(57)【要約】プレートを回転させて生体サンプルを移動させる際に、回転の中心の外周側から内周側に生体サンプルを容易に移動できる生体サンプル分析プレートを提供する。  回転の中心に対して内周側に設けたチャンバー部（１６）と、外周側に設けられたサンプル保持部（２０）を流路（１７），（１８）で連結し、サンプル保持部（２０）があらかじめ内部に空気を保有しており、プレートの回転による遠心力で生体サンプルがチャンバー部（１６）からサンプル保持部（２０）に向けて移動するときにサンプル保持部（２０）内の空気がサンプル保持部（２０）内に圧縮保持されるようにした。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ流路が形成され、該マイクロ流路を流れる生体サンプルを、光学的に、あるいは電気化学的に分析する構成を有してなる生体サンプル分析用プレートにおいて、
該生体サンプル分析用プレートの回転中心に対して内周側に設けた第１チャンバーと、外周側に設けた第２チャンバーとが、第１マイクロ流路により連結されて、前記生体サンプルが、該第１マイクロ流路を介して前記第１チャンバーと前記第２チャンバーとの間で移動可能となっており、
前記第２チャンバーは、あらかじめ内部に空気を保有しており、該生体サンプル分析用プレートの回転により生ずる遠心力によって、前記生体サンプルが前記第１チャンバーから前記第２チャンバーに向けて移動するとき、前記第２チャンバー内の空気は該第２チャンバー内に圧縮保持される、
ことを特徴とする生体サンプル分析用プレート。
【請求項２】
請求項１に記載の生体サンプル分析用プレートにおいて、
前記第２チャンバーの前記第１チャンバーと連通する開口部は、前記第２チャンバーの外壁のうちの該分析用プレートの外周側にある部分に形成されている、
ことを特徴とする生体サンプル分析用プレート。
【請求項３】
請求項１に記載の生体サンプル分析用プレートにおいて、
前記第２チャンバーに連結された前記第１マイクロ流路に、さらに、第２マイクロ流路が連結されて設けられ、
前記第２チャンバーに保持される生体サンプルが、前記第１マイクロ流路、および前記第２マイクロ流路を介して移動可能である、
ことを特徴とする生体サンプル分析用プレート。
【請求項４】
請求項２に記載の生体サンプル分析用プレートにおいて、
前記第２チャンバーに連結された前記第１マイクロ流路に、さらに、第２マイクロ流路が連結されて設けられ、
前記第２チャンバーに保持される生体サンプルが、前記第１マイクロ流路、および前記第２マイクロ流路を介して移動可能である、
ことを特徴とする生体サンプル分析用プレート。
【請求項５】
請求項４に記載の生体サンプル分析用プレートにおいて、
前記第２マイクロ流路に連結されて、第３チャンバーが設けられ、
該第３チャンバーは、前記生体サンプル分析用プレートの回転中心から、前記第１チャンバーよりも近い位置に配置され、
前記生体サンプルが、前記第２チャンバーから前記第２マイクロ流路を介して前記第３チャンバーに移動可能である、
ことを特徴とする生体サンプル分析用プレート。
【請求項６】
請求項３ないし５のいずれかに記載の生体サンプル分析用プレートにおいて、
前記第１のマイクロ流路、および前記第２のマイクロ流路により形成される試料供給用流路とその一部が接し、該接する部分でサンプル定量保持部を形成する緩衝剤供給用流路は、該生体サンプル分析用プレートの重心を中心とする円弧部分を有する、
ことを特徴とする生体サンプル分析用プレート。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれかに記載の生体サンプル分析用プレートであって、
該生体サンプル分析用プレートは、抗原抗体反応分析用のものである、
ことを特徴とする生体サンプル分析用プレート。
【請求項８】
請求項１ないし６のいずれかに記載の生体サンプル分析用プレートであって、
該生体サンプル分析用プレートは、血液成分分析用のものである、
ことを特徴とする生体サンプル分析用プレート。
【請求項９】
請求項１ないし６のいずれかに記載の生体サンプル分析用プレートであって、
該生体サンプル分析用プレートは、遺伝子分析用のものである、
ことを特徴とする生体サンプル分析用プレート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、ＤＮＡやタンパク、その他の生体サンプルを、緩衝剤中で移動させ、その輸送反応を検出して、生体サンプルを判別する生体サンプル分析用プレートに関する。
【背景技術】
【０００２】  一般的な生体サンプルを考えた場合、大きくはＤＮＡとタンパクが存在している。そして、近年、分子生物学の急速な進展によって、様々な疾患において遺伝子の関与がかなり正確に理解されるようになり、遺伝子をターゲットにした医療に注目が集まるようになってきている。ＤＮＡに関して、現在ＳＮＰｓ（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、の略で「１塩基多型」と一般に訳されており、遺伝子における１暗号（１塩基）の違いの総称である。）が注目されている。その理由としては、ＳＮＰｓの分類により、多くの疾患に対する罹患率や、各個人の薬剤に対する効果や、感受性を予測でき、さらには、地球上に親子兄弟といえども全く同じＳＮＰｓを持つ人間は絶対に存在しないことから、個人の完全な特定ができると考えられているからである。【０００３】  現在ＳＮＰｓを調べる方法としては、ＤＮＡの塩基配列を端から直接読んでいくシーケンシング（塩基配列の決定）が、最も一般的に用いられている。そして、前記シーケンシングを行う方法としては、いくつかの報告があるが、もっとも一般的に行われているのは、ジデオキシシーケリング（Ｓａｎｇｅｒ法）である。なお、シーケンシングは、このＳａｎｇｅｒ法を含め、何れの方法においても、分離能の高い変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動か、キャピラリー電気泳動によって１塩基長の長さの違いを分離・識別する技術が基になって成り立っている。【０００４】  また、他の方法として、アフィニティリガンドキャピラリー電気泳動法がある。【０００５】  アフィニティリガンドキャピラリー電気泳動は、分子間親和力、とくに生態系における特異的親和力（酵素と基質、抗原と抗体の親和力等）を利用して分離に特異性を持たせるものであり、具体的には、キャピラリー管中の泳動溶液に、塩基配列を特異的に認識するアフィニティリガンドを添加しておき、試料を電気泳動させると、試料混合物中で相互作用する分子種だけが移動速度に変化を生じることに着目して分析を行うものである（例えば、特許文献１参照）。【０００６】  一方、タンパク質は、細胞、組織、生体液中に存在し、生体活動の調節、細胞へのエネルギー供給、重要な物質の合成、生物構造体の維持、さらには細胞間でのコミュニケーションや、細胞内情報伝達に関与している。現在では、タンパク質が様々な環境や、相互作用する他のタンパク質の存在、タンパク質が受けた修飾の程度や、種類に応じて、複数の機能を有することが明らかになってきている。【０００７】  タンパク質は、２０種類のアミノ酸が、遺伝子の指示（配列情報）により順番につながることでつくられており、その種類は数千万種と言われるが、その遺伝子の配列がわかれば、どのアミノ酸が、どういう順番でつながってできているか、の情報を得ることができる。生物の遺伝子（ゲノム）から作られるタンパク質の一そろいのセットは、プロテオームと呼ばれるが、ヒトゲノムの塩基配列解読が終わった今、プロテオームの解析が盛んに進められている。【０００８】  そして、このようなタンパク質の機能解析研究としては、同定や、キャラクタリゼーションのみならず、生化学アッセイや、タンパク質間相互作用研究、タンパク質ネットワーク、または、細胞内外のシグナリング解明、なども行っていく必要がある。このタンパク質機能の研究には、多方面の技術が使用され、酵素アッセイ、酵母ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄアッセイ、クロマトグラフィーによる精製、情報ツールとデータベース等があるが、特に、電気泳動によるたんぱく質の判別は、重要な手法である。そして、電気泳動のように、キャピラリー管中のサンプル、分析物、緩衝剤、及び試薬等の液体を移動させた際に得られる輸送反応を検出して、該サンプルの分析、判別、判定等を行う場合の、前記液体の輸送、及び方向付けに関しては、さまざまな報告がある（例えば、特許文献２〜特許文献５）。
【特許文献１】特開平７−３１１１９８号公報
【特許文献２】特表２０００−５１３８１３号公報
【特許文献３】特表２００１−５２３３４１号公報
【特許文献４】特表２０００−５１４９２８号公報
【特許文献５】特開２００３−２８８８３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】  上述したように生体サンプルの分析においては、キャピラリー電気泳動装置を利用した方法が、広く使われている。実際に輸送反応を行なう部分であるキャピラリーは、外形３００ミクロン、内径１００ミクロン程度のガラス管が使用される例が多く、折れにくくするために、表面は、ポリイミド等でコーティングされている。【００１０】  しかしながら、内部試料を検出するために、検出窓として焼いたり、薬品で溶かすなどして、コーティングを一部剥ぎ取る。この時、コーティングを剥いだ部分は、折れやすくなり、取り扱いに十分注意する必要がある。折れた場合は、なお危険である。【００１１】  また、サンプルの注入においても、加圧や、吸引で行なうのが一般的な方法であるが、一定量注入する必要があり、時間で調整するものの、キャピラリー内の緩衝剤の粘度や、温度変化により、注入量が実験のたびに異なるという問題がある。サンプルの量は、測定結果に及ぼす影響は大きく、大変重要な項目である。【００１２】  また、このようなキャピラリーを使用した装置の場合、構成上短い流路での電気泳動を行なうことは困難であり、必要以上の泳動距離と、時間をかけて測定することになる。【００１３】  さらに、プレート上の流路を利用した場合でも、試料の分離を行うのに、例えば、特許文献５、特許文献６に記載の方法では、複数のキャピラリーチャンネルを交差させ、且つ少なくとも３つの電極を設けて、該少なくとも３つの設けられた電極のうちの２つの電極に印加して、前記交差部を通して前記試料を移動させているが、この方法では、流路が交差していることから、試料を電気泳動させる際にうまく泳動しない可能性があり、正確な測定結果が得られないという問題がある。【００１４】  また、例えば、特許文献３，特許文献４に記載の方法では、プラットホームに、微細チャンネルを埋設し、該プラットホームの回転速度を変化させることで、該回転から生じる向心力を変化させて試料を移動させているが、この方法では、試料を向心方向にしか移動させることができないという問題に加え、該微小チャンネルの形状が、かなり複雑であるという問題もある。【００１５】  本発明は、上記のような従来の課題を解決するためになされたもので、流路に充填された緩衝剤中で、生体サンプルを移動させた際の輸送反応を検出する時に、短時間で正確な検出結果が得られ、取り扱いも容易で、且つ小型、軽量で、安価な生体サンプル分析用プレートを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】  前記課題を解決するために、本発明にかかる生体サンプル分析用プレートは、マイクロ流路が形成され、該マイクロ流路を流れる生体サンプルを、光学的に、あるいは電気化学的に分析する構成を有してなる生体サンプル分析用プレートにおいて、該生体サンプル分析用プレートの回転中心に対して内周側に設けた第１チャンバーと、外周側に設けた第２チャンバーとが、第１マイクロ流路により連結されて、前記生体サンプルが、該第１マイクロ流路を介して前記第１チャンバーと前記第２チャンバーとの間で移動可能となっており、前記第２チャンバーは、あらかじめ内部に空気を保有しており、該生体サンプル分析用プレートの回転により生ずる遠心力によって、前記生体サンプルが前記第１チャンバーから前記第２チャンバーに向けて移動するとき、前記第２チャンバー内の空気は該第２チャンバー内に圧縮保持される、構成を有することを特徴とする。【００１７】  さらに、本発明にかかる生体サンプル分析用プレートは、前記第２チャンバーの前記第１チャンバーと連通する開口部は、前記第２チャンバーの外壁のうちの該分析用プレートの外周側にある部分に形成されている構成を有する。【００１８】  さらに、本発明にかかる生体サンプル分析用プレートは、前記第２チャンバーに連結された前記第１マイクロ流路に、さらに、第２マイクロ流路が連結されて設けられ、前記第２チャンバーに保持される生体サンプルが、前記第１マイクロ流路、および前記第２マイクロ流路を介して移動可能である構成を有する。【００１９】  さらに、本発明にかかる生体サンプル分析用プレートは、前記第２マイクロ流路に連結されて、第３チャンバーが設けられ、該第３チャンバーは、前記生体サンプル分析用プレートの回転中心から、前記第１チャンバーよりも近い位置に配置され、前記生体サンプルが、前記第２チャンバーから前記第２マイクロ流路を介して前記第３チャンバーに移動可能である構成を有する。【００２０】  さらに、本発明にかかる生体サンプル分析用プレートは、前記第１のマイクロ流路、および前記第２のマイクロ流路により形成される試料供給用流路とその一部が接し、該接する部分でサンプル定量保持部を形成する緩衝剤供給用流路は、該生体サンプル分析用プレートの重心を中心とする円弧部分を有する構成を有する。【００２１】  また、本発明にかかる生体サンプル分析用プレートは、第２の流路が、生体サンプル分析用プレートの重心を中心とする円弧部分を有する、ことを特徴とする。【００２２】  さらに、本発明にかかる生体サンプル分析用プレートは、抗原抗体反応分析用のものである。【００２３】  さらに、本発明にかかる生体サンプル分析用プレートは、血液成分分析用のものである。【００２４】  さらに、本発明にかかる生体サンプル分析用プレートは、遺伝子分析用のものである。
【発明の効果】
【００２５】  したがって、本発明によれば、生体サンプル分析用プレートを回転させることにより、外周側に設けた保持手段が保持する生体サンプルを、遠心力を利用して、定量保持部へ移動させることができる。【００２６】  また、本発明によれば、遠心力を利用した生体サンプル判別において、第２の流路を生体サンプル分析用プレートの重心を中心とする円弧形状とすることにより、生体サンプルを電気泳動させる第２の流路のほぼ全体を、スキャンすることができる。【００２７】  またこれにより、第２の流路の途中や、第２の流路の終端の、反応状況を知ることができるようになり、反応の過程を観察することにより、極めて正確な観察結果を得ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、本発明の実施の形態１による生体サンプル分析用プレートにおけるパターン形成面を示す図
【図２】図２は、本発明の実施の形態１による生体サンプル分析用プレートにおいて形成されるパターンを示す図
【図３】図３は、本発明の実施の形態１による生体サンプル分析用プレートにおける、サンプル注入部、および緩衝剤注入部の断面図
【図４】図４は、本発明の実施の形態１による生体サンプル分析用プレートにおける、チャンバー部、サンプル保持部、およびバッファ部を示す断面図
【図５】図５は、本発明の実施の形態１による生体サンプル分析用プレートにおける、正電極部、および負電極部を示す断面図
【図６（ａ）】図６（ａ）は、本発明の実施の形態１による生体サンプル分析用プレートパターンに、試料充填処理を施した時のＤＮＡコンジュゲートの状態を示す図
【図６（ｂ）】図６（ｂ）は、本発明の実施の形態１による生体サンプル分析用プレートパターンに、試料充填処理を施した時のＤＮＡコンジュゲートの状態を示すサンプル定量部の拡大図
【図７】図７は、本発明の実施の形態１による生体サンプル分析用プレートに、ＤＮＡコンジュゲートと、ＤＮＡサンプルを充填し、４０００ｒｐｍにて回転中の各試料の状態を示した図
【図８】図８は、本発明の実施の形態１による生体サンプル分析用プレートに、ＤＮＡコンジュゲートと、ＤＮＡサンプルを充填し、４０００ｒｐｍにて回転後、急停止したときの各試料の状態を示した図
【図９】図９は、本発明の実施の形態１による生体サンプル分析用プレートに、ＤＮＡコンジュゲートと、ＤＮＡサンプルを充填し、４０００ｒｐｍにて回転停止後、再回転した直後の各試料の状態を示した図
【図１０】図１０は、本発明の実施の形態１による生体サンプル分析用プレートパターンのＤＮＡスキャンを行なう部分を示した図
【図１１】図１１は、本発明の実施の形態１による生体サンプル分析用プレートにおいて、該プレートに形成されたサンプル定量部にＤＮＡサンプルが充填されて、該ＤＮＡサンプルが、第１の流路に充填された分離用ＤＮＡコンジュゲート中を移動していく様子を示す図
【符号の説明】
【００２９】  １００  生体サンプル分析用プレート
２００  パターン
３      回転部固定用穴
４      位置決め穴
５      プレート重心
６      緩衝剤注入口
７      緩衝剤注入部
８      サンプル注入口
９      サンプル注入部
１０    第１の流路
１１    第２の流路
１２    正電極部
１３    負電極部
１４    第３の流路
１５    流路
１６    チャンバー部（第１チャンバー）
１７    流路
１８    流路（第１マイクロ流路）
１９    流路（第２マイクロ流路）
２０    サンプル保持部（第２チャンバー）
２０ａ  開口部
２１    バッファ部（第３チャンバー）
２２、５０  流路
２３    サンプル定量部
２４    溝
２５    流路
２６    流路
２７    フィルム
２８    流路
２９    流路
３０    電極部
３１    ＤＮＡコンジュゲート
３２    ＤＮＡサンプル
３３    ＤＮＡサンプル
３４    空気
３５    部分
３６    部分
３７    フィルム
４０    円弧部分
８０    試料供給用流路
９０    緩衝剤供給用流路
Ａ      泳動方向
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】  （実施の形態１）
以下、図１〜図１４を用いて、本発明の実施の形態１による生体サンプル分析用プレートについて説明する。【００３１】  本発明は、生体サンプルを緩衝剤中で移動させて、生物学的、酵素的、免疫学的、及び化学的反応を行い、生体サンプルを容易、かつ安価に、精度よく、短時間で、判別することを実現するものである。【００３２】  なお、本実施の形態１では、説明を具体的にするために、生体サンプルがＤＮＡサンプルで、緩衝剤が、分離用ＤＮＡコンジュゲート、及びＤＮＡ結合制御剤を含むものであるとし、本生体サンプル分析用プレートが、流路中に充填させた分離用ＤＮＡコンジュゲート中に、定量されたＤＮＡサンプルを添加して電気泳動させ、流路中の蛍光度、あるいは吸光度を検出して、ＤＮＡサンプルのＳＮＰｓ（一塩基多型）の有無を判別するものとする。【００３３】  まず、図１〜図５を用いて、本実施の形態１による生体サンプル分析用プレート１００の構成について説明する。図１は、本実施の形態１による生体サンプル分析用プレート１００の流路形成面からみた図である。【００３４】  図２は、図１に示す本実施の形態１の生体サンプル分析用プレート１００に形成された流路パターン２００の詳細形状を示す図である。ここで、流路パターン２００は、生体サンプルの判別に用いる微小な幅と、深さを持つ溝によって形成された、微細な流路からなる。本実施の形態１では、該流路パターン２００の流路の深さは、５０ミクロンとする。【００３５】  本実施の形態１による生体サンプル分析用プレート１００には、図２に示す流路パターン２００が８個放射方向に形成されており、同時に８検体のＤＮＡ判別が可能である。【００３６】  図１に示すように、本実施の形態１による生体サンプル分析用プレート１００の外形は、８センチ四方の正方形で、４角のうち３角はＲが設けられ、残りの１角は面取りされている。【００３７】  さらに、穴４を設けているが、これは、外形を非対称にしてパターンの場所を特定できるようにされている。材料は、アクリル系の樹脂を使用し、厚みは２ｍｍである。流路形成面には、溝が形成され、さらにその上面に、厚さ５０μｍのアクリル製フィルムを接着することで、密閉流路が形成されている。また、本生体サンプル分析用プレート１００の重心５を中心に、本生体サンプル分析用プレート１００を、回転部に固定するための孔３が設けられている。【００３８】  図２に示すように、緩衝材注入口６から、緩衝剤であるＤＮＡコンジュゲートが注入され、注入された緩衝剤は、緩衝剤注入部７で一旦保持される。サンプル注入口８から注入されたＤＮＡサンプルは、サンプル注入部９で一旦保持される。緩衝剤注入部７と、サンプル注入部９は、同様の形状をしており、周辺断面を、図３に示す。【００３９】  図３は、緩衝剤注入部７や、サンプル注入部９の近傍の断面を表した図であり、斜線でハッチングした部分が、生体サンプル分析用プレート１００である。部分３５が、緩衝剤注入口６、およびサンプル注入口８にあたり、部分３６が、緩衝剤注入部７、およびサンプル注入部９にあたる。フィルム３７が、前述したアクリル製フィルムであり、溝２４にフタをするように貼り付けることで、密閉流路が形成される。ちなみに���路形成面は、下部である。【００４０】  正電極部１２は、正電極の挿入部であり、負電極部１３は、負電極の挿入部である。これらは流路１４を介して接続されており、さらには、流路１０，流路１１により緩衝剤注入部７とも、それぞれ接続されている。チャンバー部１６は、流路１５により、サンプル注入部９と接続されている。【００４１】  また、サンプル保持部２０は、流路１７と、流路１８により、チャンバー部１６と接続されているが、流路１７は細く、流路１８は流路１７に比べ太い。本実施の形態１では、流路１７の幅が、１００μｍに対し、流路１８の幅は、２００μｍである。【００４２】  バッファ部２１は、流路１７、流路１８、流路１９により、チャンバー部１６、サンプル保持部２０と、それぞれ接続されており、さらに、流路５０によって、チャンバー部１６の空気抜きが、また、流路２２によって、バッファ部２１の空気抜きが可能となる。【００４３】  サンプル定量部２３は、流路１４と、流路１９との合流部分に設けられており、ＤＮＡサンプルを定量する。【００４４】  チャンバー部１６、サンプル保持部２０、バッファ部２１は、同様の形状をしており、その周辺部分の断面図を、図４に示す。図４は、下方が流路形成面である。【００４５】  溝２４が、チャンバー部１６、サンプル保持部２０、バッファ部２１にあたる部分であり、流路形成面からみて、１．５ｍｍの深さの器状になっている。流路２５、流路２６が、各部からのびる流路となる。【００４６】  次に、正電極部１２と、負電極部１３とについて、図５を用いて説明する。【００４７】  図５は、正電極部１２と、負電極部１３の周辺部分の断面図であり、下方が、流路形成面である。【００４８】  電極部３０が、正電極部１２と、負電極部１３にあたる部分であり、生体サンプル分析用プレート１００を貫通した穴である。両面には、フィルム３７と、フィルム２７とが貼り付けてあるが、フィルム３７が、非導電性の材料を必要とするのに対して、フィルム２７は、導電性のものでもよい。導電性の場合、外部からフィルム２７に電圧を印加することで、電極部３０内の試料に電圧を印加することができる。非導電性の場合は、針状の電極を突き刺し、内部へ挿入することで、電圧印加が可能となる。【００４９】  また、フィルム３７が、生体サンプル分析用プレート１００の全面に貼られているのに対して、フィルム２７は、電極部３０の近傍のみに、それぞれ貼られている。【００５０】  それでは、以下、前述したＤＮＡサンプルのＳＮＰｓ（一塩基多型）の有無を判別するまでの具体的操作、および動作の一例を、図２を用いて説明する。【００５１】  まず、検体となるＤＮＡサンプルを準備する。【００５２】  本来ＤＮＡは、２本鎖の螺旋構造をしたものであるが、本実施の形態１においては、判別したいＳＮＰｓ部位を含む約６０塩基長の１本鎖ＤＮＡを準備する。【００５３】  抽出方法や、１本鎖化については、本発明とは直接関係がないので詳細な説明は省略する。【００５４】  次に、緩衝剤として、ＤＮＡコンジュゲートを準備する。【００５５】  ＤＮＡコンジュゲートとは、６〜１２塩基長１本鎖ＤＮＡの５’末端に、高分子のリニアポリマーが共有結合したものである。さらに���ＮＡは、正常型に対しては相補であるが、変異型に対しては相補ではない配列であり、正常型ＤＮＡに対しての結合力が強く、変異型ＤＮＡに対しての結合力が弱い特性がある。また、電気泳動した場合、５’末端に結合したリニアポリマーがおもりとなり、泳動速度がかなり遅いという特性もある。【００５６】  以後に記述する「ＤＮＡコンジュゲート」とは、電解質の役目もするｐＨ緩衝剤、およびＭｇＣｌ２などのＤＮＡ結合力制御剤を含んだ物性とする。【００５７】  試料の準備が終わったところで、ＤＮＡコンジュゲート、およびＤＮＡサンプルを、プレート内へ注入する。ＤＮＡコンジュゲートは、ピペッター等により、定量を、緩衝剤注入口６から緩衝剤注入部７へ分注する。ＤＮＡサンプルも、同様に、定量を、サンプル注入口８よりサンプル注入部９へ分注する。【００５８】  分注量としては、パターンのスケールにより異なるが、本実施の形態１においては、ＤＮＡコンジュゲートは、１８マイクロリットル、ＤＮＡサンプルは、２マイクロリットルとする。【００５９】  次に、モータ等に、生体サンプル分析用プレート１００を固定し、重心５を軸に、回転させる。この時、分注されたＤＮＡコンジュゲートと、ＤＮＡサンプルは、遠心力により、外周方向へと移動する。【００６０】  緩衝剤注入部７内のＤＮＡコンジュゲートは、流路１０と、流路１１を通り、正電極部１２と、負電極部１３へ等分され、正電極部１２へ移動したＤＮＡコンジュゲートは、さらに、流路１４を通り、サンプル定量部２３まで移動する。負電極部１３へ移動したＤＮＡコンジュゲートも、同様に、さらに、流路１４を通り、サンプル定量部２３まで移動する。【００６１】  回転開始から２分後、ＤＮＡコンジュゲートの移動が停止した状態を、図６（ａ）に示す。また、サンプル定量部２３周辺を拡大した図が、図６（ｂ）である。【００６２】  ＤＮＡコンジュゲート３１は、正電極部１２、および負電極部１３の、７割程度まで充填されており、流路１４を満たし、図６（ｂ）に示すように、サンプル定量部２３まで達している。【００６３】  正電極部１２と、負電極部１３、内に存在するＤＮＡコンジュゲートの液面高さと、サンプル定量部２３の液面高さは、重心５を中心とする同一円周上となる。【００６４】  次に、注入されたＤＮＡサンプルの移動について、図２、および図７を用いて説明する。【００６５】  サンプル注入部９内のＤＮＡサンプルは、流路１５を通り、チャンバー部１６、さらには、流路１７、流路１８を通り、外周側に位置するサンプル保持部２０にまで達する。このとき、チャンバー部１６内にあった空気は流路５０，１９を通って抜ける。しかしながら、図７に示すように、流路１８は、サンプル保持部２０の外周側に接続され、かつサンプル保持部２０には、空気抜き用の穴が存在しない。そのため、サンプル保持部２０内に残った空気は、抜けることはなく、加圧された状態となる。【００６６】  図７が、回転開始から２分後のＤＮＡサンプル３２と、ＤＮＡサンプル３３の状態を示すものである。空気３４は、圧縮されており、回転中のみ、このような遠心力と、加圧力とが、平衡となった状態を維持する。【００６７】  本実施の形態１では、回転数は、４０００���ｐｍである。【００６８】  それでは、次の動作を説明する。【００６９】  生体サンプル分析用プレート１００を、一定時間回転させ、ＤＮＡコンジュゲートと、ＤＮＡサンプルの移動が停止した状態で、回転を急停止させる。例えば、２秒で、４０００ｒｐｍより、停止までに、至らしめる。【００７０】  サンプル保持部２０内に存在していたＤＮＡサンプル３２は、遠心力が無くなり、空気３４の圧力により、サンプル保持部２０から流路１８へ、逆流しようとする。【００７１】  さらに、ＤＮＡサンプル３２は、サンプル保持部２０内の空気３４が大気圧となるまで流路１７、流路１９へと移動しようとするが、この時、流路１７は、流路１９にくらべ細く形成されているため、ＤＮＡサンプル３２は、流路１７よりも、流路１９へ多く流れようとする。【００７２】  そこで、急停止した直後の状態を、図８に示す。【００７３】  サンプル保持部２０内のＤＮＡサンプル３２は、空気３４の膨張により、流路１８、流路１９を通り、サンプル定量部２３、およびバッファ部２１にまで達する。【００７４】  特に、サンプル定量部２３では、充填されたＤＮＡコンジュゲート３１と接することになる。このとき、流路１７を通り、チャンバー部１６へ移動するＤＮＡサンプル３２も、多少存在する。【００７５】  次に、生体サンプル分析用プレート１００を、中速にて数秒間もう一度回転させる。この時減速を緩やかにすることが重要である。停止後の状態を、図９に示す。【００７６】  流路１９に充填されていたＤＮＡサンプル３２は、チャンバー部１６へと流れるが、サンプル定量部２３には、ＤＮＡサンプル３２が微量残存する。残存したＤＮＡサンプル３２ａは、他のＤＮＡサンプル３２ｂ，３２ｃに対して、電気的にも絶縁された状態である。【００７７】  また、このように、２回目の回転時に、１回目の回転時と異なる速度で回転をさせる理由は、その２回目の回転速度を、遅く、かつ減速度を緩やかにすることによって、サンプル保持部２０内の空気３４が強く圧縮されることがないようにするためである。したがって、サンプル保持部２０内のＤＮＡサンプルが逆流して、流路１９が再度充填されることもない。【００７８】  以上の動作を行ったのちに、サンプル定量部２３に残存したサンプルＤＮＡ３２が、ＳＮＰｓの判別を行なう最終試料となる。【００７９】  次に、電気泳動を行なわせる。電気泳動は、正電極部１２に正電極、負電極部１３に負電極を挿入し、数百Ｖの電圧を印加する。すると、流路１４、さらにはサンプル定量部２３において電界が発生し、サンプル定量部２３に一定量残存したＤＮＡサンプル３２は、流路１４中を、正電極側（図９中、Ａ方向）へ泳動する。【００８０】  流路１４中には、ＤＮＡコンジュゲートが充填されており、ＤＮＡサンプル３２は、ＤＮＡコンジュゲートとの結合を繰り返しながら電気泳動する。この時、上述したように、ＤＮＡサンプル３２中の正常型ＤＮＡはＤＮＡコンジュゲートとの結合力が強いため、泳動速度が遅くなり、変異型ＤＮＡはその結合力が弱いため、正常型に比べ泳動速度は速くなる。つまりＤＮＡサンプル中に、正常型、変異型の両方が存在した場合は、正常型のＤＮＡと、変異型のＤＮＡとが分離していくことと��り、ＳＮＰｓの判別を行うことができる。【００８１】  図１１は、図１０に示す流路１４の円弧部分４０を、ＤＮＡサンプルが電気泳動中に、該ＤＮＡサンプル３２をスキャンしたグラフを示す図である。【００８２】  ＤＮＡの検出は、蛍光標識（ＦＩＴＣ）を修飾したＤＮＡを、４７０ｎｍの光で励起し、５２０ｎｍ付近の光検出を行うことにより行なった。ここで、ＤＮＡの検出は、２６０ｎｍの吸光度により行なってもよい。【００８３】  図１１において、横軸が、円弧部分４０の位置を表し、ＤＮＡは、左から右へ泳動する。つまり、左側がサンプル定量部２３で、右側が正電極部１２側である。縦軸は、蛍光強度で、上から１分毎に計時変化した波形を表す。徐々に、２つの山が分離していく様子がわかる。この場合、ＤＮＡサンプル３２中には、同量の正常型ＤＮＡと、変異型ＤＮＡが存在していることが判定された。【００８４】  グラフ右側の山が、泳動速度が速いので変異型、左側が、遅く泳動しているので正常型となる。【００８５】  以上のように、本実施の形態１による生体サンプル分析用プレート１００によれば、生体サンプルを緩衝剤中で移動させた際に得られる輸送反応を検出して生体サンプルの判別を行う生体サンプル分析用プレート１００において、緩衝剤が流れる第２の流路９０と生体サンプルが流れる第１の流路８０との合流部分に、一定体積の生体サンプルを保持するサンプル定量部２３を設け、該サンプル定量部２３に生体サンプルを供給するようにするとともに、該サンプル定量部２３への生体サンプル供給用の通路１８に、その開口部２０ａを、該生体サンプル分析用プレート１００の外周側に有するサンプル保持部２０を、該通路１８に接続して設けることによって、回転動作のみによって、生体サンプル分析用プレート１００上のサンプル定量部２３にＤＮＡサンプル３２を一定量保持し、これを、正電極部１２と負電極部１３と流路１４とによって電気泳動させることができ、さらには、緩衝剤が流れる第２の流路９０である電気泳動する上記流路１４の一部を円弧形状としたことにより、細胞や血液等から特定のＤＮＡを取り出したＤＮＡサンプルを、本生体サンプル分析用プレートにおいて測定する際に、極めて精度の良い検出結果を得ることが可能となる効果がある。
【産業上の利用可能性】
【００８６】  本発明にかかる生体サンプル分析用プレートは、ＤＮＡサンプル等の生体サンプルの判別を、安価で、且つ簡便に行えるようにするものとして、非常に有用である。
【図１】
2006062149.tif 000002
【図２】
2006062149.tif 000003
【図３】
2006062149.tif 000004
【図４】
2006062149.tif 000005
【図５】
2006062149.tif 000006
【図６（ａ）】
2006062149.tif 000007
【図６（ｂ）】
2006062149.tif 000008
【図７】
2006062149.tif 000009
【図８】
2006062149.tif 000010
【図９】
2006062149.tif 000011
【図１０】
2006062149.tif 000012
【図１１】
2006062149.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成19年6月7日(2007.6.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ流路が形成され、該マイクロ流路を流れる生体サンプルを、光学的に、あるいは電気化学的に分析する構成を有してなる生体サンプル分析用プレートにおいて、
該生体サンプル分析用プレートの回転中心に対して内周側に設けた第１チャンバーと、外周側に設けた第２チャンバーとが、第１マイクロ流路により連結されて、前記生体サンプルが、該第１マイクロ流路を介して前記第１チャンバーと前記第２チャンバーとの間で移動可能となっており、
前記第２チャンバーは、あらかじめ内部に空気を保有しており、該生体サンプル分析用プレートの回転により生ずる遠心力によって、前記生体サンプルが前記第１チャンバーから前記第２チャンバーに向けて移動するとき、前記第２チャンバー内の空気は該第２チャンバー内に圧縮保持される、
ことを特徴とする生体サンプル分析用プレート。
【請求項２】
請求項１に記載の生体サンプル分析用プレートにおいて、
前記第２チャンバーの前記第１チャンバーと連通する開口部は、前記第２チャンバーの外壁のうちの該分析用プレートの外周側にある部分に形成されている、
ことを特徴とする生体サンプル分析用プレート。
【請求項３】
請求項１に記載の生体サンプル分析用プレートにおいて、
前記第２チャンバーに連結された前記第１マイクロ流路に、さらに、第２マイクロ流路が連結されて設けられ、
前記第２チャンバーに保持される生体サンプルが、前記第１マイクロ流路、および前記第２マイクロ流路を介して移動可能である、
ことを特徴とする生体サンプル分析用プレート。
【請求項４】
請求項２に記載の生体サンプル分析用プレートにおいて、
前記第２チャンバーに連結された前記第１マイクロ流路に、さらに、第２マイクロ流路が連結されて設けられ、
前記第２チャンバーに保持される生体サンプルが、前記第１マイクロ流路、および前記第２マイクロ流路を介して移動可能である、
ことを特徴とする生体サンプル分析用プレート。
【請求項５】
請求項４に記載の生体サンプル分析用プレートにおいて、
前記第２マイクロ流路に連結されて、第３チャンバーが設けられ、
該第３チャンバーは、前記生体サンプル分析用プレートの回転中心から、前記第１チャンバーよりも近い位置に配置され、
前記生体サンプルが、前記第２チャンバーから前記第２マイクロ流路を介して前記第３チャンバーに移動可能である、
ことを特徴とする生体サンプル分析用プレート。
【請求項６】
請求項３ないし５のいずれかに記載の生体サンプル分析用プレートにおいて、
前記第１のマイクロ流路、および前記第２のマイクロ流路により形成される試料供給用流路とその一部が接し、該接する部分でサンプル定量保持部を形成する緩衝剤供給用流路は、該生体サンプル分析用プレートの重心を中心とする円弧部分を有する、
ことを特徴とする生体サンプル分析用プレート。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれかに記載の生体サンプル分析用プレートであって、
該生体サンプル分析用プレートは、抗原抗体反応分析用のものである、
ことを特徴とする生体サンプル分析用プレート。
【請求項８】
請求項１ないし６のいずれかに記載の生体サンプル分析用プレートであって、
該生体サンプル分析用プレートは、血液成分分析用のものである、
ことを特徴とする生体サンプル分析用プレート。
【請求項９】
請求項１ないし６のいずれかに記載の生体サンプル分析用プレートであって、
該生体サンプル分析用プレートは、遺伝子分析用のものである、
ことを特徴とする生体サンプル分析用プレート。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡやタンパク、その他の生体サンプルを、緩衝剤中で移動させ、その輸送反応を検出して、生体サンプルを判別する生体サンプル分析用プレートに関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的な生体サンプルを考えた場合、大きくはＤＮＡとタンパクが存在している。そして、近年、分子生物学の急速な進展によって、様々な疾患において遺伝子の関与がかなり正確に理解されるようになり、遺伝子をターゲットにした医療に注目が集まるようになってきている。ＤＮＡに関して、現在ＳＮＰｓ（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、の略で「１塩基多型」と一般に訳されており、遺伝子における１暗号（１塩基）の違いの総称である。）が注目されている。その理由としては、ＳＮＰｓの分類により、多くの疾患に対する罹患率や、各個人の薬剤に対する効果や、感受性を予測でき、さらには、地球上に親子兄弟といえども全く同じＳＮＰｓを持つ人間は絶対に存在しないことから、個人の完全な特定ができると考えられているからである。
【０００３】
現在ＳＮＰｓを調べる方法としては、ＤＮＡの塩基配列を端から直接読んでいくシーケンシング（塩基配列の決定）が、最も一般的に用いられている。そして、前記シーケンシングを行う方法としては、いくつかの報告があるが、もっとも一般的に行われているのは、ジデオキシシーケリング（Ｓａｎｇｅｒ法）である。なお、シーケンシングは、このＳａｎｇｅｒ法を含め、何れの方法においても、分離能の高い変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動か、キャピラリー電気泳動によって１塩基長の長さの違いを分離・識別する技術が基になって成り立っている。
【０００４】
また、他の方法として、アフィニティリガンドキャピラリー電気泳動法がある。
【０００５】
アフィニティリガンドキャピラリー電気泳動は、分子間親和力、とくに生態系における特異的親和力（酵素と基質、抗原と抗体の親和力等）を利用して分離に特異性を持たせるものであり、具体的には、キャピラリー管中の泳動溶液に、塩基配列を特異的に認識するアフィニティリガンドを添加しておき、試料を電気泳動させると、試料混合物中で相互作用する分子種だけが移動速度に変化を生じることに着目して分析を行うものである（例えば、特許文献１参照）。
【０００６】
一方、タンパク質は、細胞、組織、生体液中に存在し、生体活動の調節、細胞へのエネルギー供給、重要な物質の合成、生物構造体の維持、さらには細胞間でのコミュニケーションや、細胞内情報伝達に関与している。現在では、タンパク質が様々な環境や、相互作用する他のタンパク質の存在、タンパク質が受けた修飾の程度や、種類に応じて、複数の機能を有することが明らかになってきている。
【０００７】
タンパク質は、２０種類のアミノ酸が、遺伝子の指示（配列情報）により順番につながることでつくられており、その種類は数千万種と言われるが、その遺伝子の配列がわかれば、どのアミノ酸が、どういう順番でつながってできているか、の情報を得ることができる。生物の遺伝子（ゲノム）から作られるタンパク質の一そろいのセットは、プロテオームと呼ばれるが、ヒトゲノムの塩基配列解読が終わった今、プロテオームの解析が盛んに進められている。
【０００８】
そして、このようなタンパク質の機能解析研究としては、同定や、キャラクタリゼーションのみならず、生化学アッセイや、タンパク質間相互作用研究、タンパク質ネットワーク、または、細胞内外のシグナリング解明、なども行っていく必要がある。このタンパク質機能の研究には、多方面の技術が使用され、酵素アッセイ、酵母  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  アッセイ、クロマトグラフィーによる精製、情報ツールとデータベース等があるが、特に、電気泳動によるたんぱく質の判別は、重要な手法である。そして、電気泳動のように、キャピラリー管中のサンプル、分析物、緩衝剤、及び試薬等の液体を移動させた際に得られる輸送反応を検出して、該サンプルの分析、判別、判定等を行う場合の、前記液体の輸送、及び方向付けに関しては、さまざまな報告がある（例えば、特許文献２〜特許文献５）。
【特許文献１】特開平７−３１１１９８号公報
【特許文献２】特表２０００−５１３８１３号公報
【特許文献３】特表２００１−５２３３４１号公報
【特許文献４】特表２０００−５１４９２８号公報
【特許文献５】特開２００３−２８８８３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述したように生体サンプルの分析においては、キャピラリー電気泳動装置を利用した方法が、広く使われている。実際に輸送反応を行なう部分であるキャピラリーは、外形３００ミクロン、内径１００ミクロン程度のガラス管が使用される例が多く、折れにくくするために、表面は、ポリイミド等でコーティングされている。
【００１０】
しかしながら、内部試料を検出するために、検出窓として焼いたり、薬品で溶かすなどして、コーティングを一部剥ぎ取る。この時、コーティングを剥いだ部分は、折れやすくなり、取り扱いに十分注意する必要がある。折れた場合は、なお危険である。
【００１１】
また、サンプルの注入においても、加圧や、吸引で行なうのが一般的な方法であるが、一定量注入する必要があり、時間で調整するものの、キャピラリー内の緩衝剤の粘度や、温度変化により、注入量が実験のたびに異なるという問題がある。サンプルの量は、測定結果に及ぼす影響は大きく、大変重要な項目である。
【００１２】
また、このようなキャピラリーを使用した装置の場合、構成上短い流路での電気泳動を行なうことは困難であり、必要以上の泳動距離と、時間をかけて測定することになる。
【００１３】
さらに、プレート上の流路を利用した場合でも、試料の分離を行うのに、例えば、特許文献５に記載の方法では、複数のキャピラリーチャンネルを交差させ、且つ少なくとも３つの電極を設けて、該少なくとも３つの設けられた電極のうちの２つの電極に印加して、前記交差部を通して前記試料を移動させているが、この方法では、流路が交差していることから、試料を電気泳動させる際にうまく泳動しない可能性があり、正確な測定結果が得られないという問題がある。
【００１４】
また、例えば、特許文献３，特許文献４に記載の方法では、プラットホームに、微細チャンネルを埋設し、該プラットホームの回転速度を変化させることで、該回転から生じる向心力を変化させて試料を移動させているが、この方法では、試料を向心方向にしか移動させることができないという問題に加え、該微小チャンネルの形状が、かなり複雑であるという問題もある。
【００１５】
本発明は、上記のような従来の課題を解決するためになされたもので、流路に充填された緩衝剤中で、生体サンプルを移動させた際の輸送反応を検出する時に、短時間で正確な検出結果が得られ、取り扱いも容易で、且つ小型、軽量で、安価な生体サンプル分析用プレートを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
前記課題を解決するために、本発明にかかる生体サンプル分析用プレートは、マイクロ流路が形成され、該マイクロ流路を流れる生体サンプルを、光学的に、あるいは電気化学的に分析する構成を有してなる生体サンプル分析用プレートにおいて、該生体サンプル分析用プレートの回転中心に対して内周側に設けた第１チャンバーと、外周側に設けた第２チャンバーとが、第１マイクロ流路により連結されて、前記生体サンプルが、該第１マイクロ流路を介して前記第１チャンバーと前記第２チャンバーとの間で移動可能となっており、前記第２チャンバーは、あらかじめ内部に空気を保有しており、該生体サンプル分析用プレートの回転により生ずる遠心力によって、前記生体サンプルが前記第１チャンバーから前記第２チャンバーに向けて移動するとき、前記第２チャンバー内の空気は該第２チャンバー内に圧縮保持される、構成を有することを特徴とする。
【００１７】
さらに、本発明にかかる生体サンプル分析用プレートは、前記第２チャンバーの前記第１チャンバーと連通する開口部は、前記第２チャンバーの外壁のうちの該分析用プレートの外周側にある部分に形成されている構成を有する。
【００１８】
さらに、本発明にかかる生体サンプル分析用プレートは、前記第２チャンバーに連結された前記第１マイクロ流路に、さらに、第２マイクロ流路が連結されて設けられ、前記第２チャンバーに保持される生体サンプルが、前記第１マイクロ流路、および前記第２マイクロ流路を介して移動可能である構成を有する。
【００１９】
さらに、本発明にかかる生体サンプル分析用プレートは、前記第２マイクロ流路に連結されて、第３チャンバーが設けられ、該第３チャンバーは、前記生体サンプル分析用プレートの回転中心から、前記第１チャンバーよりも近い位置に配置され、前記生体サンプルが、前記第２チャンバーから前記第２マイクロ流路を介して前記第３チャンバーに移動可能である構成を有する。
【００２０】
さらに、本発明にかかる生体サンプル分析用プレートは、前記第１のマイクロ流路、および前記第２のマイクロ流路により形成される試料供給用流路とその一部が接し、該接する部分でサンプル定量保持部を形成する緩衝剤供給用流路は、該生体サンプル分析用プレートの重心を中心とする円弧部分を有する構成を有する。
【００２１】
また、本発明にかかる生体サンプル分析用プレートは、第２の流路が、生体サンプル分析用プレートの重心を中心とする円弧部分を有する、ことを特徴とする。
【００２２】
さらに、本発明にかかる生体サンプル分析用プレートは、抗原抗体反応分析用のものである。
【００２３】
さらに、本発明にかかる生体サンプル分析用プレートは、血液成分分析用のものである。
【００２４】
さらに、本発明にかかる生体サンプル分析用プレートは、遺伝子分析用のものである。
【発明の効果】
【００２５】
したがって、本発明によれば、生体サンプル分析用プレートを回転させることにより、外周側に設けた保持手段が保持する生体サンプルを、遠心力を利用して、定量保持部へ移動させることができる。
【００２６】
また、本発明によれば、遠心力を利用した生体サンプル判別において、第２の流路を生体サンプル分析用プレートの重心を中心とする円弧形状とすることにより、生体サンプルを電気泳動させる第２の流路のほぼ全体を、スキャンすることができる。
【００２７】
またこれにより、第２の流路の途中や、第２の流路の終端の、反応状況を知ることができるようになり、反応の過程を観察することにより、極めて正確な観察結果を得ることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
（実施の形態１）
以下、図１〜図１４を用いて、本発明の実施の形態１による生体サンプル分析用プレートについて説明する。
【００２９】
本発明は、生体サンプルを緩衝剤中で移動させて、生物学的、酵素的、免疫学的、及び化学的反応を行い、生体サンプルを容易、かつ安価に、精度よく、短時間で、判別することを実現するものである。
【００３０】
なお、本実施の形態１では、説明を具体的にするために、生体サンプルがＤＮＡサンプルで、緩衝剤が、分離用ＤＮＡコンジュゲート、及びＤＮＡ結合制御剤を含むものであるとし、本生体サンプル分析用プレートが、流路中に充填させた分離用ＤＮＡコンジュゲート中に、定量されたＤＮＡサンプルを添加して電気泳動させ、流路中の蛍光度、あるいは吸光度を検出して、ＤＮＡサンプルのＳＮＰｓ（一塩基多型）の有無を判別するものとする。
【００３１】
まず、図１〜図５を用いて、本実施の形態１による生体サンプル分析用プレート１００の構成について説明する。図１は、本実施の形態１による生体サンプル分析用プレート１００の流路形成面からみた図である。
【００３２】
図２は、図１に示す本実施の形態１の生体サンプル分析用プレート１００に形成された流路パターン２００の詳細形状を示す図である。ここで、流路パターン２００は、生体サンプルの判別に用いる微小な幅と、深さを持つ溝によって形成された、微細な流路からなる。本実施の形態１では、該流路パターン２００の流路の深さは、５０ミクロンとする。
【００３３】
本実施の形態１による生体サンプル分析用プレート１００には、図２に示す流路パターン２００が８個放射方向に形成されており、同時に８検体のＤＮＡ判別が可能である。
【００３４】
図１に示すように、本実施の形態１による生体サンプル分析用プレート１００の外形は、８センチ四方の正方形で、４角のうち３角はＲが設けられ、残りの１角は面取りされている。
【００３５】
さらに、穴４を設けているが、これは、外形を非対称にしてパターンの場所を特定できるようにされている。材料は、アクリル系の樹脂を使用し、厚みは２ｍｍである。流路形成面には、溝が形成され、さらにその上面に、厚さ５０μｍのアクリル製フィルムを接着することで、密閉流路が形成されている。また、本生体サンプル分析用プレート１００の重心５を中心に、本生体サンプル分析用プレート１００を、回転部に固定するための孔３が設けられている。
【００３６】
図２に示すように、緩衝材注入口６から、緩衝剤であるＤＮＡコンジュゲートが注入され、注入された緩衝剤は、緩衝剤注入部７で一旦保持される。サンプル注入口８から注入されたＤＮＡサンプルは、サンプル注入部９で一旦保持される。緩衝剤注入部７と、サンプル注入部９は、同様の形状をしており、周辺断面を、図３に示す。
【００３７】
図３は、緩衝剤注入部７や、サンプル注入部９の近傍の断面を表した図であり、斜線でハッチングした部分が、生体サンプル分析用プレート１００である。部分３５が、緩衝剤注入口６、およびサンプル注入口８にあたり、部分３６が、緩衝剤注入部７、およびサンプル注入部９にあたる。フィルム３７が、前述したアクリル製フィルムであり、溝２４にフタをするように貼り付けることで、密閉流路が形成される。ちなみに流路形成面は、下部である。
【００３８】
正電極部１２は、正電極の挿入部であり、負電極部１３は、負電極の挿入部である。これらは流路１４を介して接続されており、さらには、流路１０，流路１１により緩衝剤注入部７とも、それぞれ接続されている。チャンバー部１６は、流路１５により、サンプル注入部９と接続されている。
【００３９】
また、サンプル保持部２０は、流路１７と、流路１８により、チャンバー部１６と接続されているが、流路１７は細く、流路１８は流路１７に比べ太い。本実施の形態１では、流路１７の幅が、１００μｍに対し、流路１８の幅は、２００μｍである。
【００４０】
バッファ部２１は、流路１７、流路１８、流路１９により、チャンバー部１６、サンプル保持部２０と、それぞれ接続されており、さらに、流路５０によって、チャンバー部１６の空気抜きが、また、流路２２によって、バッファ部２１の空気抜きが可能となる。
【００４１】
サンプル定量部２３は、流路１４と、流路１９との合流部分に設けられており、ＤＮＡサンプルを定量する。
【００４２】
チャンバー部１６、サンプル保持部２０、バッファ部２１は、同様の形状をしており、その周辺部分の断面図を、図４に示す。図４は、下方が流路形成面である。
【００４３】
溝２４が、チャンバー部１６、サンプル保持部２０、バッファ部２１にあたる部分であり、流路形成面からみて、１．５ｍｍの深さの器状になっている。流路２５、流路２６が、各部からのびる流路となる。
【００４４】
次に、正電極部１２と、負電極部１３とについて、図５を用いて説明する。
【００４５】
図５は、正電極部１２と、負電極部１３の周辺部分の断面図であり、下方が、流路形成面である。
【００４６】
電極部３０が、正電極部１２と、負電極部１３にあたる部分であり、生体サンプル分析用プレート１００を貫通した穴である。両面には、フィルム３７と、フィルム２７とが貼り付けてあるが、フィルム３７が、非導電性の材料を必要とするのに対して、フィルム２７は、導電性のものでもよい。導電性の場合、外部からフィルム２７に電圧を印加することで、電極部３０内の試料に電圧を印加することができる。非導電性の場合は、針状の電極を突き刺し、内部へ挿入することで、電圧印加が可能となる。
【００４７】
また、フィルム３７が、生体サンプル分析用プレート１００の全面に貼られているのに対して、フィルム２７は、電極部３０の近傍のみに、それぞれ貼られている。
【００４８】
それでは、以下、前述したＤＮＡサンプルのＳＮＰｓ（一塩基多型）の有無を判別するまでの具体的操作、および動作の一例を、図２を用いて説明する。
【００４９】
まず、検体となるＤＮＡサンプルを準備する。
【００５０】
本来ＤＮＡは、２本鎖の螺旋構造をしたものであるが、本実施の形態１においては、判別したいＳＮＰｓ部位を含む約６０塩基長の１本鎖ＤＮＡを準備する。
【００５１】
抽出方法や、１本鎖化については、本発明とは直接関係がないので詳細な説明は省略する。
【００５２】
次に、緩衝剤として、ＤＮＡコンジュゲートを準備する。
【００５３】
ＤＮＡコンジュゲートとは、６〜１２塩基長１本鎖ＤＮＡの５’末端に、高分子のリニアポリマーが共有結合したものである。さらにＤＮＡコンジュゲートは、正常型に対しては相補であるが、変異型に対しては相補ではない配列であり、正常型ＤＮＡに対しての結合力が強く、変異型ＤＮＡに対しての結合力が弱い特性がある。また、電気泳動した場合、５’末端に結合したリニアポリマーがおもりとなり、泳動速度がかなり遅いという特性もある。
【００５４】
以後に記述する「ＤＮＡコンジュゲート」とは、電解質の役目もするｐＨ緩衝剤、およびＭｇＣｌ２などのＤＮＡ結合力制御剤を含んだ物性とする。
【００５５】
試料の準備が終わったところで、ＤＮＡコンジュゲート、およびＤＮＡサンプルを、プレート内へ注入する。ＤＮＡコンジュゲートは、ピペッター等により、定量を、緩衝剤注入口６から緩衝剤注入部７へ分注する。ＤＮＡサンプルも、同様に、定量を、サンプル注入口８よりサンプル注入部９へ分注する。
【００５６】
分注量としては、パターンのスケールにより異なるが、本実施の形態１においては、ＤＮＡコンジュゲートは、１８マイクロリットル、ＤＮＡサンプルは、２マイクロリットルとする。
【００５７】
次に、モータ等に、生体サンプル分析用プレート１００を固定し、重心５を軸に、回転させる。この時、分注されたＤＮＡコンジュゲートと、ＤＮＡサンプルは、遠心力により、外周方向へと移動する。
【００５８】
緩衝剤注入部７内のＤＮＡコンジュゲートは、流路１０と、流路１１を通り、正電極部１２と、負電極部１３へ等分され、正電極部１２へ移動したＤＮＡコンジュゲートは、さらに、流路１４を通り、サンプル定量部２３まで移動する。負電極部１３へ移動したＤＮＡコンジュゲートも、同様に、さらに、流路１４を通り、サンプル定量部２３まで移動する。
【００５９】
回転開始から２分後、ＤＮＡコンジュゲートの移動が停止した状態を、図６（ａ）に示す。また、サンプル定量部２３周辺を拡大した図が、図６（ｂ）である。
【００６０】
ＤＮＡコンジュゲート３１は、正電極部１２、および負電極部１３の、７割程度まで充填されており、流路１４を満たし、図６（ｂ）に示すように、サンプル定量部２３まで達している。
【００６１】
正電極部１２と、負電極部１３、内に存在するＤＮＡコンジュゲートの液面高さと、サンプル定量部２３の液面高さは、重心５を中心とする同一円周上となる。
【００６２】
次に、注入されたＤＮＡサンプルの移動について、図２、および図７を用いて説明する。
【００６３】
サンプル注入部９内のＤＮＡサンプルは、流路１５を通り、チャンバー部１６、さらには、流路１７、流路１８を通り、外周側に位置するサンプル保持部２０にまで達する。このとき、チャンバー部１６内にあった空気は流路５０，１９を通って抜ける。しかしながら、図７に示すように、流路１８は、サンプル保持部２０の外周側に接続され、かつサンプル保持部２０には、空気抜き用の穴が存在しない。そのため、サンプル保持部２０内に残った空気は、抜けることはなく、加圧された状態となる。
【００６４】
図７が、回転開始から２分後のＤＮＡサンプル３２と、ＤＮＡサンプル３３の状態を示すものである。空気３４は、圧縮されており、回転中のみ、このような遠心力と、加圧力とが、平衡となった状態を維持する。
【００６５】
本実施の形態１では、回転数は、４０００ｒｐｍである。
【００６６】
それでは、次の動作を説明する。
【００６７】
生体サンプル分析用プレート１００を、一定時間回転させ、ＤＮＡコンジュゲートと、ＤＮＡサンプルの移動が停止した状態で、回転を急停止させる。例えば、２秒で、４０００ｒｐｍより、停止までに、至らしめる。
【００６８】
サンプル保持部２０内に存在していたＤＮＡサンプル３２は、遠心力が無くなり、空気３４の圧力により、サンプル保持部２０から流路１８へ、逆流しようとする。
【００６９】
さらに、ＤＮＡサンプル３２は、サンプル保持部２０内の空気３４が大気圧となるまで流路１７、流路１９へと移動しようとするが、この時、流路１７は、流路１９にくらべ細く形成されているため、ＤＮＡサンプル３２は、流路１７よりも、流路１９へ多く流れようとする。
【００７０】
そこで、急停止した直後の状態を、図８に示す。
【００７１】
サンプル保持部２０内のＤＮＡサンプル３２は、空気３４の膨張により、流路１８、流路１９を通り、サンプル定量部２３、およびバッファ部２１にまで達する。
【００７２】
特に、サンプル定量部２３では、充填されたＤＮＡコンジュゲート３１と接することになる。このとき、流路１７を通り、チャンバー部１６へ移動するＤＮＡサンプル３２も、多少存在する。
【００７３】
次に、生体サンプル分析用プレート１００を、中速にて数秒間もう一度回転させる。この時減速を緩やかにすることが重要である。停止後の状態を、図９に示す。
【００７４】
流路１９に充填されていたＤＮＡサンプル３２は、チャンバー部１６へと流れるが、サンプル定量部２３には、ＤＮＡサンプル３２が微量残存する。残存したＤＮＡサンプル３２ａは、他のＤＮＡサンプル３２ｂ，３２ｃに対して、電気的にも絶縁された状態である。
【００７５】
また、このように、２回目の回転時に、１回目の回転時と異なる速度で回転をさせる理由は、その２回目の回転速度を、遅く、かつ減速度を緩やかにすることによって、サンプル保持部２０内の空気３４が強く圧縮されることがないようにするためである。したがって、サンプル保持部２０内のＤＮＡサンプルが逆流して、流路１９が再度充填されることもない。
【００７６】
以上の動作を行ったのちに、サンプル定量部２３に残存したサンプルＤＮＡ３２が、ＳＮＰｓの判別を行なう最終試料となる。
【００７７】
次に、電気泳動を行なわせる。電気泳動は、正電極部１２に正電極、負電極部１３に負電極を挿入し、数百Ｖの電圧を印加する。すると、流路１４、さらにはサンプル定量部２３において電界が発生し、サンプル定量部２３に一定量残存したＤＮＡサンプル３２は、流路１４中を、正電極側（図９中、Ａ方向）へ泳動する。
【００７８】
流路１４中には、ＤＮＡコンジュゲートが充填されており、ＤＮＡサンプル３２は、ＤＮＡコンジュゲートとの結合を繰り返しながら電気泳動する。この時、上述したように、ＤＮＡサンプル３２中の正常型ＤＮＡはＤＮＡコンジュゲートとの結合力が強いため、泳動速度が遅くなり、変異型ＤＮＡはその結合力が弱いため、正常型に比べ泳動速度は速くなる。つまりＤＮＡサンプル中に、正常型、変異型の両方が存在した場合は、正常型のＤＮＡと、変異型のＤＮＡとが分離していくこととなり、ＳＮＰｓの判別を行うことができる。
【００７９】
図１１は、図１０に示す流路１４の円弧部分４０を、ＤＮＡサンプルが電気泳動中に、該ＤＮＡサンプル３２をスキャンしたグラフを示す図である。
【００８０】
ＤＮＡの検出は、蛍光標識（ＦＩＴＣ）を修飾したＤＮＡを、４７０ｎｍの光で励起し、５２０ｎｍ付近の光検出を行うことにより行なった。ここで、ＤＮＡの検出は、２６０ｎｍの吸光度により行なってもよい。
【００８１】
図１１において、横軸が、円弧部分４０の位置を表し、ＤＮＡは、左から右へ泳動する。つまり、左側がサンプル定量部２３で、右側が正電極部１２側である。縦軸は、蛍光強度で、上から１分毎に計時変化した波形を表す。徐々に、２つの山が分離していく様子がわかる。この場合、ＤＮＡサンプル３２中には、同量の正常型ＤＮＡと、変異型ＤＮＡが存在していることが判定された。
【００８２】
グラフ右側の山が、泳動速度が速いので変異型、左側が、遅く泳動しているので正常型となる。
【００８３】
以上のように、本実施の形態１による生体サンプル分析用プレート１００によれば、生体サンプルを緩衝剤中で移動させた際に得られる輸送反応を検出して生体サンプルの判別を行う生体サンプル分析用プレート１００において、緩衝剤が流れる第２の流路９０と生体サンプルが流れる第１の流路８０との合流部分に、一定体積の生体サンプルを保持するサンプル定量部２３を設け、該サンプル定量部２３に生体サンプルを供給するようにするとともに、該サンプル定量部２３への生体サンプル供給用の通路１８に、その開口部２０ａを、該生体サンプル分析用プレート１００の外周側に有するサンプル保持部２０を、該通路１８に接続して設けることによって、回転動作のみによって、生体サンプル分析用プレート１００上のサンプル定量部２３にＤＮＡサンプル３２を一定量保持し、これを、正電極部１２と負電極部１３と流路１４とによって電気泳動させることができ、さらには、緩衝剤が流れる第２の流路９０である電気泳動する上記流路１４の一部を円弧形状としたことにより、細胞や血液等から特定のＤＮＡを取り出したＤＮＡサンプルを、本生体サンプル分析用プレートにおいて測定する際に、極めて精度の良い検出結果を得ることが可能となる効果がある。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明にかかる生体サンプル分析用プレートは、ＤＮＡサンプル等の生体サンプルの判別を、安価で、且つ簡便に行えるようにするものとして、非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】図１は、本発明の実施の形態１による生体サンプル分析用プレートにおけるパターン形成面を示す図である。
【図２】図２は、本発明の実施の形態１による生体サンプル分析用プレートにおいて形成されるパターンを示す図である。
【図３】図３は、本発明の実施の形態１による生体サンプル分析用プレートにおける、サンプル注入部、および緩衝剤注入部の断面図である。
【図４】図４は、本発明の実施の形態１による生体サンプル分析用プレートにおける、チャンバー部、サンプル保持部、およびバッファ部を示す断面図である。
【図５】図５は、本発明の実施の形態１による生体サンプル分析用プレートにおける、正電極部、および負電極部を示す断面図である。
【図６（ａ）】図６（ａ）は、本発明の実施の形態１による生体サンプル分析用プレートパターンに、試料充填処理を施した時のＤＮＡコンジュゲートの状態を示す図である。
【図６（ｂ）】図６（ｂ）は、本発明の実施の形態１による生体サンプル分析用プレートパターンに、試料充填処理を施した時のＤＮＡコンジュゲートの状態を示すサンプル定量部の拡大図である。
【図７】図７は、本発明の実施の形態１による生体サンプル分析用プレートに、ＤＮＡコンジュゲートと、ＤＮＡサンプルを充填し、４０００ｒｐｍにて回転中の各試料の状態を示した図である。
【図８】図８は、本発明の実施の形態１による生体サンプル分析用プレートに、ＤＮＡコンジュゲートと、ＤＮＡサンプルを充填し、４０００ｒｐｍにて回転後、急停止したときの各試料の状態を示した図である。
【図９】図９は、本発明の実施の形態１による生体サンプル分析用プレートに、ＤＮＡコンジュゲートと、ＤＮＡサンプルを充填し、４０００ｒｐｍにて回転停止後、再回転した直後の各試料の状態を示した図である。
【図１０】図１０は、本発明の実施の形態１による生体サンプル分析用プレートパターンのＤＮＡスキャンを行なう部分を示した図である。
【図１１】図１１は、本発明の実施の形態１による生体サンプル分析用プレートにおいて、該プレートに形成されたサンプル定量部にＤＮＡサンプルが充填されて、該ＤＮＡサンプルが、第１の流路に充填された分離用ＤＮＡコンジュゲート中を移動していく様子を示す図である。
【符号の説明】
【００８６】
１００  生体サンプル分析用プレート
２００  パターン
３      回転部固定用穴
４      位置決め穴
５      プレート重心
６      緩衝剤注入口
７      緩衝剤注入部
８      サンプル注入口
９      サンプル注入部
１０    第１の流路
１１    第２の流路
１２    正電極部
１３    負電極部
１４    第３の流路
１５    流路
１６    チャンバー部（第１チャンバー）
１７    流路
１８    流路（第１マイクロ流路）
１９    流路（第２マイクロ流路）
２０    サンプル保持部（第２チャンバー）
２０ａ    開口部
２１    バッファ部（第３チャンバー）
２２、５０    流路
２３    サンプル定量部
２４    溝
２５    流路
２６    流路
２７    フィルム
２８    流路
２９    流路
３０    電極部
３１    ＤＮＡコンジュゲート
３２    ＤＮＡサンプル
３３    ＤＮＡサンプル
３４    空気
３５    部分
３６    部分
３７    フィルム
４０    円弧部分
８０    試料供給用流路
９０    緩衝剤供給用流路
Ａ      泳動方向
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2006062149.tif 000014
【図２】
2006062149.tif 000015
【図３】
2006062149.tif 000016
【図４】
2006062149.tif 000017
【図５】
2006062149.tif 000018
【図６（ａ）】
2006062149.tif 000019
【図６（ｂ）】
2006062149.tif 000020
【図７】
2006062149.tif 000021
【図８】
2006062149.tif 000022
【図９】
2006062149.tif 000023
【図１０】
2006062149.tif 000024
【図１１】
2006062149.tif 000025
【国際調査報告】
2006062149.tif 000026
2006062149.tif 000027