【手続補正書】
【提出日】令和2年4月9日(2020.4.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
封入された自然対合ｓｃＦｖアンプリコンを生成する方法であって、
ａ．単一細胞を小滴内に封入するステップであって、前記小滴は、封入された単一細胞からの重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンの自然対合を増幅及び連結するための試薬を更に含有する、ステップと、
ｂ．前記小滴内の封入された単一細胞を溶解するステップと、
ｃ．前記小滴内の自然対合ｓｃＦｖアンプリコンを生成するステップであって、ｓｃＦｖアンプリコンは、重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンの自然対合を含む、ステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記細胞は、Ｂ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試薬は、ヒトＩｇ配列に対して設計されたプライマーを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記試薬は、表１又は表５に示されるプライマーを含むプライマープールを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ｓｃＦｖアンプリコンを生成するステップは、最初に天然重鎖及び軽鎖可変領域配列から重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンを形成することを含み、及び前記試薬は、
ａ．第１及び第２の重鎖可変領域プライマーと、
ｂ．第１及び第２の軽鎖可変領域プライマーと
を含むプライマープールを含み、前記第１の重鎖可変領域プライマー及び前記第１の軽鎖可変領域プライマーは、相互作用して、前記重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンを連結する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記プライマープールは、前記第２のプライマーよりも低い濃度の前記第１のプライマーを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の重鎖可変領域プライマーは、第１のオーバーハング配列に融合され、前記第１の軽鎖可変領域プライマーは、第２のオーバーハング配列に融合され、前記オーバーハング配列は、相互作用して、前記重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンを連結する、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記第１及び第２のオーバーハング配列は、少なくとも部分的に相補的である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ａ．前記第１の重鎖可変領域プライマーは、前記天然配列／アンプリコンの重鎖可変領域内に結合するリバースプライマーであり、且つ前記第２の重鎖可変領域プライマーは、前記天然配列／アンプリコンの前記重鎖可変領域外に結合するフォワードプライマーであり、及び
ｂ．前記第１の軽鎖可変領域プライマーは、前記天然配列／アンプリコンの軽鎖可変領域内に結合するフォワードプライマーであり、且つ前記第２の軽鎖可変領域プライマーは、前記天然配列／アンプリコンの前記軽鎖可変領域外に結合するリバースプライマーである、請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記試薬は、Ｔｉｔａｎ（Ｒｏｃｈｅ  ｃａｔ  ｎｏ  １１８５５４７６００１）を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記封入するステップは、マイクロ流体力学を使用することを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記封入するステップは、水性懸濁液を油と組み合わせて、小滴内の前記封入された単一細胞を含むエマルションを形成することを含み、前記水性懸濁液は、前記細胞と、アンプリコンの自然対合を増幅及び連結するための前記試薬とを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ｓｃＦｖアンプリコンを生成するステップは、ＲＴ−ＰＣＲを使用することを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
死んだ又は死にかけている細胞からの少なくともいくつかの遊離核酸が小滴内に封入されることを防止するステップを更に含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記防止するステップは、封入前に細胞を４８時間未満にわたって刺激すること、封入前に生細胞を選択すること、又はオリゴヌクレオチド被覆磁気ビーズを使用して前記核酸を隔離することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
封入された対合ｓｃＦｖアンプリコンであって、前記ｓｃＦｖアンプリコンは油中水小滴内に封入され、前記ｓｃＦｖアンプリコンはそのまま発現に使用でき、抗原結合及び／又は機能に関するスクリーニングに適している、前記ｓｃＦｖアンプリコン。
【請求項１７】
抗原結合及び／又は機能に関するスクリーニングのための自然対合ｓｃＦｖアンプリコンのライブラリーを生成する方法であって、
ａ．請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法により、封入された自然対合ｓｃＦｖアンプリコンを生成するステップと、
ｂ．前記小滴を溶解して、自然対合ｓｃＦｖアンプリコンのライブラリーを生成するステップとを含み、
ｃ．前記ｓｃＦｖアンプリコンはそのまま発現に使用でき、抗原結合及び／又は機能に関するスクリーニングに適している、方法。
【請求項１８】
抗原結合及び／又は機能に関するスクリーニングのための自然対合ｓｃＦｖアンプリコンのライブラリーを生成する方法であって、
ａ．請求項１７に記載の方法により自然対合ｓｃＦｖアンプリコンのライブラリーを生成するステップと、
ｂ．自然対合ｓｃＦｖアンプリコンの更なるライブラリーを生成するステップであって、前記更なるライブラリーの前記自然対合ｓｃＦｖアンプリコンは、一般式Ｒ１−Ｖ１−Ｌ−Ｖ２−Ｒ２を有し、ここで、
ｉ．Ｒ１及びＲ２は、同じであるか又は異なり、且つそれぞれ制限酵素部位を含み、
ｉｉ．Ｖ１及びＶ２は、自然対合重鎖及び軽鎖可変領域であり、Ｖ１が前記軽鎖可変領域である場合、Ｖ２は、前記重鎖可変領域であり、又はＶ１が前記重鎖可変領域である場合、Ｖ２は、前記軽鎖可変領域であり、及び
ｉｉｉ．Ｌは、直接結合又はリンカーである、ステップと
を含む方法。
【請求項１９】
請求項１６に記載の封入された対合ｓｃＦｖアンプリコンを複数含むエマルションであって、前記エマルションが水中油エマルションであり、各ｓｃＦｖアンプリコンが前記エマルション中の油中水小滴内に封入される、前記エマルション。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
例えば、最近発足したＨｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｍｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ（Ｃｒｏｗｅ，Ｊ．Ｅ．＆Ｋｏｆｆ，Ｗ．Ｃ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２０１５），１４：１４２１−１４２５）等、抗体機能を予測するための次世代シーケンシングを使用する大規模な活動は、特に利益を得る可能性がある。このプロジェクトは、１０００人の個人からの発現された抗体レパートリーをシーケンシングし、シーケンシング情報のみに基づいてワクチン反応性を推測することを目的としている。このプロジェクトに対して追加される刺激的なことは、本明細書に概略した方法を使用してこれらの個人からのプールされたディスプレイライブラリーを構築し、それにより、任意の数のワクチン候補に対するヒトレパートリーの反応性を直接測定できることであり得る。
本発明は、例えば以下の実施形態を包含する。
［実施形態１］封入された自然対合ｓｃＦｖアンプリコンを生成する方法であって、
ａ．単一細胞を小滴内に封入するステップであって、前記小滴は、封入された単一細胞からの重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンの自然対合を増幅及び連結するための試薬を更に含有する、ステップと、
ｂ．前記封入された単一細胞を溶解するステップと、
ｃ．前記封入された自然対合ｓｃＦｖアンプリコンを生成するステップであって、各ｓｃＦｖアンプリコンは、重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンの自然対合を含む、ステップと
を含む方法。
［実施形態２］前記細胞は、Ｂ細胞である、実施形態１に記載の方法。
［実施形態３］前記試薬は、ヒトＩｇ配列に対して設計されたプライマーを含む、実施形態１又は２に記載の方法。
［実施形態４］前記試薬は、表１又は表５に示されるプライマーを含むプライマープールを含む、実施形態３に記載の方法。
［実施形態５］前記封入されたアンプリコンを生成するステップは、最初に天然重鎖及び軽鎖可変領域配列から重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンを形成することを含み、及び前記試薬は、
ａ．第１及び第２の重鎖可変領域プライマーと、
ｂ．第１及び第２の軽鎖可変領域プライマーと
を含むプライマープールを含み、前記第１の重鎖可変領域プライマー及び前記第１の軽鎖可変領域プライマーは、相互作用して、前記重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンを連結する、実施形態１〜４のいずれかに記載の方法。
［実施形態６］前記プライマープールは、前記第２のプライマーよりも低い濃度の前記第１のプライマーを含む、実施形態５に記載の方法。
［実施形態７］前記第１の重鎖可変領域プライマーは、第１のオーバーハング配列に融合され、前記第１の軽鎖可変領域プライマーは、第２のオーバーハング配列に融合され、前記オーバーハング配列は、相互作用して、前記重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンを連結する、実施形態５又は６に記載の方法。
［実施形態８］前記第１及び第２のオーバーハング配列は、少なくとも部分的に相補的である、実施形態７に記載の方法。
［実施形態９］ａ．前記第１の重鎖可変領域プライマーは、前記天然配列／アンプリコンの重鎖可変領域内に結合するリバースプライマーであり、且つ前記第２の重鎖可変領域プライマーは、前記天然配列／アンプリコンの前記重鎖可変領域外に結合するフォワードプライマーであり、及び
ｂ．前記第１の軽鎖可変領域プライマーは、前記天然配列／アンプリコンの軽鎖可変領域内に結合するフォワードプライマーであり、且つ前記第２の軽鎖可変領域プライマーは、前記天然配列／アンプリコンの前記軽鎖可変領域外に結合するリバースプライマーである、実施形態５〜８のいずれかに記載の方法。
［実施形態１０］封入された自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンを生成する方法であって、
ａ．単一細胞を小滴内に封入するステップであって、前記小滴は、封入された単一細胞からのＴＣＲ鎖アンプリコンの自然対合を増幅するための試薬を更に含有する、ステップと、
ｂ．前記封入された単一細胞を溶解するステップと、
ｃ．前記封入された自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンを生成するステップであって、各ｓｃＴＣＲアンプリコンは、ＴＣＲ鎖アンプリコンの自然対合を含む、ステップと
を含む方法。
［実施形態１１］前記自然対合ＴＣＲ鎖アンプリコンは、α及びβ鎖アンプリコンである、実施形態１０に記載の方法。
［実施形態１２］前記自然対合ＴＣＲ鎖アンプリコンは、γ及びδ鎖アンプリコンである、実施形態１０に記載の方法。
［実施形態１３］前記細胞は、Ｔ細胞である、実施形態１０〜１２のいずれかに記載の方法。
［実施形態１４］前記試薬は、Ｔｉｔａｎ（Ｒｏｃｈｅ  ｃａｔ  ｎｏ  １１８５５４７６００１）を含む、実施形態１〜１３のいずれかに記載の方法。
［実施形態１５］前記封入するステップは、マイクロ流体力学を使用することを含む、実施形態１〜１４のいずれかに記載の方法。
［実施形態１６］前記封入するステップは、水性懸濁液を油と組み合わせて、小滴内の前記封入された単一細胞を含むエマルションを形成することを含み、前記水性懸濁液は、前記細胞と、アンプリコンの自然対合を増幅及び連結するための前記試薬とを含む、実施形態１〜１５のいずれかに記載の方法。
［実施形態１７］前記油は、フッ素化油である、実施形態１６に記載の方法。
［実施形態１８］細胞の前記懸濁液は、約１００万〜約５００万細胞／ｍｌ、好ましくは約３５０万〜約４５０万細胞／ｍｌ、より好ましくは約４００万細胞／ｍｌの密度である、実施形態１６又は１７に記載の方法。
［実施形態１９］細胞の前記懸濁液は、安定剤を含む、実施形態１６〜１８のいずれかに記載の方法。
［実施形態２０］前記封入されたアンプリコンを生成するステップは、ＲＴ−ＰＣＲを使用することを含む、実施形態１〜１９のいずれかに記載の方法。
［実施形態２１］死んだ又は死にかけている細胞からの少なくともいくつかの遊離核酸が小滴内に封入されることを防止するステップを更に含む、実施形態１〜２０のいずれかに記載の方法。
［実施形態２２］前記防止するステップは、封入前に細胞を４８時間未満にわたって刺激することを含む、実施形態２１に記載の方法。
［実施形態２３］前記防止するステップは、封入前に生細胞を選択することを含む、実施形態２１又は２２に記載の方法。
［実施形態２４］前記防止するステップは、オリゴヌクレオチド被覆磁気ビーズを使用して前記核酸を隔離することを含む、実施形態２１〜２３のいずれかに記載の方法。
［実施形態２５］実施形態１〜２４のいずれかに記載の方法によって生成される、封入された自然対合アンプリコン。
［実施形態２６］自然対合アンプリコンのライブラリーを生成する方法であって、
ａ．実施形態１〜２４のいずれかに記載の方法により、封入された自然対合アンプリコンを生成するステップと、
ｂ．前記小滴を溶解して、自然対合アンプリコンのライブラリーを生成するステップとを含む方法。
［実施形態２７］実施形態２６に記載の方法によって生成される自然対合アンプリコンのライブラリー。
［実施形態２８］抗原結合及び／又は機能に関するスクリーニングのための自然対合ｓｃＦｖアンプリコンのライブラリーを生成する方法であって、
ａ．実施形態２７に記載の方法による自然対合ｓｃＦｖアンプリコンのライブラリーを生成するステップと、
ｂ．自然対合ｓｃＦｖアンプリコンの更なるライブラリーを生成するステップであって、前記更なるライブラリーの前記自然対合ｓｃＦｖアンプリコンは、一般式Ｒ１−Ｖ１−Ｌ−Ｖ２−Ｒ２を有し、ここで、
ｉ．Ｒ１及びＲ２は、同じであるか又は異なり、且つそれぞれ制限酵素部位を含み、
ｉｉ．Ｖ１及びＶ２は、自然対合重鎖及び軽鎖可変領域であり、Ｖ１が前記軽鎖可変領域である場合、Ｖ２は、前記重鎖可変領域であり、又はＶ１が前記重鎖可変領域である場合、Ｖ２は、前記軽鎖可変領域であり、及び
ｉｉｉ．Ｌは、直接結合又はリンカーである、ステップと
を含む方法。
［実施形態２９］前記自然対合ｓｃＦｖアンプリコンの更なるライブラリーを生成するステップは、ネステッドＰＣＲを使用することを含む、実施形態２８に記載の方法。
［実施形態３０］前記ネステッドＰＣＲは、Ｖ１のＦＲ１及びＶ２のＦＲ４に結合するプライマーを使用する、実施形態２９に記載の方法。
［実施形態３１］抗原結合及び／又は機能に関するスクリーニングのための自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンのライブラリーを生成する方法であって、
ａ．実施形態２７に記載の方法による自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンのライブラリーを生成するステップと、
ｂ．自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンの更なるライブラリーを生成するステップであって、前記更なるライブラリーの前記自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンは、一般式Ｒ１−Ｃ１−Ｌ−Ｃ２−Ｒ２を有し、ここで、
ｉ．Ｒ１及びＲ２は、同じであるか又は異なり、且つそれぞれ制限酵素部位を含み、
ｉｉ．Ｃ１及びＣ２は、自然対合α及びβ  ＴＣＲ鎖であり、Ｃ１が前記α  ＴＣＲ鎖である場合、Ｃ２は、前記β  ＴＣＲ鎖であり、又はＣ１が前記β  ＴＣＲ鎖である場合、Ｃ２は、前記α  ＴＣＲ鎖であり、及び
ｉｉｉ．Ｌは、直接結合又はリンカーである、ステップと
を含む方法。
［実施形態３２］抗原結合及び／又は機能に関するスクリーニングのための自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンのライブラリーを生成する方法であって、
ａ．実施形態２７に記載の方法による自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンのライブラリーを生成するステップと、
ｂ．自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンの更なるライブラリーを生成するステップであって、前記更なるライブラリーの前記自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンは、一般式Ｒ１−Ｃ１−Ｌ−Ｃ２−Ｒ２を有し、ここで、
ｉ．Ｒ１及びＲ２は、同じであるか又は異なり、且つそれぞれ制限酵素部位を含み、
ｉｉ．Ｃ１及びＣ２は、自然対合γ及びδ  ＴＣＲ鎖であり、Ｃ１が前記γ  ＴＣＲ鎖である場合、Ｃ２は、前記δ  ＴＣＲ鎖であり、又はＣ１が前記δ  ＴＣＲ鎖である場合、Ｃ２は、前記γ  ＴＣＲ鎖であり、及び
ｉｉｉ．Ｌは、直接結合又はリンカーである、ステップと
を含む方法。
［実施形態３３］前記自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンの更なるライブラリーを生成するステップは、ネステッドＰＣＲを使用することを含む、実施形態３１又は３２に記載の方法。
［実施形態３４］前記ネステッドＰＣＲは、制限酵素部位を含むオーバーハング配列に融合されるプライマーを使用する、実施形態２９、３０又は３３のいずれかに記載の方法。
［実施形態３５］Ｒ１は、Ｓｆｉ１制限酵素部位を含み、及びＲ２は、Ｎｏｔ１制限酵素部位を含む、実施形態３４に記載の方法。
［実施形態３６］実施形態２８〜３５のいずれかに記載の方法によって生成される、抗原結合及び／又は機能に関するスクリーニングのための自然対合ｓｃＦｖ又はｓｃＴＣＲアンプリコンのライブラリー。
［実施形態３７］抗原結合及び／又は機能に関するスクリーニングのための自然対合ｓｃＦｖ又はｓｃＴＣＲライブラリーを生成する方法であって、
ａ．実施形態２８〜３５のいずれかに記載の方法により、自然対合アンプリコンのライブラリーを生成するステップと、
ｂ．前記自然対合ｓｃＦｖ又はｓｃＴＣＲライブラリーを発現させるステップと
を含む方法。
［実施形態３８］自然対合ｓｃＦｖライブラリーを生成するためのものであり、自然対合ｓｃＦｖをｓｃＦｖ−Ｆｃとして発現させることを含む、実施形態３７に記載の方法。
［実施形態３９］自然対合ｓｃＦｖライブラリーを生成するためのものであり、自然対合ｓｃＦｖをｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーとして発現させることを含む、実施形態３７に記載の方法。
［実施形態４０］実施形態３７〜３９のいずれかに記載の方法によって生成される、抗原結合及び／又は機能に関するスクリーニングのための自然対合ｓｃＦｖ又はｓｃＴＣＲライブラリー。
［実施形態４１］抗原特異的分子を特定する方法であって、
ａ．実施形態３７〜３９のいずれかに記載の方法により、自然対合ｓｃＦｖ又はｓｃＴＣＲライブラリーを生成するステップと、
ｂ．抗原サンプルを用いて前記自然対合ｓｃＦｖ又はｓｃＴＣＲライブラリーを調べるステップと、
ｃ．抗原特異的分子を特定するステップと
を含む方法。
［実施形態４２］前記自然対合ライブラリーは、ｓｃＦｖライブラリーであり、及び前記抗原特異的分子は、抗体である、実施形態４１に記載の方法。
［実施形態４３］前記抗原サンプルは、腫瘍組織、細菌全体又はウィルス粒子である、実施形態４１又は４２に記載の方法。
［実施形態４４］実施形態４１〜４３のいずれかに記載の方法によって生成される抗原特異的分子。
［実施形態４５］単一細胞を小滴内に封入するためのマイクロ流体力学の使用であって、前記小滴は、封入された単一細胞からの重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンの自然対合を増幅及び連結するための試薬を更に含有する、使用。
［実施形態４６］前記細胞は、Ｂ細胞である、実施形態４５に記載の使用。
［実施形態４７］前記試薬は、ヒトＩｇ配列に対して設計されたプライマーを含む、実施形態４５又は４６に記載の使用。
［実施形態４８］前記試薬は、表１又は表５に示されるプライマーを含むプライマープールを含む、実施形態４７に記載の使用。
［実施形態４９］前記試薬は、
ａ．第１及び第２の重鎖可変領域プライマーと、
ｂ．第１及び第２の軽鎖可変領域プライマーと
を含むプライマープールを含み、前記第１の重鎖可変領域プライマー及び前記第１の軽鎖可変領域プライマーは、相互作用して、前記重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンを連結する、実施形態４５〜４８のいずれかに記載の使用。
［実施形態５０］前記プライマープールは、前記第２のプライマーよりも低い濃度の前記第１のプライマーを含む、実施形態４９に記載の使用。
［実施形態５１］前記第１の重鎖可変領域プライマーは、第１のオーバーハング配列に融合され、前記第１の軽鎖可変領域プライマーは、第２のオーバーハング配列に融合され、前記オーバーハング配列は、相互作用して、前記重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンを連結する、実施形態４９又は５０に記載の使用。
［実施形態５２］前記第１及び第２のオーバーハング配列は、少なくとも部分的に相補的である、実施形態５１に記載の使用。
［実施形態５３］ａ．前記第１の重鎖可変領域プライマーは、前記天然配列／アンプリコンの重鎖可変領域内に結合するリバースプライマーであり、且つ前記第２の重鎖可変領域プライマーは、前記天然配列／アンプリコンの前記重鎖可変領域外に結合するフォワードプライマーであり、及び
ｂ．前記第１の軽鎖可変領域プライマーは、前記天然配列／アンプリコンの軽鎖可変領域内に結合するフォワードプライマーであり、且つ前記第２の軽鎖可変領域プライマーは、前記天然配列／アンプリコンの前記軽鎖可変領域外に結合するリバースプライマーである、実施形態４９〜５２のいずれかに記載の使用。
［実施形態５４］単一細胞を小滴内に封入するためのマイクロ流体力学の使用であって、前記小滴は、封入された単一細胞からのＴＣＲ鎖アンプリコンの自然対合を増幅及び連結するための試薬を更に含有する、使用。
［実施形態５５］前記ＴＣＲ鎖アンプリコンは、α及びβ鎖アンプリコンである、実施形態５４に記載の使用。
［実施形態５６］前記ＴＣＲ鎖アンプリコンは、γ及びδ鎖アンプリコンである、実施形態５４に記載の使用。
［実施形態５７］前記細胞は、Ｔ細胞である、実施形態５４〜５６のいずれかに記載の使用。
［実施形態５８］前記試薬は、Ｔｉｔａｎ（Ｒｏｃｈｅ  ｃａｔ  ｎｏ  １１８５５４７６００１）を含む、実施形態４５〜５７のいずれかに記載の使用。
［実施形態５９］前記封入は、水性懸濁液を油と組み合わせて、小滴内の前記封入された単一細胞を含むエマルションを形成することを含み、前記水性懸濁液は、前記細胞と、アンプリコンの自然対合を増幅及び連結するための前記試薬とを含む、実施形態４５〜５８のいずれかに記載の使用。
［実施形態６０］前記油は、フッ素化油である、実施形態５９に記載の使用。
［実施形態６１］細胞の前記懸濁液は、約１００万〜約５００万細胞／ｍｌ、好ましくは約３５０万〜約４５０万細胞／ｍｌ、より好ましくは約４００万細胞／ｍｌの密度である、実施形態５９又は６０に記載の使用。
［実施形態６２］細胞の前記懸濁液は、安定剤を含む、実施形態５９〜６１のいずれかに記載の使用。
［実施形態６３］前記試薬は、ＲＴ−ＰＣＲのための試薬である、実施形態４５〜６２のいずれかに記載の使用。
［実施形態６４］抗原結合及び／又は機能に関するスクリーニングのための自然対合組換えｓｃＦｖを含むｓｃＦｖライブラリーであって、各ｓｃＦｖは、互いに連結された、単一細胞の自然対合の重鎖及び軽鎖可変領域を含む、ｓｃＦｖライブラリー。
［実施形態６５］前記ｓｃＦｖは、ｓｃＦｖ−Ｆｃである、実施形態６４に記載のｓｃＦｖライブラリー。
［実施形態６６］ｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーである、実施形態６４に記載のｓｃＦｖライブラリー。
［実施形態６７］前記細胞は、Ｂ細胞である、実施形態６４〜６６のいずれかに記載のｓｃＦｖライブラリー。
［実施形態６８］各ｓｃＦｖの前記重鎖及び軽鎖可変領域は、リンカーによって連結され、前記リンカーは、グリシン及び／又はセリンに富んでいる、実施形態６４〜６７のいずれかに記載のｓｃＦｖライブラリー。
［実施形態６９］各ｓｃＦｖの前記重鎖及び軽鎖可変領域は、５〜３０アミノ酸長、好ましくは１０〜２０アミノ酸長、好ましくは１３〜１８アミノ酸長、より好ましくは１５アミノ酸長のリンカーによって連結されている、実施形態６４〜６８のいずれかに記載のｓｃＦｖライブラリー。
［実施形態７０］Ｔ細胞受容体結合及び／又は機能に関するスクリーニングのための自然対合組換えｓｃＴＣＲを含むｓｃＴＣＲライブラリーであって、各ｓｃＴＣＲは、互いに連結された、単一細胞の自然対合のＴＣＲ鎖を含む、ｓｃＴＣＲライブラリー。
［実施形態７１］前記自然対合ＴＣＲ鎖は、α及びβ鎖である、実施形態７０に記載のｓｃＴＣＲライブラリー。
［実施形態７２］前記自然対合ＴＣＲ鎖は、γ及びδ鎖である、実施形態７０に記載のｓｃＴＣＲライブラリー。
［実施形態７３］前記細胞は、Ｔ細胞である、実施形態７０〜７２のいずれかに記載のｓｃＦｖライブラリー。
［実施形態７４］各ｓｃＴＣＲの前記ＴＣＲ鎖は、リンカーによって連結され、前記リンカーは、グリシン及び／又はセリンに富んでいる、実施形態７０〜７３のいずれかに記載のｓｃＴＣＲライブラリー。
［実施形態７５］各ｓｃＴＣＲの前記ＴＣＲ鎖は、５〜３０アミノ酸長、好ましくは１０〜２０アミノ酸長、好ましくは１３〜１８アミノ酸長、より好ましくは１５アミノ酸長のリンカーによって連結されている、実施形態７０〜７４のいずれかに記載のｓｃＴＣＲライブラリー。
［実施形態７６］前記リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３である、実施形態６７、６９、７４又は７５のいずれかに記載のライブラリー。
［実施形態７７］抗原特異的分子を特定する方法であって、
ａ．抗原サンプルを用いて、
ｉ．実施形態４０に記載の自然対合ｓｃＦｖ若しくはｓｃＴＣＲライブラリー、又は
ｉｉ．実施形態６４〜７６のいずれかに記載のｓｃＦｖ若しくはｓｃＴＣＲライブラリー
を調べるステップと、
ｂ．抗原特異的分子を特定するステップと
を含む方法。
［実施形態７８］前記自然対合ライブラリーは、ｓｃＦｖライブラリーであり、前記抗原特異的分子は、抗体である、実施形態７７に記載の方法。
［実施形態７９］前記抗原サンプルは、腫瘍組織、細菌全体又はウィルス粒子である、実施形態７７又は７８に記載の方法。
［実施形態８０］実施形態７７〜７９のいずれかに記載の方法によって生成される抗原特異的分子。
［実施形態８１］抗原特異的分子を特定するための、
ａ．実施形態４０に記載の自然対合ｓｃＦｖ若しくはｓｃＴＣＲライブラリー、又は
ｂ．実施形態６４〜７６のいずれかに記載のｓｃＦｖ若しくはｓｃＴＣＲライブラリー
の使用であって、抗原サンプルを用いて前記ｓｃＦｖ又はｓｃＴＣＲライブラリーを調べることと、抗原特異的分子を特定することとを含む、使用。
［実施形態８２］前記ライブラリーは、ｓｃＦｖライブラリーであり、前記抗原特異的分子は、抗体である、実施形態８１に記載の使用。
［実施形態８３］前記抗原サンプルは、腫瘍組織、細菌全体又はウィルス粒子である、実施形態８１又は８２に記載の使用。
［実施形態８４］ａ．単一細胞を、封入された単一細胞からの重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンの自然対合を増幅及び連結するための試薬と共に小滴内に封入するためのマイクロ流体チップと、
ｂ．封入された単一細胞からの重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンの自然対合を増幅及び連結して、ｓｃＦｖアンプリコンを生成するための試薬と
を含むキット。
［実施形態８５］前記細胞は、Ｂ細胞である、実施形態８４に記載のキット。
［実施形態８６］前記試薬は、ＲＴ−ＰＣＲのための試薬を含む、実施形態８４又は８５に記載のキット。
［実施形態８７］前記試薬は、ヒトＩｇ配列に対して設計されたプライマーを含む、実施形態８４〜８６のいずれかに記載のキット。
［実施形態８８］前記試薬は、表１又は表５に示されるプライマーを含むプライマープールを含む、実施形態８７に記載のキット。
［実施形態８９］前記試薬は、
ａ．第１及び第２の重鎖可変領域プライマーと、
ｂ．第１及び第２の軽鎖可変領域プライマーと
を含むプライマープールを含み、前記第１の重鎖可変領域プライマー及び前記第１の軽鎖可変領域プライマーは、相互作用して、前記重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンを連結する、実施形態８４〜８８のいずれかに記載のキット。
［実施形態９０］前記プライマープールは、前記第２のプライマーよりも低い濃度の前記第１のプライマーを含む、実施形態８９に記載のキット。
［実施形態９１］前記第１の重鎖可変領域プライマーは、第１のオーバーハング配列に融合され、前記第１の軽鎖可変領域プライマーは、第２のオーバーハング配列に融合され、前記オーバーハング配列は、相互作用して、前記重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンを連結する、実施形態８９又は９０に記載のキット。
［実施形態９２］前記第１及び第２のオーバーハング配列は、少なくとも部分的に相補的である、実施形態９１に記載のキット。
［実施形態９３］ａ．前記第１の重鎖可変領域プライマーは、重鎖可変領域内に結合するように設計されるリバースプライマーであり、且つ前記第２の重鎖可変領域プライマーは、重鎖可変領域外に結合するように設計されるフォワードプライマーであり、及び
ｂ．前記第１の軽鎖可変領域プライマーは、軽鎖可変領域内に結合するように設計されるフォワードプライマーであり、且つ前記第２の軽鎖可変領域プライマーは、軽鎖可変領域外に結合するように設計されるリバースプライマーである、実施形態８９〜９２のいずれかに記載のキット。
［実施形態９４］前記ｓｃＦｖアンプリコンをｓｃＦｖ−Ｆｃとして発現させるための発現ベクターを更に含む、実施形態８４〜９３のいずれかに記載のキット。
［実施形態９５］前記ｓｃＦｖアンプリコンをｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーの一部として発現させるための発現ベクターを更に含む、実施形態８４〜９３のいずれかに記載のキット。
［実施形態９６］ネステッドＰＣＲを使用して前記ｓｃＦｖアンプリコンを増幅するためのプライマーを更に含む、実施形態８４〜９５のいずれかに記載のキット。
［実施形態９７］前記ネステッドＰＣＲプライマーは、重鎖可変領域のＦＲ１及び軽鎖可変領域のＦＲ４に結合するように設計されている、実施形態９６に記載のキット。
［実施形態９８］ａ．単一細胞を、封入された単一細胞からのＴＣＲ鎖アンプリコンの自然対合を増幅及び連結するための試薬と共に小滴内に封入するためのマイクロ流体チップと、
ｂ．封入された単一細胞からのＴＣＲ鎖アンプリコンの自然対合を増幅及び連結して、ｓｃＴＣＲアンプリコンを生成するための試薬と
を含むキット。
［実施形態９９］前記ＴＣＲ鎖アンプリコンは、α及びβ鎖アンプリコンである、実施形態９８に記載のキット。
［実施形態１００］前記ＴＣＲ鎖アンプリコンは、γ及びδ鎖アンプリコンである、実施形態９８に記載のキット。
［実施形態１０１］前記細胞は、Ｔ細胞である、実施形態９８〜１００のいずれかに記載のキット。
［実施形態１０２］ネステッドＰＣＲを使用して前記ｓｃＴＣＲアンプリコンを増幅するためのプライマーを更に含む、実施形態９８〜１０１のいずれかに記載のキット。
［実施形態１０３］前記ネステッドＰＣＲプライマーは、制限酵素部位を含むオーバーハング配列に融合される、実施形態９６、９７又は１０２のいずれかに記載のキット。
［実施形態１０４］前記ネステッドＰＣＲプライマーは、プライマー対を含み、一方のプライマーは、Ｓｆｉ１制限酵素部位をコードするオーバーハング配列に融合され、及び他方のプライマーは、Ｎｏｔ１制限酵素部位をコードするオーバーハング配列に融合される、実施形態１０３に記載のキット。
［実施形態１０５］前記マイクロ流体チップは、親フッ素性チップである、実施形態８４〜１０４のいずれかに記載のキット。
［実施形態１０６］フッ素化油を更に含む、実施形態８４〜１０５のいずれかに記載のキット。