【手続補正書】
【提出日】令和2年8月13日(2020.8.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経細胞によって発現されるインテグリンα１０サブユニットを含むマーカーの哺乳類神経幹細胞および哺乳類神経前駆細胞のためのマーカーとしての使用であって、前記インテグリンα１０サブユニットは前記哺乳類神経幹細胞および／または神経前駆細胞の細胞表面で発現される、使用。
【請求項２】
哺乳類神経幹細胞および／または哺乳類神経前駆細胞を同定するための方法であって、
ａ）神経組織を含む試料を用意するステップと、
ｂ）前記ａ）の試料に含まれる細胞によるインテグリンα１０サブユニットの発現を検出するステップと、
ｃ）前記ｂ）のインテグリンα１０サブユニットの発現をスコア化するステップと、
ｄ）前記ｃ）でのスコア付けに従って前記哺乳類神経幹細胞および／または神経前駆細胞を同定するステップと
を含み、前記スコア化は、インテグリンα１０サブユニットを発現する基準細胞集団で行った測定と、ならびにインテグリンα１０サブユニットを発現しない細胞集団と比較することを含み、前記インテグリンα１０サブユニットは、前記哺乳類神経幹細胞および／または神経前駆細胞の細胞表面で発現される、方法。
【請求項３】
哺乳類神経幹細胞および／または哺乳類神経前駆細胞を単離するための方法であって、
ａ）神経組織を含む試料を用意するステップと、
ｂ）前記ａ）の試料に含まれる細胞によるインテグリンα１０サブユニットの発現を検出するステップと、
ｃ）前記ｂ）のインテグリンα１０サブユニットの発現をスコア化するステップと、
ｄ）前記ｃ）でのスコア付けに従って前記哺乳類神経幹細胞および／または哺乳類神経前駆細胞を選択するステップと
を含み、前記スコア化は、インテグリンα１０サブユニットを発現する基準細胞集団で行った測定と、ならびにインテグリンα１０サブユニットを発現しない細胞集団で行った測定とを比較することを含み、前記インテグリンα１０サブユニットは、前記哺乳類神経幹細胞および／または神経前駆細胞の細胞表面で発現され、それによって、単離された神経幹細胞および／または神経前駆細胞を得る、方法。
【請求項４】
前記インテグリンα１０がインテグリンβ１サブユニットとの組み合わせでヘテロ二量体として発現される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項５】
前記ｂ）の検出の前にインテグリンα１０サブユニットを特異的に結合する抗体と前記試料を接触させるステップをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項６】
Ｎｅｓｔｉｎ、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ、ＧＦＡＰ、ＰＤＦＧＲα、ＳＯＸ−２、ＣＤ１３３（プロミニン−１）、ＣＤ１５、ＣＤ２４、Ｍｕｓａｓｈｉ、ＥＧＦＲ、Ｄｏｕｂｌｅｃｏｒｔｉｎ（ＤＣＸ）、Ｐａｘ６、ＦＡＢＰ７、ＬｅＸ、ＶｉｍｅｎｔｉｎおよびＧＬＡＳＴからなる群から選択される第２のマーカーの発現を検出することをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項７】
前記方法がｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記神経組織が神経幹細胞および／または神経前駆細胞を含む、請求項２〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記神経組織が脳組織から得られるまたは脳組織に由来する、請求項２〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記神経組織が成体脳組織である、請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記神経組織が胎仔脳組織である、請求項２〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記神経組織が脳室下帯（ＳＶＺ）もしくは顆粒細胞下帯（ＳＧＺ）もしくは髄膜に由来する、請求項２〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記神経組織がヒト、イヌ、ウマ、ウシ、ネコ、マウス、ヒツジまたはブタの神経組織からなる群から選択される、請求項２〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
細胞によるインテグリンα１０サブユニット発現の前記検出がフローサイトメトリーによって決定される、請求項２〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
細胞によるインテグリンα１０サブユニット発現の前記検出がインテグリンα１０タンパク質発現を測定することによって決定される、請求項２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
細胞によるインテグリンα１０サブユニット発現の前記検出がインテグリンα１０ｍＲＮＡ発現を測定することによって決定される、請求項２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
細胞によるインテグリンα１０サブユニット発現の前記検出が免疫測定法、免疫沈降法、フローサイトメトリー、免疫蛍光法、およびウエスタンブロット法からなる群から選択される方法によって決定される、請求項２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
細胞によるインテグリンα１０サブユニット発現の検出のために用いられる前記抗体がモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体またはそれらのフラグメントである、請求項２〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体が非ヒト抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項２〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体がフルオロフォア、酵素または放射性トレーサーもしくは放射性同位体からなる群から選択される検出可能部分である、検出可能部分に共有結合される、請求項２〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体がＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧおよびＩｇＭからなる群から選択されるアイソタイプを有する、請求項２〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体が
ａ）受入番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２５８３のもとでＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって生成される、モノクローナル抗体、または
ｂ）受入番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２５８３のもとでＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨに寄託されたハイブリドーマによって生成されるモノクローナル抗体により結合されるエピトープと同じエピトープへの結合について競合する抗体、または
ｃ）ａ）もしくはｂ）のフラグメントであって、前記フラグメントがインテグリンα１０サブユニット鎖の細胞外Ｉ−ドメインに特異的に結合できる、フラグメント
である、請求項２〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体が固体支持体に結合される、請求項２〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗体が１または複数のフルオロフォアで標識される、請求項２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記フルオロフォアがフィコエリトリン、アロフィコシアニン、フルオレセイン、Ｔｅｘａｓレッド、またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、またはブリリアント染料である、請求項２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体が検出に適した部分をさらに含む、請求項２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記検出に適した部分がナノ粒子、および放射性同位体から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ナノ粒子がミセル、非弾性シェル、ナノチューブ粒子、リポソーム、金ナノ粒子およびポリマーからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記放射性同位体がβ放射体、オージェ放射体、転換電子放射体、α放射体、および低光子エネルギー放射体からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記検出可能部分が常磁性同位体を含むまたは常磁性同位体からなる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記常磁性同位体が１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｃｒおよび５６Ｆｅからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記検出可能部分がＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、ＭＲＩ、光画像診断または超音波画像診断である画像化技術によって検出できる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
試験化合物がｉｎ  ｖｉｔｒｏで哺乳類神経幹細胞および／または哺乳類神経前駆細胞の分化を調節するかどうかを決定するための方法であって、
ａ）インテグリンα１０サブユニットを発現する、または発現する能力を有する神経幹細胞および／または神経前駆細胞を用意するステップと、
ｂ）前記神経幹細胞および／または前記神経前駆細胞を試験化合物と接触させるステップと、
ｃ）前記試験化合物が神経幹細胞および／または神経前駆細胞の分化を調節する指標として前記神経幹細胞および／または神経前駆細胞の分化の速度またはパターンにおける変化を検出するステップと
を含み、前記分化の速度またはパターンが請求項２〜３３のいずれか１項に記載の方法に従って細胞によるインテグリンα１０発現を検出することによって決定される、方法。
【請求項３５】
基準集団と比較して神経幹細胞および／または神経前駆細胞に関して濃縮されている哺乳類細胞の単離集団をｉｎ  ｖｉｔｒｏで製造するための方法であって、
ａ）神経幹細胞および／または神経前駆細胞を含む、細胞集団の少なくとも一部を用意するステップと、
ｂ）前記神経幹細胞および／または神経前駆細胞によって発現されるインテグリンα１０サブユニットを同定する化合物を上記ａ）の細胞集団に導入するステップと、
ｃ）上記ｂ）の細胞集団から前記神経幹細胞および／または神経前駆細胞を選択し単離する、もしくは単離し選択する、もしくは単離する、もしくは選択するステップと
を含み、それによって神経幹細胞および／または神経前駆細胞に関して濃縮された細胞集団を生成する、方法。
【請求項３６】
前記神経幹細胞および／または前記神経前駆細胞が請求項２〜３３のいずれか１項に記載の方法によって同定されるおよび／または単離される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ステップｃ）における選択が蛍光細胞選別または磁気ビーズ選別によって行われる、請求項３５および３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
未分化哺乳類細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物であって、前記細胞が神経組織に由来し、インテグリンα１０サブユニットを発現する少なくとも９０％の哺乳類神経幹細胞を含み、前記インテグリンα１０サブユニットは未分化哺乳類細胞の細胞表面で発現され、かつ
ａ）培養中の細胞が（ｂ）に記載の血清および増殖誘導成長因子の両方を実質的に含まない培地中で分化される場合にニューロンおよび／またはオリゴデンドサイトおよび／またはアストロサイトに分化する能力を有し、少なくとも１０％ニューロンおよび／またはオリゴデンドロサイトおよび／またはアストロサイトの細胞培養物を生成し、
ｂ）前記細胞培養物がＢ２７である血清代替物と少なくとも１つの増殖誘導成長因子とを含有する培地中で分裂し、
ｃ）培養中の細胞が前記血清代替物および増殖誘導成長因子の両方を取り除くとニューロンおよび／またはオリゴデンドロサイトおよび／またはアストロサイトに分化する、
細胞培養物。
【請求項３９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物であって、
ａ）Ｂ２７である血清代替物と少なくとも１つの増殖誘導成長因子とを含む培地と、
ｂ）哺乳類の中枢神経系に由来する未分化哺乳類細胞を含み、
前記未分化哺乳類細胞は神経幹細胞または神経前駆細胞であり、前記細胞の少なくとも９０％がインテグリンα１０サブユニットを発現し、前記インテグリンα１０サブユニットは前記未分化哺乳類細胞の細胞表面で発現される、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物。
【請求項４０】
哺乳類未分化細胞の浮遊培養物であって、少なくとも９０％の前記細胞がインテグリンα１０サブユニットを発現し、前記細胞が神経組織に由来し、前記未分化哺乳類細胞が神経幹細胞または神経前駆細胞であり、前記インテグリンα１０サブユニットが前記未分化哺乳類細胞の細胞表面で発現され、前記細胞が細胞凝集体に形成され、かつ前記細胞凝集体が増殖誘導成長因子を含有する培地中で維持される、浮遊培養物。
【請求項４１】
前記インテグリンα１０がインテグリンβ１鎖との組み合わせでヘテロ二量体として発現される、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の細胞培養物または浮遊培養物。
【請求項４２】
前記培養中の細胞の一部がｎｅｓｔｉｎ、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ、ＧＦＡＰ、ＳＯＸ２、ＰＤＧＦＲα、ＣＤ１３３、ＣＤ１５、ＣＤ２４、Ｍｕｓａｓｈｉ、ＥＧＦＲ、Ｄｏｕｂｌｅｃｏｒｔｉｎ（ＤＣＸ）、Ｐａｘ６、ＦＡＢＰ７およびＧＬＡＳＴからなる群から選択される少なくとも１つのマーカーをさらに発現する、請求項３８〜４１のいずれか１項に記載の細胞培養物または浮遊培養物。
【請求項４３】
前記少なくとも１つの増殖誘導成長因子が上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子−２（ＦＧＦ−２）、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦ−α）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ＰＤＧＦαまたはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３８〜４２のいずれか１項に記載の細胞培養物または浮遊培養物。
【請求項４４】
前記培養中の細胞が哺乳類脳の脳室下帯（ＳＶＺ）もしくは顆粒細胞下帯（ＳＧＺ）もしくは髄膜から得られるまたは由来する、請求項３８〜４３のいずれか１項に記載の細胞培養物または浮遊培養物。
【請求項４５】
前記培養中の細胞がネズミ科に由来する、請求項３８〜４４のいずれか１項に記載の細胞培養物または浮遊培養物。
【請求項４６】
前記培養中の細胞がヒトに由来する、請求項３８〜４５のいずれか１項に記載の細胞培養物または浮遊培養物。
【請求項４７】
前記培養中の細胞がヒト胎児もしくはヒト成体の神経幹細胞および／または神経前駆細胞に由来する、請求項３８〜４６のいずれか１項に記載の細胞培養物または浮遊培養物。
【請求項４８】
前記培養中の細胞がヒト胚細胞またはヒト胚に由来しない、請求項３８〜４７のいずれか１項に記載の細胞培養物または浮遊培養物。
【請求項４９】
それを必要とする患者においてＣＮＳの損傷部位または患部の特性を決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、前記方法は、
ａ）前記患者のＣＮＳの損傷部位または患部の試料に抗インテグリンα１０サブユニット抗体を投与するステップと、
ｂ）前記対象のＣＮＳの損傷部位または患部の試料におけるインテグリンα１０サブユニットの発現を検出するステップと、
ｃ）ＣＮＳの前記損傷部位または患部の位置および大きさである特性を決定するステップと
を含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項５０】
前記神経組織が神経幹細胞および／または神経前駆細胞を含む、請求項４９に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項５１】
前記特性が脳卒中後のＣＮＳ組織の再生の程度を予測するために用いられる、請求項４９に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項５２】
インテグリンα１０サブユニット発現の高い値が修正ランキンスケール（ｍＲＳ）の低い値に対応する、請求項４９〜５１のいずれか１項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項５３】
前記インテグリンα１０サブユニットがバイオマーカーパネルで用いられる、請求項４９〜５２のいずれか１項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項５４】
神経系の疾患もしくは損傷を診断するおよび／または特徴づけるための方法において使用するための、哺乳類神経幹細胞および／または哺乳類神経前駆細胞のためのインテグリンα１０鎖サブユニットマーカーであって、前記マーカーは、前記神経幹細胞および／または神経前駆細胞により細胞表面で発現されるインテグリンα１０鎖サブユニットである、マーカー。
【請求項５５】
神経系の疾患もしくは損傷を治療する方法において使用するための、哺乳類神経幹細胞および／または哺乳類神経前駆細胞の単離された集団を含む組成物であって、前記単離された集団はインテグリンα１０サブユニットを発現する哺乳類神経幹細胞および／または哺乳類神経前駆細胞に関して濃縮されており、かつ前記インテグリンα１０サブユニットは前記哺乳類神経幹細胞および／または神経前駆細胞の細胞表面で発現される、組成物。
【請求項５６】
前記インテグリンα１０がインテグリンβ１鎖との組み合わせでヘテロ二量体として発現される、請求項１〜５５のいずれか１項に記載の方法、マーカーまたは組成物。
【請求項５７】
前記神経系の疾患もしくは損傷が中枢神経系または末梢神経系の傷害もしくは神経変性疾患である、請求項１〜５６のいずれか１項に記載の方法、マーカーまたは組成物。
【請求項５８】
前記神経系の傷害が脊髄傷害（ＳＣＩ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、末梢神経損傷、脳卒中および脳癌からなる群から選択される、請求項１〜５７のいずれか１項に記載の方法、マーカーまたは組成物。
【請求項５９】
前記神経系の傷害が脳卒中である、請求項１〜５８のいずれか１項に記載の方法、マーカーまたは組成物。
【請求項６０】
前記神経変性疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）および多系統萎縮症からなる群から選択される、請求項１〜５８のいずれか１項に記載の方法、マーカーまたは組成物。
【請求項６１】
前記神経幹細胞が請求項３〜３３および３５〜３７のいずれか１項に定義される方法を用いて単離される、または前記神経幹細胞が請求項３８〜４８のいずれか１項に定義される、請求項１〜５８のいずれか１項に記載の方法、マーカーまたは組成物。
【請求項６２】
前記神経幹細胞が同種神経幹細胞である、請求項１〜６１のいずれか１項に記載の方法、マーカー、または組成物。
【請求項６３】
前記神経幹細胞が自家神経幹細胞である、請求項１〜６２のいずれか１項に記載の方法、マーカー、または組成物。
【請求項６４】
前記神経前駆細胞が同種神経前駆細胞である、請求項１〜６３のいずれか１項に記載の方法、マーカー、または組成物。
【請求項６５】
前記神経前駆細胞が自家神経前駆細胞である、請求項１〜６４のいずれか１項に記載の方法、マーカー、または組成物。
【請求項６６】
前記間葉系幹細胞が同種間葉系幹細胞である、請求項１〜６５のいずれか１項に記載の方法、マーカー、または組成物。
【請求項６７】
前記間葉系幹細胞が自家間葉系幹細胞である、請求項１〜６６のいずれか１項に記載の方法、マーカー、または組成物。