【手続補正書】
【提出日】令和2年2月7日(2020.2.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量を決定するための方法であって、
ａ）前記試料核酸中の標的配列を増幅するステップであって、
前記標的配列が第１の鎖および第２の鎖を含み、
前記第１の鎖および前記第２の鎖が互いに相補的であり、かつ
前記増幅するステップが、切断剤不含、ヘリカーゼ不含、かつリコンビナーゼ不含の等温増幅条件下で非変性試料核酸を
ｉ）第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドであって、前記第１のオリゴヌクレオチドが前記第１の鎖中の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドからなり、かつ前記第２のオリゴヌクレオチドが前記第２の鎖中の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドからなる、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド、ならびに
ｉｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも１つの成分
と接触させることによって核酸増幅産物を生成することを含み、
前記核酸増幅産物が、１）前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第１のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたは実質的に同一の第１のヌクレオチド配列、２）前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第２のヌクレオチド配列、および３）１〜１０塩基を含むスペーサー配列からなり、かつ
前記スペーサー配列が前記第１のヌクレオチド配列および前記第２のヌクレオチド配列に挟まれている、ステップと、
ｂ）前記核酸増幅産物を検出するステップであって、前記核酸増幅産物を検出するステップは、リアルタイム検出方法の使用を含み、かつ前記試料核酸を（ａ）（ｉ）および（ａ）（ｉｉ）と接触させた時から１０分またはそれ未満以内に行われ、それによって試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量が決定される、ステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、超好熱菌ポリメラーゼもしくはその機能的断片、または超好熱菌ポリメラーゼと少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼもしくはその機能的断片によって提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、配列番号８のアミノ酸配列を含むポリメラーゼもしくはその機能的断片、または配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼもしくはその機能的断片によって提供される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、エキソヌクレアーゼ活性が低いまたはエキソヌクレアーゼ活性を有しないポリメラーゼによって提供される、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項５】
要素（ａ）（ｉｉ）が、逆転写酵素活性を提供する少なくとも１つの成分をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する前記少なくとも１つの成分が、逆転写酵素活性をさらに提供する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
増幅の前または増幅の間に前記試料核酸を変性させるステップを含まない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記試料核酸を、増幅の前または増幅の間に一本鎖ＤＮＡ結合性タンパク質と接触させない、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
精製されていない試料核酸が増幅される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記増幅が、約５５℃から約７５℃の一定温度で行われる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記増幅が、約６５℃の一定温度で行われる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記増幅が、約６０℃の一定温度で行われる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドがそれぞれ約８〜１６塩基の長さである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸増幅産物が約２０〜４０塩基の長さである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記スペーサー配列が、１〜５塩基を含み、かつ前記試料核酸中の前記標的配列の一部分に連続的に相補的またはそれと実質的に同一である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記核酸増幅産物を検出するステップが、蛍光シグナルの検出を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記蛍光シグナルが分子ビーコンに由来する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸増幅産物を、ｉ）前記増幅産物中の配列に相補的なポリヌクレオチド、ならびにｉｉ）フルオロフォアおよび消光剤を含むシグナル生成オリゴヌクレオチドと接触させるステップをさらに含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
単一の反応容器中で行われる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
マルチプレックス増幅を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記増幅するステップが、切断剤不含、ヘリカーゼ不含、かつリコンビナーゼ不含の等温増幅条件下で非変性試料核酸を
ｉ）第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドであって、前記第１のオリゴヌクレオチドが前記第１の鎖中の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドからなり、かつ前記第２のオリゴヌクレオチドが前記第２の鎖中の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドからなる、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド、ならびに
ｉｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する成分からなる酵素成分
と接触させることを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１のオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ塩基、修飾ＤＮＡ塩基、またはＤＮＡ塩基および修飾ＤＮＡ塩基からなる第１のポリヌクレオチドからなり、かつ前記第２のオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ塩基、修飾ＤＮＡ塩基、またはＤＮＡ塩基および修飾ＤＮＡ塩基からなる第２のポリヌクレオチドからなる、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
ある特定の態様では、試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量を決定するためのキットであって、ａ）ｉ）第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドであって、第１のオリゴヌクレオチドが、標的配列の第１の鎖中の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドからなり、かつ第２のオリゴヌクレオチドが、標的配列の第２の鎖中の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドからなり、標的配列の第１の鎖および第２の鎖が互いに相補的である、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド、ならびにｉｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも１つの成分を含む、ヘリカーゼ不含かつ／またはリコンビナーゼ不含の等温増幅条件下で試料核酸中の標的配列を増幅するための成分と、ｂ）核酸増幅産物のリアルタイム検出活性を提供する少なくとも１つの成分とを含む、キットも本明細書中で提供される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量を決定するための方法であって、
ａ）前記試料核酸中の標的配列を増幅するステップであって、
前記標的配列が第１の鎖および第２の鎖を含み、
前記第１の鎖および前記第２の鎖が互いに相補的であり、かつ
前記増幅するステップが、切断剤不含、ヘリカーゼ不含、かつリコンビナーゼ不含の等温増幅条件下で非変性試料核酸を
ｉ）第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドであって、前記第１のオリゴヌクレオチドが前記第１の鎖中の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドからなり、かつ前記第２のオリゴヌクレオチドが前記第２の鎖中の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドからなる、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド、ならびに
ｉｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも１つの成分
と接触させることによって核酸増幅産物を生成することを含み、
前記核酸増幅産物が、１）前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第１のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたは実質的に同一の第１のヌクレオチド配列、２）前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第２のヌクレオチド配列、および３）１〜１０塩基を含むスペーサー配列からなり、かつ
前記スペーサー配列が前記第１のヌクレオチド配列および前記第２のヌクレオチド配列に挟まれている、ステップと、
ｂ）前記核酸増幅産物を検出するステップであって、前記核酸増幅産物を検出するステップは、リアルタイム検出方法の使用を含み、かつ前記試料核酸を（ａ）（ｉ）および（ａ）（ｉｉ）と接触させた時から１０分またはそれ未満以内に行われ、それによって試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量が決定される、ステップと
を含む、方法。
（項目２）
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、超好熱菌ポリメラーゼもしくはその機能的断片、または超好熱菌ポリメラーゼと少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼもしくはその機能的断片によって提供される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、配列番号８のアミノ酸配列を含むポリメラーゼもしくはその機能的断片、または配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼもしくはその機能的断片によって提供される、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、エキソヌクレアーゼ活性が低いまたはエキソヌクレアーゼ活性を有しないポリメラーゼによって提供される、項目１、２、または３に記載の方法。
（項目５）
要素（ａ）（ｉｉ）が、逆転写酵素活性を提供する少なくとも１つの成分をさらに含む、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する前記少なくとも１つの成分が、逆転写酵素活性をさらに提供する、項目１〜５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
増幅の前または増幅の間に前記試料核酸を変性させるステップを含まない、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記試料核酸を、増幅の前または増幅の間に一本鎖ＤＮＡ結合性タンパク質と接触させない、項目１〜７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
精製されていない試料核酸が増幅される、項目１〜８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記増幅が、約５５℃から約７５℃の一定温度で行われる、項目１〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記増幅が、約６５℃の一定温度で行われる、項目１〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記増幅が、約６０℃の一定温度で行われる、項目１〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドがそれぞれ約８〜１６塩基の長さである、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記核酸増幅産物が約２０〜４０塩基の長さである、項目１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記スペーサー配列が、１〜５塩基を含み、かつ前記試料核酸中の前記標的配列の一部分に連続的に相補的またはそれと実質的に同一である、項目１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記核酸増幅産物を検出するステップが、蛍光シグナルの検出を含む、項目１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記蛍光シグナルが分子ビーコンに由来する、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記核酸増幅産物を、ｉ）前記増幅産物中の配列に相補的なポリヌクレオチド、ならびにｉｉ）フルオロフォアおよび消光剤を含むシグナル生成オリゴヌクレオチドと接触させるステップをさらに含む、項目１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
単一の反応容器中で行われる、項目１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
マルチプレックス増幅を含む、項目１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記増幅するステップが、切断剤不含、ヘリカーゼ不含、かつリコンビナーゼ不含の等温増幅条件下で非変性試料核酸を
ｉ）第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドであって、前記第１のオリゴヌクレオチドが前記第１の鎖中の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドからなり、かつ前記第２のオリゴヌクレオチドが前記第２の鎖中の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドからなる、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド、ならびに
ｉｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する成分からなる酵素成分
と接触させることを含む、項目１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記第１のオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ塩基、修飾ＤＮＡ塩基、またはＤＮＡ塩基および修飾ＤＮＡ塩基からなる第１のポリヌクレオチドからなり、かつ前記第２のオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ塩基、修飾ＤＮＡ塩基、またはＤＮＡ塩基および修飾ＤＮＡ塩基からなる第２のポリヌクレオチドからなる、項目１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
核酸を増幅するための方法であって、
等温増幅条件下で非変性試料核酸を、
ａ）前記試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、および
ｂ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも１つの成分
を含む成分と接触させることによって核酸増幅産物を生成するステップ
を含む、方法。
（項目２４）
核酸を増幅するための方法であって
等温増幅条件下で非変性試料核酸を
ａ）前記試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む非酵素成分、および
ｂ）超好熱菌ポリメラーゼまたは超好熱菌ポリメラーゼと少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼからなる酵素成分
と接触させることによって核酸増幅産物を生成するステップ
を含む、方法。
（項目２５）
核酸を増幅するための方法であって、
等温増幅条件下で非変性試料核酸を
ａ）前記試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む非酵素成分、ならびに
ｂ）ｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性、および任意選択でｉｉ）逆転写酵素活性からなる酵素活性
と接触させることによって核酸増幅産物を生成するステップ
を含む、方法。
（項目２６）
前記酵素活性が、ｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性、およびｉｉ）逆転写酵素活性からなる、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
増幅の前または増幅の間に前記試料核酸を変性させるステップを含まない、項目２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記試料核酸を、増幅の前または増幅の間にエンドヌクレアーゼと接触させない、項目２３〜２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記試料核酸を、増幅の前または増幅の間に巻き戻し剤と接触させない、項目２３〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記試料核酸を、増幅の前または増幅の間にヘリカーゼと接触させない、項目２３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記試料核酸を、増幅の前または増幅の間にリコンビナーゼと接触させない、項目２３〜３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記試料核酸を、増幅の前または増幅の間に一本鎖ＤＮＡ結合性タンパク質と接触させない、項目２３〜３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記試料核酸が、増幅の前に非修飾である、項目２３〜３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
非修飾の前記試料核酸が破砕細胞に由来する、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記試料核酸がＤＮＡを含む、項目２３〜３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記試料核酸がゲノムＤＮＡを含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記試料核酸がＲＮＡを含む、項目２３〜３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記試料核酸がウイルスＲＮＡを含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記試料核酸が細菌ＲＮＡを含む、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
前記試料核酸が一本鎖核酸を含む、項目２３〜３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記試料核酸が、第１の鎖および第２の鎖を含む二本鎖核酸を含む、項目２３〜３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを含む、項目２３〜４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドからなる、項目２３〜４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドがそれぞれ８〜１６塩基を含む、項目４２または４３に記載の方法。
（項目４５）
前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記試料核酸の前記第１の鎖中の標的配列に相補的な第１のポリヌクレオチドを含み、かつ前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記試料核酸の前記第２の鎖中の標的配列に相補的な第２のポリヌクレオチドを含む、項目４２、４３、または４４に記載の方法。
（項目４６）
前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記試料核酸の前記第１の鎖中の標的配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドを含み、かつ前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記試料核酸の前記第２の鎖中の標的配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドを含む、項目４２、４３、または４４に記載の方法。
（項目４７）
前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記試料核酸の前記第１の鎖中の標的配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドからなり、かつ前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記試料核酸の前記第２の鎖中の標的配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドからなる、項目４２、４３、または４４に記載の方法。
（項目４８）
試料核酸が、増幅の前に被験体から得られる、項目２３〜４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
精製されていない試料核酸が増幅される、項目２３〜４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
精製された試料核酸が増幅される、項目２３〜４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
増幅の前に試料核酸を精製するステップをさらに含む、項目２３〜４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、超好熱菌ポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、項目２３〜５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、超好熱菌ポリメラーゼと少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、項目２３〜５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、古細菌の超好熱菌ポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、項目２３〜５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、配列番号８のアミノ酸配列を含むポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、項目２３〜５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、項目２３〜５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、エキソヌクレアーゼ活性が低いポリメラーゼによって提供される、項目２３〜５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、エキソヌクレアーゼ活性を有しないポリメラーゼによって提供される、項目２３〜５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記増幅が約５５℃から約７５℃の一定温度で行われる、項目２３〜５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
前記増幅が約５５℃から約６５℃の一定温度で行われる、項目２３〜５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６１）
前記増幅が約６５℃の一定温度で行われる、項目２３〜５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
前記増幅が約６０℃の一定温度で行われる、項目２３〜５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
前記核酸増幅産物が、１０分またはそれ未満以内に検出可能である、項目２３〜６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
前記核酸増幅産物が、前記試料核酸中の標的配列に連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一のポリヌクレオチドを含む、項目２３〜６３のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
前記核酸増幅産物が、前記試料核酸中の標的配列に連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一のポリヌクレオチドからなる、項目２３〜６３のいずれか一項に記載の方法。
（項目６６）
前記核酸増幅産物が、約２０〜４０塩基の長さである、項目２３〜６５のいずれか一項に記載の方法。
（項目６７）
前記核酸増幅産物が、ｉ）前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第１のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第１のヌクレオチド配列、ｉｉ）前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第２のヌクレオチド配列、およびｉｉｉ）前記第１のヌクレオチド配列および前記第２のヌクレオチド配列に挟まれているスペーサー配列を含む、項目４３〜６６のいずれか一項に記載の方法。
（項目６８）
前記核酸増幅産物が、ｉ）前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第１のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第１のヌクレオチド配列、ｉｉ）前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第２のヌクレオチド配列、およびｉｉｉ）前記第１のヌクレオチド配列および前記第２のヌクレオチド配列に挟まれているスペーサー配列からなる、項目４３〜６６のいずれか一項に記載の方法。
（項目６９）
前記スペーサー配列が１〜１０塩基を含む、項目６７または６８に記載の方法。
（項目７０）
前記スペーサー配列が１〜５塩基を含む、項目６７または６８に記載の方法。
（項目７１）
前記スペーサー配列が、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第１のポリヌクレオチドに相補的でなくそれと同一でもなく、かつ前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２のポリヌクレオチドに相補的でなくそれと同一でもない、項目６７〜７０のいずれか一項に記載の方法。
（項目７２）
前記スペーサー配列が、前記試料核酸中の標的配列の一部分に連続的に相補的またはそれと実質的に同一である、項目６７〜７１のいずれか一項に記載の方法。
（項目７３）
前記核酸増幅産物を検出するステップをさらに含む、項目２３〜７２のいずれか一項に記載の方法。
（項目７４）
前記核酸増幅産物を検出するステップが、前記試料核酸を、前記超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する前記成分および前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと接触させた時から１０分またはそれ未満以内に行われる、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
前記核酸増幅産物を検出するステップが、リアルタイム検出方法の使用を含む、項目７３または７４に記載の方法。
（項目７６）
前記核酸増幅産物を検出するステップが、蛍光シグナルの検出を含む、項目７３、７４、または７５に記載の方法。
（項目７７）
前記蛍光シグナルが分子ビーコンに由来する、項目７６に記載の方法。
（項目７８）
前記核酸増幅産物を、ｉ）前記増幅産物中の配列に相補的なポリヌクレオチド、ならびにｉｉ）フルオロフォアおよび消光剤を含むシグナル生成オリゴヌクレオチドと接触させるステップをさらに含む、項目２３〜７７のいずれか一項に記載の方法。
（項目７９）
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの１つまたは複数が、前記試料核酸中の配列に相補的でないポリヌクレオチドであって、シグナル生成オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含み、かつ前記方法が、前記増幅産物を、フルオロフォアおよび消光剤を含む前記シグナル生成オリゴヌクレオチドと接触させるステップをさらに含む、項目２３〜７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８０）
単一の反応容量中で行われる、項目２３〜７９のいずれか一項に記載の方法。
（項目８１）
単一の反応容器中で行われる、項目２３〜８０のいずれか一項に記載の方法。
（項目８２）
マルチプレックス増幅を含む、項目２３〜８１のいずれか一項に記載の方法。
（項目８３）
前記試料核酸を、増幅の前または増幅の間に切断剤と接触させない、項目２３〜８２のいずれか一項に記載の方法。
（項目８４）
試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量を決定するためのキットであって、
ａ）ヘリカーゼ不含の等温増幅条件下で前記試料核酸中の標的配列を増幅するための成分であって、以下：
ｉ）第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドであって、前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記標的配列の第１の鎖中の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドを含み、かつ前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記標的配列の第２の鎖中の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドを含み、前記標的配列の前記第１の鎖および前記第２の鎖が互いに相補的である、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド、ならびに
ｉｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも１つの成分
を含む、成分と、
ｂ）核酸増幅産物のリアルタイム検出活性を提供する少なくとも１つの成分と
を含む、キット。
（項目８５）
前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記標的配列の第１の鎖中の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドから本質的になり、かつ前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記標的配列の第２の鎖中の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドから本質的になる、項目８４に記載のキット。
（項目８６）
前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記標的配列の第１の鎖中の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドからなり、かつ前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記標的配列の第２の鎖中の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドからなる、項目８４に記載のキット。
（項目８７）
試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量を決定するためのキットであって、
ａ）ヘリカーゼ不含の等温増幅条件下で前記試料核酸中の標的配列を増幅するための成分であって、以下：
ｉ）第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドであって、前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記標的配列の第１の鎖中の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドからなり、かつ前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記標的配列の第２の鎖中の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドからなり、前記標的配列の前記第１の鎖および前記第２の鎖が互いに相補的である、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド、ならびに
ｉｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも１つの成分
を含む、成分と、
ｂ）核酸増幅産物のリアルタイム検出活性を提供する少なくとも１つの成分と
を含む、キット。
（項目８８）
前記試料核酸が、ヘリカーゼ不含かつリコンビナーゼ不含の等温増幅条件下で増幅される、項目８４〜８７のいずれか一項に記載のキット。
（項目８９）
前記試料核酸が、ヘリカーゼ不含、リコンビナーゼ不含、かつ切断剤不含の等温増幅条件下で増幅される、項目８４〜８７のいずれか一項に記載のキット。
（項目９０）
超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する前記少なくとも１つの成分が、超好熱菌ポリメラーゼもしくはその機能的断片、または超好熱菌ポリメラーゼと少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼもしくはその機能的断片を含む、項目８４〜８９のいずれか一項に記載のキット。
（項目９１）
超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する前記少なくとも１つの成分が、超好熱菌ポリメラーゼもしくはその機能的断片、または超好熱菌ポリメラーゼと少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼもしくはその機能的断片からなる、項目８４〜８９のいずれか一項に記載のキット。
（項目９２）
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、古細菌の超好熱菌ポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、項目８４〜９１のいずれか一項に記載のキット。
（項目９３）
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、配列番号８のアミノ酸配列を含むポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、項目８４〜９２のいずれか一項に記載のキット。
（項目９４）
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、項目８４〜９２のいずれか一項に記載のキット。
（項目９５）
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、エキソヌクレアーゼ活性が低いポリメラーゼによって提供される、項目８４〜９４のいずれか一項に記載のキット。
（項目９６）
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、エキソヌクレアーゼ活性を有しないポリメラーゼによって提供される、項目８４〜９４のいずれか一項に記載のキット。
（項目９７）
要素（ａ）（ｉｉ）が、逆転写酵素活性を提供する少なくとも１つの成分をさらに含む、項目８４〜９６のいずれか一項に記載のキット。
（項目９８）
超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する前記少なくとも１つの成分が逆転写酵素活性をさらに提供する、項目８４〜９６のいずれか一項に記載のキット。
（項目９９）
前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドがそれぞれ８〜１６塩基を含む、項目８４〜９８のいずれか一項に記載のキット。
（項目１００）
前記リアルタイム検出活性が分子ビーコンによって提供される、項目８４〜９９のいずれか一項に記載のキット。
（項目１０１）
試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量を決定するための方法を実施するための指示をさらに含み、前記方法が、
ａ）前記試料核酸中の標的配列を増幅するステップであって、
前記標的配列が第１の鎖および第２の鎖を含み、
前記第１の鎖および前記第２の鎖が互いに相補的であり、
かつ前記増幅するステップが、ヘリカーゼ不含の等温増幅条件下で非変性試料核酸を
ｉ）第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドであって、前記第１のオリゴヌクレオチドが前記第１の鎖中の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドを含み、かつ前記第２のオリゴヌクレオチドが前記第２の鎖中の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドを含む、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド、ならびに
ｉｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも１つの成分
と接触させることによって核酸増幅産物を生成することを含み、前記核酸増幅産物が、１）前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第１のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第１のヌクレオチド配列、２）前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第２のヌクレオチド配列、および３）１〜１０塩基を含むスペーサー配列を含み、かつ
前記スペーサー配列が前記第１のヌクレオチド配列および前記第２のヌクレオチド配列に挟まれている、ステップと、
ｂ）前記核酸増幅産物を検出するステップであって、リアルタイム検出方法の使用を含み、かつ前記試料核酸を（ａ）（ｉ）および（ａ）（ｉｉ）と接触させた時から１０分またはそれ未満以内に行われ、それによって試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量が決定される、ステップと
を含む、項目８４〜１００のいずれか一項に記載のキット。
（項目１０２）
前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記第１の鎖中の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドから本質的になり、かつ前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記第２の鎖中の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドから本質的になり、かつ／または、前記核酸増幅産物が、１）前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第１のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第１のヌクレオチド配列、２）前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第２のヌクレオチド配列、および３）１〜１０塩基を含むスペーサー配列から本質的になる、項目１０１に記載のキット。
（項目１０３）
前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記第１の鎖中の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドからなり、かつ前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記第２の鎖中の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドからなり、かつ／または、前記核酸増幅産物が、１）前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第１のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第１のヌクレオチド配列、２）前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第２のヌクレオチド配列、および３）１〜１０塩基を含むスペーサー配列からなる、項目１０１に記載のキット。
（項目１０４）
試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量を決定するための方法を実施するための指示をさらに含み、前記方法が、
ａ）前記試料核酸中の標的配列を増幅するステップであって、
前記標的配列が第１の鎖および第２の鎖を含み、
前記第１の鎖および前記第２の鎖が互いに相補的であり、
かつ前記増幅するステップが、ヘリカーゼ不含の等温増幅条件下で非変性試料核酸を
ｉ）第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドであって、前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記第１の鎖中の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドからなり、かつ前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記第２の鎖中の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドからなる、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド、ならびに
ｉｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも１つの成分
と接触させることによって核酸増幅産物を生成することを含み、前記核酸増幅産物が、１）前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第１のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第１のヌクレオチド配列、２）前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第２のヌクレオチド配列、および３）１〜１０塩基を含むスペーサー配列からなり、かつ
前記スペーサー配列が前記第１のヌクレオチド配列および前記第２のヌクレオチド配列に挟まれている、ステップと、
ｂ）前記核酸増幅産物を検出するステップであって、リアルタイム検出方法の使用を含み、かつ前記試料核酸を（ａ）（ｉ）および（ａ）（ｉｉ）と接触させた時から１０分またはそれ未満以内に行われ、それによって試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量が決定される、ステップと
を含む、項目８４〜１００のいずれか一項に記載のキット。
（項目１０５）
前記方法が、増幅の前または増幅の間に前記試料核酸を変性させるステップを含まない、項目１０１〜１０４のいずれか一項に記載のキット。
（項目１０６）
前記試料核酸を、増幅の前、間、または後にエンドヌクレアーゼと接触させない、項目１０１〜１０５のいずれか一項に記載のキット。
（項目１０７）
前記試料核酸が、増幅の前に非修飾である、項目１０１〜１０６のいずれか一項に記載のキット。
（項目１０８）
非修飾の前記試料核酸が破砕細胞に由来する、項目１０７に記載のキット。
（項目１０９）
前記試料核酸がＤＮＡを含む、項目１０１〜１０８のいずれか一項に記載のキット。
（項目１１０）
前記試料核酸がゲノムＤＮＡを含む、項目１０９に記載のキット。
（項目１１１）
前記試料核酸がＲＮＡを含む、項目１０１〜１０８のいずれか一項に記載のキット。
（項目１１２）
前記試料核酸がウイルスＲＮＡを含む、項目１１１に記載のキット。
（項目１１３）
前記試料核酸が細菌ＲＮＡを含む、項目１１１に記載のキット。
（項目１１４）
前記試料核酸が一本鎖核酸を含む、項目１０１〜１１３のいずれか一項に記載のキット。
（項目１１５）
前記試料核酸が二本鎖核酸を含む、項目１０１〜１１３のいずれか一項に記載のキット。
（項目１１６）
試料核酸が、増幅の前に被験体から得られる、項目１０１〜１１５のいずれか一項に記載のキット。
（項目１１７）
精製されていない試料核酸が増幅される、項目１０１〜１１６のいずれか一項に記載のキット。
（項目１１８）
精製された試料核酸が増幅される、項目１０１〜１１６のいずれか一項に記載のキット。
（項目１１９）
前記方法が、増幅の前に試料核酸を精製するステップをさらに含む、項目１０１〜１１８のいずれか一項に記載のキット。
（項目１２０）
前記増幅が約５５℃から約７５℃の一定温度で行われる、項目１０１〜１１９のいずれか一項に記載のキット。
（項目１２１）
前記増幅が約５５℃から約６５℃の一定温度で行われる、項目１０１〜１１９のいずれか一項に記載のキット。
（項目１２２）
前記増幅が約６５℃の一定温度で行われる、項目１０１〜１１９のいずれか一項に記載のキット。
（項目１２３）
前記増幅が約６０℃の一定温度で行われる、項目１０１〜１１９のいずれか一項に記載のキット。
（項目１２４）
前記核酸増幅産物が約２０〜４０塩基の長さである、項目１０１〜１２３のいずれか一項に記載のキット。
（項目１２５）
前記スペーサー配列が１〜５塩基を含む、項目１０１〜１２４のいずれか一項に記載のキット。
（項目１２６）
前記スペーサー配列が、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第１のポリヌクレオチドに相補的でなくそれと同一でもなく、かつ前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２のポリヌクレオチドに相補的でなくそれと同一でもない、項目１０１〜１２５のいずれか一項に記載のキット。
（項目１２７）
前記スペーサー配列が、前記試料核酸中の標的配列の一部分に連続的に相補的またはそれと実質的に同一である、項目１０１〜１２６のいずれか一項に記載のキット。
（項目１２８）
前記核酸増幅産物を検出するステップが、蛍光シグナルの検出を含む、項目１０１〜１２７のいずれか一項に記載のキット。
（項目１２９）
前記蛍光シグナルが分子ビーコンに由来する、項目１２８に記載のキット。
（項目１３０）
前記方法が、前記核酸増幅産物を、ｉ）前記増幅産物中の配列に相補的なポリヌクレオチド、ならびにｉｉ）フルオロフォアおよび消光剤を含むシグナル生成オリゴヌクレオチドと接触させるステップをさらに含む、項目１０１〜１２９のいずれか一項に記載のキット。
（項目１３１）
前記方法が単一の反応容量中で行われる、項目１０１〜１３０のいずれか一項に記載のキット。
（項目１３２）
前記方法が単一の反応容器中で行われる、項目１０１〜１３１のいずれか一項に記載のキット。
（項目１３３）
前記方法がマルチプレックス増幅を含む、項目１０１〜１３２のいずれか一項に記載のキット。