(57)【要約】  グアニル酸シクラーゼ受容体の増強物質、刺激物質およびアゴニストとして作用するモノクローナル抗体が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体又はその抗原結合部分の結合が、リガンド又は活性化タンパク質の哺乳動物グアニル酸シクラーゼ（ｒＧＣ）受容体に対する見かけ上の親和性を増加させるように、前記哺乳動物ｒＧＣの細胞外ドメインに、前記哺乳動物ｒＧＣに特異的な前記リガンド又は活性化タンパク質の存在下で選択的に結合する、単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２】
前記哺乳動物ｒＧＣがヒトｒＧＣである、請求項１に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項３】
前記ヒトｒＧＣが、ＮＰＲＡ、ＮＰＲＢ、ＧＣ−Ｃ、ＧＣ−Ｄ、ＧＣ−Ｅ、ＧＣ−Ｆ又はＧＣ−Ｇである、請求項２に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項４】
前記ヒトｒＧＣがＮＰＲＡである、請求項３に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項５】
前記リガンドが、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、マンバナトリウム利尿ペプチド（ＤＮＰ）、ウロジラチン（Ｕｒｏ）、ツノメクサリヘビナトリウム利尿ペプチド、ヘビ毒ナトリウム利尿様ペプチドＡ（ＴＮＰ−ａ）、ヘビ毒ナトリウム利尿様ペプチドＢ（ＴＮＰ−ｂ）、又はヘビ毒ナトリウム利尿様ペプチドＣ（ＴＮＰ−ｃ）である、請求項１に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項６】
前記ヒトｒＧＣがＮＰＲ−Ａであり、前記リガンドがＡＮＰ、ＢＮＰ、Ｕｒｏ、又はそれらの混合物である、請求項２に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項７】
前記ヒトｒＧＣがＮＰＲＡであり、前記リガンドがＡＮＰ又はＢＮＰである、請求項２に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項８】
前記ヒトｒＧＣがＮＰＲＢであり、前記リガンドがＣＮＰである、請求項２に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項９】
前記ヒトｒＧＣが、ＧＣ−Ｃ、ＧＣ−Ｄ、ＧＣ−Ｅ、ＧＣ−Ｆ又はＧＣ−Ｇである、請求項２に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１０】
前記リガンド又は活性化タンパク質の哺乳動物ｒＧＣへの見かけ上の親和性の増加が、前記抗体又はその抗原結合部分が存在しない場合よりも少なくとも２倍高い、請求項１に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１１】
リガンドによって誘発された細胞内ｃＧＭＰ生成のＥＣ５０が、前記抗体又はその抗原結合部分が存在しない場合よりも少なくとも２倍低い、請求項１に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１２】
前記抗体又はその抗原結合部分の結合が、前記哺乳動物ｒＧＣに関連する触媒活性をさらに持続又は亢進する、請求項１に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１３】
前記触媒活性が、細胞内ｃＧＭＰ生成の増加である、請求項１に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１４】
前記細胞内ｃＧＭＰ生成の増加が、前記抗体又はその抗原結合部分が存在しない場合よりも少なくとも２倍高い、請求項１２に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１５】
前記抗体又はその抗原結合部分がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１６】
前記抗体がＩｇＧ抗体である、請求項１に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１７】
前記抗体が、ＩｇＧ４又はＩｇＧ１抗体である、請求項１に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１８】
前記抗体又はその抗原結合部分が、ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、キメラ抗体、ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント及び融合タンパク質からなる群から選択される、請求項１に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１９】
哺乳動物受容体グアニル酸シクラーゼ（ｒＧＣ）の細胞外ドメイン中に位置するエピトープに選択的に結合する単離された抗体又はその抗原結合部分であって、ここで該エピトープが、前記哺乳動物ｒＧＣに特異的なリガンド又は活性化タンパク質に該ｒＧＣが結合した場合に形成され、かつ該抗体が、前記ｒＧＣのリガンド又は活性化タンパク質結合部位と反応性ではない、単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２０】
該抗体が、該受容体を通して該リガンド又は活性化タンパク質の活性を増強する、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２１】
前記哺乳動物ｒＧＣがヒトｒＧＣである、請求項１８に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２２】
前記ヒトｒＧＣが、ＮＰＲＡ、ＮＰＲＢ、ＧＣ−Ｃ、ＧＣ−Ｄ、ＧＣ−Ｅ、ＧＣ−Ｆ又はＧＣ−Ｇである、請求項２０に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２３】
前記ヒトｒＧＣがＮＰＲＡである、請求項１８に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２４】
前記抗体又はその抗原結合部分が、ＮＰＲ−Ａの細胞外ドメイン中に位置するエピトープを選択的に結合し、ここで該エピトープが、ＮＰＲＡがＡＮＰ及び／又はＢＮＰに結合している場合にＮＰＲＡの三次元構造中に位置する配列を含み、ここで該エピトープが、ＮＰＲＡがＡＮＰ及び／又はＢＮＰに結合している場合にＮＰＲＡの三次元構造中に位置する、残基７−２８（ＮＬＴＶＡＶＶＬＰＬＡＮＴＳＹＰＷＳＷＡＲＶ）（配列番号３０）、１２１−１２９（ＶＫＤＥＹＡＬＴＴ）（配列番号３１）、３１３−３２０（ＴＭＥＤＧＬＶＮ）（配列番号３２）、３２７−３３３（ＨＤＧＬＬＬＹ）（配列番号３３）及び３４７−３５１（ＶＴＤＧＥ）（配列番号３４）；残基２８−８７（ＶＧＰＡＶＥＬＡＬＡＱＶＫＡＲＰＤＬＬＰＧＷＴＶＲＴＶＬＧＳＳＥＮＡＬＧＶＣＳＤＴＡＡＰＬＡＡＶＤＬＫＷＥＨＮＰＡＶＦＬ）（配列番号３５）、９６−１１３（ＡＰＶＧＲＦＴＡＨＷＲＶＰＬＬＴＡＧ）（配列番号３６）、２９３−３０１（ＰＥＹＬＥＦＬＫＱ）（配列番号３７）、３１０−３１２（ＦＮＦ）、３３４−３３５（ＩＱ）、及び３５２−３６２（ＮＩＴＱＲＭＷＮＲＳＦ）（配列番号３８）からなる群から選択される配列によって形成される、請求項２３に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２５】
前記抗体又はその抗原結合部分が、ＮＰＲＡの細胞外ドメイン中に位置するエピトープを選択的に結合し、ここで該エピトープが、ＮＰＲＡがＡＮＰ及び／又はＢＮＰに結合している場合にＮＰＲＡの三次元構造中に位置する一つ以上の配列を含む、請求項２３に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２６】
前記抗体又はその抗原結合部分が、ＮＰＲＡがリガンドに結合している場合に該ＮＰＲ−Ａの細胞外ドメイン中に位置するエピトープを選択的に結合し、該エピトープがペプチドＮＰＲＡによって形成される非連続的な領域によって定義される、請求項２５に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２７】
前記リガンドが、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、マンバナトリウム利尿ペプチド（ＤＮＰ）、ウロジラチン（Ｕｒｏ）、ツノメクサリヘビナトリウム利尿ペプチド、ヘビ毒ナトリウム利尿様ペプチドＡ（ＴＮＰ−ａ）、ヘビ毒ナトリウム利尿様ペプチドＢ（ＴＮＰ−ｂ）、又はヘビ毒ナトリウム利尿様ペプチドＣ（ＴＮＰ−ｃ）である、請求項１９に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２８】
前記ヒトｒＧＣがＮＰＲＡであり、前記リガンドがＡＮＰ、ＢＮＰ、Ｕｒｏ、又はそれらの混合物である、請求項１９に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２９】
前記ヒトｒＧＣがＮＰＲＡであり、前記リガンドがＡＮＰ又はＢＮＰである、請求項１９に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項３０】
前記ヒトｒＧＣがＮＰＲＢであり、前記リガンドがＣＮＰである、請求項１９に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項３１】
前記ヒトｒＧＣが、ＧＣ−Ｃ、ＧＣ−Ｄ、ＧＣ−Ｅ、ＧＣ−Ｆ又はＧＣ−Ｇである、請求項１９に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項３２】
前記ｒＧＣがＮＰＲＡである、請求項１９に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項３３】
哺乳動物受容体グアニル酸シクラーゼ（ｒＧＣ）に特異的なリガンド又は活性化タンパク質の存在下で前記哺乳動物ｒＧＣの細胞外ドメイン中に位置するエピトープに選択的に結合し、前記ｒＧＣのリガンド又は活性化タンパク質結合部位と非反応性であり、かつＶＨ及びＶＬ鎖を含むモノクローナル抗体と競合する、単離された抗体又はその抗原結合部分であって、各ＶＨ及びＶＬ鎖が、フレームワークアミノ酸配列によって分離された超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、前記超可変領域が各ＶＨ及びＶＬ中に、該エピトープに結合するために、
該抗体のＶＨＣＤＲ１が配列番号３の配列を有し、
該抗体のＶＨＣＤＲ２が配列番号４及び１０からなる群から選択される配列を有し、
該抗体のＶＨＣＤＲ３が配列番号１３の配列を有し、
該抗体のＶＬＣＤＲ１が配列番号１４の配列を有し、
該抗体のＶＬＣＤＲ２が配列番号１５の配列を有し、かつ
該抗体のＶＬＣＤＲ３が配列番号１６、１７及び１８からなる群から選択される配列を有する、
アミノ酸配列を有する、単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項３４】
ＶＨ及びＶＬ鎖を含む抗体によって結合されるエピトープと本質的に同一のエピトープに結合する、単離された抗体又はその抗原結合部分であって、各ＶＨ及びＶＬ鎖が、フレームワークアミノ酸配列によって分離された超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、前記超可変領域が各ＶＨ及びＶＬ中に、
該抗体のＶＨＣＤＲ１が配列番号３の配列を有し、
該抗体のＶＨＣＤＲ２が配列番号４及び１０からなる群から選択される配列を有し、
該抗体のＶＨＣＤＲ３が配列番号１３の配列を有し、
該抗体のＶＬＣＤＲ１が配列番号１４の配列を有し、
該抗体のＶＬＣＤＲ２が配列番号１５の配列を有し、かつ
該抗体のＶＬＣＤＲ３が配列番号１６、１７及び１８からなる群から選択される配列を有する、
アミノ酸配列を有する、単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項３５】
哺乳動物受容体グアニル酸シクラーゼ（ｒＧＣ）に特異的なリガンド又は活性化タンパク質の存在下で前記哺乳動物ｒＧＣの細胞外ドメイン中のエピトープに結合する、単離された抗体又はその抗原結合部分であって、ここで該エピトープが、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体に結合され、各ＶＨ及びＶＬが、フレームワークアミノ酸配列によって分離された超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、前記超可変領域が各ＶＨ及びＶＬ鎖中に、
配列番号３の配列を有するＶＨＣＤＲ１、
配列番号４及び１０からなる群から選択される配列を有するＶＨＣＤＲ２、
配列番号１３の配列を有するＶＨＣＤＲ３、
配列番号１４の配列を有するＶＬＣＤＲ１、
配列番号１５の配列を有するＶＬＣＤＲ２、及び
配列番号１６、１７及び１８からなる群から選択される配列を有するＶＬＣＤＲ３、
のアミノ酸配列を有する、単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項３６】
ＮＰＲＡに特異的な抗体であって、ａ）相補性決定領域として、それぞれ以下のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域：ＧＤＳＶＳＳＮＳＡＡＷＳ（配列番号３９）；ＲＴＹＹＲ−ＳＨＷＹＦＥＹＡＶＳＶＫＳ（配列番号４０）及びＭＤＶＰＳＦＲＹＦＤＶ（配列番号４１）；並びにｂ）相補性決定領域として、それぞれ以下のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域：ＲＡＳＱＳＶＲＳ−−−−−ＮＹＬＡ（配列番号４２）、ＧＡＳＮＲＡＴ（配列番号４３）及びＱＱＩＳＮＰＰ−−−−−Ｖ（配列番号４４）、を含み、ここで、該抗体が、ＮＰＲＡリガンドの存在下でＮＰＲＡを結合し、該抗体の非存在下における該ＮＰＲＡに対する該リガンドの親和性と比較して、該ＮＰＲＡに対する該リガンドの親和性を増加させる、抗体。
【請求項３７】
請求項１〜３６のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分を生成する、単離された細胞株。
【請求項３８】
重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１、２及び３を有する抗体であって、ここで
該抗体のＶＨＣＤＲ１が配列番号３の配列を有し、
該抗体のＶＨＣＤＲ２が配列番号４及び１０からなる群から選択される配列を有し、
該抗体のＶＨＣＤＲ３が配列番号１３の配列を有し、
該抗体のＶＬＣＤＲ１が配列番号１４の配列を有し、
該抗体のＶＬＣＤＲ２が配列番号１５の配列を有し、かつ
該抗体のＶＬＣＤＲ３が配列番号１６、１７及び１８からなる群から選択される配列を有する、
抗体を生成する、請求項３７に記載の細胞株。
【請求項３９】
ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ（ＮＰＲ−Ａ）に結合する抗体又はその抗原結合部分をコード化する配列を含む単離された核酸分子であって、ここで該抗体又はその抗原結合部分が、配列番号４及び１０からなる群から選択される配列を有する重鎖超可変領域ＣＤＲ２を含む、単離された核酸分子。
【請求項４０】
ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ（ＮＰＲ−Ａ）に結合する抗体又はその抗原結合部分をコード化する配列を含む単離された核酸分子であって、ここで該抗体又はその抗原結合部分が、配列番号１６、１７及び１８からなる群から選択される配列を有する軽鎖超可変領域ＣＤＲ３を含む、単離された核酸分子。
【請求項４１】
ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ（ＮＰＲ−Ａ）に結合する抗体又はその抗原結合部分をコード化する配列を含む単離された核酸分子であって、ここで該抗体又はその抗原結合部分が、配列番号４及び１０からなる群から選択される配列を有する重鎖超可変領域ＣＤＲ２、並びに配列番号１６、１７及び１８からなる群から選択される配列を有する軽鎖超可変領域ＣＤＲ３、を含む、単離された核酸分子。
【請求項４２】
ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ（ＮＰＲ−Ａ）に結合する抗体又はその抗原結合部分をコード化する配列を含む単離された核酸分子であって、ここで該抗体又はその抗原結合部分が重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含み、ここで前記ＶＨが、配列番号３の配列を有する超可変領域ＶＨＣＤＲ１、配列番号４及び１０からなる群から選択される配列を有する超可変領域ＶＨＣＤＲ２、並びに配列番号１３の配列を有する該抗体の超可変領域ＶＨＣＤＲ３を含み、ここで前記超可変領域が、フレームワークアミノ酸配列によって分離されている、単離された核酸分子。
【請求項４３】
ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ（ＮＰＲ−Ａ）に結合する抗体又はその抗原結合部分をコード化する配列を含む単離された核酸分子であって、ここで該抗体又はその抗原結合部分が軽鎖可変ドメイン（ＶL）を含み、ここで前記ＶLが、配列番号１４の配列を有する超可変領域ＶＬＣＤＲ１、配列番号１５の配列を有する超可変領域ＶＬＣＤＲ２、並びに配列番号１６、１７及び１８からなる群から選択される配列を有する超可変領域ＶＬＣＤＲ３を含み、ここで前記超可変領域が、フレームワークアミノ酸配列によって分離されている、単離された核酸分子。
【請求項４４】
前記超可変領域が、ヒトのフレームワーク領域中に提供される、請求項４２又は４３に記載の核酸分子。
【請求項４５】
ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ（ＮＰＲ−Ａ）に結合する抗体又はその抗原結合部分をコード化する配列を含む単離された核酸分子であって、ここで該抗体又はその抗原結合部分がＡｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４及びＡｂ５からなる群から選択され、ここでＡｂ１〜Ａｂ５がＶＨ及びＶＬ鎖を含み、各ＶＨ及びＶＬ鎖がフレームワークアミノ酸配列によって分離されている超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、前記超可変領域が各ＶＨ及びＶＬ鎖中に、以下の表に従って選択されるＡｂ１〜Ａｂ５のアミノ酸配列を有する、単離された核酸分子。
【表１】
2012510295.tif 000019
【請求項４６】
請求項３９〜４５のいずれか１項に記載の核酸分子を含みかつ発現する能力がある、ベクター。
【請求項４７】
請求項４６に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項４８】
宿主細胞が細菌性である、請求項４７に記載の宿主細胞。
【請求項４９】
宿主細胞が哺乳動物性である、請求項４６に記載の宿主細胞。
【請求項５０】
請求項１〜３６のいずれか１項に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分及び医薬的に許容可能なその担体又は添加剤を含む、医薬組成物。
【請求項５１】
抗体が、ＶＨ及びＶＬ鎖を含むモノクローナル抗ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ抗体であり、各ＶＨ及びＶＬ鎖がフレームワークアミノ酸配列によって分離されている超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、前記超可変領域が各ＶＨ及びＶＬ鎖中に、以下の表に従って選択されるＡｂ１〜Ａｂ５のアミノ酸配列を有する、請求項５０に記載の医薬組成物。
【表２】
2012510295.tif 000020
【請求項５２】
単離された抗体又はその抗原結合部分の製造方法であって、請求項４６に記載の宿主細胞又は請求項３６に記載の細胞株を適切な条件下で培養する工程、及び前記抗体又はその抗原結合部分を回収する工程を含む、方法。
【請求項５３】
フレームワークアミノ酸配列によって分離されている重鎖及び軽鎖超可変領域をコード化する核酸分子が、宿主細胞において共発現される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
リガンド又は活性化タンパク質の、哺乳動物受容体グアニル酸シクラーゼ（ｒＧＣ）の細胞外ドメインへの見かけ上の親和性を増強する方法であって、前記哺乳動物ｒＧＣを、前記リガンド又は活性化タンパク質の存在下で、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分と接触させることを含む、方法。
【請求項５５】
前記哺乳動物ｒＧＣがヒトｒＧＣである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ヒトｒＧＣが、ＮＰＲ−Ａ、ＮＰＲ−Ｂ、ＮＰＲ−Ｅ又はＮＰＲ−Ｆである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ヒトｒＧＣがＮＰＲ−Ａである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
前記リガンドが、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、マンバナトリウム利尿ペプチド（ＤＮＰ）、ウロジラチン（Ｕｒｏ）、ツノメクサリヘビナトリウム利尿ペプチド、ヘビ毒ナトリウム利尿様ペプチドＡ（ＴＮＰ−ａ）、ヘビ毒ナトリウム利尿様ペプチドＢ（ＴＮＰ−ｂ）、又はヘビ毒ナトリウム利尿様ペプチドＣ（ＴＮＰ−ｃ）である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
前記ヒトｒＧＣがＮＰＲ−Ａであり、前記リガンドが、ＡＮＰ、ＢＮＰ、Ｕｒｏ、又はそれらの混合物である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
前記ヒトｒＧＣがＮＰＲ−Ａであり、前記リガンドが、ＡＮＰ又はＢＮＰである、請求項５５に記載の方法。
【請求項６１】
前記ヒトｒＧＣがＮＰＲ−Ｂであり、前記リガンドがＣＮＰである、請求項５５に記載の方法。
【請求項６２】
前記ヒトｒＧＣが、ＮＰＲ−Ｅ又はＮＰＲ−Ｆである、請求項５５に記載の方法。
【請求項６３】
前記リガンド又は活性化タンパク質の、前記哺乳動物ｒＧＣへの見かけ上の親和性における増加が、その抗体が存在しない場合よりも少なくとも２倍高い、請求項５５に記載の方法。
【請求項６４】
前記リガンド又は活性化タンパク質の、前記哺乳動物ｒＧＣへの見かけ上の親和性における増加が、前記抗体が存在しない場合よりも少なくとも３倍高い、請求項５５に記載の方法。
【請求項６５】
前記抗体の結合が、哺乳動物ｒＧＣに関連する触媒活性をさらに亢進する、請求項５４に記載の方法。
【請求項６６】
前記触媒活性が、細胞内ｃＧＭＰ生成における増加である、請求項５４に記載の方法。
【請求項６７】
前記細胞内ｃＧＭＰ生成における増加が、前記抗体、そのバリアント又はそのフラグメントが存在しない場合よりも少なくとも２倍高い、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記抗体、そのバリアント又はそのフラグメントが、モノクローナル抗体である、請求項５４に記載の方法。
【請求項６９】
前記抗体がＩｇＧ抗体である、請求項５４に記載の方法。
【請求項７０】
前記抗体が、ＩｇＧ４又はＩｇＧ１抗体である、請求項５４に記載の方法。
【請求項７１】
前記抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント及び融合タンパク質からなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項７２】
前記増強が、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される、請求項５４に記載の方法。
【請求項７３】
対象における哺乳動物ｒＧＣの触媒活性レベルの低下に関連する障害又は状態を処置する方法であって、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分の有効量を、それを必要とする前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項７４】
対象における哺乳動物ｒＧＣの触媒活性レベルの低下に関連する障害又は状態を処置する方法であって、請求項５０に記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項７５】
該障害が、心不全、高血圧症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、糖尿病性腎症、脳卒中、心房細動、心室性不整脈（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ａｒｒｙｔｈｍｉａｓ）、深部静脈血栓症、心筋炎（ｍｙｏｃａｒｄｉｉｓ）、心臓弁膜症、肺動脈塞栓症、心膜疾患、冠動脈攣縮（ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｖａｓｏｐａｓｍ）、メタボリックシンドロームＸ、腎不全（ＣＫＤ、ＥＳＲＤ）及びアレルギー性鼻炎からなる群から選択される、請求項７３又は請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
該心疾患が、非虚血性慢性心不全、心筋梗塞後心不全（虚血性ＣＨＦ）、急性心筋梗塞、再灌流障害、左心室機能不全、心線維症（ｃａｒｄｉａｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、拡張期心不全、肥大型心筋症、急性非代償性心不全及び虚血性心疾患からなる群から選択される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
対象における急性非代償性心不全を処置する方法であって、請求項５０に記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項７８】
対象における高血圧症を処置する方法であって、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分の有効量を、それを必要とする前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項７９】
対象における高血圧症を処置する方法であって、請求項５０に記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項８０】
対象におけるアテローム性動脈硬化症を処置する方法であって、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分の有効量を、それを必要とする前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項８１】
対象におけるアテローム性動脈硬化症を処置する方法であって、請求項５０に記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項８２】
対象における疾患を処置する方法であって、前記疾患が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、糖尿病性腎症、脳卒中、心房細動／心室性不整脈、深部静脈血栓症、心筋炎、心臓弁膜症、肺動脈塞栓症、心膜疾患、冠動脈攣縮、メタボリックシンドロームＸ、腎不全、アレルギー性鼻炎、喘息、炎症性疾患、敗血症性ショック、肥満及び癌からなる群から選択され、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分でそれを必要とする前記対象に対しての有効量を含む、方法。
【請求項８３】
対象における疾患を処置する方法であって、前記疾患が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、糖尿病性腎症、脳卒中、心房細動／心室性不整脈、深部静脈血栓症、心筋炎、心臓弁膜症、肺動脈塞栓症、心膜疾患、冠動脈攣縮、メタボリックシンドロームＸ、腎不全、アレルギー性鼻炎、喘息、炎症性疾患、敗血症性ショック、肥満及び癌からなる群から選択され、請求項５０に記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする前記対象に含む、方法。
【請求項８４】
患者における心不全を処置する方法であって、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分、及び心不全の処置のための第二の治療薬剤、の治療有効量を投与することを含む、方法。
【請求項８５】
該第二の薬剤が、ＡＲＢ／ＡＣＥｉ、ＡＤＰ阻害剤、アルドステロンアンタゴニスト、ナトリウム利尿ペプチド（ｎａｔｉｅｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）、抗不整脈剤（ａｎｔｉ−ａｒｒｈｔｈｍｉｃ  ａｇｅｎｔｓ）、ＨＭＧ−ＣｏＡ阻害剤、β遮断薬、強心配糖体、カルシウムチャネル遮断薬、利尿薬、フィブラート系薬剤、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤、ヘパリン、ニコチン酸誘導体、硝酸薬及び亜硝酸薬、経口抗凝血薬、血栓溶解薬、ＴＺＤ、コレステロール吸収阻害剤、アセチルサリチル酸、ジピリダモール（ｄｉａｐｙｒｉｄａｍｏｌｅ）、ホスホジエステラーゼ阻害剤、ＣＥＴＰ阻害剤／ａｐｏＡ１模倣薬、トロンビン阻害剤、第Ｘａ因子阻害剤、レニン阻害剤、カイメース阻害剤、ＲｈｏＫ阻害剤、ＬｐＰＬＡ２阻害剤、エンドセリン受容体アンタゴニスト、ＨＤＡＣ阻害剤、核内受容体アゴニスト、核内受容体アンタゴニスト、バソペプチダーゼ阻害剤、脂肪酸酸化阻害剤（ｉｎｈｉｂｉｔｒｓ）、ＡＣＡＴ阻害剤、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質阻害剤、アデノシン受容体修飾物質、ＡＧＥ／ＲＡＧＥ相互作用修飾物質、遺伝子療法、細胞療法からなる群から選択される、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
該第二の薬剤が、ＡＮＰ又はＢＮＰである、請求項８４に記載の方法。
【請求項８７】
該第二の薬剤が、ネシリチド、カルペリチド、ウラリチド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
患者においてＮＰＲＡリガンドの治療効果を延長させる又は増大させる方法であって、該ＮＰＲＡリガンドを、請求項１〜３６のいずれかに記載の抗体と組み合わせて投与することを含む、方法。
【請求項８９】
該患者が心不全から苦しんでいる、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
該患者が急性非代償性心不全から苦しんでいる、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
該患者が慢性心不全から苦しんでいる、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
該ＮＰＲＡリガンドが、ネシリチド、カルペリチド、ウラリチド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項８９に記載の方法。
【請求項９３】
前記抗体と該ＮＰＲＡリガンドとの同時投与が、該ＮＰＲＡリガンドの効果を、該抗体の非存在下で見られる前記ＮＰＲＡリガンド活性の場合の少なくとも２倍延長する、請求項８９に記載の方法。
【請求項９４】
該抗体が、該ＮＰＲＡリガンドの投与と同時に、投与前に、又は投与後に投与される、請求項８９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
３’，５’−環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）を介した細胞内シグナル伝達は、血管緊張、腎及び心機能、免疫応答性、血小板の活性化、網膜の光伝達並びに骨成長の調節を含む、多くの基本的な生理的プロセスにおいて重要な役割を果たす。内因性ｃＧＭＰレベルが、上記生物学的プロセスを調整するため、ｃＧＭＰ合成を調節する分子は、新薬の発見及び治療法の開発のための当然の標的となる。グアニリルシクラーゼは、そのような分子である。
【０００２】
より具体的には、ｃＧＭＰは、二つのファミリーのグアニリルシクラーゼ酵素（微粒子グアニリルシクラーゼ（ｐＧＣ）及び可溶性グアニリルシクラーゼ（ｓＧＣ））のうちの一つによる、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）の触媒作用によって生成される。ｐＧＣは一般的に、触媒ドメインを含む伸長した細胞内ドメイン、膜貫通領域、及び細胞外リガンド結合ドメインを含む、ホモ二量体として存在する。これに対して、ｓＧＣは、一酸化窒素によって活性化され得る補欠分子族ヘムを含有する、細胞内ヘテロ二量体分子である。ＮＯ−ヘム錯体の形成によって、ｓＧＣは、コンフォメーション変化を経て、触媒活性における大きな増加がもたらされる。そのように生成されたｃＧＭＰは、プロテインキナーゼ、ホスホジエステラーゼ及びイオンチャネルを含む、数多くのエフェクター分子を調節し得る。
【０００３】
治療指標の宿主にとって特に関連性が深いのが、ナトリウム利尿ペプチドによって活性化される微粒子グアニリルシクラーゼのファミリーである。ナトリウム利尿ペプチドは、２８〜３２アミノ酸長の環状ペプチドホルモンであり、これはより長いプレプロタンパク質として合成され、プロセシングされて成熟ペプチドをもたらす。ナトリウム利尿ペプチドの例としては、心臓から放出されるＡ型又は心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、腎臓によって生成されるＡＮＰの異なるプロセシング形態であるウロジラチン、心室心筋において合成されるＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、並びに、内皮細胞及び軟骨細胞を含む数多くの細胞種によって生成されるＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）（非特許文献１）が挙げられる。
【０００４】
ＡＮＰ、ウロジラチン及びＢＮＰによって結合される膜結合型ＧＣの一つは、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ（ＮＰＲＡとしてもまた知られる）である。これらのホルモンによるＮＰＲＡの活性化は、血管緊張低下、ナトリウム排泄増加、利尿、脂肪分解、心肥大及び心筋線維化の阻害、レニン−アンギオテンシン−アルドステロン系の阻害、並びに交感神経活性の阻害、を含む種々の生理応答を引き起こす。一方で、ＣＮＰは、ナトリウム利尿ペプチドＢ型受容体（ＮＰＲＢ）の強力なアゴニストである。ＣＮＰ−依存的なＮＰＲＢの活性化はまた、血管拡張並びに長骨成長の刺激を引き起こし得る。全てのナトリウム利尿ペプチドは、およそ２〜２０分にわたる、非常に短い血漿内半減期を有する。それらの迅速な代謝回転の理由の一つは、それらが、中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）、メプリンＡ及びジペプチジルペプチダーゼＩＶ等のプロテアーゼによって分解されるためである。そのうえ、ＡＮＰ、ウロジラチン、ＢＮＰ及びＣＮＰはまた、非グアニリルシクラーゼのクリアランス受容体であるナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ（ＮＰＲＣ）にも結合する。ＮＰＲＣへの結合は、リソソーム分解後のペプチドの内部移行をもたらす。例えば、非特許文献２を参照のこと。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｐｏｔｔｅｒら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２７：４７，２００６
【非特許文献２】Ｃｏｈｅｎら，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，２７１：９８６３  １９９６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＮＰＲＡは、心腎機能の調節において、重要な役割を果たすことが示されてきた。ＡＮＰ及びＢＮＰによるこの受容体の活性化は、心充満圧の低下、後負荷の低減、利尿及びナトリウム利尿（ｎａｔｉｕｒｅｓｉｓ）並びに交感神経及びレニン−アンギオテンシン−アルドステロン経路等の神経ホルモン系の阻害を引き起こす。延長されたＮＰＲＡ活性化は、抗心肥大（ｃａｒｄｉａｃ  ａｎｔｉｈｙｐｅｒｔｒｏｐｉｃ）及び抗線維症効果を有する。ＡＮＰ及びＢＮＰは、緊張及び伸張に応答して心臓によって生成され、心不全の患者では上昇する。ＮＰＲＡは、細胞内ＧＣドメインを含有し、ｃＧＭＰの生成を通して、その効果を発揮する。しかしながら、多くの単一膜貫通型ホルモン受容体でそうであるように、従来のアプローチを使用した小分子アゴニストの同定は成功していない。
【０００７】
ＮＰＲＡリガンドの組換え形態が、急性非代償性心不全の処置のために承認されてきた。しかしながら、これらの組換えリガンドは、非常に短い半減期を有し（典型的には、２０分以下）、したがって、持続性静脈内注入によって投与されなければならない。ＢＮＰの組換え形態（ネシリチド（Ｎｅｓｉｒｉｔｉｄｅ））は、２００１年に米国において急性非代償性心不全の処置のために承認された。組換えヒトＡＮＰ（カルペリチド（Ｃａｒｐｅｒｉｔｉｄｅ））は、１９９５年に日本において同一の適応症のために承認され、組換えウロジラチン（ウラリチド（Ｕｌａｒｉｔｉｄｅ）、ＡＮＰの腎臓での形態）は現在臨床試験中である。承認過程の最中にＦＤＡに提出されたネシリチドのデータの検討は、組換えＢＮＰの投与に伴う重要な安全上の懸念、より詳細には、死亡率上昇及び腎機能の低下をさらに明らかにした。これらの安全上の懸念の多くはその後、推測上のものであったと考えられているものの、組換えナトリウム利尿（ｎａｔｉｕｒｅｔｉｃ）ペプチドが有害事象を誘発する可能性については疑問が残っている。このため、現在承認されている組成物の使用は、急性の適応症に限定されており、より慢性的な状態において心不全を管理するためのＮＰＲＡ経路を標的とする追加の療法に対する必要性が残っている。単回投与での急性非代償性心不全の処置及び毎週又は毎月の注射での慢性心不全の処置の両方を可能とする、ＮＰＲＡ経路の活性化を引き起こす治療介入は、これらの重篤な状態から苦しんでいる患者に対して、大いに利益を提供するだろう。現在までに、そのような療法は見つかっていない。
【０００８】
ナトリウム利尿ペプチドを改変し、かつ／又はＧＣ受容体を拮抗するための努力は、急性非代償性心不全における使用のためのいくつかの治療用組成物をもたらしたものの、これらの努力は、慢性心不全のための頑強な治療適用を作ることには失敗している。したがって、安全であり、ｉｎ  ｖｉｖｏで優れた安定性を有しかつナトリウム利尿ペプチド系の活性化を効果的に調整する、ｐＧＣを調節する分子を開発する必要性が、現在から今後にかけて存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の目的は、グアニル酸シクラーゼ受容体の増強物質又は刺激物質として作用する新規抗体の使用を通して、上記の必要性に取り組むことである。具体的には、本発明は、抗体又はその抗原結合部分の結合が、リガンド又は活性化タンパク質の哺乳動物グアニル酸シクラーゼ（ｒＧＣ）受容体への見かけ上の親和性を増加させるように、前記哺乳動物ｒＧＣの細胞外ドメインに、前記哺乳動物ｒＧＣに特異的な前記リガンド又は活性化タンパク質の存在下で選択的に結合する、単離された抗体又はその抗原結合部分に関する。具体的な実施態様において、リガンドの親和性増加は、哺乳動物のｒＧＣからのリガンドのより遅いオフ速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）として観察されることが示されており、これは親和性の見かけ上の増加を引き起こす。一般論として、本明細書中に記載される方法は、リガンドの分子効力の増加をもたらし、より低い濃度で、リガンドを、その生物学的応答においてより有効とする。極めて効力の強い薬物は、低濃度でより大きな応答を誘起する。効力は、薬物の活性を、所定の強度の効果を生じさせるのに必要な量という観点から表現した尺度であるため、本発明の方法を使用した、リガンドの「効力の増加」は一般的に、本明細書中に記載される、哺乳動物のグアニル酸シクラーゼ（ｒＧＣ）受容体の細胞外ドメインに選択的に結合する抗体又はその抗原結合部分の存在下で応答を起こすために、当該抗体又はその抗原結合部分の非存在下でそのレベルの応答を起こすために必要とされるリガンド又は活性化タンパク質の量と比較して、より少ないリガンド又は活性化タンパク質が必要とされることを意味する。
【００１０】
前記哺乳動物ｒＧＣは好ましくは、例えばＮＰＲＡ、ＮＰＲＢ、ＮＰＲＥ又はＮＰＲＦ等のヒトｒＧＣである。具体的な実施態様において、前記ヒトｒＧＣはＮＰＲＡである。
【００１１】
一定の定義された実施態様における前記リガンドは、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、マンバ（Ｄｅｎｄｒｏａｓｐｉｓ）ナトリウム利尿ペプチド（ＤＮＰ）、ウロジラチン（Ｕｒｏ）、ツノメクサリヘビ（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒａｓｔｅｓ  ｐｅｒｓｉｃｕｓ）ナトリウム利尿ペプチド、ヘビ毒ナトリウム利尿様ペプチド（ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ）Ａ（ＴＮＰ−ａ）、ヘビ毒ナトリウム利尿様ペプチドＢ（ＴＮＰ−ｂ）、もしくはヘビ毒ナトリウム利尿様ペプチドＣ（ＴＮＰ−ｃ）、又はそれらに由来するもしくはそれらを包含する活性ペプチドである。
【００１２】
具体的な実施態様において、前記ヒトｒＧＣはＮＰＲＡであり、前記リガンドはＡＮＰ、ＢＮＰ、Ｕｒｏ、又はそれらの混合物である。他の実施態様において、前記ヒトｒＧＣはＮＰＲＡであり、前記リガンドはＡＮＰ又はＢＮＰである。さらに他の実施態様において、前記ヒトｒＧＣはＮＰＲＢであり、前記リガンドはＣＮＰである。また別の実施態様において、前記ヒトｒＧＣは、ＧＣ−Ｃ、ＧＣ−Ｄ、ＧＣ−Ｅ、ＧＣ−Ｆ又はＧＣ−Ｇである（Ｋｕｈｎ，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ９３：７００，２００３）。
【００１３】
具体的な態様において、前記リガンド又は活性化タンパク質の哺乳動物ｒＧＣへの見かけ上の親和性の増加は、前記抗体又はその抗原結合部分が存在しない場合よりも少なくとも２倍高い。他の実施態様において、リガンドによって誘発された細胞内ｃＧＭＰ生成のＥＣ５０は、前記抗体又はその抗原結合部分が存在しない場合よりも少なくとも２倍低い。
【００１４】
一定の実施態様において、単離された抗体又はその抗原結合部分は、抗体又はその抗原結合部分の結合が、前記哺乳動物ｒＧＣに関連する触媒活性を亢進又は持続させるものである。より低いリガンド濃度でより多くのｃＧＭＰが生成されるように、リガンドへの亢進された受容体の応答が存在するために、触媒活性は亢進又は持続するとみられる。具体的な実施態様において、前記触媒活性は、細胞内ｃＧＭＰ生成の増加であり、ここでｒＧＣはＮＰＲＡ又はＮＰＲＢである。
【００１５】
具体的な実施態様において、前記抗体又はその抗原結合部分はモノクローナル抗体である。より具体的な実施態様において、前記抗体はＩｇＧ抗体であり、より詳細には、ＩｇＧ４又はＩｇＧ１抗体である。
【００１６】
他の実施態様において、前記抗体又はその抗原結合部分は、ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、キメラ抗体、ぺプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント及び融合タンパク質からなる群から選択される。
【００１７】
本発明の別の態様は、哺乳動物受容体グアニル酸シクラーゼ（ｒＧＣ）の細胞外ドメイン中に位置するエピトープに選択的に結合する単離された抗体又はその抗原結合部分に関し、ここで前記エピトープが、前記哺乳動物ｒＧＣに特異的なリガンド又は活性化タンパク質に前記ｒＧＣが結合した場合に形成され、かつここで前記抗体が、前記ｒＧＣのリガンド又は活性化タンパク質結合部位と反応性ではない。具体的な実施態様において、前記抗体は、前記受容体を通して前記リガンド又は活性化タンパク質の活性を増強する。
【００１８】
一定の実施態様において、前記抗体又はその抗原結合部分は、ＮＰＲＡの細胞外ドメイン中に位置するエピトープを選択的に結合し、ここで前記エピトープが、ＮＰＲＡがＡＮＰ及び／又はＢＮＰに結合している場合にＮＰＲＡの三次元構造中に位置する、残基７−２８（ＮＬＴＶＡＶＶＬＰＬＡＮＴＳＹＰＷＳＷＡＲＶ、配列番号３０）、１２１−１２９（ＶＫＤＥＹＡＬＴＴ、配列番号３１）、３１３−３２０（ＴＭＥＤＧＬＶＮ、配列番号３２）、３２７−３３３（ＨＤＧＬＬＬＹ、配列番号３３）及び３４７−３５１（ＶＴＤＧＥ、配列番号３４）を含む。
【００１９】
さらに他の実施態様において、前記抗体又はその抗原結合部分は、ＮＰＲＡの細胞外ドメイン中に位置するエピトープを選択的に結合し、ここで前記エピトープが、ＮＰＲＡがＡＮＰ及び／又はＢＮＰに結合している場合にＮＰＲＡの三次元構造中に位置する配列の一つ以上を含む。そのようなペプチドとしては、図２２に示されるピンクの部分が挙げられ、それらは、ペプチド配列２８−８７（ＶＧＰＡＶＥＬＡＬＡＱＶＫＡＲＰＤＬＬＰＧＷＴＶＲＴＶＬＧＳＳＥＮＡＬＧＶＣＳＤＴＡＡＰＬＡＡＶＤＬＫＷＥＨＮＰＡＶＦＬ）（配列番号３５）、９６−１１３（ＡＰＶＧＲＦＴＡＨＷＲＶＰＬＬＴＡＧ）（配列番号３６）、２９３−３０１（ＰＥＹＬＥＦＬＫＱ）（配列番号３７）、３１０−３１２（ＦＮＦ）、３３４−３３５（ＩＱ）、３５２−３６２（ＮＩＴＱＲＭＷＮＲＳＦ）（配列番号３８）によって生成される。
【００２０】
本発明の一定の態様は、ＮＰ−Ａがリガンドに結合している場合にＮＰＲＡの細胞外ドメイン中に位置するエピトープを選択的に結合する単離された抗体又は抗原結合部分に関し、該エピトープは、ＮＰＲＡについて上に示されたペプチドによって形成される非連続的な領域によって定義される。
【００２１】
本明細書中に記載されるモノクローナル抗体と同一のエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体もまた意図され、ここで前記モノクローナル抗体は、該抗体分子をコード化する核酸を発現するように操作された宿主細胞によって生成される。
【００２２】
具体的な、単離された抗体又はその抗原結合部分もまた意図され、それらは、哺乳動物受容体グアニル酸シクラーゼ（ｒＧＣ）に特異的なリガンド又は活性化タンパク質の存在下で前記哺乳動物ｒＧＣの細胞外ドメイン中に位置するエピトープに選択的に結合し、前記ｒＧＣのリガンド又は活性化タンパク質結合部位と非反応性であり、かつＶＨ及びＶＬ鎖を含む抗体であって、ここで各ＶＨ及びＶＬ鎖が、フレームワークアミノ酸配列によって分離された超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、前記超可変領域が各ＶＨ及びＶＬ中に、
該抗体のＶＨＣＤＲ１が配列番号３の配列を有し、
該抗体のＶＨＣＤＲ２が配列番号４、１３及び１０からなる群から選択される配列を有し、
該抗体のＶＨＣＤＲ３が配列番号１３の配列を有し、
該抗体のＶＬＣＤＲ１が配列番号１４の配列を有し、
該抗体のＶＬＣＤＲ２が配列番号１５の配列を有し、かつ
該抗体のＶＬＣＤＲ３が配列番号１６、１７及び１８からなる群から選択される配列を有する、
アミノ酸配列を有する抗体、又は表１及び２に示される抗体、からなる群から選択されるモノクローナル抗体と、該エピトープへの結合において競合する。
【００２３】
本発明の別の態様は、ＶＨ及びＶＬ鎖を含む抗体によって結合されるエピトープと本質的に同一のエピトープに結合する単離された抗体又はその抗原結合部分に関し、各ＶＨ及びＶＬ鎖は、フレームワークアミノ酸配列によって分離された超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、前記超可変領域は各ＶＨ及びＶＬ中に、
該抗体のＶＨＣＤＲ１が配列番号３の配列を有し、
該抗体のＶＨＣＤＲ２が配列番号４及び１０からなる群から選択される配列を有し、
該抗体のＶＨＣＤＲ３が配列番号１３の配列を有し、
該抗体のＶＬＣＤＲ１が配列番号１４の配列を有し、
該抗体のＶＬＣＤＲ２が配列番号１５の配列を有し、かつ
該抗体のＶＬＣＤＲ３が配列番号１６、１７及び１８からなる群から選択される配列を有する、
アミノ酸配列を有する。
【００２４】
意図される他の具体的な、単離された抗体又はその抗原結合部分は、哺乳動物受容体グアニル酸シクラーゼ（ｒＧＣ）に特異的なリガンド又は活性化タンパク質の存在下で前記哺乳動物ｒＧＣの細胞外ドメイン中のエピトープに結合する、単離された抗体又はその抗原結合部分であり、ここで該エピトープは、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体に結合され、各ＶＨ及びＶＬは、フレームワークアミノ酸配列によって分離された超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、前記超可変領域は各ＶＨ及びＶＬ鎖中に、
配列番号３の配列を有するＶＨＣＤＲ１、
配列番号４及び１０からなる群から選択される配列を有するＶＨＣＤＲ２、
配列番号１３の配列を有するＶＨＣＤＲ３、
配列番号１４の配列を有するＶＬＣＤＲ１、
配列番号１５の配列を有するＶＬＣＤＲ２、及び
配列番号１６、１７及び１８からなる群から選択される配列を有するＶＬＣＤＲ３、
のアミノ酸配列を有する。
【００２５】
他の好ましい抗体は、ＮＰＲＡに特異的な抗体であって、ａ）相補性決定領域として、それぞれ以下のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域：ＧＤＳＶＳＳＮＳＡＡＷＳ（配列番号３９）；ＲＴＹＹＲ−ＳＨＷＹＦＥＹＡＶＳＶＫＳ（配列番号４０）及びＭＤＶＰＳＦＲＹＦＤＶ（配列番号４１）；並びにｂ）相補性決定領域として、それぞれ以下のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域：ＲＡＳＱＳＶＲＳ−−−−−ＮＹＬＡ（配列番号４２）、ＧＡＳＮＲＡＴ（配列番号４３）及びＱＱＩＳＮＰＰ−−−−−Ｖ（配列番号４４）、を含み、ここで、該抗体が、ＮＰＲＡリガンドの存在下でＮＰＲＡを結合し、該抗体の非存在下における該ＮＰＲＡに対する該リガンドの親和性と比較して、該ＮＰＲＡに対する該リガンドの親和性を増加させる、抗体である。
【００２６】
本明細書中に記載される抗体又は抗体の抗原結合部分を生成する細胞株もまた意図される。具体的な細胞株としては、重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１、２及び３を有する抗体を生成する細胞株であって、ここで
該抗体のＶＨＣＤＲ１が配列番号３の配列を有し、
該抗体のＶＨＣＤＲ２が配列番号４及び１０からなる群から選択される配列を有し、
該抗体のＶＨＣＤＲ３が配列番号１３の配列を有し、
該抗体のＶＬＣＤＲ１が配列番号１４の配列を有し、
該抗体のＶＬＣＤＲ２が配列番号１５の配列を有し、かつ
該抗体のＶＬＣＤＲ３が配列番号１６、１７及び１８からなる群から選択される配列を有する、
抗体、を生成する細胞株が挙げられる。
【００２７】
ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ（ＮＰＲ−Ａ）に結合する抗体又はその抗原結合部分をコード化する配列を含む単離された核酸分子であって、ここで該抗体又はその抗原結合部分が、配列番号４及び１０からなる群から選択される配列を有する重鎖超可変領域ＣＤＲ２を含む、単離された核酸分子もまた意図される。
【００２８】
他の実施態様は、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ（ＮＰＲＡ）に結合する抗体又はその抗原結合部分をコード化する配列を含む単離された核酸分子であって、ここで該抗体又はその抗原結合部分が、配列番号１６、１７及び１８からなる群から選択される配列を有する軽鎖超可変領域ＣＤＲ３を含む、単離された核酸分子を記述する。
【００２９】
さらに別の実施態様は、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ（ＮＰＲＡ）に結合する抗体又はその抗原結合部分をコード化する配列を含む単離された核酸分子であって、ここで該抗体又はその抗原結合部分が、配列番号４及び１０からなる群から選択される配列を有する重鎖超可変領域ＣＤＲ２、並びに配列番号１６、１７及び１８からなる群から選択される配列を有する軽鎖超可変領域ＣＤＲ３、を含む、単離された核酸分子に関する。
【００３０】
本発明の別の態様は、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ（ＮＰＲＡ）に結合する抗体又はその抗原結合部分をコード化する配列を含む単離された核酸分子であって、ここで該抗体又はその抗原結合部分が重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含み、ここで前記ＶＨが、配列番号３の配列を有する超可変領域ＶＨＣＤＲ１、配列番号４及び１０からなる群から選択される配列を有する超可変領域ＶＨＣＤＲ２、並びに配列番号１３の配列を有する該抗体の超可変領域ＶＨＣＤＲ３を含み、ここで前記超可変領域が、フレームワークアミノ酸配列によって分離されている、単離された核酸分子を記述する。ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ（ＮＰＲＡ）に結合する抗体又はその抗原結合部分をコード化する配列を含む単離された核酸分子であって、ここで該抗体又はその抗原結合部分が軽鎖可変ドメイン（ＶL）を含み、ここで前記ＶLが、配列番号１４の配列を有する超可変領域ＶＬＣＤＲ１、配列番号１５の配列を有する超可変領域ＶＬＣＤＲ２、並びに配列番号１６、１７及び１８からなる群から選択される配列を有する超可変領域ＶＬＣＤＲ３を含み、ここで前記超可変領域が、フレームワークアミノ酸配列によって分離されている、単離された核酸分子もまた意図される。具体的な実施態様において、超可変領域は、ヒトのフレームワーク領域中に提供される。
【００３１】
本発明はまた、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ（ＮＰＲＡ）に結合する抗体又はその抗原結合部分をコード化する配列を含む単離された核酸分子であって、ここで該抗体又はその抗原結合部分が、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４及びＡｂ５からなる群から選択され、ここでＡｂ１〜Ａｂ５がＶＨ及びＶＬ鎖を含み、各ＶＨ及びＶＬ鎖がフレームワークアミノ酸配列によって分離されている超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、前記超可変領域が各ＶＨ及びＶＬ鎖中に、以下の表に従って選択されるＡｂ１〜Ａｂ５のアミノ酸配列を有する、単離された核酸分子に関する。
【００３２】
【表１】
2012510295.tif 000002
【００３３】
本明細書中に記載される抗体又は抗原結合部分をコード化する核酸分子を含みかつ発現する能力があるベクター、及びそのようなベクターで形質転換された宿主細胞もまた意図される。そのような宿主細胞は、細菌性宿主細胞又は哺乳動物性宿主細胞であり得る。そのような宿主細胞を培養する工程を含む、単離された抗体又はその抗原結合部分の製造方法もまた意図される。具体的な実施態様において、フレームワークアミノ酸配列によって分離されている重鎖及び軽鎖超可変領域をコード化している核酸分子は、適切な条件下で宿主細胞中で共発現され、かつ抗体又はその抗原結合部分が回収される。
【００３４】
請求項１〜３６のいずれか１項に記載の、精製された抗体又はその抗原結合部分と、医薬的に許容可能なその担体又は添加剤と、を含む、医薬組成物もまた意図される。
【００３５】
前記抗体が、モノクローナル抗ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ抗体である、請求項５０に記載の医薬組成物は、ＶＨ及びＶＬ鎖を含み、各ＶＨ及びＶＬ鎖はフレームワークアミノ酸配列によって分離されている超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、前記超可変領域は各ＶＨ及びＶＬ鎖中に、以下の表に従って選択されるＡｂ１〜Ａｂ５のアミノ酸配列を有する。
【００３６】
【表２】
2012510295.tif 000003
【００３７】
リガンド又は活性化タンパク質の、哺乳動物受容体グアニル酸シクラーゼ（ｒＧＣ）の細胞外ドメインへの見かけ上の親和性を増加させる方法もまた意図され、方法は、前記哺乳動物ｒＧＣを、前記リガンド又は活性化タンパク質の存在下で、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の精製された抗体又はその抗原結合部分と接触させることを含む。前記増強は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施され得る。
【００３８】
対象における哺乳動物ｒＧＣの触媒活性レベルの減少に関連する障害又は状態を処置する方法もまた本明細書中で意図され、方法は、本明細書中に記載される精製された抗体又は抗原結合部分の有効量を、それを必要とする前記対象に投与することを含む。
【００３９】
他の処置方法としては、対象における哺乳動物ｒＧＣの触媒活性レベルの減少に関連する障害又は状態を処置する方法であって、本明細書中に記載される医薬組成物の有効量を、それを必要とする前記対象に投与することを含む、方法が挙げられる。
【００４０】
処置されるべき障害としては、心不全、高血圧症、抵抗性高血圧症、肺高血圧症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、糖尿病性腎症、脳卒中、心房細動、心室性不整脈（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ａｒｒｙｔｈｍｉａｓ）、深部静脈血栓症、心筋炎（ｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｔｉｓ）、心臓弁膜症、肺動脈塞栓症、心膜疾患、冠動脈攣縮、メタボリックシンドロームＸ、腎不全（ＣＫＤ、ＥＳＲＤ）、肥満症、喘息及びアレルギー性鼻炎からなる群から選択される障害が挙げられるが、それらに限定されない。
【００４１】
心疾患は、非虚血性慢性心不全、心筋梗塞後心不全（虚血性ＣＨＦ）、急性心筋梗塞、再灌流障害、左心室機能不全、心線維症、拡張期心不全、肥大型心筋症、急性非代償性心不全及び虚血性心疾患からなる群から選択され得る。
【００４２】
具体的な実施態様において、本発明は、本発明の医薬組成物の有効量を、それを必要とする前記対象に投与することを含む、対象における急性非代償性心不全の処置を含む。
【００４３】
他の方法は、精製された抗体もしくは抗原結合部分又はそのような抗体もしくはその抗原結合部分を含む医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記対象における高血圧症、抵抗性高血圧症又は肺高血圧症の処置を含む。
【００４４】
他の方法は、精製された抗体もしくは抗原結合部分又はそのような抗体もしくはその抗原結合部分を含む医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記対象におけるアテローム性動脈硬化症の処置を含む。
【００４５】
他の方法は、本明細書中に記載の精製された抗体もしくはその抗原結合部分又はそのような抗体もしくはその抗原結合部分を含む医薬組成物を必要とする対象に対しての有効量を含む、前記対象における疾患の処置を含み、前記疾患は、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、糖尿病性腎症、脳卒中、心房細動／心室性不整脈、深部静脈血栓症、心筋炎（ｍｙｃｏｃａｒｄｉｔｉｓ）、心臓弁膜症、肺動脈塞栓症、心膜疾患、冠動脈攣縮、メタボリックシンドロームＸ、腎不全、アレルギー性鼻炎、喘息、炎症性疾患、敗血症性ショック、肥満症及び癌からなる群から選択される。
【００４６】
本発明の精製された抗体又はその抗原結合部分、及び心不全の処置のための第二の治療薬剤、の治療有効量を投与することを含む、患者における心不全の処置方法もまた意図される。例えば、前記第二の薬剤は、ＡＲＢ／ＡＣＥｉ、ＡＤＰ阻害剤、アルドステロンアンタゴニスト、ナトリウム利尿ペプチド（ｎａｔｉｅｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）、抗不整脈剤（ａｎｔｉ−ａｒｒｈｔｈｍｉｃ  ａｇｅｎｔｓ）、ＨＭＧ−ＣｏＡ阻害剤、β遮断薬、強心配糖体、カルシウムチャネル遮断薬、利尿薬、フィブラート系薬剤、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤、ヘパリン、ニコチン酸誘導体、硝酸薬及び亜硝酸薬、経口抗凝血薬、血栓溶解薬、ＴＺＤ、コレステロール吸収阻害剤、アセチルサリチル酸、ジピリダモール（ｄｉａｐｙｒｉｄａｍｏｌｅ）、ホスホジエステラーゼ阻害剤、ＣＥＴＰ阻害剤／ａｐｏＡ１模倣薬、トロンビン阻害剤、第Ｘａ因子阻害剤、レニン阻害剤、カイメース阻害剤、ＲｈｏＫ阻害剤、ＬｐＰＬＡ２阻害剤、エンドセリン受容体アンタゴニスト、ＨＤＡＣ阻害剤、核内受容体アゴニスト、核内受容体アンタゴニスト、バソペプチダーゼ阻害剤、脂肪酸酸化阻害剤（ｉｎｈｉｂｉｔｒｓ）、ＡＣＡＴ阻害剤、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質阻害剤、アデノシン受容体修飾物質、ＡＧＥ／ＲＡＧＥ相互作用修飾物質、遺伝子療法、細胞療法からなる群から選択され得る。
【００４７】
具体的な実施態様において、前記第二の薬剤は、ＡＮＰ、ＢＮＰ又はウロジラチンである。より具体的には、前記第二の薬剤は、ネシリチド、カルペリチド、ウラリチド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００４８】
本発明の他の方法は、前記ＮＰＲＡリガンドを、本明細書中に記載される抗体又はそのような抗体の抗原結合部分と組み合わせて投与することを含む、患者におけるＮＰＲＡリガンドの治療効果を延長又は増大させることを含む。具体的な態様において、前記患者は心不全から苦しんでいる。より具体的には、前記患者は急性非代償性心不全から苦しんでいる。他の態様において、前記患者は慢性心不全から苦しんでいる。前記ＮＰＲＡリガンドは、ネシリチド、カルペリチド、ウラリチド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。具体的な態様において、前記抗体を前記ＮＰＲＡリガンドと同時投与することで、前記ＮＰＲＡリガンドの効果が、前記抗体の非存在下で見られる前記ＮＰＲＡリガンド活性の場合の少なくとも２倍延長される。具体的な実施態様において、前記抗体は、前記ＮＰＲＡリガンドの投与と同時に、投与前に、又は投与後に投与される。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１Ａ及び図１Ｂ：ＡＮＰ又はＢＮＰの存在又は非存在下における、ＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞に対する５０６４の結合（図１Ａ）及びトランスフェクトされていないＨＥＫ細胞に対する５０６４の結合（図１Ｂ）。５０６４  Ｆａｂ、５０６４  Ｆａｂ−ｄＨＬＸ、陰性対照Ｆａｂ−ｄＨＬＸ（ｎ．ｃ．ｄＨＬＸ）及び４８８０Ｆａｂが、ＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞及びトランスフェクトされていない細胞に対する結合について、２０、２及び０．２μｇ／ｍｌでＦＡＣＳにより試験されている。４８８０  Ｆａｂは、ＡＮＰ又はＢＮＰの非存在又は存在下においてＮＰＲＡに結合するＦａｂであるため、陽性対象となる。ＭＦＩ−平均蛍光強度
【図２】図２Ａ、図２Ｂ及び図２Ｃ：異なるフォーマットの５０６４の、ＮＰＲＡでトランスフェクトされたＨＥＫ細胞への結合の用量応答。図２Ａ及び図２Ｂ：Ｆａｂ及びＦａｂ−ｄＨＬＸフォーマットの５０６４＋／−ＡＮＰ又はＢＮＰの、ＨＥＫ  ＮＰＲＡへの結合が、ＦＡＣＳによって決定されている。無関係のＦａｂ又はＦａｂ−ｄＨＬＸが、陰性対照として利用されている。図２Ｃ：ＦＡＣＳによる、ＩｇＧフォーマットの５０６４の結合が、５０６４  Ｆａｂ結合と、ＦＡＣＳによって比較されている。
【図３】ＥＬＩＳＡによる、５０６４  Ｆａｂ−ｄＨＬＸの、ＮＰＲＡ−Ｆｃへの結合の実証。結合は、リガンドの存在及び非存在下で試験された。対照Ｆｃ抗原（陰性対照抗原）への結合は、ＡＮＰの存在及び非存在下で試験された。
【図４】ＥＬＩＳＡでは、５０６４  Ｆａｂ−ｄＨＬＸは単独ではビオチン化ＡＮＰには結合しない。５０６４  Ｆａｂ−ｄＨＬＸ、陰性対照Ｆａｂ−ｄＨＬＸ、及び抗ＡＮＰマウスモノクローナル抗体が、ＥＬＩＳＡによって、プレートに結合されたビオチン化ＡＮＰへの結合について試験されている。
【図５】遊離ＡＮＰは、５０６４  Ｆａｂの結合について、ＡＮＰ複合体化ＮＰＲＡと競合しない。５０６４  Ｆａｂは、１００ｎＭのＡＮＰで負荷されたＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞に添加される前に、種々の濃度のＡＮＰと共にプレインキュベートされる。結合は、ＦＡＣＳで解析された。ＭＦＩ−平均蛍光強度
【図６】５０６４−ｄＨＬＸは、準最適濃度（Ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）のＡＮＰの存在下で、ＮＰＲＡ−媒介性ｃＧＭＰ生成を増強する。ＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞が、増加する濃度の５０６４−ｄＨＬＸ又は対照抗体及び４０ｐＭのＡＮＰの存在又は非存在下でインキュベートされ、ｃＧＭＰが記載の通り測定されている。
【図７】５０６４は、準最適濃度のＢＮＰの存在下で、ＮＰＲＡ−媒介性ｃＧＭＰ生成を亢進する。ＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞が、増加する濃度の５０６４−Ｆａｂ  ｄＨＬＸもしくはＩｇＧ、又は対照（３２０７）の存在又は非存在下で、４０ｎＭのＢＮＰと共にインキュベートされ、ｃＧＭＰが記載の通り測定されている。
【図８】図８Ａ及び図８Ｂ：ＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞における、ＡＮＰ及びＢＮＰ刺激性のｃＧＭＰ応答に対する、５０６４  Ｆａｂ及びＦａｂ−ｄＨＬＸの影響。２０μｇ／ｍｌの５０６４  ＦａｂもしくはＦａｂ−ｄＨＬＸ又は対照Ｆａｂが、増加する濃度のＡＮＰ（図８Ａ）又はＢＮＰ（Ｆｉｇ．８Ｂ）の存在下でＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞と共にインキュベートされ、ｃＧＭＰが記載の通り定量されている。
【図９】５０６４  ＩｇＧは、ＡＮＰ媒介性ＮＰＲＡ活性化を独自に増強する。２００ｎＭの５０６４  ＩｇＧ１、及び他のＮＰＲＡ結合剤４８７８、４８７９、４８８０が、増加する濃度のＡＮＰの存在下でＮＰＲＡ  ＨＥＫ細胞に添加され、ｃＧＭＰが記載の通り測定されている。
【図１０】親和性成熟Ｆａｂは、親Ｆａｂ  ５０６４よりも高い程度でＡＮＰと複合体化したＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞に結合する。ＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞は、１００ｎＭのＡＮＰで負荷されている。全細胞Ｆａｂ結合は、ＦＡＣＳ解析によってモニタリングされ、非増強性のＮＰＲＡ特異的Ｆａｂ  ４８８０及び陰性対照のＦａｂ  ３２０７もまた、対照として含まれている。ＭＦＩ−平均蛍光強度
【図１１】親和性成熟Ｆａｂは、ＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞において、準最適レベルのＡＮＰに対するｃＧＭＰ応答を亢進する。ＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞が、４００ｎＭのＦａｂと、４００ｐＭのＡＮＰとインキュベートされている。ｃＧＭＰは記載の通り定量されている。
【図１２】図１２Ａ及び図１２Ｂ：親和性成熟Ｆａｂは、ＡＮＰ及びＢＮＰの両方に対するＮＰＲＡ媒介性ｃＧＭＰ応答を亢進する。ＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞が、４００ｎＭのＦａｂと、増加する濃度のＡＮＰ（図１２Ａ）又はＢＮＰ（図１２Ｂ）と共にインキュベートされている。ｃＧＭＰは記載の通り定量されている。
【図１３】図１３Ａ及び図１３Ｂ：親和性成熟（図１３Ａ）及び交差結合（図１３Ｂ）ＩｇＧ４＿Ｐｒｏ抗体は、親抗体５０６４よりも高い親和性で、ＡＮＰで負荷されたＮＰＲＡに結合する。ＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞が、１００ｎＭのＡＮＰと、増加する濃度の抗体と共にインキュベートされ、結合は、ＦＡＣＳによって決定されている。ＭＦＩ−平均蛍光強度
【図１４】図１４Ａ及び図１４Ｂ：親和性成熟（図１４Ａ）及び交差結合（図ｌ４Ｂ）ＩｇＧ４＿Ｐｒｏ抗体は、ＡＮＰに対するＮＰＲＡ媒介性ｃＧＭＰ応答を亢進する。ＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞が、２００ｎＭの抗体と、増加する濃度のＡＮＰと共にインキュベートされている。ｃＧＭＰは記載の通り定量されている。５０６４が親抗体であり、３２０７は対照抗体である。
【図１５】図１５Ａ及び１５Ｂ：親和性成熟（図１５Ａ）及び交差結合（図ｌ５Ｂ）ＩｇＧ４＿Ｐｒｏ抗体は、ＢＮＰに対するＮＰＲＡ媒介性ｃＧＭＰ応答を亢進する。ＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞が、２００ｎＭの抗体と、増加する濃度のＢＮＰと共にインキュベートされている。ｃＧＭＰは記載の通り定量されている。５０６４が親抗体であり、３２０７は対照抗体である。
【図１６】図１６Ａ及び図１６Ｂ：親和性成熟（図１６Ａ）及び交差結合（図１６Ｂ）ＩｇＧ＿Ｐｒｏ抗体は、ＮＰＲＢと交差反応しない。ＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞＋／−１００ｎＭ  ＡＮＰ、ＨＥＫ  ＮＰＲＢ細胞＋／−１００ｎＭ  ＣＮＰ及びトランスフェクトされていないＨＥＫ細胞＋／−１００ｎＭ  ＡＮＰ又はＣＮＰが、２０ｎＭの抗体と共にインキュベートされ、結合がＦＡＣＳによって評価されている。３２０７が陰性対照抗体として含まれている。ＭＦＩ−平均蛍光強度
【図１７】親和性成熟及び交差結合ＩｇＧ＿Ｐｒｏ抗体は、ＮＰＲＣと交差反応しない。ＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞＋／−１００ｎＭ  ＡＮＰもしくはＢＮＰ又はＨＥＫ  ＮＰＲＣ細胞＋／−１００ｎＭ  ＡＮＰもしくはＢＮＰが、２０ｎＭの抗体と共にインキュベートされ、結合がＦＡＣＳによって評価されている。５０６４が、親抗体である。
【図１８】ＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞への５５９１  ＩｇＧの結合の見かけ上のＫｄを計算するために使用されるＫｉｎＥｘＡの結合曲線。７５ｐＭ（黒色、四角）及び２００ｐＭ（赤色、丸）の５５９１  ＩｇＧ
【図１９】５５９１は、ＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞において経時的に、ＮＰＲＡ媒介性ｃＧＭＰ応答を増強する。ＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞が、１０μｇ／ｍｌの５５９１  ＩｇＧの非存在又は存在下で、０、２００ｐＭ又は１μＭのＡＮＰとインキュベートされ、ｃＧＭＰレベルが１２０分まで定量されている。
【図２０】５５０２、５５０４及び５０６４は、対照抗体３２０７と比較して、ＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞に対する１２５Ｉ  ＡＮＰの結合を亢進する。ＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞が、抗ＮＰＲＡ又は対照抗体の存在下で、増加する濃度の１２５Ｉ  ＡＮＰと共にインキュベートされ、細胞関連性放射能が定量されている。過剰量の非放射性ＡＮＰを添加することによって、非特異的結合が決定されている。ＣＰＭ／ウェル＝カウント毎分／ウェル
【図２１】５５０２、５５０４、５５９１、５５９２及び５０６４は、ＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞からの１２５Ｉ  ＡＮＰのオフ速度を遅くする。ＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞が、抗ＮＰＲＡ又は対照抗体及び１００ｎＭの１２５Ｉ  ＡＮＰの存在下でインキュベートされている。次いで、過剰量の非放射性ＡＮＰが添加され、細胞関連性放射能が経時的に定量されている。ゼロ時点の左側にある点は、非放射性ＡＮＰの添加前の細胞関連性放射能を反映する。ＣＰＭ＝カウント毎分
【図２２】５５９１結合による重水素（ｄｅｔｅｒｉｕｍ）交換速度における変化を示す、ＮＰＲＡの細胞外ドメインに由来するペプチドのマッピング。ピンク色に陰影をつけた範囲は、交換からの強い保護を表わし、赤色に陰影をつけた範囲は、非常に強い保護を表わす。赤色に陰影をつけた範囲は、ＮＰＲＡがＡＮＰ及び／又はＢＮＰに結合している場合に、ＮＰＲＡの三次元構造中に位置する残基７−２８（ＮＬＴＶＡＶＶＬＰＬＡＮＴＳＹＰＷＳＷＡＲＶ）（配列番号３０）、１２１−１２９（ＶＫＤＥＹＡＬＴＴ）（配列番号３１）、３１３−３２０（ＴＭＥＤＧＬＶＮ）（配列番号３２）、３２７−３３３（ＨＤＧＬＬＬＹ）（配列番号３３）及び３４７−３５１（ＶＴＤＧＥ）（配列番号３４）を含むエピトープによって表わされ、ピンク色に陰影をつけた範囲は、ペプチド配列２８−８７（ＶＧＰＡＶＥＬＡＬＡＱＶＫＡＲＰＤＬＬＰＧＷＴＶＲＴＶＬＧＳＳＥＮＡＬＧＶＣＳＤＴＡＡＰＬＡＡＶＤＬＫＷＥＨＮＰＡＶＦＬ）（配列番号３５）、９６−１１３（ＡＰＶＧＲＦＴＡＨＷＲＶＰＬＬＴＡＧ）（配列番号３６）、２９３−３０１（ＰＥＹＬＥＦＬＫＱ）（配列番号３７）、３１０−３１２（ＦＮＦ）、３３４−３３５（ＩＱ）、３５２−３６２（ＮＩＴＱＲＭＷＮＲＳＦ）（配列番号３８）を有するエピトープを表わす。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
心不全は、依然として、工業先進国における公衆衛生上の共通かつ増大している懸念として残っている。現在利用可能な療法では、心不全の患者のおよそ５０％は、彼らの診断から５年以内に死亡する。現在承認されている心不全の療法の不適切な点は、急性非代償性心不全の処置並びに慢性心不全の管理において使用され得る、頑強かつ有効な治療用組成物の継続的な探索につながってきた。本開示は、この満たされていない必要性を潜在的に満たすための方法及び組成物を提供する。
【００５１】
一般に、本発明は、疾患の処置又は予防のための、新規抗体組成物、及び治療有効量の前記組成物を単独で又は他の治療剤と組み合わせて使用する方法、を提供する。用語「グアニリルシクラーゼ又はＧＣ」は、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）の、３’，５’−環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）及びピロリン酸への転換を触媒する酵素のファミリー（リアーゼ）をいう。ＧＣは、（１）可溶性ＧＣ及び（２）微粒子ＧＣ、の二つの形態に細分化される。可溶性ＧＣは、一酸化窒素によって活性化され得るのに対し、微粒子ＧＣは、ナトリウム利尿ペプチドを含むペプチドホルモンによって活性化され得る。微粒子ＧＣはまた、受容体グアニリルシクラーゼ（ｒＧＣ）ともいわれる。
【００５２】
本明細書中で使用される用語「ナトリウム利尿ペプチド受容体」は、ナトリウム利尿ペプチドによって結合される膜結合型受容体をいう。グアニリルシクラーゼＡ（ＧＣ−Ａアイソフォーム）又はナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ（ＮＰＲＡ）は、ナトリウム利尿ペプチドであるＡＮＰ、ウロジラチン及びＢＮＰの受容体として働く。ヒトＮＰＲＡの配列は当業者に公知である。例えば、ヒトＮＰＲＡ核酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋに受入番号ＮＭ＿０００９０６で寄託されている。ＮＰＲＡの核酸配列は、本明細書中において配列番号１として再現されている。ＮＰＲＡのアミノ酸配列は、本明細書中において配列番号２として再現されている。グアニリルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）又はナトリウム利尿ペプチド受容体Ｂ（ＮＰＲＢ）は、ナトリウム利尿ペプチドＣＮＰの受容体となる。そのうえ、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ（ＮＰＲＣ）は、ＡＮＰ、ウロジラチン、ＢＮＰ及びＣＮＰの受容体として働く。これらの種々の受容体のクローンは、オリジーン・テクノロジーズ社（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）（ロックビル、メリーランド州）から容易に購入できる。
【００５３】
用語「ナトリウム利尿ペプチド又はリガンド」は、二つのシステイン残基間のジスルフィド結合によって閉じられている１７アミノ酸長の環を各々が含有する、ペプチドホルモンのファミリーをいう。「リガンド」は、非共有結合を介して別の分子に結合する、任意の分子である。生物学的プロセスにおいて、リガンドは、酵素又はタンパク質受容体等の別の分子に特異的に結合し、他のものに転換されるか又は細胞プロセスを惹起する。ＡＮＰ、ウロジラチン、ＢＮＰ及びＣＮＰは、ｐＧＣに結合するペプチドホルモンリガンドを表わす。上記のように、ＡＮＰ、ウロジラチン、及びＢＮＰは、ＮＰＲＡに結合し、ＮＰＲＡを活性化する。本明細書中で使用される場合、用語「ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ（ＮＰＲＡ）又はグアニル酸シクラーゼＡ（ＧＣ−Ａ）」は、以下の用語及び／又は頭字語と、交換的に使用され得る：心房ナトリウム利尿（ａｔｒｉｏｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ）ペプチド受容体Ａ、ＡＮＰａ、ＡＮＰ−Ａ、ＡＮＰＲＡ、心房性ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ、心房性ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ前駆体、ＧＵＣ２Ａ、ＧＵＣＹ２Ａ及びＮＰＲ−Ａ。
【００５４】
ＮＰＲＡ活性化に関連する生物学的活性としては、血管拡張、利尿、ナトリウム排泄増加、心臓リモデリングの阻害、抗線維性効果、抗炎症効果、脂肪分解及び交感神経系活性の減少が挙げられる（例えば、Ｌｅｖｉｎら，ＮＥＪＭ，３３９：３２１，１９９８；Ｋｕｈｎ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓ．，９３：７００，２００３；及びＤｅｎｕｓら，Ｃｈｅｓｔ，１２５：６５２，２００４を参照のこと）が、これらに限定されない。本発明の組成物は、これらのｃＧＭＰ媒介性の生物学的活性に関与する種々の疾患の処置において使用され得る。そのような疾患としては、高血圧症、抵抗性高血圧症、肺高血圧症、慢性心不全、急性非代償性心不全、心筋梗塞（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆｒａｃｔｉｏｎ）、安定狭心症、不安定狭心症及び異型（プリンズメタル型）狭心症、アテローム性動脈硬化症、心臓浮腫、腎不全、ネフローゼ性浮腫、肝性浮腫、脳卒中、喘息、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、痴呆、免疫不全、早期分娩、月経困難症（ｄｙｓｍｅｎｏｒｒｈｏｅａ）、良性前立腺肥大症（ｂｅｎｉｇｎ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉｓ）（ＢＰＨ）、膀胱下尿道閉塞、失禁、血管開存性が低下した状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｖｅｓｓｅｌ  ｐａｔｅｎｃｙ）、例えば、経皮的経管的冠状動脈形成術の後（ｐｏｓｔｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｔｒａｎｓｌｕｍｉｎａｌ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ）（ＰＴＣＡ後）、末梢血管疾患、アレルギー性鼻炎、嚢胞性線維症、並びに緑内障（ｇｌｕｃｏｍａ）、並びに腸運動性の障害によって特徴付けられる疾患、例えば、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの方法において、抗体組成物及び／又は追加の治療薬剤は、一つ以上の医薬的に許容可能な担体中で別々に、又は同一組成物の成分として投与され得る。
【００５５】
本明細書中に記載される特定の態様は、慢性心不全、高血圧症、不安定狭心症、心臓突然死、及び急性心筋梗塞、特に急性非代償性心不全、を含む種々の心臓の異常の処置に関する。本明細書中に記載されるように、ＡＮＰ、及びＢＮＰ等のナトリウム利尿ペプチドは、不全心臓を持つ患者からの生物試料においては上昇しているが、対照患者からの生物試料においては低いレベルである。ＢＮＰ及びＡＮＰは、受容体ＮＰＲＡのリガンドである。本発明の抗体は、活性化されたリガンド−受容体複合体を特異的に認識する。実際に、本明細書中に提示される研究は、受容体単独に対しても、又はいずれのリガンド単独に対しても、抗体による結合をほとんど又は全く示さない。従って、本発明の抗体は、活性化された受容体複合体においてのみ、リガンドの強力かつ特異的な増強物質である。これらの抗体が、活性化された複合体の効果を増強する（例えば、効果を延長させることによって、又は効果の規模を増大させることによって）ため、これらの抗体は、現在利用可能な組換えペプチドに基づいた短命な療法に対し、有意な進歩を呈する。
【００５６】
従って、本明細書中に記載される抗体組成物は、活性化されたＮＰＲＡ−リガンド複合体を通して媒介されるｃＧＭＰの生成を、増加、増強、又は他の方法で上方制御することが望まれる任意の障害の治療介入において使用され得ることが意図される。抗体は単独で、ＮＰＲＡ受容体の効果を増強するのに効果的であることが示されている一方で、抗体組成物もまた、心不全の処置のために、現存する治療用組成物と併用して使用される場合に有用であることが意図される。特に、抗体組成物は、組換えナトリウム利尿ペプチド又はそれらの誘導体と併用して使用されることが意図される。組換えＢＮＰ（ネシリチド、Ｎａｔｒｅｃｏｒ（登録商標）。）での静脈内療法は、肺毛細管楔入圧及び全身血管抵抗を有意に低下させ、心係数を有意に上昇させる。ＢＮＰは、催不整脈性ではなく、心拍数に対する影響はない。Ｂｕｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂｕｒｇｅｒ，Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．  Ｄｒｕｇｓ  ２：９２９  ２００１。抗体組成物は、ネシリチドと併用して投与されることが意図される。そのような併用療法投与が、ネシリチド単独での使用において典型的に観察される効果よりも長い治療効果であるような量及び様式で、肺毛細管楔入圧及び全身血管抵抗の低下並びに心係数の上昇をもたらすことが意図される。従って、本明細書中に記載される一つの実施態様は、組換えナトリウム利尿ペプチド（ｎａｔｕｉｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ）での処置時に観察される、肺毛細管楔入圧及び身血管抵抗の低下並びに心係数の上昇のうち、一つ以上の時間及び／又は規模を増加させる方法である。
【００５７】
従って、いくつかの実施態様において、本明細書中に提供される抗体組成物は、哺乳動物において、ｃＧＭＰを刺激し、かつ／又は動脈を拡張するために使用され得る。また、本明細書中に提供される抗体組成物は、高血圧症、肺高血圧症、抵抗性高血圧症、急性非代償性心不全及び／又は慢性心不全を処置するために使用され得る。他の実施態様において、抗体は特に、哺乳動物において、利尿を及び／又はナトリウム排泄を増加させるのに有用である。例えば、本明細書中に記載される抗体組成物は、尿流及びナトリウムの尿中排泄を増加させるために、哺乳動物に投与され得る。また、抗体は、体液過剰状態（例えば、慢性心不全、肝不全、及び腎不全）を処置するため、及び／又はナトリウム過剰状態（例えば、慢性心不全及び腎不全）を処置するために使用され得る。
【００５８】
抗体組成物
本発明は、活性化ＮＰＲＡ−リガンド複合体を特異的に結合し、かつその受容体のリガンドの効果を増強する、抗体組成物に関する。
【００５９】
典型的には、用語「アゴニスト」は、受容体に結合し、その生物学的活性を活性化するリガンドをいう。「アゴニスト活性」は、ｃＧＭＰ生成につながるｐＧＣの活性化として定義される。より狭く具体的な態様において、用語「ＮＰＲＡアゴニスト」は、ＮＰＲＡのリガンドであるＡＮＰ又はＢＮＰの非存在下で、ＮＰＲＡの活性化を起こす薬剤をいうために使用される。
【００６０】
用語「増強物質」とは、リガンドの受容体への、リガンド結合の「オン速度」又は「オフ速度」に影響し、アゴニスト活性の有効性及び／又は持続期間における増加をもたらす分子をいう。「増強活性」とは、準最適濃度のｐＧＣリガンドの存在下における、増強されたｐＧＣの活性化として定義されている。
【００６１】
以下の表は、本発明の好ましい抗体の重鎖及び軽鎖の例証的なＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３領域を提供する。
【００６２】
【表３】
2012510295.tif 000004
【表４】
2012510295.tif 000005
【００６３】
【表５】
2012510295.tif 000006
【表６】
2012510295.tif 000007
【００６４】
例証的な抗体の重鎖のフレームワーク領域は、以下の通りであった：
ＶＨ領域のＦＲ１：ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＩＳ（配列番号２２）
ＶＨ領域のＦＲ２：ＷＩＲＱＳＰＧＲＧＬＥＷＬＧ（配列番号２３）
ＶＨ領域のＦＲ３：ＲＩＴＩＮＰＤＴＳＫＮＱＦＳＬＱＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号２４）
ＶＨ領域のＦＲ４：ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２５）
【００６５】
例証的な抗体の軽鎖のフレームワーク領域は、以下の通りであった：
ＶＬ領域のＦＲ１：ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣ（配列番号２６）
ＶＬ領域のＦＲ２：ＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹ（配列番号２７）
ＶＬ領域のＦＲ３：ＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣ（配列番号２８）
ＶＬ領域のＦＲ４：ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴ（配列番号２９）
【００６６】
本発明が、治療適用性を有する独自の抗体を同定したことを考慮すると、本願において描写される各重鎖及び軽鎖は、現在では、組換え法を使用して調製され、組換え細胞株において成熟型へとプロセシングされ得る。よって、組換え生成を哺乳動物細胞において使用することによって、抗体の成熟型が、タンパク質分解性にプロセシングされ、また糖鎖付加などの他の翻訳後修飾もまた含まれる。
【００６７】
軽鎖可変領域をコード化する核酸は、重鎖をコード化する核酸と共に構築され、共発現され得、逆もまた同じであり、随意に定常領域と結合され得る。適切なＮＰＲＡ結合親和性が維持されている限り、任意の重鎖及び軽鎖が組み合わされ得る。軽鎖及び重鎖をコード化する望ましい遺伝子が、哺乳動物細胞へと導入され、得られた組換え免疫グロブリン生成物が、標準的な組換え法を使用して、発現、精製及び特徴付けられる。
【００６８】
「抗体」は一般的に、特異的な抗原を認識して結合するタンパク質をいい、「免疫グロブリン」は一般的に、抗体として機能する糖タンパク質をいう。天然の形態では、免疫グロブリン分子は、ジスルフィド結合によって一緒にまとまっている二つの同一の重鎖（各々が約５０〜７０ｋＤａ）及び二つの同一の軽鎖（各々が約２５ｋＤａ）の４つの鎖から構成される。具体的には、各重鎖は一つのジスルフィド結合によって一つの軽鎖に結合され、他方、重鎖間のジスルフィド結合の数は、免疫グロブリンアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥ）に依存して異なる。また、各重鎖及び各軽鎖は、規則的に間隔があいた鎖内ジスルフィド結合又は架橋を有する。重鎖及び軽鎖の両方において、定常ドメイン及び可変ドメインがある。例えば、各重鎖（γ、δ、α、μ又はε）は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＨ）及びそれに続く数々の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４）を有し、他方、各軽鎖（λ又はκのいずれか）は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、他の末端に定常ドメイン（ＣＬ）を有する。ＣＬは、ＣＨ１と整列し、ＣＬはＶＬと整列している。
【００６９】
本発明の抗体は、任意のアイソタイプのＩｇＧ分子であってもよい（例えば、フレームワークは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４型ＩｇＧであってもよい）ことが意図される。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列によって、ヒト免疫グロブリンは、異なるクラスに割り当てることができる。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの５つの主要なクラスがあり、これらのいくつかはさらに、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２の、サブクラス又はアイソタイプに分類され得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、α、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元立体配置が周知である。異なるアイソタイプは、異なるエフェクター機能を有する；例えば、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３アイソタイプは、ＡＤＣＣ活性を有する。
【００７０】
一定の実施態様において、本発明の治療用抗体は、ＩｇＧ１分子である。ＩｇＧ４は、補体を活性化しないことが現在証明されており、したがって、抗原−抗体−補体複合体に起因する免疫原性応答及び炎症の確率は、他のアイソタイプと比較して、ＩｇＧ４分子の使用によって大きく低減される。このことは、ＩｇＧ４を非常に魅力的な療法の候補とし、それは、ＩｇＧ４が安全な治療法であることが予想されるためである：ＩｇＧ４は、抗原に単純に結合するはずであり、人体においていかなる追加の反応も惹起しないはずである。例えば、自然には、ＩｇＧ４に基づいた応答は、例えば、イエダニ、草の花粉又はハチ刺され等の抗原に応答して産生される。これらの抗原は典型的には、有意な免疫応答及び炎症なく、除去される。従って、いくつかの実施態様において、本発明の抗体はＩｇＧ４抗体であることが望ましい。使用されるアイソタイプにかかわらず、組成物が処方される場合、例えば、カオトロピック剤及びレドックス剤等の薬剤を含ませて二重結合のリフォールディングを制限すること（国際公開第２００６／０４７３４０号パンフレットを参照のこと）によるなど、アイソタイプの立体構造及びリフォールディングが、可能な限り均質であることを可能とする薬剤を、処方物中に含めることが望ましい。
【００７１】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、インタクトな免疫グロブリンをいい、「その抗原結合部位」は、インタクトな抗体と、特異的結合について競合するタンパク質分子をいう。抗体は、モノクローナル、キメラ、ヒト化、ヒト、ＣＤＲ−グラフト化又はマウス抗体であり得る。具体的な実施態様において、本明細書中に記載される抗体は、例えば、ＨｕＣａｌ（登録商標）（モルフォシス社、ミュンヘン、ドイツ）等のヒトコンビナトリアルライブラリーから、ファージディスプレイ法を通して同定される、完全なヒト抗体である。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術によって、又はインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断によって生成され得る。抗原結合部分としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、及び相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二特異性抗体、並びにポリペプチドが依然としてＮＰＲＡ受容体に結合し、好ましくは本明細書中に記載される抗体の生物学的活性を示すように、ポリペプチドに特異的抗原結合を与え得るのに十分な免疫グロブリンの少なくともある部分を含有するポリペプチド又は融合タンパク質が挙げられるが、それらに限定されない。
【００７２】
「エピトープ又は決定基」は一般的に、抗体の生成を刺激し、かつ抗体によって認識される、抗原上の特異的な化学的ドメインに関する。タンパク質等の分子上の個々のエピトープは、異なる抗体の合成を誘発する（抗原決定基としてもまた知られる）。エピトープは、抗体が結合する分子の三次元構造によって定義される。本開示において、受容体へのＡＮＰの結合の際に形成されるＮＰＲＡ二量体の一つの単量体に特異的に結合する抗体が同定されている。図２９は、本発明の抗体が結合する、ＮＰＲＡの三次元構造及びエピトープの質量分析のデータを要約している。
【００７３】
水素／重水素質量分析（ＨＸＭＳ）解析は、最も強い結合は、残基７−２８（ＮＬＴＶＡＶＶＬＰＬＡＮＴＳＹＰＷＳＷＡＲＶ）（配列番号３０）、１２１−１２９（ＶＫＤＥＹＡＬＴＴ）（配列番号３１）、３１３−３２０（ＴＭＥＤＧＬＶＮ）（配列番号３２）、３２７−３３３（ＨＤＧＬＬＬＹ）（配列番号３３）及び３４７−３５１（ＶＴＤＧＥ）（配列番号３４）、を包含するペプチドを含有するＮＰＲＡの細胞外ドメインの領域に対するものであることを示した。これらのペプチドは、ＮＰＲＡにＡＮＰが結合している場合に、ＮＰＲＡの三次元構造における一つの非連続的な領域を形成する。
【００７４】
用語「抗原」は、免疫応答を誘発する任意の物質を広くいう。
【００７５】
ＮＰＲＡの相補性決定領域は、構造的に異なるＩｇＧ１及びＩｇＧ２及びＩｇＧ４のヒト重鎖及び軽鎖の独自の組み合わせの中へ挿入され得る。これらの抗体のＮＰＲＡへの結合、及びそれらのＮＰＲＡアゴニスト又はＮＰＲＡリガンドの増強物質としての有効性は、以下の実施例中に記載される測定法等を使用して容易に評価され得る。
【００７６】
用語「特異的結合剤」には、上に定義された抗体、及び望ましい抗原結合特性を有するＣＤＲに由来する配列を含有する組換えペプチド又は他の化合物が含まれる。用語に具体的に含まれるものとしては、本明細書中に記載されるＮＰＲＡ抗体の一つ以上のＣＤＲと少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含有するペプチドが挙げられ、好ましくは、配列ＲＩＹＹＲＳＫＷＹＮＤＹＡＶＳＶＫＳ（配列番号４）もしくはＲＴＹＹＲＳＨＷＹＹＥＹＡＱＳＶＫＳ（配列番号１０）を有する可変重鎖ＣＤＲ２及び／又はＱＱＩＳＮＰＰＶＴ（配列番号１６）もしくはＱＱＩＳＮＳＰＰＴ（配列番号１７）もしくはＱＱＩＳＲＡＰＡＴ（配列番号１８）の配列を有する軽鎖ＣＤＲ３が含まれる。
【００７７】
他の抗体関連分子もまた意図される。特に、本発明の抗体は、「ペプチボディ」の基礎を形成し得る。これらの抗体関連分子は、少なくとも一つの抗原結合ペプチドに付着した「ビヒクル」として、抗体Ｆｃドメインを含む。特に上記の重鎖ＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３を含む、ＮＰＲＡ抗体からの抗体ＣＤＲは、ペプチボディへの組み入れに適切であり得る。ペプチボディ生成のより詳細な記述については、２０００年５月４日に発行された国際公開第００／２４７８２号パンフレットを参照のこと。ペプチボディは、ペプチドを、互いに直接又はリンカーによって分離された状態のいずれかで、縦列に（すなわち、連続的に）連結することによって作られ得る。システイン残基を含有するペプチドは、別のシステイン含有ペプチドと架橋され得、ペプチドの一方又は両方がビヒクルに連結され得る。一つより多くのシステイン残基を有する任意のペプチドはまた、ペプチド内ジスルフィド結合を形成し得る。抗体技術はしばしば、例えば、アミノ基でのカルボキシル末端のキャッピング、システイン残基のキャッピング又はアミノ酸残基以外の部分によるアミノ酸残基の置換（例えば、Ｂｈａｔｎａｇａｒら，Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．３９：３８１４，１９９６、及びＣｕｔｈｂｅｒｔｓｏｎら，Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．４０：２８７６，１９９７を参照のこと）を使用した、そのようなペプチドの誘導体化を使用するだろう。また、抗体の親和性成熟に類似するＮＰＲＡ結合特性についてのペプチドの最適化もまた実施され得る。
【００７８】
本発明の抗体の抗原結合部分もまた、特異的結合剤のペプチド部分自体の中に、又はペプチド部分とビヒクル部分との間に、特異的結合剤の望ましい活性を保持しつつ挿入され得る種々の分子で修飾され得る。例証的なそのような挿入としては、Ｆｃドメインの挿入、ポリエチレングリコール又はデキストラン、脂肪酸、脂質、コレステロール基、低炭水化物、ペプチド、細胞毒性剤（ｃｙｏｔｏｘｉｃ  ａｇｅｎｔ）、化学療法剤、本明細書中に記載されるような検出可能な部分（蛍光剤、放射性同位体等の放射性同位元素標識を含む）、オリゴ糖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、干渉（もしくは他の）ＲＮＡ、酵素、ホルモン等、の他の関連分子の添加、が挙げられる。この様式での組み入れに適切な他の分子が、当業者によって理解されるであろうし、本発明の範囲内に包含される。これは、例えば、随意に適切なリンカーによってつながれた二つの連続したアミノ酸間への、望ましい分子の挿入を含む。
【００７９】
「単離された」抗体は、同定され、それを発現した細胞の成分から分離された抗体である。細胞の混入成分とは、抗体の診断用途又は治療用途と干渉する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性又は非タンパク質性の溶質を含み得る。好ましい実施態様において、抗体は（１）抗体の９５重量％を超えるまで、最も好ましくは９９重量％を超えるまで、（２）少なくとも１５残基のＮ末端もしくは内部アミノ酸配列を取得するために十分な程度まで、又は（３）クーマシーブルー、もしくは好ましくは、銀染色を使用した、還元もしくは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、均一にまで、精製されるだろう。単離された天然に存在する抗体としては、組換え細胞内の原位置の抗体が挙げられ、これは、抗体の自然な環境の少なくとも一つの成分が存在しなくなるためである。しかしながら通常は、単離された抗体は、少なくとも一つの精製工程によって調製されるだろう。
【００８０】
用語「超可変」領域は、抗原結合の原因である、抗体のアミノ酸残基をいう。超可変領域は、相補性決定領域又はＣＤＲからのアミノ酸残基［例えば、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版、公衆衛生局、国立衛生研究所、ベテスダ、メリーランド州（１９９１）に記載されているように、軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（Ｌｌ）、５０〜５６（Ｌ２）及び８９〜９７（Ｌ３）並びに重鎖可変ドメイン中の残基３１〜３５（Ｈｌ）、５０〜６５（Ｈ２）及び９５〜１０２（Ｈ３）］を含む。単一のＣＤＲであっても、抗原を認識し、結合し得るが、それは全てのＣＤＲを含有する完全な抗原結合部位よりは低い親和性である。抗体のＣＤＲは、抗体が標的分子を結合する能力を保持する限り、上で特定した限界の外側に、追加の又はより少ない配列を含み得ることが理解される。
【００８１】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、超可変領域残基以外の可変領域残基である。
【００８２】
「抗体フラグメント」は、インタクトな完全長抗体のある部分、好ましくは、インタクトな抗体の抗原結合領域又は可変領域、を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント；二特異性抗体；直鎖状抗体（ｌｉｎｅａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）（Ｚａｐａｔａら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，８：ｌ０５７，１９９５）；単鎖抗体分子；並びに抗体フラグメントから形成された多特異性抗体が挙げられる。
【００８３】
抗体のパパイン消化は、各々が単一の抗原結合部位、及び定常領域を含有する残留（ｒｅｓｉｄｕａｌ）「Ｆｃ」フラグメントを持つ、二つの同一の「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる抗原結合フラグメントを生成する。Ｆａｂフラグメントは、全ての可変ドメイン、並びに軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の最初の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆｃフラグメントは、糖鎖を表示し、一つのクラスの抗体を、別のクラスから区別する多くの抗体エフェクター機能（例えば、補体及び細胞受容体の結合）の原因となる。
【００８４】
ペプシンで処置された抗体は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、両方が単一のポリペプチド鎖中に存在する、二つの「単鎖Ｆｖ」もしくは「ｓＦｖ」抗体フラグメントを有するＦ（ａｂ）フラグメントをもたらす。Ｆａｂフラグメントは、抗体のヒンジ領域からの一つ以上のシステインを含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端におけるわずかな追加の残基の包含によって、Ｆａｂ’フラグメントとは異なる。好ましくは、Ｆｖポリペプチドはさらに、抗原結合に望ましい構造をＦｖが形成することを可能とするポリペプチドリンカーを、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に含む。ｓＦｖの概説については、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，第１巻１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）のＰｌｕｃｋｔｈｕｎを参照のこと。
【００８５】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位及び抗原結合部位を含有する最小限の抗体フラグメントである。この領域は、密接した、非共有結合性の関連性を持つ、一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体から構成される。各可変ドメインの三つのＣＤＲが相互作用し、ＶＨ  ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を規定するのは、この立体配置においてである。まとめると、六つのＣＤＲが、抗体の抗原結合特異性を与える。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は、抗原に特異的なＣＤＲを三つのみ含む、Ｆｖの半分）は、結合部位全体よりは低い親和性であるものの、抗原を認識し結合する能力を有する。
【００８６】
用語「二特異性抗体」は、二つの抗原結合部位を持つ小さな抗体フラグメントをいい、このフラグメントは、同一のポリペプチド鎖（ＶＨ  ＶＬ）において、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同一の鎖上の二つのドメイン間の対形成を可能とするには短すぎるリンカーを使用することによって、それらのドメインは、別の鎖の相補ドメインと対形成するように強制され、二つの抗原結合部位が作られる。二特異性抗体は、例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開第９３／１１１６１号及び３０号パンフレット；Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，９０：６４４４，１９９３において、より完全に記載されている。
【００８７】
抗体フラグメントの生成のために、種々の技術が開発されてきた。伝統的には、これらのフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質消化を介してもたらされるが、組換え宿主細胞によって直接生成されてもよい。例えば、Ｂｅｔｔｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１，１９８８；Ｓｋｅｒｒａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８，１９８８；Ｃａｒｔｅｒら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３，１９９２を参照のこと。
【００８８】
抗体の同定方法
本発明の抗体は、当技術分野で周知の抗体発現系の一つを使用した組換えＤＮＡ法（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）を参照のこと）を使用して、現在では生成され得る。
【００８９】
興味の対象であるＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、本明細書中に記載されている。適切なコード化ヌクレオチド配列は、当業者に公知の技術を使用して、普遍的なコドン表に従って設計され得る。核酸は次いで増幅され、例えば、発現ベクター、ミニ遺伝子ベクター、又はファージディスプレイベクター等の、任意の適切なベクター中にクローニングされる。使用される特定のクローニング方法は、興味の対象である免疫グロブリンポリペプチドのいくつかの部分の配列を決定することが可能である限り、重大ではないことが理解されるだろう。
【００９０】
本明細書で用いられる場合、「単離された」核酸分子又は「単離された」核酸配列は、（１）同定され、核酸の天然源において通常結合している少なくとも一つの混入核酸分子から分離されているか、又は（２）興味の対象である核酸の配列が決定できるようにクローニングされ、増幅され、タグをつけられ、又は他の方法でバックグラウンドの核酸から区別される、いずれかの核酸分子である。単離された核酸分子は、自然においてそれが見られる形態又は状態以外である。しかしながら、単離された核酸分子は、例えば、天然細胞の染色体上の位置と異なる染色体上の位置に核酸分子がある場合等、抗体を通常発現する細胞に含有される核酸分子も含む。
【００９１】
ＮＰＲＡに特異的に結合する免疫グロブリン又は免疫グロブリンポリペプチドをコード化する配列は、ファージディスプレイ技術を使用して同定された。ファージディスプレイは、例えば、各々が参照することにより本明細書中に援用される、Ｄｏｗｅｒら、国際公開第９１／１７２７１号パンフレット、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、国際公開第９２／０１０４７号パンフレット、並びにＣａｔｏｎ及びＫｏｐｒｏｗｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，８７：６４５０，１９９０、に記載されている。好ましい態様において、本発明の抗体は、ヒトコンビナトリアルライブラリー（ＨｕＣａｌ（登録商標）；モルフォシス社、ミュンヘン、ドイツ）を使用したファージディスプレイ技術を使用して同定された。このライブラリーは、百億個を超える異なる完全ヒト抗体を含む。ＨｕＣＡＬ（登録商標）は、迅速かつ自動化された高親和性抗体の生成を可能とする。ライブラリーの最も重要な特色は、あらかじめ定義された仕様を満たすように、完全ヒト抗体を最適化する能力である。本明細書中に記載される抗体の同定のための詳細な実験プロトコルは、下の実施例３〜実施例６に提供される。しかしながら、簡潔には、抗体は、ＮＰＲＡリガンドであるＡＮＰ及びＢＮＰで見られる活性と類似したＮＰＲＡへの結合親和性を有する薬剤をライブラリーから選択するために、ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ライブラリーで何回かのパニングを行った後、同定された。ＮＰＲＡに特異的な抗体は、ライブラリーから選択することができたものの、どの抗体も、自分だけでＮＰＲＡの活性を誘導することはなかった。ＮＰＲＡ上の、環状ペプチドＡＮＰ及びＢＮＰの結合部位は、ペプチドよりも１０倍超大きい質量を持つＦａｂによっては、構造的に接近することができないのかもしれない。
【００９２】
別の手段として、以下のセットの選択が、受容体−リガンド複合体に対して実施された。これらの選択は、この複合体を特異的に認識する結合剤の同定を成功させた。この５０６４と名付けられた抗体は、受容体−リガンド複合体を安定化し、ＮＰＲＡ依存的ｃＧＭＰ生成において、ＡＮＰ又はＢＮＰの効力を亢進する。この抗体は現在では、ＡＮＰ及び／もしくはＢＮＰ又は任意の他のＮＰＲＡアゴニストの効果が望まれる種々の治療上適用において使用され得る。特に、本明細書中に同定される増強抗体は、ナトリウム利尿ペプチドの活性をブーストするのに特に有用であるだろう。本明細書中に提示されるデータによれば、５０６４抗体は、細胞性ＮＰＲＡからのＡＮＰの解離を減少させることができる。
【００９３】
抗体５０６４は次いで、Ｈ−ＣＤＲ２及びＬ−ＣＤＲ３における親和性成熟へと供され、これは、細胞上の受容体−リガンド複合体への結合の有意な増加のみならず、生物学的活性の上昇もまたもたらした。したがって、準最適濃度のナトリウム利尿ペプチドの存在下では、成熟抗体は、親抗体よりも、ｃＧＭＰ応答をより強く上昇させた。結論として、我々は、抗体親和性及び生物学的活性の明らかな相関関係を見出すことができる。成熟Ｌ−及びＨ−鎖の新しい組み合わせは、抗体のさらに改善された活性さえも、もたらした。興味の対象となるのは、五つの最も強力な成熟抗体が、全てＬ−ＣＤＲ３において最適化され、その一方で、Ｈ−ＣＤＲ２が成熟した結合剤は、より弱い活性を示したという事実である。もしかすると、Ｌ−ＣＤＲ３の最適化がＨ−ＣＤＲ２の最適化よりも大きな影響を与えるよう、Ｌ−ＣＤＲ３は、受容体に対する重大な結合部位を提供するのかもしれない。Ｈ−ＣＤＲ２配列において、親配列のうちのわずかな残基のみが変更されており、これは、Ｈ−ＣＤＲ２もまた結合において重要であり得るが、その配列の大きな改変を許容しないのかもしれないことを示している。
【００９４】
本明細書中に提示されるデータは、一つの候補のみから開始される親和性成熟が成功し得ることを示す。増強抗体が、初めてＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ライブラリーから単離されたが、しかしながらこの抗体は、それ自身のみではアゴニストとして作用せず、しかし天然のペプチドリガンドの活性を強く増幅する。
【００９５】
抗体の製造方法
次いで、同定された核酸の配列が決定される。典型的には、免疫グロブリンポリペプチドの可変領域全体をコード化する配列が決定されるが、しかしながら、例えば、ＣＤＲコード化部分等の、可変領域のある部分のみを配列決定することで十分な場合もあるだろう。典型的には、配列決定された部分は、少なくとも３０塩基長であり、よりしばしば、可変領域の長さの少なくとも約三分の一又は少なくとも約半分をコードする塩基が、配列決定されるだろう。
【００９６】
一度単離されると、抗体の種々の部分をコード化するＤＮＡは、発現制御配列に作動可能に連結されるか、発現ベクター中へと配置され得、次いで、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ）、又は骨髄腫細胞等の、他では免疫グロブリンタンパク質を生成しない宿主細胞中へとトランスフェクトされ、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を指示する。抗体の組換え生成は、当技術分野で周知である。
【００９７】
発現制御配列は、特定の宿主生物において、作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列をいう。原核生物に適切な制御配列としては、例えば、プロモーター、随意にオペレーター配列、及びリボソーム結合部位が挙げられる。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００９８】
核酸は、それが別の核酸配列と機能的な関係にされた場合に、作動可能に連結されている。例えば、プレ配列もしくは分泌リーダー（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｌｅａｄｅｒ）のＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参加するプレタンパク質として発現される場合に、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されており；プロモーターもしくはエンハンサーは、配列の転写に影響する場合に、コード配列に作動可能に連結されており；又は、リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されている場合に、コード配列に作動可能に連結されている。一般的に、「作動可能に連結」とは、連結されているＤＮＡ配列が隣接しており、分泌リーダーの場合には、隣接しておりかつ読み取り段階であることを意味する。しかしながら、エンハンサーは隣接していなくてもよい。連結は、便利な制限部位でのライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが、従来の習慣に従って使用される。
【００９９】
細胞、細胞株、及び細胞培養はしばしば、互換的に使用され、本明細書中の全てのそのような指定は、後代を含む。形質転換体及び形質転換細胞としては、初代対象細胞及び移行の回数に関わらずそれに由来する培養物、が挙げられる。全ての後代は、計画的又は偶発性の変異のため、ＤＮＡ量において正確に同一ではないかもしれないこともまた理解される。最初の形質転換細胞においてスクリーニングされた機能又は生物学的活性と同じ機能又は生物学的活性を有する変異後代が含まれる。
【０１００】
本発明はまた、随意に宿主細胞によって認識される制御配列に作動可能に連結された本発明の特異的結合剤又は抗体をコード化する単離された核酸、その核酸を含むベクター及び宿主細胞、並びに特異的結合剤又は抗体の生成のための組換え技術を提供し、組換え技術は、核酸が発現されるように宿主細胞を培養し、かつ随意に、特異的結合剤又は抗体を宿主細胞培養物又は培養培地から回収することを含み得る。
【０１０１】
多くのベクターが、当技術分野において知られている。ベクター成分としては、以下のうちの一つ以上が含まれ得る：シグナル配列（例えば、特異的結合剤又は抗体の分泌を指示し得るもの）、複製開始点、一つ以上の選択マーカー遺伝子（例えば、抗菌性もしくは他の薬剤耐性を付与し得るもの、栄養要求性の欠損を補うもの、又は培地中から入手できない重大な栄養素を供給するもの）、エンハンサー因子、プロモーター、及び転写終結配列であり、全ては当技術分野で周知である。
【０１０２】
適切な宿主細胞としては、原核生物、酵母、又は上記のより高等な真核生物細胞が挙げられる。この目的のための適切な原核生物としては、グラム陰性もしくはグラム陽性生物等の真正細菌、例えば、大腸菌属（例えば、大腸菌）等の腸内細菌科、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属（例えば、サルモネラ・チフィリウム）、セラチア属（例えば、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、及びシゲラ属、並びにバチルス・スブチリス及びバチルス・リケニフォルミス等のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｉ）、シュードモナス属、並びにストレプトミセス属が挙げられる。原核生物に加え、糸状菌類又は酵母等の真核微生物が、特異的結合剤コード化ベクターのために適切なクローニング宿主又は発現宿主である。サッカロミセス・セレビシア、又は一般的なパン酵母が、下等な真核宿主微生物の中で最も一般的に使用されているものである。しかしながら、ピキア属（例えば、ピキア・パストリス）、シゾサッカロミセス・ポンベ；クリベロミセス属、ヤロウイア属；カンジダ属；トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ）；ニューロスポラ・クラッサ；シュワニオミセス・オキシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）等のシュワニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）；並びに、例えば、ニューロスポラ属、ペニシリウム属、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、並びにアスペルギルス・ニデュランス及びアスペルギルス・ニガー等のアスペルギルス属宿主等の糸状菌類等、数々の他の属、種、並びに株が入手可能であり、本明細書中で有用である。
【０１０３】
グリコシル化特異的結合剤又は抗体の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株及び変異株、並びにスポドプテラ・フルギペルダ（イモムシ）、アエデス・アエジプティ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、アエデス・アルボピクタス（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショジョウバエ（ショウジョウバエ）、及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）などの宿主からの、対応する許容昆虫宿主細胞が同定されてきた。そのような細胞のトランスフェクションのための種々のウイルス株が公的に入手可能であり、例えば、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−Ｉ変異株及びカイコＮＰＶのＢｍ−５株がある。
【０１０４】
しかしながら、典型的な組換えタンパク質生成は、哺乳動物細胞を利用し、培養（組織培養）における哺乳動物細胞の増殖は、日常的な手順となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＣＨＯＫ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：４２１６，１９８０）を含むチャイニーズハムスター卵巣細胞；ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓由来ＣＶ１細胞株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胎児由来腎臓細胞株（２９３又は懸濁培養における増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞、［Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．  ３６：５９，１９７７］；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  ２３：２４３，１９８０）；サル腎臓由来細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓由来細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌由来細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝腫瘍細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら，  Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ３８３：４４，１９８２）；ＭＲＣ５細胞又はＦＳ４細胞である。
【０１０５】
宿主細胞は、本発明のＮＰＲＡ特異的抗体をコード化する核酸又はベクターで形質転換又はトランスフェクトされ、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、及び望ましい配列をコード化する遺伝子の増幅に適正なように改変された慣習的な栄養培地中で培養される。また、選択マーカーによって隔てられた複数コピーの転写単位を持つ新規なベクター及びトランスフェクトされた細胞株は、特異的結合剤又は抗体の発現のために特に有用であり、好ましい。
【０１０６】
本発明の望ましい抗体をコード化する核酸で形質転換された宿主細胞は、種々の一般に入手可能な培地中で培養され得、例えば、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（シグマ社）、基礎培地（（ＭＥＭ）、（シグマ社）、ＲＰＭＩ−１６４０（シグマ社）、及びダルベッコ変法イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、シグマ社）等の培地等が、宿主細胞の培養に適切である。これらの培地の任意のものが、ホルモン及び／又は他の増殖因子（インスリン、トランスフェリン、又は上皮増殖因子等）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩等）、緩衝剤（ＨＥＰＥＳ等）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジン等）、抗生物質、微量元素（マイクロモル濃度の領域の終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）、及びグルコース又は同等のエネルギー源によって、必要に応じて補填され得る。任意の他の必要な補填物質もまた、当業者に公知であろう適正な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨ等の培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で以前に使用されたものであり、当業者には明らかであろう。
【０１０７】
宿主細胞が培養される場合、抗体又はその部分は、細胞内で、細胞膜周辺腔において生成され得るか、又は培地中へと直接分泌され得る。特異的結合剤又は抗体が細胞内で生成される場合、第一工程として、宿主細胞か又は溶解された断片の微粒子状細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。
【０１０８】
次いで、抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、陽イオンもしくは陰イオン交換クロマトグラフィ、又は好ましくは、興味の対象である抗原又はプロテインＡもしくはプロテインＧを親和性リガンドとして使用したアフィニティクロマトグラフィを使用して精製され得る。親和性リガンドが付着されるマトリクスは、最もしばしばアガロースであるが、他のマトリクスもまた利用可能である。制御孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成されるよりも、速い流速及び短い処理時間を可能とする。特異的結合剤又は抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（登録商標）樹脂（ジェイティ・ベイカー社（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）、フィリップスバーグ、ニュージャージー州）が、精製に有用である。エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿等の、タンパク質のための他の技術もまた、回収されるべき特異的結合剤又は抗体に依存して利用可能である。
【０１０９】
抗体の誘導体及び変異体
本発明の抗体は、誘導体化され得る。例えば、異なるアミノ酸長のアミノ及び／又はカルボキシ末端融合並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を挿入することが可能である。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を持つ特異的結合剤もしくは抗体、又はエピトープタグもしくはサルベージ受容体エピトープに融合した特異的結合剤もしくは抗体（抗体フラグメントを含む）が挙げられる。特異的結合剤又は抗体分子の他の挿入変異体としては、特異的結合剤又は抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの、例えば、Ｎ末端もしくはＣ末端での、融合が挙げられる。調製され得る他の例証的な突然変異としては、鎖交換を防ぐＩｇＧ４における突然変異が挙げられる。突然変異は、例えば、Ｍａｒｉｊｎら．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１７：，１５５４，２００７に記載されているように形成され得る。その参考文献は、免疫グロブリンＧ、アイソタイプ４（ＩｇＧ４）の抗体の抗炎症活性引き起こす翻訳後修飾を記載する。ＩｇＧ４抗体は、重鎖及び付着した軽鎖（半分子）を、別の分子からの重−軽鎖対と取り替えることによってＦａｂアームを交換し、二特異性抗体をもたらす、動的な分子である。変異原性試験は、第三の定常ドメインがこの活動に重大であることを示してきた。ＩｇＧ４  Ｆａｂアーム交換の影響は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、実験的自己免疫性重症筋無力症を持つアカゲザルモデルにおいて確認された。ＩｇＧ４  Ｆａｂアーム交換は、ＩｇＧ４抗体に起因する抗炎症活性の根拠を提供する重要な生物学的機構であることが示唆されている。本明細書中に記載される抗体における鎖交換を防ぐために、ＩｇＧ４の第三の定常ドメインに変異導入することは、特に有用である。
【０１１０】
エピトープタグの例としては、インフルエンザＨＡタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Ｆｉｅｌｄら，Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．８：２１５９，１９８８］；ｃ−ｍｙｃタグ並びにそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Ｅｖａｎら，Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．５：３６１０，１９８５］；並びに単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグ及びその抗体［Ｐａｂｏｒｓｋｙら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３：５４７，１９９０］が挙げられる。他の例証的なタグは、一般的に六つ程度のヒスチジン残基であるポリヒスチジン配列であり、ニッケルキレート化を使用してそのように標識された化合物の単離を可能にする。ＦＬＡＧ（登録商標）タグ（イーストマン・コダック社、ロチェスター、ニューヨーク州）等の他の標識及びタグが周知であり、当技術分野において日常的に使用されている。
【０１１１】
用語「サルベージ受容体結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子のｉｎ  ｖｉｖｏでの血清半減期を増加させる原因である、ＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープをいう。
【０１１２】
別のタイプの変異体は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、特異的結合剤又は抗体分子中の少なくとも一つのアミノ酸残基が除去され、その位置に異なる残基が挿入されている。超可変領域もしくはＣＤＲ領域又はフレームワーク領域のいずれかにおける置換の突然変異誘発が意図される。保存的置換が特に意図される。保存的置換は、あるアミノ酸を、そのクラスの別のメンバーと交換することを含む。非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーを、別のクラスのメンバーと交換することを含む。
【０１１３】
抗体の正しい立体構造の維持に関与していない任意のシステイン残基もまた、一般的にセリンと、置換され得、分子の酸化安定性を向上させ、異常な架橋を防ぎ得る。逆に、システイン結合が、特異的結合剤又は抗体に付加され得、その安定性を向上し得る(特に、抗体が、Ｆｖフラグメント等の抗体フラグメントである場合)。
【０１１４】
例えば、抗体中に見られる一つ以上の糖鎖を除去する、及び／又は特異的結合剤もしくは抗体中に存在しない一つ以上の糖鎖付加部位を追加する等、親抗体と比較して改変された糖鎖付加パターンを有するだろう、本明細書中に記載される抗体の変異体が生成され得る。
【０１１５】
抗体を含むポリペプチドの糖鎖付加は、典型的にはＮ結合型又はＯ結合型である。Ｎ結合型は、アスパラギン残基の側鎖への糖鎖の付着をいう。アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニン（ここでＸはプロリン以外の任意のアミノ酸である）のトリペプチド配列は、糖鎖のアスパラギン側鎖への酵素的付着のための認識配列である。ポリペプチドにおける、これらのいずれかのトリペプチド配列の存在は、潜在的な糖鎖付加部位を作る。したがって、Ｎ結合型糖鎖付加部位は、一つ以上のこれらのトリペプチド配列を含有するよう、アミノ酸配列を変更することによって、特異的結合剤又は抗体に追加され得る。Ｏ結合型糖鎖付加は、Ｎ−アセチルガラクトサミン（Ｎ−ａｃｅｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）、ガラクトース、又はキシロースのうちの一つの糖の、ヒドロキシアミノ酸（最も一般的にはセリン又はスレオニンであるが、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンもまた使用され得る）への付着をいう。Ｏ結合型糖鎖付加部位は、元の特異的結合剤又は抗体の配列に、一つ以上のセリン又はスレオニン残基を挿入又は置換することによって、特異的結合剤又は抗体に追加され得る。
【０１１６】
システイン残基は、Ｆｃ領域において除去又は導入され得、それによって、この領域における鎖間のジスルフィド結合の形成を除去又は増加し得る。そのように作出されたホモ二量体の特異的結合剤又は抗体は、改善された内部移行能並びに／又は上昇した補体媒介性細胞殺傷及び抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有し得る。Ｃａｒｏｎら，Ｊ．  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１７６：１１９１，１９９２及びＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８，１９９２を参照のこと。Ｗｏｌｆｆら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：２５６０，１９９３において記載されているように、ホモ二量体の特異的結合剤又は抗体はまた、ヘテロ二機能性架橋剤を使用して調製され得る。あるいは、二重Ｆｃ領域を有し、それによって亢進された補体溶解能及びＡＤＣＣ能を有し得る特異的結合剤又は抗体が、設計され得る。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３：２１９，１９８９を参照のこと。
【０１１７】
ＣＤＲ内の配列は、抗体をＭＨＣクラスＩＩに結合させて、望まれないヘルパーＴ細胞応答の引き金を引き得る。保存的置換は、特異的結合剤又は抗体が、結合活性を保持しつつも、望まれないヘルパーＴ細胞応答の引き金を引く能力を低減することを可能にし得る。
【０１１８】
例えば、サルベージ受容体結合エピトープの組み込みもしくは付加（例えば、ＤＮＡ又はペプチド合成によって、例えば、適正な領域の変異によって、又はエピトープをペプチドタグに組み込み、次いでそれを特異的結合剤もしくは抗体のいずれかの末端又は真ん中に融合することによって）（例えば、国際公開第９６／３２４７８号パンフレットを参照のこと）又はＰＥＧもしくは多糖ポリマーを含む他の水溶性ポリマー等の分子の付加による、血清半減期を増加させるための抗体の改変もまた望ましいかもしれない。
【０１１９】
サルベージ受容体結合エピトープは好ましくは、Ｆｃドメインの一つ又は二つのループからの任意の一つ以上のアミノ酸残基が、特異的結合剤又は抗体又はフラグメントの類似の位置へと転移した領域を構成する。よりいっそう好ましくは、Ｆｃドメインの一つ又は二つのループからの三つ以上の残基が、転移している。なおより好ましくは、エピトープは、（例えば、ＩｇＧの）Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインから取られて、特異的結合剤又は抗体のＣＨ１、ＣＨ３もしくはＶＨ領域、又は一つより多くのそのような領域へと転移される。あるいは、エピトープは、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインから取られて、特異的結合剤又は抗体フラグメントのＣＬ領域もしくはＶＬ領域、又は両方へと転移される。Ｆｃ変異体及びそれらのサルベージ受容体との相互作用を使用する、抗体を改変するためのこれらの技術は、当業者に周知であり、例えば、国際公開第９７／３４６３１号パンフレット及び国際公開第９６／３２４７８号パンフレット中に記載されている。
【０１２０】
Ｃｌｑ結合部位等の、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）の原因である定常領域の他の部位及び／又は抗体依存性細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の原因である定常領域の他の部位が、同定されてきた［例えば、参照することによりその全体が本明細書中に援用される、Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：６３３，１９９２；Ｓｈｉｅｌｄｓら，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，２７６：６５９１，２００１を参照のこと］。Ｆｃ受容体結合部位内の残基の突然変異は、ＡＤＣＣもしくはＣＤＣ活性の変更、又は半減期の変更等の、エフェクター機能の変更（すなわち、増加又は減少）をもたらし得る。上記のように、可能な突然変異としては、アラニンでの置換、保存的置換、非保存的置換、もしくは異なるサブクラスからの対応するアミノ酸残基での同位置における交換（例えば、ＩｇＧ１残基を、その位置での対応するＩｇＧ２残基で交換する）を含む、一つ以上の残基の挿入、欠失、又は置換が挙げられる。
【０１２１】
抗体の共有結合的修飾もまた意図される。そのような共有結合的修飾は、化学合成によって、又は適用可能な場合、抗体の酵素的もしくは化学的切断によって、行われ得る。他のタイプの共有結合的修飾は、標的化したアミノ酸残基を、選択された側鎖又はＮもしくはＣ末端残基と反応する能力がある有機誘導体化剤と反応させることによって、特異的結合剤又は抗体へ導入され得る。
【０１２２】
システイニル残基は、クロロ酢酸又はクロロアセトアミド等のα−ハロ酢酸（及び対応するアミン）と最も一般的に反応されて、カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を与える。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルリン酸、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ安息香酸水銀、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール、又はクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１、３−ジアゾールとの反応によって誘導体化されてもよい。
【０１２３】
ジエチルピロカーボネートは、ヒスチジル側鎖に比較的特異的であるため、ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５〜７．０でジエチルピロカーボネートとの反応によって誘導化される。パラ−ブロモフェナシルブロミドもまた有用である；反応は好ましくは、０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム中で、ｐＨ６.０で実施される。
【０１２４】
リジニル及びアミノ末端残基は、コハク酸又は他のカルボン酸無水物と反応される。これらの薬剤での誘導体化は、リジニル残基の電荷を反転させる効果を有する。α−アミノ含有残基を誘導体化するための他の適切な試薬としては、メチルピコリンイミダート等のイミドエステル、ピリドキサルリン酸、ピリドキサル、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオン、及びグリオキシル酸とのトランスアミナーゼ触媒反応が挙げられる。
【０１２５】
アルギニル残基は、一つ又はいくつかの慣習的な試薬、とりわけ、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、及びニンヒドリンとの反応によって修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫａのため、アルカリ性条件で反応が実施されることを必要とする。さらに、これらの試薬は、リジン基並びにアルギニンイプシロンアミノ基と反応し得る。
【０１２６】
チロシル残基の特異的修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応によって分光標識をチロシル残基中に導入することに特に関心をもって、行われ得る。最も一般的に、Ｎ−アセチルイミジゾール及びテトラニトロメタンが使用されて、それぞれ、Ｏ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体が形成される。チロシル残基は、１２５Ｉ又は１３１Ｉを使用してヨウ素化されて、放射性免疫測定法において使用される標識タンパク質が調製される。
【０１２７】
カルボキシル側基（アスパルチル又はグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応により選択的に修飾され、ここで、Ｒ及びＲ’は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド又は１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミド等の、異なるアルキル基である。さらに、アスパルチル及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応により、アスパラギニル及びグルタミニル残基に変換される。
【０１２８】
グルタミニル及びアスパラギニル残基は、それぞれ、対応するグルタミル及びアスパルチル残基へと、頻繁に脱アミド化される。これらの残基は、中性又は塩基性条件下で脱アミド化される。これらの残基の脱アミド化された形状は、本発明の範囲内である。
【０１２９】
他の修飾としては、プロリン及びリジンの水酸化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３））、Ｎ末端アミンのアセチル化、並びに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【０１３０】
別のタイプの共有結合的修飾は、抗体に化学的又は酵素的にクリコシドをカップリングさせることを含む。これらの手法は、Ｎ−又はＯ結合型糖鎖付加の糖鎖付加の能力を有する宿主細胞において特異的結合剤又は抗体の生成を必要としないため、有益である。使用されるカップリング方法によって、糖類は、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインの遊離スルフヒドリル基等の遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニン、もしくはヒドロキシプロリンの遊離ヒドロキシル基等の遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンの芳香族残基等の芳香族残基、又は（ｆ）グルタミンのアミド基、に付着され得る。これらの方法は、１９８７年9月１１日に発行された国際公開第８７／０５３３０号パンフレット、及びＡｌｐｉｎ及びＷｒｉｓｔｏｎ，  ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６（１９８１）に記載されている。
【０１３１】
特異的結合剤又は抗体上に存在する任意の炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に達成され得る。化学的糖鎖除去は、化合物トリフルオロメタンスルホン酸、又は同等の化合物への特異的結合剤又は抗体の暴露を必要とする。この処置は、特異的結合剤又は抗体をインタクトに残しつつ、連結する糖類（Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサミン）を除く、ほとんどの又は全ての糖類の開裂をもたらす。化学的糖鎖除去は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら，Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ２５９：５２  １９８７によって、及びＥｄｇｅら．Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１８：１３１，１９８１によって記述されている。特異的結合剤又は抗体上の炭水化物部分の酵素的開裂は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら，Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １３８：３５０，１９８７によって記述されているように、種々のエンド−及びエキソ−グリコシダーゼを使用して達成され得る。
【０１３２】
別のタイプの抗体の共有結合的修飾は、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール、ポリオキシアルキレン、又はデキストラン等の多糖ポリマー等の種々の非タンパク質性ポリマーの一つに抗体を連結することを含む。そのような方法は、当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号、同第４，１７９，３３７号、同第４，７６６，１０６号、同第４，１７９，３３７号、同第４，４９５，２８５号、同第４，６０９，５４６又は欧州特許第３１５４５６号を参照のこと。
【０１３３】
治療方法
「処置」は、障害の発症、進行（ｐｒｏｇｅｓｓｉｏｎ）を防ぎ、又は病態を変化させる意図をもって実施される介入である。よって、「処置」は、治療的処置及び予防的又は防止的措置の両方をいう。処置を必要とする者としては、障害の症状を既に有する対象並びに障害を発症する可能性があると診断された者であって、故に障害が予防されるべき者、が挙げられる。語句「処置」は、状態の寛解、抑制、根絶、重傷度の軽減、発症率の頻度の低減、予防、リスクの軽減、及び／又は、発病の遅延を含み得る。
【０１３４】
処置の目的のための「哺乳動物」は、哺乳動物として分類される任意の動物をいい、ヒト、飼育動物及び家畜、並びにイヌ、ウマ、ネコ、ウシ等の動物園の動物、スポーツ用の動物、ペット用の動物が含まれる。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【０１３５】
本明細書中で使用される場合、語句「治療有効量」は、ＮＰＲＡ受容体の作用を通して、ＡＮＰ及び／又はＢＮＰの生物学的効果を延長させる、治療的又は予防的ＮＰＲＡ抗体の量を言うことを意味する。特定の態様において、これらの方法は、種々の循環器系の状態に対して効果的な処置である。そのような効果は、例えば、有効性、効力、投薬必要量、及び／又は低減された副作用において、実現され得る。用語「循環器系の状態」は、本願において広く使用されており、例えば、高血圧症（抵抗性高血圧症及び肺高血圧症を含む）、心不全（慢性心不全（すなわち、「ＣＨＦ」）、心筋梗塞後心不全等）、不整脈、拡張機能障害（左室拡張機能障害、拡張期心不全、又は拡張期充満障害等）、収縮不全、虚血（心筋虚血等）、心筋症（肥大型心筋症及び拡張型心筋症等）、心臓突然死、心筋線維症、血管線維症（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、動脈コンプライアンス障害、心筋の壊死病斑、心臓における血管の損傷、心臓における血管炎症、心筋梗塞（「ＭＩ」）（急性ＭＩ後及び慢性ＭＩ後状態の両方を含む）、冠動脈形成術、左室肥大、駆出率の低下、冠動脈血栓、心臓病変、心臓における血管壁の肥厚、内皮の肥厚、心筋炎、冠動脈疾患（冠動脈の類繊維素壊死等）、並びにアテローム性動脈硬化症を含む。
【０１３６】
抗体の投与は、高血圧症、心不全、及び／又は他の循環器系の状態と（直接的又は間接的のいずれかで）関連する種々の状態に対する効果的な処置を提供する。そのような二次的な状態としては、例えば、腎障害、脳血管疾患、一般的な血管疾患、網膜症、神経障害（末梢神経障害等）、浮腫、内皮障害、及び異常インスリン症（異常インスリン症から起る合併症を含む）が挙げられる。腎障害の例としては、糸球体硬化症、末期腎疾患、急性腎不全、糖尿病性腎症、腎血流量の低下、糸球体濾過画分の増加、タンパク尿、糸球体濾過速度の低下クレアチニンクリアランス（ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ）の低下、微量アルブミン尿症、腎動脈症、虚血性病変、腎臓における血管の損傷、腎臓における血管の炎症、並びに悪性腎硬化症（虚血性退縮、毛細管房状分岐（ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｔｕｆｔｓ）の血栓壊死、細動脈の類繊維素壊死、並びに糸球体及び微小血管を冒す血栓性の微小血管障害性病変等）が挙げられる。脳血管疾患の例としては、脳卒中が挙げられる。血管疾患の例としては、血栓性の血管疾患（壁在類繊維素壊死，赤血球細胞の血管外遊出及び断片化、並びに管腔及び／又は壁在血栓症等）、増殖性動脈症（粘液性細胞外マトリクスに囲まれた筋内膜の（ｍｙｏｉｎｔｉｍａｌ）細胞の腫大及び小結節の肥厚等）、アテローム性動脈硬化症、血管コンプライアンスの低下（病理学的な血管の硬化及び／又は心室コンプライアンスの減少等）、並びに内皮障害が挙げられる。浮腫の例としては、末梢組織浮腫及び肺うっ血が挙げられる。異常インスリン症の例としては、インスリン耐性、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、グルコース感受性、前及び糖尿病性シンドロームＸが挙げられる。
【０１３７】
したがって、いくつかの実施態様において、病態は、循環器系疾患、腎障害、浮腫、脳血管疾患、又は異常インスリン症を含む。他の実施態様において、処置されるべき状態は、循環器系疾患、脳卒中、又はＩＩ型糖尿病である。さらに他の実施態様において、処置されるべき状態は、高血圧症、心不全、左室肥大、又は脳卒中である。さらに他の実施態様において、処置されるべき状態は、循環器系疾患である。いくつかの他の態様において、処置されるべき状態は、高血圧症である。さらに他の実施態様において、処置されるべき状態は、心不全、不整脈、拡張機能障害、収縮不全、虚血、心筋症、心臓突然死、心筋線維症、血管線維症、動脈コンプライアンス障害、心筋の壊死病斑、心臓における血管の損傷、心筋梗塞、左室肥大、駆出率の低下、心臓における血管壁の肥厚、又は内皮の肥厚である。心不全は、急性心不全、急性心筋梗塞後心不全、慢性心不全、心筋梗塞後慢性心不全、高血圧症駆動型心不全、心臓突然死、心臓における血管炎症であり得る。処置されるべき状態は、冠動脈形成術、冠動脈血栓、心臓病変、心筋炎、冠動脈の類繊維素壊死等の冠動脈疾患であり得る。他の態様において、処置されるべき状態は、腎障害である。さらに他の実施態様において、処置されるべき状態は、脳血管疾患である。
【０１３８】
例証的な併用プロトコルにおいて、対象は、障害の処置のための、抗体組成物を含む第一組成物及び追加の治療的薬剤を含む第二組成物を投薬される。第一及び第二組成物は一緒になって、標的化された状態に治療上有効な処置を形成する。抗体の具体的な用量レベル及び投薬の頻度並びに他の治療剤は、例えば、選択された薬剤の特定の組み合わせ；使用される特定の治療薬剤の活性、有効性、薬物動態、及び毒性プロファイル（薬剤が併用して使用される場合のプロファイルを含む）；患者の年齢、体重、全体的な健康、性別、及び食事；投与の頻度；排出速度；処置されている状態；処置されている状態の重症度；薬物送達系が使用されているかどうか；投与の形態、経路、及び頻度；並びに他の薬学的に活性な化合物もまた投与されているかどうか、等を含む種々の要素に依存するであろうことが認識されるべきである。したがって、実際に採用される投薬計画は、大きく異なってもよく、それゆえ、本特許に記載される好ましい投薬計画から逸脱し得る。
【０１３９】
各薬物の一日量の全体は一般的に、単回投与又は比例した複数の部分用量（ｓｕｂｄｏｓｅ）で、患者に投与され得る。部分用量は典型的に、毎日２回〜約６回、より典型的には、毎日２回〜約４回投与される。用量は、望まれる結果を得るために効果的である、即時性放出形態又は持続性放出形態であり得る。本発明における治療薬剤の投薬頻度は典型的には、毎日又は一日に複数回であるが、本発明はまた、一つ以上の治療薬剤の投与の間の好ましい期間が２４時間を超える投薬計画も意図することが認識されるべきである。そのような実施態様において、投薬頻度は、例えば、３６時間毎、４８時間毎、７２時間毎、毎週、又は毎月であり得る。
【０１４０】
意図される併用療法において、投与は、固定比率の治療薬剤を有する単一の処方物（例えば、単一のカプセル剤）か、又は各々が少なくとも一つの治療薬剤を含む別々の処方物（例えば、複数のカプセル剤）のいずれかを使用して、抗体及び第二の薬剤を、実質的に同時である様式で投与することを含み得る。そのような投与はまた、抗体及び他の治療薬剤を、別々の処方物で、異なる時に投与することを含み得る。これは、例えば、併用する成分を、連続的な様式で投与することを含み得る。あるいは、それは、一つの成分を、別の成分の投与の間に、複数回投与することを含み得る。あるいは、それは、二つの成分を同時に投与し、一方で、少なくとも一つのそれらの成分の別の部分を、異なる時にもまた別々に投与することを含み得る。あるいは、それは、二段階の効果のために、二つの成分を連続的に投与することを含み得る。併用される成分が別々に投薬される場合、各成分の投薬間の期間は、数分〜数時間又は数日にわたってもよく、例えば、各成分の性質（例えば、効力、溶解性、バイオアベイラビリティ、半減期、及び動力学的プロファイル）、並びに患者の状態に依存するだろう。
【０１４１】
投薬及び投薬頻度の最適化（望ましい程度まで）は、治験において決定され得る。毎日の複数回投与は典型的には、望まれる場合に、一日量の総量を増やすために使用され得ることが、認識されるべきである。
【０１４２】
第一及び第二組成物の投薬は、当業者に公知であろうパラメータの測定に基づいて、決定及び調整され得る。そのようなパラメータの非限定的な例としては一般的に、血圧、肺毛細管楔入圧又は適正な代替マーカー（ｃＧＭＰ、ナトリウム利尿ペプチド、エンドセリン、及び他の代替マーカー等）が挙げられる。併用療法の投与後の血圧、肺毛細管楔入圧及び／又は代替マーカーレベルは、療法を投与する前の、対応するベースラインレベルに対して比較され得、本発明の方法の有効性が決定され、必要に応じて用量設定される。本方法において有用な代替マーカーの非限定的な例は、腎臓及び循環器系疾患の代替マーカーである。
【０１４３】
併用の治療薬剤はしばしば、中間レベル（特に、上記の好ましい投薬量の範囲内におさまる中間レベル）で投薬を開始し、次いで、観察された有効性及び副作用によって、上又は下に用量設定することが好ましいことが認識されるべきである。多くの実施態様において、処置は、状態が制御又は除去されるまで、必要に応じて数週間から数ヶ月又は数年の期間にわたって継続される。本明細書中に開示される抗体での処置を受けている患者は、処置されている特定の状態の処置の有効性を決定するために、当技術分野において公知の幅広い種類の方法によって、日常的にモニタリングされ得る。これは、例えば、血圧、心エコー検査法；ＭＲＩ；Ｃ反応性タンパク質、脳性ナトリウム利尿ペプチド（「ＢＮＰ」）、フィブリノーゲンレベル、及び炎症誘発性分子（例えば、ＴＮＦα、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１３等）並びに血流におけるｃＧＭＰレベルのモニタリングを含み得；腎臓関連疾患では、それはまた、例えば、尿素の出現率（ｕｒｅａ  ａｐｐｅａｒａｎｃｅ  ｒａｔｅ）（「ＵＡＲ」）のモニタリングを含み得る。腎機能はまた、当業者に公知の方法を使用して、クレアチニンクリアランス及びシスタチンレベルを使用して測定され得る。そのようなデータの継続的な解析は、各タイプの治療薬剤の至適有効量が任意の時に投与されるよう、かつ処置の持続期間も決定され得るよう、療法中の処置計画の改変を可能にする。このような方法で、処置計画／投薬スケジュールは、一緒になって満足できる有効性を呈する最少量の各治療薬剤が投与され、かつ状態をうまく処置するために必要な期間中のみにわたって投与が継続されるよう、療法の期間にわたって合理的に改変され得る。
【０１４４】
本発明の抗体処置及び／又は併用療法は、循環器系の状態（もしくは関連する状態）の診断前に予防的に投与され得、対象がその状態に感受性である期間中、併用の投与が継続され得る。顕著な臨床症状のない個体であって、しかしながら、病理学的効果に感受性である個体は、それゆえ、併用の予防的投薬を与えられ得る。そのような予防的投薬は、興味の対象である具体的な病原性効果を処置するのに使用される用量よりも低くてもよいが、そうでなくてもよい。
【０１４５】
本発明のいくつかの実施態様において、心臓の病態が同定され、ナトリウム利尿ペプチドの血中濃度に基づいて、効果的な投薬量及び頻度が決定されている。血中のナトリウム利尿ペプチドレベル、特に血中ＢＮＰレベル、の上昇は一般的に、血液量拡大（ｂｌｏｏｄ  ｖｏｌｕｍｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）の状態下及び急性心筋梗塞等の血管損傷後の対象において観察され、梗塞後、長期間にわたって上昇したままである。（Ｕｕｓｉｍａａら，Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｒｄｉｏｌ，６９：５，１９９９。本発明の療法（抗体単独又は別の療法と併用された抗体）の投与前に測定されたベースラインレベルに対するナトリウム利尿ペプチドレベルの低下は、療法によって媒介された病理学的効果における低下を示し、それゆえ、病理学的効果の阻害との相関関係を提供する。それゆえ、望ましいナトリウム利尿ペプチドレベルの血中レベルは、療法の投与前の対応するベースラインレベルに対して比較されて、病理学的効果の処置における本方法の有効性が決定され得る。そのようなナトリウム利尿ペプチドレベルの測定に基づき、併用の投薬は、循環器系の病理学的効果を減少させるために調節され得る。治療薬剤の有効性及び適正な投薬量の決定はまた、循環及び尿中ｃＧＭＰレベルに基づいていてもよい。ｃＧＭＰの血漿レベルの増加は、肺毛細管楔入圧の低下に対応する。ｃＧＭＰの尿中排泄の増加は、ナトリウム排泄増加と相関し得る。
【０１４６】
いくつかの実施態様において、本発明の療法は、組織又は循環Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベルの、統計学的に有意な低下を引き起こすのに効果的な投薬量及び頻度で投与される。
【０１４７】
いくつかの実施態様において、本発明の療法は、約４５％未満の、特に約４０％未満の、よりいっそう特に約３０％未満の駆出率を有する患者に投与される。そのような実施態様において、療法は好ましくは、左室の駆出率の統計学的に有意な増加（もしくは保存する、又は少なくとも部分的に保存する）を引き起こすのに効果的な投薬量及び頻度で投与される。他の実施態様において、療法は、心拍出量の改善、肺毛細管楔入圧の改善等の血行動態の改善を達成するのに効果的な量で投与される。療法はまた、心筋梗塞後の梗塞サイズにおける減少をもたらすのに有用であり得る。
【０１４８】
いくつかの実施態様において、本発明の療法は、一回拍出量の統計学的に有意な増加（もしくは保存する、又は少なくとも部分的に保存する）を引き起こすのに効果的な投薬量及び頻度で投与される。
【０１４９】
いくつかの実施態様において、本発明の療法は、左室の収縮末期面積、拡張末期面積、収縮末期容積、又は拡張末期容積の、統計学的に有意な減少を引き起こすのに効果的な投薬量及び頻度で投与される。
【０１５０】
いくつかの実施態様において、本発明の療法は、左室容積の統計学的に有意な減少を引き起こすのに効果的な投薬量及び頻度で投与される。
【０１５１】
いくつかの実施態様において、本発明の療法は、心臓における間質コラーゲン画分の統計学的に有意な減少（例えば、コラーゲンマーカーを測定することによって、又は、例えば、心エコー図を使用して心臓の硬直を測定することによってモニタリングされ得る）を引き起こすのに効果的な投薬量及び頻度で投与される。
【０１５２】
いくつかの実施態様において、本発明の療法は、心筋梗塞又は心不全又は左室肥大の存在に基づいて投与される。左室肥大は、心エコー図又は磁気共鳴画像法によって同定され得、処置の進展及び投薬量の妥当性をモニタリングするのに使用される。
【０１５３】
高血圧症の処置のためには、対象は典型的には最初に、血圧決定に基づいて、正常血圧、境界域高血圧、又は高血圧であると同定される。特にヒトに関しては、そのような決定は、着席での手首式水銀血圧計（ｓｅａｔｅｄ  ｃｕｆｆ  ｍｅｒｃｕｒｙ  ｓｐｈｙｇｍｏｍａｎｏｍｅｔｅｒ）を使用して達成され得る。個人は、収縮期血圧及び拡張期血圧がそれぞれ、約１２５ｍｍＨｇ未満及び約８０ｍｍＨｇ未満の場合に、正常血圧とみなされ得；収縮期血圧及び拡張期血圧がそれぞれ、約１２５〜約１４０ｍｍＨｇ及び約８０〜約９０ｍｍＨｇの範囲内の場合に境界域高血圧とみなされ得；収縮期血圧及び拡張期血圧がそれぞれ、約１４０ｍｍＨｇ及び９０ｍｍＨｇを超える場合に、高血圧とみなされ得る。高血圧状態の重症度が上昇するほど、療法の少なくとも一つの成分の好ましい用量も典型的には増加する。投与後の血圧測定に基づいて、併用成分の用量が用量設定され得る。処置に対する対象の応答の初期評価後、望ましい血圧降下効果を達成するために、用量は、それに合うように、増加又は減少され得る。
【０１５４】
腎機能の病態を処置するための投薬量及び頻度は、例えば、タンパク尿、微量アルブミン尿、糸球体濾過速度（ＧＦＲ）の低下、又はクレアチニンクリアランス低下の測定値に基づいて、決定及び調整され得る。タンパク尿は、２４時間蓄尿中、約０．３ｇを超える尿中タンパク質の存在によって同定される。微量アルブミン尿症は、アッセイ可能な尿中アルブミンにおける増加によって同定される。そのような測定に基づき、本発明の併用の投薬量及び頻度の投薬量は、腎臓の病理学的効果を寛解させるように調整され得る。
【０１５５】
神経障害、特に末梢神経障害は、感覚消失又は感覚運動能の神経学的検査によって同定され得、投薬量及び頻度は、感覚消失又は感覚運動能の神経学的検査に基づいて調整され得る。網膜症は、眼科学的検査によって同定され得、投薬量及び頻度は、眼科学的検査に基づいて調整され得る。
【０１５６】
モニタリング療法のための動物モデル
種々の動物モデルが、本発明の治療用組成物を試験するのに利用可能である。例えば、抗体組成物は、単独で又は他の一般に認識された心不全の処置との併用のいずれかで、自然発症高血圧心不全のラットモデルにおいて試験され得る。そのようなラットモデルは、当技術分野において記述されてきた。Ｈｅｙｅｎら、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ，  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ，  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＳＨＨＦ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ」，Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２８３：Ｈ１７７５，２００２（参照することにより本特許中に援用される）。このモデルは、以下に記載されるように、本明細書中で意図される抗体及び又は併用療法の治療可能性を評価するために使用され得る。
【０１５７】
例えば、痩せた、雄性ＳＨＨＦラット（ジェネティックモデルス社、インディアナポリス、インディアナ州）が試験モデルとして使用され、同齢のスプラーグドーリー（ＳＤ）ラット（チャールス・リバー・ラボラトリーズ社、ローリー、ノースカロライナ州）が対照として使用される。全ての動物は、例えば、周囲の室温で、毎日１２時間点灯された部屋に収容されて、それら動物の環境に順化される。
【０１５８】
使用され得る別のモデルは、容積拡大高血圧性（ｖｏｌｕｍｅ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ）ラットモデル（アルドステロン／塩ラットモデルとしてもまた公知である）であり、当技術分野において記述されてきた。例えば、Ｒｏｃｈａ，  Ｒ．ら，Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ，２８３：Ｈ１８０２，２００２を参照のこと。また、Ｂｌａｓｉ，  Ｅ．  Ｒ．ら，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，６３：１７９１，２００３も参照のこと。また、ＰＣＴ特許公開番号ＷＯ０１／９５８９３号パンフレットも参照のこと。
【０１５９】
順化に続いて、一側性腎摘出された（ｕｎｎｅｐｈｒｅｃｔｏｍｉｚｅｄ）ラットは、１％のＮａＣｌ飲料水を与えられ、Ａｌｚａ社の浸透圧ポンプ、モデル２００２、を介して、アルドステロンを皮下に注入（０．５ｇ／ｋｇ／ｈｒ）された。これらのラットには、以下の処置群のうちの一つが割り当てられる：（１）処置されないラット；（２）興味の対象である第二の治療薬剤を、興味のある投薬量で受けるラット、（３）興味の対象である抗体を、興味のある投薬量で受けるラット、及び（４）興味のある投薬量のアルドステロンアンタゴニストと、興味のある投薬量の抗体と、を同時投与されるラット。処置は、３週間継続された。その期間にわたって、血圧及び心拍数が、腹大動脈にカニューレ処置された圧力トランスデューサーに接続された移植トランスミッターを介して、遠隔測定法によって継続的に評価される。血圧及び心拍数データは、２４時間の期間にわたって平均される。
【０１６０】
脳卒中誘発性自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ−ＳＰ）モデルは、当技術分野において記述されている。例えば、Ｒｏｃｈａ，  Ｒ．ら，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．  ＆  Ｍｅｔ．，１２：３０８，２００１を参照のこと。
【０１６１】
研究は、例えば、１２週間の規定された期間にわたって行われ、ベースライン、並びにその後の定められた間隔（例えば、４、８、及び１２週間後）で測定がなされ、試料が採取される。順化に続いて、ベースラインの測定が実施され、１週間後に、ラットは、遺伝子型に基づいて無作為化された後、以下の処置群のうちの一つに割り当てられる：（１）処置されないラット；（２）抗体を、興味のある用量で受けるラット、（３）興味の対象である第二の薬剤を、興味のある用量で受けるラット、及び（４）興味のある用量の抗体と、興味のある望ましい用量の第二の薬剤と、を同時投与されるラット。
【０１６２】
ラットは、経胸壁心エコーについて、モニタリングされる。Ｈｅｙｅｎ，  Ｊ．  Ｒ．  Ｒ．ら、を参照のこと。検査は、ベースライン、並びに心不全の進行中の４、９及び１３週間の処置後に実施される。これらの検査の間、各動物は軽く麻酔され、胸部が剪毛され、心エコー図が取得される。
【０１６３】
脳室内収縮期血圧は、１２週間の処置に続いて測定される。この解析の間、各動物は麻酔され、右総頸動脈は、ミラー社（Ｍｉｌｌａｒ）のカテーテルトランスデューサー（ミラー社、ヒューストン、テキサス州）でカニューレ処置され、左心室内へ定圧で通過させる。データは、１０秒毎に３分間採取され、ＨＰＡ−２１０心臓機能解析装置（マイクロメッド社、ルーイヴィル、ケンタッキー州）を使用して解析される。
【０１６４】
あるいは、テイルカフの収縮期血圧は、Ｖｉｓｉｔｅｃｈ  ＢＰ−２０００血圧解析システム（ヴィジテック・システムズ社（Ｖｉｓｉｔｅｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、アペックス、ノースカロライナ州）を使用して、ベースライン、並びに６及び１２週間の処置後に非侵襲的に解析される。各動物につき、６つの測定値が採取され、平均ＳＢＰ数値のために、平均される。
【０１６５】
血清電解質は、Ｈｉｔａｃｈｉ９１２生化学診断用自動分析装置（ロシュ・ダイアグノスティック社、インディアナポリス、インディアナ州）を使用して、標準的な手順に従って解析される。
【０１６６】
実験の最後には、各動物は麻酔されて、秤量される。腹腔が開かれて、腹大動脈が露出される。次いで、１８ゲージ（ｇｕａｇｅ）の針が腹大動脈へ挿入され、動物は失血させられる。得られた血液は、直ちに血清採取管に移され、次いで試料は、１５分間、３，０００ｒｅｖ／ｍｉｎで、４℃にて遠心分離され、形成された血清は次に採取され、さらなる解析まで−８０℃にて凍結される。
【０１６７】
心臓は、失血に続いて、単離され、取り除かれ、冷ＰＢＳ（ギブコ社、ゲイサーズバーグ、メリーランド州）中でリンスされ、ブロットして乾燥され、秤量される。脛骨もまた取り除かれ（Ｘ線解析によって実証される）、その長さが、カリパスを使用して決定される。次いで、観察された心臓の重量は、脛骨長に対して標準化される（ＨＷ／ＴＬ）。６ｍｍ切片が、心臓の中央を横方向に切り取られて、１０％の中性緩衝ホルマリン中に２４時間置かれ、続いて、パラフィンに包埋されるまで７０％のアルコール中に置かれる。残りの心尖部は、液体窒素中で瞬間凍結され、−８０℃にて分子解析用に保管される。
【０１６８】
尿中タンパク尿は、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質染色試薬（ハーキュリーズ、カリフォルニア州）を使用して決定される。アッセイは、製造者の説明書に従って、９６ウェルプレート形式に変更される。
【０１６９】
この実験の間、ラットの群は、例えば、収縮期血圧、駆出率、一回拍出量、左室拡張末期面積、左室収縮末期面積、左室拡張末期容積、左室収縮末期容積、尿中タンパク質、血清及び心臓組織中のＴＮＦα、左室容積（絶対値及び脛骨長に対して標準化）、血漿オステオポンチン、並びにＭＭＰレベル及び活性に関して、比較される。
【０１７０】
当技術分野において一般的に記述され、抗体組成物を単独で、又は標準的な処置と組み合わせて試験するために使用され得る別のラットモデルは、冠動脈結紮モデル（例えば、Ｒａｙａら，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ６４：３３０，１９８９）である。成体雄性スプラーグドーリーラットに対し、動物を麻酔し、左開胸が実施され、胸郭から心臓が露出され、左冠動脈近位部周囲に結紮が配置される標準的な技術によって、実験的心筋梗塞（ＭＩ）が起こされる。次いで、心臓は、胸部に戻され、胸郭が閉じられる。回復に続いて、ラットは、上に概説されたように、抗体単独で、又は興味の対象である第二の薬剤と組み合わされて、処置される。３〜５週間の処置後、動物は麻酔され（ａｎｅｓｔｈｅｓｔｉｚｅｄ）、心機能が、上に概説されたように測定される。
【０１７１】
慢性心不全のイヌモデルもまた、当技術分野において記述されてきた。例えば、Ｓｕｚｕｋｉ，  Ｇ．，「Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ  Ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｗｉｔｈ  Ｅｐｌｅｒｅｎｏｎｅ，  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ  Ｂｌｏｃｋｅｒ，  ｏｎ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｅｆｔ  Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｄｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ」，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，第１０６巻，ｐｐ．２９６７−２９７２（１２月３日、２００２年）（参照することにより本特許中に援用される）を参照のこと。また、Ｓａｂｂａｈ，  Ｈ．  Ｎ．ら，「Ａ  ｃａｎｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｍｉｃｒｏｅｍｂｏｌｉｚａｔｉｏｎｓ」，Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２６０：Ｈ１３７９  １９９１（参照することにより本特許中に援用される）も参照のこと。このモデルは、本明細書中で意図される療法を評価するために、使用され得る。
【０１７２】
この研究において、雑種のイヌは、連続的な冠微小血管塞栓術を受けて、心不全を生じる。塞栓術は、１〜３週間離して実施され、左室の駆出率が３０％から４０％の時に中止される。微小血管塞栓術は、全身麻酔及び無菌条件下で、心臓カテーテル法の間に実施される。麻酔は、オキシモルフォン（０．２２ｍｇ／ｋｇ）、ジアゼパム（０．１７ｍｇ／ｋｇ）、及びペントバルビタールナトリウム（効果があるように、１５０から２５０ｍｇ）の静脈内注射の組み合わせから構成される。
【０１７３】
最後の微小血管塞栓術の２週間後、イヌは、無作為化前の左及び右心カテーテル検査を受ける。一日後、イヌは無作為化され、次いで、以下の処置群のうちの一つが割り当てられる：（１）処置されないイヌ；（２）興味の対象である抗体を、興味のある投薬量で受けるイヌ、（３）本発明の併用療法を受けるイヌ、及び（４）併用療法において使用される第二の治療薬剤を、興味のある投薬量で受けるイヌ。この処置は、３ヶ月間継続される。最終的な血行動態及び血管造影の測定が、３ヶ月間の終わりに行われる。麻酔下にある間、各イヌの胸部が開かれ、心臓が取り除かれ、生化学的及び組織学的評価のために組織が調製される。
【０１７４】
この実験の間、イヌの群は、例えば、左室の駆出率における変化；拡張末期容積；収縮末期容積；左室の＋ｄＰ／ｄｔのピーク；左室の−ｄＰ／ｄｔのピーク；肺動脈圧；等容性弛緩の時定数、ｒ、左室拡張末期及び収縮末期の軸の比率（一方それは、左室球形度（ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｓｐｈｅｒｉｃｉｔｙ）における変化を示す）；左室拡張末期壁張力；体重；心臓重量（体重で標準化される）；左室壁の厚さ；Ｎａ＋、Ｋ＋、ＢＵＮ、及びクレアチニン；平均大動脈圧；並びに心拍数に関して比較される。また、例えば、心筋細胞面積（一方でそれは、細胞肥大の尺度である）、間質性線維症の体積分率、及び置換性線維形成の体積分率、及び毛細血管密度、ゼラチナーゼ活性、及び塩基性線維芽細胞増殖因子の転写に関しても、比較される。
【０１７５】
処置をモニタリングするために使用され得る別の例証的なモデルは、ペーシング誘発性心不全のイヌモデルである。このモデルは、当業者には周知であり、例えば、Ｋａｔｓｕｙａら，Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４３：８６０  ２００４において記述されている。急速な右心室のペーシングによる心不全を誘発するには、改変されたマルチプログラマブルペースメーカー（メドトロニックス社）が健常な成体雄性雑種イヌに移植される。器具設置から完全に回復後（手術後１０から１４日）、動物は、２４０ｂｐｍでの急速な心室ペーシングに供される。ペーシングの８日目に、イヌには、以下の処置プロトコルのうちの一つが割り当てられる：（１）処置されないイヌ；（２）興味の対象である抗体を、興味のある投薬量で受けるイヌ、（３）本発明の併用療法を受けるイヌ、及び（４）併用療法において使用される第二の治療薬剤を、興味のある投薬量で受けるイヌ。４週間のペーシング後、ペースメーカーは止められ、動物は、３０から４０分間、平衡化させておかれた。次いで、血行動態及び心臓の測定が、上に概説されたように行われる。
【０１７６】
医薬品製剤
本発明の方法の実行において使用されるＮＰＲＡ特異的抗体は、望ましい送達方法に適切な担体を含む医薬組成物中に処方され得る。適切な担体としては、抗体と組み合わされた場合に、抗体の高親和性結合特性及びリガンドの増強特性を保持し、かつ対象の免疫系と好ましくは非反応性である、任意の物質が挙げられる。例としては、無菌のリン酸緩衝食塩水溶液、静菌水等の、数々の標準的な医薬担体のうちの任意のものが挙げられるが、それらに限定されない。例えば、水、緩衝用水、０．４％食塩水、０．３％グリシン等の、種々の水溶性担体が使用され得、穏やかな化学修飾等に供されたアルブミン、リポタンパク質、グロブリン等の、安定性の亢進のための他のタンパク質が含まれ得る。
【０１７７】
処方物中の例証的な抗体濃度は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌもしくは約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、又は約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬ、あるいは、約２ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬにわたり得る。抗体の水性処方物が、ｐＨ緩衝溶液中において、例えば、約４．５〜約６．５、又は約４．８〜約５．５にわたるｐＨ、あるいはｐＨ約５．０にて調製され得る。この範囲内のｐＨのために適切な緩衝剤の例としては、酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（コハク酸ナトリウム等）、グルコン酸、ヒスチジン、クエン酸塩及び他の有機酸緩衝剤が挙げられる。緩衝剤の濃度は、例えば、緩衝剤及び処方物の望ましい等張性に依存して、約１ｍＭ〜約２００ｍＭ、又は約１０ｍＭ〜約６０ｍＭであり得る。
【０１７８】
抗体を安定化するための等張化剤が、医薬処方物中に含まれ得る。例証的な等張化剤としては、マンニトール、スクロース又はトレハロース等のポリオールが挙げられる。好ましくは、水性処方物は等張であるが、高張又は低張な溶液も適切であり得る。処方物中のポリオールの例証的な濃度は、約１％〜約１５％ｗ／ｖにわたり得る。
【０１７９】
界面活性剤もまた、抗体処方物に添加され得、処方された抗体の凝集を減少させ、かつ／又は処方物中の微粒子形成を最小化し、かつ／又は吸着を減少させる。例証的な界面活性剤としては、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、もしくはポリソルベート８０）又はポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。界面活性剤の例証的な濃度は、約０．００１％〜約０．５％、又は約０．００５％〜約０．２％、あるいは約０．００４％〜約０．０１％ｗ／ｖの範囲にわたり得る。
【０１８０】
抗体はまた、種々の保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、クロロブタノール及びベンゼトニウムＣｌ）と共に処方され得る。保存剤が存在する場合、それらは、約０．１％〜約２％、あるいは約０．５％〜約１％の範囲にわたる濃度で、処方物中に含まれ得る。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版（２００５）中に記載されるような、一つ以上の他の医薬的に許容可能な担体、添加剤又は安定化剤もまた、それらが処方物の望ましい特性に悪影響を与えないという条件で、処方物中に含まれ得る。許容可能な担体、添加剤又は安定化剤は、用いられる投薬量及び濃度では受容者に無毒であり、追加の緩衝薬剤；共溶媒；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ポリエステル等の生分解性ポリマー；並びに／又はナトリウム等の塩形成性の対イオンを含む。
【０１８１】
抗体の治療用処方物は、望ましい程度の純度を有する抗体と、随意の生理学的に許容可能な担体、添加剤又は安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版（２００５））と、を混合することによって、凍結乾燥処方物又は水溶液の形態で、保管用に調製される。許容可能な添加剤、又は安定化剤は、用いられる投薬量及び濃度では受容者に無毒であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸等の緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコール又はベンジルアルコール；メチルパラベン又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン等のアミノ酸；単糖、二糖、及びグルコース、マンノース、マルトース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール等の糖類；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；並びに／又はＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１８２】
一実施態様において、特許請求された発明の適切な処方物は、等張化及び安定化をする、ポリオール、ソルビトール、スクロース又は塩化ナトリウム等の等張化剤と組み合わされて、リン酸塩、酢酸塩、又はＴＲＩＳ緩衝剤等の、等張緩衝剤を含有する。そのような等張化剤の一例は、５％のソルビトール又はスクロースである。また、処方物は随意に、凝集を防ぎ、０．０１から０．０２％ｗｔ／ｖｏｌでの安定化等のために、界面活性剤を含み得る。処方物のｐＨは、４．５〜６．５又は４．５〜５．５の範囲にわたり得る。抗体の医薬処方物の他の例証的な記載は、米国特許出願第２００３／０１１３３１６号及び米国特許第６，１７１，５８６号中に見られる。
【０１８３】
本明細書中の処方物はまた、処置されている特定の適応症の必要に応じて、好ましくは互いに悪影響を与えない補体活性を持つ、一つより多い活性化合物を含有し得る。例えば、免疫抑制剤をさらに提供することが望ましいかもしれない。そのような分子は、意図される目的のために効果的な量での組み合わせで、適切に存在する。
【０１８４】
有効成分はまた、例えば、コアセルベーション技術によりもしくは界面重合により調製されたマイクロカプセル中、例えばそれぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）ｐｏｌｙ−（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ）マイクロカプセル中に、又はコロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）中に、又はマクロエマルジョン（ｍａｃｒｏｅｍｕｌｓｉｏｎ）中に封入され得る。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版、Ｏｓｏｌ，  Ａ．編（１９８０）に開示されている。
【０１８５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与のために使用される処方物は、無菌でなければならない。本発明の組成物は、慣習的な、周知の滅菌技術によって滅菌され得る。例えば、滅菌は、滅菌ろ過膜を通すろ過によって、容易に達成される。得られた溶液は、使用のために包装され得るか又は無菌状況下でろ過されて凍結乾燥され得、凍結乾燥製剤は、投与前に無菌の溶液と組み合わせられる。長期保管のためにポリペプチドをフリーズドライする方法は、周知である。（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｐｏｌｌｉ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ３８：４８，  １９８４。凍結乾燥のサイクルは、凍結、初乾、及び再乾を含む。過程は、凍結乾燥ケーキとして知られる物質を生成する。その後、ケーキは、使用前に再構成され得る。
【０１８６】
凍結乾燥物質のための標準的な再構成の実施方法は、ある量（典型的には、凍結乾燥の間に取り除かれた量と等しい）の純水を添加し戻すことであるが、非経口投与のための医薬品の生成においては時々、抗菌剤の希釈溶液が使用される；Ｃｈｅｎ，  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１８：１３１１，１９９２。
【０１８７】
添加剤は、ある場合には、フリーズドライ製品のための安定化剤として働くことが述べられている；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ，７４：２２５，１９９１。例えば、公知の添加剤としては、ポリオール（マンニトール、ソルビトール及びグリセロールを含む）；糖類（グルコース及びスクロースを含む）；並びにアミノ酸（アラニン、グリシン及びグルタミン酸を含む）が挙げられる。
【０１８８】
また、ポリオール及び糖類はまた、ポリペプチドを、凍結及び乾燥によって誘発される損傷から防ぎ、かつ乾燥状態における保管の間の安定性を亢進するために、しばしば使用される。一般に、糖類、特に二糖類は、フリーズドライの過程及び保管の間の両方において、効果的である。単糖類及び二糖類並びにＰＶＰ等のポリマーを含む他のクラスの分子もまた、凍結乾燥製品の安定剤として報告されてきた。
【０１８９】
注射剤のために、医薬処方物及び／又は薬物は、上記のように適正な溶液での再構成のために適切な粉末であり得る。これらの例としては、フリーズドライ、回転乾燥もしくは噴霧乾燥された粉末、非晶質粉末、顆粒、沈殿物、又は微粒子が挙げられるが、これらに限定されない。注射剤のために、処方物は随意に、安定化剤、ｐＨ調節剤、界面活性剤、バイオアベイラビリティ調節剤及びこれらの組み合わせを含有し得る。
【０１９０】
徐放性調製物が調製され得る。徐放性調製物の適切な例としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが挙げられ、このマトリクスは、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの、成形された物品の形状である。徐放性マトリクスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とｙエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（登録商標）等の分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから構成される、注射可能なマイクロスフェア）並びにポリ−（Ｄ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸等のポリマーは、１００日を超えて分子の放出を可能とする一方で、一定のヒドロゲルはタンパク質を、より短期間放出する。被包された抗体が、体内に長期間残存する場合、それらは３７℃での水分への暴露の結果変性又は凝集して、生物学的活性の喪失及び免疫原性において変化の可能性をもたらし得る。安定化のための合理的な戦略が、関与する機構に依存して考案され得る。例えば、凝集機構が、チオ−ジスルフィド交換を経由した分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると見出された場合、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、含水量を調節し、適正な添加剤を使用し、かつ特殊のポリマーマトリクス組成物を開発することによって達成され得る。
【０１９１】
本発明の処方物は、本明細書中に記載されるように、短時間作用性、速放性、長時間作用性、又は持続性放出性であるように設計され得る。従って、医薬処方物はまた、制御放出又は徐放用に処方され得る。
【０１９２】
具体的な投薬量は、疾患の状態、年齢、体重、全体的な健康状態；対象の性別、及び食事、投薬間隔、投与経路、排出率、並びに薬物の組み合わせに依存して、調整され得る。任意の上記の有効量を含有する投薬形態は十分に、日常的な実験の範囲内であり、それゆえ、十分に本発明の範囲内である。
【０１９３】
特異的結合剤又は抗体は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、及び鼻腔内、並びに、局所処置のために望ましい場合には、病巣内投与を含む、任意の適切な手段によって投与される。非経口注入としては、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮内又は皮下投与が挙げられる。また、特異的結合剤又は抗体は、特に減少していく用量の特異的結合剤又は抗体のパルス投与によって、適切に投与される。投与が短期であるか又は慢性的であるかに一部依存して、投薬は、好ましくは、注射によって与えられ、最も好ましくは、静脈内又は皮下注射によって与えられる。局部的、特に経皮、経粘膜、直腸、経口又は局所投与（例えば、望ましい部位の近くに配置されたカテーテルを通して）を含む他の投与方法も意図される。最も好ましくは、本発明の特異的結合剤又は抗体は、生理溶液中で、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲にわたる用量にて、一日一回〜毎週〜毎月の範囲にわたる頻度（例えば、毎日、隔日、三日おき、又は毎週２、３、４、５、もしくは６回）にて、好ましくは０．１〜４５ｍｇ／ｋｇ、０．１〜１５ｍｇ／ｋｇもしくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲にわたる用量にて、毎週２回もしくは３回の頻度にて、又は最高で４５ｍｇ／ｋｇにて一ヶ月に一回、静脈内投与される。別の好ましい投与方法は、経吸入である。
【０１９４】
併用療法
用語「併用療法」は、病態を処置するための、二つ以上の治療薬剤の投与を意味する。本明細書において、病態は一般的に、循環器系の状態又は循環器系の状態に関連する状態を含む。併用の治療薬剤は一般的に、例えば、（ａ）固定比率の有効成分を有する単一の処方物（例えば、単一のカプセル剤）で、又は（ｂ）各薬剤について複数の、別々の処方物（例えば、複数のカプセル剤）で、等の、実質的に同時である様式で同時投与され得る。あるいは（又は追加で）、併用の治療薬剤は、異なる時に投与され得る。いずれの場合においても、選択された処置計画は好ましくは、状態を処置することにおいて、併用薬物の有利な効果を提供する。
【０１９５】
併用療法の文脈において、語句「治療（上）有効」は、病態の寛解、抑制、根絶、重症度の低減、発症の頻度の低減、予防、リスクの低減、及び／又は発病の遅延、の目的を達成するであろう各治療薬剤の量を限定する。
【０１９６】
心疾患の処置としては、アンギオテンシンＩＩ変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、βアドレナリン受容体阻害剤、及びアスピリンの使用等の標準的な処置が挙げられる。任意のそのような標準的な療法が、本発明の抗体を使用した治療介入と併用され得る。アンギオテンシン受容体遮断薬もまた、ＡＣＥＩを許容しない患者において使用され得、カンデサルタンがＡＣＥＩとの併用のために最近承認された。例えば、エプレレノン等のアルドステロンアンタゴニストもまた、心不全及び高血圧症の処置において効果的であることが証明された。本発明の抗体はまた、心不全において、スタチン療法と併用して使用され得る。
【０１９７】
本明細書中に記載される抗体は、例えば、アリスキレン（テクターナ、ラジレス、ノバルティス社）等のレニン阻害剤と併用して使用され得る。エンドセリンアンタゴニスト及びバソペプチダーゼ阻害剤（二重ＡＣＥ／中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）阻害剤）もまた、併用療法において有用であり得る。バソプレシンアンタゴニストとの併用療法もまた、有用であり得る。アデノシンＡ１受容体アンタゴニスト等の利尿剤もまた、併用療法のために意図される。他の有用な薬剤としては、ＣＨＦの処置のためのベータ遮断薬が挙げられる。
【０１９８】
ジゴキシン等の変力剤は、重症ＣＨＦの症状を緩和するために古くから使用されてきた。ミルリノンは、急性ＣＨＦの短期的な処置のためにのみ使用されるＰＤＥ３阻害剤及び変力剤であり、これは、このクラスの薬剤は催不整脈促進性（ｐｒｏａｒｒｙｔｈｍｉａｇｅｎｉｃ）であり、連用によって生存に負の影響を有し得るためである。心筋ミオシン活性化因子もまた、本発明の療法との併用で、有用であるかもしれない。例えば、バイアグラ、シアリス並びに現在臨床試験中である可溶性ＧＣ活性化因子／刺激物質等のＰＤＥ５阻害剤もまた、本発明の併用療法における使用が意図される。
【０１９９】
本発明の抗体と、ネシリチド（ｈＢＮＰ）及び（組換え体か、又は天然から単離されたいずれかの）他のナトリウム利尿ペプチドとの併用が、特に意図される。抗体は、ネシリチド、カルペリチド（ＡＮＰ、サントリー、現在は第一三共株式会社）、ウラリチド（ウロジラチン、ＰＤＬ、ＥＫＲセラピューティクス社）と併用され得、三つ全ての併用が特に意図される。
【０２００】
語句「アルドステロンアンタゴニスト」は、アルドステロンの効果を相殺する薬剤もしくは化合物、又は二つ以上のそのような薬剤もしくは化合物の組み合わせを包含する。メスピレノン（ｍｅｓｐｉｒｅｎｏｎｅ）等のそのような薬剤又は化合物は、受容体前（ｐｒｅ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ）機構を通して、アルドステロンの作用と拮抗し得る。スピロノラクトン及びエプレレノン等の他の薬剤及び化合物は一般的に、アルドステロン受容体アンタゴニストとして知られるクラスの中におさまり、これらは鉱質コルチコイド受容体に結合して、受容体後の現象の天然リガンドの活性化を防ぐ。多くの適切なアルドステロンアンタゴニストが、例えば、Ｐｅｒｅｚらによって、米国特許第６，４１０，５２４号（２００２年６月２５日発行；米国特許出願第０９／４３４，６８５号として１９９９年１１月５日に出願）（参照することにより本特許中に援用される）中に記載されている。
【０２０１】
本発明の方法において使用されるアルドステロンアンタゴニストは一般的に、スピロラクトン自身によって例証されるような、スピロラクトン型のステロイド性化合物である。エポキシ−ステロイド性アルドステロンアンタゴニスト化合物もまた、本明細書中で意図される併用療法において使用され得る。特に興味の対象であるのが、化合物エプレレノン（エポキシメキスレノン（ｅｐｏｘｙｍｅｘｒｅｎｏｎｅ）としてもまた公知である）である。エプレレノンは、アルドステロン受容体アンタゴニストであり、例えば、スピロノラクトンが有するよりも高いアルドステロン受容体に対する特異性を有する。本発明の方法において、アルドステロンアンタゴニストとしてエプレレノンを選択することは一般的に、例えば、女性化乳房症（より低い特異性のアルドステロンアンタゴニストが使用される場合に起こりやすい）等の一定の副作用を低減するのに有益である傾向があるだろう。
【０２０２】
用語「利尿剤」は、例えば、利尿ベンゾチアジアジン誘導体、利尿有機水銀化合物、利尿プリン類、利尿ステロイド（アルドステロン受容体アンタゴニストとして実質的な活性を有さない利尿ステロイドを含む）、利尿スルホンアミド誘導体、利尿ウラシル、等を含む。例証的なそのような化合物としては、商業的供給源から購入できる、アマノジン（ａｍａｎｏｚｉｎｅ）、アミロライド、アルブチン、クロラザニル、エタクリン酸、マンニトール、メトカルコン（ｍｅｔｏｃｈａｌｃｏｎｅ）、ムゾリミン、ペルハキシリン、及び尿素が挙げられる。利尿化合物はまた、ベンゾチアジアジン誘導体、スルホンアミド誘導体、メルカプトメリンナトリウム、メレトキシリン（ｍｅｒｅｔｈｏｘｙｌｌｉｎｅ）、プロカイン、及びテオフィリンと共にマーサリル等の有機水銀利尿剤であり得る。具体的な例において、利尿剤は、アミロライド、エタクリン酸、トリアムテレン、ヒドロクロロチアジド、クロロチアジド、ブメタニド（ｂｕｍｅｔａｍｉｄｅ）、フロセミド、又はヒドロクロロチアジドである。
【０２０３】
本発明はさらに、上記の処置方法を実施するための使用に適切なキットを含む。一実施態様において、キットは、病態（例えば、循環器系の状態又は循環器系の状態と関連する状態）に対する本発明の抗体を含む第一剤形及び第二の薬剤を含む第二剤形を、本発明の方法を実行するために十分な量で含む。好ましくは、第一剤形及び第二剤形全体で、標的とする状態の処置のための治療有効量の薬剤を含む。
【０２０４】
実施例
以下の実施例は、例証として提供され、いかなる意味でも限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例１】
【０２０５】
ナトリウム利尿ペプチド受容体を発現する安定な細胞株の作出
完全長ヒトＮＰＲＡ、ヒトＮＰＲＢ、ヒトＮＰＲＣ、アカゲザルＮＰＲＡ及びイヌＮＰＲＡ配列を含有するプラスミドを、オリジーン・テクノロジーズ社（ロックヴィル、メリーランド州）から購入し、又は配列をＤＮＡ２．０によって合成し、次いでｐｃＤＮＡ３．１哺乳動物発現ベクター（インビトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニア州）へサブクローニングする。各コンストラクトの挿入断片の配向及びヌクレオチド配列は、社外のベンダーによって検証される。ｐｃＤＮＡ３．１  ＮＰＲクローンを、リポフェクタミン（インビトロジェン社）を使用してＨＥＫ２９３細胞へトランスフェクトし、そこで安定な細胞株を、Ｇ４１８を使用して選択する。ＮＰＲＡ及びＮＰＲＢクローンを、以下に記載されるＡＮＰ−又はＣＮＰ−（シグマアルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州）誘導性ｃＧＭＰアッセイを使用してスクリーニングする。ＮＰＲＣクローンを、下に概説する１２５Ｉ−ＡＮＰ結合アッセイを使用してスクリーニングする。高ｃＧＭＰ生産又は高１２５Ｉ−ＡＮＰ結合クローンを、１００μｇ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、４００μｇ／ｍＬのＧ４１８、及び１０％のウシ胎児血清（ハイクローン社（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ローガン、ユタ州）を含有するＤＭＥＭ中で増殖させる。Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｐｏｔｔｅｒ博士（ミネソタ大学）から取得したＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＣＡ、ラットＮＰＲＡ発現細胞を、１００μｇ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、ハイグロマイシンＢ及び１０％のウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ中で成育させる。
【実施例２】
【０２０６】
ＮＰＲＡ−Ｆｃ融合タンパク質の作出
Ａ．ＮＰＲＡ−Ｆｃ融合タンパク質の構築
ＮＰＲＡの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を、ヒトＦｃ（γ１）に融合させ、ＮＰＲＡの水溶性形態を取得する。これを達成するにはまず、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１＋κ−リーダー−ＭＯＲｘｘ−ＦｃをＫｐｎＩで制限する（ＭＯＲｘｘは、命名されていない対照タンパク質を符号化している）。ＣｌａＩ部位を含有するオリゴリンカーを、付着末端を介して、ＫｐｎＩ部位中へ挿入する。オリゴリンカーは、（部分的相補性を持つ）二つのオリゴヌクレオチドをアニールすることによって生成される。結果として得られたプラスミドを、ＣｌａＩ及びＥｃｏＲＶで制限し、これは、ＭＯＲｘｘコード化配列の切除を伴う。ＮＰＲＡの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をコード化する配列を、ＮＰＲＡコード化プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ−ＮＰＲＡ）から、ＣｌａＩ及びＳｍａＩそれぞれの制限部位を導入するプライマーを使用したＰＣＲによって増幅する。ＰＣＲ産物を、ＣｌａＩ及びＳｍａＩで制限して精製し、断片を上記プラスミドの中に連結し、κリーダー、ＮＰＲＡの細胞外ドメイン及びヒトＦｃの融合をもたらす。結果として得られたプラスミドは、ｐｃＤＮＡ３．１＿κ−リーダー＿ＮＰＲＡ−ＥＣＤ＿Ｆｃと呼ばれる。
【０２０７】
Ｂ．ＮＰＲＡ−Ｆｃ融合タンパク質の発現
ＨＥＫ２９３細胞を、リン酸カルシウムに基づいたトランスフェクション手順を使用して、ｐｃＤＮＡ３．１＿κ−リーダー＿ＮＰＲＡ−ＥＣＤ＿Ｆｃでトランスフェクトする。トランスフェクション後５日目又は６日目に、遠心分離によって清澄にし、滅菌ろ過（０．２μｍ）した細胞培養液の上清（１５００ｍＬ）を回収した。上清のアリコットは、−２０℃で凍結する。
【実施例３】
【０２０８】
ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ライブラリーからのヒトＮＰＲＡ特異的抗体の同定及び作出に使用される方法
ヒトＮＰＲＡタンパク質に対する治療用抗体の作出のために、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ファージディスプレイライブラリーを用いた選択が実行される。ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）は、ＨｕＣＡＬ（登録商標）の概念に基づいたＦａｂライブラリーであり［Ｋｎａｐｐｉｋら，Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ，２９６，５７，２０００；Ｋｒｅｂｓら，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２５４，６７，２００１；Ｒａｕｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２７８，３８１９４，２００３］、ここでは６つのＣＤＲ全てが多様化され、ファージ表面にＦａｂフラグメントを連結させるために、ＣｙｓＤｉｓｐｌａｙ（登録商標）技術が利用されている［Ｌｏｈｎｉｎｇ、国際公開第０１／０５９５０号パンフレット（２００１）］。
【０２０９】
Ａ．ファージミドレスキュー、ファージ増幅、及び精製
ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ライブラリーを、３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール及び１％のグルコースを含有する２×ＹＴ培地（２×ＹＴ−ＣＧ）中で増幅させる。ＯＤ６００ｎｍが０．５のＶＣＳＭ１３ヘルパーファージでの感染（３７℃で振盪せずに３０分間；３７℃で、２５０ｒｐｍで振盪して３０分間）後、細胞を遠心沈殿（４１２０ｇ；５分；４℃）させ、２×ＹＴ／３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール／５０μｇ／ｍｌカナマイシン／０．２５ｍＭ  ＩＰＴＧ中に再懸濁し、２２℃で一晩成長させた。ファージを、上清からＰＥＧ沈殿させ、ＰＢＳ／２０％グリセロール中に再懸濁し、−８０℃で保管する。２回のパニングラウンドの間のファージ増幅は、次のように行われる：対数期の中間部の大腸菌ＴＧ１細胞を、溶出したファージで感染し、１％のグルコース及び３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールで補填したＬＢ寒天（ＬＢ−ＣＧプレート）上に播く。３０℃での一晩のインキュベーション後、ＴＧ１コロニーを寒天プレートからかきとり、ＯＤ６００ｎｍが０．５に達するまで２×ＹＴ−ＣＧに植菌し、上記のとおりＶＣＳＭ１３ヘルパーファージを感染用に添加する。
【０２１０】
Ｂ．捕捉ＮＰＲＡ−Ｆｃに対するＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）での固相パニング
本実施例は、選択に使用される固相パニングを説明する。ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）抗体−ファージを、λ及びκ軽鎖と組み合わされた異なるＶＨマスター遺伝子に対応する３つのプール（プール１：ＶＨ１／５λ＆κ、プール２：ＶＨ３λ＆κ、プール３：ＶＨ２／４／６λ＆κ）に分ける。追加のプール（プール４）は、ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）抗体―ファージハイパーファージ（Ｈｙｐｅｒｐｈａｇｅ）調製物のＶＨ３λ＆κから構成される。これらのプールを個々に、マキシソープ（ｍａｘｉｓｏｒｐ）プレート（Ｆ９６  Ｍａｘｉｓｏｒｐ、ヌンク、ロチェスター、ニューヨーク州）上に抗Ｆｃ抗体（捕捉抗体）によって捕捉されたＮＰＲＡ−ＥＣＤ−Ｆｃでの３ラウンドの固相パニングに供する。詳細：マキシソーププレートのウェルを１００μｌの捕捉抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγフラグメント特異的、ディアノバ社（Ｄｉａｎｏｖａ）、ハンブルク、ドイツ、ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ）でコーティングする。各ファージプールにつき３つのウェルをコーティングする。プレートを４℃で一晩インキュベートする。翌日、ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、次いで、２００μｌのＭＴＢＳＴ（ＴＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、５％粉乳）で２時間、室温でブロッキングする。ＰＢＳで３回洗浄後、１００μｌのＮＰＲＡ−ＥＣＤ−Ｆｃ含有細胞上清を添加し、プレートを室温で４時間インキュベートする。次いで、上清を捨て、１００μｌの新鮮な上清を添加する。プレートを、一晩４℃で保管する。
【０２１１】
ファージを、上記のように４つのプールに整理する。１．７〜８．０×１０１２個のファージに対応する、元のＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）サブプール（ＶＨ１〜６）の各々からの１００μｌのファージ又はサブプールＶＨ３（ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ハイパーファージ調製物）のファージ１００μｌを使用する。２．５％の粉乳、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０、１％のヤギＩｇＧ血清（ディアノバ社）、１％のヒトＩｇＧ血清（ディアノバ社）及び２．５％のＦＣＳ（パンバイオテック社（ＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ））を含有するＴＢＳ溶液中で、ファージを前ブロッキングする。ファージの前ブロッキングは、２ｍｌの反応管中で２時間、室温にて、ローテータ上で実施する。
【０２１２】
選択過程のために、ＮＰＲＡ−ＥＣＤ−Ｆｃ上清をマキシソーププレートから取り除き、ウェルをＰＢＳで３回洗浄する。前ブロッキングしたファージを、対応するウェルに添加し、プレートを２時間、室温にて、マイクロプレート振盪機上でインキュベートする。次いで、ファージ溶液を除去し、ウェルを次の通り洗浄する：ＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）で３回、ＰＢＳＴ（洗浄の工程と工程との間は、５分間インキュベートする）で２回、ＰＢＳで３回及び最終的にＰＢＳＴ（洗浄の工程と工程との間は、５分間インキュベートする）で２回。特異的に結合したファージの溶出のため、１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０中２０ｍＭのＤＴＴを１５０μｌ添加し、試料を１０分間、室温でインキュベートする。溶出物は、対数期の大腸菌ＴＧ１培養物を感染するために使用する。感染された大腸菌を、遠心分離によって回収し、３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール及び１％のグルコースを補填したＬＢ寒天プレート上に播く。寒天プレートを、一晩３０℃でインキュベートする。翌日、コロニーをかきとり、ＯＤが０．５に達するまで成長させ、ヘルパーファージ感染へと進む。
【０２１３】
ヘルパーファージ感染：ＴＧ１細胞を、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３（〜２０の感染多重度）で、３７℃で感染する。感染された細胞を、遠心分離によって回収し、Ｆａｂ発現の誘導のため、３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン及び０．２５ｍＭのＩＰＴＧを含有する２×ＹＴ中に再懸濁する。細胞を一晩成長させ、生成されたファージを上清からポリエチレングリコール（ＰＥＧ）／ＮａＣｌで沈殿させ、ＰＢＳ中に再懸濁する。インプット及びアウトプット力価を、点滴定（ｓｐｏｔ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）によって決定する。
【０２１４】
３ラウンドの選択を、洗浄の厳密さを上げながら実施する。各ラウンドとラウンドとの間には、溶出されたファージを上記のように沈殿させる。
【０２１５】
Ｃ．ＮＰＲＡ発現細胞を使用したオルターネイティング・パニング
受容体を発現する細胞で、全細胞パニングを使用した選択がまた実施され得る。これらの選択のために、ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）抗体−ファージを、上記のように３つのプールへ分け、追加のプール（プール４）はＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）抗体−ファージハイパーファージ調製物のＶＨ３λ＆κから構成される。これらのプールを個々に、ＮＰＲＡ−ＥＣＤ−Ｆｃに対する１ラウンドの固相パニング、続いてＮＰＲＡ発現ＨＥＫ細胞に対して１ラウンド、続いてもう１ラウンドの固相パニングに供する。１回目のラウンド及び３回目のラウンドの固相パニングを、第３．４．１節中に記載されているように実施する。２回目のラウンドのパニングは、ＮＰＲＡ発現ＨＥＫ細胞に対する全細胞パニングであり、その後にｐＨ溶出が続く。
【０２１６】
より詳しくは、２回目のラウンドにおいては、全工程を４℃で、合計１ｍｌの量で実行する。バーゼン液（Ｖｅｒｓｅｎｅ）（ギブコインビトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニア州）中での脱離後、細胞をブロッキング緩衝液（５％  ＦＣＳ／０．０５％  ＮａＮ３／ＰＢＳ）中で２回洗浄し、各抗体ファージプールにつき１．０×１０７細胞に調整する。１回目のラウンドのパニングから選択されたファージを、ブロッキング緩衝液中で２時間インキュベートし、次いで前ブロッキングした細胞へと、２時間、常に動かしながら、添加する。その後、細胞をブロッキング緩衝液中で５回洗浄し、続いて１ｍｌの溶出緩衝液（０．１Ｍグリシン、０．５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ２．２）中で、１０分間、振盪せずにインキュベートする。細胞を遠心分離によって除去し、上清を、２Ｍの非緩衝Ｔｒｉｓ溶液の添加によって中和する。
【０２１７】
溶出物を、０．６〜０．８のＯＤ６００ｎｍまで成長させた大腸菌ＴＧ１培養物１５ｍｌと混合し、４５分間、３７℃でインキュベートする。遠心分離後、細菌性沈渣を、２×ＹＴ培養液中に再懸濁し、２×ＬＢ／クロラムフェニコール／グルコース寒天プレート上に播き、一晩３０℃でインキュベートする。次いで、選択されたクローンを上記のとおりプレートからかきとり、レスキューし、増幅させる。
【０２１８】
Ｄ．ＡＮＰ及びＢＮＰの存在下でのＮＰＲＡに対するオルターネイティング・パニング
選択はまた、ＮＰＲＡリガンドの存在下で実施され得る。これらの選択のためには、ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）抗体−ファージは３つのプールには分けず、λ及びκ軽鎖と組み合わされた全ての異なるＶＨマスター遺伝子を混合し、ＮＰＲＡ−ＥＣＤ−Ｆｃに対する１ラウンドの固相パニング、続いて、ＮＰＲＡ発現ＨＥＫ細胞に対する１ラウンドの、続いてもう１ラウンドの固相パニングに供する。
【０２１９】
それでもやはり、２つの異なるプールが作られ、プール１は、ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）抗体ファージの通常の調製物から構成され、プール２は、ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）抗体−ファージハイパーファージ調製物から構成される。１回目及び３回目のラウンドの固相パニングを、以下の例外を除き、上記のとおり実施する：
【０２２０】
ファージ用のブロッキング溶液は各々、３μＭのＡＮＰ及びＢＮＰを含有した。ＮＰＲＡ−Ｆｃタンパク質でのコーティングが、はるかに短い；上清は一度のみ添加し、インキュベーションは、１時間である。このインキュベーション後、ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、次いで、１００μｌのＡＮＰ／ＢＮＰ溶液（各３μＭ）を添加し、プレートを３０分間、室温で、マイクロプレート振盪機上でインキュベートする。この選択のためには、各プールにつき８個のウェルをコーティングする。
【０２２１】
２回目のラウンドのパニングは、次の例外を除き、上記のとおりＮＰＲＡ発現ＨＥＫ細胞上での全細胞パニングであり、その後にｐＨ溶出が続く：ファージ用のブロッキング溶液は各々、４００ｎＭのＡＮＰ及びＢＮＰを含有した。ＮＰＲＡでトランスフェクトされたＨＥＫ細胞を回収後、１μＭのＡＮＰを含有するブロッキング緩衝液中で再懸濁する。ブロッキングされたファージを添加する前に、細胞とＡＮＰとの混合物を、３０分間、４℃で、常に動かしながらインキュベートする。
【０２２２】
Ｅ．可溶性Ｆａｂフラグメントのサブクローニング及び発現
可溶性Ｆａｂの迅速かつ効果的な発現を促進するために、選択されたＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ファージミドのＦａｂコード化挿入断片を、発現ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）Ｘ９＿Ｆａｂ＿ＦＨ又は二価の発現ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）Ｘ９＿Ｆａｂ＿ｄＨＬＸ＿ＭＨのそれぞれにサブクローニングする。この目的のためには、選択されたクローンのプラスミドＤＮＡを、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩで消化し（それによって、Ｆａｂコード化挿入断片（ｏｍｐＡ−ＶＬＣＬ及びｐｈｏＡ−Ｆｄ）が切除される）、ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩで消化された発現ベクターにクローニングする。これらのベクターから発現されるＦａｂは、検出及び精製の両方のための、二つのＣ末端タグを保有する。それぞれ、ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）Ｘ９＿Ｆａｂ＿ＦＨの場合、タグはＦＬＡＧ（登録商標）及び６×Ｈｉｓであり；ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）Ｘ９＿Ｆａｂ＿ｄＨＬＸ＿ＭＨの場合、タグはｍｙｃ−タグ及び６×Ｈｉｓである。
【０２２３】
Ｆ．大腸菌におけるＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）Ｆａｂ抗体の微量発現
選択されたＦａｂをｐＭＯＲＰＨ（登録商標）Ｘ９＿Ｆａｂ＿ｄＨＬＸ＿ＭＨ発現ベクターにサブクローニングした後に取得されたクロラムフェニコール耐性の単一コロニーを使用して、各ウェルに１００μｌの２×ＹＴ−ＣＧ培地を含有する無菌の９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに植菌し、一晩、３７℃で成長させた。５μｌの各大腸菌ＴＧ−１培養物を、事前に各ウェルにつき３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール及び０．１％のグルコースを補填した１００μｌの２×ＹＴ培地で満たした新しい、無菌の９６ウェルマイクロタイタープレートに移した。マイクロタイタープレートを、培養物がわずかに濁って（〜２〜４時間）、ＯＤ６００ｎｍが〜０．５になるまで、３０℃で、マイクロプレート振盪機上で４００ｒｐｍで振盪してインキュベートする。
【０２２４】
これらの発現プレートの各ウェルに、３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール及び３ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を補填した２０μｌの２×ＹＴ培地を添加し（終濃度は０．５ｍＭ  ＩＰＴＧ）、マイクロタイタープレートをガス透過性のテープで封着し、一晩、３０℃で、４００ｒｐｍで振盪してインキュベートする。
【０２２５】
全細胞溶菌液（ＢＥＬ抽出物）の作出：発現プレートの各ウェルに、２．５ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含有する４０μｌのＢＥＬ緩衝液（２×ＢＢＳ／ＥＤＴＡ：２４．７ｇ／ｌホウ酸、１８．７ｇ  ＮａＣｌ／ｌ、１．４９ｇ  ＥＤＴＡ／ｌ、ｐＨ８．０）を添加し、１時間、２２℃で、マイクロタイタープレート振盪機（４００ｒｐｍ）上でインキュベートする。ＢＥＬ抽出物は、ｃＧＭＰアッセイにおける一次スクリーニングのために使用する。
【０２２６】
Ｇ．ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）Ｆａｂ抗体の大腸菌における発現及び精製
ＴＧ−１細胞においてｐＭＯＲＰＨ（登録商標）Ｘ９＿Ｆａｂ＿ＦＨによってコード化されるＦａｂフラグメントの発現を、３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補填した７５０ｍｌの２×ＹＴ培地を使用して、振盪フラスコ培養中で実行する。培養物を、３０℃で、ＯＤ６００ｎｍが０．５に達するまで振盪する。２０時間、３０℃で０．７５ｍＭのＩＰＴＧを添加することによって発現を誘導する。細胞をリゾチームを使用して破壊し、ＦａｂフラグメントをＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィ（キアゲン社、ヒルデン、ドイツ）によって単離する。タンパク質濃度を、ＵＶ分光光度法によって決定する［Ｋｒｅｂｓら，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２５４，６７−８４（２００１）］。
【０２２７】
Ｈ．ＨｕＣＡＬ（登録商標）ＩｇＧ４のクローニング
完全長免疫グロブリン（Ｉｇ）を発現させるために、重鎖可変ドメインフラグメント（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメインフラグメント（ＶＬ）を、ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）Ｘ９＿ＦＨ  Ｆａｂ発現ベクターから、ヒトＩｇＧ４．１Ｐｒｏ用のｐＭＯＲＰＨ（登録商標）＿ｈ＿Ｉｇベクター系列へとサブクローニングする。制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＭｆｅＩ、及びＢｌｐＩを使用して、ＶＨドメインフラグメントをｐＭＯＲＰＨ（登録商標）＿ｈ＿ＩｇＧ４．１Ｐｒｏへとサブクローニングする：ベクターの骨格を、ＥｃｏＲＩ／ＢｌｐＩ消化及び６４００ｂｐ断片の抽出によって作出し、一方で、ＶＨフラグメント（３５０ｂｐ）を、ＭｆｅＩ及びＢｌｐＩでの消化と、その後の精製によって生成する。ベクター及び挿入断片を、それぞれＥｃｏＲＩ及びＭｆｅＩ消化によって作出された適合性のオーバーハングを介し、ＢｌｐＩ部位を介して連結させる。それによって、ＥｃｏＲＩ及びＭｆｅＩの両方の制限部位が破壊される。ＶＬドメインフラグメントのｐＭＯＲＰＨ（登録商標）＿ｈ＿Ｉｇκへのサブクローニングを、ＥｃｏＲＶ及びＢｓｉＷＩ部位を介して実施し、一方で、ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）＿ｈ＿Ｉｇλへのサブクローニングを、ＥｃｏＲＶ及びＨｐａＩを使用して行う。
【０２２８】
Ｉ．ヒトＩｇＧの一過性発現及び精製
真核ＨＫＢ１１又はＨＥＫ２９３細胞を、等モル量のＩｇＧ重鎖及び軽鎖発現ベクターＤＮＡでトランスフェクトする。細胞培養物の上清を、トランスフェクション後３〜７日目に回収する。上清のｐＨを８．０に調整し、無菌ろ過した後、溶液を標準的なプロテインＡアフィニティクロマトグラフィに供する（ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ  ＦＦ又はＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳＵＲＥ、ＧＥヘルスケア社）。１×ダルベッコＰＢＳ（ｐＨ７．２、インビトロジェン社）への緩衝液交換を実施し、試料を無菌ろ過（０．２μｍ）する。ＩｇＧの純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける変性性の還元条件下で解析するか、又はアジレント社のＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒを使用することにより、天然の状態においてＳＥ−ＨＰＬＣによって解析する。
【実施例４】
【０２２９】
ＮＰＲＡ結合Ｆａｂのスクリーニングに使用される方法
Ａ．ＥＬＩＳＡによるＮＰＲＡ結合Ｆａｂのスクリーニング
いくつかのパニングでは、ＮＰＲＡ−Ｆｃ結合Ｆａｂを同定するための一次スクリーニング方法として、ＥＬＩＳＡが使用される。ＮＰＲＡ−Ｆｃは、ヤギ抗ヒトＩｇＧによってマイクロタイタープレートに捕捉される。関連性のないＦｃ融合タンパク質が陰性対照として、ヒトＦｃに対して作られるＦａｂを排除する。簡潔には、ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌの捕捉抗体Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｐｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−γ特異的（ディアノバ社）を、マキシソープ（登録商標）マイクロタイタープレート（ヌンク）上に、一晩、４℃でコーティングする。翌日、ウェルをＭＰＢＳＴ（ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０／５％粉乳）で１時間、マイクロプレート振盪機上でブロッキングする。ＮＰＲＡ−ＥＣＤ−Ｆｃ含有細胞上清を添加し、１時間、室温でインキュベートする。次いで、マイクロタイタープレートのウェルを、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）で３回洗浄する。必要な場合、１５０ｎＭ  ＡＮＰ／３００ｎＭ  ＢＮＰの混合物を添加し、プレートをインキュベートし、ＰＢＳＴで洗浄する。次いで、ＨｕＣＡＬ（登録商標）Ｆａｂ抗体をウェルに添加し、１時間、室温でインキュベートする。一次抗体の検出には、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）−結合型ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ディアノバ社、１０９−０５５−０９７）が適用される。ＡＰ−コンジュゲートの顕色のために、蛍光発生基質であるＡｔｔｏＰｈｏｓ（ロシュ社）を、製造者の指示に従って使用する。プレートを、ＥＬＩＳＡリーダー（テカン社）で読み取る。
【０２３０】
Ｂ．ＦＡＣＳ  によるＮＰＲＡ結合Ｆａｂのスクリーニング
ＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞を、アキュターゼ（Ａｃｃｕｔａｓｅ）（ＰＡＡラボラトリーズ社、カタログ番号Ｌ１１−００７、オーストリア）で剥離し、遠心分離（９００ｒｐｍ、４分）によって回収し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／３％  ＦＣＳ／０．０２％  ＮａＮ３）中に、１０６細胞／ｍｌの終濃度となるよう再懸濁する。１００μｌの細胞懸濁液を、９６丸底プレート（ＴＣマイクロウェル９６Ｕ、ヌンク）の各ウェルへと移す。細胞を沈渣させ（２０００ｒｐｍ、５分、４℃）、１００ｎＭのＡＮＰを含むか、又は含まない１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートする。細胞を、１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄し、沈渣させて、ＦａｂのＢＥＬ抽出物、希釈ＢＥＬ抽出物又はＦＡＣＳ緩衝液に希釈された精製抗体を含む一次抗体を含有する５０μｌの溶液中に再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートする。細胞を再度ＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄し、二次抗体（Ｒ−フィコエリトリン結合型Ａｆｆｉｐｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗ヒトＩｇＧ、ディアノバ社）を含有する５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、氷上で４５分間インキュベートする。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＦＡＣＳアレイ（ＢＤバイオサイエンシズ社）における解析のために、２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁する。
【０２３１】
Ｃ．ＨＥＫ  ＮＰＲＡ  ｃＧＭＰアッセイにおける、アゴニストＦａｂ又は増強Ｆａｂのスクリーニング
ＮＰＲＡの活性化は、ｃＧＭＰの作出をもたらし、その量を、ＨｉｔＨｕｎｔｅｒ（登録商標）ｃＧＭＰアッセイキット（ディスカバーエックス社（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）、フレモント、カリフォルニア州）を使用して決定する。使用するアッセイ緩衝液は、１ｍＭの、ホスホジエステラーゼ阻害剤である３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ、シグマ社）を含有するＰＢＳ／０．１％  ＢＳＡ／２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳである。アッセイは、プロトコルに従って実施する。検量線のために、４ｐＭと４μＭとの間の１０倍希釈のｃＧＭＰを使用する。Ｆａｂを、ＢＥＬ溶菌液、マイクロ精製された（ｍｉｃｒｏｐｕｒｉｆｉｅｄ）Ｆａｂ又は大量精製物として、ｄＨＬＸフォーマットでスクリーニングする。それ自身ではｃＧＭＰ応答を誘発しない準最適濃度のＡＮＰ（アッセイにおける終濃度は４０ｐＭ）の存在又は非存在下で、スクリーニングを実施する。
【０２３２】
スクリーニングアッセイのために、ＡＮＰをアッセイ緩衝液中で１６０ｐＭの濃度まで希釈し、７．５μｌのこの溶液を９６丸底ウェルプレート（ＴＣマイクロウェル９６Ｕ、ヌンク）のウェルにピペットで入れた。次いで、７．５μｌのＦａｂを添加する。ＮＰＲＡでトランスフェクトされたＨＥＫ細胞を回収し、アッセイ緩衝液中で洗浄し、３．３×１０５細胞毎ｍｌの終濃度となるようにアッセイ緩衝液中に再懸濁する。１５μｌの細胞懸濁液をウェルに添加し、プレートを１５分間、３７℃でインキュベートする。次いで、２０μｌの（１：１に混合した）溶解緩衝液及び抗ｃＧＭＰ抗体試薬を添加することにより、細胞を溶解する。その直後に、２０μｌのＥＤ試薬を添加し、プレートを１時間、室温でインキュベートする。次いで、２０μｌのＥＡ試薬を添加し、プレートをさらに３０分間インキュベートする。そのインキュベーションの間に、試料を、発光の測定に適切なプレート（オプティプレート−９６（ＯｐｔｉＰｌａｔｅ−９６）、パーキン・エルマー社）へ移す。次いで、３０μｌの基質溶液（ガラクトンスター（Ｇａｌａｃｔｏｎ  Ｓｔａｒ）：エメラルドＩＩ：基質希釈液  １：５：１９）を添加する。２〜３時間後に、発光をＴＥＣＡＮリーダーで測定する。
【実施例５】
【０２３３】
ヒトＮＰＲＡ特異的抗体の同定
Ａ．最初のパニング
最初の２回のパニングは、ＮＰＲＡでトランスフェクトされたＨＥＫ細胞に対して実施する全細胞パニングであり、吸着後はトランスフェクトされていないＨＥＫ細胞に対して実施する。パニングのうちの１回は、慣習的な酸性溶出で実施し、他のパニングにおいては、抗原に潜在的に結合しているＦａｂを置換し、従って対応するファージを溶出するために、ＮＰＲＡリガンドであるＡＮＰ及びＢＮＰを添加する。各パニングから、ＮＰＲＡ−ＥＣＤ−Ｆｃ結合について、ＥＬＩＳＡで１１４０候補がスクリーニングされ、ＮＰＲＡでトランスフェクトされた細胞への特異的結合について、ＦＡＣＳで２７６候補がスクリーニングされる。いずれのスクリーニングにおいても、特異的なＦａｂは発見されていない。
【０２３４】
固相パニングを固定化ＮＰＲＡ−ＥＣＤ−Ｆｃに対して実施し、ＮＰＲＡに対してオルターネイティング・パニングを実施する。Ｆａｂを、ｐＭｘ９＿ＦＨベクターへサブクローニングする。一次スクリーニングを、ＥＬＩＳＡを介してＮＰＲＡ−ＥＣＤ−Ｆｃに対して実施する。試験した１５３２のＦａｂのうち、１２３はＮＰＲＡ−ＥＣＤに特異的な結合を示す。捕捉された対照Ｆｃ抗体に対するＥＬＩＳＡによる検出の後、Ｆｃ又は捕捉抗体に結合するＦａｂを除外する。二次スクリーニングは、ＮＰＲＡでトランスフェクトされたＨＥＫ細胞への結合を調べるＦＡＣＳスキャンから構成される。
【０２３５】
１２３の一次ヒットのうち、４９は、少なくとも弱い結合（閾値はバックグラウンドの２倍）を示す。これらの４９クローンを配列決定し、６つのユニークな配列を同定した。しかしながら、これらのＦａｂは、ｃＧＭＰアッセイにおいて、リガンドの非存在下又は準最適濃度のＡＮＰの存在下のいずれにおいても、アゴニスト活性又は増強活性を示さない。
【０２３６】
ＮＰＲＡ受容体の活性立体構造に対する抗体を作出する意図を持って、活性化リガンドであるＡＮＰ及びＢＮＰを、ＮＰＲＡ−ＥＣＤ−Ｆｃに対する一連の固相パニングの間、並びにＮＰＲＡ発現細胞に対するオルターネイティング・パニングの際に添加する。
【０２３７】
選択したＦａｂプールを、ｐＭｘ９＿ｄＨＬＸ＿ＭＨベクターへサブクローニングする。一次スクリーニングを、ＮＰＲＡ−ＥＣＤ−Ｆｃに対するＥＬＩＳＡを介して、ＡＮＰの存在下で行う。試験した１５２８のＦａｂのうち、２９９が、ＡＮＰの存在下でＮＰＲＡ−ＥＣＤへの特異的結合を示す。Ｆｃ−タンパク質又は捕捉抗体に結合するＦａｂを、捕捉された対照Ｆｃ−タンパク質に対するＥＬＩＳＡによって検出して除外する。オルターネイティング・パニングに由来する１９８のヒットのうち１７７をまた、ＦＡＣＳにおいて、ＮＰＲＡでトランスフェクトされたＨＥＫ細胞への結合について試験する。これらのうち１７５が、特異的結合を示す。二次スクリーニングは、それ自身ではｃＧＭＰ応答を誘発しないＦａｂであるが、ＡＮＰ誘導性応答を上昇させるＦａｂ、の検出を可能とするため、準最適濃度のＡＮＰ（４０ｐＭ）の存在下で実施するｃＧＭＰアッセイを介して実施する。
【０２３８】
４０ｐＭでのＡＮＰそれ自身では、アッセイにおいて検出可能なｃＧＭＰ応答を刺激しない。ＦａｂのＢＥＬ抽出物を使用した。ＥＬＩＳＡでの２９９のヒットのうち、２７９をｃＧＭＰアッセイにおいて試験する。それらのいずれもが有意なアゴニスト活性を示さないが、わずかに上昇した活性を示した６９のＦａｂを、マイクロ精製後のさらなる調査のために選ぶ。マイクロ精製は、より高いＦａｂ濃度をもたらし、いくつかの試験ではＢＥＬ緩衝液がアッセイをある程度阻害することが示されているため、マイクロ精製が好ましい。６９のＦａｂのうち、さらなる調査のために、ｃＧＭＰ応答の上昇に基づいて、９つを選ぶ。９つのうち４つについて、有意なｃＧＭＰレベルの上昇が確認される。これらのクローンを配列決定し、同一であることを証明した。同定されたＦａｂを、５０６４と命名する。
【０２３９】
Ｂ．ＨｕＣａｌ  Ｇｏｌｄによって選択されたＦａｂの性質決定
ＮＰＲＡに対するいくつかの非アゴニストＦａｂが、選択されてＩｇＧ１フォーマットに変換された場合に、１０ｎＭと２０ｎＭとの間のＥＣ５０で、ことなる飽和レベルで、ＨＥＫ  ｈＮＰＲＡ細胞に結合する。しかしながら、これらの結合剤のいずれもが、一価（Ｆａｂ）又は二価（Ｆａｂ−ｄＨＬＸ）のフォーマットでは、準最適濃度のＡＮＰの非存在又は存在下で、アゴニスト活性も増強活性も示さない。
【０２４０】
これに対して、結合剤５０６４は、一価（Ｆａｂ）及び二価（Ｆａｂ−ｄＨＬＸ）のフォーマットの両方で、ＡＮＰ又はＢＮＰの存在下でのみ、ＮＰＲＡでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞への特異的かつ濃度依存的な結合を示す、すなわち、この結合剤は、受容体−リガンド複合体を特異的に認識する（図１）。Ｆａｂ−ｄＨＬＸが、Ｆａｂよりも強い結合を示し、二価性に起因するアビディティの増大が示されている。一価及び二価の両方の５０６４は、ＢＮＰ結合受容体と比較して、ＡＮＰ結合受容体に対して、より強く結合することが明らかとなり、これはＡＮＰがＮＰＲＡに対してより高い親和性をもつことに関連しているかもしれない。より幅広い濃度範囲にわたる５０６４  Ｆａｂ、Ｆａｂ−ｄＨＬＸ及びＩｇＧ１の用量設定は、細胞結合のＥＣ５０値の推定を可能とする。５０６４  Ｆａｂは、ＡＮＰ及びＢＮＰ結合ＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞に対し、それぞれ少なくとも〜１００ｎＭ及び〜３００ｎＭのＥＣ５０を示す。対応する二価抗体のフォーマットであるＦａｂ−ｄＨＬＸ及びＩｇＧ１は、Ｆａｂよりも約５０から１００倍強い結合を示した（図２Ａ−２Ｃ）。
【０２４１】
結合剤５０６４の特異性をさらに評価するため、組換えＮＰＲＡ−Ｆｃでの結合研究を実施する。細胞性ＮＰＲＡで以前に観察されているように、抗体は、リガンドであるＡＮＰ又はＢＮＡを負荷された場合にのみ、ＮＰＲＡ−Ｆｃを結合した（図３）。５０６４が、ペプチドリガンドのみに結合し、受容体には結合しない可能性があるので、遊離リガンドへの抗体の結合を調査する。この目的のために、ビオチン標識ＡＮＰを、ストレプトアビジンビーズに結合させ、抗体の結合を決定する。ＡＮＰに対する陽性対照抗体が有意な結合を示す一方で、５０６４  Ｆａｂ−ｄＨＬＸは、全く結合を示さない（図４）。別の実験において、ＡＮＰを負荷したＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞に添加される前に、５０６４  Ｆａｂを溶液中で過剰量のＡＮＰとプレインキュベートする（図５）。この設定において、過剰量のＡＮＰとの競合は、５０６４のＡＮＰ−ＮＰＲＡ複合体への結合には影響がない。まとめると、これらの知見は、５０６４が、活性化されたリガンド−受容体複合体を特異的に認識するが、受容体単独又はナトリウム利尿ペプチド単独のいずれとも相互作用しないことを示す。
【０２４２】
結合剤をＦａｂ−ｄＨＬＸのフォーマットで、ＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞と共に、４０ｐＭのＡＮＰの非存在又は存在下でインキュベートし、ＮＰＲＡ依存的ｃＧＭＰ生成を測定することによって、ＮＰＲＡのグアニリルシクラーゼ活性に対する５０６４の効果を評価する。ＡＮＰの非存在下では、１００μｇ／ｍｌまでの５０６４の濃度（〜９００ｎＭ）では、ｃＧＭＰ応答はベースラインを超えて上昇することはなかった。４０ｐＭのＡＮＰの存在下では、陰性対照のＦａｂ−ｄＨＬＸがあってもなくても、最小限のｃＧＭＰシグナルが観察される。しかしながら、４０ｐＭのＡＮＰと、５０μｇ／ｍｌ（〜４５０ｎＭ）を超える濃度の５０６４  Ｆａｂ−ｄＨＬＸと、の存在下では、ｃＧＭＰレベルは有意に上昇する（図６）。５０６４  Ｆａｂ、Ｆａｂ−ｄＨＬＸ及びＩｇＧ１を、それ自身ではｃＧＭＰを誘導するのに不十分である４０ｎＭのＢＮＰの存在下で、種々の濃度で試験した場合に、同様の効果が観察される（図７）。５０６４  ＩｇＧは、ＮＰＲＡ依存的ｃＧＭＰ生成を、１０と１００ｎＭとの間の濃度で亢進し、１００ｎＭを超える濃度でｃＧＭＰシグナルを増加させるＦａｂ−ｄＨＬＸが、これに続いた。一価のＦａｂが、最も弱い効果を示し、これは最も高い濃度の４００ｎＭでのみ観察することができた。
【０２４３】
ＮＰＲＡの活性化におけるＡＮＰ及びＢＮＰの効力に対する５０６４の効果をさらに評価するため、２０μｇ／ｍｌの５０６４又は陰性対照のＦａｂもしくはＦａｂ−ｄＨＬＸを、増加する濃度のＡＮＰ又はＢＮＰの存在下でＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞に添加し、ｃＧＭＰ生成を測定する。５０６４  Ｆａｂ又はＦａｂ−ｄＨＬＸのいずれかの存在下では、ＡＮＰ及びＢＮＰの効力は、用量応答曲線の左側へのシフトによって見られるように、２〜３倍増加した（図８Ａ及び図８Ｂ）。５０６４は、ナトリウム利尿ペプチドの準最大濃度でのみ、ＡＮＰ及びＢＮＰ媒介性のＮＰＲＡ活性化を増強した。飽和したリガンドレベルでは、ｃＧＭＰ生成におけるさらなる増加は観察されない。５０６４は唯一、ナトリウム利尿ペプチドに対するＮＰＲＡ依存的ｃＧＭＰ応答を亢進する。ＮＰＲＡに結合する能力について選択された他のＨｕＣＡＬ（登録商標）抗体は、ｃＧＭＰ生成に対して全く効果がないか、又はｃＧＭＰ生成を阻害する（図１０）。
【実施例６】
【０２４４】
親和性成熟を通しての抗ＮＰＲＡ結合剤５０６４の最適化
これらのデータは全体で、５０６４が活性化ＮＰＲＡ受容体を結合して活性化ＮＰＲＡ受容体を安定化し、それによってナトリウム利尿ペプチドの活性を亢進する、という仮説を支持する。しかしながら、５０６４が、この活性を示す唯一の結合剤である。この結合剤は、一価のフォーマットでは中程度の親和性（ＥＣ５０がおよそ１００ｎＭ）しか有さないため、この結合剤の生物学的活性を潜在的に増加させるために、その親和性をさらに最適化する。
【０２４５】
Ａ．親和性成熟ライブラリーの作出
抗ＮＰＲＡ  ５０６４  Ｆａｂの親和性及び生物学的活性を増加させるため、Ｌ−ＣＤＲ３及びＨＣＤＲ２領域を、トリヌクレオチド指示型突然変異誘発（ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｖｉｒｎｅｋａｓら，１９９４）を使用したカセット変異導入により、平行して最適化し、一方で、フレームワーク領域は、定常に保つ。親和性成熟のためのクローニングに先立って、親Ｆａｂフラグメントを、対応する発現ベクター（ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）ｘ９＿ＦＨ）からＣｙｓＤｉｓｐｌａｙ（登録商標）ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２５＿ＬＨＣに、ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩを介して転移させる。ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２５＿ＬＨＣは、ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ディスプレイベクターであるｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２３＿ＬＨＣから、Ｈ−ＣＤＲ２最適化のためのライブラリークローニングを妨げる一つのＢｓｓＨＩＩ部位の除去によって作られる。Ｌ−ＣＤＲ３を最適化するためには、Ｌ−ＣＤＲ３及び親Ｆａｂの軽鎖の定常領域をＢｂｓＩ／ＳｐｈＩによって除去し、定常ドメインと併せて、多様化されたＬ−ＣＤＲ３のレパートリーによって置換する。第二のライブラリーにおいて、Ｈ−ＣＤＲ２（ＸｈｏＩ／ＢｓｓＨＩＩ）を多様化させ、一方で連結フレームワーク領域は定常に保つ。クローニング効率をモニタリングするために、多様化されたＨ−ＣＤＲ２カセットをクローニングして入れる前に、親Ｈ−ＣＤＲ２をダミーと交換する。二つの異なるライブラリーのライゲーション混合物を、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ細胞（インビトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニア州、米国）中にエレクトロポレーションし、５×１０８〜８×１０８個の独立コロニーを得た。このライブラリーサイズは、理論上の多様性の網羅を保証した。ライブラリーの増幅は、以前に記述されているように実施する（Ｒａｕｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒら，２００３）。品質管理のために、単一のクローンを無作為に選び出し、配列決定する（セクイサーブ社（ＳｅｑｕｉＳｅｒｖｅ）、ファターシュテッテン、ドイツ）。
【０２４６】
Ｂ．ＮＰＲＡ−ＨＥＫ細胞に対する全細胞パニング
上記成熟ライブラリーに由来するファージ（それぞれ、ＨＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３成熟）を個々に、ＮＰＲＡでトランスフェクトされた（ＮＰＲＡ−ｔｒａｎｓｅｃｔｅｄ）ＨＥＫ細胞に対する３ラウンドの全細胞パニングに供した。三つの異なる条件を適用する：条件１は、ＡＮＰ／ＢＮＰの存在下での全細胞パニングである。条件２は、親結合剤５０６４による競合下の、ＡＮＰ／ＢＮＰの存在下での全細胞パニングである。条件３は、ＡＮＰ／ＢＮＰの非存在下での全細胞パニングである。従って、６回の全細胞パニングが実施される。
【０２４７】
全工程は、４℃で実行される。アキュターゼ（ＰＡＡラボラトリーズ社、Ｌ１１−００７）での剥離後、細胞をカウントし、回収し、１ラウンド目のため、各パニングにつき５×１０６細胞に調整する。２ラウンド目は、各パニングにつき１×１０６細胞を使用し、３ラウンド目は、各パニングにつき５×１０５細胞を使用する。細胞を、１．５ｍｌのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ／５％  ＦＣＳ／０．０５％  ＮａＮ３）中に再懸濁し、３０分間、ローテータ上でインキュベートする。パニング条件１及び２では、このインキュベーション工程において、ＡＮＰ及びＢＮＰを各１００ｎＭの終濃度まで添加する。細胞を、遠心分離（２分、２０００ｒｐｍ）によって回収し、前ブロッキングされたファージを含有する溶液中に注意深く再懸濁する。その工程の前に、各パニングにつき、８３μｌのファージ（ＨＣＤＲ２成熟ライブラリーについては、５．１×１０１１個に対応し、ＬＣＤＲ３成熟ライブラリーについては、９．８×１０１１個に対応する）を９１７μｌのブロッキング緩衝液と混合することによって前ブロッキングし、２時間、ローテータ上でインキュベートしている。細胞と前ブロッキングされたファージとのインキュベーションの間に、ＡＮＰ及びＢＮＰを、条件１及び２の各々につき、１００ｎＭの終濃度まで添加する。
【０２４８】
条件２について、細胞及びファージをすでに１．５時間インキュベートして初めて、親Ｆａｂ  ５０６４を２００ｎＭの濃度まで添加する。全ての条件について、インキュベーションの合計時間は２時間である。次いで、細胞を遠心分離（２分、２０００ｒｐｍ）によって回収し、非特異的に結合したファージを、ローテータ上で１．５ｍｌのブロッキング緩衝液でインキュベートすることよって洗浄して落とす。洗浄工程は、次の通り実施する：１ラウンド目において５×１０分、２ラウンド目において５×２０分、３ラウンド目において６×２０分。条件２については、各洗浄工程において、親Ｆａｂ  ５０６４を２００ｎＭの終濃度まで添加する。特異的に結合したファージを、細胞から溶出し、その後の工程を上記のとおり実行する。
【０２４９】
Ｃ．ビーズに捕捉されたＮＰＲＡ−Ｆｃに対するパニング
三つの異なる条件を適用する：条件１及び２は、各々３０ｎＭのＡＮＰ及びＢＮＰの存在下でのパニングである。条件３は、リガンドの非存在下でのパニングである。異なる量のＮＰＲＡ−Ｆｃでコーティングされたビーズを使用することにより、又は異なる濃度のＮＰＲＡ−ＥＣＤ−Ｆｃ含有細胞上清を使用することにより、パニングの条件に依存して抗原濃度を変動させる。使用するる全てのプレスチック管を、それらを１．５ｍｌのＰＢＳ／５％  ＢＳＡで満たし、４℃で一晩、ローテータ上でインキュベートすることによって、前ブロッキングする。
【０２５０】
ＮＰＲＡ−Ｆｃタンパク質を、ダイナビーズ（登録商標）（電磁気Ｍ−２８０ストレプトアビジンビーズ、１０ｍｇ／ｍｌ、ダイナル社（Ｄｙｎａｌ））上に、ビオチン化抗Ｆｃ抗体（マウス抗ヒトＦｃ、ケミコン社、＃ＣＢＬ１０２、ＰＣ基においてビオチン化されている）を介して捕捉する。インキュベーションの工程と工程との間に、ビーズを１．５ｍｌのＢｖ緩衝液（ＰＢＳ／０．０５％  ＢＳＡ／０．０２％  Ｔｗｅｅｎ）で洗浄し、次いで磁石を使用して回収する。
【０２５１】
ビーズは以下のように調製する：６０μｌのビーズを１４３７μｌのＢｖ緩衝液及び２．０５μｌのビオチン化ＣＢＬ１０２と混合し、混合物を３０分間、２２℃にて、ローテータ上でインキュベートする。ビーズを洗浄し、１．５ｍｌのＮＰＲＡ−ＥＣＤ−Ｆｃ含有細胞上清を添加し、混合物を９０分間、２２℃にて、ローテータ上でインキュベートする。次いで、ビーズを再度洗浄し、１ｍｌのＢｖ緩衝液に再懸濁し、次いで、各々が０．５ｍｌのＮＰＲＡ−Ｆｃでコーティングされたビーズを懸濁した状態で含有する２つの新しい管に分ける。一方の管には、ＡＮＰとＢＮＰとを各々３０ｎＭの終濃度まで添加し、両方の管を３０分間、２２℃にて、ローテータ上でインキュベートする。両試料を、Ｂｖ緩衝液中で再度洗浄し、０．７５ｍｌのＢｖ緩衝液中に再懸濁する。その結果、ビーズはすぐに使用できるようになる。ビーズを、パニングの各ラウンドのたび、新しくコーティングする。
【０２５２】
ビーズのコーティングと同時に、各パニングにつき８３μｌのファージ（ＨＣＤＲ２成熟ライブラリーについては、５．１×１０１１個に対応し、ＬＣＤＲ３成熟ライブラリーについては、９．８×１０１１個に対応する）を、５μｌのＩｇ血清マウス（マウスγグロブリン、ディアノバ社、０１５−０００−００２）及び７１２μｌのＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ／５％  ＢＳＡと混合し、２時間、ローテータ上でインキュベートすることによって、前ブロッキングする。
【０２５３】
ＡＮＰとＢＮＰとで処置されたビーズを、パニング条件１及び２で使用する。リガンドなしのビーズを、パニング条件３で使用する。１回目のラウンドでは、２００μｌのビーズの「すぐに使用できる」調製物を使用する。
【０２５４】
選択では、２００μｌのビーズ（１回目のラウンド）を、８００μｌのブロッキングされたファージと混合し、２時間、ローテータ上でインキュベートする。洗浄工程は、次のとおりである：ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ中で５×急速な洗浄、ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ中、ローテータ上で３×１５分、ＰＢＳ中で４×急速及びＰＢＳ中、ローテータ上で３×５分。洗浄後、ビーズを新しい管へと移す。
【０２５５】
溶出では、ビーズを回収し、３００μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０中２０ｍＭ  ＤＴＴ中に再懸濁し、１０分間インキュベートする。次いで、ビーズを回収し、ファージを含有する上清を使用して、上記のとおり大腸菌ＴＧ１を感染する。
【０２５６】
親和性成熟後に、細胞結合ＮＰＲＡに対する向上した結合をもつＦａｂクローンを同定するために、改良ＦＡＣＳスクリーニング手順を使用する：Ｆａｂ発現細菌性クローンのＢＥＬ抽出物（全細胞溶菌液）を、特異的細胞結合について、ＦＡＣＳを介してスクリーニングする。ＢＥＬ抽出物を、ＦＡＣＳ緩衝液中で１：５０に希釈し、標準的なプロトコルに従ってＦＡＣＳスクリーニングに使用する。その希釈率が選ばれるのは、その濃度では親Ｆａｂの結合がほとんど検出できないためである。親対照で取得された値を有意に超えるＦＡＣＳシグナルを示すクローンを、さらなる性質決定のために選ぶ。
【０２５７】
Ｄ．親和性成熟Ｆａｂの性質決定
細胞及びＮＰＲＡ−Ｆｃタンパク質に対するパニングの両方から、１００を超えるヒットが同定され、これらの結合剤のうちの９４をマイクロ精製し、細胞結合アッセイ及びｃＧＭＰアッセイにおいて、さらに解析する。９４のＦａｂのうち、２１は、細胞結合アッセイ及び／又はｃＧＭＰアッセイにおいて優れた能力を示す。これらの２１の結合剤の配列決定によって、１４のユニークなクローンが明らかになり、それらを精製する。
【０２５８】
１４のＦａｂのうちの三つは、細胞パニングに由来し、１１は、ＮＰＲＡ−Ｆｃに対するパニングにおいて選択される。九つのＦａｂは、Ｈ−ＣＤＲ２成熟であり、五つのＦａｂは、Ｌ−ＣＤＲ３最適化されている。それらの全ては、ＡＮＰの存在下で行われたパニングに由来する。
【０２５９】
ｍｇのスケールで精製した十四の選択されたＦａｂを、細胞結合アッセイ及びｃＧＭＡアッセイにおいて解析する。Ｆａｂを、１００ｎＭ  ＡＮＰで負荷したＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞への結合について、種々の濃度で試験する（図１０Ａ）。この研究において、Ｆａｂ  ５５０４が最も強い結合を示し、それよりはわずかに弱い親和性であるが、それでもやはり低いナノモル濃度の範囲にあるＦａｂ  ５５０２、５５０７、５５１３、５５１４が続いた。興味深いことに、五つのＬ−ＣＤＲ３成熟Ｆａｂは、ヒトＮＰＲＡでトランスフェクトされた細胞に最も強い結合を示し、一方で、Ｈ−ＣＤＲ２成熟Ｆａｂはほとんどの場合において、より弱い結合を示す。
【０２６０】
Ｆａｂの増強活性を、準最適濃度（４００ｐＭ）のＡＮＰの存在下でのＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞におけるｃＧＭＰ生成を測定することによって評価する（図１１）。このリガンド濃度は、有意であるが完全ではないｃＧＭＰ応答をそれ自身で誘導するのに十分である。陰性対照Ｆａｂ  ３２０７と比較して、親Ｆａｂ  ５０６４はわずかに上昇したｃＧＭＰシグナルを示す。少なくともいくつかの成熟Ｆａｂ（５５０２、５５０４、５５０７、５５１１、５５１３、５５１４）は、これらの実験条件下では、５０６４よりも高いｃＧＭＰレベルを誘導するようにみえる。細胞結合のデータ及びｃＧＭＰ応答の解析に基づいて、Ｌ−ＣＤＲ３成熟Ｆａｂ  ５５０２、５５０４、５５０７、５５１３、５５１４及びＨ−ＣＤＲ２成熟Ｆａｂ  ５５１１を、より詳細に解析する。
【０２６１】
この研究においては、増加する濃度のＡＮＰを、４００ｎＭの選択されたＦａｂの存在下でＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞に添加し、ｃＧＭＰ生成をモニタリングする（図１２Ａ）。以前に見られたように、親Ｆａｂ  ５０６４はＡＮＰのＥＣ５０を、３ｎＭ（陰性対照Ｆａｂの存在下で）から１ｎＭへと減少させた。成熟Ｆａｂのうちの二つである５５０２及び５５０４は、ＡＮＰのＥＣ５０を、０．３ｎＭまでさらに低くシフトさせることができ、したがって、ＡＮＰの効力を１０倍に亢進する。三つの他の成熟Ｆａｂである５５０７、５５１３、５５１４は、中間の活性を示し、０．５〜０．６ｎＭのＡＮＰのＥＣ５０値をもたらす。ＢＮＰの用量応答に対するＦａｂの影響もまた解析する。ＡＮＰに対する影響よりははっきりしないもの、成熟Ｆａｂは、ＢＮＰの効力を明らかに亢進する。親Ｆａｂは、ＢＮＰのＥＣ５０を２分の一にしか低減しない一方、成熟Ｆａｂでは、陰性対照Ｆａｂの存在下における９０ｎＭのＥＣ５０と比較して、Ｆａｂ  ５５０４で５分の一の１８ｎＭへの減少を示す（図１２Ｂ）。
【０２６２】
全体で、データは、５０６４の親和性成熟が、得られたＦａｂのＮＰＲＡ−リガンド複合体への結合の上昇、並びにＮＰＲＡ過剰発現細胞におけるＡＮＰ及びＢＮＰ依存的ｃＧＭＰ生成増強の上昇をもたらす、という証拠を提供する。
【０２６３】
結合剤５５０２、５５０３、５５０４、５５０７、５５０８、５５１１、５５１３、５５１４を、ＩｇＧ４−Ｐｒｏフォーマットに変換する。結果として生じる抗体のエフェクター機能を最小化するために、ＩｇＧ４サブタイプを選択し、プロリン２２８からセリンへの置換変異を導入して、Ｆａｂアーム交換を抑止する（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｎｅｕｔ  Ｋｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１７：１５５４，２００７）。最も有望な候補は、軽鎖における変化を有するものたち（５５０２、５５０４、５５０７、５５１３、５５１４）である。これらのＩｇＧの軽鎖は、ｃＧＭＰアッセイにおいて５５１１  Ｆａｂが親５０６４と比較していくらか上昇した活性を示していたことから、成熟ＩｇＧ  ５５１１の重鎖と交差結合している（図１１）。
【０２６４】
親和性成熟及び交差結合ＩｇＧ４＿Ｐｒｏ抗体を、１００ｎＭのＡＮＰで負荷したＨＥＫ＿ＮＰＲＡへの結合について、ＦＡＣＳによって種々の濃度で解析する（図１３Ａ及び図１３Ｂ）。親ＩｇＧ４  Ｐｒｏ  ５０６４は、１．６ｎＭの濃度で最大半量の結合を示す一方で、成熟抗体は、おそらくアッセイの感度限界である０．５ｎＭまで下がったＥＣ５０値まで、結合の増加を示した。
【０２６５】
選択されたＩｇＧ４＿Ｐｒｏ抗体を、ｃＧＭＰアッセイにおいてＡＮＰ及びＢＮＰの効力を増加させる選択されたＩｇＧ４＿Ｐｒｏ抗体の能力についてもまた解析する。２００ｎＭの固定濃度の抗体を、種々の濃度のＡＮＰ又はＢＮＰと共にＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞に投与する。図１４Ａ及び１４Ｂ並びに１５Ａ及び１５Ｂは、例証的なｃＧＭＰアッセイを示す。成熟抗体は、親抗体５０６４と比較して、ＡＮＰ及びＢＮＰ依存的ｃＧＭＰ生成を、さらに増強する。５５０２、５５０４、５５９１及び５５９２が、最も大きなシフトを引き起こし、ＡＮＰの効力を最大１０倍まで増加させた。
【０２６６】
特性を決定した抗体が、ＮＰＲＡに選択性であるかを決定するため、関連するナトリウム利尿ペプチド受容体であるＮＰＲＢ及びＮＰＲＣへの結合を、ＦＡＣＳによって評価する。成熟（図１６Ａ）及び交差結合（図１６Ｂ）抗体が、ＡＮＰと共にインキュベートしたＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞に結合する一方で、ＨＥＫ  ＮＰＲＢ細胞のリガンドであるＣＮＰの存在又は非存在下において、ＨＥＫ  ＮＰＲＢ細胞への結合は観察されない。同様に、ＡＮＰ又はＢＮＰの存在又は非存在下において、ＨＥＫ  ＮＰＲＣ細胞への結合は見られない（図１７）。
【実施例７】
【０２６７】
ＮＰＲＡ−ナトリウム利尿ペプチド複合体への抗体結合親和性の決定
Ａ．定量的ＦＡＣＳ解析による結合親和性の決定
そのペプチドリガンドと複合体化したＮＰＲＡに対する、選択された抗体の結合親和性を、いくつかの異なる技術を利用して定量化する。一つのアッセイにおいて、１００ｎＭのＡＮＰの存在下でのＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞への結合を、上に概説したように、ＦＡＣＳ解析によって評価する。親ＩｇＧ４＿Ｐｒｏ  ５０６４は、最大半量の結合を、１．６ｎＭの濃度で示し、一方、成熟抗体及び交差結合抗体は、結合の増加を示し、ＥＣ５０値はｎＭの領域にあった。しかしながら、これらの値は、このアッセイの感度限界であると考えられる。
【０２６８】
表１：１００ｎＭのＡＮＰの存在下における、ＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞へのＩｇＧ４＿Ｐｒｏ抗体結合のＦＡＣＳ解析
【０２６９】
【表７】
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【０２７０】
Ｂ．表面プラズモン共鳴法（ビアコア社）による結合親和性の決定
別のアッセイにおいて、精製されたヒトＮＰＲＡ−Ｆｃ融合タンパク質コンストラクトを使用して、抗体の親和性定数及び動力学定数を決定するための表面プラズモン共鳴（ビアコア社）アッセイを開発する。１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５中のＮＰＲＡ−Ｆｃを、アミンカップリングを通して、ビアコア３０００装置におけるＣＭ５チップ上に１０００ＲＵの密度で固定化する（ＧＥヘルスケア社、ビアコア社）。１００ｎＭのヒトＡＮＰ、ＢＮＰ又はウロジラチンを補填した１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中、０．５〜７ｎＭの範囲にわたって増加する濃度の抗ＮＰＲＡ抗体を、２０μｌ／分の流量で１０分間フローセル中に注入し、その後、１５分間の解離期間をとる。各実験から収集した会合及び解離データを、同時に適合させた会合（ｋａ）速度及び解離（ｋｄ）速度に、包括的に適合させる。下の表中に要約されているように、動力学的結合データは、相互作用が高親和性であり、１０ｐＭ〜２００ｐＭの範囲にわたり、かつ抗体が、その三つの天然リガンド全ての存在下で、ＮＰＲＡと結合することを実証する。候補は、ＡＮＰの存在下において、ＢＮＰ及びウロジラチンの存在下におけるよりも高い親和性を有する。抗ＮＰＲＡ  ５５９２は、ＡＮＰ、ＢＮＰ又はウロジラチンの存在下で、５５０２及び５５９２よりも高い親和性を有する。データは、１：１結合モデルに当てはまり、これは、一つの二価抗体が、単一の二量体ＮＰＲＡ細胞外ドメインに結合することを示唆する。５５９１及び５５９２  Ｆａｂは、ＡＮＰの存在下において、より低い親和性で、またこれらも１：１の化学量論で、ＮＰＲＡ−Ｆｃに結合する。
【０２７１】
表２Ａ：ＡＮＰの存在下におけるＦａｂ又はＩｇＧとＮＰＲＡ−Ｆｃとの間の相互作用の表面プラズモン共鳴解析の親和性データ及び動力学的データ
【０２７２】
【表８】
2012510295.tif 000009
【０２７３】
表２Ｂ：ＢＮＰの存在下におけるＩｇＧとＮＰＲＡ−Ｆｃとの間の相互作用の表面プラズモン共鳴解析の親和性データ及び動力学的データ
【０２７４】
【表９】
2012510295.tif 000010
【０２７５】
表２Ｃ：ウロジラチンの存在下におけるＩｇＧとＮＰＲＡ−Ｆｃとの間の相互作用の表面プラズモン共鳴解析の親和性データ及び動力学的データ
【０２７６】
【表１０】
2012510295.tif 000011
【０２７７】
Ｃ．ＫｉｎＥｘＡによる結合親和性の決定
細胞結合型完全長ＮＰＲＡに対する抗ＮＰＲＡ抗体の親和性を確認するため、全細胞結合アッセイを、ＫｉｎＥｘＡ技術を用いて行う。０．５％のウシ血清アルブミンを含む冷ハンクス平衡塩類溶液中、２×１０７細胞／ｍｌ〜９．７×１０３細胞／ｍｌにわたる濃度のＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞を、１ｎＭのＡＮＰと、７５ｐＭ又は２００ｐＭのいずれかの５５９１  ＩｇＧとの存在下で、１時間、４℃でインキュベートする。細胞を沈渣させ、上清をＫｉｎＥｘＡ装置（サピジン・インストゥルメンツ社（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））上にロードし、ここで、遊離ＩｇＧは、マウス抗ヒトκ軽鎖（サザン・バイオテック社（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））を使用して、ビーズ上に捕捉され、ヤギ抗ヒトＩｇＧカップルを使用して、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（インビトロジェン社）で定量される。この方法論を使用して、５５９１抗体結合の見かけ上のＫｄは、５９０ｐＭであると決定される（図１８）。この値は、ＮＰＲＡ細胞外ドメイン−Ｆｃ融合タンパク質への表面プラズモン共鳴結合を通して取得されたＫｄよりも約２０倍高い。
【実施例８】
【０２７８】
抗体でのＮＰＲＡ媒介性ｃＧＭＰ応答の増強
ＮＰＲＡへのペプチドリガンドの結合は、この受容体に関連するグアニリルシクラーゼ活性の活性化をもたらす。リガンドに応答した、ｃＧＭＰ生成に対する抗体の影響を、懸濁状のＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞において測定する。細胞を、１０μｇ／ｍｌのＮＰＲＡ特異的ＩｇＧ＿Ｐｒｏ抗体又は対照３２０７抗体及び増加する濃度のＡＮＰ又はＢＮＰの存在下で、１５分間インキュベートする。ｃＧＭＰレベルを、発光の読み取りを含む競合免疫測定法（ヒットハンター（ＨｉｔＨｕｎｔｅｒ）キット、ディスカバーエックス社、フレモント、カリフォルニア州））を使用して定量する。ｃＧＭＰ生成の用量応答曲線を、レーベンバーグ・マルカートアルゴリズムを使用してＸＬｆｉｔ４．２データ解析ソフトウェア（ＩＤビジネスソリューションズ社、ギルフォード、英国）に適合させた４パラメータのロジスティック方程式で作出し、ＥＣ５０を算出する。ＥＣ５０における倍数のシフトは、抗ＮＰＲＡ抗体の存在下で得られたＥＣ５０と、等濃度の対照抗体３２０７の存在下で得られたＥＣ５０との間の比率を表わす。
【０２７９】
５５０２、５５９１及び５５９２は再現性よく、ＡＮＰ又はＢＮＰの用量応答曲線を、図１４及び１５中に図示されているように、左にシフトさせる。シフトの規模が表３に列挙してあり、ＡＮＰで最大７倍〜ＢＮＰで最大４４倍の範囲にわたる。範囲は、各条件下で行った、少なくとも３回の実験の、個々の実験を反映している。抗体の存在下における、ＢＮＰでのＮＰＲＡの活性化の際に観察された増加した倍数のシフトはおそらく、このＮＰＲＡペプチドリガンドのより弱い親和性の結果である。
【０２８０】
表３：ＡＮＰ又はＢＮＰで処置されたＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞における抗体媒介性ｃＧＭＰ応答の増強
【０２８１】
【表１１】
2012510295.tif 000012
【０２８２】
抗体の影響は、低いｐＭ領域にあるナトリウム利尿ペプチドの準最適レベルで最も著しく、これは、心不全の患者において観察されたＡＮＰ及びＢＮＰの濃度と一致している。類似の規模のシフトが、ＮＰＲＡを内在的に発現する、ＡＮＰで処置されたＨｅＬａ細胞において見られる。
【０２８３】
抗体の生物学的効力を測定するために、これらの試薬を、準最適濃度のＡＮＰ（２００ｐｍ）の存在下でＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞と共にインキュベートし、ｃＧＭＰ生成をモニタリングする。抗体は用量応答性であり、ＥＣ５０値が約１ｎＭであり、親抗体５０６４よりも、約１０倍強力である（表４）。
【０２８４】
表４：２００ｐＭのＡＮＰの存在下におけるＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞に対する抗ＮＰＲＡ抗体の用量設定
【０２８５】
【表１２】
2012510295.tif 000013
【実施例９】
【０２８６】
ＮＰＲＡ媒介性ｃＧＭＰ応答の５５９１による延長
低いリガンド濃度で受容体の活性化を亢進することに加え、抗ＮＰＲＡ抗体はまた、受容体シグナル伝達のタイムフレームを延長させるようである。このことは、ＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞におけるＮＰＲＡ依存的ｃＧＭＰ生成の動力学をモニタリングすることによって実証される（図１９）。細胞を、準最適（２００ｐＭ）又は過剰（１μＭ）のいずれかの濃度のＡＮＰと共に、１０μｇ／ｍｌの５５９１の非存在又は存在下でインキュベートし、ｃＧＭＰ生成を、上に詳述したとおり、一定期間にわたって測定する。
【０２８７】
準最適レベルのＡＮＰでは、５５９１は、この実験の２時間のタイムフレームにわたって、ｃＧＭＰ生成を進行的に亢進する。受容体が既に最大限に活性化されていることが予測される高濃度のＡＮＰの存在下では、抗体は影響を有さない。
【実施例１０】
【０２８８】
抗体結合は受容体−リガンド複合体を安定化する
ナトリウム利尿ペプチドと、その受容体との相互作用に対する抗体の影響を直接モニタリングするために、放射性標識ＡＮＰのＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞への結合を調査する。０．１％のウシ血清アルブミン（シグマアルドリッチ社）を含むＤＭＥＭ（インビトロジェン−ギブコ社）中２×１０６細胞／ｍｌのＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞１００μｌを、０．２％のポリエチレンイミン（シグマアルドリッチ社）でコートしたマルチスクリーンＨＴＳ  ＦＣ１．２ｍｍＧ１  ９６ウェルプレート（ミリポア社、ビレリカ、マサチューセッツ州）の各ウェルに添加する。５５０２、５５０４、親抗体５０６４又は対照抗体３２０７を、１０μｇ／ｍｌの終濃度で添加する。次いで、１００μｌ／ウェルの、種々の濃度の１２５Ｉ  ＡＮＰ（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンシズ社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）を適正なウェルに添加し、プレートを室温で、回転振盪機上で２時間インキュベートする。細胞を、真空マニフォールドを使用して、０．１％のＢＳＡを含む２００μｌ／ウェルの非放射性のＤＭＥＭで４回洗浄し、続いて、２５ｍＭのＨＥＰＥＳと０．１％のＢＳＡとを補填したＰＢＳで１回洗浄する。プレートを一晩風乾し、各プレートの底面を不透明な白色のプレートシーラーで封着し、３０μＬのマイクロシント４０（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ  ４０）を各ウェルに添加する。プレートの頂部を、トップカウント・プレート・シーラー（ＴｏｐＣｏｕｎｔ  Ｐｌａｔｅ  Ｓｅａｌｅｒ）で封着し、それらを、トップカウントマイクロプレートシンチレーションカウンタ（パーキン・エルマー社）で読み取る。細胞と１２５Ｉ  ＡＮＰとを２００倍過剰の非放射性ＡＮＰの存在下でインキュベートすることによって、非特異的結合を評価する。
【０２８９】
初期の研究は、このクラスの抗体が対照抗体３２０７と比較して、１２５Ｉ−ＡＮＰのＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞への結合を有意に亢進したことを明らかにする（図２０）。亢進された結合は、２００ｐＭ未満のＡＮＰ濃度（心不全患者において観察されるＡＮＰレベルの範囲内）においても明白である。見られた１２５Ｉ−ＡＮＰ結合の増加の観察の一つの可能な説明は、抗体が、受容体からのＡＮＰの放出を遅くするということである。この仮説を試験するために、１×１０６ＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞／ｍｌを、１００ｎＭの１２５Ｉ−ＡＮＰと共に、１０μｇ／ｍｌの抗ＮＰＲＡ抗体又は対照抗体の存在下で、２時間、４℃にてインキュベートして、複合体を形成させる。次いで、２０００倍過剰量の非放射性ＡＮＰを添加し、１００μｌの試料を、徐々にフィルタープレート中のウェルに移し、上に概説した通り、細胞関連性放射能を定量する。対照抗体３２０７の存在下では、ＡＮＰのオフ速度はとても迅速なため、ゼロ時点でさえも捉えることが困難である（図２１）。しかしながら、５５０２、５５０４、５５９１及び５５９２は、受容体からのＡＮＰの放出を有意に遅くする。親抗体５０６４は、成熟抗体及び交差結合抗体よりも、より影響が小さい。これらのデータは、抗体が、ＮＰＲＡのリガンド結合コンフォメーション（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）に結合し、そのコンフォメーションを安定化し、この受容体を通して、シグナル伝達を持続及び亢進するモデルと一致している。
【実施例１１】
【０２９０】
水素／重水素質量分析法（ＨＸＭＳ）によるエピトープマッピング
ＮＰＲＡの細胞外ドメイン上の抗体結合部位を同定するために、水素／重水素質量分析法の技術を利用する。この方法を用いて、ポリペプチドの主鎖のアミド水素の溶媒露出度と、抗体結合で起こる変化と、を調査する。これは、重水への、ＮＰＲＡ−Ｆｃ、ＮＰＲＡ−Ｆｃ＋ＡＮＰ又はＮＰＲＡ−Ｆｃ＋ＡＮＰ＋５５９１  ＩｇＧ４＿Ｐｒｏの、種々の期間の曝露を含む。水素／重水素交換を、低ｐＨ及び低温によってクエンチングさせ、タンパク質複合体を迅速にペプシンによって分解し、次いで、ＬＣ／ＭＳによって解析して、各ペプチド中への重水素の組み込みの程度を決定する。
【０２９１】
Ａ．重水素交換実験−ペプチドの同定
ペプシン消化によってＮＰＲＡ−Ｆｃから作出されたペプチドを同定する。タンパク質を、氷上で５分間、０℃でペプシン消化する。得られたペプチドを、μＨＰＬＣ／ＦＴＭＳ解析に供する。移動相Ａ（９９／１／０．１、Ｈ２Ｏ／アセトニトリル／ギ酸）及び移動相Ｂ（９５／５／０．１、Ｈ２Ｏ／アセトニトリル／ギ酸）。流量は、１５０×１ｍｍのハイパーシルＣ１８カラム（サーモＰＮ２２１０５−３９６）上への１０μｌの注入で、１００μｌ分である。勾配プログラムは、０％Ｂから１５分時点で１００％Ｂ、１９分まで保持、である。ＦＴＭＳスペクトル（ブルカー・エイペックスＩＩ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｐｅｘ  ＩＩ）、ビレリカ、マサチューセッツ州）を、ｍ／ｚ４００〜１８００で取得する。保存された各スペクトルについて、２５６Ｋ長、５０，０００の解像度で、４つの０．３５秒スペクトルが蓄積される。外部較正を、ブタのレニン基質のインソース・フラグメンテーションによって実施する。２回目のランを、同一の条件下で行うが、インターフェイスのキャピラリー電圧（ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｘｉｔ  ｖｏｌｔａｇｅ）を８０Ｖから１８０Ｖへ上昇させて、溶出されるタンパク質からフラグメントイオンを生成させ、ｍ／ｚ範囲を２００〜２０００へ変更し、５１２Ｋの単語獲得を使用する点は例外である。データを、解析のために、ＭａｓｓＬｙｎｘ（マイクロマス／ウォーターズ社、マンチェスター、英国）フォーマットに変換する。全てのスペクトルを、単一のスペクトルへと平均化する。これを、ＭａｓｓＬｙｎｘ  ＭａｘＥＮＴ３による解析に供し、デコンヴォルーションされた成分の各々のモノアイソトピック分子量のリストを作成する。このリストを、タンパク質配列に対して検索し、５ｐｐｍエラーウィンドウを使用することで、切断部位に関するいかなる制約もなく、可能性のあるペプチドを決定する。対応するスペクトルを、高キャピラリー電位のランから抽出する。スペクトルに存在するフラグメントイオンを、ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェアによって作出した理論上の断片化パターンとの比較のために使用する。
【０２９２】
Ｂ．水素／重水素交換実験
ＮＰＲＡ−Ｆｃ、ＮＰＲＡ−Ｆｃ＋ＡＮＰ又はＮＰＲＡ−Ｆｃ、＋ＡＮＰ＋５５９１−ＩｇＧ複合体を、５ｍＭのｐＨ７．０の重水素化ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液中に１：１０で希釈し、異なる期間（５、１５、４５、１００、１０００秒）、室温で交換させる。交換を、ｐＨと温度とを下げる（等量の１００ｍＭの氷冷ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ２．５を添加する）ことによってクエンチングさせる。次いで、タンパク質をペプシンで消化し（１：１で、氷上で５分間）、μＨＰＬＣによる分離のために、トラップカラム（Ｍｉｃｈｒｏｍ  Ｃ１８）上へ注入し、次いで、０．８×１５０ｍｍのＣ１８（ペップマップ（ＰｅｐＭａｐ）Ｃ１８、ＬＣパッキングス社）カラムへ注入する。注入器、試料ループ、カラム及び輸送ラインを氷浴中に置き、流量は３０μｌ／分とする。
【０２９３】
クロマトグラフィの流出物をオンラインでモニタリングするために、ＥＳＩをもつブルカー・エイペックスＩＩ  ＦＴＭＳを用いる。イオン注入、励起及び検出（ｍ／ｚ３５０〜２０００）の前に、１．１秒の六極蓄積（ｈｅｘａｐｏｌｅ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）を実施する。二つの２５６ｋスペクトルが、保存スペクトルの各々について平均化され、各ラン毎に１２８の平均化されたスペクトルが取得される。解像度は、５５，０００ＦＷＨＭである。外部較正を、ブタのレニン基質のインソース・フラグメントイオンで実施する。トラッピング値及び励起値を最適化して、イオン集団での質量割り当ての変動を減少させる。六極蓄積は、ＥＳＩイオンを集積させ、従って、相対的存在量データの測定を改善する効果を有する。キャピラリー電圧は、典型的には７０Ｖである。
【０２９４】
各時点からのスペクトルを解析する。ＥｘＰｒｏと表題を付けられたプログラム（第５２回米国質量分析学会年次大会で発表された「ＥｘｃｈａｎｇｅＰｒｏ：Ａｎ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｄａｔａ  Ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｂｙ  ＦＴＭＳ」と表題を付けられたポスター）を使用して、質量にペプチドの分子イオンクラスターの各同位体の強度を掛け算し、全強度で割り算することによって、ペプチドの分子イオンクラスターの「平均質量」を計算する。結果として得られたデータを、各ペプチドについて図表にプロットし、タンパク質保護のマップを得る。全ての実験について、報告されたデータを、各ペプチドにおける交換可能な水素の数について調整する；報告された値＝質量中心／ペプチド中の非プロリン残基の数−１。ＶｉｅｗｅｒＬｉｔｅ４．２（アクセルリス社（Ａｃｃｅｌｙｒｓ  Ｉｎｃ．））を用いて、結晶構造上に結果をマッピングする。
【０２９５】
Ｃ．結果
ＮＰＲＡの細胞外ドメインに由来する、５１の消化性ペプチド［アミノ酸７−２０、２０−２７、２０−２８、２８−４９、５０−５６、５７−６８、８１−８７、７１−８０、９１−９５、９６−１０４、９６−１０５、１０５−１１３、１０９−１１５、１１４−１２０、１１４−１２１、１２１−１２９、１３０−１３５、１３６−１５２、１４０−１５１、１４０−１５２、１６５−１７１、１６６−１７０、１７２−１８７、１８３−１９９、１８８−１９８、１９９−２０８、２１８−２２３、２１９−２２３、２３５−２３８、２３９−２４７、２４８−２６９、２５８−２７１、２７０−２７４、２７０−２７６、２７０−２８０、２８１−２８９、２９３−３０１、３１０−３２０、３１３−３２０、３２１−３２６、３２６−３３０、３２６−３３３、３２７−３３２、３２７−３３３、３３１−３３５、３３１−３４６、３４７−３６２、３５２−３６２、３６３−３７４、３７４−４００、３７８−３８６、３７８−３８７を包含する］を、５〜１０００秒にわたる５つの時点の各々で追跡する。ＡＮＰ結合及びＡＮＰ＋抗体結合での重水素交換速度における違いを決定し、最も有意な変化を示したペプチドを、公的に入手可能な、リガンド結合ラットＮＰＲＡの結晶構造（Ｏｇａｗａら、（２００４）Ｊ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９：２８６２５）に由来する、ＡＮＰが細胞外ドメインに結合したヒトＮＰＲＡの相同性モデル上へとマッピングする。５５９１の結合からの結果を、図２１に描写する。
【０２９６】
ピンク色に陰影をつけた領域（アミノ酸２８−８７、９６−１１３、２９３−３０１、３１０−３１２、３３４−３３５及び３５２−３６２を包含する）は、交換からの強い保護を表わし、赤く陰影をつけた領域（アミノ酸７−２８、１２１−１２９、３１３−３２０、３２７−３３３、３４７−３５１を包含する）は、非常に強い保護を表わす。赤く陰影をつけた領域は、ＮＰＲＡがＡＮＰ及び／又はＢＮＰに結合している場合にＮＰＲＡの三次元構造中に位置する残基７−２８（ＮＬＴＶＡＶＶＬＰＬＡＮＴＳＹＰＷＳＷＡＲＶ）（配列番号３０）、１２１−１２９（ＶＫＤＥＹＡＬＴＴ）（配列番号３１）、３１３−３２０（ＴＭＥＤＧＬＶＮ）（配列番号３２）、３２７−３３３（ＨＤＧＬＬＬＹ）（配列番号３３）及び３４７−３５１（ＶＴＤＧＥ）（配列番号３４）を含むエピトープによって表わされ、ピンク色に陰影をつけた領域はペプチド配列２８−８７（ＶＧＰＡＶＥＬＡＬＡＱＶＫＡＲＰＤＬＬＰＧＷＴＶＲＴＶＬＧＳＳＥＮＡＬＧＶＣＳＤＴＡＡＰＬＡＡＶＤＬＫＷＥＨＮＰＡＶＦＬ）（配列番号３５）、９６−１１３（ＡＰＶＧＲＦＴＡＨＷＲＶＰＬＬＴＡＧ）（配列番号３６）、２９３−３０１（ＰＥＹＬＥＦＬＫＱ）（配列番号３７）、３１０−３１２（ＦＮＦ）、３３４−３３５（ＩＱ）、３５２−３６２（ＮＩＴＱＲＭＷＮＲＳＦ）（配列番号３８）、を有するエピトープを表わす。
【０２９７】
全ての変化を、交換の速度における減少として表わす。保護の領域の大きさ（両パートナーについて、平均１６８０Ａ２）は、他の抗体−抗体ペアについて報告された大きさと同じ範囲にある。抗体結合によって、交換から保護されるペプチドにおいて、二峰性の分布が観察される。ホモ二量体の一面への結合は、その観察と一致する機構である。興味深いことに、赤く陰影をつけた領域は、受容体へのＡＮＰ結合で変化した領域に対応し、ホモ二量体間の界面にあるＡＮＰの結合部位から離れている。
【０２９８】
ＮＰＲＡ−Ｆｃ  融合タンパク質の配列は：
ＤＧＴＳＭＧＮＬＴＶＡＶＶＬＰＬＡＮＴＳＹＰＷＳＷＡＲＶＧＰＡＶＥＬＡＬＡＱＶＫＡＲＰＤＬＬＰＧＷＴＶＲＴＶＬＧＳＳＥＮＡＬＧＶＣＳＤＴＡＡＰＬＡＡＶＤＬＫＷＥＨＮＰＡＶＦＬＧＰＧＣＶＹＡＡＡＰＶＧＲＦＴＡＨＷＲＶＰＬＬＴＡＧＡＰＡＬＧＦＧＶＫＤＥＹＡＬＴＴＲＡＧＰＳＹＡＫＬＧＤＦＶＡＡＬＨＲＲＬＧＷＥＲＱＡＬＭＬＹＡＹＲＰＧＤＥＥＨＣＦＦＬＶＥＧＬＦＭＲＶＲＤＲＬＮＩＴＶＤＨＬＥＦＡＥＤＤＬＳＨＹＴＲＬＬＲＴＭＰＲＫＧＲＶＩＹＩＣＳＳＰＤＡＦＲＴＬＭＬＬＡＬＥＡＧＬＣＧＥＤＹＶＦＦＨＬＤＩＦＧＱＳＬＱＧＧＱＧＰＡＰＲＲＰＷＥＲＧＤＧＱＤＶＳＡＲＱＡＦＱＡＡＫＩＩＴＹＫＤＰＤＮＰＥＹＬＥＦＬＫＱＬＫＨＬＡＹＥＱＦＮＦＴＭＥＤＧＬＶＮＴＩＰＡＳＦＨＤＧＬＬＬＹＩＱＡＶＴＥＴＬＡＨＧＧＴＶＴＤＧＥＮＩＴＱＲＭＷＮＲＳＦＱＧＶＴＧＹＬＫＩＤＳＳＧＤＲＥＴＤＦＳＬＷＤＭＤＰＥＮＧＡＦＲＶＶＬＮＹＮＧＴＳＱＥＬＶＡＶＳＧＲＫＬＮＷＰＬＧＹＰＰＰＤＩＰＫＣＧＦＤＮＥＤＰＡＣＮＱＤＨＬＳＴＬＥＰＩＧＧＧＳＧＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＶＮＤＥＲＰＬＥＳＲＧＰＶ（配列番号４５）である。
【実施例１２】
【０２９９】
種間の交差反応性
初回の種間の交差反応性研究を、ラット、イヌ及びアカゲザルＮＰＲＡを過剰発現するＨＥＫ細胞株を使用して実施する。ラットは、この種の入手可能性及び心不全モデルの広範な使用のため、好ましいモデルであり、一方で、犬を検査するのは、この種における組換えＢＮＰの大規模プロファイリングのためである。アカゲザルもまた好ましいモデルであり、これは、ＮＰＲＡの配列情報の入手可能性及びアカゲザルのヒトとの高い配列相同性に基づく。これらの種々の種のＡＮＰ結合細胞性ＮＰＲＡへの５５９１の親和性を、Ｋｉｎｅｘａ技術を使用して決定する。これらの見かけ上のＫｄ値は、二つの抗体濃度のデータを包括的に当てはめることによって取得される。下の表５中に示されるデータは、５５９１が異なる種のＮＰＲＡに、ｐＭの親和性で結合することを示す。抗体は、ラットＮＰＲＡに対して最も高い親和性を有し、イヌ、アカゲザル及びヒトがこれに続く。
【０３００】
表５：ＨＥＫ細胞中で発現されるＡＮＰ結合ＮＰＲＡに対する５５０１の親和性
【０３０１】
【表１３】
2012510295.tif 000014
【０３０２】
種に適正なＡＮＰ及びＢＮＰに応答したｃＧＭＰ生成に対する、５５０２、５５９１及び５５９２の影響もまた評価し、その結果を表６に要約している。ヒトＮＰＲＡでそうであるように、抗体は、イヌ及びアカゲザルＮＰＲＡによるｃＧＭＰ生成を、ＡＮＰ及びＢＮＰの両方へ応答して増強する。ラットＮＰＲＡに関しては、抗体の存在下で、ラットＡＮＰでは穏やかな増強が観察されるが、ラットＢＮＰに対する用量応答におけるシフトは見られない。ＦＡＣＳ実験は、抗体が、ＢＮＰの存在下でラットＮＰＲＡに結合することを確証する。
【０３０３】
表６：ＡＮＰ又はＢＮＰで処置したＨＥＫ  ＮＰＲＡ細胞における抗体媒介性ｃＧＭＰ応答の増強
【０３０４】
【表１４】
2012510295.tif 000015
【実施例１３】
【０３０５】
薬物動態研究：血漿における抗体の検出のためのＥＬＩＳＡ
サンドイッチＥＬＩＳＡを開発して、血漿中の抗体の濃度を決定する。捕捉抗原は、ＡＮＰ結合ＮＰＲＡ−Ｆｃ融合タンパク質であり、検出抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合された、モノクローナル抗ヒトＩｇＧ４（サル血漿試料について）又はモノクローナル抗ヒトκ鎖（ラット及びイヌ血漿試料について）のいずれかである。具体的には、９６ウェルのヌンクインムノマキシソーププレート（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社、ロチェスター、ニューヨーク州）を、１ｎＭのＡＮＰを含有するヒトＮＰＲＡ−Ｆｃで一晩、コーティングする。次いで、プレートを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中３％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ＢＳＡ／ＰＢＳ）で、１時間、室温でブロッキングする。次いで、プレートを、０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄する。検量線の作成のため、例えば、１ｎＭのＡＮＰを含む０．５％のＢＳＡ／ＰＢＳ中、６００ｎｇ／ｍｌ〜０．０９ｎｇ／ｍｌに１：３に段階希釈した５５９１を、プレートに添加し、２時間、室温でインキュベートする。試験試料として、１ｎＭのＡＮＰを含むＰＢＳ中に、少なくとも１：１０に血漿を希釈する。２時間のインキュベーション後、プレートを、０．５％のＢＳＡを含有するＰＢＳＴで３回洗浄する。結合した抗体を検出するために、０．５％のＢＳＡ／ＰＢＳ中のマウス抗ヒトＩｇＧ４−ＨＲＰ又はマウス抗ヒトκ鎖−ＨＲＰを添加し、プレートを室温で１時間インキュベートする。１時間のインキュベーション後、プレートを、０．５％のＢＳＡを含有するＰＢＳＴで３回洗浄する。１回の最終的なプレートの洗浄を、ＰＢＳのみを使用して行う。ＡＢＴＳ単一溶液を１０〜２０分間添加することによって、発色させる。プレートを、４０５ｎｍで読み取る。
【実施例１４】
【０３０６】
ラットにおける単回の静脈内投薬及び皮下投薬抗体の薬物動態
リン酸緩衝食塩水ビヒクル中の５５９１を、雄性ＳＤラット（Ｎ＝３）に、０．３ｍｇ／ｋｇで静脈内投薬し、２ｍｇ／ｋｇで皮下投薬する。血液試料を、０〜１６８時間に、Ｋ２−ＥＤＴＡ管に回収し、血漿試料を−７０℃で解析まで保管した。試料を、サンドイッチＥＬＩＳＡによって上記のとおり解析する。薬物動態パラメータを、表７中に要約する。抗体は、低いクリアランス及び小さい分布容積（Ｖｓｓ）を示し、５．８日の終末相半減期を示す。抗体は、皮下投薬後、迅速かつ良好に吸収され、投薬後約３日でピークに達し、皮下投薬のバイオアベイラビリティは８１％である。
【０３０７】
表７：単回の０．３ｍｇ／ｋｇ静脈内投薬及び２ｍｇ／ｋｇ皮下投薬後の雄性ＳＤラット（Ｎ＝３）における５５９１の薬物動態パラメータ
【０３０８】
【表１５】
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【実施例１５】
【０３０９】
イヌにおける単回の静脈内投薬及び皮下投薬抗体の薬物動態
雄性ビーグル犬（Ｎ＝３）に、５０ｍＭ酢酸／１００ｍＭアルギニン／５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ中の５５９１−ＩｇＧを、０．３ｍｇ／ｋｇで静脈内投薬し、リン酸緩衝食塩水ビヒクル中の５５９１−ＩｇＧを、同一の用量で皮下投薬する。血液試料を０〜５０６時間（３週間）に、Ｋ２−ＥＤＴＡ管に回収し、血漿試料を−７０℃で解析まで保管する。試料を、サンドイッチＥＬＩＳＡによって上記のとおり解析する。
【０３１０】
薬物動態パラメータを、表８中に要約する。抗体は、低いクリアランス、血液量に近似する小さい分布容積（Ｖｓｓ）及び８１時間（〜３日）の終末相半減期を示す。
【０３１１】
表８：単回の０．３ｍｇ／ｋｇ静脈内投薬及び皮下投薬後の雄性ビーグル犬（Ｎ＝３）における５５９１−ＩｇＧの薬物動態パラメータ
【０３１２】
【表１６】
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【実施例１６】
【０３１３】
サルにおける単回の静脈内投薬及び皮下投薬抗体の薬物動態
雄性カニクイザル（Ｎ＝３）に、リン酸緩衝食塩水ビヒクル中の５５９１−ＩｇＧを、０．３ｍｇ／ｋｇで静脈内投薬及び皮下投薬する。血液試料を０〜５０６時間（３週間）に、Ｋ２−ＥＤＴＡ管に回収し、血漿試料を−７０℃で解析まで保管した。試料を、サンドイッチＥＬＩＳＡによって上記のとおり解析する。
【０３１４】
薬物動態パラメータを、表９中に要約する。抗体は、低いクリアランス、８５〜９０ｍＬ／ｋｇの血液量よりもわずかに高い小さい分布容積（Ｖｓｓ）及び２０３時間（８．５日）の終末相半減期を示す。抗体は、皮下投薬後、ゆっくりかつ良好に吸収され、投薬後約３日でピークに達し、皮下投薬のバイオアベイラビリティは１４５％であり、１００％のバイオアベイラビリティよりも大きかった理由は、現時点では不明である。
【０３１５】
表９：単回の０．３ｍｇ／ｋｇ静脈内投薬及び皮下投薬後の雄性カニクイザル（Ｎ＝３）におけるＢＩ６５５，００２の薬物動態パラメータ
【０３１６】
【表１７】
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【０３１７】
本明細書中で、他に定義されない限り、本発明に関連して使用されている科学的及び技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するべきである。さらに、文脈によって別に定められている場合を除き、単数形の用語は、複数形を含むべきであり、複数形の用語は、単数形を含むべきである。一般的に、本明細書に関連して使用されている命名法、並びに本明細書中に記載されている薬物動態解析の技術、組換えＤＮＡ法、ペプチド化学及びタンパク質化学、核酸化学並びに分子生物学及び細胞生物学は、当技術分野において周知であり、かつ一般的に使用されているものである。
【０３１８】
前述の発明は、理解の明確さの目的のために、例証及び実施例として多少詳しく記述されているものの、本発明の教示から、追加された実施態様を含む本明細書の開示の趣旨及び範囲から逸脱せずに、一定の変更及び改変が本発明に行われ得ることが、当業者には容易に明らかであるだろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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