【事件の表示】
　特願２０１１−５１５２３９「遺伝子ｆｏｘＰ３のＴＳＤＲ領域のＤＮＡメチル化分析による制御性Ｔ細胞のＤＮＡメチル化分析」拒絶査定不服審判事件〔平成２２年　１月　７日国際公開、ＷＯ２０１０／０００４７４、平成２３年１０月　６日国内公表、特表２０１１−５２６１４８〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
１．出願の経緯・本願発明
　本願は、平成２１年（２００９年）７月２日を国際出願日（パリ条約による優先権主張外国庁受理２００８年７月３日　欧州特許庁）とする出願であって、その請求項１〜１０に係る発明は、平成２７年１２月２４日付手続補正書により補正された特許請求の範囲の請求項１〜１０に記載されたとおりのものであり、そのうち請求項１には、以下のとおり記載されている。 
　
「ヒトの全血試料を使用してメチル化状態の分析を行うことにより、ヒトのＦｏｘＰ３陽性ＣＤ２５＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞を同定する方法であって、ヒトの全血試料について配列番号１４又は１５に示されるプライマーと配列番号１６又は１７に示されるプライマーの組み合わせで増幅されるｆｏｘｐ３遺伝子の調節領域における少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を分析することを含み、前記少なくとも１つのＣｐＧの少なくとも９０％又は少なくとも９２％以上の脱メチル化をＦｏｘＰ３陽性ＣＤ２５＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の指標とする、方法。」（以下、「本願発明」という。）
　
２．引用例
　当審の拒絶の理由で引用文献２として引用された本願優先日前の２００７年８月に頒布された刊行物であるEuropean Journal of Immunology(2007)Vol. 37, No.9,p..2378-2389（以下、「引用例２」という。）は、「ヒトFOXP3遺伝子座におけるDNA脱メチル化は、制御性T細胞を、活性化されFOXP3＋である通常のT細胞から区別する」という表題の学術文献であって、
（i）「転写因子FOXP3の発現は、現在Tregのための最もよく知られたマーカーを構成しているが、ヒトにおいては、活性化された非Tregにおいても一過性の発現が観察される。マウスFOXP3遺伝子座の我々の最近の知見を拡張すると、我々は、ヒトFOXP3遺伝子座のいくつかの領域のエピジェネティックな修飾が、Tregでもっぱら起きていることを観察した。重要なことに、活性化された通常のCD4+T細胞やTGF-β処理された細胞は、FOXP3を発現するにもかかわらず、FOXP3　DNAの脱メチル化を全く示さなかったのに対して、インビトロ増殖で拡張された安定なTreg分画でさえ、脱メチル化のままであった。Treg細胞系では、遺伝子の全体がエピジェネティックにインプリントされるかどうかを調べるために、我々は、ゲノムワイドの差分メチル化ハイブリダイゼーション解析を行った。幾つかの遺伝子は、Tregと通常のT細胞の間で差次的なメチル化を示すことがわかったが、広範な細胞や組織をテストしても、FOXP3ほど全体的にTregに特異的であるものはないことが判明した。我々は、
FOXP3 DNAの脱メチル化は、現時点で利用可能な最も信頼性の高い、天然Tregのための基準を構成する
(ii）「結果
TregとナイーブT細胞間でのFOXP3遺伝子におけるメチル化の差異
　相同性解析とマウスでの我々の以前の所見に基づいて、我々は、推定調節エレメントを含むヒトFOXP3遺伝子の、差次的DNAメチル化の候補領域をカバーするいくつかのアンプリコンを設計した。 DNAのメチル化状態は、
男性ドナーの末梢血由来の
　FACSソートされた分画の細胞内FOXP3染色は、他のグループの発見と一致する、CD25highCD4+ Treg（図1A）だけでの特異的なFOXP3の発現を示した。bisulfite sequenceing法の後、CpGは両方の細胞型の遺伝子の３‘領域においてメチル化されていることがわかった（図1BのAmp1,2及びサポーティングインフォメーションの表１）。エクソン1の上流では、両方の細胞型でCpGは、CpGアイランドの5 '末端（Amp9及び10）まで脱メチル化された。FOXP3遺伝子の5'末端では、メチル化はナイーブCD4+T細胞でのみ観察され、一方、Tregでは脱メチル化の傾向であった（Amp10及び11）。
メチル化パターンの著しい差異は
特に、哺乳類間で高度に保存されている領域（Amp5）で観察され、そのため、我々は最近この領域をTSDR（Tregに特異的な脱メチル化領域）と名付ける
　FOXP3は、X染色体上にコードされているから、女性では、エピジェネティックなランダムX-不活性化がX関連遺伝子の約８５％に影響している。我々は、性依存的な効果がTSDRでのメチル化状態に影響するかどうかを試験した。この解析は、TSDRのbisulfite sequenceing法と、単一CpGモチーフのmethylation-sensitive single-nucleotide primer extension（MS-SNUPE）法の両方よって行われた。予想されたとおり、
FOXP3 TSDR
図2
(iii)「制御機能のない一過性のFOXP3発現が、活性化された通常のCD4+T細胞として報告された。このような一過性のFOXP3 が発現しているCD4+T細胞において、FOXP3 TSDRの脱メチル化が起こっているかどうか決定するために、我々は、FACSソートされたナイーブCD25-CD45RA+CD4+T細胞を刺激し、FOXP3発現のフローサイトメトリー解析に続く様々な時間において、FOXP3 TSDRのメチル化状態をMS-SNuPE法で解析した。FACSソートされたCD25-CD45RA+CD4+T 細胞の当初数は、一般に０．２％以下のFOXP3+ 細胞を含んでいた。刺激により、細胞は一様にCD25をアップレギュレートし、FOXP3が高レベルで発現された明確な画分をアップレギュレートし（図５Ａ）、これは最近発表されたデータにより確認されている。活性化されたFOXP3+ CD4+T細胞のFOXP3 TSDRのメチル化状態を、MS-SNuPE解析（図５Ｂ及びサポーティングインフォメーションの表６）とbisulfite sequenceing法（データ示さず）により解析したところ、高いFOXP3発現にもかかわらず、選択されたCpGモチーフのほぼ完全なメチル化を観察した。重要なことに、我々は、トータルのCD4+T細胞を解析し、それらは約１０％のFOXP3+CD25highCD4+Tregを含有しており、これら天然のTregは、FOXP3 TSDRのMS-SNuPE解析によって（１２．７％の脱メチル化CpGモチーフ）（図５Ａ、Ｂ）検出された。同様の結果は、 CAMTA1遺伝子領域のメチル化状態においても観察され、直前に活性化されたＴ細胞では、選択されたCpGモチーフの完全なメチル化を示すのに対して、１４．０％の脱メチル化されたCpGモチーフが、トータルCD4+T 細胞で測定された（図５Ｂ及びサポーティングインフォメーションの表６）。このように、
FOXP3 TSDRとCAMTA1遺伝子領域の両方のメチル化状態の解析は、天然のFOXP3+CD25highCD4+Tregと、活性化によって一過性にFOXP3を発現しているにすぎない、制御性でない通常のCD4+ T 細胞との区別を可能とするものである。
(iv)「
末梢血における定量のためには、FOXP3 TSDR及びCAMTA1の両方の脱メチル化シグナルのパーセンテージが、直接天然Tregの数になる
(v)「この記事のSupporting Information は、http://www.wiley-vch.de/contents/jc_2040/2007/37594_s.pdfで利用可能である。」（２３７８頁下から第２行〜下から第１行）、と記載されている。
　
　また、このSupporting Informationの第１頁の表１の一部には、以下の記載がある。
　　　　　　CpG-ID　　　　　　naive　　　　　　　　　Treg
　　　　　　　　　　　　　　　　Mean 　　　　　　　　Mean
　AMP５　 　４５ 　　　　　　　９６．５　　　　　　 ３．８
　　　　　　５８　　　　　　　　１００．０　　　　　７．５
　　　　　　８３　　　　　　　　１００．０　　　　　２．３
　　　　　　１５５　　　　　　　９６．５　　　　　　０．０
　　　　　　１９０　　　　　　　１００．０　　　　　０．０
　　　　　　２０９　　　　　　　１００・０　　　　　７．３
　　　　　　２１８　　　　　　　９９．０　　　　　　４．８
　　　　　　２２６　　　　　　　１００．０　　　　　０．０
　　　　　　２３０　　　　　　　９８．５　　　　　　５．０
　　　　　　２３６　　　　　　　１００．０　　　　　１１．３
　　　　　　２３９　　　　　　　９９．５　　　　　　８．０
　　　　　　２４９　　　　　　　９９．３　　　　　　１０．５
　　　　　　２５７　　　　　　　９４．５　　　　　　１６．５
　　　　　　２９６　　　　　　　１００．０　　　　　１４．８
　　　　　　３０３　　　　　　　９８．３　　　　　　８．５
　
　上記引用例２記載事項(ii)に記載されたFOXP3のアンプリコンAMP１〜１１に存在する各ＣｐＧの、２〜３人のドナーのそれぞれからのナイーブT細胞及びTregにおけるメチル化率の平均値（Mean）をパーセンテージで表したものが、上記のSupporting Information の表１の開示内容である。また、上記引用例２記載事項(ii)には、TregとナイーブT細胞で発現するFOXP3のメチル化パターンの差異が最も著しい領域がFOXP3のAmp5であり、そのため、Amp5のこの領域をTSDR（Tregに特異的な脱メチル化領域）と名付けたことが記載されている。
　そして、上記Supporting Informationの第１頁の表１に、２人のドナーからのナイーブT細胞及びTregのFOXP3　AMP５にある１５個のＣｐＧのメチル化率が、ナイーブT細胞では９４．５〜１００％であるのに対して、Tregでは、０〜１６．５％（脱メチル化率では８３．５〜１００％）であり、FOXP3の他のAMPの中で、最もナイーブT細胞でのメチル化率が高く、最もTregでの脱メチル化率が高いことが示されている。
　さらに、上記引用例２記載事項(iii)及び(iv)には、FOXP3 TSDRの脱メチル化を測定することにより、TregをナイーブT細胞と区別できること、あるいは、Tregを定量できることが記載されており、これはTregを同定することに他ならない。
　
　そうすると、引用例２には、「ヒトの末梢血由来の試料中のFOXP3+CD25highCD4+Tregを同定する方法であって、FOXP3　TSDRであるAMP５の領域に存在するCpGのメチル化状態を分析して、脱メチル化をFOXP3+CD25highCD4+Tregの指標とする、方法」の発明（以下、「引用発明」という。）が記載されていると認められる。
　
３．対比
　本願発明の「配列番号１４又は１５に示されるプライマーと配列番号１６又は１７に示されるプライマーの組み合わせで増幅されるｆｏｘｐ３遺伝子の調節領域」とは、本願の図７に示されたＡＭＰ５の全長のヌクレオチド配列に対して、配列番号１４又は１５のプライマーと配列番号１６又は１７の組合せの１対のプライマーによりＰＣＲで増幅される領域を意味するものであり、その増幅されるｆｏｘｐ３遺伝子の調節領域中には、引用例２の上記Supporting Informationの第１頁の表１で示されたＡＭＰ５に存在する１５個のＣｐＧのうち、５番目から１３番目の計９個のＣｐＧが含まれている。
　そこで、本願発明と引用発明とを対比すると、引用発明の「FOXP3+CD25highCD4+ Treg」及び「ヒトの末梢血」は、それぞれ本願発明の「ＦｏｘＰ３陽性ＣＤ２５＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞」及び「ヒトの全血」に相当し、両者は、「ヒトの全血由来の試料を使用してメチル化状態の分析を行うことにより、ヒトのＦｏｘＰ３陽性ＣＤ２５＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞を同定する方法であって、ヒトの全血由来の試料について、ｆｏｘｐ３遺伝子のＡＭＰ５領域におけるＣｐＧ位置のメチル化状態を分析することを含み、前記ＣｐＧの脱メチル化をＦｏｘＰ３陽性ＣＤ２５＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の指標とする、方法」である点で共通する。
　しかしながら、両者は、（イ）本願発明では、ｆｏｘｐ３遺伝子のＡＭＰ５領域が、ＡＭＰ５に存在する１５個のＣｐＧ位置のうち５番目から１３番目の計９個のＣｐＧが存在するＡＭＰ５領域であり、かつ、その少なくとも１つのＣｐＧの少なくとも９０％又は少なくとも９２％以上の脱メチル化を、制御性Ｔ細胞の指標とするのに対して、引用発明では、１５個全部のＣｐＧ位置が存在するＡＭＰ５領域であり、その少なくとも１つのＣｐＧの少なくとも９０％又は少なくとも９２％以上の脱メチル化を、制御性Ｔ細胞の指標とするという特定はされていない点、及び、（ロ）使用するヒトの全血由来の試料が、本願発明では、全血試料であるのに対して、引用発明では、ヒトの全血由来の試料である点、の２点で相違する。
　
４．当審の判断
（１）相違点（イ）について
　上記２．で示したとおり、引用例２のSupporting Informationの表１には、AMP５領域にある１５個の各ＣｐＧの、２人のドナー由来のナイーブT細胞での平均のメチル化率が９４．５〜１００％の範囲であり、Tregでの平均の脱メチル化率が８３．５〜１００％の範囲であることが、個々に示されている。
　そうすると、この表１の開示に接した当業者であれば、これら１５個全てのＣｐＧの脱メチル化を測定することに代え、そのうちの一部で、しかも、Tregでの脱メチル化率がより高いＣｐＧを選択して脱メチル化を測定し、９０％以上の脱メチル化を制御性Ｔ細胞の指標とすることは、格別の創意工夫なくなし得たことであり、そのようにして、AMP５領域にある１５個のＣｐＧのうち５番から１３番の９個のＣｐＧの少なくとも１つの、９０％以上の脱メチル化を制御性Ｔ細胞の指標とすることは、当業者が必要に応じて適宜なし得たことである。
　
（２）相違点（ロ）について
　引用発明で「ヒトの全血由来の試料」を使用することは、本願発明の「ヒトの全血試料を使用する」一つの態様にすぎないから、上記相違点（ロ）は、実質的な相違ではない。
　また仮に相違であるとしても、全血試料から遠心分離等により粗精製した試料を用いるか、あるいは、粗精製もしない全血試料をそのまま用いるかは、当業者が必要に応じて適宜選択し得る事項であるから、全血試料を用いることは、当業者が容易になし得たことである。
　
（３）本願発明の効果について
　本願発明は、ＡＭＰ５に存在する１５個のＣｐＧ位置のうち５番目から１３番目の計９個のＣｐＧが存在するＡＭＰ５領域を選択し、かつ、その少なくとも１つのＣｐＧの少なくとも９０％又は少なくとも９２％以上の脱メチル化を、制御性Ｔ細胞の指標とするものであるが、本願発明において、特に特定のＡＭＰ５の領域を選択したことにより、引用例２の記載から当業者が予測できない程の格別な効果が奏されたものとはいえない。また、９０％以上という脱メチル化の数値についても引用例２から予測できる範囲のものであり、その数値に臨界的意義も見出せない。
　また、本願明細書の実施例で使用した全血試料は、全て全血試料から粗精製した試料であり、全血試料をそもまま用いた実施例は記載されていないから、この点でも、本願発明において奏される効果が、引用例２の記載から予測できない程の格別なものとはいえない。
　
（４）小括
　したがって、本願発明は、引用例２の記載に基づき当業者が容易に発明をすることができたものであり、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。
　
５．審判請求人の主張
　審判請求人は、平成２７年１２月２４日付意見書において、「しかしながら、当業者であれば引用例２に記載のＡＭＰ５を選択し、そのＡＭＰ５に存在する本願発明のCpG部位を選択したであろう(would)という理由は引用例２から見出すことはできません。すなわち、上記審判官合議体の判断は後知恵による過誤であると思料します。引用例２に記載されている多くのCpG部位から本願発明に係るCpG部位を選択する動機づけが当業者にあったとはいえません。
　また、引用例２のSupporting Informationの第１頁追加の表１における本願発明の対象
となるCpGと対応するCpGの脱メチル化率は83.5％−100％であることがわかります。本願発明の「少なくとも90%」を採用するためには、脱メチル化率が90%を下回るCpG部位を選択する動機づけがなく、本願発明の対象とするCpG部位を選択しなかったと思料します。
　引用例２ではＴＳＤＲ（Treg細胞に特異的な脱メチル化領域）の一部としてＡＭＰ５を開示し、一例として、アンプリコンＡＭＰ５の特定のCpG部位のみの分析が図２に示されています（２３８１頁）。しかしながら、引用例２には、「メチル化パターンの著しい差が遺伝子の領域内(gene body)（ＡＭＰ３−８）で観察された」との記載があります（２３７９頁、右欄）。よって、当業者は引用例２の記載からＡＭＰ３−８のすべてを対象としてCpGを選択したであろうと思料します。」と主張している。　
　
　しかしながら、上記２．にも記載したように、引用例２のFOXP3　TSDRとは、１５個のＣｐＧを含むＡＭＰ５の領域を意味しており、このことは、引用例２の第２３８１頁の図２の説明文の第２行目に「amplicin 5(Amp5)covering  the TSDR」と記載されていることからもうかがえる。
　そうすると、「引用例２ではＴＳＤＲ（Treg細胞に特異的な脱メチル化領域）の一部としてＡＭＰ５を開示し」という審判請求人の主張は、根拠のないものであり、一方、そのＡＭＰ５の領域にある特定のＣｐＧの脱メチル化を測定することは、当業者が必要に応じて適宜なし得ることは、上記４．（１）で述べたとおりであるから、審判請求人の上記主張は採用できない。
　
６．むすび 
　以上のとおりであるから、本願請求項１に係る発明は、特許法第２９条第２項の規定により、特許を受けることができないものであるから、他の請求項に係る発明については検討するまでもなく、本願は拒絶をすべきものである。
　よって、結論のとおり審決する。