(57)【要約】  高温処理に対して乳酸菌の抗アレルギー活性を維持することが可能な、乳酸菌抗アレルギー活性の高温処理に対する安定化方法、該安定化組成物、及び、安定化した乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲料等の飲食品及びその製造法を提供するものである。乳酸菌とポリフェノール類を併存させることにより、乳酸菌の抗アレルギー活性が高温処理を行った場合でも、その活性を安定的に維持することができる。本発明で用いるポリフェノール類としては、緑茶抽出ポリフェノール類のような植物抽出ポリフェノール類を用いることができる。本発明では、抗アレルギー活性を有する種々の乳酸菌を用いることができるが、特に、有利には、乳酸菌として高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を用いることができる。本発明の方法は、製造過程や流通過程、或いは、飲食時に高温加熱処理が行われる飲食品に対して適用可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌とポリフェノール類を併存させることを特徴とする乳酸菌抗アレルギー活性の高温処理に対する安定化方法。
【請求項２】
ポリフェノール類が、植物抽出ポリフェノール類であることを特徴とする請求項１記載の乳酸菌抗アレルギー活性の高温処理に対する安定化方法。
【請求項３】
植物抽出ポリフェノール類が、緑茶抽出ポリフェノール類であることを特徴とする請求項２記載の乳酸菌抗アレルギー活性の高温処理に対する安定化方法。
【請求項４】
乳酸菌が、高抗アレルギー活性を有する乳酸菌であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の乳酸菌抗アレルギー活性の高温処理に対する安定化方法。
【請求項５】
高抗アレルギー活性を有する乳酸菌が、Ｌactobacillus  paracasei  ＫＷ３１１０株、Ｌactobacillus  plantarum  ＫＷ４１１０株、Ｌactobacillus  paracasei  ＫＷ３９２５株、Ｌactobacillus  paracasei  ＫＷ３９２６株、又はStreptococcus  salivarius  ＫＷ３２１０又はこれらの派生株であることを特徴とする請求項４記載の乳酸菌抗アレルギー活性の高温処理に対する安定化方法。
【請求項６】
高抗アレルギー活性を有する乳酸菌が、Ｌ．paracasei  ＫＷ３１１０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３４）、又は、その派生株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３５）であることを特徴とする請求項４又は５記載の乳酸菌抗アレルギー活性の高温処理に対する安定化方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか記載の乳酸菌と、請求項１〜６のいずれか記載のポリフェノール類を併存させたことを特徴とする乳酸菌抗アレルギー活性の高温処理に対する安定化組成物。
【請求項８】
乳酸菌とポリフェノール類を併存させた乳酸菌抗アレルギー活性の高温処理に対する安定化組成物が、飲料添加用であることを特徴とする請求項７記載の乳酸菌抗アレルギー活性の高温処理に対する安定化組成物。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか記載の乳酸菌と、請求項１〜６のいずれか記載のポリフェノール類を併存させたことを特徴とする高温処理に対して安定化した乳酸菌抗アレルギー活性を有する食品。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか記載の乳酸菌と、請求項１〜６のいずれか記載のポリフェノール類を併存させたことを特徴とする高温処理に対して安定化した乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲料。
【請求項１１】
飲料が、乳成分非配合密封容器入り飲料であることを特徴とする請求項１０記載の高温処理に対して安定化した乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲料。
【請求項１２】
飲料が密封容器入り果汁含有清涼飲料又は茶飲料であることを特徴とする請求項１０又は１１記載の高温処理に対して安定化した乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲料。
【請求項１３】
飲料が、茶飲料に乳酸菌とポリフェノール類を添加するか、或いは、乳酸菌を添加するかして、請求項１〜６のいずれか記載の乳酸菌と請求項１〜６のいずれか記載のポリフェノール類を併存させたことを特徴とする請求項１０〜１２のいずれか記載の高温処理に対して安定化した乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲料。
【請求項１４】
茶飲料が、緑茶飲料であることを特徴とする請求項１３記載の高温処理に対して安定化した乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲料。
【請求項１５】
茶飲料が、発酵茶又は半発酵茶であることを特徴とする請求項１３記載の高温処理に対して安定化した乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲料。
【請求項１６】
密封容器入り飲料において、添加する乳酸菌が、飲料１００ｇあたり１０９〜１０１１個の範囲であることを特徴とする請求項１０〜１５のいずれか記載の高温処理に対して安定化した乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲料。
【請求項１７】
請求項１０〜１６のいずれか記載の乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲料を製造するに際して、飲料の高温処理を、ｐＨ４．６〜６．６の範囲で行うことを特徴とする高温処理に対して安定化した乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲料の製造方法。
【請求項１８】
飲料の高温処理を、ｐＨ５．５〜６．５の範囲で行うことを特徴とする請求項１７記載の高温処理に対して安定化した乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲料の製造方法。
【請求項１９】
飲料の高温処理が、ＵＨＴ殺菌処理であることを特徴とする請求項１７又は１８記載の高温処理に対して安定化した乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲料の製造方法。
【請求項２０】
請求項１０〜１６のいずれか記載の乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲料を製造するに際して、高温処理して調製した飲料を、ｐＨ５．５〜６．５の範囲に調整した後、容器に充填して密封することを特徴とする高温処理に対して安定化した乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲料の製造方法。
【請求項２１】
飲料が、緑茶飲料であることを特徴とする請求項１７〜２０のいずれか記載の高温処理に対して安定化した乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌抗アレルギー活性の高温処理に対する安定化方法、乳酸菌抗アレルギー活性の高温処理に対する安定化組成物、及び、安定化した乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲料等の飲食品及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
先進国においてアレルギーは最も頻度が高い疾患のひとつである。アレルギー発症機構は通常Ｉ型からＩＶ型の４つに分類され、Ｉ型、II型及びＩＶ型が食物アレルギーの発症に関与するとされている。一方、花粉症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎などの環境アレルギーはＩ型の発症機構を持つ。【０００３】
Ｉ型アレルギーはアレルゲン特異的ＩｇＥの誘導とヒスタミンやロイコトリエン等のケミカルメディエーターの放出をその特徴とする。Ｂ細胞において抗体のクラススイッチが起こり、ＩｇＥ抗体が産生されるようになるには、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３等のＴｈ２サイトカインを必要とする。実際、アレルギー患者のリンパ球にはＴｈ２細胞が増加していることが分かっている。つまり、外界から侵入したアレルゲンは樹状細胞・マクロファージ等の抗原提示細胞によってその一部をＭＨＣ  class II分子に結合した状態でＴ細胞に対して提示され、Ｔｈ２細胞が活性化・分化する。Ｔｈ２細胞が放出したＴｈ２サイトカインはＢ細胞のクラススイッチを誘導し、ＩｇＥ抗体が産生され、ＩｇＥ抗体は組織内のマスト細胞や血中の好塩基球表面のＦｃ・Ｒに結合する。アレルゲンは次回の侵入時にマスト細胞や好塩基球表面に結合しているＩｇＥ抗体に認識され、ＩｇＥ抗体間に架橋が形成される。この刺激を引き金としてマスト細胞や好塩基球がケミカルメディエーターを爆発的に遊離することによって、アレルギーの諸症状が現れる。【０００４】
ＩｇＥやケミカルメディエーターを介するアレルギーの予防・治療においては、例えばヒスタミンレセプターにヒスタミンと拮抗的に結合することによって末梢神経からの信号伝達を阻害する抗ヒスタミン剤、ケミカルメディエーターの産生細胞の活性を弱めて症状の軽減を試みる抗アレルギー剤、免疫応答性を弱めることによって炎症を軽減するステロイド剤、アレルゲンそのものを定期的に注射することにより寛容を誘導する減感作療法などがあるが、そのいずれも副作用が問題視されており、効果についても決定的なものがない。【０００５】
近年ＩｇＥを抑制するために、Ｔｈ２サイトカインの産生を調節する方法に注目が集まっている。結核菌や溶連菌、乳酸菌などのある種の細菌はＴｈ１免疫を増強することにより、Ｔｈ２免疫を抑制し、その結果ＩｇＥを低下させることが報告されている（臨床免疫、１９９９年、第３２巻、４５４頁；インターナショナル・アーカイブス・オブ・アレルギー・アンド・イムノロジー、１９９８年、第１１５巻、２７８頁；特開平９−２９５９号公報）。【０００６】
中でも乳酸菌は安全性の面から食品などへの応用が容易であり、有用な素材である。しかし一概に乳酸菌といっても全ての乳酸菌にＴｈ１免疫を増強させる強い効果があるわけではなく、有用な株の選択をすることが必須となってくる。抗アレルギー乳酸菌としては、Ｌ．rhamnosus  ＬＧＧ株が公知であり妊婦に摂取させることにより、子供のアトピー性皮膚炎発症が抑制されることが示されている（ランセット、２００１年、第３５７巻、１０７６頁）。乳酸菌を抗アレルギー剤として用いることについては、いくつかの特許公報でも開示されている。例えば、特開平９−２９５９号公報には、Ｌ．アシドフィルス、Ｌ．ブレビス、Ｌ．ブフネリ、及びＬ．カゼイ等の乳酸菌を添加してマウスリンパ球を培養した際のＩｇＥ産生量が３０ｎｇ／ｍｌ以下のものを抗アレルギー剤として用いることについて、特開平１０−３０９１７８号公報には、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム及びビフィドバクテリウム・ビフィダム等のビフィズス菌を特に食物アレルギーを治療するための抗アレルギー剤として用いることについて、及び、特開２０００−９５６９７号公報には、エンテロコッカス・フェカリス、ラクトバシルス・ロイテリーなどの乳酸菌をアレルギ性気管支喘息、アレルギ性鼻炎及びアトピ−性皮膚炎等のＩ型アレルギーの抑制剤として用いることについて、それぞれ開示されている。【０００７】
一方で、乳酸菌等が、Ｔｈ１免疫を増強することはＩＬ１２やＩＦＮ・ガンマーなどの産生を介してマクロファージやキラーＴ細胞、ＮＫ細胞の細胞性免疫の活性化を意味し、ウイルスや細菌感染、ガンの発生に対して抵抗することにつながることが分かっている。具体的にはマクロファージが産生するＩＬ−１２は未分化のヘルパーＴ細胞のＴｈ１細胞への分化、単球・マクロファージ・ＮＫ細胞の活性化を通して、外敵・ガンに対する抵抗性を獲得させる。従って強いＩＬ−１２産生を誘導することのできる乳酸菌株は免疫賦活剤として使用することができることが示唆されている（キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー、２０００年、第４９巻、１５７頁；特開平７−２２８５３６号公報；特開２００２−８０３６４号公報）。【０００８】
近年、アトピー性皮膚炎や花粉症など、アレルギーに起因すると考えられる体質変化をおこした人が多く見受けられ、社会問題化している。その中でも特に症状が重い患者に対しては、各種薬剤を使用しての治療行為が行われている。しかし、大部分の対象者は本格治療を行うにまでは至っておらず、日常生活をおこなっていく上で、民間療法を含め、対処療法を行って対処しているのが実情である。そのような状況に鑑みて、最近になって食餌によってアレルギーを抑えようとする研究が活発に行われている。その結果、例えば、シソ油や魚油、特定の茶ポリフェノール等、種々の飲食品の成分に抗アレルギー効果を見い出して、それらを用いた対処が行われている。【０００９】
抗アレルギー効果を有する飲食品の成分として、上述のように特定の乳酸菌にも同様な効果が知られてきており、この乳酸菌を用いたヨーグルトや乳酸菌飲料が、抗アレルギー効果を有する飲食物として一部実用化されている。乳酸菌は安全性の面から食品などへの応用が容易であり、有用な素材として着目されてきた。例えば、乳酸菌を、Ｉ型アレルギーの発症に関わるＩｇＥ抗体量を減少させてアレルギーの治療と予防を容易にする抗アレルギー剤として、各種乳酸菌を有効成分とする抗アレルギー剤が開示されている（特開平９−２９５９号公報、特開２００４−２６７２９号公報）。この種の抗アレルギー用飲食品による予防或いは治療では、安全で、かつマイルドな条件で摂取することが可能である代わり、毎日継続摂取することが必要であり、尚かつ該継続摂取することが可能な量で効能が発揮されることが必要である。【００１０】
乳酸菌の食品への応用として、ヨーグルト、チーズ、発酵乳等が挙げられ、また、乳製品以外の飲食品にも利用が図られていたが、いずれも高温加熱処理が必要でない飲食品への応用に限られていた。例えば、茶成分との利用を図るものとしては、放冷した茶葉湯に、緑茶より分離したラクトバチルス・プランタムを添加、発酵して飲料用等に用いるもの（特開平１１−２７６０７２号公報）、茶類エキス等を含む培地で培養した乳酸菌培養物を飲食品として用いるもの（特開２００１−１９０２７２号公報）、茶葉等の植物資源を細かく粉砕したものを培養基として、ラクトバチルス・プランタリウムのような乳酸菌を添加・培養して、発酵食材として利用するもの（特開２００２−３３０７２５号公報）、茶葉抽出液からポリフェノールを除去したものに、乳酸菌を添加培養して、甘い花香を有するγ−アミノ酸香含有茶飲料として利用するもの（特開２００３−３３３９９０号公報）、などが開示されている。【００１１】
しかしながら、最近流通している容器詰飲料等、多くの飲食品においては、その製造過程や流通過程、或いは、飲食時に高温加熱処理が行われるため、その際に乳酸菌菌体の物性に変化が生じて、抗アレルギー活性が影響を受けるとの問題がある。したがって、従来においては、高温加熱処理が行われる飲食品に対しては、乳酸菌の抗アレルギー活性の利用が制約を受けるとの問題があった。しかし、従来においては、高温加熱処理が行われる飲食品に対しては、そのような問題があるということのみならず、乳酸菌の抗アレルギー能に対する高温加熱処理の影響についての検討もなされないまま、利用されないできた。【００１２】
一方、植物や飲食品中に含まれるポリフェノール類の生理活性が注目され、多くの研究や報告がなされている。例えば、緑茶抽出物中のポリフェノール類の効果としては抗菌作用、抗酸化作用、コレステロール上昇抑制作用、αアミラーゼ活性阻害作用などが開示されている（特開２００３−１３８２５８号公報、特開昭６０−１５６６１４号公報、特開平３−１３３９２８号公報、特開２００４−１６６６７１号公報）。乳酸菌とポリフェノールの同時摂取による便通改善効（特開２００４−１５５７２７号公報）、茶抽出中液での培養（特開２００３−３３３９９０号公報）。これらの開示は、いずれもポリフェノール類の生理活性に注目するもので、乳酸菌との抗アレルギー能に関する相互作用に触れるようなものはなかった。【００１３】
【特許文献１】特開昭６０−１５６６１４号公報。
【特許文献２】特開平７−２２８５３６号公報。
【特許文献３】特開平９−２９５９号公報。
【特許文献４】特開平１０−３０９１７８号公報
【特許文献５】特開平１１−２７６０７２号公報。
【特許文献６】特開２０００−９５６９７号公報。
【特許文献７】特開２００１−１９０２７２号公報。
【特許文献８】特開２００２−３３０７２５号公報。
【特許文献９】特開平３−１３３９２８号公報。
【特許文献１０】特開２００２−８０３６４号公報。
【特許文献１１】特開２００３−１３８２５８号公報。
【特許文献１２】特開２００３−３３３９９０号公報。
【特許文献１３】特開２００４−２６７２９号公報。
【特許文献１４】特開２００４−１５５７２７号公報。
【特許文献１５】特開２００４−１６６６７１号公報。
【非特許文献１】臨床免疫、１９９９年、第３２巻、４５４頁；インターナショナル・アーカイブス・オブ・アレルギー・アンド・イムノロジー、１９９８年、第１１５巻、２７８頁。
【非特許文献２】ランセット、２００１年、第３５７巻、１０７６頁。
【非特許文献３】キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー、２０００年、第４９巻、１５７頁。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の課題は、その製造過程や流通過程、或いは、飲食時に高温加熱処理が行われる飲食品、更には高温処理後の常温保存下での飲食品に対しても適用が可能な、すなわち、高温処理に対して乳酸菌の抗アレルギー活性を維持することが可能な、乳酸菌抗アレルギー活性の高温処理に対する安定化方法、乳酸菌抗アレルギー活性の高温処理に対する安定化組成物、及び、安定化した乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲料等の飲食品及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者は、高温処理を行う飲食品における乳酸菌の抗アレルギー活性について鋭意研究する中で、乳酸菌とポリフェノール類を併存させることにより、乳酸菌の抗アレルギー活性が高温処理を行った場合でも、その活性を安定的に維持することができることを見い出し、発明を完成するに至った。【００１６】
すなわち、本発明者は、緑茶に抗アレルギー能を有する乳酸菌を添加し、ＵＨＴ殺菌を施す検討の中で、緑茶成分のポリフェノールがＵＨＴ殺菌、高温保存下での抗アレルギー活性、及び高温処理後の常温保存下での飲食品の抗アレルギー活性の安定化に寄与することを見い出し、本発明をなすに至った。本発明の乳酸菌抗アレルギー活性の高温処理に対する安定化方法は、特に、飲料等を始めとして、その製造過程や流通過程、或いは、飲食時に高温加熱処理が行われる広い範囲の飲食品に対して適用することが可能なものである。本発明の乳酸菌抗アレルギー活性の高温処理に対する安定化方法は、乳酸菌抗アレルギー活性の高温処理に対する安定化組成物として提供することができ、該組成物によって、高温処理の行われる飲食品に乳酸菌の安定化した抗アレルギー活性を付与することができ、本発明はそのような乳酸菌抗アレルギー活性の高温処理に対する安定化組成物を包含する。本発明で用いるポリフェノール類としては、好ましくは、緑茶抽出ポリフェノール類のような植物抽出ポリフェノール類を用いることができるが、茶類のように飲食品自体にポリフェノール類が含まれる場合には、該ポリフェノール類を利用して、或いは、必要により該ポリフェノール類に更にポリフェノール類を補充して、本発明を実施することができる。【００１７】
また、本発明においては、本発明の安定化方法を用いて、高温処理に対して安定化した乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲料等を製造するに際して、高温処理を特定のｐＨ条件で行うことにより、すなわち、ｐＨ４．６〜６．６の範囲、特に好ましくは、ｐＨ５．５〜６．５の範囲で行うことにより、高温処理に対して更に安定化した乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲料等を製造することができることを、更に、本発明の安定化方法を用いて、高温処理に対して安定化した乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲料等を製造するに際して、高温処理して調製した飲料等を、特定のｐＨ範囲に調整した後、容器に充填して密封することにより、更に安定化した乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲料等を製造することができることを、見い出し、本発明をなした。【００１８】
本発明の乳酸菌抗アレルギー活性の高温処理に対する安定化方法は、高温処理の行われる種々の飲食品に適用することができるが、特に、緑茶や発酵茶、或いは半発酵茶のような茶飲料に適用することができ、本発明により高温処理に対して安定化した乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲料を提供することができる。更に、本発明は、乳酸菌として高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を用いることができ、本発明はそのような高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を用いた、乳酸菌抗アレルギー活性の高温処理に対する安定化方法、乳酸菌抗アレルギー活性の高温処理に対する安定化組成物、及び、高温処理に対して安定化した乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲料等を包含する。かかる、高抗アレルギー活性を有する乳酸菌の例示として、特許微生物の寄託のためのブダペスト条約に基く国際寄託当局である、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（あて名：〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６；寄託日：２００４年２月２０日）に、ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３４、及び、ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３５として寄託されたＬ．paracasei  ＫＷ３１１０及びその派生株を挙げることができる。本発明の乳酸菌抗アレルギー活性の高温処理に対する安定化方法は、乳酸菌による抗アレルギー活性の付与に、乳酸菌の加熱死菌を用いた場合にもその効果を奏する。【００１９】
すなわち具体的には本発明は、（１）乳酸菌とポリフェノール類を併存させることを特徴とする乳酸菌抗アレルギー活性の高温処理に対する安定化方法や、（２）ポリフェノール類が、植物抽出ポリフェノール類であることを特徴とする上記（１）記載の乳酸菌抗アレルギー活性の高温処理に対する安定化方法や、（３）植物抽出ポリフェノール類が、緑茶抽出ポリフェノール類であることを特徴とする上記（２）記載の乳酸菌抗アレルギー活性の高温処理に対する安定化方法や、（４）乳酸菌が、高抗アレルギー活性を有する乳酸菌であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載の乳酸菌抗アレルギー活性の高温処理に対する安定化方法や、（５）高抗アレルギー活性を有する乳酸菌が、Ｌactobacillus  paracasei  ＫＷ３１１０株、Ｌactobacillus  plantarum  ＫＷ４１１０株、Ｌactobacillus  paracasei  ＫＷ３９２５株、Ｌactobacillus  paracasei  ＫＷ３９２６株、又はStreptococcus  salivarius  ＫＷ３２１０又はこれらの派生株であることを特徴とする上記（４）記載の乳酸菌抗アレルギー活性の高温処理に対する安定化方法や、（６）高抗アレルギー活性を有する乳酸菌が、Ｌ．paracasei  ＫＷ３１１０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３４）、又は、その派生株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３５）であることを特徴とする上記（４）又は（５）記載の乳酸菌抗アレルギー活性の高温処理に対する安定化方法からなる。【００２０】
また本発明は、（７）上記（１）〜（６）のいずれか記載の乳酸菌と、上記（１）〜（６）のいずれか記載のポリフェノール類を併存させたことを特徴とする乳酸菌抗アレルギー活性の高温処理に対する安定化組成物や、（８）乳酸菌とポリフェノール類を併存させた乳酸菌抗アレルギー活性の高温処理に対する安定化組成物が、飲料添加用であることを特徴とする上記（７）記載の乳酸菌抗アレルギー活性の高温処理に対する安定化組成物からなる。【００２１】
さらに本発明は、（９）上記（１）〜（６）のいずれか記載の乳酸菌と、上記（１）〜（６）のいずれか記載のポリフェノール類を併存させたことを特徴とする高温処理に対して安定化した乳酸菌抗アレルギー活性を有する食品や、（１０）上記（１）〜（６）のいずれか記載の乳酸菌と、上記（１）〜（６）のいずれか記載のポリフェノール類を併存させたことを特徴とする高温処理に対して安定化した乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲料や、（１１）飲料が、乳成分非配合密封容器入り飲料であることを特徴とする上記（１０）記載の高温処理に対して安定化した乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲料や、（１２）飲料が密封容器入り果汁含有清涼飲料又は茶飲料であることを特徴とする上記（１０）又は（１１）記載の高温処理に対して安定化した乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲料や、（１３）飲料が、茶飲料に乳酸菌とポリフェノール類を添加するか、或いは、乳酸菌を添加するかして、上記（１）〜（６）のいずれか記載の乳酸菌と上記（１）〜（６）のいずれか記載のポリフェノール類を併存させたことを特徴とする上記（１０）〜（１２）のいずれか記載の高温処理に対して安定化した乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲料や、（１４）茶飲料が、緑茶飲料であることを特徴とする上記（１３）記載の高温処理に対して安定化した乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲料や、（１５）茶飲料が、発酵茶又は半発酵茶であることを特徴とする上記（１３）記載の高温処理に対して安定化した乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲料や、（１６）密封容器入り飲料において、添加する乳酸菌が、飲料１００ｇあたり１０９〜１０１１個の範囲であることを特徴とする上記（１０）〜（１５）のいずれか記載の高温処理に対して安定化した乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲料からなる。【００２２】
また、本発明は、（１７）上記（１０）〜（１６）のいずれか記載の乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲料を製造するに際して、飲料の高温処理を、ｐＨ４．６〜６．６の範囲で行うことを特徴とする高温処理に対して安定化した乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲料の製造方法や、（１８）飲料の高温処理を、ｐＨ５．５〜６．５の範囲で行うことを特徴とする上記（１７）記載の高温処理に対して安定化した乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲料の製造方法や、（１９）飲料の高温処理が、ＵＨＴ殺菌処理であることを特徴とする上記（１７）又は（１８）記載の高温処理に対して安定化した乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲料の製造方法や、（２０）上記（１０）〜（１６）のいずれか記載の乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲料を製造するに際して、高温処理して調製した飲料を、ｐＨ５．５〜６．５の範囲に調整した後、容器に充填して密封することを特徴とする高温処理に対して安定化した乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲料の製造方法や、（２１）飲料が、緑茶飲料であることを特徴とする上記（１７）〜（２０）のいずれか記載の高温処理に対して安定化した乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲料の製造方法からなる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明で用いることができる乳酸菌及びその入手先（Ｎｏ．１）を示す図である。
【図２】本発明で用いることができる乳酸菌及びその入手先（Ｎｏ．２）を示す図である。
【図３】本発明で用いることができる乳酸菌及びその入手先（Ｎｏ．３）を示す図である。
【図４】本発明の実施例において、乳酸菌を各緑茶に混合した際の、ＵＨＴ殺菌による抗アレルギー活性の変化を示す図である。
【図５】本発明のの実施例において、緑茶中乳酸菌の抗アレルギー活性について、５℃及び５０℃保存１週間後の相対抗アレルギー活性を示す図である。
【図６】本発明の実施例において、各種ｐＨ条件における、加熱処理について、乳酸菌抗アレルギー残存活性についての相対活性を測定した結果を示す図である。
【図７】本発明の実施例において、ＵＨＴ殺菌後の緑茶を、各種ｐＨに調整後、容器に充填し、密封した場合の、緑茶中の乳酸菌の抗アレルギー能を評価した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は、乳酸菌とポリフェノール類を併存させることにより、高温処理に対して乳酸菌の持つ抗アレルギー活性を安定化する方法、該方法を用いる乳酸菌抗アレルギー活性の高温処理に対する安定化組成物及び高温処理に対して安定化した乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲食品よりなる。本発明における「高温処理」には、例えば、５０℃以上の温度で行われる殺菌操作、ホットベンダーにおける商品展示，ＵＨＴ殺菌等、飲食品の製造過程や流通過程、或いは、飲食時に飲食品に加えられる常温以上の温度処理で、乳酸菌の抗アレルギー活性を低下させるような温度処理が含まれる。本発明の安定化した乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲料等の製造において、高温処理を行うに際しては、ｐＨ４．６〜６．６の条件で行うことが好ましい。ｐＨ５．５〜６．５の範囲で行うことが更に好ましい。【００２５】
本発明で用いるポリフェノール類としては、好ましくは、緑茶抽出ポリフェノール類のような植物抽出ポリフェノール類を挙げることができる。茶類のように飲食品自体にポリフェノール類が含まれる場合には、該ポリフェノール類を利用して、乳酸菌とポリフェノール類を併存させることができ、必要により飲食品自体に含まれる該ポリフェノール類に更にポリフェノール類を補充して、或いは、濃縮等によりポリフェノール類の濃度を増して、必要量を併存させることができる。【００２６】
植物原料からポリフェノール類を調製するには、植物体からの熱水抽出等により適宜調製することができる。本発明のポリフェノールの取得方法のひとつとして緑茶抽出が用いられる。ここでいう緑茶抽出とは、茶葉から熱水若しくは水溶性有機溶媒により抽出された抽出液を濃縮したものをさらに精製する、或いは、抽出液を直接精製することである。また市販の三井農林（株）「ポリフェノン」、伊藤園（株）「テアフラン」、太陽化学（株）「サンフェノン」などの緑茶抽出液の濃縮物を用いることもできる。本発明において、飲食品中に乳酸菌とポリフェノール類を併存させる場合の好ましいポリフェノール類の濃度としては、総ポリフェノール類濃度が少なくても５０〜１３０ｍｇ／１００ｍｌの範囲のものが好ましく、更には、６０〜１３０ｍｇ／１００ｍｌの範囲のものが好ましい。【００２７】
本発明で用いられる乳酸菌は、抗アレルギー活性を有するものであれば特に限定されず、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、エンテロコッカス属等のいずれの乳酸菌をも使用することができる。本発明のための乳酸菌として具体例を挙げると：ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・デルブリュッキイ、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・ケフィア、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ラムノーサス、ラクトバチルス・サリバリウス、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ラクトコッカス・ラクティス、ラクトコッカス・プランタラム、ラクトコッカス・ラフィノラクティス、ロイコノストック・ラクティス、ロイコノストック・メセンテロイデス、等が挙げられる。【００２８】
本発明で用いることができる乳酸菌の例及びその入手先を、図１（Ｎｏ．１）及び図２（Ｎｏ．２）に示す。本発明においては、全ての菌株をＫＷで始まる番号にて識別しているが、これら試験株は独自で単離したもの、市販乳製品で使用されているもの、公的機関等から入手したもの等があるために便宜上統一した識別名を付したものであり、それぞれのＫＷ株と入手由来との関係は図１（Ｎｏ．１）、図２（Ｎｏ．２）及び図３（Ｎｏ．３）の通りである。なお、該図１及び図２の「入手先」において、「ＪＣＭ」は理化学研究所微生物系統保存施設を、「ＩＦＯ」は前財団法人発酵研究所（現在は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  生物資源センター（ＮＢＲＣ））を表す。【００２９】
本発明においては、抗アレルギー活性を有する乳酸菌として、高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を用いることができる。該高抗アレルギー活性を有する乳酸菌としては、Ｌactobacillus  paracasei  ＫＷ３１１０株、Ｌactobacillus  plantarum  ＫＷ４１１０株、Ｌactobacillus  paracasei  ＫＷ３９２５株、Ｌactobacillus  paracasei  ＫＷ３９２６株、又はStreptococcus  salivarius  ＫＷ３２１０又はこれらの派生株を挙げることができる。【００３０】
該乳酸菌は、例えばＬ．paracasei  ＫＷ３１１０株は、L.casei  Ｌ１４株として、日本乳業技術協会から入手することができる。なお、日本乳業技術協会の記載によれば、Ｌ１４株はＬ．caseiとの記載があるが、本発明者らがQUALICON社製リボプリンターを用いたＲＦＬＰ（Restriction Flagment Length Polymorphism）及びＡＦＬＰ（Amplified Flagment Length Polymorphism）を用いて解析したところ、当該株はＬ．paracaseiと判断されたため、本発明においてはＬ．ｐaracaseiと記載した。本発明で抗アレルギー用組成物の有効成分として使用されるＬ．paracasei  ＫＷ３１１０は、上記のとおり日本乳業技術協会から入手することができるが、更に、特許微生物の寄託のためのブダペスト条約に基く国際寄託当局である、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３４として寄託されている。また、Ｌ．paracasei  ＫＷ３１１０の派生株は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３５として同特許生物寄託センターに寄託されている。【００３１】
また、本発明で高抗アレルギー活性を有する乳酸菌として使用されるＬ．plantarum  ＫＷ４１１０株はＬ．plantarum  ＪＣＭ１１４９株として、Ｌ．paracasei  ＫＷ３９２６株はＬ．paracasei  ＪＣＭ８１３２株として、ＪＣＭ（理化学研究所微生物系統保存施設）から入手することができ、及び、Ｌ．paracasei  ＫＷ３９２５株はＬ．paracasei  ＮＲＩＣ１９１７株として、ＮＲＩＣ（東京農業大学）から入手することができる。【００３２】
本発明で用いる抗アレルギー活性を有する乳酸菌は、前記乳酸菌を培地において培養することにより調製することができる。培養に用いる培地は、前記乳酸菌が生育可能な培地であればどのようなものでも利用可能であり、獣乳、脱脂乳、乳性ホエー、ＭＲＳ培地、ＧＡＭ培地、ＢＬ培地、Briggs Liver Brothや合成培地などを用いることができる。培養温度は２０℃から５０℃、好ましくは２５℃から４２℃とすることができる。また、培養時間は３時間から９６時間とすることができる。培養終了後の培地をそのまま、又は必要に応じてさらに処理することにより本発明の乳酸菌とすることができる。例えば、培養終了後の培地から遠心分離、ろ過等により集菌して菌体のみとしたもの、これをスプレイドライ乾燥菌体としたもの、凍結乾燥菌体としたものも本発明の乳酸菌とすることができる。本発明の乳酸菌は、前記乳酸菌菌体に加え、他の成分を含むことができる。他の成分としては、賦形剤等の添加剤、及び後述する培地の成分等を挙げることができる。【００３３】
本発明で用いる高抗アレルギー活性を有する乳酸菌の具体的調製例を示すと：
（乳酸菌ＫＷ３１１０株菌体の調製）
乳酸菌の培養には、培養用培地（グルコース  １％、酵母エキスＳ(武田キリン食品社)１％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ２Ｏ  ５０ｐｐｍ、ＭｎＳＯ4・５Ｈ２Ｏ  ５０ｐｐｍ）を使用した。前培養は乳酸菌ＫＷ３１１０株を培養用培地１０ｍｌに接種し、３７℃で２０〜２４ｈｒ静置し、行った。本培養は、前培養液０．６ｍｌを１２０ｍｌの培養用培地に接種し、２００ｍｌ容ファーメンター（モデルＢＭＪ−２５、エイブル社）を用いて、２８℃にて培養した。通気量は０．１２Ｌ／ｍｉｎ、攪拌速度は５００ｒｐｍとした。ｐＨは２５％  ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨ  ４．５以下にならないように制御した。培養は４８時間行った。【００３４】
培養終了後、８５００Ｘｇ、１０分間の遠心分離により、菌体を集菌した。３０ｍｌの滅菌蒸留水に懸濁し、８５００Ｘｇ、１０分間の遠心分離により、菌体を集菌した。この洗浄操作を３回繰り返し、培地由来成分を除去した。洗浄菌体を、１０ｍｌの滅菌水に懸濁し、オートクレーブにて１００℃、３０分間処理した後、凍結乾燥した。最終的に乳酸菌乾燥菌体５０〜７０ｍｇが得られた。得られた乳酸菌菌体の抗アレルギー活性を確認した。【００３５】
本発明の乳酸菌とポリフェノール類を併存させる乳酸菌抗アレルギー活性の高温処理に対する安定化方法は、その製造過程や流通過程、或いは、飲食時に高温加熱処理が行われる広い範囲の飲食品に対して、適用することができる。本発明のものは、乳酸菌とポリフェノール類を併存させた乳酸菌抗アレルギー活性の高温処理に対する安定化組成物として、各種飲食品に添加して、飲食品に安定化した抗アレルギー活性を付与することができる。【００３６】
本発明の乳酸菌とポリフェノール類を併存させる乳酸菌抗アレルギー活性の高温処理に対する安定化方法は、特に、飲料における安定化した抗アレルギー活性の付与に有利に適用することができる。該飲料としては、茶系飲料或いは非茶系飲料を挙げることができる。かかる場合に配合する特に好ましいポリフェノール類としては、緑茶抽出ポリフェノール類のような植物抽出ポリフェノール類が挙げられる。緑茶抽出ポリフェノール類は、配合対象として、緑茶、半発酵茶及び発酵茶から選ばれた茶の抽出液；及び非茶系飲料に配合する特に好ましいポリフェノール類として挙げることができる。このうち、茶の抽出液に前記緑茶抽出物を配合した飲料が好ましく、緑茶の抽出液に前記緑茶抽出物を配合した緑茶飲料とするのが特に好ましい。【００３７】
半発酵茶としては烏龍茶が挙げられ、発酵茶としては紅茶が挙げられる。また非茶系飲料としては例えばソフトドリンクである炭酸飲料、果実エキス入り飲料、野菜エキス入りジュース、ニアウォーター、スポーツ飲料、ダイエット飲料などが挙げられる。本発明により、安定化した抗アレルギー活性の付与した飲料を密封容器入り飲料として製品化する場合においては、添加する乳酸菌が、飲料１００ｇあたり１０９〜１０１１個の範囲であるように調整することが好ましい。【００３８】
本発明において、本発明の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を配合する飲料としては、上記のとおり各種のものを挙げることができるが、それらの飲料の製造に際しては、通常の飲料の処方設計に用いられる糖類、香料、果汁、食品添加物などいずれも使用することが出来る。飲料の製造に関しては、既存の参考書、例えば「改訂新版ソフトドリンクス」（株式会社光琳）等を参考にすることができる。【００３９】
本発明において、特に、配合に適した飲料としては、抗アレルギー作用及び製品の保存、安定化の観点から、乳成分を含まない、すなわち、例えば、果汁入り清涼飲料或いは上記茶飲料のような乳成分非配合の形の飲料が特に好ましい。本発明の安定化した乳酸菌抗アレルギー活性を有する飲料等は、容器に充填して密封することにより、「密封容器詰飲料」として製品化することができる。その際に、高温処理して調製した飲料を、ｐＨ５．５〜６．５の範囲に調整した後、充填することが好ましい。【００４０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４１】
アスコルビン酸３ｇを溶解させた８０℃の温水３．５ｋｇで緑茶葉（かぶせ茶・玉露を主とする）１００ｇを約６分間抽出した。抽出液をメッシュに通して茶葉を取り除き、遠心分離した。その上清に重曹を５ｇ、アスコルビン酸を３ｇ加え、水を加えて１２ｋｇにした。本緑茶液を基本緑茶（１）とし、（１）にポリフェノン７０Ａ（三井農林株式会社）を８ｇ添加したものを基本緑茶＋ポリフェノン７０Ａ（２）、遠心分離後の抽出液上清を（１）の２倍量使用したものを茶葉抽出液２倍緑茶（３）、（１）における遠心分離前の抽出液にＰＶＰＰを１８ｇ添加・攪拌し、遠心分離した上清を使用したものをＰＶＰＰ処理緑茶（４）とした。【００４２】
（１）〜（４）のｐＨは６．０〜７．０であり、また、（１）〜（４）の総ポリフェノール量を、標準液に没食子酸エチルを用いた酒石酸鉄法にて定量した。（参考文献：茶業研究報告第７１号（1990）茶の分析法  タンニン値の比色定量法）。定量した結果を表１に示す。【００４３】
【表１】
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【００４４】
上記緑茶（１）〜（４）に乳酸菌Lactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株乾燥菌体（加熱死菌：キリンビール（株）機能食品カンパニーより入手）を、０．０２％添加し、ＵＨＴ殺菌を行った。殺菌条件は、１３５℃、３０秒と、１３７℃、３０秒の条件で行い、５００ｍｌ容ペットボトルにホットパック充填した。殺菌後の緑茶２５ｍｌより８０００回転、１０分間の遠心分離で乳酸菌の沈殿物を取得した。沈殿物をＰＢＳ（−）で洗浄後、再度遠心分離し、沈殿物を５ｍｌのＰＢＳ（−）に懸濁した。【００４５】
乳酸菌のin vitroにおける抗アレルギー活性はマウス脾臓リンパ球と混合培養を行った際に、培地中に放出されるＩＬ−１２量を測定することによって行った。７−１０週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（チャールズリバー）にday０とday６に卵白アルブミン（ＯＶＡ）１ｍｇをアジュバントである水酸化アルミニウム ２ｍｇと共に腹腔内注射した。Day１３に解剖し、脾臓を単離・リンパ球を調製した。脾臓リンパ球をＦＣＳ（ロシュ）とＯＶＡをそれぞれ終濃度１０％及び１ｍｇ／ｍｌになるように添加したＲＰＭ１１６４０（SIGMA）培地で細胞濃度が２．５×１０６cells ／ｍｌになるように懸濁した。乳酸菌を上記培地に０．２５μｇ／ｍｌになるように添加し、１週間３７℃、ＣＯ２濃度５％で培養した。遠心分離にて培養上清を回収し、Ｏｐｔ  ＥＩＡ  ＥＬＩＳＡ  Ｓｅｔ（ベクトン・ディッキンソン）を用いてＩＬ−１２生産量を測定した。【００４６】
図４に各緑茶に混合した際の、ＵＨＴ殺菌による抗アレルギー活性の変化を示す。殺菌前に対するＵＨＴ殺菌後の相対抗アレルギー活性を示す。両殺菌条件において、基本緑茶（１）と比較して基本緑茶＋ポリフェノン７０Ａ（２）及び、茶葉抽出液２倍緑茶のＵＨＴ殺菌後の残存活性は１０〜２０％高いい結果となった。ＰＶＰＰ処理緑茶（４）において残存抗アレルギー活性は基本緑茶（１）と比較して１０〜２０％低い結果となった。残存抗アレルギー活性の高さと表１に示すポリフェノール含量（タンニン含量）に相関があると考えられた。
【実施例２】
【００４７】
実施例（１）で調製した４種類の緑茶を５℃及び、５０℃で１週間保存し、保存後の緑茶中乳酸菌の抗アレルギー活性を評価した。実験は実施例（１）と同様の手順で行った。図５に５℃に対する５０℃保存１週間後の相対抗アレルギー活性を示す。【００４８】
両殺菌条件において、基本緑茶＋ポリフェノン７０Ａ（２）、及び茶葉抽出液２倍緑茶（３）は保存温度で抗アレルギー活性はほとんど変わらなかったのに対し、基本緑茶（１）では抗アレルギー活性の低下が見られ、ＰＶＰＰ処理緑茶（４）においては大幅な抗アレルギー活性の低下が見られた。実施例（１）のＵＨＴ殺菌直後の抗アレルギー活性と同様に、５０℃保存における安定性においてもポリフェノール含量が高いことの優位性が確認された。５０℃保存における優位性が確認されたことから，常温保存下での長期安定性も高いと考えられる。
【実施例３】
【００４９】
ｐＨ４．０、４．３、４．６、５．０、５．３、５．６、６．０、６．３、６．６、７．０の５０ｍＭ  クエン酸／クエン酸ナトリウムバッファーに乳酸菌Lactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株乾燥菌体を、０．０２５％添加し、９５℃１８０分間加熱処理を行った。加熱後、遠心分離で乳酸菌沈殿物を取得し、乳酸菌の抗アレルギー能を評価した。実験は実施例（１）と同様の手順で行った。図６にそれぞれのｐＨのバッファーに混合した際の、加熱処理による抗アレルギー能の変化を示す。加熱処理による残存活性はｐＨに依存していた。ｐＨ６．０と比較してｐＨ７．０では４０％程度低い結果となった。この事は、実施例４の緑茶混合時の結果と同様の結果であった。
【実施例４】
【００５０】
アスコルビン酸３ｇを溶解させた８０℃の温水３．５ｋｇで緑茶葉（かぶせ茶・茎茶を主とする）１００ｇを約６分間抽出した。抽出液をメッシュに通して茶葉を取り除き、遠心分離した。その上清に重曹・アスコルビン酸・緑茶エキスをそれぞれ３ｇ、乳酸菌Lactobacillus paracaseiＫＷ３１１０株乾燥菌体を２ｇ加え、水で１２ｋｇにメスアップした。これを緑茶（１）：ｐＨ＝６．０とした。上記緑茶（１）の重曹添加量を変更し、ｐＨをそれぞれ、５．５、６．５、７．０に調整したものを緑茶（２）、（３）、（４）とした。該緑茶（１）〜（４）をＵＨＴ殺菌後、３５０ｍｌ容ペットボトルにホットパック充填した。殺菌後の緑茶より遠心分離で乳酸菌沈殿物を取得し、緑茶中乳酸菌の抗アレルギー能を評価した。実験は実施例（１）と同様の手順で行った。図７に各緑茶に混合した際の、ＵＨＴ殺菌による抗アレルギー能の変化を示す。ｐＨ５．５、６．０、６．５はＵＨＴ殺菌による残存活性は同程度であったのに対し、ｐＨ７．０では５０％程度低い結果となった。残存抗アレルギー能の高さとｐＨに相関があることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明は、乳酸菌抗アレルギー活性の高温処理に対する安定化方法を提供する。本発明により、その製造過程や流通過程、或いは、飲食時に高温加熱処理が行われる広い範囲の飲食品、及び高温処理後、常温で保存される広い範囲の飲食品に対して、乳酸菌による安定化した抗アレルギー活性を付与することができ、該活性を安定化して、維持することができる。本発明は、本来ポリフェノールを多く含む、茶類等の飲料に有利に適用することができ、本発明により乳酸菌による安定した抗アレルギー活性を有する飲料を提供することができる。本発明において、好ましい態様として、用いる乳酸菌として高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を用いることができ、該乳酸菌により、高抗アレルギー機能を有する安定化した活性の飲食品を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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