｌの反応液を用い、縮重ＰＣＲ反応を行いＤＮＡ断片の増幅を試みた。反応条件は以下の通りである。９６℃、３分の熱変性後、９６℃、３０秒熱変性、４２℃、３０秒アニーリング、７２℃、１分３０秒伸長反応を３５サイクル行った後、７２℃、５分間伸長反応をさせ、４℃にて保冷した。各々のＰＣＲ産物を１重量％アガロース電気泳動に供し、ＤＮＡの増幅の確認を行ったところ、配列表の配列番号９に記載のプライマー５（αＲ２）と配列表の配列番号１１に記載のプライマー７（βＦ１）の組み合わせ及び配列表の配列番号９に記載のプライマー５（αＲ２）と配列表の配列番号１２に記載のプライマー８（βＦ２）の組み合わせで行ったＰＣＲ反応の場合のみ、約７００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が確認された。【００８２】
〔工程４〕縮重ＰＣＲ産物のクローニング及び増幅DNA断片の塩基配列解読
増幅されたＤＮＡ断片をゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて抽出し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）にＴ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅを用いてライゲーションした。Ｅｘ  ＴａｑによるＰＣＲ反応の結果、３'末端にＡが１塩基付加される性質を利用している。ライゲーション反応後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、ＬＢ寒天培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン、０．５重量％バクト酵母エキストラクト、１重量％バクトトリプトン、０．５重量％ＮａＣｌ、２．０重量％Ｂａｃｔｏ  Ａｇａｒ（ｐＨ７．５））にて３７℃で一晩培養し、アンピシリンにて形質転換体を選択した。アンピシリンを含むＬＢ培地にて培養した形質転換体から定法によりプラスミドＤＮＡを抽出し、約７００ｂｐのインサート配列を、ベクター上にあるＳＰ６及びＴ７プロモーターの配列をプライマーとして用いて塩基配列を解読した。【００８３】
その結果、増幅ＤＮＡ断片内に６８１ｂｐのオープンリーディングフレーム（以後ＯＲＦ１と呼称）が確認された。ＯＲＦ１の翻訳停止コドンと次の翻訳開始コドンＡＴＧの間は１３ｂｐであった。ＯＲＦ１の塩基配列より推定されるＮ末端側２５個のアミノ酸配列と上記精製した２８Ｋダルトンのポリペプチド鎖のＮ末端側の２５個のアミノ酸配列は全く一致しており、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列の１番目から２５番目までの配列に相当している。ＯＲＦ１のアミノ酸配列は、既知のニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列と低いながらもホモロジーを示し、該蛋白質をコードすることが示唆された。【００８４】
ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼβサブユニットは２２６アミノ酸をコードしており、既存のデーターベース中で相同性の高い蛋白質とのアミノ酸配列の一致度は、高い方から順に、クレブシエラ属ＭＣ１２６０９株のニトリルヒドラターゼβサブユニットと４３％、アグロバクテリウム属のニトリルヒドラターゼβサブユニットと４２％、ロドシュードモナス属ＪＣＭ３０９５株ニトリルヒドラターゼβサブユニットと４０％と非常に低い。また、ジオバチルス属と近縁の属であるバチルス属由来の蛋白質とのアミノ酸の一致度も、好熱菌Bacillus BR449株のニトリルヒドラターゼβサブユニットと３５．０％、好熱菌Bacillus smithii SC-J05-1株のニトリルヒドラターゼβサブユニットと３４．５％と極めて低かった。一方、好熱菌Bacillus BR449株のニトリルヒドラターゼβサブユニットと好熱菌Bacillus smithii SC-J05-1株のニトリルヒドラターゼβサブユニットは８５．６％という高い一致度を有している。【００８５】
〔工程５〕ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株ニトリルヒドラターゼαサブユニット部分の遺伝子のクローニング
上記にて得られたジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼβサブユニット部分の遺伝子の周辺遺伝子及びαサブユニット部分の遺伝子をクローニングするために、縮重ＰＣＲを行った。既知のニトリルヒドラターゼαサブユニットの下流に位置する遺伝子を参考にして、以下の縮重ＰＣＲ用オリゴヌクレオチドプライマー以下２種類を作成した。配列表の配列番号１７に記載のプライマー１３（ｐＲ１）、配列表の配列番号１８に記載のプライマー１４（ｐＲ２）である。【００８６】
また、先に塩基配列を解読したジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼβサブユニット内にＰＣＲ増幅用のオリゴヌクレオチドプライマー以下２種類を作成した。配列表の配列番号１９に記載のプライマー１５（Ｑ６ＡｐｏｓＦ）、配列表の配列番号２０に記載のプライマー１６（Ｑ６ａｂＦ１）である。ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株の染色体ＤＮＡ０．１μｇを鋳型として縮重ＰＣＲを行った。縮重ＰＣＲ反応は、アニーリング温度５０℃にて、配列表の配列番号１７、１８に記載のプライマー１３、１４と、配列表の配列番号１８、１９に記載のプライマー１５、１６の組み合わせ４通りを行った。その結果、配列表の配列番号１７に記載のプライマー１３（ｐＲ１）と配列表の配列番号１８に記載のプライマー１５（Ｑ６ＡｐｏｓＦ）の組み合わせで行ったＰＣＲ反応で約０．８ｋｂの増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。更に、配列表の配列番号１６に記載のプライマー１３（ｐＲ１）と配列表の配列番号１９に記載のプライマー１６（Ｑ６ａｂＦ１）の組み合わせで行ったＰＣＲ反応で１．５ｋの増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。なお、その他の組み合わせで行ったＰＣＲ反応の場合は、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できなかった。【００８７】
配列表の配列番号１６に記載のプライマー１３（ｐＲ１）と配列表の配列番号１９に記載のプライマー１５（Ｑ６ＡｐｏｓＦ）の組み合わせで行った縮重ＰＣＲ反応により増幅された０．８ｋｂのＤＮＡ断片をアガロースゲルより切り出し、定法によりアガロースゲルから抽出し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）へ組み込み、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンにより組換え体を選択した。アンピシリンを含むＬＢ培地にて形質転換体を培養し、常法によりプラスミドＤＮＡを抽出し、約０．８ｋｂのインサート部分の塩基配列を解読した。その結果、６１８ｂｐのオープンリーディングフレーム（以後０ＲＦ２と呼称）が確認された。ＯＲＦ２の塩基配列より推定されるＮ末端側２９個のアミノ酸配列と上記にて精製した２５Ｋダルトンのポリペプチド鎖のＮ末端側の２９個のアミノ酸配列は完全に一致しており、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列の１番目から２９番目までの配列に相当する。ＯＲＦ２のアミノ酸配列は、既知のニトリルヒドラターゼαサブユニットのアミノ酸配列と低いながらもホモロジーを示し、該蛋白質をコードすることが示唆された。【００８８】
ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼαサブユニットは２０５アミノ酸をコードしており、既存のデーターベース中で相同性の高い蛋白質とのアミノ酸配列の一致度は、高い方より順に、好熱菌Bacillus BR449のニトリルヒドラターゼβサブユニットと６６．３％、好熱菌Bacillus smithii SC-J05-1のニトリルヒドラターゼβサブユニットと６３．９％と低い。一方、好熱菌Bacillus BR449のニトリルヒドラターゼβサブユニットと好熱菌Bacillus smithii SC-J05-1のニトリルヒドラターゼβサブユニットは８８．８％という高い相同性を有している。【００８９】
以上より、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株では、５’末端側上流より２８Ｋダルトンのニトリルヒドラターゼβサブユニットをコードする遺伝子、２５Ｋダルトンのニトリルヒドラターゼαサブユニットをコードする遺伝子がこの順番で隣接して存在していることが判明した。【００９０】
〔工程６〕ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼαサブユニット及びβサブユニット部分のｐＥＴ２８ａ(＋）ベクターへの組み込み
上記にて解読した塩基配列をもとに、ニトリルヒドラターゼαサブユニット及びβサブユニット部分をＰＣＲにて増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマー以下2種類を作成した。配列表の配列番号２１に記載のプライマー１７（Ｑ６ａｂ−Ｆ１−Ｔ）、配列表の配列番号２２に記載のプライマー１８（Ｑ６ＡＢａｌｌ−Ｒ１−ＢｇｌＩＩ−Ｔ）である。配列表の配列番号２１に記載のプライマー１７は、制限酵素部位ＮｄｅＩの中に、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼβサブユニットの翻訳開始コドンを設計した。配列表の配列番号２２に記載のプライマー１８には、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼαサブユニットの翻訳終止コドンの直下に制限酵素ＢｇｌＩＩサイトを導入した。ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列表の配列番号２１、２２に記載のプライマー１７、１８を各々１００ｐｍｏｌ用いてＰＣＲ反応を行った。Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用い、全量１００μｌにて９６℃、３分の熱変性の後、９６℃３０秒熱変性、６０℃３０秒アニーリング、７２℃１分３０秒伸長反応の条件でＰＣＲを３０サイクル行った後、７２℃にて５分間伸長反応させた後、４℃に冷却した。ＰＣＲ反応後の溶液を１．５重量％アガロース電気泳動に供したところ、約１．３ｋｂのＤＮＡ断片増幅が確認された。この増幅ＤＮＡ産物をアガロースゲルより常法にて抽出し、Ｐｒｏｍｅｇａ社のｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒへライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。形質転換体より、プラスミドＤＮＡを抽出し、インサート部分の塩基配列を解読し、ＰＣＲによる増幅のエラーのないことを確認した。【００９１】
次に、このプラスミドをＮｄｅＩ，ＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、１．５重量％アガロース電気泳動に供し、約１．３ｋｂのインサートＤＮＡをアガロースゲルから切り出し、常法により抽出した。発現ベクターにはＮｏｖａｇｅｎｅ社のｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクターを用いた。このＤＮＡをＮｄｅＩ，ＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、１重量％アガロース電気泳動に供し、約５．３ｋｂのＤＮＡ断片を常法により抽出した。これらのインサートとベクターを常法に従いライゲーション反応を行い、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、カナマイシン耐性で選択した形質転換体よりプラスミドＤＮＡを抽出し、インサートが導入されたプラスミドを選出した。以上より、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼαサブユニット及びβサブユニット部分がインサートとして導入された発現プラスミドを取得した。完成したプラスミドを、ｐＥＴ−２８ａ（＋）−βαと以下呼称する。【００９２】
〔工程７〕コロニーハイブリダイゼーションによるジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株由来のニトリルヒドラターゼ周辺遺伝子の取得
（１）蛍光標識ＤＩＧプローブの作成
配列表の配列番号２５に記載のジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼαサブユニット部分のＤＮＡを鋳型に用いて、ロシュ社製のＤＩＧ−ＤＮＡラベリングキットにより蛍光標識プローブを作成した。作成方法はロシュ社のＤＩＧマニュアルに従う。【００９３】
（２）クロモソームサザンハイブリダイゼーション
実施例６の工程３にて調製したジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株の染色体ＤＮＡを様々な制限酵素を用いて消化し、１重量％アガロースゲル電気泳動に供した。アガロースゲル内のＤＮＡを、ナイロンメンブレンＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（アマシャム社）に転写した後、先に調製した蛍光標識ＤＩＧプローブを用い、クロモソームサザンハイブリダイゼーションを行った。ＤＮＡが転写、固定されたメンブレンを１枚に当たり１０ｍｌのハイブリダイゼーションバッファー（１重量％スキムミルク、０．１重量％Ｎ−ラウロイルザルコシン、０．０２重量％ＳＤＳ、５０重量％ホルムアミドを含有する５×ＳＳＣ）に浸し、４２℃で２時間プレハイブリダイゼーションを行った。上記と同様に作成した蛍光標識プローブ１００ｎｇを９５℃で１０分間の煮沸及び急冷処理により熱変性をさせ、プレハイブリゼーションバッファーに添加し、４２℃で一晩、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後のメンブレンを１５０ｍｌの０．１重量％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣにて室温で２回洗浄した。次に６５℃に加熱した１５０ｍｌの０．１重量％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中で５分間の洗浄を２回行った。続いて１００ｍｌのマレイン酸バッファー（０．１Ｍマレイン酸、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ＮａＯＨを用いてｐＨ７．５に調整済み）で５分間洗浄後、５０ｍｌのブロッキング溶液（０．３重量％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ及び１重量％スキミムルクを含む０．１Ｍマレイン酸バッファー；ｐＨ７．５）中にて室温で３０分間ブロッキング処理を行った。抗ジゴキシゲニン−ＡＰを７５ｍＵ／ｍｌとなるよう２０ｍｌのブロッキング溶液にて希釈し、室温で３０分間の抗体反応を行った後、１００ｍｌの洗浄バッファー（０．３重量％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む０．１Ｍマレイン酸バッファー；ｐＨ７．５）中でメンブレンを５回洗浄し、結合していない抗体を洗い流した。２０ｍｌの検出バッファー（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ９．５）中で５分間平衡化処理を行った後、１０ｍｌの検出バッファーに１００ｍｇ/ｍｌのＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウムクロライド）溶液を３４μｌ、５０ｍｇ/ｍｌのＢＣＩＰ（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルフォスフェイト）溶液を３５μｌを希釈した発色基質溶液ＮＢＴ／ＢＣＩＰを作成し、メンブレンが完全に浸るように覆いかけ、遮光してインキュベートを１分から１６時間行った。インキュベート中はディスクを動かしたり揺らしたりせず、発色の確認を行った。その結果、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩにより消化される約２．３ｋｂ遺伝子断片の中に、ニトリルヒドラターゼαサブユニット部分の下流遺伝子が含まれることが明らかになった。【００９４】
（３）コロニーハイブリダイゼーションによる目的クローンの取得
（ｉ）コロニーハイブリダイゼーション用のプラスミドライブラリーの作成
次に、同蛍光標識ＤＩＧプローブを用い、コロニーハイブリダイゼーションを行った。ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株の染色体ＤＮＡ１０μｇを１重量％アガロースゲル電気泳動に供し、アガロースゲルから約２．０ｋｂから２．６ｋｂのＤＮＡ断片を含む部分を切り出し、前記と同様の方法でＤＮＡ断片を抽出及び精製した。得られたＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いてｐＵＣ１１８プラスミドベクター（宝酒造社製）のマルチクローニングサイト内にあるＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位に導入した。ライゲーションに用いたｐＵＣ１１８プラスミドベクターＤＮＡは、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した後にフェノール／クロロホルム処理及びエタノール沈澱による精製を行い、続いてアルカリフォスファターゼ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いた５’末端の脱リン酸化処理後に再度フェノール／クロロホルム処理及びエタノール沈澱を行い、アガロース電気泳動に供し、アガロースゲルから抽出による再精製を行ったものを使用した。【００９５】
約２．０ｋｂから２．６ｋｂに断片化されたジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株の染色体ＤＮＡをｐＵＣ１１８プラスミドベクターとＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位にてライゲーションした溶液を用いて、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、１ｍＭのＩＰＴＧ及び２重量％Ｘ−Ｇａｌ（5- ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド）を含有するＬＢ寒天培地（０．５重量％バクト酵母エキストラクト、１重量％バクトトリプトン、０．５重量％ＮａＣｌ、２．０重量％Ａｇａｒ；ｐＨ７．５）上に撒き、３７℃で一晩培養した。その結果、１枚当たり５０個から５００個の白コロニーが出現しているシャーレを多数枚取得することができた。【００９６】
これらの染色体ＤＮＡのプラスミドライブラリーに対して、先に調製した蛍光標識ＤＩＧプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションを行い、目的のニトリルヒドラターゼαサブユニットの下流遺伝子を含むクローンをスクリーニングした。【００９７】
（ii）コロニーハイブリダイゼーションによる目的クローンの取得
まず、出現した白コロニー約１０００クローンを、滅菌済み爪楊枝を用いて新しいＬＢ寒天培地にストリークしなおした。この時、メンブレンをハイブリダイズさせるＬＢ寒天培地と、保存用のＬＢ寒天培地に同様にストリークし、３０℃で一晩培養した。【００９８】
次に、コロニーの生えたシャーレ上にアマシャム社製のナイロンメンブレンＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋を静かに置き、１分後端からピンセットを用いてゆっくりと取り除いた。剥がしたメンブレンを、菌体の付着している面を上にして変性溶液（１．５ＭのＮａＣｌを含む０．５ＭのＮａＯＨ水溶液）に７分間浸した後、中和溶液（１．５ＭのＮａＣｌと１ｍＭのＥＤＴＡ・２Ｎａを含む０．５Ｍトリス塩酸水溶液；ｐＨ７．２）に３分間浸し、新しい中和溶液に更に３分間浸した。次に、２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ１リットル中にＮａＣｌ８．７６ｇ、クエン酸ナトリウム４．４１ｇを含む）にて１回洗浄を行った後、乾いた濾紙上でメンブレンを風乾した。さらに１２０ｍＪ／ｃｍ2のＵＶ照射を行うことによりメンブレン上にＤＮＡの固定を行った。【００９９】
（iii）ＤＩＧ抗体による検出及び目的クローンの単離
上記にて処理した、ＤＮＡの固定されたメンブレンを１枚に当たり１０ｍｌのハイブリダイゼーションバッファー（１重量％スキムミルク、０．１重量％Ｎ−ラウロイルザルコシン、０．０２重量％ＳＤＳ、５０重量％ホルムアミドを含有する５×ＳＳＣ）に浸し、４２℃で２時間プレハイブリダイゼーションを行った。上記と同様に作成した蛍光標識プローブ１００ｎｇを９５℃で１０分間の煮沸及び急冷処理により熱変性をさせ、プレハイブリゼーションバッファーに添加し、４２℃で一晩、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後のメンブレンを１５０ｍｌの０．１重量％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣにて室温で２回洗浄した。次に６５℃に加熱した１５０ｍｌの０．１重量％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中で５分間の洗浄を２回行った。続いて１００ｍｌのマレイン酸バッファー（０．１Ｍマレイン酸、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ＮａＯＨを用いてｐＨ７．５に調製済み）で５分間洗浄後、５０ｍｌのブロッキング溶液（０．３重量％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ及び１重量％スキミムルクを含む０．１Ｍマレイン酸バッファー；ｐＨ７．５）中にて室温で３０分間ブロッキング処理を行った。抗ジゴキシゲニン−ＡＰを７５ｍＵ／ｍｌとなるよう２０ｍｌのブロッキング溶液にて希釈し、室温で３０分間の抗体反応を行った後、１００ｍｌの洗浄バッファー（０．３重量％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む０．１Ｍマレイン酸バッファー；ｐＨ７．５）中でメンブレンを５回洗浄し、結合していない抗体を洗い流した。２０ｍｌの検出バッファー（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ９．５）中で５分間平衡化処理を行った後、１０ｍｌの検出バッファーに１００ｍｇ/ｍｌのＮＢＴ溶液を３４μｌ、５０ｍｇ/ｍｌのＢＣＩＰ溶液を３５μｌを希釈した発色基質溶液ＮＢＴ／ＢＣＩＰを作成し、メンブレンが完全に浸るように覆いかけ、遮光してインキュベートを１分から１６時間行った。インキュベート中はディスクを動かしたり揺らしたりせず、発色の確認を行った。その結果、該メンブレン上の１０００クローンのうち、ポジティブなシグナルを４箇所見いだし、その位置と重なるポジティブクローンを元のシャーレ上で確認した。【０１００】
（４）ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼαサブユニット部分の下流遺伝子を含むポジティブクローンの解析
確認されたポジティブクローンをシャーレからアンピシリンを含有するＬＢ液体培地に植菌し、３７℃・２５０ｒｐｍで一晩振とう培養を行い、菌体を遠心により回収し、常法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。プラスミドＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した後に、１．５重量％アガロース電気泳動に供し、挿入断片の大きさの確認を行ったところ、約２．３ｋｂの大きさであった。また、挿入断片がジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼαサブユニット部分を含むことを、数パターンのＰＣＲ及び、制限酵素による消化パターンにより確認した。【０１０１】
以上より取得された本プラスミドをｐＵＣ１１８−Ｑ６Ｈｉｎ２．３と命名し、挿入断片の全塩基配列を決定した。ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼ及び下流遺伝子群の制限酵素地図及び遺伝子構成を図１に記載した。【０１０２】
その結果、挿入断片中に３３９ｂｐの塩基配列からなるオープンリディングフレーム（以下、ＯＲＦ３と呼称する）がニトリルヒドラターゼαサブユニット（ＯＲＦ２）の５’末端側下流に同じ向きに存在することが確認された。ＯＲＦ２の翻訳終止コドンとＯＲＦ３の翻訳開始コドンの間は１２ｂｐであり、ＯＲＦ３の翻訳終止コドンと更に下流に位置するＯＲＦの翻訳開始コドンの間は１４５ｂｐであった。ＯＲＦ３は１１２アミノ酸をコードしており、既存のデータ-ベース中の以下のタンパク質と大変低いながらも相同性を有していた。既存のデーターベース中で相同性の高い配列とのアミノ酸の一致する割合は、バチルス属 BR449株のＰ１２Ｋと３１．０％、ロドコッカス・ロドクロウス Ｊ１株のＮｈｈＧと３１．０%、ロドコッカス・ロドクロウス Ｊ１株のＮｈｌＥと２１．０ %、シュードノカルディア・サーモフィラ ＪＣＭ３０９５株のＰ１６と２３．２%であった。【０１０３】
〔工程８〕ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼαサブユニット及びβサブユニット及び下流遺伝子ＯＲＦ３の大腸菌プラスミド上での再構築
ｐＥＴ−２８ａ（＋）−βαプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩにて消化し、脱リン酸化反応を行い、フェノールクロロホルムで抽出することにより、脱リン酸化処理を行った。この消化産物を１重量％アガロース電気泳動に供し、約６．１ｋｂのＤＮＡ断片を常法により抽出した。このＤＮＡ断片には、ｐＥＴベクター及びジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼβサブユニット及びαサブユニットの６０番目のアミノ酸に位置するＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位までが含まれている。【０１０４】
次に、ｐＵＣ１１８−Ｑ６Ｈｉｎ２．３プラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、１重量％アガロース電気泳動に供し、約２．３ｋｂのインサートＤＮＡを抽出した。このインサートを、先に抽出した断片とライゲーションを行い、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、カナマイシン耐性で選択した形質転換体より、インサートＤＮＡを含むプラスミドを選出した。インサートの向きをＰＣＲにより確認することにより、ｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクターにジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼαサブユニット及びβサブユニット及び下流遺伝子ＯＲＦ３と更に下流域が含まれたプラスミドを取得した。こうして完成したプラスミドを、ｐＥＴ−２８ａ（＋）−βα１２と以下呼称する。【０１０５】
実施例７：ニトリルヒドラターゼ遺伝子プロモーターを用いたQ6株のニトリルヒドラターゼ遺伝子のロドコッカス・ロドクロウスM33株での発現
〔工程１〕M33株のニトリルヒドラターゼ遺伝子領域のクローニング
M33株中でQ6株のニトリルヒドラターゼを発現させるために、M33株のニトリルヒドラター遺伝子領域をクローニングした。
（１）M33株より染色体DNAの抽出
ロドコッカス・ロドクロウスM33株をYMPD培地（グルコース１．０重量％、ポリペプトン０．５重量％、イーストエキストラクト０．３重量％、マルトエキストラクト０．３重量％、ｐH７．２）で培養し、回収した菌体より、ＱＩＡＧＥＮ社のＧｅｎｏｍｉｃ―ｔｉｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（５００/Ｇ）キットを用いて染色体ＤＮＡを抽出した。【０１０６】
（２）Ｍ３３株のラムダファージライブラリーの作製
ロドコッカス・ロドクロウスM33株の染色体ＤＮＡ３０μｇを制限酵素Ｓａｕ３Ａ１により部分消化した後、０．７重量％アガロースゲル電気泳動に供し、アガロースゲルから約２０ｋｂのＤＮＡ断片を含む部分を切り出し、抽出及び精製した。この染色体ＤＮＡをＤＮＡライゲーションキット  Ｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いてLamda DASH II/BamHI Vector kits (Stratagene社製)中のベクターＤＮＡと結合させ、同キットのマニュアルに従い、コスミドライブラリーを作製した。これらの染色体ＤＮＡのラムダファージライブラリーに対して、以下に調製した蛍光標識ＤＩＧプローブを用いてプラークハイブリダイゼーションを行った。【０１０７】
（３）蛍光標識ＤＩＧプローブの作成
配列表の配列番号３２に記載のプライマーＮＨ５と配列表の配列番号３３に記載のプライマーＮＨ３を用いて、ロドコッカス・ロドクロウスM33株の染色体ＤＮＡよりニトリルヒドラターゼ遺伝子の約５３０ｂｐのＤＮＡをPCR反応により増幅後、ロシュ社製のＤＩＧ−ＤＮＡラベリングキットにより蛍光標識プローブを作成した。作成方法はロシュ社のＤＩＧマニュアルに従った。【０１０８】
（４）プラークサザンハイブリダイゼーションによる目的クローンの取得
次に、同ＤＩＧマニュアルに従い、プラークハイブリダイゼーションを行った。まず、出現した約１０００プラークをメンブレンフィルターに写し、上記で調整された蛍光標識ＤＩＧプローブを用いてハイブリダイゼーションを行い、ポジティブシグナルを示すファージプラークを３個取得した。【０１０９】
（５）ニトリルヒドラターゼ遺伝子上流を含むポジティブクローンの解析
それぞれのプラークを単離、純化した後、Wizard  Lamda  Prep（プロメガ社製）を用いてファージDNAを調整した。得られた３つのファージDNAを各種制限酵素で切断後、ニトリルヒドラターゼ遺伝子の上流部分を最長に含むλ３１１を選択した。【０１１０】
〔工程２〕ニトリルヒドラターゼ発現ベクターの構築
（１）M33KpnISacI/pGEM3zfの作製
Ｍ３３株のニトリルヒドラターゼ遺伝子及びその周辺域をプラスミドベクターにサブクローニングするために、上記で得られたλ３１１をＫｐｎＩとＳａｃＩで切断することにより得られる約５．４Kｂｐ断片をアガロース電気泳動後回収したものと、ｐＧＥＭ３ｚｆ（＋）（プロメガ社製）をＫｐｎＩとＳａｃＩで切断したものと混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結した。このプラスミドをM33KpnISacI/pGEM3zfと命名し、挿入断片の全塩基配列を決定し、配列表の配列番号４に示した。また、その制限酵素地図及び遺伝子構成を図２に記載した。【０１１１】
（２）ＫＳＮＨ−ｐＧＥＭ３ｚの作製
Ｍ３３ＫｐｎＩＳａｃＩ／ｐＧＥＭ３ｚｆ上にM33株のニトリルヒドラターゼ遺伝子のプロモーターおよびターミネーター部分を残し、その間に発現遺伝子挿入のためのＮｄｅＩ、ＢｇｌＩＩ、ＣｌａＩサイトを挿入したベクターとしてＫＳＮＨ−ｐＧＥＭ３ｚを以下の手順で作製した。Ｍ３３ＫｐｎＩＳａｃＩ／ｐＧＥＭ３ｚｆを用いてＩＮＶ１０１株に形質転換を行いｄａｍメチル化しないプラスミドを得てＣｌａＩで切断後ＰｓｔＩで部分分解を行い、ニトリルヒドラターゼ構造遺遺伝子を含むＰｓｔＩ−ＣｌａＩ断片を除いた６５４５ｂｐ断片をアガロース電気泳動後回収した。一方、M33KpnISacI/pGEM3zfを鋳型に配列表の配列番号２６に記載のプライマーＭ３３−Ｆ０５と配列番号２７に記載のＭ３３−Ｒ１８を用いてＰＣＲ増幅し、７０７ｂｐ断片をアガロース電気泳動後回収した。Ｍ３３−Ｒ１８はＭ３３株のニトリルヒドラターゼβサブユニット蛋白質の翻訳開始点に制限酵素ＮｄｅＩ、ＢｇｌＩＩ、ＣｌａＩサイトがこの順序で並ぶように設計されている。このＰＣＲ産物をＰｓｔＩとＣｌａＩで切断した後に再度、アガロース電気泳動後、４００ｂｐの断片を回収し、上記６５４５ｂｐの断片と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結しＫＳＮＨ−ｐＧＥＭ３ｚを得た。【０１１２】
（３）M33ＫＳＮＨ−ｐＨＳＧ２９８の作製
ＫＳＮＨ−ｐＧ３ｚからベクターをｐＨＳＧ２９８（タカラバイオ社製）に置換するために、ＫＳＮＨ−ｐＨＳＧ２９８を以下の要領で作製した。ＫＳＮＨ−ｐＧ３ｚをＫｐｎＩとＳａｃＩで切断し３７７４ｂｐの断片をアガロース電気泳動回収したものと、ＫｐｎＩとＳａｃＩで切断したｐＨＳＧ２９８をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し、約６．４４ｋｂのプラスミドM33ＫＳＮＨ−ｐＨＳＧ２９８を取得した。【０１１３】
（４）ジオバチルス・サーモグルコシダシウスQ6株のニトリルヒドラターゼβ、αサブユニット及び下流遺伝子orf３のM33ＫＳＮＨ−ｐＨＳＧ２９８への導入
配列表の配列番号２８に記載のalpha-maeF1及び、配列表の配列番号２９に記載のorf1-atoR1をプライマーとして用い、実施例６で作製したｐＥＴ−２８ａ（＋）−βα１２を鋳型DNAとして、ジオバチルス・サーモグルコシダシウスQ6株のニトリルヒドラターゼβ、αサブユニット及びその下流遺伝子orf3を含む約１．５kb断片を増幅した。増幅によるエラーが無いことを確認し、βサブユニットの翻訳開始コドン上に設計したNdeI制限酵素部位及び、orf3遺伝子の翻訳終始コドン直後に位置する制限酵素BglIIにて消化し、約１．５ｋｂDNA断片を回収した。一方、約６．４４ｋｂのプラスミドM33ＫＳＮＨ−ｐＨＳＧ２９８を制限酵素NdeIで消化した後BglIIで消化し、アガロースゲル電気泳動に供し、DNA断片を回収した。この約６．４４ｋｂのM33ＫＳＮＨ−ｐＨＳＧ２９８のベクター領域と、約１．５ｋｂのQ6由来ニトリルヒドラターゼβ、αサブユニット、下流遺伝子orf３部分のインサート領域をライゲーションし、約７．９４ｋｂのM33ＫＳＮＨ−ｐＨＳＧ２９８―Q6βαorf3プラスミドを作製した。【０１１４】
このM33ＫＳＮＨ−ｐＨＳＧ２９８−Q6βαorf３プラスミドは、ベクター部分が約２．６４ｋｂ、インサート部分はM33株のニトリルヒドラターゼのプロモーター領域約３．８ｋｂとQ6株のニトリルヒドラターゼα、βサブユニット、下流遺伝子orf３約１．５ｋｂを合わせた約５．３ｋｂから構成される。この結果、M３３株のニトリルヒドラターゼβサブユニットの翻訳開始コドンATG部分でQ6株のニトリルヒドラターゼβサブユニットの翻訳開始コドンに置き換わり、M33株のニトリルヒドラターゼのプロモーターを用いてQ6株のニトリルヒドラターゼ及び下流遺伝子orf3が発現する遺伝子ユニットが構築された。【０１１５】
（５）大腸菌とロドコッカス属間のシャトルベクターｐRE−７上でのニトリルヒドラターゼ発現ユニットの構築
上記で構築した発現ユニットを、カナマイシン耐性を有する約５．９ｋｂの大腸菌とロドコッカス属間用シャトルベクターｐRE−７に以下の要領で導入した。
なお、pRE-7はZhengらの方法（Plasmid 38 180-187, 1997）でpBluescript(Stratagne社製)、pACYC177（New England Biolabs社製）およびpOTSから作成される。このｐOTSはTAKAIらの文献（Infection and Imunity, Dec.2000, p6848-6847）に記載のｐ103と同一であり、また、同文献中のｐ33701とほぼ同一であり、特にpRE-7の作製に用いられる部分は完全に同一であり、ｐ33701はロドコッカス・エクイ（Rhodococcus equi）ATCC33701株より単離できる。【０１１６】
まず、配列表の配列番号３０に記載のAd５F―SacKpnNotI（５’−ｐCCGGTACCGC−３’）及び配列表の配列番号３１に記載のAd５R―SacKpnNotI（５’−ｐGGCCGCGGTACCGGAGCT−３’）（ｐは５’末端のリン酸化を示す）の2種類の1本鎖オリゴヌクレオチドをアニーリングさせて制限酵素部位SacIをNotI部位に変換するためアダプターAd5―SacKpnNotIを作製した。【０１１７】
上記にて構築した約７．９４ｋｂのM33ＫＳＮＨ−ｐＨＳＧ２９８−Q6βαorf3プラスミドを制限酵素SacI、KpnIにて消化し、約５．３ｋｂのインサート部分を切り出し、DNA断片を抽出した。このSacI制限酵素部位にアダプターAd5−SacKpnNotIを連結した。シャトルベクターｐRE−７のマルチクローニングサイトを利用し、制限酵素KpnI、NotIにて消化し、アガロースゲル電気泳動に供し、約５．９ｋｂのベクター部分のDNA断片を取得した。制限酵素部位NotI、KpnIにてベクターとインサートをライゲーションし、大腸菌JM109株を形質転換し、カナマイシン入りのLB培地にて形質転換体を選択した。【０１１８】
その結果、シャトルベクターｐRE−７（５．９ｋｂ）にM33株のニトリルヒドラターゼプロモーター領域（３．８ｋｂ）及びQ6株のニトリルヒドラターゼβ、αサブユニット及び下流遺伝子orf３領域（１．５ｋｂ）が導入された約１１．２ｋｂのｐRE−７-M33pro-Q6βαorf３プラスミドを取得した。【０１１９】
〔工程３〕ｐRE−７−M33pro−Q6βαorf３プラスミドを用いたM33株の形質転換
ＬＢ液体培地（０．５重量％バクト酵母エキストラクト、１重量％バクトトリプトン、０．５重量％ＮａＣｌ（ｐＨ７．５））１００ｍｌを含む５００ｍｌ容積の三角フラスコにロドコッカス・ロドクロウス  Ｍ３３株を１白金耳、植菌し３０℃で、１７時間培養後、４℃にて１０，０００×ｇで１５分間、遠心分離することにより集菌した。同菌体を氷冷した蒸留水２５ｍｌで２回、遠心分離（４℃にて１０，０００×ｇで１５分間）することにより洗浄し、フィルター滅菌した１０重量％のグリセロールを用いて、波長600nmの濁度が４０になるように懸濁した。同グリセロール懸濁液５０μｌを、１μｌの水に懸濁した2μｇのｐRE−７−M33pro−Q6βαorf３と混合し、速やかに、１ｍｍ幅のエレクトロポーレーション用のキュベットに入れ、１．５ＫＶ，２５μＦ，８００Ωの条件で、ＢＴＸ社製のＥＣＭ６３０を用いて遺伝子導入を行った。その後、10分間、氷中で保持し、全量を１ｍｌのＬＢ液体培地に加え30℃、4時間培養し、１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むLB寒天培地にまき、30℃で3日から5日間培養し、出現するカナマイシン耐性コロニーを選択し、ロドコッカス・ロドクロウス  Ｍ３３株の形質転換体を得た。【０１２０】
〔工程４〕M33株形質転換体の培養
生産用培地（ＫＨ2ＰＯ4  0.5 g/L、Ｋ2ＨＰＯ4  0.4 g/L、ＣｏＣｌ2６Ｈ2Ｏ  0.02 g/L、ＦｅＳＯ4７Ｈ2Ｏ  0.003 g/L、ＥＤＴＡ−２Ｎａ  0.006 g/L、ＮａＣｌ  0.01 g/L、ＣａＣｌ2２Ｈ2Ｏ  0.01 g/L、Glucose  20 g/L、ＭｇＳＯ4７Ｈ2Ｏ  1.2 g/L、Urea  7.5 g/L、カナマイシン  10mg/L）１００ｍｌを入れた５００ｍｌ用量の三角フラスコにロドコッカス・ロドクロウス  Ｍ３３株の形質転換体を１白金耳、植菌し、30℃で2日間培養した。これより得られる培養液９０ｍｌを生産用培地３Lを含む５L容積のジャーファーメンターに移植し、ｐH７．２、撹拌速度５００ｒｐｍ、３０℃で48時間培養した。培養液を２５℃にて１０，０００×ｇで１５分間、遠心分離することにより集菌した。同菌体を水２５ｍｌで２回、２５℃にて１０，０００×ｇで１５分間、遠心分離することにより洗浄し、生産反応用の菌体を得た。【０１２１】
〔工程５〕M33株形質転換体を用いたアクリルアミド生産反応
上記の工程４の培養で得られたロドコッカス・ロドクロウス  Ｍ３３株の形質転換体０．９ｇ（菌体乾燥重量相当量）を含む蒸留水８００ｍｌを１．５L反応器に入れて、２０℃から２５℃に容器内温度を調整しつつ、撹拌した。そこに、液体であるアクリロニトリルを濃度が２％を超えぬように滴下し、適宜、サンプルを取り出し、遠心分離後の上清を希釈し、高速液体クロマトグラフィーでアクリルアミド濃度を測定した。その結果、Q6株のニトリルヒドラターゼ遺伝子を持つロドコッカス・ロドクロウス  Ｍ３３株の形質転換体は５２％（重量/溶液）のアクリルアミドを蓄積した。【０１２２】
比較例１
比較例として、培地にカナマイシンを添加しない以外は上記の工程４と同様の方法で親株であるロドコッカス・ロドクロウスM33株を培養し、この培養液よりの菌体を用い工程５と同様の方法でアクリルアミド生産反応を行ったところ、アクリルアミドの最高蓄積量は４３%（重量／液量）であった。このことより、上記のM33の形質転換体では、Q6株由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子の導入により、アクリルアミド蓄積量が顕著に蓄積したことが確認された。実施例と比較例の結果を図３でグラフとした図３の結果を表３にも示す。【０１２３】
【表７】
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【０１２４】
比較例２：ネイティブ・ポリアクリルアミドゲル電気泳動による各菌体内ニトリルヒドラターゼ量の確認
比較例１で得られた親株であるM33株の培養液および上記の工程４で得られたM33株の形質転換体の培養液を、それぞれ、８，０００ｇ、１０分間の遠心分離集菌し、得られた湿菌体８０ｍｇを２ｍｌの５０ｍM リン酸ナトリウムバッファー（PH７）に再懸濁した。菌体を冷却下で超音波破砕機を用いて破砕し、菌体破砕液に１０％（重量／液量）になるようにグリセロールを添加し、各サンプルを１０％ゲルを用いたネイティブ・ポリアクリルアミド電気泳動により解析した。泳動後、クマシーブリリアントブルーによる蛋白質染色を行い、脱色した結果、M33株の形質転換体中には、親株であるM33株のニトリルヒドラターゼと同位置のバンドとともに、より泳動度の少ない位置にQ6株の精製したニトリルヒドラターゼと同位置のバンドが存在し、それぞれが細胞内全蛋白質の３０％以上を占めるという類稀な、高発現を達成していることが判明した。形質転換体のサンプルより得られたQ6株の精製したニトリルヒドラターゼと同位置バンドをブロッティング装置（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いてＰＶＤＦ膜（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）に転写し、ＣＢＢ染色し、目的のバンドが吸着している部分をＰＶＤＦ膜から切り出した。次に、全自動タンパク質一次構造分析装置PPSQ-23A（島津製作所）を用いて蛋白質のＮ末端アミノ酸配列を解読した。その結果、配列表の配列番号２３に記載の酸配列と配列表の配列番号２４に記載の配列が混合して、検出され、形質転換体は間違いなくQ6株由来のニトリルヒドラターゼを著量生産していることが判明した。一方、親株であるM33株のサンプルには当然ながら、Q6株由来のニトリルヒドラターゼの位置に相当するバンドはなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１２５】
本発明の微生物は、高温、および高ニトリル化合物濃度や高アミド化合物濃度下の反応においても、ニトリル化合物を対応するアミド化合物に変換する分野で好適に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】図１は、ジオバチルス・サーモグルコシデシウス  Ｑ−６（Geobacillus thermoglucosidasius Q-6）株のニトリルヒドラターゼβサブユニット、αサブユニット及び下流遺伝子群の遺伝子構成及び制限酵素地図を示す。コロニーハイブリダイゼーションで取得した断片（Ｈｉｎ２．３）及び、ロドコッカス属細菌にて発現させた際に導入した断片（βα１）の位置を示した。
【図２】図２は、ロドコッカス・ロドクロウス  Ｍ３３（Rhodococcus rhodochrous M33）株のニトリルヒドラターゼ遺伝子βサブユニット、αサブユニット及び下流遺伝子群の遺伝子構成及びその周辺領域の制限酵素地図を示す。制限酵素地図の両末端がプラークハイブリダイゼーションで得たλ３１１のDNAよりサブクローニングに用いたKpnIとSacIに相当する。太線部がM33ＫＳＮＨ−ｐＨＳＧ２９８に用いた部分であり、太線の切れた部分にリンカーが挿入されている。
【図３】図３は、ロドコッカス・ロドクロウス  Ｍ３３（Rhodococcus rhodochrous M33）株およびその形質転換体を用いたアクリルアミド生産反応の結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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