(57)【要約】短時間に効率よく、免疫療法に有効なようにＴ細胞を活性化することが可能で、簡便な操作で雑菌等のコンタミネ−ション等による危険性を低減させることが可能な方法を提供するものであり、Ｔ細胞を含む溶液を移動させつつ、抗ＣＤ３抗体又はそのフラグメントを固定化した担体に接触させることからなるＴ細胞の活性化方法、及び、Ｔ細胞を含む溶液を移動させつつ、抗ＣＤ３抗体又はそのフラグメントを固定化した担体に接触させてＴ細胞を活性化し、得られた活性化Ｔ細胞を、リンホカインを含む培地中で培養して活性化Ｔ細胞を増殖させることからなる活性化Ｔ細胞の製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）Ｔ細胞を含む溶液を移動させつつ、抗ＣＤ３抗体又はそのフラグメントを固定化した担体に接触させることを特徴とする、Ｔ細胞の活性化方法。
【請求項２】
（ａ）Ｔ細胞を含む溶液を移動させつつ、抗ＣＤ３抗体又はそのフラグメントを固定化した担体に接触させてＴ細胞を活性化し、（ｂ）得られた活性化Ｔ細胞を、リンホカインを含む培地中で培養することにより活性化Ｔ細胞を増殖させる、
ことを特徴とする活性化Ｔ細胞の製造方法。
【請求項３】
該リンホカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−１２及びＩＦＮ−γからなる群より選ばれる少なくとも一つである、請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
該担体がカラムに充填されている、請求項２又は３記載の製造方法。
【請求項５】
さらに副刺激シグナル供与体が、該担体に固定化されている、請求項２〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
該副刺激シグナル供与体が、抗ＣＤ４８抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ２６抗体、抗ＣＤ２８抗体及びそれらのフラグメントからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
請求項２〜６のいずれか１項に記載の製造方法によって活性化Ｔ細胞を製造することを含む、活性化Ｔ細胞を有効成分とする免疫治療剤の製造方法。
【請求項８】
請求項２〜６のいずれか１項に記載の製造方法を実施するための活性化Ｔ細胞製造用キットであって、
抗ＣＤ３抗体又はそのフラグメントを固定化するための担体と、それを充填するためのカラムとを含むキット。
【請求項９】
さらに抗ＣＤ３抗体を含む、請求項８記載の活性化Ｔ細胞製造用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔ細胞の活性化方法、活性化Ｔ細胞の製造方法、免疫治療剤の製造方法、及び、活性化Ｔ細胞製造用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ガンに対しての療法は大きく分けて「手術療法」、「化学療法」、「放射線療法」の３つがあり、それぞれの療法が単独あるいは併用で行われているが、近年「免疫療法」と呼ばれる方法が、ガンに対する第４の療法として注目を集めてきた。人間は本来、病気やけがに対して自分で治そうとする力（免疫能・免疫力）を持っており、血液中のＴ細胞がその免疫能の中心としての役割を担っており、Ｔ細胞の病気に対する攻撃力が高いほど病気になりにくい、あるいは病気に対抗する力が強いとされている。「免疫療法」はこの人体の免疫システムに着目した療法であり、Ｔ細胞の持つガン細胞を殺す能力を高める（免疫能を高める）ことによりガンを治療していくという療法である。【０００３】
近年の免疫学の進歩に伴い、種々の免疫担当細胞による免疫学的監視機構が明らかにされてきた。該機構の機能を高めることにより、腫瘍細胞などの抗原を認識し、破壊する免疫療法が開発されている。例えば、患者から採取、分離されたリンパ球をインターロイキン（ＩＬ）−２やＩＬ−４の存在下で培養して、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞を誘導し、このＬＡＫ細胞を再び患者の体内に戻すＬＡＫ療法（養子免疫法）が開発されている。【０００４】
しかしながら、ＬＡＫ細胞は、腫瘍細胞などの抗原に対して非特異的な細胞障害活性を示すので、あまり治療効果を期待できないのが現状である。そこで、抗原非特異的なキラー細胞ではなく、抗原特異的な活性化Ｔ細胞を用いて、ＬＡＫ療法と同様の治療を行う手法が注目されつつある。【０００５】
従来、活性化Ｔ細胞の誘導には、フラスコ、シャーレなどの培養基材または不溶性担体の表面に抗ＣＤ３抗体が固定化されたＴ細胞培養用担体を用いて培養する方法が提案されている（特許文献１を参照）。このＴ細胞培養用担体としては、各実験者が培養前に、担体に抗ＣＤ３抗体を添加することにより、抗ＣＤ３抗体を固定化したＴ細胞培養用担体を調製し使用するか、又は、この調製したＴ細胞培養用担体を不溶性担体に抗ＣＤ３抗体を添加した溶液状態のまま、低温で静置して保存したものを使用しているのが現状である。以上の操作で活性化されたＴ細胞を、細胞培養用バッグに入れたＩＬ−２などのリンホカインを含んだ培養液中に加え増幅させている。【０００６】
しかしながら、実験者にとって、上記Ｔ細胞培養器の調製は、熟達と多くの煩雑な操作を要するものである。また、フラスコ、シャーレなどの培養基材を用いた場合、増幅用の細胞培養用バッグに加える際、雑菌などのコンタミネーション等の危険性がある。また、抗ＣＤ３抗体溶液を添加したままで調製されたＴ細胞培養用担体は、それをそのまま培養に使用すると、固定化されていないフリーの抗ＣＤ３抗体の存在によりＴ細胞の増殖性が抑制される。そのため、使用時、培養時に、固定化されていないフリーの抗ＣＤ３抗体溶液を除去したり、さらに、リン酸緩衝食塩水溶液（ＰＢＳ）等適当な洗浄液を使用し洗浄したりする処理が必要となる。しかし、この抗ＣＤ３抗体溶液の除去及び洗浄処理においても、Ｔ細胞培養用担体としての培養フラスコ等の開口部又は蓋に付着した液滴を介した雑菌のコンタミネーション等による危険性がある。【０００７】
さらには、これまでの培養基材や担体を利用した場合、培養基材上に静置した状態で、Ｔ細胞を活性化するには１日〜３日程度の期間を要していた。これらに加えて、従来のＴ細胞活性化では、増幅させたＴ細胞の表現形を調べると、治療に効果のない細胞の比率が高い場合が度々みられる傾向があった。そのため、臨床応用のためには、より短期間で効率的に活性化が可能な手法、及び、簡便な操作で雑菌等のコンタミネーション等による危険性の少ないＴ細胞培養用担体及びＴ細胞製造用キットが望まれている。
【特許文献１】特開平３−８００７６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記現状に鑑み、短時間に効率よく、免疫療法に有効なようにＴ細胞を活性化することが可能で、しかも、簡便な操作で雑菌等のコンタミネ−ション等による危険性を低減させることが可能な、Ｔ細胞の活性化方法、活性化Ｔ細胞の製造方法、及び、活性化Ｔ細胞製造用キットを提供することを目的とするものである。
また、上記方法によって、ガン、感染症等の治療に効果的な活性化Ｔ細胞を含む免疫治療剤を製造する方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、Ｔ細胞を含む溶液を移動させつつ、抗ＣＤ３抗体又はそのフラグメントを固定化した担体に接触させることによって、活性化したＴ細胞が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は下記（１）〜（９）に関する。
（１）（ａ）Ｔ細胞を含む溶液を移動させつつ、抗ＣＤ３抗体又はそのフラグメントを固定化した担体に接触させることからなる、Ｔ細胞の活性化方法。【００１０】
（２）（ａ）Ｔ細胞を含む溶液を移動させつつ、抗ＣＤ３抗体又はそのフラグメントを固定化した担体に接触させてＴ細胞を活性化し、（ｂ）得られた活性化Ｔ細胞を、リンホカインを含む培地中で培養することにより活性化Ｔ細胞を増殖させることからなる、活性化Ｔ細胞の製造方法。
（３）該リンホカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−１２及びＩＦＮ−γからなる群より選ばれる少なくとも一つである、上記（２）記載の製造方法。
（４）該担体がカラムに充填されている、上記（２）又は（３）記載の製造方法。
（５）さらに副刺激シグナル供与体が、該担体に固定化されている、上記（２）〜（４）のいずれかに記載の製造方法。
（６）該副刺激シグナル供与体が、抗ＣＤ４８抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ２６抗体、抗ＣＤ２８抗体及びそれらのフラグメントからなる群より選ばれる少なくとも１種である、上記（５）記載の製造方法。【００１１】
（７）上記（２）〜（６）のいずれかに記載の製造方法によって活性化Ｔ細胞を製造することを含む、活性化Ｔ細胞を有効成分とする免疫治療剤の製造方法。【００１２】
（８）上記（２）〜（６）のいずれかに記載の製造方法を実施するための活性化Ｔ細胞製造用キットであって、
抗ＣＤ３抗体又はそのフラグメントを固定化するための担体と、それを充填するためのカラムとを含むキット。
（９）さらに抗ＣＤ３抗体を含む、上記（８）記載の活性化Ｔ細胞製造用キット。
以下、本発明について説明する。【００１３】
（１）Ｔ細胞の活性化
本発明によるＴ細胞の活性化方法及び活性化Ｔ細胞の製造方法において、Ｔ細胞を含む溶液を移動させつつ接触させることによってＴ細胞を活性化させるために、抗ＣＤ３抗体又はそのフラグメントを固定化した担体を使用する。【００１４】
抗ＣＤ３抗体又はそのフラグメントを固定するための担体としては、抗ＣＤ３抗体を固定化することが可能であり、移動する液体（Ｔ細胞を含む溶液）との接触に適するものであれば、特に限定されない。例えば、無機物質（例えば、ガラス、シリカ、金属酸化物など）、合成高分子（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリオレフィン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル等の合成高分子プラスチック、ポリビニル、ポリアクリルアミドなど）、アガロース、架橋デキストラン、セルロース、親水性ビニルポリマーなどから作られたものが例示される。これらの担体の表面は多孔質であっても、粗面・滑面であってもかまわない。【００１５】
上記担体の形態としては特に限定されないが、後述のようにカラムやバッグに充填できる形態のものが好ましく、例えば、粒子状、粒子の集合体、繊維状（例えば、不織布）、膜状またはホローファイバー状等が挙げられる。そのサイズ、形状については特に制限はない。【００１６】
本発明で使用する抗ＣＤ３抗体は、ＣＤ３に対する抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、安定性、コスト、品質等に優れた市販のＯＫＴ−３抗体（製造元：オーソファーマシューティカル）も使用できる。【００１７】
本発明で使用する抗ＣＤ３抗体のフラグメントとしては、ＣＤ３に結合することができるフラグメントであれば特に限定されないが、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントなどが例示される。
上記抗ＣＤ３抗体のフラグメントは、１種類のみを担体に固定しても良いし、複種類を担体に固定してもよく、また、抗ＣＤ３抗体と組合せて使用することもできる。
本発明においては、抗ＣＤ３抗体又はそのフラグメントのうち１種類のみを担体に固定しても良いし、複種類を担体に固定してもよい。【００１８】
本発明においては、抗ＣＤ３抗体に加えて、副刺激シグナル供与体も担体に固定化することが好ましい。抗原特異的なＴ細胞の活性化による免疫反応の成立には、ＴＣＲ（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を介した抗原特異的シグナルだけではなく、抗原提示細胞から供与される副刺激シグナル（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｓｉｇｎａｌ）も存在することが可能であるためである。【００１９】
上記副刺激シグナル供与体としては、Ｔ細胞の膜表面蛋白質、膜表面糖質又は膜脂質などを介して副刺激シグナルを伝達するものであれば特に限定されない。例えば、Ｂ７分子ファミリー、抗ＣＤ４８抗体、抗ＣＴＬＡ（ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ）−４抗体、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ２６抗体、抗ＣＤ２８抗体などの抗ＣＤ抗体類、それら抗体のフラグメントなどが挙げられる。
上記Ｂ７分子ファミリーとしては特に限定されないが、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＭＢ７．２などが例示される。これらは細胞由来のものでもよく、遺伝子工学的手法により調製されたものでもよい。
上記抗体のフラグメントとしては、その抗原に結合可能なフラグメントであれば特に限定されず、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントなどが例示される。
上記副刺激シグナル供与体は、１種類のみを担体に固定しても良いし、複種類を担体に固定してもよい。【００２０】
本発明においては、抗ＣＤ３抗体に加えて、糖鎖結合レクチンに対する抗体も担体に固定化することができる。上記抗糖鎖結合レクチン抗体としては特に制限はないが、例えば、シアリルルイス糖鎖結合レクチンであるＬ−セレクチン抗体などが例示される。上記抗糖鎖結合レクチン抗体は、１種類のみを担体に固定しても良いし、複種類を担体に固定してもよい。上記抗糖鎖結合レクチン抗体は、抗ＣＤ３抗体及び上記副刺激シグナル供与体と共に担体に固定化することもできる。【００２１】
上記担体と抗ＣＤ３抗体等（抗ＣＤ３抗体、そのフラグメント、副刺激シグナル供与体、及び、抗糖鎖結合レクチン抗体を示す）との結合は、共有結合、イオン結合、物理的結合、又は、生化学的特異結合などによって行うことができる。共有結合の場合、臭化シアン活性化法、エポキシ化法、酸アジド誘導体法、縮合試薬法、ジアゾ法、アルキル化法、担体架橋法などの方法が例示される。なかでも、臭化シアン活性化された担体、又は、エポキシ化された担体に対して、共有結合によって抗ＣＤ３抗体等を結合させることが好ましい。生化学的特異結合の場合、担体に抗ＣＤ３抗体等を特異的に吸着させるためのリガンド（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、抗原などの抗体接着分子、それらの誘導体、部分ペプチド断片など）を、抗ＣＤ３抗体等の固定化の前に、あらかじめコーティングしたものも使用することができる。部分ペプチド断片としては、プロテインＧの部分ペプチド断片（特開平２００３−８８３８１号公報）などが例示される。【００２２】
担体に抗ＣＤ３抗体等を固定化する方法としては特に限定されない。公知の方法としては、以下の方法が例示される。抗ＣＤ３抗体等を、波長２８０ｎｍでの吸光度として０．００１〜０．０５の蛋白濃度となるように溶液を調整する。溶液のｐＨは５〜１０程度、塩濃度は０．０１〜１．０Ｍ程度が例示される。上記塩としては特に限定されず、ナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられる。その後に当該溶液の適量と水不溶性担体とを混和あるいは接触させ、０〜３７℃で１〜２４時間程度静置する。処理後に溶液を除き、適量の洗浄液を用いて洗浄する。【００２３】
上記洗浄液としては、蒸留水、生理食塩液、またはこれらに０．０１〜０．１ｗ／ｖ％程度のアルブミン、非イオン系界面活性剤〔例えば、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、商品名トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）〕などを添加したものが使用され得る。また洗浄の際に、細胞培養用培地を用いることも可能である。【００２４】
具体的には、抗ＣＤ３抗体等を固定化した担体としては、担体の表面に抗ＣＤ３抗体等を固定化したものが例示される。その場合、前述のように、抗体を特異的に吸着するためのリガンドを介して抗ＣＤ３抗体等が担体の表面に固定化されていてもよい。さらに、これらの担体は、そのまま用いてもよいし、担体間を架橋させたもの、又は、包括させたものを用いてもよい。【００２５】
抗ＣＤ３抗体等の固定化量は、密度表示で以下の通りである。抗ＣＤ３抗体、そのフラグメント、抗ＣＤ２８抗体などの抗ＣＤ抗体類、抗ＣＴＬＡ−４抗体の場合は、０．００１〜１０００μｇ／ｃｍ２程度、好ましくは０．００１〜１０μｇ／ｃｍ２である。Ｂ７分子ファミリーの場合は、１０〜１０１５個／ｃｍ２程度、好ましくは１０〜１０９個／ｃｍ２である。上記の各数値は担体の単位面積あたりの量を意味する。【００２６】
本発明における活性化は、抗ＣＤ３抗体等を固定化した担体に、Ｔ細胞を含む溶液を移動させつつ接触させることによって実施する。本発明ではＴ細胞を含む溶液を移動させることによって、抗ＣＤ３抗体及び上述の副刺激シグナル供与体と接触する機会が増加するために、短時間（例えば２４時間以内）に効率よく、免疫療法に有効なようにＴ細胞を活性化できるものと推測される。【００２７】
抗ＣＤ３抗体等を固定化した担体は、Ｔ細胞を含む溶液を移動させつつ接触させることができる状態に保持していればよく、例えば、カラムやバッグに充填したものが好ましい。特に、カラムに充填している状態のものが、活性化処理が容易であることから好ましい。この場合、本発明の活性化は、Ｔ細胞を含む溶液を、当該カラムに通液することで極めて容易に実施することができる。バッグを使用する場合には、当該バッグ内において、Ｔ細胞を含む溶液を移動（振盪、攪拌、傾斜等）させることによって実施することができる。また、抗ＣＤ３抗体等をフィルター又は不織布に固定化し、これにＴ細胞を含む溶液を通過、移動させることにより、本発明の方法を実施することも可能である。【００２８】
本発明で使用するＴ細胞としては特に限定されないが、例えば、末梢血リンパ球細胞（ＰＢＬ）、腫瘍湿潤リンパ球、リンパ節細胞、担癌（または腫瘍）局所リンパ節細胞などが挙げられる。なお、本発明により得られた活性化Ｔ細胞を患者に投与する場合には、該患者から採取されたＴ細胞を用いることが望ましい。【００２９】
本発明において、Ｔ細胞を取得するのに必要な採血量及びそこから得られるＴ細胞の数は、特に制限されない。採血量は、患者への負担、Ｔ細胞の分離などの観点から、１〜５０ｍｌであることが望ましい。また、得られた活性化Ｔ細胞を癌転移抑制剤又は癌療法補助剤として使用する場合には、標的となる腫瘍の局所リンパ節細胞を使用することによって、腫瘍特異的な抗腫瘍効果を期待できる。【００３０】
本発明で使用する、Ｔ細胞を含む溶液としては特に限定されないが、例えば、Ｔ細胞を含む培養液、Ｔ細胞を溶液（例えば、緩衝液）に懸濁したもの等が挙げられる。Ｔ細胞を含む培養液において用いる基本培地としてはＴ細胞を培養できるものであれば特に限定されないが、最小基本培地（ＭＥＭ）、ＫＢＭ４００、ＲＰＭＩ１６４０、ハムＦ１２、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イスコフ改変イーグル培地（ＩＭＤＭ）などが挙げられる。なかでもＫＢＭ４００、及び、ＲＰＭＩ  １６４０が好ましい。【００３１】
上記基本培地には、リンホカインが含まれていることが好ましい。リンホカインとしては、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、マクロファージ走化性因子（ＭＣＦ）、皮膚反応因子（ＳＲＦ）、マクロファージ活性化因子（ＭＡＦ）、白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）、好中球走化性因子（ＮＣＦ）、好酸球走化性因子（ＥＣＦ）、好塩基球走化性因子（ＢＣＦ）、好酸球刺激促進因子（ＥＳＰ）、リンホトキシン（ＬＴ）、血管透過性亢進因子（ＶＰＦ）、幼若化因子（ＢＦまたはＭＦ）、破骨細胞活性化因子（ＯＡＦまたはＩＬ−１β）、γ−インターフェロン（ＩＦＮ−γ）などのエフェクターリンホカイン、および、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−２レセプター調節因子（ＡＴＦ）などの免疫調節性リンホカインが挙げられる。なかでも、ＩＬ−２、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γが望ましい。ＩＬ−２およびＩＬ−１２は、末梢血から分離したものでもよいし、遺伝子組換えにより調製したものでもよい。ＩＦＮ−γは、細胞培養、遺伝子組換えなどの手段により調製されたものを利用できる。添加量について後述するものを適用できる。リンホカインとしては、１種類のみを用いてもよいし、二種以上を併用することもできる。【００３２】
上記基本培地には、雑菌のコンタミネーションを防止するための薬剤が含まれていてもよい。上記薬剤としては特に限定されないが、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシンなどが挙げられる。【００３３】
上記基本培地には、Ｔ細胞増殖能をさらに向上させるための成分を添加することもできる。上記成分としては特に限定されないが、例えば、インシュリン、トランスフェリン、フェツイン、カタラーゼ、Ｏ−ホスホリルエタノールアミン、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、２−メルカプトエタノール、コルチコステロンなどが挙げられる。【００３４】
インシュリンとしては、ヒト、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマなど由来のもの、または組換え体のいずれでも使用でき、その添加量は、１〜１００μｇ／ｍｌ、特に１０μｇ／ｍｌ程度が好ましい。
トランスフェリンとしては、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、マウス、モルモット、ウサギなど由来のものが使用でき、その添加量は、１〜１００μｇ／ｍｌ、特に１０μｇ／ｍｌ程度が好ましい。
フェツインとしては、例えばウシ由来のものが使用でき、その添加量は、１〜１００μｇ／ｍｌ、特に１０μｇ／ｍｌ程度が好ましい。
カタラーゼとしては、例えばウシ、イヌ、マウス、糸状菌など由来のものが使用でき、その添加量は、２〜５０μｇ／ｍｌ、特に３０μｇ／ｍｌ程度が好ましい。
Ｏ−ホスホリルエタノールアミンまたはエタノールアミンの添加量は、２〜２００μｇ／ｍｌ、特に２０μｇ／ｍｌ程度が好ましい。
亜セレン酸ナトリウムの添加量は、１０−１０〜１０−７Ｍ、特に１０−８Ｍ程度が好ましい。
２−メルカプトエタノールの添加量は、１０−９〜１０−４Ｍ、特に５×１０−５Ｍ程度が好ましい。
コルチコステロンの添加量は、１０−９〜１０−６Ｍ、特に１０−６Ｍ程度が好ましい。【００３５】
本発明でＴ細胞を活性化するにあたって、溶液に含まれるＴ細胞の個数は特に限定されないが、例えば、１０３〜１０７個／ｍｌ程度が好ましい。【００３６】
本発明において、Ｔ細胞を含む溶液と担体との接触に必要な時間は、０時間より多ければ特に限定されない。本発明においては、きわめて短時間の接触であっても効率的に活性化を達成できるので、接触時間は、２４時間未満でよく、さらには、７時間未満であっても十分に活性化することができる。しかしながら、本発明の方法は短時間の接触に限定されるものではなく、例えば、１０日程度まで延長して接触させることも可能である。抗ＣＤ３抗体等を固定化した担体をカラムに充填し、当該カラムに、Ｔ細胞を含む溶液を通液させる場合には、例えば１時間以内、好ましくは３０分以内で上記溶液全量がカラムを通過するようにして接触を行えばよい。この場合、一回のみ通液させてもよい（ワンパス）し、複数回繰り返して通液を行ってもよい。【００３７】
接触時の温度としては特に限定されず、Ｔ細胞の活性化に適した温度であればよく、通常、３０〜４０℃程度であり、３６〜３８℃程度が好ましい。活性化は、炭酸ガスを１〜１０容量％含有する雰囲気中にて行うのが好ましい。
本発明のＴ細胞活性化に使用する担体の量は、スケールや細胞数により適宜選択できる。例えば、Ｔ細胞を含む溶液１ｍｌ当たり、１〜１０７ｃｍ３程度の割合で担体を使用すればよい。【００３８】
（２）活性化Ｔ細胞の増殖培養
本発明においては、以上の方法によって得られた活性化Ｔ細胞を、リンホカインを含む培地中で培養することにより、増殖させることができる。
培養時間は特に限定されず、活性化Ｔ細胞の必要量に応じて適宜決定すればよいが、例えば、１〜５０日間程度である。
増殖培養時の温度としても特に限定されず、Ｔ細胞の培養に適した温度であればよく、通常、３０〜４０℃程度であり、３６〜３８℃程度が好ましい。培養は、炭酸ガスを１〜１０容量％含有する雰囲気中にて行うのが好ましい。【００３９】
増殖培養に使用する培地としては、上述した基本培地を使用することができる。
増殖培養に使用する培地は、ＬＡＫ細胞を誘導するために、リンホカインを含有するものである。リンホカインとしては、末梢血から分離されたもの、または、遺伝子組換えにより調製されたものを使用することができ、具体的には、上述したものを挙げることができる。リンホカインの配合量は、例えばＩＬ−２の場合、１０〜１０００ＪＲＵ／ｍｌ、好ましくは１０〜１００ＪＲＵ／ｍｌであり、ＩＬ−１２の場合、０．１〜１０００Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．１〜１００Ｕ／ｍｌであり、ＩＦＮ−γの場合、０．１〜１０００ＩＵ／ｍｌ、好ましくは１０〜１０００ＩＵ／ｍｌである。【００４０】
増殖培養に使用する培地には、上述と同様、雑菌のコンタミネーションを防止するための薬剤や、Ｔ細胞増殖能を向上させるための成分を含有するものであってよい。
本発明においては、活性化工程と増殖培養工程を一連の閉鎖系プロセスとして実施することができ、これによって、さらに、雑菌等のコンタミネーション等が生じる危険性を低減することができる。  【００４１】
（３）免疫治療剤の製造方法
本発明により得られた活性化Ｔ細胞は、免疫治療に有利なものであり、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、マウス、ラットなどの哺乳動物に対して、感染防御、抗アレルギー、抗ＡＩＤＳ、癌転移抑制などの作用を有するので、免疫治療剤に用いることができる。【００４２】
上記免疫治療剤は、常法により、非経口投与の液状製剤（例えば、皮下、筋肉内、静脈注射剤）に調剤されることが好ましく、疾病の進度または病状に対して所望の治療的効果を生ぜしめるに効果的な量の活性化Ｔ細胞を含有するものである。【００４３】
上記免疫治療剤には、活性化Ｔ細胞に加えて、免疫治療に有用な薬剤を配合してもよい。併用し得る薬剤としては特に限定されないが、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γなどが例示される。さらに、必要に応じて、懸濁化剤、保存剤、ｐＨ緩衝剤、等張剤、局所麻酔剤、抗生物質などを配合することができる。
上記免疫治療剤は、感染防御剤、抗アレルギー剤、抗ＡＩＤＳ剤、癌転移抑制剤または癌療法補助剤などとして有用である。【００４４】
（４）活性化Ｔ細胞調製用キット
本発明の活性化Ｔ細胞製造用キットは、上述した活性化及び増幅培養を実施するためのキットであり、上記抗ＣＤ３抗体等を固定化するための担体、及び、それを充填するためのカラムを含むものである。本発明のキットにおいて、上記担体は上記カラムに充填された状態にあってもよい。【００４５】
本発明の活性化Ｔ細胞製造用キットは、さらに、抗ＣＤ３抗体、リンホカイン、基本培地、活性化Ｔ細胞を増殖培養するための容器（例えばガス透過性をもった細胞培養用バッグ）、上記カラムと上記容器を接続するためのデバイス（例えば、チューブ）などを含むものであってもよい。上記カラムと上記増殖培養用容器を接続することによって、活性化と増殖培養を一連の閉鎖系プロセスとして実施することができる。
本発明の活性化Ｔ細胞製造用キットに抗ＣＤ３抗体を添付する場合には、当該抗ＣＤ３抗体は安定に保存できる状態にして添付することが好ましい。
本発明の活性化Ｔ細胞製造用キットは、上記担体に、当該キットに添付されている抗ＣＤ３抗体、又は、別途入手した抗ＣＤ３抗体を固定化することによって、活性化Ｔ細胞を製造するのに使用することができる。
【発明の効果】
【００４６】
本発明は、上記構成によって、短時間（例えば２４時間以内）に効率よく、免疫療法に有効なようにＴ細胞を活性化することが可能である。本発明によれば、簡便な操作で雑菌等のコンタミネ−ション等が生じる危険性を低減することができる。【００４７】
本発明によれば、Ｔ細胞を、従来法と比較してより良好に、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋（活性化）Ｔ細胞などの活性化Ｔ細胞に分化、誘導することができる。また、従来法と比較して、活性化されていない（つまり免疫治療に実用上必要とされない）ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞の割合を低く抑えることができる。【００４８】
本発明のＴ細胞の活性化方法、活性化Ｔ細胞の製造方法及び活性化Ｔ細胞製造用キットは、自己免疫疾患、細菌感染、アレルギー、ＡＩＤＳ、癌の進行状況などの病状を検査、診断する際にも極めて有用である。例えば、様々な病状の患者より回収したＴ細胞を本法に従って活性化、増幅した後、その増幅率、又は、増幅したＴ細胞表面のＣＤ４、ＣＤ８などのサイトカインの発現比率を比較することで病状の進行度を推し量ることも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
以下、本発明をより詳細に説明するために実施例および実験例を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。【００５０】
実施例１  抗ＣＤ３抗体固定化担体によるヒト由来Ｔ細胞の活性化、及び、増幅
（１）抗ＣＤ３抗体固定化担体の調製
担体として、臭化シアン活性化されたアガロース担体（ＣＮＢｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６ＭＢ（商品名）、アマシャム・バイオサイエンス製）を使用した。１ｇの担体を計りとり、これを３．５ｍｌの１ｍＭ塩酸に懸濁し、ガラスフィルター上で約２００ｍｌの１ｍＭ塩酸で洗浄した。５ｍｌのカップリング緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）に担体を懸濁し、１ｍｇの抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ−３、オルソ  ファーマシューティカル  コーポレイション製）を添加し、室温で２時間、１５ｍｌ容チューブ（旭テクノグラス製）内で回転（１０ｒｐｍ）させながら混和した。その後、ガラスフィルター上で担体のみを回収し、これを２ｍｌの０．２Ｍグリシンを含むカップリング緩衝液に懸濁し、室温で２時間静置した。【００５１】
次に、担体をガラスフィルターで回収し、緩衝液Ａ（０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む０．１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ４）約１００ｍｌで洗浄した後、約１００ｍｌの緩衝液Ｂ（０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む０．１Ｍトリス緩衝液、ｐＨ８）で洗浄した。その後、このＡ−Ｂの洗浄操作をさらに２回繰り返した。その後、約１００ｍｌのＰＢＳ緩衝液（ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ  ０．１５７ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４  １．９８ｇ、ＮａＣｌ  ８．１ｇ、１，０００ｍｌ）で洗浄し、さらに約５ｍｌのＩＬ−２を含有した培地（ＫＢＭ４００、ユージンバイオ製）で洗浄したのち、最終的に５ｍｌの同培地で担体を懸濁した（なお、ここで含まれる培地は細胞を添加する際には破棄した）。【００５２】
この懸濁液を、細胞培養用のバッグ（ＮＩＰＲＯカルチャーバッグ１０００Ｎ、二プロ製）を切断して作製したカラムに加え、Ｔ細胞活性化用カラムを完成した。なお、このカラムは３ｃｍＸ１６ｃｍの小バッグを３方活栓で上下２つ連結したもので、上部の小バッグに担体を添加したものである（図１）。【００５３】
また、従来法としてフラスコに抗ＣＤ３抗体を固定したものを調製した。抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ−３、オルソ  ファーマシューティカル  コーポレイション製）をリン酸緩衝食塩水溶液（ＰＢＳ）で５μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、表面積２５ｃｍ２のフラスコ（旭テクノグラス製）に１ｍｌ注入した。この溶液をフラスコの底面にまんべんなく広げ、室温で１時間放置した。その後ＯＫＴ−３希釈液を吸引除去し、ＰＢＳで３回洗浄し、クリーンベンチ内で室温にてかるく風乾させ、Ｔ細胞活性化用コントロールフラスコを調製した。【００５４】
（２）ヒトＴ細胞の調製、並びに、担体によるヒトＴ細胞の活性化、及び、増幅
１０ｍｌの注射器を用いて採血したヒト抹消血全血８ｍｌを、ヘパリンを含有した真空採血管（滅菌済みバキュティナ採血管、日本ベクトン・ディッキンソン製）に回収し、１，６００Ｘｇで１５分間遠心した。その後、Ｔ細胞画分を分取し、遠心（１，６００Ｘｇ、１０分間）によりＴ細胞を回収し、また血しょう画分を回収した。このＴ細胞をＰＢＳ緩衝液で１度洗浄し、ここに、細胞数が約２Ｘ１０５個／ｍｌとなるように、ＩＬ−２を含有した培地（ＫＢＭ４００、ユージンバイオ製）を添加した。なお、この培地には血しょう画分を８％（ｗ／ｗ）になるように加えた。【００５５】
このＴ細胞懸濁液５ｍｌ（約１×１０６個）を、（１）で調製したＴ細胞活性化用カラム及びＴ細胞活性化用コントロールフラスコに加えて、Ｔ細胞の活性化を開始した。なお、Ｔ細胞活性化用カラムについては、培養液を１時間ごとに、担体を加えた上部の小バッグから下部の小バッグに全て通過させ（約１０分間で全量通過するように）、再度上部の小バッグに戻すという操作を繰り返した。コントロールフラスコについては静置した状態で活性化を行った。【００５６】
７時間、又は、１日の活性化処理を行った（Ｔ細胞活性化用コントロールフラスコの場合、３日間の活性化処理も行った）後、１ｍｌの培養液を１２穴プレート（日本ベクトン・ディッキンソン製）に分取し、それぞれ３日後に上記培地を１ｍｌ添加（培養液量２ｍｌ）し、５日後にこの全量を６穴プレート（日本ベクトン・ディッキンソン製）に移して上記培地を２ｍｌ添加（培養液量４ｍｌ）し、７日後にシャーレ（旭テクノグラス製））に移して１０ｍｌの上記培地を添加して全量１４ｍｌとした後、さらに９日間の培養を行った（活性化処理終了後の培養期間が合計で１６日間となる）。それぞれについて、活性化処理終了直後と、活性化処理後の培養日数が３、４、５、７、１０、１２、１４及び１６日目で細胞数を計測した。【００５７】
Ｔ細胞活性化用カラム及び従来のＴ細胞活性化用コントロールフラスコによる活性化処理終了後１６日目まで培養した時の増殖曲線を、活性化処理時間が７時間の場合について図２−１に、活性化処理時間が１日の場合について図２−２に示した。
さらに、Ｔ細胞活性化用カラムにより活性化処理を７時間行った場合の増殖曲線、及び、Ｔ細胞活性化用コントロールフラスコにより活性化処理を３日行った場合の増殖曲線を図２−３に示した。【００５８】
図２−１及び図２−２から、Ｔ細胞の増幅細胞数、即ち、活性化Ｔ細胞を増殖させる効率（活性化効率）は、従来のフラスコの場合と比較して、カラムを使用した場合に、明らかに良好であり、活性化時間がわずか７時間であっても十分な増幅を示すことが分かる。【００５９】
図２−３から、フラスコを用いて常法通り３日間の活性化を行った場合には、活性化による日数が長くなるばかりでなく、カラムによる７時間の活性化の場合と比較しても細胞増幅数が少なく、細胞増幅の立ち上げが遅いことが分かる。【００６０】
実施例２  抗ＣＤ３抗体固定化担体によるヒト由来Ｔ細胞３検体の活性化、及び、増幅
３人のヒト由来Ｔ細胞（３検体をそれぞれ、サンプルＡ、サンプルＢ及びサンプルＣとした）を実施例１（２）と同様に調製し、これらを、実施例１（１）と同様に調製したＴ細胞活性化用カラム及びＴ細胞活性化用コントロールフラスコを用いて活性化した。
実施例１（２）と同様の方法で、７時間、又は、２時間の活性化処理を行った後、１ｍｌの培養液を回収し、同様にしてＴ細胞の増幅を行った。【００６１】
Ｔ細胞活性化用カラム及び従来のＴ細胞活性化用コントロールフラスコによる活性化処理終了後２週間培養した時の増殖曲線を、活性化処理時間が２時間の場合について図３−１に、活性化処理時間が７時間の場合について図３−２に示した。
これらの図から、カラムを使用した場合、従来のフラスコの場合と比較して、３検体共に、短時間の活性化処理で十分な増幅を示すことが分かる。さらには、２時間という極めて短い活性化処理であっても十分な効果があることが分かる。【００６２】
実施例３  抗ＣＤ３抗体固定量による、ヒト由来Ｔ細胞の活性化への影響
実施例１（１）に従って臭化シアン活性化されたアガロース担体（ＣＮＢｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６ＭＢ（商品名）、アマシャム・バイオサイエンス製）に抗ＣＤ３抗体を固定した。この場合、使用した抗体量は１ｍｇ、５００μｇ、１００μｇ、５μｇとした。これらを、それぞれ、ＣＮＢｒ１０００、ＣＮＢｒ５００、ＣＮＢｒ１００、ＣＮＢｒ５とする。【００６３】
これらを用いて実施例１（２）と同様にして、ヒト由来Ｔ細胞の活性化処理を２時間行った後、２週間培養した時の増殖曲線を図４に示す。
この図から、抗体の固定量がわずかであっても十分な増幅が得られることが分かる。【００６４】
実施例４  異なる担体を用いたワンパス刺激でのヒト由来Ｔ細胞の活性化
（１）エポキシ化担体の作製
セルロース担体（特許第１９０５１０１号に記載の方法で調製、平均粒径４５０μｍ）を水で十分に洗浄した後、水に懸濁させ２時間後の沈降体積を測定した。セルロース担体：水：２Ｎ  ＮａＯＨ：エピクロロヒドリン（和光純薬製）＝１：１：０．５３：０．１８（体積比）をはかり取り、担体と水を反応容器（ポリエチレン製）内で４０℃で約１５分間振とうした。これに２Ｎ  ＮａＯＨを加え３０分間攪拌した後、エピクロロヒドリンを加えて振とうした。２時間反応後、ろ液が中性になるまで十分に水洗し、エポキシ化担体を作製した。【００６５】
（２）エポキシ化担体への抗ＣＤ３抗体の固定
実施例４（１）で作製した担体をガラスフィルター上に集め、約３００ｍｌの滅菌水で洗浄し、さらに炭酸緩衝液（０．０５Ｍ  ＮａＨＣＯ３、０．１Ｍ  ＮａＯＨ、ｐＨ１０）約３００ｍｌで洗浄した。洗浄後、担体を約７ｍｌの炭酸緩衝液に懸濁し、その内、５ｍｌを１５ｍｌ容チューブ（旭テクノグラス製）に加え、これに５μｇの抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ−３、オルソ  ファーマシューティカル  コーポレイション製）を添加し、３７℃で１７時間、回転（１０ｒｐｍ）させながら混和した。その後、静置し、上清を廃棄し、１０ｍｌのグリシン緩衝液（０．０５Ｍ  ＮａＨＣＯ３、０．１Ｍ  ＮａＯＨ、０．２Ｍ  グリシン、ｐＨ１０）を加え、３７℃で４時間静置した。その後、滅菌水約１００ｍｌで洗浄し、ＰＢＳ緩衝液で洗浄後、最後にＩＬ−２を含有した培地（ＫＢＭ４００、ユージンバイオ製）で洗浄した。この担体を５ｍｌの同培地に懸濁したものを用いて、実施例１（２）と同様にして、Ｔ細胞活性化用カラム（エポキシ）を作製した。【００６６】
（３）ワンパス刺激でのＴ細胞の活性化
実施例４（２）で調製したＴ細胞活性化用カラム（エポキシ）、及び、実施例３で作製したＴ細胞活性化用カラム（ＣＮＢｒ５）を用いて、実施例１（２）と同様にして、ヒト由来Ｔ細胞を含む培養液を、上部の小バッグから下部カラムの小バッグに１回、約２０分かけて通過させることによって活性化を行った（ワンパス刺激）。この後、実施例１（２）と同様にして２週間増幅させた結果を図５に示す。
図５から、担体の種類を変えた場合でも十分に活性化させることが可能であり、また、ワンパス刺激という簡便な短時間処理によっても効率的なＴ細胞の増幅が可能であることが分かる。【００６７】
実施例５  増幅したヒト由来Ｔ細胞の表現形（ＣＤ４、ＣＤ８）
実施例４（３）でＴ細胞活性化用カラム（ＣＮＢｒ５）又はＴ細胞活性化用カラム（エポキシ）を用いたワンパス刺激による活性化後に増幅させたＴ細胞について、ＣＤ４陽性及びＣＤ８陽性比率を測定した。また、従来のフラスコ法（活性化時間：３日）で増幅させたＴ細胞についても測定した。【００６８】
増幅したＴ細胞２Ｘ１０５個分を遠心（４３０Ｘｇ、５分間）により回収し、冷却したＰＢＳ緩衝液を２００μｌ添加した。このチューブに１０μｌの抗体試薬（トライテストＣＤ４／ＣＤ８／ＣＤ３、日本ベクトン・ディッキンソン製）を添加し、氷中で１５分間反応させた。その後、５００μｌのＰＢＳ緩衝液を加え、軽く攪拌後遠心（４３０Ｘｇ、５分間）して細胞を回収した。上清を除き、そこにＰＢＳ緩衝液を１ｍｌ加え、攪拌した後、遠心（４３０Ｘｇ、５分間）して細胞を回収し、その細胞を５００μｌのＰＢＳ緩衝液に懸濁した。この細胞懸濁液を用いてＦＡＣＳ解析（ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ、日本ベクトン・ディッキンソン製）を行い、ＣＤ３陽性、ＣＤ４陽性、ＣＤ８陽性細胞の比率を算出した。その結果を表１に示す。【００６９】
【表１】
2006101205.tif 000002
【００７０】
リンパ球療法の場合、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の比率が高い方が望ましいとされている。表１から、カラムによる活性化によって十分なＣＤ８陽性Ｔ細胞の比率が確保され、また、従来のフラスコ法に比べ、リンパ球療法には不要なＣＤ４陰性ＣＤ８陰性の割合が格段に少なく、有効なＴ細胞の存在比が高いことが分かる。【００７１】
実施例６  プロテインＡリガンドを付加した担体に抗ＣＤ３抗体を固定化したものを用いたヒト由来Ｔ細胞の活性化、及び、増幅
（１）エポキシ化担体へのプロテインＡの固定（プロテインＡ担体の作製）
実施例４（１）で作製した担体をガラスフィルター上に集め、約３００ｍｌの滅菌水で洗浄し、さらに炭酸緩衝液（０．０５Ｍ  ＮａＨＣＯ３、０．１Ｍ  ＮａＯＨ、ｐＨ１０）約３００ｍｌで洗浄した。洗浄後、担体を約７ｍｌの炭酸緩衝液に懸濁し、その内、５ｍｌを１５ｍｌ容チューブ（旭テクノグラス製）に加え、これに５０μｇ分のプロテインＡ（Ｚｙｍｅｄ製）を添加し、３７℃で１７時間、回転（１０ｒｐｍ）させながら混和した。その後、静置し、上清を廃棄した。
回収した担体を、５ｍｌのグリシン緩衝液（０．０５Ｍ  ＮａＨＣＯ３、０．１Ｍ  ＮａＯＨ、０．２Ｍ  グリシン、ｐＨ１０）を加え、３７℃で４時間静置した。その後、滅菌水約１００ｍｌで洗浄し、その後、ＰＢＳ緩衝液約１００ｍｌで２回洗浄し、最後に５ｍｌのＰＢＳ緩衝液に懸濁した。これをプロテインＡ担体とした。【００７２】
（２）プロテインＡ担体への抗ＣＤ３抗体の固定（プロテインＡ−抗ＣＤ３抗体担体の作製）
実施例６（１）で作製したプロテインＡ担体に１０μｇの抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ−３、オルソ  ファーマシューティカル  コーポレイション製）を添加し、室温で２時間、１５ｍｌ容チューブ（旭テクノグラス製）内で回転（１０ｒｐｍ）させながら混和した。その後、ガラスフィルター上で担体のみを回収し、ＰＢＳ緩衝液約１００ｍｌで２回洗浄した。その後、担体を、約５ｍｌのＩＬ−２を含有した培地（ＫＢＭ４００、ユージンバイオ製）で２回洗浄したのち、最終的に５ｍｌの同培地で担体を懸濁した（なお、ここで含まれる培地は細胞添加する際には破棄した）。これをプロテインＡ−抗ＣＤ３抗体担体（１）とした。【００７３】
同様にして、プロテインＡを固定化したアガロース担体（ＰｒｏｔｅｉｎＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６ＭＢ（商品名）、アマシャム・ファルマシア製）に抗ＣＤ３抗体を固定化したものも作製し、これをプロテインＡ−抗ＣＤ３抗体担体（２）とした。【００７４】
これらをそれぞれ、細胞培養用のバッグ（ＮＩＰＲＯカルチャーバッグ１０００Ｎ、二プロ製）を切断して作製したカラムに加え、Ｔ細胞活性化用カラムを完成した。なお、このカラムは３ｃｍＸ１６ｃｍの小バッグを３方活栓で上下２つ連結したもので、上部の小バッグに担体を添加したものである。【００７５】
従来法としてフラスコに抗ＣＤ３抗体を固定したものを調製した。抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ−３、オルソ  ファーマシューティカル  コーポレイション製）をリン酸緩衝食塩水溶液（ＰＢＳ）で５μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、表面積２５ｃｍ２のフラスコ（旭テクノグラス製）に１ｍｌ注入した。この溶液をフラスコの底面にまんべんなく広げ、室温で１時間放置した。その後ＯＫＴ−３希釈液を吸引除去し、ＰＢＳで３回洗浄し、クリーンベンチ内で室温にてかるく風乾させコントロールフラスコを調製した。【００７６】
（３）プロテインＡ−抗ＣＤ３抗体担体を用いたＴ細胞の活性化
実施例１（２）と同様にして、プロテインＡ−抗ＣＤ３抗体担体（１）を含むカラム、プロテインＡ−抗ＣＤ３抗体担体（２）を含むカラム、又は、コントロールフラスコを用いて、ヒト由来Ｔ細胞２検体（サンプルＡ及びサンプルＢ）の活性化を行った。なお、プロテインＡ−抗ＣＤ３抗体担体（１）を含むカラム、又は、プロテインＡ−抗ＣＤ３抗体担体（２）を含むカラムについては、培養液を、上部の小バッグから下部の小バッグに全て通過させるワンパス刺激で活性化を行った（約２０分間で全量通過させた）。コントロールフラスコについては、３日かけて活性化を行った。【００７７】
活性化処理後１４日目まで培養した時の増殖曲線を図６に示す。この図から、プロテインＡ−抗ＣＤ３抗体担体を用いたワンパス刺激による活性化は、Ｔ細胞の増幅細胞数、即ち、活性化Ｔ細胞を増殖させる効率（活性化効率）において、従来のフラスコ法による３日間の活性化の場合と比較して同程度か、それ以上の結果を示すことが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】実施例で用いたＴ細胞活性化用カラムの模式図
【図２−１】実施例１でＴ細胞活性化処理をカラム又はコントロールフラスコで７時間行った後の細胞数増殖曲線
【図２−２】実施例１でＴ細胞活性化処理をカラム又はコントロールフラスコで１日行った後の細胞数増殖曲線
【図２−３】実施例１でＴ細胞活性化処理を、カラムで７時間行った後、又は、コントロールフラスコで３日行った後の細胞数増殖曲線
【図３−１】実施例２でＴ細胞３検体（サンプルＡ、サンプルＢ及びサンプルＣ）の活性化処理をカラム又はコントロールフラスコで２時間行った後の細胞数増殖曲線
【図３−２】実施例２でＴ細胞３検体（サンプルＡ、サンプルＢ及びサンプルＣ）の活性化処理をカラム又はコントロールフラスコで７時間行った後の細胞数増殖曲線
【図４】実施例３において固定時の抗体使用量を１ｍｇ、５００μｇ、１００μｇ、５μｇとして作製したカラム（ＣＮＢｒ１０００、ＣＮＢｒ５００、ＣＮＢｒ１００及びＣＮＢｒ５）で活性化処理を２時間行った後の細胞数増殖曲線
【図５】実施例４においてカラム（エポキシ）又はカラム（ＣＮＢｒ５）を用いたワンパス刺激により活性化処理を行った後の細胞数増殖曲線
【図６】実施例６で、Ｔ細胞２検体（サンプルＡ及びサンプルＢ）の活性化処理を、プロテインＡ−抗ＣＤ３抗体担体（１）を含むカラム（ワンパス刺激）、プロテインＡ−抗ＣＤ３抗体担体（２）を含むカラム（ワンパス刺激）、又は、コントロールフラスコ（３日間）を用いて行った後の細胞数増殖曲線
【符号の説明】
【００７９】
１、上部の小バッグ
２、下部の小バッグ
３、三方活栓
４、担体
【図１】
2006101205.tif 000003
【図２−１】
2006101205.tif 000004
【図２−２】
2006101205.tif 000005
【図２−３】
2006101205.tif 000006
【図３−１】
2006101205.tif 000007
【図３−２】
2006101205.tif 000008
【図４】
2006101205.tif 000009
【図５】
2006101205.tif 000010
【図６】
2006101205.tif 000011
【国際調査報告】
2006101205.tif 000012
2006101205.tif 000013
2006101205.tif 000014
2006101205.tif 000015