(57)【要約】  本発明の目的は、光照射依存的に活性酸素を産生させて、これにより標的生理機能を不活性化する手段を提供することである。本発明によれば、光増感物質で標識した蛍光蛋白質から成り、光照射することにより蛍光蛋白質から光増感物質への蛍光エネルギー移動（FRET）が生じ、これにより光増感物質を励起させて活性酸素を生成させることができることを特徴とする、標的生理機能不活性化剤が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
光増感物質で標識した蛍光蛋白質から成り、光照射することにより蛍光蛋白質から光増感物質への蛍光エネルギー移動（FRET）が生じ、これにより光増感物質を励起させて活性酸素を生成させることができることを特徴とする、標的生理機能不活性化剤。
【請求項２】
蛍光蛋白質の蛍光スペクトルと光増感物質の吸収スペクトルの少なくとも一部が重なっている、請求項１に記載の標的生理機能不活性化剤。
【請求項３】
蛍光蛋白質がＧＦＰ変異体である、請求項１又は２に記載の標的生理機能不活性化剤。
【請求項４】
蛍光蛋白質がＣＦＰ変異体又はＥＧＦＰ変異体である、請求項１から３の何れかに記載の標的生理機能不活性化剤。
【請求項５】
蛍光蛋白質が、ＥＣＦＰの７２番目のセリンをアラニン、１７５番目のセリンをグリシン、及び２０６番目のアラニンをリジンに置換した蛍光蛋白質、又はＥＧＦＰの２０３番目のトレオニンをイソロイシンに置換した蛍光蛋白質である、請求項１から４の何れかに記載の標的生理機能不活性化剤。
【請求項６】
蛍光蛋白質から光増感物質への蛍光エネルギー移動（FRET）の効率が８０％以上である、請求項１から５の何れかに記載の標的生理機能不活性化剤。
【請求項７】
蛍光蛋白質から光増感物質への蛍光エネルギー移動（FRET）の効率が９０％以上である、請求項１から５の何れかに記載の標的生理機能不活性化剤。
【請求項８】
ＣＦＰの６番目のアミノ酸及び／又は２２９番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基に光増感物質が結合している、請求項１から７の何れかに記載の標的生理機能不活性化剤。
【請求項９】
光増感物質がエオシンである、請求項１から８の何れかに記載の標的生理機能不活性化剤。
【請求項１０】
請求項１から９の何れかに記載の標的生理機能不活性化剤を用いて、光照射依存的に活性酸素を発生させ、それにより標的生理機能を不活性化する方法。
【請求項１１】
標的生理機能の不活性化が蛋白質の不活性化である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
蛍光蛋白質のＮ末端又はＣ末端の一方の断片と任意の蛋白質との融合蛋白質を発現する細胞に、蛍光蛋白質のＮ末端又はＣ末端の他方の断片を光増感物質で標識した標識蛋白質を導入して、細胞内において蛍光蛋白質を再構成する工程；上記の再構成した蛍光蛋白質に光を照射することにより蛍光蛋白質から光増感物質への蛍光エネルギー移動（FRET）を生じさせ、これにより光増感物質を励起させて活性酸素を生成させる工程、を含む、標的生理機能を不活性化する方法。
【請求項１３】
蛍光蛋白質の蛍光スペクトルと光増感物質の吸収スペクトルの少なくとも一部が重なっている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
蛍光蛋白質がＣＦＰ又はその変異体である、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
光増感物質がエオシンである、請求項１２から１４の何れかに記載の方法。
【請求項１６】
蛍光蛋白質のＮ末端又はＣ末端の一方の断片と任意の蛋白質との融合蛋白質にさらに、相互に相互作用する２種類のアミノ酸配列のうちの一方のアミノ酸配列が融合しており、蛍光蛋白質のＮ末端又はＣ末端の他方の断片を光増感物質で標識した標識蛋白質にさらに、上記した相互に相互作用する２種類のアミノ酸配列のうちの他方のアミノ酸配列が融合している、請求項１２から１５の何れかに記載の方法。
【請求項１７】
蛍光蛋白質のＮ末端又はＣ末端の一方の断片又はそれをコードする遺伝子と、蛍光蛋白質のＮ末端又はＣ末端の他方の断片を光増感物質で標識した標識蛋白質とを含む、請求項１２から１６の何れかに記載の方法を行うためのキット。
【請求項１８】
蛍光蛋白質のＮ末端又はＣ末端の一方の断片と任意の蛋白質との融合蛋白質を発現する細胞と、蛍光蛋白質のＮ末端又はＣ末端の他方の断片を光増感物質で標識した標識蛋白質とを含む、請求項１２から１６の何れかに記載の方法を行うためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光蛋白質と光増感物質への蛍光エネルギー移動を介した活性酸素の産生を利用した標的生理機能不活性化剤に関する。さらに本発明は、光増感物質で標識した分割蛍光蛋白質およびその構造機能相補性を利用した標的生理機能の不活性化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クラゲのエクオレア・ビクトリア（Aequorea victoria）に由来する緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）は、生物系において多くの用途を有する。最近、ランダム突然変異誘発法および半合理的(semi-rational)突然変異誘発法に基づいて、色を変化させたり、折りたたみ特性を改善したり、輝度を高めたり、あるいはｐＨ感受性を改変したといった様々なＧＦＰ変異体が作製されている。遺伝子組み換え技術により他の蛋白質をＧＦＰ等の蛍光蛋白質に融合させて、それらの発現および輸送のモニタリングを行うことが行われている。【０００３】
最もよく使用されるＧＦＰ変異体の一つとして黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）が挙げられる。ＹＦＰは、クラゲ（Aequorea）ＧＦＰ変異体の中でも最長波長の蛍光を示す。大部分のＹＦＰのεおよびΦは、それぞれ60,000〜100,000M-1cm-1および0.6〜0.8であり（Tsien, R. Y. (1998). Ann. Rev. Biochem. 67, 509-544）、これらの値は、一般的な蛍光団（フルオレセインおよびローダミンなど）の値に匹敵する。また、ＧＦＰ変異体の他の例として、シアン蛍光蛋白質（ＣＦＰ）があり、ＥＣＦＰ（enhanced cyan fluorescent protein)が知られている。また、イソギンチャク（Discoma sp.）からは赤色蛍光蛋白質（ＲＦＰ）も単離されており、DasRedが知られている。このように蛍光蛋白質は、緑色、黄色、シアン色、赤色の４種が次々と開発されスペクトルの範囲は大幅に広がっている。【０００４】
生体分子の機能を解析するためには、生化学的に分子機能を不活性化する手法が有効である。すなわち、標的分子の機能を阻害し、その分子が正常に機能している場合と比較することによって、標的分子の機能を詳細に解析することができる。しかし、細胞内における生体分子の機能は一様なものではなく、細胞内の特定の局所において特定の生体分子が効率的に機能を発現することが知られている。従って、標的分子が特定の情報伝達の下で機能している時に、機能している場所において、その機能を不活性化することにより、細胞が生きている状態での標的分子の機能を解明することができる。時間的かつ空間的に制御した様式で標的分子を不活性化をする方法として、例えば、Daniel G. Jay, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, Vol.85, pp.5454-5458, 1988には、レーザー分子不活性化法（chromopphore-assisted laser inactivation; CALI）が記載されている。しかしながら、この方法でも、細胞が生きた状態において時間的かつ空間的に制御した様式で標的分子を効率的に不活性化することは困難であった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、光照射依存的に活性酸素を産生させて、これにより任意の標的物質（標的生理機能）を不活性化する手段を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、光増感物質で標識した蛍光蛋白質に対して当該蛍光蛋白質の励起光を照射することにより蛍光蛋白質から光増感物質への蛍光エネルギー移動を生じさせ、これにより光増感物質を励起させて活性酸素を生成させることができることを見出した。さらに本発明者らは、蛍光蛋白質のＮ末端側と遺伝子的に連結した任意の標的蛋白質を発現する細胞に、光増感物質で標識した蛍光蛋白質のＣ末端側を導入することにより、細胞内で蛍光蛋白質の構造を再構成させ、再構成された蛍光蛋白質から光増感物質への蛍光エネルギー移動を利用して、光増感物質より活性酸素を産生させ、これにより任意の標的蛋白質を不活性化することができることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。【０００７】
即ち、本発明によれば、光増感物質で標識した蛍光蛋白質から成り、光照射することにより蛍光蛋白質から光増感物質への蛍光エネルギー移動（FRET）が生じ、これにより光増感物質を励起させて活性酸素を生成させることができることを特徴とする、標的生理機能不活性化剤が提供される。【０００８】
好ましくは、蛍光蛋白質の蛍光スペクトルと光増感物質の吸収スペクトルの少なくとも一部は重なっている。
好ましくは、蛍光蛋白質はＧＦＰ変異体である。
好ましくは、蛍光蛋白質はＣＦＰ変異体又はＥＧＦＰ変異体である。
好ましくは、蛍光蛋白質は、ＥＣＦＰの７２番目のセリンをアラニン、１７５番目のセリンをグリシン、及び２０６番目のアラニンをリジンに置換した蛍光蛋白質、又はＥＧＦＰの２０３番目のトレオニンをイソロイシンに置換した蛍光蛋白質である。【０００９】
好ましくは、蛍光蛋白質から光増感物質への蛍光エネルギー移動（FRET）の効率は８０％以上であり、さらに好ましくは９０％以上である。
好ましくは、ＣＦＰの６番目のアミノ酸及び／又は２２９番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基に光増感物質が結合している。
好ましくは、光増感物質はエオシンである。【００１０】
本発明の別の側面によれば、上記した本発明の標的生理機能不活性化剤を用いて、光照射依存的に活性酸素を発生させ、それにより標的生理機能を不活性化する方法が提供される。
好ましくは、標的生理機能の不活性化は蛋白質の不活性化である。【００１１】
本発明のさらに別の側面によれば、蛍光蛋白質のＮ末端又はＣ末端の一方の断片と任意の蛋白質との融合蛋白質を発現する細胞に、蛍光蛋白質のＮ末端又はＣ末端の他方の断片を光増感物質で標識した標識蛋白質を導入して、細胞内において蛍光蛋白質を再構成する工程；上記の再構成した蛍光蛋白質に光を照射することにより蛍光蛋白質から光増感物質への蛍光エネルギー移動（FRET）を生じさせ、これにより光増感物質を励起させて活性酸素を生成させる工程、を含む、標的生理機能を不活性化する方法が提供される。【００１２】
好ましくは、蛍光蛋白質の蛍光スペクトルと光増感物質の吸収スペクトルの少なくとも一部は重なっている。
好ましくは、蛍光蛋白質はＣＦＰ又はその変異体である。
好ましくは、光増感物質はエオシンである。【００１３】
好ましくは、蛍光蛋白質のＮ末端又はＣ末端の一方の断片と任意の蛋白質との融合蛋白質にさらに、相互に相互作用する２種類のアミノ酸配列のうちの一方のアミノ酸配列が融合しており、蛍光蛋白質のＮ末端又はＣ末端の他方の断片を光増感物質で標識した標識蛋白質にさらに、上記した相互に相互作用する２種類のアミノ酸配列のうちの他方のアミノ酸配列が融合している。【００１４】
本発明のさらに別の側面によれば、蛍光蛋白質のＮ末端又はＣ末端の一方の断片又はそれをコードする遺伝子と、蛍光蛋白質のＮ末端又はＣ末端の他方の断片を光増感物質で標識した標識蛋白質とを含む、上記した本発明の標的生理機能を不活性化する方法を行うためのキットが提供される。【００１５】
本発明のさらに別の側面によれば、蛍光蛋白質のＮ末端又はＣ末端の一方の断片と任意の蛋白質との融合蛋白質を発現する細胞と、蛍光蛋白質のＮ末端又はＣ末端の他方の断片を光増感物質で標識した標識蛋白質とを含む、上記した本発明の標的生理機能を不活性化する方法を行うためのキットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
（１）蛍光蛋白質と光増感物質への蛍光エネルギー移動を介した活性酸素の産生を利用した標的生理機能不活性化剤
第一の態様によれば、本発明は、光増感物質で標識した蛍光蛋白質から成り、光照射することにより蛍光蛋白質から光増感物質への蛍光エネルギー移動（FRET）が生じ、これにより光増感物質を励起させて活性酸素を生成させることができることを特徴とする、標的生理機能不活性化剤に関する。【００１７】
本発明の方法のアウトラインを図１に示す。図１に示す通り、本発明では、蛍光蛋白質（GFP変異体など）から光増感物質への蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を利用して、活性酸素を産生する。図１に示す例では、光増感物質としてエオシン（eosin）を使用し、蛍光蛋白質として、GFP変異体であるCFP又はSapphireを使用しているが、蛍光蛋白質の蛍光スペクトルと光増感物質の吸収スペクトルが適度に重なっていれば、蛍光蛋白質（GFP変異体など）と光増感物質の組み合わせについては、任意の組み合わせを用いることができる。本発明では、蛍光蛋白質から光増感物質へのFRETの効率が８０％以上になることが好ましい。FRETの効率が８０％未満の場合には、強光照射により蛍光蛋白質が褪色するだけでなく、活性酸素も産生されなくなるので好ましくない。【００１８】
本発明で用いる蛍光蛋白質は、励起光の照射により蛍光を発することができ、かつ後述する光増感物質に対して蛍光エネルギー移動を生じさせることができる蛋白質であれば任意の蛋白質を使用することができる。本発明で用いる蛍光蛋白質は、上記した蛍光エネルギー移動においては、ドナー蛍光蛋白質として作用することになる。【００１９】
本発明で用いることができる蛍光蛋白質としては、シアン蛍光蛋白質（ＣＦＰ）、黄色蛍光蛋白質（ＹＥＰ）、緑色蛋白質（ＧＦＰ）、赤色蛍光蛋白質（ＲＥＰ）、青色蛍光蛋白質（ＢＦＰ）、又はそれらの変異体などが使用できる。【００２０】
本明細書で言う、シアン蛍光蛋白質、黄色蛍光蛋白質、緑色蛋白質、赤色蛍光蛋白質、青色蛍光蛋白質又はそれらの変異体とは、各々公知の蛍光蛋白質だけでなく、それらの変異体（例えば、上記蛍光蛋白質の蛍光強度を増強した、ＥＣＦＰ、ＥＹＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＲＦＰ、ＥＢＦＰなど）の全てを包含する意味である。例えば、緑色蛍光蛋白質の遺伝子は単離され配列も決定されている(Prasher，D.C．ら(1992)，"Primary structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein"，Gene 111：229−233)。その他の蛍光蛋白質又はその変異体のアミノ酸配列も多数報告されており、例えば、Roger Y.Tsien, Annu.Rev.Biochem.1998. 67:509-44、並びにその引用文献に記載されている。緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）またはそれらの変異体としては、例えば、オワンクラゲ（例えば、エクオレア・ビクトリア（Aequorea victoria））由来のものを使用できる。【００２１】
本発明で用いる蛍光蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列などは公知である。蛍光蛋白質をコードする遺伝子は市販のものを使用することもできる。例えば、クロンテック社から市販されている、ＥＧＦＰベクター、ＥＹＦＰベクター、ＥＣＦＰベクター、ＥＢＦＰベクターなどを用いることができる。【００２２】
また、上記した各種の公知の蛍光蛋白質のアミノ酸に新たな変異を導入した蛍光蛋白質を使用することもできる。所定の核酸配列に所望の変異を導入する方法は当業者に公知である。例えば、部位特異的変異誘発法、縮重オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ、核酸を含む細胞の変異誘発剤又は放射線への露出等の公知の技術を適宜使用することによって、変異を有するＤＮＡを構築することができる。このような公知の技術は、例えば、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989、並びにCurrent Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)に記載されている。【００２３】
本発明で用いる光増感物質は、上記した蛍光蛋白質からの蛍光エネルギー移動により励起して、活性酸素（一重項酸素）を産生することができるものであり、かつ上記した蛍光蛋白質との間でＦＲＥＴが生じるように蛍光蛋白質の蛍光スペクトルと光増感物質の吸収スペクトルが適度に重なっていれば、任意の光増感物質を使用することができる。【００２４】
光増感物質の具体例としては、エオシン、フルオレセイン、メチレンブルー、ローズベンガル、アシッドレッド、プロトポルフィリン、ヘマトポルフィリンなどが挙げられる。【００２５】
光増感物質による蛍光蛋白質の標識は、任意の方法で行うことができる。例えば、蛍光蛋白質のアミノ酸配列中の１個又は複数個のアミノ酸残基をシステインに予め置換しておき、このシステイン残基を有する蛍光蛋白質と、エオシンマレイミドなどの光増感物質をマレイミド化したものを反応させることにより、光増感物質で標識した蛍光蛋白質を作成することができる。【００２６】
上記した方法で蛍光蛋白質を光増感物質で標識する場合、システイン残基を導入する位置を選択することにより、標識位置も自由に選択することができる。本発明では、高い蛍光エネルギー移動（FRET）効率が達成できるように、上記の標識位置を選択することが好ましい。蛍光蛋白質から光増感物質への蛍光エネルギー移動（FRET）の効率は好ましくは８０％以上であり、より好ましくは９０％以上であり、さらに好ましくは９３％以上である。【００２７】
例えば、光増感物質としてエオシンを用いる場合は、ＣＦＰの６番目のアミノ酸及び／又は２２９番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基に光増感物質が結合している場合に、高いFRET効率を達成することができる。従って、本発明の好ましい態様では、ＣＦＰの６番目のアミノ酸及び／又は２２９番目のアミノ酸に対応するアミノ酸をシステインに置換し、このシステイン残基に光増感物質を結合することができる。【００２８】
本発明では、光増感物質で標識した蛍光蛋白質に、蛍光蛋白質の励起光を照射することにより、蛍光蛋白質から光増感物質への蛍光エネルギー移動を生じさせる。ここで用いる励起光の波長は、使用する蛍光蛋白質の種類に応じて適宜選択することができる。励起光の照射時間は特に限定されないが、例えば数ミリ秒から１０分間程度行うことができる。【００２９】
本発明で用いる光増感物質で標識した蛍光蛋白質は、光照射することにより蛍光蛋白質から光増感物質への蛍光エネルギー移動（FRET）が生じ、これにより光増感物質を励起させて活性酸素を生成させることができることから、標的生理機能不活性化剤として使用することができる。即ち、光増感物質で標識した蛍光蛋白質を、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入したり、あるいは生体組織に直接注入した後に励起光を照射することにより、活性酸素を生成させることができ、そしてこの活性酸素の産生により、周辺に存在する標的物質（蛋白質など）は不活性化され、その結果として標的生理機能が不活性化される。【００３０】
本発明で用いる光増感物質で標識した蛍光蛋白質には、さらに別の蛋白質を融合させることもできる。融合させる他の蛋白質の種類は特に限定されるものではないが、例えば、細胞内に局在する蛋白質、細胞内小器官に特異的な蛋白質、ターゲティングシグナル（例えば、核移行シグナル、ミトコンドリアプレ配列）等が挙げられる。あるいは、機能を不活性化させるべき蛋白質、又は機能を不活性化させるべき蛋白質と相互作用する蛋白質を、光増感物質で標識した蛍光蛋白質に融合させることもできる。【００３１】
（２）光増感物質で標識した分割蛍光蛋白質の構造機能相補性を利用した標的生理機能の不活性化方法
第二の態様によれば、本発明は、蛍光蛋白質のＮ末端又はＣ末端の一方の断片と任意の蛋白質との融合蛋白質を発現する細胞に、蛍光蛋白質のＮ末端又はＣ末端の他方の断片を光増感物質で標識した標識蛋白質を導入して、細胞内において蛍光蛋白質を再構成する工程；上記の再構成した蛍光蛋白質に光を照射することにより蛍光蛋白質から光増感物質への蛍光エネルギー移動（FRET）を生じさせ、これにより光増感物質を励起させて活性酸素を生成させる工程、を含む、標的生理機能を不活性化する方法に関する。【００３２】
本発明の方法のアウトラインを図５に示す。図５には、分割CFPの再構成と光増感色素への蛍光共鳴エネルギー移動を利用した生理機能不活性化法の概要を示す。Proteinは不活性化したいタンパク質、または細胞内小器官に局在化させるための配列などを表す。色素（光増感物質）で標識したCC195-LZAはマイクロインジェクション、ビーズロード法により細胞内に導入してもよいし、TATや9Rのようなprotein transduction domainペプチドをつなげて培地や血流に添加して細胞内に導入してもよい。【００３３】
本発明で用いる蛍光蛋白質は、励起光の照射により蛍光を発することができ、かつ後述する光増感物質に対して蛍光エネルギー移動を生じさせることができる蛋白質であれば任意の蛋白質を使用することができる。本発明で用いる蛍光蛋白質は、上記した蛍光エネルギー移動においては、ドナー蛍光蛋白質として作用することになる。【００３４】
本発明で用いることができる蛍光蛋白質としては、シアン蛍光蛋白質（ＣＦＰ）、黄色蛍光蛋白質（ＹＥＰ）、緑色蛋白質（ＧＦＰ）、赤色蛍光蛋白質（ＲＥＰ）、青色蛍光蛋白質（ＢＦＰ）、又はそれらの変異体などが使用できる。【００３５】
本明細書で言う、シアン蛍光蛋白質、黄色蛍光蛋白質、緑色蛋白質、赤色蛍光蛋白質、青色蛍光蛋白質又はそれらの変異体とは、各々公知の蛍光蛋白質だけでなく、それらの変異体（例えば、上記蛍光蛋白質の蛍光強度を増強した、ＥＣＦＰ、ＥＹＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＲＦＰ、ＥＢＦＰなど）の全てを包含する意味である。例えば、緑色蛍光蛋白質の遺伝子は単離され配列も決定されている(Prasher，D.C．ら(1992)，"Primary structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein"，Gene 111：229−233)。その他の蛍光蛋白質又はその変異体のアミノ酸配列も多数報告されており、例えば、Roger Y.Tsien, Annu.Rev.Biochem.1998. 67:509-44、並びにその引用文献に記載されている。緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）またはそれらの変異体としては、例えば、オワンクラゲ（例えば、エクオレア・ビクトリア（Aequorea victoria））由来のものを使用できる。【００３６】
本発明で用いる蛍光蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列などは公知である。蛍光蛋白質をコードする遺伝子は市販のものを使用することもできる。例えば、クロンテック社から市販されている、ＥＧＦＰベクター、ＥＹＦＰベクター、ＥＣＦＰベクター、ＥＢＦＰベクターなどを用いることができる。【００３７】
また、上記した各種の公知の蛍光蛋白質のアミノ酸に新たな変異を導入した蛍光蛋白質を使用することもできる。所定の核酸配列に所望の変異を導入する方法は当業者に公知である。例えば、部位特異的変異誘発法、縮重オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ、核酸を含む細胞の変異誘発剤又は放射線への露出等の公知の技術を適宜使用することによって、変異を有するＤＮＡを構築することができる。このような公知の技術は、例えば、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989、並びにCurrent Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)に記載されている。【００３８】
本発明では、蛍光蛋白質はＮ末端側とＣ末端側とに分割して使用する。即ち、蛍光蛋白質のＮ末端側断片又はＣ末端側断片の一方は、別の蛋白質（例えば、不活性化したい標的蛋白質、または細胞内小器官に局在化させるための配列など）と融合させ、さらに蛍光蛋白質を細胞内で再構成させるために利用する別のアミノ酸配列と相互作用するアミノ酸配列と融合させた形態で、細胞内で発現させておく。一例として、図５では、蛍光蛋白質のＮ末端側断片（図５では、ＣＡ１９４と表記）は、別の蛋白質（図５では、Proteinと表記）、並びに蛍光蛋白質を細胞内で再構成させるためのアミノ酸配列（ＬＺＢ)と融合した蛋白質として、細胞内で予め発現させている。【００３９】
蛍光蛋白質のＮ末端側断片又はＣ末端側断片の一方に融合される「別の蛋白質」の種類は特に限定されるものではないが、例えば、細胞内に局在する蛋白質、細胞内小器官に特異的な蛋白質、ターゲティングシグナル（例えば、核移行シグナル、ミトコンドリアプレ配列）等が挙げられる。あるいは、機能を不活性化させるべき蛋白質、又は機能を不活性化させるべき蛋白質と相互作用する蛋白質を融合させることもできる。【００４０】
上記した融合蛋白質を細胞内で発現させるための方法は、常法により行うことができる。即ち、融合蛋白質をコードするＤＮＡを用意し、それを適当な発現ベクターに組み込み、得られた組み換え発現ベクターを細胞に導入して形質転換を行えばよい。発現ベクターは宿主である細胞の種類に応じて適当なものを適宜選択することができる。【００４１】
宿主である細胞の種類も特に限定されず、細菌細胞、哺乳類細胞、酵母、その他任意の細胞を用いることができる。細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。また、哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞の形質転換は、例えば、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いて行うことができる。酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevis1ae)またはサッカロマイセス・クルイベリ(Ｓaccharomyces kluyveri)等が挙げられる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。【００４２】
一方、蛍光蛋白質のＮ末端側断片又はＣ末端側断片の他方は、光増感物質で標識し、さらに蛍光蛋白質を細胞内で再構成するのに有用な、蛍光蛋白質のＮ末端側断片又はＣ末端側断片の一方に融合させたアミノ酸配列と相互作用するアミノ酸配列と融合させる。一例として、図５では、蛍光蛋白質のＣ末端側断片（図５では、ＣＣ１９５と表記）は、光増感物質であるエオシン（eosin）、並びに蛍光蛋白質を細胞内で再構成させるためのアミノ酸配列（ＬＺＡ)と融合した蛋白質を細胞外から導入させている。当該蛋白質の細胞外からの導入は、マイクロインジェクション、又はビーズロード法により細胞内に導入してもよいし、あるいはTATや9Rのようなprotein transduction domainペプチドをつなげて培地や血流に添加して細胞内に導入してもよい。【００４３】
上記の通り、蛍光蛋白質のＮ末端側断片又はＣ末端側断片の一方は予め細胞内で発現させておき、その後、蛍光蛋白質のＮ末端側断片又はＣ末端側断片の他方を細胞外から導入すると、細胞内において、それぞれの断片に融合されている互いに相互作用するアミノ酸配列同士が相互作用することにより、蛍光蛋白質のＮ末端側断片とＣ末端側断片とは接近し、蛍光蛋白質が細胞内で再構成される。【００４４】
本発明で用いる光増感物質は、上記した蛍光蛋白質からの蛍光エネルギー移動により励起して、活性酸素（一重項酸素）を産生することができるものであり、かつ上記した蛍光蛋白質との間でＦＲＥＴが生じるように蛍光蛋白質の蛍光スペクトルと光増感物質の吸収スペクトルが適度に重なっていれば、任意の光増感物質を使用することができる。【００４５】
光増感物質の具体例としては、エオシン、フルオレセイン、メチレンブルー、ローズベンガル、アシッドレッド、プロトポルフィリン、ヘマトポルフィリンなどが挙げられる。【００４６】
光増感物質による蛍光蛋白質のＮ末端側断片又はＣ末端側断片の標識は、任意の方法で行うことができる。例えば、蛍光蛋白質のＮ末端側断片又はＣ末端側断片のアミノ酸配列中の１個又は複数個のアミノ酸残基をシステインに予め置換しておき、このシステイン残基を有する蛍光蛋白質と、エオシンマレイミドなどの光増感物質をマレイミド化したものを反応させることにより、光増感物質で標識した蛍光蛋白質を作成することができる。【００４７】
本発明では、細胞内で再構成された蛍光蛋白質（この蛍光蛋白質は、光増感物質で標識されている）に、当該蛍光蛋白質の励起光を照射することにより、蛍光蛋白質から光増感物質への蛍光エネルギー移動を生じさせる。ここで用いる励起光の波長は、使用する蛍光蛋白質の種類に応じて適宜選択することができる。励起光の照射時間は特に限定されないが、例えば数ミリ秒から１０分間程度行うことができる。【００４８】
本発明では、光増感物質で標識した蛍光蛋白質のＮ末端側断片又はＣ末端側断片の他方を、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入したり、あるいは生体組織に直接注入した後に励起光を照射することにより、活性酸素を生成させることができ、そしてこの活性酸素の産生により、周辺に存在する標的物質（蛋白質など）が不活性化され、その結果として、活性酸素が産生する領域の細胞の生理機能が不活性化されることになる。
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００４９】
実施例Ａ−１：CFP、Sapphire変異体の構築
先ず、ECFPタンパク質の成熟効率を向上させ、かつ多量体形成を防ぐために７２番目のセリンをアラニン、１７５番目のセリンをグリシン、２０６番目のアラニンをリジンに置換したmSECFP-72Aをコードする遺伝子を構築した。ECFP/pRSETBを鋳型に以下の3つのプライマーを用い、文献(Sawano and Miyawaki Nucleic Acids Res. 28:E78, 2000)に記載の方法により変異導入を行った。【００５０】
5'-CAGTGCTTCGCCCGCTACCCC-3'（配列番号１）
5'-GAGGACGGCGGCGTGCAGCTC-3'（配列番号２）
5'-TACCAGTCCAAGCTGAGCAAA-3'（配列番号３）【００５１】
SapphireはEGFPの203番目のトレオニンをイソロイシンに置換することにより構築した。アミノ酸置換は上記と同様の方法を用い、プライマーは下記のものを使用した。
5'-TACCTGAGCATCCAGTCCGCC-3'（配列番号４）【００５２】
次に、mSECFP-72AとSapphireの2、4、6、229、233、238のアミノ酸をシステインに置換するため、mSECFP-72A/pRSETBまたはSapphire/pRSETBを鋳型として、以下のプライマーセットでPCRを行った。【００５３】
mSECFP-2C/72A、Sapphire-2C増幅用プライマーセット
5'-ATTGGATCCCGCCTGCAAGGGCGAGGAGCTGTTC-3'（配列番号５）
5'-ATTGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3' (プライマーＡ)（配列番号６）【００５４】
mSECFP-4C/72A、Sapphire-４C増幅用プライマーセット
5'-ATTGGATCCCGGCTGCGAGGAGCTGTTCACCGGG-3'（配列番号７）
プライマーＡ【００５５】
mSECFP-6C/72A、Sapphire-６C増幅用プライマーセット
5'-ATTGGATCCCGGCTGCCTGTTCACCGGGGTGGTG-3'（配列番号８）
プライマーＡ【００５６】
mSECFP-72A/229C、Sapphire-229C増幅用プライマーセット
5'-CGGGGTACCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3' （プライマーＢ）（配列番号９）
5'-GCAGAATTCTTAGCAGTACAGCTCGTCCTAGCC-3'（配列番号１０）【００５７】
mSECFP-72A/229C、Sapphire-233C増幅用プライマーセット
プライマーＢ
5'-GCAGAATTCTTAGCAGCCGAGAGTGATCCCGGC-3'（配列番号１１）【００５８】
mSECFP-72A/229C、Sapphire-238C増幅用プライマーセット
プライマーＢ
5'-GCAGAATTCTTAGCACCCGGCGGCGGTCACGAAC-3'（配列番号１２）【００５９】
PCR産物を制限酵素BamHIとEcoRIで切断し、pRSETBのBamHI-EcoRIサイトに挿入し、mSECFP-2C/72A-pRSETB、mSECFP-4C/72A-pRSETB、mSECFP-6C/72A-pRSETB、mSECFP-72A/229C-pRSETB、mSECFP-72A/233C-pRSETB、 mSECFP-72A/238C-pRSETB、Sapphire-2C-pRSETB、Sapphire-4C-pRSETB、Sapphire-6C-pRSETB、Sapphire-229C-pRSETB、Sapphire-233C-pRSETB、Sapphire-238C-pRSETB、を構築した。【００６０】
実施例Ａ−２：CFP変異体タンパク質の調製
mSECFP-2C/72A、mSECFP-4C/72A、mSECFP-6C/72A、mSECFP-72A/229C、mSECFP-72A/233C、 mSECFP-72A/238C、Sapphire-2C、Sapphire-4C、Sapphire-6C、Sapphire-229C、Sapphire-233C、Sapphire-238Cの各タンパク質を大腸菌内で産生させるために、mSECFP-2C/72A-pRSETB、mSECFP-4C/72A-pRSETB、mSECFP-6C/72A-pRSETB、mSECFP-72A/229C-pRSETB、mSECFP-72A/233C-pRSETB、 mSECFP-72A/238C-pRSETB、Sapphire-2C-pRSETB、Sapphire-4C-pRSETB、Sapphire-6C-pRSETB、Sapphire-229C-pRSETB、Sapphire-233C-pRSETB、Sapphire-238C-pRSETBをそれぞれ10ng用いて大腸菌(JM109 DE3)を形質転換し、100μg/mlのアンピシリンを含むLBプレート上で１日培養した。１つの大腸菌コロニーをピックアップして100μg/mlアンピシリンを含むLB培地200mlに植菌し、20度で４日間振蕩培養した。遠心により菌体を回収した後、10mlのPBS(-)で懸濁し、フレンチプレスを用いて菌体を破砕した。遠心により残渣を取り除いた上清に2mlのNi-NTAアガロースを加え１時間振蕩した。Ni-NTAアガロースに吸着したタンパク質をカラムにつめ5mlのPBS(-)で洗浄後、1mlの100mMイミダゾール/PBS(-)で溶出し、ゲルろ過法によってイミダゾールを取り除いて精製タンパク質溶液とした。【００６１】
実施例Ａ−３：CFP変異体タンパク質の色素標識
精製タンパク質溶液100μlを1mM TCEPを含むPBS(-)500μlに溶かして室温30分インキュベート後、エオシンマレイミドまたはフルオレセインマレイミド（何れもMolecular Probe）を終濃度が0.3mMになるように加え暗所下、室温で２時間反応させた。未反応の色素をゲルろ過法によって取り除き、色素標識タンパク質溶液とした。タンパク質濃度はBradford法により決定した。【００６２】
実施例Ａ−４：色素標識CFP変異体タンパク質のスペクトル測定
エオシンは蛍光が弱いため、まずフルオレセイン標識したタンパク質を用いて、FRET効率の高い部位を検討した。フルオレセイン標識CFP変異体タンパク質5mgを1mlのPBS(-)に溶解し、435nmの励起光による蛍光スペクトルを蛍光分光光度計（HITACHI F-2500）を用いて測定した。この結果、N末側は6番目、C末側は２２９番目に色素を標識すると高いFRET効率が得られることが明らかとなった（図２）。図２においてＡは、N末側の２，４，６番目のアミノ酸をシステインに置換し、フルオレセインマレイミドで標識した時の蛍光スペクトルを示す。励起波長は４３５nmを用いた。図２においてＢは、C末側の２２９、２３３、２３８番目のアミノ酸をシステインに置換し、フルオレセインマレイミドで標識した時の蛍光スペクトルを示す。励起波長は４３５nmを用いた。エオシンを標識した場合でも同様の傾向が見られた。【００６３】
さらにFRET効率を向上させるため、N末、C末でFRET効率が最大の部位となったアミノ酸の双方にエオシンを標識し、標識前後でのスペクトルを測定した。また、標識の有無におけるCFP変異体、Sapphireの蛍光ピーク(480nm)の強度比から、FRET効率を算出した。算出に用いた式は以下の通りである。
ET=1-(FDA/FD)
但し、ETはFRET効率を示し、FDAは色素が標識されているCFP変異体タンパク質の480nmの蛍光強度を示し、FDは色素が標識されていないCFP変異体タンパク質の480nmの蛍光強度を示す。【００６４】
図３に標識前後のスペクトル変化とFRET効率を示す。図３において、ＡはSapphire、ＢはCFPを示す。いずれにおいても破線は未標識、実線は標識した蛍光タンパク質のスペクトルを示す。【００６５】
実施例Ａ−５：活性酸素産生測定
エオシン標識したCFPが光照射依存的に一重項酸素を産生するかどうかを調べた。一重項酸素測定にはSinglet Oxygen Sensor Green Reagent ( SOSGR, Molecular Probe)をプローブとして用いた。SOSGRは無蛍光性だが一重項酸素と特異的に反応することによって、525nmの蛍光を放出するようになる。1μgのエオシン未標識または標識mSECFP-6C/229C(それぞれCFP、CFP-eosin)を15μlのPBSに溶かし、SOSGRを終濃度が66.7μMになるように加えた。5μlをテラサキプレートの2ウェルに移し、一方に８ｍWの430nmレーザーを１分間照射した。その後、溶液全量を300μlのPBS(-)に希釈し、505nm励起による525nmの蛍光強度を蛍光分光光度計（HITACHI F-2500）を用いて測定した。レーザー照射されたサンプルの値からレーザー照射していないサンプルの値を差し引いて相対的活性酸素産生量とした。図４から、エオシン標識mSECFP-6C/229Cは430nmの光照射により有意に一重項酸素を産生することが分かる。エオシンは430nmに吸収を持たないため、この結果は430nmの光によって励起されたCFPからFRETによりエオシンにエネルギーが効率よく移動した結果と解釈された。【００６６】
実施例Ｂ−１：CN194/pcDNA3、CC195/pcDNA3の構築
mSECFP-72A/229C-pRSETBを鋳型として、以下のプライマーセットを用いてPCRを行った。【００６７】
CN194増幅用プライマーセット
5'-CCCAAGCTTCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3'  (配列番号１３)
5'-ATTGGATCCCAGCACGGGGCCGTCGCC-3'  (配列番号１４)【００６８】
CC195増幅用プライマーセット
5'-CCCAAGCTTCCACCATGCTGCCCGACAACCACTACCTG-3'  (配列番号１５)
5'-ATTGGATCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3'  (配列番号１６)【００６９】
PCR産物を制限酵素HindIIIとBamHIで切断し、pcDNA3(Invitrogen)のHindIII-BamHIサイトに挿入し、CN194/pcDNA3とCC195/pcDNA3を構築した。【００７０】
実施例Ｂ−２：CN194-LZB/pcDNA3、CC195-LZA/pcDNA3の構築
Heterodimeric coiled coil構造を形成するACID-p1(LZA)とBASE-p1(LZB)(Erin K et al., Current Biology 3, 658-667, 1993)を下記の合成オリゴヌクレオチドとプライマーセットを用いてPCRにより増幅した。【００７１】
LZA合成オリゴヌクレオチド
5'-GGA GGC GCC CAG CTA GAA AAG GAG CTG CAA GCC CTG GAG AAG GAG AAC GCC CAG CTC GAA TGG GAG CTC CAG GCC CTG GAG AAG GAG CTG GCC CAG AAG TAA-3'  (配列番号１７)
LZA増幅用プライマーセット
5'-ATT GGA TCC GGA GGC GCC CAG CTA GAA AAG-3'  (配列番号１８)
5'- ATT GAA TTC TTA CTT CTG GGC CAG CTC CTT C-3'  (配列番号１９)【００７２】
LZB合成オリゴヌクレオチド
5'-GGA GGC GCC CAG CTC AAG AAG AAG CTG CAA GCC CTG AAG AAG AAG AAC GCC CAG CTC AAG TGG AAG CTC CAG GCC CTG AAG AAG AAG CTG GCC CAG AAG TAA-3'  (配列番号２０)
LZB増幅用プライマーセット
5'-ATT GGA TCC GGA GGC GCC CAG CTC AAG AAG-3'  (配列番号２１)
5'- ATT GAA TTC TTA CTT CTG GGC CAG CTT CTT C-3'  (配列番号２２)【００７３】
LZA、LZBのPCR産物を制限酵素BamHIとEcoRIで切断し、それぞれCC195/pcDNA3とCN194/pcDNA3のBamHI-EcoRIサイトに挿入し、CC195-LZA/pcDNA3とCN194-LZB/pcDNA3を構築した。【００７４】
実施例Ｂ−３：hOC/pcDNA3の構築
ヒトオルニチンカルバミラーゼのミトコンドリア局在化配列(hOC)を下記の合成オリゴヌクレオチドとプライマーセットを用いてオーバーラップPCR法により増幅した。【００７５】
hOC-N合成オリゴヌクレオチド
5'-ACC ATG CTG TTC AAC CTG AGG ATC CTG CTG AAC AAC GCC GCC TTC AGG AAC GGC CAC AAC TTC ATG GTG AGG-3'  (配列番号２３)
hOC-C合成オリゴヌクレオチド
5'-CCC CTG CAC CTT GTT CTG CAG GGG CTG GCC GCA CCT GAA GTT CCT CAC CAT GAA GTT GTG GCC GTT-3'  (配列番号２４)
hOC-N増幅用プライマーセット
5'-CCCAAGCTTCCACCATGCTGTTCAACCTGAGGATC-3'  (配列番号２５)
5'-CGCAAGCTTTCGGCCGCCCTGCACCTTGTTCTGCAGGGGCTG-3'  (配列番号２６)【００７６】
hOCのPCR産物を制限酵素HindIIIとNotIで切断し、pcDNA3のHindIII-NotIサイトに挿入し、hOC/pcDNA3を構築した。【００７７】
実施例Ｂ−４：hOC-CN194-LZB/pcDNA3、hOC-CC195-LZA/pcDNA3の構築
CC195-LZA/pcDNA3とCN194-LZB/pcDNA3を鋳型とし、下記のプライマーセットを用いてPCRによりCN194-LZBとCC195-LZAを増幅した。【００７８】
CN194-LZB増幅用プライマーセット
5'-CCCAAGCTTGCGGCCGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3'  (配列番号２７)
5'-CCGCTCGAGTTACTTCTGGGCCAGCTTCTTC-3'  (配列番号２８)
CC195-LZA増幅用プライマーセット
5'-CCCAAGCTTGCGGCCGCATGCTGCCCGACAACCACTAC-3'  (配列番号２９)
5'-CCGCTCGAGTTACTTCTGGGCCAGCTCCTTC-3'  (配列番号３０)【００７９】
CN194-LZBとCC195-LZAのPCR産物を制限酵素NotIとXhoIで切断し、hOC/pcDNA3のNotI-XhoIサイトに挿入し、hOC-CN194-LZB/pcDNA3とhOC-CC195-LZA/pcDNA3を構築した。【００８０】
実施例Ｂ−５：hOC-CC195-LZA/pET23aの構築
hOC-CC195-LZA/pcDNA3を鋳型とし、下記のプライマーセットを用いてPCRを行い、hOC-CC195-LZAを増幅した。【００８１】
hOC-CC195-LZA増幅用プライマーセット
5'-GGAATTCCATATGCTGTTCAACCTGAGGATC-3'  (配列番号３１)
5'-CCGCTCGAGCTTCTGGGCCAGCTCCTTC-3'  (配列番号３２)【００８２】
PCR産物を制限酵素NdeIとXhoIで切断し、pET23a(Novagen)のNdeI-XhoIサイトに挿入してhOC-CC195-LZA/pET23aを構築した。【００８３】
実施例Ｂ−６：色素標識hOC-CC195-LZAタンパク質の調製
hOC-CC195-LZA/pET23a 10ngを用いて大腸菌(JM109 DE3)を形質転換し、100μg/mlのアンピシリンを含むLBプレート上で１日培養した。１つの大腸菌コロニーをピックアップして100μg/mlアンピシリンを含むLB培地200mlに植菌し、20度で４日間振蕩培養した。遠心により菌体を回収した後、10mlのPBS(-)で懸濁し、フレンチプレスを用いて菌体を破砕した。遠心により残渣を取り除き、粗精製hOC-CC195-LZAタンパク質溶液とした。次に、粗精製hOC-CC195-LZAタンパク質溶液2.5mlに終濃度が1mM になるようにTCEPを加え室温30分インキュベートした。その後、エオシンマレイミドまたはフルオレセインマレイミド（何れもMolecular Probe）を終濃度が0.3mMになるように加え暗所下、室温で２時間反応させた。反応後、2mlのNi-NTAアガロースを加え１時間振蕩した。Ni-NTAアガロースに吸着したタンパク質をカラムにつめ5mlのPBS(-)で洗浄後、1mlの100mMイミダゾール/PBS(-)で溶出し、ゲルろ過法によってイミダゾールを取り除いて精製タンパク質溶液とした。【００８４】
実施例Ｂ−７：HeLa細胞ミトコンドリア内における蛍光タンパク質の再構成と光照射によるミトコンドリア破壊
35mmガラスボトム皿上で培養されている1x105個のHeLaS3細胞にリポフェクション法により1μgのhOC-CN194-LZB/pcDNA3をトランスフェクションした。24時間後に未標識hOC-CC195-LZAをビーズロード法によりHeLa細胞に導入し、4時間後に蛍光観察を行った。顕微鏡はオリンパス社のFV1000共焦点レーザー顕微鏡を、対物レンズにはPLANApo x60 NA1.2 Waterを使用した。マルチアルゴンレーザーの458nmライン(最大出力3mW)のレーザー光(レーザーパワー15%)で励起し、470〜560nmの蛍光を取得した。【００８５】
未標識hOC-CC195-LZAが導入されていないhOC-CN194-LZBのみを発現するHeLa細胞では蛍光が観察されないのに対し、未標識hOC-CC195-LZAが導入されたHeLa細胞ではミトコンドリアからの蛍光が観察された（図６）。図６において、Ａは、hOC-CN194-LZBのみを発現するHeLa細胞の蛍光像を示し、Ｂは、hOC-CN194-LZBのみを発現するHeLa細胞にhOC-CC195-LZAを導入して4時間後の蛍光像を示す。この結果はhOCによってミトコンドリアのマトリクスに運ばれたCN194-LZBとCC195-LZAがLZBとLZAを介して相互作用し、CFPの構造が回復したことを示している。次に、エオシン標識したhOC-CC195-LZAを導入し、4時間後に同様に観察したところ、やはりミトコンドリアから蛍光が観察された。ミトコンドリアに蛍光性のある細胞に405nm（出力10mW）のレーザーを照射したのちに起こる細胞の変化をタイムラプス観察した（図７）。その結果、405nmの光照射を受けた細胞は数分後にネクローシスにより死滅することが分かった。一方、未標識hOC-CC195-LZAが導入されたHeLa細胞では同様の光照射をしても細胞は死滅しなかった。このことは405nmのレーザーによって励起されたCFPからエオシンにエネルギーが移動し、一重項酸素が産生され、ミトコンドリアの諸機能が不活性化した結果であると示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明により、光照射依存的に活性酸素を産生させ、これにより任意の標的物質（標的生理機能）を不活性化することが可能になった。本発明においては、光を照射した時に、照射した場所のみにおいて活性酸素が標的物質を不活性化することができる。一般に生体分子の機能は、その生理機能が発揮される特定の部位や、あるいは個体発生上の特定の時間に発現している場合があるので、時間及び空間に特異的に標的物質を不活性化することができる本発明の方法は、生体分子の機能解析に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図１は、本発明の方法のアウトラインを示す。
【図２】図２は、CFPの異なる部位にfluoresceinを導入したときの蛍光スペクトルを示す。
【図３】図３は、Sapphire及びCFPの6番目と229番目をシステインに置換し、エオシンマレイミドで標識した時の蛍光スペクトルとFRET効率を示す。
【図４】図４は、FRETを介した光増感物質の励起による活性酸素（一重項酸素）の産生を示す。
【図５】図５は、本発明の方法のアウトラインを示す。
【図６】図６は、分割CFPのミトコンドリア内での再構成を示す。
【図７】図７は、ミトコンドリア破壊によるネクローシス（細胞壊死）の誘導の結果を示す。
【図１】
2006068187.tif 000002
【図２】
2006068187.tif 000003
【図３】
2006068187.tif 000004
【図４】
2006068187.tif 000005
【図５】
2006068187.tif 000006
【図６】
2006068187.tif 000007
【図７】
2006068187.tif 000008
【配列表】
2006068187000001.app
【国際調査報告】
2006068187.tif 000009
2006068187.tif 000010
2006068187.tif 000011
2006068187.tif 000012