【手続補正書】
【提出日】令和2年5月22日(2020.5.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
頬上皮細胞懸濁液の調製方法であって、
(a) 頬粘膜組織を対象から採取するステップ;
(b) (a)からの組織を化学的解離剤で処理するステップ;
(c) (b)からの組織サンプルを栄養培地で洗浄するステップ;
(d) 洗浄した組織の真皮から表皮を分離するステップ;
(e) ミンチにし、ろ過して、表皮から均一な上皮細胞懸濁液を得るステップ;
(f) 任意選択で、播種して、細胞増殖を可能にするステップ;
(g) 酵素(複数可)を用いて細胞単層を採取するステップ;
(h) 遠心分離し、上清を捨てるステップ;
(i) 栄養培地と混合するステップ;
(j) 頬上皮細胞懸濁液を分析するステップ;
(k) V字形1mlバイアル中に0.4mlの頬上皮細胞懸濁液を充填するステップ; 及び
(l) 任意選択で、(a)におけるのと同じ対象へ輸送するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
対象が、成人対象である、請求項１に記載の頬上皮細胞懸濁液の調製方法。
【請求項３】
前記方法が、任意選択で、対象の尿道の欠損部位に頬上皮細胞懸濁液を膀胱鏡的に移植しながら、ゲルと混合するステップをさらに含み、ゲルが、生体適合性送達システム、例えば、フィブリノゲン及び/又はトロンビン及び/又は熱可逆性ゲル化ポリマー(TGP)ゲル及び/又はキトサンなどの組み合わせから選択される、請求項１に記載の頬上皮細胞懸濁液の調製方法。
【請求項４】
化学的解離剤が、トリプシン、ディスパーゼ、コラゲナーゼ、トリプシン-EDTA、プロナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、パパイン、及びパンクレアチンから選択される、請求項１に記載の頬上皮細胞懸濁液の調製方法。
【請求項５】
栄養培地が、必要な増殖因子を有する、DMEM、EMEM、F12、IMDMなどから選択される、請求項１に記載の頬上皮細胞懸濁液の調製方法。
【請求項６】
播種が、T-25及び/又はT-75及び/又はT-150フラスコなどの中で行われる、請求項１に記載の頬上皮細胞懸濁液の調製方法。
【請求項７】
採取のための酵素が、トリプシン-EDTA、コラゲナーゼなどから選択される、請求項１に記載の頬上皮細胞懸濁液の調製方法。
【請求項８】
実施される分析が、外観、無菌性、マイコプラズマ、内毒素、細胞計数、細胞生存性、細胞純度試験、細胞特徴付け、及び核型決定分析である、請求項１に記載の頬上皮細胞懸濁液の調製方法。
【請求項９】
採取される頬粘膜組織が、成人の頬の内側由来であり、約1×1.5cm2である、請求項１に記載の頬上皮細胞懸濁液の調製方法。
【請求項１０】
輸送が、2〜8摂氏温度におけるものである、請求項１に記載の頬上皮細胞懸濁液の調製方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
他の試験
・微小無菌性(micro sterility): 全てのサンプルにおいて陰性
・マイコプラズマ: 全てのサンプルにおいて陰性
・FACS及びRT-PCRによる細胞特徴付け(CK14+発現): 高レベルのCK14+発現の実証は、頬上皮細胞の高い効力(潜在力)を示す。
・RT-PCRによる細胞特徴付け(CD90-発現): 全てのサンプルにおいてごくわずか
・核型分析: 全てのサンプルにおいて染色体異常なし
本開示は以下の実施形態を包含する。
[１]  頬上皮細胞懸濁液の調製方法であって、
(a) 頬粘膜組織を対象から採取するステップ;
(b) (a)からの組織を化学的解離剤で処理するステップ;
(c) (b)からの組織サンプルを栄養培地で洗浄するステップ;
(d) 洗浄した組織の真皮から表皮を分離するステップ;
(e) ミンチにし、ろ過して、表皮から均一な上皮細胞懸濁液を得るステップ;
(f) 任意選択で、播種して、細胞増殖を可能にするステップ;
(g) 酵素(複数可)を用いて細胞単層を採取するステップ;
(h) 遠心分離し、上清を捨てるステップ;
(i) 栄養培地と混合するステップ;
(j) 頬上皮細胞懸濁液を分析するステップ;
(k) V字形1mlバイアル中に0.4mlの頬上皮細胞懸濁液を充填するステップ; 及び
(l) 任意選択で、(a)におけるのと同じ対象へ輸送するステップ
を含む、方法。
[２]  対象が、成人対象である、実施形態１に記載の頬上皮細胞懸濁液の調製方法。  
[３]  前記方法が、任意選択で、対象の尿道の欠損部位に頬上皮細胞懸濁液を膀胱鏡的に移植しながら、ゲルと混合するステップをさらに含み、ゲルが、生体適合性送達システム、例えば、フィブリノゲン及び/又はトロンビン及び/又は熱可逆性ゲル化ポリマー(TGP)ゲル及び/又はキトサンなどの組み合わせから選択される、実施形態１に記載の頬上皮細胞懸濁液の調製方法。
[４]  化学的解離剤が、トリプシン、ディスパーゼ、コラゲナーゼ、トリプシン-EDTA、プロナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、パパイン、及びパンクレアチンから選択される、実施形態１に記載の頬上皮細胞懸濁液の調製方法。
[５]  栄養培地が、必要な増殖因子を有する、DMEM、EMEM、F12、IMDMなどから選択される、実施形態１に記載の頬上皮細胞懸濁液の調製方法。
[６]  播種が、T-25及び/又はT-75及び/又はT-150フラスコなどの中で行われる、実施形態１に記載の頬上皮細胞懸濁液の調製方法。
[７]  採取のための酵素が、トリプシン-EDTA、コラゲナーゼなどから選択される、実施形態１に記載の頬上皮細胞懸濁液の調製方法。
[８]  実施される分析が、外観、無菌性、マイコプラズマ、内毒素、細胞計数、細胞生存性、細胞純度試験、細胞特徴付け、及び核型決定分析である、実施形態１に記載の頬上皮細胞懸濁液の調製方法。
[９]  採取される頬粘膜組織が、成人の頬の内側由来であり、約1×1.5cm2である、実施形態１に記載の頬上皮細胞懸濁液の調製方法。
[１０]  輸送が、2〜8摂氏温度におけるものである、実施形態１に記載の頬上皮細胞懸濁液の調製方法。
[１１]  成人の尿道の欠損部位に頬上皮細胞懸濁液を膀胱鏡的に移植する方法であって、
(a) ヒト頬粘膜組織を成人の頬の内側から採取するステップ;
(b) (a) からの組織を化学的解離剤に供するステップ;
(c) (b) からの組織サンプルを栄養培地で洗浄するステップ;
(d) 洗浄した組織の真皮から表皮を分離するステップ;
(e) ミンチにし、ろ過して、表皮から均一な上皮細胞懸濁液を得るステップ;
(f) 任意選択で、播種して、細胞増殖を可能にするステップ;
(g) 酵素(複数可)を用いて細胞単層を採取するステップ;
(h) 遠心分離し、上清を捨てるステップ;
(i) 栄養培地と混合するステップ;
(j) 頬上皮細胞懸濁液を分析するステップ;
(k) 任意選択で、V字形1mlバイアル中に頬上皮細胞懸濁液を充填し、輸送するステップ; 及び
(l) 任意選択で、成人の尿道の欠損部位に頬上皮細胞懸濁液を膀胱鏡的に移植しながら、ゲルと混合するステップ
を含む、方法。
[１２]  化学的解離剤が、トリプシン、ディスパーゼ、コラゲナーゼ、トリプシン-EDTA、プロナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、パパイン、及びパンクレアチンから選択される、実施形態１１に記載の成人の尿道の欠損部位に頬上皮細胞懸濁液を膀胱鏡的に移植する方法。
[１３]  栄養培地が、必要な増殖因子を有する、DMEM、EMEM、F12、IMDMなどから選択される、実施形態１１に記載の成人の尿道の欠損部位に頬上皮細胞懸濁液を膀胱鏡的に移植する方法。
[１４]  播種が、T-25及び/又はT-75及び/又はT-150フラスコなどの中で行われる、実施形態１１に記載の成人の尿道の欠損部位に頬上皮細胞懸濁液を膀胱鏡的に移植する方法。
[１５]  酵素が、トリプシン-EDTA、コラゲナーゼなどから選択される、実施形態１１に記載の成人の尿道の欠損部位に頬上皮細胞懸濁液を膀胱鏡的に移植する方法。
[１６]  実施される分析が、外観、無菌性、マイコプラズマ、内毒素、細胞計数、細胞生存性、細胞純度試験、細胞特徴付け、及び核型決定分析である、実施形態１１に記載の成人の尿道の欠損部位に頬上皮細胞懸濁液を膀胱鏡的に移植する方法。
[１７]  ヒトの頬の内側から採取されるヒト頬粘膜組織が、約1×1.5cm2である、実施形態１１に記載の成人の尿道の欠損部位に頬上皮細胞懸濁液を膀胱鏡的に移植する方法。
[１８]  輸送が、2〜8摂氏温度におけるものである、実施形態１１に記載の成人の尿道の欠損部位に頬上皮細胞懸濁液を膀胱鏡的に移植する方法。
[１９]  ゲルが、生体適合性送達システム、例えば、フィブリノゲン及び/又はトロンビン及び/又は熱可逆性ゲル化ポリマー(TGP)ゲル及び/又はキトサンなどの組み合わせから選択される、実施形態１１に記載の成人の尿道の欠損部位に頬上皮細胞懸濁液を膀胱鏡的に移植する方法。