(57)【要約】  ヒト抗ヒトB7 Related Protein 1（以下、B7RP-1）抗体、該抗体フラグメントおよびその利用方法を提供する。ファージ抗体法を用いて、ヒトB7RP-1に対して高い親和性を有するヒト抗ヒトB7RP-1抗体および該抗体フラグメントを得た。得られた抗体および該抗体フラグメントは、B7RP-1が原因となって惹起される炎症、免疫異常性疾患の治療薬として期待される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトB7 Related Protein 1（以下、B7RP-1）に結合性を有するヒト抗ヒトB7RP-1抗体。
【請求項２】
Ｈ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）が以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、Ｌ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）が以下の（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のヒト抗ヒトB7RP-1抗体：
（ａ）ＣＤＲ１として配列番号１〜３のいずれか一つ、ＣＤＲ２として配列番号４〜６のいずれか一つ、およびＣＤＲ３として配列番号７〜９のいずれか一つによりそれぞれ示されるアミノ酸配列；
（ｂ）ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列として、それぞれ、配列番号１〜３、４〜６、または７〜９、またはこれらアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、ヒトB7RP-1に対するＨ鎖の相補性決定領域となりうるもの；
（ｃ）ＣＤＲ１として配列番号１０〜１２のいずれか一つ、ＣＤＲ２として配列番号１３〜１５のいずれか一つ、ＣＤＲ３として配列番号１６〜１８のいずれか一つによりそれぞれ示されるアミノ酸配列；
（ｄ）ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列として、それぞれ、配列番号１０〜１２、１３〜１５、または１６〜１８、またはこれらアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、ヒトB7RP-1に対するＬ鎖の相補性決定領域となりうるもの。
【請求項３】
Ｈ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、配列番号１、４および７、配列番号２、５および８、または配列番号３、６および９の組み合わせから選択されるアミノ酸配列であり、Ｌ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、配列番号１０、１３および１６、配列番号１１、１４および１７、または配列番号１２、１５および１８の組み合わせから選択されるアミノ酸配列である請求項１または２に記載のヒト抗ヒトB7RP-1抗体。
【請求項４】
Ｈ鎖のＣＤＲ１〜３とＬ鎖のＣＤＲ１〜３との組み合わせのアミノ酸配列が、配列番号１、４および７と配列番号１０、１３および１６、配列番号２、５および８と配列番号１１、１４および１７、または配列番号３、６および９と配列番号１２、１５および１８とのいずれか一つの組み合わせである、請求項３に記載のヒト抗ヒトB7RP-1抗体。
【請求項５】
Ｈ鎖可変領域が以下の（ｅ）または（ｆ）のアミノ酸配列を有し、Ｌ鎖可変領域が以下の（ｇ）または（ｈ）のアミノ酸配列を有する、請求項１から４のいずれかに記載のヒト抗ヒトB7RP-1抗体：
（ｅ）配列番号１９〜２１のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号１９〜２１に示されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、ヒトB7RP-1に対するＨ鎖可変領域となりうるもの；
（ｇ）配列番号２２〜２４のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号２２〜２４に示されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、ヒトB7RP-1に対するＬ鎖可変領域となりうるもの。
【請求項６】
Ｈ鎖可変領域とＬ鎖可変領域との組み合わせのアミノ酸配列が、配列番号１９と配列番号２２、配列番号２０と配列番号２３、または配列番号２１と配列番号２４との組み合わせにより示されるアミノ酸配列である、請求項１から５のいずれかに記載のヒト抗ヒトB7RP-1抗体。
【請求項７】
ヒトB7RP-1に結合性を有するヒト抗ヒトB7RP-1抗体のＨ鎖可変領域フラグメント。
【請求項８】
相補性決定領域（ＣＤＲ）が以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有する、請求項７に記載のヒト抗ヒトB7RP-1抗体のＨ鎖可変領域フラグメント：
（ａ）ＣＤＲ１として配列番号１〜３のいずれか一つ、ＣＤＲ２として配列番号４〜６のいずれか一つ、およびＣＤＲ３として配列番号７〜９のいずれか一つによりそれぞれ示されるアミノ酸配列；
（ｂ）ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列として、それぞれ、配列番号１〜３、４〜６、または７〜９、またはこれらアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、ヒトB7RP-1に対するＨ鎖の相補性決定領域となりうるもの。
【請求項９】
ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、配列番号１、４および７、配列番号２、５および８、または配列番号３、６および９の組み合わせから選択されるアミノ酸配列である、請求項８に記載のヒト抗ヒトB7RP-1抗体のＨ鎖可変領域フラグメント。
【請求項１０】
以下の（ｅ）または（ｆ）のアミノ酸配列を有する、請求項７から９のいずれかに記載のヒト抗ヒトB7RP-1抗体のＨ鎖可変領域フラグメント：
（ｅ）配列番号１９〜２１のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号１９〜２１に示されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、ヒトB7RP-1に対するＨ鎖可変領域となりうるもの。
【請求項１１】
ヒトB7RP-1に結合性を有するヒト抗ヒトB7RP-1抗体のＬ鎖可変領域フラグメント。
【請求項１２】
相補性決定領域（ＣＤＲ）が以下の（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載のヒト抗ヒトB7RP-1抗体のＬ鎖可変領域フラグメント：
（ｃ）ＣＤＲ１として配列番号１０〜１２のいずれか一つ、ＣＤＲ２として配列番号１３〜１５のいずれか一つ、およびＣＤＲ３として配列番号１６〜１８のいずれか一つによりそれぞれ示されるアミノ酸配列；
（ｄ）ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列として、それぞれ、配列番号１０〜１８、１３〜１５のいずれか一つ、または１６〜１８、またはこれらアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、ヒト抗ヒトB7RP-1抗体のＬ鎖の相補性決定領域となりうるもの。
【請求項１３】
ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、配列番号１０、１３および１６、配列番号１１、１４および１７、または配列番号１２、１５および１８の組み合わせから選択されるアミノ酸配列である、請求項１２に記載のヒト抗ヒトB7RP-1抗体のＬ鎖可変領域フラグメント。
【請求項１４】
以下の（ｇ）または（ｈ）のアミノ酸配列を有する、請求項１１から１３のいずれかに記載のヒト抗ヒトB7RP-1抗体のＬ鎖可変領域フラグメント：
（ｇ）配列番号２２〜２４のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列； 
（ｈ）配列番号２２〜２４に示されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、ヒトB7RP-1に対するＬ鎖可変領域となりうるもの。
【請求項１５】
請求項７から１０のいずれかに記載のヒト抗ヒトB7RP-1抗体のＨ鎖可変領域フラグメントと、請求項１１から１４のいずれかに記載のヒト抗ヒトB7RP-1抗体のＬ鎖可変領域フラグメントとを連結してなる、ヒトB7RP-1に対するヒト由来の抗体の一本鎖可変領域フラグメント。
【請求項１６】
請求項７から１０のいずれかに記載のヒト抗ヒトB7RP-1抗体のＨ鎖可変領域フラグメント、および／または請求項１１から１４のいずれかに記載のヒト抗ヒトB7RP-1抗体のＬ鎖可変領域フラグメントに、ヒト由来の抗体定常領域を連結してなる、ヒトB7RP-1に対するヒト由来の抗体またはその抗体フラグメント。
【請求項１７】
当該抗体フラグメントが、Ｆab、Ｆab'、Ｆ(ab')2、scAb、またはscFv-Fcである請求項１６に記載の抗体フラグメント。
【請求項１８】
請求項１から１７のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントとペプチド或いは他のタンパク質とを融合させた融合抗体またはそのフラグメント。
【請求項１９】
請求項１から１８のいずれかに記載の抗体もしくは融合抗体またはそのフラグメントに修飾剤が結合されてなる修飾抗体またはそのフラグメント。
【請求項２０】
請求項１から１９のいずれかに記載の抗体もしくは融合抗体またはそのフラグメントをコードする遺伝子。
【請求項２１】
請求項２０に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
【請求項２２】
請求項２０に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
【請求項２３】
請求項２０に記載の遺伝子を宿主に発現させることによって、ヒト抗B7RP-1抗体またはその断片を生産する方法。
【請求項２４】
請求項１から１７のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント、または請求項１８に記載の融合抗体またはそのフラグメント、または請求項１９に記載の修飾抗体またはそのフラグメントを用いたB7RP-1の検出試薬。
【請求項２５】
請求項２０に記載の遺伝子を含む遺伝子治療剤。
【請求項２６】
請求項１から１７のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント、または請求項１８に記載の融合抗体またはそのフラグメント、または請求項１９に記載の修飾抗体またはそのフラグメントを用いたB7RP-1とICOSとの結合活性阻害剤。
【請求項２７】
請求項１から１７のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント、または請求項１８に記載の融合抗体またはそのフラグメント、または請求項１９に記載の修飾抗体またはそのフラグメントが認識するB7RP-1上の抗原決定領域に基づいて分子設計された低分子化合物またはその誘導体。
【請求項２８】
請求項２７に記載の低分子化合物またはその誘導体を用いたB7RP-1とICOSとの結合活性阻害剤。
【請求項２９】
請求項２６または請求項２８に記載の結合活性阻害剤を用いたB7RP-1とICOSとの相互作用により惹起される炎症および免疫異常性疾患の予防または治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトB7 Related Protein 1（別名、B7h、GL50、ICOSリガンド、以下、「B7RP-1」とする）に結合し、その生物活性を阻害するヒト抗ヒトB7RP-1抗体または該抗体フラグメントに関する。当該抗体および抗体フラグメントは、B7RP-1が、そのＴ細胞上のレセプターであるICOS（Inducible costimulator）と結合することによって惹起されるＴ細胞の過度な活性化を抑えることで、臓器移植時の免疫抑制剤、アレルギー・自己免疫などの免疫異常性疾患の治療薬として期待される。
【背景技術】
【０００２】
ICOSは、Ｔ細胞の補助刺激レセプターCD28ファミリーの第３番目の分子として発見され、ホモダイマーを形成する膜結合型蛋白であり、TCRを介したシグナルによってＴ細胞を刺激することでＴ細胞表面上に誘導される（非特許文献１）。この分子を介する補助刺激は、CD4、CD8双方のＴ細胞の増殖を増大させ、IL-4、IL-10などのサイトカインの分泌とともに、Ｔ細胞のCD154（CD40リガンド）の発現を誘導する。このことから、ICOSは特に、活性化Ｔ細胞における様々なエフェクター機能において重要であると考えられる。実際に、ICOSをノックアウトしたマウスでは、抗原刺激によるＴ細胞の増殖やIL-4産生能が消失する（非特許文献２）。【０００３】
ICOSのリガンドとして同定されたB7RP-1は、もうひとつの補助刺激分子であるCD28のリガンドであるB7分子（CD80、CD86）のファミリーに属し、Ｂ細胞やマクロファージ、LPSなどで刺激された非免疫細胞に発現する膜結合蛋白である（非特許文献３）。B7RP-1は、現在知られている唯一のICOSのリガンドであり、生理学的な条件下では、CD28やCTLA4（CD154）などとの交差結合性は示さない。ICOSとB7RP-1間の結合は、Ｔ細胞のヘルパー機能に非常に重要であり、ICOSのノックアウトマウスでは、ヘルパー機能による抗体のクラススイッチが著しく抑制される（非特許文献２）。しかし、この抑制は抗CD40抗体を用いたCD40からのＢ細胞刺激によって、部分的に回復することが知られている（非特許文献４）。【０００４】
オボアルブミン（OVA）により免疫したマウスを用いたOVAの吸気によるマウス気管支炎症モデル実験で、抗ICOS阻害抗体あるいはICOS-FcによるICOS/B7RP-1間のシグナルブロックの前処理をしたマウスでは、気管支肺胞洗浄液（BAL：bronchoalveolar lavage）中でのリンパ球、好中球の侵入が減少し、IL-4、IL-10などのサイトカインの産生も抑えられた。このような抑制は、CTLA4-FcによるCD28/B7間のシグナルのブロックによってもみられたが、特に、これらの阻害剤の投与時期の違いに伴い、IL-4産生のパターンが顕著に異なっていた。このことから、補助刺激CD28/B7とICOS/B7RP-1の役割の違いとして、前者はＴ細胞の活性化開始において重要な役割を果たすのに対し、後者はその活性化後のエフェクター機能を制御する上で主要な役割を担っていることが示された（非特許文献５）。【０００５】
ヒトの分類不能型免疫不全（CVID：common variable immunodeficiency）の原因が、ICOSのホモザイゴートによる遺伝子欠損によることが明らかにされている。このことは、ヒトＢ細胞の成熟、抗体産生へと導くヘルパーＴ細胞機能におけるICOSの重要性を示しているとともに、ICOSが種々の免疫疾患の原因遺伝子となることを強く示唆している（非特許文献６）。【０００６】
マウスを用いた心臓の同種異個体（アロ）移植において、抗ICOS阻害抗体の投与は、急性の拒絶反応を遅延させるだけでなく、移植断片へのCD4、CD8陽性Ｔ細胞、マクロファージの浸潤も抑制した。この抗ICOS阻害抗体によるこのような効果は、免疫抑制剤として使用されているシクロスポリンＡと相乗的な免疫抑制効果を示し、拒絶までの時期を遅延させた（非特許文献７）。免疫抑制を目的とした蛋白製剤として、CTLA4-IgによるCD28/B7間のシグナルの阻害や、抗CD40リガンド抗体によるCD40/CD40リガンド（CD154）間のシグナルの阻害が検討されているが、ICOS/B7RP-1間の阻害による抑制効果は、それらと同等もしくは、格段に優れた結果をもたらしている。【０００７】
実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE：experimental allergic encephalomyelitis）モデルを用いたマウスの実験では、抗ICOS阻害抗体の投与により、EAEの発症までの期間を延ばすことができた。しかしながら、EAE誘導のための抗原ペプチド感作と同時期に抗ICOS阻害抗体の投与を行うと、症状が劇的に増悪する結果となった（非特許文献８）。このことは、臨床において抗ICOS抗体でシグナルを阻害することは、アレルギー症状などを増悪する危険性を孕むことを示唆している。【０００８】
一方、B7RP-1に対するモノクローナル抗体の使用例は、これまであまり報告されていないが、マウスB7RP-1に対するラットモノクローナル抗体が、マウスのコラーゲン誘導関節炎（CIA：collagen type II-induced arthritis）に対して治療的投与により効果を示したことが報告されており、自己免疫疾患の病態形成にもICOS/B7RP-1間のシグナルが重要な寄与を果たしていることが示唆されている（非特許文献９）。【０００９】
【非特許文献１】Hutloff, A.ら、(1999) Nature, 397(6716), p.263-266
【非特許文献２】Dong, C.ら、(2001) Nature, 409(6816), p.97-101
【非特許文献３】Yoshinaga, S. K.ら、(1999) Nature, 402(6763), p.827-832
【非特許文献４】McAdam, A. J.ら、(2001) Nature, 409(6816), p.102-105
【非特許文献５】Gonzalo, J. A.ら、(2001) Nat. Immunol., 2(7), p.597-604
【非特許文献６】Grimbacher, B.ら、(2003) Nat. Immunol., 4(3), p.261-268
【非特許文献７】Ozkaynak, E.ら、(2001) Nat. Immunol., 2(7), p.591-596
【非特許文献８】Rottman, J. B.ら、(2001) Nat. Immunol., 2(7), p.605-611
【非特許文献９】Iwai, H.ら、(2002) J. Immunol., 169(8), p.4332-4339
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
臓器移植の拒絶反応、アレルギーなどの免疫異常性疾患の症状の増悪には、Ｔ細胞の増殖、患部への浸潤、エフェクター機能が決定的な関与をしている。そのような機能に関与するICOS/B7RP-1間のシグナルの阻害、あるいは制御を行う医薬品は、臓器移植時の免疫抑制、アレルギーなどの免疫異常性疾患の治療薬として期待される。【００１１】
ICOS/B7RP-1間のシグナルをブロックする特異的なモノクローナル抗体を開発することができれば、ICOS/B7RP-1のシグナルによって発症、増悪する多くの疾患の有効な治療手段になることが期待される。【００１２】
ICOS/B7RP-1の補助シグナルをブロックする抗体として、抗ICOS抗体と抗B7RP-1抗体が考えられる。抗体の抗原結合部は２価であり、それゆえ、抗体と標的分子との結合によって細胞にシグナルを入れる可能性があり、特に抗ICOS抗体の場合、ICOSのシグナルを阻害する目的での投与が、逆にシグナルを送ることで、Ｔ細胞の増殖を促す可能性も除外できない。その意味で、抗B7RP-1抗体によるICOS/B7RP-1間のシグナル阻害は、ICOSを介してＴ細胞の増殖活性化を促すことは考えられない。たとえＢ細胞上のB7RP-1への抗B7RP-1抗体の結合によりＢ細胞へシグナルが送られたとしても、ICOS/B7RP-1シグナルにより、B7RP-1は発現が減少することが知られており、Ｔ細胞のエフェクター機能を抑制する方向に働くため、阻害抗体として抗B7RP-1抗体は優れていると考えられる。【００１３】
現在、ヒトB7RP-1に対する抗体（抗ヒトB7RP-1抗体）としては、マウスやラット由来のモノクローナル抗体がいくつか取得されているに過ぎない。このような従来の抗ヒトB7RP-1抗体は、非ヒト由来のため、その高い免疫原性によって、ヒトに対して投与した場合、異物として認識・排除される。したがって、従来の抗ヒトB7RP-1抗体を、疾患の治療薬剤として用いることは困難である。【００１４】
この問題を解決する方法として、ヒトB7RP-1に対するマウスモノクローナル抗体を、蛋白工学的手法を用いてヒト化することが考えられるが、マウスモノクローナル抗体由来の配列を一部含むため、反復投与や長期投与により、投与するヒト化抗B7RP-1抗体の活性を阻害するような抗体が作られ、その効果を著しく減弱するだけでなく、重篤な副作用を招く可能性がある。また、ヒト化により活性が低下することも多く、構築には多大な労力とコストを要する。【００１５】
本発明は、安全性と治療効果を兼ね備えたヒト抗ヒトB7RP-1抗体およびその断片を提供するとともに、それらの利用方法を提案するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者は、上記課題に対して検討した結果、健常人の末梢血Ｂリンパ球より調製した免疫グロブリンＨ鎖およびＬ鎖の可変領域（ＶＨ,ＶＬ）をコードする遺伝子を発現したヒト単鎖Ｆｖ抗体ファージディスプレイライブラリーから、抗ヒトB7RP-1単鎖Ｆｖ抗体分子（抗体断片）を取得し、そのアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子の塩基配列を明らかにした。さらに、この単鎖Ｆｖ抗体が、ヒトのB7RP-1の生理活性を阻害することを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１７】
本発明による抗体は、ヒト抗体遺伝子に由来する抗体ファージライブラリーを用いて単離したものであり、これらの抗体は完全にヒト由来の配列をもち、このままヒトへの治療用として利用しても、免疫原性としては問題ないものである。その意味では、従来のマウスモノクローナル抗体からヒト化技術によって作製されたヒト化抗体において危惧されるマウス由来の配列に対する免疫原性についても解決されている。また、その開発コストは、ヒト化抗体に比べて非常に低い。一方で、近年、ヒトの染色体をもつトランスクロモソームマウスによるヒト抗体産生も行われているが、ヒトの分子に対する阻害作用を有するヒト抗体を作製する技術が、本発明のようにまったく動物を使用せずに作製できることは、大きなメリットである。【００１８】
すなわち、本発明は、医学上または産業上有用な方法・物質として下記１）〜２９）の発明を含むものである。【００１９】
１）ヒトB7 Related Protein 1（以下、B7RP-1）に結合性を有するヒト抗ヒトB7RP-1抗体。【００２０】
２）Ｈ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）が以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、Ｌ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）が以下の（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列を有する、上記１）に記載のヒト抗ヒトB7RP-1抗体：
（ａ）ＣＤＲ１として配列番号１〜３のいずれか一つ、ＣＤＲ２として配列番号４〜６のいずれか一つ、およびＣＤＲ３として配列番号７〜９のいずれか一つによりそれぞれ示されるアミノ酸配列；
（ｂ）ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列として、それぞれ、配列番号１〜３、４〜６、または７〜９、またはこれらアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、ヒトB7RP-1に対するＨ鎖の相補性決定領域となりうるもの；
（ｃ）ＣＤＲ１として配列番号１０〜１２のいずれか一つ、ＣＤＲ２として配列番号１３〜１５のいずれか一つ、ＣＤＲ３として配列番号１６〜１８のいずれか一つによりそれぞれ示されるアミノ酸配列；
（ｄ）ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列として、それぞれ、配列番号１０〜１２、１３〜１５、または１６〜１８、またはこれらアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、ヒトB7RP-1に対するＬ鎖の相補性決定領域となりうるもの。【００２１】
３）Ｈ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、配列番号１、４および７、配列番号２、５および８、または配列番号３、６および９の組み合わせから選択されるアミノ酸配列であり、Ｌ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、配列番号１０、１３および１６、配列番号１１、１４および１７、または配列番号１２、１５および１８の組み合わせから選択されるアミノ酸配列である上記１）または２）に記載のヒト抗ヒトB7RP-1抗体。【００２２】
４）Ｈ鎖のＣＤＲ１〜３とＬ鎖のＣＤＲ１〜３との組み合わせのアミノ酸配列が、配列番号１、４および７と配列番号１０、１３および１６、配列番号２、５および８と配列番号１１、１４および１７、または配列番号３、６および９と配列番号１２、１５および１８とのいずれか一つの組み合わせである、上記３）に記載のヒト抗ヒトB7RP-1抗体。【００２３】
５）Ｈ鎖可変領域が以下の（ｅ）または（ｆ）のアミノ酸配列を有し、Ｌ鎖可変領域が以下の（ｇ）または（ｈ）のアミノ酸配列を有する、上記１）から４）のいずれかに記載のヒト抗ヒトB7RP-1抗体：
（ｅ）配列番号１９〜２１のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号１９〜２１に示されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、ヒトB7RP-1に対するＨ鎖可変領域となりうるもの；
（ｇ）配列番号２２〜２４のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号２２〜２４に示されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、ヒトB7RP-1に対するＬ鎖可変領域となりうるもの。【００２４】
６）Ｈ鎖可変領域とＬ鎖可変領域との組み合わせのアミノ酸配列が、配列番号１９と配列番号２２、配列番号２０と配列番号２３、または配列番号２１と配列番号２４との組み合わせにより示されるアミノ酸配列である、上記１）から５）のいずれかに記載のヒト抗ヒトB7RP-1抗体。【００２５】
７）ヒトB7RP-1に結合性を有するヒト抗ヒトB7RP-1抗体のＨ鎖可変領域フラグメント。【００２６】
８）相補性決定領域（ＣＤＲ）が以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有する、上記７）に記載のヒト抗ヒトB7RP-1抗体のＨ鎖可変領域フラグメント：
（ａ）ＣＤＲ１として配列番号１〜３のいずれか一つ、ＣＤＲ２として配列番号４〜６のいずれか一つ、およびＣＤＲ３として配列番号７〜９のいずれか一つによりそれぞれ示されるアミノ酸配列；
（ｂ）ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列として、それぞれ、配列番号１〜３、４〜６、または７〜９、またはこれらアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、ヒトB7RP-1に対するＨ鎖の相補性決定領域となりうるもの。【００２７】
９）ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、配列番号１、４および７、配列番号２、５および８、または配列番号３、６および９の組み合わせから選択されるアミノ酸配列である、上記８）に記載のヒト抗ヒトB7RP-1抗体のＨ鎖可変領域フラグメント。【００２８】
１０）以下の（ｅ）または（ｆ）のアミノ酸配列を有する、上記７）から９）のいずれかに記載のヒト抗ヒトB7RP-1抗体のＨ鎖可変領域フラグメント：
（ｅ）配列番号１９〜２１のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号１９〜２１に示されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、ヒトB7RP-1に対するＨ鎖可変領域となりうるもの。【００２９】
１１）ヒトB7RP-1に結合性を有するヒト抗ヒトB7RP-1抗体のＬ鎖可変領域フラグメント。【００３０】
１２）相補性決定領域（ＣＤＲ）が以下の（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列を有する、上記１１）に記載のヒト抗ヒトB7RP-1抗体のＬ鎖可変領域フラグメント：
（ｃ）ＣＤＲ１として配列番号１０〜１２のいずれか一つ、ＣＤＲ２として配列番号１３〜１５のいずれか一つ、およびＣＤＲ３として配列番号１６〜１８のいずれか一つによりそれぞれ示されるアミノ酸配列；
（ｄ）ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列として、それぞれ、配列番号１０〜１８、１３〜１５のいずれか一つ、または１６〜１８、またはこれらアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、ヒト抗ヒトB7RP-1抗体のＬ鎖の相補性決定領域となりうるもの。【００３１】
１３）ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、配列番号１０、１３および１６、配列番号１１、１４および１７、または配列番号１２、１５および１８の組み合わせから選択されるアミノ酸配列である、上記１２）に記載のヒト抗ヒトB7RP-1抗体のＬ鎖可変領域フラグメント。【００３２】
１４）以下の（ｇ）または（ｈ）のアミノ酸配列を有する、上記１１）から１３）のいずれかに記載のヒト抗ヒトB7RP-1抗体のＬ鎖可変領域フラグメント：
（ｇ）配列番号２２〜２４のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列； 
（ｈ）配列番号２２〜２４に示されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、ヒトB7RP-1に対するＬ鎖可変領域となりうるもの。【００３３】
１５）上記７）から１０）のいずれかに記載のヒト抗ヒトB7RP-1抗体のＨ鎖可変領域フラグメントと、上記１１）から１４）のいずれかに記載のヒト抗ヒトB7RP-1抗体のＬ鎖可変領域フラグメントとを連結してなる、ヒトB7RP-1に対するヒト由来の抗体の一本鎖可変領域フラグメント。【００３４】
１６）上記７）から１０）のいずれかに記載のヒト抗ヒトB7RP-1抗体のＨ鎖可変領域フラグメント、および／または上記１１）から１４）のいずれかに記載のヒト抗ヒトB7RP-1抗体のＬ鎖可変領域フラグメントに、ヒト由来の抗体定常領域を連結してなる、B7RP-1に対するヒト由来の抗体またはその抗体フラグメント。【００３５】
１７）当該抗体フラグメントが、Ｆab、Ｆab'、Ｆ(ab')2、scAb、またはscFv-Fcである上記１６）に記載の抗体フラグメント。【００３６】
１８）上記１）から１７）のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントとペプチド或いは他のタンパク質とを融合させた融合抗体またはそのフラグメント。【００３７】
１９）上記１）から１８）のいずれかに記載の抗体もしくは融合抗体またはそのフラグメントに修飾剤が結合されてなる修飾抗体またはそのフラグメント。【００３８】
２０）上記１）から１９）のいずれかに記載の抗体もしくは融合抗体またはそのフラグメントをコードする遺伝子。【００３９】
２１）上記２０）に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。【００４０】
２２）上記２０）に記載の遺伝子が導入された形質転換体。【００４１】
２３）上記２０）に記載の遺伝子を宿主に発現させることによって、ヒト抗B7RP-1抗体またはその断片を生産する方法。【００４２】
２４）上記１）から１７）のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント、または上記１８）に記載の融合抗体またはそのフラグメント、または上記１９）に記載の修飾抗体またはそのフラグメントを用いたB7RP-1の検出試薬。【００４３】
２５）上記２０）に記載の遺伝子を含む遺伝子治療剤。【００４４】
２６）上記１）から１７）のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント、または上記１８）に記載の融合抗体またはそのフラグメント、または上記１９）に記載の修飾抗体またはそのフラグメントを用いたB7RP-1とICOSとの結合活性阻害剤。【００４５】
２７）上記１）から１７）のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント、または上記１８）に記載の融合抗体またはそのフラグメント、または上記１９）に記載の修飾抗体またはそのフラグメントが認識するB7RP-1上の抗原決定領域に基づいて分子設計された低分子化合物またはその誘導体。【００４６】
２８）上記２７）に記載の低分子化合物またはその誘導体を用いたB7RP-1とICOSとの結合活性阻害剤。【００４７】
２９）上記２６）または上記２８）に記載の結合活性阻害剤を用いたB7RP-1とICOSとの相互作用により惹起される炎症および免疫異常性疾患の予防または治療薬。
【発明の効果】
【００４８】
本発明のヒトモノクローナル抗体および該抗体フラグメント分子は、ヒト由来抗ヒトB7RP-1抗体の可変領域を有し、ヒトB7RP-1と強く反応して、そのICOSとの相互作用を阻害する。このことから、本発明の抗体および該抗体フラグメントはB7RP-1とICOSとの結合により惹起される炎症および免疫異常性疾患の予防または治療薬として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】クローン化した単鎖Ｆｖ抗体ファージのB7RP-1-Fcに対する結合特異性を評価したＥＬＩＳＡの結果を示す図。
【００５０】
【図２】クローン化した単鎖Ｆｖ抗体のB7RP-1-Fcに対する結合特異性を評価したＥＬＩＳＡの結果を示す図。
【００５１】
【図３】単離した抗B7RP-1単鎖Ｆｖ抗体とセンサーチップ上に固定化されたB7RP1との結合の速度論的解析を表面プラズモン共鳴によって評価した結果を示す図。
【００５２】
【図４】単離された抗B7RP-1単鎖Ｆｖ抗体によるICOS-FｃとB7RP-1-Fc間の結合阻害活性を評価したＥＬＩＳＡの結果を示す図。
【００５３】
【図５】フローサイトメータを用いた単離した抗B7RP-1単鎖Ｆｖ抗体のＢ細胞への結合性を評価した結果を示す図（FITC並びにPEでともに染色された集団をボックスで示してある）。
【００５４】
【図６】単離した抗B7RP-1単鎖Ｆｖ抗体を用いたICOS補助刺激シグナルのブロックによるＴ細胞増殖阻害活性を評価した結果を示す図。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
本発明の抗体および抗体フラグメントに使用されるｓｃＦｖは以下のようにして得られた。【００５６】
健常者２０名分の末梢血Ｂリンパ球より、ＲＴ−ＰＣＲ法にて、免疫グロブリン重（Ｈ）鎖、軽（Ｌ）鎖ｃＤＮＡを増幅、更に両者をリンカーＤＮＡで結合し、健常者リンパ球由来のＨ鎖可変領域（ＶＨ鎖またはＶＨ）とＬ鎖可変領域（ＶＬ鎖またはＶＬ）のランダムな組み合わせによるｓｃＦｖ ＤＮＡを作製した。【００５７】
このｓｃＦｖ ＤＮＡをファージミドベクターpCANTAB5Eに組込み、109クローンからなる健常者由来ｓｃＦｖディスプレイファージライブラリーを作製した。このライブラリーを、固相に固定化されたヒトB7RP-1と結合させて回収、濃縮し、抗ヒトB7RP-1 ｓｃＦｖディスプレイファージクローンをスクリーニングした。その結果、スクリーニングされた各クローンは、ヒトB7RP-1と結合するｓｃＦｖを産生した。【００５８】
ｓｃＦｖの発現方法としては、例えば、大腸菌で発現させることができる。大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列等、発現させるｓｃＦｖを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーターとしては、lacZプロモーター、araBプロモーター等を挙げることができる。ｓｃＦｖの分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに発現させる場合、pelBシグナル配列（Lei, SP.ら、J. Bacteriol., 1987, 169 : 4379-4383）を用いるとよい。培養上清中に分泌させるにはＭ１３ファージのｇ３蛋白のシグナル配列を用いることもできる。【００５９】
発現されたｓｃＦｖは細胞内外、宿主から分離し均一にまで精製することができる。本発明で発現されるｓｃＦｖは、そのＣ末端にE tag配列が付加されているので、抗E tag抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて、容易に短時間で精製することができる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を組み合わせて精製することも可能である。例えば、限外濾過、塩析、ゲル濾過／イオン交換／疎水クロマト等のカラムクロマトグラフィーを組み合わせれば抗体を分離・精製することができる。【００６０】
得られた抗体や抗体フラグメントのヒトB7RP-1に対する結合活性を測定する方法としては、ＥＬＩＳＡ、BIAcore等の方法がある。例えばＥＬＩＳＡを用いる場合、ヒトB7RP-1-Fcを固相化した９６穴プレートに目的の抗体や抗体フラグメントを含む試料、例えば大腸菌の培養上清や精製抗体を加える。次にパーオキシダーゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、プレートをインキュベーション、洗浄した後、発色基質ＴＭＢＺを加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。また、BIAcoreを用いる場合、センサーチップにB7-RP1-Fcを固定化するか、または抗ヒトFc F(ab')2抗体にB7-RP1-Fcをキャプチャーさせて、目的の試料の結合解離定数を測定することができる。【００６１】
また、得られた抗体や抗体フラグメントのB7RP-1/ICOS結合阻害活性を測定する方法として、ＥＬＩＳＡ、BIAcore等の方法がある。例えばＥＬＩＳＡを用いる場合、ヒトB7RP-1-Fcを固相化した９６穴プレートに目的の抗体や抗体フラグメントを含む試料と、ビオチン標識したICOS-Fcを混合したものを加える。次にパーオキシダーゼ等の酵素で標識したストレプトアビジンを添加し、プレートをインキュベーション、洗浄した後、発色基質ＴＭＢＺを加えて吸光度を測定することでB7RP-1/ICOS結合阻害活性を評価することができる。【００６２】
更に、得られた抗体や抗体フラグメントについて、末梢血Ｂリンパ球上のB7RP-1への結合性を調べる方法として、フローサイトメータを用いる方法がある。例えば、ヒト末梢血リンパ球を用いて、蛍光フローサイトメータで解析する場合、ヒト末梢血より末梢血リンパ球を精製し、PMAとPHAで刺激した後、ヒトIgG抗体を加えてヒトIgG Fcγレセプターのブロックを行い、目的の抗体や抗体フラグメントを含む試料（E tagを付加したｓｃＦｖであればｓｃＦｖを含む試料と抗E tag抗体の混合物）を加え反応させる。細胞を洗浄後、PEラベル化したストレプトアビジンならびに、ヒトＢ細胞特異的マーカーとして、FITCでラベル化した抗CD19抗体を反応させ、蛍光ラベル化する。洗浄後、蛍光フローサイトメータを用いて、PEならびにFITCチャンネルでの２次元フローサイトメトリー解析を行い、末梢血Bリンパ球上のB7RP-1への結合性を評価することができる。【００６３】
上記の抗体や抗体フラグメントについて、Ｔ細胞補助刺激シグナルに対する阻害活性を調べる方法としては、Ｔ細胞増殖刺激アッセイがある。例えば、96穴プレートに、抗CD3抗体と抗ヒトIgG FcフラグメントF(ab')2抗体の混合液をコートし洗浄したのち、B7RP-1-Fcを加えて反応させる。再度プレートを洗浄した後、目的の抗体や抗体フラグメントを含む試料を加え反応させ、その後ヒト末梢血から調製した末梢血リンパ球を加え、培養する。培養中にトリチウムチミジンを添加し、細胞が取り込んだトリチウムチミジン量を測定することで、Ｔ細胞補助刺激シグナルに対する阻害活性を評価することができる。【００６４】
上記の方法により、抗ヒトB7RP-1 ｓｃＦｖを分離し評価した結果、B7RP-1に特異的に結合すること、しかもその親和性はレセプターであるICOSに匹敵する程高いものであること、抗原提示細胞上に発現されているB7RP-1にも結合しうること、B7RP-1とICOSとの結合を阻害すること、およびB7RP-1/ICOSを介した補助刺激によるＴ細胞の増殖を抑制することが示された。従ってこれらの抗体は、生体内でも同様の効果を示し、B7RP-1/ICOSの結合およびＴ細胞の増殖を抑制する薬剤として有用であると考えられる。【００６５】
上記阻害活性を有する３種類のｓｃＦｖ（２２３、３２３、３２５）のＶＨ鎖およびＶＬ鎖のアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列は、下記の通りである。
（１）クローン２２３
クローン２２３のＶＨ鎖のアミノ酸配列を配列番号１９に示した。当該ＶＨ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号１、４および７に示した。すなわち、配列番号１９に示すＶＨ鎖のアミノ酸配列において、３１番目〜３５番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号１）、５０番目〜６６番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号４）、９９番目〜１０９番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号７）に対応している。また、当該ＶＨ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号２５に示した。【００６６】
また、クローン２２３のＶＬ鎖のアミノ酸配列を配列番号２２に示した。当該ＶＬ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号１０、１３および１６に示した。すなわち、配列番号２２に示すＶＬ鎖のアミノ酸配列において、２４番目〜３５番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号１０）、５１番目〜５７番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号１３）、９０番目〜９８番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号１６）に対応している。また、当該ＶＬ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号２８に示した。【００６７】
（２）クローン３２３
クローン３２３のＶＨ鎖のアミノ酸配列を配列番号２０に示した。当該ＶＨ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号２、５および８に示した。すなわち、配列番号２０に示すＶＨ鎖のアミノ酸配列において、３０番目〜３４番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号２）、４９番目〜６５番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号５）、９８番目〜１０８番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号８）に対応している。また、当該ＶＨ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号２６に示した。【００６８】
また、クローン３２３のＶＬ鎖のアミノ酸配列を配列番号２３に示した。当該ＶＬ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号１１、１４および１７に示した。すなわち、配列番号２３に示すＶＬ鎖のアミノ酸配列において、２３番目〜３３番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号１１）、４９番目〜５５番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号１４）、８８番目〜９８番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号１７）に対応している。また、当該ＶＬ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号２９に示した。【００６９】
（３）クローン３２５
クローン３２５のＶＨ鎖のアミノ酸配列を配列番号２１に示した。当該ＶＨ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号３、９および１５に示した。すなわち、配列番号２１に示すＶＨ鎖のアミノ酸配列において、３１番目〜３５番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号３）、５０番目〜６６番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号９）、９９番目〜１０８番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号１５）に対応している。また、当該ＶＨ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号２７に示した。【００７０】
また、クローン３２５のＶＬ鎖のアミノ酸配列を配列番号２４に示した。当該ＶＬ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号１２、１５および１８に示した。すなわち、配列番号２４に示すＶＬ鎖のアミノ酸配列において、２３番目〜３３番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号１２）、４９番目〜５５番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号１５）、８８番目〜９８番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号１８）に対応している。また、当該ＶＬ鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号３０に示した。【００７１】
本発明により得られたクローン毎にアミノ酸配列および塩基配列について上述したが、配列表に記載された各アミノ酸配列情報（ＶＨ鎖、ＶＬ鎖、各ＣＤＲ１〜３）をもとに、単独または複数の配列を適宜組み合わせて使用することも可能である。【００７２】
本発明の抗体およびその抗体フラグメントは、上記ＶＨ鎖およびＶＬ鎖、並びにそれらのＣＤＲとして、上記配列番号に示される配列に限定されるものではなく、それらの一部が改変された変異ポリペプチドであってもよい。【００７３】
すなわち、各配列番号に記載されたアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒトB7RP-1に対するＨ鎖またはＬ鎖の相補性決定領域、Ｈ鎖またはＬ鎖の可変領域となるポリペプチドも含まれる。【００７４】
ここで、「１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、および／又は付加できる程度の数、例えば、１ないし６程度の数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／又は付加されることを意味する。このような「変異」としては、主として、公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然（例えばヒト）に存在する同様の変異ポリペプチドを単離精製したものであってもよい。【００７５】
なお、上記「変異」は、本発明の抗体またはその抗体フラグメントを、治療薬として利用する場合（ヒトに投与する場合）には、ヒト由来の構造を保持またはヒトが免疫反応を起こさない範囲で行い、検出器具や診断キットなどとして使用する場合（ヒトに投与しない場合）には、その範囲は特に制限されない。【００７６】
本発明で開示されるＶＨ鎖および／またはＶＬ鎖は、ファージ抗体法を用いて主としてｓｃＦｖの形で得られたものであるが、原則としてその適用はｓｃＦｖに限定されることはない。例えば、開示したＶＨ鎖および／またはＶＬ鎖をヒト免疫グロブリンの定常領域と連結した完全分子型、またヒト免疫グロブリンの定常領域の一部と組み合わせたＦab、Ｆab'またはＦ(ab')２、さらにｓｃＦｖをヒト免疫グロブリンのＬ鎖の定常領域と結合させた一本鎖抗体（ｓｃＡｂ）や、ｓｃＦｖをヒト免疫グロブリンのＨ鎖の定常領域と結合させたｓｃＦｖ-Ｆｃなどの他の抗体フラグメントもその適用範囲に含まれる。【００７７】
また、本発明の抗体またはそのフラグメントは、当該抗体またはフラグメントにペプチド或いは他のタンパク質と融合させた融合抗体またはそのフラグメントとすることもできる。【００７８】
また、これらの抗体および抗体フラグメントあるいは上記融合抗体またはそのフラグメントに、ポリエチレングリコールなどの高分子修飾剤を結合させた修飾抗体またはそのフラグメントとすることもできる。【００７９】
Ｈ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたｓｃＦｖを調製する場合、ペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸１０〜２５残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。【００８０】
本発明の抗体または抗体フラグメントは、配列番号２５から３０に示した本発明により得られた各クローンのＶＨ鎖およびＶＬ鎖をコードする遺伝子配列情報をもとに、適当な宿主（例えば、細菌、酵母）に導入して、本発明の抗体またはそのフラグメントを発現させることができる。【００８１】
また本発明の遺伝子は、B7RP-1とICOSとの相互作用を調節するための、遺伝子治療の補助剤としても利用できる。【００８２】
本発明の抗体またはその抗体フラグメントは、B7RP-1とICOSとの結合活性阻害剤として利用可能である。【００８３】
また、これらの抗体またはそのフラグメントが認識するヒトB7RP-1上の抗原決定領域に基づき分子設計することにより、B7RP-1/ICOSのシグナリングに作用する低分子化合物の開発に重要な手段を提供する。【００８４】
その低分子化合物には、本発明の抗体またはそのフラグメントが認識しうるアミノ酸配列からなるペプチドおよびその立体構造を模した化合物が含まれる。そのペプチドのアミノ酸配列に非天然アミノ酸を加えた改変ペプチドも同様に使用できる。また、それらのペプチドを他のタンパク質と融合させた融合蛋白質も同様である。上記のペプチドまたは化合物に、ポリエチレングリコールなどの高分子修飾剤を結合させた修飾分子も同様である。【００８５】
これらの低分子化合物またはその誘導体も、B7RP-1とICOSとの結合活性阻害剤として利用可能である。【００８６】
さらに、本発明の抗体またはその抗体フラグメント、並びに低分子化合物またはその誘導体からなる結合活性阻害剤は、B7RP-1とICOSとの相互作用により惹起される炎症および免疫異常性疾患の予防または治療薬として有効である。【００８７】
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００８８】
《実施例１：健常者からのファージライブラリーの構築》
ファージライブラリーの構築は、J. D. Marks ら（J. Mol. Biol., 222: 581-597, 1991）により報告されている方法を参考に、健常者２０名由来末梢血由来リンパ球を出発材料に、構築した。構築したＶＨ(γ)−Ｖκ、ＶＨ(γ)−Ｖλ、ＶＨ(μ)−Ｖκ、ＶＨ(μ)−Ｖλの各サブライブラリーはそれぞれ1.1×108、2.1×108、8.4×107、5.3×107クローンの多様性を有すると評価された。【００８９】
《実施例２：パンニング》
ヒトB7RP-1-Fc（10μg）を0.1M NaHCO3溶液1mlに溶解し、イムノチューブ（Nunc）に一晩、４℃にてコートした。0.1％Tween20を含むＰＢＳで１回洗浄後、0.5％ゼラチン／PBSで、２時間、室温にてブロックした。0.1％Tween／PBSで、６回洗浄した後、健常人由来の抗体ファージライブラリー（一本鎖抗体提示ファージ液、1012 TU／ml）を１ml加え、２時間、室温で反応させた。【００９０】
非特異的なファージを0.1％Tween20/PBSで２０回の洗浄によって除いた後、B7RP-1-Fcに結合したファージクローンを1mg/ml BSA（ウシ血清アルブミン）を含む0.1Mグリシン-HCl（pH2.2）で溶出し、直ちに1.0M Tris-HCl（pH9.1）で中和した。中和したファージ溶液を、ヒトIgGをコートし0.5％ゼラチン／PBSでブロックしたイムノチューブに加え、２時間、室温で反応させた。その上清を、対数増殖期の大腸菌TG1（20ml）に加え、３０℃にて、３０分、放置後、一部をSOBAGプレートに撒き、残りについては培地を30mlの２×ＹＴＡＧに換えた後、３０℃にて一晩培養した。培養液を2200rpm×10分で遠心後、沈殿した大腸菌を3mlの２×ＹＴＡＧに懸濁し、１次パンニングの大腸菌ライブラリーとした。このＴＧ１液を、２×ＹＴＡＧ培地に植え、ヘルパーファージを用いてレスキューし、スクリーニング後のファージライブラリーを調製した。【００９１】
上記のバイオパンニングの操作を、合計で３回行い、それぞれ、２次、３次のパンニングで得られたファージ溶液を、２次ファージライブラリー、３次ファージライブラリーとした。ただし、２次パンニング、３次パンニングでは、ブロッキング溶液にそれぞれ、5％スキムミルク、0.5％BSAを用いた。【００９２】
２次パンニング、ならびに３次パンニング後のSOBAGプレートから任意にクローンを抽出し、短鎖Ｆｖ抗体ファージクローンを調製して、B7RP-1-Fcに対する特異性の確認ならびに抗体遺伝子の配列解析を行った。【００９３】
《実施例３：スクリーニングB7RP-1 ＥＬＩＳＡ》
分離した単鎖Ｆｖ抗体ファージのＥＬＩＳＡによる結合特異性の確認は、以下の方法で行った。ＥＬＩＳＡプレート（Nunc）にB7RP-1-Fc（80ng/well）を４℃で一晩コートし、0.5％ゼラチン/PBSでブロッキングを行った。0.1％Tween20/PBSで洗浄後、単離した単鎖Ｆｖファージクローン（1×1013pfu/ml）40μlを加え、常温で２時間反応させた。結合ファージの検出は、一次抗体としてビオチン化抗M13ファージ抗体（Pharmacia）を、二次抗体としてAP標識したストレプトアビジンを加え反応させた後、基質溶液（10％2,2-イミノジエタノールを含む１mg/ml PNP-リン酸のPBS溶液）を加え、405nmでの吸光度を、マルチプレートオートリーダーNJ-2001（Nunc社）にて測定した。その結果、最終的に評価したクローンすべてが、B7RP-1に特異的であることがわかった（図１）。【００９４】
《実施例４：クローンの配列分析》
単離したクローンのｓｃＦｖ遺伝子のＶＨおよびＶＬのＤＮＡ塩基配列をDye terminator cycle sequencing FS Ready Reaction kit（Applied Biosystems）を用いて決定した。ＥＬＩＳＡおよび配列分析の結果、単離したクローンは４種のｓｃＦｖに分類された。【００９５】
《実施例５：ヒト由来抗ヒトB7RP-1ｓｃＦｖの発現と精製》
前記実施例２、３で単離したヒトB7RP-1に反応するｓｃＦｖクローンからプラスミドＤＮＡを回収して、常法に従って大腸菌HB2151を形質転換した。2％グルコースおよび100μg/mLのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地でこれらの大腸菌を一夜前培養後、グルコースフリーの２×ＹＴ培地に一部移植し、終濃度１mM IPTG、100μg/mLのアンピシリンを加えて４時間培養してｓｃＦｖの発現誘導を行った。培養終了後菌体を遠心回収し、１mM ＥＤＴＡを含むＰＢＳに懸濁して氷中に３０分菌体を放置した。次いで8,900×gで３０分間遠心し、上清を0.45μmフィルター濾過したものをペリプラズム画分とし、ｓｃＦｖの精製出発材料とした。【００９６】
このようにして調製した精製の出発材料を、抗E tag抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで常法に従って精製した。ＰＢＳで透析後、エンドトキシン除去カラムDetoxi-gel（PIERCE社）で添付のプロトコルに従いエンドトキシンを除去した。分子量カット10,000のCentricon（Amicon社）で濃縮後、0.45μmフィルター濾過して精製標品とした。保存は-20℃で行った。【００９７】
《実施例６：精製ｓｃＦｖのヒトB7RP-1との結合性》
精製した単鎖Ｆｖ抗体のB7RP-1に対する結合活性の測定は、以下の方法で行った。ＥＬＩＳＡプレート（Nunc）にB7RP-1-Fc （80ng/well）を４℃で一晩コートし、0.5％ゼラチン/PBSでブロッキングを行った、0.1％Tween20/PBSで洗浄後、単離した単鎖Ｆｖ抗体（20μg/ml）と抗E-tag抗体を混合したものを40μl加え、２時間反応させた。検出は、二次抗体としてAP標識した抗マウスIgG Fcγ抗体を加え６０分反応させた後、基質溶液を加え、405nmでの吸光度を、マルチプレートオートリーダーNJ-2001にて測定した。その結果、最終的に評価したクローンすべてが、B7RP-1に特異的であることがわかった（図２）。【００９８】
また、クローン２２３について、単鎖Ｆｖ抗体とB7RP-1との結合解離定数をBIAcoreを用いて検討した。センサーチップCM5（Biacore AB, Uppsala, Sweden）上の４つのフローセルに20℃で10mM酢酸緩衝液（pH4.0）で希釈したB7RP-1-Fc、ICOS-Fc、CTLA-4-Fc、抗ヒトFc F(ab')2抗体（各10μg/mL）をそれぞれ流速5μL/分で固定化した。HBS緩衝液（100mM HEPES/5M NaCl/0.5M EDTA/0.005％Tween20（Pharmacia biotech））によりセンサーチップを洗浄した後、HBS緩衝液/0.01％BSAで希釈したB7RP-1-Fcを反応させ、抗ヒトFc F(ab')2抗体にキャプチャーさせた。引き続き、各ｓｃＦｖサンプル（100nMに調整）を流速10μL/分で注入して反応させ、サンプル毎の結合解離定数を測定した。また、各サンプルを反応させる工程の前に、200mM NaCl を含む200mMグリシン-HCl緩衝液（pH2.2）によりｓｃＦｖを溶出し洗浄した。データ解析にはBIAevaluationソフトを使用した。その結果、まずB7RP-1-FcはICOS-Fcと抗ヒトFc F(ab')2抗体を固定したチップにのみ反応を示し、その結果から、B7RP-1とICOSとの結合解離定数は約7nMであることが分かった。引き続き、２３３を反応させたところ、B7-RP1-Fcを固定したチップと、抗ヒトFc F(ab')2抗体にB7-RP1-Fcをキャプチャーさせたチップにのみ結合性を示し、ICOSと結合しているB7-RP1-Fcには結合性を示さなかったことから、２３３についてはICOSとの結合部位に結合することが推定された。B7RP-1との結合解離定数は約13〜15nMと算出されたことから、レセプターであるICOSとほぼ同等であることが確認された（図３）。【００９９】
《実施例７：抗B7RP-1単鎖Ｆｖ抗体によるICOS-FｃとB7RP-1-Fc間の結合阻害》
96穴プレートにB7RP-1-Fc (40ng/well)を４℃で一晩コートし、0.5％ゼラチン/PBSでブロックした後、0.1％Tween20 /PBSで洗浄した。125nM〜２μMの抗B7RP-1単鎖Ｆｖ抗体溶液とビオチン標識したICOS-Fcを混合したものを加え、９０分反応させた。洗浄後、AP標識したストレプトアビジンを加え、３０分反応させた後、基質溶液を加え、405nmの吸光度を測定した。その結果、クローン２２３、３２３、３２５については、加えた単鎖Ｆｖ抗体の用量依存的に、ICOSとB7RP-1間の結合を阻害していることがわかった（図４）。【０１００】
《実施例８：単鎖Ｆｖ抗体の末梢血Bリンパ球上のB7RP-1への結合のフローサイトメータによる解析》
単離したヒト抗B7RP-1単鎖Ｆｖ抗体の細胞上に発現されたB7RP-1分子に対する結合活性を確認するために、ヒト末梢血リンパ球を用いて、蛍光フローサイトメータを使って解析した。ヒトヘパリン末梢血からフィコールを用いた定法によりPBMCを精製した。PMA（5ng/ml）とPHA（2μg/ml）で４１時間刺激した後、ヒトIgG抗体を加えることでヒトIgG Fcγレセプターのブロックを行い、単鎖Ｆｖ抗体と抗E tag抗体の混合物を加え90分応させた。細胞を洗浄後、PEラベル化したストレプトアビジンならびに、ヒトＢ細胞特異的マーカーとして、FITCでラベル化した抗CD19抗体で３０分間反応させ、蛍光ラベル化した。洗浄後、Coulter EPICS XL（Coulter 社 Miami, FL）フローサイトメータを用いて、PEならびにFITCチャンネルでの２次元フローサイトメトリー解析を行った。その結果、クローン名、２２３、３２３、３２５において、抗CD19抗体によってFITCラベル化されたＢ細胞集団のPEによる染色が確認されたことから、これらのクローンについては、Ｂ細胞上のB7RP-1に対する結合活性を有することが示された（図５）。【０１０１】
《実施例９：ヒト抗B7RP-1単鎖Ｆｖ抗体によるＴ細胞補助刺激シグナルに対するＴ細胞増殖阻害活性》
抗原提示細胞上のB7RP-1とＴ細胞上のICOS間の補助シグナルの伝達に対する、得られた単鎖Ｆｖ抗体の阻害活性をＴ細胞増殖活性を指標に解析した。96穴の丸底プレートに、抗CD3抗体（2μg/ml）と抗ヒトIgG FcフラグメントF(ab')2抗体（2.4μg/ml）の混合液を37℃で９０分間コートした。プレートをPBSで洗浄したのち、B7RP-1-Fc（1μg/ml）を加えて37℃で２時間反応させた。再度プレートを洗浄した後、RPMI1640で調製した1nM〜500nMの単鎖Ｆｖ抗体および抗B7RP-1抗体を加え３０分反応させ、その後ヒト末梢血から調製した末梢血リンパ球（1×105細胞/well）を加え、37℃で培養した。培養開始から４８時間後にトリチウムチミジン（0.5μCi/well）を加え、さらに１８時間培養した。細胞のDNAをガラスフィルターに吸着させた後、液体シンチレータに溶かし、DNA中のトリチウムチミジン量をシンチレーションカウンターで測定した。すべてのクローンで、ヒトICOS-Fｃを加えた場合とほぼ同等の単鎖Ｆｖ抗体による用量依存的なＴ細胞増殖阻害が起こっており、これらの単鎖Ｆｖクローン２２３、３２３、３２５のICOSシグナルに対する阻害活性が示された（図６）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年5月2日(2006.5.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】請求の範囲
【請求項１】（削除）
【請求項２】Ｈ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）が以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有し、Ｌ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）が以下の（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列を有する、ヒトＢ７  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １（以下、Ｂ７ＲＰ−１）に結合性を有するヒト抗ヒトＢ７ＲＰ−１抗体：
（ａ）ＣＤＲ１として配列番号１〜３のいずれか一つ、ＣＤＲ２として配列番号４〜６のいずれか一つ、およびＣＤＲ３として配列番号７〜９のいずれか一つによりそれぞれ示されるアミノ酸配列；
（ｂ）ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列として、それぞれ、配列番号１〜３、４〜６、または７〜９、またはこれらアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、ヒトＢ７ＲＰ−１に対するＨ鎖の相補性決定領域となりうるもの；
（ｃ）ＣＤＲ１として配列番号１０〜１２のいずれか一つ、ＣＤＲ２として配列番号１３〜１５のいずれか一つ、ＣＤＲ３として配列番号１６〜１８のいずれか一つによりそれぞれ示されるアミノ酸配列；
（ｄ）ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列として、それぞれ、配列番号１０〜１２、１３〜１５、または１６〜１８、またはこれらアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、ヒトＢ７ＲＰ−１に対するＬ鎖の相補性決定領域となりうるもの。
【請求項３】Ｈ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、配列番号１、４および７、配列番号２、５および８、または配列番号３、６および９の組み合わせから選択されるアミノ酸配列であり、Ｌ鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、配列番号１０、１３および１６、配列番号１１、１４および１７、または配列番号１２、１５および１８の組み合わせから選択されるアミノ酸配列である請求項２に記載のヒト抗ヒトＢ７ＲＰ−１抗体。
【請求項４】Ｈ鎖のＣＤＲ１〜３とＬ鎖のＣＤＲ１〜３との組み合わせのアミノ酸配列が、配列番号１、４および７と配列番号１０、１３および１６、配列番号２、５および８と配列番号１１、１４および１７、または配列番号３、６および９と配列番号１２、１５および１８とのいずれか一つの組み合わせである、請求項３に記載のヒト抗ヒトＢ７ＲＰ−１抗体。
【請求項５】Ｈ鎖可変領域が以下の（ｅ）または（ｆ）のアミノ酸配列を有し、Ｌ鎖可変領域が以下の（ｇ）または（ｈ）のアミノ酸配列を有する、請求項２から４のいずれかに記載のヒト抗ヒトＢ７ＲＰ−１抗体：
（ｅ）配列番号１９〜２１のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号１９〜２１に示されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、ヒトＢ７ＲＰ−１に対するＨ鎖可変領域となりうるもの；
（ｇ）配列番号２２〜２４のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号２２〜２４に示されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、ヒトＢ７ＲＰ−１に対するＬ鎖可変領域となりうるもの。
【請求項６】Ｈ鎖可変領域とＬ鎖可変領域との組み合わせのアミノ酸配列が、配列番号１９と配列番号２２、配列番号２０と配列番号２３、または配列番号２１と配列番号２４との組み合わせにより示されるアミノ酸配列である、請求項２から５のいずれかに記載のヒト抗ヒトＢ７ＲＰ−１抗体。
【請求項７】（削除）
【請求項８】相補性決定領域（ＣＤＲ）が以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を有する、ヒトＢ７ＲＰ−１に結合性を有するヒト抗ヒトＢ７ＲＰ−１抗体のＨ鎖可変領域フラグメント：
（ａ）ＣＤＲ１として配列番号１〜３のいずれか一つ、ＣＤＲ２として配列番号４〜６のいずれか一つ、およびＣＤＲ３として配列番号７〜９のいずれか一つによりそれぞれ示されるアミノ酸配列；
（ｂ）ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列として、それぞれ、配列番号１〜３、４〜６、または７〜９、またはこれらアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、ヒトＢ７ＲＰ−１に対するＨ鎖の相補性決定領域となりうるもの。
【請求項９】ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、配列番号１、４および７、配列番号２、５および８、または配列番号３、６および９の組み合わせから選択されるアミノ酸配列である、請求項８に記載のヒト抗ヒトＢ７ＲＰ−１抗体のＨ鎖可変領域フラグメント。
【請求項１０】以下の（ｅ）または（ｆ）のアミノ酸配列を有する、請求項８または９に記載のヒト抗ヒトＢ７ＲＰ−１抗体のＨ鎖可変領域フラグメント：
（ｅ）配列番号１９〜２１のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号１９〜２１に示されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、ヒトＢ７ＲＰ−１に対するＨ鎖可変領域となりうるもの。
【請求項１１】（削除）
【請求項１２】相補性決定領域（ＣＤＲ）が以下の（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列を有する、ヒトＢ７ＲＰ−１に結合性を有するヒト抗ヒトＢ７ＲＰ−１抗体のＬ鎖可変領域フラグメント：
（ｃ）ＣＤＲ１として配列番号１０〜１２のいずれか一つ、ＣＤＲ２として配列番号１３〜１５のいずれか一つ、およびＣＤＲ３として配列番号１６〜１８のいずれか一つによりそれぞれ示されるアミノ酸配列；
（ｄ）ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列として、それぞれ、配列番号１０〜１８、１３〜１５のいずれか一つ、または１６〜１８、またはこれらアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、ヒト抗ヒトＢ７ＲＰ−１抗体のＬ鎖の相補性決定領域となりうるもの。
【請求項１３】ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、配列番号１０、１３および１６、配列番号１１、１４および１７、または配列番号１２、１５および１８の組み合わせから選択されるアミノ酸配列である、請求項１２に記載のヒト抗ヒトＢ７ＲＰ−１抗体のＬ鎖可変領域フラグメント。
【請求項１４】以下の（ｇ）または（ｈ）のアミノ酸配列を有する、請求項１２または１３に記載のヒト抗ヒトＢ７ＲＰ−１抗体のＬ鎖可変領域フラグメント：
（ｇ）配列番号２２〜２４のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号２２〜２４に示されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列であって、ヒトＢ７ＲＰ−１に対するＬ鎖可変領域となりうるもの。
【請求項１５】請求項８から１０のいずれかに記載のヒト抗ヒトＢ７ＲＰ−１抗体のＨ鎖可変領域フラグメントと、請求項１２から１４のいずれかに記載のヒト抗ヒトＢ７ＲＰ−１抗体のＬ鎖可変領域フラグメントとを連結してなる、ヒトＢ７ＲＰ−１に対するヒト由来の抗体の一本鎖可変領域フラグメント。
【請求項１６】請求項８から１０のいずれかに記載のヒト抗ヒトＢ７ＲＰ−１抗体のＨ鎖可変領域フラグメント、および／または請求項１２から１４のいずれかに記載のヒト抗ヒトＢ７ＲＰ−１抗体のＬ鎖可変領域フラグメントに、ヒト由来の抗体定常領域を連結してなる、ヒトＢ７ＲＰ−１に対するヒト由来の抗体またはその抗体フラグメント。
【請求項１７】当該抗体フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＡｂ、またはｓｃＦｖ−Ｆｃである請求項１６に記載の抗体フラグメント。
【請求項１８】請求項２から６、８から１０、または１２から１７のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントとペプチド或いは他のタンパク質とを融合させた融合抗体またはそのフラグメント。
【請求項１９】請求項２から６、８から１０、または１２から１８のいずれかに記載の抗体もしくは融合抗体またはそのフラグメントに修飾剤が結合されてなる修飾抗体またはそのフラグメント。
【請求項２０】請求項２から６、８から１０、または１２から１９のいずれかに記載の抗体もしくは融合抗体またはそのフラグメントをコードする遺伝子。
【請求項２１】請求項２０に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
【請求項２２】請求項２０に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
【請求項２３】請求項２０に記載の遺伝子を宿主に発現させることによって、ヒト抗Ｂ７ＲＰ−１抗体またはその断片を生産する方法。
【請求項２４】請求項２から６、８から１０、または１２から１７のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント、または請求項１８に記載の融合抗体またはそのフラグメント、または請求項１９に記載の修飾抗体またはそのフラグメントを用いたＢ７ＲＰ−１の検出試薬。
【請求項２５】請求項２０に記載の遺伝子を含む遺伝子治療剤。
【請求項２６】請求項２から６、８から１０、または１２から１７のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント、または請求項１８に記載の融合抗体またはそのフラグメント、または請求項１９に記載の修飾抗体またはそのフラグメントを用いたＢ７ＲＰ−１とＩＣＯＳとの結合活性阻害剤。
【請求項２７】請求項２から６、８から１０、または１２から１７のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント、または請求項１８に記載の融合抗体またはそのフラグメント、または請求項１９に記載の修飾抗体またはそのフラグメントが認識するＢ７ＲＰ−１上の抗原決定領域に基づいて分子設計された低分子化合物またはその誘導体。
【請求項２８】請求項２７に記載の低分子化合物またはその誘導体を用いたＢ７ＲＰ−１とＩＣＯＳとの結合活性阻害剤。
【請求項２９】請求項２６または請求項２８に記載の結合活性阻害剤を用いたＢ７ＲＰ−１とＩＣＯＳとの相互作用により惹起される炎症および免疫異常性疾患の予防または治療薬。
【国際調査報告】
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