【手続補正書】
【提出日】令和2年1月8日(2020.1.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デオキシリボ核酸結合ドメイン認識部位(DNA-BDRS)と、上流の選択可能なマーカー遺伝子及び上流の選択可能なマーカー遺伝子と異なる下流のフレーム外の選択可能なマーカー遺伝子によって挟まれたヌクレアーゼ認識部位を含む活性化可能なレポーターカセットとを含む操作核酸構築物。
【請求項２】
目的の遺伝子をコードする核酸を更に含み、目的の遺伝子がヌクレアーゼをコードする、請求項１記載の操作核酸構築物。
【請求項３】
ヌクレアーゼがCas9又はCpf1である、請求項２記載の操作核酸構築物。
【請求項４】
(a)少なくとも1つのヌクレアーゼ認識部位を含む目的の標的遺伝子、(b)請求項１記載の操作核酸構築物、及び(c)DNA-BDRSに結合するプログラム可能なヌクレアーゼを含む細胞。
【請求項５】
プログラム可能なヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ又はCas9-FokIヌクレアーゼである、請求項４記載の細胞。
【請求項６】
活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位を切断し、目的の標的遺伝子のヌクレアーゼ認識部位を切断するヌクレアーゼを更に含む、請求項４記載の細胞。
【請求項７】
ヌクレアーゼがCas9又はCpf1である、請求項６記載の細胞。
【請求項８】
活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位に相補的なガイドRNA(gRNA)及び目的の標的遺伝子のヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAを更に含む、請求項４記載の細胞。
【請求項９】
活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNA及び目的の標的遺伝子のヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAが、同じ構築物上に位置する操作核酸によってコードされる、請求項８記載の細胞。
【請求項１０】
構築物がヌクレアーゼをコードする核酸を更に含む、請求項９記載の細胞。
【請求項１１】
それぞれが目的の標的遺伝子の異なるヌクレアーゼ認識部位に相補的な多重gRNAを含む、請求項４記載の細胞。
【請求項１２】
哺乳動物細胞である、請求項４記載の細胞。
【請求項１３】
人工多能性幹細胞である、請求項４記載の細胞。
【請求項１４】
請求項４記載の細胞を含む細胞集団。
【請求項１５】
細胞培地及び請求項１４記載の細胞集団を含む培養物。
【請求項１６】
(a)目的の標的遺伝子に特異的なヌクレアーゼ認識部位を含む目的の標的遺伝子、
(b)上流の選択可能なマーカー遺伝子及び上流の選択可能なマーカー遺伝子と異なる下流のフレーム外の選択可能なマーカー遺伝子によって挟まれたヌクレアーゼ認識部位を含む活性化可能なレポーターカセット、
(c)活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位を切断し、目的の標的遺伝子のヌクレアーゼ認識部位を切断するヌクレアーゼ、並びに
(d)活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位に相補的なガイドRNA(gRNA)及び目的の標的遺伝子のヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNA
を発現する細胞。
【請求項１７】
遺伝子修飾アッセイ用の細胞を産生する方法であって、
(a)目的の標的遺伝子に特異的なヌクレアーゼ認識部位を含む目的の標的遺伝子、(b)上流の選択可能なマーカー遺伝子及び上流の選択可能なマーカー遺伝子と異なる下流のフレーム外の選択可能なマーカー遺伝子によって挟まれたヌクレアーゼ認識部位を含む活性化可能なレポーターカセット、並びに(c)(a)及び(b)のヌクレアーゼ認識部位を切断するヌクレアーゼを発現する細胞に、(a)のヌクレアーゼ認識部位に相補的なガイドRNA(gRNA)及び(b)のヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードする少なくとも1つの操作核酸をトランスフェクトすること
を含み、それにより、遺伝子修飾アッセイ用の細胞を産生する、前記方法。
【請求項１８】
少なくとも1つの操作核酸が、
細胞によって発現される第1の目的の標的遺伝子のヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードし、活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードする第1のヌクレオチド配列、及び
細胞によって発現される第2の目的の標的遺伝子のヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードし、活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードする第2のヌクレオチド配列
を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも1つの操作核酸が、少なくとも3つのgRNA:目的の標的遺伝子の第1のヌクレアーゼ認識部位に相補的な第1のgRNA;目的の標的遺伝子の第2のヌクレアーゼ認識部位に相補的な第2のgRNA;及び活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位に相補的な第3のgRNAをコードする、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
遺伝子修飾アッセイ用の細胞を産生する方法であって、
(a)(i)第1の目的の標的遺伝子に特異的なヌクレアーゼ認識部位を含む第1の目的の標的遺伝子、(ii)上流の選択可能なマーカー遺伝子及び上流の選択可能なマーカー遺伝子と異なる下流のフレーム外の選択可能なマーカー遺伝子によって挟まれたヌクレアーゼ認識部位を含む活性化可能なレポーターカセット、並びに(iii)(a)(i)のヌクレアーゼ認識部位及び(a)(ii)のヌクレアーゼ認識部位を切断するヌクレアーゼを発現する細胞の第1の集団に、(a)(i)のヌクレアーゼ認識部位に相補的なガイドRNA(gRNA)及び(a)(ii)のヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードする少なくとも1つの操作核酸をトランスフェクトすること、及び
(b)(i)ヌクレアーゼ認識部位を含む第2の目的の標的遺伝子、(ii)上流の選択可能なマーカー遺伝子及び上流の選択可能なマーカー遺伝子と異なる下流のフレーム外の選択可能なマーカー遺伝子によって挟まれたヌクレアーゼ認識部位を含む活性化可能なレポーターカセット、並びに(iii)(b)(i)のヌクレアーゼ認識部位及び(b)(ii)のヌクレアーゼ認識部位を切断するヌクレアーゼを発現する細胞の第2の集団に、(b)(i)のヌクレアーゼ認識部位に相補的なガイドRNA(gRNA)及び(b)(ii)のヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードする少なくとも1つの操作核酸をトランスフェクトすること
を含み、それにより、遺伝子修飾アッセイ用の細胞を産生する、前記方法。
【請求項２１】
(a)試薬を、(i)少なくとも1つのヌクレアーゼ認識部位を含む目的の標的遺伝子、並びに(ii)上流の選択可能なマーカー遺伝子及び上流の選択可能なマーカー遺伝子と異なる下流のフレーム外の選択可能なマーカー遺伝子によって挟まれたヌクレアーゼ認識部位を含む少なくとも1つの活性化可能なレポーターカセットを含む混合集団の細胞に導入することであって、試薬が、少なくとも1つのヌクレアーゼ認識部位を切断するヌクレアーゼ、活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位に相補的なガイドRNA(gRNA)及び目的の標的遺伝子のヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAを含み、それにより、試薬を含む細胞を産生する、導入すること、
(b)試薬を含む(a)の細胞を、上流の選択可能なマーカー遺伝子の発現及び少なくとも1つのヌクレアーゼ認識部位の切断をもたらす条件下でインキュベートし、それにより、上流の選択可能なマーカー遺伝子を発現する細胞を産生すること、及び
(c)上流の選択可能なマーカー遺伝子を発現する(b)の細胞を、下流の選択可能なマーカー遺伝子を発現しない細胞の死をもたらす条件下で、下流の選択可能なマーカー遺伝子と関連付けられる選択剤と接触させ、それにより、下流の選択可能なマーカー遺伝子を発現する細胞を産生すること、
を含む方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０５】
特許請求の範囲において、並びに上記明細書において、「を含む(comprising)」、「を含む(including)」、「を保有する(carrying)」、「を有する(having)」、「を含有する(containing)」、「を伴う(involving)」、「を保持する(holding)」、「で構成される(composed of)」等などの移行句は全て、制約がないと理解されるべきであり、即ち、含むが限定されないことを意味すると理解されるべきである。移行句「からなる(consisting of)」及び「から本質的になる(consisting essentially of)」のみが、米国特許商標庁の特許審査基準セクション2111.03に記述されるように、それぞれ閉鎖式又は半閉鎖式の移行句であるべきである。
以下、本発明の実施形態を示す。
（１）デオキシリボ核酸結合ドメイン認識部位(DNA-BDRS)と、上流の選択可能なマーカー遺伝子及び上流の選択可能なマーカー遺伝子と異なる下流のフレーム外の選択可能なマーカー遺伝子によって挟まれたヌクレアーゼ認識部位を含む活性化可能なレポーターカセットとを含む操作核酸構築物。
（２）上流の選択可能なマーカー遺伝子が、プロモーターを含まない、（1）に記載の操作核酸構築物。
（３）上流の選択可能なマーカー遺伝子が、プロモーターに作動可能に連結されている、（1）に記載の操作核酸構築物。
（４）目的の遺伝子をコードする核酸を更に含む、（1）に記載の操作核酸構築物。
（５）目的の遺伝子が、ヌクレアーゼをコードする、（4）に記載の操作核酸構築物。
（６）ヌクレアーゼが、Cas9である、（5）に記載の操作核酸構築物。
（７）ヌクレアーゼが、Cpf1である、（5）に記載の操作核酸構築物。
（８）(a)少なくとも1つのヌクレアーゼ認識部位を含む目的の標的遺伝子、(b)（1）に記載の操作核酸構築物、及び(c)DNA-BDRSに結合するプログラム可能なヌクレアーゼを含む細胞。
（９）プログラム可能なヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ又はCas9-FokIヌクレアーゼである、（8）に記載の細胞。
（１０）活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位を切断し、目的の標的遺伝子のヌクレアーゼ認識部位を切断するヌクレアーゼを更に含む、（8）に記載の細胞。
（１１）ヌクレアーゼが、Cas9である、（10）に記載の細胞。
（１２）ヌクレアーゼが、Cpf1である、（10）に記載の細胞。
（１３）活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位に相補的なガイドRNA(gRNA)及び目的の標的遺伝子のヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAを更に含む、（8）に記載の細胞。
（１４）活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNA及び目的の標的遺伝子のヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAが、同じ構築物上に位置する操作核酸によってコードされる、（13）に記載の細胞。
（１５）構築物が、ヌクレアーゼをコードする核酸を更に含む、（14）に記載の細胞。
（１６）それぞれが、目的の標的遺伝子の異なるヌクレアーゼ認識部位に相補的な多重gRNAを含む、（8）に記載の細胞。
（１７）上流の選択可能なマーカー遺伝子によってコードされる選択可能なマーカーが、ピューロマイシン耐性、ブラストサイジンSデアミナーゼ耐性、アンピシリン耐性、カナマイシン耐性、ジェネティシン耐性、ハイグロマイシン耐性、clonNAT耐性又はトリクロサン耐性を、細胞に付与する、（8）に記載の細胞。
（１８）下流の選択可能なマーカー遺伝子によってコードされる選択可能なマーカーが、ピューロマイシン耐性、ブラストサイジンSデアミナーゼ耐性、アンピシリン耐性、カナマイシン耐性、ジェネティシン耐性、ハイグロマイシン耐性、clonNAT耐性又はトリクロサン耐性を、細胞に付与する、（8）に記載の細胞。
（１９）活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位が、他の場合では細胞のゲノム中に存在しない、（8）に記載の細胞。
（２０）細菌細胞である、（8）に記載の細胞。
（２１）哺乳動物細胞である、（8）に記載の細胞。
（２２）哺乳動物細胞が、ヒト細胞である、（21）に記載の細胞。
（２３）多能性幹細胞である、（21）に記載の細胞。
（２４）人工多能性幹細胞である、（23）に記載の細胞。
（２５）（8）に記載の細胞を含む細胞集団。
（２６）細胞培地及び（25）に記載の細胞集団を含む培養物。
（２７）(a)目的の標的遺伝子に特異的なヌクレアーゼ認識部位を含む目的の標的遺伝子、
(b)上流の選択可能なマーカー遺伝子及び上流の選択可能なマーカー遺伝子と異なる下流のフレーム外の選択可能なマーカー遺伝子によって挟まれたヌクレアーゼ認識部位を含む活性化可能なレポーターカセット、
(c)活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位を切断し、目的の標的遺伝子のヌクレアーゼ認識部位を切断するヌクレアーゼ、並びに
(d)活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位に相補的なガイドRNA(gRNA)及び目的の標的遺伝子のヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNA
を発現する細胞。
（２８）上流の選択可能なマーカー遺伝子によってコードされる選択可能なマーカーが、ピューロマイシン耐性、ブラストサイジンSデアミナーゼ耐性、アンピシリン耐性、カナマイシン耐性、ジェネティシン耐性、又はトリクロサン耐性を、細胞に付与する、（27）に記載の細胞。
（２９）下流の選択可能なマーカー遺伝子によってコードされる選択可能なマーカーが、ピューロマイシン耐性、ブラストサイジンSデアミナーゼ耐性、アンピシリン耐性、カナマイシン耐性、ジェネティシン耐性、又はトリクロサン耐性を、細胞に付与する、（27）に記載の細胞。
（３０）哺乳動物細胞である、（27）に記載の細胞。
（３１）哺乳動物細胞が、ヒト細胞である、（30）に記載の細胞。
（３２）多能性幹細胞である、（27）に記載の細胞。
（３３）人工多能性幹細胞である、（32）に記載の細胞。
（３４）遺伝子修飾アッセイ用の細胞を産生する方法であって、
(a)目的の標的遺伝子に特異的なヌクレアーゼ認識部位を含む目的の標的遺伝子、(b)上流の選択可能なマーカー遺伝子及び上流の選択可能なマーカー遺伝子と異なる下流のフレーム外の選択可能なマーカー遺伝子によって挟まれたヌクレアーゼ認識部位を含む活性化可能なレポーターカセット、並びに(c)(a)及び(b)のヌクレアーゼ認識部位を切断するヌクレアーゼを発現する細胞に、(a)のヌクレアーゼ認識部位に相補的なガイドRNA(gRNA)及び(b)のヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードする少なくとも1つの操作核酸をトランスフェクトすること
を含み、それにより、遺伝子修飾アッセイ用の細胞を産生する、前記方法。
（３５）少なくとも1つの操作核酸が、
細胞によって発現される第1の目的の標的遺伝子のヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードし、活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードする第1のヌクレオチド配列、及び
細胞によって発現される第2の目的の標的遺伝子のヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードし、活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードする第2のヌクレオチド配列
を含む、（34）に記載の方法。
（３６）少なくとも1つの操作核酸が、
目的の標的遺伝子の第1のヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードし、活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードする第1のヌクレオチド配列、及び
目的の標的遺伝子の第2のヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードし、活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードする第2のヌクレオチド配列
を含む、（34）に記載の方法。
（３７）少なくとも1つの操作核酸が、少なくとも3つのgRNA:目的の標的遺伝子の第1のヌクレアーゼ認識部位に相補的な第1のgRNA;目的の標的遺伝子の第2のヌクレアーゼ認識部位に相補的な第2のgRNA;及び活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位に相補的な第3のgRNAをコードする、（34）に記載の方法。
（３８）細胞を、(a)のヌクレアーゼ認識部位の切断、(b)のヌクレアーゼ認識部位の切断、及び下流の選択可能なマーカー遺伝子の、フレーム外から、上流の選択可能なマーカー遺伝子を有するフレーム内への再設定をもたらす条件下でインキュベートすることを更に含む、（34）に記載の方法。
（３９）下流の選択可能なマーカーを発現する細胞を選択することを更に含む、（38）に記載の方法。
（４０）下流の選択可能なマーカーを発現する細胞の表現型を分析することを更に含む、（39）に記載の方法。
（４１）遺伝子修飾アッセイ用の細胞を産生する方法であって、
(a)(i)第1の目的の標的遺伝子に特異的なヌクレアーゼ認識部位を含む第1の目的の標的遺伝子、(ii)上流の選択可能なマーカー遺伝子及び上流の選択可能なマーカー遺伝子と異なる下流のフレーム外の選択可能なマーカー遺伝子によって挟まれたヌクレアーゼ認識部位を含む活性化可能なレポーターカセット、並びに(iii)(a)(i)のヌクレアーゼ認識部位及び(a)(ii)のヌクレアーゼ認識部位を切断するヌクレアーゼを発現する細胞の第1の集団に、(a)(i)のヌクレアーゼ認識部位に相補的なガイドRNA(gRNA)及び(a)(ii)のヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードする少なくとも1つの操作核酸をトランスフェクトすること、及び
(b)(i)ヌクレアーゼ認識部位を含む第2の目的の標的遺伝子、(ii)上流の選択可能なマーカー遺伝子及び上流の選択可能なマーカー遺伝子と異なる下流のフレーム外の選択可能なマーカー遺伝子によって挟まれたヌクレアーゼ認識部位を含む活性化可能なレポーターカセット、並びに(iii)(b)(i)のヌクレアーゼ認識部位及び(b)(ii)のヌクレアーゼ認識部位を切断するヌクレアーゼを発現する細胞の第2の集団に、(b)(i)のヌクレアーゼ認識部位に相補的なガイドRNA(gRNA)及び(b)(ii)のヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードする少なくとも1つの操作核酸をトランスフェクトすること
を含み、それにより、遺伝子修飾アッセイ用の細胞を産生する、前記方法。
（４２）第1の集団の細胞及び第2の集団の細胞を、(a)(i)、(a)(ii)、(b)(i)及び(b)(ii)のヌクレアーゼ認識部位の切断、並びにそれぞれ、(a)(ii)及び(b)(ii)の下流の選択可能なマーカー遺伝子の、フレーム外から、(a)(ii)及び(b)(ii)の上流の選択可能なマーカー遺伝子を有するフレーム内への再設定をもたらす条件下でインキュベートすることを更に含む、（41）に記載の方法。
（４３）(a)(ii)の下流の選択可能なマーカー遺伝子によってコードされる下流の選択可能なマーカーを発現する第1の集団の細胞を選択すること、及び(b)(ii)の下流の選択可能なマーカー遺伝子によってコードされる下流の選択可能なマーカーを発現する第2の集団の細胞を選択することを更に含む、（42）に記載の方法。
（４４）(a)(ii)の下流の選択可能なマーカー遺伝子によってコードされる下流の選択可能なマーカーを発現する第1の集団の細胞の表現型を分析すること、及び(b)(ii)の下流の選択可能なマーカー遺伝子によってコードされる下流の選択可能なマーカーを発現する第2の集団の細胞の表現型を分析することを更に含む、（43）に記載の方法。
（４５）遺伝子修飾アッセイ用の細胞を産生する方法であって、
(a)目的の標的遺伝子に特異的なヌクレアーゼ認識部位を含む目的の標的遺伝子、(b)上流の選択可能なマーカー遺伝子及び上流の選択可能なマーカー遺伝子と異なる下流のフレーム外の選択可能なマーカー遺伝子によって挟まれたヌクレアーゼ認識部位を含む活性化可能なレポーターカセット、並びに(c)(a)及び(b)のヌクレアーゼ認識部位を切断するヌクレアーゼを発現する細胞に、(a)のヌクレアーゼ認識部位に相補的な少なくとも1つの操作ガイドRNA(gRNA)及び(b)のヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAを導入すること
を含み、それにより、遺伝子修飾アッセイ用の細胞を産生する、前記方法。
（４６）gRNAが、電気穿孔により細胞に導入される、（45）に記載の方法。
（４７）遺伝子修飾アッセイ用の細胞を産生する方法であって、
(a)目的の標的遺伝子に特異的なヌクレアーゼ認識部位を含む目的の標的遺伝子、並びに(b)上流の選択可能なマーカー遺伝子及び上流の選択可能なマーカー遺伝子と異なる下流のフレーム外の選択可能なマーカー遺伝子によって挟まれたヌクレアーゼ認識部位を含む活性化可能なレポーターカセットを発現する細胞に、(a)のヌクレアーゼ認識部位に相補的なガイドRNA(gRNA)及び(b)のヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードする少なくとも1つの操作核酸をトランスフェクトすること
を含み、それにより、遺伝子修飾アッセイ用の細胞を産生する、前記方法。
（４８）少なくとも1つの操作核酸が、
細胞によって発現される第1の目的の標的遺伝子に特異的なヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードし、活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードする第1の操作核酸、及び
細胞によって発現される第2の目的の標的遺伝子に特異的なヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードし、活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードする第2の操作核酸
を含む、（47）に記載の方法。
（４９）少なくとも1つの操作核酸が、
目的の標的遺伝子に特異的な第1のヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードし、活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードする第1の操作核酸、及び
目的の標的遺伝子に特異的な第2のヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードし、活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードする第2の操作核酸
を含む、（47）に記載の方法。
（５０）少なくとも1つの操作核酸が、少なくとも3つのgRNA:目的の標的遺伝子の第1のヌクレアーゼ認識部位に相補的な第1のgRNA;目的の標的遺伝子の第2のヌクレアーゼ認識部位に相補的な第2のgRNA;及び活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位に相補的な第3のgRNAをコードする、（47）に記載の方法。
（５１）少なくとも1つの操作核酸が、(a)及び(b)のヌクレアーゼ認識部位を切断するヌクレアーゼを更にコードする、（47）に記載の方法。
（５２）細胞に、(a)及び(b)のヌクレアーゼ認識部位を切断するヌクレアーゼをコードする操作核酸をトランスフェクトすることを更に含む、（47）に記載の方法。
（５３）細胞を、(a)のヌクレアーゼ認識部位の切断、(b)のヌクレアーゼ認識部位の切断、及び下流の選択可能なマーカー遺伝子の、フレーム外から、上流の選択可能なマーカー遺伝子を有するフレーム内への再設定をもたらす条件下でインキュベートすることを更に含む、（51）に記載の方法。
（５４）下流の選択可能なマーカーを発現する細胞を選択することを更に含む、（53）に記載の方法。
（５５）下流の選択可能なマーカーを発現する細胞の表現型を分析することを更に含む、（54）に記載の方法。
（５６）遺伝子修飾アッセイ用の細胞を産生する方法であって、
(a)目的の標的遺伝子に特異的なヌクレアーゼ認識部位を含む目的の標的遺伝子、及び(b)目的の標的遺伝子のヌクレアーゼ認識部位を切断し、活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位を切断するヌクレアーゼを発現する細胞に、デオキシリボ核酸結合ドメイン認識部位(DNA-BDRS)と、上流の選択可能なマーカー遺伝子及び上流の選択可能なマーカー遺伝子と異なる下流のフレーム外の選択可能なマーカー遺伝子によって挟まれたヌクレアーゼ認識部位を含む活性化可能なレポーターカセットとを含む操作核酸構築物をトランスフェクトすること
を含む、前記方法。
（５７）上流の選択可能なマーカー遺伝子が、プロモーターを含まない、（56）に記載の方法。
（５８）上流の選択可能なマーカー遺伝子が、プロモーターに作動可能に連結されている、（56）に記載の方法。
（５９）細胞が、DNA-BDRSに結合して、それを切断するプログラム可能なヌクレアーゼを更に発現する、（56）に記載の方法。
（６０）細胞に、DNA-BDRSに結合して、それを切断するプログラム可能なヌクレアーゼをコードする核酸をトランスフェクトすることを更に含む、（56）に記載の方法。
（６１）細胞を、活性化可能なレポーターカセットの、細胞のゲノムへの挿入及び上流の選択可能なマーカー遺伝子の発現をもたらす条件下でインキュベートすることを更に含む、（59）に記載の方法。
（６２）上流の選択可能なマーカー遺伝子を発現する細胞を選択することを更に含む、（61）に記載の方法。
（６３）上流の選択可能なマーカー遺伝子を発現する細胞に、目的の標的遺伝子のヌクレアーゼ認識部位に相補的なガイドRNA(gRNA)及び活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードする少なくとも1つの操作核酸をトランスフェクトすることを更に含む、（62）に記載の方法。
（６４）少なくとも1つの操作核酸が、
細胞によって発現される第1の目的の標的遺伝子のヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードし、活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードする第1の操作核酸、及び
細胞によって発現される第2の目的の標的遺伝子のヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードし、活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードする第2の操作核酸
を含む、（63）に記載の方法。
（６５）少なくとも1つの操作核酸が、
目的の標的遺伝子の第1のヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードし、活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードする第1の操作核酸、及び
目的の標的遺伝子の第2のヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードし、活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードする第2の操作核酸
を含む、（63）に記載の方法。
（６６）少なくとも1つの操作核酸が、少なくとも3つのgRNA:目的の標的遺伝子の第1のヌクレアーゼ認識部位に相補的な第1のgRNA;目的の標的遺伝子の第2のヌクレアーゼ認識部位に相補的な第2のgRNA;及び活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位に相補的な第3のgRNAをコードする、（63）に記載の方法。
（６７）細胞を、目的の標的遺伝子のヌクレアーゼ認識部位の切断、活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位の切断、及び下流の選択可能なマーカー遺伝子の、フレーム外から、上流の選択可能なマーカー遺伝子を有するフレーム内への再設定をもたらす条件下でインキュベートすることを更に含む、（63）に記載の方法。
（６８）下流の選択可能なマーカーを発現する細胞を選択することを更に含む、（67）に記載の方法。
（６９）下流の選択可能なマーカーを発現する細胞の表現型を分析することを更に含む、（68）に記載の方法。
（７０）遺伝子修飾アッセイ用の細胞を産生する方法であって、
目的の標的遺伝子に特異的なヌクレアーゼ認識部位を含む目的の標的遺伝子を発現する細胞に、デオキシリボ核酸結合ドメイン認識部位(DNA-BDRS)と、上流の選択可能なマーカー遺伝子及び上流の選択可能なマーカー遺伝子と異なる下流のフレーム外の選択可能なマーカー遺伝子によって挟まれたヌクレアーゼ認識部位を含む活性化可能なレポーターカセットとを含む操作核酸構築物をトランスフェクトすること
を含む、前記方法。
（７１）上流の選択可能なマーカー遺伝子が、プロモーターを含まない、（70）に記載の方法。
（７２）上流の選択可能なマーカー遺伝子が、第1のプロモーターに作動可能に連結されている、（70）に記載の方法。
（７３）細胞が、DNA-BDRSに結合して、それを切断するプログラム可能なヌクレアーゼを更に発現する、（70）に記載の方法。
（７４）細胞に、DNA-BDRSに結合して、それを切断するプログラム可能なヌクレアーゼをコードする核酸をトランスフェクトすることを更に含む、（70）に記載の方法。
（７５）細胞を、活性化可能なレポーターカセットの、細胞のゲノムへの挿入及び上流の選択可能なマーカー遺伝子の発現をもたらす条件下でインキュベートすることを更に含む、（73）に記載の方法。
（７６）上流の選択可能なマーカー遺伝子を発現する細胞を選択することを更に含む、（75）に記載の方法。
（７７）上流の選択可能なマーカー遺伝子を発現する細胞に、目的の標的遺伝子のヌクレアーゼ認識部位に相補的なガイドRNA(gRNA)及び活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードする少なくとも1つの操作核酸をトランスフェクトすることを更に含む、（76）に記載の方法。
（７８）少なくとも1つの操作核酸が、
細胞によって発現される第1の目的の標的遺伝子のヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードし、活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードする第1の操作核酸、及び
細胞によって発現される第2の目的の標的遺伝子のヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードし、活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードする第2の操作核酸
を含む、（77）に記載の方法。
（７９）少なくとも1つの操作核酸が、
目的の標的遺伝子の第1のヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードし、活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードする第1の操作核酸、及び
目的の標的遺伝子の第2のヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードし、活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAをコードする第2の操作核酸
を含む、（77）に記載の方法。
（８０）少なくとも1つの操作核酸が、少なくとも3つのgRNA:目的の標的遺伝子の第1のヌクレアーゼ認識部位に相補的な第1のgRNA;目的の標的遺伝子の第2のヌクレアーゼ認識部位に相補的な第2のgRNA;及び活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位に相補的な第3のgRNAをコードする、（79）に記載の方法。
（８１）gRNAをコードする少なくとも1つの操作核酸が、目的の標的遺伝子のヌクレアーゼ認識部位を切断し、活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位を切断するヌクレアーゼを更にコードする、（77）に記載の方法。
（８２）DNA-BDRS及び活性化可能なレポーター構築物をコードする操作核酸構築物が、目的の標的遺伝子のヌクレアーゼ認識部位を切断し、活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位を切断するヌクレアーゼを更にコードする、（70）に記載の方法。
（８３）活性化可能なレポーター構築物の上流の選択可能なマーカー遺伝子が、第1のプロモーターに作動可能に連結され、ヌクレアーゼが、第1のプロモーターと異なる第2のプロモーターに作動可能に連結されている遺伝子によってコードされる、（82）に記載の方法。
（８４）細胞を、目的の標的遺伝子のヌクレアーゼ認識部位の切断、活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位の切断、及び下流の選択可能なマーカー遺伝子の、フレーム外から、上流の選択可能なマーカー遺伝子を有するフレーム内への再設定をもたらす条件下でインキュベートすることを更に含む、（81）に記載の方法。
（８５）下流の選択可能なマーカーを発現する細胞を選択することを更に含む、（84）に記載の方法。
（８６）下流の選択可能なマーカーを発現する細胞の表現型を分析することを更に含む、（85）に記載の方法。
（８７）(a)試薬を、(i)少なくとも1つのヌクレアーゼ認識部位を含む目的の標的遺伝子、並びに(ii)上流の選択可能なマーカー遺伝子及び上流の選択可能なマーカー遺伝子と異なる下流のフレーム外の選択可能なマーカー遺伝子によって挟まれたヌクレアーゼ認識部位を含む少なくとも1つの活性化可能なレポーターカセットを含む混合集団の細胞に導入することであって、試薬が、少なくとも1つのヌクレアーゼ認識部位を切断するヌクレアーゼ、活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位に相補的なガイドRNA(gRNA)及び目的の標的遺伝子のヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAを含み、それにより、試薬を含む細胞を産生する、導入すること、
(b)試薬を含む(a)の細胞を、上流の選択可能なマーカー遺伝子の発現及び少なくとも1つのヌクレアーゼ認識部位の切断をもたらす条件下でインキュベートし、それにより、上流の選択可能なマーカー遺伝子を発現する細胞を産生すること、及び
(c)上流の選択可能なマーカー遺伝子を発現する(b)の細胞を、下流の選択可能なマーカー遺伝子を発現しない細胞の死をもたらす条件下で、下流の選択可能なマーカー遺伝子と関連付けられる選択剤と接触させ、それにより、下流の選択可能なマーカー遺伝子を発現する細胞を産生すること、
を含む方法。
（８８）(a)試薬を、(i)少なくとも1つのヌクレアーゼ認識部位を含む目的の標的遺伝子、(ii)上流の選択可能なマーカー遺伝子及び上流の選択可能なマーカー遺伝子と異なる下流のフレーム外の選択可能なマーカー遺伝子によって挟まれたヌクレアーゼ認識部位を含む少なくとも1つの活性化可能なレポーターカセット、並びに(iii)少なくとも1つのヌクレアーゼ認識部位を切断するヌクレアーゼを含む混合集団の細胞に導入することであって、試薬が、活性化可能なレポーターカセットのヌクレアーゼ認識部位に相補的なガイドRNA(gRNA)及び目的の標的遺伝子のヌクレアーゼ認識部位に相補的なgRNAを含み、それにより、試薬を含む細胞を産生する、導入すること、
(b)試薬を含む(a)の細胞を、上流の選択可能なマーカー遺伝子の発現及び少なくとも1つのヌクレアーゼ認識部位の切断をもたらす条件下でインキュベートし、それにより、上流の選択可能なマーカー遺伝子を発現する細胞を産生すること、及び
(c)上流の選択可能なマーカー遺伝子を発現する(b)の細胞を、下流の選択可能なマーカー遺伝子を発現しない細胞の死をもたらす条件下で、下流の選択可能なマーカー遺伝子と関連付けられる選択剤と接触させ、それにより、下流の選択可能なマーカー遺伝子を発現する細胞を産生すること、
を含む方法。
（８９）下流の選択可能なマーカー遺伝子を発現する(c)において産生される細胞を分析することを更に含む、（87）に記載の方法。