【手続補正書】
【提出日】令和2年4月10日(2020.4.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象から得られた生物学的試料中の標的核酸を増幅するための方法であって、生物学的試料は対象由来の細胞又は細胞破砕物を含み、前記方法は、
(a)生物学的試料中の細胞を溶解させて溶解物を形成するステップ、
(b)溶解物に緩衝剤を含む緩衝液を添加して反応混合物を形成するステップであって、緩衝液は室温で適度にアルカリ性のpHを有するステップ、
(c)ステップ(b)に続き、反応混合物を加熱して変性反応混合物を形成するステップ、
(d)変性反応混合物に熱安定性核酸ポリメラーゼを添加するステップ、及び、
(e)標的核酸を増幅して単位複製配列を含む増幅溶液を形成するステップ、
を含む、前記方法。
【請求項２】
ステップ(d)における熱安定性核酸ポリメラーゼの終濃度が、変性反応混合物1マイクロリットル当たり少なくとも約0.02ユニットである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ステップ(d)が、変性反応混合物1マイクロリットル当たり少なくとも約2.4x10-5マイクログラムの熱安定性核酸ポリメラーゼを変性反応混合物に添加するステップを含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
生物学的試料が約0.2mL〜約5mLである、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
生物学的試料が血液、血の混じった液体、組織試料及び痰から成る群より選択される、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
(i)血液が全血、粗血液溶解物、血清又は血漿であるか、
(ii)血の混じった液体が、傷からの滲出液、痰又は胆汁であるか、又は、
(iii)組織試料が組織生検である、
請求項５記載の方法。
【請求項７】
(i)組織生検が皮膚生検、筋肉生検又はリンパ節生検であるか、又は、(ii)組織試料がホモジナイズされた組織試料である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
全血試料中の標的核酸を増幅するための方法であって、前記方法は、
(a)対象由来の全血試料中の赤血球を溶解させることによって生成される粗血液溶解物を用意し、試料を遠心して上清と細胞を含むペレットとを形成し、上清の一部又は全部を廃棄し、任意選択でペレットを洗浄し、及びペレット中の細胞を溶解させるステップ、
(b)粗血液溶解物に緩衝剤を含む緩衝液を添加して反応混合物を形成するステップであって、緩衝液は室温で適度にアルカリ性のpHを有するステップ、
(c)ステップ(b)に続き、反応混合物を加熱して変性反応混合物を形成するステップ、
(d)変性反応混合物に熱安定性核酸ポリメラーゼを添加するステップであって、熱安定性核酸ポリメラーゼの終濃度は変性反応混合物1マイクロリットル当たり少なくとも約0.02ユニットであるステップ、並びに、
(e)標的核酸を増幅して単位複製配列を含む増幅溶液を形成するステップ、
を含む、前記方法。
【請求項９】
全血試料中の標的核酸を増幅するための方法であって、
(a)対象由来の全血試料中の赤血球を溶解させることによって生成される粗血液溶解物を用意し、試料を遠心して上清と細胞を含むペレットとを形成し、上清の一部又は全部を廃棄し、任意選択でペレットを洗浄し、及びペレット中の細胞を溶解させるステップ、
(b)粗血液溶解物に緩衝剤を含む緩衝液を添加して反応混合物を形成するステップであって、緩衝液は室温で適度にアルカリ性のpHを有するステップ、
(c)ステップ(b)に続き、反応混合物を加熱して変性反応混合物を形成するステップ、
(d)変性反応混合物1マイクロリットル当たり少なくとも約2.4x10-5マイクログラムの熱安定性核酸ポリメラーゼを変性反応混合物に添加するステップ、並びに、
(e)標的核酸を増幅して、単位複製配列を含む増幅溶液を形成するステップ、
を含む、前記方法。
【請求項１０】
(i)ステップ(c)がステップ(d)の前に変性反応混合物を遠心するステップをさらに含むか、及び/又は、
(ii)前記方法が、ステップ(b)中又はステップ(d)中に、デオキシヌクレオチド三リン酸（dNTPs）、マグネシウム、フォワードプライマー、及び/又はリバースプライマーを添加するステップを含む、
請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
(i)全血試料が約0.2mL〜約5mLであるか、
(ii)全血試料から生成される粗血液溶解物が約10μL〜約500μLの容量を有するか、及び/又は、
(iii)ステップ(b)の反応混合物が約1％〜約70％の粗血液溶解物を含有する、
請求項８〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
未処理全血を含む試料中の標的核酸を増幅するための方法であって、前記方法は、
(a)緩衝剤を含む緩衝液、dNTPs、マグネシウム、フォワードプライマー、リバースプライマー及び熱安定性核酸ポリメラーゼを含む混合物を用意するステップであって、緩衝液は室温で適度にアルカリ性のpHを有し、熱安定性核酸ポリメラーゼの終濃度は混合物1マイクロリットル当たり少なくとも約0.02ユニットであるステップ、
(b)混合物に対象から得られた全血試料の一部を添加して反応混合物を形成するステップ、並びに、
(c)標的核酸を増幅して単位複製配列を含む増幅溶液を形成するステップ、
を含む、前記方法。
【請求項１３】
全血を含む試料中の標的核酸を増幅するための方法であって、前記方法は、
(a)緩衝剤を含む緩衝液、dNTPs、マグネシウム、フォワードプライマー、リバースプライマー及び熱安定性核酸ポリメラーゼを含む混合物を用意するステップであって、緩衝液は室温で適度にアルカリ性のpHを有し、混合物は混合物1マイクロリットル当たり少なくとも約2.4x10-5マイクログラムの熱安定性核酸ポリメラーゼを含有するステップ、
(b)混合物に対象から得られた全血試料の一部を添加して反応混合物を形成するステップ、並びに、
(c)標的核酸を増幅して単位複製配列を含む増幅溶液を形成するステップ、
を含む、前記方法。
【請求項１４】
反応混合物が約1％〜約50％（v/v）の全血を含有する、請求項１２又は１３記載の方法。
【請求項１５】
(i)室温での適度にアルカリ性のpHが約pH7.1〜約pH10.5であるか、及び/又は、
(ii)緩衝液のpHが95℃でおよそ中性pHのままであるか又は中性pHよりも上のままである、
請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
(i)室温での適度にアルカリ性のpHが約pH8.7であるか、及び/又は、
(ii)緩衝液のpHが95℃で約7.2である、
請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
熱安定性核酸ポリメラーゼの終濃度が約0.02〜約0.8ユニット/μLの範囲である、請求項２〜８、１０〜１２又は１４〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
熱安定性核酸ポリメラーゼの終濃度が、変性反応混合物又は反応混合物1マイクロリットル当たり約2.4x10-5マイクログラム〜約0.01マイクログラムである、請求項３〜７、９〜１１又は１３〜１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
熱安定性核酸ポリメラーゼが熱安定性DNAポリメラーゼである、請求項１〜１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
熱安定性DNAポリメラーゼが野生型熱安定性DNAポリメラーゼ又は変異型熱安定性DNAポリメラーゼである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
(i)野生型熱安定性DNAポリメラーゼが、テルムス・アクウァーティクス（Thermus aquaticus）（Taq）DNAポリメラーゼ、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）（Tth）DNAポリメラーゼ、サーマス・フィリフォルミス（Thermus filiformis）（Tfi）DNAポリメラーゼ、サーマス・フラブス（Thermus flavus）（Tfl）DNAポリメラーゼ、サーモトガ・マリティマ（Thermatoga maritima）（Tma）DNAポリメラーゼ、テルムス属（Thermus）種Z05 DNAポリメラーゼ、又は古細菌ポリメラーゼであるか、
(ii)変異型熱安定性DNAポリメラーゼが、Klentaq（登録商標） 1、Klentaq（登録商標） LA、Cesium Klentaq（登録商標） AC、Cesium Klentaq（登録商標） AC LA、Cesium Klentaq（登録商標） C、Cesium Klentaq（登録商標） C LA、Omni Klentaq（登録商標）、Omni Klentaq（登録商標） 2、Omni Klentaq（登録商標） LA、Omni Taq、OmniTaq LA、Omni Taq 2、Omni Taq 3、Hemo KlenTaq（登録商標）、KAPA Blood DNA polymerase、KAPA3G Plant DNA polymerase、KAPA 3G Robust DNA polymerase、MyTaq（商標） Blood、及びPHUSION（登録商標） Blood II DNA polymeraseから成る群より選択されるか、又は、
(iii)変異型熱安定性DNAポリメラーゼが、ホットスタート熱安定性DNAポリメラーゼである、
請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ホットスタート熱安定性DNAポリメラーゼがAPTATAQ（商標）、Hawk Z05、又はPHUSION（登録商標） Blood II DNA polymeraseである、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
熱安定性核酸ポリメラーゼが通常の反応条件下で対象由来の細胞又は細胞破砕物の存在によって阻害される、請求項１〜２２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
熱安定性核酸ポリメラーゼが通常の反応条件下で全血の存在によって阻害される、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
熱安定性核酸ポリメラーゼが通常の反応条件下で1％（v/v）の全血によって阻害される、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
通常の反応条件が熱安定性DNAポリメラーゼの製造者によって推奨される反応条件である、請求項２３〜２５のいずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
前記方法がマルチプレックス化PCR反応において1以上の付加的な標的核酸を増幅して1以上の付加的な単位複製配列を生成するステップをさらに含む、請求項１〜２６のいずれか１項記載の方法。
【請求項２８】
単位複製配列が少なくとも10μgの対象DNAの存在下で生成される、請求項１〜２７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２９】
前記方法の結果として少なくとも106コピーの単位複製配列の生成がもたらされる、請求項１〜２８のいずれか１項記載の方法。
【請求項３０】
前記方法の結果として少なくとも109コピーの単位複製配列の生成がもたらされる、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
単位複製配列又は1以上の付加的な単位複製配列を検出するステップをさらに含む、請求項１〜３０のいずれか１項記載の方法。
【請求項３２】
単位複製配列又は1以上の付加的な単位複製配列が、光学的測定、蛍光測定、質量測定、密度測定、磁性測定、クロマトグラフィー測定及び/又は電気化学的測定によって検出される、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
単位複製配列を検出するステップが、以下のステップ：
(a')増幅溶液の一部分に増幅溶液1ミリリットル当たり1x106〜1x1013の磁性粒子を添加することによってアッセイ試料を調製するステップであって、磁性粒子が700nm〜950nmの平均直径と、それらの表面上に結合性部分とを有し、結合性部分が単位複製配列の存在下で磁性粒子の凝集を変更するように作動するものであり、前記磁性粒子が1x109〜1x1012mM-1s-1の粒子1つ当たりのT2緩和度を有するステップ、
(b')アッセイ試料をデバイス内の検出チューブに用意するステップであって、デバイスが、アッセイ試料を含む検出チューブを保持するウェルを規定する支持体を含み、1つ以上の磁石及びRFパルス列を使用して創出されたバイアス磁界へと混合物を曝露することによりもたらされる信号を検出するように構成されたRFコイルを有するステップ、
(c')アッセイ試料を、バイアス磁界及びRFパルス列へと曝露するステップ、
(d')ステップ(c')に続き、アッセイ試料によって生成された信号を測定し、それによって単位複製配列が存在するか又存在しないかを検出するステップ、
を含む、請求項３１又は３２記載の方法。
【請求項３４】
磁性粒子が、第1のプローブへとコンジュゲートさせた磁性粒子の第1の集団、及び第2のプローブへとコンジュゲートさせた磁性粒子の第2の集団を含み、第1のプローブが単位複製配列の第1のセグメントに結合するように作動し、第2のプローブが単位複製配列の第2のセグメントに結合するように作動し、磁性粒子が単位複製配列の存在下で凝集物を形成する、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
検出がステップ(a)の開始から4時間以内に起きる、請求項３３又は３４記載の方法。
【請求項３６】
前記方法が1012コピーの単位複製配列を検出することができる、請求項３１〜３５のいずれか１項記載の方法。
【請求項３７】
標的核酸が病原体に特徴的である、請求項１〜３６のいずれか１項記載の方法。
【請求項３８】
病原体が真菌病原体、細菌病原体、原生動物病原体又はウイルス病原体である、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
真菌病原体がカンジダ属(Candida)種である、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
カンジダ属(Candida)種が、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・ギリエルモンディ(Candida guilliermondii)、カンジダ・グラブラータ(Candida glabrata)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ルシタニエ(Candida lusitaniae)、カンジダ・パラプシローシス(Candida parapsilosis)及びカンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)から成る群より選択される、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
細菌病原体が、アシネトバクター・バウマニ(Acinetobacter baumannii)、大腸菌(Escherichia coli)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、ボレリア・アフゼリ（Borrelia afzelii）、ボレリア・ガリニ（Borrelia garinii）、リケッチア・リケッチイ（Rickettsia rickettsii）、アナプラズマ・ファゴサイトフイルム（Anaplasma phagocytophilum）、コクシエラ・ブルネッティ（Coxiella burnetii）、エーリキア・シャフェンシス（Ehrlichia chaffeensis）、エーリキア・エウィンギイ（Ehrlichia ewingii）、野兎病菌（Francisella tularensis）、肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）及び髄膜炎菌（Neisseria meningitides）から成る群より選択される、請求項３８記載の方法。
【請求項４２】
原生動物病原体がバベシア・マイクロティ（Babesia microti）又は多型バベシア（Babesia divergens）である、請求項３８記載の方法。
【請求項４３】
前記方法が全血試料中の約1、3、5又は10コロニー形成ユニット（CFU）/mLの濃度の病原体種を検出することができる、請求項３７〜４２のいずれか１項記載の方法。
【請求項４４】
単位複製配列の検出に基づいて対象を診断するステップをさらに含み、単位複製配列の存在によって対象が病原体に関連する疾患を罹患していることが示される、請求項３７〜４３のいずれか１項記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２０】
他の実施形態は、特許請求の範囲内にある。
以下、本発明の実施形態を示す。
（１）対象から得られた生物学的試料中の標的核酸を増幅するための方法であって、生物学的試料は対象由来の細胞又は細胞破砕物を含み、前記方法は、
(a)生物学的試料中の細胞を溶解させて溶解物を形成するステップ、
(b)溶解物に緩衝剤を含む緩衝液を添加して反応混合物を形成するステップであって、緩衝液は室温で適度にアルカリ性のpHを有するステップ
(c)ステップ(b)に続き、反応混合物を加熱して変性反応混合物を形成するステップ
(d)変性反応混合物に熱安定性核酸ポリメラーゼを添加するステップ、及び
(e)標的核酸を増幅して単位複製配列を含む増幅溶液を形成するステップ
を含む方法。
（２）ステップ(d)における熱安定性核酸ポリメラーゼの終濃度が、変性反応混合物1マイクロリットル当たり少なくとも約0.02ユニットである、（１）記載の方法。
（３）ステップ(d)が、変性反応混合物1マイクロリットル当たり少なくとも約2.4x10-5マイクログラムの熱安定性核酸ポリメラーゼを変性反応混合物に添加するステップを含む、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）生物学的試料が約0.2mL〜約5mLである、（１）〜（３）のいずれか一に記載の方法。
（５）生物学的試料が約0.9mLである、（４）記載の方法。
（６）生物学的試料が血液、血の混じった液体、組織試料及び痰からなる群より選択される、（１）〜（５）のいずれか一に記載の方法。
（７）血液が全血、粗血液溶解物、血清又は血漿である、（６）記載の方法。
（８）血の混じった液体が、傷からの滲出液、痰又は胆汁である、（６）記載の方法。
（９）組織試料が組織生検である、（６）記載の方法。
（１０）組織生検が皮膚生検、筋肉生検又はリンパ節生検である、（９）記載の方法。
（１１）組織試料がホモジナイズされた組織試料である、（６）、（９）又は（１０）のいずれか一に記載の方法。
（１２）全血試料中の標的核酸を増幅するための方法であって、前記方法は、
(a)対象由来の全血試料中の赤血球を溶解させることによって生成される粗血液溶解物を用意し、試料を遠心して上清と細胞を含むペレットとを形成し、上清の一部又は全部を廃棄し、任意選択でペレットを洗浄し、及びペレット中の細胞を溶解させるステップ、
(b)粗血液溶解物に緩衝剤を含む緩衝液を添加して反応混合物を形成するステップであって、緩衝液は室温で適度にアルカリ性のpHを有するステップ
(c)ステップ(b)に続き、反応混合物を加熱して変性反応混合物を形成するステップ
(d)変性反応混合物に熱安定性核酸ポリメラーゼを添加するステップであって、熱安定性核酸ポリメラーゼの終濃度は変性反応混合物1マイクロリットル当たり少なくとも約0.02ユニットであるステップ、並びに
(e)標的核酸を増幅して単位複製配列を含む増幅溶液を形成するステップ
を含む方法。
（１３）全血試料中の標的核酸を増幅するための方法であって、
(a)対象由来の全血試料中の赤血球を溶解させることによって生成される粗血液溶解物を用意し、試料を遠心して上清と細胞を含むペレットとを形成し、上清の一部又は全部を廃棄し、任意選択でペレットを洗浄し、及びペレット中の細胞を溶解させるステップ、
(b)粗血液溶解物に緩衝剤を含む緩衝液を添加して反応混合物を形成するステップであって、緩衝液は室温で適度にアルカリ性のpHを有するステップ
(c)ステップ(b)に続き、反応混合物を加熱して変性反応混合物を形成するステップ
(d)変性反応混合物1マイクロリットル当たり少なくとも約2.4x10-5マイクログラムの熱安定性核酸ポリメラーゼを変性反応混合物に添加するステップ、並びに
(e)標的核酸を増幅して、単位複製配列を含む増幅溶液を形成するステップ
を含む方法。
（１４）ステップ(c)がステップ(d)の前に変性反応混合物を遠心するステップをさらに含む、（１）〜（１３）のいずれか一に記載の方法。
（１５）前記方法が、ステップ(b)中又はステップ(d)中に、(i)デオキシヌクレオチド三リン酸（dNTPs）、(ii)マグネシウム、(iii)フォワードプライマー、及び／又は(iv)リバースプライマーを添加するステップを含む、（１）〜（１４）のいずれか一に記載の方法。
（１６）全血試料が約0.2mL〜約5mLである、（１２）〜（１５）のいずれか一に記載の方法。
（１７）全血試料が約0.9mLである、（１６）記載の方法。
（１８）全血試料から生成される粗血液溶解物が約10μL〜約500μLの容量を有する、（１２）〜（１７）のいずれか一に記載の方法。
（１９）全血試料から生成される粗血液溶解物が約25μL〜約200μLの容量を有する、（１８）記載の方法。
（２０）全血試料から生成される粗血液溶解物が約50μLの容量を有する、（１９）記載の方法。
（２１）ステップ(b)の反応混合物が約1％〜約70％の粗血液溶解物を含有する、（１２）〜（２０）のいずれか一に記載の方法。
（２２）ステップ(b)の反応混合物が約50％の粗血液溶解物を含有する、（２1）記載の方法。
（２３）未処理全血を含む試料中の標的核酸を増幅するための方法であって、前記方法は、
(a)緩衝剤を含む緩衝液、dNTPs、マグネシウム、フォワードプライマー、リバースプライマー及び熱安定性核酸ポリメラーゼを含む混合物を用意するステップであって、緩衝液は室温で適度にアルカリ性のpHを有し、熱安定性核酸ポリメラーゼの終濃度は混合物1マイクロリットル当たり少なくとも約0.02ユニットであるステップ、
(b)混合物に対象から得られた全血試料の一部を添加して反応混合物を形成するステップ、並びに
(c)標的核酸を増幅して単位複製配列を含む増幅溶液を形成するステップ
を含む方法。
（２４）全血を含む試料中の標的核酸を増幅するための方法であって、前記方法は、
(a)緩衝剤を含む緩衝液、dNTPs、マグネシウム、フォワードプライマー、リバースプライマー及び熱安定性核酸ポリメラーゼを含む混合物を用意するステップであって、緩衝液は室温で適度にアルカリ性のpHを有し、混合物は混合物1マイクロリットル当たり少なくとも約2.4x10-5マイクログラムの熱安定性核酸ポリメラーゼを含有するステップ
(b)混合物に対象から得られた全血試料の一部を添加して反応混合物を形成するステップ、並びに
(c)標的核酸を増幅して単位複製配列を含む増幅溶液を形成するステップ
を含む方法。
（２５）反応混合物が約1％〜約50％（v/v）の全血を含有する、（２３）又は（２４）に記載の方法。
（２６）反応混合物が約30％〜約40％（v/v）の全血を含有する、（２５）記載の方法。
（２７）室温での適度にアルカリ性のpHが約pH7.1〜約pH10.5である、（１）〜（２６）のいずれか一に記載の方法。
（２８）室温での適度にアルカリ性のpHが約pH7.5〜約pH9.5である、（２７）記載の方法。
（２９）室温での適度にアルカリ性のpHが約pH8〜約pH9である、（２８）記載の方法。
（３０）室温での適度にアルカリ性のpHが約pH8.7である、（２９）記載の方法。
（３１）緩衝液のpHが95℃でおよそ中性pHのままであるか又は中性pHよりも上のままである、（１）〜（３０）のいずれか一に記載の方法。
（３２）緩衝液のpHが95℃で約6.5〜約9.0である、（３１）記載の方法。
（３３）緩衝液のpHが95℃で約7.0〜約8.5である、（３２）記載の方法。
（３４）緩衝液のpHが95℃で約7.0〜約7.5である、（３３）記載の方法。
（３５）緩衝液のpHが95℃で約7.2である、（３３）又は（３４）に記載の方法。
（３６）熱安定性核酸ポリメラーゼの終濃度が約0.02〜約0.8ユニット/μLの範囲である、（２）〜（１２）、（１４）〜（２３）、又は（２５）〜（３５）のいずれか一に記載の方法。
（３７）熱安定性核酸ポリメラーゼの終濃度が約0.125〜約0.5ユニット/μLの範囲である、（３６）記載の方法。
（３８）熱安定性核酸ポリメラーゼの終濃度が約0.125〜約0.25ユニット/μLの範囲である、（３７）記載の方法。
（３９）熱安定性核酸ポリメラーゼの終濃度が、変性反応混合物又は反応混合物1マイクロリットル当たり約2.4x10-5マイクログラム〜約0.01マイクログラムである、（３）〜（１１）、（１３）〜（２２）、又は（２４）〜（３８）のいずれか一に記載の方法。
（４０）熱安定性核酸ポリメラーゼの終濃度が、変性反応混合物又は反応混合物1マイクロリットル当たり約2.4x10-5マイクログラム〜約0.001マイクログラムである、（３９）記載の方法。
（４１）熱安定性核酸ポリメラーゼの終濃度が、変性反応混合物又は反応混合物1マイクロリットル当たり約2.4x10-5マイクログラム〜約0.0001マイクログラムである、（４０）記載の方法。
（４２）熱安定性核酸ポリメラーゼが熱安定性DNAポリメラーゼである、（１）〜（４１）のいずれか一に記載の方法。
（４３）熱安定性DNAポリメラーゼが野生型熱安定性DNAポリメラーゼ又は変異型熱安定性DNAポリメラーゼである、（４２）記載の方法。
（４４）野生型熱安定性DNAポリメラーゼが、テルムス・アクウァーティクス（Thermus aquaticus）（Taq）DNAポリメラーゼ、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）（Tth）DNAポリメラーゼ、サーマス・フィリフォルミス（Thermus filiformis）（Tfi）DNAポリメラーゼ、サーマス・フラブス（Thermus flavus）（Tfl）DNAポリメラーゼ、サーモトガ・マリティマ（Thermatoga maritima）（Tma）DNAポリメラーゼ、テルムス属（Thermus）種Z05 DNAポリメラーゼ、又は古細菌ポリメラーゼである、（４３）記載の方法。
（４５）変異型熱安定性DNAポリメラーゼが、Klentaq（登録商標） 1、Klentaq（登録商標） LA、Cesium Klentaq（登録商標） AC、Cesium Klentaq（登録商標） AC LA、Cesium Klentaq（登録商標） C、Cesium Klentaq（登録商標） C LA、Omni Klentaq（登録商標）、Omni Klentaq（登録商標） 2、Omni Klentaq（登録商標） LA、Omni Taq、OmniTaq LA、Omni Taq 2、Omni Taq 3、Hemo KlenTaq（登録商標）、KAPA Blood DNA polymerase、KAPA3G Plant DNA polymerase、KAPA 3G Robust DNA polymerase、MyTaq（商標） Blood、及びPHUSION（登録商標） Blood II DNA polymeraseからなる群より選択される、（４３）記載の方法。
（４６）変異型熱安定性DNAポリメラーゼが、ホットスタート熱安定性DNAポリメラーゼである、（４３）記載の方法。
（４７）ホットスタート熱安定性DNAポリメラーゼがAPTATAQ（商標）、Hawk Z05、又はPHUSION（登録商標） Blood II DNA polymeraseである、（４６）記載の方法。
（４８）熱安定性核酸ポリメラーゼが通常の反応条件下で対象由来の細胞又は細胞破砕物の存在によって阻害される、（１）〜（４７）のいずれか一に記載の方法。
（４９）熱安定性核酸ポリメラーゼが通常の反応条件下で全血の存在によって阻害される、（４８）記載の方法。
（５０）熱安定性核酸ポリメラーゼが通常の反応条件下で1％（v/v）の全血によって阻害される、（４９）記載の方法。
（５１）熱安定性核酸ポリメラーゼが通常の反応条件下で8％（v/v）の全血によって阻害される、（５０）記載の方法。
（５２）通常の反応条件が熱安定性DNAポリメラーゼの製造者によって推奨される反応条件である、（４８）〜（５１）のいずれか一に記載の方法。
（５３）前記方法がマルチプレックス化PCR反応において1以上の付加的な標的核酸を増幅して1以上の付加的な単位複製配列を生成するステップをさらに含む、（１）〜（５２）のいずれか一に記載の方法。
（５４）単位複製配列が少なくとも10μgの対象DNAの存在下で生成される、（１）〜（５３）のいずれか一に記載の方法。
（５５）単位複製配列が少なくとも20μgの対象DNAの存在下で生成される、（５４）記載の方法。
（５６）単位複製配列が少なくとも35μgの対象DNAの存在下で生成される、（５５）記載の方法。
（５７）前記方法の結果として少なくとも106コピーの単位複製配列の生成がもたらされる、（１）〜（５６）のいずれか一に記載の方法。
（５８）前記方法の結果として少なくとも109コピーの単位複製配列の生成がもたらされる、（５７）記載の方法。
（５９）前記方法の結果として少なくとも1010コピーの単位複製配列の生成がもたらされる、（５８）記載の方法。
（６０）前記方法の結果として少なくとも1012コピーの単位複製配列の生成がもたらされる、（５９）記載の方法。
（６１）単位複製配列又は1以上の付加的な単位複製配列を検出するステップをさらに含む、（１）〜（６０）のいずれか一に記載の方法。
（６２）単位複製配列又は1以上の付加的な単位複製配列が、光学的測定、蛍光測定、質量測定、密度測定、磁性測定、クロマトグラフィー測定及び／又は電気化学的測定によって検出される、（６１）記載の方法。
（６３）単位複製配列を検出するステップが、以下のステップ：
(a')増幅溶液の一部分に増幅溶液1ミリリットル当たり1x106〜1x1013の磁性粒子を添加することによってアッセイ試料を調製するステップであって、磁性粒子が700nm〜950nmの平均直径と、それらの表面上に結合性部分とを有し、結合性部分が単位複製配列の存在下で磁性粒子の凝集を変更するように作動するものであり、前記磁性粒子が1x109〜1x1012mM-1s-1の粒子1つ当たりのT2緩和度を有するステップ、
(b')アッセイ試料をデバイス内の検出チューブに用意するステップであって、デバイスが、アッセイ試料を含む検出チューブを保持するウェルを規定する支持体を含み、1つ以上の磁石及びRFパルス列を使用して創出されたバイアス磁界へと混合物を曝露することによりもたらされる信号を検出するように構成されたRFコイルを有するステップ、
(c')アッセイ試料を、バイアス磁界及びRFパルス列へと曝露するステップ、
(d')ステップ(c')に続き、アッセイ試料によって生成された信号を測定し、それによって単位複製配列が存在するか又存在しないかを検出するステップ
を含む、（６１）又は（６２）に記載の方法。
（６４）磁性粒子が、第1のプローブへとコンジュゲートさせた磁性粒子の第1の集団、及び第2のプローブへとコンジュゲートさせた磁性粒子の第2の集団を含み、第1のプローブが単位複製配列の第1のセグメントに結合するように作動し、第2のプローブが単位複製配列の第2のセグメントに結合するように作動し、磁性粒子が単位複製配列の存在下で凝集物を形成する、（６３）記載の方法。
（６５）検出がステップ(a)の開始から4時間以内に起きる、（６３）又は（６４）に記載の方法。
（６６）検出がステップ(a)の開始から3時間以内に起きる、（６５）記載の方法。
（６７）前記方法が1012コピーの単位複製配列を検出することができる、（６１）〜（６６）のいずれか一に記載の方法。
（６８）前記方法が1010コピーの単位複製配列を検出することができる、（６７）記載の方法。
（６９）前記方法が109コピーの単位複製配列を検出することができる、（６８）記載の方法。
（７０）標的核酸が病原体に特徴的である、（１）〜（６９）のいずれか一に記載の方法。
（７１）病原体が真菌病原体、細菌病原体、原生動物病原体又はウイルス病原体である、（７０）記載の方法。
（７２）真菌病原体がカンジダ属(Candida)種である、（７１）記載の方法。
（７３）カンジダ属(Candida)種が、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・ギリエルモンディ(Candida guilliermondii)、カンジダ・グラブラータ(Candida glabrata)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ルシタニエ(Candida lusitaniae)、カンジダ・パラプシローシス(Candida parapsilosis)及びカンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)からなる群より選択される、（７２）記載の方法。
（７４）細菌病原体が、アシネトバクター・バウマニ(Acinetobacter baumannii)、大腸菌(Escherichia coli)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、ボレリア・アフゼリ（Borrelia afzelii）、ボレリア・ガリニ（Borrelia garinii）、リケッチア・リケッチイ（Rickettsia rickettsii）、アナプラズマ・ファゴサイトフイルム（Anaplasma phagocytophilum）、コクシエラ・ブルネッティ（Coxiella burnetii）、エーリキア・シャフェンシス（Ehrlichia chaffeensis）、エーリキア・エウィンギイ（Ehrlichia ewingii）、野兎病菌（Francisella tularensis）、肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）及び髄膜炎菌（Neisseria meningitides）からなる群より選択される、（７１）記載の方法。
（７５）原生動物病原体がバベシア・マイクロティ（Babesia microti）又は多型バベシア（Babesia divergens）である、（７１）記載の方法。
（７６）前記方法が全血試料中の約10コロニー形成ユニット（CFU）/mLの濃度の病原体種を検出することができる、（７０）〜（７５）のいずれか一に記載の方法。
（７７）前記方法が全血試料中の約5 CFU/mLの濃度の病原体種を検出することができる、（７６）記載の方法。
（７８）前記方法が全血試料中の約3 CFU/mLの濃度の病原体種を検出することができる、（７７）記載の方法。
（７９）前記方法が全血試料中の約1 CFU/mLの濃度の病原体種を検出することができる、（７８）記載の方法。
（８０）単位複製配列の検出に基づいて対象を診断するステップをさらに含み、単位複製配列の存在によって対象が病原体に関連する疾患を罹患していることが示される、（７０）〜（７９）のいずれか一に記載の方法。
（８１）前記方法が好適な治療法を対象に付与するステップをさらに含む、（８０）記載の方法。