(57)【要約】  本発明は、チオレドキシンの発現を誘導し、酸化ストレスによる影響の緩和等の有用で、安全性な組成物を提供することを目的とする。  ヨモギ、ヨモギ抽出物、青ジソ及び青ジソ抽出物からなる群より選択される少なくとも１種の成分を配合して、食品、医薬、飼料などの分野で使用される組成物を調製する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヨモギ、ヨモギ抽出物、青ジソ及び青ジソ抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を含むことを特徴とする、チオレドキシン発現誘導用組成物。
【請求項２】
ヨモギ抽出物及び／又は青ジソ抽出物を含む、チオレドキシン発現誘導用組成物。
【請求項３】
酸化ストレス緩和用である、請求項１に記載のチオレドキシン発現誘導用組成物。
【請求項４】
ヨモギ抽出物及び／又は青ジソ抽出物の総量が、組成物の全量に対して０．１〜２５重量％である、請求項２に記載のチオレドキシン発現誘導用組成物。
【請求項５】
食品である、請求項１に記載のチオレドキシン発現誘導用組成物。
【請求項６】
医薬組成物である、請求項１に記載のチオレドキシン発現誘導用組成物。
【請求項７】
動物用飼料である、請求項１に記載のチオレドキシン発現誘導用組成物。
【請求項８】
ヨモギ抽出物及び／又は青ジソ抽出物を、食品中に０．１〜２５重量％となるように添加することを特徴とする、チオレドキシン発現誘導用食品の製造方法。
【請求項９】
ヨモギ、ヨモギ抽出物、青ジソ及び青ジソ抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を、ほ乳動物に投与又は摂取させることを特徴とする、チオレドキシンの発現誘導方法。
【請求項１０】
ヨモギ、ヨモギ抽出物、青ジソ及び青ジソ抽出物からなる群より選択される少なくとも１種の、チオレドキシン発現誘導用組成物の製造のための使用。
【請求項１１】
ヨモギ抽出物及び／又は青ジソ抽出物の、チオレドキシン発現誘導用組成物の製造のための使用。
【請求項１２】
ヨモギ抽出物及び／又は青ジソ抽出物の、チオレドキシン発現誘導用医薬組成物の製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チオレドキシンの発現を誘導する組成物に関する。具体的には、チオレドキシンの発現を誘導し、酸化ストレスの緩和等に有用であるチオレドキシン発現誘導用組成物に関する。更に、本発明は、チオレドキシンの発現誘導方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
チオレドキシンは、その活性部位にある２つのシステイン残基によって、NADPH依存性酵素であるチオレドキシンリダクターゼを触媒として可逆的な酸化還元反応（レドックス制御）を行う分子である（例えば非特許文献１）。また、チオレドキシンは、細胞内還元環境を維持し、酸化ストレス（フリーラジカル）や腫瘍壊死因子α（TNF-α）が引き起こす障害から細胞を保護する役割を持つことが知られている（例えば非特許文献2及び3）。【０００３】
さらに、チオレドキシントランスジェニックマウスは、寿命の延長や虚血障害、急性肺不全、糖尿病等に対して抵抗性を示す(例えば、非特許文献4〜8)。これらの病態は酸化ストレスに密接な関係があることから、チオレドキシンは酸化ストレスに対して重要な保護作用を示すと考えられている。【０００４】
この様なチオレドキシンの特徴を利用し、チオレドキシンの発現を誘導することで、酸化ストレスの影響を緩和できると考えられる。
【非特許文献１】Holmgren A. et al., Methods Enzymol 1995; 252:199-208.
【非特許文献２】Nakamura H. et al., Immunol Lett 1994; 42:75-80.
【非特許文献３】Matsuda M. et al., J Immunol 1991; 147:3837-3841.
【非特許文献４】Mitsui A. et al., Antioxid Redox Signal 2002; 4:693-696.
【非特許文献５】Takagi Y. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 1999; 96:4131-4136.
【非特許文献６】Hoshino T. et al., Am J Respir Crit Care Med 2003; 168:1075-1083.
【非特許文献７】Hotta M. et al., J Exp Med 1998; 188:1445-1451.
【非特許文献８】Yoon BI. et al., Arch Environ Contam Toxicol 2001; 41:232-236.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、チオレドキシンの発現を誘導し、酸化ストレスによる影響の緩和等の有用で、安全性な組成物を提供することを目的とする。更に、本発明は、ヒトを含むほ乳動物において、チオレドキシンの発現を誘導する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ヨモギ抽出物及び青ジソ抽出物には、チオレドキシンの発現を誘導する作用があることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて完成するに至った。【０００７】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する：
項１．  ヨモギ、ヨモギ抽出物、青ジソ及び青ジソ抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を含むことを特徴とする、チオレドキシン発現誘導用組成物。
である飲食品。
項２．  ヨモギ抽出物及び／又は青ジソ抽出物を含む、チオレドキシン発現誘導用組成物。
項３．  酸化ストレス緩和用である、項１又は２に記載のチオレドキシン発現誘導用組成物。
項４．  ヨモギ抽出物及び／又は青ジソ抽出物の総量が、組成物の全量に対して０．１〜２５重量％である、項２に記載のチオレドキシン発現誘導用組成物。
項５．  食品である、請求項１に記載のチオレドキシン発現誘導用組成物。
項６．  ヨモギ、ヨモギ抽出物、青ジソ及び青ジソ抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を含むことを特徴とする、チオレドキシン発現誘導用食品。
項７．  ヨモギ抽出物及び／又は青ジソ抽出物を含む、チオレドキシン発現誘導用食品。
項８．  酸化ストレス緩和用である、項６又は７に記載のチオレドキシン発現誘導用食品。
項９．  肝障害の改善、更年期障害の改善、血中コレステロールの低下、血中中性脂質の低下、血糖値の低下、血圧の低下、動脈硬化の予防、又は老化の予防用である旨が表示されている、項６又は７に記載のチオレドキシン発現誘導用食品。
項１０．  ヨモギ抽出物及び／又は青ジソ抽出物を、食品中に０．１〜２５重量％となるように添加することを特徴とする、チオレドキシン発現誘導用食品の製造方法。
項１１．  医薬組成物である、項１に記載のチオレドキシン発現誘導用組成物。
項１２．  更年期障害の改善用、血中コレステロールの低下用、血中中性脂質の低下用、血糖値低下用、血圧低下用、老化予防用、動脈硬化の予防又は治療用、糖尿病の予防又は治療用、肝臓病の予防又は治療用、或いは抗アレルギー用の医薬組成物である、項１に記載のチオレドキシン発現誘導用組成物。
項１３．  動物用飼料である、項１に記載のチオレドキシン発現誘導用組成物。
項１４．  ヨモギ、ヨモギ抽出物、青ジソ及び青ジソ抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を、ほ乳動物に投与又は摂取させることを特徴とする、チオレドキシンの発現誘導方法。
項１５．  ヨモギ、ヨモギ抽出物、青ジソ及び青ジソ抽出物からなる群より選択される少なくとも１種の、チオレドキシン発現誘導用組成物の製造のための使用。
項１６．  ヨモギ抽出物及び／又は青ジソ抽出物の、チオレドキシン発現誘導用組成物の製造のための使用。
項１７．  ヨモギ抽出物及び／又は青ジソ抽出物の、チオレドキシン発現誘導用食品の製造のための使用。
項１８．  ヨモギ抽出物及び／又は青ジソ抽出物の、チオレドキシン発現誘導用医薬組成物の製造のための使用。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のチオレドキシン発現誘導用組成物に含まれる有効成分の１つであるヨモギ抽出物又は青ジソ抽出物は、チオレドキシンの発現を一層効果的に誘導することができる。従って、本発明のチオレドキシン発現誘導用組成物は、、酸化ストレス緩和（フリーラジカルの消去）を目的として用いることができる。チオレドキシンは、チオレドキシンペルオキシダーゼと協調して細胞内の過酸化水素を消去することで、体内の還元状態を維持しており、この経路は細胞内の酸化ストレス消去に必須の役割を果たしている。抗酸化作用を有する物質としては、チオレドキシンの他に、ポリフェノール、ビタミンC等がある。例えば、青ジソはポリフェノールの一種であるロズマリン酸を含み、そのフェノール性水酸基がヒドロキシラジカル等の捕捉にはたらくことが知られている。しかし、これらの抗酸化物質は、自身が酸化されると抗酸化作用を示さなくなる。【０００９】
一方、チオレドキシンは、二つのシスティン残基の酸化、還元によって抗酸化作用を発揮し、一旦酸化型になっても体内のNADPH、チオレドキシンレダクターゼ等の還元酵素により再び還元型にもどることが知られている。従って、チオレドキシンの発現を誘導する物質を投与／摂取することは、細胞の内部での酸化ストレスを消去でき、しかも生理的な酸化ストレス消去系を利用するため、効果的だと考えられる。【００１０】
本発明によれば、チオレドキシンの発現を誘導することによって、例えば、二日酔い等を含む肝障害の改善、更年期障害の改善、滋養強壮等に有効な食品や医薬組成物を提供することが可能である。また、本発明のチオレドキシン発現誘導用組成物に使用される有効成分は、食用植物由来であるため、極めて安全性の高いものである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】K562細胞におけるヨモギ水性抽出物によるチオレドキシン遺伝子の活性化を示す。
【図１Ｂ】K562細胞における青ジソアセトン抽出物によるチオレドキシン遺伝子の活性化を示す。
【図２Ａ】ヨモギ抽出物で処理されたK562細胞におけるチオレドキシン遺伝子の活性化を示す。
【図２Ｂ】青ジソ抽出物で処理されたK562細胞におけるチオレドキシン遺伝子の活性化を示す。
【図３Ａ】ホモジニアスアッセイにおける、ヨモギ抽出物によるチオレドキシン遺伝子の活性化を示す。
【図３Ｂ】ホモジニアスアッセイにおける、青ジソ抽出物によるチオレドキシン遺伝子の活性化を示す。
【図４Ａ】ヨモギ抽出物によるチオレドキシンmRNA発現の誘導のRT-PCRによる結果を示す。
【図４Ｂ】ヨモギ抽出物によるチオレドキシンmRNA発現の誘導のReal Time RT-PCRの結果を示す。
【図４Ｃ】青ジソ抽出物によるチオレドキシンmRNA発現の誘導のRT-PCRによる結果を示す。
【図４Ｄ】青ジソ抽出物によるチオレドキシンmRNA発現の誘導のReal Time RT-PCRの結果を示す。
【図５Ａ】ヨモギ抽出物によるチオレドキシンタンパク質発現の誘導を示す。
【図５Ｂ】青ジソ抽出物によるチオレドキシンタンパク質発現の誘導を示す。
【図６】ヨモギ抽出物による過酸化水素誘導性細胞傷害の抑制を示す。2% TritonX-100での吸光度の値を100%細胞死、培地+細胞での吸光度の値を0%細胞死とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
１．チオレドキシン発現誘導用組成物
本発明のチオレドキシン発現誘導用組成物は、ヨモギ、ヨモギ抽出物、青ジソ及び青ジソ抽出物（以下、単に「有効成分」と表記することもある）の内、１種又は２種以上を含むことを特徴とする。【００１３】
ヨモギ（Artemisia princeps）は、多年草のキク科ヨモギ属植物である。ヨモギ抽出物は、ヨモギを抽出処理することにより得ることができる。【００１４】
また、青ジソ（Perilla frutescens）は、1年草のシソ科シソ属植物である。青ジソ抽出物は、青ジソを抽出処理することにより得ることができる。【００１５】
本発明において、有効成分としてヨモギ及び／又は青ジソを使用する場合、それらを乾燥させたのも、ペースト状にしたもの、細切したもの等を用いることができる。【００１６】
ヨモギ抽出物又は青ジソ抽出物としては、いずれもチオレドキシン発現誘導作用を有するものであれば、抽出される部位は特に限定されず、植物体全体（全草）又は任意の部分（例えば、葉、根茎、茎等）から抽出されたものを用いることができる。【００１７】
本発明で使用するヨモギ抽出物又は青ジソ抽出物は、当業者によって通常用いられる抽出処理方法によって得ることができる。抽出処理方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、水、有機溶媒、又はこれらの混合液を抽出溶媒として使用して、ヨモギ又は青ジソを抽出する方法が挙げられる。【００１８】
抽出に使用する溶媒としては、特に限定されないが、例えば、水、エタノール、メタノール、n-プロパノール、iso-プロパノール、n-ブタノール、iso-ブタノール、tert-ブタ
ノール等の１級アルコール、酢酸エチル等の低級アルキルエステル、ベンゼン、ヘキサン等の炭化水素、アセトン、塩化メチレン等の従来公知の溶媒、またはそれらの混合溶液が例示される。これらの抽出溶媒は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用してもよい。中でも好ましい溶媒としては、水、エタノール又はエタノール及び水の混合溶液があげられる。また、超臨界CO2等の超臨界溶媒で抽出してもよい。抽出を行う場合、抽出回数は単回でもよく、収率を上げるために複数回行ってもよい。【００１９】
この様にして得られた抽出物は、ヨモギ抽出物又は青ジソ抽出物としてそのまま使用することもできるが、更に、本発明の効果を失わない範囲内で脱臭、脱色等の精製工程に供してもよい。また、該抽出物は、必要に応じて、合成吸着剤による処理、ろ過処理、濃縮処理等の分離・精製工程に供してもよい。合成吸着剤による処理方法は特に限定されず、従来公知の方法でよいが、具体的には、合成吸着剤を充填したカラムに通し、水、エタノール、又はこれらの混合溶液等の溶出液等で溶出する方法があげられる。合成吸着剤としては、例えば、芳香族系（架橋スチレン系）合成吸着剤、置換芳香族系合成吸着剤、アクリル系合成吸着剤等があげられる。また、上記抽出処理後、ヨモギ抽出物又は青ジソ抽出物は液状形態で得られるが、該抽出物にペクチン、デキストリン等の水溶性食物繊維を賦形剤として加え、スプレードライ法等の公知の方法により乾燥させることにより、該抽出物を粉末形態に調製してもよい。更に、この粉末状にした抽出物を水、エタノール、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、グリセリン等の溶媒に再溶解して用いることもできる。【００２０】
また、モギ抽出物又は青ジソ抽出物の含有成分の安定性を高めるという観点から、これらの抽出物は、乾燥状態であることが望ましい。【００２１】
本発明のチオレドキシン発現誘導用組成物は、ヨモギ、ヨモギ抽出物、青ジソ、及び青ジソ抽出物の内の１種又は２種以上を含んでいればよい。これらの含有成分の中で、ヨモギ抽出物及び青ジソ抽出物は、チオレドキシン発現をより効果的に誘導できるため、本発明において好適に使用される。【００２２】
本発明のチオレドキシン発現誘導用組成物は、内服、摂取、注射、点滴等の各種形態で、ほ乳動物に適用されることにより、該ほ乳動物に体内でチオレドキシンの発現を誘導することができる。【００２３】
本発明のチオレドキシン発現誘導用組成物の適用量（摂取量又は投与量）については、チオレドキシン発現誘導にための有効量であればよく、その組成物の形態、適用形態、有効成分の種類、対象者の年齢、性別、体重、健康状態、その他の条件、症状の程度等により適宜選択される。一例として、ヨモギ抽出物及び／又は青ジソ抽出物を含有成分としてヒトに適用する場合であれば、その適用量は、乾燥重量換算で、ヨモギ抽出物及び／又は青ジソ抽出物が総量で1人当り1日当り2〜400mg/kg程度、好ましくは10〜150mg/kg程度、より好ましくは20〜80mg/kg程度となる量が挙げられる。また、本発明のチオレドキシン発現誘導用組成物は、上記の1日当たりの適用量を単回で適用してもよく、数回に分けて適用してもよい。【００２４】
本発明のチオレドキシン発現誘導用組成物において、上記有効成分の配合割合については、該組成物の種類、使用する有効成分の種類、１日当たりの適用量等に応じて適宜設定することができる。上記有効成分として、ヨモギ抽出物及び／又は青ジソ抽出物を使用する場合であれば、その配合割合の一例として、チオレドキシン発現誘導用組成物の総量に対して、ヨモギ抽出物及び／又は青ジソ抽出物が総量で０．１〜２５重量％となる割合が挙げられる。【００２５】
本発明のチオレドキシン発現誘導用組成物は、食品、医薬、飼料等の分野で使用される。即ち、本発明のチオレドキシン発現誘導用組成物を、食品、医薬品、飼料等の形態に調製することにより、チオレドキシンの発現誘導を可能とする食品、医薬組成物、飼料を提供することが可能になる。以下、食品、医薬、及び飼料分野での具体的態様について、詳細に説明する。【００２６】
食品
本発明のチオレドキシン発現誘導用組成物を食品として調製することにより、チオレドキシンの発現を誘導することができる食品が提供される。【００２７】
当該食品としては、例えば、栄養補助食品、バランス栄養食品、健康食品、栄養機能食品、特定保健用食品、病者用食品等の飲食品が挙げられる。これらの食品の製造方法は、網膜保護効果が得られるものであれば特に限定されない。当該食品の好適な具体例として、粉末、顆粒、カプセル、錠剤等の形態を有するサプリメントが例示される。この様な形態の食品には、好適には、含有成分として、ヨモギ抽出物及び／又は青ジソ抽出物が使用される。また、上記形態以外にも、当該食品としては、ガム、キャンディー、グミ、錠菓、クッキー、ケーキ、チョコレート、アイスクリーム、ゼリー、ムース、プリン、ビスケット、コーンフレーク、チュアブルタブレット、ウエハース、煎餅等の菓子類；炭酸飲料、清涼飲料、乳飲料、コーヒー飲料、紅茶飲料、果汁飲料、栄養飲料、アルコール飲料、ミネラルウォーター等の飲料類；粉末ジュース，粉末スープ等の粉末飲料；ドレッシング、ソース等の調味料；パン類；麺類；かまぼこ等の練り製品；ふりかけ等があげられる。また、経口摂取用の形態以外に、経管摂取用（流動食等）の形態としてもよい。【００２８】
当該食品における有効成分の含有割合については、上記の１日当たりの適用量、食品の形態、食品の風味等に応じて適宜調節することができる。例えば、有効成分として、ヨモギ抽出物及び／又は青ジソ抽出物を使用する場合、通常、該食品の総量に対して、ヨモギ抽出物及び／又は青ジソ抽出物が総量で０．１〜２５重量％、好ましくは０．５〜１０重量％、更に好ましくは１〜５重量％となる割合が例示される。また、チオレドキシンの発現誘導をより効果的に発現させるために、高含有量のヨモギ抽出物及び／又は青ジソ抽出物を含む食品としてもよい。このように高含量のヨモギ抽出物及び／又は青ジソ抽出物を含む食品とする場合、食品の総量に対して、ヨモギ抽出物及び／又は青ジソ抽出物が総量で、例えば２０重量％以上、好ましくは３０〜７０重量％となる割合が挙げられる。【００２９】
また、当該食品において、有効成分としてヨモギ抽出物及び／又は青ジソ抽出物を使用する場合には、更にヨモギ及び／又は青ジソ自体を含んでいてもよい。【００３０】
当該食品は、食品原料又は添加剤等を含む担体に上記有効成分を混合し、食品形態に応じて、常法に従って調製することができる。添加剤としては、例えば、甘味剤、着色剤、抗酸化剤、ビタミン類、香料等があげられる。【００３１】
当該食品は、摂取したヒトの体内でチオレドキシンの発現を誘導することができる。このチオレドキシンの発現によって、例えば、二日酔い等を含む肝障害の改善、更年期障害の改善、血中コレステロールの低下、血中中性脂質の低下、血糖値の低下、血圧の低下、動脈硬化の予防、老化の予防等が期待される。従って、当該食品は、コレステロールが高めの人、血圧が高めの人（例えば、血圧が正常高値の人、軽症高血圧の人）、肝機能が気になり始めた人、血糖値が気になり始めた人、身体の老化が気になる人等に適用され得る。【００３２】
例えば、動脈硬化は、活性酸素種の一種である過酸化脂質の蓄積が原因とされている。当該食品を摂取することにより、チオレドキシンの発現が誘導され、チオレドキシン自体あるいはチオレドキシン依存性のペルオキシダーゼの活性酸素種消去作用によって動脈硬化が改善されることが期待される。【００３３】
また、血糖値の過度の上昇は、膵臓ラ氏島のインシュリン産生細胞の酸化ストレスによる傷害の関与がその発症の一因として考えられている。当該食品を摂取することにより、チオレドキシンの発現が誘導され、チオレドキシン自体、あるいはチオレドキシン依存性のペルオキシダーゼの活性酸素種消去作用によってインシュリン産生細胞の傷害が抑制されることで血糖値の低下が期待される。【００３４】
さらに、当該食品、体内でチオレドキシンの発現を誘導し、抗酸化作用を発揮することから、（酸化）ストレスの解消や身体の酸化・還元（レドックス）のバランス維持に役立ち、（酸化）ストレスが気になる人等に好適に適用することができる。【００３５】
また、当該食品を動脈硬化、糖尿病、肝臓病、アレルギー等の病者用食品として利用することで、効果的にこれらの疾患を治療又は改善できる可能性がある。【００３６】
そして更に、当該食品は、滋養強壮、疲労回復等を目的として用いることもできる。【００３７】
医薬組成物
本発明のチオレドキシン発現誘導用組成物は、上記有効成分と共に、薬学的に許容される担体を配合して調製されることにより、チオレドキシン発現誘導用医薬組成物として提供される。【００３８】
当該網膜保護用医薬組成物に配合される担体としては、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、吸収促進剤、保湿剤、吸着剤、滑沢剤、充填剤、増量剤、付湿剤、防腐剤、安定剤、乳化剤、可溶化剤、浸透圧を調節する塩、緩衝剤等の希釈剤又は賦形剤を例示でき、これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用される。また、当該網チオレドキシン発現誘導用医薬組成物には、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等の添加剤や他の薬理活性成分を含有させてもよい。【００３９】
当該チオレドキシン発現誘導用医薬組成物は、内服剤；静脈注射、皮下注射、皮内注射、筋肉注射及び腹腔内注射等の注射剤；点滴剤等の製剤形態で使用される。【００４０】
当該網膜保護用医薬組成物の剤型としては、適用形態に応じて適宜設定されるが、一例として、錠剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤等の固形製剤；液剤、乳剤、懸濁剤等の液状製剤が挙げられる。【００４１】
当該チオレドキシン発現誘導用医薬組成物が、液剤、乳剤、懸濁剤等の注射剤である場合、これらは殺菌され且つ血液と等張であるのが好ましく、これらの剤型に製剤化するに際しては、希釈剤として例えば水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を使用できる。なお、この場合、等張性の溶液を調整するに充分な量の食塩、ブドウ糖あるいはグリセリンを本発明薬剤中に含有させてもよい。また、通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を添加してもよい。【００４２】
また、当該チオレドキシン発現誘導用医薬組成物が液状製剤である場合は、凍結保存または凍結乾燥等の状態で保存されていてもよい。凍結乾燥製状態である場合には、使用時に注射用蒸留水等を加え、再度溶解して使用される。【００４３】
当該医薬組成物における有効成分の配合割合は、上記の１日当たりの適用量や該組成物の形態等に応じて適宜調節することができる。【００４４】
当該医薬組成物は、投与されたヒトの体内でチオレドキシンの発現を誘導し、これによって種々の有用生理活性が発揮させることができる。具体的には、当該医薬組成物は、更年期障害の改善、血中コレステロールの低下、血中中性脂質の低下、血糖値低下、血圧低下、老化予防、動脈硬化の予防又は治療、糖尿病の予防又は治療、肝臓病の予防又は治療、抗アレルギー等のために有用である。中でも特に、当該医薬組成物は、動脈硬化の予防又は治療用、糖尿病の予防又は治療用、或いは肝臓病の予防又は治療用の医薬組成物として好適に使用される。【００４５】
飼料
本発明のチオレドキシン発現誘導用組成物を飼料として調製することにより、チオレドキシンの発現を誘導することができる飼料が提供される。当該飼料には、家畜や家禽用の飼料の他、ほ乳動物用のペットフードも含まれる。【００４６】
当該飼料は、飼料原料や飼料用添加物と共に、上記有効成分を配合することにより、調製されるすることにより、調製される。当該飼料は、その形状については特に制限されない。【００４７】
当該飼料の摂取量は、上記のヒトの場合の適用量を参考にして適宜選択することができる。また、当該飼料中の有効成分の配合割合についても、対象動物の種類、使用する有効成分の種類、１日当たりの有効成分の摂取量等に応じて適宜設定することができる。【００４８】
当該飼料は、摂取した動物の体内でチオレドキシンの発現を誘導して、酸化ストレスによる影響を軽減することができる。従って、当該飼料は、動物の健全な生育を促し、健康状態を維持するのに有用である。【００４９】
２．チオレドキシンの発現誘導方法
本発明は、更に、ヨモギ、ヨモギ抽出物、青ジソ及び青ジソ抽出物からなる群より選択される少なくとも１種の有効量を、チオレドキシンの発現の誘導が望まれているほ乳動物に投与又は摂取させることを特徴とする、チオレドキシンの発現誘導方法を提供する。【００５０】
当該方法において、ほ乳動物にはヒトが含まれる。また、当該改善方法において、使用する有効成分の種類、これらの投与又は摂取有効量、１日当たりの投与又は適用回数等については、前述する通りである。また、当該方法は、更年期障害の改善、血中コレステロールの低下、血中中性脂質の低下、血糖値の低下剤、血圧の低下、老化の予防、動脈硬化の予防又は治療、糖尿病の予防又は治療、肝臓病の予防又は治療、アレルギー疾患の予防又は治療等に有用である。
【実施例】
【００５１】
以下、本発明を実施例を挙げてさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
実施例１【００５２】
（１）ヨモギ抽出物／青ジソ抽出物の調製I
ヨモギ（Artemisia princeps）又は青ジソ（Perilla frutescens）に2容量の滅菌水を加えて3分間、9000rpmでホモジェナイズし、濾過した後、15000rpmで遠心分離を行った。この上清を、解析用の乾燥粉末を得るために凍結乾燥した（水性抽出物）。【００５３】
濾過によって得られた青ジソの濾過ケーキ（filter cake）を凍結乾燥し、60容量のアセトンに溶解させて薄膜フィルターで濾過し、30℃のエバポレーターで乾燥させた。乾燥させた材料を、1mlのエタノールに溶解させ（アセトン抽出物）、解析に使用した。【００５４】
本実施例を通して使用したスルフォラファンは、LTK laboratories Inc.（製品番号：S8046）から購入し、10μMの濃度で使用した。本発明者らは、スルフォラファンが、チオレドキシンの発現を誘導することを確認している。【００５５】
（２）培養細胞及び培養系
ヒト赤芽球様白血病細胞株K562を、熱処理で不活性化した10％ウシ胎児血清（FCS）及び抗生物質（100 IU/ml のペニシリン及び100 (g /mlストレプトマイシン)を加えたRPMI1640培地（Life Technologies）中にて、37℃、5％CO2の湿潤条件下で培養した。【００５６】
（３）プラスミド
pTRXCATプラスミドを、Taniguchi Y. et al., Nucleic Acids Res 1996; 24:2746-2752.の記載に従って作製した。pTRXCATベクター由来のHindIII-BamHIインサートを、pBluescriptII KS(+)（pTRXblue vector）にサブクローニングした。本実施例において使用されたpTRX-Lucベクターを、Kim Y-C. J Biol Chem 2001; 276, 18399-18406.及びKim YC. et al., Oncogene 2003; 22:1860-1865に記載される方法に従って調製した。pTRX(-1148)-Lucベクターは、pTRXblueベクターのKpnI/BamHIフラグメントを、pGL3 basicベクター（Promega）のKpnI/BglIIサイトにラーゲーションさせることで作製された。【００５７】
実施例で用いた全てのコンストラクトを、Thermo Sequenase II dye terminator cycle sequencing kit（Amersham Pharimacia）を用いてヌクレオチド配列を確認した。【００５８】
（４）トランスフェクション及びルシフェラーゼアッセイ
DMRIEC（GIBCO製）を用い、使用説明に従って、ルシフェラーゼレポーター発現ベクター又はpGL3-basicベクター（コントロール）をK562細胞にトランスフェクションした。4時間のインキュベーション後、各ベクターをトランスフェクションしたK562細胞にDMSO（最終濃度0.1％）、10μMスルフォラファン、青ジソのアセトン抽出物（最終濃度1％）又はヨモギ水性抽出物（最終濃度3%）を加え、24時間おいた。【００５９】
トランスフェクションの効果を平準化するため、ウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼ遺伝子発現を、pRL-TK（Promega）を用いてモニターした。ウミシイタケルシフェラーゼ活性によって標準化されたルシフェラーゼ遺伝子発現を、アッセイキット（Promega）を用いて、24時間後に解析を行った。アッセイは、2度行った。【００６０】
上記（１）〜（４）に記載の方法に従い、アブラナ科植物以外の野菜抽出物が、K562細胞においてチオレドキシン遺伝子の発現を誘導するかどうかについて解析を行った。解析には、チオレドキシン遺伝子の全制御領域を含むベクターを用いた。【００６１】
ヨモギ水性抽出物は、コントロールに対して約7.61倍のチオレドキシン遺伝子発現の活性化を示した（図１Ａ）。また、青ジソのアセトン抽出物は、コントロールに対して約6.14倍のチオレドキシン遺伝子発現の活性化を示した（図１Ｂ）。
実施例２【００６２】
本発明者らは、ヨモギ抽出物又は青ジソ抽出物によるチオレドキシン遺伝子発現誘導にantioxidant responsive element (ARE)領域が関与することを見出した。従って、以下の実施例では、野生型3xAREを含むベクター（pTRX-3xARE-Lucベクター）を作製し、該ベクターを用いて解析を行った。pTRX-3xARE-Lucベクターの作製のために使用したpcDNA3を、Invitrogen社から購入した。【００６３】
pTRX-3xARE-Lucベクターは、3xAREオリゴヌクレオチドをpGL3プロモーターベクターのKpnI-NheIサイトに挿入したものである。【００６４】
ベクターの構築のために使用したオリゴヌクレオチドは、以下の通りである。
ARE：FW；5'-AATTCGGTCACCGTTACTCAGCACTGGTCACCGTTACTCAGCACTGGTCACCGTTACTCAGCACTG-3'（配列番号１）
ReV；5'-TCGACAGTGCTGAGTAACGGTGACCAGTGCTGAGTAACGGTGACCAGTGCTGAGTAACGGTGACCG-3'（配列番号２）
［ヨモギ抽出物／青ジソ抽出物の調製II］
ヨモギ又は青ジソを２倍量の滅菌水を加えて5分間、10000rpmでホモジェナイズした。ホモジェネートを、PTFE（Teflon（登録商標））メッシュフィルターに通し、45000rpmで遠心分離した。この上清をDiaion HP20（三菱化学株式会社製）吸着カラムに通し、99.5％エタノールで溶出した。この溶出液を真空条件下で乾燥させ、抽出物を調製した。さらに、この乾燥させた材料（収率0.1％）を最終濃度が5％（weight/volume %；g/100mL）になるように、エタノールに再懸濁した。実施例２〜６においては、この方法で調製したヨモギ抽出物又は青ジソ抽出物を使用した。【００６５】
チオレドキシン遺伝子活性化の程度が抽出物によって異なるかどうかを試験するため、pTRX-3xARE-WT-Lucを用いて、実施例１（４）に記載される方法でルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。【００６６】
ヨモギ抽出物（最終濃度0.2％）は、図２Ａに示すように、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を約82倍活性化した。コントロールとしてエタノール（最終濃度0.5％）を使用した。【００６７】
青ジソ抽出物（最終濃度0.33％）は、図２Ｂに示すように、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を約32.4倍活性化した。コントロールとしてエタノール（最終濃度0.33％）を使用した。
実施例３【００６８】
ヨモギ抽出物及び青ジソ抽出物によるチオレドキシンの活性化についてさらに試験するため、下記に記載のホモジニアスアッセイにより、チオレドキシンプロモーターの制御下でのルシフェラーゼ遺伝子を観察した。【００６９】
［ホモジニアスアッセイ］
チオレドキシンプロモーターの制御下においてルシフェラーゼ遺伝子を発現するK562細胞を、pTRX(-1148)-Luc及びpMAM2-BSDでトランスフェクションし、その後、ブラストサイジンSによる選択及び限外希釈を行うことで調製した。細胞を、96ウェルプレートに5×104細胞／ウェルの濃度でプレーティングし、DMSO（最終濃度0.1％）、スルフォラファン（10 mM）、エタノール（0.2%）、ヨモギ抽出物又は青ジソ抽出物（［ヨモギ抽出物／青ジソ抽出物の調製II］で得られた抽出物）を、それぞれ最終濃度0.05、0.1又は0.2％になるように加えた）をそれぞれ加え、24時間のインキュベーション後、ルシフェラーゼ遺伝子発現を、Bright-Glo luciferase assay kit（Promega）を用いて解析した。アッセイは、２度行った。【００７０】
ヨモギ抽出物（図３Ａ）又は青ジソ抽出物（図３Ｂ）は、いずれもチオレドキシン遺伝子を用量依存的に活性化した。
実施例４【００７１】
以下に記載のRT-PCR及びreal time RT-PCRの方法を用いて、チオレドキシンmRNA発現に対するヨモギ抽出物又は青ジソ抽出物の効果を観察した。【００７２】
（１）RT-PCR
細胞を、エタノール（最終濃度0.1％）、ヨモギ抽出物又は青ジソ抽出物（それぞれ最終濃度0.1％）で処理した。24時間後、細胞を回収し、リン酸緩衝溶液（PBS）で洗浄した。使用説明に従ってRNeasy Mini Kit（QIAGEN）を用い、トータルRNAを単離した。RT-PCR用のSuperScript III First-strand System（QIAGEN）を用い、使用説明に従って、Oligo(dT)20プライマーでcDNAを合成した。RT条件は、48℃で30分であった。【００７３】
ヒトチオレドキシンに対するオリゴヌクレオチドフォワード（配列番号３）及びリバースプライマー（配列番号４）を、使用説明に従って設計した。サーマルサイクラーを使用し、Klen Taq DNAポリメラーゼ（Sigma）でPCRを行った。PCRの条件は、95℃にて30秒及び48℃にて30秒及び72℃にて1分を22サイクル行った。GAPDH（Glyceraldehyde 3 - phosphate dehydrogenase）の増幅を、内部コントロールとして使用した。【００７４】
（２）Real Time RT-PCR
細胞処理及びトータルRNA単離には、RT-PCRと同じ方法を利用した。細胞処理には、ヨモギ抽出物又は青ジソ抽出物（それぞれ最終濃度0.1％）、スルフォラファン（10mM）を用い、DMSO（最終濃度0.1％）及びエタノール（最終濃度0.1％）をコントロールとして使用した。使用説明に従い、オリゴヌクレオチドフォワード（配列番号５）及びリバースプライマー（配列番号６）、ならびにヒトチオレドキシンに対するTaqManプローブ（配列番号７）を設計した。TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents（Applied Biosystems）を使用し、ABI PRISM7000を用いて96ウェルプレート中にて、定量的Real Time RT-PCRを行った。各反応混合溶液は、最終容量50μl中にの50ngのトータルRNAを含んだ。【００７５】
RT-PCR条件：RTステップは48℃にて30分、PCRステップは95℃にて15秒及び60℃にて1分を40サイクル行った。TaqMan Ribosomal Control Reagents（Applied Biosystems）を使用し、内部コントロールアッセイとして、18S rRNAの増幅を行い、チオレドキシン遺伝子の量を標準化した。【００７６】
チオレドキシンのmRNAレベルは、K562細胞をヨモギ抽出物（図４Ａ及び４Ｂ）又は青ジソ抽出物（図４Ｃ及び４Ｄ）で処理した24時間後、顕著に増加した。
実施例５【００７７】
以下に記載するウェスタンブロット解析の方法により、チオレドキシンタンパク質発現に対するヨモギ抽出物又は青ジソ抽出物の効果を観察した。【００７８】
［ウェスタンブロット解析］
細胞を、ヨモギ抽出物又は青ジソ抽出物（それぞれ最終濃度1％）、エタノール（最終濃度1％）で処理した。48時間後、細胞を回収し、氷冷したリン酸緩衝溶液（PBS）で洗浄し、その後、氷上で30分間、細胞溶解液（solubilizing solution）（10 mM Tris-HCI (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 0.1 mM PMSF, 8 (g/ml アプロチニン及び2(g/ml ロイペプチン)で溶解した。この細胞溶解液を、遠心分離によって精製した。細胞の溶解液は、95℃に5分間おき、その後、15％SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳働で分離した（細胞溶解液：2.5μg）。この分離されたタンパク質を、ポリビニリデンジフロライド膜（PVDF膜：Millipore）に転写した。この膜を、T-PBS（0.05％のTween20を含むPBS）に溶解させた10％（weight/volume）スキムミルクで一晩処理し、抗ヒトチオレドキシンモノクローナル抗体（レドックス・バイオサイエンス株式会社製）で１時間インキュベーションした。その後、ペルオキシダーゼを結合させた抗マウスIgG（1：5000希釈）（Amersham Pharmacia Biotech）で１時間インキュベーションを行った。その後、このエピトープを、ELCウェスタンブロット検出キット（Amersham Pharmacia Biotech）で可視化した。【００７９】
ヨモギ抽出物（図５Ａ）又は青ジソ抽出物（図５Ｂ）で48時間処理したK562細胞において、チオレドキシンタンパク質の発現が増加した。
実施例６【００８０】
チオレドキシンは、酸化ストレスに対して重要なはたらきをするタンパク質であることから、ヨモギ抽出物によるチオレドキシン発現の誘導が、K562細胞における酸化ストレス性の傷害を抑える事ができるかどうかを観察した。以下に記載のLDHアッセイの方法に従い、傷害された細胞からのLDH遊離に対するヨモギ抽出物を用いた前処理の効果を解析した。【００８１】
［LDHアッセイ］
K562細胞を、1×104細胞／ウェルの濃度で96ウェルプレートにプレーティングした。その後、細胞を2％TritonX-100（この値を100%の細胞傷害として換算する）、DMSO（最終濃度0.1％）、スルフォラファン（10μM）、エタノール（0.2%）又はヨモギ抽出物（最終濃度0.05、0.1又は0.2％）で処理した。37℃にて48時間のインキュベーションの後、この細胞を200μMのH2O2で48時間処理した。LDH assay kit（Roche）を用い、使用説明に従って、試料50μl中のLDHの測定を行った。【００８２】
図６に示すように、最終濃度0.05、0.1又は0.2％のヨモギ抽出物で48時間の前処理を行った細胞は、コントロールに比べ、過酸化水素による細胞傷害が顕著に抑制された。【００８３】
従って、ヨモギ抽出物の前処理によるチオレドキシンの誘導が、過酸化水素による酸化ストレスに対して細胞保護のはたらきをすることが示唆された。【００８４】
また、同様の試験を青ジソ抽出物で行った細胞においても、コントロールに比べ、過酸化水素による細胞傷害が顕著に抑制されることが期待される。
【配列表フリーテキスト】
【００８５】
配列番号１は、AREフォワードプライマーである。【００８６】
配列番号２は、AREリバースプライマーである。【００８７】
配列番号３は、ヒトチオレドキシンに対するオリゴヌクレオチドフォワードプライマーである。【００８８】
配列番号４は、ヒトチオレドキシンに対するオリゴヌクレオチドリバースプライマーである。【００８９】
配列番号５は、Real Time RT-PCRで使用したオリゴヌクレオチドフォワードプライマーである。【００９０】
配列番号６は、Real Time RT-PCRで使用したオリゴヌクレオチドリバースプライマーである。【００９１】
配列番号７は、Real Time RT-PCRで使用したヒトチオレドキシンに対するTaqManプローブである。
【図１Ａ】
2006033351.tif 000002
【図１Ｂ】
2006033351.tif 000003
【図２Ａ】
2006033351.tif 000004
【図２Ｂ】
2006033351.tif 000005
【図３Ａ】
2006033351.tif 000006
【図３Ｂ】
2006033351.tif 000007
【図４Ｂ】
2006033351.tif 000008
【図４Ｄ】
2006033351.tif 000009
【図５Ａ】
2006033351.tif 000010
【図５Ｂ】
2006033351.tif 000011
【図６】
2006033351.tif 000012
【図４Ａ】
2006033351.tif 000013
【図４Ｃ】
2006033351.tif 000014
【配列表】
2006033351000001.app
【国際調査報告】
2006033351.tif 000015
2006033351.tif 000016
2006033351.tif 000017
2006033351.tif 000018
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