(57)【要約】  本発明は、幹細胞（例えば、間葉系幹細胞（特に脂肪由来）のような組織幹細胞）を増幅する方法を提供する。フィブリンのりに代表されるフィブリノゲンまたはその誘導体、あるいは細胞外マトリクス（例えば、コラーゲン（例えば、Ｉ型、ＩＶ型など）、ラミニン、フィブロネクチンなど）、ゼラチンなどをコーティングした培養容器。本発明は、幹細胞を調製するための方法であって、Ａ）幹細胞を提供する工程；およびＢ）該幹細胞を、培地ならびにフィブリノゲンまたはその誘導体を含む培養容器中で培養する工程、を包含する、方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブリノゲンまたはその誘導体を含む、幹細胞を培養するための培養容器。
【請求項２】
前記フィブリノゲンまたはその誘導体は、前記培養容器にコーティングされる、請求項１に記載の培養容器。
【請求項３】
前記フィブリノゲンまたはその誘導体は、前記培養容器に５０μｍ〜３００μｍの厚さでコーティングされる、請求項１に記載の培養容器。
【請求項４】
前記フィブリノゲンまたはその誘導体は、フィブリンを含む、請求項１に記載の培養容器。
【請求項５】
前記フィブリンは、フィブリンモノマー、フィブリンポリマーおよびフィブリン塊からなる群より選択される形態を含む、請求項１に記載の培養容器。
【請求項６】
前記フィブリノゲンまたはその誘導体は、プロテアーゼを含む、請求項１に記載の培養容器。
【請求項７】
前記フィブリノゲンまたはその誘導体は、トロンビンまたはバトロキソビンを含む、請求項１に記載の培養容器。
【請求項８】
前記フィブリノゲンまたはその誘導体は、αトロンビンを含む、請求項１に記載の培養容器。
【請求項９】
前記フィブリノゲンまたはその誘導体は、プロテアーゼ阻害剤を含む、請求項１に記載の培養容器。
【請求項１０】
前記プロテアーゼ阻害剤は、アプロチニンおよび／または４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸を含む、請求項９に記載の培養容器。
【請求項１１】
前記フィブリノゲンまたはその誘導体は、フィブリンのりである、請求項１に記載の培養容器。
【請求項１２】
前記フィブリンのりは、フィブリンモノマー、フィブリンポリマー、フィブリノゲンまたは血小板の全部もしくは一部を成分として含む、請求項１１に記載の培養容器。
【請求項１３】
前記フィブリンのりは、該フィブリンのり中に含まれる可溶性のフィブリノゲン（Ｉ因子）が、トロンビンによって不溶性のフィブリン（フィブリンモノマー）に転換されるが、フィブリンモノマーは互いのＮ末端とＣ末端が重合して、フィブリンポリマーとなり、フィブリン塊を形成していくという接着性を有する、請求項１１に記載の培養容器。
【請求項１４】
前記フィブリンのりは、クリオプレシピテート、血漿または血小板含有血漿（ＰＲＰ）を５００倍以下に希釈したものである、請求項１１に記載の培養容器。
【請求項１５】
前記フィブリンのりは、クリオプレシピテート、血漿または血小板含有血漿（ＰＲＰ）を５０倍〜５００倍に希釈したものである、請求項１１に記載の培養容器。
【請求項１６】
前記幹細胞は、脂肪組織由来である、請求項１に記載の培養容器。
【請求項１７】
前記幹細胞は、間葉系幹細胞である、請求項１に記載の培養容器。
【請求項１８】
前記幹細胞は、脂肪吸引物に由来する、請求項１に記載の培養容器。
【請求項１９】
前記幹細胞は、脂肪細胞由来幹細胞（ＡＳＣ；ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）である、請求項１に記載の培養容器。
【請求項２０】
前記フィブリンまたはその分解物は、０．１〜１００ｍｇ／ｃｍ２の濃度で含まれることを特徴とする、請求項１に記載の培養容器。
【請求項２１】
前記培養容器の材質は、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属、天然ポリマーおよび合成ポリマーからなる群より選択される材料を含む、請求項１に記載の培養容器。
【請求項２２】
幹細胞を調製するための方法であって、
Ａ）幹細胞を提供する工程；および
Ｂ）該幹細胞を、培地ならびにフィブリノゲンまたはその誘導体を含む培養容器中で培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項２３】
前記培養は、ｐＨ７．２〜７．４、温度３７℃、およびＣＯ２濃度  ５％という条件下で培養される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記培養は、ＤＭＥＭ、Ｐ１９９、ＭＥＭ、Ｈａｎｋｓ平衡化塩溶液（ＨＢＳＳ）、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２、ＢＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ１０４およびＭＣＤＢ１５３（ＫＧＭ）からなる群より選択される培地を用いて行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記培養は、副腎皮質ステロイド、インスリン、グルコース、インドメタシン、イソブチル−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、アスコルビン酸およびその誘導体、グリセロホスフェート、エストロゲンおよびその誘導体、プロゲステロンおよびその誘導体、アンドロゲンおよびその誘導体、増殖因子、下垂体エキス、松果体エキス、レチノイン酸、ビタミンＤ、甲状腺ホルモン、子牛血清、馬血清、ヒト血清、ヘパリン、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、アルブミン、トランスフェリン、セレン酸塩、リノレン酸、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、脱メチル化剤、ヒストン脱アセチル化剤、アクチビン、サイトカイン、ヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジブチルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヨードデオキシウリジン（ＩｄＵ）、ヒドロキシウレア（ＨＵ）、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、酪酸ナトリウム（ＮａＢｕ）、ポリブレンおよびセレニウムからなる群より選択される成分のうち少なくとも１つを含む培養液中で行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
さらに、前記幹細胞を入手する工程を包含する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
さらに、前記幹細胞を分化させる工程を包含する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記フィブリノゲンまたはその誘導体は、前記培養容器にコーティングされる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
幹細胞を培養するための、フィブリノゲンまたはその誘導体がコーティングされた培養容器を生産するための方法であって、
Ａ）培養容器を提供する工程；
Ｂ）該培養容器にフィブリノゲンまたはその誘導体を提供する工程；および
Ｃ）該フィブリノゲンまたはその誘導体を該培養容器の表面に固定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３０】
前記フィブリノゲンまたはその誘導体の提供は、無菌操作にて行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記固定は、乾燥状態で一定時間放置すること、または紫外線照射という特徴を有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
幹細胞を培養するための、組織接着剤がコーティングされた培養容器。
【請求項３３】
前記組織接着剤は、シアノアクリレート系接着剤、ゼラチン−アルデヒド系接着剤およびフィブリングルー系接着剤からなる群より選択される、請求項３２に記載の培養容器。
【請求項３４】
幹細胞を培養するための、細胞外マトリクスがコーティングされた培養容器。
【請求項３５】
前記幹細胞は、脂肪組織由来である、請求項３４に記載の培養容器。
【請求項３６】
前記幹細胞は、間葉系幹細胞である、請求項３４に記載の培養容器。
【請求項３７】
前記幹細胞は、脂肪細胞由来幹細胞である、請求項３４に記載の培養容器。
【請求項３８】
前記幹細胞は、脂肪吸引物に由来する、請求項３４に記載の培養容器。
【請求項３９】
前記細胞外マトリクスは、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、テネイシン、サイトタクチン、ヘキサブラキオン、エンタクチン、ナイトジェン、ビトロネクチン、ゼラチンおよびプロテオグリカンからなる群より選択される、請求項３４に記載の培養容器。
【請求項４０】
前記細胞外マトリクスは、３μｇ／ｃｍ２〜２０μｇ／ｃｍ２の濃度で含まれることを特徴とする、請求項３４に記載の培養容器。
【請求項４１】
幹細胞を培養するための、ゼラチンがコーティングされた培養容器。
【請求項４２】
幹細胞を調製するための方法であって、
Ａ）培地、ならびに細胞外マトリクスおよび／またはゼラチンを含む培養容器を提供する工程；
Ｂ）幹細胞を該培養容器に配置する工程；
Ｃ）該幹細胞を所望の期間培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項４３】
幹細胞を培養するための、細胞外マトリクスおよび／またはゼラチンがコーティングされた培養容器を生産するための方法であって、
Ａ）培養容器を提供する工程；
Ｂ）該培養容器に細胞外マトリクスおよび／またはゼラチンを提供する工程；および
Ｃ）該細胞外マトリクスおよび／またはゼラチンを該培養容器の表面に固定する工程、
を包含する、方法。
【請求項４４】
フィブリノゲンまたはその誘導体の、幹細胞を調製するための使用。
【請求項４５】
細胞外マトリクスおよび／またはゼラチンの、幹細胞を調製するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再生医療に関する。より詳細には、本発明は、幹細胞の培養に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞の利用を中心とした、再生医療は、ここ数年で、かなりの発展を遂げてきた。従来であれば、存在しないと考えられていた、組織幹細胞が種々の組織から発見され、同定されてきた。このように、再生医療による疾患治療が最近注目を浴びている。【０００３】
幹細胞は、種々存在し、受精卵に由来する幹細胞、胚性幹細胞の他、組織幹細胞と呼ばれるものがある。受精卵は、原腸陥入の後、内胚葉、中胚葉および外胚葉の３つの胚葉に分かれ、外胚葉由来の細胞は、主に脳に存在し、神経幹細胞などが含まれる。中胚葉由来の細胞は、主に骨髄に存在し、血管幹細胞、造血幹細胞および間葉系幹細胞などが含まれる。内胚葉由来の細胞は主に臓器に存在し、肝幹細胞、膵幹細胞などが含まれる。【０００４】
脂肪細胞、骨、靭帯、心筋などを含む間葉系細胞は、身体の骨格を形成するに重要な働きを有していることから、その細胞を含む集団、組織など、間葉系細胞の再生医療および移植医療への応用の期待が高まっている。特に、骨髄間葉系幹細胞は、中胚葉系の種々の臓器に分化することが報告されるようになっており、再生医療の中心として注目を浴びている。しかし、その分化の条件は、分化誘導剤（例えば、デキサメサゾンなど）を含む特殊な培地を必要とすることが知られるかなり特殊なものを必要とするとされている（非特許文献１）。【０００５】
間葉系幹細胞は、組織幹細胞の一種であり、天然にはごく少量（ヒト新生児の骨髄に１万分の１存在し、その後急速に減少する。高齢者では２００万分の１といわれる）存在するだけであり、分離することが困難である。間葉系幹細胞は、中胚葉以外にも分化することが報告されていることから、その応用範囲は従来以上に広がっている。しかし、そのような分化の条件は、上述のもの以上に特殊である。間葉系幹細胞の表面抗原は、ＣＤ１０５（＋）、ＣＤ７３（＋）、ＣＤ２９（＋）、ＣＤ４４（＋）、ＣＤ１４（−）、ＣＤ３４（−）、ＣＤ４５（−）であるとされている。【０００６】
一方、脂肪にも幹細胞があることが分かってきた（特許文献１〜３、非特許文献２〜３）。脂肪にある幹細胞は、他の組織（例えば、骨髄）に比べて、その供給源が豊富であり、存在率も多いようであることから、その利用が注目されている。しかし、幹細胞の処置方法については、未知な部分が多い。【０００７】
特に、このような幹細胞は、それほど多量に取れないことから、大量に幹細胞を必要とする場合は、多数の供給源から供給する必要がある。しかし、幹細胞の供給源は限られており、さらに、複数の系統が混じることによる副作用が生じる恐れもある。【０００８】
他方、幹細胞を効率よく増殖する方法に対することが対応策として考えられる。しかし、幹細胞を、その多能性を維持しながら増殖する（増幅する）方法は、ほとんど知られておらず、特に、脂肪などに由来する間葉系幹細胞については、増殖方法は皆無であることが現状である。
【特許文献１】国際公開ＷＯ００／５３７９５パンフレット
【特許文献２】国際公開ＷＯ０３／０２２９８８パンフレット
【特許文献３】国際公開ＷＯ０１／６２９０１パンフレット
【非特許文献１】幹細胞・クローン  研究プロトコール  中辻編、羊土社（２００１）
【非特許文献２】Ｚｕｋ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．７，２１１−２２８、２００１
【非特許文献３】Ｚｕｋ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  Ｖｏｌ．，１３，４２７９−４２９５、２００２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、幹細胞（例えば、間葉系幹細胞（特に脂肪由来）のような組織幹細胞）を増幅する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題は、本発明者らがフィブリンのりに代表されるフィブリノゲンまたはその誘導体、あるいは細胞外マトリクス（例えば、コラーゲン（例えば、Ｉ型、ＩＶ型など）、ラミニン、フィブロネクチンなど）、ゼラチンなどをコーティングした培養容器を用いることによって、脂肪などに由来する幹細胞が効率よく増幅することを見出したことによって完成された。【００１１】
従って、本発明は、以下を提供する。
（１）フィブリノゲンまたはその誘導体を含む、幹細胞を培養するための培養容器。
（２）上記フィブリノゲンまたはその誘導体は、上記培養容器にコーティングされる、項目１に記載の培養容器。
（３）上記フィブリノゲンまたはその誘導体は、上記培養容器に５０μｍ〜３００μｍの厚さでコーティングされる、項目１に記載の培養容器。
（４）上記フィブリノゲンまたはその誘導体は、フィブリンを含む、項目１に記載の培養容器。
（５）上記フィブリンは、フィブリンモノマー、フィブリンポリマーおよびフィブリン塊からなる群より選択される形態を含む、項目１に記載の培養容器。
（６）上記フィブリノゲンまたはその誘導体は、プロテアーゼを含む、項目１に記載の培養容器。
（７）上記フィブリノゲンまたはその誘導体は、トロンビンまたはバトロキソビンを含む、項目１に記載の培養容器。
（８）上記フィブリノゲンまたはその誘導体は、αトロンビンを含む、項目１に記載の培養容器。
（９）上記フィブリノゲンまたはその誘導体は、プロテアーゼ阻害剤を含む、項目１に記載の培養容器。
（１０）上記プロテアーゼ阻害剤は、アプロチニンおよび／または４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸を含む、項目９に記載の培養容器。
（１１）上記フィブリノゲンまたはその誘導体は、フィブリンのりである、項目１に記載の培養容器。
（１２）上記フィブリンのりは、フィブリンモノマー、フィブリンポリマー、フィブリノゲンまたは血小板の全部もしくは一部を成分として含む、項目１１に記載の培養容器。
（１３）上記フィブリンのりは、上記フィブリンのり中に含まれる可溶性のフィブリノゲン(Ｉ因子)が、トロンビンによって不溶性のフィブリン（フィブリンモノマー）に転換されるが、フィブリンモノマーは互いのN末端とC末端が重合して、フィブリンポリマーとなり、フィブリン塊を形成していくという接着性を有する、項目１１に記載の培養容器。
（１４）上記フィブリンのりは、クリオプレシピテート、血漿または血小板含有血漿（ＰＲＰ）を５００倍以下に希釈したものである、項目１１に記載の培養容器。
（１５）上記フィブリンのりは、クリオプレシピテート、血漿または血小板含有血漿（ＰＲＰ）を５０倍〜５００倍に希釈したものである、項目１１に記載の培養容器。
（１６）上記幹細胞は、脂肪組織由来である、項目１に記載の培養容器。
（１７）上記幹細胞は、間葉系幹細胞である、項目１に記載の培養容器。
（１８）上記幹細胞は、脂肪吸引物に由来する、項目１に記載の培養容器。
（１９）上記幹細胞は、脂肪細胞由来幹細胞である、項目１に記載の培養容器。
（２０）上記フィブリンまたはその分解物は、０．１〜１００ｍｇ／ｃｍ２の濃度で含まれることを特徴とする、項目１に記載の培養容器。
（２１）上記培養容器の材質は、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属、天然ポリマーおよび合成ポリマーからなる群より選択される材料を含む、項目１に記載の培養容器。
（２２）幹細胞を調製するための方法であって、
Ａ）幹細胞を提供する工程；および
Ｂ）上記幹細胞を、培地ならびにフィブリノゲンまたはその誘導体を含む培養容器中で培養する工程、
を包含する、方法。
（２３）上記培養は、ｐＨ７．２〜７．４、温度３７℃、およびＣＯ２濃度  ５％という条件下で培養される、項目２２に記載の方法。
（２４）上記培養は、ＤＭＥＭ、Ｐ１９９、ＭＥＭ、Ｈａｎｋｓ平衡化塩溶液（ＨＢＳＳ）、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２、ＢＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ１０４およびＭＣＤＢ１５３（ＫＧＭ）からなる群より選択される培地を用いて行われる、項目２２に記載の方法。
（２５）上記培養は、副腎皮質ステロイド、インスリン、グルコース、インドメタシン、イソブチル−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、アスコルビン酸およびその誘導体、グリセロホスフェート、エストロゲンおよびその誘導体、プロゲステロンおよびその誘導体、アンドロゲンおよびその誘導体、増殖因子、下垂体エキス、松果体エキス、レチノイン酸、ビタミンＤ、甲状腺ホルモン、子牛血清、馬血清、ヒト血清、ヘパリン、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、アルブミン、トランスフェリン、セレン酸塩、リノレン酸、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、脱メチル化剤、ヒストン脱アセチル化剤、アクチビン、サイトカイン、ヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジブチルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヨードデオキシウリジン（ＩｄＵ）、ヒドロキシウレア（ＨＵ）、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、酪酸ナトリウム（ＮａＢｕ）、ポリブレンおよびセレニウムからなる群より選択される成分のうち少なくとも１つを含む培養液中で行われる、項目２２に記載の方法。
（２６）さらに、上記幹細胞を入手する工程を包含する、項目２２に記載の方法。
（２７）さらに、上記幹細胞を分化させる工程を包含する、項目２２に記載の方法。
（２８）上記フィブリノゲンまたはその誘導体は、上記培養容器にコーティングされる、項目２２に記載の方法。
（２９）幹細胞を培養するための、フィブリノゲンまたはその誘導体がコーティングされた培養容器を生産するための方法であって、
Ａ）培養容器を提供する工程；
Ｂ）上記培養容器にフィブリノゲンまたはその誘導体を提供する工程；および
Ｃ）上記フィブリノゲンまたはその誘導体を上記培養容器の表面に固定する工程、
を包含する、方法。
（３０）上記フィブリノゲンまたはその誘導体の提供は、無菌操作にて行われる、項目２９に記載の方法。
（３１）上記固定は、乾燥状態で一定時間放置すること、または紫外線照射という特徴を有する、項目２９に記載の方法。
（３２）幹細胞を培養するための、組織接着剤がコーティングされた培養容器。
（３３）上記組織接着剤は、シアノアクリレート系接着剤、ゼラチン−アルデヒド系接着剤およびフィブリングルー系接着剤からなる群より選択される、項目３２に記載の培養容器。
（３４）幹細胞を培養するための、細胞外マトリクスがコーティングされた培養容器。
（３５）上記幹細胞は、脂肪組織由来である、項目３４に記載の培養容器。
（３６）上記幹細胞は、間葉系幹細胞である、項目３４に記載の培養容器。
（３７）上記幹細胞は、脂肪細胞由来幹（ＡＳＣ；ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）細胞である、項目３４に記載の培養容器。
（３８）上記幹細胞は、脂肪吸引物に由来する、項目３４に記載の培養容器。
（３９）上記細胞外マトリクスは、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、テネイシン、サイトタクチン、ヘキサブラキオン、エンタクチン、ナイトジェン、ビトロネクチン、ゼラチンおよびプロテオグリカンからなる群より選択される、項目３４に記載の培養容器。
（４０）上記細胞外マトリクスは、３μｇ／ｃｍ２〜２０μｇ／ｃｍ２の濃度で含まれることを特徴とする、項目３４に記載の培養容器。
（４１）幹細胞を培養するための、ゼラチンがコーティングされた培養容器。
（４２）幹細胞を調製するための方法であって、
Ａ）培地、ならびに細胞外マトリクスおよび／またはゼラチンを含む培養容器を提供する工程；
Ｂ）幹細胞を上記培養容器に配置する工程；
Ｃ）上記幹細胞を所望の期間培養する工程、
を包含する、方法。
（４３）幹細胞を培養するための、細胞外マトリクスおよび／またはゼラチンがコーティングされた培養容器を生産するための方法であって、
Ａ）培養容器を提供する工程；
Ｂ）上記培養容器に細胞外マトリクスおよび／またはゼラチンを提供する工程；および
Ｃ）上記細胞外マトリクスおよび／またはゼラチンを上記培養容器の表面に固定する工程、
を包含する、方法。
（４４）フィブリノゲンまたはその誘導体の、幹細胞を調製するための使用。
（４５）細胞外マトリクスおよび／またはゼラチンの、幹細胞を調製するための使用。【００１２】
従って、本発明のこれらおよび他の利点は、添付の図面を参照して、以下の詳細な説明を読みかつ理解すれば、当業者には明白になることが理解される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、幹細胞を効率よく増殖／増幅するための方法を提供する。このような方法は、従来達成されておらず、美容整形などにおいて有用な幹細胞を効率よく増幅し、少ない原料から多くの用途に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、各種コーティングディッシュを用いた場合の、２日目の幹細胞（脂肪由来）の増殖速度を示す。
【図２】図２は、ＰＲＰコーティングディッシュを用いた場合の、ＦＢＳ１０％添加したＭ１９９を用いて、ヒトＰＲＰコート６ウェル−プレート，非コーティング６ウェル−プレートにヒト脂肪細胞由来幹細胞（Ａ）を２×１０４細胞／ウェルにて播種した。４日後に培地交換、７日後に細胞数を測定した結果を示す。横軸は、左から、コーティングなし０％ＦＢＳ，コーティングなし１０％ＦＢＳ、ＰＲＰコーティング０％ＦＢＳ、ＰＲＰコーティング１０％ＦＢＳを示す。縦軸は、細胞数である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。【００１６】
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。【００１７】
本明細書において使用される「細胞」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、多細胞生物の組織の構成単位であって、外界を隔離する膜構造に包まれ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する生命体をいう。本発明の方法においては、どのような細胞でも対象とされ得る。本発明で使用される「細胞」の数は、光学顕微鏡を通じて計数することができる。光学顕微鏡を通じて計数する場合は、核の数を数えることにより計数を行う。当該組織を組織切片スライスとし、ヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）染色を行うことにより細胞外マトリクス（例えば、エラスチンまたはコラーゲン）および細胞に由来する核を色素によって染め分ける。この組織切片を光学顕微鏡にて検鏡し、特定の面積（例えば、２００μｍ×２００μｍ）あたりの核の数を細胞数と見積って計数することができる。【００１８】
本発明において使用される細胞は、幹細胞（特に、脂肪組織に由来する幹細胞）またはその対応物がある限り、どの生物由来の細胞（例えば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）でも用いることができる。好ましくは、そのような細胞は、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）由来の細胞が用いられる。１つの実施形態では、霊長類（たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来の細胞、特にヒト由来の細胞が用いられるがそれに限定されない。【００１９】
本明細書において「幹細胞」とは、自己複製能を有し、多分化能（すなわち多能性）（「ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ」）を有する細胞をいう。幹細胞は通常、組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。本明細書では幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞または組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞または体性幹細胞ともいう）であり得るがそれらに限定されない。また、上述の能力を有している限り、人工的に作製した細胞もまた、幹細胞であり得る。胚性幹細胞とは初期胚に由来する多能性幹細胞をいう。胚性幹細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。組織幹細胞は、胚性幹細胞とは異なり、分化の方向が限定されている細胞であり、組織中の特定の位置に存在し、未分化な細胞内構造をしている。従って、組織幹細胞は多能性のレベルが低い。組織幹細胞は、核／細胞質比が高く、細胞内小器官が乏しい。組織幹細胞は、概して、多分化能を有し、細胞周期が遅く、個体の一生以上に増殖能を維持する。本明細書において使用される場合は、幹細胞は好ましくは間葉系幹細胞のような組織幹細胞であり得るが、状況に応じて胚性幹細胞も使用され得る。【００２０】
本明細書において幹細胞というときは、幹細胞を少なくとも一定量含む組織集合物をさし得ることが理解される。幹細胞の入手は、当該分野において周知の任意の方法を用いて行うことができる。したがって、本明細書では、幹細胞は、例えば、コラゲナーゼ処理して脂肪組織から採取した幹細胞（実施例において使用される脂肪細胞由来幹細胞など）を用いることができるがそれらに限定されない。【００２１】
由来する部位により分類すると、組織幹細胞は、例えば、皮膚系、消化器系、骨髄系、神経系などに分けられる。皮膚系の組織幹細胞としては、表皮幹細胞、毛嚢幹細胞などが挙げられる。消化器系の組織幹細胞としては、膵（共通）幹細胞、肝幹細胞などが挙げられる。骨髄系の組織幹細胞としては、造血幹細胞、間葉系幹細胞などが挙げられる。神経系の組織幹細胞としては、神経幹細胞、網膜幹細胞などが挙げられる。【００２２】
本明細書において「間葉系幹細胞」とは、間葉に見出される幹細胞をいう。本明細書ではＭＳＣと略されることがある。ここで、間葉とは、多細胞動物の発生各期に認められる、上皮組織間の間隙をうめる星状または不規則な突起をもつ遊離細胞の集団と，それに伴う細胞間質によって形成される組織をいう。間葉系幹細胞は、増殖能と、骨細胞、軟骨細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞（心筋細胞を含む）、ストローマ細胞、腱細胞、脂肪細胞への分化能を有する。間葉系幹細胞は、患者から採取した骨髄細胞等を培養または増殖、軟骨細胞あるいは骨芽細胞に分化させるために使用され、または歯槽骨、関節症等の骨、軟骨、関節などの再建材料として使用されており、その需要は大きい。また、間葉系幹細胞は、血液細胞、リンパ系細胞へも分化し得ることから、その需要がますます高まっている。【００２３】
本明細書において「脂肪幹細胞」とは、脂肪組織に由来する幹細胞をいう。このような幹細胞の分離方法の一部は公知であり、例えば、非特許文献１、特許文献１〜３などに記載される方法を利用して分離することができる。これらの文献に記載された事項は、本明細書において特に関連する場所が参考として援用される。本明細書における脂肪幹細胞は、この公知の分離方法によって得られる脂肪組織由来幹細胞を含む、すべての脂肪組織由来幹細胞のことを指す。【００２４】
ここで、脂肪幹細胞は、ＷＯ００／５３７９５、ＷＯ０３／０２２９８８、ＷＯ０１／６２９０１、Ｚｕｋ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．７，２１１−２２８、２００１、ならびにＺｕｋ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  Ｖｏｌ．，１３，４２７９−４２９５、２００２などに記載される方法またはその改変を利用して調製することができる。具体的には、例えば、（１）脂肪吸引物を１リットル大の分液漏斗を用いて生理食塩水で十分に洗浄し；（２）上層に脂肪吸引物、下層に生理食塩水が十分に分離したのを確認し、下層を捨てる。肉眼で見て生理食塩水がほぼ透明になるまでこれを繰り返し；（３）脂肪吸引物と同量の０．０７５％コラゲナーゼ／ＰＢＳを加え、３７℃でよく攪拌しながら３０分間インキュベートし；（４）上記の試料に等量の１０％血清加ＤＭＥＭを加え；（５）上記の試料を１２００ｇで１０分間遠心分離し；（６）ペレットに０．１６Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ／ＰＢＳを加えて懸濁し、室温で１０分間インキュベートし；（７）上記の試料を口径１００μｍのメッシュを用いて吸引ろ過し；および（８）ろ過物を１２００ｇで５分間遠心分離することによって調製することができる。ここで、調製量に応じて、上記プロトコールをスケールアップまたはスケールダウンすることは、当業者の技術範囲内である。このような方法によって調製された細胞は、脂肪細胞由来幹細胞（ＡＳＣ；ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）またはＰＬＡ（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  ｌｉｐｏａｓｐｉｒａｔｅ）細胞とも呼ばれる。本明細書において、ＡＳＣとＰＬＡ細胞とは、交換可能に用いられ、その調製法に限定されることなく脂肪細胞に由来する幹細胞一般を指すことが理解される。従って、ＡＳＣおよびＰＬＡ細胞は、上記以外の調製法で調製された幹細胞であり得る。【００２５】
本明細書において「体細胞」とは、卵子、精子などの生殖細胞以外の細胞であり、そのＤＮＡを次世代に直接引き渡さない全ての細胞をいう。体細胞は通常、多能性が限定されているかまたは消失している。本明細書において使用される体細胞は、天然に存在するものであってもよく、遺伝子改変されたものであってもよい。【００２６】
本明細書において「分化（した）細胞」とは、機能および形態が特殊化した細胞（例えば、筋細胞、神経細胞など）をいい、幹細胞とは異なり、多能性はないか、またはほとんどない。分化した細胞としては、例えば、表皮細胞、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などが挙げられる。本発明において用いられる場合、分化細胞は、集団または組織の形態であってもよい。【００２７】
本明細書において「フィブリノゲンまたはその誘導体」とは、フィブリノゲンそのものおよびフィブリノゲンをプロテアーゼなどの分解酵素によって分解したもの、ならびにそれを改変したもの（例えば、化学的修飾を行ったもの）をいう。フィブリノゲンまたはその誘導体としては、代表的に、フィブリンのりが挙げられるがそれに限定されない。【００２８】
本明細書において「フィブリン」とは、フィブリノゲンにトロンビンが作用してフィブリノペプチドＡおよびＢを遊離した残余のタンパク質(フィブリンモノマー)およびこのタンパク質を構成単位とする高分子(フィブリンポリマー)の総称である。無色あるいは白色、繊維状無定形で弾性のある固体であり、血液凝固の際に血球をからめて硬化し血餅となる。血漿中および重合阻止作用をもたない塩類溶液中で生成したフィブリンは析出してゲル状となり、フィブリン塊を形成する。フィブリノゲンおよびフィブリンを構成するポリペプチド鎖は、α、βおよびγの３本鎖からなる。フィブリノゲンにトロンビンおよびＣａ２＋を加えて生成したフィブリンは、３０％（Ｗ／Ｖ）尿素溶液および１％（Ｗ／Ｖ）モノクロル酢酸溶液に可溶性であるが、正常血漿にＣａ２＋を加えて生成したフィブリンはこれらの溶液に不溶性である。その理由は，前者ではフィブリノゲン（α（Ａ）β（Ｂ）γ）２がトロンビンの作用でＮ末端からフィブリノペプチドＡおよびＢを遊離してフィブリンモノマー（αβγ）となり，さらにＣａ２＋の存在下で水素結合により重合してフィブリンポリマーとなりゲル化した状態となるのに対し，後者ではさらに血漿中に含有されていてγ−グルタミル基転移酵素作用を示す第ＶＩＩＩ因子の作用を受けて，フィブリンモノマー分子間に架橋が生じ、イソペプチド結合が形成され、フィブリンモノマーを構成単位とする高分子（αβγ）ｎが生成される。フィブリンはプラスミンによって分解される。他方，フィブリノゲンはある種のヘビ毒にも加水分解され，フィブリノペプチドＡだけを遊離して脱Ａフィブリンとなりゲル化する。【００２９】
本明細書において「プロテアーゼ」とは、ペプチド結合を加水分解する酵素をいう。本発明では、フィブリノゲンを分解するために用いられ得る。フィブリノゲンを加水分解することによって、接着性が出てくるからである。好ましくは、プロテアーゼとしては、フィブリノゲンの接着性を改善するような分解を行うものが使用され、そのような例としては、例えば、トロンビン、バトロキソビンなどを挙げることができるがそれらに限定されない。【００３０】
本明細書において、プロテアーゼ阻害剤とは、プロテアーゼのペプチド結合分解活性を阻害する任意の因子をいう。そのようなプロテアーゼ阻害剤としては、例えば、アプロチニン、４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸などを挙げることができるがそれらに限定されない。【００３１】
本明細書において「組織接着剤」とは、生体組織を接着するために用いられる任意の薬剤をいう。そのような組織接着剤としては、例えば、シアノアクリレート系接着剤、ゼラチン−アルデヒド系接着剤、フィブリングルー系接着剤などを挙げることができるがそれらに限定されない。本発明では、組織接着能を有する物質を培養容器にコーティングすることによって、幹細胞の増殖が顕著に改善したこという効果を有する。【００３２】
本明細書において、「シアノアクリレート系接着剤」とは、シアノアクリレート・モノマーの重合反応を利用した接着剤をいう。接着強度が高く、しかも接着速度が速い点で優れている。【００３３】
本明細書において、「ゼラチン-アルデヒド系接着剤」とは、ゼラチン（生体高分子のコラーゲンが変性したもの）とホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドの架橋反応を利用した接着剤をいう。接着強度は十分高い。【００３４】
本明細書において、「フィブリンのり」または「フィブリングルー系接着剤」とは、血液が凝固する反応（フィブリンの重合過程）を利用した接着剤をいう。この接着剤は、毒性がなく創傷治癒を阻害しないが、柔軟であるため接着力がそれほど強くない。幹細胞の維持および増殖に適していることが本発明において見出された。理論に束縛されないが、フィブリンのり自体が細胞の培地（栄養）となることが一つの要因であることが予想される。フィブリンのりとしては、例えば、クリオプレシピテート、血漿または血小板含有血漿（ＰＲＰ）を適宜の倍率に希釈したものを挙げることができる。【００３５】
本明細書においてフィブリンのりの倍率は、クリオプレシピテートと標準トロンビン溶液で生成されたものを基準として算出される。通常１倍〜１００００倍のフィブリンのりが用いられ、好ましくは５〜５０００倍、より好ましくは１０〜１０００倍、さらに好ましくは５０〜５００倍のものが使用される。【００３６】
本明細書において「細胞外マトリクス」（ＥＣＭ）とは「細胞外基質」とも呼ばれ、上皮細胞、非上皮細胞を問わず体細胞（ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ）の間に存在する物質をいう。細胞外マトリクスは、組織の支持だけでなく、すべての体細胞の生存に必要な内部環境の構成に関与する。細胞外マトリクスは一般に、結合組織細胞から産生されるが、一部は上皮細胞や内皮細胞のような基底膜を保有する細胞自身からも分泌される。線維成分とその間を満たす基質とに大別され、線維成分としては膠原線維および弾性線維がある。基質の基本構成成分はグリコサミノグリカン（酸性ムコ多糖）であり、その大部分は非コラーゲン性タンパクと結合してプロテオグリカン（酸性ムコ多糖−タンパク複合体）の高分子を形成する。このほかに、基底膜のラミニン、弾性線維周囲のミクロフィブリル（ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌ）、線維、細胞表面のフィブロネクチンなどの糖タンパクも基質に含まれる。特殊に分化した組織でも基本構造は同一で、例えば硝子軟骨では軟骨芽細胞によって特徴的に大量のプロテオグリカンを含む軟骨基質が産生され、骨では骨芽細胞によって石灰沈着が起こる骨基質が産生される。【００３７】
本明細書において、「ゼラチン」とは、当該分野において用いられる最広義で用いられ、動物の皮、腱または骨などを構成するコラーゲンを熱湯で処理して得られる誘導タンパク質をいう。【００３８】
本明細書において、「培養容器」とは、細胞を培養するための任意の容器をいう。従って、本発明では、培養容器は底面積を有する限り、当該分野において通常使用されるような任意の容器を用いることができ、例えば、シャーレ、フラスコ、型容器など、好ましくは底面積が広い（例えば、１ｃｍ２以上）容器が使用され得るが特定の面積に限定されるわけではない。その容器の材質もまた、どのような材料を利用してもよく、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリカーボネートなど）、金属、天然ポリマーおよび合成ポリマーなどが用いられ得るがそれらに限定されない。【００３９】
本明細書において「培地」とは、細胞を培養するために用いられる任意の物質をいい、ＤＭＥＭ、Ｐ１９９、ＭＥＭ、Ｈａｎｋｓ’平衡化塩溶液（ＨＢＳＳ）、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２、ＢＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ１０４およびＭＣＤＢ１５３（ＫＧＭ）などを挙げることができるがそれに限定されない。培地には、例えば、副腎皮質ステロイド、インスリン、グルコース、インドメタシン、イソブチル−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、アスコルビン酸およびその誘導体、グリセロホスフェート、エストロゲンおよびその誘導体、プロゲステロンおよびその誘導体、アンドロゲンおよびその誘導体、増殖因子、下垂体エキス、松果体エキス、レチノイン酸、ビタミンＤ、甲状腺ホルモン、子牛血清、馬血清、ヒト血清、ヘパリン、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、アルブミン、トランスフェリン、セレン酸塩、リノレン酸、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、脱メチル化剤、ヒストン脱アセチル化剤、アクチビン、サイトカイン、ヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジブチルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヨードデオキシウリジン（ＩｄＵ）、ヒドロキシウレア（ＨＵ）、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、酪酸ナトリウム（ＮａＢｕ）、ポリブレン、セレニウムなどの補助成分を加えても良い。【００４０】
本明細書において「分化細胞への分化を促進する因子」または「分化促進因子」とは、分化細胞への分化を促進することが知られている因子（例えば、化学物質、温度など）であれば、どのような因子であってもよい。そのような因子としては、例えば、種々の環境要因を挙げることができ、そのような因子としては、例えば、温度、湿度、ｐＨ、塩濃度、栄養、金属、ガス、有機溶媒、圧力、化学物質（例えば、ステロイド、抗生物質など）などまたはそれらの任意の組み合わせが挙げられるがそれらに限定されない。そのような因子のうち代表的なものとしては、ＤＮＡ脱メチル化剤（５−アザシチジンなど）、ヒストン脱アセチル化剤（トリコスタチンなど）、核内レセプターリガンド（例えば、レチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ビタミンＤ３、Ｔ３など）、細胞増殖因子（アクチビン、ＩＧＦ−１、ＦＧＦ，ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２／４など）、サイトカイン（ＬＩＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−６など）、ヘキサメチレンビスアセトアミド、ジメチルアセトアミド、ジブチルｃＡＭＰ、ジメチオルスルホキシド、ヨードデオキシウリジン、ヒドロキシル尿素、シトシンアラビノシド、マイトマイシンＣ、酪酸ナトリウム、アフィディコリン、フルオロデオキシウリジン、ポリブレン、セレンなどが挙げられるがそれらに限定されない。しかし、従来は、分化促進因子として、分化した細胞は想定されていなかった。分化した細胞は、むしろ、分化を抑制するような因子を放出すると考えられていたからである。【００４１】
本発明において使用される代表的な細胞を判別するために有用なマーカーとしては、例えば、（１）脂肪：細胞質内におけるトリグリセリドの存在、ＯｉｌＲｅｄ−Ｏ染色、グリセロホスフェートデヒドロゲナーゼ（Ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ＝ＧＰＤＨ）活性、細胞質内のＧＬＵＴ４  、Ａｐ２（脂肪酸結合タンパク質）、ＬＰＬ（リポタンパク質リパーゼ）、ＰＰＡＲγ１，２（ペルオキシソーム増殖活性化レセプターγ１，２）、やレプチン（Ｌｅｐｔｉｎ）の発現；（２）骨細胞、骨組織：アルカリフォスファターゼの存在、骨石灰化（カルシウムの沈着）の程度を確認する；オステオカルシン（Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）、オステオポンチン（Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ）、オステオネクチン（Ｏｓｔｅｏｎｅｃｔｉｎ）の発現；（３）軟骨細胞、軟骨組織：ムコ多糖の存在、タイプ２コラーゲン、コンドロイチン−４−サルフェート（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ−４−ｓｕｌｆａｔｅ）の発現・存在；（４）骨格筋細胞：細胞質内のミオシンの豊富な存在などが挙げられるがそれらに限定されない。【００４２】
細胞は、同定された細胞を用いてもよいが、性質が未知の細胞であったとしても、例えば、マーカーを用いることによって、ＦＡＣＳなどの分別技術を用いて所望の部位に対応する細胞を調製することができる。ＦＡＣＳの使用方法は、フローサイトメトリー自由自在  細胞工学別冊（秀潤社）、中内編、１９９９などに記載されており、本明細書においてその内容を参考として援用する。【００４３】
本明細書において「移植」とは、本発明の細胞、組成物、医薬などを、単独で、または他の治療剤と組み合わせて体内に移入することを意味する。本発明により調製された幹細胞またはその分化産物は、種々の目的（例えば、治療、再生、美容、予防目的など）で体内に移植することができる。【００４４】
本明細書において自己または自家とは、ある個体についていうとき、その個体に由来する個体またはその一部（例えば、細胞、組織、臓器など）をいう。本明細書において自己というときは、広義には遺伝的に同じ他個体（例えば一卵性双生児）からの移植片をも含み得る。【００４５】
本明細書において同種（同種異系）とは、同種であっても遺伝的には異なる他個体から移植される個体またはその一部（例えば、細胞、組織、臓器など）をいう。遺伝的に異なることから、同種異系のものは、移植された個体（レシピエント）において免疫反応を惹起し得る。そのような細胞などの例としては、親由来の細胞などが挙げられるがそれらに限定されない。【００４６】
本明細書において異種とは、異種個体から移植されるものをいう。従って、例えば、ヒトがレシピエントである場合、ブタからの移植物は異種移植物という。【００４７】
本発明において使用されるコーティング剤（例えば、フィブリノゲンまたはその誘導体、細胞外マトリクスなど）としては、培養が企図される細胞と、異種であってもよく、同種（特に自家）であってもよい。【００４８】
幹細胞の提供者がヒトである場合、通常インフォームド・コンセントを得る必要がある。【００４９】
ヒト受精胚の提供候補者については、幹細胞研究に凍結胚を提供依頼にあたってのインフォームド・コンセントによる同意が与えられるかどうかを、次のような手順に従って確認する。不妊治療の開始から凍結胚の廃棄決定に至る手続き、および関連文書、その後に始まる幹細胞研究への提供に関するプロセスの例示的概要を示す。【００５０】
（１）  不妊治療の結果作られて凍結保存されているヒト受精胚が、子宮へ移植されることなく廃棄させることが決定するまでは、幹細胞研究とは全く無関係な不妊治療プロセスとして患者と不妊治療担当医師による臨床的問題である。【００５１】
（２）  廃棄させることが決定した凍結胚について、不妊治療担当医師が中立的立場を保ちながら、幹細胞の研究について説明を受けるかどうか提供候補者に質問する。【００５２】
（３）  説明を受けたいとの意思を示した提供候補者に対して、樹立機関の説明者（樹立責任者以外）が幹細胞とはなにか、将来の医療への応用の可能性、研究内容の概要、幹細胞株樹立によって提供者は利益も不利益も受けないこと、提供者のプライバシーは保護されること、などについて十分に説明する。これらの説明は、全く中立の立場で行われる。【００５３】
（４）  提供候補者は説明を受けた後に、提供医療機関の長に対して提供に同意するかどうかを回答する。同意はインフォームド・コンセントの書類への署名を必要とし、その書類は提供医療機関が厳重に保管する。特定の提供候補者による同意あるいは不同意に関する結果は樹立関係者には伝えない。【００５４】
（５）  提供候補者による同意の署名から一ヶ月間以上の猶予期間をおいて、提供候補者の意思に変更がない場合は、凍結胚を樹立機関に移送する。その際、複数の提供者からの凍結胚を同時に引渡すとともに、凍結胚容器からは提供者を同定できるラベルなどを完全に除去しておく。従って、樹立機関の説明担当者が複数の提供候補者と面会はするが、その氏名などの個人情報は知ることがなく、またそれらの候補のうち誰が同意して提供者となったかも知ることがないので、提供者の匿名性は保証され得る。さらに、複数の提供者からの凍結胚を使ってその一部のみから細胞株が樹立されるので、どの提供者の胚から実際に幹細胞株が樹立されたかは樹立機関と提供医療機関の両者ともに知ることができないようにする。【００５５】
本明細書において「キット」とは、通常２つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、試薬、培養容器、コーティング剤、粒子など）が提供されるユニットをいう。混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合してまたはコーティングして使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、試薬、培養容器、コーティング剤、粒子など）をどのように処理すべきかを記載する説明書を備えていることが有利である。このような説明書は、どのような媒体であってもよく、例えば、そのような媒体としては、紙媒体、伝送媒体、記録媒体などが挙げられるがそれらに限定されない。伝送媒体としては、例えば、インターネット、イントラネット、エクストラネット、ＬＡＮなどが挙げられるがそれらに限定されない。記録媒体としては、ＣＤ−ＲＯＭ、ＣＤ−Ｒ、フレキシブルディスク、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ＭＤ、ミニディスク、ＭＯ、メモリースティックなどが挙げられるがそれらに限定されない。【００５６】
本発明では、任意の培養液を用いることができる。そのような培養液としては、例えば、ＤＭＥＭ、Ｐ１９９、ＭＥＭ、ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ平衡化塩溶液）、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２、ＢＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ１０４、ＭＣＤＢ１５３（ＫＧＭ）などが挙げられるがそれらに限定されない。このような培養液には、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）などの副腎皮質ステロイド、インスリン、グルコース、インドメタシン、イソブチル−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、アスコルベート−２−ホスフェート（ａｓｃｏｒｂａｔｅ−２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、アスコルビン酸およびその誘導体、グリセロホスフェート（ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、エストロゲンおよびその誘導体、プロゲステロンおよびその誘導体、アンドロゲンおよびその誘導体、ａＦＧＦ・ｂＦＧＦ・ＥＧＦ・ＩＧＦ・ＴＧＦβ・ＥＣＧＦ・ＢＭＰ・ＰＤＧＦをはじめとする増殖因子、下垂体エキス、松果体エキス、レチノイン酸、ビタミンＤ、甲状腺ホルモン、子牛血清、馬血清、ヒト血清、ヘパリン、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、アルブミン、トランスフェリン、セレン酸（亜セレン酸ナトリウムなど）、リノレン酸、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、５−アザンシチジンなどの脱メチル化剤、トリコスタチンなどのヒストン脱アセチル化剤、アクチビン、ＬＩＦ・ＩＬ−２・ＩＬ−６などのサイトカイン、ヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジブチルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヨードデオキシウリジン（ＩｄＵ）、ヒドロキシウレア（ＨＵ）、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、酪酸ナトリウム（ＮａＢｕ）、ポリブレン、セレニウムなどを１つまたはその組み合わせとして含ませておいてもよい。【００５７】
本明細書において「コーティング」とは、物体表面を特定の物質の薄膜でおおうことをいう。そのような物質としては、任意の物質を用いることができる。本発明では、特に、フィブリノゲンまたはその誘導体、組織接着剤、細胞外マトリクス、ゼラチンなどをコーティングに用いることができるがそれらに限定されない。このようなコーティングは、当該分野において周知の技術によって実施することができ、例えば、そのような生体適合性高分子溶液中に脱細胞化組織を浸す方法、あるいは、スプレーなどで塗布する方法などが挙げられるがそれらに限定されない。コーティングを行った後は、好ましくは固定を行うことが有利であり得る。固定には、例えば、乾燥、放置、化学処理、物理的処理など任意の方法を用いることができる。例えば、コーティングは、架橋をすることによって固定され得るがそれに限定されない。そのような架橋は、例えば、化学処理、ラジカル反応（例えば、紫外線照射、フリーラジカル供給源への暴露、超音波処理、Ｘ線照射、γ線照射および電子線照射など）によって行うことができる。【００５８】
コーティングには、本発明の特定の物質に加えて、他の適切なさらなる物質を用いることができることが理解される。例えば、そのような物質には、生体適合性分子を挙げることができる。【００５９】
好ましい実施形態において、本発明において用いられる生体適合性高分子は、生分解性であり得る。【００６０】
本明細書において「生体適合性」とは、毒性および免疫学的拒絶能がないために生体内で障害なく存在することができる性質をいう。【００６１】
本明細書において「生体適合性高分子」とは、生体適合性のよい高分子をいい、具体的には、残存しても毒性を生じないことをいう。ある高分子がそのような生体適合性を有しているかどうかを判定する方法は、本明細書においては、ラット等の実験動物皮下への埋植試験等の試験法を使用する。この試験法では、皮下埋植試験の結果、比較的急性の免疫反応やアレルギー反応等が起き、腫れたり、発赤もしくは発熱したりする場合には肉眼的に生体適合性が低いことが解る。さらに人工血管を動物の血管に移植した場合など、特定の患部に移植した場合には、数日から数ヶ月後に、移植箇所を観察し、組織の生着の有無、移植組織周辺の炎症、癒着、血液凝固による血栓形成などの程度を観察して、組織適合性の判定を行う。この他、移植部位の組織切片を作成してヘマトキシリン・エオシン染色その他の染色法にて細胞を染色・観察し、組織適合性の低さの指標としては免疫系を担当する顆粒性の細胞が多く侵入しているかどうか、もしくは従来組織と移植組織の間に両者を隔てる瘢痕組織の形成が認められるか否かを判定する。また、特に脱細胞化組織の組織適合性の高さの指標としては、血管内皮細胞、繊維芽細胞、平滑筋細胞など各種の細胞が従来組織より侵入し、再細胞化が起きているかどうか（すなわち従来組織と移植組織の境界が明確でない程度に移植組織が生着しているかどうか）を判定する。【００６２】
また、上記の組織や細胞の形状観察による判定以外にも、炎症反応の進行に起因する血液中のサイトカインの濃度、異物として認識された移植組織に対する抗体の濃度（力価）、補体成分の濃度、異物埋入により誘導された薬物代謝酵素（Ｐ４５０等）の酵素量、等の生物化学的な定量値とその移植前後の変動の追跡をもって、組織適合性の指標とする場合もある。【００６３】
医療器具類の材料については、その毒性を評価して医療器具への使用を合理的に規制する為に、細胞毒性試験、感作性試験、刺激性試験、埋植試験、遺伝毒性試験、血液適合性試験、全身毒性試験、などの試験項目があり、厚生労働省のガイドライン、米国のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、国際的産業基準のＩＳＯ−１０９９３等により個別の試験法が規定されている。【００６４】
生体適合性高分子としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、コラーゲン、γ−ポリグルタミン酸、シリコーン、ポリ塩化ビニル、ポリメタクリル酸メチル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリウレタン、セルロース、ポリスチレン、ナイロン、ポリカーボネート、ピリサルホン、ポリアクリロニトリル、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、キチン、キトサン、アルギン酸、デンプン、γ-ポリグルタミン酸、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸などが挙げられるがそれらに限定されない。ここで、ポリビニルアルコールの中には、未修飾のものの他に、アミノ基、カルボキシル基、アセチル基などにより若干の程度化学修飾されたものもあり、それらは市販されており、これらの改変ポリビニルアルコールもまた本発明において使用することができる。好ましくは、生体適合性高分子は、生分解性であるがそれに限定されない。【００６５】
本明細書において「生分解性」とは、物質について言及するとき、生体内で，あるいは微生物の作用により分解される性質をいう。生分解性の高分子は、例えば、加水分解により，水，二酸化炭素、メタンなどに分解され得る。本明細書では、生分解性であるかどうかを判定する方法は、生分解性の一部である生体吸収性に関しては、ラット、ウサギ、イヌなど実験動物への数日間から数年間にわたる埋植試験、微生物による分解の試験に関しては、シート状の高分子の土壌中での数日間から数年間にわたる埋入・崩壊試験などの方法を使用する。移植に関する場合、動物における試験を使用することが好ましい。また、上記の試験方法に準ずるより簡便な代替試験法としては、高分子の非酵素的分解についてはリン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）などの各種緩衝液を、高分子の酵素分解については当該高分子の加水分解酵素（プロテアーゼ、グリコシダーゼ、リパーゼ、エステラーゼ等）を添加した緩衝液を、それぞれ用いて水溶液中での溶解試験を行うこともある。生分解性の高分子には、天然および合成高分子がある。天然高分子の例としては，コラーゲン，デンプンなどのタンパク質、多糖類が挙げられ、そして合成高分子の例としてはポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリエチレンスクシナートなどの脂肪族ポリエステルが挙げられるがそれらに限定されない。ポリビニルアルコールは、生分解性については、弱い生分解性を示すことから、本明細書では、生分解性を有するものとして認識され得る。【００６６】
本明細書において「高分子」は、「分子」と同様の意味で用いられ、特に分子量を限定しない。高分子について分子量を限定して議論する場合、通常、分子量が５００以上のものを指すがそれに限定されない。本発明において用いられる高分子の分子量の上限は、原理的には無限大であるが、本発明では、通常、溶液として取り扱い、分子量を議論できる（動的光散乱、ゲル濾過、遠心分離器による沈降平衡などの分子量測定が適用できるという意味で）のは分子量５００万程度までが使用され得るがそれに限定されない。【００６７】
（発明を実施するための好ましい実施形態）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。【００６８】
１つの局面において、本発明は、フィブリノゲンまたはその誘導体を含む、幹細胞を培養するための培養容器を提供する。フィブリノゲンまたはその誘導体としては、任意のものを使用することができることが理解される。従って、フィブリノゲンまたはその誘導体の調製には、当該分野において公知の任意の方法を用いることができる。フィブリンのりの代表的な作製法を以下に示す。【００６９】
（Ａ液）
ＡＣＤ加血（テルモ４連バッグ）またはその等価物（４時間以内のものを使用する琴が好ましいようである）を使用する。この血液を、４℃  ３０００ｒｐｍ  １０ｍｉｎ  （あるいは４０００ｒｐｍ  ６分）で処理する。バフィーコート、赤血球を取り除き血漿を使用する。この血漿は、−８０℃で急速冷凍するか、あるいは、−４０℃でエアキャップなどを巻いてゆっくり凍結させる。（フィブリンの収量を出来るだけ多くするため）。ここで、静置した状態で凍結・解凍を２度繰り返すと収量は１．５倍になるとも言われる。あるいは、−２０℃で振盪しながら緩速凍結し、４℃水槽で緩速解凍したほうが、収量が多いようである。−２０℃で保存する。解凍は、４℃で１６〜１８〜２４時間程度行う。【００７０】
使用時には、４℃  ２３００ｒｐｍ  ４０分で遠心分離して上清（ＦＦＰ）を除き、沈澱を使用する。この際、最後の遠沈の後、４℃の部屋で逆さにしておくとさらに収量が上がるようである。また、振盪したほうが、収量が多くなるようである。再凍結後４℃水槽中で解凍したほうが室温解凍のものよりも収量が多いようである。【００７１】
保存は、−８０℃で急速冷凍するか、あるいは、−２０℃で保存する。使用時には、３７℃で解凍し使用する。【００７２】
使用時のフィブリン濃度は、１０ｍｇ／ｍｌ程度から１００ｍｇ／ｍｌ程度のものが使用され得る。市販のものは８０ｍｇ／ｍｌが多い。【００７３】
＜Ｂ液＞
Ｂ液は、自己血輸血マニュアル：高折益彦  先生  著  克誠堂出版、１９９６に準じて調製することができる。Ｂ液は、トロンビン末５０００単位；０．５Ｍ塩化カルシウム液１ｍｌ
アプロチニン３５００単位；蒸留水７．５ｍｌで調製することができる。アプロチニンは、Ｂａｙｅｒなどから入手することができる。【００７４】
あるいは、グルコン酸Ｃａ（カルチコール）５ｍｌ；トロンビン１００００単位を用いても良い。アプロチニンの代わりに「フサン」を用いても良い。【００７５】
使用時には、Ａ液およびＢ液を混ぜて用いることが望ましい。【００７６】
１つの実施形態において、フィブリノゲンまたはその誘導体は、培養容器にコーティングされる。コーティングの方法は、当該分野において公知の任意の方法を用いることができることが理解される。【００７７】
１つの実施形態において、このようなフィブリノゲンまたはその誘導体は、培養容器にどのような厚さでコーティングされても良いが、好ましくは、１μｍ〜１００μｍの厚さでコーティングされ、より好ましくは５μｍ〜５０μｍの厚さでコーティングされる。少なすぎると、細胞の増殖に耐えられない可能性があることから、ある程度の厚みがあることが好ましいことが理解される。【００７８】
１つの実施形態において、フィブリノゲンまたはその誘導体は、どのような分子量のものでも用いることができるが、好ましくは、分子量が３４万Ｄａ以上であり、より好ましくはフィブリンポリマーまたはフィブリン塊となったものが使用される。【００７９】
１つの実施形態において、本発明の培養容器に含まれるフィブリノゲンまたはその誘導体は、フィブリンを含む。フィブリンは、どのような濃度で含まれても良いが好ましくは容器１ｃｍ２あたり０．１ｍｇ〜１００ｍｇ含まれることが好ましくあり得る。【００８０】
別の実施形態において、フィブリノゲンまたはその誘導体は、プロテアーゼを含む。プロテアーゼを含むことにより、フィブリノゲンの分解が進み、接着能力が改善するからである。なお、使用時にはプロテアーゼは失活していてもよい。プロテアーゼとしては、例えば、トロンビン（例えば、αトロンビンなど）またはバトロキソビンなどを挙げることができるがそれに限定されない。【００８１】
好ましい実施形態では、本発明において使用されるフィブリノゲンまたはその誘導体は、プロテアーゼ阻害剤を含む。プロテアーゼ阻害剤を含むことによって、プロテアーゼの悪影響をコントロールすることができるからである。プロテアーゼとしては任意のものを使用することができるがそれに限定されない。【００８２】
別の実施形態において、プロテアーゼ阻害剤としては、アプロチニン、フサン、４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸などを挙げることができるがそれに限定されない。【００８３】
好ましくは、本発明において使用されるフィブリノゲンまたはその誘導体は、フィブリンのりである。【００８４】
別の実施形態において、本発明において使用されるフィブリンのりは、フィブリン、フィブリンモノマー、フィブリンポリマー、フィブロネクチン、血小板などの成分を含む。【００８５】
好ましい実施形態において、本発明において使用されるフィブリンのりは、トロンビンによってフィブリノゲンのＡα鎖のＮ末端からフィブリノペプチドＡ（ＦＰＡ）が、Ｂβ鎖のＮ末端からフィブリノペプチドＢ（ＦＰＢ）が切断される。フィブリノゲン１分子から２分子ずつのＦＰＡとＦＰＢが切断されて残った分子がフィブリンモノマーである。本発明におけるフィブリンのりは、フィブリンモノマーは重合部位が露出しているため互いのＮ末端とＣ末端が重合する程度の接着性を有し、フィブリンポリマー〜フィブリン塊となる。【００８６】
本発明において使用される場合、フィブリンのりは、どのような濃度でも用いることができるが、好ましくは、５００倍以下に希釈された（クリオプレシピテートと標準トロンビン溶液で生成されたものを基準として定義される）ものを用いることが好ましい。あるいは、フィブリンのりは、５０倍〜５００倍に希釈されたものを用いることがより好ましくあり得るが、それに限定されない。より好ましくは、１００倍以上、例えば、約５００倍に希釈されたものを用いることが好ましくあり得る。増殖効率が格段に向上するからである。フィブリンのりの希釈は、任意の媒体を用いることができるが、好ましくは、生理的に適合された媒体を用いることが好ましい。そのような溶液としては、例えば、生理食塩水などを挙げることができるがそれに限定されない。【００８７】
本発明において使用され得るフィブリンのりは、「クリオプレシピテートあるいは血漿あるいは血小板含有血漿（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ  ｐｌａｓｍａ：ＰＲＰ）」と「トロンビンに塩化カルシウム、アプロチニン液（製品名トラジロール）を添加した溶液」を混和して作製され得る。希釈は、代表的にクリオプレシピテートは、１００００倍程度まで、血漿は、５００倍程度まで希釈可能。後者のトロンビン溶液の方で、１０００倍程度までが可能である。トロンビン溶液の組成は、例えば、
・トロンビン５０００単位を蒸留水７．５ｍｌで溶解
・０．５Ｍ  塩化カルシウム  １ｍｌ
・アプロチニン  ３５０００単位（トラジロール３．５ｍｌ）
で、総量１２ｍｌとすることによって調製することができる。【００８８】
従って、トロンビン溶液の希釈倍率の５００倍とは、トロンビンの濃度で定義すると０．８３単位／ｍｌである。【００８９】
従って、本発明において用いられるフィブリノゲンまたはその誘導体は、例えば、フィブリンモノマー、フィブリンポリマー、フィブリノゲン、血小板などを含み得る。【００９０】
例えば、フィブリンのりは、（１）「クリオプレシピテート（濃厚フィブリノゲン血漿）あるいは血漿血小板含有血漿（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ  ｐｌａｓｍａ：  ＰＲＰ）」と（２）「トロンビン溶液（トロンビンに塩化カルシウム、アプロチニン液（製品名トラジロール）を添加した溶液）（トロンビン５０００単位を１２ｍｌに含む）」を混和して作製することができる。（１）および（２）ともに希釈して使用することが可能である。【００９１】
本発明が対象とする幹細胞は、どのような幹細胞でも良いが、好ましくは組織幹細胞であり、より好ましくは、間葉系幹細胞であり、例えば、脂肪組織由来の幹細胞であり得る。特に、そのような細胞として、脂肪吸引物に由来する幹細胞を用いることができたことは、従来技術において達成できていなかったことであり（Ｄａｎｉｅｌ  Ａ．Ｄｅ  Ｕｇａｒｔｅａ  Ｋｏｕｋｉ  Ｍｏｒｉｚｏｎｏｃ  Ａｍｉｒ  Ｅｌｂａｒｂａｒｙａ  Ｚｅｎｉ  Ａｌｆｏｎｓｏｂ，  Ｐａｔｒｉｃｉａ  Ａ．Ｚｕｋａ  Ｍｉｎ  Ｚｈｕａ  Ｊａｓｏｎ  Ｌ．Ｄｒａｇｏｏａ  Ｐｅｔｅｒ  Ａｓｈｊｉａｎａ  Ｂｅｒｔ  Ｔｈｏｍａｓａ，  Ｐｒｏｓｐｅｒ  Ｂｅｎｈａｉｍａ  Ｉｒｖｉｎ  Ｃｈｅｎｃ  Ｊｏｈｎ  Ｆｒａｓｅｒｂ  Ｍａｒｃ  Ｈ．Ｈｅｄｒｉｃｋａ，  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｏｒｇａｎｓ  ２００３；１７４：１０１-１０９）、従来では達成できなかった効果を有するといえる。なお、この文献では、ダブリング時間が７８（±２６）時間とされており、本発明より顕著に遅い。好ましくは、本発明で培養されるべき幹細胞は、脂肪細胞由来幹細胞（ＡＳＣ；ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）であり得る。【００９２】
１つの実施形態において、本発明において用いられる、フィブリンまたはその分解物は、コーティング後に乾燥した場合、単位面積あたりの重量で、０．１−１００ｍｇ／ｃｍ２の濃度で含まれる。【００９３】
本発明の培養容器の材質としては、細胞培養に適切なものであれば、任意の材料を使用することができ、例えば、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属、天然ポリマーおよび合成ポリマーからなる群より選択される材料を用いることができる。【００９４】
別の局面において、本発明は、本発明の容器を用いて幹細胞を培養する方法を提供する。そのような幹細胞を調製（または培養）するための方法は、Ａ）幹細胞を提供する工程；およびＢ）該幹細胞を、培地ならびにフィブリノゲンまたはその誘導体を含む培養容器中で培養する工程、を包含する。【００９５】
幹細胞の提供は、当該分野において公知の任意の手法を用いることができる。そのような提供には、例えば、幹細胞に特異的なマーカーを指標にＦＡＣＳにより細胞をソートすることなどが挙げられるがそれらに限定されない。【００９６】
本発明の方法において、幹細胞の培養は、通常使用される任意の培地を用いることができる。そのような培養条件としては、例えば、ｐＨ７．２〜７．４、温度３７℃、ＣＯ２濃度５％という条件を挙げることができるがそれらに限定されない。ｐＨとしては、例えば、中性付近（例えば、ｐＨ５〜９など）、温度としては、例えば、常温〜３７℃など、ＣＯ２濃度としては、例えば、１〜１０％（例えば、５％）などを挙げることができるがそれらに限定されない。【００９７】
本発明の方法において使用され得る培地としては、例えば、ＤＭＥＭ、Ｐ１９９、ＭＥＭ、Ｈａｎｋｓ’平衡化塩溶液（ＨＢＳＳ）、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２、ＢＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ１０４およびＭＣＤＢ１５３（ＫＧＭ）などを挙げることができるがそれらに限定されない。ＤＭＥＭおよびＰ１９９が好ましい。幹細胞の増殖に適切であることが示されているからである。【００９８】
本発明の方法において用いられる培地は、副腎皮質ステロイド、インスリン、グルコース、インドメタシン、イソブチル−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、アスコルビン酸およびその誘導体、グリセロホスフェート、エストロゲンおよびその誘導体、プロゲステロンおよびその誘導体、アンドロゲンおよびその誘導体、増殖因子、下垂体エキス、松果体エキス、レチノイン酸、ビタミンＤ、甲状腺ホルモン、子牛血清、馬血清、ヒト血清、ヘパリン、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、アルブミン、トランスフェリン、セレン酸塩、リノレン酸、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、脱メチル化剤、ヒストン脱アセチル化剤、アクチビン、サイトカイン、ヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジブチルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヨードデオキシウリジン（ＩｄＵ）、ヒドロキシウレア（ＨＵ）、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、酪酸ナトリウム（ＮａＢｕ）、ポリブレンおよびセレニウムなどをさらに加えることができる。【００９９】
１つの実施形態において、本発明の細胞調製法では、原料となる幹細胞を入手する工程をさらに包含する。そのような入手の方法は、生体からの分離、あるいは、サンプルからのＦＡＣＳソート、分離などを挙げることができるがそれらに限定されない。【０１００】
別の実施形態において、本発明の細胞調製法は、幹細胞を分化させる工程をさらに包含することができる。そのようにして分化させた細胞を用いることも本発明の範囲内に入ることが理解される。【０１０１】
別の局面において、本発明は、幹細胞を培養するための、フィブリノゲンまたはその誘導体がコーティングされた培養容器を生産するための方法を提供する。この方法は、Ａ）培養容器を提供する工程；Ｂ）該培養容器にフィブリノゲンまたはその誘導体を提供する工程；およびＣ）該フィブリノゲンまたはその誘導体を該培養容器の表面に固定する工程、を包含する。培養容器の提供は、当該分野において周知の方法により実現することができる。このような培養容器にフィブリノゲンまたはその誘導体を提供することは、任意公知技術を用いることができ、好ましくは、コーティングすることが有利である。そのようなフィブリノゲンまたはその誘導体は、培養容器に当該分野において公知の任意の方法を用いて固定される。【０１０２】
好ましい実施形態において、本発明において使用されるフィブリノゲンまたはその誘導体の提供は、無菌操作にて行われる。そのような条件によって提供されることによって、培養に対してプラスの効果があることが判明したからである。【０１０３】
別の好ましい実施形態において、本発明のフィブリノゲンまたはその誘導体の固定は、乾燥状態で一定時間放置すること、または紫外線照射下などにより行うことができる。【０１０４】
１つの局面において、本発明は、幹細胞を培養するための、組織接着剤がコーティングされた培養容器を提供する。このような組織接着剤は、当該分野において公知のものを使用することができ、例えば、シアノアクリレート系接着剤、ゼラチン−アルデヒド系接着剤およびフィブリングルー系接着剤などを挙げることができる。培養容器については、上記フィブリノゲンまたはその誘導体を含む培養容器に関する説明において記載される任意の形態を採用することができる。これらの培養容器が対象とする細胞についてもまた、上記フィブリノゲンまたはその誘導体を含む培養容器に関する説明において記載される任意の形態を採用することができる。【０１０５】
ここで、好ましくは、上記細胞接着剤は、0.1−100mg/cm2以上の濃度で含まれ得る。【０１０６】
別の局面において、本発明は、幹細胞を培養するための、細胞外マトリクスがコーティングされた培養容器を提供する。このような細胞外マトリクスは、当該分野において公知のものを使用することができ、例えば、フィブロネクチン、コラーゲンおよびラミニンなどを挙げることができる。培養容器については、上記フィブリノゲンまたはその誘導体を含む培養容器に関する説明において記載される任意の形態を採用することができる。これらの培養容器が対象とする細胞についてもまた、上記フィブリノゲンまたはその誘導体を含む培養容器に関する説明において記載される任意の形態を採用することができる。【０１０７】
ここで、好ましくは、上記細胞外マトリクスは、０．１〜１００ｍｇ／ｃｍ２以上の濃度で含まれ得る。例えば、より好ましくは、フィブロネクチンが１〜２．５μｇ／ｃｍ２、コラーゲンが３〜８μｇ／ｃｍ２、ラミニンが５〜２０μｇ／ｃｍ２であってもよい。【０１０８】
別の局面において、本発明は、幹細胞を培養するための、ゼラチンがコーティングされた培養容器を提供する。このようなゼラチンは、当該分野において公知のものを使用することができる。培養容器については、上記フィブリノゲンまたはその誘導体を含む培養容器に関する説明において記載される任意の形態を採用することができる。これらの培養容器が対象とする細胞についてもまた、上記フィブリノゲンまたはその誘導体を含む培養容器に関する説明において記載される任意の形態を採用することができる。【０１０９】
別の局面において、本発明は、幹細胞を調製するための方法を提供する。この方法は、Ａ）培地、ならびに細胞外マトリクスおよび／またはゼラチンを含む培養容器を提供する工程；Ｂ）幹細胞を該培養容器に配置する工程；Ｃ）該幹細胞を所望の期間培養する工程、を包含する。この方法でもまた、培養容器については、上記フィブリノゲンまたはその誘導体を含む局面に関する説明において記載される任意の形態を採用することができる。これらの培養容器が対象とする細胞についてもまた、上記フィブリノゲンまたはその誘導体を含む局面に関する説明において記載される任意の形態を採用することができる。【０１１０】
他の局面において、本発明は、幹細胞を培養するための、細胞外マトリクスおよび／またはゼラチンがコーティングされた培養容器を生産するための方法を提供する。この方法は、Ａ）培養容器を提供する工程；Ｂ）該培養容器に細胞外マトリクスおよび／またはゼラチンを提供する工程；およびＣ）該細胞外マトリクスおよび／またはゼラチンを該培養容器の表面に固定する工程、を包含する。この方法でもまた、培養容器については、上記フィブリノゲンまたはその誘導体を含む局面に関する説明において記載される任意の形態を採用することができる。これらの培養容器が対象とする細胞についてもまた、上記フィブリノゲンまたはその誘導体を含む局面に関する説明において記載される任意の形態を採用することができる。【０１１１】
他の局面において、本発明は、フィブリノゲンまたはその誘導体の、幹細胞を調製するための使用を提供する。フィブリノゲンまたはその誘導体が、幹細胞（特に、組織幹細胞）に対して増殖効果を有するかどうか知られていなかった。従って、本発明は、フィブリノゲンまたはその誘導体の新規用途を提供することになる。この使用でもまた、培養容器については、上記フィブリノゲンまたはその誘導体を含む局面に関する説明において記載される任意の形態を採用することができる。これらの培養容器が対象とする細胞についてもまた、上記フィブリノゲンまたはその誘導体を含む局面に関する説明において記載される任意の形態を採用することができる。【０１１２】
別の局面において、本発明は、細胞外マトリクスおよび／またはゼラチンの、幹細胞を調製するための使用を提供する。細胞外マトリクス（特に、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンなど）が増殖効果を有するかどうか知られていなかった。従って、本発明は、フィブリノゲンまたはその誘導体の新規用途を提供することになる。この使用でもまた、培養容器については、上記フィブリノゲンまたはその誘導体を含む局面に関する説明において記載される任意の形態を採用することができる。これらの培養容器が対象とする細胞についてもまた、上記フィブリノゲンまたはその誘導体を含む局面に関する説明において記載される任意の形態を採用することができる。【０１１３】
（脂肪吸引廃液からの幹細胞の調製方法）
本発明の１つの局面において、脂肪吸引廃液から幹細胞を調製する方法であって、Ａ）脂肪吸引廃液を得る工程；Ｂ）該脂肪吸引廃液を遠心分離して細胞画分を得る工程；Ｃ）該細胞画分を密度勾配遠心分離にかけて比重による細胞分離を行う工程；および、Ｄ）赤血球よりも比重が軽い細胞層を収集する工程、を含む、方法が提供される。本方法において用いる脂肪吸引廃液としては、脂肪吸引時に一緒に吸引された液体（例えば、トゥメセント液および血液が挙げられるが、これらに限定されない）または、吸引脂肪を液体で洗浄する際に生じた廃液が挙げられるが、これらに限定されない。【０１１４】
脂肪吸引方法は、当業者に周知である技術を用いて、実施することができる。脂肪吸引方法に用いられる装置としては、例えば、ケイセイ脱脂吸引機サルポンプＳＡＬ７６−Ａ（ケイセイ医科工業（株）、東京都文京区本郷３−１９−６）が挙げられるが、これらに限定されない。例えばヒトの場合、０．０００１％アドレナリン入り生理食塩水などの液体を、予定吸引脂肪量の等量から２倍量、脂肪組織内に注入し、その後、内径２−３ｍｍのカニューレ（金属製吸引管）を用いて、−２５０〜９００ｍｍＨｇ程度の陰圧で吸引することによって行う。【０１１５】
吸引した脂肪細胞を洗浄する液体として通常は、生理食塩水が用いられる。しかし、生理食塩水以外にも、単離すべき幹細胞に悪影響を与えない液体であれば、任意の液体が使用可能である。具体的には、例えば、リンゲル液、および哺乳動物培養培地（例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｍ１９９、およびＭＣＤＢ１５３など）のような、任意の等張液が使用可能である。【０１１６】
脂肪吸引廃液から幹細胞を調製する場合、必要に応じて、脂肪吸引廃液にコラゲナーゼなどの酵素処理を行なうことも可能である。しかし、脂肪吸引廃液中に含まれるコラーゲンの量は、脂肪組織と比較して少ないため、幹細胞調製の原料として脂肪吸引廃液を用いる場合、コラゲナーゼ処理に必要とされる時間、および／または酵素処理に必要とされる酵素量が、脂肪組織の場合と比較して、より少ない。【０１１７】
脂肪吸引廃液を遠心分離して細胞画分を得る工程においては、細胞画分と、その他の成分（例えば、血漿、手術時に注入した生理食塩水、麻酔薬、止血薬、破壊された脂肪細胞から漏出した脂質成分）を分離する任意の条件を用いることができる。例えば、４００〜８００×ｇでの５〜１５分程度の遠心分離を用いることが可能である。【０１１８】
単離された細胞画分を密度勾配遠心分離にかけて比重による細胞分離を行う工程では、細胞画分を、例えば、密度勾配遠心分離法によって、その比重によって分離する。その媒体としては、密度勾配遠心分離法に使用可能な媒体を用いる。好ましい媒体は、２０℃での比重が１．０７６〜１．０７８  ｇ／ｍｌである。また、好ましい媒体のｐＨは、４．５〜７．５である。また、媒体中の好ましいエンドトキシンレベルは０．１２  ＥＵ／ｍｌ以下である。代表的な媒体としては、スクロース、フィコール（スクロースとエピクロロヒドリンの共重合物）、およびパーコール（ポリビニルピロリドンの被膜を有するコロイド状シリカ製品）が挙げられるが、これらに限定されない。フィコールは、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（ファルマシアバイオテク株式会社、東京）、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社、東京）、およびリンフォプレップ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）（登録商標）（ニコメッド、オスロ（ノルウェー））など名称の製品が市販されている。パーコールは、Ｐｅｒｃｏｌｌ（シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社、東京）という名称の製品が市販されている。【０１１９】
比重による遠心分離の条件は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳを媒体として用いる場合、４００×ｇ、３０〜４０分であり、ヒストパックを媒体として用いる場合、３７０ｇ×ｇ、約３０分であり、リンフォプレップを媒体として用いる場合、８００×ｇ、約２０分または１１００×ｇ、約１０分である。【０１２０】
この比重による遠心分離において、通常最も多い細胞は、赤血球細胞であり、赤色の細胞層として確認することができる。幹細胞は、赤血球よりも比重が軽いため、幹細胞を分離する場合には、赤血球よりも軽い細胞層を収集する。好ましくは、比重１．０５０〜１．０７５の範囲の細胞層を収集する。【０１２１】
おおまかな細胞の比重は、パーコール、レディグラッドのような密度勾配遠心分離媒体を塩化ナトリウム溶液やスクロース溶液で調製し、収集した細胞と共にデンシティーマーカービーズ（ｄｅｎｓｉｔｙ  ｍａｒｋｅｒ  ｂｅａｄｓ）を加えて遠心し、ビーズによって分けられた５−１０層のうち、どの層に細胞があるかを確認することで、調べることが可能である。【０１２２】
また、層に分離した細胞の回収は、例えば、ピペットを用いて行なうことができる。【０１２３】
比重による遠心分離においては、セルセパレーター（例えば、血液成分分離装置ＡＳＴＥＣ２０４、（株）アムコ）を使用することも可能である。【０１２４】
収集された細胞を培養する培地としては、例えば、ＤＭＥＭ、Ｍ１９９、ＭＥＭ、ＨＢＳＳ、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２、ＢＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ１０４、ＭＣＤＢ１５３（ＫＧＭ）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい培地としては、ＤＭＥＭ、およびＭ１９９が挙げられる。【０１２５】
収集された細胞は、ヘテロな細胞の集団であり、ＣＤ１３、２９、４４、４９ｄ、７１、７３、９９、１０５、１５１を発現する幹細胞を含み、さらにＣＤ３１、ＣＤ３４のどちらか、もしくは両方を発現する幹細胞を含む。【０１２６】
本発明の１つの局面において、収集された細胞を、各種条件で培養することによって、例えば、血管内皮細胞、神経細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞、靭帯細胞、およびストローマ細胞を得ることが可能である。【０１２７】
さらに、本発明において、以下の方法を用いて、収集された細胞群から、血管内皮前駆細胞を分離、回収することが可能である。【０１２８】
得られた細胞群を、血管内皮細胞用培地を用いて１％ゼラチンコート培養皿にて４−５日培養する。０．２５％トリプシンで培養皿から剥がして、ａｎｔｉ−ＰＥＣＡＭ−１ビーズと反応させて、抗体と反応した細胞のみをＭＡＣＳ（磁気細胞分離システム）もしくはＦＡＣＳ（フローサイトメトリー）を用いて分離する。分離した細胞を、再度、血管内皮細胞用培地・１％ゼラチンコート培養皿にて培養する。わずかに混在する繊維芽細胞などを除外するため、血管内皮細胞の方がトリプシンで剥がれやすいのを利用して、０．２５％トリプシンを３０−４０秒ほど反応させて剥がれた細胞のみを回収し、別の培養皿で培養することにより、血管内皮前駆細胞に分化した細胞を単離することが可能である。（例えば、Ｈｕｔｌｅｙ  ＬＪ，  ｅｔ  ａｌ：  Ｈｕｍａｎ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．  ２００１  Ｎｏｖ；２８１（５）：Ｅ１０３７−４４．を参照のこと）。【０１２９】
本発明のさらなる局面において、幹細胞を調製するためのシステムであって：Ａ）脂肪吸引廃液を得るための手段；Ｂ）脂肪吸引廃液を遠心分離して細胞画分を得る手段；および、Ｃ）細胞画分を密度勾配遠心分離にかけて比重による細胞分離を行う手段；を含む、システムが提供される。このシステムによって、簡便かつ大量に幹細胞を、自動的に調製することが可能となる。【０１３０】
脂肪吸引廃液を得るための手段としては、減圧によって生体内から脂肪を吸引する手段が挙げられる。例えば、そのような手段としては、脂肪吸引手術（手動の陰圧注射器を用いる脂肪吸引手術、および電動の脂肪吸引器を用いる脂肪吸引手術）、ならびに皮膚を切開することによる除脂術が挙げられるが、これらに限定されない。【０１３１】
脂肪吸引廃液を遠心分離して細胞画分を得る手段、および細胞画分を密度勾配遠心分離にかけて比重による細胞分離を行う手段としては、遠心分離装置が挙げられる。脂肪吸引廃液を遠心分離して細胞画分を得る場合、その条件としては、２００〜１２００×ｇ、３〜６０分間の遠心分離が挙げられ、好ましくは２６０〜９００×ｇ、３〜３０分間の遠心分離、より好ましくは４００〜８００×ｇ、３〜１５分間の遠心分離、最も好ましくは４００×ｇ、５〜１０分間の遠心分離を行う。また、フィコールを用いて、細胞画分を密度勾配遠心分離にかけて比重による細胞分離を行う場合、その条件としては、２００〜１２００×ｇ、１０〜６０分間の遠心分離が挙げられ、好ましくは２６０〜９００×ｇ、１０〜６０分間の遠心分離、好ましくは３７０〜１１００×ｇ、１０〜６０分間の遠心分離、より好ましくは４００〜８００×ｇ、１０〜４０分間の遠心分離、最も好ましくは４００×ｇ、３０〜４０分間の遠心分離を行う。また、このシステムは、必要に応じて、特定の比重の細胞層を収集する手段を備える。好ましくは、収集される細胞層は、赤血球よりも比重が軽い細胞層である。そのような手段としては、手動ピペッター、手動アスピレーター、自動ピペッター、および自動アスピレーターが挙げられるが、これらに限定されない。【０１３２】
本発明の幹細胞を用いて、種々の分化細胞および／または前駆細胞を得ることができる。具体的には、以下の方法を用いる。【０１３３】
（分化細胞を調製するための方法）
１つの局面において、本発明は、幹細胞から分化細胞を調製するための方法を提供する。幹細胞から得られる分化細胞としては、最終的に分化した細胞のみならず、前駆細胞も含まれる。【０１３４】
脂肪吸引廃液由来の幹細胞から分化細胞を調製する方法としては、（１）培地中に分化誘導剤（例えば、デキサメサゾンなど）を添加する方法、および（２）所望の部位に対応する分化細胞とともに培養する方法が挙げられる。【０１３５】
（培地中に分化誘導剤を添加することにより、幹細胞の分化を誘導する方法）
幹細胞の分化を誘導する分化誘導剤としては、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）などの副腎皮質ステロイド、インスリン、グルコース、インドメタシン、イソブチル−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、アスコルベート−２−ホスフェート（ａｓｃｏｒｂａｔｅ−２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、アスコルビン酸およびその誘導体、グリセロホスフェート（ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、エストロゲンおよびその誘導体、プロゲステロンおよびその誘導体、アンドロゲンおよびその誘導体、ａＦＧＦ・ｂＦＧＦ・ＥＧＦ・ＩＧＦ・ＴＧＦβ・ＥＣＧＦ・ＢＭＰ・ＰＤＧＦをはじめとする増殖因子、下垂体エキス、松果体エキス、レチノイン酸、ビタミンＤ、甲状腺ホルモン、子牛血清、馬血清、ヒト血清、ヘパリン、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、アルブミン、トランスフェリン、セレン酸（亜セレン酸ナトリウムなど）、リノレン酸、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、５−アザンシチジンなどの脱メチル化剤、トリコスタチンなどのヒストン脱アセチル化剤、アクチビン、ＬＩＦ・ＩＬ−２・ＩＬ−６などのサイトカイン、ヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジブチルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヨードデオキシウリジン（ＩｄＵ）、ヒドロキシウレア（ＨＵ）、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、酪酸ナトリウム（ＮａＢｕ）、ポリブレン、セレニウムが挙げられるがそれらに限定されない。【０１３６】
使用される培地としては、本発明の細胞混合物は、混合される細胞の維持および所望の部位に対応する分化細胞への分化を維持する限り、任意の培養液を用いることができる。そのような培養液としては、例えば、ＤＭＥＭ、Ｍ１９９、ＭＥＭ、ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ’Ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２、ＢＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ１０４、ＭＣＤＢ１５３  （ＫＧＭ）などが挙げられるがそれらに限定されない。このような培養液には、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）などの副腎皮質ステロイド、インスリン、グルコース、インドメタシン、イソブチル−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、アスコルベート−２−ホスフェート（ａｓｃｏｒｂａｔｅ−２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、アスコルビン酸およびその誘導体、グリセロホスフェート（ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、エストロゲンおよびその誘導体、プロゲステロンおよびその誘導体、アンドロゲンおよびその誘導体、ａＦＧＦ・ｂＦＧＦ・ＥＧＦ・ＩＧＦ・ＴＧＦβ・ＥＣＧＦ・ＢＭＰ・ＰＤＧＦをはじめとする増殖因子、下垂体エキス、松果体エキス、レチノイン酸、ビタミンＤ、甲状腺ホルモン、子牛血清、馬血清、ヒト血清、ヘパリン、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、アルブミン、トランスフェリン、セレン酸（亜セレン酸ナトリウムなど）、リノレン酸、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、５−アザンシチジンなどの脱メチル化剤、トリコスタチンなどのヒストン脱アセチル化剤、アクチビン、ＬＩＦ・ＩＬ−２・ＩＬ−６などのサイトカイン、ヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジブチルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヨードデオキシウリジン（ＩｄＵ）、ヒドロキシウレア（ＨＵ）、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、酪酸ナトリウム（ＮａＢｕ）、ポリブレン、セレニウムなどを１つまたはその組み合わせとして含ませておいてもよい。【０１３７】
脂肪吸引廃液由来の幹細胞の脂肪細胞への分化誘導は、例えば、ＤＭＥＭ培地に、イソブチル−メチルキサンチン、デキサメタゾン、インスリン、およびインドメタシンを添加した培地中で培養することによって行われるが、これに限定されない。【０１３８】
脂肪吸引廃液由来の幹細胞の軟骨細胞への分化誘導は、例えば、１％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に、インスリン、アスコルベート−２−ホスフェート、およびＴＧＦ−β１を添加した培地中で培養することによって行われるが、これに限定されない。【０１３９】
脂肪吸引廃液由来の幹細胞の骨細胞への分化誘導は、例えば、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に、デキサメタゾン、アスコルベート−２−ホスフェート、β−グリセロホスフェートを添加した培地中で培養することによって行われるが、これに限定されない。【０１４０】
脂肪吸引廃液由来の幹細胞の筋細胞への分化誘導は、例えば、１０％のＦＢＳと５％のＨＳ（馬血清）を含むＤＭＥＭ培地に、デキサメタゾン、ハイドロコルチゾンを添加した培地中で培養することによって行われるが、これに限定されない。【０１４１】
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１４２】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。以下の実施例において用いられる試薬などは、例外を除き、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）、和光純薬（大阪、日本）などから市販されるものを用いた。幹細胞の供与は、本発明者らが調製した。【０１４３】
（実施例１：脂肪幹細胞の調製）
本実施例では、まず、本実験に対して同意を示したヒトから脂肪幹細胞を脂肪吸引物から調製した。脂肪吸引物を１リットル大の分液漏斗を用いて生理食塩水で十分に洗浄した。上層に脂肪吸引物、下層に生理食塩水が十分に分離したのを確認し、下層を捨て、肉眼で見て生理食塩水がほぼ透明になるまでこれを繰り返した。この実施例では、５回行った。【０１４４】
脂肪吸引物を１０ｍｌと同量１０ｍｌの０．０７５％コラゲナーゼ／ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を加え、３７℃でよく攪拌しながら３０分間インキュベートした。この試料に、同量の１０％血清加ＤＭＥＭを加え、１２００×ｇで１０分間遠心分離した。【０１４５】
遠心分離により得られたペレットに０．１６Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ／ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を加えて懸濁し、２５℃で１０分間インキュベートした。この試料を口径１００μｍのメッシュ（Ｗｈａｔｍａｎ）を用いて吸引ろ過した。このろ過物を１２００×ｇで５分間遠心分離した。このようにして、脂肪細胞由来幹細胞（ＡＳＣ；ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）（またはＰＬＡ細胞）を調製することができる。幹細胞であることは、細胞マーカー（ＣＤ４、ＣＤ１３、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ７１、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１５１）により確認した。【０１４６】
（実施例２：脂肪吸引廃液の調製)
脂肪吸引手術前に予定吸引脂肪量以上の、トゥメセント液（０．０００１％アドレナリンを含む生理食塩水）を皮下脂肪層に注入し（トゥメセント法（ｔｕｍｅｓｃｅｎｔ法））、その後、脂肪吸引のために内径２〜３ｍｍのカニューレ（金属製吸引筒）を使用して、脂肪吸引手術を行った。脂肪吸引手術は、当該分野において周知であり、例えば、美容外科手術プラクティス２、市田正成・谷野隆三郎・保阪善昭  共編、文光堂、P429-469に、その方法が記載される。【０１４７】
吸引脂肪を生理食塩水で洗浄した。洗浄によって生じる計５〜１０リットル程度の廃液のうち、細胞成分の豊富な最初の１〜２リットルだけを、その後の処理に使用した。【０１４８】
（実施例３：脂肪吸引廃液からの、幹細胞懸濁液の調製)
廃液について、以下の２方法のいずれかを用いて処理することによって、幹細胞懸濁液を調製した。以下の２方法のいずれも、コラゲナーゼなどの酵素を用いる処理が不要であるため、コラゲナーゼなどの酵素の混入がない点においても、従来法で調製された脂肪組織由来の幹細胞とは異なる。【０１４９】
（Ｉ）調製方法１
１）脂肪吸引廃液（通常、２〜４リットル程度）を４００×ｇ、１０分遠心した。
２）上清を捨てた。ただし、沈殿した細胞は浮遊しやすいため、アスピレーターを用いて、細胞を失わないよう慎重に吸引した。
３）沈殿した細胞（ほとんどが赤血球）を５０ｍｌのポリプロピレン製チューブ数本に移し、再度遠心（４００×ｇ、５分）した。
４）上清を吸引し、総量が１５〜２０ｍｌとなるように沈殿細胞を集めた。マトリクス成分が多い場合は１００μｍフィルターで濾過・除去した。必要に応じて、再遠心を行なった。
５）５０ｍｌのチューブにフィコール（登録商標）１５ｍｌを入れ、その上に層を作るように極力ゆっくりと細胞液１５〜２０ｍｌを加えた。
６）４００×ｇ、３０分遠心した。（１８〜２０℃）
７）遠心後は４層に分離した。上から（Ａ層）無細胞層（透明）、（Ｂ層）単核球層（淡赤色）、（Ｃ層）フィコール層（透明）、（Ｄ層）赤血球層（濃赤色）で、幹細胞を含む接着細胞群はに含まれていた。Ａ層を吸引後、Ｂ層および約３ｍｌ程度のＣ層を細胞懸濁液として回収し、５０ｍｌのチューブに移した。
８）回収した細胞懸濁液に、血清加ＰＢＳ（１０％ＦＢＳ、もしくは１０％ヒト血清を加えたＰＢＳ）を加えて５０ｍｌとし、ピペッティングによる混和後、遠心（４００×ｇ、５分）した。
９）上清を吸引し、再度血清加ＰＢＳを加えて５０ｍｌとし、ピペッティングによる混和後、遠心（４００×ｇ、５分）した。
１０）上清を吸引し、沈殿した幹細胞を含む細胞群を回収した。【０１５０】
（ＩＩ）調製方法２
１）クリーンベンチ内で、吸引管を用いて廃液を吸引し、フィルター（ポアサイズ；１２０μｍ）付きリザーバーを通して、ろ過液を閉鎖分離バックに封入した。
２）セルセパレーター（血液成分分離装置ＡＳＴＥＣ２０４、（株）アムコ）で遠心分離法にて３回プロセシングを行い、比重の軽い血小板成分、比重の重い赤血球、顆粒球成分を可及的に除去した。
３）幹細胞を高濃度に含む分画（約３０〜４０ｍｌ）を採取した。単離した細胞の比重を、測定したところ、１．０５０〜１．０７５の範囲であった。【０１５１】
おおまかな細胞の比重は、パーコール、レディグラッドのような密度勾配遠心分離媒体を塩化ナトリウム溶液やスクロース溶液で調製し、収集した細胞と共にデンシティーマーカービーズ（ｄｅｎｓｉｔｙ  ｍａｒｋｅｒ  ｂｅａｄｓ）を加えて遠心し、ビーズによって分けられた５〜１０層のうち、どの層に細胞があるかを確認することで、調べることが可能である。【０１５２】
（実施例４：回収した幹細胞の特徴付け）
実施例３において回収した幹細胞を、以下の手順でＦＡＣＳを用いて特徴付けした。【０１５３】
約５ｍｌの細胞懸濁液を、染色培地（ＳＭ；０．５％  ウシ血清アルブミンおよび０．０５％  ＮａＮ３を含むＰＢＳ）で２回洗浄した。必要に応じて、細胞を計数した。【０１５４】
約１〜１０×１０６細胞／ｍｌの細胞懸濁的に対して、最終濃度として０．００１〜０．１μｇ／ｍｌの標識化抗体（標識には、フィコエリトリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）および／またはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を用いた）を添加した。【０１５５】
氷上で３０分間ほどインキュベーションした後、細胞を洗浄し、ＳＭを用いて細胞浮遊液の濃度を５×１０５細胞／ｍｌ程度に調整した。【０１５６】
ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を使用した。抗体の標識を指標として、単離した幹細胞における各種ＣＤタンパク質の発現を解析した。その結果、脂肪吸引廃液由来の幹細胞は、表１に示すように、ＣＤ９０およびＣＤ４９ｄを発現することが判明した。【０１５７】
単離した幹細胞を、ＤＭＥＭ培地において２回継代培養した。継代は、８０％のコンフルエンス時に行った。２度の継代培養後の細胞を、上記と同様の手順でＦＡＣＳによる分析を行った。その結果を以下の表１に示す。【０１５８】
（表１：２回継代培養した後の幹細胞における種々のＣＤの発現）
ＣＤ        発現量    
３          −
４          −
１１ｃ        −
１３          ＋＋
１４          −
１５          −
１６          −
１９          −
２９          ＋＋
３１          ＋
３３          −
３４          ＋
３６          ＋＋
３８          −
４４          ＋
４５          ＋
４９ｄ        ＋＋
５４          ＋
５６          −
５８          ＋
６１          −
６２Ｅ        −
６２Ｐ        −
６９          −
７１          ＋＋
７３          ＋＋
９０          ＋＋
１０４          −
１０５          ＋＋
１０６          −
１１７          ＋
１３５          −
１４４          −
１４６          ＋
１５１          ＋＋
２３５ａ        −
ＳＨ３          ＋
ＳＴＲＯ−１          ＋      
「−」＝発現検出されず、
「＋」＝２０％以下の細胞に検出される
「＋＋」＝２０％以上の細胞に検出される
以上の結果から、脂肪吸引廃液から調製された幹細胞には、間葉系幹細胞ではあるものの、従来法によって調製される脂肪由来幹細胞群と異なり、ＣＤ３１、３４陽性細胞が含まれた。従って、本発明の方法によって調製された幹細胞は、血管内皮への分化（血管新生）が容易かつ高効率で可能な細胞群であることが理解できる。さらに、今回指標として用いたＣＤ発現は、２回継代培養した後に確認されていることから、本発明の幹細胞は、２回程度の継代培養後もその表現型のほとんどを変化しないことが理解される。【０１５９】
（実施例５：複数の被検体からの廃液より回収した幹細胞の特徴付け）
さらに、複数の被検体からの廃液より幹細胞を回収し、その特徴付を行った。その結果を以下に示す。【０１６０】
（表２：複数の被検体からの廃液より回収した幹細胞の特徴付けの結果）【０１６１】
【表２】
2005090550.tif 000002
数字は、細胞集団中で、各タンパク質を発現する幹細胞の割合（％）
「−」＝発現検出されず、「＋」＝発現検出された、Ｎ．Ｔ．＝試験せず。【０１６２】
収集された幹細胞は、その集団のほとんどの細胞が、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１５１、およびＳＨ３について陽性であった。従って、本発明の脂肪幹細胞は、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１５１、およびＳＨ３からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質を発現する細胞である。ＣＤ１０６を発現する幹細胞であることが、その特徴の１つである。また、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、およびＣＤ１４６については、その幹細胞の集団の一部が陽性であり、一部は陰性であった。【０１６３】
さらに、その幹細胞の集団は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ６２ｅ、ＣＤ６２ｐ、ＣＤ６９、ＣＤ１０４、ＣＤ１３５、およびＣＤ１４４については、陰性であった。従って、本発明の脂肪幹細胞は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ６２ｅ、ＣＤ６２ｐ、ＣＤ６９、ＣＤ１０４、ＣＤ１３５、およびＣＤ１４４の少なくとも１つを発現しない細胞である。【０１６４】
この幹細胞の集団を、分化誘導培地で培養する場合、２−３週間で骨、軟骨、脂肪など臓器特異的なタンパク質の発現が認められた。この幹細胞の集団は、ヒト真皮由来培養線維芽細胞とは異なり、線維芽細胞の多くの細胞で発現するＣＤ５６を、発現しなかった。逆に、この幹細胞の集団が発現するＣＤ１０５の発現は、線維芽細胞では、通常は見られなかった。また、この幹細胞の集団が発現するＣＤ４９ｄの発現は、骨髄由来間葉系幹細胞では通常は見られなかった。【０１６５】
また、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ４５、ＣＤ１０６、およびＣＤ１１７は培養期間が長くなると発現が無くなる傾向が見られた。そのため、継代培養を続けた場合、継代培養前に見られたＣＤ１０６発現が見られなくなる場合があった。【０１６６】
（実施例６：幹細胞の増殖）
上記実施例のように調製した幹細胞を、以下の表３に示すようなコーティングを施したディッシュ上で培養した。培養条件は、以下のとおりであった。【０１６７】
細胞密度：８６２細胞／ｃｍ２
培地：Ｍ１９９（酸性ＦＧＦ  ２ｎｇ／ｍｌ＋ヘパリン５μｇ／ｍｌ＋抗生物質含有）
温度：３７度
継代数：３（脂肪細胞由来幹細胞）
ＣＯ２濃度：５．０％。【０１６８】
【表３】
2005090550.tif 000003
フィブリンのりは、以下のようにして調製した。【０１６９】
（Ａ液）
ＡＣＤ加血（テルモ４連バッグ）またはその等価物（４時間以内のものを使用する琴が好ましいようである）を使用した。この血液を、４℃  ３０００ｒｐｍ  １０ｍｉｎ  （あるいは４０００ｒｐｍ  ６分）で処理した。バフィーコート、赤血球を取り除き血漿を使用した。この血漿は、−８０℃で急速冷凍するか、あるいは、−４０℃でエアキャップなどを巻いてゆっくり凍結させた。（フィブリンの収量を出来るだけ多くするため）。ここで、静置した状態で凍結・解凍を２度繰り返すと収量は１．５倍になる。あるいは、−２０度で振盪しながら緩速凍結し、４℃水槽で緩速解凍したほうが、収量が多かった。−２０℃で保存する。解凍は、４℃で１６〜１８〜２４時間程度行った。【０１７０】
−８０℃で凍結保存されていたものを４℃で解凍して用いた。（２４時間）
（Ｂ液）
トロンビン末５０００単位；０．５Ｍ塩化カルシウム液１ｍｌ；アプロチニン３５００単位；蒸留水７．５ｍｌで調製したＢ液を、蒸留水にて５０倍、５００倍に希釈・調製した。【０１７１】
このフィブリンのりは、市販される日本臓器（製品名：ティシール）または藤沢薬品（製品名：ボルヒール）またはヘキスト（製品名：ベリプラスト）から入手して用いることもできる。【０１７２】
上述のフィブリンのりを、以下のようにして培養容器にコーティングした。培養容器として１０ｃｍディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ  ３５−３００３  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｄｉｓｈ，  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の容器を用いた。【０１７３】
コーティングの方法は以下のとおりである。
１０ｃｍ  ｄｉｓｈにＡ液３ｍｌを加えてプレート前面が浸るように振盪したのち、不要なＡ液を吸引・回収した。それから、調製したＢ液３ｍｌを加えてやはり同様に振盪したのち余分は吸引除去して風乾した。（３０分）。【０１７４】
このようにして調製したディッシュを用いて、以下のような条件で幹細胞を培養した。その手順を以下に示す。【０１７５】
細胞密度：８６２細胞／ｃｍ２
培地：Ｍ１９９（酸性ＦＧＦ  ２ｎｇ／ｍｌ＋ヘパリン５μｇ／ｍｌ＋抗生物質）  
温度：３７℃
継代数：３（脂肪細胞由来幹細胞）
ＣＯ２濃度：５．０％
（結果）
培養した結果を以下の表および図１に示す。【０１７６】
【表４】
2005090550.tif 000004
（数は、細胞数である）
図１および上記表４からも明らかなように、いずれのコーティング剤を用いても、コーティングなしよりも顕著に幹細胞の増殖が上昇していることが明らかになった。このような細胞の多分化能を調べたところ、維持されていることも明らかになった。【０１７７】
（実施例７：別の幹細胞）
実施例６に準じて、他の幹細胞（骨髄由来の間葉系幹細胞など）についても、増殖促進活性があるかどうかを確認する。骨髄由来の間葉系幹細胞は、骨髄から、ＦＡＣＳにてソートすることによって調製する。セルソーターを用いて、ＣＤ３４＋，ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）＋，Ｓｃａ−１＋を未分化の指標として用いて、必要に応じてＳＨ−２（ＣＤ７３），ＳＨ−３（ＣＤ１０５），ＳＴＲＯ−１，ＣＤ１３，ＣＤ４５などを参酌して選抜する。【０１７８】
実施例６において用いたディッシュを用いる。その結果、骨髄由来の幹細胞でも、同様に増殖が上昇することが明らかになる。【０１７９】
（実施例８：多分化能の確認）
実施例６および７で調製される細胞の多分化能を確認する。当該分野において周知の方法によって、本発明の幹細胞を分化させたところ、分化能が保持されていることが明らかになる。【０１８０】
（実施例９：別の幹細胞）
実施例６に準じて、他の幹細胞（ＥＳ細胞など）についても、増殖促進活性があるかどうかを確認する。ＥＳ細胞は当該分野において公知の手法により確立する。【０１８１】
実施例６において用いたディッシュを用いる。その結果、骨髄由来の幹細胞でも、同様に増殖が上昇することが明らかになる。【０１８２】
（実施例７：ＰＲＰ（血小板含有血漿）を用いた細胞増殖比較実験）
（実験材料及び実験方法）
・細胞：ヒト脂肪組織由来間質細胞（脂肪細胞由来幹細胞）
・培地：１０％  ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）／Ｍ１９９（Ｍｅｄｉｕｍ  １９９、ペニシリン／ストレプトマイシン，酸性ＦＧＦ，ヘパリン添加）
・ＰＲＰコーティングディッシュ：Ａ液（トロンビン５０００Ｕ、０．５Ｍ  ＣａＣｌ２  １ｍｌ，アプロチニン３５０００Ｕ）を滅菌水で５０倍希釈する。希釈後のＡ液をディッシュに広げ、その上にヒトＰＲＰを全体に広げた後乾燥させる。【０１８３】
（ＰＲＰコートディッシュを用いた増殖実験）
ＦＢＳ１０％添加したＭ１９９を用いて、ヒトＰＲＰコート６ウェル−プレート，非コーティング６ウェル−プレートにヒト脂肪細胞由来幹細胞（Ａ）を２×１０４細胞／ウェルにて播種した。４日後に培地交換、７日後に細胞数を測定した。【０１８４】
（結果）
１０％ＦＢＳ添加Ｍ１９９培地を用いた脂肪細胞由来幹細胞の増殖には、ＰＲＰコートが効果的であった。【０１８５】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１８６】
本発明は、幹細胞（特に、脂肪由来の幹細胞）に関し簡便に増殖速度を上昇させることを可能にする。従って、本発明は、幹細胞を利用する医療、医薬、農学分野などにおいて有用性を有する。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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