【手続補正書】
【提出日】令和2年11月2日(2020.11.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
調節可能なヒト細胞であって、遺伝子操作されたゲノムを含み、前記遺伝子操作されたゲノムは、ノックアウトまたは下方制御された、栄養要求性を生じさせる遺伝子を含み、調節可能なヒト細胞の増殖は栄養要求性因子により調節される、調節可能なヒト細胞。
【請求項２】
前記栄養要求性因子は、栄養素、酵素、ｐＨ変化、温度変化、非有機分子、非必須アミノ酸、部分の濃度変化、およびニッチ環境からなる群から選択される、請求項１に記載の調節可能な細胞。
【請求項３】
ノックアウトまたは下方制御された前記遺伝子は、表１に列挙したものから選択される、請求項１または２に記載の調節可能な細胞。
【請求項４】
ノックアウトまたは下方制御された前記遺伝子は、ウリジン一リン酸合成酵素遺伝子またはホロカルボキシラーゼ合成酵素遺伝子である、請求項３に記載の調節可能な細胞。
【請求項５】
前記細胞は、リンパ球、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性幹細胞、体性幹細胞、造血幹細胞または末梢血単核細胞である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の調節可能な細胞。
【請求項６】
前記細胞は、Ｔ細胞である、請求項５に記載の調節可能な細胞。
【請求項７】
前記Ｔ細胞は、ＣＡＲ−Ｔ細胞である、請求項６に記載の調節可能な細胞。
【請求項８】
前記細胞は、ｉＰＳまたは胚性幹細胞である、請求項５に記載の調節可能な細胞。
【請求項９】
前記操作ゲノムは、ウリジン一リン酸合成酵素遺伝子、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）遺伝子、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（ＤＰＹＤ）遺伝子、フェレドキシンレダクターゼ（ＦＤＸＲ）遺伝子、またはカルバモイルリン酸シンテターゼ（ＣＡＤ）遺伝子のノックアウトを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の調節可能な細胞。
【請求項１０】
複数の請求項１〜９のいずれか一項に記載の調節可能な細胞と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項１１】
栄養要求性因子をさらに含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記調節可能な細胞は、ノックアウトされたウリジン一リン酸合成酵素遺伝子を含み、前記栄養要求性因子はウラシル、ウリジンまたはＵＭＰである、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
対象における疾患を治療するための医薬組成物であって、複数の請求項１〜９のいずれか一項に記載の調節可能な細胞を含み、前記疾患は、がん、パーキンソン病、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、自己免疫状態、過剰増殖性障害または状態、悪性転化、肝臓状態、遺伝性状態、若年発症糖尿病および眼コンパートメント状態からなる群から選択される、医薬組成物。
【請求項１４】
薬学的に許容される賦形剤と栄養要求性因子とをさらに含む、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記対象において、１つまたは複数の栄養要求性因子と共に使用される、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記調節可能な細胞は、ノックアウトされたウリジン一リン酸合成酵素遺伝子を含み、共に使用される前記栄養要求性因子はウリジンである、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
調節可能なヒト細胞を生成する方法であって、
（ａ）ヒト細胞のプールを得るステップと、
（ｂ）ヌクレアーゼシステムを前記ヒト細胞に送達して、栄養要求性を生じさせる標的遺伝子に付加、欠失または置換を導入し、それによってその遺伝子の発現をノックアウトまたは下方制御するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で作製された遺伝子操作されたヒト細胞を栄養要求性因子と一緒に培養し、前記調節可能なヒト細胞を作製するステップと
を含む方法。
【請求項１８】
前記標的遺伝子は表１から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的遺伝子はウリジン一リン酸合成酵素またはホロカルボキシラーゼ合成酵素である、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞のプールは、リンパ球、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性幹細胞、体性幹細胞、造血幹細胞および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞のプールは、Ｔ細胞を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞のプールは、ｉＰＳまたは胚性幹細胞を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記ヌクレアーゼシステムは、ヌクレアーゼとしてのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ、および標的細胞に特異的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記栄養要求性因子は、表１に列挙した因子から選択される、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
標的遺伝子は、ウリジン一リン酸合成酵素遺伝子、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）遺伝子、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（ＤＰＹＤ）遺伝子、フェレドキシンレダクターゼ（ＦＤＸＲ）遺伝子、またはカルバモイルリン酸シンテターゼ（ＣＡＤ）遺伝子であり、前記前記栄養要求性因子はウラシル、ウリジンまたはＵＭＰであり、または、標的遺伝子はホロカルボキシラーゼ合成酵素遺伝子であり、栄養要求性因子はビオチンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
標的遺伝子は、ウリジン一リン酸合成酵素遺伝子であり、前記栄養要求性因子はウラシル、ウリジンまたはＵＭＰであり、（ｄ）ステップ（ｂ）で作製された遺伝子操作されたヒト細胞、または、ステップ（ｃ）で作製された調節可能なヒト細胞を（ａ）ウラシル、ウリジンまたはＵＭＰおよび（ｂ）５−ＦＯＡの両方の存在下で培養するステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４４】
[実施例９]
インビボ分析
インビトロで検証された栄養要求性ノックアウト細胞系をインビボで分析してよい。これらの細胞系は、ヒトにおける栄養要求性因子の毒性およびバイオアベイラビリティの制約を受ける。遺伝子ノックアウト細胞系は、ヒトＴ細胞または任意の他のリンパ球から操作される。細胞系による条件付きインビトロ増殖は、栄養要求性因子の存在下で実証され、栄養要求性因子の非存在下では実証されない。因子に対して栄養要求性であることが確認された細胞系、例えば栄養要求性応答システムまたは要素を含むヒトリンパ球をマウスモデルに投与してよい。栄養要求性因子添加物を摂取するマウスのみが、栄養要求性応答システムまたは要素である栄養要求性遺伝子欠失を含むヒトリンパ球の増殖を維持すると仮定されている。さらに、マウス食物源から栄養素を除去すると、細胞増殖はインビボで停止する。
また、本発明は以下を提供する。
［１］
調節可能なヒト細胞系であって、栄養要求性応答システムを含むかまたはコードするように操作された操作ゲノムを含み、遺伝子の発現または活性がノックアウトまたは下方制御されて栄養要求性が生じている、調節可能なヒト細胞系。
［２］
前記栄養要求性応答システムまたは要素は、栄養素、酵素、ｐＨ変化、温度変化、非有機分子、非必須アミノ酸、部分の濃度変化、およびニッチ環境からなる群から選択される栄養要求性因子の存在に応答する、［１］に記載の調節可能な細胞系。
［３］
正常な生理的条件下では、前記栄養素または前記酵素は、細胞系毒性でも、ヒトにおいて前記調節可能な細胞系を維持するのに十分な濃度でバイオアベイラブルでもない、［２］に記載の調節可能な細胞系。
［４］
前記栄養素は、表１に列挙したものから選択される、［２］または［３］に記載の調節可能な細胞系。
［５］
前記栄養素はウラシルまたはビオチンである、［２］〜［４］のいずれか一項に記載の調節可能な細胞系。
［６］
ノックアウトまたは下方制御された前記遺伝子は、表１に列挙したものから選択される、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の調節可能な細胞系。
［７］
ノックアウトまたは下方制御された前記遺伝子は、ウリジン一リン酸合成酵素またはホロカルボキシラーゼ合成酵素である、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の調節可能な細胞系。
［８］
前記細胞系は、リンパ球、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性幹細胞、体性幹細胞、造血幹細胞および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からなる群から選択される少なくとも１つの細胞タイプを含む、［１］〜［７］のいずれか一項に記載の調節可能な細胞系。
［９］
前記細胞系は、Ｔ細胞系である、［１］〜［８］のいずれか一項に記載の調節可能な細胞系。
［１０］
前記操作ゲノムは治療用産物、任意選択でサイトカイン、抗原、および幹細胞からなる群から選択される少なくとも１つを標的とする治療用産物をさらに含むかまたはコードする、［１］〜［９］のいずれか一項に記載の調節可能な細胞系。
［１１］
前記操作ゲノムは、前記栄養要求性因子を産生または代謝するタンパク質をコードする遺伝子のノックアウトを含む、［１］〜［１０］のいずれか一項に記載の調節可能な細胞系。
［１２］
［１］〜［１１］のいずれか一項に記載の調節可能な細胞系と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
［１３］
無菌である、［１２］に記載の医薬組成物。
［１４］
栄養要求性因子をさらに含む、［１３］に記載の医薬組成物。
［１５］
（ａ）ヒトへの投与、または（ｂ）疾患、障害もしくは状態の治療に使用するための、［１］〜［１１］のいずれか一項に記載の調節可能な細胞系または［１２］〜［１４］のいずれか一項に記載の組成物。
［１６］
細胞系（ａ）ヒトへの投与、または（ｂ）疾患、障害もしくは状態の治療に使用するための、［１］〜［１１］のいずれか一項に記載の調節可能な細胞系または［１２］もしくは［１３］に記載の組成物であって、栄養要求性因子が前記細胞系または組成物と同時にまたは連続して投与される、細胞系または組成物。
［１７］
対象における疾患、障害または状態を治療する方法であって、（ａ）［１］〜［１１］のいずれか一項に記載の調節可能なヒト細胞系を前記対象に投与すること、および（ｂ）前記調節可能なヒト細胞系の増殖を促進するのに十分な量で栄養要求性因子を前記対象に投与することを含む方法。
［１８］
対象における疾患、障害または状態を調節可能な細胞系で治療する方法であって、
（ｉ）前記対象には存在しない栄養素、酵素、ｐＨ変化、温度変化、部分の濃度変化、および／またはニッチ環境に対して栄養要求性であるヒト細胞系を生成すること、
（ｉｉ）前記対象を、得られたステップ（ｉ）の前記栄養要求性細胞系に接触させること、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の前記対象を、前記対象には以前に存在しなかった前記対象における栄養素、酵素、ｐＨおよび／または温度を変化させる部分、および細胞のニッチ環境から選択される栄養要求性因子に接触させることであって、前記栄養要求性因子が、前記栄養要求性システムまたは要素を活性化して、前記細胞系の増殖および／または前記対象のための１つまたは複数の治療物の発現をもたらすこと
を含む方法。
［１９］
［１］〜［１１］のいずれか一項に記載の調節可能なヒト細胞系を含む、ヒトへの投与に使用するための栄養素。
［２０］
前記調節可能なヒト細胞系は治療用産物をコードする操作ゲノムを有し、および前記栄養素は、対象における疾患、障害、または状態を治療するための有効量の前記治療用産物の発現を誘導するのに十分な量で投与される、［１９］に記載の使用のための栄養素。
［２１］
（ａ）前記栄養素はウラシルであり、かつウリジン一リン酸合成酵素は前記調節可能なヒト細胞系においてノックアウトもしくは下方制御されている、または（ｂ）前記栄養素はビオチンであり、かつホロカルボキシラーゼ合成酵素は前記調節可能なヒト細胞系においてノックアウトもしくは下方制御されている、［１９］または［２０］に記載の使用のための栄養素。
［２２］
前記疾患、前記障害、または前記状態は、がん、パーキンソン病、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、自己免疫状態、過剰増殖性障害または状態、悪性転化、肝臓状態、遺伝性状態、若年発症糖尿病および眼コンパートメント状態からなる群から選択される、［１５］もしくは［１６］に記載の使用のための細胞系もしくは組成物、［１７］もしくは［１８］に記載の方法、または［２０］もしくは［２１］に記載の使用のための栄養素。
［２３］
前記疾患、前記障害、または前記状態は、筋肉系、骨格系、循環器系、神経系、リンパ系、呼吸器系、内分泌系、消化系、排せつ系、および生殖系からなる群から選択される少なくとも１つの体の組織に影響を及ぼす、［１５］もしくは［１６］に記載の使用のための細胞系もしくは組成物、［１７］もしくは［１８］に記載の方法、または［２０］〜［２２］のいずれか一項に記載の使用のための栄養素。
［２４］
前記細胞系は再生性である、［１５もしくは［１６］に記載の使用のための細胞系もしくは組成物、［１７］もしくは［１８］に記載の方法、または［２０］〜［２３］のいずれか一項に記載の使用のための栄養素。
［２５］
前記対象が複数の調節可能な細胞系に接触する、［１５］もしくは［１６］に記載の使用のための細胞系もしくは組成物、［１７］もしくは［１８］に記載の方法、または［２０］〜［２４］のいずれか一項に記載の使用のための栄養素。
［２６］
前記対象が１つまたは複数の栄養要求性因子に接触する、［１５］もしくは［１６］に記載の使用のための細胞系もしくは組成物、［１７］もしくは［１８］に記載の方法、または［２０］〜［２５］のいずれか一項に記載の使用のための栄養素。
［２７］
ステップ（ｉｉｉ）は前記栄養素または前記酵素の局所的な放出を含む、［１７］、［１８または［２２］〜［２６］のいずれか一項に記載の方法。
［２８］
前記局所的な放出は生体適合性デバイスの利用を介して達成される、［２７］に記載の方法。
［２９］
前記生体適合性デバイスは前記対象における前記細胞系の拡散を制限する、［２８］に記載の方法。
［３０］
前記対象における前記調節可能な細胞系の治療効果を枯渇させるため、または前記調節可能な細胞系において細胞死を誘導するために前記栄養要求性因子を除去することをさらに含む、［１５］もしくは［１６］に記載の使用のための細胞系もしくは組成物、または［１７］、［１８］もしくは［２２］〜［２９］のいずれか一項に記載の方法。
［３１］
前記治療効果は、分子輸送、細胞死の誘導、追加の細胞の動員、および細胞増殖からなる群から選択される少なくとも１つを含む、［１５］もしくは［１６］に記載の使用のための細胞系もしくは組成物、または［１７］、［１８］もしくは［２２］〜［３０］のいずれか一項に記載の方法。
［３２］
前記栄養要求性因子は局所的に放出される栄養素または酵素であり、前記放出は、任意選択で生体適合性デバイスの利用を介して達成され、前記デバイスは任意選択で前記細胞系の拡散を制限する、［１６］に記載の使用のための細胞系または組成物。
［３３］
前記細胞系はステップ（ｉ）より前に前記対象から得たものである、［１８］または［２２］〜［３１］のいずれか一項に記載の方法。
［３４］
前記細胞は、ヌクレアーゼを使用して標的遺伝子に１つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失または置換を導入し、それによってその遺伝子の発現をノックアウトまたは下方制御することによって、ステップ（ｉ）において栄養要求性にされる、［１８］または［２２］〜［３１］のいずれか一項に記載の方法。
［３５］
［１］〜［９］のいずれか一項に記載の調節可能なヒト細胞系を生成する方法であって、
（ａ）細胞のプールを得るステップと、
（ｂ）ヌクレアーゼを使用して標的遺伝子に付加、欠失または置換を導入し、それによってその遺伝子の発現をノックアウトまたは下方制御するステップと、
（ｃ）栄養要求性をスクリーニングするステップと
を含む方法。
［３６］
前記標的遺伝子は表１から選択される、［３４］または［３５］に記載の方法。
［３７］
前記標的遺伝子はウリジン一リン酸合成酵素またはホロカルボキシラーゼ合成酵素から選択される、［３４］〜［３６］のいずれか一項に記載の方法。
［３８］
前記細胞はリンパ球（Ｔ細胞など）、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性幹細胞、体性幹細胞、造血幹細胞および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、［３４］〜［３７］のいずれか一項に記載の方法。
［３９］
前記ヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼである、［３４］〜［３８］のいずれか一項に記載の方法。
［４０］
前記細胞は表１に列挙した因子に対して栄養要求性である、［３４］〜［３９］のいずれか一項に記載の方法。
［４１］
前記細胞はウラシルまたはビオチンに対して栄養要求性である、［３４］〜［４０］のいずれか一項に記載の方法。