(57)【要約】本発明は、多数種類の外来物質（例えば、遺伝子）に対応可能な細胞培養技術を開発することを課題とする。  上記課題は、細胞および培養培地を保持し得る開口部を有する固相、ならびに該開口部を覆う膜を備える細胞培養用容器を開発することによって、解決された。その結果、本発明によって、多くの異なる物質を、同一の固相上の細胞に対して試験するために培養することが可能となった。本発明の細胞培養用容器は、そのまま、遺伝子導入、細胞解析に用いることができるので、多数種類の遺伝子の各々を同時に異なる細胞に導入し、そして導入された遺伝子によって生じる表現型を解析することが可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞および第１の培養培地を保持し得る開口部を有する固相、ならびに該開口部を覆う膜を備える細胞培養用容器。
【請求項２】
前記膜が、糖、塩、アミノ酸、核酸、および有機酸からなる群から選択される物質を通過し得る膜である、請求項１に記載の細胞培養用容器。
【請求項３】
請求項１に記載の細胞培養用容器であって、ここで、前記固相は少なくとも２つの開口部を備え、そして、該少なくとも２つの開口部中の第１の開口部中に保持された細胞の、該第１の開口部以外の開口部への移動は、前記膜によって妨げられる、容器。
【請求項４】
請求項１に記載の細胞培養用容器であって、ここで前記容器は、さらに、第２の培養培地を備え、ここで、該第２の培養培地は、前記開口部と接していない前記膜の表面に接する、容器。
【請求項５】
前記第２の培養培地が、ゲル化培地である、請求項４に記載の細胞培養用容器。
【請求項６】
請求項４に記載の細胞培養用容器であって、ここで、前記膜は、前記第２の培養培地中の成分を前記開口部内に透過させる膜である、細胞培養用容器。
【請求項７】
さらに、第２の培養培地と接した板を備える、請求項４に記載の細胞培養用容器。
【請求項８】
前記開口部がアレイ状に配置されている、請求項３に記載の細胞培養用容器。
【請求項９】
前記膜が限界膜である、請求項１に記載の細胞培養用容器。
【請求項１０】
前記限界膜の孔径が１μｍ以下である、請求項９に記載の細胞培養用容器。
【請求項１１】
前記膜が、親水性ポリカーボネート膜、ナイロン膜、およびアルミナ膜からなる群から選択される膜である、請求項１に記載の細胞培養用容器。
【請求項１２】
前記膜が、親水性ポリカーボネート膜である、請求項１１に記載の細胞培養用容器。
【請求項１３】
前記ゲル化培地は、コラーゲンゲル、アガロースゲル、ゼラチンゲル、および、アルギン酸カルシウムゲル、ならびにこれらの混合物からなる群から選択されるゲルを含有する、請求項５に記載の細胞培養用容器。
【請求項１４】
前記ゲル化培地は、コラーゲンゲルを含有する、請求項１３に記載の細胞培養用容器。
【請求項１５】
前記板が、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、およびセルロースからなる群から選択される物質から形成される、請求項７に記載の細胞培養用容器。
【請求項１６】
前記板が、カバーガラスである、請求項１５に記載の細胞培養用容器。
【請求項１７】
前記細胞が動物細胞である、請求項１に記載の細胞培養用容器。
【請求項１８】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１７に記載の細胞培養用容器。
【請求項１９】
前記動物細胞が、付着性の動物細胞である、請求項１７に記載の細胞培養用容器。
【請求項２０】
前記動物細胞が、浮遊性の動物細胞である、請求項１７に記載の細胞培養用容器。
【請求項２１】
前記細胞が植物細胞である、請求項１に記載の細胞培養用容器。
【請求項２２】
フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ゼラチン、ポリオルニチン、およびポリリジンならびにこれらの混合物からなる群から選択されるタンパク質を開口部内に含有する、請求項１に記載の細胞培養用容器。
【請求項２３】
フィブロネクチンを開口部内に含有する、請求項２２に記載の細胞培養用容器。
【請求項２４】
少なくとも、９６個の開口部を備える、請求項１に記載の細胞培養用容器。
【請求項２５】
少なくとも、３８０個の開口部を備える、請求項２４に記載の細胞培養用容器。
【請求項２６】
少なくとも、１５００個の開口部を備える、請求項２５に記載の細胞培養用容器。
【請求項２７】
少なくとも、３０００個の開口部を備える、請求項２６に記載の細胞培養用容器。
【請求項２８】
少なくとも、５０００個の開口部を備える、請求項２７に記載の細胞培養用容器。
【請求項２９】
前記開口部の断面積が、０．２ｍｍ２以下である、請求項１に記載の細胞培養用容器。
【請求項３０】
前記開口部の断面積が、０．１ｍｍ２以下である、請求項２９に記載の細胞培養用容器。
【請求項３１】
請求項１に記載の細胞培養用容器であって、ここで、以下：
遺伝子導入ベクター、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、デコイ核酸、およびオリゴヌクレオチドからなる群から選択される物質が前記開口部内に固定化されている、細胞培養用容器。
【請求項３２】
請求項３１に記載の細胞培養用容器であって、ここで、遺伝子導入ベクターが前記開口部内に固定化されている、細胞培養用容器。
【請求項３３】
請求項３２に記載の細胞培養用容器であって、ここで、前記固定化されている遺伝子導入ベクターがウイルスエンベロープベクターである、細胞培養用容器。
【請求項３４】
前記ウイルスエンベロープが、野生型ウイルスまたは組換え型ウイルス由来のウイルスエンベロープである、請求項３３に記載の細胞培養用容器。
【請求項３５】
前記ウイルスエンベロープが、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科、およびヘパドナウイルス科からなる群から選択される科に属するウイルス由来である、請求項３２に記載の細胞培養用容器。
【請求項３６】
前記ウイルスがパラミクソウイルス科に属するウイルス由来である、請求項３５に記載の細胞培養用容器。
【請求項３７】
前記ウイルスがＨＶＪである、請求項３６に記載の細胞培養用容器。
【請求項３８】
前記遺伝子導入ベクターが、ウイルスエンベロープタンパク質の少なくとも１つを含むリポソームである請求項３２に記載の細胞培養用容器。
【請求項３９】
前記ウイルスエンベロープタンパク質が、Ｆタンパク質、ＨＮタンパク質、ＮＰタンパク質、およびその組み合わせからなる群から選択されるタンパク質である、請求項３８に記載の細胞培養用容器。
【請求項４０】
請求項３２に記載の細胞培養用容器であって、ここで、前記遺伝子導入ベクターが細胞に導入する核酸を含まない、細胞培養用容器。
【請求項４１】
請求項４０に記載の細胞培養用容器であって、ここで、前記固定化されている遺伝子導入ベクターがウイルスエンベロープベクターである、細胞培養用容器。
【請求項４２】
前記ウイルスエンベロープが、パラミクソウイルス科に属するウイルス由来である、請求項４１に記載の細胞培養用容器。
【請求項４３】
前記ウイルスがＨＶＪである、請求項４２に記載の細胞培養用容器。
【請求項４４】
さらに、以下の式
Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３
を有する糖を含む中性界面活性剤を前記開口部内に含む、請求項１に記載の容器であって、ここでＳが単糖または二糖であり、ｎ＝７〜１１である、細胞培養用容器。
【請求項４５】
前記Ｓがグルコシド、ガラクトシドまたはマルトシドである、請求項４４に記載の細胞培養用容器。
【請求項４６】
前記中性界面活性剤が、オクチルマルトシド、デシルマルトシド、ドデシルマルトシド、オクチルグルコシド、デシルグルコシド、およびドデシルグルコシドからなる群から選択される界面活性剤である、請求項４５に記載の細胞培養用容器。
【請求項４７】
前記中性界面活性剤の濃度が、０．０００９％〜０．００５％である、請求項４４に記載の細胞培養用容器。
【請求項４８】
さらに、硫酸プロタミン溶液を含有する、請求項１３に記載の細胞培養用容器。
【請求項４９】
さらに、ポリエチレンイミンを含有する、請求項１３に記載の細胞培養用容器。
【請求項５０】
細胞培養のためのキットであって、以下：
（１）細胞および第１の培養培地を保持し得る開口部を有する固相、および
（２）該開口部を覆うことができる膜であって、糖、塩、アミノ酸、核酸、および有機酸からなる群から選択される物質を通過し得る膜、
を備えるキット。
【請求項５１】
さらに、第２の培養培地に接することができる板を供える、請求項５０に記載のキット。
【請求項５２】
前記開口部がアレイ状に配置されている、請求項５０に記載のキット。
【請求項５３】
前記膜が限界膜である、請求項５０に記載のキット。
【請求項５４】
前記膜が、親水性ポリカーボネート膜である、請求項５３に記載のキット。
【請求項５５】
前記板が、カバーガラスである、請求項５１に記載のキット。
【請求項５６】
請求項１に記載の細胞培養用容器であって、安定化剤をさらに含む、細胞培養用容器。
【請求項５７】
請求項５６に記載の細胞培養用容器であって、前記安定化剤が、トレハロース、マルトース、ラフィノース、フルクトース、スクロース、グルコース、ラクトース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、グリシン、マンニトール、ジメチルスルホオキシド（ＤＭＳＯ）またはこれらの混合物からなる群から選択される、細胞培養用容器。
【請求項５８】
請求項５７に記載の細胞培養用容器であって、前記安定化剤が、トレハロース、マルトース、ラフィノース、フルクトースまたはこれらの混合物からなる群から選択される、細胞培養用容器。
【請求項５９】
請求項５８に記載の細胞培養用容器であって、前記安定化剤が、トレハロースである、細胞培養用容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、固相上において、多種類の細胞を同時に培養するための方法、およびその方法に使用される細胞培養用容器に関する。
【背景技術】
【０００２】  ゲノムプロジェクトの成果により明らかとなるヒト遺伝子の情報を、迅速に疾患治療や創薬に結びつけるためには、種々の疾患に対する原因遺伝子や治療用遺伝子の同定を高速かつ高効率に行う必要がある。遺伝子や遺伝子によって産生されるタンパク質が、実際の細胞や生体の臓器でどのような機能を持つかを高効率に同定することは、病因の解明や創薬を行う上で必須となっている。【０００３】  多数の遺伝子の機能解析のために、遺伝子アレイや遺伝子チップなどを利用して遺伝子情報の集積化が行われ、疾患時に遺伝子の発現パターンがどのように変化するのかを解析するために使用されている。しかし、それらのデバイスでは疾患時における遺伝子発現パターンの変化（例えば、メッセンジャー量の決定）を測定することは出来るが、それらの遺伝子が実際の細胞でどのような機能を持つのかを同定することは出来ない。【０００４】  細胞レベルでの遺伝子解析技術は、実際の細胞レベルでの機能を解析することは可能であるが、従来のマニュアル法を利用した細胞レベルでの遺伝子解析技術では、高速化、高効率化、多数処理化を行うことは困難である。細胞レベルでの遺伝子解析技術は、（１）遺伝子導入技術、および（２）遺伝子導入した細胞の解析技術、に大きく分けられる。これら２つの技術のいずれにおいても、単位面積あたりに遺伝子導入・細胞培養・細胞解析を行う場合には、高密度での細胞培養技術、すなわち、単位面積あたりに培養する細胞の種類を増加する技術を確立する必要がある。【０００５】  従来技術の細胞培養技術においては、多数の細胞の解析を行うことは、困難であった。複数種類の細胞を同時に培養して、その特徴を検出・測定する従来技術としては、アレイ状の固相が用いられている。しかし、従来技術における、固相上で多種類の培養細胞を培養する技術では、表面積あたりに培養が可能な細胞の種類が限定されている。さらに、単位面積あたりに培養する細胞の種類を増加しようとする場合には、異なる細胞集団間での相互夾雑の問題も生じる。【０００６】  従って、多数種類の遺伝子に対応可能な遺伝子導入技術および細胞解析技術の開発が望まれている。
【特許文献１】特開平５−２９５１４５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  本発明は、多数の細胞を固相上で同時に培養する容器を開発することによって達成された。【０００８】  したがって、本発明は、以下を提供する。
１．細胞および第１の培養培地を保持し得る開口部を有する固相、ならびに該開口部を覆う膜を備える細胞培養用容器。
２．前記膜が、糖、塩、アミノ酸、核酸、および有機酸からなる群から選択される物質を通過し得る膜である、項目１に記載の細胞培養用容器。
３．項目１に記載の細胞培養用容器であって、ここで、前記固相は少なくとも２つの開口部を備え、そして、該少なくとも２つの開口部中の第１の開口部中に保持された細胞の、該第１の開口部以外の開口部への移動は、前記膜によって妨げられる、容器。
４．項目１に記載の細胞培養用容器であって、ここで前記容器は、さらに、第２の培養培地を備え、ここで、該第２の培養培地は、前記開口部と接していない前記膜の表面に接する、容器。
５．前記第２の培養培地が、ゲル化培地である、項目４に記載の細胞培養用容器。
６．項目４に記載の細胞培養用容器であって、ここで、前記膜は、前記第２の培養培地中の成分を前記開口部内に透過させる膜である、細胞培養用容器。
７．さらに、第２の培養培地と接した板を備える、項目４に記載の細胞培養用容器。
８．前記開口部がアレイ状に配置されている、項目３に記載の細胞培養用容器。
９．前記膜が限界膜である、項目１に記載の細胞培養用容器。
１０．前記限界膜の孔径が１μｍ以下である、項目９に記載の細胞培養用容器。
１１．前記膜が、親水性ポリカーボネート膜、ナイロン膜、およびアルミナ膜からなる群から選択される膜である、項目１に記載の細胞培養用容器。
１２．前記膜が、親水性ポリカーボネート膜である、項目１１に記載の細胞培養用容器。
１３．前記ゲル化培地は、コラーゲンゲル、アガロースゲル、ゼラチンゲル、および、アルギン酸カルシウムゲル、ならびにこれらの混合物からなる群から選択されるゲルを含有する、項目５に記載の細胞培養用容器。
１４．前記ゲル化培地は、コラーゲンゲルを含有する、項目１３に記載の細胞培養用容器。
１５．前記板が、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、およびセルロースからなる群から選択される物質から形成される、項目７に記載の細胞培養用容器。
１６．前記板が、カバーガラスである、項目１５に記載の細胞培養用容器。
１７．前記細胞が動物細胞である、項目１に記載の細胞培養用容器。
１８．前記細胞が哺乳動物細胞である、項目１７に記載の細胞培養用容器。
１９．前記動物細胞が、付着性の動物細胞である、項目１７に記載の細胞培養用容器。
２０．前記動物細胞が、浮遊性の動物細胞である、項目１７に記載の細胞培養用容器。
２１．前記細胞が植物細胞である、項目１に記載の細胞培養用容器。
２２．フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ゼラチン、ポリオルニチン、およびポリリジンならびにこれらの混合物からなる群から選択されるタンパク質を開口部内に含有する、項目１に記載の細胞培養用容器。
２３．フィブロネクチンを開口部内に含有する、項目２２に記載の細胞培養用容器。
２４．少なくとも、９６個の開口部を備える、項目１に記載の細胞培養用容器。
２５．少なくとも、３８０個の開口部を備える、項目２４に記載の細胞培養用容器。
２６．少なくとも、１５００個の開口部を備える、項目２５に記載の細胞培養用容器。
２７．少なくとも、３０００個の開口部を備える、項目２６に記載の細胞培養用容器。
２８．少なくとも、５０００個の開口部を備える、項目２７に記載の細胞培養用容器。
２９．前記開口部の断面積が、０．２ｍｍ２以下である、項目１に記載の細胞培養用容器。
３０．前記開口部の断面積が、０．１ｍｍ２以下である、項目２９に記載の細胞培養用容器。
３１．項目１に記載の細胞培養用容器であって、ここで、以下：
遺伝子導入ベクター、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、デコイ核酸、およびオリゴヌクレオチドからなる群から選択される物質が前記開口部内に固定化されている、細胞培養用容器。
３２．項目３１に記載の細胞培養用容器であって、ここで、遺伝子導入ベクターが前記開口部内に固定化されている、細胞培養用容器。
３３．項目３２に記載の細胞培養用容器であって、ここで、前記固定化されている遺伝子導入ベクターがウイルスエンベロープベクターである、細胞培養用容器。
３４．前記ウイルスエンベロープが、野生型ウイルスまたは組換え型ウイルス由来のウイルスエンベロープである、項目３３に記載の細胞培養用容器。
３５．前記ウイルスエンベロープが、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科、およびヘパドナウイルス科からなる群から選択される科に属するウイルス由来である、項目３２に記載の細胞培養用容器。
３６．前記ウイルスがパラミクソウイルス科に属するウイルス由来である、項目３５に記載の細胞培養用容器。
３７．前記ウイルスがＨＶＪである、項目３６に記載の細胞培養用容器。
３８．前記遺伝子導入ベクターが、ウイルスエンベロープタンパク質の少なくとも１つを含むリポソームである項目３２に記載の細胞培養用容器。
３９．前記ウイルスエンベロープタンパク質が、Ｆタンパク質、ＨＮタンパク質、ＮＰタンパク質、およびその組み合わせからなる群から選択されるタンパク質である、項目３８に記載の細胞培養用容器。
４０．項目３２に記載の細胞培養用容器であって、ここで、前記遺伝子導入ベクターが細胞に導入する核酸を含まない、細胞培養用容器。
４１．項目４０に記載の細胞培養用容器であって、ここで、前記固定化されている遺伝子導入ベクターがウイルスエンベロープベクターである、細胞培養用容器。
４２．前記ウイルスエンベロープが、パラミクソウイルス科に属するウイルス由来である、項目４１に記載の細胞培養用容器。
４３．前記ウイルスがＨＶＪである、項目４２に記載の細胞培養用容器。
４４．さらに、以下の式
Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３
を有する糖を含む中性界面活性剤を前記開口部内に含む、項目１に記載の容器であって、ここでＳが単糖または二糖であり、ｎ＝７〜１１である、細胞培養用容器。
４５．前記Ｓがグルコシド、ガラクトシドまたはマルトシドである、項目４４に記載の細胞培養用容器。
４６．前記中性界面活性剤が、オクチルマルトシド、デシルマルトシド、ドデシルマルトシド、オクチルグルコシド、デシルグルコシド、およびドデシルグルコシドからなる群から選択される界面活性剤である、項目４５に記載の細胞培養用容器。
４７．前記中性界面活性剤の濃度が、０．０００９％〜０．００５％である、項目４４に記載の細胞培養用容器。
４８．さらに、硫酸プロタミン溶液を含有する、項目１３に記載の細胞培養用容器。
４９．さらに、ポリエチレンイミンを含有する、項目１３に記載の細胞培養用容器。
５０．細胞培養のためのキットであって、以下：
（１）細胞および第１の培養培地を保持し得る開口部を有する固相、および
（２）該開口部を覆うことができる膜であって、糖、塩、アミノ酸、核酸、および有機酸からなる群から選択される物質を通過し得る膜、
を備えるキット。
５１．さらに、第２の培養培地に接することができる板を供える、項目５０に記載のキット。
５２．前記開口部がアレイ状に配置されている、項目５０に記載のキット。
５３．前記膜が限界膜である、項目５０に記載のキット。
５４．前記膜が、親水性ポリカーボネート膜である、項目５３に記載のキット。
５５．前記板が、カバーガラスである、項目５１に記載のキット。
５６．項目１に記載の細胞培養用容器であって、安定化剤をさらに含む、細胞培養用容器。
５７．項目５６に記載の細胞培養用容器であって、前記安定化剤が、トレハロース、マルトース、ラフィノース、フルクトース、スクロース、グルコース、ラクトース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、グリシン、マンニトール、ジメチルスルホオキシド（ＤＭＳＯ）またはこれらの混合物からなる群から選択される、細胞培養用容器。
５８．項目５７に記載の細胞培養用容器であって、前記安定化剤が、トレハロース、マルトース、ラフィノース、フルクトースまたはこれらの混合物からなる群から選択される、細胞培養用容器。
５９．項目５８に記載の細胞培養用容器であって、前記安定化剤が、トレハロースである、細胞培養用容器。
【発明の効果】
【０００９】  本発明によって、多数の細胞を、同一の固相上で、相互に遮断された空間において、培養することが可能となった。本発明の細胞培養用容器は、そのまま、遺伝子導入、細胞解析に用いることができるので、多数種類の遺伝子の各々を同時に異なる細胞に導入し、そして導入された遺伝子によって生じる表現型を解析することが可能となる。さらに、この技術によって、例えば、３万〜４万種類と推定されているヒト遺伝子や様々な生体高分子が実際の細胞中で、どのような機能を持つのかを、高速かつ高効率に同時に解析できる高集積型デバイスが提供される。例えば、数千の開口部（ウェル）をアレイ状に備える本発明の培養用容器において、各開口部に遺伝子やタンパク質などの生体高分子を封入したＨＶＪベクターを高集積で固定化し、開口部中で細胞への導入後に多検体検出装置で解析することで、大量のヒト遺伝子の機能を生細胞中で同時評価することが可能となる。【００１０】  また、本発明の培養用容器を用いて細胞内に導入される物質としては、ヌクレオチドフラグメント、ＤＮＡ、ＲＮＡのような核酸のみならず、タンパク質、糖鎖、低分子化合物、プロテオグリカン、グリコペプチド、脂質、金属イオンなどが挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】［図１］図１は、自動化のための界面活性剤の選択を示すグラフであり、本発明の方法に従って、種々の界面活性剤を種々の濃度で使用して遺伝子導入を行った結果を示す。
［図２］図２は、自動化のための界面活性剤の選択を示すグラフであり、本発明の方法に従って、種々の界面活性剤を種々の濃度で使用して遺伝子導入を行った結果を示す。
［図３］図３は、本発明の方法に従って、ｐＧＬ３発現プラスミドを導入した場合の、高い再現性を示す図である。Ｘ軸は、横のウェル番号を示し（１〜１２）、Ｙ軸は、横のウェル番号（Ａ〜Ｈ）を示す。
［図４Ａ］図４Ａは、本発明の方法に従って、ｐＧＬ３発現プラスミドを導入した場合の、高い再現性を示す図である。Ｘ軸は、横のウェル番号を示し（１〜１２）、Ｙ軸は、横のウェル番号（Ａ〜Ｈ）を示す。
［図４Ｂ］図４Ｂは、本発明の方法に従って、ｐＧＬ３発現プラスミドを導入した場合の、高い再現性を示す図である。Ｘ軸は、横のウェル番号を示し（１〜１２）、Ｙ軸は、横のウェル番号（Ａ〜Ｈ）を示す。
［図５］図５は、種々の物質でコートされたプレートを用いた場合の、遺伝子導入効率の差を示す図である。
［図６］図６は、本願発明の細胞培養用容器を示す図である。
［図７］図７は、ＨＶＪ−Ｅベクターをスポッティングしたマイクロウェルに細胞を添加することによって細胞に遺伝子導入をした結果を示す。
［図８］図８は、硫酸プロタミンとポリエチルイミンを用いた場合の遺伝子導入効率を示す結果である。「エンハンサーなし」は、硫酸プロタミンもポリエチルイミンも用いない実験の結果を示す。
［図９］図９は、硫酸プロタミンとポリエチルイミンを用いた場合の遺伝子導入効率を示す結果である。
［図１０Ａ］図１０は、種々のポリエチルイミンを用いた場合の遺伝子導入効率を示す結果である。図１０Ａは、ＰＥＩ−Ｌ  ２５Ｋを用いた場合の遺伝子導入効率を示す。Ｘ軸は、導入時のＰＥＩ−Ｌ  ２５Ｋ濃度である。
［図１０Ｂ］図１０は、種々のポリエチルイミンを用いた場合の遺伝子導入効率を示す結果である。図１０Ｂは、ＰＥＩ−Ｌ  ２．５Ｋを用いた場合の遺伝子導入効率を示す。Ｘ軸は、導入時のＰＥＩ−Ｌ  ２．５Ｋ濃度である。
［図１０Ｃ］図１０は、種々のポリエチルイミンを用いた場合の遺伝子導入効率を示す結果である。図１０Ｃは、ＰＥＩ−Ｂ  ２５Ｋを用いた場合の遺伝子導入効率を示す。Ｘ軸は、導入時のＰＥＢ−Ｌ  ２５Ｋ濃度である。
［図１０Ｄ］図１０は、種々のポリエチルイミンを用いた場合の遺伝子導入効率を示す結果である。図１０Ｄは、ＰＥＩ−Ｂ  ７５０Ｋを用いた場合の遺伝子導入効率を示す。Ｘ軸は、導入時のＰＥＢ−Ｌ  ７５０Ｋ濃度である。
［図１１Ａ］図１１Ａは、種々のポリエチルイミンの細胞毒性を示す結果である。
［図１１Ｂ］図１１Ｂは、種々のポリエチルイミンの細胞毒性を示す結果である。
［図１２］図１２は、凍結乾燥による安定性を示す結果である。
［図１３］図１３は、凍結乾燥後に長期保存した場合に、遺伝子導入効率が保持されることを示す結果である。
［図１４］図１４は、異なる安定化剤を用いて凍結乾燥後に長期保存した場合に、遺伝子導入効率が保持されることを示す結果である。
［図１５］図１５は、異なる安定化剤を用いて凍結乾燥後に長期保存した場合に、遺伝子導入効率が保持されることを示す結果である。
［図１６］図１６は、各ウェルでの保存安定性が均一であることを示す結果である。
［図１７］図１７は、ｓｉＲＮＡを導入する場合にも、ＤＮＡの場合と同様に長期保存後に遺伝子導入効率が保持されることを示す結果である。
［図１８］図１８は、ｓｉＲＮＡを導入する場合にも、ＤＮＡの場合と同様に長期保存後に遺伝子導入効率が保持されることを示す結果である。
［図１９］図１９は、凍結乾燥法が、プレートのコーティングに関係しないことを示す結果である。
［図２０］図２０は、導入する核酸を含まないウイルスベクターを加えて凍結乾燥したプレートを用いた、遺伝子導入実験の結果である。
【符号の説明】
【００１２】１  細胞培養用容器
１１  板（カバーガラス）
１２  膜（限界膜）
１３  第１の培養培地
１４  第２の培養培地（ゲル化培地）
２１  細胞
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】  （用語の定義）
本明細書において使用される場合、用語「開口部」とは、固相の一部であって、その内部に液体および／または固体を保持することができる部分をいう。開口部は、代表的にはウェルの形状である。本発明の固相は、９６個、３８０個、１５００個、３０００個、４０００個、５０００個またはそれ以上の開口部を備え得る。また、本発明の開口部は、１ｍｍ２以下、０．５ｍｍ２以下、０．３ｍｍ２以下、０．２ｍｍ２以下、０．１ｍｍ２以下、０．０５ｍｍ２以下、０．０２ｍｍ２以下の断面積を有し得る。【００１４】  本明細書において使用される場合、用語「ゲル化培地」とは、細胞培養に用いることができる成分を含むゲル状の物質をいう。ゲル化培地は、例えば、コラーゲン、アガロース、寒天、ゼラチンゲル、アルギン酸カルシウムゲル、ならびにこれらの混合物を含み得る。ゲル化培地はまた、細胞培養培地に添加される少なくとも１つの成分を含み得る。そのような成分としては、例えば、限定されることはないが、グルコース、およびデキストロースのような糖、アミノ酸、およびクエン酸のような有機酸、ホスファチジルコリンのような脂質、増殖因子ようなタンパク質、ならびにアデノシン３リン酸のようなヌクレオシドからなる群から選択される成分が挙げられるが、これらに限定されない。【００１５】  本明細書において使用される場合、「膜」とは、水分、糖、塩、アミノ酸、核酸、および有機酸からなる群から選択される物質を通過し得るが、細胞を通過させることができないシート状の物質である。本発明における膜は、可撓性であっても、可撓性でなくてもよい。本発明の膜は、好ましくは１μｍ以下の孔径を有するため、細胞が透過できない。本発明の膜の材質は、限定されることはないが、親水性ポリカーボネート膜、ナイロン膜、およびアルミナ膜からなる群から選択される。好ましくは、本発明の膜は、親水性ポリカーボネート膜である。本発明の膜は、好ましくは、固相に重層される場合、固相と密着し、その結果、固相上の第１の開口部と、同一固相上の第２の開口部は、相互に細胞が通過することができないように遮断される。しかし、水分、糖、塩、アミノ酸、核酸、および／または有機酸のような物質は、本発明の膜を通過することができるので、膜によって隔たれた第１の開口部の内部と、第１の開口部の外部を、これら物質は、通過することが可能である。従って、本発明の膜によって遮断することによって、第１の開口部内に保持された細胞は、その他の開口部に保持された細胞と相互夾雑することなく、しかも、開口部外部からの細胞増殖のための栄養分の補給を受けることが可能となる。このような開口部を高密度で配置することによって、非常に多数の細胞集団を、相互夾雑させることなく、培養することが可能である。【００１６】  従って、本発明に従って、多数種類の分子（例えば、限定されることはないが、核酸分子、タンパク質分子、脂質分子、有機低分子化合物、イオン、塩）の各々を、個別に細胞に導入し、そして異なる分子が導入された細胞を、相互に夾雑させることなく、培養することができる。さらに、そのような培養方法が可能となるために、多数の物質の細胞に対する効果の観察が、高速かつ高効率で行うことが可能となる。例えば���核酸ライブラリーを用いることによって、多数種類の核酸分子を、異なる開口部（ウェル）内でその細胞に対する効果（表現型）を測定することが可能である。また、薬剤のスクリーニングにおいては、多数種類の候補化合物の細胞に対する影響を、同時に検出することが可能である。【００１７】  また、本発明の細胞培養用容器に開口部には、少なくとも２種類以上の物質（例えば、少なくとも２種類の核酸、少なくとも２種類の低分子化合物、少なくとも２種類のタンパク質、タンパク質と核酸の混合物）を同時に適用して、細胞に対する影響を観察することが可能である。【００１８】  本明細書において使用される「安定化剤」は、遺伝子導入ベクターを含む本発明の細胞培養用容器を凍結乾燥によって保存した際に、その保存安定性を向上させる薬剤をいう。本発明の安定化剤としては、トレハロース、マルトース、ラフィノース、フルクトース、スクロース、グルコース、ラクトース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、グリシン、マンニトール、ジメチルスルホオキシド（ＤＭＳＯ）またはこれらの混合物からなる群から選択される物質が挙げられるが、これらに限定されない。安定化剤としては、好ましくはトレハロース、マルトース、ラフィノース、フルクトースまたはこれらの混合物が挙げられる。より好ましくは、本発明の安定化剤は、トレハロースである。【００１９】  本発明の細胞培養容器（アレイまたはプレートともいう）を凍結乾燥させる条件は、当業者に周知である。【００２０】  本明細書において使用する場合、ポリエチレンイミン（ＰＥＩと略す）は、直鎖型および分岐型の両方を含む。直鎖型のＰＥＩの構造は、−［ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２］ｘ−として示される。ここで、ｘは任意の整数である。直鎖型のＰＥＩとしては、例えば、好ましい直鎖型のＰＥＩとしては、分子量２．５ｋＤａのＰＥＩ−Ｌ（ＰＥＩ−Ｌ２．５Ｋ）および２５ｋＤａのＰＥＩ−Ｌ（ＰＥＩ−Ｌ２５Ｋ）が挙げられる。分岐型ＰＥＩは、−［ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２］ｙ−［Ｎ（ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２）−ＣＨ２−ＣＨ２］ｚ−として示され。ここで、ｙは任意の整数である。ここでｚは、ｙとは独立する任意の整数である。例えば、好ましい分岐型ＰＥＩは、分子量２５ｋＤａ（ＰＥＩ−Ｂ  ２５Ｋ）のＰＥＩ−Ｂと７５０ｋＤａのＰＥＩ−Ｂ（ＰＥＩ−Ｂ  ７５０Ｋ）である。【００２１】  本明細書において使用する場合、用語「アンチセンス」とは、ｍＲＮＡの塩基配列（センス配列）に対して相補的な塩基配列を有する核酸である。アンチセンスは、ＤＮＡにコードされる遺伝情報が、転写・翻訳されることを妨げ得る核酸である。アンチセンス核酸は、ヌクレオチドであっても、ヌクレオチドアナログであってもよい。アンチセンス核酸に使用されるヌクレオチドアナログとしては、代表的には、インターヌクレオチド結合のリン酸基の（Ｏ）Ｐ−Ｏ−をチオリン酸基（Ｏ）Ｐ−Ｓ−に置換したホスホロチオエートＤＮＡを用いられている。また、ヌクレオチドアナログとして、「ＨーホスホネートＤＮＡ」もまた使用され得る。このヌクレオチドアナログはインターヌクレオチド結合のリン酸基の（Ｏ）Ｐ−Ｏ−をホスホニル基（Ｏ）Ｐ−Ｈに置換したもので、��れまで報告されていたリン酸基を置換したアンチセンス核酸のなかで、最も立体障害の少ないもので、理論的には、立体異性体がたとえできても、立体効果が小さいため、どちらの異性体もつよく標的遺伝子に結合できる、すぐれた特徴を持つと考えられている。【００２２】  本明細書において使用する場合、用語「ｓｉＲＮＡ」は、用語「Ｓｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ」と互換可能に用いられ、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉：ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）作用を有する２１〜２３塩基の二本鎖ＲＮＡをいう。ＲＮＡｉとは、細胞に導入された二本鎖ＲＮＡが、それと同じ配列を持つ遺伝子の発現（タンパク質合成）を抑制する現象のことです。この方法は、標的遺伝子（ｍＲＮＡ）を破壊することで発現を抑制する為、遺伝子の機能解析に有効な方法として現在注目されている。また、ＲＮＡｉは、配列のわかっている遺伝子を破壊することができる為、遺伝子機能の解析に有効である。従って、ｓｉＲＮＡは、代表的には、標的とする遺伝子由来の、２１〜２３塩基の二本鎖ＲＮＡである。ｓｉＲＮＡの設計法としては、代表的には以下が挙げられるがこれに限定されない：（１）スタートコドンから、７５塩基以上下流の最初のＡＡを見つける（転写因子の結合部位を避けるためである）；（２）遺伝子データバンク（例えば、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）のＢＬＡＳＴ  ｓｅａｒｃｈ）を用いて、ＡＡに続く、ＧＣ含量が５０％前後である１９塩基の合計２１塩基が標的に対して特異的であることを確認する。【００２３】  ｓｉＲＮＡの、代表的な製造方法は以下のとおりである：（１）合成された１本鎖ＲＮＡをそれぞれアニーリング緩衝液（１００ｍＭ  ＫＯＡｃ，２ｍＭ  ＭｇＯＡｃ，３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．４）に溶解する、（２）両方のＲＮＡ鎖（センス鎖およびアンチセンス鎖）を等量（等ｍｏｌｅ数）混合する、（３）９５℃で５分間処理後、徐々に２５℃まで冷却する、（４）その後、フェノール／クロロホルム抽出・エタノール沈殿を行なう。使用するｓｉＲＮＡの量は、細胞の種類によって異なるが、通常は、１〜３×１０４細胞／ウェルに対して、０．５〜２０ｐｍｏｌｅ／ウェルである。【００２４】  本明細書において使用する場合、用語「デコイ」または「デコイ化合物」とは、ＤＮＡ結合能を有する転写制御因子が結合する染色体上の部位、あるいはそのような転写因子に制御される遺伝子内の他の転写調節因子が結合する染色体上の部位（以下標的結合部位という）に結合し、転写因子と、これらの標的結合部位への結合について拮抗する化合物をいう。代表的には、デコイまたはデコイ化合物は、核酸およびその類似体である。デコイが核内に存在する場合、転写調節因子の標的結合部位への結合について、デコイが転写調節因子と競合し、その結果、転写調節因子の標的結合部位への結合によってもたらされる生物学的機能が阻害される。デコイは、標的結合配列に結合し得る核酸配列を少なくとも１つ含む。標的結合配列への結合活性を有する限り、デコイは、薬学的組成物の調製に用いることができる。【００２５】  本明細書で使用される場合、「ウイルスエンベロープベクター」とは、ウイルスエンベロープ中に外来遺伝子を封入したベクター、またはウイルスエンベロープ由来のタンパク質を含む成分中に外来遺伝子を封入したベクターをいう。ウイルスベクターの調製のために使用されるウイルスとしては、野生型ウイルスであっても、組換え型ウイルスであってもよい。【００２６】  本発明において、ウイルスエンベロープまたはウイルスエンベロープ由来タンパク質の調製のために使用されるウイルスとしては、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科、およびヘパドナウイルス科からなる群から選択される科に属するウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、パラミクソウイルス科に属するウイルスが、より好ましくは、ＨＶＪ（センダイウイルス）が、用いられる。【００２７】  ウイルスエンベロープ由来タンパク質としては、例えば、ＨＶＪのＦタンパク質、ＨＮタンパク質、ＮＰタンパク質およびＭタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。【００２８】  本明細書において、「ＨＶＪ」および「センダイウイルス」は、互換可能に用いられ得る。例えば、本明細書において「ＨＶＪのエンベロープ」と「センダイウイルスのエンベロープ」とは同一の意味を示す語句として用いられる。【００２９】  本明細書において「センダイウイルス」とは、パラミクソウイルス科パラミクソウイルス属に属し、細胞融合作用をもつウイルスをいう。ウイルス粒子は、エンベロープをもち、直径１５０〜３００ｎｍの多形性を示す．ゲノムは、約１５５００塩基長のマイナス鎖ＲＮＡである。ＲＮＡポリメラーゼを持ち、熱に不安定で、ほとんどあらゆる種類の赤血球を凝集し、また溶血性を示す。【００３０】  本明細書において、「ＨＡＵ」とは、ニワトリ赤血球０．５％を凝集可能なウイルスの活性をいい、１  ＨＡＵは、ほぼ２４００万ウイルス粒子に相当する（Ｏｋａｄａ，Ｙ．ら、Ｂｉｋｅｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ４、２０９〜２１３、１９６１）。【００３１】  宿主細胞として使用される動物細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒト白血病細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ヒト大腸癌細胞株などを挙げることができる。マウス・ミエローマ細胞としては、ｐｓ２０、ＮＳＯなど、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０など、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）など、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１など、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ヒト大腸癌細胞株としてはＨＣＴ−１５などが例示される。【００３２】  本明細書において使用される用語「固相」「基板」および「支持体」は、本明細書において、同じ意味で使用され、本発明のアレイが構築される材料（好ましくは固体）をいう。基板の材料としては、共有結合かまたは非共有結合のいずれかで、本発明において使用される生体分子に結合する特性を有するかま���はそのような特性を有するように誘導体化され得る、任意の固体材料が挙げられる。【００３３】  基板として使用するためのそのような材料としては、固体表面を形成し得る任意の材料が使用され得るが、例えば、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属（合金も含まれる）、天然および合成のポリマー（例えば、ポリスチレン、セルロース、キトサン、デキストラン、およびナイロン）以下が挙げられるがそれらに限定されない。基板は、複数の異なる材料の層から形成されていてもよい。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化珪素、酸化珪素、窒化珪素などの無機絶縁材料を使用できる。また、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料を用いることができる。本発明においてはまた、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜など、ブロッティングに使用される膜を用いることもできる。ナイロン膜が好ましい。ナイロン膜を用いた場合は、簡便な解析システムを用いて結果を分析することができるからである。しかし、高密度のものを解析する場合は、ガラスなど硬度のあるものを材料として使用することが好ましい。【００３４】  本明細書において「チップ」または「マイクロチップ」とは、多様の機能をもち、システムの一部となる超小型集積回路をいう。本明細書において、「ＤＮＡチップ」とは、基板と、ＤＮＡとを含み、その基板にはＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ断片）が少なくとも１つ配置されている。本明細書において、「プロテインチップ」とは、基板と、タンパク質とを含み、その基板にはタンパク質（例えば、ポリペプチドまたはオリゴペプチド）が少なくとも１つ配置されている。「ＤＮＡチップ」および「プロテインチップ」は、本明細書では、「マイクロチップ」または単に「チップ」に含まれる。「マイクロアレイ」とは、そのようなチップ上に１以上の生体分子（例えば、ｃＤＮＡ断片のようなオリゴヌクレオチド、またはペプチド）が整列されて配置されたものをいう。【００３５】  本発明において使用される生体分子（たとえば、ＤＮＡのようなオリゴヌクレオチド、またはペプチド）は、生体から採取されたものを利用し得るほか、当業者に公知の方法によって化学的に合成され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどにより市販されるＤＮＡ合成機もしくはペプチド合成機の何れかを用いて、自動化学合成により調製され得る。自動オリゴヌクレオチドの合成のための組成物および方法は、例えば、米国特許第４，４１５，７３２号，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）；米国特許第４，５００，７０７号および���ａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８５）；米国特許第４，６６８，７７７号，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）に開示される。【００３６】  基板には、任意の数の生体分子（例えば、ＤＮＡまたはペプチド）が配置され得るが、通常、基板１つあたり、１０８個の生体分子まで、他の実施形態において１０７個の生体分子まで、１０６個の生体分子まで、１０５個の生体分子まで、１０４個の生体分子まで、１０３個の生体分子まで、または１０２個の生体分子までの個の生体分子が配置され得る。これらの場合において、基板の大きさはより小さいことが好ましい。特に、生体分子（例えば、ＤＮＡまたはペプチド）のスポットの大きさは、単一の生体分子のサイズと同じ小さくあり得る（これは、１−２ｎｍの桁であり得る）。最小限の基板の面積は、いくつかの場合において基板上の生体分子の数によって決定される。【００３７】  本発明において使用する場合、「糖部分を有する界面活性剤」とは、その分子内に、「糖部分」を有する界面活性剤を有する。界面活性剤としては、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、および非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤が挙げられる。糖部分を有する界面活性剤の糖部分としては、単糖、二糖、三糖、四糖、五糖、六糖、七糖、および八糖が挙げられるがこれらに限定されない。糖部分は、分岐しても、しなくてもよい。糖部分は、好ましくは、単糖〜五糖、より好ましくは、単糖、または二糖である。糖部分としては、例えば、グルコシド、ガラクトシド、マルトシド、チオマルトシド、チオグルコシドが挙げられるが、これらに限定されない。また、糖部分を有する界面活性剤は、例えば、Ａ−（ＣＨ）ｎ−ＣＨ３で表される化合物であり、ここでＡが糖部分であり、−（ＣＨ）ｎ−ＣＨ３が糖部分以外の疎水性部分である。その疎水性部分は、ここで、ｎは、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、または１０以上、であり、かつ１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、または７以下であり得る。好ましいｎの範囲は、７〜１１である。例えば、この糖部分を有する界面活性剤は、オクチルマルトシド、デシルマルトシド、ドデシルマルトシド、オクチルグルコシド、デシルグルコシド、およびドデシルグルコシド、ならびにこれらの混合物からなる群から選択される。好ましい糖部分を有する界面活性剤は、デシルマルトシドである。【００３８】  （好ましい実施形態の説明）
（物質導入デバイスの調製）
本発明において、ウイルスベクターを固定化した物質導入デバイスの調製は、以下の工程によって実施することができる：
（１）固相に、ウイルスベクターと、導入される物質との混合物を添加する工程；および
（２）固相に、糖部分を有する界面活性剤を含む溶液を添加する工程。
上記の方法において、導入される物質としては、核酸、タンパク質、ペプチド、ヌクレオチドフラグメント、ヌクレオチドフラグメント、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド、ヌクレオシドおよびこれらの誘導体のような核酸のみならず、タンパク質、糖鎖、低分子化合物、プロテオグリカン、グリコペプチド、脂質、金属イオンも挙げられる。導入される物質が、遺伝子をコードする核酸である場合、導入される遺伝子は、任意の生体由来であり得、そして、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはヌクレオチドアナログであり得る。導入される遺伝子は、１種類であっても、複数種類であってもよい。【００３９】  上記方法において、遺伝子が導入される細胞は、特に限定されることはないが、好ましくは、動物細胞、より好ましくは、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞である。ウイルスエンベロープを用いる導入法、またはウイルスエンベロープの少なくとも１つのタンパク質を含むリポソームを用いる導入法を用いる場合、そのウイルスエンベロープを調製するために使用されるウイルスは、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科、およびヘパドナウイルス科からなる群から選択される科に属するウイルス由来であり得る。好ましくは、ウイルスは、パラミクソウイルス科のウイルス、特にＨＶＪである。【００４０】  ウイルスエンベロープの少なくとも１つのタンパク質を含むリポソームを用いて、細胞に候補核酸を導入する方法もまた、利用可能である。この方法において使用されるタンパク質としては、Ｆタンパク質、ＨＮタンパク質、ＮＰタンパク質、Ｍタンパク質またはその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。【００４１】  ウイルスベクターと、導入される物質との混合物は、例えば、ウイルスベクターを含む溶液を遠心分離して沈殿を生じさせ、導入される物質溶液を用いて該沈殿を懸濁することによって調製され得る。この遠心分離の条件は、例えば、１５０００×ｇ、４℃、１５分間が挙げられるが、これに限定されない。例えば、大量調製の場合は、１５０００×ｇ、４℃、６０分間の遠心分離条件も使用可能である。【００４２】  あるいは、予め、別の容器において、ウイルスベクター溶液と、導入される物質溶液との混合物を調製し、その混合物を固相に添加してもよい。また、固相にウイルスベクターと、導入される物質との混合物を添加する代わりに、ウイルスベクター溶液と、導入される物質溶液とを別々に固相に添加してもよい。【００４３】  必要に応じて、ウイルスベクター、導入される物質、および糖部分を有する界面活性剤を含む固相である物質導入デバイスを、室温にて、放置する。インキュベート時間は、好ましくは、５分、７分、１０分、１２分、１５分、１７分、２０分、２５分、３０分であり得る。【００４４】  必要に応じて、遺伝子導入効率を上昇させるために、硫酸プロタミン（ＰＳ）またはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を添加する。使用される硫酸プロタミンの濃度は、好ましくは、１μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは、１０μｇ／ｍｌ〜２５０μｇ／ｍｌ、最��好ましくは、１００μｇ／ｍｌである。使用されるポリエチレンイミンの濃度は、好ましくは、０．１μｇ／ｍｌ〜３００μｇ／ｍｌ、より好ましくは、０．５μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌ、最も好ましくは、１μｇ／ｍｌ〜ｌ００μｇ／ｍｌである
さらに、必要に応じて、硫酸プロタミンおよび／またはポリエチレンイミンを添加した後、物質導入デバイスを遠心分離機にかける。この遠心分離の条件は、例えば、１６４３×ｇ、４℃、３０分間であるが、これに限定されない。【００４５】  （本発明の物質導入デバイスを用いた細胞への遺伝子導入）
上記のようにして調製した物質導入デバイスを用いて、以下の方法によって、細胞に外来遺伝子を導入することができる。【００４６】  ウイルスベクターを固定化した物質導入デバイスに、細胞懸濁液を導入する。必要に応じて、デバイスを遠心分離機にかける。その遠心分離機の条件は、代表的には、１８２×ｇ、３２℃、３０分間であるが、これに限定されない。その後、必要に応じて、デバイスを振盪し、そして遠心分離機にかける。その遠心分離機の条件は、代表的には、１８２×ｇ、３２℃、３０分間であるが、これに限定されない。必要に応じて、さらに１８２×ｇ、３２℃、３０分間の遠心分離をさらに２回行うことも可能である。【００４７】  （本発明の物質導入デバイスを用いた細胞への遺伝子導入法の適用）
上記の遺伝子導入方法を用いて、多数種類の遺伝子の機能解析、およびスクリーニングなどを行うことが可能である。【００４８】  （Ａ．遺伝子機能の解析）
ゲノムプロジェクト等の進展に伴い、多数の遺伝子が単離・同定されている。しかし、未だ多くの遺伝子については、その機能が未知である。そのため、機能が未知である遺伝子の機能を同定する簡便な方法を開発することは、非常に有用である。例えば、本発明の遺伝子導入技術を用いて、本発明の物質導入デバイスに多数種類の遺伝子を導入した多数種類の細胞集団を作製し、その細胞集団の機能を解析することによって、所望の機能的性質を有する核酸が導入された細胞が選択され、その結果、所望の機能を有する遺伝子が同定される。所望の機能としては、例えば、血管新生を誘発する遺伝子をコードすること、癌抑制遺伝子をコードすること、骨形成増強遺伝子をコードすること、アポトーシス誘発遺伝子をコードすること、サイトカイン分泌遺伝子をコードすること、神経細胞樹状突起誘導遺伝子をコードすること、動脈硬化抑制遺伝子をコードすること、糖尿病抑制遺伝子をコードすること、自己免疫疾患抑制遺伝子をコードすること、アルツハイマー病抑制遺伝子をコードすること、パーキンソン病抑制遺伝子をコードすること、神経細胞保護遺伝子をコードすること、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。【００４９】  また、この選択は、好ましくは、候補核酸の発現によって変化する宿主細胞の形質に基づいて行われる。例えば、候補核酸から、増殖因子をコードする遺伝子を単離する場合、その所望の機能的性質は、特定の細胞または任意の細胞の増殖の促進である。【００５０】  上記の解析方法は、目的とする機能的性質が認識可能である限り、任意の機能的性質に対して適用可能である。上記解析方法において意図される機能的性質としては、細胞増殖の促進もしくは抑制、細胞の分化もしくは脱分化、マーカータンパク質の発現もしくは発現の抑制、マーカーｍＲＮＡの発現もしくは発現の抑制、膜電位の変化、脱分極、アポトーシス、癌化、増殖の停止、形態の変化、大きさの変化などが挙げられるが、これらに限定されない。【００５１】  上記解析方法において、遺伝子導入した細胞から核酸を抽出する方法としては、種々の周知の方法、および市販のキットを用いることができる。【００５２】  （Ｂ．スクリーニング）
本発明の遺伝子導入法は、スクリーニングに応用することができる。例えば、（１）固相；（２）ウイルスベクター；（３）導入される物質；および（４）糖部分を有する界面活性剤を備える物質導入デバイスを調製する際に、（３）導入される物質として、遺伝子ライブラリーを用いることによって、スクリーニングへの応用が可能である。遺伝子ライブラリーを用いてデバイス上に、遺伝子ライブラリーを含む細胞集団を調製し、その細胞の中から所望の機能を有する細胞を選択し、その細胞中の核酸を単離、同定することによって、所望の機能を有する遺伝子をスクリーニングすることができる。また、スクリーニングで陽性であることが判明した細胞集団が、複数種類の遺伝子を含む場合は、その物質を純化することによって、所望の機能を有する遺伝子を単離・同定することが可能である。【００５３】  このスクリーニング方法は、プラスミド状の核酸のみならず、タンパク質、ペプチド、低分子化合物、ヌクレオチドフラグメントなども、その対象とすることが可能である。【００５４】  また、物質導入デバイスは、ウイルスベクターの固定化領域を小さくすることが可能であるため、９６ウェルプレートのみならず、３８４ウェルプレート、および１５３６ウェルプレートでも、生体分子のスクリーニングを行うことが可能である。【００５５】  さらに、本発明の物質導入デバイスは、自動化に適している。本発明の方法を実施するためのキットもまた本発明において提供される。
（１．ウイルスエンベロープベクターの調製）
ウイルスエンベロープベクターとして種々の方法が公知である。例えば、本発明者らは、ウイルスおよび非ウイルスベクターを組み合わせることにより、ハイブリッド遺伝子移入ベクターを開発し、日本血球凝集性ウイルス（ＨＶＪ；センダイウイルス）由来の融合形成性エンベロープを持つ融合形成性ウイルスリポソームを構築した（Ｋａｎｅｄａ、Ｂｉｏｇｅｎｉｃ  Ａｍｉｎｅｓ，１４：５５３−５７２（１９９８）；Ｋａｎｅｄａら、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ，５：２９８−３０３（１９９９））。この送達システムでは、ＤＮＡ充填リポソームを、ＵＶ不活性化ＨＶＪと融合させ、融合形成性ウイルス−リポソームであるＨＶＪリポソーム（直径４００〜５００ｎｍ）を形成する。融合媒介送達の利点は、ＤＮＡをトランスフェクトすることが、受容体細胞におけるエンドソーム分解およびリソソーム分解から保護されることである。１００ｋｂまでのＤＮＡがＨＶＪリポソーム中に取り込まれ、そして哺乳動物細胞に送達される。ＲＮＡ、オリゴヌクレオチドおよび薬物もまた、インビトロおよび生体内で細胞中に効率的に導入される。ＨＶＪ−リポソームは、生体内で有意な細胞損傷を誘導することは示されなかった。【００５６】  繰り返したトランスフェクションが、ＨＶＪの低い免疫原性のため生体内で成功している（Ｈｉｒａｎｏら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，５：４５９−４６４（１９９８））。このベクターシステムは改良され、そしてより効率的な遺伝子送達のためにアニオンタイプおよびカチオンタイプＨＶＪ−リポソームが開発された（Ｓａｅｋｉら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，８：１９６５−１９７２（１９９７））。このＨＶＪ−リポソームシステムを用いて多くの遺伝子治療戦略が成功した（Ｄｚａｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１１４２１−１１４２５（１９９６）；Ｋａｎｅｄａら、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ，５：２９８−３０３（１９９９））。また、ＨＶＪ由来の合成ビロソーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅ）を構築するためにいくつかの試みがなされている（Ｗｕら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔ．，１９０：７３−７６（１９９５）；Ｒａｍａｎｉら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４０４：１６４−１６８（１９９７）；Ｒａｍａｎｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：１１８８６−１１８９０（１９９８））
ベクターの調製のためにウイルスを不活化する必要がある場合、種々の公知の方法を使用する事ができる。代表的な不活化法としては、ＵＶの照射、アルキル化剤での処理、β−プロピオラクトンでの処理、界面活性剤での処理、酵素処理によるエンベロープの部分的分解が挙げられるが、これらに限定されない。【００５７】  上記に列挙したウイルスエンベロープベクターを改良した調製方法もまた公知である。その代表的な例を以下に示す。以下に説明するウイルスエンベロープベクターの調製方法は、例示であって、本発明は以下の調製方法によって調製されたベクターに限定されない。
（１．１．ウイルスエンベロープ由来のタンパク質を含む成分中に外来遺伝子を封入したウイルスベクターの調製）
ウイルスエンベロープ由来のタンパク質を含むウイルスベクターとしては、ＨＶＪ（センダイウイルス）のＦ融合タンパク質およびＨＮ融合タンパク質を再構成したリポソームからなる、ウイルスベクターであって、ＲＴ−ＰＣＲによって検出可能な量のＨＶＪゲノムＲＮＡを含まない、ウイルスベクターが挙げられる。【００５８】  そのようなウイルスベクターの調製に用いられるＦ融合タンパク質およびＨＮ融合タンパク質は、天然のＨＶＪ由来のタンパク質であっても、組換え発現したタンパク質であってもよい。組換え産生される融合タンパク質は、インビトロでプロテアーゼによってプロセシングされるか、または哺乳動物細胞宿主内において、内在性プロテアーゼによってプロセシングされる。【００５９】  ウイルスエンベロープ由来のタンパク質を含むウイルスベクターは、例えば、以下の工程を包含する方法によって調製される：
・ＵＶ照射をしていないＨＶＪウイルスから、融合タンパク質を単離する工程、
・融合タンパク質を界面活性剤および脂質の存在下で再構成して、再構成粒子を調製する工程、
・所望の核酸を充填したリポソームを調製する工程、および
・再構成粒子および該リポソームを調製する工程。【００６０】  上記方法において使用される界面活性剤は、特定の界面活性剤に限定されないが、好ましくは、オクチルグルコシド、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、ＣＨＡＰＳまたはＮＰ−４０、あるいはこれらの混合物である。【００６１】  上記方法において使用される脂質は、特定の脂質に限定されず、（１）分子中に長鎖脂肪酸または類似の炭化水素鎖を持ち、かつ（２）生体内に存在するか、または生体に由来する分子であればよい。好ましい脂質としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、コレステロール、スフィンゴミエリン、およびホスファチジン酸が挙げられるが、これらに限定されない。【００６２】  リポソームの調製法は周知であり、例えば、以下の方法を使用することも可能である：
（Ａ）第１の試験管内にリン脂質薄膜をあらかじめ作っておく。この試験管に、５５℃の水を飽和させた窒素ガスを導入し、十分に水和させる。水和が完了すると、薄膜は透明になる；
（Ｂ）第２の試験管の緩衝液を静かに試験管Ａに加え、窒素ガスを導入後、密封し（例えば、パラフィルムによる）、３７℃の恒温槽（一定の温度で実験を行うための装置です）中で約２時間放置する；
（Ｃ）静かに振り動かすことにより巨大リポソームを調製する。リポソームが生成すると液が薄く濁る。これを用いて、次の測定を行う。
（Ｄ）試料を一滴スライドグラス上に採り、蛍光顕微鏡（１０００倍）によりその形態を確認する。【００６３】  ウイルスエンベロープ由来のタンパク質を含む成分中に外来遺伝子を封入したウイルスベクターを作製するために必要とされるタンパク質の調製方法は周知である。【００６４】  例えば、天然のＨＶＪを供給源としてＨＶＪのエンベロープタンパク質を精製するか、または組換え発現したＨＶＪのエンベロープタンパク質を精製することができる。周知のタンパク質の精製方法としては、例えば、硫安沈殿法、等電点電気泳動、およびカラムによる精製法が挙げられるが、これらに限定されない。カラムによるタンパク質の精製を行う場合、所望のタンパク質の性質および夾雑物の性質に応じて、種々のカラムを選択する。タンパク質精製のためのカラムとしては、陰イオン交換カラム、陽イオン交換カラム、ゲルろ過カラム、アフィニティーカラムが挙げられるが、これらに限定されない。【００６５】  あるいは、ウイルスエンベロープ由来のタンパク質を含むウイルスベクターは、以下の工程を包含する方法によって調製される：
・ＨＶＪのＦタンパク質およびＨＮタンパク質を組換え発現する工程、
・Ｆタンパク質をプロテアーゼでプロセシングする工程、
・Ｆタンパク質およびＨＮタンパク質を単離する工程、
・Ｆタンパク質およびＨＮタンパク質を界面活性剤および脂質の存在下で再構成して、再構成粒子を調製する工程、
・核酸を充填したリポソームを調製する工程、および
・再構成粒子および該リポソームをする工程。【００６６】  また、ウイルスエンベロープ由来のタンパク質を含むウイルスベクターは、以下の工程を包含する方法によっても調製される：
・Ｆタンパク質をプロセシングするプロテアーゼを発現する宿主細胞内において、Ｆタンパク質およびＨＮタンパク質を組換え発現する工程、
・Ｆタンパク質およびＨＮタンパク質を単離する工程、
・Ｆタンパク質およびＨＮタンパク質を界面活性剤および脂質の存在下で再構成して、再構成粒子を調製する工程、
・所望の核酸を充填したリポソームを調製する工程、および
・再構成粒子および該リポソームを融合する工程。
（１．２．ウイルスエンベロープ中に外来遺伝子を封入したウイルスベクターの調製）
ウイルスエンベロープ中に外来遺伝子を封入したウイルスベクターの調製法としては、例えば、以下の工程を包含する方法が挙げられる：
１）ウイルスを外来遺伝子と混合する工程、および
２）この混合液を凍結融解するか、もしくはこの混合液を、さらに界面活性剤と混合する工程。【００６７】  あるいは、ウイルスエンベロープ由来のウイルスベクターは、以下の工程を包含する方法によって調製される：
・ウイルスを不活性化する工程、
・不活性化ウイルスを外来遺伝子と混合する工程、および
・混合液を凍結融解する工程、
を包含する、方法が提供される。【００６８】  本発明のさらなる局面において、遺伝子導入のための不活性化ウイルスエンベロープベクターの調製方法であって、以下；
・ウイルスを不活性化する工程、および
・不活性化ウイルスを界面活性剤の存在下で外来遺伝子と混合する工程、
を包含する、方法が提供される。
（１．３．リポソームベクター）
リポソームベクターは、リポフェクションに一般的に用いられる脂質から調製したリポソームを用いることができる。例えば、ｌｉｐｏｆｅｃｔ  ＡＭＩＮＥ  ２０００のような脂質を用いることができる。
（細胞の選択）
本発明において、種々の細胞が、物質を導入される細胞として使用され得る。そのような細胞は、好ましくは、哺乳動物であり、より好ましくは、候補核酸が由来する種由来の細胞である。【００６９】  以上、好ましい実施形態を例示して本発明を説明してきた。以下に、図面を参照しながら、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供されることに留意されるべきである。従って、本発明の範囲は、説明に用いた特定の実施形態にも下記実施例にも限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００７０】（実施例１：ウイルスエンベロープ由来のタンパク質を含む成分中に外来遺伝子を封入したウイルスベクターの調製および使用）
（ウイルスの調製）
ＨＶＪ、Ｚ株を、先に記載のように（Ｋａｎｅｄａ、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ（Ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｆｌｏｒｉｄａ，ｖｏｌ．３，ｐｐ．５０−５７（１９９４））差示的遠心分離により精製した。精製ＨＶＪを平衡化塩溶液（ＢＳＳ：１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）中に再懸濁し、そしてウイルス力価を、５４０ｎｍにおける吸光度を測定することにより決定した。５４０ｎｍにおける光学的密度は、１５，０００血球凝集単位（ＨＡＵ）に対応し、融合活性と相関する。【００７１】  （ＨＶＪからのＦおよびＨＮ融合タンパク質の抽出）
エタノール中に溶解した、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ−４０）およびフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を、それぞれ０．５％および２ｍＭの最終濃度で精製ＨＶＪ懸濁液の２０ｍｌ（１，７５０，０００  ＨＡＵ）に添加した。この混合物を、回転しながら、４℃で３０分間インキュベートした。次いで、この懸濁液を、１００，０００ｇ、４℃で７５分間遠心分離し、不溶性タンパク質およびウイルスゲノムを除去した（Ｕｃｈｉｄａら、１９７９）。上清液を、５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対して３日間透析し、緩衝液を毎日交換することにより、残存ＮＰ−４０およびＰＭＳＦを洗い流した。透析した溶液を、１００，０００ｇ、７５分間４℃で遠心分離し、不溶性物質を取り除いた。上清液を、先に記載した方法（Ｙｏｓｈｉｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５６：５３５５−５３６１（１９８１））に基づき０．３Ｍスクロースおよび１ｍＭ  ＫＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．２）で平衡化したＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）のイオン交換カラムにアプライした。素通り画分および０．２Ｍ  ＮａＣｌ溶出液を集めた。両画分を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけ、タンパク質成分を分析した。ゲルをクマシーブリリアントブルーで染色し、そして各タンパク質の比率を、コンピューター化デンシトメトリー（ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ；Ａｐｐｌｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ、Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて評価した。【００７２】  （組換え発現）
ＨＶＪの融合タンパク質は、融合タンパク質をコードする遺伝子を、発現ベクターに組み込み、適切な宿主細胞において発現することによっても、調製され得る。Ｆタンパク質およびＨＮタンパク質のアミノ酸配列は公知である。【００７３】  種々の宿主細胞に使用され得る発現ベクターとしては、市販の各種のベクターを使用し得る。【００７４】  融合タンパク質をコードする発現ベクターは、細胞に導入され得、当該分野において公知でありそして記載される任意の種々の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｙ  Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ  Ｅｄ、Ｖｏｌｓ  １  ｔｏ  ３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）、およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ（１９９４）、これらの各々は、本明細書において参考として援用される））によって、本発明の融合タンパク質を産生し得る。組換え発現ベクターを原核生物または真核生物細胞中に導入する方法として、例えば、エレクトロポーレーション法などの、形質転換またはトランスフェクション法が挙げられる。【００７５】  組換えＦタンパク質を大腸菌で発現した場合、不活性なＦ０形態として発現された。大腸菌で発現された不活性なＦ０形態のタンパク質を活性なＦ１形態に変換するためには、０．０００４〜０．００１％トリプシンを用いる３７℃３０分間のトリプシン処理が必要とされた。【００７６】  トリプシン処理された活性化Ｆ１タンパク質に対応するポリペプチドは、短縮された活性化Ｆ１のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む発現ベクターを用いて、大腸菌で発現され得る。短縮されたＦ１タンパク質は、少なくとも、１１７番目のフェニルアラニンから１４２番目のアラニンまでの２６アミノ酸残基を含む必要がある。短縮型タンパク質が封入体を形成する場合は、封入体をリフォールディングすることにより、活性型タンパク質を得ることが当業者にとって容易に可能である（Ｒｏｂｅｒｔ  Ｆ．ＫｅｌｌｅｙおよびＭａｒｊｏｒｉｅ  Ｅ．Ｗｉｎｋｌｅｒ、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、（１９９０）ｖｏｌ．１２、１〜１９頁を参照のこと）。【００７７】  ＨＶＪが複製し得る細胞（例えば、げっ歯類の気管上皮細胞；ニワトリ胚；サル腎臓の初代培養細胞；ヒト胎児肺、腎臓、羊膜の初代培養細胞）を宿主細胞として使用してＦタンパク質を発現させる場合、発現された全長Ｆタンパク質が宿主細胞の内在性プロテアーゼにより切断され、その結果として活性化されるため、活性型Ｆタンパク質を発現および単離することが可能である。あるいは、Ｔｒｉｐｔａｓｅ  ｃｌａｒａ（Ｋｉｄｏら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌｓ  ９，２３５−２４４（１９９９））を、内在性の酵素として発現する宿主細胞（例えば、ラットの気管上皮細胞）、または組換え的に発現する宿主細胞もまた使用され得る。【００７８】  これら発現ベクターの選択および構築方法、宿主細胞への導入方法、宿主細胞での発現方法、ならびに発現タンパク質の回収方法は、当業者に���って周知である。【００７９】  （ＨＶＪからの融合タンパク質の精製）
融合タンパク質の精製のために、ＮＰ−４０処理したＨＶＪの溶解物を、超遠心によって明澄化した。上清のタンパク質を、さらなる精製の前に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。この上清は、ＨＶＪ由来の多くのタンパク質を含んでいた。次に、この上清を、イオン交換クロマトグラフィーにアプライした。５２ｋＤａおよび７２ｋＤａタンパク質が主に、素通り画分に溶出された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの移動度によって、これら２つのタンパク質を、それぞれＦ１およびＨＮであると同定した（Ｏｋａｄａ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｎ．Ｄｕｚｇｎｅｓ（Ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ｖｏｌ．２２１，ｐｐ．１８−４１（１９９３））。５２ｋＤａタンパク質の下のかすかなバンドは、融合タンパク質（Ｆ１およびＨＮ）の分解産物であると考えられた。なぜなら、これらのタンパク質は、異なる実験間で再現性がなかったからである。タンパク質を、さらに０．２Ｍ  ＮａＣｌによって溶出した。しかし、融合タンパク質は、効率よくは得られなかった。そしてＨＶＪのＮＰタンパク質であると推測されるさらなる６０ｋＤａタンパク質が出現した。結果として、素通り画分のみを、さらなる実験の融合タンパク質の供給源として使用した。デンシトメトリーは、素通り画分のＦ１対ＨＮの濃度比が２．３：１であることを示した。このことは、ウイルスエンベロープ中の両タンパク質の比と一致した。以前の論文（Ｎａｋａｎｉｓｈｉら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，１４２：９５−１０１（１９８２））は、この比がＨＶＪの効率的な融合に必要であると報告している。【００８０】  （ウイルスベクターの調製）
３．５６ｍｇホスファチジルコリンおよび０．４４ｍｇコレステロールの脂質混合物を、クロロホルム中に溶解し、そしてこの脂質溶液を、ロータリーエバポレーター中で蒸発させた（Ｕｃｈｉｄａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８０：１０−２０（１９７９））。乾燥脂質混合物を、０．８５％
ＮＰ−４０を含む２．０ｍｌの上記素通り画分からのタンパク質溶液（１．６ｍｇ）中にボルテックスにより完全に溶解した。次いで、この溶液を０．３Ｍスクロースおよび１ｍＭ  ＫＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に対して透析し、ＮＰ−４０を除去した。透析は、毎日緩衝液を交換して６日間実施した。この透析された溶液を、０．３Ｍ  スクロースおよび１ｍＭ  ＫＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．２）で平衡化したアガロースビーズ（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ａ−５０ｍ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）にアプライした。５４０ｎｍにおける光学的密度が１．５を超える画分を再構成融合粒子として集め、そして以下に記載のように１０ｍｇ脂質から調製された核酸充填リポソームと融合し、ウイルスベクターを調製した。【００８１】  （ヒトＨＥＫ２９３株由来のトランスフェクト細胞におけるルシフェラーゼ遺伝子発現）
上記の方法で調製したウイルスベクターの遺伝子導入活性を確認するために、ヒトＨＥＫ２９３株およびルシフェラーゼ遺伝子を、以下のように用いた。【００８２】  ｐＣＭＶ−ルシフェラーゼ（７．４ｋｂ）を、ｐＧＥＭ−ｌｕｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ、ＵＳＡ）からのルシフェラーゼ遺伝子を、ｐｃＤＮＡ３（５．４ｋｂ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）中に、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ部位でクローニングすることにより構築した。約４０μｇのｐＣＭＶ−ルシフェラーゼを含むウイルスベクターを、先に記載のように構築し、そしてこのウイルスベクター（約１．５×１０１１粒子／ｍｌ、ＤＮＡ濃度は約４０μｇ／ｍｌ）の１／１０量（１００μｌ）を、ヒト２９３細胞株（ヒト胎児腎臓：ＨＥＫ）由来の２×１０５細胞とインキュベートした。ＨＶＪリポソームを用いて、また同量のルシフェラーゼＤＮＡを２×１０５ＨＥＫ２９３細胞に導入した。導入２４時間後、細胞を回収し、そして他に記載のように（Ｓａｅｋｉら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，８：１９６５−１９７２（１９９７））、ルシフェラーゼ活性アッセイを確認した。【００８３】（実施例２：凍結融解によるＨＶＪエンベロープベクターの調製および使用）
（ウイルスベクターの調製およびその使用）
（１：凍結融解によるＨＶＪエンベロープベクターの調製）
外来遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用い、組換えＨＶＪウイルスを様々な回数で凍結融解した後、培養細胞に遺伝子導入した。【００８４】  ＴＥ５００μｌに、７５０μｇのルシフェラーゼ発現ベクターｐｃＯｒｉＰＬｕｃ（ＳａｅｋｉおよびＫａｎｅｄａら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１１、４７１〜４７９（２０００））と様々な濃度のＨＶＪウイルスを混合した。ＨＶＪウイルス濃度は、１０、２５、５０、１００ＨＡＵ／μｌに調製した。この溶液を１２分割し、それぞれをドライアイスによって凍結させた後、融解することを最大３０回まで繰り返した。所定回数の凍結融解を終えた溶液を、ＢＨＫ−２１細胞（２４ウェルディッシュ、４×１０４細胞／ディッシュ、０．５ｍｌ  ＤＭＥＭ，１０％ＦＣＳ）の培地に添加し、３７℃、５％ＣＯ２にて２０分間反応後、ＰＢＳにより洗浄し、新たに培養液を０．５ｍｌ加えて２４時間培養した。【００８５】  培地を除去し、１×Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）５００μｌを細胞上に加えて細胞を溶解した後、マイクロチューブに移して遠心し、得られた上清２０μｌから、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  ＳｙｓｔｅｍとＬｕｍａｔ  ＬＢ９５０１  Ｌｕｍｉｎｏｐｈｏ  ｔｏｍｅｔｅｒを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。測定は各溶液について３回行い、平均値を求めた。【００８６】  この結果、組換えＨＶＪウイルスの凍結融解の回数が増加するに従ってルシフェラーゼ活性が上昇し、３回の凍結融解に比べ２０回の凍結融解では１０倍以上のルシフェラーゼ発現が観察された。この結果から、この実施例に用いた条件では、組換えＨＶＪウイルスの凍結融解の回数は好ましくは５回以上、さらに好ましくは１５〜２０回程度であることが確認された。【００８７】  （２：凍結融解により調製されたＨＶＪエンベロープベクターの遺伝子導入効率）
上記１と同様の組換えＨＶＪウイルスを３０回凍結融解した後、宿主細胞に添加するウイルス数を同一条件として、細胞への遺伝子導入効率を調べた。【００８８】  その結果、例えばＸ軸が５００ＨＡＵの場合では、ウイルス濃度１０ＨＡＵ／μｌの溶液の添加量は５０μｌであり、１００ＨＡＵ／μｌの溶液は５μｌとなる。ウイルス濃度が１０ＯＨＡＵ／μｌの溶液は１０〜５０ＨＡＵ／μｌ濃度の場合に比較して遺伝子発現の効率が約５０％低下した。この結果から、この実施例の条件では、組換えウイルス濃度は１０〜５０ＨＡＵ／μｌの範囲とすることが好ましいことが確認された。【００８９】  また、組換えＨＶＪウイルスを２９回凍結融解した後、３０回目の凍結を行い、その凍結状態で１週間保存した後、融解して細胞に添加した。その結果、この１週間冷凍保存した組換えＨＶＪウイルスも、３０回の凍結融解を連続で行ったウイルスと同程度のルシフェラーゼ遺伝子発現を示した。【００９０】（実施例３：界面活性剤を用いる不活性化ＨＶＪエンベロープベクター（ＨＶＪ−Ｅ）の調製および使用）
（１：ＨＶＪの増殖）
ＨＶＪは鶏の受精卵への種ウイルスの接種により増殖されたものが一般に使用され得るが、サル、ヒトなどの培養細胞、培養組織へのウイルスの持続感染系（トリプシンなどの加水分解酵素を培養液中に添加）を利用して増殖させたもの、クローニングされたウイルスゲノムを培養細胞に感染させ持続感染をおこさせて増殖させたもの、全てが利用可能である。【００９１】  本実施例において、ＨＶＪの増殖を以下のようにおこなった。【００９２】  ＨＶＪの種ウイルスを、ＳＰＦ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｆｒｅｅ）の受精卵を使って増殖させ分離・精製したＨＶＪ（Ｚ種）を細胞保存用チューブに分注し、１０％  ＤＭＳＯを加えて液体窒素中に保存し、調製した。【００９３】  受精直後のニワトリ卵を入荷し、インキュベーター（ＳＨＯＷＡ−ＦＵＲＡＮＫＩ  Ｐ−０３型；約３００鶏卵収容）にいれ、３６．５℃、湿度４０％以上の条件で１０〜１４日飼育した。暗室中で、検卵器（電球の光が口径約１．５ｃｍの窓を通して出るようになっているもの）を用いて、胚の生存及び気室と漿尿膜を確認し、漿尿膜の約５ｍｍ上方に鉛筆でウイルス注入箇所の記しをつけた（太い血管を除いた場所を選定する）。ポリペプトン溶液（１％ポリペプトン、０．２％  ＮａＣｌを混合し、１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整してオートクレーブ滅菌し、４℃保存したもの）で種ウイルス（液体窒素からとりだしたもの）を５００倍に希釈し、４℃においた。卵をイソジン及びアルコールで消毒し、ウイルス注入箇所に千枚通しで小孔をあけ、希釈した種ウイルス０．１ｍｌを２６ゲージの針付き１ｍｌシリンジを用いて、漿尿腔内に入るように注入した。溶かしたパラフィン（融点５０〜５２℃）をパスツールピペットを用いて孔の上に置きこれをふさいだ。卵をインキュベーターにいれ、３６．５℃、湿度４０％以上の条件で３日飼育した。次に、接種卵を一晩４℃においた。翌日、卵の気室部分をピンセットで割り、１８ゲージの針を付けた１０ｍｌシリンジを漿尿膜の中にいれて、漿尿液を吸引し、滅菌ボトルに集め、４℃に保存した。【００９４】  （２：ＨＶＪの精製）
ＨＶＪは、遠心分離による精製方法、カラムによる精製方法、または当該分野において公知のその他の精製方法によって、精製され得る。
（２．１：遠心分離による精製方法）
手短には、増殖させたウイルス液を回収し低速遠心で培養液や漿尿液中の組織・細胞片を除去した。その上清を高速遠心（２７，５００×ｇ、３０分間）とショ糖密度勾配（３０〜６０％ｗ／ｖ）を利用した超遠心（６２，８００×ｇ、９０分間）により精製した。精製の間にウイルスをできるだけ穏和に扱い、４℃で保存することに注意すべきである。【００９５】  本実施例において、具体的には、以下の方法によってＨＶＪを精製した。【００９６】  ＨＶＪ含有漿尿液（ＨＶＪ含有のニワトリ卵の漿尿液を集め４℃にて保存）の約１００ｍｌを広ロの駒込ピペットで５０ｍｌの遠心チューブ２本に入れ（Ｓａｅｋｉ，Ｙ．，およびＫａｎｅｄａ，Ｙ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ（ＨＶＪ−ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ，ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｈａｎｄｂｏｏｋ（第２版）Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ編（Ａｃａｄｃｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ）第４巻、１２７〜１３５、１９９８を参照のこと）、低速遠心機で３０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心し（ブレーキはオフ）、卵の組織片を除去した。【００９７】  遠心後、上清を３５ｍｌ遠心チューブ４本（高速遠心用）に分注し、アングルローターで２７，０００ｇ，３０分遠心した（アクセル、ブレーキはオン）。上清を除き、沈殿にＢＳＳ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ；オートクレーブし、４℃保存）（ＢＳＳのかわりにＰＢＳでも可能）をチューブ当たり約５ｍｌ加え、そのまま４℃で一晩静置した。広ロの駒込ピペットでゆるやかにピペッティングして沈殿をほぐし１本のチューブに集め、同様にアングルローターで２７，０００ｇ、３０分遠心した。上清をのぞき沈殿にＢＳＳ約１０ｍｌを加え、同様に４℃で一晩静置した。広ロの駒込ピペットでゆるやかにピペッティングして沈殿をほぐし、低速遠心機で３０００ｒｐｍ，１０分、４℃で遠心し（ブレーキはオフ）、除ききれなかった組織片やウイルスの凝集塊をのぞいた。上清を新しい滅菌済みチューブに入れ精製ウイルスとして４℃で保存する。【００９８】  このウイルス液０．１ｍｌにＢＳＳを０．９ｍｌ加え、分光光度計で５４０ｎｍの吸収を測定し、ウイルス力価を赤血球凝集活性（ＨＡＵ）に換算した。５４０ｎｍの吸収値１がほぼ１５，０００ＨＡＵに相当した。ＨＡＵは融合活性とほぼ比例すると考えられる。また実際にニワトリ赤血球液（０．５％）を用いて、赤血球凝集活性を測定してもよい（動物細胞利用実用化マニュアル、ＲＥＡＬＩＺＥ  ＩＮＣ．（内田、大石、古沢編集）Ｐ２５９〜２６８、１９８４を参照のこと）。【００９９】  さらにショ糖密度勾配を用いたＨＶＪの精製も必要に応じて行い得る。具体的には、ウイルス懸濁液を６０％、３０％のショ糖溶液（オートクレーブ滅菌）を重層した遠心チューブにのせ、６２，８００×ｇで１２０分間密度勾配遠心を行う。遠心後、６０％ショ糖溶液層上にみられるバンドを回収する。回収したウイルス懸濁液をＢＳＳもしくはＰＢＳを外液として４℃で透析を一晩行い、ショ糖���除去する。すぐに使用しない場合は、ウイルス懸濁液にグリセロール（オートクレーブ滅菌）と０．５Ｍ  ＥＤＴＡ液（オートクレーブ滅菌）をそれぞれ最終濃度が１０％と２〜１０ｍＭになるように加えて−８０℃で穏やかに凍結し、最終的に液体窒素中で保存する（凍結保存はグリセロールと０．５Ｍ  ＥＤＴＡ液の代わりに１０ｍＭ  ＤＭＳＯでも可能）。
（２．２：カラムおよび限外濾過による精製方法）
遠心分離による精製方法に代えて、カラムによるＨＶＪの精製も本発明に適用可能である。【０１００】  手短には、分子量カットオフが５０，０００のフィルターによる限外濾過による濃縮（約１０倍）とイオン交換クロマトグラフィー（０．３Ｍ〜１Ｍ  ＮａＣｌ）による溶出を用いて精製した。【０１０１】  具体的には、本実施例において、以下の方法を使用して、ＨＶＪをカラムによって精製した。【０１０２】  漿尿液を採集した後、８０μｍ〜１０μｍのメンブランフィルターにてろ過した。０．００６〜０．００８％ＢＰＬ（最終濃度）を漿尿液に加え（４℃、１時間）、ＨＶＪを不活性化した。漿尿液を３７℃、２時間インキュベートすることによって、ＢＰＬを不活性化した。【０１０３】  ５００ＫＭＷＣＯ（Ａ／Ｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｎｅｅｄｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いたタンジェンシャルフロー限外ろ過法により約１０倍濃縮した。緩衝液として、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２％マンニトール、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）を用いた。ＨＡＵアッセイにより、ほぼ１００％のＨＶＪ回収率であり優れた結果がえられた。【０１０４】  ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（アマシャムファルマシアバイオテクＫＫ、Ｔｏｋｙｏ）によるカラムクロマトグラフィー法（緩衝液：２０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．２〜１Ｍ  ＮａＣｌ）でＨＶＪを精製した。４０〜５０％の回収率であり、純度は９９％以上であった。【０１０５】  ５００ＫＭＷＣＯ（Ａ／Ｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いたタンジェンシャルフロー限外ろ過法によりＨＶＪの画分を濃縮した。【０１０６】  （３：ＨＶＪの不活性化）
ＨＶＪの不活性化が必要な場合、以下に記載するように、紫外線照射またはアルキル化剤処理により行った。【０１０７】  （３．１：紫外線照射法）
ＨＶＪ懸濁液１ｍｌを３０ｍｍ径のシャーレにとり、９９または１９８ミリジュール／ｃｍ２を照射した。ガンマー線照射も利用可能である（５〜２０グレイ）が完全な不活性化がおこらない。【０１０８】  （３．２：アルキル化剤による処理）
使用直前に、１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ中に０．０１％  β−プロピオラクトンの調製をした。作業中は低温下に保ち素早く作業を行った。【０１０９】  精製直後のＨＶＪの懸濁液に最終０．０１％になるようにβ−プロピオラクトンを添加し、氷上で６０分間でインキュベートした。その後２時間、３７℃でインキュベートした。エッペンドルフチューブにチューブあたり１０，０００ＨＡＵ分ずつ分注し、１５，０００ｒｐｍ、１５分遠心し、沈殿を−２０℃で保存する。上記の不活性化法によらず、沈殿を−２０℃で保存せず、そのまま界面活性剤処理によりＤＮＡを取り込ませ、ベクターを作成することも可能である。【０１１０】  （４：ＨＶＪエンベロープベクターの作成）
保存してあったＨＶＪに外来ＤＮＡ２００〜８００μｇを含む溶液９２μｌを加えてピペッティングでよく懸濁した。この溶液は、−２０℃で、少なくとも、３ヶ月保存可能である。ＨＶＪとの混合前にＤＮＡに硫酸プロタミンを添加すると、発現効率が２倍以上増強した。【０１１１】  この混合液を氷上に１分間置き、オクチルグルコシド（１０％）を８μｌ加えて１５秒氷上でチューブを振盪し、４５秒氷上に静置した。界面活性剤での処理時間は、１〜５分間が好ましい。オクチルグルコシド以外に、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸）、ＮＰ−４０（ノニルフェノキシポリエトキシエタノール）などの界面活性剤も使用し得る。Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、ＮＰ−４０およびＣＨＡＰＳの好ましい最終濃度は、それぞれ、０．２４〜０．８０％、０．０４〜０．１２％および１．２〜２．０％である。【０１１２】  冷ＢＳＳを１ｍｌ添加し、すぐに１５，０００ｒｐｍで１５分遠心した。生じた沈殿にＰＢＳまたは生理食塩水などを３００μｌ加えて、ボルテックス、ピペッティングで懸濁した。懸濁液は直接遺伝子導入に使用することも、−２０℃で保存後に遺伝子導入に使用することも可能である。このＨＶＪエンベロープベクターは、少なくとも２ヶ月間の保存後、同程度の遺伝子導入効率を維持した。【０１１３】  （５：ＨＶＪエンベロープベクターによる細胞内への遺伝子導入）
（遺伝子導入方法）
１，０００ＨＡＵ分をエッペンドルフチューブにとり（３０μｌ）、硫酸プロタミン（１ｍｇ／ｍｌ）５μｌを加えた。ＢＨＫ−２１細胞（前日に、ウェルあたり２００，０００個で、６つのウェルにまいたもの）の培地を交換し、１ウェルあたり０．５ｍｌの培地（１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ）を添加した。各ウェルに、上記のベクター（１，０００ＨＡＵ相当）と硫酸プロタミンの混合液を加え、プレートを前後左右にふってベクターと細胞を良く混ぜ合わせ、３７℃で、５％ＣＯ２インキュベーター中に１０分間放置した。【０１１４】  培地交換し、３７℃で、５％ＣＯ２インキュベーター中でオーバーナイト（１６ｈｒ〜２４ｈｒ）放置し、遺伝子発現を調べた。ルシフェラーゼ（ｐｃＬｕｃｉ；ＣＭＶプロモーターを有するルシフェラーゼ遺伝子）の場合は、Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）０．５ｍｌで細胞を溶解し、その２０μｌ溶液中の活性をルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。グリーン蛍光タンパク質（ｐＣＭＶ−ＧＦＰＥ；Ｐｒｏｍｅｇａ）の場合は、そのまま蛍光顕微鏡で観察し、４００倍率で５〜８視野を観察し、蛍光を発する細胞の割合を算出した。【０１１５】  （実施例４：リポソームベクターの調製および使用）
（リポソームベクターの調製）
本発明のリポソームベクターを、２０〜２４μｇのｃＤＮＡライブラリー由来のｃＤＮＡと、２４〜７２μｌのｌｉｐｏｆｅｃｔ  ＡＭＩＮＥ  ２０００（リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ９２００８））試薬をそれぞれ１．２ｍｌの無血清培地に希釈し、速やかに混合し、２０分間常温でインキュベートすることにより、リポソームと核酸との複合体を形成する。【０１１６】  （リポソームベクターによるトランスフェクション）
宿主細胞を、適切な培地とともに、９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、培養する。血清存在下でトランスフェクションする場合、複合体１２．５μｌを９６ウェルプレートの各ウェルに直接添加し混合する。血清非存在下でトランスフェクションする場合は複合体を添加する前に血清を含んだ培地を除去し、血清を含まない培地に交換する。
４〜１２時間ＣＯ２インキュベーターで培養後、培地交換を行う。所定の時間の培養後、アッセイを行う。【０１１７】  （実施例５：種々の界面活性剤を用いて調製した物質導入デバイスを用いる遺伝子導入）
以下の方法を用いて、固相に所望の核酸を含むＨＶＪ−Ｅベクターを固定化することにより、物質導入デバイスを調製した。【０１１８】  （細胞、プラスミドＤＮＡおよびＨＶＪ−Ｅの調製）
ＢＨＫ−２１細胞（ｂａｂｙｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌ）は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）より購入した。細胞を、１０％ＦＢＳを添加したダルベッコ改変イーグル培地で培養した。トランスフェクション効率を評価するために、ルシフェラーゼ発現ベクターであるｐＧＬ３（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。プラスミドは、Ｑｉａｇｅｎカラム（Ｈｉｌｄｅｎ，ドイツ）を用いて調製した。ＨＶＪウイルスを、増幅し、そしてＨＶＪ−Ｅベクターを実施例３に記載のように調製した。【０１１９】  （核酸を含むＨＶＪ−Ｅの調製）
１６．７ＨＡＵのＨＶＪ−Ｅを、１５０００ｇ、１５分、４℃で遠心した。上清除去後、１．３３μｇ（０．６７μｌ）のｐＧＬ３プラスミド溶液に懸濁し、さらに、４９．３３μｌのＰＢＳ（−）を添加した。この混合物を９６ウェルマイクロタイタープレートの１ウェルに添加し、図１、２に示した１５μｌの界面活性剤を混合物に添加した。混合物を１５分間インキュベートし、次に、０．２１ｍｇ／ｍｌの硫酸プロタミン（ＰＢＳ（−）中に溶解）８５μｌを添加した。このプレートを、３０００ｒｐｍ（１６４３×ｇ）、３０分、４℃、遠心分離機にかけ、さらに４℃、オーバーナイトでインキュベートした。【０１２０】  （トランスフェクション）
トランフェクションのために、上記で調製した核酸を含むベクターを添加したプレートのウェルの中の上清８０μｌを除去し、２．５×１０４細胞を添加後、１０００ｒｐｍで３０分間、３２℃で２回遠心分離機にかけた。細胞を、１０％ＦＢＳを補充した培地を用い、３４℃、オーバーナイトで培養した。ルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて検出し、そして蛍光強度をイメージリーダーＡＲＶＯｍｘ（Ｗａｌｌａｃ）で検出した。その結果を図１、および図２に示す。【０１２１】  図１に示すように、ドデシルマルトシド、オクチルグルコシド、およびジギトニンの各々を用いた場合、ルシフェラーゼ活性が検出された。活性の強度は、ドデシルマルトシドが最も強く、次にオクチルグルコシドが強く、ジギトニンが最も弱かった。【０１２２】  図２に示すように、オクチルグルコシド、オクチルマルトシド、デシルマルトシド、ドデシルマルトシド、ジギトニン、およびＴｒｉｔｏｎ−Ｘを用いた。オクチルグルコシド、オクチルマルトシド、デシルマルトシド、ドデシルマルトシド、およびジギトニンを用いた場合、ルシフェラーゼ活性が検出された。これに対して、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを用いた場合、ルシフェラーゼ活性が検出されなかった。この結果から、遺伝子導入のためには、界面活性剤が糖部分を有することが必要であると考えられる。これに対して、疎水性部分は、アルキル基であってもステロイドであっても、遺伝子導入活性が確認されたことから、疎水性部分に必須の構造的特徴はないと考えられる。しかし、疎水性部分がアルキル基の場合は、ステロイドの場合よりも、高い遺伝子導入効率をもたらした。疎水性部分が、式−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３で表されるアルキル基の場合、ｎ＝７〜１１の場合に、高い遺伝子導入効率がもたらされた。最も遺伝子導入効率が高かったのは、ｎ＝９の場合であった。また、使用した個々の界面活性剤の中で、活性の強い順番は、デシルマルトシド、ドデシルマルトシド、オクチルマルトシド、オクチルグルコシド、ジギトニンであった。【０１２３】  図１に関してＣＭＣ以下の濃度について検討を行った。この方法において有効な界面活性剤はドデシルマルトシドであり、１／４ＣＭＣにおいてピークが見られた。そこで図２において、図１で設定された１／４ＣＭＣにおいて類以の界面活性剤を検討した。オクチルグルコシド、ジギトニンについては細胞毒性が観察されたのでその効果が最小である濃度を選んだ。また、従来法との比較を行うためにＴｒｉｔｏｎＸ−１００は従来法で使用していた濃度を用いた。【０１２４】  （実施例６：種々の界面活性剤を用いて調製した物質導入デバイスを用いる遺伝子導入）
全体として４２０８ＨＡＵのＨＶＪ−Ｅを、１５０００ｇ、１５分間、４℃で遠心した。上清を除去した後、２ｍｇ／ｍｌのｐＧＬ３（１６７．８μｌ）を添加して、ベクターを懸濁した。４．０５ｍｌのＰＢＳ（−）を混合物に添加し、そして１６．７μｌのｐＧＬ３／ＨＶＪ−Ｅ／ＰＢＳ混合液を、９６オートディスペンサーマシン（ＡＤＳ−３８４、Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、９６ウェルプレートの各ウェルに分注した（ＨＶＪ−Ｅ：１６．７ＨＡＵ／ウェル、ｐＧＬ３：１．３３ｕｇ／ウェル）。９６ウェルの各々に０．０１％のドデシルマルトシドを、５μｌ／ウェルになるように添加した。プレートを１５分間インキュベートし、次に２２．３μｌ／ウェルになるようにＰＢＳ（−）を添加し、そして６．０μｌ／ウェルになるように、１ｍｇ／ｍｌ硫酸プロタミン／ＰＢＳ（−）を添加した。溶液をプレートに添加し、そのプレートを３０００ｒｐｍ、３０分間、４℃で遠心分離機にかけ、さらに４℃、オーバーナイトでインキュベートした。【０１２５】  トランスフェクションのために１．６７×１０ｅ５  ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞溶液を調製し、９６オートディスペンサーマシン（ＡＤＳ−３８４、Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、上記で調製した核酸を含むベクターを添加したプレートに２．５×１０４細胞（１５０μｌ）を添加し、１０００ｒｐｍで３０分間、３２℃で２回遠心分離機にかけた。細胞を、１０％ＦＢＳを補充した培地を用い、３４℃、オーバーナイトで培養した。ルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて検出し、そして蛍光強度をイメージリーダーＡＲＶＯｍｘ（Ｗａｌｌａｃ）で検出した。その結果を図３、および図４に示す。【０１２６】  図３に示すように、本発明の遺伝子導入方法は、高い再現性を示した。蛍光強度（ＲＵ）の平均値は、２０８０５１８、および１６６７７４７であり、標準偏差は、３７７９２８．９および３２４４７７であった。相対標準偏差（Ｃ．Ｖ．％）は、１８．２％および１９．５％であり、本発明の再現性の高さが数値で示されている（図４ＡおよびＢ）。【０１２７】  （実施例７：種々のタンパク質でコートした固相を用いた場合の、遺伝子導入効率）
全体として２０９９５ＨＡＵのＨＶＪ−Ｅを、１５０００ｇ、１５分、４℃で遠心した。上清除去後、２ｍｇ／ｍｌのｐＧＬ３プラスミド溶液１５７μｌでベクターを懸濁した。１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を４７．１μｌ添加し、１５０００ｇ、１５分、４℃で遠心した。上清除去後、１６６２．４μｌのＰＢＳ（−）でベクターを懸濁し、１ｍｇ／ｍｌの硫酸プロタミン（ＰＢＳ（−）中に溶解）２３７．５μｌを添加した。次に、６．１ｍｌのＰＢＳ（−）を添加し、この溶液を図５に示した２４ウェルプレートの各々に添加した（２００μｌ／ウェル）。プレートを、３０００ｒｐｍ（１６４３×ｇ）、３０分、４℃、遠心分離機にかけ、さらに４℃、オーバーナイトでインキュベートした。【０１２８】  トランスフェクションのために、上記で調製した核酸を含むベクターを添加したプレートのウェル中の上清を１００μｌ除去し、２．５×１０ｅ５細胞（１ｍｌ）を添加後、１０００ｒｐｍで３０分間、３２℃で２回遠心分離機にかけた。細胞を、１０％ＦＢＳを補充した培地を用い、３４℃、オーバーナイトで培養した。ルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて検出し、そして蛍光強度をイメージリーダーＡＲＶＯｍｘ（Ｗａｌｌａｃ）で検出した。【０１２９】  図５に示すプレートを用いた。各プレートのコーティングは、以下のとおりである：
Ｃｏｒｎｉｎｇ：コーティングなし（コーニング社製）、
ＳＵＭＩＬＯＮ：コーティングなし（住友ベークライト社製）、
ＰＬＬ：ポリＬリシンコーティング（住友ベークライト社製）、
Ｇｅｌａｔｉｎ：ゼラチンコーティング（住友ベークライト社製）、
Ｃ−１：コラーゲン１コーティング（住友ベークライト社製）、
Ｂ．Ｄ．：コーティングなし（ＢＤバイオサイエンス社製）、
ＰＬＯ／ＬＭ：ポリＬオルニチン／ラミニンコーティング（ＢＤバイオサイエンス社製）、
ＰＤＬ／ＬＭ：ポリＤリジン／ラミニンコーティング（ＢＤバイオサイエンス社製）、
Ｌａｍｉｎｉｎ：コーティング（ＢＤバイオサイエンス社製）、
Ｃ−１：コラーゲン１コーティング（ＢＤバイオサイエンス社製）、
Ｃ−４：コラーゲン４コーティング（ＢＤバイオサイエンス社製）、および
Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ：フィブロネクチンコーティング（ＢＤバイオサイエンス社製）。【０１３０】  図５に示されるように、フィブロネクチンでコートしたプレートを用いた場合に、遺伝子導入効率が最も高かった。【０１３１】  （実施例８：ＨＶＪへの所望の物質の封入効率の改良）
上記実施例においては、ＨＶＪへの従来封入エンハンサーには硫酸プロタミン（ＰＳ）を用いていたが、本実施例においては、ＰＳの代わりにポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いた。その結果、ＰＳと比較して、（１）細胞への生体高分子導入効率の上昇、（２）細胞汎用性の拡大、が実証された。また、ＰＥＩは直鎖型と分岐型があるが、（１）直鎖型の方が幅広い濃度で高い導入効率が維持される、（２）直鎖型の方が細胞毒性が低い、ことが実証された。その結果を以下に示す。【０１３２】  カチオニックポリマーとして知られるＰＥＩは直鎖型と分岐型が存在する。今回は分子量の異なるものを直鎖型（ＰＥＩ−Ｌ）と分岐型（ＰＥＩ−Ｂ）それぞれ２種類ずつ、計４種類のＰＥＩを用いた。直鎖型のＰＥＩの構造は、−［ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２］ｘ−として示され（Ｘは任意の整数）、本実施例においては、分子量２．５ｋＤａのＰＥＩ−Ｌ（ＰＥＩ−Ｌ２．５Ｋ）と２５ｋＤａのＰＥＩ−Ｌ（ＰＥＩ−Ｌ２５Ｋ）を使用した。分岐型ＰＥＩは、−［ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２］ｙ−［Ｎ（ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２）−ＣＨ２−ＣＨ２］ｚ−として示され（ｙおよびｚは任意の整数）、本実施例においては、分子量２５ｋＤａ（ＰＥＩ−Ｂ  ２５Ｋ）のＰＥＩ−Ｂと７５０ｋＤａのＰＥＩ−Ｂ（ＰＥＩ−Ｂ  ７５０Ｋ）を使用した。【０１３３】  ＢＡＥＣ細胞に対して、上記実施例６の方法を以下のとおりに改変し、そして、ＰＳを使用した代わりに、ＰＥＩを用いた。具体的には、以下のとおりである。【０１３４】  ＨＶＪ−Ｅを９６ウェルプレートの１ウェルあたり４．５ＨＡＵを添加するために、１５０００ｇ、１５分間、４℃にて遠心した。上清を除去した後、適量のＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ；ハンクス平衡塩溶液）中に懸濁し、５μｌ（４．５ＨＡＵ）のＨＶＪ−Ｅ／ＨＢＳＳ混合液を９６オートディスペンサーマシンで９６ウェルプレートの各ウェルに分注した。９６ウェルの各々にＤＮＡ溶液（０．２５ｍｇ／ｍＬ  ｐＥＧＦＰ−Ｃ１を５μｌ／ウェル）添加して、混合した。その後、９６ウェルの各々に０．０１％ドデシルマルトシドを３μｌ／ウェル添加し、混合してプレートを１５分間インキュベートした。次に、ＰＥＩを１２μｌ／ウェル（使用する細胞、生体高分子により、濃度・種類が異なる）で添加し、混合後に、ＨＢＳＳを２５μｌ／ウェル添加し、混合した。そのプレートを３０００ｒｐｍ、３０分間、４℃で遠心分離機にかけ、さらに、４℃、オーバーナイトでインキュベートした。【０１３５】  トランスフェクションのために、６．７×１０４細胞／ｍｌのＢＡＣＥ細胞溶液を調製し、９６オートディスペンサーマシンを用いて、上記で調製した核酸を含むベクターを添加したプレートに１×１０４細胞（１５０μｌ）を添加し、１０００ｒｐｍで３０分間、３２℃で２回遠心分離機にかけた。細胞を、１０％ＦＢＳを補充した培地を用い、３４℃、５０時間で培養した。ルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて検出し、そして蛍光強度をイメージリーダーＡＲＶＯｍｘ（Ｗａｌｌａｃ）で検出した。その結果を図８、および図９に示す。【０１３６】  図８に示されるように、今回使用した全���のＰＥＩにおいてＰＳを用いた場合よりも細胞に対するプラスミドＤＮＡの導入効率が向上した。さらに、図９に示されるように、ＰＳを用いた場合には検出可能な遺伝子導入ができなかったＧＢ−１細胞およびＳＫ−ＢＲ−３細胞に対する遺伝子導入も実証された。また、ＰＥＩを用いると、浮遊細胞への遺伝子導入も同様に高効率である。【０１３７】  次に、上記条件において４種類のＰＥＩを用いた遺伝子導入効率を比較した。その結果を図１０に示す。ＰＥＩをＨＶＪ−Ｅと用いる場合、ＢＡＥＣ細胞ではＰＥＩ−Ｌ  ２５Ｋが最も適することが実証された。細胞によって最適なＰＥＩの種類は異なる。ＰＥＩ−Ｌ（直鎖型）を用いた場合、高い導入効率を示すＰＥＩ濃度の幅が広く、ＰＥＩ−Ｂ（分岐型）を用いた場合は高い導入効率を示す濃度範囲の幅が狭かった。他の細胞でも同様の傾向が見られる。【０１３８】  次に、ＰＥＩ  ４種類を用いた細胞毒性を比較した。具体的には、ＢＡＥＣ細胞を７６時間培養した際の、細胞増殖に対する各種ＰＥＩの影響を測定した。その結果、図１１に示されるように、ＨＶＪ−Ｅと用いる場合、ＰＥＩ−Ｌと比較してＰＥＩ−Ｂの方が細胞に対する毒性が強かった。ＰＥＩの分子量が大きくなるに従って細胞毒性が強くなった。ＰＥＩ−ＬもＰＥＩ−Ｂも細胞毒性が表れる限界の濃度付近において最も導入効率が高くなった。このことは他の細胞でも同様の傾向が見られる。【０１３９】  （実施例９：凍結乾燥プロトコール）
様々な物質を細胞に導入することのできるウィルスベクターは、病因の解明、創薬を行う上で非常に有効である。そのため、特に、導入物質を封入したウィルスベクターを長期にわたり保存した後、安定に効率良く細胞に導入する必要がある。長期保存によって、効率を保持する技術が必要となる。そこで、本発明により、以下のように、長期保存による活性保持を達成する。【０１４０】  （凍結乾燥プロトコール）
遺伝子（レポーター遺伝子）等を封入したウィルスベクター（ＨＶＪ−Ｅ）を９６穴プレートの各ウェル中で凍結乾燥し、各条件に従い保存を行った。その後、保存していたプレートの各ウェルに細胞を分注することで、細胞に遺伝子等を導入した。細胞内で発現されたレポーター遺伝子を指標に、凍結乾燥を施したＨＶＪ−Ｅの安定試験をレポーターアッセイ（ルシフェラーゼアッセイ）によって測定した。例示的なプロトコールは、以下のとおりである。
１、ウィルスベクターを蒸留水で懸濁する。
２、自動封入装置（ＡＤＳ３８４（装置名：Ｍｕｌｔｉｓｔａｇｅ  Ｄｉｓｐｅｎｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ＡＤＳ−３８４−８、製造業者：バイオテック株式会社（東京）））にてＤＮＡまたはｓｉＲＮＡ（他に、ＲＮＡ、抗体、ペプチド、機能性タンパク質、糖鎖、脂質、半導体もしくはその複合体）を界面活性剤ドデシルマルトシド（他にトライトンＸ−１００等）と共にウィルスベクター懸濁液をプレート上（プレートコーティングの種類：フィブロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、組織培養処置、ゼラチン、ポリＤリシン、ラミニン、ポリＬオルニチン）で混合する。
３、安定化剤（トレハロース、マルトース、ラフィノース、フルクトース、スクロース、グルコース、ラクトース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、グリシン、マンニトール、ジメチルスルホオキシド（ＤＭＳＯ）またはこれらの混合物からなる群から選択される物質が挙げられるが、これらに限定されない。安定化剤としては、好ましくはトレハロース、マルトース、ラフィノース、フルクトースまたはこれらの混合物が挙げられる。）を添加し、３０００回転で遠心を行う。
４、凍結乾燥プログラムに従い真空凍結乾燥装置（ＦＴＳ社）を用いて凍結乾燥を行う。
５、凍結乾燥済みのプレートを脱酸素剤と乾燥剤（近江化学）と共にポリエチレン製の袋に密封し、さらにアルミパックに密封し、各温度で保存を行う。
６、保存後、レポーターアッセイ（ルシフェラーゼアッセイ（プロメガ社））により活性（ＲＬＵ）をプレートリーダー（パーキンエルマー社）で測定することで評価を行った。【０１４１】  その際、安定化剤の種類と濃度、保存温度、保存期間の条件を設定し評価を行った。【０１４２】  （凍結乾燥プレートの作製）
ウェルあたり１４．４ＨＡＵのＨＶＪ−Ｅ、および０．２５μｇのプラスミドを含有する凍結乾燥プレートを、以下の手順で作製した。【０１４３】  １５０００ｇ、１５分間、４℃にてＨＶＪ−Ｅを遠心し、上清を除去した。蒸留水にて懸濁して、ＨＶＪ−Ｅ懸濁液とした。そして、以後の操作を、ＡＤＳ３８４装置を用いて、自動化にて行った。【０１４４】  ＨＶＪ−Ｅ懸濁液（１４．４ＨＡＵ）を９６ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルに、添加した（５μｌ／ウェル）。そして、０．２５μｇのＤＮＡ（０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度で、５μｌ）を含む溶液を添加し、混合した。ドデシルマルトシド（０．０１％を３／１０倍量；本実施例では、３μｌ）を添加し、混合した。次に、硫酸プロタミン（０．１２５ｍｇ／ｍｌ濃度で１２μｌ；本実施例では、１．５μｇ／ウェル）を添加し、混合した。次に、種々の安定化剤を示された濃度で添加し、混合した。本実施例では、実際には、５μｌ添加した。トレハロースの場合には、３％溶液を５μｌ添加して、最終濃度を０．５％とした。真空凍結乾燥装置ＦＴＳ（ＦＴＳ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．３５３８  Ｍａｉｎ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１５８  ＳｔｏｎｅＲｉｄｇｅ，ＮＹ  １２４８４  ＵＳＡ）にて、プレートを凍結乾燥した。【０１４５】  （１．凍結乾燥化による安定性）
安定化剤であるトレハロース（濃度：０．５％）を用いて、ｐＧＬ３プラスミドのＢＨＫ細胞への導入効率を、凍結乾燥しない場合と、凍結乾燥した後とで、比較した。その結果、図１２に示すように、凍結乾燥未処理の標本と凍結乾燥で処理された標本を、ルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ）によって比較すると、凍結乾燥・保存処理によってほとんど劣化してなかった。このことから、凍結乾燥は長期保存の安定性に有効であることが示された。【０１４６】  （２．保存温度と期間についての試験）
２．５μｇのプラスミドｐＧＬ３、１４．４ＨＡＵのＨＶＪ−Ｅ：ＪＰ４９、および０．５％のトレハロースを用い、種々の保存温度および保存期間の後、２．５×１０４個のＢＨＫ細胞への遺伝子導入を行い２４時間、３４℃で培養し、遺伝子導入効率を測定した。保存温度を、−８０度、−２０度、４度、２５度（６０％Ｒｈ）とし、保存期間を１ヶ月、および６ヶ月とした。その結果、図１３に示されるように、６ヶ月間各温度で保存しても、ルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ）が全く劣化しなかった。このことから、凍結乾燥によって保存温度に関わらず長期に渡り安定に保存できることが示された。【０１４７】  （３．安定化剤と保存期間についての試験）
安定化剤の種類として、トレハロース、およびマルトースを用いた。その結果、図１４に示されるように、６ヶ月保存した場合であっても、安定化剤添加していれば十分導入活性を保持していることが実証された。６ヶ月の−２０度保存で０．５％安定剤を用いることで、活性を７０倍以上保持できた。【０１４８】  （４．安定化剤についての試験）
種々の安定化剤（トレハロース、マルトース、ラフィノース、フルクトース）を、種々の濃度（０．０３％から１．５％）で用いて、−２０℃での１ヶ月保存での保存安定性を評価した。その安定化剤についての評価は、凍結乾燥前の標本濃度を０．０３％から１．５％で行った。その結果を、図１５に示す。【０１４９】  それぞれの安定化剤において、０．００１％から３％の濃度が好ましいが、特に以下の濃度が好ましかった。【０１５０】                          濃度（％）
トレハロース              ０．１−０．２５
マルトース                ０．１−０．２５
ラフィノース              ０．０３−０．１３
フルクトース              ０．１−０．５
（５．本発明の安定化によって提供される均一な安定性）
９６ウェル全てに同じ標本を分注したプレートに対し凍結乾燥を行い、細胞に導入し、各プレート内の標本全てに対しグラフを作成し、その結果を図１６に示した。図１６に示されるように、−２０℃での１ヶ月保存であっても、−８０℃での１ヶ月保存であっても、９６ウェルの標本においてほぼ等しいルシフェラーゼ活性を得た。この結果に示されるように、ウェル間における凍結乾燥による差はほとんどなく、創薬や臨床開発に問題なく使用できることが実証された。【０１５１】  （６．ＤＮＡ以外の導入物質例）
ｓｉＲＮＡを用い、凍結乾燥・保存したプレートでの遺伝子導入の活性の保持を検討した。ｓｉＲＮＡ（１０ｐｍｏｌ）を封入したウィルスベクター（１４．４ＨＡＵ）をフィブロネクチンプレート（Ｈｕｍａｎ  Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  Ｃｅｌｌｗａｒｅ  ９６−ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅ（ベクトンデッキンソン社））上で凍結乾燥し、１ヵ月保存後、レポーターアッセイを行った。細胞として、２．５×１０４個のＢＨＫ細胞を用いた。【０１５２】  この実験では、ｓｉＲＮＡ（ｐＧＬ２に対するｓｉＲＮＡ）およびｐＧＬ２（ホタルルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミド、プロメガ社）を用いた。レポーターアッセイは、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用いた。その結果、図１７に示されるように、−２０度〜２５度での保存において発現抑制活性が保持された。図１８は、図１７の実験と同様の条件を用いて、プレート調製直後と−２０℃での１ヶ月保存後の各々について、遺伝子抑制活性をＹ軸に示したグラフである。ｓｉＲＮＡのターゲット遺伝子に対する抑制効果そのものに対して、凍結乾燥による劣化はみられなかった。この結果から、ｓｉＲＮＡを含むＨＶＪ−Ｅを長期保存できることが実証された。【０１５３】  （７．固相化用プレートの種類）
ルシフェラーゼ遺伝子を封入したウィルスベクター（１４．４ＨＡＵ）を各種プレートに凍結乾燥し、レポーターアッセイを行った。プレートとして、コラーゲン処理９６ウェルプレート（ベクトンデッキンソン社製）、フィブロネクチン処理９６ウェルプレート（ベクトンデッキンソン社製）、組織培養処理９６ウェルプレート（ベクトンデッキンソン社製）の３種類を用いた。細胞として、２．５×１０４個のＢＨＫ細胞を用いた。その結果、図１９示されるように、いずれのプレートでもルシフェラーゼ活性が得られた。保存後の活性は、コラーゲン処理９６ウェルプレート、フィブロネクチン処理９６ウェルプレート、組織培養処理９６ウェルプレートの順に高かった。【０１５４】  （実施例１０：凍結乾燥法の応用）
遺伝子を細胞に導入することのできる従来の遺伝子導入剤は、幾つかのステップを踏み、細胞に遺伝子を導入するものであった。さらに、遺伝子を混ぜた遺伝子導入剤は、長期にわたる保存が効かなかった。そのため、長期にわたり保存した後、安定に効率良く簡便に細胞に導入することが可能な遺伝子導入用アレイ・装置の開発が望まれる。本発明はウィルスベクターを固相化したプレート上に所望の遺伝子を滴下し、細胞を播種することで細胞導入を行う、今までには無い画期的な簡単明瞭な操作のみで遺伝導入を行うことを可能にする。【０１５５】  （１．本実施例のプレートの調製および使用）
本実施例のプレートは、好ましくは、以下の手順（Ａ）によって、調製される。このプレートは、好ましくは、以下の手順（Ｂ）のように使用される。また、その評価は、例えば、手順（Ｃ）のように行われる。【０１５６】  （Ａ．プレートの調製）
本実施例のプレートを以下のように調製する。
１、ウィルスベクターを蒸留水で懸濁する。
２、自動封入装置（ＡＤＳ３８４）にて硫酸プロタミンと共にウイルスベクター懸濁液を、プレート上（プレートコーティングの種類：フィブロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、組織培養処理、ゼラチン、ポリＤリシン、ラミニン、ポリＬオルニチンのうちの一つまたは、これらを混合したもの。好ましくは、フィブロネクチン）で混合する。次に、安定化剤（トレハロース、マルトース、ラフィノース、フルクトース、スクロース、グルコース、ラクトース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、グリシン、マンニトール、ジメチルスルホオキシド（ＤＭＳＯ）またはこれらの混合物からなる群から選択される物質が挙げられるが、これらに限定されない。安定化剤としては、好ましくはトレハロース、マルトース、ラフィノース、フルクトースまたはこれらの混合物が挙げられる）を混合する。
３、３０００回転で遠心を行いプレートに固相化を行う。
４、凍結乾燥プログラムに従い真空凍結乾燥装置（ＦＴＳ社）を用いて凍結乾燥を行う。
５、凍結乾燥済みのプレートを脱酸素剤と乾燥剤（近江化学）と共にポリエチレン製の袋に密封し、さらにアルミパックに密封し、各温度で保存を行う。【０１５７】  （Ｂ．プレートの使用方法）
上記のように調製された本発明のプレートを以下のように使用する。
６、保存したプレートに対して、（細胞への遺伝子導入直前に）自動封入装置（ＡＤＳ３８４）にてＤＮＡまたはｓｉＲＮＡ（他に、ＲＮＡ、抗体、ペプチド、機能性タンパク質、糖鎖、脂質、半導体）を各ウェルに滴下し、遺伝子をウィルスベクターに封入したのち、細胞を播種することで、細胞への遺伝子導入を行う。【０１５８】  （Ｃ．遺伝子導入効率の評価）
本発明のプレートを以下のように評価する。
７、レポーターアッセイ（ルシフェラーゼアッセイ（プロメガ社））により活性をプレートリーダー（パーキンエルマー社）で測定することで評価を行う。【０１５９】  （２．本実施例のプレートの調製および使用）
ウェルあたり１４．４ＨＡＵのＨＶＪ−Ｅを含有する凍結乾燥プレートを、以下の手順で作製した。【０１６０】  自動封入装置（ＡＤＳ３８４）を用いて、９６ウェルのマイクロタイタープレートに、１４．４ＨＡＵのＨＶＪ−Ｅを添加し、１５０００ｇ、１５分間、４℃にて遠心し、上清を除去した。蒸留水にて懸濁して、ＨＶＪ−Ｅ懸濁液とした。次に、硫酸プロタミン（０．１２５ｍｇ／ｍｌ濃度で１２μｌ）と共に、ＨＶＪ−Ｅ懸濁液をフィブロネクチンコートしたプレート上で混合した。次に、安定化剤（トレハロース、濃度：０．５％）を、混合した。プレートを、３０００回転、３０分間、４℃にて遠心して、固定化した。真空凍結乾燥装置ＦＴＳにて、プレートを凍結乾燥した。【０１６１】  凍結乾燥したプレート（ＨＶＪ−Ｅを含む）にプラスミドｐＧＬ３−ＣＭＶ（０．０５ｍｇ／ｍＬ）を５μｌ（０．２５）、１０μｌ（０．５）滴下した。また、コントロールとして、ＨＶＪ−Ｅを含まないプレート上のウェルに対して、プラスミドｐＧＬ３−ＣＭＶ（０．０５ｍｇ／ｍＬ）を５μｌ（０．２５）、１０μｌ（０．５）滴下した。その結果を、図２０に示す。横軸はプラスミド量（μｇ）、縦軸はルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ）を示す。【０１６２】  ウィルスベクターが無い場合、遺伝子を滴下してもルシフェラーゼ活性は全くみられないが、ウィルスベクターを固相化した凍結乾燥プレートにプラスミド溶液を滴下した場合、最大で約４０倍のルシフェラーゼ活性が、確認された。このことは、導入される核酸を含まないプレートを保存し、核酸を導入する直前に、ＨＶＪ−Ｅを含む凍結乾燥プレートに核酸溶液を添加するだけで、高効率な遺伝子導入が可能になったことを実証する。本発明によって、プラスミド溶液を加えるだけで行える簡便な遺伝子導入プレートが作製され得る。【０１６３】  上記方法によって作製された遺伝子導入プレートを、実施例１１〜１３に記載される方法に従って遺伝子導入に使用することができる。【０１６４】  （実施例１１：細胞培養用容器の固相の作製）
マイクロウェル（開口部）を備える固相としては、例えば、ガラスおよびプラスチック、ならびに穴あき樹脂でコートしたガラスを用いることができる。マイクロウェルは、プラスチックまたはガラスをコートする樹脂を、金型によって作製する際に、固相に所望の大きさおよび深さを有するマイクロウェルを形成することによって作製した。本実施例で用いた固相の大きさは、２５．４×７６．２ｍｍ、厚さ１ｍｍであった。また、マイクロウェルの深さは、５０μｍであった。直径０．４ｍｍのウェルを０．１ｍｍ間隔で作製し、スポットしやすいようにした。スライド１枚あたり３０００〜５０００のウェルを作製した。【０１６５】  （実施例１２：マイクロウェルへのサンプルの注入）
予備実験として、ＬｕｃｉｄｅａＡｒｒａｙ  Ｓｐｏｔｔｅｒ高集積アレイスポッター（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて、Ｃｙ３色素で標識したオリゴヌクレオチド（Ｃｙ３／ｏｌｉｇ−５０％ＤＭＳＯ  Ｓｐｏｔｔｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（カタログ＃０３６５−９１５）アマシャムバイオサイエンス社製）を、０．５ｍｍ間隔でスポットし、アレイスキャナで導入されたＣｙ５を検出した。その結果、全ての分注が、所定のマイクロウェルに対して行われていたことが確認された。【０１６６】  （実施例１３：本願発明の細胞培養用容器内での、遺伝子導入、細胞培養、および細胞解析）
上記の結果に基づき、多数のマイクロウェルを有する固相における遺伝子導入およびその解析を行った。【０１６７】  （アレイのスポッティング）
分注装置としては、ＡＤＳ−３８４（自動分注装置バイオテック製）を９６ウェルのタイタープレートに用いて、実施例３で調製したＨＶＪ−ＥベクターへのｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）の封入を以下のように行った。【０１６８】  ４２０８ＨＡＵのＨＶＪ−Ｅを、１５０００×ｇ、１５分、４℃で遠心し、上清を除いた後、１６７．８μｌの２ｍｇ／ｍｌｐＥＧＦＰ−Ｃ１を添加し、ベクターともに懸濁した。４．０５ｍｌのＰＢＳ（−）を添加し、１６．７μｌのｐＥＧＦＰ−Ｃ１／ＨＶＪ−Ｅ／ＰＢＳを、９６自動分注装置（ＡＤＳ−３８４，Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて、９６ウェルの各々に分注した（ＨＶＪ−Ｅ：１６．７ＨＡＵ／ウェル、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１：１．３３μｇ／ウェル）、５μｌ／ウェルの量で０．０１％ドデシルマルトシドを添加した。この混合物を、１５分間インキュベートし、次に２２．３μｌ／ウェルのＰＢＳ（−）および６．０μｌ／ウェルの１ｍｇ／ｍｌ硫酸プロタミン／ＰＢＳ（−）を添加した。プレートに９６ヘッドを備えた自動分注装置（ＡＤＳ−３８４，Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で、９６ウェルプレートから３８４ウェルプレートに溶液を分注した。Ｌｕｃｉｄｅａａｒｒａｙ  ｓｐｏｔｔｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて、ＨＶＪ−Ｅベクターを、３８４ウェルプレートから３０７２ウェルを有するスライドのマイクロウェルの底部に１００ｐｌ／ウェルずつ分注した。分注は、湿度６５％の環境下で、０．５ｍｍ間隔で行った。【０１６９】  （マイクロウェルスライドを用いるアレイでのトランスフェクション）
２５．４ｍｍ×７６．２ｍｍ、１ｍｍ厚のスライドガラス上に実施例１１のように、３０７２個のマイクロウェルを、５０μｍの深さで作製した（８×１６個のウェルのクラスターを２４個）。Ｌｕｃｉｄｅａアレイスポッターを用いた。ＨＶＪ−Ｅ／プラスミド混合物をスポッティングした後。培養培地を含む細胞懸濁液を、マイクロウェルに分注し、トランスフェクションした。マイクロウェルをサイクロポア膜（Ｗｈａｔｍａｎ，７６ｍｍ  ｘ  ２５ｍｍ）で覆い、細胞培養中の交差夾雑を防いだ。ゲルマトリクスを含むゲル化培地、カバーガラス（松浪、６０ｍｍ×２４ｍｍ）をさらに膜に重ね、膜が動かないようにした。ゲル化培地は、ＩＡ型コラーゲン（ニッタゼラチン）または０．８％アガロースゲルを用いて調製した（図６）。【０１７０】  （トランスフェクション）
トランスフェクションのために、１０〜１００／ウェル程度の細胞（細胞種によって異なる）を、ＨＶＪ−Ｅベクターをスポッティングしたマイクロウェルに添加し、サイクロポア膜およびゲル化培地で覆った。細胞培養容器を培養培地を含む培養皿に配置した。細胞を２４−４８時間、３４℃、５％ＣＯ２存在下（加湿）で培養した。細胞を、蛍光顕微鏡で観察して、遺伝子導入および発現を確認した（ＩＸ７１−２２ＦＬ／ＰＨ，ＯＬＹＭＰＵＳ）。その結果を図７に示す。図７の左の図は、１５１２個のウェルを有する固相の写真である。その各ウェル内には、ＨＶＪ−Ｅベクターがスポッティングされている。図の右側は、左側に示した固相の１ウェルを拡大した写真である。右側上段は、可視光線にて観察した細胞の写真である。光って見える部分は、固相開口部の底部に付着した細胞である。右側下段は、細胞を蛍光観察した写真である。光って見える細胞は、ＨＶＪ−Ｅベクターに封入されたＧＦＰ発現ベクターから発現されたＧＦＰに由来する蛍光である。図７に示された結果は、限界膜遮断したマイクロウェル内において、細胞がトランスフェクションされ、そして外来遺伝子を発現したことが示されている。【０１７１】  （実施例１４：複数種類の細胞の培養）
上記実施例で示した結果は、単一の種類の細胞を用いた結果である。本発明は、単一種類の細胞に限定されることはなく、複数種類の細胞にも適用可能である。例えば、細胞を傷つけることなく分注する分注装置を用い、所望の種類の細胞を、固相上の所望のウェル（開口部）に分注し、そして、さらに別の種類の細胞を、固相上の所望のウェルに分注することによって、複数種類の細胞に適用することが可能である。【０１７２】  以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１７３】  本発明は、多数種類の細胞培養を同時にすることが可能な細胞培養用容器を提供する。この細胞培養用容器は、遺伝子導入、細胞レベルでの導入遺伝子の解析に用いることができる。また、本発明の容器によって、遺伝子のみならず、多種類の所望の物質（例えば、ペプチド、化合物、ヌクレオチドフラグメントなど）の各々を異なる細胞集団へ導入し、そして各細胞集団を培養・解析する技術も提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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