(57)【要約】  本発明は、［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］型（Ｘ＝ハロゲン，擬似ハロゲン；ｐｄｔｃ＝ペプチド−／エステル化ペプチドジチオカルバマト）のＡｕ（ＩＩＩ）錯体に関するものであり、それは、抗腫瘍特性と、先に報告されたＡｕ(ＩＩＩ)−ジチオカルバマト錯体の腎毒性の副作用の欠如の両方を維持することができ、更には、ペプチドが媒介した細胞内部移行を通して生物学的利用率を向上させる。記載されたＡｕ（ＩＩＩ）錯体は、ヒトの腫瘍細胞株に対する有意な生物学的活性を示し、それ故に、それらは、抗腫瘍薬として有利に使用できる。更に、本発明のＡｕ（ＩＩＩ）錯体の調製方法とその腫瘍性病態を治療するための使用について記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
【化１】
2012520833.tif 000010
及びその薬剤的に許容できる塩によって表される［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］型のＡｕ（ＩＩＩ）錯体であって、
式中：
Ｘ１及びＸ２は、互いに等しくても異なっていてもよいが、Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ，ＣＮ，及びＳＣＮからなる群から選択され；
ｍは、２〜５の範囲の整数であり；
有機的部分［−Ｃ(＝Ｏ)−Ｚｎ−Ｃ(Ｒ２)(Ｒ３)−Ｎ(Ｒ１)−］は、互いに等しくても異なってもよいアミノ酸残基であり、ここで、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３及びＺｎは、互いに等しくても異なっていてもよいが：
Ｒ１は、Ｈ，ＣＨ３，直鎖状又は枝分かれＣ２−Ｃ６アルキル，Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル，フェニル，及びＲ３に結合したＣＨ２（ここで、Ｒ３は、(ＣＨ２)２に等しい）からなる群から選択される残基であり；
Ｒ２は、Ｈ，ＣＨ３，直鎖状又は枝分かれＣ２−Ｃ６アルキル，Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル，及びフェニルからなる群から選択される残基であり；
Ｒ３は、Ｈ，ＣＨ３，
【化２】
2012520833.tif 000011
ＣＨ(ＣＨ３)２，Ｒ１に結合した(ＣＨ２)２（ここで、Ｒ１は、ＣＨ２に等しい），ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)２，ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ２ＣＨ３，ＣＨ２−(Ｃ６Ｈ５)，
【化３】
2012520833.tif 000012
ＣＨ２ＯＨ，ＣＨ２−(Ｃ６Ｈ４)−ＯＨ，ＣＨ(ＣＨ３)ＯＨ，ＣＨ２ＳＨ，(ＣＨ２)２Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ２，(ＣＨ２)３ＮＨＣ(＝ＮＨ)ＮＨ２，(ＣＨ２)２ＳＣＨ３，(ＣＨ２)４ＮＨ２，ＣＨ２Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ２，ＣＨ２Ｃ(＝Ｏ)ＯＨ，及び(ＣＨ２)２Ｃ(＝Ｏ)ＯＨからなる群から選択される残基であり；
Ｚｎ（ｎ＝０，１）は、−Ｃ−(Ｒ５)(Ｒ６)であり（ここで、Ｒ５及びＲ６は、互いに等しくても異なっていてもよいが、Ｈ，ＣＨ３，直鎖状又は枝分かれＣ２−Ｃ６アルキル，Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル，及びフェニルからなる群から選択される残基である）；
Ｙは、Ｏ，Ｓ，及びＮＲ７から選択され（ここで、Ｒ７は、Ｈ，ＣＨ３，直鎖状又は枝分かれＣ２−Ｃ６アルキル，Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル，及びフェニルからなる群から選択される残基である）；
Ｒ４は、Ｈ，ＣＨ３，直鎖状又は枝分かれＣ２−Ｃ６アルキル，Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル，フェニル，及び(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｐＨからなる群から選択される残基である（ここで、ｐは、１〜４の範囲の整数である）
ことを特徴とする［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］型のＡｕ（ＩＩＩ）錯体。
【請求項２】
Ｒ２及びＲ３に結合したキラル炭素原子が、Ｒ体の立体化学であることを特徴とする請求項１に記載の［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］型のＡｕ（ＩＩＩ）錯体。
【請求項３】
Ｒ２及びＲ３に結合したキラル炭素原子が、Ｓ体の立体化学であることを特徴とする請求項１に記載の［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］型のＡｕ（ＩＩＩ）錯体。
【請求項４】
Ｒ５及びＲ６に結合したキラル炭素原子が、Ｒ体の立体化学であることを特徴とする請求項１に記載の［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］型のＡｕ（ＩＩＩ）錯体。
【請求項５】
Ｒ５及びＲ６に結合したキラル炭素原子が、Ｓ体の立体化学であることを特徴とする請求項１に記載の［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］型のＡｕ（ＩＩＩ）錯体。
【請求項６】
前記アミノ酸残基が、グリシン，アラニン，プロリン，セリン，サルコシン，α−アミノイソ酪酸，及びフェニルアラニンからなるアミノ酸の群において選択されることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］型のＡｕ（ＩＩＩ）錯体。
【請求項７】
Ｘ１及びＸ２が、Ｃｌ及びＢｒから選択されるハロゲンであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］型のＡｕ（ＩＩＩ）錯体。
【請求項８】
有機的部分［−Ｃ(＝Ｏ)−Ｚｎ−Ｃ(Ｒ２)(Ｒ３)−Ｎ(Ｒ１)−］が、−Ｓａｒ−Ｇｌｙ−，−Ｓａｒ−Ａｉｂ−，−Ｓａｒ−Ｐｈｅ−，−Ｓａｒ−Ｓｅｒ−，−Ｓａｒ−Ａｉｂ２−，及び−Ｓａｒ−Ａｉｂ３−Ｇｌｙ−からなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］型のＡｕ（ＩＩＩ）錯体。
【請求項９】
ＹがＯであることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］型のＡｕ（ＩＩＩ）錯体。
【請求項１０】
Ｒ４が、メチル，エチル，及びｔ−ブチルからなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］型のＡｕ（ＩＩＩ）錯体。
【請求項１１】
配位子ｐｄｔｃが、(ｔ−Ｂｕ)Ｏ−Ｇｌｙ−Ｓａｒ−ＣＳＳ，(ｔ−Ｂｕ)Ｏ−Ａｉｂ−Ｓａｒ−ＣＳＳ，(ｔ−Ｂｕ)Ｏ−Ｐｈｅ−Ｓａｒ−ＣＳＳ，ＭｅＯ−Ｇｌｙ−Ｓａｒ−ＣＳＳ，ＭｅＯ−Ａｉｂ−Ｓａｒ−ＣＳＳ，ＭｅＯ−Ｐｈｅ−Ｓａｒ−ＣＳＳ，ＭｅＯ−Ｓｅｒ−Ｓａｒ−ＣＳＳ，(ｔ−Ｂｕ)Ｏ−Ａｉｂ２−Ｓａｒ−ＣＳＳ，及びＥｔＯ−Ｇｌｙ−Ａｉｂ３−Ｓａｒ−ＣＳＳからなる群から選択されることを特徴とする請求項８〜１０のいずれかに記載の［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］型のＡｕ（ＩＩＩ）錯体。
【請求項１２】
抗腫瘍薬として用いるための、請求項１〜１１のいずれかに記載の［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］型のＡｕ（ＩＩＩ）錯体。
【請求項１３】
腫瘍性病態を治療するための薬剤的に許容できる賦形剤及び／又は希釈剤と組み合わせて、請求項１〜１１のいずれかに記載の［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］型のＡｕ（ＩＩＩ）錯体を少なくとも１種含む組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれかに記載の［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］型のＡｕ（ＩＩＩ）錯体を調製する方法であって、
ａ）０℃の水中における、選択されたペプチド又はエステル化ペプチドの塩酸塩（ｐ・ＨＣｌ）、二硫化炭素（ＣＳ２）及びアルカリ金属の水酸化物（ＭＯＨ，Ｍ＝Ｎａ，Ｋ）間での１：１：１化学量論的反応により、ジチオカルバマト配位子をインサイチューで合成する工程と；
ｂ）０℃の水中において２：１の割合にある、先の工程ａ）においてインサイチューで生成したジチオカルバマト配位子とＭ[ＡｕＩＩＩＸ４]（Ｍ＝Ｎａ，Ｋ；Ｘ＝Ｂｒ，Ｃｌ）間での２：１配位子対金属の反応によって、Ａｕ（ＩＩＩ）中心にジチオカルバマト配位子が配位することにより、［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］錯体を合成する工程と；
ｃ）前記錯体を分離し、それを任意に精製する工程と；
を少なくとも含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴペプチドによるＡｕ(ＩＩＩ)−ジチオカルバマト誘導体、その調製方法及びその腫瘍性病態を治療するための使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
６０年代の中頃、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇは、シスプラチン（ｃｉｓ−ジクロロジアンミン白金（ＩＩ），ｃｉｓ−[ＰｔＩＩＣｌ２(ＮＨ３)２]）の抗癌特性を偶然に発見した。これらの研究の励まされる結果を受けて、１９７８年の終わりに、それは、食品医薬品局（ＦＤＡ）によって泌尿生殖器腫瘍の治療に承認された。現在のところ、シスプラチンは、睾丸癌の治療に使用され、また他の化学療法剤と併用して卵巣癌、小細胞肺癌、膀胱癌、子宮頸癌、脳腫瘍及び乳癌の治療に使用される最も有効な薬の一つである。しかしながら、すべての化学療法薬は欠点を有しており、シスプラチンも例外ではない。実際、数種類の腫瘍の治療においてその治療が成功しているにもかかわらず、嘔気、脱毛症、聴器毒性、神経毒性、骨髄抑制及び腎臓毒性等の一部の有害な副作用が、その高い有効性の厳しい妨げとなる。２番目の主な欠点は、癌抵抗性であって、それは、シスプラチンによる治療サイクルの間に得られたり（例えば卵巣癌の患者に起こる）又は内因性であったりする（例えば結腸直腸癌、前立腺癌、肺癌又は乳癌の患者に見られる）［非特許文献１］。それ故、新規白金薬剤の設計における初期努力の大半は、患者に対してより安全なシスプラチン系の治療を作り出すことを目的としており、具体的には、予測できない重度の副作用を減少又は除去すること、経口バイオアベイラビリティを提供すること、そして、内因性の抵抗及び後天性の抵抗の両方を克服することである。上記欠点を軽減するための努力は、化学者に、様々な類似物の合成を促してきたものの、ほんの一握りの新規薬剤のみが臨床応用に適していることを示しただけであり、それらの中には、カルボプラチン（ｃｉｓ−(１，１−シクロブタンジカルボキシラト)ジアンミン白金（ＩＩ））、オキサリプラチン（エタンジチオアト−Ｏ，Ｏ’)(Ｒ，Ｒ)−１，２−ジアミノシクロヘキサノ−Ｎ，Ｎ’)白金（ＩＩ））、及びサトラプラチン（ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ，ｃｉｓ−ジクロロビス(アセタート−Ｏ)アミノ(シクロヘキシルアミノ)白金（ＩＶ））がある。
【０００３】
カルボプラチンは、本質的に腎臓毒性がなく、神経毒性が低く、胃腸管に対する毒性が低い。一方、骨髄抑制、主として血小板減少症は、その用量規制因子である。オキサリプラチンは、シスプラチンに反応しないか又はほとんど反応しない腫瘍、例えば大腸腫瘍に対し特に興味深い。それにもかかわらず、神経毒性がその主な欠点であると証明された。サトラプラチン（一部のＰｔ（ＩＩ）類似体に生体内で還元されるＰｔ（ＩＶ）化合物）は、入院せずに投与できるため、治療計画の観点から期待できると証明された。
【０００４】
前述したように、腎毒性は、シスプラチン及び関連した白金系の治療の使用を制限する。腎臓毒性は、体内へのシスプラチンの高過ぎる投薬量又は蓄積に起因し得る。シスプラチンの腎機能に対する効果は、完全に理解されていないものの、最近の研究では、シスプラチン腎臓毒性の機序、特には尿細管細胞死及び炎症に導くシグナル伝達経路に関する新たな知見がもたらされた。白金がチオール含有酵素へ結合し、それを不活性化させることによって、腎不全が引き起こされ得ると仮定されている［非特許文献２］。それ故、チオール系の硫黄含有求核試薬の多くが、シスプラチン腎臓毒性を調節するための化学的保護剤として試験された［非特許文献３］。化学的保護剤の開発のためには、２つの主な問題点を考慮に入れる必要がある：（ｉ）非腫瘍の正常組織の選択的保護と、（ｉｉ）毒性があれば少量の添加である。Ｌ−ＢＳＯ（Ｌ−ブチオニンスルホキシミン）、ジスルフィラム（即ちアンタビュース，テトラエチルチウラムジスルフィド）、ＮＡＣ（Ｎ−アセチルシステイン）、メスナ（Ｓ−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム塩）、チオ硫酸ナトリウム、及びＯＲＧ−２７６６（メラノコルチン由来のペプチド）等、多くの硫黄系化学的保護剤は、シスプラチンの腎臓毒性を調節するための試験を受け、いくつかが臨床用途に見込みのあるものであると示された。しかしながら、抗腫瘍効果を阻害することのない正常組織の選択的保護は、困難だがやりがいがあると証明された。
【０００５】
この関連で、ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム（ＤＥＤＴＮａ，Ｎａ((ＣＨ３ＣＨ２)２ＮＣＳＳ)）を用いて前向きな結果が得られた。実際、シスプラチンの抗腫瘍特性を低下させることなく、シスプラチンによって生じる腎臓毒性、胃腸毒性及び骨髄毒性に対する保護を提供することが示された。その化学的保護効果は、その抗腫瘍活性に関与する白金−ＤＮＡ付加体の逆転なしに、タンパク質のチオール基から白金を取り除く能力に起因する。白金−ＤＮＡ付加体は、シスプラチンの投与後間もなくＤＥＤＴＮａによって細胞を処理する場合、およそ５０％減少し、それ故に治療効果の喪失をもたらすことを示した一方で、シスプラチンの３時間後にＤＥＤＴＮａを投与した場合、抗癌活性の変化は観察されなかった。
【０００６】
しかしながら、ＤＥＤＴＮａの総合的な腎臓保護効果は、ジチオカルバミン酸塩それ自体の急性毒性プロファイルによって有意に制限される。実際、遊離の（即ち、非配位の）ジチオカルバミン酸塩と関連した潜在的なヒトの健康への危険について、遺伝毒性及び起こり得る発癌性を含め、今もなお調べられている［非特許文献３］。
【０００７】
それにもかかわらず、白金薬剤の幅の広い成功は、少なくとも原則としてその抗癌挙動に似ている可能性がある代わりの白金化合物及び他の金属系化合物の両方の開発を促進した。
【０００８】
これらの前提に基づき、Ｆａｒａｇｌｉａ  Ｇ．及び共働者［非特許文献４］は、混合したジチオカルバマト／アミノＰｔ（ＩＩ）及びＰｄ（ＩＩ）錯体（[ＭＩＩ(μ−Ｃｌ)(ＥＳＤＴ)]２，Ｍ＝Ｐｔ及びＰｄ，ＥＳＤＴ＝ＣＨ３ＣＨ２Ｏ(Ｏ)ＣＣＨ２Ｎ(ＣＨ３)ＣＳＳ；[ＭＩＩＣｌ(ＥＳＤＴ)(ｐｙ)]，Ｍ＝Ｐｔ及びＰｄ，ＥＳＤＴ＝ＣＨ３ＣＨ２Ｏ(Ｏ)ＣＣＨ２Ｎ(ＣＨ３)ＣＳＳ，ｐｙ＝ピリジン；[ＭＩＩＣｌ(ＥＳＤＴ)(ｎ−ｐｒａ)]，Ｍ＝Ｐｄ，ＥＳＤＴ＝ＣＨ３ＣＨ２Ｏ(Ｏ)ＣＣＨ２Ｎ(ＣＨ３)ＣＳＳ，ｎ−ｐｒａ＝ｎ−プロピルアミン；[ＭＩＩＣｌ(ＥＳＤＴ)(ｅｎ)]Ｃｌ，Ｍ＝Ｐｔ及びＰｄ，ＥＳＤＴ＝ＣＨ３ＣＨ２Ｏ(Ｏ)ＣＣＨ２Ｎ(ＣＨ３)ＣＳＳ，ｅｎ＝エチレンジアミン；[ＭＩＩＣｌ(ＥＳＤＴ)(ｎ−ｐｒａ)２]Ｃｌ，Ｍ＝Ｐｄ，ＥＳＤＴ＝ＣＨ３ＣＨ２Ｏ(Ｏ)ＣＣＨ２Ｎ(ＣＨ３)ＣＳＳ，ｎ−ｐｒａ＝ｎ−プロピルアミン）をこれまでに設計しており、それは、金属中心の細胞障害活性を腎臓毒性の欠如と組み合わせることができる可能性がある。これらの種は、（ｉ）最も生物活性の高いＰｔ（ＩＩ）錯体としてのアミノ配位子、（ｉｉ）加水分解を受け、ＤＮＡに結合できる良好な脱離基（クロリド）（それ故にシスプラチンの作用機序と似ている）、及び（ｉｉｉ）金属中心の硫黄含有タンパク質との相互作用を防ぐことのできる可能性があるＳ，Ｓ’−キレート配位子（ジチオカルバマート）を含有しており、それ故に、腎臓毒性を低減する。
【０００９】
これら錯体は、ヒト扁平上皮子宮頸部腺癌（ＨｅＬａ）及びヒト白血病性前骨髄球（ＨＬ６０）細胞に対するインビトロでの細胞障害活性について評価された。錯体［ＰｔＩＩＣｌ(ＥＳＤＴ)(ｐｙ)］は最も見込みのある細胞毒性作用を示したため、それをシスプラチン−感受性（２００８）及び−抵抗性（Ｃ１３＊）ヒト卵巣癌細胞についても評価した［非特許文献５］。興味深いことに、それは、シスプラチンより大きな腫瘍細胞増殖の阻害を引き起こし、Ｃ１３＊細胞中における交差耐性の完全な欠如が観察された。加えて、ＤＮＡを白金化させる効率が悪いことが分かり、その細胞障害活性及びシスプラチン抵抗を克服する能力は、ＤＮＡ及び／又は他の重要な細胞成分との相互作用の様々な機序に関係している可能性があることを示唆している［非特許文献５］。最後に、実験結果によって、［ＰｔＩＩＣｌ(ＥＳＤＴ)(ｐｙ)］がシスプラチンより５倍低い腎臓毒性を生じさせることができると確認された［非特許文献６］。
【００１０】
これらの励みになる結果にもかかわらず、潜在的な抗癌剤としての［ＰｔＩＩＣｌ(ＥＳＤＴ)(ｐｙ)］の更なる評価は、その乏しい水溶性及び生理学的条件下での比較的低い安定性が原因で却下された。Ｆｒｅｇｏｎａ  Ｄ．及び共働者は、インビトロでの高い細胞毒性を示すと共に、腎臓毒性が低いか又は欠如している類似の混合したジチオカルバマト／アミノＰｔ（ＩＩ）及びＰｄ（ＩＩ）錯体の多くに関して更なる研究を行ったが［非特許文献７］、長い合成経路及び生理環境における不十分な安定性が、主な欠点であった。
【００１１】
これらの問題点を克服するため、Ｆｒｅｇｏｎａ  Ｄ．及び共働者は、最近になって代わりの解決策を調査しており、最も見込みのあるものとしては、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）及びＲｕ（ＩＩＩ）等の白金及びパラジウム以外の金属のジチオカルバマト誘導体の設計である［非特許文献８及び９］。
【００１２】
この文脈において、金（ＩＩＩ）化合物は、未解決の細胞毒性作用を備えた金属錯体の新しい群として現れており、現在のところ、潜在的な抗腫瘍薬として評価されている。リウマチ性関節炎の治療においてそれらの伝統的な医薬用途を考えると、金化合物は、白金薬剤に代わる可能性がある。実際、それらの抗関節炎活性は、既知の免疫抑制作用及び抗炎症作用に起因しており、それ故、少なくとも原理上は、その２つの治療効果の間で、関係を構築する。金（ＩＩＩ）錯体は、正方形−平面の配位を優先すること、典型的なｄ８電子配置等、臨床上用いられるＰｔ（ＩＩ）錯体のものと非常に近い化学的特徴を示し、それらを抗腫瘍薬としてテストするのに非常に魅力的なものとする。驚くべきことに、この厳しい類似点にもかかわらず、抗癌剤としてのＡｕ（ＩＩＩ）錯体の使用に関する文献データはほとんどなく、データの少なさは恐らくそれらの高い酸化還元電位と比較的乏しい安定性に由来しており、生理的条件下でのそれらの使用をかなり問題のあるものとしている。近年、Ｆｒｅｇｏｎａ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．は、いくつかの［ＡｕＩＩＩＸ２(ｄｔｃ)］型のＡｕ(ＩＩＩ)−ジチオカルバマト誘導体（Ｘ＝Ｃｌ，Ｂｒ；ｄｔｃ＝各種ジチオカルバマト配位子：ＭＳＤＴ＝ＣＨ３Ｏ(Ｏ)ＣＣＨ２Ｎ(ＣＨ３)ＣＳＳ；ＥＳＤＴ＝ＣＨ３ＣＨ２Ｏ(Ｏ)ＣＣＨ２Ｎ(ＣＨ３)ＣＳＳ；ＤＭＤＴ＝(ＣＨ３)２ＮＣＳＳ）について報告を行っており、それらは、シスプラチンの主な特徴を緊密に再生するように設計されたものである。
【００１３】
ヒト扁平上皮子宮頸部腺癌（ＨｅＬａ）及びヒト白血病性前骨髄球（ＨＬ６０）細胞に対するＰｔ(ＩＩ)−，Ｐｄ(ＩＩ)−及びＡｕ(ＩＩＩ)−ＭＳＤＴ（ＭＳＤＴ＝ＣＨ３Ｏ(Ｏ)ＣＣＨ２Ｎ(ＣＨ３)ＣＳＳ）誘導体のインビトロでの細胞毒性の研究を比較すると、Ａｕ（ＩＩＩ）錯体は、同一の実験条件下におけるシスプラチンとＰｔ（ＩＩ）及びＰｄ（ＩＩ）の対照物の双方に比べて有意に活性があるという結果となった［非特許文献１０］。［ＡｕＩＩＩＸ２(ＭＳＤＴ)］型の化合物は、ＤＮＡ断片化及び細胞アポトーシスを誘発することによって、対照薬剤よりおよそ１０倍低いＩＣ５０値の急性骨髄性白血病細胞株パネル上での細胞増殖を用量依存的に抑制すると証明された［非特許文献１１］。
【００１４】
これらの励まされる結果のため、Ｆｒｅｇｏｎａ  Ｄ．及び共働者は、［ＡｕＩＩＩＸ２(ＤＭＤＴ)］及び［ＡｕＩＩＩＸ２(ＥＳＤＴ)］（Ｘ＝Ｃｌ，Ｂｒ；ＤＭＤＴ＝(ＣＨ３)２ＮＣＳＳ）；ＥＳＤＴ＝ＣＨ３ＣＨ２Ｏ(Ｏ)ＣＣＨ２Ｎ(ＣＨ３)ＣＳＳ）型の他のＡｕ(ＩＩＩ)−ジチオカルバマト誘導体を開発することによって同じように続けた。これら化合物は、シスプラチンと比べてインビトロでより強い細胞毒性を示し、シスプラチン自体に対して本質的に耐性を示すヒト腫瘍細胞株に関してさえも細胞毒性を示すと証明された。更に、それらは、シスプラチン耐性細胞株に対してもより強い活性があると思われ、それは対応するシスプラチン感受性の細胞株への活性に匹敵する活性レベルであり、交差耐性現象の発生を除外する［非特許文献１２］。
【００１５】
それらの生理的条件下での挙動及びＤＮＡ結合特性についても評価した［非特許文献１３］。これらＡｕ（ＩＩＩ）錯体は、一部の生物学的に関連し且つ単離された高分子に対して高い反応性を示し、ＤＮＡ及びＲＮＡ合成の両方の劇的な阻害をもたらし、シスプラチンより速い反応速度論でＤＮＡ損傷を引き起こし、白金薬剤と比べて異なった作用機序の仮説を支持する。
【００１６】
これに関し、同一の研究グループは、最近になって、プロテアソームをこれらＡｕ(ＩＩＩ)−ジチオカルバマト誘導体のインビトロ及びインビボでの主な標的として確認した［非特許文献１４］。具体的には、著者は、［ＡｕＩＩＩＢｒ２(ＤＭＤＴ)］によるプロテアソーム活性（特にはキモトリプシン様活性）の阻害が、高度に転移性のＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞培養物及び腫瘍において強いアポトーシス刺激であることを示した。また、Ｆｒｅｇｏｎａ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．は、化合物［ＡｕＩＩＩＢｒ２(ＤＭＤＴ)］によるＭＤＡ−ＭＢ−２３１担癌ヌードマウスの処置が、プロテアソーム阻害及びアポトーシス誘発の結果として、全身毒性の欠如、重量損失、活性低下、又は食欲不振と共に、腫瘍増殖の有意な阻害をもたらすことを示した。
【００１７】
Ｓａｇｇｉｏｒｏ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．は、錯体［ＡｕＩＩＩＣｌ２(ＤＭＤＴ)］、［ＡｕＩＩＩＢｒ２(ＤＭＤＴ)］、［ＡｕＩＩＩＣｌ２(ＥＳＤＴ)］及び［ＡｕＩＩＩＢｒ２(ＥＳＤＴ)］の潜在的な標的としてのミトコンドリアに対する生物学的評価を拡張し、それらがアポトーシス機序及び非アポトーシス機序の両方を通して癌細胞の死を引き起こすことを見出した［非特許文献１５］。また、それらは、チオレドキシン還元酵素活性を阻害し、遊離ラジカルを生成し、一部のミトコンドリア機能を修飾し、ＥＲＫ１／２リン酸化反応を増大させる。［ＡｕＩＩＩＢｒ２(ＥＳＤＴ)］のインビボでの抗腫瘍活性並びに耐容性及び腎毒性を評価し、見込みのある結果を得た。
【００１８】
それ故に、注目に値するインビトロ及びインビボでの抗腫瘍活性、シスプラチンによる交差耐性の欠如及び有害な副作用の低減の観点から潜在的な利点を考慮すると、この種のＡｕ(ＩＩＩ)−ジチオカルバマト誘導体を、見込みのある金属系抗腫瘍薬として考えることができる［非特許文献１６］。
【００１９】
これらの達成された前向きな結果にもかかわらず、この種類の錯体の治療効果の向上については、細胞膜の横断に関する限り、未だに問題がある。
【００２０】
実際、治療薬の細胞取り込みは、これら分子の大部分についての不透過性の障壁を構成する原形質膜のため、依然として困難な課題である。この問題を回避するため、幾つかのキャリヤー媒介送達システムを開発した。それらの中でも、近年ではペプチド系送達システムの使用が大いに注目されている。ペプチド輸送体は、複合的な原形質膜タンパク質であり、ジ−及びトリ−ペプチド並びにペプチド様薬物の細胞取り込みを媒介する［非特許文献１７］。２つのペプチド輸送体、即ちＰＥＰＴ１及びＰＥＰＴ２は、哺乳動物中において確認されている［非特許文献１８］。それらは、主に小腸、乳腺、肺、脈絡叢及び腎臓の上皮細胞中に存在しているが、他の細胞の種類においても見つけられる。固有の特徴は、異なって荷電した種を含めた、可能性のある全てのジ−及びトリ−ペプチドの配列非依存性輸送の能力である。これら輸送体は、アミノ酸のＬ−鏡像異性体を含有するペプチドに対して立体選択的である。ＰＥＰＴ１及びＰＥＰＴ２は両方とも同様な基質特異性を示すが、構造、輸送容量及び結合親和性の点で異なる。ＰＥＰＴ１は、低親和性で、高容量の輸送体であり、一方、ＰＥＰＴ２は、高親和性及び低容量で作用する。それ故に、ペプチド輸送体は、それらの基質結合部位が、異なる大きさ、疎水性及び電荷の幅広い分子を収容できるため、薬理学的に活性な化合物の送達のための優れた標的を表す。
【００２１】
ペプチドの金属錯体は、金属イオンとタンパク質間の相互作用のモデルとして広く使用されており、これらの研究の大部分はＰｔ（ＩＩ）に関するものである。それにもかかわらず、主な欠点が動力学的不活性である数少ないＰｔ(ＩＩ)−ペプチド錯体だけが単離されており、Ａｕ３＋イオンと生体分子間の直接相互作用を調べるという公然の目的でのＡｕ(ＩＩＩ)−ペプチド誘導体に関する研究はほとんど報告されていない［非特許文献１９及び２０］。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】L. Kelland, Nat. Rev. Cancer 2007, 7, 573-584
【非特許文献２】N. Pabla, Z. Dong, Kidney Int. 2008, 73, 994-1007
【非特許文献３】R.T. Dorr,“A review of the modulation of cisplatin toxicities by chemoprotectants”in: H.M. Pinedo, J.H. Schornagel (Eds.), Platinum and Other Metal Coordination Compounds in Cancer Chemotherapy 2, Plenum Press, New York, 1996, pp. 131-154
【非特許文献４】G. Faraglia, D. Fregona, S. Sitran, L. Giovagnini, C. Marzano, F. Baccichetti, U. Casellato, R. Graziani, J. Inorg. Biochem. 2001, 83, 31-40
【非特許文献５】C. Marzano, D. Fregona, F. Baccichetti, A. Trevisan, L. Giovagnini, F. Bordin, Chem. Biol. Interact. 2002, 140, 215-229
【非特許文献６】C. Marzano, A. Trevisan, L. Giovagnini, D. Fregona, Toxicol. in Vitro 2002, 16, 413-419
【非特許文献７】V. Alverdi, L. Giovagnini, C. Marzano, R. Seraglia, F. Bettio, S. Sitran, R. Graziani, D. Fregona, J. Inorg. Biochem. 2004, 98, 1117-1128
【非特許文献８】L. Giovagnini, S. Sitran, M. Montopoli, L. Caparrotta, M. Corsini, C. Rosani, P. Zanello, Q.P. Dou, D. Fregona, Inorg. Chem. 2008, 47, 6336-6343
【非特許文献９】L. Giovagnini, S. Sitran, I. Castagliuolo, P. Brun, M. Corsini, P. Zanello, A. Zoleo, A. Maniero, B. Biondi, D. Fregona, Dalton Trans. 2008, 6699-6708
【非特許文献１０】L. Giovagnini, L. Ronconi, D. Aldinucci, D. Lorenzon, S. Sitran, D. Fregona, J. Med. Chem. 2005, 48, 1588-1595
【非特許文献１１】D. Aldinucci, D. Lorenzon, L. Stefani, L. Giovagnini, A. Colombatti, D. Fregona, Anti-Cancer Drugs 2007, 18, 323-332
【非特許文献１２】L. Ronconi, L. Giovagnini, C. Marzano, F. Bettio, R. Graziani, G. Pilloni, D. Fregona, Inorg. Chem. 2005, 44, 1867-1881
【非特許文献１３】L. Ronconi, C. Marzano, P. Zanello, M. Corsini, G. Miolo, C. Macca, A. Trevisan, D. Fregona, J. Med. Chem. 2006, 49, 1648-1657
【非特許文献１４】V. Milacic, D. Chen, L. Ronconi, K.R. Landis-Piwowar, D. Fregona, Q.P. Dou, Cancer Res. 2006, 66, 10478-10486
【非特許文献１５】D. Saggioro, M.P. Rigobello, L. Paloschi, A. Folda, S.A. Moggach, S. Parsons, L. Ronconi, D. Fregona, A. Bindoli, Chem. Biol. 2007, 14, 1128-1139
【非特許文献１６】V. Milacic, D. Fregona, Q.P. Dou, Histol. Histopathol. 2008, 23, 101-108
【非特許文献１７】A. Biegel, S. Gebauera, B. Hartrodta, I. Knutter, K. Neuberta, M. Brandschb, I. Thondorf, Eur. J. Pharm. Sci. 2007, 32, 69-76
【非特許文献１８】Rubio-Aliaga, H. Daniel Trends Pharmacol. Sci. 2002, 23, 434-440
【非特許文献１９】M. Wienken, B. Lippert, E. Zangrando, L. Randaccio Inorg. Chem. 1992, 31, 1983-1985
【非特許文献２０】S. Carotti, G. Marcon, M. Marussich, T. Mazzei, L. Messori, E. Mini, P. Orioli, Chem. Biol. Interact. 2000, 125, 29-38
【発明の概要】
【００２３】
本発明の目的は、適切な抗腫瘍特性及び毒性（特には腎臓毒性）の欠如を特徴とし、向上した細胞内薬物移動及び送達を示す金（ＩＩＩ）錯体を提供することにある。
【００２４】
更に、本発明の他の目的は、上述の適切な生物学的特性と共に、容易に得られ且つ十分に安定な可能性があるＡｕ（ＩＩＩ）錯体を提供することにあり、産業レベルで大量に利益をもたらすそれらの合成プロセスを作る。
【００２５】
これら目的のため、輸送体タンパク質によって支持された、改良した潜在的細胞内薬物移動及び送達システムである、新規なオリゴペプチドのＡｕ(ＩＩＩ)−ジチオカルバマト錯体が、金属系抗腫瘍薬の細胞標的化についての上述した問題を解決するのに適した可能性のある化合物群として確認された。
【００２６】
そこで、第一の態様において、本発明は、［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］型（Ｘ＝ハロゲン，擬似ハロゲン；ｐｄｔｃ＝ペプチド／エステル化ペプチドジチオカルバマト）のＡｕ（ＩＩＩ）錯体に関するものであり、それは、抗腫瘍特性と、先に報告されたＡｕ(ＩＩＩ)−ジチオカルバマト錯体の腎毒性の副作用の欠如の両方を維持することができ、更には、ペプチドが媒介した細胞内部移行を通して生物学的利用率を向上させる。
【００２７】
本発明の対象であるＡｕ（ＩＩＩ）錯体は、一般式（Ｉ）
【化１】
2012520833.tif 000002
によって表されたオリゴペプチドによるＡｕ(ＩＩＩ)−ジチオカルバマト錯体［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］及びその薬剤的に許容できる塩であって、
式中：
Ｘ１，Ｘ２は、互いに等しくても異なっていてもよいが、Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ，ＣＮ，ＳＣＮからなる群から選択され；
ｍは、２〜５の範囲の整数であり；
有機的部分［−Ｃ(＝Ｏ)−Ｚｎ−Ｃ(Ｒ２)(Ｒ３)−Ｎ(Ｒ１)−］は、互いに等しくても異なってもよいアミノ酸残基であり、ここで、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３及びＺｎは、互いに等しくても異なっていてもよいが：
Ｒ１は、Ｈ，ＣＨ３，直鎖状又は枝分かれＣ２−Ｃ６アルキル，Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル，フェニル，Ｒ３に結合したＣＨ２（ここで、Ｒ３は、(ＣＨ２)２に等しい）からなる群から選択される残基であり；
Ｒ２は、Ｈ，ＣＨ３，直鎖状又は枝分かれＣ２−Ｃ６アルキル，Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル，フェニルからなる群から選択される残基であり；
Ｒ３は、Ｈ，ＣＨ３，
【化２】
2012520833.tif 000003
ＣＨ(ＣＨ３)２，Ｒ１に結合した(ＣＨ２)２（ここで、Ｒ１は、ＣＨ２に等しい），ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)２，ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ２ＣＨ３，ＣＨ２−(Ｃ６Ｈ５)，ＣＨ２ＯＨ，ＣＨ２−(Ｃ６Ｈ４)−ＯＨ，
【化３】
2012520833.tif 000004
ＣＨ(ＣＨ３)ＯＨ，ＣＨ２ＳＨ，(ＣＨ２)２Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ２，(ＣＨ２)３ＮＨＣ(＝ＮＨ)ＮＨ２，(ＣＨ２)２ＳＣＨ３，(ＣＨ２)４ＮＨ２，ＣＨ２Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ２，ＣＨ２Ｃ(＝Ｏ)ＯＨ，(ＣＨ２)２Ｃ(＝Ｏ)ＯＨからなる群から選択される残基であり；
Ｚｎ（ｎ＝０，１）は、−Ｃ−(Ｒ５)(Ｒ６)であり（ここで、Ｒ５，Ｒ６は、互いに等しくても異なっていてもよいが、Ｈ，ＣＨ３，直鎖状又は枝分かれＣ２−Ｃ６アルキル，Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル，フェニルからなる群から選択される残基である）；
Ｙは、Ｏ，Ｓ，ＮＲ７から選択され（ここで、Ｒ７は、Ｈ，ＣＨ３，直鎖状又は枝分かれＣ２−Ｃ６アルキル，Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル，フェニルからなる群から選択される残基である）；
Ｒ４は、Ｈ，ＣＨ３，直鎖状又は枝分かれＣ２−Ｃ６アルキル，Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル，フェニル，(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｐＨからなる群から選択される残基である（ここで、ｐは、１〜４の範囲の整数である）。
【００２８】
更に、本発明は、一般式（Ｉ）によって表される［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］錯体
（式中：
Ｒ２及びＲ３に結合したキラル炭素原子がＲ体の立体化学であり；
Ｒ２及びＲ３に結合したキラル炭素原子がＳ体の立体化学であり；
Ｒ５及びＲ６に結合したキラル炭素原子がＲ体の立体化学であり；
Ｒ５及びＲ６に結合したキラル炭素原子がＳ体の立体化学である）
及びその薬剤的に許容できる塩にまで及ぶ。
【００２９】
本発明の更なる目的は、一般式（Ｉ）の［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］錯体の形成をもたらす全合成プロセス、及び腫瘍性病態を治療するためのその抗腫瘍薬としての使用である。
【００３０】
本発明の対象である新規なオリゴペプチドのＡｕ(ＩＩＩ)−ジチオカルバマト誘導体［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］錯体の、抗腫瘍薬としての、目的及び利益は、以下に示す詳細な記載を通して更に理解されることになる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ヒト前立腺癌ＰＣ３細胞を本発明の一部の調査したＡｕ(ＩＩＩ)−ジチオカルバマト錯体（５μＭ）によって２４時間処置した後のアネキシンＶ及びアネキシンＶ−ＰＩ分析である。白色バー：アネキシンＶ（早いアポトーシス）；黒色バー：アネキシンＶ−ＰＩ（遅いアポトーシス）。
【図２】エストロゲン受容体α陰性のヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の増殖に対するＡＵＤ６及びＡＵＤ８の阻害効果である。
【図３】Ａ）精製したウサギ２０Ｓプロテアソーム及びＢ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１全細胞抽出物において錯体ＡＵＤ６及びＡＵＤ８によって誘発されたプロテアソームのキモトリプシン様活性の阻害である。
【図４】ヒト乳癌の異種移植片に対するＡＵＤ６及びＡＵＤ８のインビボでの阻害効果である。ヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を有した雌ヌードマウスを１ｍｇ／ｋｇの金錯体ＡｕＤ６若しくはＡｕＤ８又は対照ベクター（Ｖ）によって毎日ｓ．ｃ．処置した。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
既存の治療法に対する膨大な潜在的影響は、新規で且つより選択的な金属系化学療法剤を有する必要があり、限局した癌における部位特異的送達の可能性を備える場合、発明者に、細胞取り込みを大きく向上させ且つ金属系化学療法剤の典型的な望ましくない副作用を最小限に抑えようとする新規なＡｕ（ＩＩＩ）錯体を設計するよう促した。
【００３３】
それ故に、ここで既に報告した一般式（Ｉ）によって表される［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］錯体は、対照薬剤シスプラチンの主な特徴を緊密に再生し、そして、薬剤の強化された細胞内送達のためのキャリヤーとしてＡｕ（ＩＩＩ）金属中心に直接結合したペプチド（内在性化学的保護剤としてのジチオカルバマト部分の存在と組み合わされている）を用いることによって細胞取り込みを改良しようとする試みの際に設計された。
【００３４】
実際、これら錯体は、ほぼ正方形−平面の形状を示し、加水分解を容易に受け得る２つのｃｉｓ−Ａｕ(ＩＩＩ)−ハロゲン又は擬似ハロゲン結合を含有するべきであり、残りの配位位置は、ペプチド−ジチオカルバマト配位子によって占有され、−ＮＣＳＳ部分は、対称性を持った二座配位の状態で硫黄供与性原子を介して金属中心に配位し、同一平面内に位置している。
【００３５】
しかしながら、金は、異なる酸化状態を示し、豊かな配位化学を持つ。それ故、この種の金属、具体的には金についてよく知られているように、その錯体のちょっとした変化は、それらの物理化学的特性、延いてはそれらの生物学的特性の劇的な変化をもたらすことができる。それ故、以前に報告した単一のアミノ酸ジチオカルバマト配位子を含有するＡｕ（ＩＩＩ）類似体［L. Ronconi et al. 2005, ref. cit.］から本発明の対象である化合物に移行させて、それらの化学的及び生物学的挙動の変化が期待された。実際、ジチオカルバマト配位子のアミノ酸鎖の延長は、生理的条件下での安定性、抗腫瘍活性、腎臓毒性及び交差耐性等、それらの特性の劇的な変化へとつながった可能性があり（将来の化合物では、実際につながる可能性がある）、その予測は決してささいなことではない。
【００３６】
本発明の第一の実施態様において、配位子ｐｄｔｃのオリゴペプチド部分は、２〜５個のアミノ酸からなるペプチド／エステル化ペプチドのジチオカルバマト誘導体であり、該アミノ酸は、天然又は合成のいずれかであり、互いに独立してＳ（Ｌ）又はＲ（Ｄ）の立体化学を示す。好ましくは、上記アミノ酸は、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、サルコシン（Ｓａｒ）、α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）からなる群において選択される。
【００３７】
一般式（Ｉ）に従うＡｕ（ＩＩＩ）錯体の更に好適な実施態様においては、
Ｘ１及びＸ２が、Ｃｌ及びＢｒから選択されるハロゲンであり；
配位子ｐｄｔｃのオリゴペプチド残基が、−Ｓａｒ−Ｇｌｙ−，−Ｓａｒ−Ａｉｂ−，−Ｓａｒ−Ｐｈｅ−，−Ｓａｒ−Ｓｅｒ−，−Ｓａｒ−Ａｉｂ２−，−Ｓａｒ−Ａｉｂ３−Ｇｌｙ−からなる群から選択され；
ＹがＯであり；
Ｒ４が、メチル、エチル、ｔ−ブチルからなる群から選択される。
【００３８】
最も好適な実施態様としては、ｐｄｔｃ配位子が、(ｔ−Ｂｕ)Ｏ−Ｇｌｙ−Ｓａｒ−ＣＳＳ，(ｔ−Ｂｕ)Ｏ−Ａｉｂ−Ｓａｒ−ＣＳＳ，(ｔ−Ｂｕ)Ｏ−Ｐｈｅ−Ｓａｒ−ＣＳＳ，ＭｅＯ−Ｇｌｙ−Ｓａｒ−ＣＳＳ，ＭｅＯ−Ａｉｂ−Ｓａｒ−ＣＳＳ，ＭｅＯ−Ｓｅｒ−Ｓａｒ−ＣＳＳ，ＭｅＯ−Ｐｈｅ−Ｓａｒ−ＣＳＳ，(ｔ−Ｂｕ)Ｏ−Ａｉｂ２−Ｓａｒ−ＣＳＳ，ＥｔＯ−Ｇｌｙ−Ａｉｂ３−Ｓａｒ−ＣＳＳからなる群から選択される。
【００３９】
本発明に従う錯体は、関連性のあるインビトロでの細胞毒性を示しており、ヒト癌細胞株上でのアポトーシスを誘発する能力に関連したものであり、両方の効果は、対照薬剤シスプラチンより有意に高いものである。加えて、これら錯体は、精製したプロテオソーム上で、また腫瘍細胞株全体での抽出物上で、プロテオソームのキモトリプシン様活性を阻害することができ、以前に調べられたＡｕ(ＩＩＩ)−ジチオカルバマト類似体より２倍強力であった。
【００４０】
従って、本発明のＡｕ（ＩＩＩ）錯体は、腫瘍性病態を治療するための抗腫瘍薬として有効に使用できる。具体的に、ここで開示されたＡｕ（ＩＩＩ）錯体は、それら単独で使用してもよいし、リンパ腫、骨髄腫、急性及び慢性白血病、泌尿生殖器癌、睾丸癌及び卵巣癌、小細胞肺癌、膀胱癌、子宮頸癌、脳腫瘍、並びに乳癌等の腫瘍性病態を治療する他の化学療法剤と組み合わせて使用してもよい。
【００４１】
このため、上記錯体は、非経口投与、経口投与、局所投与及び経皮投与に適した薬剤的に許容できる賦形剤及び／又は希釈剤と組み合わせた組成物の調製に使用できる。上記組成物は、治療の準備ができているか又は投与の際に調製される高速−又は緩徐−放出組成物とすることができる。また、一般式（Ｉ）のＡｕ（ＩＩＩ）錯体を含む組成物は、一般的な局所投与に適した装置を用いても投与できる。
【００４２】
本発明に従う［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］型の錯体（Ｘ＝ハロゲン，擬似ハロゲン；ｐｄｔｃ＝ペプチド−／エステル化ペプチドジチオカルバマト）に導く一般的な合成方法を以下の通り段階的に要約することができる：
１）反応
【化４】
2012520833.tif 000005
に従って、０℃の水中における、選択されたペプチド／エステル化ペプチドの塩酸塩（ｐ・ＨＣｌ）、二硫化炭素（ＣＳ２）及び水酸化ナトリウム又は水酸化カリウム（ＭＯＨ，Ｍ＝Ｎａ，Ｋ）間での１：１：１化学量論的反応により、ジチオカルバマト配位子をインサイチューで鋳型合成し、対応するジチオカルバミン酸（ｐｄｔｃＨ＝ｐ−Ｃ(Ｓ)ＳＨ）の形成をもたらす。
２）反応
【化５】
2012520833.tif 000006
に従って、０℃の水中において、インサイチュー（先の工程１）で生成したジチオカルバマト配位子とＭ[ＡｕＩＩＩＸ４]（Ｍ＝Ｎａ，Ｋ）間での２：１配位子対金属の反応によって、金金属中心にジチオカルバマト配位子を配位させ、［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］錯体の沈殿をもたらす。
３）［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］錯体を分離し、それを任意に精製する。
【００４３】
先の工程２で得られた固体は、遠心分離によって分離され、水を用いて数回洗浄し、減圧下でＰ２Ｏ５を用いて乾燥させる。
【００４４】
一般式（Ｉ）を有するオリゴペプチドのＡｕ(ＩＩＩ)−ジチオカルバマト誘導体の一部が、合成及び精製され、十分に特徴付けられた。これら錯体の合成及びそれらのインビトロでの抗腫瘍活性についての非制限的な例を以下に説明する。
【実施例】
【００４５】
＜［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］錯体の合成及び特徴付け＞
以下に報告した８つのエステル化ペプチド（Ｐ１−Ｐ９）は、文献［G.M. Bonora, C. Toniolo, Biopolymers 1974, 13, 2179-2190; M.K. Dhaon, R.K. Olsen, K. Ramasamy, J. Org. Chem. 1982, 47, 1962-1965; D.S. Jones, G.W. Kenner, J. Preston, R.C. Sheppard, J. Chem. Soc. 1965, 6227-6239］において既に報告されている確立した手順を受け、塩酸塩として合成され、それらを精製し、十分に特徴付けた。キラルアミノ酸が存在する場合、それはＳ（Ｌ）の立体化学を有する。
【００４６】
【化６】
2012520833.tif 000007
【００４７】
ここで、Ｓａｒ＝サルコシン；Ｇｌｙ＝グリシン；Ａｉｂ＝α−アミノイソ酪酸；Ｐｈｅ＝フェニルアラニン；Ｓｅｒ＝セリンである。
【００４８】
次いで、これらオリゴペプチドは、以下の化学構造及び合成のように報告されるオリゴペプチドのＡｕ(ＩＩＩ)−ジチオカルバマト誘導体の合成及び特徴付けに使用された。
【００４９】
【化７】
2012520833.tif 000008
【００５０】
ここで、Ｓａｒ＝サルコシン；Ｇｌｙ＝グリシン；Ａｉｂ＝α−アミノイソ酪酸；Ｐｈｅ＝フェニルアラニンである。
【００５１】
例１：［ＡｕＩＩＩＢｒ２((ｔ−Ｂｕ)Ｏ−Ｇｌｙ−Ｓａｒ−ｄｔｃ)］（ＡＵＤ６）
０℃にて冷却したＨＣｌ・Ｈ−Ｓａｒ−Ｇｌｙ−Ｏ(ｔ−Ｂｕ)（１．４２ｍｍｏｌ）の水溶液（およそ３ｍＬ）を、連続攪拌下、冷ＣＳ２（１．４３ｍｍｏｌ）及びＮａＯＨ（１．４２ｍｍｏｌ）の水溶液（１ｍＬ）によって滴下処理した。およそ２時間後にｐＨが１１から６に変化し、その溶液をＫ[ＡｕＢｒ４]（０．７０ｍｍｏｌ）の冷却（０℃）水溶液（およそ２ｍＬ）に攪拌しながらゆっくりと加え、赤褐色固体の速やかな沈殿をもたらし、それをろ別し、水を用いて洗浄し、減圧下でＰ２Ｏ５を用いて乾燥させた。最終収率は７７．２％であった。
【００５２】
C10H17AuBr2N2O3S2の元素分析  計算値：C, 18.94; H, 2.70; N, 4.42; S, 10.11%. 実測値：C, 19.20; H, 2.88; N, 4.42; S, 10.25%.
融点：錯体は１５２．６℃にて分解する．
IRデータ(KBr, cm-1): 3352 (ν, N-H); 1736 (ν, C=Oエステル); 1673 (ν, C=Oアミド); 1568 (ν,アミドII + N-CSS); 1253 (ν,アミドIII); 1228 (ν, C-O(t-Bu)); 1161 (ν, (t-Bu)-O); 1006, 556 (νa,s, S-C-S); 387 (νa,s, S-Au-S); 252, 227 (νa,s, Br-Au-Br).
1H NMR (300.13 MHz,アセトン-D6, 298 K):δ (ppm) 1.45 (C(CH3)3); 3.53, 3.57 (NCH3); 3.95, 3.96 (CH2 Gly); 4.71, 4.75 (CH2 Sar); 7.96 (NH).
13C NMR (75.48 MHz,アセトン-D6, 298 K):δ (ppm) 28.66 (C(CH3)3); 40.13, 41.12 (NCH3); 43.09 (CH2 Gly); 55.12, 58.98 (CH2 Sar); 82.59 (C(CH3)3); 165.06, 165.35 (NCO); 169.93 (COO); 196.74, 200.48 (CSS).
【００５３】
例２：［ＡｕＩＩＩＣｌ２((ｔ−Ｂｕ)Ｏ−Ｇｌｙ−Ｓａｒ−ｄｔｃ)］（ＡＵＤ７）
０℃にて冷却したＨＣｌ・Ｈ−Ｓａｒ−Ｇｌｙ−Ｏ(ｔ−Ｂｕ)（１．５６ｍｍｏｌ）の水溶液（およそ３ｍＬ）を、連続攪拌下、冷ＣＳ２（１．５８ｍｍｏｌ）及びＮａＯＨ（１．５８ｍｍｏｌ）の水溶液（１ｍＬ）によって滴下処理した。およそ２時間後にｐＨが１１から６に変化し、その溶液をＫ[ＡｕＣｌ４]（０．７７ｍｍｏｌ）の冷却（０℃）水溶液（およそ２ｍＬ）に攪拌しながらゆっくりと加え、黄土色固体の速やかな沈殿をもたらし、それをろ別し、水を用いて洗浄し、減圧下でＰ２Ｏ５を用いて乾燥させた。最終収率は７６．９％であった。
【００５４】
C10H17AuCl2N2O3S2の元素分析  計算値：C, 22.03; H, 3.14; N, 5.14; S, 11.76%. 実測値：C, 22.00; H, 3.23; N, 5.08; S, 11.96%.
融点：錯体は１５５．３℃にて分解する．
IRデータ(KBr, cm-1): 3349 (ν, N-H); 1737 (ν, C=Oエステル); 1672 (ν, C=Oアミド); 1561 (ν,アミドII + N-CSS); 1253 (ν,アミドIII); 1229 (ν, C-O(t-Bu)); 1162 (ν, (t-Bu)-O); 1006, 558 (νa,s, S-C-S); 384 (νa,s, S-Au-S); 358, 339 (νa,s, Cl-Au-Cl).
1H NMR (300.13 MHz,アセトン-D6, 298 K):δ (ppm) 1.45 (C(CH3)3); 3.56, 3.57 (NCH3); 3.94, 3.97 (CH2 Gly); 4.75 (CH2 Sar); 7.92 (NH).
13C NMR (75.48 MHz,アセトン-D6, 298 K):δ (ppm) 28.70 (C(CH3)3); 40.66, 41.10 (NCH3); 43.27 (CH2 Gly); 55.64 (CH2 Sar); 82.66 (C(CH3)3); 165.10 (NCO); 169.82 (COO); 195.45, 200.60 (CSS).
【００５５】
例３：［ＡｕＩＩＩＢｒ２((ｔ−Ｂｕ)Ｏ−Ａｉｂ−Ｓａｒ−ｄｔｃ)］（ＡＵＤ８）
０℃にて冷却したＨＣｌ・Ｈ−Ｓａｒ−Ａｉｂ−Ｏ(ｔ−Ｂｕ)（１．４３ｍｍｏｌ）の水溶液（およそ３ｍＬ）を、連続攪拌下、冷ＣＳ２（１．４３ｍｍｏｌ）及びＮａＯＨ（１．４２ｍｍｏｌ）の水溶液（１ｍＬ）によって滴下処理した。およそ２．５時間後にｐＨが１１から６に変化し、その溶液をＫ[ＡｕＢｒ４]（０．７１ｍｍｏｌ）の冷却（０℃）水溶液（およそ２ｍＬ）に攪拌しながらゆっくりと加え、赤褐色固体の速やかな沈殿をもたらし、それをろ別し、水を用いて洗浄し、減圧下でＰ２Ｏ５を用いて乾燥させた。最終収率は７６．４％であった。
【００５６】
C12H21AuBr2N2O3S2の元素分析  計算値：C, 21.76; H, 3.20; N, 4.23; S, 9.68%. 実測値：C, 22.03; H, 3.33; N, 4.34; S, 9.58%.
M.p.: １６５．９℃にて分解する．
IRデータ(KBr, cm-1): 3362 (ν, N-H); 1734 (ν, C=Oエステル); 1690 (ν, C=Oアミド); 1560 (ν, N-CSS); 1531 (ν,アミドII); 1252 (ν,アミドIII); 1215 (ν, C-O(t-Bu)); 1144 (ν, (t-Bu)-O); 996, 545 (νa,s, S-C-S); 383 (νa,s, S-Au-S); 252, 223 (νa,s, Br-Au-Br).
1H NMR (300.13 MHz,アセトン-D6, 298 K):δ (ppm) 1.44 (C(CH3)3); 1.45, 1.46 (C(CH3)2Aib); 3.51, 3.54 (NCH3); 4.62, 4.66 (CH2 Sar); 7.90 (NH).
13C NMR (75.48 MHz,アセトン-D6, 298 K):δ (ppm) 25.61 (C(CH3)2 Aib); 28.60 (C(CH3)3); 40.21, 41.20 (NCH3); 55.26, 56.15 (CH2 Sar); 58.35 (C(CH3)2Aib); 81.91 (C(CH3)3); 164.00 (NCO); 173.73 (COO); 196.57, 200.26 (CSS).
【００５７】
例４：［ＡｕＩＩＩＣｌ２((ｔ−Ｂｕ)Ｏ−Ａｉｂ−Ｓａｒ−ｄｔｃ)］（ＡＵＤ９）
０℃にて冷却したＨＣｌ・Ｈ−Ｓａｒ−Ａｉｂ−Ｏ(ｔ−Ｂｕ)（１．５８ｍｍｏｌ）の水溶液（およそ３ｍＬ）を、連続攪拌下、冷ＣＳ２（１．５８ｍｍｏｌ）及びＮａＯＨ（１．５９ｍｍｏｌ）の水溶液（１ｍＬ）によって滴下処理した。およそ２．５時間後にｐＨが１１から６に変化し、その溶液をＫ[ＡｕＣｌ４]（０．７８ｍｍｏｌ）の冷却（０℃）水溶液（およそ２ｍＬ）に攪拌しながらゆっくりと加え、黄土色固体の速やかな沈殿をもたらし、それをろ別し、水を用いて洗浄し、減圧下でＰ２Ｏ５を用いて乾燥させた。最終収率は８０．６％であった。
【００５８】
C12H21AuCl2N2O3S2の元素分析  計算値：C, 25.14; H, 3.69; N, 4.89; S, 11.19%. 実測値：C, 25.11; H, 3.84; N, 4.84; S, 11.37%.
融点：錯体は１６６．６℃にて分解する．
IRデータ(KBr, cm-1): 3365 (ν, N-H); 1733 (ν, C=Oエステル); 1691 (ν, C=Oアミド); 1564 (ν, N-CSS); 1534 (ν,アミドII); 1252 (ν,アミドIII); 1214 (ν, C-O(t-Bu)); 1146 (ν, (t-Bu)-O); 996, 547 (νa,s, S-C-S); 383 (νa,s, S-Au-S); 347 (νa,s, Cl-Au-Cl).
1H NMR (300.13 MHz,アセトン-D6, 298 K):δ (ppm) 1.44 (C(CH3)3); 1.45, 1.46 (C(CH3)2Aib); 3.54, 3.55 (NCH3); 4.66 (CH2 Sar); 7.89 (NH).
13C NMR (75.48 MHz,アセトン-D6, 298 K):δ (ppm) 25.52 (C(CH3)2 Aib); 28.50 (C(CH3)3); 40.64, 41.04 (NCH3); 55.67 (CH2 Sar); 58.20 (C(CH3)2Aib); 81.87 (C(CH3)3); 163.80 (NCO); 173.62 (COO); 195.09, 200.19 (CSS).
【００５９】
例５：［ＡｕＩＩＩＢｒ２((ｔ−Ｂｕ)Ｏ−Ｐｈｅ−Ｓａｒ−ｄｔｃ)］（ＡＵＤ１０）
０℃にて冷却したＨＣｌ・Ｈ−Ｓａｒ−Ｐｈｅ−Ｏ(ｔ−Ｂｕ)（１．３８ｍｍｏｌ）の水溶液（およそ３ｍＬ）を、連続攪拌下、冷ＣＳ２（１．３９ｍｍｏｌ）及びＮａＯＨ（１．３８ｍｍｏｌ）の水溶液（１ｍＬ）によって滴下処理した。およそ１．５時間後にｐＨが１１から６に変化し、その溶液をＫ[ＡｕＢｒ４]（０．６９ｍｍｏｌ）の冷却（０℃）水溶液（およそ２ｍＬ）に攪拌しながらゆっくりと加え、赤褐色固体の速やかな沈殿をもたらし、それをろ別し、水を用いて洗浄し、減圧下でＰ２Ｏ５を用いて乾燥させた。最終収率は７１．５％であった。
【００６０】
C17H23AuBr2N2O3S2の元素分析  計算値：C, 28.19; H, 3.20; N, 3.87; S, 8.85%. 実測値：C, 28.34; H, 3.09; N, 3.87; S, 8.63%.
融点：錯体は１２４．３℃にて分解する．
IRデータ(KBr, cm-1): 3431 (ν, N-H); 1731 (ν, C=Oエステル); 1683 (ν, C=Oアミド); 1558 (ν, N-CSS); 1543 (ν,アミドII); 1259 (ν,アミドIII); 1214 (ν, C-O(t-Bu)); 1155 (ν, (t-Bu)-O); 994, 562 (νa,s, S-C-S); 381 (νa,s, S-Au-S); 252, 221 (νa,s, Br-Au-Br).
1H NMR (300.13 MHz,アセトン-D6, 298 K):δ (ppm) 1.43 (C(CH3)3); 2.98-3.20 (CH2-Ph); 3.45, 3.49 (NCH3); 4.65, 4.70 (CH2 Sar); 4.67-4.74 (CH); 7.25-7.33 (C6H5); 7.91 (NH).
13C NMR (75.48 MHz,アセトン-D6, 298 K):δ (ppm) 28.11 (C(CH3)3); 38.50 (CH2-Ph); 39.74, 40.74 (NCH3); 54.65, 55.56 (CH2 Sar); 55.23 (CH); 82.56 (C(CH3)3); 127.86 (Ph, p-CH); 129.41 (Ph, m-CH); 130.43 (Ph, o-CH); 137.72 (Ph, CH2-C); 164.10, 164.33 (NCO); 170.75 (COO); 196.11, 199.33 (CSS).
【００６１】
例６：［ＡｕＩＩＩＣｌ２((ｔ−Ｂｕ)Ｏ−Ｐｈｅ−Ｓａｒ−ｄｔｃ)］（ＡＵＤ１１）
０℃にて冷却したＨＣｌ・Ｈ−Ｓａｒ−Ｐｈｅ−Ｏ(ｔ−Ｂｕ)（１．６２ｍｍｏｌ）の水溶液（およそ３ｍＬ）を、連続攪拌下、冷ＣＳ２（１．６４ｍｍｏｌ）及びＮａＯＨ（１．６１ｍｍｏｌ）の水溶液（１ｍＬ）によって滴下処理した。およそ１．５時間後にｐＨが１１から６に変化し、その溶液をＫ[ＡｕＣｌ４]（０．８０ｍｍｏｌ）の冷却（０℃）水溶液（およそ２ｍＬ）に攪拌しながらゆっくりと加え、薄茶色固体の速やかな沈殿をもたらし、それをろ別し、水を用いて洗浄し、減圧下でＰ２Ｏ５を用いて乾燥させた。最終収率は８１．７％であった。
【００６２】
C17H23AuCl2N2O3S2の元素分析  計算値：C, 32.14; H, 3.65; N, 4.41; S, 10.09%. 実測値：C, 32.31; H, 3.54; N, 4.40; S, 9.95%.
融点：錯体は１３８．３℃にて分解する．
IRデータ(KBr, cm-1): 3342 (ν, N-H); 1733 (ν, C=Oエステル); 1684 (ν, C=Oアミド); 1559 (ν, N-CSS); 1542 (ν,アミドII); 1256 (ν,アミドIII); 1213 (ν, C-O(t-Bu)); 1155 (ν, (t-Bu)-O); 994, 563 (νa,s, S-C-S); 383 (νa,s, S-Au-S); 359 (νa,s, Cl-Au-Cl).
1H NMR (300.13 MHz,アセトン-D6, 298 K):δ (ppm) 1.43 (C(CH3)3); 2.98-3.20 (CH2-Ph); 3.49 (NCH3); 4.70 (CH2 Sar); 4.67-4.74 (CH); 7.25-7.33 (C6H5); 7.92 (NH).
13C NMR (75.48 MHz,アセトン-D6, 298 K):δ (ppm) 27.86 (C(CH3)3); 38.29 (CH2-Ph); 40.49 (NCH3); 55.31 (CH2 Sar); 54.97 (CH); 82.33 (C(CH3)3); 127.50 (Ph, p-CH); 129.15 (Ph, m-CH); 130.40 (Ph, o-CH); 137.73 (Ph, CH2-C); 163.97, 164.10 (NCO); 170.93 (COO); 194.45, 199.61 (CSS).
【００６３】
例７：［ＡｕＩＩＩＢｒ２(ＥｔＯ−Ｇｌｙ−Ａｉｂ３−Ｓａｒ−ｄｔｃ)］（ＡＵＤ１２）
０℃にて冷却したＨＣｌ・Ｈ−Ｓａｒ−Ａｉｂ３−Ｇｌｙ−ＯＥｔ（０．８４ｍｍｏｌ）の水溶液（およそ３ｍＬ）を、連続攪拌下、冷ＣＳ２（０．８６ｍｍｏｌ）及びＮａＯＨ（０．８４ｍｍｏｌ）の水溶液（１ｍＬ）によって滴下処理した。およそ２時間後にｐＨが１１から６に変化し、その溶液をＫ[ＡｕＢｒ４]（０．４１ｍｍｏｌ）の冷却（０℃）水溶液（およそ２ｍＬ）に攪拌しながらゆっくりと加え、赤褐色固体の速やかな沈殿をもたらし、それをろ別し、水を用いて洗浄し、減圧下でＰ２Ｏ５を用いて乾燥させた。最終収率は７８．９％であった。
【００６４】
C20H34AuBr2N5O6S2の元素分析  計算値：C, 27.89; H, 3.98; N, 8.13; S, 7.44%. 実測値：C, 27.71; H, 4.10; N, 8.24; S, 7.58%.
M.p.:１６０．３℃にて分解する．
IRデータ(KBr, cm-1): 3358 (ν, N-H); 1741 (ν, C=Oエステル); 1689 (ν, C=Oアミド); 1563 (ν, N-CSS); 1533 (ν,アミドII); 1253 (ν,アミドIII); 1240 (ν, C-OEt); 1098 (ν, Et-O); 998, 547 (νa,s, S-C-S); 384 (νa,s, S-Au-S); 253, 222 (νa,s, Br-Au-Br).
1H NMR (300.13 MHz,アセトン-D6, 298 K):δ (ppm) 1.22 (CH3 Et); 1.38-1.51 (C(CH3)2Aib); 3.54, 3.58 (NCH3); 3.86, 3.90 (CH2 Gly); 4.10 (CH2Et); 4.80, 4.83 (CH2 Sar); 7.15-8.38 (NH).
【００６５】
例８：［ＡｕＩＩＩＢｒ２((ｔ−Ｂｕ)Ｏ−Ａｉｂ２−Ｓａｒ−ｄｔｃ)］（ＡＵＤ１３）
０℃にて冷却したＨＣｌ・Ｈ−Ｓａｒ−Ａｉｂ２−Ｏ(ｔ−Ｂｕ)（１．５８ｍｍｏｌ）の水溶液（およそ３ｍＬ）を、連続攪拌下、冷ＣＳ２（１．５８ｍｍｏｌ）及びＮａＯＨ（１．６０ｍｍｏｌ）の水溶液（１ｍＬ）によって滴下処理した。およそ２．５時間後にｐＨが１１から６に変化し、その溶液をＫ[ＡｕＢｒ４]（０．７８ｍｍｏｌ）の冷却（０℃）水溶液（およそ２ｍＬ）に攪拌しながらゆっくりと加え、赤褐色固体の速やかな沈殿をもたらし、それをろ別し、水を用いて洗浄し、減圧下でＰ２Ｏ５を用いて乾燥させた。最終収率は８１．２％であった。
【００６６】
C16H28AuBr2N3O4S2の元素分析  計算値：C, 25.71; H, 3.78; N, 5.62; S, 8.58%. 実測値：C, 25.79; H, 3.75; N, 5.48; S, 8.50%.
M.p.:１６１．７℃にて分解する．
IRデータ(KBr, cm-1): 3360 (ν, N-H); 1735 (ν, C=Oエステル); 1688 (ν, C=Oアミド); 1561 (ν, N-CSS); 1538 (ν,アミドII); 1252 (ν,アミドIII); 1216 (ν, C-O(t-Bu)); 1145 (ν, (t-Bu)-O); 995, 545 (νa,s, S-C-S); 383 (νa,s, S-Au-S); 252, 222 (νa,s, Br-Au-Br).
1H NMR (300.13 MHz,アセトン-D6, 298 K):δ (ppm) 1.87 (C(CH3)3); 1.85-1.97 (C(CH3)2Aib); 3.96, 4.00 (NCH3); 5.15, 5.20 (CH2 Sar); 7.83-8.41 (NH).
【００６７】
例９：［ＡｕＩＩＩＣｌ２((ｔ−Ｂｕ)Ｏ−Ａｉｂ２−Ｓａｒ−ｄｔｃ)］（ＡＵＤ１４）
０℃にて冷却したＨＣｌ・Ｈ−Ｓａｒ−Ａｉｂ２−Ｏ(ｔ−Ｂｕ)（１．６７ｍｍｏｌ）の水溶液（およそ３ｍＬ）を、連続攪拌下、冷ＣＳ２（１．６８ｍｍｏｌ）及びＮａＯＨ（１．６７ｍｍｏｌ）の水溶液（１ｍＬ）によって滴下処理した。およそ２．５時間後にｐＨが１１から６に変化し、その溶液をＫ[ＡｕＣｌ４]（０．８３ｍｍｏｌ）の冷却（０℃）水溶液（およそ２ｍＬ）に攪拌しながらゆっくりと加え、濃い黄土色固体の速やかな沈殿をもたらし、それをろ別し、水を用いて洗浄し、減圧下でＰ２Ｏ５を用いて乾燥させた。最終収率は７６．３％であった。
【００６８】
C16H28AuCl2N3O4S2の元素分析  計算値：C, 29.19; H, 4.29; N, 6.38; S, 9.74%. 実測値：C, 29.02; H, 4.19; N, 6.48; S, 9.60%.
M.p.:１６６．９℃にて分解する．
IRデータ(KBr, cm-1): 3365 (ν, N-H); 1733 (ν, C=Oエステル); 1692 (ν, C=Oアミド); 1563 (ν, N-CSS); 1535 (ν,アミドII); 1252 (ν,アミドIII); 1213 (ν, C-O(t-Bu)); 1145 (ν, (t-Bu)-O); 995, 546 (νa,s, S-C-S); 384 (νa,s, S-Au-S); 351 (νa,s, Cl-Au-Cl).
1H NMR (300.13 MHz,アセトン-D6, 298 K):δ (ppm) 1.87 (C(CH3)3); 1.85-1.98 (C(CH3)2Aib); 4.00 (NCH3); 5.18 (CH2 Sar); 7.80-8.29 (NH).
【００６９】
＜生物学的活性の評価＞
Ａ−インビトロ
細胞毒性についてのインビトロでの予備テストを、本発明に従う［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］錯体の一部の例に対して行った。
【００７０】
ヒト前立腺癌ＰＣ３細胞（骨髄転移から確立され、アンドロゲン処置に対して無応答性である）は、５％ＣＯ２及び水分が濃縮された雰囲気下、３７℃にて、熱失活した１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ペニシリン（２ｍｇｍＬ−１）、ストレプトマイシン（２ｍｇｍＬ−１）、Ｌ−グルタミン（０．１％ｗ／ｖ）が補充されたＩＤＭＦ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）中で培養された。
【００７１】
使用前には、［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］錯体（ＡＵＤ６、ＡＵＤ７、ＡＵＤ８、ＡＵＤ９）及びシスプラチンを実験の直前にメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解させた。次いで、計算された量の薬剤溶液を適切な培地に加え、最終濃度を０．５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯにした。ここで、細胞死への認識できる影響はなかった。テストした全ての錯体は４８時間以上ＤＭＳＯ中で安定していることが１Ｈ  ＮＭＲによって証明された。
【００７２】
細胞毒性アッセイについては、１０％熱失活ＦＢＳが補充されたＩＭＤＭ中における９６−ウェルの平底マイクロプレート中に細胞（２．５×１０３細胞ｍＬ−１）を播種し、５％ＣＯ２雰囲気中３７℃にてインキュベートした。次いで、その培地を除去し、研究されるべき化合物（予めＤＭＳＯ中に溶解されたもの）を漸増濃度（０．０５〜１０μＭ）で含有する新鮮なものと交換し、それ故に、細胞を調査化合物に７２時間さらした。３通りの培養物を各処置について確立した。細胞生存率は、製造業者の手順に従い、細胞増殖ＥＬＩＳＡ  ５−ブロモ−２'−デオキシウリジン比色分析キットによって決定された。パーセント細胞生存度は、試験化合物で処置した細胞の平均吸光度をコントロールのもので割ることによって求められ、薬物濃度（対数尺度）に対してプロットし、そのＩＣ５０（コントロールと比べて５０％の細胞増殖阻害をもたらすのに必要な薬物濃度）を決定した。なお、標準偏差は、３回の試験の平均から推定された。比較のため、シスプラチンの細胞毒性を同一の実験条件下で評価した。
【００７３】
表１に報告されるように、増加する濃度のＡＵＤ６、ＡＵＤ７、ＡＵＤ８、ＡＵＤ９錯体にＰＣ３細胞をさらすことによって、顕著な用量依存性の増殖阻害をもたらし、ここで、ＩＣ５０（５０％増殖阻害をもたらすのに必要な薬物の濃度）の値は対照薬剤シスプラチンより低く、最も活性なものは［ＡｕＩＩＩＢｒ２((ｔ−Ｂｕ)Ｏ−Ａｉｂ−Ｓａｒ−ｄｔｃ)］（ＡＵＤ８）であった。
【００７４】
【表１】
2012520833.tif 000009
【００７５】
また、調査化合物のアポトーシスを誘導する能力についても調べた。アポトーシスの最も早い特徴の一つは、細胞膜の内層から外層へのリン脂質ホスファチジルセリン（ＰＳ）膜の転位置の結果としての、原形質膜の形態変化である。カルシウムイオンの存在中において、アネキシンＶは、ＰＳに対し高い特異性と親和性を有する。それ故に、さらされたＰＳを持つ細胞へのアネキシンＶの結合は、アポトーシスを検出するための信頼性でき且つ感受性のある方法を提供する。アポトーシス細胞の集団は、同様にアネキシンＶを結合する壊死細胞を、それらの損傷した原形質膜が原因で、含有し得る。アポトーシス細胞と壊死細胞間で区別するため、蛍光色素ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）が、壊死細胞の損傷した原形質膜のみを横断できるために使用される。アネキシンＶの結合及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の染色は、フローサイトメトリーによって検出された。
【００７６】
指数増殖期におけるＰＣ３細胞を、調査化合物（５μＭ）の存在又は不在下において、１０％熱失活ＦＢＳが補充されたＩＭＤＭ中で２４時間インキュベートした。次いで、細胞を収集し、結合緩衝液（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ／ＮａＯＨ  ｐＨ７．４，１４０ｍＭのＮａＣｌ，２．５ｍＭのＣａＣｌ２）１００μｌ中に再懸濁させ、５μｌのアネキシンＶ−フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）と１０μＬのＰＩ（結合緩衝液中１０μｇ／ｍＬ）と共に暗所で１５分間インキュベートし、各サンプルに対して０．３μＬの結合緩衝液を加えた後、アッセイした。アネキシンＶでラベルした可視細胞は、それらの前方直角散乱によるフローサイトメトリーによって確認され、電子的にゲートを付けられ、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター上で分析された。
【００７７】
図１中に明らかに示されるように、テストした全てのＡｕ(ＩＩＩ)−ジチオカルバマト錯体は、早期アポトーシスマーカーであるアネキシンによって評価されるように、アポトーシスを誘導することができ、アネキシンＶ結合／ＰＩ染色の有意な増加を示す。
【００７８】
また、エストロゲン受容体α陰性のヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対するＡＵＤ６及びＡＵＤ８の増殖抑制効果を評価した。細胞は、５％ＣＯ２及び水分が濃縮された雰囲気下、３７℃にて、１０％熱失活ウシ胎仔血清、ペニシリン（１００単位ｍＬ−１）、ストレプトマイシン（１００μｇｍＬ−１）、Ｌ−グルタミン（０．１％ｗ／ｖ）が補充されたＲＰＭＩ１６４０培地中で培養された。細胞毒性アッセイについては、ＲＰＭＩ１６４０培地中における９６−ウェルマイクロプレート中に細胞を播種し、７０％〜８０％密集度まで培養し、次いで、研究されるべき化合物（予めＤＭＳＯ中に溶解されたもの）を漸増濃度（１〜５０μＭ）にて加え、５％ＣＯ２雰囲気中において３７℃にてインキュベートし、それ故に、細胞を調査化合物に２２時間さらした。３通りの培養物を各処置について確立した。細胞呼吸は、細胞生存度の指標であり、既に説明されているように、ＭＴＴ（３−(４，５−ジメチルチアゾール−２−イル)−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）のホルマザンへのミトコンドリア依存性還元によって決定される［V. Milacic, D. Chen, L. Ronconi, K.R. Landis-Piwowar, D. Fregona, Q.P. Dou, Cancer Res. 2006, 66, 10478-10486］。細胞生存率は、試験化合物で処置した細胞の平均吸光度をコントロールのもので割ることによって求められ、その標準偏差は、３回の試験の平均から推定された。図２中に報告されるように、ＡＵＤ６及びＡＵＤ８は、同様な阻害パターンであり、後者の方がわずかに高い活性を示す。更に、これらの結果は、先に調査されたＡｕ(ＩＩＩ)−ジチオカルバマト類似体［V. Milacic et al. 2006, ref. cit.］のように、両方の化合物が、ヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞増殖を阻害する際に同様に強力であると示唆する。
【００７９】
これら化合物も生物学的標的としてのプロテアソームを有するのかどうかについて調べるため、精製したウサギ２０Ｓプロテアソーム（３５ｎｇ）又はＭＤＡ−ＭＢ−２３１全細胞抽出物（１０μｇ）が、漸増濃度（０．１〜２５μＭ）の研究されるべき化合物（予めＤＭＳＯ中に溶解されたもの）の存在下において又はコントロールとしての同体積の純ＤＭＳＯの存在下において、１００μＬのアッセイ緩衝液（２０ｍｍｏｌＬ−１のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中、２０μＭの基質（プロテアソームのキモトリプシン（ＣＴ）活性についてのもの）と共にインキュベートされた。３７℃で２時間のインキュベーションの後、それぞれのプロテアソームキモトリプシン活性の阻害は、既に説明されたように測定された［V. Milacic et al. 2006, ref. cit.］。全てのＡｕ(ＩＩＩ)錯体（ＡＵＤ６、ＡＵＤ８）が、精製したウサギ２０Ｓプロテアソーム（図３Ａ）とＭＤＡ−ＭＢ−２３１全細胞抽出物（図３Ｂ）の両方のプロテアソームキモトリプシン様活性を濃度依存性にて阻害すると証明され、この場合もやはり、先に調査されたＡｕ(ＩＩＩ)−ジチオカルバマト類似体［V. Milacic et al. 2006, ref. cit.］より２倍強力であった。
【００８０】
更なる生物学的研究は、調査した両方のＡｕ(ＩＩＩ)錯体（ＡＵＤ６、ＡＵＤ８）が、Ｂａｘ及びｐ２７等のプロテアソーム標的タンパク質の蓄積を誘発することを事前に示しており、ＡＵＤ６及びＡＵＤ８によるプロテアソーム抑制（細胞死に関連する）が有効であり、そのプロテアソームが主な細胞標的であることを示す。
【００８１】
Ｂ−インビボ
細胞培養物及び細胞抽出物の調製．
エストロゲン受容体α陰性のヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、５％ＣＯ２及び水分が濃縮された雰囲気下、３７℃にて、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン（１００単位ｍＬ−１）、及びストレプトマイシン（１００μｇｍＬ−１）が補充されたＲＰＭＩ１６４０培地中で培養された。
【００８２】
ヒト乳癌の異種移植片の実験．
齢５週の雌の無胸腺ヌードマウスをＴａｃｏｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｅｖｉｃｅｓ（ハドソン）から購入し、ウェイン州立大学のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって認可されているプロトコルに従って収容した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（無血清ＲＰＭＩ１６４０培地０．１ｍＬ中に５．０×１０６細胞ｍＬ−１で懸濁させたもの）は、それぞれのマウスの右脇腹中に皮下（ｓ．ｃ．）接種された（グループにつき４匹のマウス）。腫瘍がおよそ１２０ｍｍ３の大きさに達したとき、マウスを無作為にグループ化し、１．０ｍｇｋｇ−１のＡＵＤ６若しくはＡＵＤ８又はビヒクル［１０％ＤＭＳＯ、２０％Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒｅ／エタノール（３：１）及び７０％ＰＢＳ］のｓ．ｃ．注射によって毎日処置した。腫瘍サイズは、キャリパーを用いて一日おきに測定され、それらの体積は、幅２×長さ／２の式によって求められた。マウスは、１３日間処置されていた。初期の腫瘍増殖抑制を分析した。
【００８３】
ＡＵＤ６とＡＵＤ８錯体両方のヒト乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）異種移植片の増殖をインビボで阻害する能力に関して得られた結果を図４に示す。ＡＵＤ８で処置された担癌マウスにおいては、１３日後に有意な腫瘍増殖抑制が観測された。コントロール腫瘍は、４５３ｍｍ３の平均サイズにまで成長したが、ＡＵＤ８で処置された腫瘍は、ずっと小さい平均サイズまでしか成長しておらず、＞９０％の阻害に相当する。ＡＵＤ６による類似の処置は、細胞増殖について中程度の抑制をもたらした（およそ３３％）。これらの結果は、先に議論されたインビトロでの研究と一致しており、ここで、ＡＵＤ８は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞増殖を阻害する際にＡＵＤより強力であることが示された。
【図１】
2012520833.tif 000013
【図２】
2012520833.tif 000014
【図３】
2012520833.tif 000015
【図４】
2012520833.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】平成23年11月18日(2011.11.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
【化１】
2012520833.tif 000017
又はその薬剤的に許容できる塩によって表される［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］型のＡｕ（ＩＩＩ）錯体であって、
式中：
Ｘ１及びＸ２は、互いに等しくても異なっていてもよいが、Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ，ＣＮ，及びＳＣＮからなる群から選択され；
ｍは、２〜５の範囲の整数であり；
有機的部分［−Ｃ(＝Ｏ)−Ｚｎ−Ｃ(Ｒ２)(Ｒ３)−Ｎ(Ｒ１)−］は、互いに等しくても異なってもよいアミノ酸残基であり、ここで、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３及びＺｎは、互いに等しくても異なっていてもよいが：
Ｒ１は、Ｈ，ＣＨ３，直鎖状又は枝分かれＣ２−Ｃ６アルキル，Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル，フェニル，及びＲ３に結合したＣＨ２（ここで、Ｒ３は、(ＣＨ２)２に等しい）からなる群から選択される残基であり；
Ｒ２は、Ｈ，ＣＨ３，直鎖状又は枝分かれＣ２−Ｃ６アルキル，Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル，及びフェニルからなる群から選択される残基であり；
Ｒ３は、Ｈ，ＣＨ３，
【化２】
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ＣＨ(ＣＨ３)２，Ｒ１に結合した(ＣＨ２)２（ここで、Ｒ１は、ＣＨ２に等しい），ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)２，ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ２ＣＨ３，ＣＨ２−(Ｃ６Ｈ５)，
【化３】
2012520833.tif 000019
ＣＨ２ＯＨ，ＣＨ２−(Ｃ６Ｈ４)−ＯＨ，ＣＨ(ＣＨ３)ＯＨ，ＣＨ２ＳＨ，(ＣＨ２)２Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ２，(ＣＨ２)３ＮＨＣ(＝ＮＨ)ＮＨ２，(ＣＨ２)２ＳＣＨ３，(ＣＨ２)４ＮＨ２，ＣＨ２Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ２，ＣＨ２Ｃ(＝Ｏ)ＯＨ，及び(ＣＨ２)２Ｃ(＝Ｏ)ＯＨからなる群から選択される残基であり；
Ｚｎ（ｎ＝０，１）は、−Ｃ−(Ｒ５)(Ｒ６)であり（ここで、Ｒ５及びＲ６は、互いに等しくても異なっていてもよいが、Ｈ，ＣＨ３，直鎖状又は枝分かれＣ２−Ｃ６アルキル，Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル，及びフェニルからなる群から選択される残基である）；
Ｙは、Ｏ，Ｓ，及びＮＲ７から選択され（ここで、Ｒ７は、Ｈ，ＣＨ３，直鎖状又は枝分かれＣ２−Ｃ６アルキル，Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル，及びフェニルからなる群から選択される残基である）；
Ｒ４は、Ｈ，ＣＨ３，直鎖状又は枝分かれＣ２−Ｃ６アルキル，Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル，フェニル，及び(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｐＨからなる群から選択される残基である（ここで、ｐは、１〜４の範囲の整数である）
ことを特徴とする［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］型のＡｕ（ＩＩＩ）錯体。
【請求項２】
Ｒ２及びＲ３に結合したキラル炭素原子が、Ｒ体の立体化学であることを特徴とする請求項１に記載の［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］型のＡｕ（ＩＩＩ）錯体。
【請求項３】
Ｒ２及びＲ３に結合したキラル炭素原子が、Ｓ体の立体化学であることを特徴とする請求項１に記載の［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］型のＡｕ（ＩＩＩ）錯体。
【請求項４】
Ｒ５及びＲ６に結合したキラル炭素原子が、Ｒ体の立体化学であることを特徴とする請求項１に記載の［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］型のＡｕ（ＩＩＩ）錯体。
【請求項５】
Ｒ５及びＲ６に結合したキラル炭素原子が、Ｓ体の立体化学であることを特徴とする請求項１に記載の［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］型のＡｕ（ＩＩＩ）錯体。
【請求項６】
前記アミノ酸残基が、グリシン，アラニン，プロリン，セリン，サルコシン，α−アミノイソ酪酸，及びフェニルアラニンからなるアミノ酸の群において選択されることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］型のＡｕ（ＩＩＩ）錯体。
【請求項７】
Ｘ１及びＸ２が、Ｃｌ及びＢｒから選択されるハロゲンであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］型のＡｕ（ＩＩＩ）錯体。
【請求項８】
有機的部分［−Ｃ(＝Ｏ)−Ｚｎ−Ｃ(Ｒ２)(Ｒ３)−Ｎ(Ｒ１)−］が、−[Ｇｌｙ]−[Ｓａｒ]−，−[Ａｉｂ]−[Ｓａｒ]−，−[Ｐｈｅ]−[Ｓａｒ]−，−[Ｓｅｒ]−[Ｓａｒ]−，−[Ａｉｂ]２−[Ｓａｒ]−，及び−[Ｇｌｙ]−[Ａｉｂ]３−[Ｓａｒ]−からなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］型のＡｕ（ＩＩＩ）錯体。
【請求項９】
ＹがＯであることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］型のＡｕ（ＩＩＩ）錯体。
【請求項１０】
Ｒ４が、メチル，エチル，及びｔ−ブチルからなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］型のＡｕ（ＩＩＩ）錯体。
【請求項１１】
配位子ｐｄｔｃが、(ｔ−Ｂｕ)Ｏ−Ｇｌｙ−Ｓａｒ−ＣＳＳ，(ｔ−Ｂｕ)Ｏ−Ａｉｂ−Ｓａｒ−ＣＳＳ，(ｔ−Ｂｕ)Ｏ−Ｐｈｅ−Ｓａｒ−ＣＳＳ，ＭｅＯ−Ｇｌｙ−Ｓａｒ−ＣＳＳ，ＭｅＯ−Ａｉｂ−Ｓａｒ−ＣＳＳ，ＭｅＯ−Ｐｈｅ−Ｓａｒ−ＣＳＳ，ＭｅＯ−Ｓｅｒ−Ｓａｒ−ＣＳＳ，(ｔ−Ｂｕ)Ｏ−Ａｉｂ２−Ｓａｒ−ＣＳＳ，及びＥｔＯ−Ｇｌｙ−Ａｉｂ３−Ｓａｒ−ＣＳＳからなる群から選択されることを特徴とする請求項８〜１０のいずれかに記載の［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］型のＡｕ（ＩＩＩ）錯体。
【請求項１２】
抗腫瘍薬として用いるための、請求項１〜１１のいずれかに記載の［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］型のＡｕ（ＩＩＩ）錯体。
【請求項１３】
腫瘍性病態を治療するための薬剤的に許容できる賦形剤及び／又は希釈剤と組み合わせて、請求項１〜１１のいずれかに記載の［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］型のＡｕ（ＩＩＩ）錯体を少なくとも１種含む組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれかに記載の［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］型のＡｕ（ＩＩＩ）錯体を調製する方法であって、
ａ）０℃の水中における、選択されたペプチド又はエステル化ペプチドの塩酸塩（ｐ・ＨＣｌ）、二硫化炭素（ＣＳ２）及びアルカリ金属の水酸化物（ＭＯＨ，Ｍ＝Ｎａ，Ｋ）間での１：１：１化学量論的反応により、ジチオカルバマト配位子をインサイチューで合成する工程と；
ｂ）０℃の水中において２：１の割合にある、先の工程ａ）においてインサイチューで生成したジチオカルバマト配位子とＭ[ＡｕＩＩＩＸ４]（Ｍ＝Ｎａ，Ｋ；Ｘ＝Ｂｒ，Ｃｌ）間での２：１配位子対金属の反応によって、Ａｕ（ＩＩＩ）中心にジチオカルバマト配位子が配位することにより、［ＡｕＩＩＩＸ２(ｐｄｔｃ)］錯体を合成する工程と；
ｃ）前記錯体を分離し、それを任意に精製する工程と；
を少なくとも含むことを特徴とする方法。
【国際調査報告】
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