(57)【要約】  【課題】  ＧＲＰ７８の発現誘導を抑制する物質を探索し、新規抗がん剤を見い出すこと。  【解決手段】  本発明者は、ＧＲＰ７８の発現誘導を抑制する物質として、「化１」の化学式で表される新規化合物を新規に見い出し、プラナスタチンと命名した。プラナスタチンは、公知化合物のＳＷ−１６３Ａと類似構造を持つ物質で、放線菌のストレプトマイセス  ヴィオラセオニガー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｖｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ）  ４５２１−ＳＶＳ３株などによって、生産できる。本発明に係る化合物を少なくとも含有する医薬組成物は、抗がん剤として、有効な可能性がある。  【化１】2006101073.tif 000019  【選択図】  図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式［化１］で表されるプラナスタチン又はその塩。
【化１】
2006101073.tif 000015
（式中、置換基Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジンのいずれかのアミノ酸の側鎖構造を表す。）
【請求項２】
下記の化学式［化２］で表されるプラナスタチンＡ又はその塩。
【化２】
2006101073.tif 000016
【請求項３】
請求項１記載のプラナスタチン又はその塩を有効成分として含有する抗がん剤。
【請求項４】
下記の一般式［化３］で表される化合物又はその塩を有効成分として含有する抗がん剤。
【化３】
2006101073.tif 000017
（式中、置換基Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジンのいずれかのアミノ酸の側鎖構造を表す。）
【請求項５】
下記の化学式［化４］で表されるＳＷ１６３Ａ又はその塩を有効成分として含有する抗がん剤。
【化４】
2006101073.tif 000018
【請求項６】
請求項１記載のプラナスタチンを生産できる、ストレプトマイセス  ヴィオラセオニガー  ４５２１−ＳＶＳ３株（茨城県つくば市東１−１−１中央第６に所在の独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０５４８  寄託日平成１８年３月３日）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＧＲＰ７８の発現を抑制する新規化合物「プラナスタチン」、ＧＲＰ７８の発現を抑制する化合物（「ＳＷ１６３Ａ」などネオアンチマイシン類縁体）、前記化合物を少なくとも含有する抗がん剤、並びに前記化合物を生産できる放線菌株「ストレプトマイセス  ヴィオラセオニガー  ４５２１−ＳＶＳ３株」、に関する。
【背景技術】
【０００２】
小胞体は、真核生物の細胞内小器官の一つで、タンパク質の合成、折り畳み、糖鎖修飾などを行う。その小胞体内に、未成熟なタンパク質が蓄積した状態を、「小胞体ストレス」という。例えば、グルコース飢餓などのストレス条件下では、タンパク質の折りたたみ（フォールディング）が不完全となり、小胞体内に、未成熟なタンパク質が蓄積し、小胞体ストレスの状態になる。
分子シャペロンとは、タンパク質合成過程において、合成タンパク質の折りたたみ（フォールディング）を制御するタンパク質をいう。真核生物では、「ＨＳＰ（Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）７０」ファミリーと「シャペロニン（Ｈｓｐ６０）」ファミリーが代表的なものとして知られている。
細胞には、小胞体ストレスに対する防御機構が存在することが知られている。小胞体内に、折りたたみの不完全なタンパク質が蓄積すると、分子シャペロンの発現が誘導される。細胞は、分子シャペロンの発現を誘導することにより、タンパク質の折りたたみを促進し、小胞体ストレスから細胞を防御する。
そして、分子シャペロンの発現誘導によって小胞体ストレスが解消されない場合、アポトーシス（細胞死）に至る経路が活性化される（非特許文献１参照）。
なお、小胞体ストレスは、ツニカマイシンなどの化合物によって、惹起されることが知られている。【０００３】
ＧＲＰ７８（Ｇｌｕｃｏｓｅ−Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ７８−ｋＤ）は、ＨＳＰＡ５（Ｈｅａｔ−Ｓｈｏｃｋ  ７０ｋＤ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ５）若しくはＢＩＰ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ−ＢＩｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）とも呼ばれるタンパク質で、ＨＳＰ７０ファミリーに属する、ストレス応答型の分子シャペロンであり、小胞体内に存在する。
ＧＲＰ７８は、動物細胞において、グルコース飢餓条件下、若しくはツニカマイシンなどの存在下で、発現が誘導されることが知られている（非特許文献１など参照）。【０００４】
固形がんは、一般的に、正常な組織と異なり、グルコース飢餓状態の領域を持つことが知られており（非特許文献３など参照）、また、ＧＲＰ７８の発現が誘導されることが報告されている（非特許文献４など参照）。その他、グルコース飢餓条件下などにおいて、ＧＲＰ７８の発現誘導がアポトーシス誘導を抑制することが報告されている（非特許文献５参照）。
前記の各知見は、グルコース飢餓状態において、ＧＲＰ７８の発現誘導を抑制することによりアポトーシスなどを惹起できること、即ち、ＧＲＰ７８の発現誘導を抑制することにより飢餓状態の細胞（がん細胞）を死滅できる可能性を示唆する。
そこで、新規抗がん剤として、ＧＲＰ７８の発現誘導を抑制する物質を探索する試みが、各種、行われている（特許文献１、非特許文献３〜非特許文献９など参照）。【０００５】
ここで、本発明と関連性のある化合物、ネオアンチマイシン類縁体について説明する。ネオアンチマイシン類縁体は、下記の一般式［化５］で表される化合物で、ＳＷ１６３Ａ、ＳＷ１６３Ｂ、ネオアンチマイシン（Ｎｅｏａｎｔｉｍｙｃｉｎ）などが知られている。
【化５】
2006101073.tif 000002
【０００６】
ＳＷ１６３Ａは、Ｒ１がメチル基、Ｒ２がアンテイソブチル基の化合物であり、ＳＷ１６３Ｂは、Ｒ１がメチル基、Ｒ２がイソプロピル基の化合物である。また、ネオアンチマイシンは、Ｒ１がイソプロピル基、Ｒ２がアンテイソブチル基の化合物である。【０００７】
ＳＷ−１６３ＡとＳＷ−１６３Ｂは、放線菌「ストレプトマイセス」属の菌株の代謝産物から同定された物質で、免疫抑制剤としての報告はあるが（非特許文献１０）、具体的な作用・用途は報告されていない。ネオアンチマイシンは、その化学構造が知られているが（例えば非特許文献１１参照）、具体的な作用・用途は報告されていない。ＳＷ−１６３Ａの化学構造を、下記の［化４］に示す。
【化４】
2006101073.tif 000003
【特許文献１】ＰＣＴ／ＪＰ０２／１２２３７
【非特許文献１】生化学辞典  第３版（東京化学同人）：ｐ４２２（グルコース調節タンパク質の項）、ｐ６０７（ＧＲＰ９４の項）など。
【非特許文献２】実験医学増刊、「成熟・展開するアポトーシス研究」、羊土社、２００４年発行：ｐ６６〜７２（小胞体ストレスによるアポトーシス）
【非特許文献３】Tomida A et al, “Drug resistance mediated by cellular stressresponse to the microenvironment of solid tumors” Anticancer Drug Des (2):169-77 (1999)
【非特許文献４】Jamora C, et al, “Inhibition of tumor progression by suppression ofstress protein GRP78/Bip induction in fibrosarcoma B/C10ME” Proc Natl Acad SciUSA. (15):7690-4 (1996)
【非特許文献５】Miyake H., et al “Stress protein GRP78 prevents apoptosis induced bycalcium ionophore, ionomycin, in human prostate cancer cells” J Cell Biochem.(3):396-408 (2000)
【非特許文献６】Hae-Ryong Park, et al “Versipelostatin, a novel GRP78/Bip molecularchaperone down-regulator of microbial origin” Tetrahedron Letters(43):6941-6945 (2002)
【非特許文献７】Park HR, et al “Effect on tumor cells of blocking survival responseto glucose deprivation” J Natl Cancer Inst. (17):1266-7 (2004)
【非特許文献８】Park HR., et al “Effect on tumor cells of blocking survival responseto glucose deprivation” J Natl Cancer Inst (17):1300-10 (2004)
【非特許文献９】Lee AS., et al “The glucose-regulated protein: stress induction andclinical application” Trends Biochem Sci. (8):504-10 (2001)
【非特許文献１０】Takahashi K., et al “Sw-163A and B, novel immunosuppressantsproduced by Streptomyces sp.” J Antibiot (11):867-73 (2001)
【非特許文献１１】Takeda Y., et al “Nuclear magnetic resonance and biosyntheticstudies of neoantimycin and structure elucidation of isoneoantimycin, a minormetabolite related to neoantimycin.” J Nat Prod (8):978-81 (1998)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前記の通り、がん細胞において、ＧＲＰ７８の発現誘導を抑制する物質は、抗がん剤として、有効な可能性がある。【０００９】
そこで、本発明は、ＧＲＰ７８の発現誘導を抑制する物質を探索し、新規抗がん剤を見い出すことを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、前記探索を行った結果、ＧＲＰ７８の発現誘導を抑制する物質として、下記の一般式［化１］で表される新規化合物を新規に見い出し、プラナスタチン（Ｐｒｕｎｕｓｔａｔｉｎ）と命名した。また、プラナスタチンの化学構造のうち、Ｒ１がメチル基、Ｒ２がアンテイソブチル基の化合物を、プラナスタチンＡと命名した。【００１１】
そこで、本発明では、下記の一般式［化１］で表される新規化合物のプラナスタチン又はその塩、並びに下記の化学式［化２］で表される新規化合物のプラナスタチンＡ又はその塩、を提供する。なお、一般式［化１］中、置換基Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジンのいずれかのアミノ酸の側鎖構造を表す。上記構造のうち、置換基Ｒ１、Ｒ２が、それぞれ、メチル基（アラニンの側鎖構造）、イソプロピル基（バリンの側鎖構造）、アンテイソブチル基（ロイシンの側鎖構造）、のいずれかである場合が、特に、好適である。
【化１】
2006101073.tif 000004
【化２】
2006101073.tif 000005
【００１２】
また、前記探索の結果、前記一般式［化５］で表した化合物（以下、「ネオアンチマイシン類縁体」とする。）にも、ＧＲＰ７８の発現を抑制する作用があることを、新規に見い出した。そこで、本発明では、ＧＲＰ７８の発現を抑制する、下記の一般式［化３］で表されるネオアンチマイシン類縁体又はその塩、並びにＧＲＰ７８の発現を抑制する、下記の化学式［化４］で表されるＳＷ−１６３Ａ又はその塩をも提供する。なお、下記の一般式［化３］中、置換基Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジンのいずれかのアミノ酸の側鎖構造を表す。上記構造のうち、置換基Ｒ１、Ｒ２が、それぞれ、メチル基（アラニンの側鎖構造）、イソプロピル基（バリンの側鎖構造）、アンテイソブチル基（ロイシンの側鎖構造）、のいずれかである場合が、特に、好適である。
【化３】
2006101073.tif 000006
【化４】
2006101073.tif 000007
【００１３】
前記の通り、がん細胞において、ＧＲＰ７８の発現誘導を抑制する物質は、抗がん剤として、有効な可能性がある。従って、上述の各化合物のいずれかを少なくとも含有する医薬組成物は、抗がん剤として、有効な可能性がある。【００１４】
なお、上記各化合物は、例えば、ストレプトマイセス  ヴィオラセオニガー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ）  ４５２１−ＳＶＳ３株（茨城県つくば市東１−１−１中央第６に所在の独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０５４８  寄託日平成１８年３月３日）などの代謝産物として、生産できる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に係る化合物は、ＧＲＰ７８の発現誘導を抑制し、がん細胞のアポトーシス（細胞死）を誘導すると推定されるため、抗がん剤として、有効な可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】プラナスタチンに、ＧＲＰ７８発現誘導抑制作用があることを示すグラフ。
【図２】ＳＷ−１６３Ａにも、ＧＲＰ７８発現誘導抑制作用があることを示すグラフ。（Prunustation AおよびSX-163AのHT1080 G-L細胞におけるGRP78プロモーター制御ルシフェラーゼ産生抑制効果（黒丸：Prunustation A、黒三角：SW-163A）
【図３】プラナスタチンが、ＨＳＰ７０発現誘導にはほとんど影響を与えないことを示すグラフ。
【図４】プラナスタチンが、グルコース飢餓条件下においてのみ、ＧＲＰ７８の発現誘導を抑制することを示すウエスタンブロット写真。
【図５】プラナスタチンが、アポトーシス（細胞死）を誘導することを示したグラフ。
【図６】ストレプトマイセス  ヴィオラセオニガー  ４５２１−ＳＶＳ３株の電子顕微鏡写真（低倍率）。
【図７】ストレプトマイセス  ヴィオラセオニガー  ４５２１−ＳＶＳ３株の電子顕微鏡写真（高倍率）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
＜本発明に係る化合物について＞：
本発明に係るプラナスタチンの一例として、プラナスタチンＡの物理学的性状を表１に示す。【００１８】
なお、各データは、以下の手順で分離・精製したプラナスタチンＡについて測定したデータである。まず、ストレプトマイセス  ヴィオラセオニガー  ４５２１−ＳＶＳ３株の培養液（２Ｌ）から菌体を遠心分離し、培養菌体をアセトンで抽出した。次に、アセトン抽出物を濃縮後、酢酸エチルで２回抽出しＮａ２ＳＯ４を用いて脱水した後、減圧下で濃縮乾固した。次に、粗抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（２：１）で展開し、活性化区分を濃縮した。次に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０カラムクロマトグラフィー（内径２０ｍｍ、長さ５００ｍｍ）に供し、クロロホルムーメタノール（１：１）でゲル濾過を行い、活性画分を集め濃縮した。さらに、８０％メタノールを展開溶媒として用いた逆相ＨＰＬＣ（ＰＥＧＡＳＩＬ  ＯＤＳ、内径２０ｍｍ、長さ２５０ｍｍ）を行うことにより、２Ｌの培養液からプラナスタチンＡを２．５ｍｇ単離した。
【表１】
2006101073.tif 000008
【００１９】
表１中、
（１）「Ａｐｐｅａｒａｎｃｅ」は物質の性状を示し、「Ｐａｌｅ  ｙｅｌｌｏｗ  ｐｏｗｄｅｒ」は青黄色粉末状であることを示す。
（２）「ＭＰ」は融点（Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｐｏｉｎｔ）を示す。
（３）［α］は、比旋光度を示す。「２７」は測定温度を示し、「Ｄ」はナトリウムＤ線を用いて測定したことを示す。「ｃ０．３２」は溶液濃度を、「ＣＨＣｌ３」はクロロホルム中で測定したことを示す。
（４）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｏｒｍｕｌａ」は分子式を示す。
（５）「ＨＲ−ＦＡＢ  ＭＳ（Ｈｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｆａｓｔ  Ａｔｏｍ  Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒａ）」は高分解能ＦＡＢ質量分析装置によって測定した、プラナスタチンＡの精密質量（ｍ／ｚ）を示す。「ｆｏｕｎｄ」は実測値（［Ｍ＋Ｈ］＋）を、「ｃａｌｃｄ」は計算値を示す。
（６）「ＵＶ」は紫外線吸収スペクトルを、「λｍａｘ  ｎｍ（ε）」は極大吸収を、「ＭｅＯＨ」はメタノール中で測定したことを示す。
（７）「ＩＲ」は赤外線吸収スペクトルを、「υｍａｘ  ｃｍ−１」は極大吸収を、「ＫＢｒ」は臭化カリウム錠剤法で測定したことを示す。【００２０】
また、プラナスタチンＡの１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル及び１Ｈ−核磁気共鳴スペクトルを表２に示す。表２中、「ＣＤＣｌ３」は重クロロホルム溶液を用いて測定したことを示す。
【表２】
2006101073.tif 000009
【００２１】
なお、ネオアンチマイシン類縁体（ＳＷ−１６３Ａ、ＳＷ−１６３Ｂ、ネオアンチマイシン）の物理学的性状については、公知である（非特許文献１０、１１参照）。【００２２】
その他、本発明に係る各化合物には、その塩、溶媒和物なども含まれる。塩としては、例えば、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩など）アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩など）、金属塩（アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩など）、無機塩（酢酸塩、アンモニウム塩など）、有機アミン塩（ジベンジルアミン塩、グルコサミン塩、エチレンジアミン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、ジエタノールアミン塩、テトラメチルアンモニア塩など）、アミノ酸塩（グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、アスパラギン塩など）などが適用できる。【００２３】
＜本発明に係る抗がん剤について＞：
本発明に係る抗がん剤は、本発明に係るプラナスタチン（それらの塩を含む）若しくはネオアンチマイシン類縁体（それらの塩を含む）が、少なくとも含有していればよく、医薬組成物の剤型などによって、狭く限定されない。また、本発明に係る化合物など以外の組成物が含まれる場合も、本発明に係る抗がん剤に含まれる。【００２４】
即ち、本発明に係る抗がん剤は、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、注射剤などに製剤化してもよい。また、本発明に係る抗がん剤の成分中に、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などを適宜添加してもよい。【００２５】
＜本発明に係る化合物の生産菌並びに生産方法について（一例）＞：
プラナスタチン及びネオアンチマイシン類縁体は、例えば、放線菌の「ストレプトマイセス  ヴィオラセオニガー  ４５２１−ＳＶＳ３株」を用いて生産できる。本菌株は寄託を行った（茨城県つくば市東１−１−１中央第６に所在の独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０５４８  寄託日平成１８年３月３日）。なお、本菌株の同定については後述する。【００２６】
本菌株の培養は、通常の放線菌（ストレプトマイセス）と同様の方法により行うことができる。例えば、培養温度２７℃（２４〜３０℃）、好気的条件（振盪培養、通気撹拌培養など）で培養を行う。
大量液体培養を行う場合、例えば、まず、２〜３日前培養を行った後、本培養を行ってもよい。少量の培地で前培養を行うことにより、菌株の増殖を活性化できるため、前培養後、その培養液を大量の培地に摂取することにより、培養の効率化を図ることができる。
なお、培養温度、通気量、培養時間などの培養条件は、適宜、変更可能である。【００２７】
本発明に係るプラナスタチン又はネオアンチマイシン類縁体の分離・精製は、公知の方法により、行うことができる。
例えば、まず、前記培養液を遠心分離又はろ過などした後、菌体成分を分離し、その上清又はろ液を回収する。
次に、プラナスタチンの精製を行う。プラナスタチンの精製は、例えば、シリカゲルなどの担体を用いた吸着カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過用樹脂を用いたゲルろ過カラムクロマトグラフィー、陰イオン交換若しくは陽イオン交換樹脂を用いたイオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ＧＲＰ７８の発現活性抑制を利用した方法などにより、行うことができる。【００２８】
その他、ＳＷ−１６３Ａは、例えば、プラナスタチンＡを、ＮａＢＨ４（ソディウムボロハイドライド）を用いて還元することによっても、得ることができる。
【実施例１】
【００２９】
実施例１は、本発明に係るプラナスタチンに、ＧＲＰ７８発現誘導抑制作用があることを示す実験である。【００３０】
実験の概要は次の通りである。
「ルシフェラーゼ」は、発光物質ルシフェリンの酸化反応を触媒する酵素である。ルシフェリンはルシフェラーゼの作用により、酸化し、発色する。
そこで、まず、ベクターに、ＧＲＰ７８のプロモーター遺伝子とルシフェラーゼ遺伝子（レポーター遺伝子）を挿入する。ルシフェラーゼ遺伝子は、プロモーターの下流に挿入する。次に、そのベクターをがん細胞に導入する。
これにより、ＧＲＰ７８の発現を促進する物質が、がん細胞に供給されると、その候補物質がプロモーター部位に作用し、ルシフェラーゼを発現する。発現したルシフェラーゼは、ルシフェリンを酸化し、発色させるため、発色強度を検出することにより、ＧＲＰ７８の発現誘導を検出できる。
なお、本実験では、がん細胞として、ＨＴ１０８０Ｇ−Ｌ細胞を用いた。【００３１】
結果を図１に示す。図中、縦軸「Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」は、ルシフェラーゼ活性（検出した発色強度）を示す。「ｃｏｎｔｒｏｌ」は無添加の場合の発色強度、「２−ＤＧ」は前記がん細胞に２−デオキシグルコース（２−ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ）を１０ｎＭ添加した場合の発色強度、「Ｐ．Ａ．」は前記がん細胞にプラナスタチンＡを添加した場合の発色強度、をそれぞれ表す。
なお、デオキシグルコースは、グルコース代謝阻害剤であり、がん細胞内において、小胞体ストレスを誘導する化合物である。【００３２】
図１の左から二番目のバーが示すとおり、がん細胞にデオキシグルコースを供給した場合、ＧＲＰ７８の発現が誘導された。即ち、がん細胞における小胞体ストレスは、ＧＲＰ７８の発現を誘導することを確認できた。【００３３】
それに対し、図１の左から三番目から一番右までの各バーが示すとおり、がん細胞にデオキシグルコースとプラナスタチンＡを供給すると、ＧＲＰ７８の発現誘導が抑制された。また、プラナスタチンＡの供給量が大きいほど、ＧＲＰ７８の発現誘導は、大きく抑制された。【００３４】
以上の結果は、本発明に係るプラナスタチンＡが、がん細胞において、ＧＲＰ７８の発現誘導を抑制する作用があることを示す。
【実施例２】
【００３５】
実施例２は、本発明に係るネオアンチマイシン類縁体にも、ＧＲＰ７８発現誘導抑制作用があることを示す実験である。実験概要は、実施例１とほぼ同様である。【００３６】
結果を図２に示す。図中、縦軸「Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」は、ルシフェラーゼ活性（検出した発色強度）を、横軸「Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ｎＭ）」はプラナスタチンＡ又はＳＷ−１６３Ａの濃度を、それぞれ示す。図中、黒丸はプラナスタチンＡのルシフェラーゼ活性を、黒三角はＳＷ１６３Ａのルシフェラーゼ活性を、それぞれ示す。【００３７】
図２に示すとおり、がん細胞にＳＷ−１６３Ａを供給した場合にも、プラナスタチンＡと同様、発色強度が減少した。また、両化合物とも、濃度が高くなるに従い、発色強度が減少した。なお、プラナスタチンＡのＩＣ５０値（発色強度が５０％阻害される濃度）は１．９ｎＭ、ＳＷ−１６３ＡのＩＣ５０値は、１２．９ｎＭだった。【００３８】
以上の結果は、ＳＷ−１６３Ａにも、ＧＲＰ７８の発現誘導を抑制する作用があることを示す。
【実施例３】
【００３９】
実施例３は、本発明に係るプラナスタチンに、ＨＳＰ７０発現誘導抑制作用があるか、調べた実験である。【００４０】
「ＨＳＰ７０」は、ＧＲＰ７８と同じファミリーに属する分子シャペロンで、ヒートショック（熱ショック）が加わると、発現が誘導されることが知られている。
本実験は、プラナスタチンが、ＧＲＰ７８だけでなく、他の分子シャペロンの発現誘導を抑制する作用があるかどうか、調べた実験である。実験の概要は、ほぼ実施例１と同様である。【００４１】
結果を図３に示す。図中、縦軸「Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」は、ルシフェラーゼ活性（検出した発色強度）を示す。「ｎｏｎｅ」はヒートショックを加えない場合の発色強度、「Ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ」は前記がん細胞にヒートショックを加えた場合の発色強度、「Ｐ．Ａ．」は前記がん細胞にプラナスタチンＡを添加した場合の発色強度、をそれぞれ表す。【００４２】
図２の左から二番目のバーが示すとおり、がん細胞にヒートショックを加えた場合、ＨＳＰ７０の発現が誘導された。【００４３】
それに対し、図２の左から三番目から一番右のバーが示すとおり、がん細胞にヒートショック付加とプラナスタチンＡ添加の両方を行った場合、ＨＳＰ７０の発現誘導はほとんど抑制されなかった。【００４４】
以上の結果は、本発明に係るプラナスタチンが、ＨＳＰ７０の発現誘導にはほとんど影響を与えないこと、即ち、本発明に係るプラナスタチンが、ＧＲＰ７８の発現誘導抑制に、特異的に作用することを示す。
【実施例４】
【００４５】
実施例４は、本発明に係るプラナスタチンが、グルコース飢餓下でのみ、ＧＲＰ７８発現抑制作用を有することを示した実験である。【００４６】
前述の通り、ＧＲＰ７８は、グルコース飢餓条件下、若しくはツニカマイシンなどの存在下で、発現が誘導されることが知られている。そこで、本実験では、プラナスタチンが、ツニカマイシン存在下においても、ＧＲＰ７８発現誘導抑制作用を持つか、調べた。【００４７】
実験の概要は次の通りである。
まず、ＨｅＬａ細胞（がん細胞）をＤＭＥＭ培地で培養した。次に、培地中に、プラナスタチンＡを各濃度添加し、その３０分後に、２−デオキシグルコース若しくはツニカマイシンを各濃度添加し、１８時間培養した。
次に、培養した細胞を集めた後、抗ＧＲＰ７８抗体を用いて、ウエスタンブロットを行い、発現したＧＲＰ７８を検出した。【００４８】
結果を図４に示す。図中、上の写真は２−デオキシグルコースを添加した場合のウエスタンブロット写真、下の写真はツニカマイシンを添加した場合のウエスタンブロット写真である。「２−ＤＧ」は２−デオキシグルコースを、「Ｐｒｕｎｕｓｕｔａｔｉｎ  Ａ」はプラナスタチンＡを、「ＴＭ」はツニカマイシンを、それぞれ示し、各数値は添加量を示す。「ＧＲＰ７８」はＧＲＰ７８のバンドの位置を、「ａｃｔｉｎ」はアクチンのバンドの位置を、それぞれ示す。なお、アクチンのバンドは、各実験条件において、集めた細胞数がほぼ同量であることを示すコントロールである。【００４９】
図４の上のウエスタンブロット写真について、左から二番目及び三番目のレーンでは、ＧＲＰ７８のバンドが検出された。これは、２−デオキシグルコースの添加により、ＧＲＰ７８の発現が誘導されたことを示す。
それに対し、左から四番目から一番右の各レーンでは、ＧＲＰ７８のバンドは減衰し、特に、左から四番目から六番目までの各レーンでは、バンドがほとんど消失した。これは、プラナスタチンＡ添加により、ＧＲＰ７８の発現誘導が抑制されたことを示す。【００５０】
図４の下のウエスタンブロット写真について、左から二番目及び三番目のレーンでは、ＧＲＰ７８のバンドが検出された。これは、ツニカマイシンの添加により、ＧＲＰ７８の発現が誘導されたことを示す。
また、左から七番目から一番右までの各レーンでも、左から二番目及び三番目のレーンと同様のバンドが検出された。これは、ツニカマイシンの添加によりＧＲＰ７８の発現を誘導した場合、プラナスタチンＡが、ＧＲＰ７８の発現誘導を抑制しないことを示す。【００５１】
従って、以上の結果は、プラナスタチンが、グルコース飢餓条件下においてのみ、ＧＲＰ７８の発現誘導を抑制することを強く示唆する。
【実施例５】
【００５２】
実施例５は、本発明に係るプラナスタチンが、ＧＲＰ７８発現誘導を抑制するだけでなく、アポトーシス（細胞死）も誘導することを示した実験である。【００５３】
実験の概要は次の通りである。
「ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ」は、核酸染色色素の一つで、死細胞内に入り込み、死細胞内のＤＮＡ二重らせんにインターカレートする蛍光色素である。そこで、がん細胞にプラナスタチンＡを供給した後、ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅで死細胞を染色し、死細胞の数を計測することにより、アポトーシスが起こっているかどうか調べた。【００５４】
具体的な手順は次の通りである。
まず、ＨＴ１０８０細胞（がん細胞）を、プラナスタチンＡと、ツニカマイシン又は２−デオキシグルコースと、で処理した。次に、前記細胞をｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅで染色した。次に、落射蛍光顕微鏡を用いて、ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅで染色された死細胞の細胞数を計測した。【００５５】
結果を図５に示す。図中、縦軸は細胞死率（％）を示す。「ｃｏｎｔｒｏｌ」は無添加の場合、「ＴＭ」はツニカマイシンを添加した場合、「２−ＤＧ」は２−デオキシグルコースを添加した場合、「ＰＡ」はプラナスタチンＡを添加した場合、であることを示す。【００５６】
図５中、左から八番目から十一番目までのバーと比較して、左から十二番目から一番右までのバーでは、細胞死率が顕著に上昇した。【００５７】
この結果は、プラナスタチンがＧＲＰ７８の発現誘導を抑制することにより、アポトーシスが誘導されることを強く示唆する。即ち、プラナスタチンは、抗がん剤として、有効である可能性を強く示唆する。
【実施例６】
【００５８】
ストレプトマイセス  ヴィオラセオニガー  ４５２１−ＳＶＳ３株の同定について、実施例６に記載する。【００５９】
本菌株は、沖縄県久米町で採取した土壌から分離された放線菌である。その形態的性質、培養的性質、生理学的性質は、次の通りである。【００６０】
（１）形態的性質：
本菌株の電子顕微鏡写真を図６、図７に示す。
気菌糸は、長い主軸を形成し、その主軸は不規則に分枝していた。分枝の先端には、１０又はそれ以上からなる、コンパクトな３〜６回転のらせん状の胞子鎖が形成されていた。基生菌糸の分断は観察されなかった。
胞子は、非運動性で、培養初期にはシースに覆われ胞子の形態が判別できなかったが、培養開始から３週間経過すると、胞子がシースから突出し、楕円形の胞子が観察された。菌核、胞子嚢、その他の特殊形態は観察されなかった。
細胞壁化学型は、（Ｉ）型であり、ＬＬ−ジアミノピメリン酸を含んでいた。ＤＮＡのＧＣ含量は、７３．２％であった。【００６１】
（２）培養的性質：
培養的性質を表３に示す。集落表面の菌叢色は灰色系列であるが、培養が長期に及ぶと黒湿化した。裏面色は無機塩スターチ寒天培地、オートミール寒天培地、チロシン寒天培地などでは淡黄色を呈したが、その他の寒天培地では赤紫色から暗赤紫色を呈し、また、ｐＨにより変化しなかった。拡散性色素の生成は認められなかった。
【表３】
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【００６２】
（３）生理学的性質：
生理学的性質を表４に示す。本菌株は、中温性であり、メラニン様色素の産生は、チロシン寒天培地、ペプトン・イースト・鉄寒天培地、トリプトン・イースト・ブロスでは、認められなかった。
【表４】
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【００６３】
本菌株は、胞子がらせん状に長く連鎖する胞子鎖形態を持っていること、及び、細胞壁化学型が（Ｉ）型であること、より、ストレプトマイセス属に位置する菌種であると推定した。
そこで、ストレプトマイセス属の菌種のうち、上記諸性質と一致するものを、「細菌名承認リスト、１９８０」及びそれ以後の有効名リストを用いて、検索した。
その結果、近縁種として、ストレプトマイセス  ヴィオラセオニガーを発見した。本菌株とストレプトマイセス  ヴィオラセオニガーとを比較したところ、アラビノースとラフィノースの炭素源の同化が異なっていたが、その他の性質はよく一致していた（表５参照）。
そこで、発明者は、本菌株を、ストレプトマイセス  ヴィオラセオニガーに分類される一菌株として同定し、ストレプトマイセス  ヴィオラセオニガー  ４５２１−ＳＶＳ３株と命名した。
【表５】
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【実施例７】
【００６４】
実施例７では、ストレプトマイセス  ヴィオラセオニガー  ４５２１−ＳＶＳ３株の培養方法の一例を示す。【００６５】
まず、「表６」に示した組成の前培養培地１５ｍｌを、５０ｍｌの大型試験管に分注、殺菌後、本菌株を培養スラント上より白金耳接種し、２７℃、３日間、培養したものを種母とする。
【表６】
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【００６６】
次に、５００ｍｌ容コブ付き三角フラスコに、「表７」に示した組成の生産培地１００ｍｌずつ分注後、殺菌する。次に、各フラスコに、上記種母を２ｍｌずつ添加し、ロータリーシェーカー上で、２７℃、５日間、培養する。
【表７】
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【００６７】
例えば、上記手順で本菌株を培養することにより、本菌株を大量培養できるため、本発明に係る化合物（プラナスタチン、ＳＷ１６３など）を含有する培養液を高効率に得ることができる。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明に係るプラナスタチンは、抗がん剤として、適用可能性がある。【００６９】
プラナスタチンは、グルコース飢餓状態においてのみ、ＧＲＰ７８の発現誘導を抑制するため、がん細胞以外の細胞の反応系に与える影響が少ないと推測する。従って、本発明に係る抗がん剤は、従来のものよりも、副作用が少なく、安全性が高い可能性がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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