(57)【要約】本発明は、治療上有効量の（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドを投与することを特徴とする頭部外傷、外傷性脳損傷、および／またはボクサー認知症の治療方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療上有効量の（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドを治療が必要な哺乳類に投与することを特徴とする、頭部外傷、外傷性脳損傷、および／またはボクサー認知症の治療方法。
【請求項２】
頭部外傷の治療のための請求項１の方法。
【請求項３】
外傷性脳損傷の治療のための請求項１の方法。
【請求項４】
ボクサー認知症の治療のための請求項１の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は薬物特性および生体作用特性を有する（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミド、それらの医薬的組成物、その製造方法および使用方法に関連する。該新規化合物はＡβペプチド産生の特異な阻害を有し、故にＡβペプチドの蓄積および／またはアミロイドタンパクの沈着の予防に作用し、頭部外傷、外傷性脳損傷、ボクサー認知症、および／または他のβ−アミロイドペプチドが関連する病態の治療に有用である。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
アルツハイマー病（ＡＤ）は進行性の神経変性疾患であり、記憶障害に始まり、重篤な認知障害、行動異常、および運動機能低下へと進行する（Grundman, M. et al., Arch. Neurol., 61:59-66 (2004)； Walsh, D.M. et al., Neuron, 44:181-193 (2004)）。それは最も多い形態の認知症であり、心臓障害および癌に続く３番目に多い死因となっている。ＡＤの代償は甚大であり、患者およびその家族の苦しみならびに患者およびその介護者の生産性の低下が含まれる。ＡＤを効果的に予防する、または臨床症状およびその原因となる病態生理を回復させる治療は今のところ存在しない。
【０００３】
認知症患者のＡＤの最終診断には、剖検における老人斑および神経原線維変化の数および局在の病理組織学的評価が必要である（Consensus recommendations for the postmortem diagnosis of Alzheimeｒ’ｓ disease.  Neurobiol. Aging, 18:S1-S2 (1997)）。同様の変化がトリソミー２１（ダウン症）の患者に見られる。老人斑は主にβ−アミロイド（Ａβ）ペプチドからなり、Ａβは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のβ−サイトＡＰＰ−切断酵素（ＢＡＣＥ）（Ｎ−末端を形成）およびγ−セクレターゼ（Ｃ−末端を形成）による段階的なタンパク質分解的切断により産生される（Selkoe, D.J., Physiol Rev., 81:741-766 (2001)）。γ−セクレターゼは膜貫通タンパク質複合体であり、ニカストリン、Ａｐｈ−１、ＰＥＮ−２、およびプレセニリン−１（ＰＳ−１）またはプレセニリン−２（ＰＳ−２）のいずれかを含む（Wolfe, M.S. et al., Science, 305: 1119-1123 (2004)）。ＰＳ−１およびＰＳ−２はγ−セクレターゼの活性部位を含むと考えられている。
【０００４】
Ａβ４０は産生されるＡβの最も多い形態であり（８０−９０％）、一方でＡβ４２はＡＤ病変形成に最も密接に関連する。特に、稀な家族性の形態のＡＤを引き起こすＡＰＰ、ＰＳ−１、およびＰＳ−２遺伝子における変異は、Ａβ４２が主要な毒性種として凝集することで発症に関与する（Selkoe, D.J., Physiol. Rev., 81:741-766 (2001)）。最近の証拠により、オリゴマー、プロトフィブリル、および細胞内Ａβ４２が疾患の過程に重要な役割を果たすことが示唆されている（Cleary, J.P. et al., Nat. Neurosci., 8:79-84 (2005)）。Ａβ４２を形成する酵素、例えばγ−セクレターゼの阻害剤は、ＡＤ治療のための強力な疾患修飾薬となる可能性を有する。
【０００５】
γ−セクレターゼはＡＰＰに加え、様々なＩ型膜貫通タンパク質を切断する（Pollack, S.J. et al., Curr. Opin. Investig. Drugs, 6:35-47 (2005)）。これらの切断の大半における生理的意義は不明であるが、遺伝学的証拠により、γ−セクレターゼによるＮｏｔｃｈの切断がＮｏｔｃｈシグナリングに必要であることが示唆されている（Artavanis-Tsakonas, S. et al., Science, 284(5415):770-776 (1999)； Kadesch, T., Exp. Cell Res., 260(1):1-8 (2000)）。γ−セクレターゼ阻害剤を投与したげっ歯類において、薬剤−関連毒性が消化管（ＧＩ）、胸腺、および脾臓で確認された（Searfoss, G.H. et al., J. Biol. Chem., 278: 46107-46116 (2003)； Wong, G.T. et al., J. Biol. Chem., 279:12876-12882 (2004)；  Milano, J. et al., Toxicol. Sci., 82:341-358 (2004)）。これらの毒性はＮｏｔｃｈシグナリングの阻害に関連していると考えられる（Jensen, J. et al., Nat Genet., 24:36-44 (2000)）。
【０００６】
メカニズムに基づく毒性の同定は、許容可能な治療指数がγ−セクレターゼ阻害剤により達成できるかという疑問を呈する。Ｎｏｔｃｈ切断と比較してのＡβ形成の選択的阻害、薬物動態、薬物蓄積および／または組織特異的な薬力が治療限界に影響し得る。
【０００７】
γ−セクレターゼ阻害による脳内Ａβレベルの減少がＡＤの発症および進行を予防し得ることが証拠により示唆される（Selkoe, D., Physiol. Rev., 81:741-766 (2001)； Wolfe, M., J. Med. Chem., 44:2039-2060 (2001)）。他の疾患、例えば軽度認識障害（ＭＣＩ）、ダウン症、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）、レヴィー小体型認知症（ＤＬＢ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ−Ｄ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、および加齢性黄斑変性症におけるＡβの役割に関して新しいデータが出されている。有利なことに、γ−セクレターゼを阻害し、Ａβ産生を減少させる化合物は、これらのまたは他のＡβ−依存的疾患の治療に用いられ得る。
【０００８】
Ａβの過剰な産生および／またはクリアランスの減少はＣＡＡ（Thal, D. et al., J. Neuropath. Exp. Neuro., 61:282-293 (2002)）を引き起こす。これらの患者において、血管アミロイド沈着が血管壁の変性を引き起こし、高齢患者における出血性卒中の１０−１５％の原因は動脈瘤である可能性がある。ＡＤと同様に、Ａβをコードする遺伝子における変異がオランダ型脳出血アミロイドーシスと呼ばれるＣＡＡの早期発症を引き起こし、この変異タンパク質を発現するマウスは患者と同様のＣＡＡを発症する。γ−セクレターゼを特異的な標的とする化合物はＣＡＡを減弱または予防し得る。
【０００９】
ＤＬＢは幻視、妄想、およびパーキンソニズムを症状とする。興味深いことに、Ａβ沈着を引き起こす家族性ＡＤ変異は、レヴィー小体およびＤＬＢ症候をも引き起こし得る（Yokota, O. et al., Acta Neuropathol. (Berl.), 104:637-648 (2002)）。さらに、孤発性ＤＬＢ患者はＡＤと同様のＡβ沈着を有する（Deramecourt, V. et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 65:278-288 (2006)）。これらのデータに基づくと、ＡβはＤＬＢにおけるレヴィー小体病理を促進すると考えられ、故にγ−セクレターゼ阻害剤はＤＬＢを減弱または予防し得る。
【００１０】
ＡＬＳ患者の約２５％が重篤な認知症または失語症を呈する（Hamilton, R.L. et al., Acta Neuropathol. (Berl.), 107:515-522 (2004)）。これらの患者の大部分（〜６０％）（ＡＬＳ−Ｄとする）は主にＴＤＰ−４３タンパクからなるユビキチン−陽性封入体を有する（Neumann, M. et al., Science, 314:130-133 (2006)）。ＡＬＳ−Ｄ患者の約３０％がその認知症を引き起こすＡβと一致するアミロイド斑を有する（Hamilton, R.L. et al., Acta Neuropathol. (Berl.), 107:515-522 (2004)）。これらの患者はアミロイドイメージング試薬で同定可能であり、γ−セクレターゼ阻害剤で治療できる可能性が高い。
【００１１】
ＩＢＭは稀な骨格筋の年齢依存的変性疾患である。ＩＢＭの筋肉におけるＡβ沈着の出現および筋肉にＡＰＰを過剰発現させたトランスジェニックマウスにおけるいくつかの病態の再現により、ＩＢＭにおいてＡβが役割を有することが支持される（Murphy, M.P. et al., Neurology, 66:S65-S68 (2006)によりレビュー）。γ−セクレターゼを特異的な標的とする化合物はＩＢＭを減弱または予防し得る。
【００１２】
加齢性黄斑変性症において、Ａβはドルーゼン、網膜色素上皮（ＲＰＥ）下の細胞外沈着物のいくつかの成分に１つとして同定された（Anderson, D.H. et al., Exp. Eye Res., 78:243-256 (2004)）。最近の研究により、マウスにおけるＡβと黄斑変性の密接な関連が示された（Yoshida, T. et al., J. Clin. Invest., 115:2793-2800 (2005)）。ＡＤ患者において、Ａβ沈着および核白内障の増加が認められている（Goldstein, L.E. et al., Lancet, 361:1258-1265 (2003)）。γ−セクレターゼを特異的な標的とする化合物は加齢性黄斑変性症を減弱または予防し得る。
【００１３】
腫瘍形成におけるＮｏｔｃｈシグナリングの役割に基づくと、γ−セクレターゼを阻害する化合物は癌の治療のための治療薬としても有効であり得る（Shih, I.-M. et al., Cancer Res., 67:1879-1882 (2007)）。
【００１４】
γ−セクレターゼを阻害する化合物は、例えば多発性硬化症などにおける髄鞘形成の減少に伴う症状の治療にも有効であり得る（Watkins, T.A. et al., Neuron, 60:555-569 (2008)）。
【００１５】
ジョージタウン大学メディカルセンターの研究者による最近の研究により、γ−セクレターゼ阻害剤が外傷性脳損傷における長期的な損傷を防止し得ることが示唆された（Loane, D.J., et al., Nat. Med., 1-3 (2009)）。
【００１６】
Smith et al.は国際出願ＷＯ ００／５０３９１（２０００年８月３１日公開）において、様々な疾患、特にアルツハイマー病および他のアミロイド沈着に関連する疾患の治療方法としてアミロイドβタンパクの産生調節に働く一連のスルホンアミド化合物を開示する。
【００１７】
特許第１１３４３２７９号（１９９９年１２月１４日公開）は、自己免疫疾患の治療に有用なＴＮＦ−α阻害剤である一連のスルホンアミド誘導体を開示する。
【００１８】
Parker et al.は国際出願ＷＯ ０３/０５３９１２（２００３年７月３日公開）において、アルツハイマー病および他のβ−アミロイドペプチドが関連する病態の治療に有用なβアミロイド阻害剤として一連のα−（Ｎ−スルホンアミド）アセトアミド誘導体を開示する。
【００１９】
ＷＯ ０３／０５３９１２の式の定義に含まれる本発明の化合物はParker et al.には開示または記載されていない。驚くべきことに、（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドがアルツハイマー病および他のβアミロイドペプチドが関連する病態の治療に有用な独特の特性を有することが発見されている。
【発明の概要】
【００２０】
本発明は式（Ｉ）を有する（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミド、それらの医薬組成物、およびアルツハイマー病（ＡＤ）または他のβ−アミロイドペプチドが関連する障害を患うまたは患いやすい患者においてＡβ産生を阻害するためのそれらの使用に関連する。
【００２１】
（発明の詳細な説明）
別の実施態様の１つにおいて、本発明は治療上有効量の（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドを医薬的に許容されるアジュバント、担体または希釈剤と共に含む医薬組成物を提供する。
【００２２】
別の実施態様の１つにおいて、本発明は治療上有効量の（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドまたはその溶媒和物または水和物を一般的なアジュバント、担体または希釈剤と共に投与することを特徴とする、β−アミロイドペプチドが関連する障害、特にアルツハイマー病、脳アミロイド血管症、軽度認知障害およびダウン症の治療、緩和またはその発症の遅延のための方法を提供する。
【００２３】
別の態様の１つにおいて、本発明は、不活性な有機溶媒中、塩基、好ましくは炭酸セシウムなどの不活性な塩基の存在下において（Ｒ）−２−（４−クロロフェニルスルホンアミド）−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドを３−（４−（ブロモメチル）−３−フルオロフェニル）−１，２，４−オキサジアゾールと反応させる工程を含む（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドの製造方法を提供する。
【００２４】
別の態様の１つにおいて、本発明は
（ａ）  （Ｒ）−２−（４−クロロ−Ｎ−（４−シアノ−２−フルオロベンジル）フェニルスルホンアミド）−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドをヒドロキシルアミンと反応させる工程、および
（ｂ）  得られた（Ｒ）−２−（４−クロロ−Ｎ−（２−フルオロ−４−（Ｎ’−ヒドロキシカルバムイミドイル）ベンジル）フェニルスルホンアミド）−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドを不活性な有機溶媒中、酸触媒の存在下においてオルトギ酸トリエチルで処理する工程
を含む（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドの製造方法を提供する。
【００２５】
本発明の化合物は不斉炭素原子を有するため、本発明は式（Ｉ）の化合物のラセミ体および個々のエナンチオマーならびに本明細書中に記載の中間体のキラル体およびラセミ体を包含する。単一の記号、例えば（Ｒ）または（Ｓ）の使用は、通常１つの立体異性体を含むよう意図される。異性体の混合物は、例えば分別結晶化、クロマトグラフィ吸着または別の分離方法などの周知の方法により個々の異性体に分離することができる。得られたラセミ体は、適切な塩形成基の導入後に通常の方法により、例えば光学活性な塩形成剤を用いてジアステレオマー塩の混合物を形成し、混合物をジアステレオマー塩に分離し、分離した塩を遊離化合物に変換することにより対掌体に分離することができる。エナンチオマー体は、キラル高圧液体クロマトグラフィカラムによる分画によっても分離することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の方法において、用語「治療上有効量」は意義のある患者利益を示す、例えばβ−アミロイドが関連する病態の治癒に十分な、該方法における各成分の総量を意味する。個々の活性成分に適用される場合、該用語はその成分単独を意味する。組み合わせに適用される場合、該用語は、組み合わせ、連続または同時に投与されるかどうかにかかわらず、治療効果をもたらす活性成分の合計量を意味する。本明細書中および請求項で用いられる用語「治療する、治療の、治療」は、β−アミロイド関連の疾患の予防、遅延、抑制または改善を意味する。
【００２７】
本発明の別の実施態様の１つにおいて、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ）の化合物が有用な疾患または病態の治療／予防／抑制または改善に使用される別の薬剤と組み合わせて用いられてもよい。かかる別の薬剤は、それらが通常用いられる経路および投与量において、本発明の化合物と同時に、または時間差で用いられてもよい。式（Ｉ）の化合物が１つまたはそれ以上の別の薬剤と同時に用いられる場合、式（Ｉ）の化合物に加えてかかる薬剤を含む医薬組成物が好ましい。かくして、本発明の医薬組成物は、式（Ｉ）の化合物に加えて１つまたはそれ以上の別の活性成分を含む医薬組成物を包含する。アルツハイマー病の治療のために（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドとの組み合わせで用いられ、別々のまたは同一の医薬組成物において投与され得る別の活性成分の例は、これらに限定されないが、コリンエステラーゼ阻害剤に分類される薬剤、例えばドネペジル（ＡＲＩＣＥＰＴ（登録商標））、リバスチグミン（ＥＸＥＬＯＮ（登録商標））、ガランタミン（ＲＥＭＩＮＹＬ（登録商標）、現ＲＡＺＡＤＹＮＥ（登録商標））；ＮＭＤＡアンタゴニストである別の薬剤、例えばメマンチン（ＮＡＭＥＮＤＡ（登録商標））およびＰＤＥ４阻害剤、例えばシロミラスト（ＡＲＩＦＬＯ（登録商標））；ＮＳＡＩＤ類、例えばＲ−フルルビプロフェン（ＦＬＵＲＩＺＡＮ（登録商標））；コレステロール低下スタチン薬剤、例えばプラバスタチン、シンバスタチンおよびアトルバスタチン；抗アミロイドおよび抗Ａβ免疫療法；Ａβの凝集を阻害する薬剤、例えばシロイノシトール（scylloinositol）およびクリキノール；Ａβ産生または切断を阻害または調節する別の化合物、例えばγ−セクレターゼ阻害剤、β−セクレターゼ阻害剤、γ−セクレターゼモジュレーター（modulator）、Ａβモジュレーター、およびＧＳＫ−３阻害剤；Ａβのターンオーバーを制御する化合物、例えばＰＡＩ−１阻害剤；タウのリン酸化を制御する化合物、例えばＧＳＫ−３およびＣＤＫ−５阻害剤；ＰＰＡＲγアゴニスト、例えばロシグリタゾン；タウもしくはリン酸化タウのターンオーバーまたはオリゴマー化を制御する化合物、例えばＨＳＰ９０阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤および抗タウ免疫療法；および微小管を安定化または微小管と結合する化合物、例えばタキサン誘導体およびエポチロン誘導体；およびミトコンドリア機能を制御する化合物、例えばＤｉｍｅｂｏｎである。
【００２８】
癌の治療において、本発明の化合物は既知の抗癌剤または抗癌療法と共に用いられてもよい。かかる薬剤および治療方法は、例えば細胞障害性／細胞増殖抑制剤、アンドロゲン受容体モジュレーター、エストロゲン受容体モジュレーター、レチノイド受容体モジュレーター、プレニル化タンパク転移酵素阻害剤、血管新生阻害剤、細胞周期チェックポイントに干渉する薬剤、および放射線療法である。さらに、本発明の化合物はループスなどの免疫障害の治療においても有効であり得る。
【００２９】
上記の薬剤は、本発明の化合物との組み合わせで用いられる場合、例えばＰｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＰＤＲ）で指示される量（適用可能であるか、さもなければ当業者により決定される）において用いられ得る。
【００３０】
しかしながら、実際に投与される量は、関連する状況、例えば治療目的の症状、投与する化合物の選択、選択される投与経路、個々の患者の年齢、体重、ならびに反応、および患者の症候の重症度を考慮して医師により決定されることは理解されるべきである。
【００３１】
一般的な反応スキーム
本発明の化合物は有機合成分野の当業者に周知の数多くの方法により製造され得る。式（Ｉ）の化合物は以下の反応スキーム１−５に記載される方法により製造することができる。記載の方法の合理的な変法および当業者に明らかな合成方法は、本発明の範囲に包含されるよう意図される。
【００３２】
反応スキーム１
【化１】
2012520875.tif 000002
反応スキーム１で説明される１つの製造方法において、実質的に鏡像的純粋な形態で用いられる式（ＩＩ）の開始物質は、トリフルオロブチルアルデヒドを式（ＩＩ）の（α−アミノ）アセトアミドに変換する反応スキーム３に記載される不斉ストレッカー合成方法などの文献的に周知の方法により製造されてもよく、あるいは、（Ｒ）−５，５，５−トリフルオロノルバリン（Ojima, I., J. Org. Chem., 54:4511-4522 (1989)を参照）から、反応スキーム４に記載の方法、次いでアミド製造の一般的方法（Larock, R.C., Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, New York, pp. 972-976 (1989)）により製造されてもよい。式（ＩＩ）の（α−アミノ）アセトアミドを適切な塩基で処理し、室温に近い温度下などにおいてＣＨ２Ｃｌ２などの適切な非プロトン性溶媒中でｐ−クロロスルホニルクロリドによりスルホニル化すると、式（ＩＩＩ）の（α−スルホンアミド）アセトアミドが得られる。適切な塩基は、例えば、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、ピリジンなどである。
【００３３】
式（ＩＩＩ）の化合物の式（Ｉ）のスルホンアミドへの変換は、塩基の存在下、適切な非プロトン性溶媒中において、加熱または非加熱下で式（ＩＩＩ）の（α−スルホンアミド）アセトアミドを式（ＩＶ）のオキサジアゾールフルオロベンジルアルカリ化試薬と反応させることにより行われる。式（ＩＶ）のフルオロベンジルオキサジアゾールは、当業者に周知の方法および反応スキーム６に記載の方法により（ここで、Ｘは脱離基である）容易に製造され得る。このアルキル化における適切な塩基は、例えば炭酸カリウムおよび炭酸セシウムである。好ましい溶媒は、例えばＤＭＦおよびアセトニトリルである。該反応を実施するための温度範囲は、典型的には２０℃から１００℃である。
【００３４】
反応スキーム２
【化２】
2012520875.tif 000003
反応スキーム２で説明される別の製造方法において、式（Ｉ）の１，２，４−オキサジアゾール化合物は、式（ＩＩＩ）の化合物を適切な溶媒中で式（ＶＩ）の２−シアノ−４−フルオロベンジル誘導体（ここで、Ｘは脱離基である）でアルキル化し、式（ＶＩＩ）のニトリル化合物を得ることにより製造される。次いで、目的の式（Ｉ）の化合物は、式（ＶＩＩ）のニトリル化合物から当業者に周知の方法を用いて製造される（参考文献：Joule, J.A. et al., Heterocyclic Chemistry, 3rd ed., Chapman & Hall, London, pp. 452-456 (1995)およびその文献中の引用文献）。例えば、メタノールまたはエタノールなどのアルコール溶媒中、最高で還流温度までにおける式（ＶＩＩ）のニトリル化合物とヒドロキシルアミンの反応により、中間体アミドオキシムが得られ、それを次いで、トリフルオロ酢酸または三フッ化ホウ素エーテルなどの酸源の存在下、ＣＨ２Ｃｌ２、アセトニトリル、テトラヒドロフランなどの不活性有機溶媒中でオルトギ酸エステル（例えばオルトギ酸トリエチルまたはオルトギ酸トリメチル）で処理することにより、式（Ｉ）の１，２，４−オキサジアゾールが得られる。
【００３５】
反応スキーム３
【化３】
2012520875.tif 000004
反応スキーム３は、市販のトリフルオロブチルアルデヒドおよび（Ｒ）−α−メチルベンジルアミンを開始物質とし、ストレッカー（Strecker）条件下において、酢酸、およびシアン化ナトリウム、シアン化カリウムまたはトリメチルシリルシアニドなどのシアン化物源を用い、メタノールなどの適切な溶媒中で式（ＶＩＩＩ）のアミノニトリルをジアステレオマーの混合物として得る式（ＩＩ）の（α−アミノ）アセトアミドの製造を示す。開始物質トリフルオロブチルアルデヒドはトリフルオロブタノールを酸化して製造されてもよい。式（ＶＩＩＩ）のアミノニトリルの対応する式（ＩＸ）のアミドへの加水分解は、硫酸を用い、反応物を中和し、次いで酸性化し、メタノール、イソプロパノール、酢酸エチル、メチル ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、またはそれらの混合物などの適切な溶媒中で再結晶化することにより行われ、式（Ｘ）のアミドが＞９９％のジアステレオマー過剰率において得られる。次いで、水酸化パラジウムまたはパラジウム炭素などの適切な触媒の存在下における水素付加によりベンジル基を除去することができ、式（ＩＩ）のアミノアミドが得られ、それをｐ−クロロスルホニルクロリドでスルホン化することにより式（ＩＩＩ）のスルホンアミドが得られる。
【００３６】
反応スキーム４
【化４】
2012520875.tif 000005
別の製造方法において、式（ＩＩ）の（α−アミノ）アセトアミドは、反応スキーム４で説明されるように、５，５，５−トリフルオロ−２−オキソペンタン酸を開始物質とする酵素過程により立体選択的に製造することができる。式（ＸＩＶ）の（Ｒ）−５，５，５−トリフルオロノルバリンは、式（ＸＩＩＩ）の化合物から、市販の酵素（Ｒ）−アミノトランスフェラーゼを用い、当業者に周知の方法により、鏡像異性的に非常に純度の高い形態で製造され得る。あるいは別の方法において、酵素過程は市販の（Ｒ）−アミノ酸デヒドロゲナーゼによって行われてもよい。酵素過程は以下に記載の方法および当業者に周知の方法により行われる。式（ＸＩＶ）の（Ｒ）−５，５，５−トリフルオロノルバリンの式（ＩＩ）の化合物への変換は、当業者に周知のアミド製造の一般的工程を用いて行われる。
【００３７】
反応スキーム５
【化５】
2012520875.tif 000006
式（ＶＩａ）のベンジルブロミドは、反応スキーム５で説明されるように、ジクロロメタン、ジクロロエタンまたは四塩化炭素などの適切な溶媒中で、ＡＩＢＮなどのイニシエーターを用いて市販の２−フルオロ−４−シアノトルエンをＮ−ブロモスクシンイミドでブロム化することにより製造することができる。ブロム化は高収率で進行し、必要なら、当業者に周知の方法により、式（ＶＩａ）の化合物は直ちに式（ＶＩ）の化合物（ここで、Ｘは脱離基である）に変換することができる。
【００３８】
反応スキーム６
【化６】
2012520875.tif 000007
上の反応スキーム２に記載される式（Ｉ）のスルホンアミドオキサジアゾールの直線的な反応順序における式（ＶＩ）の化合物の使用に代わるものとして、反応スキーム１で説明される変換経路において使用するための式（ＩＶ）の化合物の製造を反応スキーム６で示す。市販の２−フルオロ−４−シアノトルエンを室温、適切なアルコール溶媒中においてヒドロキシルアミンで処理することにより、直接次の反応に用いることができる式（ＸＩ）の粗アミドオキシムが得られる。三フッ化ホウ素エーテルおよびオルトギ酸トリエチルで処理することにより式（ＸＩ）のアミドオキシムを環化し、式（ＸＩＩ）のオキサジアゾールが９０％を超える収率で得られる（２工程）。三フッ化ホウ素の使用に代わるものとして、環化反応はトリフルオロ酢酸を酸源として用いることによっても完全に行うことができる。ジクロロメタン、ジクロロエタンまたは四塩化炭素などの適切な溶媒中でＡＩＢＮなどのイニシエーターを用い、Ｎ−ブロモスクシンイミドによりブロム化を行うことにより、式（ＩＶａ）のモノ−ブロモオキサジアゾール化合物が得られる。モノ−およびジ−ブロム化物の混合物が得られる可能性を避ける必要がある場合、式（ＸＩ）のトルイル官能基を意図的にＮ−ブロモスクシンイミドおよびＡＩＢＮで過剰にブロム化して対応するジブロミドを得、次いでそれを亜リン酸ジエチルで還元すると式（ＶＩａ）のモノ−ブロミドが９０％を超える収率で得ることができる。ジブロム化および還元は、ジブロミドを単離することなく一度に９０％を超える収率で行うことができる。あるいは、式（ＩＶａ）の化合物は、過剰の臭素酸ナトリウムおよび亜硫酸水素ナトリウムの存在下、酢酸エチル／水、ジクロロメタン／水、酢酸ブチル／水、トリフルオロトルエン／水などの適切な二相溶媒系において式（ＸＩＩ）の化合物からモノ−およびジ−ブロミド中間体の混合物を得、それをそのままリン酸ジエチル／ジイソプロピルアミンで還元することにより式（ＩＶａ）のモノ−ブロミドを得ることにより製造されてもよい。必要なら、式（ＩＶａ）の化合物は、当業者に周知の方法により、直ちに式（ＩＶ）の化合物（ここで、Ｘは脱離基である）に変換されてもよい。
【００３９】
別の実施態様の１つにおいて、本発明は式（Ｉ）の化合物を医薬的アジュバント、担体または希釈剤との組み合わせで含む医薬組成物を包含する。
【００４０】
別の実施態様の１つにおいて、本発明は、治療上有効量の式（Ｉ）の化合物またはその溶媒和物もしくは水和物を哺乳類の対象に投与することを特徴とする、治療が必要な哺乳類におけるβ−アミロイド阻害に応答する障害の治療方法に関連する。
【００４１】
別の実施態様に１つにおいて、本発明は、治療上有効量の式（Ｉ）の化合物またはその溶媒和物もしくは水和物を患者に投与することを特徴とする、治療が必要な患者におけるアルツハイマー病、脳アミロイド血管症、全身性アミロイドーシス、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血（オランダ型）、多発脳梗塞性認知症、軽度認知障害およびダウン症の治療、改善または発症の遅延のための方法に関連する。
【００４２】
別の実施態様の１つにおいて、本発明は、治療上有効量の式（Ｉ）の化合物またはその溶媒和物もしくは水和物を治療が必要な哺乳類の対象に投与することを特徴とする、頭部外傷、外傷性脳損傷、および／またはボクサー認知症の治療のための方法に関連する。
【００４３】
別の実施態様の１つにおいて、本発明は、治療上有効量の式（Ｉ）の化合物またはその溶媒和物もしくは水和物を治療が必要な哺乳類の対象に投与することを特徴とする、頭部外傷の治療のための方法に関連する。
【００４４】
別の実施態様の１つにおいて、本発明は、治療上有効量の式（Ｉ）の化合物またはその溶媒和物もしくは水和物を治療が必要な哺乳類の対象に投与することを特徴とする、外傷性脳損傷の治療のための方法に関連する。
【００４５】
別の実施態様の１つにおいて、本発明は、治療上有効量の式（Ｉ）の化合物またはその溶媒和物もしくは水和物を治療が必要な哺乳類の対象に投与することを特徴とする、ボクサー認知症の治療のための方法に関連する。
【００４６】
治療を目的とした使用において、医薬的に活性な式（Ｉ）の化合物は、通常、少なくとも１つのかかる化合物を不可欠な活性成分として、固形もしくは液状の医薬的に許容される担体ならびに医薬的に許容されるアジュバントおよび賦形剤を標準的かつ一般的な技術を用いて適宜共に含有させた医薬組成物として投与される。
【００４７】
該医薬組成物は、経口、非経口（例えば皮下、筋肉内、皮内および静脈）、皮内、舌下、気管支または経鼻に適した投与剤形を含む。故に、固形の担体が用いられた場合、錠剤、硬ゼラチンカプセル内の粉剤もしくはペレット剤形、またはトローチ剤もしくは薬用キャンディーの剤形として製造されてもよい。固形の担体は一般的な賦形剤、例えば結合剤、充填剤、錠剤化滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤などを含んでいてもよい。錠剤は、必要な場合、一般的な技術により薄膜でコーティングされてもよい。経口用投与剤形は、ゼラチン製押し出しカプセル、およびグリセロールもしくはソルビトールによるコーティングを有するゼラチン製の軟性の被覆カプセル（scaled capsule）を含む。押し出しカプセルは充填剤または結合剤（例えば乳糖もしくはデンプン）、滑沢剤（例えばタルクもしくはステアリン酸マグネシウム）、および適宜安定化剤と混合した活性成分を含み得る。軟性のカプセルにおいて、活性成分は安定化剤の存在下または不存在下で適切な液体（例えば脂肪油、液体、または液体ポリエチレングリコール）に溶解または懸濁されてもよい。液体の担体が用いられた場合、剤形はシロップ剤、エマルジョン剤、ソフトゼラチンカプセル、注射用の滅菌媒体、水性または非水性の液体懸濁剤、または使用前に水もしくは適切な別の媒体で再構成する乾燥製剤の形でもよく、液体製剤の剤形は一般的な添加剤、例えば懸濁化剤、乳化剤、湿潤剤、非水性媒体（例えば食用油）、保存剤ならびに香料および／または着色剤を含んでいてもよい。非経口投与において、媒体は通常大部分において滅菌水を含むが、生理食塩水、グルコース溶液などを利用してもよい。注射可能な懸濁剤もまた用いられ得るが、この場合、一般的な懸濁化剤を用いてもよい。一般的な保存剤、緩衝剤などもまた、非経口投与剤形に用いられ得る。局所的または経鼻投与において、特定のバリアーの透過に適した浸透剤または透過剤を製剤に用いてもよい。かかる浸透剤は技術的に周知である。該医薬組成物は、本発明による式（Ｉ）の化合物である活性成分を含む目的の製剤に適した一般的な技術により製造される（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, 17th edition (1985)参照）。
【００４８】
治療効果を達成するための式（Ｉ）の化合物の投与量は、患者の年齢、体重および性別ならびに投与方法などの因子だけでなく、目的とするＡβ阻害の度合いおよび考慮する具体的な障害または疾患における式（Ｉ）の化合物の能力に依存する。治療および式（Ｉ）の化合物の用量は単位投与剤形で投与してもよく、単位投与剤形は活性の相対的レベルを反映するよう当業者により適宜調整され得ることも意図される。用いられる具体的用量(および一日あたりの投与回数)の決定は医師の裁量の範囲内であり、目的の治療効果を提供するための、具体的状況に対する本発明の用量の設定により変化し得る。
【００４９】
哺乳類、例えば本明細書中に記載されるＡβペプチド産生が関連するいずれの病態に罹患している、または罹患していると思われるヒトに対する本発明の化合物、またはその医薬組成物の適切な用量は、通常、非経口投与の場合、１日あたり約０．０１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは約０．１から２ｍｇ／ｋｇである。経口投与の場合、用量は約０．０１から約２０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、好ましくは０．１から１０ｍｇ／ｋｇ体重である。活性成分は、好ましくは１日あたり１から４回、等量を投与される。しかしながら、通常は低用量が投与され、治療下の対象における最適の用量が決定されるまで用量は徐々に増加する。良好な臨床的実践に従い、いずれの有害または厄介な副作用を引き起こすことなしに効果的な抗アミロイド効果をもたらすような濃度レベルにおいて本発明の化合物を投与することが望ましい。しかしながら、実際に投与される該化合物の量は、治療する病態、投与する化合物の選択、投与経路の選択、個々の患者の年齢、体重および応答、ならびに該患者の症状の重篤度といった関連する状況に応じて医師により決定されることは理解されるべきである。
【実施例】
【００５０】
（生物学的データ）
ＰＸＲのトランス活性化
プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）は主にシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）３Ａ４の誘導に重要な核内ホルモン受容体であり、ＣＹＰ３Ａ４は多くの臨床的に処方される薬剤の代謝において主要な役割を果たす。ＣＹＰ３Ａ４の誘導が、同時投与されたＣＹＰ３Ａ４の基質の代謝クリアランスを増加させることによる薬剤−薬剤間相互作用（Bertilsson, G. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 95:12208-12213 (1998); Lehmann, J.M. et al., J. Clin. Invest., 102:1016-1023 (1998)）、または自己誘導による薬剤暴露の消失を引き起こすことはよく知られている。薬剤の候補化合物の発見または開発における誘導能力のキャラクタライズは医薬品産業の重要な評価方法となった。ＰＸＲトランス活性化アッセイをＣＹＰ３Ａ４誘導能力の評価に用い、ＨｅｐＧ２細胞の細胞毒性アッセイを細胞毒性のアッセイにおける干渉のモニターに用いる。
【００５１】
ＤＭＥＭを細胞培養用培地として用いる。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、ＰＢＳ、トリプシン−ＥＤＴＡ（０．２５％）、およびペニシリン−ストレプトマイシンをＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールズバッド、カリフォルニア州）から購入した。熱非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）はＳｉｇｍａ（セントルイス、ミズーリ州）から購入した。活性炭／デキストラン処理済ウシ胎児血清（ＦＢＳ）はＨｙｃｌｏｎｅ（ローガン、ユタ州）。ＨｅｐＧ２細胞はＡＴＣＣ（マナッサス、ヴァージニア州）から得た。ヒトＰＸＲ−ｐｃＤＮＡ３およびルシフェラーゼレポーターを含んだＣＹＰ３Ａ４プロモーター、ＣＹＰ３Ａ−ＬｕｃはＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂで調製した。黒色スタンダード３８４−ウェルプレートはＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（レキシントン、ケンタッキー州）から購入した。ルシフェラーゼ基質（Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ）は（マディソン、ウィスコンシン州）から購入した。コントロール化合物リファンピシンはＳｉｇｍａ（セントルイス、ミズーリ州）から購入した。
【００５２】
ＨｅｐＧ２細胞の培養は、Ｔ１７５フラスコ内で１０％ＦＢＳを含んだＤＭＥＭを用いて行った。トランスフェクション混合物は、１μｇ／ｍＬのＰＸＲ−ｐｃＤＮＡ３プラスミドＤＮＡ、２０μｇ／ｍＬのＣｙｐ３Ａ−ＬｕｃプラスミドＤＮＡ、９０μＬ／ｍＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、および血清不含培地を含む。室温で２０分間インキュベート後、トランスフェクション混合物（フラスコあたり１ｍＬ）を新鮮な培地（フラスコあたり２０ｍＬ）中の細胞にアプライし、フラスコを３７℃で（５％ＣＯ２）で終夜インキュベートした。
【００５３】
各フラスコ内の細胞をＰＢＳで洗浄し、４ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡ（０．２５％）を加え、室温で１分間インキュベートした。トリプシンを吸引して除去し、フラスコをさらに室温で５分間インキュベートした。次いでフラスコを激しく叩き、細胞の凝集物を壊した。５％活性炭／デキストラン処理済ＦＢＳを含んだ１０ｍＬのＤＭＥＭを加えた後、混合物全体をコニカルチューブに移した。１ｍｌピペットチップを通したピペッティングにより懸濁物内の細胞のプールをさらに分散させた。次いで細胞数を計測し、培地で３．０ｘ１０５細胞／ｍＬに希釈した。０．２５μＬの試験化合物（１００％ＤＭＳＯに溶解）を含んだ黒色スタンダード３８４−ウェルプレートの各ウェルに５０μＬの細胞混合物を加えた。プレートを３７℃（５％ＣＯ２）で終夜インキュベートし、２５μＬのルシフェラーゼ基質（Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに加えた。１５分後、プレートをＶｉｅｗｌｕｘ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）プレートリーダーで測定した。
【００５４】
各プレートはリファンピシン（１０μＭ）（ＰＸＲ作動薬として有名）を内部標準およびポジティブコントロールとして含む。データは、パーセント活性化（％Ａｃｔ）として表され、総シグナルは１０μＭリファンピシン、ブランクシグナルはＤＭＳＯ媒体からのシグナルである。
2012520875.tif 000008
化合物は１０種類の濃度（５０μＭ−２．５ｎＭ、１：３の段階希釈）で試験され、ＸＬ−Ｆｉｔ（ＩＤＢＳ，Ｉｎｃ．）を曲線近似に用いた。２０％および６０％の活性化が起こる濃度（それぞれＥＣ２０ＡおよびＥＣ６０Ａ）を報告する。
【００５５】
ヒト  プレグナン−Ｘ受容体は主に、ＣＹＰ３Ａ４、およびＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８／９、ＵＧＴなどの第２相酵素、ならびにＰ−ｇｐ、ＭＲＰ２およびＯＡＴＰ２などのいくつかのトランスポーターの誘導に重要である。上のｈＰＸＲトランス活性化アッセイにおいて、（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドは６．９μＭのＥＣ２０Ａ（１０μＭリファンピシン応答の２０％）および１６．７μＭ以上のＥＣ６０Ａ（１０μＭリファンピシン応答の６０％）を示した。これらの結果により、（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドがｈＰＸＲの活性化を介したヒトＣＹＰ３Ａ４誘導因子となり得ることが示唆される。
【００５６】
Ｆａ２Ｎ−４細胞におけるシトクロムＰ４５０の誘導
（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドのＣＹＰ３Ａ４  ｍＲＮＡ誘導能力をインビトロでＦａ２Ｎ−４細胞株を用いて評価した。Ｆａ２Ｎ−４は不死化遺伝子としてシミアンウィルス４０（ＳＶ４０）Ｔ抗原を用いて作成され、ＣＹＰ３Ａ４を含むいくつかのＣＹＰアイソフォームの基底発現および誘導能を保っている不死化ヒト肝細胞株であり、ＭＦＥ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｍｅｄｉａ ＦはＸｅｎｏＴｅｃｈ、ＬＬＣ（レネックサ、カンサス州）から提供された。
【００５７】
Ｆａ２Ｎ−４細胞を１２−ウェル、コラーゲンコートプレートに播種密度０．６７ｘ１０６細胞／ウェルで播種した。播種後、培地を交換し、細胞を加湿ＣＯ２供給インキュベーター内に終夜維持した。この順応期間後、細胞を光学顕微鏡下で観察し、細胞の形態が正常であり使用に適しているかを決定した。処理期間中、毎日細胞を、細胞の形態、密集度、および試験品による毒性の兆候を視覚的に検査し、必要に応じて記録した。細胞培養物を４つの濃度（最終的なインキュベーションにおいて０．５、２、８、および２０μＭ）の（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミド、および溶媒媒体コントロール（０．１％  ＤＭＳＯ）により、３組で処理した。典型的なＣＹＰ３Ａ４誘導因子であるリファンピシン（１０μＭ）をポジティブコントロールに用いた。Ｆａ２Ｎ−４細胞を試験品に合計３日間暴露した。培養用培地は、毎日試験品を含んだ新鮮な培地と交換した。合計〜７２時間培養後、培地を吸引し、細胞を温リン酸緩衝生理食塩水で１回洗浄し、細胞溶解バッファー（Ｑｉａｇｅｎ、バレンシア、カリフォルニア州）を加えた。
【００５８】
（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドのＣＹＰ３Ａ４  ｍＲＮＡ発現能力をＦａ２Ｎ−４不死化ヒト肝細胞で調べた。Ｆａ２Ｎ−４肝細胞をリファンピシン（１０μＭ）で３日間処理すると、細胞のＣＹＰ３Ａ４  ｍＲＮＡ発現における顕著な増大（１２倍）が引き起こされ、該細胞が正常に機能していることが示された。肝細胞を（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドと共に３日間インキュベートすることにより、濃度依存的なＣＹＰ３Ａ４  ｍＲＮＡ発現の増大が起こり、試験された最も高い濃度（２０μＭ）において媒体コントロールの２．６倍に達した。この誘導の度合いはリファンピシンにより引き起こされる誘導応答の２２％にあたり、これにより（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドが２０μＭを超える濃度においてＣＹＰ３Ａ４を緩やかに誘導することが示唆された。より低濃度の（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミド（≦８．０μＭ）により、相対的に最小量のＣＹＰ３Ａ４誘導（≦２．０倍）が観察された。
【００５９】
肝ミクロソームにおける代謝的安定性
マウス、ラット、イヌ、ヒトおよびカニクイザルの肝ミクロソームをＢＤ Ｇｅｎｔｅｓｔ（ウォバーン、マサチューセッツ州）から得た。ロット番号は１３（マウス）、８（ラット）、８（イヌ）、１９ならびに２６（ヒト）、および３（カニクイザル）であった。肝ミクロソームにおける（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドの酸化的代謝を３組の条件下で調べた。ヒトおよびイヌ用のインキュベーション混合物（総体積３ｍＬ、有機溶媒含有率０．３％）には（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミド（１μＭ）、ミクロソームタンパク質（１ｍｇ／ｍＬ）、ＮＡＤＰＨ（１ｍＭ）、トリス塩化物バッファー（１００ｍＭ、ｐＨ７．４）、および塩化マグネシウム（３．３ｍＭ）が含まれていた。反応はトリプリケートで行い、ＮＡＤＰＨの添加により開始され、次いで３７℃で５０分間インキュベートした。サンプルのアリコート（０．２５ｍＬ）を０、５、１０、２０、３０、４０および５０分に採取し、３容積のアセトニトリルを加えることにより反応をクエンチした。カニクイザルおよびラット用のインキュベーション混合物（総体積３ｍＬ、有機溶媒含有率０．３％）には（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミド（１μＭ）、ミクロソームタンパク質（０．１ｍｇ／ｍＬ）、ＮＡＤＰＨ（１ｍＭ）、トリス塩化物バッファー（１００ｍＭ、ｐＨ７．４）、および塩化マグネシウム（３．３ｍＭ）が含まれていた。反応はトリプリケートで行い、ＮＡＤＰＨの添加により開始され、３７℃で５０分間インキュベートした。サンプルのアリコート（０．２５ｍＬ）を０、５、１０、２０、３０、４０分および５０分に採取し、３容積のアセトニトリルを加えることにより反応をクエンチした。マウスおよびカニクイザル用のインキュベーション混合物（総体積３ｍＬ、有機溶媒含有率０．３％）には（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミド（１μＭ）、ミクロソームタンパク質（０．１ｍｇ／ｍＬ）、ＮＡＤＰＨ（１ｍＭ）、トリス塩化物バッファー（１００ｍＭ、ｐＨ７．４）、および塩化マグネシウム（３．３ｍＭ）が含まれていた。反応はデュプリケートで行い、ＮＡＤＰＨの添加により開始され、３７℃で４０分間インキュベートした。サンプルのアリコート（０．２５ｍＬ）を０、５、１０、１５、２０、３０および４０分に採取し、３容積のアセトニトリルを加えることにより、反応をクエンチした。全ての試験において、サンプルを直ちにＬＣ／ＭＳ法により分析した。親化合物の消失速度は、各タイムポイントにおける（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェ��ル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドのピーク面積の比から算出した。
【００６０】
様々な種における（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドの肝固有クリアランス（ＣＬｈ，ｉｎｔ、ｍＬ／分／ｋｇ）は肝ミクロソームのデータからHouston, J.B., Biochem. Pharmacol., 47:1469-1479 (1994); Iwatsubo et al., Pharmacol. Ther., 73:147-171 (1997); および Obach et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 283:46-58 (1997) に記載の方法により推定した。
【００６１】
様々な種のＮＡＤＰＨ−強化肝ミクロソーム存在下における（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドのインビトロ代謝速度を算出した。本発明の化合物（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミド（１μＭ）は、マウス、ラット、イヌ、ヒト、カニクイザルのミクロソームの存在下において、それぞれ６９０、６３０、４０、４９５および３２ｐｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質の速度で代謝された。（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドの消費速度をインビボクリアランスに換算すると、予想される（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドのインビボ（血中）クリアランス値は、マウス、ラット、イヌ、ヒト、カニクイザルにおいて、それぞれ約８７、５２、１４、３９および８ｍＬ／分／ｋｇであった。これらのデータにより、（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドはヒトにおいて低クリアランスの化合物であることが予測された。
【００６２】
（インビトロにおける薬理）
プレセニリン結合アッセイ
［３Ｈ］ （Ｒ）−４−（（Ｎ−（１−アミノ−４−メチル−１−オキソペンタン−２−イル）−４−クロロフェニルスルホンアミド）メチル）−Ｎ−（２−メトキシエチル）ベンズアミドにおける放射性リガンド置換アッセイは、［３Ｈ］ （２Ｒ，３Ｓ）−２−イソブチル−Ｎ１−（（Ｓ）−２−オキソ−１−（３−フェノキシベンジル）アゼパン−３−イル）−３−プロピルスクシンアミド（ＲＥ９８７、化合物Ａ［Seiffert, D. et al., 「Presenilin-1 and -2 are molecular targets for γ-secretase inhibitors」, J. Biol. Chem., 275(44):34086-34091 (2000)］）に関して先に記述された方法を用いて行われた。［３Ｈ］ （Ｒ）−４−（（Ｎ−（１−アミノ−４−メチル−１−オキソペンタン−２−イル）−４−クロロフェニルスルホンアミド）メチル）−Ｎ−（２−メトキシエチル）ベンズアミドがγ−セクレターゼに結合することを確認するためにいくつかの実験を行った。第１に、［３Ｈ］ （Ｒ）−４−（（Ｎ−（１−アミノ−４−メチル−１−オキソペンタン−２−イル）−４−クロロフェニルスルホンアミド）メチル）−Ｎ−（２−メトキシエチル）ベンズアミドの、野生型およびＰＳ−１／ＰＳ−２ノックアウト線維芽細胞由来の膜への特異的な結合により、［３Ｈ］ （Ｒ）−４−（（Ｎ−（１−アミノ−４−メチル−１−オキソペンタン−２−イル）−４−クロロフェニルスルホンアミド）メチル）−Ｎ−（２−メトキシエチル）ベンズアミドがノックアウトではなく野生型線維芽細胞由来の膜に特異的に結合すること、およびその特異的なシグナルが構造的に異なるγ−セクレターゼ阻害剤により競合されることが示された。第２に、［３Ｈ］ （Ｒ）−４−（（Ｎ−（１−アミノ−４−メチル−１−オキソペンタン−２−イル）−４−クロロフェニルスルホンアミド）メチル）−Ｎ−（２−メトキシエチル）ベンズアミド結合の薬理を、いくつかのγ−セクレターゼ阻害剤を用いて調べた。これらの結果により、［３Ｈ］ （Ｒ）−４−（（Ｎ−（１−アミノ−４−メチル−１−オキソペンタン−２−イル）−４−クロロフェニルスルホンアミド）メチル）−Ｎ−（２−メトキシエチル）ベンズアミドのＴＨＰ−１膜への結合の置換は、前述の放射性リガンド置換アッセイおよび培養細胞におけるＡβ形成阻害を用いて測定されたγ−セクレターゼの能力とよく相関することが示された。
【００６３】
ＴＨＰ−１細胞を、Ｌ−グルタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）および１０μＭ  β−メルカプトエタノールを含んだＲＰＭＩ １６４０中における撹拌培養により、細胞密度５ｘ１０５／ｍＬに増殖させた。遠心により細胞を回収し、２ｘ１０８個の細胞を含んだペレットをドライアイス／エタノールで急速冷凍し、使用まで−７０℃で保存した。アッセイ日に、細胞を、２ｘ１０８／１０ｍＬホモジナイズバッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、１０４μＭ  ４−（２−アミノエチル） ベンゼンスルホニルフルオリドヒドロクロリド、８０ｎＭ  アプロチニン、２μＭ  ロイペプチン、４μＭ  ベスタチン、１．５μＭ  ペプスタチンＡならびに１．４μＭ  Ｅ−６４（０．１％プロテアーゼ阻害剤カクテルＰ８３４０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州））の濃度に４℃で解凍した。細胞をＰｏｌｙｔｒｏｎ（Ｂｒｉｎｋｍａｎ、ウェストベリー、ニューヨーク州）を用いて１８，０００ｒｐｍ、１５秒間ホモジナイズし、Ｓｏｒｖａｌ ＲＣ５Ｂ遠心機を用いて１８，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心した。得られたペレットを４℃でバッファーに再懸濁し、総タンパク濃度５ｍｇ／ｍＬとした。結合アッセイに使用するために、細胞ホモジネートを、アッセイバッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、０．１％  ＣＨＡＰＳＯ）で濃度３００μｇ／ｍＬに希釈した。アッセイはポリプロピレン９６−ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）内で２００μＬの細胞ホモジネートを５０μＬのアッセイバッファー（０．７５ｎＭ  放射性リガンド(［３Ｈ］ （Ｒ）−４−（（Ｎ−（１−アミノ−４−メチル−１−オキソペンタン−２−イル）−４−クロロフェニルスルホンアミド）メチル）−Ｎ−（２−メトキシエチル）ベンズアミド、１１０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および様々な濃度の非標識化合物を含む）に添加することにより開始され、３７℃で１時間インキュベートした。最終的なＤＭＳＯ濃度は１％とした。Ｉｎｎｏｔｅｃｈセルハーベスターを用い、ＧＦＦグラスファイバーフィルター（Ｉｎｎｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ランシング、ミシガン州）で濾過することにより、遊離放射リガンドから結合放射リガンドを分離した。フィルターを４℃でウェルあたり０．３ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．０）で３回洗浄し、放射活性をＷａｌｌａｃ １４５０ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ液体シンチレーションカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ボストン、マサチューセッツ州）で計測した。競合化合物のＫｉ値は、ＸＬｆｉｔ（ＩＤＢＳ、ギルドフォード、イギリス）を用いて算出したＩＣ５０値のＣｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｓｏｆｆ補正により得た。
【００６４】
上記の放射性リガンド結合アッセイをγ−セクレターゼ複合体のプレセニリンの標的部位への化合物の親和性の測定に用いた。（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドはＴＨＰ−１膜における［３Ｈ］ （Ｒ）−４−（（Ｎ−（１−アミノ−４−メチル−１−オキソペンタン−２−イル）−４−クロロフェニルスルホンアミド）メチル）−Ｎ−（２−メトキシエチル）ベンズアミドのプレセニリンへの結合の濃度依存的な阻害を引き起こした。多数の実験を解析した結果、Ｋｉ＝０．４８ｎＭ±０．２４ｎＭ（平均±ＳＤ、ｎ＝８）を得た。
【００６５】
培養細胞におけるＡβ形成の阻害
Ｈ４  ＡＰＰ７５１  ＳＷＥクローン８．２０（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂで開発）およびスウェーデン変異型ＡＰＰ７５１を安定的に発現するＨ４神経膠腫細胞株を用いて、細胞における化合物のＡβ４０およびＡβ４２阻害について化合物のアッセイを行った。１：２０の希釈における継代を週２回行い、細胞を対数期に維持した。ＩＣ５０を決定するために、３０μＬの細胞（１．５ｘ１０４細胞／ウェル）を０．０１２５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａ８４１２）含有ＤＭＥＭ培地において、０．１μＬのＤＭＳＯにより段階希釈された化合物を含む３８４−ウェルの化合物プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３７０９）に直接播種した。次いで、５％ＣＯ２、３７℃において１９時間インキュベートし、プレートを簡単に遠心した（１０００ｒｐｍ、５分間）。Ａβ４０を測定するために、各ウェルから１０μＬのアリコートを第２のアッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ ３７０９）に移した。抗体カクテルを４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４、０．２％ＢＳＡ）に新しく希釈することにより調製し、アッセイプレートに加えた。Ａβ４２の測定用には、Ａβ４２ネオエピトープ特異的抗体（５６５、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂで開発；Ｗａｌｌａｃ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）とコンジュゲート）およびＡβのＮ−末端配列特異的抗体(２６Ｄ６、ＳＩＢＩＡ／Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂで開発；ＡＰＣ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）とコンジュゲート）を混合し、２０μＬの混合物をインキュベートした細胞プレートの各ウェルに加え、最終濃度を０．８ｎｇ／ウェル（５６５）および７５ｎｇ／ウェル（２６Ｄ６）とした。Ａβ４０を測定用には、Ａβ４０ネオエピトープ特異的抗体（ＴＳＤ、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂで開発；Ｗａｌｌａｃ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）とコンジュゲート）および上記の２６Ｄ６を混合し、２０μＬの混合物を先に細胞プレートから採取した１０μＬのアリコートに加え、最終濃度を１．６ｎｇ／ウェル（ＴＳＤ）および１７．５ｎｇ／ウェル（２６Ｄ６）とした。抗体を含むアッセイプレートをアルミホイルで密閉し、終夜４℃でインキュベートした。シグナルはＶｉｅｗｌｕｘカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて測定し、ＩＣ５０値はＣｕｒｖｅＭａｓｔｅｒ（Ｅｘｃｅｌフィットに基づく）によるカーブフィッティングを用いて決定した。
【００６６】
（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドはＨ４−８Ｓｗ細胞においてＡβ４０およびＡβ４２の形成を強力に阻害した。多数の実験を解析することにより、Ａβ４０阻害においてＩＣ５０＝０．３０±０．１５ｎＭ（平均±ＳＤ、ｎ＝５０）、Ａβ４２阻害においてＩＣ５０＝０．２７±０．１２ｎＭ（平均±ＳＤ、ｎ＝４５）を得た。
【００６７】
培養細胞におけるＮｏｔｃｈシグナリングの阻害
γ−セクレターゼは膜貫通受容体であるＮｏｔｃｈファミリーによるシグナリングに必要である。Ｎｏｔｃｈシグナリングの阻害は望ましくない、メカニズムに基づく副作用を引き起こすため、Ｎｏｔｃｈ１−ΔＥシグナリングの細胞アッセイをγ−セクレターゼ阻害剤のカウンタースクリーニングに用いた。
【００６８】
マウスＮｏｔｃｈ１発現コンストラクトを一般的な分子生物学的手法を用いてＰＣＲにより作成し、シークエンスにより確認した。このコンストラクトは、ｐＣＤＮＡ３．１＋Ｈｙｇベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、Ｎ−末端側に２０アミノ酸のシグナル配列およびＣ−末端側に７Ｘ  ｍｙｃタグを含むように改変して作成した。シグナル配列はマウスＮｏｔｃｈ１に由来し、７Ｘ  ｍｙｃ−タグは重複するプライマーを用いて作製し、ｐＣＤＮＡ３．１＋ＨｙｇベクターのＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩサイトにサブクローニングした。
【００６９】
マウスＮｏｔｃｈ１−ΔＥコンストラクトはマウスＮｏｔｃｈ１シグナル配列、および内部翻訳開始を抑制するために膜貫通部位にＭ１７２７Ｖ変異を含む。アミノ酸１７０４から２１９３のマウスＮｏｔｃｈ１−ΔＥをコードする配列をＭｏｕｓｅ Ｓｐｌｅｅｎ Ｑｕｉｃｋ Ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から単離し、７Ｘ ｍｙｃ−タグおよびシグナル配列を含む改変ベクターにＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩ断片としてサブクローニングした。
【００７０】
Ｈｅｌａ細胞を１０％ＦＢＳ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）および２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を含むＤＭＥＭ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）で維持した。ＴｒａｎｓＩＴ−ＨｅｌａＭＯＮＳＴＥＲ  （Ｍｉｒｕｓ）を製造者の指示に従って用い、細胞を過渡的にトランスフェクションした。Ｈｅｌａ細胞（ＡＴＣＣ）をトランスフェクションの１６時間前に密度４ｘ１０６細胞／Ｔ１７５フラスコでＨｅｌａ増殖培地（ＤＭＥＭ（高グルコース、ＨＥＰＥＳ含有）、グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンおよび１０％ウシ胎児血清を含む）を用いて播種した。増殖培地中で：６μｇマウスＮｏｔｃｈ１−ΔＥプラスミド、１５．６μｇ担体プラスミド（ｐＣＤＮＡ３．１＋ｈｙｇ）、１４．４μｇＣＢＦ１プラスミド（ルシフェラーゼレポーター）をＨｅｌａＭｏｎｓｔｅｒ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ （Ｍｉｒｕｓ）を用いて細胞にトランスフェクションした。ＣＢＦ１−ルシフェラーゼレポーターコンストラクトは、ＳＶ４０プロモーター（ｐＧＬ３−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ、Ｐｒｏｍｅｇａ）の上流のＣＢＦ１結合エレメントの４Ｘコピーからなる。ＣＢＦ１−ルシフェラーゼレポーターは、重複するプライマーを用いて４Ｘ ＣＢＦ１結合領域を作り、作製された。この断片をｐＧＬ３−ＰｒｏｍｏｔｅｒコンストラクトのＮｈｅＩ／ＢｇｌＩＩサイトにサブクローニングした。このコンストラクトの完全性はシークエンスにより確認した。ＤＮＡストックをＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）でトランスフェクション用に希釈した。ＤＮＡ添加から５から６時間後、細胞をトリプシン−ＥＤＴＡでフラスコから取り除き、規定の培地（ＤＭＥＭ（高グルコース、ＨＥＰＥＳ含有）、グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、０．０１２５％ウシ血清アルブミンおよび非必須アミノ酸含有）で５ｘ１０４細胞／ｍＬとなるよう懸濁した。細胞を９６ウェル黒色Ｃｌｅａｒｖｉｅｗプレート（Ｐａｃｋａｒｄ）に体積２００μＬ／ウェル（１ｘ１０４細胞）で播種し、３７℃で１．５時間インキュベートして細胞をプレートに接着させた。試験化合物を、まず９６ウェルポリプロピレンプレートに１００％ＤＭＳＯで希釈した。次いで、ＤＭＳＯ化合物ストックを規定の培地を含むプレートに移すことにより４７．６倍に希釈し、ＤＭＳＯ濃度を２．１％とした。希釈された化合物溶液（１０μＬ）を細胞プレートに加え、最終的なＤＭＳＯ濃度を０．１％とした。化合物を含む細胞プレートを３７℃で終夜インキュベートした。この終夜のインキュベーションに続き、培地を静かに除去し、２５μＬのリン酸緩衝生理食塩水（カルシウムおよびマグネシウムを含む）を各ウェルに加えた。Ｌｕｃ−Ｓｃｒｅｅｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）試薬ＡおよびＢを等量混合し、５０μＬの混合物を各ウェルに加えた。プレートを室温で１０分間インキュベートし、黒色の裏当てをプレートの底に取り付け、シグナルをＴｏｐＣｏｕｎｔ（Ｐａｃｋａｒｄ）で測定した。非線形回帰を用いて濃度応答曲線をフィットし、ＩＣ５０値を決定した。
【００７１】
γ−セクレターゼは膜貫通受容体であるＮｏｔｃｈファミリーによるシグナリングに必要である。Ｎｏｔｃｈシグナリングの阻害は望ましくない、メカニズムに基づく副作用を引き起こすため、上記のＮｏｔｃｈ１−ΔＥシグナリングの細胞アッセイをγ−セクレターゼ阻害剤のカウンタースクリーニングに用いた。（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドによるＮｏｔｃｈ１−ΔＥシグナリングの阻害に関する多数の実験を解析した結果、ＩＣ５０＝５８±２３ｎＭ（平均±ＳＤ、ｎ＝５８）を得た。
【００７２】
細胞におけるＡβ４０阻害能（０．３ｎＭ）およびＮｏｔｃｈ阻害能（５８ｎＭ）に基き、（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドのＮｏｔｃｈ／ＡＰＰ選択性は１９３Ｘ（９５％ＣＩ＝１６３−２３２）であった。
【００７３】
（インビボにおける薬理）
ＡβＥＬＩＳＡ
サンドウィッチＥＬＩＳＡアッセイを用いて動物からのＡβ種を測定した。個々の抗体のエピトープの詳細が検出するＡβ種を決定するため、これらのアッセイに関する簡単な考察を本明細書中に記載する。マウスおよびラットのＡβはヒトＡβとは異なる共通のＡβ配列を共有する。これらの配列の違いにより、ヒトＡβのＮ−末端領域を認識する抗体、例えば２６Ｄ６はげっ歯類のＡβには弱く結合する。同様に、げっ歯類Ａβと強固に結合する抗体、例えば２５２はヒトＡβには弱く結合する。げっ歯類Ａβ４０を測定するため、２つのアッセイ：２５２−ＴＳＤおよび４Ｇ８−ＴＳＤを開発した。ＴＳＤ−４Ｇ８アッセイはＡβ４０だけではなく、他のＢＡＣＥ−γ−セクレターゼ切断産物（Ａβ１１−４０）およびα−セクレターゼ−γ−セクレターゼ切断産物（Ｐ３）も測定することができる。表１に、本出願に示されるアッセイおよびその使用をまとめる。
【表１】
2012520875.tif 000009
【００７４】
これらの各アッセイはいくつかの方法を用いて検証された。第１に、様々な量の合成Ａβを生体マトリックスに添加し、シグナルの増大をバッファー溶液中の合成Ａβで得られたものと比較した。第２に、抗−Ａβ抗体により、生体サンプル中のＡβを枯渇させた。第３に、高用量のγ−セクレターゼ阻害剤を投与した動物からのサンプルをアッセイした。有効なアッセイにおいて、外因性Ａβ（＞８０％回収）が効果的に検出され、Ａβ免疫枯渇後のシグナルは大幅に減少し（非特異的コントロールに比べて＞８０％減少）、高用量のγ−セクレターゼ阻害剤を投与した動物からのサンプルを用いた場合、シグナルはアッセイ下限に到達または重複する値にまで減少した。最適化され有効なＡβアッセイは、依然として、抗−Ａβ抗体またはγ−セクレターゼ阻害剤で枯渇できなかった少量のシグナル（ベヒクルコントロールの５−２０％）を含んでいた。このシグナルはＡβではないと考えられ、故にこれがアッセイ下限と考えられる。このアッセイ下限はいずれのＡβ測定の補正にも用いず、報告する値は実際のＡβ阻害を過小評価していると考えられる。
【００７５】
Ａβ４０をインビボにおけるＡβ４２の代替物として用いた。生体サンプルにおいてＡβ４０はＡβ４２の約１０倍豊富である。（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドおよび別のγ−セクレターゼ阻害剤によりＡβ４０およびＡβ４２が同様に阻害された培養細胞の実験に基づくと、Ａβ４０はＡβ４２の優れた代替物である。
【００７６】
（ラットの研究）
生体内
メスＨａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（〜２００−２５０ｇ）に、毎朝、９９％ ＰＥＧ−４００、１％ Ｔｗｅｅｎ−８０（４ｍＬ／ｋｇ）を投与媒体として強制経口投与した。投与溶液は、実験開始時に一度に作製した。化合物の投与溶液への溶解には、５６℃における加熱および超音波処理を用いた。全ての過程は、ＡＣＵＣガイドラインに準拠して行われた。末梢血液サンプルは、ＣＯ２による安楽死後の心穿刺により採取し、ＥＤＴＡチューブに回収した。遠心後、血漿を得た。脳組織を解剖し、重量を測定し、解析までドライアイスにより凍結した。ＣＳＦサンプルを遠心して細胞または組織片を除去し、４％ ＢＳＡにより１：２で希釈し、続く解析用に凍結した。病理組織学的サンプルは中性緩衝ホルマリンに浸し、その後加工した。使用するために集めたサンプルは、包埋用マトリックスでコートし、２−メチルブタン浴中−２５℃から−３０℃で凍結し、次いでドライアイスで凍結した。生体血漿サンプルは後眼窩採血により採取した。
【００７７】
脳Ａβ４０アッセイ
ポリトロンを用い、４ｍＬ／ｇのＰＢＳ（ｐＨ７．８、２％  ＣＨＡＰＳ、ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（Ｒｏｃｈｅ））によりラット脳（半脳）をホモジナイズした。大きな組織片を２０，８００ ｘ ｇで３０分間遠心することにより除去し、得られた上清をＰＢＳ（２．５％  ＢＳＡ）で１：２に希釈した。Ｗｈｉｔｅ Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅ ＩＩ ＥＬＩＳＡ プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）を５０μｇ／ｍＬ  ＴＳＤ９Ｓ３．２抗体／ＰＢＳで１時間、３７℃でインキュベートした。プレートを２００μＬの５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；重量／体積、ＰＢＳにより調製）で、２時間、室温、プレートシェーカー上でブロッキングし、５００μＬ／ウェルのＰＢＳ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で５回洗浄した。精製した脳ホモジネートを５０μＬ／ウェル、６組でロードし、室温で１時間インキュベートした。プレートを先ほどと同様に洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−コンジュゲート  ２５２抗体（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）（ＰＢＳ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、０．１％  ＢＳＡ）により１：２０００で希釈）で１時間インキュベートした。３組は２５２−ＨＲＰ抗体のみ、３組は２５２−ＨＲＰ抗体と１μｇ／ｍＬのラットＡβ１−１４（Ａｎａｓｐｅｃ）（特異的に結合する抗体と競合する）を含む；このバックグランドのシグナルを総シグナルから差し引き、特異的なシグナルを得た。結合した２５２−ＨＲＰ抗体はＰｉｅｒｃｅ Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ基質を１０分間用いて検出し、Ｐａｃｋａｒｄ ＴｏｐＣｏｕｎｔで定量した。サンプルは各プレートに設置した脳ホモジネートの基準によりノーマライズした。Ａβ４０標準曲線によると、ＬＬＱは１０ｐｇ／ｍＬ、ＬＬＤは２０ｐｇ／ｇ組織であった。
【００７８】
血漿Ａβ４０アッセイ
プレートをＴＳＤ抗体でコートし、脳Ａβ４０アッセイと同様に洗浄した。血漿サンプルをＰＢＳバッファー（ｐＨ７．８、０．２５％  ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、２．５％  ＢＳＡ）で１：３に希釈した。サンプルを５０μＬ／ウェルで６組にロードし、室温で１−２時間インキュベートした。サンプルは１時間、４Ｇ８−ビオチン（Ｓｉｇｎｅｔ）（ＰＢＳ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、０．１％  ＢＳＡ）で１：８０００に希釈）を用いて検出した。３組は４Ｇ８−ビオチン抗体のみ、３組は４Ｇ８−ビオチン抗体および１μｇ／ｍＬのＡβ１７−２４（特異的なシグナルと競合するため、各サンプルのバックグランド値となる）を含む。上記と同様にして洗浄し、プレートをストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｚｙｍｅｄ）（ＰＢＳ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、０．１％  ＢＳＡ）で１：５０，０００に希釈）で１０分間インキュベートした。検出および定量は脳Ａβ４０アッセイと同様に行った。サンプルは各プレートに設定された血漿の基準でノーマライズした。Ａβ４０標準曲線によると、ＬＬＱは７．５ｐｇ／ｍＬ、ＬＬＤは２３ｐｇ／ｍＬ血漿であった。
【００７９】
ＣＳＦＡβ４０アッセイ
プレートをＴＳＤ抗体でコートし、脳Ａβ４０アッセイと同様に洗浄した。ＣＳＦサンプルをＰＢＳ（ｐＨ７．８、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で１：１０に希釈した。採取時、ＣＳＦは先に４％ ＢＳＡ／水で１：２に希釈された。サンプルを３組、５０μＬ／ウェルでロードし、室温で１−２時間インキュベートした。サンプルは、１時間、４Ｇ８−ビオチン（Ｓｉｇｎｅｔ）（ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、０．１％  ＢＳＡで１：８０００に希釈）を用いて検出した。バックグランドが低かったため、このアッセイにおいては、競合ペプチドを用いた複製サンプルの測定は必要なかった。結合した４Ｇ８−ＨＲＰは血漿Ａβ４０アッセイと同様にして検出、定量した。サンプルは各プレートに設置されたＣＳＦの基準によりノーマライズした。Ａβ４０標準曲線によると、ＬＬＱは２０ｐｇ／ｍＬ、ＬＬＤは４００ｐｇ／ｍＬ  ＣＳＦであった。
【００８０】
γ−セクレターゼサイト占有率
クリオスタットにより２０μｍの厚さで脳切片を冠状に切り、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓスライド上に解凍した。切片は、吻側の海馬で、スライドあたり３つの切片を約１２０μｍの間隔で作製し、使用まで−２０℃で凍結した。占有率を求める実験用に、脳切片を室温に昇温し、乾燥し、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）中で１０分間インキュベートし、次いで１．５ｎＭ  ［３Ｈ］ＩＮ９７３（Goldstein, M.E. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 323:102-108 (2007)）または［３Ｈ］  （Ｒ）−４−（（Ｎ−（１−アミノ−４−メチル−１−オキソペンタン−２−イル）−４−クロロフェニルスルホンアミド）メチル）−Ｎ−（２−メトキシエチル）ベンズアミドを含む同じバッファー中に移し、室温で１０分間インキュベートした。非特異的結合を求めるため、隣接切片を［３Ｈ］  ＩＮ９７３または［３Ｈ］  （Ｒ）−４−（（Ｎ−（１−アミノ−４−メチル−１−オキソペンタン−２−イル）−４−クロロフェニルスルホンアミド）メチル）−Ｎ−（２−メトキシエチル）ベンズアミドを含むが、非標識γ−セクレターゼ阻害剤（０．５μＭ）を含むバッファー中でインキュベートした。インキュベート後、スライドを氷冷ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で２分間、３回洗浄し、氷冷蒸留水に浸漬し、冷たい空気を吹き出すファンにより乾燥した。スライドをトリチウム感受性ｐｈｏｓｐｈｏｒ ｓｔｏｒａｇｅ ｓｃｒｅｅｎｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、アーリントンハイツ、イリノイ州）に設置し、７日間暗所に曝した。イメージをＣｙｃｌｏｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒ ｓｃａｎｎｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ、メリデン、コネティカット州）およびＯｐｔｉＱｕａｎｔ取り込みならびに分析ソフトウェア（Ｐａｃｋａｒｄ）を用いてｐｈｏｓｐｈｏｒ ｓｔｏｒａｇｅ ｓｃｒｅｅｎｓから得た。関心領域における光学濃度（デジタル光単位／平方ミリメートルで表される）を測定し、ベヒクルコントロールのパーセントで表した。
【００８１】
病理組織学的方法
ＣＯ２窒息による安楽死後、近位十二指腸の長さ約３ｃｍの切片を腹部から取り出し、氷冷リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、切片化前に１０％緩衝ホルマリンに入れた。十二指腸の組織切片を液体パラフィンに包埋し、ブロックを形成し、３組の矢状（管腔−横断）環状切片に切り、顕微鏡観察の前に過ヨウ素酸−シッフ塩基方法で染色した。全ての動物は予定された死体解剖まで生存した。
【００８２】
急性ラット研究
（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドの単回投与（３０ｍｇ／ｋｇ）により、血漿Ａβ４０および脳内Ａβ４０量がベヒクルコントロールのそれぞれ２％および１６％まで顕著に減少した。（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドのラットにおける効果をさらに検証するため、（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドを１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、および１００ｍｇ／ｋｇで単回投与し、組織を２、５、８、１２、および２４時間後に、血漿Ａβ４０、脳Ａβ４０、およびγ−セクレターゼサイト占有率の測定用に採取した。これらの測定により、１０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇの投与は投与後２から２４時間後に、血漿Ａβ４０および脳Ａβ４０をベースラインＡβ４０値の２５％以下に減少させることが示された。対照的に、１ｍｇ／ｋｇの投与は脳Ａβ４０においては統計学的に有意な変化を引き起こさず、その代わりに血漿Ａβ４０において一時的な増加を引き起こした。特に、８時間後に血漿Ａβ４０は開始値の２５０％に増加し、２４時間までにベースラインに戻った。γ−セクレターゼサイト占有率により、１００ｍｇ／ｋｇの投与後の投与間隔を通じ、および１０ｍｇ／ｋｇ投与後の２４時間後（８８％）を除く全てのタイムポイントにおいて脳内の９４％以上のγ−セクレターゼ阻害剤結合部位が占有されていることが示された。対照的に、１ｍｇ／ｋｇ投与後２時間では７５％の脳内γ−セクレターゼ結合部位しか占有されておらず、サイト占有率は２４時間までに徐々にベースラインに回復した。
【００８３】
急性ラット研究の結果により、（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドが血漿Ａβ４０、脳Ａβ４０、およびＣＳＦ  Ａβ４０を１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇの間のＥＤ５０において減少させることが示された。
【００８４】
亜慢性ラット研究
先のセクションで述べた（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドのラット脳Ａβ４０に対する効果に基づき、ラットに毎日、３、１０、３０または１００ｍｇ／ｋｇ／日を投与した。３回目の投与から１２もしくは２４時間後、または４回目の投与から５時間後に動物を安楽死させた。表２に示すように、脳Ａβ４０  ＡＵＣの減少を同一グループ内の投与後５，１２または２４時間後の動物から得られた値の直線外挿法により推定した。この分析に基づくと、３ｍｇ／ｋｇ／日におけるＡβ４０  ＡＵＣの減少の平均は５３%であり、１０ｍｇ／ｋｇ／日またはそれ以上の投与量においては８５％以上に上昇した。実験開始および終了時の化合物ＡＵＣ値（０−２４時間）を推定するために化合物濃度を数回測定した。これらの値により、３回の投与後の化合物暴露量は最初の投与後に比べて２倍以内であることが示された。これらのラットからの十二指腸組織の病理組織学的解析により、１００ｍｇ／ｋｇ／日投与されたラットの１／３に軽度の障害があることが示された。
【表２】
2012520875.tif 000010
【００８５】
亜慢性ラット研究の結果から、（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドが消化管毒性無しに脳Ａβ４０を減少させることが示された。特に、消化管毒性の誘導に必要な１００ｍｇ／ｋｇ／日の投与に比べ、３ｍｇ／ｋｇ／日の投与により、脳Ａβ４０  ＡＵＣにおける約５０％の減少が引き起こされた。
【００８６】
１００ｍｇ／ｋｇ／日の（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドを１日１回４日間投与した高用量グループの１匹の動物（この投与量レベルで評価した動物の３匹に１匹）において、顕微鏡観察により軽度の杯細胞化生が起こっていることが示された。≦３０ｍｇ／ｋｇの（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドを投与された動物において、薬剤−関連の十二指腸における変化は見られなかった。
【００８７】
別の実験の１つにおいて、ラットに毎日３０ｍｇ／ｋｇ／日または３００ｍｇ／ｋｇ／日を４または７日間投与した（表３）。最終的な脳Ａβ４０量（投与５時間後）はベヒクルコントロールの１３％であり、（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドを用いた先のラット研究と同様であった。化合物の血漿濃度は、１回目および４回目の投与の５時間後において同様であった。３００ｍｇ／ｋｇ／日投与グループの何匹かのラット（５匹中４匹）は投与後４日後において消化管毒性を示したが、７日間投与した動物を含め、別の処理グループのラットにおいては見られなかった。
【表３】
2012520875.tif 000011
【００８８】
上記の結果により、（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドが強力かつ選択的なγ−セクレターゼ阻害剤であることが確認された。これらの結果は、（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドのアルツハイマー病、頭部外傷、外傷性脳損傷、ボクサー認知症、および／または他のβ−アミロイドペプチド関連の疾患における治療療法としての使用を支持する。
【００８９】
以下の実施例は説明のために提供され、いかなる形においても本発明を限定すると解釈されることはなく、それは本発明の精神の範囲内において本発明の改変が可能であるからである。
【００９０】
本発明の化合物は有機合成分野の当業者に周知の数多くの方法により製造可能である。本発明の化合物は、以下の方法、および有機化学合成の分野において周知の方法、または当業者により成されるそれらの変法により製造され得る。好ましい方法は、限定されないが、以下に記載する方法である。本明細書中に引用される全ての引用文献は、引用によりその全体をここに取り込むものとする。
【００９１】
化合物はこのセクションに記載される反応および技術を用いて製造されてもよい。反応は用いる試薬および原料にてきした溶媒中で行われ、行われる変換に適切なものである。また、以下に記載する合成方法の記載において、提案される全ての反応条件、例えば溶媒の選択、反応雰囲気、反応温度、実験期間およびワークアップ過程はその反応において標準的なものとして選択され、それは当業者に容易に認識されるべきであることは自明である。該分子の様々な位置に存在する官能基が提案される試薬および反応に準拠したものでなくてはならないことは、有機合成分野の当業者に理解されるべきである。該反応条件に準拠する置換基に対するかかる制限は当業者に容易に理解され、代わりの方法が用いられるはずである。
【００９２】
（具体的実施態様の説明）
以下の実施例において、全ての温度は摂氏で提供される。融点はＴｈｏｍａｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｕｎｉｍｅｌｔ毛細管融点装置で記録され、校正は行わなかった。プロトン磁気共鳴（１Ｈ ＮＭＲ）スペクトルはＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ３００、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ４００、またはＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ５００分光計で記録した。全てのスペクトルは示された溶媒中で決定され、化学シフトは内部標準テトラメチルシラン（ＴＭＳ）から低磁場へのδ単位で記録され、プロトン間結合定数はヘルツ（Ｈｚ）で記録される。多重度パターンを以下のように示す：ｓ、一重線；ｄ、二重線；ｔ、三重線；ｑ、四重線；ｍ、多重線；ｂｒ、ブロードなピーク；ｄｄ、二重の二重線；ｂｒ ｄ、ブロードな二重線；ｄｔ、二重の三重線；ｂｒ ｓ、ブロードな一重線;ｄｑ、二重の四重線。臭化カリウム（ＫＢｒ）または塩化ナトリウムフィルムを用いた赤外線（ＩＲ）スペクトルはポリスチレンフィルムの１６０１ｃｍ−１吸収にキャリブレートした４０００ｃｍ−１から４００ｃｍ−１のＪａｓｃｏ ＦＴ／ＩＲ−４１０またはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ２０００ ＦＴ−ＩＲ分光計を用いて決定し、波数（ｃｍ−１）で記録した。施光度［α］Ｄは、Ｒｕｄｏｌｐｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｕｔｏｐｏｌ ＩＶ旋光計を用い、示された溶媒中で測定した；濃度はｍｇ／ｍＬで記される。低解像度質量分析（ＭＳ）および見かけの分子（ＭＨ＋）または（Ｍ-Ｈ）＋はＦｉｎｎｅｇａｎ ＳＳＱ７０００で測定した。高解像度質量分析はＦｉｎｎｅｇａｎ ＭＡＴ９００で測定した。液体クロマトグラフィ（ＬＣ）／質量分析はＷａｔｅｒ Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＺＱに装着したＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣを用いて行った。
【００９３】
以下の略語を用いた：ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）；ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）；ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、Ｌｅｕ（ロイシン）；ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）；ＭＴＢＥ（メチル ｔｅｒｔ−ブチルエーテル）；ＤＡＳＴ（フッ化ジエチルアミノ硫黄）、ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィ）；ｒｔ（室温）；ａｑ．（水溶液）；ＡＰ（面積パーセント）。
【００９４】
製造Ａ
（Ｒ）−２−アミノ−５，５，５−トリフルオロペンタンアミド 塩酸塩
工程Ａ．４，４，４−トリフルオロブタナール
【化７】
2012520875.tif 000012
ジクロロメタン（４．２Ｌ）をメカニカルスターラーおよび冷却槽を備えた２０Ｌの四ツ口丸底フラスコに入れた。撹拌を開始し、反応混合物を０から−２℃に冷却した。４，４，４−トリフルオロブタノール（７５０．０ｇ）を入れ、反応混合物をさらに−５から−８℃に冷却した。ＴＥＭＰＯ；（２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ、フリーラジカル）（９．１５ｇ）を加え、その間温度を−５から−８℃に保った。臭化カリウム水溶液（６０ｇ／１．１７Ｌの水）を上の溶液に加え、温度を−５から−８℃に保った。ＮａＯＣｌ水溶液（８．８Ｌ、６−７重量％、炭酸水素ナトリウムによりｐＨ＝８．５に緩衝）を反応混合物に加え（注：発熱）、その間反応混合物の温度を５℃に保った。同様に、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）をＮａＯＣｌの代わりに酸化剤として用いることができる。添加を完了後、ジクロロメタン層を分離し、水層をジクロロメタン（１ｘ７５０ｍＬ）で洗浄した。ジクロロメタン層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を濾過し、４，４，４−トリフルオロブタナール溶液の濃度をＮＭＲにより決定した。表題化合物を含む溶液をさらに加工することなく直接次の工程に用いた。
1H NMR (CDCl3) (400 MHz) δ 2.30 - 2.50 (m, 2H, CH2-CF3), 2.70 - 2.80 (m, 2H, CH2-CHO), 9.8 (s, 1H, CHO).
【００９５】
工程Ｂ．５，５，５−トリフルオロ−２−（１−フェニルエチルアミノ）ペンタンニトリル（ジアステレオマー混合物）
【化８】
2012520875.tif 000013
Ｒ−α−メチルベンジルアミン（５２８．５ｇ）をメカニカルスターラーおよび冷却槽を備えた適切な容器に入れ、窒素ブランケット下に維持した。４，４，４−トリフルオロブチルアルデヒド溶液（工程Ａから、５５０ｇ）、次いでメタノール（３．３Ｌ）を入れた。次いで、反応混合物を約０から−３℃に冷却した。酢酸（氷酢酸、２６０ｍＬ）を滴下して加え、その間温度を０℃付近に保ち、次いでトリメチルシリルシアニド（５８１ｍＬ）を１５分間かけて加えた。同様に、シアン化ナトリウム（ＮａＣＮ）またはシアン化カリウムをシアニド源として用いることができる。反応混合物を２５から２７℃に昇温し、終夜撹拌した。反応の完了はＴＬＣで決定した。冷却した水（１０．０Ｌ）を反応混合物に入れ、反応混合物をジクロロメタン（１ｘ１０．０Ｌ）で抽出した。ジクロロメタン層を水（２ｘ１０．０Ｌ）、次いでブライン（１ｘ５．０Ｌ）で洗浄した。ジクロロメタン層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮し、表題のアミノニトリル（ジアステレオマー混合物）を粘稠性の液体として得、平均収率は９０％であった。
1H NMR (CDCl3) (400 MHz) δ 1.42 (d&m, 5H), 2.15 & 2.35 (two m, 1H each), 3.10 - 3.20 ( m, 1H), 4.10 - 4.15 (m,1H), 7.10 - 7.35 (m, 6H).
【００９６】
工程Ｃ．５，５，５−トリフルオロ−２−（１−フェニルエチルアミノ）ペンタンアミド（ジアステレオマー混合物）
【化９】
2012520875.tif 000014
メカニカルスターラーおよび冷却用の氷浴を備えた適切な容器内で、５，５，５−トリフルオロ−２−（１−フェニルエチルアミノ）ペンタンニトリル（工程Ｂからのジアステレオマーの粗混合物、１．１０ｋｇ）をジクロロメタン（５．５Ｌ）に溶解し、窒素ブランケット下に維持した。撹拌を開始し、反応混合物を０から−５℃に冷却した。濃硫酸（１．７５Ｌ）を上の混合物に温度を０℃以下に保ちながら１時間かけて滴下して加え；反応完了後に透明な溶液を得た。反応混合物の温度を２５から２７℃に昇温し、終夜撹拌した（１２−１４時間）。反応の完了はＨＰＬＣにより決定した。反応混合物を破砕した氷（〜１５．０ｋｇ）にゆっくりと注ぎ、アンモニア水（〜２５体積％）で中和した。水層を分離し、ジクロロメタン（２ｘ３．０Ｌ）で抽出した。ジクロロメタン層を合わせ、水（１ｘ１２．０Ｌ）、次いでブライン（１ｘ３．０Ｌ）で洗浄した。生成物に富んだ有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮し、０．８５ｋｇ（７２．０％）の粗表題化合物を得た。
1H NMR (CDCl3) (400 MHz)  (Mixture of diastereomers) δ 1.36 (d&m, 4H, CH3 (J = 8.0 Hz &  1H of CH2), 1.90 (m, 1H of CH2), 2.15 & 2.35 (two m, 1H each of CH2-CF3), 2.80 - 2.90 ( m, 1H, CH-Ph), 3.60 - 3.70 (m,1H,  (CONH2)CH(NH), 5.90 & 6.45 (1H each of CONH2 with minor peaks for other diastereomer), 7.20 - 7.40 (m, 6H, Ar + NH).
【００９７】
工程Ｄ．（Ｒ）−５，５，５−トリフルオロ−２−（（Ｒ）−１−フェニルエチルアミノ）ペンタンアミド 塩酸塩
【化１０】
2012520875.tif 000015
５，５，５−トリフルオロ−２−（１−フェニルエチルアミノ）ペンタンアミド（ジアステレオマー混合物）（８５０ｇ）をメカニカルスターラーおよび冷却槽を備えた適切な容器に入れた。メタノール（２．５５Ｌ）、酢酸エチル（１．７Ｌ）および水（１．０６Ｌ）を入れ、反応混合物を０から５℃に冷却した。ＨＣｌのジオキサン溶液（４．５Ｍ、１．７２Ｌ）を３０から４５分間かけて滴下して加えた。同様に、イソプロパノールおよびメチル ｔｅｒｔ−ブチルエーテルの混合物を溶媒として、ＨＣｌ水溶液または濃ＨＣｌをＨＣｌ源として用いることができる。次いで反応混合物の温度を２５から２７℃に昇温し、２時間撹拌した。反応の完了はＴＬＣで決定した。沈殿した固形物を濾過し、該ケーキを適切な溶媒、例えば酢酸エチル（１．８Ｌ）、次いで石油エーテル（２．５Ｌ）、またはイソプロパノールおよびメチル ｔｅｒｔ−ブチルエーテルの混合物で洗浄した。固形物をオープントレイ上において周囲温度で乾燥し、表題Ｒ−アミノアミド（４８０ｇ、収率５０％、ジアステレオマー過剰率＝９９．９％）を得た。
1H NMR (CDCl3) (400 MHz) δ 1.73 (d, 3H, CH3, J = 8.0 Hz), 2.08 - 2.09 (m, 2H of CH2), 2.20 - 2.40 (m, 2H, CH2-CF3), 3.50 - 3.55 ( m, 1H, CH-Ph), 4.40 - 4.41 (m,1H, -(CONH2)CH(NH), 7.48 - 7.53 (br s, 5H, Ar).
【００９８】
工程Ｅ．（Ｒ）−２−アミノ−５，５，５−トリフルオロペンタンアミド 塩酸塩
【化１１】
2012520875.tif 000016
（Ｒ）−５，５，５−トリフルオロ−２−（（Ｒ）−１−フェニルエチルアミノ）−ペンタンアミド 塩酸塩（１．５０ｋｇ）をメタノール（１５．０Ｌ）と共に適切な圧力容器に入れた。次いで、水（７０１．０ｍＬ）、これに次いで２０％水酸化パラジウム／炭素（２２５ｇ）を加えた。同様に、パラジウム炭素（Ｐｄ／Ｃ）を水素化触媒として用いることができる。容器に窒素を３回フラッシュし、次いで容器に水素ガスを６０℃で加圧して注入した（３−４  ｋｇ／ｃｍ２）。反応の完了はＨＰＬＣでモニターした。完了の際、反応混合物を３０−３５℃に冷却し、ＣＥＬＩＴＥ（登録商標）パッドを通して濾過し、次いでメタノールで洗浄した。次いで、濾液を減圧濃縮した。濃縮完了後、残った反応混合物をジクロロメタン（２．５Ｌ／洗浄）で処理し、濾過し、４５℃で１２時間乾燥し、表題化合物（９１５ｇ、９１．０％；純度＝９７％）を得た。
1H NMR (DMSO-d6) (400 MHz) δ 2.00 (m, 2H, CH2), 2.30 - 2.40 (m, 2H of CH2-CF3), 3.85 - 3.88 (m,1H, -(CONH2)CH(NH), 7.64 & 8.11 (br s, 1H, each of CONH2), 8.44 (br s, 3H, NH3+).  13C NMR (DMSO-d6) (100.0 MHz) δ 169.57, 131.20, 128.45, 125.71, 122.97, 50.91, 29.46, 29.18, 28.89, 28.61, 23.56, 23.53.
【００９９】
製造Ｂ
（Ｒ）−５，５，５−トリフルオロノルバリン
方法Ａ．Ｒ−トランスアミナーゼ（ＢｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃｓおよびＢＭＳトランスアミナーゼ）
５，５，５−トリフルオロ−２−オキソペンタン酸（１００ｍｇ、０．５８８ｍｍｏｌ）、Ｒ，Ｓ−アラニン（２００ｍｇ、２．２４４ｍｍｏｌ）、および０．０２ｍＭ  ピリドキサールリン酸を含む０．１Ｍ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）溶液をＢｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃｓからのＲ−トランスアミナーゼＡＴ−１０３（５ｍｇ、４４ユニット）、またはバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis） ＳＣ１６５６９からクローン化されたＲ−トランスアミナーゼ（０．５ｍＬ、１０ユニット、ＢＭＳトランスアミナーゼ）と共に、１５ｍＬのチューブ中５ｍＬの総体積において３０℃で４４時間インキュベートした。（Ｒ）−５，５，５−トリフルオロ−２−アミノペンタン酸の反応収率は、ＡＴ−１０３およびＢＭＳトランスアミナーゼについてそれぞれ４９％および４８％であった。両ケースにおいて、ｅｅは１００％であった。
【０１００】
ピルビン酸を乳酸に還元する補助酵素を加えることにより、収率は上昇した。乳酸脱水素酵素は補因子としてＮＡＤＨを必要とする。ＮＡＤＨは葉酸脱水素酵素を用いることで再生された。５，５，５−トリフルオロ−２−オキソペンタン酸（１００ｍｇ、０．５８８ｍｍｏｌ）、Ｄ，Ｌ−アラニン（２００ｍｇ、２．２４４ｍｍｏｌ）、０．０２ｍＭ  リン酸ピリドキサール、ギ酸ナトリウム（６８ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、ＮＡＤ（３．３１ｍｇ、５μｍｏｌ）、ウサギの筋肉からクローニングしたＬ−乳酸脱水素酵素（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃｓ  ＬＤＨ−１０３、０．１０７ｍｇ、１５ユニット）、および葉酸脱水素酵素（０．５ｍＬ、１５ユニット、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）からクローニングし、大腸菌（Escherichia coli）で発現）を含む０．１Ｍ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）溶液をＢｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃｓからのＲ−トランスアミナーゼ  ＡＴ−１０３（５ｍｇ、４４ユニット）またはバチルス・チューリンゲンシスからのＲ−トランスアミナーゼ  ＳＣ１６５６９（０．５ｍＬ、１０ユニット）と共に、１５ｍＬのチューブ中５ｍＬの総体積において３０℃でインキュベートした。（Ｒ）−５，５，５−トリフルオロ−２−アミノペンタン酸の反応収率は、ＡＴ−１０３およびＢＭＳトランスアミナーゼについてそれぞれ９４％および９１％であった。両ケースにおいて、ｅｅは１００％であった。
【０１０１】
方法Ｂ．（Ｒ）−アミノ酸脱水素酵素（ＢｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃｓおよびＢＭＳ）
手順１：５，５，５−トリフルオロ−２−オキソペンタン酸（６０．００ｇ、０．３５３ｍｏｌ）、ＮＨ４Ｃｌ（６４．１９ｇ、１．２ｍｏｌ）、グルコース（８６．４ｇ、０．４７９ｍｏｌ）および水（９７５ｍＬ）を２-Ｌのジャケット付反応器に入れた。ＮａＯＨ（１０Ｎを３６ｍＬ）を加え、マグネットを用いて混合物を３０℃で撹拌し、固形物を溶解した。該ｐＨは約７であった。Ｎａ２ＣＯ３（１２．７２ｇ、０．１２ｍｏｌ）を加えてｐＨを約８．５にした。ＮＡＤＰ（４５８ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）、グルコース脱水素酵素（３３．７ｍｇ、５２７７ユニット、天野エンザイム株式会社から購入）、およびＲ−アミノ酸脱水素酵素（６００ｍｇ  Ｄ−ＡＡＤＨ−１０２、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃｓから）を、この順番で加えた。１０Ｎ  ＮａＯＨを滴下して反応混合物のｐＨを９に調整した。反応混合物を３０℃で撹拌し、ｐＨスタットから５Ｎ  ＮａＯＨを加えてｐＨを９．００に維持した。２１時間後、（Ｒ）−５，５，５−トリフルオロ−２−アミノペンタン酸の溶液収量は５１．１ｇ、収率８４．７％、１００％  ｅｅであった。
【０１０２】
手順２：５，５，５−トリフルオロ−２−オキソペンタン酸（６０．００ｇ、０．３５３ｍｏｌ）、ＮＨ４Ｃｌ（６４．１９ｇ、１．２ｍｏｌ）、グルコース（８６．４ｇ、０．４７９ｍｏｌ)および水（９７５ｍＬ）を２−Ｌのジャケット付反応器に入れた。ＮａＯＨ（１０Ｎを３６ｍＬ）を加え、マグネットを用いて混合物を３０℃で撹拌し、固形物を溶解した。該ｐＨは約７であった。Ｎａ２ＣＯ３（１２．７２ｇ、０．１２ｍｏｌ)を加えてｐＨを約８．５に調整した。ＮＡＤＰ（４５８ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ)、グルコース脱水素酵素（３３．７ｍｇ、５２７７ユニット、天野エンザイム株式会社から購入）、およびＤ−アミノ酸脱水素酵素（１５００ユニットを含む５０ｍＬの抽出物、ＢＭＳ酵素）をこの順番で添加した。１０Ｎ  ＮａＯＨを滴下することにより、反応混合物のｐＨを９に調整した。反応混合物を３０℃で撹拌し、ｐＨスタットから５Ｎ  ＮａＯＨを加えることによりｐＨを９に維持した。１５時間後、（Ｒ）−５，５，５−トリフルオロ−２−アミノペンタン酸の溶液収量は５１．０４ｇ、収率８４．６％、９９．１％  ｅｅであった。
【０１０３】
製造Ｃ
４−（ブロモメチル）−３−フルオロベンゾニトリル
【化１２】
2012520875.tif 000017
方法Ａ．ＮＢＳ／ＡＩＢＮブロム化
１,２−ジクロロエタン（１５１ｋｇ）を４−シアノ−２−フルオロトルエン（２４ｋｇ）およびＡＩＢＮ（２ｋｇ）と共に適切な容器に入れた。混合物を７０〜７４℃で加熱した。バッチ温度が７０℃に達したら、温度を７０〜７４℃に維持しながら（４７．４ｋｇ）を少量ずつ１２ｋｇ／時の速度で加えた（発熱反応を避けるため、添加速度を制御することが重要である）。２４ｋｇのＮ−ブロモスクシンイミドを添加後、混合物をＧＣ検出により検査し、反応の完了が観察されるまで反応混合物を７０−７４℃で加熱した。混合物を０−５℃に冷却し、さらに２時間おいた。混合物を濾過し、ケーキをＭＴＢＥ（２４ｋｇ）で洗浄した。濾液を水（３ｘ６５ｋｇ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム（１０．３ｋｇ）で６時間乾燥し、濾過し、ケーキをＭＴＢＥ（２４ｋｇ）で洗浄した。溶液を減圧下でエバポレートし、エタノール（１２ｋｇ）を加え、混合物を４０−４５℃で加熱し、次いでゆっくりと０−５℃に冷却し、この間、撹拌して結晶化させた。混合物を濾過し、ケーキを冷エタノール（５ｋｇ）で洗浄した。粗固形物を石油エーテルから再結晶化し、濾過し、石油エーテル（１０ｋｇ）で洗浄し、表題化合物４−（ブロモメチル）−３−フルオロベンゾニトリルを灰白色の固形物（２１ｋｇ、収率５５％）として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ ppm 4.46 - 4.50 (m, 2 H) 7.36 (dd, J=8.85, 1.32 Hz, 1H) 7.44 (dd, J=7.91, 1.32 Hz, 1 H) 7.52 (dd, J=7.91, 7.16 Hz, 1 H).  13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ ppm 23.65 (d, J=4.60 Hz, 1 C) 113.76 (d, J=9.77 Hz, 1 C) 117.09 (d, J=2.87 Hz, 1 C) 119.44 (d, J=24.71 Hz, 1 C) 128.44 (d, J=4.02 Hz, 1 C) 130.66 - 130.81 (s, 1 C) 130.81 - 131.06 (s, 1 C) 132.18 (d, J=3.45 Hz, 1 C) 159.86 (d, J=254.03 Hz, 1C).  IR:  (KBr) 3088, 3077, 3040, 2982, 2250, 1571, 1508, 1439, 1248 cm -1.  Anal. Calcd for C8H5BrFN: Calc.C,44.89; H, 2.35; N, 6.54; F, 8.88; Found: C, 44.94; H, 2.73; N, 6.56; F, 8.73.
【０１０４】
方法Ｂ．臭素酸ナトリウムブロム化
適切な反応器に、ジクロロメタン（４０Ｌ）および３−フルオロ−４−メチルベンゾニトリル（４ｋｇ、１８．７ｍｏｌ）、次いで臭素酸ナトリウムの水溶液（１３．４５ｋｇ、８９．１ｍｏｌを５３．６Ｌの水に溶解）を加えた。反応混合物を０−５℃に冷却した。亜硫酸水素ナトリウム溶液（９．２５ｋｇを４２Ｌの水に溶解）を２−３時間かけて加え、この間バッチ温度を１０−２０℃に保った（該反応は発熱性である）。添加完了後、２００Ｗのランプで反応器を照らし、バッチ温度を２５−３０℃に昇温した。ランプ照射および該温度をＨＰＬＣにより７０−７５％の生成物が確認されるまで続けた。ランプを取り外し、撹拌を停止し、反応液を１５分間安定させた。有機層を除去し、残った水層をジクロロメタンで２回抽出した。有機層を合わせ、次いで１０％チオ硫酸ナトリウム溶液で４回洗浄した。次いで、有機層をブライン（１０Ｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。有機層を濃縮し、石油エーテルを加え、２回蒸留して全てのジクロロメタンを除去した。石油エーテル（３Ｌ）を加え、スラリーを５−１０℃で１時間冷却した。該スラリーを濾過し、冷却した石油エーテルで洗浄した。該生成物を真空オーブン内において４０−４５℃で乾燥し、表題化合物（３．２kｇ、収率５０．４％）を灰白色の固形物として得た。
【０１０５】
母液から表題化合物を回収する代表的な方法：母液（３００ｇ）の濃縮から得られた粗物質（〜３６％、４−（ブロモメチル）−３−フルオロベンゾニトリルおよび〜５９％  ｇｅｍ−ジブロミド）および２当量のジイソプロピルエチルアミン（ｇｅｍ−ジブロミドに基づく）をアセトニトリル（３Ｌ）および水（５０ｍＬ）に溶解した。反応液を０−５℃に冷却し、亜リン酸ジエチル（１６９ｇ、１．２２ｍｏｌ）を３０分間かけて加えた（添加は発熱性であった）。反応液を０−５℃で６０−９０分間撹拌し、反応をＴＬＣでモニターした。ＴＬＣにおいてジブロミドが存在しなくなったら、水（３．３Ｌ）を加え、得られたスラリーを濾過した。濾過ケーキを水で洗浄し、真空オーブンで乾燥し（含水量が＜１％になるまで）、２０２ｇ（ＨＰＬＣによると９８  ＡＰ）のさらなる表題化合物を得た。
【０１０６】
製造Ｄ
３−フルオロ−Ｎ’−ヒドロキシ−４−メチルベンズイミドアミドの製造
メカニカルスターラーを備えた適切な容器に、窒素下において２０２．０ｇの３−フルオロ−４−メチルベンゾニトリル、次いで１．０Ｌのエタノールを入れた。ヒドロキシルアミン（１４４ｍＬ、５０％水溶液）を２０分間かけて滴下漏斗により加えた。ＨＰＬＣ分析により反応の完了が示されるまで（残存開始物質がなくなるまで）、混合物を周囲温度で撹拌した。水（３．０Ｌ）を淡黄色の溶液に１時間かけて滴下して加え、濃厚なスラリーを得た。スラリーを氷／水浴中２℃で１．５時間冷却し、濾過し、３５℃で２２時間減圧乾燥し、表題化合物（２３０．３ｇ、９１．６％）を白色の固形物として得た。
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 7.30 (m, 2H), 7.19 (m, 1H), 4.87 (s, 2H), 2.28 (s, 3H);  13C-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 162.15, 160.19, 151.58, 131.82, 131.76, 131.66, 131.62, 127.01, 126.87, 121.06, 112.69, 112.51, 14.48;  19F-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ-116.35, -116.37, -116.39.  LC-MS M+H169.19.
【０１０７】
製造Ｅ
３−（３−フルオロ−４−メチルフェニル）−１，２，４−オキサジアゾールの製造
方法Ａ．ボロントリフルオリド
クルードなアミドオキシム３−フルオロ−Ｎ’−ヒドロキシ−４−メチルベンズイミドアミド（１１８．６ｇ）およびオルトギ酸トリエチル（２９２ｍＬ、２６０ｇ、１．７６ｍｏｌ）をジクロロメタン（８００ｍＬ）でスラリーにし、ボロントリフルオリドジエチルエーテレート（１４．８ｍＬ、１６．６ｇ、０．１２ｍｏｌ）を室温で加えた。得られた黄色の溶液を４５℃で１時間加熱し、１６時間室温に維持し、ＨＰＬＣによると６０％が変換された。溶液を４５℃で２．５時間加熱し、〜１％の残存開始物質まで変換された。室温に冷却後、１Ｎ  ＨＣｌ（６００ｍＬ）を混合物に加えた。相を分離し、水相をジクロロメタン（２００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、２５℃で減圧乾燥し、白色の固形物を得た。高真空下で１６時間乾燥し、表題化合物（１０２．３ｇ、２工程で収率９８％）を得た。
【０１０８】
方法Ｂ．トリフルオロ酢酸
メカニカルスターラーを備えた適切な容器に、Ｎ２雰囲気下において３−フルオロ−Ｎ’−ヒドロキシ−４−メチルベンズイミドアミド（３０２．５２ｇ、１．７９ｍｏｌ）、オルトギ酸トリエチル（３８２．５ｍＬ、３４１．１ｇ、２．３ｍｏｌ）およびアセトニトリル（１５１２ｍＬ）を加えた。反応混合物を４５℃に加熱し、トリフルオロ酢酸（６．７２ｍＬ、１０．０８ｇ、８７．６ｍｍｏｌ）をこの温度で加えた。反応混合物を６０℃でさらに９０分間加熱し、室温に冷却した。水（３Ｌ）を６０分間かけて滴下して加えた。スラリーを４℃に冷却し、この温度で３０分間撹拌した。固形物を濾過し、５０℃で１２時間減圧乾燥し、３−（３−フルオロ−４−メチルフェニル）−１，２，４−オキサジアゾールを白色の固形物（３０６ｇ、９５．６%）として得た。ＨＰＬＣにより９９．８%の化学的純度であることが示された。
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.67 (s, 1H), 7.71 (m, 2H), 7.23 (t, J=8 HZ, 1H), 2.28 (s, 3H);  13C-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ166.9447, 164.7258, 162.5473, 160.1066, 132.0480, 132.0077, 128.5987, 122.9910, 122.9507, 114.2568, 114.0147, 14.6902. 19F-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ-115.94, -115.96.  Anal. Calcd for C9H7N2O: C, 60.67; H, 3.96; N, 15.72.  Found: C, 60.54; H, 3.78; N, 15.69.
【０１０９】
製造Ｆ
３−（４−（ブロモメチル）−３−フルオロフェニル）−１，２，４−オキサジアゾールの製造
方法Ａ．段階的ブロム化
３−（３−フルオロ−４−メチルフェニル）−１，２，４−オキサジアゾール（５．３４ｇ、３０ｍｍｏｌ）、ＣＣｌ４（５０ｍＬ）およびＮＢＳ（１１．７ｇ、６６ｍｍｏｌ）の撹拌した混合物にＡＩＢＮ（２４６ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を窒素下において８０℃で３時間加熱し、室温に冷却し、５０ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加えた。有機層を分離し、水層をジクロロメタン（５０ｍＬ）で抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、ロータリーエバポレーターで乾燥し、３−（４−（ジブロモメチル）−３−フルオロフェニル）−１，２，４−オキサジアゾール（９．３４ｇ、９３%）を白色の混合物として得、さらに精製することなく次に用いた。２００ｍＬの丸底フラスコに３−（４−（ジブロモメチル）−３−フルオロフェニル）−１，２，４−オキサジアゾール（８．３７ｇ、２５ｍｍｏｌ）およびＴＨＦ（６０ｍＬ）を入れた。混合物を０℃に冷却し、ジイソプロピルエチルアミン（３．４８ｇ、２７ｍｍｏｌ）を１５分間かけて滴下して加え、次いで亜リン酸ジエチル（３.７ｇ、２６．８ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で６０分間撹拌し、４０ｍＬの水でクエンチした。水層をエーテル（２ｘ８０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、２０ｍＬの飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液および２０ｍＬの飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮し、クルードな固形物を得、それを短いシリカパッドで精製し、３−（４−（ブロモメチル）−３−フルオロフェニル）−１，２，４−オキサジアゾール（６．０３ｇ、９４%）を得た。
融点８７．３℃。
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.80 (s, 1H), 7.94 (dd, 1H), 7.87 (dd, 1H), 7.58 (t, 1H), 4.57 (s, 2H); 13C-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 166.97, 166.95, 165.45, 162.29, 159.73, 132.34, 132.30, 128.99, 128.90, 128.81, 124.04, 124.01, 115.56, 115.32, 25.22, 25.18; 19F-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ -115.81, -115.84, -115.86. Anal. Calcd for C9H6BrFN2O: C, 42.05; H, 2.35; N, 10.90.  Found: C, 42.17; H, 2.17; N, 10.63.
【０１１０】
方法Ｂ．代替のワンポットブロム化
３−（３−フルオロ−４−メチルフェニル）−１，２，４−オキサジアゾール（１０１．８ｇ、０．５７ｍｏｌ）およびＮ−ブロモスクシンイミド（２０６ｇ、１．１６ｍｏｌ）をアセトニトリル（〜１Ｌ）に溶解し、アゾビスイソブチロニトリル（４．２ｇ、２６ｍｍｏｌ）を室温で加えた。混合物を７０℃で２時間加熱し、その時点でＨＰＬＣにより開始物質のモノブロミドおよびジブロミドへの変換が完了していることが示された。混合物を０℃に冷却し、ジイソプロピルエチルアミン（７３ｍＬ、５４．２ｇ、０．４２ｍｏｌ）を加え、この間反応温度を５℃以下に維持した。亜リン酸ジエチル（５４．７ｍＬ、５８．６ｇ、０．４２ｍｏｌ）をゆっくりと加え、反応混合物を室温に昇温した。２時間後、ＨＰＬＣによりジブロミドのモノブロミドへの変換が完了していることが示された。水（１．２Ｌ）を加え、生じた沈殿物を濾過した。水（２ｘ２００ｍＬ）で洗浄し、乾燥し、３−（４−（ブロモメチル）−３−フルオロフェニル）−１，２，４−オキサジアゾール（１３５ｇ、収率９２％）を得た。
【０１１１】
方法Ｃ：臭素酸ナトリウムブロム化（直接単離）
臭素酸ナトリウム（２．５４ｇ）を水（８．４ｍＬ）に溶解した。この溶液に３−（３−フルオロ−４−メチルフェニル）−１，２，４−オキサジアゾール（１．０ｇ）のＥｔＯＡｃ（１２ｍＬ）溶液を室温で加えた。ＮａＨＳＯ３（１．７５ｇ）の水（１７ｍＬ）溶液を滴下して加えた（注：発熱性）。混合物を室温で２時間撹拌し、低温室に終夜維持した。有機層を分離し、１０％Ｎａ２Ｓ２Ｏ３および水で洗浄し、次いで濃縮した。得られた固形物をＥｔＯＡｃ（〜６ｍＬ）に溶解した。ヘプタンをゆっくりと加えた（〜３０ｍＬ）。スラリーを室温で３時間撹拌し、次いで濾過した。固形物をヘプタン（１５ｍＬ）で洗浄し、乾燥し、０．７４ｇ（５１％）の表題化合物を得た：ＨＰＬＣ：９９．４２ＡＰ。第２のクロップの回収：濾液を〜３０ｍＬの体積まで濃縮し、得られたスラリーを濾過し表題化合物を白色の固形物０．２３（１６％）として得た（ＨＰＬＣ：９７．０９ＡＰ）。
【０１１２】
方法Ｄ：臭素酸ナトリウムブロム化（ジブロミドの還元を用いた２段階の製造方法）
３−（３−フルオロ−４−メチルフェニル）−１，２，４−オキサジアゾール（２０．０ｇ、１１２．２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２００ｍＬ）溶液をＮａＢｒＯ３（５０．８ｇ、３３６．７ｍｍｏｌ）の水（２００ｍＬ）溶液に室温で加えた。得られた２相の混合物を０℃に冷却した。ＮａＨＳＯ３（３５．７ｇ、３３６．７ｍｍｏｌ）の水（１６０ｍＬ）溶液を滴下して加え、バッチ温度を２０℃（〜１時間）に維持した。得られた赤色の溶液を室温で３−（３−フルオロ−４−メチルフェニル）−１，２，４−オキサジアゾールが１．０ＡＰ（ＨＰＬＣによる）になるまで（〜２時間）撹拌した。有機層（下層）を分離し、水層をジクロロメタン（２００ｍＬ）で抽出した。ジクロロメタン溶液を合わせ、１０％Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液（２００ｍＬ）、水（２００ｍＬ）および１５％ブライン（２００ｍＬ）で洗浄した。減圧濃縮後、白色の固形物（モノブロミドおよびジブロミドの混合物）が得られた。この固形物を湿ＭｅＣＮ（２００ｍＬ、ＫＦ：１．５−４％）に溶解し、溶液を−５℃から０℃で冷却した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６．０ｇ、８．１ｍＬ、４６．４ｍｍｏｌ）を加え、次いで亜リン酸ジエチル（６．０ｇ、４６．１ｍｍｏｌ）を１５分間かけて滴下して加えた。混合物を−５℃から０℃で、３−（４−（ジブロモメチル）−３−フルオロフェニル）−１，２，４−オキサジアゾールが＜０．５ＡＰになるまで（１．５−２時間）撹拌した。水（５００ｍＬ）を３０分間かけて加え、白色のスラリーを得た。このスラリーを室温で１−３時間撹拌し、次いで濾過した。ケーキを水（２Ｘ２００ｍＬ）で洗浄し、次いで４５℃で２０時間減圧乾燥した。
Anal. Calcd. for C9H6BrFN2O:  Calc. C, 42.05; H, 2.35; N, 10.89; Br, 31.08; F, 7.39.  Found: C, 42.10; H, 2.24; N, 10.90; Br, 31.18; F, 7.00.
【０１１３】
実施例１
（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミド
工程Ａ.５，５，５−トリフルオロ−２−（１−フェニルエチルアミノ）ペンタンニトリル
（Ｒ）−フェネチルアミン（９．６０ｇ、７９．４ｍｍｏｌ）および酢酸（５．０８ｇ、７９．６ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（１５０ｍＬ）溶液にＮａＣＮ（３．８８ｇ、７９．６ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を０℃に冷却し、４，４，４−トリフルオロブチルアルデヒド（１０．０ｇ、７９．６ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（５０ｍＬ）溶液を加えた。該反応液を室温に昇温し、２０時間撹拌した。反応液を水（４００ｍＬ）で希釈し、ＣＨ２Ｃｌ２（３ｘ３００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮し、アミノニトリル表題化合物（１８．１ｇ、８９％、ジアステレオマーの４：１混合物）を淡黄色の油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 7.38-7.27 (m, 5H), 4.15-4.02 (m, 1H), 3.69 (t, J = 7.5 Hz, 0.22H), 3.18 (t, J = 7.5 Hz, 0.78H), 2.48-2.26 (m, 1H), 2.25-2.03 (m, 1H), 2.01-1.86 (m, 2H), 1.39 (d, J = 6.5 Hz, 2.34H), 1.36 (d, J = 6.5 Hz, 0.66H); ESI MS m/z 257 [C13H15F3N2 + H].
【０１１４】
工程Ｂ．（Ｒ）−５，５，５−トリフルオロ−２−（（Ｒ）−１−フェニルエチルアミノ）ペンタンアミド 塩酸塩
５，５，５−トリフルオロ−２−（１−フェニルエチルアミノ）ペンタンニトリル（１８．０ｇ、７０．３１ｍｍｏｌ、ジアステレオマーの４：１混合物）のＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）溶液にＨ２ＳＯ４（１００ｍＬ）を加えた。反応液を室温で２２時間撹拌し、破砕した氷に注ぎ、ＮＨ４ＯＨで中和した。混合物をＥｔＯＡｃ（３ｘ５００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮し、表題化合物の遊離塩基をジアステレオマーの混合物（１８．９４ｇ、９８％）として、橙色の油状物として得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.40-7.18 (m, 5H), 6.78 (br s, 0.23H), 6.50 (br s, 0.77H), 6.00 (br s, 0.77H), 5.81 (br s, 0.23H), 3.82 (q, J = 6.5 Hz, 0.23H), 3.70 (q, J = 6.5 Hz, 0.77H), 3.14 (t, J = 6.0 Hz, 0.23H), 2.86 (t, J = 7.0 Hz, 0.77H), 2.35-1.86 (m, 2H), 1.84-1.64 (m, 2H), 1.39 (d, J = 6.5 Hz, 0.69H), 1.35 (d, J = 6.5 Hz, 2.31H); ESI MS m/z 275 [C13H17F3N2O + H].
【０１１５】
塩酸塩
ジアステレオマーの混合物としての表題化合物の遊離塩基（１１．９ｇ、４３．４ｍｍｏｌ）のＥｔ２Ｏ／ＭｅＯＨ（７：１、４０ｍＬ）溶液に１Ｎ  ＨＣｌのＥｔ２Ｏ（７０ｍＬ）溶液を加えた。混合物を加熱することにより、生じた白色の沈殿物を再溶解し、ＭｅＯＨを加えた（Ｅｔ２Ｏ／ＭｅＯＨの最終的な比が４：１になるように）。該溶液を室温に冷却し、終夜放置した。表題化合物のアミノアミド塩酸塩を単一のジアステレオマー（３．１１ｇ、２３％）、白色の固形物として単離した。
1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 7.93 (br s, 1H), 7.69 (br s, 1H), 7.54-7.44 (m, 5H), 4.39 (q, J = 7.0 Hz, 1H), 3.50 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 2.29-2.20 (m, 2H), 2.10-2.01 (m, 2H), 2.07 (d, J = 7.0 Hz, 3H); ESI MS m/z 275 [C13H17F3N2O + H].
【０１１６】
工程Ｃ．（Ｒ）−２−（４−クロロフェニルスルホンアミド）−５，５，５−トリフルオロペンタンアミド
（Ｒ）−５，５，５−トリフルオロ−２−（（Ｒ）−１−フェニルエチルアミノ）ペンタンアミド 塩酸塩（３．１０ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（１００ｍＬ）溶液にＰｄ（ＯＨ）２（３５０ｍｇ）および水（１０ｍＬ）を加えた。反応混合物を５０℃で４時間水素化した（４０ｐｓｉ）。ＣＥＬＩＴＥ（登録商標）を通して反応物を濾過し、濾液を減圧濃縮し、中間体アミン塩酸塩を白色の固形物として得た。該アミンのＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）懸濁物にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５．２５ｍＬ、３０．０ｍｍｏｌ）および４−クロロベンゼンスルホニルクロリド（２．５３ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を室温で１８時間撹拌し、ＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で希釈し、ＮａＨＣＯ３（２５０ｍＬ）およびブライン（２５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン  （２：１）でトリチュレートし、表題化合物（２．９１ｇ、８４％）を白色の固形物として得た。
1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 7.84 (dt, J = 8.5, 2.0 Hz, 2H), 7.55 (dt, J = 8.5, 2.0 Hz, 2H), 3.85 (dd, J = 8.5, 5.0 Hz, 1H), 2.34-2.05 (m, 2H), 1.97-1.68 (m, 2H); ESI MS m/z 345 [C11H12ClF3N2O3S + H].
【０１１７】
工程Ｄ．（Ｒ）−２−（４−クロロ−Ｎ−（２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）ベンジル）フェニルスルホンアミド）−５，５，５−トリフルオロペンタンアミド
スルホンアミド  （Ｒ）−２−（４−クロロフェニルスルホンアミド）−５，５，５−トリフルオロペンタンアミド（１３０ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液にＣｓ２ＣＯ３（２４１ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ）および３−（４−ブロモメチル−３−フルオロ-ベンジル）−１，２，４−オキサジアゾール（２５７ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を室温で２時間撹拌し、水（５０ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（２ｘ５０ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を合わせ、水（２ｘ５０ｍＬ）およびブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、０−５５％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、表題のオキサジアゾール化合物（９２ｍｇ、４５％）を白色の固形物として得た。
融点６６−６８℃。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.77 (s, 1H), 7.90 (dd, J = 8.0, 1.5 Hz, 1H), 7.77-7.71 (m, 3H), 7.64 (dd, J = 7.5, 7.5 Hz, 1H), 7.51 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.34 (s, 1H), 5.28 (s, 1H), 4.66 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 4.51 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 4.39 (dd, J = 8.9, 6.3 Hz, 1H), 2.25-1.82 (m, 3H), 1.54-1.47 (m, 1H); ESI MS m/z 521 [C20H17ClF4N4O4S + H]+; HPLC 98.9% (AUC), 保持時間 = 19.4 分.
【０１１８】
実施例２
（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミド
工程Ａ．４−（ブロモメチル）−３−フルオロベンゾニトリル
３−フルオロ−４−メチルベンゾニトリル（５．０ｇ、０．２３ｍｏｌ）の四塩化炭素（１００ｍＬ）溶液にＮ−ブロモスクシンイミド（４．９７ｇ、０．２８ｍｏｌ）およびＡＩＢＮ（１００ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ）を加え、混合物を６時間還流した。反応物を冷却し、濾過した。濾液を水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、溶媒を減圧除去し、５．４４ｇの表題化合物を灰白色の固形物として得た。１Ｈ ＮＭＲにより２０％の開始物質が存在することが示された。
表題化合物の1H NMR (400 MHz, CDCl3) : δ 7. 54-7.30 (m, 3H), 4.83 (s, 2H).
【０１１９】
工程Ｂ．（Ｒ）−２−（４−クロロ−Ｎ−（４−シアノ−２−フルオロベンジル）フェニルスルホンアミド）−５，５，５−トリフルオロペンタンアミド
（Ｒ）−２−（４−クロロフェニルスルホンアミド）−５，５，５−トリフルオロペンタンアミド（６．８８ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）および４−（ブロモメチル）−３−フルオロベンゾニトリル（６．４３ｇ、３０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３５ｍＬ）溶液に無水Ｃｓ２ＣＯ３（１９．５６ｇ、６０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で４５分間撹拌し、ＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で希釈し、水（１００ｍＬｘ４）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。生成物をＢｉｏｔａｇｅ（４０＋Ｍカラム、３％から８０％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、６５１ｍＬ）で精製した。表題化合物を白色の固形物として得た（６．５０ｇ、収率６８．１％）。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 7.80-7.88 (m, 3H), 7.70-7.75 (m, 2H), 7.67 (d, 2H, J=8), 7.60 (s, 1H), 7.26 (s, 1H), 4.99 (d, 1H, J=16), 4.68 (d, 1H, J=16), 4.14 (t, 1H, J=8), 1.99-2.17 (m, 2H), 1.80-1.94 (m, 1H), 1.40-1.56 (m, 1H).  LC/MS  M+H 478.14, 94%.
【０１２０】
工程Ｃ．（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミド
（Ｒ）−２−（４−クロロ−Ｎ−（４−シアノ−２−フルオロベンジル）フェニルスルホンアミド）−５，５，５−トリフルオロペンタンアミド（６．５ｇ、１３．６ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（７０ｍＬ）溶液にＮＨ２ＯＨ（５０％／Ｈ２Ｏ、２．６ｍＬ、４０．８ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を窒素下、８０℃で１時間撹拌し、次いで室温に冷却した。溶媒を減圧下でエバポレートした。残渣をＥｔＯＡｃに溶解し、水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒をエバポレートし、白色の固形物を得、それをＥｔＯＡｃから再結晶し、中間体アミドオキシムを白色の固形物として得た（６．９３ｇ、定量的収率）。中間体（Ｒ）−２−（４−クロロ−Ｎ−（２−フルオロ−４−（Ｎ’−ヒドロキシカルバムイミドイル）ベンジル）フェニルスルホンアミド）−５，５，５−トリフルオロペンタンアミド（６．９３ｇ、１３．６ｍｍｏｌ）およびオルトギ酸トリエチル（６．７７ｍＬ、４０．８ｍｍｏｌ）のジクロロエタン（３０ｍＬ）混合物にＢＦ３・ＯＥｔ２（０．１７ｍＬ、１．３６ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を７０℃で１時間撹拌し、次いで室温に冷却した。クロマトグラフィ（シリカゲル、ｂｉｏｔａｇｅ  ４０＋Ｍカラム、３％から８０％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、６５１ｍＬ）により、表題化合物を白色の固形物として得た（４．９ｇ、収率６９．３％）。
【０１２１】
上記の４．９ｇの生成物を（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミド（実施例１の記載により製造）の第２のロット９．８ｇと合わせた。この合わせたロット（１４．７ｇ）にイソプロピルアルコール（７５ｍＬ）を加えた。ほとんど完全に溶解するまで混合物を還流し、次いで濾過した。濾液を室温で１６時間撹拌し、濾過した。これを恒量にまで乾燥し、細かい結晶性の白色の固形物である（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミド（１３．７ｇ）を得た。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 8.77 (s, 1H), 7.90 (dd, J = 8.0, 1.5 Hz, 1H), 7.77-7.71 (m, 3H), 7.64 (dd, J = 7.5, 7.5 Hz, 1H), 7.51 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.34 (s, 1H), 5.28 (s, 1H), 4.66 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 4.51 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 4.39 (dd, J = 8.9, 6.3 Hz, 1H), 2.25-1.82 (m, 3H), 1.54-1.47 (m, 1H); ESI MS m/z 521 [C20H17ClF4N4O4S + H]+.
【０１２２】
実施例３
（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミド
工程Ａ．（Ｒ）−２−（４−クロロフェニルスルホンアミド）−５，５，５−トリフルオロペンタンアミド
【化１３】
2012520875.tif 000018
乾燥した適切な容器に、（Ｒ）−２−アミノ−５，５，５−トリフルオロペンタンアミド 塩酸塩（１９９．５２ｇ、０．９６６ｍｏｌ、１．０当量）、次いで４−クロロベンゼンスルホニルクロリド（２１５．２２ｇ、０．９８９ｍｏｌ、１．０２当量、９７％ ｗ／ｗ％）および１．６ＬのＴＨＦを室温で加えた。トリエチルアミン（２０６．５ｇ、２．０４ｍｏｌ、２．１当量）を２０分間かけて加え、ポット温度を１５−２５℃に維持し、得られた白色のスラリーを１５−２５℃で３０分間撹拌した。水（１．４Ｌ、７容積）を反応混合物に２０−２５℃で加え、次いでＴＨＦ（１．４Ｌ、７容積）を減圧下における蒸留により除去した（蒸留過程中、ポット温度を２５０−４００ｍｍＨｇで４０−６０℃に維持した）。蒸留工程終了時に１．４Ｌ（７容積）の水を３０分間かけて加え、この間ポット温度を５０−６０℃に維持し、得られたスラリーを５０−６０℃で３０分間撹拌し、１０℃に冷却した。スラリーを１時間以上撹拌し、生成物を濾過した。ケーキのｐＨが≧５となるまでケーキを水（６００ｍＬ／各洗浄）で洗浄した。乾燥による損失が≦０．５  ｗ／ｗ％であるまで該ケーキを７０℃以下（ジャケット温度）で減圧乾燥し、表題化合物を白色の固形物として得た（３００ｇ、収率９１％）。
1H NMR (DMSO-d6) (400 MHz) δ 160 - 1.90 (two m, 1H each of CH2), 2.10 - 2.35 (m, 2H of CH2-CF3), 3.85 - 3.88 (m,1H, -(CONH2)CH(NH), 7.13 & 7.37 (br s, 1H, each of CONH2), 7.61 (m, 2H, Ar-Ha), 7.64 (m, 2H, Ar-Hb), 8.18 (d, 1H, J = 8.0 Hz, NH-SO2).  13C NMR (DMSO-d6) (100.0 MHz) δ 171.75, 140.27, 137.77, 131.71, 129.56, 128.95, 126.22, 55.12, 30.1, 29.82, 29.53, 29.25, 25.82, 25.79.
【０１２３】
工程Ｂ．（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミド
【化１５】
2012520875.tif 000019
工程Ｂ、手順１．
適切な容器に３−（４−（ブロモメチル）−３−フルオロフェニル）−１，２，４−オキサジアゾール（４９２．１４ｇ、１．１０当量、１．９１４ｍｏｌ）、（Ｒ）−２−（４−クロロフェニルスルホンアミド）−５，５，５−トリフルオロペンタンアミド（６００ｇ、１．００当量；１．７４ｍｏｌ）、炭酸セシウム（３１２．２２ｇ、０．５５当量；０．９８ｍｏｌ）、テトラ−Ｎ−ブチルアンモニウム ヨージド（６４．２９ｇ、０．１０当量；０．１７ｍｍｏｌ）、およびアセトニトリル（９ｍＬ/ｇ；５．４Ｌ）を入れた。ジャケットを４０℃（内部は３８℃）で加熱した。（Ｒ）−２−（４−クロロフェニルスルホンアミド）−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドが＜５ＡＰとなるまで、反応をＨＰＬＣでモニターした。内部温度が２０℃になるまで容器を冷却し、水（５．４Ｌ）を加えた。相を分離し、生成物を大量に含むのは上の層であった。下層は廃棄した。水（３．７Ｌ）を１８分間かけて加え、反応物を２０℃で２０時間置き、次いで濾過した。水（６Ｌ）を容器に加え、撹拌して撹拌機および容器壁に固着した固形物の移動を補助した。粗ケーキを１回水で洗浄し、その水を反応器の洗浄に用いた。該粗ケーキを減圧下、５０℃においてトレーで乾燥した。乾燥した粗ケーキの重量は６９９ｇであった。該ケーキを１０Ｌの反応器に移し、ＴＨＦ（２．０２５Ｌ）、次いでヒドロキシルアミン溶液（５０％／水）（４２．９７ｍＬ、０．４０当量、０．６９６ｍｏｌ）を加えた。反応器ジャケットを４０℃に加熱した。（Ｒ）−２−（４−クロロ−Ｎ−（４−シアノ−２−フルオロベンジル）フェニルスルホンアミド）−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドが＜０．４ ＡＰとなるまで、反応をＨＰＬＣでモニターした。反応物を２０℃に冷却し、水（２Ｌ）を加え、反応物を２０℃で３０分間撹拌した。相を分離し、有機相をヘプタン（８Ｌ）で撹拌しながら処理し、反応物を油状化させ、次いで沈殿させた。スラリーを２０℃で２時間保ち、反応物を濾過し、ケーキをヘプタン（２Ｌ）で洗浄した。粗ケーキをトレー上、減圧下、４０−５０℃で乾燥し、化合物による損失が＜１％になった後、重量は６１３ｇであった。粗生成物をＭｅＯＨ（３．６７８Ｌ）およびＭｅＣＮ（１．２２６Ｌ）と共に容器に戻した。ジャケットを６０℃（内部は５２℃）に加熱して完全に溶解させ、内部温度を＞５０℃に維持しながら水（２．０２３Ｌ）をその温度においてゆっくりと加えた。水の添加が完了したら、溶液を４時間かけて内部温度１５℃まで冷却し、この間に結晶が生じた。さらに水（４００ｍＬ）を反応器に加え、反応物を濾過し、母液を容器に戻した。母液を２分間撹拌し、容器に固着した生成物を容器から取り外した。粗ケーキを母液、次いでヘプタン（１．５００Ｌ）で洗浄した。生成物をトレーに載せ、減圧下、４０−５０℃において、化合物による損失が＜０．５％であるまで乾燥し、（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドを輝きのある灰白色の固形物（５７７．６ｇ、収率６３．７６％）として得た。
【０１２４】
工程Ｂ、手順２．
適切な容器に（Ｒ）−２−（４−クロロフェニルスルホンアミド）−５，５，５−トリフルオロペンタンアミド（２．６８ｋｇ、７．７７ｍｏｌ、１当量）、３−（４−（ブロモメチル）−３−フルオロフェニル）−１，２，４−オキサジアゾール（２．００ｋｇ、７．７８ｍｏｌ、１当量）、炭酸セシウム（１．６５ｋｇ、５．０６ｍｏｌ、０．６５当量）、テトラブチルアンモニウム ヨージド（０．２９ｋｇ、０．７８ｍｏｌ、０．１当量）およびアセトニトリル(１２．０Ｌ、４．５Ｌ／ｋｇ）を入れた。ＨＰＬＣで反応の完了が確認されるまで（ＨＰＬＣによる３−（４−（ブロモメチル）−３−フルオロフェニル）−１，２，４−オキサジアゾールの相対的ＡＰ＜０．５となるまで）、反応物を３５℃で加熱した。反応物を１５℃に冷却し、水（１０．７２Ｌ、４Ｌ／ｋｇ）を撹拌しながら加え、次いで氷酢酸（０．２２ｋｇ）を加え、反応物のｐＨを＜６．５とした。撹拌を停止し、相を分離した（上層が生成物を含む）。生成物を多く含む層にトルエン（２６．８ｋｇ、３１Ｌ、１０ｋｇ／ｋｇ）、次いでブライン溶液（２０％ ｗ／ｗ、６．３９ｋｇ、２Ｌ／ｋｇ）を加え、層を分離した（上層が生成物を含む）。アセトニトリルが除去されるまで〜５０℃、減圧下（２００ｍｂａｒ）で混合物を蒸留した。蒸留後、容器内の総容積が〜１０Ｌ／ｋｇとなるよう、必要に応じてさらにトルエンを加えて濃度を調節した。イソプロピルアルコール（０．４８ｋｇ、０．２Ｌ／ｋｇ）を加え、バッチを１５℃に冷却し、結晶化を開始させた。得られたスラリーを濾過し、冷トルエン（１８．６５ｋｇ、２１．５６Ｌ、８Ｌ／ｋｇ）で洗浄した。粗ケーキをトレーに載せ、乾燥による損失が＜１．０％であるまで減圧下、５０℃において乾燥した。乾燥したケーキをイソプロピルアルコール（２７．３４ｋｇ、３４．８Ｌ、１３Ｌ／ｋｇ）およびヒドロキシルアミン（５０％水溶液、０．０５ｋｇ、１．５１ｍｏｌ、０．２当量)と共に１００Ｌの反応器に加えた。混合物を６５℃に加熱し、（Ｒ）−２−（４−クロロ−Ｎ−（４−シアノ−２−フルオロベンジル）フェニルスルホンアミド）−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドが＜０．４ＡＰとなるまでＨＰＬＣでモニターした。次いで、反応物体積が元の〜６０％となるまで反応物を蒸留した（ポット温度〜５０℃、減圧３００ｍｂａｒ）。アセトニトリル（５．３６ｋｇ、２Ｌ／ｋｇ）を加え、反応温度を７０℃に昇温して溶解を完了させた。水（１１．２６Ｌ、４．２Ｌ／ｋｇ）をゆっくりと加え、この間反応温度を＞６５℃に維持した。反応物を２時間かけて１５℃に冷却し、結晶化が起こった。スラリーを濾過し、冷イソプロピルアルコール水溶液（２：１  ＩＰＡ：水、体積比）で洗浄した。該ケーキを乾燥による損失が＜１％であるまで減圧乾燥した。次いで、生成物をアセトニトリル（２Ｌ／ｋｇ、乾燥ケーキの投入重量に基づく）およびメタノール（６Ｌ／ｋｇ）に溶解することにより再結晶化し、次いで５０℃に加熱した。反応温度を＞５０℃に保ちながら、水（４Ｌ／ｋｇ）ゆっくりと加えた。反応物を２時間かけて１５℃に冷却した。得られたスラリーを濾過し、メタノール：アセトニトリル：水（６：２：４、５Ｌ／ｋｇ）溶液で洗浄し、（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミド（２．０２ｋｇ、収率５０％）を白色の固形物として得た。
【０１２５】
実施例４
（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミド
工程Ａ．（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［（４−シアノ−２−フルオロフェニル）メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミド
【化１４】
2012520875.tif 000020
（Ｒ）−２−（４−クロロフェニルスルホンアミド）−５，５，５−トリフルオロペンタンアミド（３．４４４ｋｇ）、炭酸カリウム（２．７７４ｋｇ）、テトラブチルアンモニウム ブロミド（０．４８４ｋｇ）、および４−（ブロモメチル）−３−フルオロベンゾニトリル（２．０９２ｋｇ）を反応器に入れた。次いで、酢酸エチル（１７．２Ｌ）および水（３．４４Ｌ）を加え、ＨＰＬＣで反応の完了が確認されるまで（開始物質が＜１相対的ＡＰとなるまで）、バッチを５０℃で加熱した。反応は通常約１５時間以内に完了した。バッチを１５−２０℃に冷却し、水（６．８８Ｌ）を加え、下層の水層を分離した。リン酸一ナトリウム溶液（０．２Ｍ／水、２０．６６Ｌ）を加え、下層の水層を分離し、ｐＨを測定して＜６．５であることを確認した（注：ｐＨが＞６．５の場合、さらに２０．６６Ｌの０．２Ｍ  リン酸一ナトリウム溶液を加え、抽出およびｐＨ測定を繰り返してもよい）。次いで、定積減圧蒸留（constant volume vacuum distillation）により溶媒を交換した。反応器を減圧下（２７０ｍｍＨｇ）に置き、ジャケットを７５−８０℃に加熱した。一旦酢酸エチルの蒸留が開始されると、イソプロパノール（４１．３４Ｌ）を蒸留物の回収と同じ速度で加え、全体のバッチ体積を同じレベルに維持した。全てのイソプロパノールを加え終わると、減圧を解除し、水（１３．７６Ｌ）を加えた。水を加える間、バッチ温度を約５０℃に維持した。次いでバッチを１５−２０℃に冷却し、濾過した。湿ったケーキを５０％（ｖ／ｖ）イソプロパノール水溶液（４ｘ２１．６ｋｇ）で洗浄し、５０℃で減圧乾燥し、表題化合物を灰白色の固形物として得た（３．６４８ｋｇ、収率７８％）。
1H NMR (300 MHz, DMSO- d6) δ ppm 1.42 - 1.55 (m, 1 H) 1.80 - 1.93 (m, 1 H) 2.00 - 2.15 (m, 2 H) 4.44 (dd, J=7.91, 1.13 Hz, 1 H) 4.68 (d, J=17.71 Hz, 1 H) 4.99 (d, J=17.71 Hz, 1 H) 7.26 (s, 1 H) 7.50 (s, 1 H) 7.63 -7.73 (m, 4 H) 7.78 - 7.87 (m, 3 H). 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6) ppm 22.58 -22.97 (m, 1 C) 29.96 (d, J=29.09 Hz, 1 C) 41.46 (d, J=5.49 Hz, 1 C), 57.86, 110.97,  111.45 (d, J=10.43 Hz, 1 C), 117.58, 119.11 (d, J=25.80 Hz, 1 C), 124.89, 128.53, 128.56, 129.21, 131.17, 131.98, 137.44, 138.32, 158.99 (d, J=247.54 Hz, 2 C), 170.25.  19F NMR, (CDCl3, 282 MHz) δ: -116.5, -65.9.  IR (KBr):  3443, 3342, 3210, 2955, 2245, 1699, 1577, 1476, 1163 cm -1.  Anal. Calcd. for C19H16ClF4N3O3S  Calc. C, 47.75; H, 3.37; N, 8.79; S, 6.71; F, 15.90; Cl, 7.41. Found:  C, 47.95; H,   3.31; N, 8.67; S, 6.72; F, 15.59; Cl, 7.49.
【０１２６】
工程Ｂ．（Ｒ）−２−（４−クロロ−Ｎ−（２−フルオロ−４−（Ｎ’−ヒドロキシカルバムイミドイル）ベンジル）フェニルスルホンアミド）−５，５，５−トリフルオロペンタンアミド
【化１５】
2012520875.tif 000021
（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［（４−シアノ−２−フルオロフェニル）メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミド（３９９ｇ）およびメタノール（１．６Ｌ）を反応器に入れ、次いでヒドロキシルアミン（５０％溶液／水、９３ｍＬ、１．８当量）を入れた。ＨＰＬＣにより反応の完了が確認されるまで（開始物質の相対的ＡＰが＜０．１５となるまで）、混合物を４５−５０℃で加熱した。バッチ温度を３０−５０℃の間に維持しながら、水（０．５Ｌ）をゆっくりと加えた。結晶化が始まるまでバッチを静置し、次いで水（２．７Ｌ）を加えた。バッチを１５−２０℃に冷却し、濾過した。ケーキを２：１  ＭｅＯＨ：水（２Ｌ）で洗浄し、５０℃で減圧乾燥し、表題化合物を白色の固形物として得た（４１５ｇ、収率９６％）。
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.43 - 1.64 (m, 1 H) 1.77 - 1.93 (m, 1 H) 1.93 - 2.17 (m, 2 H) 4.41 (dd, J=8.48, 6.03 Hz, 1 H) 4.60 (d,J=17.14 Hz, 1 H) 4.94 (d, J=16.77 Hz, 1 H) 5.81 - 5.98 (m, 2 H) 7.19 - 7.27 (m, 1 H) 7.37 - 7.47 (m, 2 H) 7.52 (d, J=4.14 Hz, 2 H) 7.64 (d, J=8.67,Hz, 2 H) 7.85 (d, J=8.85 Hz, 2 H) 9.71 - 9.83 (m, 1 H).    
IR (KBr):  3491, 3379, 1680, 1651, 1592, 1433, 1343.  
Anal. Calcd. for C19H19ClF4N4O4S  Calc.  C, 44.66; H, 3.74; N, 10.96; S, 6.27; F, 14.87; Cl, 6.94.  Found: C, 44.90; H, 3.91; N, 10.91; S, 6.41; F, 15.21; Cl, 6.95.
【０１２７】
工程Ｃ．（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミド
【化１６】
2012520875.tif 000022
（Ｒ）−２−（４−クロロ−Ｎ−（２−フルオロ−４−（Ｎ’−ヒドロキシカルバムイミドイル）ベンジル）−フェニルスルホンアミド）−５，５，５−トリフルオロペンタンアミド（２４６ｇ）を反応器に入れ、次いで乾燥アセトニトリル（５０９ｍＬ）、オルトギ酸トリエチル（１２０ｍＬ）、およびトリフルオロ酢酸（７ｍＬ）を入れた。ＨＰＬＣにより反応の完了が確認されるまで（開始物質の相対的ＡＰが＜０．１５となるまで）、溶液を４０−５０℃で加熱した。バッチを４５−５０℃に維持しながらメタノール（１．４８Ｌ）を一度に加え、次いで水（１．０３４Ｌ）を加えた。次いで、バッチを１５−２０℃に冷却し、濾過した。ケーキを２：６：５  ＭｅＣＮ：ＭｅＯＨ：水で洗浄し、トレーに載せて５０−６０℃で減圧乾燥し、表題化合物を白色の固形物として得た（２２８ｇ、収率９０％）。
1H NMR, (CDCl3, 300 MHz) δ: 1.40 - 1.58 (m, 1 H) 1.75 - 1.90 (m, 1 H) 1.92 - 2.07 (m, 1 H) 2.10 - 2.26 (m, 1 H) 4.37 (dd, J=8.67, 6.22 Hz, 1 H) 4.48 (d, J=15.64 Hz, 1 H) 4.64 (d, J=15.82 Hz, 1 H) 5.54 (s, 1 H) 6.33 (s, 1 H) 7.44 - 7.54 (m, 2 H) 7.62 (t, J=7.72 Hz, 1 H) 7.68 - 7.76 (m, 3 H) 7.85 (dd, J=7.91, 1.51 Hz, 1 H) 8.76 (s, 1 H).  13C NMR, (DMSO-d6, 75 MHz) δ: 170.34, 167.75, 165.80, 159.64 (d, J = 244.5 Hz, 1 C), 138.19, 137.64, 131.25 (d, J = 3.75 Hz, 1C), 129.31, 129.23, 129.05 (d, J = 14.25 Hz, 1C), 126.74 (q, J = 274.5 Hz, 1C), 126.91, 126.80, 123.12 (d, J = 3.75 Hz, 1C), 113.7 (d, J = 24.0 Hz, 1 C), 57.92, 41.38 (d, J = 4.5 Hz, 1 C), 30.04 (d, J = 30.0 Hz, 1 C), 22.90.  19F NMR, (CDCl3, 282 MHz) δ: -116.3, -66.5.  IR (KBr):  3454, 334, 3286, 2952, 1705, 1432, 1325, 1260, 1167, 1084, 828 cm-1.  Anal. Calcd. for C20H17ClF4N4O4S  Calc. C, 46.11; H, 3.29; N, 10.71; S, 6.15; F, 14.58; Cl, 6.80.  Found C, 46.06; H, 3.24; N, 10.71; S, 6.25; F, 14.60; Cl, 6.88.
【手続補正書】
【提出日】平成24年3月1日(2012.3.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（２Ｒ）−２−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］［［２−フルオロ−４−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル］アミノ］−５，５，５−トリフルオロペンタンアミドを含む、頭部外傷、外傷性脳損傷、および／またはボクサー認知症の治療剤。
【請求項２】
請求項１に記載される、頭部外傷の治療剤。
【請求項３】
請求項１に記載される、外傷性脳損傷の治療剤。
【請求項４】
請求項１に記載される、ボクサー認知症の治療剤。
【国際調査報告】
2012520875.tif 000023
2012520875.tif 000024
2012520875.tif 000025