【手続補正書】
【提出日】令和2年5月15日(2020.5.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を含む複数の生体試料のアイデンティティを識別する方法であって、
基体又は容器である、核酸を含む生体試料を各々が含有する複数の担体を準備する工程であって、
ここで、各担体が、前記核酸を含む試料に加えて、前記担体を標識するための少なくとも2つのヌクレオチドバーコード核酸を含み、
これらの少なくとも2つのヌクレオチドバーコード核酸の各々が、少なくとも4ヌクレオチド長の異なる最小ヌクレオチドバーコード配列を含み、
これらの異なるヌクレオチドバーコード核酸の組み合わせが、移動可能な分子識別バーコードを生成することによって、各移動可能な分子識別バーコードが前記担体の各々に対して異なり、
前記少なくとも2つのヌクレオチドバーコード核酸中の前記最小ヌクレオチドバーコード配列の片側又は両側に全てのヌクレオチドバーコード核酸において同一である非ウイルス性及び非細菌性のヌクレオチドバーコード配列識別子配列が隣接し、
片側又は両側に全てのヌクレオチドバーコード核酸において同一である非ウイルス性及び非細菌性の抽出配列が隣接することを特徴とし、これらが前記最小ヌクレオチドバーコード配列の識別を可能として、
各担体が、前記担体に貼り付けられた移動可能な分子識別バーコードに対応する巨視的なバーコードラベルを含む、工程と、
前記生体試料の前記核酸中の1以上の標的配列を配列決定するとともに、前記最小ヌクレオチドバーコード配列を含む前記ヌクレオチドバーコード核酸中の標的配列を配列決定する工程であって、
前記生体試料の前記核酸中の前記標的配列の配列決定、及び前記最小ヌクレオチドバーコード配列を含む前記ヌクレオチドバーコード核酸の標的配列の配列決定が並行配列決定法によって行われ、
前記並行配列決定法が、前記生体試料の前記核酸中の標的配列、及び前記最小ヌクレオチドバーコード配列を含む前記ヌクレオチドバーコード核酸の標的配列をプールすることによって進められる、工程、又は異なる試料に由来する、前記生体試料の前記核酸中の標的配列、及び前記最小ヌクレオチドバーコード配列を含む前記ヌクレオチドバーコード核酸の標的配列をプールすることによって進められる、工程と、
前記得られた配列データから、ヌクレオチドバーコード核酸に由来する前記配列を特定し、選択する工程であって、前記得られた配列データから、ヌクレオチドバーコード核酸に由来するそれらの配列を選択する工程を含み、
前記選択工程が、前記最小ヌクレオチドバーコード配列に近接した1以上のヌクレオチドバーコード配列識別子配列を有する配列の識別を含む、工程と、
ヌクレオチドバーコード配列識別子配列を有する前記単離された配列内の前記最小ヌクレオチドバーコード配列を特定し、選択する工程であって、
規定の長さで2つの抽出配列間に存在する前記配列を選択し、又は規定の長さで1つの抽出配列に近接して存在する前記配列を選択し、
これらの選択された配列を最小ヌクレオチドバーコード配列として特定する工程を含む、工程と、
前記特定された最小ヌクレオチドバーコード配列と、前記予想される最小ヌクレオチドバーコード配列とを、前記担体によって提供される巨視的なバーコードラベルに基づいて照合することにより、前記試料のアイデンティティ及び／又は汚染を識別する工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
前記試料中の前記標的核酸に対して、及び前記ヌクレオチドバーコード配列を含む前記核酸に対してアダプターを連結する工程を含むとともに、
前記標的配列及び前記ヌクレオチドバーコード配列を、前記連結生成物を配列決定テンプレートとして使用して配列決定する工程を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸試料中の標的配列の濃縮工程を行うとともに、前記ヌクレオチドバーコード配列の濃縮工程を行う工程を含む、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
前記濃縮工程が捕捉又は増幅を用いて行われる工程であって、前記増幅が、1段階PCR、2段階PCR、プライマー伸長に続くライゲーション及びPCR、環状化に基づく増幅、並びにナノポアシーケンシングから選択される、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
試料の前記標的配列に対して、試料特異的プール化バーコードを付着させる工程、又は試料特異的プール化バーコードを付着させる工程であって、前記試料中の前記ヌクレオチドバーコード配列を含む前記核酸に対しても、同じ試料特異的プール化バーコードを付着させる、工程を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
物品を標識するための核酸を含む、基体又は容器である担体の収集物であって、
各担体が、標識のため、試料核酸以外に、少なくとも2つのヌクレオチドバーコード核酸を含み、
各ヌクレオチドバーコード核酸が少なくとも4ヌクレオチド長の異なる最小ヌクレオチドバーコード配列を含み、
ここで、前記異なるヌクレオチドバーコード核酸の少なくとも2つが同じ長さの最小ヌクレオチドバーコード配列を有し、
これらの異なるヌクレオチドバーコード核酸の組み合わせが移動可能な分子識別バーコードを生成することによって、かかる各移動可能な分子識別バーコードが前記収集物における前記担体の各々に対して異なり、
前記少なくとも2つのヌクレオチドバーコード核酸中の前記最小ヌクレオチドバーコード配列の片側若しくは両側に、全てのヌクレオチドバーコード核酸において同一である非ウイルス性及び非細菌性のヌクレオチドバーコード配列識別子配列が隣接する、及び／又は片側若しくは両側に、全てのヌクレオチドバーコード核酸において同一である非ウイルス性及び非細菌性の抽出配列が隣接することを特徴とし、これらが前記ヌクレオチドバーコード配列の識別を可能とし、
各担体が、前記担体に貼り付けられた前記移動可能な分子識別バーコードに対応する巨視的なバーコードラベルを含む、担体の収集物。
【請求項７】
前記収集物が少なくとも100個の担体、又は少なくとも10000個の担体を含んでなる、請求項6に記載の担体の収集物。
【請求項８】
標識のための前記ヌクレオチドバーコード核酸が核酸をRNAに転写するための配列を含まない、請求項6又は7に記載の収集物。
【請求項９】
前記試料がDNA含有試料又はRNA含有試料である、請求項6〜8のいずれか一項に記載の担体の収集物。
【請求項１０】
前記最小ヌクレオチドバーコード配列に、増幅によって前記最小ヌクレオチドバーコード配列を濃縮するためのオリゴヌクレオチド配列が隣接し、又は、
前記最小ヌクレオチドバーコード配列の片側若しくは両側に1以上のオリゴヌクレオチド結合配列が隣接し、
これらが前記ヌクレオチドバーコード配列中の片方又は両方のオリゴヌクレオチド結合配列におけるハイブリダイゼーションに基づく配列捕捉を可能とする、請求項6〜9のいずれか一項に記載の担体の収集物。
【請求項１１】
前記ヌクレオチドバーコード核酸がクローニングベクターのフラグメント中に含まれる、請求項6〜10のいずれか一項に記載の担体の収集物。
【請求項１２】
前記ベクター又はベクターフラグメントが、配列番号1〜配列番号20からなる群から選択される配列を含む、又は前記ベクター又はベクターフラグメントが、配列番号1及び配列番号11の配列を含む、請求項11に記載の担体の収集物。
【請求項１３】
前記ヌクレオチドバーコード配列を含む核酸を捕捉および／又は増幅するため、1以上のプライマーを更に含む、請求項6〜12のいずれか一項に記載の担体の収集物。
【請求項１４】
移動可能な分子識別バーコードを含む、基体又は容器である担体の収集物を作製する方法であって、
a）少なくとも4ヌクレオチドの最小ヌクレオチドバーコード配列を含む、異なるヌクレオチドバーコード核酸の第1の収集物を準備する工程であって、
前記異なるヌクレオチドバーコード核酸の少なくとも2つが同じ長さの最小ヌクレオチドバーコード配列を有し、
その前記最小ヌクレオチドバーコード配列が、前記収集物中の前記ヌクレオチドバーコード核酸の間で、並びに1以上の非ウイルス性及び非細菌性のヌクレオチドバーコード配列識別子配列及び／又は1以上の非ウイルス性及び非細菌性の抽出配列で異なり、これらがヌクレオチドバーコード核酸中の前記最小ヌクレオチドバーコード配列の識別を可能とする、工程と、
b）工程a）の前記ヌクレオチドバーコード核酸の少なくとも2つの組み合わせを各担体に添加して、最小ヌクレオチドバーコード配列のミックスにおける相違によって定義される独自の移動可能な分子識別バーコードを各々有する担体の収集物を得る工程と、
c）各担体を、前記最小ヌクレオチドバーコード配列の異なるミックスによって定義される前記移動可能な分子識別バーコードに対応する巨視的なバーコードラベルで標識する工程と、
d）前記巨視的なラベルと、前記移動可能な分子識別バーコード中の最小ヌクレオチドバーコード配列のミックスとの関係を保存する工程と、
を含む、方法。
【請求項１５】
前記少なくとも2つのヌクレオチドバーコード核酸中の前記最小ヌクレオチドバーコード配列の片側若しくは両側に、全てのヌクレオチドバーコード核酸において同一である非ウイルス性及び非細菌性のヌクレオチドバーコード配列識別子配列が隣接する、及び／又は片側若しくは両側に、全てのヌクレオチドバーコード核酸において同一である非ウイルス性及び非細菌性の抽出配列が隣接する、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記ヌクレオチドバーコード核酸が配列番号1〜配列番号20からなる群から選択される配列を含む、又は前記ヌクレオチドバーコード核酸が配列番号1及び配列番号11の配列を含む、請求項14又は15に記載の方法。
【請求項１７】
ヌクレオチドバーコード配列を含むベクターを有する宿主の収集物を作製する方法であって、
a）宿主において核酸ベクターの第1の収集物を準備する工程であって、
前記ベクターが、前記収集物中のヌクレオチドバーコード核酸ベクター間で異なる少なくとも4ヌクレオチド長の最小ヌクレオチドバーコード配列を有するヌクレオチドバーコード配列を含み、
前記異なるヌクレオチドバーコード配列の少なくとも2つが、同じ長さの最小ヌクレオチドバーコード配列を有して、前記最小ヌクレオチドバーコード配列の片側又は両側に、1以上の非ウイルス性及び非細菌性のヌクレオチドバーコード配列識別子配列、及び／又は1以上の非ウイルス性及び非細菌性の抽出配列を含み、これらが前記最小ヌクレオチドバーコード配列の識別を可能とする、工程と、
b）前記宿主の個々のコロニーを準備し、複数のコロニーに対して、前記核酸ベクター中の前記ヌクレオチドバーコード配列を配列決定して、単離されたコロニーの第2の収集物を得る工程であって、
各コロニーが異なるヌクレオチドバーコード配列を有する核酸ベクターを含む、工程と、
を含む、方法。
【請求項１８】
前記ベクターが配列番号1〜配列番号20からなる群から選択される配列、又は前記ベクターが配列番号1及び配列番号11の配列を含む、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
移動可能な分子識別バーコードを含む、基体又は容器である担体の収集物を作製する方法であって、
a）請求項17に記載の宿主の収集物を準備する工程と、
b）コロニーの選択のため、前記コロニーから前記ベクターを単離する工程と、
c）前記担体の収集物中の各担体に、異なるヌクレオチドバーコード配列を有する少なくとも2つの核酸ベクターの組み合わせを添加する工程であって、
前記核酸ベクターの少なくとも2つが、担体間において、最小ヌクレオチドバーコード配列のミックスにおける相違によって定義される、独自の移動可能な分子識別バーコードを各々有する担体の収集物を得るため、工程b）の同じ長さの最小ヌクレオチドバーコード配列を有し、
制限酵素によって前記ベクターを断片化する、工程又は制限酵素によって前記ベクターを断片化しない工程と、
d）各担体を、前記異なる最小ヌクレオチドバーコード配列のミックスによって定義される、前記移動可能な分子識別バーコードに対応する巨視的なバーコードラベルで標識する工程と、
e）前記巨視的なバーコードラベルと、前記移動可能な分子識別バーコード中の前記最小ヌクレオチドバーコード配列の配列との関係を保存する工程と、
を含む、方法。
【請求項２０】
担体のセットにおいてヌクレオチドバーコード核酸を追跡する方法であって、
前記担体を標識するための少なくとも2つのヌクレオチドバーコード核酸を含み、ゲノムDNA又はRNAを含まない、複数の担体を準備する工程であって、
これらの少なくとも2つのヌクレオチドバーコード核酸の各々が、少なくとも4ヌクレオチド長の異なる最小ヌクレオチドバーコード配列を含み、
これらの異なるヌクレオチドバーコード核酸の組み合わせが、移動可能な分子識別バーコードを生成することによって、各移動可能な分子識別バーコードが前記担体の各々に対して異なり、
前記少なくとも2つのヌクレオチドバーコード核酸中の前記最小ヌクレオチドバーコード配列の片側又は両側に、全てのヌクレオチドバーコード核酸において同一である非ウイルス性及び非細菌性のヌクレオチドバーコード配列識別子配列が隣接し、片側又は両側に、全てのヌクレオチドバーコード核酸において同一である非ウイルス性及び非細菌性の抽出配列が隣接することを特徴とし、これらが前記最小ヌクレオチドバーコード配列の識別を可能として、
各担体が、前記担体に貼り付けられた前記移動可能な分子識別バーコードに対応する巨視的なバーコードラベルを含む、工程と、
前記最小ヌクレオチドバーコード配列を含む、前記ヌクレオチドバーコード核酸中の標的配列を、並行配列決定法によって配列決定する工程であって、
前記並行配列決定法が、前記ヌクレオチドバーコード核酸の標的配列をプールすることによって進められる、工程又は、前記最小ヌクレオチドバーコード配列を含む前記ヌクレオチドバーコード核酸の標的配列をプールすることによって進められる、工程と、
前記得られた配列データから、ヌクレオチドバーコード核酸に由来する前記配列を特定し、選択する工程であって、前記得られた配列データから、ヌクレオチドバーコード核酸に由来するそれらの配列を選択する工程を含み、
前記選択工程が、前記最小ヌクレオチドバーコード配列に近接した1以上のヌクレオチドバーコード配列識別子配列を有する配列の識別を含む、工程と、
ヌクレオチドバーコード配列識別子配列を有する前記単離された配列内の前記最小ヌクレオチドバーコード配列を特定し、選択する工程であって、
規定の長さで2つの抽出配列間に存在する前記配列を選択し、又は規定の長さで1つの抽出配列に近接して存在する前記配列を選択し、これらの選択された配列を最小ヌクレオチドバーコード配列として特定する工程を含む、工程と、
前記特定された最小ヌクレオチドバーコード配列と、前記予想される最小ヌクレオチドバーコード配列とを、前記担体によって提供される前記巨視的なバーコードラベルに基づいて照合する工程と、
を含む、方法。