【手続補正書】
【提出日】令和2年2月25日(2020.2.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）骨髄系分化を誘導する条件下でヒト多能性幹細胞を培養する工程、
（b）工程（a）において生成したCD14＋および/またはCX3CR1＋細胞を単離する工程
を含み、該CD14＋および/またはCX3CR1＋細胞がミクログリア前駆細胞である、ミクログリア前駆細胞を生成するための方法。
【請求項２】
（a）CD14＋および/またはCX3CR1＋ミクログリア前駆細胞の生成につながる骨髄系分化を誘導する条件下でヒト多能性幹細胞を培養する工程、ならびに
（b）CD14＋および/またはCX3CR1＋ミクログリア前駆細胞を、（i）IL-34を含む第1のミクログリア分化培地、または（ii）M-CSFを含む第2のミクログリア分化培地のいずれかにおいて、培養する工程
を含み、それによってヒトミクログリア細胞を生成する、ミクログリア細胞を生成するための方法。
【請求項３】
工程（b）においてCD14＋および/またはCX3CR1＋ミクログリア前駆細胞を培養する前に、工程（a）において産生されたCD14＋および/またはCX3CR1＋ミクログリア前駆細胞を単離する工程をさらに含む、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
工程（a）が、多能性幹細胞の造血前駆細胞への分化を誘導することを含む、請求項1または請求項２に記載の方法。
【請求項５】
造血前駆細胞の骨髄系前駆細胞への分化を誘導することをさらに含む、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
骨髄系前駆細胞のCD14＋および/またはCX3CR1＋ミクログリア前駆細胞への分化を誘導することをさらに含む、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
工程（a）が、細胞培養物を、多能性幹細胞の維持または分化に適した無血清培地中で、BMP4を含む第1の組成物と接触させることを含み、細胞培養物を第1の組成物と最初に接触させるときに、細胞培養物が多能性幹細胞を含む、請求項1または請求項2に記載の方法。
【請求項８】
細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、(i)bFGF、SCF、VEGF-Aおよびそれらの組合せからなる群より選択される1種または複数種の因子、または(ii)bFGF、SCF、VEGF-Aおよびそれらの組合せ、を含む第2の組成物と接触させることをさらに含む、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、(i)SCF、IL-3、TPO、MCSF、FLT3リガンドおよびそれらの組合せからなる群より選択される1種または複数種の因子、または(ii) SCF、IL-3、TPO、MCSF、FLT3リガンドおよびそれらの組合せ、を含む第3の組成物と接触させることをさらに含む、請求項7に記載の方法。
【請求項１０】
細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、(i)MCSF、FLT3リガンド、GM-CSFおよびそれらの組合せからなる群より選択される1種または複数種の因子、または(ii) MCSF、FLT3リガンド、GM-CSFおよびそれらの組合せ、を含む第4の組成物と接触させることをさらに含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
工程（a）が、
a）細胞培養物を、多能性幹細胞の維持または分化に適した無血清培地中で、BMP4を含む第1の組成物と接触させることであって、細胞培養物を第1の組成物と最初に接触させるときに、細胞培養物が多能性幹細胞を含む、接触させること、
b）細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、bFGF、SCF、およびVEGF-Aを含む第2の組成物と接触させること、
c）細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、SCF、IL-3、TPO、MCSF、およびFLT3リガンドを含む第3の組成物と接触させること、ならびに
d）細胞培養物を、無血清造血細胞培地中で、MCSF、FLT3リガンド、およびGM-CSFを含む第4の組成物と接触させること
を逐次的に含む、請求項1または請求項2に記載の方法。
【請求項１２】
第1のミクログリア分化培地がGM-CSFをさらに含む、請求項2に記載の方法。
【請求項１３】
第2のミクログリア分化培地が、GM-CSF、NGF-β、CCL2およびそれらの組合せからなる群より選択される1種または複数種の因子をさらに含む、請求項2に記載の方法。
【請求項１４】
第2のミクログリア分化培地が、GM-CSF、NGF-βおよびCCL2をさらに含む、請求項2に記載の方法。
【請求項１５】
CD14＋および/またはCX3CR1＋ミクログリア前駆細胞が、第1または第2のミクログリア分化培地においておよそ15日間にわたって培養される、請求項2に記載の方法。
【請求項１６】
ヒト多能性幹細胞が、骨髄系分化を誘導する条件下でおよそ25〜50日間培養される、請求項1または請求項2に記載の方法。
【請求項１７】
細胞培養物を、およそ4日間、第1の組成物と接触させることを含む、請求項7または請求項11に記載の方法。
【請求項１８】
細胞培養物を、およそ2日間、第2の組成物と接触させることを含む、請求項8または請求項11に記載の方法。
【請求項１９】
細胞培養物を、およそ8日間、第3の組成物と接触させることを含む、請求項9または請求項11に記載の方法。
【請求項２０】
細胞培養物を、およそ11〜36日間、第4の組成物と接触させることを含む、請求項10または請求項11に記載の方法。
【請求項２１】
多能性幹細胞の分化に適した培地が、(i)多能性因子を含まない、および／または(ii) 塩化リチウム、GABA、ピペコリン酸、bFGFまたはTGFβ1を含まないmTeSR1培地である、請求項7に記載の方法。
【請求項２２】
前記造血細胞培地がStemPro-34である、請求項8〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
CD14＋および/またはCX3CR1＋ミクログリア前駆細胞を単離する工程が、細胞を抗CD14＋抗体および/またはCX3CR1＋抗体と接触させることを含む、請求項1または請求項3に記載の方法。
【請求項２４】
抗体が結合した細胞を、抗体が結合していない細胞から分離することを含む、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
蛍光活性化細胞選別（FACS）を行うことを含む、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
細胞を、抗体に直接的または間接的に結合する磁気ビーズと接触させること、および磁石を使って、抗体が結合した細胞を抗体が結合していない細胞から分離することを含む、請求項24に記載の方法。
【請求項２７】
培地を交換するときに培養上清中に存在する細胞を収集すること、および収集した細胞を細胞培養物に戻すことを含む、請求項1または請求項2に記載の方法。
【請求項２８】
工程（a）中に行われる培地交換に関して、培養上清中に存在する細胞を収集すること、および収集した細胞を細胞培養物に戻すことを含む、請求項2に記載の方法。
【請求項２９】
工程（a）の約10日目より後に行われる培地交換に関して、培養上清中に存在する細胞を収集すること、および収集した細胞を細胞培養物に戻すことを含む、請求項1または請求項2に記載の方法。
【請求項３０】
細胞が第3の組成物または第4の組成物と接触しているときに行われる培地交換に関して、培養上清中に存在する細胞を収集すること、および収集した細胞を細胞培養物に戻すことを含む、請求項9〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
多能性幹細胞が、(i)誘導多能性幹（iPS）細胞である、または(ii)胚性幹（ES）細胞である、請求項1または請求項2に記載の方法。
【請求項３２】
請求項2〜31のいずれか一項に記載の方法を使って生成したミクログリア細胞またはミクログリア前駆細胞を含む、対象を処置するための薬学的組成物。
【請求項３３】
対象が、ミクログリア細胞またはミクログリア前駆細胞の欠陥または欠乏と関連する疾患または障害を有する、請求項32に記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
対象が、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、アルツハイマー病（AD）、多発性硬化症（MS）、パーキンソン病、レット症候群、スフェロイド形成を伴うびまん性白質脳症、軸索スフェロイド形成を伴う遺伝性びまん性白質脳症、前頭側頭葉変性症（FTLD）、家族性FTLD、統合失調症および自閉症スペクトラム障害からなる群より選択される疾患または障害を有する、請求項32に記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
ミクログリア細胞またはミクログリア前駆細胞が、前記対象から得られる体細胞に由来する誘導多能性幹（iPS）細胞から生成される、請求項32に記載の薬学的組成物。
【請求項３６】
前記方法が、
a）対象から得られた体細胞から誘導多能性幹（iPS）細胞を生成する工程、および
b）請求項2〜31のいずれか一項に記載の方法を使ってiPS細胞からミクログリア細胞またはミクログリア前駆細胞を生成する工程、を含む、
請求項32に記載の薬学的組成物。
【請求項３７】
ミクログリア細胞またはミクログリア先駆細胞の欠陥または欠乏と関連する疾患または障害の処置または予防に有用な化合物を同定する方法であって、請求項2〜31に記載の方法によって生成したミクログリア細胞またはミクログリア前駆細胞を、候補化合物と接触させる工程、および該候補化合物がミクログリア細胞またはミクログリア前駆細胞の前記欠陥または欠乏を改善するかどうかを決定する工程を含む、方法。
【請求項３８】
ハイスループット法である、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
請求項2〜31に記載の方法によって生成したミクログリア細胞を候補化合物と接触させる工程、および該候補化合物が、P2RY12 Gタンパク質共役受容体の活性を調節するかどうかを決定する工程を含む、P2RY12 Gタンパク質共役受容体の調節物質を同定する方法。