(57)【要約】本発明は、細胞の再生・増殖・分化関与遺伝子及び細胞の再生・増殖・分化調節剤のスクリーニング方法、細胞の再生・増殖・分化調節剤などの提供を目的とする。具体的には、本発明は、再生・分化・増殖能力を有する細胞における複数の遺伝子の発現量をまとめて定量解析することにより、細胞の再生、増殖または分化に関与している遺伝子を特定する工程を含む、細胞の再生・増殖・分化関与遺伝子のスクリーニング方法；再生・分化・増殖能力を有する細胞における複数の遺伝子の発現量をまとめて定量解析することにより、その細胞において発現量が上位に位置するあるいは他の細胞に比較して発現が特異的である一又は二以上の遺伝子を特定する工程、及び、その特定された遺伝子又はその遺伝子産物の機能を調節し得る少なくとも一種の候補物質をその細胞に接触させ、その接触の前後の変化を比較する工程を含む、細胞の再生・増殖・分化調節剤のスクリーニング方法などを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
再生・分化・増殖能力を有する細胞における複数の遺伝子の発現量をまとめて定量解析することにより、細胞の再生、増殖または分化に関与している遺伝子を特定する工程を含む、細胞の再生・増殖・分化関与遺伝子のスクリーニング方法。
【請求項２】
再生・分化・増殖能力を有する細胞における複数の遺伝子の発現量をまとめて定量解析することにより、その細胞において発現量が上位に位置するあるいは他の細胞に比較して発現が特異的である一又は二以上の遺伝子を特定する工程、及び、その特定された遺伝子又はその遺伝子産物の機能を調節し得る少なくとも一種の候補物質をその細胞に接触させ、その接触の前後の変化を比較する工程を含む請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記再生・分化・増殖能力を有する細胞が、ヒトまたは温血動物の胚性幹細胞、体性幹細胞、初代培養細胞及び株化細胞から選択される請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記複数の遺伝子が、Ｇタンパク質共役型レセプター遺伝子ファミリー；核内受容体遺伝子ファミリー；チロシンリン酸化酵素型レセプター遺伝子ファミリー；転写因子；及びプロテインキナーゼ、プロテインフォスファターゼ、プロテアーゼ、ＡＴＰａｓｅ、ＧＴＰａｓｅ、ＤＮＡ結合プロテイン、細胞接着因子およびその受容体、イオンチャンネル、輸送体、細胞外マトリックス構成成分、細胞内骨格構成成分、細胞増殖因子、サイトカイン、神経栄養因子、生理活性ペプチド、ホルモン、酸化あるいは還元酵素、加水分解酵素、水酸化酵素、メチル化あるいは脱メチル化酵素、転移酵素、リボゾーム構成タンパク質、組織適合性抗原タンパク質群のいずれかに関連する遺伝子ファミリーおよびそれらに直接あるいは間接的に作用して活性を調節する遺伝子群から選択される遺伝子群である請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記複数の遺伝子が、Ｇタンパク質共役型レセプター遺伝子ファミリー；核内受容体遺伝子ファミリー；及びプロテインキナーゼ型受容体遺伝子ファミリーから選択される遺伝子群である請求項１記載の方法。
【請求項６】
複数の反応場所を有する反応器具の各反応場所で、再生・分化・増殖能力を有する細胞から得られる、複数の標的ｍＲＮＡを含み得るｍＲＮＡ試料と、それぞれの標的ｍＲＮＡに対応するプライマー対をそれぞれ含んでなる各増幅試薬とを接触させることにより、増幅反応を行い、得られた増幅生成物の生成量を測定することによって細胞の再生、増殖または分化に関与している遺伝子を特定する請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記反応器具が反応場所としての複数の穴を有するプレートである請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記プレートが９６穴または３８４穴プレートである請求項７記載の方法。
【請求項９】
１０〜８００個のプライマー対を用いる請求項６記載の方法。
【請求項１０】
１０〜３００個のプライマー対を用いる請求項６記載の方法。
【請求項１１】
前記増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である請求項６記載の方法。
【請求項１２】
増幅生成物の生成量の測定が、該増幅生成物に相補的又は実質的に相補的であるプローブを用いて行われる請求項６記載の方法。
【請求項１３】
前記プローブが、ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡにハイブリダイズするプローブである請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記プローブが蛍光標識されたプローブである請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
前記ｍＲＮＡ試料中で発現が亢進または減少しているｍＲＮＡを特定し、該ｍＲＮＡをコードする遺伝子をその細胞の再生、増殖又は分化に関与する遺伝子であると特定する請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
再生・分化・増殖能力を有する細胞における複数の遺伝子の発現量をまとめて定量解析することにより、その細胞において発現量が上位に位置するあるいは他の細胞に比較して発現が特異的である一又は二以上の遺伝子を特定する工程、及び、その特定された遺伝子又はその遺伝子産物の機能を調節し得る少なくとも一種の候補物質をその細胞に接触させ、その接触の前後の変化を比較する工程を含む、細胞の再生・増殖・分化調節剤のスクリーニング方法。
【請求項１７】
請求項１記載のスクリーニング方法によって同定された遺伝子の遺伝子産物を阻害または活性化することを特徴とする、該遺伝子産物を含有する細胞の再生、増殖又は分化調節方法。
【請求項１８】
前記細胞が、胚性幹細胞、体性幹細胞、間葉系幹細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞または血球系細胞である請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
請求項１７に記載の方法を用いて、臓器を再生する方法。
【請求項２０】
前記臓器が、脳、脳の各部位、角膜、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、歯、骨、関節または骨格筋である請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
細胞の再生、増殖又は分化に関与する疾患を治療する方法である請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記疾患が、中枢性疾患・神経疾患、炎症性疾患、循環器疾患、癌、肥満、糖尿病、免疫系疾患、肝臓・胆のう疾患、消化器系疾患、熱傷、骨折、変形性関節症、歯周病又は脱毛症である請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質又はこのタンパク質をコードするＤＮＡを含有してなる薬剤。
【請求項２４】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質を阻害または活性化することを特徴とする、該タンパク質を含有する細胞の再生、増殖又は分化調節方法。
【請求項２５】
細胞の再生、増殖又は分化調節剤である請求項２３記載の薬剤。
【請求項２６】
コレシストキニン又はその類縁体を含有してなる、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質を含有する細胞の再生、増殖又は分化調節剤。
【請求項２７】
幹細胞の分化を調節することができる請求項２６記載の剤。
【請求項２８】
間葉系幹細胞の分化を調節することができる請求項２７記載の剤。
【請求項２９】
脂肪細胞への分化を調節することができる請求項２６記載の剤。
【請求項３０】
請求項２６記載の調節剤によって分化を調節することによって得られる細胞。
【請求項３１】
請求項２６記載の調節剤を用いて細胞の再生、増殖又は分化を調節する方法。
【請求項３２】
請求項３１記載の方法を用いて、臓器を再生する方法。
【請求項３３】
請求項２６記載の調節剤を投与することによって細胞の再生、増殖又は分化が関与する疾患を治療する方法。
【請求項３４】
前記疾患が肥満、糖尿病、免疫系疾患、肝臓疾患、消化器系疾患または美容整形時の組織の損傷である請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドを用いることを特徴とする、細胞の再生、増殖又は分化を調節しうる化合物のスクリーニング方法。
【請求項３６】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドを含有することを特徴とする、細胞の再生、増殖又は分化を調節しうる化合物のスクリーニング用キット。
【請求項３７】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質に結合する化合物を含有する体性幹細胞のマーカー。
【請求項３８】
該化合物で体性幹細胞を標識することにより、その細胞を識別、選択または濃縮する際に使用し得る請求項３７記載のマーカー。
【請求項３９】
骨髄由来の間葉系幹細胞を標識し得る請求項３７記載のマーカー。
【請求項４０】
請求項３０記載の細胞を用いる移植による損傷あるいは疾患によって喪失された機能を補填する治療方法。
【請求項４１】
請求項３０記載の細胞を用いる医薬候補化合物のスクリーニング方法。
【請求項４２】
請求項３０記載の細胞を用いる医薬候補化合物の安全性確認方法。
【請求項４３】
ヒト間葉系幹細胞を無血清培地上で培養することを特徴とする、ヒト間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化誘導する方法。
【請求項４４】
前記無血清培地にオンコスタチンＭが添加されている、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
オンコスタチンＭを含有する無血清培地用の細胞分化誘導剤。
【請求項４６】
ヒト間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化誘導する、請求項４５記載の細胞分化誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、細胞の再生・増殖・分化に関与する遺伝子のスクリーニング方法、細胞の再生・増殖・分化調節剤のスクリーニング方法、そのスクリーニング方法によって得られる物質を含有する細胞の再生・増殖・分化調節剤等に関する。また、本発明は、コレシストキニン受容体、この受容体タンパク質に作用する化合物を含有する細胞の再生・増殖・分化調節剤等にも関する。さらに、本発明は、無血清培地上でヒト間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化誘導する方法に関する。
【背景技術】  再生とは、生体の欠失した細胞・組織が幹細胞などの増殖や分化によって修復される現象である。皮膚や消化管上皮のように寿命の尽きた細胞の代わりに新しい細胞を供給する恒常的な細胞の更新は生理的再生と呼ばれ、損傷や疾病によって急速に失われた細胞・組織を補充し回復させるものを病理的再生と呼ぶ。再生は多細胞生物が生存してゆくために必須の現象であるが、ヒトなどの高等動物においては自然に備わった再生力に限界があり、これを超えた重篤あるいは広範囲に及ぶ損傷を受けた臓器や組織は治癒することなく個体全体の生命維持の危機を引き起こす。腎臓や肝臓、心臓のような生体の維持にとって重要ないくつかの臓器の不全に対しては、既に臓器移植による治療法が確立しているが、ドナーの確保や免疫適合性などの問題点のために治療の恩恵を受けることができる患者数には限界があった。そのような臓器移植の問題点を克服するものとして最近注目されているのが再生医療である。これは組織の発生や再生に関して生体に備わった能力を制御する技術を開発し、自己あるいは他人から採取した細胞を材料として組織の再構築や臓器の再生を行なうものである。既に臨床で用いられているものとしては、白血病など多くの疾患で行なわれている骨髄移植や熱傷に対する皮膚移植などがある。そのほか、パーキンソン病に対する神経幹細胞移植、心筋梗塞に対する骨髄細胞移植、糖尿病における膵島移植なども臨床への応用が期待されている。
【発明の開示】
現状では、幹細胞（胚性幹細胞や体性幹細胞など）や前駆脂肪などを用いて人為的に調製が可能な細胞、臓器の種類には限界があり、例えば膵臓β細胞や腎臓、消化管など多くのものについては、臨床応用が可能な細胞、組織の作出には至っていない。また、再生医療にある程度有用な細胞であったとしても、喪失した機能を完全に補填するほど充分なレベルに達していないものも多い。臨床面での需要は非常に高いにも関わらず調製が不可能あるいは効率が低い細胞、組織を再生医療に提供できるようになるためには、従来よりも細胞の分化をより効率良く制御する技術が必要である。また、技術開発の過程で明らかになってくる細胞分化を調節する新たなメカニズムを応用することによって、生体内外で組織の再構築や臓器の再生を促すような医薬候補物質の新規スクリーニング系の構築が可能となる。さらに、ヒトあるいは高等動物のあらゆる細胞、組織を効率的にかつ大量に調製することができれば、従来からの創薬プロセスにおける医薬候補物質のスクリーニングや薬効評価、安全性試験などに応用可能となる。
臓器・器官の発生や再生においては、幹細胞の増殖と分化、それを支持する環境や周辺に存在する多数の細胞との直接あるいは間接的な相互作用、機能的な組織構造の構築など複数の現象が相互に関係している。特に、個々の細胞に対する内外からの刺激は、液性因子あるいは細胞表面上に存在する分子と、それらに対する受容体分子との結合によって細胞内へ伝達される。各細胞に発現する受容体を明らかにし、その受容体に特異的に作用する天然型リガンド、組換え型もしくは合成アゴニスト、アンタゴニストを作用させることができれば、幹細胞あるいは前駆細胞から目的とする成熟細胞をより効率よく分化させ、逆に脱分化や分化転換などを惹起させることもできるようになる。そのような細胞分化調節効果をスクリーニングの指標にすれば、受容体に直接作用して効果を発揮する物質以外にも、細胞内シグナル伝達系や代謝系などに作用して分化を調節する新たな物質を得ることもできる。また、各種の受容体を介した細胞内シグナル伝達系はお互いに相互作用をすることが広く知られており、複数の受容体を介して同時あるいは差時的に細胞を刺激することによって、単一の受容体を介した刺激の場合とは異なった効果をもたらすことが期待できる。一部の受容体についてはサブタイプが存在することが知られており、同じリガンドを作用させても一方では促進的に作用し、他方では抑制的に作用するような場合がある。このような場合、いずれか一方の作用のみを細胞分化の調節において選択的に刺激したい場合には、標的となる受容体サブタイプに選択的に作用するアゴニストあるいはアンタゴニストを作用させることができる。また、細胞表面上に発現しているタイプの受容体分子については、細胞を生かした状態で標識、選別するための表面マーカー抗原としても使用することができる。抗体によってはリガンドとの結合部位あるいはその近傍を抗原として認識するものがあり、そのような抗体は内因性リガンドの作用の中和抗体としても使用することができる。核内受容体のように細胞内に存在し、染色体ＤＮＡ上の特定の配列を認識して結合して遺伝子の転写調節を行なうような受容体分子については、調節を受ける側の遺伝子群が知られているものも多く、受容体の発現の検出によってリガンド添加後の効果の予測することも可能である。
このように、受容体分子は臓器・器官の発生や再生において重要なスイッチの役割を果たしており、それを利用して細胞の分化・増殖を人為的に調節することができる。しかし、実際の細胞表面あるいは細胞内には無数の受容体が発現しているために、従来から行なわれてきたような分化・増殖因子を細胞に作用させ、その効果を評価するような方法では、効果的な受容体とリガンドの組み合わせに到達するまでには膨大な検討が必要であった。また、特定の受容体が発現しているかどうかの情報を得る方法としては、結合試験、シグナル伝達あるいは作用の検出、ノザンブロットやＲＴ−ＰＣＲなどの方法があるが、いずれの方法も調査対象となる受容体の数を多くすると非常に煩雑となり、発現量を相互に比較することも困難であった。細胞に発現する受容体は分化にともなって質的・量的にも変動し、分化誘導因子に対する細胞の感受性が変化することも良く知られている。そのため、細胞の分化を効率よく制御するためには、分化の各段階における受容体の発現を幅広くかつ定量的に調べる必要があった。
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、幹細胞あるいは前駆細胞とその分化の過程において細胞に発現する受容体等の遺伝子の発現を幅広くかつ定量的に解析することによって、これらの細胞を効率的に分化誘導させることができることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて、さらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下に示す、細胞の再生・増殖・分化関与遺伝子のスクリーニング方法、細胞の再生・増殖・分化調節剤のスクリーニング方法、それらの方法によって得られる物質を含有する細胞の再生・増殖・分化調節剤、コレシストキニン受容体又はこの受容体タンパク質に作用する化合物を含有する細胞の再生・増殖・分化調節剤、上記スクリーニング方法によって特定された遺伝子またはその遺伝子産物を利用してその遺伝子が関与する疾患を診断する方法、それらの方法に用いられる診断剤または診断キットなどを提供する。
（１）再生・分化・増殖能力を有する細胞における複数の遺伝子の発現量をまとめて定量解析することにより、細胞の再生、増殖または分化に関与している遺伝子を特定する工程を含む、細胞の再生・増殖・分化関与遺伝子のスクリーニング方法。
（２）再生・分化・増殖能力を有する細胞における複数の遺伝子の発現量をまとめて定量解析することにより、その細胞において発現量が上位に位置するあるいは他の細胞に比較して発現が特異的である一又は二以上の遺伝子を特定する工程、及び、その特定された遺伝子又はその遺伝子産物の機能を調節し得る少なくとも一種の候補物質をその細胞に接触させ、その接触の前後の変化を比較する工程を含む上記（１）記載のスクリーニング方法。
（３）前記再生・分化・増殖能力を有する細胞が、ヒトまたは温血動物の胚性幹細胞、体性幹細胞、初代培養細胞及び株化細胞から選択される上記（１）記載の方法。
（４）前記複数の遺伝子が、Ｇタンパク質共役型レセプター遺伝子ファミリー；核内受容体遺伝子ファミリー；チロシンリン酸化酵素型レセプター遺伝子ファミリー；転写因子；及びプロテインキナーゼ、プロテインフォスファターゼ、プロテアーゼ、ＡＴＰａｓｅ、ＧＴＰａｓｅ、ＤＮＡ結合プロテイン、細胞接着因子およびその受容体、イオンチャンネル、輸送体、細胞外マトリックス構成成分、細胞内骨格構成成分、細胞増殖因子、サイトカイン、神経栄養因子、生理活性ペプチド、ホルモン、酸化あるいは還元酵素、加水分解酵素、水酸化酵素、メチル化あるいは脱メチル化酵素、転移酵素、リボゾーム構成タンパク質、組織適合性抗原タンパク質群のいずれかに関連する遺伝子ファミリーおよびそれらに直接あるいは間接的に作用して活性を調節する遺伝子群から選択される遺伝子群である上記（１）記載の方法。
（５）前記複数の遺伝子が、Ｇタンパク質共役型レセプター遺伝子ファミリー；核内受容体遺伝子ファミリー；及びプロテインキナーゼ型受容体遺伝子ファミリーから選択される遺伝子群である上記（１）記載の方法。
（６）複数の反応場所を有する反応器具の各反応場所で、再生・分化・増殖能力を有する細胞から得られる、複数の標的ｍＲＮＡを含み得るｍＲＮＡ試料と、それぞれの標的ｍＲＮＡに対応するプライマー対をそれぞれ含んでなる各増幅試薬とを接触させることにより、増幅反応を行い、得られた増幅生成物の生成量を測定することによって細胞の再生、増殖または分化に関与している遺伝子を特定する上記（１）記載の方法。
（７）前記反応器具が反応場所としての複数の穴を有するプレートである上記（６）記載の方法。
（８）前記プレートが９６穴または３８４穴プレートである上記（７）記載の方法。
（９）１０〜８００個のプライマー対を用いる上記（６）記載の方法。
（１０）１０〜３００個のプライマー対を用いる上記（６）記載の方法。
（１１）前記増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である上記（６）記載の方法。
（１２）増幅生成物の生成量の測定が、該増幅生成物に相補的又は実質的に相補的であるプローブを用いて行われる上記（６）記載の方法。
（１３）前記プローブが、ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡにハイブリダイズするプローブである上記（１２）記載の方法。
（１４）前記プローブが蛍光標識されたプロープである上記（１２）記載の方法。
（１５）前記ｍＲＮＡ試料中で発現が亢進または減少しているｍＲＮＡを特定し、該ｍＲＮＡをコードする遺伝子をその細胞の再生、増殖又は分化に関与する遺伝子であると特定する上記（１３）記載の方法。
（１６）再生・分化・増殖能力を有する細胞における複数の遺伝子の発現量をまとめて定量解析することにより、その細胞において発現量が上位に位置するあるいは他の細胞に比較して発現が特異的である一又は二以上の遺伝子を特定する工程、及び、その特定された遺伝子又はその遺伝子産物の機能を調節し得る少なくとも一種の候補物質をその細胞に接触させ、その接触の前後の変化を比較する工程を含む、細胞の再生・増殖・分化調節剤のスクリーニング方法。
（１７）上記（１）記載のスクリーニング方法によって同定された遺伝子の遺伝子産物に対するアゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤、活性化剤もしくは抗体、またはその遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドもしくはそのアンチセンスポリヌクレオチドを含んでなる薬剤。
（１８）細胞の再生、増殖又は分化調節剤である上記（１７）記載の薬剤。
（１８ａ）上記（１）記載のスクリーニング方法によって同定された遺伝子の遺伝子産物を阻害または活性化することを特徴とする、該遺伝子産物を含有する細胞の再生、増殖又は分化調節方法。
（１９）上記（１７）記載の薬剤によって細胞の再生、増殖又は分化を調節する方法。
（２０）前記細胞が、胚性幹細胞、体性幹細胞、間葉系幹細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓（α、β又はδ）細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋（骨格筋・心筋）細胞、脂肪細胞、免疫細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞または血球系細胞である上記（１９）記載の方法。
（２０ａ）前記細胞が、胚性幹細胞、体性幹細胞、間葉系幹細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞または血球系細胞である上記（１８ａ）記載の方法。
（２１）上記（１７）記載の薬剤によって臓器を再生する方法。
（２１ａ）上記（１８ａ）記載の方法を用いて、臓器を再生する方法。
（２２）前記臓器が、脳、脳の各部位、角膜、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、歯、骨、関節または骨格筋である上記（２１）または（２１ａ）記載の方法。
（２３）細胞の再生、増殖又は分化に関与する疾患を治療する薬剤である上記（１７）記載の薬剤。
（２３ａ）上記（１８ａ）記載の細胞の再生、増殖又は分化に関与する疾患を治療する方法である上記（１８ａ）記載の方法。
（２４）前記疾患が、神経疾患、炎症性疾患、循環器疾患、癌、肥満、糖尿病、免疫系疾患、肝臓・胆のう疾患、消化器系疾患、熱傷、骨折、変形性関節症、歯周病又は脱毛症である上記（１７）記載の薬剤。
（２４ａ）前記疾患が、神経疾患、炎症性疾患、循環器疾患、癌、肥満、糖尿病、免疫系疾患、肝臓・胆のう疾患、消化器系疾患、熱傷、骨折、変形性関節症、歯周病又は脱毛症である上記（２３ａ）記載の方法。
（２５）上記（１７）記載の薬剤を投与することによって細胞の再生、増殖又は分化が関与する疾患を治療する方法。
（２６）前記疾患が神経疾患、炎症性疾患、循環器疾患、癌、肥満、糖尿病、免疫系疾患、肝臓・胆のう疾患、消化器系疾患、熱傷、骨折、変形性関節症、歯周病又は脱毛症である上記（２５）記載の治療方法。
（２７）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、このタンパク質をコードするＤＮＡ又はこのタンパク質に作用する化合物を含有してなる薬剤。
（２８）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質に作用する化合物を含有してなる上記（２７）記載の薬剤。
（２８ａ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質を阻害または活性化することを特徴とする、該タンパク質を含有する細胞の再生、増殖又は分化調節方法。
（２９）前記化合物が、前記タンパク質に対するアゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤、活性化剤もしくは抗体である上記（２８）記載の薬剤。
（３０）細胞の再生、増殖又は分化調節剤である上記（２７）または（２９）記載の薬剤。
（３１）前記化合物がコレシストキニン又はその類縁体である上記（２８）記載の薬剤。
（３２）細胞の再生、増殖又は分化調節剤である上記（３１）記載の薬剤。
（３２ａ）コレシストキニン又はその類縁体を含有してなる、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質を含有する細胞の再生、増殖又は分化調節剤。
（３３）幹細胞の分化を調節することができる上記（３２）または（３２ａ）記載の剤。
（３４）間葉系幹細胞の分化を調節することができる上記（３３）または（３２ａ）記載の剤。
（３５）脂肪細胞への分化を調節することができる上記（３２）または（３２ａ）記載の剤。
（３６）上記（１６）記載の方法によって得られる調節剤または上記（３１）記載の調節剤によって分化を調節することによって得られる細胞。
（３７）上記（１６）または（３２ａ）記載の調節剤を用いて細胞の再生、増殖又は分化を調節する方法。
（３７ａ）上記（３７）記載の方法を用いて、臓器を再生する方法。
（３８）上記（１６）または（３２ａ）記載の調節剤を投与することによって細胞の再生、増殖又は分化が関与する疾患を治療する方法。
（３９）前記疾患が肥満、糖尿病、免疫系疾患、肝臓疾患、消化器系疾患または美容整形時の組織の損傷である上記（３８）記載の治療方法。
（４０）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドを用いることを特徴とする、細胞の再生、増殖又は分化を調節しうる化合物のスクリーニング方法。
（４１）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドを含有することを特徴とする、細胞の再生、増殖又は分化を調節しうる化合物のスクリーニング用キット。
（４２）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質に結合する化合物を含有する体性幹細胞のマーカー。
（４３）該化合物で体性幹細胞を標識することにより、その細胞を識別、選択または濃縮する際に使用し得る上記（４２）記載のマーカー。
（４４）骨髄由来の間葉系幹細胞を標識し得る上記（４２）記載のマーカー。
（４５）上記（１）記載の方法によって特定される遺伝子の遺伝子産物に対する抗体を含有する、細胞の再生・増殖・分化が関与している疾患を診断するための診断薬。
（４６）上記（１）記載の方法によって特定される遺伝子の遺伝子産物に対する抗体を含有する、細胞の再生・増殖・分化が関与している疾患を診断するための診断キット。
（４７）上記（４５）記載の診断薬又は上記（４６）記載の診断キットを用いて、細胞の再生・増殖・分化関与遺伝子の発現量を測定することによって、細胞の再生・増殖・分化が関与している疾患を診断する方法。
（４８）上記（１）記載の方法によって特定される遺伝子の遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含有する、細胞の再生・増殖・分化が関与している疾患を診断するための診断薬。
（４９）上記（１）記載の方法によって特定される遺伝子の遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含有する、細胞の再生・増殖・分化が関与している疾患を診断するための診断キット。
（５０）上記（４８）記載の診断薬又は上記（４９）記載の診断キットを用いて、細胞の再生・増殖・分化関与遺伝子から翻訳されるｍＲＮＡを定量することによって、細胞の再生・増殖・分化が関与している疾患を診断する方法。
（５１）上記（３６）記載の細胞を用いる移植による損傷あるいは疾患によって喪失された機能を補填する治療方法。
（５２）上記（３６）記載の細胞を用いる医薬候補化合物のスクリーニング方法。
（５３）上記（３６）記載の細胞を用いる医薬候補化合物の安全性確認方法。
（５４）ヒト間葉系幹細胞を無血清培地上で培養することを特徴とする、ヒト間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化誘導する方法。
（５５）前記無血清培地にオンコスタチンＭが添加されている、上記（５４）記載の方法。
（５６）オンコスタチンＭを含有する無血清培地用の細胞分化誘導剤。
（５７）ヒト間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化誘導する、上記（５６）記載の細胞分化誘導剤。
本発明の細胞の再生・増殖・分化関与遺伝子のスクリーニング方法によれば、ある再生・分化・増殖能力を有する細胞において、細胞の再生・増殖・分化に関与している遺伝子を数少ない工程によって効率良く特定することができる。また、本発明の細胞の再生・増殖・分化調節剤のスクリーニング方法によれば、従来法に比較して効率良く細胞の再生・増殖・分化調節剤を得ることができる。
このような方法によって特定される細胞の再生・増殖・分化調節剤は、細胞の再生、増殖または分化の調節を行うことができるので、細胞の再生、増殖または分化が関与している疾患、例えば、中枢性疾患、神経疾患、炎症性疾患、循環器疾患、癌、肥満、糖尿病、免疫系疾患、肝臓・胆のう疾患、消化器系疾患、熱傷、骨折、変形性関節症、歯周病、脱毛症などの疾患や傷害の予防および／または治療剤として有用である。
さらに、本発明の細胞の再生・増殖・分化が関与している疾患を診断するための診断剤、診断キット及び診断方法によれば、簡便に細胞の再生・増殖・分化が関与している疾患を診断することができる利点がある。
【図面の簡単な説明】  図１は、コレシストキニンの脂肪細胞への分化調節機能を確認する実験の結果を示す図である。
図２は、培養１０日目のカルシウム蓄積量を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明について詳細に説明する。
（細胞の再生、増殖又は分化に関与する遺伝子をスクリーニングする方法）
本発明は、細胞の再生、増殖又は分化に関与する遺伝子をスクリーニングする方法において、再生・分化・増殖能力を有する細胞における複数の遺伝子の発現量をまとめて定量解析することにより、細胞の再生、増殖または分化に関与している遺伝子を特定することを特徴としている。このように再生・分化・増殖能力を有する細胞における複数の遺伝子の発現量を網羅的に定量解析する方法は未だ知られていないので、本発明の方法は、再生・分化・増殖能力を有する細胞における複数の遺伝子の機能を解析するための画期的な手法である。実際に、本発明の遺伝子解析方法を用いることにより、コレシストキニン受容体の新規機能が解明されており、本発明の方法の実効性が証明されている。本発明の好ましい態様に係るスクリーニング方法は、（１）再生・分化・増殖能力を有する細胞における複数の遺伝子の発現量をまとめて定量解析することにより、その細胞において発現量が上位に位置するあるいは他の細胞に比較して発現が特異的である一又は二以上の遺伝子を特定する工程、及び、（２）その特定された遺伝子又はその遺伝子産物の機能を調節し得る少なくとも一種の候補物質をその細胞に接触させ、その接触の前後の変化を比較する工程を含む。ここで、「発現量が上位に位置する」とは、ある細胞において発現している遺伝子の発現量が他の遺伝子と比較して相対的に多いことをいい、例えば、ｍＲＮＡ量で比較した場合に上位（例えば上位２０％、好ましくは上位１０％）に属することをいう。「他の細胞に比較して発現が特異的」とは、測定対象となる細胞と異なる細胞における遺伝子の発現と比較して、生理学的有為さがある程度に異なることをいい、例えば、成熟細胞に比較して発現量が多い（例えば、２０％以上多い、好ましくは３０％以上多い、より好ましくは５０％以上多い）場合、成熟細胞に比較して発現量が少ない（例えば、２０％以上少ない、好ましくは３０％以上少ない、より好ましくは５０％以上少ない）場合、あるいは細胞分化の特定の時期に発現が亢進または抑制されていることを意味する。
本発明において標的とする遺伝子は、特に限定されないが、例えば、Ｇタンパク質共役型レセプター遺伝子ファミリー；核内受容体遺伝子ファミリー；チロシンリン酸化酵素型レセプター遺伝子ファミリー；転写因子；及びプロテインキナーゼ、プロテインフォスファターゼ、プロテアーゼ、ＡＴＰａｓｅ、ＧＴＰａｓｅ、ＤＮＡ結合プロテイン、細胞接着因子およびその受容体、イオンチャンネル、輸送体、細胞外マトリックス構成成分、細胞内骨格構成成分、細胞増殖因子、サイトカイン、神経栄養因子、生理活性ペプチド、ホルモン、酸化あるいは還元酵素、加水分解酵素、水酸化酵素、メチル化あるいは脱メチル化酵素、転移酵素、リボゾーム構成タンパク質、組織適合性抗原タンパク質群のいずれかに関連する遺伝子ファミリーおよびそれらに直接あるいは間接的に作用して活性を調節する遺伝子群（好ましくは、Ｇタンパク質共役型レセプター遺伝子ファミリー；核内受容体遺伝子ファミリー；及びプロテインキナーゼ型受容体遺伝子ファミリーから選択される遺伝子群など）から選択される。
複数の遺伝子とは、２個以上の遺伝子を意味し、上限は実施可能な限り、特に限定されないが、通常２〜数万個、好ましくは２〜１０００個、より好ましくは１０〜８００個、さらに好ましくは１０〜３００個の遺伝子である。また、複数の遺伝子は、例えば、Ｇタンパク質共役型レセプター遺伝子ファミリー；核内受容体遺伝子ファミリー；プロテインキナーゼ型受容体遺伝子ファミリー；などのように、ある共通する機能を有する遺伝子群であることが好ましく、また、当該遺伝子群に属する遺伝子を網羅的に漏れなく（好ましくは、当該遺伝子群に属する遺伝子の５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、なかでも好ましくは約９０％以上、とりわけ好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９９％以上）より好ましくは、当該遺伝子群に属する遺伝子の７０％以上；さらに好ましくは、当該遺伝子群に属する遺伝子の９０％以上；とりわけ好ましくは、当該遺伝子群に属する遺伝子の９５％以上）、同条件で（好ましくは、同時に）一気に定量解析することが好ましい。
より具体的には、本発明の遺伝子の発現解析は、複数の各反応場所、好ましくは複数の反応場所を有する反応器具の各反応場所で、複数の標的ｍＲＮＡを含み得るｍＲＮＡ試料と、それぞれの標的ｍＲＮＡに対応するプライマー対をそれぞれ含んでなる各増幅試薬とを接触させることにより、増幅反応を行い、得られた増幅生成物の生成量を測定することによって行う。以下、この方法について説明する。
（ｍＲＮＡ試料）
本発明の好ましい態様によれば、再生・分化・増殖能力のある細胞から得られる、ｍＲＮＡ試料に含まれ得る複数の標的遺伝子のｍＲＮＡを定量することによって遺伝子の発現解析を行う。ここで、「ｍＲＮＡ試料」とは、ｍＲＮＡを含有する試料であって、その試料中に含まれるｍＲＮＡの種類や量を測定する対象となる試料のことをいう。
より具体的には、本発明において対象となるｍＲＮＡ試料は、その試料中の特定遺伝子の発現レベルを解析する対象となる試料であり、例えば、ヒトまたはその他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）の再生・分化・増殖能力を有する細胞から得る。そのような再生・分化・増殖能力を有する細胞としては、胚性幹細胞、体性幹細胞（骨髄由来の間葉性幹細胞、造血幹細胞、臍帯および臍帯血由来の幹細胞などを含む）、初代培養細胞、株化細胞などが挙げられる。これらの細胞は、種々の組織から入手可能である。そのような組織として、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などが挙げられる。このようなｍＲＮＡ試料を用いて、その試料中に含まれる標的ｍＲＮＡを定量することによって、再生・分化・増殖能力を有する細胞から得られるｍＲＮＡ試料における標的遺伝子の発現レベルを解析することができる。
本発明においては、再生・分化・増殖能力を有する細胞から得られるｍＲＮＡ試料を用いることによって、その細胞において発現量が上位に位置するあるいは他の細胞に比較して発現が特異的である遺伝子が、細胞の再生・分化・増殖に関与していると予測することができる。そのようにして予測された遺伝子が、再生・分化・増殖に関与しているか否かは、例えば、その特定された遺伝子又はその遺伝子産物の機能を調節し得る少なくとも一種の候補物質をその細胞に接触させ、その接触の前後の変化を比較することによって行なうことができる。ここで、「遺伝子又はその遺伝子産物の機能を調節し得る少なくとも一種の候補物質」としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
このような比較試験において、細胞の再生、増殖又は分化が、上記候補物質を接触した後に生理学的に有意な程度に変化した場合は、その遺伝子は、細胞の再生、増殖又は分化に関与していると特定することができる。ここで、生理学的に有為な程度とは、例えば、その候補物質を接触させた場合に、接触させない場合と比較して、細胞の再生、増殖または分化が１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上促進または抑制された場合をいう。
なお、遺伝子発現量の定量または遺伝子発現量の絶対値の算出は、後述する標的ｍＲＮＡの定量法に従って行うことが出来る。
（複数の反応場所を有する反応器具）
上記スクリーニング方法は、複数の反応場所を有する反応器具によって効率良く実施することができる。
複数の反応場所とは、２つ以上の反応場所であれば特に限定されないが、通常２〜数万個、好ましくは２〜１０００個、より好ましくは１０〜８００個、さらに好ましくは１０〜３００個の反応場所である。
本発明においては、ｍＲＮＡ試料中に含まれ得る標的ｍＲＮＡを増幅するために、その標的ｍＲＮＡに対応するプライマー対をそれぞれ含む各増幅試薬とを一度に反応させる。このために、本発明では、好ましくは複数の反応場所を有する反応器具が用いられ、ｍＲＮＡ試料と各増幅試薬との反応は、各反応場所で行われる。本発明で用いる反応器具は、ｍＲＮＡ試料と各増幅試薬とを一度に反応させることができるように、２つ以上の反応場所を有している限り、反応器具の構成及び構造は限定されない。好ましくは、本発明において用いられる反応器具として、例えば、複数の穴を有するプレート、複数のスライドグラスを備えてなる反応器具、複数の試験管を備えてなる反応器具などが挙げられる。実験スペース、操作性等を考慮した場合は、複数の穴を有するプレートを好ましく用いることができる。これらのプレートは、使用するプライマー対の数によって決められるが、市販されている９６穴または３８４穴プレートが好ましく用いられる。しかし、プライマー対の数に応じて所望の数の反応場所を設けた反応器具を使うことができる。また、市販されている９６穴または３８４穴プレートを２個以上使用することにより、本発明の方法を実施することもできる。
（増幅試薬）
本発明において用いられる各増幅試薬は、例えば、標的ｍＲＮＡに対応する一対のプライマー対、標的ｍＲＮＡに対応するプローブ、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液等を含む。
ここで、本発明において用いられる「標的ｍＲＮＡに対応するプライマー対」とは、標的ｍＲＮＡをコードする標的遺伝子配列のエクソン領域の一方の鎖に相補的又は実質的に相補的である第１のプライマーおよび該標的遺伝子配列のエクソン領域の他方の鎖に相補的又は実質的に相補的である第２のプライマーから成るプライマーの一対をいう。本発明においては、これらのプライマー対を少なくとも２対以上使って、一度に、ｍＲＮＡ試料中の標的遺伝子から転写されるｍＲＮＡの有無及びその転写量を検出できる。したがって、使用するプライマー対の数は、多ければ多いほど、本発明の定量方法の効率が上がることになる。
本発明の定量方法において、使用されるプライマー対群は、標的ｍＲＮＡの数に応じて調整すればよいので特に限定されないが、例えば、１０〜８００個のプライマー対から構成される。本発明の他の態様によれば、使用されるプライマー対群は、１０〜３００個のプライマー対から構成される。プライマー対の数が多い場合は、異なるセットの増幅試薬を複数枚のプレート（例えば、２〜１０枚のプレート）に分けてセットしておき、定量反応を複数回に分けて行うこともできる。
本発明における好ましい態様によれば、標的遺伝子は、Ｇタンパク質共役型レセプター遺伝子ファミリー、核内受容体遺伝子ファミリー及びプロテインキナーゼ型受容体遺伝子ファミリーから選択される遺伝子である。ゆえに標的ｍＲＮＡはＧタンパク質共役型レセプター遺伝子ファミリー、核内受容体遺伝子ファミリー、及びプロテインキナーゼ型受容体遺伝子ファミリーに属する遺伝子群のｍＲＮＡである。
この場合、上記標的遺伝子群のｍＲＮＡに対応するプライマー対を含んでなる各増幅試薬とｍＲＮＡ試料とを、反応器具の各反応場所において接触させることにより、増幅反応させ、ｍＲＮＡ増幅生成物を定量することによって、そのｍＲＮＡ試料中に含まれていた標的遺伝子群の発現量を測定することができる。
本発明のより好ましい態様によれば、全ての公知のＧタンパク質共役型レセプター遺伝子ファミリー、核内受容体遺伝子ファミリー、及びプロテインキナーゼ型受容体遺伝子ファミリーに属する遺伝子ｍＲＮＡに対応するプライマー対を全て準備し、そのプライマー対をそれぞれ含む増幅試薬を各反応場所にセットしておけば、一度の定量作業で、ｍＲＮＡ試料中において、どの標的遺伝子由来のｍＲＮＡがどの程度産生していたかを知ることができる。勿論、必要に応じて、異なるセットの増幅試薬を複数枚のプレートに分けてセットしておき、定量反応を複数回に分けて行うこともできる。
なお、現在、Ｇタンパク質共役型レセプター（または遺伝子）として次のものが公知である。
（１）アセチルコリンレセプター：Ｍ１；Ｍ２；Ｍ３；Ｍ４；Ｍ５
（２）アデノシンレセプター：Ａ１；Ａ２Ａ；Ａ２Ｂ；Ａ３
（３）アドレノセプター（Ａｄｒｅｎｏｃｅｐｔｏｒｓ）：α１Ａ；α１Ｂ；α１Ｄ；α２Ａ；α２Ｂ；α２Ｃ；β１；β２；β３
（４）アンギオテンシンレセプター：ＡＴ１；ＡＴ２
（５）ボンベシン（Ｂｏｍｂｅｓｉｎ）レセプター：ＢＢ１；ＢＢ２；ＢＢ３
（６）ブラジキニンレセプター：Ｂ１；Ｂ２
（７）カルシトニン・アイニリン・ＣＧＲＰ及びアドレノメヅリン（ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ）レセプター：
（８）カンナビノイドレセプター：ＣＢ１；ＣＢ２
（９）ケモカインレセプター：ＣＣＲ１；ＣＣＲ２；ＣＣＲ３；ＣＣＲ４；ＣＣＲ５；ＣＣＲ６；ＣＣＲ７；ＣＣＲ８；ＣＣＲ９；ＣＣＲ１０；ＣＸＣＲ１；ＣＸＣＲ２；ＣＸＣＲ３；ＣＸＣＲ４；ＣＸＣＲ５；ＣＸ３ＣＲ１；ＸＣＲ１；
（１０）ケニオタクチックペプチド（Ｃｈｅｎｉｏｔａｃｔｉｃ）レセプター：Ｃ３ａ；Ｃ５ａ；ｆＭＬＰ
（１１）コレシストキニン及びガストリン（Ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ  ａｎｄ  ｇａｓｔｒｉｎ）レセプター：ＣＣＫ１；ＣＣＫ２
（１２）コーチコトロピン放出因子（Ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）レセプター：ＣＲＦ１；ＣＲＦ２
（１３）ドーパミンレセプター：Ｄ１；Ｄ２；Ｄ３；Ｄ４；Ｄ５
（１４）エンドセリンレセプター：ＴＡ；ＥＴＢ
（１５）ガラニンレセプター（Ｇａｌａｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）：ＧＡＬ１；ＧＡＬ２；ＧＡＬ３
（１６）グルタメートレセプター：ｍｇｌｕ１；ｍｇｌｕ２；ｍｇｌｕ３；ｍｇｌｕ４；ｍｇｌｕ５；ｍｇｌｕ６；ｍｇｌｕ７；ｍｇｌｕ８
（１７）グリコプロテインホルモン（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｏｒｍｏｎｅ）レセプター：ＦＳＨ；ＬＳＨ；ＴＳＨ
（１８）ヒスタミンレセプター：Ｈ１；Ｈ２；Ｈ３；Ｈ４
（１９）５−ＨＴレセプター：５−ＨＴ１Ａ；５−ＨＴ１Ｂ；５−ＨＴ１Ｄ；５−ｈｔ１Ｂ；５−ｈｔ１Ｆ；５−ＨＴ２Ａ；５−ＨＴ２Ｆ；５−ＨＴ２Ｃ；５−ＨＴ３；５−ＨＴ４；５−ｈｔ５Ａ；５−ｈｔ５Ｂ；５−ＨＴ６；５−ＨＴ７
（２０）ロイコトリエンレセプター：ＢＬＴ；ＣｙｓＬＴ１；ＣｙｓＬＴ２
（２１）リソフォスフォリピッド（Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）レセプター：ｅｄｇ１；ｅｄｇ２；ｅｄｇ３；ｅｄｇ４
（２２）メラノコルチン（Ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ）レセプター：ＭＣ１；ＭＣ２；ＭＣ３；ＭＣ４；ＭＣ５
（２３）メラトニンレセプター：ＭＴ１；ＭＴ２；ＭＴ３
（２４）ニューロペプチドＹレセプター：Ｙ１；Ｙ２；Ｙ４；Ｙ５；Ｙ６
（２５）ニューロテンシン（Ｎｅｕｒｏｔｅｎｓｉｎ）レセプター：ＮＴＳ１；ＮＴＳ２
（２６）オピオイドレセプター：ＤＯＰ；ＫＯＰ；ＭＯＰ；ＮＯＰ
（２７）Ｐ２Ｙ  レセプター：Ｐ２Ｙ１；Ｐ２Ｙ２；Ｐ２Ｙ４；Ｐ２Ｙ６；Ｐ２Ｙ１１；Ｐ２Ｙ１２
（２８）プロスタノイド（Ｐｒｏｓｔａｎｏｉｄ）レセプター：ＤＰ；ＦＰ；ＩＰ；ＴＰ；ＥＰ１；ＥＰ２；ＥＰ３；ＥＰ４
（２９）プロテアーゼ活性化（Ｐｒｏｔｅａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ）レセプター：ＰＡＲ１；ＰＡＲ２；ＰＡＲ３；ＰＡＲ４
（３０）ソマトスタチン（Ｓｏｍａｔｏｔａｔｉｎ）レセプター：ｓｓｔ１；ｓｓｔ２；ｓｓｔ３；ｓｓｔ４；ｓｓｔ５
（３１）タヒキニン（Ｔａｃｈｙｋｉｎｉｎ）レセプター：ＮＫ１；ＮＫ２；ＮＫ３
（３２）チロトロピン放出ホルモン（Ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ）レセプター：ＴＲＨ１；ＴＲＨ２
（３３）ウロテンシン−ＩＩ（Ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ−ＩＩ）レセプター：
（３４）バソアクティブインテスティナルペプチド（Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）
及びピチュイタリアデニレートサイクラーゼ活性ペプチド（ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  ａｄｅｎｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）レセプター：ＶＰＡＣ１；ＶＰＡＣ２；ＰＡＣ１
（３５）バソプレシン（Ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ）及びオキシトシン（ｏｘｙｔｏｃｉｎ）レセプター：Ｖ１ａ；Ｖ１ｂ；Ｖ２；ＯＴ
また、現在、チロシンリン酸化酵素型レセプター、イオンチャンネル遺伝子などのファミリーに属する遺伝子として、次のものが公知である。
（３６）イオンチャネル：Ｎａ＋チャネル（タイプＩ；タイプＩＩ／タイプＩＩＡ；タイプＩＩＩ；ＳＣＬ１１／ＮａＧ；ＰＮ１；ＮａＣｈ６；ＮａＤＲＧ；ＳｋＭ１／μｌ，ＳｋＭ２）、Ｋ＋チャネル（Ｋｖ；ＥＡＧ；ＫＱＴ；ＩＲＫ；ＲＯＭＫ；ＧＩＲＫ；ＫＡＴＰ等）、Ｃａ２＋チャネル（α１Ｇ；α１Ｅ；α１Ｓ：α１Ｃ；α１Ｄ；α１Ｂ；α１Ａ；ＩＰ３；リアノジンレセプターなど）、Ｃ１−チャネル（ＧＡＢＡＡ；ＧＡＢＡＣ；グリシンレセプター；Ｃ１Ｃ０；Ｃ１Ｃ１；ＣＦＴＲなど）、非選択性カチオンチャネル（ｎＡＣｈＲ；５−ＨＴ３；ＮＭＤＡ；ＡＭＰＡ；Ｐ２ＸＡＴＰ；ＣＮＧなど）など
（３７）チロシンリン酸化酵素レセプター：インスリンレセプター；ＥＧＦレセプターなど
そのほか、核内受容体として公知のものとしては、例えば、
（３８）パーオキシソームプロリフェレータ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ）活性化レセプター：ＰＰＡＲ−α；ＰＰＡＲ−β；ＰＰＡＲ−γ等がある。
標的ｍＲＮＡを増幅させるためのプライマー対は、その標的ＧＰＣＲ遺伝子の配列に基づいて当業者であれば容易に設計することができる（例えば、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１９９６  Ｏｃｔ；６（１０）：９８６−９４参照）。
次に、本発明において用いられる標的ｍＲＮＡに対応するプローブは、標的配列に応じて当業者に容易に設計できる（例えば、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１９９６  Ｏｃｔ；６（１０）：９８６−９４参照）。
本発明において用いられる適当なオリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは約１５〜約５０ヌクレオチドの長さを有し、より好ましくは約２５〜約３５ヌクレオチドの長さを有する。オリゴヌクレオチドプローブは、生化学的、免疫化学的、又は化学的な手段によって検出可能な化学物質等を組込むことによって標識することができる。有用な標識としては、３２Ｐ等の放射性同位元素、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート等の蛍光物質、ルミノール、ルシフェリン等の発光物質、β−ガラクトシダーゼ、パーオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等の酵素、ビオチン、及び抗体等があげられる。
本発明において用いられるＤＮＡポリメラーゼとしては、逆転写活性および５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。
本発明においては、公知のあるいは市販されている緩衝液が用いられる（例えば、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製緩衝液；Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１９９６  Ｏｃｔ；６（１０）：９８６−９４参照）。
（ｍＲＮＡの増幅）
本発明の解析法において、ｍＲＮＡ試料中に含まれ得る標的ｍＲＮＡは、その標的ｍＲＮＡを増幅させるためのプライマー対を含む増幅試薬を用いて増幅される。本発明の好ましい態様によれば、標的ｍＲＮＡの増幅は公知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて行われる（米国特許第４，６８３，１９５号；第４，６８３，２０２号；第４，９６５，１８８号など参照）。
ｍＲＮＡの増幅は、最初に、例えばウィルスの逆転写酵素を用いて、標的ｍＲＮＡを逆転写し、生じたｃＤＮＡを増幅することによって行うことができる。さらに好ましい態様において、ｍＲＮＡの増幅は、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて行われる（米国特許第５，３１０，６５２号；第５，３２２，７７０号；第５，５６１，０５８号；第５，６４１，８６４号；５，６９３，５１７号等参照）。
なお、本発明においては、前記ポリメラーゼ連鎖反応以外にも種々のｍＲＮＡ増幅法が用いられる。そのような増幅法として、例えば、鎖置換アッセイ法（米国特許第５，４５５，１６６号など参照）、転写に基づく増幅法（ＴＡＳ）（米国特許第５，４３７，９９０号；第５，４０９，８１８号；第５，３９９，４９１号等参照）、自立配列複製法（３ＳＲ）（ＷＯ９２／０８８００等参照）などが挙げられる。
これらの増幅反応の反応条件は、使用する試薬の種類等に応じて、当業者によって容易に設定することができる。
（標的ｍＲＮＡの定量法）
次に、本発明の好ましい方法においては、前記のｍＲＮＡ増幅生成物の生成量を定量する。増幅生成物の定量は、好ましくはプローブを使用する方法によって行われる。好ましい態様によれば、蛍光物質により標識したプローブを用いた方法によって行われる。
本発明のより好ましい態様によれば、標的ｍＲＮＡの定量は「ＴａｑＭａｎ法」又は「５’ヌクレアーゼアッセイ法」を用いて行われる（プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー、第８８巻、第７２７６−７２８０頁（１９９１年）；米国特許第５，２１０，０１５号；第５，４８７，９７２号；第５，８０４，３７５号など参照）。ＴａｑＭａｎアッセイ法において、５’末端を標識したプローブが用いられる。また、このプローブは、プローブがＤＮＡ合成のためのプライマーとして働くことを防ぐために３’末端が修飾される。この修飾として、リン酸基、蛍光物質等の末端への付加があげられる。標的ｍＲＮＡの増幅は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて行われる。前記プライマーの下流の標的ｍＲＮＡにハイブリダイズするプローブは、増幅反応の間、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によって分解される。新規に標的領域が増幅されるたびに、プローブが分解され、標識物質が遊離される。この遊離される標識物質を定量することにより、標的ｍＲＮＡ量が間接的に測定される。
遊離される標識物質を定量的に検出するためには公知の方法が用いられる。好ましい方法において、前記プローブは、２つの蛍光物質で５’および３’末端が標識され、このうちの一方が、他方の物質の蛍光を消光することができる。このプローブは鋳型ＤＮＡにハイブリダイズしている間は２つの蛍光物質の相互作用により蛍光が消光されているが、ＤＮＡポリメラーゼが有する５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により分解されることにより蛍光を発するようになる。増幅反応の進行に伴い蛍光が増大し、この蛍光の増大がモニターされる。
標的ｍＲＮＡを含む試料の定量は、予め知られている量の標的ｍＲＮＡを含む試料を用い、これを増幅させて作製した「標準曲線」に基づいて行われる。標準曲線は、増幅の間に生じたシグナル由来の、投入したコピー数を計算するために使用される。従って、試料中の、未知の標的配列のコピー数は、前記の標準曲線を用いて、あらかじめ観察されるものに等しいシグナルを生じることが決定されたコピー数を計算することによって推計される。次に、前記試料中の標的配列の濃度を、反応前に決定する投入コピー数及び試料のサイズから計算することができる（特許公開第２００１−２０４４８３号公報など参照）。
実験上の誤差を排除するために内部標準を用いることができる。内部標準を用いる、増幅を基にした定量法は、米国特許第５，２１９，７１７号、第５，４７６，７７４号などに記載されている。増幅反応の特異性を増大させるための種々の方法が知られており、例えば、欧州特許出願第０  ８６６，０７１号などに記載されている。
（細胞の再生・増殖・分化調節剤をスクリーニングする方法）
本発明の他の態様によれば、再生・分化・増殖能力を有する細胞における複数の遺伝子の発現量をまとめて定量解析することにより、その細胞において発現量が上位に位置するあるいは他の細胞に比較して発現が特異的である一又は二以上の遺伝子を特定する工程、及び、その特定された遺伝子又はその遺伝子産物の機能を調節し得る少なくとも一種の候補物質をその細胞に接触させ、その接触の前後の変化を比較する工程を含む、細胞の再生・増殖・分化調節剤（または細胞の増殖・分化調節化合物）のスクリーニング方法が提供される。このような方法において、上記比較試験において、ある候補物質を細胞に接触させる前後において、細胞の再生、増殖又は分化に生理学的に有為な程度の相違が見られた場合は、その候補物質は、細胞の再生、分化又は増殖に関与していると特定することができる。ここで、「遺伝子又はその遺伝子産物の機能を調節し得る少なくとも一種の候補物質」としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。「生理学的に有為な程度」とは、例えば、その候補物質を接触させた場合に、接触させない場合と比較して、細胞の再生、増殖または分化が１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上促進または抑制された場合をいう。このように細胞の再生、分化又は増殖に関与している物質は、細胞の再生、分化又は増殖調節剤として用いることができる。ここで、「細胞の再生、分化又は増殖調節剤」とは、細胞の再生、分化又は増殖を促進するものと、細胞の再生、分化又は増殖を抑制するものが含まれる。
（上記スクリーニング方法によって得られる物質を含有する薬剤など）
次に、本発明は、上記（１）記載のスクリーニング方法によって同定された遺伝子の遺伝子産物に対するアゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤、活性化剤もしくは抗体、またはその遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）もしくはそのアンチセンスポリヌクレオチドを含んでなる薬剤にも関する。ここでいう「薬剤」は、化合物単体を含む意味で用いられる。好ましくは、この薬剤は、細胞の再生、増殖又は分化調節剤であり、このような薬剤を用いることによって、細胞の再生、増殖又は分化を調節することができる。より具体的に述べると、例えば、生体内においてある遺伝子又はその遺伝子産物（例えば、レセプタータンパク質）の発現が減少しているためにその遺伝子又は遺伝子産物が関与する細胞の再生、増殖又は分化に異常がある患者がいる場合に、（１）その遺伝子産物（例えば、レセプタータンパク質）を該患者に投与し該遺伝子産物の量を補充したり、（２）（イ）その遺伝子産物をコードするＤＮＡを該患者に投与し発現させることによって、あるいは（ロ）対象となる細胞にその遺伝子産物をコードするＤＮＡを挿入し発現させた後に、該細胞を該患者に移植することなどによって、患者の体内における当該遺伝子産物の量を増加させ、その遺伝子又は遺伝子産物の作用を充分に発揮させることができる。また、上記（１）記載のスクリーニング方法によって同定された遺伝子の遺伝子産物を阻害または活性化することにより、該遺伝子産物を含有する細胞の再生、増殖又は分化を調節することができる。
したがって、本発明の薬剤は、特定された遺伝子が関与する細胞の再生、増殖又は分化が関与している疾患の予防または治療に有効であり、例えば、中枢性疾患・神経疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、虚血性神経障害など）、炎症性疾患（例えば、アレルギー性疾患、喘息、リュウマチ、変形性関節症など）、循環器疾患（例えば、心筋梗塞、心不全、心肥大、狭心症、動脈硬化症等）、癌（例えば、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌等）、肥満、糖尿病、免疫系疾患（例えば、自己免疫疾患、アトピー性皮膚炎、アレルギー性疾患、免疫不全、喘息、リュウマチ性関節炎、乾癬、動脈硬化症、糖尿病、アルツハイマー病等）、肝臓・胆のう疾患（例えば、肝硬変、肝炎、肝不全、胆汁うっ滞症、結石等）、消化器系疾患（例えば、潰瘍、腸炎、消化不全、過敏性大腸炎、潰瘍性大腸炎、下痢、イレウス等）、熱傷、骨折、変形関節症、歯周病、脱毛症などの疾患や傷害の予防および／または治療に有用である。
本発明で特定された遺伝子の遺伝子産物（例えば、レセプタータンパク質）、それに対するアゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤、活性化剤もしくはその抗体、またはその遺伝子をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）もしくはそのアンチセンスポリヌクレオチドを上記予防及び／又は治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、本発明で用いられる医薬は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、本発明の医薬を、生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、上記予防および／または治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトやその他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
本発明の予防および／または治療剤の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、癌患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、癌患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
ＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）を上記予防及び／又は治療剤として使用する場合は、そのＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。そのＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
本発明のＤＮＡの投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、癌患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、癌患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明の細胞の再生・増殖・分化調節剤は、例えば、胚性幹細胞、体性幹細胞、間葉系幹細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓（α、β、δ）細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋（骨格筋・心筋）細胞、脂肪細胞、免疫細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞または血球系細胞などの細胞の再生、増殖または分化を調節することができる。そのような細胞の再生、増殖または分化の調節は上記のように患者に投与することによって生体内で行うことができるし、生体外で行うこともできる。生体外で、細胞の再生、増殖または分化を行う場合は、対象とする細胞を、本発明の細胞の再生・増殖・分化調節剤の存在下に培養することによって行うことができる。ここで用いられる培養条件（培地、温度、時間、調節剤の使用量など）は、対象とする細胞の種類、使用する細胞の再生・増殖・分化調節剤の種類等に応じて当業者が適宜設定することができる。ここで用いることができる培養方法、培養条件などは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｖｏｌ．４０，１４４−１５１（２００３）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｖｏｌ．４０，２６５−２７０（２００３）；Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５，９７５−９７７（１９９９）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（Ｍ．Ｖ．Ｗｉｌｅｓ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２５：９００（１９９３）；Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７５：１７３（１９９７）；Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：１４８（１９９７）などの文献を参照して適宜設定することができる。例えば、対象とする細胞を、フィーダー細胞の存在または非存在下、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ等の適当な培地で０．０１ｎｇ／ｍｌ〜１０．０ｍｇ／ｍｌの量の本発明の細胞再生・増殖・分化調節剤（例えば、後述のコレシストキニン）の存在下、２０〜４５℃（好ましくは３７℃）で１〜２０日間、ＣＯ２インキュベーター中で培養する。この培養は、対象とする細胞の再生、増殖又は分化に関与している因子が公知の場合は、そのような因子の存在下実施される。神経細胞の増殖に関与する因子としては、例えば、ＮＧＦ、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ等が知られており、血液細胞を増殖する因子としては、例えば、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ６、ＳＣＦ、ＧＭ−ＳＣＦ、ＥＰＯなどが知られている。なお、本発明は、このようにして分化を調節することによって得られる細胞をも包含する。細胞の再生、増殖又は分化は、ＦＡＣＳによる測定や、電子顕微鏡による観察によって確認することができる。なお、このようにして得られる細胞を用いて、移植による損傷あるいは疾患によって喪失された機能を補填する治療をすることも可能である。また、このようにして得られる細胞を用いて医薬候補化合物のスクリーニングを行なうこともできるし、医薬候補化合物の安全性を確認することもできる。
また、本発明の細胞の再生・分化・増殖調節剤は、細胞の再生、増殖又は分化を促進させることができるので、組織または臓器を再生することができる。そのように再生することができる臓器としては、脳、脳の各部位、角膜、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、歯、骨、関節または骨格筋等が挙げられる。本発明の細胞の再生・分化・増殖調節剤を用いて組織または臓器を再生する場合は、上記のようにして製剤化した調節剤を上記のような手法で患者に投与する。また、組織または臓器の再生は、公知の移植療法を用いて実施することもできる。そのような公知の手法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｖｏｌ．４０，２−８（２００３）；Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５，９７５−９７７（１９９９）；Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１１３，１０−１８（１９９７）；Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７，４３０−４３６（２００１）；Ｎａｔｕｒｅ  ４１０，７０１−７０５（２００１）；Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．５６１，３６４−３７０（２０００）；Ｓｔｒｏｋｅ  ３２，１００５−１０１１（２００１）；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８，１６６０−１６６３（２０００）などの文献に記載されている。
（コレシストキニン受容体等）
上記の本発明の遺伝子発現解析方法を用いた結果得られた配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプタータンパク質の新規用途について、以下に説明する。
本発明において、上記スクリーニング方法を用いることによって、細胞の再生・分化・増殖に関与している遺伝子として、コレシストキニン受容体遺伝子を特定することができた（詳細は、実施例参照）。ここで、コレシストキニン受容体タンパク質は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプタータンパク質（以下、「本発明のレセプタータンパク質」ともいう）をいう。なお、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質は、ヒトコレシストキニン受容体タンパク質であり、ＧｅｎＢａｎｋにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＡ３５６５９（配列番号：１）として登録されている。また、ヒトコレシストキニン受容体をコードする遺伝子の塩基配列はＧｅｎＢａｎｋにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｌ１３６０５（配列番号：２）として登録されている。
本発明のレセプタータンパク質は、例えば、ヒトやその他の哺乳動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）のあらゆる細胞〔例えば、網膜細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、白血球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞（例、乳癌細胞株（ＧＩ−１０１）、結腸癌細胞株（ＣＸ−１、ＧＩ−１１２）、肺癌細胞株（ＬＸ−１、ＧＩ−１１７）、卵巣癌細胞株（ＧＩ−１０２）、前立腺癌細胞株など）など〕、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、または血球系の細胞もしくはその培養細胞（例えば、ＭＥＬ，Ｍ１，ＣＴＬＬ−２，ＨＴ−２，ＷＥＨＩ−３，ＨＬ−６０，ＪＯＳＫ−１，Ｋ５６２，ＭＬ−１，ＭＯＬＴ−３，ＭＯＬＴ−４，ＭＯＬＴ−１０，ＣＣＲＦ−ＣＥＭ，ＴＡＬＬ−１，Ｊｕｒｋａｔ，ＣＣＲＴ−ＨＳＢ−２，ＫＥ−３７，ＳＫＷ−３，ＨＵＴ−７８，ＨＵＴ−１０２，Ｈ９，Ｕ９３７，ＴＨＰ−１，ＨＥＬ，ＪＫ−１，ＣＭＫ，ＫＯ−８１２，ＭＥＧ−０１など）に由来するタンパク質であってもよく、また合成タンパク質であってもよい。
本明細書において、「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、比較するアミノ酸配列に対して、例えば、約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、なかでも好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をいう。
配列番号：９で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、細胞の再生・増殖・分化活性、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。したがって、細胞の再生・増殖・分化活性、リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
細胞の再生・増殖・分化活性、リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、公知の方法に準じて行なうことができるが、例えば、後に記載するリガンドの決定方法やスクリーニング方法に従って測定することができる。
また、本発明のレセプタータンパク質としては、（１）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（２）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（３）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（４）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質なども用いられる。
本明細書におけるレセプタータンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って、左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。本発明のレセプタータンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明のレセプタータンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のレセプタータンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明のレセプタータンパク質には、上記したタンパク質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され
生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
本発明のレセプタータンパク質の具体例としては、例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるヒト由来コレシストキニン受容体タンパク質である。
本発明のレセプタータンパク質またはその塩は、上記したヒトや哺乳動物の細胞または組織から公知のレセプタータンパク質の精製方法によって製造することもできるし、後に記載する本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後に記載するタンパク質合成法またはこれに準じて製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
（レセプタータンパク質の部分ペプチド）
本発明の部分ペプチド（以下、単に「部分ペプチド」と略記する場合がある）としては、上記した本発明のレセプタータンパク質の部分アミノ酸配列を有するペプチドであれば何れのものであってもよいが、例えば、本発明のレセプタータンパク質の分子のうち、細胞膜の外に露出している部位であって、本発明のレセプタータンパク質と実質的に同質のレセプター結合活性を有するものなどが用いられる。
具体的には、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有する本発明のレセプタータンパク質の部分ペプチドとしては、疎水性プロット解析において細胞外領域（親水性（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｅ）部位）であると分析された部分を含むペプチドである。また、疎水性（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでも良い。
本発明の部分ペプチドのアミノ酸の数は、上記した本発明のレセプタータンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。
実質的に同一のアミノ酸配列とは、これらアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、なかでも好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を示す。
ここで、「実質的に同質のレセプター結合活性」とは、上記と同意義を示す。「実質的に同質のレセプター結合活性」の測定は上記と同様に行なうことができる。
また、本発明の部分ペプチドは、上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜数個（１〜５個））のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは１〜数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、本発明の部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。
さらに、本発明の部分ペプチドには、上記した本発明のレセプタータンパク質と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したＧｌｎがピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの塩としては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明の部分ペプチドまたはその塩は、公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明のＧＰＣＲを適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明のＧＰＣＲを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下のａ）〜ｅ）に記載された方法が挙げられる。
ａ）Ｍ．ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド  シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６６年）
ｂ）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ  ペプチド（Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６５年）
ｃ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）（１９７５年）
ｄ）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、２０５、（１９７７年）
ｅ）矢島治明監修、続医薬品の開発  第１４巻  ペプチド合成  広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
（ポリヌクレオチド）
本発明のレセプタータンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、上記した本発明のレセプタータンパク質をコードする塩基配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を含有するものであればいかなるものであってもよい。該ポリヌクレオチドとしては、本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであり、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非コード鎖）であってもよい。
本発明のレセプタータンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、実験医学増刊「新ＰＣＲとその応用」１５（７）、１９９７記載の公知の方法またはそれに準じた方法
により、本発明のレセプタータンパク質のｍＲＮＡを定量することができる。
本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞または組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞または組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細胞または組織よりｔｏｔａｌ  ＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
具体的には、本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有し、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を含有するレセプタータンパク質と実質的に同質の活性（例、細胞の再生・増殖・分化活性、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するレセプタータンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
配列番号：２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
「該ハイストリンジェントな条件」とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
本発明の「レセプタータンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列の一部、または該ＤＮＡと相補的な塩基配列の一部を含有してなるポリヌクレオチド」とは、下記の本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡを包含するだけではなく、ＲＮＡをも包含する意味で用いられる。
本発明に従えば、レセプタータンパク質遺伝子の複製または発現を阻害することのできるアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）を、クローン化した、あるいは決定されたレセプタータンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうしたポリヌクレオチド（核酸）は、レセプタータンパク質遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成または機能を阻害することができるか、あるいはレセプタータンパク質関連ＲＮＡとの相互作用を介してレセプタータンパク質遺伝子の発現を調節・制御することができる。レセプタータンパク質関連ＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、およびレセプタータンパク質関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外でレセプタータンパク質遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列または核酸とペプチド（タンパク質）との間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列またはその相補体から誘導される指令にあるペプチド（タンパク質）のアミノ酸を通常指している。レセプタータンパク質遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ＯＲＦ翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、レセプタータンパク質遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチド（以下、包括的に本発明のレセプタータンパク質と略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のレセプタータンパク質の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のレセプタータンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
（アンチセンス・ポリヌクレオチド）
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係は、対象物とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、「アンチセンス」であるということができる。アンチセンス・ポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販のタンパク質、核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えばタンパク質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレート化合物（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。
こうした修飾は当該分野で数多く知られており、例えばＪ．Ｋａｗａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｔｅｃｈ  Ｊａｐａｎ，Ｖｏｌ．８，ｐｐ．２４７，１９９２；Ｖｏｌ．８，ｐｐ．３９５，１９９２；Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３などに開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいはレセプタータンパク質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸は公知の各種の方法で細胞に適用できる。
本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチドは、生体内における本発明のタンパク質または本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）の機能を抑制することができるので、例えば、本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤として用いることができる。さらに、本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチドは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできるので、本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患の診断に用いることができる。
（部分ペプチドをコードするＤＮＡ）
本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、上記した本発明の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞または組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞または組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細胞または組織よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
具体的には、本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、
（１）配列番号：２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、
（２）配列番号：２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有し、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質ペプチドと実質的に同質の活性（例、細胞の再生・分化・増殖活性、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するタンパク質をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
（抗体）
本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体は、本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、あるいは本発明のレセプタータンパク質を含有する細胞を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩（以下、本発明のレセプタータンパク質等と略記する場合がある）に対する抗体は、本発明のレセプタータンパク質等を抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナルモノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のレセプタータンパク質等は、哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化レセプタータンパク質等と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６巻、４９５頁（１９７５年）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、約２０〜４０℃、好ましくは約３０〜３７℃で約１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、レセプタータンパク質等の抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したレセプタータンパク質等を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ  １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））またはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（本発明のタンパク質等の抗原）とキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のレセプタータンパク質等に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことができる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
［レセプタータンパク質、ＤＮＡなどの用途］
本発明のレセプタータンパク質、それをコードするポリヌクレオチド（以下、本発明のポリヌクレオチドと略記する場合がある）、本発明のレセプタータンパク質に作用する化合物（リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤、活性化剤、抗体等）、発明のレセプタータンパク質に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）、本発明のＤＮＡに対するアンチセンスポリヌクレオチド（以下、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドと略記する場合がある）などは、以下の用途を有している。なお、本発明のレセプタータンパク質のリガンドとして、コレシストキニンが知られている。
（１）細胞の再生・増殖・分化が関与する疾患の予防および／または治療剤
本発明のレセプタータンパク質は細胞の再生・増殖・分化に関与していることから、ａ）本発明のレセプタータンパク質、ｂ）本発明のレセプタータンパク質をコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）又はｃ）本発明のレセプタータンパク質に作用する化合物（リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤、活性化剤、抗体など）は、細胞の再生・増殖・分化調節剤として有用である。したがって、そのような細胞の再生・増殖・分化調節剤は、細胞の再生、増殖又は分化が関与している疾患の予防および／または治療剤として使用することができる。そのような疾患としては、例えば、肥満、糖尿病、免疫系疾患（例えば、自己免疫疾患、アトピー性皮膚炎、アレルギー性疾患、免疫不全、喘息、リュウマチ性関節炎、乾癬、動脈硬化症、糖尿病、アルツハイマー病等）、肝臓疾患（例えば、肝硬変、肝炎、肝不全等）、消化器系疾患（例えば、潰瘍、腸炎、消化不全、過敏性大腸炎、潰瘍性大腸炎、下痢、イレウス等）などの疾患や傷害、美容整形時の組織の損傷などが挙げられる。また、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質を阻害または活性化することにより、該タンパク質を含有する細胞の再生、増殖又は分化を調節することができる。
例えば、生体内において本発明のレセプタータンパク質が減少しているために、リガンドの生理作用（例えば、細胞の再生・増殖・分化作用）が期待できない（本発明のレセプタータンパク質の欠乏症）患者がいる場合に、ａ）本発明のレセプタータンパク質を該患者に投与し該レセプタータンパク質の量を補充したり、ｂ）（イ）本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡを該患者に投与し発現させることによって、あるいは（ロ）対象となる細胞に本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡを挿入し発現させた後に、該細胞を該患者に移植することなどによって、患者の体内における該レセプタータンパク質の量を増加させ、リガンドの作用を充分に発揮させることができる。
コレシストキニンは本発明のレセプタータンパク質のリガンドであるから、コレシストキニンおよびその類縁体は、細胞の再生、増殖又は分化調節剤として用いることができる。このような細胞の再生、増殖又は分化調節剤は、幹細胞、特に間葉系幹細胞の分化を調節することができるので有用である。また、このような細胞の再生、増殖又は分化調節剤は、脂肪細胞への分化を調節することも確認されているので（後述の実施例２参照）、脂肪細胞への分化調節剤としても有用である。
本発明のレセプタータンパク質、それをコードするポリヌクレオチド、本発明のレセプタータンパク質に作用する化合物等を上記医薬として使用する場合は、上記のような常套手段に従って製剤化し、上記のような手法で投与することができる。
（２）ポリヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチドを用いる診断剤及び診断方法
本発明の方法によって特定され得るポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）およびアンチセンスポリヌクレオチド（例、アンチセンスＤＮＡ）は、プローブとして使用することにより、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）における本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。
本発明のポリヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチドを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ），第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションにより本発明のレセプタータンパク質の発現低下または発現過多が検出された場合は、例えば、本発明のレセプタータンパク質の機能不全または過剰発現に起因する疾患、例えば、肥満、糖尿病、免疫系疾患（例えば、自己免疫疾患、アトピー性皮膚炎、アレルギー性疾患、免疫不全、喘息、リュウマチ性関節炎、乾癬、動脈硬化症、糖尿病、アルツハイマー病等）、肝臓・胆のう疾患（例えば、肝硬変、肝炎、肝不全、胆汁うっ滞症、結石等）、消化器系疾患（例えば、潰瘍、腸炎、消化不全、過敏性大腸炎、潰瘍性大腸炎、下痢、イレウス等）、熱傷、骨折、脱毛症などの疾患に罹患している可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
（３）アンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医薬
本発明の方法によって特定され得るアンチセンスポリヌクレオチドは、本発明のレセプタータンパク質の過剰発現などに起因する疾患（例えば、神経疾患、炎症性疾患、循環器疾患、癌、肥満、糖尿病、免疫系疾患、肝臓・胆のう疾患、消化器系疾患、熱傷、骨折、変形性関節症、歯周病又は脱毛症）の予防及び／又は治療剤として用いることができる。
例えば、該アンチセンスポリヌクレオチドを用いる場合、該アンチセンスポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスペクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。該アンチセンスポリヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
さらに、該アンチセンスポリヌクレオチドは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
（４）上記スクリーニング方法によって特定された遺伝子の遺伝子産物、本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物のスクリーニング方法
上記スクリーニング方法によって特定された遺伝子の塩基配列を有するポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）は、プローブとして用いることにより、上記スクリーニング方法によって特定された遺伝子の遺伝子産物、本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物のスクリーニングに用いることができる。すなわち、細胞の再生・増殖・分化を調節する化合物をスクリーニングすることができる。
すなわち、本発明は、例えば、（ｉ）非ヒト哺乳動物の（１）血液、（２）特定の臓器、（３）臓器から単離した組織もしくは細胞、または（ｉｉ）形質転換体等に含まれる本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドのｍＲＮＡ量を測定することによる、上記スクリーニング方法によって特定された遺伝子、本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法によって特定された遺伝子の遺伝子産物、本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドのｍＲＮＡ量の測定は具体的には以下のようにして行なう。
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体的には担癌マウスなど）に対して、薬剤（例えば、抗癌剤など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肺、大腸、前立腺など）、または臓器から単離した組織、あるいは細胞を得る。
得られた細胞に含まれる本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドのｍＲＮＡは、例えば、通常の方法により細胞等からｍＲＮＡを抽出し、例えば、ＴａｑＭａｎＰＣＲなどの手法を用いることにより定量することができ、公知の手段によりノザンブロットを行うことにより解析することもできる。
（ｉｉ）上記スクリーニング方法によって特定された遺伝子又はその遺伝子産物、本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドを発現する形質転換体を上記の方法に従い作製し、該形質転換体に含まれる本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドのｍＲＮＡを同様にして定量、解析することができる。
上記スクリーニング方法によって特定された遺伝子もしくはその遺伝子産物、本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物（本発明のレセプタータンパク質に作用する化合物）のスクリーニングは、
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、薬剤あるいは物理的ストレスなどを与える一定時間前（３０分前〜２４時間前、好ましくは３０分前〜１２時間前、より好ましくは１時間前〜６時間前）もしくは一定時間後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に被検化合物を投与し、投与後一定時間経過後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、細胞に含まれる本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドのｍＲＮＡ量を定量、解析することにより行なうことができ、
（ｉｉ）形質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中に混合させ、一定時間培養後（１日後〜７日後、好ましくは１日後〜３日後、より好ましくは２日後〜３日後）、該形質転換体に含まれる本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドのｍＲＮＡ量を定量、解析することにより行なうことができる。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記スクリーニング方法によって特定された遺伝子もしくはその遺伝子産物、本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる作用を有する化合物であり、具体的には、（イ）上記スクリーニング方法によって特定された遺伝子もしくはその遺伝子産物、本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を増加させることにより、細胞の再生・増殖・分化活性を増強させる化合物、（ロ）上記スクリーニング方法によって特定された遺伝子もしくはその遺伝子産物、本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を減少させることにより、細胞の再生・増殖・分化活性を減弱させる化合物である。
試験化合物としては、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物（脂質、アミン、アミノ酸、糖、核酸、イオン等）、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
上記のようにして得られる細胞の再生・増殖・分化活性を調節し得る化合物は、細胞再生・増殖・分化調節剤として有用である。
（５）本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物を含有する各種疾病の予防および／または治療剤
本発明のレセプタータンパク質は上記のとおり、例えば、中枢機能など生体内で何らかの重要な役割を果たしていると考えられる。したがって、本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物は、本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤として用いることができる。
該化合物を本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤として使用する場合は、上記のような常套手段に従って製剤化することができる。
（６）本発明のレセプタータンパク質を用いる細胞の再生、増殖又は分化を調節し得る化合物（アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤、活性化剤など）のスクリーニング方法及びスクリーニングキット
本発明のレセプタータンパク質は、細胞の再生、増殖又は分化に関与しているから、このタンパク質とそのリガンドとの結合性を変化させる化合物は、細胞の再生、増殖又は分化を調節することができると予測される。したがって、結合性実験によって細胞の再生、増殖又は分化を調節する化合物を一次スクリーニングすることができる。このスクリーニングで選択された化合物が、細胞の再生、増殖・分化活性を有するか否かは、実際にその化合物を再生・分化・増殖能力のある細胞に接触させることによって容易に確認することができる。
本発明のレセプタータンパク質等を用いるか、または組換え型レセプタータンパク質等の発現系を構築し、該発現系を用いたレセプター結合アッセイ系を用いることによって、リガンドと本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物（例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物など）またはその塩を効率よくスクリーニングすることができる。なお、ここでいうリガンドの種類は特に限定されず、例えば、タンパク質、ペプチド、脂質、アミン、アミノ酸、糖、核酸、イオンで、天然型アゴニストおよびアンタゴニスト、組換え型アゴニストおよびアンタゴニスト、合成アゴニストおよびアンタゴニスト、それらの誘導体および代謝物、リガンドの生合成阻害剤、シグナル伝達系の阻害剤、中和抗体、結合タンパク質を含む。
上記したとおり、本発明のレセプタータンパク質に対するリガンドの１つとして、コレシストキニンが挙げられる。
リガンドと本発明のレセプタータンパク質との結合性を変化させる化合物には、（イ）レセプターを介する細胞刺激活性などを促進する活性または抑制する活性など）を有する化合物（いわゆる、本発明のレセプタータンパク質に対するアゴニスト）、（ロ）該細胞刺激活性を有しない化合物（いわゆる、本発明のレセプタータンパク質に対するアンタゴニスト）、（ハ）リガンドと本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質との結合力を増強する化合物、あるいは（ニ）リガンドと本発明のレセプタータンパク質との結合力を減少させる化合物などが含まれる（なお、上記（イ）の化合物は、上記したリガンド決定方法によってスクリーニングすることが好ましい）。
細胞刺激活性としては、例えば、（１）アラキドン酸遊離、（２）アセチルコリン遊離、（３）細胞内Ｃａ２＋遊離、（４）細胞内ｃＡＭＰ生成、（５）細胞内ｃＧＭＰ生成、（６）イノシトールリン酸産生、（７）細胞膜電位変動、（８）細胞内タンパク質（例、ＭＡＰキナーゼ）のリン酸化、（９）ｃ−ｆｏｓの活性化、（１０）ｐＨの低下、（１１）Ｒｈｏ，Ｒａｃ，Ｒａｓなどの低分子量Ｇタンパク質の活性化、（１２）転写因子ＣＲＥ（ｃＡＭＰ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）、ＡＰ１、ＮＦＡＴ、ＳＲＥ（Ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）などの下流につないだレポーター遺伝子（例、ルシフェラーゼなど）の活性化などが挙げられ、特に細胞内ｃＡＭＰ生成の促進活性などが好ましい。
すなわち、本発明は、（ｉ）本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、リガンドとを接触させた場合と（ｉｉ）本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、リガンドおよび試験化合物とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とするリガンドと本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法においては、（ｉ）と（ｉｉ）の場合における、例えば、該レセプタータンパク質等に対するリガンドの結合量、細胞刺激活性などを測定して、比較することを特徴とする。
より具体的には、本発明は、
（ｉ）標識したリガンドを、本発明のレセプタータンパク質等に接触させた場合と、標識したリガンドおよび試験化合物を本発明のレセプタータンパク質等に接触させた場合における、標識したリガンドの該レセプタータンパク質等に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするリガンドと本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（ｉｉ）標識したリガンドを、本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、標識したリガンドおよび試験化合物を本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、標識したリガンドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするリガンドと本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（ｉｉｉ）標識したリガンドを、本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したレセプタータンパク質等に接触させた場合と、標識したリガンドおよび試験化合物を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明のレセプタータンパク質等に接触させた場合における、標識したリガンドの該レセプタータンパク質等に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするリガンドと本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（ｉｖ）本発明のレセプタータンパク質等を活性化する化合物（例えば、リガンドなど）を本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞に接触させた場合と、本発明のレセプタータンパク質等を活性化する化合物および試験化合物を本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞に接触させた場合における、レセプターを介した細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とするリガンドと本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、および
（ｖ）本発明のレセプタータンパク質等を活性化する化合物（例えば、リガンドなど）を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明のレセプタータンパク質等に接触させた場合と、本発明のレセプタータンパク質等を活性化する化合物および試験化合物を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明のレセプタータンパク質等に接触させた場合における、レセプターを介する細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とするリガンドと本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、本発明のスクリーニング方法に用いる本発明のレセプタータンパク質等としては、上記した本発明のレセプタータンパク質等を含有するものであれば何れのものであってもよいが、本発明のレセプタータンパク質等を含有する哺乳動物の臓器の細胞膜画分が好適である。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量発現させたヒト由来のレセプタータンパク質等などが適している。
本発明のレセプタータンパク質を製造するには、上記の方法が用いられるが、本発明のＤＮＡを哺乳細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうことが好ましい。目的とするタンパク質部分をコードするＤＮＡ断片には相補ＤＮＡが用いられるが、必ずしもこれに制約されるものではない。例えば、遺伝子断片や合成ＤＮＡを用いてもよい。本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡ断片を宿主動物細胞に導入し、それらを効率よく発現させるためには、該ＤＮＡ断片を昆虫を宿主とするバキュロウイルスに属する核多角体病ウイルス（ｎｕｃｌｅａｒｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ；ＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーター、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒトヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどの下流に組み込むのが好ましい。発現したレセプターの量と質の検査はそれ自体公知の方法で行うことができる。例えば、文献〔Ｎａｍｂｉ，Ｐ．ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２６７巻，１９５５５〜１９５５９頁，１９９２年〕に記載の方法に従って行なうことができる。
なお、本発明のスクリーニング方法において、本発明のレセプタータンパク質等を含有するものとしては、公知の方法に従って精製したレセプタータンパク質等であってもよいし、該レセプタータンパク質等を含有する細胞を用いてもよく、また該レセプタータンパク質等を含有する細胞の膜画分を用いてもよい。
本発明のスクリーニング方法において、本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法は公知の方法に従って行なうことができる。
本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞としては、該レセプタータンパク質等を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが好ましい。
細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製）のよる破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したレセプタータンパク質等と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの膜成分が多く含まれる。
該レセプタータンパク質等を含有する細胞や膜画分中のレセプタータンパク質の量は、１細胞当たり１０３〜１０８分子であるのが好ましく、１０５〜１０７分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
リガンドと本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする上記の（１）〜（３）を実施するためには、例えば、適当なレセプタータンパク質画分と、標識したリガンドが必要である。
レセプタータンパク質画分としては、天然型のレセプタータンパク質画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型レセプタータンパク質画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などを示す。
標識したリガンドとしては、標識したリガンド、標識したリガンドアナログ化合物などが用いられる。例えば〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、〔３５Ｓ〕などで標識されたリガンドなどが用いられる。
具体的には、リガンドと本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物のスクリーニングを行なうには、まず本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりレセプタータンパク質標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドとレセプタータンパク質との結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０ＴＭ（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによるレセプターやリガンドの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０．０１ｍｌ〜１０ｍｌの該レセプター溶液に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐｍ）の標識したリガンドを添加し、同時に１０−４Ｍ〜１０−１０Ｍの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識のリガンドを加えた反応チューブも用意する。反応は約０℃から５０℃、望ましくは約４℃から３７℃で、約２０分から２４時間、望ましくは約３０分から３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント（Ｂ０）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ０−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が、例えば、５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
リガンドと本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする方法を実施するためには、例えば、上記したレセプタータンパク質を介する細胞刺激活性を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。
具体的には、まず、本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行なうにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、適当なレセプタータンパク質を発現した細胞が必要である。本発明のレセプタータンパク質等を発現した細胞としては、天然型の本発明のレセプタータンパク質等を有する細胞株、上記の組換え型レセプタータンパク質等を発現した細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが用いられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
また、試験化合物としては、本発明のレセプタータンパク質の活性部位の原子座標およびリガンド結合ポケットの位置に基づいて、リガンド結合ポケットに結合するように設計された化合物が好ましく用いられる。本発明のレセプタータンパク質の活性部位の原子座標およびリガンド結合ポケットの位置の測定は、公知の方法あるいはそれに準じる方法を用いて行うことができる。
リガンドと本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キットは、本発明のレセプタータンパク質等、本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞、または本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞の膜画分を含有するものなどである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
１．スクリーニング用試薬
（１）測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Ｈａｎｋｓ’Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ギブコ社製）に、０．０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径０．４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
（２）Ｇタンパク質共役型レセプター標品
本発明のレセプタータンパク質を発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０５個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ２、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
（３）標識リガンド
市販の〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、〔３５Ｓ〕などで標識したリガンド
水溶液の状態のものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。
（４）リガンド標準液
リガンドを０．１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で保存する。
２．測定法
（１）１２穴組織培養用プレートにて培養した本発明のレセプタータンパク質発現ＣＨＯ細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
（２）１０−３〜１０−１０Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた後、標識リガンドを５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の代わりに１０−３Ｍのリガンドを５μｌ加えておく。
（３）反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。細胞に結合した標識リガンドを０．２Ｎ  ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
（４）液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Ｐｅｒｃｅｎｔ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｂｉｎｄｉｎｇ（ＰＭＢ）を次の式で求める。
ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ０−ＮＳＢ）］×１００
ＰＭＢ：Ｐｅｒｃｅｎｔ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｂｉｎｄｉｎｇ
Ｂ    ：検体を加えた時の値
ＮＳＢ：Ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｂｉｎｄｉｎｇ（非特異的結合量）
Ｂ０  ：最大結合量
リガンドと本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物またはその塩がアゴニストであるかアンタゴニストであるかの具体的な評価方法は以下の（ｉ）または（ｉｉ）に従えばよい。
（ｉ）前記（１）〜（３）のスクリーニング方法で示されるバインディング・アッセイを行い、リガンドと本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる（特に、結合を阻害する）化合物を得た後、該化合物が上記した本発明のレセプタータンパク質を介する細胞刺激活性を有しているか否かを測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩はアゴニストであり、該活性を有しない化合物またはその塩はアンタゴニストである。
（ｉｉ）（ａ）試験化合物を本発明のレセプタータンパク質を含有する細胞に接触させ、上記した本発明のレセプタータンパク質を介する細胞刺激活性を測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩はアゴニストである。
（ｂ）本発明のレセプタータンパク質を活性化する化合物（例えば、リガンドまたは本発明のレセプタータンパク質に対するアゴニストなど）を本発明のレセプタータンパク質を含有する細胞に接触させた場合と、本発明のレセプタータンパク質を活性化する化合物および試験化合物を本発明のレセプタータンパク質を含有する細胞に接触させた場合における、上記した本発明のレセプタータンパク質を介する細胞刺激活性を測定し、比較する。本発明のレセプタータンパク質を活性化する化合物による細胞刺激活性を減少させ得る化合物またはその塩はアンタゴニストである。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、リガンドと本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる作用を有する化合物であり、具体的には、（１）上記した本発明のレセプタータンパク質を介する細胞刺激活性を有する化合物（いわゆる、本発明のレセプタータンパク質に対するアゴニスト）、（２）該細胞刺激活性を有しない化合物（いわゆる、本発明のレセプタータンパク質に対するアンタゴニスト）、（３）リガンドと本発明のレセプタータンパク質との結合力を増強する化合物、あるいは（４）リガンドと本発明のレセプタータンパク質との結合力を減少させる化合物である。
該化合物としては、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
本発明のレセプタータンパク質等に対するアゴニストは、本発明のレセプタータンパク質等に対する上記リガンドが有する生理活性と同様の作用を有しているので、該生理活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のレセプタータンパク質等に対するアンタゴニストは、本発明のレセプタータンパク質等に対する上記リガンドが有する生理活性を抑制することができるので、該生理活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。
リガンドと本発明のレセプタータンパク質との結合力を増強する化合物は、本発明のレセプタータンパク質等に対する上記リガンドが有する生理活性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。
リガンドと本発明のレセプタータンパク質との結合力を減少させる化合物は、本発明のレセプタータンパク質等に対する上記リガンドが有する生理活性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。
具体的には、本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られるリガンドと本発明のレセプタータンパク質との結合性を変化させる作用を有する化合物またはその塩は、例えば、肥満、糖尿病、免疫系疾患、肝臓疾患、消化器系疾患または美容整形時の組織の損傷に対する予防及び／又は治療薬として有用である。
（７）本発明のレセプタータンパク質とリガンドとの結合性を変化させる化合物（アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤、活性化剤など）を含有する各種疾病の予防および／または治療剤）
本発明のレセプタータンパク質とリガンドとの結合性を変化させる化合物（アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤、活性化剤）や本発明のレセプタータンパク質に対する上記リガンドは、本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患、例えば、肥満、糖尿病、免疫系疾患、肝臓疾患、消化器系疾患または美容整形時の組織の損傷に対する予防および／または治療剤として用いることができる。
該化合物やリガンドを本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤として使用する場合は、上述したような常套手段に従って製剤化することができる。
（８）本発明の抗体を用いるタンパク質などの定量、本発明の抗体を含有する診断薬およびそれを用いる診断方法
本発明の抗体は、本発明のレセプタータンパク質等を特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のレセプタータンパク質等の定量、特にサンドイッチ免疫測定法、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどによる定量などに使用することができる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のレセプタータンパク質またはその塩の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる〔例えば、入江  寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「メソッズ・イン・エンジモノジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ）Ｖｏｌ．７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ａ））、同書  Ｖｏｌ．７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｂ））、同書  Ｖｏｌ．７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｃ））、同書  Ｖｏｌ．８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、同書  Ｖｏｌ．９２（Ｉｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ））、同書  Ｖｏｌ．１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）、ＷＯ  ００／１４２２７号公報第３９頁第２５行〜第４２頁第８行、ＥＰ１１１１０４７Ａ２号公報段落［０１１５］第１９頁第３５行〜第２０頁第４７行など参照」。
以上のように、本発明の抗体を用いることによって、本発明のレセプタータンパク質またはその塩を感度良く定量することができる。
さらに、本発明の抗体を用いて、生体内での本発明のレセプタータンパク質またその塩を定量することによって、本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する各種疾患の診断をすることができる。
例えば、本発明の抗体を用いて本発明のレセプタータンパク質の濃度を定量することによって、該レセプタータンパク質の濃度の増加または減少が検出された場合、例えば、該レセプタータンパク質の機能不全または過剰発現、例えば、肥満、糖尿病、免疫系疾患、肝臓疾患、消化器系疾患などの疾患に罹患している可能性が高い、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のレセプタータンパク質等を特異的に検出するために使用することができる。また、本発明のレセプタータンパク質等を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のレセプタータンパク質等の検出、被検細胞内における本発明のレセプタータンパク質の挙動の分析などのために使用することができる。
（９）細胞膜における本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物のスクリーニング方法
本発明の抗体は、本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を特異的に認識することができるので、細胞膜における本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち本発明は、例えば、
（ｉ）非ヒト哺乳動物のａ）血液、ｂ）特定の臓器、ｃ）臓器から単離した組織もしくは細胞等を破壊した後、細胞膜画分を単離し、細胞膜画分に含まれる本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドを定量することによる、細胞膜における本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（ｉｉ）本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドを発現する形質転換体等を破壊した後、細胞膜画分を単離し、細胞膜画分に含まれる本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドを定量することによる、細胞膜における本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（ｉｉｉ）非ヒト哺乳動物のａ）血液、ｂ）特定の臓器、ｃ）臓器から単離した組織もしくは細胞等を切片とした後、免疫染色法を用いることにより、細胞表層での該レセプタータンパク質の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上の該タンパク質を確認することによる、細胞膜における本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。
（ｉｖ）本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドを発現する形質転換体等を切片とした後、免疫染色法を用いることにより、細胞表層での該レセプタータンパク質の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上の該タンパク質を確認することによる、細胞膜における本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。
細胞膜画分に含まれる本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの定量は具体的には以下のようにして行なう。
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体的には担癌マウスなど）に対して、薬剤（例えば、抗癌剤など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肺、大腸、前立腺など）、または臓器から単離した組織、あるいは細胞を得る。得られた臓器、組織または細胞等を、例えば、適当な緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ヘペス緩衝液など）等に懸濁し、臓器、組織あるいは細胞を破壊し、界面活性剤（例えば、トリトンＸ１００ＴＭ、ツイーン２０ＴＭなど）などを用い、さらに遠心分離や濾過、カラム分画などの手法を用いて細胞膜画分を得る。
細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したレセプタータンパク質等と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの膜成分が多く含まれる。
細胞膜画分に含まれる本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドは、例えば、本発明の抗体を用いたサンドイッチ免疫測定法、ウエスタンブロット解析などにより定量することができる。
かかるサンドイッチ免疫測定法は上記の方法と同様にして行なうことができ、ウエスタンブロットは公知の手段により行なうことができる。
（ｉｉ）本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドを発現する形質転換体を上記の方法に従い作製し、細胞膜画分に含まれる本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドを定量することができる。
細胞膜における本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物のスクリーニングは、
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、薬剤あるいは物理的ストレスなどを与える一定時間前（３０分前〜２４時間前、好ましくは３０分前〜１２時間前、より好ましくは１時間前〜６時間前）もしくは一定時間後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に被検化合物を投与し、投与後一定時間経過後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、細胞膜における本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの量を定量することにより行なうことができ、
（ｉｉ）形質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中に混合させ、一定時間培養後（１日後〜７日後、好ましくは１日後〜３日後、より好ましくは２日後〜３日後）、細胞膜における本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの量を定量することにより行なうことができる。
細胞膜画分に含まれる本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの確認は具体的には以下のようにして行なう。
（ｉｉｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体的には痴呆ラット、肥満マウス、動脈硬化ウサギ、担癌マウスなど）に対して、薬剤（例えば、抗痴呆薬、血圧低下薬、抗癌剤、抗肥満薬など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肺、大腸など）、または臓器から単離した組織、あるいは細胞を得る。得られた臓器、組織または細胞等を、常法に従い組織切片とし、本発明の抗体を用いて免疫染色を行う。細胞表層での該レセプタータンパク質の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上の該タンパク質を確認することにより、定量的または定性的に、細胞膜における本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの量を確認することができる。
（ｉｖ）本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドを発現する形質転換体等を用いて同様の手段をとることにより確認することもできる。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、細胞膜における本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させる作用を有する化合物であり、具体的には、（イ）細胞膜における本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの量を増加させることにより、レセプターを介する細胞刺激活性を増強させる化合物、（ロ）細胞膜における本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの量を減少させることにより、該細胞刺激活性を減弱させる化合物である。
該化合物としては、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
該細胞刺激活性を増強させる化合物は、本発明のレセプタータンパク質等の生理活性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。
該細胞刺激活性を減弱させる化合物は、本発明のレセプタータンパク質等の生理活性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。
（１０）体性幹細胞のマーカー
配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するコレシストキニン受容体は体性幹細胞、特に骨髄由来の間葉性幹細胞に特異的に発現している。したがって、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質に結合する化合物は体性幹細胞のマーカーとなり得る。このようなマーカーは、コレシストキニン受容体に結合し、その受容体を有する体性幹細胞、特に骨髄由来の間葉系幹細胞を標識することができるので、そのような細胞を識別、選択または濃縮する際に使用することができる。ここで、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質に結合する化合物としては、そのようなタンパク質を認識する抗体、リガンドなどが例示される。コレシストキニンは、コレシストキニン受容体のリガンドであるから、ここで用いられるマーカー物質として利用できる。マーカーとして識別性をもたせるためには、通常、その物質に、標識物質を付す。そのような標識物質は、蛍光性物質、放射性標識物質などから適宜選択される。適当な標識物質としては、例えばフルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質；３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等の放射性同位体などが挙げられる。
（１１）間葉系幹細胞の分化誘導方法
本発明はまた、ヒト間葉系幹細胞を無血清培地上で培養することを特徴とする、ヒト間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導方法を提供する。具体的には、オンコスタチンＭを含有する無血清培地を用いることを特徴とする。
間葉系幹細胞の分化誘導は以下のようにして行うことができる。
維持培地は細胞を維持できるものであればいずれの培地でもよいが、例えば１．０ｇ／ｌのグルコースを含むＤｕＩｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、インビトロゲン社）に１０％ウシ胎児血清（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（インビトロゲン社）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したものが望ましい。分化培地として、維持培地に０．１μＭ  ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、０．０５ｍＭ  ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ、１０ｍＭ  β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅを加えたもの（＝１０％ＦＢＳ含有分化培地）、或いはウシ胎児血清を含有しない維持培地に上記３つを添加したもの（＝無血清分化培地）を用いることができる。特に、オンコスタチンＭを細胞の分化誘導のために添加した無血清培地が望ましい。培養および分化誘導は、具体的には以下のように行うことができる。ヒト間葉系幹細胞を１ｘ１０３〜１ｘ１０４／ｗｅｌｌ、好ましくは６ｘ１０３／ｗｅｌｌの濃度で培養用プレート、例えば２４ウェルプレートに播種して一晩、３７℃で培養する。培養後、１ｎｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌのオンコスタチンＭを添加した分化培地に置換し、例えば４日おきに培地交換を行う。分化誘導は例えば、培養１０日目にウェルあたりのカルシウム蓄積量を定量（カルシウムＣテスト、和光純薬）することにより確認することができる。
（１２）分化誘導剤
本発明はオンコスタチンＭを含有する無血清培地用の細胞分化誘導剤、特にヒト間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化誘導する無血清培地用の細胞分化誘導剤を提供する。オンコスタチンＭはそのままで、または培養を阻害しない適当な緩衝液、例えば０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳあるいは適当な溶媒、例えばメタノールに溶解して培地添加することができる。添加量として、１ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１ｎｇ／ｍｌから１５ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１ｎｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは１０ｎｇ／ｍｌを用いることができる。
（略号の表示）
本明細書において、塩基、アミノ酸、化合物等を略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づき表示を行い、その例を以下に記載する。またアミノ酸が光学異性体を取りうる場合、特に明示しなければＬ体を表す。
ＤＮＡ          ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ        ：相補的デオキシリボ核酸
ａまたはＡ      ：アデニン
ｔまたはＴ      ：チミン
ｇまたはＧ      ：グアニン
ｃまたはＣ      ：シトシン
ｕまたはＵ      ：ウラシル
ＲＮＡ          ：リボ核酸
ｍＲＮＡ        ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ        ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ        ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ        ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ        ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ          ：アデノシン三リン酸
Ｇｌｙ          ：グリシン
Ａｌａ          ：アラニン
Ｖａｌ          ：バリン
Ｌｅｕ          ：ロイシン
Ｉｌｅ          ：イソロイシン
Ｓｅｒ          ：セリン
Ｔｈｒ          ：スレオニン
Ｃｙｓ          ：システイン
Ｍｅｔ          ：メチオニン
Ｇｌｕ          ：グルタミン酸
Ａｓｐ          ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ          ：リジン
Ａｒｇ          ：アルギニン
Ｈｉｓ          ：ヒスチジン
Ｐｈｅ          ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ          ：チロシン
Ｔｒｐ          ：トリプトファン
Ｐｒｏ          ：プロリン
Ａｓｎ          ：アスパラギン
Ｇｌｎ          ：グルタミン
ｐＧｌｕ        ：ピログルタミン酸
本明細書の配列表記載の配列は以下のとおりである。
［配列番号：１］ヒトコレシストキニン受容体のアミノ酸配列を表す。
［配列番号：２］ヒトコレシストキニン受容体をコードするＤＮＡの塩基配列を表す。
【実施例】  以下に実施例を示して本発明をより詳細に説明するが、これは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
（ヒト間葉系幹細胞において発現する受容体の検出）
市販のヒト間葉系幹細胞から公知の方法に従って全ＲＮＡ画分を調製した後、一般的な方法（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓｈａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ）参照）に従ってｃＤＮＡを合成した。アプライドバイオシステムズ社のリアルタイムＰＣＲシステムを用いてＧタンパク質共役型受容体ファミリーｍＲＮＡの発現量の定量を行なったところ、ヒト間葉系幹細胞においてコレシストキニン受容体Ａ型が２５ｎｇの全ＲＮＡ中に含まれ６ｍＲＮＡのコピー数として約７１，０００コピー発現していることを見出した。
実施例２
（ヒト間葉系幹細胞において発現する受容体のリガンドを用いた脂肪細胞への分化の調節）
ヒト間葉系幹細胞を細胞が密集した状態となるように２４穴培養プレートにて培養し、インスリン、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチン、インドメタシンと抗生物質、１０％ウシ胎児血清を添加した高グルコースＤＭＥＭ培地にコレシスキニン（１００ｎＭ）を添加して調製した分化誘導培地に交換して３日間培養した。コントロールにはコレシストキニンを添加しない分化誘導培地を用いた。インスリンと抗生物質、１０％ウシ胎児血清のみを添加した高グルコースＤＭＥＭ培地（脂肪維持培地）で３日間培養した後、同じ処理（誘導と維持を各３日間）を繰り返して実施した。細胞内に蓄積した脂肪の可視化はオイルレッド０色素による染色法によって行なった。
得られた結果を図１に示す。図１に示されているように、細胞内に蓄積された脂肪がオイルレッド０色素による染色によって検出されているが、コレシストキニン（ＣＣＫ：１００ｎＭ）を同時に作用させることによってコントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて脂肪の蓄積が亢進していることが分かる。
実施例３
（ヒト間葉系幹細胞からの骨芽細胞分化誘導におけるＯｎｃｏｓｔａｔｉｎ  Ｍの効果）
ヒト間葉系幹細胞はＣａｍｂｒｅｘ社より購入した。維持培地は１．０ｇ／ｌのグルコースを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、インビトロゲン社）に１０％ウシ胎児血清（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（インビトロゲン社）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したものを用いた。分化培地には維持培地に０．１μＭ  ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、０．０５ｍＭ  ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ、１０ｍＭ  β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅを加えたもの（＝１０％ＦＢＳ含有分化培地）、或いはウシ胎児血清を含有しない維持培地に上記３つを添加したもの（＝無血清分化培地）を用いた。ヒト間葉系幹細胞を６ｘ１０３／ｗｅｌｌの濃度で２４ウェルプレートに播種して一晩培養した後、各濃度（１０ｎｇ／ｍｌ，０ｎｇ／ｍｌ）のＯｎｃｏｓｔａｔｉｎ  Ｍを添加した分化培地に置換した。以後４日おきに培地交換を行い、培養１０日目にウェルあたりのカルシウム蓄積量を定量した（カルシウムＣテスト、和光純薬）。その結果、図２に示したように、Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ  Ｍを添加しない条件では１０％ＦＢＳ含有分化培地の方が無血清分化培地よりカルシウムを多く蓄積したが、Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ  Ｍ（１０μｇ／ｍｌ）を添加する条件では、ＦＢＳの有無に関わらずＯｎｃｏｓｔａｔｉｎ  Ｍ非添加１０％ＦＢＳ含有分化培地と比べて顕著なカルシウムの蓄積が認められた。これらの結果はＯｎｃｏｓｔａｔｉｎ  Ｍがヒト間葉系幹細胞からの骨芽細胞の無血清培地での分化誘導系において分化促進因子として有用であることを示している。
【産業上の利用可能性】  本発明の細胞の再生・増殖・分化関与遺伝子のスクリーニング方法によれば、ある再生・分化・増殖能力を有する細胞において、細胞の再生・増殖・分化に関与している遺伝子を数少ない工程によって効率良く特定することができる。また、本発明の細胞の再生・増殖・分化調節剤のスクリーニング方法によれば、従来法に比較して効率良く細胞の再生・増殖・分化調節剤を得ることができる。
このような方法によって特定される細胞の再生・増殖・分化調節剤は、細胞の再生、増殖または分化の調節を行うことができるので、細胞の再生、増殖または分化が関与している疾患、例えば、神経疾患、炎症性疾患、循環器疾患、心筋梗塞、心不全、癌、肥満、糖尿病、免疫系疾患、肝臓・胆のう疾患、消化器系疾患、熱傷、骨折、変形性関節症、歯周病、脱毛症などの疾患や傷害の予防および／または治療剤として有用である。
さらに、本発明の細胞の再生・増殖・分化が関与している疾患を診断するための診断剤、診断キット及び診断方法によれば、簡便に細胞の再生・増殖・分化が関与している疾患を診断することができる利点がある。
【図１】
2006006722.tif 000002
【図２】
2006006722.tif 000003
【配列表】
2006006722000001.xml
【国際調査報告】
2006006722.tif 000009
2006006722.tif 000010
2006006722.tif 000011
2006006722.tif 000012
2006006722.tif 000013
2006006722.tif 000014
2006006722.tif 000015