【手続補正書】
【提出日】令和2年8月6日(2020.8.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クラミドモナス種（Chlamydomonas species）の高密度培養物の好気性従属栄養培養のための方法であって、
クラミドモナス種の実質的に純粋な培養物の接種材料を、0.1〜15g/Lの濃度で得る工程;
生産培養物を好気的に6.0〜9.0のpHおよび15℃〜37℃の温度で維持する工程;
生産培養物のpHについての設定点を選択する工程であって、該設定点が、±1.0単位の設定点範囲でpH6.5〜pH7.5である、工程；
生産培養物のpHが所定の設定点を超えたときに生産培養物にフィード培地を供給することによって、生産培養物のフィードを開始し、該pHが所定の設定点を下回るまで低下したときにフィードを中止する工程;
目標密度に達するまで、生産培養物を無菌条件下で増殖させる工程;ならびに
生産培養物からクラミドモナス種を回収する工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
クラミドモナス種が異種遺伝子を含まない、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
クラミドモナス種が異種遺伝子を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
生産培養物が光の非存在下で維持される、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
フィード培地が、生産培養物のための炭素源として酢酸または酢酸塩を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
pH設定点が6.0、6.2、6.5、6.8、および7.0からなる群より選択される、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
目標密度が、50〜75g/L、75〜100g/L、100〜125g/L、125〜150g/L、150〜175g/L、または175〜200g/L乾燥細胞重量である、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
目標密度が、生産培養物の接種後250時間以内に達成される、請求項7記載の方法。
【請求項９】
生産培養物のpHが設定点を少なくとも0.5単位超えたときに、フィードが開始される、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
前記pHが設定点を0.5単位を超えて下回るまで低下したときに、フィードが中止される、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
前記異種遺伝子が治療用タンパク質をコードし、前記方法が治療用タンパク質を生産培養物から回収する工程をさらに含む、請求項3記載の方法。
【請求項１２】
生産培養物から回収されたクラミドモナス種から栄養補助食品または栄養添加物を調製する工程をさらに含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
クラミドモナス種を、25％未満、20％未満、15％未満、10%未満、または5%未満の水分の含水量まで乾燥する工程をさらに含む、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
クラミドモナス種が、コナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）、クラミドモナス・ディソモス（Chlamydomonas dysomos）、クラミドモナス・ムンダン（Chlamydomonas mundane）、クラミドモナス・デバリアナ（Chlamydomonas debaryana）、クラミドモナス・モエブシィ（Chlamydomonas moewusii）、クラミドモナス・キュレウス（Chlamydomonas culleus）、クラミドモナス・ノクチガマ（Chlamydomonas noctigama）、クラミドモナス・オーラタ（Chlamydomonas aulata）、クラミドモナス・アプラナタ（Chlamydomonas applanata）、クラミドモナス・マルバニィ（Chlamydomonas marvanii）、クラミドモナス・プロボシゲラ（Chlamydomonas proboscigera）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
クラミドモナス種がコナミドリムシである、請求項14記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
いくつかの態様では、藻類は、回収後に、例えば噴霧乾燥、リング乾燥、パドル乾燥、トレイ乾燥、天日乾燥もしくは太陽乾燥、真空乾燥または凍結乾燥によって乾燥される。さらに他の態様では、この方法は、藻類から少なくとも1つの治療用タンパク質を単離することをさらに含む。
[本発明1001]
クラミドモナス種（Chlamydomonas species）の高密度培養物の好気性従属栄養培養のための方法であって、
クラミドモナス種の実質的に純粋な培養物の接種材料を、0.1〜15g/Lの濃度で得る工程;
初期容量の発酵培地に、前記初期容量の発酵培地の20％を超えない容量の接種材料を接種することによって、生産培養物を生成する工程;
生産培養物を好気的にpH6.0〜10.0および15℃〜37℃の温度で維持する工程;
生産培養物のpHの変化によって決定される量およびスケジュールでフィード培地を生産培養物に供給することによって、生産培養物にフィードする工程;
少なくとも60g/L乾燥細胞重量の目標密度に達するまで、生産培養物を無菌条件下で増殖させる工程;ならびに
生産培養物からクラミドモナス種を回収する工程
を含み、前記クラミドモナス種が異種遺伝子を含まない、前記方法。
[本発明1002]
生産培養物が光の非存在下で維持される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
フィードがpHの上昇によって決定される、本発明1001の方法。
[本発明1004]
フィード培地が、生産培地のpHをpH6.8±0.5に維持するために生産培養物に供給される、本発明1001の方法。
[本発明1005]
生産培養物のpHが培養設定点を超えるときは常に、フィード培地が生産培養物に供給され、生産培養物のpHがpH設定点より低いときは常に、フィード培地が中止される、本発明1001の方法。
[本発明1006]
pH設定点が6.0である、本発明1001の方法。
[本発明1007]
pH設定点が6.2である、本発明1001の方法。
[本発明1008]
pH設定点が6.5である、本発明1001の方法。
[本発明1009]
pH設定点が6.8である、本発明1001の方法。
[本発明1010]
pH設定点が7.0である、本発明1001の方法。
[本発明1011]
目標密度が、少なくとも50g/L、少なくとも55g/L、少なくとも60g/L、少なくとも65g/L、少なくとも70g/L、少なくとも75g/L、少なくとも80g/L、少なくとも85g/L、少なくとも90g/L、少なくとも95g/L、少なくとも100g/L、少なくとも105g/L、少なくとも110g/L、少なくとも115g/L、少なくとも120g/L、少なくとも125g/L、少なくとも130g/L、少なくとも135g/L、少なくとも140g/L、少なくとも145g/L、少なくとも150g/L、少なくとも155g/L、少なくとも160g/L、少なくとも165g/L、少なくとも170g/L、少なくとも175g/L、少なくとも180g/L、少なくとも185g/L、少なくとも190g/L、少なくとも195g/L、または少なくとも200g/L乾燥重量である、本発明1001の方法。
[本発明1012]
目標密度が、50〜75g/L、75〜100g/L、100〜125g/L、125〜150g/L、150〜175g/L、または175〜200g/L乾燥細胞重量である、本発明1001の方法。
[本発明1013]
目標密度が、50g/L、55g/L、65g/L、70g/L、75g/L、80g/L、90g/L、95g/L、100g/L、105g/L、110g/L、115g/L、120g/L、125g/L、130g/L、135g/L、140g/L、145g/L、150g/L、155g/L、160g/L、165g/L、170ｇ/L、175g/L、180g/L、185g/L、190g/L、195g/L、または200g/L乾燥細胞重量である、本発明1001の方法。
[本発明1014]
目標密度が、生産培養物の接種後250時間以内に達成される、本発明1001の方法。
[本発明1015]
クラミドモナス種がろ過または遠心分離によって回収される、本発明1001の方法。
[本発明1016]
クラミドモナス種がバッチ遠心分離によって回収される、本発明1015の方法。
[本発明1017]
クラミドモナス種が連続遠心分離によって回収される、本発明1015の方法。
[本発明1018]
回収されたクラミドモナス種を乾燥する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1019]
乾燥が、噴霧乾燥、リング乾燥、パドル乾燥、トレイ乾燥、天日乾燥もしくは太陽乾燥、真空乾燥、または凍結乾燥による、本発明1018の方法。
[本発明1020]
クラミドモナス種を15％未満の含水量まで乾燥する工程をさらに含む、本発明1018の方法。
[本発明1021]
クラミドモナス種が、コナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）、クラミドモナス・ディソモス（Chlamydomonas dysomos）、クラミドモナス・ムンダン（Chlamydomonas mundane）、クラミドモナス・デバリアナ（Chlamydomonas debaryana）、クラミドモナス・モエブシィ（Chlamydomonas moewusii）、クラミドモナス・キュレウス（Chlamydomonas culleus）、クラミドモナス・ノクチガマ（Chlamydomonas noctigama）、クラミドモナス・オーラタ（Chlamydomonas aulata）、クラミドモナス・アプラナタ（Chlamydomonas applanata）、クラミドモナス・マルバニィ（Chlamydomonas marvanii）、およびクラミドモナス・プロボシゲラ（Chlamydomonas proboscigera）の1種または複数種である、本発明1001の方法。
[本発明1022]
クラミドモナス種がコナミドリムシである、本発明1021の方法。
[本発明1023]
本発明1001の方法によって生成された90％超または少なくとも1種のクラミドモナス種を含む、栄養補助食品であって、
2019526282.tif 000001
を含む、前記栄養補助食品。
[本発明1024]
オメガ3、オメガ6、およびオメガ9脂肪酸をさらに含む、本発明1023の栄養補助食品。
[本発明1024]
増殖条件下で1種または複数種のクラミドモナス藻類を含む、藻類培養物であって、少なくとも50g/L乾燥細胞重量の濃度で前記藻類を含み、および前記増殖条件で培養物の密度が24時間当たり50％〜300％の割合で増加する、前記藻類培養物。
[本発明1025]
定常状態条件下で培養物の密度が24時間当たり0.1％〜50％の割合で増加する、本発明1019の藻類培養物。
[本発明1026]
治療用タンパク質を生産する方法であって、
少なくとも1つの外因性治療用タンパク質を発現するクラミドモナス種の実質的に純粋な培養物の接種材料を、0.1〜15g/Lの濃度で得る工程;
初期容量の発酵培地に、前記初期容量の発酵培地の20％を超えない容量の接種材料を接種することによって、生産培養物を生成する工程;
生産培養物を好気的にpH6.0〜10.0および15℃〜37℃の温度で維持する工程;
生産培養物のpHの変化によって決定される量およびスケジュールでフィード培地を生産培養物に供給することによって、生産培養物にフィードする工程;
無菌条件下で少なくとも50g/L乾燥細胞重量の目標密度に達するまで、生産培養物を増殖させる工程;ならびに
生産培養物からクラミドモナス種を回収する工程
を含む、前記方法。
[本発明1027]
生産培養物が光の非存在下で維持される、本発明1026の方法。
[本発明1028]
フィードがpHの上昇によって決定される、本発明1026の方法。
[本発明1029]
フィード培地が、生産培地のpHをpH6.8±0.5に維持するために生産培養物に供給される、本発明1026の方法。
[本発明1030]
生産培養物のpHが培養設定点を超えるときは常に、フィード培地が生産培養物に供給され、生産培養物のpHがpH設定点より低いときは常に、フィード培地が中止される、本発明1026の方法。
[本発明1031]
pH設定点が6.0である、本発明1026の方法。
[本発明1032]
pH設定点が6.2である、本発明1026の方法。
[本発明1033]
pH設定点が6.5である、本発明1026の方法。
[本発明1034]
pH設定点が6.8である、本発明1026の方法。
[本発明1035]
pH設定点が7.0である、本発明1026の方法。
[本発明1036]
目標密度が、少なくとも50g/L、少なくとも55g/L、少なくとも60g/L、少なくとも65g/L、少なくとも70g/L、少なくとも75g/L、少なくとも80g/L、少なくとも85g/L、少なくとも90g/L、少なくとも95g/L、少なくとも100g/L、少なくとも105g/L、少なくとも110g/L、少なくとも115g/L、少なくとも120g/L、少なくとも125g/L、少なくとも130g/L、少なくとも135g/L、少なくとも140g/L、少なくとも145g/L、少なくとも150g/L、少なくとも155g/L、少なくとも160g/L、少なくとも165g/L、少なくとも170g/L、少なくとも175g/L、少なくとも180g/L、少なくとも185g/L、少なくとも190g/L、少なくとも195g/L、または少なくとも200g/L乾燥重量である、本発明1026の方法。
[本発明1037]
目標密度が、50〜75g/L、75〜100g/L、100〜125g/L、125〜150g/L、150〜175g/L、または175〜200g/L乾燥細胞重量である、本発明1026の方法。
[本発明1038]
目標密度が、50g/L、55g/L、65g/L、70g/L、75g/L、80g/L、90g/L、95g/L、100g/L、105g/L、110g/L、115g/L、120g/L、125g/L、130g/L、135g/L、140g/L、145g/L、150g/L、155g/L、160g/L、165g/L、170ｇ/L、175g/L、180g/L、185g/L、190g/L、195g/L、または200g/L乾燥細胞重量である、本発明1026の方法。
[本発明1039]
目標密度が、生産培養物の接種後250時間以内に達成される、本発明1026の方法。
[本発明1040]
クラミドモナス種がろ過または遠心分離によって回収される、本発明1026の方法。
[本発明1041]
クラミドモナス種が連続遠心分離によって回収される、本発明1040の方法。
[本発明1042]
回収されたクラミドモナス種を乾燥する工程をさらに含む、本発明1026の方法。
[本発明1045]
乾燥が、噴霧乾燥、リング乾燥、パドル乾燥、トレイ乾燥、天日乾燥もしくは太陽乾燥、真空乾燥、または凍結乾燥による、本発明1042の方法。
[本発明1046]
少なくとも1つの治療用タンパク質をクラミドモナス種から単離する工程をさらに含む、本発明1026の方法。