(57)【要約】  本発明は、単一の細長い区画に複数の細胞を同軸にカプセル化するための方法を提供する。かかるカプセル化により、前記細胞は少なくともひとつの分離物質で保護され、お互いの緊密な接近を維持し、これによりカプセル化された細胞をより活発にし、その結果ミクロ組織形成の高い機会をもたらす。かかるカプセル化された細胞区画の製造方法及び装置が開示される。また、かかる細胞区画の、組織治療及び組織再生のための医薬としての使用が開示される。
2012510268.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
共押出しのためのノズルであり、それぞれが細胞分散物、細胞シグナル分子又は分離物質を含む溶液を含む、少なくとも２つのシリンダを含み、
細胞分散物又は細胞シグナル分子を含み溶液を含みシリンダが分離物質を含むシリンダのより分離され、
前記最も外のシリンダが分離物質を含む、ノズル。
【請求項２】
請求項１に記載のノズルであり、４つの同軸シリンダを含み、第一のシリンダは細胞分散物を含み、第二のシリンダは細胞分散物又は細胞シグナル分子を含み溶液を含む、ノズル。
【請求項３】
請求項１に記載のノズルであり、前記シリンダの少なくとも１つの前記分離物質が生分解性及び／又は細胞シグナル分子アに対して透過性である、ノズル。
【請求項４】
請求項１に記載の前記ノズルを含む押出し装置。
【請求項５】
請求項１に記載の前記ノズル又は請求項４に記載の前記押出し装置の使用であり、分離物質の層によりカプセル化されら細胞分散物を含む少なくともひとつの区画を生成するための使用。
【請求項６】
細胞分散物のカプセル化及び／又はミクロ組織の生成のための方法であり、かかる方法が：
少なくともひとつの細胞分散物、少なくともひとつの分離物質及び場合により少なくともひとつの細胞シグナル分子を含む溶液を、同軸共押出しし、
細胞分散物又は細胞シグナル分子を含む溶液を分離物質により分離し、
得られる最も外側の層が分離物質を含む、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の、カプセル化された細胞分散物の生成方法であり、ひとつの分散物が複数の細胞を含み、ひとつの取り囲む分離物質が同軸共押出しされる、方法。
【請求項８】
請求項６に記載の、ミクロ組織の生成方法であり、２つの分散物が複数の細胞を含み、２つの分離物質が同軸共押出しされる、方法。
【請求項９】
請求項６に記載の、ミクロ組織の生成方法であり、複数の細胞を含むひとつの分散物、細胞シグナル分子を含むひとつの溶液及び２つの分離物質が同軸共押出しされる、方法。
【請求項１０】
請求項６に記載の方法であり、少なくともひとつの分離物質が、光重合性であり、前記方法がさらに前記少なくともひとつの分離物質の光重合反応のステップを含む、方法。
【請求項１１】
請求項６に記載の方法により得られ得る、カプセル化された細胞分散物又はミクロ組織。
【請求項１２】
医薬としての、請求項１１に記載のカプセル化された細胞分散物又はミクロ組織。
【請求項１３】
細胞治療及び／又はミクロ組織移植応用のための医薬としての、請求項１１に記載のカプセル化された細胞分散物又はミクロ組織。
【請求項１４】
請求項１１に記載のミクロ組織の少なくとも２つの層をスタックするステップを含む、組織再生の方法。
【請求項１５】
請求項１１に記載のミクロ組織又は請求項１４に記載の方法により得られ得るミクロ組織の少なくとも２つのスタックされた層を含む、組織。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再生医学、特に細胞治療及び再生医学の技術分野に関し、また細胞分散物の同軸カプセル化の方法及び／又はミクロ組織生成の方法を提供する。さらに同軸上にカプセル化された細胞分散物、ミクロ組織及び組織が、それらの医学用途と共に開示される。
【背景技術】
【０００２】
再生医薬は医科学分野の領域では新しく出現してきた分野である。再生医薬において使用される多くの方法やアプローチがある。
【０００３】
細胞治療は細胞、特に幹細胞を損傷した組織に移植して組織の機能を回復させるというものである。
【０００４】
再生医学では、組織を体の外で、足場材（ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）と細胞を用いて成長させる。再生させた組織をその後患者に埋め込み損傷又は損失組織と交換する。
【０００５】
細胞の扱い及び増殖は、これらの応用にとって極めて重要なファクタである。一般的に、細胞は、適切な細胞源から、即ち患者（「自己」）又はドナー（異質遺伝子）から植えつけ、そしていくつかの異なるステップを経て、最終的には患者に戻され損傷を受けた組織が交換されるか、回復される。細胞治療及び再生医学のこれまでの数年間の非常な進歩にも拘わらず、基本的かつ本質的なステップ、例えば細胞取り扱い、足場での増殖、細胞分化、細胞移植及び細胞保持などについてはいまだ問題が多く、再生医薬が医学的に適切なものとなるにはさらなる改良が必要とされる。
【０００６】
特に、３つの主な問題が細胞治療及び再生医学における分野に存在する。ひとつは、患者に移植された細胞は、損傷を受けた組織の領域に、例えば病変部分に局在してかつ生存可能に維持される必要があるということである。（幹）細胞治療の基本原理は、（幹）細胞を損傷又は病変領域に導入することである。新規に導入された（幹）細胞は増殖し、分割し分化する可能性を持ち、損傷部分に新たに増殖した組織を再生し、かかる新たな組織はもともとの組織と同じ又は類似の構造と機能を持つ。開発中の細胞治療における主な懸念は次の事実に基づく。即ち、多くの治療において大量の細胞が必要であるということである。しばしば、損傷細胞のほんの１％のみが、移植され及び／又はその領域に維持されそして最初の一週間生き延びるだけである。細胞は高価であり、大量に取得することが困難である（時間がかかる）。従って、かかる導入された細胞を、それらが増殖し、複製され、分化することができるようになるまで導入された場所から外れないように保持する方法が求められている。
【０００７】
また２番目は、異種（巨大）組織、例えば維管束組織や神経組織の提供はいまだ主要な挑戦であるということである。
【０００８】
さらに３番目は、体外での組織工学は、現在はまだ制限された厚さでのみ可能であることである（約１００μｍの範囲）。これは次の事実による。即ち、これらの組織増殖させる際に、例えば栄養物や酸素を再生される組織の全ての細胞に供給できる循環スステムが存在しないということである。従って、現在の方法で再生される組織の特に内部の細胞は死に絶える傾向にある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題はこれらの問題を解決しようとするものである。特に本発明の課題は、複数の細胞を、単一の同軸及び細長い区画へのカプセル化を可能とする方法を提供する。ここで、前記カプセル化された細胞はお互いにコミュニケーション可能となり、それらの活力を増加させ、従って細胞間接触がより容易となってミクロ組織を形成する機会を増加させることができる。従って、本発明のひとつの課題は、同軸及び細長いカプセル化された細胞分散物であり、複数の細胞を含み、お互いにコミュニケーションすることが可能なものである。
【００１０】
さらに、本発明は、かかる複数の細胞を含む細長い区画から１００μｍよりも厚い組織を成長させる方法を提供する。これは、かかる細長い区画は繊維性ミクロ組織へと培養され、さらなるステップで、増加された厚さの組織を形成するように配置され又はスタックされることができる。かかる組織はまた、不均一組織であり得る。即ち異なるタイプの細胞を含むことができる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明のひとつの側面によれば、同軸押出しのためのノズル８が提供される。これは、少なくとも２つの同軸シリンダを含み、それぞれのシリンダは細胞分散物１、細胞シグナル分子を含む溶液又は分離物質３を含む。細胞分散物又は細胞シグナル分子を含む溶液を含むシリンダは、分離物質を含むシリンダで分離され、また前記最も外側のシリンダは分離物資を含む。
【００１２】
本発明のさらなる側面によれば、本発明による前記ノズルを含む押出し装置が提供される。
【００１３】
本発明のさらなる側面によれば、本発明の前記ノズル又は前記押出し装置を、分離物質の層によりカプセル化された細胞分散物を含む少なくともひとつの区画を生成するための使用が提供される。
【００１４】
本発明のさらなる側面によれば、細胞分散物及び／又はミクロ組織の生成の方法が提供される。かかる方法は、少なくともひとつの細胞分散物、少なくともひとつの分離物質及び場合により少なくともひとつの細胞シグナル分子を含む溶液を同軸押出しすることを含み、細胞分散物又は細胞シグナル分子を含む溶液が分離物質で分離され、その結果最外層が分離物質を含む。
本発明のさらなる側面によれば、本発明は、本発明による方法により得られ得るカプセル化された細胞分散物を提供する。
【００１５】
本発明のさらなる側面によれば、本発明のカプセル化された細胞分散物又はミクロ組織の医薬としての使用を提供する。
【００１６】
本発明のさらなる側面によれば、組織生成の方法が提供され、本発明による少なくとも２つのミクロ組織層をスタックするステップを含む。
【００１７】
最後に、本発明の方法により得られ得る又は本発明によるミクロ組織の少なくとも２つのスタック層を含む。
【００１８】
本発明の課題につき、さらなる詳細、構成、特徴及び利点は、特許請求の範囲の従属項、図面及び詳細な説明に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
図面は、例示的様式で本発明の好ましい実施態様につき示している。
【図１】図１は、２つの同軸シリンダを含む本発明によるノズル８の断面を示す。中心シリンダは、複数の細胞２を含む細胞分散物１を含む。外側シリンダは分離物質３を含む。さらに放射源９及び押出し製品７の閉鎖部又はシーリングが示される。
【図２ａ】図２ａは、図１（カプセル化細胞分散物）で示されるノズルによる押出し製品のそれぞれの垂直及び水平断面を示す。さらに、複数の細胞２を含む細胞分散物１、外側保護層を形成する分離物質３及び閉鎖部又はシーリング７が示される。
【図２ｂ】図２ｂは、図１（カプセル化細胞分散物）で示されるノズルによる押出し製品のそれぞれの垂直及び水平断面を示す。さらに、複数の細胞２を含む細胞分散物１、外側保護層を形成する分離物質３及び閉鎖部又はシーリング７が示される。
【図３ａ】図３ａは、図２の押出された製品の時間経過後を示す。図２で示される個々の細胞は、ミクロ組織となっており、かかる細胞は分離物質の層に付着されている。
【図３ｂ】図３ｂは、図２の押出し製品の時間経過後を示す。図２で示される個々の細胞は、ミクロ組織となっており、かかる細胞は分離物質の層に付着されている。
【図３ｃ】図３ｃは、図２の押出し製品の時間経過後を示す。図で示される個々の細胞は、ミクロ組織となっており、かかる細胞は分離物質の層に付着されている。
【図４】図４は、４つの同軸シリンダを含む本発明によるノズル８の断面を示す。中心のシリンダは、複数の細胞２を含む細胞分散物１を含み、この回りには分離物質３を含むシリンダ、さらに複数の第二のタイプの細胞５を含む細胞分散物４を含むシリンダで囲まれている。最外側シリンダは、分離物質６を含み、これは他の分離物質３と同じ又は異なる物質でもよい。さらに、２つの放射源９及び押出し製品の閉鎖部又はシーリング７が示される。
【図５ａ】図５ａは、図４で示されるノズルによる押出し製品の垂直及び水平のそれぞれの断面を示す。複数の細胞２及び５を含む２つの細胞分散物１及び４、分離物質３及び６及び押出し製品の閉鎖部又はシーリング７が示される。
【図５ｂ】図５ｂは、図４で示されるノズルによる押出し製品の垂直及び水平のそれぞれの断面を示す。複数の細胞２及び５を含む２つの細胞分散物１及び４、分離物質３及び６及び押出し製品の閉鎖部又はシーリング７が示される。
【図６ａ】図６ａは、図５の押出し製品の時間経過後、好ましくは前記押出し製品の培養後を示す。図からわかるように、図５で示される複数の個々の細胞がミクロ組織になっており、それら細胞は、分離物質の層に付着されている。異なる細胞タイプが細胞２及び５として使用された場合、不均一ミクロ組織が従って提供される。
【図６ｂ】図６ｂは、図５の押出し製品の時間経過後、好ましくは前記押出された製品の培養後を示す。図からわかるように、図５で示される複数の個々の細胞がミクロ組織になっており、それら細胞は、分離物質の層に付着されている。異なる細胞タイプが細胞２及び５として使用された場合、不均一ミクロ組織が従って提供される。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、単一の細長い区画又は複数結合された細長い区画の中に、複数の細胞を含む細胞溶液の、同軸カプセル化を可能とする方法を提供する。かかるカプセル化により、前記細胞は分離物質の少なくともひとつの層により保護され、緊密な接触が維持される。驚くべきことに、かかる細胞間の接触は、カプセル化された細胞をより活発にし、ミクロ組織を形成する上でより高い機会を与える結果となる。
【００２１】
さらに、本発明のカプセル化細胞分散物及び／又はそれから発達したミクロ組織は、細胞治療及び／又は生体内ミクロ組織移植に適用するために使用され得る。カプセル化細胞及び／又はミクロ組織は、患者の損傷／挿入位置で保持されるであろう。従来の方法では、細胞分散物は単純に、例えば損傷場所に注入されるだけであり、前記細胞は、そこで機能性細胞に分化して以前の組織と交換するというよりも、その場所から離れていく傾向があった。
【００２２】
従って、本発明は、細胞又はミクロ組織をより高い信頼性で患者に必要な場所に移植し、そこで、前記細胞が活発なまま維持されその組織形成の機会が増加する方法を提供する。さらに、前記細胞及び／又は発展組織は、それらが注入又は挿入された患者の体内の特定の場所、例えば損傷を受けた場所に維持される。従って、機能性交換組織の形成の機会が劇的に増加する。
【００２３】
本発明による使用される分離物質は、生分解性である場合、前記注入／挿入された細胞及び／又は組織は−注入／挿入後しばらくすると−前記分離物質は分解され分離物質によるカプセル化はなくなるであろう。
【００２４】
さらに、本発明はまた、１以上の種類の細胞を同軸に入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）／スタック（ｓｔａｃｋｅｄ）された区画へのカプセル化を提供する。この方法により、不均一組織が生成され、ミクロ組織移植への適用において高い価値を持ち得る。例えば機能性血液循環組織又は神経組織が提供され得る。
【００２５】
さらに、本発明は、少なくともひとつの細胞を第一の区画へのカプセル化であって、第二の区画にカプセル化された細胞シグナル分子を含む溶液に隣接し、前記第二の区画が同軸に前記第一の区画を囲む、カプセル化を提供する。この方法により、例えば細胞分化において重要である細胞シグナル分子は、前記細胞に高い信頼性で供給されることができる。
【００２６】
本発明はさらに、約１００μｍよりも厚い組織の生成を提供する。かかる組織の生成においては通常、血液循環系が存在しない組織内に位置する前記細胞を維持することに問題となり得る。
【００２７】
本発明は、かかる組織の生成方法を提供する。ここで、本発明のミクロ組織はお互いの上に重ねられており、組織厚さ≧１００μｍ、好ましくは≧１ｃｍ及びより好ましくは≧２ｃｍの組織を生成する。本発明のミクロ組織のスタックは、たとえ循環系がなくとも栄養分が増殖中の全ての細胞に運ばれることが可能である。ひとつの具体的な実施態様において前記組織は厚さが≧１００μｍ及び≦５ｃｍである。他の具体的な実施態様においては、組織は厚さが≧３００μｍ及び≦２ｃｍである。他の具体的な実施態様においては、組織は厚さが≧５００μｍ及び≦１ｃｍである。
【００２８】
以下、本発明は好ましい実施態様及び実施例により説明されるが、本発明がこれらにより限定されると理解されるべきではない。
【００２９】
定義
ここで使用される「ノズル」とは、本発明による同軸押出し方法を適用するに適切な可能なすべての装置を意味する。押出しとは、対象物を固定断面形状に成形するために使用されるプロセスであり、物質、例えば前記分離物質が、望ましい断面形状を有するダイに対し押し付けられるか引っ張られる。前記ノズルの最小寸法は、通常サイズ５から５０μｍである細胞がカプセル化され得るものである。
【００３０】
ひとつの実施態様において、前記ノズルの内直径は、≧１０μｍ及び≦１ｃｍである。他の実施態様において、前記ノズルの内直径は、≧２５０μｍ及び≦７５０μｍである。他の実施態様において、前記ノズルの内直径は、≧３５０μｍ及び≦５５０μｍである。
【００３１】
ここで使用される用語「シリンダ」とは、ノズルを形成する同軸に重なったチューブを意味する。しかし、単純化の理由により、用語「シリンダ」はまた、２つのかかるチューブ間で形成される空間も意味する。例として図１が参照される。ここで、ノズル８は、２つの同軸に重ねられたチューブ（黒で示される）からなり、２つの空間を形成する。形成された第一の及び最も内部の空間（点で示される）は、細胞分散物１を含み、一方第二の空間（ハッチで示される）は第一の空間を同軸に囲み、分離物質３を含む。従って例えば用語「最外シリンダ」とは、ノズルを形成する最も外側のチューブ（黒で示される）を意味するか、又は前記最も内側のチューブと最も外側のチューブで形成されるハッチされた最も外側の空間を意味し、これは分離物質３を含む。
【００３２】
ひとつの実施態様において、分離物質を含むシリンダを形成する２つの連続する同軸チューブ間の距離は、≧１００ｎｍ及び≦１ｍｍ、≧３００ｎｍ及び≦８００μｍ、≧５００ｎｍ及び≦５００μｍ又は≧１μｍ及び≦２００μｍである。従って、かかるシリンダから押出される分離物質の層の厚さは≧１００ｎｍ及び≦１ｍｍ、≧３００ｎｍ及び≦８００μｍ、≧５００ｎｍ及び≦５００μｍ又は≧１μｍ及び≦２００μｍである。
【００３３】
細胞分散物を含むシリンダを形成する２つの同軸チューブ間の距離は押出される細胞の直径に依存する。さらなる実施態様において、細胞分散物を含むシリンダを形成する２つの同軸チューブ間の距離は≧５μｍ、好ましくは≧５μｍ及び≦５ｃｍ、≧１０μｍ及び≦２ｃｍ、≧２０μｍ及び≦１ｃｍ、≧３０μｍ及び≦５００μｍ、≧４０μｍ及び≦４００μｍ、≧５０μｍ及び≦３００μｍ、≧１００μｍ及び≦５００μｍ又は≧２００μｍ及び≦４００μｍである。
【００３４】
本発明のさらなる実施態様においては、前記シリンダの壁の厚さは≧２０μｍ及び≦５００μｍ、好ましくは少なくとも≧３０μｍ及び≦１００μｍである。
【００３５】
さらに本発明の実施態様において、同軸押出しシリンダのそれぞれの長さは≧５００μｍ及び≦１０ｃｍ、好ましくは≧１ｍｍ及び≦５ｃｍ及び≧３ｍｍ及び≦５ｃｍ、≧３ｍｍ及び≦３ｃｍ又は≧５ｍｍ及び≦３ｃｍである。
【００３６】
ここで使用する「押出し装置」とは、例えば分離物質、細胞分散物及び／又は細胞シグナル分子を含む溶液である物質を本発明によりノズルを通して押す又は引くために適切な装置を意味する。ひとつの具体的実施態様では、前記押出し装置は、通常のシリンジを用いるシリンジポンプを用いるものであり、かかる照明臨時は前記ノズルと、例えば小さなチューブを介して結合されている。
【００３７】
ひとつの具体的実施態様では、前記分離物質、細胞分散物及び／又は細胞シグナル分子を含む溶液の流速は≧０ｍ／分及び≦１０ｍ／分、≧０ｍ／分及び≦８ｍ／分、≧０ｍ／分及び≦６ｍ／分、≧０ｍ／分及び≦４ｍ／分、≧０ｍ／分及び≦２ｍ／分、≧０ｍ／分及び≦１．５ｍ／分、≧０ｍ／分及び≦１ｍ／分又は≧０ｍ／分及び≦０．５ｍ／分である。
【００３８】
ここで使用される用語「細胞分散物」とは、複数の細胞がすべての適切な流体であって、前記細胞の維持、増殖、分化又は成長を可能とする流体に分散されていることを意味する。ひとつの実施態様においては、前記流体は細胞栄養媒体である。細胞栄養媒体は特に培養液又は成長媒体であってよく、詳しい成分は細胞分散物に含まれる細胞の種類に依存する。細胞栄養媒体の一例としては、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  （ＤＭＥＭ，  Ｇｉｂｃｏ）培養媒体に、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）と１％のペニシリン／ストレプトマイシン及び１％のＧｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で補助されたものが挙げられる。
【００３９】
本発明の具体的な実施態様において、前記細胞分散物は濃度として、≧１及び≦１０９細胞／ｍｌ、より具体的には前記細胞分散物は濃度≧１０００及び≦１０８、より好ましくは≧１０５及び≦１０７細胞／ｍｌである。
【００４０】
本発明のさらなる具体的な実施態様においては、前記細胞は、幹細胞、前駆細胞、完全分化細胞、神経細胞、グリア細胞、シュワン細胞、オリゴデンドロサイト、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、膵前駆細胞、フィーダー細胞、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、多分化能幹細胞、体性幹細胞、骨髄幹細胞及び／又はリンパ幹細胞を含む群から選択される。
【００４１】
ヒトＡＳＣは、骨、軟骨、脂肪及び筋肉の分化することが示されている。一方ラットＡＳＣは、神経に変換されることが知られている。
【００４２】
ＭＳＣは多可能性幹細胞であり、種々の組織に分化可能であり、臍帯血、ウオートンジェリ、胎盤、脂肪組織、肺及び骨髄から単離される。ＭＳＣは、分化し、栄養支持提供及び自然免疫応答を和らげることができるものであることから医療において興味がもたれている。ＥＰＣは、骨折及び障害治癒の研究にとって非常に重要である。
【００４３】
単一の細胞分散物における細胞は、単一細胞タイプでもよいし又はより多くの細胞タイプでもよい。さらなる実施態様において、前記細胞は培養細胞である。
【００４４】
さらに、次の添加物を、前記細胞分散物又は細胞シグナル分子を含む溶液に加えられてもよい。
（ｉ）前記押出された製品の生適合性を強化する試薬、
（ｉｉ）生分解性及び／又は生物学的に安全な材料、
（ｉｉｉ）ラベル化剤又はマーカー及び／又は
（ｉｖ）成長因子、
（ｖ）抗生物質。
【００４５】
ここで使用される「ミクロ組織」とは、凝集した細胞の少なくともひとつの層であり、押出された溶液中で前記細胞が分離物質の層に付着して生成されるものを意味する（例えば図３ａ及び図６ａ参照）。従って用語ミクロ組織は、細胞のコンフルエント層を意味し、細胞間の接触が確立されている。
【００４６】
ここで使用される「細胞シグナル分子」とは、所与の細胞の維持、増殖、分化、脱分化又は成長についての効果を有するすべての分子を意味する。かかる細胞シグナル分子の好ましい実施態様は、成長印組織、サイトカイン及び／又はケモカインである。
【００４７】
本発明のひとつの具体的実施態様によれば、細胞シグナル分子は、  Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＧＦ−Ｉ、繊維芽細胞成功因子（ＦＧＦ）、ベーシックＦＧＦ（ｂＦＧＦ）、形質転換成長因子β１（ＴＧＦ−β１）、アクチビン−Ａ、骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）、血液成長因子（ＨＧＦ）、表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、β神経成長因子（β−ＮＧＦ）、レチノイン酸、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、スロンボポイエチン（ＴＰＯ）及び／又はエリスロポイエチン（ＥＰＯ）を含む群から選択される少なくともひとつである。
【００４８】
ひとつの具体的実施態様において、前記細胞シグナル分子は、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）であり、ミオサイト増殖を促進することが知られている。
【００４９】
さらなる具体的な実施態様において、前記細胞シグナル分子は、ニューロトロフィンである。ニューロトロフィンはニューロンの生存、増殖及び機能を誘導するタンパク質のファミリである。これらは成長因子、分泌タンパク質に分類され、特定の細胞に生存、分化又は成長につきシグナルすることができるものである。ニューロンの生存を促進するニューロトロフィンのような成長因子は、ニューロトロフィック因子として知られている。ニューロトロフィック因子は、ターゲット組織により分泌され、伴う細胞が細胞死プログラムを開始させなくするように作用し、従ってニューロンが生存することができるようになる。ニューロトロフィンはまた、始原細胞のニューロン分化を誘導する。
【００５０】
さらに具体的な実施態様において、細胞シグナル分子は、肝細胞成長因子／分散因子（ＨＧＦ／ＳＦ）であり、これはパラクリン細胞増殖、運動性及び形態形成因子である。間葉細胞及びターゲット細胞から分泌され、主に上皮細胞及び内皮細胞に対して作用するがまた、造血前駆体細胞にも作用する。胎児器官成長、大人の器官再生及び傷害治癒に主な役割を果たすことが示されている。肝細胞成長因子は、癌原遺伝子ｃＭｅｔレセプタに結合した後チロシンキナーゼシナカルカスケードを活性化して細胞成長、細胞運動及び形態形成を制御する。肝細胞成長因子は間葉細胞により分泌され、主に上皮由来の細胞に多機能サイトカインとして作用する。その有糸分裂、細胞運動及び細胞質侵入を可能にすることは、血管形成、発ガン及び組織再生に中心的な役割を果たしている。
【００５１】
さらに具体的実施態様において、細胞シグナル分子は、成長分化因子９（ＧＤＦ９）である。卵巣体細胞により合成される成長因子であり、卵母細胞成長及び機能に直接影響する。ＧＤＦ９は、卵母細胞で発現し、卵胞起因に要求されると考えられている。ＧＤＦ９は形質転換成長因子−β（ＴＧＦβ）スパーファミリの一員であると考えられている。ＤＧＦ９は、卵巣での主卵胞成長に決定的な役割を果たしている。これは顆粒膜細胞及び卵胞膜細胞成長に、同じく卵胞の分化及び成長に、決定的な役割を果たす。ＧＤＦ９は、排卵率と卵巣機能の早期停止における違いに関連付けされており、従って出生率に重要な役割を果たす。
【００５２】
本発明のひとつの実施態様において、サイトカインは、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）−２０である。ＦＧＦ−２０は、線維芽細胞成長因子ファミリ（ＦＧＦ）の一員であり、かかるファミリの一員は、広範な細胞分裂及び細胞生存活性を有する。さらに、胎児成長、細胞成長、形態形成、組織修復、癌成長及び侵入を含む種々の生物的過程に関わっている。ＦＧＦ−２０は正常な脳、特に小脳で発現され、生体内で中脳のドーパミン作動性ニューロンの生存を強化することが示されている。ＦＧＦ−２０はさらに、ｈＥＳＣ由来のドーパミン作動性ニューロンの大部分を生成するためのタンパク質効果を持つことも知られている。
【００５３】
細胞シグナル分子の溶液は、初めは前記細胞分散物と、前記細胞分散物を囲む前記分離物質により分離されているであろう。ひとつの実施態様において、分離物質は生分解性であり、従って時間が経過すると、前記細胞分散物及び前記細胞シグナル分子とが接触するようになる。他の実施態様において、前記分離物質は、前記細胞シグナル分子に対し透過性であり（及び細胞に対しては透過性でない）、従って透過性係数に依存して、前記細胞シグナル分子の前記細胞分散物を含む区画への拡散を制御することができる。
【００５４】
ここで使用される用語「分離物質」とは、２つの液体を分離するに適する全ての種類の物質を意味する。ひとつの実施態様において、用語「分離」とは、前記２つの前記液体媒体の混合が抑制されるという意味である。好ましくは、前記分離物質は、細胞分散物と細胞シグナル分子を含む溶液とを分離する及び／又は細胞分散物と他の細胞分散物とを分離するものである。本発明による分離物質は、ゲル、例えばヒドロゲル、自動ゲル化液体又は重合性物質があり得る。
【００５５】
好ましい分離物質は特に、ヒドロゲルであり、例えばＰＥＧアクリレート、ｐＮｉＰＡＡｍ、ＰＡＡｍ、ＰＨＥＭＡであるモノマーから誘導されるポリマーネットワークと、クロスリンカである例えばＰＥＧＤＡ、ＤＥＧＤＡ、ＤＥＧＤＭＡ、ＴＥＧＤＡ、ＴＥＧＤＭＡ、生分解性クロスリンカ分子である、オリゴラクチド部分、オリゴグリコリド部分、オリゴカプロラクトン部分及び他のオリゴエステル部分を含むジ（メタ）アクリレート物質との組み合わせが挙げられる。または、ヒドロゲル系アルギニン酸塩又はペプチド両性ナノファイバを使用することも可能である。さらに重合誘導相分離（ＰＩＰＳ）により得られる多孔性ポリマーシステム（膜）が、又は例えばｐＮｉＰＡＡｍ及び他の当該技術分野で知られる温度感受性ヒドロゲルが使用可能である。
【００５６】
具体的な実施態様において、かかる多孔性ポリマーシステム／膜は、クロスリンクモノマー及び単一のポロゲン溶媒を含む混合物の光重合誘導相分離により得られる。ここで前記溶媒は、≧４０及び≦８０重量％、好ましくは≧４２及び≦７０重量％、より好ましくは≧４５及び≦６０重量％、最も好ましくは約５０重量％である。
【００５７】
さらに具体的実施態様においては、前記膜は前記混合物の光重合相分離により得られるが、前記クロスリンクモノマーはテトラエチレングリコールジメチルアクリレートである。
【００５８】
他の好ましい実施態様においては、前記膜は製造され、前記混合物がグリシジルメタクリレート及び／又はアクリル酸をさらに反応モノマーとして含む。
【００５９】
ポロゲン溶媒は、ポアを形成し及び／又は重合の際にポリマー鎖を排出するのに適する溶媒である。かかる溶媒の性質及びマクロレチクラ又はマクロポーラス樹脂を形成するために使用についてはＵＳ４，２２４，４１５に開示され、この内容は参照して本明細書の一部となる。ポロゲン溶媒は、（共）重合される前記モノマーを溶解するが、得られる（共）重合体は溶解しない。加えて、ポロゲン溶媒は、重合条件に不活性である。即ち重合反応に干渉しないしまた重合反応に関与することもない。本発明の実施態様によれば、多孔性膜が形成される混合物質は、ポリ（メタ）アクリル系物質を含むポリマー物質からなる。
【００６０】
本発明の他の実施態様において、前記多孔性膜は、少なくともひとつの（メタ）アクリル酸モノマー及び少なくともひとつのポリ官能性（メタ）アクリル系モノマーの重合によるポリ（メタ）アクリル系物質を含む。
【００６１】
本発明の他の実施態様によれば、前記（メタ）アクリル系モノマーは、（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリル酸、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、エトキシエトキシエチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、イソボルニル（メタ）アクリレート、イソボルニルメタ（メタ）アクリレート又はそれらの混合物を含む群から選択される。
【００６２】
本発明のさらなる実施態様においては、ポリ官能性（メタ）アクリル系モノマーは、ビス−（メタ）アクリル及び／又はトリ−（メタ）アクリル及び／又はテトラ−（メタ）アクリル及び／又はペンタ−（メタ）アクリル系モノマーである。
【００６３】
本発明の他の実施態様によれば、前記ポリ官能性（メタ）アクリル系モノマーは、ビス（メタ）アクリルアミド、トリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、エトキシル化ビスフェノール−Ａ−ジ（メタ）アクリレート又はそれらの混合物を含む群から選択される。
【００６４】
本発明の実施態様によれば、前記ポリ（メタ）アクリル系物質のクロスリンク密度は、≧０．０５及び≦１、好ましくは≧０．１及び≦０．８、より好ましくは≧０．４及び≦０．５である。
【００６５】
ひとつの実施態様において、前記分離物質は、生分解性及び／又は選択的透過性物質である。
【００６６】
ひとつの実施態様において、前記分離物質は、ヒドロゲルであり、荷電即ちアニオン又はカチオン基を含み、それぞれのアニオン性又はカチオン性種に対し透過性を制限するものである。さらなる例及び具体的実施態様は、（（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウム）で官能化されたポリマーであり、これはＮａ＋をブロックし、また２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸で官能化されたポリマーであり、これはＣｌ−をブロックする。
【００６７】
他の実施態様において、前記分離物質は、極性であり、例えば親水性物質をブロックする疎水性ポリマーである。さらなる実施態様において、前記分離物質の透過性はクロスリンク密度及び／又は前記分離物質の多孔度の関数である。一例として、高いクロスリンク密度を持つ分離物質は、低分子量分子のカットオフフィルタとして作用し、従ってより高分子量を持つ物質に対する選択的透過性物質として利用可能である。
【００６８】
適切な生分解性物質は例えば、Ｇｕｎａｔｉｌｌａｋｅ  Ｐ及びＡｄｈｉｋａｒｉ  Ｒ等のＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（５）２００３，１−１６に開示されており、この内容は参照され本明細書の一部となる。特にこれらは、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）及びそれらのコポリマー及びその誘導体であって例えばポリ（ｄ，ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリラクトン例えばポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）及びその誘導体、ポリ（プロピレンフマレート）（ＰＰＦ）及びその誘導体、ポリ無水物例えばポリ［１，６−ビス（カルボキシフェノキシ）ヘキサン］、チロシン−誘導ポリカーボナート及びそれらの誘導体、ポリオルトエステル（ＰＯＥ）及びそれらの誘導体、ポリウレタン（ＰＵ）であって毒性のない分解物を持つもの例えばリジンジイソシアネート（ＬＤＩ、２，６−ジイソシナネートヘキサノエート）及び他の脂肪族ジイソシナネート例えばヘキサメチレンジイソシナネート（ＨＤＩ）及び１，４−ブタンジイソシアネート例えばポリ（グリコリド−ｃｏ−γ−カプロラクトン）、ポリホスファジン例えばエチルグリシナートポリホスファジン及びそれらの誘導体等である。
【００６９】
他の生分解性ポリマーには、ポリ（マレイン酸）、ポリ（ｐ−ジオキサノン）、ポリ（トリメチレン−カルボナート）、ポリ（３−ヒドロキシブタラート）、ポリ（３−ヒドロキシバロラート）及びそれらのコポリマーが挙げられる。適切な応答性生分解性ポリマーは、ポリ（Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドモノ／ジ乳酸エステル）であり、Ｓｏｇａ  Ｏ等により、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２００４（５）８１８−８２１に開示されている。この内容は参照され本明細書の一部となる。
【００７０】
他の適切な生分解性物質には、アルギニン酸塩、ヒアルロン酸、キトサン、コラーゲン、ゼラチン、絹又はそれらの混合物が挙げられる。
【００７１】
これらの生分解性物質はこれら自体で用いることが可能であるが又は、それらはクロスリンク剤と共にネットワーク内に使用することも可能である。作られるネットワークは、ある時間後分解され、及び、クロスリンク剤は小さな分子量を持つことから流れ出てしまうであろう。他の実施態様においては、生分解性物質は非生分解性物質からなるネットワークに固定される。
【００７２】
ここで使用される「ヒドロゲル」とは、少なくとも一部において以下のポリマーを含むものを意味する。即ち、水中では水を吸収して膨潤したネットワーク及び／又は水溶性であるポリマー鎖のネットワークを形成するポリマーである。好ましくはヒドロゲル透過性層は、膨潤率≧５０％水及び／又は溶媒であり、より好ましくは≧７０％、最も好ましくは≧８０％である。ここで好ましい溶媒は有機溶媒、好ましくは有機極性溶媒であり、最も好ましくは例えばエタノール、メタノール及び／又は（イソ）プロパノールであるアルカノールである。
【００７３】
本発明の第一の側面は、少なくとも２つの同軸シリンダを含む同軸押出しのためのノズル８に向けられ、それぞれのシリンダが複数の細胞１の細胞分散物、細胞シグナル分子又は分離物質３を含む溶液を含み、細胞分散物又は細胞シグナル分子を含む溶液を含むシリンダが、分離物質を含むシリンダにより分離され、及び前記最も外側のシリンダが分離物質を含む。
【００７４】
かかるノズルは、複数の細胞の分散物及び／又は分離物質の層で囲まれた細胞シグナル分子を含む溶液を含む、細長い押出された製品（押出し製品）を生成するために使用することができる。従って、本発明の前記ノズルは、複数の細胞及び／又は分離物質の層で囲まれた細胞シグナル分子を含む溶液を含む区画の生成を可能とする。ひとつ以上の区画が生成される場合、これらの区画はスタックされる、即ち入れ子構造とされる。
【００７５】
前記ノズルの最も外側のシリンダは、分離物質を含むシリンダである必要があり、細胞分散物又は細胞シグナル分子を含む溶液を含むシリンダは分離物質を含むシリンダで分離される。従って、前記シリンダの内容物が本発明の方法により押出される場合、前記液体の混合は生じない。
【００７６】
結果得られる区画は、図５及び６に例示されるように入れ子構造／スタック構造であり得る。従って、一例であり好ましい実施態様において、タイプ１の細胞の分散物を含む区画と、タイプ２の細胞の分散物を含む区画は、隣り合って押出されることが可能であり、前記２つの区分の（液体）内容物は、それらの間にある分離物質の層との共押出しにより分離される。その結果、押出された製品においては、タイプ１の細胞はタイプ２の細胞と、分離物質の層により分離されている。
【００７７】
他の例及び好ましい実施態様において、細胞の分散物を含む区画と、細胞シグナル分子を含む溶液を含む区画は、隣接して押出されることが可能である。従って、その結果、押出された製品においては、細胞分散物は細胞シグナル分子を含む溶液と、分離物質の層により分離されている。
【００７８】
ひとつの具体的実施態様において、前記シリンダの少なくともひとつは細胞分散物を含む。好ましくは、前記細胞は、幹細胞、前駆細胞、完全文化細胞、神経細胞、グリア細胞、シュワン細胞、オリゴデンドロサイト、脂肪誘導幹細胞（ＡＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、パンクレアチン前駆細胞及び内皮性前駆細胞の少なくともひとつである。
【００７９】
本発明のひとつの実施態様において、図１で示されるように、前記ノズル８は、２つの同軸シリンダを含み、内側のシリンダは複数の細胞２を含む細胞分散物１を含み、外側のシリンダは分離物質３を含む。押出された製品は、分離物質の層でカプセル化された複数の細胞を含む細胞分散物を含む細長い区画を含む。本発明のこの実施態様は従って、図１、２ａ及び２ｂで示されるように同軸カプセル化された複数の細胞を含む分散物を含む単一の区画を製造するために用いることができる。前記区画にカプセル化された細胞のタイプに依存して、当該技術分野の熟練者に知られている培養手段により、これらの区画は図３ａ及び３ｂに示されるように中空上の繊維性ミクロ組織へと変換される。
【００８０】
本発明の他の実施態様において、前記ノズルは、３つの同軸シリンダを含む。内側及び外側のシリンダは分離物質を含み、中間のシリンダは細胞分散物を含む。従って、分離物質は前記中心シリンダで押出され、細胞分散物で囲まれる。当該細胞分散物自体はまた分離物質で形成されるカプセル化層によりカプセル化されている。この結果得られる押出された製品は、外側の分離物質の層によりカプセル化されている細胞分散物を含む単一の細長い区画と、さらに分離物質の中心チューブを含む。図１押出し装置２に例示されるように本発明のこの実施態様は、前記分離物質３で形成される同軸の保護層内にカプセル化された複数の細胞２を含む分散物１を含む単一の繊維状区画を製造するために使用することができる。
【００８１】
培養ステップの後、中空状ミクロ組織が得られる（図３参照）。
【００８２】
本発明の他の実施態様において、前記ノズルは、４つの同軸シリンダを含む。第一のシリンダは細胞分散物１を含み、第二のシリンダは細胞分散物４又は細胞シグナル分子を含む溶液を含む。細胞分散物又は細胞シグナル分子を含む溶液を含むこれらのシリンダは、分離溶液を含むシリンダ及び同様に分離溶液を含む最も外側のシリンダによりお互いに分離されている。
【００８３】
従って、押出された製品は、細胞分散物を含むひとつの区画とさらに細胞分散物又は細胞シグナル分子を含む溶液を含む区画を含み、これらの区画は分離物質で分離されスタックされている。当該方法によりそれぞれの区画に含まれる内容物の混合は、前記分離物質が前記２つの内容物のいずれも完全に透過させない場合、生じない。
【００８４】
ひとつの具体的な実施態様においては、図４に示されるように、最も内側のシリンダがタイプ１（２）を含む細胞分散物含み、これは分離溶液３を含むシリンダで囲まれている。これはまた、タイプ２（５）の細胞を含む細胞分散物４を含むシリンダにより囲まれている。また最も外側のシリンダは分離溶液６を含む。当該ノズルを用いることで、図５及び６に示されるように、例えば同軸ミクロ組織である繊維性不均一組織を調製することができる（培養初期及び培養が進んだ状態をそれぞれ示す）。
【００８５】
ひとつの具体的な実施態様においては、タイプ１の前記細胞及びタイプ２の前記細胞はグリア細胞である（又はシュワン細胞又はオリゴデンドロサイトである）。これらのグリア細胞はその後ミエリン鞘を形成する。これは前記内部区画内で発達して電気的に活性なニューロンの絶縁体となる。従って、本発明は、絶縁性のミエリン鞘で囲まれる機能性ニューロン繊維の生成を提供する。
【００８６】
さらなる実施態様において、タイプ１の細胞は幹細胞であり、タイプ２の細胞がフィーダー細胞である。好ましい実施態様において、これらの細胞分散物タイプのひとつ又は両方ともシグナル分子を分泌しこれは他の細胞へ影響する。例えば、２つの細胞のひとつがフィーダー細胞である場合、他のタイプの細胞（幹細胞であり得る）の維持及び／又は増殖に必要なシグナル分子を分泌するであろう。
【００８７】
さらなる実施態様において、前記ノズルの前記４つのシリンダのひとつのみが細胞分散物を含み、一方他のひとつは細胞シグナル分子を含む溶液を含む。ひとつの実施態様において、前記細胞分散物は最も内側のシリンダに含まれ、他の実施態様においては細胞シグナル分子を含む溶液が最も内側のシリンダに含まれる。従って、このノズルを用いることで、押出される製品は、細胞シグナル分子を含む溶液をカプセル化する区画と細胞分散物をカプセル化する区画を含み、これらの区画はお互いから前記分離物質の層をカプセル化する層によって分離されている。
【００８８】
さらなる実施態様においては、前記分離物質は生分解性及び／又は前記細胞シグナル分子（前記細胞ではなく）に透過性であって前記細胞シグナル分子を前記細胞への輸送を制御することができる。
【００８９】
さらなる実施態様において、前記細胞は、幹細胞、前駆細胞、完全分化細胞、神経細胞、グリア細胞、シュワン細胞、オリゴデンドロサイト、脂肪誘導幹細胞（ＡＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、パンクレアチン前駆細胞及び内皮性前駆細胞の少なくともひとつである。
【００９０】
さらなる実施態様において、前記細胞シグナル分子は成長因子、サイトカイン又はケモカインである。具体的な実施態様においては、細胞シグナル分子は、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＧＦ−Ｉ、繊維芽細胞成功因子（ＦＧＦ）、ベーシックＦＧＦ（ｂＦＧＦ）、形質転換成長因子β１（ＴＧＦ−β１）、アクチビン−Ａ、骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）、血液成長因子（ＨＧＦ）、表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、β神経成長因子（β−ＮＧＦ）、レチノイン酸、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、スロンボポイエチン（ＴＰＯ）及び／又はエリスロポイエチン（ＥＰＯ）を含む群から選択される少なくともひとつである。
【００９１】
上で説明した通り、前記分離物質は（最初は）完全に非透過性物質であってよく、前記カプセル化された細胞分散物及び／又は細胞シグナル分子を含む溶液が区画から出ることを抑制する。さらなる実施態様によれば、前記シリンダの少なくともひとつに含まれる前記分離物質は生分解性及び／又は細胞シグナル分子に透過性である。好ましい実施態様において、全てのシリンダの前記分離物質生分解性及び／又は細胞シグナル分子に透過性である。前記分離物質が生分解性である場合、前記カプセル化層は−時間の経過後−分解され従って区画内の内容物が放出されるようになる。さらに及び特に再生医薬、特に細胞治療及び再生医学に適合するものとして、前記生分解性物質で形成されるカプセル化層は完全に分解され、患者の体内には残存しないものである。一例として、図２又は図３による押出された製品が患者に導入され、本発明の押出された製品の最も外側をカプセル化して保護する層３は−所与の時間経過後−完全に分解され、前記細胞２のみを残し、当該細胞は分化し、例えばその時間まで組織化するであろう。
【００９２】
さらなる実施態様において、前記分離物質は、ゲル、自己ゲル化又は重合によるゲル化物である。好ましくは前記重合反応は光重合反応である。より好ましくは前記光重合反応はＵＶ照射により開始される。
【００９３】
さらなる実施態様において、本発明の前記ノズルを含む装置が開示される。好ましくは前記装置は押出し装置である。
【００９４】
本発明のひとつの実施態様によれば、前記押出し装置はさらに少なくともひとつの光重合反応のための放射源９を含み、前記光重合反応の放射源は、前記光重合性分離物質を含む前記それぞれのシリンダの前記端部に近接して設けられる。ひとつの好ましい実施態様では、前記押出し装置は、ひとつ以上の放射源を含み、光重合性分離物質を含む前記シリンダの前記それぞれの端部に設けられる（図４、（９））。
【００９５】
さらなる実施態様において、前記放射源は、ＵＶ光源である。具体的実施態様において、前記放射源は高強度平行（ｃｏｌｌｉｍａｔｅｄ）ＵＶ源であり、その強度は≧０．１ｍＷ／ｃｍ２及び≦５Ｗ／ｃｍ２、≧１ｍＷ／ｃｍ２及び≦１Ｗ／ｃｍ２、≧２００ｍＷ／ｃｍ２及び≦５００ｍＷ／ｃｍ２、又は０．３Ｗ／ｃｍ２である。
【００９６】
さらなる具体的実施態様において、前記押出し装置はシャッタ、好ましくは高速度シャッタを含む。前記シャッタは前記放射源に結合されていてよい。
【００９７】
さらなる実施態様において、前記押出し装置はパルス押出しモードの手段を含む。前記パルス押出しモードは、閉鎖された押出し製品７を生成するために用いられる。この押出しモードは、特定のフロープロファイル、即ち押出される物質の流速の時間依存変化に基づく。ひとつの具体的実施態様において、前記分離物質の流速は最初（即ちｔ＝０秒）所定値（例えば０．５ｍ／分）で、一方前記細胞分散物又は細胞シグナル分子を含む溶液の流速は０ｍ／分である。従って、分離物質は前記細胞分散物を含むシリンダを囲むシリンダから押出されるが細胞分散物は押出されないことになる。従って前記押出された分離物質は、例えば前記分離物質は光重合性であり、かつＵＶ光源が前記分離物質を含むシリンダの出口点に位置されている場合、シールを形成することになる。その後の時点（例えばｔ＝０．５秒）で、前記細胞分散物の流速を前記分離物質の流速まで増加させる（前記分離物質の流速をその前に遅くすることも可能である）。従って、前記細胞分散物は、前記分離物質とともに押出される。前記分離物質はそのそれぞれのシリンダから出る際に光重合反応する。さらに時間経過後（例えばｔ＝１．５秒）で、細胞分散物の流速を再び停止、分離物質の流速は維持されるか増加され、再び分離物質によるシールが形成されることになる。その結果、細胞分散物を含む区画は、分離物質の層で閉鎖され、前記区画は閉鎖端７を有する。
【００９８】
他の実施態様において、前記外側及び内側のシリンダの当該フロープロフィルが多数回繰り返されて細胞分散物で満たされた閉鎖端区画を複数個生成する。従って本発明はさらに、複数個の細胞分散物で満たされた閉鎖端区画の製造方法を提供する。
【００９９】
ひとつのパルス押出しモードの例において、共押出しがパルス式で実行され、一方前記ＵＶ源の前の前記シャッタは常時開かれている。外側のシリンダ内の前記モノマー溶液がｔ＝０から１ｍ／分の流速で押出される。前記細胞分散物からの流速はこの時間では０ｍ／分である。ｔ＝０．５秒で、外側シリンダの流速を０．５ｍ／分に減速し、同時に内側シリンダの流速を０から０．５ｍ／分に増加する。ｔ＝１．５秒で、当該流速を再び停止すると同時に外側シリンダの流速を１ｍ／分に増加する。ｔ＝２秒で、すべての流速をゼロに設定する。このプロフィルの結果、閉鎖端区画７となる。
【０１００】
具体的実施態様において、前記分離物質の流速、細胞分散物の流速及び／又は細胞シグナル分子を含む溶液の流速は、≧０ｍ／分及び≦１０ｍ／分、≧０ｍ／分及び≦８ｍ／分、≧０ｍ／分及び≦６ｍ／分、≧０ｍ／分及び≦４ｍ／分、≧０ｍ／分及び≦２ｍ／分、≧０ｍ／分及び≦１．５ｍ／分、≧０ｍ／分及び≦１ｍ／分、≧０ｍ／分及び≦０．５ｍ／分である。
【０１０１】
本発明のさらなる側面は、本発明の前記ノズル又は押出し装置の使用であり、分離物質によるカプセル化された複数の細胞を含む細胞分散物を含む少なくともひとつの細長い区画を製造するための使用に関する（図２、３参照）。好ましくは図５及び６に示されるように、前記細長い区画は少なくとも２つのスタック／入れ子構造の区画を含む。
本発明のさらなる側面は、本発明のノズル又は押出し装置の使用であり、分離物質の層によりカプセル化された複数の細胞を含む細胞分散物を含む、少なくとも２つの結合する区画（結合された区画）の製造のための使用である。結合する区画（結合された区画）とは、連続して押出され、特に実施例３で説明されるように閉鎖部７で分離された区画を意味する。好ましくは前記少なくとも２つの結合する区画は、例えば図５及び６で示される少なくとも２つのスタック／入れ子構造の区画を含む。
【０１０２】
この技術分野の熟練者にとって、前記記載に基づき、分離物質の層によりカプセル化されたかかる区画のひとつ以上を同時に製造するための使用がまた、本発明の範囲に含まれることは明らかであろう。本発明によりひとつ以上のカプセル化された区画を製造する場合、結果として得られる区画は入れ子構造となる。即ち、得られる押出された製品は第一の区画であって分離物質の層でカプセル化され、これは分離物質の層でカプセル化された他の区画で囲まれている。この技術分野の熟練者にとって、区画が「入れ子構造」が、２つ以上の区画に、好ましくは３、４又は５区画に拡張可能であることは明らかであろう。
【０１０３】
好ましい実施態様において、本発明の前記ノズル又は押出し装置は２つの入れ子構造の区画の製造に使用することが可能である。ここで、ひとつの区画が細胞分散物を含み、他の区画が同じタイプの細胞分散物又は異なるタイプの細胞分散物を含むか、又は細胞シグナル分子を含む溶液を含む（図５及び５）。
【０１０４】
本発明の方法は、分離物質の層で囲まれた、複数の細胞を含む細胞分散物及び／又は細胞シグナル分子を含む溶液を含む区画を生成することができる。全ての区画をカプセル化する分離物質の層で囲うことは、この区画を保護し、及び細胞分散物の場合には前記区画内で前記細胞を保持することでカプセル化された細胞間の接触を確実にする。さらに、分離物質のカプセル化層は、２つの隣接する区画であって細胞分散物又は細胞シグナル分子を含む溶液を含む区画を分離することが可能となり、前記２つの区画の内容物の混合を抑制したり遅らせたり（例えば生分解性及び／又は選択的透過性物質の使用）することが可能である。さらに、前記分離層は前記２つの区画内の内容物の交換を可能とする（例えば選択的透過性物質の使用）。具体的実施態様において、前記分離物質は、生分解性物質である。
【０１０５】
ひとつの実施態様において本発明は、細胞分散物のカプセル化及び／又はカプセル化ミクロ組織の生成方法を提供する。ここで少なくともひとつの細胞分散物、少なくともひとつの分離物質及び場合により少なくともひとつの細胞シグナル分子を含む溶液が共押出しされ、細胞分散物又は細胞シグナル分子を含む溶液が分離物質の層により分離され、及び得られる最も外側の層が分離物質を含む（即ち、分離物質は前記ノズルの前記最も外側のシリンダから押出される）。
【０１０６】
具体的実施態様において、前記分離物質、細胞分散物及び／又は細胞シグナル分子を含む溶液の流速は、≧０ｍ／分及び≦１０ｍ／分、≧０ｍ／分及び≦８ｍ／分、≧０ｍ／分及び≦６ｍ／分、≧０ｍ／分及び≦４ｍ／分、≧０ｍ／分及び≦２ｍ／分、≧０ｍ／分及び≦１．５ｍ／分、≧０ｍ／分及び≦１ｍ／分、≧０ｍ／分及び≦０．５ｍ／分である。
【０１０７】
本発明のさらなる具体的な実施態様においては、前記細胞は、幹細胞、前駆細胞、完全分化細胞、神経細胞、グリア細胞、シュワン細胞、オリゴデンドロサイト、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、膵前駆細胞、フィーダー細胞、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、多分化能幹細胞、体性幹細胞、骨髄幹細胞及び／又はリンパ幹細胞を含む群から選択される。
【０１０８】
ひとつの実施態様において、本発明の方法は、１以上の区画の生成を提供する。ここで、前記区画は入れ子構造／スタック構造である。一例及びより好ましい実施態様として、本発明の方法は、中心区画の生成であり、当該中心区画はタイプ１の細胞の細胞分散物を含み（図５及び６（１、２））、分離物質の層で囲まれているかカプセル化されており（図５及び６（３））、かつこの分離物質の層自体がさらに、タイプ２の細胞の細胞分散物を含む区画で囲まれ（図５及び６（４、５））、さらに当該区画が同様に分離物質の層によりカプセル化されている（図５及び６（６））。従って、得られる押出された製品において、タイプ１の細胞はタイプ２の細胞から、分離物質の層により分離されている。
【０１０９】
本発明の（一時的に）カプセル化された細胞分散物は、再生医薬の分野、より好ましくは生体内細胞移植のために極めて価値がある。
【０１１０】
好ましくは、得られる押出されたカプセル化細胞分散物（例えば図２及び図５）は、さらなるステップで、この技術分野の熟練者にとって知られた適切な条件でカプセル化されたミクロ組織を形成させるために培養される（図３及び図６）。
【０１１１】
本発明の方法は、中空の繊維性ミクロ組織の生成を可能とする。ここで複数の細胞を含む単一の分散物及び単一の取り囲む分離物質は同軸に押出されて、得られる区画が分離物質の層でカプセル化された前記細胞分散物を含む。これは例えば図２で示される。さらには、前記押出された製品がこの技術分野の熟練者にとって知られた適切な条件で中空繊維状ミクロ組織を形成させるために培養される。これは例えば図３で示される。
【０１１２】
本発明の方法は、中空の繊維状均一又は不均一ミクロ組織の生成を可能とする。ここで、細胞分散物を含む少なくともひとつの区画とさらに細胞分散物又は細胞シグナル分子を含む溶液を含む少なくともひとつの区画を同軸共押出しされる。この実施例の例として図４及び図５に示される。さらには、前記押出された製品がこの技術分野の熟練者にとって知られた適切な条件で中空繊維状ミクロ組織を形成させるために培養される。これは例えば図６で示される。
【０１１３】
本発明の方法により生成されるミクロ組織の具体的実施態様は、神経組織、循環組織、骨組織、腎組織及び／又は肝組織が含まれる。
【０１１４】
かかる（一時的）カプセル化された均一及び不均一ミクロ組織は、再生医薬の分野、より好ましくは生体内ミクロ組織移植のために極めて価値がある。
【０１１５】
ひとつの実施態様において、前記分離物質は生分解性である。従って、カプセル化／分離は一時的である。というのは前記分離物質は時間経過とともに、例えば前記カプセル化された細胞分散物を患者の体内へ導入した後分解されていくからである。
【０１１６】
さらなる実施態様において、前記分離物質は選択的透過性である。従って、２つの隣接する区画間で選択的交換が実行可能である。一例及び好ましい実施態様として、ひとつの区画が幹細胞を含み隣接する区画がフィーダー細胞を含んでいてよい。前記分離物質が前記フィーダー細胞により作られる前記細胞シグナル分子に対して透過性であるが両方の細胞に対しては透過性でない場合、前記幹細胞は前記フィーダー細胞と非常に近接したまま保持され（幹細胞の維持及び増殖は保証され）これら２つの細胞は混合されることがない。
【０１１７】
さらなる実施態様において、前記細胞は、幹細胞、前駆細胞、完全分化細胞、神経細胞、グリア細胞、シュワン細胞、オリゴデンドロサイト、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、膵前駆細胞、フィーダー細胞、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、多分化能幹細胞、体性幹細胞、骨髄幹細胞及び／又はリンパ幹細胞を含む群から選択される。
【０１１８】
ひとつの実施態様において、本発明の方法は、細胞分散物の複数の細胞をカプセル化する製造方法を提供する。ここで、複数の細胞を含む単一の分散物及びこれを囲む単一の分離物質が同軸共押出しされる。従って、得られる区画は、分離物質の単一の保護層でカプセル化された前記細胞分散物を含み、例えば図２に示されるとおりである。好ましい実施態様では、得られるカプセル化された細胞分散物はさらなるステップで、この技術分野の熟練者にとって知られた適切な条件でミクロ組織を形成させるために培養される。これは例えば図３で示される。
【０１１９】
他の実施態様において、中空繊維状ミクロ組織の生成方法が提供され、ここで複数の細胞を含む単一の分散物が、分離物の２つの層間で同軸共押出しされる。従って、前記分離物質は前記ノズルの前記中心シリンダ内で押出され、これは細胞分散物で囲まれており、当該細胞分散物自体は再び分離物質の層によりカプセル化されている。好ましい実施態様において、得られる押出された製品は、その後さらなるステップで、この技術分野の熟練者にとって知られた適切な条件で最終的に中心チャネルを持つ中空繊維状ミクロ組織を形成させるために培養される。この方法で生成され得るミクロ組織の例は神経組織（例えばグリア細胞を形成する、ミエリン鞘で囲まれたニューロン細胞）、血液循環組織及び／又は骨組織である。
【０１２０】
他の実施態様において、均一又は不均一ミクロ組織の製造方法が提供される。ここで、複数の細胞を含む２つの分散物と、２つの分離物質が同軸共押出しされる。従って、図４、５及び６に示されるように、４つの同軸シリンダを含むノズルが用いられる。ここで、第一のシリンダが細胞分散物１を含み、第二のシリンダが細胞分散物４を含む。細胞分散物又は細胞シグナル分子を含む溶液を含むシリンダは、お互いに分離物質を含むシリンダにより分離され、最も外側のシリンダは同様に分離物質を含む。得られる押出された製品は（図５に例示）従って、細胞分散物１を含む中心層を含み、それは分離物質３でカプセル化され、かかる分離物質３はまた他の細胞分散物４を含む層によりカプセル化され、この細胞分散物４はさらに分離物質６の最も外側の層によりカプセル化されている。好ましい実施態様において、得られる押出された製品はその後さらなるステップで、この技術分野の熟練者にとって知られた適切な条件で最終的に状ミクロ組織を形成させるために培養される。
【０１２１】
具体的実施態様において、前記２つの細胞分散物の細胞は同じタイプの細胞である。
【０１２２】
さらなる実施態様において、前記２つの細胞分散物の細胞は異なるタイプの細胞である（図４、５、６（２）及び（５））。異なるタイプの細胞が用いられる場合、不均一組織が得られる。他の実施態様において、前記タイプの細胞のひとつ又は両方は、幹細胞、前駆細胞、完全分化細胞、神経細胞、グリア細胞、シュワン細胞、オリゴデンドロサイト、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、膵前駆細胞、フィーダー細胞、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、多分化能幹細胞、体性幹細胞、骨髄幹細胞及び／又はリンパ幹細胞を含む群から選択される。
【０１２３】
具体的実施態様において、本発明により得られるミクロ組織は、神経組織、血液循環組織、骨組織、腎組織及び／又は肝組織である。
【０１２４】
更なる実施態様において、前記２つの層（３）及び（６）で使用した分離物質は同じ物質である。他の好ましい実施態様では、前記２つの層３、６で使用した物質は異なる分離物質である。  
ひとつの実施態様において、図４に示されるように、最も内側のシリンダはタイプ１（２）の細胞を含む細胞分散物１を含み、分離物質３を含むシリンダで囲まれており、分離物質３を含むシリンダはタイプ２（５）の細胞を含む細胞を含むシリンダで囲まれている。更に再び最も外側のシリンダは分離物質６を含む。当該ノズルを用いて、同軸ミクロ組織のような繊維性不均一組織を作成することができる。これは図５及び６に示される（それぞれ、培養の初期状態及び培養が進行した状態を示す）。
【０１２５】
他の実施態様において、タイプ１の前記細胞はニューロン細胞及びタイプ２の細胞はグリア細胞（シュワイン細胞又はオリゴデンドロサイト）である。
【０１２６】
さらなる実施態様において、タイプ１細胞は幹細胞であり、タイプ２の細胞はフィーダー細胞である。好ましい実施態様において、ひとつ又は両方の細胞が、細胞シグナル分子を分泌して相手の細胞に影響を与えるものである。
【０１２７】
他の実施態様において、前記２つの細胞区画を分離する分離物質の層は、生分解性及び／又は選択的細胞シグナル分子透過性である。
【０１２８】
他の実施態様において、繊維状ミクロ組織の生成方法が提供される。ここで、複数の細胞を含むひとつの分散物、細胞シグナル分子を含むひとつの溶液及び２つの分離物質が、同軸共押出しされる。従って、４つの同軸シリンダを含むノズルが使用される。ここで、細胞分散物及び細胞シグナル分子を含む溶液を含む２つのシリンダが存在し、これらは分離物質を含むシリンダで分離されている。さらに最も外側のシリンダが分離物質を含む。
【０１２９】
ひとつの具体的実施態様において、前記細胞分散物は細胞シグナル分子を含む溶液を含む区画により囲まれる前記中心区画として押出される。従って、得られる押出された製品は、細胞分散物を含む中心区画であって分離物質の層でカプセル化されており、前記分離物質の層自体が細胞シグナル分子を含む溶液を含む区画で囲まれており、さらに細胞シグナル分子を含む溶液を含む区画は分離物質の最終層でカプセル化されている。
【０１３０】
他の実施態様において、細胞シグナル分子を含む溶液は前記中心区画であって前記細胞分散物を含む区画で囲まれる区画として押出される。従って、得られる押出された製品は、細胞シグナル分子を含む溶液を含む中心区画で分離物質の層によりカプセル化された区画を含み、分離物質の層自体が細胞分散物を含む区画により囲まれており、細胞分散物を含む区画が分離物質の最終的な層でカプセル化されている。
【０１３１】
好ましい実施態様において、前記押出された製品は、その後さらなるステップで、この技術分野の熟練者にとって知られた条件を用いてミクロ組織を形成することができる。
【０１３２】
本発明のこの実施態様により、例えば同軸状のミクロ組織である繊維状の組織を製造することができる。ここで、前記細胞は、細胞シグナル分子を含み溶液と共に共押出しされる。かかる細胞シグナル分子は、例えば前記細胞の分化に効果的なものである。
【０１３３】
上で説明したとおり、前記分離物質はゲル形成物質、ゲル及び／又は重合性物質であり得る。本発明の他の実施態様においては、押出される分離物質の少なくともひとつは光重合性であり、本発明はさらに前記光重合性物質の光重合反応のステップを含み。図１又は図４に示されるように、光重合反応は放射源９により達成され得る。好ましくは、放射源は前記ノズルから前記分離物質が放出される点の近くに設けられる。従って、放射源は前記ノズルからそれぞれの分離物質が放出される点の近隣（前又は後）に設けられることができる（図４で例示される）。放射源は、前記分離物質の光重合反応が、他の層、例えば細胞分散物の層が同軸共押出しされて前記分離物質の層と接触してもこれら２つの層が混合しないように十分に進行することを確実にする。
【０１３４】
好ましい実施態様において、前記放射源はＵＶ源である。具体的実施態様において、放射源は、高強度の平行ＵＶ源で、その強度が、≧０．１ｍＷ／ｃｍ２及び≦５Ｗ／ｃｍ２、≧１ｍＷ／ｃｍ２及び≦１Ｗ／ｃｍ２、≧２００ｍＷ／ｃｍ２及び≦５００ｍＷ／ｃｍ２又は０．３Ｗ／ｃｍ２である。さらなる実施態様においては、ＵＶ源のピーク波長は、≧１００ｎｍ及び≦５００ｎｍ、≧２００ｎｍ及び≦４００ｎｍ又は≧３００ｎｍ及び≦３５０ｎｍである。
【０１３５】
他の具体的実施態様においては、光重合反応で使用する投与量（即ち時間＊強度）は、≧３００ｍＪ／ｃｍ２及び≦１５００ｍＪ／ｃｍ２、≧５００ｍＪ／ｃｍ２及び≦１０００ｍＪ／ｃｍ２、≧６００ｍＪ／ｃｍ２及び≦９００ｍＪ／ｃｍ２である。本発明において適切なＵＶ源は例えばＦｕｓｉｏｎ  ＵＶ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡから入手可能である。
【０１３６】
本発明の他の好ましい実施態様によると、前記押出しは、パルス式共押出しモードで実行し前記区画を閉鎖することができる。上記のとおり、パルス式押出しモードは、閉鎖された押出された製品７を製造するために適用される。ここで、前記シリンダ内の細胞分散物、細胞シグナル分子を含み溶液及び／又は分離物質の流速は一定に維持されるのではなく押出しの間に変更される。かかるフロープロフィルを適用することで、押出された区画の閉鎖が達成される。
【０１３７】
本発明の他の側面は、カプセル化された細胞分散物又はミクロ組織であり、これらは本発明の方法により、又は本発明のノズルを使用することにより製造される。本発明は、これは分離物質の保護層により囲まれた単一の区画内にある、同軸にカプセル化された細胞分散物、好ましくは培養細胞の分散物を提供するものである。複数の細胞のかかる同軸カプセル化は、本発明による同軸共押出しにより達成され、前記カプセル化された細胞はその活性が増加される結果となる。というのはこれらの細胞はお互いに接触しているからである。さらに、細胞間接触が存在することから、これらのカプセル化された細胞からミクロ組織への形成も同様により頻繁により容易に生じる。
【０１３８】
本発明による複数の細胞（培養細胞）のカプセル化は、カプセル化された細胞の細胞間相互作用を可能にし、その結果前記細胞をより活発にし、ミクロ組織への形成機会を高めるものであることから、本発明によるカプセル化された細胞分散物及び／又はミクロ組織は医薬品として、例えば種々の細胞治療応用及び／又は生体内ミクロ組織移植において、使用されることが可能である。
【０１３９】
本発明のさらなる実施態様において、本発明は、医薬品としての、カプセル化された細胞分散物又はミクロ組織に関する。特に好ましい実施態様において本発明は、カプセル化された細胞分散物又はミクロ組織の再生医薬の応用への医薬品に関する。再生医薬のかかる応用の例及び好ましい実施態様は、細胞治療及び／又はミクロ組織移植、心臓発作や虚血による傷害、麻痺、神経性変性／疾患、アルツハイマー又はパーキンソン病又は糖尿病が挙げられる。
【０１４０】
本発明のさらなる側面は、カプセル化された細胞分散物又はミクロ組織を損傷組織領域に移植することである。この実施態様において、前記損傷組織の組織機能の回復を助ける幹細胞（又はそれから生成されたミクロ組織）が好ましく使用可能である。かかる方法は、神経性変性疾患、例えばアルツハイマーやパーキンソン病の治療に非常に将来有望であり、また例えば心臓発作の結果の壊死組織の修復においても同様である。
【０１４１】
具体的実施態様において、カプセル化された細胞分散物及び／又はミクロ組織は、糖尿病及びそれに伴う症状治療のための医薬として使用される。具体的実施態様においては、前記医薬は、新しいβ−細胞及び／又は幹細胞を含み、かかる細胞に分化することができる。さらに具体的実施態様において、前記医薬は糖尿病に苦しむ患者のすい臓に移植される。
【０１４２】
他の具体的実施態様において、カプセル化された細胞分散物及び／又はミクロ組織は、神経性変性疾患、例えばパーキンソン病及びそれに伴う症状を治療するための医薬として使用される。具体的実施態様において、前記医薬は、新しい神経細胞及び／又は幹細胞を含み、それら細胞に分化することができる。さらなる実施態様において、前記医薬は、神経性変性疾患で苦しむ患者の中枢神経系、好ましくは大脳へ運ばれる。パーキンソン病の場合、かかる細胞は、例えば、ドーパミン生産を回復させる。
【０１４３】
他の実施態様において、カプセル化された細胞分散物及び／又はミクロ組織は、脊椎傷害及び／又は麻痺の治療のための医薬として使用される。具体的実施態様においては、前記医薬は、新しい神経細胞及び／又は幹細胞を含み、これらはかかる細胞に分化することができる。さらなる具体的実施態様においては、前記医薬は、脊椎損傷及び／又は麻痺に苦しむ患者の脊椎に運ばれ、運動機能が回復される。
【０１４４】
他の具体的実施態様においては、カプセル化された細胞分散物及び／又はミクロ組織は、心筋梗塞およびそれに伴う症状の治療のための医薬として使用される。心筋梗塞は、心筋細胞の大量の損失を引き起こし、繊維性組織の形成及び残った心筋の肥大応答を生じる。これにより心臓機能に欠陥をもたらす。好ましい実施態様において、本発明のカプセル化された細胞分散物又はミクロ組織は心筋内注入により患者に運ばれる。より好ましくはこの注入はカテーテルにより行われる。好ましい実施態様において、前記医薬は、新しい心筋細胞（心筋細胞）及び／又は幹細胞を含み、これらはかかる細胞に発展することができる。
【０１４５】
好ましい実施態様においては、本発明のカプセル化された細胞分散物又はミクロ組織は注入により患者に運ばれる。より好ましくはこの注入はカテーテルにより実行される。本発明のカプセル化された細胞分散物又はミクロ組織の他の適用方法は、ホトニックニードル法（ｐｈｏｔｏｎｉｃ  ｎｅｅｄｌｅ  ｃｏｎｃｅｐｔ）の適用である。ホトニックニードルは、光ファイバが含まれ、針を適用する際、例えば本発明のカプセル化細胞分散物又はミクロ組織を投与する目的で針を適用する際に光学イメージを可能とするものである。光ファイバはまた、ＵＶ光と結合させて使用することが可能であり、このＵＶ光は身体内で押出したモノマーを重合させるために使用することができる出口近くに設けられる。従って、ホトニックニードルは、本発明のノズルとして設計され、本発明のカプセル化細胞分散物又はミクロ組織が患者の身体内で押出されることを可能とする。
【０１４６】
他の実施態様において、本発明のミクロ組織は、再生医学の分野の主要な問題であるひとつを解決するために組織を形成するために使用することができる。組織の厚さが約１００μｍよりも厚い組織が生体外で生成しようとする場合、通常、前記組織の内側に位置する細胞に例えば栄養や酸素を供給することに問題を生じる。従って、最も内側の細胞が死ぬことから約１００μｍよりも厚い組織は現在の方法では生産することができない。
【０１４７】
この不利益は、本発明により克服される。本発明のミクロ組織は、お互いの上にスタックされて厚さ≧１００μｍ、好ましくは厚さ≧１ｃｍ、より好ましくは厚さ≧２ｃｍの組織を形成することができる。
【０１４８】
本発明のミクロ組織をスタックすることで、細胞からはいかなる固体も形成されずむしろ繊維状の及び細長い複数の細胞を含む区画のメッシュが形成される。これらのカプセル化された区画の間に、ガス交換及び例えば媒体が容易に到達可能となり、例えば循環系が再生された組織内に形成されるまで前記細胞に十分な栄養が供給されることが可能となる。
【０１４９】
本発明は従って、組織生成の方法であり、本発明により得られ得る組織と同じく、本発明による少なくとも２つのミクロ組織をスタックすることを含む。具体的実施態様において、再生された組織は不均一再生組織である。
【０１５０】
さらなる実施態様においては、前記組織は、厚さ≧１００μｍ及び≦５ｃｍである。さらなる他の具体的実施態様においては、前記組織は、厚さ≧３００μｍ及び≦２ｃｍである。さらなる他の具体的実施態様においては、前記組織は、厚さ≧５００μｍ及び≦１ｃｍである。
【０１５１】
さらなる実施態様においては、≧１及び≦１００のミクロ組織がスタックされる。さらなる実施態様においては、≧１０及び≦９０、≧２０及び≦８０、≧３０及び≦７０、≧４０及び≦６０のミクロ組織がスタックされる。さらなる実施態様においては、≧２及び≦１０、≧３及び≦９、≧４及び≦８、≧５及び≦７のミクロ組織がスタックされる。
【０１５２】
本発明は図面及びこれまでの記載により詳細に説明及び記載されてきたが、かかる記載及び説明は説明又は例示の目的のためであって決して限定するためではない。本発明は開示された実施態様に制限されるものではない。
【０１５３】
開示された実施態様の他の変形例についても、この技術分野の熟練者にとって図面、開示及び添付の特許請求の範囲を参照することで、請求された発明を実施する上で理解されることができる特許請求の範囲において、「含む」なる用語は他の要素やステップを排除するものではない。「ひとつの」なる用語は、複数の意味を排除するものではない。単に特定の手段が相互に異なる従属請求項に記載されているからといって、これらの組み合わせが有効ではないということを示すものではない。特許請求の範囲のすべての参照符号は、本発明の範囲を制限するように解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１５４】
実施例１
真核生物扁平上皮癌細胞Ａ４３１（ＡＣＴＴ番号ＣＲＬ１５５５）を、培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ）に牛胎児血清１０％、１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補足した培養液で、標準細胞培養条件（３７℃、５％ＣＯ２、〜９５％湿度）で培養した。
【０１５５】
２日後前記細胞はコンフルエント細胞層を形成した。培地を除いた。細胞を２回リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、さらに１０分間ＥＤＴＡ／トリプシンでインキュベートした。１０ｍｌの培地を加えて細胞分散物を得た。
【０１５６】
細胞分散物（１ｘ１０５細胞／ｍｌ）を同軸押出し装置の中心シリンダに入れた。一方分離物質［アクリルアミド（１０ｗ／ｗ％）の水溶液、ビスアクリルアミド（１０ｗ／ｗ％及び光開始剤、イルガキュア（Ｉｒｇａｃｕｒｅ）２９５９（０．１％）］を外側のシリンダに入れた。
【０１５７】
前記外側のシリンダ内のモノマー溶液及び内側のシリンダの前記細胞分散物を、流速１ｍ／分で共押出しした。
【０１５８】
高速シャッタ付きの平行化ＵＶ源（０．３Ｗ／ｃｍ２）を前記押出し装置のノズル出口に設けた。細胞分散物及び分離物質の共押出しの間、シャッタを開閉周波数１Ｈｚで行った。
【０１５９】
アクリルアミド／ビスアクリルアミド混合物の光重合反応により、複数のＡ４３１細胞を含みポリアクリルアミドの層で囲まれてカプセル化された、端が開いた区画を得た。
【０１６０】
実施例２
パルス押出し装置を用いた実施例１と同様に行った。ここで、前記ＵＶ源の前のシャッタを連続して開放とした。用いたフロープロフィルは以下の通りである。
【０１６１】
ｔ＝０で、外側のシリンダ内のモノマー溶液を１ｍ／分の流速で押出し、細胞分散物の流速を０ｍ／分とした。
【０１６２】
ｔ＝０．５で、外側のシリンダ内のモノマー溶液を０．５ｍ／分の流速に減速し、内側のシリンダ（細胞分散物）の流速を０から０．５ｍ／分と増加した。
【０１６３】
ｔ＝１．５で、細胞分散物の流速を再び停止、外側シリンダの流速は１ｍ／分に戻した。
【０１６４】
ｔ＝２で、全ての流速をゼロとした。
【０１６５】
この実験条件により、Ａ４３１細胞分散物を含み、ポリアクリルアミド層により囲まれてカプセル化された閉鎖端部区画が形成された。
【０１６６】
実施例３
実施例２を繰り返したが、フロープロフィルを３０回繰り返した。
【０１６７】
この実験条件により、Ａ３４１細胞分散物を含み、ポリアクリルアミドの層で囲まれてカプセル化された、約３０個の結合された閉鎖端区画が形成された。
【０１６８】
実施例４
実施例２を繰り返した。ここで使用したノズルは３つのシリンダを含む。
【０１６９】
前記モノマー溶液を、中心シリンダ及び外側シリンダに入れ、細胞分散物を中間のシリンダに入れた。共押出しを上記与えられた流速で実施した。高速シャッタを付けた２つの高強度平行化ＵＶ源（０．３Ｗ／ｃｍ２）をそれぞれの分離物質を複数のシリンダの出口点に設けた。
【０１７０】
この実験条件により、分離物質の層でカプセル化されたＡ４３１細胞分散物を含む閉鎖端細長い区画でありさらに分離物質の中心チューブを含む区画が形成された。
【０１７１】
実施例５
実験条件は実施例２の条件と類似であるが、使用したノズルは４つに同軸シリンダであった。
【０１７２】
さらに、Ａ４３１細胞を、この技術分野の熟練者にとって知られた条件で培養されたプライマリ神経細胞と置き換えた。さらに、この技術分野の熟練者にとって知られた条件で培養されたプライマリグリア細胞の複数の（１ｘ１０５個／ｍｌ）細胞分散物を準備した。
【０１７３】
前記神経細胞を含む細胞分散物を中心シリンダに入れた。グリア細胞を含む細胞分散物を第３のシリンダ（最も内部のシリンダから数えて）に入れた。分離物質を最も外側のシリンダ及び前記細胞分散物を含む２つのシリンダの間のシリンダに入れた。
【０１７４】
押出し装置のシリンダを次の手順で押出した（最も内側のシリンダから始める）：
神経細胞分散物−分離物質−グリア細胞分散物−分離物質
高速シャッタ付き２つの高強度平行化ＵＶ源（０．３Ｗ／ｃｍ２）を分離物質を含むそれぞれのシリンダの出口点の設けた。
【０１７５】
この実験条件により、閉鎖端を持つ区画であって、神経細胞分散物を含む、ポリアクリルアミドの層により囲まれてカプセル化され、それがグリア細胞分散物により囲まれ、さらに同様にそれがポリアクリルアミドの層で囲まれた、区画を形成した。
【０１７６】
実施例６
実施例５を繰り返した。ここでＡ４３１細胞をヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）と交換した。また第二の細胞分散物を繊維芽成長因子−２０（ＦＧＦ−２０）の１０ｎｇ／ｍｌ培地の濃度の溶液と交換した。
【０１７７】
押出し装置のシリンダを次の手順で準備した（最も内側のシリンダから始める）：
ｈＥＳＣ細胞分散物−分離物質−ＦＧＦ−２０溶液−分離物質
この実験条件により、閉鎖端区画であって、ｈＥＳＣ細胞分散物を含み、回りをポリアクリルアミド層で囲まれ、さらに細胞シグナル分子ＦＧＦ−２０を含む溶液で囲まれ、さらに同様にポリアクリルアミド層でその外側を囲まれた区画を形成した。
【０１７８】
実施例７
実施例６を繰り返す。使用されるノズルは、６つの同軸シリンダを含む。さらに追加の細胞分散物がＰＡ６マウス間質細胞（１ｘ１０５個／ｍｌ）が準備される。
【０１７９】
押出し装置のシリンダを次の手順で準備した（最も内側のシリンダから始める）：
細胞シグナル分子を含む溶液−分離物質−ｈＥＳＣ細胞分散物−分離物質−ＰＡ６細胞分散物−分離物質
高速シャッタ付き３つの高強度平行化ＵＶ源（０．３Ｗ／ｃｍ２）を、分離物質を含むそれぞれのシリンダの出口点の設けた。
【０１８０】
この実験条件により、閉鎖端区画であって、ＦＧＦ−２０の溶液を含み、ポリアクリルアミド層でカプセル化され、これがさらにポリアクリルアミド層で囲まれてカプセル化されたｈＥＳＣ細胞分散物を含み、これはさらにポリアクリルアミド層で外側を囲まれたＰＡ６細胞分散物で囲まれ、さらに同様にポリアクリルアミド層でその外側を囲まれた区画、を形成した。
【０１８１】
得られた押出された製品は３週間この技術分野の熟練者にとって知られた条件で培養された。続いて初めｈＳＥＣを含んでいた区画を切り開き、生成されたミクロ組織を、チロシンヒドロキシラーゼ発現につき分析する。チロシンヒドロキシラーゼを発現する大量の細胞が検出されることが予想され、この結果はｈＥＳＣから誘導されるドーパミン作動性神経細胞が生成されたことを示す。かかるドーパミン作動性神経細胞はパーキンソン病の治療において高い利用性があるであろう。
【０１８２】
実施例８
実施例１及び２が繰り返される。ここで分離物質が生分解性分離物質である：ポリ酢酸系クロスリンク（ビス［ポリ（Ｌ−ラクチド）］３、６、９、１２、１５−ペンタオキサヘプタデカン−１、１７−ジオキシカルボニル末端ジアクリレート）である。
【０１８３】
得られるカプセル化された区画は実施例１、２の区画と比べることができる。
【図１】
2012510268.tif 000003
【図２ａ】
2012510268.tif 000004
【図２ｂ】
2012510268.tif 000005
【図３ａ】
2012510268.tif 000006
【図３ｂ】
2012510268.tif 000007
【図４】
2012510268.tif 000008
【図５ａ】
2012510268.tif 000009
【図５ｂ】
2012510268.tif 000010
【図６ａ】
2012510268.tif 000011
【図６ｂ】
2012510268.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成23年6月3日(2011.6.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
共押出しのためのノズルであり、それぞれが細胞分散物、細胞シグナル分子又は分離物質を含む溶液を含む、少なくとも２つのシリンダを含み、
細胞分散物又は細胞シグナル分子を含み溶液を含みシリンダが分離物質を含むシリンダのより分離され、
前記最も外のシリンダが分離物質を含み、
前記分離物質が、ＵＶ照射により誘起される光重合反応により重合するゲルである、ノズル。
【請求項２】
請求項１に記載のノズルであり、４つの同軸シリンダを含み、第一のシリンダは細胞分散物を含み、第二のシリンダは細胞分散物又は細胞シグナル分子を含み溶液を含む、ノズル。
【請求項３】
請求項１に記載のノズルであり、前記シリンダの少なくとも１つの前記分離物質が生分解性及び／又は細胞シグナル分子アに対して透過性である、ノズル。
【請求項４】
請求項１に記載の前記ノズルを含む押出し装置。
【請求項５】
請求項４に記載の押出し装置であり、さらに少なくともひとつの光重合反応のための照射源を含み、前記光重合反応のための照射源が前記光重合性分離物質を含む前記それぞれのシリンダの端部に近接して設けられる、押出し装置。
【請求項６】
請求項１に記載の前記ノズル又は請求項４又は５のいずれかに記載の前記押出し装置の使用であり、分離物質の層によりカプセル化されら細胞分散物を含む少なくともひとつの区画を生成するための使用。
【請求項７】
細胞分散物のカプセル化及び／又はミクロ組織の生成のための方法であり、かかる方法が：
少なくともひとつの細胞分散物、少なくともひとつの分離物質及び場合により少なくともひとつの細胞シグナル分子を含む溶液及び光重合性の少なくともひとつの分離物質を、同軸共押出しし、
細胞分散物又は細胞シグナル分子を含む溶液を分離物質により分離し、
得られる最も外側の層が分離物質を含み、少なくともひとつの分離物質が光重合性である、方法。
【請求項８】
請求項６に記載の、カプセル化された細胞分散物の生成方法であり、ひとつの分散物が複数の細胞を含み、ひとつの取り囲む分離物質が同軸共押出しされる、方法。
【請求項９】
請求項６に記載の、ミクロ組織の生成方法であり、２つの分散物が複数の細胞を含み、２つの分離物質が同軸共押出しされる、方法。
【請求項１０】
請求項６に記載の、ミクロ組織の生成方法であり、複数の細胞を含むひとつの分散物、細胞シグナル分子を含むひとつの溶液及び２つの分離物質が同軸共押出しされる、方法。
【請求項１１】
請求項６に記載の方法により得られる、カプセル化された細胞分散物又はミクロ組織。
【請求項１２】
医薬としての、請求項１１に記載のカプセル化された細胞分散物又はミクロ組織。
【請求項１３】
細胞治療及び／又はミクロ組織移植応用のための医薬としての、請求項１１に記載のカプセル化された細胞分散物又はミクロ組織。
【請求項１４】
請求項１１に記載のミクロ組織の少なくとも２つの層をスタックするステップを含む、組織再生の方法。
【請求項１５】
請求項１１に記載のミクロ組織又は請求項１４に記載の方法により得られ得るミクロ組織の少なくとも２つのスタックされた層を含む、組織。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
本発明のひとつの側面によれば、同軸押出しのためのノズル８が提供される。これは、少なくとも２つの同軸シリンダを含み、それぞれのシリンダは細胞分散物１、細胞シグナル分子を含む溶液又は分離物質３を含む。細胞分散物又は細胞シグナル分子を含む溶液を含むシリンダは、分離物質を含むシリンダで分離され、また前記最も外側のシリンダは分離物資を含み、前記分離物質（３）がゲルであり、UV照射手段により誘起される光重合反応により重合する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
本発明のさらなる側面によれば、本発明による前記ノズルを含む押出し装置が提供される。
本発明のさらなる側面によれば、本発明の前記ノズル及び少なくともひとつの光重合反応のための照射源（９）を含むを含む押出し装置を提供する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本発明のさらなる側面によれば、細胞分散物及び／又はミクロ組織の生成の方法が提供される。かかる方法は、少なくともひとつの細胞分散物、少なくともひとつの分離物質及び場合により少なくともひとつの細胞シグナル分子を含む溶液を同軸押出し、少なくともひとつの分離物質を光重合反応させることを含み、細胞分散物又は細胞シグナル分子を含む溶液が分離物質で分離され、その結果最外層が分離物質を含み、かつ少なくともひとつの分離物質が光重合性である。
本発明のさらなる側面によれば、本発明は、本発明による方法により得られ得るカプセル化された細胞分散物を提供する。
【国際調査報告】
2012510268.tif 000013
2012510268.tif 000014