【手続補正書】
【提出日】令和2年10月26日(2020.10.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
未修飾のドメインを備える参照ポリケチドと比較して酵素活性が改変された１つまたは複数の修飾されたドメインを備える、遺伝子操作されたポリケチドシンターゼであって、遺伝子操作されたポリケチドシンターゼによる化合物の発現を可能にするのに適した条件下で発現された場合にポリケチドを生産することができる、遺伝子操作されたポリケチドシンターゼ。
【請求項２】
前記１つまたは複数の修飾されたドメインが、低下した酵素活性を有する、または、機能的に不活性である、請求項１に記載の遺伝子操作されたポリケチドシンターゼ。
【請求項３】
前記１つまたは複数の修飾されたドメインが、β−ケトンプロセシングドメインである、請求項１に記載の遺伝子操作されたポリケチドシンターゼ。
【請求項４】
β−ケトンプロセシングドメインが、ケトレダクターゼ、デヒドラターゼ、またはエノイルレダクターゼである、請求項３に記載の遺伝子操作されたポリケチドシンターゼ。
【請求項５】
β−ケトンプロセシングドメインが、配列番号１〜９のいずれか１つの保存された領域に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する部分を備える、請求項３に記載の遺伝子操作されたポリケチドシンターゼ。
【請求項６】
β−ケトンプロセシングドメインが、ケトレダクターゼであり、ケトレダクターゼが、（ａ）保存されたＹＡＡＡＮ触媒性モチーフ内のチロシンに対応する位置でチロシン以外のアミノ酸を備え、配列番号１内の保存されたαＦＧヘリックスを備えていないか、（ｂ）配列番号２内のＳ９−ｐｋｓＡ  ＯＲＦのアラニン６６３２に対応する位置でグルタミン酸残基を備えているか（Ｓ９における変化）、または（ｃ）配列番号３のＷＴ  Ｓ１２−ｐｋｓＢ  ＯＲＦのアミノ酸３３８６から３５１６に対応するアミノ酸を備えていない、請求項４に記載の遺伝子操作されたポリケチドシンターゼ。
【請求項７】
β−ケトンプロセシングドメインが、デヒドラターゼであり、デヒドラターゼが、（ａ）配列番号４の保存されたＨＸＸＸＧＸＸＸＸＰモチーフ内のＳ６７９−ｐｋｓＢ  ＯＲＦのｐｋｓＢにおける４２８８位のグリシンに対応する位置でアスパラギン酸を備えるか、（ｂ）配列番号５内のＳ１２−ｐｋｓＢ  ＯＲＦにおける３０６６位から３０７０位に対応する位置の保存されたＬＰＦＸＷモチーフにおける置換を備えるか、（ｃ）配列番号６のＳ６７９−ｐｋｓＡ  ＯＲＦのＰｒｏ６８４４からＴｒｐ６８７４の間の欠失を備えるか、または（ｄ）配列番号７のＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤに対応する位置での置換もしくは欠失を備える、請求項４に記載の遺伝子操作されたポリケチドシンターゼ。
【請求項８】
β−ケトンプロセシングドメインが、エノイルレダクターゼであり、エノイルレダクターゼが、配列番号８内のＳ１２−ｐｋｓＢ  ＯＲＦの１５４６位に対応する位置でリジンを備えていない、および／または配列番号８もしくは９内のＳ１２−ｐｋｓＢの１５６８位に対応する位置でアスパラギン酸を備えていない、請求項４に記載の遺伝子操作されたポリケチドシンターゼ。
【請求項９】
（ａ）第１のポリケチドシンターゼのドメインの保存された領域を備える、第１のドメイン、および（ｂ）第２のポリケチドシンターゼのドメインの保存された領域を備える、第２のドメインを備える、ポリケチドシンターゼ。
【請求項１０】
第１のドメインおよび第２のドメインの少なくとも１つが、β−ケトンプロセシングドメインである、請求項９に記載のポリケチドシンターゼ。
【請求項１１】
β−ケトンプロセシングドメインが、ケトレダクターゼ、デヒドラターゼ、またはエノイルレダクターゼである、請求項１０に記載のポリケチドシンターゼ。
【請求項１２】
第１のドメインおよび第２のドメインの少なくとも１つが、機能的に不活性なドメインである、請求項９に記載のポリケチドシンターゼ。
【請求項１３】
キメラポリケチドシンターゼであって、
（ｉ）ポリケチドシンターゼの少なくとも１つのドメインが、配列番号１０または１１の配列を有するポリケチドシンターゼと比較して修飾されており、前記修飾が、酵素活性の改変をもたらす；
（ｉｉ）少なくとも１つのケトレダクターゼドメインが、（ａ）保存されたＹＡＡＡＮ触媒性モチーフ内のチロシンに対応する位置でチロシン以外のアミノ酸を備え、配列番号１内の保存されたαＦＧヘリックスを備えていないか、（ｂ）配列番号２におけるＳ９−ｐｋｓＡ  ＯＲＦのアラニン６６３２に対応する位置でグルタミン酸残基を備えるか、または（ｃ）配列番号３のＷＴ  Ｓ１２−ｐｋｓＢ  ＯＲＦのアミノ酸３３８６から３５１６に対応するアミノ酸を備えていない；
（ｉｉｉ）少なくとも１つのデヒドラターゼドメインが、（ａ）配列番号４の保存されたＨＸＸＸＧＸＸＸＸＰモチーフ内のＳ６７９−ｐｋｓＢ  ＯＲＦのｐｋｓＢにおける４２８８位のグリシンに対応する位置でアスパラギン酸を備えるか、（ｂ）配列番号５内のＳ１２−ｐｋｓＢ  ＯＲＦにおける３０６６位から３０７０位に対応する位置の保存されたＬＰＦＸＷモチーフにおける置換を備えるか、（ｃ）配列番号６のＳ６７９−ｐｋｓＡ  ＯＲＦのＰｒｏ６８４４からＴｒｐ６８７４の間の位置に対応する欠失を備えるか、または（ｄ）配列番号７のＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤに対応する位置での置換もしくは欠失を備える；
（ｉｖ）少なくとも１つのエノイルレダクターゼドメインが、配列番号８内のＳ１２−ｐｋｓＢ  ＯＲＦの１５４６位に対応する位置でリジンを備えていない、および／または配列番号８もしくは９内のＳ１２−ｐｋｓＢの１５６８位に対応する位置でアスパラギン酸を備えていない；または
（ｖ）（ａ）配列番号７、８、もしくは９、（ｂ）配列番号１０、１１、もしくは１２、（ｃ）配列番号１３、１４、もしくは１５、（ｄ）配列番号１６、１７、もしくは１８、（ｅ）配列番号１９、２０、２１、もしくは２２、（ｆ）配列番号２３、２４、２５、もしくは２６、（ｇ）配列番号２７、２８、２９、もしくは３０、または（ｈ）配列番号３１もしくは３２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するドメインを備える、キメラポリケチドシンターゼ。
【請求項１４】
請求項１乃至１３のいずれか１項に記載のポリケチドシンターゼをコードする核酸。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸を備える発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載の発現ベクターを備える宿主細胞。
【請求項１７】
ポリケチドが宿主細胞に対して異種である、請求項１乃至１３のいずれか１項に記載のポリケチドシンターゼを備える宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１６に記載の宿主細胞を、前記ポリケチドシンターゼがポリケチド化合物を生産するのに適した条件下で培養する工程を備える、ポリケチドを生産する方法。
【請求項１９】
請求項１７に記載の宿主細胞を、前記ポリケチドシンターゼがポリケチド化合物を生産するのに適した条件下で培養する工程を備える、ポリケチドを生産する方法。
【請求項２０】
ポリケチドシンターゼの活性を調節する方法であって、
（ａ）親ポリケチドシンターゼをコードする親核酸配列を提供する工程、および
（ｂ）親核酸配列の少なくとも１つのコドンを修飾する工程であって、前記コドンが、親ポリケチドシンターゼの少なくとも１つのドメインの保存されたモチーフ内の残基を特定し、
前記修飾が、少なくとも１つのドメインの酵素活性または調節活性の改変をもたらす、工程を備える、方法。
【請求項２１】
化合物を生産する方法であって、
（ａ）親ポリケチドシンターゼをコードする親核酸を提供する工程、
（ｂ）親核酸の少なくとも１つのコドンを修飾して、化合物を生産することができる修飾されたポリケチドシンターゼをコードする修飾された核酸を生成させる工程であって、前記コドンが、ポリケチドシンターゼの少なくとも１つのドメインの保存されたドメイン内の残基を特定し、前記修飾が、ポリケチドシンターゼの少なくとも１つのドメインの酵素活性の改変をもたらす、工程、
（ｃ）修飾された核酸を宿主細胞に導入する工程、および
（ｄ）修飾されたポリケチドシンターゼによる化合物の発現を可能にするのに適した条件下で宿主細胞を培養する工程を備え、それによって化合物を生産する、方法。
【請求項２２】
請求項２０または２１に記載の方法によって生産される化合物。