(57)【要約】  【課題】UDP-アセチルムラミン酸などの基質を低コストで調製方法を提供する。    【解決手段】非許容温度で培養した場合に目的とする基質を蓄積する温度感受性株を許容温度で培養して菌数を増加させた後、非許容温度で培養することによりその基質を蓄積させることができるので基質の調製が可能となる。またグルコース等の糖類及びバンコマイシン等の細胞壁合成酵素を培地に添加することにより基質の収率を上げることができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）非許容温度で培養した場合に目的とする基質を蓄積する温度感受性変異株を許容温度で培養して菌数を増やす工程、
（２）該温度感受性変異株を、非許容温度で培養して該基質を菌体内に蓄積させる工程、
（３）菌体内から該基質を抽出する工程
を含む、目的とする基質の調製方法。
【請求項２】
温度感受性変異株が目的とする基質に対する酵素に変異を有するものである請求項１記載の基質の調製方法。
【請求項３】
該酵素がMurCである請求項２記載の基質の調製方法。
【請求項４】
該酵素がMurFである請求項２記載の基質の調製方法。
【請求項５】
基質が細胞壁合成酵素の基質である請求項１または２に記載の基質の調製方法。
【請求項６】
基質がUDP-N-アセチルムラミン酸である請求項５記載の基質の調製方法。
【請求項７】
基質がUDP-N-アセチルムラミン酸-トリペプチドである請求項５記載の基質の調製方法。
【請求項８】
培養培地に糖類を添加することを特徴とする請求項１または２に記載の基質の調製方法。
【請求項９】
糖類がグルコースである請求項８記載の基質の調製方法。
【請求項１０】
培養培地に細胞壁合成阻害剤を添加することを特徴とする請求項１または２に記載の基質の調製方法。
【請求項１１】
細胞壁合成阻害剤がバンコマイシンである請求項１０記載の基質の調製方法。
【請求項１２】
細胞壁合成阻害剤がD-シクロセリンである請求項１０記載の基質の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は温度感受性変異株を用いた基質の調製方法に関する。より詳しくはMurCの基質であるUDP-N-アセチルムラミン酸 (以下、UDP-Mur-NAcもしくはUNAMとも記載する。)やMurFの基質であるUDP-N-アセチルムラミン酸-トリペプチド(以下、UDP-Mur-NAc-トリペプチドと記載する。)等の基質の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物・微生物細胞は細胞膜の外側がペプチドグリカンを主成分とする細胞壁に覆われている。この構造は動物細胞には存在しないことから、細胞壁の合成系の阻害は抗菌薬の開発において重要なターゲットとされてきた。【０００３】
ペプチドグリカン前駆体は、MurA, MurB, MurC, MurD, MurE, MurFのカスケードをなす酵素群によって細胞内でUDP-Mur-NAc-ペンタペプチドまで合成され、次にこれが膜に転移され、さらに細胞外に運び出され、そこで最終的にペプチドグリカンが合成される（Mol. Microbiol., 47, 1-12, 2003.参照）。この合成経路の上流酵素であるMurA及びMurBによってUDP-N-アセチルグルコサミン(UDP-Glc-NAc)からUDP-Mur-NAcが合成される。さらにこれを基質として、ATP 存在下でリン酸の遊離を伴ってMurCによってL-アラニンが付加される。式（Ｉ）に示すとおり、MurCにより生合成されたUDP-Mur-NAc-L-Ala は、その後もMurD、MurE、MurFなどの一連の酵素の働きによりそれぞれD-グルタミン酸、L-リジン、D-アラニル-D-アラニンが付加されてU DP-Mur-NAc-ペンタペプチドが合成される。これらの酵素群は、温度感受性変異株の報告（特許文献１）等からS.aureus等の各種細菌において生存に必須の酵素であることが知られている（非特許文献１）。
式（Ｉ）：
【化１】
2006001319.tif 000002
【０００４】
現在、細胞壁合成経路の初期段階の酵素を阻害する抗菌薬としては、MurA酵素の阻害剤として知られるホスホマイシン(FOM)が唯一であり、その他の上記段階の酵素を阻害することにより抗菌力を発揮する薬剤は上市されていない。耐性菌の出現が問題となっている現状においては、新しいメカニズムの抗菌薬の開発は急務となっていることから、これらの酵素は、抗菌薬のターゲットとして重要である。【０００５】
ペプチドグリカン合成阻害剤のスクリーニングを行う場合、必要となる生合成酵素の調製方法は遺伝子工学的手法により確立されているのに対し、UDP-Mur-NAc等の基質は調製が困難であり、ペプチドグリカン合成酵素をターゲットとした抗菌薬に関する探索研究の障壁となっていた。これは本酵素群に限らずその他の酵素一般にもあてはまることである。現在知られている主な基質の調製方法として、１）化学合成、２）酵素的調製法、３）菌体からの単離調製法が挙げられる。【０００６】
例えばUDP-Mur-NAcの場合、１）の化学合成法については、Blanotらが1994年に初めて全合成を完成したあとも収率を挙げるため鋭意工夫がなされてきた（非特許文献２）。UDP-Mur-NAc等の基質は、複雑な構造を有する糖誘導体であるので、非常に扱いにくく、しかも合成過程においてアノマー体が生じるので分離を要するなど、困難であった。【０００７】
また、２）の酵素的調製法については、出発原料となるMurA の基質であるUD P-N-アセチルグルコサミン(UDP-Glc-NAc) やホスホエノールピルビン酸(PEP)が市販されており比較的容易に入手できるものの、精製酵素が大量に必要なため、製造コスト上の問題があった。また、生合成経路の下流の酵素ほどその基質を調製するために必要な酵素の種類が増える問題点もあった。さらに、酵素量、pH、反応時間など反応条件によって反応生成物中の最終産物の純度が変化するなど、酵素基質を効率よく安価に調製する方法としては満足できるものではなかった（非特許文献３）。【０００８】
一方、Flouretらの報告（非特許文献４）にもある３）の菌体からの単離調製方法は容易でありコストが低い点において他の方法よりも優れているが、必ずしも目的とする基質が菌体内で有意に蓄積されるわけではなく収率が低いという問題があった。
【特許文献１】米国特許第６６３８７１８号明細書
【非特許文献１】DNA  Seq １９９９年、第１０巻、p. １９
【非特許文献２】Bioorganic&Medical Chemistry Letters  ２０００年、第１０巻、p.１４３
【非特許文献３】FEMS Microbiology Letters  ２００３年、第２２９巻、p.８３
【非特許文献４】J.Anal.Biochem  １９８１年、第１１４巻、p.５９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、入手が困難である酵素の基質を効率的に調製する方法を提供することである。例えば、抗菌薬のスクリーニング等に用いる酵素の基質を効率的に調製する方法を提供することである。具体的には、MurC酵素の基質であるUDP-N-アセチルムラミン酸(UDP-Mur-NAc)や、MurF酵素の基質であるUDP-N-アセチルムラミン酸-トリペプチド(UDP-Mur-NAc-トリペプチド)等を効率的に調製する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、従来、遺伝子機能の解析ツールとして利用されてきた温度感受性変異株を非許容温度で培養すること、さらにグルコース等の糖類およびバンコマイシン等の細胞壁合成阻害剤を添加することにより、細菌等の微生物の酵素の基質を効率よく調製できることを見出した。特にMurCをコードする遺伝子が変異した温度感受性変異株は、非許容温度で培養することにより、その基質であるUDP-Mur-NAcを顕著に菌体内に蓄積することからこの基質の調製方法に利用したものである。また本方法が、他の酵素の基質の調製にも利用できることを確認した。例えば、MurFの基質であるUDP-Mur-NAc-トリペプチド等も調製することができる。【００１１】
即ち、本発明は、以下の発明に関する。
[１]
（１）非許容温度で培養した場合に目的とする基質を蓄積する温度感受性変異株を許容温度で培養して菌数を増やす工程、
（２）該温度感受性変異株を、非許容温度で培養して該基質を菌体内に蓄積させる工程、
（３）菌体内から該基質を抽出する工程
を含む、目的とする基質の調製方法。
[２]
温度感受性変異株が目的とする基質に対する酵素に変異を有するものである上記[１]記載の基質の調製方法。
[３]
該酵素がMurCである上記[２]記載の基質の調製方法。
[４]
該酵素がMurFである上記[２]記載の基質の調製方法。
[５]
基質が細胞壁合成酵素の基質である上記[１]または[２]に記載の基質の調製方法。
[６]
基質がUDP-N-アセチルムラミン酸である上記[５]記載の基質の調製方法。
[７]
基質がUDP-N-アセチルムラミン酸-トリペプチドである上記[５]記載の基質の調製方法。
[８]
培養培地に糖類を添加することを特徴とする上記[１]または[２]に記載の基質の調製方法。
[９]
糖類がグルコースである上記[８]記載の基質の調製方法。
[１０]
培養培地に細胞壁合成阻害剤を添加することを特徴とする上記[１]または[２]に記載の基質の調製方法。
[１１]
細胞壁合成阻害剤がバンコマイシンである上記[１０]記載の基質の調製方法。
[１２]
細胞壁合成阻害剤がD-シクロセリンである上記[１０]記載の基質の調製方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明を利用することにより、効率的に細菌等微生物の酵素の基質を調製することができる。例えば、MurCをコードする遺伝子が変異した温度感受性変異株を使用すれば基質であるUDP-N-アセチルムラミン酸(UDP-Mur-NAc)を低いコストで効率的に提供することが可能となり、MurFをコードする遺伝子が変異した温度感受性変異株を使用すれば基質であるUDP-N-アセチルムラミン酸-トリペプチド(UDP-Mur-NAc-tripeptide)を低いコストで効率的に提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、
（１）非許容温度で培養した場合に目的とする基質を蓄積する温度感受性変異株を許容温度で培養して菌数を増やす工程、
（２）該温度感受性変異株を、非許容温度で培養して該基質を菌体内に蓄積させる工程、
（３）菌体内から該基質を抽出する工程
を含む、目的とする基質の調製方法である。
本明細書において使用される用語は、特に言及する場合を除いて当該分野で通常用いられる意味として用いられる。以下に特に本明細書で用いられる用語について説明する。【００１４】
前記「非許容温度（nonpermissive temperature）」とは、野生株は増殖できるが温度感受性変異株は増殖できない温度をいう。これは菌株毎に異なり一般的には35〜45 ℃であるが、好ましくは40 〜45 ℃であり、特に好ましくは43℃である。それに対して「許容温度（permissive temperature）」とは、野生株も温度感受性変異株も増殖できる温度をいう。これも菌株毎に異なり、一般的には 20〜37 ℃であるが、好ましくは 25〜35 ℃であり、特に好ましくは30℃である。【００１５】
前記「温度感受性変異株」とは、許容温度では増殖できるが、非許容温度では増殖できないような突然変異株を意味する。例えば、30℃では増殖できるが43℃で増殖できないような突然変異株のことである。温度感受性変異株は、少なくとも非許容温度（例えば、43℃）では、細胞機能に必要不可欠である酵素の活性が失われているので致死となるが、許容温度（例えば、30℃）では増殖できる株である。この株が許容温度で増殖できるのは、変異タンパク質の構造が許容温度では野生型のタンパク質にきわめて近い構造に保たれているからと思われる。このような温度感受性変異株の例は種々の細菌において広く知られている。【００１６】
なお、その遺伝子の突然変異株が全て温度感受性を示すとは限らない。場合によっては、30℃、43℃いずれの温度でも致死となる。そのような場合には、30℃でも増殖しないため、温度感受性変異株として樹立することができない。
また、他の場合には、30℃、43℃いずれの温度でも増殖できるものがある。その場合にも、温度感受性変異株としては同定されない。
30℃で増殖し、43℃では増殖できないという、特別な条件を満足する突然変異株だけが温度感受性変異株として選択されてくる。大腸菌を用いた研究からも、温度感受性株は、必須遺伝子の変異によることが分かっている。
なお、本発明に使用される変異株としては、特に限定されず、例えば、酵母、各種グラム陽性菌、グラム陰性菌等の各種微生物が挙げられる。【００１７】
以下に、温度感受性変異株の作製方法を説明する。この方法は関水らの方法（特開平2001-309793、Mol. Genet. Genomics., 2001年第266巻p.564）に従ったものである。【００１８】
まず温度感受性変異株を分離する必要がある。具体的には、野生型黄色ブドウ球菌を変異原で処理して、突然変異体の存在割合を高めた上で、30℃で培養する。１個の黄色ブドウ球菌は一晩で108個までに増殖し、寒天を含む培地上でコロニーと呼ばれる細菌の集合体を形成する。通常は、直径12センチのシャーレに、500個程度のコロニーを作らせる。これをマスタープレートとする。【００１９】
次に、レプリカと呼ばれるスタンプに似た方法で、該マスタープレート上の500個のコロニーを2つの異なるシャーレの寒天培地上に写し取り、一方のシャーレを30℃で、他方のシャーレを43℃で培養する。一昼夜培養後、30℃ではコロニーが現れるが43℃では現れないという、温度感受性変異株をマスタープレートから分離し、シングルコロニーアイソレーション法で精製する。【００２０】
次に、分離された温度感受性変異株を用いて、増殖に必要不可欠な遺伝子を同定する。温度感受性遺伝子の同定とは、分離した突然変異株の変異遺伝子が何であるかを決めることである。このような変異遺伝子は一般に細胞の増殖や生存に必須であることが知られている。例えば黄色ブドウ球菌のような細菌細胞には、およそ2500個の遺伝子が含まれている。そのうち1割くらいが増殖に必要不可欠なものであり、温度感受性変異に関わるものが含まれると考えられる。どの遺伝子が野生型と異なっているかを決めることは、以降のステップに進む上に必要な手順である。【００２１】
温度感受性変異株の変異遺伝子の同定方法はすでに大腸菌でよく研究されている。例えば実施例では、ショットガンクローニングと呼ばれる方法で行うことができる。これは、温度感受性変異株に、変異した遺伝子の野生型が存在すると、温度感受性が非感受性になることを利用した方法である。【００２２】
具体的には、まず野生型株から染色体DNAを抽出精製し、これを様々な制限酵素により断片化し、さらにベクターと呼ばれるDNAに繋ぎ込む。ベクターは、黄色ブドウ球菌の中で自己複製することができる寄生性のプラスミドと呼ばれるDNAである。ベクターに繋いだ遺伝子断片を、対象となる温度感受性変異株に導入し、温度感受性が温度非感受性となる株を検索する。2500の遺伝子のうち、偶発的に、変異した遺伝子に相当する野生型遺伝子を取り込んだ温度感受性変異株は、本来増殖できないはずの43℃で増殖できるようになり、コロニーを形成する。この現象は温度感受性相補と呼ばれ、43℃で野生株と同様に増殖できるようになった株は、温度感受性相補株（あるいは単に相補株）と呼ばれている。また、細胞へのDNAの注入により細胞の形質が変化する現象は、形質転換（transformation）と呼ばれている。【００２３】
形質転換体（transformant）からプラスミドDNAを抽出し、プラスミド中の染色体DNA由来部分の両端の塩基配列を解析する。現在では黄色ブドウ球菌(S.aureus)の全遺伝子の解読が終了し、塩基配列が一般公開されている(NCBI Accession No.NC-002745等)。したがって、塩基配列の一部を決定すれば、これらのデータベースを利用して染色体DNA由来部分全体の塩基配列を決定することができる。その中に含まれている遺伝子が温度感受性を相補する遺伝子(あるいは単に相補遺伝子を呼ばれることもある。）である。複数の遺伝子が含まれている場合は、複数のプラスミドを解析して、その中に共通して含まれる遺伝子を相補遺伝子として同定することもある。それでも絞りきれないときは、個々の候補遺伝子を単独でプラスミドにクローニングし、温度感受性変異株に導入して温度感受性を相補する否かを観察して相補遺伝子を決定する。【００２４】
さらに、相補遺伝子の塩基配列を用いた温度感受性変異株と親株の間で比較し、温度感受性変異株では該遺伝子に変異が生じていることを確認する。通常は、アミノ酸置換を伴う一塩基置換が生じている場合が多い。変異部位が同定できれば、相補遺伝子が温度感受性の原因遺伝子であること、つまり増殖必須遺伝子であることの確認になり、さらに、遺伝子工学的手法により任意に目的の温度感受性変異株の作製が可能となる点で、この作業は有用である。【００２５】
上記のようにして得た温度感受性変異株は許容温度（例えば30℃）では野生株と同様の培養条件により増殖できる。増殖の程度は培養液の濁度を測定することによって確認できる。細胞密度は培養液の濁度に一次比例するからである。例えば、600nmや660nm等の可視光における濁度を測定することにより確認できる。本発明の実施においては株を培養して対数増殖中期、対数増殖後期あるいは静止期まで増殖させた後に非許容温度に移行して培養することが望ましい。増殖期は予備実験として細胞増殖曲線を作成しこの結果をもとに判断することができる。一般的に黄色ブドウ球菌の温度感受性変異株については通常600nmの波長において濁度が0.3〜0.8になるまで培養した後、非許容温度へ移行するのが望ましい。この場合設定温度以外は特に培養条件を変える必要はないが、所望の基質が増加する条件に変更してもよい。【００２６】
前記「目的とする基質」とは、本発明の調製方法により調製することを目的とする基質である。好ましくは温度感受性変異株において変異を有する酵素の基質であるがこれに限定されるものではない。【００２７】
ある目的とする基質を調製する場合、培養したときにその基質を蓄積するような株を選択することが重要である。このような性質を有する株として、目的の基質を利用する特定の酵素をコードする遺伝子の一部の塩基が置換、欠失、付加または挿入を有する温度感受性変異株を用いた。このためには各種温度感受性変異株から該酵素をコードする遺伝子に変異が生じた株を選ぶか、あるいは該酵素をコードする遺伝子の変異を人工的に行うなどにより、該変異株のうち許容温度で増殖し非許容温度で増殖しない株を温度感受性変異株として取得する必要がある。この時、選択した、あるいは取得した変異株を非許容温度で培養したときに目的とする基質を蓄積するかどうかを調べなければならない。なぜなら、温度感受性株は必ずしも温度感受性化した酵素の基質を蓄積するとは限らず、蓄積量も変異箇所により異なるからである。【００２８】
菌体内における基質の種類および量の確認を行うのに、通常は菌体を超音波処理等の物理的手法により破砕する。このとき、例えばリゾスタフィンやムタノリシン等の細胞壁構造を溶解させる化学物質を添加することにより破砕が容易になる。この破砕液を遠心分離・濾過等の分離操作を行ったあと高速液体クロマトグラフィー(HPLC)等を用いることにより基質の種類および量の確認できる。例えば、試料注入から試料が検出されるまでの時間(保持時間)はその他の諸条件が同一であればそれぞれの物質に固有の値となることが知られているので物質の同定に利用できる。また、単離した物質はLC/MSやLC/MS/MS等の分析機器を利用しても確認することができる。【００２９】
本発明者らは、MurCの温度感受性変異株は許容温度で培養後に非許容温度で培養した場合、MurCの基質であるUDP-Mur-NAcをその他の代謝産物と比較して菌体内に多量に蓄積できることを見出した。このような基質蓄積現象は自明ではなく、例えば、われわれが分離したMurDやMurEの温度感受性変異株では見られなかったMurD温度感受性変異株ではその基質であるUDP-N-アセチル-ムラモイルアラニン（UDP-Mur-NAc-L-Ala）ではなくUDP-Mur-NAcが蓄積した。これはMurCが細胞壁の合成カスケードにおいて調節因子的な役割をしていることや、この酵素が合成過程において律速段階であるため結果的にこの酵素の基質が蓄積しやすい、等の理由が考えられる。本発明はMurCのこのような特性に着目し、基質の調製に利用したものである。
また、他にMurFの温度感受性変異株もその基質を蓄積させること及びグルコースやD-シクロセリン、バンコマイシン等の添加で蓄積量を増加させることから基質の調製に利用できる。【００３０】
前記「基質」とは酵素によって触媒作用を受ける化合物または分子をいう。例えば、細胞壁合成酵素、細胞質膜合成酵素、核酸合成酵素、タンパク質合成酵素、葉酸合成酵素、脂肪酸合成酵素、細胞構造合成酵素等の基質が挙げられるが、好ましくは細胞壁合成酵素の基質である。これら酵素の基質は通常複雑な糖構造を有しているので有機合成の手法を用いて調製するのは容易でない（Carbohydrate Research、1994年、252巻、p107）ため本発明の利用価値が高いといえるからである。ここで「細胞壁合成酵素」とは、細菌や酵母などの細胞壁を有する微生物が細胞壁を合成するときに用いる酵素をさす。例えば、UDP-N-アセチルグルコサミン-エノールピルビン酸転移酵素（MurA）、UDP-N-アセチル-ムラミン酸脱水素酵素(MurB)、UDP-N-アセチル-ムラミン酸-アラニン合成酵素(MurC)、UDP-N-アセチル-ムラモイルアラニン-D-グルタミン酸合成酵素(MurD)、UDP-N-アセチル-ムラモイルアラニン-D-グルタメート-2,6-ジアミノピメリン酸合成酵素、UDP-N-アセチル-ムラモイルアラニン-D-グルタメート-2,6-リジン合成酵素(MurE)、D-アラニン-D-アラニン合成酵素(ddlA,ddlB)、UDP-N-アセチル-ムラモイルアラニル-D-グルタミル-2,6-ジアミノピメリン酸-D-アラニル-D-アラニン合成酵素、UDP-N-アセチル-ムラモイルアラニル-D-グルタミル-2,6-リジン-D-アラニル-D-アラニン合成酵素(MurF)、ホスホNアセチルムラモイル-ペンタペプチド-転移酵素(MraY)、UDP-N-アセチル-グルコサミン-N-アセチルムラミル-(ペンタペプチド)ピロホスホリル-アンデカプレノルN-アセチルグルコサミン転移酵素(MurG) などが挙げられる。【００３１】
前記「基質を抽出する」とは、基質を蓄積させた後に培養物やその破砕液などの混合物から目的とする基質を単離精製することをさし、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、SDS-PAGE、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどにより、基質を菌株から分離し、調製することができる。【００３２】
本発明の調製方法における培養条件としては、温度等の特記事項を除いて、「図解微生物実験マニュアル（技報堂、1992年）」等に記載されている野生株を培養するための通常の培養条件を使用することができる。例えば「培地」は、通常培養に使用できる培地であればよく、使用する微生物に適した培地を使用すればよい。例えば、S.aureusであればLB培地の他にスタフィロコッカス培地110（酵母エキス：0.25％、ペプトン：1％，ゼラチン：3％、乳糖：0.2％、マンニット：1％、塩化ナトリウム：7.5％、リン酸水素二カリウム：0.5％、脱脂カンテン：1.5％  ｐＨ7.0）、トリプトソイ寒天培地（トリプトン：1.5％、ソイペプトン：0.5％、塩化ナトリウム：0.5％、カンテン：1.5％  pH7.3）、ミュラーヒントン培地（牛肉抽出液：30％、カゼイン水解物：1.75％、可溶性デンプン：0.15％、カンテン：1.7％  pH7.3）等が挙げられる。【００３３】
「目的とする基質に対する酵素」とは目的とする基質を利用する酵素をいう。多くの場合、目的とする基質を調製するには、目的とする基質に対する酵素に変異を有する温度感受性株を用いることが好ましい。例えば、目的とする基質がUDP-Mur-NAcであればMurCをさし、UDP-Mur-NAc-トリペプチドであればMurFをさす。【００３４】
「MurC」とは、例えば配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり式（Ｉ）に示すように、UDP-Mur-NAc(UNAM)にATP 存在下でリン酸の遊離を伴ってL-アラニンを付加する酵素をさす。UDP-Nアセチルムラミン酸-アラニン合成酵素ともいう。【００３５】
「MurCに変異を有する温度感受性変異株」とは、MurCをコードする遺伝子の塩基配列の一部が変異することによって温度感受性化した株をいう。具体的には、配列番号１であらわされるDNA配列（以下、野生株型murCともいう）の一部もしくは全部で相補することによって、その株の温度感受性が相補できるような株をいう。このような変異は通常１つの塩基が置換することにより生じることが知られている。例えばMurCをコードするオープンリーディングフレーム（以下ORFともいう。）において、以下の（表１）に示す変異を有する温度感受性株を使用できる。なお「MurCに変異を有する温度感受性変異株」は、これらの例に何ら限定されるものではないが、本発明の実施において好ましくはMurCのアミノ酸配列のN末端より第222番目のグリシンが他のアミノ酸に置換した株である。さらに好ましくはグルタミン酸もしくはアルギニンに置換した変異を含む株である（実施例2参照）。【００３６】
グルタミン酸に置換した株として例えばTS2913が挙げられる。TS2913の遺伝子配列（配列番号3）及び推定アミノ酸配列（配列番号4）を示す。この株は野生型murCのORF中665番目のグアニンがアデニンに塩基対置換型突然変異が生じたために推定アミノ酸配列のN末端より222番目のグリシンがグルタミン酸に置換されている。【００３７】
アルギニンに置換した株として例えばTS3601が挙げられる。TS3601の遺伝子配列（配列番号5）及び推定アミノ酸配列（配列番号6）を示す。この株は野生型murCのORF中664番目のグアニンがアデニンに塩基対置換型突然変異が生じたために推定アミノ酸配列のN末端より222番目のグリシンがアルギニンに置換している。【００３８】
【表１】
2006001319.tif 000003
【００３９】
前記「MurF」とは、例えば配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり式（ＩＩ）に示すように、UDP-Mur-NAc-Lアラニル-Dグルタミン酸-L-リジン(UDP-MurNAc-トリペプチド)にATP 存在下でリン酸及びADPの遊離を伴ってD-アラニル-D-アラニンを付加してUDP-Mur-NAc-ペンタペプチドを合成する酵素をさす。D-アラニル-D-アラニン付加酵素ともいう。
式（ＩＩ）：
【化２】
2006001319.tif 000004
【００４０】
「MurFに変異を有する温度感受性変異株」とは、MurFをコードする遺伝子の塩基配列の一部が変異することによって温度感受性化した株をいう。具体的には、配列番号７であらわされるDNA配列（以下、野生株型murFともいう）の一部もしくは全部で相補することによって、その株の温度感受性が相補できるような株をいう。このような変異は通常１つの塩基が置換することにより生じることが知られている。例えばMurFをコードするORFにおいて、以下の（表2）に示す変異を有する温度感受性株を使用できる。なお「MurFに変異を有する温度感受性変異株」は、これらの例に何ら限定されるものではないが、本発明の実施において好ましくはMurFのアミノ酸配列のN末端より第403番目のグリシンが他のアミノ酸に置換した変異を含む株である。さらに好ましくはアスパラギン酸に置換した株である。なぜなら、この株はこの酵素の基質であるUDP-N-アセチルムラミン酸-トリペプチドを他の変異株に比較して多量に蓄積するからである。【００４１】
アスパラギン酸に置換した株として例えばTS2571が挙げられる。TS2571の遺伝子配列（配列番号9）及び推定アミノ酸配列（配列番号10）を示す。この株は野生型murFのORF中1208番目のグアニンがアデニンに塩基対置換型突然変異が生じたために推定アミノ酸配列のN末端より403番目のグリシンがアスパラギン酸に置換している。【００４２】
【表２】
2006001319.tif 000005
【００４３】
このような「目的とする基質に対する酵素に変異を有する」温度感受性変異株は上記のように関水らの方法（特開平2001-309793、Mol. Genet. Genomics., 2001年第266巻p.564）によって取得してもよく、また遺伝子工学的手法を利用して一部の塩基を置換することによって人工的に作製してもよい。【００４４】
遺伝子工学的手法とは、例えば部位指定削除法（Nuc. Acids Res., 11, 1645, 1983）、部位特異的変異法（Zoller, M. J. et al., Methods in Enzymol., 100, 468, 1983）、PCR突然変異生成法、制限酵素処理と合成遺伝子の利用による方法等がある。部位特異的変異法であれば、例えばMolecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd Edition(2001)（Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の部位特異的変異誘発法やPCR法などの方法を用い、塩基配列の任意の位置に変異を導入することができる。【００４５】
前記「細胞壁合成酵素の基質」とは、例えばUDP-Glc-NAc、UDP-Glc-NAc-EP、UDP-Mur-NAc、UDP-Mur-NAc-L-Ala、UDP-Mur-NAc-L-Ala-D-Glu、UDP-Mur-NAc- Tripeptide(UDP-Mur-NAc-L-Ala-D-Glu-L-Lys)、UDP-Mur-NAc-Pentapeptide  (UDP-Mur-NAc-L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala-D-Ala)、UDP-Mur-NAc-Pentapeptide-p-p-lipid、Glu-NAc-Mur-NAc-Pentapeptide-p-p-lipid、ペプチドグリカン前駆体、ペプチドグリカンなど細胞壁合成酵素の基質をいうが、好ましくはUDP-Mur-NAcやUDP-Mur-NAc-Tripeptideである。【００４６】
前記「糖類」は、例えばグルコースやフルクトースやラクトースのような単糖類のほか、デンプン、グリコーゲン、セルロースなどの多糖類も含む。これらを単独でもしくは複数の種類を組み合わせて培養開始時もしくは培養中のいずれかの時期に培地中に添加することができる。また糖類を含有している培地、例えばYCC液体培地（酵母エキス：0.5％、ペプトン：1.5％、グルコース：0.45％、リン酸二カリウム：0.2％、亜硫酸ナトリウム：0.02％、pH7.2）やトリプトソイブイヨン培地（トリプトン：1.7％、ソイペプトン：0.3％、グルコース：0.25％、塩化ナトリウム：0.5％、リン酸二カリウム：0.25％、pH7.2）等を用いてもよい。好ましい実施形態としてはグルコースを培地に非許容温度移行時に添加することである。糖類の添加濃度は、グルコースについては培地中において0.1%〜5%の濃度になることが好ましく、より好ましくは0.2%〜3%であり、特に好ましくは1%である。【００４７】
前記「細胞壁合成阻害剤」としては、当技術分野ではよく知られており、ペニシリン系、セフェム系、モノバクタム系、カルバペネム系等のβ-ラクタム系、ホスホマイシン、バンコマイシン、テイコプラニン、D-シクロセリン、バシトラシンなどの化合物が挙げられる。特に好ましい実施形態としては「バンコマイシン」や「D-シクロセリン」が挙げられる。バンコマイシンは単体で使用するのみならずその塩や溶媒和物も含むものとする。このときの使用濃度は、1μg/ml〜50μg/mlであることが好ましく、より好ましくは2μg/ml〜25μg/mlであり、10μg/mlで使用するのが最も好ましい。D-シクロセリンの場合は1μg/ml〜100μg/mlであることが好ましく、より好ましくは6.25μg/ml〜62.5μg/mlであり、50μg/mlで使用するのが最も好ましい。【００４８】
以下、参考例及び実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【参考例１】
【００４９】
（リコンビナント酵素を用いたUDP-Mur-NAc の調製）
MurA及びMurBの組換えタンパク（リコンビナント酵素）の調製法
MRSA（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）の一種であるCOL株の染色体を鋳型としてPCR法にて増幅したmurA遺伝子を、発現用ベクターpET28b+にクローニングした。作製したプラスミドpKM10のmurAの塩基配列を確認後、このプラスミドを大腸菌JM109(DE3)にトランスフォームした。各菌株を18℃で660nmにおける吸光度が0.5〜0.7となるまで培養し、IPTG（イソプロピル1-チオ-β-D-ガラクトシド）の最終濃度が 1mMになるように加えさらに3時間培養の後、洗菌して集菌した。菌体を超音波破砕後、遠心で可溶性画分と沈澱画分に分離した。MurAを精製するためHis-tagが融合したタンパク質を精製することができるTALONスピンカラム（クローンテック社製）を用いて可溶性画分からMurAタンパクを精製した。SDS-PAGE後のクマシー染色とウエスタンブロット法により精製物がほぼMurAタンパクの単一バンドになっていることを確認した。同様にMurBタンパクについても調製した。
【００５０】
次に1 mM UDP-Glc-NAc(シグマアルドリッチ社製)、1 mM ホスホエノールピルビン酸 (シグマアルドリッチ社製)、0.1 mg/ml BSA、25 mM Tris-HCl (pH 7.8)の溶液に希釈したMurAの組換えタンパクを加え、37℃で一昼夜反応した。この反応液をDevelosil RPAqueous column 4.6 ×150 mm にアプライし、生成したUDP-Glc-NAc-EP を分取した。移動相には20 mM 酢酸アンモニウム(ナカライテスク社製)(pH6.0)を使用し、0.7 ml/min の流速でHPLCを行った。分取したUDP-Glc-NAc-EPを遠心エバポレーターで溶媒を除去し、蒸留水に溶解し、50 mM Tris-HCl (pH 7.8)、20 mM KCl、0.5 mM DTT、1.5 mM NADPH (シグマアルドリッチ社製)となるよう加えた反応液にMurBの組換えタンパクを添加し、37℃で一夜反応した。この反応液を同じ条件でHPLCにアプライして分析した。
【００５１】
（結果）図１に示すとおりUDP-Glc-NAc-EP、UDP-Mur-NAc、UDP-Glc-NAcの保持時間(retention time)は3.6分、4 .2分、4.6分であった。
【参考例２】
【００５２】
（murC温度感受性変異株の分離及び変異部位の同定）
pSR515プラスミドは、黄色ブドウ球菌で複製するpSR100プラスミドの複製開始部位と大腸菌で複製するpUC18プラスミドの複製開始部位を含むシャトルベクターである。黄色ブドウ球菌ゲノムDNAライブラリーの作製に使用した。
【００５３】
黄色ブドウ球菌あるいは大腸菌の培養は、LB培地（組成：1％バクトトリプトン、0.5％イーストエキストラクト、1％NaCl、pH7.0）で行った。pSR515由来プラスミドを導入した黄色ブドウ球菌または大腸菌の形質転換体の培養は、それぞれ30μg/mlのクロラムフェニコールまたは50μg/mlのアンピシリンを含むLB培地で行った。
【００５４】
黄色ブドウ球菌からの染色体DNAの抽出は、プロトプラスト法で行った。具体的には、一昼夜培養液（200 ml)を遠心集菌後、10 mlのスクロース-マグネシウム-トリス-緩衝液 (0.8M sucrose-0.04M MgSO4-0.1M Tris-Cl, pH7.6)に懸濁し、リゾスタフィン（シグマアルドリッチ社製、1m g/ml）とムタノリジン（シグマアルドリッチ社製、1mg/ml）をそれぞれ0.3 ml加え、37℃で120 分インキュベートした。遠心集菌後、5 mlの0.1M Tris-Cl-0.1M EDTA-0.15M NaClに懸濁した。0.1 mlのRNase A (シグマアルドリッチ社製、 type 1-A, 10mg/ml)を加え、37℃に60分静置した。次に0.5 mlのPronase (シグマアルドリッチ社製、 20mg/ml）を加え、37℃でさらに60分間静置した。0.6mlのSDS（10% SDSと9 5% エタノールの等量混合液）を加えて溶菌し、2サイクル/秒の速さで1分間手で激しく振って塊をほぐした。6mlフェノール抽出、水槽をさらに6 mlクロロホルム抽出した。抽出液にエタノールを加え、析出したDNAをガラス棒で巻き取った。
プラスミドDNAは、アルカリ法（Molecular Cloning, 2001年）により抽出精製した。
【００５５】
黄色ブドウ球菌ゲノムライブラリーの作製は以下の通りに行った。まず黄色ブドウ球菌の染色体DNAを制限酵素、例えばSspIやEcoRV、あるいはDNaseIで部分加水分解した。得られたDNA断片をT4DNAポリメラーゼとKlenowフラグメントで処理して末端を平滑化した。DNaseIで加水分解したDNA断片についてはさらにアガロースゲル電気泳動して1〜5kb断片を集めた。一方、ベクターであるpSR515は制限酵素SmaIで加水分解した。上記染色体DNA断片とベクターを混ぜ、T4 Ligaseを用いてライゲーションした。得られた産物をフェノール・クロロホルム処理した後、エレクトロポーレーションで大腸菌DH10B株に導入し、アンピシリン含有平板培地に植菌した。翌日出現したコロニーの数、各コロニーから抽出したプラスミドが染色体由来DNA断片を含む確率によってライブラリー中の染色体DNA部分の多様性を推測した。コロニーをかき取ってプールし、プラスミドを調製し、ゲノムDNAライブラリーとして温度感受性相補遺伝子の同定に使用した。
【００５６】
黄色ブドウ球菌  RN4220株をメタンスルホン酸エチルエステル（シグマアルドリッチ社製）で処理することにより温度感受性変異株を分離した。上記ゲノムDNAライブラリーを分離した温度感受性変異株にエレクトロポーレーション法で導入し、高温でも増殖する温度感受性相補株を分離した。種々の相補株について、導入されたライブラリープラスミドが含む染色体由来部分の両端の塩基配列を決定し、黄色ブドウ球菌のゲノムデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）から検索した結果、murC遺伝子(SA1561)を含むプラスミドを保有する複数の株を見出すことができた。
【００５７】
そこで、これらの株がmurCの温度感受性変異株である可能性を考え、野生型murC遺伝子がこれらの株の温度感受性を相補するかを検証した。まず、分離した相補株が保有するプラスミドの中にmurCのみを完全な形で含むプラスミド（pSmurC）があったのでこれを分離精製した。次に、pSmurCプラスミドをエレクトロポレーション法により試験しようとする温度感受性株に導入した結果、温度感受性が相補されることがわかった。
【００５８】
次にmurC温度感受性変異株TS1441、TS2913、TS3601、TS4304、TS9214、TS9224、TS10023のmurC遺伝子の全塩基配列を決定し、突然変異部位の同定を試みた。親株RN4220および温度感受性株の染色体DNAを鋳型として、murC遺伝子をPCRにより増幅した。このとき用いたプライマーを配列番号11及び配列番号12に示す。増幅断片の塩基配列をMolecular Cloning (2001年)等に記載の常法に従ってシークエンシング反応を行い、DNA Sequencer ABI PRISM 3100を用いて解析した。塩基配列解析の結果、それぞれのmurC温度感受性変異株において、murC遺伝子内に、ただ１つのアミノ酸置換を伴う点突然変異が生じていることを見出した。
【実施例１】
【００５９】
（MurC 温度感受性株を用いたUDP-Mur-NAcの調製）
親株であるRN4220株およびそのmurC 温度感受性株であるTS2913株それぞれについて5 mLのLB培地(日本BD社製)で30℃で一夜前培養後、2％となるようにフレッシュな5 mLのLB培地[1% グルコース (ナカライテスク社製)添加]に植菌した。それぞれの株について培養条件を変えて培養を行った。培養終了後、培養液から遠心分離により菌体を集め、500μlのリゾスタフィン溶液(シグマアルドリッチ社製)( 50μg/ml、25 mM Tris-HCl、pH7.5）に懸濁し43℃で20〜30分インキュベートした後、超音波処理(Sonifier 250、 ブランソンウルトラソニック社製)により菌体を破砕した。その菌体破砕物を高速遠心機（MX-300, トミー精工製)を用いて12,000×rpm で10分間遠心させた後、その上清についてはさらに分子量5,000カットのフィルター(Ultrafree-MC 遠心式フィルターユニット、ミリポア社製)により5,000×g で15分間遠心濾過しその濾液を抽出原液とした。【００６０】
各抽出原液について高速液体クロマトグラフィー( HPLC)を行ってUDP-Mur-NAcの産生量を調べた。カラムはHP-1100型HPLC（アジレント社製）にDevelosil RPAqueous カラム（野村化学社製）を装着して使用した。カラムは 径4.6 mm、長さ150 mm のサイズを用い、移動相として 20 mM の酢酸アンモニウム緩衝液(pH 6.0)を使用し、各抽出原液をそれぞれ 30μlアプライした。流速 0.7 ml/分で最初の10分は酢酸アンモニウム緩衝液のみで溶出し、溶出開始10分から20分にかけて0%から30%のアセトニトリルの濃度勾配を設け、20分から25分にかけて再び酢酸アンモニウム緩衝液のみで溶出した。なお調製用として径 10 mm、長さ 150 mm のカラムを使用し、流速 1.5〜2.0 mlで酢酸アンモニウムで溶出を行い参考例１の結果を参考にUDP-Mur-NAcと思われるピーク部分を分取した。【００６１】
（結果）図2は親株であるRN4220株を30℃で5時間培養して集菌した後、その抽出原液を分析したチャートである。図3はRN4220株を30℃で3時間培養後43℃に温度を上げてさらに2時間培養した後集菌し、その抽出原液を分析したチャートである。図4はMurC温度感受性株であるTS2913株を30℃で5時間培養して集菌した後、その抽出原液を分析したチャートである。図5はTS2913株を30℃で3時間培養後43℃に温度を上げてさらに2時間培養した後集菌しその抽出原液を分析したチャートである。これらの結果をもとに（表３）にUDP-MurNAcの産生量の比較を示した。UNAM(mAUs)はUDP-Mur-NAc(UNAM)のピーク面積、mAUs/μl/OD は単位アプライ量あたりのUDP-Mur-NAcの面積を培養終了時の培養液の濁度で割った比率を示している。また表中のnot detectedは検出限界以下の値であり、−はそれに伴い値を算出していないことを意味する（以下同じ）。
【表３】
2006001319.tif 000006
【００６２】
TS2913株（図4,5）においては4.3分付近でTS4220株（図2,3）では、ほとんど見られないピークが観察された。特に30℃で3時間培養後に43℃で2時間培養の条件(図5)では大きなピークが観察される。このピークを分画し、LC/MS/MS解析を行ったところポジティブm/z 680、ネガティブm/z 678 であり分子量がUDP-Mur-NAcの文献値と一致した。この結果から当該物質はUDP-Mur-NAcであると同定できた。また保持時間も参考例１のUDP-Mur-NAcのものと一致していることから、この培養条件で有意にUDP-Mur-NAcを蓄積させており高い収率で調製できる。また、1L培養をおこなった場合、培養菌体から約2.5 mg の精製 UDP-Mur-NAc を得ることができた。
【実施例２】
【００６３】
（変異パターンによる比較）
MurCの温度感受性変異株であり、変異パターンが異なる株(TS2913,TS3601,TS4303,  TS9214)について実施例１と同様にして抽出した原液について高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を行ってUDP-Mur-NAcの産生量を比較した。カラムはDevelosil RPAqueous column （4.6 ×150 mm）を使用した。移動相として 20 mM の酢酸アンモニウム緩衝液(pH 6.0)を使用し、各抽出原液をそれぞれ 30μlアプライした。流速 0.7 ml/分で最初の10分は酢酸アンモニウム緩衝液のみで溶出し、溶出開始10分から30分にかけて0%から30 %のアセトニトリルの濃度勾配を設け、30分から40分にかけて再び酢酸アンモニウム緩衝液のみで溶出した。【００６４】
（結果）（表４）においてTotal mAUs はクロマトグラムの全面積の和を示しており、UMN/Total mAUs はUDP-MurNAcのピーク面積のクロマトグラムの全面積に対する比率を示している。この結果よりMurC変異株の中でもORFにおいてN末端から222番目のグリシンが他のアミノ酸に置換した株であるTS2913又はTS3601が他の変異パターンの株と比較してUDP-Mur-NAcを多く蓄積していることがわかる。TS2913及びTS3601のmurC遺伝子の遺伝子配列を配列番号：3、5に、また前記遺伝子により推定されるアミノ酸配列を配列番号：4、6に示す。
【表４】
2006001319.tif 000007
【実施例３】
【００６５】
（グルコース及びバンコマイシンの添加による影響）
RN4220株およびそのmurC 温度感受性株であるTS2913株を5 mlのLB培地(日本BD社製)で30℃で一夜前培養後、2％となるようにフレッシュな5 mlのLB培地に植菌したものを４本ずつ用意した。30℃で約3時間培養後、培地に（１）1% Glucose及びバンコマイシンを添加（1μg/ml）（２）1% Glucoseのみを添加（３）バンコマイシン（1μg/ml）のみを添加、して43℃でさらに2時間培養した。このとき対照群としてどちらも添加しないで培養した。培養終了後、培養液から遠心分離により菌体を集め、500μlのリゾスタフィン溶液(シグマアルドリッチ社製)( 50μg/ml, 25 mM Tris-HCl, pH7.5）に懸濁し43℃で20〜30分インキュベート後、超音波処理(Sonifier 250, ブランソンウルトラソニック社製)により菌体を破砕した。その菌体破砕物を高速遠心機（MX-300, トミー精工製)を用いて12,000×rpm で10分間遠心させた後、その上清についてはさらに分子量5,000カットのフィルター(Ultrafree-MC 遠心式フィルターユニット, ミリポア社製)により5,000×gで15分間遠心ろ過しその濾液を抽出原液とした。【００６６】
各抽出原液について高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を行ってUDP-Mur-NAcの産生量を調べた。カラムはHP-1100型HPLC（アジレント社製）にD evelosil RPAqueous カラム（野村化学社製）を装着して使用した。カラムは 径4.6 mm、長さ150 mm のサイズを用い、移動相として 20 mM の酢酸アンモニウム緩衝液(pH 6.0)を使用し、各抽出原液をそれぞれ 30μlアプライした。流速 0.7ml/分で最初の10分は酢酸アンモニウム緩衝液のみで溶出し、溶出開始10分から20分にかけて0から30 % のアセトニトリルの濃度勾配を設け、20分から25分にかけて再び酢酸アンモニウム緩衝液のみで溶出した。【００６７】
（結果）（表５）にRN4220及びTS2913について各培養条件においてUDP-Mur-NAcのピーク面積（mAUs）を培養終了時の600 nmにおける菌の濁度あたりの値を示した。この結果は、グルコース(Glc)及びバンコマイシン(VCM)の添加がUDP-Mur-NAcを有意に増加させることを示している。特にTS2913株のような温度感受性変異株の培地中にグルコースもしくはバンコマイシンを添加させた場合にUDP-Mur-NAcの蓄積させることがわかる。
【表５】
2006001319.tif 000008
【００６８】
同様の試験を、参考例に従って取得したMu rFの温度感受性変異株であるTS2571（ORFの403番目のグリシンがアスパラギン酸に置換した温度感受性変異株）についても行った。（表６）に示す通りグルコース(Glc)、バンコマイシン(VCM)もしくはD-シクロセリン(CS)の添加はUDP-Mur-NAc-トリペプチドを有意に増加させることを示している。
【表６】
2006001319.tif 000009
【００６９】
また（表７）は、RN4220株を用い、37℃で3時間培養後に各種化合物を加えた後さらに一時間培養後、菌体を破砕してHPLCにアプライしたときにUDP-Mur-NAc(UNAM)の生成量を比較したものである。バンコマイシン(VCM)だけでなくオキサシリン(MPIPC)、ツニカマイシン(Tunicamycin)、D-シクロセリン(D-Cycloserine)等のように、他の細胞壁合成阻害剤を添加してもUDP-Mur-NAcの増加が確認された。一方、作用機序の異なるテトラサイクリン（蛋白質合成阻害）、リファンピシン（蛋白質合成阻害）、オフロキサシン(DNA合成阻害)などではまったく検出されなかった。これらの結果は細胞壁合成を阻害する化合物がUDP-Mur-NAc を蓄積させることを示している。
【表７】
2006001319.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】HPLCによる基質の溶出パターン。UDP-Glc-NAc-EP(3.664分)、UDP-Mur-NAc(4.248分)、UDP-Glc-NAc(4.560分)の順に溶出した。
【図２】30℃でのみ培養したRN4220株菌体抽出原液のHPLCクロマトグラム
【図３】30℃で培養後さらに43℃へ温度をあげて培養したRN4220株菌体抽出原液のHPLCクロマトグラム
【図４】30℃でのみ培養したTS2913株抽出原液のHPLCクロマトグラム
【図５】30℃で培養後さらに43℃へ温度を上げて培養したTS2913株抽出原液のHPLCクロマトグラム
【配列表フリーテキスト】
【００７１】
配列番号：１は、RN4220株のmurCの遺伝子配列である。
配列番号：２は、RN4220株のmurCにコードされる推定アミノ酸配列である。
配列番号：３は、TS2913株のmurCの遺伝子配列である。
配列番号：４は、TS2913株のmurCにコードされる推定アミノ酸配列である。
配列番号：５は、TS3601株のmurCの遺伝子配列である。
配列番号：６は、TS3601株のmurCにコードされる推定アミノ酸配列である。
配列番号：７は、RN4220株のmurＦの遺伝子配列である。
配列番号：８は、RN4220株のmurＦにコードされる推定アミノ酸配列である。
配列番号：９は、TS2571株のmurFの遺伝子配列である。
配列番号：１０は、TS2571株のmurFにコードされる推定アミノ酸配列である。
配列番号：１１は、murC遺伝子クローニング用のセンスプライマーの配列である。
配列番号：１２は、murC遺伝子クローニング用のアンチセンスプライマーの配列である。
【図１】
2006001319.tif 000011
【図２】
2006001319.tif 000012
【図３】
2006001319.tif 000013
【図４】
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【図５】
2006001319.tif 000015
【配列表】
2006001319000001.app
【国際調査報告】
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2006001319.tif 000017
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