(57)【要約】本発明は、細胞増殖性疾患（特に癌）に罹患しているか罹患しやすい対象を治療することができる化合物、本化合物の特定および使用方法、その医薬組成物およびキットを提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌に罹患しているか罹患しやすい対象を治療する方法であって、その前記対象にＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用を調節することができる化合物の有効量を投与することを含む方法。
【請求項２】
前記癌は、乳房、気道、脳、生殖器、消化管、尿路、眼、肝臓、皮膚、頭頸部、甲状腺、副甲状腺の癌、または固体腫瘍の遠隔転移である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記癌は、膵臓癌、黒色腫または食道癌である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記癌は膵臓癌である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記化合物は、
ａ）２−（ヒドロキシメチル）−６−イミノ−２，３，３ａ，９ａ−テトラヒドロ−６Ｈ−フロ［２，３：４，５］［１，３］オキサゾロ［３，２−ａ］ピリミジン−３−イルリン酸二水素、
ｂ）４−（メチルチオ）−７−（５−Ｏ−ホスホノ−Ｄ−リボフラノシル）−｛７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン｝、
ｃ）１，１’−（１，７，９−トリヒドロキシ−８，９ｂ−ジメチル−３−オキソ−４ａ−（フェニルチオ）−３，４，４ａ，９ｂ−テトラヒドロジベンゾ−［ｂ，ｄ］フラン−２，６−ジイル）ジエタノン、
ｄ）３−メチル−２，４−ジスルホペンタン二酸、および
ｅ）１−アミノプロパン−１，３−ジイルジホスホン酸、
またはその薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物は、４−（メチルチオ）−７−（５−Ｏ−ホスホノ−Ｄ−リボフラノシル）−｛７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン｝またはその薬学的に許容される塩である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記方法は、その前記対象に追加の治療薬を投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記追加の治療薬は化学療法剤である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記追加の治療薬は、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、カルセイン−ＡＭ、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、コラスパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、エトポシド、ＥＴ−７４３、エルロチニブ、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、ゲフィチニブ、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシ尿素、イホスファミド、イリノテカン、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、６−メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ＮＶＰ−ＡＥＷ５４１、パクリタキセル、プレドニソロン、プレドニゾン、プロカルバジン、ラロキシフェン、ローダミン−１２３、ストレプトゾシン、ＴＡＥ２２６、タモキシフェン、チオグアニン、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびザリプシスからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記追加の治療薬は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ゲムシタビン、フルオロピリミジン、ヌクレオシドシチジン類似体、ＮＶＰ−ＡＥＷ５４１、白金類似体、トポイソメラーゼ阻害剤、ＴＡＥ−２２６、微小管阻害剤、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ビタミンＤ類似体、アラキドン酸経路阻害剤、ヒストン脱アセチル化阻害剤およびファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
その前記対象を外科手術、化学療法、放射線、免疫療法、モノクローナル抗体療法および上皮成長因子受容体療法からなる群から選択される少なくとも１つの治療法によって治療することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
その前記対象を化学療法および／または放射線によって治療することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
癌に罹患しているか罹患しやすい対象を治療する方法であって、前記対象に、
ａ）２−（ヒドロキシメチル）−６−イミノ−２，３，３ａ，９ａ−テトラヒドロ−６Ｈ−フロ［２，３：４，５］［１，３］オキサゾロ［３，２−ａ］ピリミジン−３−イルリン酸二水素、
ｂ）４−（メチルチオ）−７−（５−Ｏ−ホスホノ−Ｄ−リボフラノシル）−｛７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン｝、
ｃ）１，１’−（１，７，９−トリヒドロキシ−８，９ｂ−ジメチル−３−オキソ−４ａ−（フェニルチオ）−３，４，４ａ，９ｂ−テトラヒドロジベンゾ−［ｂ，ｄ］フラン−２，６−ジイル）ジエタノン、
ｄ）３−メチル−２，４−ジスルホペンタン二酸、および
ｅ）１−アミノプロパン−１，３−ジイルジホスホン酸、
またはその薬学的に許容される塩からなる群から選択される化合物の有効量を投与することを含む方法。
【請求項１４】
前記化合物は、４−（メチルチオ）−７−（５−Ｏ−ホスホノ−Ｄ−リボフラノシル）−｛７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン｝またはその薬学的に許容される塩である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記癌は、膵臓癌、黒色腫または食道癌である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象に追加の治療薬を投与することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
その前記対象を外科手術、化学療法、放射線、免疫療法、モノクローナル抗体療法または上皮成長因子受容体療法によって治療することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用を調節する方法であって、ＦＡＫをＦＡＫまたはその特異的ドメインに会合または結合することができる化合物に接触させることを含む方法。
【請求項１９】
前記化合物はＦＡＫのチロシンリン酸化を阻害することができる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記化合物は、
ａ）２−（ヒドロキシメチル）−６−イミノ−２，３，３ａ，９ａ−テトラヒドロ−６Ｈ−フロ［２，３：４，５］［１，３］オキサゾロ［３，２−ａ］ピリミジン−３−イルリン酸二水素、
ｂ）４−（メチルチオ）−７−（５−Ｏ−ホスホノ−Ｄ−リボフラノシル）−｛７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン｝、
ｃ）１，１’−（１，７，９−トリヒドロキシ−８，９ｂ−ジメチル−３−オキソ−４ａ−（フェニルチオ）−３，４，４ａ，９ｂ−テトラヒドロジベンゾ−［ｂ，ｄ］フラン−２，６−ジイル）ジエタノン、
ｄ）３−メチル−２，４−ジスルホペンタン二酸、および
ｅ）１−アミノプロパン−１，３−ジイルジホスホン酸、
またはその薬学的に許容される塩からなる群から選択される化合物である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記化合物はＦＡＫアミノ末端断片（ＮＴ２）に結合または会合することができる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用を調節する方法であって、ＩＧＦ−１ＲをＩＧＦ−１Ｒまたはその特異的ドメインに結合または会合することができる化合物に接触させることを含む方法。
【請求項２３】
前記化合物はＩＧＦ−１Ｒのチロシンリン酸化を阻害することができる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記化合物は、
ａ）２−（ヒドロキシメチル）−６−イミノ−２，３，３ａ，９ａ−テトラヒドロ−６Ｈ−フロ［２，３：４，５］［１，３］オキサゾロ［３，２−ａ］ピリミジン−３−イルリン酸二水素、
ｂ）４−（メチルチオ）−７−（５−Ｏ−ホスホノ−Ｄ−リボフラノシル）−｛７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン｝、
ｃ）１，１’−（１，７，９−トリヒドロキシ−８，９ｂ−ジメチル−３−オキソ−４ａ−（フェニルチオ）−３，４，４ａ，９ｂ−テトラヒドロジベンゾ−［ｂ，ｄ］フラン−２，６−ジイル）ジエタノン、
ｄ）３−メチル−２，４−ジスルホペンタン二酸、および
ｅ）１−アミノプロパン−１，３−ジイルジホスホン酸、
またはその薬学的に許容される塩からなる群から選択される化合物である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
癌に罹患しているか罹患しやすい対象を治療する方法であって、その前記対象に、ＩＧＦ−１ＲおよびＡＫＴのリン酸化を減少させ、かつ癌細胞のアポトーシスを誘発することができる化合物を投与することを含む方法。
【請求項２６】
前記化合物は、
ａ）２−（ヒドロキシメチル）−６−イミノ−２，３，３ａ，９ａ−テトラヒドロ−６Ｈ−フロ［２，３：４，５］［１，３］オキサゾロ［３，２−ａ］ピリミジン−３−イルリン酸二水素、
ｂ）４−（メチルチオ）−７−（５−Ｏ−ホスホノ−Ｄ−リボフラノシル）−｛７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン｝、
ｃ）１，１’−（１，７，９−トリヒドロキシ−８，９ｂ−ジメチル−３−オキソ−４ａ−（フェニルチオ）−３，４，４ａ，９ｂ−テトラヒドロジベンゾ−［ｂ，ｄ］フラン−２，６−ジイル）ジエタノン、
ｄ）３−メチル−２，４−ジスルホペンタン二酸、および
ｅ）１−アミノプロパン−１，３−ジイルジホスホン酸、
またはその薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記化合物は、４−（メチルチオ）−７−（５−Ｏ−ホスホノ−Ｄ−リボフラノシル）−｛７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン｝またはその薬学的に許容される塩である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
制御されない細胞増殖を調節する方法であって、増殖の制御ができない細胞をＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用を調節することができる化合物に接触させることを含む方法。
【請求項２９】
前記化合物は、
ａ）２−（ヒドロキシメチル）−６−イミノ−２，３，３ａ，９ａ−テトラヒドロ−６Ｈ−フロ［２，３：４，５］［１，３］オキサゾロ［３，２−ａ］ピリミジン−３−イルリン酸二水素、
ｂ）４−（メチルチオ）−７−（５−Ｏ−ホスホノ−Ｄ−リボフラノシル）−｛７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン｝、
ｃ）１，１’−（１，７，９−トリヒドロキシ−８，９ｂ−ジメチル−３−オキソ−４ａ−（フェニルチオ）−３，４，４ａ，９ｂ−テトラヒドロジベンゾ−［ｂ，ｄ］フラン−２，６−ジイル）ジエタノン、
ｄ）３−メチル−２，４−ジスルホペンタン二酸、および
ｅ）１−アミノプロパン−１，３−ジイルジホスホン酸、
またはその薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記化合物は、４−（メチルチオ）−７−（５−Ｏ−ホスホノ−Ｄ−リボフラノシル）−｛７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン｝またはその薬学的に許容される塩である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
細胞増殖性疾患に罹患しているか罹患しやすい対象を治療する方法であって、その前記対象にＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用を調節することができる化合物の有効量を投与することを含む方法。
【請求項３２】
前記化合物は、
ａ）２−（ヒドロキシメチル）−６−イミノ−２，３，３ａ，９ａ−テトラヒドロ−６Ｈ−フロ［２，３：４，５］［１，３］オキサゾロ［３，２−ａ］ピリミジン−３−イルリン酸二水素、
ｂ）４−（メチルチオ）−７−（５−Ｏ−ホスホノ−Ｄ−リボフラノシル）−｛７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン｝、
ｃ）１，１’−（１，７，９−トリヒドロキシ−８，９ｂ−ジメチル−３−オキソ−４ａ−（フェニルチオ）−３，４，４ａ，９ｂ−テトラヒドロジベンゾ−［ｂ，ｄ］フラン−２，６−ジイル）ジエタノン、
ｄ）３−メチル−２，４−ジスルホペンタン二酸、および
ｅ）１−アミノプロパン−１，３−ジイルジホスホン酸、
またはその薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記化合物は、４−（メチルチオ）−７−（５−Ｏ−ホスホノ−Ｄ−リボフラノシル）−｛７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン｝またはその薬学的に許容される塩である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
細胞増殖性疾患に罹患しているか罹患しやすい対象を治療する際に使用されるキットであって、ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用を調節することができる化合物の有効量を含むキット。
【請求項３５】
前記化合物は、
ａ）２−（ヒドロキシメチル）−６−イミノ−２，３，３ａ，９ａ−テトラヒドロ−６Ｈ−フロ［２，３：４，５］［１，３］オキサゾロ［３，２−ａ］ピリミジン−３−イルリン酸二水素、
ｂ）４−（メチルチオ）−７−（５−Ｏ−ホスホノ−Ｄ−リボフラノシル）−｛７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン｝、
ｃ）１，１’−（１，７，９−トリヒドロキシ−８，９ｂ−ジメチル−３−オキソ−４ａ−（フェニルチオ）−３，４，４ａ，９ｂ−テトラヒドロジベンゾ−［ｂ，ｄ］フラン−２，６−ジイル）ジエタノン、
ｄ）３−メチル−２，４−ジスルホペンタン二酸、および
ｅ）１−アミノプロパン−１，３−ジイルジホスホン酸、
またはその薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
前記化合物は、４−（メチルチオ）−７−（５−Ｏ−ホスホノ−Ｄ−リボフラノシル）−｛７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン｝またはその薬学的に許容される塩である、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
前記細胞増殖性疾患は癌である、請求項３４に記載のキット。
【請求項３８】
前記癌は、乳房、気道、脳、生殖器、消化管、尿路、眼、肝臓、皮膚、頭頸部、甲状腺、副甲状腺の癌、または固体腫瘍の遠隔転移である、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
前記癌は、膵臓癌、黒色腫または食道癌である、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
前記癌は膵臓癌である、請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
追加の治療薬をさらに含む、請求項３４に記載のキット。
【請求項４２】
前記追加の治療薬は、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、カルセイン−ＡＭ、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、コラスパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、エトポシド、ＥＴ−７４３、エルロチニブ、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、ゲフィチニブ、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシ尿素、イホスファミド、イリノテカン、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、６−メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ＮＶＰ−ＡＥＷ５４１、パクリタキセル、プレドニソロン、プレドニゾン、プロカルバジン、ラロキシフェン、ローダミン−１２３、ストレプトゾシン、ＴＡＥ２２６、タモキシフェン、チオグアニン、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびザリプシスからなる群から選択される、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
癌に罹患しているか罹患しやすい対象を治療するための医薬組成物であって、ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用を調節することができる化合物の有効量および薬学的に許容される担体または希釈液を含む医薬組成物。
【請求項４４】
前記化合物は、
ａ）２−（ヒドロキシメチル）−６−イミノ−２，３，３ａ，９ａ−テトラヒドロ−６Ｈ−フロ［２，３：４，５］［１，３］オキサゾロ［３，２−ａ］ピリミジン−３−イルリン酸二水素、
ｂ）４−（メチルチオ）−７−（５−Ｏ−ホスホノ−Ｄ−リボフラノシル）−｛７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン｝、
ｃ）１，１’−（１，７，９−トリヒドロキシ−８，９ｂ−ジメチル−３−オキソ−４ａ−（フェニルチオ）−３，４，４ａ，９ｂ−テトラヒドロジベンゾ−［ｂ，ｄ］フラン−２，６−ジイル）ジエタノン、
ｄ）３−メチル−２，４−ジスルホペンタン二酸、および
ｅ）１−アミノプロパン−１，３−ジイルジホスホン酸、
またはその薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項４３に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
前記化合物は、４−（メチルチオ）−７−（５−Ｏ−ホスホノ−Ｄ−リボフラノシル）−｛７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン｝またはその薬学的に許容される塩である、請求項４４に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
前記癌は、膵臓癌、黒色腫または食道癌である、請求項４３に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００９年３月１２日に出願された米国仮出願第６１／２１０，０５３号の優先権を主張するものであり、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載）
この研究の一部は、米国国立衛生研究所／国立癌研究所の助成金（助成金番号：ＣＡ１１３７６６（Ｓ．Ｎ．Ｈ．））による支援のもとでなされた。連邦政府は本発明において所定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
細胞増殖性疾患は、望ましくない細胞増殖または制御されない細胞増殖を伴う疾患である。細胞増殖性疾患の特定の例は癌である。癌は全世界において深刻な健康問題である。癌は、全ての年齢の人々に（胎児にさえ）影響を与える。２００７年に世界保健機構によって報告されたように、癌は全ての死亡の約１３％を引き起こしている。２００７年には世界で約７，６００，０００人が癌で死亡した。米国癌学会によれば、米国だけで毎年このような癌の４２５，０００件の新しい症例が診断されるものと推定されている。
【０００４】
癌は、多種多様な異なる臓器、組織および細胞型において生じる可能性がある。「癌」という用語は、１，０００種以上の異なる疾患の集合体を指す。１つの例は膵臓癌であり、これは膵臓の悪性腫瘍である。膵臓癌は、米国において、癌死の第４の主要な原因である致死的疾患である。膵臓癌、特に局所的に進行した膵臓癌の治療は、生存期間中央値が約１０〜１２ヶ月であり、臨床的課題の代表である。標準的な治療戦略としては放射線および／または化学療法が挙げられる。残念ながら局所的制御は不十分であり、１年および２年の局所的進行率はそれぞれ３６％および６２％と推定され、局所的進行までの平均期間は６．４ヶ月である。原発性腫瘍の制御に失敗すると、痛み、幽門十二指腸閉塞、上部消化管の潰瘍および出血などの症状が生じる。従って、患者の予後（例えば、全体的な生存、無病生存、局所制御、有害作用および生活の質）の改善を達成することができる治療法の発見が早急に求められている。
【０００５】
接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）は、細胞とそれらの細胞外マトリックスとの接触点（接着斑）に局所化され、かつインテグリン、成長因子およびキナーゼからの複数のシグナル伝達経路の収束点である非受容体タンパク質チロシンキナーゼである（McLean GW et al. Nature Reviews 2005; 5(7):505-15を参照）。ＦＡＫは、細胞増殖、生存および遊走などの必須な細胞プロセスを媒介する際に重要な役割を担う。ＦＡＫは、正常組織において低レベルで発現するが、多くの癌種（例えば、膵臓癌患者からの腫瘍の大部分）において過剰発現する（Liu W. et al. Carcinogenesis, 2008; 29(6): 1096-107および国際公開第２００５／０４９８５２号を参照）。ＦＡＫ遺伝子のサイレンシングによってアポトーシスが容易となり、かつ膵臓癌細胞および異種移植モデルにおいて転移が抑制されることが知られている（Liu W. et al. Carcinogenesis, 2008, 29(6): 1096-107を参照）。従って、ＦＡＫは、癌治療にとって実現性のある標的である。ＦＡＫを標的とする薬物の開発は、多くの既存の癌療法への自然な補足物であろう。
【０００６】
インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）は、細胞増殖において主要な役割を担う受容体チロシンキナーゼであり、腫瘍形成にも関連している（Vincent AM, et al., Growth Hormone and IGF Research. 2002; 12:
193-197を参照）。この受容体はＩＧＦ−１の効果を媒介するものであり、分子構造がインスリンに類似したポリペプチドタンパク質ホルモンである。様々なヒトの癌において過剰発現するＩＧＦ−１Ｒは、細胞増殖を刺激し、癌化を可能にし、かつアポトーシスを抑制する。ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−１Ｒ自己分泌ループは、様々なヒトの腫瘍細胞において発現し、膵臓癌などのいくつかの腫瘍型におけるこの軸の活性化によって転移が促進されることが知られている。さらに、ＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達の阻害によって、多くの動物モデルにおいて腫瘍成長が抑制されることも知られている。
【０００７】
しかし、この分野におけるその新興のデータがＦＡＫおよび／またはＩＧＦ−１Ｒが癌療法を開発するための実現性のある標的になり得ることを示唆しているという事実にも関わらず、所望の特異性を有するキナーゼ阻害剤はまだ得られていない。特に、医療分野では、膵臓癌の悪性挙動に対するＦＡＫおよびＩＧＦ−１Ｒの寄与に関して入手し得る情報が少ない。
【０００８】
従って、所望の特異性を有する新規な癌療法および癌の治療における新規な戦略の開発が臨床的になお必要とされている。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の一態様は、癌に罹患しているか罹患しやすい対象を治療する方法であって、対象にＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用を調節することができる化合物を投与することを含む方法を提供する。
【００１０】
一実施形態では、本化合物は、ＦＡＫ−ＮＴとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用を調節することができる。別の実施形態は、ＦＡＫ−ＮＴ２とＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用を調節することができる化合物を提供する。
【００１１】
特定の実施形態では、本化合物は、ａ）２−（ヒドロキシメチル）−６−イミノ−２，３，３ａ，９ａ−テトラヒドロ−６Ｈ−フロ［２，３：４，５］［１，３］オキサゾロ［３，２−ａ］ピリミジン−３−イルリン酸二水素、ｂ）４−（メチルチオ）−７−（５−Ｏ−ホスホノ−Ｄ−リボフラノシル）−｛７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン｝、ｃ）１，１’−（１，７，９−トリヒドロキシ−８，９ｂ−ジメチル−３−オキソ−４ａ−（フェニルチオ）−３，４，４ａ，９ｂ−テトラヒドロジベンゾ−［ｂ，ｄ］フラン−２，６−ジイル）ジエタノン、ｄ）３−メチル−２，４−ジスルホペンタン二酸、ｅ）１−アミノプロパン−１，３−ジイルジホスホン酸またはそれらの薬学的に許容される塩、エステルまたはプロドラッグである。特定の例は、４−（メチルチオ）−７−（５−Ｏ−ホスホノ−Ｄ−リボフラノシル）−｛７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン｝またはその薬学的に許容される塩、エステルまたはプロドラッグである。
【００１２】
本発明は、癌に罹患しているか罹患しやすい対象に、ａ）２−（ヒドロキシメチル）−６−イミノ−２，３，３ａ，９ａ−テトラヒドロ−６Ｈ−フロ［２，３：４，５］［１，３］オキサゾロ［３，２−ａ］ピリミジン−３−イルリン酸二水素、ｂ）４−（メチルチオ）−７−（５−Ｏ−ホスホノ−Ｄ−リボフラノシル）−｛７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン｝、ｃ）１，１’−（１，７，９−トリヒドロキシ−８，９ｂ−ジメチル−３−オキソ−４ａ−（フェニルチオ）−３，４，４ａ，９ｂ−テトラヒドロジベンゾ−［ｂ，ｄ］フラン−２，６−ジイル）ジエタノン、ｄ）３−メチル−２，４−ジスルホペンタン二酸、およびｅ）１−アミノプロパン−１，３−ジイルジホスホン酸またはそれらの薬学的に許容される塩、エステルまたはプロドラッグからなる群から選択される化合物の有効量を投与することによってその対象を治療する方法も提供する。本化合物の特定の例は、４−（メチルチオ）−７−（５−Ｏ−ホスホノ−Ｄ−リボフラノシル）−｛７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン｝、またはその薬学的に許容される塩、エステルまたはプロドラッグである。
【００１３】
一実施形態では、癌は、乳房、気道、脳、生殖器、消化管、尿路、眼、肝臓、皮膚、頭頸部、甲状腺、副甲状腺の癌、または固形腫瘍の遠隔転移である。特定の実施形態では、癌は、膵臓癌、黒色腫または食道癌である。一実施形態では、癌は膵臓癌である。
【００１４】
一実施形態では、本発明の方法は、対象に追加の治療薬を投与することをさらに含む。一実施形態では、追加の治療薬は化学療法剤である。特定の実施形態では、追加の治療薬は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ゲムシタビン、フルオロピリミジン、ヌクレオシドシチジン類似体、ＮＶＰ−ＡＥＷ５４１、白金類似体、ＴＡＥ２２６、トポイソメラーゼ阻害剤、微小管阻害剤、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害剤（ＰＩ３キナーゼ阻害剤）、プロテアソーム阻害剤、ビタミンＤ類似体、アラキドン酸経路阻害剤、ヒストン脱アセチル化(deacytylator)阻害剤およびファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤からなる群から選択される。特定の実施形態では、追加の治療薬は、ＴＡＥ２２６、ＮＶＰ−ＡＥＷ５４１、ワートマニンまたはＬＹ２９４００２である。
【００１５】
特定の実施形態では、追加の治療薬は、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、カルセイン−ＡＭ、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、コラスパーゼ(colaspase)、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、エトポシド、ＥＴ−７４３、エルロチニブ、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、ゲフィチニブ、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシ尿素、イホスファミド、イリノテカン、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、６−メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ＮＶＰ−ＡＥＷ５４１、パクリタキセル、プレドニソロン、プレドニゾン、プロカルバジン、ラロキシフェン、ローダミン−１２３、ストレプトゾシン、ＴＡＥ２２６、タモキシフェン、チオグアニン、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンまたはザリプシスである。
【００１６】
別の実施形態では、本発明の方法は、それを必要としている対象を少なくとも１種の追加の治療法で治療することをさらに含む。この治療法は、外科手術、化学療法、放射線、免疫療法、モノクローナル抗体療法および上皮成長因子受容体療法であってもよいが、これらに限定されない。
【００１７】
一実施形態では、追加の治療法は化学療法である。別の実施形態では、追加の治療法は放射線である。一実施形態では、本方法は、対象を化学療法と放射線とを併用して治療することを含む。
【００１８】
本発明の別の態様は、癌に罹患しているか罹患しやすい対象を治療する方法であって、それを必要としている対象に、ＩＧＦ−１ＲおよびＡＫＴのリン酸化を減少させることができる化合物を投与し、癌細胞のアポトーシスを誘発することを含む方法を提供する。例示的な化合物は本明細書に詳述されている。
【００１９】
本発明のさらに別の態様は、制御されない細胞増殖を調節する方法を提供する。本方法は、増殖の制御ができない細胞をＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用を調節することができるものとして特定された化合物に接触させることを含む。一実施形態では、本化合物は、本明細書に詳述されている化合物である。
【００２０】
一態様では、本発明は、細胞増殖性疾患に罹患しているか罹患しやすい対象を治療する方法を提供する。本方法は、本対象にＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用を調節することができる化合物の有効量を投与することを含む。一実施形態では、本化合物は、本明細書に詳述されている化合物である。
【００２１】
本発明は、ＦＡＫを、ＦＡＫまたはその特異的ドメインに結合または会合することができる化合物に接触させることによって、ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用を調節する方法も提供する。一実施形態では、本化合物は、ＦＡＫのチロシンリン酸化を阻害し、それによりＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用を阻止することができる。一実施形態では、本化合物は、本明細書に詳述されている化合物である。別の実施形態では、本化合物はＦＡＫアミノ末端断片（ＮＴ２）に結合または会合することができる。
【００２２】
別の態様では、ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用を調節する方法は、ＩＧＦ−１Ｒを、ＩＧＦ−１Ｒまたはその特異的ドメインに結合または会合することができる化合物に接触させることを含む。一実施形態では、本化合物は、ＩＧＦ−１Ｒのチロシンリン酸化を阻害し、それによりＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用を阻止することができる。例示的な化合物は本明細書に詳述されている。一実施形態では、本化合物はＩＧＦ−１Ｒのキナーゼドメインに結合または会合することができる。
【００２３】
本発明は、細胞増殖性疾患に罹患しているか罹患しやすい対象を治療する際に使用されるキットも提供する。特に、本キットは、ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用を調節することができる化合物の有効量を含む。一実施形態では、本キットに含まれる化合物は、本明細書に詳述されている化合物である。
【００２４】
一実施形態では、細胞増殖性疾患は癌である。特定の実施形態では、癌は、乳房、気道、脳、生殖器、消化管、尿路、眼、肝臓、皮膚、頭頸部、甲状腺、副甲状腺の癌、または固形腫瘍の遠隔転移である。特定の実施形態では、癌は、膵臓癌、黒色腫または食道癌である。特定の例は膵臓癌である。
【００２５】
特定の実施形態では、本キットは、追加の治療薬をさらに含む。特定の実施形態では、追加の治療薬は上に詳述されている薬剤である。
【００２６】
本発明は、癌に罹患しているか罹患しやすい対象を治療するための医薬組成物も提供する。特に、本組成物は、薬学的に許容される担体または希釈液と共に、ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用を調節することができる化合物の有効量を含む。一実施形態では、癌は、膵臓癌、黒色腫または食道癌である。別の実施形態では、本化合物は、本明細書に詳述されている化合物である。本医薬組成物は、追加の治療薬をさらに含んでいてもよい。追加の治療薬の例は上に述べられている。
【００２７】
本発明は、ＦＡＫ、ＩＧＦ−１Ｒまたはそれらの特異的ドメインに結合する化合物またはＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用を調節することができる化合物を設計、評価および特定する方法も提供する。本発明の他の実施形態について以下に開示する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ＦＡＫおよびＩＧＦ−１Ｒタンパク質構築物間のタンパク質プルダウンアッセイの結果を示す。
【図２】ＮＳＣ３４４５５３で２４時間処理した（Ｃ８１６１黒色腫癌細胞からの）細胞溶解物に対する免疫沈降およびウェスタンブロットの結果を示す。
【図３】Ｃ８１６１黒色腫癌細胞に対する７５μＭのＮＳＣ３４４５５３の免疫沈降およびウェスタンブロット試験の結果を示す。
【図４】１μＭのＮＳＣ３４４５５３で処理したＣ８１６１黒色腫癌細胞に対するウェスタンブロットの結果を示す。
【図５】５μＭのＮＳＣ３４４５５３およびＰＩ３キナーゼ阻害剤で２４時間処理したＣ８１６１黒色腫癌細胞に対するウェスタンブロットの結果を示す。
【図６】ＮＳＣ３４４５５３で７２時間処理した膵臓および黒色腫癌細胞に対する細胞生存率アッセイの結果を示す。
【図７】ＩＧＦ−１Ｒ＋／／−細胞に対する２μＭのＮＳＣ３４４５５３処理の効果を示す。
【図８】ＦＡＫ＋／／−細胞に対するＮＳＣ３４４５５３処理の効果を示す。
【図９】ＮＳＣ３４４５５３で処理したＰａｎｃ−１癌細胞に対するウェスタンブロットの分析を示す。
【図１０】ＦＡＫ野生型およびヌル細胞ならびにＩＧＦ−１Ｒ野生型およびヌル細胞に対するＮＳＣ３４４５５３処理のＭＴＴ細胞タイター９６アッセイ(MTT cell titer 96 assay)の結果を示す。
【図１１】ＭＴＴアッセイを用いた、ＮＳＣ３４４５５３で処理したＡ３７５およびＣ８１６１黒色腫癌細胞に関する細胞生存率の結果を示す。
【図１２】ＮＳＣ１２８６８７で２４時間処理した膵臓（ＭｉａＰａＣａ−２）細胞に対する免疫沈降およびウェスタンブロットの結果を示す。
【図１３】７２時間のＮＳＣ２５０４３５処理に対するＭｉａＰａＣａ−２癌細胞の用量反応曲線を示す。
【図１４】ＮＳＣ３４４５５３で処理した黒色腫（Ａ３７５およびＣ８１６１）および膵臓（Ｐａｎｃ−１およびＭｉａＰａＣａ−２）癌細胞に対するウェスタンブロットの結果を示す。
【図１５Ａ】ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの相互作用、ＩＮＴ２−３１（ＮＳＣ３４４５５３）の構造、およびＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの相互作用の阻止のコンピュータによるモデル化を示す。図１５Ａ：ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの相互作用の提案される部位をコンピュータモデリングに基づいて示す。ＩＮＴ２−３１は、ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの相互作用部位に対応するＦＡＫ上のポケット（アミノ酸１２７〜２４３）内にモデル化されている。ＩＮＴ２−３１の構造は、上の右側に示されている。図１５Ｂ：ＩＮＴ２−３１の用量の増加に伴って、ＩＧＦ−１ＲβのＧＳＴ−ＦＡＫ−ＮＴ２によるプルダウンは減少する。図１５Ｃ：ＩＮＴ２−３１の用量の増加に伴って、ＦＡＫおよびＩＧＦ−１Ｒの免疫共沈降は、Ｃ８１６１黒色腫細胞において減少する。図１５Ｄ：ＩＮＴ２−３１の用量の増加に伴って、ＦＡＫおよびＩＧＦ−１Ｒの免疫共沈降は、Ａ３７５黒色腫細胞において減少する。ＩＧＦ−１Ｒ／ＦＡＫの比を示す光学濃度測定は、図１５Ｂ、図１５Ｃおよび図１５Ｄのウェスタンブロットの下に示されている。図は、三つ組で行った実験の代表である。
【図１５Ｂ】ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの相互作用、ＩＮＴ２−３１（ＮＳＣ３４４５５３）の構造、およびＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの相互作用の阻止のコンピュータによるモデル化を示す。図１５Ａ：ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの相互作用の提案される部位をコンピュータモデリングに基づいて示す。ＩＮＴ２−３１は、ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの相互作用部位に対応するＦＡＫ上のポケット（アミノ酸１２７〜２４３）内にモデル化されている。ＩＮＴ２−３１の構造は、上の右側に示されている。図１５Ｂ：ＩＮＴ２−３１の用量の増加に伴って、ＩＧＦ−１ＲβのＧＳＴ−ＦＡＫ−ＮＴ２によるプルダウンは減少する。図１５Ｃ：ＩＮＴ２−３１の用量の増加に伴って、ＦＡＫおよびＩＧＦ−１Ｒの免疫共沈降は、Ｃ８１６１黒色腫細胞において減少する。図１５Ｄ：ＩＮＴ２−３１の用量の増加に伴って、ＦＡＫおよびＩＧＦ−１Ｒの免疫共沈降は、Ａ３７５黒色腫細胞において減少する。ＩＧＦ−１Ｒ／ＦＡＫの比を示す光学濃度測定は、図１５Ｂ、図１５Ｃおよび図１５Ｄのウェスタンブロットの下に示されている。図は、三つ組で行った実験の代表である。
【図１５Ｃ】ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの相互作用、ＩＮＴ２−３１（ＮＳＣ３４４５５３）の構造、およびＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの相互作用の阻止のコンピュータによるモデル化を示す。図１５Ａ：ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの相互作用の提案される部位をコンピュータモデリングに基づいて示す。ＩＮＴ２−３１は、ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの相互作用部位に対応するＦＡＫ上のポケット（アミノ酸１２７〜２４３）内にモデル化されている。ＩＮＴ２−３１の構造は、上の右側に示されている。図１５Ｂ：ＩＮＴ２−３１の用量の増加に伴って、ＩＧＦ−１ＲβのＧＳＴ−ＦＡＫ−ＮＴ２によるプルダウンは減少する。図１５Ｃ：ＩＮＴ２−３１の用量の増加に伴って、ＦＡＫおよびＩＧＦ−１Ｒの免疫共沈降は、Ｃ８１６１黒色腫細胞において減少する。図１５Ｄ：ＩＮＴ２−３１の用量の増加に伴って、ＦＡＫおよびＩＧＦ−１Ｒの免疫共沈降は、Ａ３７５黒色腫細胞において減少する。ＩＧＦ−１Ｒ／ＦＡＫの比を示す光学濃度測定は、図１５Ｂ、図１５Ｃおよび図１５Ｄのウェスタンブロットの下に示されている。図は、三つ組で行った実験の代表である。
【図１５Ｄ】ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの相互作用、ＩＮＴ２−３１（ＮＳＣ３４４５５３）の構造、およびＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの相互作用の阻止のコンピュータによるモデル化を示す。図１５Ａ：ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの相互作用の提案される部位をコンピュータモデリングに基づいて示す。ＩＮＴ２−３１は、ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの相互作用部位に対応するＦＡＫ上のポケット（アミノ酸１２７〜２４３）内にモデル化されている。ＩＮＴ２−３１の構造は、上の右側に示されている。図１５Ｂ：ＩＮＴ２−３１の用量の増加に伴って、ＩＧＦ−１ＲβのＧＳＴ−ＦＡＫ−ＮＴ２によるプルダウンは減少する。図１５Ｃ：ＩＮＴ２−３１の用量の増加に伴って、ＦＡＫおよびＩＧＦ−１Ｒの免疫共沈降は、Ｃ８１６１黒色腫細胞において減少する。図１５Ｄ：ＩＮＴ２−３１の用量の増加に伴って、ＦＡＫおよびＩＧＦ−１Ｒの免疫共沈降は、Ａ３７５黒色腫細胞において減少する。ＩＧＦ−１Ｒ／ＦＡＫの比を示す光学濃度測定は、図１５Ｂ、図１５Ｃおよび図１５Ｄのウェスタンブロットの下に示されている。図は、三つ組で行った実験の代表である。
【図１６Ａ】黒色腫細胞の生存率および増殖に対するＩＮＴ２−３１の効果を示す。図１６Ａ：ＩＮＴ２−３１は、７２時間にわたって用量依存的に正常なメラニン形成細胞および３種類の黒色腫細胞株の細胞生存率を阻害した。図１６Ｂ：３種類の黒色腫細胞株およびメラニン形成細胞における、ＦＡＫ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＡｋｔおよびＥＲＫの発現。図１６Ｃ：ＩＮＴ２−３１またはＴＡＥ２２６の漸増用量の存在下でのＡ３７５黒色腫細胞（左）およびＣ８１６１黒色腫細胞（右）に関するＣＳＦＥ細胞増殖アッセイ（二重ＦＡＫおよびＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤）。図１６Ｄ：ＩＮＴ２−３１またはＴＡＥ２２６の存在下におけるＣ８１６１黒色腫癌細胞の計数。図は、三つ組で行った実験の代表である。
【図１６Ｂ】黒色腫細胞の生存率および増殖に対するＩＮＴ２−３１の効果を示す。図１６Ａ：ＩＮＴ２−３１は、７２時間にわたって用量依存的に正常なメラニン形成細胞および３種類の黒色腫細胞株の細胞生存率を阻害した。図１６Ｂ：３種類の黒色腫細胞株およびメラニン形成細胞における、ＦＡＫ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＡｋｔおよびＥＲＫの発現。図１６Ｃ：ＩＮＴ２−３１またはＴＡＥ２２６の漸増用量の存在下でのＡ３７５黒色腫細胞（左）およびＣ８１６１黒色腫細胞（右）に関するＣＳＦＥ細胞増殖アッセイ（二重ＦＡＫおよびＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤）。図１６Ｄ：ＩＮＴ２−３１またはＴＡＥ２２６の存在下におけるＣ８１６１黒色腫癌細胞の計数。図は、三つ組で行った実験の代表である。
【図１６Ｃ】黒色腫細胞の生存率および増殖に対するＩＮＴ２−３１の効果を示す。図１６Ａ：ＩＮＴ２−３１は、７２時間にわたって用量依存的に正常なメラニン形成細胞および３種類の黒色腫細胞株の細胞生存率を阻害した。図１６Ｂ：３種類の黒色腫細胞株およびメラニン形成細胞における、ＦＡＫ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＡｋｔおよびＥＲＫの発現。図１６Ｃ：ＩＮＴ２−３１またはＴＡＥ２２６の漸増用量の存在下でのＡ３７５黒色腫細胞（左）およびＣ８１６１黒色腫細胞（右）に関するＣＳＦＥ細胞増殖アッセイ（二重ＦＡＫおよびＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤）。図１６Ｄ：ＩＮＴ２−３１またはＴＡＥ２２６の存在下におけるＣ８１６１黒色腫癌細胞の計数。図は、三つ組で行った実験の代表である。
【図１６Ｄ】黒色腫細胞の生存率および増殖に対するＩＮＴ２−３１の効果を示す。図１６Ａ：ＩＮＴ２−３１は、７２時間にわたって用量依存的に正常なメラニン形成細胞および３種類の黒色腫細胞株の細胞生存率を阻害した。図１６Ｂ：３種類の黒色腫細胞株およびメラニン形成細胞における、ＦＡＫ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＡｋｔおよびＥＲＫの発現。図１６Ｃ：ＩＮＴ２−３１またはＴＡＥ２２６の漸増用量の存在下でのＡ３７５黒色腫細胞（左）およびＣ８１６１黒色腫細胞（右）に関するＣＳＦＥ細胞増殖アッセイ（二重ＦＡＫおよびＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤）。図１６Ｄ：ＩＮＴ２−３１またはＴＡＥ２２６の存在下におけるＣ８１６１黒色腫癌細胞の計数。図は、三つ組で行った実験の代表である。
【図１７Ａ】ＩＮＴ２−３１の効果がＦＡＫおよびＩＧＦ−１Ｒ特異的であることを示す。図１７Ａ：ＦＡＫｓｈＲＮＡによるＦＡＫのノックダウンを示すウェスタンブロット。図１７Ｂ：親および偽のトランスフェクト細胞と比較して、ＦＡＫノックダウンＣ８１６１細胞におけるＩＮＴ２−３１処理に対する感受性の減少を示すＭＴＴアッセイ。図１７Ｃ：ＦＡＫ特異性。ヌル線維芽細胞と比較して、ＦＡＫ野生型に対するＩＮＴ２−３１（３１）またはＮＶＰ−ＡＥＷ５４１（ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、ＮＶＰ）の効果の増加を示すＭＴＴアッセイ。＊ｐ＜０．０５。図１７Ｄ：ＩＧＦ−１Ｒ特異性。ヌル線維芽細胞と比較して、ＩＧＦ−１Ｒ野生型に対するＩＮＴ２−３１（３１）またはＮＶＰ−ＡＥＷ５４１（ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、ＮＶＰ）の効果の増加を示すＭＴＴアッセイ。＊ｐ＜０．０５。図は、三つ組で行った実験の代表である。
【図１７Ｂ】ＩＮＴ２−３１の効果がＦＡＫおよびＩＧＦ−１Ｒ特異的であることを示す。図１７Ａ：ＦＡＫｓｈＲＮＡによるＦＡＫのノックダウンを示すウェスタンブロット。図１７Ｂ：親および偽のトランスフェクト細胞と比較して、ＦＡＫノックダウンＣ８１６１細胞におけるＩＮＴ２−３１処理に対する感受性の減少を示すＭＴＴアッセイ。図１７Ｃ：ＦＡＫ特異性。ヌル線維芽細胞と比較して、ＦＡＫ野生型に対するＩＮＴ２−３１（３１）またはＮＶＰ−ＡＥＷ５４１（ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、ＮＶＰ）の効果の増加を示すＭＴＴアッセイ。＊ｐ＜０．０５。図１７Ｄ：ＩＧＦ−１Ｒ特異性。ヌル線維芽細胞と比較して、ＩＧＦ−１Ｒ野生型に対するＩＮＴ２−３１（３１）またはＮＶＰ−ＡＥＷ５４１（ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、ＮＶＰ）の効果の増加を示すＭＴＴアッセイ。＊ｐ＜０．０５。図は、三つ組で行った実験の代表である。
【図１７Ｃ】ＩＮＴ２−３１の効果がＦＡＫおよびＩＧＦ−１Ｒ特異的であることを示す。図１７Ａ：ＦＡＫｓｈＲＮＡによるＦＡＫのノックダウンを示すウェスタンブロット。図１７Ｂ：親および偽のトランスフェクト細胞と比較して、ＦＡＫノックダウンＣ８１６１細胞におけるＩＮＴ２−３１処理に対する感受性の減少を示すＭＴＴアッセイ。図１７Ｃ：ＦＡＫ特異性。ヌル線維芽細胞と比較して、ＦＡＫ野生型に対するＩＮＴ２−３１（３１）またはＮＶＰ−ＡＥＷ５４１（ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、ＮＶＰ）の効果の増加を示すＭＴＴアッセイ。＊ｐ＜０．０５。図１７Ｄ：ＩＧＦ−１Ｒ特異性。ヌル線維芽細胞と比較して、ＩＧＦ−１Ｒ野生型に対するＩＮＴ２−３１（３１）またはＮＶＰ−ＡＥＷ５４１（ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、ＮＶＰ）の効果の増加を示すＭＴＴアッセイ。＊ｐ＜０．０５。図は、三つ組で行った実験の代表である。
【図１７Ｄ】ＩＮＴ２−３１の効果がＦＡＫおよびＩＧＦ−１Ｒ特異的であることを示す。図１７Ａ：ＦＡＫｓｈＲＮＡによるＦＡＫのノックダウンを示すウェスタンブロット。図１７Ｂ：親および偽のトランスフェクト細胞と比較して、ＦＡＫノックダウンＣ８１６１細胞におけるＩＮＴ２−３１処理に対する感受性の減少を示すＭＴＴアッセイ。図１７Ｃ：ＦＡＫ特異性。ヌル線維芽細胞と比較して、ＦＡＫ野生型に対するＩＮＴ２−３１（３１）またはＮＶＰ−ＡＥＷ５４１（ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、ＮＶＰ）の効果の増加を示すＭＴＴアッセイ。＊ｐ＜０．０５。図１７Ｄ：ＩＧＦ−１Ｒ特異性。ヌル線維芽細胞と比較して、ＩＧＦ−１Ｒ野生型に対するＩＮＴ２−３１（３１）またはＮＶＰ−ＡＥＷ５４１（ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、ＮＶＰ）の効果の増加を示すＭＴＴアッセイ。＊ｐ＜０．０５。図は、三つ組で行った実験の代表である。
【図１８Ａ】ＩＮＴ２−３１が剥離およびアポトーシスを誘発することを示す。図１８Ａ：７２時間後に、５μＭのＩＮＴ２−３１で処理した細胞における剥離において、僅かであるが有意ではない増加が認められる。より大きな効果は、４８時間および７２時間後にＴＡＥ（ＴＡＥ２２６）を用いた場合に認められる（対照に対して＊ｐ＜０．０５）。図１８Ｂ：ＩＮＴ２−３１で処理した細胞のヘキスト染色。図１８Ｃ：４８時間のＩＮＴ２−３１またはＴＡＥ２２６処理による活性化カスパーゼ３／７の検出。図１８Ｄ：アポトーシスの経路の生化学的マーカーのウェスタンブロット分析。図は、三つ組で行った実験の代表である。
【図１８Ｂ】ＩＮＴ２−３１が剥離およびアポトーシスを誘発することを示す。図１８Ａ：７２時間後に、５μＭのＩＮＴ２−３１で処理した細胞における剥離において、僅かであるが有意ではない増加が認められる。より大きな効果は、４８時間および７２時間後にＴＡＥ（ＴＡＥ２２６）を用いた場合に認められる（対照に対して＊ｐ＜０．０５）。図１８Ｂ：ＩＮＴ２−３１で処理した細胞のヘキスト染色。図１８Ｃ：４８時間のＩＮＴ２−３１またはＴＡＥ２２６処理による活性化カスパーゼ３／７の検出。図１８Ｄ：アポトーシスの経路の生化学的マーカーのウェスタンブロット分析。図は、三つ組で行った実験の代表である。
【図１８Ｃ】ＩＮＴ２−３１が剥離およびアポトーシスを誘発することを示す。図１８Ａ：７２時間後に、５μＭのＩＮＴ２−３１で処理した細胞における剥離において、僅かであるが有意ではない増加が認められる。より大きな効果は、４８時間および７２時間後にＴＡＥ（ＴＡＥ２２６）を用いた場合に認められる（対照に対して＊ｐ＜０．０５）。図１８Ｂ：ＩＮＴ２−３１で処理した細胞のヘキスト染色。図１８Ｃ：４８時間のＩＮＴ２−３１またはＴＡＥ２２６処理による活性化カスパーゼ３／７の検出。図１８Ｄ：アポトーシスの経路の生化学的マーカーのウェスタンブロット分析。図は、三つ組で行った実験の代表である。
【図１８Ｄ】ＩＮＴ２−３１が剥離およびアポトーシスを誘発することを示す。図１８Ａ：７２時間後に、５μＭのＩＮＴ２−３１で処理した細胞における剥離において、僅かであるが有意ではない増加が認められる。より大きな効果は、４８時間および７２時間後にＴＡＥ（ＴＡＥ２２６）を用いた場合に認められる（対照に対して＊ｐ＜０．０５）。図１８Ｂ：ＩＮＴ２−３１で処理した細胞のヘキスト染色。図１８Ｃ：４８時間のＩＮＴ２−３１またはＴＡＥ２２６処理による活性化カスパーゼ３／７の検出。図１８Ｄ：アポトーシスの経路の生化学的マーカーのウェスタンブロット分析。図は、三つ組で行った実験の代表である。
【図１９Ａ】ＩＮＴ２−３１がＦＡＫ−ＩＧＦ−１Ｒ依存的シグナル伝達を阻止し、かつキナーゼ活性を阻害せずにＩＧＦ依存的Ａｋｔ活性化を阻止することを示す。２４時間後の、Ｃ８１６１（図１９Ａ）、Ａ３７５（図１９Ｂ）およびＳＫ−ＭＥＬ−２８（図１９Ｃ）細胞におけるシグナル伝達に対するＩＧＦ−１刺激の存在および非存在下での漸増用量のＩＮＴ２−３１の効果。図は、三つ組で行った実験の代表である。図１９Ｄ：ＩＮＴ２−３１は、これらの１２種のキナーゼのキナーゼ活性を有意に阻害しなかった。図１９Ｅ：Ｃ８１６１細胞を６ウェルプレートに播種し、５μＭのＩＮＴ２−３１で２４、４８および７２時間処理した。図１９Ｆおよび図１９Ｇ：ＦＡＫ−ＮＴ２断片の過剰発現によって、ＡＫＴのＩＧＦ−１誘発性リン酸化が減少する。ＦＡＫのＮ末端（ＦＡＫ−ＮＴ１、ＦＡＫ−ＮＴ２およびＦＡＫ−ＮＴ３）の３種のＧＦＰ断片をトランスフェクトしたＣ８１６１細胞。
【図１９Ｂ】ＩＮＴ２−３１がＦＡＫ−ＩＧＦ−１Ｒ依存的シグナル伝達を阻止し、かつキナーゼ活性を阻害せずにＩＧＦ依存的Ａｋｔ活性化を阻止することを示す。２４時間後の、Ｃ８１６１（図１９Ａ）、Ａ３７５（図１９Ｂ）およびＳＫ−ＭＥＬ−２８（図１９Ｃ）細胞におけるシグナル伝達に対するＩＧＦ−１刺激の存在および非存在下での漸増用量のＩＮＴ２−３１の効果。図は、三つ組で行った実験の代表である。図１９Ｄ：ＩＮＴ２−３１は、これらの１２種のキナーゼのキナーゼ活性を有意に阻害しなかった。図１９Ｅ：Ｃ８１６１細胞を６ウェルプレートに播種し、５μＭのＩＮＴ２−３１で２４、４８および７２時間処理した。図１９Ｆおよび図１９Ｇ：ＦＡＫ−ＮＴ２断片の過剰発現によって、ＡＫＴのＩＧＦ−１誘発性リン酸化が減少する。ＦＡＫのＮ末端（ＦＡＫ−ＮＴ１、ＦＡＫ−ＮＴ２およびＦＡＫ−ＮＴ３）の３種のＧＦＰ断片をトランスフェクトしたＣ８１６１細胞。
【図１９Ｃ】ＩＮＴ２−３１がＦＡＫ−ＩＧＦ−１Ｒ依存的シグナル伝達を阻止し、かつキナーゼ活性を阻害せずにＩＧＦ依存的Ａｋｔ活性化を阻止することを示す。２４時間後の、Ｃ８１６１（図１９Ａ）、Ａ３７５（図１９Ｂ）およびＳＫ−ＭＥＬ−２８（図１９Ｃ）細胞におけるシグナル伝達に対するＩＧＦ−１刺激の存在および非存在下での漸増用量のＩＮＴ２−３１の効果。図は、三つ組で行った実験の代表である。図１９Ｄ：ＩＮＴ２−３１は、これらの１２種のキナーゼのキナーゼ活性を有意に阻害しなかった。図１９Ｅ：Ｃ８１６１細胞を６ウェルプレートに播種し、５μＭのＩＮＴ２−３１で２４、４８および７２時間処理した。図１９Ｆおよび図１９Ｇ：ＦＡＫ−ＮＴ２断片の過剰発現によって、ＡＫＴのＩＧＦ−１誘発性リン酸化が減少する。ＦＡＫのＮ末端（ＦＡＫ−ＮＴ１、ＦＡＫ−ＮＴ２およびＦＡＫ−ＮＴ３）の３種のＧＦＰ断片をトランスフェクトしたＣ８１６１細胞。
【図１９Ｄ】ＩＮＴ２−３１がＦＡＫ−ＩＧＦ−１Ｒ依存的シグナル伝達を阻止し、かつキナーゼ活性を阻害せずにＩＧＦ依存的Ａｋｔ活性化を阻止することを示す。２４時間後の、Ｃ８１６１（図１９Ａ）、Ａ３７５（図１９Ｂ）およびＳＫ−ＭＥＬ−２８（図１９Ｃ）細胞におけるシグナル伝達に対するＩＧＦ−１刺激の存在および非存在下での漸増用量のＩＮＴ２−３１の効果。図は、三つ組で行った実験の代表である。図１９Ｄ：ＩＮＴ２−３１は、これらの１２種のキナーゼのキナーゼ活性を有意に阻害しなかった。図１９Ｅ：Ｃ８１６１細胞を６ウェルプレートに播種し、５μＭのＩＮＴ２−３１で２４、４８および７２時間処理した。図１９Ｆおよび図１９Ｇ：ＦＡＫ−ＮＴ２断片の過剰発現によって、ＡＫＴのＩＧＦ−１誘発性リン酸化が減少する。ＦＡＫのＮ末端（ＦＡＫ−ＮＴ１、ＦＡＫ−ＮＴ２およびＦＡＫ−ＮＴ３）の３種のＧＦＰ断片をトランスフェクトしたＣ８１６１細胞。
【図１９Ｅ】ＩＮＴ２−３１がＦＡＫ−ＩＧＦ−１Ｒ依存的シグナル伝達を阻止し、かつキナーゼ活性を阻害せずにＩＧＦ依存的Ａｋｔ活性化を阻止することを示す。２４時間後の、Ｃ８１６１（図１９Ａ）、Ａ３７５（図１９Ｂ）およびＳＫ−ＭＥＬ−２８（図１９Ｃ）細胞におけるシグナル伝達に対するＩＧＦ−１刺激の存在および非存在下での漸増用量のＩＮＴ２−３１の効果。図は、三つ組で行った実験の代表である。図１９Ｄ：ＩＮＴ２−３１は、これらの１２種のキナーゼのキナーゼ活性を有意に阻害しなかった。図１９Ｅ：Ｃ８１６１細胞を６ウェルプレートに播種し、５μＭのＩＮＴ２−３１で２４、４８および７２時間処理した。図１９Ｆおよび図１９Ｇ：ＦＡＫ−ＮＴ２断片の過剰発現によって、ＡＫＴのＩＧＦ−１誘発性リン酸化が減少する。ＦＡＫのＮ末端（ＦＡＫ−ＮＴ１、ＦＡＫ−ＮＴ２およびＦＡＫ−ＮＴ３）の３種のＧＦＰ断片をトランスフェクトしたＣ８１６１細胞。
【図１９Ｆ】ＩＮＴ２−３１がＦＡＫ−ＩＧＦ−１Ｒ依存的シグナル伝達を阻止し、かつキナーゼ活性を阻害せずにＩＧＦ依存的Ａｋｔ活性化を阻止することを示す。２４時間後の、Ｃ８１６１（図１９Ａ）、Ａ３７５（図１９Ｂ）およびＳＫ−ＭＥＬ−２８（図１９Ｃ）細胞におけるシグナル伝達に対するＩＧＦ−１刺激の存在および非存在下での漸増用量のＩＮＴ２−３１の効果。図は、三つ組で行った実験の代表である。図１９Ｄ：ＩＮＴ２−３１は、これらの１２種のキナーゼのキナーゼ活性を有意に阻害しなかった。図１９Ｅ：Ｃ８１６１細胞を６ウェルプレートに播種し、５μＭのＩＮＴ２−３１で２４、４８および７２時間処理した。図１９Ｆおよび図１９Ｇ：ＦＡＫ−ＮＴ２断片の過剰発現によって、ＡＫＴのＩＧＦ−１誘発性リン酸化が減少する。ＦＡＫのＮ末端（ＦＡＫ−ＮＴ１、ＦＡＫ−ＮＴ２およびＦＡＫ−ＮＴ３）の３種のＧＦＰ断片をトランスフェクトしたＣ８１６１細胞。
【図１９Ｇ】ＩＮＴ２−３１がＦＡＫ−ＩＧＦ−１Ｒ依存的シグナル伝達を阻止し、かつキナーゼ活性を阻害せずにＩＧＦ依存的Ａｋｔ活性化を阻止することを示す。２４時間後の、Ｃ８１６１（図１９Ａ）、Ａ３７５（図１９Ｂ）およびＳＫ−ＭＥＬ−２８（図１９Ｃ）細胞におけるシグナル伝達に対するＩＧＦ−１刺激の存在および非存在下での漸増用量のＩＮＴ２−３１の効果。図は、三つ組で行った実験の代表である。図１９Ｄ：ＩＮＴ２−３１は、これらの１２種のキナーゼのキナーゼ活性を有意に阻害しなかった。図１９Ｅ：Ｃ８１６１細胞を６ウェルプレートに播種し、５μＭのＩＮＴ２−３１で２４、４８および７２時間処理した。図１９Ｆおよび図１９Ｇ：ＦＡＫ−ＮＴ２断片の過剰発現によって、ＡＫＴのＩＧＦ−１誘発性リン酸化が減少する。ＦＡＫのＮ末端（ＦＡＫ−ＮＴ１、ＦＡＫ−ＮＴ２およびＦＡＫ−ＮＴ３）の３種のＧＦＰ断片をトランスフェクトしたＣ８１６１細胞。
【図２０Ａ】ＩＮＴ２−３１によって腫瘍ｐ−Ａｋｔおよび黒色腫異種移植片の増殖が減少することを示す。動物にＣ８１６１（図２０Ａ）またはＡ３７５（図２０Ｂ）腫瘍細胞を皮下に接種し、腹腔内注射による１５ｍｇ／ｋｇのＩＮＴ２−３１対ＰＢＳで処理した。動物の体重は成長曲線の下に示されている（＊ｐ＜０．０５）。腫瘍成長の図は、三つ組で行った実験の代表である。図２０Ｃ：ＩＮＴ２−３１（１５ｍｇ／ｋｇ）対ＰＢＳ対照で処理したＣ８１６１腫瘍のＫｉ６７染色。反応性細胞の割合は、左上のグラフに示されている。染色強度は、左下のグラフに示されている（＊ｐ＜０．０５）。実験の完了時に切除された腫瘍のＴＵＮＥＬ染色は右側に示されている（＊ｐ＜０．０５）。図２０Ｄ：生体内でのＡＫＴのリン酸化に対するＩＮＴ２−３１（１５ｍｇ／ｋｇ）の効果。ｐ−Ａｋｔ／Ａｋｔ／ＧＡＰＤＨの比の光学濃度測定は図の下に示されている。これは、ＩＮＴ２−３１対ＰＢＳ対照で処理した動物の腫瘍におけるｐ−Ａｋｔ／Ａｋｔの有意に減少した比を示している。図２０Ｅ：腫瘍試料からのＦＡＫおよびＩＧＦ−１Ｒの免疫共沈降に対するＩＮＴ２−３１の効果。下のグラフは、ＩＧＦ−１Ｒ／ＦＡＫ信号の比の光学濃度測定を示す。
【図２０Ｂ】ＩＮＴ２−３１によって腫瘍ｐ−Ａｋｔおよび黒色腫異種移植片の増殖が減少することを示す。動物にＣ８１６１（図２０Ａ）またはＡ３７５（図２０Ｂ）腫瘍細胞を皮下に接種し、腹腔内注射による１５ｍｇ／ｋｇのＩＮＴ２−３１対ＰＢＳで処理した。動物の体重は成長曲線の下に示されている（＊ｐ＜０．０５）。腫瘍成長の図は、三つ組で行った実験の代表である。図２０Ｃ：ＩＮＴ２−３１（１５ｍｇ／ｋｇ）対ＰＢＳ対照で処理したＣ８１６１腫瘍のＫｉ６７染色。反応性細胞の割合は、左上のグラフに示されている。染色強度は、左下のグラフに示されている（＊ｐ＜０．０５）。実験の完了時に切除された腫瘍のＴＵＮＥＬ染色は右側に示されている（＊ｐ＜０．０５）。図２０Ｄ：生体内でのＡＫＴのリン酸化に対するＩＮＴ２−３１（１５ｍｇ／ｋｇ）の効果。ｐ−Ａｋｔ／Ａｋｔ／ＧＡＰＤＨの比の光学濃度測定は図の下に示されている。これは、ＩＮＴ２−３１対ＰＢＳ対照で処理した動物の腫瘍におけるｐ−Ａｋｔ／Ａｋｔの有意に減少した比を示している。図２０Ｅ：腫瘍試料からのＦＡＫおよびＩＧＦ−１Ｒの免疫共沈降に対するＩＮＴ２−３１の効果。下のグラフは、ＩＧＦ−１Ｒ／ＦＡＫ信号の比の光学濃度測定を示す。
【図２０Ｃ】ＩＮＴ２−３１によって腫瘍ｐ−Ａｋｔおよび黒色腫異種移植片の増殖が減少することを示す。動物にＣ８１６１（図２０Ａ）またはＡ３７５（図２０Ｂ）腫瘍細胞を皮下に接種し、腹腔内注射による１５ｍｇ／ｋｇのＩＮＴ２−３１対ＰＢＳで処理した。動物の体重は成長曲線の下に示されている（＊ｐ＜０．０５）。腫瘍成長の図は、三つ組で行った実験の代表である。図２０Ｃ：ＩＮＴ２−３１（１５ｍｇ／ｋｇ）対ＰＢＳ対照で処理したＣ８１６１腫瘍のＫｉ６７染色。反応性細胞の割合は、左上のグラフに示されている。染色強度は、左下のグラフに示されている（＊ｐ＜０．０５）。実験の完了時に切除された腫瘍のＴＵＮＥＬ染色は右側に示されている（＊ｐ＜０．０５）。図２０Ｄ：生体内でのＡＫＴのリン酸化に対するＩＮＴ２−３１（１５ｍｇ／ｋｇ）の効果。ｐ−Ａｋｔ／Ａｋｔ／ＧＡＰＤＨの比の光学濃度測定は図の下に示されている。これは、ＩＮＴ２−３１対ＰＢＳ対照で処理した動物の腫瘍におけるｐ−Ａｋｔ／Ａｋｔの有意に減少した比を示している。図２０Ｅ：腫瘍試料からのＦＡＫおよびＩＧＦ−１Ｒの免疫共沈降に対するＩＮＴ２−３１の効果。下のグラフは、ＩＧＦ−１Ｒ／ＦＡＫ信号の比の光学濃度測定を示す。
【図２０Ｄ】ＩＮＴ２−３１によって腫瘍ｐ−Ａｋｔおよび黒色腫異種移植片の増殖が減少することを示す。動物にＣ８１６１（図２０Ａ）またはＡ３７５（図２０Ｂ）腫瘍細胞を皮下に接種し、腹腔内注射による１５ｍｇ／ｋｇのＩＮＴ２−３１対ＰＢＳで処理した。動物の体重は成長曲線の下に示されている（＊ｐ＜０．０５）。腫瘍成長の図は、三つ組で行った実験の代表である。図２０Ｃ：ＩＮＴ２−３１（１５ｍｇ／ｋｇ）対ＰＢＳ対照で処理したＣ８１６１腫瘍のＫｉ６７染色。反応性細胞の割合は、左上のグラフに示されている。染色強度は、左下のグラフに示されている（＊ｐ＜０．０５）。実験の完了時に切除された腫瘍のＴＵＮＥＬ染色は右側に示されている（＊ｐ＜０．０５）。図２０Ｄ：生体内でのＡＫＴのリン酸化に対するＩＮＴ２−３１（１５ｍｇ／ｋｇ）の効果。ｐ−Ａｋｔ／Ａｋｔ／ＧＡＰＤＨの比の光学濃度測定は図の下に示されている。これは、ＩＮＴ２−３１対ＰＢＳ対照で処理した動物の腫瘍におけるｐ−Ａｋｔ／Ａｋｔの有意に減少した比を示している。図２０Ｅ：腫瘍試料からのＦＡＫおよびＩＧＦ−１Ｒの免疫共沈降に対するＩＮＴ２−３１の効果。下のグラフは、ＩＧＦ−１Ｒ／ＦＡＫ信号の比の光学濃度測定を示す。
【図２０Ｅ】ＩＮＴ２−３１によって腫瘍ｐ−Ａｋｔおよび黒色腫異種移植片の増殖が減少することを示す。動物にＣ８１６１（図２０Ａ）またはＡ３７５（図２０Ｂ）腫瘍細胞を皮下に接種し、腹腔内注射による１５ｍｇ／ｋｇのＩＮＴ２−３１対ＰＢＳで処理した。動物の体重は成長曲線の下に示されている（＊ｐ＜０．０５）。腫瘍成長の図は、三つ組で行った実験の代表である。図２０Ｃ：ＩＮＴ２−３１（１５ｍｇ／ｋｇ）対ＰＢＳ対照で処理したＣ８１６１腫瘍のＫｉ６７染色。反応性細胞の割合は、左上のグラフに示されている。染色強度は、左下のグラフに示されている（＊ｐ＜０．０５）。実験の完了時に切除された腫瘍のＴＵＮＥＬ染色は右側に示されている（＊ｐ＜０．０５）。図２０Ｄ：生体内でのＡＫＴのリン酸化に対するＩＮＴ２−３１（１５ｍｇ／ｋｇ）の効果。ｐ−Ａｋｔ／Ａｋｔ／ＧＡＰＤＨの比の光学濃度測定は図の下に示されている。これは、ＩＮＴ２−３１対ＰＢＳ対照で処理した動物の腫瘍におけるｐ−Ａｋｔ／Ａｋｔの有意に減少した比を示している。図２０Ｅ：腫瘍試料からのＦＡＫおよびＩＧＦ−１Ｒの免疫共沈降に対するＩＮＴ２−３１の効果。下のグラフは、ＩＧＦ−１Ｒ／ＦＡＫ信号の比の光学濃度測定を示す。
【図２１Ａ】ＩＮＴ２−３１によって食道癌細胞の化学療法に対する感受性が増加した。漸増濃度のＩＮＴ２−３１、５−ＦＵまたは組み合わせで７２時間処理したＫＹＳＥ７０（図２１Ａ）およびＫＹＳＥ１４０（図２１Ｂ）食道癌細胞株の生存率を示すＭＴＴアッセイ。
【図２１Ｂ】ＩＮＴ２−３１によって食道癌細胞の化学療法に対する感受性が増加した。漸増濃度のＩＮＴ２−３１、５−ＦＵまたは組み合わせで７２時間処理したＫＹＳＥ７０（図２１Ａ）およびＫＹＳＥ１４０（図２１Ｂ）食道癌細胞株の生存率を示すＭＴＴアッセイ。
【図２２】ＩＮＴ２−３１によって膵臓癌細胞の化学療法に対する感受性が増加した。Ａ）漸増濃度のＩＮＴ２−３１、５−ＦＵまたは組み合わせで７２時間処理したＰａｎｃ−１細胞株の生存率を示すＭＴＴアッセイ。
【図２３Ａ】直接的な食道癌患者＃５の検体に対するＩＮＴ２−３１の効果。図２３Ａ：漸増濃度のＩＮＴ２−３１によって食道癌患者＃５の細胞の細胞生存率が抑制されたことを示すＭＴＴアッセイ。図２３Ｂ：食道癌患者＃５の異種移植片を腹腔内注射による５０ｍｇ／ｋｇのＩＮＴ２−３１対ＰＢＳで処理した。処理は、腫瘍の移植から１０日後に開始した。動物の体重は成長曲線の下に示されている（＊ｐ＜０．０５）。図２３Ｃ：処理異種移植片対対照異種移植片における、Ｋｉ６７抗体で染色された反応性細胞の割合が示されている。＊ｐ＜０．０５。
【図２３Ｂ】直接的な食道癌患者＃５の検体に対するＩＮＴ２−３１の効果。図２３Ａ：漸増濃度のＩＮＴ２−３１によって食道癌患者＃５の細胞の細胞生存率が抑制されたことを示すＭＴＴアッセイ。図２３Ｂ：食道癌患者＃５の異種移植片を腹腔内注射による５０ｍｇ／ｋｇのＩＮＴ２−３１対ＰＢＳで処理した。処理は、腫瘍の移植から１０日後に開始した。動物の体重は成長曲線の下に示されている（＊ｐ＜０．０５）。図２３Ｃ：処理異種移植片対対照異種移植片における、Ｋｉ６７抗体で染色された反応性細胞の割合が示されている。＊ｐ＜０．０５。
【図２３Ｃ】直接的な食道癌患者＃５の検体に対するＩＮＴ２−３１の効果。図２３Ａ：漸増濃度のＩＮＴ２−３１によって食道癌患者＃５の細胞の細胞生存率が抑制されたことを示すＭＴＴアッセイ。図２３Ｂ：食道癌患者＃５の異種移植片を腹腔内注射による５０ｍｇ／ｋｇのＩＮＴ２−３１対ＰＢＳで処理した。処理は、腫瘍の移植から１０日後に開始した。動物の体重は成長曲線の下に示されている（＊ｐ＜０．０５）。図２３Ｃ：処理異種移植片対対照異種移植片における、Ｋｉ６７抗体で染色された反応性細胞の割合が示されている。＊ｐ＜０．０５。
【図２４Ａ】同所性膵臓マウスモデルに対するＩＮＴ２−３１の効果。図２４Ａ：ＭｉａＰａＣａ−２異種移植片を腹腔内注射による５０ｍｇ／ｋｇのＩＮＴ２−３１対ＰＢＳで処理した。処理は、腫瘍の移植から７日後に開始した。図２４Ｂ：Ｐａｎｃ−１異種移植片を、皮下注射による１５ｍｇ／ｋｇのＩＮＴ２−３１対ＰＢＳで処理した。処理は、腫瘍の移植から１５日後に開始した。
【図２４Ｂ】同所性膵臓マウスモデルに対するＩＮＴ２−３１の効果。図２４Ａ：ＭｉａＰａＣａ−２異種移植片を腹腔内注射による５０ｍｇ／ｋｇのＩＮＴ２−３１対ＰＢＳで処理した。処理は、腫瘍の移植から７日後に開始した。図２４Ｂ：Ｐａｎｃ−１異種移植片を、皮下注射による１５ｍｇ／ｋｇのＩＮＴ２−３１対ＰＢＳで処理した。処理は、腫瘍の移植から１５日後に開始した。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、癌細胞の生存率を抑制するかアポトーシスを増加させることできる新規な癌治療薬としての化合物を提供する。一態様では、本発明の化合物は、ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用を調節（例えば阻害）することができる。別の態様では、本発明の化合物は、ＦＡＫおよび／またはＩＧＦ−１Ｒの相互作用部位（１つまたは複数）を標的とする（例えば、会合または結合する）ことができ、それにより、ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用を阻止する。本発明は、ＦＡＫおよび／またはＩＧＦ−１Ｒのチロシンリン酸化を阻害し、それにより、ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用を阻止することできる化合物も提供する。
【００３０】
本発明は、細胞増殖性疾患に罹患しているか罹患しやすい対象を治療するための本発明の化合物の使用方法も提供する。特定の実施形態では、細胞増殖性疾患は癌である。
【００３１】
本発明は少なくとも部分的に、ＦＡＫが癌細胞（例えば膵臓癌細胞）においてＩＧＦ−１Ｒと物理的に相互作用するという発見に基づいている。ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用は両方のキナーゼのリン酸化状態に依存しており、どちらか一方のキナーゼのチロシンリン酸化の阻害によって相互作用が阻止されると現在考えられている（W. Liu et al., Carcinogenesis, 29, 6, 2008, 1096-1107を参照）。
【００３２】
ＧＳＴおよびＨＩＳタグを付けた精製タンパク質を用いた非細胞系アッセイを行った。その結果は、ＦＡＫアミノ末端断片（ＮＴ）（より具体的には、ＮＴ２）とＩＧＦ−１Ｒのキナーゼドメインとの間に直接的な物理的相互作用が存在することを実証している（図１）。そのようなＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用が、膵臓癌細胞などの癌細胞にとって必須な生存信号を提供すると考えられている。
【００３３】
本発明に従って、構造的な分析と共にコンピュータモデリングを行った。リピンスキーの法則に従って、公知の正確な構造を有する約２５０，０００種の小分子化合物を、ＤＯＣＫ５．１コンピュータプログラムを用いて、ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの相互作用部位に１００通りの異なる方向でドッキングさせた。次いで、ＦＡＫ−ＮＴ２に結合し、かつＩＧＦ−１Ｒとの相互作用を阻止する確率が最も高い小分子を、国立癌研究所開発治療プログラム（ＮＣＩ／ＤＴＰ）から機能試験のために入手した。ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの相互作用部位を標的とするリード化合物を特定した。次いで、リード化合物を、精製したＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒタンパク質との結合を阻止し、癌細胞の生存率を抑制し、ＩＧＦ−１ＲおよびＡＫＴのリン酸化を減少させ、かつ／またはアポトーシスを誘発するそれらの能力について複数の細胞系アッセイで評価した。食道癌（ＫＹＳＥ１４０）、膵臓癌（Ｐａｎｃ−１）、および黒色腫（Ｃ８１６１）などのいくつかの癌細胞株を、いくつかのリード化合物を用いて試験した。予備段階の結果は、リード化合物の４−（メチルチオ）−７−（５−Ｏ−ホスホノ−Ｄ−リボフラノシル）−｛７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン｝が、腫瘍細胞生存率を抑制し、ＦＡＫおよびＩＧＦ−１Ｒのシグナル伝達を変え、かつ生体内における腫瘍成長を阻害することを実証している。
【００３４】
本発明は、新規な癌治療薬としての小分子阻害剤を提供する。これらの阻害剤は、ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用を調節（例えば、阻害または阻止）することができる。本発明は、癌を治療するための新規かつ効果的な治療戦略も提供する。
【００３５】
一実施形態では、本発明の阻害剤は、癌細胞（例えば黒色腫細胞）の生存率を減少させる、癌細胞（例えば黒色腫細胞）の増殖を阻害する、アポトーシスを誘発する、キナーゼ活性を阻害せずにＡｋｔの活性化を減少させる、腫瘍ｐ−Ａｋｔを減少させる、および黒色腫異種移植片の増殖を減少させるという機能のうちの少なくとも１つを有する。
【００３６】
Ｉ．定義
本発明のさらなる説明の前に、本発明をより容易に理解することができるようにするために、特定の用語を最初に定義し、かつ便宜上ここに集約する。
【００３７】
「投与」または「投与すること」という用語は、目的の機能を果たすように本発明の化合物を対象に導入する経路を含む。使用され得る投与経路の例としては、注射（皮下、静脈内、非経口、腹膜内、クモ膜下腔内）、経口、吸入、直腸内および経皮が挙げられる。医薬製剤は、各投与経路に適した形態で投与してもよい。例えば、これらの製剤は、錠剤またはカプセルの形態で、注射、吸入、目薬、軟膏、坐薬などによる投与、注射、注入または吸入による投与、ローションまたは軟膏による局所投与、および坐薬による直腸内投与によって投与される。経口投与が好ましい。注射は、ボーラスまたは持続注入であってもよい。投与経路に応じて、本発明の化合物は、選択した材料でコーティングするか、その材料の中に配置して、目的の機能を果たすその能力に悪影響を及ぼし得る自然条件からそれを保護することができる。本発明の化合物は、単独で、あるいは上述した別の薬剤のいずれかまたは薬学的に許容される担体あるいは両方と組み合わせて投与することができる。本発明の化合物は、他の薬剤の投与前、他の薬剤と同時または他の薬剤の投与後に投与することができる。さらに、本発明の化合物は、生体内でその活性な代謝産物またはより活性な代謝産物に変換されるプロドラッグの形態で投与することもできる。
【００３８】
「アルキル」という用語は、直鎖アルキル基、分枝鎖アルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキル置換シクロアルキル基およびシクロアルキル置換アルキル基などの飽和脂肪族基のラジカルを指す。アルキルという用語は、炭化水素骨格の１つまたは複数の炭素を置き換えている酸素、窒素、硫黄またはリン原子（例えば、酸素、窒素、硫黄またはリン原子）をさらに含むことができるアルキル基をさらに含む。特定の実施形態では、直鎖または分枝鎖アルキルは、その骨格に３０個以下（例えば、直鎖ではＣ１〜Ｃ３０、分枝鎖ではＣ３〜Ｃ３０）、２６個以下、２０個以下、４個以下の炭素原子を有する。同様に、シクロアルキルは、環構造において、その環構造に３〜１０個（例えば、３、４、５または６個）の炭素原子を有していてもよい。
【００３９】
炭素数が特に明記されていない限り、本明細書で使用される「低級アルキル」は、上に定義したアルキル基であるが、その骨格構造に１〜１０個、１〜６個の炭素、１〜４個の炭素原子を有するアルキルを意味し、これは直鎖であっても分枝鎖であってもよい。低級アルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチルなどが挙げられる。一実施形態では、「低級アルキル」という用語は、その骨格に４個以下の炭素原子を有する直鎖アルキル、例えば、Ｃ１〜Ｃ４アルキルを含む。
【００４０】
「アポトーシス」という用語は、多細胞生物において生じ得るプログラムされた細胞死（ＰＣＤ）のプロセスを指す。プログラムされた細胞死には、特徴的な細胞形態および死を引き起こす一連の生化学的な事象、より具体的には、様々な形態学的変化、例えば、膜非対称性および接着の喪失などの細胞膜に対する変化、細胞収縮、核断片化、クロマチン凝縮および染色体ＤＮＡ断片化を引き起こす一連の生化学的な事象が伴う。
【００４１】
「〜に結合している」という用語は、化学物質もしくは化合物またはそれらの部分とタンパク質上の結合ポケットまたは結合部位との間の近接状態を指す。結合は、非共有結合（ここでは、水素結合またはファンデルワールスもしくは静電的相互作用により、並置がエネルギー的に有利である）であっても共有結合であってもよい。
【００４２】
本明細書で使用される「結合ポケット」という用語は、その形状により有利に別の化学物質もしくは化合物に結合する分子または分子複合体の領域を指す。
【００４３】
本発明の化合物の「生物学的活性」という言葉は、反応性細胞における本発明の化合物によって誘発される全ての活性を含む。この言葉は、本化合物によって誘発されるゲノムおよび非ゲノム活性を含む。
【００４４】
「生物学的組成物」または「生体試料」は、細胞または生体高分子を含むか、またはそれらに由来する組成物を指す。細胞を含む組成物としては、例えば、哺乳類の血液、赤血球濃縮物、血小板濃縮物、白血球濃縮物、血液細胞タンパク質、血漿、多血小板血漿、血漿濃縮物、血漿の任意の分別からの沈殿物、血漿の任意の分別からの上澄み、血漿タンパク質画分、精製もしくは部分的に精製された血液タンパク質または他の成分、血清、精液、哺乳類の初乳、牛乳、唾液、胎盤抽出物、寒冷沈降物、寒冷上澄み(cryo supernatant)、細胞溶解物、哺乳類の細胞培養液または培地、発酵産物、腹水、血液細胞中で誘発されたタンパク質、および正常細胞または形質転換細胞によって細胞培養液中で産生された産物（例えば、組み換えＤＮＡもしくはモノクローナル抗体技術による）が挙げられる。生物学的組成物は無細胞であってもよい。一実施形態では、好適な生物学的組成物または生体試料は赤血球懸濁液である。いくつかの実施形態では、血球懸濁液は哺乳類の血液細胞を含む。血液細胞は、ヒト、ヒト以外の霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジまたはブタから得ることができる。特定の実施形態では、血球懸濁液は、赤血球および／または血小板および／または白血球および／または骨髄細胞を含む。
【００４５】
「癌」という用語は、ある群の細胞が制御されない増殖、浸潤および転移を示す疾患の種類を指す。この言葉は、乳房、気道、脳、生殖器、消化管、尿路、眼、肝臓、皮膚、頭頸部、甲状腺、副甲状腺の癌、または固形腫瘍の遠隔転移（これらに限定されない）を含むことが意図されている。癌のいくつかの具体的な例としては、乳癌、膀胱癌、結腸および直腸癌、結腸直腸癌、皮膚黒色腫、子宮内膜癌、腎臓癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、骨肉腫、前立腺癌、リンパ腫、白血病、皮膚癌、甲状腺癌および肉腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
「細胞増殖性疾患」という用語は、細胞の望ましくない増殖または制御されない増殖に関わる疾患を含む。そのような疾患の例としては、腫瘍または癌（例えば、肺癌（小細胞および非小細胞）、甲状腺癌、前立腺癌、膵臓癌、乳癌または結腸癌）、肉腫または黒色腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
「化学療法」という用語は、細胞（具体的には、微生物または癌の細胞）を殺す化学物質による疾患の治療を指す。本出願では、この用語は、癌を治療するために使用される抗癌治療薬、またはこれらの薬物を組み合わせて細胞毒性の標準治療計画にしたものを指す。
【００４８】
「キラル」という用語は、鏡像相手に重ね合わせ不可能な特性を有する分子を指し、「アキラル」という用語は、鏡像相手に重ね合わせ可能な分子を指す。
【００４９】
「細胞毒性」および「毒性」という用語は、細胞に有毒な特質を指す。有毒な薬剤は、化学物質、免疫細胞またはいくつかの種類の毒液であってもよい。
【００５０】
「ジアステレオマー」という用語は、２つ以上の不斉中心を有し、かつその分子が互いに鏡像でない立体異性体を指す。
【００５１】
「遠隔転移」という用語は、リンパまたは血液を介する１つの臓器もしくは部分から別の隣接していない臓器もしくは部分までの疾患の広がりを意味する。本出願の目的では、「転移」という用語は、原発性腫瘍から広がって、リンパ管および血管に侵入し、血流によって循環し、かつ体内の別の箇所の正常組織内に定着して成長することができる癌細胞を指す。
【００５２】
「有効量」という用語は、「治療的に有効な抗増殖量」または「予防的に有効な抗増殖量」を指す。この用語は、投与時および所望の結果を達成するのに必要な（例えば、細胞増殖性疾患を治療するために十分な）期間において効果的な量を含む。本発明の化合物の有効量は、対象の病状、年齢および体重などの要因、ならびに対象において所望の反応を誘発する本発明の化合物の能力に応じて変動してもよい。投与計画は、最適な治療反応を与えるように調整してもよい。有効量は、治療的に有益な効果が本発明の化合物の任意の有毒または有害な効果（例えば、副作用）を上回る量でもある。
【００５３】
本発明の化合物の治療的有効量（すなわち、有効な投与量）は、約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であってもよい。特定の例は、約０．０１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、約１〜１０ｍｇ／ｋｇ、２〜９ｍｇ／ｋｇ、３〜８ｍｇ／ｋｇ、４〜７ｍｇ／ｋｇまたは５〜６ｍｇ／ｋｇ体重である。当業者は、対象が罹患しているか罹患しやすい疾患または障害の種類、疾患または障害のステージ、疾患または障害の重症度、以前の治療的処置、対象の一般的な健康状態または年齢および存在する他の疾患などのこれらに限定されない特定の要因が対象を効果的に治療するために必要とされる投与量に影響する場合があることを理解しているであろう。さらに、本発明の化合物の治療的有効量による対象の治療は、単一の治療または一連の治療を含むことができる。一例では、対象が１日に１回約０．００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の投与量の本発明の化合物で治療される。治療のために使用される本発明の化合物の有効な投与量が特定の治療の過程を通じて増減し得ることも理解されるであろう。
【００５４】
「鏡像異性体」という用語は、互いに重ね合わせ不可能な鏡像である化合物の２種類の立体異性体を指す。２種類の鏡像異性体の等モル混合物は、「ラセミ混合物」または「ラセミ体」と呼ばれる。
【００５５】
「上皮成長因子受容体療法」という用語は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的とする癌療法を指す。ＥＧＦＲは、上皮性腫瘍において頻繁に発現する受容体チロシンキナーゼ受容体である。診療所で入手可能な特定の抗ＥＧＦＲ薬剤としては、例えば、ゲフィチニブおよびエルロチニブが挙げられる。
【００５６】
「ＦＡＫ結合パートナー」という言葉は、ＦＡＫ（例えば、全長、Ｎ末端、Ｃ末端、カルボキシ末端、キナーゼドメイン、ＦＥＲＭドメイン、ＦＡＴドメイン）を有する複合体に組み込まれたタンパク質を指す。
【００５７】
「ホメオスタシス」という用語は、内部環境の静的（すなわち一定）状態の維持を意味するように当該技術分野で認識されている。
【００５８】
「異性体」または「立体異性体」という用語は、同一の化学構成を有するが、空間における原子または基の配置に関して異なる化合物を指す。
【００５９】
「免疫療法」という用語は、治療されている対象の免疫系を調節することによって癌を治療する療法を指す。特定の実施形態では、癌治療で使用される免疫療法は、対象の体内における腫瘍特異的適応免疫応答を刺激することを目的としている。
【００６０】
「向上した生物学的特性」という言葉は、生体内でのその有効性を高める本発明の化合物に固有の任意の活性を指す。一実施形態では、この用語は、本発明の化合物の任意の質的または量的に向上した治療的特性（例えば、毒性の減少）を指す。
【００６１】
「分裂死」という用語は、ＤＮＡ損傷または紡錘体形成の乱れによって、有糸分裂の間に生じる細胞死の形態を指す。これは、通常は有糸分裂への進行を停止し、よって修復が達成されるまで破局的な事象を抑制する様々なチェックポイント機構（中でも注目すべきはｐ５３）の調節不全を伴う。これにより、微小核形成および核分裂が生じ、その結果、細胞死が生じる。
【００６２】
「調節する」という用語は、例えば、本発明の化合物に対する曝露に反応して細胞が増殖する能力における上昇または低下、例えば、所望の最終的な結果（例えば、治療的な結果）が達成されるように動物における少なくとも細胞の亜集団の増殖の阻害を指す。
【００６３】
「モノクローナル抗体療法」という用語は、具体的には癌細胞を標的とするために、モノクローナル抗体（またはｍＡｂ）を用いる治療法を指す。その目的は、対象の免疫系を刺激して悪性腫瘍細胞を攻撃すること、および特異的な細胞受容体を遮断することによる腫瘍成長の防止である。この治療法の例としては、放射免疫療法、抗体介在性酵素プロドラッグ療法、免疫リポソームを用いた薬物および遺伝子療法が挙げられる。特定の治療的なモノクローナル抗体としては、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、エファリズマブ、イブリツモマブチウキセタン、１１１ｉｎ−カプロマブ、イムシロマブ、パニツムマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、リツキシマブ、トシツモマブおよびトラスツズマブが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
「ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用を調節（または阻害）することができる化合物を得る」というような場合の「得る」という用語は、本化合物を購入、合成またはそれ以外の方法で入手することを含むことが意図されている。
【００６５】
本明細書で使用される「非経口投与」および「非経口的に投与された」という語句は、経腸および局所投与以外の通常は注射による投与様式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、クモ膜下腔内、包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊椎内および胸骨内注射および注入が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
「プロドラッグ（ｐｒｏｄｒｕｇ）」または「プロドラッグ（ｐｒｏ−ｄｒｕｇ）」という用語は、生体内で代謝することができる部分を有する化合物を含む。一般に、プロドラッグは、エステラーゼによって、あるいは活性薬物に対する他の機序によって、生体内で代謝される。プロドラッグおよびそれらの使用例は、当業界では良く知られている（例えば、Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci.
66: 1-19を参照）。プロドラッグは、化合物の最終的な単離および精製の間に原位置で、あるいは好適なエステル化剤によってその遊離酸形態の精製された化合物またはヒドロキシルを別々に反応させることによって、調製することができる。ヒドロキシル基は、カルボキシル酸による処理によってエステルに変換することができる。プロドラッグ部分の例としては、置換もしくは未置換の、分岐鎖もしくは非分岐鎖低級アルキルエステル部分（例えば、プロピオン酸エステル）、低級アルケニルエステル、ジ低級アルキルアミノ低級アルキルエステル（例えば、ジメチルアミノエチルエステル）、アシルアミノ低級アルキルエステル（例えば、アセチルオキシメチルエステル）、アシロキシ低級アルキルエステル（例えば、ピバロイルオキシメチルエステル）、アリールエステル（フェニルエステル）、アリール低級アルキルエステル（例えば、ベンジルエステル）、（例えば、メチル、ハロまたはメトキシ置換基で）置換されたアリールおよびアリール低級アルキルエステル、アミド、低級アルキルアミド、ジ低級アルキルアミドおよびヒドロキシアミドが挙げられる。特定の実施形態では、プロドラッグ部分は、プロピオン酸エステルおよびアシルエステルである。生体内で他の機序によって活性型に変換されるプロドラッグも含まれる。
【００６７】
化合物の「予防的に有効な量」という言葉は、細胞増殖性疾患を予防または治療する際に、それを必要としているものとして特定された患者に単回もしくは複数回用量を投与すると有効である本発明の化合物の量、またはそれ以外に本明細書に記載されている化合物の量を指す。
【００６８】
「放射線治療」（または、「放射線療法」）という用語は、悪性細胞を制御するための治療的処置の一部としての電離放射線の医学的使用を指す。特定の例では、放射線療法は、治癒的または補助的癌治療のために使用される。
【００６９】
「毒性の減少」という言葉は、生体内に投与された場合に本発明の化合物によって誘発される任意の望ましくない副作用の減少を含むことが意図されている。
【００７０】
「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明の化合物の比較的毒性のない無機または有機酸付加塩を指す。例えば、S. M. Berge, et al. "Pharmaceutical Salts," J. Pharm. Sci.
1977, 66, 1-19を参照。薬学的に許容される塩としては、塩基として機能する主化合物を無機または有機酸と反応させて塩を形成することによって得られる塩、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、カンファースルホン酸、シュウ酸、マレイン酸、琥珀酸およびクエン酸の塩が挙げられる。薬学的に許容される塩としては、主化合物が酸として機能し、かつ適当な塩基と反応させて、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウムおよびコリンの塩を形成する塩も挙げられる。当業者は、複数の公知の方法のいずれかによって、特許請求されている化合物を適当な無機もしくは有機酸と反応させて、本化合物の酸付加塩を調製し得ることをさらに理解しているであろう。あるいは、本発明の酸性化合物のアルカリおよびアルカリ土類金属塩を、様々な公知の方法によって本発明の化合物を適当な塩基と反応させることによって調製する。
【００７１】
本発明の化合物の代表的な塩としては、従来の毒性のない塩および例えば、当該技術分野で良く知られている手段によって、無機もしくは有機酸または塩基から形成される第四級アンモニウム塩が挙げられる。例えば、そのような酸付加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、桂皮酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、イタコン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、スルホン酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩およびウンデカン酸塩が挙げられる。塩基塩としては、カリウムおよびナトリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウムおよびマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ならびにジシクロヘキシルアミンおよびＮ−メチル−Ｄ−グルカミンなどの有機塩基とのアンモニウム塩が挙げられる。さらに、塩基性窒素を含む基は、塩化メチル、塩化エチル、塩化プロピルおよび塩化ブチル、臭化メチル、臭化エチル、臭化プロピルおよび臭化ブチルおよびヨウ化メチル、ヨウ化エチル、ヨウ化プロピルおよびヨウ化ブチルなどの低級ハロゲン化アルキル；硫酸ジメチル、硫酸ジエチルおよび硫酸ジブチルのような硫酸ジアルキル；硫酸ジアミル、塩化デシル、塩化ラウリル、塩化ミリスチルおよび塩化ステアリル、臭化デシル、臭化ラウリル、臭化ミリスチルおよび臭化ステアリルおよびヨウ化デシル、ヨウ化ラウリル、ヨウ化ミリスチルおよびヨウ化ステアリルなどの長鎖ハロゲン化物、臭化ベンジルおよび臭化フェネチルのようなアラルキルハロゲン化物などの薬剤で四級化されていてもよい。
【００７２】
「溶媒和物」という用語は、溶媒と固体状態の本発明の化合物との複合体を包含することが意図されている。例示的な溶媒和物としては、本発明の化合物のエタノールまたはメタノールとの複合体が挙げられるが、これらに限定されない。水和物は、溶媒が水である溶媒和物の具体的な形態である。
【００７３】
「対象」という用語は、細胞増殖性疾患に罹患することができる生物、またはそれ以外では、本発明の本発明の化合物の投与から恩恵を受けることができる生物、例えば、ヒトおよびヒト以外の動物を含む。好ましいヒトとしては、細胞増殖性疾患または本明細書に記載されている関連する状態に罹患しているか罹患しやすいヒトの患者が挙げられる。本発明の「ヒト以外の動物」という用語は、例えば、哺乳類、齧歯類（例えばマウス）、および非哺乳類、ヒト以外の霊長類（例えば、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ）、両生類、爬虫類などの全ての脊椎動物を含む。
【００７４】
「細胞増殖性疾患に罹患しやすい」という用語は、細胞増殖の疾患（例えば癌）を発病する恐れのある対象、すなわち、癌ウイルスによるウイルス性感染に罹患している対象、電離放射線または発癌性化合物に曝された対象、癌の家族歴または病歴を有する対象などを含むことが意図されている。
【００７５】
本明細書で使用される「全身投与」「全身に投与される」「末梢投与」および「末梢に投与される」という語句は、患者の体内に入れることで代謝および他の同様のプロセスが行われるように、本発明の化合物（１種または複数）、薬物または他の材料を投与（例えば皮下投与）することを意味する。
【００７６】
本発明の本発明の化合物の「治療的有効量」という言葉は、患者に単回もしくは複数回用量を投与すると、細胞増殖および／または細胞増殖性疾患の症状を阻害する、あるいはそのような治療をしない場合に予想される生存性を超えてそのような細胞増殖性疾患に罹患している患者の生存性を引き延ばすのに有効な薬剤の量を指す。
【００７７】
キラル中心の命名に関して、「ｄ」および「ｌ」配置という用語は、ＩＵＰＡＣ勧告の定義による。用語の使用に関しては、ジアステレオマー、ラセミ体、エピマーおよび鏡像異性体は、製剤の立体化学を説明するためのそれらの通常の文脈で使用する。
【００７８】
ＩＩ．本発明の化合物
一態様では、本発明は、細胞増殖性疾患（特に癌）に罹患しているか罹患しやすい対象を治療することができる化合物を提供する。一実施形態では、癌は、膵臓癌、黒色腫または食道癌である。本発明の化合物は、ＦＡＫおよび／またはＩＧＦ−１Ｒ活性を直接または間接的に調節（例えば阻害）することができると考えられている。一実施形態では、本発明は、ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用を調節することができる化合物およびその薬学的に許容されるエステル、塩およびプロドラッグを提供する。
【００７９】
一実施形態では、本発明の化合物としては、本明細書に具体的に詳述されている以下の化合物が挙げられる：
１）２−（ヒドロキシメチル）−６−イミノ−２，３，３ａ，９ａ−テトラヒドロ−６Ｈ−フロ［２，３：４，５］［１，３］オキサゾロ［３，２−ａ］ピリミジン−３−イルリン酸二水素（「ＮＳＣ１２８６８７」ともいう）：
【化１】
2012520299.tif 000003
２）４−（メチルチオ）−７−（５−Ｏ−ホスホノ−Ｄ−リボフラノシル）−｛７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン｝（「ＮＳＣ３４４５５３」ともいう）：
【化２】
2012520299.tif 000004
３）１，１’−（１，７，９−トリヒドロキシ−８，９ｂ−ジメチル−３−オキソ−４ａ−（フェニルチオ）−３，４，４ａ，９ｂ−テトラヒドロジベンゾ−［ｂ，ｄ］フラン−２，６−ジイル）ジエタノン（「ＮＳＣ２５０４３５」ともいう）：
【化３】
2012520299.tif 000005
４）．３−メチル−２，４−ジスルホペンタン二酸（「ＮＳＣ２４３６２０」ともいう）：
【化４】
2012520299.tif 000006
５）１−アミノプロパン−１，３−ジイルジホスホン酸（「ＮＳＣ１３３８８１」ともいう）：
【化５】
2012520299.tif 000007
上述した化合物の各々の化学名および構造は、それらの化合物の全てのジアステレオマーを明示的に含む。
【００８０】
本発明は、本発明の化合物の薬学的に許容される塩、エステル、水和物、溶媒和物、包接体、多形およびプロドラッグも提供する。
【００８１】
本発明の化合物は、１つ以上の不斉中心を含んでいてもよく、従って、ラセミ体およびラセミ混合物、単一の鏡像異性体、個々のジアステレオマーおよびジアステレオマー混合物として生じ得る。これら化合物のそのような異性体は全て、本発明に明示的に含まれている。本発明の化合物は、複数の互変異性体で表すこともでき、そのような場合、本発明は、本明細書に記載されている化合物の全ての互変異性体を明示的に含む。そのような化合物のそのような異性体は全て、本発明に明示的に含まれている。本明細書に記載されている化合物の全ての結晶形は、本発明に明示的に含まれている。
【００８２】
天然に生じる異性体または合成の異性体は、当該技術分野で知られているいくつかの方法で分離することができる。２種類の鏡像異性体のラセミ混合物を分離する方法としては、キラル固定相を用いるクロマトグラフィーが挙げられる（例えば、"Chiral Liquid Chromatography," W.J. Lough, Ed. Chapman
and Hall, New York (1989)を参照）。鏡像異性体は古典的な分解法によっても分離することができる。例えば、ジアステレオマー塩の形成および分別結晶を使用して鏡像異性体を分離することができる。カルボン酸の鏡像異性体の分離のために、鏡像異性的に純粋なキラル塩基（例えば、ブルシン、キニーネ、エフェドリン、ストリキニーネなど）の添加によって、ジアステレオマー塩を形成することができる。あるいは、メントールなどの鏡像異性的に純粋なキラルアルコールによって、ジアステレオマーエステルを形成した後、ジアステレオマーエステルを分離および加水分解して、鏡像異性的に富化された遊離カルボン酸を得ることができる。アミノ化合物の光学異性体の分離のために、カンファースルホン酸、酒石酸、マンデル酸または乳酸などのキラルなカルボン酸またはスルホン酸の添加によって、ジアステレオマー塩を形成することができる。
【００８３】
本発明の化合物を得る方法としては、本化合物の購入、合成またはそれ以外の方法で入手することが挙げられる。本発明の化合物を合成することは、当該技術分野において、通常の技術を有する化学者の手段の範囲内である。反応条件を最適化し、必要であれば競合している副生成物を最小にする方法は当該技術分野で知られている。また、本方法は、最終的に本明細書中の化合物の合成を可能にするために、本明細書に具体的に記載されている工程の前または後のいずれかに好適な保護基を付加または除去するための工程をさらに含んでいてもよい。さらに、様々な合成工程を別の順序または順番で行なって所望の化合物を得てもよい。応用可能な化合物の合成に有用な合成化学変換および保護基手法（保護および脱保護）が当該技術分野で知られており、例えば、R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers
(1989)、 T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Protective
Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed., John Wiley and Sons (1999)、L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic
Synthesis, John Wiley and Sons (1994)、L. Paquette, ed.,
Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995)およびこれらの改訂版に記載されているものが挙げられる。
【００８４】
別の態様では、本発明は、ＦＡＫまたはその特異的ドメインに会合または結合し、それによりＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用を妨害する化合物を提供する。一実施形態では、本化合物はＦＡＫのチロシンリン酸化を阻害し、それによりＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用を阻止することができる。
【００８５】
別の態様では、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒまたはその特異的ドメインに会合または結合し、それによりＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用を妨害する化合物を提供する。一実施形態では、本化合物はＩＧＦ−１Ｒのチロシンリン酸化を阻害し、それによりＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用を阻止することができる。
【００８６】
本発明は、ＩＧＦ−１ＲおよびＡＫＴのリン酸化を減少させ、かつ癌細胞のアポトーシスを誘発することができる化合物も提供する。
【００８７】
本発明は、細胞増殖性疾患を治療するための化合物をスクリーニングするのに有用なポリペプチドも提供する。そのようなポリペプチドとしては、例えば、ＦＡＫ、ＦＡＫのドメイン、ＩＧＦ−１Ｒのドメインが挙げられる。一実施形態では、ＦＡＫドメインとしてＦＡＫ−ＮＴが挙げられる。別の実施形態では、ＦＡＫドメインとしてＦＡＫ−ＮＴ２が挙げられる。別の実施形態では、ＩＧＦ−１ＲのドメインはＩＧＦ−１Ｒのキナーゼドメインを含む。
【００８８】
そのようなポリペプチドは、融合タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質などの検出可能なレポーター部分と融合した、あるいは蛍光標識、放射線標識などの検出可能なタグで標識された結合ポケット部分であってもよい。そのような融合タンパク質は、ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用を調節することができる化合物のスクリーニングで使用することができる。
【００８９】
どんな理論にも縛られたくはないが、本発明の化合物によって癌細胞の生存率を抑制し、それにより、癌に罹患しているか罹患しやすい対象を治療することができる。
【００９０】
ＩＩＩ．本発明の化合物の使用
本発明は、癌に罹患しているか罹患しやすい対象を治療する方法を提供する。本方法は、それを必要としている対象に本発明の化合物の有効量を投与することを含む。特定の実施形態では、癌は、乳房、気道、脳、生殖器、消化管、尿路、眼、肝臓、皮膚、頭頸部、甲状腺、副甲状腺の癌、または固形腫瘍の遠隔転移である。具体的な例は、膵臓癌、黒色腫および食道癌である。
【００９１】
本発明の一態様は、細胞増殖性疾患に罹患しているか罹患しやすい対象を治療するための本発明の化合物およびその組成物の使用方法を提供する。細胞増殖性疾患の１つの具体的な例は癌である。一実施形態では、本発明の方法は、それを必要としている対象に、ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用を直接または間接的に調節することができる化合物の有効量を投与し、それにより、好ましくないまたは望ましくない細胞増殖または細胞増殖性疾患に罹患しているか罹患しやすい対象を治療することを含む。
【００９２】
本発明の化合物の有効量は、対象における疾患／障害（の発生率または重症度）を減少させるために十分な量である。本発明の化合物の有効量は、１回または一連の投与（または用量）で提供することができる。本発明の化合物の有効量は一般に、医師によって個別に決定され、かつ当業者の技術の範囲内である。
【００９３】
投与は、医薬分野で知られている任意の投与経路によるものであってもよい。対象は、（例えば癌と）既に診断されているものであっても、細胞増殖性疾患を発病する恐れがあるものであっても、細胞増殖性疾患の症状を呈しているものであってもよく、あるいは細胞増殖性疾患への罹病性を増加させることができる状況への予期されるまたは予期されない曝露の前に予防治療を必要としているものであってもよい。細胞増殖性疾患（例えば癌）に対して治療を必要としている対象の特定は、当業者の能力および知識の範囲内である。本発明の方法（１つまたは複数）によって治療することができる細胞増殖性疾患を発病する恐れがある対象を特定する方法のいくつかは医療分野で理解されており、例えば、対象における家族歴およびその疾患／障害状態の発症に関連づけられる危険因子の存在である。当該技術分野の熟練した臨床医であれば、例えば、臨床検査、身体検査および病歴／家族歴を用いてそのような候補対象を容易に特定することができる。
【００９４】
特定の実施形態では、対象は、哺乳類、例えば霊長類（例えばヒト）である。
【００９５】
特定の実施形態では、癌は、乳房、気道、脳、生殖器、消化管、尿路、眼、肝臓、皮膚、頭頸部、甲状腺、副甲状腺の癌、または固形腫瘍の遠隔転移である。一実施形態では、癌は、膵臓癌、黒色腫または食道癌である。
【００９６】
本発明は、対象における治療の有効性を評価または監視する方法であって、当該技術分野で良く知られている方法によって、細胞増殖性疾患（特に癌）の治療前の程度を測定すること（例えば、細胞増殖性疾患が癌である場合には、腫瘍の大きさを測定することまたは腫瘍マーカーをスクリーニングすること）、次いで、対象に本発明の化合物の有効量を投与することを含む方法も提供する。本化合物の投与から適当な期間（例えば、１日、１週間、２週間、１ヵ月、６ヶ月）後に、病気の程度を再び測定する。疾患／障害の程度または重症度の調節（例えば減少）は、治療の有効性を示す。疾患の程度または重症度は、治療中、定期的に測定してもよい。例えば、病気の程度または重症度を、数時間、数日または数週間ごとに検査し、治療のさらなる有効性を評価してもよい。疾患／障害の程度または重症度の減少は、治療が有効であることを示す。本記載の方法は、本発明の化合物による治療から恩恵を受け得る患者をスクリーニングまたは選択するために使用してもよい。
【００９７】
状態の調節によって対象が治療に対して好ましい臨床的反応を有し得ることが示される場合には、対象を本化合物で治療してもよい。例えば、本化合物の治療的に有効な単回もしくは複数回用量を対象に投与することができる。
【００９８】
本発明の方法は、それを必要としているものとして特定された対象に、１種または複数の追加の治療薬と共に本発明の化合物の有効量を投与することを含んでいてもよい。これらの治療薬の例としては、癌を治療することで知られている薬剤、例えば、抗癌剤、抗増殖剤および化学療法剤が挙げられる。
【００９９】
一実施形態では、追加の治療薬は化学療法剤である。別の実施形態では、追加の薬剤としては、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ゲムシタビン、フルオロピリミジン、ヌクレオシドシチジン類似体、ＮＶＰ−ＡＥＷ５４１、白金類似体、ＴＡＥ２２６、トポイソメラーゼ阻害剤、微小管阻害剤、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ビタミンＤ類似体、アラキドン酸経路阻害剤、ヒストン脱アセチル化阻害剤およびファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤が挙げられる。
【０１００】
追加の治療薬としては、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、カルセイン−ＡＭ、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、コラスパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、エトポシド、ＥＴ−７４３、エルロチニブ、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、ゲフィチニブ、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシ尿素、イホスファミド、イリノテカン、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、６−メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ＮＶＰ−ＡＥＷ５４１、パクリタキセル、プレドニソロン、プレドニゾン、プロカルバジン、ラロキシフェン、ローダミン−１２３、ストレプトゾシン、ＴＡＥ２２６、タモキシフェン、チオグアニン、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびザリプシスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０１】
使用され得る他の薬学的に活性な化合物は、Harrison's Principles of Internal Medicine, 17th Edition, Eds. T.R.
Harrison et al. McGraw-Hill N. Y., NYおよびthe Physicians
Desk Reference 62th Edition 2008, Oradell New Jersey, Medical Economics Co.に記載されており、その内容は全て参照により本明細書に明示的に組み込まれる。本発明の化合物および追加の治療薬（１種または複数）は、同じ医薬組成物としてあるいは異なる医薬組成物として（同時または異なる時間に）対象に投与してもよい。
【０１０２】
本発明の方法は、対象を１種または複数の抗細胞増殖療法で治療することをさらに含んでいてもよい。特に、この療法は癌療法である。従来の癌療法としては、外科手術、化学療法、放射線、免疫療法、モノクローナル抗体療法および上皮成長因子受容体療法が挙げられるが、これらに限定されない。癌療法の１つの例は放射線である。別の例は化学療法である。一実施形態では、本方法は、対象を化学療法と放射線とを併用して治療することを含む。
【０１０３】
本発明の方法は、例えば試験管内または生体外で培養液中の細胞に対して、あるいは、例えば生体内で動物対象の体内に存在する細胞に対して実施することができる。本発明の化合物は、増殖している細胞（例えば、形質転換細胞、腫瘍細胞株など）の一次培養液を用いて試験管内で初期試験を行うことができる。あるいは、本発明の化合物の効果は、動物モデルを用いて生体内で特徴づけることができる。
【０１０４】
本発明は、制御されない細胞増殖を調節（例えば抑制）する方法も提供する。本方法は、本発明の化合物を増殖の制御ができない細胞に接触させることを含む。その化合物は、ＦＡＫの活性、ＩＧＦ−１Ｒの活性またはＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用を直接または間接的に調節してもよい。本発明の化合物と細胞とのそのような接触によって、細胞増殖が抑制されるかアポトーシスが誘発される。本発明の化合物の細胞との接触または対象へのその投与は、細胞の治療方法または細胞増殖性疾患に罹患しているか罹患しやすい対象の治療方法の１つである。
【０１０５】
一実施形態では、接触させることは、試験管内で、例えば細胞を取り囲んでいる流体（例えば、細胞が生存または存在している培養基）に本化合物を添加することであってもよい。また、接触させることは、本化合物を細胞に直接接触させることであってもよい。あるいは、接触させることは、生体内で、例えば対象の体内に本化合物を通過させることであってもよく、例えば、投与後に、投与経路に応じて本化合物を消化管または血流内を移動させてもよく、あるいは治療を必要としている細胞に直接塗布または投与してもよい。
【０１０６】
本発明は、癌に罹患しているか罹患しやすい対象を治療することができる化合物を特定する方法も提供する。特に、本化合物は、ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用を調節することができる。
【０１０７】
別の態様では、本発明は、ＦＡＫおよび／またはＩＧＦ−１Ｒを本発明の化合物に接触させることによって、ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用を調節する方法を提供する。特定の実施形態では、本化合物はＦＡＫおよび／またはＩＧＦ−１Ｒのチロシンリン酸化を阻害し、それによりＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用を阻止することができる。別の実施形態では、本方法は、優性阻害の構築物（ＦＡＫ−ＣＤ）または低分子干渉ＲＮＡを使用することをさらに含む。
【０１０８】
特定の実施形態では、本発明の化合物は、ＦＡＫまたはその特異的ドメインに会合または結合し、それにより、ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用を妨害することができる。一実施形態では、本化合物はＦＡＫのチロシンリン酸化を抑制することができる。一実施形態では、本化合物はＦＡＫアミノ末端断片（ＮＴ２）に結合または会合することができる。
【０１０９】
別の実施形態では、本発明の化合物は、ＩＧＦ−１Ｒまたはその特異的ドメインに会合または結合し、それによりＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用を妨害することができる。一実施形態では、本化合物はＩＧＦ−１Ｒのチロシンリン酸化を抑制することができる。一実施形態では、本化合物はＩＧＦ−１Ｒのキナーゼドメインに結合または会合することができる。
【０１１０】
本発明の方法は、優性阻害の構築物（ＦＡＫ−ＣＤ）または低分子干渉ＲＮＡを使用することをさらに含んでいてもよい。
【０１１１】
本発明は、ＩＧＦ−１ＲおよびＡＫＴのリン酸化を減少させ、かつ癌細胞のアポトーシスを誘発することができる化合物を特定する方法も提供する。
【０１１２】
本方法は、試験化合物の有無に関わらず、ＦＡＫ、ＩＧＦ−１Ｒまたはそれらの特異的ドメイン（アポ形態であっても複合体であってもよい）の結晶構造を得ること、またはＦＡＫ、ＩＧＦ−１Ｒまたはそれらの特異的ドメイン（アポ形態であっても複合体であってもよい）の結晶構造に関する情報を得ることを含んでいてもよい。これらの具体的なドメインの例としては、ＦＡＫ−ＮＴ２およびＩＧＦ−１Ｒのキナーゼドメインが挙げられる。次いで、化合物を、ＦＡＫ、ＩＧＦ−１Ｒまたはそれらの特異的ドメインの結晶構造の結合部位内にコンピュータでモデル化し、試験化合物とＦＡＫ、ＩＧＦ−１Ｒまたはそれらの特異的ドメインとの相互作用の安定化を予測してもよい。可能な調節化合物（modulating compound）が特定されたら、本明細書に特定されているアッセイおよび当該技術分野で知られている競合アッセイなどの細胞アッセイを用いて本化合物をスクリーニングしてもよい。このようにして特定された化合物は治療薬として有用である。
【０１１３】
一実施形態では、本方法は、試験化合物の評価方法であって、１）ＦＡＫ、ＩＧＦ−１Ｒまたはそれらの特異的ドメインを試験化合物（複合体）に接触させること、および２）接触後に結合相互作用を評価することを含み、基準値に対する複合体の安定性の変化は、試験化合物が複合体の安定性を調節していることを示すことを特徴とする方法をさらに含む。
【０１１４】
一実施形態では、ＦＡＫ、ＩＧＦ−１Ｒまたはそれらの特異的ドメインの複合体は、コンピュータでモデル化したものであってもよく、あるいは、細胞内の複合体、細胞から単離した複合体、組み換えにより発現された複合体、細胞もしくは組み換え型発現系から精製もしくは単離した複合体、あるいは細胞もしくは組み換え型発現系から部分的に精製もしくは単離した複合体であってもよい。
【０１１５】
さらに他の態様では、本発明は、本明細書に記載されている疾患、障害または病気の対象における治療または予防のために、単一の組成物として、あるいは別の剤形としての薬の製造における、単独の、あるいは１種または複数の追加の治療薬と併用した本発明の化合物の使用を提供する。本発明の別の態様は、対象における本明細書に詳述されているその疾患、障害または病気の治療または予防に使用される本発明の化合物である。
【０１１６】
本明細書に詳述されている方法は、対象を特定の定められた治療を必要としているものとして特定する方法を含む。対象をそのような治療を必要としているものとして特定することは、対象または医療の専門家の判断であってもよく、主観的（例えば、所見）または客観的（例えば、試験または診断法によって測定可能）であってもよい。
【０１１７】
ＩＶ．投与量
本発明の化合物の好適な投与量は、公知の技術を用いて、および類似した環境下で得られた結果を観察することによって、当業者としての医師または獣医師（「主治医」）が容易に決定することができる。
【０１１８】
投与量は、主治医の判断において、患者の必要、すなわち治療されている病気の重症度、治療されている病気のステージおよび用いられている特定の化合物に応じて変動してもよい。治療的に有効な抗増殖量もしくは用量および予防的に有効な抗増殖量もしくは用量を決定する際には、罹患している特定の細胞増殖性疾患、特定の薬剤の薬力学的特性、投与様式および投与経路、所望の治療時間の経過、哺乳類の種、その大きさ、年齢および一般的な健康状態、罹患している特異的疾患、疾患の罹患もしくは重症の程度、個々の患者の反応、投与される特定の化合物、投与様式、投与される製剤の生物学的利用能特性、選択される用法、併用治療の種類（すなわち、本発明の化合物と他の併用投与される治療薬との相互作用）、および他の関連する状況などのこれらに限定されない複数の要因が主治医によって検討される。
【０１１９】
Remington:
The Science and Practice of Pharmacy, 17th edition, Mack Publishing Companyなどの標準的なテキストおよび米医薬品便覧（それぞれの開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）は、投与に適した組成物および用量を調製するために参考にすることができる。適当な投薬量の決定は、本明細書に記載されている使用のためのパラメータを考慮すれば当業者の技術の範囲内である。
【０１２０】
治療は、より少ない投与量で開始することができる。次いで、その状況下で最適な効果が得られるまで、少ない増加量で投与量を増加してもよい。便宜のために、必要に応じて総投与量を投与期間に複数回に分けて投与してもよい。
【０１２１】
本発明の化合物の投与量は、約０．０１ｍｇ〜約５，０００ｍｇ／日の範囲で変動させることができる。場合によっては、投与量は、約１００ｍｇ〜約４０００ｍｇ／日または約１０００ｍｇ〜約３０００ｍｇ／日の範囲で変動する。用量範囲を確認することは、当業者の技術の範囲に十分に含まれている。特定の実施形態では、本発明の化合物の投与量は、体重の約０．００１〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。特定の範囲は、約０．０１〜約３０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、約１〜１０ｍｇ／ｋｇ、約２〜９ｍｇ／ｋｇ、約３〜８ｍｇ／ｋｇ、約４〜７ｍｇ／ｋｇまたは約５〜６ｍｇ／ｋｇ体重である。そのような投与量は、例えば、複数回の投与が与えられるか否か、組織の種類および投与経路、個体の病気、所望の目的および当業者に知られている他の要因に応じて変動してもよい。投与は、疾患症状の減少などの測定可能な所望のパラメータが検出されるまで、例えば、規則的に毎日または１週間に１回を基本として頻繁に行うことができる。さらに、２週間または１月に１回を基本とするように投与を減少させることができる。
【０１２２】
動物（例えば、イヌ、ニワトリおよび齧歯類）における細胞増殖性疾患の予防または治療に効果的であると判断された化合物は、ヒトにおける腫瘍の治療にも有用となり得る。ヒトにおける腫瘍を治療する当業者であれば、動物研究で得られたデータに基づいてヒトへの本化合物の投与量および投与経路を知っているであろう。
【０１２３】
Ｖ．医薬組成物および剤形
本発明は、本発明の化合物の有効量を含む医薬組成物も提供する。また、本医薬組成物は、薬学的に許容される担体または希釈液を含んでいてもよい。本組成物は、細胞増殖性疾患（特に癌）に罹患しているか罹患しやすい対象を治療するために製剤化され、かつ疾患／障害に罹患しているか罹患しやすい対象を治療するための説明書と共に包装されていてもよい。有効量は、上に記載した疾患／障害を治療するのに効果的である。
【０１２４】
一実施形態では、本発明の本化合物は、薬学的に許容される製剤、例えば、薬学的に許容される製剤が対象に投与されてから少なくとも１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、１週間、２週間、３週間または４週間にわたる本発明の化合物の持続放出を対象に提供する薬学的に許容される製剤を用いて対象に投与される。
【０１２５】
特定の実施形態では、これらの医薬組成物は、対象への局所もしくは経口投与に適している。他の実施形態では、以下に詳細に説明するように、本発明の医薬組成物は、以下のものに適した形態を含む固体または液体の形態で投与のために特別に製剤化されていてもよい：（１）経口投与（例えば、飲薬（水性もしくは非水性溶液または懸濁液）、錠剤、巨丸剤、粉末、顆粒、ペースト）、（２）非経口投与（例えば、無菌溶液または懸濁液としての、例えば皮下、筋肉内または静脈内注射）、（３）局所投与（例えば、皮膚に塗布されるクリーム、軟膏またはスプレー）、（４）膣内または直腸内投与（例えば、膣座薬、クリームまたは発泡剤）、あるいは（５）エアロゾル（例えば、本化合物を含む水性エアロゾル、リポソーム製剤または固体粒子）。
【０１２６】
「薬学的に許容される」という語句は、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応または他の問題もしくは合併症を生じることなく、適切な医学的判断の範囲において、ヒトおよび動物の組織に接触させて使用するのに適した、妥当な利益／リスク比に見合った、本発明の本発明のそれらの化合物、そのような化合物を含む組成物および／または剤形を指す。
【０１２７】
「薬学的に許容される担体」という語句は、ある臓器もしくは体の一部から別の臓器もしくは体の一部への主題の化学物質の運搬または輸送に関与する薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクル（例えば、液体または固体充填剤）、希釈液、賦形剤、溶媒または封入材料を含む。各担体は、製剤の他の成分と適合し、かつ患者に有害でないという意味において、「許容」される。薬学的に許容される担体として機能し得る材料のいくつかの例としては、（１）糖（例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロース）、（２）澱粉（例えば、コーンスターチおよびジャガイモ澱粉）、（３）セルロースおよびその誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース）、（４）トラガント末、（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）タルク、（８）賦形剤（例えば、カカオ脂および座薬ワックス）、（９）油（例えば、落花生油、綿実油、サフラワー油、胡麻油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油）、（１０）グリコール（例えば、プロピレングリコール）、（１１）ポリオール（例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール）、（１２）エステル（例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル）、（１３）寒天、（１４）緩衝剤（例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム）、（１５）アルギン酸、（１６）発熱性物質除去蒸留水、（１７）等張食塩水、（１８）リンゲル液、（１９）エチルアルコール、（２０）リン酸緩衝液、および（２１）医薬組成物に用いられる他の毒性のない適合物質が挙げられる。
【０１２８】
湿潤剤、乳化剤および滑沢剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム）ならびに着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味料、香味料および芳香剤、防腐剤および抗酸化剤も本組成物中に含めることができる。
【０１２９】
薬学的に許容される抗酸化剤の例としては、（１）水溶性抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど）、（２）油溶性抗酸化剤（例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなど）、および（３）金属キレート化剤（例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸など）が挙げられる。
【０１３０】
本発明の化合物を含む組成物としては、経口、経鼻、局所（口内および舌下を含む）、直腸内、膣内、エアゾールおよび／または非経口投与に適したものが挙げられる。本組成物は、好都合に単位剤形で提供してもよく、かつ薬学の分野で良く知られている任意の方法によって調製してもよい。単一剤形を生成するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、治療されているホスト、特定の投与様式によって異なるであろう。単一剤形を生成するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、一般に治療効果を生じさせる本化合物のその量である。一般に、有効成分の量は、１００％中、約１％〜約９９％、好ましくは、約５％〜約７０％、より好ましくは、約１０％〜約３０％の範囲である。
【０１３１】
これらの組成物を調製する方法は、本発明の化合物を、担体および場合により１種または複数の副成分と混合する工程を含む。一般に、本製剤は、本発明の化合物を液体担体または微粉固体担体あるいは両方と均一かつ密接に混合し、次いで、必要であればその生成物を成形することによって調製する。
【０１３２】
経口投与に適した本発明の組成物は、有効成分として所定の量の本発明の化合物をそれぞれ含む、カプセル、カシェ剤、丸剤、錠剤、トローチ剤（風味をつけた主成分、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカンタを用いる）、粉末、顆粒の形態、水性もしくは非水性液体の溶液または懸濁液、水中油型または油中水型液体エマルジョン、エリキシルまたはシロップ、あるいは香錠（ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアなどの不活性主成分を用いる）、および／または洗口剤などであってもよい。また、化合物は、巨丸剤、舐剤またはペーストとして投与してもよい。
【０１３３】
経口投与（カプセル、錠剤、丸剤、糖衣丸、粉末、顆粒など）のための本発明の固体投与形態では、有効成分は、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムなどの１種または複数の薬学的に許容される担体および／または（１）充填剤または増量剤（例えば、澱粉、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよび／またはケイ酸）、（２）結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアカシア）、（３）保湿剤（例えば、グリセリン）、（４）崩壊剤（例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモもしくはタピオカ澱粉、アルギン酸、特定のケイ酸塩および炭酸ナトリウム）、（５）溶液緩染剤（例えば、パラフィン）、（６）吸収促進剤（例えば、第四級アンモニウム化合物）、（７）湿潤剤（例えば、アセチルアルコールおよびグリセリンモノステアレート）、（８）吸収剤（例えば、カオリンおよびベントナイト粘土）、（９）滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体のポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムおよびそれらの混合物）、および（１０）着色剤のうちのいずれかと混合する。カプセル、錠剤および丸剤の場合、本医薬組成物は緩衝剤を含んでいてもよい。また、ラクトースすなわち乳糖や高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を用いた軟充填および硬充填ゼラチンカプセル内の充填剤として類似した種類の固体組成物を使用してもよい。
【０１３４】
錠剤は、場合により１種または複数の副成分と共に、圧縮または成形によって調製してもよい。圧縮錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑沢剤、不活性希釈剤、防腐剤、崩壊剤（例えば、グリコール酸澱粉ナトリウムまたはクロスリンクカルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤または分散剤を用いて調製してもよい。湿製錠剤は、不活性液体希釈液で湿らせた粉末状の有効成分の混合物を好適な機械で成形することによって調製してもよい。
【０１３５】
錠剤および、糖衣丸、カプセル、丸剤および顆粒などの本発明の医薬組成物の他の固体投与形態は、場合により、刻み目を入れたり、あるいは医薬製剤化技術で良く知られている腸溶コーティングおよび他のコーティングなどのコーティングおよびシェルを用いて調製したりしてもよい。また、それらは、所望の放出プロファイル、他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／またはマイクロスフェアを提供するために、例えば、異なる割合でヒドロキシプロピルメチルセルロースを用いてその中の有効成分の徐放または制御放出を提供するように製剤化してもよい。例えば、細菌保持フィルタ(bacteria-retaining filter)による濾過によって、あるいは使用直前に無菌水またはいくつかの他の無菌注射媒体に溶解することができる無菌固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことによって、それらを滅菌してもよい。また、これらの組成物は場合により乳白剤を含んでいてもよく、消化管の特定の部分において、場合により遅延的に、有効成分（１種または複数）のみを（すなわち優先的に）放出する組成物であってもよい。使用することができる包埋組成物の例としては、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。有効成分は、適当であれば１種または複数の上記賦形剤と共にマイクロ封入された形態であってもよい。
【０１３６】
本発明の化合物の経口投与用の液体剤形としては、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシルが挙げられる。有効成分に加えて、液体剤形は、当該技術分野において一般に使用される、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤などの不活性希釈剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油および胡麻油）、グリセリン、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステルおよびそれらの混合物を含んでいてもよい。
【０１３７】
不活性希釈剤に加えて、本経口組成物は、湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、甘味料、香味料、着色剤、芳香剤および防腐剤などの補助剤を含むことができる。
【０１３８】
懸濁液は、本発明の活性化合物に加えて、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガカンタおよびそれらの混合物などの懸濁化剤を含んでいてもよい。
【０１３９】
直腸内または膣内投与用の本発明の医薬組成物は、本発明の１種または複数の化合物を、例えば、カカオ脂、ポリエチレングリコール、座薬ワックスまたはサリチル酸塩を含む１種または複数の好適な非刺激性賦形剤または担体と混合することによって調製し得る坐薬であり、室温では固体だが体温で液体となるため直腸内または膣腔内で溶解して活性剤を放出する坐薬として提供してもよい。
【０１４０】
また、膣内投与に適している本発明の組成物としては、適当なものとして当該技術分野で知られているような担体を含む膣座薬、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、発泡剤またはスプレー製剤も挙げられる。
【０１４１】
本発明の化合物の局所または経皮投与の剤形としては、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶剤、パッチ、吸入剤が挙げられる。本発明の活性化合物は、無菌条件下で、薬学的に許容される担体および必要とされ得る任意の防腐剤、緩衝液または噴射剤と混合してもよい。
【０１４２】
軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは、本発明の化合物に加えて、動物性および植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカンタ、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛またはそれらの混合物などの賦形剤を含んでいてもよい。
【０１４３】
粉末およびスプレーは、本発明の化合物に加えて、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末またはこれらの物質の混合物などの賦形剤を含むことができる。スプレーは、クロロフルオロ炭化水素および揮発性の未置換炭化水素（例えば、ブタンおよびプロパン）などの慣用の噴射剤をさらに含むことができる。
【０１４４】
あるいは、本発明の化合物はエアロゾルによって投与することができる。これは、本化合物を含む水性エアロゾル、リポソーム製剤または固体粒子を調製することによって達成される。非水性（例えば、フルオロカーボン噴射剤）の懸濁液を使用することができる。音波噴霧器は、薬剤を本化合物の分解を生じさせ得る剪断への曝露を最小にするため好ましい。
【０１４５】
通常、水性エアロゾルは、従来の薬学的に許容される担体および安定剤と共に薬剤の水溶液または懸濁液を製剤化することによって調製される。担体および安定剤は、特定の化合物の必要によって異なるが、典型的には、非イオン性界面活性剤（トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール）、血清アルブミンのような無害なタンパク質、ソルビタンエステル、オレイン酸、レシチン、グリシンなどのアミノ酸、緩衝液、塩、糖または糖アルコールが挙げられる。エアロゾルは一般に等張溶液から調製される。
【０１４６】
経皮パッチは、体に本発明の化合物を制御送達するというさらなる利点を有する。そのような剤形は、適切な媒体に薬剤を溶解または分散させることによって調製することができる。皮膚全体における有効成分の流量を増加させるために吸収促進剤も使用することができる。そのような流量率は、膜の制御率を提供するか、あるいはポリマーマトリックスまたはゲル内に有効成分を分散させることによって制御することができる。
【０１４７】
眼科用製剤（眼軟膏、粉末、溶液など）も本発明の範囲内のものとして想定されている。
【０１４８】
非経口投与に適した本発明の医薬組成物は、１種または複数の薬学的に許容される無菌の水性もしくは非水性等張溶液、分散液、懸濁液またはエマルジョンと共に、あるいは、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬、製剤を対象のレシピエントの血液と等張させる溶質、懸濁剤または増粘剤を含み得る無菌の注射溶液または分散液に使用直前に再構成され得る無菌粉末と共に本発明の１種または複数の化合物を含む。
【０１４９】
本発明の医薬組成物中に用いられ得る好適な水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）および好適なそれらの混合物、植物油（例えば、オリーブ油）、および注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）が挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料を用いて、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、そして界面活性剤の使用によって維持することができる。
【０１５０】
また、これらの組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などの補助剤を含んでいてもよい。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌薬および抗真菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、ソルビン酸フェノール(phenol sorbic acid)などを含めることによって確実してもよい。また、本組成物に糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を含めることが望ましい場合もある。さらに、注射可能な医薬形態の長期にわたる吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤を含めることによって生じさせてもよい。
【０１５１】
薬物の効果を引き延ばすために、皮下もしくは筋肉内注射によって薬物の吸収を遅らせることが望ましい場合もある。これは、水溶性が乏しい結晶もしくは非晶質材料からなる液体懸濁液を使用することによって達成してもよい。従って、薬物の吸収速度は、薬物の溶解速度に依存し、さらに、その溶解速度は結晶の大きさおよび結晶形態に依存し得る。あるいは、非経口的に投与される剤形(drug form)の吸収の遅延は、油性ビヒクルに薬物を溶解または懸濁することによって達成される。
【０１５２】
注射可能なデポー形態は、ポリ乳酸−ポリグリコライドなどの生分解性ポリマー内に本発明の化合物のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって調製される。薬物とポリマーとの比および用いられる特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルソエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。注射可能なデポー製剤は、体組織と適合するリポソームまたはマイクロエマルジョンに薬物を封入することによっても調製される。
【０１５３】
本発明の化合物がヒトおよび動物に医薬として投与される場合、医薬は、そのままで、あるいは薬学的に許容される担体と共に例えば、０．１〜９９．５％（より好ましくは０．５〜９０％）の有効成分を含む医薬組成物として投与することができる。
【０１５４】
選択される投与経路に関係なく、好適な水和形態で使用され得る本発明の化合物および／または本発明の医薬組成物は、当業者に知られている従来の方法によって薬学的に許容される剤形に製剤化される。
【０１５５】
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルおよび投与の時間経過は、患者に対して毒性を示すことなく、特定の患者、組成物および投与様式に対して所望の治療反応を達成するのに効果的な量の有効成分を得るように変更してもよい。例示的な用量範囲は、０．１〜１０ｍｇ／日である。
【０１５６】
本発明の化合物の好適な用量は、患者が耐えることができ、かつ深刻な副作用を生じない最大の量である。例えば、本発明の化合物は、体重あたり約０．００１ｍｇ〜約１００ｍｇ、約０．００１〜約１０ｍｇ／ｋｇまたは約０．００１ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの濃度で投与される。用量範囲の他の例は上に述べられている。
【０１５７】
本発明の医薬組成物は、上述した追加の治療薬をさらに含んでいてもよい。一実施形態では、追加の治療薬は化学療法剤である。別の実施形態では、追加の治療薬は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ゲムシタビン、フルオロピリミジン、ヌクレオシドシチジン類似体、ＮＶＰ−ＡＥＷ５４１、白金類似体、ＴＡＥ２２６、トポイソメラーゼ阻害剤、微小管阻害剤、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ビタミンＤ類似体、アラキドン酸経路阻害剤、ヒストン脱アセチル化阻害剤およびファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤からなる群から選択される。
【０１５８】
追加の治療薬の特定の例としては、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、カルセイン−ＡＭ、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、コラスパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、エトポシド、ＥＴ−７４３、エルロチニブ、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、ゲフィチニブ、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシ尿素、イホスファミド、イリノテカン、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、６−メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ＮＶＰ−ＡＥＷ５４１、パクリタキセル、プレドニソロン、プレドニゾン、プロカルバジン、ラロキシフェン、ローダミン−１２３、ストレプトゾシン、ＴＡＥ２２６、タモキシフェン、チオグアニン、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびザリプシスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５９】
本発明の化合物がヒトおよび動物に医薬として投与される場合、医薬は、そのままで、あるいは薬学的に許容される担体と共に例えば、０．１〜９９．５％（または０．５〜９０％）の有効成分を含む医薬組成物として投与することができる。
【０１６０】
選択された投与経路に関係なく、好適な水和形態で使用され得る本発明の化合物および／または本発明の医薬組成物は、当業者に知られている従来の方法によって薬学的に許容される剤形に製剤化される。
【０１６１】
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルおよび投与の時間経過は、患者に対して毒性を示すことなく、特定の対象、組成物および投与様式に対して所望の治療反応を達成するのに効果的な量の有効成分を得るように変更してもよい。
【０１６２】
ＶＩ．キット
本発明は、本明細書に詳述されている障害／疾患を治療するためのキットも提供する。本発明の典型的なキットは、本明細書に記載されている化合物、医薬製剤または組み合わせおよび使用説明書を含む。使用説明書は、投与量、送達方法、キットの保管などに関する情報を含んでいてもよい。特定の実施形態では、本キットは、本化合物、製剤または本発明の組み合わせを投与するための説明書を含む。
【０１６３】
本キットは、治療を必要としている対象を特定するための説明書および／または情報を含んでいてもよい。特定の実施形態では、本キットは、細胞増殖性疾患に罹患しているか罹患しやすい対象を治療するための説明書を含んでいてもよい。一実施形態では、疾患は癌である。特定の例では、癌は、乳房、気道、脳、生殖器、消化管、尿路、眼、肝臓、皮膚、頭頸部、甲状腺、副甲状腺の癌、または固体腫瘍の遠隔転移である。具体的な例は、膵臓癌、黒色腫および食道癌である。
【０１６４】
一実施形態では、本キットは、対象における細胞増殖性疾患を治療または予防するための使用説明書をさらに含む。使用説明書は、投与量、送達方法、キットの保管などに関する情報を含んでいてもよい。
【０１６５】
本キットに含まれる本化合物の有効量は、上述されている量である。典型的には、本発明の化合物の有効量は、治療されている対象において深刻な副作用を生じさせるのに必要な投与量よりも少ない投与量である。特定の例では、本キットは、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの用量の本発明の化合物を含む。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、本キットは追加の治療薬をさらに含む。一実施形態では、追加の治療薬は化学療法剤である。別の実施形態では、追加の治療薬は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ゲムシタビン、フルオロピリミジン、ヌクレオシドシチジン類似体、ＮＶＰ−ＡＥＷ５４１、白金類似体、トポイソメラーゼ阻害剤、ＴＡＥ２２６、微小管阻害剤、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ビタミンＤ類似体、アラキドン酸経路阻害剤、ヒストン脱アセチル化阻害剤およびファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤からなる群から選択される。特定の実施形態では、追加の治療薬はＴＡＥ２２６、ＮＶＰ−ＡＥＷ５４１、ワートマニンまたはＬＹ２９４００２である。
【０１６７】
追加の治療薬の例としては、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、カルセイン−ＡＭ、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、コラスパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、エトポシド、ＥＴ−７４３、エルロチニブ、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、ゲフィチニブ、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシ尿素、イホスファミド、イリノテカン、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、６−メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ＮＶＰ−ＡＥＷ５４１、パクリタキセル、プレドニソロン、プレドニゾン、プロカルバジン、ラロキシフェン、ローダミン−１２３、ストレプトゾシン、ＴＡＥ２２６、タモキシフェン、チオグアニン、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびザリプシスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６８】
また、本キットは、試薬、例えば、試験化合物、緩衝液、培地（例えば、細胞増殖培地）、細胞などを含んでいてもよい。試験化合物は、公知の化合物または新しく発見された化合物、例えば、化合物のコンビナトリアルライブラリーを含んでいてもよい。
【０１６９】
本発明のキットは、本発明の化合物を投与するために使用される装置をさらに含むことができる。そのような装置の例としては、静脈内カニューレ挿入装置、注射器、点滴用バッグ、パッチ、局所ゲル、ポンプ、光分解から保護するための容器、自動注入装置および吸入器が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７０】
また、本発明のキットは、１種または複数の有効成分を投与するために使用することができる薬学的に許容されるビヒクルを含むことができる。例えば、有効成分が非経口投与のために再構成しなければならない固体形態で提供される場合、本キットは、有効成分を溶解して非経口投与に適した、粒子を含有しない無菌溶液を生成することができる好適なビヒクルの密封容器を含むことができる。薬学的に許容されるビヒクルの例としては、米国薬局方（ＵＳＰ）注射用蒸留水、塩化ナトリウム注射、リンゲル液、デキストロース注射、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射、および乳酸加リンゲル液（これらに限定されない）などの水性ビヒクル、エチルアルコール、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコール（これらに限定されない）などの水混和性ビヒクル、およびトウモロコシ油、綿実油、落花生油、胡麻油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピルおよび安息香酸ベンジル（これらに限定されない）などの非水性ビヒクルが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７１】
本発明の１つまたは複数のキットは一緒に包装されていてもよく、例えば、細胞増殖性疾患（例えば癌）の治療の有効性を評価するためのキットが、本発明に従って細胞増殖性疾患に対して治療されている対象の経過を監視するためのキットと一緒に包装されていてもよい。
【０１７２】
ＶＩＩ．スクリーニング方法およびシステム
別の態様では、本発明は、本明細書に特定されている結合ポケットあるいは同じような形状の相同的な結合ポケットの一方または両方の構造座標を含む機械読み取り可能な記憶媒体を提供する。これらのデータと共に符号化されたそのような記憶媒体は、コンピュータスクリーンまたは類似の視覚装置にそのような結合ポケットを含む分子または分子複合体の３次元グラフィック表示を表示することができる。
【０１７３】
本発明は、上述した結合ポケットに結合する化合物を設計、評価および特定する方法も提供する。従って、本コンピュータは、結合ポケットを含む分子または分子複合体の３次元グラフィック構造を生成する。
【０１７４】
別の実施形態では、本発明は、ＦＡＫ、ＩＧＦ−１Ｒまたはそれらの特異的ドメインの構造座標によって定義された分子または分子複合体の３次元表示あるいは前記分子または分子複合体の相同体の３次元表示を生成するためのコンピュータであって、前記相同体は、前記アミノ酸の骨格原子からの根平均二乗偏差が２．０（好ましくは、１．５）オングストローム以下の結合ポケットを含むことを特徴とするコンピュータを提供する。一実施形態では、使用される構造は、ＦＡＫアミノ末端断片（ＮＴ）またはＩＧＦ−１Ｒのキナーゼドメインに配位する。別の実施形態では、使用される構造は、ＦＡＫ−ＮＴ２に配位する。
【０１７５】
例示的な実施形態では、本コンピュータまたはコンピュータシステムは、例えば、米国特許第５，９７８，７４０号および／または第６，１８３，１２１号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている当該技術分野で通常である構成要素を含むことができる。例えば、コンピュータシステムは、従来のシステムバスによって全て相互に接続された中央処理装置（「ＣＰＵ」）、ワーキングメモリ（例えば、ＲＡＭ（ランダムアクセスメモリ）または「コア」メモリであってもよい）、大容量記憶装置（例えば、１つまたは複数のディスクドライブまたはＣＤ−ＲＯＭドライブなど）、１つまたは複数のブラウン管（ＣＲＴ）または液晶表示装置（ＬＣＤ）表示端末装置、１つまたは複数のキーボード、１つまたは複数の入力回線および１つまたは複数の出力回線を備えたコンピュータを含むことができる。
【０１７６】
本発明の機械読み取り可能なデータは、データ回線によって接続された１つまたは複数のモデムを使用してコンピュータに入力してもよい。代わりとして、あるいは、追加として、入力ハードウェアは、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、ディスクドライブまたはフラッシュメモリを含んでいてもよい。キーボードを表示端末装置と組み合わせて、入力装置として使用してもよい。
【０１７７】
出力回線によってコンピュータに接続された出力ハードウェアは、同様に従来の装置によって実装されていてもよい。一例として、出力ハードウェアは、プログラム（例えば、ＱＵＡＮＴＡまたはＰＹＭＯＬ）を用いて本発明の結合ポケットのグラフィック表示を表示するためのＣＲＴまたはＬＣＤ表示端末装置を含んでいてもよい。また、出力ハードウェアは、プリンタまたは後の使用のためにシステム出力を記憶するディスクドライブを含んでいてもよい。
【０１７８】
動作中、ＣＰＵは様々な入出力装置の使用を調節し、大容量記憶装置からのデータアクセスおよびワーキングメモリへ／からのアクセスを調節し、かつデータ処理工程の順序を決定する。市販のソフトウェアを含む複数のプログラムを使用して本発明の機械読み取り可能なデータを処理してもよい。
【０１７９】
本発明に係る機械読み取り可能なデータを記憶するための磁気記憶媒体は、従来のものであってもよい。磁気データ記憶媒体は、上記コンピュータシステムなどのシステムによって実行することができる機械読み取り可能なデータと共に符号化することができる。この媒体は、従来型でもよい好適な基板と、片面または両面に、極性または向きを磁気的に変更することが可能な磁区を含む従来型でもよい好適なコーティングとを有する従来型のフロッピー（登録商標）ディスクまたはハードディスクであってもよい。また、この媒体は、ディスクドライブまたは他のデータ記憶装置のスピンドルを受け入れる開口（図示せず）を有していてもよい。
【０１８０】
本明細書に記載されているコンピュータシステムなどのシステムによる実行のために、媒体の磁区は、従来の方法であってもよい方法で本明細書に記載されている機械読み取り可能なデータを符号化するように分極化または配向されている。
【０１８１】
光学的に読み取り可能なデータ記憶媒体も、機械読み取り可能なデータまたはコンピュータシステムによって実行することができる一組の命令と共に符号化することができる。この媒体は、従来のコンパクトディスク読出し専用メモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）または光学的に読み取り可能かつ磁気光学的に書込み可能である光磁気ディスクなどの書き換え可能な媒体であってもよい。
【０１８２】
ＣＤ−ＲＯＭの場合、周知のように、ディスクコーティングは反射性であり、かつ機械読み取り可能なデータを符号化するための複数のピットが型押しされている。ピットの配置は、コーティングの表面からの反射レーザー光によって読み込まれる。好ましくは実質的に透明である保護コーティングが反射性コーティング上に設けられている。
【０１８３】
光磁気ディスクの場合、周知のように、データ記録コーティングはピットを有していないが、例えばレーザーによって特定の温度を超えて加熱された場合に極性または向きを磁気的に変えることができる複数の磁区を有する。磁区の向きは、コーティングから反射されたレーザー光の極性を測定することによって読み込むことができる。磁区の配置によって、上記のようにデータが符号化される。
【０１８４】
構造データは、それらの座標を結合ポケットを含む分子または分子複合体の３次元構造に変換するようにソフトウェアによってプログラムされたコンピュータと共に使用する場合、様々な目的、例えば薬物の発見のために使用してもよい。
【０１８５】
一実施形態では、ＤＯＴは、分子または分子複合体の予測のために使用されるソフトウェアである。ＤＯＴは、第２の分子の周りを移動および回転させる１つの分子の系統的な剛体の調査を行う。この調査によって生成された全ての立体配置の分子間エネルギーは、静電気およびファンデルワールスエネルギーの合計として計算する。これらのエネルギーの項は相関関数として求め、速いフーリエ変換によって効率的に計算する。典型的な実行では、２種類の分子の約１０８，０００，０００，０００通りの立体配置のエネルギーを数時間で計算することができる。
【０１８６】
例えば、データと共に符号化された構造は、化学物質に結合するその能力についてコンピュータで評価してもよい。ＦＡＫ、ＩＧＦ−１Ｒまたはそれらの特異的ドメインの結合ポケットに結合する化学物質は可能な薬物候補である。特定のＦＡＫドメインとしてはＦＡＫ−ＮＴが挙げられる。一実施形態では、データによって符合化された構造は、ＦＡＫ−ＮＴ２またはＩＧＦ−１Ｒのキナーゼドメインに配位する。別の実施形態では、データによって符合化された構造は、ＦＡＫアミノ酸１２６〜２４３またはＩＧＦ−１Ｒアミノ酸９５９〜１２６６に配位する。データによって符号化された構造は、コンピュータスクリーン上にグラフィック３次元表示で表示してもよい。これにより、構造の目視検査ならびに構造の化学物質との結合の目視検査が可能となる。
【０１８７】
従って、別の実施形態によれば、本発明は、化学物質が、ａ）ＦＡＫ、ＩＧＦ−１Ｒまたはそれらの特異的ドメインの結合ポケットを含む分子または分子複合体、またはｂ）前記分子または分子複合体の相同体に結合する可能性を評価するための方法であって、前記相同体は、前記アミノ酸の骨格原子から根平均二乗偏差が２．０（より好ましくは１．５）オングストローム以下の結合ポケットを含むことを特徴とする方法に関する。
【０１８８】
本方法は、
ｉ）化学物質と分子または分子複合体の結合ポケットとのフィッティング演算を行うための計算手段を用いる工程と、
ｉｉ）化学物質と結合ポケットとの結合を定量化するためにフィッティング演算の結果を分析する工程と、
を含む。本明細書で使用される「化学物質」という用語は、化学的化合物、少なくとも２種類の化学的化合物の複合体およびそのような化合物または複合体の断片を指す。
【０１８９】
本発明によれば、ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの相互作用部位に結合または会合する化合物あるいはＦＡＫ、ＩＧＦ−１Ｒまたはそれらの特異的ドメインに結合するかそれらを阻害する化合物の設計では一般に、いくつかの要因が考察される。第一に、この物質は、ＦＡＫ、ＩＧＦ−１Ｒまたはそれらの特異的ドメインの一部または全体あるいはＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用部位に物理的かつ構造的に結合することができるものでなければならない。この結合において、重要な非共有分子間相互作用としては、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水的相互作用および静電的相互作用が挙げられる。第２に、この物質は、ＦＡＫ、ＩＧＦ−１Ｒまたはそれらの特異的ドメインあるいはＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの相互作用部位に直接結合することができる立体配座をとることができるものでなければならない。この物質の特定の部分はこれらの結合に直接関与しないが、それでもこの物質のそれらの部分が分子の全体的な立体配座に影響を与える場合がある。次いで、これが作用強度に重大な影響を与える場合がある。そのような立体配座要件としては、結合ポケットの全体または一部に対する化学物質の全体的な３次元構造および方向、あるいは結合ポケットまたはその相同体と直接相互作用するいくつかの化学物質を含む物質の官能基間の間隔が挙げられる。
【０１９０】
コンピュータモデリング技術を用いて、その実際の合成および試験の前に、ＦＡＫ、ＩＧＦ−１Ｒまたはそれらの特異的ドメインあるいはＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの相互作用部位に対する化学物質の可能な阻害もしくは結合効果を分析してもよい。所与の化学物質の理論上の構造が物質と標的結合ポケットとの間の不十分な相互作用および結合を示唆する場合には、化学物質の試験は不要となる。しかし、コンピュータモデリングが強い相互作用を示す場合は、分子を合成し、ＦＡＫ、ＩＧＦ−１Ｒまたはそれらの特異的ドメインに結合するその能力またはＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの相互作用部位に結合するその能力について試験してもよい。一実施形態では、ＦＡＫ−ＮＴ（またはＦＡＫ−ＮＴ２）あるいはＩＧＦ−１Ｒのキナーゼドメインに結合するその能力について分子を試験してもよい。別の実施形態では、本化合物を、ＦＡＫアミノ酸１２６〜２４３および／またはＩＧＦ−１Ｒアミノ酸９５９〜１２６６に結合するその能力により選択する。これは、例えば、本明細書に記載されているアッセイまたは当該技術分野で知られているアッセイを用いて、例えば、ＦＡＫ、ＩＧＦ−１Ｒまたはそれらの特異的ドメインの活性を阻害する分子の能力またはＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用を調節する能力を試験することによって達成してもよい。このようにして効力のない化合物の合成を回避してもよい。
【０１９１】
ＦＡＫ、ＩＧＦ−１Ｒまたはそれらの特異的ドメインの、あるいは、ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの結合相互作用の可能な阻害剤を、化学物質または断片がＦＡＫ、ＩＧＦ−１Ｒまたはそれらの特異的ドメインあるいはＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの相互作用部位に結合するそれらの能力をスクリーニングおよび選択する一連の工程によって、コンピュータで評価してもよい。一実施形態では、可能な阻害剤を、ＦＡＫ−ＮＴ（またはＦＡＫ−ＮＴ２）ドメインあるいはＩＧＦ−１Ｒのキナーゼドメインに結合するその能力について評価してもよい。一例として、ＦＡＫアミノ酸１２６〜２４３および／またはＩＧＦ−１Ｒアミノ酸９５９〜１２６６をこのプロセスで利用することができる。
【０１９２】
当業者は、ＦＡＫ、ＩＧＦ−１Ｒまたはそれらの特異的ドメインあるいはＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの相互作用部位に結合するそれらの能力について化学物質または断片をスクリーニングするためのいくつかの方法のうちの１つを使用してもよい。このプロセスは、ＦＡＫ、ＩＧＦ−１Ｒ、それらの特異的ドメインまたはＦＡＫおよびＩＧＦ−１Ｒの複合体の構造あるいは機械読み取り可能な記憶媒体から生成された類似した形状を定義する他の座標に基づいて、例えば、コンピュータスクリーン上のＦＡＫ、ＩＧＦ−１Ｒまたはそれらの特異的ドメイン（例えば、ＦＡＫ−ＮＴ２ドメインまたはＩＧＦ−１Ｒのキナーゼドメイン）あるいはＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの相互作用部位の目視検査によって始めてもよい。次いで、選択された断片または化学物質を様々な方向に配置してもよいし、あるいは上に定義されているその結合ポケット内にドッキングしてもよい。ドッキングは、ＱｕａｎｔａおよびＤＯＣＫなどのソフトウェア、次いで、ＣＨＡＲＭＭおよびＡＭＢＥＲなどの標準的な分子力学力場によるエネルギーの最小化および分子動力学を用いて達成してもよい。
【０１９３】
専門のコンピュータプログラム（例えば、当該技術分野で知られているものおよび／または市販されているものおよび／または本明細書に記載されているもの）も、断片または化学物質を選択するプロセスにおいて有用となり得る。
【０１９４】
好適な化学物質または断片が選択されると、それらを単一の化合物または複合体に組み立てることができる。組み立ては、標的結合ポケットの構造座標に対するコンピュータスクリーン上に表示された３次元画像上の断片の互いの関係の目視検査の後であってもよい。
【０１９５】
上記のように、１度に１つの断片または化学物質で段階的に結合ポケットの阻害剤を構築し続ける代わりに、阻害化合物または他の結合化合物は、空の結合部位のいずれかを用いるか、または場合により公知の阻害剤（１種または複数）のいくつかの部分を含めて全体として、あるいは「新たに」設計してもよい。当該技術分野で知られている多くの新規のリガンド設計方法があり、そのうちのいくつかは市販されている（例えば、ミズーリ州セントルイスのTripos Associates社から入手可能なＬｅａｐＦｒｏｇ）。
【０１９６】
他の分子モデリング技術も本発明に従って用いてもよい［例えば、N. C. Cohen et al., "Molecular Modeling Software and Methods
for Medicinal Chemistry", J. Med. Chem., 33, pp. 883-894 (1990)を参照、M. A. Navia and M. A. Murcko, "The Use of Structural
Information in Drug Design", Current Opinions in Structural Biology, 2,
pp. 202-210 (1992)、L. M. Balbes et al., "A
Perspective of Modern Methods in Computer-Aided Drug Design", in Reviews
in Computational Chemistry, Vol. 5, K. B. Lipkowitz and D. B. Boyd, Eds., VCH,
New York, pp. 337-380 (1994)も参照、W. C. Guida,
"Software For Structure-Based Drug Design", Curr. Opin. Struct.
Biology,, 4, pp. 777-781 (1994)も参照]。
【０１９７】
化合物を設計または選択したら、その物質が結合ポケットに結合し得る効率をコンピュータ評価によって試験および最適化してもよい。
【０１９８】
化合物の変形エネルギーおよび静電的相互作用を評価するための特定のコンピュータソフトウェアが当該技術分野において入手可能である。そのような用途のために設計されたプログラムの例としては、ＡＭＢＥＲ、ＱＵＡＮＴＡ／ＣＨＡＲＭＭ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社、ウィスコンシン州マディソン）などが挙げられる。これらのプログラムは、例えば市販のグラフィックスワークステーションを用いて実行していてもよい。他のハードウェアシステムおよびソフトウェアパッケージは当業者に知られているであろう。
【０１９９】
別の技術では、例えば、本明細書に記載されている化合物の仮想ライブラリーをコンピュータでスクリーニングする。何千もの多くの化合物を素早くスクリーニングすることができ、最良の仮想化合物を（例えば、合成および試験管内試験による）さらなるスクリーニングのために選択することができる。小分子データベースは、全体的または部分的に、ＦＡＫ、ＩＧＦ−１Ｒまたはそれらの特異的ドメインの結合ポケットに結合する、あるいはＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの相互作用部位に結合することができる化学物質または化合物についてスクリーニングすることができる。このスクリーニングでは、そのような物質の結合部位への適合性を、形状相補性によって、あるいは推定される相互作用エネルギーによって判断してもよい。
【実施例】
【０２００】
本発明について、本発明の範囲を限定するものではなく例示するための以下の実施例によってさらに詳しく説明する。
【０２０１】
材料
細胞株および培養液。Ｐａｎｃ−１およびＭｉａＰａＣａ−２細胞を米国培養細胞系統保存機関から入手した。Ｐａｎｃ−１細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１μｇ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシンを添加したダルベッコ変法イーグル培地に維持した。ＭｉａＰａＣａ−２細胞を１０％ＦＢＳ、２．５％ウマ血清および１μｇ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシンを添加したダルベッコ変法イーグル培地に維持した。Ｌ．３．６ｐｌ細胞株をテキサス大学ＭＤアンダーソン癌センターから入手し、１０％ＦＢＳ、１μｇ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシン、ビタミン群、１ｍｍｏｌ／ｌのピルビン酸ナトリウム、２ｍｍｏｌ／ｌのＬ−グルタミンおよび非必須アミノ酸を添加した変法イーグル培地に維持した。全ての細胞株を５％ＣＯ２加湿インキュベータ内において３７℃でインキュベートした。
【０２０２】
ＬａｃＺを保持する組み換え型アデノウイルスまたはＦＡＫのアミノ酸６９３〜１０５２をコードする優性阻害のＦＡＫ構築物を保持する組み換え型アデノウイルス（Ａｄ−ＦＡＫ−ＣＤ）は、ノースカロライナ大学遺伝子療法センターウイルスベクターコア施設(Gene Therapy Center Virus Vector Core Facility)によって繁殖されている。
【０２０３】
Ａ３７５、ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞を米国培養細胞系統保存機関（メリーランド州ロックビル）から入手した。Ｃ８１６１、ＦＡＫ＋／＋およびＦＡＫ−／−マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）の細胞株は、William Cance博士（ロズウェルパーク癌研究所、ニューヨーク州バッファロー）から好意で提供された。ＩＧＦ−１Ｒ＋／＋および−／−ＭＥＦは、Renato Baserga（トーマスジェファーソン大学ペンシルバニア州フィラデルフィア）から好意で提供された。メラニン形成細胞をLifeline Cell Technology社から入手し、ＤｅｒｍａＬｉｆｅ（登録商標）Ｍメラニン形成細胞培地（Lifeline Cell Technology社、メリーランド州ウォーカーズビル）に維持した。
【０２０４】
食道癌細胞株
ＴＥおよびＫＹＳＥ群の細胞株は、Yutaka Shimada博士（富山大学、日本、富山県）から好意で提供された。食道癌株を１０％ＦＢＳ、１μｇ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０に維持した。全ての細胞株を５％ＣＯ２加湿インキュベータ内において３７℃でインキュベートした。
【０２０５】
膵臓癌細胞株
Ａｓ−ＰＣ１、Ｂｘ−ＰＣ３、Ｐａｎｃ−１およびＭｉａＰａＣａ−２細胞を米国培養細胞系統保存機関（メリーランド州ロックビル）から入手した。Ｐａｎｃ−１細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１μｇ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシンを添加したダルベッコ変法イーグル培地に維持した。ＭｉａＰａＣａ−２細胞を１０％ＦＢＳ、２．５％ウマ血清および１μｇ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシンを添加したダルベッコ変法イーグル培地に維持した。Ａｓ−ＰＣ１およびＢｘ−ＰＣ３細胞株を１０％ＦＢＳ、１μｇ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０に維持した。ヒトの膵管上皮（ＨＰＤＥ）細胞は、Carol Otey博士（ノースカロライナ大学、ノースカロライナ州チャペルヒル）から好意で提供され、Ｌ−グルタミン、ＥＧＦ＆ＢＰＥおよび大豆トリプシン阻害剤を添加したケラチノサイト−ＳＦＭ無血清培地（Ｇｉｂｃｏ社／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド）に維持した。全ての細胞株を５％ＣＯ２加湿インキュベータ内で３７℃でインキュベートした。
【０２０６】
他の細胞株
ＦＡＫノックアウトマウス胎児線維芽細胞（ＦＡＫ−／−ＭＥＦ）は、William Cance博士（ロズウェルパーク、ニューヨーク州バッファロー）から好意で提供され、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１μｇ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシンを添加したダルベッコ変法イーグル培地に維持した。ＩＧＦ−１Ｒノックアウトマウス胎児線維芽細胞（ＩＧＦ−１Ｒ−／−ＭＥＦ）は、Renato Baserga博士（トーマスジェファーソン大学キンメル癌センター(Kimmel
Cancer Center)、ペンシルバニア州フィラデルフィア）から好意で提供され、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１μｇ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシンを添加したダルベッコ変法イーグル培地に維持した。２００ｍｇ／ｍｌのヒグロマイシンＢを用いてＩＧＦ−１Ｒ−／−クローンを選択した。ＭＣＦ７、ＭＣＦ１０ＡおよびＢＴ４７４細胞を米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ、メリーランド州ロックビル）から購入した。ＢＴ４７４を１０％ウシ胎児血清およびインスリン２５０ｕｇ／ｍｌを含むＲＰＭＩ−１６４０に維持した。ＭＣＦ７細胞を１０％ウシ胎児血清、１×非必須アミノ酸（Ｃｅｌｌｇｒｏ社、ヴァージニア州ハーンドン）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび５００μｇ／ｍｌのインスリンを含む変法イーグル最小培地に維持した。ＭＣＦ１０Ａ（不死化ヒト乳房上皮細胞）を５％ウマ血清、ヒドロコルチゾン（０．５μｇ／ｍｌ）、インスリン（１０μｇ／ｍｌ）、上皮成長因子（２０ｎｇ／ｍｌ）およびペニシリン−ストレプトマイシン（各々１００μｇ／ｍｌ）を添加したダルベッコ変法イーグル培地およびＦ１２培地（ＤＭＥＭ−Ｆ１２）の１：１混合物中で培養した。
【０２０７】
試薬および抗体：ＦＡＫｓｉＲＮＡをDharmacon RNA Technologies社（コロラド州ラファイエット）から購入した。ＮＶＰ−ＡＥＷ５４１およびＴＡＥ２２６をＮｏｖａｒｔｉｓ社（ニュージャージー州イーストハノーバー）から入手した。抗ＦＡＫモノクローナル（４．４７）および抗リン酸化チロシンモノクローナル（４Ｇ１０）抗体をＵｐｓｔａｔｅ社（ニューヨーク州レークプラシッド）から入手した。抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体をＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社（カリフォルニア州サンディエゴ）から入手した。抗リン酸化ＦＡＫ（Ｔｙｒ３９７）および抗リン酸化Ｓｒｃ抗体をＢｉｏｓｏｕｒｃｅ社（カリフォルニア州カマリロ）から入手した。抗リン酸化ＥＧＦＲ、抗ＥＧＦＲ、抗リン酸化Ａｋｔ、抗Ａｋｔ、抗リン酸化ＥＲＫ１／２、抗ＥＲＫ１／２、抗サイクリンＢ１および抗オーロラ（Ａｕｒｏｒａ）ＢをCell Signaling Technology社（マサチューセッツ州ベヴァリー）から入手した。抗カスパーゼ３および抗ＰＡＲＰ抗体をBD Biosciences社（カリフォルニア州サンホゼ、カタログ番号６１１０３８）から入手した。抗アクチン抗体をＳｉｇｍａ社（ミズーリ州セントルイス）から入手した。抗グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）抗体をAdvanced ImmunoChemical社（カリフォルニア州ロングビーチ）から入手した。そして、実験で使用するＩＧＦ−１ＲおよびＦＡＫの異なるタンパク質構築物を本発明者らの研究室で作製した。
【０２０８】
ＴＡＥ２２６をＮｏｖａｒｔｉｓ社（ニュージャージー州イーストハノーバー）から入手した。抗ＦＡＫ（４．４７）および抗リン酸化チロシンモノクローナル（４Ｇ１０）抗体をＵｐｓｔａｔｅ社（ニューヨーク州レークプラシッド）から入手した。抗ＦＡＫ（Ｃ２０）および抗ＩＧＦ−１Ｒβ抗体（Ｃ２０）をSanta Cruz Biotechnology社（カリフォルニア州サンタクルーズ）から入手した。抗Ｈｉｓおよび抗ＧＳＴ抗体をＳｉｇｍａ社（ミシシッピー州セントルイス）から入手した。抗リン酸化ＩＧＦ−１Ｒおよび抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体をＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社（カリフォルニア州サンディエゴ）から入手した。抗リン酸化ＦＡＫ（Ｔｙｒ３９７）をＢｉｏｓｏｕｒｃｅ社（カリフォルニア州カマリロ）から入手した。抗カスパーゼ８、抗カスパーゼ９、抗リン酸化Ａｋｔ、抗Ａｋｔ、抗リン酸化ＥＲＫ１／２、抗ＥＲＫ１／２抗体をCell Signaling Technology社（マサチューセッツ州ベヴァリー）から入手した。抗カスパーゼ３／７および抗ＰＡＲＰ抗体（カタログ＃６１１０３８、カリフォルニア州サンホゼ、全長（ＰＡＲＰの非切断型）を認識する）をBD Biosciences社から入手した。抗β−アクチン抗体をＳｉｇｍａ社（ミズーリ州セントルイス）から入手した。抗グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）抗体をAdvanced ImmunoChemical社（カリフォルニア州ロングビーチ）から入手した。
【０２０９】
ＭＴＴ試薬をＰｒｏｍｅｇａ社（ウィスコンシン州マディソン）から購入した。ＣＦＳＥをMolecular Probes社（オレゴン州ユージーン）から購入した。ＴＡＥ２２６をＮｏｖａｒｔｉｓ社（ニュージャージー州イーストハノーバー）から入手した。ゲムシタビン（ジェムザール）をEli Lilly社（米国インディアナ州インディアナポリス）から購入した。５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）は、Sigma-Aldrich Chemical社（英国プール）から提供された。組み換え型ヒトＩＧＦ−１をＲ＆Ｄ社（ミネソタ州ミネアポリス）から購入した。抗ＦＡＫモノクローナル（４．４７）および抗リン酸化チロシンモノクローナル（４Ｇ１０）抗体をＵｐｓｔａｔｅ社（ニューヨーク州レークプラシッド）から入手した。抗ＦＡＫ（Ｃ２０）抗体および抗ＩＧＦ−１Ｒβ抗体（Ｃ２０）をSanta Cruz Biotechnology社（カリフォルニア州サンタクルーズ）から入手した。抗Ｈｉｓ抗体および抗ＧＳＴ抗体をＳｉｇｍａ社（ミシシッピー州セントルイス）から入手した。抗リン酸化ＩＧＦ−１Ｒおよび抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体をＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社（カリフォルニア州サンディエゴ）から入手した。抗リン酸化ＦＡＫ（Ｔｙｒ３９７）および抗リン酸化Ｓｒｃ抗体をＢｉｏｓｏｕｒｃｅ社（カリフォルニア州カマリロ）から入手した。抗ｓｒｃ、抗カスパーゼ８、抗カスパーゼ９、抗リン酸化Ａｋｔ、抗Ａｋｔ、抗リン酸化ＥＲＫ１／２、抗ＥＲＫ１／２をCell Signaling Technology社（マサチューセッツ州ベヴァリー）から入手した。抗カスパーゼ３／７および抗ＰＡＲＰ抗体（カタログ＃６１１０３８、カリフォルニア州サンホゼ）をBD Biosciences社から入手した。このＰＡＲＰ抗体は、全長すなわちＰＡＲＰの非切断型を認識した。抗β−アクチン抗体をＳｉｇｍａ社（ミズーリ州セントルイス）から入手した。抗グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）抗体をAdvanced ImmunoChemical社（カリフォルニア州ロングビーチ）から入手した。
【０２１０】
細胞生存率（ＭＴＴ）およびＣＦＳＥ増殖アッセイ：細胞を９６ウェルプレートに播種し、一晩付着させた。細胞の処理後、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイ（CellTiter 96(登録商標)Aqueous、Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マディソン）によって細胞生存率を測定した。
【０２１１】
剥離アッセイでは、剥離および付着した細胞を別々に回収し、血球計算器で計数した。剥離した細胞の数を総細胞数で割って剥離率を計算した。
【０２１２】
ＣＦＳＥ（Molecular
Probes社、オレゴン州ユージーン）での染色のために、１×１０７／ｍｌの細胞をＰＢＳに懸濁し、１０μＭのＣＦＳＥと共に３７℃で５分間インキュベートした。染色された細胞を、培地単独で、あるいは阻害剤と共に２４、４８および７２時間培養し、固定し、そしてFACS Calibur血球計算器（Becton Dickinson社、カリフォルニア州サンホゼ）で分析した。
【０２１３】
コンピュータによるドッキング：ＦＡＫ（ＰＤＢコード２ＡＬ６）（２２）のＮ末端ドメインおよびＩＧＦ−１Ｒ（ＰＤＢコード１Ｐ４０Ａ）（２３）のキナーゼドメインの結晶構造を、上述したように、それらの相互作用のコンピュータによる分子モデル化のために利用した。国立癌研究所開発治療プログラム（ＮＣＩ／ＤＴＰ）のデータベースから入手した化合物ＮＳＣ３４４５５３（ＩＮＴ２−３１）の３次元座標を、ＩＧＦ−１Ｒの細胞質内部分を有するＦＡＫのアミノ末端（アミノ酸１２７〜２４３）の予測界面にドッキングさせた（２１）。ドッキングの計算は全て、ＦＡＫ上の標的部分を描く球体のセットと共に、小分子構造を方向付けるためのクリークマッチングアルゴリズムを用いて、サンフランシスコのカリフォルニア大学ＤＯＣＫ５．１．プログラムによって行った（３７）。標的部位においてＮＳＣ３４４５５３に関して１００通りの方向を創出し、コンピュータプログラムの格子ベースのスコアリング関数を用いてスコアリングした。ドッキング計算は、フロリダ大学高性能計算スーパーコンピューティングクラスタ上で行った(http:hpc.ufl.edu)。ＦＡＫ−ＮＴ２に結合する際のＮＳＣ３４４５５３の全ての立体配置の分子間エネルギーは、静電気およびファンデルワールスエネルギーの合計として計算した。これらのエネルギーの項は相関関数として求め、速いフーリエ変換によって効率的に計算した。
【０２１４】
ＧＳＴ融合タンパク質の産生：ＦＡＫ−ＧＳＴプラスミド構築物（ｐＧＥＸベクター）は、Elena Kurenova博士（ロズウェルパーク癌研究所、ニューヨーク州バッファロー）から好意で提供された。Ｈｉｓタグを付けたＩＧＦ−１Ｒタンパク質をBlue Sky Biotechnology社（マサチューセッツ州ウォーチェスター）から購入した。ＧＳＴ融合タンパク質（ＦＡＫ断片）を、０．２ｍＭのイソプロピルｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）と共に３７℃で６時間インキュベートして、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細菌内に発現させた。細菌を超音波処理で溶解し、融合タンパク質をグルタチオン−セファロース４Ｂビーズ（GE Healthcare社、ニュージャージー州）で精製した。
【０２１５】
プルダウンアッセイ：プルダウン結合アッセイのために、Ｈｉｓタグを付けたＩＧＦ−１Ｒ断片タンパク質（２００ｎｇ）を、グルタチオン−セファロース４Ｂビーズ上に固定化されたＧＳＴによって事前に浄化した。事前に浄化したＨｉｓタグを付けたタンパク質を、グルタチオン−セファロース４Ｂビーズに固定化されたＧＳＴ−ＦＡＫ融合タンパク質０．２μｇと共に４℃で１時間インキュベートし、次いで、３×ＰＢＳで洗浄した。等量のＧＳＴ融合タンパク質を各結合アッセイに使用した。結合したタンパク質を、６×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中で煮沸させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット法によって分析した。
【０２１６】
免疫沈降およびウェスタンブロット法：細胞を１×氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、２０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、５ｍＭのＥＤＴＡ酸、プロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤、Ｒｏｃｈｅ社、ニュージャージー州）およびホスファターゼ阻害剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、カリフォルニア州）を含む緩衝液に溶解した。免疫沈降のために、総細胞抽出物の１００〜２００μｇを各試料に使用した。この抽出物を１μｇの抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。次いで、２５μｌのタンパク質Ａ／Ｇ−アガロースビーズを添加し、この試料を４℃で２時間インキュベートした。沈殿物を溶解緩衝液で４回洗浄し、３０μｇのタンパク質を含む試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。ウェスタンブロットにおけるバンドの強さをＳｃｉｏｎ画像解析ソフトウエアプログラムで測定した。
【０２１７】
細胞の低分子ヘアピン型ＲＮＡトランスフェクション：対照ｓｈＲＮＡ（偽）およびＦＡＫｓｈＲＮＡをOpen Biosystems社から入手した。ヒトＦＡＫに対する低分子ヘアピン型ＲＮＡの配列は：（５’−ＣＣＧＧＣＣＧＡＴＴＧＧＡＡＡＣＣＡＡＣＡＴＡＴＡＣＴＣＧＡＧＴＡＴＡＴＧＴＴＧＧＴＴＴＣＣＡＡＴＣＧＴＴＴＴＧ−３’、５’−ＣＣＧＧＧＣＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＡＴＣＡＧＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＣＴＧＡＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧＧＧＣＴＴＴＴＴＧ−３’）および対照ｓｈＲＮＡ（偽）（５’−ＴＣＣＧＡＡＣＧＴＧＴＣＡＣＧＴＴＣＴＣＴＴＧＡＡＡＣＧＴＧＡＣＡＣＧＴＴＣＧＧＡＧＡ−３’）であった。細胞のトランスフェクションのために、トランスフェクション前のいずれかの日に、２×１０５細胞／ウェルを２ｍｌの培地を含む６ウェルプレートに播種した。製造業者の実験計画書に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州）を用いて細胞をトランスフェクトした。
【０２１８】
ＧＦＰ融合ＦＡＫ構築物および細胞のトランスフェクション
ＦＡＫ−ＮＴ１（アミノ酸１〜１２６）、ＦＡＫ−ＮＴ２（アミノ酸１２７〜２４３）、およびＦＡＫ−ＮＴ３（アミノ酸２４４−４１５）を、遺伝子特異的プライマーを用いてＰＣＲによって増幅し、ｐＥＧＦＰ−Ｃ２ベクター（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社、カリフォルニア州マウンテンビュー）にクローン化した。全ての配列を自動配列決定（ＩＣＢＲ配列決定施設(ICBR Sequencing Facility)、フロリダ大学)によって確認した。ＦＡＫ断片を過剰発現させるために、供給元からの説明書に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州）を用いて、プラスミドｐＥＧＦＰ−ＦＡＫ−ＮＴ１、ｐＥＧＦＰ−ＦＡＫ−ＮＴ２およびｐＥＧＦＰ−ＦＡＫ−ＮＴ３を細胞にトランスフェクトした。
【０２１９】
細胞株の安定な形質導入
Lung-ji
Chang博士の研究室において、膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ−１およびＭｉａＰａＣａ−２の感染を行った。ルシフェラーゼ発現のためのレンチウイルスベクターは、フロリダ大学のＲＤ−０６３７およびＲＤ−０６３３実験計画書に登録されていた。
【０２２０】
膵臓癌細胞株をトリプシン処理し、計数した。次いで、この細胞を２４ウェルトレイに播種し、６０〜８０％の集密になるまで加湿５％ＣＯ２−９５％空気下３７℃でインキュベートした。各ウェルにおいて、レンチウイルス粒子を含む１０μｌの体積のホタルルシフェラーゼおよび赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を培地に添加した。混合のためにプレートを穏やかに回転させた後、最適な形質導入効率を可能にするために、細胞を加湿インキュベータ内において５％ＣＯ２雰囲気下３７℃でインキュベートした。４時間後、ウイルスを含む培地を新しい培地と交換した。ＲＦＰタンパク質の発現および細胞のフローサイトメトリー選別に基づいて、形質導入された細胞の純粋集団を得た。
【０２２１】
剥離アッセイ：化合物を使用する場合と使用しない場合で、細胞を２４、４８および７２時間平板培養し、剥離および付着した細胞を血球計算器で計数した。剥離した細胞の数を総細胞数で割って剥離率を計算し、実験を三つ組で行った。
【０２２２】
アポトーシスアッセイ：処理後、付着および剥離した細胞を回収し、計数し、末端ウリジンデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴＵＮＥＬ）アッセイのために、ＡＰＯ−ＢＲＤＵキット（BD Pharmingen社、カリフォルニア州サンディエゴ）を利用して調製し、かつＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ血球計算器（Becton Dickinson社、カリフォルニア州サンホゼ）で分析した。さらに、アポトーシス細胞をヘキスト３３３４２染色（１μｇ／ｍｌ）によって分析した。アポトーシス細胞の割合をアポトーシス細胞／総細胞数の比として計算した。カスパーゼ３／７の活性化の検出のために、２０００個の細胞をガラス製の底に播種し、２％ゼラチンでプレートをコーティングし、蛍光活性化を共焦点顕微鏡法によって評価した。
【０２２３】
ヘキスト染色
さらに、アポトーシス細胞をヘキスト染色によっても分析した。上述したように調製した細胞に、ヘキスト３３３４２（１μｇ／ｍｌ）を添加し、暗室温で１０分間インキュベートし、検体をガラス製のカバーグラスに乗せた。スライドをアポトーシス核についてＺｅｉｓｓ顕微鏡で観察した。アポトーシス細胞の割合は、アポトーシス細胞／総細胞数の比として計算した。１つの試料につき３００個以上の細胞を分析した。
【０２２４】
カスパーゼ３／７アポトーシスアッセイ
活性化されたカスパーゼ３／７酵素の検出のために、処理した細胞におけるアポトーシスの確認として、Ａｐｏ−ＯＮＥ（登録商標）カスパーゼ−３／７試薬キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マディソン）を使用した。２０００個の細胞を９６ウェルガラス製ボトムプレートに播種し、異なる濃度の本化合物で処理した。処理から２４、４８および７２時間後、細胞を、１０μＬのプロ蛍光性カスパーゼ−３／７コンセンサス基質（ローダミン１１０、ビス−Ｎ−ＣＢＺ−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−バリルアスパラギン酸アミド）（Ｚ−ＤＥＶＤ−Ｒ１１０）と共に、暗所において室温で３０分間インキュベートした。カスパーゼ−３／７酵素によってＤＥＶＤペプチド基質配列内のアスパラギン酸残基のＣ末端側が切断されるとすぐに、４９８ｎｍの波長で励起されると、ローダミン１１０は蛍光性になる。最大励起波長は５２１ｎｍである。生成された蛍光性産物の量は、試料中に存在する活性なカスパーゼ−３／７の量の代表である。画像化は、４０倍油浸対物レンズを用いて、ＬＡＳ−ＡＦ画像化ソフトウェアを備えたLeica TCS SP5レーザー走査共焦点顕微鏡によって行った。
【０２２５】
キナーゼプロファイラー（Ｐｒｏｆｉｌｅｒ）スクリーニング：キナーゼ特異性スクリーニングをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＳｅｌｅｃｔＳｃｒｅｅｎ（登録商標）キナーゼプロファイリングサービス(http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Services/Discovery-Research/SelctScreen-Profiling-Service/SelectScreen-Kinase-Profiling-Service.html)によって行った。スクリーニングは、Ｚ’−ＬＹＴＥ（商標）キナーゼアッセイに従って、１０種類の組み換え型キナーゼに対して１μＭの化合物、ＩＮＴ２−３１、１０μＭのＡＴＰおよびキナーゼ基質を用いて行った。ＰＩ３キナーゼ活性のために、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製Ａｄａｐｔａ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌキナーゼアッセイ実験計画書と共に１００μＭのＡＴＰおよびキナーゼ基質を利用した。
【０２２６】
生体内でのヌードマウスの腫瘍成長：６週齢の雌の無胸腺ヌードマウスをHarlan Laboratory社から購入した。このマウスを動物施設内に維持し、全ての実験をＮＩＨ動物実験(animal-use)ガイドラインおよびＩＡＣＵＣによって承認された実験計画書に準拠して行った。黒色腫細胞を５×１０６細胞で皮下注射した。腫瘍の大きさが１００ｍｍ３に達したら、２１日間にわたって１日１回１５ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射によってＩＮＴ２−３１を導入した。腫瘍の直径を測径器で測定し、腫瘍の体積（単位：ｍｍ３）を式［（幅）２×長さ］／２を用いて計算した。実験終了時に、腫瘍の重量および体積を測定した。
【０２２７】
黒色腫異種移植片
黒色腫の研究のために、フロリダ大学ＩＡＣＵＣは、実験計画書（ＩＡＣＵＣ研究＃２００８０１０７７）を承認した。黒色腫細胞（５×１０６細胞）を皮下注射した。腫瘍の大きさが１００ｍｍ３に達したら、１日１回１５ｍｇ／ｋｇの用量でＩＮＴ２−３１を腹腔内注射によって導入した。腫瘍の直径を測径器で測定し、腫瘍の体積（単位：ｍｍ３）を式［（幅）２×長さ］／２を用いて計算した。実験終了時に、腫瘍の重量および体積を測定した。
【０２２８】
患者対象および異種移植片
この研究においてヒトの対象を使用したのは、単に、再調査のために食道および膵臓固形腫瘍組織を入手するためであり、実験計画書＃２７６−２００８および３２１−２００５に基づくフロリダ大学医療センター治験審査委員会（ＩＲＢ）の特定の承認は既に得られていた。
【０２２９】
食道または膵臓癌に罹患したヒトの患者からの腫瘍試料に対して、フロリダ大学ＩＡＣＵＣは、実験計画書（ＩＡＣＵＣ研究＃２０００９０２７６７）を承認した。膵臓癌に罹患した１０人および食道癌に罹患した１５人の合計２５人の患者を特定し、その検体をヌードマウスに移植した。最初に、新しいヒトの膵臓および食道腫瘍試料からの小片（０．３×０．３×０．３ｃｍ）を、フロリダ大学シャンズ（Ｓｈａｎｄｓ）病院で手術を受けた患者の手術検体から得、各患者につき２匹のマウスの内集団に皮下移植した。食道癌の検体では、それらのうちの１つが１．５ｃｃに達したら、それを切除し、小片（０．３×０．３×０．３ｃｍ）に切断し、さらに１０匹のマウスに皮下移植した。腫瘍が約１００ｍｍ３に達したら、マウスを以下の２群（各群に５匹のマウス）に無作為化した：
・群１：対照：処理なし
・群２：ＩＮＴ２−３１（化合物３１）：５０μＬ中５０ｍｇ／ｋｇ／日、２１日間の腹腔内投与（この薬物は、我々の研究室で事前に試験し、この用量において測定可能な毒性は有していない）
【０２３０】
腫瘍接種から３０〜４０日後にマウスを安楽死させ、腫瘍および組織を回収した。本発明者らの皮下モデルにおける腫瘍成長の阻害のために、腫瘍体積（長さ×幅×高さ×ｐ／６）および体重を、週末および休日を含み毎日測定して腫瘍成長を監視し、かつ体重減少および痛み、苦痛または行動および生理機能の異常の徴候を考慮して全体的な臨床状態を評価した。対照の平均腫瘍体積が１．５ｃｃになったときに実験を終了した（約３０〜４０日）。
【０２３１】
抗腫瘍活性は、Ｔ／Ｃ％（処理した動物の腫瘍体積の平均的増加を対照動物の腫瘍体積の平均的増加で割って１００を掛けたもの）として表した。
【０２３２】
膵臓癌の同所性モデル
膵臓癌の同所性モデルのために、フロリダ大学ＩＡＣＵＣは、以下の実験計画書（ＩＡＣＵＣ研究＃２０００８０１５０６）を承認した。膵臓癌細胞株ＭｉａＰａＣａ−２およびＰａｎｃ−１細胞を、異種移植片の生体内での画像化のために、ルシフェラーゼ−ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）レポーター遺伝子を用いて安定的にトランスフェクトした。ＲＦＰ陽性細胞の増殖および選別の後、細胞を培養液中で増殖させ、５×１０６腫瘍細胞を２０匹のマウスの膵臓に移植した。細胞を膵臓に移植するために、ＡＣＳが提供および保守する齧歯類麻酔器(ACS provided and maintained rodent anesthesia machine)を用いてマウスをイソフルランで麻酔した。無菌手術条件下で、皮膚、腹壁および腹膜を１．０ｃｍ切開して、脾臓を後退させ、２９ゲージ針を用いて３０μＬ体積の細胞を膵尾に注射した。腹壁および腹膜は５．０吸収性縫合糸を用いて縫合し、皮膚は医療用接着剤（ダーマボンド（ｄｅｒｍａｂｏｎｄ））で塞いだ。術後鎮痛は、術後８〜１２時間ごとに０．０５ｍｇ／ｋｇのブプレノルフィンを皮下投与して行った。
【０２３３】
腫瘍が約１００ｍｍ３に達したら、マウスを以下の４つの群（各群に３匹のマウス）に無作為化した：
・群１：対照：処理なし
・群２：ゲムシタビン：５０μＬ中４０ｍｇ／ｋｇ、３週間にわたる５日ごとの腹腔内（ｉｐ）投与による処理
・群３：ＩＮＴ２−３１：５０μＬ中１５ｍｇ／ｋｇ／日、腹腔内投与
・群４：ゲムシタビンおよびＩＮＴ２−３１の併用処理
【０２３４】
腹腔内注射前にマウスを手で抑えた。腫瘍接種から６週間後にマウスを安楽死させ、腫瘍および組織を回収した。下記のように、ＩＶＩＳ管腔内撮像装置でマウスを毎週撮像し、腫瘍の大きさを生物発光信号によって推定した。
【０２３５】
マウスの生体内画像化
生物発光タグを発現している腫瘍を有する全てのマウスにおいて非侵襲的画像化を行った。ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する腫瘍については、ＩＶＩＳ管腔内プラットフォームを使用した。画像化を達成するために、マウスをＡＣＳが提供および保守する齧歯類麻酔器を用いてイソフルランで麻酔した。Living Image収録および分析ソフトウェア（バージョン２．１１、Ｘｅｎｏｇｅｎ社）を備えた低温冷却したＩＶＩＳ画像化システム（Ｘｅｎｏｇｅｎ社）を使用して、マウス中の生体発光信号を検出した。ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現している腫瘍を有するマウスでは、画像化前に、２５〜２７ゲージの針を用いて１００μＬ中体重１ｋｇ当たり１５０ｍｇのルシフェリン（Ｘｅｎｏｇｅｎ社、カリフォルニア州アラメダ）をマウスに腹膜内または皮下注射した。注射領域は標準的な外科消毒薬を用いて清潔にし、全ての溶液は無菌であり、かつフロリダ大学の薬物ポリシーを満たしていた。１０分後、上述したようにマウスを麻酔し、加熱した試料棚に置いた。最初に画像化システムによって薄暗い照明の室内で写真画像を撮影した。その後、発光性画像を収録した。全てのマウス腫瘍モデルの発光性画像収録のために１分間の積分時間を使用した。Living Imageソフトウェアを使用して、マウスから得られた総生体発光信号（光子数に換算）を積分した。ＩＶＩＳ画像化システムの生体外での検出限界は、１，０００ＥＳ−２／ｌｕｃ細胞である。
【０２３６】
各動物について６週間にわたって週に１回のみ調査した。発光信号に基づいて、腫瘍の大きさを容易に推定した。４２日目、あるいは腫瘍の大きさが１．５ｃｃに達したら、マウスを安楽死させた。
【０２３７】
免疫組織化学：異種移植片腫瘍組織を１０％ホルマリンで固定し、パラフィンで包埋した。Ｋｉ−６７染色のために、試料の脱パラフィンおよび抗原回復処理を行い、１：２００の濃度で、一次抗体すなわちＫｉ−６７(Dako M7240)と共に４０℃で一晩インキュベートした。この組織を色素原ＤＡＢで染色し、ヘマトキシリンおよび１％ＴＢＳで対比染色した。
【０２３８】
アポトーシス細胞の評価のために、製造業者からの説明書に従って、Dead End（商標）ＴＵＮＥＬ熱量測定システム(Calorimetric TUNEL
System)（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マディソン）を利用して染色を行った。アポトーシス細胞の割合は、高倍率視野で少なくとも４００個の細胞を計数して測定した。
【０２３９】
統計分析：有意性を判定するためにスチューデントのｔ−検定を行った。Ｐ＜０．０５を有するデータ間の差は有意であるとみなした。
【０２４０】
ＥＬＩＳＡ試験
２種類の異なる酵素結合免疫測定法を行って、ＩＧＦ−１ＲβサブユニットとＦＡＫ−ＮＴとの結合を調査した。第１のアッセイでは、ＩＧＦ−１Ｒと固定化ＦＡＫ−ＮＴとの相互作用を調査し、第２のアッセイでは、ＦＡＫ−ＮＴと固定化ＩＧＦ−１Ｒとの相互作用を調査した。
【０２４１】
第１の症例では、９６マイクロタイタープレートウェルを、ＦＡＫの精製されたＧＳＴ融合ＦＥＲＭドメインの５０μｌのＰＢＳ溶液（ＮａＣｌ：１３７ｍＭ、ＫＣｌ：２．７ｍＭ、Ｎａ２ＨＰＯ４：４．３ｍＭ：ＫＨ２ＰＯ４：１．４ｍＭ）で、４℃で一晩コーティングおよび精製した。次いで、ウェルを洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％トウィーン）ですすぎ、２００μｌのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ）で、３７℃で３時間ブロッキングした。洗浄緩衝液で３回すすいだ後、本化合物の有無に関わらず、精製したＩＧＦ−１Ｒ総タンパク０．２μＭを含む１００μｌの結合緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％トウィーン、１％ＢＳＡ）をウェルに添加し、３７℃で１時間反応させた。ウェルを再び３回すすぎ、２００ｎｇ／ｍｌの一次抗体である抗ＩＧＦ−１Ｒ（ｓｃ−６１３、Santa Cruz社）を含む１００μｌの結合緩衝液を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。さらに３回すすいだ後、２次ＨＲＰ抗ウサギ抗体を含む同じ緩衝液１００μｌを添加し、３７℃でさらに１時間インキュベートした。最後に、ＡＢＴＳ基質（２，２’−アジノビス［３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸］−二アンモニウム塩）１００μｌを塗布し、陽性対照の色の強度が最大になり、かつ陰性対照が非特異的反応を生じなくなるまで（６〜１０分）、プレートを暗所に維持した。ＥＬＩＳＡプレートを、４５０ｎｍにおいてＢｉｏｔｅｃｈ社製ＥＬＩＳＡリーダーで読み取った。
【０２４２】
第２のアッセイでは、同じ方法を利用したが、ＩＧＦ−１Ｒをウェルに固定し、ＦＡＫ−ＮＴと共にインキュベートした。一次抗体の抗ＦＡＫ−４．４７（０５−５３７、Ｕｐｓｔａｔｅ社）を使用して、結合反応を明らかにした。
【０２４３】
ＢＩＡＣＯＲＥ分析
ＥＬＩＳＡ分析と組み合わせてBiacore T100技術を使用して、ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの相互作用部位を標的とする小分子化合物の熱力学的結合パラメータを特徴づけた。
【０２４４】
全ての実験をBiacore
T100光バイオセンサ(http://www.biacore.com)を用いて行った。Series S CM5センサチップ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、エタノールアミンＨＣｌ、および器具特異的な消耗品ならびに付属品は、フロリダ大学のＩＣＢＲから提供された。
【０２４５】
ＦＡＫ−ＮＴ固定化
ＦＡＫおよびＩＧＦ−１Ｒにセンサチップを再生利用するために、抗マウス第２抗体をセンサチップの表面に固定した。これにより、一次抗体を使用してリガンドタンパク質を表面に固定することができ、かつチップ表面へのタンパク質の固定化の間にタンパク質の相互作用部位を遮蔽する可能性も排除した。
【０２４６】
固定化手順は、泳動用緩衝液としてＨｅｐｅｓ緩衝食塩水（ＨＢＳ：１０ｍＭのＨｅｐｅｓおよび１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を用いて行った。最初に、センサチップ表面を１００μｌ／分の流速で、１００ｍＭのＨＣｌ、５０ｍＭのＮａＯＨおよび０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のそれぞれ２回の６秒間パルスで事前にコンディショニングした。抗マウス抗体表面は、３０℃および１０μｌ／分の流速でアミンカップリング化学を用いて調製した。表面を活性化させるために、ＮＨＳ／ＥＤＣを１５分間注入し、１００μｇ／ｍｌの抗体（１０ｍＭの酢酸ナトリウムに溶解、ｐＨ４．５）を１０分間注入し、最後に、エタノールアミンを７分間注入して、残留する活性基をブロックした。この固定化手順によって、５０００〜７０００の共鳴単位（Ｒｕ）の抗体が固定化された。固定化後、機器を分析泳動用緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％トウィーン２０、０．１％Ｂｒｉｊ−３５および５％ジメチルスルホキシド［ＤＭＳＯ］、ｐＨ８．０）で広範囲にわたって刺激した。抗マウス抗体の固定化後、１００μｇ／ｍｌのマウス抗ＦＡＫ４．４７抗体（０５−５３７、Ｕｐｓｔａｔｅ社）（１０ｍＭの酢酸ナトリウムに溶解、ｐＨ４．５）を１０分間注入し、センサチップ表面を洗浄して、１００μｌ／分の流速で１００ｍＭのＨＣｌ、５０ｍＭのＮａＯＨおよび０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のそれぞれ３回の５秒間パルスで未結合抗体を除去した。この固定化手順により、１５０００〜２００００の共鳴単位（Ｒｕ）の一次抗体が固定化された。最後に、２００μｇ／ｍｌのＦＡＫ−ＮＴ（１０ｍＭの酢酸ナトリウムに溶解、ｐＨ４．５）を１０分間注入し、センサチップ表面を、１００μｌ／分の流速で、１００ｍＭのＨＣｌ、５０ｍＭのＮａＯＨおよび０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のそれぞれ３回の５秒間パルスで洗浄した。この固定化によって、３００００〜４００００の共鳴単位（Ｒｕ）のＦＡＫ−ＮＴが固定化された。
【０２４７】
ＩＧＦ−１Ｒの捕捉
ＩＧＦ−１Ｒの分割量を使用するまで８０℃で冷凍保存した。新しく調製した２００μｇ／ｍｌの体積のＩＧＦ−１Ｒ（１０ｍＭの酢酸ナトリウムに溶解、ｐＨ４．５）を１０分間注入し、溶液を高速脱塩カラム（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１０ｍＭのＭｇＣｌ２によって平衡、ｐＨ８．０）上を２回通過させて、未結合タンパク質を除去した。捕捉手順によって、２５℃でＦＡＫ−ＮＴの表面に典型的に２０００〜４０００Ｒｕの密度が得られた。一次抗体が結合した表面は基準として機能した。
【０２４８】
分析物溶液の調製
原液のために、本化合物を１０ｍＭの濃度になるまで１００％ＤＭＳＯに溶解し、ＤＭＳＯおよび／または泳動用緩衝液への本化合物の原液のさらなる希釈を分析の直前に行った。分析物および泳動用緩衝液のＤＭＳＯ含有量を正確に一致させるために、第２の原液５０μｌを、１ｍｌの５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％トゥイーン２０および０．１％Ｂｒｉｊ−３５（ｐＨ８．０）に添加して、分析のために選択した高濃度よりも９倍濃い化合物濃度が得られるような濃度に本化合物をＤＭＳＯに希釈して、低濃度の第２の原液を調製した。この開始濃度を分析泳動用緩衝液に９倍に希釈して高濃度を得た。この試料のさらなる９倍の希釈によって、低濃度を生成した。この高および低分析物濃度の濃度における伝搬誤差を計算すると約３．０％であった。
【０２４９】
分析パラメータ
各温度において、５種類の緩衝液ブランクを最初に注入して、機器を完全に平衡させた。５０μｌ／分の流速を用いて、化合物を３０〜６０秒間注入し、解離を１〜２０分間監視した（選択した注入および解離時間は予備結合試験で決定した）。強固に結合した複合体を得るためには再生工程が必要であった。表面を４〜１１０℃では６０％エチレングリコール、１６〜１８℃では４０％エチレングリコール、２２〜２８℃では３０％エチレングリコール、３２〜３９℃では５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％エチレングリコール、１５ｍＭのＡＴＰ、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、５％ＤＭＳＯおよび０．１％トウィーン２０（ｐＨ８．０）の１０回の１００秒間パルスで再生した。データ回収率は１０Ｈｚであった。
【０２５０】
データ分析
Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２（BioLogic Software社、オーストラリア）を用いて処理および分析したバイオセンサデータを、単純な１：１モデル（Ａ＋Ｂ＝ＡＢ）または質量輸送条件を含む１：１の相互作用モデル（Ａｏ＝Ａ、Ａ＋Ｂ＝Ａｂ）のいずれか一方にあてはめた。Ｓｃｒｕｂｂｅｒで決定した平衡解離定数をファントホッフの式Ｉｎ（ＫＤ）＝ΔＨ°／ＲＴ−ΔＳｏＲにあてはめた（ΔＣｐ°の条件を含む集積形態のファントホッフの式の使用を検討したが、Ｉｎ（ＫＤ）対１／Ｔプロットにおける曲率の欠如によって、この手法の使用が不要であることが示された）。ΔＨ°およびΔＳ°の値は、マイクロソフトエクセルのＳｏｌｖｅｒマクロを用いて直接得た。また、ΔＨ°およびΔＳ°の値は、エクセルの回帰関数を用いて、Ｉｎ（ＫＤ）対１／Ｔプロットの線形回帰分析によって間接的に決定した（ここで、傾斜および切片は、ΔＨ°／Ｒおよび−ΔＳ°／Ｒにそれぞれ対応していた）。ＳｏｌｖｅｒからのΔＨ°およびΔＳ°のフィッティング誤差は、ＳｏｌｖｅｒＡｉｄと呼ばれるダウンロード可能なマクロ(http://www.bowdoin.edu/~rdelevie/excellaneous)を用いて得た。回帰ルーチンからのパラメータΔＨ°およびΔＳ°の誤差は、マイクロソフトエクセルの統計的読み出しから直接得た。両方法から得られた値は十分に一致していた。標準誤差は、エクセルの一般式Δｚ２＝（∂ｆ／∂ｘ）２Δ×２＋（∂ｆ／＜∂ｙ）２Δｙ２＋．．．に従って伝播した。プログラムした式を、ダウンロード可能なマクロＰｒｏｐａｇａｔｅ（これもhttp://www.bowdoin.edu/~rdelevie/excellaneousで入手可能である）を用いて最初に確認した。
【０２５１】
実施例１
小分子のデータベース
ＮＣＩ／ＤＴＰは、非専売品であり、かつ癌、エイズあるいは癌またはエイズの対象が罹患する日和見感染症の治療のための新しい薬剤の発見および開発のために研究団体に提供された約２５０，０００種の試料（すなわち、プレート化された(plated)化合物のセット）のリポジトリを管理している。ＮＣＩ／ＤＴＰのプレート化された化合物のセットの３次元座標は、MDL SDフォーマット(http://www.chm.tu-dresden.de/edv/vamp65/REFERS/vr_03d.htm)で得られ、かつＤＯＣＫユーティリティプログラムＳＤＦ２ＭＯＬ２によってｍｏｌ２フォーマットに変換される。リガンドに関する部分的な原子電荷、溶媒和エネルギーおよびファンデルワールスパラメータをＳＹＢＤＢを用いて計算し、かつプレート化された化合物のセットのｍｏｌ２ファイルに追加した。
【０２５２】
実施例２
ＦＡＫ／ＩＧＦ−１Ｒの可能な小分子阻害剤を特定するためのデータベーススクリーニング
高処理スクリーニングを行う代わりに、コンピュータによる分子ドッキングを機能的な試験と組み合わせた、構造に基づく手法を使用する。周知の３次元構造を有する化合物の大きな化学ライブラリーを、ヒトのＦＡＫ（ＰＤＢコード１Ｋ０５）の結晶構造上のＳＰＨＧＥＮ（ＵＣＳＦ社）によって選択された構造的なポケット内に配置する。薬物のような特性を有する２５０，０００種の小分子化合物（リピンスキーの法則に従う）を、ＤＯＣＫ５．１コンピュータプログラム（ＵＣＳＦ社）を用いて、ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの相互作用部位に１００通りの異なる方向でドッキングさせた。ＤＯＣＫの一般的な特徴としては、リガンドの受容体球体への強固な配向、ＡＭＢＥＲエネルギースコアリング、ＧＢ／ＳＡ溶媒和スコアリング、接触スコアリング、内部非結合エネルギースコアリング、リガンドの柔軟性、ならびに剛性シンプレックスおよび捻れシンプレックス両方の最小化が挙げられる。
【０２５３】
化合物をＦＡＫおよび／またはＩＧＦ−１Ｒ阻害剤として選択するモデルのために、以下の配列を利用した。
ＦＡＫアミノ酸１２６〜２４３：
ssvr
ekyelahppe ewkyelriry lpkgflnqft edkptlnffy qqvksdymle iadqvdqeia lklgcleirr
sywemrgnal ekksnyevle kdvglkrffp kslldsvkak tlr
ＩＧＦ−１Ｒアミノ酸９５９〜１２６６：
hrkrnnsrlgng
vlyasvnpey fsaadvyvpd ewevarekit msrelgqgsf gmvyegvakg vvkdepetrv aiktvneaas
mrerieflne asvmkefnch hvvrllgvvs qgqptlvime lmtrgdlksy lrslrpemen npvlappsls
kmiqmageia dgmaylnank fvhrdlaarn cmvaedftvk igdfgmtrdi yetdyyrkgg kgllpvrwms
peslkdgvft tysdvwsfgv vlweiatlae qpyqglsneq vlrfvmeggl ldkpdncpdm lfelmrmcwq ynpkmrpsfl
eiissi
【０２５４】
各化合物と相互作用部位との相互作用の予測される結合エネルギーは、ＤＯＣＫスコアが１モル当たり−１７．７ｋｃａｌの場合に上位のスコアの化合物であると評価される。最高スコアを有する上位のスコアの化合物に対して、ＮＣＩ／ＤＴＰから機能的な試験を依頼された。選択された小分子を、食道（ＫＹＳＥ１４０）、黒色腫（Ｃ８１６１、Ａ３７５）および膵臓（Ｐａｎｃ−１）癌細胞において細胞系増殖およびアポトーシスアッセイで評価した。
【０２５５】
ＮＣＩ／ＤＴＰのプレート化された化合物のセットの３次元座標を、MDL SDフォーマットで得、ＤＯＣＫユーティリティプログラムＳＤＦ２ＭＯＬ２によってｍｏｌ２フォーマットに変換した。リガンドに関する部分的な原子電荷、溶媒和エネルギーおよびファンデルワールスパラメータをＳＹＢＤＢを用いて計算し、かつプレート化された化合物のセットのｍｏｌ２ファイルに追加した。
【０２５６】
実施例３
細胞増殖アッセイ：少量のOne Solution Reagentを培養ウェルに直接添加し、１〜４時間インキュベートし、次いで、分光光度的プレートリーダーを用いて４９０ｎｍにおいて吸光度を記録することによって、CellTiter 96 Aqueous One Solutionを用いて細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を行った。４９０ｎｍにおける吸光度の量によって測定されるホルマザン産物の量は、培養液中の生細胞の数に正比例していた。
【０２５７】
実施例４
アデノウイルス感染：培養プレートに６×１０３または２×１０５の密度で細胞を播種し、２４時間付着させた。次いで、これらの細胞を、細胞当たり５０〜５００の感染多重度またはフォーカス形成単位（ＦＦＵ）のウイルス濃度でアデノウイルスに感染させた（Golubovskaya,V. et al., J. Biol. Chem., 277, 2002, 38978-38987を参照）。この最適なウイルス価は、細胞を様々な用量のＡｄ−ＧＦＰに感染させ、かつ蛍光顕微鏡検査によって感染率を視覚化するによって測定した。１細胞につき１００ＦＦＵのＡｄ−ＧＦＰによる処理によって９５％の感染率が得られた。さらなる実験のために感染から４８または７２時間後に細胞を使用した。
【０２５８】
実施例５
ｓｉＲＮＡトランスフェクションアッセイ：６０ｍｍの直径の培養プレートに対して６×１０３の細胞密度で、あるいは１００ｍｍの直径の培養プレートに対して２×１０５の細胞密度で細胞を播種し、２４時間付着させた。次いで、これらの細胞を、製造業者の実験計画書に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド）を用いて１〜１０ｎＭのＦＡＫｓｉＲＮＡまたは非特異的ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。いくつかのＦＡＫｓｉＲＮＡ配列を利用して、ＦＡＫのノックダウンについてスクリーニングした。細胞株に利用したＦＡＫｓｉＲＮＡの配列は、５’−ＧＡＡＧＵＵＧＧＧＵＵＧＵＣＵＡＧＡＡＵＵ−３’および５’−ＧＧＵＵＣＡＡＧＣＵＧＧＡＵＵＡＵＵＵＵＵ−３’であった。次いで、トランスフェクションから４８〜７２時間後に細胞をインキュベートした後、実験に使用した。ｓｉＲＮＡによるＦＡＫの阻害は、ウェスタンブロット法によって確認した。実験は三つ組で行った。
【０２５９】
実施例６
免疫沈降およびウェスタンブロット法：細胞を１×氷冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、２０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸、プロテアーゼ阻害剤（ニュージャージー州ナトリーのＲｏｃｈｅ社製Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル）および（ホスファターゼ阻害剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製ホスファターゼ阻害剤カクテルセットＩおよびセットＩＩ）を含む緩衝液に氷上で３０分間溶解した。溶解物を、１００００ｒｐｍで４℃で３０分間遠心分離し、上澄みを分析した。タンパク質濃度をＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイを用いて測定した。
【０２６０】
免疫沈降：１ｍｇの総細胞抽出物を各試料に使用した。抽出物を４℃で一晩１１ｇの適当な抗体と共にインキュベートした。２５マイクロリットルのタンパク質Ａ／Ｇ−アガロースビーズ（Oncogene Research Products社、カリフォルニア州ラホーヤ）を添加し、試料を４℃で振盪しながらさらに２時間インキュベートした。沈殿物を溶解緩衝液で３回洗浄し、４０μｌのＬａｅｍｍｌｉ緩衝液に再懸濁し、３５μｌをウェスタンブロット法のために取り出した。
【０２６１】
ウェスタンブロット法：３０μｇのタンパク質を含む煮沸させた試料を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分解した後、ポリフッ化ビニリデン膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、カリフォルニア州ハーキュリーズ）に移した。各抗体と共に提供された実験計画書に従って、ウェスタンブロット法を行った。免疫ブロットを、Western Lightning（商標）化学発光試薬プラス(Chemiluminescence
Reagent Plus)（PerkinElmer Life Sciences社、マサチューセッツ州ウォルサム）によって展開した。ウェスタンブロットにおけるバンドの強さを画像解析ソフトウエアプログラム（ＩｍａｇｅＪ）で測定した。
【０２６２】
結果：ＮＳＣ３４４５５３で処理した細胞溶解物に対する免疫沈降およびウェスタンブロット分析を図２および図３に示す。図２は、様々な用量のＮＳＣ３４４５５３で試験したＣ８１６１黒色腫癌細胞からの細胞溶解物の免疫沈降およびウェスタンブロット分析によって示されている、ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの相互作用に対するＮＳＣ３４４５５３の効果を示す。図３は、７５μＭのＮＳＣ３４４５５３で処理したＣ８１６１黒色腫癌細胞に対する効果を示す。ＮＳＣ１２８６８７で処理したＭｉａＰａＣａ−２膵臓癌細胞の免疫沈降およびウェスタンブロット分析は図１２に示されている。
【０２６３】
ＩＧＦ−１、ＮＳＣ３４４５５３、ＰＩ３キナーゼ阻害剤またはＮＶＰ−ＡＥＷ５４１（「ＮＶＰ」）で処理した黒色腫（Ｃ８１６１およびＡ３７５）および膵臓（Ｐａｎｃ−１およびＭｉａＰａＣａ−２）癌細胞に対してウェスタンブロット分析を行った（図４、図５、図７、図８、図９および図１４を参照）。
【０２６４】
図５は、５μＭのＮＳＣ３４４５５３またはＰＩ３キナーゼ阻害剤で処理したＣ８１６１黒色腫癌細胞に対する効果を示す。図７は、ＩＧＦ−１Ｒ野生型およびヌルマウス胚線維芽細胞において、最も有意な効果が２４時間の処理およびＩＧＦ−１による３０分間刺激群においてｐ−ＡＫＴの減少が認められたことを示す。図８は、ＦＡＫ野生型およびヌル線維芽細胞に関するウェスタンブロット分析を示す。最も有意な効果は、２４時間の処理およびＩＧＦ−１による３０分間刺激群におけるｐ−ＡＫＴの減少において認められる。図９は、ＮＳＣ３４４５５３で処理した際のＰａｎｃ−１癌細胞に対する効果を示す。
【０２６５】
実施例７
細胞生存率および剥離アッセイ：細胞をｓｉＲＮＡトランスフェクションで処理した後、細胞生存率を３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ、Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マディソン）で測定した。手短に言うと、２０μｌのテトラゾリウム化合物を各ウェルに添加した。次いで、これらの細胞を３７℃で１時間インキュベートした。プレートをプレートリーダーを用いて４９０ｎｍで読み取って、生存率を測定した。剥離アッセイでは、剥離および付着した細胞を別々に回収し、血球計算器で計数した。剥離した細胞の数を総細胞数で割って剥離の割合を計算した。
【０２６６】
アポトーシスアッセイ：処理後、付着および剥離した細胞を回収し、計数し、そして末端ウリジンデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴＵＮＥＬ）アッセイのために、製造業者の説明書に従って、ＡＰＯ−ＢＲＤＵキット（BD Pharmingen社、カリフォルニア州サンディエゴ）を利用して調製した。染色された細胞を、蛍光標示式細胞分取−Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメータ（BD Biosciences社）を用いて分析した。試料中のアポトーシス細胞の割合の計算は、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（BD Biosciences社）によって完了した。アポトーシス細胞をヘキスト染色によっても分析した。ヘキスト３３３４２（１１ｇ／ｍｌ）を固定化された細胞に添加し、検体をガラス製のカバーグラスに乗せた。スライドをアポトーシス核についてＺｅｉｓｓ顕微鏡で観察した。アポトーシス細胞の割合は、アポトーシス細胞／総細胞数の比として計算した。
【０２６７】
結果：ＮＳＣ３４４５５３に対するＭＴＴ（細胞タイター９６）アッセイの結果を図１１に示す。これは、ＮＳＣ３４４５５３によるＡ３７５およびＣ８１６１黒色腫癌細胞に対する処理が用量依存的（範囲０．０５〜２５μＭ）に細胞生存率を抑制すること実証している。図６は、ＮＳＣ３４４５５３が膵臓（Ｐａｎｃ−１およびＭｉａＰａＣａ−２）および黒色腫（Ｃ８１６１およびＡ３７５）癌細胞の細胞生存率を抑制することを示す。
【０２６８】
図１０は、ＦＡＫ野生型およびヌル細胞ならびにＩＧＦ−１Ｒ野生型およびヌル細胞に対する０．０５μＭのＮＳＣ３４４５５３の７２時間の処理を示す。結果は、ＮＳＣ３４４５５３処理によってＦＡＫ＋／＋およびＩＧＦ−１Ｒ＋／＋線維芽細胞の増殖は減少するが、ＦＡＫ−／−およびＩＧＦ−１Ｒ−／−細胞に対する影響は生じなかったことを示す。
【０２６９】
ＭＴＴアッセイの結果は、ＮＳＣ３４４５５３による処理によって、ＡＫＴのリン酸化が減少し、かつ関連するＰＡＲＰ切断によって用量依存的（範囲０．０５〜１００μＭ）に細胞生存率が抑制されることを実証している。０．０５μＭのＮＳＣ３４４５５３によって、ＦＡＫ＋／＋およびＩＧＦ−１Ｒ＋／＋線維芽細胞の増殖は減少するが、ＦＡＫ−／−およびＩＧＦ−１Ｒ−／−細胞に対する影響はなかったことも認められた。さらに重要なことに、１５ｍｇ／ｋｇのＮＳＣ３４４５５３の５日間の腹腔内注射によって、ヌードマウスにおける黒色腫腫瘍を効果的に（ｐ＜０．０５）退行させた。
【０２７０】
ＮＳＣ２５０４３５に対するＭＴＴ（細胞タイター９６）アッセイの結果を図１３に示した。これは、ＮＳＣ２５０４３５がＡ３７５およびＣ８１６１黒色腫癌細胞の細胞生存率を抑制したことを実証している。
【０２７１】
実施例８
クローン原性アッセイ：この実験では、膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ−１、ＭｉａＰａＣａ−２、Ｐａｎｃ２．０３およびＰａｎｃ３．２７を使用する。細胞生存を明確するために、クローン原性アッセイを行って、細胞増殖恒常性を評価する（Chinnaiyan P. et al., Clin. Cancer Res. 2008; 14(17): 5410-5を参照）。クローン原性アッセイは、放射線誘発性細胞死の全ての形態を検出するため、放射線感受性分析の「至適基準」とみなされる。１）ＦＡＫ／ＩＧＦ−１Ｒ経路を抑制するために必要とされる最小の用量（ウェスタンブロットに基づく）、および２）最大下活性（細胞生存における２０％〜５０％の減少）を示す濃度を含む２種類の薬物濃度を使用する。細胞を、放射線の２４時間前に（ウェスタンブロットによって決定されたＦＡＫ／ＩＧＦ−１Ｒ活性化の阻害に必要とされる時間に基づく）、ＦＡＫ／ＩＧＦ−１Ｒ阻害剤に曝露する。放射線から２４時間後に、薬物を含む培地を新しい培地（薬物を含まない）と交換した。次いで、コロニー（≧５０細胞によって定義）を染色し、照射から１０〜１４日後に計数した。
【０２７２】
実施例９
放射線誘発性細胞遊走に対するＦＡＫ／ＩＧＦ−１Ｒ経路の阻害の効果
細胞運動を測定するために、２ウェルボイデン型チェンバー内でトランスウェル移動アッセイを行う。１×１０５細胞／ウェルを、５ｕＭの孔（２４ウェル）のトランスウェルの上部チャンバの孔のそれぞれの培地に播種し、３０分間付着させた。これらの細胞は、対照細胞および、ＦＡＫ／ＩＧＦ−１Ｒ阻害剤に２４時間予め曝露された細胞を含む。処理条件としては、処理なし、放射線療法（ＲＴ）単独、ＦＡＫ／ＩＧＦ−１Ｒ単独による阻害ならびにＲＴおよびＦＡＫ／ＩＧＦ−１Ｒ阻害剤の組み合わせが挙げられる。これらの細胞を放射線（２Ｇｙ、４Ｇｙ、６Ｇｙまたは８Ｇｙ）の段階的な線量に曝露し、２４時間のインキュベータに戻し、すすいで、固定する。ポリカーボネート膜上に残留している細胞は綿棒で除去する。孔を通って下面に移動した細胞をエタノール系クリスタルバイオレットで染色する。次いで、膜をマイクロスライド上に乗せ、計数する。
【０２７３】
実施例１０
免疫蛍光染色および共焦点顕微鏡法
細胞を３．７％パラホルムアルデヒドの１×ＰＢＳ溶液で１０分間固定し、０．５％トリトン(Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００で５分間透過処理した。次いで、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、２５％の正常なヤギ血清の１×ＰＢＳ溶液で２０分間ブロッキングし、一次抗体（２５％ヤギ血清で１：２００に希釈）と共に室温で３０分間インキュベートした。１×ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞をテキサスレッド（Texas Red）に結合した２次抗体（２５％ヤギ血清で１：４００に希釈）と共に室温で３０分間インキュベートし、１×ＰＢＳでさらに３回洗浄した後、顕微鏡で観察した。共免疫染色(coimmunostaining)実験のために、細胞を２５％ヤギ血清で１：１００に希釈した別の一次抗体と共に１時間インキュベートした。１×ＰＢＳで３回洗浄した後、イソチオシアン酸フルオレセインに結合した２次抗体（１：１００の希釈）をカバーグラスに塗布した。ＦＡＫおよびＩＧＦ−１Ｒ抗体で免疫染色された細胞を、ライカ共焦点顕微鏡およびＭＲＣ−１０２４共焦点レーザー自動読取りシステムを用いて共存について評価した。試験化合物の有無に関わらずＦＡＫ−ＣＤまたはＦＡＫｓｉＲＮＡで処理した細胞を、ＦＡＫ抗体で染色し、Ｚｅｉｓｓ顕微鏡を用いて接着斑からのＦＡＫの変位について評価した。
【０２７４】
結果：共焦点顕微鏡アッセイによって、ＦＡＫ−ＮＴおよびＦＡＫ−ＮＴ２構築物とＩＧＦ−１Ｒとの共存が存在することが実証される。重複の割合は、ＦＡＫ−ＮＴおよびＦＡＫ−ＮＴ２のトランスフェクションでは高く、これは、ＩＧＦ−１Ｒと共存するのはＦＡＫ−ＮＴ（より具体的にはＦＡＫ−ＮＴ２）であることを示している。共存は、ＦＡＫ−ＮＴ１、ＦＡＫ−ＮＴ３およびＦＡＫ−ＣＤでは低い。細胞をＮＳＣ２５０４３５の存在下でトランスフェクトした場合、ＦＡＫ−ＮＴ（より具体的にはＦＡＫ−ＮＴ２）とＩＧＦ−１Ｒとの相互作用の割合は約３０％まで有意に減少する。この結果は、ＮＳＣ２５０４３５がＦＡＫ−ＮＴ２とＩＧＦ−１Ｒとの相互作用を阻止することを実証している。
【０２７５】
実施例１１
ＦＡＫ／ＩＧＦ−１Ｒ経路の放射線誘発性活性化
２Ｇｙおよび１０Ｇｙの放射線の曝露後に、細胞を経時的に回収する。溶解物を回収し、ＦＡＫおよびＩＧＦ−１Ｒについて免疫沈降を行う。それらのそれぞれのリン酸化形態について細胞に対してウェスタンブロットを行う（Liu W. et al., Carcinogenesis, 2008; 29(6): 1096-1107を参照）。同様の研究を、ＦＡＫ／ＩＧＦ−１Ｒキナーゼおよび小分子阻害剤での細胞の前処理後に行う。ＲＴの後に、ＦＡＫ／ＩＧＦ−１Ｒに結合するタンパク質を明確するために質量分析を行う。次いで、放射線治療の存在下でＦＡＫ−ＩＧＦ−１Ｒ複合体に結合する特定されたタンパク質をｓｉＲＮＡを用いて標的化して、ＦＡＫ／ＩＧＦ−１Ｒ活性化および下流のシグナル伝達に対するその相対的な役割を決定する。
【０２７６】
分裂死
次いで、細胞／核形態学および抑制されたＧ２／Ｍチェックポイントの活性化によって、分裂死を評価する(Xu B. et al., Molecular and Cell Biology, 2002; 22(4): 1049-59)。分裂死の顕微鏡測定はヘキスト染色を用いて行い、多核細胞の割合によって定量化する(Castedo M., et al., Oncogene, 2004; 23(16): 2825-37)。
【０２７７】
細胞周期チェックポイントの活性化
放射線後、ＦＡＫ／ＩＧＦ−１Ｒ阻害剤に曝露した細胞における抑制されたＧ２／Ｍ期の停止は、フローサイトメトリーを用いて測定する。Ｇ２／Ｍ期（４ｎ）の細胞を個々のＭ期およびＧ２期成分に分離するために、ヨウ化プロピジウムおよび分裂期の間に特異的に発現されるリン酸化ヒストンＨ３による二重標識化を行う。この分析によって、Ｇ２細胞のＭ期への進行およびＧ２チェックポイントの活性化に対するＦＡＫ／ＩＧＦ−１Ｒ経路の影響の基準が得られる。
【０２７８】
ＤＮＡ損傷／修復
DNA DSBおよび修復の研究では、ＤＮＡ二重鎖切断とのその関係について、ヒストン変異体Ｈ２ＡＸ（γＨ２ＡＸと称される）のリン酸化形態を採用した。具体的には、γＨ２ＡＸ病巣を免疫蛍光法によって数分の放射線で検出することができ、これは二重鎖切断に直接関係していた。照射の２４時間後に測定したγＨ２ＡＸの残留レベル（または逆に言えば病巣の分散）は、放射線の感受性に相関していることが以前から知られている(Banath JP, et al., Cancer Res., 2004; 64(19): 7144-9)。DNA DSB修復に対するＦＡＫ／ＩＧＦ−１Ｒ経路阻害の影響は、γＨ２ＡＸ病巣動態を明確することによって測定する（Chinnaiyan P. et al., Clin. Cancer Res. 2008; 14(17): 5410-5を参照）。
【０２７９】
実施例１２
構造に基づくコンピュータによる分子モデル化およびコンピュータドッキング
以前の調査から、ＦＡＫのアミノ末端（アミノ酸１２７〜２４３、ＦＡＫ−ＮＴ２）がＩＧＦ−１Ｒの細胞質内部分の一部（アミノ酸９５９〜１２６６）に直接結合することが実証されている（２１）。ＮＣＩ開発治療プログラムのデータベースからの化合物をＤＯＣＫ５．１プログラム用いて分析して、予測されるＦＡＫ−ＮＴ２／ＩＧＦ−１Ｒ界面上のＦＡＫ−ＦＥＲＭに推定的に結合するものを特定した（図１５Ａ）。高い確率で界面に結合する化合物をＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの相互作用を阻害するそれらの能力についてスクリーニングした。その後、ＩＮＴ２−３１（ＮＳＣ３４４５５３）が、最も強力なＦＡＫ／ＩＧＦ−１Ｒ結合阻害剤として特定された。この化合物の分子量は、３７７．３１ｇ／ｍｏｌであり、分子式はＣ１２Ｈ１６Ｎ３Ｏ７ＰＳである。この構造を図１５Ａに示す。ＦＡＫ−ＮＴ２への結合の際のＩＮＴ２−３１の全ての立体配置の分子間エネルギーを静電気およびファンデルワールスエネルギーの合計として計算し、ＦＡＫ−ＮＴ２との相互作用の予測される最も低いエネルギーとしては、ファンデルワールス電荷が−１６．２８、静電荷が−３３．８４である−５０．１２の予測スコアが挙げられる。
【０２８０】
実施例１３
ＩＮＴ２−３１は、ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの相互作用を阻止する
ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとのタンパク質間相互作用を阻止するＩＮＴ２−３１の作用強度を、タグを付けた精製タンパク質構築物を用いるプルダウンアッセイで評価した。ＩＮＴ２−３１は、３．９６μＭの平均ＩＣ５０を有する精製されたＧＳＴ−ＦＡＫ−ＮＴ２とＩＧＦ−１Ｒβとの結合において用量依存的な減少を引き起こした（図１５Ｂ）。試験管内での薬物の効果を特徴づけるために、２種類の黒色腫細胞株を評価した。ＩＮＴ２−３１は、ＦＡＫに対する抗体を用いる免疫沈降によって実証されているように、低マイクロモル濃度（平均ＩＣ５０はそれぞれ２．７２および３．１７μＭ）で、Ｃ８１６１およびＡ３７５黒色腫癌細胞における結合を阻止した（図１５Ｃおよび図１５Ｄ）。
【０２８１】
さらに、食道癌、膵臓癌および乳癌細胞株の生存率に対するＩＮＴ２−３１の効果を分析し、表１に示すように、各細胞株のＩＣ５０値を測定した。平均ＩＣ５０値を得るために、三つ組で各細胞株を漸増濃度の本化合物で７２時間処理し、３回の別々の実験からのＩＣ５０値の平均を計算した。黒色腫の結果と同様に、ＩＮＴ２−３１は正常な細胞と比較して癌細胞において、より生存率を抑制する。ＩＮＴ２−３１に対する細胞の感受性は異なり、細胞のＦＡＫおよびＩＧＦ−１Ｒ発現レベルに直接相関していた。
【表１】
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【０２８２】
実施例１４
ＩＮＴ２−３１は黒色腫細胞の生存率を減少させる
黒色腫癌細胞の生存率に対する効果を測定するために、３種類のヒトの黒色腫細胞株を漸増用量のＩＮＴ２−３１に７２時間曝露し、その結果をヒトのメラニン形成細胞と比較した。図１６Ａに示すように、ＩＮＴ２−３１は、正常な細胞よりも癌細胞において生存率を抑制する。各細胞株を三つ組で漸増濃度の本化合物で７２時間処理し、平均ＩＣ５０値を３回の別々の実験から計算した。全ての３種類の黒色腫細胞株は、ＦＡＫおよびＩＧＦ−１Ｒの発現を上方制御し、正常なヒトのメラニン形成細胞と比較して、ＩＮＴ２−３１に対する感受性を増加させた（図１６Ｂ）。ＩＮＴ２−３１の効果は３種類の細胞株において異なり、ＦＡＫおよびＩＧＦ−１Ｒの最も高い発現を有する最も感受性が低い細胞株（ＳＫ−ＭＥＬ−２８）による構成性ＦＡＫおよびＩＧＦ−１Ｒ活性化に関係していると思われた。
【０２８３】
実施例１５
ＩＮＴ２−３１は黒色腫癌細胞の増殖を阻害し、かつＦＡＫおよびＩＧＦ−１Ｒの存在に依存する効果を有する
細胞増殖に対するＩＮＴ２−３１の効果を評価するために、ＣＳＦＥ細胞分布アッセイを行った。図１６Ｃに示すように、ＩＮＴ２−３１はＣ８１６１およびＡ３７５細胞において細胞増殖を阻害したが、その効果はＣ８１６１細胞においてより高かった。ＩＮＴ２−３１処理による細胞数の評価によって、Ｃ８１６１黒色腫細胞の増殖の時間および用量依存的な強力な阻害が実証された（図１６Ｄ）。これらの結果は、ＭＴＴアッセイによって認められた結果に類似していた（図１６Ａ）。
【０２８４】
ＩＮＴ２−３１の効果がＦＡＫを発現している細胞に特異的であることを示すために、Ｃ８１６１細胞をＦＡＫｓｈＲＮＡ構築物でトランスフェクトし、それによりＦＡＫの一過性のノックダウンが生じた（図１７Ａ）。ＦＡＫｓｈＲＮＡ２と比較してＦＡＫノックダウン効率がより大きかったため、ＦＡＫｓｈＲＮＡ１をＭＴＴアッセイに利用した。ＦＡＫｓｈＲＮＡを発現しているＣ８１６１細胞は、ＩＮＴ２−３１の効果に対して、親および偽のトランスフェクト細胞よりも感受性が有意に低かった（図１７Ｂ）。これらの発見を、ＦＡＫ野生型およびヌル線維芽細胞を用いて確認した。ＦＡＫ野生型線維芽細胞は、ＩＮＴ２−３１の効果に対して、ＦＡＫヌル線維芽細胞よりも感受性が有意に低かった（図１７Ｃ）。ＩＧＦ−１Ｒに対する特異性も、ＩＧＦ−１Ｒ発現(proficient)および欠損線維芽細胞の処理の間に示された。ＩＧＦ−１Ｒ−／−線維芽細胞は、ＩＧＦ−１Ｒ＋／＋細胞よりもＩＮＴ２−３１効果に対して感受性が有意に低かった（ｐ＜０．０５、図１７Ｄ）。
【０２８５】
実施例１６
ＩＮＴ２−３１はアポトーシスを誘発する
処理した細胞の剥離に対するＩＮＴ２−３１の効果を測定した。Ｃ８１６１黒色腫細胞の剥離は、漸増濃度のＩＮＴ２−３１の存在下で測定した。図１８Ａに示すように、Ｃ８１６１細胞の７％のみが、５μＭによるＩＮＴ２−３１による７２時間の処理後にプレートから剥離した。ＩＮＴ２−３１の効果は、ＦＡＫおよびＩＧＦ−１Ｒキナーゼ二重阻害剤、すなわちＴＡＥ２２６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ社、バーゼル）よりも有意に低かった。アポトーシスに対するＩＮＴ２−３１の効果は、５μＭの用量での処理から７２時間後のヘキスト陽性細胞の検出によって示されるように、５０％を超えるアポトーシスの誘発により顕著である（図１８Ｂ）。これは、共焦点顕微鏡法によって検出された１μＭおよび５μＭのＩＮＴ２−３１による７２時間の処理後に、カスパーゼ３／７活性化分析によって確認した（図１８Ｃ）。最後に、ＩＮＴ２−３１の効果をウェスタンブロットによって評価した。図１８Ｄは、４８時間のＩＮＴ２−３１処理後のＰＡＲＰおよびカスパーゼ−９切断を示す。ＩＮＴ２−３１の有意な効果はカスパーゼ８レベルに対しては認められなかった。
【０２８６】
実施例１７
ＩＮＴ２−３１はキナーゼ活性を阻害することなくＡｋｔの活性化を減少させる
ＦＡＫおよびＩＧＦ−１Ｒ経路エフェクターに対するＩＮＴ２−３１の効果を、異なる濃度および処理時間において３種類の黒色腫細胞株で分析した（図１９）。ＩＮＴ２−３１処理によってＡＫＴへの構成性およびＩＧＦ−１誘発性シグナル伝達の一貫した阻害が引き起こされた。なお、ＦＡＫの構成性リン酸化またはＩＧＦ−１Ｒの構成性もしくはＩＧＦ−１誘発性リン酸化に対するＩＮＴ２−３１の有意な効果は認められなかった。さらに、Ａｋｔに対する顕著な効果は認められたが、ＥＲＫに対するシグナル伝達に対する効果はより低く、高用量による全ての細胞株におけるｐ−ＥＲＫの減少は僅かであった。ｐ−Ａｋｔに対するＩＮＴ２−３１の効果は、０．５〜１μＭの処理によるｐ−Ａｋｔの有意な阻害を有するＣ８１６１細胞に関する細胞増殖、生存率およびアポトーシスに対する効果と相関していたが、Ａ３７５およびＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞においてｐ−Ａｋｔを有意に減少させるためには、より高用量のＩＮＴ２−３１が必要であった（それぞれ１〜５μＭおよび５〜１０μＭ）。
【０２８７】
Ａｋｔリン酸化に対するＩＮＴ２−３１処理の経時的分析によって、７２時間後に持続した効果を有する処理の２４時間後にいくらかの脱リン酸化が明らかとなった（図１９Ｅ）。
【０２８８】
その後、ＦＡＫ、ＩＧＦ−１Ｒ、インスリン受容体、ＶＥＧＦＲ−１、ＡＫＴ−１、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ−２、ｃ−ＭＥＴ、ＰＤＧＦＲａ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＳｒｃおよびＰＩ３キナーゼのキナーゼ活性に対するこの化合物の効果を測定した（図１９Ｄ）。１μＭの用量において、この化合物は、ＦＡＫまたはＩＧＦ−１Ｒのキナーゼ活性を阻害せず、２２％を超えて他のタンパク質キナーゼのいずれも阻害しなかった。従って、ＩＮＴ２−３１は、それらのキナーゼ活性を阻害することなくＦＡＫおよびＩＧＦ−１Ｒの結合を阻止し、用量および時間依存的に黒色腫細胞の生存率を抑制した。
【０２８９】
さらに、ＩＮＴ２−３１は、ＦＡＫのＮＴ２領域（アミノ酸１２７〜２４３）に特異的に結合して、ＩＧＦ−１Ｒとの相互作用を阻止し、かつＡｋｔのリン酸化を減少させることを確認するために、Ｃ８１６１細胞をＦＡＫのＮ末端（ＦＡＫ−ＮＴ１、ＦＡＫ−ＮＴ２およびＦＡＫ−ＮＴ３）の３種類のＧＦＰ断片でトランスフェクトした。図１９Ｆおよび図１９Ｇに示すように、ＦＡＫ−ＮＴ１およびＮＴ３過剰発現細胞と比較して、ＦＡＫ−ＮＴ２断片の過剰発現によって、ＡＫＴのＩＧＦ−１誘発性リン酸化が減少した。
【０２９０】
実施例１８
ＩＮＴ２−３１によって腫瘍ｐ−Ａｋｔおよび黒色腫異種移植片の増殖が減少する
図２０Ａおよび図２０Ｂに示すように、２１日間にわたる１５ｍｇ／ｋｇのＩＮＴ２−３１の１日１回の腹腔内注射によって、ＰＢＳ対照注入を受けているマウスと比較して、Ｃ８１６１およびＡ３７５皮下腫瘍成長における有意な減少が生じた（ｐ＜０．０５）。この濃度では、各群の動物間で体重における有意差が認められなかったため、薬物は深刻な毒性作用を有していなかった。細胞増殖に対するＩＮＴ２−３１の生体内効果を評価するために、Ｃ８１６１異種移植片をＫｉ６７抗体で染色した（図２０Ｃ）。Ｋｉ６７に対する細胞の反応率およびＫｉ６７の染色強度は、ＰＢＳ（対照）で処理したマウスに対して、ＮＴ２−３１で処理したマウスからの腫瘍において有意に減少した。さらに、アポトーシス細胞の割合は、対照と比較して、ＩＮＴ２−３１で処理された腫瘍において有意に増加した（図２０Ｃ、ｐ＜０．０５）。これにより、ＩＮＴ２−３１によって増殖が減少し、かつ癌細胞のアポトーシスが増加することを実証している生体外データが裏付けられた。Ｃ８１６１腫瘍における生体内でのＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの相互作用に対するＩＮＴ２−３１の効果を、処理群または未処理群の腫瘍からのＦＡＫの免疫沈降によって分析した。ＩＧＦ−１Ｒのウェスタンブロットによって、ＦＡＫおよびＩＧＦ−１Ｒの免疫共沈降の減少が実証される。各腫瘍におけるＩＧＦ−１Ｒ／ＦＡＫの比の光学濃度測定は、ＰＢＳで処理した（０．９８＋／−０．１１、ｐ＝０．０９）腫瘍試料と比較して、ＩＮＴ２−３１で処理した（０．７８＋／−０．１６）腫瘍試料における平均比の減少を示した。最後に、ＡＫＴ活性化の腫瘍分析を行い、ｐ−ＡＫＴのレベルをウェスタンブロットによって検出した。分析は、ＰＢＳ対照で処理した動物に対してＩＮＴ２−３１で処理した動物におけるＡＫＴのリン酸化の減少を実証した（図２０Ｄ）。従って、本発明者らのリード化合物（ＴＮＴ２−３１）によって、生体内での腫瘍成長は減少し、ＦＡＫとＩＧＦ−１Ｒとの生体内相互作用は阻止され、その結果、ＡＫＴのリン酸化が減少する。
【０２９１】
実施例１９
化学療法に対するＩＮＴ２−３１感受性癌細胞
Ａｋｔ脱リン酸化に対するＩＮＴ２−３１の効果を評価し、かつ従来の化学療法に対する細胞の感受性に相関させるために、細胞生存率およびアポトーシスに対する併用療法の効果について食道および膵臓癌細胞株を分析した。ＫＹＳＥ７０および１４０の食道癌細胞はどちらも、ＩＮＴ２−３１および５−ＦＵ処理に対して感受性が高く、０．５および１μＭのＩＮＴ２−３１は、５−ＦＵとの相乗効果を有していた（図２１）。本発明者らの膵臓癌細胞では、ゲムシタビンと併用した場合にＩＮＴ２−３１の細胞生存率に対する効果は付加的なものであったが（データは示さず）、ＩＮＴ２−３１は、１μＭの濃度で５−ＦＵ化学療法との相乗効果を有していた（図２１および図２２）。
【０２９２】
実施例２０
生体外および生体内でのＩＮＴ２−３１処理による食道癌の生存率および増殖の阻害
食道癌は、ＦＡＫおよびＩＧＦ−１Ｒを過剰発現させることが知られている。直接的な患者検体において、これらのタンパク質の相互作用を標的とするという効果を同じにするために、直接的な食道癌の検体をマウスおよび組織培養プレート内で増殖させて、実験のために新しいヒトの組織を可能にするシステムを開発した。２０種類を超える腫瘍および対応する正常な組織検体が癌患者から得られた。試料の免疫組織化学的分析およびウェスタンブロット分析によっても、正常組織と比較して、腫瘍試料におけるＦＡＫおよびＩＧＦ−１Ｒのレベルの増加が実証された。患者検体に対するＩＮＴ２−３１の生体外効果を評価するために、最大８継代まで組織培養プレート内で増殖させた細胞のＭＴＴアッセイを利用した。食道癌患者＃５のＭＴＴアッセイの代表的な結果を図２３Ａに示す。漸増濃度のＩＮＴ１−３１によって細胞の生存率は効果的に減少し、平均ＩＣ５０値は２．１８μＭであった。
【０２９３】
その後、食道癌患者＃５の検体の生体内での腫瘍成長の阻害を評価した。方法のセクションに記載しているように、新しいヒトの食道腺癌腫瘍試料からの小片（０．３×０．３×０．３ｃｍ）を２匹のマウスの皮下に移植した。これらの腫瘍のうちの１つが１．５ｃｃ３に達したら、それを切除し、小片（０．３×０．３×０．３ｃｍ）に切断し、さらに１０匹のマウスに皮下移植した。腫瘍が約１００ｍｍ３に達したら、マウスを２つの群（各群に５匹のマウス）に無作為化した。図２３Ｂに示すように、２１日間にわたる５０ｍｇ／ｋｇのＩＮＴ２−３１の１日１回の腹腔内注射によって、ＰＢＳ対照の注入を受けているマウスと比較して、新しい食道腺癌の腫瘍成長が有意に減少した（ｐ＜０．０５）。この濃度では、各群の動物間で体重における有意差が認められなかったため、薬物は深刻な毒性作用を有していなかった。細胞増殖に対するＩＮＴ２−３１の生体内効果を評価するために、食道癌患者＃５の腫瘍検体異種移植片をＫｉ６７抗体で染色した。図２３Ｃに示すように、腫瘍の免疫組織化学的染色によって、Ｋｉ６７に対する細胞の反応率は、ＰＢＳ群と比較して、ＩＮＴ２−３１で処理したマウスからの腫瘍において有意に減少したことが実証された。これによって、本薬物が癌細胞の増殖を減少させるという本発明者らの生体外のデータおよび黒色腫モデルに関する生体内のデータが裏付けられた。
【０２９４】
実施例２１
ＩＮＴ２−３１処理による同所性膵臓異種移植片の阻害
ＩＮＴ２−３１の活性および特異性をさらに検証するために、同所性マウスモデルを用いた。膵臓癌細胞株、ＭｉａＰａＣａ−２およびＰａｎｃ−１細胞を、異種移植片の生体内での画像化のために、ルシフェラーゼ−ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）レポーター遺伝子を用いて安定的にトランスフェクトした。ＲＦＰ陽性細胞の増殖および選別後、細胞を培養液中で増殖させ、５×１０６腫瘍細胞を１４匹のマウスの膵臓に移植した。材料および方法のセクションに記載されているように、マウスをＩＶＩＳ管腔内撮像装置によって、週１回撮像し、腫瘍の大きさを生物発光信号によって推定した。腫瘍が約１００ｍｍ３に達したら、マウスを以下の２つの群（各群に７匹のマウス）、すなわち対照および１５ｍｇ／ｋｇのＩＮＴ２−３１に無作為化した。図２４に示すように、２１日間にわたって１日１回、５０ｍｇ／ｋｇのＭｉａｐａｃａ２の腹腔内投与による処理および１５ｍｇ／ｋｇのＩＮＴ２−３１の皮下注射によって、動物の体重および外見によって判断される任意の顕著な副作用を生じることなく同所性膵臓異種移植片の増殖は十分に減少した。
【０２９５】
参照による組み込み
本出願全体にわたって引用されている全ての参考文献（論文(literature reference)、交付済み特許、公開された特許出願および同時係属中の特許出願を含む）の内容は全て、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【０２９６】
実施形態および均等物
本明細書中の化学基の列挙に関する記載は、任意の単一の基または列挙されている基の組み合わせの定義を含む。本明細書中の一実施形態の記載は、任意の単一の実施形態としてあるいは任意の他の実施形態またはそれらの一部との組み合わせとしてのその実施形態を含む。
【０２９７】
特定の実施形態を参照しながら本発明を開示してきたが、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明の他の実施形態および変形が他の当業者によって考案され得ることは明らかである。特許請求の範囲は、そのような実施形態および等価な変形を含むように解釈されることが意図されている。
【０２９８】
当業者であれば、本明細書中の記載されている本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識し、かつ日常の実験のみを用いてそれらを確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図されている。
【０２９９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図１９Ｇ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【国際調査報告】
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