【手続補正書】
【提出日】令和2年5月15日(2020.5.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ソルガムの分化胚形成カルス（ＤＥＣ）組織を調製する方法であって、
前記方法は、ソルガムから分離された未熟胚（ＩＥ）を、前記ＩＥからＤＥＣ組織を生産するに足る充分な時間及び条件下でカルス誘導培地（ＣＩＭ）において培養することを含み、
前記ＣＩＭは、１種以上のオーキシン、１種以上のサイトカイニン、酸化褐変を低減する１種以上の薬剤が補充された、植物細胞の培養に適した基本培地を含む、
方法。
【請求項２】
前記ＣＩＭは、下記特徴：
（ｉ）酸化褐変を低減する前記１種以上の薬剤は、リポ酸、メラトニン、２−アミノイダン（aminoidan）−２−ホスホン酸、アスコルビン酸、アルファトコフェロール、３，５−ジブチル−４−ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、システイン、亜セレン酸塩、ポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、フェノキサン（phenoxane）、硝酸銀、クエン酸塩、グルタチオン、フィチン酸、ノルジヒドログアヤレチン酸（ＮＤＧＡ）、及び活性炭からなる群より選ばれる；
（ｉｉ）酸化褐変を低減する前記１種以上の薬剤は、約０．１ｍｇ／Ｌ〜約５ｍｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、又は約１ｇ／Ｌの濃度で前記ＣＩＭ中に存在する；
（ｉｉｉ）前記１種以上のオーキシンは、インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）、４−クロロインドール−３−酢酸、フェニル酢酸、インドール−３−酪酸（ＩＢＡ）、１−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、２−ナフトキシ酢酸、４−クロロフェノキシ酢酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸、２，３，５−トリヨード安息香酸、ピクロラム、及びこれらのいずれか１つの塩形態からなる群より選ばれる；
（ｉｖ）前記１種以上のオーキシンは、約０．１ｍｇ／Ｌ〜約５ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ〜約３ｍｇ／Ｌ、約０．３ｍｇ／Ｌ〜約２ｍｇ／Ｌ、又は約０．５ｍｇ／Ｌ〜約１ｍｇ／Ｌの濃度で前記ＣＩＭ中に存在する；
（ｖ）前記１種以上のサイトカイニンは、ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、ゼアチン、カイネチン、２ＩＰ、ゼアチンリボシド、ジフェニル尿素、及びチジアズロン（ＴＤＺ）からなる群より選ばれる；
（ｖｉ）前記１種以上のサイトカイニンは、約０．０１ｍｇ／Ｌ〜約２ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ〜約２ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ〜約２ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ〜約１ｍｇ／Ｌ、又は約０．５ｍｇ／Ｌの濃度で前記ＣＩＭ中に存在する；
（ｖｉｉ）前記１種以上のオーキシン及び前記１種以上のサイトカイニンは、前記ＩＥからの前記ＤＥＣの生産及び／又は維持を行うに足る充分な互いの相対量で前記ＣＩＭ中に存在する；
（ｖｉｉｉ）前記１種以上のオーキシン及び前記１種以上のサイトカイニンは、約１．２５：１、約１．５：１、約１．７５：１、約２：１、約２．２５：１、約２．５：１、約２．７５：１、又は約３：１の重量比（オーキシン：サイトカイニン）で前記ＣＩＭ中に存在する；
の１つ以上又は全部を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＣＩＭは、約０．５ｍｇ／Ｌ〜約２．０ｍｇ／Ｌ、又は約１ｍｇ／Ｌの濃度のリポ酸を含み、そして／あるいは、
前記ＣＩＭは、下記：
（ｉ）約０．２ｇ／Ｌ〜約２ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約１．５ｇ／Ｌ、約０．７ｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、又は約０．８ｇ／Ｌの濃度のペプトン；
（ｉｉ）硫酸銅、塩化銅、硝酸銅、グルコン酸銅、又は酢酸銅の形態をした銅；
（ｉｉｉ）銅が存在する場合、前記銅は、約０．１ｍｇ／Ｌ〜約５ｍｇ／Ｌ、約０．３ｍｇ／Ｌ〜約３ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ〜約１．５ｍｇ／Ｌ、約０．７ｍｇ／Ｌ〜約１ｍｇ／Ｌ、又は約０．８ｍｇ／Ｌの濃度で存在する；及び／又は
（ｉｖ）浸透圧剤；
の１つ以上又は全部をさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
遺伝子改変ソルガム細胞を生産する方法であって、１つ以上の核酸をソルガムの分化胚形成カルス（ＤＥＣ）組織に導入することを含み、前記ＤＥＣ組織は、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法により生産される、方法。
【請求項５】
遺伝子改変ソルガム植物又はその再生部分を生産する方法であって、順に下記：
（ａ）１つ以上のＤＥＣ組織に対して請求項４に記載の方法を実施することと；
（ｂ）培養により前記ＤＥＣ組織からシュート形成が誘発されるように、前記１つ以上の核酸が導入された前記ＤＥＣ組織を単一培地上又は一連の培地上で培養することにより、１つ以上の遺伝子改変シュートを生産することと；
（ｃ）ステップ（ｂ）の前記遺伝子改変シュートから１つ以上の遺伝子改変ソルガム植物を生産することにより、前記遺伝子改変ソルガム植物を生産することと；
（ｄ）任意に、ステップ（ｃ）の前記遺伝子改変植物から再生部分を取得することと；
を含む、方法。
【請求項６】
遺伝子改変ソルガム植物又はその再生部分を生産する方法であって、順に下記：
（ａ）ソルガム組織の集団に１つ以上の核酸を導入することと；
（ｂ）前記１つ以上の核酸が導入されたソルガム組織１００個当たり少なくとも３５個の遺伝子改変シュートの効率で培養により前記ソルガム組織からシュート形成が誘導されるように、前記１つ以上の核酸が導入された前記ソルガム組織を単一培地上又は一連の培地上で培養することにより、遺伝子改変シュートを生産することと；
（ｃ）ステップ（ｂ）の前記遺伝子改変シュートから１つ以上の遺伝子改変ソルガム植物を生産することにより、前記遺伝子改変ソルガム植物を生産することと；
（ｄ）任意に、ステップ（ｃ）の前記遺伝子改変植物から再生部分を取得することと；
を含む、方法。
【請求項７】
前記１つ以上の核酸のうちの少なくとも１つは選択マーカー遺伝子を含み、ステップ（ｂ）は、前記選択マーカー遺伝子が導入された単一又は複数の組織を選択することを含む、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｂ）の単一又は複数の前記ソルガム組織の培養に使われる前記単一培地又は前記一連の培地のうちの少なくとも１つは、請求項２又は３に定義されるＣＩＭを含む、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記１つ以上の核酸を導入した後、単一又は複数の前記ソルガム組織をそれぞれ２つ以上の部分に分割することをさらに含む、請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｂ）における前記一連の培地のうちの１つ以上はＬ−システイン及び／又はアスコルビン酸を含む、請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも３５％又は少なくとも４０％の遺伝子改変効率が得られる、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の方法であって、前記遺伝子改変効率は、ステップ（ｂ）で生産される遺伝子改変シュートの数を、ステップ（ａ）で用いるＤＥＣ組織又はソルガム組織の数に対する百分率で表したものである、方法。
【請求項１２】
遺伝子改変ソルガム植物の子孫を生産する方法であって、請求項５〜１１のいずれか一項に記載の方法を用いて生産された遺伝子改変ソルガム植物の自殖又は交雑により子孫植物を生産することを含む、方法。
【請求項１３】
請求項５〜１２のいずれか一項に記載の方法を用いて生産され、前記方法により導入された遺伝子改変を含む、遺伝子改変ソルガム植物、その子孫又は一部。
【請求項１４】
ソルガムの分化胚形成カルス（ＤＥＣ）組織の調製での使用に適した培地であって、前記培地は、１種以上のオーキシン、１種以上のサイトカイニン、及び酸化褐変を低減する１種以上の薬剤が補充された、植物細胞の培養に適した基本培地を含み、酸化褐変を低減する前記１種以上の薬剤は、前記ソルガム組織の酸化褐変を防止又は低減するに足る充分な濃度で前記培地中に存在し、前記１種以上のオーキシン及び前記１種以上のサイトカイニンは、培養時に前記ＩＥから前記ＤＥＣを生産するに足る充分な互いの相対量で前記培地中に存在する、
培地。
【請求項１５】
下記特徴：
（ｉ）酸化褐変を低減する前記１種以上の薬剤は、リポ酸、メラトニン、２−アミノイダン（aminoidan）−２−ホスホン酸、アスコルビン酸、アルファトコフェロール、３，５−ジブチル−４−ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、システイン、亜セレン酸塩、ポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、フェノキサン（phenoxane）、硝酸銀、クエン酸塩、グルタチオン、フィチン酸、ノルジヒドログアヤレチン酸（ＮＤＧＡ）、及び活性炭からなる群より選択される；
（ｉｉ）酸化褐変を低減する前記１種以上の薬剤は、約０．１ｍｇ／Ｌ〜約１０ｍｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、又は約１ｇ／Ｌの濃度で存在する；
（ｉｉｉ）前記１種以上のオーキシンは、インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）、４−クロロインドール−３−酢酸、フェニル酢酸、インドール−３−酪酸（ＩＢＡ）、１−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、２−ナフトキシ酢酸、４−クロロフェノキシ酢酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸、２，３，５−トリヨード安息香酸、ピクロラム、及びこれらのいずれか１つの塩形態からなる群より選択される；
（ｉｖ）前記１種以上のオーキシンは、約０．１ｍｇ／Ｌ〜約５ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ〜約３ｍｇ／Ｌ、約０．３ｍｇ／Ｌ〜約２ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ〜約１ｍｇ／Ｌ、又は約１ｍｇ／Ｌの濃度で存在する；
（ｖ）前記１種以上のサイトカイニンは、ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、ゼアチン、カイネチン、２ＩＰ、ゼアチンリボシド、ジフェニル尿素、及びチジアズロン（ＴＤＺ）からなる群より選択される；
（ｖｉ）前記１種以上のサイトカイニンは、約０．０１ｍｇ／Ｌ〜約２ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ〜約２ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ〜約２ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ〜約１ｍｇ／Ｌ、又は約０．５ｍｇ／Ｌの濃度で存在する；及び
（ｖｉｉ）前記１種以上のオーキシン及び前記１種以上のサイトカイニンは、約１．２５：１、約１．５：１、約１．７５：１、約２：１、約２．２５：１、約２．５：１、約２．７５：１、又は約３：１の重量比（オーキシン：サイトカイニン）で培地中に存在する；
の１つ以上又は全部を有する、請求項１４に記載の培地。
【請求項１６】
約０．５ｍｇ／Ｌ〜約２．０ｍｇ／Ｌ、又は約１ｍｇ／Ｌの濃度のリポ酸、及び／又は
下記：
（ｉ）約０．２ｇ／Ｌ〜約２ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約１．５ｇ／Ｌ、約０．７ｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、又は約０．８ｇ／Ｌの濃度のペプトン；
（ｉｉ）硫酸銅、塩化銅、硝酸銅、グルコン酸銅、又は酢酸銅の形態の銅；
（ｉｉｉ）銅が存在する場合、前記銅は、約０．１ｍｇ／Ｌ〜約５ｍｇ／Ｌ、約０．３ｍｇ／Ｌ〜約３ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ〜約１．５  ｍｇ／Ｌ、約０．７ｍｇ／Ｌ〜約１ｍｇ／Ｌ、又は約０．８ｍｇ／Ｌの濃度で存在する；
（ｉｖ）浸透圧剤；
（ｖ）約４ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌの濃度のＭＳ培地と、約１ｍｇ／Ｌの濃度の２，４−Ｄと、約０．５ｍｇ／Ｌの濃度のＢＡＰと、約１ｍｇ／Ｌの濃度のリポ酸；
の１つ以上又は全部を含み、そして／あるいは
下記：
（ｖｉ）約０．５ｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌの濃度のＬ−プロリン；
（ｖｉｉ）約０．５ｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌの濃度のペプトン；
（ｖｉｉｉ）約１００ｍｇ／Ｌ〜約２００ｍｇ／Ｌの濃度のミオイノシトール；
（ｉｘ）約０．５ｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌの濃度の硫酸銅；
（ｘ）約１０ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌの濃度のマルトース；及び
（ｘｉ）約６ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌの濃度の寒天；
の１つ以上又は全部をさらに含む、請求項１４又は１５に記載の培地。
【請求項１７】
少なくとも３５％の効率で遺伝子改変されることが可能な、ソルガムの分化胚形成カルス（ＤＥＣ）組織。