(57)【要約】  被検対象の個体由来の被検試料における配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定するステップを含み、ここで、被検試料における発現レベルが、正常個体由来の対照試料における発現レベルと異なる場合、該被検試料が、骨疾患又は関節疾患に罹患している疑いがある個体由来の試料であることの指標となる、骨疾患又は関節疾患を簡便かつ迅速に検出又は選別する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検対象の個体由来の被検試料における配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定するステップを含み、ここで、被検試料における発現レベルが、正常個体由来の対照試料における発現レベルと異なる場合、該被検試料が、骨疾患又は関節疾患に罹患している疑いがある個体由来の試料であることの指標となる、骨疾患若しくは関節疾患に罹患している疑いがある個体由来の試料の検出又は選別方法。
【請求項２】
骨疾患又は関節疾患が、軟骨形成異常、骨形成異常、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症又はスポーツによる関節障害である請求項１記載の方法。
【請求項３】
被検対象の個体由来の被検試料における配列番号：１８、２１〜２３、２５、２９からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定するステップを含み、ここで、被検試料における発現レベルが、正常個体由来の対照試料における発現レベルよりも高くなり、かつ、慢性関節リウマチ患者由来の対照試料における発現レベルよりも低くなる場合、該被検試料が、変形性関節症に罹患している疑いがある個体由来の試料であることの指標となる、変形性関節症に罹患している疑いがある個体由来の試料の検出又は選別方法。
【請求項４】
被検対象の個体由来の被検試料における配列番号：１９、２０、２４、２６〜２８、３０〜３３からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定するステップを含み、ここで、被検試料における発現レベルが、正常個体由来の対照試料における発現レベルよりも高くなり、かつ、慢性関節リウマチ患者個体由来の対照試料における発現レベルよりも高くなる場合、該被検試料が、変形性関節症に罹患している疑いがある個体由来の試料であることの指標となる、変形性関節症に罹患している疑いがある個体由来の試料の検出又は選別方法。
【請求項５】
被検対象の個体由来の被検試料における配列番号：３４のアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定するステップを含み、ここで、被検試料における発現レベルが、正常個体由来の対照試料における発現レベルよりも低くなり、かつ、慢性関節リウマチ患者個体由来の対照試料における発現レベルよりも高くなる場合、該被検試料が、変形性関節症に罹患している疑いがある個体由来の試料であることの指標となる、変形性関節症に罹患している疑いがある個体由来の試料の検出又は選別方法。
【請求項６】
被検対象の個体由来の被検試料における配列番号：１８、２１〜２３、２５、２９からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定するステップを含み、ここで、被検試料における発現レベルが、正常個体由来の対照試料における発現レベルよりも高くなり、かつ、変形性関節症患者由来の対照試料における発現レベルよりも高くなる場合、該被検試料が、慢性関節リウマチに罹患している疑いがある個体由来の試料であることの指標となる、慢性関節リウマチに罹患している疑いがある個体由来の試料の検出又は選別方法。
【請求項７】
被検対象の個体由来の被検試料における配列番号：３４のアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定するステップを含み、ここで、被検試料における発現レベルが、正常個体由来の対照試料における発現レベルよりも低くなり、かつ、変形性関節症患者個体由来の対照試料における発現レベルよりも低くなる場合、該被検試料が、慢性関節リウマチに罹患している疑いがある個体由来の試料であることの指標となる、慢性関節リウマチに罹患している疑いがある個体由来の試料の検出又は選別方法。
【請求項８】
発現レベルが、配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子のｍＲＮＡ量を指標として測定される、請求項１〜７いずれかに記載の方法。
【請求項９】
発現レベルが、配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する少なくとも１つのタンパク質又はその部分ペプチド又はその塩を指標として測定される、請求項１〜７いずれかに記載の方法。
【請求項１０】
配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を検出しうる核酸を用いる請求項８記載の方法。
【請求項１１】
該遺伝子が、配列番号：１〜１７からなる群より選ばれる塩基配列からなる核酸である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
該遺伝子が、配列番号：６及び／又は１３の塩基配列からなる核酸である請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
配列番号：３５及び／又は３６の塩基配列からなる核酸を用いるものである請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する少なくとも１つのタンパク質又はその部分ペプチド又はその塩に対する抗体又はその断片を用いる請求項９記載の方法。
【請求項１５】
配列番号：２３及び／又は３０のアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する少なくとも１つのタンパク質又はその部分ペプチド又はその塩に対する抗体又はその断片を用いる請求項９記載の方法。
【請求項１６】
配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を検出しうる核酸を含有してなる、請求項１０〜１５いずれかに記載の方法に使用するための診断薬。
【請求項１７】
該遺伝子が、配列番号：１〜１７からなる群より選ばれる塩基配列からなる核酸である請求項１６記載の診断薬。
【請求項１８】
該遺伝子が、配列番号：６及び／又は１３の塩基配列からなる核酸である請求項１６記載の診断薬。
【請求項１９】
配列番号：３５及び／又は３６の塩基配列からなる核酸を含有してなる、請求項１８記載の診断薬。
【請求項２０】
配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する少なくとも１つのタンパク質又はその部分ペプチド又はその塩に対する抗体又はその断片を含有してなる、請求項１４又は１５記載の方法に使用するための診断薬。
【請求項２１】
配列番号：２３及び／又は３０のアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する少なくとも１つのタンパク質又はその部分ペプチド又はその塩に対する抗体又はその断片を含有してなる、請求項１４又は１５記載の方法に使用するための診断薬。
【請求項２２】
配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を用いることを特徴とする骨疾患又は関節疾患の予防剤及び／又は治療剤のスクリーニング方法。
【請求項２３】
配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する少なくとも１つのタンパク質若しくはその部分ペプチド又はその塩を用いることを特徴とする骨疾患又は関節疾患の予防剤及び／又は治療剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨疾患又は関節疾患の診断、治療、予防等のための手段に関する。より詳しくは、本発明は、骨疾患若しくは関節疾患に罹患している疑いがある個体由来の試料の検出又は選別方法、又は診断薬、骨疾患若しくは関節疾患の治療剤又は予防剤のスクリーニング方法、該スクリーニング方法に用いるキット、医薬組成物、骨疾患又は関節疾患の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節とは、骨相互間の可動結合部であり、この部分の骨は動きをスムーズにするために関節軟骨で覆われている。また、関節の中では滑膜から関節液が分泌されており、関節の運動を滑らかにしている。【０００３】
変形性関節症（ＯＡ）は、慢性の関節炎及び滑膜性関節の関節軟骨の退行変性を伴う消耗性疾患である。ＯＡは、加齢と共にその発症率が増加することが知られており、高齢者にとって最も頻度の高い疾患の一つである。高齢化社会に直面している現代において、大きな課題の一つとなっているが、その原因は明らかでなく、有効な治療法がない。長い間、ＯＡは不可避な加齢に起因するものとして考えられてきたが、遺伝学的研究によりＯＡの発症には遺伝的要因が大きく関わることが明らかになってきた（非特許文献１参照）。ＯＡは多因子遺伝病であり、複数の遺伝的要因がその発症、伸展に関与しており、これらの遺伝子と、運動、栄養等の環境因子の相互作用により病気が成り立っていると考えられる。現在までの研究により、ＯＡに関連する遺伝子として、多数の候補遺伝子（特許文献１及び２参照）やSNPｓ（一塩基多型）が挙げられている（非特許文献２参照）。しかし、ＯＡの発症機構は完全には解明されておらず、未知の遺伝子の関与しうる可能性が考えられている。【０００４】
慢性関節リウマチ（ＲＡ）は、中小関節を対称性におかす多発性関節炎を主症状とする原因不明の慢性炎症性疾患である。炎症性サイトカインとリウマトイド因子の局所的産生、関節液中でのＩｇＧとリウマトイド因子よりなる免疫複合体の形成、好中球遊走、免疫複合体貪食、リソソーム酵素放出、関節軟骨破壊、滑膜増殖、破骨細胞活性化など一連の反応により炎症の慢性化と関節破壊が進行する。現在までの研究により、ＲＡに関連する遺伝子として、多数の候補遺伝子（特許文献３及び４参照）やSNPｓが挙げられている（非特許文献３参照）。しかし、ＲＡの発症機構は完全には解明されておらず、未知の遺伝子の関与しうる可能性が考えられている。【０００５】
また、多関節炎（症）を呈する原因疾患は多数あり、その中では関節リウマチ（ＲＡ）とＯＡの頻度が高い。ＯＡとＲＡは共に関節が痛くなるという点で共通しており、識別の必要がある。現在、ＯＡ又はＲＡの診断の際には、炎症の程度を知るための検査やX線検査等が行われる。ただし、早期では診断困難な場合があり、臨床検査と経過観察が必要となる（非特許文献４参照）。そのため、ＯＡとＲＡを容易に区別が出来る診断方法、かつ、より早期に疾患が発見できるよう簡便な診断法の開発が求められている。【０００６】
上記の様な状況の下、ＯＡ又はＲＡの発症に関わる遺伝子の同定及び同遺伝子を用いた疾患の診断方法が待望されていた。【０００７】
Ｎ１０３２（配列番号：１）は、ヒトの乳癌の癌抑制遺伝子候補１（ｂｃｓｃ−１）（配列番号：１８）である。しかしながら、Ｎ１０３２とＯＡとの関連についての報告はない。【０００８】
Ｎ１１０８（配列番号：２）は、タンパク質フォスファターゼ2A B'α1調節サブユニット（配列番号：１９）をコードするヒト遺伝子である（非特許文献５参照）。しかしながら、Ｎ１１０８とＯＡとの関連についての報告はない。【０００９】
Ｎ１１１２（配列番号：３）は、げっ歯動物の遺伝子Kid１と相同性を持ち、主として腎臓で発現する、新規ヒト亜鉛フィンガー型の転写因子（配列番号：２０）をコードするヒト遺伝子である（非特許文献６参照）。しかしながら、Ｎ１１１２とＯＡとの関連についての報告はない。【００１０】
Ｎ１１２３（配列番号：４）は、X染色体にコードされたホスホグリセリン酸キナーゼ（配列番号：２１）をコードするヒト遺伝子である（非特許文献７参照）。しかしながら、Ｎ１１２３とＯＡとの関連についての報告はない。【００１１】
Ｎ０１５４（配列番号：５）は、Ｌ‐イジトール‐２デヒドロゲナーゼ（配列番号：２２）をコードするヒト遺伝子である（非特許文献８参照）。しかしながら、Ｎ０１５４とＯＡとの関連についての報告はない。【００１２】
Ｎ０２８１（配列番号：６）は、ヒトの遺伝性多発性外骨症の原因遺伝子EXT1（配列番号：２３）である（非特許文献９参照）。しかしながら、Ｎ０２８１とＯＡとの関連についての報告はない。【００１３】
Ｎ０４３９（配列番号：７）は、ヘパラン‐サルフェート‐６‐スルホトランスフェラーゼ（配列番号：２４）をコードするヒト遺伝子である（非特許文献１０参照）。しかしながら、Ｎ０４３９とＯＡとの関連についての報告はない。【００１４】
Ｎ０４４６（配列番号：８）は、ヒスチジル‐tRNA合成酵素（配列番号：２５）と相同性のあるヒト遺伝子である（非特許文献１１参照）。しかしながら、Ｎ０４４６とＯＡとの関連についての報告はない。【００１５】
Ｎ０５１３（配列番号：９）は、チューブリン‐フォールディング  コファクター C（配列番号：２６）をコードするヒト遺伝子である（非特許文献１２参照）。しかしながら、Ｎ０５１３とＯＡとの関連についての報告はない。【００１６】
Ｎ０５５３（配列番号：１０）は、N’端に２つのLIMモチーフを持つセリン／スレオニン  キナーゼ（配列番号：２７）をコードするヒト遺伝子である（非特許文献１３参照）。しかしながら、Ｎ０５５３とＯＡとの関連についての報告はない。【００１７】
Ｎ００６５（配列番号：１１）は、膜タンパク質であるLAK-4（配列番号：２８）をコードするヒト遺伝子である。しかしながら、Ｎ００６５とＯＡとの関連についての報告はない。【００１８】
Ｎ０１６０（配列番号：１２）は、血管作用性小腸ペプチドレセプター（配列番号：２９）をコードするヒト遺伝子である（非特許文献１４参照）。しかしながら、Ｎ０１６０とＯＡとの関連についての報告はない。【００１９】
Ｅ０２１５（配列番号：１３）は、ＥＧＦ含有フィブリン様細胞外マトリックスタンパク質１（ＥＦＥＭＰ１、Ｆｉｂｕｌｉｎ−３）（配列番号：３０）をコードするヒト遺伝子である（非特許文献１５参照）。しかしながら、Ｅ０２１５とＯＡとの関連についての報告はない。【００２０】
Ｅ０７３９（配列番号：１４）は、３つのK‐相同ドメインを持つ細胞のpoly(rC)‐結合タンパク質（配列番号：３１）をコードするヒト遺伝子である（非特許文献１６参照）。しかしながら、Ｅ０７３９とＯＡとの関連についての報告はない。【００２１】
Ｃ００５２（配列番号：１５）は、AP‐エンドヌクレアーゼ（配列番号：３２）をコードするヒト遺伝子である（非特許文献１７参照）。しかしながら、Ｃ００５２とＯＡとの関連についての報告はない。【００２２】
Ｄ００３２（配列番号：１６）は、マクロファージ炎症性タンパク質‐２α（配列番号：３３）をコードするヒト遺伝子である（非特許文献１８参照）。しかしながら、Ｄ００３２とＯＡとの関連についての報告はない。【００２３】
Ｅ００８３（配列番号：１７）は、グルタチオンS‐トランスフェラーゼ（配列番号：３４）をコードするヒト遺伝子である（非特許文献１９参照）。しかしながら、Ｅ００８３とＯＡとの関連についての報告はない。
【特許文献１】特開２００３−１８３１７７号公報
【特許文献２】特開２００４−７５６７５号公報
【特許文献３】特開２００２−５１７８２号公報
【特許文献４】特開２００３−２０４７９０号公報
【非特許文献１】スペクター（Spector, T. D.）ら、ブリティッシュ  メディカル  ジャーナル（BMJ）、３１２巻、９４０−９４３頁（１９９６）
【非特許文献２】池川（Ikegawa, S.）ら、ジャーナル  オブ  ボーン  アンド  ミネラル  リサーチ（JBMR）、１７巻、１２９０−１２９６頁（２００２）
【非特許文献３】山本（Yamamoto, K.）ら、ネイチャー  ジェネティックス（Nat. Genet.）、３５巻、３４１−３４８頁（２００３）
【非特許文献４】吉田  浩著「RA又は他の炎症性多発性関節症（DRG/PPS対応臨床検査のガイドライン）」日本臨床検査医学会、平成１４年９月、ｐ.８５−８８
【非特許文献５】カミバヤシ（Kamibayashi, C.）ら、ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（J. Biol. Chem.）、２７１巻、５１６４−５１７０頁（１９９６）
【非特許文献６】ナカムラ（Nakamura, Y.）ら、サイトジェネティックス  アンド  セル  ジェネティックス（Cytogenet. Cell Genet）、７８巻、２８５−２８８頁（１９９７）
【非特許文献７】オーキン（Orkin, S.H.）ら、プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）、８０巻、４７２−４７６頁（１９８３）
【非特許文献８】カーパー（Carper, D.）ら、ゲノミックス（Genomics）、２６巻、５５−６２頁（１９９５）
【非特許文献９】ウェルズ（Wells, D.E.）ら、ネイチャー  ジェネティックス（Nat. Genet.）、１１巻、１３７−１４３頁（１９９５）
【非特許文献１０】キマタ（Kimata, K.）ら、ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（J. Biol. Chem.）、２７３巻、９２０８−９２１３頁（１９９８）
【非特許文献１１】ミラー（Miller, F.W.）ら、バイオケミカル  アンド  バイオフィジカル  リサーチ  コミュニケーションズ（Biochem. Biophys. Res. Commun.）、２１０巻、５５６−５６６頁（１９９５）
【非特許文献１２】コーワン（Cowan, N.J.）ら、セル（Cell）、８６巻、２８７−２９６頁（１９９６）
【非特許文献１３】ミズノ（Mizuno, K.）ら、ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（J. Biol. Chem.）、２７０巻、３１３２１−３１３３０頁（１９９５）
【非特許文献１４】ゴッツェル（Goetzl, E.J.）ら、バイオケミカル  アンド  バイオフィジカル  リサーチ  コミュニケーションズ（Biochem. Biophys. Res. Commun.）、１９３巻、５４６−５５３頁（１９９３）
【非特許文献１５】ゴールドステイン（Goldstein, S.）ら、モレキュラー  アンド  セルラー  バイオロジー（Mol. Cell. Biol.）、１５巻、１２０−１２８頁（１９９５）
【非特許文献１６】セリス（Celis, J.E.）ら、ヨーロピアン  ジャーナル  オブ  バイオケミストリー（Eur. J. Biochem.）、２３０巻、４４７−４５３頁（１９９５）
【非特許文献１７】ヒクソン（Hickson, I.D.）ら、ヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Nucleic Acids Res.）、１９巻、５５１９−５５２３頁（１９９１）
【非特許文献１８】セラミ（Cerami, A.）ら、ザ  ジャーナル  オブ  エクスペリメンタル  メディスン（J. Exp. Med.）、１７２巻、９１１−９１９頁（１９９０）
【非特許文献１９】テイラー（Taylor, J.B.）ら、バイオケミカル  ジャーナル（Biochem. J.）、３００巻、２７１−２７６頁（１９９４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
本発明は、配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質の遺伝子の発現レベルを測定することによる、骨疾患若しくは関節疾患に罹患している疑いがある個体由来の試料の簡便かつ迅速な検出又は選別方法、骨疾患又は関節疾患の簡便かつ迅速な診断方法、該方法を効率的に行ないうる診断薬を提供することを目的とする。また、代表的な関節疾患であり、似た症状を示すＲＡとＯＡの識別が可能な診断薬を提供することを目的とする。【００２５】
また、本発明は、配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質の遺伝子の動態を検出又は測定することによる、骨疾患若しくは関節疾患の治療剤又は予防剤の効率的なスクリーニング方法、前記スクリーニング方法を簡便かつ迅速に行ないうるスクリーニング用キットを提供することを目的とする。【００２６】
さらに、本発明は、前記スクリーニング方法により得られる、骨疾患若しくは関節疾患の治療剤又は予防剤として好適に使用される化合物又はその塩、骨疾患若しくは関節疾患の治療又は予防に好適な前記化合物又はその塩を有効成分とする医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本発明者らは、ＯＡ患者又はＲＡ患者の同意の下に、手術時に摘出された滑膜を採取し、解析を行った。鋭意研究の結果、非ＯＡ患者と比較しＯＡ患者の滑膜組織において発現に変化が見られる遺伝子を見出した。また、非ＲＡ患者と比較しＲＡ患者の滑膜組織において発現に変化が見られる遺伝子を見出した。ＯＡ膝組織においてはメカニカル・ストレスによって破壊された軟骨組織のデブリスによる刺激を受けた増生滑膜から様々な炎症性物質が分泌されると考えられている。従って、そのような刺激を受けた滑膜においては、炎症性物質や関節組織破壊のマーカーとなりうる物質をコードする遺伝子の発現が増強されると考えられた。また、滑膜組織には、脂肪細胞様細胞、骨芽細胞、軟骨細胞等の間葉系細胞へ分化する能カを有する未分化な線維芽滑膜細胞が存在する。そこで、更に研究を進めた結果、該遺伝子が、滑膜組織の異常が一因となる骨疾患又は関節疾患の新規な診断薬として使用可能であることを見出し、本発明を完成させた。【００２８】
すなわち、本発明は、
（１）被検対象の個体由来の被検試料における配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定するステップを含み、ここで、被検試料における発現レベルが、正常個体由来の対照試料における発現レベルと異なる場合、該被検試料が、骨疾患又は関節疾患に罹患している疑いがある個体由来の試料であることの指標となる、骨疾患若しくは関節疾患に罹患している疑いがある個体由来の試料の検出又は選別方法、
（２）骨疾患又は関節疾患が、軟骨形成異常、骨形成異常、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症又はスポーツによる関節障害である（１）記載の方法、
（３）被検対象の個体由来の被検試料における配列番号：１８、２１〜２３、２５、２９からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定するステップを含み、ここで、被検試料における発現レベルが、正常個体由来の対照試料における発現レベルよりも高くなり、かつ、慢性関節リウマチ患者由来の対照試料における発現レベルよりも低くなる場合、該被検試料が、変形性関節症に罹患している疑いがある個体由来の試料であることの指標となる、変形性関節症に罹患している疑いがある個体由来の試料の検出又は選別方法、
（４）被検対象の個体由来の被検試料における配列番号：１９、２０、２４、２６〜２８、３０〜３３からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定するステップを含み、ここで、被検試料における発現レベルが、正常個体由来の対照試料における発現レベルよりも高くなり、かつ、慢性関節リウマチ患者個体由来の対照試料における発現レベルよりも高くなる場合、該被検試料が、変形性関節症に罹患している疑いがある個体由来の試料であることの指標となる、変形性関節症に罹患している疑いがある個体由来の試料の検出又は選別方法、
（５）被検対象の個体由来の被検試料における配列番号：３４のアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定するステップを含み、ここで、被検試料における発現レベルが、正常個体由来の対照試料における発現レベルよりも低くなり、かつ、慢性関節リウマチ患者個体由来の対照試料における発現レベルよりも高くなる場合、該被検試料が、変形性関節症に罹患している疑いがある個体由来の試料であることの指標となる、変形性関節症に罹患している疑いがある個体由来の試料の検出又は選別方法、
（６）被検対象の個体由来の被検試料における配列番号：１８、２１〜２３、２５、２９からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定するステップを含み、ここで、被検試料における発現レベルが、正常個体由来の対照試料における発現レベルよりも高くなり、かつ、変形性関節症患者由来の対照試料における発現レベルよりも高くなる場合、該被検試料が、慢性関節リウマチに罹患している疑いがある個体由来の試料であることの指標となる、慢性関節リウマチに罹患している疑いがある個体由来の試料の検出又は選別方法、
（７）被検対象の個体由来の被検試料における配列番号：３４のアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定するステップを含み、ここで、被検試料における発現レベルが、正常個体由来の対照試料における発現レベルよりも低くなり、かつ、変形性関節症患者個体由来の対照試料における発現レベルよりも低くなる場合、該被検試料が、慢性関節リウマチに罹患している疑いがある個体由来の試料であることの指標となる、慢性関節リウマチに罹患している疑いがある個体由来の試料の検出又は選別方法、
（８）発現レベルが、配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子のｍＲＮＡ量を指標として測定される、（１）〜（７）いずれかに記載の方法、
（９）発現レベルが、配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する少なくとも１つのタンパク質又はその部分ペプチド又はその塩を指標として測定される、（１）〜（７）いずれかに記載の方法、
（１０）配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を検出しうる核酸を用いる（８）記載の方法、
（１１）該遺伝子が、配列番号：１〜１７からなる群より選ばれる塩基配列からなる核酸である（１０）記載の方法、
（１２）該遺伝子が、配列番号：６及び／又は１３の塩基配列からなる核酸である（１０）記載の方法、
（１３）配列番号：３５及び／又は３６の塩基配列からなる核酸を用いるものである（１２）記載の方法、
（１４）配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する少なくとも１つのタンパク質又はその部分ペプチド又はその塩に対する抗体又はその断片を用いる（９）記載の方法、
（１５）配列番号：２３及び／又は３０のアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する少なくとも１つのタンパク質又はその部分ペプチド又はその塩に対する抗体又はその断片を用いる（９）記載の方法、
（１６）配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を検出しうる核酸を含有してなる、（１０）〜（１５）いずれかに記載の方法に使用するための診断薬、
（１７）該遺伝子が、配列番号：１〜１７からなる群より選ばれる塩基配列からなる核酸である（１６）記載の診断薬、
（１８）該遺伝子が、配列番号：６及び／又は１３の塩基配列からなる核酸である（１６）記載の診断薬、
（１９）配列番号：３５及び／又は３６の塩基配列からなる核酸を含有してなる、（１８）記載の診断薬、
（２０）配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する少なくとも１つのタンパク質又はその部分ペプチド又はその塩に対する抗体又はその断片を含有してなる、（１４）又は（１５）記載の方法に使用するための診断薬、
（２１）配列番号：２３及び／又は３０のアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する少なくとも１つのタンパク質又はその部分ペプチド又はその塩に対する抗体又はその断片を含有してなる、（１４）又は（１５）記載の方法に使用するための診断薬、
（２２）配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を用いることを特徴とする骨疾患又は関節疾患の予防剤及び／又は治療剤のスクリーニング方法、
（２３）配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する少なくとも１つのタンパク質若しくはその部分ペプチド又はその塩を用いることを特徴とする骨疾患又は関節疾患の予防剤及び／又は治療剤のスクリーニング方法、に関する。【００２９】
また、本発明は、
（２４）被検物質の存在下、配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子の動態を検出又は測定することを特徴とする、骨疾患又は関節疾患治療剤の予防剤及び／又は治療剤のスクリーニング方法、
（２５）（Ｉ）被検物質の存在下、配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質又はその部分ペプチド又はその塩と、被検物質とを接触させるステップ、並びに
（ＩＩ）前記ステップ（Ｉ）の後、該タンパク質又はその部分ペプチドと被検物質との結合を検出し、それにより、該タンパク質又はその部分ペプチドと結合する被検物質を、骨疾患又は関節疾患の予防剤及び／又は治療剤の候補化合物として選択するステップ
を含む、（２４）記載の方法、
（２６）（Ａ）被検物質の存在下、配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸を細胞に導入するステップ、
（Ｂ）被検物質の存在下、前記ステップ（Ａ）で得られた細胞において前記核酸を発現させるステップ、並びに
（Ｃ）被検物質の非存在下の場合と比較して、前記核酸の発現の有無を検出し、又は前記核酸の発現の変動を測定し、それにより、該核酸の発現の変化をもたらす被検物質を骨疾患又は関節疾患の予防剤及び／又は治療剤の候補化合物として選択するステップ
を含む、（２４）記載の方法、
（２７）（Ａ）被検物質の存在下、配列番号：１８〜３３からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸を細胞に導入するステップ、
（Ｂ）被検物質の存在下、前記ステップ（Ａ）で得られた細胞において前記核酸を発現させるステップ、並びに
（Ｃ）被検物質の非存在下の場合と比較して、前記核酸の発現の上昇を測定し、それにより、該核酸の発現の変化をもたらす被検物質を骨疾患又は関節疾患の予防剤及び／又は治療剤の候補化合物として選択するステップ
を含む、（２４）記載の方法、
（２８）（Ａ）被検物質の存在下、配列番号：３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸を細胞に導入するステップ、
（Ｂ）被検物質の存在下、前記ステップ（Ａ）で得られた細胞において前記核酸を発現させるステップ、並びに
（Ｃ）被検物質の非存在下の場合と比較して、前記核酸の発現の減少を測定し、それにより、該核酸の発現の変化をもたらす被検物質を骨疾患又は関節疾患の予防剤及び／又は治療剤の候補化合物として選択するステップ
を含む、（２４）記載の方法、
（２９）骨疾患又は関節疾患が軟骨形成異常、骨形成異常、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症又はスポーツによる関節障害である（２４）〜（２８）いずれかに記載の方法、
（３０）配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質又はその部分ペプチド又はその塩を含有してなる（２４）、（２５）及び（２９）いずれかに記載の方法に使用するためのキット、
（３１）被検物質の存在下、配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸を含む核酸構築物を含有してなる（２４）、（２６）〜（２９）いずれかに記載の方法に使用するためのキット、
（３２）配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸が導入された細胞を含有してなる（２４）、（２６）〜（２９）いずれかに記載の方法に使用するためのキット、
（３３）配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質又は部分ペプチド又はその塩に対する抗体を含有してなる（２４）〜（２９）いずれかに記載の方法に使用するためのキット、
（３４）（２４）〜（２９）いずれかに記載の方法により得られる化合物又はその塩、
（３５）（３４）に記載の化合物又はその塩を有効成分として含有してなる医薬組成物、
（３６）骨疾患若しくは関節疾患の治療又は予防に用いる、（３５）記載の医薬組成物、
（３７）被検対象の個体由来の被検試料における配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定するステップを含み、ここで、被検試料における発現レベルが、正常個体由来又はＲＡ患者由来の対照試料における発現レベルと異なる場合、該被検試料が、骨疾患又は関節疾患に罹患している疑いがある個体由来の試料であることの指標となる、骨疾患又は関節疾患の診断方法、
（３８）発現レベルが、配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子のｍＲＮＡ量を指標として測定される、（３７）記載の方法、
（３９）発現レベルが、配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する少なくとも１つのタンパク質又はその部分ペプチド又はその塩を指標として測定される、（３７）記載の方法、
（４０）骨疾患又は関節疾患が、軟骨形成異常、骨形成異常、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症又はスポーツによる関節障害である（３７）〜（３９）いずれか記載の方法、に関する。
【発明の効果】
【００３０】
本発明で用いられるタンパク質はＯＡ滑膜又はＲＡ滑膜で発現が変化するため、例えば、滑膜組織の異常が一因となる骨疾患又は関節疾患の診断指標として有用である。また、本発明で用いられるタンパク質は、関節痛を症状の一つとし、判別しにくいＯＡとＲＡを区別する、ＯＡ又はＲＡの診断指標として有用である。また、該タンパク質の活性を調節する化合物又はその塩、該タンパク質遺伝子の発現を調節する化合物又はその塩、該タンパク質に対する中和抗体、該タンパク質をコードする遺伝子のアンチセンスヌクレオチドは、該骨疾患若しくは関節疾患の予防剤又は治療剤として安全に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】Ｆｉｂｕｌｉｎ−３遺伝子の発現
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明は、骨疾患若しくは関節疾患に罹患している疑いがある個体由来の試料の検出又は選別方法、骨疾患又は関節疾患の診断方法、該検出・選別・診断方法に用いる診断薬、骨疾患若しくは関節疾患の治療剤又は予防剤のスクリーニング方法、該スクリーニング方法に用いるキット、医薬組成物に関するものである。【００３３】
「骨疾患又は関節疾患」とは、例えば、軟骨形成異常、骨形成異常、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症又はスポーツによる関節障害が挙げられる。本発明は、特に、変形性関節症又は慢性関節リウマチに対して好適に使用され得る。【００３４】
以下、本発明を詳細に説明する。なお、本明細書において、特に指示のない限り、遺伝子組換え技術、細胞での組換えタンパク質の生産技術、発現タンパク質の分離精製法、分析法、分子生物学手法及び免疫学的手法等は、公知の方法が採用される。【００３５】
本発明の「骨疾患若しくは関節疾患に罹患している疑いがある個体由来の試料の検出又は選別方法」は、被検対象の個体由来の被検試料におけるタンパク質又は部分ペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを測定することを１つの特徴とする。したがって、本発明の検出又は選別方法によれば、被検対象の個体が骨疾患又は関節疾患に罹患している疑いがあるか否かを簡便かつ迅速に検出又は選別することができるという優れた効果が発揮される。また、代表的な関節疾患であり、似た症状を示すＯＡとＲＡを区別し、ＯＡ患者又はＲＡ患者由来の試料の検出又は選別することができる。【００３６】
前記「個体」としては、特に限定されるものではないが、哺乳動物、特にヒト、マウス、マウス、サル等が挙げられる。【００３７】
「被検試料」は、例えば、骨疾患又は関節疾患に罹患している疑いのある個体由来の組織（例えば、骨膜、軟骨等）、細胞、関節液、血液、尿等から慣用の手法により調製されうる。特に簡便に検査可能な関節液、血液及び尿から調製するのが好ましい。関節液、血液及び尿は、通常の関節液検査、血液検査及び尿検査と同様の方法で採取する。対照試料は、正常個体、ＲＡ患者又はＯＡ患者から被検試料と同様の部位から調製されたものであればよく、例えば、被検試料と同様にして同部位より調製することができる。また、骨疾患又は関節疾患に罹患している疑いのある個体から、手術時に摘出された組織（例えば、骨膜、軟骨等）が存在する場合、該組織を慣用の手法により調整し、使用することもできる。【００３８】
本発明の「検出又は選別方法」は、被検対象の個体由来の被検試料における配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定するステップを含み、ここで、被検試料における発現レベルが、対照試料における発現レベルと異なる場合、該被検試料が、骨疾患又は関節疾患に罹患している疑いがある個体由来の試料であることの指標となる。配列番号：１〜１７からなる群より選ばれる塩基配列からなる１７個の遺伝子は、１個の遺伝子の発現のみにより骨疾患又は関節疾患の指標となる。特に、正常個体と比べ、２倍以上の発現の上昇を表す遺伝子が指標として好ましい。【００３９】
配列番号：２、３、７、９〜１１、１３〜１６からなる群より選ばれる塩基配列からなる１０個の遺伝子は、被検試料における発現レベルが、正常個体及びＲＡ患者における発現レベルより高くなる場合、ＯＡ患者であると判断可能である。配列番号：１、４〜６、８、１２からなる群より選ばれる塩基配列からなる６個の遺伝子は、被検試料における発現レベルが、正常個体における発現レベルより高くなり、かつ、ＲＡ患者における発現レベルより低くなる場合、ＯＡ患者であると判断可能である。配列番号：１７の塩基配列からなる遺伝子は、被検試料における発現レベルが、正常個体における発現レベルより低くなり、かつ、ＲＡ患者における発現レベルより高くなる場合、ＯＡ患者であると判断可能である。特に、配列番号：６又は１３の塩基配列からなる遺伝子が指標として好ましい。      【００４０】
また、配列番号：１、４〜６、８、１２からなる群より選ばれる塩基配列からなる６個の遺伝子は、被検試料における発現レベルが、正常個体及びＯＡ患者における発現レベルより高くなる場合、ＲＡ患者であると判断可能である。配列番号：１７の塩基配列からなる遺伝子は、被検試料における発現レベルが、正常個体及びＯＡ患者における発現レベルより低くなる場合、ＲＡ患者であると判断可能である。【００４１】
本発明の「検出又は選別方法」において発現レベルを測定する遺伝子にコードされている「配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質」（以下、「本発明のタンパク質」と称することもある）は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル等）の細胞（例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞若しくは間質細胞、又はこれら細胞の前駆細胞、幹細胞若しくはガン細胞等）若しくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋等に由来するタンパク質であってもよい。【００４２】
「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば、（A）配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列中の１又は２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（B）配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列に１又は２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（C）配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列に１又は２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（D）配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列中の１又は２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、又は（E）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質が挙げられる。アミノ酸配列が挿入、欠失又は置換されている場合、その挿入、欠失又は置換の位置としては、特に限定されない。【００４３】
「遺伝子の発現レベル」は、該遺伝子のｍＲＮＡ量又はタンパク質の量を指標として測定するのが好適である。ｍＲＮＡの検出を行う分子生物学的測定方法又はタンパク質の検出を行う免疫学的測定方法であればいかなる方法でもよい。例えば、分子生物学的測定方法としてポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）、ノーザンブロット法、ドットブロット法、マイクロアレイ又はマクロアレイを用いた解析方法等が例示され、免疫学的測定方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、 ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法等が例示される。【００４４】
本発明には、発現レベルが、配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子のｍＲＮＡ量を指標として測定される方法も包含される。これは、上記の分子生物学的測定方法にあたる。【００４５】
例えば、配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を検出しうる核酸を用いる方法、さらには、該遺伝子が、配列番号：１〜１７からなる群より選ばれる塩基配列からなる核酸である方法、該遺伝子が、配列番号：６及び／又は１３の塩基配列からなる核酸である方法、配列番号：３５及び／又は３６の塩基配列からなる核酸を用いる方法も包含される。以下に、具体的に記載する。【００４６】
分子生物学的測定方法
ＰＣＲの場合、被検対象の個体由来の被検試料を、例えば、前記配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸若しくは該核酸に特徴的な部分配列からなる核酸をそれぞれ特異的に増幅しうるプライマー対を用いたＰＣＲ等に供し、ハイブリッドの形成若しくはその量又は増幅産物の出現若しくはその量を測定し、対照試料における結果と比較することにより、本発明のタンパク質の遺伝子の発現レベルを評価することができる。【００４７】
ＰＣＲに用いられる「プライマー対」としては、本発明のタンパク質をコードする核酸若しくは該核酸に特徴的な配列部分からなる核酸の５’末端のアンチセンス配列に対応するプライマーと３’末端のアンチセンス配列に対応するプライマーとからなるプライマー対等が挙げられる。かかるプライマー対は、使用時における操作性を考慮し、適切なＴｍ値、二次構造等に基づき、適宜選択されうる。具体的には、配列番号：１〜１７に記載の塩基配列の全部又はその特徴的な部分配列を増幅可能なものであるのが好適である。より具体的には、例えば、配列番号：１〜１７に記載の塩基配列を有する核酸からなる群より選ばれたプライマー対等が挙げられる。プライマー対の具体例としては、特に限定はないが、配列番号：３５と３６とのプライマー対等が挙げられる。かかるプライマーは、慣用の蛍光色素、放射性物質等で標識されたプライマーであってもよい。増幅産物の検出は、慣用のアガロースゲル電気泳動等において、臭化エチジウムや蛍光物質による可視化、標識プライマーに基づく検出等を行なうこと等により行なわれうる。【００４８】
本明細書において、「（核酸に）特徴的な部分配列」とは、例えば、データベースに登録された配列のうち、前記本発明のタンパク質をコードする遺伝子以外の遺伝子の塩基配列には実質的に見出されない部分配列をいい、例えば、データベースに登録された配列との配列同一性が、通常、２０％以下、好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下、特に好ましくは０％である配列をいう。【００４９】
ノーザンブロット法の場合、被検対象の個体由来の被検試料を、例えば、前記配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸を検出するプローブを用い、ハイブリッドの形成若しくはその量又は増幅産物の出現若しくはその量を測定し、対照試料における結果と比較することにより、本発明のタンパク質の遺伝子の発現レベルを評価することができる。【００５０】
マイクロアレイ又はマクロアレイを用いた解析方法の場合、被検対象の個体由来の被検試料を、例えば、前記配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸を検出するプローブを少なくとも１つ以上含んだマイクロアレイ又はマクロアレイを用い、ハイブリッドの形成若しくはその量又は増幅産物の出現若しくはその量を測定し、対照試料における結果と比較することにより、本発明のタンパク質の遺伝子の発現レベルを評価することができる。【００５１】
ノーザンブロット法やマイクロアレイ又はマクロアレイを用いた解析方法に用いられる「プローブ」としては、配列番号：１〜１７からなる群より選ばれる塩基配列からなる核酸を検出するために使用される核酸が挙げられる。プローブとして用いられる核酸は、使用時における操作性を考慮し、適切なＴｍ値、二次構造等に基づき、適宜選択されうる。かかる核酸は、慣用の蛍光色素、放射性物質等で標識されていてもよい。【００５２】
本発明には、発現レベルが、配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する少なくとも１つのタンパク質又はその部分ペプチド又はその塩を指標として測定される方法も包含される。これは、上記の免疫学的測定方法にあたる。【００５３】
「タンパク質の部分ペプチド」としては、前記本発明のタンパク質の部分ペプチドであって、好ましくは、前記本発明のタンパク質と同様の性質を有するものであればいずれのものでもよい。例えば、本発明のタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有するペプチド等が用いられる。【００５４】
また、「部分ペプチド」は、そのアミノ酸配列中の１又は２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失し、又は、そのアミノ酸配列に１又は２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加し、又は、そのアミノ酸配列に１又は２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入され、又は、そのアミノ酸配列中の１又は２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。【００５５】
「タンパク質又は部分ペプチドの塩」としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）等との塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩等が用いられる。【００５６】
例えば、配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する少なくとも１つのタンパク質又はその部分ペプチド又はその塩に対する抗体又はその断片を用いる方法、配列番号：２３及び／又は３０のアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する少なくとも１つのタンパク質又はその部分ペプチド又はその塩に対する抗体又はその断片を用いる方法が挙げられる。以下に、具体的に記載する。【００５７】
免疫学的測定方法
タンパク質の量を指標とする場合、被検対象の個体由来の被検試料及び対照試料のそれぞれを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、本発明のタンパク質に対する抗体又はその断片を用いたウエスタンブロット解析、前記抗体又はその断片を用いたイムノアッセイ等に供し、タンパク質の量を測定し、比較することにより、遺伝子の発現レベルを評価することができる。【００５８】
「抗体」とは、本発明のタンパク質に対する抗体、その断片等が挙げられる。すなわち、前記抗体は、前記本発明のタンパク質に特異的に結合する能力を有するものであれば、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。前記抗体は、例えば、前記本発明のタンパク質中における特定の部分断片に特異的に結合しうる抗体であってもよい。前記抗体の作製方法は、下記に具体的に記載する。また、得られた抗体を精製後、ペプチダーゼ等により処理することにより、抗体の断片が得られる。さらに、前記抗体の誘導体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂフラグメント、単鎖抗体等や公知技術により修飾された抗体等を使用することもできる。かかる抗体又はその断片は、慣用の酵素（例えば、ペルオキシダーゼ等）、蛍光色素、放射性物質、アビジン若しくはビオチン等で標識されていてもよい。【００５９】
（ｉ）ポリクローナル抗体の作製
本発明のタンパク質の一部のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として用い、動物に投与することによりポリクローナル抗体を作製することができる。
投与する動物として、ウサギ、ヤギ、ラット、マウス、ハムスター等を用いることができる。該抗原の投与量は動物１匹当たり５０〜１００μｇが好ましい。ペプチドを用いる場合は、ペプチドをスカシガイヘモシアニン（keyhole limpet haemocyanin）や牛チログロブリン等のキャリアタンパク質に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。抗原とするペプチドは、ペプチド合成機で合成することができる。該抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊 １９７６年、Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lavoratory (1988)〕等で確認する。
免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分な抗体価を示した非ヒトほ乳動物より血清を取得し、該血清より、下記方法によりポリクローナル抗体を分離、精製することができる。抗体を分離、精製する方法としては、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿〔Antibodies,A Laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)〕、又はＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡ又はＧ−カラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独又は組み合わせて処理する方法があげられる。【００６０】
（ｉｉ）モノクローナル抗体の作製
（ａ）抗体産生細胞の調製
免疫に用いた本発明のタンパク質の部分断片ポリペプチドに対し、その血清が十分な抗体価を示したラットを抗体産生細胞の供給源として供する。
該抗体価を示したラットに抗原物質を最終投与した後３〜７日目に、脾臓を摘出する。 該脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の脾細胞をトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
（ｂ）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウス又はラットから取得した株化細胞を使用する。例えば、８−アザグアニン耐性マウス（BALB/c由来）骨髄腫細胞株P3-X63Ag8-U1(以下、Ｐ３−Ｕ１と略す)〔Curr. Topics. Microbiol. Immunol., 81, 1 (1978)、Europ. J. Immunol., 6, 511 (1976)〕、SP2/0-Ag14(SP-2)〔Nature, 276,269 (1978)〕、P3-X63-Ag8653(653)〔J. Immunol., 123, 1548 (1979)］、P3-X63-Ag8(X63)〔Nature, 256, 495 (1975)〕等を用いることができる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔RPMI-1640培地にグルタミン（１．５ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（５×１０-5Ｍ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）及び牛胎児血清（ＦＣＳ）（ＣＳＬ社製、１０％）を加えた培地（以下、正常培地という）に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍｌ）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地で培養し、融合には該細胞を２×１０7個以上用いる。
（ｃ）ハイブリドーマの作製
（ａ）で取得した抗体産生細胞と（ｂ）で取得した骨髄腫細胞をＭＥＭ培地又はＰＢＳ（リン酸二ナトリウム １．８３ｇ、リン酸一カリウム ０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水 １リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に、攪拌しながら、３７℃で、１０8抗体産生細胞あたり、ポリエチレングライコール−１０００（ＰＥＧ−１０００） ２ｇ、ＭＥＭ ２ｍｌ及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．７ｍｌを混合した溶液を０．２〜１ｍｌ添加し、更に１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回添加する。添加後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍｌになるように調製する。該調製液を９００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の細胞を、ゆるやかにほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかにＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチン（１０-4Ｍ）、チミジン（１．５×１０-5Ｍ）及びアミノプテリン（４×１０-7Ｍ）を加えた培地〕１００ｍｌ中に懸濁する。
該懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μｌ／穴ずつ分注し、５％ ＣＯ2インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。培養後、培養上清の一部をとりアンチボディイズ〔Antibodies, A Laboratorymanual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14 (1988)〕等に述べられている 酵素免疫測定法により、本発明のタンパク質の部分断片ポリペプチドに特異的に反応するハイブリドーマを選択する。【００６１】
抗体は、例えば、OA又はRA患者由来の試料を検出するための方法において使用され得る。このような方法は、抗体を使用して、適切な生物学的サンプルにおける本明細書に記載の本発明のタンパク質の存在又は非存在を検出することを包含する。本明細書中に使用される適切な生物学的サンプルは、患者から取得した滑膜液又は正常組織生検、これらのホモジェネート又は抽出物を含む。【００６２】
サンプル中のタンパク質を検出するための抗体の使用について、当業者に公知の種々のアッセイ形式が存在する。例えば、Harlow及びLane，Anti bodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988を参照のこと。免疫学的検出法としては、ＥＬＩＳＡ法・蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法等をあげることができる。ウエスタンブロット形式において行う場合には、生物学的サンプル由来のポリペプチド調製物は、ゲル電気泳動に供され、適切なメンブレンに移され、そして抗体と反応させられる。次いで、メンブレン上の抗体の存在は、下記のように、適切な検出試薬を用いて検出され得る。【００６３】
別の実施態様において、検出方法は、タンパク質と結合し、そしてこれをサンプルの残りから取り出すための固相支持体に固定された抗体の使用を包含する。次いで、結合タンパク質は、レポーター基を有する二次抗体又は試薬を用いて検出され得る。あるいは、タンパク質がレポーター基で標識され、そして抗体とサンプルとのインキュベーション後、固定抗体と結合させられる、競合アッセイが使用され得る。サンプルの成分が標識タンパク質と抗体との結合を阻害する程度が、サンプルの固定抗体との反応性を示し、そして結果として、サンプル中のタンパク質の濃度を示す。【００６４】
固相支持体は、抗体が付着し得る、当業者に公知の、任意の物質であり得る。固相支持体は、例えば、マイクロタイタープレートの試験ウェル、若しくはニトロセルロースフィルター、若しくは他の適切なメンブレンであり得る。あるいは、支持体は、ビーズ又はディスク（例えば、ガラス、ガラス繊維、ラテックス又は可塑性物質（例えば、ポリスチレン又はポリ塩化ビニル））であり得る。支持体はまた、磁性粒子又は繊維光学センサー（例えば、米国特許第5,359,681号に開示される）であり得る。【００６５】
抗体は、特許文献及び科学文献に詳細に記載されている、当業者に公知の種々の技術を用いて、固相支持体に固定され得る。本発明の文脈において、用語「固定」は、非共有的会合（例えば、吸着）及び共有的付着（抗原と支持体上の官能基との間の直接的連結であり得るか、又は架橋剤による連結であり得る）の両方をいう。マイクロタイタープレートのウェル又はメンブレンへの吸着による固定が好ましい。このような場合において、吸着は、適切な緩衝液中の抗体を支持体と適切な時間の間接触させることにより達成され得る。接触時間は、温度により変化するが、代表的には、約１時間と１日の間である。一般的に、プラスティックマイクロタイタープレート（例えば、ポリスチレン又はポリ塩化ビニル）のウェルと、約10ngから約１μｇ、及び好ましくは約100〜200ngの範囲の量の抗体との接触が、適切な量のタンパク質を固定するに十分である。【００６６】
抗体の固相支持体への共有的付着はまた、一般的に、支持体と抗体上の官能基（例えば、水酸基又はアミノ基）の両方に反応する二官能性薬剤と支持体をまず反応させることにより達成され得る。例えば、抗体は、適切なポリマーコートを有する支持体に、ベンゾキノンを用いるか又は支持体上のアルデヒド基と結合パートナー上のアミン及び活性水素との縮合により、共有的に付着され得る（例えば、Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook（199 1）A12〜A13を参照のこと）。【００６７】
特定の実施態様において、サンプル中のタンパク質の検出のためのアッセイは、二抗体サンドイッチアッセイである。このアッセイは、まず、固相支持体（通常、マイクロタイタープレートのウェル）に固定されている抗体と、生物学的サンプルとを、サンプル中のポリペプチドが固定された抗体に結合するように接触させることにより行われ得る。次いで、非結合サンプルは、固定されたポリペプチド−抗体複合体から除去され、そしてポリペプチド上の異なる部位に結合し得る二次抗体（レポーター基を含む）が添加される。次いで、固相支持体に結合したままの二次抗体の量は、特定のレポーター基に適切な方法を用いて決定される。【００６８】
より詳細には、一旦抗体が支持体上に上記のように固定されると、支持体上の残りのポリペプチド結合部位は代表的にはブロックされる。任意の適切なブロッキング剤（例えば、ウシ血清アルブミン又はTween 20TM(Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO)）は、当業者に公知である。次いで、固定抗体はサンプルと共にインキュベートされ、そしてポリペプチドは抗体に結合させられる。サンプルは、インキュベーションの前に適切な希釈剤（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)）で希釈され得る。一般的に、適切な接触時間（すなわち、インキュベーション時間）は、乳癌を有する個体から得られたサンプル中のポリペプチドの存在を検出するに十分な時間である。好ましくは、接触時間は、結合ポリペプチド及び非結合ポリペプチドとの間の平衡で達成される結合レベルの少なくとも95％の結合のレベルを達成するに十分な時間である。当業者は、平衡を達成するに必要な時間は、一定時間にわたって生じる結合のレベルをアッセイすることにより容易に決定されることを理解する。室温にて、約30分間のインキュベーション時間が一般的に十分である。【００６９】
次いで、結合していないサンプルは、固相支持体を適切な緩衝液（例えば、0.1％Tween 20TMを含むPBS）で洗浄することにより除去され得る。次いで、レポーター基を有する二次抗体が、固相支持体に添加され得る。好ましいレポーター基は、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、基質、補因子、インヒビター、色素、放射性核種、発色基、蛍光基、及びビオチンを含む。抗体とのレポーター基との結合は、当業者に公知の標準的方法を用いて達成され得る。【００７０】
次いで、二次抗体は、固定抗体-ポリペプチド複合体と共に、結合したポリペプチドを検出するに十分な時間インキュベートされる。適切な時間は、一般的に、所定の時間にわたって生じる結合のレベルをアッセイすることにより決定され得る。次いで、結合していない二次抗体が除去され、そして結合した二次抗体はレポーター基を用いて検出される。レポーター基を検出するために用いられる方法は、レポーター基の性質に依存する。放射活性基については、シンチレーション計数法又はオートラジオグラフィー法が一般的に適切である。分光法は、色素、発色基及び蛍光基を検出するために使用され得る。ビオチンは、異なるレポーター基（通常は、放射活性基若しくは蛍光基又は酵素）に結合されたアビジンを用いて検出され得る。酵素レポーター基は、一般的に、基質の添加（一般的に特定の時間の間）、続く反応産物の分光分析又は他の分析により検出され得る。【００７１】
疾患の存在又は非存在を決定するために、固相支持体に結合したままのレポーター基から検出されるシグナルは、一般的に、正常組織から確立された事前に決定されたカットオフ値に対応するシグナルと比較される。１つの好ましい実施態様において、カットオフ値は、固定抗体が骨疾患又は関節疾患を有さない患者由来のサンプルとインキュベートされる場合に得られる平均シグナルである。一般的に、事前に決定されるカットオフ値を３標準偏差越えるシグナルを生じるサンプルは、骨疾患又は関節疾患について陽性と考えられ得る。別の好ましい実施態様において、カットオフ値は、Sackettら、Clinical Epidemiology:A Basic Science for Clinical Medicene 106-7頁、(Little Brown and Co，1985)の方法に従うReceiver Oparator Curveを用いて決定される。簡潔に述べると、この実施態様においては、カットオフ値は、診断試験結果についてそれぞれの可能なカットオフ値に対応する真の陽性率（すなわち、感度）と偽陽性率（100％特異性）との対をプロットすることにより決定され得る。プロット上の左上角に最も近いカットオフ値（すなわち、最も大きな面積を囲む値）が、最も正確なカットオフ値であり、この方法により決定されるカットオフ値よりも高いシグナルを生じるサンプルは、陽性であると考えられ得る。あるいは、カットオフ値は、偽陽性率を最少にするためにプロットに沿って左に、又は偽陰性率を最少にするために右にシフトされ得る。【００７２】
関連する実施態様において、フロースルー試験又はストリップ試験形式において本発明のタンパク質の検出が行われる。ここで、抗体はメンブレン（例えば、ニトロセルロース）に固定されている。フロースルー試験において、サンプル中のポリペプチドは、サンプルがメンブレンを通り抜けると、固定抗体に結合する。次いで、標識した二次抗体が、二次抗体を含む溶液がメンブレンを通って流れると抗体−ポリペプチド複合体に結合する。次いで、結合した二次抗体の検出は、上記のように行われ得る。ストリップ試験形式においては、抗体が結合しているメンブレンの一方の端が、サンプルを含む溶液に浸される。サンプルは、二次抗体を含む領域を通り、そして固定抗体の範囲へメンブレンに沿って移動する。固定抗体の範囲での二次抗体の濃度が、骨疾患又は関節疾患の存在を示す。代表的には、この部位での二次抗体の濃度は、視覚的に読み取り得るパターン（例えば、線）を生じる。このようなパターンが存在しなければ、結果が陰性であることが示される。一般的に、メンブレン上に固定される抗体の量は、生物学的サンプルが、上で議論した形式の二抗体サンドイッチアッセイにおいて陽性のシグナルを生じるに十分なレベルのポリペプチドを含む場合に、視覚的に判別し得るパターンを生じるように選択される。好ましくは、メンブレン上に固定される抗体の量は、約25ng〜約１μｇの範囲であり、そしてより好ましくは約50ng〜約１μｇの範囲である。このような試験は、代表的には、非常に少量の生物学的サンプルを用いて行われ得る。【００７３】
さらに、本発明の骨疾患若しくは関節疾患に罹患している疑いがある個体由来の試料の検出又は選別方法は、骨疾患若しくは関節疾患の診断方法にも使用することができる。このような診断方法も、本発明に包含される。本発明の診断方法を、簡便、迅速に、高処理量で、高い信頼性で行ないうる、前記プローブ及び／又はプライマー対を含有した診断薬、又は前記タンパク質に対する抗体若しくはその断片を含有した診断薬が提供される。【００７４】
例えば、以下の診断薬も本発明の範囲内である。
−  配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を検出しうる核酸を含有してなる骨疾患若しくは関節疾患の診断薬、
−  該遺伝子が、配列番号：１〜１７からなる群より選ばれる塩基配列からなる核酸である骨疾患若しくは関節疾患の診断薬、
−  該遺伝子が、配列番号：６及び／又は１３の塩基配列からなる核酸である骨疾患若しくは関節疾患の診断薬の診断薬、
−  配列番号：３５及び／又は３６の塩基配列からなる核酸を含有してなる、骨疾患若しくは関節疾患の診断薬、
−  配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する少なくとも１つのタンパク質又はその部分ペプチド又はその塩に対する抗体又はその断片を含有してなる、骨疾患若しくは関節疾患の診断薬、
−  配列番号：２３及び／又は３０のアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する少なくとも１つのタンパク質又はその部分ペプチド又はその塩に対する抗体又はその断片を含有してなる、骨疾患若しくは関節疾患の診断薬。【００７５】
本発明の診断薬には、検出用試薬、緩衝液、対照試料、本発明の診断方法の説明書等をさらに含有させてもよい。【００７６】
また、本発明は、以下のスクリーニング方法も包含する。
−  配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を用いることを特徴とする骨疾患又は関節疾患の予防剤及び／又は治療剤のスクリーニング方法、
−  配列番号：１８〜３４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する少なくとも１つのタンパク質若しくはその部分ペプチド又はその塩を用いることを特徴とする骨疾患又は関節疾患の予防剤及び／又は治療剤のスクリーニング方法。【００７７】
スクリーニング方法に使用するタンパク質は、ヒトや温血動物の細胞若しくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織等に由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」を有するタンパク質は、前記の「検出又は選別方法」において発現を測定されるタンパク質と同意義である。【００７８】
本発明のタンパク質の製造方法
本発明のタンパク質は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー サプルメント１〜３８等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、タンパク質をコードしている遺伝子を宿主細胞中で発現させ、製造することができる。【００７９】
タンパク質をコードする全長ＤＮＡを基にして、必要に応じて、該タンパク質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該タンパク質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換したＤＮＡを調製する。該ＤＮＡは該タンパク質の生産率を向上させる上で有用である。該ＤＮＡ断片、又は全長ＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡ（組換えベクター）を作製する。該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、タンパク質を生産する形質転換体を得ることができる。【００８０】
宿主細胞としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製が可能、又は染色体中への組込みが可能で、本発明のタンパク質の遺伝子の転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。【００８１】
（ｉ）細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合
本発明のタンパク質の発現ベクターは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のタンパク質、転写終結配列、より構成されていることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、pBTrp2、pBTac1、pBTac2（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、pKK233-2（ファルマシア社）、pSE280（インビトロジェン社）、pGEMEX-1〔プロメガ(Promega)社製〕、pQE-8（キアゲン(QIAGEN)社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200〔Agric. Biol. Chem., 48, 669(1984)〕、pLSA1〔Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescript II SK+（ストラタジーン社製）、pBluescript II SK(-)（ストラタジーン社製）、pTrs30（FERM BP-5407）、pTrs32(FERM BP-5408)、pGHA2(FERM BP-400)、pGKA2(FERM B-6798)、pTerm2（特開平3-22979、US4686191、US4939094、US5160735）、pEG400〔J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)〕、pGEX（ファルマシア社製）、pETシステム（ノバジェン社製）、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pTrxFus（Invitrogen社製）、pMAL-c2（New England Biolabs社製）、pUC19〔Gene, 33, 103 (1985)〕、pSTV28（宝酒造社製）、pUC118（宝酒造社製）、pPA1（特開昭63-233798）等を例示することができる 。
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ptrp）、lacプロモーター（Plac）、PLプロモーター、PRプロモーター、PSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、S PO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーター等をあげることができる。またPtrpを２つ直列させたプロモーター（Ptrp x2）、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。本発明のタンパク質の遺伝子の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、Escherichia coli BL21(DE3)、Escherichia coli BL21(DE3)pLysS、Escherichia coli HMS174(DE3)、Escherichia coli HMS174(DE3)pLysS、Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia liquefaciens、Serratia marcescens、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Brevibacterium ammmoniagenes、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticumATCC14066、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC14067、Corynebacterium glutamicum ATCC13869、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、Pseudomonas sp. D-0110等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)〕、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法（特開昭63-2483942）、Gene, 17, 107 (1982)やMolecular & General Genetics, 168, 111 (1979)に記載の方法等をあげることができる。【００８２】
（ｉｉ）酵母を宿主細胞として用いる場合
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、YEp13（ATCC37115）、YEp24（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）、pHS19、pHS15等を例示することができる。プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいかなるものでもよく、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal 1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、CUP 1プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces lactis、Trichosporon pullulans、Schwanniomyces alluvius、Pichia pastoris等をあげることができる。組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Methods. Enzymol., 194, 182 (1990)〕、スフェロプラスト法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA,84, 1929 (1978)〕、酢酸リチウム法〔J. Bacteriol., 153, 163(1983)〕、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)記載の方法等をあげることができる。【００８３】
（ｉｉｉ）動物細胞を宿主細胞として用いる場合
動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（いずれもフナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７〔特開平３−２２９７９、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, ３, １３３ (１９９０)〕、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３〔J. Biochem., 101, 1307 (1987)〕、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ〔J. Biol. Chem., 268, 22782-22787 (1993)、別名ｐＡＭｏＰＲＳＡ（特開平05-336963）〕、ｐＡＳ３−３（特開平2-227075）、ｐＨＭ６、ｐＨＢ６（ロシュダイアグノスティックス社製）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ（アマシャムバイオテク社製）、ｐＥＴ−３、ｐＥＴ−１１、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（登録商標）  ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（登録商標）  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＵＣ１９、ｐＴｒｘＦｕｓ（インビトロジェン社製）、ｐＵＣ１１８、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ（ニューイングランドバイオラボ社製）等を例示することができる。使用されるベクターとしては、前記遺伝子を組み込んで動物細胞で発現できるベクターであればいずれでもよい。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（immediateearly）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、モロニー・ミュリン・ロイケミア・ウイルス（Moloney Murine Leukemia Virus）のロング・ターミナル・リピート・プロモーター（Long Terminal Repeat Promoter）、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、あるいはメタロチオネインのプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるCHO細胞、BHK細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒトの細胞であるNamalwa細胞又はNamalwa KJM-1細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、HBT5637（特開昭63−299）、ヒト大腸癌細胞株等をあげることができる。マウス・ミエローマ細胞としては、SP2/0、NSO等、ラット・ミエローマ細胞としてはYB2/0等、ヒト胎児腎臓細胞としてはHEK293(ATCC: CRL-1573)等、ヒト白血病細胞としてはBALL-1等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはCOS-1、COS-7、ヒト大腸癌細胞株としてはHCT-15等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕、virology, 52, 456 (1973)に記載の方法等をあげることができる。【００８４】
（ｉｖ）植物細胞を宿主細胞として用いる場合
植物細胞又は植物個体を宿主として用いる場合には、公知の方法〔組織培養, 20 (1994)、組織培養, 21 (1995)、Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)〕に準じてタンパク質を生産することができる。発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
遺伝子発現に用いるプロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の35Sプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。また、プロモーターと発現させる遺伝子の間に、トウモロコシのアルコール脱水素酵素遺伝子のイントロン１などを挿入することにより、遺伝子の発現効率をあげることもできる。
宿主細胞としては、ポテト、タバコ、トウモロコシ、イネ、アブラナ、大豆、トマト、ニンジン、小麦、大麦、ライ麦、アルファルファ、亜麻等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Agrobacterium）（特開昭59-140885、特開昭60-70080、WO94/00977）、エレクトロポレーション法（特開昭60-251887）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第2606856、特許第2517813）等をあげることができる。【００８５】
（ｖ）昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えば、バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ ア・ラボラトリー・マニュアル〔Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, NewYork (1992)〕、モレキュラー・バイオロジー ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Biology, A Laboratory Manual）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー サプルメント１〜３８（Current Protocols in Molecular Biology）、Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、タンパク質を発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクター及びバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる。該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII（すべてインビトロジェン社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞、Trichoplusia niの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞としてはSf9、Sf21（バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ ア・ラボラトリー・マニュアル）等、Trichoplusia niの卵巣細胞としてはHigh 5、BTI-TN-5B1-4（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはBombyx mori N4等をあげることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84,7413 (1987)〕等をあげることができる。
また、動物細胞にＤＮＡを導入する方法と同様の方法を用いて、昆虫細胞にＤＮＡを導入することもでき、例えば、エレクトロポレーション法〔Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕等をあげることができる。【００８６】
（ｖi）培養方法
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する形質転換体が、大腸菌、酵母、動物細胞あるいは植物細胞等の細胞の場合、各種宿主に適した通常の培養方法に従って培養し、該タンパク質を産生・蓄積させ、形質転換体又は培養液より該タンパク質を回収することにより、該タンパク質を製造することができる。形質転換体が、動物個体又は植物個体の場合、各種宿主に適した通常の生育方法に従って飼育又は栽培し、該タンパク質を産生・蓄積させ、該動物個体又は植物個体より該タンパク質を回収することにより、該タンパク質を製造することができる。
宿主が動物個体の場合、例えば、本発明のポリヌクレオチドを保有する非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該組換え体ＤＮＡのコードする本発明のタンパク質のタンパク質を該動物中に産生・蓄積させ、該動物個体中から該タンパク質を回収することにより、本発明のタンパク質のタンパク質を製造することができる。動物個体中の産生・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク、唾液、卵等を挙げることができる。
宿主が植物個体の場合、例えば、本発明のタンパク質のポリヌクレオチドを保有するトランスジェニック植物を栽培し、該組換え体ＤＮＡのコードする本発明のタンパク質のタンパク質を該植物個体中に産生・蓄積させ、植物個体中から該タンパク質を回収することにより、本発明のタンパク質のタンパク質を製造することができる。
宿主が大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、例えば、本発明のポリヌクレオチドを保有する形質転換体を培地中で培養し、該組換え体ＤＮＡのコードする本発明のタンパク質を培養液に産生・蓄積させ、該培養液から該タンパク質を回収することにより、本発明のタンパク質を製造することができる。【００８７】
本発明の本発明のタンパク質の形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
形質転換体が大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物である場合、得られた形質転換体を培養する培地としては、宿主が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。宿主が大腸菌である形質転換体を培養する際の培地としては、例えば、バクトトリプトン、イーストエクストラクト及び塩化ナトリウムを含むＹＴ培地が好ましい。
炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素物質、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。培養は、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。
培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。【００８８】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。遺伝子を導入した植物の細胞や器官は、ジャーファーメンターを用いて大量培養することができる。培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ(MS)培地、ホワイト(White)培地、又はこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
本発明のタンパク質製造用形質転換体が動物細胞である場合、該細胞を培養する培地は、一般に使用されているRPMI1640培地〔T he Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)〕、EagleのMEM培地〔Science, 122,501 (1952)〕、DMEM培地〔Virology, 8, 396 (1959)〕、199培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)〕又はこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、２５〜４０℃、５％ＣＯ2存在下等の条件下で１〜７日間行う。また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
本発明のタンパク質製造用形質転換体が昆虫細胞である場合、該細胞を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（ファーミンジェン社製）、Sf-900 II SFM培地（ギブコＢＲＬ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００ 、ＥｘＣｅｌｌ４０５〔いずれもＪＲＨバイオサイエンシーズ社製〕、Grace's InsectMedium〔Nature, 195, 788 (1962)〕等を用いることができる。【００８９】
（ｖｉｉ）タンパク質の製造方法
本発明のタンパク質製造用形質転換体の培養物から、本発明のタンパク質を単離・精製するには、通常の酵素の単離・精製法を用いることができる。例えば、本発明のタンパク質が本発明のタンパク質製造用形質転換体の細胞外に該タンパク質が分泌される場合には、該培養物を遠心分離等の手法により処理し、可溶性画分を取得する。該可溶性画分から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、DIAION HPA-75 （三菱化成社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用い、精製標品を得ることができる。
本発明のタンパク質が本発明のタンパク質製造用形質転換体の細胞内に溶解状態で蓄積する場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、該細胞を洗浄した後に、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、DIAION HPA-75 （三菱化成社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用い、精製標品を得ることができる。【００９０】
また、該タンパク質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該タンパク質を回収後、該タンパク質の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を、タンパク質変性剤を含まないあるいはタンパク質変性剤の濃度がタンパク質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該タンパク質を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
また、通常のタンパク質の精製方法〔J. Evan. Sadler ら：メソッド・イン・エンザイモロジー (Methods in Enzymology)，83,458〕に準じて精製できる。また、本発明のタンパク質を他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性を持つ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる〔山川彰夫，実験医学，13, 469-474(1995)〕。例えば、ロウらの方法〔Proc.Natl.Acad.Sci.,USA, 86, 8227 (1989)、GenesDevelop., 4, 1288 （1990)〕に記載の方法に準じて、本発明のタンパク質をプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。【００９１】
また、本発明のタンパク質をＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として生産し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288 （1990)〕。
更に、該タンパク質自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。本発明のタンパク質は、公知の方法〔J. Biomolecular NMR, 6, 129-134、Science, 242, 1162-1164、J.Biochem., 110, 166-168 (1991)〕に準じて、in vitro転写・翻訳系を用いてを生産することができる。
上記で取得されたタンパク質のアミノ酸情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても本発明のタンパク質を製造することができる。また、アドバンスト・ケムテック（Advanced ChemTech ）社、パーキン・エルマー社、ファルマシアバイオテク社、プロテイン・テクノロジー・インストゥルメント（Protein Technology Instrument）社、シンセセル・ベガ（Synthecell−Vega）社、パーセプティブ（PerSeptive）社、島津製作所等のペプチド合成機を利用し化学合成することもできる。
精製した本発明のタンパク質の構造解析は、タンパク質化学で通常用いられる方法、例えば遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析（平野久著、東京化学同人発行、１９９３年）に記載の方法により実施可能である。【００９２】
「部分ペプチド又はその塩」は、上記タンパク質の合成法に従って、あるいは本発明のタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体又は他の塩に変換することができる。【００９３】
スクリーニング方法に使用する「タンパク質をコードする遺伝子」は、前述した本発明で用いられるタンパク質をコードする塩基配列を含有する核酸であればいかなるものであってもよい。好ましくはＤＮＡである。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。【００９４】
本発明のタンパク質をコードする遺伝子の取得方法
「タンパク質をコードする遺伝子」は、以下のように取得することができる。
ヒト脳、心臓、骨格筋、ひ臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、これら組織由来のヒト正常細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞又はヒト卵巣癌あるいはヒト大腸癌より、常法によりｃＤＮＡライブラリーを作製する。【００９５】
ｃＤＮＡライブラリー作製法としては、モレキュラー・クローニング第２版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー サプルメント１〜３８、A Laboratory Manual, 2nd Ed.(1989)、ＤＮＡ Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばスーパースクリプト・プラスミド・システム・フォー・ｃＤＮＡ・シンセシス・アンド・プラスミド・クローニング〔SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning；ギブコＢＲＬ（Gibco BRL）社製〕やザップ−ｃＤＮＡ ・シンセシス・キット〔ZAP-cDNA Synthesis Kit、ストラタジーン社製〕を用いる方法等があげられる。【００９６】
該方法により取得されるＤＮＡとして、具体的には、配列番号：１〜１７で表される塩基配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。配列番号：１〜１７のＤＮＡを含むプラスミドとしては、例えば、後述の実施例に記載したプラスミドをあげることができる。【００９７】
該発現ベクターとしては、該ｃＤＮＡを組み込んで動物細胞で発現できるベクターであればいかなるものでも用いることができ、例えば、pcDNAI/Amp、pcDNAI、pCDM8（いずれもフナコシ社より市販）、pAGE107〔特開平3-22979、Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕、pREP4（インビトロジェン社製）、pAGE103〔J. Biochem., 101, 1307 (1987)〕、pAMo、pAMoA〔J. Biol. Chem., 268, 22782-22787 (1993) 〕、pAS3-3（特開平2-227075）等を用いることができる。【００９８】
ｃＤＮＡを組み込んだ発現ベクターは、目的とするｃＤＮＡを選択可能な動物細胞に導入し、形質転換細胞を取得する。該発現ベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれの方法も用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕、Virology, 52, 456 (1973)に記載の方法等の方法をあげることができる。【００９９】
動物細胞としては、ヒトの細胞であるNamalwa細胞、Namalwa細胞のサブラインであるNamalwa KJM-1細胞、サルの細胞であるCOS細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるCHO細胞、HBT5637（特開昭63−299）、大腸癌細胞株であるHCT-15等をあげることができ、好ましくは、Namalwa細胞、Namalwa KJM-1細胞又はHCT-15を用いうる。【０１００】
得られた形質転換細胞を常法により培養する。具体的には、以下の形質転換体の培養方法により培養することができる。形質転換体が動物細胞である場合、該細胞を培養する培地は、一般に使用されているRPMI1640培地〔The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)〕、EagleのMEM培地〔Science, 122,501 (1952)〕、DMEM培地〔Virology, 8, 396 (1959)〕、199培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)〕又はこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる  【０１０１】
培養は、通常ｐＨ６〜８、２５〜４０℃、５％ＣＯ2存在下等の条件下で１〜７日間行う。また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。【０１０２】
以上のようにして、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを取得することができる。
また、アミノ酸配列に基づいて、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを化学合成することによってもＤＮＡを調製することができる。ＤＮＡの化学合成は、チオホスファイト法を利用した島津製作所社製のＤＮＡ合成機、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社製のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ３９２等を用いて行うことができる。【０１０３】
さらに、後述のオリゴヌクレオチドをセンスプライマー（配列番号：３５）及びアンチセンスプライマー（配列番号：３６）として用い、これらＤＮＡに相補的なｍＲＮＡを発現している細胞のｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行うことによっても、目的とするＤＮＡを調製することができる。【０１０４】
「部分ペプチドをコードする遺伝子」は、前述した本発明で用いられる部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドであればいかなるものであってもよく、ＤＮＡが好ましい。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。上記、「タンパク質をコードする遺伝子」の取得方法に従って、取得することができる。【０１０５】
本発明の骨疾患若しくは関節疾患の治療剤又は予防剤のスクリーニング方法は、被検物質の存在下、本発明のタンパク質若しくは該タンパク質をコードする遺伝子の動態を検出又は測定することを１つの特徴とする。【０１０６】
すなわち、骨疾患又は関節疾患の発症との関連が認められる本発明のタンパク質の動態に対する被検物質による影響を調べることにより、骨疾患若しくは関節疾患に対する治療剤又は予防剤として有効な物質のスクリーニングを効率的に行なうものである。本発明のタンパク質の動態に対する被検物質による影響は、被検物質の非存在下における該動態を対照として調べるのが好適である。【０１０７】
また、本発明のスクリーニング方法は、骨疾患又は関節疾患に対する予防剤及び／又は治療剤の候補化合物の薬理評価に用いることができる。【０１０８】
前記被検物質としては、化合物又はその塩が挙げられる。なお、本明細書においては、前記化合物又はその塩は、低分子化合物、高分子化合物、ポリペプチド又はその誘導体、核酸又はその誘導体等を含む。かかる被検物質は、天然物質であってもよく、非天然物質であってもよい。ポリペプチドの誘導体としては、修飾基を付加して得られた修飾ポリペプチド、アミノ酸残基を改変することにより得られたバリアントポリペプチド等が挙げられる。また、核酸の誘導体としては、修飾基を付加して得られた修飾核酸、塩基を改変することにより得られたバリアント核酸、ペプチド核酸等が挙げられる。【０１０９】
本発明のスクリーニング方法における測定又は検出対象の「本発明のタンパク質の動態」としては、例えば、該タンパク質とそのリガンドとの結合の有無；該タンパク質の発現、具体的には、該発現の有無や該発現の変動等が挙げられる。【０１１０】
本発明のスクリーニング方法としては、測定又は検出対象の「本発明のタンパク質の動態」に応じて、大きく２つの実施態様がある。【０１１１】
本発明のスクリーニング方法の第１の実施態様としては、
（Ｉ）本発明のタンパク質と、被検物質とを接触させるステップ、並びに
（ＩＩ）前記ステップ（Ｉ）の後、該タンパク質と被検物質との結合を検出し、それにより、該タンパク質と結合する被検物質を、骨疾患又は関節疾患の予防剤及び／又は治療剤の候補化合物として選択するステップ
を含む方法が挙げられる。かかる方法によれば、前記タンパク質への結合を介して当該タンパク質の機能に作用する物質を選択することができるため、選択された候補化合物は、直接的かつ特異的に前記タンパク質に結合してその機能を調節するという特徴的な性質を有する。【０１１２】
前記ステップ（Ｉ）において、前記タンパク質と被検物質との接触は、例えば、該タンパク質の本来の機能を妨げない溶液中において、前記タンパク質と被検物質とを混合し、適切な反応条件（例えば、反応温度、反応時間等）の下、維持する（すなわち、両者を反応させる）ことにより行なわれうる。【０１１３】
前記「タンパク質の本来の機能を妨げない溶液」としては、例えば、リン酸緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）、ＨＥＰＥＳバッファー、Ｔｒｉｓバッファー等の溶液が挙げられる。【０１１４】
ステップ（Ｉ）における反応条件としては、特に限定されないが、例えば、前記溶液中、通常、ｐＨ６．０〜１０．０、好ましくはｐＨ７．０〜９．０、より好ましくはｐＨ７．５〜８．５、さらに好ましくはｐＨ８．０で、通常、１０℃から５０℃、好ましくは２０℃〜４０℃、より好ましくは２５℃〜３７℃、さらに好ましくは２５℃、通常、１分間〜１時間、好ましくは３〜３０分間、より好ましくは５〜２０分間、さらに好ましくは１０分間維持すること等が挙げられる。より具体的には、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、８０ｍＭ  ＫＣｌ、５％  グリセロール、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍｇ／ｍｌ  ｐｏｌｙｄＩｄＣ、５０ｎｇ／ｍｌ  ｈｅｒｒｉｎｇ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１０％  ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  ｌｙｓａｔｅ中、前記条件下に維持することが挙げられる。【０１１５】
ついで、ステップ（ＩＩ）において、前記タンパク質と被検物質との結合を検出し、該結合の有無を調べる。【０１１６】
結合は、例えば、前記のようにしてステップ（Ｉ）で前記タンパク質と、例えば、放射性物質により標識した被検物質とを反応させた後の溶液に含まれる該タンパク質の放射活性を、大過剰の非放射性被検物質との競合下において解析することにより検出することができる。結合が検出された場合、使用された被検物質を骨疾患又は関節疾患の予防剤及び／又は治療剤の候補化合物として選択する。【０１１７】
また、ステップ（Ｉ）とステップ（ＩＩ）を連続した工程により実施してもよい。かかる態様は、例えば、被検物質を保持した担体へのバインディングアッセイ等を利用することにより実施することができる。【０１１８】
本発明のスクリーニング方法の第２の実施態様としては、
（Ａ）本発明のタンパク質をコードする遺伝子を細胞に導入するステップ、
（Ｂ）被検物質の存在下、前記ステップ（Ａ）で得られた細胞において前記遺伝子を発現させるステップ、並びに
（Ｃ）被検物質の非存在下の場合と比較して、前記遺伝子の発現の有無を検出し、又は前記遺伝子の発現の変動を測定し、それにより、該遺伝子の発現の変化をもたらす被検物質を骨疾患又は関節疾患の予防剤及び／又は治療剤の候補化合物として選択するステップ
を含む方法が挙げられる。【０１１９】
前記ステップ（Ａ）において、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を細胞に導入      するには、例えば、該タンパク質の発現調節領域として知られる発現調節性エレメントの下流かつその支配下に、前記タンパク質をコードする遺伝子が動作可能に連結されてなる核酸構築物を用いて行なうのが好適である。前記発現調節性エレメントとしては、例えば、Niimi T et al., Molecular Endocrinology, 2001, Vol.15, 2021-2136に記載されている。【０１２０】
前記「核酸構築物」は、前記発現調節性エレメント及び本発明のタンパク質をコードする遺伝子を慣用の発現ベクターのクローニング部位に挿入することにより簡便に構築されうる。当該ベクターとしては、例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター等が挙げられる。  【０１２１】
なお、本発明のタンパク質をコードする遺伝子には、当該遺伝子そのもの；前記遺伝子のアンチセンス鎖にストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつ前記タンパク質と同等の作用を有するタンパク質をコードする遺伝子；前記遺伝子の塩基配列において、少なくとも１塩基の変異を有し、かつ前記タンパク質と同等の作用を有するタンパク質をコードする遺伝子；前記遺伝子の塩基配列と少なくとも６０％、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の配列同一性を有し、かつ前記タンパク質と同等の作用を有するタンパク質をコードする遺伝子等も含まれる。【０１２２】
前記「ストリンジェントな条件」とは、高ストリンジェンシーな条件、例えば、１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳの条件等をいう。ここで、ストリンジェンシーを向上させるため、より低イオン強度、例えば、０．５×ＳＳＣ、好ましくは０．２×ＳＳＣ、より好ましくは０．１×ＳＳＣ等の条件及び／又はより高温、例えば、用いられる核酸のＴｍ値により異なるが、５０℃以上、好ましくは６０℃以上、より好ましくは６５℃以上等の条件下で洗浄等を行なってもよい。【０１２３】
前記「変異」とは、塩基の置換、欠失、付加及び挿入をいう。かかる変異は、天然に存在するバリエーションであってもよく、慣用の部位特異的変異方法等により人為的に導入された変異であってもよい。【０１２４】
前記「配列同一性」とは、比較対象の少なくとも２つの配列について、適切に整列化させ、それぞれの配列に存在する同一の残基を決定して、適合部位の数を決定し、ついで、比較対象の配列領域内の残基の総数で、前記適合部位の数を割、得られた数値に１００をかけることにより算出されうる値をいう。かかる配列同一性は、具体的には、例えば、ホームページアドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／において、一般に利用可能であるＢＬＡＳＴアルゴリズム等により算出されうる。【０１２５】
なお、本発明の種々の態様において、その構成上、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現を必須とする場合、当該遺伝子の発現において用いられるベクター、核酸構築物を導入する宿主細胞等は、それらの任意の組み合わせにより、前記遺伝子の発現が達成されうるのであれば、それらはどのような生物種由来のものであってもよい。具体例及び細胞への前記核酸構築物の導入方法、前記核酸構築物が導入された形質転換体の培養方法等は、上記タンパク質の製造方法の形質転換体に関する記載と同様である。本発明のタンパク質をコードする遺伝子が真核生物に由来するものである点、及び本発明において提供される治療剤又は予防剤等が真核生物、中でも哺乳動物、特にヒトにおいて好適に使用されうる点を考慮すれば、前記遺伝子の発現に使用される宿主細胞としては動物細胞であるのが好適である。【０１２６】
また、本実施態様においては、前記核酸構築物が導入された安定な細胞系を用いる場合、ステップ（Ａ）は、省略してもよい。【０１２７】
ついで、ステップ（Ｂ）において、被検物質の存在下、前記ステップ（Ａ）で得られた細胞において本発明のタンパク質をコードする遺伝子を発現させる。【０１２８】
当該工程は、例えば、被検物質を含有した培地を用いて、前記ステップ（Ａ）で得られた細胞を培養することにより行なわれうる。培養条件は上記タンパク質の製造方法の形質転換体培養条件と同様である。【０１２９】
続いて、ステップ（Ｃ）において、被検物質の非存在下の場合と比較して、前記遺伝子の発現の有無を検出し、又は前記遺伝子の発現の変動を測定し、それにより、該遺伝子の発現の変化をもたらす被検物質を骨疾患又は関節疾患の予防剤及び／又は治療剤の候補化合物として選択する。【０１３０】
なお、「被検物質の非存在下の場合」とは、ステップ（Ｂ）において、被検物質の非存在下にステップ（Ａ）で得られた細胞において前記遺伝子を発現させた場合をいい、被検物質の存在下における前記遺伝子の発現の変化を把握するための基準となる。具体的には、かかる場合の細胞、又は該細胞の抽出液等を対照として用いる。【０１３１】
前記遺伝子の発現の有無を検出し、又はその発現の変動を測定した結果、対照と比較して該遺伝子の発現の変化が認められた時、例えば、対照において前記遺伝子の発現が見られた場合に、被検物質と接触させた細胞において前記遺伝子の発現が検出されないか、又は対象に比べて発現レベルが低下した時、すなわち、対照と比較して前記遺伝子の発現が減少した時、該被検物質が骨疾患若しくは関節疾患の予防剤及び／又は治療剤の候補化合物であると判定され、該被検物質を候補化合物として選択する。【０１３２】
選択された候補化合物は、細胞レベルにおいて前記遺伝子の発現を転写レベルで抑制するという特徴的な性質を有するものと考えられ、前記遺伝子の発現を特異的に抑制することができるという優れた効果を発揮する。【０１３３】
遺伝子の発現の有無の検出、又はその発現の変動の測定は、上記分子生物学的測定方法又は免疫学的測定方法に従って行うことができる。【０１３４】
本発明のスクリーニング方法により得られる化合物又はその塩としては、例えば、前記本発明のタンパク質等に結合することにより、該タンパク質の機能を阻害する化合物、例えば、低分子化合物、高分子化合物、該本発明のタンパク質に対する抗体、該本発明のタンパク質をコードする遺伝子からなる核酸のアンチセンス鎖等の核酸、ペプチド等が挙げられる。【０１３５】
また、本発明のスクリーニング方法に用いられる前記本発明のタンパク質、該本発明のタンパク質をコードする遺伝子を保持してなる核酸構築物、該遺伝子が導入された細胞、本発明のタンパク質の抗体等を含む、本発明のスクリーニング方法を行なうためのキットが提供される。かかるスクリーニング用キットも本発明に含まれる。【０１３６】
本発明のスクリーニング用キットとしては、具体的には、
−  本発明のタンパク質を含有してなるキット、
−  本発明のタンパク質をコードする遺伝子を含む核酸構築物を含有してなるキット、
−  本発明のタンパク質をコードする遺伝子が導入された細胞を含有してなるキット、
−  本発明のタンパク質に対する抗体又はその断片を含有してなるキット、
等が挙げられる。【０１３７】
また、各キットには、所望により、本発明のスクリーニング方法に好適に使用されうる前記プローブ及び／又はプライマー対を含有させてもよい。さらには、
所望により検出用試薬、緩衝液、標準物質、本発明のスクリーニング方法を実施するための説明書等を含有させてもよい。【０１３８】
本発明のスクリーニング用キットによれば、前記スクリーニング方法を簡便かつ迅速に、高処理量で行なうことができるという優れた効果が発揮される。【０１３９】
本発明のスクリーニング方法により得られた化合物又はその塩は、その発症に本発明のタンパク質の発現が関与する骨疾患又は関節疾患に対して治療又は予防作用を発揮しうる。したがって、前記スクリーニング方法により得られた化合物又はその塩により、骨疾患又は関節疾患、例えば、O A又はRAの治療又は予防に用いるための医薬組成物が提供される。【０１４０】
本発明の医薬組成物は、本発明のスクリーニング方法により得られた化合物又はその塩を有効成分として含有することに１つの特徴がある。したがって、本発明の医薬組成物は、骨疾患又は関節疾患に対し、本発明のタンパク質の発現に対する作用（例えば、該発現に対して抑制的に働く）を介して治療又は予防効果を発揮する。【０１４１】
本発明の医薬組成物中における前記化合物又はその塩の含有量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調節することができ、治療上有効量であればよく、低分子化合物又は高分子化合物の場合、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１〜１００ｍｇ、ポリペプチド又はその誘導体の場合、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１〜１００ｍｇ、核酸又はその誘導体の場合、例えば、０．００００１〜１００ｍｇ、好ましくは０．０００１〜１０ｍｇであることが望ましい。【０１４２】
本発明の医薬組成物は、前記化合物又はその塩を安定に保持しうる種々の助剤をさらに含有してもよい。具体的には、有効成分の送達対象となる部位に到達するまでの間に、有効成分が分解することを抑制する性質を呈する薬学的に許容されうる助剤、賦形剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等が挙げられる。【０１４３】
本発明の医薬組成物の投与形態は、有効成分の種類；投与対象となる個体、器官、局所部位、組織；投与対象となる個体の年齢、体重等に応じて、適宜選択される。前記投与形態としては、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、局所投与等が挙げられる。【０１４４】
また、本発明の医薬組成物の投与量も、有効成分の種類；投与対象となる個体、器官、局所部位、組織；投与対象となる個体の年齢、体重等に応じて、適宜選択される。投与方法としては、特に限定されないが、有効成分が、低分子化合物又は高分子化合物である場合、前記有効成分の量として、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、ポリペプチド又はその誘導体の場合、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、核酸又はその誘導体の場合、例えば、０．００００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．０００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の１回投与量となるように、１日につき、１回若しくは複数回投与すること等が挙げられる。投与期間も特に限定されるものではない。【０１４５】
本発明の医薬組成物の薬理評価は、例えば、骨疾患又は関節疾患モデルマウスに、本発明の医薬組成物を投与し、非投与動物に比べ、投与動物において、骨疾患又は関節疾患の改善が見られた場合を指標として評価する方法により行なうことができる。【０１４６】
また、本発明により、骨疾患又は関節疾患の診断方法が提供される。本発明の診断方法は、被検対象の個体由来の被検試料及び対照試料それぞれにおける本発明のタンパク質の遺伝子の発現レベルを測定することを１つの特徴とする。したがって、本発明の診断方法によれば、被検対象の個体が骨疾患又は関節疾患に罹患している疑いがあるか否かを簡便かつ迅速に診断することができるという優れた効果が発揮される。【０１４７】
本発明の診断方法においては、被検試料における発現レベルが、対照試料における発現レベルと異なる場合（例えば、高くなる場合、低くなる場合）、該被検対象の個体が、骨疾患又は関節疾患に罹患している疑いがあることの指標となる。【０１４８】
以下実施例は、例示のために提供され、そして限定するためではない。遺伝子操作的手法として、特に断らない限りモレキュラー・クローニング第２版に記載された方法を用いた。
【実施例１】
【０１４９】
ＤＮＡチップの作成
ヒト間葉系幹細胞（ＢＩＯ  ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ社）より、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  Ｍｉｃｒｏ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アマシャム バイオサイエンス社）を用い、添付のマニュアルに従ってｍＲＮＡを調製した。得られたｍＲＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（インビトロジェン社）にて添付マニュアルに従ってｃＤＮＡ化して、ｃＤＮＡクローンを得た。その後、ｃＤＮＡクローンからＰＣＲ法によりヒトｃＤＮＡ断片３２６５個を調製し、マイクロアレイ用コントロールＤＮＡであるＬｕｃｉｄｅａ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＳｃｏｒｅＣａｒｄ（アマシャム バイオサイエンス社）と共に、ＤＮＡチップ作製システムＭｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＩＩＩ  Ｓｐｏｔｔｅｒ（モレキュラー  ダイナミクス社）を用いて、Ｔｙｐｅ７ｓｔａｒスライドグラス（モレキュラー  ダイナミクス社）に１スライドあたり、左右対称になる形で（以下、左側をＳＥＴ１、右側をＳＥＴ２とする）2セットをスポットしてＤＮＡチップを作製した。
【実施例２】
【０１５０】
ヒト膝関節滑膜からのＲＮＡ調製
三重大学医学部整形外科において症状、理学所見、画像所見より変形性膝関節症（膝ＯＡ）と診断され、手術治療を行った患者４４例を対象とした。またコントロール群として慢性関節リウマチ（ＲＡ）１０例、及び非ＯＡ非ＲＡ８例（骨肉腫、ユーイング肉腫等大腿骨遠位部における悪性骨腫瘍で治療のために関節の合併切除を必要とする患者及び外傷により関節手術を受ける患者）も対象とした。これら対象者に対して事前に十分な説明を行った上で、同意を得られた対象者から手術時に膝関節の滑膜組織（約０．５ｇ）を摘出し、マイクロチューブに入れ、ただちに液体窒素を用いて凍結した。凍結した滑膜組織は、液体窒素にて冷却した試料粉砕機クライオプレス ＣＰ−１００Ｗ（マイクロテック・ニチオン社）を用いて粉砕し、直ちにＴＲＩｚｏｌ試薬（インビトロジェン社）中でホモゲナイザー・ポリトロン２１００（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社）を用いて懸濁し、ＴＲＩｚｏｌ試薬の処方に従って全ＲＮＡを抽出した。
【実施例３】
【０１５１】
変形性関節症滑膜検体において発現が変動する遺伝子の検索
実施例１で述べたＤＮＡチップを用いて、ヒト変形性膝関節症滑膜臨床検体での遺伝子発現変動解析を実施した。実施例２で述べたＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（キアゲン社）にて添付マニュアルに従い、ＤＮａｓｅ  Ｉ処理した後、回収した。
これで得た全ＲＮＡ２.５μｇを用い、ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ ａＲＮＡ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）のマニュアルに従い、増幅ＲＮＡ（ａＲＮＡ）を合成した。合成したａＲＮＡをプローブの鋳型とし、Ａｔｌａｓ Ｇｌａｓｓ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社 現ＢＤ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ社）若しくはＡｔｌａｓ ＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（現ＢＤ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ）を用いて、マニュアルに従いＲａｎｄｏｍ  １８ｍｅｒ プライマーによりＣｙ−３  ｄＣＴＰ又はＣｙ−５  ｄＣＴＰ（アマシャムバイオサイエンス社）を取り込ませてｃＤＮＡを蛍光標識した。これをプローブとし、Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｓｌｉｄｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（アマシャム バイオサイエンス社）を用いてＤＮＡチップとのハイブリダイゼーションを実施した。ハイブリダイゼーションは、Ｔｙｐｅ  ７ｓｔａｒスライド（アマシャム バイオサイエンス社）のプロトコールに従い、前処理の後にプローブと４８℃で１２時間行った。バッファーにはＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｖｅｒ．２（アマシャムバイオサインス社）を用いた。洗浄後、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＩＩＩ Ｓｃａｎｎｅｒ（モレキュラー  ダイナミクス社）により読み取りを行なった。この方法に従い、膝ＯＡ、ＲＡ、非ＯＡ非ＲＡからなる６２症例を用いて、重複して行なった実験も含め、７８スライドの実験を行なった。
【実施例４】
【０１５２】
統計解析による変形性関節症関連遺伝子の探索
実施例３で述べたＤＮＡチップ実験より得られた遺伝子発現量データを用いて、変形性関節症に関与する遺伝子を、正常者あるいは慢性関節リウマチと比較して探索した。【０１５３】
1.  解析用正規化データ
遺伝子発現量を
【数１】
2006006477.tif 000002
とし、３DR遺伝子の発現量がスライド内及びスライド間で同一になるように、（1）式の正規化を実施した。
【数２】
2006006477.tif 000003
なお、３ＤＲとは実施例１で述べたＬｕｃｉｄｅａ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＳｃｏｒｅＣａｒｄ（商品名、アマシャム バイオサイエンス社）に含まれるチェック用遺伝子のひとつである。また、症例によっては複数枚のスライドで測定がなされていたが、とくに断らない限り、複数のスライドがあった症例では、スライド番号の最も小さいスライドを解析に用いた。また、実施例１で述べたように、1スライドには、ＳＥＴ１とＳＥＴ２のデータが存在する。
正規化には統計解析パッケージソフトウェアＳＡＳ（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｊａｐａｎ社）を利用した。データ解析には、単変量解析のＣｌｕｓｔｅｒ＋ＬｏｇｉｓｔｉｃｓではＳＡＳを利用した。【０１５４】
2.  遺伝子単位としての単変量解析
i（＝１，…，６１）番目のスライドのk（＝１，…，３２６５）番目の遺伝子における正規化後の発現量を単に
【数３】
2006006477.tif 000004
で表示する。また、スライドが正常、ＯＡ、ＲＡのいずれから得られたかを識別する場合は、それぞれ
【数４】
2006006477.tif 000005
で表示する。
全３２６５個の遺伝子の中から正常、ＯＡ、ＲＡの３群を識別するにあたって、とくに重要な遺伝子を選ぶことを目的として、１遺伝子ごとの解析（単変量解析）を行った。【０１５５】
2.1  1症例1スライド解析
ＳＥＴ１とＳＥＴ２を対象とした解析をそれぞれ実施し、次の条件を満たした遺伝子を求めた。
条件Ａ：ＳＥＴ１とＳＥＴ２のどちらかで、平均値の比較と平均絶対差の比較のどちらかで、ＯＡと正常の間、ＯＡとＲＡの間で共に有意差が認められること。
条件B：ＳＥＴ１とＳＥＴ２で共に、平均値の比較で、ＯＡと正常の間、ＯＡとＲＡの間のどちらかで有意差が認められること。
ここに、平均絶対差の比較はデータ
【数５】
2006006477.tif 000006
を用いた比較を指し、
【数６】
2006006477.tif 000007
は正常群での中央値を表す。平均値の比較はデータ
【数７】
2006006477.tif 000008
を用いた比較を指す。
ＯＡと正常、ＯＡとＲＡの２通りのペア間比較には、全体有意水準を０．０５として、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較法を用いた。【０１５６】
2.2  １症例複数スライド解析
スライド間変動とＳＥＴ間変動を含む線形混合効果モデルに基づく解析で、次の条件を満たした遺伝子を求めた。 
条件Ｃ：平均値の比較と平均絶対差の比較とで、ＯＡと正常の間、ＯＡとＲＡの間で共に有意差が認められること。
ここでの有意差は、ＯＡと正常、ＯＡとＲＡの２通りのペア間比較に対応する回帰係数の検定での有意性を指す。【０１５７】
2.3  単変量解析の結果の集約
以下の２つの基準で遺伝子を選択した。
第１次選択基準：条件Aを満たす。
第２次選択基準：第１次選択基準を満たさず、条件Bかつ条件Cを満たす。
その結果、第１次選択基準で２３個、第２次選択基準で３個の遺伝子を選択し、合計２６個の遺伝子をＯＡに関与する遺伝子とした（表１）。これらの遺伝子について、ＯＡ患者における発現量をＲＡ患者と正常個体それぞれにおける発現量と比べた（表２）。ある遺伝子において、ＯＡ患者における発現量がＲＡ患者及び正常個体における発現量を基準としてともに＋である場合、該遺伝子の発現レベルは、ＯＡ患者＞ＲＡ患者、かつ、ＯＡ患者＞正常個体であることを示唆している。ある遺伝子において、ＯＡにおける発現量がＲＡ患者における発現量を基準として＋であり、正常個体における発現量を基準として−である場合、該遺伝子の発現レベルは、正常個体＞ＯＡ患者＞ＲＡ患者であることを示唆している。また、ある遺伝子において、ＯＡ患者における発現量がＲＡ患者における発現量を基準として−であり、正常個体における発現量を基準として＋である場合、該遺伝子の発現レベルは、ＲＡ患者＞ＯＡ患者＞正常個体であることを示唆している。【０１５８】
【表１】
2006006477.tif 000009
【０１５９】
【表２】
2006006477.tif 000010
【実施例５】
【０１６０】
ＯＡに関与する遺伝子の塩基配列解析
実施例４で述べた２６個のＯＡに関連する遺伝子について、それぞれ実施例１で述べたＰＣＲ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンシング装置ＭｅｇａＢＡＣＥ１０００（アマシャムバイオサイエンシズ社）を用いて解析した。ＰＣＲ断片が得られなかった２個の遺伝子を除き、残り２４個の遺伝子について得られた塩基配列はそれぞれ遺伝子情報解析ソフトウェアｂｉｏＳＣＯＵＴ（ＬＩＯＮ社）を用いて相同性検索を行った。その結果、２４個すべての遺伝子について遺伝子名が判明し、３個はＦｉｂｕｌｉｎ−３が重複していた。重複を除く２２個の遺伝子について、ＰｕｂＭＥＤ（米国立医学図書館生物工学情報センター）及びＰＡＴＥＮＴＷｅｂ（ＭｉｃｒｏＰａｔｅｎｔ社）を検索し、それぞれの遺伝子とＯＡとの関連性が公知であるか否かを検討し、その関連性が既に示されている遺伝子５個を除き、残り１７個の遺伝子がＯＡに関与していることが新たに明らかとなった。表３にその１７個の遺伝子を示す。【０１６１】
【表３】
2006006477.tif 000011
【実施例６】
【０１６２】
リアルタイム定量ＰＣＲ法によるＦｉｂｕｌｉｎ−３ｍＲＮＡの発現解析
統計解析の結果、最終的に選出した１７個の遺伝子において、４個の遺伝子がＦｉｂｕｌｉｎ−３（配列番号：１３）であったことから、ＲＴ−ＰＣＲ法により、ヒト変形性膝関節症滑膜組織におけるＦｉｂｕｌｉｎ−３遺伝子の発現プロファイルを調べ、ＤＮＡチップの結果と比較した。サンプルはすべてＤＮＡチップ解析に用いたＲＮＡを用いた。サンプル番号１は正常、２−１２はＯＡ患者の滑膜ＲＮＡである。
なお、ＲＴ−ＰＣＲには、配列番号：３５及び３６のプライマー対を用いた。実施例２で述べたヒト変形性膝関節症滑膜臨床検体より調製したＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（キアゲン社）にて添付マニュアルに従い、ＤＮａｓｅ  Ｉ処理した後、回収した。
得られた全ＲＮＡ  ２.５μｇよりＲＴ−ＰＣＲ用ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓiｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）を用いて添付マニュアルに従い、ｃＤＮＡを合成した。次に、ヒトＦｉｂｕｌｉｎ−３（配列番号：１３）の配列をもとにプローブ検索ソフトＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（アプライドバイオシステムズ社）によりリアルタイム定量ＰＣＲ用プライマー（配列番号：３５及び３６）を選択した。プライマーは、キアゲン社に合成を依頼した。このプライマーを用いて、合成したｃＤＮＡを鋳型としてＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉによるリアルタイム定量ＰＣＲを行ない、ｍＲＮＡ量を定量した。
反応試薬としては、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）を使用し、９５℃で１０分間反応した後、９５℃で１０秒、６０℃で６０秒４０サイクル行なって蛍光強度を定量した。ＰＣＲ、及び蛍光測定は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ５７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社）を用いて行なった。その結果、ＤＮＡチップ実験同様、リアルタイム定量ＰＣＲ実験によっても、ＯＡ臨床検体ではＦｉｂｕｌｉｎ−３遺伝子の発現が増強することが確認された（図１）。図１のリアルタイム定量ＰＣＲデータのグラフは、正常滑膜臨床検体（サンプル番号１）における発現量を１とした相対量で示している。なお、ＤＮＡチップ法とリアルタイム定量ＰＣＲ法とによる遺伝子発現量は正の相関（Ｐｅａｒｓｏｎの相関係数：約０．６９）を示すことが確認された。従って、残りの遺伝子についても同様の結果であることが予想され、表３に示した１７個の遺伝子のｍＲＮＡ発現を指標として、変形性関節症が診断できることが示唆された。また、実施例４において、発現レベルが正常個体＞ＯＡ患者＞ＲＡ患者、又はＲＡ患者＞ＯＡ患者＞正常個体という関係を示した７個の遺伝子については、ｍＲＮＡ発現を指標として、慢性関節リウマチが診断できることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１６３】
本発明の検出又は選別方法により、骨疾患又は関節疾患、特に変形性関節症、慢性関節リウマチに罹患している疑いがある個体由来の試料を簡便かつ迅速に検出又は選別をすることができる。また、検出又は選別に必要な診断薬を提供する。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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