【手続補正書】
【提出日】令和2年10月8日(2020.10.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０７】
実施例7
hPSCにおける最適化した誘導性CRISPR/Cas9ノックアウトプラットフォームの開発
発明者らは、誘導性ノックアウトアプローチを開発することに注意を向けた。現在の誘導性CRISPR/Cas9方法は、構成的に発現するgRNAの存在下でのCas9の条件付き過剰発現に依存する。この場合、Cas9過剰発現の制御は、ドキシサイクリン処理後に、テトラサイクリンに制御される逆トランス活性化因子（rtTA）がPol II依存性テトラサイクリン応答エレメント（TRE）プロモーター（複数のTETオペロンと最小CMVプロモーターの融合物）を活性化するTET-ON方法によって達成される。このTET-ONプラットフォームは、特定のヒト細胞型に正常に適用されてきたが、発明者らは、この誘導システムが、AAVS1 GSHに標的化した後でさえ、複数の系統（心筋細胞、肝細胞、及び平滑筋細胞を含む）へのhPSCの分化中にサイレンシングされることを観察した(データは示さず）。発明者らは、誘導性shRNA発現用に開発されたものに基づく誘導性gRNAカセットと構成的発現CAGプロモーター促進Cas9を組み合わせることによって別の改良された方法を開発する可能性を検討した（図18A、B）。したがって、発明者らは、蛍光レポーター遺伝子が誘導性の方法でノックアウトされ得るhESC株を作製した（図18C）。このために、発明者らは、各導入遺伝子が2つの対立遺伝子の一方に組込まれているAAVS1遺伝子座の中に誘導性EGFP gRNAと構成的Cas9の両方を有するROSA26-EGFPd2レポーターhESCを標的化した。この二重標的化アプローチは、迅速で（2週間未満）かつ効率的（両方の導入遺伝子を含有する株の90％超）であった。注目すべきことに、個々のクローン亜株をテトラサイクリンの存在下で増殖させた場合に、発明者らは、標的株の全てにおいてEGFPd2発現の低下を観察し、EGFPd2ホモ接合細胞は、テトラサイクリン誘導後、早ければ5日ほどでレポーター遺伝子の少なくとも1つのコピーのほぼ均質な喪失を示した（EGFPd2蛍光の50％減少によって示されるように）。テトラサイクリンでの長期処理は、最大75％のEGFPd2ホモ接合細胞においてEGFPd2蛍光の進行性の完全喪失をもたらした（データは示さず）。興味深いことに、同じAAVS1遺伝子座からの同じEGFP gRNAカセットの2又は3コピーのいずれかの同時発現は、分析した全てのクローン亜株において誘導性EGFPd2ノックアウトの速度及び効率を顕著に向上させるのに十分であった。例えば、同じgRNAの3コピーの同時誘導が、テトラサイクリン処理後に、異例の95％ノックアウト効率をもたらした。重要なことは、誘導性EGFPd2ノックアウトhESCは、いくつかのgRNAコピーが使用されても、テトラサイクリンの非存在下での長期培養後に、EGFPd2陽性細胞の割合も、それらの蛍光も顕著な減少を示さなかった。これから、誘導性gRNA発現が厳密に制御されたことが実証された。最後に、EGFPd2に対するさらなるgRNAの試験から、誘導性ノックアウトの速度及び効率が強くgRNAに依存していることが明らかになった。実際に、最適な配列は、誘導のわずか2日後に最大90％のノックアウトを可能にした。注目すべきは、最も効率的なgRNAはまた、制御されないEGFPd2ノックアウトをもたらしたが、この制限は、さらにストリンジェントな転写制御を確実にするために、誘導性H1プロモーターに第2のTETオペロンを付加するだけで回避された。まとめると、これらの結果は、該ノックダウンシステムは、誘導性gRNA発現を支持し、広範囲のgRNA効力を上回るRISPR/Cas9のしっかり制御さ��た活性を可能にするように容易に再び目的を持たせることができることを示す。発明者らの知る限り、これは、誘導性gRNA発現に基づく第1の条件付きCRISPR/Cas9アプローチである。
本件出願は、以下の態様の発明を提供する。
（態様1）
細胞内で遺伝子配列の転写を制御する方法であって、
a）第1の遺伝子セーフハーバー部位への転写調節タンパク質コード遺伝子の標的化挿入の工程；及び
b）第2の遺伝子セーフハーバー部位への誘導カセットの標的化挿入の工程であって、前記誘導カセットが、誘導プロモーターに作動可能に連結された前記遺伝子配列を含み、前記プロモーターが前記転写調節タンパク質によって調節される、前記工程、
を含み、前記第1及び第2の遺伝子セーフハーバー部位が異なる、前記方法。
（態様２）
前記遺伝子配列が導入遺伝子である、態様1記載の方法。
（態様３）
前記遺伝子配列が、ノンコーディングRNAをコードする、態様1記載の方法。
（態様４）
前記転写調節タンパク質の活性が、外部から供給される物質によって制御される、態様1〜3のいずれか一項記載の方法。
（態様５）
前記転写調節タンパク質が構成的に発現する、態様1〜4のいずれか一項記載の方法。
（態様６）
前記転写調節タンパク質が、テトラサイクリン応答性転写活性化タンパク質（rtTa）、テトラサイクリン抑制因子（TetR）、VgEcR合成受容体又は遺伝子スイッチハイブリッド転写調節タンパク質、及び任意のそれらの誘導体のいずれか1つから選択される、態様1〜5のいずれか一項記載の方法。
（態様７）
前記転写調節タンパク質が、rtTA又はそれらの任意の誘導体である、態様1〜6のいずれか一項記載の方法。
（態様８）
前記tTAの活性が、テトラサイクリン又はその誘導体、任意に、ドキシサイクリンによって制御される、態様5記載の方法。
（態様９）
前記誘導プロモーターが、Tet応答エレメント（TRE）を含む、態様7又は態様8記載の方法。
（態様1０）
前記第1及び第2のゲノムセーフハーバー部位が、hROSA26遺伝子座、AAVS1遺伝子座、CLYBL遺伝子、CCR5遺伝子又はHPRT遺伝子のいずれか2つから選択される、態様1〜9のいずれか一項記載の方法。
（態様11）
第1の遺伝子セーフハーバー部位への前記転写調節タンパク質コード遺伝子の挿入が、前記細胞の両方の染色体で生じ、かつ/又は第2の遺伝子セーフハーバー部位への前記誘導カセットの挿入が前記細胞の両方の染色体上で生じる、態様1〜10のいずれか一項記載の方法。
（態様1２）
さらなる遺伝物質が、第1及び/又は第2のゲノムセーフハーバー部位に挿入され、任意に、以下のもの:
a）自殺遺伝子;
b）選択マーカー;
c）レポーター遺伝子;及び/又は
d）ノンコーディングRNAの遺伝子
態様1〜11のいずれか一項記載の方法。
（態様1３）
前記方法がエクスビボで行われる、態様1〜12のいずれか一項記載の前記方法。
（態様1４）
前記細胞が多能性幹細胞、体性幹細胞又は成熟細胞から選択される、態様1〜13のいずれか一項記載の方法。
（態様1５）
前記方法が、定義された成熟細胞への多能性幹細胞のプログラミングのためのものである、態様1又は態様2記載の方法。
（態様1６）
前記細胞が多能性幹細胞であり、前記遺伝子配列が、1以上のマスター調節因子、任意に、転写因子の導入遺伝子である、態様1又は態様2記載の方法。
（態様1７）
前記遺伝子配列の転写が、定義された成熟細胞型への前記細胞のフォワードプログラミングをもたらす、態様16記載の方法。
（態様1８）
前記成熟細胞型が、以下の細胞型:：神経細胞、筋細胞、骨細胞、軟骨細胞、上皮細胞、分泌細胞、及び/又は血液細胞のいずれか1つから選択される、態様17記載の方法。
（態様1９）
前記多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞（iPSC）又は胚性幹細胞（ESC）から選択される、態様14〜18のいずれか一項記載の方法。
（態様２０）
前記細胞がヒトである、態様1〜19のいずれか一項記載の方法。
（態様２1）
前記方法が、遺伝子治療の目的のための遺伝子配列の挿入のためであり、任意に、前記遺伝子配列が、野生型タンパク質、改変タンパク質、抗原、酵素、選択マーカー又はノンコーディングRNA分子を含むタンパク質をコードする、態様1記載の方法。
（態様２２）
態様1の方法によって作製される細胞。
（態様２３）
第1遺伝子セーフハーバー部位に挿入される転写調節タンパク質コード遺伝子;及び第2の遺伝子セーフハーバー部位に挿入される誘導プロモーターに作動可能に連結された遺伝子配列を含む誘導カセットを含む改変ゲノムを有する細胞であって、前記誘導プロモーターが、転写調節タンパク質によって調節され、前記第1及び第2の部位が異なる、前記細胞。
（態様２４）
治療における態様22又は態様23記載の細胞の使用。
（態様２５）
インビトロ診断のための、態様22又は23記載の細胞の使用。
（態様２６）
組織工学、任意に、培養肉のための、態様22又は23記載の細胞の使用。
（態様２７）
多能性幹細胞からの筋細胞の生成方法であって、
a）第1の遺伝子セーフハーバー部位への転写調節タンパク質コード遺伝子の標的化挿入の工程；及び
b）第2の遺伝子セーフハーバー部位への、誘導プロモーターに作動可能に連結されたMYOD1遺伝子の標的化挿入の工程であって、前記誘導プロモーターが前記転写調節タンパク質によって調節される、前記工程、
を含み、前記第1及び第2の遺伝子セーフハーバー部位が異なり、
レチノイン酸の存在下で前記細胞を培養することを含む、前記方法。
（態様２８）
多能性幹細胞からのオリゴデンドロサイトの生成方法であって、
a）第1の遺伝子セーフハーバー部位への転写調節タンパク質コード遺伝子の標的化挿入の工程;及び
b）誘導プロモーターに作動可能に連結されたSOX 10遺伝子の、第2の遺伝子セーフハーバー部位への標的化挿入の工程であって、前記誘導プロモーターが転写調節タンパク質によって調節される、前記工程
を含み、前記第1及び第2の遺伝子セーフハーバー部位が異なり、
レチノイン酸の存在下で前記細胞を培養することを含む、前記方法。
（態様２９）
細胞内で内因性遺伝子の転写及び/又は翻訳を低下させる方法であって、
a）第1の遺伝子セーフハーバー部位への転写調節タンパク質コード遺伝子の標的化挿入の工程;及び
b）第2の遺伝子セーフハーバー部位への誘導カセットの標的化挿入の工程であって、前記誘導カセットが、誘導プロモーターに作動可能に連結されたノンコーディングRNA配列をコードするDNAを含み、前記プロモーターが、転写調節タンパク質によって調節され、前記ノンコーディングRNA配列が、内因性遺伝子の転写又は翻訳を抑制する、前記工程、
を含み、
前記第1及び第2の遺伝子セーフハーバー部位が異なる、前記方法。
（態様３０）
細胞内の内因性遺伝子をノックアウトする方法であって
a）転写調節タンパク質コード遺伝子及びCas9コード遺伝子の、第1の遺伝子セーフハーバー部位への標的化挿入の工程;及び
b）第2の遺伝子セーフハーバー部位への誘導カセットの標的化挿入の工程であって、前記誘導カセットが、誘導プロモーターに作動可能に連結されたガイドRNAを含み、前記プロモーターが前記転写調節タンパク質によって調節され、前記gRNA配列が内因性遺伝子を標的化する、前記工程、
を含み、
前記第1及び第2の遺伝子セーフハーバー部位が異なる、前記方法。
（態様３１）
さらなる誘導カセット又は導入遺伝子が、前記第1及び第2のGSHと異なるさらなるGSHに挿入される、態様1〜21又は27〜29のいずれか一項記載の方法。
（態様３２）
配列番号6と80％、85％、90％、95％又は99％の相同性を有する配列を含む最適化tetR配列。
（態様３３）
MYOD1を発現する多能性幹細胞からの筋細胞の生成方法であって、レチノイン酸の存在下で前記細胞を培養することを含む、前記方法。