【手続補正書】
【提出日】令和2年8月13日(2020.8.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃａｓタンパク質、二本鎖標的ポリヌクレオチドにおいて標的核酸配列を認識する少なくとも１つのターゲッティングＲＮＡ分子、および前記標的ポリヌクレオチドを含む、核タンパク質複合体であって、
前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７７％の同一性の配列を有し、
前記二本鎖標的ポリヌクレオチドが、前記標的核酸配列を含む標的核酸鎖、ならびに前記標的核酸配列に相補的であるプロトスペーサー核酸配列および前記プロトスペーサー配列の３’末端に直接隣接したプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含む非標的核酸鎖を含み、前記ＰＡＭ配列が、５’−ＮＮＮＮＣＮＮ−３’を含み、前記核タンパク質複合体がヒト細胞におけるものではなく、任意選択で、前記細胞が胚性幹細胞ではない、核タンパク質複合体。
【請求項２】
標的核酸配列を含む二本鎖標的ポリヌクレオチドを有する形質転換ヒト細胞であって、前記二本鎖標的ポリヌクレオチドが、前記標的核酸配列を含む標的核酸鎖、および前記標的核酸配列に相補的であるプロトスペーサー核酸配列を含む非標的核酸鎖を含み、前記細胞が、
配列番号１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７７％の同一性の配列を有する、Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔ：クラスター化し規則的に間隔を置いた短い回文配列の繰り返し）ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ：ＣＲＩＳＰＲ関連）タンパク質、
前記標的核酸鎖中の前記標的核酸配列を認識する少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子であって、前記非標的鎖が、前記プロトスペーサー配列の３’末端に直接隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列をさらに含み、前記ＰＡＭ配列が５’−ＮＮＮＮＣＮＮ−３’を含む、少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子、および
少なくとも１つの前記Ｃａｓタンパク質および前記ターゲティングＲＮＡ分子をコードする核酸を含む発現ベクター
を含み、任意選択で、前記ヒト細胞が胚性幹細胞ではない、形質転換ヒト細胞。
【請求項３】
前記Ｃａｓタンパク質が、発現ベクターから発現される、請求項２に記載の形質転換細胞。
【請求項４】
前記結合、切断、標識もしくは改変、または前記核タンパク質複合体が、２０℃と１００℃の間の温度で、３０℃と８０℃の間の温度で、３７℃と７８℃の間の温度で、好ましくは５５℃超の温度で、より好ましくは５５℃と８０℃の間の温度で、さらにより好ましくは、５５℃と６５℃の間または６０℃と６５℃の間の温度で発生する、請求項１から３のいずれかに記載の形質転換細胞または核タンパク質複合体。
【請求項５】
前記標的核酸配列を含む前記二本鎖標的ポリヌクレオチドが前記Ｃａｓタンパク質により切断され、好ましくは前記切断がＤＮＡ切断である、請求項１から４のいずれかに記載の形質転換細胞または核タンパク質複合体。
【請求項６】
前記標的配列を含む前記標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡであり、前記結合、切断、標識または改変が、前記標的ポリヌクレオチド中の二本鎖切断をもたらす、請求項１から５のいずれかに記載の形質転換細胞または核タンパク質複合体。
【請求項７】
前記Ｃａｓタンパク質が、前記二本鎖ＤＮＡを切断するヌクレアーゼ活性を欠いても、なお前記標的ポリヌクレオチドの遺伝子サイレンシングが存在する、請求項１から４のいずれかに記載の形質転換細胞または核タンパク質複合体。
【請求項８】
前記ＰＡＭ配列が、５’−ＮＮＮＮＣＮＮＡ−３’［配列番号４７］を含み、好ましくは、前記ＰＡＭ配列が、５’−ＮＮＮＮＣＳＡＡ−３’［配列番号４８］を含み、より好ましくは、前記ＰＡＭ配列が、５’−ＮＮＮＮＣＣＡＡ−３’［配列番号５０］を含む、請求項１から７のいずれかに記載の形質転換細胞または核タンパク質複合体。
【請求項９】
前記結合、切断、標識または改変が、２０℃と７０℃の間の温度で起こり、好ましくは、前記結合、切断、標識または改変が、２５℃と６５℃の間の温度で起こる、請求項８のいずれかに記載の形質転換細胞または核タンパク質複合体。
【請求項１０】
前記Ｃａｓタンパク質が、細菌、古細菌またはウイルスから、好ましくは好熱性細菌から得られ、より好ましくは、前記Ｃａｓタンパク質が、ゲオバチルス（Geobacillus）属種、好ましくはゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）から得ることができる、請求項１から９のいずれかに記載の形質転換細胞または核タンパク質複合体。
【請求項１１】
前記ターゲティングＲＮＡ分子が、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項１から１０のいずれかに記載の形質転換細胞または核タンパク質複合体。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子の長さが、３５〜２００ヌクレオチド残基の範囲である、および／または、前記標的核酸配列が、１５〜３２ヌクレオチド残基長である、請求項１から１１のいずれかに記載の形質転換細胞または核タンパク質複合体。
【請求項１３】
前記Ｃａｓタンパク質の前記ヌクレアーゼ活性が不活性でもよく、前記Ｃａｓタンパク質が少なくとも１つの機能的部分、好ましくは、タンパク質をさらに含み、任意選択で、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ−ヌクレアーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンメチラーゼ、アセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（共）活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構築タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質、シグナルペプチド、細胞内局在配列、抗体エピトープまたは親和性精製タグ、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）から選択される、請求項１から１２のいずれかに記載の形質転換細胞または核タンパク質複合体。
【請求項１４】
ヒト細胞中における二本鎖標的ポリヌクレオチドに結合する、これを切断する、標識するまたは改変する方法であって、前記二本鎖標的ポリヌクレオチドが、標的核酸配列を含む標的核酸鎖、および前記標的核酸配列に相補的であるプロトスペーサー核酸配列を含む非標的核酸を含み、前記方法が、
ａ．少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子を設計するステップであって、前記ターゲティングＲＮＡ分子が、前記標的鎖の前記標的配列を認識し、前記非標的鎖が、前記プロトスペーサー配列の３’末端に直接隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列をさらに含み、前記ＰＡＭ配列が、５’−ＮＮＮＮＣＮＮ−３’を含む、ステップ、ｂ．前記ターゲティングＲＮＡ分子およびＣａｓタンパク質を含むリボ核タンパク質複合体を形成するステップであって、前記単離Ｃａｓタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７７％の同一性の配列を有する、ステップ、および
ｃ．前記標的ポリヌクレオチドに結合する、これを切断する、標識するまたは改変する前記リボ核タンパク質複合体であって、任意選択で前記ヒト細胞が胚性幹細胞ではなく、任意選択で前記方法が前記ヒトの生殖細胞系遺伝的同一性を改変しない、リボ核タンパク質複合体
を含む、方法。
【請求項１５】
標的核酸配列を含む二本鎖標的ポリヌクレオチドに結合する、切断する、標識するまたは改変するための、少なくとも１つのターゲッティングＲＮＡ分子およびＣａｓタンパク質の使用であって、
前記二本鎖標的ポリヌクレオチドが、前記標的核酸配列を含む標的核酸鎖、および前記標的核酸配列に相補的であるプロトスペーサー核酸配列を含む非標的核酸鎖を含み、
前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７７％の同一性の配列を有し、
前記少なくとも１つのターゲッティングＲＮＡ分子が、前記標的配列を認識し、
前記非標的核酸鎖が、前記プロトスペーサー核酸配列の３’末端に直接隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列をさらに含み、前記ＰＡＭ配列が、５’−ＮＮＮＮＣＮＮ−３’を含み、前記使用が、ヒト細胞におけるものあり、任意選択で前記ヒト細胞が胚性幹細胞ではない、使用。
【請求項１６】
請求項３から１３のいずれかに記載の特徴のいずれかをさらに含む、請求項１４に記載の方法または請求項１５に記載の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
発明者らは、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９：好熱性細菌であるゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）Ｔ１２のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ＩＩＣ型系からＲＮＡ−ガイドＤＮＡ−エンドヌクレアーゼを発見して、特徴付けた。発明者らは、驚くべきことに、幅広い温度範囲にわたる、そのｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性を示し、熱安定性に対するｓｇＲＮＡ−構造の重要性を実証し、幅広い温度範囲にわたる、ｉｎ  ｖｉｖｏでのゲノム編集に、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９を適用した。
本開示は、以下の［１］から［１００］を含む。
［１］標的核酸配列を含む二本鎖標的ポリヌクレオチドに結合する、切断する、標識するまたは改変するための、少なくとも１つのターゲッティングＲＮＡ分子およびＣａｓタンパク質の使用であって、
上記二本鎖標的ポリヌクレオチドが、上記標的核酸配列を含む標的核酸鎖、および上記標的核酸配列に相補的であるプロトスペーサー核酸配列を含む非標的核酸鎖を含み、
上記Ｃａｓタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７７％の同一性の配列を有し、
上記少なくとも１つのターゲッティングＲＮＡ分子が、上記標的配列を認識し、
上記非標的核酸鎖が、上記プロトスペーサー核酸配列の３’末端に直接隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列をさらに含み、上記ＰＡＭ配列が、５’−ＮＮＮＮＣＮＮ−３’を含み、上記使用が、ヒト細胞におけるものあり、任意選択で上記ヒト細胞が胚性幹細胞ではない、使用。
［２］上記結合、切断、標識または改変が、２０℃と１００℃の間の温度で、３０℃と８０℃の間の温度で、３７℃と７８℃の間の温度で、好ましくは５５℃超の温度で、より好ましくは５５℃と８０℃の間の温度で、さらにより好ましくは、５５℃と６５℃の間または６０℃と６５℃の間の温度で起こる、上記［１］に記載の使用。
［３］上記標的核酸配列を含む上記ポリヌクレオチドが上記Ｃａｓタンパク質により切断され、好ましくは、上記切断がＤＮＡ切断である、上記［１］または上記［２］に記載の使用。
［４］上記標的配列を含む上記標的核酸鎖が二本鎖ＤＮＡであり、上記使用が、上記標的核酸配列を含む上記ポリヌクレオチド中の二本鎖切断をもたらす、上記［１］から［３］のいずれかに記載の使用。
［５］上記標的核酸配列を含む上記ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡであり、上記Ｃａｓタンパク質が上記二本鎖ＤＮＡを切断する能力を欠き、上記使用が上記ポリヌクレオチドの遺伝子サイレンシングをもたらす、上記［１］または上記［２］に記載の使用。
［６］上記Ｃａｓタンパク質を含む上記ポリヌクレオチドが、変異Ｄ８ＡおよびＨ５８２Ａを含む、上記［５］に記載の使用。
［７］上記ＰＡＭ配列が、５’−ＮＮＮＮＣＮＮＡ−３’［配列番号４７］を含む、上記［１］から［６］のいずれかに記載の使用。
［８］上記ＰＡＭ配列が、５’−ＮＮＮＮＣＳＡＡ−３’［配列番号４８］を含む、上記［１］から［７］のいずれかに記載の使用。
［９］上記ＰＡＭ配列が、５’−ＮＮＮＮＣＣＡＡ−３’［配列番号５０］を含む、上記［８］に記載の使用。
［１０］上記結合、切断、標識または改変が、２０℃と７０℃の間の温度で起こる、上記［８］または上記［９］に記載の使用。
［１１］結合、切断、標識または改変が、２５℃と６５℃の間の温度で起こる、上記［７］から［１０］のいずれかに記載の使用。
［１２］上記Ｃａｓタンパク質が、細菌、古細菌またはウイルスから、好ましくは好熱性細菌から得られる、上記［１］から［１１］のいずれかに記載の使用。
［１３］上記Ｃａｓタンパク質が、ゲオバチルス（Geobacillus）属種、好ましくはゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）から得ることができる、上記［１］から［１２］のいずれかに記載の使用。
［１４］上記ターゲティングＲＮＡ分子が、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、上記［１］から［１３］のいずれかに記載の使用。
［１５］上記少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子の長さが、３５〜２００ヌクレオチド残基の範囲である、上記［１］から［１４］のいずれかに記載の使用。
［１６］上記標的核酸配列が、１５〜３２ヌクレオチド残基長である、上記［１］から［１５］のいずれかに記載の使用。
［１７］上記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、上記［１］から［１６］のいずれかに記載の使用。
［１８］上記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つのさらなる機能的または非機能的タンパク質を含むタンパク質複合体の一部として提供され、任意選択で、上記少なくとも１つのさらなるタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、上記［１］から［１７］のいずれかに記載の使用。
［１９］上記Ｃａｓタンパク質またはさらなるタンパク質が、上記Ｃａｓタンパク質またはタンパク質複合体のＮ終端および／もしくはＣ終端、好ましくはＣ終端に融合または連結している、少なくとも１つの機能的部分を含む、上記［１７］または上記［１８］に記載の使用。
［２０］上記少なくとも１つの機能的部分がタンパク質であり、任意選択で、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ−ヌクレアーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンメチラーゼ、アセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（共）活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構築タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質、シグナルペプチド、細胞内局在配列、抗体エピトープまたは親和性精製タグ、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）から選択される、上記［１７］から［１９］のいずれかに記載の使用。
［２１］上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼの天然の活性が不活化されており、上記Ｃａｓタンパク質が少なくとも１つの機能的部分に連結している、上記［２０］に記載の使用。
［２２］上記少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼドメイン、好ましくはＦｏｋＩヌクレアーゼドメインである、上記［２０］または上記［２１］に記載の使用。
［２３］上記少なくとも１つの機能的部分がマーカータンパク質である、上記［２０］から［２２］のいずれかに記載の使用。
［２４］ヒト細胞中における二本鎖標的ポリヌクレオチドに結合する、これを切断する、標識するまたは改変する方法であって、上記二本鎖標的ポリヌクレオチドが、標的核酸配列を含む標的核酸鎖、および上記標的核酸配列に相補的であるプロトスペーサー核酸配列を含む非標的核酸を含み、上記方法が、
ａ．少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子を設計するステップであって、上記ターゲティングＲＮＡ分子が、上記標的鎖の上記標的配列を認識し、上記非標的鎖が、上記プロトスペーサー配列の３’末端に直接隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列をさらに含み、上記ＰＡＭ配列が、５’−ＮＮＮＮＣＮＮ−３’を含む、ステップ、ｂ．上記ターゲティングＲＮＡ分子およびＣａｓタンパク質を含むリボ核タンパク質複合体を形成するステップであって、上記単離Ｃａｓタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７７％の同一性の配列を有する、ステップ、および
ｃ．上記標的ポリヌクレオチドに結合する、これを切断する、標識するまたは改変する上記リボ核タンパク質複合体であって、任意選択で上記ヒト細胞が胚性幹細胞ではなく、任意選択で上記方法が上記ヒトの生殖細胞系遺伝的同一性を改変しない、リボ核タンパク質複合体
を含む、方法。
［２５］上記結合、切断、標識または改変が、２０℃と１００℃の間の温度で、３０℃と８０℃の間の温度で、３７℃と７８℃の間の温度で、好ましくは５５℃超の温度で、より好ましくは５５℃と８０℃の間の温度で、さらにより好ましくは、５５℃と６５℃の間または６０℃と６５℃の間の温度で起こる、上記［２４］に記載の方法。
［２６］上記標的核酸配列を含む上記二本鎖標的ポリヌクレオチドが上記Ｃａｓタンパク質により切断され、好ましくは上記切断がＤＮＡ切断である、上記［２４］または上記［２５］に記載の方法。
［２７］上記標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡであり、上記使用が、上記ポリヌクレオチド中の二本鎖切断をもたらす、上記［２４］から［２６］のいずれかに記載の方法。
［２８］上記標的核酸配列を含む上記標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡであり、上記Ｃａｓタンパク質が、上記二本鎖ＤＮＡを切断する能力を欠き、上記方法が、上記標的ポリヌクレオチドの遺伝子サイレンシングをもたらす、上記［２４］または上記［２５］に記載の方法。
［２９］上記ＰＡＭ配列が、５’−ＮＮＮＮＣＮＮＡ−３’［配列番号４７］を含む、上記［２４］から［２８］のいずれかに記載の方法。
［３０］上記ＰＡＭ配列が、５’−ＮＮＮＮＣＳＡＡ−３’［配列番号４８］を含む、上記［２９］に記載の方法。
［３１］上記ＰＡＭ配列が、５’−ＮＮＮＮＣＣＡＡ−３’［配列番号５０］を含む、上記［３０］に記載の方法。
［３２］上記結合、切断、標識または改変が、２０℃と７０℃の間の温度で起こる、上記［３０］または上記［３１］に記載の方法。
［３３］結合、切断、標識または改変が、２５℃と６５℃の間の温度で起こる、上記［２９］から上記［３２］のいずれかに記載の方法。
［３４］上記Ｃａｓタンパク質が、細菌、古細菌またはウイルスから、好ましくは好熱性細菌から得られる、上記［２４］から［３３］のいずれかに記載の使用。
［３５］上記Ｃａｓタンパク質が、ゲオバチルス（Geobacillus）属種、好ましくはゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）から得ることができる、上記［２４］から［３４］のいずれかに記載の方法。
［３６］上記ターゲティングＲＮＡ分子が、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、上記［２４］から［３５］のいずれかに記載の方法。
［３７］上記少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子の長さが、３５〜２００ヌクレオチド残基の範囲である、上記［２４］から［３６］のいずれかに記載の方法。
［３８］上記標的核酸配列が、１５〜３２ヌクレオチド残基長である、上記［２４］から［３７］のいずれかに記載の方法。
［３９］上記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、上記［２４］から［３９］のいずれかに記載の方法。
［４０］上記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つのさらなる機能的または非機能的タンパク質を含むタンパク質複合体の一部として提供され、任意選択で、上記少なくとも１つのさらなるタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、上記［２４］から［４０］のいずれかに記載の方法。
［４１］上記Ｃａｓタンパク質またはさらなるタンパク質が、上記Ｃａｓタンパク質またはタンパク質複合体のＮ終端および／もしくはＣ終端、好ましくはＣ終端に融合または連結している、少なくとも１つの機能的部分を含む、上記［３９］または上記［４０］に記載の方法。
［４２］上記少なくとも１つの機能的部分がタンパク質であり、任意選択で、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ−ヌクレアーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンメチラーゼ、アセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（共）活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構築タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質、シグナルペプチド、細胞内局在配列、抗体エピトープまたは親和性精製タグ、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）から選択される、上記［３９］から［４１］のいずれかに記載の方法。
［４３］上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼの天然の活性が不活化されており、上記Ｃａｓタンパク質が少なくとも１つの機能的部分に連結している、上記［４２］に記載の方法。
［４４］上記少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼドメイン、好ましくはＦｏｋＩヌクレアーゼドメインである、上記［４２］または上記［４３］に記載の方法。
［４５］上記少なくとも１つの機能的部分がマーカータンパク質である、上記［４２］から［４４］のいずれかに記載の方法。
［４６］上記二本鎖標的ポリヌクレオチドがｄｓＤＮＡであり、上記少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼまたはヘリカーゼ−ヌクレアーゼであり、上記改変が、所望の遺伝子座における一本鎖または二本鎖切断である、上記［２０］に記載の使用または上記［４２］に記載の方法。
［４７］上記二本鎖標的ポリヌクレオチドがｄｓＤＮＡであり、上記機能的部分が、ＤＮＡ改変酵素（例えば、メチラーゼまたはアセチラーゼ）、転写活性因子または転写リプレッサーから選択され、上記結合、切断、標識または改変が、遺伝子発現の改変をもたらす、上記［２０］に記載の使用、または上記［４２］に記載の方法。
［４８］上記結合、切断、標識または改変が、ｉｎ  ｖｉｖｏで行われる、上記［２０］に記載の使用、または上記［４２］に記載の方法。
［４９］上記結合、切断、標識または改変が、所望の位置に、所望のヌクレオチド配列を改変または欠失および／もしくは挿入をもたらし、かつ／または上記結合、切断、標識または改変が、所望の遺伝子座にサイレンシング遺伝子発現をもたらす、上記［１］から［４］、［７］から［２３］、もしくは［４６］のいずれかに記載の使用、または上記［２４］から［２７］、［２９］から［４６］のいずれかに記載の方法。
［５０］標的核酸配列を含む二本鎖標的ポリヌクレオチドを有する形質転換ヒト細胞であって、上記二本鎖標的ポリヌクレオチドが、上記標的核酸配列を含む標的核酸鎖、および上記標的核酸配列に相補的であるプロトスペーサー核酸配列を含む非標的核酸鎖を含み、上記細胞が、
配列番号１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７７％の同一性の配列を有する、Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔ：クラスター化し規則的に間隔を置いた短い回文配列の繰り返し）ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ：ＣＲＩＳＰＲ関連）タンパク質、
上記標的核酸鎖中の上記標的核酸配列を認識する少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子であって、上記非標的鎖が、上記プロトスペーサー配列の３’末端に直接隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列をさらに含み、上記ＰＡＭ配列が５’−ＮＮＮＮＣＮＮ−３’を含む、少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子、および
少なくとも１つの上記Ｃａｓタンパク質および上記ターゲティングＲＮＡ分子をコードする核酸を含む発現ベクター
を含み、任意選択で、上記ヒト細胞が胚性幹細胞ではない、形質転換ヒト細胞。
［５１］上記Ｃａｓタンパク質および上記ターゲティングＲＮＡ分子により、上記細胞中の上記標的ポリヌクレオチドの結合、切断、標識または改変が可能になり、上記結合、切断、標識または改変が、２０℃と１００℃の間の温度で、３０℃と８０℃の間の温度で、３７℃と７８℃の間の温度で、好ましくは５５℃超の温度で、より好ましくは５５℃と８０℃の間の温度で、さらにより好ましくは、５５℃と６５℃の間または６０℃と６５℃の間の温度で起こる、上記［５０］に記載の形質転換細胞。
［５２］上記標的核酸配列を含む上記標的核酸鎖がＣａｓタンパク質により切断され、好ましくは上記切断がＤＮＡ切断である、上記［５０］または上記［５１］に記載の形質転換細胞。
［５３］上記標的配列を含む上記標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡであり、上記結合、切断、標識または改変が、上記標的ポリヌクレオチド中の二本鎖切断をもたらす、上記［５０］から［５２］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［５４］上記標的核酸配列を含む上記標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡであり、上記Ｃａｓタンパク質が、上記二本鎖ＤＮＡを切断する能力を欠き、上記結合、切断、標識または改変が、上記標的ポリヌクレオチドの遺伝子サイレンシングをもたらす、上記［５０または上記［５１］に記載の形質転換細胞。
［５５］上記ＰＡＭ配列が、５’−ＮＮＮＮＣＮＮＡ−３’［配列番号４７］を含む、上記［５０］から［５４］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［５６］上記ＰＡＭ配列が、５’−ＮＮＮＮＣＳＡＡ−３’［配列番号４８］を含む、上記［５５］に記載の形質転換細胞。
［５７］上記ＰＡＭ配列が、５’−ＮＮＮＮＣＣＡＡ−３’［配列番号５０］を含む、上記［５６］に記載の形質転換細胞。
［５８］上記結合、切断、標識または改変が、２０℃と７０℃の間の温度で起こる、上記［５６］または上記［５７］に記載の形質転換細胞。
［５９］結合、切断、標識または改変が、２５℃と６５℃の間の温度で起こる、上記［５５］から上記［５８］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［６０］上記Ｃａｓタンパク質が、細菌、古細菌またはウイルスから、好ましくは好熱性細菌から得られる、上記［５０］から［５９］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［６１］上記Ｃａｓタンパク質が、ゲオバチルス（Geobacillus）属種、好ましくはゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）から得ることができる、上記［５０］から［６０］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［６２］上記ターゲティングＲＮＡ分子が、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、上記［５０］から［６１］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［６３］上記少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子の長さが、３５〜２００ヌクレオチド残基の範囲である、上記［５０］から［６２］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［６４］上記標的核酸配列が、１５〜３２ヌクレオチド残基長である、上記［５０］から［６３］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［６５］上記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、上記［５０］から［６４］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［６６］上記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つのさらなる機能的または非機能的タンパク質を含むタンパク質複合体の一部として提供され、任意選択で、上記少なくとも１つのさらなるタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、上記［５０］から［６５］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［６７］上記Ｃａｓタンパク質またはさらなるタンパク質が、上記Ｃａｓタンパク質またはタンパク質複合体のＮ終端および／またはＣ終端に、好ましくはＮ終端に融合または連結している、少なくとも１つの機能的部分を含む、上記［６５］または上記［６６］に記載の形質転換細胞。
［６８］上記少なくとも１つの機能的部分がタンパク質であり、任意選択で、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ−ヌクレアーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンメチラーゼ、アセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（共）活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構築タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質、シグナルペプチド、細胞内局在配列、抗体エピトープまたは親和性精製タグ、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）から選択される、上記［６５］から［６７］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［６９］上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼの天然の活性が不活化されており、上記Ｃａｓタンパク質が少なくとも１つの機能的部分に連結している、上記［６８］に記載の形質転換細胞。
［７０］上記少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼドメイン、好ましくはＦｏｋＩヌクレアーゼドメインである、上記［６５］から［６９］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［７１］上記少なくとも１つの機能的部分がマーカータンパク質である、上記［６５］から［６９］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［７２］上記二本鎖標的ポリヌクレオチドがｄｓＤＮＡであり、上記少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼまたはヘリカーゼ−ヌクレアーゼであり、上記改変が、所望の遺伝子座における一本鎖または二本鎖切断である、上記［６５］から［７０］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［７３］上記二本鎖標的ポリヌクレオチドがｄｓＤＮＡであり、上記機能的部分が、ＤＮＡ改変酵素（例えば、メチラーゼまたはアセチラーゼ）、転写活性因子または転写リプレッサーから選択され、上記結合、切断、標識または改変が、遺伝子発現の改変をもたらす、上記［６５］から［６９］のいずれかに記載の形質転換細胞、または上記［４２］に記載の方法。
［７４］上記Ｃａｓタンパク質が、発現ベクターから発現される、上記［６５］から［７０］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［７５］上記結合、切断、標識または改変が、所望の位置に、所望のヌクレオチド配列を改変または欠失および／もしくは挿入をもたらし、かつ／または上記結合、切断、標識または改変が、所望の遺伝子座にサイレンシング遺伝子発現をもたらす、上記［５０］から［７４］のいずれかに記載の形質転換細胞。
［７６］Ｃａｓタンパク質、二本鎖標的ポリヌクレオチドにおいて標的核酸配列を認識する少なくとも１つのターゲッティングＲＮＡ分子、および上記標的ポリヌクレオチドを含む、核タンパク質複合体であって、
上記Ｃａｓタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７７％の同一性の配列を有し、
上記二本鎖標的ポリヌクレオチドが、上記標的核酸配列を含む標的核酸鎖、ならびに上記標的核酸配列に相補的であるプロトスペーサー核酸配列および上記プロトスペーサー配列の３‘末端に直接隣接したプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含む非標的核酸鎖を含み、上記ＰＡＭ配列が、５‘−ＮＮＮＮＣＮＮ−３’を含み、上記核タンパク質複合体がヒト細胞におけるものではなく、任意選択で、上記細胞が胚性幹細胞ではない、核タンパク質複合体。
［７７］２０℃と１００℃の間の温度で、３０℃と８０℃の間の温度で、３７℃と７８℃の間の温度で、好ましくは５５℃超の温度で、より好ましくは５５℃と８０℃の間の温度で、さらにより好ましくは、５５℃と６５℃の間または６０℃と６５℃の間の温度で発生する、上記［７６］に記載の核タンパク質複合体。
［７８］上記標的核酸配列を含む上記二本鎖標的ポリヌクレオチドが上記Ｃａｓタンパク質により切断され、好ましくは上記切断がＤＮＡ切断である、上記［７６］または上記［７７］に記載の核タンパク質複合体。
［７９］上記標的配列を含む上記標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡであり、上記結合、切断、標識または改変が、上記標的ポリヌクレオチド中の二本鎖切断をもたらす、上記［７６］から［７８］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［８０］上記標的核酸配列を含む上記標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡであり、上記Ｃａｓタンパク質が、上記二本鎖ＤＮＡを切断する能力を欠き、上記核タンパク質複合体が存在することにより、上記標的ポリヌクレオチドの遺伝子サイレンシングがもたらされる、上記［７６］または上記［７７］に記載の核タンパク質複合体。
［８１］上記ＰＡＭ配列が、５’−ＮＮＮＮＣＮＮＡ−３’［配列番号４７］を含む、上記［７６］から［８０］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［８２］上記ＰＡＭ配列が、５’−ＮＮＮＮＣＳＡＡ−３’［配列番号４８］を含む、上記［８１］に記載の核タンパク質複合体。
［８３］上記ＰＡＭ配列が、５’−ＮＮＮＮＣＣＡＡ−３’［配列番号５０］を含む、上記［８２］に記載の核タンパク質複合体。
［８４］上記結合、切断、標識または改変が、２０℃と７０℃の間の温度で起こる、上記［８２］または上記［８３］に記載の核タンパク質複合体。
［８５］結合、切断、標識または改変が、２５℃と６５℃の間の温度で起こる、上記［８１］から上記［８４］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［８６］上記Ｃａｓタンパク質が、細菌、古細菌またはウイルスから、好ましくは好熱性細菌から得られる、上記［７６］から［８５］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［８７］上記Ｃａｓタンパク質が、ゲオバチルス（Geobacillus）属種、好ましくはゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）から得ることができる、上記［７６］から［８６］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［８８］上記ターゲティングＲＮＡ分子が、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、上記［７６］から［８７］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［８９］上記少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子の長さが、３５〜２００ヌクレオチド残基の範囲である、上記［７６］から［８８］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［９０］上記標的核酸配列が、１５〜３２ヌクレオチド残基長である、上記［７６］から［８９］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［９１］上記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、上記［７６］から［９０］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［９２］上記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つのさらなる機能的または非機能的タンパク質を含むタンパク質複合体の一部として提供され、任意選択で、上記少なくとも１つのさらなるタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、上記［７６］から［９１］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［９３］上記Ｃａｓタンパク質またはさらなるタンパク質が、上記Ｃａｓタンパク質またはタンパク質複合体のＮ終端および／もしくはＣ終端、好ましくはＣ終端に融合または連結している、少なくとも１つの機能的部分を含む、上記［９１］または上記［９２］に記載の核タンパク質複合体。
［９４］上記少なくとも１つの機能的部分がタンパク質であり、任意選択で、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ−ヌクレアーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンメチラーゼ、アセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（共）活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構築タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質、シグナルペプチド、細胞内局在配列、抗体エピトープまたは親和性精製タグ、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）から選択される、上記［９１］から［９３］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［９５］上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼの天然の活性が不活化されており、上記Ｃａｓタンパク質が少なくとも１つの機能的部分に連結している、上記［９４］に記載の核タンパク質複合体。
［９６］上記少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼドメイン、好ましくはＦｏｋＩヌクレアーゼドメインである、上記［９１］から［９５］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［９７］上記少なくとも１つの機能的部分がマーカータンパク質である、上記［９１］から［９５］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［９８］上記核酸がｄｓＤＮＡであり、上記少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼまたはヘリカーゼ−ヌクレアーゼであり、上記標的ポリヌクレオチドが、所望の遺伝子座における一本鎖または二本鎖切断を有する、上記［９１］から［９６］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［９９］上記核酸がｄｓＤＮＡであり、上記機能的部分が、ＤＮＡ改変酵素（例えば、メチラーゼまたはアセチラーゼ）、転写活性因子または転写リプレッサーから選択され、上記核タンパク質複合体形成により、遺伝子発現の改変がもたらされる、上記［９１］から［９５］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
［１００］上記核タンパク質形成により、所望の位置に、所望のヌクレオチド配列を改変または欠失および／もしくは挿入がもたらされ、かつ／または上記核タンパク質複合体形成により、所望の遺伝子座にサイレンシング遺伝子発現がもたらされる、上記［７６］から［９９］のいずれかに記載の核タンパク質複合体。