【手続補正書】
【提出日】令和2年8月12日(2020.8.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
【図１】例示的な典型的な高効率塩基編集システムの図。その２つのヌクレアーゼドメインのうち１つにおいて触媒的に不活性化性の変異を有するニック導入性Ｃａｓ９（ｎＣａｓ９）は、ｓｇＲＮＡの可変性のスペーサー配列によって指示される標的部位に結合する。安定なＲループの形成は、脱アミノ化されていない鎖上にｓｓＤＮＡ編集ウインドウを創出する。Ｃａｓ９は、ゲノムＤＮＡ中に一本鎖切断を創出し、宿主細胞が、脱アミノ化された鎖を鋳型として使用して損傷を修復するのを促進し、そうして、シトシン→チミン遷移置換に向けて修復を偏らせる。
【図２Ａ−２Ｂ】図２Ａおよび２Ｂは、それぞれ、認識ループ１（ＲＬ１）およびループ７についてのアラインメントを示す図である。両方の領域は、全てのタンパク質にわたって低い保存を示し、各酵素の配列特異性に顕著に寄与することが実験的に実証されている、または相同性に基づいて寄与すると予測される。Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックスによって実施し、Ｇｅｎｅｉｏｕｓにおいて可視化したアラインメント。
【図３Ａ−３Ｂ】ＡＰＯ３ＡとｓｓＤＮＡ基質との間で形成されるタンパク質−ＤＮＡ接触の図である。ＲＬ１残基はマゼンタで示され、ループ７残基は赤で示され、ｓｓＤＮＡ基質は黄色で示され、ＡＰＯ３Ａの残りの残基は灰色で示される。図３Ａは、本発明者らが、本明細書に記載されるデアミナーゼドメイン（配列番号１〜９）の特異性を変更または増強するために置換変異をなすことを提案する、ＲＬ１およびループ７中の全ての残基の配向を示す。図３Ｂは、−１位（標的Ｃに対して）におけるチミンとＤ１３１（配列番号１０〜１８）との間で形成される、黒の破線で示される塩基特異的水素結合を示す。ＰＤＢコード：５ＳＷＷ。
【図４】ＡＰＯ３Ａ−ｎＣａｓ９−ＵＧＩタンパク質を、ゲノムに組み込まれたＥＧＦＰ遺伝子内の部位を標的化するガイドＲＮＡ（配列番号１９）と共に、Ｕ２ＯＳ細胞において過剰発現させたグラフである。７２時間後、ゲノムＤＮＡをこれらの細胞から抽出し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定に供した。スペーサー内の各シトシンヌクレオチドについてのＣ＞Ｔ遷移の頻度を、単一残基置換を有する１５個のＡＰＯ３Ａバリアントの各々についてプロットした。
【図５】ＡＰＯ３Ａ−ｎＣａｓ９−ＵＧＩタンパク質を、ゲノムに組み込まれたＥＧＦＰ遺伝子内の部位を標的化するガイドＲＮＡ（配列番号１９）と共に、Ｕ２ＯＳ細胞において過剰発現させたグラフである。７２時間後、ゲノムＤＮＡをこれらの細胞から抽出し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定に供した。スペーサー内の各シトシンヌクレオチドについてのＣ＞Ｔ遷移の頻度を、Ｎ５７またはＫ６０において単一残基置換を有するＡＰＯ３Ａ−ｎＣａｓ９−ＵＧＩタンパク質についてプロットした。これらのタンパク質の各々は、野生型塩基エディタータンパク質と比較して減少された効率で、編集ウインドウ内のオフターゲットＧＣＴモチーフを脱アミノ化したが、編集ウインドウ内のオンターゲットＴＣＧモチーフにおいては効率的な脱アミノ化活性を保持した。
【図６】ＥＧＦＰ部位１におけるオンターゲットＴＣＧおよびオフターゲットＧＣＴモチーフ（共に編集ウインドウ中にある）についてのシトシンからチミンへの編集効率の比が、単一残基置換を有するＡＰＯ３Ａ−ｎＣａｓ９−ＵＧＩタンパク質の各々についてプロットされたグラフである。Ｎ５７またはＫ６０置換を有するタンパク質は、野生型ＡＰＯ３Ａ塩基エディタータンパク質と比較して、増加した特異性比を有する。
【図７】ＡＰＯ３Ａ−ｎＣａｓ９−ＵＧＩタンパク質を、ゲノムに組み込まれたＥＧＦＰ遺伝子内の部位を標的化するガイドＲＮＡ（配列番号２０）と共に、Ｕ２ＯＳ細胞において過剰発現させたグラフである。７２時間後、ゲノムＤＮＡをこれらの細胞から抽出し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定に供した。スペーサー内の各シトシンヌクレオチドについてのＣ＞Ｔ遷移の頻度を、各塩基エディタータンパク質についてプロットした。
【図８】ＥＧＦＰ部位２標的の編集ウインドウ内の全てのシトシン（これらは全て、オフターゲットトリヌクレオチドモチーフ中に存在する）についての、シトシンからチミンへの累積遷移頻度が、各塩基エディタータンパク質についてプロットされたグラフである。Ｎ５７およびＫ６０において単一残基置換を有するＡＰＯ３Ａ塩基エディタータンパク質は、この標的部位の編集ウインドウ中に存在するオフターゲットシトシンを脱アミノ化する能力が顕著に減少されている。特に、ＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７Ａは、この部位においてデアミナーゼ活性を全く示さなかった。
【図９】安定に組み込まれたＥＧＦＰ遺伝子を有するＵ２ＯＳ細胞に、ＥＧＦＰを標的化するガイド（配列番号２２）および示された塩基エディタータンパク質を発現するプラスミドをトランスフェクトしたグラフである。７２時間後、ゲノムＤＮＡを細胞から抽出し、標的部位をＰＣＲによって増幅し、ＰＣＲ産物を、ハイスループットＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定に供した。コグネートおよびノンコグネートモチーフにおけるＣからＴへの遷移の頻度を、トランスフェクション条件の各々についてプロットした。ｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ（ＡＰＯ３Ａ）Ｎ５７に対してなされた変異は、塩基エディター構造中のデアミナーゼドメインの配列特異性を回復することにおいて、非常に有効であった。
【図１０】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、示されたｇＲＮＡおよび塩基エディタータンパク質を発現するプラスミドを一過的にトランスフェクトしたグラフである。２つの置換を有するＡＰＯ３Ａ  ＢＥ３タンパク質は一般に、試験した両方のｇＲＮＡ中のコグネートモチーフにおける顕著な活性を喪失した。しかし、ＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７Ｑ／Ｙ１３０Ｆ塩基エディター３（ＢＥ３）二重変異体は、ノンコグネートモチーフにおける脱アミノ化の頻度を顕著に減少させつつ、両方のｇＲＮＡのコグネートモチーフに対する活性を保持した。
【図１１】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、示されたｇＲＮＡおよび塩基エディタータンパク質を発現するプラスミドを一過的にトランスフェクトした図である。７２時間後、ゲノムＤＮＡを抽出し、標的部位をＰＣＲによって増幅し、ＰＣＲ産物を、ハイスループットＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定に供した。２０ヌクレオチドのスペーサー配列内の全てのシチジンについてのＣからＴへの遷移の頻度が、ヒートマップ形式でプロットされる。３つ全てのＡＰＯ３Ａ  ＢＥ３タンパク質が、ＢＥ３ならびに操作されたバリアントＹＥ１、ＹＥ２およびＹＥＥ  ＢＥ３（ＹＥ  ＢＥ３）と比較して、コグネートモチーフに向けて脱アミノ化を強力に偏らせることができ、これは、ラットＡＰＯＢＥＣ１（ｒＡＰＯ１）デアミナーゼドメイン中に、ＢＥ３と比較してその速度論的速度を緩徐化し、その編集ウインドウの長さを制限する点変異を取り込むことによってかかるバイスタンダー変異の頻度を減少させる４４。参照配列、配列番号２３〜２８。
【図１２】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、示されたｇＲＮＡおよび塩基エディタータンパク質を発現するプラスミドを一過的にトランスフェクトした図である。７２時間後、ゲノムＤＮＡを抽出し、標的部位をＰＣＲによって増幅し、ＰＣＲ産物を、ハイスループットＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定に供した。２０ヌクレオチドのスペーサー配列内の全てのシチジンについてのＣからＴへの遷移の頻度が、ヒートマップ形式でプロットされる。３つ全てのＡＰＯ３Ａ  ＢＥ３タンパク質が、ＢＥ３およびＹＥ  ＢＥ３タンパク質と比較して、コグネートモチーフに向けて脱アミノ化を強力に偏らせることができた。参照配列、配列番号２９〜３４。
【図１３】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、示されたｇＲＮＡおよび塩基エディタータンパク質を発現するプラスミドを一過的にトランスフェクトした図である。サンプルを、以前に概説したように処理した。Ｎ５７Ｇに加えてＡ７１またはＩ９６に対する変異を有するＡＰＯ３Ａ  ＢＥ３タンパク質は、ノンコグネートモチーフにおける脱アミノ化頻度を大きく減少させた。各部位についてのコグネート対ノンコグネートの編集の比を、バリアント塩基エディタータンパク質の各々に関して３つ全ての部位についてプロットしたところ、ＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７Ｇ  Ｉ９６Ｔ  ＢＥ３が、試験した３つの部位の各々についておよそ１３のコグネート：ノンコグネート編集比を達成したことが実証された。参照配列、配列番号３５〜３７。
【図１４】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、示されたｇＲＮＡおよび塩基エディタータンパク質を発現するプラスミドを一過的にトランスフェクトしたグラフである。サンプルを、以前に概説したように処理した。プロットされた脱アミノ化頻度を得るために、編集ウインドウ内に入るシチジンについての全てのＣからＴへの遷移頻度を合計した。ＡＰＯ３Ａ  ＢＥ３は、２５個のオフターゲット部位のうち１６個において、非常に高いレベルの脱アミノ化を誘導した。ＢＥ３は、より低い頻度でではあるが、ＡＰＯ３Ａ  ＢＥ３と同じオフターゲット部位において脱アミノ化を誘導した。ＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７Ｇ  ＢＥ３は、２５個の部位のうち６個のみにおいてインデルを誘導し、これら６個の部位では、ＢＥ３よりもかなり低い頻度であった。
【図１５】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、示されたｇＲＮＡおよび塩基エディタータンパク質を発現するプラスミドを一過的にトランスフェクトしたグラフである。サンプルを、以前に概説したように処理した。プロットされた脱アミノ化頻度を得るために、編集ウインドウ内に入るシチジンについての全てのＣからＴへの遷移頻度を合計した。ＡＰＯ３Ａ  ＢＥ３は、１５個のオフターゲット部位のうち３個において、非常に高いレベルの脱アミノ化を誘導した。ＢＥ３は、より低い頻度でではあるが、ＡＰＯ３Ａ  ＢＥ３と同じオフターゲット部位において脱アミノ化を誘導した。ＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７Ｇ  ＢＥ３は、１５個の調査したオフターゲット部位のいずれにおいても、脱アミノ化を誘導しなかった。
【図１６】塩基エディタータンパク質を用いてＨＢＢ−２８（Ａ＞Ｇ）疾患対立遺伝子を標的化することから生じる潜在的対立遺伝子産物を示す模式図。編集ウインドウ中に存在する−２５バイスタンダーシチジンの変異は、−２８位における編集とは独立して、ベータ−サラセミア表現型を引き起こす。このように、−２５位が塩基エディタータンパク質によって編集されないことが重要である。配列番号３８〜４２が示される。
【図１７】ＨＢＢ−２８（Ａ＞Ｇ）疾患原因対立遺伝子の、染色体に組み込まれた２００塩基対断片を有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＨＢＢ−２８標的化ｇＲＮＡおよび示されたＢＥタンパク質を発現するプラスミドを一過的にトランスフェクトした図である。ＢＥ３およびＹＥ  ＢＥ３タンパク質は、およそ等しい頻度でコグネートおよびノンコグネートシチジンを脱アミノ化したが、ＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７Ｇ  ＢＥタンパク質は、編集ウインドウ中の２番目のシチジンの脱アミノ化を回避しつつ、疾患を修正するために、−２８コグネートモチーフを強力に脱アミノ化した。参照配列、配列番号４３。
【図１８】ＢＥ３およびＹＥ  ＢＥ３タンパク質は、疾患原因ＨＢＢ−２８（Ａ＞Ｇ）変異の脱アミノ化を誘導するが、これは、配列決定した総対立遺伝子の１％未満において完全に修正された対立遺伝子を生じる。逆に、ＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７Ｇ  ＢＥタンパク質は、配列決定した総対立遺伝子の１５〜２２％において完全に修正された対立遺伝子を生じる。
【図１９】ＨＢＢ−２８（Ａ＞Ｇ）対立遺伝子の、染色体に組み込まれた断片を有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、示されたｇＲＮＡおよび塩基エディタータンパク質を発現するプラスミドを一過的にトランスフェクトしたグラフである。サンプルを、以前に概説したように処理した。プロットされた脱アミノ化頻度を得るために、編集ウインドウ内に入るシチジンについての全てのＣからＴへの遷移頻度を合計した。ＢＥ３は、調査した８つのオフターゲット部位のうち３つにおいて脱アミノ化を生じたが、ＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７  ＢＥ３は、非常に低い頻度で、８つの部位のうちたった１つにおいて脱アミノ化を生じた。配列番号４４が示される。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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