【手続補正書】
【提出日】令和2年6月10日(2020.6.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマーマトリックス及びそれと結合する少なくとも１つのヒドロポルフィリンを含む蛍光性マイクロ粒子及び/又はナノ粒子であって、該ヒドロポルフィリンが、クロリン類（ホルビン類を含む。）、バクテリオクロリン類（バクテリオホルビン類を含む。）、及びイソバクテリオクロリン類（融合「Ｅ」環を含むイソバクテリオクロリン類を含む。）からなる群から選択され、該少なくとも１つのヒドロポルフィリンの内の１又はそれ以上が、下記化学式Ｉ及びＩＩから成る群から選択される構造を有する、蛍光性マイクロ粒子及び/又はナノ粒子。
【化１】
2019524972.tif 000001
（式中、Ｍは金属であるか又は存在しない；
Ｘは、Ｓｅ、ＮＨ、ＣＨ２、Ｏ及びＳから成る群から選択され；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアルキルアルケニル、シクロアルキルアルキニル、ヘテロシクロ、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、ヘテロシクロアルキニル、アリール、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、アルコキシ、ハロ、メルカプト、アジド、シアノ、ホルミル、カルボン酸、ヒドロキシル、ニトロ、アシル、アリールオキシ、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアルキルアミノ、ジ置換アミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、エステル、アミド、スルホキシル、スルホニル、スルホネート、スルホン酸、スルホンアミド、尿素、アルコキシルアシルアミノ、アミノアシルオキシ、結合基、及び表面結合基から成る群から選択され；
Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３及びＫ４は、それぞれ独立して、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、Ｔｅ及びＣＨから成る群から選択されるヘテロ原子であり；
Ｓ３、Ｓ４、Ｓ７、Ｓ８、Ｓ９、Ｓ１０、Ｓ１１、Ｓ１２、Ｓ１３及びＳ１４、ならびにＳ１及びＳ５のいずれか、又はＳ２及びＳ６のいずれかは、それぞれ独立して、水素原子、アリール、フェニル、シクロアルキル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン原子、アルコキシ、アルキルチオ、ペルフルオロアルキル、ペルフルオロアリール、ピリジル、シアノ、チオシアナト、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、アシル、スルホキシル、スルホニル、イミド、アミド、及びカルバモイルであり、又はＳ７とＳ１３は共に＝Ｏを形成する。）
【請求項２】
前記蛍光性マイクロ粒子及び/又はナノ粒子が、蛍光性マイクロ粒子及び/又はナノ粒子の集団中に存在し、さらに、
(i) 該集団が、複数の異なる蛍光性マイクロ粒子及び/又はナノ粒子を含み；
(ii) 各異なる蛍光性マイクロ粒子及び/又はナノ粒子が、１又はそれ以上の異なるヒドロポルフィリンと結合し；
(iii) 各異なるヒドロポルフィリンが、その最大ピーク半値幅が２５ｎｍ未満であり、かつこのピークが該集団中の他の異なるヒドロポルフィリンのいずれかの発光波長帯から少なくとも５ｎｍ離れている、発光波長帯を有し；及び
(iv) 前記ポリマーマトリックスがポリスチレンである、請求項１に記載の蛍光性マイクロ粒子及び/又はナノ粒子。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の複数の異なる蛍光性マイクロ粒子及び/又はナノ粒子を含む集団であって、
(i) 各蛍光性マイクロ粒子及び/又はナノ粒子が、ポリマーマトリックス及び少なくとも１つのヒドロポルフィリンを含み、かつ
(ii) 該集団が、異なるヒドロポルフィリンを含む、少なくとも２つの異なる蛍光性マイクロ粒子及び/又はナノ粒子を含む、集団。
【請求項４】
各異なる蛍光性マイクロ粒子及び/又はナノ粒子が、１又はそれ以上の異なるヒドロポルフィリンと結合し、最大ピーク半値幅が２５ｎｍ未満であり、かつこのピークが該集団中の他の異なるヒドロポルフィリンのいずれかのものから少なくとも５ｎｍ離れている、発光波長帯を有する、請求項３に記載の集団。
【請求項５】
前記異なる蛍光性ポリマーマイクロ粒子及び/又はナノ粒子の少なくとも一つのサブセットが、クロリン類（ホルビン類を含む。）、バクテリオクロリン類（バクテリオホルビン類を含む。）、及びイソバクテリオクロリン類（融合「Ｅ」環を含むイソバクテリオクロリン類を含む。）からなる群から選択される１つのヒドロポルフィリンを含む、請求項３又は４に記載の集団。
【請求項６】
前記少なくとも１つのヒドロポルフィリンの内の１又はそれ以上が、下記化学式Ｉ及びＩＩから成る群から選択される構造を有する、請求項３〜５のいずれか一項に記載の集団。
【化１】
2019524972.tif 000002
（式中、Ｍは金属であるか又は存在しない；
Ｘは、Ｓｅ、ＮＨ、ＣＨ２、Ｏ及びＳから成る群から選択され；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアルキルアルケニル、シクロアルキルアルキニル、ヘテロシクロ、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、ヘテロシクロアルキニル、アリール、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、アルコキシ、ハロ、メルカプト、アジド、シアノ、ホルミル、カルボン酸、ヒドロキシル、ニトロ、アシル、アリールオキシ、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアルキルアミノ、ジ置換アミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、エステル、アミド、スルホキシル、スルホニル、スルホネート、スルホン酸、スルホンアミド、尿素、アルコキシルアシルアミノ、アミノアシルオキシ、結合基、及び表面結合基から成る群から選択され；
Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３及びＫ４は、それぞれ独立して、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、Ｔｅ及びＣＨから成る群から選択されるヘテロ原子であり；
Ｓ３、Ｓ４、Ｓ７、Ｓ８、Ｓ９、Ｓ１０、Ｓ１１、Ｓ１２、Ｓ１３及びＳ１４、ならびにＳ１及びＳ５のいずれか、又はＳ２及びＳ６のいずれかは、それぞれ独立して、水素原子、アリール、フェニル、シクロアルキル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン原子、アルコキシ、アルキルチオ、ペルフルオロアルキル、ペルフルオロアリール、ピリジル、シアノ、チオシアナト、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、アシル、スルホキシル、スルホニル、イミド、アミド、及びカルバモイルであり、又はＳ７とＳ１３は共に＝Ｏを形成する。）
【請求項７】
下記段階(a)〜(f)から成る、複数の蛍光性ポリマーマイクロ粒子及び/又はナノ粒子を含む集団を作る方法であって、
(a) 溶剤中の１又はそれ以上のヒドロポルフィリンの第１溶液を調製する段階；
(b) 該第１溶液を、ポリマーマイクロ粒子及び/又はナノ粒子、水、及びポリマー界面活性剤を含む第１混合液に添加して、第２混合液を調整する段階；
(c) 第２混合液を一定期間混合する段階；
(d) 該第２混合液から溶媒を除去して第１の蛍光性ポリマーマイクロ粒子及び/又はナノ粒子を提供する段階；
(e) 該段階(a)〜(d)を繰り返して、１又はそれ以上の更なる蛍光性ポリマーマイクロ粒子及び/又はナノ粒子を提供する段階であって、該１又はそれ以上の更なる蛍光性ポリマーマイクロ粒子及び/又はナノ粒子のそれぞれが、該第１の蛍光性ポリマーマイクロ粒子及び/又はナノ粒子、及び/又は１又はそれ以上の更なる蛍光性ポリマーマイクロ粒子及び/又はナノ粒子とは異なる１つのヒドロポルフィリン又はヒドロポルフィリン混合物を含む、段階；及び
(f) 該第１の蛍光性ポリマーマイクロ粒子及び/又はナノ粒子を、該１又はそれ以上の更なる蛍光性ポリマーマイクロ粒子及び/又はナノ粒子のいずれかと混合する段階；
その結果、複数の異なる蛍光性マイクロ粒子及び/又はナノ粒子を含む集団であって、各蛍光性マイクロ粒子及び/又はナノ粒子が、ポリマーマトリックス及び少なくとも１つのヒドロポルフィリンを含む、集団が提供され、該集団が光によって励起されると、該複数の蛍光性マイクロ粒子及び/又はナノ粒子が、別個に及び/又は同時に検出されることができる、方法。
【請求項８】
前記複数の蛍光性ポリマーマイクロ粒子及び/又はナノ粒子のそれぞれが、その最大ピーク半値幅が２５ｎｍ未満であり、及び/又はこのピークが他の蛍光性ポリマーマイクロ粒子及び/又はナノ粒子のいずれかから少なくとも５ｎｍ離れている、異なる発光波長帯を有する、請求項３〜６のいずれか一項に記載の集団。
【請求項９】
１〜５個の蛍光性ポリマーマイクロ粒子及び/又はナノ粒子を含む請求項３〜６、８のいずれか一項に記載の集団であって、該１〜５個の蛍光性マイクロ粒子及び/又はナノ粒子のそれぞれが、ヒドロポルフィリンＳＥ１９７、ＳＥ２１１、ＳＥ４２０、ＳＥ３５７、ＳＥ３５５、Ｂ５６、Ｂ６２、Ｂ６６、及びそれらの組み合わせから成る群から選択されるヒドロポルフィリンを含み、更にヒドロポルフィリンＳＥ１９７、ＳＥ２１１、ＳＥ４２０、ＳＥ３５７、ＳＥ３５５、Ｂ５６、Ｂ６２及びＢ６６が以下の構造を有する、集団。
【化２】
2019524972.tif 000003
【請求項１０】
マルチプレックスアッセイに使用するための別個に検出可能な蛍光性マイクロ粒子及び/又はナノ粒子のセットを調製するための、下記段階(a)〜(e)から成る方法であって、
(a) 溶剤中の１又はそれ以上のヒドロポルフィリンの第１溶液を調製する段階；
(b) 該第１溶液を、ポリマーマイクロ粒子及び/又はナノ粒子、水、及びポリマー界面活性剤を含む第１混合液に添加して、第２混合液を調整する段階；
(c) 第２混合液をある期間混合する段階；
(d) 該第２混合液から溶媒を除去して第１の蛍光性ポリマーマイクロ粒子及び/又はナノ粒子を提供する段階；及び
(e) 該段階(a)〜(d)を繰り返して、１又はそれ以上の更なる蛍光性ポリマーマイクロ粒子及び/又はナノ粒子を提供する段階であって、該１又はそれ以上の更なる蛍光性ポリマーマイクロ粒子及び/又はナノ粒子のそれぞれが、該第１の蛍光性ポリマーマイクロ粒子及び/又はナノ粒子、及び/又は１又はそれ以上の更なる蛍光性ポリマーマイクロ粒子及び/又はナノ粒子とは異なる１つのヒドロポルフィリン又はヒドロポルフィリン混合物を含む、段階；
該セット中の該蛍光性高分子マイクロ粒子及び/又は前記ナノ粒子の吸着波長帯域が重複しており、該セット中の該蛍光性高分子マイクロ粒子及び/又は前記ナノ粒子のそれぞれが、その最大ピーク半値幅が２５ｎｍ未満であり、及び/又はこのピークが他の蛍光性ポリマーマイクロ粒子及び/又はナノ粒子のいずれかから少なくとも５ｎｍ離れている、異なる発光波長帯を有する、方法。
【請求項１１】
更に、分子、タンパク質、抗体、抗体断片、核酸、及び細胞からなる群の１つに前記マイクロ粒子及び/又はナノ粒子の１又はそれ以上を結合させる段階を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ポリマーマトリックス及びそれと結合する少なくとも１つのヒドロポルフィリンを含む蛍光性マイクロ粒子及び/又はナノ粒子であって、
(i)  該マイクロ粒子又はナノ粒子はビーズであって、
(ii)  該ビーズはポリスチレンビーズであって、及び／又は
(iii)  該ビーズが少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の異なる蛍光分子を含むように、該ビーズが、さらに、複数の異なるヒドロポルフィリン含有ダイアドを含む、及び／又は
(iv)  該ヒドロポルフィリン含有ダイアドが、クロリンを含む第１の蛍光分子及びバクテリオクロリンを含む第２の蛍光分子を含む、及び／又は
(iv)  該第２の蛍光分子が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）供与体を含み、該ＦＲＥＴ供与体が該第１の蛍光分子の最大発光と重複する発光スペクトルを持つことを特徴とする、
蛍光性マイクロ粒子及び/又はナノ粒子。
【請求項１３】
ヒドロポルフィリンを組み込んだ蛍光ナノ粒子の集団を、細胞を差別的に標識するために使用する方法であって、その中に存在する特定の蛍光ナノ粒子に由来する区別可能な発光スペクトルに基づいて個々の細胞を互いに区別できるようにヒドロポルフィリンを組み込んだ異なる蛍光ナノ粒子を細胞に導入する段階を含む方法。