【誤訳訂正書】
【提出日】令和1年12月10日(2019.12.10)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１３０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１３０】
実施例２−（Ｓ）−レチクリンの１，２−デヒドロレチクリンへの変換
この実施例では、パパヴェル・ロエアス（Ｐａｐａｖｅｒ  ｒｈｏｅａｓ）のＣＹＰ４５０（配列番号３２５）を使用する、酵母における（Ｓ）−レチクリンの１，２−デヒドロレチクリンへのｉｎ  ｖｉｔｒｏ変換が示される。下記のように、ｐＥＳＣ−ｌｅｕ２ｄ：：ＰｓＣＰＲ／ＰｒＤＲＳを保持するサッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＹＰＨ４９９を増殖させ、ミクロソームを精製した。手短に言えば、２％グルコースを添加した、ロイシン不含合成完全（ＳＣ）培地中で、この酵母株を３０℃で１６時間、２５０ｒｐｍで増殖させた。この培養物の１ミリリットルを、１．８％ガラクトース、０．２％グルコース、および１％ラフィノースを添加した、ロイシン不含ＳＣ培地５０ｍＬに加え、３０℃で７２時間、２５０ｒｐｍで増殖させた。次いで、培養物を４，０００ｇで５分間遠心分離し、ＴＥＫ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＫＣｌ）５ｍＬで洗浄した。次いで、ペレットを、ＴＥＳＢ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．６Ｍソルビトール）１ｍＬに再懸濁し、０．５ｍｍのガラスビーズを等量加えた。チューブを１０℃で４分間、手で振盪した。ビーズをＴＥＳＢで洗浄し、洗浄液を集め、１４，０００ｇで１０分間遠心分離した。次いで、上清を１２５，０００ｇで１時間超遠心分離し、上清を廃棄した。次いで、ミクロソームを５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５に再懸濁した。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１３３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１３３】
実施例３−１，２−デヒドロレチクリンの（Ｒ）−レチクリンへの変換
この実施例では、パパヴェル・ロエアス（Ｐａｐａｖｅｒ  ｒｈｏｅａｓ）のＡＫＲ（配列番号３２７）を使用する、酵母における１，２−デヒドロレチクリンの（Ｒ）−レチクリンへのｉｎ  ｖｉｔｒｏ変換が示される。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体を調製するための方法であって、
（ａ）宿主細胞に、
（ｉ）作動可能に連結される成分として、配列番号３２５と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０）ポリペプチドをコードする第１の核酸配列と、細胞における第１の核酸配列の発現を制御する第２の核酸配列とを含む第１のキメラ核酸配列と、
（ｉｉ）作動可能に連結される成分として、配列番号３２７または配列番号３２９と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むアルド・ケト還元酵素（ＡＫＲ）ポリペプチドをコードする第３の核酸配列と、細胞における前記第３の核酸配列の発現を制御する第４の核酸配列とを含む第２のキメラ核酸配列と、
を導入するステップと、
（ｂ）前記宿主細胞を増殖させて（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体を産生させるステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記ＣＹＰ４５０ポリペプチドが、配列番号３２５のアミノ酸配列を含み、前記ＡＫＲポリペプチドが、配列番号３２７または配列番号３２９のアミノ酸配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体を調製するための方法であって、
（ａ）作動可能に連結される成分として、
（ｉ）シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０）ポリペプチドをコードする第１の核酸配列と、
（ｉｉ）アルド・ケト還元酵素（ＡＫＲ）ポリペプチドをコードする第２の核酸配列と、
（ｉｉｉ）宿主細胞における発現を制御することができる１つまたは複数の核酸配列と
を含むキメラ核酸配列を導入するステップと、
（ｂ）前記宿主細胞を増殖させて、（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体を産生させるステップと
を含み、前記（Ｒ）−レチクリン前駆体が、化学式：
2017500024.tif 000001
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ、水素原子、ヒドロキシル基、またはメトキシ基であり；
Ｒ５は、水素原子またはメチル基である］
を有するが、（Ｒ）−レチクリンが前記式から除外されており、
前記第１の核酸配列が、配列番号３２５と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、かつ、前記第２の核酸配列が、配列番号３２７または配列番号３２９と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、または、
前記キメラ核酸配列が、配列番号２または配列番号３２３と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドをコードすることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法において、前記第１の核酸配列が、配列番号３２５のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、かつ、前記第２の核酸配列が、配列番号３２７または配列番号３２９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、または、前記キメラ核酸配列が、配列番号２または配列番号３２３のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドをコードすることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項３または４に記載の方法において、前記第１および第２の核酸配列が、ＣＹＰ４５０ポリペプチドおよびＡＫＲポリペプチドを含む融合ポリペプチドを産生させるために作動可能に連結されており、前記融合ポリペプチドが配列番号３２３のアミノ酸配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１乃至５の何れか１項に記載の方法において、前記方法が、（Ｒ）−レチクリンを産生することを特徴とする方法。
【請求項７】
シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０）ポリペプチドおよびアルド・ケト還元酵素（ＡＫＲ）ポリペプチドを含む単離された組成物であって、
前記ＣＹＰ４５０ポリペプチドが、配列番号３２５と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、
前記ＡＫＲポリペプチドが、配列番号３２７または配列番号３２９と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
または、
前記ＣＹＰ４５０ポリペプチドおよび前記ＡＫＲポリペプチドが、配列番号２または配列番号３２３と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドを形成することを特徴とする組成物。
【請求項８】
請求項７に記載の組成物において、前記ＣＹＰ４５０ポリペプチドが、配列番号３２５のアミノ酸配列を含み、かつ、前記ＡＫＲポリペプチドが、配列番号３２７または配列番号３２９のアミノ酸配列を含む、または、前記融合ポリペプチドが、配列番号２または配列番号３２３のアミノ酸配列を含むことを特徴とする組成物。
【請求項９】
請求項７または８に記載の組成物において、前記融合ポリペプチドが、配列番号３２３のアミノ酸配列を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１０】
作動可能に連結される成分として、
（ａ）宿主細胞における発現を制御することができる核酸配列と、
（ｂ）（ｉ）配列番号３２５と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０）ポリペプチド、および、配列番号３２７または配列番号３２９と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むアルド・ケト還元酵素（ＡＫＲ）ポリペプチド、または、
（ｉｉ）配列番号２または配列番号３２３と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドと、
をコードする核酸配列とを含む組換え発現ベクターであって、前記発現ベクターが、宿主細胞における発現に適していることを特徴とする組換え発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターにおいて、前記ＣＹＰ４５０ポリペプチドが、配列番号３２５のアミノ酸配列を含み、かつ、前記ＡＫＲポリペプチドが、配列番号３２７または配列番号３２９のアミノ酸配列を含む、または、前記融合ポリペプチドが、配列番号２または配列番号３２３のアミノ酸配列を含むことを特徴とするベクター。
【請求項１２】
植物の外で（Ｒ）−レチクリンを製造する方法であって、
最適な条件下で、（Ｓ）−レチクリンを（Ｒ）−レチクリンに変換することができる１つまたは複数の酵素と（Ｓ）−レチクリンを接触させるステップと
を含み、
前記１つまたは複数の酵素が、
（ａ）配列番号３２５のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０）ポリペプチド、および、配列番号３２７または配列番号３２９と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むアルド・ケト還元酵素（ＡＫＲ）である、または、
（ｂ）ＣＹＰ４５０およびＡＫＲポリペプチドを含み、かつ配列番号３２３と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する融合ポリペプチドであることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法において、前記ＣＹＰ４５０ポリペプチドが配列番号３２５のアミノ酸配列を含み、かつ、前記ＡＫＲポリペプチドが、配列番号３２７または配列番号３２９のアミノ酸配列を含む、または前記融合ポリペプチドが、配列番号３２３のアミノ酸配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
ａ）（Ｓ）−レチクリンを１，２−デヒドロレチクリンへと酸化することができる第１のポリペプチド；および／または
ｂ）１，２−デヒドロレチクリンを（Ｒ）−レチクリンへと還元することができる第２のポリペプチド
を発現するキメラ核酸を含む微生物であって、
前記第１のポリペプチドが配列番号３２５と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、前記第２のポリペプチドが配列番号３２７または配列番号３２９と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、または、
前記第１および第２のポリペプチドが、配列番号２または配列番号３２３と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドを形成することを特徴とする微生物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の微生物において、前記第１のポリペプチドが配列番号３２５のアミノ酸配列を含み、かつ、前記第２のポリペプチドが配列番号３２７または配列番号３２９のアミノ酸配列を含む、または、前記融合ポリペプチドが配列番号２または配列番号３２３のアミノ酸配列を含むことを特徴とする微生物。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の微生物において、前記微生物が酵母であることを特徴とする微生物。