(57)【要約】  胚性幹細胞の分化によって得られたアストロサイト様細胞を培養することを特徴とする胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地の製造方法及び該製造方法により得られた培地、並びに該培地の神経細胞の培養及び胚性幹細胞から神経系細胞への分化誘導等における使用。【特許請求の範囲】
【請求項１】
胚性幹細胞の分化によって得られたアストロサイト様細胞を培養することを特徴とする、胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地の製造方法。
【請求項２】
胚性幹細胞が、哺乳動物の胚性幹細胞である、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
哺乳動物が、霊長類動物である、請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
霊長類動物が、ヒトである、請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
（Ａ）胚性幹細胞からアストロサイト様細胞を得る工程、及び
（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られたアストロサイト様細胞を培養し、培養上清を得る工程、
を含む、請求項１〜４いずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
工程（Ａ）において、アストロサイト馴化培地、予め調製されたアストロサイト様細胞馴化培地、又は該アストロサイト馴化培地若しくはアストロサイト様細胞馴化培地と機能的に同等の予め調製された培地を用いて、胚性幹細胞を分化誘導させる、請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６いずれか１項に記載の製造方法により得られる、胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地。
【請求項８】
請求項７記載の胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地の存在下で神経細胞を培養することを特徴とする、神経細胞の培養方法。
【請求項９】
請求項８記載の培養方法により培養された神経細胞。
【請求項１０】
請求項７記載の胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地の存在下で胚性幹細胞から神経細胞を分化誘導することを特徴とする、胚性幹細胞から神経系細胞への分化誘導方法。
【請求項１１】
請求項７記載の胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を用いて分化誘導されてなる、神経系細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地に関する。さらに詳しくは、本発明は、胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地、その製造方法、該胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を用いる神経細胞の培養方法、該培養方法で培養された神経細胞、該胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を用いる胚性幹細胞から神経系細胞への分化誘導方法、胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地の存在下に分化誘導して得られる神経系細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経系細胞の培養には、通常、神経系細胞の維持に必要であると考えられる因子（例えば、神経成長因子、サイトカイン等）や既知組成の（chemically-defined）成分が添加された基本培地からなる合成培地、又はアストロサイト馴化培地を含有する培地が用いられている。合成培地に比べ、アストロサイト馴化培地を含有する培地によれば、神経細胞をより長期かつ安定に培養しうることが知られている。【０００３】
また、胚性幹細胞の分化誘導によって神経系細胞を得ようとする場合、アストロサイト馴化培地を含有した培地によれば、胚性幹細胞から神経系細胞の分化誘導を効率よく行なうことができることも知られている（非特許文献１及び２参照）。【０００４】
前記アストロサイト馴化培地として、動物（ラット、マウス、ウシ、ウマ、ブタ、サル、ウサギ、ニワトリ等）の神経系組織よりアストロサイトを採取し、該初代培養アストロサイトを栄養培地中で培養することにより得られる培養上清が用いられている（特許文献１及び２参照）。【０００５】
しかしながら、アストロサイトの供給源となる生体（神経系）組織の入手に制限があるうえ、生体からのアストロサイトの採取に、多大な時間と労力が必要である。また、初代培養細胞は、培養器中で安定的に培養維持することが難しく、継代操作も数回以内に限られる。したがって、前記のようなアストロサイト馴化培地の製造法でアストロサイト馴化培地を大量に製造する場合、生体組織を十分量確保したうえで、さらに処理工程を繰り返し行なう必要があるため、多大な労力と時間とを要するという欠点があった。【０００６】
さらに、初代培養アストロサイトは、それが由来する生体の成熟段階や、生体組織の部位により性質が異なっている。また、生体からの採取に際し、目的とするアストロサイト以外の細胞が混入が避けられない。したがって、実質的に均質なアストロサイト馴化培地を安定的に製造することは困難であった。【０００７】
神経細胞の培養維持のための培地として、種々のサイトカイン、成長因子等を添加した培地（無血清培地）がこれまでに多く報告されている（非特許文献３及び非特許文献４参照）。しかしながら、これらの文献等に記載の培地等を用いた培養系では、一般に、神経細胞を長期間、安定的に培養できない。また、たとえ神経細胞の培養維持に効果があったとしても、グリア細胞の増殖をも促進してしまい、その結果、神経細胞とグリア細胞との混合培養物をもたらすことが多い。したがって、これらの培養系は、例えば、神経細胞に対する被検物質の薬理作用を検討する場合のように、神経細胞のみを対象とする培養系としては必ずしも適切でない。【０００８】
さらに、初代培養アストロサイト馴化培地が神経細胞の培養能を有することが古くから知られている。しかしながら、神経細胞の長期安定培養に関しては、初代培養アストロサイト馴化培地の単独使用では従来報告されていた程の効果がないことが明らかにされている。そして、初代アストロサイト馴化培地に様々な添加剤（因子）を加えることにより、はじめて、神経細胞の長期安定培養の用途に適した培養液を得ることができる、と報告されている（特許文献１及び２参照）。
【特許文献１】特開平９−２８９８９１号公報
【特許文献２】特開平９−３２２７６５号公報
【非特許文献１】中山孝ら、  Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ、「胚性幹細胞からの神経幹細胞及び神経細胞の効率のよい製造方法（Efficient production of neural stem cells and neurons from embryonic stem cells）」、第１５巻、第３号、第４８７−４９１頁、２００４年３月発行
【非特許文献２】中山孝ら、  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、「アストロサイト由来因子は、胚性幹細胞の神経細胞への分化を指示する（Astrocyte-derived factors instruct differentiation of embryonic stem cell into neurons）」、第４６巻、第２号、第２４１−２４９頁、２００３年２月発行
【非特許文献３】ボテンシュタイン（Ｂｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎ  ＪＥ）ら、「無血清培地におけるラット神経芽細胞腫細胞系の生育(Growth of a rat neuroblastoma cell line in serum-free supplemented medium)」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ．、第７６巻、第５１４−５１７頁、１９７９年発行
【非特許文献４】ブリューワー（Ｂｒｅｗｅｒ  ＧＪ）ら、「低密度での規定培地における海馬ニューロンの生存及び生育：長所、技術又は低酸素(survival and growth of hippocampal neurons in defined medium at low density :advantages, technique or low oxgen)」、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第４９４巻、第６５〜７４頁、１９８９年発行
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、実質的に均質なアストロサイト様細胞馴化培地を安定的に供給すること、簡便な方法でアストロサイト様細胞馴化培地を大量に供給すること、所望の動物以外の動物由来の細胞成分を実質的に含まないアストロサイト様細胞馴化培地を供給すること、例えば、非ヒト細胞成分を実質的に含まないヒトアストロサイト様細胞馴化培地を供給すること、胚性幹細胞から神経系細胞を効率よく分化誘導することができるアストロサイト様細胞馴化培地を供給すること、単離された神経細胞を長期間にわたって安定に、良好な状態で培養維持することができるアストロサイト様細胞馴化培地を供給すること等の、少なくとも１つを達成しうる、胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地の製造方法を提供することを目的とするものである。【００１０】
本発明はまた、胚性幹細胞から神経系細胞を効率よく分化誘導すること、神経系細胞を長期間にわたって安定に、良好な状態で培養すること等の少なくとも１つを達成しうる、前記製造方法により得られるアストロサイト様細胞馴化培地を提供することを目的とするものである。【００１１】
さらに、本発明は、神経細胞を長期間にわたって安定に、良好な状態で培養すること、所望の動物以外の動物由来の成分を実質的に含まない条件下に所望の動物の神経細胞を培養すること等の少なくとも１つを達成しうる、神経細胞の維持方法を提供することを目的とするものである。【００１２】
また、本発明は、胚性幹細胞から神経系細胞を効率よく分化誘導すること、所望の動物以外の動物に由来する成分を実質的に含まない条件下で所望の動物の胚性幹細胞から神経系細胞に分化誘導すること等の少なくとも１つを達成しうる、胚性幹細胞から神経系細胞への分化誘導方法を提供することを目的とするものである。【００１３】
さらに、本発明は、所望の動物（例えば、ヒト）以外の成分の混入を実質的に伴わずに細胞移植治療を行なうこと、所望の動物（例えば、ヒト）の生体への高い適合性を発揮すること等の少なくとも１つを達成しうる、胚性幹細胞から分化誘導した神経系細胞を提供することを目的としている。
本発明のさらなる目的は、本明細書の記載及び従来技術より明らかである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、上記の目的に鑑みてなされたものであり、
〔１〕  胚性幹細胞の分化によって得られたアストロサイト様細胞を培養することを特徴とする、胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地の製造方法、
〔２〕  胚性幹細胞が、哺乳動物の胚性幹細胞である、前記〔１〕記載の製造方法、
〔３〕  哺乳動物が、霊長類動物である、前記〔２〕記載の製造方法、
〔４〕  霊長類動物が、ヒトである、前記〔３〕記載の製造方法、
〔５〕  （Ａ）胚性幹細胞からアストロサイト様細胞を得る工程、及び
（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られたアストロサイト様細胞を培養し、培養上清を得る工程、
を含む、前記〔１〕〜〔４〕いずれか１項に記載の製造方法、
〔６〕  工程（Ａ）において、アストロサイト馴化培地、予め調製されたアストロサイト様細胞馴化培地、又は該アストロサイト馴化培地若しくはアストロサイト様細胞馴化培地と機能的に同等の予め調製された培地を用いて、胚性幹細胞を分化誘導させる、前記〔５〕記載の製造方法、
〔７〕  前記〔１〕〜〔６〕いずれか１項に記載の製造方法により得られる、胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地、
〔８〕  前記〔７〕記載の胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地の存在下で神経細胞を培養することを特徴とする、神経細胞の培養方法、
〔９〕  前記〔８〕記載の培養方法により培養された神経細胞、
〔１０〕  前記〔７〕記載の胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地の存在下で胚性幹細胞から神経系細胞へ分化誘導することを特徴とする、胚性幹細胞から神経系細胞への分化誘導方法、並びに
〔１１〕  前記〔７〕記載の胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を用いて分化誘導されてなる、神経系細胞、
などに関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地の製造方法によれば、実質的に均質なアストロサイト様細胞馴化培地を、簡便に、大量にかつ安定的に供給することができる。また、本発明の製造方法によれば、所望の動物以外の動物由来の成分、例えば、非ヒト細胞成分を実質的に含まないヒトアストロサイト様細胞馴化培地を供給することができる。【００１６】
さらに、本発明の胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地は、実質的に均質であるという優れた性質を有する。また、本発明の胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地によれば、胚性幹細胞から神経系細胞を効率よく分化誘導することができ、神経細胞を長期間にわたって安定的に、良好な状態で維持することができる。また、本発明の胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地によれば、所望の動物以外の動物に由来する成分が実質的に存在しない条件下で神経系細胞を製造又は維持することができる。本発明の胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地によれば、例えば、非ヒト細胞成分を実質的に含まない工程でヒト神経系細胞（神経幹細胞、神経細胞、アストロサイト等）を製造することができる。【００１７】
また、本発明の神経細胞の培養方法によれば、神経細胞を長期間にわたって安定に、良好な状態で培養することができ、所望の動物以外の動物由来の成分が実質的に存在しない条件下で神経細胞を培養することができる。本発明の神経細胞の培養方法によれば、例えば、非ヒト細胞成分を実質的に含まない条件下でヒト神経細胞を培養維持することができる。【００１８】
さらに、本発明の胚性幹細胞から神経系細胞への分化誘導方法によれば、胚性幹細胞から神経系細胞を効率よく製造することができ、所望の動物以外の動物由来の成分が実質的に存在しない条件下で神経系細胞を得ることができる。したがって、本発明の分化誘導方法により得られた神経系細胞は、再生医療分野における細胞移植材、創薬アッセイ系（例えば、毒性評価、薬効評価等）への利用等の医薬品開発等に有用である。【００１９】
また、本発明の神経系細胞によれば、所望の動物以外の動物に由来する成分を実質的に伴わずに細胞移植治療を行なうことができる。さらに、本発明の神経系細胞は、所望の動物（例えば、ヒト）の生体への高い適合性を発揮しうる。本発明の神経系細胞は、所望の動物（例えば、ヒト）に適した医薬の開発のための創薬アッセイ系に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、マウス胎仔大脳皮質由来初代神経細胞をマウス胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地又はＮ２培地（ＤＭＥＭ：Ｆ−１２＋Ｎ２添加物）で２日間培養して得られた細胞の形態を示す図である。図中、パネルＡ及びＢは、Ｎ２培地を用いた場合の結果を示し、パネルＣ及びＤは、マウス胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を用いた場合の結果を示す。図中、スケールバーは５０μｍを示す。
【００２１】
【図２】図２は、免疫染色によりＧＦＡＰ（グリア繊維酸性タンパク質）及びＭＡＰ２（微小管関連タンパク質2）のそれぞれの発現を検出した結果を示す図である。図中、パネルＡは、Ｎ２培地を用いた場合の結果を示し、パネルＢは、マウス胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を用いた場合の結果を示す。ＭＡＰ２の発現は、緑色の蛍光により検出され、ＧＦＡＰの発現は、赤色の蛍光により検出される。また、図中、スケールバーは５０μｍを示す。
【００２２】
【図３】図３は、胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地及びＢ−２７サプリメント含有NeurobasalTM培地を用いた場合に得られる細胞の培養８日目の状態を示す図である。図中、パネルＡ及びＢは、Ｂ−２７サプリメントを含有するNeurobasalTM培地を用いた場合の細胞を示し、パネルＣ及びＤは、胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を用いた場合の細胞を示す。また、図中、スケールバーは５０μｍを示す。
【００２３】
【図４】図４は、胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地及びＢ−２７サプリメント含有NeurobasalTM培地を用いた場合に得られる細胞の培養１０日目の状態を示す図である。図中、パネルＡ及びＢは、Ｂ−２７サプリメントを含有するNeurobasalTM培地を用いた場合の細胞を示し、パネルＣ及びＤは、胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を用いた場合の細胞を示す。また、図中、スケールバーは５０μｍを示す。
【００２４】
【図５】図５は、サル胚性幹細胞から調製したアストロサイト様細胞を示す。抗ＧＦＡＰ抗体及び抗ＭＡＰ２抗体による免疫染色の結果として、図中、パネルＡはＧＦＡＰの発現（緑色蛍光）、パネルＢはＭＡＰ２の発現（赤色蛍光）、パネルＣは、パネルＡとＢの重ね合わせ画像を示す。スケールバーは１００μｍを示す。
【００２５】
【図６】図６は、サル胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を用いて、サル胚性幹細胞を神経（系）細胞に分化誘導した結果を示す図である。  図中、パネルＡ及びＤは、免疫染色を行った細胞（ｈｒＧＦＰの構成的発現により緑色蛍光を呈し、本検討に用いたサル胚性幹細胞（ＣＭＫ６-Ｇ４株）及びこれから派生した分化細胞の所在を示す。）を、パネルＢとパネルＥは、それぞれβIIIチューブリン発現（赤色蛍光；パネルＡに対応するもの）とＭＡＰ２発現（赤色蛍光；パネルＤに対応するもの）を、またパネルＣ及びＦは、それぞれパネルＡとＢ、パネルＤとＥの重ね合わせ画像を示す。また、図中、スケールバーは１００μｍを示す。
【００２６】
【図７】図７は、ヒト胚性幹細胞から調製したアストロサイト様細胞を示す。抗ＧＦＡＰ抗体及び抗ＭＡＰ２抗体による免疫染色の結果として、図中、パネルＡはＧＦＡＰの発現（緑色蛍光）、パネルＢはＭＡＰ２の発現（赤色蛍光）、パネルＣは、パネルＡとＢの重ね合わせ画像を示す。スケールバーは１００μｍを示す。
【００２７】
【図８】図８は、ヒト胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を用いて、ヒト胚性幹細胞を神経（系）細胞に分化誘導した結果を示す図である。  図中、パネルＡ及びＤは、免疫染色を行った細胞（ｈｒＧＦＰの構成的発現により緑色蛍光を呈し、本検討に用いたヒト胚性幹細胞（ＳＡ１８１ｈｒＧ２株）及びこれから派生した分化細胞の所在を示す。）を、パネルＢとパネルＥは、それぞれβIIIチューブリン発現（赤色蛍光；パネルＡに対応するもの）とＭＡＰ２発現（赤色蛍光；パネルＤに対応するもの）を、またパネルＣ及びＦは、それぞれパネルＡとＢ、パネルＤとＥの重ね合わせ画像を示す。また、図中、スケールバーは１００μｍを示す。
【００２８】
【図９】図９は、ヒト神経前駆細胞をヒト胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地又はＮ２培地で１４日間培養して得られた細胞集団におけるクラスIIIβチューブリン陽性細胞を免疫染色により検出した結果を示す。  図中、パネルＡは、Ｎ２培地（Ｎ２）を用いた結果を示し、パネルＢは、ヒト胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地（ｈＥＳ-ＡＣＭ）を用いた結果を示す。Ｎ２培地を用いた場合、培養容器中にパネルＡのような部分がまばらに観察されるのに対し、ｈＥＳ-ＡＣＭを用いた場合には、培養容器中の全面にパネルＢのような神経細胞が観察される。図中、スケールバーは１００μｍを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明は、胚性幹細胞の分化によって得られるアストロサイト様細胞を培養することにより得られる馴化培地を、神経系細胞の培養又は胚性幹細胞から神経系細胞への分化誘導に用いると、初代培養アストロサイトの馴化培地と同等又はそれ以上の優れた神経系細胞培養維持能及び神経分化誘導能を示すという驚くべき知見に基づく。【００３０】
本明細書中、「アストロサイト様細胞」とは、胚性幹細胞の分化により得られるグリア線維酸性タンパク質（Glial fibrillary acidic protein：ＧＦＡＰ）を発現する細胞集団として定義される。一方、「初代培養アストロサイト」とは、生体より組織を取出し、該組織をトリプシン等の細胞分散剤で処理して個々の細胞を解離させることにより得られる、ＧＦＡＰを発現する細胞集団をいう。したがって、かかる初代培養アストロサイトには、組織を構成する種々の細胞が混在する。【００３１】
また、本明細書中、「アストロサイト馴化培地」とは、特に明記しない限り、前記初代培養アストロサイトに由来する培養上清をいう。【００３２】
さらに、本明細書中、本発明の、胚性幹細胞を分化誘導して得られたアストロサイト様細胞の馴化培地を、「アストロサイト様細胞馴化培地」又は「胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地」ともいう。【００３３】
なお、本明細書中、前記「アストロサイト馴化培地」、本発明の「アストロサイト様細胞馴化培地」及び本発明の「胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地」を総称して、「馴化培地」又は「本発明の馴化培地」と表記する場合もある。【００３４】
また、本明細書中で用いられる「神経系細胞」という用語は、神経幹細胞、神経細胞(ニューロン)、グリア細胞（例えば、アストロサイト、オリゴデンドロサイト）等を包含するものとする。なお、グリア細胞は、神経細胞（ニューロン）を支持する細胞全般を指す。【００３５】
本発明の１つの側面は、胚性幹細胞の分化によって得られたアストロサイト様細胞を培養することを特徴とする、胚性幹細胞由来アストロサイト馴化培地の製造方法である。本発明の製造方法によれば、胚性幹細胞から神経系細胞を効率よく分化誘導することができるという優れた性質を有する馴化培地を、簡便な操作により、安定かつ大量に供給することができる。また、本発明の製造方法によれば、神経細胞を長期間にわたって良好な状態で培養維持することができるという優れた性質を有する馴化培地を簡便な操作により、安定かつ大量に供給することができる。【００３６】
本発明の製造方法の特徴の一つは、馴化培地の製造に際して、胚性幹細胞の分化によって得られるアストロサイト様細胞を用いる点にある。したがって、本発明の製造方法により得られる馴化培地は、神経系細胞への分化誘導等に関し、初代培養アストロサイトを用いて得られる馴化培地と同等又はそれ以上の性質を有する。しかも、本発明の製造方法によれば、初代培養アストロサイトを使用する際に危惧される問題、すなわち、供給源である生体の部位、年齢等により、培地の性質や状態等にばらつきを生じる恐れがあり、かつ、アストロサイト以外の他の細胞の混入が避けられない、という問題を回避することができるので、実質的に均質な胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を提供することができる。【００３７】
また、本発明の製造方法に用いるアストロサイト様細胞は、無限増殖性を有する胚性幹細胞を一定の条件下で分化させることによって得られる細胞であり、量産性や品質の安定性が優れている。そのため、本発明の製造方法は、初代アストロサイトを用いる馴化培地製造方法に比較して、馴化培地を安定的にかつ大量に供給することができ、工業的に優れた効果を発揮する。【００３８】
さらに、本発明の製造方法は、生体由来の初代培養アストロサイトを使用するものではないため、所望の動物以外の動物由来の細胞成分を実質的に含まない条件下で、胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を供給できるという優れた効果を発揮する。また、本発明の製造方法によれば、例えば、非ヒト細胞成分を実質的に含まない工程で胚性幹細胞由来アストロサイト馴化培地を供給することができる。このため、例えば、ヒト胚性幹細胞由来アストロサイト馴化培地を用いることにより、非ヒト細胞成分を実質的に含まない工程で、ヒト胚性幹細胞からヒト神経系細胞を製造することが可能になる。したがって、本発明によれば、細胞移植治療等の再生医療への応用、創薬研究における霊長類動物、特に、ヒト細胞を利用する医薬品開発、霊長類動物、特に、ヒトの神経系細胞の実質的に純粋な状態での培養や長期にわたる安定的な培養等が可能になる。【００３９】
本発明の製造方法に用いる胚性幹細胞は、使用目的等に応じて、適当な動物由来の胚性幹細胞であればよく、具体的には、哺乳動物の胚性幹細胞等が挙げられる。前記哺乳動物としては、より具体的には、マウス、ラット、ミンク、ハムスター、ブタ、サル（例えば、マーモセット、アカゲザル、カニクイザル等）、ヒト等が挙げられる。なお、本発明においては、例えば、動物への移植等の目的で用いられる神経系細胞の製造、維持等、具体的には、ヒトへの細胞移植治療等の臨床応用のための細胞の製造、維持等に用いるための馴化培地を製造する場合、組織適合性等の観点から、移植等の対象となるヒト由来の胚性幹細胞を用いることが有利である。【００４０】
本発明の製造方法としては、
（Ａ）胚性幹細胞からアストロサイト様細胞を得る工程、及び
（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られたアストロサイト様細胞を培養し、培養上清を得る工程、
を含む方法等が挙げられる。【００４１】
前記工程（Ａ）は、具体的には、特に限定されないが、例えば、
１）アストロサイト馴化培地を用いて、胚性幹細胞から神経幹細胞へ分化誘導する工程、
２）前記工程で生じた神経幹細胞を増幅する工程、及び
３）前記工程で増幅された神経幹細胞からアストロサイト様細胞ヘ選択的に分化誘導する工程、
により行うことができる。【００４２】
前記工程１）において、胚性幹細胞から神経幹細胞への分化誘導は、例えば、胚性幹細胞を、アストロサイト馴化培地中で培養すること等により行なうことができる。なお、前記工程１）においては、前記アストロサイト馴化培地若しくは該アストロサイト馴化培地に機能的に同等の培地等に、因子（例えば、成長因子、サイトカイン等）や化学的に決定された(chemically-defined)成分が添加された基本培地からなる合成培地を混合してもよい。【００４３】
なお、本発明の製造方法においては、一旦、胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞が得られた後は、前記アストロサイト馴化培地の代わりに、前記胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞により得られるアストロサイト様細胞馴化培地を用いることができる。本発明のアストロサイト様細胞馴化培地を継続的に使用して本発明のアストロサイト様細胞馴化培地を製造することができる。本発明においては、好ましくは、前記工程１）として、
１’）胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を用いて、胚性幹細胞から神経幹細胞へ分化誘導する工程を行なう態様が望ましい。【００４４】
前記工程１）及び１’）それぞれにおける分化誘導は、例えば、浮遊培養等により行なうことができる。【００４５】
前記工程１）又は１’）において、より具体的には、例えば、胚性幹細胞の未分化コロニーを丸ごとの状態で浮遊培養することにより、細胞塊（いわゆるNeural stem sphere;  ＮＳＳ）が生じ、該ＮＳＳの表層部に多数の神経幹細胞が局在する構造等の特徴を示す細胞が出現すればよい。ここで、「神経幹細胞」とは、アストロサイト様細胞に分化する前駆細胞であり、ネスチン、ムサシ等の神経幹細胞マーカー、Ａ２Ｂ５等のグリア前駆細胞マーカー等を発現する陽性細胞として同定できる細胞をいう。【００４６】
前記培養に用いる培養容器の形状及び大きさは、細胞塊（ＮＳＳ）が、浮遊培養中に培養容器の底面等に接着せず、安定に浮遊培養を継続して行なうことができるものであればよい。かかる培養容器としては、例えば、浮遊培養用ディッシュ、細菌用ペトリディッシュ等が挙げられる。また、前記培養容器は、０．５重量％  アガロース（寒天）を入れ、底面に細胞塊が接着しないように加工されたものであってもよい。【００４７】
浮遊培養時間は、用いられる胚性幹細胞の種類に応じて適宜設定することができる。かかる培養時間は、例えば、ＮＳＳの表層部に、アストロサイト前駆細胞となる神経幹細胞が出現することを指標として設定してもよい。前記神経幹細胞は、例えば、神経幹細胞マーカー（例えば、ネスチン、ムサシ等）、グリア前駆細胞マーカー（Ａ２Ｂ５等）の発現を指標として検出することができる。さらに、浮遊培養による神経系細胞の分化誘導効率の評価は、幼若神経マーカー（βIIIチューブリン等）の発現を、免疫組織化学的手法により検出することによっても行なうことができる。前記培養時間は、具体的には、例えば、マウス胚性幹細胞を用いる場合、通常、１〜１０日、好ましくは、４日前後（例えば３〜５日）、霊長類動物（サル、ヒト）胚性幹細胞の場合、通常、１〜１５日、好ましくは、７日前後（例えば、５〜８日）であればよい。【００４８】
ついで、神経幹細胞を増幅する〔工程２〕。前記工程２）において、前記工程１）で生じた神経幹細胞自体又は該神経幹細胞を含むＮＳＳを、接着培養する。前記工程２）を行なうことにより、神経幹細胞が増幅される。また、神経幹細胞を含むＮＳＳを接着培養した場合、接着したＮＳＳの周囲に、神経幹細胞が、遊走増殖される。したがって、かかる工程２）を行ない、神経幹細胞を増幅することにより、後述の工程３）でアストロサイト様細胞を大量に調製できる。【００４９】
前記工程２）において、ＮＳＳを、神経幹細胞等を接着させて増幅させるに適した培地としては、例えば、ＤＭＥＭ：Ｆ−１２（１：１）、商品名：NeurobasalTM培地〔インビトロジェン（Invitrogen）社製〕等に、Ｂ２７添加物〔ブリューワー（Brewer，G．J．），Focus，16，6−9（1994）；ブリューワー（Brewer，G．J．），Ｊ．Neurosci．Res．，35，567-576（1993）〕〔インビトロジェン（Invitrogen）社製、カタログ番号：17504−044〕と、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）等の増殖・成長因子とを含む培地等が挙げられる。具体的には、Ｂ２７添加物とｂＦＧＦと任意にＥＧＦとを含むNeurobasal培地、Ｎ２添加物とｂＦＧＦと任意にＥＧＦとを含むＤＭＥＭ：Ｆ−１２（１：１）を用い、接着培養を行なうこと等により、神経幹細胞を増幅させることができる。【００５０】
神経幹細胞を増幅するための接着培養に際しては、ＮＳＳ及び遊走増幅する神経幹細胞それぞれの培養容器への接着性と神経幹細胞の性状を安定に維持する観点から、培養容器を、例えば、マトリゲルTM〔ビーディー・バイオサイエンス（ＢＤ  Bioscience）社製〕、ポリ−Ｌ−リジン、ラミニン等でコートした培養容器を用いることが好ましい。【００５１】
前記培養容器のコーティングは、マトリゲルTMを用いる場合、製造者の説明書に記載の方法により行なえばよい。また、その他の細胞外基質を用いる場合も、慣用の方法、例えば、細胞外基質を含む溶液に、培養容器の底面が十分に浸るようにし、一定時間放置又は３７℃でインキュベーションする方法等により行なうことができる。【００５２】
前記ｂＦＧＦ、ＥＧＦ等の増殖・成長因子を用いる場合、培地中におけるｂＦＧＦ、ＥＧＦ等の増殖・成長因子の濃度は、胚性幹細胞の種類等により適宜設定することができる。ｂＦＧＦを用いる場合、１〜２００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、２０〜４０ｎｇ／ｍｌであることが望ましい。また、ＥＧＦを用いる場合、１０〜５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１０〜２０ｎｇ／ｍｌであることが望ましい。さらに、ｂＦＧＦとＥＧＦとを併用する場合、例えば、ｂＦＧＦを１０〜２０ｎｇ／ｍｌの濃度、ＥＧＦを１０〜２０ｎｇ／ｍｌの濃度となるように混合して用いてもよい。【００５３】
前記接着培養における培養時間は、胚性幹細胞の由来元となる動物種、分化誘導の程度等に応じて適宜設定することができる。【００５４】
前記工程２）においては、遊走増幅した神経幹細胞を、トリプシン、ディスパーゼ、コラゲナーゼ、パパイン等の酵素、ＥＤＴＡ、細胞解離バッファー〔ギブコ  インビトロジェン社製〕等の細胞分散剤を用いて培養器から解離・分散させ、別の新しい培養容器に継代することによって、さらに神経幹細胞を増幅することもできる。具体的には、例えば、０．０５〜０．３５重量％トリプシンを用いて、遊走増殖した各神経幹細胞を解離・分散し、さらに継代増幅すればよい。【００５５】
また、ＮＳＳから神経幹細胞を遊走増幅させる途上で、培養系から未分化胚性幹細胞等の神経幹細胞以外の細胞種の混在率を低減し、神経幹細胞の存在比を高める観点から、細胞集団の中心部分に存在する未分化胚性幹細胞等を除去してもよい。【００５６】
その後、前記工程２）で増幅された神経幹細胞からアストロサイト様細胞ヘ選択的に分化誘導する〔工程３]。【００５７】
アストロサイト様細胞への選択的な分化誘導は、用いる胚性幹細胞の種類に応じて適宜設定することができるが、例えば、前記工程２）で用いた培地を、前記ｂＦＧＦ、ＥＧＦ等の増殖・成長因子を含まない培地に交換すること等により、行なうことができる。【００５８】
前記工程（Ａ）において、工程１）〜３）を行なうことにより、ＧＦＡＰを発現する細胞を含む細胞集団として、胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞を得ることができる。【００５９】
ついで、前記工程（Ａ）で得られた胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞を培養し、培養上清を得る〔工程（Ｂ）〕。【００６０】
前記工程（Ｂ）において、胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞の培養は、該アストロサイト様細胞の生存が可能で、かつ該アストロサイト様細胞から各種因子が放出され得る条件であれば、培養条件は特に限定されないが、異種生物細胞成分の混入を回避した製造過程が必要である場合等においては、無血清培地を培地に用いることが好ましい。具体的には、例えば、Ｎ２添加物を、×１濃度〔５μｇ／ｍｌ インスリン、１００μｇ／ｍｌ トランスフェリン、６３ｎｇ／ｍｌ プロゲステロン、１６．１１μｇ／ｍｌ プトレッシン、２ｎｇ／ｍｌ 亜セレン酸塩〕で含有するＤＭＥＭ：Ｆ−１２培地などを用い、３７℃、ＣＯ2濃度５％前後で培養すればよい。【００６１】
前記工程（Ｂ）における培養時間は、動物種、細胞数等に応じ、アストロサイト様細胞が産生する各種因子を十分に培養液中に放出させるように適宜設定することができるが、通常は、例えば、１日前後であればよい。【００６２】
培養後、得られた培養物から上清を回収する。具体的には、培養物を全部又は上清の一部を回収し、例えば、遠心分離及び適切な孔径のフィルター等に供して、アストロサイト様細胞を除去することにより、無細胞の培養上清として胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を得ることができる。【００６３】
培養物を全部回収して、アストロサイト様細胞を除去した場合、当該アストロサイト様細胞に、前記工程（Ｂ）での培養に用いる培地及び添加剤を添加し、同様の培養条件で培養を行なうことからなる一連の操作を繰り返すことにより、胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を繰り返し製造することが可能である。また、培養物から上清の一部を回収した場合、残部の培養物に、前記工程（Ｂ）での培養に用いる培地及び添加剤を補追し、さらに、同様の培養条件で培養を行なう一連の操作を繰り返すことにより、胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を繰り返し製造することが可能である。本発明の製造方法には、かかる態様の製造方法も含まれる。【００６４】
本発明の製造方法により得られた胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地によれば、胚性幹細胞から神経系細胞を効率よく分化誘導することができる。また、本発明の製造方法により得られた胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地によれば、神経細胞を長期間にわたって安定に、良好な状態で培養維持することができる。【００６５】
本発明の製造方法により得られた胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地は、神経細胞培養維持能及び胚性幹細胞における神経分化誘導能を調べることにより評価することができる。【００６６】
前記神経細胞培養維持能は、例えば、生体から調製された初代培養神経細胞又は胚性幹細胞から分化誘導して得られた神経細胞を、本発明の製造方法により得られた胚性幹細胞由来アストロサイト馴化培地の存在下に培養し、経時的又は定期的に、細胞の性状（生存・形態等）を解析することにより評価することができる。なお、前記神経細胞の培養は、例えば、シュプリンガーフェアラーク東京発行、中川八郎監修、畠中寛編、ニューロサイエンス  ラボマニュアル「神経細胞培養法」第３４７頁（３５）（１９９７年４月２４日）に記載の条件により行なうことができる。【００６７】
神経細胞の維持培養を行なう場合、該神経細胞を、評価対象の馴化培地の存在下、培養に適した条件で培養する。形態的特徴を、細胞体、樹状突起、軸索、軸索成長円錐等の有無に基づいて評価する。また、マーカーとして、神経伝達物質の受容体の発現、例えば、ニューロフィラメント、チロシン水酸化酵素、グルタミン酸脱炭酸酵素、コリンアセチルトランスフェラーゼ等の発現を免疫組織化学的手法等により検出すること等により、評価する。これらマーカーの発現を示し、特有の形態がみられた場合、前記馴化培地を、神経細胞を良好に維持することができるものと評価することができる。【００６８】
本発明の他の側面は、本発明の製造方法により得られる、胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地である。本発明の胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地は、胚性幹細胞から分化誘導して得られたアストロサイト様細胞の培養上清に基づくものであるため、初代培養アストロサイトの馴化培地に比べ、より安定した品質を示し得る。また、本発明の胚性幹細胞由来アストロサイト馴化培地と胚性幹細胞とを組み合わせて使用すれば、所望の動物以外の動物由来の成分が実質的に存在しない工程により、神経系細胞を製造することができる。したがって、本発明の胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地によれば、実質的に所望の動物以外の動物由来の成分を含まない、より高い品質の神経系細胞を供給できるため、例えば、医薬品開発における創薬アッセイ系への利用や細胞毒性評価への利用が可能になり、また、細胞移植治療等の再生医療に適した適合性の高い移植細胞材の供給が可能になる。【００６９】
さらに、本発明の胚性幹細胞由来アストロサイト馴化培地によれば、胚性幹細胞から神経系細胞を効率よく分化誘導することができ、神経細胞を長期間にわたって安定に、良好な状態で培養維持することができる。【００７０】
本発明の胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地は、Ｎ２添加物〔インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸塩、プロゲステロン；例えば、ボテンシュタイン（Bottenstein）ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、76：514（1979）等を参照のこと〕、アルブミン、前記アンチオキシダント等の添加剤をさらに含有してもよい。本発明の胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地中における前記添加剤の含有量は、使用目的、培養対象の細胞、例えば、胚性幹細胞、神経系細胞等の種類、該細胞の供給源となる動物種に応じて適宜設定することができる。前記Ｎ２添加物の含有量は、特に限定されないが、例えば、インスリンについて、最終濃度１〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは、３〜２０μｇ／ｍｌ、トランスフェリンについて、最終濃度１〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは、３〜２０μｇ／ｍｌ、亜セレン酸塩について、最終濃度１〜１００ｎＭ、好ましくは、３〜５０ｎＭ、プロゲステロンについて、最終濃度１〜１００ｎＭ、好ましくは、２０ｎＭであればよい。【００７１】
なお、本発明の胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地は、使用目的、培養対象の細胞の種類、該細胞の供給源となる動物種等に応じて、細胞の培養に適し、所望の細胞への分化誘導を促進し得る因子等をさらに含有してもよい。【００７２】
また、前記胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地は、細胞、例えば、神経系細胞のより長期かつ安定的な維持及びより効率のよい分化誘導を行なう観点から、細胞、例えば、胚性幹細胞、神経系細胞等に用いられる慣用の基本培地をさらに含有してもよい。前記胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地と、基本培地との混合比は、使用目的、培養対象の細胞の種類、該細胞の供給源となる動物種等に応じて、適宜設定されうる。【００７３】
本発明の胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地は、例えば、凍結又は冷蔵して保存することができる。本発明の胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を長期保存する場合、凍結して保存することが望ましく、好ましくは、−１０〜−８０℃で保存することが望ましい。本発明の胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を凍結して保存する場合、当該培地の性能の根源であると考えられる各種タンパク質性因子の活性低下を軽減し、安定した性質を発揮させる観点等から、凍結融解の操作を繰り返さないことが望ましい。また、冷蔵保存する場合、好ましくは、４〜８℃で保存することが望ましい。【００７４】
本発明の胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地は、単独で、あるいは、例えば、各動物種の胚性幹細胞、神経系細胞、細胞の培養に適した因子又は試薬、分化誘導に適した因子又は試薬、細胞接着分子でコーティングされた培養容器、浮遊培養に適した培養容器等とともにキットとしても提供することができる。【００７５】
なお、本発明の胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地中から分離同定される各種の機能的に有効な成分（以下、「機能成分」と呼称）をそれぞれ有効量用いることにより、本発明の胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地と同等の効果を得ることが可能となる。したがって、本発明には、例えば、個々の機能成分を供給し、使用前に前記機能成分それぞれを混合して、本発明の胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地と同等の神経系細胞の培養能、胚性幹細胞から神経系細胞への分化誘導能を有する機能成分混合培地を調製する態様も含まれる。本発明には、前記機能成分を混合して得られた機能成分混合培地も含まれる。また、前記機能成分は、単独でも、神経系細胞の培養能、胚性幹細胞から神経系細胞への分化誘導能を示しうる成分もある。かかる機能成分の単独での使用も本発明に含まれる。前記機能成分は、単独で、又は少なくとも２種を組み合わせて、神経系細胞の培養用及び／又は維持用試薬、胚性幹細胞から神経系細胞への分化誘導用試薬として、提供することができる。【００７６】
また、本発明の別の側面は、胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を培地として使用すること、具体的には、胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地の存在下で神経細胞を培養することを特徴とする、神経細胞の培養方法である。本発明の神経細胞の培養方法によれば、本発明の胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地が用いられているため、神経細胞を長期間にわたって安定に、良好な状態で培養することができ、所望の動物以外の動物由来の成分が実質的に存在しない条件下で神経細胞を培養することができる。【００７７】
また、本発明の培養方法においては、神経細胞の供給源となる動物種は、特に限定されるものではなく、例えば、哺乳動物、具体的には、マウス、ラット、ミンク、ハムスター、ブタ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、サル、ヒト等が挙げられる。【００７８】
なお、本発明の培養方法においては、適用対象となる神経系細胞を、例えば、移植等に用いる場合、適合性等の観点から、胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地は、移植対象となる動物と同種の胚性幹細胞より得られたアストロサイト様細胞の馴化培地であることが望ましい。【００７９】
本発明の培養方法は、神経細胞を培養するいかなる方法にも適用することができる。【００８０】
神経細胞を培養する場合、例えば、該神経細胞を、本発明の胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地の存在下、培養に適した条件で培養することにより行なわれうる。胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を用いること以外の培養条件は、特に限定されるものではないが、具体的には、胚性幹細胞由来アストロサイト馴化培地の存在下、Ｎ２添加物を、×１濃度〔５μｇ／ｍｌ インスリン、１００μｇ／ｍｌ トランスフェリン、６３ｎｇ／ｍｌ プロゲステロン、１６．１１μｇ／ｍｌ プトレッシン、２ｎｇ／ｍｌ 亜セレン酸塩〕で含有するＤＭＥＭ：Ｆ−１２培地で胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞を培養した後の培養上清、本発明の胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地に前記Ｎ２添加物を×１濃度で追補した培地等を用い、３７℃前後（例えば、３７℃±０．２℃）、ＣＯ2  濃度５％前後（例えば、４．８〜５．２％）で、ポリ−Ｌ−リジン、ラミニン等でコーティングされた培養容器で培養すること等が挙げられる。【００８１】
本発明の別の側面は、本発明の製造方法により得られた胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を培地として用いること、例えば、本発明の製造方法により得られた胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地の存在下で胚性幹細胞から神経系細胞へ分化誘導することを特徴とする、胚性幹細胞から神経系細胞への分化誘導方法である。本発明の分化誘導方法によれば、本発明の胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地が用いられているため、所望の動物由来の神経系細胞を調製する場合、かかる動物種の胚性幹細胞を用いることにより、所望の動物以外の動物由来の成分が実質的に存在しない条件下で神経系細胞を得ることができる。したがって、本発明の分化誘導方法により得られた神経系細胞によれば、移植等への使用に好適な細胞を調製することができるという優れた効果を発揮する。また、本発明の分化誘導方法によれば、ヒトへの臨床応用、例えば、神経系細胞を用いる細胞移植治療において、非ヒト成分を実質的に含まない工程により得られたヒト神経系細胞を製造できる点で有利である。【００８２】
本発明の分化誘導方法に用いられる胚性幹細胞は、得られた神経系細胞の使用目的等に応じて、適宜選択することができる。本発明の分化誘導方法に用いられる胚性幹細胞の供給源の動物種は、特に限定されるものではなく、例えば、哺乳動物、具体的には、マウス、ラット、ミンク、ハムスター、ブタ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、サル、ヒト等が挙げられる。【００８３】
本発明の分化誘導方法により、胚性幹細胞から、神経幹細胞への分化誘導は、前記製造方法における工程（Ａ）の工程１’）により行なうことができる。【００８４】
得られた神経幹細胞は、神経系細胞（神経細胞やグリア細胞）への分化能や前記神経幹細胞マーカーの発現等を調べることにより評価することができる。【００８５】
また、本発明の分化誘導方法による、胚性幹細胞から、神経細胞への分化誘導は、本発明の胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を用いて、胚性幹細胞のコロニーを、浮遊培養して、中心（芯）部分の未分化胚性幹細胞の層と表層部に生じた多数の神経幹細胞とから構成される構造等の特徴を示す細胞塊（ＮＳＳ）を生じさせ、得られたＮＳＳを、本発明の胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地の存在下、接着培養すること；前記神経幹細胞を、本発明の胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地の存在下、接着培養すること等により行なうことができる。さらに、得られた神経細胞の同定は、神経細胞マーカー、例えば、ニューロフィラメント、チロシン水酸化酵素、グルタミン酸脱炭酸酵素、コリンアセチルトランスフェラーゼ等のマーカーの発現を指標として行うことができる。用いられる培地は、本発明の胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地が挙げられ、さらに、ＤＭＥＭ：Ｆ−１２、ＤＭＥＭ、Ｆ−１２、ＭＥＭ、NeurobasalTM等のいずれかの培地や新たな因子等を添加してもよい。培養気相の条件としては、３７℃前後、例えば、３７℃±０．２℃、ＣＯ2濃度５％前後、例えば、４．８〜５．２％、湿度１００％の条件等が挙げられる。培養時間は、胚性幹細胞の供給源となる動物種に応じて、適宜設定でき、マウスの場合、１〜７日であることが望ましく、サルの場合、１〜１４日であることが望ましい。【００８６】
得られた細胞が神経細胞であることは、例えば、形態的特徴、例えば、細胞体、樹状突起、軸索、軸索成長円錐等を指標として確認することもできる。また、得られた神経細胞は、ニューロフィラメント、チロシン水酸化酵素、グルタミン酸脱炭酸酵素、コリンアセチルトランスフェラーゼ等のマーカー又はそれをコードする遺伝子の発現等を調べることにより評価することができる。【００８７】
本発明の分化誘導方法による、胚性幹細胞から、グリア細胞への分化誘導は、前記ＮＳＳ又は神経幹細胞を、接着培養すること等により行なうことができる。用いられる培地としては、特に限定されないが、ＤＭＥＭ：Ｆ−１２＋Ｎ２添加物（Ｎ２培地）等が挙げられる。培養時間は、用いられる胚性幹細胞の種類により適宜設定することができ、マウス由来胚性幹細胞の場合、１〜７日であることが望ましく、サルの場合、１〜１４日であることが望ましい。さらに、得られたグリア細胞は、形態的特徴やグリア細胞マーカー、例えば、アストロサイトはグリア繊維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）等のマーカーの発現等を指標とし同定することができる。【００８８】
本発明の分化誘導方法により得られる神経系細胞は、所望の動物以外の動物由来の成分、例えば、非ヒト成分の非存在下に得られる。したがって、前記神経系細胞によれば、所望の動物以外の動物由来の成分を実質的に伴わずに細胞移植治療を行なうことができる。また、本発明の分化誘導方法により得られる神経系細胞は、胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を用いて得られる細胞であるため、所望の動物（例えば、ヒト）の胚性幹細胞由来のアストロサイト様細胞馴化培地を用いて、分化誘導することにより、所望の動物以外の動物由来の成分を実質的に伴わずに、所望の動物の生体への高い適合性を有する神経系細胞を得ることができる。したがって、本発明の神経系細胞は、所望の動物に適した医薬の開発のための創薬アッセイ系に利用することができる。また、本発明の神経系細胞によれば、個体の神経変性部位又は神経損傷部位に導入することにより、神経変性又は神経損傷に起因する疾患や状態、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症等の神経変性疾患；脳虚血、脱髄疾患、頭部外傷、脊髄損傷、脳梗塞等における神経再生医療への応用が可能になる。かかる神経系細胞も本発明に含まれる。
【実施例】
【００８９】
以下、実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明は、かかる実施例により限定されるものではない。なお、以下の実施例において、「％」は、特に明記がない場合は、重量％を示すものとする。また、ＣＯ2における「％」表記は、体積％を示すものとする。【００９０】
実施例１
マウス胚性幹細胞１２９ＳＶ株を常法により培養し、播種後３日目に、キャピラリーを用いて、物理的に細胞をコロニーごとピックアップした。得られたコロニーを、神経細胞培養用培養液（ここでは、初代培養アストロサイト馴化培地の代替物として使用した、住友ベークライト製品：品番ＭＢ−Ｘ９５０１）で３７℃、５％ＣＯ2で４日間浮遊培養し、それにより、中心に未分化胚性幹細胞の層、神経幹細胞の表層、両者の中間層の３層構造を形成しているNeural stem sphere（ＮＳＳ）を得た。【００９１】
その後、前記ＮＳＳを、ポリ−Ｌ−リジン／ラミニンコートディッシュ中、１×Ｂ−２７サプリメント〔カタログ番号：１７５０４−０４４、インビトロジェン  コーポレーション（Invitrogen Corporation）製；×５０濃度の市販品を、×１の濃度に調整して使用〕を含有したNeurobasalTM培地〔カタログ番号：２１１０３−０４９、インビトロジェン  コーポレーション製〕上に播種し、毎日、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を最終濃度２０ｎｇ／ｍｌとなるよう添加しながら、３７℃、５％ＣＯ2で培養し、神経幹細胞を増殖させた。なお、前記ポリ−Ｌ−リジン／ラミニンコートディッシュは、ポリ−Ｌ−リジンコートディッシュ〔ＩＷＡＫＩ、旭テクノグラス社製〕を、１０μｇ／ｍｌ  ラミニン〔カタログ番号：Ｌ０００１、旭テクノグラス社製〕で３時間処理することによりコーティングした。【００９２】
７日間培養した後、遊走増幅された神経幹細胞の存在比を高める目的でキャピラリーピペットを用いて、増殖している細胞の中心部分の未分化細胞を物理的に除去し、３７℃、５％ＣＯ2でさらに７日間培養を継続し、神経幹細胞を増幅させた。【００９３】
その後、増幅した神経幹細胞をアストロサイト様細胞に選択的に分化誘導するために、培地を除去して、Ｃａ2+及びＭｇ2+不含リン酸緩衝化生理食塩水で細胞を洗浄後、０．０５重量％  トリプシン／ＥＤＴＡで該細胞を解離させた。解離後の細胞について、ポリ−Ｌ−リジン／ラミニンコートディッシュ〔住友ベークライト社製〕中、以下の濃度：５μｇ／ｍｌ  インシュリン、１００μｇ／ｍｌ  トランスフェリンと、６．３ｎｇ／ｍｌ  プロゲステロン、１６．１１μｇ／ｍｌ  プトレッシン、５．２ｎｇ／ｍｌ  亜セレン酸塩、カタログ番号：１７５０２−０４８、インビトロジェン（Invitrogen）社製でＮ２添加物を添加したＤＭＥＭ：Ｆ−１２培地（以下、Ｎ２培地と称す）により継代培養を行なった。【００９４】
ついで、３日間培養後、得られた培養物から上清を回収し、孔径２２ｎｍのフィルター〔商品名：ＤＩＳＭＩＣ−２５ＣＳ、アドバンテック社製〕で濾過し、胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を得た。得られた胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地に、栄養素を補う目的でＮ２添加物〔インビトロジェン  コーポレーション製〕を、最終濃度１％〔前記Ｎ２添加物（×１００濃度）を×１濃度となるように調整〕となるように添加した。【００９５】
実施例２
神経細胞の培養能の検討に用いる神経細胞を調製する目的で、凍結保存されたマウス胎仔大脳皮質〔神経細胞培養システム〔住友ベークライト社製〕の商品名：神経細胞ＣＸ（Ｍ）〔カタログ番号：ＭＢ−Ｘ０３０５〕を室温で融解し、神経細胞分散液〔神経細胞培養システム〔住友ベークライト社製〕の細胞分散液キット〔カタログ番号：ＭＢ−Ｘ９９０１〕に分散させ、マウス胎仔大脳皮質由来初代神経細胞分散液を得た。【００９６】
ついで、前記マウス胎仔大脳皮質由来初代神経細胞分散液を、日立製作所社製himac  CF702を用い、３００ｒｐｍで1分間遠心分離し、マウス胎仔大脳皮質由来初代神経細胞を洗浄した。ついで、マウス胎仔大脳皮質由来初代神経細胞を、前記実施例１で得られたマウス胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地に、１×１０5細胞／ｍｌとなるように懸濁させ、ポリ−Ｌ−リジンコート２４ウェルプレート〔住友ベークライト社製〕上に、０．５ｍｌ／ウェルとなるように播種し、３７℃で５％ＣＯ2で培養した。なお、培地を、２日おきに全培地の半分の量ずつ交換した。また、対照として、Ｎ２培地を用い、前記マウス胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を用いた場合と同様に、マウス胎仔大脳皮質由来初代神経細胞を培養した。２日間培養した時点の細胞の形態を観察した結果を図１に示す。図１中、パネルＡ及びＢは、Ｎ２培地を用いた場合の結果を示し、パネルＣ及びＤは、マウス胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を用いた場合の結果を示す。【００９７】
その結果、図１のパネルＣ及びＤに示されるように、胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を用いた場合、非常に良好な接着と突起の伸長が見られた。一方、図１のパネルＡ及びＢに示されるように、Ｎ２培地を用いた場合、細胞の接着自体が不十分であり、接着した細胞もほとんど突起を伸ばさないことがわかる。【００９８】
さらに、培養4日目、培養物から培地を除去した。得られた細胞に、４重量％  パラホルムアルデヒドを添加し、室温で５分間インキュベーションした。その後、得られた混合物に、０．１％ TritonTM−X １ｍｌを添加し、室温で５分間インキュベーションした。得られた混合物に、１重量％Normal Goat Serumをさらに添加し、室温で３０分間インキュベーションして、ブロッキングを行なった。【００９９】
その後、前記ブロッキング後の細胞に、１重量％Normal Goat Serumで適宜希釈した抗ＧＦＡＰ抗体〔カタログ番号：ＡＢ５８０４、ケミコン（ＣＨＥＭＩＣＯＮ）社製〕及び抗ＭＡＰ２抗体〔カタログ番号：４４２６９５、カルビオケム（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）社製〕を添加し、４℃で一晩インキュベーションして、反応させた。ついで、Ｃａ2+及びＭｇ2+フリーのリン酸緩衝化生理食塩水で、細胞を洗浄し、２次抗体〔商品名：Alexa Fluor488；モレキュラープローブス（Molecular Probe）社製〕を添加し、室温で３０分間インキュベーションし、反応させた。その後、前記２次抗体の蛍光により、細胞におけるグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）及びＭＡＰ２のそれぞれの発現を検出した。かかる免疫染色の結果を図２に示す。図中、パネルＡは、Ｎ２培地を用いた場合の結果を示し、パネルＢは、マウス胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を用いた場合の結果を示す。【０１００】
その結果、図２のパネルＢに示されるように、胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を用いた場合、細胞において、非常に良好にＭＡＰ２の発現が見られたが、ＧＦＡＰの発現はほとんど見られなかった。これは、胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を用いると、神経細胞のみが非常に良好に培養できることを示している。一方、図２のパネルＡに示されるように、Ｎ２培地を用いた場合、ＧＦＡＰ及びＭＡＰ２のそれぞれに対して陽性の細胞が見られなかった。【０１０１】
また、培養２日目、前記実施例１で得られた胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を用いて得られた培養物のウェルにおいて、胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を、１× Ｂ−２７サプリメント〔インビトロジェン コーポレーション製〕を含有したNeurobasalTM培地〔インビトロジェン コーポレーション製〕に置換し、さらに、３７℃、５％ＣＯ2で１０日間培養し、前記実施例１で得られた胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地による長期培養能について評価した。【０１０２】
その結果、培養開始時からＮ２培地を用いて培養を行なった細胞は、培養５日目には死滅した。【０１０３】
胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地及びＢ−２７サプリメント含有NeurobasalTM培地を用いた場合の細胞について、培養８日目の状態を図３に、培養１０日目の状態を図４に示す。各図中、パネルＡ及びＢは、Ｂ−２７サプリメント含有NeurobasalTM培地を用いた場合の細胞を示し、パネルＣ及びＤは、胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を用いた場合の細胞を示す。【０１０４】
その結果、図３及び図４それぞれのパネルＣ及びＤに示されるように、胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を用いて培養した神経系細胞は、培養１０日目においても神経細胞間の緊密なネットワークを形成していることがわかる。【０１０５】
一方、Ｂ−２７サプリメント含有NeurobasalTM培地で培養した神経系細胞は、培養７日目から死に始め、図３のパネルＡ及びＢに示されるように、培養８日目の時点で、ほとんどの細胞が死んでおり、図４のパネルＡ及びＢに示されるように、培養１０日目には死滅していることがわかる。【０１０６】
このように、胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を用いると、従来、長期間にわたって良好な状態で維持することが困難であった神経細胞、例えば、初代培養系神経細胞をin vitroで長期間、安定的に培養維持することが可能であることが示された。【０１０７】
実施例３
前記実施例１で得られた胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を用いて、以下のように、マウス胚性幹細胞から神経細胞への分化誘導能を調べた。【０１０８】
マウス胚性幹細胞１２９ＳＶ株を、常法により３日間培養し、大きく成長したコロニーを形成させた。ついで、キャピラリーピペットを用いて、コロニーごと回収し、得られたコロニーを、前記実施例１で得られた胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地、対照として、Ｎ２培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ2で４日間浮遊培養した。【０１０９】
その後、得られたコロニーをポリ−Ｌ−リジンコートディッシュ〔旭テクノグラス社製〕上、それぞれの培地で、３７℃、５％ＣＯ2で７日間接着培養し、神経系細胞に分化誘導した。【０１１０】
マウス胚性幹細胞からの神経細胞分化の程度（神経分化のみられたコロニー数）を評価する目的で、得られた細胞集団におけるクラスIII βチューブリンの発現を、抗βIII チューブリン抗体（ＴｕＪ）を用いた免疫染色により解析した。結果を表１に示す。表中、ＥＳＡＣＭは得られた胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を、Ｎ２はＮ２培地をそれぞれ示す。また、表中、括弧内の数値は陽性コロニー数の割合を示しており、（総陽性コロニー数／ピックアップ数）×１００（％）により算出された値である。【０１１１】
【表１】
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【０１１２】
その結果、表１に示されるように、胚性幹細胞から神経細胞への分化誘導系において、前記実施例１で得られた胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を用いた場合、陽性コロニー数の割合は、５１％であり、胚性幹細胞を神経系細胞に分化誘導する能力を十分に有することが明らかとなった。【０１１３】
また、分化誘導によって得られる神経幹細胞の性状を確認するため、前記実施例１で得られた胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を用いて分化誘導された神経幹細胞の性状について、分化誘導された神経幹細胞の増殖能を、NeurobasalTM培地〔インビトロジェン  コーポレーション製〕で３７℃、５％ＣＯ2で７日間培養し、得られた細胞について、顕微鏡〔株式会社ニコン製、商品名：ＥＣＬＩＰＳＥ  ＴＥ２０００−Ｕ〕下で観察した。
その結果、前記実施例１で得られた胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を用いて分化誘導された神経幹細胞は、良好な増殖が観察された。【０１１４】
さらに、増幅した神経幹細胞について、前記実施例１で得られた胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地により７日間培養後、得られた細胞を慣用の手法により、ＭＡＰ２により免疫染色し、顕微鏡下〔株式会社ニコン製、商品名：ECLIPSE  TE2000−U〕で観察することにより、神経細胞への分化を調べた。
その結果、前記増殖細胞は、神経細胞の形態に分化し、大半の細胞が、ＭＡＰ２に対して陽性であった。したがって、前記実施例１で得られた胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を用いて分化誘導された神経幹細胞は、増殖能及び分化能を有していることが示唆された。【０１１５】
また、サル胚性幹細胞ＣＭＫ６株について、得られた胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を用い、サル由来細胞に適した条件下、実施例２と同様の手順により、胚性幹細胞から神経系細胞への分化誘導を行なった。その結果を表２に示す。表中、ＥＳＡＣＭは胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を、Ｎ２はＮ２培地を、それぞれ示す。【０１１６】
【表２】
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【０１１７】
その結果、表２に示されるように、サル胚性幹細胞においても胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地は、十分な神経系細胞への分化誘導能を有していることが明らかとなった。またマウス胚性幹細胞の場合と同様に、誘導した神経幹細胞の増殖能を検討した結果、良好な増殖能が観察できた。【０１１８】
実施例４
カニクイザルＥＳ細胞ＣＭＫ６株を常法により培養し、播種後３日目に、キャピラリーを用いて、細胞をコロニーごと物理的にピックアップした。得られたコロニーを、２０ｎｇ／ｍｌ のｂＦＧＦを含む神経細胞培養用培養液（住友ベークライト製品：品番ＭＢ−Ｘ９５０１、初代培養アストロサイト馴化培地の代替物として使用）で３７℃、５％ＣＯ2で１０日間浮遊培養し、それによりNeural stem sphere（ＮＳＳ）を得た。１０日間の浮遊培養期間中は、上記の浮遊培養液に毎日、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を最終濃度２０ｎｇ／ｍｌとなるよう添加した。【０１１９】
その後、前記ＮＳＳを１×Ｂ-２７添加物〔カタログ番号：１７５０４−０４４、インビトロジェン  コーポレーション製；×５０濃度の市販品を×１の濃度で使用〕を含有したNeurobasalTM培地〔カタログ番号：２１１０３−０４９、インビトロジェン  コーポレーション製〕培地を用いて、ポリ−Ｌ−リジン／ラミニンコートディッシュ上に播種し、毎日、ｂＦＧＦと上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）を、それぞれ最終濃度２０ｎｇ／ｍｌとなるよう添加しながら、３７℃、５％ＣＯ2で７日間接着培養し、神経幹細胞を増殖させた。【０１２０】
なお、前記ポリ−Ｌ−リジン／ラミニンコートディッシュは、ポリ−Ｌ−リジンコートディッシュ〔ＩＷＡＫＩ、旭テクノグラス社製〕を、１０μｇ／ｍｌ  ラミニン〔カタログ番号：Ｌ０００１、旭テクノグラス社製〕で３時間処理することによりコーティングして使用した。【０１２１】
７日間培養した後、キャピラリーピペットを用いて、増殖している細胞の中心部分を物理的にポリ−Ｌ−リジン／ラミニンコートディッシュ上に移しかえ、Ｇ-５添加物〔カタログ番号：１７５０３−０１２、インビトロジェン社製；×１００濃度〕を×１濃度で加えたDulbecco's Modified Eagle Medium（ＤＭＥＭ）〔カタログ番号：１１９６０−０６９、インビトロジェン社製〕（以下、Ｇ５培地と称す）により培養を継続した。３７℃、５％ＣＯ2でさらに７日間培養を継続した。この培養期間中は、毎日ｂＦＧＦ及びＥＧＦを２０ｎｇ／ｍｌが最終濃度になるよう添加し続けた。【０１２２】
上記培養７日めの時点で、増殖している細胞の中心部分をキャピラリーにより物理的に除去し、その後さらに７日間培養を継続した。
その後、Ｇ-５培地を除去して、Ｃａ2+及びＭｇ2+不含リン酸緩衝化生理食塩水で細胞を洗浄後、０．０５重量％トリプシン／ＥＤＴＡで該細胞を解離させ、この解離後の細胞（上記で増幅した神経幹細胞）を、再びＧ-５培地を培養液として、ポリ−Ｌ−リジン／ラミニンコートディッシュ上で１０日間の培養を行い、アストロサイト様細胞を誘導した。【０１２３】
図５は、こうして得られたサル胚性幹細胞由来の培養物を抗ＧＦＡＰ抗体〔カタログ番号：ＡＢ５８０４、ケミコン（ＣＨＥＭＩＣＯＮ）社製〕及び抗ＭＡＰ２抗体〔カタログ番号：４４２６９５、カルビオケム（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）社製〕を用いて常法に従って免疫染色した結果を示す。図中、パネルＡはＧＦＡＰの発現、パネルＢはＭＡＰ２の発現、パネルＣは、パネルＡとＢの重ね合わせ画像を示す。【０１２４】
培養器中のほとんどの細胞がアストロサイト様細胞（ＧＦＡＰ陽性）となっており、ＭＡＰ２陽性の神経細胞は殆ど存在せず、純度のかなり高い均一なサルアストロサイト様細胞が得られることがわかった。【０１２５】
その後、培養液をＮ２培地（Ｎ２添加物を×１濃度で添加したＤＭＥＭ/Ｆ−１２培地）に置換して培養を継続し、その２−４日後に、得られた培養物から上清を回収し、孔径２２ｎｍのフィルター〔商品名：ＤＩＳＭＩＣ−２５ＣＳ、アドバンテック社製〕で濾過し、サル胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を得た。
得られたサル胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地は、その後、Ｎ２添加物〔カタログ番号：１７５０２−０４８、インビトロジェン  社製；×１００濃度〕あるいはＢ-２７添加物〔カタログ番号：１７５０４−０４４、インビトロジェン社製；×５０濃度〕を、それぞれ最終×１濃度となるように添加した後、胚性幹細胞の神経細胞誘導能や神経細胞の長期安定培養能を検討した。【０１２６】
実施例５
実施例４により調製したサル胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を用いて、ＣＭＫ６-Ｇ４株（ｈｒＧＦＰ遺伝子安定発現株）の神経細胞への分化誘導能を検討した。
ＣＭＫ６-Ｇ４株を常法により培養し、播種後３日目に、キャピラリーを用いて、細胞をコロニーごと物理的にピックアップした。得られたコロニーを、２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含むサル胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地（実施例４で得られたもの）で３７℃、５％ＣＯ2で１０日間浮遊培養し、それにより、Neural stem sphere（ＮＳＳ）を得た。１０日間の浮遊培養期間中は、上記の浮遊培養液に毎日、ｂＦＧＦを２０ｎｇ／ｍｌが最終濃度になるよう添加した。【０１２７】
その後、前記ＮＳＳを、同じサル胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を用いて、ポリ−Ｌ−リジン／ラミニンコートディッシュ上に播種し、３７℃、５％ＣＯ2で１４日間接着培養し、神経系細胞に分化誘導したところ、おびただしい数の神経突起が顕微鏡下で観察された。【０１２８】
サル胚性幹細胞からの神経細胞分化を確認する目的で、得られた細胞集団におけるクラスIII  βチューブリン及びＭＡＰ２の発現を、それぞれ抗βIII チューブリン（ＴｕＪ）抗体〔カタログ番号：ＭＡＢ１６３７、ケミコン（ＣＨＥＭＩＣＯＮ）社製〕及び抗ＭＡＰ２抗体〔カタログ番号：４４２６９５、カルビオケム（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）社製〕を用いた免疫染色を常法にて解析した。かかる結果を図６に示す。【０１２９】
図６に示されるように、サル胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を用いた場合、極めて多数のβIIIチューブリンやＭＡＰ２を発現する細胞（神経細胞）が分化誘導されていることがわかった。
このことは、サル胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地が、サル胚性幹細胞から神経幹細胞を誘導し、神経細胞を効率よく分化誘導する能力を有することを示す結果といえる。【０１３０】
一方、比較対照として、Ｎ２培地（馴化培地の調製に用いた基本培地）やＢ２７培地（Ｂ−２７サプリメント含有NeurobasalTM培地）を用いたものでは、自発的分化と思われる少量程度の神経細胞は観察されたものの、積極的な神経分化誘導効果は、認められなかった。（データ省略）【０１３１】
実施例６
ヒトＥＳ細胞ＳＡ１８１株を常法により培養し、播種後３日目に、キャピラリーを用いて、細胞をコロニーごと物理的にピックアップした。得られたコロニーを、２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含む神経細胞培養用培養液（住友ベークライト製品：品番ＭＢ−Ｘ９５０１、初代培養アストロサイト馴化培地の代替物として使用）で３７℃、５％ＣＯ2で１２日間浮遊培養し、それにより、Neural stem sphere（ＮＳＳ）を得た。この浮遊培養期間中は、上記の浮遊培養液にｂＦＧＦを２０ｎｇ／ｍｌが最終濃度になるよう毎日添加を続けた。【０１３２】
その後、前記ＮＳＳを、１×Ｂ−２７添加物〔カタログ番号：１７５０４−０４４、インビトロジェン  コーポレーション製；×５０濃度の市販品を×１の濃度で使用〕を含有したNeurobasalTM培地〔カタログ番号：２１１０３−０４９、インビトロジェン  コーポレーション製〕培地を用いて、ポリ−Ｌ−リジン／ラミニンコートディッシュ上に播種し、毎日、ｂＦＧＦとＥＧＦを、それぞれ最終濃度２０ｎｇ／ｍｌとなるよう添加しながら、３７℃、５％ＣＯ2で７日間接着培養して神経幹細胞を増殖させた。【０１３３】
なお、前記ポリ−Ｌ−リジン／ラミニンコートディッシュは、ポリ−Ｌ−リジンコートディッシュ〔ＩＷＡＫＩ、旭テクノグラス社製〕を、１０μｇ／ｍｌ  ラミニン〔カタログ番号：Ｌ０００１、旭テクノグラス社製〕で３時間処理することによりコーティングして使用した。【０１３４】
７日間培養した後、キャピラリーピペットを用いて、増殖している細胞の中心部分を物理的にポリ−Ｌ−リジン／ラミニンコートディッシュ上に移しかえ、Ｇ-５添加物〔カタログ番号：１７５０３−０１２、インビトロジェン社製；×１００濃度〕を×１濃度で加えたDulbecco's Modified Eagle Medium（ＤＭＥＭ）〔カタログ番号：１１９６０−０６９、インビトロジェン社製〕（以下、Ｇ５培地と称す）により培養を継続した。３７℃、５％ＣＯ2でさらに７日間培養を継続した。この培養期間中は、毎日ｂＦＧＦ及びＥＧＦを２０ｎｇ／ｍｌが最終濃度になるよう添加し続けた。【０１３５】
上記培養７日めの時点で、増殖している細胞の中心部分をキャピラリーにより物理的に除去し、その後さらに７日間培養を継続した。
その後、Ｇ-５培地を除去して、Ｃａ2+及びＭｇ2+不含リン酸緩衝化生理食塩水で細胞を洗浄後、０．０５重量％  トリプシン／ＥＤＴＡで該細胞を解離させ、この解離後の細胞を、再びＧ-５培地を培養液として、ポリ−Ｌ−リジン／ラミニンコートディッシュ上で１４日間の培養を行い、アストロサイト様細胞を誘導した。【０１３６】
図７は、こうして得られたヒト胚性幹細胞由来の培養物を抗ＧＦＡＰ抗体及び抗ＭＡＰ２抗体を用いて免疫染色した結果を示す。
図に示されるように、培養器中のほとんどの細胞がアストロサイト様細胞（ＧＦＡＰ陽性）となっており、ＭＡＰ２陽性の神経細胞は殆ど存在せず、純度のかなり高い均一なサルアストロサイト様細胞が得られることがわかった。【０１３７】
その後、培養液をＮ２培地（Ｎ２添加物を×１濃度で添加したＤＭＥＭ/Ｆ−１２培地）に置換して培養を継続し、その２−４日後に、得られた培養物から上清を回収し、孔径２２ｎｍのフィルター〔商品名：ＤＩＳＭＩＣ−２５ＣＳ、アドバンテック社製〕で濾過し、ヒト胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を得た。
得られたヒト胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地は、その後、Ｎ２添加物〔カタログ番号：１７５０２−０４８、インビトロジェン  社製；×１００濃度〕あるいはＢ-２７添加物〔カタログ番号：１７５０４−０４４、インビトロジェン社製；×５０濃度〕を、それぞれ最終×１濃度となるように添加した。【０１３８】
実施例７
実施例６により調製したヒト胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を用いて、ＳＡ１８１ｈｒＧ２株（ｈｒＧＦＰ遺伝子安定発現株；緑色蛍光を発することで細胞の同定が容易になるように作製されたもの）の神経細胞への分化誘導能を検討した。
ＳＡ１８１ｈｒＧ２株を常法により培養し、播種後３日目に、キャピラリーを用いて、細胞をコロニーごと物理的にピックアップした。得られたコロニーを、２０ｎｇ／ｍｌ のｂＦＧＦを含むヒト胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地（実施例６で得られたもの）で３７℃、５％ＣＯ2で１２日間浮遊培養し、それにより、Neural stem sphere（ＮＳＳ）を得た。１２日間の浮遊培養期間中は、上記の浮遊培養液に毎日、ｂＦＧＦを２０ｎｇ／ｍｌが最終濃度になるよう添加した。【０１３９】
その後、前記ＮＳＳを、同じヒト胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を用いて、ポリ−Ｌ−リジン／ラミニンコートディッシュ上に播種し、３７℃、５％ＣＯ2で１４日間接着培養し、神経細胞を分化誘導したところ、おびただしい数の神経突起が顕微鏡下で観察された。【０１４０】
ヒト胚性幹細胞からの神経細胞分化を確認する目的で、得られた細胞集団におけるクラスIII  βチューブリン及びＭＡＰ２の発現を、それぞれ抗βIII チューブリン（ＴｕＪ）抗体〔カタログ番号：ＭＡＢ１６３７、ケミコン（ＣＨＥＭＩＣＯＮ）社製〕及び抗ＭＡＰ２抗体〔カタログ番号：４４２６９５、カルビオケム（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）社製〕を用いた免疫染色を常法にて解析した。かかる免疫染色の結果を図８に示す。【０１４１】
図８に示されるように、ヒト胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を用いた場合、極めて多数の神経細胞（クラスIIIβチューブリンやＭＡＰ２を発現する細胞）が分化誘導されていることがわかった。
このことは、ヒト胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地が、ヒト胚性幹細胞から神経幹細胞を誘導し、神経細胞を効率よく分化誘導する能力を有することを示す結果といえる。【０１４２】
一方、比較対照として、Ｎ２培地（馴化培地の調製に用いた基本培地）やＢ２７培地（Ｂ−２７サプリメント含有NeurobasalTM培地）を用いたものでは、自発的分化と思われる少量程度の神経細胞は観察されたものの、積極的な神経分化誘導効果は、認められなかった。【０１４３】
また、実施例６で調製したヒト胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地を用いて、神経細胞を培養した検討では、実施例２に記載された内容と全く同様の結果として、マウス胎仔大脳皮質由来初代神経細胞〔カタログ番号：ＭＢ−Ｘ０３０５：神経細胞ＣＸ（Ｍ）、住友ベークライト社製〕をはじめ、正常ヒト神経前駆細胞〔製品コード：ＰＴ−２５９９：Ｃａｍｂｒｅｘ社製〕、ヒト胚性幹細胞から分化した神経細胞のいずれにおいても、良好な培養性能（神経細胞の生存と神経突起の伸展）が確認されている。【０１４４】
図９は、ヒト神経前駆細胞を培養した結果を示す。Ｎ２培地（馴化培地を調製する際の基本培地）を用いた場合、培養容器中にパネルＡのような部分がまばらに観察されるのに対し、ｈＥＳ-ＡＣＭを用いた場合には、パネルＢのような多数の神経細胞が培養容器中の全面にわたって観察され、良好な培養性能を示すことがわかる。【０１４５】
実施例８
マウス由来アストロサイト細胞株であるＫＴ-５細胞（ＧＦＡＰ陽性；ヒューマンサイエンス研究資源バンク資産番号：ＩＦＯ５０１６１）から同様の方法にて馴化培地を調製し、それを用いてＥＳ細胞神経細胞分化誘導能及び神経細胞の長期安定培養性能について検討した。【０１４６】
マウスＫＴ-５細胞を１０％ウシ胎児血清を含むＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ-１２ ＨＡＭ培養液（カタログＮｏ．Ｎ８６４１；シグマ社製）を用いた常法にて継代培養し、７０％コンフルエントの状態になった段階で、培養液をＮ２添加物を×１濃度で含有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２倍溶液に置換し、２日培養した後、その培養物から上清を回収し、孔径２２ｎｍのフィルター〔商品名：ＤＩＳＭＩＣ−２５ＣＳ、アドバンテック社製〕で濾過することで、マウスＫＴ-５細胞馴化培地を得た。【０１４７】
得られた当該馴化培地には、その後、Ｎ２添加物〔カタログ番号：１７５０２−０４８、インビトロジェン  コーポレーション製；×１００濃度〕あるいはＢ-２７添加物〔カタログ番号：１７５０４−０４４、インビトロジェン  コーポレーション製；×５０濃度〕を、それぞれ最終×１濃度となるように添加した後、マウス胚性幹細胞に対する神経系細胞への分化誘導能及び神経細胞のin vitro培養における長期安定培養能を検討した。
しかし、このＫＴ−５細胞馴化培地を用いた場合には、神経細胞を長期安定培養したり、胚性幹細胞を神経系細胞に効率よく分化誘導したりすることができなかった。【０１４８】
この結果は、同じＧＦＡＰ陽性細胞（アストロサイト様細胞）であっても、その馴化培地における機能面において、必ずしも、神経細胞の長期安定培養能や、胚性幹細胞の神経系細胞への分化誘導能を保証するものではないこと（胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地と同等の性能を獲得できるものではないということ）を示す１例といえる。【０１４９】
以上の実施例により、本発明の胚性幹細胞由来アストロサイト様細胞馴化培地は、神経細胞の長時間にわたる安定的な維持、胚性幹細胞の神経系細胞への分化誘導等に有用であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１５０】
本発明によれば、アストロサイト馴化培地を簡便に、大量かつ安定的に供給することができる。この馴化培地は、神経系細胞の安定的な製造や工業的製造において、神経細胞の長期かつ安定的な培養、胚性幹細胞から神経系細胞への効率的な分化誘導、胚性幹細胞から神経系細胞への工業的スケールでの分化誘導による神経系細胞の供給等を可能にするものである。したがって、本発明により、簡便に、大量かつ高品質の神経系細胞を供給することが可能になる。また、本発明によれば、所望の動物以外の動物由来の細胞成分が実質的に存在しない条件下に神経系細胞を維持又は生産することができるため、細胞移植療法等に適した生体への適合性が高い材料の提供が可能になる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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