【手続補正書】
【提出日】令和2年1月27日(2020.1.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞を分化させるためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、複数の細胞が分化し、１種または複数の皮質ニューロン前駆体マーカーを発現するように、幹細胞集団を、有効濃度の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤、ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびノッチシグナル伝達の１種または複数の阻害剤に曝露するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記幹細胞集団が、前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤への曝露の開始後、少なくとも６日目に、検出可能なレベルのＰＡＸ６を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記幹細胞集団が、前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤への曝露の開始後、６日目までに、検出可能なレベルのＰＡＸ６を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記幹細胞集団を前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤に曝露した後、少なくとも２日目または３日目に、前記ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、前記ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および前記ノッチシグナル伝達の１種または複数の阻害剤を前記幹細胞集団に曝露する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記幹細胞集団を前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤に曝露した後、２日目または３日目までに、前記ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、前記ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および前記ノッチシグナル伝達の１種または複数の阻害剤を前記幹細胞集団に曝露する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記複数の細胞が、前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤への曝露後、少なくとも１３日目に、ＴＵＪ１、ＴＢＲ１、ＴＬＥ４、ＤＣＸ、ＲＥＥＬＩＮ、ＣＴＩＰ２、ＳＡＴＢ２、ＦＯＸＰ２、ＲＧＳ４、ＣＵＸ２、ＢＬＢＰ、およびそれらの組合せからなる群から選択される検出可能なレベルのマーカーを発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記複数の細胞が、前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤への曝露後、１３日目までに、ＴＵＪ１、ＴＢＲ１、ＴＬＥ４、ＤＣＸ、ＲＥＥＬＩＮ、ＣＴＩＰ２、ＳＡＴＢ２、ＦＯＸＰ２、ＲＧＳ４、ＣＵＸ２、ＢＬＢＰ、およびそれらの組合せからなる群から選択される検出可能なレベルのマーカーを発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
検出可能なレベルのＴＵＪ１を発現する前記複数の細胞の少なくとも５０％が、検出可能なレベルのＴＢＲ１、ＴＬＥ４、またはそれらの組合せも発現する、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記幹細胞集団が、前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤に曝露された後、少なくとも１６日目に、分化した皮質ニューロンの電気生理学的活性を示す、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１０】
前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、前記骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および前記ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤を、前記幹細胞集団に少なくとも６日間曝露する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、前記骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および前記ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤を、前記幹細胞集団に６日間まで曝露する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、前記骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および前記ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤を、前記幹細胞集団に少なくとも７日間曝露する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、前記骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および前記ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤を、前記幹細胞集団に７日間まで曝露する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤が、ＳＢ４３１５４２、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤が、ＬＤＮ１９３１８９、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤が、ＸＡＶ９３９、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼシグナル伝達の１種または複数の阻害剤が、ＰＤ０３２５９０１、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤が、ＳＵ５４０２、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ノッチシグナル伝達の１種または複数の阻害剤が、γ−セクレターゼ阻害剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記γ−セクレターゼ阻害剤が、ＤＡＰＴ、それらの誘導体、またはそれらの混合物を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２１】
前記幹細胞が、ヒト胚幹細胞、ヒト人工多能性幹細胞、ヒト単為生殖幹細胞、始原胚細胞様の多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、およびＦクラス多能性幹細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞を皮質ニューロンに成熟させるのに好都合な条件に、前記複数の細胞を晒すステップをさらに含み、前記複数の細胞を、ＢＤＮＦ、ｃＡＭＰ、およびアスコルビン酸シグナル伝達を活性化する１種または複数の化合物に曝露するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
１種または複数の皮質ニューロンマーカーまたはそれらの前駆体を発現する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団であって、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法に従って幹細胞集団から誘導される、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団。
【請求項２４】
請求項２３に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団を含む、組成物。
【請求項２５】
対象の神経変性障害を処置するための、請求項２３に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団を含む組成物。
【請求項２６】
前記対象が、神経変性障害を有すると診断を受けたか、またはその危険性がある、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記神経変性障害が、パーキンソン病である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
神経変性障害を処置するための医薬の製造における、請求項２３に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団の使用。
【請求項２９】
幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、
（ａ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、
（ｂ）ＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、
（ｃ）ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤、
（ｅ）ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、
（ｅ）ノッチシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、
（ｆ）ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および
（ｇ）請求項１から２２のいずれか一項に記載の１種または複数の皮質ニューロンマーカーを発現する分化細胞集団への前記幹細胞の分化を誘導するための指示書
の１つまたは複数を含む、キット。
【請求項３０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団を含むキットであって、前記細胞集団が、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法に従って分化する、キット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２０】
特許文書、特許出願、刊行物、生成物の説明およびプロトコールが、本願を通して引用されているが、それらの開示は、あらゆる目的でそれらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
多能性幹細胞を分化させるためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、複数の細胞が分化し、１種または複数の皮質ニューロン前駆体マーカーを発現するように、幹細胞集団を、有効濃度の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤、ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびノッチシグナル伝達の１種または複数の阻害剤に曝露するステップを含む、方法。
（項目２）
前記幹細胞集団が、前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤への曝露の開始後、少なくとも６日目に、検出可能なレベルのＰＡＸ６を発現する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記幹細胞集団が、前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤への曝露の開始後、６日目までに、検出可能なレベルのＰＡＸ６を発現する、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記幹細胞集団を前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤に曝露した後、少なくとも２日目または３日目に、前記ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、前記ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および前記ノッチシグナル伝達の１種または複数の阻害剤を前記幹細胞集団に曝露する、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記幹細胞集団を前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤に曝露した後、２日目または３日目までに、前記ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、前記ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および前記ノッチシグナル伝達の１種または複数の阻害剤を前記幹細胞集団に曝露する、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記複数の細胞が、前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤への曝露後、少なくとも１３日目に、ＴＵＪ１、ＴＢＲ１、ＴＬＥ４、ＤＣＸ、ＲＥＥＬＩＮ、ＣＴＩＰ２、ＳＡＴＢ２、ＦＯＸＰ２、ＲＧＳ４、ＣＵＸ２、ＢＬＢＰ、およびそれらの組合せからなる群から選択される検出可能なレベルのマーカーを発現する、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記複数の細胞が、前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤への曝露後、１３日目までに、ＴＵＪ１、ＴＢＲ１、ＴＬＥ４、ＤＣＸ、ＲＥＥＬＩＮ、ＣＴＩＰ２、ＳＡＴＢ２、ＦＯＸＰ２、ＲＧＳ４、ＣＵＸ２、ＢＬＢＰ、およびそれらの組合せからなる群から選択される検出可能なレベルのマーカーを発現する、項目１に記載の方法。
（項目８）
検出可能なレベルのＴＵＪ１を発現する前記複数の細胞の少なくとも５０％が、検出可能なレベルのＴＢＲ１、ＴＬＥ４、またはそれらの組合せも発現する、項目６または７に記載の方法。
（項目９）
前記幹細胞集団が、前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤に曝露された後、少なくとも１６日目に、分化した皮質ニューロンの電気生理学的活性を示す、項目６または７に記載の方法。
（項目１０）
前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、前記骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および前記ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤を、前記幹細胞集団に少なくとも６日間曝露する、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、前記骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および前記ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤を、前記幹細胞集団に６日間まで曝露する、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、前記骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および前記ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤を、前記幹細胞集団に少なくとも７日間曝露する、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、前記骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および前記ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤を、前記幹細胞集団に７日間まで曝露する、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤が、ＳＢ４３１５４２、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される化合物を含む、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤が、ＬＤＮ１９３１８９、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される化合物を含む、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤が、ＸＡＶ９３９、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される化合物を含む、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼシグナル伝達の１種または複数の阻害剤が、ＰＤ０３２５９０１、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される化合物を含む、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤が、ＳＵ５４０２、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される化合物を含む、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記ノッチシグナル伝達の１種または複数の阻害剤が、γ−セクレターゼ阻害剤を含む、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記γ−セクレターゼ阻害剤が、ＤＡＰＴ、それらの誘導体、またはそれらの混合物を含む、項目２０に記載の方法。
（項目２１）
前記幹細胞が、ヒト胚幹細胞、ヒト人工多能性幹細胞、ヒト単為生殖幹細胞、始原胚細胞様の多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、およびＦクラス多能性幹細胞からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目２２）
前記細胞を皮質ニューロンに成熟させるのに好都合な条件に、前記複数の細胞を晒すステップをさらに含み、前記複数の細胞を、ＢＤＮＦ、ｃＡＭＰ、およびアスコルビン酸シグナル伝達を活性化する１種または複数の化合物に曝露するステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目２３）
１種または複数の皮質ニューロンマーカーまたはそれらの前駆体を発現する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団であって、項目１から２２のいずれか一項に記載の方法に従って幹細胞集団から誘導される、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団。
（項目２４）
項目２３に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団を含む、組成物。
（項目２５）
対象の神経変性障害を処置する方法であって、有効量の項目２３に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法。
（項目２６）
前記対象が、神経変性障害を有すると診断を受けたか、またはその危険性がある、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記神経変性障害が、パーキンソン病である、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
神経変性障害を処置するための医薬の製造における、項目２３に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団の使用。
（項目２９）
幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、
（ａ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、
（ｂ）ＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、
（ｃ）ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤、
（ｅ）ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、
（ｅ）ノッチシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、
（ｆ）ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および
（ｇ）項目１から２２のいずれか一項に記載の１種または複数の皮質ニューロンマーカーを発現する分化細胞集団への前記幹細胞の分化を誘導するための指示書
の１つまたは複数を含む、キット。
（項目３０）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団を含むキットであって、前記細胞集団が、項目１から２２のいずれか一項に記載の方法に従って分化する、キット。