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　特願２０１０−５１０３５８「遺伝子改変された光合成生物のハイスループットスクリーニング」拒絶査定不服審判事件〔平成２０年１２月１１日国際公開、ＷＯ２００８／１５０４６１、平成２２年　８月２６日国内公表、特表２０１０−５２８６０９〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
１．手続の経緯・本願発明
　本願は、平成２０（２０１０）年５月３０日を国際出願日（パリ条約による優先権主張外国庁受理　２００７年６月１日　米国、　２００８年３月２０日　米国、２００８年３月２０日　米国）とする出願であって、その請求項１に係る発明は、平成２６年１１月７日付手続補正書の特許請求の範囲の請求項１に記載された、以下のとおりのものである。
「【請求項１】
　原形質状態を決定するために、形質転換した非維管束光合成生物をスクリーニングする方法であって、
　第１のプライマー対を用いて前記形質転換した生物の第１の内因性葉緑体核酸配列を増幅させる工程、ここで、第１の内因性葉緑体核酸配列は、前記生物を形質転換するための発現ベクターの標的配列を含み、前記第１のプライマー対の１つのプライマーは、前記発現ベクターによって置換される前記標的配列においてアニールする；
　第２のプライマー対を用いて同一のチューブ内で前記形質転換した生物の第２の内因性葉緑体核酸配列を増幅させる工程、ここで、第２の内因性葉緑体核酸配列は、前記生物を形質転換するための発現ベクターの標的配列でない；
　前記第１の内因性葉緑体核酸配列が増幅され、前記第２の内因性葉緑体核酸配列が増幅されているか否かを決定する工程；そして、
　前記第１の内因性葉緑体核酸配列が増幅されず、および前記第２の内因性葉緑体核酸配列が増幅されている場合に、前記形質転換した生物の原形質状態をホモプラスミーと決定する工程、
を含む、方法。」（以下、「本願発明」という。）
２．引用例
　原査定の拒絶の理由で引用文献３として引用された本願優先日前の２００５年に頒布された刊行物であるBiochem Biophys Res Commun.(2005),Vol.329,No.3,p.966-975（以下、「引用例」という。）には、次の事項が記載されている。
　なお、翻訳は当審によるものであって、下線は当審が付与したものである。
（ア）「Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ　ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおける、ｃｈｌＬ遺伝子の、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのニトロゲナーゼＦｅタンパク質遺伝子（ｎｉｆＨ）による機能的置換」（タイトル）
(イ)「Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ　ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉが暗闇でクロロフィル生合成をするために獲得した必須の
葉緑体遺伝子である、ｃｈｌＬ
(ウ)「より明確にホモプラスミックとヘテロプラスミックの形質転換体を区別するために、我々はｃｈｌＬ領域の側面に位置する、ｐｅｔＢにおけるＮｃｏＩサイトから、ｃｈｌＬの下流のＸｂａＩサイトに伸びる、３．４ｋｂプローブも用いた（Ｆｉｇ．２）。７．８ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントは、ｃｈｌＬを含むＤＮＡにあると予測される。ｎｉｆＨまたはｕｉｄＡの内側で特異的に切断する二番目の酵素で消化すると、その結果、２つのより短いフラグメントが予測されるから、このフラグメントは、ホモプラスミックな形質転換体には存在しないはずである（Ｆｉｇ．３Ｄと４Ｃ）。ｎｉｆＨ形質転換体１０Ｅからの細胞ＤＮＡ全体が、ＥｃｏＲＩとＡｈｄＩで分解され、３．４ｋｂプローブでプローブされた時、期待された２つのより短いバンド（３．７と４．１ｋｂ）が検出され、野生型のバンド（７．８ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメント）は、明らかになかった（とても長い暴露時間の後でさえ）。これは、このｎｉｆＨ形質転換体は、確かにホモプラスミックであることを示す（Ｆｉｇ．４Ｃ）。二つのｕｉｄＡ形質転換体３Ｅと３Ｂの同様な分析において、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩの消化で、５．１と３．７ｋｂのハイブリダイズするバンドが得られ、野生型の７．８ｋｂのバンドがないから、それらもホモプラスミックなラインであることが明らかになった（Ｆｉｇ．３Ｄ）。
念のため、我々はｎｉｆＨホモプラスミックな系において、ｃｈｌＬ特異的オリゴヌクレオチド７と８（Ｔａｂｌｅ１）を用いたＰＣＲも行い、追加の４５サイクル後でさえバンドがないことは、ｃｈｌＬ遺伝子の欠損を証明し、ヘテロプラスミックな系において、野生型ｃｈｌＬの存在を示す、大変明るいバンドが検出された（
　
（エ）「
図１　構造物と２段階の葉緑体形質転換の概略図・・（Ｂ）二回目の形質転換のための受容物として用いられるｐｅｔＢ変異体を得るためのｐＣＱ３ベクターの衝撃と、ｎｉｆＨの遺伝子修飾された葉緑体を有するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉを得るためのｎｉｆＨ遺伝子を有する
ｐＣＱ９ベクターの送達による、相同組換えでの２段階の葉緑体形質転換
  　
　上記引用例記載事項（ウ）の「念のため、我々はｎｉｆＨホモプラスミックな系において、ｃｈｌＬ特異的オリゴヌクレオチド７と８（Ｔａｂｌｅ１）を用いたＰＣＲも行い、追加の４５サイクル後でさえバンドがないことは、ｃｈｌＬ遺伝子の欠損を証明し、ヘテロプラスミックな系において、野生型ｃｈｌＬの存在を示す、大変明るいバンドが検出された。」において、「ｎｉｆＨホモプラスミックな系」とは、上記引用例記載事項（ア）、（イ）に記載のように、「Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ　ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおける、葉緑体のｃｈｌＬ遺伝子が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのｎｉｆＨに置換された、ｎｉｆＨホモプラスミックな形質転換体」である。
　また、「ＰＣＲも行い、追加の４５サイクル後でさえバンドがない」ことは、核酸配列が増幅されないことであることは本願優先日前の技術常識である。
　そして、上記引用例記載事項（ウ）は、ｎｉｆＨホモプラスミックな系において、念のために、ＰＣＲによってｃｈｌＬ遺伝子の欠損を証明し、ヘテロプラスミックな系においてｃｈｌＬの存在を示すバンドが検出されたことが記載されているから、ＰＣＲにおいてｃｈｌＬ遺伝子が増幅されない場合に、ホモプラスミーと決定する方法が記載されているといえる。
　そうすると、引用例には、次の発明（以下、「引用発明」という。）が記載されていると認められる。
「Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ　ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおける、葉緑体のｃｈｌＬ遺伝子が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのｎｉｆＨに置換された、ｎｉｆＨホモプラスミックな形質転換体において、ｃｈｌＬ特異的オリゴヌクレオチド７と８（Ｔａｂｌｅ１）を用いたＰＣＲも行い核酸配列が増幅されない場合に、形質転換体をホモプラスミーと決定する方法。」
３．対比
　本願発明と引用発明とを対比する。
　引用発明の「Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ　ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ」とは、「非維管束光合成生物」であるから、引用発明の「Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ　ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおける・・形質転換体」は、本願発明の「形質転換した非維管束光合成生物」に相当する。
　また、引用発明の「ｃｈｌＬ遺伝子」とは、上記引用例記載事項（イ）、（エ）より、葉緑体に内在する配列で、ｎｉｆＨ遺伝子に置換される標的配列であり、ｎｉｆＨ遺伝子の形質転換は発現ベクターで行うことから、引用発明の「ｃｈｌＬ遺伝子」、「ｃｈｌＬ特異的オリゴヌクレオチド７と８」は、それぞれ、「形質転換するための発現ベクターの標的配列を含む、第１の内因性葉緑体核酸」、「発現ベクターによって置換される標的配列においてアニールするプライマー」に相当し、引用発明の「ｃｈｌＬ特異的オリゴヌクレオチド７と８」は、本願発明の「第１のプライマー対」に相当する。
　そうすると、本願発明と引用発明とは、「形質転換した非維管束光合成生物をスクリーニングする方法であって、
　第１のプライマー対を用いて前記形質転換した生物の第１の内因性葉緑体核酸配列を増幅させる工程、ここで、第１の内因性葉緑体核酸配列は、前記生物を形質転換するための発現ベクターの標的配列を含み、前記第１のプライマー対の１つのプライマーは、前記発現ベクターによって置換される前記標的配列においてアニールする；
　前記第１の内因性葉緑体核酸配列が増幅されているか否かを決定する工程；
　前記第１の内因性葉緑体核酸配列が増幅されない場合に、形質転換した生物をホモプラスミーと決定する方法。」
で一致し、
（相違点１）本願発明は、「
原形質状態
原形質状態
（相違点２）本願発明は、「第２のプライマー対を用いて同一のチューブ内で前記形質転換した生物の第２の内因性葉緑体核酸配列を増幅させる工程、ここで、第２の内因性葉緑体核酸配列は、前記生物を形質転換するための発現ベクターの標的配列でない；、第２の内因性葉緑体核酸配列が増幅されているか否かを決定する工程、第２の内因性葉緑体核酸配列が増幅されている場合に形質転換した生物の原形質状態をホモプラスミーと決定する工程」を含むのに対し、引用発明では、該工程がない点。
４．当審の判断
（相違点１）について
　「原形質」とは、 細胞を構成している物質のことであることは、当業者に周知の事項である（必要なら、例えば、今堀和友ほか編、「生化学辞典（第３版）」第２刷、１９９８年１１月２０日、株式会社東京化学同人発行、４７７ページの「原形質」の欄参照。）ところ、引用文献に、内因性葉緑体遺伝子である、ｃｈｌＬ遺伝子が、ＰＣＲによって増幅されない場合に、形質転換体がホモプラスミーと決定することが記載されており、引用発明においても、形質転換体の細胞を構成している物質をスクリーニングし、ホモプラスミーと決定しているといえるから、上記相違点は実質的な相違ではない。
　
（相違点２）について
　本願優先日前より、ＰＣＲによる増幅反応を行う際に、ＰＣＲでネガティブな結果がでたときに、鋳型が存在しないのか反応が悪いのか不明であるから、その結果が実験の単純ミスから生じていないことを示すためにポジティブコントロールを用いること、形質転換されているかされていないかをＰＣＲによって確認する際に、ポジティブコントロールとして、形質転換生物および形質転換されていない生物の両方に存在する遺伝子を増幅するプライマー対を用いること、ポジティブコントロールのプライマー対によるＰＣＲ反応を標的遺伝子を増幅するプライマー対と同一のチューブ内で行うことは、周知である（例えば、Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９２），Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．１２，．ｐ．３１８５−３１８９のＡｂｓｔｒａｃｔ、細胞工学別冊　目で見る実験ノートシリーズ　バイオ実験イラストレイテッド　新版 本当に増えるＰＣＲ，１９９９年７月１日第２版第２刷発行、株式会社秀潤社、ｐ．４９−５１、特開２００１−２３８７００号公報　段落【００２２】〜【００２６】参照）。
　したがって、引用発明の、ｃｈｌＬ遺伝子を増幅する第１のプライマー対によるＰＣＲにより、ｃｈｌＬ遺伝子が増幅されないことを確認するスクリーニング方法に加えて、ポジティブコントロールとして、「ｃｈｌＬ遺伝子が形質転換されていないＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ　ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ」と「ｃｈｌＬ遺伝子がｎｉｆＨに形質転換されているＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ　ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ」の両方に発現する遺伝子を増幅する第２プライマー対を同一チューブ内に設けること、第２プライマー対として、置換標的ではない、葉緑体遺伝子を増幅するプライマー対をポジティブコントロールとし、第１のプライマー対による増幅がされないことが、ｃｈｌＬ遺伝子の不存在であることを確認することは、当業者が容易に想到しうることである。
　そして、本願発明において奏される効果も、引用例から予測できない程の格別なものとはいえない。
　したがって、本願発明は、引用例に記載された発明から当業者が容易に発明をすることができたものであり、特許法第２９条第２項の規定により、特許を受けることができない。
　
５．審判請求人の主張
　審判請求人は、平成２６年１１月７日付審判請求書において、引用文献３では、原形質状態を決定するためにＰＣＲのみを用いて１群のコロニーを試験しておらず、並行して別個の群から同質細胞質コロニーを同定するためにサザンブロッティングを使用しており、ＰＣＲは、サザンブロッティングを用いて同質細胞質として同定したコロニーについて行っているにすぎないから、同引用文献は、未知の原形質状態を有する形質転換体を選別するためにＰＣＲを使用することは記載も示唆もしておらず、ＰＣＲのみが生物の原形質状態を決定するとの目的を達成したであろうことは示唆さえしていない旨、主張している。
　しかしながら、サザンブロッティングによってホモプラスミーであるとした形質転換体についてではあるが、ホモプラスミーであるか確認する手段として、ＰＣＲによって、形質転換の標的遺伝子が増幅されないことをもって、ホモプラスミーであるかを確認できることが引用例に記載されていれば、サザンブロッティングを用いることなく、ＰＣＲ単独で形質転換体がホモプラスミーであるかを決定することは、当業者が容易に想到しうることである。
　また、本願発明は、ＰＣＲにより形質転換体がホモプラスミーと決定する工程を含むスクリーニング方法であり、他の検出方法を含むことを妨げるものではない。なお、本願発明に相当する、本願実施例においても、形質転換細胞を確認するために、薬剤耐性で選別したり、サザンブロッティング、形質転換によって導入した遺伝子を検出するＰＣＲも併せて行っている。　
　したがって、審判請求人の上記主張は採用できない。
６．むすび
　以上のとおりであるから、本願請求項１に係る発明は、特許法第２９条第２項の規定により、特許を受けることができないので、他の請求項に係る発明については検討するまでもなく、本願は拒絶をすべきものである。