(57)【要約】本発明は、土壌などの試料中から安価かつ効率的に腐植を除去することによって核酸を抽出する方法を提供することを目的としている。本発明の核酸抽出方法は、腐植と核酸とを少なくとも含む試料から核酸を抽出する核酸抽出方法である。この核酸抽出方法は、腐植と核酸とを少なくとも含む試料を、マグネシウム塩を含む水溶液と混合する混合工程と、上記混合工程によって生じた腐植を含む沈殿を除去して核酸を抽出する除去工程とを含んでいる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腐植と核酸とを少なくとも含む試料から核酸を抽出する核酸抽出方法であって、
上記試料を、マグネシウム塩を含む水溶液と混合する混合工程と、
上記混合工程によって生じた腐植を含む沈殿を除去して核酸を抽出する除去工程と、を含んでなることを特徴とする核酸抽出方法。
【請求項２】
上記マグネシウム塩は、塩化マグネシウム、または硫酸マグネシウムの何れかであることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項３】
上記水溶液におけるマグネシウム塩の濃度は、約０．５〜約１．０ｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項４】
上記除去工程の後に、塩化リチウム溶液を上記試料に添加する添加工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項５】
腐植と核酸とを少なくとも含む試料から核酸を抽出するために用いられる核酸抽出剤であって、
マグネシウム塩を少なくとも含むことを特徴とする核酸抽出剤。
【請求項６】
腐植と核酸とを少なくとも含む試料から核酸を抽出するために用いられる核酸抽出用キットであって、
マグネシウム塩およびＣＴＡＢを少なくとも含むことを特徴とする核酸抽出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、土壌などの腐植を含む試料から腐植を取り除いて、試料中に存在するＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸を抽出する方法、および、上記試料から核酸を抽出するために用いられる核酸抽出剤、並びに核酸抽出用キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】  土壌中には主に微生物に由来する核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）が存在している。土壌中の微生物の動態を解析するためには、土壌から直接核酸を抽出し精製を行う必要があるものの、多くの土壌には植物の組織に由来する有機成分である腐植が存在している。この腐植は単一の化合物ではなく、種々の高分子弱酸（フミン酸、フルボ酸）を含んだ不均一な混合物である。【０００３】  この腐植は核酸と強固に結合しているため、抽出操作で完全に除去することが困難である。残存する腐植は、これらの核酸を用いたその後の解析において、酵素反応、ハイブリダイゼーション反応などに悪影響を与えるなどして、解析の妨害物質として働く。そこで、この土壌中から核酸を抽出する際には、土壌中に含まれる腐植を取り除くことが多くの研究者の課題となっている。【０００４】  この腐植を除く技術としては、例えば、特許文献１、特許文献２、非特許文献１、および非特許文献２に開示されているものが挙げられる。【０００５】  特許文献１に記載のＤＮＡ調製物の精製方法は、腐植を含むＤＮＡ調製物をジチオカルバミン酸塩と水性液相で接触させて不溶物を除去するという方法である。【０００６】  特許文献２に記載のＤＮＡの抽出方法は、腐植酸を含む環境中に存在する微生物由来のＤＮＡの抽出方法である。この方法では、水溶液中で微生物を破壊する場合に、水溶性の腐植酸吸着剤を添加することを特徴としている。そして、上記水溶性の腐植酸吸着剤は、好ましくは、ポリビニルピロリドン（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ｐｙｒｏｌｌｉｄｏｎｅ、以下「ＰＶＰＰ」と表記する）である。【０００７】  非特許文献１には、ＣＴＡＢ（ｈｅｘａｄｏｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）を主体とする抽出バッファーを用いて、土壌からビードビーター（ｂｅａｄ  ｂｅａｔｅｒ：Ｂｉｏ  １０１／Ｓａｖａｎｔ，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，Ｎ．Ｙ．）を用いて微生物の核酸を抽出する手法が記載されている。【０００８】  非特許文献２には、土壌からＤＮＡおよびＲＮＡを抽出する方法であって、抽出を行う前にＲＮＡ安定化剤としてＧｕａｎｉｄｉｎｅ  ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅを主体とする溶液を加え、その後、凍結融解法によって菌体を破壊して、ＣＴＡＢとＳＤＳとを主体とする抽出溶液で核酸を抽出するという方法が記載されている。【０００９】  〔特許文献１〕
特開平７−２４１１９３号公報（公開日：平成７年（１９９５年）９月１９日）
〔特許文献２〕
特開２００１−１７１６８号公報（公開日：平成１３年（２００１年）１月２３日）
〔非特許文献１〕
Ｂｕｒｇｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｒ．２００３，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９，１９２８−１９３５，“ｍＲＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｉｆＨ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ  ｉｎ  ｓｏｉｌ”
〔非特許文献２〕
Ｈｕｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｃｔ．２００１，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７，４４９５−４５０３，“Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  Ｓｏｉｌｓ  ａｎｄ  Ｓｅｄｉｍｅｎｔｓ”
以上のように、核酸を含む土壌などの試料から腐植を取り除く方法に関しては、これまでに多くの研究者によって研究されてきているが、簡便に効率よく腐植を除去する手法はいまだ開発されていないのが現状である。【００１０】  特に、本願発明者らが、上記非特許文献１および２に記載の手順に従って実験を行ったところ、手順が煩雑である上、腐植が多い土壌の場合には腐植を充分に除去することができず、核酸をうまく抽出できないという問題点が生じた。【００１１】  また、これまでに提案されているその他の手法として、ＰＶＰＰをゲル中に混在させてこれに吸着させて、電気泳動を行った後に核酸のバンドのみ切り出す手法、および既存の土壌核酸精製キット（例えば、Ｂｉｏ１０１  Ｓｏｉｌ  ＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑ−ＢＩＯｇｅｎｅ社製）、Ｂｉｏ１０１  Ｓｏｉｌ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑ−ＢＩＯｇｅｎｅ社製）、ＳｏｉｌＭａｓｔｅｒ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社製）など）を用いて精製する手法などが存在する。しかし、前者は操作が煩雑であり、精製度も低いという問題点を有しており、後者は高価であるという問題点を有している。【００１２】  本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであって、その目的は、土壌などの試料中から安価かつ効率的に腐植を除去することによって核酸を抽出する方法を提供することにある。
【発明の開示】
【００１３】  本願発明者らは、上記の課題について鋭意検討した結果、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウムなどのマグネシウム塩の水溶液を、精製対象となる核酸を含む試料に添加すると、核酸は水溶液中に溶解させた状態で、夾雑物として試料中に混入している腐植を効率的よく沈殿させることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】  すなわち、本発明にかかる核酸抽出方法は、腐植と核酸とを少なくとも含む試料から核酸を抽出する核酸抽出方法であって、上記試料を、マグネシウム塩を含む水溶液と混合する混合工程と、上記混合工程によって生じた腐植を含む沈殿を除去して核酸を抽出する除去工程と、を含んでなることを特徴としている。
【００１５】  上記の核酸抽出方法によれば、腐植と核酸とを含む試料を、マグネシウム塩を含む水溶液と混合することによって、抽出したい核酸については水溶液中に溶解させた状態とし、除去したい腐植については効率よく沈殿させることができる。したがって、上記の方法によれば、煩雑な操作を必要とせず、安価かつ効率的に腐植を除去して核酸を精製することができる。
【００１６】  本発明の核酸抽出方法において、上記マグネシウム塩は、塩化マグネシウム、または硫酸マグネシウムの何れかであることが好ましい。
【００１７】  上記マグネシウム塩が、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウムの何れかであれば、混合工程において、除去したい腐植を効率よく沈殿させることができる。
【００１８】  本発明の核酸抽出方法において、上記水溶液におけるマグネシウム塩の濃度は、約０．５〜約１．０ｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。
【００１９】  マグネシウム塩の濃度が、０．５ｍｏｌ／Ｌより低いと腐植の除去効率が低下する。一方、マグネシウム塩の濃度が、１．０ｍｏｌ／Ｌより高いと核酸の回収率が低下する。したがって、マグネシウム塩の濃度は、０．５〜１．０ｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。なお、「約０．５ｍｏｌ／Ｌ」とは、四捨五入によって０．５ｍｏｌ／Ｌとなる濃度のことを意味する。また「約１．０ｍｏｌ／Ｌ」についても同様に、四捨五入によって１．０ｍｏｌ／Ｌとなる濃度のことを意味する。
【００２０】  本発明の核酸抽出方法は、上記混合工程の前に、上記試料にＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液を添加して試料中に含まれる核酸を沈殿させる沈殿工程をさらに含んでもよい。
【００２１】  上記のように、マグネシウム塩を含む水溶液を用いて腐植を沈殿させる前段階で、試料にＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液を添加することによって、腐植は溶液中に溶解した状態で核酸を効率よく沈殿させることができる。それゆえ、上記沈殿工程によって、試料中の核酸を沈殿させ、この沈殿を取得した後、再度この核酸を含む沈殿を溶液中に溶解させ、マグネシウム塩と混合する混合工程を実施することによって、より効率的に試料中から腐植を除去することができる。
【００２２】  ここで、上記「ＰＥＧ」とは、ポリエチレングリコールのことを意味する。また、ＰＥＧ／ＮａＣｌとは、より具体的には、２０％（ｗ／ｖ）ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌｅ  ６０００，２．５Ｍ  ＮａＣｌのことを意味する。
【００２３】  本発明の核酸抽出方法は、上記沈殿工程の前に、上記試料にＣＴＡＢを添加するＣＴＡＢ添加工程をさらに含んでもよい。
【００２４】  ここで、「ＣＴＡＢ」とは、ｈｅｘａｄｏｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅあるいはｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄのことを意味する。ＣＴＡＢは、陽イオン変性剤であり、低イオン溶液中で核酸と酸性の多糖を沈殿させ、タンパク質と中性多糖を溶液中に残す。その一方で、ＣＴＡＢは、高イオン濃度下では、タンパク質と大部分の酸性多糖とともに複合体を形成し、核酸を溶液中に残す。このような性質を有することから、ＣＴＡＢは多糖類などの夾雑物を多く含む組織から核酸を抽出するために利用される。
【００２５】  そのため、上記のように、核酸抽出の最初の段階で、ＣＴＡＢを添加することによって、試料中から効率的に核酸を抽出することができるという効果が得られる。
【００２６】  本発明の核酸抽出方法は、上記除去工程の後に、塩化リチウム溶液を上記試料に添加する添加工程をさらに含むことが好ましい。
【００２７】  上記のように、除去工程後の核酸を含む試料に塩化リチウム溶液を添加することによって、上記除去工程の後にさらに核酸中に混在する腐植を上澄み液に残し、核酸のみを効率よく沈殿させることができる。そして、この沈殿を従来公知の手法を用いて採取すれば、核酸の精製度をより高めることができる。
【００２８】  また、本発明にかかる核酸抽出剤は、上記課題を解決するために、腐植と核酸とを少なくとも含む試料から核酸を抽出するために用いられる核酸抽出剤であって、マグネシウム塩を少なくとも含むことを特徴としている。
【００２９】  本発明の核酸抽出剤を水溶液の状態にし、この水溶液を腐植と核酸とを含む試料に混合させることによって、抽出したい核酸については水溶液中に溶解させた状態とし、除去したい腐植については効率よく沈殿させることができる。そして、この沈殿を除去することによって、精製度の高い核酸を得ることができる。
【００３０】  また、本発明にかかる核酸抽出用キットは、上記課題を解決するために、腐植と核酸とを少なくとも含む試料から核酸を抽出するために用いられる核酸抽出用キットであって、マグネシウム塩およびＣＴＡＢを少なくとも含むことを特徴としている。
【００３１】  本発明にかかる核酸抽出用キットは、マグネシウム塩およびＣＴＡＢを少なくとも含むものであればよい。その他の具体的な構成については特に限定されるものではなく、必要な試薬や器具等を適宜選択してキットの構成とすればよい。当該核酸抽出用キットを用いることにより、簡便かつ効率的に試料から腐植を除去して核酸を抽出することができる。
【００３２】  本発明にかかる核酸抽出方法は、以上のように、試料を、マグネシウム塩を含む水溶液と混合する混合工程と、上記混合工程によって生じた腐植を含む沈殿を除去して核酸を抽出する除去工程と、を含んでなるものである。
【００３３】  それゆえ、本発明の核酸抽出方法によれば、腐植と核酸とを含む試料を、マグネシウム塩を含む水溶液と混合することによって、抽出したい核酸については水溶液中に溶解させた状態とし、除去したい腐植については効率よく沈殿させることができる。したがって、上記の方法によれば、煩雑な操作を必要とせず、安価かつ効率的に腐植を除去して核酸を精製することができるという効果を奏する。
【００３４】  本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、次の説明で明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本実施例において、土壌から核酸の抽出操作を行って得られた試料について、電気泳動を行った結果を示すアガロースゲルの模式図である。
【図２】本実施例において、土壌から核酸の抽出操作を行って得られた試料についてアガロースゲル電気泳動を行った後に、当該アガロースゲルをＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉで染色した結果を示す模式図である。
【図３】本実施例においてマグネシウム塩を試薬として核酸抽出を行った結果と、比較のために他の金属塩溶液を試薬として用いて核酸抽出を行った場合の結果とを示す表である。
【図４】本実施例において、土壌から取得されたＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ−ＤＧＧＥを行った結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】  以下、本発明についてより具体的に説明するが、本発明はこの記載に限定されるものではない。【００３７】  本発明にかかる核酸抽出方法は、腐植と核酸とを少なくとも含む土壌などの試料から核酸を抽出する核酸抽出方法であって、上記試料を、マグネシウム塩を含む水溶液に添加して混合する混合工程と、この混合工程によって生じた沈殿を除去して核酸を抽出する除去工程とを、少なくとも含んでいる。【００３８】  このように、本発明では、マグネシウム塩を含む水溶液中に核酸と腐植とを含む試料を添加し、混合することによって、抽出目的となる核酸については水溶液中に溶解させた状態とし、除去したい腐植については効率よく沈殿させることができる。したがって、腐植を多量に含んでいる土壌、河川沈殿物、汚泥、胃腸内内容物、糞便などを試料として、当該試料から核酸を効率よく抽出することができる。上記試料から、腐植を除去することによって、その後に行われる核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）の解析を円滑に行うことができる。【００３９】  ここで、「腐植」とは、土壌中に存在する有機物、特に、暗褐色を呈する有機物のことを指す。英名は、“Ｈｕｍｉｃ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ”である。腐植を構成する物質は、腐植酸、フルボ酸、ヒューミンなどであり、これら各化合物が混合して腐植を構成している。これらの各化合物は、土壌中に存在する生物遺体の分解物、および、土壌中に存在する微生物の再合成産物、すなわち、タンパク質、炭水化物、これらの誘導体、脂質、リグニンおよびこれらの分解生成物に由来するものである。【００４０】  そして本発明の核酸抽出方法では、上記マグネシウム塩としては、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、または硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）の何れかを使用することが好ましい。これによれば、後述の実施例にも示すように、土壌などの試料から腐植を効率よく除去することができる。また、上記マグネシウム塩として、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、または硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）の何れかを使用すれば、特に腐植の含有割合の多い試料の場合でも、核酸の精製度を高めることができるため、その後に行われる核酸の解析に支障をきたすことがない。さらに、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、および硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）は、抽出された核酸のその後の酵素反応、ハイブリダイゼーション反応などに悪影響を与えないという利点も有している。【００４１】  なお、本発明では、上記マグネシウム塩として、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）の何れかを使用することが好ましいが、必ずしもこれに限定されることはなく、他のマグネシウム塩を用いることもできる。また、マグネシウム塩の範疇に含まれる複数の化合物を混合して用いてもよい。【００４２】  また、本発明の核酸抽出方法において、マグネシウム塩の濃度は、約０．５〜約１．０Ｍ（換言すれば、約０．５〜約１．０ｍｏｌ／Ｌ）であることが好ましい。塩化マグネシウムの濃度は、０．５Ｍよりも低濃度であると腐植の除去効率が低下し、１．０Ｍよりも高濃度であると核酸の回収率が低下する。なお本明細書において「〜」は「以上、以下」を意味し、例えば「★★〜☆☆」は「★★以上、☆☆以��」を意味する。【００４３】  また上記マグネシウム塩の添加量は、試料溶液１に対して体積比で０．１〜２．０ｖｏｌｕｍｅであることが好ましく、１ｖｏｌｕｍｅであることが最も好ましい。上記好ましい範囲未満であると腐植の除去効率が低下し、上記好ましい範囲を超えると核酸の回収率が低下する。なお、以下、適宜「ｖｏｌｕｍｅ」を「ｖｏｌ」と表記する。【００４４】  また、本発明の核酸抽出工程において、上記混合工程の前に、上記試料にＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液を添加して試料中に含まれる核酸を沈殿させる沈殿工程をさらに含んでもよい。このように、マグネシウム塩を含む水溶液を用いて腐植を沈殿させる前段階で、試料にＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液を添加することによって、腐植は溶液中に溶解した状態で核酸を効率よく沈殿させることができる。上記ＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液の添加は、上記の効果を得ることができる添加量および添加方法であれば特に限定されるものではないが、例えば、２０ＭのＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液を添加する場合、試料溶液１に対して体積比で０．９〜１．２ｖｏｌを添加することが好ましく、１．０６２５ｖｏｌを添加することが最も好ましい。上記好ましい範囲未満であると腐植の除去効率が低下し、上記好ましい範囲を超えると核酸の回収率が低下する。【００４５】  さらに、上記沈殿工程の前に、上記試料にＣＴＡＢを添加するＣＴＡＢ添加工程をさらに含んでもよい。核酸抽出の最初の段階で、ＣＴＡＢを添加することによって、試料中に含まれる多糖類などの夾雑物の除去を促進するという効果が得られる。上記ＣＴＡＢの添加は、上記の効果を得ることができる添加量および添加方法であれば特に限定されるものではないが、例えば０．０２％（ｗ／ｖ）のＣＴＡＢ溶液を添加する場合、試料０．５ｇに対して比重を１とした場合に０．２５〜２．５ｖｏｌを添加することが好ましく、０．５から２ｖｏｌを添加することがさらに好ましく、１．２５ｖｏｌを添加することが最も好ましい。上記好ましい範囲未満であると試料中に含まれる多糖類などの夾雑物の除去効率が低下し、上記好ましい範囲を超えると核酸の回収率が低下する。【００４６】  また、本発明の核酸抽出方法において、上記除去工程の後に、塩化リチウム溶液を上記試料に添加する添加工程をさらに含むことが好ましい。上記のように、除去工程後の核酸を含む試料に塩化リチウム溶液を添加することによって、上記除去工程の後にさらに核酸中に混在する腐植を上澄み液に残し、核酸のみを効率よく沈殿させることができる。上記塩化リチウムの添加は、上記の効果を得ることができる添加量および添加方法であれば特に限定されるものではないが、例えば、１０Ｍの塩化リチウムを添加する場合、試料溶液１に対して体積比で１ｖｏｌを添加することが最も好ましい。上記好ましい範囲未満であると試料中に含まれる多糖類などの夾雑物の除去効率が低下し、上記好ましい範囲を超えると核酸の回収率が低下する。【００４７】  なお、本発明にかかる核酸抽出方法において、マグネシウム塩を含む水溶液を用いて試料中の腐植を沈殿させるという手法以外の核酸抽出の手順については、従来公知の核酸抽出の手順に準じて行うこともできる。この従来公知の方法としては、例えば、非特許文���１、非特許文献２に記載の手順を用いることができる。また、これら２つの文献に記載の手法を組み合わせて実施することもできる。【００４８】  本発明にかかる核酸抽出方法では、例えば、その他の試薬としてＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを添加する事によって、核酸（ＲＮＡ）の精製度を高めることもできる。このＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを添加するタイミングは、ＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液を添加することによって生じた沈殿を溶解した後である。【００４９】  また、本発明の核酸抽出方法において、精製対象となる核酸（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）は、土壌などの腐植物質中に存在する微生物のみならず、他の生物、例えば植物、動物由来のＤＮＡ、ＲＮＡであってもよい。【００５０】  また、上記試料としては、腐植と核酸とが少なくとも含まれている可能性があるものであれば特に限定されることはなく、環境中に存在する種々の液状物・固形物を試料とすることができる。上記試料としては、例えば、土壌、河川沈殿物、汚泥、胃腸内内容物、糞便などが挙げられる。【００５１】  また、本発明にかかる核酸抽出剤は、腐植と核酸とを少なくとも含む試料から核酸を抽出するために用いられる核酸抽出剤であって、マグネシウム塩を少なくとも含むものである。上記核酸抽出剤は、既述した本発明の核酸抽出法の実施に利用される。【００５２】  この核酸抽出剤は、例えば、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４などのマグネシウム塩を含む水溶液であってもよい。そして、上記水溶液中におけるマグネシウム塩の濃度は、約０．５〜約１．０Ｍであることが好ましい。【００５３】  また、本発明にかかる核酸抽出用キットは、マグネシウム塩およびＣＴＡＢを少なくとも含み、核酸抽出の手順ごとに上記各試薬が計量されて小分けされるなどしてキット化されたものである。上記核酸抽出用キットに含まれるマグネシウム塩は、特にＭｇＣｌ２溶液であることが好ましい。【００５４】  また、本発明にかかる核酸抽出用キットに含まれる具体的な試薬としては、例えば、Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＤＴＴ、ＣＴＡＢ、ＮａＯＡｃ含有）、ＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液、ＭｇＣｌ２溶液、ＤＮａｓｅ溶液などが挙げられる。本発明の核酸抽出用キットを用いることにより、簡便かつ効率的に試料から腐植を除去して核酸を抽出することができる。上記核酸抽出キットは、既述した本発明の核酸抽出法の実施に利用される。【００５５】  本発明によれば、土壌などから微生物由来の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）を抽出し、これらを解析することができる。ここで「解析」とは、ＤＮＡの場合はＰＣＲ、ＰＣＲ−ＤＧＧＥ、制限酵素処理、クローンライブラリーの作製などのことである。また、ＲＮＡの場合はＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ−ＤＧＧＥ、クローンライブラリーの作製、マイクロアレイを用いた試験に利用が可能である。また、腐植を核酸から除去する手法を利用して、土壌由来のＤＮＡ、ＲＮＡのＦＩＳＨ解析への応用も可能である。【００５６】  また、本発明の核酸抽出剤を実際に利用する場合には、後述の実施例に記載の通り、土壌からの核酸抽出方法における一連の操作の中で当該核酸抽出剤を使用することが望ましい。また上記核酸抽出剤は、核酸抽出キットを構成する１つのアイテム���して利用される。【００５７】  また、本発明の核酸抽出方法を利用した腐植の除去方法は、土壌中の様々な化合物を分析する場合にも有効であり、例えば土壌中に含まれるタンパク質（あるいはこれに準じたペプチド）の分析にも応用が可能である。【００５８】  本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００５９】  以下に、本発明の実施例について説明する。【００６０】  〔実施例１〕
実施例１では、下記の試薬を用いて、下記の手順によって土壌試料中からＤＮＡ、ＲＮＡの抽出を行った。なお、この実施例で用いた操作手順は、非特許文献１に準じたものである。【００６１】  まず、以下に示す試薬を用意した。なお、上記核酸抽出用キットあるいは上記土壌核酸精製キットには、これらの試薬が含まれていることが好ましい。【００６２】  ＜用意する試薬＞
・１０％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢ（Ｈ２Ｏ  １７ｍｌ＋２ｇ  ＣＴＡＢ，ｍｅｓｓ  ｕｐ  ２０ｍｌ、すなわち１０％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢは、２ｇ  ＣＴＡＢを１７ｍｌ  ＭｉｌｌｉＱ  ｇｒａｄｅ  ＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｈ２Ｏ（あるいは、ＤＥＰＣ処理済みＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｈ２Ｏ）に溶解し２０ｍｌにメスアップして調製された。なお本実施例で使用したＣＴＡＢの製造元は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社である。）
・Ａ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：０．２Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ（７１．６３ｇ／Ｌ）
・Ｂ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：０．２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ（３１．２１ｇ／Ｌ）
・１Ｍ  １，４−ｄｉｔｈｉｏ−ＤＬ−ｔｈｒｅｉｔｏｌ（以下「ＤＴＴ」と表記する）
・５Ｍ  ＮａＣｌ
・０．５Ｍ  ＥＤＴＡ
・２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ／２．５Ｍ  ＮａＣｌ（２０ｇ  ＰＥＧ  ６０００  ｉｎ  ２．５Ｍ  ＮａＣｌ  １００ｍｌ、すなわち２０％  ＰＥＧ／２．５Ｍ  ＮａＣｌは、２０ｇＰＥＧ  ６０００を２．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液  １００ｍｌに溶解して調製された。以下「ＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液」と表記する）
・ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅＩ
・３Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５）（８１．６２ｇ  ＮａＯＡｃ・３Ｈ２Ｏ，１００ｍｌ  Ｈ２Ｏ，ａｄｊｕｓｔ  ｐＨ  ｗｉｔｈ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ，ｍｅｓｓ  ｕｐ  ２００ｍｌ  ｂｙ  Ｈ２Ｏ．、すなわち３Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５）は、８１．６２ｇ  ＮａＯＡｃ・３Ｈ２Ｏを１００ｍｌのＨ２Ｏに溶解し、酢酸（ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）でｐＨを４．５に調整し、２００ｍｌにＨ２Ｏでメスアップして調製された）
・Ｐｈｅｎｏｌ（ｐＨ４．５）（５００ｇ  ＰｈｅｎｏｌをＨ２Ｏ  ３００ｍｌに溶解して調製された）
・Ｐｈｅｎｏｌ（ｐＨ４．５）／ＴＥ（ｐＨ８．０）
・Ｃｈｌ／ｉｓｏ（Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ：Ｉｓｏａｍｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ＝２４ｖ：１ｖ）
・１．０Ｍ  ＭｇＣｌ２
・Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  １０ｍｇ／ｍｌ
続いて、Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  １を作製した。作製方法は以下の通りである。
（１）Ａ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ４７．３５ｍｌ
（２）Ｂ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ２．６５ｍｌ
（３）１Ｍ  ＤＴＴ  １００μｌ
（４）５Ｍ  ＮａＣｌ  ２ｍｌ
（５）１０％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢ  ２００μｌ
上記（１）〜（５）の試薬を混合し、ＭｉｌｌｉＱ  ｇｒａｄｅ  ＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｈ２Ｏ（あるいは、ＤＥＰＣ処理済みＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｈ２Ｏ）で１００ｍｌにメスアップした。なお、ＭｉｌｌｉＱ  ｇｒａｄｅ  ＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｈ２Ｏは、ＭｉｌｌｉＱ（Ｗａｔｅｒ社製の純水製造装置）で作製された高精度純水のことを意味する。また、ＤＥＰＣ処理済みＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｈ２Ｏは、脱塩水に０．１％（ｖ／ｖ）になるようにＤｉｅｔｈｙｌ  Ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅを加え、室温で１２時間以上放置し、オートクレーブ（１２１℃、３０分以上）処理することによって作製されたものである。【００６３】  続いて、ＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを作製した。作製方法は以下の通りである。
（ｉ）１Ｍ  ＤＴＴ  １００μｌ
（ｉｉ）１０％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢ  ６００μｌ
（ｉｉｉ）３Ｍ  ＮａＯＡＣ（ｐＨ４．５）１６６７μｌ
上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の試薬を混合し、ＭｉｌｌｉＱ  ｇｒａｄｅ  ＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｈ２Ｏ（あるいは、ＤＥＰＣ処理済みＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｈ２Ｏ）で１００ｍｌにメスアップした。【００６４】  次に、下記の（１−１）〜（１−１７）の手順で操作を行った。
（１−１）：Ｓｉｌｉｃａ  ｂｅａｄｓ（０．１ｍｍ  直径）０．７５ｇを２ｍｌ容  遠心チューブに入れる。
（１−２）：０．５ｇ  Ｓｏｉｌを２ｍｌ容  遠心チューブに入れる。
（１−３）：ｂｅａｄ  ｂｅａｔｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ  ＭＭ  ３００）のプレートを３７℃であらかじめ温めておく。
（１−４）：１．２５ｍｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  １を（１−２）記載の２ｍｌ容  遠心チューブに加える。
（１−５）：ｂｅａｄ  ｂｅａｔｅｒの設定を４５ｓｅｃ，２５ｓ−１とする。
（１−６）：（１−４）記載の試料をｂｅａｄ  ｂｅａｔｅｒで処理後、１７，４００×ｇで５分間遠心分離を行う。
（１−７）：（１−６）記載の遠心分離により得られた上澄み液を７５０μｌ取り、別の２ｍｌ容  遠心チューブに移す。
（１−８）：（１−７）記載の遠心チューブに、６５６μｌ  ｐｈｅｎｏｌ／ＴＥと６５６μｌ  Ｃｈｌ／ｉｓｏとを加え、よく転倒混和する。
（１−９）：（１−８）の処理後の遠心チューブを、１７，４００×ｇ５分間で遠心分離を行う。
（１−１０）：（１−９）記載の遠心分離により得られた上澄み液７５０μｌを、別の２ｍｌ容  遠心チューブに移す。
（１−１１）：（１−１０）記載の遠心チューブへ、１３１２μｌ  Ｃｈｌ／ｉｓｏを加え、よく転倒混和する。
（１−１２）：（１−１１）記載の遠心チューブを、１７，４００×ｇ  ３分間遠心分離を行う。
（１−１３）：（１−１２）記載の遠心分離により得られた上澄み液７５０μｌを別の遠心チューブに移す。
（１−１４）：（１−１３）記載の上澄み液に、ＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液  ７９７μｌを加えてピペッティングを行って、よく混合する。
（１−１５）：（１−１４）記載の溶液を、３７℃の恒温槽内で一時間静置する。
（１−１６）：（１−１５）後の溶液を、１７，４００×ｇ  ３０分間（室温）で遠心分離を行う。
（１−１７）：（１−１６）記載の遠心分離により得られた上澄み液を捨て、沈殿を７０％（ｖ／ｖ）エタノール（「ＥｔＯＨ」と表記する）で洗浄した後、当該沈殿を乾燥させる。【００６５】  次に、下記の（２−１）〜（２−８）の手順で操作を行った。
（２−１）：（１−１７）で得られた沈殿をＨ２Ｏ  ４００μｌで完全に溶解する。
（２−２）：（２−１）記載の溶液に１．０Ｍ  ＭｇＣｌ２  ４００μｌを加えてよく混ぜる。
（２−３）：（２−２）記載の溶液を１７，４００×ｇ  １０分間  遠心分離を行う。この時遠心分離の停止は緩やかに行う（ｓｏｆｔ  ｂｒａｋｅ）。
（２−４）：（２−３）記載の遠心分離後の上澄み液を別の２ｍｌ容  遠心チューブに移す。ここで、沈殿の沈降度が緩い場合は再度遠心分離を行う。
（２−５）：ここで、溶液の腐植の除去がまだ完全でない場合は、（２−５）の上澄み液に８５０μｌのＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液を加えてピペッティングする。
（２−６）：（２−４）または（２−５）により得られた上澄み液を、３７℃で一時間静置する。
（２−７）：（２−６）後の上澄み液を、１７，４００×ｇ  ３０分間、遠心分離を行う。
（２−８）：沈殿を７０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨで洗浄した後、当該沈殿を乾燥させる。【００６６】  続いて、上記（２−８）で乾燥された沈殿を、ＴＥ  １００μｌまたはＭｉｌｌｉＱ  ｇｒａｄｅ  ＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｈ２Ｏ（あるいは、ＤＥＰＣ処理済みＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｈ２Ｏ）１００μｌに溶解させることによってＤＮＡの抽出を行った。【００６７】  一方、ＲＮＡの抽出については下記（３−１）〜（３−１６）の手順に従って実施した。
（３−１）：ＤＮａｓｅＩ  Ｂｕｆｆｅｒ３００μｌで上記（２−８）で得られた沈殿を溶解する。
（３−２）：（３−１）記載の溶液に、５Ｕ  ＤＮａｓｅＩを加える。
（３−３）：（３−２）記載の溶液を、２５℃で３０分間静置する。
（３−４）：（３−３）記載の溶液を、１７，４００×ｇ  １０分間  遠心分離を行う。この時、遠心分離の停止は緩やかに行う（ｓｏｆｔ  ｂｒａｋｅ）。
（３−５）：（３−４）記載の遠心分離後の上澄み液を、別の２ｍｌ容  遠心チューブに移す。ここで、沈殿の沈降度が緩い場合は再度遠心分離を行う。
（３−６）：（３−５）記載の上澄み液に、ＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを１２５０μｌ加え、よく混ぜる。
（３−７）：（３−６）記載の溶液を、半分に（７７５μｌずつに）分け、２ｍｌ容  遠心チューブに移す。
（３−８）：（３−７）の工程で半分に分けたそれぞれの溶液に、６２５μｌ  Ｐｈｅｎｏｌ／ＴＥおよび６２５μｌ  Ｃｈｌ／ｉｓｏを加える。
（３−９）：（３−８）記載の溶液を遠心分離し、遠心分離により得られた上澄み液に１２５０μｌ  Ｃｈｌ／ｉｓｏを加える。
（３−１０）：（３−９）記載の溶液を遠心分離し、遠心分離により得られた上澄み液に１μｌ  Ｇｌｙｃｏｇｅｎを加える。
（３−１１）：（３−１０）記載の溶液に、１０００μｌ  ２−プロパノール（「２ＰｒＯＨ」と表記する）を加えて混ぜる。
（３−１２）：（３−１１）記載の溶液を室温で３分間放置する。
（３−１３）：（３−１２）記載の処理後の溶液を氷上で３分間放置する。
（３−１４）：（３−１３）記載の処理後の溶液を、１７，４００×ｇ  １０分間、０℃で遠心分離を行う。
（３−１５）：（３−１４）記載の遠心分離により得られた沈殿を７０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨ（約１ｍｌ）で洗った後に乾燥させる。
（３−１６）：（３−１５）記載の工程により得られた沈殿を、ＭｉｌｌｉＱ  ｇｒａｄｅ  ＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｈ２ＯあるいはＴＥ  １０〜２０μｌに溶解する。【００６８】  図１には、上記の（２−８）の手順において得られた沈殿を溶解した試料について、０．２％ＰＶＰＰを含有する１％アガロースゲル電気泳動を行った結果を示す。なお、図１において、レーン１，２がＭｇＣｌ２を用いて上記の手順で核酸抽出操作を行った場合に得られた試料であり、レーン３，４が同じ土壌試料についてＭｇＣｌ２を用いないで上記の手順で核酸抽出操作を行った場合に得られた試料である。【００６９】  図１に示すように、ＭｇＣｌ２を用いたレーン１，２の試料には、矢印で示す部分に腐植に由来するバンドが確認されず、腐植が完全に除去できたことが確認された。一方、ＭｇＣｌ２を用いなかったレーン３，４の試料には、矢印で示す部分に腐植に由来するバンドが確認された。このことから、ＭｇＣｌ２を用いなければ、腐植を完全に除去することができないということがわかった。【００７０】  図２には、上記の（２−８）の手順において得られた沈殿を溶解した試料について、０．２％ＰＶＰＰを含有する１％アガロースゲル電気泳動を行った後に、ゲルをＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉで染色した結果を示す。図２において、レーンＭ：マーカー（λ  ＨｉｎｄＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔ）、レーン１〜３：褐色森林土由来の土壌試料、レーン４〜６：泥炭土由来の土壌試料である。また、レーン１，４は、ＭｇＣｌ２を用いないで核酸抽出操作を行ったものであり、レーン２，３，５，６は、ＭｇＣｌ２を用いて核酸抽出操作を行ったものである。なお、レーン２と３、および、レーン５と６は、それぞれ同じ試料である。【００７１】  図２に示すように、ＭｇＣｌ２を用いないで核酸抽出操作を行ったもの（レーン１，４）では、腐植が依然として混入していることが確認された（同図中矢印で示す）。一方、ＭｇＣｌ２を用いて核酸抽出操作を行ったもの（レーン２，３，５，６）では、腐植がほぼ完全に除去されたことがわかった。【００７２】  また図４に、上記（３−１６）の手順において得られた土壌由来のＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ−ＤＧＧＥを行った結果を示す。ＲＴ−ＰＣＲ−ＤＧＧＥによれば試料中にＲＮＡが存在しない場合は増幅されないことから、増幅産物が確認されれば、それはＲＮＡ由来の増幅産物であることがわかる。すなわち、ＲＴ−ＰＣＲ−ＤＧＧＥの結果、増幅産物が確認されれば、試料中にＲＮＡが存在していることが確認できる。【００７３】  図４は、得られた試料の一部をＲＴ反応（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）によって１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列に関して増幅した後に、わずかに異なる塩基配列（異なる微生物種に由来する）を検出するために、その一部の領域をＰＣＲによって再度増幅し、ＤＧＧＥ法（変成剤ゲル密度勾配法）によって１０％アクリルアミドゲルで分離した結果である。図４のレーンＭは、既知の微生物を鋳型として増幅したものを流したものであり、レーン１〜３はルーピンの根圏土壌を用い（３−１６）の手順において得られた試料を鋳型とした場合の結果であり、レーン４〜６はトウモロコシの根圏土壌を用い（３−１６）の���順において得られた試料を鋳型とした場合の結果であり、レーン７〜９はナタネの根圏土壌を用い（３−１６）の手順において得られた試料を鋳型とした場合の結果であり、レーン１０〜１２はビートの根圏土壌を用い（３−１６）の手順において得られた試料を鋳型とした場合の結果である。図４のレーン１〜１２のそれぞれにおいて、明確な複数のバンドが検出されており、本実施例の手法によって複数の微生物由来のＲＮＡが土壌から効率的に抽出され、腐植による増幅の阻害も認められないということが明らかとなった。【００７４】  〔実施例２〕
実施例２では、下記の手順によって土壌試料中からＲＮＡの抽出を行った。なお、この実施例で用いた操作手順は、非特許文献２に記載の方法に準じたものである。【００７５】  まず、非特許文献２に記載の方法に準じてＲＮＡ安定化剤を土壌に添加し、磨砕し、抽出液を添加して核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）溶液を回収した。等量のクロロホルムで脂溶性の化合物を除去した後に、０．６ｖｏｌの２ＰｒＯＨ（２−Ｐｒｏｐａｎｏｌ）で沈殿を得た。ここまでの手順については、非特許文献２に記載の方法に従って行った。【００７６】  続いて、下記の（４−１）〜（４−１２）の手順で操作を行った。
（４−１）：０．７５ｍｌ  ＭｉｌｌｉＱ  ｇｒａｄｅ  ＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｈ２Ｏ（あるいは、ＤＥＰＣ処理済みＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｈ２Ｏ）で、上記沈殿をまず溶解する。
（４−２）：（４−１）記載の溶液７５０μｌに、７９７μｌの比率で２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液を加える。
（４−３）：（４−２）記載の溶液を、３７℃で一時間静置する。
（４−４）：（４−３）記載の溶液を、１７，４００×ｇ  ３０分間遠心分離を行う。
（４−５）：（４−４）記載の遠心分離により得られた沈殿を７０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨで洗浄した後、乾燥させて沈殿を回収する。
（４−６）：（４−５）で得られた沈殿を０．５ｍｌ  ＭｉｌｌｉＱ  ｇｒａｄｅ  ＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｈ２Ｏ（あるいは、ＤＥＰＣ処理済みＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｈ２Ｏ）で溶解した後に、０．５ｍｌ  １Ｍ  ＭｇＣｌ２を加え、よく混ぜる。
（４−７）：（４−６）記載の溶液を、１７，４００×ｇで１０分間遠心分離（温度は４℃）を行った後、上澄み液を回収する。
（４−８）：（４−７）記載の上澄み液を、１７，４００×ｇで１０分間遠心分離（温度は４℃）を行った後、上澄み液を回収する。
（４−９）：（４−８）記載の上澄み液を、２ＰｒＯＨで沈殿させる（上澄み液に対して０．６ｖｏｌ  ２ＰｒＯＨを上澄み液に添加し、０℃で１０分間静置後、１７，４００×ｇ、０℃の条件で、２０分間遠心分離を行う）
（４−１０）：（４−９）で得られた沈殿を０．５ｍｌ  ＴＥに溶解する。
（４−１１）：（４−１０）で得られた溶液に、１０Ｍ  ＬｉＣｌ  ０．５ｍｌを加える。−８０℃で上記溶液を１時間放置した後、１７，４００×ｇ、０℃の条件で１０分間遠心分離を行った後、沈殿を回収する。
（４−１２）：（４−１１）で得られた沈殿を、水あるいはＴＥに溶解する。さらにＲＮＡの純度を高める場合にはＤＮａｓｅＩ処理を行う。【００７７】  続いて、下記の手順で核酸抽出を行った。なお、本実施例では、下記の試験試薬としてマグネシウム塩を含む溶液として、０．５Ｍ塩化マグネシウム溶液、または、０．５Ｍ硫酸マグネシウム溶液を使用した。また、比較のためにマグネシウム塩以外の金属塩（図３参照）を含む水溶液を濃度０．５Ｍに調製して試験試薬として使用した。【００７８】  以下に、手順を示す。
（５−１）：−８０℃に保存しておいた２ＰｒＯＨ（Ｉｓｏ−ｐｒｏｐａｎｏｌ）沈殿後の核酸ペレット（上記（４−１１）で得られた沈殿）を２２μｌのＭｉｌｌｉＱ  ｇｒａｄｅ  ＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｈ２Ｏ（あるいは、ＤＥＰＣ処理済みＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｈ２Ｏ）に溶解させる。
（５−２）：（５−１）記載の溶液の２μｌを、１０倍希釈して吸光度を測定する。
（５−３）：（５−１）記載の溶液のうち、残りの２０μｌを、１０μｌずつ新しい２ｍｌ容  遠心チューブに移す。
（５−４）：（５−３）記載の遠心チューブに、８００μｌの試験試薬を加え良く混合する。
（５−５）：（５−４）記載の溶液を、４℃、１７，４００×ｇ、の条件で、１０分間、遠心分離を行う。この時、遠心分離の停止は緩やかに行う（ｓｏｆｔ  ｂｒａｋｅ）。
（５−６）：上澄み液を新しい２ｍｌ容  遠心チューブに移し、ＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液を８５０μｌ加え、よく混合する。
（５−７）：（５−６）記載の溶液を３７℃で１時間保温する。
（５−８）：（５−７）記載の溶液を、１７，４００×ｇ、３０分間（室温）で遠心分離を行う。
（５−９）：（５−８）記載の遠心分離後、上澄み液を捨て、沈殿（ペレット）を７０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨでリンスする。
（５−１０）：（５−９）で得られた沈殿を減圧遠心乾燥機で乾燥させる。
（５−１１）：（５−１０）で得られた沈殿を、１０μｌのＭｉｌｌｉＱ  ｇｒａｄｅ  ＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｈ２Ｏ（あるいは、ＤＥＰＣ処理済みＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｈ２Ｏ）に溶かして吸光度を測定する。【００７９】  図３には、上記試験試薬に用いた各化合物、各試験試薬の調製方法、および、実験結果を示す。図３の１，２は、マグネシウム塩を用いた試験試薬であり、図３の３〜２１は、マグネシウム塩以外の金属塩を用いた試験試薬である。なお、図３に示す「ろ過滅菌」の項目は、実施例において作製した各溶液の除菌方法を示すものであり、「オートクレーブ」は、通常の方法でオートクレーブを行ったもの、「ろ過滅菌」は、作製した溶液をポアサイズ０．２２μｍのフィルターを用いてろ過して除菌したものを、それぞれ示す。【００８０】  本実施例の結果において、図３の「６：Ｎａ２ＣＯ３」および「９：Ｋ２ＣＯ３」については、ＰＥＧ沈後のペレットは「なし」と示しているが、（５−９）の工程において７０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨ（エタノール）でリンスした後に少量の沈殿（ペレット）が確認された。【００８１】  試験試薬を添加した後に腐植が溶けないもの（すなわち、図３の「遠心後のペレット」の項目において「あり」のもの）は、Ｂｅ塩、Ｃａ塩、Ｍｎ塩、Ｃｕ塩、Ａｌ塩であった。この沈殿には、腐植が含まれていると考えられる。なお、Ｍｇ塩を溶液に加えた場合には、溶液が茶色に着色し、フロック状の塊は確認されなかった。しかし、その後の遠心分離操作によって腐植の沈殿が発生し、当該沈殿を除去することができた。【００８２】  図３に示す「試薬添加後の腐植」の項目において、「可溶」とはフロック状の塊がないもののことを指し、「不溶」とはフロック状の塊があるもののことを指している。そのため、Ｍｇ塩（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）の結果については、図３の「試薬添加後の腐植」の欄は「可溶」と記載している。つまり、図３において、「遠心後のペレットあり」のものが、試験試薬を加えたことによって腐植が沈殿したものを指す。また、「ＰＥＧ沈後のペレットあり」のものが、腐植を除去した上澄み液についてＰＥＧを添加したことによって核酸が沈殿したものを指す。【００８３】  したがって、図３において、「遠心後のペレットあり」であり、かつ「ＰＥＧ沈後のペレットあり」に該当する化合物が、土壌試料から腐植を除去することができ、かつ核酸を抽出することができたものに相当する。つまり、上記の結果から、試料中から腐植をうまく除去することができたのは、Ｍｇ塩（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）のみであることが確認された。ただし、ＭｇＳＯ４は、ＭｇＣｌ２よりも腐植を除去する効果が小さかった。
【産業上の利用可能性】
【００８４】  本発明によれば、土壌、河川沈殿物、汚泥、胃腸内内容物、糞便などといった腐植を多量に含んでいる試料中から、安価かつ簡便に腐植を除去して核酸を精製することができる。そのため、本発明を利用すれば、腐植を含む試料中から核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）を抽出し、これらを解析することができる。具体的には、ＤＮＡを抽出した場合には、このＤＮＡを、ＰＣＲ、ＰＣＲ−ＤＧＧＥ、制限酵素処理、クローンライブラリーの作製などに利用することができる。また、ＲＮＡを抽出した場合には、このＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ−ＤＧＧＥ、クローンライブラリーの作製、マイクロアレイを用いた試験などに利用することができる。さらに、本発明の核酸抽出方法は、土壌中のＤＮＡ、ＲＮＡのＦＩＳＨ解析への応用に利用することもできる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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