(57)【要約】ｓｉＲＮＡに基づく細胞特異的有効分子、該分子製造のための適用キット及び該分子の使用。２．１．本発明の目的はｓｉＲＮＡと一以上のペプチドの間に結合を形成することであって、ｓｉＲＮＡはペプチド分離後に活性化され、細胞中で活性化されたｓｉＲＮＡの生物学的効力を著しく減少させるリンカー及び／又はペプチドを残さない。２．２．本発明によれば、ペプチド（３）は特殊なアミノＣｎリンカー、例えばアミノＣ６リンカー（１）を介してｓｉＲＮＡ（２）とカップリングする。アミノＣｎリンカーはｓｉＲＮＡに残存するにもかかわらず、及び場合によってはペプチド残基も残存するにもかかわらず、ｓｉＲＮＡの生物学的効力を減少させないか、又はあまり阻害しない。２．３．前記分子は、例えば、好ましくは疾病・感染を有する器官又は細胞の遺伝子発現に影響を与えたり、細胞混合物中の標的遺伝子の発現を減少させたりするために用いられる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞に生物学的に不活性なトランスフェクションを行うためのｓｉＲＮＡに基づく細胞特異的有効分子であって、前記標的細胞中で生物学的に活性化した後にｍＲＮＡとの結合により「ＲＩＳＣ」複合体を形成して遺伝子の発現を阻害するために、前記ｓｉＲＮＡは生物学的に不活性化する目的でリンカーを介して一以上のペプチドとカップリングしており、前記リンカーは該分子が生物学的に活性化した後にｓｉＲＮＡに残存する細胞特異的有効分子において、前記ｓｉＲＮＡ（２）はＣｎ＝Ｃｌ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５又はＣ６のアミノＣｎリンカー（１）を介して一以上のペプチド（３）とカップリングしていることを特徴とする細胞特異的有効分子。
【請求項２】
前記アミノＣｎリンカーとしてアミノＣ６リンカーが提供されていることを特徴とする、請求項１に記載の細胞特異的有効分子。
【請求項３】
前記アミノＣｎリンカーとしてアミノＣ５リンカーが使用されることを特徴とする、請求項１に記載の細胞特異的有効分子。
【請求項４】
前記アミノＣｎリンカーとしてアミノＣ４リンカーが提供されていることを特徴とする、請求項１に記載の細胞特異的有効分子。
【請求項５】
前記アミノＣｎリンカーとしてアミノＣ３リンカーが挿入されていることを特徴とする、請求項１に記載の細胞特異的有効分子。
【請求項６】
前記アミノＣｎリンカーとしてアミノＣ２リンカーが用いられることを特徴とする、請求項１に記載の細胞特異的有効分子。
【請求項７】
前記アミノＣｎリンカーとしてアミノＣ１リンカーが提供されていることを特徴とする、請求項１に記載の細胞特異的有効分子。
【請求項８】
請求項１に記載の細胞特異的有効分子において、アミノＣｎリンカーを介して共有結合した一以上のペプチドと、標的細胞へのトランスフェクション又は標的細胞との結合のためのトランスフェクションシステムとが共有的又は非共有的にカップリングしており、前記トランスフェクションシステムは、例えば、ナノ粒子、リガンド／抗体／抗原標識等の担体システム；選択的に活性化可能な生物学的有効分子をトランスフェクションのためにコーティングするためのナノ粒子、ポリマー又は脂質等の分子；脂質に基づく方法；又はＴＡＴタンパク質フランキングであることを特徴とする細胞特異的有効分子。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項以上に記載の細胞特異的有効分子を使用又は投与するための適用キットであって、少なくとも
【請求項１０】
不活性化の目的のために選択されたペプチドと結合したｓｉＲＮＡ及び該ｓｉＲＮＡと結合したアミノＣｎリンカーを含む少なくとも１本のアンプル（アンプルＡ）と、
トランスフェクションシステム、例えばナノ粒子又は脂質を含む少なくとも１本の他のアンプル（アンプルＢ）と、
アンプルＡとアンプルＢの内容物に対する希釈緩衝剤及び反応緩衝剤と、
アンプル内容物からなる混合物を、標的細胞を含む媒体に注入するためのカニューレを備える１本以上のプローブ又は注射器、及びその他の必要な器材と、
使用又は投与のための使用説明書と、を含む適用キット。
【請求項１１】
一以上の他の物質、例えば生物学的有効分子を標的細胞に半選択的に結合させるための抗体及び／又はペプチドと生物学的有効分子を定着させるためのポリエチレングリコール鎖を含む、請求項１３に記載の適用キット。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか一項以上に記載の細胞特異的有効分子を製造するための適用キットであって、少なくとも
ｓｉＲＮＡを不活性化する目的で該ｓｉＲＮＡと結合させることができるペプチドを含むアンプル（アンプルＡ）と、
該ペプチドをｓｉＲＮＡに結合するための反応緩衝剤を有するアンプル（アンプルＢ）と、
ｓｉＲＮＡと結合した後にペプチドを修飾するためのアンプル（アンプルＣ）と、
更なる反応緩衝剤を有するアンプル（アンプルＤ）と、
ペプチドがｓｉＲＮＡに結合した後に部分生成物又は最終生成物を純化するためのシステムと、
アンプル内容物からなる混合物を注入するための一以上の注入手段、例えばカニューレを備えるプローブ又は注射器、及び透析膜又は反応容器等のその他の必要な器材、適用のための使用説明書と、を含む適用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は「低分子干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）に基づく特殊な生物学的有効分子に関する。前記生物学的有効分子は活性化された後に標的遺伝子のｍＲＮＡと相互作用して、特殊なエンドリボヌクレアーゼと共に「ＲＩＳＣ」（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）と呼ばれるＲＮＡタンパク質複合体を形成する。ＲＩＳＣ複合体は標的ｍＲＮＡに結合し、エンドヌクレアーゼは標的ｍＲＮＡを切断する。このようにして遺伝子発現が阻害され、更に標的タンパク質の生成が阻害される。
【０００２】
特定の細胞においてのみ活性化する生物学的有効分子は、特に腫瘍の治療、ウイルス感染の治療、老化に関する特有の治療等において異常細胞の除去や成長阻害に用いることができる。一般に、細胞特異的に活性化が可能な生物学的有効分子は標的細胞の遺伝子発現の調節に利用できる。生物学的活性分子は標的遺伝子のネガティブレギュレーターの発現の低減することにより、遺伝子発現を減少させることも増加させることもできる。
【背景技術】
【０００３】
短い（１９〜２３ｂｐ）二本鎖ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）を真核細胞内に導入することにより、標的遺伝子のｍＲＮＡの配列セグメントに対して特異的に遺伝子発現を阻害することは既に報告されている（エルバシル・ＳＭら「培養哺乳類細胞のＲＮＡ干渉を媒介する２１ヌクレオチドＲＮＡの二重らせん」、ネイチャー、２００１年５月２４日、４１１（６８３６）、ｐ．４９４〜８；リュウ・Ｙら「ペプチド核酸による細胞遺伝子発現の効率的イソ型選択的阻害」、バイオケミストリー、２００４年２月２４日、４３（７）、ｐ．１９２１〜７；米国特許第５，８９８，０３１号明細書；米国特許第７，０５６，７０４号明細書）。
【０００４】
このような分子は遺伝子の読取り及びｍＲＮＡの生成は阻害しないが、ｓｉＲＮＡは標的ｍＲＮＡを分解するという細胞固有のメカニズムを誘起する。更に、上述のように、他の遺伝子の発現を損ねることなく特定のタンパク質の生成が抑制される（転写後遺伝子サイレンシング）。
【０００５】
遺伝子の発現を抑制する目的で、ｓｉＲＮＡ分子を特にトランスフェクション試薬及びエレクトロポレーションを介して直接細胞に導入することができる（ツァン・Ｍら：「ダウンレギュレーションが哺乳類細胞におけるＲＮＡ干渉による緑色蛍光タンパク質遺伝子発現を強化」、ＲＮＡバイオロジー、２００４年５月、１（１）、ｐ．７４〜７；ジルモア・ＩＲら「ｓｉＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングに対するデリバー戦略」電子出版、２００４年５月２２日、カレント・ドラッグ・デリバリー誌、２００６年４月、３（２）、ｐ．１４７〜５；米国特許第６，５０６，５５９号明細書）。
【０００６】
この場合の問題は、ｓｉＲＮＡが比較的不安定なことであるが、これは化学的修飾によって改善できる（米国特許第６，１０７，０９４号明細書）。
【０００７】
生物学的有効分子を治療に使用する際の具体的問題は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの適用の際に起こる。この種の適用のために、ｓｉＲＮＡを安定化して分解を低減させる方法が開発された（モリッシーら「合成ｓｉＲＮＡの化学的修飾」、ファーマシューティカルディスカバリー、２００５年５月１日）。また、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてもｓｉＲＮＡを細胞に導入できるトランスフェクション試薬、例えばナノ粒子ｉｎ  ｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩ(登録商標)（ポリプラス社）が開発された（ヴェルヌジュールら「原発性及び転移性膵臓癌モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏソマトスタチン受容体サブタイプ２遺伝子導入の抗腫瘍効果」、キャンサーリサーチ、６２、２００２年、ｐ．６１２４〜３１；アーバンクライン・Ｂ、ウェルス・Ｓ、アブハルベイド・Ｓ、ツベイコ・Ｆ、アイグナー・Ａ「ｉｎ  ｖｉｖｏでのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）複合ｓｉＲＮＡの全身適用によるＲＮＡｉ媒介遺伝子ターゲティング」、ジーンセラピー、１２（５）、２００５年、ｐ．４６１〜６）。
【０００８】
更に、ｓｉＲＮＡを増強して標的組織の細胞にｉｎ  ｖｉｖｏ導入する方法が開発された（イケダら「リガンドを標的とした治療用ｓｉＲＮＡのデリバリー」、ファーマシューティカルリサーチ、２３巻８号、２００６年８月）。
【０００９】
しかしながら生物学的活性物質のｉｎ  ｖｉｖｏ投与に際して、その全身的作用がしばしば問題となる。これらの物質を選択的に標的細胞に導入する際の特異性は十分ではない。このことは特に標的細胞のみにおいて選択的に作用すべきｓｉＲＮＡ分子にとっては問題である。組織特異的又は細胞特異的に標識されたトランスフェクション試薬（例えば抗体／抗原標識されたナノ粒子、ＴＡＴタンパク質フランキング等）を用いても十分に高い細胞特異性は達成されず、その結果トランスフェクションエラーが起こる。
【００１０】
更に、蛍光色素を結合させることによりｓｉＲＮＡ分子の生物学的作用を不活性化し、特定の波長の光を照射して再び活性体に戻すことが知られている（ＱＮ・ニュエンら「光制御性ｓｉＲＮＡは細胞における遺伝子抑制及び表現型を調節」バイオキム・バイオフィズ・アクタ、２００６年）。この活性化は外的に誘起されるものであり、細胞特異的ではない。従って、前記ｓｉＲＮＡ分子は活性化した後に所定の標的細胞だけでなく、他の全ての細胞においても意図されずに作用してしまう。
【００１１】
このメカニズムはｉｎ  ｖｉｖｏで適用することは難しい。
【００１２】
また、ペプチドを結合させることによりｓｉＲＮＡ分子の生物学的作用を不活性化することも知られており、これらのペプチドは標的細胞中では標的細胞に特異的な活性を有するペプチダーゼによって分離されるが、非標的細胞中では不活性を維持するように構成されている（ＷＯ／００２００８０９８５６９Ａ２）。このようにして前記分子はｓｉＲＮＡに基づいて標的細胞においては非常に選択的に活性化されるが、他の細胞においてはそれら細胞の機能に好ましくない作用を発揮することはなくなる。
【００１３】
実際の使用においては、ｓｉＲＮＡとペプチドの結合に全く問題が無いわけではなく、ペプチドが分離した後にｓｉＲＮＡに残存するリンカー又は残存するペプチド残基が標的細胞におけるｓｉＲＮＡの作用を不利に阻害することが示された。確かにｓｉＲＮＡ分子はペプチドと結合している間は確実に不活性化されているが、ペプチド分離後にｓｉＲＮＡに残存するリンカーは、及び場合によっては前記ペプチド残基も同様に、ＲＮＡ干渉の誘導に悪影響を及ぼし、それによってｓｉＲＮＡの生物学的効力が阻害される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第５，８９８，０３１号明細書
【特許文献２】米国特許第７，０５６，７０４号明細書
【特許文献３】米国特許第６，５０６，５５９号明細書
【特許文献４】米国特許第６，１０７，０９４号明細書
【特許文献５】ＷＯ／００２００８０９８５６９Ａ２
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】エルバシル・ＳＭら「培養哺乳類細胞のＲＮＡ干渉を媒介する２１ヌクレオチドＲＮＡの二重らせん」、ネイチャー、２００１年５月２４日、４１１（６８３６）、ｐ．４９４〜８
【非特許文献２】リュウ・Ｙら「ペプチド核酸による細胞遺伝子発現の効率的イソ型選択的阻害」、バイオケミストリー、２００４年２月２４日、４３（７）、ｐ．１９２１〜７
【非特許文献３】ツァン・Ｍら：「ダウンレギュレーションが哺乳類細胞におけるＲＮＡ干渉による緑色蛍光タンパク質遺伝子発現を強化」、ＲＮＡバイオロジー、２００４年５月、１（１）、ｐ．７４〜７
【非特許文献４】ジルモア・ＩＲら「ｓｉＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングに対するデリバー戦略」電子出版、２００４年５月２２日、カレント・ドラッグ・デリバリー誌、２００６年４月、３（２）、ｐ．１４７〜５
【非特許文献５】モリッシーら「合成ｓｉＲＮＡの化学的修飾」、ファーマシューティカルディスカバリー、２００５年５月１日
【非特許文献６】ヴェルヌジュールら「原発性及び転移性膵臓癌モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏソマトスタチン受容体サブタイプ２遺伝子導入の抗腫瘍効果」、キャンサーリサーチ、６２、２００２年、ｐ．６１２４〜３１
【非特許文献７】アーバンクライン・Ｂ、ウェルス・Ｓ、アブハルベイド・Ｓ、ツベイコ・Ｆ、アイグナー・Ａ「ｉｎ  ｖｉｖｏでのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）複合ｓｉＲＮＡの全身適用によるＲＮＡｉ媒介遺伝子ターゲティング」、ジーンセラピー、１２（５）、２００５年、ｐ．４６１〜６
【非特許文献８】イケダら「リガンドを標的とした治療用ｓｉＲＮＡのデリバリー」、ファーマシューティカルリサーチ、２３巻８号、２００６年８月
【非特許文献９】ＱＮ・ニュエンら「光制御性ｓｉＲＮＡは細胞における遺伝子抑制及び表現型を調節」バイオキム・バイオフィズ・アクタ、２００６年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の目的は、ｓｉＲＮＡと一以上のペプチドとの間に結合を提供し、しかもｓｉＲＮＡはペプチド分離後に活性化され、細胞中で活性化されたｓｉＲＮＡの生物学的効力を著しく損ねるリンカー及び／又はペプチド残基を残さないことである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明によれば、特殊なアミノＣｎリンカー（Ｃｎ＝Ｃｌ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５又はＣ６）、例えばアミノＣ６リンカーが提案され、このリンカーを介してｓｉＲＮＡはその３’末端又は／及び５’末端で一以上のペプチドと共有結合的にカップリングしている。この共有結合により生物学的に有効なｓｉＲＮＡ分子が不活性化される。従って、対応する標的細胞に特異的な酵素が存在しないという理由でカップリング状態にあるペプチドのいずれか一つがｓｉＲＮＡ分子に残存していても、このような不活性な分子のトランスフェクションの後に特異的な遺伝子発現が阻害されることはない。
【００１８】
生物学的有効分子を活性化するためにペプチドがｓｉＲＮＡから分離され、アミノＣｎリンカー、場合によってはペプチド残基もｓｉＲＮＡに残存する。
【００１９】
提案された特殊なリンカーは、ペプチドが生物学的有効分子から分離した後にｓｉＲＮＡに残存する（及び場合によってはペプチド残基も分離の際に残留する）が、驚くべきことにこのリンカー及び場合によっては前記ペプチド残基が残存したとしても、分離後の分子が有する活性化されたｓｉＲＮＡ効力に悪影響を及ぼすことは殆どない（或いは何らかの悪影響を及ぼしたとしても無視できる）ことが示された。しかしながら当業者は、ｓｉＲＮＡに残存する分子の如何なる部分もｓｉＲＮＡの生物学的効力を制限する作用を及ぼすと予想するであろう。これらリンカー（ｓｉＲＮＡ分子に対して提案されたアミノＣｎリンカーも）自体は公知であるが、実際には分離可能なペプチドとのカップリングには使用されていない。このような使用は当業界においても知られていなかった。本発明においては、標的細胞に対する特異的酵素によっても開裂されないｓｉＲＮＡ系分子（ＷＯ／００２００８０９８５６９Ａ２参照）は確実に不活性に留まり、標的細胞にトランスフェクションされた後の分子開裂時に活性化されてｓｉＲＮＡの有効な生物学的効力を提供する。
【００２０】
本発明の効果はアミノＣ６リンカーに基づいて証明されたが、これより小さい又は大きい構造のリンカータイプ（アミノＣ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５リンカー等）も同程度の作用で使用することができる。
【００２１】
適切なトランスフェクションシステム、例えばナノ粒子、又はリポソーム等の被覆分子を利用すれば、不活性化された成分分子を公知の方法により標的細胞に導入することができる。前記の不活性化をもたらす共有結合は、カップリングペプチドの結合配列に関連する特異的酵素によって細胞特異的に開裂され、それによって現在標的細胞内にあり且つペプチドから分離された分子の生物学的効力が活性化される。次にこの分子は標的細胞の特定のｍＲＮＡと結合することにより、公知の方法でこの特定の細胞における遺伝子発現を阻害する。
【００２２】
対象となる生体における所定の標的細胞以外の細胞であって、前記不活性な分子構造物が同様に到達できるすべての細胞において、有効成分分子は確実に不活性に留まっている。これは、標的細胞に特異的な酵素が存在しないために、生物学的に有効な分子（特にｓｉＲＮＡ）とペプチドとの間の共有結合が完全に維持される（ペプチド結合が開裂されなかった）、或いは部分的に維持される（一部のペプチド結合が開裂された）からである。本発明の生物学的有効分子においては、共有結合的なペプチド結合が維持されているため、該細胞のｍＲＮＡとは結合せず、従ってＲＩＳＣは生成されない。
【００２３】
例えば腫瘍の治療において導入されるべき本発明に係る分子構造物は、腫瘍が発生した標的細胞に不活性な（結合した）形態で到達するだけでなく、（実用においてほとんど避けられないことであるが）健全な細胞にも達する可能性がある。しかし、前記分子は腫瘍が発生した標的細胞に存在する特異的酵素により選択的に生物学的作用が活性化され、標的遺伝子の発現が有効物質に起因して効果的に阻害される。これらの分子構造物が発病していない（或いは意図した生物学的作用の標的とされていない）細胞内に存在していても、恒久的に不活性な状態にあるため、健全な細胞の維持に必要な遺伝子発現、ひいてはタンパク質の生成はその作用物質の影響を受けない。
【００２４】
提案された分子は、標的細胞の酵素に特異的な不活性／活性化に基づく高選択的作用を有するため、トランスフェクトされるべき適切なペプチド結合（定義されたアミノ酸配列を有する）を有する生物学的に不活性な分子構造物は全身投与することができる。
【００２５】
前記分子構造物は標的細胞への輸送性を改善するために、また分子構造物を安定化するために更に他の物質（例えば担体システムとしてのナノ粒子）と結合させることができる。
【００２６】
本発明によれば、トランスフェクションエラーは防止できないものの、標的細胞以外の細胞に誤って導入された分子は望ましくないが生物学的な作用は有さない。この状態は、たとえ標的細胞において分子が活性化しても維持されるので、生物学的作用は選択的に標的細胞において行われる。公知のメカニズムとは異なり遺伝子発現が高度に細胞選択的に調節される。
【００２７】
更に、１８〜２３ｂｐの大きさのｓｉＲＮＡ分子の代わりに、より小さい二本鎖ＲＮＡ分子を使用することも考慮される。
【００２８】
ｓｉＲＮＡが一以上のペプチドと共有結合したこのような分子を使用する可能性は、既にＷＯ／００２００８０９８５６９Ａ２に記載されている。
【００２９】
導入すべき生物学的有効分子を、選択可能なリンカーを介して選択可能なペプチド（ＷＯ／００２００８０９８５６９Ａ２参照）と結合させてなる適用キットが好ましく使用される。本適用キットはアンプル中に全ての必須成分を含み、実用上、適切なトランスフェクションシステム（例えばナノ粒子や脂質）、その他添加物（例えば抗体やリガンド、ポリエチレングリコール）及びアンプル内容物からなる混合物を標的細胞を含む媒体に注入するための１本以上のカニューレ付きプローブ又はカニューレ付き注射器を更に含む。ユーザーは該分子の使用又は投与のための使用説明書に従い、適用目的に適う混合物を調製して適用することができる。更に、前記の生物学的有効分子の製造に使用できる適用キットも考えられる。
【００３０】
このような適用キットは特定標的細胞及び特定標的遺伝子のために、各適用方法（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ）に応じて提供することが適切である。
【００３１】
以下、実施形態として図面に示したアミノＣ６リンカーに基づいて本発明を詳しく説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】アミノＣ６リンカーを介してｓｉＲＮＡをペプチドとカップリングすることにより不活性化されたｓｉＲＮＡ分子、及びアミノＣ６リンカーの化学的構造。
【図２】ペプチド結合が開裂され、ｓｉＲＮＡ分子にアミノＣ６リンカー及びペプチド残基が残存している細胞特異的に活性化されたｓｉＲＮＡ分子。
【図３】標的細胞及び非標的細胞におけるカスパーゼ４の酵素活性を示すグラフ。
【図４】ペプチド抑制ｓｉＲＮＡによるＧＦＰ遺伝子の発現の細胞特異的な減少を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
図１は、Ｃｎ＝Ｃｌ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５又はＣ６のアミノＣｎリンカーの例として、自体公知のアミノＣ６リンカー１の化学的構造を示す。ｓｉＲＮＡ２はこのアミノＣ６リンカー１を介してその生物学的不活性化（細胞内でのｓｉＲＮＡの作用の不活性化）のためにペプチド３とカップリングされている。アミノＣ６リンカー１は、ｓｉＲＮＡ２のアンチセンス鎖の５’末端を介してｓｉＲＮＡ２と結合されている。ペプチド３がｓｉＲＮＡ分子に結合されている限り、ｓｉＲＮＡ分子は生物学的に不活性化されている。
【００３４】
図１に示す不活性化されたｓｉＲＮＡ分子が導入された標的細胞に対する特異的酵素によってペプチド結合が開裂されると（ペプチド３の完全な分離）、意図したｓｉＲＮＡの自体公知の細胞特異的な作用が分子トランスフェクションにより活性化され、残存するｓｉＲＮＡ分子の生物学的活性化が行われる（ＷＯ／００２００８０９８５６９Ａ２も参照）。
【００３５】
驚くべきことにこの活性化は、ペプチド結合の開裂後にアミノＣ６リンカー１及び場合によってはペプチド３の残基がｓｉＲＮＡ分子の残部に残存しても行われる（図２参照）。このような残存にかかわらず、ｓｉＲＮＡ２の生物学的作用は分子に残存するアミノＣ６リンカー１及びペプチド４の残基によって損なわれないか、或いは損なわれても無視できる程度である。
【００３６】
図３に、分解酵素カスパーゼ４の細胞特異的な活性を示す。ここでは酵素カスパーゼ４は標的細胞（ＪＥＧ−３絨毛膜癌細胞；グラフ中の黒柱）において活性であるが、非標的細胞（ヒト胎児腎臓細胞、ＨＥＫ；グラフ中の白柱）においては不活性である。ここで明らかなように、図１に示すリンカー構造を介してカスパーゼ４に対する標的ペプチドと結合することによって抑制されたｓｉＲＮＡは、活性カスパーゼ４を含む標的細胞において分離され、活性化される。
【００３７】
図４は、機能を有さない対照ｓｉＲＮＡ、ＧＦＰ遺伝子の発現を減少させるｓｉＲＮＡ、及びカスパーゼ４によって活性化され得るペプチド抑制ｓｉＲＮＡを導入した場合の検出蛍光強度を示す。ここで、蛍光の減少はｓｉＲＮＡの生物学的活性と相関している。ここで観察されるように、標的細胞（ＪＥＧ−３絨毛膜癌細胞；グラフ中の黒柱）ではｓｉＲＮＡが活性化されてＧＦＰ遺伝子の発現が減少しているが、非標的細胞（ヒト胎児腎臓細胞、ＨＥＫ；グラフ中の白柱）ではこの遺伝子の発現は減少しない。活性化されたｓｉＲＮＡにリンカー構造及びペプチド残基が残存していても（この場合はグリシンと結合したアミノＣ６リンカー）、ｓｉＲＮＡの作用は通常のｓｉＲＮＡの作用と同等である。
【符号の説明】
【００３８】
１  アミノＣ６リンカー
２  ｓｉＲＮＡ
３  ｓｉＲＮＡを不活性化するためのペプチド
４  ペプチド残基
【図１】
2012520060.tif 000003
【図２】
2012520060.tif 000004
【図３】
2012520060.tif 000005
【図４】
2012520060.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成23年11月10日(2011.11.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞に生物学的に不活性なトランスフェクションを行うためのｓｉＲＮＡに基づく細胞特異的有効分子であって、前記標的細胞中で生物学的に活性化した後にｍＲＮＡとの結合により「ＲＩＳＣ」複合体を形成して遺伝子の発現を阻害するために、前記ｓｉＲＮＡは生物学的に不活性化する目的でリンカーを介して一以上のペプチドとカップリングしており、前記リンカーは該分子が生物学的に活性化した後にｓｉＲＮＡに残存する細胞特異的有効分子において、前記ｓｉＲＮＡ（２）はＣｎ＝Ｃｌ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５又はＣ６のアミノＣｎリンカー（１）を介して一以上のペプチド（３）とカップリングしていることを特徴とする細胞特異的有効分子。
【請求項２】
前記アミノＣｎリンカーとしてアミノＣ６リンカーが提供されていることを特徴とする、請求項１に記載の細胞特異的有効分子。
【請求項３】
前記アミノＣｎリンカーとしてアミノＣ５リンカーが使用されることを特徴とする、請求項１に記載の細胞特異的有効分子。
【請求項４】
前記アミノＣｎリンカーとしてアミノＣ４リンカーが提供されていることを特徴とする、請求項１に記載の細胞特異的有効分子。
【請求項５】
前記アミノＣｎリンカーとしてアミノＣ３リンカーが挿入されていることを特徴とする、請求項１に記載の細胞特異的有効分子。
【請求項６】
前記アミノＣｎリンカーとしてアミノＣ２リンカーが用いられることを特徴とする、請求項１に記載の細胞特異的有効分子。
【請求項７】
前記アミノＣｎリンカーとしてアミノＣ１リンカーが提供されていることを特徴とする、請求項１に記載の細胞特異的有効分子。
【請求項８】
請求項１に記載の細胞特異的有効分子において、アミノＣｎリンカーを介して共有結合した一以上のペプチドと、標的細胞へのトランスフェクション又は標的細胞との結合のためのトランスフェクションシステムとが共有的又は非共有的にカップリングしており、前記トランスフェクションシステムは、例えば、ナノ粒子、リガンド／抗体／抗原標識等の担体システム；選択的に活性化可能な生物学的有効分子をトランスフェクションのためにコーティングするためのナノ粒子、ポリマー又は脂質等の分子；脂質に基づく方法；又はＴＡＴタンパク質フランキングであることを特徴とする細胞特異的有効分子。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項以上に記載の細胞特異的有効分子を使用又は投与するための適用キットであって、少なくとも、
不活性化の目的のために選択されたペプチドと結合したｓｉＲＮＡ及び該ｓｉＲＮＡと結合したアミノＣｎリンカーを含む少なくとも１本のアンプル（アンプルＡ）と、
トランスフェクションシステム、例えばナノ粒子又は脂質を含む少なくとも１本の他のアンプル（アンプルＢ）と、
アンプルＡとアンプルＢの内容物に対する希釈緩衝剤及び反応緩衝剤と、
アンプル内容物からなる混合物を、標的細胞を含む媒体に注入するためのカニューレを備える１本以上のプローブ又は注射器、及びその他の必要な器材と、
使用又は投与のための使用説明書と、を含む適用キット。
【請求項１０】
一以上の他の物質、例えば生物学的有効分子を標的細胞に半選択的に結合させるための抗体及び／又はペプチドと生物学的有効分子を定着させるためのポリエチレングリコール鎖を含む、請求項９に記載の適用キット。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか一項以上に記載の細胞特異的有効分子を製造するための適用キットであって、少なくとも
ｓｉＲＮＡを不活性化する目的で該ｓｉＲＮＡと結合させることができるペプチドを含むアンプル（アンプルＡ）と、
該ペプチドをｓｉＲＮＡに結合するための反応緩衝剤を有するアンプル（アンプルＢ）と、
ｓｉＲＮＡと結合した後にペプチドを修飾するためのアンプル（アンプルＣ）と、
更なる反応緩衝剤を有するアンプル（アンプルＤ）と、
ペプチドがｓｉＲＮＡに結合した後に部分生成物又は最終生成物を純化するためのシステムと、
アンプル内容物からなる混合物を注入するための一以上の注入手段、例えばカニューレを備えるプローブ又は注射器、及び透析膜又は反応容器等のその他の必要な器材、適用のための使用説明書と、を含む適用キット。
【国際調査報告】
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