【手続補正書】
【提出日】令和2年3月26日(2020.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマーを解析する方法であって、
ナノポアを通してポリマーを移動させるステップであって、前記ポリマーの異なる種類のモノマーが、鑑別可能な光学的シグナルを生成する異なる光学的標識で標識され、前記ナノポアが、複数のモノマーを包含する励起ゾーンを通って一列で移動するように前記モノマーを制約する、ステップと、
前記励起ゾーンを通過するときに、前記モノマーからの光学的シグナルの時間順のセットを検出するステップと、
光学的シグナルのモノマー特異的な時間順のセットを形成するために、異なる種類のモノマーからの光学的シグナルを分離するステップと、
前記ポリマーからの前記光学的シグナルのモノマー特異的な時間順のセットからモノマーの配列を決定するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記ポリマーがポリヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリマーが、標識されたヌクレオシド三リン酸の存在下で鋳型核酸分子にアニールされたプライマーを伸長することにより標識されたポリヌクレオチドである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記プライマーが、前記ポリヌクレオチドが前記ナノポアを移動して前記励起ゾーンを通過するときに初期光学的シグナルを生成する標識されたヌクレオチドを有する鍵配列を含有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記伸長されたプライマーにおける少なくとも２個の異なる種類のヌクレオチドを、鑑別可能な蛍光標識によって生成された蛍光シグナルによって同定することができるように、前記標識されたヌクレオシド三リン酸が、少なくとも２個の異なる種類のヌクレオシド三リン酸に付着された少なくとも２個の鑑別可能な蛍光標識を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記決定するステップが、前記光学的シグナルから決定されたヌクレオチドの重複するセグメントから候補配列を形成することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記検出するステップが、前記光学的シグナルを生成するために、前記励起ゾーンにおいて前記光学的標識を励起することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記光学的標識が、蛍光標識であり、前記励起ゾーンが、前記ナノポア、隣接する蛍光標識の相互クエンチ、および／またはクエンチ剤によって決定される体積および幾何学的配置を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ナノポアが、タンパク質ナノポアである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
本発明は、光学に基づくナノポア解析における２個以上の光学的標識の寄与を含む光学的測定の問題を有利に克服する。本発明の上述および他の利点は、多数の実行および用途において例証されており、その一部は、後述および本明細書を通して要約される。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ポリマーを解析する方法であって、
ナノポアを通してポリマーを移動させるステップであって、前記ポリマーの異なる種類のモノマーが、鑑別可能な光学的シグナルを生成する異なる光学的標識で標識され、前記ナノポアが、複数のモノマーを包含する励起ゾーンを通って一列で移動するように前記モノマーを制約する、ステップと、
前記励起ゾーンを通過するときに、前記モノマーからの光学的シグナルの時間順のセットを検出するステップと、
光学的シグナルのモノマー特異的な時間順のセットを形成するために、異なる種類のモノマーからの光学的シグナルを分離するステップと、
前記ポリマーからの前記光学的シグナルのモノマー特異的な時間順のセットからモノマーの配列を決定するステップと
を含む方法。
（項目２）
前記ポリマーが、標識されたヌクレオシド三リン酸の存在下で鋳型核酸分子にアニールされたプライマーを伸長することにより標識されたポリヌクレオチドである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記プライマーが、前記ポリヌクレオチドが前記ナノポアを移動して前記励起ゾーンを通過するときに初期光学的シグナルを生成する標識されたヌクレオチドを有する鍵配列を含有する、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記伸長されたプライマーにおける少なくとも２個の異なる種類のヌクレオチドを、鑑別可能な蛍光標識によって生成された蛍光シグナルによって同定することができるように、前記標識されたヌクレオシド三リン酸が、少なくとも２個の異なる種類のヌクレオシド三リン酸に付着された少なくとも２個の鑑別可能な蛍光標識を含む、項目２に記載の方法。
（項目５）
前記ポリマーが、ポリヌクレオチドであり、前記決定するステップが、前記光学的シグナルから決定されたヌクレオチドの重複するセグメントから候補配列を形成することを含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記ナノポアが、タンパク質ナノポアである、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記検出するステップが、前記光学的シグナルを生成するために、前記励起ゾーンにおいて前記光学的標識を励起することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記光学的標識が、蛍光標識であり、前記励起ゾーンが、前記ナノポア、隣接する蛍光標識の相互クエンチ、および／またはクエンチ剤によって決定される体積および幾何学的配置を有する、項目７に記載の方法。
（項目９）
ポリヌクレオチドを解析する方法であって、
ナノポアを通してポリヌクレオチドを移動させるステップであって、前記ポリヌクレオチドのヌクレオチドが、蛍光標識で標識されており、前記ナノポアが、前記蛍光標識を空間的に制約して、その移動の際の蛍光シグナルの放出を防止する穿孔を有する、ステップと、
前記蛍光標識を励起するステップと、
前記ポリヌクレオチドが前記穿孔を通って移動するときに、前記蛍光標識からの蛍光シグナルの時系列を検出するステップと、
蛍光シグナルの前記時系列から、前記ポリヌクレオチドのヌクレオチドに付着された蛍光標識の配列を決定するステップと
を含む方法。
（項目１０）
前記ポリヌクレオチドの異なる種類のヌクレオチドにおける前記蛍光標識が、別個の蛍光シグナルを放出する、項目９に記載の方法。
（項目１１）
蛍光シグナルの前記時系列における各値が、複数の前記蛍光標識からの蛍光シグナルを含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記検出するステップが、蛍光シグナルの複数の測定された標識特異的時系列を形成するために、前記別個の蛍光シグナルを分離することを含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記決定するステップが、蛍光シグナルの前記複数の標識特異的時系列を、ヌクレオチド配列と比較することと、蛍光シグナルの前記測定された標識特異的時系列に最も近い蛍光シグナルの時系列を生成するヌクレオチド配列を選択することとを含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記決定するステップが、前記蛍光シグナルから決定されたヌクレオチドの重複するセグメントから候補配列を形成することを含む、項目９に記載の方法。
（項目１５）
ポリヌクレオチドを解析する方法であって、
ナノポアを通してポリヌクレオチドを移動させるステップであって、前記ポリヌクレオチドのヌクレオチドが、蛍光標識で標識されており、前記ナノポアが、進入口および退出口を有する穿孔を有し、穿孔が、前記蛍光標識を空間的に制約して、その移動の間の蛍光シグナルの放出を防止する、ステップと、
前記穿孔の前記進入口に隣接する進入口領域および前記穿孔の前記退出口に隣接する退出口領域を包含するエバネセント場によって、前記蛍光標識を励起するステップと、
前記ポリヌクレオチドが前記穿孔を移動するときに、前記蛍光標識からの蛍光シグナルの時系列を検出するステップであって、前記検出された蛍光シグナルが、前記進入口領域および前記退出口領域における蛍光標識の蛍光シグナルを含む、ステップと、
蛍光シグナルの前記時系列から、前記ポリヌクレオチドのヌクレオチドに付着された蛍光標識の配列を決定するステップと
を含む方法。
（項目１６）
異なる種類のヌクレオチドに付着された前記蛍光標識が、鑑別可能な蛍光シグナルを生成する、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記検出するステップが、前記鑑別可能な蛍光シグナルを分離するステップを含み、前記決定するステップが、前記分離された蛍光シグナルの時系列から蛍光標識の前記配列を決定することを含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するための方法であって、
ナノポアの穿孔を通してポリヌクレオチドを移動させるステップであって、自由溶液中でヌクレオチドの蛍光標識が実質的にクエンチされるように、前記ポリヌクレオチドのヌクレオチドが、蛍光標識で標識され、前記穿孔内の蛍光標識が、その中で検出可能な蛍光シグナルが実質的に生成されないように制約され、異なる種類のヌクレオチドが、鑑別可能な蛍光シグナルを生成する異なる蛍光標識で標識される、ステップと、
前記ナノポアを退出する際、および先行する相互にクエンチする蛍光標識またはクエンチ剤との相互作用によりクエンチする前に、各ヌクレオチドの前記蛍光標識を励起するステップと、
前記ナノポアを退出する蛍光標識によって生成された蛍光シグナルを測定するステップと、
蛍光シグナルのヌクレオチド特異的な時間順のセットを形成するために、異なる種類のヌクレオチド由来の蛍光シグナルを分離するステップと、
前記ポリヌクレオチド由来の蛍光シグナルの前記ヌクレオチド特異的な時間順のセットからヌクレオチドの配列を決定するステップと
を含む方法。