(57)【要約】ヒト肝細胞を移植したキメラマウスを用いて、薬物代謝酵素ＣＹＰ２Ｄ６，ＣＹＰ２Ｃ９，ＣＹＰ２Ｃ１９によって主として代謝される医薬候補品をスクリーニングする方法であって、医薬候補物質が、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ９、またはＣＹＰ２Ｃ１９欠損者で代謝されるか否かを判定する方法を提供する。また、ヒト肝臓移植キメラマウスを用いて、医薬候補物質が薬物代謝酵素ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６またはＣＹＰ３Ａ４のいずれか対してその活性を誘導または阻害するかを判定する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物代謝酵素ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ９、またはＣＹＰ２Ｃ１９で主として代謝される医薬候補物質が、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ９、またはＣＹＰ２Ｃ１９欠損者で代謝されるか否かを判定する方法であって、
（１）      移植されたヒト肝細胞がマウス肝臓の７０％以上を占めている高置換キメラマウスと、ヒト肝細胞がほとんど生着していない低置換キメラマウスのそれぞれに医薬候補物質を投与する工程；
（２）      高置換キメラマウスと低置換キメラマウスのそれぞれから採取した血清中の医薬候補物質の濃度を経時的に測定する工程；
を含み、低置換キメラマウスに比較して高置換キメラマウスで有意に早く代謝される医薬候補物質が、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ９、またはＣＹＰ２Ｃ１９欠損者では代謝されない物質であると判定することを特徴とする方法。
【請求項２】
医薬候補物質が、薬物代謝酵素の活性を促進または阻害するか否かを判定する方法であって、
（１）      高置換キメラマウスに医薬候補物質を投与する工程；
（２）      高置換キメラマウスに、複数の薬物代謝酵素のそれぞれによって代謝される複数の指標化合物を投与する工程；
（３）      高置換キメラマウスから採取した血清中の指標化合物の濃度を経時的に測定する工程；
を含み、医薬候補物質を投与していない時の血清中の指標化合物の濃度と比較することにより、医薬候補物質がいずれの薬物代謝酵素に対してその活性を誘導または阻害するかを判定することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  この出願の発明は、薬物代謝酵素ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ９、またはＣＹＰ２Ｃ１９によって主として代謝される医薬候補物質をスクリーニングする方法に関するものである。また、医薬候補物質がＣＹＰ群薬物代謝酵素のいずれに対してその活性を誘導または阻害するかを判定する方法に関するものである。
【背景技術】  医薬品開発において医薬候補物質を選択する段階は製薬会社においてもっとも関心が高い。医薬品開発については３００億円以上の膨大な研究開発費と１０年以上の歳月を要することは衆知の事実である。それゆえ、医薬候補物質が研究開発の途中で開発を中止するようなことが生じることは避けなければならない。また、最近、国内製薬企業は日米欧同時開発を進めており、有効性に人種差、民族差などが生じることは同時開発の妨げとなり、企業は人種差のでる医薬候補物質の開発を避けているのが現状である。一般に、薬物動態に人種差が生じる要因として、薬物代謝酵素の人種差が考えられており、特に薬物代謝酵素Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０（ＣＹＰ）２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ９、またはＣＹＰ２Ｃ１９の遺伝多型が、これらの酵素で主として代謝される医薬候補物質の薬物動態に人種差を生じるものと考えられている。たとえば、ＣＹＰ２Ｄ６は欧米人で約１０％の欠損患者（ＰＭ：Ｐｏｏｒ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）がおり、ＣＹＰ２Ｄ６で主として代謝される化合物等は、医薬候補物質としては選択されないのが現状である。
また、医薬品の薬物相互作用に関しては、薬の組み合わせによっては重篤な症状を引き起こすなど、医療現場において重要な問題となっている。薬物相互作用の問題が生じた場合、製薬企業は市場から医薬品を回収する事態に発展することもある。したがって、薬物代謝酵素の誘導、阻害に基づく薬物相互作用は、医薬品の研究開発上の重要な意思決定要因となっているため、ヒトにおける薬物相互作用の予測は研究開発の重要な関心事になっている。
なお、この出願の発明者らは、ヒトの薬物代謝に係わるヒト肝細胞が、マウス肝臓内でマウス肝細胞を高い割合で置換したキメラマウスを作出することに成功し、特許出願している（特許文献１、２）。
【特許文献１】日本特許公開２００２−４５０８７号公報
【特許文献２】国際特許公開ＷＯ２００３／０８０８２１号パンフレット
【発明の開示】
しかしながら、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ９、またはＣＹＰ２Ｃ１９で主として代謝される医薬候補物質かどうかの判定を放射性同位元素によるラベル化合物がない段階で判定するのは困難である。医薬候補物質のラベル化合物を用いてＡＤＭＥ試験を実施すると、全体の代謝経路が判明しＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ９、またはＣＹＰ２Ｃ１９が関与する代謝過程がその医薬候補物質の代謝のどのくらいを占めているかがわかる。従って、探索段階においてラベル化合物がない状況では、医薬候補物質に対するＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ９、またはＣＹＰ２Ｃ１９代謝の関与を的確に見積もることはできない。
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、医薬候補物質がＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ９、またはＣＹＰ２Ｃ１９によって主として代謝される物質であった場合、その薬物動態に遺伝多型が生じるか否かを判定するスクリーニング方法を提供することを課題としている。
また、これまで、ヒトの薬物相互作用を検出するｉｎ  ｖｉｖｏの系は存在しなかった。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏの系では、細胞に対する薬物暴露濃度が常に高い状態にあるため、ヒトの体の中での薬物相互作用を予測することが困難であった。したがって、この出願の発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるヒトの薬物相互作用を検出するスクリーニング方法を提供することを課題としている。
この出願は、前記の課題を解決するための第１の発明として、薬物代謝酵素ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ９、またはＣＹＰ２Ｃ１９で主として代謝される医薬候補物質が、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ９、またはＣＹＰ２Ｃ１９欠損者で代謝されるか否かを判定する方法であって、
（１）      移植されたヒト肝細胞がマウス肝臓の７０％以上を占めている高置換キメラマウスと、ヒト肝細胞がほとんど生着していない低置換キメラマウスのそれぞれに医薬候補物質を投与する工程；
（２）      高置換キメラマウスと低置換キメラマウスのそれぞれから採取した血清中の医薬候補物質の濃度を経時的に測定する工程；
を含み、低置換キメラマウスに比較して高置換キメラマウスで有意に早く代謝される医薬候補物質が、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ９、またはＣＹＰ２Ｃ１９欠損者では代謝されない物質であると判定することを特徴とする方法を提供する。
またこの出願は、第２の発明として、医薬候補物質が、薬物代謝酵素の活性を促進または阻害するか否かを判定する方法であって、
（１）      高置換キメラマウスに医薬候補物質を投与する工程；
（２）      高置換キメラマウスに、複数の薬物代謝酵素のそれぞれによって代謝される複数の指標化合物を投与する工程；
（３）      高置換キメラマウスから採取した血清中の指標化合物の濃度を経時的に測定する工程；
を含み、医薬候補物質を投与していない時の血清中の指標化合物の濃度と比較することにより、医薬候補物質がいずれの薬物代謝酵素に対してその活性を誘導または阻害するかを判定することを特徴とする方法を提供する。
【図面の簡単な説明】  図１は、５化合物を同時に投与したマウス血清サンプルをＬＣ−ＭＳ／ＭＳで解析し、検出されたピークの１例を示す図である。
図２は、カフェインをマウスに投与した時のマウス血清中に検出されたカフェイン濃度の経時的変化を示す図である。ドナー細胞（ＩＶＴ０７９）を移植したキメラマウスを用いた。
図３は、トルブタミドをマウスに投与した時のマウス血清中に検出されたトルブタミド濃度の経時的変化を示す図である。ドナー細胞（ＩＶＴ０７９）を移植したキメラマウスを用いた。
図４は、オメプラゾールをマウスに投与した時のマウス血清中に検出されたオメプラゾール濃度の経時的変化を示す図である。ドナー細胞（ＩＶＴ０７９）を移植したキメラマウスを用いた。
図５は、デキストロメトルファンをマウスに投与した時のマウス血漿中に検出されたデキストロメトルファン濃度の経時的変化を示す図である。ドナー細胞（ＩＶＴ０７９）を移植したキメラマウスを用いた。
図６は、エリスロマイシンをマウスに投与した時のマウス血漿中に検出されたエリスロマイシン濃度の経時的変化を示す図である。ドナー細胞（ＩＶＴ０７９）を移植したキメラマウスを用いた。
図７は、カフェインまたはトルブタミドをマウスに投与した時のマウス血漿中に検出されたカフェインまたはトルブタミド濃度の経時的変化を示す図である。ドナー細胞（ＢＤ５１）を移植したキメラマウスを用いた。
図８は、オメプラゾールまたはデキストロメトルファンをマウスに投与した時のマウス血漿中に検出されたオメプラゾールまたはデキストロメトルファン濃度の経時的変化を示す図である。ドナー細胞（ＢＤ５１）を移植したキメラマウスを用いた。
図９は、エリスロマイシンをマウスに投与した時のマウス血漿中に検出されたエリスロマイシン濃度の経時的変化を示す図である。ドナー細胞（ＢＤ５１）を移植したキメラマウスを用いた。
図１０は、パロキセチン非投与または投与後にカフェイン、トルブタミド、オメプラゾール、デキストロメトルファン、エリスロマイシンをマウスに投与した時の高置換キメラマウス血漿中に検出されたそれぞれの投与物質の濃度の経時的変化を示す図である。ドナー細胞（ＢＤ５１）を移植したキメラマウスを用いた。
【発明を実施するための最良の形態】  第１発明の方法は、
（１）：高置換キメラマウスと、低置換キメラマウスのそれぞれに医薬候補物質を投与する工程；
（２）：高置換キメラマウスと低置換キメラマウスのそれぞれから採取した血清中の医薬候補物質の濃度を経時的に測定する工程；
を含む。そして、低置換キメラマウスに比較して高置換キメラマウスで有意に早く代謝される医薬候補物質が、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ９、またはＣＹＰ２Ｃ１９欠損者では代謝されない物質であると判定することを特徴とする方法である。
高置換キメラマウスは移植されたヒト肝細胞がマウス肝臓の７０％以上を占めているマウスであり、特許文献１または２に記載された方法によって得ることができる。特に、特許文献２の方法（移植したヒト肝細胞の産生するヒト補体の攻撃から防御させた状態でマウスを飼育する方法）は、７０％以上のヒト肝細胞置換率を達成する方法として好ましい。また、低置換キメラマウスは、ヒト肝細胞がほとんど定着していない（具体的には、ヒト肝細胞の置換率が１％未満）マウスである。
これらのキメラマウスは、例えば、ヒト肝細胞の移植から６０日程度後に医薬候補物質の投与に使用する。また、キメラマウスのヒト肝細胞置換率は、マウス血中のヒトアルブミン濃度の測定等の方法により事前に確認することができる。さらに、試験後のキメラマウスの肝臓を特許文献２等に記載された方法で解剖検査することによって、より正確な置換率を確認することができる。
医薬候補物質は、医薬品開発の過程にある物質であり、ヒトにおける薬物相互作用の予測を必要とする物質である。このような物質は、医薬品の薬効に対する主成分物質であってもよく、あるいは主成分物質を含む組成物であってもよい。医薬候補物質の投与量は、その物質が対象とする疾患の種類や物質組成の種類、あるいは投与経路等によって異なるが、０．１ｍｇ／ｋｇ体重から２０００ｍｇ／ｋｇ体重程度とすることができる。また投与経路は、医薬候補物質の種類やその適した剤型等に応じて、経口、皮下、静脈内または腹腔内投与等とすることができる。
キメラマウスの肝臓内における医薬候補物質の代謝の程度は、マウス血清における医薬候補物質の濃度を、当該技術分野における定法（例えば、実施例に記載したクロマトグラフ法など）によって行うことができる。また、測定は、候補物質の投与から３０分から２４時間程度まで、経時的（１５分〜２４時間間隔程度）で行うことができる。
そして、この血清中の医薬候補物質の濃度（肝臓において薬物代謝酵素によって代謝された物質の濃度）によって、医薬候補物質が、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ９、またはＣＹＰ２Ｃ１９欠損者で代謝されやすい物質か代謝されにくい物質かを判定する。具体的には、低置換キメラマウスに比較して高置換キメラマウスで血清中の医薬候補物質が有意に早く代謝される場合、その医薬候補物質はＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ９、またはＣＹＰ２Ｃ１９で代謝されると考えられる。そのため、この医薬候補物質がＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ９、またはＣＹＰ２Ｃ１９欠損者では代謝されない物質であると判定する。
なお、「有意に早く代謝される」とは、マウス血中の医薬候補品の濃度より算出したＡＵＣ（Ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｕｒｖｅ：濃度曲線下面積）が２／３程度を示した場合であり、好ましくは低置換マウスに比較して１／２から１／３程度の平均ＡＵＣ値を示すことを意味する。
第２発明の方法は、
（１）：高置換キメラマウスに医薬候補物質を投与する工程；
（２）：高置換キメラマウスに、複数の薬物代謝酵素のそれぞれによって代謝される複数の指標化合物を投与する工程；および
（３）：高置換キメラマウスから採取した血清中の指標化合物の濃度を経時的に測定する工程；
を含む。そして、医薬候補物質を投与していない時の血清中の指標化合物の濃度と比較することにより、医薬候補物質がいずれの薬物代謝酵素に対してその活性を誘導または阻害するかを判定する方法である。
ヒトの薬物代謝酵素は、ＣＹＰ群酵素に属するＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１０、ＣＹＰ２Ｃ１８、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ３、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ４Ｆ１、ＣＹＰ４Ａ２、ＣＹＰ４Ａ３等であり、それぞれの指標化合物は、例えば、ＣＹＰ１Ａ２で代謝される指標化合物はカフェイン、ＣＹＰ２Ｃ９はトルブタミド、ＣＹＰ２Ｄ６はデキストロメトルファン、ＣＹＰ２Ｃ１９はオメプラゾール、ＣＹＰ３Ａ４はエリスロマイシン等である。高置換キメラマウスに医薬候補物質を投与した後、これらの指標化合物の混合物を投与し、経時的に各化合物の血清中濃度を測定することによって、医薬候補物質が各酵素の活性を促進する物質か、あるいは阻害する物質であるかを判定することができる。例えば、指標化合物の混合物のうち、カフェインの代謝が促進して血清中濃度が減少していれば、その医薬候補物質はＣＹＰ１Ａ２の活性を特異的に促進する物質であると判定することができる。
以下、実施例を示してこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例によって限定されるものではない。
【実施例１】  キメラマウスを用いた薬物動態試験
１  材料と方法
１−１  被験物質
指標薬物を用いてヒト肝細胞キメラマウスにおける薬物動態を評価するために、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０（ＣＹＰ）の標準薬物であるカフェイン（ＣＹＰ１Ａ２）、トルブタミド（ＣＹＰ２Ｃ９）、オメプラゾール（ＣＹＰ２Ｃ１９）、デキストロメトルファン（ＣＹＰ２Ｄ６）、エリスロマイシン（ＣＹＰ３Ａ４）の５化合物を用いた。
１−２  使用動物
キメラマウスは広島県産業科学技術研究所または（株）フェニックスバイオにおいて作製したものを用いた。すなわち、肝障害と免疫不全の性質を有するマウスであるｕＰＡ（＋／＋）／ＳＣＩＤマウスの脾臓にヒト肝細胞（ＩＶＴ０７９，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｔｃｃｈｎｏｌｏｇｙ社より購入、またはＢＤ５１，ＢＤ  Ｇｅｎｔｅｓｔ社より購入）を移植し、ヒト肝細胞がマウス肝臓に生着し増殖したマウスを作製した。マウス肝臓がヒト肝細胞で７０％以上置換されたマウス（高置換キメラマウス）及びヒト肝細胞を移植したが置換率がほぼ０％の低置換キメラマウス、または非移植マウス（ゼロ置換マウス）を各３匹ずつ用いた。また、コントロールとして、ｕＰＡ（−／−）／ＳＣＩＤマウスを３匹用いた。
各マウスは水（０．０１２％次亜塩素酸含有）及びビタミンＣ含有滅菌固形飼料（ＣＲＦ−１、オリエンタル酵母）を自由に摂取させ、室温２４±２℃条件下で飼育した。なお、高置換キメラマウスには、１日２回メシル酸ナファモスタット注射液（０．３ｍｇ／０．２ｍｌ／ｂｏｄｙ）を腹腔内に投与した。
１−３  投与薬物の調製
それぞれの薬物を投与濃度の５倍で調製し、投与直前に５化合物を混合して最終濃度がそれぞれの投与濃度となるようにした。ＣＹＰ１Ａ２の標準薬物であるカフェインの投与濃度は２５ｍｇ／ｋｇ  ｂ．ｗ．であり、１２．５ｍｇ秤量しメノウ乳鉢中でＣＭＣ液１ｍｌに懸濁させ投与濃度の５倍の１２．５ｍｇ／ｍｌ懸濁液を調製した。ＣＹＰ２Ｃ９の標準薬物であるトルブタミドの投与濃度は８．３５ｍｇ／ｋｇ  ｂ．ｗ．であり、４．１７５ｍｇを秤量しメノウ乳鉢中でＣＭＣ液１ｍｌに懸濁させ投与濃度の５倍の４．１７５ｍｇ／ｍｌ懸濁液を調製した。ＣＹＰ２Ｄ６の標準薬物であるデキストロメトルファンの投与濃度は２．５ｍｇ／ｋｇ  ｂ．ｗ．でありデキストロメトルファンハイドロマイドモノハイドレイト２０ｍｇを秤量しメノウ乳鉢中でＣＭＣ液１６ｍｌに懸濁させ投与濃度の５倍の１．２５ｍｇ／ｍｌ懸濁液を調製した。ＣＹＰ２Ｃ１９の標準薬物であるオメプラゾールの投与濃度は８．３５ｍｇ／ｋｇ  ｂ．ｗ．であり、１バイアル２０ｍｇをミリＱ水４．７６ｍｌに溶かし投与濃度５倍の４．２ｍｇ／ｍｌの水溶液を調製した。ＣＹＰ３Ａ４の標準薬物であるエリスロマイシンの投与濃度は１２５ｍｇ／ｋｇ  ｂ．ｗ．であり、エリスロマイシンラクトバイオネイト１バイアル５００ｍｇをミリＱ水８ｍｌに溶かし投与濃度の５倍の６２．５ｍｇ／ｍｌの水溶液を調製した。調製した各薬物１ｍｌずつを混合し５ｍｌにし、懸濁液を１０μｌ／ｇ  ｂ．ｗマウスに投与した。
１−４  投与方法及び血清採取方法
高置換キメラマウス、低置換キメラマウス（またはゼロ置換マウス）、ｕＰＡ（−／−）／ＳＣＩＤマウス各３匹ずつに、５化合物同時に強制経口投与、または静脈投与を行った。採血は投与後０．２５（静脈投与のみ）、０．５、１、２、４（経口投与のみ）、８時間後にマウス尾静脈からそれぞれ１５μｌずつ採血し、さらに３，５００ｒｐｍ、５分間遠心分離後に血清（上清）を採取し、−３０℃の冷凍庫に保存した。
１−５  血清中薬物の定量及び分析
血漿サンプルはドライアイス中にて（株）住化分析センターに輸送し、以下の方法でＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより測定した。
１−５−１  測定対象物質標準溶液およびＩ．Ｓ．標準溶液の調製
カフェイン、トルブタミド、オメプラゾール、デキストロメトルファンハイドロブロマイドモノハイドレイト、エリスロマイシンラクトバイオネイトをメタノールで希釈し、２０００，１０００，５００，１００，５０，１０，５，１，０．５，０．１ｎｇ／ｍｌの標準溶液を調製した。フェニトインをメタノールに溶解し、１０，１ｍｇ／ｍｌの標準溶液を調製し、Ｉ．Ｓ．標準溶液とした。
１−５−２  測定装置および測定条件（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）
液体クロマトグラフは、ＳＩＬ−ＨＴＣおよびＬＣ−１０Ａシリーズ（島津製作所）を用い、カラムはＳｙｎｅｒｇｉ  ４μ  Ｐｏｌａｒ−ＲＰ  ８０Ａ，１５０ｍｍ  Ｌ．ｘ  ２．００ｍｍＩ．Ｄ．，４μｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社）を、３０℃で用いた。移動相としてメタノール／１０ｍｍｏｌ／ｌ酢酸アンモニウム溶液／酢酸（７００：３００：２，ｖ／ｖ／ｖ）を用い、流速０．２ｍｌ／ｍｉｎとした。注入量は２μｌ、測定時間１０ｍｉｎでオートサンプラーの設定温度は４℃とした。質量分析計は、Ｔａｎｄｅｍ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ  ＡＰＩ４０００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ  ＳＣＩＥＸ社）を用いた。ＡＰＩ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  はＴｕｒｂｏ  Ｖ（ＥＳＩプローブ）とし、Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｍｏｄｅはＰｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｍｏｄｅを用いた。Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＭＲＭのｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｉｏｎは、カフェイン：ｍ／ｚ１９５．１→ｍ／ｚ１３８．２（１７０ｍｓｅｃ／ｌ  ｓｃａｎ）、トルブタミド：ｍ／ｚ２７１．１→ｍ／ｚ７４．３（１７０ｍｓｅｃ／ｌ  ｓｃａｎ）、オメプラゾール：ｍ／ｚ３４６．１→ｍ／ｚ１９８．２（１５０ｍｓｅｃ／ｌ  ｓｃａｎ）、デキストロメトルファン：ｍ／ｚ２７２．２→ｍ／ｚ２１５．３（１５０ｍｓｅｃ／ｌ  ｓｃａｎ）、エリスロマイシン：ｍ／ｚ７３４．４→ｍ／ｚ１５８．４（１５０ｍｓｅｃ／ｌ  ｓｃａｎ）、フェニトイン：ｍ／ｚ２５３．１→ｍ／ｚ１８２．３（１５０ｍｓｅｃ／ｌ  ｓｃａｎ）とした。
１−５−３  添加検量線試料の調製
エッペンドルフチューブに、コントロールマウス血清を５μｌずつ計り取り、測定対象物質標準溶液（５化合物混合）１００μｌを添加し、最終濃度０．１，０．５，１，５，１０，５０，１００，５００，１０００ｎｇ／ｍｌを調製した。次に１μｇ／ｍｌのＩ．Ｓ．標準溶液を１０μｌ添加し、超音波処理およびボルテックスミキサーにより十分混和した。これを遠心分離（１５，０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ，室温）した後、上清をろ過フィルターにて遠心濾過（１０，０００ｒｐｍ，２ｍｉｎ，室温）して、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ注入試料とした。
１−５−４  測定試料の調製
測定試料（血漿）５μｌの入ったエッペンドルフチューブにメタノールを１００μｌ添加し、１μｇ／ｍｌのＩ．Ｓ．標準溶液を１０μｌ添加した後、超音波処理およびボルテックスミキサーにより十分混和した。これを遠心分離（１５，０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ，室温）した後、上清をろ過フィルターにて遠心濾過（１０，０００ｒｐｍ，２ｍｉｎ，室温）して、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ注入試料とした。
２  試験結果
血漿中薬物濃度の定量値は添加検量線試料のＬＳ−ＭＳ／ＭＳ測定で得られたピーク面積比より求めた。図１にＬＳ−ＭＳ／ＭＳ測定により得られたピークの例を示す。定量値から採血時間と血中の投与薬物の濃度の関係をグラフにした（図２−９）。グラフより最高血漿中濃度（Ｃｍａｘ）、半減期（ｔ１／２）、血中濃度曲線下面積（Ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｕｒｖｅ：ＡＵＣ）、生体利用率及び、クリアランスの解析を行い、ヒトの薬物動態の予測を行った。結果は表１、２、および３に示した。
ほとんどすべてのＣＹＰが関与するＡＵＣは、高置換キメラマウスの方が低置換キメラマウスに比べて低かった。ドナー肝細胞にＩＶＴ０７９を用いたキメラマウスでは、トルブタミド（ＣＹＰ２Ｃ９）、およびデキストロメトルファン（ＣＹＰ２Ｄ６）を投与した時のＡＵＣが、低置換率キメラマウスよりも高置換率キメラマウスの方が著しく低かった。また、生体利用率においても同様の結果が得られた。ドナー肝細胞にＢＤ５１を用いたキメラマウスでは、カフェイン（ＣＹＰ１Ａ２）およびトルブタミド（ＣＹＰ２Ｃ９）を投与した時のＡＵＣが、低置換率キメラマウスよりも高置換率キメラマウスの方が著しく低かった。
【表１】
2006054755.tif 000002
【表２】
2006054755.tif 000003
【表３】
2006054755.tif 000004
以上の結果から、高置換キメラマウスと低置換キメラマウスにおける各種指標薬物のファーマコキネティクスを比較すると、２Ｃ１９と３Ａ４の指標薬物を投与した場合には顕著な差は認められなかったが、移植に用いたドナー肝細胞によっては、ＣＹＰ１Ａ２，ＣＹＰ２Ｃ９，およびＣＹＰ２Ｄ６の指標薬物を投与した場合、高置換キメラマウスに比べて、低置換キメラマウスで代謝速度が遅いことが判明した。すなわち、ＣＹＰ１Ａ２，ＣＹＰ２Ｃ９，またはＣＹＰ２Ｄ６に関して、低置換キメラマウスはヒトでのＰＭ（Ｐｏｏｒ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）、高置換キメラマウスは代謝速度が速いＥＭ（Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）に相当することが明らかになった。これにより、医薬品開発において、ＣＹＰ２Ｃ９、またはＣＹＰ２Ｄ６で主として代謝される医薬候補物質の遺伝多型における薬物動態の違いを判定できる。また、移植に用いるドナー肝細胞を選択することにより、ＣＹＰ２Ｃ１９で主として代謝される医薬候補物質の遺伝多型における薬物動態の違いも判定できると考えられた。
ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、またはＣＹＰ２Ｄ６で主として代謝される医薬候補物質の高置換および低置換キメラマウスにおけるファーマコキネティックスを調べることにより、医薬候補物質の開発継続かあるいは中止かの意思決定をすることが可能となる。
【実施例２】  キメラマウスを用いたＣＹＰ２Ｄ６阻害における薬物動態試験
１  材料と方法
１−１  被験物質
（ＣＹＰ２Ｄ６酵素阻害剤）によりＣＹＰ２Ｄ６酵素を阻害した状態で、指標薬物を用いてヒト肝細胞キメラマウスにおける薬物動態を評価するために、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０（ＣＹＰ）の指標薬物であるカフェイン（ＣＹＰ１Ａ２）、トルブタミド（ＣＹＰ２Ｃ９）、オメプラゾール（ＣＹＰ２Ｃ１９）、デキストロメトルファン（ＣＹＰ２Ｄ６）、エリスロマイシン（ＣＹＰ３Ａ４）の５化合物を用いた。
１−２  使用動物
キメラマウスは（株）フェニックスバイオにおいて作製したものを用いた。すなわち、肝障害と免疫不全の性質を有するマウスであるｕＰＡ（＋／＋）／ＳＣＩＤマウスの脾臓にヒト肝細胞（ＢＤ５１，ＢＤ  Ｇｅｎｔｉｓｔ社より購入）を移植し、ヒト肝細胞がマウス肝臓に生着し増殖したマウスを３匹作製した。
各マウスは実施例１と同様に水及び飼料を摂取および飼育した。なお、高置換キメラマウスには、実施例１と同様に１日２回メシル酸ナファモスタット注射液（０．３ｍｇ／０．２ｍｌ／ｂｏｄｙ）を腹腔内に投与した。
１−３  阻害薬物の調製
パロキセチンをミリＱ水に溶解（バス型超音波を使用）し、６ｍｇ／ｍｌとなるように調製した。調製した薬物は５μｌ／ｇ  ｂ．ｗ．（３０ｍｇ／ｋｇ  ｂ．ｗ．／ｄａｙ）でマウス腹腔内に投与した。
１−４  指標薬物の調製
実施例１と同様に行った。
１−５  投与方法及び血漿採取方法
高置換キメラマウスに、パロキセチンを３日間腹腔内投与した。その後実施例１と同様に５化合物同時に強制経口投与し、経時的に採血後、血漿を保存した。
１−６  血漿中薬物の定量及び分析
実施例１と同様に行った。
１−６−１  測定対象物質標準溶液およびＩ．Ｓ．標準溶液の調整
実施例１と同様に行った。
１−６−２  測定装置および測定条件（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）
実施例１と同様に行った。
１−６−３  添加検量線試料の調整
実施例１と同様に行った。
１−６−４  測定試料の調整
実施例１と同様に行った。
２  試験結果
血漿中薬物濃度の定量値は添加検量線試料のＬＳ−ＭＳ／ＭＳ測定で得られたピーク面積比より求めた。定量値から採血時間と血中の投与薬物の濃度の関係をグラフにした（図１０）。グラフよりＣｍａｘ、ｔ１／２、ＡＵＣの解析を行った。
結果は表４に示した。パロキセチン投与により、ＣＹＰ１Ａ２，２Ｃ１９，２Ｄ６，３Ａ４の代謝活性の阻害が認められた。パロキセチンが特異的に阻害すると言われているＣＹＰ２Ｄ６の代謝活性は特に阻害された。
【表４】
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以上の結果から、高置換キメラマウスに被検物質を投与し各指標物質のＡＵＣの変化を調べることにより、被検物質の誘導または阻害活性を調べることが可能である。したがって、キメラマウスを用いることにより、ヒトにおける薬物相互作用を予測することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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