【誤訳訂正書】
【提出日】令和2年9月2日(2020.9.2)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１３】
ｐｎＣａｓ９−ＰＢＥ、ｐＵｂｉ−ＢＦＰｍ、及びｐＯｓＵ３−ＢＦＰ−ｓｇＲＮＡ（ｐＴａＵ６−ＢＦＰ−ｓｇＲＮＡ又はｐＺｍＵ３−ＢＦＰ−ｓｇＲＮＡ）で形質転換したイネ（コムギ又はトウモロコシ）プロトプラストの徹底的なシーケンシングは、合計ＤＮＡの約４．００％がＣからＴへの変異を有することを示した（図１ｄ）。変異は、プロトスペース配列（標的配列）における３位、４位、６位及び９位でのＣ塩基に対してのみに生じ、変異頻度は、それぞれ、２．４８〜３．９２％、３．０６〜３．７９％、５．８６〜８．７５％、及び６．４７〜７．８６％であった（図１ｄ）。所望のＣ（４位）も変異させるが、その変異頻度は高くない。ｐｄＣａｓ９−ＰＢＥをｐｎＣａｓ９−ＰＢＥに置き換える場合に、前記位置でＣ塩基も変異させるが、変異頻度（０．０６〜０．２２％）は、ｐｎＣａｓ９−ＰＢＥ（２．４８〜８．７５％）よりも著しく低かった（図１ｄ）。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１４】
したがって、蛍光タンパク質レポーターアッセイの結果は、ｎＣａｓ９−ＰＢＥ及びｄＣａｓ９−ＰＢＥの双方が、コムギ、イネ及びトウモロコシのプロトプラストにおける標的領域においてＣからＴに変換することができ、脱アミノ化領域がプロトスペース配列（標的配列）の３〜９位を含むことを示す。そして、ｎＣａｓ９−ＰＢＥの活性は、ｄＣａｓ９−ＰＢＥよりも強い。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１８】
ｐｎＣａｓ９−ＰＢＥについて、ＣからＴへの移行は全ての７つの標的において観察され、かつ脱アミノ化領域は、プロトスペース配列（標的配列）の３〜６位を含む（図２ａ）。ＣからＴへの一置換頻度は、０．５７％〜７．０７％であり、７位又は７位の近くでのＣ塩基は、最も高い置換頻度を有し、編集事象は、配列の構造に依存していない（図２ａ）。多重Ｃ編集（２〜５つのＣを含む）頻度は、０．３１％〜１２．４８％の間であり、一方で２又は３つのＣを編集する頻度はより高い（図２ｂ）。ｐｎＣａｓ９−ＰＢＥで誘導される挿入欠失頻度は、ｐｗＣａｓ９で誘導される挿入欠失頻度（６．２７％〜１１．６８％）と比較して、標的部位７で非常に低い（０．０１％〜０．３４％）（図２ｃ及び表３）。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ｉ）〜（ｖ）の少なくとも１つを含む、植物ゲノムにおける標的配列に対して塩基編集を実施するためのシステムを植物又は植物細胞に導入し、それによりガイドＲＮＡが、塩基編集融合タンパク質を前記植物又は植物細胞のゲノムにおける標的配列に標的化し、前記標的配列における１つ以上のＣからＴへの置換をもたらすことを含む、遺伝子改変植物又は植物細胞を製造するための方法：
（ｉ）塩基編集融合タンパク質、及びガイドＲＮＡ、
（ｉｉ）塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、及びガイドＲＮＡ、
（ｉｉｉ）塩基編集融合タンパク質、及びガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、
（ｉｖ）塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、及びガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、又は
（ｖ）塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列及びガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、
ここで、塩基編集融合タンパク質は、ヌクレアーゼ−不活性化Ｃａｓ９ドメイン及びデアミナーゼドメインを含み、ガイドＲＮＡは、植物ゲノムにおける標的配列に対して塩基編集融合タンパク質を標的化でき、デアミナーゼは、プロトスペース配列の３〜９位で７ヌクレオチドの脱アミノ化領域を有する、アポリポタンパク質Ｂ−ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーデアミナーゼである。
【請求項２】
前記導入が任意の選択圧の非存在下で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的配列中の３〜９位における１つ以上のＣをＴに置換する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
さらに、所望のヌクレオチド置換で植物についてスクリーニングすることを含む、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記植物が、単子葉植物及び双子葉植物から選択される、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記植物が、作物、例えばコムギ、イネ、トウモロコシ、ダイズ、ヒマワリ、モロコシ、ナタネ、アルファルファ、ワタ、オオムギ、キビ、サトウキビ、トマト、タバコ、キャッサバ、又はジャガイモである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記標的配列を、植物形質、例えば農学的形質と関連付け、それにより前記塩基編集が、野生型植物と比較して植物における形質の変化をもたらす、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記システムが、微粒子銃、ＰＥＧ媒介プロトプラスト形質転換、アグロバクテリウム媒介形質転換、植物ウイルス媒介形質転換、花粉管アプローチ、及び子房注入アプローチから選択される方法によって前記植物に導入される、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
さらに、遺伝子改変植物の子孫を得ることを含む、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記デアミナーゼが、ＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼが、配列番号１１に示すアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９が、野生型Ｃａｓ９と比較してＤ１０Ａ及び／又はＨ８４０Ａのアミノ酸置換を含み、例えば前記ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９が、配列番号１３又は１４に示すアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記デアミナーゼドメインを、前記ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９ドメインのＮ末端に融合させるか、又は前記デアミナーゼドメインを、前記ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９ドメインのＣ末端に融合させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記デアミナーゼドメイン及び前記ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９ドメインを、リンカーによって融合させ、例えば前記リンカーが、配列番号１２において示したＸＴＥＮリンカーである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記塩基編集融合タンパク質が、さらに、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）を含み、例えば前記ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤が、配列番号１５において示すアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記塩基編集融合タンパク質が、さらに、核局在化配列（ＮＬＳ）を含み、例えば前記ＮＬＳが、配列番号３０又は３１において示すアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記塩基編集融合タンパク質が、２つのＮＬＳを有し、かつ２つのＮＬＳが、それぞれＮ末端及びＣ末端に位置する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記塩基編集融合タンパク質が、配列番号２２又は２３において示すアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、塩基編集するために植物についてコドン最適化し、例えば前記塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を配列番号１９又は２０において示す、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ガイドＲＮＡが、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列及び／又は前記ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を、植物のための発現調節エレメントに操作可能に連結する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記発現調節エレメントが、プロモーター、例えば３５Ｓプロモーター、トウモロコシＵｂｉ−１プロモーター、コムギＵ６プロモーター、イネＵ３プロモーター、又はトウモロコシＵ３プロモーターである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
遺伝子改変植物細胞であって、該植物細胞が、以下の（ｉ）〜（ｖ）の少なくとも１つを含み、かつ請求項１から２０までのいずれか１項に記載の方法により得られる、遺伝子改変植物細胞：
（ｉ）塩基編集融合タンパク質、及びガイドＲＮＡ、
（ｉｉ）塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、及びガイドＲＮＡ、
（ｉｉｉ）塩基編集融合タンパク質、及びガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、
（ｉｖ）塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、及びガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、又は
（ｖ）塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列及びガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、
ここで、塩基編集融合タンパク質は、ヌクレアーゼ−不活性化Ｃａｓ９ドメイン及びデアミナーゼドメインを含み、ガイドＲＮＡは、植物ゲノムにおける標的配列に対して塩基編集融合タンパク質を標的化でき、デアミナーゼは、プロトスペース配列の３〜９位で７ヌクレオチドの脱アミノ化領域を有する、アポリポタンパク質Ｂ−ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーデアミナーゼである。
【請求項２４】
請求項１から２０までのいずれか１項に記載の方法によって遺伝子改変した第一の植物と、前記遺伝子改変を含まない第二の植物とを交雑させて、前記第二の植物中に前記遺伝子改変を導入することを含む、植物の育種方法。