(57)【要約】  本発明は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）を補酵素とするアルドース脱水素酵素によるアルドースの酸化反応に、ＮＡＤＨオキシダーゼを用いたＮＡＤ＋再生系を共役させ、効率的にアルドン酸を製造することに関する。本発明はまた、ＮＡＤＨオキシダーゼとアルドン酸脱水素酵素を同一宿主内で発現させた組換え微生物、およびＮＡＤを補酵素とするアルドース脱水素酵素、およびＮＡＤＨオキシダーゼを含む組成物を提供する。  本発明によれば、食品添加物、飼料添加物、医薬品製用添加物などの広い用途で利用されるアルドン酸類を、簡便な方法で効率よく製造することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）および（２）を含むアルドン酸類の製造方法：
（１）アルドースにＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を補酵素とするアルドース脱水素酵素を接触させ、アルドン酸へと転化する；
（２）（１）の反応により生成したＮＡＤＨをＮＡＤＨオキシダーゼと接触させ、ＮＡＤ＋へと変換する。
【請求項２】
以下の（３）の工程をさらに含む請求項１記載のアルドン酸の製造方法：
（３）アルドースから変換されたアルドノラクトンを加水分解酵素によってアルドン酸へと変換する。
【請求項３】
前記アルドース脱水素酵素が、グルコース脱水素酵素（Glucose 1-dehydrogenase）、グルコース−６リン酸脱水素酵素（Glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase）、アルドース  １−脱水素酵素（Aldose 1-dehydrogenase）、スレオ−アルドース  １−脱水素酵素（D-threo-aldose 1-dehydrogenase）、アラビノース脱水素酵素（Arabinose 1-dehydrogenase）、およびガラクトース  １−脱水素酵素（Galactose 1-dehydrogenase）からなる群より選ばれる少なくとも１種以上である請求項１または２記載の製造方法。
【請求項４】
前記グルコース脱水素酵素が、バシルス（Bacillus）属、アセトバクター（Acetobacter）属、グルコノバクター（Gluconobacter）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、キサントモナス（Xanthomonas）属、およびサーモプラズマ（Thermoplasma）属からなる群により選ばれる少なくとも１種以上の微生物由来の酵素またはその酵素と実質的に同一の酵素である請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
前記ＮＡＤＨオキシダーゼが、水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼである請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
前記水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼが、酸素存在下であっても酵素保護剤なしで安定な水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼである請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
前記水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼが、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、ラクトバシルス（Lactobacillus）属、エンテロコッカス（Enterococcus）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属、およびペディオコッカス（Pediococcus）属からなる群より選ばれた少なくとも１種以上の微生物由来の酵素またはその酵素と実質的に同一の酵素である請求項５〜６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
前記アルドース脱水素酵素の酵素源が、本酵素を生産し得る組換え微生物の培養物である請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９】
前記ＮＡＤＨオキシダーゼの酵素源が、本酵素を生産し得る組換え微生物の培養物である請求項１〜８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１０】
前記アルドース脱水素酵素の酵素源およびＮＡＤＨオキシダーゼの酵素源が、当該アルドース酸脱水素酵素と当該ＮＡＤＨオキシダーゼとを同一宿主内で発現し得る組換え微生物の培養物である請求項１〜９のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１１】
前記アルドースが、グルコース、グルコース−６リン酸、２−デオキシグルコース、マンノース、ガラクトース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、グルコサミン、マンノサミン、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミンであり、アルドン酸がグルコン酸、グルコン酸−６リン酸、２−デオキシグルコン酸、マンノン酸、ガラクトン酸、アロン酸、アルトロン酸、グロン酸、イドン酸、タロン酸、リボン酸、アラビノン酸、キシロン酸、リキソン酸、グルコサミン酸、マンノサミン酸、ガラクトサミン酸、Ｎ−アセチルグルコサミン酸、Ｎ−アセチルマンノサミン酸、またはＮ−アセチルガラクトサミン酸である請求項１〜１０のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１２】
アルドン酸脱水素酵素をコードする遺伝子と、ＮＡＤＨオキシダーゼをコードする遺伝子とを含むベクター。
【請求項１３】
アルドン酸脱水素酵素をコードする遺伝子と、ＮＡＤＨオキシダーゼをコードする遺伝子の両方を導入された形質転換微生物。
【請求項１４】
アルドン酸脱水素酵素をコードする遺伝子およびＮＡＤＨオキシダーゼをコードする遺伝子の両方を含むベクターによって形質転換された請求項１３記載の形質転換体微生物。
【請求項１５】
ＮＡＤ＋を補酵素とするアルドース脱水素酵素、およびＮＡＤＨオキシダーゼを含む組成物。
【請求項１６】
アルドース脱水素酵素によるアルドース類の酸化反応伴って生ずるＮＡＤＨを水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼによりＮＡＤ＋へ変換することを特徴とするＮＡＤ＋の再生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単糖アルドースを原料としたアルドン酸の酵素的製造方法に関する。
【関連出願の相互参照】
【０００２】
日本国特許２００４−２７７５７９号（２００４年９月２４日出願）の明細書、請求の範囲、図面および要約を含む全開示内容は、これら全開示内容を参照することによって本出願に合体される。
【背景技術】
【０００３】
アルドン酸、例えばグルコン酸は、洗浄剤、金属表面処理剤やコンクリート用混和剤などの用途とともに、調味料、ｐＨ調整剤、品質改善剤等の食品添加物として利用されている。また、最近、整腸作用が報告され、健康志向型食品素材として注目されている。更に、飼料添加物、医薬品製剤中への添加物など幅広い用途に利用されている。【０００４】
アルドン酸、例えばグルコン酸の工業的製造は、従来より主にアスペルギルス（Aspergillus）などの微生物を利用したグルコースを原料とした発酵法により行われてきた。【０００５】
グルコン酸の製法としては、上記発酵法以外に、グルコースオキシダーゼとカタラーゼを用いた酵素法が報告されている（特許文献１、２、３、非特許文献１）。本方法は、グルコースをグルコースオキシダーゼによりグルコン酸へと変換すると同時に、反応により生成するもう一方の生成物である過酸化水素をカタラーゼにより分解することを基本的方法としている。
【特許文献１】特表２０００−５０２９０４号公報
【特許文献２】特表平１０−５０２８２５号公報
【特許文献３】特開平６−７０７８５号公報
【非特許文献１】Biotech. Lett., Vol.5, 743-748, (1983)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記発酵生産法においては、グルコースのほかに、微生物の増殖のための各種栄養源が必要である。また、原料として用いたグルコースは、グルコン酸へ変換される以外にも、菌体増殖のための炭素源としても利用されるため、使用したグルコースに対するグルコン酸の収率はあまり高くない。これらの点は工業的生産法としては経済的に大きな問題である。また、反応液中には、グルコン酸以外に、例えばクエン酸、シュウ酸、５−ケトグルコン酸などの発酵の過程で生じた多くの有機酸が存在するため、反応液からグルコン酸を複雑な工程を経て精製する必要がある。【０００７】
上記酵素法においては、過酸化水素によって、グルコースオキシダーゼ（グルコース酸化酵素）、カタラーゼの不活性化が生ずる。この不活性化の問題点の解決のため、基質であるグルコース添加濃度を低くする、反応温度を低くする、グルコースオキシダーゼに対し過剰量のカタラーゼを使用するなどの改良が行われているが、現在のところ、経済的に実施可能なグルコン酸の製造方法とは言いがたい。【０００８】
上記に鑑み、本発明の目的は、グルコン酸などのアルドン酸類の効率的な生化学的製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題につき鋭意検討を行った結果、アルドース脱水素酵素とＮＡＤＨオキシダーゼとを利用した酵素法により、アルドースからアルドン酸が効率的に製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１０】
本発明の一つの特徴は、以下の（１）および（２）を含むアルドン酸類の製造方法である：
（１）アルドースにＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を補酵素とするアルドース脱水素酵素を接触させ、アルドン酸へと転化する；
（２）（１）の反応により生成したＮＡＤＨをＮＡＤＨオキシダーゼと接触させ、ＮＡＤ＋へと変換する。【００１１】
本発明の別の特徴は、アルドン酸脱水素酵素をコードする遺伝子と、ＮＡＤＨオキシダーゼをコードする遺伝子とを含むベクターである。【００１２】
本発明の別の特徴は、アルドン酸脱水素酵素をコードする遺伝子と、ＮＡＤＨオキシダーゼをコードする遺伝子の両方を導入された形質転換体微生物である。【００１３】
本発明の別の特徴は、ＮＡＤ＋を補酵素とするアルドース脱水素酵素、およびＮＡＤＨオキシダーゼを含む組成物である。【００１４】
本発明の別の特徴は、アルドース脱水素酵素によるアルドース類の酸化反応伴って生ずるＮＡＤＨを水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼによりＮＡＤ＋へ変換することを特徴とするＮＡＤ＋の再生方法である。【００１５】
本発明の実施形態としてのアルドン酸類の製造方法は、ＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を補酵素とするアルドース脱水素酵素によってアルドース類をアルドン酸類へと転化する転化反応において、さらに、（ａ）前記転化反応に伴って生ずるＮＡＤＨをＮＡＤ＋に再変換するために、酸素存在下であっても酵素保護剤なしで安定であることを特徴とする水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼと、（ｂ）前記転化反応によって生ずるアルドノラクトンをアルドン酸類へ変換する加水分解酵素、とを組合わせて使用することを特徴とするアルドン酸類の製造方法である。【００１６】
本発明の前記アルドース脱水素酵素は、下記反応式ａに示すアルドースをアルドノラクトンへと変換する酸化反応を触媒する。
（反応式ａ）アルドース ＋ ＮＡＤ+ → アルドノラクトン ＋ ＮＡＤＨ
上記反応によって生じたアルドノラクトンは、下記反応式ｂに示すように、水存在下で自発的な加水分解によりアルドン酸へと変換される。また、このようなアルドノラクトンのアルドン酸への加水分解反応は、ラクトナーゼなどの加水分解酵素により酵素的に行うことも可能である。
（反応式ｂ）アルドノラクトン ＋ Ｈ2Ｏ → アルドン酸
したがって、アルドースを水存在下、アルドース脱水素酵素で処理すると、全体として下記反応式ｃに示す反応によりアルドン酸が生成する。
（反応式ｃ）アルドース ＋ ＮＡＤ+ ＋ Ｈ2Ｏ → アルドン酸 ＋ ＮＡＤＨ
本発明に係る前記アルドース脱水素酵素を利用した上記アルドースのアルドン酸への変換、例えばグルコースのグルコン酸への変換反応は、グルコースオキシダーゼを利用した従来の方法のように過酸化水素が生成しないため、酵素の安定性の観点からも非常に有利な反応である。【００１７】
また、上記アルドース脱水素酵素による反応では、化学量論量のＮＡＤ＋が必要である。この点、本発明は、上記アルドース脱水素酵素の反応に対して、ＮＡＤＨオキシダーゼによるＮＡＤＨをＮＡＤ＋へ変換する反応（ＮＡＤ＋再生系）を共役させることにより、ＮＡＤ＋の化学量論量の使用を避け、その使用量を減らすことができる。したがって、本発明によれば、グルコン酸などのアルドン酸が非常に効率的に製造することが可能となる（化学式１）。【００１８】
【化１】
2006033333.tif 000002
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、食品添加物、飼料添加物、医薬品製用添加物などの広い用途で利用されるアルドン酸類を、簡便な方法で効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、組み換えベクターｐＮＴＮＸの作製方法および構造を示す図である。
【図２】図２は、組み換えベクターｐＮＴＧ１の作製方法および構造を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
１．アルドースおよびアルドン酸
本発明で言う「アルドース」とは、アルデヒド性カルボニル基、または潜在アルデヒド性カルボニル基をもつ単糖を意味する。本発明で使用する「アルドース」としては、グルコース脱水素酵素などのアルドース脱水素酵素が作用するものであれば、特に限定しないが、６単糖であるアルドヘキソース、５単糖であるアルドペントースおよびそれらのデオキシ体、アミノ糖、アミノ糖のＮ−アセチル体などを挙げる事が出来る。具体的には、グルコース、グルコース−６リン酸、２−デオキシグルコース、マンノース、ガラクトース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、グルコサミン、マンノサミン、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミンが挙げられ、好ましくはグルコース、２−デオキシグルコース、マンノース、ガラクトース、キシロース、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミンであり、更に好ましくはグルコースが挙げられる。【００２２】
本発明で言う反応生成物である「アルドン酸」とは、基質に使用したアルドースのアルデヒド基の酸化によって得られるカルボン酸を意味し、糖酸と称される場合もある。【００２３】
例えば、グルコン酸、グルコン酸−６リン酸、２−デオキシグルコン酸、マンノン酸、ガラクトン酸、アロン酸、アルトロン酸、グロン酸、イドン酸、タロン酸、リボン酸、アラビノン酸、キシロン酸、リキソン酸、グルコサミン酸、マンノサミン酸、ガラクトサミン酸、Ｎ−アセチルグルコサミン酸、Ｎ−アセチルマンノサミン酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン酸などが挙げられ、好ましくはグルコン酸、２−デオキシグルコン酸、マンノン酸、ガラクトン酸、キシロン酸、グルコサミン酸、Ｎ−アセチルグルコサミン酸、更に好ましくはグルコン酸が挙げられる。【００２４】
２．アルドース脱水素酵素
本発明で言う「アルドース脱水素酵素」とは、ＮＡＤ＋を補酵素とし、アルドースのアルドノラクトンへの酸化反応を触媒する酵素を意味する。本発明で使用する「アルドース脱水素酵素」としては、例えば、ＥＣ  １．１．１．４７またはＥＣ  １．１．１．１１８に分類されるグルコース脱水素酵素（Glucose 1-dehydrogenase）、ＥＣ  １．１．１．４９に分類されるグルコース−６リン酸脱水素酵素（Glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase）、ＥＣ  １．１．１．１２１に分類されるアルドース  １−脱水素酵素（Aldose 1-dehydrogenase）、ＥＣ １．１．１．１２２に分類されるスレオ−アルドース  １−脱水素酵素、ＥＣ  １．１．１．１１６に分類されるアラビノース脱水素酵素（Arabinose 1-dehydrogenase）、ＥＣ  １．１．１．４８に分類されるガラクトース  １−脱水素酵素（Galactose 1-dehydrogenase）などが挙げられるが、特に限定されるものではない。【００２５】
上記アルドース脱水素酵素のうち、例えばグルコース脱水素酵素としては、ＮＡＤ＋を補酵素として、グルコースからグルコノラクトンへの酸化反応を触媒するものであれば、特に限定されないが、例えば、バシルス（Bacillus）属、アセトバクター（Acetobacter）属、グルコノバクター（Gluconobacter）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、キサントモナス（Xanthomonas）属、サーモプラズマ（Thermoplasma）属等に属する微生物が生産するグルコース脱水素酵素を挙げることができる。【００２６】
上記微生物の具体例としては特に限定されず、例えば、バシルス  メガテリウム（Bacillus megaterium）、バシルス  セレウス（Bacillus cereus）、バシルス  サブチリス（Bacillus subtilis）、アセトバクター  サブオキシダンス（Acetobacter suboxydans）、グルコノバクター  サブオキシダンス（Gluconobacter suboxydans）、キサントモナス  ファセオリ（Xanthomonas phaseoli）、サーモプラズマ  アシドフィラム（Thermoplasma acidophilum）などを挙げることができる。さらに、バシルス  メガテリウム（Bacillus megaterium）に属する微生物としては、バシルス  メガテリウム（Bacillus megaterium）ＩＡＭ１０３０を挙げることができる。【００２７】
従来より、グルコース脱水素酵素はグルコース以外にも種々のアルドースに対し酸化活性を有することが知られている。例えばバチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）由来のグルコース脱水素酵素はグルコース以外に２−デオキシ−グルコース、マンノース、ガラクトース、キシロース、グルコサミンなどのアルドースに対して酸化活性を有することが報告されている（Eur. J. Biochem. 186, 389-393, (1989)）。従って、グルコースの場合と同様に、これらのアルドースを水存在下、グルコース脱水素酵素で処理することにより、対応するアルドン酸、即ち２−デオキシグルコン酸、マンノン酸、ガラクトン酸、キシロン酸、グルコサミン酸などを製造することが可能である。また、グルコース脱水素酵素以外にも上記に挙げたアルドース脱水素酵素は、種々のアルドースに作用することが知られており、これらのアルドース脱水素酵素を使用することにより、種々のアルドースより対応するアルドン酸を製造することが可能である。【００２８】
３．ＮＡＤＨオキシダーゼ
本発明の「ＮＡＤＨオキシダーゼ」は、酸素を電子受容体として、ＮＡＤＨをＮＡＤ＋へと変換する反応を触媒する酵素であり、以下に示す過酸化水素生成型、水生成型の２種類の酵素が存在する。【００２９】
ＮＡＤＨ ＋ Ｈ+＋ Ｏ2 → ＮＡＤ+ ＋ Ｈ2Ｏ2  （過酸化水素生成型）
２ＮＡＤＨ ＋ ２Ｈ+ ＋Ｏ2 → ２ＮＡＤ+ ＋ ２Ｈ2Ｏ  （水生成型）
本発明の「ＮＡＤＨオキシダーゼ」としては、過酸化水素生成型、水生成型のいずれの酵素も使用し得る。ＮＡＤ＋再生系に使用するには、酵素にダメージを与える過酸化水素を生成しない点で、水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼの利用が好ましい。一方、過酸化水素生成型ＮＡＤＨオキシダーゼを利用する場合には、生成する過酸化水素を分解するためにカタラーゼを添加するのが好ましい。【００３０】
本発明で用いる「ＮＡＤＨオキシダーゼ」は、ＮＡＤＨをＮＡＤ＋へ変換する能力を有するものであれば特に限定されないが、そのうち水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼとしては、例えば、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、ラクトバシルス（Lactobacillus）属、エンテロコッカス（Enterococcus）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属、ペディオコッカス（Pediococcus）属等に属する微生物が生産するＮＡＤＨオキシダーゼを挙げることができる。【００３１】
上記微生物の具体例としては特に限定されず、例えば、ストレプトコッカス  ミュータンス（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス  フィカリス（Streptococcus faecalis）、ストレプトコッカス  サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）、ストレプトコッカス  イクイ（Streptococcus equi）、ラクトバシルス  ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバシルス  ラクティス（Lactobacillus lactis）、ラクトバシルス  サンフランシッセンシス（Lactobacillus sanfranciscensis）、ラクトバシルス  デルブルエッキ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス  アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバシルス  マリ（Lactobacillus mali）、ラクトバシルス  バクネリ（Lactobacillus bachneri）、ラクトバシルス  プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバシルス  ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバシルス  コリニフォルミス（Lactobacillus corniformis）、ラクトバシルス  カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバシルス  ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、エンテロコッカス  フィシウム（Enterococcus faecium）、ロイコノストック  メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）、ロイコノストック  ラクティス（Leuconostoc lactis）、ペディオコッカス  アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）、ペディオコッカス  ペントサシウス（Pediococcus pentosaceus）などを挙げることができる。【００３２】
更に、ストレプトコッカス・ミュータンスに属する微生物としては、ストレプトコッカス・ミュータンス  ＮＣＩＢ１１７２３を挙げることができる。ストレプトコッカス・ミュータンスＮＣＩＢ１１７２３由来の水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼのアミノ酸配列、およびそれをコードするＤＮＡの塩基配列は、既に報告されている（特開平８−１９６２８１）。【００３３】
本発明のＮＡＤ＋再生系に使用する「水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ」は、酸化的条件下で安定である、すなわち、失活しないもの、または顕著な失活が抑制されるものを使用してもよい。【００３４】
本明細書における「酸化的条件で安定である」とは、酸素存在下、例えば、特に脱気操作をしていない緩衝液中、又は酵素液を含んだ試験管を振盪するなどの酸素供給条件下において顕著な失活なく、ＮＡＤＨをＮＡＤ＋へと変換する反応を触媒する場合を含む概念である。また、酸素存在下において、酵素保護剤（例えばＤＴＴ(ジチオスレイトール)）を利用しない場合であっても酵素保護剤を利用する場合と同様に安定である状態も、「酸化的条件で安定である」という概念に含まれる。本発明で使用する「酸化的条件で安定である水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ」としては、ＤＴＴなどの酵素保護剤非存在下で、酸素存在下、約２０℃、約３時間で約７０％以上、好ましくは約８０％以上、更に好ましくは約９０％以上の活性が保持される。【００３５】
そのような「水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ」の起源の例として、ストレプトコッカス属微生物が挙げられ、好ましくはストレプトコッカス・ミュータンス、さらに好ましくはストレプトコッカス・ミュータンスＮＣＩＢ１１７２３を挙げることが出来る。当該ストレプトコッカス属は、野生株であってもよく、また変異株であってもよい。【００３６】
上記微生物は、野生株であってもよく、また変異株であってもよい。変異株は、定法に従い、ＵＶ照射や、Ｎ−メチル−Ｎ’ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、メチルエタンスルホネート（ＥＭＳ）等の変異剤による処理により取得することができる。変異株が、野生株と同等の機能、すなわちアルドース脱水素活性またはＮＡＤＨ酸化活性を有する限り、本発明の目的のために使用し得る。【００３７】
４．アルドノラクトンの加水分解
また、先に述べたように、アルドースのアルドース脱水素酵素による酸化反応により生じたアルドノラクトンは、その多くが、水存在下で自発的な加水分解によりアルドン酸へと変換される。ただし、アルドノラクトンからのアルドン酸への加水分解反応を、加水分解酵素を用いて酵素的に行うことも可能である。そのような加水分解酵素を利用すれば、例えば上記自発的な加水分解による変換がされ難い化合物の場合、アルドン酸を効率的に製造することができる点で非常に有効である。【００３８】
使用する加水分解酵素としては、アルドノラクトンをアルドン酸へと加水分解する活性を有する酵素であれば、特に限定しないが、例えば、ＥＣ３．１．１．１７に分類されるグルコノラクトナーゼ（Gluconolactonase）、ＥＣ  ３．１．１．３１に分類される６−ホスホグルコノラクトナーゼ（6-Phosphogluconolactonase）、ＥＣ  ３．１．１．２５に分類される１，４−ラクトナーゼ（1,4-Lactonase）、ＥＣ  ３．１．１．３０に分類されるＤ−アラビノノラクトナーゼ（D-Arabinonolactonase），ＥＣ  ３．１．１．６５に分類されるＬ−ラムノノ−１，４−ラクトナーゼ（L-Rhamnono-1,4-lactonase）、ＥＣ  ３．１．１．６８に分類されるキシロノ−１，４−ラクトナーゼ（Xylono-1,4-lactonase）などのラクトナーゼが挙げられる。【００３９】
５．実質的に同一の酵素等
本発明では、前記の酵素と実質的に同一の酵素またはタンパクを使用できる。「実質的に同一」の酵素またはタンパクとは、酵素またはタンパクのアミノ酸配列において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の置換、欠失および／または挿入を導入し、そのとき該タンパクまたは酵素が同等の機能を有する場合、当該酵素またはタンパクは実質的に同一であるといえる。【００４０】
また、本発明で使用するＮＨＤＨオキシダーゼ（またはアルドース脱水素酵素）は配列番号２（または配列番号７）に示すアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、そして最も好ましくは９９％以上のアミノ酸配列の同一性を有し、配列番号２（または配列番号７）に示すアミノ酸配列からなる酵素タンパク質と同等の機能を有する場合、当該酵素タンパク質は実質的に同一であると言える。上記アミノ酸配列の「同一性」とは、比較対象となる配列を最適な状態にアラインメントされた状態で比較することにより決定される。比較対象となる配列は、最適な状態にアラインメントされた場合に、付加または欠失を有していてもよい。アミノ酸配列の同一性は、例えば相同検索プログラムＦＡＳＴＡ（W.R. Pearson & D.J. Lipman P.N.A.S. (1988) 85:2444-2448）やＢＬＡＳＴ（Altschul et. al., J. Mol. Biol. (1990)  215:403-410）を用いて２つのアミノ酸配列を比較した場合に、Ｉｄｅｎｔｉｔｙの値で算出することができる。 ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nih.gov/)を通じて公衆に利用可能である。【００４１】
ここでいう同等の機能を有する酵素タンパク質は、それらをコードするヌクレオチド配列に相補的な配列を有するヌクレオチド鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むＤＮＡによりコードされ得る。【００４２】
該ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションとしては、約７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、約０．５ＭのSodium phosphate、約１ｍＭのＥＤＴＡ中で約５０℃でハイブリダイゼーションを行った後、約２×ＳＳＣ、約０．１％のＳＤＳ中５０℃で洗浄する条件をが挙げられる。【００４３】
好ましくは前記と同様にハイブリダイゼーションを行った後、約１×ＳＳＣ、約０．１％のＳＤＳ中約５０℃で洗浄を行う条件である。より好ましくは前記と同様にハイブリダイゼーションを行った後、約０．５×ＳＳＣ、約０．１％のＳＤＳ中約５０℃で洗浄を行う条件である。更に好ましくは前記と同様にハイブリダイゼーションを行った後、約０．１×ＳＳＣ、約０．１％のＳＤＳ中約５０℃で洗浄する条件である。最も好ましくは前記と同様にハイブリダイゼーションを行った後、約０．１×ＳＳＣ、約０．１％のＳＤＳ中約６５℃で洗浄で洗浄する条件である。もっとも、該条件は、ヌクレオチド鎖の長さ、該配列、および異なる環境パラメーターに依存して異なり得る。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。【００４４】
核酸のハイブリダイゼーションの詳細なガイドは、例えばTijssen(1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay" Elsvier, New Yorkに見出される。【００４５】
６．ベクター
本発明で使用するグルコース脱水素酵素などのアルドース脱水素酵素、およびＮＡＤＨオキシダーゼは、上記微生物などの培養液から酵素を調製するのみならず、本酵素をコードするＤＮＡをベクターに組込み、これを宿主内に導入してなる形質転換体内で酵素遺伝子を発現させることにより、本酵素を容易かつ大量に得る事が可能である。上記形質転転換体を得るために用いられるベクターとしては、適切な宿主内で該酵素遺伝子を発現できるものであればいずれもが使用できる。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられる。また、他の宿主との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。【００４６】
このようなベクターは、作動可能に連結されたプロモーター（ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター）等の制御因子を含み、本発明のＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、ｐＵＣＮＴ（国際公開第ＷＯ９４／０３６１３号パンフレット）等が好適に使用できる。【００４７】
本明細書で用いる用語「制御因子」は、機能的プロモーター及び、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。本明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子が発現するように、ＤＮＡと、その発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントとが宿主細胞中で作動できる状態で連結されることをいう。制御因子のタイプ及び種類が、宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。【００４８】
７．形質転換体
本発明のＤＮＡを含有する組換えベクターを導入する宿主としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞などが挙げられるが、大腸菌が特に好ましい。本発明のＤＮＡは定法により宿主細胞に導入できる。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、例えば塩化カルシウム法により、本発明のＤＮＡを導入できる。【００４９】
また、反応を行う際、アルドース脱水素酵素とＮＡＤＨオキシダーゼの両者を同一宿主細胞内に導入した形質転換微生物の培養物を用いれば、別々に両酵素を発現する微生物を培養する必要はないため、より低コストでアルドン酸類が製造できる。さらに、両酵素を同一細胞内に発現した形質転換微生物を用いれば、微生物細胞内のＮＡＤ＋を使用し、反応が進行することも可能となり、従って、外部から別途ＮＡＤ＋を添加する必要がない、または添加するＮＡＤ＋の量を大幅に減らす事が可能となる。このような形質転換体は、使用するアルドース脱水素酵素をコードするＤＮＡ及びＮＡＤＨオキシダーゼをコードするＤＮＡを、同一のベクターに組込み、これを宿主に導入することにより製造できるし、また、これら２種類のＤＮＡを不和合性グループの異なる２種のベクターにそれぞれ組込み、それらを同一の宿主に導入することによっても製造できる。すなわち、使用するアルドース脱水素酵素をコードするＤＮＡとＮＡＤＨオキシダーゼをコードするＤＮＡとを含有する組換えベクターを含む形質転換体や、使用する脱水素酵素をコードするＤＮＡを含有する第１の組換えベクターと、ＮＡＤＨオキシダーゼをコードするＤＮＡを含有する第２の組換えベクターとを含む形質転換体を使用できる。【００５０】
８．酵素
本発明に使用する酵素、例えばグルコース脱水素酵素などのアルドース脱水素酵素、およびＮＡＤＨオキシダーゼは、単一にまたは部分的に精製された酵素であってもよいし、これら酵素を産生する微生物の培養物を使用することも可能である。ここで、「微生物の培養物」とは、菌体を含む培養液あるいは培養菌体等を意味し、また、その処理物であってもよい。ここで、「その処理物」とは、例えば、粗抽出液、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、あるいはそれらの磨砕物、これらの混合物などを意味する。更にそれらは、公知の手段（例えば、架橋法、物理的吸着法、包括法など）で固定化して、固定化酵素または固定化菌体としても使用できる。【００５１】
９．アルドン酸の製造
本発明のグルコースなどのアルドン酸の製造は、以下のように行うことができる。まず、適当な溶媒中にグルコースなどのアルドース、グルコース脱水素酵素、ＮＡＤＨオキシダーゼおよびＮＡＤ＋（又はＮＡＤＨ）を添加し攪拌することにより行うことができる。反応条件は、使用する酵素などにより異なるが、通常、約５〜８０℃、好ましくは約１０〜５０℃の温度で行われ、また、ｐＨは約４〜１０、好ましくは５〜９で行う。基質であるアルドースの濃度は約０．１〜８０％（ｗ／ｖ）、好ましくは約１〜６０％である。ＮＡＤ＋の濃度は基質に対して約０．００００１〜１モル％、好ましくは約０．００００１〜０．１％（ｗ／ｖ）である。反応の進行によるグルコン酸などのアルドン酸の生成に伴い、反応液のｐＨは低下するが、必要に応じて、水酸化ナトリウム水溶液やアンモニア水などのアルカリ溶液でｐＨを調整する。【００５２】
ＮＡＤＨオキシダーゼの反応には、酸素が必要であるため、反応液が空気または比較的純粋な酸素存在下で行われる事が好ましい。また、酸素の反応液への溶解を促進するため、反応は、振盪あるいは攪拌条件下で行われる事が好ましい。さらに大気圧以上の加圧下で反応する事により、反応液への酸素の溶解度が向上し、反応がより効率に進む場合もある。
【実施例】
【００５３】
以下に、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例になんら限定されるものではない。【００５４】
（実施例１）水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ遺伝子を含む組換えベクターの作成及び組換え大腸菌の作成
大腸菌においてストレプトコッカス・ミュータンスＮＣＩＢ１１７２３由来の水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ（配列番号１および２）を発現させるために、形質転換に用いる組換えベクターを作成した。まずＮＡＤＨオキシダーゼの構造遺伝子の開始部分にＮｄｅＩ部位を付加し、かつ終止コドンの直後に新たな終止コドンとＰｓｔＩ部位を付加した二本鎖ＤＮＡを以下の方法により取得した。【００５５】
5'-gaggatttgcatatgagtaaaatcgttattg-3'（ｐｒｉｍｅｒ−１：配列番号３）及び5'-atgaaaacatgtgaattcccattgacatatc-3'（ｐｒｉｍｅｒ−２：配列番号４）の合成プライマーの組み合わせ、更に5'-gatatgtcaatgggaattcacatgttttcat-3'（ｐｒｉｍｅｒ−３：配列番号５）及び5'-tttctgcagttatcatttagcttttaatgct-3'（ｐｒｉｍｅｒ−４：配列番号６）の合成プライマーの組み合わせで、水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＳＳＷ６１（Biosci. Biotech. Biochem., 60(1), 39-43, 1996）を鋳型としてＰＣＲを行い、それぞれ二本鎖のＤＮＡ１、２を合成した。更に前記２種の合成プライマー（ｐｒｉｍｅｒ−１、ｐｒｉｍｅｒ−４）を用い、上記で得た二本鎖ＮＡＤ１、２の混合物を鋳型にＰＣＲを行い、二本鎖ＤＮＡを得た。【００５６】
得られたＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＰｓｔＩ消化し、プラスミドｐＵＣＮＴ（国際公報第ＷＯ９４／０３６１３号パンフレット参照）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ−ＰｓｔＩ部位に挿入することにより、組換えプラスミドｐＮＴＮＸを得た。【００５７】
図１は、ｐＮＴＮＸの作製法及び構造を示す。本組換えベクターｐＮＴＮＸを用いて大腸菌ＨＢ１０１（宝酒造株式会社製）を形質転換し、組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＮＸ）を得た。【００５８】
（実施例２）組換え大腸菌による水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼの発現および無細胞抽出液の調製
実施例１で得た組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＮＸ）を１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及びグリセリン０．８％（ｗ／ｖ）を含む２×ＹＴ培地（バクト・トリプトン１．６％（ｗ／ｖ）、バクト・イーストエキス１．０％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌ０．５％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．０）で３０℃、３２時間の振盪培養を行い、その後、培養液５００ｍｌから遠心分離により集菌後、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）に懸濁し、超音波破砕法により菌体を破砕し無細胞抽出液を得た。本無細胞中の水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼの比活性は３０Ｕ／ｍｇタンパクであった。【００５９】
（実施例３）バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）ＩＡＭ１０３０株由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を含む組換えベクターの作成及び組換え大腸菌の作成
大腸菌においてバシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）ＩＡＭ１０３０株由来のグルコース脱水素酵素（配列番号７および８）を発現させるために、形質転換に用いる組換えベクターを作成した。まずグルコース脱水素酵素の構造遺伝子の開始部分にＮｄｅＩ部位を付加し、かつ終止コドンの直後にＳａｌＩ部位を付加した二本鎖ＤＮＡを以下の方法により取得した。【００６０】
5'-gcgcatatgtataaagatttagaagg-3'（ｐｒｉｍｅｒ−５：配列番号９）及び5'-gcggtcgacttatccgcgtcctgcttgg-3'（ｐｒｉｍｅｒ−６：配列番号１０）の合成プライマーの組み合わせで、バシルス・メガテリウムＩＡＭ１０３０株由来のグルコース脱水素酵素の構造遺伝子を含有するプラスミドｐＧＤＫ１（Eur. J. Biochem., 186, 389 (1989)）を鋳型としてＰＣＲを行い、二本鎖ＤＮＡを合成した。得られたＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＳａｌＩ消化し、プラスミドｐＵＣＮＴ（国際公開第ＷＯ９４／０３６１３号パンフレット）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ−ＰｓｔＩ部位に挿入することにより、組換えプラスミドｐＮＴＧ１を得た。図２は、ｐＮＴＧ１の作製法及び構造を示す。【００６１】
本組換えベクターｐＮＴＧ１を用いて大腸菌ＨＢ１０１（宝酒造株式会社製）を形質転換し、組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＮＸ）を得た。【００６２】
（実施例４）組換え大腸菌によるグルコース脱水素酵素の発現および無細胞抽出液の調製
実施例３で得た組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＧ１）を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（バクト・トリプトン１．６％（ｗ／ｖ）、バクト・イーストエキス１．０％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌ０．５％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．０）で３７℃、２６時間の振盪培養を行い、その後、培養液５００ｍｌから遠心分離により集菌後、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）５０ｍｌに懸濁し、超音波破砕法により菌体を破砕し無細胞抽出液を得た。本無細胞中のグルコース脱水素酵素の比活性は５５Ｕ／ｍｇタンパクであった。【００６３】
（実施例５）グルコン酸の生成（水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ添加および非添加の場合）
実施例４で調製したＨＢ１０１（ｐＮＴＧ１）の無細胞抽出液（グルコース脱水素酵素液）１ｍｌおよびグルコース３００ｍｇを含む３００ｍＭリン酸緩衝液８ｍｌに対して、実施例２で調製したＨＢ１０１（ｐＮＴＮＸ）の無細胞抽出液（水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ液）１ｍｌを添加した反応液、および水１ｍｌを添加した反応液をそれぞれ作製し、大型試験管中で振盪し反応を行った。反応は、３０分おきに５規定の水酸化ナトリウム水溶液で反応液のｐＨを７に調整しながら、２０℃で、５時間、振盪（３００ｒｐｍ）しつつ行った。【００６４】
反応終了後、高速液体クロマトグラフィーによりグルコン酸を定量した結果、反応液中には、ＨＢ１０１（ｐＮＴＮＸ）無細胞抽出液（ＮＡＤＨオキシダーゼ液）を加えた場合、変換率９６％でグルコン酸が生成していた。一方、ＨＢ１０１（ｐＮＴＮＸ）の無細胞抽出液（水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ液）を加えなかった場合、変換率４％でグルコン酸が生成していた。このように、グルコース脱水素酵素によるグルコースの酸化反応に水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼを用いたＮＡＤ＋再生系を共役させることが、グルコン酸の生産性の上で非常に有効であった。【００６５】
［グルコン酸の分析条件］
高速クロマトグラフィーにより行った。
カラム：  Ｓｈｏｄｅｘ  Ｉｏｎｐａｋ  ＫＣ−８１１カラム（昭和電工株式会社製）を２本繋げる。
溶離液：  ２ｍＭのＨＣｌＯ4水溶液
流速：  １ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：  ４０℃
検出：  示差屈折率を測定
溶出時間：  １３ｍｉｎ（グルコン酸）【００６６】
（実施例６）グルコン酸の生成（１０％仕込み反応）
実施例４で調製したＨＢ１０１（ｐＮＴＧ１）の無細胞抽出液（グルコース脱水素酵素液）２０ｍｌと実施例２で調製したＨＢ１０１（ｐＮＴＮＸ）の無細胞抽出液（ＮＡＤＨオキシダーゼ液）２０ｍｌ、グルコース４０ｇ、３００ｍＭリン酸緩衝液を含む反応液２００ｍｌを卓上ミニ培養装置  ＭＤＳ−Ｕ５０（５００ｍｌ容、丸菱バイオエンジ社製）で、５規定の水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．５に調整し、空気を供給（１ＶＶＭ）しながら、２０℃、２００ｒｐｍで攪拌しつつ反応を行った。反応１０時間目に、実施例５と同様な方法でグルコン酸を定量した結果、反応液中には、変換率９７％でグルコン酸が生成していた。【００６７】
（実施例７）グルコン酸の生成（Thermoplasma acidophilum由来のグルコース脱水素酵素の使用）
Thermoplasma acidophilum由来のグルコース脱水素酵素（Ｓｉｇｍａ社製）５００ｕｎｉｔ、実施例２で調製したＨＢ１０１（ｐＮＴＮＸ）無細胞抽出液（水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ液）１ｍｌおよびグルコース３００ｍｇを含む３００ｍＭリン酸緩衝液１０ｍｌを試験管中で反応を行った。反応は、３０分おきに５規定の水酸化ナトリウム水溶液で反応液のｐＨを７に調整しながら、２０℃で、５時間、振盪（３００ｒｐｍ）しつつ行った。実施例５と同様な方法で反応液中のグルコン酸を定量した結果、反応液中には、変換率９５％でグルコン酸が生成していた。【００６８】
（実施例８）酸素存在下での水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼの安定性
実施例２で調製した水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼを含むＨＢ１０１（ｐＮＴＮＸ）無細胞抽出液０．１ｍｌを１００ｍＭリン酸緩衝液または５ｍＭのＤＴＴを含む１００ｍＭリン酸緩衝液０．９ｍｌに添加し、小型試験管中で静置または３００ｒｐｍでの振盪条件下（酸素供給条件下）、２０℃、３時間保存し、残存するＮＡＤＨオキシダーゼ活性を測定した。その結果を表１に示す。いずれの条件においても、９０％以上の活性が保持されていた。【００６９】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2006033333.tif 000008
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