(57)【要約】  本発明は、モジュリン由来ペプチド（ＰＳＭ、フェノール可溶性モジュリン）に対するその共有結合により、抗原ペプチドの免疫原性を増大させる方法に関する。特に、抗原（病原体または腫瘍関連タンパク質由来）に対するＰＳＭα、ＰＳＭγおよびＰＳＭδペプチドの結合は、当該抗原がインビボで免疫応答を活性化させる能力を増大させる。したがって、これらの抗原に結合したＰＳＭα、ＰＳＭγおよびＰＳＭδペプチドは感染性疾患または癌を予防または治療するためのワクチンの開発において使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）フェノール可溶性モジュリン（ＰＳＭ）または機能的に同等なその変異体、および
（ｉｉ）１またはそれ以上の抗原ペプチド
を含んでなるコンジュゲートであって、成分（ｉ）と（ｉｉ）が共有結合されてなり、該コンジュゲートが、前記１またはそれ以上の抗原ペプチドに対する細胞傷害応答を促進するものである、コンジュゲート。
【請求項２】
前記ＰＳＭが、配列番号１〜１０およびこれらの機能的に同等な変異体からなる群から選択されるものである、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
成分（ｉｉ）が、成分（ｉ）と一本鎖ポリペプチド鎖を形成してなるものである、請求項１または２に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
請求項３に規定されたコンジュゲートをコードする核酸配列を含んでなる、ポリヌクレオチドまたは遺伝子構築体。
【請求項５】
請求項４に規定されたポリヌクレオチドまたは遺伝子構築体を含んでなる、ベクター。
【請求項６】
請求項４に規定されたポリヌクレオチドまたは遺伝子構築体、または請求項５に規定されたベクターを含んでなる、宿主細胞。
【請求項７】
以下の（ａ）、（ｂ）を、ともにまたは独立して含んでなる、組成物：
（ａ）請求項１〜３のいずれか一項に規定されたコンジュゲート、請求項４に規定されたポリヌクレオチドまたは遺伝子構築体、請求項５に規定されたベクター、または請求項６に規定された宿主細胞、および
（ｂ）以下の群から選ばれる第二成分：
（ｉ）１またはそれ以上のＴｏｌｌ様受容体アゴニスト、
（ｉｉ）１またはそれ以上の共刺激分子のアゴニスト抗体、
（ｉｉｉ）１またはそれ以上のサイトカイン、および
（ｉｖ）上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の化合物の任意の組合せ。
【請求項８】
前記第二成分のＴｏｌｌ様受容体アゴニストが、ＴＬＲ３リガンド、ＴＬＲ４リガンドおよびＴＬＲ９リガンドからなる群から選ばれるものである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＴＬＲ３リガンドが、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃであり、前記ＴＬＲ４リガンドがＬＰＳまたはＥＤＡタンパク質であり、および／または前記ＴＬＲ９リガンドがＣｐＧである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
抗原に感作された抗原提示細胞を得るための方法であって、
（ｉ）抗原提示細胞を、請求項１〜３のいずれか一項に規定されたコンジュゲート、請求項４に規定されたポリヌクレオチドまたは遺伝子構築体、請求項５に規定されたベクター、請求項６に規定された宿主細胞、または請求項７〜９のいずれか一項に規定された組成物と接触させ、そして
（ｉｉ）抗原に感作された抗原提示細胞を単離することを含んでなる、方法。
【請求項１１】
前記抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項１０に規定された方法。
【請求項１２】
請求項１０または１１に規定された方法によって得られた、抗原提示細胞。
【請求項１３】
請求項１〜３のいずれか一項に規定されたコンジュゲート、請求項４に規定されたポリヌクレオチドまたは遺伝子構築体、請求項５に規定されたベクター、請求項６に規定された宿主細胞、請求項７〜９のいずれか一項に規定された組成物、または請求項１２に規定された抗原提示細胞と、薬学的に許容される担体とを含んでなる、医薬製剤またはワクチン。
【請求項１４】
医薬として用いられる、請求項１〜３のいずれか一項に規定されたコンジュゲート、請求項４に規定されたポリヌクレオチドまたは遺伝子構築体、請求項５に規定されたベクター、請求項６に規定された宿主細胞、請求項７〜９のいずれか一項に規定された組成物、請求項１０に規定された医薬組成物またはワクチン、または請求項１２に規定された抗原提示細胞。
【請求項１５】
抗原ペプチドに対する細胞傷害応答を誘導する方法において用いられる、請求項１〜３のいずれか一項に規定されたコンジュゲート、請求項４に規定されたポリヌクレオチドまたは遺伝子構築体、請求項５に規定されたベクター、請求項６に規定された宿主細胞、請求項７〜９のいずれか一項に規定された組成物、請求項１０に規定された医薬組成物またはワクチン、または請求項１２に規定された抗原提示細胞。
【請求項１６】
感染性疾患、アレルギー性疾患または腫瘍性疾患に対する細胞傷害応答を誘導する方法において用いられる、請求項１〜３のいずれか一項に規定されたコンジュゲート、請求項４に規定されたポリヌクレオチドまたは遺伝子構築体、請求項５に規定されたベクター、請求項６に規定された宿主細胞、請求項７〜９のいずれか一項に規定された組成物、請求項１０に規定された医薬組成物またはワクチン、または請求項１２に規定された抗原提示細胞。
【請求項１７】
抗原提示細胞によって１以上の抗原ペプチドの発現を促進するための、または抗原提示細胞の成熟を促進するための、インビトロでの方法における、請求項１〜３のいずれか一項に規定されたコンジュゲート、請求項４に規定されたポリヌクレオチドもしくは遺伝子構築体、請求項５に規定されたベクター、請求項６に規定された宿主細胞、請求項７〜９のいずれか一項に規定された組成物の使用。
【請求項１８】
（ｉ）フェノール可溶性モジュリン（ＰＳＭ）または機能的に同等なその変異体、および
（ｉｉ）生物活性化合物
を含んでなり、上記成分（ｉ）と（ｉｉ）が共有結合されてなる、コンジュゲート。
【請求項１９】
前記ＰＳＭが、配列番号１〜１０からなる群から選ばれる、または機能的に同等なその変異体である、請求項１８に記載のコンジュゲート。
【請求項２０】
前記成分（ｉｉ）が、成分（ｉ）と一本鎖ポリペプチド鎖を形成するペプチド性化合物である、請求項１８または１９に記載のコンジュゲート。
【請求項２１】
請求項２０に規定されたコンジュゲートをコードする核酸配列を含んでなる、ポリヌクレオチドまたは遺伝子構築体。
【請求項２２】
請求項２１に規定されたポリヌクレオチドまたは遺伝子構築体を含んでなる、ベクター。
【請求項２３】
請求項２２に規定されたポリヌクレオチドまたは遺伝子構築体を含んでなる、宿主細胞。
【請求項２４】
請求項１８〜２０のいずれか一項に規定されたコンジュゲート、請求項２１に規定されたポリヌクレオチドもしくは遺伝子構築体、請求項２２に規定されたベクター、または請求項２３に規定された宿主細胞と、薬学的に許容されるい担体とを含んでなる、医薬製剤。
【請求項２５】
医薬として用いられる、請求項１８〜２０のいずれか一項に規定されたコンジュゲート、請求項２１に規定されたポリヌクレオチドまたは遺伝子構築体、請求項２２に規定されたベクター、請求項２３に規定された宿主細胞、または請求項２４に規定された医薬製剤。
【請求項２６】
ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ｃ、Ｆ４／８、もしくはＣＤ１１７陽性細胞、またはこれらの組合せからなる群から選ばれる細胞の望ましくない増殖または望ましくない活性によって特徴づけられる疾患の治療において用いられる、請求項１８〜２０のいずれか一項に規定されたコンジュゲート、請求項２１に規定されたポリヌクレオチドまたは遺伝子構築体、請求項２２に規定されたベクター、請求項２３に規定された宿主細胞、または請求項２４に規定された医薬製剤。
【請求項２７】
前記ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ｃ、Ｆ４／８、もしくはＣＤ１１７陽性細胞、またはこれらの組合せからなる群から選ばれる細胞の望ましくない増殖または望ましくない活性によって特徴づけられる疾患が、自己免疫性疾患、ＣＤ４陽性細胞のレトロウイルス感染、無毒の外来物質およびＢ細胞系悪性腫瘍によって誘導された自己抗原に対する免疫応答の結果として生じた疾患である、請求項１８〜２０のいずれか一項に規定されたコンジュゲート、請求項２１に規定されたポリヌクレオチドもしくは遺伝子構築体、請求項２２に規定されたベクター、請求項２３に規定された宿主細胞、または請求項２４に規定された医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して免疫学の分野に関し、特にモジュリン由来ペプチド（ＰＳＭ、フェノール可溶性モジュリン）への共有結合により、抗原ペプチドの免疫原性（抗原性）を増大させる方法に関する。特に、ＰＳＭα、ＰＳＭγおよびＰＳＭδペプチドの抗原（病原体または腫瘍関連タンパク質由来）への結合は、当該抗原のインビボでの免疫応答活性化能力を増大させる。したがって、これらの抗原に結合しているＰＳＭα、ＰＳＭγおよびＰＳＭδペプチドは、感染症または癌を予防または治療するためのワクチンの開発において使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
病原体および癌は、依然世界中で死の主原因である。既に存在しているワクチンの有効性および安全性の改善だけでなく、エイズ、マラリア等の、それに対する接種ワクチンが無い疾患の予防のためのワクチン、あるいは慢性疾患または癌を治療するためのワクチンの開発も、今なお最重要事項である。ほとんどの場合、そのようなワクチンの開発には、ＣＤ８＋（陽性）細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）を特異的に刺激する方法が必要とされる。
【０００３】
ＣＴＬｓは、ＭＨＣクラスＩ分子に結合した低分子ペプチドのＴ細胞受容体（ＴＣＲｓ）への提示によって活性化させられる。これらのペプチド−ＭＨＣクラスＩ複合体は、抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）の表面上に存在して、ＣＴＬｓの最適活性化のための刺激シグナルを与える。
【０００４】
樹状細胞（ＤＣｓ）は最も強力なＡＰＣｓであり、活性化されていないＴリンパ球（Ｔ細胞）（ナイーブＴリンパ球）と相互作用し、一次免疫応答を引き起こし、ＣＤ４＋ヘルパーＴリンパ球およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化する独特な能力を有する。
【０００５】
炎症および免疫応答がない場合、樹状細胞は、血液、末梢組織、リンパ（液）および二次リンパ器官を経由して移動する。末梢組織では、樹状細胞は自己のおよび外来の抗原を捕獲する。捕獲された抗原は、プロセッシングされてタンパク分解ペプチドになり、（それぞれ、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔリンパ球を活性化させるために）ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子へ渡される。抗原獲得、分解およびローディングというこのプロセスは、抗原提示と呼ばれる。しかしながら、刺激がない場合、末梢の樹状細胞は抗原を非効率的に提示する。病原体由来の外因性の１以上のシグナルまたは内因性の１以上のシグナルは、樹状細胞をＡＰＣｓへ、そしてＴ細胞アクチベーターへトランスフォームさせる、成熟と呼ばれる発生プロセスを開始するよう樹状細胞を誘導する。
【０００６】
細菌のおよびウイルスの産物だけでなく、炎症性サイトカイン、その他自己の分子も、イナート樹状細胞の表面受容体との直接の相互作用による樹状細胞の成熟を誘導する。ＣＤ４０依存性および非依存性経路を経たＴ細胞および内皮細胞は、直接的な細胞間の接触によって、およびサイトカインの分泌によって、樹状細胞の最終成熟に貢献する。ある危険なシグナルが生じると間もなく、抗原捕獲、細胞内輸送および分解、並びにＭＨＣ分子の細胞内輸送の効率が変更れる。ペプチドロードだけでなく半減期も、そしてＭＨＣ分子の細胞表面への移動も増大する。Ｔ細胞共刺激分子の発現もまた増大する。このようにして、樹状細胞は最も強力なＡＰＣｓへ変換され、これらだけが不活性Ｔ細胞を活性化させ、免疫応答を引き起こすことができる。それらの抗原提示能力の改変とともに、成熟は樹状細胞の末梢組織からの大規模な移動をも誘導する。ケモカイン受容体および接着分子の発現における改変だけでなく、細胞骨格の組織における重要な変化も、樹状細胞のリンパを経由してから二次リンパ器官までの移動に貢献する。
【０００７】
樹状細胞は、２種のシグナル、すなわち病原体の直接的な認識（特異的認識パターンを有する受容体による）、および感染の非直接的な認識（炎症性サイトカイン、細胞内化合物および特異的免疫応答による）に対して応答する。これらのシグナルに応答して、樹状細胞は活性化させられ、自己をＴ細胞促進剤へトランスフォームさせる成熟プロセスを開始する。ＤＣｓの成熟のために最も有効なシグナルのひとつは、Ｔｏｌｌ様受容体，ＴＬＲｓ（ＴＬＲ１〜９）のそれら各自のリガンドとの相互作用によってメディエートされる（ＫａｉｓｈｏおよびＡｋｉｒａ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，２００２，１５８９：１−１３によるレビュー）。
【０００８】
ＭＨＣクラスＩおよび／またはＩＩ分子への標的抗原ペプチドの最初の試みは、ＡＰＣｓの表面上にあるこれらの分子に直接結合することができる選択されたエピトープを含む合成ペプチドワクチンに基づいてなされた。ある場合には、これらのペプチドはマウスモデルでの腫瘍予防またはウイルス除去を達成している一方で、他の場合には、それらは耐性を誘導している。ヒトの異なるタイプのペプチドを用いた研究は、癌患者において僅かな臨床的成果がえらただけである。この低い免疫原性は以下の事実に起因し、その事実とは、抗原提示が非免疫原性の環境下で望まれる抗原（アネルギー）に対する応答を引き起こさないように、ペプチドは一般的に樹状細胞の成熟を活性化しない、という事実である。
【０００９】
他に、抗原ペプチドをＡＰＣの表面上の受容体に対して親和性を示す第二の化合物とともに含む組成物を用いて、ペプチドをＡＰＣに対し標的とするような試みがいくつか報告されている。この意味では、ＡＰＣに対し、免疫原性ペプチドを標的とするためにＴＬＲリガンドを用いることは、これまで報告されている。
【００１０】
ＴＬＲｓは、マクロファージ、樹状細胞、およびＢリンパ球等の他の細胞において発現される。いくつかのＴＬＲｓに対するリガンドも同定されている。これらのリガンドのほとんどは病原体に由来し、宿主では発見されておらず、これは、ＴＬＲｓが、侵入する微生物を検出するために不可欠であることを示している。ＴＬＲｓによるリガンドの認識は、炎症誘発サイトカインの産生を誘導することに基づく先天性免疫の素早い活性化と、共刺激分子の過剰調節とを引き起こす。活性化させられた先天性免疫は有効な適応免疫を引き起こす。
【００１１】
様々なＴＬＲリガンドが、抗原の能率を増大させるために使用されており、たとえばＥＤＡ（Ｌａｓａｒｔｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００７，スペイン特許ＥＳ２００５０１４１２）、フラジェリン（Ｃｕａｄｒｏｓ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００４  Ｍａｙ；７２：２８１０−６）またはＣｐＧｓ（Ｔｉｇｈｅ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１９３９）が含まれる。
【００１２】
ＷＯ２００５／０２５６１４は、ＴＬＲアゴニストをコードする核酸およびＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）をコードする核酸を含んでなるアジュバンド組成物を記載するが、この文献にはＧＭ−ＣＳＦがＴＬＲアゴニストとの融合タンパク質として提供され得るという言及はされていない。
【００１３】
ＷＯ２００４／０６３３１９は、抗原に対する免疫応答を増大させるためにＴＬＲアゴニストとＴＮＦ（腫瘍壊死因子）受容体アゴニストの双方を含んでなるアジュバンド組成物を記載するが、この文献ではこれら両成分は共有結合されていない。
【００１４】
ＷＯ０７／０４２５８３は、ＴＬＲ３アゴニスト（ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ）、ＣＤ４０アゴニストおよびＮＳ３ポリペプチドを含んでなるＣ型肝炎ウイルスに対する免疫刺激組成物を記載する。それは上記組成物の任意の要素間での共有結合複合体を教示しない。
【００１５】
ＷＯ０６／１３４１９０は、ＴＬＲ４に対してアフィニティーを有するフィブロネクチンフラグメントを含んでなる免疫刺激化合物を記載する。この文献はフィブロネクチンフラグメントと抗原との共有結合の可能性を述べている。しかしながら、この文献はＴＬＲ２またはＰＳＭを用いる類似化合物に言及していない。
【００１６】
ＷＯ２００７／１０３３２２は、免疫原性ポリペプチドと、ＴＬＲ５アゴニスト（フラジェリン）またはＴＬＲ２／６アゴニスト（Ｐａｍ３Ｃｙｓリポペプチド）のいずれかとを含む融合タンパク質、並びに免疫原性ペプチドに対する抗体反応を誘導するためのその使用を記載する。
【００１７】
ＷＯ２００６／０８３７０６は、ＴＬＲ２リガンドの同定のための、並びに一連の新しいＴＬＲ２リガンドだけでなく、これらのリガンドおよび防御免疫を生み出すために用いることができる抗原を含んでなる共有結合コンジュゲートの単離のための、スクリーニング方法を記載する。
【００１８】
しかしながら、依然、以下の能力を有する免疫原性組成物に対する希求が存在する：（ｉ）抗原由来Ｔリンパ球エピトープをＡＰＣｓ（またはＤＣｓ）へ輸送し、それにより、それらがＭＨＣクラスＩおよび／またはＩＩ分子にロードされるようにする、（ｉｉ）成熟シグナルが存在しない状態での、抗原のＤＣへの到達は、ヘルパーおよび細胞傷害性Ｔリンパ球の活性化ではなく耐性を引き起こすが故に、ＤＣに、その活性化を誘導するための適切なシグナルを伝達できる、そして（ｉｉｉ）キャリア自体に対する先行する免疫に関係なく、有効な免疫原性を導くことができる。
【発明の概要】
【００１９】
第一の側面において、本発明は、
（ｉ）フェノール可溶性モジュリン（ＰＳＭ）または機能的に同等なその変異体、および
（ｉｉ）一またはそれ以上の抗原ペプチド
を含んでなるコンジュゲート（複合体）であって、上記成分（ｉ）と（ｉｉ）が共有結合し、当該コンジュゲートが、前記一またはそれ以上の抗原ペプチドに対する細胞傷害応答を促進するもの、に関する。
【００２０】
さらなる側面において、本発明は、本発明によるコンジュゲートをコードする核酸配列を含んでなるポリヌクレオチドまたは遺伝子構築体、本発明のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築体を含んでなるベクター、および本発明のポリヌクレオチド、遺伝子構築体またはベクターを含んでなる宿主細胞に関する。
【００２１】
別の側面において、本発明は、以下の（ａ）、（ｂ）を、ともにまたは独立して含んでなる組成物に関し、該組成物は：
（ａ）本発明によるコンジュゲート、ポリヌクレオチド、遺伝子構築体、ベクター、または宿主細胞、および
（ｂ）以下の群から選ばれる第二成分；
（ｉ）一またはそれ以上のＴｏｌｌ様受容体アゴニスト、
（ｉｉ）一またはそれ以上の共刺激分子のアゴニスト抗体、
（ｉｉｉ）一またはそれ以上のサイトカイン、および
（ｉｖ）上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の化合物の任意の組合せ
を含んでなる。
【００２２】
別の側面において、本発明は、以下の工程（ｉ）、（ｉｉ）を含んでなる抗原に感作された抗原提示細胞を得るための方法に関し、該方法は：
（ｉ）抗原提示細胞を、本発明によるコンジュゲート、ポリヌクレオチド、遺伝子構築体、ベクター、宿主細胞、または組成物と接触させ、そして
（ｉｉ）前記の抗原に感作された抗原提示細胞を単離することを含んでなる。
【００２３】
別の側面において、本発明は、本発明の方法によって得られる抗原に感作された抗原提示細胞に関する。
【００２４】
別の側面において、本発明は、コンジュゲート、ポリヌクレオチド、遺伝子構築体、ベクター、宿主細胞、組成物、または抗原に感作された抗原提示細胞を含んでなる医薬組成物またはワクチンに関する。
【００２５】
別の側面において、本発明は、治療において使用するための、本発明によるコンジュゲート、ポリヌクレオチド、遺伝子構築体、ベクター、宿主細胞、組成物、医薬組成物、ワクチンまたは抗原提示細胞に関する。
【００２６】
さらに別の側面において、本発明は、感染性疾患、アレルギー性疾患、または腫瘍性疾患に対する細胞傷害応答を誘導する方法において用いられる本発明によるコンジュゲート、ポリヌクレオチド、遺伝子構築体、ベクター、宿主細胞、組成物、本発明の医薬組成物、ワクチンまたは抗原提示細胞に関する。
【００２７】
さらに別の側面において、本発明は、抗原提示細胞によって抗原ペプチドの提示を促進するための、もしくは抗原提示細胞の成熟を促進するための、インビトロでの方法における、本発明によるコンジュゲート、ポリヌクレオチド、遺伝子構築体、ベクター、宿主細胞、組成物、医薬組成物、ワクチンまたは抗原提示細胞の使用に関する。
【００２８】
別の側面において、本発明は、
（ｉ）フェノール可溶性モジュリン（ＰＳＭ）または機能的に同等なその変異体、および
（ｉｉ）生物活性化合物
を含んでなるコンジュゲートであって、上記成分（ｉ）と（ｉｉ）が共有結合されてなるもの、に関する。
【００２９】
別の側面において、本発明は、本発明の非免疫原性コンジュゲートをコードする核酸配列を含んでなるポリヌクレオチドまたは遺伝子構築体、本発明のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築体を含んでなるベクター、本発明のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築体を含んでなる宿主細胞に関する。
【００３０】
別の側面において、本発明は、本発明の非免疫原性コンジュゲート、ポリヌクレオチド、遺伝子構築体、ベクター、または宿主細胞および薬学的に許容できる担体を含んでなる医薬製剤に関する。
【００３１】
さらに別の側面において、本発明は、薬学治療において使用するための、本発明によるコンジュゲート、ポリヌクレオチド、遺伝子構築体、ベクター、宿主細胞、または医薬組成物に関する。
【００３２】
さらに別の側面において、本発明は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ｃ、Ｆ４／８、もしくはＣＤ１１７陽性細胞、またはこれらの組合せからなる群から選ばれる細胞の望ましくない増殖または望ましくない活性によって特徴づけられる疾患の治療において用いられる、本発明の非免疫原性コンジュゲート、ポリヌクレオチド、遺伝子構築体、ベクター、宿主細胞、または医薬組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１Ａ−Ｆ】マウス脾細胞に結合するＰＳＭペプチド  マウス脾細胞（パネルＡ、Ｂ、ＤおよびＥ）または骨髄由来樹状細胞（パネルＣおよびＦ）はグルタルアルデヒドで固定され、その後ＣＦＳＥ  αＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（パネルＡ、ＢおよびＣ）で、またはＣＦＳＥ  γＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（パネルＤ、ＥおよびＦ）で、インキュベートした（それらは、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドと共有結合したＰＳＭαまたはＰＳＭγペプチドを含み、アミノ末端をＣＦＳＥで標識された）。コントロールとして、複数の細胞も標識されたコントロールペプチドＣＦＳＥ−ＯＶＡ（２３５−２６４）（Ａ、Ｃ、ＤおよびＦ）で染色された。結合の特異性を検討するため、我々は競争剤としてＣＦＳＥで標識していないαＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ（Ｂ）またはγＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ（Ｄ）ペプチドの存在下または非存在下でＣＦＳＥ標識ペプチドのインキュベーションを行った。４℃で３０分後、ＰＢＳで２回洗浄し、細胞をフローサイトメトリーにより解析した。
【図１Ｇ−１】（Ｇ）ＣＦＳＥ  γＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを用いた、およびフィコエリトリンで標識された抗ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１９、Ｆ４８０またはＧＲ１抗体を用いた、全脾細胞の二重染色法。パネルＧの下側のヒストグラムはＣＦＳＥ  γＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドで染色された表面マーカーについての陽性細胞のパーセンテージを示す。
【図１Ｇ−２】図１Ｂの続きである。
【図２】ＰＳＭペプチドは骨髄由来樹状細胞の成熟を誘導し、抗原提示を向上させる。ＩＬ−１２タンパク質（ｐ４０）（Ａ）またはＴＮＦ−α（Ｂ）をコードするメッセンジャーＲＮＡの発現。骨髄由来樹状細胞は５０μＭの濃度で所望のペプチドと培養された。１４時間培養後、細胞のＲＮＡが精製され、その逆転写が行われた。ＩＬ１２−ｐ４０およびＴＮＦαのｍＲＮＡの発現がリアルタイムＰＣＲにより行われた。（Ｃ）樹状細胞の細胞表面上の成熟マーカーの発現。骨髄由来樹状細胞は所望のペプチドの存在下で（Ａ）に記載されたように培養された。４８時間培養後、所望のマーカーの発現が特異的抗体を用いたフローサイトメトリーにより解析された。（ＲＦＵ：相対蛍光強度）（Ｄ）抗原発現のインビトロアッセイ。骨髄由来樹状細胞が１０μＭの所望のペプチドの存在下または非存在下で培養された。４０時間後、細胞は洗浄され、異なる濃度で９６ウェルプレートに分けられ、１０５Ｔ細胞／ウェル（トランスジェニック  ＯＴ−１マウス（トリ卵白アルブミンのＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに対する特異的Ｔ細胞受容体を発現する）から得られた）の存在下でインキュベートされた。７２時間後、トリチウムチミジンが培養物に加えられ、６時間後、細胞が採取され、取り込まれたチミジンがシンチレーションカウンター（Ｔｏｐｃｏｕｎｔ，Ｐａｃｋａｒｄ社）で分析された。
【図３】ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに対して特異的なインビボ細胞応答の活性化。Ｃ５７ＢＬ／６は５ｎモルの所望のペプチドおよび５０μｇのｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃで免疫を与えられた。免疫付与後７日（ＡおよびＢ）または６０日（ＣおよびＤ）、マウスを犠牲死させ、免疫付与されたマウスの各グループにおいて、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドまたは相当するモジュリンペプチドに応答するＩＦＮγ産生細胞の数を定量するため、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（ＡおよびＣ）が行われた。（ＢおよびＤ）異なるペプチドで免疫付与した７日（Ｂ）または６０日（Ｄ）後のＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに対する特異的細胞傷害活性の測定。インビボlysis（インビボkilling）アッセイがマウスに０．２５μＭのＣＦＳＥまたは２．５μＭのＣＦＳＥおよびＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（１０μｇ／ｍｌ）で標識された脾細胞を静脈インジェクションすることによって行われた。１６時間後、マウスを犠牲死し、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドでパルスされた細胞溶解を定量するために脾細胞がフローサイトメトリーにより解析された。
【図４】細胞応答のインビボ活性において異なるＴＬＲリガンドを用いたモジュリンの相乗効果。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは５ｎモルの所望のペプチドで、および５０μｇの所望のＴＬＲリガンド：ＰＧＮ（ペプチドグリカン）、ｐＩＣ（ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ）、ＬＰＳ（リポ多糖）、ＥＤＡ（フィブロネクチンの細胞外ドメイン）、またはＣｐＧとの組合せで、免疫を与えられた。７日後、異なるペプチドで免疫付与後誘導されたＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに対する特異的細胞傷害活性が測定された。インビボlysis（インビボkilling）アッセイがマウスに０．２５μＭのＣＦＳＥまたは２．５μＭのＣＦＳＥおよびＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（１０μｇ／ｍｌ）で標識された脾細胞を静脈インジェクションすることによって行われた。１６時間後、マウスを犠牲死し、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドでパルスされた細胞溶解を定量するために脾細胞がフローサイトメトリーにより解析された。
【図５】腫瘍の増殖に対する防御。（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、５ｎモルのＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド、αＭｏｄ  ｐｌｕｓ  ＳＩＩＮＦＥＫＬ（共有結合していない）、αＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ、またはＳＩＩＮＦＥＫＬ−αＭｏｄ、これらのすべて、５０μｇのｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃとの組合せで、皮下に静脈に免疫された。ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃのみを受け取ったマウスのグループおよび他のグループはＰＢＳ（腫瘍成長コントロールとして）をインジェクトされた。（Ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、５ｎモルのＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを、またはγＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドをｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃと一緒に皮下に静脈免疫された。ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃのみを受け取ったマウスのグループおよび他のグループはＰＢＳ（腫瘍成長コントロールとして）をインジェクトされた。免疫付与７日後、５×１０５（Ａ）または７×１０５（Ｂ）ＥＧ７ＯＶＡ腫瘍細胞が皮下インジェクションされた。腫瘍成長の経過観察がゲージを用いてモニターされた。各処理に対するマウス生存のカプラン−マイヤープロットが示される。腫瘍攻撃に対する防御へのαＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ（Ａ）およびγＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ（Ｂ）の影響。
【図６Ａ】αＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドおよびｐｏｌｙ  Ｉにより確立されたＣＥＧ７ＯＶＡを有するマウスの治療。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５×１０５ＥＧ７ＯＶＡ腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍が直径５ｍｍに達したとき、それらはＰＢＳでまたは所望のペプチドおよびｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃで処理された。腫瘍成長の経過観察が、ゲージを用いてモニターされた。各処理に対するマウス生存のカプラン−マイヤープロットが示される。
【図６Ｂ】ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃと組み合わされたαＭｏｄ−Ｅ７（４９−５７）ペプチドによる免疫は、Ｅ７（４９−５７）ペプチドに対する特異的細胞傷害応答を誘導し、ＴＣ１皮下腫瘍を有するマウスを治療することができる。（Ａ）Ｃ５７Ｂ／６マウスは５０μｇのｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃと一緒に５ｎモルの所望のペプチドで免疫された。免疫７日後、細胞傷害性ペプチドＥ７（４９−５７）に対して誘導された応答がＩＦＮ−γを産生する細胞数を定量するためにＥＬＩＳＰＯＴで測定された。（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）Ｃ５７Ｂ／６マウスは５×１０５ＴＣ−１腫瘍細胞（ＨＰＶ−１６  Ｅ７タンパク質を発現する）を皮下インジェクションされた。２５日後、腫瘍が直径８ｍｍになったとき、マウスは静脈内をＰＢＳ（Ｂ）で、Ｅ７（４９−５７）ペプチド＋５０μｇ／ｍｌのｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ（Ｃ）で、またはαＭｏｄ−Ｅ７（４９−５７）ペプチド＋５０μｇ／ｍｌのｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ（Ｄ）で、処理された。７日後、マウスは同じ免疫原を用いた二次免疫付与により再び免疫付与された。２つの直交する直径の平均として示される、腫瘍の大きさが通常に測定された。グループごとの全マウスの数に対する腫瘍のないマウスの数が治療ごとに含まれる。
【図７】ｐ１０７３に結合したα、γまたはδ−由来モジュリンペプチドを用いることによる、Ｃ型肝炎ＮＳ３ペプチドｐ１０７３に対するＴ細胞応答のインビボ誘導  Ｃ５７Ｂ／６は、５ｎモルの所望のペプチドおよび５０μｇのｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃで免疫された。７日後、マウスは犠牲死され、Ｃ型肝炎ＮＳ３タンパク質由来のペプチドｐ１０７３（１０７３）に対して特異的なＩＦＮγ産生細胞の存在を測定するために、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（Ａ）が行われた。インビボキリングアッセイが、０．２５μＭのＣＦＳＥで、または２．５μＭのＣＦＳＥおよびペプチドｐ１０７３（１０μｇ／ｍｌ）で標識された脾臓細胞を用いて行われた。
【図８】ＴＬＲ２  ＫＯマウスのモジュリン由来ペプチドによって誘導された細胞応答の活性化。Ｃ５７Ｂ／６野生型マウスまたはＴＬＲ２  ＫＯマウスが、５ｎモルの所望のペプチドにより、および５０μｇのｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃと組み合わせて免疫された。免疫７日後、上記動物は犠牲死され、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに応答するＩＦＮγ産生細胞の数を定量するために、ＥＬＩＳＰＯＴが行われた。（Ｂ）免疫後異なるペプチドで誘導されるＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに対する特異的細胞傷害活性の測定。インビボ溶解（インビボキリング）アッセイが、０．２５μＭのＣＦＳＥで、または２．５μＭのＣＦＳＥおよびＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（１０μｇ／ｍｌ）で標識された脾細胞をマウスに静脈インジェクションすることによって行われた。１６時間後、マウスは犠牲死され、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドでパルス細胞溶解を定量するために、脾細胞がフローサイトメトリーにより解析された。
【図９】ＰＳＭペプチドはＴＬＲ２ノックアウトマウス由来のマウス脾細胞と結合する。ＴＬＲ  ２ＫＯマウス由来のマウス脾細胞をグルタルアルデヒドで固定し、その後ＣＦＳＥ  αＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドで、またはＣＦＳＥ  γＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドで、インキュベートした。コントロールとして、複数の細胞も標識されたコントロールペプチドＣＦＳＥ−ＯＶＡ（２３５−２６４）で染色されたか、または未処理（網掛けグレーのヒストグラム）とした。４℃、３０分のインキュベーション、およびＰＢＳで２回洗浄後、細胞はフローサイトメトリーにより解析された。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明の発明者らは、ＰＳＭペプチドが、抗原を抗原提示細胞へ運び、その成熟を活性化し、抗原提示を改善し、そしてその結果、抗原に対する免疫細胞応答の活性化を促進する能力を有することを示した。この戦略は、細胞傷害応答を誘導すること、およびＣ５７ＢＬ／６マウスを腫瘍の増殖から守ることにおいて効果があることが立証された。しかし、モジュリン由来ペプチドの作用機序は、ＴＬＲ２とは無関係であることが観察された。事実、抗原に結合したαまたはγモジュリンを含むペプチドでのマウスの免疫は、ＴＬＲ２受容体ノックアウトマウスにおいてさえ強い細胞応答を誘導した。
【００３５】
Ｉ．本発明によるコンジュゲート
本発明の発明者らは、フェノール可溶性モジュリンおよび抗原ペプチドを含んでなる共有結合コンジュゲートが、樹状細胞の成熟、および当該ＰＳＭｓに共有結合しているペプチドの、樹状細胞によるペプチド提示を促進する能力を有するものであることを明らかにした。
【００３６】
本発明の実施例２が示すように、ＰＳＭおよびペプチドを含んでなる融合タンパク質は、樹状細胞の成熟および抗原提示を、抗原ペプチドのみで観察されるそれらより高い程度まで促進している。さらに、本発明の実施例３は、コンジュゲートの投与は強力で長期間の細胞傷害応答を導き、これはＰＳＭと抗原ペプチドとの非共有結合混合物の組成物の投与によっては観察されないことを示している。
【００３７】
したがって、第一の側面において、本発明は、
（ｉ）フェノール可溶性モジュリン（ＰＳＭ）または機能的に同等なその変異体、および
（ｉｉ）一またはそれ以上の抗原ペプチド
を含んでなるコンジュゲートであって、上記成分（ｉ）と（ｉｉ）が共有結合し、当該コンジュゲートが、前記一またはそれ以上の抗原ペプチドに対する細胞傷害応答を促進するものに関する。
【００３８】
Ａ．フェノール可溶性モジュリン
本発明によるコンジュゲートの第一の成分はフェノール可溶性モジュリンまたは機能的に同等なその変異体に相当する。本明細書において「フェノール可溶性モジュリン」および「ＰＳＭ」という用語は、明確に区別しないで使用され、種々のブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、特にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、によって分泌される細胞傷害性ペプチドファミリーの任意のメンバーに関連しており、並びにホットフェノールで抽出された場合有機相に分離させられる能力によって特徴づけられる。
【００３９】
ＰＳＭは、もともとはＭｅｈｌｉｎ等（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９９，１８９：９０７−９１７）によってＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ細菌から得られた炎症活性を有するポリペプチド複合体として同定され、後にＴＬＲ２シグナル経路を活性化することができるものとして同定された（Ｈａｊｊａｒ  ＡＭ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６６：１５−１９）。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ細菌は他のブドウ球菌に比べると重症ではないが、この細菌による感染も敗血症を引き起こし得る。当該細菌は種々のペプチドを放出し、それらはそれらのフェノールへの溶解性のゆえ、一般にフェノール可溶性モジュリン（ＰＳＭ）として知られている。ＰＳＭは、２２乃至５４の間のアミノ酸からなる低分子タンパク質であるＰＳＭα、ＰＳＭβ、ＰＳＭδおよびＰＳＭγという少なくとも４つのコンポーネントを有する。Ｓ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＰＳＭは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６サイトカインの産生を誘導し、マクロファージにおけるＮＦ−κβ転写因子を活性化するということが記載されている（Ｌｉｌｅｓ  ＷＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．７０：９６−１０２）。
【００４０】
本発明によるコンジュゲートにおいて使用のための好ましいモジュリンは、表１に示される通りである。
【表１】
2012510284.tif 000002
【００４１】
最も好ましくは、本発明によるコンジュゲートにおいて使用されるＰＳＭは、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、１３および１４に記載されたとおりのα−、γ−およびδ−モジュリンを含む。
【００４２】
ＰＳＭの「機能的に同等な変異体」という語句は、ＰＳＭと実質的に同一の生物学的活性を示す化合物をいう。任意の化合物が機能的に同等な当該ＰＳＭの変異体であるかどうかを決定するための適切な機能アッセイは、たとえば、ＰＳＭがＴＨＰ−１細胞のＨＩＶ−１  ＬＴＲを活性化する能力だけでなく、ＰＳＭがＴＨＰ−１細胞によるＴＮＦ−α分泌を促進する能力をも基礎とするアッセイであり、双方の能力はＭｅｈｌｉｎ等（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９９，１８９：９０７−９１７）により記載されており、Ｈａｊｊａｒ等（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００１，１６６：１５−１９）により記載されているような、ＴＬＲ２を発現する細胞（一時的にＴＬＲ２をトランスフェクトされる細胞または構成的にＴＬＲ２を発現する細胞のいずれか）のＮＦ−κＢ活性を促進する能力を基礎とするアッセイである。
【００４３】
本発明によるコンジュゲートの成分（ｉ）として適切な関連分子は、前記のＰＳＭと実質的に相同な配列の分子も含む。本明細書において「実質的に相同な」という語句は、上記した任意のヌクレオチド配列に関する。そのヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列に関して少なくとも６０％の、有利には少なくとも７０％の、好ましくは少なくとも８５％の、より好ましくは少なくとも９５％の同一性の程度を有する。本発明のヌクレオチド配列と実質的に相同なヌクレオチド配列は、一般的には前記ヌクレオチド配列中に含まれている情報に基づく本発明のポリペプチドの生成生物から単離され得る。または、それはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−１４に示されるＤＮＡ配列に基づいて、たとえば、同類または非同類置換によって構成される。可能性がある改変の他の例としては、当該配列中への１以上のヌクレオチドの挿入、当該配列の任意の末端への１以上のヌクレオチドの付加、または当該配列の任意の末端もしくは内部における１以上のヌクレオチドの欠失が挙げられる。２つのポリヌクレオチド間の同一性の程度はコンピューターアルゴリズムおよび当業者に広く知られている方法を用いて決定される。２つのアミノ酸配列の間の同一性は好ましくはＢＬＡＳＴＮアルゴリズム[ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）］を用いることにより決定される。
【００４４】
適切なペプチドは表２に示される。本発明で使用される好ましいＰＳＭホモログは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓから単離されるデルタ溶解素およびデルタ−溶血毒素を含む。
【００４５】
好ましい実施形態において、本発明によるコンジュゲートの成分（ｉ）はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至２６の群から選ばれるＰＳＭである。
【表２】
2012510284.tif 000003
【００４６】
Ｂ．抗原ペプチド
本発明によるコンジュゲートの成分（ｉｉ）は一またはそれ以上の抗原ペプチドである。本明細書において「抗原ペプチド」という語句は、腫瘍または感染性疾患を抱える哺乳類の免疫系を刺激することにより、腫瘍を攻撃させ、およびその成長を阻害させ、または当該疾患を引き起こす病原体を破壊させるものとして理解される。それゆえ、本発明で使用される抗原は、治療される動物において発見される特異的疾患に適合するものとされる。
【００４７】
一般的に、ペプチド抗原はＰＳＭに対して異種（非相同）である。すなわち、ある状況では、たとえばＰＳＭタンパク質そのものに対する応答を誘導するために、同一のＰＳＭの２つのコピーを含んでなる融合タンパク質を用いることが望ましいけれども、ペプチド抗原はＰＳＭタンパク質そのものまたはそのフラグメント（断片）ではない。抗原はＰＳＭとして同一の生物から得られうる。抗原がＰＳＭを産生する種に由来する場合は、ＰＳＭそのものに対して引き起こされる任意の免疫応答が当該生物に対して与えられている防御に貢献するであろうから、当該種由来のＰＳＭを使用することが望ましいであろう。たとえば、抗原がＳ．ａｕｒｅｕｓに由来する場合は、ＰＳＭもＳ．ａｕｒｅｕｓに由来することが好ましい。
【００４８】
一またはそれ以上の抗原は、完全なタンパク質、タンパク質の単離されたドメイン、タンパク質のペプチドフラグメント（断片）、または多数のエピトープ（たとえば、５から１００までの異なるエピトープ）を含んでなるポリエピトピックな融合タンパク質であることが好ましいであろう。ポリペプチドは随意に付加的なセグメントを含むことができる。たとえば、少なくとも４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、９０、または実に１００以上のセグメントを含むことができ、各セグメントは病原体の、および／または天然に存在する腫瘍抗原の、天然に存在する、他のセグメントが由来するタンパク質と同一もしくは異なることができるタンパク質の一部である。これらのセグメントの各々は少なくとも８アミノ酸長であることができ、他のセグメントのエピトープとは異なる少なくとも１つ（好ましくは２以上）のエピトープを含む。ハイブリッドポリペプチドにおけるセグメントの少なくとも１つ（好ましくは、少なくとも２つまたは３つ）は、たとえば３、４、５、６、７、または実に１０以上のエピトープ、特にＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ結合エピトープを含むことができる。当該セグメントの２、３以上はハイブリッドポリペプチドにおいて連続していることができる。すなわち、それらはそれらの間にスペーサーがない状態で、端と端で結合している。あるいは、任意の２つの隣接するセグメントはスペーサーアミノ酸またはスペーサーペプチドにより連結していることができる。
【００４９】
抗原は、たとえばウイルス抗原、細菌性抗原、真菌抗原、分化抗原、腫瘍抗原、胚抗原、癌遺伝子および突然変異した癌抑制遺伝子の抗原、染色体転座の結果として生ずるユニーク腫瘍抗原、および／またはその誘導体であり得るがこれらに限定されない。
【００５０】
ウイルス抗原
ウイルスに対する免疫応答を引き出すことができるウイルス抗原は、ＨＩＶ−１抗原（ｔａｔ、ｎｅｆ、ｇｐ１２０もしくはｇｐ１６０、ｇｐ４０、ｐ２４、ｇａｇ、ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｒｅｖ等）、ヒトヘルペスウイルス（ｇＨ、ｇＬ、ｇＭ、ｇＢ、ｇＣ、ｇＫ、ｇＥもしくはｇＤまたはこれらの誘導体等）、ＨＳＶ１もしくはＨＳＶ２由来のＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ＩＣＰ４、ＩＣＰ３６等の前初期タンパク質、特にヒトサイトメガロウイルス（ｇＢまたはその誘導体等）、エプスタイン・バー・ウイルス（ｇｐ３５０またはその誘導体等）、水痘帯状疱疹ウイルス（ｇｐ１、ＩＩ、Ｉ１１およびＩＥ６３等）、Ｂ型肝炎ウイルス（たとえば、Ｂ型肝炎表面抗原または肝炎コア抗原）、Ｃ型肝炎ウイルス（たとえば、コア、Ｅ１、ＮＳ３またはＮＳ５抗原）等の肝炎ウイルス由来、呼吸器合胞体ウイルス（ＦおよびＧタンパク質またはそれらの誘導体等）等のパラミクソウイルス由来、パラインフルエンザウイルス由来、風疹ウイルス（タンパク質Ｅ１およびＥ２等）、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ヒトパピローマ（乳頭腫）ウイルス（たとえば、ＨＰＶ６、１１、１６、１８；たとえば、ＬＩ、Ｌ２、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７）、フラビウイルス（たとえば、黄熱病ウイルス、デングウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス）由来、またはインフルエンザウイルス細胞（ＨＡ、ＮＰ、ＮＡもしくはＭタンパク質またはこれらの組合せ等）、ロタウイルス抗原（ＶＰ７ｓｃおよび他のロタウイルス性成分等）などを含む（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｓ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．Ｎ．  ａｎｄ  Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１）ｆｏｒ  ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｅｘａｍｐｌｅｓ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ａｎｔｉｇｅｎｓ参照）。
【００５１】
好ましい実施形態において、抗原ペプチドはＣ型肝炎に由来し、より好ましい実施形態において、ペプチドはＣ型肝炎ＮＳ３タンパク質に由来する。より好ましい実施形態において、抗原ペプチドはＨＬＡ−Ａ２拘束性ＮＳ３ペプチドのアミノ酸１０７３−１０８１に相当し、その配列はＣＶＮＧＶＣＷＴＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）である。
【００５２】
好ましい実施形態において、抗原ペプチドはヒトパピローマウイルスに由来し、より好ましい実施形態において、ヒトパピローマウイルス１６に由来し、さらに好ましい実施形態において、ペプチドはヒトパピローマウイルスＥ７タンパク質に由来し、より好ましい実施形態において、上記ペプチドは配列ＲＡＨＹＮＩＶＴＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）を含んでなる。
【００５３】
細菌性抗原
本発明は細菌性抗原の使用を検討する。たとえば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属のＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａおよびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓなど由来の抗原（トランスフェリン結合タンパク質、ラクトフェリン結合タンパク質、ＰｉＩＣおよびアドヒーシン）；Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の抗原（Ｍタンパク質またはそのフラグメントおよびＣ５Ａプロテアーゼ等）；Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ；Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉ；Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓとしても知られているＭｏｒａｘｅｌｌａ属のＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓなど由来の抗原（高および低分子量アドヒーシンおよびインベーシン等）；Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属のＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（たとえば、パラ百日咳菌）およびＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａなど由来の抗原（パータクチン、百日咳毒素またはその誘導体、線維状ヘマグルチニン、アデニレートシクラーゼ、線毛等）；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓなど；Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ属のＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａなど由来の抗原（たとえば、ＥＳＡＴ６、抗原８５Ａ、−Ｂまたは−Ｃ、ＭＰＴ４４、ＭＰＴ５９、ＭＰＴ４５、ＨＳＰＩＯ、ＨＳＰ６５、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ７５、ＨＳＰ９０、ＰＰＤ  １９ｋＤａ［Ｒｖ３７６３］、ＰＰＤ  ３８ｋＤａ［Ｒｖ０９３４］）；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属のエンテロトキシン産生Ｅ．ｃｏｌｉなど由来の抗原（たとえば、コロニー形成因子、易熱性毒素またはその誘導体、耐熱性毒素またはその誘導体）；腸管出血性Ｅ．ｃｏｌｉおよび病原性Ｅ．ｃｏｌｉ由来の抗原（たとえば、志賀毒素様毒素またはその誘導体）；Ｖｉｂｒｉｏ属のＶ．ｃｈｏｌｅｒａなど由来の抗原（たとえば、コレラ毒素またはその誘導体）；Ｓｈｉｇｅｌｌａ属のＳ．ｓｏｎｎｅｉ、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉｉなど；Ｙｅｒｓｉｎｉａ属のＹ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａなど由来の抗原（たとえば、Ｙｏｐタンパク質）；Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ、Ｙ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属のＣ．ｊｅｊｕｎｉなど由来の抗原（たとえば、トキシン、アドヒーシンおよびインベーシン）；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属のＳ．ｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓなど；Ｌｉｓｔｅｒｉａ属のＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓなど；Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ属のＨ．ｐｙｌｏｒｉなど由来の抗原（たとえば、ウレアーゼ、カタラーゼ、空胞化毒素）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなど；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属のＳ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓなど；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属のＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍなど；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属のＣ．ｔｅｔａｎｉなど由来の抗原（たとえば、破傷風毒素およびその誘導体）；Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ由来の抗原（たとえば、ボツリヌス毒素およびその誘導体）；Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の抗原（たとえば、クロストリジウム毒素ＡおよびＢ並びにその誘導体）；Ｂａｃｉｌｌｕｓ属のＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓなど由来の抗原（たとえば、炭疽毒素およびその誘導体）；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属のＣ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅなど由来の抗原（たとえば、ジフテリア毒素およびその誘導体）；Ｂｏｒｒｅｌｉａ属のＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉなど由来の抗原（たとえば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）；Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ由来の抗原（たとえば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ由来の抗原（たとえば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）；Ｂ．ａｎｄｅｒｓｏｎｆｉ由来の抗原（たとえば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）；Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉ；Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ属のＥ．ｅｑｕｉおよびヒト顆粒球エーリキア症の病原体；Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ属のＲ．ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉなど；Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓなど由来の抗原（たとえば、ＭＯＭＰ、ヘパリン結合タンパク質）；Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原（たとえば、ＭＯＭＰ、ヘパリン結合タンパク質）；Ｃ．Ｐｓｉｔｔａｃｉ；Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ属のＬ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓなど；Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属のＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍなど由来の抗原（たとえば、希少外膜タンパク質）；Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｔ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ由来の抗原；Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属のＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍなど；Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ属およびＴ．ｇｏｎｄｉｉ由来の抗原（たとえば、ＳＡＧ２、ＳＡＧＳ、Ｔｇ３４）；Ｅｎｔａｍｏｅｂａ属のＥ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａなど；Ｂａｂｅｓｉａ属のＢ．ｍｉｃｒｏｔｉなど；Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ属のＴ．ｃｒｕｚｉなど；Ｇｉａｒｄｉａ属のＧ．ｌａｍｂｌｉａなど；Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ属のＬ．ｍａｊｏｒなど；Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ属のＰ．ｃａｒｉｎｉｉなど；Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ属のＴ．ｖａｇｉｎａｌｉｓなど；Ｓｃｈｉｓｏｓｔｏｍａ属のＳ．ｍａｎｓｏｎｉなど、またはＣａｎｄｉｄａ属のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓなど酵母由来の抗原；Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属のＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓなど；Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来の抗原（Ｒｖ２５５７、Ｒｖ２５５８、ＲＰＦｓ：Ｒｖ０８３７ｃ、Ｒｖ１８８４ｃ、Ｒｖ２３８９ｃ、Ｒｖ２４５０、Ｒｖ１００９、ａｃｅＡ（Ｒｖ０４６７）、ＰｓｔＳ１（Ｒｖ０９３２）、ＳｏｄＡ（Ｒｖ３８４６）、Ｒｖ２０３１ｃ  １６ｋＤａｌ、Ｔｂ  Ｒａ１２、Ｔｂ  Ｈ９、Ｔｂ  Ｒａ３５、Ｔｂ３８−１、Ｅｒｄ１４、ＤＰＶ、ＭＴＩ、ＭＳＬ、ｍＴＴＣ２、およびｈＴＣＣ１等）；Ｃｈｌａｍｙｄｉａ(たとえば、高分子量タンパク質（ＨＷＭＰ）、ＯＲＦ３（ＥＰ  ３６６４１２）、および推定膜タンパク質（Ｐｍｐｓ）由来の抗原；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅなど由来の抗原（ＰｓａＡ、ＰｓｐＡ、ストレプトリジン、コリン結合タンパク質、タンパク質抗原  肺炎球菌溶血素、および変異により無毒化されたその誘導体）；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属のＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｔｙｐｅ  Ｂ由来の抗原（たとえば、ＰＲＰおよびそのコンジュゲート）；分類できないＨ．ｉｎｆｌｕｅｎ��ａｅ由来の抗原（ＯＭＰ２６、高分子量アドヒーシン、Ｐ５、Ｐ６、タンパク質Ｄおよびリポタンパク質Ｄ、並びにフィンブリンおよびフィンブリン由来ペプチド、またはこれらのマルチコピー変異体もしくは融合タンパク質等）；Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ由来の抗原（ＲＴＳ．Ｓ、ＴＲＡＰ、ＭＳＰ１、ＡＭＡ１、ＭＳＰ３、ＥＢＡ、ＧＬＵＲＰ、ＲＡＰ１、ＲＡＰ２、セクエストリン、ＰｆＥＭＰ１、Ｐｆ３３２、ＬＳＡ１、ＬＳＡ３、ＳＴＡＲＰ、ＳＡＬＳＡ、ＰｆＥＸＰ１、Ｐｆｓ２５、Ｐｆｓ２８、ＰＦＳ２７／２５、Ｐｆｓ１６、Ｐｆｓ４８／４５、Ｐｆｓ２３０およびこれらのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ属のアナログ等）である。
【００５４】
真菌抗原
本発明によるコンジュゲートおよび方法とともに使用するための真菌抗原としては、たとえば、Ｃａｎｄｉｄａ（カンジダ）真菌抗原成分；ヒートショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０）および他のヒストプラスマ真菌抗原成分等のｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ（ヒストプラスマ）真菌抗原；莢膜多糖類および他のクリプトコッカス真菌抗原等のｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃａｌ（クリプトコッカス）真菌抗原；小球抗原および他のコクシディオイデス真菌抗原成分等のｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ（コクシディオイデス）真菌抗原；およびトリコフィトン（白癬菌）および他の白癬真菌抗原成分等のｔｉｎｅａ（白癬）真菌抗原が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５５】
原生動物性および他の寄生性抗原
原虫抗原は、メロゾイト表面抗原等のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ抗原、スポロゾイト（種虫）表面抗原、スポロゾイト周囲抗原、生殖母細胞／配偶子表面抗原、血液期抗原ｐｆ、５５／ＲＥＳＡおよび他のプラスモジウム抗原成分；ＳＡＧ−Ｉ等のトキソプラズマ抗原、ｐ３０および他のトキソプラズマ抗原成分；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ等のジストマ（吸虫）抗原、パラミオシンおよび他のジストマ抗原成分；森林型熱帯リーシュマニア、並びにｇｐ６３、リポホスホグリカンおよびその関連タンパク質等の他のリーシュマニア抗原成分、他のリーシュマニア抗原成分；７５−７７ｋＤａ抗原等のＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ抗原、５６ｋＤａ抗原および他のトリパノソーマ抗原成分；を含むがこれらに限定されない。
【００５６】
アレルゲンおよび環境抗原
抗原はアレルゲンまたは環境抗原であることができ、たとえば、花粉アレルゲン（樹木、ハーブ、雑草および草の花粉アレルゲン）、昆虫アレルゲン（吸入抗原、唾液および毒アレルゲン）、動物の毛髪およびふけのアレルゲン、および食物アレルゲン等の天然に存在するアレルゲン由来の抗原であることができるが、これらに限定されない。樹木、草およびハーブ由来の重要な花粉アレルゲンは、ブナ目、モクセイ目、ピノール（Ｐｉｎｏｌｅｓ）、スズカケノキ科という分類上の目を起源とし、樺（カバノキ属）、ハンの木（ハンノキ属）、ハシバミ（ハシバミ属）、シデ（シデ属）、オリーブ（オリーブ属）、ヒマラヤスギ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａａｎｄビャクシン属）、スズカケノキ（プラタナス）、ドクムギ属の草、フレウム属、イチゴツナギ類、Ｃｙｎｏｄｏｎ、Ｄａｃｔｙｌｉｓ、ホルクス属、クサヨシ属、ライムギ属、およびモロコシ属を含むイネ目の目、とりわけブタクサ属のハーブ、ヨモギ属、およびパリエタリア属を含むキク目、イラクサ目の目が含まれる。使用され得る他のアレルゲン抗原は、ＤｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓおよびＥｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ属のイエダニ、チリダニ由来のアレルゲン；倉庫ダニ（storage  mite）、たとえば、レピトグリフィス（Ｌｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｙｓ）、グリシファガス（Ｇｌｙｃｙｐｈａｇｕｓ）、及びペリプラネラ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｒａ）；ゴキブリ、蚊、ノミ由来のアレルゲン、たとえば、ブラテラ（Ｂｌａｔｅｌｌａ）、ペリプラネタ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ）、キロノムス（Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ）、及びクテノセッファィデス（Ｃｔｅｎｏｃｅｐｐｈａｌｉｄｅｓ）；ネコ、イヌ、ウマ、トリ等の哺乳類由来のアレルゲン抗原；ハナバチ（Ａｐｉｄａｅ上科）、カリバチ、およびアリ（Ｆｏｒｍｉｃｏｉｄａｅ上科）等の膜翅目という分類学上の目に由来する昆虫に刺されたり噛まれたりすることに起因する毒アレルゲンを含む。使用され得るさらなる他のアレルゲン抗原は、たとえばアルタナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）及びクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属由来の真菌類由来の吸入アレルゲンを含む。
【００５７】
腫瘍抗原
腫瘍抗原の例としては、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、ジペプチジルペプチダーゼ  ＩＶ（ＤＰＰ  ＩＶ）、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−００１７−１Ａ／ＧＡ７３３、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）およびその抗原エピトープ  ＣＡＰ−１およびＣＡＰ−２、ｅｔｖ６、ａｍｌｌ（急性混合型白血病）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）およびその抗原エピトープ  ＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２およびＰＳＡ−３、、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３−ζ鎖、ＭＡＧＥ−ファミリー腫瘍抗原（たとえば、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＭＡＧＥ−Ｃ３、ＭＡＧＥ−Ｃ４、ＭＡＧＥ−Ｃ５）、腫瘍抗原のＧＡＧＥ−ファミリー（たとえば、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８、ＧＡＧＥ−９）、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＮＡＧ、ＧｎＴ−Ｖ、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ムチン（ＭＵＣ）ファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、ＲＣＡＳ１、α−フェトプロテイン、Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、１３−カテニン、γ−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１００Ｐｍｅ１１１７、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｃｄｃ２７、大腸腺腫症タンパク質（ＡＰＣ）、フォドリン、コネキシン３７、Ｉｇ−イディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２およびＧＤ２ガングリオシド、ヒトパピローマウイルスタンパク等のウイルス産物、腫瘍抗原のＳｍａｄファミリー、１ｍｐ−１、Ｐ１Ａ、ＥＢＶエンコード核抗原（ＥＢＮＡ）−１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ４０）、ＳＳＸ−３、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１およびＣＴ−７、およびｃ-ｅｒｂＢ−２、急性リンパ性白血病（ｅｔｖ６、ａｍｌｌ、シクロフィリンｂ）、Ｂ細胞リンパ腫（Ｉｇ−イディオタイプ）、神経膠腫（Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、１３−カテニン、７−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ）、膀胱癌（ｐ２１ｒａｓ）、胆道癌（ｐ２１ｒａｓ）、乳癌（ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２）、子宮頸癌（ｐ５３、ｐ２１ｒａｓ）、結腸癌（ｐ２１ｒａｓ,ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ＭＵＣファミリー）、結腸直腸癌（結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−００１７−１Ａ／ＧＡ７３３、ＡＰＣ）、絨毛癌（ＣＥＡ）、上皮細胞癌（シクロフィリンｂ）、胃癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ｇａ７３３糖タンパク）、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫（ｌｍｐ−１，  ＥＢＮＡ−１）、肺癌（ＣＥＡ、ＭＡＧＥ−３、ＮＹ−ＥＳＯ−１）、リンパ系細胞白血病（シクロフィリンｂ）、黒色腫（ｐ１５タンパク質、ｇｐ７５、腫瘍胎児抗原、ＧＭ２およびＧＤ２ガングリオシド、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲ��−１、ｃｄｃ２７、ＭＡＧＥ−３、ｐ２１ｒａｓ、ｇｐ１００Ｐｍｅ１１１７）、骨髄腫（ＭＵＣファミリー、ｐ２１ｒａｓ）、非小細胞肺癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２）、鼻咽腔癌（ｌｍｐ−１、ＥＢＮＡ−１）、卵巣癌（ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２）、前立腺癌（前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）並びにその抗原エピトープＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２およびＰＳＡ−３、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ｇａ７３３糖タンパク）、腎（臓）癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２）、頸部および食道扁平上皮細胞癌（ヒトパピローマウイルスタンパク等のウイルス産物）、精巣癌（ＮＹ−ＥＳ０−１）、およびＴ細胞白血病（ＨＴＬＶ−１エピトープ）が挙げられる。
【００５８】
成分（ｉ）および（ｉｉ）を連結させるリンカー
本発明によるコンジュゲートは、第一成分と第二成分を連結させるリンカーを含んでなることができる。本発明によれば、非天然中間アミノ酸配列はドメイン間のヒンジ領域として作用し、ドメインが個々のドメインの３次元構造を維持しつつも互いに独立に動くことを可能にする。この意味において、本発明の好ましい非天然中間アミノ酸配列は、当該動作を可能にする構造的柔軟性によって特徴づけられるヒンジ領域である。本発明の成分（ｉ）および（ｉｉ）を連結するために使用することができる非制限的で典型的なリンカーには非天然フレキシブルリンカーが含まれる。好ましい実施形態において、上記フレキシブルリンカーは、２０以下のアミノ酸長のふれきしる部リンカーペプチドである。さらに好ましい実施形態において、当該リンカーペプチドは、グリシン、セリン、アラニンおよびスレオニンからなる群から選ばれる２以上のアミノ酸を含んでなる。本発明の好ましい実施形態において、上記フレキシブルリンカーはポリグリシンリンカーである。リンカー／スペーサー配列の可能性のある例としては、ＳＧＧＴＳＧＳＴＳＧＴＧＳＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）、ＡＧＳＳＴＧＳＳＴＧＰＧＳＴＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）またはＧＧＳＧＧＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）が挙げられる。これらの配列はデザインコイルドヘリックスを他のタンパクドメインへ結合させるために使用されている（Ｍｕｌｌｅｒ，  Ｋ．Ｍ．，  Ａｒｎｄｔ，  Ｋ．Ｍ．  ａｎｄ  Ａｌｂｅｒ，Ｔ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０００，３２８：２６１−２８１）。上記リンカーはアミノ酸配列ＧＧＧＶＥＧＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）を含む／からなることが好ましい。
【００５９】
リンカー領域の効果は、成分（ｉ）と成分（ｉｉ）との間にスペースを提供しており、その結果、成分（ｉ）の第二の構造が成分（ｉｉ）の存在によって影響を受けることはなく、逆もまた同じである。スペーサーはペプチドの性質を有することが好ましい。リンカーペプチドは好ましくは少なくとも２アミノ酸、少なくとも３アミノ酸、少なくとも５アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも３０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも７０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも９０アミノ酸、または約１００アミノ酸を含んでなる。
【００６０】
リンカーは、共有結合および好ましくはスペーサーが実質的に非免疫原性であり、および／またはシステイン残基を含んでいないことによって、本発明によるコンジュゲートの２成分に隣接する成分に結合することができる。同様な方法で、スペーサーの３次元構造は直鎖状または実質的に直鎖状であることが好ましい。
【００６１】
スペーサーまたはリンカーペプチドの好ましい例としては、結合させられたタンパク質の機能を実質的に損なわせることなしに、または、少なくとも結合させられたタンパク質のひとつの機能を実質的に損なわせることなしに、タンパク質を結合させるために使用されているものが挙げられる。より好ましくは、スペーサーまたはリンカーはコイルドヘリックスを持つ構造を含んでなるタンパク質を結合させるために使用されている。
【００６２】
リンカーは、βシートを形成する５３−５６アミノ酸残基からなるテトラネクチン、およびターンを形成する５７−５９残基からなるテトラネクチンを含むことができる（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｂ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１２：３８８−３９６，１９９７）。そのセグメントの配列はＧＴＫＶＨＭＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）である。このリンカーは、それがネイティブテトラネクチン中に存在している場合、それがＣＲＤドメイン（炭化水素認識ドメイン）を有する三量体ドメインに結合し、ゆえに概してそれが三量体ドメインを他のドメインに連結させるために適切であるという利点を有する。さらに、その結果として得られた構造体は、リンカーをもたない構造体ほど免疫原性を示さないことが期待されている。
【００６３】
あるいは、ヒトフィブロネクチン由来の連結ストランド３由来のサブ配列がアミノ酸１９９２−２１０２（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ、登録番号Ｐ０２７５１）に相当するリンカーとして選択され得る。アミノ酸番号２０３７−２０４９に相当するサブ配列ＰＧＴＳＧＱＱＰＳＶＧＱＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）が好ましく使用され、当該サブ配列の中のアミノ酸番号２０３８−２０４２に相当するサブ配列フラグメントＧＴＳＧＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）がより好ましい。この構造体は、フィブロネクチンは血漿中高濃度で存在しているので、タンパクを分解的に切断する傾向がそれほど無く、免疫原性もそれほど強くないという利点を有している。
【００６４】
あるいは、適切なペプチドリンカーは、マウスＩｇＧ３の上流ヒンジ領域の１０アミノ酸残基配列に基づくことができる。このペプチド（ＰＫＰＳＴＰＰＧＳＳ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３４）はコイルドへリックスによって二量化された抗体を産生するために使用されており(Ｐａｃｋ  Ｐ．  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：１５７９−１５８４)、本発明によるスペーサーペプチドとして有益であり得る。ヒトＩｇＧ３の上流ヒンジ領域の相当する配列はさらにより好ましい。ヒトＩｇＧ３配列は人間において免疫原性を示さないと期待されている。
【００６５】
好ましい実施形態において、リンカーペプチドは配列ＡＰＡＥＴＫＡＥＰＭＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）を有するペプチドおよび配列ＧＡＰを有するペプチドからなる群から選ばれる。
【００６６】
あるいは、本発明によるコンジュゲートの２つの成分は、その配列がプロテアーゼの切断標的を含むペプチドによって連結させることができ、それゆえ成分（ｉ）を成分（ｉｉ）から分離することができる。本発明のポリペプチドへの組込みに適したプロテアーゼ切断サイトは、エンテロキナーゼ（切断サイトＤＤＤＤＫ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）、Ｘａ因子（切断サイトＩＥＤＧＲ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）、トロンビン（切断サイトＬＶＰＲＧＳ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）、ＴＥＶプロテアーゼ（切断サイトＥＮＬＹＦＱＧ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（切断サイトＬＥＶＬＦＱＧＰ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、インテイン等を含む。好ましい実施形態において、切断サイトは腫瘍組織で、炎症組織で、または肝臓で発現されるプロテアーゼ切断サイトである。コンジュゲートが肝臓に到達すると、アポＡおよび成分（ｉｉ）の切り離しが起こる。好ましい実施形態において、リンカーはマトリクスメタロプロテアーゼ−９認識サイト（切断サイトＬＦＰＴＳ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）を含む。
【００６７】
本発明として、また、成分（ｉｉ）が一を超える抗原またはエピトープを含んでなるコンジュゲートであることも期待できる。この場合、抗原またはエピトープは同一でも異なっていてもよい。抗原ペプチドがＰＳＭに結合している場合、異なるペプチドはＰＳＭの異なるサイトに結合することができる。あるいは、抗原ペプチドはＰＳＭのシングルサイトに結合することができる一本鎖ポリペプチド鎖を形成することができる。
【００６８】
好ましい実施形態において、本発明によるコンジュゲートは成分（ｉｉ）のＣ末端が成分（ｉ）と一本鎖ポリペプチド鎖を形成するシングル抗原ペプチドである一本鎖ポリペプチド鎖によって形成されることができる。さらに好ましい実施形態において、本発明によるコンジュゲートは、成分（ｉｉ）のＣ末端が成分（ｉ）のＮ末端に結合してなるか、または、成分（ｉｉ）のＮ末端が成分（ｉ）のＣ末端に結合してなる一本鎖ポリペプチド鎖である。
【００６９】
好ましい実施形態において、本発明によるコンジュゲートは、
ＬＭＳＣＬＩＬＲＩＦＩＬＩＫＥＧＶＩＳＭＡＱＤＩＩＳＴＩＧＤＬＶＫＷＩＩＤＴＶＮＫＦＴＫＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、および
ＭＡＱＤＩＩＳＴＩＧＤＬＶＫＷＩＩＤＴＶＮＫＦＴＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）
からなる群から選ばれるペプチドではない。
【００７０】
Ｃ．本発明によるコンジュゲートの細胞傷害性効果
本発明によるコンジュゲートは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によってコードされているタンパク質に関連して提示されたペプチド抗原を表面に発現する細胞に対して、特異性を有する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を誘導することができる。ＣＴＬｓは、細胞内の病原菌の細胞内破壊、またはそのような病原菌に感染した、もしくはその表面に腫瘍抗原を発現する細胞の溶解を誘導および促進する。
【００７１】
本発明に従って処理された動物においてＣＴＬ応答が得られたか否かを決定するために、ＣＴＬ応答  血液または脾臓もしくはリンパ節等のリンパ器官に存在しているＣＤ８＋（陽性）細胞（すわなちＣＴＬ）のレベルを測定する。この決定は、本発明の方法を実施する前のＣＤ８＋細胞のレベルの最初の測定および処理中、たとえば、７、１０、２０、４０日におけるレベルの測定によってなされる。ＣＤ８＋（ＣＴＬ）応答のレベルまたは強さはインビボまたはインビトロで評価され得る。
【００７２】
ヒトでは、今のところ、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を測定するために唯一のインビボ試験があり、それは皮膚試験である。この皮膚試験では、ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドが皮内注射される。ＣＴＬ応答が存在する場合、これらの細胞は、サイトカイン放出または細胞傷害メカニズムのいずれかにより局所炎症反応を引き起こしながら、ペプチドパルス真皮細胞を認識し攻撃する。この炎症反応は当該局所皮膚発疹の直径を測定することによって、および／または、浸潤物の直径を測定することによって（すなわち、腫脹反応）、定量される。易溶性ペプチドの注射の代替として、ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドは結合させられた、たとえば対外で樹状細胞と結合させられた形態でも、皮内注射され得る。他の哺乳動物では、実験的ではあるものの、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を評価するためのさらなるインビボ試験が存在する。たとえば、マウスモデルでは、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、免疫付与のために使用されるペプチドを発現する組換えワクシニアウイルスを用いた攻撃感染によって測定され得る。再感染に対する免疫のレベルは、攻撃感染後マウス器官から回収させられたワクシニアウイルス力価の減少係数として定量され得る。
【００７３】
ＣＤ８＋Ｔ細胞応答のレベルは、問題となっている抗原ペプチドに対して特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の数を測定することによってインビトロでも定量される。非投与哺乳動物において、いわゆる「頻度（frequency）」、すなわち非特異的白血球の数で除された特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数、は１０−６未満である。所望の免疫付与の後、頻度は特異的Ｔ細胞の増殖によって増大する。たとえば急性ウイルス感染の期間に、特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度は１０−２まで上昇し得る。ウイルスの除去後、特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度は通常約１０−４の「メモリー」レベルまで低下する。したがって、特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を測定することによって定量され得る。頻度が高くなればなるほど、応答はより強くなる。特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の測定のために使用される古典的なアッセイは、Ｋｕｎｄｉｇ，Ｔ．Ｍ．等（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１９９６，９３：９７１６−９７２３）によって詳細に記載されているように、限界希釈細胞培養法に基づく。特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を評価するための新たなアプローチは、それらの溝に結合させられたペプチドを有する可溶性ＭＨＣクラスＩ（マウスで使用するための）またはＨＬＡ分子（ヒトで使用するための）を構築し、特異的Ｔ細胞受容体がこれらの複合体に結合できるようにすることである。これらの複合体は検出のために、たとえばフローサイトメトリーによる検出を可能にさせるべく、蛍光物質で、標識させられ得る。インビボでのＣＴＬ活性のレベルを定量するための別のアプローチは、本発明の図３、４および９に記載されているインビボキリングアッセイである。
【００７４】
ＩＩ．本発明によるコンジュゲートを得るための方法
本発明によるコンジュゲートは当業者に知られている任意の方法を用いて得ることができる。したがって、任意の標準的な方法によって、ＰＳＭまたは当該タンパク質の変異体を得ることは可能である。たとえば、ＰＳＭタンパク質は、Ｍｅｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９９，１８９：９０７）に記載されているように、固定（stationary）Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの上清のフェノール抽出によって精製され得る。あるいは、ＰＳＭタンパク質は、Ｏｔｔｏ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ（Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．２００４，１９０：７４８−５５）に記載されている方法など当技術分野で知られている方法を用いた、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓｃ、昆虫細胞等異種生物における発現によるｃＤＮＡから得ることができる。
【００７５】
十分な量の精製ＰＳＭタンパク質があるならば、それを目的の抗原化合物に結合させる。治療効果のある成分（ｉｉ）のＰＳＭへの結合は、種々の方法で行われ得る。ひとつの可能性は、官能基の治療効果のある成分への、当該成分の活性を妨げない位置における、直接的な結合である。本発明では、当然のことながら、官能基はある分子における当該分子の特有の化学反応に関与する特定の原子団に関する。官能基の例としては、ヒドロキシ、アルデヒド、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、カルボキサミド、第１級、２級、３級および４級アミン、アミノキシ、アジド、アゾ（ジイミド）、ベンジル、炭酸塩、エステル、エーテル、グリオキシリル、ハロアルキル、ハロホルミル、イミン、イミド、ケトン、マレイミド、イソシアニド、イソシアネート、カルボニル、硝酸エステル、亜硝酸エステル、ニトロ、ニトロソ、過酸化物、フェニル、ホスフィン、燐酸エステル、ホスホノ、ピリジル、スルフィド、スルホニル、スルフィニル、チオエステル、チオール、酸化３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）基が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＳＭ分子のチオール基と特異的に反応する上記官能基の例はマレイミドまたはグリオキシリル基であり、およびＰＳＭ分子の第１級アミン基と特異的に反応するのは、酸化３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）基である。
【００７６】
別の可能性は、ホモまたはヘテロ二官能性基の使用による、治療効果のある成分（ｉｉ）のＰＳＭ分子への結合である。二官能性基は最初に治療効果のある成分に結合させられ、その後ＰＳＭペプチドに結合させられるか、または、その替わりに、二官能性基をＰＳＭタンパク質に結合させ、その後それを成分（ｉｉ）に結合させることが可能である。これらのタイプのコンジュゲートの説明に役立つ実例としては、ケトンオキシム（米国特許２００５０２５５０４２に記載されている）として知られているコンジュゲートが挙げられ、当該コンジュゲートの第一の成分はアミノオキシ基を含んでなり、当該アミノオキシ基はヘテロ二官能性基に存在するケトン基に結合させられ、当該ケトン基は当該コンジュゲートの第二の成分のアミノ基に順に結合させられている。
【００７７】
別の実施形態において、本発明によるコンジュゲートである成分（ｉ）および（ｉｉ）のコンジュゲートに使用される薬剤は、光分解的に、化学的に、熱的に、または酵素的に処理され得る。細胞標的に存在している酵素により加水分解され得る連結剤を使用し、治療効果のある成分のみが当該細胞の内部に放出されるようにすることは特に興味深い。細胞内で処理され得る連結剤の例は、ＷＯ０４０５４６２２、ＷＯ０６１０７６１７、ＷＯ０７０４６８９３およびＷＯ０７１１２１９３に記載されている。
【００７８】
好ましい実施形態において、本発明によるコンジュゲートの成分（ｉｉ）はオリゴペプチドおよびペプチドの双方を包含する天然ペプチドを有する化合物である。ポリペプチド鎖を化学的に改変する方法は当業者に広く知られており、システイン部分に存在するチオール基を介するコンジュゲートに基づく方法、リシン部分に存在する１級アミノ基を介するコンジュゲートに基づく方法（ＵＳ６８０９１８６）、ＮおよびＣ末端部分を介するコンジュゲートに基づく方法を含む。ポリペプチドが他の化合物に結合することを可能にするためにポリペプチドを改変するための適切な試薬としては、グルタルアルデヒド（化合物がポリペプチドのＮ末端に結合することを可能にする）、カルボジイミド（化合物がポリペプチドのＣ末端に結合することを可能にする）、Ｎ末端およびシステイン部分を活性化できるようにするスクシンイミドエステル（たとえば、ＭＢＳ、ＳＭＣＣ）、チロシン部分を活性化できるようにするベンジジン（ＢＤＢ，ビスジアゾ化ベンジジン）、糖化されたタンパク質の炭水化物部分を活性化できるようにする過ヨウ素酸塩が挙げられる。
【００７９】
ＰＳＭ成分および抗原ペプチドがシングルペプチド鎖を形成している特定の場合において、上記コンジュゲートをコードしている本発明の遺伝子構築体を使用して単一工程でコンジュゲートを発現させることが可能であり、そのため上記構築体は、転写および、随意に翻訳調節因子とともに、異種生物でのその発現のために適切なベクターに導入される。本発明の発現カセットに存在する転写および、随意の翻訳調節因子は、ヌクレオチド配列に作用可能に結合しヌクレオチド配列の転写を推進するプロモーター、並びに転写および転写の時間や場所の適切な制御のために必要または適切な他の配列、たとえば、開始および終止シグナル、切断サイト、ポリアデニル化シグナル、複製起点、転写エンハンサー、転写サイレンサー等、を含んでなる。発現カセットを構築するために使用される本発明のベクターおよび組換えベクターはもちろん上記因子も、一般に、使用される宿主細胞に応じて選択される。
【００８０】
ＩＩＩ．本発明によるポリヌクレオチド、遺伝子構築体、ベクターおよび宿主細胞
別の側面において、本発明は、本発明によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。当業者は、相対配向にかかわらず、および両成分が直接連結しているまたはスペーサー領域によって離れているという事実にかかわらず、本発明のポリヌクレオチドは、成分（ｉｉ）がペプチドの性質を有し、さらに成分（ｉ）とシングルペプチド鎖を形成するコンジュゲートをただコードするということを理解することができる。
【００８１】
別の側面において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含んでなる遺伝子構築体に関する。当該構築体は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドの発現を制御している機能調節配列の下流に位置する本発明のポリヌクレオチドを含んでなる。当業者は、本発明のポリヌクレオチドは、標的組織の核にアクセスしなければならいこと、および生物学的に活性な融合タンパク質を生じさせるために転写および翻訳されなければならないことを理解することができる。
【００８２】
原則として、プロモーターが、ポリヌクレオチドが発現され得る細胞と適合するならば、任意のプロモーターを本発明の遺伝子構築体に対して使用することができる。それゆえ、本発明の実施形態に適したプロモーターは、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０、ＣＭＶ、トリ肉腫ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスその他の真核生物ウイルスのゲノムの誘導体などの構成的プロモーター、メタロチオネイン遺伝子のプロモーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子のプロモーター、レトロウイルスＬＴＲ領域、免疫グロブリン遺伝子のプロモーター、アクチン遺伝子のプロモーター、ＥＦ−１α遺伝子のプロモーターを含むが、必ずしもこれらに限定されることはなく、さらにテトラサイクリンシステム、ＮＦκＢ／ＵＶライトシステム、Ｃｒｅ／Ｌｏｘシステムなどタンパク質の発現が分子または外因性シグナルの添加に依存するプロモーター、およびヒートショック遺伝子のプロモーター、ＷＯ２００６／１３５４３６に記載されているＲＮＡポリメラーゼの調節可能プロモーター、くわえて組織特異的プロモーターをも含む。好ましい実施形態において、本発明の遺伝子構築体は、主に肝臓の発現遺伝子からなるプロモーター領域に存在する発現エンハンス領域を含み、たとえば、ヒト血清アルブミン遺伝子、プロトロンビン遺伝子、α１−ミクログロブリン遺伝子またはアルドラーゼ遺伝子、これらの単一コピーもしくは複数コピーの形態、単離された形態もしくは他のサイトメガロウイルス、α１−抗トリプシンまたはアルブミンプロモーターなどの肝臓特異的発現因子との組合せを含む。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドを発現させるために使用されるプロモーターは、樹状細胞における機能的なプロモーター、たとえばＢｒｏｓ等（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００３，１７１：１８２５−１８３４）によって記載されているファシン遺伝子プロモーター、ＤＣ−ＣＫ１、ＤＣ−ＳＴＡＭＰおよびＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子プロモーター、Ｍｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，２００１，８：１７２９−３７）に記載されているＤｅｃｔｉｎ−２プロモーター、(Ｍａｓｏｏｄ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ８：３３５−３４３  ａｎｄ  Ｓｏｍｉａ，Ｎ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．１９９５．Ｐｒｏｃ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：７５７０−７５７４)に記載されているＣＤ１１ｃ遺伝子プロモーター、である。
【００８３】
組織特異的プロモーターの他の例としては、アルブミン遺伝子（Ｍｉｙａｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７１：５１２４−３２）、肝炎ウイルスのコアプロモーター（Ｓａｎｄｉｇ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３：１００２−９）、α胎児型タンパク遺伝子のプロモーター（Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，７：１５０３−１４）、およびチロキシンに結合するグロブリン結合タンパク遺伝子のプロモーター（Ｗａｎｇ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１１５６３−１１５６６）が挙げられる。
【００８４】
本発明のポリヌクレオチドまたはこれらを形成する遺伝子構築体はベクターの一部を形成することができる。それゆえ、別の側面において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたは遺伝子構築体を含んでなるベクターに関する。当業者は、ベクターは、増殖のために、およびポリヌクレオチド、適切な遺伝子構築体またはコンジュゲートを精製するために適切な種々の異種生物における発現ベクターを得るために、適切なクローニングベクターであり得るので、使用し得るベクターのタイプに関しては制限がないということを理解することができる。したがって、本発明における適切なベクターとしては、原核生物における発現ベクター、たとえばｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔおよびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏＩＥ１、ｐＣＲ１、ｐＲＰ４、ファージ、ｐＳＡ３およびｐＡＴ２８等のシャトルベクター、２ミクロンプラスミドのタイプのベクター等の酵母における発現ベクター、組み込みプラスミド、ＹＥＰベクター、セントロメアプラスミドなど、ｐＡＣシリーズ、ｐＶＬシリーズ等の昆虫細胞における発現ベクター、ｐＩＢＩ、ｐＥａｒｌｅｙＧａｔｅ、ｐＡＶＡ、ｐＣＡＭＢＩＡ、ｐＧＳＡ、ｐＧＷＢ、ｐＭＤＣ、ｐＭＹ、ｐＯＲＥシリーズベクターなど植物において発現するベクター等の植物における発現ベクター、ウイルスベクター（アデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルスはもちろんのこと、レトロウイルス、レンチウイルスも）だけでなく非ウイルスベクター、たとえばｐＳｉｌｅｎｃｅｒ  ４．１−ＣＭＶ（Ａｍｂｉｏｎ）、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇ、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１、ｐＺｅｏＳＶ２、ｐＣＩ、ｐＳＶＬ、およびｐＫＳＶ−１０、ｐＢＰＶ−１、ｐＭＬ２ｄおよびｐＴＤＴ１、をも基礎とする高等真核細胞における発現ベクターを挙げることができる。
【００８５】
本発明のベクターは、当該ベクターによって形質転換され、トランスフェクトされ、または感染させられ得る細胞を、形質転換させ、トランスフェクトさせ、または感染させるために使用される。上記細胞は原核細胞または真核細胞であることができる。例として、上記ＤＮＡ配列が導入されたベクターはプラスミドまたはベクターであることができ、これらは、これらが宿主細胞内に導入されたとき、当該細胞のゲノムに組み込まれ、これらが既に組み込まれた染色体と共に複製する。上記ベクターは当業者に知られている慣用の方法によって得ることができる（前掲Ｓａｍｂｒｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【００８６】
したがって、別の側面において、本発明は、本発明のポリヌクレオチド、遺伝子構築体またはベクターを含んでなる細胞に関し、当該細胞は本発明によって提供される構築体またはベクターを用いてトランスフォームされ、トランスフェクトされ、または感染され得る。トランスフォームされ、トランスフェクトされ、または感染された細胞は、当業者に知られている慣用の方法によって得ることができる（前掲Ｓａｍｂｒｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。特定の実施形態において、上記宿主細胞は、適切なベクターでトランスフェクトまたは感染された動物細胞である。
【００８７】
本発明によるコンジュゲートの発現のために適切な宿主細胞は、哺乳動物、植物、昆虫、真菌、細菌の細胞を含むが、これらに限定されない。細菌細胞としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属などのグラム陽性細菌細胞、並びにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の細胞などのグラム陰性細菌細胞が挙げられるが、これらに限定されない。真菌細胞は、好ましくは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａなどの酵母の細胞を含む。昆虫細胞は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞およびＳｆ９細胞を含むが、これらに限定されない。植物細胞は、とりわけ穀草類などの作物、薬効のある、観賞用の、球根状の植物の細胞を含む。本発明の適切な哺乳動物細胞は、上皮細胞株（ブタ等）、骨肉腫細胞株（ヒト等）、神経芽腫細胞株（ヒト等）、上皮性癌（ヒト等）、グリア細胞（マウス等）、肝細胞株（サル等由来）、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、９１１、ＡＴ１０８０、Ａ５４９、２９３またはＰＥＲ．Ｃ６、ＮＴＥＲＡ−２ヒトＥＣＣ細胞、ｍＥＳＣ株のＤ３細胞、等のヒト胚性幹細胞、例えばＨＳ２９３、およびＢＧＶ０１、ＳＨＥＦ１、ＳＨＥＦ２およびＨＳ１８１、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、２９３Ｔ、ＲＥＨおよびＭＣＦ−７およびｈＭＳＣ細胞を含む。
【００８８】
ＩＶ．本発明の医薬製剤
本発明の発明者らは、本発明によるコンジュゲートが、当該コンジュゲートの一部を形成する抗原に対するＣＴＬ応答を引き出すことができ、その結果当該抗原に対する免疫応答が要求される疾患の治療のための当該コンジュゲートの使用が可能であることを観察している。それゆえ、別の側面において、本発明は、本発明によるコンジュゲート、本発明のポリヌクレオチドもしくは遺伝子構築体、本発明のベクター、または本発明の宿主細胞、および薬学的に許容できる担体を含んでなる医薬製剤またはワクチン関する。
【００８９】
「薬学的に許容できる担体」という用語は、それが投与される被検体においてアレルギー反応または他の悪影響を引き起こさない担体をいう。適切な薬学的に許容できる担体は、たとえば水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびこれらの組合せの１以上を含む。さらに、所望ならば、ワクチンは、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および／または当該ワクチンの効能を増進するアジュバンド等の少量の補助物質を含むことができる。効果的であり得るアジュバントの例としては、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、ＭＴＰ−ＰＥ、並びに、細菌から抽出された３成分、モノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコール酸および細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％のスクアレン／Ｔｗｅｅｎ  ８０エマルジョン中に含むＲＩＢＩが挙げられるが、これらに限定されない。アジュバントの他の例としては、ＤＤＡ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）、フロイント完全および不完全アジュバント、並びにＱｕｉｌＡが挙げられる。くわえて、リンホカイン（たとえば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）等の免疫調節物質、またはポリＩ：Ｃ等の合成ＩＦＮ−γ誘導因子は、本明細書に記載されたアジュバントとともに使用され得る。
【００９０】
さらに別の側面において、本発明は、治療において使用するための、本発明によるコンジュゲート、本発明のポリヌクレオチドもしくは遺伝子構築体、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、医薬組成物もしくはワクチンに関する。
【００９１】
コンジュゲートは単独で使用されることができ、または、他の抗原もしくはＣＴＬ応答の免疫刺激を増進させることで知られている、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＴＮＦ、ＩＦＮ、ＩＬ−１８、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−１０、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、Ｇ−ＳＣＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−βなどのサイトカイン等他の化合物とともに供与され得る。サイトカインは当技術分野において知られており、文献上または商業的に容易に入手される。
【００９２】
別の側面において、本発明は、抗原ペプチドに対する細胞傷害性応答を誘発する方法において使用するための、本発明によるコンジュゲート、本発明のポリヌクレオチドもしくは遺伝子構築体、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明による医薬組成物もくしはワクチンに関する。さらに、本発明は、その応答を必要としている被検体において免疫応答を誘発する、当該被検体への本発明によるコンジュゲート、本発明のポリヌクレオチドもしくは遺伝子構築体、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明による医薬組成物もくしはワクチン投与を含んでなる方法に関する。
【００９３】
本発明によるコンジュゲート、ポリヌクレオチド、遺伝子構築体、ベクター、宿主細胞および医薬組成物を、それに対してＣＴＬ応答の発生を導く抗原ペプチドが同定されている任意の疾患の治療のために用いることができることは明らかである。したがって、本発明の化合物は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（たとえば、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−ＩＩ，ＣＭＶまたはＶＺＶ）、ポックスウイルス（たとえば、天然痘もしくは牛痘等のオルトポックスウイルスまたは伝染性軟属腫）、ピコルナウイルス（たとえば、ライノウイルスまたはエンテロウイルス）、オルトミクソウイルス（たとえば、インフルエンザウイルス）、パラミクソウイルス（たとえば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルスおよび呼吸系発疹ウイルス）、コロナウイルス（たとえば、重症急性呼吸器症候群）、パボウイルス（たとえば、陰部疣贅、尋常性疣贅または足底疣贅を引き起こすようなパピローマウイルス）、ヘパドナウイルス（たとえば、Ｂ型肝炎ウイルス）、フラビウイルス（たとえば、Ｃ型肝炎ウイルスまたはデングウイルス）、またはレトロウイルス（たとえば、ＨＩＶ−１等のレンチウイルス）などの感染の結果として生じる疾患等のウイルス疾患の治療のために適切である。
【００９４】
好ましい実施形態において、本発明によるコンジュゲート、ポリヌクレオチド、遺伝子構築体、ベクター、宿主細胞および医薬製剤は、Ｃ型肝炎ウイルスによって引き起こされる感染性疾患の治療のために使用することができる。これらの疾患としては慢性および急性Ｃ型肝炎が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
細菌性疾患としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ属、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂｒｕｃｅｌｌａ属、Ｙｅｒｓｉｎｉａ属、Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ属またはＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ属の細菌による感染の結果生じる疾患など。
【００９６】
真菌性疾患等の他の感染性疾患としては、カンジダ症、アスペルギルス症、ヒストプラズマ症、クリプトコックス髄膜炎、またはマラリア、ニューモシスティス・カリニ、肺炎、リーシュマニア症、クリプトスポリジア症、トキソプラズマ症、トリパノソーマ感染などを含むがこれらに限定されない寄生虫性疾患が挙げられるがこれらに限定されない。
【００９７】
本発明によるコンジュゲートは、これらに限定されないが、結腸、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、目、頭部、頸部、神経（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、泌尿生殖器系などに位置する腫瘍等の過剰増殖性疾患の治療のためにも適している。
【００９８】
同様に、本発明の化合物によって治療または検出され得る他の過剰増殖性疾患としては、小児急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、成人（原発性）肝細胞癌、成人（原発性）肝癌、成人急性リンパ性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人ホジキン病、成人ホジキンリンパ腫、成人リンパ性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、成人原発性肝癌、成人軟部組織肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ＡＩＤＳ関連悪性腫瘍、肛門癌、星状細胞腫、胆管癌、膀胱癌、骨肉種、脳幹グリオーマ、脳腫瘍、乳癌、腎盂および尿管の癌、中枢神経系（原発性）リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、子宮頸癌、小児（原発性）肝細胞癌、小児（原発性）肝癌、小児急性リンパ芽球性白血病、小児急性骨髄性白血病、小児脳幹グリオーマ、小児小脳星細胞腫、小児大脳星細胞腫、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、小児ホジキン病、小児ホジキンリンパ腫、小児視床下部および視経路膠腫、小児リンパ芽球性白血病、小児髄芽腫、小児非ホジキンリンパ腫、小児松果体およびテント上未分化（原始）神経外胚葉性腫瘍、小児原発性肝癌、小児横紋筋肉腫、小児軟部組織肉腫、小児視経路および視床下部膠腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、皮膚Ｔ細胞白血病、膵島細胞癌、子宮内膜癌、上衣（細胞）腫、上皮性腫瘍、食道癌、ユーイング肉腫および関連腫瘍、膵外分泌癌、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌、女性乳癌、ゴーシェ病、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、胃腸腫瘍、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、ヘアリー（有毛）細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、ホジキン病、ホジキンリンパ腫、高γグロブリン血症、下咽頭癌、腸癌、眼内黒色腫、島細胞癌、膵島細胞癌、カポジ肉腫、腎（臓）癌、喉頭癌、口唇および口腔がん、肝（臓）癌、肺癌、リンパ（組織）増殖性疾患、マクログロブリン血症、男性乳癌、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽（細胞）腫、メラノーマ（黒色腫）、中皮腫、原発不明転移性扁平上皮性頸部癌、原発性転移性扁平上皮性頸部癌、転移性扁平上皮性頸部癌、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、骨髄異形成症候群、骨髄性（Ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）白血病、骨髄性（Ｍｙｅｌｏｉｄ）白血病、骨髄増殖性疾患、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽腔癌（上咽頭癌）、神経芽細胞腫、妊娠中の非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚癌、非小細胞肺癌、原発不明転移性扁平上皮性頸部癌、口腔咽頭癌、Ｏｓｔｅｏ−Ｚ悪性線維性肉腫、骨肉腫Ｗ悪性線維性組織球腫、骨肉腫／骨の悪性繊維性組織球腫、上皮性卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵（臓）癌、異常タンパク血症、紫斑病、副甲状腺癌（上皮小体癌）、陰茎癌、褐色細胞腫、下垂体部腫瘍、形質細胞腫／多発性骨髄腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂および尿管の癌、網膜芽（細胞）腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、サルコイドーシス肉腫、セザリー症候群（皮膚Ｔ細胞リンパ腫）、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮性頸部癌、胃癌、テント上未分化（原始）神経外胚葉性および松果体腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、睾丸癌（精巣癌）、胸腺腫、甲状腺癌、腎���および尿管の移行上皮（細胞）癌、移行性腎盂および尿管癌、絨毛性腫瘍、尿管および腎盂細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視経路および視床下部膠腫、外陰癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、並びにその他任意の過剰増殖性疾患、くわえて上記した器官系に位置する腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９９】
さらに、本発明によるコンジュゲートは、前癌状態を予防および／または治療し、並びに上記した疾患を含むがそれらに限定されない腫瘍性もしくは悪性の状態への進行を予防するためにも適切であり得る。そのような使用は、腫瘍または癌への進行について知られ若しくは疑われている状態、特に、過形成、化生、またはとりわけ形成異常からなる非腫瘍性細胞増殖が引き起こされている状態、において指し示されている。
【０１００】
過形成（異常増殖）は、構造や機能における顕著な変化なしに、ある組織または器官における細胞数の増加を伴う、調節された細胞増殖の一形態である。本発明の化合物で予防および／または治療され得る過形成性疾患としては、血管胞状縦隔リンパ節過形成、好酸球増多随伴性血管リンパ球増殖症、異型メラノサイト（メラニン産生細胞）過成形、基底細胞過形成、良性巨大リンパ節過形成、セメント質過形成、先天性副腎（皮質）過形成、先天性脂腺過形成、嚢胞性過形成、胸部の嚢胞性過形成、義歯性線維症、乳管過形成、子宮内膜増殖症、線維筋性過形成、局所性上皮過形成、歯肉増殖症、炎症性線維性過形成、炎症性乳頭過形成、血管内乳頭状内皮過形成、前立腺結節性過形成、再生結節性過形成、偽上皮腫性過形成、老人性脂腺増殖症、およびいぼ状の過形成が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０１】
化生は、ある種の成熟または完全に分化した細胞が別の成熟した細胞と置き換わるという調節された細胞増殖の一形態である。本発明の化合物で予防および／または治療され得る化生疾患としては、原発性骨髄線維症、アポクリン化生、異型化生、自己実質化生、結合組織化生、上皮化生、腸化生、化生性貧血、変形骨化、化生性ポリープ、骨髄化生、原発性骨髄化生、二次性骨髄化生、扁平上皮化生、羊膜の扁平上皮化生、および症候性骨髄化生が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０２】
形成異常はしばしば癌の前兆であり、主に上皮（組織）において発見される；形成異常は、個々の細胞の同一性および複数の細胞の構造上の配向性における損失を伴う、非腫瘍性細胞増殖の中で最も無秩序な形態である。形成異常細胞は大抵、異常に大きく、核が強く染色され、多形性を示す。形成異常は慢性的な刺激または炎症が存在する箇所で特徴的に発生する。本発明の化合物で予防および／または治療され得る形成異常疾患としては、無汗性外胚葉性形成異常、前後形成異常、窒息性胸郭異形成、心房指状形成異常、気管支肺異形成、終脳形成異常、頸部形成異常、軟骨外胚葉性形成異常、鎖骨頭蓋骨形成不全、先天性外胚葉性形成異常、頭蓋骨幹形成異常、頭蓋骨手根骨足根骨形成不全、頭蓋骨幹端形成異常、象牙質異形成症、骨幹形成異常、外胚葉性形成異常、エナメル質形成異常、脳−眼異形成、骨端固定半肢症形成異常、多発性骨端固定形成異常、点状骨端固定形成異常、上皮形成異常、顔面指趾生殖器形成異常、顎の家族性線維性形成異常、家族性白色襞性形成異常、線維筋性形成異常，骨の線維筋性形成異常、開花性骨異形成症、遺伝性腎性−網膜形成異常、発汗性外胚葉性形成異常、無汗性外胚葉形成異常症、リンパ球減少性胸腺形成異常、乳房形成異常、顎顔面形成異常、骨幹端形成異常、モンディーニ型内耳形成異常、単発性線維性形成異常、粘膜上皮形成異常、多発性骨端形成異常、眼耳脊椎形成異常、眼歯指形成異常、眼脊椎形成異常、歯牙形成不全、眼下顎四肢形成不全、根尖性セメント質異形成症、多発性線維性骨形成異常、偽軟骨発育不全脊椎骨端形成異常、網膜形成異常、中隔−視覚異形成症、脊椎骨端形成異常、および心室橈骨形成異常が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０３】
本発明による化合物で予防および／または治療され得るさらなる前癌性疾患としては、良性異常増殖疾患（たとえば、良性腫瘍、線維嚢胞性病変、組織肥大、腸ポリープ、大腸ポリープおよび食道異形成）、白板症、角化症、ボーエン病、農夫皮膚、日光口唇炎および日光性角化症が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０４】
好ましい実施形態において、本発明によるコンジュゲート、ポリヌクレオチド、遺伝子構築体、ベクター、宿主細胞および医薬製剤は、いぼや腫瘍を含むヒトパピローマ（乳頭腫）ウイルスによって引き起こされる望ましくない細胞増殖によって引き起こされる疾患の治療のために使用される。本発明の組成物で治療され得るいぼのタイプとしては、尋常性疣贅、足底疣贅、陰部疣贅（生殖器疣）、爪下または爪周囲疣贅、および扁平疣贅が挙げられる。本発明の組成物で治療され得る腫瘍としては、子宮頸癌、外陰、女性の膣と肛門および男性の陰茎および肛門が挙げられる。
【０１０５】
Ｖ．本発明の組成物
本発明の発明者らは、本発明によるコンジュゲートの免疫学的効果は、当該コンジュゲートが他の免疫刺激性化合物とともに投与される場合、相乗的に増大することを見出している。本願の実施例３は、ＰＳＭコンジュゲート、およびＴＬＲ２リガンド（ＰＧＮ）、ＴＬＲ３リガンド（ｐＩＣ）、ＴＬＲ４リガンド（ＬＰＳまたはフィブロネクチンのＥＤＡドメイン）またはＴＬＲ９リガンド（ＣｐＧ）のいずれかとの組合せの、ＰＳＭに結合されたペプチドに対する細胞傷害応答を促進する能力を記載しており、それは、ペプチドが、追加のＴＬＲリガンドがない状態で、ＰＳＭとのコンジュゲートとして投与された場合に得られる応答に比べて強い。
【０１０６】
したがって、別の側面において、本発明は以下の（ａ）、（ｂ）を、ともにまたは独立に、含んでなる組成物に関する：
（ａ）本発明によるコンジュゲート、本発明によるポリヌクレオチドもしくは遺伝子構築体、本発明によるベクター、または本発明による宿主細胞、
（ｂ）以下の群から選ばれる第二成分
（ｉ）一またはそれ以上のＴｏｌｌ様受容体アゴニスト、
（ｉｉ）一またはそれ以上の共刺激分子のアゴニスト抗体、
（ｉｉｉ）一またはそれ以上のサイトカイン、および
（ｉｖ）一またはそれ以上の上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）に規定された化合物。
【０１０７】
本明細書において「ＴＬＲアゴニスト」という用語は、直接的なリガンドとして、または、内因性もしくは外因性リガンドを介して間接的に、ＴＬＲシグナル経路を介したシグナル応答を引き起こすことができる成分をいう（Ｓａｂｒｏｅ  ｅｔ  ａｌ，ＪＩ  ２００３  ｐ１６３０−５）。
【０１０８】
本発明のひとつの実施形態において、ＴＬＲアゴニストはＴＬＲ−１を介したシグナル応答を引き起こすことができる。ＴＬＲ−１アゴニストの非限定的な例としては、トリアシル化リポペプチド（ＬＰｓ）；フェノール可溶性モジュリン；ヒト型結核菌ＬＰ；Ｓ−（２，３−ビス（パルミトイルオキシ）−（２−ＲＳ）−プロピル）−ｎ−パルミトイル−（Ｒ）−Ｃｙｓ−（Ｓ）−Ｓｅｒ−（Ｓ）−Ｌｙｓ（４）−ＯＨ、三塩酸塩（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）ＬＰを挙げることができ、これは細菌リポタンパクのアセチル化アミノ末端およびＢｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｉ由来のＯｓｐＡ  ＬＰに類似する。
【０１０９】
別の実施形態において、ＴＬＲアゴニストはＴＬＲ−２を介したシグナル応答を引き起こすことができる。ＴＬＲ−２アゴニストの非限定的な例としては、表１および２に定義されるとおりのフェノール可溶性モジュリン（ＰＳＭ）およびその変異体、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｔ．Ｐａｌｌｉｄｕｍ由来の１以上の細菌リポペプチド；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを含む種由来のペプチドグリカン；リポタイコ酸、マンヌロン酸、ナイセリアポーリン、細菌線毛、エルシニア毒性因子、ＣＭＶビリオン、麻疹の赤血球凝集素および酵母由来のザイモサンが挙げられる。
【０１１０】
別の実施形態において、２本鎖ＲＮＡまたはポリイノシン酸−ポリシチジル酸（ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ）などのＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ−３を介したシグナル応答を引き起こすことができる。
【０１１１】
別の実施形態において、フィブロネクチンのＥＤＡドメインの１以上、グラム陰性細菌由来のリポ多糖（ＬＰＳ）またはそのフラグメント（断片）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）１０、６０、６５、７０、７５または９０；サーファクタントプロテインＡ、ヒアルロン酸オリゴ糖、ヘパラン硫酸フラグメント（断片）、フィブロネクチンフラグメント（断片）、フィブリノゲンペプチドおよびｂ−ディフェンシン−２などのＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ−４を介したシグナル応答を引き起こすことができる。ひとつの実施形態において、ＴＬＲアゴニストはＨＳＰ６０、７０または９０である。別の実施形態において、ＴＬＲ−４を介したシグナル応答を引き起こすことができるＴＬＲアゴニストは、Ｒｉｂｉ  ｅｔ  ａｌ  （１９８６，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏｒｐ．，ＮＹ，ｐ４０７−４１９）により記載されているようなモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）などの非毒性ＬＰＳ誘導体および下記式で表される構造を有する化合物である。
【０１１２】
【化１】
2012510284.tif 000004
【０１１３】
より解毒された型のＭＰＬは、二糖骨格の３位からアシル鎖を取り除くことから生じ、３−０−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）と呼ばれている。
【０１１４】
本発明においてＴＬＲアゴニストとして使用され得るＬＰＳの非毒性誘導体または細菌リポ多糖は、細菌源から精製および処理され、またはその替わりに合成され得る。たとえば、精製されたモノホスホリルリピドＡは、Ｒｉｂｉ  ｅｔ  ａｌ  １９８６（前掲）に記載され、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属由来の３−０−脱アシル化モノホスホリルもしくはジホスホリルリピドＡは、ＧＢ２２２０２１１およびＵＳ４９１２０９４に記載されている。他の精製および合成リポ多糖は、ＵＳ６，００５，０９９およびＥＰ０７２９４７３Ｂ１；Ｈｉｌｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，ＩｎｔＡｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７９（４）：３９２−６；Ｈｉｌｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６０（１）：１４１−６；およびＥＰ０５４９０７４Ｂ１に記載されている。細菌リポ多糖アジュバントは、ＵＳ６，００５，０９９およびＥＰ０７２９４７３Ｂ１に記載されている３Ｄ−ＭＰＬおよびｆ３（１−６）グルコサミンジサッカライドである。本発明においてＴＬＲアゴニストとして使用され得る他のＬＰＳ誘導体は、ＬＰＳ、ＭＰＬまたは３Ｄ−ＭＰＬ誘導体と構造的に類似している免疫刺激剤である。本発明の別の側面において、ＬＰＳ誘導体はアシル化された単糖であり、ＭＰＬの上記構造のサブポーションである。二糖のアゴニストは、精製または合成された下記式で表されるリピドＡであることができる。
【０１１５】
【化２】
2012510284.tif 000005
式中、Ｒ２はＨまたはＰＯ３Ｈ２であり；Ｒ３はアシル鎖、８−ヒドロキシミリストイルまたは下記式を有する３−アシルオキシアシル残基であり、
【化３】
2012510284.tif 000006
Ｒ４は−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）Ｘ−ＣＨ３であり
ＸおよびＹは０乃至２０の値を有する。
【０１１６】
ＬＰＳと構造上の相同性をほとんど共有しない、純粋に合成された非毒性ＬＰＳ誘導体は、ＷＯ００／００４６２に記載されたものであり、その内容は参照することにより本明細書の開示として全て組み込まれる。
【０１１７】
別の実施形態において、細菌フラジェリンなどのＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ−５を介してシグナル応答を引き起こすことができる。
【０１１８】
別の実施形態において、マイコバクテリアリポタンパク、ジアシル化ＬＰおよびフェノール可溶性モジュリンなどのＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ−６を介してシグナル応答を引き起こすことができる。さらなるＴＬＲ６アゴニストはＷ０２００３／０４３５７２に記載されている。
【０１１９】
別の実施形態において、ロキソリビン、Ｎ７位およびＣ８位でのグアノシンアナログ、イミダゾキノリン化合物またはその誘導体などのＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ−７を介してシグナル応答を引き起こすことができる。ひとつの実施形態において、ＴＬＲアゴニストはイミキモドである。さらなるＴＬＲ７アゴニストはＷ００２０８５９０５に記載されている。
【０１２０】
別の実施形態において、抗ウイルス活性を有するイミダゾキノリン分子、たとえばレシキモド（Ｒ８４８）；レシキモドはＴＬＲ−７によっても認識される、などのＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ−８を介してシグナル応答を引き起こすことができる。使用できる他のＴＬＲ−８アゴニストとしてはＷＯ２００４／０７１４５９に記載されているが含まれる。
【０１２１】
別の実施形態において、非メチル化ＣｐＧヌクレオチド、特にＣｐＧモチーフとして知られる配列関係、を含むＤＮＡなどのＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ−９を介してシグナル応答を引き起こすことができる。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは主にＴｈ１応答を誘導する。そのようなオリゴヌクレオチドはよく知られており、たとえばＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９９／３３４８８並びにＵＳ６，００８，２００およびＵＳ５，８５６，４６２に記載されている。ひとつの実施形態において、ＣｐＧヌクレオチドはＣｐＧオリゴヌクレオチドである。
【０１２２】
別の実施形態において、成分（ｉ）は、ＴＬＲ−１０を介してシグナル応答を引き起こすことができるＴＬＲアゴニストである。また、このＴＬＲアゴニストは、上述したＴＬＲの２以上の任意の組合せを介してシグナル応答を引き起こすことができる
【０１２３】
本明細書で使用される「共刺激分子のアゴニスト抗体」という用語は、高い親和性でＴ細胞の表面にあるタンパク質と結合することができ、さらにアゴニスト作用、すなわちそれらは受容体を介してシグナルを活性化し、リガンドが結合した場合と同一の効果をもたらすことができる作用を有する化合物に関する。アゴニスト抗体とともに標的にされ得る好ましい共刺激分子は、Ｔ細胞増殖に対して共刺激活性を有する分子であり、ＣＤ４およびＣＤ１３７を含むがこれらに限定されない。それゆえ、本発明の組成物における使用のために適した好ましいアゴニスト抗体は、抗ＣＤ４および抗ＣＤ１３７特異的抗体を含む。本発明によれば、「抗体」という用語は、ＣＤ１３７またはＣＤ４に結合することができ、その結果ＣＤ１３７またはＣＤ４の機能に対してアゴニスト作用を発揮できる、完全な抗体分子だけでなくそのフラグメント（断片）も含む。ＣＤ１３７の活性化はＴリンパ球の増殖を共刺激し（Ｇｏｏｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｐｏｌｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｓｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、Ｂリンパ球により発現されたＣＤ１３７リガンドはＴ細胞増殖をＢ７（ＤｅＢｅｎｅｄｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）とともに相乗的に共刺激する。
【０１２４】
本発明における使用のための抗体は、ＣＤ１３７またはＣＤ４に対して向けられる。「抗体」という用語は、ポリクローナルだけでなくモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体も含み、結合された、または可溶な形態で存在し得る。さらに、本発明による「抗体」は上記した種のフラグメントまたは誘導体であり得る。そのような抗体または抗体フラグメントは組換え分子、たとえば他の（タンパク性）成分との融合タンパク質、として存在もし得る。抗体フラグメントは通常酵素消化、タンパク質合成を経て、または当業者に知られている組換え技術によって作製される。したがって、本発明における使用のための抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、ヒトもしくはヒト化、組換え抗体またはそれらのフラグメントだけでなく、１本鎖抗体、たとえばｓｃＦｖ構築体または合成抗体であることもできる。
【０１２５】
ポリクローナル抗体は、抗原で免疫された動物の血清から作製される抗体分子の異種混合物である。本発明の対象は抗体混合物の精製により（たとえば、特異的エピトープを有するペプチドを担持したカラムを通過させるクロマトグラフィーを用いて）得られたポリクローナル単一特異的抗体でもある。モノクローナル抗体は抗原の単一エピトープに特異的な抗体の同種集団を表す。
【０１２６】
モノクローナル抗体は先行技術（たとえば、Ｋｏｈｌｅｒ  ｕｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−３９７，（１９７５）；ＵＳ４，３７６，１１０；Ｈａｒｌｏｗ  ｕｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ，Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ），１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｍｐ；Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載されている方法によって調製され得る。
【０１２７】
本発明における使用のための遺伝子工学により作製された抗体は、上記した参考文献に記載に従い調製されてよい。
【０１２８】
本発明における使用のための抗体は、次のクラスの免疫グロブリン：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＧＩＬＤおよび、適切な場合は、上述したクラスのサブクラス、たとえばＩｇＧクラスのサブクラスの任意のひとつに属する。ＩｇＧおよび第１サブクラス、たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３またはＩｇＧＭが好ましい。ＩｇＧサブタイプであるＩｇＧ１／ｋまたはＩｇＧ２ｂ／ｋは特に好ましい。本発明における使用のためのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンはインビボ、インサイチュ、インビトロで培養され得る。高力価のモノクローナル抗体は、好ましくはインビボまたはインサイチュで産生される。
【０１２９】
キメラ抗体は異なる起源の成分を含む種である（たとえば、マウスモノクローナル抗体由来の様々な領域を含む抗体、およびヒト免疫グロブリン由来の定常領域）。キメラ抗体は患者に投与されたとき当該種の免疫原性を低減させるためおよび産生効率を改善するために使用される。たとえば、ハイブリドーマ細胞株と比較して、マウスモノクローナル抗体はより高い収率を与える。しかしながら、キメラ抗体はヒト患者においてより強い免疫原性をもたらす。それゆえ、ヒト／マウスキメラ抗体が好ましく使用される。マウスモノクローナル抗体の超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）がヒト抗体のさらなる抗体領域と結合させられたモノクローナル抗体がさらにより好ましい。そのような抗体はヒト化抗体と呼ばれている。キメラ抗体およびその作製方法は先行技術に記載されている（Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３２７３−３２７７  （１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３１２  ６４３−６４６（１９８４）；Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＰ−Ａ−１２５０２３；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２６８−２７０（１９８５）；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＰ−Ａ−１７１４９６；Ｍｏｒｒｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＰ−Ａ−１７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ８６／０１５３３；Ｋｕｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＰ−Ａ−１８４１８７；Ｓａｈａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：１０６６−１０７４（１９８６）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ８７／０２６７１；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８４：３４３９−３４４３（１９８７）；Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８４：２１４２１８（１９８７）；Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３  （１９８８）  ｕｎｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ｕｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，前掲）。
【０１３０】
抗体フラグメントは、抗原に対する１または２の結合部位（すなわち、ＣＤ１３７またはＣＤ１３７リガンドの１以上のエピトープ）を有する、任意の欠失または誘導体化された抗体部分を含む。
【０１３１】
そのような抗体フラグメントの具体例は、Ｆｖ、ＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）２フラグメント、またはｓｃＦｖ等の１本鎖フラグメントである。Ｆｖ、ＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）２などの２本鎖フラグメントが好ましい。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは完全なままの抗体におけるＦｃフラグメントを有していない。有益な結果として、そのようなフラグメントは循環系においてより速く輸送され、完全な抗体種と比較して、非特異的な組織結合を示し難い。そのようなフラグメントはパパイン（Ｆａｂフラグメントの産生のため）、ペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの産生のため）等のプロテアーゼを用いたタンパク分解または化学的酸化によって完全なままの抗体から産生され得る。
【０１３２】
好ましくは、抗体フラグメントまたは抗体構築体は、対応する抗体遺伝子の遺伝子操作により産生される。組換え抗体構築体は普通１本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖｓ、サイズ３０ｋＤａ）を含み、そのＶＨおよびＶＬドメインは、発現および折りたたみ効率を改善するためポリペプチドリンカーを介して連結されている。機能的親和性を強めるため、およびサイズを増大させ血中クリアランス量を減少させるために、単量体ｓｃＦｖフラグメントは、接着タンパクドメインまたはペプチドリンカーを用いて複合され、二量体化、三量体化または大きな会合体にさせられ得る。そのような２価のｓｃＦｖ二量体の構築体の例は、各ｓｃＦｖのＶＨおよびＶドメイン間の短い、たとえば５残基の、リンカーが、Ｖドメインが１本鎖Ｆｖモジュールに入り込む配置を防止し、その代わりに２つのｓｃＦｖ分子が会合するようになる、６０ｋＤａの二重特異性抗体である。二重特異性抗体は２つの機能的な抗原結合部位を有する。リンカーは３残基未満まで減らされることもでき、二重特異性抗体の立体構造を妨げ、その代わりに３つのｓｃＦｖ分子が会合して３つの機能的な抗原結合部位を有する三量体（９０ｋＤａ三重特異性抗体）になるように導く。４価の四重特異性抗体になる４つのｓｃＦｖ分子の会合もまた可能である。本発明における使用のためのさらに好ましい抗体構築体はｓｃＦｖ−ＣＨ３融合タンパク質の二量体（８０ｋＤａ；いわゆる「ミニ抗体」）である。本発明における使用のための抗体は、好ましくはＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｌ１２９６４  ８（図８Ａ参照）によるヌクレオチド配列を含む核酸、またはＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｌ１２９６４によるヌクレオチド配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９７％の相同性を有する核酸によってコードされているペプチドまたはタンパク質を対象とする。
【０１３３】
本明細書において「免疫刺激性サイトカイン」という用語は、免疫系の任意の成分、その一部を形成する成分または細胞（介在）性免疫応答、液性免疫応答および補体系に関与する成分を含む、の活性の増大を促進する任意の化合物として理解される。好ましくは、免疫刺激性サイトカインは、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２４、ＧＭ−ＣＳＦ，ＴＮＦα、ＣＤ４０リガンド、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγおよび機能的に同等なそれらの変異体からなる群から選ばれる。
【０１３４】
好ましい実施形態において、本発明の組成物の成分（ｂ）はＴＬＲアゴニストを含む。さらにより好ましい実施形態において、当該アゴニストはＴＬＲリガンド３、ＴＬＲ４リガンドおよびＴＬＲ９リガンドからなる群から選ばれる。さらにより好ましい実施形態において、ＴＬＲリガンド３はｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃであり、ＴＬＲ４リガンドはＬＰＳまたはフィブロネクチンのＥＤＡドメインであり、および／またはＴＬＲ９リガンドはＣｐＧである。
【０１３５】
ＶＩ．本発明の組成物の医薬としての使用
本発明の組成物は、コンジュゲートの一部を形成する抗原ペプチドに対する免疫応答の促進に適する。それゆえ、別の側面において、本発明は、本発明の組成物と薬学的に許容できる担体とを含んでなる医薬製剤またはワクチンに関する。別の側面において、本発明は、医薬において使用するための、本発明の組成物または本発明の組成物を含んでなる医薬製剤またはワクチンに関する。
【０１３６】
本発明の組成物は本発明によるコンジュゲートと同一の目的のために使用され得る。それゆえ、別の側面において、本発明は医薬において使用するための本発明の組成物に関する。
【０１３７】
本発明の組成物は、抗原ペプチドに対する細胞傷害応答を誘導するためのワクチンとしてインビボで使用され得る。それゆえ、別の側面において、本発明は、細胞傷害応答を必要としている被検体に、本発明の組成物を投与することを含んでなる、抗原ペプチドに対する細胞傷害応答を誘導する方法に関する。別の側面において、本発明は、抗原ペプチドに対する細胞傷害応答を誘導する方法において使用するための、本発明の組成物および医薬組成物に関する。好ましい実施形態において、本発明は感染性疾患、アレルギー性疾患または腫瘍性疾患に対する細胞傷害応答を誘導するための方法に関する。
【０１３８】
したがって、別の側面において、本発明は、感染性疾患、アレルギー性疾患または腫瘍性疾患の治療において使用するための本発明の組成物に関する。別の側面において、本発明は、その投与を必要としている患者に対する本発明の組成物の投与を含んでなる、感染性疾患、アレルギー性疾患または腫瘍性疾患を治療する方法に関する。
【０１３９】
ＶＩＩ．本発明によるコンジュゲートおよび組成物のインビトロでの使用
本発明の実施例２において示すように、本発明によるコンジュゲートは樹状細胞の成熟および抗原提示を促進することができる。それゆえ、本発明によるコンジュゲートは樹状細胞の成熟を促進するためにインビトロで使用することもできる。それゆえ、別の側面において、本発明は、抗原提示細胞による抗原ペプチドもしくは抗原の提示を促進するための、または抗原提示細胞の成熟を促進するための、本発明によるコンジュゲート、本発明のポリヌクレオチドもしくは遺伝子構築体、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、または本発明の組成物の使用に関する。好ましい実施形態において、抗原提示細胞は樹状細胞である。
【０１４０】
樹状細胞の成熟を促進する方法に関する異なる実施形態は以下の項目ＶＩＩＩで詳細に述べる。
【０１４１】
ＶＩＩＩ．抗原に感作された抗原提示細胞の作製方法および当該方法を用いて得られた抗原提示細胞
本発明の発明者らは、本発明によるコンジュゲートが樹状細胞の成熟と、当該細胞による抗原提示とを促進し、その結果抗原に感作された樹状細胞へ導くことができることを確認している。それゆえ、別の側面において、本発明は抗原に感作された樹状細胞を得るための方法に関し、該方法は：
（ｉ）抗原提示細胞（ＡＰＣ）を、本発明によるコンジュゲート、ポリヌクレオチド、遺伝子構築体、ベクター、宿主細胞、または医薬組成物もしくは製剤と接触させ、そして
（ｉｉ）抗原がロードされたＡＰＣを単離することを含んでなる。
【０１４２】
第一の工程において、抗原に感作されたＡＰＣを得る方法は、ＡＰＣを本発明によるコンジュゲートに接触（作用）させることを含んでなる。
【０１４３】
本明細書において、「抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）」という用語は、１以上の抗原を免疫系の特異的エフェクター細胞によって認識されるペプチド−ＭＨＣ複合体の形で提示することができ、さらにそのことによって、提示された１以上の抗原に対する効果的な細胞性免疫応答を誘発することができる細胞のクラスをいう。本発明における使用のために適したＡＰＣは、プロフェッショナルなＡＰＣ、たとえば樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージおよびＢ細胞、だけでなくノンプロフェッショナルなＡＰＣ、たとえば線維芽細胞、胸腺上皮細胞、甲状腺上皮細胞、グリア細胞、膵臓ベータ細胞および血管内皮細胞も含む。好ましい実施形態において、ＡＰＣは樹状細胞である。好ましくは、本発明の方法において使用するＡＰＣは樹状細胞であり、それは、これらが、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答のためにナイーブＴ細胞を活性化するため、有効量で、抗原を提示する能力を有する唯一のＡＰＣであるからである。
【０１４４】
「樹状細胞（ＤＣｓ）」という用語は、様々なリンパおよび非リンパ組織で発見された形態学的に類似している細胞型の種々の集団をいう（Ｓｔｅｉｎｍａｎ（１９９１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２７１−２９６）。樹状細胞は生体中で最も強力で好ましいＡＰＣｓである。樹状細胞は単球から分化させられ得るが、特異的な表現型を有する。たとえば、特定の分化マーカーであるＣＤ１４抗原は樹状細胞では発見されないが、単球によって所有されている。また、成熟樹状細胞は食細胞でないのに対し、単球は強力に食作用を有する細胞である。成熟ＤＣｓはＴ細胞の活性化および増殖のために必要なすべてのシグナルを提供することができるということが示されている。
【０１４５】
樹状細胞は、当技術分野において知られている任意の方法によって、脾臓、リンパ節、扁桃腺、腸のパイアー斑および骨髄などこれらに限定されない、被検体の血液、骨髄または二次リンパ器官、から単離または作り出され得る。好ましくは、本発明の方法で使用されるＤＣｓは（最終分化した）樹状細胞である。樹状細胞の起源はヒト血中単球である。
【０１４６】
そのような起源から得られる免疫細胞は、通常、分化および成熟の様々な段階で再循環リンパ球およびマクロファージを主に含む。樹状細胞の調製は標準的な技術、たとえばＴ細胞および接着細胞の枯渇、引き続き密度勾配遠心分離、により改良され得る（たとえばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７．３２．１−７．３２．１６，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９７参照）。ＤＣｓは、場合によっては、さらに蛍光標識された細胞のソーティングにより、または抗ＣＤ８３ＭＡｂ電磁ビーズにより単離され得る。また、高収率の相対的に相同なＤＣｓ集団は、血液サンプルまたは骨髄中に存在するＤＣ前駆細胞を顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびインターロイキン４（ＩＬ−４）などのサイトカインで処理することによって得られる。そのような条件下で、単球は細胞増殖しないで樹状細胞に分化する。ＴＮＦα等の試薬を用いたさらなる処理はＤＣｓの最終分化を刺激する。
【０１４７】
限定されない例として、樹状細胞は血中単球から次のとおり得ることができる：末梢血単球は標準的な方法（たとえば、Ｓａｌｌｕｓｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１１０９−１１１８参照）により得られる。健常な血液ドナー由来の白血球は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離を用いた白血球除去輸血パックまたは軟膜調製およびプラスチック吸着によって集められる。成熟ＤＣｓが望ましい場合は、ＤＣｓを培養するため、次のプロトコルを使用することができる。細胞は３７℃で４時間プラスチック皿に接着させられる。非接着細胞は除去され、接着単球は０．１ｍｕ  ｇ／ｍｌ顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および０．０５ｍｕ  ｇ／ｍｌインターロイキン４（ＩＬ−４）を含む培地で７日間培養される。成熟樹状細胞を調製するために、腫瘍壊死因子αが５日目に添加され、細胞は７日目に集められる。
【０１４８】
未成熟樹状細胞を成熟させる方法は当技術分野において知られている。たとえば、完全なおよび不可逆的に成熟および安定したＤＣｓは未成熟樹状細胞を自己または非自己単球を培養した培養液を加えた培地で培養することによって得ることができる（ＰＢＭＣ馴化培地またはＳＡＣｓ；Ｒｏｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９６，１９６：１３７）およびＢｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９６，１９６：１２１）参照）。Ｊｏｎｕｌｅｉｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９７  １２：３１３５−３１４２）は未成熟ＤＣｓのＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４、並びにＴＮＦ−Ｉ±、ＩＬ−１Ｉ２、ＩＬ−６およびＰＧＥ２を含む「サイトカインカクテル」を含む培地でのオーバーナイト培養による成熟を開示する。上記カクテル中のサイトカインの好ましい濃度は、１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦ−Ｉ±、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１Ｉ２、１００ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６および１  Ｉ１／４ｇ／ｍｌ  ＰＧＥ２である。ＥＰ−Ａ−０９２２７５８には、単球由来の未成熟樹状細胞からＩＦＮ−１を含む培地での培養によって成熟樹状細胞を作製することが記載されている。ＵＳ２００４／０１５２１９１には、ＲＵ  ４１７４０を用いた培養による樹状細胞の成熟が記載されている。ＤＣ成熟のための「ＣＤ４０Ｌベースプロセス」および「成熟後エレクトロポレーション（ＰＭＥ）ＣＤ４０Ｌプロセス」はＷＯ２００６／０４２１７７に記載されており、その内容は参照することにより本明細書に援用される。ＣＤ４０Ｌベースプロセスにおいて、未成熟ＤＣはＣＤ４０Ｌ  ｍＲＮＡおよび抗原をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされ、その後ＩＦＮ−１（１０００Ｕ／ｍｌ）もしくはＴＮＦ−Ｉ±（１０ｎｇ／ｍｌ）またはＩＦＮ−Ｉ３およびＰＥＧ２（１  Ｉ１／４ｇ／ｍｌ）で処理される。オーバーナイト培養後、ＤＣｓは採取され、抗原をコードするＲＮＡおよびＣＤ４０Ｌ  ｍＲＮＡをエレクトロポレーションされ、８００Ｕ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦおよび５００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−４を含むＸ−ＶＩＶＯ  １５培地で、分離される前に、４時間以上培養され、細胞またはウイルスの溶解物または抽出物でパルスするためにアリコートされる。
【０１４９】
また、マクロファージ、樹状細胞およびＢ細胞を含むがこれらに限定されない抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）は、Ｉｎａｂａ  ｅｔ  ａｌ，（１９９２）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７６  １６９３−１７０２に記載されているように、ヒト末梢血または骨髄由来の幹細胞および前駆細胞からインビトロで産生することによって得ることができる。
【０１５０】
この方法で得られる樹状細胞は、特徴として、細胞表面マーカーＣＤ８３を発現する。加えて、その細胞は、特徴的に、ＭＨＣクラスＩＩ分子だけでなく細胞表面マーカーＣＤ１α、ＣＤ４０、ＣＤ８６、ＣＤ５４およびＣＤ８０を高レベルで発現するが、ＣＤ１４を発現しない。他の細胞表面マーカーとしては、特徴的に、Ｔ細胞マーカーＣＤ２およびＣＤ５、Ｂ細胞マーカーＣＤ７、並びに骨髄細胞マーカーＣＤ１３、ＣＤ３２（ＦｃγＲＩＩ）、ＣＤ３３、ＣＤ３６およびＣＤ６３、さらには多数の白血球関連抗原を挙げることができる。
【０１５１】
場合によって、標準的技術、たとえば形態学的観察および免疫化学的染色、が樹状細胞の存在を確認するために使用され得る。たとえば、樹状細胞の純度は１以上の特徴的な細胞表面マーカー；たとえば上記したＣＤ８３、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１α、ＣＤ４０、および／またはＣＤ５４；に対して向けられた蛍光標識された抗体を用いたフローサイトメトリーによって評価され得る。この技術は、未成熟ＤＣｓで発現するが成熟ＤＣｓでは発現しないＣＤ１４に対して向けられた蛍光標識された抗体を用いて、未成熟ＤＣｓと成熟ＤＣｓを識別するためにも使用され得る。
【０１５２】
ＤＣ前駆体は、健常な被検体または特異的抗原の発現に関連する疾患に罹患していることが分かっている被検体から得ることができる。そのようなＤＣ前駆体は同種異型であるかまたは自己移植的であり得る。
【０１５３】
ＤＣ前駆体が得られたら、それらは適切な条件下で細胞集団を拡大するのに十分な時間培養され、ＤＣｓを最適な抗原の取り込み、プロセッシングおよび提示ができる状態で維持する。米国特許出願６０／１５８，  ６１８号に詳しいように、ＤＣ前駆体を培養するひとつの好ましいアプローチにおいて、ＤＣは、血清またはタンパク質を含んでいない培地で４０時間、外から加えられたサイトカインの非存在下で、エクスビボ培養によって、そのようなＤＣ前駆体から生み出される。
【０１５４】
ＤＣ単離および培養の好ましい態様は、外から供給されたサイトカインを欠く培養培地を用い、血清なしの条件下で、既にＡｇをプロセッシングし、免疫細胞にＡｇを提示する能力を有し、Ａｇ特異的免疫応答、たとえば腫瘍抗原に対するＣＴＬ介在型Ｔ細胞応答を素早く生み出す、Ａｇをロードした非常に活性化されたＤＣの発生をもたらすための効率的な方法での培養を含む。
【０１５５】
樹状細胞は、本発明によるコンジュゲートに対する暴露の前後、冷温（冷凍）保存によって保存され得る。
【０１５６】
本発明の抗原をロードした樹状細胞を得る方法の工程（ｉ）において、ＡＰＣは、樹状細胞と、本発明によるコンジュゲート、ポリヌクレオチド、遺伝子構築体、ベクター、宿主細胞または医薬組成物とを接触させながら接触させる。接触工程は、ＤＣがコンジュゲートまたは当該コンジュゲートをコードする核酸のいずれに接触させられるかに依存して異なって行われ得る。
【０１５７】
接触工程が、本発明によるコンジュゲートを用いて行われる場合、当該接触工程はＤＣを十分な時間コンジュゲートに接触させ／インキュベートすることを含む。ひとつの実施形態において、感作はＡＰＣｓをコンジュゲートに非共有結合したヒートショックプロテイン（ｈｓｐ）に接触させることによって増大させ得る。抗原分子に非共有結合したｈｓｐは、ＡＰＣ感作を増大させることが実証されている。
【０１５８】
あるいは、ＡＰＣは、コンジュゲートをコードしているベクターでトランスフェクトされ、養子免疫治療およびワクチン治療のために使用され得る。インビボ、エクスビボおよびインビトロで核酸を細胞に導入するためのいくつかのアプローチ、たとえば脂質またはリポソームベースの遺伝子運搬および治療的なポリヌクレオチド配列をレトロウイルスゲノムの一部として含む複製欠損レトロウイルスベクターが使用されている。広く使用されているレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、アルファウイルス、およびこれらの組合せに基づくものが挙げられる。ベクターは、ベクターに対応するレトロウイルスによって感染されない細胞に対するベクターのホスト領域程度まで任意に偽型である。たとえば、水疱性口内炎ウイルスエンベロープ糖タンパク（ＶＳＶ−Ｇ）は、造血幹細胞に感染することができるＶＳＶ−Ｇ偽型ＨＩＶベクターを構築するために使用されている。アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベースベクターも、たとえば、核酸およびペプチドのインビトロ産生、およびインビボオヨビエクスビボ遺伝子治療手段において、標的核酸を細胞にトランスデュースするために使用されている。他の適切なウイルスベクターは、ヘルペスウイルス、レンチウイルスおよびワクシニアウイルスを含む。
【０１５９】
ウイルスベクターに加えて、いくつかの非ウイルストランスフェクション法が利用できる。そのような方法としては、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポソーム、カチオン性脂質複合体、油中水型エマルジョン、ポリエチレンイミン、およびデンドリマーを挙げることができるが、これらに限定されない。ここで、適切な２種以上のベクターがともに使用され得る。たとえば、プラスミドベクターはリポソームとの結合で使用され得る。非ウイルスベクターのケースでは、核酸が当技術分野で知られている任意の適切な方法により、非ウイルスベクターに組み込まれ得る。プラスミドとしては、適切な制限部位に構築体を連結することを含む。リポソーム、油中水型エマルジョン、ポリエチレンイミン、デンドリマーなどのベクターとしては、ベクターおよび構築体は当技術分野で知られている適切な条件下で混合することによって連結される。
【０１６０】
ＲＮＡを用いてＡＰＣをロードすることも可能である。これは通常エレクトロポレーション、パッシブ・アップテイク、リポフェクション、マイクロインジェクション、カチオン性試薬、ウイルストランスダクション、ＣａＰＯ４などの技術を用いることで行われる。
【０１６１】
ＤＣの活性化は、ＤＣをコンジュゲート中に存在する抗原ペプチドに特異的なＴ細胞受容体を発現するＴ細胞クローンに接触させること、Ｔ細胞の増殖を測定すること、大抵標識されたヌクレオチドアナログの取込みを測定することによって検出され得る。
【０１６２】
ＡＰＣが抗原で感作されたならば、その細胞は、抗原に感作されたＡＰＣを得るために単離される。本発明の方法を実施するために必要な細胞を単離するために細胞表面マーカーが使用され得る。たとえば、ＤＣｓはＭＨＣ分子および共刺激分子（たとえば、Ｂ７−１およびｂ７−２）を発現する。表面マーカーの発現はこれらの細胞の同定および単離を促進する。同定および単離のこれらの方法はＦＡＣＳ、カラムクロマトグラフィーなどを含む。一般の免疫学的および免疫アッセイ手段の説明として、前掲Ｓｔｉｔｅｓ  ａｎｄ  Ｔｅｒｒ  （ｅｄｓ．）１９９１  Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（７ｔｈ  ｅｄ．）  ａｎｄ  Ｐａｕｌ  を参照されたい。細胞精製の間の細胞の検出のための細胞単離または免疫アッセイは任意のいくつかの形態、たとえばＭａｇｇｉｏ（ｅｄ．）（１９８０）Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＩａ．；Ｔｉｊａｎ（１９８５）“Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，”Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（前掲）；Ｃｈａｎ（ｅｄ．）（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＩａ．；Ｐｒｉｃｅ  ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ（ｅｄｓ．）（１９９１）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ；ａｎｄ  Ｎｇｏ（ｅｄ．）（１９８８）Ｎｏｎ−ｉｓｏｔｏｐｉｃ  ｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹで説明されている形態で行われ得る。細胞はフローサイトメトリー法およびＦＡＣＳ解析によって単離され、特徴づけられる。様々な種類のフローサイトメトリー法が知られている。蛍光励起フローサイトメトリーの一般的概説として、たとえばＡｂｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，特に第３章、およびＫｕｂｙ（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、特に第６章を参照されたい。
【０１６３】
細胞抗原を標識するために使用され得る標識物質としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、タンパク質、またはアフィニティーマトリクス、炭水化物もしくは脂質等のその他のポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。検出は任意の知られた方法、たとえばイムノブロッティング、ウェスタンブロット解析、放射性もしくは生物発光性マーカーのトラッキング、キャピラリー電気泳動、またはサイズ、電荷、アフィニティーに基づいて分子を追跡する他の方法、によって進められる。
【０１６４】
それゆえ、別の側面において、本発明は先述した方法によって得られるＡＰＣに関する。
【０１６５】
本発明の方法を用いて得られた抗原がロードされたＡＰＣは、インビトロでＣＤ８陽性Ｔ細胞および／またはＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化するために使用され、またはインビボでＴ細胞を活性化するために被検体に直接導入され得る。それゆえ、さらに別の側面において、本発明は、医薬において使用するための本発明の方法によって得ることができるＡＰＣだけでなく、本発明の方法によって得ることができるＡＰＣを含んでなるワクチンに関する。医薬的使用の目的のために、細胞は治療される同一の個（自己移植）または異なる個（同種移植）に由来することができるということが理解できる。同種移植では、ドナーおよびレシピアントは、ドナーおよびレシピアント細胞双方の互いに対する免疫応答を最小化するために、ＨＬＡ抗原の類似性に基づいて適合させられる。
【０１６６】
インビボで成長させられたＣＤ８陽性Ｔ細胞は哺乳動物に導入され得る。動物細胞では、ＣＤ８陽性Ｔ細胞は、当該Ｔ細胞が活性化させられる、ＭＨＣクラスＩ分子上の抗原ペプチドに対応する抗原ペプチドを有する標的細胞に対して細胞傷害性である。これらの標的細胞は通常癌細胞、またはそのＭＨＣクラスＩ表面上に固有の抗原ペプチドを発現する病原体感染細胞である。Ｔ細胞が活性化される
【０１６７】
同様に、ＭＨＣクラスＩＩとの関連で抗原ペプチドを認識するＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞も、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ双方との関係の抗原ペプチドを含む本発明のＡＰＣｓによって刺激されることができる。ヘルパーＴ細胞も標的細胞に対する免疫応答を刺激する。細胞傷害性Ｔ細胞と同様、ヘルパーＴ細胞は抗原がロードされたＡＰＣにインビトロまたはインビボで刺激される。
【０１６８】
それゆえ、別の側面において、本発明は、細胞傷害性抗原に対する細胞傷害性細胞応答を誘導する方法において使用するための、本発明による抗原提示細胞に関する。別の側面において、本発明は、感染性、アレルギー性または腫瘍性疾患に対する細胞傷害性細胞応答を誘導する方法において使用するための、本発明の抗原提示細胞に関する。
【０１６９】
抗原提示細胞または本発明の方法により産生される教育Ｔ細胞の免疫原性は、よく知られた方法によって決定することができ、当該方法は以下のものを含むがこれらに限定されない。
−  ＣＴＬ機能のための５１Ｃｒリリース・リシス・アッセイ  細胞傷害性Ｔ細胞は、自己が特異的に認識する特異的なペプチド：ＭＨＣクラスＩ複合体を発現する細胞を殺すことができる。ＣＴＬ機能は一般的に標的細胞（たとえば、抗原ロードＡＰＣ、腫瘍細胞、病原体細胞など）による放射性アイソタイプの放出を測定することによって決定される。
−  サイトカイン・リリース・アッセイ  改変ＡＰＣｓに接触するＴ細胞によって分泌されるサイトカインのタイプおよび量の分析は、機能活性の測定とすることができる。サイトカインは、サイトカイン産生の比率および全量を決定するために、ＥＬＩＳＡまたはＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定され得る（Ｆｕｊｉｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａ／．（１９９３）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１６０：１８１；ＴａｎｑｕａｙおよびＫｉｌｌｉｏｎ（１９９４）Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．１３：２５９）。
−  インビトロＴ細胞感作  本発明の組成物を、健常ドナーまたは患者由来ＰＢＭＣから反応性Ｔ細胞集団を引き出す能力についてアッセイすることができる。このシステムでは、取り出されたＴ細胞は、溶解作用、サイトカイン放出、ポリクローナリティー、および抗原エピトープに対する交差反応性をテストされ得る（Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６，１５７：２５３９）。
−  トランスジェニック動物モデル  免疫原性は、ＨＬＡトランスジェニックマウスに本発明の組成物をワクチン接種し、誘導された免疫応答の性質および強さを決定することによってインビボでアッセイされ得る。また、ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスモデルは、ヒトＰＢＬの養子トランスファーによって、マウスにおけるヒト免疫システムの再構築を許容する。これらの動物は、前掲Ｓｈｉｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：２７３３；  Ｍｏｓｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：２４４３に記載されているように、当該組成物でワクチン接種され、免疫応答を解析される。
−  増殖アッセイ  Ｔ細胞は反応性組成物に応答して増殖し得る。増殖は、たとえばトリチウムチミジン取込みを測定することによって定量的にモニターすることができる。好ましい方法において、Ｔ細胞増殖は、カルボキシフルオレセインジアセテートサクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）を用いて測定される。ＣＦＳＥは、フルサクシニミジルエステル官能基および２つのアセテート部分を含むオレセイン分子からなる。リンパ球は、最初、膜透過性で非蛍光のＣＦＳＥでインキュベートされ、当該ＣＦＳＥは細胞中に受動的に拡散し、細胞内エステラーゼがアセテート基を開裂し、ＣＦＳＥを膜非透過性の蛍光色素に変換する。過剰な色素は洗い流され、静止細胞はインビトロで細胞増殖または抗原性刺激によって増殖するよう誘導される。細胞は６日間培養、維持される。細胞分裂の各ラウンドの間、ＣＦＳＥ蛍光は半減し、連続する細胞発生の同定を許容する。ＣＦＳＥは標準的なフルオレセインフィルター（励起＝４９２ｎｍ、発光＝５１７ｎｍ）を用いて検出される。細胞表面分子、たとえばＣＤ４およびＣＤ８および細胞内マーカー、に対する蛍光標識された抗体を用いた染色は、特異的リンパ球サブセットの増殖の試験だけでなく、フローサイトメトリーを用いて、増殖している細胞の表現型のおよび機能的な特性の特性評価も許容する。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の併用は細胞の生存能力の評価を促進する。ＣＦＳＥフローキットはＲｅｎｏｖａｒ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）および他の供給元を通じて入手できる。
−  霊長類モデル  非ヒト霊長類（チンパンジー）モデルシステムを、ＨＬＡ拘束性リガンドのインビボ免疫原性をモニターするために使用することができる。チンパンジーは、ヒトＭＨＣ分子と重複するＭＨＣリガンド特異性を共有しており、それゆえ相対的インビボ免疫原性につていのＨＬＡ拘束性リガンドがテストされる（Ｂｅｒｔｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：４４４７）。
−  ＴＣＲシグナル伝達事象のモニタリング  いくつかの細胞内シグナル伝達事象（たとえば、リン酸化反応）は、ＭＨＣリガンド複合体によるＴＣＲ結合の成功と関係がある。これらの事象の定性および定量分析は、組成物のＴＣＲ結合を介してエフェクター細胞を活性化させる相対能力と相関性がある（Ｓａｌａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｔｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８５８２９；ｌｓａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：３７５）。
【０１７０】
ＡＰＣ細胞は、当該抗原提示細胞の感作のために使用されるコンジュゲートの一部を形成する抗原のタイプに依存する様々な疾患の治療のために使用される。感作のための適切な抗原は前記したとおりであり、したがって当該細胞は感染性疾患、アレルギー性疾患または腫瘍性疾患の治療のために適するものとなる。それゆえ、別の側面において、本発明は、感染性疾患、アレルギー性疾患または腫瘍性疾患の治療において使用するための、本発明の抗原提示細胞に関する。さらに別の側面において、本発明は、本発明の抗原提示細胞を患者へ投与することを含む、感染性疾患、アレルギー性疾患または腫瘍性疾患の治療のための方法に関する。別の側面において、本発明は、細胞傷害性抗原に対する細胞傷害性細胞応答を誘導するための方法において使用されるための、または、感染性、アレルギー性もしくは腫瘍性疾患に対する細胞傷害性細胞応答を誘導するための方法において使用されるための、本発明による抗原提示細胞の使用に関する。
【０１７１】
好ましくは、本発明による治療方法は、いわゆる養子免疫療法を含む。「養子免疫療法」という用語は、免疫細胞が直接的または間接的に望ましくない細胞に対する特異的免疫を仲介する（すなわち、望ましくない細胞に対する免疫応答をマウントする）という目的で、免疫細胞が宿主に投与され、癌または感染性疾患を治療するための治療的アプローチをいう。好ましい実施形態において、免疫応答は腫瘍および／または転移性細胞の成長および／または増殖の阻害をもたらし、最も好ましくは、腫瘍性細胞の死および／または融食作用をもたらす。免疫細胞は、種々の生物／宿主（外因性免疫細胞）に由来することができ、または被検体生物（自己免疫細胞）に由来する細胞であることができる。
【０１７２】
免疫細胞は、インビトロでのＡＰＣの活性化のための上記した任意の技術を用いて、通常特異的抗原（この場合は、本発明によるコンジュゲートにおいて使用される抗原ペプチド）によってインビトロで活性化される。養子免疫療法を行う方法は当業者によく知られている（たとえば、ＵＳ５，０８１，０２９、５，９８５，２７０、５，８３０，４６４、５，７７６，４５１、５，２２９，１１５、６９０，９１５など参照）。本発明から、養子免疫療法の多数の手法が期待される。ひとつの実施形態において、ＤＣ（たとえば、患者または自己樹状細胞から単離された）は、本発明によるコンジュゲートによって刺激され、その後、それらＤＣがインビボで存在し免疫細胞を活性化する当該被検体に注射して戻される。さらに、またはその替わりに、ＤＣは、本発明によるコンジュゲートをコードしている核酸がトランスフェクトされ、その後患者に再導入され得る。さらに別の実施形態において、ＤＣは、本発明によるコンジュゲートで刺激され、または、本発明によるコンジュゲートをコードしている核酸でトランスフェクトされ、その後末梢血リンパ球または培養ＴＩＬ（腫瘍浸潤リンパ球）を刺激するために使用され、後に患者に注入される抗原ペプチドに対する標的にされたＣＴＬｓを活性化する。同様に、線維芽細胞および他の樹状細胞または腫瘍細胞は、本発明によるコンジュゲートをコードする核酸でトランスフェクトされ、後に患者に注入され得る抗原ペプチドに対するＣＴＬｓを作り出すために、エクスビボで腫瘍細胞またはＰＢＬｓを活性化するために使用される。
【０１７３】
本明細書により提供される技術を用いて、本発明によるコンジュゲートまたは当該コンジュゲートをコードしている核酸を活用した他の治療様式が容易に開発される。上述したとおり、ひとつの実施形態において、免疫細胞は末梢血リンパ球またはＴＩＬ（たとえば、腫瘍／腫瘍サスペンション）に由来している。インビトロでの活性化のために使用されるリンパ球としては、Ｔリンパ球、様々な抗原提示細胞（たとえば、単球、樹状細胞、Ｂ細胞等）などが挙げられるが、これらに限定されない。活性化は、後に抗原（またはそのフラグメント）を、たとえばＨＬＡクラスＩ分子および／またはＨＬＡクラスＩＩ分子上に、提示する、抗原提示細胞を本発明によるコンジュゲートに接触させることを含むことができ、および／または細胞（たとえば、Ｔリンパ球）をそのキメラ分子に直接的に接触させることを含むことができる。免疫細胞の活性化は多数の態様をとることができ、コンジュゲートの末梢血リンパ球（ＰＢＬｓ）または培養腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬｓ）への直接添加、培養キメラ分子を用いた抗原提示細胞（たとえば、単球、樹状細胞等）のローディング、コンジュゲートをコードする核酸などを用いた、抗原提示細胞、ＰＢＬｓのトランスフェクションを含むことができるが、これらに限定されない。
【０１７４】
活性化された細胞のインキュベーションは、好ましくは、全身投与を介する。細胞は、中心静脈カテーテルを介して、または大きな末梢静脈中に、静脈内投与される。投与の他の方法（たとえば、動脈への直接注入）は本発明の範囲内である。
【０１７５】
本発明による樹状細胞は患者への投与に適した処方で、たとえば静脈注射で、提供される。患者への投与に適した本発明によるＤＣｓは、本明細書では、「ワクチン」または「ＤＣワクチン」という。ワクチンまたはＤＣワクチンは、免疫応答を調節することを助ける添加化合物をさらに含むことができ、また患者への投与に適するために、さらにプロセッシングされてよい。樹状細胞を静脈内投与する方法は当技術分野において知られており、当業者は投与されるＤＣｓの治療効果を最大限にするために、静脈内投与のパラメータを変更することができるであろう。
【０１７６】
それゆえ、ＤＣｓは、しばしば少なくともひとつの薬学的に許容される担体とともに、任意の適切な方法で患者に投与される。薬学的に許容される担体の適性は、投与される特定の組成によってだけでなく、当該組成物を投与するために使用される特定の方法によってもある程度決定される。最も一般的には、品質管理試験（たとえば、微生物学的測定法、クローン形成法、生死判別試験）が行われ、細胞は、いくつかのケースではジフェンヒドラミンおよびヒドロコルチゾンの投与によって先行されて、患者に再注入して戻される。たとえば、Ｋｏｒｂｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｂｌｏｏｄ  ６７：５２９−５３２およびＨａａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１８：９４−９８を参照されたい。
【０１７７】
非経口投与、たとえば静脈内投与に適した製剤は、酸化防止剤、緩衝液、静菌薬並びに当該製剤を対象レシピエントの血液で等張にする溶質だけでなく、懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および防腐剤を含むことができる水性および非水性滅菌サスペンションも含むことができる水性等張滅菌注射液を含む。一般的に、本発明のＤＣｓは、様々な濃度での有効量、細胞型（たとえば、ＬＤ−５０）の毒性、および細胞型の副作用によって決定される割合で、量および当業者によって決定された被検体の全体の健康に応じて適切に、被検体に投与され得る。投与は単回投与または分割投与により行われ得る。本発明のＤＣｓは、疾患または病気のための他の治療、たとえば放射線治療、細胞毒性薬、ヌクレオチドアナログ、および生物学的反応修飾物質を補完することができる。
【０１７８】
患者に投与される樹状細胞の投与量は、本発明に照らして、患者における有益な治療反応をもたらすのに、癌細胞の増殖を阻害するのに、または感染を阻害するのに十分でなければならない。それゆえ、細胞は、ウイルスまたは腫瘍抗原に対する有効なＣＴＬ応答を引き起こすために、および／または疾患もしくは感染による症状および／または合併症を緩和、軽減、治療または少なくとも部分的に停止させるために十分な量で患者に投与される。このことを達成するための十分な量は「治療的有効量」として定義される。投与量は、産生される樹状細胞の活性および患者の状態だけでなく、体重または患者の治療される表面積によっても決定される。使用量もまた、特定の患者における特定の細胞の投与に伴って起こる任意の不利な副作用の存在、性質および程度によって決定される。癌（たとえば、転移性黒色腫、前立腺癌など）等の疾患の治療または予防において、投与される細胞の有効量を決定する場合、医師は、循環血漿中濃度、ＣＴＬ傷害性、疾患の進行、および任意の導入された細胞型に対する免疫応答の誘導を評価する必要がある。
【０１７９】
注入前、血液サンプルが得られ、分析のために保存される。一般的に、少なくとも１０４〜１０６、特に１０８乃至１０１０細胞が、７０ｋｇの患者に大体６０〜１２０分を超えて静脈内または腹腔内注入される。好ましくは、各ワクチン接種ポイントに対して少なくとも１０７の細胞数が使用された。注射は、たとえば２週間間隔で４回繰り返され、好ましくはリンパ節付近に皮内または皮下注射によって行われるべきである。４週間後、ブースター注射が行われ得る。パルス酸素濃度計により、バイタルサインおよび酸素飽和度が綿密にモニターされる。血液サンプルが注入後５分および１時間に得られ、分析のために保存される。細胞再注入は大体毎月、１年の期間で全１０〜１２処理が繰り返される。最初の処理の後、注入は臨床医の裁量で外来で行われ得る。再注入が外来で行われた場合、参加者は治療後少なくとも４時間モニターされる。投与のため、本発明の細胞は、細胞型のＬＤ−５０（または毒性の他の測定）および様々な濃度での細胞型の副作用によって決定された割合で、患者の体重および健康状態に適応して投与される。投与は単回または分割投与により達成され得る。いくつかのレジメンでは、患者は選択的に追加で適切な生物学的反応修飾物質、サイトカインＩＦＮα、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＴＮＦまたは他のサイトカイン成長因子、アンチセンスＴＧＦβ、アンチセンスｅＩＬ−１０などを含むがこれらに限定されない、を受け取ることができる。
【０１８０】
活性化された細胞が腫瘍を治療のために用いられる場合、当該細胞は単独でまたは他の治療レジメン、ＩＬ−２の投与、他の化学療法（たとえば、ドキソルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン等）、放射線治療、手術などを含むがこれらに限定されない、と併用して使用され得る。上述したように、当該細胞は、選択的に、培養で拡張されてもよい。この拡張は、本発明によるコンジュゲートを用いた、ＩＬ−２を用いた若しくはＩＬ−２を用いない、またはＩＬ−２のみを含む培地での増殖による、Ｔ細胞の繰り返される刺激によって達成され得る。Ｔ細胞培養（たとえば、他のリンホカイン、増殖因子、または他の生物活性分子を用いて）の他の方法もまた本発明の範囲内である。
【０１８１】
ＩＸ．治療効果のある化合物をＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ｃ、Ｆ４／８、および／またはＣＤ１１７マーカーを発現する細胞へ輸送するための方法
本発明の発明者らは、本発明によるＰＳＭコンジュゲートは、多数のＢリンパ球、マクロファージ、ＣＤ１１ｃ樹状細胞、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔリンパ球の表面または顆粒球の表面に効果的に結合することができること、並びに特にＣＤ４、ＣＤ８，ＣＤ１９，ＣＤ１１ｃ、Ｆ４／８、および／またはＣＤ１１７マーカーを発現する細胞に結合することができることをまた観察している。
【０１８２】
このような発見は、目的の化合物を１以上の上記マーカーを発現する細胞へ輸送できる新たな追加的な治療の扉を開ける。目的の化合物には、特定の細胞に向けられた薬学的に活性な化合物および異常に上昇した数の細胞または望ましくない活性を示す細胞が存在する場所で要求される細胞傷害性化合物が含まれる。
【０１８３】
したがって、別の側面において、本発明は、
（ｉ）フェノール可溶性モジュリンまたは機能的に同等なその変異体、および
（ｉｉ）生物活性化合物
を含んでなるコンジュゲート（以下「非免疫原性コンジュゲート」という。）に関する。
【０１８４】
本発明の非免疫原性コンジュゲートにおける使用のための適切なＰＳＭは、免疫原性コンジュゲートとの関係で既に詳細に説明している。
【０１８５】
「生物活性化合物」という用語は、疾患の症状を予防または除くことができる化合物として定義される。本発明にあっては、まず、実質的にその生物活性を損なうことなしに共有結合修飾を受け得る任意の治療化合物を用いることができ、その結果、当該化合物はＰＳＭまたは機能的に同等なその変異体にコンジュゲートされ得る。それゆえ、本発明には、治療的に有効な成分として、低分子有機分子、ペプチド、ペプチド模倣薬、ペプトイド、タンパク質、ポリペプチド、糖タンパク、オリゴ糖、核酸などを使用することができる。
【０１８６】
好ましい実施形態において、生物活性化合物はペプチド化合物である。さらにより好ましい実施形態において、生物活性ペプチド化合物はＰＳＭとともに一本鎖ポリペプチド鎖を形成する。本発明はまた、非免疫原性コンジュゲートをコードしている配列を含んでなるポリヌクレオチドまたは遺伝子構築体、上記ポリヌクレオチドまたは遺伝子構築体を含んでなるベクターに関し、さらに、ポリヌクレオチド、遺伝子構築体またはベクターを含んでなる宿主細胞に関する。非免疫原性コンジュゲートを発現する適切なベクターおよび宿主細胞は、本質的に免疫原性コンジュゲートのために使用されるそれらと同一であり、さらに説明の必要はないであろう。
【０１８７】
別の側面において、本発明は、本発明による非免疫原性コンジュゲートを含んでなる医薬組成物と、さらには上記コンジュゲートをコードしているポリヌクレオチド、上記ポリヌクレオチドを含んでなるベクターもしくは遺伝子構築体、または上記ポリヌクレオチド、ベクターもしくは遺伝子構築体を含んでなる宿主細胞を、薬学的に許容される担体、アジュバント、ビヒクルとともに含んでなる医薬組成物をも提供する。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という表現は、ある器官もしくは身体の一部から別の器官もしくは身体の一部に上記物質を輸送または運搬することに関与している、薬学的に許容できる材料、化合物、ビヒクル、たとえば液体、固体フィラー、希釈剤、賦形剤（添加剤）、溶媒、封入材料を意味する。各担体は、当該製剤の他の成分と相溶性があるという意味において「許容される」ものでなければならない。薬学的に許容される担体として役目を果たすことができる材料のいくつかの例としては、（１）糖、たとえばラクトース、グルコース、スクロース、（２）でんぷん、たとえばコーンスターチ、ポテトスターチ、（３）セルロースおよびその誘導体、たとえばカルボキシルメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロース、（４）トラガント末、（５）モルト、（６）ゼラチン、（７）タルク、（８）賦形財、たとえばココアバターおよび坐薬ワックス、（９）オイル、たとえばピーナッツオイル、綿実油、サフラワー油、セサミオイル、オリーブオイル、コーンオイル、大豆油、（１０）グリコール、たとえばプロピレングリコール、（１１）ポリオール、たとえばグリセリン、ソルビトール、マンニトール、ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）、ポリエチレングリコール、（１２）エステル、たとえばオレイン酸エチル、ラウリン酸エチル、（１３）寒天、（１４）緩衝剤、たとえば水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、（１５）アルギン酸、（１６）発熱性物質除去蒸留水、（１７）等張食塩水、（１８）リンガー溶液、（１９）エチルアルコール、（２０）リン酸緩衝液、および（２１）他の医薬製剤において使用されている非毒性相溶性物質、たとえばＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）およびその誘導体を挙げることができる。
【０１８８】
医薬組成物は、任意の適切な投与経路、たとえば、経口、局所、直腸、非経口経路（皮下、腹腔内、皮内、筋肉内、静脈内経路を含む）により投与することができる。
【０１８９】
経口投与のための適切な医薬形態は、任意の固体組成物（錠剤、トローチ剤、カプセル剤、顆粒剤など）または液体組成物（液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤など）を含み、当技術分野に知られている慣用の添加剤、たとえば結合剤、たとえばシロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカントまたはポリビニルピロリドン；フィラー、たとえばラクトース、糖、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ソルビトールまたはグリシン；錠剤を調製するための滑剤、たとえばステアリン酸マグネシウム、錠剤分解物質（崩壊剤）、たとえばスターチ、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルスターチナトリウムまたは結晶セルロース；または薬学的に許容できる湿潤剤、たとえばラウリル硫酸ナトリウムを含むことができる。
【０１９０】
固体経口組成物は、錠剤を混合、調合または調製するための慣用方法によって調製することができる。繰り返し混合する作業は、大量のフィラー剤を用い、活性成分を全組成物に分配することでなされる。そのような作業は当技術分野において慣習的である。錠剤は、たとえば、湿式または乾式造粒によって調製でき、場合によっては、通常の薬務においてよく知られている方法に従って、特に腸溶コーティングでコートされ得る。
【０１９１】
医薬組成物は、また、適切な統一された医薬形態で、滅菌溶液、懸濁液または凍結乾燥製剤などの非経口投与のために適合されてよい。充填剤（膨張性薬剤、増量剤）、緩衝剤または界面活性剤などの適切な添加剤（賦形剤）が使用され得る。上述した製剤は、スペイン薬局方および合衆国薬局方並びに類似の文献、テキストに記載または参照された方法など普通の方法を用いて調製される。
【０１９２】
本発明において使用される化合物または組成物の投与は、たとえば静脈内注入、経口投与、腹腔内および静脈内投与など任意の適切な方法によって得ることができる。それにもかかわらず、好ましい投与経路は患者の疾患に依存する。経口投与は患者および治療されるべき疾患の慢性的性質にとって楽であり好ましい。
【０１９３】
治療用途にとって、本発明の組成物は医薬的に許容される、実質的に純粋な形態が好ましく、すなわち、本発明の組成物は、薬学的に許容される添加剤を除き、そして通常の剤形レベルで毒性であると考えられる物質を含まない、薬学的に許容される純度レベルを有する。
【０１９４】
本発明による非免疫原性コンジュゲートの治療的な有効量は、一般的に、いくつかある要因の中で特に、治療されるべき個人、上記個人が罹る疾患の重症度、選択された投与形態などに依存する。この理由として、本発明で示した投与量は当業者にとってのガイドとして考慮されるべきであり、選択された投与形態に依存する有効量は既に記載されたすべてに従う投与量に適応させられるべきである。それにもかかわらず、コンジュゲートは１日につき１回以上、たとえば１日につき１、２、３または４回、通常の１日の全量が１乃至２００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１乃至１０ｍｇ／ｋｇ体重の間に含まれるように、投与され得る。同様に、コリンキナーゼ阻害剤は１日につき１回以上、たとえば１日につき１、２、３または４回、通常の１日の全量が１乃至２００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１乃至１０ｍｇ／ｋｇ体重の間に含まれるように、投与され得る。
【０１９５】
非免疫原性コンジュゲートは薬剤として使用され得、従って、本発明は、非免疫原性コンジュゲート、上記コンジュゲートをコードするポリヌクレオチド、上記ポリヌクレオチドを含んでなるベクターもしくは遺伝子構築体、ポリヌクレオチド、遺伝子構築体もしくはベクターを含んでなる宿主細胞、または上記コンジュゲートを含んでなる医薬の、薬剤としての使用に関する。
【０１９６】
本発明による非免疫原性コンジュゲートは、当該コンジュゲートがその細胞型に対してアフィニティーを示す細胞へ特に生物活性化合物を輸送するためのものとされる。実施例１に示されているように、当該コンジュゲートはＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１９、Ｆ４８０またはＣＤ１１７を発現する細胞に結合することができる。化合物が細胞傷害性または増殖抑制遺伝子を阻害することができる場合において、当該化合物は上述した細胞の１以上の型が望ましくない増殖が起こる疾患の治療のために使用することができる。しかしながら、化合物はまた任意の上記した細胞型の特性を復元するために適切な化合物の輸送のために使用される。化合物は細胞に失った活性を供給し、または細胞の任意の特性の消失に関与する遺伝子を阻害するであろう。
【０１９７】
それゆえ、別の側面において、本発明は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１９、Ｆ４８０もしくはＣＤ１１７陽性細胞またはこれらの組合せからなる群から選ばれる細胞の望ましくない増殖または望ましくない活性によって特徴づけられる疾患を治療するための方法であって、患者に上記コンジュゲートをコードするポリヌクレオチド、上記ポリヌクレオチドを含んでなるベクターもしくは遺伝子構築体、ポリヌクレオチド、遺伝子構築体もしくはベクターを含んでなる宿主細胞、または上記コンジュゲートを含んでなる医薬を投与することを含んでなる方法に関する。好ましい実施形態において、非免疫原性コンジュゲートは細胞傷害性化合物を含んでなり、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１９、Ｆ４８０またはＣＤ１１７を発現する細胞の望ましくない増殖によって特徴づけられる疾患を治療するために使用されることができる。
【０１９８】
サイトトキシン（細胞毒素）または細胞毒素薬は細胞に対して有害な（たとえば、細胞を殺す）あらゆる物質を含む。当技術分野において知られているこれらのクラスの薬およびこれらの作用機序の説明として、Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  Ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１９９０を参照されたい。抗体抗毒素の調製に関連する追加的な技術は、たとえばＶｉｔｅｔｔａ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ  １４，２５２（１９９３）およびＵＳ５，１９４，５９４において提供される。本発明のために有用な免疫コンジュゲートを形成する適切な治療薬としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシテトラヒドロアントラセンジオン,ミトキサントロン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロ−テストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシン、代謝拮抗物質（たとえば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、５−5-フルオロウラシル、ダカルバジン、ヒドロキシウレア、アスパラギナーゼ、ゲムシタビン、クラドリビン）、アルキル化剤（たとえば、メクロルエタミン、チオエパ、クロランブシル、メルファラン、カルマスティン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、プロカルバジン、マイトマイシンＣ、シスプラチンおよび他のプラチナ誘導体、たとえばカルボプラチン）、抗体（たとえば、ダクチノマイシン（元はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ダウノルビシン（元はダウノマイシン）、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、カリケアマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ））、ジフテリア毒素および関連分子（たとえば、ジフテリアＡ鎖およびその活性フラグメントおよびハイブリッド分子）、リシン毒素（たとえば、リシンＡまたは脱グリコシルリシンＡ鎖毒素）、コレラ毒素、志賀様毒素（ＳＬＴ−Ｉ，ＳＬＴ−ＩＩ，ＳＬＴ−ＩＩＶ）、ＬＴ毒素、Ｃ３毒素、志賀毒素、百日咳毒素、破傷風毒素、大豆Ｂｏｗｍａｎ―Ｂｉｒｋプロテアーゼ阻害剤、緑膿菌外毒素、アロリン、サポリン、モデシン、ガラニン、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、αアルシン、シナアブラギリタンパク、ジアンシンタンパク、ヨウシュヤマゴボウタンパク（ＰＡＰＩ，ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、苦瓜阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリアオフィシナリス阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、およびエノマイシン毒素が挙げられる。本明細書の他の箇所に記載された抗体と一緒に投与され得る治療薬は、本発明で使用される抗体コンジュげーションのために有用な治療成分の候補でもあり得る。さらに、細胞���害性化合物がポリペプチドの場合、これとしては、アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素またはジフテリア毒素などの酵素的に活性な毒素もしくはその活性フラグメント；腫瘍壊死因子もしくはインターフェロンγなどのタンパク質、リンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、もしくは他の成長因子およびミトコンドリアから単離されたアポトーシス誘導タンパク質などの生物学的応答調節剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９９】
ＣＤ４陽性細胞を破壊することが望ましいとされる疾患は、たとえば自己免疫疾患；たとえば、全身性エリテマトーデス（紅斑性狼瘡）、関節リウマチ、変形性関節症（骨関節炎）、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症、突発性炎症性筋疾患、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、甲状腺炎、糖尿病、免疫介在性腎疾患、中枢または末梢神経系の脱髄疾患、突発性脱髄性多発性神経障害、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、肝胆汁性疾患、感染性または自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、肉芽腫性肝炎、硬化性胆管炎、炎症性腸疾患（炎症性大腸炎）、グルテン過敏性腸疾患、ウィップル病、自己免疫性または免疫性介在性皮膚疾患、水疱性皮膚疾患、多形性紅斑、接触性皮膚炎、乾癬、アレルギー性疾患、ぜんそく、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食品に対する過敏性、蕁麻疹、肺の免疫疾患、好酸球性肺炎、特発性肺線維症、過敏性肺炎、移植関連疾患、移植片拒絶または移植片対宿主病；において起こるような自己ターゲットまたは器官に対するＣＤ４細胞の増大する活性が存在する状況において、ＣＤ４発現細胞の増殖阻害を促進するためのＨＩＶ−１感染である。
【０２００】
ＣＤ８陽性細胞の望ましくない増殖または望ましくない活性によって特徴づけられる疾患は、自己抗原に対する免疫応答または無毒の外来抗原（すなわち、非細胞変性ウイルスまたは自己抗原を模倣したウイルスの感染）に対する不適切な免疫応答の結果として生じる免疫介在性疾患である。
【０２０１】
本明細書で、「自己免疫疾患」という言葉は、被検体のそれ自身の細胞、組織および／または器官（臓器）に対する免疫応答により引き起こされる細胞、組織および／または器官損傷によって特徴付けられる被検体における疾患をいうものとする。本発明の細胞集団で治療され得る自己免疫疾患の説明に役立つ、非制限的な実例としては、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎および精巣炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアック病（セリアックスプルー皮膚炎）、慢性疲労免疫機能障害症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、クレスト症候群、寒冷凝集素症、円板状ループス（紅斑性狼瘡）、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛  線維筋炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ神経障害、若年性関節炎、扁平苔癬、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、Ｉ型または免疫介在性糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変症、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、サルコイドーシス、強皮症、全身性進行性硬化症、シェーグレン症候群、グッドパスチャー症候群、スティフマン症候群、全身性エリテマトーデス（紅斑性狼瘡）、エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、疱疹状皮膚炎性血管炎等の血管炎、白斑、ウェゲナー肉芽腫症等が挙げられる。
【０２０２】
無毒の外来抗原（すなわち、非細胞変性ウイルスまたは自己抗原を模倣したウイルスの感染）に対する不適切な応答の結果として生じる疾患は、ＨＩＶ−１誘導性神経疾患、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス（ＴＭＥＶ）介在性多発性硬化症、ＨＳＶ誘導性重症筋無力症、ロタウイルス誘導性膵島自己免疫などを含む。
【０２０３】
ＣＤ１１ｃ陽性細胞の望ましくない増殖または望ましくない活性によって特徴づけられる疾患は、任意のＢ細胞系統悪性腫瘍、たとえばリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、マントル（外套）細胞リンパ腫、バーキット型白血病、多発性骨髄腫、急性リンパ性白血病などを含む。
【０２０４】
本発明は以下の実施例によって説明されるが、かかる実施例は本発明の範囲の単なる実例的なものであり、限定的ではないものとして構成されるべきものである。
【実施例】
【０２０５】
実施例１．モジュリンペプチドは脾細胞の細胞表面に結合することができる。モジュリン由来ペプチドに結合することができる亜集団の解析
材料および方法
本解析で使用したペプチドは表３に示されるとおりであった。
【表３】
2012510284.tif 000007
【０２０６】
結合アッセイは脾細胞（図１、パネルＡ、Ｂ、Ｄ、ＥおよびＧ）または骨髄由来樹状細胞（図１、パネルＣおよびＦ）のいずれかを用いて行われた。細胞は０．４％グルタルアルデヒド溶液を用いて４℃で１５分間インキュベーションすることにより固定された。５×１０５の固定化された細胞は２０μＭのＣＦＳＥαＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ（図１、パネルＡ、ＢおよびＣ）またはＣＦＳＥγＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ（図１、パネルＤ、Ｅ、ＦおよびＧ）の存在下でインキュベートされた。いくつかのアッセイにおいて、ＣＦＳＥ標識ペプチド結合の特異性を調べるために、これらのインキュベーションは非標識ペプチド、αＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ、γＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬまたはＳＩＩＮＦＥＫＬ（１００μＭ）の存在下または非存在下において行われた（パネルＢおよびＥ）。また、我々はネガティブ・コントロールとしてＣＦＳＥ標識ペプチド、ＣＦＳＥ−ＯＶＡ（２３５−２６４）を用いて結合アッセイを行った（図１、パネルＡ、Ｃ、ＤおよびＦ）。４℃で３０分インキュベーション後、ＰＢＳで２回洗浄が行われ、付された標識がフローサイトメトリーにより解析された。いくつかの実験において（図１Ｇ）、ＣＦＳＥ−γＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドと一緒にフィコエリトリン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）で標識された抗ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１９、Ｆ４８０またはＧＲ１（ＣＤ１１７）抗体を用いて二重染色が行われた。これらの場合において、特異的抗体での標識は細胞をグルタルアルデヒドで固定する前に行われた。上述したとおり、いくつかの場合において、以下に示すように得られる骨髄由来樹状細胞について、ＣＦＳＥγＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬもしくはＣＦＳＥαＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬまたはＣＦＳＥ−ＯＶＡ（２３５−２６４）コントロールペプチドにより標識実験が行われた（図１Ｃおよび１Ｆ）。
【０２０７】
結果および考察
効果的な免疫応答を誘導するために免疫原の活性を促進することができる特徴のひとつは、抗原提示細胞によって効果的に捕獲される免疫原の能力である。モジュリンペプチドはこの能力をもつことができた。なぜなら、モジュリンペプチドはＴＬＲ２シグナル経路を活性化することができ、抗原提示細胞は表面にこの分子（ＴＬＲ２）を発現することができることが記載されているからである。しかしながら、モジュリンペプチドが抗原提示細胞の表面に結合するという実験的な証拠はない。このような理由により、フローサイトメトリーにより細胞表面に結合する能力を解析するために、オボアルブミンの細胞傷害Ｔ決定基ＳＩＩＮＦＥＫＬに結合したγモジュリン配列およびペプチドのアミノ末端に結合したＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインジアセテートサクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ））蛍光染料を含むＣＦＳＥ−γＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドが合成された。
【０２０８】
それゆえ、図１に示されるように、ＣＦＳＥ−αＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドが脾細胞に結合するということが分かった。実際、ＣＦＳＥ−αＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬでインキュベートされた脾細胞は、ＣＦＳＥ標識された不適切なペプチドＣＦＳＥ−ＯＶＡでインキュベートされた脾細胞に比べて高い蛍光強度を示した（図１Ａ）。この陽性シグナルは、非標識ペプチドαＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬの添加によって著しく阻害されたが、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドでは阻害されず（図１Ｂ）、ＣＦＳＥ−αＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬで得られるシグナルは特異的で、かつαモジュリンの存在に関係しているということを示唆している。ＣＦＳＥ−αＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬのこの結合能力は、骨髄由来樹状細胞が使用された場合、明確に観察された（図１Ｃ）。ＣＦＳＥ−γＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを使用したとき、類似の結果が見られた（図１Ｃ，ＤおよびＥ）。この場合、２つの蛍光ピーク（一方は低蛍光発光で（ｌｏｗ）、他方は高蛍光発光で（ｂｒｉｇｈｔ））が見られた。ＣＦＳＥ標識された不適切なペプチドＣＦＳＥ−ＯＶＡ（２３５−２６４）で得られた蛍光発光は、ＣＦＳＥ−γＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ（図１Ｄ）で観察された低蛍光ピークに類似しており、このセカンドピークは非特異的結合によるものであったということを示唆している。ＣＦＳＥを含んでおらず、それゆえその受容体に対してＣＦＳＥ−γＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドと競合する、γＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを用いたインキュベーションはｂｒｉｇｈｔ蛍光発光を減少させた（図１Ｅ点線参照）。しかしながら、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを用いたインキュベーションはこのシグナルに影響を及ぼさず、細胞表面へのペプチドの結合がγモジュリン配列の作用によるものであることを示唆している。
【０２０９】
ＣＦＳＥ−αＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドの場合のように、ＣＦＳＥ−γＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドも骨髄由来樹状細胞を染色することができた（図１Ｆ）。ＣＦＳＥ−γＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドと一緒にフィコエリトリン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）で標識された抗ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１９、Ｆ４８０またはＧＲ１（ＣＤ１１７）抗体を用いて二重染色が行われた場合（図１Ｇ）、約２４．４％のＣＤ４陽性細胞、１７．８％のＣＤ８陽性細胞、６２．１％のＣＤ１１ｃ細胞、５２．８％のＣＤ１９細胞、６６．２％のＦ４８０細胞および２７．３％のＧＲ１陽性細胞がＣＦＳＥ−γＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドで染色されたということが発見され、γモジュリンがこれらの細胞に結合したことを示唆する。
【０２１０】
このデータは、αモジュリンおよびγモジュリンは特定の細胞サブタイプに、特に抗原提示細胞に特異的に結合し、抗原に対する特異的細胞応答を活性化する時に、これらの細胞へ抗原を輸送するしながら、非常に有用な特性を有することを示唆している。
【０２１１】
実施例２．α−モジュリンおよびγ−モジュリンペプチドは樹状細胞の成熟および抗原提示を活性化させる
材料および方法
骨髄由来樹状細胞の産生
樹状細胞は骨髄細胞から成長させた。ＡＣＫ溶解バッファーで赤血球を溶解した後、細胞を洗浄し、リンパ球および顆粒球は抗ＣＤ４（ＧＫ１；ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、ＣＤ８（５３．６．７２；ＡＴＣＣ）、Ｌｙ−６Ｇ／Ｇｒ１(ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ)およびＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）抗体の混合物さらにウサギ補給剤を用いたインキュベーションによって取り除かれた。維持細胞は、２０ｎｇ／ｍｌのｍＧＭ−ＣＳＦおよび２０ｎｇ／ｍｌのｍＩＬ−４（双方、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；Ｌｏｎｄｏｎ，ＧＢから入手）で補給された１０６細胞／ｍｌの完全培地で、１２培養プレートで増殖した。２日ごとに、培地はサイトカインを含む新しい培地で置換された。７日目に、非接着樹状細胞が集められ、５０μＭのモジュリンペプチドまたは１μｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ）の存在下または非存在下で培養され、３７℃および５％ＣＯ２で４８時間インキュベートされた。この期間後、細胞は単離され、抗ＩＡｂ、ＣＤ５４、ＣＤ８６抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いてインキュベートされた。並列実験として、樹状細胞は意図された刺激剤で１６時間インキュベートされ、その後ＩＬ−１２のｐ４０分子およびＴＮＦ−αのためのメッセンジャーＲＮＡの発現が解析された。
【０２１２】
ＩＬ−１２  ｐ４０およびＴＮＦαメッセンジャーＲＮＡの発現の解析
上記した異なる刺激剤で１６時間インキュベートされた樹状細胞の全ＲＮＡは、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｌｙｓｉｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）およびＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ６１００  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ＰｒｅｐＳｔａｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）ｓｅｍｉａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｓｙｓｔｅｍを用いて抽出された。ＤＮａｓｅを用いた処理、逆転写、並びにＩＬ１２のｐ４０サブユニットおよびＴＮＦαのｍＲＮＡの発現が定量的リアルタイムＰＣＲは、これらのサイトカインの特異的プライマーを用いて先述したとおりに行われた（Ｚａｂａｌａ，Ｍ．，ｅｔ  ｔｏ  ｔｈｅ  ２００７．Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ４７：８０７−８１５）。メッセンジャーＲＮＡ定量値は式：２ΔＣｔ、ここでΔＣｔはコントロール遺伝子（βアクチン）と研究対象の遺伝子との間の閾値回路における差異を意味する、を用いて算出された。
【０２１３】
成熟マーカーのアップレギュレーション
ＤＣ成熟マーカーの発現はフローサイトメトリーによって測定された。ＤＣは採取され、一次抗体の非特異的結合をブロックするために、ラット抗ＣＤ１６／３２  ｍＡｂ（２．４Ｇ２  ｃｌｏｎｅ，  ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて１５分間プレインキュベートされた。この最初のインキュベーション後、細胞は４℃で１５分間一次抗体で染色され、洗浄され、ＦＡＣＳｓｃａｎ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）で獲得され、およびＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析された。使用された抗体は、抗Ｈ−２Ｋｂ（ＡＦ６−８８．５クローン）、抗ＣＤ５４（３Ｅ２クローン）、抗ＣＤ８６（ＧＬ１クローン）および抗ＣＤ１１ｃ（ＨＬ−３クローン）（すべてＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ製）であった。
【０２１４】
抗原提示アッセイ
骨髄由来樹状細胞は１０μＭの所望のペプチドの存在下または非存在下で培養された（図３）。４０時間後、細胞は洗浄され、９６ウェルプレートに異なる濃度で分配され、ＯＴ−１トランスジェニックマウス（トリ卵白アルブミンのＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド特異的Ｔ細胞受容体を発現する）から得られた１０５Ｔ細胞／ウェルの存在下で培養された。４２時間後、トリチウム化チミジンを培養物に加え、６時間後、細胞を集め、取り込まれたチミジンをシンチレーションカウンター（Topcount  Packard）により分析した。
【０２１５】
結果および考察
樹状細胞（ＤＣ）の成熟
樹状細胞（ＤＣ）の成熟はＴリンパ球応答の最適な刺激を要求する。成熟が起こるとき、ＡＰＣｓはＭＨＣクラスＩ（このモデルのＨ２Ｋｂ）およびＭＨＣクラスＩＩ（このモデルのＩＡｂ）並びにＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６分子等の細胞表面分子の発現を増大させる。それゆえ、α−モジュリンまたはγ−モジュリン由来のペプチドＥＤＡ−ＳＩＩＮＦＥＫＬが骨髄由来樹状細胞の成熟を誘導するかどうかが解析された。そのために、樹状細胞は材料および方法において示されたように培養され、これらの成熟マーカーの発現を観察するためにフローサイトメトリーにより解析された。図２Ｃから、α−モジュリンまたはγ−モジュリンの添加はこれらの中のいくつかのマーカーの過剰発現を誘導するかもしれないことが観察される。特に、α−モジュリンはＣＤ５４、ＣＤ８６およびＩＡｂ分子の発現を活性化し、これに対して、γ−モジュリンはＣＤ５４およびＩＡｂ分子の発現を促進する。このようなデータは、モジュリンが樹状細胞の成熟を刺激することによって、抗原に対する免疫応答の活性化における促進効果を有することを示唆する。
【０２１６】
ＩＬ−１２およびＴＮＦ−αサイトカインのメッセンジャーＲＮＡの発現を解析すると（それぞれ、図２Ａおよび２Ｂ）、α−およびγ−モジュリンは、これらのｍＲＮＡｓの発現をある程度増大させることができることが発見され（α−もしくはγ−モジュリンで、または培地のみで培養されたＤＣのｍＲＮＡ発現を比較したとき、双方の場合においてｐ＜０．０５）、それらは、抗原に対する免疫応答の活性化を助ける、これら炎症誘発性のサイトカインの分泌を促進することができる、ということを示唆している。
【０２１７】
モジュリンペプチドの樹状細胞の表面に結合する、および樹状細胞の成熟を活性化する能力が一旦解析されたら、それらが共有結合するＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドが抗原提示を促進するかどうかが研究された。そして、樹状細胞を１０μＭのペプチド：αＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ、γＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ、ＯＶＡ（２３５−２６４）、αＭｏｄ、γＭｏｄまたはＳＩＩＮＦＥＫＬ単独で培養し、およびこれらの細胞がＯＴ−１マウスのＴリンパ球（ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドのための特異的Ｔ細胞受容体を有する）の増殖を活性化させるための提示細胞として使用されたとき、それが樹状細胞の表面のＭＨＣクラスＩ分子に直接に結合するので、樹状細胞が抗原プロセッシングを必要としないＳＩＩＮＦＥＫＬ単独でインキュベートされたときに、Ｔリンパ球がより増殖することが見出された。しかしながら、抗原プロセッシングを必要とするあれらのペプチド（より長いペプチド）を比較すると、αＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬまたはγＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬで培養された樹状細胞は、ＯＶＡ（２３５−２６４）ペプチド（ｐ＜０．０５）（で培養された樹状細胞）に比べて、ＯＴ−１  Ｔ細胞増殖を非常によく刺激したということが見出された。したがって、図２Ｄから分かるように、α−モジュリンまたはγ−モジュリンの存在は、ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的Ｔリンパ球が自己の増殖を改善するために、ＳＩＩＮＦＥＫＬのプロセッシングおよび樹状細胞によるその提示を助ける。
【０２１８】
実施例３Ａ．細胞傷害性ＳＩＩＮＦＥＫＬ抗原に結合するモジュリン由来ペプチドを用いた、およびいくつかのＴＬＲリガンドを併用した、免疫は抗原に対する細胞傷害応答の活性を誘導する。この細胞傷害応答は長く続き、かつＥＧ．７ＯＶＡ腫瘍細胞を皮下注射したマウスを保護する
【０２１９】
材料および方法
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のインビボ誘導の測定（インビボキリング）および免疫後ＩＦＮ−γ産生細胞のインビボ誘導の測定（ＥＬＩＳＰＯＴ）
【０２２０】
Ｃ５７ＢＬ６マウスは５０μｇのＴＬＲ３リガンドポリＩ：Ｃを併用して５ｎモルの所望のペプチドで静脈免疫された。いくつかの場合において、ペプチドはＴＬＲ２リガンド（ペプチドグリカン）、ＴＬＲ４リガンド（ＬＰＳもしくはＥＤＡタンパク質）またはＴＬＲ９（ＣｐＧ）リガンドの存在下で免疫された。免疫後７日目、マウスは５×１０６脾細胞、その半分は０．２５μＭのＣで予め標識され、残りの半分は２．５μＭのＣＦＳＥで（予め標識され）、並びにＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（１０μｇ／ｍｌ）の混合物を静脈注射された。翌日、マウスを犠牲死し、低くＣＦＳＥ標識された細胞に対する高くＣＦＳＥ標識された細胞の数を定量するために、脾細胞がフローサイトメトリーにより解析された。それゆえ、細胞傷害性ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを用いてインキュベートされた細胞中溶解した細胞のパーセンテージは、インビボキリングと呼ばれる実験において算出され得る。
【０２２１】
ＳＩＩＮＦＥＫＬに対して特異的な、および免疫付与によりインビボ誘導されたＩＦＮγ産生細胞の解析のために、ＥＬＩＳＰＯＴ実験がＢＤ−ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）キットを用いて、その製造会社の取扱説明書に従って行われた。簡単にいうと、抗ＩＦＮγ抗体を用いてオーバーナイトでインキュベートされたプレート（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ  ＨＴＳ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）は２時間１０％ウマ血清を含むＨＬ−１培地（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）でブロックされた。それゆえ、５×１０５の脾細胞は抗原の非存在下または存在下で３７℃、５％ＣＯ２で３倍インキュベートされた。翌日、プレートはＰＢＳで洗浄され、ビオチン化抗ＩＦＮγ抗体（２ｍｇ／ｍｌ）でインキュベートされた。２時間後、プレートは洗浄され、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼの１／１００希釈液で培養された。１時間後、ウェルは洗浄され、ＡＥＣ基質セット（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて成長させた。比色反応は蒸留水で止められ、スポットの数がＥＬＩＳＰＯＴ自動リーダー（ＣＴＬ，Ａａｌｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて定量された。
【０２２２】
ＥＧ７腫瘍細胞発現ＯＶＡタンパク質を抗原投与することに対する防衛
Ｃ５７ＢＬ６マウスは、５ｎモルの適合するペプチドでポリＩ：Ｃを併用して静脈免疫された。免疫後７日目、マウスは５×１０５または５×１０７ＥＧ７ＯＶＡ細胞を静脈注射された。いくつかの実験では、マウスは最初５×１０５細胞を皮下注射で投与され、腫瘍が直径５ｍｍに達したとき適合するペプチドで処理された。腫瘍成長はゲージで調節された。マウスを、腫瘍が４ｃｍ３を超える大きさに達したとき犠牲死させた。各免疫原に対するマウス生存のカプラン−マイヤープロットが示される。
【０２２３】
結果および考察
図３に示すとおり、Ｃ５７ＢＬ６マウスのαＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬまたはγＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを用いた免疫は、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを用いた刺激に応答して、強力な細胞傷害応答（図３Ｂ）およびＩＦＮγの産生（図３Ａ）を誘導する。しかしながら、ＳＩＩＮＦＥＫＬ非含有ペプチドはこれらの応答を活性化することができない。α−モジュリンまたはγ−モジュリンペプチドとＳＩＩＮＦＥＫＬとの組合せにおいて、後者が共有結合していない組合せも同様である。これらの免疫原の長期間続く応答を活性化する能力も研究された。誘導された応答が免疫後６０日目に解析されたとき、ＳＩＩＮＦＥＫＬに結合したαまたはγ−モジュリン由来ペプチドは特異的細胞応答（図３Ｃ、ＥＬＩＳＰＯＴによるＩＦＮγ産生細胞、および図３Ｄ、インビボｋｉｌｌｉｎｇにより測定された溶解能力を有する細胞）を誘導することができ、その応答はＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドとポリＩ：Ｃアジュバントの組合せでは誘導することができないということがわかった。これらの結果は、αまたはγ−モジュリンペプチドへの細胞傷害性決定基の共有結合が、それに細胞傷害性抗原に対する長続きする細胞傷害性細胞応答の誘導のために不可欠な特性を提供するということを示唆する。この特性は、および既述の図において観察された結果によれば、抗原を提示細胞へ輸送するモジュリンペプチドの能力によって測定することができる。提示細胞への抗原の結合は、当該細胞の成熟およびより効率的な方法での細胞障害性決定基の提示をさらに助長することができる。そして、このことは、ポリＩ：Ｃ、ＴＬＲ３リガンドなどのアジュバントの援助とともに、細胞応答の活性化を極めて大きく促進することができるであろう。
【０２２４】
他のＴＬＲリガンドのモジュリン由来ペプチドとの結合のそれらのＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに対する細胞傷害性応答の活性化を促進する能力に及ぼす効果も研究された。図４に示されるとおり、モジュリン由来ペプチド（αＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬおよびγＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ）のＴＬＲ３およびＴＬＲ９リガンドとの結合、およびＴＬＲ４リガンドとのより弱い程度の結合は、免疫応答の活性化に対して相乗的な効果を有する。このデータは、将来的なワクチン設計のために、モジュリンペプチドがこれらのリガンドと結合することができることを示唆している。
【０２２５】
モジュリン由来ペプチドのＳＩＩＮＦＥＫＬ抗原に対する細胞傷害性応答を活性化する能力が実証されたので、これらの免疫原の、ＥＧ７ＯＶＡ腫瘍細胞が注入されたマウスを守る能力を評価した。従って、マウスを、ポリＩ：Ｃアジュバントと一緒に図５Ａおよび５Ｂに示されるように５ｎモルのペプチドで静脈免疫した。免疫後７日目、５×１０５（Ａ）または５×１０７（Ｂ）ＥＧ７ＯＶＡ細胞を静脈注射した。αＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ（図５Ａ）またはγＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ（図５Ｂ）を用いた免疫は、マウスを腫瘍成長から防衛するということが観察された。ＳＩＩＮＦＥＫＬまたは生理食塩水で免疫された全てのマウスは腫瘍を成長させた。我々はまたモジュリン由来ペプチドの静脈内腫瘍を有するマウスを治療する能力をテストした。この場合、ＥＧ７ＯＶＡ腫瘍を有するマウスは、γＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬおよびポリＩ：Ｃ、γＭｏｄおよびＳＩＩＮＦＥＫＬ（共有結合していない）並びにポリＩ：Ｃ、ＳＩＩＮＦＥＫＬおよびポリＩ：Ｃ、ポリＩ：Ｃのみ、またはポリＩ：Ｃおよび生理食塩水で治療され、腫瘍成長が評価された。γＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬでのマウスの治療は、残りの治療で０％であったのに比べて（図６、ｐ＜０．０５）、マウスの約３８％において腫瘍を拒絶することができた。これらのデータは、αまたはγモジュリンペプチドが、病原体または癌に対するワクチン戦略の開発において担体またはアジュバントとして使用され得るということを示す。
【０２２６】
次いで、ＳＩＩＮＦＥＫＬと異なる別の抗原を用いて、モジュリンペプチドの免疫刺激性能力がテストされ、その結果が再現されるかどうかを確認した。モジュリン由来ペプチドはＣ型肝炎ウイルス由来の非構成性タンパク質ＮＳ３（ＨＬＡ−Ａ２制限ＮＳ３ペプチド１０７３−１０８１，配列ＣＶＮＧＶＣＷＴＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０））由来のよく特徴づけられた細胞傷害性Ｔ細胞決定基と結合することができた。それゆえ、ペプチドαＭｏｄ−１０７３、γＭｏｄ−１０７３およびδＭｏｄ−１０７３だけでなくペプチドｐ１０７３単独が合成された。ＨＨＤトランスジェニックマウス（ヒトＨＬＡ−Ａ２分子を発現する）はポリＩ：Ｃの存在下で５ｎモルの相当するペプチドで免疫された。免疫後７日目、ＥＬＩＳＰＯＴおよびインビボキリングアッセイが、上述したとおりペプチド１０７３でパルスされた標的細胞を用いて行われた。図７Ａおよび７Ｂに示されるように、ペプチド１０７３に結合したαＭｏｄ、γＭｏｄおよびδＭｏｄの存在は、マウスがペプチド１０７３およびポリＩ：Ｃで注射された場合には観察できなかった、強力な当該ペプチド特異的Ｔ細胞免疫応答の誘導を許容した。実際、αＭｏｄ−１０７３、γＭｏｄ−１０７３およびδＭｏｄ−１０７３で免疫されたマウスはペプチド１０７３特異的ＩＦＮγ産生細胞の数が多く（図７Ａ）、ＣＴＬ活性のレベルも高い（図７Ｂ）。
【０２２７】
まとめると、このデータは抗原へのα−モジュリン、γ−モジュリンおよびδ−モジュリンの結合は抗原提示細胞へ抗原を輸送すること、それらの成熟および抗原提示の促進を助けることを示す。この特性は、これらの免疫原がＴＬＲ３、４または９と結合して、抗原に対する強力な細胞傷害性細胞応答をインビボで誘導し、当該抗原を発現する腫瘍細胞またはウイルス抗原を発現する細胞の成長からマウスを守る。
【０２２８】
それゆえ、モジュリン由来ペプチドは、目的の抗原に対する細胞応答の誘導のために非常に適切なベクターを形成することができる。これらのペプチドを基にする融合タンパク質の構築体には、腫瘍性疾患または感染因子によって引き起こされる疾患に対するワクチン接種プロトコルにおける適切な戦略が含まれる。
【０２２９】
実施例３Ｂ．ポリＩ：Ｃを併用したαＭｏｄ−Ｅ７（４９−５７）を用いた免疫は、ペプチドＥ７（４９−５７）に対する特異的細胞傷害性応答を誘導し、ＴＣ１静脈内腫瘍をキャリーするマウスを治療することができる
【０２３０】
材料および方法
以下のペプチドがこのセクションで使用された。
【表４】
2012510284.tif 000008
【０２３１】
免疫後ＩＦＮ−γのインビボ誘導の測定（ＥＬＩＳＰＯＴ）
Ｃ５７ＢＬ６マウスは、５０μｇのＴＬＲ３リガンドであるポリＩ：Ｃと併用して、５ｎモルの適合するペプチドで静脈免疫された。ペプチドＥ７（４９−５７）の存在下における、および免疫付与によってインビボ誘導されたＩＦＮ−γ産生細胞の解析のために、その動物を免疫後７日目に犠牲死し、ＥＬＩＳＰＯＴ実験が、上述したとおりＢＤ−ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）キットを用いて、抗原としてＥ７（４９−５７）を用いて行われた。
【０２３２】
ＴＣ１腫瘍細胞が発現するＨＰＶウイルス（ヒトパピローマウイルス１６）のＥ７タンパク質抗原投与に対する防衛
Ｃ５７ＢＬ６マウスに、５×１０５ＴＣ−１腫瘍細胞（ＨＰＶ−１６ウイルスのＥ７タンパク質を発現する）を静脈注射した。２５日後、腫瘍の直径が８ｍｍに達したとき、マウスに、ＰＢＳ（Ｂ）、ペプチドＥ７（４９−５７）および５０μｇ／ｍｌポリＩ：Ｃ（Ｃ）、またはペプチドαＭｏｄ−Ｅ７（４９−５７）および５０μｇ／ｍｌポリＩ：Ｃ（Ｄ）を静注し、処理する。７日後、マウスは同一免疫原の二次免疫を受けた。腫瘍サイズは、２つの直交する直径の平均として示され、ゲージを用いて通常の間隔で測定された。グループごとの全マウスの数に対する腫瘍のないマウスの数が治療ごとに含まれる。
【０２３３】
結果および考察
先の実験では、モジュリン由来ペプチドは脾細胞の表面に結合すること、抗原提示細胞の成熟を活性化すること、および抗原を輸送するキャリアーとして作用することができ、その結果これらのモジュリン由来ペプチドと、ＴＬＲリガンドと結合したＳＩＩＮＦＥＫＬ等の細胞傷害性Ｔ決定基との融合タンパク質を用いた免疫が、強力なインビボでの細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導すること、およびＥＧ７ＯＶＡ腫瘍細胞発現抗原投与後のマウスを防衛できることが実証された。本発明が、ＥＧ７ＯＶＡ腫瘍モデルで観察されるこの治療効果が他のモデルへ外挿され得るかどうかを理解できる。
【０２３４】
子宮頸癌は世界中で女性において最も日常的な腫瘍のひとつであり、一般的にも５番目に頻繁に起こる腫瘍であり、推定患者数は１．４百万人である。様々なタイプのmucosatropicヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）による慢性生殖管感染症が、子宮頸癌を引き起こすという一貫した証拠がある。それゆえ、ＨＰＶは子宮頸部発癌イニシエーターとして作用し、その悪性転換は他の因子との相互作用に依存すると仮定されている。
【０２３５】
子宮癌に対し現在使用されている、ガーダシルと呼ばれている米国Ｍｅｒｃｋ社ワクチンは、全ての子宮癌ケースの約７０％の起源であるＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１７ウイルス株による感染の予防のためと提示されている。このワクチンは、非常に若年時（１１−１２歳）の女性に投与されたとき、この疾患の予防において有効であることが証明されている。しかしながら、このワクチンは子宮癌が後年時に現れたときの治療のためには提示されていない。
【０２３６】
ＨＰＶ−Ｅ６およびＥ７の発癌性タンパク質の発現は、悪性転換の開始および維持のため、およびＨＰＶ誘発病変の臨床的および細胞学的な解決に関連するＥ７に対する細胞免疫のために必要である。したがって、腫瘍抗原としてＨＰＶ１６  Ｅ７抗原を発現するＴＣ１腫瘍モデルが使用されている。一旦、腫瘍細胞の静脈注射後、直径が８ｍｍに達するまで、腫瘍が形成された場合、その動物は異なる選択肢をワクチン接種された。ペプチドαＭｏｄ−Ｅ７（４９−５７）およびポリＩ：Ｃで免疫を受けたそれらの動物は腫瘍を完全に除去することが発見された。それゆえ、この免疫原で処理された１１のマウスのうち１１が治療されたのに対し、マウスがペプチドＥ７（４９−５７）で処理された場合、１１のマウスのうち４のみが腫瘍の排除を達成できた。これらのデータは、融合ペプチドαＭｏｄ−Ｅ７（４９−５７）またはモジュリン由来ペプチドおよびＨＰＶ抗原の間の融合に基づく類似ペプチドはヒト子宮頸癌に対する代替治療の開発のために考慮され得るということを示唆している。
【０２３７】
実施例４．モジュリン由来ペプチドの抗原に対する細胞応答を誘導する能力はＴＬＲ２経路の活性化と無関係である
材料および方法
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のインビボ誘導（インビボキリング）およびＴＬＲ２ＫＯマウスにおける免疫後ＩＦＮ−γ産生細胞のインビボ誘導（ＥＬＩＳＰＯＴ）の測定
Ｃ５７ＢＬ６野生型マウスおよびノックアウトマウスを、モジュリン由来ペプチドの免疫刺激性能力におけるＴＬＲ２への依存性を研究する目的で、ＴＬＲ２で免疫した。それゆえ、異なるマウスが５ｎモルの適合するペプチドまたはＰＢＳで、５０μｇのＴＬＲ３リガンドであるポリＩ：Ｃと一緒に免疫された。免疫後７日目、マウスに、５×１０６脾細胞（その半分は０．２５μＭのＣで、残りの半分は２．５μＭのＣＦＳＥで予め標識された）およびＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（１０μｇ／ｍｌ）の混合物を静脈注射した。翌日、実施例３と同じ方法で、マウスを犠牲死し、低くＣＦＳＥ標識された細胞に対する高くＣＦＳＥ標識された細胞の数を定量するために、脾細胞がフローサイトメトリーにより解析された。
【０２３８】
ＳＩＩＮＦＥＫＬの存在下で、免疫付与によりインビボ誘導されたＩＦＮγ産生細胞の解析のために、ＥＬＩＳＰＯＴ実験を、ＢＤ−ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）キットを用いて、その製造会社の取扱説明書に従って、実施例３と同じ方法で行った。
【０２３９】
バインディング・アッセイ
マウス脾細胞を、脾臓をホモジナイズした後、Ｃ５７ＢＬ６  ＴＬＲ２  ＫＯマウスから純化した。細胞は、４℃で１５分間、０．４％のグルタルアルデヒド溶液を用いたインキュベーションによって固定した。５×１０５の固定された脾細胞は、その結合特異性を示すために、２０μＭのＣＦＳＥ  γＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ、ＣＦＳＥ  αＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ、またはＣＦＳＥ−ＯＶＡ（２３５−２６４）コントロールペプチドの存在下でインキュベートされた。４℃でのインキュベーションの３０分後、ＰＢＳで２回洗浄が行われ、付された標識がフローサイトメトリーによって解析された。
【０２４０】
結果および考察
予期したとおり、Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスが免疫された場合、αＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドまたはγＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドでの免疫は、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドでインキュベートされた標的細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導することができる。同様に、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（それぞれ、図８Ａおよび８Ｂ）に対して特異的なＩＦＮ−γ産生細胞の活性化が誘導された。しかしながら、この応答は、驚くべきことに、ＴＬＲ２分子を欠失したマウスが免疫された場合にも観察された。実際、観察された応答レベルは両ケースのマウスにおいて類似しており、ＴＬＲ２分子は、使用されるモジュリン由来ペプチドのＳＩＩＮＦＥＫＬ  Ｔ細胞決定基に対する細胞応答の誘導を助長する能力に関与していないことを示唆している（図８）。
【０２４１】
したがって、ＣＦＳＥ標識ペプチドを用いた結合アッセイが行われた場合、ＣＦＳＥ  αＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬおよびＣＦＳＥ  γＭｏｄ−ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド双方がまだ脾細胞の表面に結合する能力を保持することが発見され（図９）、この結合はＴＬＲ２分子と関係がないことを示している。
【０２４２】
モジュリンペプチドがＴＬＲ２経路を活性化するということは文献に記載されていないが、これらの実験で、この特性は、もし正しければ、それらの免疫促進能力のために必要ではないということが結論づけられ得る。これらのペプチドのそれらが結合する抗原に対する細胞応答の誘導を助長するための作用機序は、今後明らかにされるであろう。
【図１Ｇ−１】
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【図１Ｇ−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図１Ａ−Ｆ】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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