【手続補正書】
【提出日】令和2年7月6日(2020.7.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
外来性タンパク質を発現する網状赤血球の集団を製造する方法であって、
（ａ）赤血球前駆体細胞の集団を提供することと、
（ｂ）前記赤血球前駆体細胞の集団を分化条件下で培養して、成熟段階における分化している赤血球細胞の集団を提供することと、
（ｃ）前記成熟段階における分化している赤血球細胞の集団の複数の細胞を、前記外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡと、前記複数の細胞による前記ｍＲＮＡの取込みを可能にする条件下で接触させることと、
（ｄ）前記複数の細胞を更に培養して、網状赤血球の集団を提供することと
を含み、それにより、前記外来性タンパク質を発現する網状赤血球の集団を製造する、方法。
【請求項２】
前記成熟段階における分化している赤血球細胞の集団が、成熟培地中で３〜７日間にわたって拡大された集団である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記成熟段階における分化している赤血球細胞の集団が、成熟培地中で４または５日間にわたって拡大された集団である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記成熟段階における分化している赤血球細胞の集団が、成熟培地中で４〜６日間にわたって拡大された集団である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ｍＲＮＡが、脂質ナノ粒子と複合体化している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記接触させることが、遺伝子導入、電気穿孔、低張負荷、細胞圧の変化または細胞変形を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記接触させることが、電気穿孔を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記赤血球前駆体細胞の集団が、ＣＤ３４＋細胞である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団の細胞の少なくとも８４％は、ＧＰＡ陽性である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団の細胞の少なくとも５４％は、バンド３陽性である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団の細胞の少なくとも９５％は、α４インテグリン陽性である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記接触させることの前または後に、前記複数の細胞は、分化している赤血球細胞の集団から分離される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
接触させることの前または後に、前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団を同期させることを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記赤血球前駆細胞が、ヒト細胞である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
本明細書に記載したものと類似の又は均等な方法及び材料を本発明の実践又は試験に使用することができるが、好適な方法及び材料が以下に記載される。本明細書に言及した全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献（例えば、配列データベース参照番号）は、それらの全体が参照により組み込まれる。例えば、例として本明細書の任意の表において本明細書に引用した全てのジェンバンク、Ｕｎｉｇｅｎｅ、及びＥｎｔｒｅｚ配列は、参照により組み込まれる。特に明記しない限り、本明細書（本明細書の任意の表内を含む）に特定した配列受入番号は、２０１６年７月７日現在最新のデータベースエントリーを指す。１つの遺伝子又はタンパク質が複数の配列受入番号を参照する場合、配列変異体の全てが包含される。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む赤血球細胞を作製する方法であって、
ａ）成熟段階における赤血球細胞を提供することと、
ｂ）前記赤血球細胞を、前記外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡと、前記赤血球細胞による前記ｍＲＮＡの取込みを可能にする条件下で接触させること
を含み、それにより、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む赤血球細胞を作製する、方法。
（項目２）
前記赤血球細胞は、前記外来性タンパク質をコードする前記ｍＲＮＡを取込む、項目１に記載の方法。
（項目３）
成熟段階における赤血球細胞の集団を提供することと、前記赤血球細胞の集団の複数の細胞を、前記外来性タンパク質をコードする前記ｍＲＮＡと接触させることとを含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記赤血球細胞の集団の前記複数の細胞は、前記外来性タンパク質をコードする前記ｍＲＮＡをそれぞれ取込む、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記外来性タンパク質をコードする前記ｍＲＮＡの取込み後、前記細胞又は前記複数の細胞は、前記外来性タンパク質を発現する、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記細胞又は前記複数の細胞は、前記外来性タンパク質を含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
成熟段階における前記赤血球細胞の集団は、成熟培地中で３〜７日間、例えば４〜５又は４〜６日間にわたって拡大された細胞の集団である、項目３〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
外来性タンパク質を発現する網状赤血球の集団を製造する方法であって、
（ｅ）赤血球前駆体細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）の集団を提供することと、
（ｆ）前記赤血球前駆体細胞の集団を分化条件下で培養して、分化している赤血球細胞の集団を提供することと、
（ｇ）前記分化している赤血球細胞の集団の複数の細胞を、前記外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡと、前記分化している赤血球細胞の集団の前記複数の細胞による前記ｍＲＮＡの取込みを可能にする条件下で接触させることと、
（ｈ）前記分化している赤血球細胞の集団の前記複数の細胞を更に培養して、網状赤血球の集団を提供することと
を含み、それにより、前記外来性タンパク質を発現する網状赤血球の集団を製造する、方法。
（項目９）
前記更なる培養は、３、２、又は１未満の集団の倍加を含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：
ｉ．ａ）前記集団における前記細胞の２〜４０％、３〜３３％、５〜３０％、１０〜２５％、又は１５〜２０％は、脱核されていること、
ｉ．ｂ）前記集団における前記細胞の０％、０．１％、０．２％、又は０．５％を超えるが、２％、３％、４％、又は５％未満は、脱核されていること、
ｉ．ｃ）前記集団における前記細胞の０％、０．１％、０．２％、又は０．５％を超えるが、６％、１０％、１５％、２０％、又は２５％未満は、脱核されていること、
ｉ．ｄ）前記集団における前記細胞の０％、０．１％、０．２％、又は０．５％を超えるが、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％未満は、脱核されていること、
ｉ．ｅ）前記集団における前記細胞の１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、又は２０％以下は、脱核されていること、
ｉ．ｆ）前記集団における前記細胞の２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％以下は、脱核されていること、
ｉ．ｇ）前記細胞の集団は、最大脱核の６〜７０％、１０〜６０％、２０〜５０％、又は３０〜４０％に到達していること、
ｉ．ｈ）前記細胞の集団は、最大脱核の１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、又は２０％以下に到達していること、
ｉ．ｉ）前記細胞の集団は、最大脱核の２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、又は６０％以下に到達していること、
ｉｉ．ａ）前記細胞の集団は、細胞分裂におけるプラトーから３、２、又は１未満だけ倍加した集団であること、
ｉｉ．ｂ）前記細胞の集団は、３、２、又は１未満の集団の倍加が可能であること、
ｉｉ．ｃ）前記集団は、前記集団が前記集団における細胞の少なくとも７０％の脱核レベルに到達する前に１．５、２、又は３倍以下だけ増大すること、
ｉｉｉ．ａ）前記集団における前記細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）であること、
ｉｉｉ．ｂ）前記集団における前記細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、又は７９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）であること、
ｉｉｉ．ｃ）前記集団における前記細胞の３０〜９０％、４０〜９０％、５０〜９０％、６０〜９０％、又は７０〜９０％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）であること、
ｉｉｉ．ｄ）前記集団における前記細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）の形態を示すこと、
ｉｉｉ．ｅ）前記集団における前記細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、又は７９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）の形態を示すこと、又はｉｉｉ．ｆ）前記集団における前記細胞の３０〜９０％、４０〜９０％、５０〜９０％、６０〜９０％、又は７０〜９０％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）の形態を示すこと
の１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又はそれを超える）を含む赤血球細胞の集団である、項目３〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団は、ｉの特性及びｉｉの特性を含む赤血球細胞の集団である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団は、ｉの特性及びｉｉｉの特性を含む赤血球細胞の集団である、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団は、ｉｉの特性及びｉｉｉの特性を含む赤血球細胞の集団である、項目１０に記載の方法。
（項目１４）
前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団は、ｉの特性、ｉｉの特性、及びｉｉｉの特性を含む赤血球細胞の集団である、項目１０に記載の方法。
（項目１５）
前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例１０のフローサイトメトリーアッセイによって測定されて、前記集団における前記細胞の８４〜９９％、８５〜９５％、又は約９
０％は、ＧＰＡ陽性であることを含む赤血球細胞の集団である、項目３〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例１０のフローサイトメトリーアッセイによって測定されて、前記集団における前記細胞の少なくとも８４％、８５％、９０％、９５％、又は９９％は、ＧＰＡ陽性であることを含む赤血球細胞の集団である、項目３〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例１０のフローサイトメトリーアッセイによって測定されて、前記集団における前記細胞の５４〜９９％、５５〜９８％、６０〜９５％、６５〜９０％、７０〜８５％、又は７５〜８０％は、バンド３陽性であることを含む赤血球細胞の集団である、項目３〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例１０のフローサイトメトリーアッセイによって測定されて、前記集団における前記細胞の少なくとも５４％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％は、バンド３陽性であることを含む赤血球細胞の集団である、項目３〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例１０のフローサイトメトリーアッセイによって測定されて、前記集団における前記細胞の９６〜１００％、９７〜９９％、又は約９８％は、α４インテグリン陽性であることを含む赤血球細胞の集団である、項目３〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例１０のフローサイトメトリーアッセイによって測定されて、前記集団における前記細胞の少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％は、α４インテグリン陽性であることを含む赤血球細胞の集団である、項目３〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記複数の細胞を、前記外来性タンパク質をコードする前記ｍＲＮＡと接触させる前又は接触させた後、前記複数の細胞は、前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団から分離され、例えば、前記複数の細胞は、脱核状態に基づいて前記集団から分離される（例えば、前記複数の細胞は、有核細胞であり、及び前記集団の残りのものは、脱核細胞である）、項目３〜２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記複数の細胞を、前記外来性タンパク質をコードする前記ｍＲＮＡと接触させる前又は接触させた後、例えば前記集団を脱核の阻害剤（例えば、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）の阻害剤、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）の阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の阻害剤、又はプロテアソーム阻害剤）と共にインキュベートすることにより、例えば前記集団の成長、発達、ヘモグロビン合成、又は脱核プロセスを停止させることにより、前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団を同期させることを含む、項目３〜２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
停止は、前記集団における前記細胞の１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０％超の脱核前に行われる、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
外来性タンパク質を発現する網状赤血球の集団を製造する方法であって、
（ｉ）赤血球前駆体細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）の集団を提供することと、
（ｊ）前記赤血球前駆体細胞の集団を分化条件下で培養して、分化している赤血球細胞の集団を提供することと、
（ｋ）前記分化している赤血球細胞を、前記外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡと、前記分化している赤血球細胞による前記ｍＲＮＡの取込みを可能にする条件下で接触させることであって、前記分化している赤血球細胞の集団が０．１〜２５％脱核されている（例えば、０．１〜２０％脱核されている、０．１〜１５％脱核されている、０．１〜１２％脱核されている、又は０．１〜１０％脱核されている）ときに行われる、接触させることと、
（ｌ）前記分化している赤血球細胞を更に培養して、網状赤血球の集団を提供することとを含み、それにより、前記外来性タンパク質を発現する網状赤血球の集団を製造する、方法。
（項目２５）
前記更なる培養は、３、２、又は１未満の集団の倍加を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記接触は、前記分化している赤血球細胞の少なくとも５０％（少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、又は９５％）が正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）の形態を示すときに行われる、項目２４又は２５に記載の方法。
（項目２７）
外来性タンパク質を発現する網状赤血球の集団を製造する方法であって、（ａ）赤血球前駆体細胞の集団を提供することと、（ｂ）前記赤血球前駆体細胞の集団を分化条件下で培養して、分化している赤血球細胞の集団を提供することと、（ｃ）前記分化している赤血球細胞を、前記外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡと接触させることとを含み、改善は、前記接触が、前記分化している赤血球細胞の集団が０．１〜２５％脱核されている（例えば、０．１〜２０％脱核されている、０．１〜１５％脱核されている、０．１〜１２％脱核されている、又は０．１〜１０％脱核されている）ときに行われることを含む、方法。
（項目２８）
前記接触は、前記分化している赤血球細胞の集団が細胞分裂におけるプラトーの前に３、２、又は１未満の集団の倍加を有するときに行われる、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記接触は、前記分化している赤血球細胞の少なくとも５０％（少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、又は９５％）が正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）の形態を示すときに行われる、項目２７又は２８に記載の方法。
（項目３０）
異種非翻訳領域（ＵＴＲ）に作動可能に結合されたコード領域を含む外来性ｍＲＮＡを含み、前記異種ＵＴＲは、調節エレメントを含む、赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞。
（項目３１）
表１の１つ以上の化学修飾ヌクレオチド、表２の１つ以上の化学的バックボーン修飾、表３の１つ以上の化学修飾キャップ、又はそれらの任意の組み合わせを含む外来性ｍＲＮＡを含む赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞。
（項目３２）
赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞を生成する方法であって、
ａ）赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を、調節エレメントを含む異種ＵＴＲに作動可能に結合されたコード領域を含む外来性ｍＲＮＡ（例えば、単離ＲＮＡ又はインビトロ転写ＲＮＡ）と接触させることと、
ｂ）前記接触された赤血球細胞を前記外来性ｍＲＮＡの取込みに好適な条件下で維持する
ことと
を含み、それにより、前記赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞を生成する、方法。
（項目３３）
赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞を生成する方法であって、
ａ）赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を、表１の１つ以上の化学修飾ヌクレオチド、表２の１つ以上の化学的バックボーン修飾、表３の１つ以上の化学修飾キャップ、又はそれらの任意の組み合わせを含む外来性ｍＲＮＡと接触させることと、
ｂ）前記接触された赤血球細胞を前記外来性ｍＲＮＡの取込みに好適な条件下で維持することと
を含み、それにより、前記赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞を生成する、方法。
（項目３４）
脱核赤血球細胞における外来性タンパク質を生成する方法であって、
ａ）調節エレメントを含む異種ＵＴＲに作動可能に結合されたコード領域を含む外来性ｍＲＮＡ（例えば、単離ＲＮＡ又はインビトロ転写ＲＮＡ）を含む赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を提供し、且つ、
ｂ）前記赤血球細胞を前記外来性タンパク質の生成に好適な条件下で培養し、それにより、前記外来性タンパク質を生成する、方法。
（項目３５）
脱核赤血球細胞における外来性タンパク質を生成する方法であって、
ａ）表１の１つ以上の化学修飾ヌクレオチド、表２の１つ以上の化学的バックボーン修飾、表３の１つ以上の化学修飾キャップ、又はそれらの任意の組み合わせを含む赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を提供し、且つ、
ｂ）前記赤血球細胞を前記外来性タンパク質の生成に好適な条件下で培養し、それにより、前記外来性タンパク質を生成する、方法。
（項目３６）
外来性タンパク質を対象に提供するか、外来性タンパク質を生成することができる脱核赤血球細胞を対象に提供するか、又は対象を処置する方法であって、
調節エレメントを含む異種ＵＴＲに作動可能に結合されたコード領域を含む外来性ｍＲＮＡ（例えば、単離ＲＮＡ又はインビトロ転写ＲＮＡ）を含む赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を前記対象に投与すること
を含み、それにより、外来性タンパク質を対象に提供するか、外来性タンパク質を生成することができる脱核赤血球細胞を対象に提供するか、又は対象を処置する、方法。
（項目３７）
外来性タンパク質を対象に提供するか、外来性タンパク質を生成することができる脱核赤血球細胞を対象に提供するか、又は対象を処置する方法であって、
表１の１つ以上の化学修飾ヌクレオチド、表２の１つ以上の化学的バックボーン修飾、表３の１つ以上の化学修飾キャップ、又はそれらの任意の組み合わせを含む外来性ｍＲＮＡを含む赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を前記対象に投与すること
を含み、それにより、外来性タンパク質を対象に提供するか、外来性タンパク質を生成することができる脱核赤血球細胞を対象に提供するか、又は対象を処置する、方法。
（項目３８）
赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞（又は前記細胞のバッチ）を評価する方法であって、
ａ）調節エレメントを含む異種ＵＴＲに作動可能に結合されたコード領域を含む外来性ｍＲＮＡを含む赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞（又は前記細胞のバッチ）を提供することと、
ｂ）前記赤血球細胞、例えば前記有核赤血球細胞（又は前記細胞のバッチ）を、予め選択されたパラメーターに関して評価することと
を含み、それにより、前記赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞（又は前記細胞のバッチ）を評価する、方法。
（項目３９）
赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞（又は前記細胞のバッチ）を評価する方法であって、
ａ）表１の１つ以上の化学修飾ヌクレオチド、表２の１つ以上の化学的バックボーン修飾、表３の１つ以上の化学修飾キャップ、又はそれらの任意の組み合わせを含む赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を提供することと、
ｂ）前記赤血球細胞、例えば前記有核赤血球細胞（又は前記細胞のバッチ）を、予め選択されたパラメーターに関して評価することと
を含み、それにより、前記赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞（又は前記細胞のバッチ）を評価する、方法。
（項目４０）
前記集団における前記細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、例えば、前記ｍＲＮＡと接触させてから５日後に前記外来性タンパク質を含む、項目３０に記載の方法。
（項目４１）
前記集団における前記細胞は、例えば、前記ｍＲＮＡとの前記接触から５日後に前記外来性タンパク質の少なくとも１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、又は１００，０００コピーを含む、項目３０に記載の方法。
（項目４２）
前記細胞は、前記ｍＲＮＡと接触させた後、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５日間にわたって前記外来性タンパク質の少なくとも１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、又は１００，０００コピーを含む、項目３０に記載の方法。
（項目４３）
外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む赤血球細胞を作製する方法であって、
赤血球細胞及び前記外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む反応混合物を、例えば前記反応混合物中にリボヌクレアーゼ阻害剤を含めることにより、ｍＲＮＡの分解を阻害する条件下で提供することと、
前記赤血球細胞による前記ｍＲＮＡの取込みを可能にする条件下で前記反応混合物を維持することと
を含み、それにより、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む赤血球細胞を作製する、方法。
（項目４４）
赤血球細胞の集団を提供することと、前記集団を、前記外来性タンパク質をコードする前記ｍＲＮＡと接触させることとを含む、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記集団の複数の赤血球細胞は、前記外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡをそれぞれ取込む、項目４３又は４４に記載の方法。
（項目４６）
前記細胞又は複数の細胞は、前記外来性タンパク質を発現する、項目４３〜４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記細胞又は複数の細胞は、前記外来性タンパク質を含む、項目４３〜４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記細胞又は細胞の集団を電気穿孔することを更に含む、項目４３〜４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
赤血球細胞の集団をリボヌクレアーゼ阻害剤と接触させることを更に含む、項目４３〜４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記細胞を前記ｍＲＮＡと接触させる前、接触させている間、又は接触させた後、前記細胞の集団を前記リボヌクレアーゼ阻害剤と接触させることを含む、項目４３〜４９のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
成熟段階の４、５、又は６日目に前記細胞を前記リボヌクレアーゼ阻害剤と接触させることを含む、項目４３〜５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記細胞は、成熟段階にある、項目４３〜５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記細胞が、以下の特性：
ｉ．ａ）前記集団における前記細胞の２〜４０％、３〜３３％、５〜３０％、１０〜２５％、又は１５〜２０％は、脱核されていること、
ｉ．ｂ）前記集団における前記細胞の０％、０．１％、０．２％、又は０．５％を超えるが、２％、３％、４％、又は５％未満は、脱核されていること、
ｉ．ｃ）前記集団における前記細胞の０％、０．１％、０．２％、又は０．５％を超えるが、６％、１０％、１５％、２０％、又は２５％未満は、脱核されていること、
ｉ．ｄ）前記集団における前記細胞の０％、０．１％、０．２％、又は０．５％を超えるが、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％未満は、脱核されていること、
ｉ．ｅ）前記集団における前記細胞の１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、又は２０％以下は、脱核されていること、
ｉ．ｆ）前記集団における前記細胞の２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％以下は、脱核されていること、
ｉ．ｇ）前記細胞の集団は、最大脱核の６〜７０％、１０〜６０％、２０〜５０％、又は３０〜４０％に到達していること、
ｉ．ｈ）前記細胞の集団は、最大脱核の１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、又は２０％以下に到達していること、
ｉ．ｉ）前記細胞の集団は、最大脱核の２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、又は６０％以下に到達していること、
ｉｉ．ａ）前記細胞の集団は、細胞分裂におけるプラトーから３、２、又は１未満だけ倍加した集団であること、
ｉｉ．ｂ）前記細胞の集団は、３、２、又は１未満の集団の倍加が可能であること、
ｉｉ．ｃ）前記集団は、前記集団が前記集団における細胞の少なくとも７０％の脱核レベルに到達する前に１．５、２、又は３倍以下だけ増大すること、
ｉｉｉ．ａ）前記集団における前記細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）であること、
ｉｉｉ．ｂ）前記集団における前記細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、又は７９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）であること、
ｉｉｉ．ｃ）前記集団における前記細胞の３０〜９０％、４０〜９０％、５０〜９０％、６０〜９０％、又は７０〜９０％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）であること、
ｉｉｉ．ｄ）前記集団における前記細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）の形態を示すこと、
ｉｉｉ．ｅ）前記集団における前記細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、又は７９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）の形態を示すこと、又は
ｉｉｉ．ｆ）前記集団における前記細胞の３０〜９０％、４０〜９０％、５０〜９０％、６０〜９０％、又は７０〜９０％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）の形態を示すこと
の１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４
、１５、１６、１７、又はそれを超える）を含む時点で前記細胞を前記リボヌクレアーゼ阻害剤と接触させることを含む、項目４３〜５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
前記赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉの特性及びｉｉの特性を含む赤血球細胞の集団である、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉの特性及びｉｉｉの特性を含む赤血球細胞の集団である、項目５３に記載の方法。
（項目５６）
前記赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉｉの特性及びｉｉｉの特性を含む赤血球細胞の集団である、項目５３に記載の方法。
（項目５７）
前記赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉの特性、ｉｉの特性、及びｉｉｉの特性を含む赤血球細胞の集団である、項目５３に記載の方法。
（項目５８）
（例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例１０のフローサイトメトリーアッセイにより）前記細胞が、以下の特性：
前記集団における前記細胞の８４〜９９％、８５〜９５％、又は約９０％は、ＧＰＡ陽性であること、
前記集団における前記細胞の少なくとも８４％、８５％、９０％、９５％、又は９９％は、ＧＰＡ陽性であること、
前記集団における前記細胞の５４〜９９％、５５〜９８％、６０〜９５％、６５〜９０％、７０〜８５％、又は７５〜８０％は、バンド３陽性であること、
前記集団における前記細胞の少なくとも５４％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％は、バンド３陽性であること、
前記集団における前記細胞の９６〜１００％、９７〜９９％、又は約９８％は、α４インテグリン陽性であること、又は
前記集団における前記細胞の少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％は、α４インテグリン陽性であること
の１つ以上（例えば、２、３、４、５、又はそれを超える）を含む時点で前記細胞を前記リボヌクレアーゼ阻害剤と接触させることを含む、項目４３〜５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記ｍＲＮＡは、インビトロ転写ｍＲＮＡである、項目４３〜５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
前記集団の前記細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％は、前記細胞が前記ｍＲＮＡと接触されてから５日後に生存可能である、項目４３〜５９のいずれか一項に記載の方法。
（項目６１）
前記集団の前記細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％は、前記細胞が前記ｍＲＮＡと接触されてから５日後に脱核されている、項目４３〜６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
細胞が前記ｍＲＮＡと接触されてから５日後に脱核されている前記細胞の割合は、前記リボヌクレアーゼ阻害剤で処理されていない他に同様の細胞の集団における脱核されている細胞の割合の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％である、項目４３〜６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
前記細胞の集団は、前記細胞が前記ｍＲＮＡと接触される時点で少なくとも１×１０６、２×１０６、５×１０６、１×１０７、２×１０７、５×１０７、又は１×１０８細胞を含む、項目４３〜６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
前記細胞の集団は、前記細胞が前記ｍＲＮＡと接触されてから５日以内に少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％だけ拡大する、項目４３〜６３のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
前記集団の前記細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、例えば、前記細胞が前記ｍＲＮＡと接触されてから５日後に前記外来性タンパク質を発現する、項目４３〜６４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６６）
前記集団の前記細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、例えば、前記細胞が前記ｍＲＮＡと接触されてから５日後に前記外来性タンパク質の少なくとも１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、又は１００，０００コピーを含む、項目４３〜６５のいずれか一項に記載の方法。
（項目６７）
前記細胞の集団は、前記リボヌクレアーゼ阻害剤で処理されていない他に同様の細胞の集団よりも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％だけ多い、又は少なくとも２倍、３倍、４倍、若しくは５倍だけ多い前記外来性タンパク質を含む、項目４３〜６６のいずれか一項に記載の方法。
（項目６８）
ｉ）赤血球細胞、ｉｉ）外来性タンパク質を含むｍＲＮＡ、及びｉｉｉ）リボヌクレアーゼ阻害剤を含む反応混合物。
（項目６９）
前記ｍＲＮＡは、前記赤血球細胞内にある、項目６８に記載の反応混合物。
（項目７０）
複数の赤血球細胞を含む、項目６８又は６９に記載の反応混合物。
（項目７１）
リボヌクレアーゼ阻害剤のための外来性タンパク質を含む脱核赤血球細胞を含む反応混合物をアッセイする方法であって、
外来性タンパク質を含む脱核赤血球細胞を含む反応混合物を提供することと、
例えば、前記反応混合物のアリコートにおける例えばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、又は質量分析により、リボヌクレアーゼ阻害剤の存在又はレベルに関してアッセイすることと
を含む方法。
（項目７２）
前記リボヌクレアーゼ阻害剤のレベルを基準値と比較することを更に含む、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
前記比較に応答して、
前記集団を、例えば必須要件を満たすか又は必須要件を満たさないとして分類することであって、例えば、前記必須要件は、前記リボヌクレアーゼ阻害剤のレベルが前記基準値を下回る場合に満たされる、分類すること、
例えば、前記リボヌクレアーゼ阻害剤のレベルが前記基準値を上回る場合、前記集団が、続く精製ステップに好適であるとき、前記集団を、続く処理ステップに好適であるか又は好適でないとして分類すること、
前記集団を、治療としての使用に好適である、又は好適でないとして分類すること、又は例えば、前記リボヌクレアーゼ阻害剤のレベルが前記基準値を下回る場合、前記集団又は
そのアリコートを治療的使用のために処方又は包装すること
の１つ以上を更に含む、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記リボヌクレアーゼ阻害剤は、ＲＮＡｓｉｎ  Ｐｌｕｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｏｒ  ＲＮＡｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、又はＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｈｕｍａである、項目４３〜７３のいずれか一項に記載の反応混合物又は方法。
（項目７５）
外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む赤血球細胞を作製する方法であって、
赤血球細胞及び前記外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む反応混合物を、例えば前記反応混合物中にプロテアソーム阻害剤を含めることにより、タンパク質分解を阻害する条件下で提供することと、
前記赤血球細胞による前記ｍＲＮＡの取込みを可能にする条件下で前記反応混合物を維持することと
を含み、それにより、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む赤血球細胞を作製する、方法。
（項目７６）
赤血球細胞の集団を提供することと、前記集団を、前記外来性タンパク質をコードする前記ｍＲＮＡと接触させることとを含む、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
前記集団の複数の赤血球細胞は、前記外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡをそれぞれ取込む、項目７５又は７６に記載の方法。
（項目７８）
前記細胞又は複数の細胞は、前記外来性タンパク質を発現する、項目７５〜７７のいずれか一項に記載の方法。
（項目７９）
前記細胞又は複数の細胞は、前記外来性タンパク質を含む、項目７５〜７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８０）
前記細胞又は細胞の集団を電気穿孔することを更に含む、項目７５〜７９のいずれか一項に記載の方法。
（項目８１）
赤血球細胞の集団をプロテアソーム阻害剤と接触させることを更に含む、項目７５〜８０のいずれか一項に記載の方法。
（項目８２）
前記細胞を前記ｍＲＮＡと接触させる前、接触させている間、又は接触させた後、例えば前記細胞を前記ｍＲＮＡと接触させる０．５〜２日前又は後に前記細胞の集団を前記プロテアソーム阻害剤と接触させることを含む、項目７５〜８１のいずれか一項に記載の方法。
（項目８３）
成熟段階の４、５、又は６日目に前記細胞を前記プロテアソーム阻害剤と接触させることを含む、項目７５〜８２のいずれか一項に記載の方法。
（項目８４）
前記細胞は、成熟段階にある、項目７５〜８３のいずれか一項に記載の方法。
（項目８５）
前記細胞が、以下の特性：
ｉ．ａ）前記集団における前記細胞の２〜４０％、３〜３３％、５〜３０％、１０〜２５％、又は１５〜２０％は、脱核されていること、
ｉ．ｂ）前記集団における前記細胞の０％、０．１％、０．２％、又は０．５％を超えるが、２％、３％、４％、又は５％未満は、脱核されていること、
ｉ．ｃ）前記集団における前記細胞の０％、０．１％、０．２％、又は０．５％を超え
るが、６％、１０％、１５％、２０％、又は２５％未満は、脱核されていること、
ｉ．ｄ）前記集団における前記細胞の０％、０．１％、０．２％、又は０．５％を超えるが、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％未満は、脱核されていること、
ｉ．ｅ）前記集団における前記細胞の１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、又は２０％以下は、脱核されていること、
ｉ．ｆ）前記集団における前記細胞の２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％以下は、脱核されていること、
ｉ．ｇ）前記細胞の集団は、最大脱核の６〜７０％、１０〜６０％、２０〜５０％、又は３０〜４０％に到達していること、
ｉ．ｈ）前記細胞の集団は、最大脱核の１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、又は２０％以下に到達していること、
ｉ．ｉ）前記細胞の集団は、最大脱核の２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、又は６０％以下に到達していること、
ｉｉ．ａ）前記細胞の集団は、細胞分裂におけるプラトーから３、２、又は１未満だけ倍加した集団であること、
ｉｉ．ｂ）前記細胞の集団は、３、２、又は１未満の集団の倍加が可能であること、
ｉｉ．ｃ）前記集団は、前記集団が前記集団における細胞の少なくとも７０％の脱核レベルに到達する前に１．５、２、又は３倍以下だけ増大すること、
ｉｉｉ．ａ）前記集団における前記細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）であること、
ｉｉｉ．ｂ）前記集団における前記細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、又は７９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）であること、
ｉｉｉ．ｃ）前記集団における前記細胞の３０〜９０％、４０〜９０％、５０〜９０％、６０〜９０％、又は７０〜９０％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）であること、
ｉｉｉ．ｄ）前記集団における前記細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）の形態を示すこと、
ｉｉｉ．ｅ）前記集団における前記細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、又は７９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）の形態を示すこと、又は
ｉｉｉ．ｆ）前記集団における前記細胞の３０〜９０％、４０〜９０％、５０〜９０％、６０〜９０％、又は７０〜９０％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）の形態を示すこと
の１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又はそれを超える）を含む時点で前記細胞を前記プロテアソーム阻害剤と接触させることを含む、項目７５〜８４のいずれか一項に記載の方法。
（項目８６）
前記赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉの特性及びｉｉの特性を含む赤血球細胞の集団である、項目８５に記載の方法。
（項目８７）
前記赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉの特性及びｉｉｉの特性を含む赤血球細胞の集団である、項目８５に記載の方法。
（項目８８）
前記赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉｉの特性及びｉｉｉの特性を含む赤血球細胞の集団である、項目８５に記載の方法。
（項目８９）
前記赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉの特性、ｉｉの特性、及びｉｉｉの特性を含む赤血球細胞の集団である、項目８５に記載の方法。
（項目９０）
（例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例１０のフローサイトメトリー
アッセイにより）前記細胞が、以下の特性：
前記集団における前記細胞の８４〜９９％、８５〜９５％、又は約９０％は、ＧＰＡ陽性であること、
前記集団における前記細胞の少なくとも８４％、８５％、９０％、９５％、又は９９％は、ＧＰＡ陽性であること、
前記集団における前記細胞の５４〜９９％、５５〜９８％、６０〜９５％、６５〜９０％、７０〜８５％、又は７５〜８０％は、バンド３陽性であること、
前記集団における前記細胞の少なくとも５４％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％は、バンド３陽性であること、
前記集団における前記細胞の９６〜１００％、９７〜９９％、又は約９８％は、α４インテグリン陽性であること、又は
前記集団における前記細胞の少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％は、α４インテグリン陽性であること
の１つ以上（例えば、２、３、４、５、又はそれを超える）を含む時点で前記細胞を前記プロテアソーム阻害剤と接触させることを含む、項目７５〜８９のいずれか一項に記載の方法。
（項目９１）
前記ｍＲＮＡは、インビトロ転写ｍＲＮＡである、項目７５〜９０のいずれか一項に記載の方法。
（項目９２）
前記集団の前記細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、前記細胞が前記ｍＲＮＡと接触されてから５日後に生存可能である、項目７５〜９１のいずれか一項に記載の方法。
（項目９３）
前記集団の前記細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％は、前記細胞が前記ｍＲＮＡと接触されてから５日後に脱核されている、項目７５〜９２のいずれか一項に記載の方法。
（項目９４）
前記細胞が前記ｍＲＮＡと接触されてから５日後に脱核されている細胞の割合は、前記プロテアソーム阻害剤で処理されていない他に同様の細胞の集団における脱核されている細胞の割合の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％である、項目７５〜９３のいずれか一項に記載の方法。
（項目９５）
前記細胞の集団は、前記細胞が前記ｍＲＮＡと接触される時点で少なくとも１×１０６、２×１０６、５×１０６、１×１０７、２×１０７、５×１０７、又は１×１０８細胞を含む、項目７５〜９４のいずれか一項に記載の方法。
（項目９６）
前記細胞の集団は、前記細胞が前記ｍＲＮＡと接触されてから５日以内に少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％だけ拡大する、項目７５〜９５のいずれか一項に記載の方法。
（項目９７）
前記集団の前記細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、例えば、前記細胞が前記ｍＲＮＡと接触されてから５日後に前記外来性タンパク質を発現する、項目７５〜９６のいずれか一項に記載の方法。
（項目９８）
前記集団の前記細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、例えば、前記細胞が前記ｍＲＮＡと接触されてから５日後に前記外来性タンパク質の少なくとも１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、又は１００，０００コピーを含む、項目７５〜９７のいずれか一項
に記載の方法。
（項目９９）
前記細胞の集団は、前記プロテアソーム阻害剤で処理されていない他に同様の細胞の集団よりも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％だけ多い、又は少なくとも２倍、３倍、４倍、若しくは５倍だけ多い前記外来性タンパク質を含む、項目７５〜９８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１００）
ｉ）赤血球細胞、ｉｉ）外来性タンパク質を含むｍＲＮＡ、及びｉｉｉ）プロテアソーム阻害剤を含む反応混合物。
（項目１０１）
前記ｍＲＮＡは、前記赤血球細胞内にある、項目１００に記載の反応混合物。
（項目１０２）
複数の赤血球細胞を含む、項目１００又は１０１に記載の反応混合物。
（項目１０３）
プロテアソーム阻害剤のための外来性タンパク質を含む脱核赤血球細胞を含む反応混合物をアッセイする方法であって、
外来性タンパク質を含む脱核赤血球細胞を含む反応混合物を提供することと、
例えば、前記反応混合物のアリコートにおける例えばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、又は質量分析により、プロテアソーム阻害剤の存在又はレベルに関してアッセイすることと
を含む方法。
（項目１０４）
前記プロテアソーム阻害剤のレベルを基準値と比較することを更に含む、項目１０３に記載の方法。
（項目１０５）
前記比較に応答して、
前記集団を、例えば必須要件を満たすか又は必須要件を満たさないとして分類することであって、例えば、前記必須要件は、前記プロテアソーム阻害剤のレベルが前記基準値を下回る場合に満たされる、分類すること、
例えば、前記プロテアソーム阻害剤のレベルが前記基準値を上回る場合、前記集団が、続く精製ステップに好適であるとき、前記集団を、続く処理ステップに好適であるか又は好適でないとして分類すること、
前記集団を、治療としての使用に好適である、又は好適でないとして分類すること、又は例えば、前記プロテアソーム阻害剤のレベルが前記基準値を下回る場合、前記集団又はそのアリコートを治療的使用のために処方又は包装すること
の１つ以上を更に含む、項目１０４に記載の方法。
（項目１０６）
前記プロテアソーム阻害剤は、２０Ｓプロテアソーム阻害剤、例えばＭＧ−１３２若しくはカルフィルゾミブ、又は２６Ｓプロテアソーム阻害剤、例えばボルテゾミブである、項目７５〜１０５のいずれか一項に記載の反応混合物又は方法。
（項目１０７）
第１の外来性タンパク質及び第２の外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む赤血球細胞を作製する方法であって、
ａ）例えば、成熟段階における赤血球細胞を提供することと、
ｂ）前記赤血球細胞を、前記第１の外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡ及び前記第２の外来性タンパク質をコードする第２のｍＲＮＡと、前記赤血球細胞による前記第１のｍＲＮＡ及び前記第２のｍＲＮＡの取込みを可能にする条件下で接触させることと
を含み、それにより、前記第１のｍＲＮＡ及び前記第２のｍＲＮＡを含む赤血球細胞を作製する、方法。
（項目１０８）
前記赤血球細胞は、例えば、前記ｍＲＮＡとの前記接触から５日後に前記第１の外来性タンパク質及び前記第２の外来性タンパク質の少なくとも１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、又は１００，０００コピーを含む、項目１０７に記載の方法。
（項目１０９）
第１の外来性タンパク質及び第２の外来性タンパク質を発現する赤血球細胞の集団を生成する方法であって、
ａ）例えば、成熟段階における赤血球細胞の集団を提供することと、
ｂ）前記赤血球細胞の集団を、第１の外来性タンパク質をコードする第１のｍＲＮＡ及び第２の外来性タンパク質をコードする第２のｍＲＮＡと接触させることと
を含み、それにより、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む赤血球細胞を作製する、方法であって、前記集団における細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％は、前記第１のｍＲＮＡ及び前記第２のｍＲＮＡの両方を含む、方法。
（項目１１０）
前記赤血球細胞の集団は、例えば、前記ｍＲＮＡとの前記接触から５日後に１細胞当たり前記第１の外来性タンパク質及び前記第２の外来性タンパク質の少なくとも平均１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、又は１００，０００コピーを含む、項目１０９に記載の方法。
（項目１１１）
前記接触は、電気穿孔を行うことを含む、項目１０７〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１２）
前記細胞の集団は、細胞が前記第１及び第２のｍＲＮＡと接触された後、少なくとも５日間にわたって前記細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％において前記第１の外来性タンパク質及び前記第２の外来性タンパク質を含む、項目１０９〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１３）
前記集団における細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％は、第１の外来性タンパク質及び第２の外来性タンパク質を発現し、前記集団は、前記細胞を、前記第１又は第２の外来性タンパク質をコードするＤＮＡと接触させることによって作製されたものではない、赤血球細胞の集団。
（項目１１４）
１細胞当たり外来性タンパク質の所定の数のコピーを含む複数の赤血球細胞を生成する方法であって、前記集団を、前記外来性タンパク質をコードする所定の量のｍＲＮＡと接触させることを含み、それにより、前記所定の量の前記外来性タンパク質を含む前記赤血球細胞を作製する、方法。
（項目１１５）
前記複数の赤血球細胞（例えば、脱核赤血球細胞）の１つ以上を評価して、前記外来性タンパク質の量を決定することを更に含む、項目１１４に記載の方法。
（項目１１６）
赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞のサンプル中の外来性タンパク質の量を評価する方法であって、
１細胞当たり外来性タンパク質の所定の数のコピーを含む複数の赤血球細胞を提供することであって、前記複数の赤血球細胞は、前記集団を、前記外来性タンパク質をコードする所定の量のｍＲＮＡと接触させることによって作製されたものである、提供することと、前記複数の赤血球細胞における前記外来性タンパク質の量を決定することと
を含む方法。
（項目１１７）
前記細胞集団を、前記集団における５Ｅ６細胞当たり０．６±２０％ｕｇのｍＲＮＡと
接触させることは、１細胞当たり前記外来性タンパク質の１，０００，０００±２０％のコピーを発現する細胞の集団を産出し、
前記細胞集団を、前記集団における５Ｅ６細胞当たり０．４±２０％ｕｇのｍＲＮＡと接触させることは、１細胞当たり前記外来性タンパク質の８７０，０００±２０％のコピーを発現する細胞の集団を産出し、
前記細胞集団を、前記集団における５Ｅ６細胞当たり０．２±２０％ｕｇのｍＲＮＡと接触させることは、１細胞当たり前記外来性タンパク質の６１０，０００±２０％のコピーを発現する細胞の集団を産出し、
前記細胞集団を、前記集団における５Ｅ６細胞当たり０．１±２０％ｕｇのｍＲＮＡと接触させることは、１細胞当たり前記外来性タンパク質の２７０，０００±２０％のコピーを発現する細胞の集団を産出し、
前記細胞集団を、前記集団における５Ｅ６細胞当たり０．０５±２０％ｕｇのｍＲＮＡと接触させることは、１細胞当たり前記外来性タンパク質の１００，０００±２０％のコピーを発現する細胞の集団を産出し、又は
前記細胞集団を、前記集団における５Ｅ６細胞当たり０．０２５±２０％ｕｇのｍＲＮＡと接触させることは、１細胞当たり前記外来性タンパク質の４３，０００±２０％のコピーを発現する細胞の集団を産出する、項目１１４〜１１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１８）
前記集団の前記細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、前記細胞が前記外来性タンパク質と接触されてから１日後に前記外来性タンパク質を発現する、項目１１４〜１１７のいずれか一項に記載の方法。