【手続補正書】
【提出日】令和2年3月3日(2020.3.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物細胞中で非キャプシド化ｄｓＲＮＡを産生するための方法であって、前記微生物細胞が、（１）キャプシドタンパク質をコードするコートタンパク質遺伝子であって、前記キャプシドタンパク質が、バクテリオファージＭＳ２のキャプシドタンパク質、バクテリオファージＱβのキャプシドタンパク質、またはそれらのN末端断片である、コートタンパク質遺伝子、および（２）相補的配列のハイブリダイゼーションの際にステムループ構造が形成されるように非相補的配列によって分離された自己相補的な一続きの配列を含むｄｓＲＮＡ遺伝子であって、ステム構造が、ＭＳ２キャプシドの内径を超える長さを有する、ｄｓＲＮＡ遺伝子を含み、前記方法は、前記コートタンパク質遺伝子を有するｄｓＲＮＡを共発現させるステップを含み、産生される非キャプシド化ｄｓＲＮＡの量が、前記コートタンパク質遺伝子が共発現されない場合に産生される非キャプシド化ｄｓＲＮＡの量よりもはるかに多い、方法。
【請求項２】
前記キャプシドタンパク質が、バクテリオファージＭＳ２のコートタンパク質遺伝子によってコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記キャプシドタンパク質が、バクテリオファージＱのコートタンパク質遺伝子によってコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ｄｓＲＮＡをコードする遺伝子及び前記キャプシドタンパク質をコードする前記コートタンパク質遺伝子が、誘導性プロモーターから発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記キャプシドタンパク質をコードする前記コートタンパク質遺伝子が、構成的プロモーターから発現され、前記ｄｓＲＮＡをコードする前記遺伝子が、誘導性プロモーターから発現される、請求項５に記載の方法。
【請求項６】
前記キャプシドタンパク質をコードする前記コートタンパク質遺伝子が、前記ｄｓＲＮＡをコードする前記遺伝子の前に、またはこれと同時に発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ｄｓＲＮＡをコードする前記遺伝子及び前記キャプシドタンパク質をコードする前記コートタンパク質遺伝子が、前記微生物細胞内の1つのプラスミドまたは染色体外要素上に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ｄｓＲＮＡをコードする前記遺伝子及び前記キャプシドタンパク質をコードする前記コートタンパク質遺伝子が、前記微生物細胞内の別々のプラスミドまたは染色体外要素上に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ｄｓＲＮＡをコードする前記遺伝子及び前記キャプシドタンパク質をコードする前記遺伝子のうちの一方が、プラスミドまたは染色体外要素上に存在し、前記ｄｓＲＮＡをコードする前記遺伝子及び前記キャプシドタンパク質をコードする前記遺伝子のうちの他方が、前記微生物細胞の染色体上に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｄｓＲＮＡをコードする前記遺伝子及び前記キャプシドタンパク質をコードする前記コートタンパク質遺伝子が、前記微生物細胞の前記染色体上に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｄｓＲＮＡが、ＲＮＡｉ前駆体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記微生物細胞の溶解物から前記非キャプシド化ｄｓＲＮＡを回収するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記非キャプシド化ｄｓＲＮＡを含む前記微生物細胞の溶解物が、前記ｄｓＲＮＡをさらに精製することなく、適用のために処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｄｓＲＮＡの産生後に、前記微生物細胞が、前記ｄｓＲＮＡを溶解またはさらに精製することなく、適用のために処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記キャプシドタンパク質が、前記キャプシドタンパク質の少なくとも最初の１１個のアミノ酸を含み、最初の４１個のアミノ酸よりも少ない、ＭＳ２またはＱβのアミノ末端断片であり、好ましくは、前記アミノ末端断片が、前記キャプシドタンパク質の最初の４１個のアミノ酸、最初の３５個のアミノ酸、最初の２５個のアミノ酸、最初の２１個のアミノ酸、または最初の１２個のアミノ酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記アミノ末端断片が、前記キャプシドタンパク質の最初の４１個のアミノ酸を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記アミノ末端断片が、前記キャプシドタンパク質の最初の35個のアミノ酸を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記アミノ末端断片が、前記キャプシドタンパク質の最初の25個のアミノ酸を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記微生物細胞が、細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記微生物細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの株である、またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの株である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記微生物細胞が、酵母である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記微生物細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記微生物細胞が、フェドバッチ発酵条件下で培養され、それにより、前記微生物細胞において３ｇ／Ｌの回収可能な非キャプシド化ｄｓＲＮＡの蓄積を達成することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ｄｓＲＮＡの前記ステム構造は、長さが少なくとも７５塩基対である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ｄｓＲＮＡの前記ステム構造は、長さが２０ｎｍよりも長い、請求項１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
関連する実施形態において、ｄｓＲＮＡは、細胞を溶解して溶解物を産生し、適用のために精製されたｄｓＲＮＡを処理する前に、溶解物内の細胞成分からｄｓＲＮＡを精製することによって、微生物宿主細胞から精製することができる。そのような処理には、物理的取扱い特性を改善するための賦形剤、結合剤もしくは充填剤との混合、分解を減少させる安定剤、または適用標的の範囲を拡大するための化学的殺虫剤、殺菌剤、枯草剤もしくは他のＲＦＮＡｉ分子などの他の活性剤を挙げることができるが、これらに限定されず、ペレット化、噴霧乾燥、または液体担体に材料を溶解することを含むことができる。別の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、溶解物からさらに精製されず、直接適用のために処理される。さらに別の実施形態では、微生物宿主細胞は溶解されず、適用のために直接処理され、ｄｓＲＮＡは処理された細胞内で未精製のままである。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
微生物細胞中で非キャプシド化ｄｓＲＮＡを産生するための方法であって、前記ｄｓＲＮＡが、キャプシドタンパク質をコードするコートタンパク質遺伝子と共発現される、方法。
（項目２）
前記キャプシドタンパク質が、レビウイルスコートタンパク質遺伝子によってコードされる、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記キャプシドタンパク質が、バクテリオファージＭＳ２のコートタンパク質遺伝子によってコードされる、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記キャプシドタンパク質が、バクテリオファージＱβのコートタンパク質遺伝子によってコードされる、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記ｄｓＲＮＡをコードする遺伝子及び前記キャプシドタンパク質をコードする前記コートタンパク質遺伝子が、誘導性プロモーターから発現される、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記キャプシドタンパク質をコードする前記コートタンパク質遺伝子が、構成的プロモーターから発現され、前記ｄｓＲＮＡをコードする前記遺伝子が、誘導性プロモーターから発現される、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記キャプシドタンパク質をコードする前記コートタンパク質遺伝子が、前記ｄｓＲＮＡをコードする前記遺伝子の前に、またはこれと同時に発現される、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記ｄｓＲＮＡをコードする前記遺伝子及び前記キャプシドタンパク質をコードする前記コートタンパク質遺伝子が、前記微生物細胞内の1つのプラスミドまたは染色体外要素上に存在する、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記ｄｓＲＮＡをコードする前記遺伝子及び前記キャプシドタンパク質をコードする前記コートタンパク質遺伝子が、前記微生物細胞内の別々のプラスミドまたは染色体外要素上に存在する、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記ｄｓＲＮＡをコードする前記遺伝子及び前記キャプシドタンパク質をコードする前記遺伝子のうちの一方が、プラスミドまたは染色体外要素上に存在し、前記ｄｓＲＮＡをコードする前記遺伝子及び前記キャプシドタンパク質をコードする前記遺伝子のうちの他方が、前記微生物細胞の染色体上に存在する、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記ｄｓＲＮＡをコードする前記遺伝子及び前記キャプシドタンパク質をコードする前記コートタンパク質遺伝子が、前記微生物細胞の前記染色体上に存在する、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記ｄｓＲＮＡが、ＲＮＡｉ前駆体である、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記ｄｓＲＮＡの産生後に、前記微生物細胞が続いて溶解され、前記ｄｓＲＮＡが、適用のための処理に先立って、前記溶解物から精製される、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記ｄｓＲＮＡの産生後に、前記微生物細胞が溶解され、前記ｄｓＲＮＡをさらに精製することなく、適用のために処理される、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記ｄｓＲＮＡの産生後に、前記微生物細胞が、前記ｄｓＲＮＡを溶解またはさらに精製することなく、適用のために処理される、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記キャプシドタンパク質が、短縮型キャプシドタンパク質を含む、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記キャプシドタンパク質のＮ末端から本質的になる、項目１６に記載の短縮型ＭＳ２キャプシドタンパク質。
（項目１８）
前記キャプシドタンパク質の最初の４１個のアミノ酸を含む、項目１６に記載の短縮型キャプシドタンパク質。
（項目１９）
前記キャプシドタンパク質の最初の35個のアミノ酸を含む、項目１６に記載の短縮型キャプシドタンパク質。
（項目２０）
前記キャプシドタンパク質の最初の25個のアミノ酸を含む、項目１６に記載の短縮型キャプシドタンパク質。
（項目２１）
前記キャプシドタンパク質の最初の21個のアミノ酸を含む、項目１６に記載の短縮型キャプシドタンパク質。
（項目２２）
前記キャプシドタンパク質の最初の11個のアミノ酸を含む、項目１６に記載の短縮型キャプシドタンパク質。
（項目２３）
前記微生物細胞が、細菌である、項目１に記載の方法。
（項目２４）
前記微生物細胞が、グラム陰性細菌である、項目１に記載の方法。
（項目２５）
前記微生物細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの株である、項目１に記載の方法。
（項目２６）
前記微生物細胞が、グラム陽性細菌である、項目１に記載の方法。
（項目２７）
前記微生物細胞が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの株である、項目１に記載の方法。
（項目２８）
前記微生物細胞が、酵母である、項目１に記載の方法。
（項目２９）
前記微生物細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株である、項目１に記載の方法。