【手続補正書】
【提出日】令和1年12月9日(2019.12.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｃｉｓ開口部、中間部、およびｔｒａｎｓ開口部を含む修飾細胞溶解素Ａ（ＣｌｙＡ）ナノポアであって、前記ｃｉｓ開口部の内部表面は第１の正に荷電したアミノ酸の置換を含み、前記中間部の内部表面は第２の正に荷電したアミノ酸の置換を含み、前記ｔｒａｎｓ開口部は負に帯電したくびれを含み、
前記第２の正に荷電したアミノ酸の置換が、配列番号１または配列番号２のＤ７４、Ｄ７１、Ｄ６４、Ｅ５３、Ｅ１６１、Ｄ１５８、Ｅ４６、Ｅ４２、Ｄ４１に対応する１つまたは複数の位置における、負に荷電したアミノ酸の正に荷電したアミノ酸での置換に対応する、修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項２】
前記第１および第２の正に荷電したアミノ酸の置換がそれぞれアルギニンを含む、請求項１に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項３】
前記第１の正に荷電したアミノ酸の置換が、配列番号２のアミノ酸配列のＳ１１０Ｒ変異に対応する、および／または、
前記第２の正に荷電したアミノ酸の置換が、配列番号２のアミノ酸配列のＤ６４Ｒ変異に対応する、請求項１または請求項２に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項４】
１２量体ポアである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項５】
ＣｌｙＡナノポアを通じてＤＮＡを移行する方法であって、
ａ．１５０ｍＭ〜３００ｍＭの低イオン強度溶液に、請求項１〜４のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアと人工膜とを供給するステップであり、ここで前記修飾ＣｌｙＡナノポアは、前記修飾ＣｌｙＡナノポアのｃｉｓ開口部が前記低イオン強度溶液のｃｉｓ側に存在し、前記修飾ＣｌｙＡナノポアのｔｒａｎｓ開口部が前記低イオン強度溶液のｔｒａｎｓ側に存在するように、前記人工膜に存在する、ステップと、
ｂ．前記低イオン強度溶液の前記ｃｉｓ側にＤＮＡを供給するステップと、
ｃ．前記修飾ＣｌｙＡナノポアにわたり電位を印加して、前記ＤＮＡを、前記修飾ＣｌｙＡナノポアを通じて前記ｃｉｓ側から前記ｔｒａｎｓ側へ移行させるステップと
を含む、方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項７】
複数の、請求項１〜４のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを含むホモ多量体修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項８】
少なくとも１つの、請求項１〜４のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを含むヘテロ多量体修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項９】
第１の開口部と、中間部と、第２の開口部と、前記第１の開口部から前記中間部を通じて前記第２の開口部に延びる内腔とを含む修飾ＣｌｙＡナノポアであって、前記第１の開口部の内腔表面は第１の正に荷電したアミノ酸の置換を含み、前記中間部の内腔表面は第２の正に荷電したアミノ酸の置換を含み、前記第２の開口部の内腔表面は負に帯電したくびれを画定する、修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項１０】
前記第１の正に荷電したアミノ酸の置換から前記第２の正に荷電したアミノ酸の置換までの前記内腔内の距離が０．５ｎｍから１０ｎｍの範囲である、請求項９に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項１１】
配列番号１または配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するサブユニットポリペプチドを含む、請求項９または１０に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項１２】
配列番号１または配列番号２に示すアミノ酸配列と比較して、前記第１および第２の正に荷電したアミノ酸の置換を含む最大１０個の置換を有するサブユニットポリペプチドを含む、請求項９または１０に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項１３】
１２量体ポアである、または、１３マーのポアである、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項１４】
請求項７〜１３のいずれか一項に記載の少なくとも１つの修飾ＣｌｙＡナノポアを含む組成物。
【請求項１５】
標的ポリヌクレオチドを特徴付ける方法であって、
（ａ）１５０ｍＭから３００ｍＭの低イオン強度溶液に、請求項７〜１３のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアと膜とを供給するステップであり、ここで前記修飾ＣｌｙＡナノポアは前記膜に存在する、ステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の前記低イオン強度溶液に前記標的ポリヌクレオチドを添加するステップと、
（ｃ）前記ナノポアにわたり電位を印加する間に、前記修飾ＣｌｙＡナノポアを流れるイオン流を測定するステップであり、ここでイオン流の測定は、前記標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特徴の指標となる、ステップと
を含む、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５７】
逆のことを明記しない限り、１つを超えるステップまたは行為を含む、本明細書に特許請求される任意の方法において、方法のステップまたは行為の順序は、方法のステップまたは行為が列挙された順序に必ずしも限定されないことも理解されるものとする。
また、本発明は以下を提供する。
[１]
ｃｉｓ開口部、中間部、およびｔｒａｎｓ開口部を含む修飾ＣｌｙＡナノポアであって、前記ｃｉｓ開口部の内部表面は第１の正に荷電したアミノ酸の置換を含み、前記中間部の内部表面は第２の正に荷電したアミノ酸の置換を含み、前記ｔｒａｎｓ開口部は負に帯電したくびれを含む、修飾ＣｌｙＡナノポア。
[２]
前記第１の正に荷電したアミノ酸の置換が、前記修飾ＣｌｙＡナノポアへのデオキシリボ核酸の捕捉を可能にするように前記ｃｉｓ開口部に配置されている、上記[１]に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
[３]
前記第２の正に荷電したアミノ酸の置換が、前記修飾ＣｌｙＡナノポアを通じた前記デオキシリボ核酸の移行を可能にするように前記中間部に配置されている、上記[２]記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
[４]
前記第１および第２の正に荷電したアミノ酸の置換がそれぞれアルギニンを含む、上記[１]〜[３]のいずれかに記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
[５]
前記第１の正に荷電したアミノ酸の置換が、ＣｌｙＡ−ＡＳのアミノ酸配列のＳ１１０Ｒ変異に対応する、上記[１]〜[４]のいずれかに記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
[６]
前記第２の正に荷電したアミノ酸の置換が、ＣｌｙＡ−ＡＳのアミノ酸配列のＤ６４Ｒ変異に対応する、上記[１]〜[５]のいずれかに記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
[７]
１２量体ポアである、上記[１]〜[６]のいずれかに記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
[８]
上記[１]〜[７]のいずれかに記載の修飾ＣｌｙＡナノポアを含む組成物。
[９]
人工膜をさらに含み、前記修飾ＣｌｙＡナノポアが前記人工膜に存在する、上記[８]に記載の組成物。
[１０]
低イオン強度溶液をさらに含む、上記[８]または[９]に記載の組成物。
[１１]
前記低イオン強度溶液が、約５０ｍＭから約１Ｍのイオン強度を有する塩溶液である、上記[１０]に記載の組成物。
[１２]
前記イオン強度が約１５０ｍＭである、上記[１１]に記載の組成物。
[１３]
前記塩溶液が塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む、上記[１１]または[１２]に記載の組成物。
[１４]
ＣｌｙＡナノポアを通じてＤＮＡを移行する方法であって、
ａ．低イオン強度溶液に、上記[１]〜[１３]のいずれかに記載の修飾ＣｌｙＡナノポアと人工膜とを供給するステップであり、ここで前記修飾ＣｌｙＡナノポアは、前記修飾ＣｌｙＡナノポアのｃｉｓ開口部が前記低イオン強度溶液のｃｉｓ側に存在し、前記修飾ＣｌｙＡナノポアのｔｒａｎｓ開口部が前記低イオン強度溶液のｔｒａｎｓ側に存在するように、前記人工膜に存在する、ステップと、
ｂ．前記低イオン強度溶液の前記ｃｉｓ側にＤＮＡを供給するステップと、
ｃ．前記修飾ＣｌｙＡナノポアにわたり電位を印加して、前記ＤＮＡを、前記修飾ＣｌｙＡナノポアを通じて前記ｃｉｓ側から前記ｔｒａｎｓ側へ移行させるステップと
を含む、方法。
[１５]
前記低イオン強度溶液が、約１５０ｍＭから約３００ｍＭのイオン強度を有する塩溶液である、上記[１４に記載の方法。
[１６]
前記イオン強度が約１５０ｍＭである、上記[１５]に記載の方法。
[１７]
前記塩溶液が塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む、上記[１５]または[１６]に記載の方法。
[１８]
前記ＤＮＡが一本鎖ＤＮＡである、上記[１４]〜[１７]のいずれかに記載の方法。
[１９]
前記ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡである、上記[１４]〜[１７]のいずれかに記載の方法。
[２０]
ＤＮＡシーケンシングのために使用される、上記[１４]〜[１９]のいずれかに記載の方法。
[２１]
配列番号１（野生型ＣｌｙＡのアミノ酸配列に対応）または配列番号２（ＣｌｙＡ−ＡＳのアミノ酸配列に対応）に示すアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドであって、前記アミノ酸配列は配列番号１または配列番号２の１０６〜７８の範囲内の位置に第１の正に荷電したアミノ酸の置換を含み、配列番号１または配列番号２の４１〜７４の範囲内の位置に第２の正に荷電したアミノ酸の置換を含む、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチド。
[２２]
配列番号１または配列番号２の１〜３２位のアミノ酸が正味の負電荷をもたらす、上記[２１]に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチド。
[２３]
前記第１の正に荷電したアミノ酸の置換が、配列番号１または配列番号２の１１０位に配置されている、上記[２１]または[２２]に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチド。
[２４]
前記第２の正に荷電したアミノ酸の置換が、配列番号１または配列番号２の６４位に配置されている、上記[２１]〜[２３]のいずれかに記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチド。
[２５]
前記第１および第２の正に荷電したアミノ酸の置換がそれぞれ独立してアルギニン、ヒスチジンまたはリジンを含む、上記[２１]〜[２４]のいずれかに記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチド。
[２６]
上記[２１]〜[２５]のいずれかに記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
[２７]
複数の、上記[２１]〜[２５]のいずれかに記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを含むホモ多量体修飾ＣｌｙＡナノポア。
[２８]
１２〜１４個の前記修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを含む、上記[２７]に記載のホモ多量体修飾ＣｌｙＡナノポア。
[２９]
前記修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドの第１の正に荷電したアミノ酸の置換が、前記ホモ多量体修飾ＣｌｙＡナノポアの第１の開口部に曝露された溶液内の負に荷電したポリマーの捕捉を可能にするように、前記第１の開口部に配置されている、上記[２７]または[２８]に記載のホモ多量体修飾ＣｌｙＡナノポア。
[３０]
前記修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドの第２の正に荷電したアミノ酸の置換が、前記ナノポアを通じた前記負に荷電したポリマーの移行を可能にするように、前記ホモ多量体修飾ＣｌｙＡナノポアの中間部に配置されている、上記[２９]に記載のホモ多量体修飾ＣｌｙＡナノポア。
[３１]
少なくとも１つの、上記[２１]〜[２５]のいずれかに記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを含むヘテロ多量体修飾ＣｌｙＡナノポア。
[３２]
前記少なくとも１つの修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを含む、１２〜１４個のＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを含む、上記[３１]に記載のヘテロ多量体修飾ＣｌｙＡナノポア。
[３３]
前記修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドの第１の正に荷電したアミノ酸の置換が、前記ヘテロ多量体修飾ＣｌｙＡナノポアの第１の開口部に曝露された溶液内の負に荷電したポリマーの捕捉を可能にするように、前記第１の開口部に配置されている、上記[３１]または[３２]に記載のヘテロ多量体修飾ＣｌｙＡナノポア。
[３４]
前記修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドの第２の正に荷電したアミノ酸の置換が、前記ナノポアを通じた前記負に荷電したポリマーの移行を可能にするように、前記ヘテロ多量体修飾ＣｌｙＡナノポアの中間部に配置されている、上記[３３]に記載のヘテロ多量体修飾ＣｌｙＡナノポア。
[３５]
第１の開口部と、中間部と、第２の開口部と、前記第１の開口部から前記中間部を通じて前記第２の開口部に延びる内腔とを含む修飾ＣｌｙＡナノポアであって、前記第１の開口部の内腔表面は第１の正に荷電したアミノ酸の置換を含み、前記中間部の内腔表面は第２の正に荷電したアミノ酸の置換を含み、前記第２の開口部の内腔表面は負に帯電したくびれを画定する、修飾ＣｌｙＡナノポア。
[３６]
前記第１の正に荷電したアミノ酸の置換から前記第２の正に荷電したアミノ酸の置換までの前記内腔内の距離が０．５ｎｍから１０ｎｍの範囲である、上記[３５]に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
[３７]
配列番号１または配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するサブユニットポリペプチドを含む、上記[３５]または[３６]に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
[３８]
配列番号１または配列番号２に示すアミノ酸配列と比較して、前記第１および第２の正に荷電したアミノ酸の置換を含む最大１０個の置換を有するサブユニットポリペプチドを含む、上記[３５]または[３６]に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
[３９]
前記第１の正に荷電したアミノ酸の置換が、配列番号１または配列番号２のアミノ酸１１０、１０６、１１４、１２１、１２２、１２９、８５、７８、２６８、２６７、２６５および２５８からなる群から選択されるアミノ酸の置換である、上記[３５]〜[３８]のいずれかに記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
[４０]
前記第２の正に荷電したアミノ酸の置換が、配列番号１または配列番号２のアミノ酸７４、７１、６４、５３、１６１、１５８、４６、４２、４１からなる群から選択されるアミノ酸の置換である、上記[３５]〜[３９]のいずれかに記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
[４１]
第１の正に荷電したアミノ酸の置換が、前記第１の開口部に曝露された溶液内の負に荷電したポリマーの捕捉を可能にするように、前記第１の開口部に配置されている、上記[３５]〜[４０]のいずれかに記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
[４２]
前記第２の正に荷電したアミノ酸の置換が、ポアの前記内腔を通じた前記負に荷電したポリマーの移行を可能にするように、前記中間部に配置されている、上記[４１]に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
[４３]
前記負に荷電したポリマーが核酸である、上記[４１]または[４２]に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
[４４]
前記核酸がデオキシリボ核酸である、上記[４３]に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
[４５]
前記デオキシリボ核酸が二本鎖である、上記[４４]に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
[４６]
前記デオキシリボ核酸が一本鎖である、上記[４４]に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
[４７]
１２量体ポアである、上記[３５]〜[４６]のいずれかに記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
[４８]
１３マーのポアである、上記[３５]〜[４６]のいずれかに記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
[４９]
上記[２７]〜[４８]のいずれかに記載の少なくとも１つの修飾ＣｌｙＡナノポアを含む組成物。
[５０]
膜をさらに含み、前記修飾ＣｌｙＡナノポアが前記膜に存在する、上記[４９]に記載の組成物。
[５１]
ポリヌクレオチド結合タンパク質をさらに含む、上記[４９]または[５０]に記載の組成物。
[５２]
前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が、前記修飾ＣｌｙＡナノポアに結合している、上記[５１]に記載の組成物。
[５３]
低イオン強度溶液をさらに含む、上記[４９]〜[５２]のいずれかに記載の組成物。
[５４]
前記低イオン強度溶液が、約１５０ｍＭから約３００ｍＭのイオン強度を有する塩溶液である、上記[５２]に記載の組成物。
[５５]
前記塩溶液が塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む、上記[５２]または[５３]に記載の組成物。
[５６]
標的ポリヌクレオチドを特徴付ける方法であって、
（ａ）約１５０ｍＭから約３００ｍＭの低イオン強度溶液に、上記[２７]〜[４８]のいずれかに記載の修飾ＣｌｙＡナノポアと膜とを供給するステップであり、ここで前記修飾ＣｌｙＡナノポアは前記膜に存在する、ステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の前記低イオン強度溶液に前記標的ポリヌクレオチドを添加するステップと、
（ｃ）前記ナノポアにわたり電位を印加する間に、前記修飾ＣｌｙＡナノポアを流れるイオン流を測定するステップであり、ここでイオン流の測定は、前記標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特徴の指標となる、ステップと
を含む、方法。
[５７]
前記１つまたは複数の特徴が、（ｉ）前記標的ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）前記標的ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）前記標的ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）前記標的ポリヌクレオチドの二次構造、ならびに（ｖ）前記標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否か、およびそれによる前記標的ポリヌクレオチドの特徴付けから選択される、上記[５６]に記載の方法。
[５８]
ポリヌクレオチド結合タンパク質が前記標的ポリヌクレオチドに結合し、前記修飾ＣｌｙＡナノポアを通じた前記標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように、前記ポリヌクレオチド結合タンパク質をステップ（ｂ）の前記低イオン強度溶液に添加するステップをさらに含む、上記[５６]または[５７]に記載の方法。
[５９]
前記標的ポリヌクレオチドが一本鎖ＤＮＡである、上記[５６]〜[５８]のいずれかに記載の方法。
[６０]
前記標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡである、上記[５６]〜[５８]のいずれかに記載の方法。
[６１]
前記イオン流の測定が、電流測定、インピーダンス測定、トンネル測定または電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）測定を含む、上記[５６]〜[６０]のいずれかに記載の方法。
[６２]
前記低イオン強度溶液が塩化ナトリウムを含む、上記[５６]〜[６１]のいずれかに記載の方法。