【手続補正書】
【提出日】令和2年10月23日(2020.10.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
補体Ｃ５ｂ−９沈着を測定する方法であって、
（ａ）補体関連障害であるか、または、前記障害であることが疑われる患者から得られた生体試料を、疾患関連細胞と生体外で接触させることと、
（ｂ）前記細胞におけるＣ５ｂ−９沈着レベルを評価することと、
（ｃ）細胞数によってＣ５ｂ−９沈着レベルを正規化することと、を含む、方法。
【請求項２】
Ｃ５ｂ−９沈着レベルを、補体関連障害を有する患者がＣ５の阻害剤での治療から利益を得るかどうかの指標とする方法であって、前記方法が、
（ａ）前記患者から得られた生体試料を、Ｃ５の阻害剤がある状態および前記阻害剤がない状態でインキュベートすることと、
（ｂ）工程（ａ）からの前記生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｃ）前記細胞におけるＣ５ｂ−９沈着レベルを評価することと、
（ｄ）細胞数によってＣ５ｂ−９沈着レベルを正規化することと、を含み、
前記阻害剤がない状態でのインキュベートと比較して、前記阻害剤がある状態でインキュベートした生体試料ではＣ５ｂ−９沈着がより少ないということが、前記患者が前記阻害剤での治療から利益を得る可能性が高いことを示唆するものである、方法。
【請求項３】
Ｃ５ｂ−９沈着レベルを、補体関連障害を有する患者がエクリズマブまたはＢＮＪ４４１／ＡＬＸＮ１２１０での治療から利益を得るかどうかの指標とする方法であって、前記方法が、
（ａ）前記患者から得られた生体試料を、エクリズマブまたはＢＮＪ４４１／ＡＬＸＮ１２１０がある状態およびエクリズマブがない状態でインキュベートすることと、
（ｂ）工程（ａ）からの前記生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｃ）前記細胞におけるＣ５ｂ−９沈着レベルを評価することと、
（ｄ）細胞数によってＣ５ｂ−９沈着レベルを正規化することと、を含み、
エクリズマブまたはＢＮＪ４４１／ＡＬＸＮ１２１０がない状態でのインキュベートと比較して、エクリズマブまたはＢＮＪ４４１／ＡＬＸＮ１２１０がある状態でインキュベートした生体試料ではＣ５ｂ−９沈着がより少ないということが、前記患者がエクリズマブまたはＢＮＪ４４１／ＡＬＸＮ１２１０での治療から利益を得る可能性が高いことを示唆するものである、方法。
【請求項４】
Ｃ５ｂ−９沈着レベルを、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）を有する患者がエクリズマブまたはＢＮＪ４４１／ＡＬＸＮ１２１０での治療から利益を得る可能性が高いかどうかの指標とする方法であって、前記方法が、
（ａ）前記患者から得られた生体試料を、エクリズマブまたはＢＮＪ４４１／ＡＬＸＮ１２１０がある状態およびエクリズマブまたはＢＮＪ４４１／ＡＬＸＮ１２１０がない状態でインキュベートすることと、
（ｂ）工程（ａ）からの前記生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｃ）前記細胞におけるＣ５ｂ−９沈着レベルを評価することと、
（ｄ）細胞数によってＣ５ｂ−９沈着レベルを正規化することと、を含み、
エクリズマブまたはＢＮＪ４４１／ＡＬＸＮ１２１０がない状態でのインキュベートと比較して、エクリズマブまたはＢＮＪ４４１／ＡＬＸＮ１２１０がある状態でインキュベートした生体試料ではＣ５ｂ−９沈着がより少ないということが、前記患者がエクリズマブまたはＢＮＪ４４１／ＡＬＸＮ１２１０での治療から利益を得る可能性が高いことを示唆するものである、方法。
【請求項５】
Ｃ５ｂ−９沈着レベルを、補体関連障害を有し、Ｃ５の阻害剤で治療されている患者をモニタリングするための指標とする方法であって、前記方法が、
（ａ）前記患者からの生体試料およびコントロール試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｂ）前記細胞におけるＣ５ｂ−９沈着レベルを評価することと、
（ｃ）細胞数によってＣ５ｂ−９沈着レベルを正規化することと
を含む方法であって、前記阻害剤で治療されている前記患者からの前記生体試料でのＣ５ｂ−９沈着が、前記コントロール試料でのＣ５ｂ−９沈着と比較してより多いことが、前記患者に投与する前記阻害剤の用量が増加させられ得ることを示す、方法。
【請求項６】
増加させた用量の前記阻害剤を前記患者に投与する場合、工程（ａ）から（ｃ）を繰り返して、前記増加させた用量が前記細胞におけるＣ５ｂ−９沈着レベルを正規化するのに十分であるかどうかを判断する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１から４のいずれか一項に記載の方法に従ってＣ５の阻害剤またはエクリズマブもしくはＢＮＪ４４１／ＡＬＸＮ１２１０に対して応答性であると判断された患者において補体関連障害を治療するための、エクリズマブまたはＢＮＪ４４１／ＡＬＸＮ１２１０を含む組成物。
【請求項８】
前記Ｃ５の前記阻害剤は、エクリズマブまたはＢＮＪ４４１／ＡＬＸＮ１２１０などの抗体である、請求項２、５または６に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、マイクロプレートなどの固体プラットフォーム上で培養される、請求項１から６および８のいずれか一項に記載の方法または請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記固体プラットフォームが、９６ウェルマイクロプレートである、請求項９に記載の方法または組成物。
【請求項１１】
前記疾患関連細胞は、内皮細胞、網膜色素上皮細胞、軟骨細胞、ニューロン、グリア細胞、骨格筋細胞、および心筋細胞からなる群から選択される、請求項１から６および８から１０のいずれか一項に記載の方法または請求項７、９および１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記疾患関連細胞は、皮膚起源由来のヒト微小血管内皮細胞、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞、包皮の内皮細胞、および肝臓腺癌由来の内皮細胞からなる群から選択される内皮細胞である、請求項１１記載の方法または組成物。
【請求項１３】
前記細胞は、ウェル当たり約５，０００〜約６，０００細胞の密度で蒔かれて、コンフルエントまで培養される、請求項１から６および８から１２のいずれか一項に記載の方法または請求項７および９から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記細胞は、ウェル当たり約１０，０００〜約１２，５００細胞の密度で蒔かれて、コンフルエントまで培養される、請求項１から６および８から１３のいずれか一項に記載の方法または請求項７および９から１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記細胞は、ウェル当たり約１５，０００細胞の密度で蒔かれて、コンフルエントまで培養される、請求項１から６および８から１２のいずれか一項に記載の方法または請求項７および９から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
細胞は、前記生体試料と接触させられる前にコンフルエントである、請求項１から６および８から１５のいずれか一項に記載の方法または請求項７および９から１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記生体試料が血清である、請求項１から６および８から１６のいずれか一項に記載の方法または請求項７および９から１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記血清は、ａＨＵＳの患者、寛解の患者またはエクリズマブ未感作またはＢＮＪ４４１／ＡＬＸＮ１２１０未感作患者由来のものである、請求項１７に記載の方法または組成物。
【請求項１９】
前記細胞は、アデノシン５’−二リン酸、トロンビン、またはリポ多糖で活性化される、請求項１から６および８から１８のいずれか一項に記載の方法または請求項７および９から１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記細胞は、約１．５時間〜約４時間、前記生体試料と接触させられる、請求項１から６および８から１９のいずれか一項に記載の方法または請求項７および９から１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記細胞は、前記接触させる工程の後であるが、前記評価する工程の前に、パラホルムアルデヒドなどの固定液と共にインキュベートされる、請求項１から６および８から２０のいずれか一項に記載の方法または請求項７および９から２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
Ｃ５ｂ−９沈着のレベルは、抗Ｃ５ｂ−９抗体を使用して評価される、請求項１から６および８から２１のいずれか一項に記載の方法または請求項７および９から２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記抗Ｃ５ｂ−９抗体は、色素などの検出可能な標識を含む二次抗体で検出される、請求項２０記載の方法または組成物。
【請求項２４】
Ｃ５ｂ−９沈着のレベルは、Ｏｎ−ｃｅｌｌ  Ｗｅｓｔｅｒｎアッセイを使用して評価される、請求項１から６および８から２３のいずれか一項に記載の方法または請求項７および９から２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記抗Ｃ５ｂ−９抗体が二次抗体で検出された後で、前記細胞を透過処理する、請求項２３に記載の方法または組成物。
【請求項２６】
前記抗Ｃ５ｂ−９抗体が二次抗体で検出される前に、前記細胞を透過処理する、請求項２３に記載の方法または組成物。
【請求項２７】
透過処理の後、ＤＮＡを染色する薬剤などである、核に蓄積する薬剤と共に前記細胞をインキュベートする、請求項２５または２６に記載の方法または組成物。
【請求項２８】
前記薬剤が、ＣｅｌｌＴａｇ  ７００  Ｓｔａｉｎ、ＤＡＰＩ、アクリジンオレンジ、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２  Ｄｙｅ、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、ＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｔａｉｎ、およびＶｙｂｒａｎｔ  ＤｙｅＣｙｃｌｅ  ｓｔａｉｎからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法または組成物。
【請求項２９】
一つ以上の工程が自動化されている、請求項１から６および８から２８のいずれか一項に記載の方法または請求項７および９から２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記患者は、非典型溶血性尿毒症症候群、ＳＴＥＣ−ＨＵＳ、糖尿病、ループス腎炎、血管炎、または慢性の同種移植片拒絶反応を有する、請求項１から３、５、６、８から１７、および、１９から２９のいずれか一項に記載の方法または請求項７、９から１７および１９から１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
前記疾患関連細胞は、内皮細胞、網膜色素上皮細胞、軟骨細胞、ニューロン、グリア細胞、骨格筋細胞、および心筋細胞からなる群から選択される、請求項１および９から３０のいずれか一項に記載の方法または請求項７および９から３０のいずれか一項に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
特定の実施形態では、本明細書に記載の方法の一つ以上の工程は自動化される。
特許または出願書類は、カラーで作成された少なくとも一つの図面を含む。カラー図面を伴う本特許または特許出願公開公報の写しは、請求および必要な料金の支払いにより米国特許庁によって提供されることとなる。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
補体Ｃ５ｂ−９沈着を測定する方法であって、
（ａ）補体関連障害であるか、または、前記障害であることが疑われる患者から得られた生体試料を、疾患関連細胞と生体外で接触させることと、
（ｂ）前記細胞におけるＣ５ｂ−９沈着レベルを評価することと、
（ｃ）細胞数によってＣ５ｂ−９沈着レベルを正規化することと、を含む、方法。
(項目２)
補体関連障害を有する患者がＣ５の阻害剤での治療から利益を得るかどうかを判断する方法であって、前記方法が、
（ａ）前記患者から得られた生体試料を、Ｃ５の阻害剤がある状態および前記阻害剤がない状態でインキュベートすることと、
（ｂ）工程（ａ）からの前記生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｃ）前記細胞におけるＣ５ｂ−９沈着レベルを評価することと、
（ｄ）細胞数によってＣ５ｂ−９沈着レベルを正規化することと、を含み、
前記阻害剤がない状態でのインキュベートと比較して、前記阻害剤がある状態でインキュベートした生体試料ではＣ５ｂ−９沈着がより少ないということが、前記患者が前記阻害剤での治療から利益を得る可能性が高いことを示唆するものである、方法。
(項目３)
補体関連障害を有する患者がエクリズマブでの治療から利益を得るかどうかを判断する方法であって、前記方法が、
（ａ）前記患者から得られた生体試料を、エクリズマブがある状態およびエクリズマブがない状態でインキュベートすることと、
（ｂ）工程（ａ）からの前記生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｃ）前記細胞におけるＣ５ｂ−９沈着レベルを評価することと、
（ｄ）細胞数によってＣ５ｂ−９沈着レベルを正規化することと、を含み、
エクリズマブがない状態でのインキュベートと比較して、エクリズマブがある状態でインキュベートした生体試料ではＣ５ｂ−９沈着がより少ないということが、前記患者がエクリズマブでの治療から利益を得る可能性が高いことを示唆するものである、方法。
(項目４)
非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）を有する患者がエクリズマブでの治療から利益を得る可能性が高いかどうかを判断するための方法であって、前記方法が、
（ａ）前記患者から得られた生体試料を、エクリズマブがある状態およびエクリズマブがない状態でインキュベートすることと、
（ｂ）工程（ａ）からの前記生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｃ）前記細胞におけるＣ５ｂ−９沈着レベルを評価することと、
（ｄ）細胞数によってＣ５ｂ−９沈着レベルを正規化することと、を含み、
エクリズマブがない状態でのインキュベートと比較して、エクリズマブがある状態でインキュベートした生体試料ではＣ５ｂ−９沈着がより少ないということが、前記患者がエクリズマブでの治療から利益を得る可能性が高いことを示唆するものである、方法。
(項目５)
補体関連障害を有し、Ｃ５の阻害剤で治療されている患者をモニタリングする方法であって、前記方法が、
（ａ）前記患者からの生体試料およびコントロール試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｂ）前記細胞におけるＣ５ｂ−９沈着レベルを評価することと、
（ｃ）細胞数によってＣ５ｂ−９沈着レベルを正規化することと、
（ｄ）前記阻害剤で治療されている前記患者からの前記生体試料でのＣ５ｂ−９沈着が、前記コントロール試料でのＣ５ｂ−９沈着と比較してより多い場合、前記患者に投与する前記阻害剤の用量を増加させることとを含む、方法。
(項目６)
増加させた用量の前記阻害剤を前記患者に投与する場合、工程（ａ）から（ｃ）を繰り返して、前記増加させた用量が前記細胞におけるＣ５ｂ−９沈着レベルを正規化するのに十分であるかどうかを判断する、項目５に記載の方法。
(項目７)
項目１から４のいずれか一項に記載の方法に従ってＣ５の阻害剤またはエクリズマブに対して応答性であると判断された患者において補体関連障害を治療する方法であって、前記方法は、治療有効量の前記阻害剤またはエクリズマブを前記患者に投与することを含む、方法。
(項目８)
前記Ｃ５の前記阻害剤は、エクリズマブなどの抗体である、項目２、５または６に記載の方法。
(項目９)
前記細胞が、マイクロプレートなどの固体プラットフォーム上で培養される、項目１から８のいずれか一項に記載の方法。
(項目１０)
前記固体プラットフォームが、９６ウェルマイクロプレートである、項目９に記載の方法。
(項目１１)
前記疾患関連細胞は、内皮細胞、網膜色素上皮細胞、軟骨細胞、ニューロン、グリア細胞、骨格筋細胞、および心筋細胞からなる群から選択される、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
(項目１２)
前記疾患関連細胞は、皮膚起源由来のヒト微小血管内皮細胞、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞、包皮の内皮細胞、および肝臓腺癌由来の内皮細胞からなる群から選択される内皮細胞である、項目１１記載の方法。
(項目１３)
前記細胞は、ウェル当たり約５，０００〜約６，０００細胞の密度で蒔かれて、コンフルエントまで培養される、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
(項目１４)
前記細胞は、ウェル当たり約１０，０００〜約１２，５００細胞の密度で蒔かれて、コンフルエントまで培養される、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
(項目１５)
前記細胞は、ウェル当たり約１５，０００細胞の密度で蒔かれて、コンフルエントまで培養される、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
(項目１６)
細胞は、前記生体試料と接触させられる前にコンフルエントである、項目１から１５のいずれか一項に記載の方法。
(項目１７)
前記生体試料が血清である、項目１から１６のいずれか一項に記載の方法。
(項目１８)
前記血清は、ａＨＵＳの患者、寛解の患者またはエクリズマブ未感作患者由来のものである、項目１７に記載の方法。
(項目１９)
前記細胞は、アデノシン５’−二リン酸、トロンビン、またはリポ多糖で活性化される、項目１から１８のいずれか一項に記載の方法。
(項目２０)
前記細胞は、約１．５時間〜約４時間、前記生体試料と接触させられる、項目１から１９のいずれか一項に記載の方法。
(項目２１)
前記細胞は、前記接触させる工程の後であるが、前記評価する工程の前に、パラホルムアルデヒドなどの固定液と共にインキュベートされる、項目１から２０のいずれか一項に記載の方法。
(項目２２)
Ｃ５ｂ−９沈着のレベルは、抗Ｃ５ｂ−９抗体を使用して評価される、項目１から２１のいずれか一項に記載の方法。
(項目２３)
前記抗Ｃ５ｂ−９抗体は、色素などの検出可能な標識を含む二次抗体で検出される、項目２０記載の方法。
(項目２４)
Ｃ５ｂ−９沈着のレベルは、Ｏｎ−ｃｅｌｌ  Ｗｅｓｔｅｒｎアッセイを使用して評価される、項目１から２３のいずれか一項に記載の方法。
(項目２５)
前記抗Ｃ５ｂ−９抗体が二次抗体で検出された後で、前記細胞を透過処理する、項目２３に記載の方法。
(項目２６)
前記抗Ｃ５ｂ−９抗体が二次抗体で検出される前に、前記細胞を透過処理する、項目２３に記載の方法。
(項目２７)
透過処理の後、ＤＮＡを染色する薬剤などである、核に蓄積する薬剤と共に前記細胞をインキュベートする、項目２５または２６に記載の方法。
(項目２８)
前記薬剤が、ＣｅｌｌＴａｇ  ７００  Ｓｔａｉｎ、ＤＡＰＩ、アクリジンオレンジ、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２  Ｄｙｅ、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、ＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｔａｉｎ、およびＶｙｂｒａｎｔ  ＤｙｅＣｙｃｌｅ  ｓｔａｉｎからなる群から選択される、項目２７に記載の方法。
(項目２９)
一つ以上の工程が自動化されている、項目１から２８のいずれか一項に記載の方法。
(項目３０)
前記患者は、非典型溶血性尿毒症症候群、ＳＴＥＣ−ＨＵＳ、糖尿病、ループス腎炎、血管炎、または慢性の同種移植片拒絶反応を有する、項目１から３、５から１７、および、１９から２９のいずれか一項に記載の方法。