(57)【要約】  本発明の目的は、パルサー法の、捕捉された被験遺伝子に結合しない状態でもポリマーが形成され、非特異的なシグナルとして定量性に影響を及ぼす可能性があるという問題点を解決するために、プローブ同志の集合体（ポリマー）を形成させる工程において、ポリマーの形成を制御して被験遺伝子上でのみポリマーを形成させる手法を開発し、感度と定量性を向上させることにある。  相互に相補結合能を有する複数種のプローブを反応させポリマーを形成させる工程において、それらプローブを一緒に加えて反応させるのではなく、まず一方の第１プローブを反応させて後、他方の第２プローブを反応させ、次いで第１プローブ、次いで第２プローブと、プローブを一種類ずつ順番に反応させてポリマーを形成させることにより、定量的にポリマーを形成させ非特異的反応を抑制することを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
互いに相補的塩基配列領域を有し互いに相補的結合能を有する複数種のプローブを反応させてポリマーを形成させる方法であって、該プローブの少なくとも１種を被験遺伝子に固定化した後、該複数種のプローブを１種類ずつ順番に反応させ、ポリマーを形成することを特徴とするシグナルプローブポリマーの形成方法。
【請求項２】
前記複数種のプローブが、３箇所の相補的塩基配列領域Ｘ，Ｙ及びＺからなる、下記化学式（１）の構造を有するプローブ−１と、３箇所の相補的塩基配列領域Ｘ’，Ｙ’及びＺ’からなる、下記化学式（２）の構造を有するプローブ−２であり、該プローブ−１と該プローブ−２を１種類ずつ順番に反応させ、ポリマーを形成することを特徴とする請求項１記載の方法。
【化１】
2006028162.tif 000033
【化２】
2006028162.tif 000034
（式（１）及び式（２）において、ＸとＸ’、ＹとＹ’及びＺとＺ’はそれぞれ互いに相補的塩基配列を有する。）
【請求項３】
前記複数種のプローブが、下記化学式（３）の構造を有するダイマープローブ−１と、下記化学式（４）又は下記化学式（５）の構造を有するダイマープローブ−２であり、該ダイマープローブ−１と該ダイマープローブ−２を１種類ずつ順番に反応させ、ポリマーを形成することを特徴とする請求項１記載の方法。
【化３】
2006028162.tif 000035
【化４】
2006028162.tif 000036
【化５】
2006028162.tif 000037
（式（３）〜式（５）においてＡとＡ’、ＢとＢ’、ＣとＣ’、ＤとＤ’、ＥとＥ’及びＦとＦ’はそれぞれ互いに相補的塩基配列を有する。）
【請求項４】
前記複数種のプローブが、下記化学式（６）の構造を有するダイマープローブ−３と、下記化学式（７）又は下記化学式（８）の構造を有する２本の架橋プローブであり、該ダイマープローブ−３と該架橋プローブを１種類ずつ順番に反応させ、ポリマーを形成することを特徴とする請求項１記載の方法。
【化６】
2006028162.tif 000038
【化７】
2006028162.tif 000039
【化８】
2006028162.tif 000040
（式（６）〜式（８）において、ＡとＡ’、ＢとＢ’、ＣとＣ’、ＤとＤ’及びＦとＦ’はそれぞれ相補的塩基配列を有する。）
【請求項５】
前記ポリマー形成に使用するプローブが、標識物質で標識されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記標識物質が放射性同位元素、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光物質、発光物質又は色素であることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記ポリマー形成に使用するプローブ中の一つのプローブの一部又は全てと同じ塩基配列及び被験遺伝子と相補的な塩基配列を有する固定化用プローブを被験遺伝子に固定化した後、該固定化したプローブに前記複数種のプローブを１種類ずつ順番に反応させ、ポリマーを形成することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載の方法により形成されることを特徴とするポリマー。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項記載の方法でポリマーを形成させ、形成されたポリマー量を測定することにより被験遺伝子を測定することを特徴とする被験遺伝子の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、互いに相補的塩基配列領域を保有する複数種のオリゴヌクレオチドを、順次反応させてプローブ同士の集合体（ポリマー）を形成させる方法であって、試料中の被験遺伝子の検出に利用できるシグナルプローブポリマーの形成方法、該方法により形成されるポリマー、及び被験遺伝子の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料中の微量の遺伝子を検出する方法として、核酸合成酵素を用いて遺伝子を増幅するPolymerase chain reaction法があり、さらに改良された多くの遺伝子検出法が報告されている。また、一本鎖ＤＮＡを枝分かれさせたオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションさせて遺伝子を検出する方法などもいくつか報告されている（非特許文献１、２）。【０００３】
一方、薄井らは酵素を使用しない新規な等温核酸増幅法を報告している（特許文献１〜４）。この方法は、互いに相補的塩基配列領域を保持させた複数種のオリゴヌクレオチド（プローブという）を自己集合反応させてプローブ同士の集合体（ポリマー）を形成させる方法であり、該ポリマーを定量することにより、試料中の被験遺伝子の検出に応用するものである。この方法は、例えば、使用するプローブの相補的塩基配列領域の１箇所を試料中の被験遺伝子と相補的塩基配列とすることにより、該プローブと被験遺伝子とを結合させてからプローブのポリマーを形成させることにより被験遺伝子を有効に検出する方法であって、パルサー（PALSAR）法と呼ばれている。【０００４】
このパルサー法は使用するプローブの種類により大きく３つに分類される。第１の種類のプローブとしては、下記化学式（１）及び化学式（２）に示される３箇所の相補的塩基配列領域からなる２本のオリゴヌクレオチドであり（プローブ−１、プローブ−２という）、領域ＸとＸ’、ＹとＹ’、ＺとＺ’は互いに相補的塩基配列を有していることにより、互いに相補結合して下記化学式（９）に示されるポリマーを形成することができる（特許文献１及び２、以下パルサーIと称す）。
【化１】
2006028162.tif 000002
【化２】
2006028162.tif 000003
【化３】
2006028162.tif 000004
【０００５】
第２の種類のプローブとしては、下記化学式（３）及び化学式（４）に示される相補的塩基配列領域を有する２種類のプローブ（ダイマープローブ−１、ダイマープローブ−２という）であって、ここで、領域ＡとＡ’、ＢとＢ’、ＣとＣ’、ＤとＤ’、ＥとＥ’、ＦとＦ’が相補的塩基配列を保持させることにより、互いに相補結合して化学式（９）に示されるポリマーを形成することができる（特許文献３、以下パルサーIIと称す）。
【化４】
2006028162.tif 000005
【化５】
2006028162.tif 000006
【化６】
2006028162.tif 000007
【０００６】
第３の種類のプローブとしては、下記化学式（６）に示される一つのダイマープローブ（ダイマープローブ−３という）と下記化学式（７）に示される２本のオリゴヌクレオチド（架橋プローブという）であり、ここで、領域ＡとＡ’、ＢとＢ’、ＣとＣ’、ＤとＤ’、ＦとＦ’が相補的塩基配列を保持させることにより、互いに相補結合して化学式（１０）に示されるポリマーを形成することができる（特許文献４、以下パルサーIIIと称す）。
【化７】
2006028162.tif 000008
【化８】
2006028162.tif 000009
【化９】
2006028162.tif 000010
【０００７】
該パルサー法を利用して試料中の被験遺伝子を検出する方法の一例は、例えば２種のプローブを使用する場合、支持体に固定した捕捉用オリゴヌクレオチドと試料を反応させて該遺伝子を捕捉する。この際、捕捉用オリゴヌクレオチドは被験遺伝子と相補的塩基配列領域を保有する。次いで、該遺伝子の塩基配列（捕捉用オリゴヌクレオチドと結合した部分ではない）と相補的塩基配列領域を一つの領域として保有する一方のプローブを反応させて該遺伝子と結合させる。次いで相補結合能を有する両方のプローブを添加してポリマーを形成させ、該ポリマー量を定量することにより、該遺伝子を測定するものである。
しかしながら、このユニークなパルサー法において、相補結合能を有する複数種のプローブを反応液に添加しポリマー形成反応を実施したとき、捕捉された被験遺伝子以外の箇所、いわゆる、被験遺伝子に結合しない状態でポリマーが形成される可能性があり、その結果、非特異的なシグナルとして定量性に影響を及ぼすことが懸念された。
【特許文献１】特許第３，２６７，５７６号
【特許文献２】国際公開第０１／７５１５７号明細書
【特許文献３】国際公開第０２／３１１９２号明細書
【特許文献４】特開２００２−３５５０８１号公報
【非特許文献１】Shchepinov et.al ,Nuc. Acids Res. 1997, 25, 4447-4454
【非特許文献２】Stears et. al, Physiol. Genomics, 2000, 3:93-99
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、上記のパルサー法の問題点を解決し、プローブ同士の集合体（ポリマー）を形成させる工程において、ポリマーの形成を制御して被験遺伝子上でのみポリマーを形成させる手法を開発し、感度と定量性を向上させることにある。
即ち、本発明は、ポリマーの形成を制御し非特異反応を抑制することが可能なシグナルプローブポリマーの形成方法、該方法により形成されるポリマー、並びに優れた検出感度及び定量性を有する被験遺伝子の測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記問題に鑑み本発明者らは鋭意研究の結果、相互に相補結合能を有する複数種のプローブを反応させポリマーを形成させる工程において、それらプローブを一緒に加えて反応させるのではなく、まず一方の第１プローブを反応させて後、他方の第２プローブを反応させ、次いで第１プローブ、次いで第２プローブと、プローブを一種類ずつ順番に反応させてポリマーを形成させることにより、定量的にポリマーを形成させ非特異的反応を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１０】
すなわち本発明のシグナルプローブポリマーの形成方法は、互いに相補的塩基配列領域を有し互いに相補的結合能を有する複数種のオリゴヌクレオチド（プローブという）を反応させてポリマーを形成させる方法であって、該プローブの少なくとも１種を被験遺伝子に固定化した後、該複数種のプローブを１種類ずつ順番に反応させ、ポリマーを形成することを特徴とする。なお、被験遺伝子にプローブを固定化する手法は特に限定されず、ポリマー形成に使用する複数種のプローブの一方と被験遺伝子とが、直接的又は間接的に結合している状態であればよい。本明細書中でシグナルプローブポリマーとは、複数種のプローブにより形成される前記集合体（ポリマー）を言う。【００１１】
前記複数種のプローブが、３箇所の相補的塩基配列領域Ｘ，Ｙ及びＺからなる、下記化学式（１）の構造を有するプローブ−１と、３箇所の相補的塩基配列領域Ｘ’，Ｙ’及びＺ’からなる、下記化学式（２）の構造を有するプローブ−２であり、該プローブ−１と該プローブ−２を１種類ずつ順番に反応させ、ポリマーを形成することが好ましい。
【化１０】
2006028162.tif 000011
【化１１】
2006028162.tif 000012
（式（１）及び式（２）において、ＸとＸ’、ＹとＹ’及びＺとＺ’はそれぞれ互いに相補的塩基配列を有する。）【００１２】
また、前記複数種のプローブが、下記化学式（３）の構造を有するダイマープローブ−１と、下記化学式（４）又は下記化学式（５）の構造を有するダイマープローブ−２であり、該ダイマープローブ−１と該ダイマープローブ−２を１種類ずつ順番に反応させ、ポリマーを形成することが好適である。
【化１２】
2006028162.tif 000013
【化１３】
2006028162.tif 000014
【化１４】
2006028162.tif 000015
（式（３）〜式（５）においてＡとＡ’、ＢとＢ’、ＣとＣ’、ＤとＤ’、ＥとＥ’及びＦとＦ’はそれぞれ互いに相補的塩基配列を有する。）【００１３】
前記複数種のプローブが、下記化学式（６）の構造を有するダイマープローブ−３と、下記化学式（７）又は下記化学式（８）の構造を有する２本の架橋プローブであり、該ダイマープローブ−３と該架橋プローブを１種類ずつ順番に反応させ、ポリマーを形成することが好ましい。
【化１５】
2006028162.tif 000016
【化１６】
2006028162.tif 000017
【化１７】
2006028162.tif 000018
（式（６）〜式（８）において、ＡとＡ’、ＢとＢ’、ＣとＣ’、ＤとＤ’及びＦとＦ’はそれぞれ相補的塩基配列を有する。）【００１４】
本発明のシグナルプローブポリマーの形成方法において、前記ポリマー形成に使用するプローブが、標識物質で標識されていることが好ましく、前記標識物質が放射性同位元素、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光物質、発光物質又は色素であることがより好ましい。【００１５】
また、本発明のシグナルプローブポリマーの形成方法において、前記ポリマー形成に使用する複数種のプローブ中の一つのプローブの一部又は全てと同じ塩基配列及び被験遺伝子と相補的な塩基配列を有する固定化用プローブを被験遺伝子に固定化した後、該固定化したプローブに前記複数種のプローブを１種類ずつ順番に反応させ、ポリマーを形成することが好適である。【００１６】
前記複数種のプローブが、前記プローブ−１及び前記プローブ−２であり、前記固定化用プローブが前記プローブ−１の一部又は全てと同じ塩基配列及び被験遺伝子と相補的な塩基配列を有することが好ましい。また、前記複数種のプローブが、前記ダイマープローブ−１及び前記ダイマープローブ−２であり、前記固定化用プローブが前記ダイマープローブ−１又は２の一部又は全てと同じ塩基配列及び被験遺伝子と相補的な塩基配列を有することが好ましい。さらに、前記複数種のプローブが、前記ダイマープローブ−３及び前記架橋プローブであり、前記固定化用プローブがダイマープローブ−３又は前記架橋プローブの一部又は全てと同じ塩基配列及び被験遺伝子と相補的な塩基配列を有することが好ましい。【００１７】
本発明のポリマーは、本発明のシグナルプローブポリマーの形成方法により形成されることを特徴とする。【００１８】
本発明の被験遺伝子の測定方法は、本発明のシグナルプローブポリマーの形成方法を用いてポリマーを形成させ、形成されたポリマー量を測定することにより被験遺伝子を測定することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、自己集合能を有する複数種のプローブを用いてポリマーを形成させる反応工程において、プローブを１種類ずつ順番に反応させることにより、ポリマー形成及び検出感度を制御し、非特異的反応を抑制して、定量性と再現性を向上させることができる。さらに、ポリマーを形成させる反応工程において、各種のプローブを含む溶液を再利用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】被検遺伝子に固定化したプローブの模式図である。
【図２】本発明のシグナルプローブポリマーの形成方法の一例を示す概略説明図である。
【図３】実施例１の結果を示すグラフである。
【図４】実施例２で用いた２組のダイマーα及びβを示す概略説明図である。
【図５】実施例２のシグナル増幅反応工程における第１の反応を示す概略説明図である。
【図６】実施例２のシグナル増幅反応工程における第２の反応を示す概略説明図である。
【図７】実施例２のシグナル増幅反応工程における第３の反応を示す概略説明図である。
【図８】実施例２の結果を示すグラフである。
【図９】実施例３で用いた１組のダイマーγ及び１組の架橋プローブを示す概略説明図である。
【図１０】実施例３のシグナル増幅反応工程における第１の反応を示す概略説明図である。
【図１１】実施例３のシグナル増幅反応工程における第２の反応を示す概略説明図である。
【図１２】実施例３のシグナル増幅反応工程における第３の反応を示す概略説明図である。
【図１３】実施例３のシグナル増幅反応工程における第４の反応を示す概略説明図である。
【図１４】実施例３の結果を示すグラフである。
【符号の説明】
【００２１】
１０：被験遺伝子、１２：捕捉用オリゴヌクレオチド、１４：固定化用プローブ、１６：支持体、２０：固定化したプローブ、２２：第１プローブ、２４：第２プローブ、２６：第１プローブ反応槽、２８：第２プローブ反応槽、３０：ビオチン、３２：アビジン、４０：ダイマーα、４１：ダイマーβ、４２：ダイマー形成用プローブ−１、４４：ダイマー形成用プローブ−２、４６：ダイマー形成用プローブ−３、４８：ダイマー形成用プローブ−４、５０：捕捉用オリゴヌクレオチド−１、５１：支持体、５２：固定化用プローブ−２、５４：固定化用プローブ−３、５６：被験遺伝子、６０：ダイマーγ、６２：ダイマー形成用プローブ−５、６４：ダイマー形成用プローブ−６、６６：架橋プローブ−１、６８：架橋プローブ−２、７０：固定化用プローブ−３。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下に本発明の実施の形態を説明するが、本発明の技術思想から逸脱しない限り種々の変形が可能であることはいうまでもない。以下に、（１）被験遺伝子にプローブを固定化する方法、（２）ポリマーを形成させる方法、（３）ポリマー量を測定する方法について順次説明する。【００２３】
（１）被験遺伝子にプローブを固定化する方法
パルサー法は試料中の被験遺伝子の測定を主な目的とする。本明細書中で、「固定化したプローブ」とは、使用するプローブの一方が測定される被験遺伝子に直接又は間接的に結合した状態を意味する。被験遺伝子にプローブを固定化する手法は特に限定されないが、被験遺伝子と相補的な塩基配列、及びポリマー形成に使用する１プローブの一部又は全てと同じ塩基配列（又は相補的な塩基配列）を有するプローブである固定化用プローブを用いて、固定化用プローブを介してポリマー形成に使用するプローブと被験遺伝子とを結合させることが好ましい。前記固定化用プローブと同じ塩基配列とするポリマー形成に使用するプローブの部位は特に限定されないが、ポリマー形成用プローブの全領域中、１又は２以上の領域を選択することが好ましい。また、適切な架橋剤も使用できる。
前記固定化用プローブは、ポリマー形成に使用する複数種のプローブの一方の一部を、被験遺伝子と相補的塩基配列となるようにデザインし、該プローブを固定化用プローブとして使用することができる。また、被験遺伝子と相補的な塩基配列、及びポリマー形成に使用するプローブと相補的な塩基配列の両方を別途有するプローブ（アシストプローブ）を用いてもよい。該アシストプローブは、被験遺伝子と相補的な部分を変えた複数のアシストプローブを準備することにより、同じ複数種のプローブのセットにより複数の遺伝子を同時に検出できるという利点を有している。【００２４】
図１は、固定化用プローブを用いた被験遺伝子にプローブを固定化する方法の一例を示す概略説明図である。図１に示す、（i）被験遺伝子１０及び（ii）捕捉用オリゴヌクレオチド１２により、（iii）固定化用プローブ１４を固定化する手法は、
（i）被験遺伝子１０、
（ii）捕捉用オリゴヌクレオチド１２：被験遺伝子上の領域、好ましくは１５塩基以上、更に好ましくは２０塩基以上の領域と相補的なオリゴヌクレオチド、
（iii）固定化用プローブ１４：被験遺伝子上の領域と相補的な塩基配列及びポリマー形成で用いる第１プローブと同じ塩基配列を有するプローブ、なお、該被験遺伝子と相補的な領域は、（ii）の領域とは異なり好ましくは（ii）の領域と隣接した領域で、好ましくは１５塩基以上、更に好ましくは２０塩基以上の領域である、
の三種のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、（i）被験遺伝子１０を橋渡しにして（ii）捕捉用オリゴヌクレオチド１２と（iii）固定化用プローブ１４を結合させることにより行う。【００２５】
なお、図１は、後述するパルサーIのプローブを用いた方法において、固定化用プローブとして、下記式（１１）で示される、被験遺伝子と相補的な塩基配列領域Ｔ1と、ポリマー形成に使用する１プローブの全てと同じ塩基配列領域（Ｘ、Ｙ及びＺ）とを有するプローブ、即ち、被験遺伝子上の領域と相補的なオリゴヌクレオチドを連結させた、ポリマー形成で用いる第１プローブと同じ塩基配列を有するプローブを用いた例を示したが、固定化用プローブはこれに限定されるものではない。
【化１８】
2006028162.tif 000019
【００２６】
ポリマー形成に使用されるプローブと被験遺伝子との固定化に用いられるプローブは１種のみでなく、２種以上組み合わせて用いても良い。例えば、後述する実施例２及び３の如く、下記式（１２）の構造を有する第１の固定化用プローブと、下記式（１３）の構造を有する第２の固定化用プローブを用いることができる。
【化１９】
2006028162.tif 000020
【化２０】
2006028162.tif 000021
（式（１２）及び（１３）中、Ｔ2は被験遺伝子に相補的な塩基配列を有する領域であり、Ａ’及びＦ’はそれぞれポリマー形成に使用するプローブの１領域と同じ塩基配列を有する領域であり、ＧとＧ’は相補的塩基配列である。）【００２７】
（ii）捕捉用オリゴヌクレオチドを固相と結合させ固相化する、好ましくはビーズ等の支持体１６に固相化することにより操作を簡便に行うことができる。
ハイブリダイズさせる順番は、三種を同時にハイブリダイズしても、最初に（i）と（ii）をハイブリダイズした後に（iii）をハイブリダイズしてもよく、また最初に（i）と（iii）をハイブリダイズした後に（ii）をハイブリダイズすることも許される。（ii）を固相化した場合は、最初に（i）と（iii）をハイブリダイズした後に（ii）をハイブリダイズすることが好ましい。
場合によっては、三種のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせた後に、（ii）捕捉用オリゴヌクレオチドと（iii）固定化用プローブの間を別に結合させる、好ましくはライゲーション反応により結合することも許される。【００２８】
なお、（２）のポリマー形成には複数種のプローブを使用するが、被験遺伝子に最初に固定化するプローブは、その複数種のプローブのいずれを選択するかは自由であり、特に限定されるものではない。便宜的に固定化したプローブと同じ塩基配列を有するプローブを第１プローブ、第１プローブと相補的塩基配列領域を有するプローブを第２プローブと称す。
被験遺伝子を測定するための支持体の材料としては、ガラス、プラスティック（例えば、ポリスチレン、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレンなど）、金属などであり、支持体の形は、カップ型、平板、粒子など、特に限定されない。試料とは、被験遺伝子の有無を測定するサンプルであって、血液、血清、髄液などの生体液、生体組織、微生物、培養物など、及びそれらの抽出物などを意味するものである。【００２９】
（２）ポリマーを形成させる方法
固定化したプローブ（第１プローブと同じ塩基配列を有する）に第２プローブを結合させ、順次第１プローブ、第２プローブを反応させてポリマーを形成させる。第１プローブと第２プローブとしては、例えば下記の（１）．パルサーIのプローブ、（２）．パルサーIIのプローブ、（３）．パルサーIIIのプローブを使用する。【００３０】
（１）．パルサーIのプローブ
第１プローブ、第２プローブとして下記化学式（１）及び化学式（２）で示されるヌクレオチドを使用する。ここでＸとＸ’、ＹとＹ’及びＺとＺ’はそれぞれ互いに相補的塩基配列を有し、矢印はヌクレオチドの５’から３’の方向を意味する。
【化２１】
2006028162.tif 000022
【化２２】
2006028162.tif 000023
【００３１】
（２）．パルサーIIのプローブ
第１プローブ、第２プローブとして下記化学式（３）及び化学式（４）で示されるダイマープローブを使用する。各ダイマープローブは化学式（１４）及び化学式（１５）のヌクレオチドをハイブリダイズすることにより作製する。ここでＡとＡ’、ＢとＢ’、ＣとＣ’、ＤとＤ’、ＥとＥ’及びＦとＦ’はそれぞれ互いに相補的塩基配列を有し、矢印はヌクレオチドの５’から３’の方向を意味する。
【化２３】
2006028162.tif 000024
【化２４】
2006028162.tif 000025
【化２５】
2006028162.tif 000026
【化２６】
2006028162.tif 000027
【００３２】
また、ダイマープローブとして、前記化学式（４）の構造を有するダイマープローブの代わりに下記化学式（５）の構造を有するダイマープローブを用いることもできる。
【化２７】
2006028162.tif 000028
【００３３】
（３）．パルサーIIIのプローブ
第１プローブ、第２プローブとして、下記化学式（６）に示されるダイマープローブと下記化学式（７）に示される２本のオリゴヌクレオチドである架橋プローブを使用する。ダイマープローブは前記化学式（１４）のヌクレオチドをハイブリダイズすることにより作製する。ここでＡとＡ’、ＢとＢ’、ＣとＣ’、ＤとＤ’及びＦとＦ’はそれぞれ互いに相補的塩基配列を有し、矢印はヌクレオチドの５’から３’の方向を意味する。
【化２８】
2006028162.tif 000029
【化２９】
2006028162.tif 000030
【００３４】
また、架橋プローブとして、前記化学式（７）の構造を有するヌクレオチドの代わりに下記化学式（８）の構造を有する２本のヌクレオチドを用いることもできる。
【化３０】
2006028162.tif 000031
【００３５】
上記に加え、例えば相補的塩基配列領域の数が４箇所でも５箇所でもポリマーの形成は可能であり（特許文献２）、またダイマープローブは２種類を使用しているが、相補的塩基配列領域の位置関係を工夫すれば、さらに多種類のダイマープローブを使用することもできる（特許文献３）。このように、使用するプローブは、上記に記載のプローブの他にも相補的塩基配列領域の配置を工夫することによって他の種類のプローブも使用可能であり、自己集合するポリマーを形成するのであれば本発明に含まれる。
プローブを構成する塩基の種類としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどいずれも使用することができ、被験遺伝子に応じて適宜選択することができる。また、プローブの各相補的塩基配列領域の長さは、塩基数にして、少なくとも５塩基であり、好ましくは少なくとも８塩基、さらに好ましくは１０塩基〜１００塩基、さらに好ましくは１５〜３０塩基である。また、それぞれのプローブにおける相補的塩基配列領域の長さは同じであることが望ましい。【００３６】
図２に、本発明のシグナルプローブポリマーの形成方法の一例を示す。図２はパルサーIのプローブ（第１プローブ２２、第２プローブ２４）を用いた例であり、２０は捕捉用オリゴヌクレオチド及び被験遺伝子により支持体に固定化された固定化用プローブを示す。また、図２は、ビオチン３０を結合させた捕捉用オリゴヌクレオチドと、アビジン３２を結合させた支持体を用い、ビオチン３０とアビジン３２の結合により捕捉用オリゴヌクレオチドを支持体に固定化した場合の一例を示した。
使用するプローブを順番に反応させる手法として、支持体に結合させた被験遺伝子に固定化したプローブ（第１プローブと同じ塩基配列を有する）を洗浄した後、次いで第２プローブを反応させ洗浄する。以下順番に第１プローブと第２プローブを順次繰り返し反応させてポリマーを形成することができる。たとえば、図２に示したように第１プローブ２２を含む第１プローブ反応槽２６、洗浄槽、第２プローブ２４を含む第２プローブ反応槽２８を準備して、被験遺伝子及び固定化用プローブが結合した支持体２０を順番に移動して反応させる方法、後述する実施例１〜３のように、該支持体を含む容器に対して順番に第２プローブ反応液の添加・反応、洗浄、第１プローブ反応液の添加・反応、洗浄を繰り返す方法、また該支持体をカラムにセットして、順番に第２プローブ反応液と第１プローブ反応液を通過させて反応させる方法など、その手法は特に限定されない。本発明方法によれば、各プローブ反応液を再利用することが可能である。また、手法によっては洗浄操作を省略することも可能である。【００３７】
ハイブリダイゼーション反応を実施するための反応液は、通常使用される組成液で問題はなく、適度なナトリウム塩を含むほぼ中性の緩衝液、ブロッキング剤、ハイブリダイゼーション反応を促進させるための添加剤なども含まれている。これら試薬類については、Sambrookら（Molecular cloning 3rd ed, 2001）の成書に記載されているものが使用できる。ポリマーを形成させるときの温度は、それぞれの構成プローブ同士がハイブリダイズすることができる温度であれば特に制限されず、通常の４０〜９０℃の範囲で、好ましくは４５〜６５℃の範囲で実施することができる。【００３８】
（３）ポリマー量を測定する方法
形成させたポリマー量の測定は、該ポリマーにエチジウムブロミド、オリゴグリーン、ＳＹＢＲなどのインターカレーティング色素を結合させて蛍光により検出する方法があげられる。また使用するプローブに、あらかじめ標識物質、例えば、放射性アイソトープ、アクリジウムエステルなどの発光、発色物質、蛍光物質、酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン等を結合させておくことができる。結合させる標識物質はポリマーの形成に影響を与えない限り特に限定されない。
測定は標識物質に対応した方法、放射性アイソトープであれば放射能を測定し、発光物質であれば放射光を、発色物質であれば比色により、蛍光物質であれば蛍光により、酵素であれば酵素活性により、それぞれ対応した方法で測定する。
ビオチン、ジゴキシゲニン等で標識した場合には、それらと特異的に結合する標識したアビジン、抗ジゴキシゲニン抗体等を結合させ、標識物質に対応した方法により測定する。
【実施例】
【００３９】
以下実施例に基づき本発明を具体的に説明するが、本発明はその要旨を越えない限り以下の実施例に限定されるものではない。【００４０】
［実施例１］パルサーＩのプローブを用いた黄色ブドウ球菌数の測定
（１）各溶液の調製
（１−１）溶菌液の調製
トリプチックソイアガーで１８時間培養した黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）を生理食塩水に懸濁させたものを培養液原液とした。これを生理食塩水で所定の菌数に希釈し、Birnboimらの方法（H.C. Birnboim et al Nuc Acids Res 1979 7 1513-1523）に従って溶菌させたものを以下の実施例に用いた。菌数については、培養菌原液の希釈系列を調製して、トリプチックソイアガーで培養して得られた生菌数から所定の菌数を算出した。なお、希釈菌液のかわりに生理食塩水を用いて同様に反応させたものを対照として、「（−）」と示した。【００４１】
（１−２）第１ハイブリダイゼーション溶液の調製
下記組成となるように第１ハイブリダイゼーション溶液を調製した。
捕捉用オリゴヌクレオチド−１（配列番号１）及び固定化用プローブ−１（配列番号２）をそれぞれ２．５ｐｍｏｌ／μＬ含む１２×ＳＳＣ、１２．５％ポリエチレングリコール＃２００００溶液。
捕捉用オリゴヌクレオチド−１及び固定化用プローブ−１の配列は、Staphylococcus aureusの23s rRNA（GENBANK アクセッション番号NC 003923.1 GI:21281729に基づく）を捕捉するように下記の通り設計した。
捕捉用オリゴヌクレオチド−１の塩基配列（３’末端ビオチン標識）（配列番号１）
5'-cggaatttca cgtgctccgt ccgacgacga cgacgacgac gttttttttt tttttttttt tttttt-3'-Biotin
固定化用プローブ−１の塩基配列（配列番号２）
5'-Ｔ1領域（gagacaacattttcgactaca）・Ｘ領域（catgtctcgagtcttgcttg）・Ｙ領域（ctgctacagtgatcaccaag）・Ｚ領域（gttctcgacatagaccagtc）-3'【００４２】
（１−３）ハイブリダイゼーション溶液Ａ及びハイブリダイゼーション溶液Ｂの調製
パルサーＩの一対のプローブとして下記塩基配列を有するプローブ−１及びジゴキシゲニン化されているプローブ−２をそれぞれ作製した。
プローブ−１の塩基配列（配列番号３）
5'-Ｘ領域（catgtctcgagtcttgcttg）・Ｙ領域（ctgctacagtgatcaccaag）・Ｚ領域（gttctcgacatagaccagtc）-3'
プローブ−２の塩基配列（５’末端ジゴキシゲニン標識）（配列番号４）
5'-DIG-Ｘ’領域（caagcaagactcgagacatg）・Ｙ’領域（cttggtgatcactgtagcag）・Ｚ’領域（gactggtctatgtcgagaac）-3'【００４３】
下記組成となるようにハイブリダイゼーション溶液Ａ及びハイブリダイゼーション溶液Ｂをそれぞれ調製した。
ハイブリダイゼーション溶液Ａ：
プローブ−２（配列番号４）を１０ｐｍｏｌ／μＬ含む、６×ＳＳＣ、０．３％硫酸ドデシルナトリウム、５％ポリエチレングリコール＃２００００溶液。
ハイブリダイゼーション溶液Ｂ：
プローブ−１（配列番号３）を１０ｐｍｏｌ／μＬを含む、６×ＳＳＣ、０．３％硫酸ドデシルナトリウム、５％ポリエチレングリコール＃２００００溶液。【００４４】
（２）パルサーIによるシグナル増幅
黄色ブドウ球菌の５×１０5、５×１０4、５×１０3、５×１０2、５×１０1、（−）の菌数（CFU/mL）をそれぞれ含む溶菌液１００μＬを検体試料とした。試験管に検体試料と、ビオチン化捕捉用オリゴヌクレオチド−１及び固定化用プローブ−１を含む前記第１ハイブリダイゼーション溶液１００μＬを加えて、４５℃にて１時間加温した。
加温後、試験管に１０μＬのアビジン化磁気ビーズ（ＤＹＮＡＬ社、Dynabeads M-280 Streptoavidin、６−７×１０6beads）を添加し、室温で３０分間攪拌させた。上記反応により、図１に示される如く、固定化されたプローブが形成される。攪拌にはAppropriate Technical Resources社製ＲＫＶＳＤを用いた。磁気ビーズを磁石で収集し、反応後の溶液を排除した。【００４５】
前記磁気ビーズを含む試験管に、プローブ−２を含む前記ハイブリダイゼーション溶液Ａを２００μＬ加え、４５℃で５分間加温した（図２の（ｂ）参照。）。その後磁気ビーズのみを磁石で収集してハイブリダイゼーション溶液Ａを試験管から回収した。その後、試験管にプローブ−１を含む前記ハイブリダイゼーション溶液Ｂを２００μＬ加えて４５℃で５分間加温した（図２の（ｃ）参照）。磁気ビーズを収集してハイブリダイゼーション溶液Ｂを試験管から回収した（１回目）。なお、本実施例では、前記ハイブリダイゼーション溶液Ａによる反応と前記ハイブリダイゼーション溶液Ｂによる反応のセットをシグナル増幅の１サイクルとして数えた。【００４６】
前記磁気ビーズを含む試験管に、前記回収したハイブリダイゼーション溶液Ａを加えて４５℃で５分間加温した（図２の（ｄ）参照。）。その後磁気ビーズを収集してハイブリダイゼーション溶液Ａを試験管から回収した。その後、試験管に前記回収したハイブリダイゼーション溶液Ｂを加えて４５℃で５分間加温した（図２の（ｅ）参照。）。磁気ビーズを収集してハイブリダイゼーション溶液Ｂを試験管から回収した（２回目）。
以下同様にしてハイブリダイゼーション溶液Ａ添加・加温→磁気ビーズ収集・溶液回収→ハイブリダイゼーション溶液Ｂ添加・加温→磁気ビーズ収集・溶液回収の操作を繰り返して５回目まで行った。また、１回目のみ、２回目まで、３回目まで、４回目まで行った磁気ビーズをそれぞれ調製した。それぞれの磁気ビーズを収集し、最後に２００μＬの洗浄溶液Ａ［50mM Tris-HCl(pH7.6), 0.3M NaCl, 0.1% TritonX-100］で２回洗浄した。【００４７】
（３）化学発色検出
前記洗浄後、磁気ビーズを含む試験管に、洗浄溶液Ｂ［1%BSA, 50mM Tris-HCl(pH7.6), 0.3M NaCl, 0.1% TritonX-100］で１０００倍に希釈した抗ジゴキシゲニンＦａｂ−ＰＯＤコンジュゲート（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を２００μＬ加え、室温で３０分間攪拌させた。その後磁気ビーズを収集し溶液を排除し、２００μＬの洗浄溶液Ａで２回洗浄した。1 step TMB turbo ELISA（pierce社製）を２００μＬ加え、室温で１５分間反応させた。磁気ビーズを収集し、溶液を１５０μＬ回収し、該溶液の６５５ｎｍの吸光度を測定した。結果を図３に示す。
その結果、図３に示すように、黄色ブドウ球菌数に応じて定量的に測定することができた。また、回数を重ねるごとに発色値が増強しポリマー形成の効果が確認された。【００４８】
また、標識物質として、ジゴキシゲニンの代わりに放射性同位元素、ビオチン、蛍光物質、発光物質又は色素を用いて同様の実験を行った結果、実施例１と同じく、黄色ブドウ球菌数に応じて定量的に測定することができ且つ回数を重ねるごとに発色値が増強しポリマー形成の効果が確認された。【００４９】
［実施例２］パルサーIIのプローブを用いた合成ＨＣＶｃＲＮＡの検出
（１）合成ＨＣＶｃＲＮＡの調製
（１−１）一本鎖ｃＤＮＡの調製
０．２ｍＬのマイクロチューブに１０12個／μＬのＨＣＶＲＮＡを含む保存血清を１μＬ、１ｐｍｏｌ／μＬｃＤＮＡ合成用プライマーを２μＬ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰを４μＬ、滅菌蒸留水を６μＬ加えて総量１３μＬにした。６５℃で５分間加温した後、スーパースクリプトIII（superscript III、INVITROGEN社製）に添付の5x First-strand bufferを４μＬ、０．１Ｍ  ＤＴＴを１μＬ、RNAsin（Promega社製）を１μＬ、スーパースクリプトIIIを１μＬ加え、５０℃で１時間加温した。その後７０℃で１５分間加温して酵素活性を喪失させ、ｃＤＮＡ溶液を調製した。
なお、ｃＤＮＡ合成用プライマーの塩基配列は下記の通りである。
5'-TGA GGT TTAGGA TTC GTG CTC-3'（配列番号５）【００５０】
（１−２）ＰＣＲ
前記調製したｃＤＮＡ溶液２μＬにMaster mixtureを４０μＬ、５Ｕ／μＬAmpliTaq（Applied Biosystems社製）を０．２μＬ、滅菌蒸留水を８μＬ加えて総量５０μＬにした。下記表１に示すサイクル条件で増幅を行った。
【表１】
2006028162.tif 000032
上記ＰＣＲによって増幅される目的のＤＮＡは約２７０塩基対である。
なお、上記Master mixtureはMaxim Biotech社製Virus, Hepatitis typeC virus 5' UTR, Primer set kit(Cat. No.: SP-10275) に含まれるミクスチャーでキット添付の取扱説明書に従いキット含有のpre-mixed primers ２５０μＬを７５０μＬのOptimized PCR Bufferに添加して調製したものを指す。【００５１】
（１−３）クローニング
１．５ｍＬのマイクロチューブに前述のＰＣＲによって得られた増幅産物２μＬ、TOPO TA Cloning Kit for Sequencing（INVITROGEN社製）に添付のSalt solutionを１μＬ、滅菌蒸留水を２μＬ、TOPOクローニングベクターを１μＬ加え、室温で５分間放置した。上記反応溶液２μＬをE. coli DH5α Competent Cells（タカラバイオ社製）に加え、氷中で３０分間置いた。４２℃で３０秒間ヒートショックさせ、すぐさま氷中に置き、２分間放置した。これにE. coli DH5α Competent Cells（タカラバイオ社製）に添付のSOC mediumを２５０μＬ加え、３７℃で３０分間加温した後、５０μＬを１００μｇ／ｍＬでアンピシリンを含む２ｘYT培地（１６ｇトリプトン、１０ｇイーストエキストラクト、５ｇ塩化ナトリウム／Ｌ、１．５％寒天）の表層に５０μＬの４％Xgal（タカラバイオ社製）と２５μＬのIPTG（タカラバイオ社製）を予め塗布した寒天プレート上に塗布し、３７℃で１６時間培養した。【００５２】
（１−４）ｃＲＮＡの調製
前述のクローニングで得られた目的のクローンを、１００μｇ／ｍＬでアンピシリンを含む２ｘYT培地５ｍＬで３７℃、１２時間しんとう培養した後、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いてプラスミドクローンを得た。更にApplied Biosystems社製のＤＮＡシーケンサー３１３０でインサートの配列を確定した。シーケンス確認したHCV5'UTRのシーケンスを下記に示す。
5'-AGGCCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCTAGCAGTCTCGCGGGGGCACGCCCAAATCTCCAGGCATCGAGCGGGTTGATCCAAGAAAGGGCCCGGTCGTCCTGGCAATTCCGGTGTACTCACCGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTCCCGGGAGGGGGGGTCCCGGAGGCTGCACGACACTCATACTAACGCCATGGCTAGACGCTTTCTGCGTGAAGACAGTAGTTCCTCACAGGGGAGTGATCTATGGTGGAGTGTCGCCCCC-3'（配列番号６）【００５３】
得られたプラスミドクローン１０μｇを５０ＵのPstI（タカラバイオ社製）で酵素添付の緩衝液２０μＬを加え、滅菌蒸留水で総量を２００μＬにして３７℃で３時間反応させ完全に直鎖状のＤＮＡを得た。１μｇの前記直鎖状ＤＮＡとT7 RNA polymerase（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）添付の10x transcription bufferを２μＬ、10mM ribonucleotide mix（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を１μＬ、RNase inhibitor（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を１μＬ加え、滅菌蒸留水で総量を２０．５μＬにし３７℃で２時間反応させた。その後、DNase I（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を２μＬ加え３７℃で１５分間反応させた。これに１００μＬのＴＥ（１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）、１０μＬの４Ｍ  ＬｉＣｌ、３００μＬのエタノールを加え、−８０℃で３０分間置いた。４℃、１５０００回転、１０分間遠心分離してｃＲＮＡを沈殿物として回収した。５００μＬの７０％エタノールで沈殿物を洗浄後乾燥させ、１０μＬのＴＥ（ｐＨ８．０）に溶解させた。２６０ｎｍの吸光度より濃度を求めた。【００５４】
（２）各溶液の作製
（２−１）パルサーII用ダイマーの調製
パルサーII用の２組のダイマーα及びβ［図４（ａ）の符号４０及び図４（ｂ）の符号４１］作製の為に下記塩基配列を有するプローブをそれぞれ作製した。
ダイマー形成用プローブ−１（図４の符号４２）の塩基配列（配列番号７）（５’末端ジゴキシゲニン標識）
5'-DIG-Ａ領域（CAGTACAAGCACGATCTCTG）・Ｂ領域（ATTTGCCAGGACTGCGTTTC）・Ｃ領域（GACTGGTCTAGTCTGAGAAC）-3'
ダイマー形成用プローブ−２（図４の符号４４）の塩基配列（配列番号８）（５’末端ジゴキシゲニン標識）
5'-DIG-Ｄ領域（GCATAGGACTTTGTGAGCAC）・Ｂ’領域（GAAACGCAGTCCTGGCAAAT）・Ｆ領域（TCAGCACTAACTTCCGTCAC）-3'
ダイマー形成用プローブ−３（図４の符号４６）の塩基配列（配列番号９）（５’末端ジゴキシゲニン標識）
5'-DIG-Ａ’領域（CAGAGATCGTGCTTGTACTG）・Ｅ’領域（TCAGCTGCTACGAGACCATA）・Ｃ’領域（GTTCTCAGACTAGACCAGTC）-3'
ダイマー形成用プローブ−４（図４の符号４８）の塩基配列（配列番号１０）（５’末端ジゴキシゲニン標識）
5'-DIG-Ｄ’領域（GTGCTCACAAAGTCCTATGC）・Ｅ領域（TATGGTCTCGTAGCAGCTGA）・Ｆ’領域（GTGACGGAAGTTAGTGCTGA）-3'【００５５】
０．２ｍＬマイクロチューブを用意し、前記ダイマー形成用プローブ−１及び２をそれぞれ１０ｐｍｏｌずつ加え、さらに２５ｘＳＳＣを終濃度４ｘＳＳＣになるように添加して滅菌蒸留水で総量１０μＬに調節した。該溶液を９８℃で２分間加温した後すぐさま５７℃で１時間加温し、ダイマーαを含むダイマーα溶液を調製した。また、ダイマー形成用プローブ−１及び２の代わりにダイマー形成用プローブ−３及び４を用いた以外は同様の方法により、ダイマーβを含むダイマーβ溶液を調製した。【００５６】
（２−２）ハイブリダイゼーション溶液Ａ及びハイブリダイゼーション溶液Ｂの調製
２００μＬの溶液あたり、前記ダイマーα溶液を０．１μＬ含む［４×ＳＳＣ、０．１％硫酸ドデシルナトリウム］溶液を調製し、ハイブリダイゼーション溶液Ａとして用いた。また、ダイマーα溶液の代わりにダイマーβ溶液を用いた以外は同様の方法により、ハイブリダイゼーション溶液Ｂを調製した。【００５７】
（２−３）第１ハイブリダイゼーション溶液の調製
標的遺伝子である前記調製したｃＲＮＡを捕捉するように下記の如く捕捉用オリゴヌクレオチド−２を設計した。また、前記ダイマーαを標的遺伝子に固定化させるために、下記固定化用プローブ−２及び３を作製した。
捕捉用オリゴヌクレオチド−２（図５の符号５０）の塩基配列（配列番号１１）（５’末端ビオチン標識）
5'-Biotin-ACA CTC ATA CTA ACG-3'
固定化用プローブ−２（図５の符号５２）の塩基配列（配列番号１２）
5'-Ａ’領域（CAGAGATCGTGCTTGTACTG）・Ｇ領域（TGCGATAACCAATGTCAGGC）・Ｔ2領域（GCTAGACGCTTTCTGCGTGA）-3'
固定化用プローブ−３（図５の符号５４）の塩基配列（配列番号１３）
5'-Ｇ’領域（GCCTGACATTGGTTATCGCA）・Ｆ’領域（GTGACGGAAGTTAGTGCTGA）-3'【００５８】
下記組成となるように第１ハイブリダイゼーション溶液を調製した。
前記捕捉用オリゴヌクレオチド−２及び固定化用プローブ−２及び３をそれぞれ２．５ｐｍｏｌを含む、４×ＳＳＣ、５％ポリエチレングリコール＃２００００、０．１％硫酸ドデシルナトリウム溶液。【００５９】
（３）パルサーIIによるシグナル増幅
前記調製したｃＲＮＡ８ｎｇ含む滅菌蒸留水１００μＬを試料とした。試験管に該試料と、ビオチン化捕捉用オリゴヌクレオチド−２及び固定化用プローブ−２及び３を含む前記第１ハイブリダイゼーション溶液を１００μＬ加えて、４５℃にて１時間加温した（第１の反応）。図５〜図７は実施例２のシグナル増幅反応工程の概略説明図であり、図５は、この第１の反応の概略説明図である。なお、図５中、符号５６は被験遺伝子であるＨＣＶｃＲＮＡを示す。
加温後の試験管に、１０μＬのアビジン化磁気ビーズ（ＤＹＮＡＬ社、Dynabeads M-280 Streptoavidin、６−７×１０6beads）を添加し、室温で３０分間攪拌させた。攪拌にはAppropriate Technical Resources社製ＲＫＶＳＤを用いた。磁気ビーズを磁石で収集し、反応後の溶液を排除した。【００６０】
前記磁気ビーズを含む試験管に、ダイマーαを含む前記ハイブリダイゼーション溶液Ａを２００μＬ加え、４５℃で１０分間加温した（第２の反応）。図６はこの第２の反応の概略説明図である。なお、図６中、符号５１は支持体である磁気ビーズを示す。その後磁気ビーズのみを磁石で収集してハイブリダイゼーション溶液Ａを試験管から回収した。その後、試験管に、ダイマーβを含む前記ハイブリダイゼーション溶液Ｂを２００μＬ加えて４５℃で１０分間加温した（第３の反応）。図７はこの第３の反応の概略説明図である。磁気ビーズを収集してハイブリダイゼーション溶液Ｂを試験管から回収した（１回目）。なお、本実施例では、前記ハイブリダイゼーション溶液Ａによる反応と前記ハイブリダイゼーション溶液Ｂによる反応のセットをシグナル増幅の１サイクルとした。【００６１】
前記磁気ビーズを含む試験管に、前記回収したハイブリダイゼーション溶液Ａを加えて４５℃で１０分間加温した。その後磁気ビーズを収集してハイブリダイゼーション溶液Ａを試験管から回収した。その後、試験管に前記回収したハイブリダイゼーション溶液Ｂを加えて４５℃で１０分間加温した。磁気ビーズを収集してハイブリダイゼーション溶液Ｂを試験管から回収した（２回目）。
以下同様にしてハイブリダイゼーション溶液Ａ添加・加温→磁気ビーズ収集・溶液回収→ハイブリダイゼーション溶液Ｂ添加・加温→磁気ビーズ収集・溶液回収の操作を行った（３回目）。また、１回目のみ、２回目まで行った磁気ビーズをそれぞれ調製した。それぞれの磁気ビーズを収集し、最後に２００μＬの洗浄溶液Ａ［50mM Tris-HCl(pH7.6), 0.3M NaCl, 0.1% TritonX-100］で２回洗浄した。【００６２】
（４）化学発色検出
前記洗浄後、磁気ビーズを収集し、洗浄溶液Ｂ［1%BSA, 50mM Tris-HCl(pH7.6), 0.3M NaCl, 0.1% TritonX-100］で１０００倍に希釈した抗ジゴキシゲニンＦａｂ−ＰＯＤコンジュゲート（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を２００μＬ加え、室温で３０分間攪拌させた。攪拌にはAppropriate Technical Resources社製ＲＫＶＳＤを用いた。その後磁気ビーズを収集し溶液を排除し、２００μＬの洗浄溶液Ａで２回洗浄した。1 step TMB turbo ELISA（pierce社製）を２００μＬ加え、室温で５分間反応させ、５Ｎ硫酸を４０μＬ加え反応を停止させた。磁気ビーズを収集し、溶液を１５０μＬ回収し、該溶液の４５５ｎｍの吸光度を測定した。結果を図８に示す。
その結果、図８に示すように、回数を重ねるごとに発色値が増強しポリマー形成の効果が確認された。【００６３】
また、標識物質として、ジゴキシゲニンの代わりに放射性同位元素、ビオチン、蛍光物質、発光物質又は色素を用いて同様の実験を行った結果、回数を重ねるごとに発色値が増強しポリマー形成の効果が確認された。【００６４】
［実施例３］パルサーIIIのプローブを用いた合成ＨＣＶｃＲＮＡの検出
（１）各溶液の調製
（１−１）パルサーIII用ダイマー及び架橋プローブの作製
パルサーIII用の１組のダイマーγ［図９（ａ）の符号６０］及び１組の架橋プローブ［図９（ｂ）］作製の為に下記塩基配列を有するプローブを作製した。
ダイマー形成用プローブ−５（図９の符号６２）の塩基配列（配列番号１４）（５’末端ジゴキシゲニン標識）
5'-DIG-Ａ領域（CAGTACAAGCACGATCTCTG）・Ｈ領域（GATGGTGTTCACTGTAGCAG）・Ｃ領域（GACTGGTCTAGTCTGAGAAC）-3'
ダイマー形成用プローブ−６（図９の符号６４）の塩基配列（配列番号１５）（５’末端ジゴキシゲニン標識）
5'-DIG-Ｄ領域（GCATAGGACTTTGTGAGCAC）・Ｈ’領域（CTGCTACAGTGAACACCATC）・Ｆ領域（TCAGCACTAACTTCCGTCAC）-3'
架橋プローブ−１（図９の符号６６）の塩基配列（配列番号１６）
5'-Ａ’領域（CAGAGATCGTGCTTGTACTG）・Ｃ’領域（GTTCTCAGACTAGACCAGTC）-3'
架橋プローブ−２（図９の符号６８）の塩基配列（配列番号１７）
5'-Ｄ’領域（GTGCTCACAAAGTCCTATGC）・Ｆ’領域（GTGACGGAAGTTAGTGCTGA）-3'【００６５】
０．２ｍＬマイクロチューブを用意し、前記ダイマー形成用プローブ−５及び６を１０ｐｍｏｌずつ加え、さらに２５ｘＳＳＣを終濃度４ｘＳＳＣになるように添加して滅菌蒸留水で総量１０μＬに調節した。該溶液を９８℃で２分間加温した後すぐさま５７℃で１時間加温し、ダイマーγを含むダイマーγ溶液を調製した。【００６６】
（１−２）ハイブリダイゼーション溶液Ａ及びハイブリダイゼーション溶液Ｂの調製
２００μＬの溶液あたり、前記ダイマーγ溶液を５μＬ含む、［４×ＳＳＣ、０．１％硫酸ドデシルナトリウム］溶液を調製し、ハイブリダイゼーション溶液Ａとして用いた。
また、下記組成となるようにハイブリダイゼーション溶液Ｂを調製した。
５ｐｍｏｌの前記架橋プローブ−１及び２を含む、４×ＳＳＣ、０．１％硫酸ドデシルナトリウム溶液。【００６７】
（１−３）第１ハイブリダイゼーション溶液の調製
下記組成の溶液を第１ハイブリダイゼーション溶液として用いた。
ビオチン化された捕捉用オリゴヌクレオチド−２（配列番号１１）、固定化用プローブ−２（配列番号１２）及び固定化用プローブ−４（配列番号１８）をそれぞれ２．５ｐｍｏｌを含む４×ＳＳＣ、５％ポリエチレングリコール＃２００００、０．１％硫酸ドデシルナトリウム溶液。
なお、前記捕捉用オリゴヌクレオチド−２及び固定化用プローブ−２は実施例２と同様であり、固定化用プローブ−４（図１０の符号７０）の塩基配列は下記の通りである。
5'-Ｇ’領域（GCCTGACATTGGTTATCGCA）・Ｃ’領域（GTTCTCAGACTAGACCAGTC）-3'（配列番号１８）【００６８】
（２）パルサーIIIによるシグナル増幅
実施例２と同様に調製したｃＲＮＡ１０ｎｇ含む滅菌蒸留水１００μＬを試料とした。試験管に該試料と、捕捉用オリゴヌクレオチド−２及び固定化用プローブ−２及び４を含む前記第１ハイブリダイゼーション溶液を１００μＬ加えて、４５℃にて１時間加温した（第１の反応）。図１０〜図１３は実施例３のシグナル増幅反応工程の概略説明図であり、図１０はこの第１の反応の概略説明図である。
加温後、試験管に１０μＬのアビジン化磁気ビーズ（ＤＹＮＡＬ社、Dynabeads M-280 Streptoavidin、６−７×１０6beads）を添加し、室温で３０分間攪拌させた。攪拌にはAppropriate Technical Resources社製ＲＫＶＳＤを用いた。磁気ビーズを磁石で収集し、反応後の溶液を排除した。【００６９】
前記磁気ビーズを含む試験管に、ダイマーγを含む前記ハイブリダイゼーション溶液Ａを２００μＬ加え、４５℃で１０分間加温した（第２の反応）。図１１はこの第２の反応の概略説明図である。その後磁気ビーズのみを磁石で収集してハイブリダイゼーション溶液Ａを試験管から回収した。その後、試験管に架橋用プローブ−１及び２を含む前記ハイブリダイゼーション溶液Ｂを２００μＬ加えて４５℃で１０分間加温した（第３の反応）。図１２はこの第３の反応の概略説明図である。磁気ビーズを収集してハイブリダイゼーション溶液Ｂを試験管から回収した（１回目）。なお、本実施例では、前記ハイブリダイゼーション溶液Ａによる反応と前記ハイブリダイゼーション溶液Ｂによる反応のセットをシグナル増幅の１サイクルとした。【００７０】
前記磁気ビーズを含む試験管に、前記回収したハイブリダイゼーション溶液Ａを加えて４５℃で１０分間加温した（第４の反応）。図１３はこの第４の反応の概略説明図である。その後磁気ビーズを収集してハイブリダイゼーション溶液Ａを試験管から回収した。その後、試験管に前記回収したハイブリダイゼーション溶液Ｂを加えて４５℃で１０分間加温した。磁気ビーズを収集してハイブリダイゼーション溶液Ｂを試験管から回収した（２回目）。
以下同様にしてハイブリダイゼーション溶液Ａ添加・加温→磁気ビーズ収集・溶液回収→ハイブリダイゼーション溶液Ｂ添加・加温→磁気ビーズ収集・溶液回収の操作を繰り返して５回目まで行った。また、１回目のみ、及び３回目まで行った磁気ビーズをそれぞれ調製した。それぞれの磁気ビーズを収集し、最後に２００μＬの洗浄溶液Ａ［50mM Tris-HCl(pH7.6), 0.3M NaCl, 0.1% TritonX-100］で２回洗浄した。【００７１】
（３）化学発色検出
前記洗浄後、磁気ビーズを収集し、洗浄溶液Ｂ［1%BSA, 50mM Tris-HCl(pH7.6), 0.3M NaCl, 0.1% TritonX-100］で１０００倍に希釈した抗ジゴキシゲニンＦａｂ−ＰＯＤコンジュゲート（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を２００μＬ加え、室温で３０分間攪拌させた。攪拌にはAppropriate Technical Resources社製ＲＫＶＳＤを用いた。その後磁気ビーズを収集し溶液を排除し、２００μＬの洗浄溶液Ａで２回洗浄した。1 step TMB turbo ELISA（pierce社製）を２００μＬ加え、室温で５分間反応させ、５Ｎ硫酸を４０μＬ加え反応を停止させた。磁気ビーズを収集し、溶液を１５０μＬ回収し、該溶液の４５５ｎｍの吸光度を測定した。結果を図１４に示す。
その結果、図１４に示すように、回数を重ねるごとに発色値が増強しポリマー形成の効果が確認された。【００７２】
また、標識物質として、ジゴキシゲニンの代わりに放射性同位元素、ビオチン、蛍光物質、発光物質又は色素を用いて同様の実験を行った結果、回数を重ねるごとに発色値が増強しポリマー形成の効果が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明により、パルサー法において、非特異的な反応が抑制され、検出感度が高まった。これにより、特異的な遺伝子の検出が可能となった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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