【手続補正書】
【提出日】令和2年1月24日(2020.1.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
拡大された内耳支持細胞の集団を作製する方法であって、内耳支持細胞の集団を、
（ａ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；
（ｂ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；
（ｃ）表Ｂに明示された骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達阻害剤；
（ｄ）表Ｃに明示されたサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）活性化剤；
（ｅ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；
（ｆ）表Ｅに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達活性化剤；
（ｇ）表Ｆに明示されたヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤；
（ｈ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；
（ｉ）表Ｈに明示されたＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤；および
（ｊ）表Ｉに明示されたｃＡＭＰ応答エレメント結合性タンパク質（ＣＲＥＢ）活性化剤
からなる群から選択される、１つまたは複数の薬剤と接触させるステップ
を含み、
前記１つまたは複数の薬剤が、拡大された内耳支持細胞の集団を作製するのに十分な量で存在する、前記方法。
【請求項２】
前記Ｎｏｔｃｈシグナル伝達活性化剤が、Ｄｅｌｔａ様タンパク質活性化剤、Ｊａｇｇｅｄタンパク質活性化剤、Ｎｏｔｃｈ活性化剤、および／またはγ−セクレターゼ活性化剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つまたは複数の薬剤が、
（ａ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；
（ｂ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；
（ｃ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；
（ｄ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；および
（ｅ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤
からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記拡大された内耳支持細胞の集団が、拡大されたＬｇｒ５＋内耳支持細胞の集団であり、好ましくは、前記拡大されたＬｇｒ５＋内耳支持細胞の集団が、拡大されたＬｇｒ５＋蝸牛支持細胞の集団、または拡大されたＬｇｒ５＋前庭支持細胞の集団である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
内耳支持細胞の集団の、内耳有毛細胞の集団への分化を促進する方法であって、内耳支持細胞の集団を、
（ａ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；
（ｂ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；
（ｃ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；
（ｄ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；
（ｅ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；
（ｆ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤；
（ｇ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；
（ｈ）表Ｈに明示されたＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤；
（ｉ）表Ｉに明示されたＣＲＥＢ活性化剤；および
（ｊ）表Ｊに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤
からなる群から選択される、１つまたは複数の薬剤と接触させるステップ
を含み、
前記１つまたは複数の薬剤が、内耳有毛細胞の集団への分化を促進するのに十分な量で存在する、前記方法。
【請求項６】
前記１つまたは複数の薬剤が、
（ａ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；
（ｂ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；
（ｃ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤；
（ｄ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；および
（ｅ）表Ｊに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤
からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤が、Ｄｅｌｔａ様タンパク質阻害剤、Ｊａｇｇｅｄタンパク質阻害剤、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、および／もしくはγ−セクレターゼ阻害剤であり、並びに／または前記内耳有毛細胞の集団が、Ａｔｏｈ１（ａｔｏｎａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １）＋内耳有毛細胞の集団であり、好ましくは、前記Ａｔｏｈ１＋内耳有毛細胞の集団が、Ａｔｏｈ１＋蝸牛有毛細胞の集団、またはＡｔｏｈ１＋前庭有毛細胞の集団である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤が、表Ｋに明示されたレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アゴニストまたは表Ｋに明示されたレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）アゴニストであり、好ましくは、前記ＲＡＲアゴニストが、ＲＡＲαアゴニスト、ＲＡＲβアゴニスト、および／またはＲＡＲγアゴニストであるか、あるいは、前記ＲＸＲアゴニストが、ＲＸＲαアゴニスト、ＲＸＲβアゴニスト、および／またはＲＸＲγアゴニストであり、あるいは、前記ＢＭＰシグナル伝達阻害剤が、Ｎｏｇｇｉｎ活性化剤、Ｃｈｏｒｄｉｎ活性化剤、ＢＭＰ受容体阻害剤、ＳＭＡＤ１／５／８阻害剤、ＳＭＡＤ２／３阻害剤、および／またはＳＭＡＤ４阻害剤である、請求項１から５および７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｗｎｔシグナル伝達活性化剤が、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３β（ＧＳＫ−３β）阻害剤、Ｗｎｔ活性化剤、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体活性化剤、リポタンパク質受容体関連タンパク質５／６（ＬＲＰ５／６）活性化剤、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ（Ｄｖｌ）活性化剤、アキシン阻害剤、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ（Ｄｋｋ）阻害剤、分泌型Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ｓＦＲＰ）阻害剤、Ｇｒｏｕｃｈｏ阻害剤、および／またはＷｎｔ阻害性タンパク質（ＷＩＦ）阻害剤であり、および／または前記Ｅ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤が、Ａｔｏｈ１活性化剤であり、および／または前記ＣＤＫ活性化剤が、ｐ２７Ｋｉｐ１阻害剤および／または網膜芽細胞腫タンパク質（Ｒｂ）阻害剤である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＨＤＡＣ阻害剤が、ＨＤＡＣクラスＩ阻害剤、ＨＤＡＣクラスＩＩ阻害剤、ＨＤＡＣクラスＩＩＩ阻害剤、および／または汎ＨＤＡＣ阻害剤であり、好ましくは、前記ＨＤＡＣクラスＩＩＩ阻害剤が、ＳＩＲＴ１阻害剤および／またはＳＩＲＴ２阻害剤であり、および／または前記タンパク質分解阻害剤が、プロテアソーム阻害剤またはユビキチンリガーゼ阻害剤であり、および／または前記ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤が、Ａｋｔ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、および／またはＰＤＫ１阻害剤である、請求項１、２、および４から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記内耳支持細胞の集団が、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞の集団であり、好ましくは、前記Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞の集団が、Ｌｇｒ５＋蝸牛支持細胞の集団、またはＬｇｒ５＋前庭支持細胞の集団である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。 
【請求項１２】
蝸牛有毛細胞または前庭有毛細胞の喪失と関連する難聴または平衡感覚障害を処置するための候補薬剤を同定するための方法であって、
（ａ）内耳支持細胞の集団を、拡大された内耳支持細胞の集団を作製するのに十分な条件下で維持するステップであって、
前記内耳支持細胞の集団は、マウスのゲノムに安定的に組み込まれた２つ以上の組換え核酸分子を有するトランスジェニックマウスであって、Ｌｇｒ５、Ｓｏｘ２、ｐ２７、Ｐｒｏｘ１、ＦＧＦＲ３、Ｇｌａｓｔ、およびＬｆｎｇからなる群から選択される内耳支持細胞マーカーの調節エレメントの制御下で第１のレポーター遺伝子を含む少なくとも第１の組換え核酸分子、ならびにＡｔｏｈ１、Ｍｙｏ７ａ、Ｃｄｈ２３、Ｐｃｄｈ１５、Ｍｙｏ６、Ｍｙｏ１ｃ、Ｔｍｃ１、およびＣａｖ１．３からなる群から選択される内耳有毛細胞マーカーの調節エレメントの制御下で第２のレポーター遺伝子を含む第２の組換え核酸分子を含み、前記第１のレポーター遺伝子が、前記第２のレポーター遺伝子と異なる、トランスジェニックマウスから単離される、前記ステップ、
（ｂ）被験化合物を、前記拡大された内耳支持細胞の集団に投与するステップ；
（ｃ）前記被験化合物の存在下において、前記拡大された内耳支持細胞の集団内の前記第１のレポーター遺伝子および前記第２のレポーター遺伝子の発現レベルを検出するステップ；ならびに
（ｄ）難聴または平衡感覚障害を処置するための候補薬剤として、前記第１のレポーター遺伝子の発現レベルを、被験化合物の非存在下における前記第１のレポーター遺伝子の発現レベルと比較して上昇させ、かつ／または前記第２のレポーター遺伝子の発現レベルを、被験化合物の非存在下における前記第２のレポーター遺伝子の発現レベルと比較して上昇させる被験化合物を選択するステップ
を含む方法。
【請求項１３】
前記拡大された内耳支持細胞の集団を作製するのに十分な条件が、１つまたは複数の成長因子、好ましくは表皮成長因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、および／またはインスリン様成長因子（ＩＧＦ１）の存在下における培地、好ましくはＤＭＥＭおよびＦ１２培地の混合物、好ましくは１：１の混合物を含み、ならびに／または、前記内耳支持細胞マーカーがＬｇｒ５であり、前記内耳有毛細胞マーカーがＡｔｏｈ１であり、ならびに／または、前記第１のレポーター遺伝子が第１の蛍光タンパク質をコードし、前記第２のレポーター遺伝子が第２の蛍光タンパク質をコードし、前記第１の蛍光タンパク質が前記第２の蛍光タンパク質と異なり、ならびに／または、
前記拡大された内耳支持細胞の集団を作製するのに十分な条件が、
（ａ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；
（ｂ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；
（ｃ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；
（ｄ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；
（ｅ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；
（ｆ）表Ｅに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達活性化剤、または表Ｊに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤；
（ｇ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤；
（ｈ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；
（ｉ）表Ｈに明示されたＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤；および
表Ｉに明示されたＣＲＥＢ活性化剤
からなる群から選択される、１つまたは複数の薬剤をさらに含み、
好ましくは、前記レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤が、表Ｋに明示されたＲＡＲアゴニスト、または表Ｋに明示されたＲＸＲアゴニストであり、ならびに／または、
前記拡大された内耳支持細胞の集団を作製するのに十分な条件が、表１に明示された１つまたは複数の薬剤を含み、ならびに／または、
前記拡大された内耳支持細胞の集団を作製するのに十分な条件が、Ｎ２、Ｂ２７、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ１、ＣＨＩＲ９９０２１、およびＶＰＡを補充した培地、好ましくはＤＭＥＭおよびＦ１２の１：１の混合物を含み、ならびに／または、
前記候補薬剤が、低分子、化合物、核酸、ペプチド、ポリペプチド、成長因子、および後成的修飾剤からなる群から選択され、ならびに／または、
前記内耳支持細胞の集団は、最初にコルチ器を切開するステップと、感覚上皮を単離するステップと、単一細胞の懸濁液を創出するステップとを含む方法により、前記マウスの蝸牛から単離され、ならびに／または、
前記内耳支持細胞の集団が、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞の集団であり、ならびに／または、
前記第１のレポーター遺伝子が、第１の蛍光タンパク質をコードし、前記第２のレポーター遺伝子が、第２の蛍光タンパク質をコードし、前記第１の蛍光タンパク質が、前記第２の蛍光タンパク質と異なり、ならびに／または、
前記第１のレポーター遺伝子および前記第２のレポーター遺伝子の発現レベルが、タンパク質の発現レベルである、
請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
難聴または平衡感覚障害を有する対象を処置する方法に使用するための組成物であって、前記方法は、それを必要とする前記対象に、
（ａ）治療有効量の、
（ｉ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；
（ｉｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；
（ｉｉｉ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；
（ｉｖ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；
（ｖ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；
（ｖｉ）表Ｅに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達活性化剤；
（ｖｉｉ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤；
（ｖｉｉｉ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；および
（ｉｘ）表Ｈに明示されたＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤
からなる群から選択される、内耳支持細胞の増殖を促進する１つもしくは複数の薬剤；ならびに／または
（ｂ）治療有効量の、
（ｉ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；
（ｉｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；
（ｉｉｉ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；
（ｉｖ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；
（ｖ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；
（ｖｉ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤；
（ｖｉｉ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；
（ｖｉｉｉ）表Ｈに明示されたＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達阻害剤；および
（ｉｘ）表Ｊに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤
からなる群から選択される、内耳支持細胞の内耳有毛細胞への分化を促進する１つもしくは複数の薬剤
のうちの一方または両方を投与するステップを含む、前記組成物。
【請求項１５】
前記組成物は、
（ａ）治療有効量の、
（ｉ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；
（ｉｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；
（ｉｉｉ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；
（ｉｖ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；および
（ｖ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤
からなる群から選択される、内耳支持細胞の増殖を促進する１つもしくは複数の薬剤；ならびに／または
（ｂ）治療有効量の、
（ｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；
（ｉｉ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；
（ｉｉｉ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤；
（ｉｖ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；および
（ｖ）表Ｊに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤
からなる群から選択される、内耳支持細胞の内耳有毛細胞への分化を促進する１つもしくは複数の薬剤
のうちの一方または両方を含み、ならびに／または、
前記１つまたは複数の薬剤は、全身投与するか、または前記対象の耳、好ましくは前記対象の中耳に経鼓膜投与するものであり、ならびに／または、
前記内耳支持細胞の増殖を促進する１つまたは複数の薬剤は、前記内耳支持細胞の内耳有毛細胞への分化を促進する１つまたは複数の薬剤の前に投与するものであり、ならびに／または、
（ａ）前記内耳支持細胞の増殖を促進する１つまたは複数の薬剤が、
（ｉ）レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤；
（ｉｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；
（ｉｉｉ）表Ｂに明示されたＢＭＰシグナル伝達阻害剤；
（ｉｖ）表Ｃに明示されたＣＤＫ活性化剤；および
（ｖ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤
からなる群から選択され；
（ｂ）前記内耳支持細胞の内耳有毛細胞への分化を促進する１つまたは複数の薬剤が、
（ｉ）表Ａに明示されたＷｎｔシグナル伝達活性化剤；
（ｉｉ）表Ｄに明示されたＥ  ｂｏｘ依存性転写活性化剤；
（ｉｉｉ）表Ｆに明示されたＨＤＡＣ阻害剤；
（ｉｖ）表Ｇに明示されたタンパク質分解阻害剤；および
（ｖ）表Ｊに明示されたＮｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤
からなる群から選択され、ならびに／または、
前記レチノイド受容体シグナル伝達活性化剤が、表Ｋに明示されたＲＡＲアゴニスト、または表Ｋに明示されたＲＸＲアゴニストであり、ならびに／または、
前記内耳支持細胞が、Ｌｇｒ５＋内耳支持細胞であり、ならびに／または、
前記内耳有毛細胞が、Ａｔｏｈ１＋内耳有毛細胞であり、ならびに／または、
前記対象が、平衡感覚障害を有し、ならびに／または、
前記対象が、難聴、好ましくは感覚神経的難聴であり、ならびに／または、
前記難聴が、遺伝性欠損もしくは先天性欠損、外傷、老化、または化学物質誘導性中毒性難聴の結果であり、ならびに／または、
前記対象が、ヒトである、
請求項１４に記載の組成物。