【手続補正書】
【提出日】令和2年6月15日(2020.6.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＭＩ１欠損性である霊長類の皮質神経細胞であり、アルツハイマー病の１つ以上のフェノタイプ特徴を示す単離細胞。
【請求項２】
前記１つ以上のフェノタイプ特徴が、軸索膨張、軸索セグメントの切断、β−アミロイド蓄積、Ｃ９９断片蓄積、ｐ−Ｔａｕ蓄積、シナプス萎縮、神経細胞アポトーシス、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３抗体を用いたヘテロクロマチン脱凝縮、ファロイジン染色を用いたＦ−アクチン束形成、及びこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の単離細胞。
【請求項３】
ＢＭＩ１が欠失しているか、あるいはＢＭＩ１遺伝的活性、ＢＭＩ遺伝子発現、ＢＭＩ１タンパク質機能、及び／又はＢＭＩ１タンパク質発現が低下及び／又は不活化している、請求項１又は請求項２に記載の単離細胞。
【請求項４】
ＢＭＩ１遺伝子に対するマイクロＲＮＡ、ＢＭＩ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、ＢＭＩ１遺伝子に対するｓｈＲＮＡ、ＣＲＥ−ｌｏｘｐを用いたＢＭＩ１遺伝子の遺伝的不活化、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いたＢＭＩ１遺伝子の遺伝的不活化、ＴＡＬＥＮを用いたＢＭＩ１遺伝子の遺伝的不活化、ＺＦＮを用いたＢＭＩ１遺伝子の遺伝的不活化、及びこれらの組合せのうちの１つ以上を用いる遺伝的不活化を介してＢＭＩ１が不活化されている、請求項１又は請求項２に記載の単離細胞。
【請求項５】
前記霊長類がヒトである、請求項１〜請求項４の何れか一項に記載の単離細胞。
【請求項６】
ヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞又はヒト胚性幹細胞である、請求項５に記載の単離細胞。
【請求項７】
前記アルツハイマー病が孤発性アルツハイマー病である、請求項１〜請求項６の何れか一項に記載の単離細胞。
【請求項８】
複数の請求項１に記載の単離細胞のインビトロ培養物を含む、認知症関連神経性疾患の細胞モデル。
【請求項９】
請求項１に記載の単離細胞が３次元的に培養される、請求項８に記載の細胞モデル。
【請求項１０】
前記細胞モデルが、アミロイドプラーク及びＴａｕ濃縮物を生じる、請求項８又は請求項９に記載の細胞モデル。
【請求項１１】
前記単離細胞が３Ｄマトリゲル（商標）マトリックス中で培養される、請求項８〜請求項１０の何れか一項に記載の細胞モデル。
【請求項１２】
星状細胞との共培養物をさらに含む、請求項８〜請求項１１の何れか一項に記載の細胞モデル。
【請求項１３】
前記皮質神経細胞及び前記星状細胞がヒト細胞である、請求項１２に記載の細胞モデル。
【請求項１４】
前記認知症関連神経性疾患がアルツハイマー病である、請求項８〜請求項１３の何れか一項に記載の細胞モデル。
【請求項１５】
前記認知症関連神経性疾患が、前頭側頭型認知症又はレビー小体型認知症である、請求項８〜請求項１４の何れか一項に記載の細胞モデル。
【請求項１６】
（ｉ）霊長類の皮質神経細胞を提供する工程、及び
（ｉｉ）ＢＭＩ１の発現又は生物活性を不活化又は抑制する工程
を含む、請求項１〜請求項７の何れか一項に記載の単離細胞を調製する方法。
【請求項１７】
請求項１〜請求項７の何れか一項に記載の単離細胞又は請求項８〜請求項１５の何れか一項に記載の細胞モデルと、
アッセイ緩衝液、対照、基質、標準物質、検出材料、実験室用品、及び使用者向けマニュアル又は指示書からなる群より選択される１つ以上の追加構成要素と、
を含む、抗アルツハイマー薬スクリーニング用キット。
【請求項１８】
請求項１〜請求項７の何れか一項に記載の単離細胞を、被験抗アルツハイマー化合物に曝露することと、
前記被験化合物が存在する状態で、アルツハイマー病の１つ以上のフェノタイプ特徴について前記単離細胞を評価することと、
アルツハイマー病の１つの、又は１つ以上の前記フェノタイプ特徴を抑制すること及び／又は減少させることが可能な被験化合物を選択することと、
を含む、抗アルツハイマー薬をスクリーニングする方法。
【請求項１９】
（ｉ）ＢＭＩ１欠損を有する細胞又は非ヒト動物を、試験される被験化合物と接触させることと、
（ｉｉ）アルツハイマー病の１つ以上のフェノタイプ特徴に対する前記被験化合物の活性を評価することと、
を含む、抗アルツハイマー薬候補を特定するためのスクリーニング方法。
【請求項２０】
前記１つ以上のフェノタイプ特徴が、軸索膨張、軸索セグメントの切断、β−アミロイド蓄積、Ｃ９９断片蓄積、ｐ−Ｔａｕ蓄積、シナプス萎縮、神経細胞アポトーシス、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３抗体を用いたヘテロクロマチン脱凝縮、ファロイジン染色を用いたＦ−アクチン束形成、及びこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記被験化合物との接触の存在下で、又は前記被験化合物との接触若しくは曝露の後で前記評価が実施される、請求項１８又は請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
以下の生物学的効果のうちの１つ以上を有する被験化合物を選択することを含む、請求項１８〜請求項２１の何れか一項に記載の方法：
軸索膨張の防止又は阻害；
軸索セグメントの切断の防止又は阻害；
β−アミロイド蓄積の防止又は阻害；
Ｃ９９断片蓄積の防止又は阻害；
ｐ−Ｔａｕ蓄積の防止又は阻害；
シナプス萎縮の防止又は阻害；
神経細胞アポトーシスの防止又は阻害；
Ｈ３Ｋ９ｍｅ３抗体を用いたヘテロクロマチン脱凝縮の防止又は阻害；
ファロイジン染色を用いたＦ−アクチン束形成の防止又は阻害；及び
核膜異常の防止又は阻害。
【請求項２３】
前記評価が、前記１つ以上のフェノタイプ特徴を、前記被験化合物に曝露された、又は曝露されていない野生型皮質ニューロンと比較することを含む、請求項１８〜請求項２２の何れか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記評価が、前記１つ以上のフェノタイプ特徴を、前記被験化合物に曝露されていない対照の細胞又は動物と比較することを含む、請求項１８〜請求項２３の何れか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ＢＭＩ１欠損を有する非ヒト動物の、アルツハイマー病の動物モデルとしての使用。
【請求項２６】
前記動物が、軸索膨張、軸索セグメントの切断、β−アミロイド蓄積、Ｃ９９断片蓄積、ｐ−Ｔａｕ蓄積、シナプス萎縮、神経細胞アポトーシス、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３抗体を用いたヘテロクロマチン脱凝縮、ファロイジン染色を用いたＦ−アクチン束形成、及びこれらの組合せからなる群より選択されるアルツハイマー病の１つ以上のフェノタイプ特徴を示す、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
前記動物がＢＭＩ１についてヘミ接合である、請求項２５又は請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記動物がマウスである、請求項２５〜請求項２７の何れか一項に記載の使用。
【請求項２９】
アルツハイマー病の研究のための、及び／又は抗アルツハイマー化合物候補の特定、検査、スクリーニング、及び／又は設計のための請求項２５〜請求項２８の何れか一項に記載の使用。
【請求項３０】
（ａ）請求項１〜請求項７の何れか一項に記載の単離細胞を被験抗アルツハイマー化合物に曝露する工程、
（ｂ）アルツハイマー病の１つ以上のフェノタイプ特徴について前記細胞を評価する工程、
（ｃ）アルツハイマー病の１つの、又は１つ以上の前記フェノタイプ特徴を抑制すること及び／又は減少させることが可能な被験化合物を選択する工程、並びに
（ｄ）工程（ｃ）の被験化合物の化学構造を改変して抗アルツハイマー活性が改善した改変化合物を得る工程
を含む、抗アルツハイマー薬を設計する方法。
【請求項３１】
前記改変化合物を用いて工程（ａ）〜（ｃ）を再度繰り返すこと、及び所望により工程（ｄ）を再度繰り返すことをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
（ａ）請求項１〜請求項７の何れか一項に記載の単離細胞を野生型皮質ニューロンと定量的プロテオーム比較解析又はゲノムワイド発現比較解析する工程、及び
（ｂ）発現又は翻訳後修飾が異なる遺伝子又はタンパク質を特定する工程、
を含み、
工程（ｂ）において特定された遺伝子又はタンパク質は抗アルツハイマー薬の生物学的標的候補である、抗アルツハイマー薬の生物学的標的候補を特定する方法。
【請求項３３】
（ｃ）請求項１〜請求項７の何れか一項に記載の単離細胞及び／又は前記野生型皮質ニューロンを抗アルツハイマー薬に曝露する工程、及び
（ｄ）曝露細胞及び／又は曝露皮質ニューロンを、工程（ａ）の定量的プロテオーム解析と比較定量的プロテオーム解析又は比較遺伝子発現解析する工程
をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
対象の脳細胞におけるＢＭＩ１活性を評価することを含み、
ＢＭＩ１活性の低下又は不在がアルツハイマー病の徴候である、対象におけるアルツハイマー病の有無の判定方法。
【請求項３５】
前記脳細胞が、海馬由来の細胞、前頭皮質由来の細胞、及び嗅内皮質由来の細胞からなる群より選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記評価が、ＢＭＩ１に対する親和性を有する放射性及び／又は蛍光性血液脳関門透過性分子を前記対象に投与することを含む、請求項３４又は請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記評価が、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）脳走査の使用を含む、請求項３４〜請求項３６の何れか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記評価が、組織生検の取得を含む、請求項３４〜請求項３７の何れか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記評価が、死後に実施される、請求項３４〜請求項３８の何れか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記評価が、ＢＭＩ１の発現レベルの検出及び／又はＢＭＩ１生物活性の検出を含む、請求項３４〜請求項３９の何れか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＢＭＩ１の発現レベルの検出及び／又はＢＭＩ１生物活性の検出が、ｑＰＣＲ、ＤＮＡマイクロアレイ、ＲＮＡ−シーケンシング、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、ウエスタンブロッティング、及び／又はこれらの組合せのうちのいずれか１つによって実施される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
対象の海馬、前頭皮質、及び／又は嗅内皮質におけるＢＭＩ１のエピジェネティックサイレンシングを検出することを含む、ヒト対象における孤発性アルツハイマー病の有無の判定方法。

【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
本明細書に記載される実施例及び実施形態は例示だけを目的としており、当業者はそれらの実施例及び実施形態を考慮した様々な改変又は変更を思いつき、それらの様々な改変又は変更が本発明及び添付されている特許請求の範囲内に含まれることが理解される。
（付記）
本開示は以下の態様を含む。
＜１＞  ＢＭＩ１欠損性である霊長類の皮質神経細胞であり、アルツハイマー病の１つ以上のフェノタイプ特徴を示す単離細胞。
＜２＞  前記１つ以上のフェノタイプ特徴が、軸索膨張、軸索セグメントの切断、β−アミロイド蓄積、Ｃ９９断片蓄積、ｐ−Ｔａｕ蓄積、シナプス萎縮、神経細胞アポトーシス、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３抗体を用いたヘテロクロマチン脱凝縮、ファロイジン染色を用いたＦ−アクチン束形成、及びこれらの組合せからなる群より選択される、＜１＞に記載の細胞。
＜３＞  ＢＭＩ１が欠失しているか、あるいはＢＭＩ１遺伝的活性、ＢＭＩ遺伝子発現、ＢＭＩ１タンパク質機能、及び／又はＢＭＩ１タンパク質発現が低下及び／又は不活化している、＜１＞又は＜２＞に記載の細胞。
＜４＞  ＢＭＩ１遺伝子に対するマイクロＲＮＡ、ＢＭＩ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、ＢＭＩ１遺伝子に対するｓｈＲＮＡ、ＣＲＥ−ｌｏｘｐを用いたＢＭＩ１遺伝子の遺伝的不活化、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いたＢＭＩ１遺伝子の遺伝的不活化、ＴＡＬＥＮを用いたＢＭＩ１遺伝子の遺伝的不活化、ＺＦＮを用いたＢＭＩ１遺伝子の遺伝的不活化、及びこれらの組合せのうちの１つ以上を用いる遺伝的不活化を介してＢＭＩ１が不活化されている、＜１＞又は＜２＞に記載の細胞。
＜５＞  前記霊長類がヒトである、＜１＞〜＜４＞の何れか一項に記載の細胞。
＜６＞  ヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞又はヒト胚性幹細胞である、＜５＞に記載の細胞。
＜７＞  前記アルツハイマー病が孤発性アルツハイマー病である、＜１＞〜＜６＞の何れか一項に記載の細胞。
＜８＞  複数の＜１＞に記載の皮質神経細胞のインビトロ培養物を含む、認知症関連神経性疾患の細胞モデル。
＜９＞  ＜１＞に記載の細胞が３次元的に培養される、＜８＞に記載の細胞モデル。
＜１０＞  前記細胞モデルが、アミロイドプラーク及びＴａｕ濃縮物を生じる、＜８＞又は＜９＞に記載の細胞モデル。
＜１１＞  前記神経細胞が３Ｄマトリゲル（商標）マトリックス中で培養される、＜８＞〜＜１０＞の何れか一項に記載の細胞モデル。
＜１２＞  星状細胞との共培養物をさらに含む、＜８＞〜＜１１＞の何れか一項に記載の細胞モデル。
＜１３＞  前記皮質神経細胞及び前記星状細胞がヒト細胞である、＜１２＞に記載の細胞モデル。
＜１４＞  前記認知症関連神経性疾患がアルツハイマー病である、＜８＞〜＜１３＞の何れか一項に記載の細胞モデル。
＜１５＞  前記認知症関連神経性疾患が、前頭側頭型認知症又はレビー小体型認知症である、＜８＞〜＜１４＞の何れか一項に記載の細胞モデル。
＜１６＞  
（ｉ）霊長類の皮質神経細胞を提供する工程、及び
（ｉｉ）ＢＭＩ１の発現又は生物活性を不活化又は抑制する工程
を含む、＜１＞〜＜７＞の何れか一項に記載の細胞を調製する方法。
＜１７＞  ＜１＞〜＜７＞の何れか一項に記載の神経細胞又は＜８＞〜＜１５＞の何れか一項に記載の細胞モデルと、
アッセイ緩衝液、対照、基質、標準物質、検出材料、実験室用品、及び使用者向けマニュアル又は指示書からなる群より選択される１つ以上の追加構成要素と、
を含む、抗アルツハイマー薬スクリーニング用キット。
＜１８＞  ＜１＞〜＜７＞の何れか一項に記載の細胞を、被験抗アルツハイマー化合物に曝露することと、
前記被験化合物が存在する状態で、アルツハイマー病の１つ以上のフェノタイプ特徴について前記細胞を評価することと、
アルツハイマー病の前記１つの、又は１つ以上のフェノタイプ特徴を抑制すること及び／又は減少させることが可能な被験化合物を選択することと、
を含む、抗アルツハイマー薬をスクリーニングする方法。
＜１９＞  
（ｉ）ＢＭＩ１欠損を有する細胞又は動物を、試験される被験化合物と接触させることと、
（ｉｉ）アルツハイマー病の１つ以上のフェノタイプ特徴に対する前記被験化合物の活性を評価することと、
を含む、抗アルツハイマー薬候補を特定するためのスクリーニング方法。
＜２０＞
前記１つ以上のフェノタイプ特徴が、軸索膨張、軸索セグメントの切断、β−アミロイド蓄積、Ｃ９９断片蓄積、ｐ−Ｔａｕ蓄積、シナプス萎縮、神経細胞アポトーシス、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３抗体を用いたヘテロクロマチン脱凝縮、ファロイジン染色を用いたＦ−アクチン束形成、及びこれらの組合せからなる群より選択される、＜１９＞に記載の方法。
＜２１＞  前記被験化合物との接触の存在下で、又は前記被験化合物との接触若しくは曝露の後で前記評価が実施される、＜１８＞又は＜１９＞に記載の方法。
＜２２＞  前記選択が、以下の生物学的効果のうちの１つ以上を有する被験化合物を選択することを含む、＜１８＞〜＜２１＞の何れか一項に記載の方法：
軸索膨張の防止又は阻害；
軸索セグメントの切断の防止又は阻害；
β−アミロイド蓄積の防止又は阻害；
Ｃ９９断片蓄積の防止又は阻害；
ｐ−Ｔａｕ蓄積の防止又は阻害；
シナプス萎縮の防止又は阻害；
神経細胞アポトーシスの防止又は阻害；
Ｈ３Ｋ９ｍｅ３抗体を用いたヘテロクロマチン脱凝縮の防止又は阻害；
ファロイジン染色を用いたＦ−アクチン束形成の防止又は阻害；及び
核膜異常の防止又は阻害。
＜２３＞  前記評価が、前記１つ以上のフェノタイプ特徴を、前記被験化合物に曝露された、又は曝露されていない野生型皮質ニューロンと比較することを含む、＜１８＞〜＜２２＞の何れか一項に記載の方法。
＜２４＞  前記評価が、前記１つ以上のフェノタイプ特徴を、前記被験化合物に曝露されていない対照の細胞又は動物と比較することを含む、＜１８＞〜＜２３＞の何れか一項に記載の方法。
＜２５＞  ＢＭＩ１欠損を有する非ヒト動物の、アルツハイマー病の動物モデルとしての使用。
＜２６＞  前記動物が、軸索膨張、軸索セグメントの切断、β−アミロイド蓄積、Ｃ９９断片蓄積、ｐ−Ｔａｕ蓄積、シナプス萎縮、神経細胞アポトーシス、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３抗体を用いたヘテロクロマチン脱凝縮、ファロイジン染色を用いたＦ−アクチン束形成、及びこれらの組合せからなる群より選択されるアルツハイマー病の１つ以上のフェノタイプ特徴を示す、＜２５＞に記載の使用。
＜２７＞  前記動物がＢＭＩ１についてヘミ接合である、＜２５＞又は＜２６＞に記載の使用。
＜２８＞  前記動物がマウスである、＜１８＞〜＜２７＞の何れか一項に記載の使用。
＜２９＞  アルツハイマー病の研究のための、及び／又は抗アルツハイマー化合物候補の特定、検査、スクリーニング、及び／又は設計のための＜１８＞〜＜２８＞の何れか一項に記載の使用。
＜３０＞
（ａ）＜１＞〜＜７＞の何れか一項に記載の細胞を被験抗アルツハイマー化合物に曝露する工程、
（ｂ）アルツハイマー病の１つ以上のフェノタイプ特徴について前記細胞を評価する工程、
（ｃ）アルツハイマー病の前記１つの、又は１つ以上のフェノタイプ特徴を抑制すること及び／又は減少させることが可能な被験化合物を選択する工程、並びに
（ｄ）工程（ｃ）の被験化合物の化学構造を改変して抗アルツハイマー活性が改善した改変化合物を得る工程
を含む、抗アルツハイマー薬を設計する方法。
＜３１＞  前記改変化合物を用いて工程（ａ）〜（ｃ）を再度繰り返すこと、及び所望により工程（ｄ）を再度繰り返すことをさらに含む、＜３０＞に記載の方法。
＜３２＞
（ａ）＜１＞〜＜７＞の何れか一項に記載の細胞を野生型皮質ニューロンと定量的プロテオーム比較解析又はゲノムワイド発現比較解析する工程、及び
（ｂ）発現又は翻訳後修飾が異なる遺伝子又はタンパク質を特定する工程、
を含み、
工程（ｂ）において特定された遺伝子又はタンパク質は抗アルツハイマー薬の生物学的標的候補である、抗アルツハイマー薬の生物学的標的候補を特定する方法。
＜３３＞
（ｃ）＜１＞〜＜７＞の何れか一項に記載の細胞及び／又は前記野生型皮質ニューロンを抗アルツハイマー薬に曝露する工程、及び
（ｄ）曝露細胞及び／又は曝露皮質ニューロンを、工程（ａ）の定量的プロテオーム解析と比較定量的プロテオーム解析又は比較遺伝子発現解析する工程
をさらに含む、＜３２＞に記載の方法。
＜３４＞  対象の脳細胞におけるＢＭＩ１活性を評価することを含み、
ＢＭＩ１活性の低下又は不在がアルツハイマー病の徴候である、対象におけるアルツハイマー病を診断する方法。
＜３５＞  前記脳細胞が、海馬由来の細胞、前頭皮質由来の細胞、及び嗅内皮質由来の細胞からなる群より選択される、＜３４＞に記載の方法。
＜３６＞  前記評価が、ＢＭＩ１に対する親和性を有する放射性及び／又は蛍光性血液脳関門透過性分子を前記対象に投与することを含む、＜３４＞又は＜３５＞に記載の方法。
＜３７＞  前記評価が、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）脳走査の使用を含む、＜３４＞〜＜３６＞の何れか一項に記載の方法。
＜３８＞  前記評価が、組織生検の取得を含む、＜３４＞〜＜３７＞の何れか一項に記載の方法。
＜３９＞  前記評価が、死後に実施される、＜３４＞〜＜３８＞の何れか一項に記載の方法。
＜４０＞  前記評価が、ＢＭＩ１の発現レベルの検出及び／又はＢＭＩ１生物活性の検出を含む、＜３４＞〜＜３９＞の何れか一項に記載の方法。
＜４１＞  前記ＢＭＩ１の発現レベルの検出及び／又はＢＭＩ１生物活性の検出が、ｑＰＣＲ、ＤＮＡマイクロアレイ、ＲＮＡ−シーケンシング、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、ウエスタンブロッティング、及び／又はこれらの組合せのうちのいずれか１つによって実施される、＜４０＞に記載の方法。
＜４２＞  対象の海馬、前頭皮質、及び／又は嗅内皮質におけるＢＭＩ１のエピジェネティックサイレンシングを検出することを含む、ヒト対象における孤発性アルツハイマー病を診断する方法。