【手続補正書】
【提出日】令和2年5月7日(2020.5.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の外来抗原に対する抗原結合タンパク質を産生するための方法であって、
（ａ）目的の外来抗原に対する寛容が抑制された遺伝子組換え非ヒト動物を作製することであって、
（ｉ）非ヒト動物１細胞期胚にまたは１細胞期胚ではない非ヒト動物多能性細胞に、
（Ｉ）Ｃａｓ９タンパク質または前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸と、
（ＩＩ）第１のガイドＲＮＡまたは前記第１のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡであって、前記第１のガイドＲＮＡは標的ゲノム遺伝子座内の第１のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズし、
前記標的ゲノム遺伝子座は、前記目的の外来抗原と相同であるまたは前記目的の外来抗原と目的のエピトープを共有する自己抗原をコードする遺伝子の全てまたは一部を含む、前記第１のガイドＲＮＡまたは前記第１のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡと、
（ＩＩＩ）第２のガイドＲＮＡまたは前記第２のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡであって、前記第２のガイドＲＮＡは前記標的ゲノム遺伝子座内の第２のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする、前記第２のガイドＲＮＡまたは前記第２のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡと、
を導入することと、
（ｉｉ）前記標的ゲノム遺伝子座で、改変非ヒト動物１細胞期胚、または二対立遺伝子改変を有する改変非ヒト動物多能性細胞を識別することであって、前記自己抗原の発現は排除される、前記識別することと、
（ｉｉｉ）前記改変非ヒト動物１細胞期胚または前記改変非ヒト動物多能性細胞から遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を作製することであって、
前記標的ゲノム遺伝子座は、前記自己抗原の発現が排除されるように、前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物内における対応する第１の染色体と第２の染色体の前記ペア内で改変される、前記作製することと、
を含む、前記作製することと、
（ｂ）工程（ａ）で作製した前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を前記目的の外来抗原で免疫化することと、
（ｃ）前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を、前記目的の外来抗原に対する免疫応答を開始するのに十分な条件下に維持することと、
を含み、
前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物は、前記目的の外来抗原に対する抗原結合タンパク質を産生する、
前記方法。
【請求項２】
前記Ｃａｓ９タンパク質が、二本鎖切断誘導活性を有し、前記Ｃａｓ９タンパク質および前記ガイドＲＮＡが前記標的ゲノム遺伝子座内の異なる部位における対の二本鎖切断を生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（Ｉ）工程（ａ）（ｉ）における前記細胞または胚が、非ヒト動物１細胞期胚であり、工程（ａ）（ｉｉｉ）における遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を作製することは、前記改変非ヒト動物１細胞期胚を代理母に移植して、前記自己抗原の発現が排除されるように、前記標的ゲノム遺伝子座が対応する第１の染色体と第２の染色体の前記ペア内で改変された前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を作製することを含むか、または
（ＩＩ）工程（ａ）（ｉ）における前記細胞または胚が、前記非ヒト動物多能性細胞であり、前記非ヒト動物多能性細胞は前記非ヒト動物胚性幹細胞であり、工程（ａ）（ｉｉｉ）における遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を作製することは、前記改変非ヒト動物多能性細胞を宿主胚へと導入し、前記宿主胚を代理母に妊娠させて、前記自己抗原の発現が排除されるように、前記標的ゲノム遺伝子座が対応する第１の染色体と第２の染色体の前記ペア内で改変された前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を作製することを含む、
請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ａ）（ｉ）における前記細胞または胚が非ヒト動物多能性細胞であり、前記非ヒト動物多能性細胞が非ヒト動物胚性幹細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記免疫化した遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物から単離したＢ細胞からハイブリドーマを作製することを更に含む、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記免疫化した遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物から、前記目的の外来抗原に対する前記抗原結合タンパク質のうちの１つにおける免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする第１の核酸配列、及び／または、前記目的の外来抗原に対する前記抗原結合タンパク質のうちの１つにおける免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードする第２の核酸配列を得ることを更に含み、
必要に応じて、前記第１の核酸配列及び／または前記第２の核酸配列は、前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物のリンパ球から、または、前記リンパ球から作製したハイブリドーマから得られ、
必要に応じて、前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物はヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含み、前記第１の核酸配列はヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードし、前記第２の核酸配列はヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードする、
請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
（Ｉ）前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物が産生した前記目的の外来抗原に対する前記抗原結合タンパク質は、前記標的ゲノム遺伝子座において野生型である対照非ヒト動物を前記目的の外来抗原で免疫化した後の前記対照非ヒト動物が産生した抗原結合タンパク質と比較して、より高い力価を有する、および／または
（ＩＩ）前記標的ゲノム遺伝子座において野生型である対照非ヒト動物を前記目的の外来抗原で免疫化した後の前記対照非ヒト動物が産生した抗原結合タンパク質と比較して、前記目的の外来抗原に対する抗原結合タンパク質のより多様なレパートリーは、前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を前記目的の外来抗原で免疫化した後の前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物により産生される、および／または
（ＩＩＩ）前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物が産生した前記目的の外来抗原に対する前記抗原結合タンパク質は、前記標的ゲノム遺伝子座において野生型である対照非ヒト動物を前記目的の外来抗原で免疫化した後の前記対照非ヒト動物が産生した抗原結合タンパク質と比較して、より多様性が大きい重鎖Ｖ遺伝子セグメント及び／または軽鎖Ｖ遺伝子セグメントを使用する、および／または
（ＩＶ）前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物が産生した前記目的の外来抗原に対する前記抗原結合タンパク質の一部は、前記自己抗原と交差反応する、
請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記第１のガイドＲＮＡ認識配列は、前記標的ゲノム遺伝子座内における前記第２のガイドＲＮＡ認識配列の５´であり、
工程（ａ）（ｉｉ）は、保持アッセイを実施して、５´領域及び前記第１のガイドＲＮＡ認識配列の約１ｋｂ内における及び／または３´領域及び前記第２のガイドＲＮＡ認識配列の約１ｋｂ内におけるコピー数が、２であることを確認することを含む、
請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記目的の外来抗原は、前記自己抗原のオルソログである、および／または前記目的の外来抗原は、ヒトタンパク質の全てまたは一部を含む、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的ゲノム遺伝子座は、改変されて、１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、または、１つまたは複数のヌクレオチドの置換を含む、請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的ゲノム遺伝子座は、改変されて、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失を含み、前記改変は、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の全てまたは一部の二対立遺伝子欠失を含み、必要に応じて、前記欠失は、ランダムな挿入及び欠失（インデル）を伴わない正確な欠失であり、必要に応じて、前記標的ゲノム遺伝子座は、改変されて、約０．１ｋｂ〜約２００ｋｂの二対立遺伝子欠失を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
（Ｉ）前記第１のガイドＲＮＡ認識配列は、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の開始コドンを含むか、または、前記開始コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内であり、前記第２のガイドＲＮＡ認識配列は、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の終止コドンを含むか、または、前記終止コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内であり、前記改変は、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の全てまたは一部の二対立遺伝子欠失を含むか、または
（ＩＩ）第１と第２のガイドＲＮＡ認識配列は異なり、前記第１と第２のガイドＲＮＡ認識配列のそれぞれは、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の開始コドンを含むか、または、前記開始コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内であり、前記改変は、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の全てまたは一部の二対立遺伝子欠失を含む、
請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記導入工程（ａ）（ｉ）は、前記非ヒト動物多能性細胞または前記非ヒト動物１細胞期胚に、
（ＩＶ）第３のガイドＲＮＡもしくは前記第３のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡであって、前記第３のガイドＲＮＡが、前記標的ゲノム遺伝子座内の第３のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする、第３のガイドＲＮＡもしくは前記第３のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ、及び／または、
（Ｖ）第４のガイドＲＮＡもしくは前記第４のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡであって、前記第４のガイドＲＮＡが、前記標的ゲノム遺伝子座内の第４のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする、第４のガイドＲＮＡもしくは前記第４のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ
を導入することを更に含む、請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
（Ｉ）工程（ａ）（ｉ）における前記細胞または胚が非ヒト動物の多能性幹細胞であり、工程（ａ）（ｉ）が前記Ｃａｓ９タンパク質をコードするＤＮＡ、前記第１のガイドＲＮＡをコードする前記ＤＮＡおよび前記第２のガイドＲＮＡをコードする前記ＤＮＡを導入することを含み、必要に応じて、前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする前記ＤＮＡ、前記第１のガイドＲＮＡをコードする前記ＤＮＡおよび前記第２のガイドＲＮＡをコードする前記ＤＮＡはそれぞれエレクトロポレーションまたはヌクレオフェクションにより前記非ヒト動物の多能性幹細胞に導入されるか、または
（ＩＩ）工程（ａ）（ｉ）における前記細胞または胚が非ヒト動物１細胞期胚であり、工程（ａ）（ｉ）が前記Ｃａｓ９タンパク質をコードするＲＮＡ、前記第１のガイドＲＮＡおよび前記第２のガイドＲＮＡを導入することを含み、必要に応じて、前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする前記ＲＮＡ、前記第１のガイドＲＮＡおよび前記第２のガイドＲＮＡはそれぞれ前核注入または細胞質注入により前記非ヒト動物１細胞期胚に導入される、
請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
外来修復テンプレートは、工程（ａ）（ｉ）で導入されない、請求項１から請求項１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記導入工程（ａ）（ｉ）は、工程（ａ）（ｉ）の前記細胞または胚が前記非ヒト動物１細胞期胚であり、前記外来修復テンプレートの長さが約５ｋｂ以下である場合、前記非ヒト動物多能性細胞または前記非ヒト動物１細胞期胚に、前記標的ゲノム遺伝子座における５´標的配列にハイブリダイズする５´ホモロジーアーム、及び前記標的ゲノム遺伝子座における３´標的配列にハイブリダイズする３´ホモロジーアームを含む外来修復テンプレートを導入することを更に含み、
必要に応じて、前記標的ゲノム遺伝子座は、改変されて、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失を含み、好ましくは、前記欠失核酸配列は、前記５´標的配列と前記３´標的配列の間の前記核酸配列からなる、
請求項１から請求項１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記外来修復テンプレートは、前記５´ホモロジーアームと前記３´ホモロジーアームに隣接する核酸インサートを更に含み、
必要に応じて、前記核酸インサートは、前記標的ゲノム遺伝子座に対して相同またはオルソロガスであり、前記標的ゲノム遺伝子座は、改変されて、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失を含み、前記核酸インサートは前記欠失核酸配列を置換する、
請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記外来修復テンプレートは、約５０ヌクレオチド長〜約１ｋｂ長であり、必要に応じて、前記外来修復テンプレートは、約８０ヌクレオチド長〜約２００ヌクレオチド長であり、必要に応じて、前記外来修復テンプレートは一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドである、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
工程（ａ）（ｉ）の前記細胞または胚は前記非ヒト動物多能性細胞であり、
（ａ）前記外来修復テンプレートは、少なくとも１０ｋｂ長の大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）である、または、
（ｂ）前記外来修復テンプレートはＬＴＶＥＣであり、前記ＬＴＶＥＣの前記５´ホモロジーアームと前記３´ホモロジーアームの総合計は少なくとも１０ｋｂ長である、
請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記非ヒト動物はヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含む、請求項１から請求項１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記非ヒト動物はげっ歯類であり、必要に応じて、前記げっ歯類はラットまたはマウスである、請求項１から請求項２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記げっ歯類はマウスであり、必要に応じて、前記マウス系統はＢＡＬＢ／ｃ系統を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記マウス系統は、ＢＡＬＢ／ｃ系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統及び１２９系統を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記マウス系統は、５０％  ＢＡＬＢ／ｃ、２５％  Ｃ５７ＢＬ／６、及び２５％  １２９であり、必要に応じて、前記マウスのＭＨＣハプロタイプはＭＨＣｂ／ｄである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記マウスは、内在マウス免疫グロブリン遺伝子座に挿入されたヒト非再構成可変領域遺伝子セグメントをその生殖細胞系内に含み、前記ヒト非再構成可変領域遺伝子セグメントは重鎖遺伝子セグメントであり、前記マウス免疫グロブリン遺伝子座は重鎖遺伝子座であり、及び／または、前記ヒト非再構成可変領域遺伝子セグメントはカッパまたはラムダ軽鎖セグメントであり、前記マウス免疫グロブリン遺伝子座は軽鎖遺伝子座である、請求項２２から請求項２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記マウスはマウス定常領域遺伝子と機能的に連結したヒト非再構成可変領域遺伝子セグメントをその生殖細胞系内に含み、前記マウスはヒト定常領域遺伝子を欠き、前記マウス定常領域遺伝子は内在マウス免疫グロブリン遺伝子座に存在し、
必要に応じて、前記マウスは
（Ｉ）ヒト免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの挿入を含むハイブリッド重鎖遺伝子座であって、
前記ヒト重鎖免疫グロブリンＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントは、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子と機能的に連結し、前記マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子は内在マウス免疫グロブリン遺伝子座に存在する、前記ハイブリッド重鎖遺伝子座と、
（ＩＩ）ヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントの挿入を含むハイブリッド軽鎖遺伝子座であって、
前記ヒトＶ及びＪ遺伝子セグメントは、マウス免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列と機能的に連結する、前記ハイブリッド軽鎖遺伝子座と、
を含み、
（Ｉ）は再構成されて、マウス定常領域と機能的に連結したヒト可変領域を含むハイブリッド重鎖配列を形成し、（ＩＩ）は再構成されて、マウス定常領域と機能的に連結したヒト可変領域を含むハイブリッド軽鎖配列を形成し、前記マウスは、ヒト可変領域及びヒト定常領域を含む抗体を形成することができない、
請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記マウスは、マウス軽鎖定常領域と機能的に連結した１つ以下または２つ以下の再構成ヒト軽鎖Ｖ／Ｊ配列を含むヒト化免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子座をその生殖細胞系内に含み、前記マウスは、マウス重鎖定常領域遺伝子と機能的に連結した少なくとも１つの非再構成ヒトＶセグメント、少なくとも１つの非再構成ヒトＤセグメント、及び少なくとも１つの非再構成ヒトＪセグメントを含むヒト化免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座を更に含み、
必要に応じて、前記マウスは、ヒト化重鎖免疫グロブリン可変遺伝子座及びヒト化軽鎖免疫グロブリン可変遺伝子座を含み、前記マウスは単一軽鎖を発現する、
請求項２２から請求項２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記マウスは、
（ａ）免疫グロブリン軽鎖のヒトＶＬドメインをコードする単一再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ／ＪＬ）であって、
前記単一再構成ヒトＶＬ／ＪＬ領域は、ヒトＶκ１−３９／Ｊκ５遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子セグメントから選択される、前記単一再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ／ＪＬ）と、
（ｂ）内在重鎖可変（ＶＨ）遺伝子セグメントの１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントへの置換であって、
前記ヒトＶＨ遺伝子セグメントは内在重鎖定常（ＣＨ）領域遺伝子と機能的に連結し、前記ヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ヒト／マウスキメラ重鎖遺伝子を再構成及び形成することができる、前記置換と、
を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記マウスは抗体の集団を発現し、前記マウスの生殖細胞系は、再構成ヒト生殖細胞系カッパ軽鎖可変領域遺伝子である単一免疫グロブリンカッパ軽鎖可変領域遺伝子のみを含み、
前記マウスは、１つのコピーのみを含有するという点で前記単一免疫グロブリンカッパ軽鎖可変領域遺伝子にヘテロ接合性であるか、または、２つのコピーを含有するという点で前記単一免疫グロブリンカッパ軽鎖可変領域遺伝子にホモ接合性であるかのいずれかであり、前記マウスは、
（ａ）前記集団のそれぞれの免疫グロブリンカッパ軽鎖は、前記再構成ヒト生殖細胞系カッパ軽鎖可変領域遺伝子またはその体細胞変異体によりコードされる軽鎖可変ドメインを含み、
（ｂ）前記集団は、その軽鎖可変ドメインが前記再構成ヒト生殖細胞系カッパ軽鎖可変領域遺伝子によりコードされる前記免疫グロブリンカッパ軽鎖を含む抗体、及び、その軽鎖可変ドメインが前記その体細胞変異体によりコードされる前記免疫グロブリンカッパ軽鎖を含む抗体を含み、
（ｃ）前記マウスは、前記免疫グロブリンカッパ軽鎖と成功裏にペアとなり前記集団の前記抗体を形成する体細胞変異高親和性重鎖の多様な集団を産生する、
ために、
活性な親和性成熟を特徴とする、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記マウスは、その生殖細胞系内において、
（ａ）
（ｉ）単一ヒト生殖細胞系Ｖκ配列であって、
前記単一ヒト生殖細胞系Ｖκ配列は配列番号：１４８または配列番号：１４９内に存在する、前記単一ヒト生殖細胞系Ｖκ配列と、
（ｉｉ）単一ヒト生殖細胞系Ｊκ配列であって、
前記再構成Ｖκ／Ｊκ配列は前記内在マウスκ定常領域と機能的に連結する、前記単一ヒト生殖細胞系Ｊκ配列と、
を含む再構成Ｖκ／Ｊκ配列の内在マウスκ免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座における挿入に、
（ｂ）複数のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントの内在マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座における挿入であって、
前記ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントは内在マウス免疫グロブリン重鎖定常領域と機能的に連結し、前記ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントは、再構成ヒト／マウスキメラ免疫グロブリン重鎖遺伝子を再構成及び形成することができる、前記挿入に、
ヘテロ接合性またはホモ接合性である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記マウスは免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含み、前記改変は内在ＡＤＡＭ６機能を抑制または排除し、
前記マウスは、マウスＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントをコードする異所性核酸配列を含み、前記ＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントは、雄マウスにおいて機能しており、
前記マウスＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントをコードする前記異所性核酸配列は、前記ヒト重鎖可変領域遺伝子座に存在する、
請求項２５から請求項３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記非ヒト動物は少なくとも部分的にＢＡＬＢ／ｃ系統に由来するマウスであり、前記マウスはヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含み、
前記目的の外来抗原は、前記自己抗原に対してオルソロガスなヒトタンパク質の全てまたは一部であり、
（Ｉ）前記第１のガイドＲＮＡ認識配列は、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の開始コドンを含むか、または、前記開始コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内であり、前記第２のガイドＲＮＡ認識配列は、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の終止コドンを含むか、または、前記終止コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内であり、
前記改変は、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の全てまたは一部の二対立遺伝子欠失を含み、それにより前記自己抗原の発現は排除されるか、または
（ＩＩ）前記第１および第２のガイドＲＮＡ認識配列は異なり、前記第１および第２のガイドＲＮＡ認識配列のそれぞれが前記自己抗原をコードする前記遺伝子の開始コドンを含むか、または、前記開始コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内であり、前記改変は、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の前記開始コドンの二対立遺伝子破壊を含み、それにより前記自己抗原の発現は排除される、
請求項１から請求項３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記マウスは、
（ａ）マウスＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントをコードする異所性核酸配列であって、
前記ＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントは、雄マウスにおいて機能している、前記異所性核酸配列と、
（ｂ）ヒト免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの挿入を含むハイブリッド重鎖遺伝子座であって、
前記ヒト重鎖免疫グロブリンＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントは、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子と機能的に連結し、前記マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子は内在マウス免疫グロブリン遺伝子座に存在する、前記ハイブリッド重鎖遺伝子座と、
（ｃ）ヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントの挿入を含むハイブリッド軽鎖遺伝子座であって、
前記ヒトＶ及びＪ遺伝子セグメントは、マウス免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列と機能的に連結する、前記ハイブリッド軽鎖遺伝子座と、
を含み、
（ｂ）は再構成されて、マウス定常領域と機能的に連結したヒト可変領域を含むハイブリッド重鎖配列を形成し、（ｃ）は再構成されて、マウス定常領域と機能的に連結したヒト可変領域を含むハイブリッド軽鎖配列を形成し、前記マウスは、ヒト可変領域及びヒト定常領域を含む抗体を形成することができない、
請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記マウスは、その生殖細胞系内において、
（ａ）マウスＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントをコードする異所性核酸配列であって、
前記ＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントは、雄マウスにおいて機能している、前記異所性核酸配列に、
（ｂ）
（ｉ）単一ヒト生殖細胞系Ｖκ配列であって、
前記単一ヒト生殖細胞系Ｖκ配列は配列番号：１４８または配列番号：１４９内に存在する、前記単一ヒト生殖細胞系Ｖκ配列と、
（ｉｉ）単一ヒト生殖細胞系Ｊκ配列であって、
前記再構成Ｖκ／Ｊκ配列は前記内在マウスκ定常領域と機能的に連結する、前記単一ヒト生殖細胞系Ｊκ配列と、
を含む再構成Ｖκ／Ｊκ配列の内在マウスκ免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座における挿入に、
（ｃ）複数のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントの内在マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座における挿入であって、
前記ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントは内在マウス免疫グロブリン重鎖定常領域と機能的に連結し、前記ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントは、再構成ヒト／マウスキメラ免疫グロブリン重鎖遺伝子を再構成及び形成することができる、前記挿入に、
ヘテロ接合性またはホモ接合性である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１から請求項３４のいずれか１項に記載の方法であって、前記非ヒト動物多能性細胞はハイブリッド細胞であり、または、前記非ヒト動物１細胞期胚はハイブリッド１細胞期胚であり、前記方法は、
（ａ’）前記標的ゲノム遺伝子座内の対応する第１の染色体と第２の染色体の前記ペアの前記配列を比較して、前記標的ゲノム遺伝子座内の標的領域を選択した後に、前記標的ゲノム遺伝子座の残部の全てまたは一部と比較して、対応する第１の染色体と第２の染色体の前記ペア間のより高いパーセンテージの配列同一性を有する前記標的領域に基づいて前記接触工程（ａ）を実施すること、を更に含み、前記標的領域は、
前記第１のガイドＲＮＡ認識配列、及び、前記第１のガイドＲＮＡ認識配列の５´側、３´側または両側上にある少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂまたは１０ｋｂの隣接配列、及び／または、
前記第２のガイドＲＮＡ認識配列、及び、前記第２のガイドＲＮＡ認識配列の５´側、３´側または両側上にある少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂまたは１０ｋｂの隣接配列、
を含み、
必要に応じて、前記標的領域は、前記標的ゲノム遺伝子座の残部と比較して、対応する第１と第２の前記ペア間のより高いパーセンテージの配列同一性を有し、
必要に応じて、前記標的領域は、対応する第１の染色体と第２の染色体の前記ペア間の少なくとも９９．９％の配列同一性を有し、前記標的ゲノム遺伝子座の残部は、対応する第１の染色体と第２の染色体の前記ペア間の９９．８％以下の配列同一性を有する、
前記方法。
【請求項３６】
目的の外来抗原に対する寛容が抑制された遺伝子組換え非ヒト動物を作製するための方法であって、
（ａ）非ヒト動物１細胞期胚にまたは１細胞期胚ではない非ヒト動物多能性細胞に、
（ｉ）Ｃａｓ９タンパク質または前記Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸と、
（ｉｉ）第１のガイドＲＮＡまたは前記第１のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡであって、前記第１のガイドＲＮＡは標的ゲノム遺伝子座内の第１のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズし、
前記標的ゲノム遺伝子座は、前記目的の外来抗原と相同であるまたは前記目的の外来抗原と目的のエピトープを共有する自己抗原をコードする遺伝子の全てまたは一部を含む、前記第１のガイドＲＮＡまたは前記第１のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡと、
（ｉｉｉ）第２のガイドＲＮＡまたは前記第２のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡであって、前記第２のガイドＲＮＡは前記標的ゲノム遺伝子座内の第２のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡまたは前記第２のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡと、
を導入することと、
（ｂ）前記標的ゲノム遺伝子座で、改変非ヒト動物１細胞期胚、または二対立遺伝子改変を有する改変非ヒト動物多能性細胞を識別することであって、前記自己抗原の発現は排除される、前記識別することと、
（ｃ）前記改変非ヒト動物１細胞期胚または前記改変非ヒト動物多能性細胞から遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を作製することであって、
前記標的ゲノム遺伝子座は、前記自己抗原の発現が排除されるように、前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物内における対応する第１の染色体と第２の染色体の前記ペア内で改変される、前記作製することと、
を含む、前記方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４７８】
合計、１９２のＮｅｏ＋クローン、１２８のＨｙｇ＋クローン、及び１６のＮｅｏ＋／Ｈｙｇ＋クローンをスクリーニングした。ＬＴＶＥＣと、４つのｓｇＲＮＡによりガイドされるＣａｓ９エンドヌクレアーゼと組み合わせることにより、一部ヘテロ接合性標的クローン、ヘミ接合性標的クローン、二対立遺伝子崩壊クローン、ＮＨＥＪ欠失を有するヘテロ接合性標的クローン、二対立遺伝子ＮＨＥＪ欠失を有するクローン、及びをＮＨＥＪ欠失有するヘテロ接合性崩壊クローン、を生成した。しかしながら、ホモ接合性標的クローンは観察されなかった。このことは、相同染色体対内のそれぞれの染色体上における独立した標的化事象ではなく、局所的な遺伝子変換事象が、その他の実験で観察されたホモ接合性標的クローンに影響を及ぼすことを示唆している。相同染色体対内のそれぞれの染色体上における独立した標的化事象が、その他の実験で観察されたホモ接合性標的クローンに影響を及ぼす場合、相同染色体対内の２つの染色体のそれぞれのために特に調整された２つの標的化ベクターを使用すると、染色体のそれぞれのために調整された標的化ベクターが５´及び３´標的配列内の対立遺伝子配列変異に向かうために、５´及び３´ホモロジーアームの５´及び３´標的配列内の高いパーセンテージの対立遺伝子配列変異にもかかわらずホモ接合性標的クローンを生成することが予想された。しかしながら、２つのＬＴＶＥＣを使用しても、ホモ接合性標的クローンは一切生成されなかった。このことは、図２７に示すようなホモ接合性標的改変の考えまたは局所的な遺伝子変換事象により生成された考えを更に裏付けるものである。本発明者らは、極性遺伝子変換よりも高い比率で標的欠失及び挿入の両側に局所的なヘテロ接合性の喪失を観察した。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
目的の外来抗原に対する抗原結合タンパク質を産生するための方法であって、
（ａ）目的の外来抗原に対する寛容が抑制された遺伝子組換え非ヒト動物を作製することであって、
（ｉ）非ヒト動物１細胞期胚にまたは１細胞期胚ではない非ヒト動物多能性細胞に、
（Ｉ）Ｃａｓ９タンパク質と、
（ＩＩ）標的ゲノム遺伝子座内の第１のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡであって、
前記標的ゲノム遺伝子座は、前記目的の外来抗原と相同であるまたは前記目的の外来抗原と目的のエピトープを共有する自己抗原をコードする遺伝子の全てまたは一部を含む、前記第１のガイドＲＮＡと、
（ＩＩＩ）前記標的ゲノム遺伝子座内の第２のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡと、
を導入することであって、
前記標的ゲノム遺伝子座は、対応する第１の染色体と第２の染色体のペア内で改変されて、改変非ヒト動物１細胞期胚、または二対立遺伝子改変を有する改変非ヒト動物多能性細胞を産生し、前記自己抗原の発現は排除される、前記導入することと、
（ｉｉ）前記改変非ヒト動物１細胞期胚または前記改変非ヒト動物多能性細胞から遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を作製することであって、
前記標的ゲノム遺伝子座は、前記自己抗原の発現が排除されるように、前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物内における対応する第１の染色体と第２の染色体の前記ペア内で改変される、前記作製することと、
を含む、前記作製することと、
（ｂ）工程（ａ）で作製した前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を前記目的の外来抗原で免疫化することと、
（ｃ）前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を、前記目的の外来抗原に対する免疫応答を開始するのに十分な条件下に維持することと、
を含み、
前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物は、前記目的の外来抗原に対する抗原結合タンパク質を産生する、
前記方法。
(項目２)
工程（ａ）（ｉ）の前記細胞は前記非ヒト動物の多能性幹細胞であり、工程（ａ）（ｉｉ）における前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物の前記作製は、
（Ｉ）前記改変非ヒト動物多能性細胞を宿主胚に導入することと、
（ＩＩ）前記宿主胚を代理母に移植して、前記自己抗原の発現が排除されるように、前記標的ゲノム遺伝子座が対応する第１の染色体と第２の染色体の前記ペア内で改変された前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を作製することと、
を含む、項目１に記載の方法。
(項目３)
前記多能性細胞は胚性幹（ＥＳ）細胞である、項目２に記載の方法。
(項目４)
工程（ａ）（ｉ）の前記細胞は前記非ヒト動物１細胞期胚であり、工程（ａ）（ｉｉ）における前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物の前記作製は、前記改変非ヒト動物１細胞期胚を代理母に移植して、前記自己抗原の発現が排除されるように、前記標的ゲノム遺伝子座が対応する第１の染色体と第２の染色体の前記ペア内で改変された前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を作製することを含む、項目１に記載の方法。
(項目５)
前記免疫化した遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物から単離したＢ細胞からハイブリドーマを作製することを更に含む、項目１から項目４のいずれか１項に記載の方法。
(項目６)
前記免疫化した遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物から、前記目的の外来抗原に対する前記抗原結合タンパク質のうちの１つにおける免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする第１の核酸配列、及び／または、前記目的の外来抗原に対する前記抗原結合タンパク質のうちの１つにおける免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードする第２の核酸配列を得ることを更に含む、項目１から項目５のいずれか１項に記載の方法。
(項目７)
前記第１の核酸配列及び／または前記第２の核酸配列は、前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物のリンパ球から、または、前記リンパ球から作製したハイブリドーマから得られる、項目６に記載の方法。
(項目８)
前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物はヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含み、前記第１の核酸配列はヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードし、前記第２の核酸配列はヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードする、項目６または項目７に記載の方法。
(項目９)
前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物が産生した前記目的の外来抗原に対する前記抗原結合タンパク質は、前記標的ゲノム遺伝子座において野生型である対照非ヒト動物を前記目的の外来抗原で免疫化した後の前記対照非ヒト動物が産生した抗原結合タンパク質と比較して、より高い力価を有する、項目１から項目８のいずれか１項に記載の方法。
(項目１０)
前記標的ゲノム遺伝子座において野生型である対照非ヒト動物を前記目的の外来抗原で免疫化した後の前記対照非ヒト動物が産生した抗原結合タンパク質と比較して、前記目的の外来抗原に対する抗原結合タンパク質のより多様なレパートリーは、前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を前記目的の外来抗原で免疫化した後の前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物により産生される、項目１から項目９のいずれか１項に記載の方法。
(項目１１)
前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物が産生した前記目的の外来抗原に対する前記抗原結合タンパク質は、前記標的ゲノム遺伝子座において野生型である対照非ヒト動物を前記目的の外来抗原で免疫化した後の前記対照非ヒト動物が産生した抗原結合タンパク質と比較して、より多様性が大きい重鎖Ｖ遺伝子セグメント及び／または軽鎖Ｖ遺伝子セグメントを使用する、項目１から項目１０のいずれか１項に記載の方法。
(項目１２)
前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物が産生した前記目的の外来抗原に対する前記抗原結合タンパク質の一部は、前記自己抗原と交差反応する、項目１から項目１１のいずれか１項に記載の方法。
(項目１３)
前記第１のガイドＲＮＡ認識配列は、前記標的ゲノム遺伝子座内における前記第２のガイドＲＮＡ認識配列の５´であり、
工程（ａ）（ｉ）は、保持アッセイを実施して、５´領域及び前記第１のガイドＲＮＡ認識配列の約１ｋｂ内における及び／または３´領域及び前記第２のガイドＲＮＡ認識配列の約１ｋｂ内におけるコピー数が、２であることを確認することを更に含む、
項目１から項目１２のいずれか１項に記載の方法。
(項目１４)
前記目的の外来抗原は、前記自己抗原のオルソログである、項目１から項目１３のいずれか１項に記載の方法。
(項目１５)
前記目的の外来抗原は、ヒトタンパク質の全てまたは一部を含む、項目１から項目１４のいずれか１項に記載の方法。
(項目１６)
前記標的ゲノム遺伝子座は、改変されて、１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、または、１つまたは複数のヌクレオチドの置換を含む、項目１から項目１５のいずれか１項に記載の方法。
(項目１７)
前記標的ゲノム遺伝子座は、改変されて、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失を含む、項目１６に記載の方法。
(項目１８)
前記欠失は、ランダムな挿入及び欠失（インデル）を伴わない正確な欠失である、項目１７に記載の方法。
(項目１９)
前記第１のガイドＲＮＡ認識配列は、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の開始コドンを含むか、または、前記開始コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内であり、前記第２のガイドＲＮＡ認識配列は、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の終止コドンを含むか、または、前記終止コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内である、項目１から項目１８のいずれか１項に記載の方法。
(項目２０)
前記第１と第２のガイドＲＮＡ認識配列は異なり、前記第１と第２のガイドＲＮＡ認識配列のそれぞれは、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の開始コドンを含むか、または、前記開始コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内である、項目１から項目１８のいずれか１項に記載の方法。
(項目２１)
前記標的ゲノム遺伝子座は、改変されて、約０．１ｋｂ〜約２００ｋｂの二対立遺伝子欠失を含む、項目１から項目２０のいずれか１項に記載の方法。
(項目２２)
前記改変は、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の全てまたは一部の二対立遺伝子欠失を含む、項目１から項目２１のいずれか１項に記載の方法。
(項目２３)
前記改変は、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の開始コドンの二対立遺伝子破壊を含む、項目１から項目２２のいずれか１項に記載の方法。
(項目２４)
前記導入工程（ａ）（ｉ）は、前記非ヒト動物多能性細胞または前記非ヒト動物１細胞期胚に、
（ｉｖ）前記標的ゲノム遺伝子座内の第３のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第３のガイドＲＮＡ、及び／または、
（ｖ）前記標的ゲノム遺伝子座内の第４のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第４のガイドＲＮＡ、
を導入することを更に含む、項目１から項目２３のいずれか１項に記載の方法。
(項目２５)
工程（ａ）（ｉ）の前記細胞は前記非ヒト動物の多能性幹細胞であり、前記Ｃａｓ９タンパク質、前記第１のガイドＲＮＡ及び前記第２のガイドＲＮＡはそれぞれ、ＤＮＡの形態で前記非ヒト動物の多能性幹細胞に導入される、項目１から項目２４のいずれか１項に記載の方法。
(項目２６)
工程（ａ）（ｉ）の前記細胞は前記非ヒト動物の多能性幹細胞であり、前記Ｃａｓ９タンパク質、前記第１のガイドＲＮＡ及び前記第２のガイドＲＮＡはそれぞれ、エレクトロポレーションまたはヌクレオフェクションにより前記非ヒト動物の多能性幹細胞に導入される、項目１から項目２５のいずれか１項に記載の方法。
(項目２７)
工程（ａ）（ｉ）の前記細胞は前記非ヒト動物１細胞期胚であり、前記Ｃａｓ９タンパク質、前記第１のガイドＲＮＡ及び前記第２のガイドＲＮＡはそれぞれ、ＲＮＡの形態で前記非ヒト動物１細胞期胚に導入される、項目１から項目２４のいずれか１項に記載の方法。
(項目２８)
工程（ａ）（ｉ）の前記細胞は前記非ヒト動物１細胞期胚であり、前記Ｃａｓ９タンパク質、前記第１のガイドＲＮＡ及び前記第２のガイドＲＮＡは、前核注入または細胞質注入により前記非ヒト動物１細胞期胚に導入される、項目１から項目２４及び項目２７のいずれか１項に記載の方法。
(項目２９)
外来修復テンプレートは、工程（ａ）（ｉ）で導入されない、項目１から項目２８のいずれか１項に記載の方法。
(項目３０)
前記導入工程（ａ）（ｉ）は、工程（ａ）（ｉ）の前記細胞が前記非ヒト動物１細胞期胚であり、前記外来修復テンプレートの長さが約５ｋｂ以下である場合、前記非ヒト動物多能性細胞または前記非ヒト動物１細胞期胚に、前記標的ゲノム遺伝子座における５´標的配列にハイブリダイズする５´ホモロジーアーム、及び前記標的ゲノム遺伝子座における３´標的配列にハイブリダイズする３´ホモロジーアームを含む外来修復テンプレートを導入することを更に含む、項目１から項目２８のいずれか１項に記載の方法。
(項目３１)
前記外来修復テンプレートは、前記５´ホモロジーアームと前記３´ホモロジーアームに隣接する核酸インサートを更に含む、項目３０に記載の方法。
(項目３２)
前記核酸インサートは、前記標的ゲノム遺伝子座に対して相同またはオルソロガスである、項目３１に記載の方法。
(項目３３)
前記外来修復テンプレートは、約５０ヌクレオチド長〜約１ｋｂ長である、項目３０から項目３２のいずれか１項に記載の方法。
(項目３４)
前記外来修復テンプレートは、約８０ヌクレオチド長〜約２００ヌクレオチド長である、項目３３に記載の方法。
(項目３５)
前記外来修復テンプレートは一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドである、項目３０から項目３４のいずれか１項に記載の方法。
(項目３６)
工程（ａ）（ｉ）の前記細胞は前記非ヒト動物多能性細胞であり、
（ａ）前記外来修復テンプレートは、少なくとも１０ｋｂ長の大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）である、または、
（ｂ）前記外来修復テンプレートはＬＴＶＥＣであり、前記ＬＴＶＥＣの前記５´ホモロジーアームと前記３´ホモロジーアームの総合計は少なくとも１０ｋｂ長である、
項目３０から項目３２のいずれか１項に記載の方法。
(項目３７)
前記標的ゲノム遺伝子座は、改変されて、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失を含み、
前記欠失核酸配列は、前記５´標的配列と前記３´標的配列の間の前記核酸配列からなる、
項目３０から項目３６のいずれか１項に記載の方法。
(項目３８)
前記外来修復テンプレートは、前記５´ホモロジーアームと前記３´ホモロジーアームに隣接する核酸インサートを含み、
前記核酸インサートは、前記欠失核酸配列に対して相同またはオルソロガスであり、
前記標的ゲノム遺伝子座は、改変されて、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失を含み、
前記核酸インサートは前記欠失核酸配列を置換する、
項目３０から項目３７のいずれか１項に記載の方法。
(項目３９)
前記非ヒト動物はヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含む、項目１から項目３８のいずれか１項に記載の方法。
(項目４０)
前記非ヒト動物はげっ歯類である、項目１から項目３９のいずれか１項に記載の方法。
(項目４１)
前記げっ歯類はマウスである、項目４０に記載の方法。
(項目４２)
前記マウス系統はＢＡＬＢ／ｃ系統を含む、項目４１に記載の方法。
(項目４３)
前記マウス系統は、ＢＡＬＢ／ｃ系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統及び１２９系統を含む、項目４２に記載の方法。
(項目４４)
前記マウス系統は、５０％  ＢＡＬＢ／ｃ、２５％  Ｃ５７ＢＬ／６、及び２５％  １２９である、項目４３に記載の方法。
(項目４５)
前記マウスのＭＨＣハプロタイプはＭＨＣｂ／ｄである、項目４１から項目４４のいずれか１項に記載の方法。
(項目４６)
前記マウスは、内在マウス免疫グロブリン遺伝子座に挿入されたヒト非再構成可変領域遺伝子セグメントをその生殖細胞系内に含む、項目４１から項目４５のいずれか１項に記載の方法。
(項目４７)
前記ヒト非再構成可変領域遺伝子セグメントは重鎖遺伝子セグメントであり、前記マウス免疫グロブリン遺伝子座は重鎖遺伝子座であり、及び／または、前記ヒト非再構成可変領域遺伝子セグメントはカッパまたはラムダ軽鎖セグメントであり、前記マウス免疫グロブリン遺伝子座は軽鎖遺伝子座である、項目４６に記載の方法。
(項目４８)
前記マウスはマウス定常領域遺伝子と機能的に連結したヒト非再構成可変領域遺伝子セグメントをその生殖細胞系内に含み、前記マウスはヒト定常領域遺伝子を欠き、前記マウス定常領域遺伝子は内在マウス免疫グロブリン遺伝子座に存在する、項目４６または項目４７に記載の方法。
(項目４９)
前記マウスは、
（ａ）ヒト免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの挿入を含むハイブリッド重鎖遺伝子座であって、
前記ヒト重鎖免疫グロブリンＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントは、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子と機能的に連結し、前記マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子は内在マウス免疫グロブリン遺伝子座に存在する、前記ハイブリッド重鎖遺伝子座と、
（ｂ）ヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントの挿入を含むハイブリッド軽鎖遺伝子座であって、
前記ヒトＶ及びＪ遺伝子セグメントは、マウス免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列と機能的に連結する、前記ハイブリッド軽鎖遺伝子座と、
を含み、
（ａ）は再構成されて、マウス定常領域と機能的に連結したヒト可変領域を含むハイブリッド重鎖配列を形成し、（ｂ）は再構成されて、マウス定常領域と機能的に連結したヒト可変領域を含むハイブリッド軽鎖配列を形成し、前記マウスは、ヒト可変領域及びヒト定常領域を含む抗体を形成することができない、
項目４６から項目４８のいずれか１項に記載の方法。
(項目５０)
前記マウスは、マウス軽鎖定常領域と機能的に連結した１つ以下または２つ以下の再構成ヒト軽鎖Ｖ／Ｊ配列を含むヒト化免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子座をその生殖細胞系内に含み、前記マウスは、マウス重鎖定常領域遺伝子と機能的に連結した少なくとも１つの非再構成ヒトＶセグメント、少なくとも１つの非再構成ヒトＤセグメント、及び少なくとも１つの非再構成ヒトＪセグメントを含むヒト化免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座を更に含む、項目４１から項目４８のいずれか１項に記載の方法。
(項目５１)
前記マウスは、ヒト化重鎖免疫グロブリン可変遺伝子座及びヒト化軽鎖免疫グロブリン可変遺伝子座を含み、前記マウスは単一軽鎖を発現する、項目５０に記載の方法。
(項目５２)
前記マウスは、
（ａ）免疫グロブリン軽鎖のヒトＶＬドメインをコードする単一再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ／ＪＬ）であって、
前記単一再構成ヒトＶＬ／ＪＬ領域は、ヒトＶκ１−３９／Ｊκ５遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子セグメントから選択される、前記単一再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ／ＪＬ）と、
（ｂ）内在重鎖可変（ＶＨ）遺伝子セグメントの１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントへの置換であって、
前記ヒトＶＨ遺伝子セグメントは内在重鎖定常（ＣＨ）領域遺伝子と機能的に連結し、前記ヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ヒト／マウスキメラ重鎖遺伝子を再構成及び形成することができる、前記置換と、
を含む、項目５１に記載の方法。
(項目５３)
前記マウスは抗体の集団を発現し、前記マウスの生殖細胞系は、再構成ヒト生殖細胞系カッパ軽鎖可変領域遺伝子である単一免疫グロブリンカッパ軽鎖可変領域遺伝子のみを含み、
前記マウスは、１つのコピーのみを含有するという点で前記単一免疫グロブリンカッパ軽鎖可変領域遺伝子にヘテロ接合性であるか、または、２つのコピーを含有するという点で前記単一免疫グロブリンカッパ軽鎖可変領域遺伝子にホモ接合性であるかのいずれかであり、前記マウスは、
（ｉ）前記集団のそれぞれの免疫グロブリンカッパ軽鎖は、前記再構成ヒト生殖細胞系カッパ軽鎖可変領域遺伝子またはその体細胞変異体によりコードされる軽鎖可変ドメインを含み、
（ｉｉ）前記集団は、その軽鎖可変ドメインが前記再構成ヒト生殖細胞系カッパ軽鎖可変領域遺伝子によりコードされる前記免疫グロブリンカッパ軽鎖を含む抗体、及び、その軽鎖可変ドメインが前記その体細胞変異体によりコードされる前記免疫グロブリンカッパ軽鎖を含む抗体を含み、
（ｉｉｉ）前記マウスは、前記免疫グロブリンカッパ軽鎖と成功裏にペアとなり前記集団の前記抗体を形成する体細胞変異高親和性重鎖の多様な集団を産生する、
ために、
活性な親和性成熟を特徴とする、項目５１に記載の方法。
(項目５４)
前記マウスは、その生殖細胞系内において、
（ａ）
（ｉ）単一ヒト生殖細胞系Ｖκ配列であって、
前記単一ヒト生殖細胞系Ｖκ配列は配列番号：１４８または配列番号：１４９内に存在する、前記単一ヒト生殖細胞系Ｖκ配列と、
（ｉｉ）単一ヒト生殖細胞系Ｊκ配列であって、
前記再構成Ｖκ／Ｊκ配列は前記内在マウスκ定常領域と機能的に連結する、前記単一ヒト生殖細胞系Ｊκ配列と、
を含む再構成Ｖκ／Ｊκ配列の内在マウスκ免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座における挿入に、
（ｂ）複数のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントの内在マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座における挿入であって、
前記ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントは内在マウス免疫グロブリン重鎖定常領域と機能的に連結し、前記ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントは、再構成ヒト／マウスキメラ免疫グロブリン重鎖遺伝子を再構成及び形成することができる、前記挿入に、
ヘテロ接合性またはホモ接合性である、項目５１に記載の方法。
(項目５５)
前記マウスは免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含み、前記改変は内在ＡＤＡＭ６機能を抑制または排除し、
前記マウスは、マウスＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントをコードする異所性核酸配列を含み、前記ＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントは、雄マウスにおいて機能しており、
前記マウスＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントをコードする前記異所性核酸配列は、前記ヒト重鎖可変領域遺伝子座に存在する、
項目４６から項目５４のいずれか１項に記載の方法。
(項目５６)
前記非ヒト動物は少なくとも部分的にＢＡＬＢ／ｃ系統に由来するマウスであり、前記マウスはヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含み、
前記目的の外来抗原は、前記自己抗原に対してオルソロガスなヒトタンパク質の全てまたは一部であり、
前記第１のガイドＲＮＡ認識配列は、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の開始コドンを含むか、または、前記開始コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内であり、前記第２のガイドＲＮＡ認識配列は、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の終止コドンを含むか、または、前記終止コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内であり、
前記改変は、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の全てまたは一部の二対立遺伝子欠失を含み、それにより前記自己抗原の発現は排除される、
項目１から項目５５のいずれか１項に記載の方法。
(項目５７)
前記非ヒト動物は少なくとも部分的にＢＡＬＢ／ｃ系統に由来するマウスであり、前記マウスはヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含み、
前記目的の外来抗原は、前記自己抗原に対してオルソロガスなヒトタンパク質の全てまたは一部であり、
前記第１のガイドＲＮＡ認識配列は、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の開始コドンを含み、前記第２のガイドＲＮＡ認識配列は、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の終止コドンを含むか、または、前記開始コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内であり、
前記改変は、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の開始コドンの二対立遺伝子破壊を含み、それにより前記自己抗原の発現は排除される、
項目１から項目５５のいずれか１項に記載の方法。
(項目５８)
前記マウスは、
（ａ）マウスＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントをコードする異所性核酸配列であって、
前記ＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントは、雄マウスにおいて機能している、前記異所性核酸配列と、
（ｂ）ヒト免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの挿入を含むハイブリッド重鎖遺伝子座であって、
前記ヒト重鎖免疫グロブリンＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントは、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子と機能的に連結し、前記マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子は内在マウス免疫グロブリン遺伝子座に存在する、前記ハイブリッド重鎖遺伝子座と、
（ｃ）ヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントの挿入を含むハイブリッド軽鎖遺伝子座であって、
前記ヒトＶ及びＪ遺伝子セグメントは、マウス免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列と機能的に連結する、前記ハイブリッド軽鎖遺伝子座と、
を含み、
（ｂ）は再構成されて、マウス定常領域と機能的に連結したヒト可変領域を含むハイブリッド重鎖配列を形成し、（ｃ）は再構成されて、マウス定常領域と機能的に連結したヒト可変領域を含むハイブリッド軽鎖配列を形成し、前記マウスは、ヒト可変領域及びヒト定常領域を含む抗体を形成することができない、
項目５６または項目５７に記載の方法。
(項目５９)
前記マウスは、その生殖細胞系内において、
（ａ）マウスＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントをコードする異所性核酸配列であって、
前記ＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントは、雄マウスにおいて機能している、前記異所性核酸配列に、
（ｂ）
（ｉ）単一ヒト生殖細胞系Ｖκ配列であって、
前記単一ヒト生殖細胞系Ｖκ配列は配列番号：１４８または配列番号：１４９内に存在する、前記単一ヒト生殖細胞系Ｖκ配列と、
（ｉｉ）単一ヒト生殖細胞系Ｊκ配列であって、
前記再構成Ｖκ／Ｊκ配列は前記内在マウスκ定常領域と機能的に連結する、前記単一ヒト生殖細胞系Ｊκ配列と、
を含む再構成Ｖκ／Ｊκ配列の内在マウスκ免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座における挿入に、
（ｃ）複数のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントの内在マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座における挿入であって、
前記ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントは内在マウス免疫グロブリン重鎖定常領域と機能的に連結し、前記ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントは、再構成ヒト／マウスキメラ免疫グロブリン重鎖遺伝子を再構成及び形成することができる、前記挿入に、
ヘテロ接合性またはホモ接合性である、項目５６または項目５７に記載の方法。
(項目６０)
項目１から項目５９のいずれか１項に記載の方法であって、前記非ヒト動物多能性細胞はハイブリッド細胞であり、または、前記非ヒト哺乳動物１細胞期胚はハイブリッド１細胞期胚であり、前記方法は、
（ａ’）前記標的ゲノム遺伝子座内の対応する第１の染色体と第２の染色体の前記ペアの前記配列を比較して、前記標的ゲノム遺伝子座内の標的領域を選択した後に、前記標的ゲノム遺伝子座の残部の全てまたは一部と比較して、対応する第１の染色体と第２の染色体の前記ペア間のより高いパーセンテージの配列同一性を有する前記標的領域に基づいて前記接触工程（ａ）を実施すること、を更に含み、前記標的領域は、
前記第１のガイドＲＮＡ認識配列、及び、前記第１のガイドＲＮＡ認識配列の５´側、３´側または両側上にある少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂまたは１０ｋｂの隣接配列、及び／または、
前記第２のガイドＲＮＡ認識配列、及び、前記第２のガイドＲＮＡ認識配列の５´側、３´側または両側上にある少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂまたは１０ｋｂの隣接配列、
を含む、前記方法。
(項目６１)
前記標的領域は、前記標的ゲノム遺伝子座の残部と比較して、対応する第１と第２の前記ペア間のより高いパーセンテージの配列同一性を有する、項目６０に記載の方法。
(項目６２)
前記標的領域は、対応する第１の染色体と第２の染色体の前記ペア間の少なくとも９９．９％の配列同一性を有し、前記標的ゲノム遺伝子座の残部は、対応する第１の染色体と第２の染色体の前記ペア間の９９．８％以下の配列同一性を有する、項目６１に記載の方法。
(項目６３)
目的の外来抗原に対する寛容が抑制された遺伝子組換え非ヒト動物を作製するための方法であって、
（ａ）非ヒト動物１細胞期胚にまたは１細胞期胚ではない非ヒト動物多能性細胞に、
（ｉ）Ｃａｓ９タンパク質と、
（ｉｉ）標的ゲノム遺伝子座内の第１のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡであって、
前記標的ゲノム遺伝子座は、前記目的の外来抗原と相同であるまたは前記目的の外来抗原と目的のエピトープを共有する自己抗原をコードする遺伝子の全てまたは一部を含む、前記第１のガイドＲＮＡと、
（ｉｉｉ）前記標的ゲノム遺伝子座内の第２のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡと、
を導入することであって、
前記標的ゲノム遺伝子座は、対応する第１の染色体と第２の染色体のペア内で改変されて、改変非ヒト動物１細胞期胚、または二対立遺伝子改変を有する改変非ヒト動物多能性細胞を産生し、前記自己抗原の発現は排除される、前記導入することと、
（ｂ）前記改変非ヒト動物１細胞期胚または前記改変非ヒト動物多能性細胞から遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を作製することであって、
前記標的ゲノム遺伝子座は、前記自己抗原の発現が排除されるように、前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物内における対応する第１の染色体と第２の染色体の前記ペア内で改変される、前記作製することと、
を含む、前記方法。
(項目６４)
工程（ａ）の前記細胞は前記非ヒト動物の多能性幹細胞であり、工程（ｂ）における前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物の前記作製は、
（Ｉ）前記改変非ヒト動物多能性細胞を宿主胚に導入することと、
（ＩＩ）前記宿主胚を代理母に移植して、前記自己抗原の発現が排除されるように、前記標的ゲノム遺伝子座が対応する第１の染色体と第２の染色体の前記ペア内で改変された前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を作製することと、
を含む、項目６３に記載の方法。
(項目６５)
前記多能性細胞は胚性幹（ＥＳ）細胞である、項目６４に記載の方法。
(項目６６)
工程（ａ）の前記細胞は前記非ヒト動物１細胞期胚であり、工程（ｂ）における前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物の前記作製は、前記改変非ヒト動物１細胞期胚を代理母に移植して、前記自己抗原の発現が排除されるように、前記標的ゲノム遺伝子座が対応する第１の染色体と第２の染色体の前記ペア内で改変された前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を作製することを含む、項目６３に記載の方法。
(項目６７)
前記目的の外来抗原は、前記自己抗原のオルソログである、項目６３から項目６６のいずれか１項に記載の方法。
(項目６８)
前記第１のガイドＲＮＡ認識配列は、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の開始コドンを含むか、または、前記開始コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内であり、前記第２のガイドＲＮＡ認識配列は、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の終止コドンを含むか、または、前記終止コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内である、項目６３から項目６７のいずれか１項に記載の方法。
(項目６９)
前記第１と第２のガイドＲＮＡ認識配列は異なり、前記第１と第２のガイドＲＮＡ認識配列のそれぞれは、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の開始コドンを含むか、または、前記開始コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内である、項目６３から項目６７のいずれか１項に記載の方法。
(項目７０)
前記第１のガイドＲＮＡ認識配列は、前記標的ゲノム遺伝子座内における前記第２のガイドＲＮＡ認識配列の５´であり、
工程（ａ）（ｉ）は、保持アッセイを実施して、５´領域及び前記第１のガイドＲＮＡ認識配列の約１ｋｂ内における及び／または３´領域及び前記第２のガイドＲＮＡ認識配列の約１ｋｂ内におけるコピー数が、２であることを確認することを更に含む、
項目６３から項目６９のいずれか１項に記載の方法。
(項目７１)
前記改変は、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の全てまたは一部の二対立遺伝子欠失を含む、項目６３から項目７０のいずれか１項に記載の方法。
(項目７２)
前記改変は、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の開始コドンの二対立遺伝子破壊を含む、項目６３から項目７１のいずれか１項に記載の方法。
(項目７３)
前記非ヒト動物はマウスである、項目６３から項目７２のいずれか１項に記載の方法。