(57)【要約】  本発明は、ＰＰＡＲγ遺伝子における発現量が異なるアレルを識別するための遺伝子多型、及びＰＰＡＲγ遺伝子の遺伝子多型に関連する表現型の判定方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
（ａ）試料中のペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）遺伝子の核内ＲＮＡ（一次転写産物）又はｍＲＮＡから増幅したｃＤＮＡを用いて、ＰＰＡＲγ遺伝子の遺伝子多型をタイピングするステップ、
（ｂ）試料中のペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）遺伝子のゲノムＤＮＡを用いて、ＰＰＡＲγ遺伝子の遺伝子多型をタイピングするステップ、
（ｃ）試料中のペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）遺伝子の発現量を測定するステップ、
のいずれかのステップを含む、ＰＰＡＲγ遺伝子に関連した疾患の存在の可能性若しくは発症リスク、又はＰＰＡＲγ遺伝子に関連した薬剤応答性の判定方法。
【請求項２】
ＰＰＡＲγ遺伝子の遺伝子多型が、一塩基多型ｒｓ１０５１０４１０、ｒｓ１０５１０４１１及びｒｓ１０５１０４１０、並びに該一塩基多型の近傍に存在する遺伝子多型及び該一塩基多型と連鎖不均衡にある遺伝子多型からなる群より選択される少なくとも１つの多型である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
タイピングしたｒｓ１０５１０４１０、ｒｓ１０５１０４１１及びｒｓ１０５１０４１２の遺伝子多型がそれぞれＣＣ、ＡＡ及びＡＡのホモ接合体である場合に、ＰＰＡＲγ遺伝子の過剰発現に関連した疾患の存在の可能性若しくは発症リスク、又はＰＰＡＲγ遺伝子の過剰発現に関連した薬剤応答性があると判定する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ＰＰＡＲγ遺伝子に関連した疾患が、糖尿病、肥満、虚血性心疾患、炎症、脂質代謝にかかわる疾患、及び腫瘍からなる群より選択されるものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ＰＰＡＲγ遺伝子に関連した薬剤応答性がアクトス（塩酸ピオグリタゾン）に対する応答性である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＰＡＲγ遺伝子における発現量が異なるアレルを識別するための遺伝子多型、及びＰＰＡＲγ遺伝子の遺伝子多型に関連する表現型の判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノムの同じ位置にある同じ遺伝子であっても、それが異なるアレル上にある場合にその遺伝子発現量に差が見られる現象は、近年報告されている比較的新しい概念である（非特許文献１：Knight JC. Allele-specific gene expression uncovered. Trends Genet. Mar;20(3):113-6. PMID: 15049300、2004年）。【０００３】
アレル間で異なる発現を示す遺伝子というのは大きく分けて刷り込みを受ける遺伝子（imprinted gene）と刷り込みを受けない遺伝子（non-imprinted gene）の２種類がある。前者は、刷り込み（imprinting）といって、ある細胞若しくは組織において、両親から片アレルずつ受け継いだ場合にどちらか一方が生理的にメチル化などの不活化を受けて発現が抑制されるという現象である。後者、すなわち刷り込みを受けない遺伝子（non-imprinted gene）においても、アレル間で異なる発現差が見られる場合がある。これは、遺伝子内若しくはそれに近接しているアレル間のゲノムの多型が、近傍の遺伝子の発現を調節するシス作用領域（cis-acting element）として働き、アレル間の遺伝子発現量の差を生み出すと考えられている。後者に見られる、ゲノムＤＮＡの配列の違いに起因するアレルごとの発現の変化は、世代を超えて引き継がれる性質と考えられ、個体間の遺伝子発現量の差、ひいては個人の体質の差、病態とそのリスク、また薬剤の応答性の違いに影響することが考えられる。従って、このようなアレル間で発現量が異なる遺伝子は疾患又は障害などの表現型と関係する可能性がある。【０００４】
一方、ヒトのペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ又はＰＰＡＲＧ）は、糖尿病、肥満、虚血性心疾患、炎症、脂質代謝に関わる疾患、腫瘍などの疾患と関連していること、また薬剤アクトス（塩酸ピオグリタゾン）に対する薬剤応答性と関連していることが報告されている（非特許文献２：公共データベースＯＭＩＮ（on-line menderian inheritance in man）  インターネット（URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=601487））。従って、ＰＰＡＲγ遺伝子の多型又はその発現量と形質発現との関連性を調べることができれば、疾患の原因や有効な治療法などを検討することができると考えられる。
【発明の開示】
【０００５】
そこで、本発明は、上述した実状に鑑み、ＰＰＡＲγ遺伝子の遺伝子多型又は発現量を利用してＰＰＡＲγ遺伝子に関連した表現型を判定する方法を提供することを目的とする。
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するため、アレル間で発現量が異なる遺伝子を判定することができる遺伝子多型を検索するための方法を開発し、実際に当該方法を実施したところ、ヒトのペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ遺伝子がアレル間で発現量が異なることを見出し、また、各アレルからの発現量の違いを判定することができる遺伝子多型を見つけることができ、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下のいずれかのステップを含む、ＰＰＡＲγ遺伝子に関連した疾患の存在の可能性若しくは発症リスク、又はＰＰＡＲγ遺伝子に関連した薬剤応答性の判定方法である：
（ａ）試料中のペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）遺伝子の核内ＲＮＡ（一次転写産物）又はｍＲＮＡから増幅したｃＤＮＡを用いて、ＰＰＡＲγ遺伝子の遺伝子多型をタイピングするステップ、
（ｂ）試料中のペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）遺伝子のゲノムＤＮＡを用いて、ＰＰＡＲγ遺伝子の遺伝子多型をタイピングするステップ、
（ｃ）試料中のペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）遺伝子の発現量を測定するステップ。
【０００８】
上記判定方法において、ＰＰＡＲγ遺伝子の遺伝子多型は、一塩基多型ｒｓ１０５１０４１０、ｒｓ１０５１０４１１及びｒｓ１０５１０４１０、並びに該一塩基多型の近傍に存在する遺伝子多型及び該一塩基多型と連鎖不均衡にある遺伝子多型からなる群より選択される少なくとも１つの多型とすることができる。
【０００９】
またタイピングしたｒｓ１０５１０４１０、ｒｓ１０５１０４１１及びｒｓ１０５１０４１２の遺伝子多型がそれぞれＣＣ、ＡＡ及びＡＡのホモ接合体である場合には、例えばＰＰＡＲγ遺伝子の過剰発現に関連した疾患の存在の可能性若しくは発症リスク、又はＰＰＡＲγ遺伝子の過剰発現に関連した薬剤応答性があると判定する。
【００１０】
ここで、ＰＰＡＲγ遺伝子に関連した疾患としては、限定されるものではないが、糖尿病、肥満、虚血性心疾患、炎症、脂質代謝にかかわる疾患、及び腫瘍などが挙げられる。
【００１１】
また、上記判定方法において、ＰＰＡＲγ遺伝子に関連した薬剤応答性は、例えばアクトス（塩酸ピオグリタゾン）に対する応答性である。
【００１２】
本発明により、ＰＰＡＲγ遺伝子に関連した表現型を判定する方法が提供される。すなわち、ＰＰＡＲγ遺伝子に関連した疾患の存在の可能性や発症リスク、又はＰＰＡＲγ遺伝子に関連した薬剤応答性を判定することが可能となる。本発明に従って疾患の存在や薬剤応答性を判定することによって、疾患の早期発見や有効な治療法の検討などを行うことができるため、本発明は医療及び薬学分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＰＰＡＲγ遺伝子上のＳＮＰの位置を示す図である。
【図２】ダイレクト・シーケンス法を用いたＳＮＰの確認の概要を示す図である。
【図３Ａ】日本人３０人の抹消血リンパ球のＰＰＡＲＧ遺伝子の発現量と遺伝子多型のタイピングとの相関を示す図である。
【図３Ｂ】日本人３０人の抹消血リンパ球のＰＰＡＲＧ遺伝子の発現量と遺伝子多型のタイピングの度数分布を示す図である。
【図３Ｃ】ＰＰＡＲＧ遺伝子のハプロタイプＭとｍのアレルを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。本願は、２００４年１２月２２日に出願された日本国特許出願第２００４−３７１９４８号の優先権を主張するものであり、上記特許出願の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。【００１５】
本発明者は、アレル間で発現量が異なる遺伝子を判定することができる遺伝子多型を検索するための方法を開発し、実際に当該方法を実施したところ、ヒトのペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ又はＰＰＡＲＧ）遺伝子がアレル間で発現量が異なることを見出し、また、各アレルからの発現量の違いを判定することができる遺伝子多型を見つけることができた。そのため、ＰＰＡＲγ遺伝子の発現量、及びＰＰＡＲγ遺伝子の遺伝子多型は、ＰＰＡＲγ遺伝子に関連する表現型、例えば疾患の存在や疾患の発症リスク、薬剤応答性に関係している可能性がある。【００１６】
ここで、ＰＰＡＲγ遺伝子は、公知の遺伝子であり、その転写産物（ｍＲＮＡ）の塩基配列はＮＭ０１５８６９、ＮＭ００５０３７、ＮＭ１３８７１１及びＮＭ１３８７１２として登録されている。また、ＰＰＡＲγ遺伝子は、糖尿病、肥満、虚血性心疾患、炎症、脂質代謝にかかわる疾患、腫瘍（大腸癌、乳癌、前立腺癌、甲状腺癌、脳腫瘍、血液腫瘍、下垂体腫瘍等）などの疾患と関連していることが報告されている。またＰＰＡＲγ遺伝子は、薬剤アクトス（塩酸ピオグリタゾン）に対する薬剤応答性と関連していることが報告されている。ＰＰＡＲγ遺伝子の機能及び性質については、公共データベースＯＭＩＮ（on-line menderian inheritance in man）    （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=601487）を参照されたい。【００１７】
従って、本発明に係る方法は、ＰＰＡＲγ遺伝子の発現量を測定するか、又はＰＰＡＲγ遺伝子の遺伝子多型をタイピングし、その結果に基づいて、ＰＰＡＲγ遺伝子に関係する疾患の存在若しくは疾患の発症リスク、又は薬剤応答性を判定するものである。ここで、「疾患の存在」とは、すでに疾患に罹患していることを意味する。また、「発症リスク」とは、疾患への罹りやすさ（感受性）又は罹りにくさ（抵抗性）を意味し、「発症リスクが高い」とは、他の被験者と比較して、特定の多型を有する被験者が疾患を発症する確率が高いことを意味し、一方「発症リスクが低い」とは、他の被験者と比較して、特定の多型を有する被験者が疾患を発症する確率が低いことを意味する。また、「薬剤応答性」とは、薬剤に対する被験者の応答性を意味し、例えば、薬剤に対して顕著な効果を示す被験者（good responder）、薬剤の有効性が低い被験者（poor responder）及び薬剤の効果を全く示さない被験者（non responder）に分類することができる。【００１８】
本方法は、具体的には以下のいずれかのステップを含むものである：
（ａ）試料中のペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）遺伝子の核内ＲＮＡ（一次転写産物）又はｍＲＮＡから増幅したｃＤＮＡを用いて、ＰＰＡＲγ遺伝子の遺伝子多型をタイピングするステップ、
（ｂ）試料中のペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）遺伝子のゲノムＤＮＡを用いて、ＰＰＡＲγ遺伝子の遺伝子多型をタイピングするステップ、
（ｃ）試料中のペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）遺伝子の発現量を測定するステップ。【００１９】
本方法において、試料は、ヒト被験者に由来する生物学的試料であれば特に限定されるものではなく、例えば血液、唾液、リンパ液、気道粘液、骨髄液、尿、腹腔液等の体液、細胞、組織等である。ＰＰＡＲγ遺伝子は血球系、脂肪細胞などで発現されることが多いため、そのような細胞が含まれる試料を用いることが好ましい。【００２０】
核内ＲＮＡ又はｍＲＮＡからのｃＤＮＡの合成は、当技術分野で公知の方法に従って行うことができる。ここで「核内ＲＮＡ」とは、ゲノムＤＮＡから転写された後、スプライシングを受けておらず、そのため細胞質には移行せず、まだ核内に存在している一次転写産物（primary transcript）をいう。すなわち、核内ＲＮＡは、ゲノム上のエキソン及びイントロンの両方を含み、長い鎖長を有するものが多い。例えば、試料から総ＲＮＡ、細胞質ＲＮＡ又は核内ＲＮＡを抽出した後、得られたＲＮＡからＰＰＡＲγ遺伝子に特異的なｃＤＮＡ合成用プライマーを使用して選択的にｃＤＮＡを合成してもよいし、あるいは得られたＲＮＡからランダムプライマー又はポリＴプライマーを使用してｃＤＮＡを合成した後、ＰＰＡＲγ遺伝子に特異的な増幅用プライマーを使用して選択的にｃＤＮＡを増幅することができる。ＲＮＡの抽出は当技術分野で公知の方法、例えば、総ＲＮＡを抽出する場合には、ＡＧＰＣ（酸グアニジウム−フェノール−クロロホルム）法などを用いて行うことができる。またＰＰＡＲγ遺伝子の合成用プライマー又は増幅用プライマーの設計は、当技術分野で公知の一般的なプライマー設計法に従って行うことができる。【００２１】
ゲノムＤＮＡの抽出は、当技術分野で公知の方法（フェノール・クロロホルム法など）又は市販のキットを用いて行うことができる。【００２２】
ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡにおける遺伝子多型（ＳＮＰ又はハプロタイプなど）のタイピング（検出）は、当技術分野で公知の手法を用いて行うことができる。例えば、遺伝子多型のタイピングは、一の遺伝子多型に特異的なプローブとのハイブリダイゼーションにより行うことができる。プローブは、必要に応じて、蛍光物質や放射性物質等の適当な手段により標識することができる。プローブは、遺伝子多型部位を含み、ｃＤＮＡと特異的にハイブリダイズするものである限りいかなるものでもよく、具体的なプローブの設計は当技術分野で公知である。また、ハイブリダイゼーションの条件も、遺伝子多型を区別するのに十分な条件であればよく、例えば一の遺伝子多型の場合にはハイブリダイズするが、他の遺伝子多型の場合にはハイブリダイズしないような条件、例えばストリンジェントな条件であり、このような条件は当業者に公知である。【００２３】
プローブは、一端を基板に固定してＤＮＡチップ（マイクロアレイ）として用いることもできる。この場合、ＤＮＡチップには、一の遺伝子多型に対応するプローブのみが固定されていても、両方の遺伝子多型に対応するプローブが固定されていてもよい。このようなＤＮＡチップを用いた遺伝子多型の検出は、例えば「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」、村松正明及び那波宏之監修、秀潤社、２０００年、第１０章などに記載されている。【００２４】
ＤＮＡチップを用いた遺伝子多型の検出の具体的な例として、Affymetrix社製のGeneChip(登録商標) Human Mapping 100K arrayを用いる方法について説明する。GeneChip(登録商標) Human Mapping 100K arrayは、２枚のアレイを含み、ゲノム上に存在する１００，０００個を超えるＳＮＰの検出を行うことができるアレイである。使用方法は、試料（ゲノム、ｃＤＮＡなど）を制限酵素（ＸｂａＩ若しくはＨｉｎｄＩＩＩ）で切断し、アダプターをつけて、そのアダプターに特異的な１種類のプライマー（ＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩについてそれぞれ１種類ずつ）を用いてＰＣＲ反応により増幅し、ラベリングを行う。２枚のアレイは各ＳＮＰのアレルごとに相補的になるように設計されており、ハイブリダイゼーション後、シグナルに基づいて試料のＳＮＰを判定し、また各アレルの発現量をシグナル強度又はシグナル比に基づいて比較することができる。このＤＮＡチップの詳細については、http://www.affymetrix.co.jp/products/arrays/specific/100k.及びhtmlhttp://www.affymetrix.co.jp/pdf/Mapping_100K.pdfで公開されている製品情報及びデータシートを参照されたい。【００２５】
また、遺伝子多型は、上述した以外にも、当業者に公知のあらゆる方法によってタイピングすることができる。そのような方法としては、遺伝子多型に特異的なプライマーを用いる方法、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）を利用する方法、直接配列決定法、変性勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）、ミスマッチ部位の化学的切断を利用した方法（ＣＣＭ）、プライマー伸長法（ＰＥＸ）、インベーダー（Ｉｎｖａｄｅｒ）法、定量的リアルタイムＰＣＲ検出法（ＴａｑＭａｎ法）等を用いることができる。【００２６】
本方法においては、簡便かつ迅速に遺伝子多型をタイピングすることができるＤＮＡチップ（マイクロアレイ）を使用することが好ましい。【００２７】
本方法において、タイピングすべきＰＰＡＲγ遺伝子の遺伝子多型としては、一塩基多型ｒｓ１０５１０４１０、ｒｓ１０５１０４１１及びｒｓ１０５１０４１０、並びにそれらの近傍に存在する遺伝子多型及びそれらと連鎖不均衡にある遺伝子多型からなる群より選択される少なくとも１つの多型である。好ましくは、ｒｓ１０５１０４１０、ｒｓ１０５１０４１１及びｒｓ１０５１０４１０からなるハプロタイプをタイピングすることが好ましい。ここで、２００４年４月に報告されたHuman Genome Build34（http://genome.ucsc.edu/）によるとｒｓ１０５１０４１０は染色体３番の12321738番目に位置するＡ／ＣのＳＮＰであり、ｒｓ１０５１０４１１は染色体３番の12321849番目に位置するＧ／ＡのＳＮＰであり、ｒｓ１０５１０４１２は染色体３番の12321962番目に位置するＧ／ＡのＳＮＰである。【００２８】
ＰＰＡＲγ遺伝子の一塩基多型ｒｓ１０５１０４１０、ｒｓ１０５１０４１１、及びｒｓ１０５１０４１２をタイピングするには、例えば上述したGeneChip(登録商標) Human Mapping 100K array（Affimetrix社製）を用いることができる。具体的には、限定するものではないが、下記のプローブを用いることができる：
ｒｓ１０５０１４１０：
tagataaaaatatacttcacttcca[G/T]attacactcagagacaaccaaaggc（配列番号１）
ｒｓ１０５１０４１１：
gttgctctttatgagacgaaataaa[A/G]ttggatgtcacttataaatggattt（配列番号２）
ｒｓ１０５１０４１２：
ttaggagttattcaacaagccatta[C/T]gcttacaaaaatttatgagtcaaag（配列番号３）
また、上記遺伝子多型の近傍に存在する遺伝子多型とは、上記遺伝子多型から、約３０，０００ｋｂ以内、好ましくは約１０，０００ｋｂ以内に位置する遺伝子多型である。このような近傍に存在する遺伝子多型は、染色体組換え時に一緒に組換わる確率が高い。また、上記遺伝子多型と連鎖不均衡にある遺伝子多型とは、上記遺伝子多型と関連性のある遺伝子多型であり、具体的には、上記遺伝子多型がＸである場合には、常に別の遺伝子多型がＹとなるという関係が成立するようなものである。【００２９】
上記ｒｓ１０５１０４１０、ｒｓ１０５１０４１１及びｒｓ１０５１０４１２の遺伝子多型がそれぞれＣＣ、ＡＡ及びＡＡのホモ接合体である場合には、ＰＰＡＲγ遺伝子の発現量が多いという結果が得られたため（実施例２）、当該ホモ接合体を有する被験者は、ＰＰＡＲγ遺伝子の過剰発現に起因する疾患の存在の可能性若しくは発症リスクがある、またＰＰＡＲγ遺伝子の過剰発現に関連した薬剤応答性があると判定することができる。【００３０】
また本方法においては、ＰＰＡＲγ遺伝子の発現量を測定することにより、ＰＰＡＲγ遺伝子と関連する表現型を判定することもできる。このＰＰＡＲγ遺伝子の発現量の測定においては、ＰＰＡＲγ遺伝子の転写産物（核内ＲＮＡ又はｍＲＮＡ）を測定してもよいし、又はＰＰＡＲγ遺伝子によりコードされるタンパク質を測定してもよい。このような遺伝子発現量の測定は、当技術分野で周知であり、任意の方法により行うことができる。【００３１】
上記判定方法は、ＰＰＡＲγ遺伝子上の上記遺伝子多型を検出することができる手段を含むキットを用いることにより簡便に行うことができる。従って、本発明は、かかるＰＰＡＲγ遺伝子に関連する疾患又は薬剤応答性の判定キットも包含する。ＰＰＡＲγ遺伝子上の遺伝子多型を検出することができる手段としては、上記遺伝子多型を有する核酸と特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブ、上記遺伝子多型を有する核酸を鋳型として特異的な増幅反応を行うことができるプライマーセット、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）を利用する方法、直接配列決定法、変性勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）、ミスマッチ部位の化学的切断を利用した方法（ＣＣＭ）、プライマー伸長法（ＰＥＸ）、インベーダー（Ｉｎｖａｄｅｒ）法、定量的リアルタイムＰＣＲ検出法（ＴａｑＭａｎ法）等などが挙げられる。そのほか、判定キットは、ポリメラーゼ、バッファー、ｄＮＴＰ、標識及び検出用試薬（蛍光など）、説明書などを含んでもよい。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例を用いて本方法をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。【００３３】
〔実施例１〕
本実施例においては、アレル間で発現量に差異のある遺伝子の検索を行った。【００３４】
ＥＢウイルスにて株化したリンパ球ＢＬ１３９５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−５９５７）及びＢＬ２１２２（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−５９６７）の総ＲＮＡそれぞれ１μｇをＤＮＡａｓｅ処理をした後に逆転写酵素（Invitrogen社SuperscriptIII RT enzyme）を用いて、添付プロトコールどおり逆転写して１本鎖ｃＤＮＡを作製した。得られた反応液２０μｌより１μｌを精製なしに、Amersham Bioscienceより発売されている商品名Genomiphiのプロトコールどおりのランダムプライマー及びｐｈｉ２９酵素の入った反応溶液に添加し、３０℃にて１６時間の反応を行い、それぞれ２．３４μｇ及び２．２７μｇの収量のｃＤＮＡを得た。【００３５】
増幅したｃＤＮＡを用いて、１００Ｋアレイのプロトコール（Affimetrix）（http://www.affymetrix.com/support/downloads/manuals/100k_manual.pdf）にしたがって２５０ｎｇから反応をスタートした。具体的には、増幅したｃＤＮＡと、同様にｐｈｉ２９で増幅したゲノムＤＮＡとを、通常の１００Ｋのプロトコールにしたがって増幅した後、そのシグナル強度の比（ｃＤＮＡのシグナル強度／ゲノムＤＮＡのシグナル強度）を取り、その度数分布を調べた。このようにしてシグナル強度の比を求めることにより、配列の差異が生み出す二次構造の差によってｐｈｉ２９によって増えやすい配列と増えにくい配列がある（増幅のバイアス）が、ｃＤＮＡのシグナル値をｐｈｉ２９で増幅したゲノムのシグナル値で割ることによって、こうした増幅のバイアスを除くことができた。【００３６】
その結果、シグナル比の低いところにはノイズと思われる正規分布曲線に近い形があらわれ、そこでは遺伝子のない領域に存在する遺伝子多型に基づくシグナル（プローブセット）が多かった。この度数分布の形及びプローブセットとゲノム上の遺伝子との位置関係から、このアッセイによって遺伝子（ｃＤＮＡ）由来のシグナルとノイズが分離出来ており、ｃＤＮＡとゲノムとのシグナル比の測定によって、シグナル比の高い部分を、発現遺伝子（主に核内ＲＮＡ由来のｃＤＮＡ）によるシグナルであると考えてよいことがわかった。【００３７】
このようにして一方のアレルと他方のアレルとの間の発現量の差異を、ｃＤＮＡ／ゲノム比を利用して比較したところ、ヒトペルオキシソーム増殖活性化受容体γ（ＰＰＡＲＧ）遺伝子に存在する３つの一塩基多型（ＳＮＰ）において有意差があった。そのため、ＰＰＡＲＧ遺伝子をアレル間で発現量に差がある遺伝子として選択した。【００３８】
〔実施例２〕
本実施例においては、ＰＰＡＲＧ遺伝子のアレル間の発現差を調べた。【００３９】
１００Ｋアレイに含まれる５０Ｋ  ＸｂａＩアレイにはゲノム上のＰＰＡＲＧ遺伝子領域に合計７箇所のＳＮＰの位置にプローブセットが設計されている。実施例２で行ったリンパ球ＢＬ１３９５の解析では、上流に近い３００ｂｐ以内に近接したｒｓ１０５１０４１１、ｒｓ１０５１０４１１及びｒｓ１０５１０４１２（ＮＣＢＩ  ｄｂＳＮＰデータベースＩＤ）の３つのＳＮＰがゲノムのタイピングで多型で（すなわち二つのアレルが区別可能で）あった。この３つのＳＮＰのＰＰＡＲＧ遺伝子上の位置を図１に示す。図１中、白抜きの星印が、ＰＰＡＲＧ遺伝子のアレル間の発現量の差異を判定することができるＳＮＰ（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ ＳＮＰ）である。【００４０】
いずれの位置のＳＮＰについても両アレル間の発現比（アレルＡとアレルＢとのｃＤＮＡ／ゲノム比の比）は、表１に示すとおり４倍以上であった。
【表１】
2006068111.tif 000002
【００４１】
この３つのＳＮＰを含む領域をダイレクト・シーケンス法によりアレルの存在比を確認した。その概要は図２に示すが、例えばＢＬ１３９５のサンプルにおけるｒｓ１０５１０４１０の場合には、図のようにゲノムＤＮＡ（ｃ）においてはＡ／Ｃのヘテロであり、それはｐｈｉ２９で増幅されたゲノムＤＮＡ（ａ及びｂ）においても変化はなかった。一方、ｐｈｉ２９で増幅されたｃＤＮＡにおいてはアレルＡからのシグナルが低下しほぼアレルＣのみの波形になっている。すなわち、ゲノム上でｒｓ１０５１０４１０はＡ／Ｃのヘテロであるが、実際に発現される遺伝子においてはＣのアレルからの発現量が多いことがわかる。この結果は５０Ｋ  ＸｂａＩアレイの結果と一致していた。ＢＬ２１２２のリンパ球ではＰＰＡＲＧ遺伝子の発現は認められなかった。【００４２】
またこの３つのＳＮＰについて、日本人３０人をダイレクト・シーケンス法によってタイピングし、抹消血リンパ球のＰＰＡＲＧ遺伝子の発現との相関を調べた。すなわち、上記３つのＳＮＰのタイプとＰＰＡＲＧ遺伝子の発現量との関係について分析した。ＰＰＡＲＧ遺伝子の発現解析にはAmersham Bioscience社発現解析用アレイＣｏｄｅＬｉｎｋを通常のプロトコールどおりに使用し、各アレイの総プローブのシグナルを中央値が１となるように平均化した。【００４３】
その結果、図３Ａ及び３Ｂ（表と度数分布）に示すように、検体は、日本人３０人における存在頻度に応じて、ｒｓ１０５１０４１１、ｒｓ１０５１０４１１及びｒｓ１０５１０４１２においてそれぞれＣ型、Ａ型及びＡ型である存在頻度の低いアレル（ｍ）のホモ型、ｒｓ１０５１０４１１、ｒｓ１０５１０４１１及びｒｓ１０５１０４１２においてそれぞれＡ型、Ｇ型及びＧ型である存在頻度の高いアレル（Ｍ）のホモ型、並びにこれらのヘテロ型に分類することができた。存在頻度の低いアレルのホモ型（ｍｍ型とする。図３Ａ及び３Ｂで網掛けで表示）ではそれ以外（ｍＭ及びＭＭ型とする）のものに比して発現値が高く（ｍｍの平均値１．５８に対しそれ以外０．８０）、特に発現の特に高い上位３検体のうち２検体でｍｍであった。【００４４】
以上の結果から、これらのＳＮＰ（ハプロタイプ）の存在がＰＰＡＲＧ遺伝子の発現量と相関し、個人のＰＰＡＲＧ活性、ＰＰＡＲＧとの関連が示唆される病気の診断、スクリーニング及びＰＰＡＲＧを標的とする薬剤の応答性を調べるためにこれらのＳＮＰタイピングが有効であることが示された。【００４５】
またこれらの３０人の検体で３箇所のＳＮＰ（ｒｓ１０５１０４１１、ｒｓ１０５１０４１１及びｒｓ１０５１０４１２）においてメジャーアレルＭとマイナーアレルｍの組み合わせが全て一致すること（図３Ａ）より、３つのＳＮＰは完全に連鎖不均衡の状態にあってハプロタイプを形成し、図３Ｃに示すように二つのハプロタイプＭ及びｍが存在しハプロタイプｍがＰＰＡＲＧの発現量の高いほうであると考えられた（図３Ａ）。このハプロタイプ内及びそれと連鎖不均衡にある周辺のＳＮＰを調べることによっても上記の目的が達成できると考えられた。
【産業上の利用の可能性】
【００４６】
本発明により、ＰＰＡＲγ遺伝子に関連した表現型を判定する方法が提供される。すなわち、ＰＰＡＲγ遺伝子に関連した疾患の存在の明確化やそれらの疾患の治療薬の開発、ＰＰＡＲγ遺伝子に関連する薬剤による適応症の拡大や薬剤評価、新たな治療薬の開発、発症リスク診断、又はＰＰＡＲγ遺伝子に関連した薬剤応答性を判定することが可能となる。本発明に従って疾患の存在や薬剤応答性を判定することによって、疾患の早期発見や診断、有効な薬剤の選択や副作用の予測、それに基づく治療法の検討などを行うことができるため、本発明は診断、医療及び医薬品産業において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００４７】
配列番号１：２６番目のｋはｇ又はｔを表す
配列番号２：２６番目のｒはａ又はｇを表す
配列番号３：２６番目のｙはｃ又はｔを表す
配列番号４〜６：ヒトペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γの部分配列（配列番号６におけるｎはｇ又はｔを表す）
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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