【手続補正書】
【提出日】令和2年10月12日(2020.10.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
独立したポリペプチドカーゴを標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核に送達するのに使用するための組成物であって、前記組成物はシャトル剤を含み、前記シャトル剤が、
（１）少なくとも２０アミノ酸長であり、
（３）正に帯電した親水性の外面および
疎水性の外面
を有する
（２）両親媒性のアルファヘリックスモチーフを含み、
次のパラメーター（４）〜（１５）の内の少なくとも５つが満たされるペプチドであり、
（４）疎水性の外面が、ターン当たり３．６残基を有するアルファヘリックスのオープンシリンダー表現に基づいて、ペプチドのアミノ酸の１２〜５０％に相当する空間的に隣接するＬ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｗ、および／またはＭアミノ酸から構成される高度疎水性コアを含む；
（５）３．５〜１１の疎水性モーメント（μ）を有する；
（６）生理学的ｐＨで少なくとも＋４の予測正味電荷を有する；
（７）８〜１３の等電点（ｐＩ）を有する；
（８）３５％〜６５％のアミノ酸：Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、およびＶの任意の組み合わせから構成される；
（９）０％〜３０％のアミノ酸：Ｎ、Ｑ、Ｓ、およびＴの任意の組み合わせから構成される；
（１０）３５％〜８５％のアミノ酸：Ａ、Ｌ、Ｋ、またはＲの任意の組み合わせから構成される；
（１１）少なくとも５％のＬがペプチド中に存在するという条件で、１５％〜４５％のアミノ酸：ＡおよびＬの任意の組み合わせから構成される；
（１２）２０％〜４５％のアミノ酸：ＫおよびＲの任意の組み合わせから構成される；
（１３）０％〜１０％のアミノ酸：ＤおよびＥの任意の組み合わせから構成される；
（１４）前記ペプチド中のＡおよびＬ残基パーセンテージ（％Ａ＋Ｌ）と、前記ペプチド中のＫとＲ残基パーセンテージ（Ｋ＋Ｒ）との差異が、１０％以下である；
（１５）１０％〜４５％のアミノ酸：Ｑ、Ｙ、Ｗ、Ｐ、Ｉ、Ｓ、Ｇ、Ｖ、Ｆ、Ｅ、Ｄ、Ｃ、Ｍ、Ｎ、Ｔ、およびＨの任意の組み合わせから構成される、ならびに、
前記組成物の使用に際して、前記シャトル剤の濃度が、前記シャトル剤の非存在下の場合に比べて、前記独立したポリペプチドカーゴの、標的真核細胞のサイトゾルおよび／または核への形質導入効率を高めるのに十分な濃度で使用される、
組成物。
【請求項２】
前記両親媒性のアルファヘリックスモチーフが、正に帯電した親水性の外面を含み、この親水性の外面が、（ａ）ヘリカルホイール投影図上に、少なくとも２個から４個の隣接する正に帯電したＫおよび／もしくはＲ残基；ならびに／または（ｂ）ヘリカルホイール投影図上に、１００度の連続アミノ酸間の回転角度および／もしくはターン当たり３．６残基を有するアルファヘリックスに基づいて、３個から５個のＫおよび／もしくはＲ残基を含む６個の隣接する残基のセグメントを含む、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項３】
前記両親媒性のアルファヘリックスモチーフが、疎水性の外面を含み、この疎水性の外面は、（ａ）ヘリカルホイール投影図上で、少なくとも２個の隣接するＬ残基；ならびに／または（ｂ）ヘリカルホイール投影図上で、１００度の連続アミノ酸間の回転角度および／もしくはターン当たり３．６残基を有するアルファヘリックスに基づいて、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｗ、およびＭから選択される少なくとも５個の疎水性の残基を含む１０個の隣接する残基のセグメント、を含む、請求項１または２に記載の使用のための組成物。
【請求項４】
前記シャトル剤が、少なくとも６個のパラメーター（４）〜（１５）を満たす、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項５】
前記シャトル剤が、少なくとも７個のパラメーター（４）〜（１５）を満たす、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項６】
前記シャトル剤が、少なくとも８個のパラメーター（４）〜（１５）を満たす、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項７】
前記シャトル剤が、少なくとも９個のパラメーター（４）〜（１５）を満たす、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項８】
前記シャトル剤が、少なくとも１０個のパラメーター（４）〜（１５）を満たす、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項９】
（ｉ）前記シャトル剤が、２０アミノ酸の最小長、および１５０アミノ酸の最大長を有するペプチドであり、
（ｉｉ）前記両親媒性のアルファヘリックスモチーフが、３．５の下限値と、１１．０の上限値との間の疎水性モーメント（μ）を有し、
（ｉｉｉ）前記疎水性の外面が、前記ペプチドのアミノ酸の１２．５％から４５％に相当する空間的に隣接するＬ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｗ、および／またはＭアミノ酸から構成される高度疎水性コアを含み、
（ｉｖ）前記ペプチドが、４．０の下限値と、１０．５の上限値との間の疎水性モーメント（μ）を有し、
（ｖ）前記ペプチドが、＋４〜＋１５の予測実効電荷を有し、
（ｖｉｉ）前記ペプチドが、１０〜１３の予測ｐＩを有し、または
（ｖｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）の内の任意の組み合わせである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項１０】
前記シャトル剤が、次のパラメーターの少なくとも１つを満たす、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物：
（８）前記ペプチドが、３６％〜６４％のアミノ酸：Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、およびＶの任意の組み合わせから構成される；
（９）前記ペプチドが、１％〜２９％のアミノ酸：Ｎ、Ｑ、Ｓ、およびＴの任意の組み合わせから構成される；
（１０）前記ペプチドが、３６％〜８０％のアミノ酸：Ａ、Ｌ、Ｋ、またはＲの任意の組み合わせから構成される；
（１１）前記ペプチドが、１５％〜４０％のアミノ酸：ＡおよびＬの任意の組み合わせから構成される；
（１２）前記ペプチドが、２０％〜４０％のアミノ酸：ＫおよびＲの任意の組み合わせから構成される；
（１３）前記ペプチドが、５％〜１０％のアミノ酸：ＤおよびＥの任意の組み合わせから構成される；
（１４）前記ペプチド中のＡおよびＬ残基パーセンテージ（％Ａ＋Ｌ）と、前記ペプチド中のＫおよび／またはＲ残基のパーセンテージ（Ｋ＋Ｒ）との差異が、９％以下である；ならびに
（１５）前記ペプチドが、１５〜４０％のアミノ酸：Ｑ、Ｙ、Ｗ、Ｐ、Ｉ、Ｓ、Ｇ、Ｖ、Ｆ、Ｅ、Ｄ、Ｃ、Ｍ、Ｎ、Ｔ、およびＨの任意の組み合わせから構成される。
【請求項１１】
前記ペプチドが、ヒスチジンリッチドメインを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項１２】
前記ペプチドが、セリンおよび／またはグリシン残基が濃縮されたフレキシブルリンカードメインを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項１３】
前記ペプチドが、次記のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
（ａ）［Ｘ１］−［Ｘ２］−［リンカー］−［Ｘ３］−［Ｘ４］（式１）；
（ｂ）［Ｘ１］−［Ｘ２］−［リンカー］−［Ｘ４］−［Ｘ３］（式２）；
（ｃ）［Ｘ２］−［Ｘ１］−［リンカー］−［Ｘ３］−［Ｘ４］（式３）；
（ｄ）［Ｘ２］−［Ｘ１］−［リンカー］−［Ｘ４］−［Ｘ３］（式４）；
（ｅ）［Ｘ３］−［Ｘ４］−［リンカー］−［Ｘ１］−［Ｘ２］（式５）；
（ｆ）［Ｘ３］−［Ｘ４］−［リンカー］−［Ｘ２］−［Ｘ１］（式６）；
（ｇ）［Ｘ４］−［Ｘ３］−［リンカー］−［Ｘ１］−［Ｘ２］（式７）；または
（ｈ）［Ｘ４］−［Ｘ３］−［リンカー］−［Ｘ２］−［Ｘ１］（式８）；
式中、
［Ｘ１］が、次記から選択され：２［Φ］−１［＋］−２［Φ］−１［ζ］−１［＋］−；２［Φ］−１［＋］−２［Φ］−２［＋］−；１［＋］−１［Φ］−１［＋］−２［Φ］−１［ζ］−１［＋］−；および１［＋］−１［Φ］−１［＋］−２［Φ］−２［＋］−；
［Ｘ２］が次記から選択され：−２［Φ］−１［＋］−２［Φ］−２［ζ］−；−２［Φ］−１［＋］−２［Φ］−２［＋］−；−２［Φ］−１［＋］−２［Φ］−１［＋］−１［ζ］−；−２［Φ］−１［＋］−２［Φ］−１［ζ］−１［＋］−；−２［Φ］−２［＋］−１［Φ］−２［＋］−；−２［Φ］−２［＋］−１［Φ］−２［ζ］−；−２［Φ］−２［＋］−１［Φ］−１［＋］−１［ζ］−；および−２［Φ］−２［＋］−１［Φ］−１［ζ］−１［＋］−；
［Ｘ３］が次記から選択され：−４［＋］−Ａ−；−３［＋］−Ｇ−Ａ−；−３［＋］−Ａ−Ａ−；−２［＋］−１［Φ］−１［＋］−Ａ−；−２［＋］−１［Φ］−Ｇ−Ａ−；−２［＋］−１［Φ］−Ａ−Ａ−；または−２［＋］−Ａ−１［＋］−Ａ；−２［＋］−Ａ−Ｇ−Ａ；−２［＋］−Ａ−Ａ−Ａ−；−１［Φ］−３［＋］−Ａ−；−１［Φ］−２［＋］−Ｇ−Ａ−；−１［Φ］−２［＋］−Ａ−Ａ−；−１［Φ］−１［＋］−１［Φ］−１［＋］−Ａ；−１［Φ］−１［＋］−１［Φ］−Ｇ−Ａ；−１［Φ］−１［＋］−１［Φ］−Ａ−Ａ；−１［Φ］−１［＋］−Ａ−１［＋］−Ａ；−１［Φ］−１［＋］−Ａ−Ｇ−Ａ；−１［Φ］−１［＋］−Ａ−Ａ−Ａ；−Ａ−１［＋］−Ａ−１［＋］−Ａ；−Ａ−１［＋］−Ａ−Ｇ−Ａ；および−Ａ−１［＋］−Ａ−Ａ−Ａ；
［Ｘ４］が次記から選択され：−１［ζ］−２Ａ−１［＋］−Ａ；−１［ζ］−２Ａ−２［＋］；−１［＋］−２Ａ−１［＋］−Ａ；−１［ζ］−２Ａ−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−１［ζ］−Ａ−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−２［＋］−Ａ−２［＋］；−２［＋］−Ａ−１［＋］−Ａ；−２［＋］−Ａ−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−２［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］−Ａ；−１［＋］−１［ζ］−Ａ−２［＋］；−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−１［＋］−２［ζ］−Ａ−１［＋］；−１［＋］−２［ζ］−２［＋］；−１［＋］−２［ζ］−１［＋］−Ａ；−１［＋］−２［ζ］−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−１［＋］−２［ζ］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−３［ζ］−２［＋］；−３［ζ］−１［＋］−Ａ；−３［ζ］−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−１［ζ］−２Ａ−１［＋］−Ａ；−１［ζ］−２Ａ−２［＋］；−１［ζ］−２Ａ−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−２［＋］−Ａ−１［＋］−Ａ；−２［＋］−１［ζ］−１［＋］−Ａ；−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］−Ａ；−１［＋］−２Ａ−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；および−１［ζ］−Ａ−１［ζ］−Ａ−１［＋］；ならびに
［リンカー］が、次記から選択され：−Ｇｎ−；−Ｓｎ−；−（ＧｎＳｎ）ｎ−；−（ＧｎＳｎ）ｎＧｎ−；−（ＧｎＳｎ）ｎＳｎ−；−（ＧｎＳｎ）ｎＧｎ（ＧｎＳｎ）ｎ−；および−（ＧｎＳｎ）ｎＳｎ（ＧｎＳｎ）ｎ−；
式中、
［Φ］はアミノ酸：Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり；
［＋］は、アミノ酸：ＬｙｓまたはＡｒｇであり；
［ζ］が、アミノ酸：Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、またはＳｅｒであり；
Ａが、アミノ酸：Ａｌａであり；
Ｇが、アミノ酸：Ｇｌｙであり；
Ｓが、アミノ酸：Ｓｅｒであり；および
ｎが、１〜２０の整数である。
【請求項１４】
前記シャトル剤が、前記標的真核細胞により完全に代謝可能である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記標的真核細胞と前記ポリペプチドカーゴとを前記シャトル剤の存在下で接触させることにより、前記シャトル剤の非存在下の場合に比べて、前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率が、少なくとも１０倍まで高められる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
ポリペプチドカーゴを標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核に送達するためのインビトロ方法であって、前記方法が、前記標的真核細胞と前記ポリペプチドカーゴとを、シャトル剤の非存在下の場合に比べて、前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率を高めるのに十分な濃度の前記シャトル剤の存在下で接触させることを含み、前記シャトル剤が、請求項１〜１５のいずれか１項に定義されるものである、方法。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれか１項で定義のシャトル剤および標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核へ送達されるべき独立したポリペプチドカーゴを含む、組成物。
【請求項１８】
前記ポリペプチドカーゴが、細胞膜透過性ドメインを欠いている、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項１９】
前記ポリペプチドカーゴが、細胞内ターゲティングドメインを含む、請求項１〜１５および１８のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項２０】
前記細胞内ターゲティングドメインが、
（ａ）核移行シグナル（ＮＬＳ）；
（ｂ）核小体シグナル配列；
（ｃ）ミトコンドリアシグナル配列；または
（ｄ）ペルオキシソームシグナル配列、である、請求項１〜１５、１８、および、１９のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項２１】
前記ポリペプチドカーゴが、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ分子と複合体化されている、請求項１〜１５、および、１８〜２０のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項２２】
前記ポリペプチドカーゴが、転写因子、ヌクレアーゼ、サイトカイン、ホルモン、増殖因子、抗体、ペプチドカーゴ、酵素、酵素阻害剤、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項１〜１５、および、１８〜２１のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項２３】
（ａ）前記転写因子が、ＨＯＸＢ４、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ９、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、ＭｙｏＤ、Ｐｄｘ１、Ｎｇｎ３、ＭａｆＡ、Ｂｌｉｍｐ−１、Ｅｏｍｅｓ、Ｔ−ｂｅｔ、ＦＯＸＯ３Ａ、ＮＦ−ＹＡ、ＳＡＬＬ４、ＩＳＬ１、ＦｏｘＡ１、Ｎａｎｏｇ、Ｅｓｒｒｂ、Ｌｉｎ２８、ＨＩＦ１−ａｌｐｈａ、Ｈｌｆ、Ｒｕｎｘ１ｔ１、Ｐｂｘ１、Ｌｍｏ２、Ｚｆｐ３７、Ｐｒｄｍ５、Ｂｃｌ−６またはそれらの任意の組合せであり；
（ｂ）前記ヌクレアーゼが、触媒的に活性なまたは触媒的に死んだ：ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）、Ｃｐｆ１、ＣａｓＹ、ＣａｓＸ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼもしくはメガヌクレアーゼ、ＤＮＡ誘導性ヌクレアーゼ、ナトロノバクテリウム・グレゴリーアルゴノート（ＮｇＡｇｏ）、またはそれらの任意の組合せであり；
（ｃ）前記抗体が細胞内抗原を認識し；および／または
（ｄ）前記ペプチドカーゴが、細胞内分子を認識する、請求項１〜１５、および、１８〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記標的真核細胞が、動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、幹細胞、初代細胞、免疫細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または樹状細胞である、請求項１〜１５、および、１８〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ポリペプチドカーゴが、請求項１８〜２３のいずれか１項に定義されたものである、および／または、前記標的真核細胞が、請求項２４に定義されたものである、請求項１６に記載のインビトロ方法。
【請求項２６】
前記ポリペプチドカーゴが、請求項１８〜２３のいずれか１項に定義されたものである、および／または、前記標的真核細胞が、請求項２４に定義されたものである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２７】
独立したポリペプチドカーゴを標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核に送達する合成ペプチドシャトル剤の製造方法であって、請求項１〜１５のいずれか１項に定義のペプチドを合成することを含む方法。
【請求項２８】
独立したポリペプチドカーゴを標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核に送達するシャトル剤を特定する方法であって、次記を含む方法：
（ａ）請求項１〜１５のいずれか１項で定義のペプチドであるペプチドを合成すること；
（ｂ）前記標的真核細胞と前記ポリペプチドカーゴとを、前記ペプチドの存在下で、接触させること；
（ｃ）前記標的真核細胞中の前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率を測定すること；および
（ｄ）前記標的真核細胞中の前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率の増加が観察される場合、前記ポリペプチドカーゴを形質導入するシャトル剤として、前記ペプチドを特定すること。
【請求項２９】
前記ポリペプチドカーゴが請求項１８〜２３のいずれか１項で定義の通りである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
目的のポリペプチドカーゴを形質導入した真核細胞を濃縮する方法であって、次記を含む方法：
（ａ）目的の独立したポリペプチドカーゴおよびマーカータンパク質を用いた標的真核細胞集団を同時形質導入すること；および
（ｂ）前記マーカータンパク質を形質導入された真核細胞を単離または濃縮し、それにより、前記目的のポリペプチドカーゴを形質導入された真核細胞を濃縮すること。
【請求項３１】
（ｉ）前記マーカータンパク質が前記目的のポリペプチドカーゴに共有結合していない、または前記マーカータンパク質が切断可能リンカーを介して前記目的のポリペプチドカーゴに共有結合している；および／または
（ｉｉ）前記マーカータンパク質が検出可能な標識を含むか、または前記マーカータンパク質が蛍光タンパク質、蛍光標識タンパク質、生物発光タンパク質、同位体標識タンパク質、もしくは磁気標識タンパク質である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記形質導入マーカータンパク質の細胞内濃度が、前記目的の形質導入ポリペプチドカーゴの細胞内濃度と、正の相関をする、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記マーカータンパク質を形質導入された真核細胞が、前記マーカータンパク質を欠く細胞から単離または選別され、それにより、マーカータンパク質陽性細胞集団および／またはマーカータンパク質陰性細胞集団を製造する、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
ステップ（ａ）および（ｂ）を、前記マーカータンパク質陰性細胞集団、前記マーカータンパク質陽性細胞集団、または前記マーカータンパク質陰性および前記マーカータンパク質陽性細胞集団の両方に対して１回または複数回反復することをさらに含む、請求項３３に記載の方法。