【手続補正書】
【提出日】令和2年1月10日(2020.1.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を選択する方法であって、
（ａ）複数のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子を複数のＴ細胞と接触させるステップと；
（ｂ）ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体を、
（ｉ）複数のベッセルのうちの１つのベッセル中の、ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子のオリゴヌクレオチド部分、および
（ｉｉ）前記ベッセル中の複数のＴ細胞のうちの１つの単一のＴ細胞に由来するＴＣＲポリヌクレオチド
に付着させるステップと；
（ｃ）前記オリゴヌクレオチド部分またはその相補体および前記ＴＣＲポリヌクレオチドまたはその相補体を配列決定し、それによって配列情報を生成するステップと
を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子が、検出部分を含み、；
前記複数のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチド分子を前記複数のＴ細胞と接触させた後、および前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体を付着させる前に、
（ｂ’）前記検出部分の検出に基づいて、前記複数のＴ細胞から、富化させたＴ細胞集団を得るステップと；
（ｂ’’）富化させた前記集団から、ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子に結合した１つの単一のＴ細胞を、複数のベッセルのうちの１つのベッセルに単離するステップと
を含む方法。
【請求項３】
前記配列情報に基づいて、前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートへの前記ＴＣＲポリヌクレオチドによってコードされるＴＣＲの結合親和性を決定するステップをさらに含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記富化させたＴ細胞集団が、前記接触させるステップの後の前記複数のＴ細胞中のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子に結合したＴ細胞の全Ｔ細胞に対する比より高い、ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子に結合したＴ細胞の全Ｔ細胞に対する比を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を選択する方法であって、
（ａ）第１の複数のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子を、第１の複数のＴ細胞と、第１のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子対細胞の比で接触させるステップと；
（ｂ）第２の複数のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子を、第２の複数のＴ細胞と、前記第１のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子対細胞の比より低い、第２のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子対細胞の比で接触させるステップと；
（ｃ）第１のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体を、
（ｉ）複数のベッセルのうちの第１のベッセル中の前記第１の複数のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子のオリゴヌクレオチド部分、および
（ｉｉ）前記第１のベッセル中の前記第１の複数のＴ細胞の単一のＴ細胞に由来する第１のＴＣＲポリヌクレオチド
に付着させるステップと；
（ｄ）第２のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体を、
（ｉ）前記複数のベッセルのうちの第２のベッセル中の前記第２の複数のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子のオリゴヌクレオチド部分、および
（ｉｉ）前記第２のベッセル中の前記第２の複数のＴ細胞の単一のＴ細胞に由来する第２のＴＣＲポリヌクレオチド
に付着させるステップと；
（ｅ）前記第１のベッセル中の前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の前記オリゴヌクレオチド部分またはその相補体および前記第１のＴＣＲポリヌクレオチドまたはその相補体を配列決定し、それによって配列情報の第１のセットを生成するステップと；
（ｆ）前記第２のベッセル中の前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の前記オリゴヌクレオチド部分またはその相補体および前記第２のＴＣＲポリヌクレオチドまたはその相補体を配列決定し、それによって配列情報の第２のセットを生成するステップと；
（ｇ）配列情報の前記第１のセットに基づいて、前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートへの前記第１のＴＣＲポリヌクレオチドによってコードされるＴＣＲの第１の結合シグナルを決定するステップ、および配列情報の前記第２のセットに基づいて、前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートへの前記第２のＴＣＲポリヌクレオチドによってコードされるＴＣＲの第２の結合シグナルを決定するステップと
を含み、前記第１のＴＣＲポリヌクレオチドおよび前記第２のＴＣＲポリヌクレオチドが、同じＴＣＲをコードする、方法。
【請求項６】
前記第１のＴＣＲポリヌクレオチドおよび前記第２のＴＣＲポリヌクレオチドによってコードされる同じＴＣＲの結合親和性を、前記第１の結合シグナルおよび前記第２の結合シグナルに基づいて決定するステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第１および第２の複数のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子が、同じペプチドを含む、または同じｐＭＨＣサブタイプを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を選択する方法であって、
（ａ）複数のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子を複数のＴ細胞と接触させるステップと；
（ｂ）
（ｉ）第１のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体を、複数のベッセルのうちの第１のベッセル中のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子のオリゴヌクレオチド部分に付着させ、
（ｉｉ）前記第１のベッセル中のＴ細胞集団の第１の単一のＴ細胞に由来する第１のＴＣＲポリヌクレオチドを付着させ；
（ｉｉｉ）第２のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体を、前記複数のベッセルのうちの第２のベッセル中のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子のオリゴヌクレオチド部分に付着させ、
（ｉｖ）前記第２のベッセル中のＴ細胞集団の第２の単一のＴ細胞に由来するＴＣＲポリヌクレオチドを付着させるステップと；
（ｃ）
（ｉ）前記第１のベッセル中の前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の前記オリゴヌクレオチド部分またはその相補体および前記第１のＴＣＲポリヌクレオチドまたはその相補体を配列決定し、それによって、ＴＣＲポリヌクレオチドベッセルバーコード配列読み取りおよびオリゴヌクレオチドベッセルバーコード配列読み取りを含む配列情報の第１のセットを生成し；
（ｉｉ）前記第２のベッセル中の前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の前記オリゴヌクレオチド部分またはその相補体および第２のＴＣＲポリヌクレオチドまたはその相補体を配列決定し、それによって、ＴＣＲポリヌクレオチドベッセルバーコード配列読み取りおよびオリゴヌクレオチドベッセルバーコード配列読み取りを含む配列情報の第２のセットを生成するステップと；
（ｄ）前記第１のＴＣＲポリヌクレオチドによってコードされる前記ＴＣＲの結合親和性と前記第２のＴＣＲポリヌクレオチドによってコードされる前記ＴＣＲの結合親和性とを比較するステップであって、前記第１のＴＣＲポリヌクレオチドによってコードされる前記ＴＣＲの前記結合親和性が、配列情報の前記第１のセットに基づいて決定され、前記第２のＴＣＲポリヌクレオチドによってコードされる前記ＴＣＲの前記結合親和性が、配列情報の前記第２のセットに基づいて決定される、ステップと；
（ｅ）前記比較するステップに基づいて前記第１のＴＣＲポリヌクレオチドによってコードされる前記ＴＣＲを選択するステップであって、前記第１のＴＣＲポリヌクレオチドによってコードされる選択された前記ＴＣＲが、前記第２のＴＣＲポリヌクレオチドによってコードされる前記ＴＣＲより強力な結合親和性を有する、ステップと
を含む方法。
【請求項９】
前記第１の単一のＴ細胞が、疾患または状態に罹患している患者に由来し、必要に応じて、前記第２の単一のＴ細胞が、前記疾患または状態に罹患していない患者に由来する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子が、検出部分を含み、前記方法が、前記検出部分の検出に基づいて、富化させたＴ細胞集団を得るステップをさらに含む、請求項５から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記検出部分が、フルオロフォアを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１のベッセル中のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体のベッセルバーコード配列が、複数の前記ベッセルのうちの第２のベッセル中のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンのベッセルバーコード配列と異なる、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記配列情報が、ＴＣＲポリヌクレオチドベッセルバーコード配列読み取りおよびオリゴヌクレオチドベッセルバーコード配列読み取りを含む、請求項１、２、５または８に記載の方法。
【請求項１４】
前記単一のＴ細胞に結合したｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の数を決定するステップをさらに含む、請求項１、２、５または８に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの前記オリゴヌクレオチド部分が、前記複数のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の単一のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子に固有な四量体分子バーコード（ＴＭＢ）配列を含み、前記配列情報が、ＴＭＢ配列読み取りを含む、請求項１、２、５または８に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの前記オリゴヌクレオチド部分が、前記複数のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の単一のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子に固有な四量体分子バーコード（ＴＭＢ）配列を含み、前記配列情報が、ＴＭＢ配列読み取りを含み、前記単一のＴ細胞に結合したｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の数が、前記ＴＭＢ配列読み取りから決定される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子のｐＭＨＣ部分が、ｐＭＨＣの多量体、必要に応じてｐＭＨＣの四量体を含む、請求項１、２、５または８に記載の方法。
【請求項１８】
前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の前記ＭＨＣが、可溶形態である、請求項１、２、５または８に記載の方法。
【請求項１９】
前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の前記ｐＭＨＣ部分のペプチドが、合成ペプチドを含む、請求項１、２、５または８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の前記オリゴヌクレオチド部分が、四量体同定（ＴＩＤ）配列を含み、必要に応じて、前記複数のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の各ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子が、固有のＴＩＤ配列を含み、さらに必要に応じて、前記ＴＩＤ配列が、前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の前記ペプチドまたは前記ｐＭＨＣ部分にバーコード化される、請求項１、２、５または８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドが、前記ベッセル中の鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドに由来する、請求項１、２、５または８に記載の方法。
【請求項２２】
前記配列情報が、前記ＴＩＤ配列またはその相補体を含み、および／または前記ＴＩＤ配列を有する分子のコピー数を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記接触させるステップの後に前記複数のＴ細胞を洗浄するステップをさらに含む、請求項１、２、５または８に記載の方法。
【請求項２４】
前記単一のＴ細胞を溶解するステップをさらに含み、前記溶解するステップが、前記単一のＴ細胞が前記ベッセル中で単離された後である、請求項１、２、５または８に記載の方法。
【請求項２５】
前記複数のＴ細胞が、複数のソーティングされていないＴ細胞である、請求項１、２、５または８に記載の方法。
【請求項２６】
前記複数のベッセルのうちの単一のベッセル中の各ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体の前記ベッセルバーコード配列が、同じベッセルバーコード配列を含む、請求項１、２、５または８に記載の方法。
【請求項２７】
前記複数のベッセルのうちの任意の単一のベッセル中の各ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体の前記ベッセルバーコード配列が、前記複数のベッセルのうちの任意の他の単一のベッセル中の各ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体の前記ベッセルバーコード配列に固有である、請求項１、２、５または８に記載の方法。
【請求項２８】
ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドをオリゴヌクレオチド部分に付着させる前記ステップ、およびベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを前記単一のＴ細胞に由来するＴＣＲポリヌクレオチドに付着させる前記ステップが、同時に実行される、請求項１、２、５または８に記載の方法。
【請求項２９】
前記オリゴヌクレオチド部分もしくはその相補体および／または前記ＴＣＲ細胞ポリヌクレオチドもしくはその相補体を増幅するステップをさらに含み、必要に応じて、前記オリゴヌクレオチド部分もしくはその相補体および前記ＴＣＲ細胞ポリヌクレオチドもしくはその相補体を同時に増幅するステップを含む、請求項１、２、５または８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＴＣＲ細胞ポリヌクレオチドの前記ベッセルバーコード配列および前記オリゴヌクレオチド部分の前記ベッセルバーコード配列が、同じである、請求項１、２、５または８に記載の方法。
【請求項３１】
前記複数のベッセルのうちの２またはそれより多くのベッセルから、オリゴヌクレオチド部分またはＴＣＲ細胞ポリヌクレオチドまたはその増幅産物またはその相補体をプールするステップをさらに含み、必要に応じて、前記プールするステップが、配列決定するステップの前である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記複数のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子が、異なるｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子を含む、請求項１、２、５または８に記載の方法。
【請求項３３】
前記オリゴヌクレオチド部分が、融合配列を含み、前記付着させるステップが、前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを前記融合配列に付着させることを含む、請求項１、２、５または８に記載の方法。
【請求項３４】
前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の前記オリゴヌクレオチド部分が、プライマー結合配列または定常配列を含む、請求項１、２、５または８に記載の方法。
【請求項３５】
前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の前記オリゴヌクレオチド部分が、ＴＩＤ配列およびＴＭＢ配列を含む、請求項１、２、５または８に記載の方法。
【請求項３６】
前記オリゴヌクレオチド配列読み取りのベッセルバーコード配列、ＴＩＤ配列および／またはＴＭＢ配列を分析するステップをさらに含み、必要に応じて、１つまたは複数のベッセルバーコード配列、１つまたは複数のＴＩＤ配列、１つまたは複数のＴＭＢ配列、またはその組合せの頻度を決定するステップをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
オリゴヌクレオチド配列読み取りのＴＩＤ配列を、オリゴヌクレオチド配列読み取りのＴＭＢ配列と比較するステップをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
（ｉ）オリゴヌクレオチド部分配列読み取りをＴＣＲポリヌクレオチド配列読み取りと比較するステップ、（ｉｉ）オリゴヌクレオチド部分配列読み取りのベッセルバーコード配列を、ＴＣＲポリヌクレオチド配列読み取りのベッセルバーコード配列と比較するステップ、（ｉｉｉ）ＴＣＲポリヌクレオチド配列読み取りを比較するステップ、（ｉｖ）ＴＣＲポリヌクレオチド配列読み取りのベッセルバーコード配列を分析するステップ、および／または（ｖ）前記分析するステップまたは前記比較するステップに基づいて単一のＴ細胞の特徴を決定するステップをさらに含む、請求項１、２、５または８に記載の方法。
【請求項３９】
前記オリゴヌクレオチド部分配列読み取りに基づいてＴＣＲを選択するステップをさらに含む、請求項１、２、５または８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＴＣＲポリヌクレオチド配列読み取りに基づいてＴＣＲを選択するステップを含む、請求項１、２、５または８に記載の方法。
【請求項４１】
前記オリゴヌクレオチドに付着された前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチド、および前記ＴＣＲポリヌクレオチドに付着された前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドが、前記ベッセル中の同じ鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドに由来する、請求項１、２、５または８に記載の方法。
【請求項４２】
前記ベッセルが、固体支持体を含む、請求項１、２、５または８に記載の方法。
【請求項４３】
前記ベッセルが、固体支持体を含まない、請求項１、２、５または８に記載の方法。
【請求項４４】
前記複数のベッセルの各ベッセルが、単一の細胞を含む、請求項１、２、５または８に記載の方法。
【請求項４５】
前記ベッセルが、ウェル、エマルジョンまたは液滴である、請求項１、２、５または８に記載の方法。
【請求項４６】
前記鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドが、固体支持体に結合されていない、請求項２１に記載の方法。
【請求項４７】
前記鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドが、固体支持体に結合されている、請求項２１に記載の方法。
【請求項４８】
複数の分子バーコード化ポリヌクレオチドのうちの分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコード配列を前記ＴＣＲポリヌクレオチドに付着させるステップであって、前記分子バーコード配列が、単一のＴＣＲポリヌクレオチドおよびその増幅産物にバーコード化される、ステップをさらに含み、必要に応じて、前記ＴＣＲポリヌクレオチド配列読み取りの分子バーコード配列を分析するステップをさらに含む、請求項１、２、５または８に記載の方法。
【請求項４９】
前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドの前記付着させるステップが、ライゲーションすること、酵素によって付着させることまたはハイブリダイズさせることを含み、必要に応じて、前記付着させるステップが、前記オリゴヌクレオチド部分またはＴＣＲポリヌクレオチドを伸長させるステップをさらに含む、請求項１、２、５または８に記載の方法。
【請求項５０】
前記付着させるステップが、鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを増幅することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項５１】
前記オリゴヌクレオチド部分またはＴＣＲポリヌクレオチドが、二本鎖である、請求項１、２、５または８に記載の方法。
【請求項５２】
前記オリゴヌクレオチド部分またはＴＣＲポリヌクレオチドが、一本鎖である、請求項１、２、５または８に記載の方法。
【請求項５３】
前記オリゴヌクレオチド部分またはＴＣＲポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、請求項１、２、５または８に記載の方法。
【請求項５４】
前記オリゴヌクレオチド部分またはＴＣＲポリヌクレオチドが、ＲＮＡであり、必要に応じてｍＲＮＡである、請求項１、２、５または８に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＴＣＲポリヌクレオチドが、可変領域配列を含み、前記方法が、必要に応じて、可変領域配列を含有するネイティブのＴＣＲ鎖配列を対合させるステップをさらに含む、請求項１、２、５または８に記載の方法。
【請求項５６】
複数のベッセルを含む組成物であって、前記複数のベッセルのうちの１つのベッセルが、
（ａ）複数のＴ細胞を含む試料に由来する単一のＴ細胞、および
（ｂ）ベッセルバーコード配列を含むベッセルバーコード化ポリヌクレオチド
を含み、前記ベッセルが、前記単一のＴ細胞のＴＣＲに結合するｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートをさらに含む、組成物。
【請求項５７】
複数のベッセルを含む組成物であって、前記複数のベッセルのうちの１つのベッセルが、
（ａ）複数のＴ細胞を含む試料に由来する単一の溶解Ｔ細胞、および
（ｂ）前記単一の溶解Ｔ細胞のＴＣＲに結合するｐＭＨＣ部分を含むｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート
を含み、前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分が、ベッセルバーコード配列を含み、前記単一の溶解Ｔ細胞に由来するＴＣＲポリヌクレオチドが、同じベッセルバーコード配列を含む、組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
本明細書に記載されている新規特徴は、特に添付の特許請求の範囲に示されている。本明細書に記載されている特徴および特徴の利点に関するより良好な理解は、本明細書に記載されている特徴の原理が利用されている説明例が示されている以下の詳細な記載および添付の図面を参照することにより得られ得る。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を選択する方法であって、
（ａ）複数のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子を複数のＴ細胞と接触させるステップと；
（ｂ）ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体を、
（ｉ）複数のベッセルのうちの１つのベッセル中の、ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子のオリゴヌクレオチド部分、および
（ｉｉ）前記ベッセル中の複数のＴ細胞のうちの１つの単一のＴ細胞に由来するＴＣＲポリヌクレオチド
に付着させるステップと；
（ｃ）前記オリゴヌクレオチド部分またはその相補体および前記ＴＣＲポリヌクレオチドまたはその相補体を配列決定し、それによって配列情報を生成するステップと
を含む方法。
（項目２）
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合親和性を決定する方法であって、
（ａ）複数のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子を複数のＴ細胞と接触させるステップと；
（ｂ）オリゴヌクレオチド部分またはその相補体を配列決定し、それによって配列情報を生成するステップと；
（ｃ）前記配列情報に基づいて、ｐＭＨＣオリゴヌクレオチドコンジュゲートへのＴＣＲの結合親和性を決定するステップと
を含む方法。
（項目３）
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を選択する方法であって、
（ａ）複数のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子を複数のＴ細胞と接触させるステップであって、前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子が、検出部分を含む、ステップと；
（ｂ）前記検出部分の検出に基づいて、（ａ）の前記複数のＴ細胞から、富化させたＴ細胞集団を得るステップと；
（ｃ）富化させた前記集団から、ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子に結合した１つの単一のＴ細胞を、複数のベッセルのうちの１つの第１のベッセルに単離するステップと；
（ｄ）ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体を、
（ｉ）前記第１のベッセル中の前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子のオリゴヌクレオチド部分、および
（ｉｉ）前記第１のベッセル中の前記単一のＴ細胞に由来するＴＣＲポリヌクレオチド
に付着させるステップと；
（ｅ）前記オリゴヌクレオチド部分またはその相補体および前記ＴＣＲポリヌクレオチドまたはその相補体を配列決定し、それによって配列情報を生成するステップと
を含む方法。
（項目４）
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を選択する方法であって、
（ａ）複数のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子を複数のＴ細胞と接触させるステップであって、前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子が、検出部分を含む、ステップと；
（ｂ）前記検出部分の検出に基づいて、（ａ）の前記複数のＴ細胞から、富化させたＴ細胞集団を得るステップと；
（ｃ）富化させた前記集団から、ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子に結合した１つの単一のＴ細胞を、複数のベッセルのうちの１つの第１のベッセルに単離するステップと；
（ｄ）オリゴヌクレオチド部分またはその相補体およびＴＣＲポリヌクレオチドまたはその相補体を配列決定し、それによって配列情報を生成するステップと；
（ｅ）前記配列情報に基づいて、前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートへの前記ＴＣＲポリヌクレオチドによってコードされるＴＣＲの結合親和性を決定するステップと
を含む方法。
（項目５）
前記富化させたＴ細胞集団が、前記接触させるステップの後の前記複数のＴ細胞中のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子に結合したＴ細胞の全Ｔ細胞に対する比より高い、ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子に結合したＴ細胞の全Ｔ細胞に対する比を含む、項目３または４に記載の方法。
（項目６）
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を選択する方法であって、
（ａ）第１の複数のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子を、第１の複数のＴ細胞と、第１のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子対細胞の比で接触させるステップと；
（ｂ）第２の複数のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子を、第２の複数のＴ細胞と、前記第１のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子対細胞の比より低い、第２のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子対細胞の比で接触させるステップと；
（ｃ）第１のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体を、
（ｉ）複数のベッセルのうちの第１のベッセル中のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子のオリゴヌクレオチド部分、および
（ｉｉ）前記第１のベッセル中の第１のＴ細胞集団の単一のＴ細胞に由来する第１のＴＣＲポリヌクレオチド
に付着させるステップと；
（ｄ）第２のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体を、
（ｉ）前記複数のベッセルのうちの第２のベッセル中のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子のオリゴヌクレオチド部分、および
（ｉｉ）前記第２のベッセル中の第２のＴ細胞集団の単一のＴ細胞に由来する第２のＴＣＲポリヌクレオチド
に付着させるステップと；
（ｅ）前記第１のベッセル中の前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の前記オリゴヌクレオチド部分またはその相補体および前記第１のＴＣＲポリヌクレオチドまたはその相補体を配列決定し、それによって配列情報の第１のセットを生成するステップと；
（ｆ）前記第２のベッセル中の前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の前記オリゴヌクレオチド部分またはその相補体および前記第２のＴＣＲポリヌクレオチドまたはその相補体を配列決定し、それによって配列情報の第２のセットを生成するステップと；
（ｇ）配列情報の前記第１のセットに基づいて、前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートへの前記第１のＴＣＲポリヌクレオチドによってコードされるＴＣＲの第１の結合シグナルを決定するステップ、および配列情報の前記第２のセットに基づいて、前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートへの前記第２のＴＣＲポリヌクレオチドによってコードされるＴＣＲの第２の結合シグナルを決定するステップと
を含み、前記第１のＴＣＲポリヌクレオチドおよび前記第２のＴＣＲポリヌクレオチドが、同じＴＣＲをコードする、方法。
（項目７）
前記配列情報に基づいて、前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートへの前記ＴＣＲポリヌクレオチドによってコードされるＴＣＲの結合親和性を決定するステップをさらに含む、項目１または３に記載の方法。
（項目８）
前記第１のＴＣＲポリヌクレオチドおよび前記第２のＴＣＲポリヌクレオチドによってコードされる同じＴＣＲの結合親和性を、前記第１の結合シグナルおよび前記第２の結合シグナルに基づいて決定するステップをさらに含む、項目６に記載の方法。
（項目９）
前記第１および第２の複数のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子が、同じペプチドを含む、項目６に記載の方法。
（項目１０）
前記第１および第２の複数のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子のＭＨＣが、同じサブタイプである、項目６または９に記載の方法。
（項目１１）
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を選択する方法であって、
（ａ）複数のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子を複数のＴ細胞と接触させるステップと；
（ｂ）
（ｉ）第１のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体を、複数のベッセルのうちの第１のベッセル中のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子のオリゴヌクレオチド部分に付着させ、
（ｉｉ）前記第１のベッセル中のＴ細胞集団の第１の単一のＴ細胞に由来する第１のＴＣＲポリヌクレオチドを付着させ；
（ｉｉｉ）第２のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体を、前記複数のベッセルのうちの第２のベッセル中のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子のオリゴヌクレオチド部分に付着させ、
（ｉｖ）前記第２のベッセル中のＴ細胞集団の第２の単一のＴ細胞に由来するＴＣＲポリヌクレオチドを付着させるステップと；
（ｃ）
（ｉ）前記第１のベッセル中の前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の前記オリゴヌクレオチド部分またはその相補体および前記第１のＴＣＲポリヌクレオチドまたはその相補体を配列決定し、それによって、ＴＣＲポリヌクレオチドベッセルバーコード配列読み取りおよびオリゴヌクレオチドベッセルバーコード配列読み取りを含む配列情報の第１のセットを生成し；
（ｉｉ）前記第２のベッセル中の前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の前記オリゴヌクレオチド部分またはその相補体および第２のＴＣＲポリヌクレオチドまたはその相補体を配列決定し、それによって、ＴＣＲポリヌクレオチドベッセルバーコード配列読み取りおよびオリゴヌクレオチドベッセルバーコード配列読み取りを含む配列情報の第２のセットを生成するステップと；
（ｄ）前記第１のＴＣＲポリヌクレオチドによってコードされる前記ＴＣＲの結合親和性と前記第２のＴＣＲポリヌクレオチドによってコードされる前記ＴＣＲの結合親和性とを比較するステップであって、前記第１のＴＣＲポリヌクレオチドによってコードされる前記ＴＣＲの前記結合親和性が、配列情報の前記第１のセットに基づいて決定され、前記第２のＴＣＲポリヌクレオチドによってコードされる前記ＴＣＲの前記結合親和性が、配列情報の前記第２のセットに基づいて決定される、ステップと；
（ｅ）前記比較するステップに基づいて前記第１のＴＣＲポリヌクレオチドによってコードされる前記ＴＣＲを選択するステップであって、前記第１のＴＣＲポリヌクレオチドによってコードされる選択された前記ＴＣＲが、前記第２のＴＣＲポリヌクレオチドによってコードされる前記ＴＣＲより強力な結合親和性を有する、ステップと
を含む方法。
（項目１２）
前記第１の単一のＴ細胞が、疾患または状態に罹患している患者に由来する、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記第２の単一のＴ細胞が、前記疾患または状態に罹患していない患者に由来する、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子が、検出部分を含む、項目１または６から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
富化させたＴ細胞集団を得るステップが、前記検出部分の検出に基づく、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記検出部分が、フルオロフォアを含む、項目１４または１５に記載の方法。
（項目１７）
前記第１のベッセル中のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体のベッセルバーコード配列が、複数の前記ベッセルのうちの第２のベッセル中のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンのベッセルバーコード配列と異なる、項目１から１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記配列情報が、ＴＣＲポリヌクレオチドベッセルバーコード配列読み取りおよびオリゴヌクレオチドベッセルバーコード配列読み取りを含む、項目１から１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記接触させるステップの後に、前記接触させるステップの後の前記複数のＴ細胞中のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子に結合したＴ細胞の百分率よりも高い百分率のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子に結合したＴ細胞を含む富化させたＴ細胞集団を得るステップをさらに含む、項目１または６から１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記単一の細胞に結合したｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の数を決定するステップをさらに含む、項目１から１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの前記オリゴヌクレオチド部分が、前記複数のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の単一のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子に固有な四量体分子バーコード（ＴＭＢ）配列を含む、項目１から２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記配列情報が、四量体分子バーコード配列読み取りを含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記単一のＴ細胞に結合したｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の数が、前記配列情報から決定される、項目２１または２２に記載の方法。
（項目２４）
前記単一のＴ細胞に結合したｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の数が、前記四量体分子バーコード配列読み取りから決定される、項目２１から２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記複数のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の各ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子が、固有のＴＭＢ配列を含む、項目２１から２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのｐＭＨＣ部分が、ｐＭＨＣの多量体、任意選択でｐＭＨＣの四量体を含む、項目１から２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記ＭＨＣが、可溶形態である、項目１から２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの前記ｐＭＨＣ部分のペプチドが、合成ペプチドを含む、項目１から２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記ｐＭＨＣ部分が、前記単一のＴ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合する、項目１から２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記オリゴヌクレオチド部分が、四量体同定配列（ＴＩＤ）を含む、項目１から２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記ＴＩＤが、前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの前記ペプチドまたは前記ｐＭＨＣ部分にバーコード化される、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドが、前記ベッセル中の鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドに由来する、項目１から３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記配列情報に基づいて、前記ベッセル中の前記単一のＴ細胞の特徴を決定するステップをさらに含む、項目１から３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記配列情報が、前記四量体同定（ＴＩＤ）配列またはその相補体を含み、および／または前記ＴＩＤ配列を有する分子のコピー数を含む、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記接触させるステップの後に前記複数のＴ細胞を洗浄するステップをさらに含む、項目１から３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記ベッセル中の前記単一のＴ細胞を単離するステップをさらに含む、項目１または６から３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記単一のＴ細胞が、単離するステップの前に前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートに結合している、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記単一のＴ細胞を溶解するステップをさらに含む、項目１から３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記溶解するステップが、前記単一のＴ細胞が前記ベッセル中で単離された後である、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記複数のＴ細胞が、複数のソーティングされていないＴ細胞である、項目１から３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記複数のベッセルのうちの第１のベッセル中のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体の前記ベッセルバーコード配列が、前記複数のベッセルのうちの第２のベッセル中のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体の前記ベッセルバーコード配列と異なる、項目１から４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記複数のベッセルのうちの単一のベッセル中の各ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体の前記ベッセルバーコード配列が、同じベッセルバーコード配列を含む、項目１から４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記複数のベッセルのうちの任意の単一のベッセル中の各ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体の前記ベッセルバーコード配列が、前記複数のベッセルのうちの任意の他の単一のベッセル中の各ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体の前記ベッセルバーコード配列に固有である、項目１から４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドをオリゴヌクレオチド部分に付着させる前記ステップ、およびベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを前記単一のＴ細胞に由来するＴＣＲポリヌクレオチドに付着させる前記ステップが、同時に実行される、項目１から４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記オリゴヌクレオチドまたはその相補体を増幅するステップをさらに含む、項目１から４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記ＴＣＲ細胞ポリヌクレオチドまたはその相補体を増幅するステップをさらに含む、項目１から４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記オリゴヌクレオチドまたはその相補体を増幅するステップおよび前記ＴＣＲポリヌクレオチドまたはその相補体を増幅するステップが、同時に実行される、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記細胞ポリヌクレオチドの前記ベッセルバーコード配列および前記オリゴヌクレオチドの前記ベッセルバーコード配列が、同じである、項目４４から４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記複数のベッセルのうちの２またはそれより多くのベッセルから、オリゴヌクレオチド、その増幅産物またはその相補体をプールするステップをさらに含む、項目１から４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記複数のベッセルのうちの２またはそれより多くのベッセルから、オリゴヌクレオチド、その増幅産物またはその相補体、およびＴＣＲポリヌクレオチドまたはその相補体をプールするステップをさらに含む、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記プールするステップが、配列決定するステップの前である、項目４９または５０に記載の方法。
（項目５２）
前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートが、複数の異なるｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを含む、項目１から５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記複数のｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの各ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートが、固有の四量体同定（ＴＩＤ）配列を含む、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記オリゴヌクレオチドが、融合配列を含み、前記付着させるステップが、前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを前記融合配列に付着させることを含む、項目１から５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
前記オリゴヌクレオチドが、プライマー結合配列を含む、項目１から５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
前記オリゴヌクレオチドが、定常配列を含む、項目１から５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記オリゴヌクレオチド配列読み取りのベッセルバーコード配列を分析するステップをさらに含む、項目１から５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
前記オリゴヌクレオチド配列読み取りの四量体同定（ＴＩＤ）配列を分析するステップをさらに含む、項目１から５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記オリゴヌクレオチド配列読み取りの四量体分子バーコード（ＴＭＢ）配列を分析するステップをさらに含む、項目１から５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
前記分析するステップが、１つまたは複数のベッセルバーコード配列、１つまたは複数のＴＩＤ配列、１つまたは複数の四量体分子バーコード（ＴＭＢ）配列、またはその組合せの頻度を決定することを含む、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記分析するステップが、比較することを含む、項目５９または６０に記載の方法。
（項目６２）
オリゴヌクレオチド配列読み取りの四量体同定（ＴＩＤ）配列を、オリゴヌクレオチド配列読み取りの四量体分子バーコード（ＴＭＢ）配列と比較するステップをさらに含む、項目５７から６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
前記ＴＣＲポリヌクレオチド、その相補体、その増幅産物、またはその組合せを配列決定し、それによってＴＣＲポリヌクレオチド配列読み取りを産生するステップをさらに含む、項目４４から６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
オリゴヌクレオチド配列読み取りを前記ＴＣＲポリヌクレオチド配列読み取りと比較するステップをさらに含む、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
オリゴヌクレオチド配列読み取りのベッセルバーコード配列を、前記ＴＣＲポリヌクレオチド配列読み取りのベッセルバーコード配列と比較するステップをさらに含む、項目６３または６４に記載の方法。
（項目６６）
前記ＴＣＲポリヌクレオチド配列読み取りを比較するステップをさらに含む、項目６３から６５のいずれか一項に記載の方法。
（項目６７）
前記ＴＣＲポリヌクレオチド配列読み取りのベッセルバーコード配列を分析するステップをさらに含む、項目６３から６６のいずれか一項に記載の方法。
（項目６８）
前記ＴＣＲポリヌクレオチド配列読み取りの分子バーコード配列を分析するステップをさらに含む、項目６３から６７のいずれか一項に記載の方法。
（項目６９）
前記分析するステップまたは前記比較するステップに基づいて細胞の特徴を決定するステップをさらに含む、項目６３から６８のいずれか一項に記載の方法。
（項目７０）
前記オリゴヌクレオチド配列読み取りに基づいてＴＣＲを選択するステップをさらに含む、項目５７から６９のいずれか一項に記載の方法。
（項目７１）
前記ＴＣＲポリヌクレオチド配列読み取りに基づいてＴＣＲを選択するステップをさらに含む、項目６３から７０のいずれか一項に記載の方法。
（項目７２）
前記オリゴヌクレオチドに付着された前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチド、および前記ＴＣＲポリヌクレオチドに付着された前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドが、前記ベッセル中の同じ鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドに由来する、項目１から７１のいずれか一項に記載の方法。
（項目７３）
前記オリゴヌクレオチドに付着された前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドが、鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドの増幅産物である、項目１から７２のいずれか一項に記載の方法。
（項目７４）
前記ＴＣＲポリヌクレオチドに付着された前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドが、前記鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドの増幅産物である、項目７２または７３に記載の方法。
（項目７５）
前記ベッセルが、固体支持体を含む、項目１から７４のいずれか一項に記載の方法。
（項目７６）
前記ベッセルが、固体支持体を含まない、項目１から７４のいずれか一項に記載の方法。
（項目７７）
前記複数のベッセルの各ベッセルが、単一の細胞を含む、項目１から７６のいずれか一項に記載の方法。
（項目７８）
前記ベッセルが、ウェル、エマルジョンまたは液滴である、項目１から７７のいずれか一項に記載の方法。
（項目７９）
前記鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドが、固体支持体に結合されていない、項目１から７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８０）
前記鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドが、固体支持体に結合されている、項目１から７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８１）
複数の分子バーコード化ポリヌクレオチドのうちの分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコード配列を前記ＴＣＲポリヌクレオチドに付着させるステップであって、前記分子バーコード配列が、単一のＴＣＲポリヌクレオチド分子およびその増幅産物にバーコード化される、ステップをさらに含む、項目１から８０のいずれか一項に記載の方法。
（項目８２）
前記付着させるステップが、前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体を前記オリゴヌクレオチドにライゲーションすることを含む、項目１から８１のいずれか一項に記載の方法。
（項目８３）
前記付着させるステップが、前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体を、酵素によって前記オリゴヌクレオチドに付着させることを含む、項目１から８２のいずれか一項に記載の方法。
（項目８４）
前記付着させるステップが、前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体を、前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることを含む、項目１から８３のいずれか一項に記載の方法。
（項目８５）
前記付着させるステップが、前記オリゴヌクレオチドを伸長させるステップをさらに含む、項目８４に記載の方法。
（項目８６）
前記付着させるステップが、鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを増幅することを含む、項目１から８５のいずれか一項に記載の方法。
（項目８７）
前記オリゴヌクレオチドが、二本鎖である、項目１から８６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８８）
前記オリゴヌクレオチドが、一本鎖である、項目１から８６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８９）
前記オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡである、項目１から８８のいずれか一項に記載の方法。
（項目９０）
前記オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡである、項目１から８８のいずれか一項に記載の方法。
（項目９１）
前記細胞ポリヌクレオチドが、可変領域配列を含む、項目１から９０のいずれか一項に記載の方法。
（項目９２）
可変領域配列を含有するネイティブのＴＣＲ鎖配列を対合させるステップをさらに含む、項目１から９１のいずれか一項に記載の方法。
（項目９３）
前記ＴＣＲポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、項目１から９２のいずれか一項に記載の方法。
（項目９４）
前記ＴＣＲポリヌクレオチドが、ＲＮＡである、項目１から９３のいずれか一項に記載の方法。
（項目９５）
前記ＲＮＡが、ｍＲＮＡである、項目９４に記載の方法。
（項目９６）
複数のベッセルを含む組成物であって、前記複数のベッセルのうちの１つのベッセルが、
（ａ）複数のＴ細胞を含む試料に由来する単一のＴ細胞、および
（ｂ）ベッセルバーコード配列を含むベッセルバーコード化ポリヌクレオチド
を含み、前記ベッセルが、前記単一のＴ細胞のＴＣＲに結合するｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートをさらに含む、組成物。
（項目９７）
複数のベッセルを含む組成物であって、前記複数のベッセルのうちの１つのベッセルが、
（ａ）複数のＴ細胞を含む試料に由来する単一の溶解Ｔ細胞、および
（ｂ）前記単一の溶解Ｔ細胞のＴＣＲに結合するｐＭＨＣ部分を含むｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート
を含み、前記ｐＭＨＣ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分が、ベッセルバーコード配列を含み、前記単一の溶解Ｔ細胞に由来するＴＣＲポリヌクレオチドが、同じベッセルバーコード配列を含む、組成物。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４３６】
（実施例１）
Ｔ細胞集団中の単一Ｔリンパ球のイムノタイピング
本明細書に記載されているイムノフェノタイピング法を、ヒトＴリンパ球におけるＣＤ４およびＣＤ８のｍＲＮＡならびに表面タンパク質発現の両方を分析することにより検証した。通常、成熟Ｔ細胞は、ＣＤ４サブタイプまたはＣＤ８サブタイプのいずれかであると予想される。ＣＤ４サブタイプは、ＣＤ４  ｍＲＮＡおよびＣＤ４タンパク質を共に発現するはずであるが、ＣＤ８  ｍＲＮＡまたはＣＤ８タンパク質のいずれかを発現するはずである。ＣＤ８サブタイプは、ＣＤ８  ｍＲＮＡおよびＣＤ８タンパク質を共に発現するはずであるが、ＣＤ４  ｍＲＮＡまたはＣＤ４タンパク質のいずれかを発現するはずである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４４１】
（実施例３）
健常血液試料からのＢ細胞ＶＨＶＬペア対の大規模回収
最初に、本技術を開発し、対合能力およびスループットを、陰性ビーズ濃縮により健常ボランティアの末梢血から単離された３００万個のＢ細胞でアセスメントした。エマルジョンを６つの別々の画分に分割し、それらを並列で処理し、配列決定前に再混合しなかった。エマルジョンを、１液滴当たり０．２細胞になるように装填した。これは、占有液滴の約９０％が単一細胞を含有するというポアソン期待値をもたらし、エマルジョン液滴観察と一致していた（図６Ａ）。エマルジョン破壊および追加のライブラリー処理ステップを行った後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑを用いて、ペアエンド３２５＋３００ｂｐ配列決定を実施した。配列決定データを処理するため、液滴および分子バーコードを共に使用して、元々の各ｍＲＮＡ分子からＰＣＲ複製読み取りを収集し、各ｍＲＮＡについてコンセンサスを決定して、少なくとも２つの読み取りから組み立てられたｍＲＮＡ配列のみを維持した。フォワードおよびリバース読み取りを繋ぎ合わせて、５’ＵＴＲ、完全Ｖ（Ｄ）Ｊ配列、およびアイソタイプ決定に十分な定常領域を含む全長産物を生成した。ＩＭＧＴ  Ｈｉｇｈ−ＶＱｕｅｓｔおよび／またはＩｇＢＬＡＳＴを用いて、再配置された免疫グロブリン重鎖および軽鎖配列に注釈を付けた。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４４２】
得られたデータセットは、少なくとも１つの重鎖（ＶＨ）および１つの軽鎖（ＶＬ）ｍＲＮＡと関連していた３２４，９８８個の液滴バーコードを含有し、重鎖クラスター分析で評価して２２９，８６９個の異なるＶＨクローン系列が存在していた。この生セットは、複数細胞ならびに単一細胞液滴に由来するデータを含むため、非一致の重鎖または軽鎖Ｖ（Ｄ）Ｊ配列に関連した液滴バーコードをフィルタリングして取り除くことにより、単一細胞液滴に由来するデータを濃縮した（図６Ｂ）。このことを実施することが可能であるのは、典型的な免疫レパートリーの多様性が高いためであり、２つのランダム細胞に由来するＶＨまたはＶＬ  ｍＲＮＡがマッチングすることは、ほとんど全くないだろう。得られた濃縮データセットは、２５９，３６８個のＶＨＶＬ液滴バーコードを含み、１８２，７４５個のＶＨのクローン系列を含有していた。これは、現在までで最も高深度の対合した免疫レパートリーのサンプリングであることをほぼ間違いなく示す。クローン的に関連する細胞は、それらのＶＨＶＬ対合が一貫しているはずであるため、クローン拡大の発生を識別することにより、ＶＨＶＬ対合の精度を直接的に評価した。１つよりも多くのエマルジョン画分で、クローン的に拡大した細胞であることが高い信頼性で観察された２，６０４個のＶＨクローンが識別された。これらＶＨクローンと対合したＶＬ配列は、画分間の一貫性が非常に高く、９６．１％の対合精度を示した。これにより、２５９，３６８個のＶＨＶＬペアのフィルタリングされたデータセット全体に高い信頼性が与えられた。交差画分ＶＨおよびＶＬ配列は、各画分にて異なる液滴および分子バーコードと関連することが常であり、したがってライブラリー交差汚染を示さなかった。一部のＢ細胞は複数の軽鎖を発現することが公知であるため、分析は、対合精度を過小評価する場合がある。２５９，３６８個のフィルタリングされたＶＨＶＬ液滴バーコードまたは「ＶＨＶＬペア」の７５．０％は、ＩｇＭおよび／またはＩｇＤを含有していた（図６Ｃ）。これは、未感作ナイーブＢ細胞は典型的にはＩｇＭ＋ＩｇＤ＋表現型であることを考慮すると、予想通り一緒に観察されることが多かった。より少ないがかなりの割合のＩｇＡ（１８．３％）およびＩｇＧ（６．６％）ＶＨＶＬペアも見出された。ＶＨアイソタイプは全て、約３：２の比率でＩｇκまたはＩｇλのいずれかと対合した。１８２，７４５個のＶＨクローン系列中のクローン拡大を２つの方法でアセスメントした：クローンに関連する液滴バーコードの数；およびエマルジョン画分にわたるそのクローンの観察。複数の液滴バーコードでクローンが見られることは、クローン拡大を反映する場合もあり、または複数バーコード液滴を反映する場合もある。初期λ＝１であったこと、つまり液滴内へのバーコードの分散がポアソン分散であったことを考慮すると、液滴の約３７％で複数バーコード液滴が予想された。しかしながら、＞８つの液滴バーコードにより表わされるクローンは全て、間違いなく拡大性である可能性が高い（単一液滴中のポアソン確率は、＜１０−６）。全体でクローンの６．０％が１つよりも多くの画分で見られたが、８つよりも多くの液滴バーコードで見���れたクローン（全体で０．７％）の場合、それらの９９％は、１つよりも多くの画分で見られた。１００個の最も高頻度のクローン（各々３０〜１３７個の液滴バーコード、図６Ｄ）は全て、６つの画分の少なくとも５つで見られた。したがって、バーコード計数および独立した画分分析を組み合わせると、非増殖クローンの厖大なバックグラウンドの中から、希少な拡大系列を検出することが可能になる。しかしながら、最も多量の拡大したクローンでさえ、１０００個に１個未満の細胞にしか存在していなかったことは注目すべきことであり、ヒト末梢免疫レパートリーの多様性が非常に高いことを例示している。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４４３】
発現レベルの推定としての、ペア内の各ＶＨおよびＶＬ鎖の捕捉ｍＲＮＡの数（図６Ｅ）。概して、１液滴バーコード当たり１０個未満の重鎖（平均２．０）および軽鎖（平均４．０）ｍＲＮＡが捕捉され、１細胞当たり、数ダース〜数百個の捕捉重鎖および軽鎖ｍＲＮＡを有する液滴バーコードの小集団が、ほとんど排他的にＩｇＧおよびＩｇＡ発現細胞から観察された。興味深いことには、ペア内のＶＨおよびＶＬ突然変異の程度は、各アイソタイプ（例えば、ＩｇＧの場合は、ＶＨ対ＶＬ）内、およびアイソタイプ間（例えば、ＩｇＧ対ＩｇＭ）の両方で、強い相関性を示した（図６Ｆ）。さらに、ＩｇＧおよびＩｇＡ対はほとんど全てが、ＶＨおよびＶＬ鎖の両方にかなりの突然変異を示したが、ＩｇＭおよびＩｇＤペアはほとんどが、ＶＨまたはＶＬ突然変異をほとんど示さなかった。こうした結果は、Ｂ細胞活性化の機序と一致し、ＩｇＭおよびＩｇＤからＩｇＧまたはＩｇＡへのクラススイッチ、免疫グロブリン発現の増加、ならびに細胞の重鎖および軽鎖遺伝子座の両方に影響を及ぼす体細胞超変異に至る。高度に突然変異を起こしたＶＨ鎖は、高度に突然変異を起こしたＶＬ鎖と対合する傾向があるというこの観察に加えて、本方法は、休止ヒトＢ細胞レパートリーに由来する多数の全長のネイティブに対合したＢＣＲを生成することが可能である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４４４】
（実施例４）
ＨＩＶ長期非進行者からの公既知の低頻度ＶＨＶＬ対ペアの回収。
アッセイの対合感度および正確性のさらなる検証として、いくつかの希少な（１０，０００個の細胞中、＜１個の細胞）ネイティブＶＨＶＬ対合が既に既知である試料を処理した。ＨＩＶ長期非進行患者から末梢Ｂ細胞を得た。この患者のメモリＢ細胞は、ＨＩＶ中和活性を示す抗体が近年詳細に探索されている。３５０，０００個のＢ細胞を処理して、合計３８，６２０個のフィルタリングされたＶＨＶＬペアを生成した。興味深いことには、この個体は、以前の健常試料（図７Ａ）または典型的な健常末梢Ｂ細胞レパートリーよりも高い割合のＩｇＧを示した。このデータセットに由来するＶＨ配列を、ＰＧＴ１２１を含む、この個体に由来する全ての報告されている広域中和抗体（ｂＮＡｂ）と比較し、８つの類似または同一のＶＨ配列を見出した。これは、ｂＮＡｂのこのファミリーが循環Ｂ細胞の０．０３％未満であることを示す。重要なことには、これら重鎖と対合した全ての軽鎖は、予想される同様に希少のｂＮＡｂ系列のものであり、以前に報告されているように、同じＩｇλ−Ｖ３−２１／Ｊ３再配置および特徴的な３コドン挿入を示し、本発明者らの方法の正確性および感度が高いことが支持された。さらに、この個体に由来する、全ての既知の新らたに生成されたＰＧＴ１２１様ＶＨＶＬペアの系統樹（図７Ｂ）では、ＶＨおよびＶＬツリーは、鏡像様位置を占める対合したＶＨおよびＶＬ配列と非常に類似したトポロジーを示しており、これは、系統発生史が共通していることを反映している可能性が高い。ここで発見されたバリアントペアは、このルールに良好に当てはまる。興味深いことには、２つの発表されている抗体ＰＧＴ１２２およびＰＧＴ１２３は、例外であると考えられ、これら２つの対合を支持するものは見出されなかったが、その代わりに、ＰＧＴ１２２ＶＨ：ＰＧＴ１２３ＶＬ様のおよびＰＧＴ１２３ＶＨ：ＰＧＴ１２２ＶＬ様のペアが見出された。これは、元々の報告書では確認されていない対合を示している。８つの新規なＰＧＴ様ＶＨＶＬペアの完全なＶ（Ｄ）Ｊ領域をコードするＤＮＡを合成し、抗体を完全ＩｇＧとして発現させ、複数のＨＩＶ擬似系統を中和する能力を試験した（図７Ｃ）。抗体は良好に発現され、全てがウイルスに対する強力な中和活性を示し、関連する生物学的試料からネイティブに対合した機能性抗体バリアントを迅速に生成する本発明者らの手法の有用性が実証された。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４４５】
（実施例５）
腫瘍浸潤リンパ球に由来するＢ細胞およびＴ細胞受容体対ペア
対合した受容体をハイスループットで回収するためにエマルジョンバーコード付与が検証されたことを受けて、免疫受容体を、腫瘍から直接回収した。プロテアーゼで分離された切除卵巣腺癌試料を得、４００，０００個のソーティングされていない細胞をエマルジョンに入れた。別々の等量の試料をＣＤ３／ＣＤ１９染色することにより、かなりの数の浸潤性Ｂ（約５％）およびＴ細胞（約２０％）が物質中に存在することが示唆された。エマルジョン中の単一細胞分散系は、いくつかの限定的な塊が視認されたとはいえ、精製細胞と類似しており、試料の細胞タイプが不均質であったことを考慮すると予想通りに液滴内の細胞サイズおよび形状に広範なばらつきがあった（図８Ａ）。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４４６】
Ｔ細胞受容体アルファおよびベータ鎖の定常領域を共に標的とするプライマーを、以前に使用されたＢＣＲプライマーと共に使用し、配列決定およびストリンジェントなフィルタリング後に、ＢＣＲまたはＴＣＲ産物にリンクする数千個の液滴バーコードを回収した。単一細胞精度をアセスメントするため、液滴バーコード内の４つの標的遺伝子座（ＶＨ、ＶＬ、Ｖα、Ｖβ）のあらゆる考え得る組合せを計数した（図８Ｂ）。１つよりも多くの標的鎖を有する液滴バーコードの大部分（９７．９％）は、生物学的に予想されるＢＣＲ  ＶＨ＋ＶＬまたはＴＣＲ  Ｖα＋Ｖβの対合を含有し、混合ＢＣＲ−ＴＣＲ組合せは２．１％しか含有されていなかった。産物のバーコード付与は、標的鎖に関して偏りがないため、この結果は、得られた６，０５６個のＢＣＲ  ＶＨＶＬおよび５，２１７個のＴＣＲ  ＶαＶβペアの信頼性を高度化することが可能である。ＢＣＲでは、他のアイソタイプと比較して、ＩｇＧ（＞８０％）が著しく優勢であったが（図８Ｃ）、全てが存在した（ＩｇＥ＜０．０５％のみ）ことが示された。カッパおよびラムダ軽鎖は、末梢血データセットと同様の比率で存在した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４４７】
末梢血と同様に、ＢＣＲアイソタイプとＶＨおよびＶＬ鎖の両方の突然変異レベルとの間に相関性が観察され、ＩｇＧおよびＩｇＡペアは、ＩｇＤおよびＩｇＭよりも大きなＶＨおよびＶＬ突然変異、ならびに各アイソタイプ内でのＶＨおよびＶＬ間の突然変異の一般的相関性を示した（図８Ｄ）。興味深いことには、ＩｇＤ、ＩｇＭ、およびＩｇＡペアは、腫瘍と末梢血データセットとの間で非常に類似した突然変異分布を示した。また、腫瘍ＩｇＧ画分は、末梢血では観察されなかった、ほとんど突然変異していないかまたは全く突然変異してない配列をかなりの割合で含有していた。ＴＣＲの場合、およびＩｇＤを含有するＢＣＲの場合、１液滴バーコード当たり、末梢血のＢＣＲ結果と同様の数の捕捉ｍＲＮＡが観察された（図８Ｅ、ほとんどが１液滴バーコード当たり＜１０）。極めて対照的だが、腫瘍由来のＩｇＭ、ＩｇＡ、およびＩｇＧペアは、１０〜１００倍の平均発現レベル増加を示し、液滴バーコードの多くには数百または数千個の標的ｍＲＮＡが捕捉された。その後、捕捉ＴＩＬ−ＴＣＲおよびＢＣＲレパートリーの多様性をアセスメントした（図８Ｆ）。５，２１７個の合計ＴＣＲペアの中で、２，４２３個の異なるＴＣＲベータクローンが観察された。７つのクローンが、＞１％の頻度で存在し、上位クローンは、全ての液滴バーコードの１６．９％に相当した。６，０５６個の合計ＢＣＲペア中で、１，５１８個の異なる重鎖クローンが観察され、１５個のクローンが＞１％の頻度であったが、＞５％の頻度のものはなかった。これは、多様性が、健常末梢ＢＣＲレパートリーよりも実質的により制限されていることを表わしているが（０．０６％を超える頻度で存在するクローンはなかった）、クラス転換し、突然変異を起こし、高度に発現されたクローンが、腫瘍試料中に非常に多く存在することは、ＴＩＬを特徴付けるためには、高深度で高感度のサンプリング手法が必要であることを示す。本方法は、規定されたＴＩＬ集団を事前にソーティングまたは外因的活性化する必要なく、ＢおよびＴ細胞の両方から同時に、多数のＴＩＬ免疫受容体ペアを迅速に回収することを可能にする。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４４８】
（実施例６）
追加の目的の表現型マーカーの捕捉
液滴バーコード付与による受容体鎖の対合は、潜在的に、免疫受容体の他に追加の標的の捕捉を可能にする。この可能性を調査するため、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋集団に入る健常Ｔ細胞を、磁気ビーズ濃縮により分離し、各タイプの２０，０００個の細胞を別々のエマルジョンに入れ、ＴＣＲアルファおよびベータ鎖を標的とするプライマーならびにＣＤ４およびＣＤ８のｍＲＮＡを用いて実験を行った。配列決定後、ＣＤ４＋単離細胞に由来するＴＣＲ  ＶαおよびＶβ（「ＴＣＲペア」）を含有する３，８６１個の液滴バーコードの４７．０％は、ＣＤ４  ｍＲＮＡに関連していたが、ＣＤ８  ｍＲＮＡに関連したものは０．３％に過ぎなかった。反対に、ＣＤ８＋単離細胞に由来する２，２３５個のＴＣＲペアの５０．６％が、ＣＤ８  ｍＲＮＡにリンクしていたが、ＣＤ４  ｍＲＮＡにリンクしていたものは０．６％に過ぎなかった。これは、以前の報告と同様に、細胞表現型を決定するためのｍＲＮＡに基づく手法は、高特異性だが、感度に制限があることを示す。対照的に、細胞表面受容体等のタンパク質は、通常、それらのコードｍＲＮＡよりも非常に大きな数（１細胞当たり１，０００〜１００，０００個）で存在し、検出がより容易である可能性が高いだけでなく、より直接的に細胞表現型と関連する可能性が高い。各細胞での標的タンパク質レベルを測定するため、特注オリゴヌクレオチドＤＮＡ標識を、抗ヒトＣＤ４およびＣＤ８抗体にコンジュゲートし、標識抗体を、３０，０００個の細胞をエマルジョンに入力する前に、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の未分離混合物と共にインキュベートした（図３Ａ）。ＤＮＡ標識は、抗体特異的配列タグだけでなく、分子バーコード、および増幅された液滴バーコードに相補的な配列を担持し、ｍＲＮＡでの実施と同様に、エマルジョン液滴バーコード付与、および分子計数を可能にする。ＤＮＡ標識、ならびにＴＣＲ、ＣＤ４、およびＣＤ８  ｍＲＮＡを、同時に標的とした。配列決定およびフィルタリング後、３，６８２個の液滴バーコードを、高い信頼性でＴＣＲ  ＶαＶβペアであると識別した。以前の実験と一致して、ＴＣＲペアのおよそ半分（５２％）を、ｍＲＮＡに基づいてＣＤ４またはＣＤ８ステータスに帰属させることができた（図３Ｂ〜３Ｃ）。しかしながら、液滴バーコードの９５％超は、タンパク質ステータスに基づいてＣＤ４またはＣＤ８に帰属させることができ、１液滴当たりの平均分子計数は、ＣＤ４／８タンパク質（平均２０．５）が、ＣＤ４／８  ｍＲＮＡ（平均１．０）よりもかなり高かった。ｍＲＮＡおよびタンパク質決定が両方とも合致していたことを考慮すると、ｍＲＮＡとタンパク質シグナルとの間の合致率は高く（図３Ｄ）、液滴の９６．０％だった。一部の希少な例では、ＣＤ４およびＣＤ８タンパク質の両方が検出された。これは、液滴が、２つまたはそれよりも多くの細胞を含有していた結果であると考えられた。エマルジョンバーコード付与により、単一細胞免疫受容体を、目的のｍＲＮＡおよびタンパク質マーカーと、全てハイスループットで直接的に関連付けることが初めて可能になった。抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４等の拡大された免疫腫瘍学的関連マーカーセットを用いて、この手法をＴＩＬに応用���ることは、保証されている。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４６６】
標的特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞および非特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞対照集団を、蛍光標識標準ＭＨＣ−ペプチド四量体または様々な漸減濃度の蛍光標識四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのいずれかと共にインキュベートした。インキュベーションの後、標準のＭＨＣ−ペプチド四量体または四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートに陽性染色した細胞の存在は、フローサイトメトリーによって同定した。非特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞と共にインキュベートした標準のＭＨＣ−ペプチド四量体および四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの両方は、陽性染色をほとんど示さなかったか全く示さなかった（図２０、上列フローサイトメトリープロット）。標的特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞と共にインキュベートした標準のＭＨＣ−ペプチド四量体は、強力な二重陽性ＭＨＣ−ペプチド四量体＋ＣＤ８＋細胞集団を示した（図２０、下列、左のフローサイトメトリープロット）。標的特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞と共にインキュベートした四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、強力な二重陽性四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート＋ＣＤ８＋細胞集団を示し、この二重陽性集団は、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート濃度の低下に伴って減少した（図２０、下列、右の３つのフローサイトメトリープロット）。これは、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートが標準のＭＨＣ−ペプチド四量体と同様に標的特異的Ｔ細胞に結合したこと、および、標的特異的Ｔ細胞に結合している四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートが、四量体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの濃度に依存性であったことを示した。