【手続補正書】
【提出日】令和2年10月2日(2020.10.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞の保存のための方法であって、前記方法が、
（ｉ）前記幹細胞を凍結保存培地と組み合わせて混合物を生成し、前記混合物を凍結して凍結幹細胞生成物を生成すること、
（ii）前記幹細胞を凍結保存培地と組み合わせて混合物を生成し、前記混合物を凍結して凍結幹細胞生成物を生成し、前記凍結幹細胞生成物を解凍し、前記解凍された幹細胞を保存培地に移し、前記幹細胞を前記保存培地中で保存すること、又は、
（iii）予め凍結保存培地中で凍結され、解凍され、前記保存培地中に移された前記幹細胞を、保存培地中で保存すること
を含むと共に、
前記凍結保存培地及び／又は前記保存培地が、組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む、方法。
【請求項２】
前記方法が、
前記幹細胞を凍結保存培地と組み合わせて混合物を生成し、前記混合物を凍結して凍結幹細胞生成物を生成し、前記凍結幹細胞生成物を解凍し、前記解凍された幹細胞を保存培地に移し、前記幹細胞を前記保存培地中で保存すること
を含むと共に、
前記凍結保存培地及び／又は前記保存培地が、組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物が、前記凍結保存培地及び／又は前記保存培地中に存在すると共に、前記凍結保存培地及び／又は前記保存培地中の前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物の濃度が、前記凍結保存培地及び／又は前記保存培地が前記幹細胞と混合された場合に、前記組換え酵母由来血清アルブミンのタンパク質濃度が（ｉ）約０．０１％（ｗ／ｖ）超、１０％（ｗ／ｖ）未満、（ii）約０．１％（ｗ／ｖ）〜約５％（ｗ／ｖ）、又は（iii）約２％（ｗ／ｖ）から選択される濃度となるような量である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）前記幹細胞が前記保存培地中で、温度２〜８℃で保存され、及び／又は、
（ｂ）前記幹細胞が前記保存培地中で、２４時間超；２４時間超、約４８時間以内；２４時間超、約７２時間以内；又は、約７２時間超；から選択される期間に亘って保存され、及び／又は、
（ｃ）前記幹細胞が前記保存培地中で、温度２〜８℃で、２４時間超；２４時間超、約４８時間以内；２４時間超、約７２時間以内；又は、約７２時間超から選択される期間に亘って保存され、前記保存期間の終了時における前記幹細胞の生存率が、５％超、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％以上である、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記凍結保存培地及び／又は前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質が、
（ａ）０．５％（ｗ／ｗ）、０．４％（ｗ／ｗ）、０．３％（ｗ／ｗ）、０．２％（ｗ／ｗ）、又は０．１５％（ｗ／ｗ）未満がコンカナバリンＡに結合すること、及び／又は、
（ｂ）タンパク質１モル当たりヘキソース０．６、０．１０、０．０７５、又は０．０５モル未満の糖化レベル
のうち、１又は２以上の特性を示す、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記凍結保存培地及び／又は前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質において、
（ａ）少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９．５％、又は実質的に１００％が単量体及び二量体である、
（ｂ）少なくとも約９３％、９４％、９５％、９６％、又は９７％が単量体である、及び／又は、
（ｃ）アルブミンの単量体及び二量体と区別されるアルブミンポリマーの含有量が、約１．０％（ｗ／ｗ）、０．１％（ｗ／ｗ）、又は０．０１％（ｗ／ｗ）以下又は未満である、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記凍結保存培地及び／又は前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物が、
（ａ）酵母由来血清アルブミンタンパク質、カチオン及び平衡用アニオン、水、並びに任意によりオクタノエート及びポリソルベート８０を含み、又はこれらから実質的になり、又はこれらからなり、
（ｂ）無傷又は実質的に無傷のＮ末端配列を有し、
（ｃ）質量分析を行った場合に、天然無傷ヒト血清アルブミン分子を表す約６６．４ｋＤａの主ピークとは異なるピークの数が、組換え植物由来血清アルブミンタンパク質と比較して実質的により少なく、
（ｄ）遊離チオール基が６２％超であり、又は遊離チオール基が少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％であるアルブミンタンパク質を含み、
（ｅ）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を行った場合に、ピーク保持時間１４分未満及び１９分超にピークを有さないＳＥＣプロファイル、或いは、ピーク保持時間１４又は１５分未満及び１８分間超にピークを有さないＳＥＣプロファイルを有するアルブミンタンパク質を含み、
（ｆ）逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を行った場合に、アルブミンの天然単量体に対応する単一の主ピークを有するアルブミンタンパク質を含み、
（ｇ）質量分析を行った場合に、ヘキソース修飾リシン及び／又はアルギニン残基の数が、１タンパク質当たり１３、１２、１１、１０、９、８、７、又は６個未満である、或いは、ヘキソース修飾リシン及び／又はアルギニン残基の数が、１タンパク質当たり約１〜１１、１〜８、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、１、又は１未満であるアルブミンタンパク質を含み、及び／又は、
（ｈ）植物特異的糖で糖化されていないアルブミンタンパク質を含み、又は、α−１，３−フコース及び／又はβ−１，２−キシロースから選択される植物特異的糖で糖化されていないアルブミンタンパク質を含む、請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記凍結保存培地及び／又は前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物、及び／又は、前記凍結保存培地及び／又は前記保存培地自体において、
（ａ）オクタノエート含量が３５ｍＭ未満、２０ｍＭ未満、１０ｍＭ未満、５ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１ｍＭ未満、０．０１ｍＭ未満、若しくは０．００１ｍＭ未満であり、又は実質的にオクタノエートを含まず、又はオクタノエートを含まず、
（ｂ）総脂肪酸含量が３５ｍＭ以下、２０ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、５ｍＭ以下、若しくは１ｍＭ以下であり、又は脂肪酸を実質的に含まず、又は脂肪酸を含まず、
（ｃ）洗剤の濃度が２００ｍｇ・Ｌ−１未満、１００ｍｇ・Ｌ−１未満、５０ｍｇ・Ｌ−１未満、１０ｍｇ・Ｌ−１未満、１ｍｇ・Ｌ−１未満、０．１ｍｇ・Ｌ−１未満、０．０１ｍｇ・Ｌ−１未満、若しくは０．００１ｍｇ・Ｌ−１未満であり、又は洗剤を実質的に含まず、又は洗剤を含まず、
（ｄ）総遊離アミノ酸レベル及び／又はＮ−アセチルトリプトファンレベルが３５ｍＭ未満、２０ｍＭ未満、１０ｍＭ未満、５ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．１ｍＭ未満、０．０１ｍＭ未満、０．００５ｍＭ未満、若しくは０．００１ｍＭ未満であり、又は、遊離アミノ酸及び／又は特にＮ−アセチルトリプトファンを実質的に含まず、又は、遊離アミノ酸及び／又は特にＮ−アセチルトリプトファンを含まず、
（ｅ）オクタノエート、遊離アミノ酸、及び／又は、特にＮ−アセチルトリプトファン、並びに洗剤を、実質的に含まず、或いはこれらの全てを全く含まず、及び／又は、
（ｆ）ヘム、プレカリクレイン活性化因子、発熱物質、Ｃ型肝炎、及び／又は、ヒトウイルスから選択される成分の少なくとも１種又は全てを含まず、及び／又は、アルミニウム濃度が２００ｇ・Ｌ−１未満、１００ｇ・Ｌ−１未満、５０ｇ・Ｌ−１未満、又は約１０ｇ・Ｌ−１〜約３０ｇ・Ｌ−１の範囲内である
、請求項１〜７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記凍結保存培地及び／又は前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物、及び／又は、前記凍結保存培地及び／又は前記保存培地自体において、洗剤の濃度が２００ｍｇ・Ｌ−１未満、１００ｍｇ・Ｌ−１未満、５０ｍｇ・Ｌ−１未満、１０ｍｇ・Ｌ−１未満、１ｍｇ・Ｌ−１未満、０．１ｍｇ・Ｌ−１未満、０．０１ｍｇ・Ｌ−１未満、若しくは０．００１ｍｇ・Ｌ−１未満であり、又は洗剤を実質的に含まず、又は洗剤を含まず、前記洗剤がポリソルベート又はポリソルベート８０である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記凍結保存培地及び／又は前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物、及び／又は 前記凍結保存培地及び／又は前記保存培地自体において、オクタノエート、遊離アミノ酸、及び／又は、特にＮ−アセチルトリプトファン、並びに洗剤を実質的に含まず、或いはこれらの全てを全く含まず、前記洗剤がポリソルベート８０である、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）前記凍結保存培地が、前記組換え血清アルブミン調製物と、保存剤とを含み、或いは、
（ｂ）前記凍結保存培地が、前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物、保存剤、及びイオン性緩衝剤の水溶液を含み、或いは当該水溶液から実質的になり、或いは当該水溶液からなると共に、
（ｉ）前記凍結保存培地が、幹細胞培養増殖培地ではなく、
（ii）前記凍結保存培地が、幹細胞培養増殖培地ではないと共に、幹細胞の増殖を支持せず、
（iii）前記凍結保存培地が、幹細胞培養増殖培地ではないと共に、幹細胞の増殖を支持せず、且つ、典型的な幹細胞培地の成分のうち少なくとも１以上又は全ての成分のレベルが、実質的にゼロ、或いはゼロである、請求項１〜１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記凍結保存培地が、幹細胞培養増殖培地ではないと共に、幹細胞の増殖を支持せず、且つ、典型的な幹細胞培地の成分のうち少なくとも１以上、或いは全ての成分のレベルが、実質的にゼロ、或いはゼロであり、前記典型的な幹細胞培地の成分が、ビタミン、ホルモン成長因子、鉄源、遊離アミノ酸、及び／又は、グルコースを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
（a）前記保存培地が、前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含み、又は、
（b）前記保存培地が、前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物とイオン性緩衝剤との水溶液を含み、或いは当該水溶液から実質的になり、或いは当該水溶液からなると共に、
（ｉ）前記保存培地が、幹細胞培養増殖培地ではなく、
（ii）前記保存培地が、幹細胞培養増殖培地ではないと共に、幹細胞の増殖を支持せず、
（iii）前記保存培地が、幹細胞培養増殖培地ではないと共に、幹細胞の増殖を支持せず、且つ、典型的な幹細胞培地の成分のうち少なくとも１以上又は全ての成分のレベルが、実質的にゼロ、或いはゼロである、請求項１〜１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記保存培地が、幹細胞培養増殖培地ではないと共に、幹細胞の増殖を支持せず、且つ、典型的な幹細胞培地の成分のうち少なくとも１以上、或いは全ての成分のレベルが、実質的にゼロ、或いはゼロであり、前記典型的な幹細胞培地の成分が、ビタミン、ホルモン成長因子、鉄源、遊離アミノ酸、及び／又は、グルコースを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法が、
（ｉ）前記幹細胞を前記保存培地中で保存すること、
（ii）前記幹細胞を前記保存培地中で、温度２〜８℃で保存すること、又は、
（iii）前記幹細胞を前記保存培地中で、２４時間超；２４時間超、約４８時間以内；２４時間超、約７２時間以内；又は、約７２時間超；から選択される期間に亘って保存すること
を含むと共に、
前記（i）、（ii）、又は（iii）の幹細胞を前記保存培地中で保存する工程の後に、連続して又は他の工程の後に、
前記幹細胞を培養すること、
前記幹細胞の培養物を展開すること、
前記幹細胞を分化させること、
前記の幹細胞、培養細胞、及び／又は、これらから分化させた細胞を固定化すること、
前記の幹細胞、培養細胞、及び／又は、これらから分化させた細胞を、組織又は医療用インプラントに固定化すること、及び／又は、
前記の幹細胞、培養細胞、及び／又は、これらから分化させた細胞を、医薬的に許容可能な組成物又は獣医学的に許容可能な組成物として製剤化すること
から選択される１又は２以上の工程を更に含む、請求項１〜１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
幹細胞を凍結保存するための凍結保存培地であって、
（ｉ）前記凍結保存培地は、組換え酵母由来血清アルブミン調製物と保存剤とを含み、又は、前記凍結保存培地は、組換え酵母由来血清アルブミン調製物と保存剤とを含み、前記凍結保存培地は、請求項１〜１５の何れか一項に記載の凍結保存培地であり、
（ii）前記凍結保存培地は、前記（ｉ）に記載の凍結保存培地であって、更に幹細胞を含み、又は、
（iii）前記凍結保存培地は、前記（ii）に記載の幹細胞を含む凍結保存凍結保存培地であって、凍結された凍結保存培地であり、又は、前記（ii）に記載の幹細胞であって、凍結及び融解された幹細胞を含む凍結保存凍結保存培地である、凍結保存培地。
【請求項１７】
凍結保存培地中で凍結及び融解された幹細胞を移送して保存するための保存培地であって、
（ｉ）前記保存培地は、組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含むと共に、幹細胞培養増殖培地ではなく、前記保存培地は、請求項１〜１５の何れか一項に記載の保存培地であって、幹細胞培養増殖培地ではなく、
（ii）前記保存培地は、前記（ｉ）に記載の保存培地であって、更に幹細胞を含み、又は、
（iii）前記保存培地は、前記（ii）に記載の保存培地であって、前記幹細胞は、凍結保存培地中で凍結後、融解された幹細胞を含む保存培地であり、又は、
（iv）前記保存培地は、前記（iii）に記載の保存培地であって、前記凍結保存培地は、請求項１６に記載の凍結保存培地である、保存培地。
【請求項１８】
前記保存培地は、
（ａ）幹細胞の増殖を支持せず、及び／又は
（ｂ）ビタミン、ホルモン、成長因子、鉄源、遊離アミノ酸、及び／又は、グルコースのうちｉ種以上のレベルが、実質的にゼロ、又はゼロである、
請求項１７に記載の保存培地。
【請求項１９】
幹細胞を更に含むと共に、前記幹細胞が、
（ｉ）前記保存培地に移送される前に、（ａ）凍結保存培地中で凍結後、融解された幹細胞であるか、若しくは、（ｂ）他の生理学的ショックに暴露された幹細胞であり、
（ii）前記保存培地中で、温度２〜８℃で、２４時間超；２４時間超、約４８時間以内；２４時間超、約７２時間以内；若しくは７２時間超の期間に亘って保存された幹細胞であり、又は、
（iii）前記保存期間の終了時における生存率が、５％超、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、若しくは９５％以上の幹細胞である、請求項１７又は１８の保存培地。
【請求項２０】
請求項１６に記載の凍結保存培地の使用であって、
（ｉ）幹細胞の保存のための使用、
（ii）幹細胞を温度２〜８℃で、２４時間超、２４時間超、約４８時間以内、２４時間超、約７２時間以内、若しくは７２時間超に亘って保存した後における、前記幹細胞の生存状態での保存のための使用、又は、
（iii）前記（ｉ）又は（ii）に記載の使用であって、前記保存期間の終了時における前記幹細胞の生存率が、５％超、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、若しくは９５％以上である使用。
【請求項２１】
（ａ）前記幹細胞を前記凍結保存培地と組み合わせて混合物を調製し、前記混合物を凍結して凍結幹細胞生成物を生成し、前記幹細胞を他の生理学的ショックに暴露した後に、温度２〜８℃で２４時間超、２４時間超、約４８時間以内、２４時間超、約７２時間以内、又は７２時間超に亘って保存する方法、
（ｂ）前記凍結幹細胞生成物を解凍し、前記解凍された幹細胞を保存培地に移し、前記幹細胞を前記保存培地中で、温度２〜８℃で２４時間超、２４時間超、約４８時間以内、２４時間超、約７２時間以内、若しくは７２時間超の期間に亘って保存する方法、
（ｃ）前記幹細胞を前記凍結保存培地と組み合わせて混合物を調製し、前記幹細胞を生理学的ショックに暴露し、前記幹細胞を保存培地に移送し、前記幹細胞を前記保存培地中で、温度２〜８℃で２４時間超、２４時間超、約４８時間以内、２４時間超、約７２時間以内、若しくは７２時間超の期間に亘って保存する方法
による幹細胞の保存のための、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
（ｉ）幹細胞を前記保存培地中で保存することによる、幹細胞の保存、
（ii）予め凍結保存培地中で凍結され、解凍され、前記保存培地中に移された幹細胞を前記保存培地中で保存することによる、幹細胞の保存、
（iii）前記（ii）の幹細胞の保存であって、前記凍結保存培地が請求項１６に記載の凍結保存培地である、幹細胞の保存、
（iv）予め凍結保存培地と混合され、生理学的ショックに暴露されてから、前記保存培地に移送された幹細胞幹細胞の保存、
（ｖ）前記（iv）の幹細胞の保存であって、前記凍結保存培地が請求項１６に記載の凍結保存培地である、幹細胞の保存
のための、請求項１７〜１９の何れか一項に記載の保存培地。
【請求項２３】
組換え酵母由来血清アルブミンの使用であって、
（ｉ）凍結保存幹細胞の融解後生存率を改善するための使用、
（ii）前記（ｉ）に記載の凍結保存幹細胞の融解後生存率を改善するための使用であって、前記改善が、血漿由来血清アルブミンを同濃度で使用した場合との比較における改善である使用、
（iii）前記（ｉ）若しくは（ii）に記載の凍結保存幹細胞の融解後生存率を改善するための使用であって、前記改善が、前記融解後幹細胞を保存培地中で、温度２〜８℃で２４時間超、２４時間超、約４８時間以内、２４時間超、約７２時間以内、若しくは７２時間超の期間に亘って保存した場合に観察される改善である使用、
（iv）前記（ｉ）〜（iii）の何れかに記載の凍結保存幹細胞の融解後生存率を改善するための使用であって、前記組換え酵母由来血清アルブミンを含む凍結保存培地を調製し、前記凍結保存培地を凍結前の幹細胞と混合することによる使用、
（ｖ）前記（iv）に記載の凍結保存幹細胞の融解後生存率を改善するための使用であって、前記凍結保存培地が請求項１６に記載の凍結保存培地である使用、
（vi）前記（ｉ）〜（ｖ）の何れかに記載の凍結保存幹細胞の融解後生存率を改善するための使用であって、前記組換え酵母由来血清アルブミンを含む保存培地を調製し、前記保存培地を融解後の幹細胞と混合することによる使用、又は、
（vii）前記（vi）に記載の凍結保存幹細胞の融解後生存率を改善するための使用であって、前記保存培地が請求項１７〜１９の何れか一項に記載の培地である使用。
【請求項２４】
組換え酵母由来血清アルブミンの使用であって、
（ｉ）生理学的ショックに暴露される幹細胞の生存率を改善するための使用、
（ii）前記（ｉ）に記載の生理学的ショックに暴露される幹細胞の生存率を改善するための使用であって、前記改善が、血漿由来血清アルブミンを同濃度で使用した場合との比較における改善である使用、
（iii）前記（ｉ）又は（ii）に記載の生理学的ショックに暴露される幹細胞の生存率を改善するための使用であって、前記改善が、前記生理学的ショック暴露後幹細胞を保存培地中で、温度２〜８℃で２４時間超、２４時間超、約４８時間以内、２４時間超、約７２時間以内、若しくは７２時間超の期間に亘って保存した場合に観察される改善である使用、
（iv）前記（ｉ）〜（iii）の何れかに記載の生理学的ショックに暴露される幹細胞の生存率を改善するための使用であって、前記組換え酵母由来血清アルブミンを含む凍結保存培地を調製し、前記凍結保存培地を生理学的ショック暴露前の幹細胞と混合することによる使用、
（ｖ）前記（iv）に記載の生理学的ショックに暴露される幹細胞の生存率を改善するための使用であって、前記凍結保存培地が請求項１６に記載の凍結保存培地である使用、
（vi）前記（ｉ）〜（ｖ）の何れかに記載の生理学的ショックに暴露される幹細胞の生存率を改善するための使用であって、前記組換え酵母由来血清アルブミンを含む保存培地を調製し、前記保存培地を生理学的ショック暴露後の幹細胞と混合することによる使用、又は、
（vii）前記（vi）に記載の生理学的ショックに暴露される幹細胞の生存率を改善するための使用であって、前記保存培地が請求項１７〜１９の何れか一項に記載の培地である使用。