【手続補正書】
【提出日】令和2年8月6日(2020.8.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１または配列番号１１と、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼをコードする異種核酸を含む遺伝子改変された宿主細胞であって、
９０％、９５％、９６％、または９７％より大きい効率で、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能である、遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項２】
ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、配列番号１または配列番号１１の配列を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項３】
ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、ステビオール配糖体の１９−ＯグルコースのＣ２’位をベータ１，２グリコシル化することが可能である、請求項１または２に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項４】
ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、異種核酸によってコードされ、異種核酸は、配列番号１３と、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項５】
ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、配列番号１３の配列を有する異種核酸によってコードされる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項６】
９０％、９５％、９６％、または９７％より大きい効率で、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能であり、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、配列番号１または配列番号１１と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項７】
ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、配列番号１または配列番号１１の機能性ドメインと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する機能性ドメインを有するポリペプチドである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項８】
ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、配列番号１または配列番号１１の糖アクセプタードメインを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項９】
ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、糖アクセプタードメインを含み、糖アクセプタードメインのアミノ酸配列は、配列番号１または配列番号１１の糖アクセプタードメインのアミノ酸配列と、少なくとも８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項１０】
ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、
（ａ）それぞれ配列番号１もしくは配列番号１１のループ１の箇所に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの箇所における、配列番号１もしくは配列番号１１のループ１のアミノ酸配列、配列番号２８の配列、またはバリアントループ１のアミノ酸配列；
（ｂ）それぞれ配列番号１もしくは配列番号１１のループ２の箇所に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの箇所における、配列番号１もしくは配列番号１１のループ２のアミノ酸配列、またはバリアントループ２のアミノ酸配列；
（ｃ）それぞれ配列番号１もしくは配列番号１１のループ３＿１の箇所に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの箇所における、配列番号１もしくは配列番号１１のループ３＿１のアミノ酸配列、またはバリアントループ３＿１のアミノ酸配列；
（ｄ）それぞれ配列番号１もしくは配列番号１１のループ３＿２の箇所に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの箇所における、配列番号１もしくは配列番号１１のループ３＿２のアミノ酸配列、またはバリアントループ３＿２のアミノ酸配列；
（ｅ）それぞれ配列番号１もしくは配列番号１１のループ４＿１の箇所に対応する箇所における、配列番号１もしくは配列番号１１のループ４＿１のアミノ酸配列、またはバリアントループ４＿１のアミノ酸配列；
（ｆ）それぞれ配列番号１または配列番号１１のループ４＿２の箇所に対応する箇所における、配列番号１または配列番号１１のループ４＿２のアミノ酸配列；または
（ｇ）（ａ）から（ｆ）の任意の組合せ
を含む、請求項９に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項１１】
バリアントループ１のアミノ酸配列、バリアントループ２のアミノ酸配列、バリアントループ３＿１のアミノ酸配列、バリアントループ３＿２のアミノ酸配列、およびバリアントループ４＿１のアミノ酸配列のいずれかが、配列番号１または配列番号１１と異なる別のＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのそれらそれぞれの対応するループ箇所から得られ、別のＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼは、配列番号１または配列番号１１と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項１２】
ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、
（ａ）配列番号１または配列番号１１の糖アクセプタードメインと、少なくとも６１％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む別のＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの糖アクセプタードメイン；および
（ｂ）それぞれ配列番号１または配列番号１１のループ４＿１の箇所に対応する別のＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの箇所における、配列番号１または配列番号１１のループ４＿１のアミノ酸配列
を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項１３】
ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、配列番号１または配列番号１１と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、それぞれ配列番号１または配列番号１１のループ４＿１の箇所に対応する箇所における、配列番号１または配列番号１１のループ４＿１のアミノ酸配列を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項１４】
ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、以下のアミノ酸残基：
（ａ）配列番号１１のアミノ酸位置１１に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置におけるバリン；
（ｂ）配列番号１１のアミノ酸位置１２に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置におけるイソロイシン；
（ｃ）配列番号１１のアミノ酸位置５５に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置におけるプロリン；
（ｄ）配列番号１１のアミノ酸位置９０に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置におけるグルタミン酸；
（ｅ）配列番号１１のアミノ酸位置２０３に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置におけるセリン；
（ｆ）配列番号１１のアミノ酸位置２２３に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置におけるグルタミン酸；または
（ｇ）配列番号１１のアミノ酸位置４１３に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置におけるバリン
の１つまたは複数を含み、配列番号１１のアミノ酸位置に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置は、配列アライメントによって決定される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項１５】
ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、配列番号２４を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項１６】
ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、糖ドナードメインを含み、糖ドナードメインは、配列番号１または配列番号１１の糖ドナードメインのアミノ酸配列と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項１７】
ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、配列番号１または配列番号１１と、少なくとも９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項１８】
ＲｅｂＭを産生することが可能である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項１９】
ステビオールを生成するための経路の１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数の異種核酸をさらに含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項２０】
ステビオール配糖体を生成するための経路の１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数の異種核酸をさらに含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項２１】
前記経路の１つまたは複数の酵素が、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、コパリル二リン酸シンターゼ、ｅｎｔ−カウレンシンターゼ、カウレンオキシダーゼ、カウレン酸ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ８５Ｃ２、およびＵＧＴ９１Ｄを含む、請求項１９または２０に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項２２】
細菌細胞、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞、および植物細胞からなる群から選択される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項２３】
真菌細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項２２に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項２４】
ＲｅｂＭを産生するための方法であって、
（ａ）ＲｅｂＭの生成に好適な条件下で、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞の集団を、炭素源を含む培地中で培養すること；および
（ｂ）培地から前記ＲｅｂＭ化合物を回収すること
を含む方法。
【請求項２５】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞によって産生された、ステビオール配糖体を含む発酵組成物であって、ステビオール配糖体は、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＤおよびＲｅｂＭを、少なくとも１：７：５０のＲｅｂＡ：ＲｅｂＤ：ＲｅｂＭの比率で含む、発酵組成物。
【請求項２６】
配列番号１または配列番号１１と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％の配列同一性を有する、天然に存在しないＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項２７】
ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが、以下のアミノ酸残基：
（ａ）配列番号１１のアミノ酸位置１１に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置におけるバリン；
（ｂ）配列番号１１のアミノ酸位置１２に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置におけるイソロイシン；
（ｃ）配列番号１１のアミノ酸位置５５に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置におけるプロリン；
（ｄ）配列番号１１のアミノ酸位置９０に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置におけるグルタミン酸；
（ｅ）配列番号１１のアミノ酸位置２０３に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置におけるセリン；
（ｆ）配列番号１１のアミノ酸位置２２３に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置におけるグルタミン酸；または
（ｇ）配列番号１１のアミノ酸位置４１３に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置におけるバリン
の１つまたは複数を含み、配列番号１１のアミノ酸位置に対応するＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置は、配列アライメントによって決定される、請求項２６に記載の天然に存在しないＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ。