(57)【要約】少なくとも可溶性グアニル酸シクラーゼ（３）と、サイクリックグアノシン３’，５’−一リン酸（５）を認識してシグナルを発するｃＧＭＰ可視化プローブ（６）が、生細胞内で共存していることを特徴とする一酸化窒素検出用センサー細胞（１）とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも可溶性グアニル酸シクラーゼと、サイクリックグアノシン３’，５’−一リン酸を認識してシグナルを発するｃＧＭＰ可視化プローブが、生細胞内で共存していることを特徴とする一酸化窒素検出用センサー細胞。
【請求項２】
可溶性グアニル酸シクラーゼを発現している細胞に、ｃＧＭＰ可視化プローブを発現するポリヌクレオチドを導入することにより、該細胞内で可溶性グアニル酸シクラーゼとｃＧＭＰ可視化プローブを共存させてなる請求項１のセンサー細胞。
【請求項３】
細胞内に、可溶性グアニル酸シクラーゼを発現するポリヌクレオチドとｃＧＭＰ可視化プローブを発現するポリヌクレオチドを導入することにより、該細胞内で可溶性グアニル酸シクラーゼとｃＧＭＰ可視化プローブを共存させてなる請求項１のセンサー細胞。
【請求項４】
細胞内に、可溶性グアニル酸シクラーゼの二つのサブユニットαおよびβの各々にｃＧＭＰ可視化プローブを連結してなる二種類のハイブリッド蛋白質を発現する二種類のポリヌクレオチドを導入することにより、該細胞内で可溶性グアニル酸シクラーゼとｃＧＭＰ可視化プローブを共存させてなる請求項１のセンサー細胞。
【請求項５】
ｃＧＭＰ可視化プローブは、ｃＧＭＰ結合蛋白の両末端に互いの近接が検出可能な二つのマーカー部位が連結されてなるものである請求項１ないし４のいずれかののセンサー細胞。
【請求項６】
ｃＧＭＰ可視化プローブにおけるｃＧＭＰ結合蛋白は、ｃＧＭＰ依存性キナーゼＩαである請求項５のセンサー細胞。
【請求項７】
ｃＧＭＰ可視化プローブにおける互いの近接が検出可能な二つのマーカー部位は、シアン蛍光蛋白質と黄色蛍光蛋白質である請求項５または６のいずれかのセンサー細胞。
【請求項８】
全細胞が請求項１ないし７のセンサー細胞であるトランスジェニック非ヒト動物であって、可溶性グアニル酸シクラーゼを発現している細胞に、ｃＧＭＰ可視化プローブを発現するポリヌクレオチドを導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することにより得られる非ヒト動物またはその子孫動物。
【請求項９】
全細胞が請求項１ないし７のセンサー細胞であるトランスジェニック非ヒト動物であって、細胞内に、可溶性グアニル酸シクラーゼを発現するポリヌクレオチドとｃＧＭＰ可視化プローブを発現するポリヌクレオチドを導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することにより得られる非ヒト動物またはその子孫動物。
【請求項１０】
全細胞が請求項１ないし７のセンサー細胞であるトランスジェニック非ヒト動物であって、細胞内に、可溶性グアニル酸シクラーゼの二つのサブユニットαおよびβの各々にｃＧＭＰ可視化プローブを連結してなる二種類のハイブリッド蛋白質を発現する二種類のポリヌクレオチドを導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することにより得られる非ヒト動物またはその子孫動物。
【請求項１１】
ｃＧＭＰ可視化プローブは、ｃＧＭＰ結合蛋白の両末端に互いの近接が検出可能な二つのマーカー部位が連結されてなるものである請求項８ないし１０のいずれかの非ヒト動物またはその子孫動物。
【請求項１２】
ｃＧＭＰ可視化プローブにおけるｃＧＭＰ結合蛋白は、ｃＧＭＰ依存性キナーゼＩαである請求項１１の非ヒト動物またはその子孫動物。
【請求項１３】
ｃＧＭＰ可視化プローブにおける互いの近接が検出可能な二つのマーカー部位は、シアン蛍光蛋白質と黄色蛍光蛋白質である請求項１１または１２のいずれかの非ヒト動物またはその子孫動物。
【請求項１４】
細胞内の一酸化窒素を検出・定量するための方法であって、請求項１ないし７のいずれかのセンサー細胞におけるシグナル変化を測定することを特徴とする細胞内一酸化窒素の検出・定量方法。
【請求項１５】
刺激による細胞内での一酸化窒素濃度の変化をモニタリングするための方法であって、請求項１ないし７のいずれかのセンサー細胞に刺激を付与し、刺激付与前後におけるシグナル変化を測定することを特徴とする細胞内一酸化窒素濃度のモニタリング方法。
【請求項１６】
細胞から放出される一酸化窒素を検出・定量するための方法であって、一酸化窒素の放出を検出・定量したい細胞と、請求項１ないし７のいずれかのセンサー細胞を近接配置し、センサー細胞におけるシグナル変化を測定することを特徴とする細胞放出一酸化窒素の検出・定量方法。
【請求項１７】
可溶性グアニル酸シクラーゼに対する一酸化窒素の結合に影響を与える物質をスクリーニングする方法であって、請求項１ないし７のいずれかのセンサー細胞に候補物質を導入し、候補物質存在下および非存在下におけるシグナル変化を測定することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項１８】
生体における一酸化窒素を検出・定量するための方法であって、請求項８ないし１３のいずれかの非ヒト動物におけるシグナル変化を測定することを特徴とする生体内一酸化窒素の検出・定量方法。
【請求項１９】
刺激による生体内での一酸化窒素濃度の変化をモニタリングするための方法であって、請求項８ないし１３のいずれかの非ヒト動物に刺激を付与し、刺激付与前後の該非ヒト動物におけるシグナル変化を測定することを特徴とする生体内一酸化窒素濃度のモニタリング方法。
【請求項２０】
可溶性グアニル酸シクラーゼに対する一酸化窒素の結合に影響を与える物質をスクリーニングする方法であって、請求項８ないし１３のいずれかの非ヒト動物に候補物質を投与し、候補物質存在下および非存在下における該非ヒト動物のシグナル変化を測定することを特徴とするスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  この出願の発明は、細胞内の一酸化窒素を検出するためのセンサー細胞と、全細胞がそのようなセンサー細胞となっているトランスジェニック非ヒト動物に関するものであり、さらには、それらを用いた一酸化窒素の検出・定量方法、一酸化窒素濃度のモニタリング方法、並びに可溶性グアニル酸シクラーゼと一酸化窒素の結合に影響を与える物質のスクリーニング方法に関するものである。
【背景技術】  一酸化窒素（Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ；ＮＯ）については、１９８７年に血管内皮由来の血管弛緩因子であることが報告されて以来、その生理活性物質としての役割が次々に見出され、心血管系のみならず、免疫系、中枢神経系においても重要な生体分子であることが明らかになっている。また、疾患に関しても、心血管系では動脈硬化、脳卒中、高血圧、免疫系では感染疾患、中枢神経系では痴呆、アルツハイマー病等にＮＯが関係していると考えられている。
細胞内において、Ｌ−アルギニンを基質としてＮＯ合成酵素（ＮＯ  ｓｙｎｔｈａｓｅ；ＮＯＳ）により合成されたＮＯは、その細胞から放出されて近隣の細胞に侵入し、作用を発揮することが知られている。心血管系、免疫系、中枢神経系においては、血管内皮細胞、マクロファージ、ニューロン（ｐｏｓｔｓｙｎａｐｓｅ）等がそれぞれＮＯのドナー細胞となりうるものであり、平滑筋細胞、抗原、ニューロン（ｐｒｅｓｙｎａｐｓｅ）等がそれぞれＮＯのアクセプター細胞となりうる。
アクセプター細胞には、ＮＯの標的蛋白質の一つである可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓｏｌｕｂｌｅ  ｇｕａｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ；ｓＧＣ）が存在するが、このｓＧＣのヘム鉄にＮＯが配位結合すると、ｓＧＣの酵素活性が２００倍以上に上昇し、セカンドメッセンジャーであるサイクリックグアノシン３’，５’−一リン酸（ｇｕａｎｏｓｉｎｅ  ３’，５’−ｃｙｃｌｉｃ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ｃＧＭＰ）が大量に生成されて細胞内シグナル伝達が誘起される。
このようなＮＯは、生体内において酵素や活性酸素による酸化を受けやすく、不安定で短寿命な分子である。そのため、生理的濃度のＮＯを検出するのは困難であり、生体内におけるＮＯの動態は未知の領域であったのが実情である。
生体内においてＮＯを検出する方法として、ＮＯと化学反応するジアミノ基を有するフルオレセイン骨格の有機分子（ｄｉａｍｉｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ；ＤＡＦ）が報告されている（非特許文献１）。ＤＡＦは、通常は無蛍光であるが、酸素存在下でＮＯと反応すると蛍光性のトリアゾール体となり、緑色蛍光を呈するようになる。したがって、このような有機分子を用いることにより、細胞内に生成したＮＯを蛍光顕微鏡下で可視化分析することが可能となった。また、同様の原理により赤色蛍光を呈するローダミン骨格の有機分子（ＤＡＲ）も報告されている（非特許文献２）。
しかしながら、これら従来の有機分子は、細胞内に導入する際に脂質膜に非特異的に吸着してＮＯに非依存的な蛍光を発するため、ＮＯに対する検出下限が大幅に上昇するという問題があった。また、これら有機分子は、ＮＯと不可逆的に化学反応するため、ＮＯ濃度の変化など、複雑なＮＯの生体内動態を追跡できないという問題もあった。さらに、ＮＯによる生理作用の発現を理解する上では、ドナー細胞から放出されるＮＯの定量が必要だが、１分子のＮＯを１分子の蛍光プローブで認識するこれらの有機分子では、それが出来ないという問題もあった。
そこで、この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、細胞内の低濃度のＮＯを、精度高く、簡便に検出・定量するための新たな手法を提供することを課題としている。
文献
【非特許文献１】Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０；２４４６−２４５３，１９９８．
【非特許文献２】Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３；１９６７−１９７３，２００１．
【非特許文献３】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７；７３８０−７３８４，１９８０
【特許文献１】特開２００２−０１７３５９
【特許文献２】ＰＣＴ／ＪＰ０１／５６３１
【発明の開示】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、第１には、少なくとも可溶性グアニル酸シクラーゼ（以下、ｓＧＣと記載する）と、サイクリックグアノシン３’，５’−一リン酸（以下、ｃＧＭＰと記載する）を認識してシグナルを発するｃＧＭＰ可視化プローブが、生細胞内で共存していることを特徴とする一酸化窒素（以下、ＮＯと記載する）検出用センサー細胞を提供する。
この出願の発明は、第２には、ｓＧＣを発現している細胞に、ｃＧＭＰ可視化プローブを発現するポリヌクレオチドを導入することにより、該細胞内でｓＧＣとｃＧＭＰ可視化プローブを共存させてなるセンサー細胞を、第３には、細胞内に、ｓＧＣを発現するポリヌクレオチドとｃＧＭＰ可視化プローブを発現するポリヌクレオチドを導入することにより、該細胞内でｓＧＣとｃＧＭＰ可視化プローブを共存させてなるセンサー細胞を、そして、第４には、細胞内に、ｓＧＣの二つのサブユニットαおよびβの各々にｃＧＭＰ可視化プローブを連結してなる二種類のハイブリッド蛋白質を発現する二種類のポリヌクレオチドを導入することにより、該細胞内でｓＧＣとｃＧＭＰ可視化プローブを共存させてなるセンサー細胞を提供する。
また、この出願の発明は、第５には、ｃＧＭＰ可視化プローブが、ｃＧＭＰ結合蛋白の両末端に互いの近接が検出可能な二つのマーカー部位が連結されてなるものである前記いずれかのセンサー細胞を、第６には、ｃＧＭＰ可視化プローブにおけるｃＧＭＰ結合蛋白が、ｃＧＭＰ依存性キナーゼＩαである前記のセンサー細胞を、第７には、ｃＧＭＰ可視化プローブにおける互いの近接が検出可能な二つのマーカー部位が、シアン蛍光蛋白質と黄色蛍光蛋白質であるセンサー細胞を提供する。
さらに、この出願の発明は、第８には、全細胞が前記のセンサー細胞であるトランスジェニック非ヒト動物であって、ｓＧＣを発現している細胞に、ｃＧＭＰ可視化プローブを発現するポリヌクレオチドを導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することにより得られる非ヒト動物またはその子孫動物を、また、第９には、全細胞が前記のセンサー細胞であるトランスジェニック非ヒト動物であって、細胞内に、ｓＧＣを発現するポリヌクレオチドとｃＧＭＰ可視化プローブを発現するポリヌクレオチドを導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することにより得られる非ヒト動物またはその子孫動物を、さらに、第１０には、全細胞が前記のセンサー細胞であるトランスジェニック非ヒト動物であって、細胞内に、ｓＧＣの二つのサブユニットαおよびβの各々にｃＧＭＰ可視化プローブを連結してなる二種類のハイブリッド蛋白質を発現する二種類のポリヌクレオチドを導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することにより得られる非ヒト動物またはその子孫動物を提供する。
この出願の発明は、第１１には、ｃＧＭＰ可視化プローブが、ｃＧＭＰ結合蛋白の両末端に互いの近接が検出可能な二つのマーカー部位が連結されてなるものである前記いずれかの非ヒト動物またはその子孫動物を、第１２には、ｃＧＭＰ可視化プローブにおけるｃＧＭＰ結合蛋白が、ｃＧＭＰ依存性キナーゼＩαである非ヒト動物またはその子孫動物を、第１３には、ｃＧＭＰ可視化プローブにおける互いの近接が検出可能な二つのマーカー部位が、シアン蛍光蛋白質と黄色蛍光蛋白質である非ヒト動物またはその子孫動物を提供する。
さらに、この出願の発明は、第１４には、細胞内のＮＯを検出・定量するための方法であって、前記いずれかのセンサー細胞におけるシグナル変化を測定することを特徴とする細胞内ＮＯの検出・定量方法を、第１５には、刺激による細胞内でのＮＯ濃度の変化をモニタリングするための方法であって、前記いずれかのセンサー細胞に刺激を付与し、刺激付与前後におけるシグナル変化を測定することを特徴とする細胞内ＮＯ濃度のモニタリング方法を提供する。
この出願の発明は、第１６には、細胞から放出されるＮＯを検出・定量するための方法であって、ＮＯの放出を検出・定量したい細胞と、前記いずれかのセンサー細胞を近接配置し、センサー細胞におけるシグナル変化を測定することを特徴とする細胞放出ＮＯの検出・定量方法を、第１７には、ｓＧＣに対するＮＯの結合に影響を与える物質をスクリーニングする方法であって、前記いずれかのセンサー細胞に候補物質を導入し、候補物質存在下および非存在下におけるシグナル変化を測定することを特徴とするスクリーニング方法を提供する。
そして、この出願の発明は、第１８には、生体におけるＮＯを検出・定量するための方法であって、前記いずれかの非ヒト動物におけるシグナル変化を測定することを特徴とする生体内ＮＯの検出・定量方法を、第１９には、刺激による生体内でのＮＯ濃度の変化をモニタリングするための方法であって、前記いずれかの非ヒト動物に刺激を付与し、刺激付与前後の該非ヒト動物におけるシグナル変化を測定することを特徴とする生体内ＮＯ濃度のモニタリング方法を、そして、第２０には、ｓＧＣに対するＮＯの結合に影響を与える物質をスクリーニングする方法であって、前記いずれかの非ヒト動物に候補物質を投与し、候補物質存在下および非存在下における該非ヒト動物のシグナル変化を測定することを特徴とするスクリーニング方法を提供する。
そして、上記第１の発明のＮＯ検出用センサー細胞では、少なくともｓＧＣと、ｃＧＭＰを認識してシグナルを発するｃＧＭＰ可視化プローブが、生細胞内で共存していることから、ＮＯが存在または侵入すると、ｓＧＣのヘム鉄にＮＯが配位結合し、ｓＧＣの酵素活性が２００倍以上に上昇してセカンドメッセンジャーのｃＧＭＰが大量に生成される。このｃＧＭＰは、センサー細胞内に共存するｃＧＭＰ可視化プローブにより認識され、ｃＧＭＰ可視化プローブはシグナルを発する。したがって、このシグナル変化を測定することにより、ＮＯの存在または侵入を精度高く検出することが可能となる。
また、上記第２の発明のセンサー細胞では、ｓＧＣを発現している細胞に、ｃＧＭＰ可視化プローブを発現するポリヌクレオチドを導入することにより、該細胞内でｓＧＣとｃＧＭＰ可視化プローブを共存させる。上記第３の発明のセンサー細胞では、細胞内に、可溶性グアニル酸シクラーゼを発現するポリヌクレオチドとｃＧＭＰ可視化プローブを発現するポリヌクレオチドを導入することにより、該細胞内でｓＧＣとｃＧＭＰ可視化プローブを共存させる。さらに、上記第４の発明のセンサー細胞では、細胞内に、可溶性グアニル酸シクラーゼの二つのサブユニットαおよびβの各々にｃＧＭＰ可視化プローブを連結してなる二種類のハイブリッド蛋白質を発現する二種類のポリヌクレオチドを導入することにより、該細胞内で、ｓＧＣのαおよびβ二つのサブユニットが二量化しｓＧＣが構築される。したがって、ｓＧＣとｃＧＭＰ可視化プローブが細胞内で共存することになる。
上記第５の発明のセンサー細胞では、ｃＧＭＰ可視化プローブは、ｃＧＭＰ結合蛋白の両末端に互いの近接が検出可能な二つのマーカー部位が連結されてなるものであることから、センサー細胞内にＮＯが存在または侵入し、ｓＧＣによりｃＧＭＰが生成されると、ｃＧＭＰがｃＧＭＰ結合蛋白と結合し、ｃＧＭＰ結合蛋白の立体構造が変化し、両末端に連結された二つのマーカー部位が近接するようになる。これによりシグナルが発信され、ＮＯの存在または侵入を精度高く検出することが可能となる。
さらに、このようなセンサー細胞の態様として、上記第６の発明では、ｃＧＭＰ結合蛋白をｃＧＭＰ依存性蛋白キナーゼＩα（以下、ＰＫＧＩαと記載することがある）とし、上記第７の発明では、ｃＧＭＰ可視化プローブにおける互いの近接が検出可能な二つのマーカー部位を、シアン蛍光蛋白質と黄色蛍光蛋白質とする。
また、上記第８の発明の非ヒト動物またはその子孫動物は、ｓＧＣを発現している細胞にｃＧＭＰ可視化プローブを発現するポリヌクレオチドを導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することにより得られることから、このようなトランスジェニック非ヒト動物では、全細胞がｓＧＣとｃＧＭＰ可視化プローブの共存するセンサー細胞となる。
また、上記第９の発明の非ヒト動物またはその子孫動物は、細胞内に、可溶性グアニル酸シクラーゼを発現するポリヌクレオチドとｃＧＭＰ可視化プローブを発現するポリヌクレオチドを導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することにより得られることから、このようなトランスジェニック非ヒト動物では、全細胞がｓＧＣとｃＧＭＰ可視化プローブの共存するセンサー細胞となる。
さらに、上記第１０の発明の非ヒト動物またはその子孫動物は、細胞内に、可溶性グアニル酸シクラーゼの二つのサブユニットαおよびβの各々にｃＧＭＰ可視化プローブを連結してなる二種類のハイブリッド蛋白質を発現する二種類のポリヌクレオチドを導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することにより得られる。したがって、このようなトランスジェニック非ヒト動物では、全細胞がｓＧＣとｃＧＭＰ可視化プローブの共存するセンサー細胞となる。
これらのトランスジェニック非ヒト動物では、前記のとおり、全細胞においてｓＧＣとｃＧＭＰ可視化プローブが共存しており、全細胞が、前記のセンサー細胞であるといえる。したがって、このような動物に刺激を付与したり、候補物質を投与したりすることにより、生体内の各臓器や組織におけるＮＯ濃度の変化や、ＮＯ濃度の生命活動に対する影響等を観察することが可能となる。
また、上記第１１の発明では、ｃＧＭＰ可視化プローブを、ｃＧＭＰ結合蛋白の両末端に互いの近接が検出可能な二つのマーカー部位が連結されてなるものとすることから、細胞内にＮＯが存在または侵入し、ｓＧＣによりｃＧＭＰが生成されると、ｃＧＭＰがｃＧＭＰ結合蛋白と結合し、ｃＧＭＰ結合蛋白の立体構造が変化し、両末端に連結された二つのマーカー部位が近接するようになり、シグナルが発信される。したがって、特定の臓器または組織におけるＮＯの存在または侵入を精度高く検出することが可能となる。
さらに、このような非ヒト動物またはその子孫動物の態様として、上記第１２の発明では、ｃＧＭＰ結合蛋白をＰＫＧＩαとし、上記第１３の発明では、ｃＧＭＰ可視化プローブにおける互いの近接が検出可能な二つのマーカー部位をシアン蛍光蛋白質と黄色蛍光蛋白質とする。
上記第１４の発明の細胞内ＮＯの検出・定量方法では、前記いずれかのセンサー細胞におけるシグナル変化を測定することにより、細胞内ＮＯを検出・定量することが可能となる。
また、上記第１５の発明の細胞内ＮＯ濃度のモニタリング方法では、前記いずれかのセンサー細胞に刺激を付与し、刺激付与前後におけるシグナル変化を測定することにより、刺激による細胞内でのＮＯ濃度の変化をモニタリングできる。
上記第１６の発明の細胞放出ＮＯの検出・定量方法では、ＮＯの放出を検出・定量したい細胞と、前記いずれかのセンサー細胞を近接配置し、センサー細胞におけるシグナル変化を測定することにより、細胞から放出されるＮＯを検出・定量することができる。
上記第１７の発明のスクリーニング方法では、前記いずれかのＮＯに候補物質を導入し、候補物質存在下および非存在下におけるシグナル変化を測定することにより、ｓＧＣに対するＮＯの結合に影響を与える物質をスクリーニングすることができる。
さらに、上記第１８の発明の生体内ＮＯの検出・定量方法では、前記いずれかの非ヒト動物またはその子孫動物におけるシグナル変化を測定することにより、生体内ＮＯを検出・定量することが可能となる。
上記第１９の発明のモニタリング方法では、前記いずれかの非ヒト動物に刺激を付与し、刺激付与前後の該非ヒト動物におけるシグナル変化を測定することにより、刺激による生体内でのＮＯ濃度の変化をモニタリングできる。
そして、上記第２０のスクリーニング方法では、前記いずれかの非ヒト動物に候補物質を投与し、候補物質存在下および非存在下における該非ヒト動物のシグナル変化を測定することにより、ｓＧＣに対するＮＯの結合に影響を与える物質をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、この出願の発明の一酸化窒素検出用センサー細胞の構成を例示した概略模式図である。
図２は、この出願の発明の一酸化窒素検出用センサー細胞の別の構成を例示した概略模式図である。
図３は、この出願の発明の実施例において、一酸化窒素検出用センサー細胞をＮＯの供与体であるＮＯＣ−７（１０、５０、１００ｎＭおよび１μＭ）で刺激した際のＣＦＰとＹＦＰの蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）の経時変化を示した図である。
図４は、この出願の発明の実施例において、一酸化窒素検出用センサー細胞をＮＯＣ−７で刺激した際のＮＯＣ−７濃度とＣＦＰとＹＦＰの蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）変化の関係を示した図である。
図５は、この出願の発明の実施例において、一酸化窒素検出用センサー細胞に神経細胞（ニューロン）を近接配置し、該神経細胞を神経伝達物質として知られるグルタミン酸（１、５、１０および１００μＭ）で刺激した際のＣＦＰとＹＦＰの蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）の経時変化を示した図である。
図６は、この出願の発明の実施例において、一酸化窒素検出用センサー細胞に近接配置した神経細胞（ニューロン）をグルタミン酸で刺激した際のグルタミン酸濃度とＣＦＰとＹＦＰの蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）変化の関係を示した図である。
図７は、この出願の発明の実施例において、一酸化窒素検出用センサー細胞を敷き詰めた培養皿に海馬部位を置いた際のＣＦＰとＹＦＰの蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）の経時変化を示した図である。
図８は、一酸化窒素検出用センサー細胞の応答の検証において、（Ａ）励起光を絞って狭い領域で紫外光を照射しＮＯを放出させた場合（ｌｏｃａｌ  ｕｎｃａｇｉｎｇ：狭領域放出）と、（Ｂ）励起光を絞らず広い領域でＮＯを放出させた場合（ｕｎｉｆｏｒｍａｌ  ｕｎｃａｇｉｎｇ：広領域放出）場合を示している。
図９は、ＢＮＮ５Ｎａ刺激による一酸化窒素検出用センサー細胞の蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）変化を疑似カラー変化として表示した図であり、１はＮＯを放出させる前（ＢＮＮ５Ｎａ刺激前）のセンサー細胞の疑似カラー変化、２（Ｌ）は局所的にＮＯを放出させた場合の疑似カラー変化、３は２（Ｌ）における時間経過後の疑似カラー変化、４（Ｌ）は広い領域でＮＯを放出させた場合の疑似カラー変化、５は４（Ｌ）における時間経過後の疑似カラー変化を示している。
図１０は、領域−１と領域−３とにおける、一酸化窒素検出用センサー細胞の蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）変化と時間経過（単位は分）との関係を示した図である。
図１１は、一酸化窒素検出用センサー細胞を用いた血管内皮細胞から放出されるＮＯの時空間分析の様子を示した図であり、（Ａ）は時空間分析の実験系を例示した模式図であり、（Ｂ−１）はカバーガラス上のセンサー細胞のＰＣイメージ、（Ｂ−２）はカバーガラス上のセンサー細胞の蛍光イメージ、（Ｃ）はディッシュ上の血管内皮細胞のＰＣイメージである。
図１２は、ブラジキニン（ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ）刺激を受けた血管内皮細胞による、一酸化窒素検出用センサー細胞の蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）変化を疑似カラー変化として表示した図であり、（Ａ）はブラジキニン刺激前のセンサー細胞の疑似カラー変化、（Ｂ）はブラジキニン刺激して２３０秒後のセンサー細胞の疑似カラー変化、（Ｃ）はブラジキニン刺激して１０４０秒後のセンサー細胞の疑似カラー変化を示している。
図１３は、領域−１と領域−２とにおける、一酸化窒素検出用センサー細胞の蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）変化と時間経過（単位は秒）との関係を示した図である。
なお、図中の符号は以下のものを示している。
１  センサー細胞
２  一酸化窒素（ＮＯ）
３  可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）
３１  ヘム鉄
３２  α（サブユニット）
３３  β（サブユニット）
４  グアノシン５’−三リン酸（ＧＴＰ）
５  サイクリックグアノシン３’，５’−一リン酸（ｃＧＭＰ）
６  ｃＧＭＰ可視化プローブ
ａ  配位結合
ｂ  ｃＧＭＰ生成
ｃ  ｃＧＭＰ認識
ｄ  シグナル発信
【発明を実施するための最良の形態】  この出願の発明の一酸化窒素（ＮＯ）検出用センサー細胞は、前記のどおり、生細胞内で、少なくともｓＧＣとｃＧＭＰ可視化プローブが共存していることを特徴とするものであり、その作用原理は、図１に模式的に示したとおりである。
すなわち、センサー細胞（１）内にＮＯ（２）が存在したり、センサー細胞（１）に外部からＮＯ（２）が侵入したりした場合には、ｓＧＣ（３）のヘム鉄（３１）にＮＯ（２）が配位結合し（ａ）、これによりｓＧＣ（３）の酵素活性が増大し、センサー細胞（１）内に内在的に存在するグアノシン５’−三リン酸（以下、ＧＴＰと記載する）（４）を基質として大量のｃＧＭＰ（５）が生成される（ｂ）。すると、センサー細胞（１）内のｃＧＭＰ可視化プローブ（６）がｃＧＭＰ（５）を認識し（ｃ）、シグナルを発信する（ｄ）。したがって、言い換えれば、ＮＯ（２）の濃度変化は、ｓＧＣ（３）により増幅され、ｃＧＭＰ（５）濃度の変化としてｃＧＭＰ可視化プローブ（６）からのシグナル変化として検出されるのである。
また、ＮＯ（２）のｓＧＣ（３）のヘム鉄（３１）への配位結合は、平衡反応であり、可逆的であることから、ＮＯ（２）がｓＧＣ（３）のヘム鉄（３１）に配位結合し、センサー細胞（１）内に遊離しているＮＯ（２）が減少すると、ｓＧＣ（３）のヘム鉄（３１）からＮＯ（２）が解離するようになり、ｓＧＣ（３）の酵素活性が失われる。そのため、センサー細胞（１）内でのｃＧＭＰ（５）生成が行われなくなり、センサー細胞（１）内に内在的に存在するホスホジエステラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ；ＰＤＥ）によるｃＧＭＰ（５）の分解だけが進行するようになる。そのため、センサー細胞（１）内のｃＧＭＰ（５）濃度は減少し、ｃＧＭＰ可視化プローブ（６）のシグナル変化として現れる。
したがって、この出願の発明のセンサー細胞（１）は、ＮＯ（２）濃度依存的に可逆的な応答を示すといえる。
このようなＮＯ検出用センサー細胞（１）において、ｃＧＭＰ可視化ブローブ（６）は、ｃＧＭＰを認識してシグナルを発するものであればよく、とくに限定されないが、好ましくは、この出願の発明者らが報告しているもの（特許文献１および２）、すなわち、ｃＧＭＰ結合蛋白の両末端に互いの近接が検出可能な二つのマーカー部位が連結されてなるものとすることが望ましい。このようなｃＧＭＰ可視化プローブ（６）は、ｃＧＭＰ（５）が共存するとき、ｃＧＭＰ結合蛋白がｃＧＭＰ（５）と結合し、それにより生じる二つのマーカー部位の立体配置の変化が光学的変化として現れる。したがって、この光学的変化を測定することにより、センサー細胞におけるＮＯ（２）を、ｃＧＭＰ（５）を介して検出・定量できるのである。
このようなｃＧＭＰ可視化プローブ（６）において、ｃＧＭＰ結合蛋白としては、ｃＧＭＰ依存性蛋白キナーゼＩα（ＰＫＧＩα）が例示される。哺乳動物のＰＫＧＩαは、４種の機能性ドメインを有する二つの同一モノマーからなり、Ｎ−末端側に存在する二量体化ドメインは、ロイシン／イソロイシンジッパーモチーフからなる。ｃＧＭＰ（５）が共存しない場合、ＰＫＧＩαは、キナーゼ不活性で、触媒中心が自己阻害ドメインによって占有されるクローズドコンホメーションを示すが、ｃＧＭＰ（５）と結合した場合には、自己阻害ドメインが活性中心から除去され、ＰＫＧＩαは、オープンコンホメーションを示す。したがって、このようなｃＧＭＰ（５）との結合によりＰＫＧＩαの両末端のマーカー部位の立体配置が変化し、光学的変化を生じて、ｃＧＭＰ（５）との結合が可視的に検出されるのである。
もちろん、ｃＧＭＰ可視化プローブ（６）におけるｃＧＭＰ結合蛋白は、ＰＫＧＩαに限定されず、合成および天然のあらゆるペプチド鎖を用いることができる。
また、この出願の発明の一酸化窒素検出用センサー細胞（１）中に存在するｃＧＭＰ可視化プローブ（６）が、前記のようにｃＧＭＰ結合蛋白の両末端に互いの近接が検出可能な二つのマーカー部位が連結されてなるものである場合、互いの近接が検出可能な二つのマーカー部位としては、種々の発色団が考慮される。このとき、発色団は、ｃＧＭＰ（５）とｃＧＭＰ結合蛋白の結合により生じる立体構造の変化に応答して精度高く波長変化を生じなければならない。生化学の分野においては、一般的に種々の蛍光発色団が用いられるが、構造変化に敏速に応答するものとしては、蛍光共鳴エネルギー移動（以下、ＦＲＥＴ）の生起により蛍光強度比に変化を来たす発色団がある。したがって、二つのマーカー部位としては、異なる蛍光波長を有する二つの蛍光発色団、具体的には、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のＧＦＰのブルーシフト変異タンパク質であるシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）や、レッドシフト変異タンパク質である黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）が適用できる。これにより、ｃＧＭＰ（５）の生成を、蛍光波長の変化として、通常行われる種々の化学的、生化学的分析方法により検出することが可能となる。もちろん、このような二つのマーカー部位としては、ＣＦＰとＹＦＰの組み合わせ以外にも、各種の蛍光タンパク質やスプリットしたレニラルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ等が適用できる。
一方、この出願の発明の一酸化窒素検出用センサー細胞（１）において、ｓＧＣ（３）は、可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓｏｌｕｂｌｅ  ｇｕａｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ）であり、広く生物一般に存在するものである。
したがって、一酸化窒素検出用センサー細胞（１）において、ｓＧＣ（３）とｃＧＭＰ可視化プローブ（６）を共存させる方法としては、例えば、ｓＧＣ（３）を発現している細胞に、ｃＧＭＰ可視化プローブ（６）を発現するポリヌクレオチドを導入することにより、該細胞内でｓＧＣ（３）とｃＧＭＰ可視化プローブ（６）を共存させる方法が挙げられる。このとき、発現ベクターとしては、動物細胞発現用のプラスミドベクターが好ましく用いられる。このようなプラスミドベクターを細胞に導入する方法としては、電気穿孔法、リン酸化カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の公知の方法を採用することができる。このように、ｃＧＭＰ可視化プローブ（６）を組み込んだ発現ベクターを、内在的にｓＧＣ（３）を有する細胞に導入する方法を用いることにより、細胞内でｓＧＣ（３）とｃＧＭＰ可視化プローブ（６）を共存させることができる。
もちろん、細胞内に、ｓＧＣ（３）を発現するポリヌクレオチドとＧＭＰ可視化プローブ（６）を発現するポリヌクレオチドを導入することによっても、該細胞内でｓＧＣ（３）とＧＭＰ可視化プローブ（６）を共存させることができる。
さらに、この出願の発明では、図２に模式的に示されるように、細胞（１）内に、ｓＧＣ（３）の二つのサブユニットα（３２）およびβ（３３）の各々にＧＭＰ可視化プローブ（６）を連結してなる二種類のハイブリッド蛋白質を発現する二種類のポリヌクレオチドを導入することにより、該細胞（１）内で、ｓＧＣ（３）の二つのサブユニットα（３２）およびβ（３３）が二量化しα（３２）およびβ（３３）サブユニットに各々ＧＭＰ可視化プローブ（６）が連結されたｓＧＣ（３）が構築されるようにしてもよい。
以上のとおりのセンサー細胞（１）を用いれば、前記のとおり、細胞内に存在する一酸化窒素を検出・定量することが可能となる。例えば、通常の条件で発せされるシグナルを測定した後、特定の刺激を付与し、その際のシグナル変化を測定することにより、該刺激の細胞内一酸化窒素濃度変化に与える影響をモニタリングすることが可能となる。具体的には、センサー細胞（１）におけるＧＭＰ可視化プローブ（６）を、前記のｃＧＭＰ結合蛋白の両末端に互いの近接が検出可能な二つのマーカー部位が連結されてなるものとし、二つのマーカー部位がＣＦＰとＹＦＰの組み合わせとした場合、刺激によりＮＯ（２）濃度が増大すれば、ＣＦＰとＹＦＰの蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）は減少する。もちろん、測定を連続して行うことにより、刺激の時間的な影響、すなわち、刺激によるＮＯ（２）濃度の経時変化を観察することも可能となる。このとき付与される刺激は、ホルモン、内分泌攪乱物質等の生化学的刺激であってもよいし、電気、放射線、熱等の物理的刺激であってもよい。
また、このセンサー細胞（１）を用いて、細胞から放出されるＮＯ（２）を検出・定量することもできる。これは、一酸化窒素の放出を検出・定量したい細胞（以下、ドナー細胞とする）と、センサー細胞（１）を近接配置し、センサー細胞（１）におけるシグナル変化を測定することにより可能となる。すなわち、ドナー細胞から放出されたＮＯ（２）が、センサー細胞（１）に侵入することから、センサー細胞（１）におけるシグナル変化として現れるという原理により可能となる。
さらに、センサー細胞（１）を用いて、ｓＧＣ（３）に対するＮＯ（２）の結合に影響を与える物質をスクリーニングすることもできる。すなわち、センサー細胞（１）に候補物質を導入し、候補物質存在下および非存在下におけるシグナル変化を測定したり、前記のドナー細胞に候補物質を導入し、候補物質存在下および非存在下におけるドナー細胞からのＮＯ（２）放出量をセンサー細胞（１）からのシグナル変化を測定したりすることにより、この候補物質が、ｓＧＣ（３）へのＮＯ（２）の結合を阻害するか否かを判断することができるのである。
この出願の発明では、さらに、全細胞が以上のとおりのセンサー細胞であるトランスジェニック非ヒト動物も提供される。すなわち、前記のいずれかの方法により細胞（１）内でｓＧＣ（３）とｃＧＭＰ可視化プローブ（６）を共存させ、非ヒト全能性細胞を個体発生することにより、全細胞においてｓＧＣ（３）とｃＧＭＰ可視化プローブ（６）が共存している非ヒト動物またはその子孫動物が得られる。このようなトランスジェニック非ヒト動物は、公知の作成法（例えば、非特許文献３）に従って作成することができる。
このようなトランスジェニック非ヒト動物は、すべての体細胞にｓＧＣ（３）とｃＧＭＰ可視化プローブ（６）を保有しているため、シグナル変化を測定することにより生体内におけるＮＯ（２）濃度を測定することが可能となる。また、例えば、その体内に熱、電気、放射線等の刺激を与えたり、医薬品等の検査物質を投与したりし、細胞、組織、臓器等におけるＮＯ濃度を測定することにより、生体における刺激の影響をモニタリングしたり、様々な物質のスクリーニングを行うことも可能となる。さらに、このようなトランスジェニック非ヒト動物を、すべての体細胞にｓＧＣ（３）とｃＧＭＰ可視化プローブ（６）を保有する遺伝子破壊動物等の疾患モデル動物とし、ＮＯ産生について正常動物との差異を観察すれば、ＮＯの生理作用に関して基礎生物学的知見を得ることが可能となる。
なお、トランスジェニック非ヒト動物におけるシグナル測定方法としては、蛍光顕微鏡、共焦点レーザー走査顕微鏡、実体蛍光顕微鏡、多光子レーザー走査顕微鏡等が挙げられる。
以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
【実施例】＜実施例１＞
ｓＧＣを発現している培養細胞として、ブタ肝臓由来のＰＫ１５細胞を選択した。
このＰＫ１５細胞に、特許文献１および２に記載の方法で作製したｃＧＭＰ可視化プローブ（以下、ＣＧＹと記載する）を発現するｃＤＮＡを導入し、ｃＧＹを発現させた。
この細胞を、ＮＯの供与体であるＮＯＣ−７（１０、５０、および１００ｎＭ）で刺激したところ、図３に示されるように、ＣＦＰとＹＦＰの蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）が急激に減少し、極小値に達した後、再び初期値まで徐々に回復した。
これより、ＮＯが増加したことにより、ｓＧＣの酵素活性が高まり、細胞内でｃＧＭＰが増加したものの、時間の経過に伴いＮＯの酸化によるＮＯ濃度の低下や、細胞内のＰＤＥによるｃＧＭＰ量の減少が起こったことが示された。
したがって、この出願の発明の方法により、ＮＯ濃度変化に対応したｃＧＭＰ濃度の変化を可逆的に検出できることが確認された。
次に、より高濃度のＮＯＣ−７（１μＭ）で細胞を刺激したところ、図３に示されるように、直ちに応答が飽和に達した。これは、高濃度のＮＯＣ−７による刺激で細胞内に大量のｃＧＭＰが生成したことによると考えられる。しかし、この飽和応答は、２５分経過後もほとんど変化せず、蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）が刺激前の値に戻ることはなかった。
これより、ＮＯが酸化されてｃＧＭＰの生成量が減少したり、ｃＧＭＰがＰＤＥにより分解されたりした後も、ＣＧＹの飽和に十分なｃＧＭＰと、その生成を刺激するのに十分なＮＯが存在していることが示唆された。
以上より、この出願の発明の方法により、１０ｎＭという生理的濃度のＮＯを高感度に検出できることが確認された（図４）。
＜実施例２＞
次にラット胎児脳の海馬より調製した神経細胞（ニューロン）に、ｓＧＣとＣＧＹを発現した実施例１のＰＫ１５細胞を近接配置し、神経細胞を神経伝達物質として知られるグルタミン酸で刺激した。
図５および６に示されるとおり、グルタミン酸濃度依存的なＰＫ１５細胞による応答が確認された。これより、神経細胞から放出されるＮＯを、ｓＧＣとＣＧＹを発現したＰＫ１５細胞により検出・定量できることが確認された。
また、血管内皮細胞やマクロファージをＮＯドナー細胞とし、同様にｓＧＣとＣＧＹを発現した実施例１のＰＫ１５を近接配置したところ、これらのＮＯドナー細胞からのＮＯ放出についても可視化することができた。
＜実施例３＞
生後２１日目のラットから脳を取り出して４００μｍの厚さにスライスし、さらにそこから記憶・学習に重要な海馬部位を切り出した。
ｓＧＣおよびＣＧＹを発現した実施例１のＰＫ１５細胞を培養皿に敷き詰め、その上に海馬部位を置いて蛍光顕微鏡で観察したところ、直ちに蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）の減少が観察された（図７ａ）。（なお、図中＊印で示した時間に海馬部位をセンサー細胞上に置いた。）
一方、海馬部位をあらかじめＮＯ合成酵素（ＮＯＳ）の阻害剤であるＬ−ＮＡＭＥで処理し、同様の試験を行ったところ、蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）に有意な変化は見られなかった（図７ｂ）。
これより、ｓＧＣとＣＧＹを発現した実施例１のＰＫ１５細胞を用いて、海馬から放出されるＮＯを検出できることが示された。
海馬には、多くの神経細胞がネットワークを形成しており、外部から刺激物質を添加しなくても、自発的に神経細胞がある程度活性化していると考えられる。
このように、生理的条件での海馬からのＮＯ放出を高感度に検査できることが示されたことから、この出願の発明の方法は、海馬、脳部位、血管組織以外の、従来知られていなかった新しいＮＯ放出部位の時空間的マッピングをも可能にすると期待される。
＜実施例４＞
一酸化窒素（ＮＯ）検出用センサー細胞（以下、センサー細胞とすることがある）を培養して作製したシート上で、局所的にＮＯを放出させ、個々のセンサー細胞の応答を検証した。
なお、局所的なＮＯ放出剤として、センサー細胞の細胞外液にｃａｇｅｄ  ＮＯであるＮ，Ｎ’−ｄｉｎｉｔｒｏｓｏｐｈｅｎｙｌｅｎｅｎｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ’−ｄｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ（ＢＮＮ５Ｎａ）を１μＭになるように加えた。ＢＮＮ５Ｎａは、水溶性であるため細胞外に存在しており、また、紫外光励起によってＮＯを放出することを特徴としている。
（１）  まず、図８（Ａ）に示したように、励起光を絞って狭い領域で紫外光を照射しＮＯを放出させた場合（ｌｏｃａｌ  ｕｎｃａｇｉｎｇ：狭領域放出）と、図８（Ｂ）に示したように、励起光を絞らず広い領域でＮＯを放出させた場合（ｕｎｉｆｏｒｍａｌ  ｕｎｃａｇｉｎｇ：広領域放出）を比較した。
（２）  図９は、ＢＮＮ５Ｎａ刺激によるセンサー細胞の蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）変化を疑似カラー変化として表示した図である。センサー細胞がＮＯを感知すると、ＦＲＥＴが生起するため蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）は減少し、疑似カラーはｂｌｕｅ  ｓｈｉｆｔすることになる。
図８（Ａ）に示したように局所的にＮＯを放出させた場合には、ＮＯを放出させた視野の中央あたりでのみセンサー細胞が応答し、疑似カラーの大きな変化が観察されたが、その一方で、その周辺ではほとんど疑似カラーは変化していない（図９−２（Ｌ））。なお、図９−１は、ＮＯを放出させる前（ＢＮＮ５Ｎａ刺激前）のセンサー細胞の疑似カラー変化を示している。
その後、応答したセンサー細胞は、図９−１に示した元の疑似カラーに戻る様子が観察された（図９−３）。このセンサー細胞の局所的応答および引き続く疑似カラーの回復は、生成したＮＯの拡散による濃度低下のためである。
続いて、図８（Ｂ）のように、広い領域でＮＯを放出させると、視野全体でセンサー細胞が応答し、疑似カラーの大きな変化が観察された（図９−４（Ｕ））。その後、センサー細胞は、もとの疑似カラーに戻る様子が観察された（図９−５）．この疑似カラーの回復は、狭領域放出の時と同様に、生成したＮＯの拡散による濃度低下のためである。
（３）  上記実験を繰り返し行い、その結果を図１０に示した。領域−１（ｒｅｇｉｏｎ−１）は、狭領域放出でも、広領域放出でもＮＯが放出されている領域のセンサー細胞の蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）変化を示し、領域−３（ｒｅｇｉｏｎ−３）は、広領域放出でのみＮＯが放出されている領域のセンサー細胞の蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）変化を示している。
この図１０から、狭領域放出では、領域−１に比べて領域−３でのセンサー細胞の応答が小さいことが確認でき、その一方で、広領域放出では、領域−１および領域−３のセンサー細胞が、ほぼ同様の応答を示していることが確認できた。この狭領域放出と広領域放出を繰り返し行ったところ、センサー細胞の応答も再現よく得られることも、図１０に示した結果から確認することができた。
以上の結果から、この出願の発明のＮＯ検出用センサー細胞は、局所的に放出されるＮＯを再現性よく時空間可視分析できることを確認することができた。
＜実施例５＞
ＮＯを放出する細胞として血管内皮細胞や神経細胞、免疫細胞等が知られているが、この出願の発明の実施形態の一例として、ＮＯ検出用センサー細胞を用いて内皮細胞から放出されるＮＯの時空間分析を行った。
（１）  図１１（Ａ）に例示したように、カバーガラス上にセンサー細胞を培養し、次に、血管内皮細胞をディッシュに培養して、この上にセンサー細胞が張り付いたカバーガラスをのせて実験系を構築した。
焦点面を変えることで、図１１（Ｂ−１）（Ｂ−２）に示したカバーガラス上のセンサー細胞と、図１１（Ｃ）に示したディッシュ上の内皮細胞をそれぞれ観察した。図１１（Ｂ）（Ｃ）に示したとおり、センサー細胞は、視野の全面に敷き詰め、図１１（Ｃ）に示したとおり、内皮細胞は薄捲きしており、視野の中央に一つだけ存在している（図中の実線で囲んだ部分）。
（２）  細胞外液に、血管弛緩性ペプチドホルモンのブラジキニン（ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ）１μＭを添加し、血管内皮細胞を刺激したところ、図１２（Ｂ）のように、センサー細胞が、内皮細胞の真上とその周辺領域で応答する様子が観察された。
その後、センサー細胞が応答している領域は、小さくなっていく様子が観察された（図１２（Ｃ））。なお、図１２（Ａ）は、刺激前のセンサー細胞の様子を示している。また、図１２（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）中のセンサー細胞における実線で囲んだ部分は、図１１（Ｃ）で示した内皮細胞における実線で囲んだ部分と対応している。
（３）  図１３は、この実験における蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）変化を示している。領域−１（ｒｅｇｉｏｎ−１）は、内皮細胞の真上に存在するセンサー細胞の応答であり、領域−２（ｒｅｇｉｏｎ−２）はその周辺に存在するセンサー細胞の応答である。領域−１、領域−２ともに、ブラジキニン依存的な蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）変化は観察されたが、その大きさは異なっており、内皮細胞の真上（領域−１）の方が、その周辺（領域−２）よりも応答が大きいことを確認することができた。
さらに、図１３の結果からは、刺激後の１０００秒後でも内皮細胞の真上（領域−１）では、センサー細胞の応答が続いたが、その周辺（領域−２）では、センサー細胞の応答が無くなっていることを確認することができた。
ＮＯは、それが生成した細胞の近隣の細胞にも侵入し、それら細胞内の情報伝達をも活性化すると考えられていたが、どの程度の範囲の細胞が一つの細胞から放出されたＮＯにより遠隔的に支配されるのか、従来法では明らかにできなかった。
しかしながら、以上のとおり、この出願の発明のＮＯ検出用のセンサー細胞は、一つ一つの細胞から放出されるＮＯの拡散を時空間可視分析できるのである。そして、この出願の発明の方法は、血管内皮細胞のみならず神経細胞、免疫細胞等、各種の細胞でも適用可能である。
【産業上の利用可能性】  以上詳しく説明したとおり、この発明によって、細胞内の低濃度のＮＯを、精度高く、簡便に検出・定量できるセンサー細胞が提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年9月19日(2006.9.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】請求の範囲
【請求項１】少なくとも可溶性グアニル酸シクラーゼと、サイクリックグアノシン３’，５’−一リン酸を認識してシグナルを発するｃＧＭＰ可視化プローブが共存している生細胞であって、近接する検体細胞が放出する一酸化窒素の濃度に依存してｃＧＭＰ可視化プローブが可逆的なシグナル変化を示すことを特徴とする一酸化窒素検出用センサー細胞。
【請求項２】可溶性グアニル酸シクラーゼを発現している細胞に、ｃＧＭＰ可視化プローブを発現するポリヌクレオチドを導入することにより、該細胞内で可溶性グアニル酸シクラーゼとｃＧＭＰ可視化プローブを共存させてなる請求項１のセンサー細胞。
【請求項３】細胞内に、可溶性グアニル酸シクラーゼを発現するポリヌクレオチドとｃＧＭＰ可視化プローブを発現するポリヌクレオチドを導入することにより、該細胞内で可溶性グアニル酸シクラーゼとｃＧＭＰ可視化プローブを共存させてなる請求項１のセンサー細胞。
【請求項４】細胞内に、可溶性グアニル酸シクラーゼの二つのサブユニットαおよびβの各々にｃＧＭＰ可視化プローブを連結してなる二種類のハイブリッド蛋白質を発現する二種類のポリヌクレオチドを導入することにより、該細胞内で可溶性グアニル酸シクラーゼとｃＧＭＰ可視化プローブを共存させてなる請求項１のセンサー細胞。
【請求項５】ｃＧＭＰ可視化プローブは、ｃＧＭＰ結合蛋白の両末端に互いの近接が検出可能な二つのマーカー部位が連結されてなるものである請求項１ないし４のいずれかののセンサー細胞。
【請求項６】ｃＧＭＰ可視化プローブにおけるｃＧＭＰ結合蛋白は、ｃＧＭＰ依存性キナーゼＩαである請求項５のセンサー細胞。
【請求項７】ｃＧＭＰ可視化プローブにおける互いの近接が検出可能な二つのマーカー部位は、シアン蛍光蛋白質と黄色蛍光蛋白質である請求項５または６のいずれかのセンサー細胞。
【請求項８】（削除）
【請求項９】（削除）
【請求項１０】（削除）
【請求項１１】（削除）
【請求項１２】（削除）
【請求項１３】（削除）
【請求項１４】（削除）
【請求項１５】検体細胞から放出される一酸化窒素を検出・定量する方法であって、検体細胞と、請求項１ないし７のいずれかのセンサー細胞を近接配置し、センサー細胞における可逆的なシグナル変化を測定することによって、検体細胞から拡散される一酸化窒素を検出・定量することを特徴とする検体細胞放出一酸化窒素の検出・定量方法。
【請求項１６】検体細胞から放出される一酸化窒素が、検体細胞を刺激した際に放出される一酸化窒素である請求項１５の方法。
【請求項１７】可溶性グアニル酸シクラーゼに対する一酸化窒素の結合に影響を与える物質をスクリーニングする方法であって、候補物質を導入した検体細胞と、請求項１ないし７のいずれかのセンサー細胞を近接配置し、センサー細胞における可逆的なシグナル変化を測定することを特徴とするスクリーニング方法。
【国際調査報告】
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