(57)【要約】ストレプトコッカス属に属し、魚類の連鎖球菌症に対してワクチン効果を有する物質を生産する能力を有する微生物、例えばストレプトコッカス・ディスガラクチアエ・サブスピーシーズ・ディスガラクチアエ（ ＦＥＲＭ  ＢＰ‐１０４４２）の培養物を不活化して調製したワクチン。このワクチンは魚類の新型レンサ球菌症に対して優れたワクチン効果を有する。抗生物質を使用する従来の方法に比し、薬剤耐性菌の出現の心配も無くレンサ球菌症の予防及び治療が可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
レンサ球菌の新菌株ストレプトコッカス・ディスガラクチアエ・サブスピーシーズ・ディスガラクチアエ（Streptococcus dysgalactiae
subsp. Streptococcus dysgalactiae）０７−１２。
【請求項２】
ストレプトコッカス属に属し、魚類の新型レンサ球菌症に対してワクチン効果を有する物質を生産する能力を有する微生物を栄養培地で培養し、培養終了液を不活化し、魚類のレンサ球菌症に対するワクチン効果物質を採取することを特徴とする魚類のレンサ球菌症予防又は治療用ワクチン効果物質の製造方法。
【請求項３】
ストレプトコッカス属に属し、魚類の新型レンサ球菌症に対してワクチン効果を有する物質を生産する能力を有する微生物が、ストレプトコッカス・ディスガラクチアエ・サブスピーシーズ・ディスガラクチアエ07−12（ ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４４２）である請求項２に記載の魚類のレンサ球菌症予防又は治療用ワクチン効果物質の製造方法。
【請求項４】
ストレプトコッカス属に属し、魚類のレンサ球菌症に対してワクチン効果を有する物質を生産する能力を有する微生物の培養物を含有する魚類のレンサ球菌症予防又は治療用ワクチン製剤。
【請求項５】
ストレプトコッカス属に属し、魚類のレンサ球菌症に対してワクチン効果を有する物質を生産する能力を有する微生物の培養物が、該微生物の培養物の培養上清である請求項4に記載の魚類のレンサ球菌症予防又は治療用ワクチン製剤。
【請求項６】
魚類のレンサ球菌症が、ランスフィールドC群のレンサ球菌である請求項4又は請求項５の何れかに記載の魚類のレンサ球菌症予防又は治療用ワクチン製剤。
【請求項７】
魚類のレンサ球菌症が、ランスフィールドC群のレンサ球菌である請求項4、請求項５又は請求項６の何れかに記載の魚類のレンサ球菌症予防乃至治療用ワクチン製剤を含有する混合ワクチン製剤。
【請求項８】
請求項4、請求項５、請求項６又は請求項７の何れかに記載の魚類のレンサ球菌症予防乃至治療用ワクチン製剤を養殖魚類に投与することを特徴とする魚類のレンサ球菌症の予防又は治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、魚類の新型レンサ球菌疾患の予防及び治療に有効なワクチンの製造方法、新型レンサ球菌症用魚病ワクチン製剤及び魚類のレンサ球菌症の予防又は治療方法に関する。さらに詳しくは、魚類のレンサ球菌症の原因菌が属するストレプトコッカス属の新規な菌株、ストレプトコッカス属に属し、魚類の新型レンサ球菌症に対してワクチン効果を有する物質を生産する能力を有する微生物を用いて魚類のレンサ球菌症予防または治療用ワクチン効果物質の製造方法、此処に得られる魚類のレンサ球菌症予防または治療用ワクチン効果物質からなるワクチン製剤、及び該新規な菌株を利用した魚類の新型レンサ球菌症を予防及び治療するためのワクチンならびにワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９７４年のブリでの発生報告に始まる従来の魚類のレンサ球菌症の原因菌は、初めα溶血性ストレプトコッカス・エスピー（Streptococcus sp）、 次いで エンテロカッカス属の菌種（Enterococcus）、現在はラクトコッカス属の菌 （Lactococcus）の ラクトコッカス・ガルヴィアエ（L. garvieae）に分類されているが（非特許文献１）、現在でもレンサ球菌症と呼ばれることが多い。２００２年夏頃から、この従来型のレンサ球菌症（ラクトコッカス・ガルヴィアエ感染症 ）と類似の症状・病変を示すが、原因菌が異なる魚類の新型のレンサ球菌症発症例がカンパチで確認された。この罹病魚から原因菌を分離し、一般性状及び16S rDNAの塩基配列を決定した結果、ランスフィールドＣ群（Lancefield C群）に血清型別されるストレプトコッカス・ディスガラクチアエ（Streptococcus
dysgalactiae） 感染症であることを確認し報告した（非特許文献２）。以後、毎年水温の高い夏から秋にかけての発生が確認され、カンパチ以外にブリでも発生することを確認し報告した（非特許文献３）。【０００３】
本疾病罹病魚の肉眼的観察による特徴は、尾柄部の発赤・腫脹・充血、潰瘍・膿瘍、鰭基部の潰瘍・膿瘍であり、罹病魚からは病変部及び全臓器から原因菌の分離ができる。本症の発生初期はエリスロマイシン等の抗生物質の投与が有効であるが、流行の中期以降になると薬剤耐性菌の出現により、効果的な治療法はない。従って、魚類の新型レンサ球菌症への対処法は、ワクチン投与による予防及び治療が重要である。しかしながら、ストレプトコッカス・ディスガラクチアエ感染による新型レンサ球菌症の予防及び治療を目的としたワクチンは未だ実用化されるには至っていない。また、養殖現場では、新型のレンサ球菌症（Streptococcus
dysgalactiae感染症）及び従来型のレンサ球菌症（Lactococcus
garvieae感染症）の発生の混在、あるいは両者の混合感染の発生のため、病性鑑定、原因菌の確定で混乱することがあり、そのため両疾病を同時に予防及び治療することが可能な混合ワクチンの投与による予防及び治療はさらに重要視される。しかし、新型のレンサ球菌症及び従来型のレンサ球菌症を同時に予防及び治療することが可能な混合ワクチン、あるいはその他の魚病も同時に予防及び治療することを目的とした混合ワクチンは、未だ実用化されていない。
【特許文献１】特許第３５４３７３９号公報
【非特許文献１】テイゼイラ・エル・エム等（Teixeira、L.M. et.al.）、インターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（InternationalJ. Systematic Bacteriol.）、４６巻６６４−６６８頁、１９９６年
【非特許文献２】日本水産学会大会、演題番号１２４３（カンパチの病変部より分離した新規連鎖球菌）、２００３年４月１日〜５日
【非特許文献３】平成１６年度日本魚病学会大会、演題番号２０７（ブリ属魚類におけるLancefield C群連鎖球菌症の疫学に関する研究）、２００４年９月１７日〜１９日
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明はストレプトコッカス・ディスガラクチアエの感染による魚類用の新型レンサ球菌症に対する予防及び治療用ワクチンを提供するものである。さらに、従来のレンサ球菌症用ワクチンとの混合ワクチン、及びその他の魚病用ワクチンとの混合ワクチンを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は、ストレプトコッカス属の微生物、例えば、レンサ球菌の新菌株ストレプトコッカス・ディスガラクチアエ・サブスピーシーズ・ディスガラクチアエ０７−１２が、魚類の新型レンサ球菌症に対して強力なワクチン効果を有する物質を生産する能力を有すること、その培養物が、魚類の新型レンサ球菌症に対して強力なワクチン効果を有すること、そしてこの培養物が、優れた魚類のレンサ球菌症予防及び治療用ワクチンとして用いられることを見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成した。
尚、ストレプトコッカス・ディスガラクチアエ・サブスピーシーズ・ディスガラクチアエ０７−１２は、独立行政法人産業技術綜合研究所、特許生物寄託センターに平成１６年８月１１日  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４４２として寄託されている。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、ストレプトコッカス・ディスガラクチアエに起因する魚類の新型レンサ球菌症の予防及び治療方法として、ワクチン投与による予防及び治療が可能となった。
本発明によって、薬剤耐性菌が出現しても新型レンサ球菌症の予防及び治療が可能となった。本発明に係わるワクチンは、従来型レンサ球菌症(Lactococcus garvieae感染症)ワクチンと混合しても効果は妨げられず、またイリド・ウイルス（Irido virus）の不活化ウイルス液等その他の干渉作用を認めない不活化ワクチン液と混合することで多価ワクチンとして使用できる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ストレプトコッカス・ディスガラクチアエの培地別の増殖経過を示す図である。
【図２】混合ワクチンの有効性を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明に係わるレンサ球菌ストレプトコッカス・ディスガラクチアエは、ランスフィールドＣ群（Lancefield
group C）に属するものであり、ブリ及びカンパチ等のブリ属魚類等に感染する。この感染による症状としては特に尾柄部における潰瘍が顕著であることが挙げられる。
その中でも、本発明に係る新型のレンサ球菌ストレプトコッカス・ディスガラクチアエ・サブスピーシーズ・ディスガラクチアエ０７−１２が有する菌学的性状を表１に示す。【０００９】
【表１】
2006068077.tif 000002
【００１０】
本発明に係わるストレプトコッカス・ディスガラクチアエの培養方法は特に限定はなく、一般的なレンサ球菌の培養方法を用いればよい。培養に用いる培地は本菌が増殖できる培地であれば特に限定されず、肉汁培地、ハート・インフージョン・ブロス培地（Heart
Infusion Broth）（以下HIと表す）、ブレイン・ハート・インフージョン・ブロス培地（Brain Heart
Infusion Broth）（以下、BHIと表す）、トリプティック・ソーイ・ブロス培地（Tryptic Soy Broth）乃至ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト培地（Soybean-Casein Digest）（以下SCDと表す）、トッド・ヘビット・ブロス培地（Todd Hewitt Broth）（以下、THBと表す）、血液寒天培地等で培養可能であるが、血液または血清及び海水または食塩を加えた培地でよく発育する。培養温度は10〜45℃、好ましくは15〜42℃さらに好ましくは25℃〜37℃である。また、培養時のpHは4.5〜9.6
、好ましくは5.5〜8.5 、さらに好ましくは7.0〜8.0である。培養に当たっては、静置培養、振とう培養、攪拌培養等の何れの条件下でも良いが、緩やかに攪拌しながら培養すると良好な生育が得られる。 また、THB培地あるいはSCD培地で10代継代培養しても有効性に変化は認めない。【００１１】
本発明のワクチンは、ストレプトコッカス属に属し、魚類のレンサ球菌症に対してワクチン効果を有する物質を生産する能力を有する微生物の培養菌液を不活化することによって作製することができる。培養菌液の不活化方法は特に限定されず、一般的な細菌の不活化方法を用いることができる。例えば、ホルマリン、マーゾニン、β−プロピルラクトン等を加えて化学的に不活化する方法が挙げられる。また、65℃、30分間または72℃、15分間の加熱殺菌、あるいは超音波処理による菌体破砕など、物理的な不活化法によることもできる。【００１２】
本発明における効果のあるワクチンは、ストレプトコッカス・ディスガラクチアエの培養菌液（培養物）を上記の方法により不活化したものを使用することができる。本発明におけるワクチン効果物質は、上記培養物から分離した菌体、あるいは菌体を分離除去した培養上清を不活化したものであっても良い。より好ましくはストレプトコッカス・ディスガラクチアエ・サブスピーシーズ・ディスガラクチアエ０７−１２の培養菌液（培養物）を不活化したもの、または、その培養物から分離した菌体、あるいは菌体を分離除去した培養上清を不活化したものがよい。特に、菌体を分離除去した培養上清を不活化したものを使用することがより好ましい。【００１３】
本発明に係わるワクチンを投与する場合、投与経路は経口、浸漬、腹腔内または筋肉内等であり特に限定されないが、好ましくは腹腔内、筋肉内への注射投与である。本ワクチンは発症する前に予防的に投与することができ、また、発症後に投与することにより、治療剤としても効果を期待することができる。投与量は、不活化前の菌数として1×105〜1×1010 CFU／尾、好ましくは1×106〜1×109 CFU／尾、さらに好ましくは1×107〜1×10８ CFU／尾である。【００１４】
ワクチン投与の対象魚は、ブリ、カンパチ、ヒラマサ等ブリ属魚類の他、アジ類魚類等新型レンサ球菌症に罹患する魚類であれば特に限定されない。また、投与するときの魚齢は特に限定されず、技術的に注射することが可能な大きさに成長したものであればよい。通常、魚種を問わず体重が10ｇ〜20ｇ以上に達したものであればよい。投与回数は１回で十分であるが、さらに３〜12カ月後に再免疫することがより好ましい。【００１５】
本発明のワクチンを組成物として注射による投与を行う際に、植物油、鉱物油、アルミニウムゲル等の公知のアジュバントと共に投与すると、ワクチン効果を一層高めることができる。更には、ビタミンE、ペプチドグリカン等公知の免疫増強剤を加えることによって、一層効果を高めることができる。
必要に応じて、本発明のワクチン組成物に薬学的に許容し得る担体を添加し、例えば、注射剤や液剤等の適当な剤型にして使用することができる。薬学的に許容し得る担体としては、当業者に周知の溶媒、基剤、安定化剤、防腐剤、溶解剤、賦形剤、及び緩衝剤等が含まれる。
以下、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００１６】
実施例１
レンサ球菌ストレプトコッカス・ディスガラクチアエ・サブスピーシーズ・ディスガラクチアエ07−12（受託番号：FERM  ＢＰ−１０４４２）の培養
（１）試験方法
レンサ球菌ストレプトコッカス・ディスガラクチアエ・サブスピーシーズ・ディスガラクチアエ07−12（受託番号： FERM  BP−１０４４２）を市販のBHI、 SCD、 及び THB（いずれもベクトン・ディッキンソン社製（Becton
Dickinson Microbiology Systems、 Becton Dickinson and Company
USA）（以下ＢＤと表す））の各培地に接種し、25℃で24時間培養し、常法により生菌数を測定した。
（２）試験結果
いずれの培地を用いて培養しても、107 CFU/0.1mL以上に増殖した。各培地での増殖経過は図１に示したとおりである。【００１７】
実施例２
ワクチンの調製：
実施例１と同一のTHBまたはSCD培地を用いて25℃ 24〜72時間培養した菌液（培養物）にホルマリンを0.3（vol/vol）% に加え、25℃で48時間不活化した。不活化菌液を5000×G 30分間遠心し、沈渣の菌体及び培養上清液を得た。菌体は1/50量のリン酸緩衝食塩液に再浮遊させて濃縮菌液とし、また、上清液を限外濾過法により濃縮し各種濃度の濃縮上清液を得た。濃縮菌液及び各種濃度の濃縮上清液を割合を変えて混合することで、あるいは他種ワクチンを混合することで、さらにはリン酸緩衝食塩液で希釈することで、各種組成の試験用ワクチンを作製した。【００１８】
本発明に係わるワクチンの有効性を、実験データを挙げて以下に詳述する。
実施例３
カンパチにおける免疫原性（ワクチン効果）の試験１
（1）ワクチンの調製
実施例２に準じて作製した各種組成の試験用ワクチンを用いた。また、上記の培地以外に牛胎児血清（FBS）で培養した菌液、あるいはFBSを適量添加したTHB培地で培養した菌液から作製したワクチンも用いた。なお、全ての培地で得られた菌液は24時間培養したものである。【００１９】
（2）試験方法
循環式水槽、水温25℃で７日間馴致飼育した平均体重 約30ｇのカンパチを1群19〜20尾づつ群分けした。各種組成の試験用ワクチンを各試験群の試験魚の腹腔内に１尾当たり0.1
mLづつ注射した。対照群は、ワクチンの替わりにリン酸緩衝食塩液を0.1mL注射した。免疫14日後に攻撃し、ストレプトコッカス・ディスガラクチアエ・サブスピーシーズ・ディスガラクチアエ０７−１２（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４４２ ）の培養菌液を腹腔内に注射することにより攻撃した後（表１は攻撃菌数3.1×107 CFU/0.1mL/尾、 また表２は攻撃菌数4.9×107  CFU/0.1mL/尾 の成績）、21日間臨床症状を観察して所見を記録した。
（3）試験結果
免疫群の死亡率は攻撃対照群（ワクチンのかわりにリン酸緩衝食塩液を注射）の死亡率より低く、試験用ワクチンの効果が確認された。ワクチンの有効性試験結果を表２及び表３に示した。【００２０】
【表２】
2006068077.tif 000003
【００２１】
【表３】
2006068077.tif 000004
【００２２】
実施例４
カンパチにおける免疫原性（ワクチン効果）の試験２
（1）ワクチンの調製
実施例2に準じて調製したストレプトコッカス・ディスガラクチアエ・サブスピーシーズ・ディスガラクチアエ０７−１２のワクチン（４倍濃縮培養上清に不活化菌体を108 CFU/ｍLとなるように混合）に、ラクトコッカス・ガルビアエＫＧ９４０８（Lactococcus garviae ＫＧ９４０８）（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７４９）の不活化菌体を109 CFU/mLとなるように加え、混合ワクチンを作製した。なお、菌液は24〜72時間培養後、不活化して用いた。【００２３】
（2）試験方法
循環式水槽、水温25℃で７日間馴致飼育した平均体重 約30ｇのカンパチを1群19〜20尾づつ群分けした。 試験用混合ワクチンを各試験群（免疫群）の試験魚の腹腔内に１尾当たり0.1 ｍLづつ注射した。対照群は、ワクチンの代わりにリン酸緩衝食塩液を0.1 mL注射した。免疫の14日後に、免疫群と対照群のそれぞれにストレプトコッカス・ディスガラクチアエ07-12の培養菌液の血管内注射(攻撃菌数：1.6×107 CFU／0.1
mL／尾)、及びラクトコッカス・ガルビアエKG9408の腹腔内注射（攻撃菌数： 1.1×104 CFU／0.1
mL／尾）により攻撃した後、14日間臨床症状を観察し所見を記録した。
（3）試験結果
新旧レンサ球菌症混合ワクチン免疫群の死亡率は、対応する新旧レンサ球菌それぞれの攻撃対照群の死亡率より低く、新旧レンサ球菌のいずれに対してもワクチンの効果が確認された。試験結果を図２に示した。
【図１】
2006068077.tif 000005
【図２】
2006068077.tif 000006
【国際調査報告】
2006068077.tif 000007
2006068077.tif 000008
2006068077.tif 000009
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