(57)【要約】    【課題】  骨芽細胞との機械的結合が比較的高く、強度が高いインプラント材料を提供する。    【解決手段】  胴部２１と橋げた２２を有するロッド１１と、そのロッドの胴部の外周に形成された結合層１３と、その結合層の外周に形成された金属繊維層１４とからなり、さらに金属繊維層１４の外周には補強層１５が形成されている生体硬組織誘導性スカフォールド材料１０。この結合層１３は平均ポアサイズが１００μｍより小さく、金属繊維層１４は、平均ポアサイズが１００〜４００μｍである。【選択図】  図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属基材と、その金属基材の外周に設けられている金属線からなる金属繊維層とを備え、前記金属繊維層の平均ポアサイズが１００〜４００μｍである生体硬組織または生体軟組織誘導性スカフォールド材料。
【請求項２】
前記金属繊維層の内側に金属線からなる平均ポアサイズが１００μｍより小さい結合層を備えている請求項１記載のスカフォールド材料。
【請求項３】
前記金属繊維層の平均ポアサイズが、最内から最外にかけて傾斜的にまたは段階的に大きくなっている請求項１記載のスカフォールド材料。
【請求項４】
前記金属繊維層が径５〜４００μｍの金属線を絡合することによって形成されている金属不織布を固定したものである請求項１記載のスカフォールド材料。
【請求項５】
前記金属繊維層が径５〜４００μｍの金属線からなり、その金属線の絡合度の差により、平均ポアサイズを傾斜的または段階的に大きくなるように変化させている請求項３記載のスカフォールド材料。
【請求項６】
前記金属繊維層が径５〜４００μｍの金属線からなり、その金属線径の差により、平均ポアサイズを傾斜的または段階的に大きくなるように変化させている請求項３記載のスカフォールド材料。
【請求項７】
前記結合層が、径５〜４００μｍの金属線を絡合させることにより形成されており、その絡合された金属線間に金属粉または金属粒子が密に埋め込まれている請求項２記載のスカフォールド。
【請求項８】
前記金属粉または金属粒子の径が１００μｍ以下である請求項７記載のスカフォールド。
【請求項９】
前記金属繊維層の外周に、径１００〜２０００μｍの金属線を用い、平均ポアサイズを１００〜２０００μｍとした補強層が形成されている請求項１から８いずれか記載のスカフォールド材料。
【請求項１０】
前記金属基材の形状がロッドであり、そのロッド表面にロッドの半径方向に対して外側に突出している橋げたまたは突起物が形成されている請求項１から９いずれか記載のスカフォールド材料。
【請求項１１】
前記金属基材の形状がプレートであり、そのプレート表面外側に突出している突起物が形成されている請求項１から９いずれか記載のスカフォールド材料。
【請求項１２】
前記金属基材と前記金属繊維層および／または結合層とを共に焼結することにより形成している請求項１から１１いずれか記載のスカフォールド材料。
【請求項１３】
前記焼結が、金属基材の融点（Ｔｍ・℃）の０．３〜０．９倍の温度により行われる請求項１２記載のスカフォールド材料。
【請求項１４】
前記金属基材と金属繊維層または結合層を接着剤でもって接着している請求項２記載のスカフォールド材料。
【請求項１５】
前記金属基材および金属繊維層および／または結合層の材質がチタン、チタン合金、金、金合金からなる群より選ばれた一種または二種の金属である請求項１から１４いずれか記載のスカフォールド材料。
【請求項１６】
前記金属繊維層および／または結合層がアパタイト生成液によって処理され、炭酸アパタイトを含む、ヒドロキシアパタイト、その他のリン酸カルシウム化合物によってコートされている請求項１から１５いずれか記載のスカフォールド材料。
【請求項１７】
基材と、その基材の外周に設けられている平均ポアサイズが１００〜４００μｍの多孔質構造体からなる細胞誘導層とを備えており、
前記基材が、２ｍｍ以下のミクロな孔を持つポーラス構造体で、中心方向に向かって延びる少なくとも一本の導入孔を備えており、この導入孔と基材の外部とがミクロな孔によって複雑に連通している、生体硬組織または生体軟組織誘導性スカフォールド材料。
【請求項１８】
基材と、その基材の外周に設けられている平均ポアサイズが１００〜４００μｍの多孔質構造体からなる細胞誘導層とを備えており、
前記基材は、中空部を備えた基材本体と、その中空部に充填される多孔質三次元構造体とを有しており、
前記基材本体は、中空部に連通するように外面に形成された少なくとも１つ以上の外径２ｍｍ以下の穿孔と、中空部に連通するように外面に形成された穿孔より大きい導入孔とを備えている、生体硬組織または生体軟組織誘導性スカフォールド材料。
【請求項１９】
前記中空部に、支柱が配置されている請求項１８記載の生体硬組織または生体軟組織誘導性スカフォールド材料。
【請求項２０】
前記細胞誘導層は、金属線を絡合することによって形成されている請求項１７または１８記載の生体硬組織または生体軟組織誘導性スカフォールド材料。
【請求項２１】
前記金属繊維層および／または結合層に骨形成タンパク質などのサイトカイン、インシュリンなどのホルモン、インターフェロンなどの微量活性物質からなる群から選ばれた一種または二種以上コートされている請求項１から２０いずれか記載のスカフォールド材料。
【請求項２２】
生体内に埋設させ、生体の周囲表面に一体に固定する請求項１から２１いずれか記載の生体硬組織または生体軟組織誘導性スカフォールド材料を備えた生体インプラント材料。
【請求項２３】
人工歯根、人工関節、骨プレートなどの骨固定具、代替骨、人工臓器またはその保持装置、皮膚端子からなる群より選ばれた一種に用いられる請求項２２記載の生体インプラント材料。
【請求項２４】
細繊維を絡合したウエブからなる培養基盤に足場依存性の細胞または微生物を播種し、ついで播種した培養基盤に培養液を加えて前記細胞または微生物を培養する、細胞・微生物の培養方法。
【請求項２５】
前記培養基盤の底部に不透過層を設けて複合層とした状態で、細胞または微生物を培養する請求項２４記載の細胞・微生物の培養方法。
【請求項２６】
前記培養基盤の側面にも不透過層を設けて、細胞または微生物を培養する請求項２５記載の細胞・微生物の培養方法。
【請求項２７】
前記培養基盤を多数枚、複数段の着脱可能な積層状態で筒状の容器内に収容し、その容器内に培養液を環流させる請求項２４記載の細胞・微生物の培養方法。
【請求項２８】
所定の生物由来物質を産生する細胞または微生物を請求項２４−２７のいずれかに記載の培養方法で培養し、ついで培養した細胞または微生物から得られた生物由来物質を分離・回収する生物由来物質の産生方法。
【請求項２９】
前記生物由来物質がコラーゲンなどのマトリックスタンパク質、骨形成タンパク質などのサイトカイン、インシュリンなどのホルモン、インターフェロンなどの微量活性物質、医学上・産業上有用なリコンビナントタンパク質からなる群から選ばれた１種または２種以上である請求項２８記載の産生方法。
【請求項３０】
前記環流させる培養液の一部を回収し、その培養液中に分泌された生物由来物質を回収する請求項２９記載の産生方法。
【請求項３１】
前記培養基盤に沈着された生物由来物質を溶媒または酵素処理によって可溶化し、溶媒中に溶けている生物由来物質を抽出する請求項２８記載の産生方法。
【請求項３２】
筒状の容器と、その内部に積層状態で着脱自在に収容される細繊維を絡合したウエブからなる複数枚の培養基盤と、前記容器内に培養液を環流させる手段とを備えている培養装置。
【請求項３３】
前記細繊維が、太さ１〜１０００μｍの生体親和性が高い金属製の細繊維であり、前記ウエブが厚さ０．５〜１０ｍｍのシート状を呈する請求３２記載の培養装置。
【請求項３４】
前記ウエブにリン酸カルシウム化合物がコートされている請求項３２記載の培養装置。
【請求項３５】
前記リン酸カルシウム化合物のコートの上に、さらに産生目的の生物由来物質のマトリックスタンパクをコートしている請求項３４記載の培養装置。
【請求項３６】
前記積層される培養基盤が、培養基盤同士の間に隙間をあけるようにそれぞれホルダーに載置された状態で積層されている請求項３２記載の培養装置。
【請求項３７】
前記ホルダーが、培養基盤を載置する薄板リング状の底板と、その底板の周囲から立ち上がる周囲壁とからなり、周囲壁の内面の高さが培養基盤と同程度ないしそれよりいくらか高い請求項３６記載の培養装置。
【請求項３８】
請求項３２−３７のいずれかに記載の培養装置と、前記培養基盤または培養液から生物由来物質を取り出す手段とを備えている生物由来物質の産生装置。
【請求項３９】
前記培養基盤に第１細胞を播種し、ついで播種した培養基盤に培養液を加えて前記第１細胞を培養し、その後、その第１細胞を培養した培養基盤の上に第２細胞を播種し、ついで播種した培養基盤に培養液を加えて第１および第２細胞を培養することによって製造される三次元人工モデルの製造方法。
【請求項４０】
前記三次元人工モデルが三次元皮膚モデルである請求項３９記載の三次元皮膚モデルの製造方法。
【請求項４１】
前記第１細胞が線維芽細胞であり、前記第２細胞が上皮細胞である、請求項４０記載の三次元皮膚モデル製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は人工歯根インプラント、人工関節インプラント、骨プレートなどの骨固定具、代替骨または人工臓器およびその保持装置に用いられる生体硬組織または軟組織誘導性スカフォールド材料（以下、スカフォールド材料という）に関する。さらに、本発明は細胞・微生物の培養方法、それを用いた生物由来物質（とくに医療用のコラーゲン）の産生方法、ならびにそれらの方法に用いる装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
【特許文献１】特開平１１−３４１号公報
【特許文献２】特開平８−１４０９９６号公報
【特許文献３】特開２００４−６７５４７号公報
【特許文献４】特開２００４−６７５４７号公報
【０００３】
従来、生体内植え込み用インプラント材料として、人工歯根、人工関節などの硬組織誘導性のインプラント材料または人工臓器およびその保持装置、皮膚端子など軟組織誘導性のインプラント材料が知られている。ここで人工歯根、人工関節などの骨固定具は、生体内の硬組織である骨組織（骨芽細胞、骨細胞）の誘導および成長が重要となり、人工臓器またはその保持装置あるいは皮膚端子などは、生体内の軟組織（線維芽細胞等）の誘導および成長が重要となる。このようなインプラント材料の金属材料としてチタンおよびチタン合金が、他の金属に比べて生体内での異物反応が少ない特異な親和性を有するとして好ましく用いられている。
しかし、たとえ生体内での異物反応が少ない場合でも、これらのインプラント材料が生体内に植え込まれたとき、インプラント材料表面には結合組織系の線維芽細胞などが膠原繊維と共に集まって被包組織を形成するため、インプラント材料と骨組織とは直接接することができず、骨組織を誘導するのに時間がかかり実用的でなかった。また、材料の表面がたとえ粗造な平面でも２次元構造のため、前記被包組織等を含む軟組織とは結合することができない。そのためインプラント材料が生体内に強固に固定されるためには、インプラント材料と生体硬組織または軟組織とが短時間でそして、より多くの機械的結合を備えることが必要になる。このような趣旨から生体硬組織または軟組織と機械的結合する部位を備えた様々な幾何学的構造を有するインプラント材料が開発されている。【０００４】
特許文献１には、外部表面が複数の開口セルを有する金属製の泡構造薄層で被覆されたインプラント材料が開示されている。そして、この泡構造薄層の被覆部に強化された骨セメントを含侵させることにより、インプラント材料と骨との中間的な機械的性質を示すものである。
また特許文献２には、金属線材をインプラント材料の下部外周に多重に圧縮して巻きつけて形成される埋入部を備えたインプラント材料が開示されている。このインプラント材料も骨芽細胞との金属的結合部位を増やすことを目的としており、さらに、埋入部が緩衝機能に優れているため、咬合等の外力にたいしても破断が起こりにくい。
しかし、上述する幾何学的構造を有するインプラント材料には骨芽細胞のインプラント材料への侵入は見られるが、細胞との一体となったオステオインテグレーション状態を満足するものではなかった。【０００５】
本発明者は、特許文献３において「骨芽細胞は細い繊維が構成する幾何学的空間に好んで成育し、１００μｍ未満の太さのチタン繊維集団が構成する幾何学的空間構造で、その広がりが１００〜４００μｍであるような構造に対して極めて高い親和性を示し、積極的に付着する特性がある」と記載している。そして、この知見を元にチタン金属製のロッドと、直径が１００ミクロン未満、アスペクト比２０以上（短軸：長軸比＝１：２０以上）のチタン繊維又はチタン基合金繊維を絡合して層状に形成したものを前記ロッドの外周に巻きつけた生体組織着床空間とからなる生体硬組織誘導性スカフォールド材料を開示している。この特許文献３のスカフォールド材料を生体に用いることにより、材料と骨芽細胞との間で３次元的な物理的結合が形成され、極めて良好なオステオインテグレーション組織となる。【０００６】
しかし、特許文献３の多孔質の生体組織着床層を備えたインプラント材は、骨芽細胞との機械的結合は好ましくなるが、外力に対する耐久性、特にロッドと硬組織形成誘導層との間の接合面に加わる力、ねじりまたはせん断等に対する強度についてのさらなる改善が求められている。
本発明は、硬組織（骨芽細胞）が好んで育成する幾何学的空間を維持したまま、ロッドと硬組織形成誘導層との間の接合面に加わる力、特にねじりまたはせん断等に対する強度を向上させることを目的としている。
また、現在人工心臓を初めとする人工臓器を生体内に埋め込む場合、その人工臓器を保持するために、生体内組織と結合しやすい別の人工物を人工臓器と共に埋め込んでいる。本発明は軟組織が誘導され易いポアサイズで、かつ幾何学的空間を持ち、骨芽細胞以外の各種（足場依存性）細胞や軟組織である皮膚や筋肉にも用いることができるスカフォールド材料およびそのインプラント材料を提供することも目的としている。【０００７】
本発明の生体組織誘導性スカフォールド材料（請求項１）は、金属基材と、その金属基材の外周に設けられている金属線からなる金属繊維層とを備え、前記金属繊維層の平均ポアサイズが１００〜４００μｍであることを特徴としている。このようなスカフォールド材料であって金属繊維層の内側に金属線からなる平均ポアサイズが１００μｍより小さい結合層を備えているものが好ましい（請求項２）。また、金属繊維層の平均ポアサイズが、最内から最外にかけて傾斜的または段階的に大きくなっているものが好ましい（請求項３）。【０００８】
上述のスカフォールド材料の金属繊維層として、径５〜４００μｍの金属線を絡合することによって形成されている金属不織布を固定したものが挙げられる（請求項４）。また、金属繊維層が径５〜４００μｍの金属線からなり、その金属線の絡合度の差または金属線径の差により、ポアサイズを傾斜的または段階的に大きくなるように変化させているものであってもよい（請求項５、６）。
さらに、前記結合層が、径５〜４００μｍの金属線を絡合させることにより形成され、その絡合された金属線間に金属粉または金属粒子を密に埋め込むことにより、平均ポアサイズが１００μｍより小さい結合層を形成してもよい（請求項７）。このような金属粉または金属粒子の径は１００μｍ以下であることが好ましい（請求項８）。
また、金属繊維層の外周に、径１００〜２０００μｍの金属線を用い、平均ポアサイズを１００〜２０００μｍとした補強層を形成してもよい（請求項９）。【０００９】
このようなスカフォールド材料の金属基材は用途に応じてその形状をロッドとし、そのロッド表面にロッドの半径方向に対して外側に突出している橋げたまたは突起物を形成してもよい（請求項１０）。また、金属基材の形状をプレートとし、そのプレート表面外側に突出している突起物を形成してもよい（請求項１１）。【００１０】
さらに、スカフォールド材料は金属基材と金属繊維層および／または結合層とを共に焼結することにより形成するのが好ましい（請求項１２）。そのような焼結は金属基材の融点（Ｔｍ・℃）の０．３〜０．９倍の温度により行うのが好ましい（請求項１３）。しかし、金属基材と金属繊維層または結合層を接着剤でもって接着してもよい（請求項１４）。
スカフォールド材料の材質は、金属基材および金属繊維層および／または結合層の材質がチタン、チタン合金、金、金合金からなる群より選ばれた一種または二種の金属であるものが好ましく（請求項１５）、金属繊維層および／または結合層がアパタイト生成液によって処理され、炭酸アパタイトを含む、ヒドロキシアパタイト、その他のリン酸カルシウム化合物によってコートされているものが好ましい（請求項１６）。【００１１】
本発明の生体硬組織または軟組織誘導性スカフォールド材料の第２の態様は、基材と、その基材の外周に設けられている平均ポアサイズが１００〜４００μｍの多孔質構造体からなる細胞誘導層とを備えており、前記基材が、２ｍｍ以下のミクロな孔を持つポーラス構造体で、中心方向に向かって延びる少なくとも一本の導入孔を備えており、この導入孔と基材の外部とがミクロな孔によって複雑に連通していることを特徴としている（請求項１７）。【００１２】
本発明の生体硬組織または軟組織誘導性スカフォールド材料の第３の態様は、基材と、その基材の外周に設けられている平均ポアサイズが１００〜４００μｍの多孔質構造体からなる細胞誘導層とを備えており、前記基材は、中空部を備えた基材本体と、その中空部に充填される多孔質三次元構造体とを有しており、前記基材本体は、中空部に連通するように外面に形成された少なくとも１つ以上の外径２ｍｍ以下の穿孔と、中空部に連通するように外面に形成された穿孔より大きい導入孔とを備えていることを特徴としている（請求項１８）。また、前記中空部に、支柱が配置されているものが好ましい（請求項１９）。
さらに、本発明の第２または第３の態様のスカフォールド材料において、前記細胞誘導層は、金属線を絡合することによって形成されているものが好ましい（請求項２０）。また、前記のようにリン酸カルシウム化合物をコートしたものおよび未コートのものに骨形成たんぱく質などのサイトカイン、インシュリンなどのホルモン、インターフェロンなどの微量活性物質からなる群から選ばれた一種または二種以上がコートされているものが好ましい（請求項２１）。【００１３】
本発明の生体インプラント材料は、生体内に埋設させ、生体の周囲表面に一体に固定する上述したいずれかの生体組織誘導性スカフォールド材料を備えたことを特徴としている（請求項２２）。また、このインプラント材料は、人工歯根、人工関節、骨プレートなどの骨固定具、代替骨、人工臓器またはその保持装置または皮膚端子に用いられるのが好ましい（請求項２３）。【００１４】
本発明のスカフォールド材料（請求項１）は、平均ポアサイズが１００〜４００μｍの金属繊維層を備えているため、生体硬組織の誘導および着床性に優れており、骨芽細胞が好んで定着し、成長しやすい。そのため、金属繊維層において、骨芽細胞とスカフォールド材料は一体化し、いわゆるコラボレーション・ゾーンを形成する。
このようなスカフォールド材料であって、金属繊維層の内側に平均ポアサイズが１００μｍより小さい結合層を備えているため（請求項２）、金属基材と結合層との密着性が優れており、強固に固着される。そして、金属繊維層と金属基材との接合強度も結合層を挟んでより強固になる。
また、金属繊維層の平均ポアサイズが最内から最外にかけて傾斜的または段階的に大きくなるように形成されているため（請求項３）、骨芽細胞が成長した後、両層の境界面がなくなるため、スカフォールド材料に力が加わっても、せん断しにくい。そして、最外部位の平均ポアサイズが一番大きいため、細胞が侵入しやすい。【００１５】
前記金属繊維層が径５〜４００μｍの金属線を絡合することによって形成された金属不織布を巻きつけたもの（請求項４）、また、前記金属繊維層が径５〜４００μｍの金属線からなり、その金属線の絡合度の差または金属線径の差により、平均ポアサイズを傾斜的または段階的に大きくなるように変化させたもの（請求項５、６）は、製造が容易である。たとえば、同径の金属線からなる金属不織布または同径の金属線を徐々に巻きつけ力を弱めながら絡合して形成する、または、平均ポアサイズの異なる複数の金属不織布を連続して巻きつける、または、金属線または金属不織布を巻きつけ、または、金型に入れて外部より異なる圧力をかけることにより絡合度に差を設ける、さらには、異なる径の金属線または異なる径の金属線からなる金属不織布を一定の巻きつけ力で絡合していく等が挙げられる。もちろんこれらを組合せても構わない。しかし、これらに限定するものではない。【００１６】
また、前記結合層が、径５〜４００μｍの金属線を絡合させることにより形成されており、その絡合された金属線間に金属粉または金属粒子が密に埋め込まれている場合（請求項７）、金属繊維層の平均ポアサイズを、金属線を金属基材に設ける前にも設けた後にも自由に調整できるため、その製造が容易である。また、金属粉または金属粒子を埋め込むことにより金属繊維層の平均ポアサイズを調整してもよく、その金属繊維層の平均ポアサイズは一律にしても、段階的または傾斜的にしてもよい。【００１７】
本発明のスカフォールド材料であって、金属繊維層の外周に、径１００〜２０００μｍの金属線を用い、平均ポアサイズを１００〜２０００μｍとした補強層が形成されている場合（請求項９）、この補強層がスカフォールド材料全体の骨組みとなり、ねじり等の外力に対してさらに強固になる。【００１８】
前記基材の形状をロッドとすることにより、人工歯根、人工関節、代替骨として使用することができ、また、基材の形状をプレートにすることにより、骨プレートなどの骨固定具、人工臓器または保持装置として使用することができる。さらに、そのロッド表面にロッドの半径方向に対して外側に突出している橋げたまたは突起物が形成されている場合（請求項１０、１１）、外力特にねじり、せん断に対するロッドと金属繊維層との接合強度を向上させることができる。【００１９】
上述したスカフォールド材料の金属基材と金属繊維層および／または結合層とを共に焼結することによって形成する場合（請求項１２）、金属基材と金属線との接合部位および金属線同士の絡合部位が焼結によって固着されるため、一層強固になる。このような場合、金属基材と金属線が同種の金属であることが好ましい。
本発明のスカフォールド材料の金属基材、金属繊維層および／または結合層の材料がチタン、チタン合金、金、金合金である場合（請求項１５）、生体親和性が高く好ましい。また、金属繊維層および／または結合層がアパタイト生成液によって処理され、炭酸アパタイトを含むヒドロキシアパタイト、その他のリン酸カルシウム化合物および骨形成タンパク質などのサイトカイン、インシュリンなどのホルモン、インターフェロンなどの微量活性物質によってコートされている場合（請求項１６、１７）、短期間で骨芽細胞を金属繊維層内に誘導することができ、着床させることができる。【００２０】
本発明のインプラント材料は、生体内に埋設させ、生体の周囲表面に一体に固定する上述したいずれか記載のスカフォールド材料を備えているため（請求項１８）、生体と強固に固着させることができ、金属基材に加わるねじりまたはせん断等の外力による金属基材と金属繊維層との間との間の境界面の破断を防止する。【００２１】
一方、医療用コラーゲンは皮膚、骨、軟骨など、あらゆる組織と臓器の再建・再生医療にとって最良の基本素材である。このような医療用コラーゲンは、ウシの皮膚、骨などから供給されており、現在、その特性をもつ人工の代替品は開発されていない。しかし近年、ウシ海綿脳炎（ＢＳＥ、狂牛病）の出現の影響により、最大の医療用コラーゲン供給源であったウシの皮膚、骨などが利用困難になりつつある。また、ウシ以外の哺乳動物、たとえばブタでも類似疾患の可能性が否定できない。また、魚類のコラーゲンは特性が著しく劣るため、使用できない場合が多い。【００２２】
そこでヒト・コラーゲンの遺伝子工学的手法による製造が試みられたが、従来のウシ・コラーゲンと比較して、非常にコスト高になり、一般の医療用として実用的でない。コスト高の原因の一つは、コラーゲン遺伝子を導入した哺乳類細胞を大量培養する場合の細胞支持体が平面（プラスチックの皿）であるため、コラーゲン生産力に限界があるためである。【００２３】
特許文献４には、人工関節インプラント、骨補綴用インプラント、人工歯根インプラントなどの各種のインプラントと共に使用される生体硬組織誘導スカフォールド材料として、直径１００ミクロン未満、アスペクト比２０以上のチタンまたはチタン基合金繊維を絡合して層状に形成したものが開示されている。さらに特許文献１には、前記繊維表面をアパタイト生成液により処理され、ヒドロキシアパタイトまたは炭酸アパタイトを含むリン酸カルシウム化合物によりコートしたものも開示されている。【００２４】
それらの繊維層からなるスカフォールド材料は、チタンまたはチタン基合金材料よりなるインプラント材料の周囲に巻き掛けた上で生体骨に埋設すると、繊維層内部に骨組織を誘導させ、チタンと骨組織との立体的なハイブリッド状態を形成することができ、骨組織との親和性がきわめて高くなる。また、従来のポリマーなどの繊維では、目詰まりと変形が生ずるので採用が難しく、セラミック製では破損が生じやすい。【００２５】
本発明は前述の２次元平板の細胞培養法を改良し、特許文献１に示す３次元スカフォールド材料と同様な３次元構造を利用して、コラーゲン産生細胞（ヒト線維芽細胞、ヒト骨芽細胞など）などの細胞、あるいは抗生物質や各種医学上、産業上有用な物質を産生する微生物を効率的に培養する方法および生物由来物質（細胞由来物質、微生物由来物質）を効率的かつ大量に産生する方法、ならびにそれらの方法に用いる装置を提供することを技術課題としている。【００２６】
本発明の細胞・微生物の培養方法は、細繊維を絡合したウエブからなる培養基盤に足場依存性の細胞または微生物を播種し、ついで播種した培養基盤に培養液を加えて前記細胞または微生物を培養することを特徴としている（請求項２４）。このような培養方法においては、前記培養基盤の底部に、あるいは底部と側面に不透過層を設けて複合層とした状態で、細胞または微生物を培養するのが好ましい（請求項２５）。【００２７】
また、前記培養基盤を多数枚、複数段の着脱可能な積層状態で筒状の容器内に収容し、その容器内に培養液を環流させるのが好ましい（請求項２６）。その場合、培養基盤を容器に収容する前に、旋回培養により細胞または微生物を培養するのが好ましい（請求項２７）。【００２８】
本発明の生物由来物質の産生方法は、所定の生物由来物質を産生する細胞または微生物を前述のいずれかの培養方法で培養し、ついで培養した細胞または微生物から得られた生物由来物質を分離・回収することを特徴としている（請求項２８）。前記生物由来物質としては、コラーゲンなどのマトリックスタンパク質、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）などのサイトカイン、インシュリンなどのホルモン、インターフェロンなどの微量活性物質など、医学上・産業上有用なリコンビナントタンパク質などがあげられ、用いられる細胞、微生物についても、医療と産業に有益なリコンビナントタンパク質をつくるほとんど全ての細胞ならびに微生物があげられる（請求項２９）。前記産生方法においては、前記環流させる培養液の一部を回収し、その培養液中に分泌された生物由来物質を回収するのが好ましい（請求項３０）。さらに前記培養基盤に沈着された生物由来物質を溶媒またはペプシンなどの酵素処理によって可溶化し、溶媒中に溶けている生物由来物質を抽出することもできる（請求項３１）。【００２９】
本発明の培養装置は、筒状の容器と、その内部に積層状態で着脱自在に収容される細繊維を絡合したウエブからなる複数枚の培養基盤と、前記容器内に培養液を環流させる手段とを備えていることを特徴としている（請求項３２）。このような培養装置では、前記細繊維が、太さ１〜１０００μｍ、望ましくは１００μｍ以下の、チタン、チタン合金、金、金合金などの生体親和性がある金属製の細繊維であり、前記ウエブが厚さ０．５〜１０ｍｍ、望ましくは１〜３ｍｍのシート状を呈するものが好ましい（請求項３３）。さらに前記ウエブに炭酸アパタイトを含むヒドロキシアパタイト、その他のリン酸カルシウム化合物をコートするのが好ましい（請求項３４）。さらにリン酸カルシウム化合物をコートした上に、コラーゲンなどのマトリックスタンパクをコートしたものが好ましい（請求項３５）。【００３０】
また、前記積層される培養基盤が、培養基盤同士の間に隙間をあけるようにそれぞれホルダーに載置された状態で積層されているものが好ましい（請求項３６）。その場合、前記ホルダーが、培養基盤を載置する薄板リング状の底板と、その底板の周囲から立ち上がる周囲壁とからなり、周囲壁の内面の高さが培養基盤と同程度ないしそれよりいくらか高いものが好ましい（請求項３７）。【００３１】
本発明の生物由来物質の産生装置は、前述のいずれかの培養装置と、前記培養基盤または培養液から生物由来物質を取り出す手段とを備えていることを特徴としている（請求項３８）。【００３２】
本発明の三次元人工モデルの製造方法は、前記培養基盤に第１細胞を播種し、ついで播種した培養基盤に培養液を加えて前記第１細胞を培養し、その後、その第１細胞を培養した培養基盤の上に第２細胞を播種し、ついで播種した培養基盤に培養液を加えて第１および第２細胞を培養することによって製造されることを特徴としている（請求項３９）。
また、この三次元人工モデルの製造方法により、三次元皮膚モデルを製造することができる（請求項４０）。特に、この製造方法において、前記第１細胞が線維芽細胞であり、前記第２細胞が上皮細胞である、好ましい三次元皮膚モデルを製造することができる（請求項４１）。【００３３】
本発明の培養方法（請求項２４）では、細繊維を絡合したウエブからなる三次元的な培養基盤に細胞や微生物を播種し、その前記培養基盤で培養する。そのため、細胞や微生物を支持する面積が広く、多数の細胞あるいは微生物を一度に培養することができる。このような培養方法において、前記培養基盤の底部に不透過層を設けて複合層とした状態で細胞または微生物を培養する場合は、細胞および微生物が培養基盤から落ちにくい。そのため、通常の振とう培養をしなくてもよく、培養皿での培養が可能である。また、前記培養基盤を、底面および側面を有する不透過層の内部に載置した状態で、細胞または微生物を培養する場合は、細胞または微生物が産生（分泌）した、活性物質が培養基盤から散らばらず、不透過層の上に留まりやすい。それにより細胞または微生物が活性化される（請求項２５、２６）。【００３４】
前記培養基盤を多数枚、複数段の着脱可能な積層状態で筒状の容器内に収容し、その容器内に培養液を環流させる場合は、多量の細胞や微生物を効率的に培養することができる（請求項２７）。このような培養方法において、前記培養基盤を容器に収容する前に、旋回培養により細胞や微生物を培養する場合は、容器内で培養する前に、それぞれの培養基盤に高密度に細胞や微生物を培養することができる。そのため、一層多量の細胞や微生物を培養することができる。【００３５】
本発明の生物由来物質の産生方法（請求項２８）は、前述の効率的な方法で多量の細胞や微生物を培養し、培養した細胞や微生物に生物由来物質を産生させるので、多量の生物由来物質を効率的に分離・回収することができる。前記生物由来物質がコラーゲンなどのマトリックスタンパク質、骨形成タンパク質（ＭＢＰ）などのサイトカイン、インシュリンなどのホルモン、インターフェロンなどの微量活性物質、その他、医療と産業に有益なリコンビナントタンパク質の場合は、多量の物質を効率的に産生することができ、医療と産業に有益である（請求項２９）。このような産生方法において、前記環流させる培養液の一部を回収し、その培養液中に分泌された生物由来物質を回収する場合は、培養液の循環と産生された物質の回収を一度に行うことができるので、効率的である（請求項３０）。また、前記培養基盤に沈着された生物由来物質を溶媒またはペプシンなどの酵素処理によって可溶化し、溶媒中に溶けている生物由来物質を抽出する場合は、一度に多量の物質を回収することができる（請求項３１）。【００３６】
本発明の培養装置は、培養基盤として細繊維を絡合したウエブからなる三次元的な培養基盤を用いる（請求項３２）。そのため細胞や微生物を支持する面積が広く、多数の細胞や微生物を一度に培養することができる。さらに培養基盤を容器内に複数段に積層した状態で収容して培養するので、狭いスペースでも多量の細胞や微生物を効率的に培養することができる。【００３７】
前記細繊維が、太さ１〜１０００μｍの生物親和性が高い金属製の細繊維である場合は、ウエブを構成する細繊維の生物適合性が高い（請求項３３）。そのため、細胞や微生物が培養基盤から脱落しにくい。金属がチタン、チタン合金、金、金合金のばあいは、とくに生物適合性が高い。また、細繊維の径が１００μｍ以下の場合は、一層細胞や微生物との接触が密になり、培養効率が高くなる。さらに前記ウエブを厚さ  ０．５〜１０ｍｍのシート状とする場合は、各ウエブの取り扱いが容易であり、積層したときの細胞や微生物の密度を高くすることができる。とくに厚さ１〜３ｍｍとする場合は、生体の支持が確実で、しかも培養液の透過性が高い。さらに前記ウエブに炭酸アパタイトを含むヒドロキシアパタイト、その他のリン酸カルシウム化合物がコートされている場合は、細繊維の生体適合性が一層高くなる（請求項３４）。前記リン酸化合物のコートの上に、さらに産生目的の生物由来物質のマトリックスタンパクをコートしている場合は、細胞や微生物同士の接着性を増大させることができる（請求項３５）。【００３８】
前記積層される培養基盤が、培養基盤同士の間に隙間をあけるようにそれぞれホルダーに載置された状態で積層されている場合は、培養基盤の表面に新鮮な培養液が供給されやすくなる（請求項３６）。そのため、細胞や微生物の活性が高くなり、効率的に培養することができる。【００３９】
前記ホルダーが、培養基盤を載置する薄板リング状の底板と、その底板の周囲から立ち上がる周囲壁とからなり、周囲壁の内面の高さが培養基盤と同程度ないしそれよりいくらか高い場合は、それぞれの培養基盤をホルダーごと容器内に収容したり、取り出したりすることができる（請求項３７）。そのため、新しい培養基盤を容器内に収容する作業および培養基盤の交換作業において培養基盤の取り扱いが容易である。さらにホルダーにより各培養基盤の間に隙間ができるので、新鮮な培養液が培養基盤の表面の細胞や微生物に供給される。【００４０】
本発明の生物由来物質の産生方法は、前記いずれかの培養装置と、生物由来物質を取り出す手段とを備えているので、前述のように効率的に細胞や微生物を多量に培養することができ、それらの細胞や微生物から多量の生物由来物質を分離・回収することができる（請求項３８）。【００４１】
本発明の三次元人工モデルの製造方法は、前記培養基盤に第１細胞を播種し、ついで播種した培養基盤に培養液を加えて前記第１細胞を培養し、その後、その第１細胞を培養した培養基盤の上に第２細胞を播種し、ついで播種した培養基盤に培養液を加えて第１および第２細胞を培養することによって製造されることにより、第１細胞および第２細胞を培養基盤内において層構造となるような三次元人工モデルを製造することができる（請求項３９）。そのため、薬剤スクリーニング用として三次元人工モデルの生産が可能である。
特にこの製造方法において、前記第１細胞として線維芽細胞を用い、前記第２細胞として上皮細胞を用いることで、三次元皮膚モデルを容易に製造することができる（請求項４０）。また、この製造方法を用いることにより、三次元皮膚モデルの生産もできる（請求項４１）。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明のスカフォールド材料の一実施形態を示す断面図である。
【図２】本発明のスカフォールド材料の他の実施形態を示す斜視図である。
【図３】本発明のスカフォールド材料のさらに他の実施形態を示す斜視図である。
【図４】本発明のスカフォールド材料の金属繊維層で細胞を培養した後の顕微鏡写真である。
【図５】図５ａは本発明のスカフォールド材料のさらに他の実施形態を示す側面断面図であり、図５ｂはその正面断面図であり、図５ｃはその基材を示す側面図である。
【図６】本発明のスカフォールド材料のさらに他の実施形態を示す側面断面図である。
【図７】本発明のスカフォールド材料のさらに他の実施形態を示す側面断面図である。
【図８】本発明のスカフォールド材料のさらに他の実施形態を示す側万断面図である。
【図９】図８のスカフォールド材料を用いた治療方法を表わす概略図である。
【図１０】本発明のスカフォールド材料と従来公知のスカフォールド材料の破壊トルクを比較した表である。
【図１１】本発明のスカフォールド材料と従来公知のスカフォールド材料の破壊ねじれ角を比較した表である。
【図１２】本発明の細胞由来物質の産生装置の一実施形態を示す概略構成図である。
【図１３】図１２におけるホルダーと培養基盤の組立前の状態を示す斜視図である。
【図１４】図１３のホルダーと培養基盤の組立後の断面図である。
【図１５】本発明の産生方法の一実施形態を示す要部工程図である。
【図１６】図１６ａおよび図１６ｂはそれぞれ本発明の培養基盤の他の実施形態を示す断面図である。
【図１７】本発明の培養方法によって産生したコラーゲンと、従来の培養方法によって産生したコラーゲンとの産生量を示す表図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
図１は本発明のスカフォールド材料の一実施形態を示す断面図、図２は本発明のスカフォールド材料の他の実施形態を示す斜視図、図３は本発明のスカフォールド材料のさらに他の実施形態を示す斜視図、図４は本発明のスカフォールド材料の金属繊維層で細胞を培養した後の顕微鏡写真である。なお、これらの実施例は、本発明を容易にするための一助としての具体例を開示するものであり、これによって、本発明を限定するものではない。
本発明の人工歯根１０は、金属基材であるロッド１１と、そのロッドの外周に形成された結合層１３と、その結合層の外周に設けられた金属繊維層１４と、さらにその金属繊維層の外周に設けられ、全体を支える骨組みとして働く補強層１５とからなる。【００４４】
ロッド１１は、径が３〜５ｍｍである胴部２１と、その胴部の上中下部に設けられた橋げた２２ａ、２２ｂ、２２ｃと、胴部の上下端に設けられたフランジ部２３ａ、２３ｂとからなる。上端フランジ部２３ａの上面には歯の支台部（図示せず）を嵌入する嵌入孔２４が形成されている。また、下端フランジ部２３ｂの下部は骨組織に埋入させやすいようにねじ切り用タップとなっている。ロッドの１１の全体の長さは７〜２０ｍｍであり、橋げた２２の高さは０．２〜２ｍｍであるものが好ましい。このようなロッド１１としてチタン、チタン合金、金、金合金製のものが好ましい。しかし、ステンレス鋼またはコバルト−クロム合金などの生体親和性の高いものであれば特に限定されるものではない。【００４５】
結合層１３は、平均ポアサイズが１００μｍより小さく、径が５〜４００μｍの金属線をロッド１１の外周の橋げた２２の間に厚さが０．１〜２ｍｍとなるようにきつく巻きつけることにより形成される。また、また金属繊維層１４は、平均ポアサイズが１００〜４００μｍであり、径が５〜４００μｍの金属線を絡合した網状のウエブ（金属不織布）を結合層１３の外周に厚さが０．３〜１０ｍｍとなるようにきつく巻きつけることにより形成される。この後、ロッドと共に真空焼結することにより各金属線の交点および結合層とロッドの接点を融着する。この金属線および金属不織布の金属基材への固定方法は、鋳型法を用いる。すなわち、あらかじめこれらの金属線および金属不織布が入る体積を計算して、空隙率と線径から使用する金属線および金属不織布の材料の体積並びに重量などを計算して、その必要量を基材と鋳型との間に押し込み、厚さを計算して圧力下にて真空焼結する。金属繊維層と結合層の全体の厚さを０．４〜１２ｍｍとすることにより金属線からなるウエブの真空焼結を容易にすることができる。この焼結温度は金属線の融点（Ｔｍ・℃）により異なり、金属または金属合金の融点（Ｔｍ・℃）の０．３〜０．９倍が好ましい。たとえば、基材および金属線としてチタンを用いるとき、チタンの融点は１６６８℃であるため、焼結温度は約５００〜１５００℃が好ましい。【００４６】
補強層１５は、径が１００〜２０００μｍの金属線を平均ポアサイズが１００〜２０００μｍになるように絡合した網状のウエブを厚みが０．１〜５ｍｍとなるように金属繊維層１４に巻きつけたものである。
このように補強層１５は、比較的太い金属線から形成されているため、スカフォールド材料全体を支える骨組みとして働き、ねじれまたはせん断等の外力による生体と最外層および中間層からなる金属繊維層との間の境界面の破断を防止する。【００４７】
各層には、生体細胞を誘導する誘導剤がコートされている。このような誘導剤として炭酸アパタイトを含むヒドロキシアパタイト、その他のリン酸カルシウム化合物などが挙げられる。これにより、骨芽細胞が作り出す骨組織と金属繊維層１４とが一体化したコラボレーション・ゾーンを一層短期間で達成することができる。また、このとき補強層のポアサイズは金属繊維層の平均ポアサイズより大きいため、骨芽細胞の金属繊維層までの成育を阻害することはない。【００４８】
このように構成されている人工歯根１０は、掘削して形成した顎骨の埋入部に埋入される。これにより生体細胞は比較的平均ポアサイズの大きい補強層１５を介して、金属繊維層１４そして結合層１３に至る。また、金属繊維層１４は骨芽細胞が好んで成育する幾何学的構造を備えているため、骨芽細胞が短期間で成育する。この金属繊維層１４と骨芽細胞とが一体となったオステオインテグレーションの状態となるまでの期間は、個人差は見られるが約１〜２ヶ月である。
このように骨芽細胞は各層に定着して骨を作り、しかも代謝を営んでいるため常に骨とこの人工歯根１０との結合強度に大きく寄与する。またロッドに対して咬合外力等による外力（圧迫、ねじり、せん断等）が働いても、結合層１３の存在により金属繊維層１４と基材との間の境界面の破断を防止する。つまり、一度骨芽細胞が成長すると生体と金属繊維層１４との各境界面での破断が起こりにくい。【００４９】
図１の人工歯根１０の各層は、絡合した金属線を真空焼結することにより形成されているが、ロッドの胴部外周に径が１００μｍより小さく金属不織布と同質の金属粉末または金属粒子を鋳型を使って、真空焼結してもよい。また、ロッドの外周にエポキシ接着剤、紫外線硬化型接着剤などを塗布し、５〜５００μｍの金属線からなるウエブを巻きつけてもよい。このように各層が形成されているため、ロッドは結合層１３を介して金属繊維層１４と強固に固定する。しかし、すべての各層をロッドと同種の金属または合金の金属線を用いてロッドと共に焼結してロッドに固定する場合、ロッドと金属繊維層とを融着によって一体化させることができるので最も好ましい。【００５０】
図２のスカフォールド材料３０は、チタン板３１と、その上面に設けられる金属繊維層３２とからなるものである。この金属繊維層３２は平均ポアサイズが１００〜４００μｍである金属不織布をチタン板３１に固着したものである。このスカフォールド材料を人工臓器に取りつけ、生体に埋設する。これにより、金属繊維層内で軟組織が約１〜２ヶ月で成長し、人工臓器をしっかり保持する。【００５１】
図３のスカフォールド材料３５は、円筒状のチタンロッド３６と、その内外面に設けられた平均ポアサイズが１００〜４００μｍの金属繊維層３７ａ、ｂとからなるものである。このようなスカフォールド材料３５は、主として人工血管、その他、食道、気管、神経、脊椎の再菅として生体に埋設し、使用することができる。【００５２】
図４に示す写真は、細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１を平均ポアサイズが１００〜３００μｍのチタン不織布上で４週間ならびに６週間培養した後の金属繊維と前記細胞が合成したコラーゲン繊維との結合を表すものである。この図２で表されるように、わずか1ヶ月足らずで金属繊維とコラーゲン繊維が密接に結合しているのがわかり、軟組織が誘導され、成長しているのがわかる。【００５３】
図５ａに示すスカフォールド材料は、生体硬組織誘導性である人工歯根に用いられるものであり、この人工歯根４０は、円柱状の基材４１と、その基材の外周に設けられている細胞誘導層４２とからなる。【００５４】
基材４１は、上端に形成されたフランジ部４３と、上面中心にその柱の軸に沿って中心に向かって形成された導入孔４４と、軸方向に延びるように側面から突出して形成された突起４５とを備えている。また、基材４１は、２ｍｍ以下のミクロな孔４５ａを持つポーラス構造体であり、導入孔４４と基材外部とはこのミクロな孔によって複雑に連通している。また、導入孔４４の内面には、人工歯を取り付ける上部構造体あるいはアパットメント（図示せず）と螺合できるように雌ネジ４６が形成されている。【００５５】
このような基材は、その材料として金属を用いる場合は、例えば、金型に金属繊維を充填し、固め、真空焼結することによって成形したり、金型に溶融した金属を流し込み、凝固時における過飽和ガス原子の析出に伴い気泡を生成させたり、または、凝固後に外形を整えてからドリルなどによって穿孔することにより成形したりすることができる。また、基材の材料として合成樹脂を用いる場合は、発泡剤を加えた溶融した合成樹脂を金型に流し込んで成形することができる。【００５６】
細胞誘導層４２は、平均ポアサイズが１００〜４００μｍの多孔質構造体であり、基材のフランジ部４３および突起４５と当接するように設けられている。これにより、外力を加えられても細胞誘導層が基材から容易にはずれないように構成されている。また、このような細胞誘導層４２は、アパタイト生成液によって処理され、炭酸アパタイトを含むヒドロキシアパタイト、その他のリン酸カルシウム化合物および骨形成タンパク質などのサイトカイン、インシュリンなどのホルモン、インターフェロンなどの微量活性物質によってコートされている。これによって生体硬組織の誘導を促進させることができる。
このような細胞誘導層４２は、たとえば、径５〜４００μｍの金属線を絡合させることによって形成される金属不織布をポアサイズが１００〜４００μｍとなるように巻きつけて形成される。また、合成樹脂材料を使用する場合、金型で形成し、その後、基材４１に嵌合させてもよい。【００５７】
このような人工歯根４０は、次のようにして口内に取り付けられる。始めに人工歯根の導入孔４４（アパットメント取り付け部）に骨髄液などを注入し、その後注射器等で導入孔４４内を陽圧にして骨髄液を基材４１の内部に送り込む。その後、人工歯根４０を口内に埋植し、導入孔４４に雄ネジを有するカバーあるいは導入孔４４を閉じるカバーを取り付け、人工歯根４０が生体と一体化するまで一定期間放置する。このとき、基材内部の骨髄液は、ミクロの孔を通って細胞誘導層４２に到達する。そのため、人工歯根の外部から開始される骨の再生が促進される。その後、カバーを取り外し、導入孔を清浄したのち、雄ネジを有するアパットメントを導入孔４４に装着する。【００５８】
このようにこの人工歯根４０を用いた治療は、従来の治療操作とほとんど変わらない。しかし、平均ポアサイズが１００〜４００μｍの多孔質構造体からなる細胞誘導層４２を備えており、かつ、導入孔４４に骨髄を注入し、基材全体に骨髄を分布させているため、その骨髄効果により骨の再生速度は格段に向上する。【００５９】
図６に示すスカフォールド材料は、生体硬組織誘導性である人工歯根に用いられるものであり、この人工歯根５０は、円柱状の基材５０ａと、その基材の外周に設けられている細胞誘導層５１とからなる。【００６０】
基材５０ａは、筒状の基材本体５１ａと、内部に充填される多孔質三次元構造体５２と、内部に配置される支柱５３とから構成されている。
筒状の基材本体５１ａは、その側面に外径２ｍｍ以下の小孔５５が形成されている。この基材本体５１ａは、筒状金属体の側面穿孔によって基材本体５１ａを生成し、その基材本体内へ支柱５３を焼結による設置し、そして基材本体の内部へ金属繊維を充填した後、焼結の操作によって多孔質三次元構造５２を形成して製造される。
多孔質三次元構造体５２は、特に限定されるものではなく、基材本体５１ａを通して細胞誘導層５１に後述して充填される骨髄などの栄養を供給するものである。また、三次元構造体５２の内部に血管や神経なども導入、形成されるため、いわば、人工歯髄を形成することができる。このような多孔質三次元構造体５２は、生体親和性のある合成樹脂あるいは金属の繊維を基材本体の内部に充填することにより形成される。
また、支柱５３は人工歯根全体の強度を保つために配置されるものである。このような支柱も生体親和性のある材料が用いられる。【００６１】
細胞誘導層５１は、図５の細胞誘導層４２と実質的に同じものであり、たとえば、径５〜４００μｍの金属線を絡合させることによって形成される金属不織布をポアサイズが１００〜４００μｍとなるように巻きつけた形成される。【００６２】
このように人工歯根５０は構成されているため、図５の人工歯根４０と同様に、始めに人工歯根の基材本体内部の多孔質三次元構造体５２に骨髄液などを注入し、その後注射器等で基材本体の内部を陽圧にして多孔質三次元構造体５２内に平均して分布するようにする。その後、人工歯根５０を口内に埋植し、基材の開口にカバー（図示せず）を取り付け、人工歯根５０が生体と一体化するまで一定期間放置する。このとき、図５の人工歯根４０と同様に基材内部に充填された骨髄液等は、基材本体の穿孔５５を介して細胞誘導層５１にまで到達する。これにより、内部から開始される骨の再生が一層促進される。その後、カバーを取り外し、導入孔を清浄した後、アパットメント５５ａを装着する。【００６３】
このように基材の内部に多孔質三次元構造体５２を備えているため、その多孔質三次元構造体５２に貯蓄された栄養を供給するための最短の栄養供給ルート（人工歯髄）が形成される。また、この人工歯髄により、象牙質の再生や細菌に対する免疫反応が高まり、人工歯根の長期安定性が向上する。【００６４】
図７に示す人工歯根５９は、基材の内部に支柱が設けられていないものであり、他の構成は図６の人工歯根５０と実質的に同じものである。これにより、人工歯根５９は、人工歯根５０より強度は弱くなるが、その取り付けは容易になる。【００６５】
図８に示すスカフォールド材料は、生体硬組織誘導性の人工関節に用いられるものであり、この人工関節６０は、円柱状の基材６１と、その基材の外周に設けられている細胞誘導層６２とからなる。
また、基材６１は、側面に外径２ｍｍ以下の小孔６３ａを有する円筒状の基材本体６３と、その基材本体の内部に充填される多孔質三次元構造体６４と、その基材本体６３の内部に沿って配置される支柱６５とからなる。この支柱６５の上端には人工骨節６５ａが形成されており、また、この支柱６５の中部には、基材内において半径方向に突出するようにリブ６５ａが形成されている。また、この人工関節６５ａには、想像線で示すように小孔６３ａが設けられていてもよい。さらに、この想像線で示す小孔６３ａはより微細な孔であってもよい。
多孔質三次元構造体６４は、図６の多孔質三次元構造体と実質的に同じものであり、例えば、チタン金属の繊維を基材本体６３の内部に充填することにより形成される。
支柱６５の材料として強度が高く、生体親和性の高いチタンやチタン合金が用いられる。【００６６】
このように構成された人工関節６０は、図９ａに示すよう配置する。ここで図９ｂは正常な状態の関節の概略図である。ここで符号６６ｂは軟骨、符号６６ｃは緻密骨、符号６６ｄは海綿骨と骨髄とが混合している部位、符号６６ｅは、骨髄を表わす。また、図９ａの符号６６は、人工関節の受け皿である。この受け皿６６は、扇状の金属基材６７と、その内面に設けられた合成樹脂層６８と、金属基材の外面に設けられたチタンウェブからなる金属繊維層６９とからなる。図９ａに示すように生体の骨髄Ａは人工関節６０を配置した近辺に存在するため、この骨髄Ａは、基材の下端開口６１ｂから基材の三次元構造体６４内に誘導される。そして、誘導された骨髄Ａは、次に基材本体の小孔６３ａを通じて細胞誘導層６２の全域に送られる。これにより、人工関節６０の治癒期間の短縮化が図れる。このように、人工関節のように骨再生域が広いものは外部から骨侵入のみでは治癒時間がかかるため、内部からの再生が重要であり、本発明の人工関節６０は内部からの再生プロセスが可能となる。また、周囲の骨と一体になった際には、三次元構造体内に血管や神経が導入、形成されているため、従来の生体内に似た構造体で復元される。そのため、再生された細胞誘導層６２に誘導された骨は骨髄から栄養を受けることができ、長期経過後も骨がやせることはない。そのため従来の人工関節で問題となる人工関節と骨との隙間（ルーズニング）が発生しなく、人工関節の取り替えが必要ない。
【実施例】
【００６７】
［実施例１］
図５の人工歯根４０を作成した。ここで導入孔４４の内面に形成された雌ネジは形成していない。基材４１は、そのフランジ部４３の径が４ｍｍ、導入孔４４の径が２ｍｍ、長さが３ｍｍ、そして、平均ポアサイズが８０μｍとなるように径が８０μｍのチタン金属線を金型に詰め込み、焼結して成形した。
また、細胞誘導層４２は、径が８０μｍのチタン金属線を絡合させることによって形成される金属不識布を平均ポアサイズが２００μｍとなるようにまきつけた。
そして、チタンロッドを導入孔４４に取り付けて真空焼結によりそれらを結合して人工歯根を作成した。このように形成された人工歯根４０は、基材４１が特許請求の範囲における結合層に該当し、細胞誘導層４２が金属繊維層に該当する。
［比較例１］
チタンロッドに径が８０μｍのチタン金属線を絡合させて平均ポアサイズが２００μｍとなるように巻きつけた。これを真空焼結して人工歯根を作成した。これを比較例１とする。
［比較例２］
チタンロッドに径が８０μｍのチタン金属線を絡合させて平均ポアサイズが８０μｍとなるように巻きつけた。これを真空焼結して人工歯根を作成した。これを比較例２とする。【００６８】
これらの実施例１および比較例１および２の人工歯根のねじれ破壊試験を行った。その破壊トルクおよび破壊ねじれ角の結果を図１０および図１１に示す。この結果からわかるように、本発明の人工歯根である実施例１は破壊トルクで約４倍の力を加えても破壊しなかった。また、実施例１は、比較例の人工歯根の約１０倍のねじれに対してもロッドと結合層および金属繊維層との間に破壊が見られず。その柔軟性が著しく高くなったことがわかる。【００６９】
図１２に示す産生装置７０は、カラム７１と、そのカラムの内部に積層状態で収容される皿状のホルダー７２と、それぞれのホルダー内に収容される培養基盤７３と、カラム７１内に培養液を環流させる閉ループ状の管路７４とを備えている。その管路７４には、空気や新鮮な培地（培養液）を混合して供給する混合槽７５および気泡除去槽７６が介在されている。【００７０】
前記カラム７１としては、たとえばジャケット付きファルマシア・クロマト・カラムなどが用いられる。カラム本体７１ａの外周をジャケット８１が囲んでおり、そのジャケットの下部に設けられる入口および上部に設けられる出口には、たとえば３７℃の水を循環させる管路８２が連結されている。それによりカラム７１内に充填する培地を生体内の温度に維持することができる。本体７１ａは円筒状の外周壁８３と、その上端を塞ぐ上蓋８４と、下端を塞ぐ下蓋８５とを備えており、全体が液密状態で結合されている。外周壁８３は通常はガラス製であるが、ステンレスなどの金属製であってもよい。培地としては、通常用いられる培地をいずれも採用することができ、たとえばイーグルの最小必要培地、ならびにその改良組成を持つ培地をいずれも用いることができる。【００７１】
カラム７１の上蓋８４にはパイプ状の出口部材８６が貫通しており、その出口部材は円板上の固定部材８７によって上蓋８４に固定されている。出口部材８６の下端には、積層された多段のホルダー７２の上端を保持する上押さえ部材８８が固定されている。他方、下蓋８５にはパイプ状の入口部材８９が貫通すると共に、固定部材９０によって下蓋８５に固定されている。入口部材８９の上端には、積層したホルダー７２の下端を支持する下押さえ部材９１が固定されている。【００７２】
前記上押さえ部材８８にはカラム７１から使用後の培地を流出するための送り出しチューブ９２の一端が連結され、出口部材８６内を通って外部に出ていき、他端は混合槽７５内の上部空洞（気体部）７５ａに開口している。出口部材８６の上端には、送り出しチューブ９２の一端が連結され、その混合槽７５の培地（液体）７５ｂには中間チューブ９３の一端が漬けられ、その中間チューブの他端は気泡除去槽７６の上部空洞７６ａに開口している。気泡除去槽７６内の培地７６ｂには、戻りチューブ９４の一端が漬けられており、ペリスタポンプ（チュービングポンプ）９５、圧力計９６および予備加熱槽９７を経由して、カラム７１の入口部材８９を通って下押さえ部材９１に連結されている。【００７３】
前記送り出しチューブ９２、中間チューブ９３および戻りチューブ９４などは全体として前述のカラム７１に培地を環流させる管路７４を構成しており、ペリスタポンプ９５は管路７４内の培地を循環させるものである。ペリスタポンプ９５はいわば生体の心臓の役割を果たす。予備加熱槽９７はカラム７１内に送り込む培地をあらかじめ生体内の温度（たとえば３７℃）近辺まで加熱するための装置である。【００７４】
前記混合槽７５の培地７５ｂには、空気と炭酸ガスとの混合ガスを供給するチューブ９８の端部が漬けられている。そのチューブはフィルタ９９を介して空気と炭酸ガスとを混合するためのミキサー１００に連結されている。ミキサー１００には、空気を供給するコンプレッサ１０２と炭酸ガスを供給するためのガスボンベ１０３がホースないしチューブを介して連結されている。なお、符号１０４はフィルタである。【００７５】
さらに混合槽７５の上部空洞７５ａには、新鮮な培地を供給するチューブ１０５の端部が開口しており、そのチューブ１０５の他端は新鮮な培地１０６ｂを充填した新鮮培地槽１０６の培地１０６ｂ内に漬けられている。新鮮培地槽１０６は蓋によって密閉されており、上部空洞１０６ａにフィルタ１０７を介して外気を導入するチューブ１０８が開口している。【００７６】
さらに本実施形態では、送り出しチューブ９２の途中に切り替え弁（コック）１１０が介在されており、そのコック１１０にチューブ１１１を介して回収・モニタ槽１１２が連結されている。回収・モニタ槽１１２は、産生装置７０を作動させた後、カラム７１内で細胞が目的としてい物質、たとえばコラーゲンを産生していることを確認したり、産生された物質を回収するための槽である。【００７７】
図１３および図１４はそれぞれ図１２のカラム７１に収容されるホルダー７２と、その内部に収容する培養基盤７３とを拡大して示している。ホルダー７２は略皿状の部材であり、リング状を呈し、内部に培養基盤７３を載置する段部１１４が設けられている。ホルダー７２の上端から段部１１４までの深さＤは、培養基盤７３の厚さよりも深い。培養基盤７３は細胞を播種して培養する基盤であり、チタンあるいはチタン合金製の細繊維を絡合してマット状に構成したウエブによって形成している。【００７８】
培養基盤７３を構成する細繊維の太さは適切な空隙を構成するため、２００μｍ以下、とくに１００μｍ以下が好ましい。また、通常は２０μｍ以上、好ましくは５０μｍ以上のものが用いられる。細繊維の長さおよび本数はとくに制限はない。なお、１枚の培養基盤７３を１本の細繊維で構成してもよい。細繊維を絡合するには、たとえば各細繊維を直角に交差させて金網とするなどの方法を用いることができる。また、不織布ないし織布状のシートにして、所定の形状に打ち抜いて構成することもできる。培養基盤７３の厚さは１〜２ｍｍ程度であり、径は使用するカラム（図１２の符号７１）の大きさによって異なるが、通常は１０〜２００ｍｍ程度である。培養基盤７３の重量は１〜１００ｇ程度である。チタン以外には、たとえばチタン合金、ステンレス、金、金合金などの細繊維を用いることもできる。細繊維の状態で、あるいは培養基盤７３を形成した後、細繊維にヒドロキシアパタイト、炭酸アパタイトを含むヒドロキシアパタイトなどのリン酸カルシウム化合物をコートすると、生物適合性が高くなり、細胞（および微生物）が付着しやすいので好ましい。さらにその上にコラーゲンをはじめ、フィブリロネクチンなどの細胞接着物質をあらかじめコートして、いわば「二重コート」にすることもきわめて好ましい。【００７９】
ホルダー７２はたとえばポリアクリルアミドなどのプラスチックで形成される。ポリアクリルアミドを用いる場合は、加工性が高いという利点がある。ただしポリプロピレン、ポリエチレン、スチレンなど、他のプラスチックも使用することができる。なお、薄い環状板からなるディバイダ７２ａの上に、外径が同じで厚いリング状のサポータ７２ｂを重ねて接着するなどにより、構成することもできる。このようなホルダー７２に培養基盤７３を入れて重ねると、培養基盤７３同士の間に隙間をあけた状態で多数の培養基盤７３を積層することができる。そのため、この状態で図１２のカラム７１に収容すると、それぞれの培養基盤７３に培地が接触し、培養基盤７３上で培養されている細胞を長期間培養し続けることができる。【００８０】
培養基盤７３で培養する細胞としては、培養基盤７３を足場として培養できる足場依存性のもの、たとえば線維芽細胞、骨芽細胞などのコラーゲンを産生する細胞、血管内皮細胞、副腎皮質細胞などの副腎皮質（ホルモン）を産生する細胞、すい臓細胞などのインシュリンを産生する細胞、血管系のサイトカインを産生する分化過程にある骨髄由来血液細胞、肝細胞などの有用な血液タンパクを産生する細胞など、種々の細胞由来物質を産生する細胞を使用することができる。ただし図１２の産生装置７０は、細胞由来物質を産生させる場合に限らず、単に細胞を培養、増殖させるためだけにも用いることができる。その場合は回収・モニタ槽５２は不要である。このような細胞の培養・増殖など、細胞由来物質の産生を目的としない場合は、産生装置というよりも、単なる細胞培養装置である。コラーゲンを産生させる場合は、培地としてビタミンＣを含むものなどが好ましい。牛海綿状胞症（ＢＳＥ）を避けるために合成培地を用いてもよい。【００８１】
このように細胞（第１細胞）を培養した培養基盤７３に、上から異なる種類の第２細胞を播種して、さらに培養してもよい。それにより、２層の細胞を培養した培養基盤自体を薬剤スクリーニング用の三次元人工モデルとして使用することができる。特に、第１細胞として培養基盤上でファイブロブラスト（線維芽細胞）を播種し、第２細胞として上皮細胞を播種して培養することにより、三次元皮膚モデルを製造することができる。
この実施形態では、円板状の培養基盤７３を用いているが、この三次元人工モデルを製造するとき、その形状は特に限定されるものではない。【００８２】
つぎに図１２の産生装置７０を用いて線維芽細胞、骨芽細胞などのコラーゲン産生細胞からコラーゲンを産生させる方法を説明する。線維芽細胞は、たとえば骨、軟骨、歯周組織、神経、筋、靱帯の一部を欠損した患者の口腔粘膜などを数ｍｍオーダーで採取して、そこに含まれる線維芽細胞を公知の方法で増殖させて用いる。なお、患者以外に、提供者の承諾を得た上で、特定の新生児の臍帯、若い成人の皮下組織などから線維芽細胞を分離して増殖したものを用いることもできる。骨芽細胞は骨髄由来の間葉系幹細胞などにより得ることができる。【００８３】
つぎに図１５に示すように、増殖させた線維芽細胞や骨芽細胞の細胞片１１５を、シャーレ１１６内に収容した培養基盤７３に播種する。シャーレ１１６の培養基盤７３は適切な培地に浸しておく。ついでシャーレ１１６を旋回培養器に設置し、往復旋回させて細胞に刺激を与える旋回培養を行う。細胞片１１５が培養基盤７３上で培養されたことを確認した後、図１３のように培養基盤７３をホルダー７２に収容し、多数のホルダー７２を重ねて図１２のカラム７１内に入れる。重ねるホルダー７２の個数は産生するコラーゲンの量によって異なるが、２０〜５０段程度である。【００８４】
上記のようにして図１２のカラム７１内に培養基盤７３を収容した多数のホルダー７２を設置した後、ペリスタポンプ９５を作動させて管路７４内に培地を循環させ、培養基盤７３の細胞を培養する。カラム７１のジャケットには前述のように３７℃の温水を循環させてカラム７１内を生体内と類似の環境にする。混合槽７５に前述のコンプレッサ１０２から空気を供給し、ガスボンベ１０３から炭酸ガスを供給する。両者の比率は、たとえば炭酸ガス９５％（重量％）、空気５％（重量％）の比率であり、供給量は０．１〜１リットル／分程度である。炭酸ガスおよび空気の混合ガスは供給用のチューブ９８の端部からバブリングにより培地内に混入される。この混合槽７５はいわば生体の肺の働きをする。【００８５】
新鮮培地槽１０６から混合槽７５へは、混合槽７５の液面が低下したときにサイホンの原理で新鮮な培地を供給する。ただしポンプを用いて強制的に供給することもできる。混合槽７５に供給する新鮮な環流液の量は、０．１〜１ｍリットル／分程度である。ここで供給される培地は細胞に栄養を供給する働きがあるので、いわば消化器官としても作用する。【００８６】
前記気泡除去槽７６では、混合槽７５から送られてくる培地を静かにためておき、それにより培地混合槽７５でバブリングにより培地内に混合された炭酸ガスと空気との混合ガスのうち、培地内に溶けずに気泡として残っているものを上部空洞内に浮かび上がらせて除去する。【００８７】
上記のように産生装置７０を作動させることにより、カラム７１内に収容した培養基盤７３がコラーゲンを分泌する。分泌されたコラーゲンのうち、一部は培地中に分泌され、他は培養基盤７３内に不溶性コラーゲンとして沈着する。培地中には不溶性コラーゲンと可溶性コラーゲンの両方が含まれるが、それらのコラーゲンは、適宜コック１１０を切り替えて、回収・モニタ槽１１２に連続的に回収することができる。すなわち回収・モニタ槽１１２に回収された培地から、塩析法、イオン交換法などにより、コラーゲンを精製分離することができる。【００８８】
他方、培養基盤７３内に沈着した不溶性コラーゲンは、カラム７１から取り外し、個々の培養基盤７３をコラーゲン可溶化溶媒、たとえば１Ｍ食塩を含む中性緩衝液、あるいは０．５Ｍ酢酸、あるいはペプシンを含む０．５Ｍ酢酸で抽出することにより、ほぼ完全に回収することができる。【００８９】
上記のように、産生装置７０を用いることにより、患者の口腔粘膜などから得た線維芽細胞を培養してコラーゲンを連続的に産生することができ、可溶性コラーゲンおよび不溶性コラーゲンの両方を効率よく回収することができる。回収したコラーゲンは、患者の必要部位、すなわち骨、軟骨、歯周組織、神経、筋、靱帯などの修復治療に還元することができる。また、患者以外の組織提供者（ドナー）から得た組織から産生したコラーゲンについても、患者の再生医療一般に利用することができる。【００９０】
上記のようにこの産生方法では、３次元のチタン細繊維を絡合したウエブからなる培養基盤７３を、それぞれ分離を図りつつ、数十枚重ねて産生させるので、産生量を従来の平板法に比して１０倍以上に増大させることができる。これによって、コラーゲン産制遺伝子を導入した細胞はもちろん、遺伝子操作をすることなく、正常のヒト細胞から、大量のコラーゲンを製造し、安全な再生医療の素材を提供することができる。【００９１】
前記実施の形態ではコラーゲンを産生する場合について説明したが、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）などのサイトカイン、インシュリンなどのホルモン、インターフェロンなどの微量活性物質、その他、医療と産業に有益なリコンビナントタンパク質などを産生する場合も、実質的に同様の方法で産生することができる。また、ヒト細胞を用いる場合について説明したが、ヒト以外の動物の細胞を用いてコラーゲン、その他の細胞由来物質を産生することができる。その場合は、安全性が確認されればヒトの患者の再生医療や、獣医分野で使用することができる。さらに細胞以外に、有用な生物由来物質を産生する足場依存性の微生物を培養したり、その微生物に有用物質を産生させたりする場合も、本発明の方法や装置を採用することができ、同様の作用効果を得ることができる。【００９２】
前記実施形態では、培養基盤７３として、チタンあるいはチタン合金製の細繊維を絡合してマット状に構成したウエブをそのまま用いているが、図１６ａに示すように、培養基盤７３の下面側に、培養液、細胞や微生物またはこれら細胞や微生物が産生した活性物質を透過させない不透過層１１７を設けて複合層としてもよい。このような不透過層１１７は合成樹脂シートやフィルム、金属箔、金属プレートなどによって形成することができる。また、培養基盤７３と別個に設けるほか、培養基盤７３の下面側に粉末、微小ビーズなどを充填して、いわゆる目詰まりを生じる層を設けることによっても形成することができる。【００９３】
前述のように培養基盤７３の下面側に不透過層１１７を設ける場合は、細胞および微生物が培養基盤７３から落ちにくくなる。そのため、通常の振とう培養をしなくてもよく、培養皿での培養が可能である。【００９４】
さらに図１６ｂに示すように、培養基盤７３の底部に加えて側面にも不透過層１１８を設けてもよい。この側面の不透過層１１８も前述の底部の不透過層１１７と同様のものを用いることができる。底部および側面に不透過層１１７、１１８を設ける場合は、細胞または微生物が産生（分泌）した、活性物質が培養基盤から散らばらず、不透過層１１７の上に留まりやすい。それにより細胞または微生物が活性化される。【００９５】
図１５のように培養基盤７３をシャーレ１１６に入れる場合、あるいは図１３、図１４のようにホルダー７２に入れる場合も、培養基盤７３に不透過層１１７、１１８を設けたまま一緒に入れることができる。それにより、細胞や微生物が落下しにくいなどの効果を奏する。ただし不透過層１１７、１１８を培養基盤７３に対して着脱自在に構成し、ホルダー７２に入れる場合など、特定の状態で取り外すようにすることもできる。【００９６】
［実施例１］
本発明の培養方法に用いられる培養基盤に該当する径が５０μｍのチタン金属線を空隙率８７％となるように絡合したチタンウェブを製造した。これを実施例１とする。
［実施例２］
実施例１のチタンウェブを有底筒状のチタン製のホルダーに挿入した培養基盤を製造した。これを実施例２とする。
［比較例１］
従来公知で平面のプラスチックの皿からなるプラスチックセルを比較例１とする。【００９７】
これらの実施例１、２および比較例１に線維芽細胞を播種し、培養液に浸して２週間培養した。図１７にこのときに線維芽細胞によって生産されたコラーゲンの産生量を示す。この図面からもわかるように本発明の培養方法に用いられる培養基盤（実施例１）を用いて培養した場合、コラーゲンの産生が通常のプラスチックセルより１．４倍向上した。さらに、ホルダーをつけた培養基盤（実施例２）で培養した場合は、通常のプラスチックセルよりコラーゲンの産生が１．８倍も向上した。
【図１】
2006033435.tif 000002
【図２】
2006033435.tif 000003
【図３】
2006033435.tif 000004
【図４】
2006033435.tif 000005
【図５】
2006033435.tif 000006
【図６】
2006033435.tif 000007
【図７】
2006033435.tif 000008
【図８】
2006033435.tif 000009
【図９】
2006033435.tif 000010
【図１０】
2006033435.tif 000011
【図１１】
2006033435.tif 000012
【図１２】
2006033435.tif 000013
【図１３】
2006033435.tif 000014
【図１４】
2006033435.tif 000015
【図１５】
2006033435.tif 000016
【図１６】
2006033435.tif 000017
【図１７】
2006033435.tif 000018
【国際調査報告】
2006033435.tif 000019
2006033435.tif 000020
2006033435.tif 000021
2006033435.tif 000022
2006033435.tif 000023
2006033435.tif 000024
2006033435.tif 000025
2006033435.tif 000026