(57)【要約】  本発明は診断分野、特に慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患の検出に関する。より詳細には、本発明は、慢性関節リウマチまたはその疾病素質の存在または不存在を検出するための方法、免疫系に関連した標的遺伝子の発現データを用いて対象者における慢性関節リウマチのモニタリングを行うための方法、並びにバイオインフォマティックスのための手段を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象者における自己免疫疾患またはその疾病素質の存在または不存在を検出するための、以下の工程ａ）〜ｃ）を包含する方法。
ａ）対象者から採取した全血試料から総ＲＮＡまたはｍＲＮＡを単離し、
ｂ）工程ａ）で単離した総ＲＮＡまたはｍＲＮＡについて、少なくともＣ３遺伝子、ＣＲ１遺伝子、Ｆｏｘｐ３遺伝子、ＧＩＴＲ遺伝子、ＩＣＯＳ遺伝子、ＩＦＮ−γ遺伝子、ＩＬ−２遺伝子、ＩＬ−１２Ｒｂ１２遺伝子およびＴＩＭ−３遺伝子を含む標的遺伝子群のそれぞれの遺伝子に対応するｍＲＮＡ産物を定量し、そして
ｃ）対象者における該自己免疫疾患の存在または不存在、あるいは対象者が該自己免疫疾患を発症する傾向にあるかどうかを検出するように訓練した識別器に、工程ｂ）で得たｍＲＮＡ産物の定量データを入力する。
【請求項２】
該識別器が、健康な対照者および自己免疫疾患を発症している患者からなる、病態が既知の対象者群から得たデータによって訓練されており、訓練データは、工程ｂ）で使用した標的遺伝子と実質的に同じ遺伝子のｍＲＮＡ発現結果に基づくデータであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ｂ）で使用する標的遺伝子群が、ＣＤ２５遺伝子、ガレクチン−９遺伝子、ＧＡＴＡ−３遺伝子、ＩＬ−４Ｒ遺伝子、ＩＮＯＳ遺伝子およびＴＢＥＴ遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子を更に包含することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
自己免疫疾患が関節リウマチであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
工程ｂ）を、逆転写リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴｑＰＣＲ）で実施することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程ｃ）で使用する識別器が、線形予測法であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
該線形予測法が、回帰分析および線形判別分析を含む線形回帰モデルであることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
患者における関節リウマチの進行のモニタリング用である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
対象者における自己免疫疾患またはその疾病素質の存在または不存在の検出を目的とした識別器を構築するための、以下の工程ａ）〜ｅ）を包含する方法。
ａ）少なくともＣ３遺伝子、ＣＲ１遺伝子、Ｆｏｘｐ３遺伝子、ＧＩＴＲ遺伝子、ＩＣＯＳ遺伝子、ＩＦＮ−γ遺伝子、ＩＬ−２遺伝子、ＩＬ−１２Ｒｂ１２遺伝子およびＴＩＭ−３遺伝子を含む標的遺伝子群を選択し、
ｂ）健康な対照者および所望の自己免疫疾患を発症している患者からなる、病態が既知の対象者群のそれぞれの対象者から全血試料を採取し、総ＲＮＡまたはｍＲＮＡを単離し、
ｃ）工程ｂ）で単離した総ＲＮＡまたはｍＲＮＡについて、工程ａ）で選択した標的遺伝子群のそれぞれの遺伝子に対応するｍＲＮＡ産物を定量することによって、ｍＲＮＡプロファイルを包含する試験データを提供し、
ｄ）多重データ識別器に試験データを入力し、
ｅ）工程ｄ）で得られる結果をまとめることによって、識別器の訓練には使用していない別の患者試料から得た、工程ｃ）のｍＲＮＡプロファイルと実質的に類似した患者ｍＲＮＡプロファイルに基づいて、該自己免疫疾患の存在または不存在を検出することが可能な訓練された識別器を得る。
【請求項１０】
工程ｄ）の多重データ識別器が、人工ニューラルネットワーク、分類木と回帰木、ｋ近傍分類法および回帰法を包含することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
対象者における自己免疫疾患またはその疾病素質の存在または不存在を検出するための、以下の工程ａ）〜ｃ）を包含する方法。
ａ）対象者から採取した全血試料から総ＲＮＡまたはｍＲＮＡを単離し、
ｂ）工程ａ）で単離した総ＲＮＡまたはｍＲＮＡについて、少なくともその一部がＣ３遺伝子、ＣＲ１遺伝子、ＣＤ２５遺伝子、Ｆｏｘｐ３遺伝子、ガレクチン−９遺伝子、ＧＡＴＡ−３遺伝子、ＧＩＴＲ遺伝子、ＩＣＯＳ遺伝子、ＩＦＮ−γ遺伝子、ＩＬ−２遺伝子、ＩＬ−４Ｒ遺伝子、ＩＬ−１２Ｒｂ１２遺伝子、ＩＮＯＳ遺伝子、ＴＢＥＴ遺伝子およびＴＩＭ−３遺伝子からなる群より選ばれる遺伝子である標的遺伝子群のそれぞれの遺伝子に対応するｍＲＮＡ産物を定量し、そして
ｃ）対象者における該自己免疫疾患の存在または不存在、あるいは対象者が該自己免疫疾患を発症する傾向にあるかどうかを検出するように訓練した識別器に、工程ｂ）で得たｍＲＮＡ産物の定量データを入力する。
【請求項１２】
該識別器が、健康な対照者および自己免疫疾患を発症している患者からなる、病態が既知である対象者群から得たデータによって訓練されており、訓練データは、工程ｂ）で使用した標的遺伝子と実質的に同じ遺伝子のｍＲＮＡ発現結果に基づくデータであることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
自己免疫疾患が関節リウマチであることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
対象者における自己免疫疾患またはその疾病素質の存在または不存在の検出を目的とした識別器を構築するための、以下の工程ａ）〜ｅ）を包含する方法。
ａ）標的遺伝子群の少なくとも一部を、Ｃ３遺伝子、ＣＲ１遺伝子、ＣＤ２５遺伝子、Ｆｏｘｐ３遺伝子、ガレクチン−９遺伝子、ＧＡＴＡ−３遺伝子、ＧＩＴＲ遺伝子、ＩＣＯＳ遺伝子、ＩＦＮ−γ遺伝子、ＩＬ−２遺伝子、ＩＬ−４Ｒ遺伝子、ＩＬ−１２Ｒｂ１２遺伝子、ＩＮＯＳ遺伝子、ＴＢＥＴ遺伝子およびＴＩＭ−３遺伝子からなる群より選択し、
ｂ）健康な対照者および所望の自己免疫疾患を発症している患者からなる、病態が既知の対象者群のそれぞれの対象者から全血試料を採取し、総ＲＮＡまたはｍＲＮＡを単離し、
ｃ）工程ｂ）で単離した総ＲＮＡまたはｍＲＮＡについて、工程ａ）で選択した標的遺伝子群のそれぞれの遺伝子に対応するｍＲＮＡ産物を定量することによって、ｍＲＮＡプロファイルを包含する試験データを提供し、
ｄ）多重データ識別器に試験データを入力し、
ｅ）工程ｄ）で得られる結果をまとめることによって、識別器の訓練には使用していない別の患者試料から得た、工程ｃ）のｍＲＮＡプロファイルと実質的に類似した患者ｍＲＮＡプロファイルに基づいて、該自己免疫疾患の存在または不存在を検出することが可能な訓練された識別器を得る。
【請求項１５】
工程ｄ）の多重データ識別器が、人工ニューラルネットワーク、分類木と回帰木、ｋ近傍分類法および回帰法を包含することを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は診断分野、特に関節リウマチなどの自己免疫疾患の検出に関する。より詳細には、本発明は、関節リウマチまたはその疾病素質の存在または不存在を検出するための方法、あるいは免疫系に関連した標的遺伝子の発現データを用いて対象者における関節リウマチのモニタリングを行うための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
自己免疫疾患と潜在的に関連する多くの遺伝子が既知であり、最近では、こういった標的遺伝子の発現プロファイルを、患者における種々の自己免疫疾患またはその疾病素質の存在を評価するために用いることが提案されている（例えば、WO 2004/056866およびUS 2005/0048574を参照）。
【０００３】
関節リウマチは、多種の臓器および組織を冒す自己免疫疾患であるが、主に滑膜性関節の炎症によって特徴付けられている。滑膜性関節の炎症は、痛みを伴う症状をもたらし、しばしば、重度の身体障害に至る。人口の約１％が関節リウマチを患っており、女性の患者数は男性の約３倍である。疾病の初期段階で治療を開始することによって最も高い効果が得られることから、関節リウマチの早期および迅速な診断は患者にとって非常に有益である。更に、最も効果的な治療は積極的且つ高価であるため、患者は正しく診断され、必要な場合にのみ治療を受けるべきである。
【０００４】
関節リウマチは、以下の理由により、初期段階の診断が困難である。第１に、この疾患のための単一の試験は存在しない。痛み、こわばりおよび関節機能、更にこれらの経時変化に関する患者からの説明が、医師による疾患の初期判断に重要である。患者の身体検査、レントゲン、およびリウマチ因子、白血球数、赤血球沈降速度およびｃ反応性タンパク質などに関する臨床試験は、起こりうる関節炎に関する情報を提供する。しかし、現在使用されている上記臨床的変数の予測精度を上回ったり、予測精度を向上させたりすることのできるバイオマーカーは未だ見出されていない。
【０００５】
複雑なシステム生物学を説明するためのバイオインフォマティックスの手段は、診断手段の探索において成功を収めている。線形回帰分析、人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）および非線形パターン認識技術は、医療分野の意思決定において急速に認知度を高めている。ＡＮＮは、例えば、以下の態様において成功を収めている： 末端肝疾患に対する成果の予測（Cucchetti, Vivarelli et al. 2007）、急性心筋梗塞の診断（Heden, Ohlin et al. 1997）、結腸腫瘍の診断（Selaru, Xu et al. 2002）、ならびに乳癌の解析（Papadopoulos, Fotiadis et al. 2005）および治療（Eden, Ritz et al. 2004）。ＡＮＮは、急性すい臓炎やすい臓癌の予測にも使用されている（Bartosch-Harlid, Andersson et al. 2008に総説有）。本研究は、非関節リウマチ（非ＲＡ）患者から、関節リウマチ（ＲＡ）患者を臨床的に区別するための方法を探索することを目的とした。本発明の方法は、全血試料由来の免疫関連遺伝子に関する定量ＲＴ−ＰＣＲデータを使用する。このデータを、ＡＮＮ、線形回帰、線形判別、ｋ近傍分類（ＫＮＮ）および決定木といった予測法の組み合わせによって解析する。これら働きの異なる手段の使用は、ＲＡおよび非ＲＡを同定するためのより確固とした予測結果をもたらすため有利である。
【０００６】
US 2005/0003394は、血液試料から関節リウマチ関連遺伝子の転写産物が検出可能であると開示している。関節リウマチに関連した遺伝子群またはそれらに対応するマイクロアレイが、例えば、以下の特許文献に開示されている：US 2008/0108077、US 2006/0127963、US 2005/0048574、US 2007/0196835、US 2008/0113346、US 2003/0154032、US 2007/0298518およびWO 2007/137405。しかしながら、関節リウマチ患者の迅速且つ正確な診断を可能にする新規方法を求める継続的な需要が存在する。本発明は、関節リウマチまたはその発症傾向があると疑われる患者に由来する全血試料から効率よく関節リウマチを判断するための、免疫系に関連した臨床マーカーのパターンおよびバイオインフォマティックスのための手段を提供する。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
発明の詳細な説明
本発明は、対象者における自己免疫疾患の存在または不存在の検出に関する。本発明の関連する自己免疫疾患としては、関節リウマチおよび強直性脊椎炎などのリウマチ様疾患、ならびに炎症性腸疾患が挙げられる。特に本発明は、関節リウマチの存在または不存在の検出方法を提供する。別の態様においては、本発明の方法を関節リウマチの疾病素質の評価に使用することも可能であり、その結果、関節リウマチの発症傾向がある対象者を検出することが可能となる。更に別の態様においては、患者における関節リウマチの進行をモニタリングするために本発明の方法を使用することも可能であり、その結果、例えば、医師による処方薬の効果の追跡が可能となる。
【０００８】
更に詳細には、本発明の方法は以下の工程ａ）〜ｃ）を包含する。
ａ）患者から採取した全血試料から総ＲＮＡまたはｍＲＮＡを単離し、
ｂ）工程ａ）で単離した総ＲＮＡまたはｍＲＮＡについて、少なくともその一部がＣ３遺伝子、ＣＲ１遺伝子、ＣＤ２５遺伝子、Ｆｏｘｐ３遺伝子、ガレクチン−９遺伝子、ＧＡＴＡ−３遺伝子、ＧＩＴＲ遺伝子、ＩＣＯＳ遺伝子、ＩＦＮ−γ遺伝子、ＩＬ−２遺伝子、ＩＬ−４Ｒ遺伝子、ＩＬ−１２Ｒｂ１２遺伝子、ＩＮＯＳ遺伝子、ＴＢＥＴ遺伝子およびＴＩＭ−３遺伝子からなる群より選ばれた遺伝子である標的遺伝子群のそれぞれの遺伝子に対応するｍＲＮＡ産物を定量し、そして
ｃ）対象者における所望の該自己免疫疾患の存在または不存在、あるいは対象者が該自己免疫疾患を発症する傾向にあるかどうかを検出するように訓練した識別器に、工程ｂ）で得たｍＲＮＡ産物の定量データを入力するが、該識別器は、健康な対照者および該自己免疫疾患を発症している患者からなる、病態が既知の対象者群から得たデータによって訓練されており、訓練データは、工程ｂ）で使用した標的遺伝子と実質的に同じ遺伝子のｍＲＮＡ発現結果に基づくデータである。
【０００９】
工程ｂ）においてｍＲＮＡ産物の量を求める際には、以下の遺伝子群ａ）〜ｆ）よりなる群から選ばれる少なくとも１種を定量することが好ましい。
ａ）ＩＦＮ−γ遺伝子とＣＲ１遺伝子；
ｂ）ＩＦＮ−γ遺伝子、ＣＲ１遺伝子とＧＩＴＲ遺伝子；
ｃ）ＩＦＮ−γ遺伝子、ＣＲ１遺伝子とＣ３遺伝子；
ｄ）ＩＦＮ−γ遺伝子、ＣＲ１遺伝子、ＧＩＴＲ遺伝子とＣ３遺伝子；
ｅ）ＣＲ１遺伝子とＧＩＴＲ遺伝子；および
ｆ）ＣＲ１遺伝子、ＧＩＴＲ遺伝子とＣ３遺伝子。
【００１０】
更に工程ｂ）において使用する遺伝子群としては、
ｇ）ＩＦＮ−γ遺伝子、ＣＲ１遺伝子とＴＩＭ−３遺伝子；
ｈ）ＩＦＮ−γ遺伝子、Ｃ３遺伝子とＴＩＭ−３遺伝子；および
ｉ）ＩＦＮ−γ遺伝子、ＣＲ１遺伝子、Ｃ３遺伝子とＴＩＭ−３遺伝子
が挙げられ、これらは工程ｃ）においてＡＮＮで解析することが好ましい。
【００１１】
工程ｂ）において使用する更なる遺伝子群としては、
ｊ）ＩＦＮ−γ遺伝子、Ｆｏｘｐ３遺伝子とＧＩＴＲ遺伝子
が挙げられ、これらは工程ｃ）において線形回帰または線形判別で解析することが好ましい。
【００１２】
本発明で使用するマーカー遺伝子の大部分がＴ細胞マーカーである（表１を参照）。関節リウマチなどの自己免疫性炎症性リウマチ性疾患の免疫病因においては、ＣＤ４ Ｔ細胞が支配的な役割を担っていると考えられる証拠が存在する（総説についてはSkapenko, Lipsky et al. 2006を参照）。胸腺から発生するＣＤ４ Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞プールに属するものである。正常な活性化によって、ナイーブＴ細胞は増殖し、特定のエフェクター細胞に分化する。ＣＤ４ Ｔ細胞は、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞またはＴｒｅｇ細胞に分類される、特化したエフェクター細胞に分化することができる。ＣＤ４ Ｔ細胞の各分化プログラムについて、特異的な転写因子が主要調節因子として同定されている。ＴＢＥＴはＴｈ１細胞、ＧＡＴＡ−３はＴｈ２細胞、ＲＯＲ−ｇａｍｍａ ｔはＴｈ１７細胞、そしてＦｏｘｐ３はＴｒｅｇ細胞の転写因子である。本研究においては、コピー数が低すぎて、試料の大部分において信頼性の高い検出が不可能だったＲＯＲ−ｇａｍｍａ ｔを除いた上記全ての転写因子について研究した。
【００１３】
更に、補体カスケードの２つの遺伝子、即ち、補体成分３（Ｃ３）遺伝子および補体受容体１（ＣＲ１）遺伝子、を本研究に含めた。古典的補体経路および補体副経路の両方がＲＡにおいては病理学的に活性化されることを示す説得力の高い証拠が存在する（Okroj, Heinegard et al. 2007）。補体の活性化の中心を担うのはＣ３の開裂である。補体カスケードは速やかに活性化され、宿主にとっては潜在的に破壊的である。従って、補体の活性化を正しく制御することが炎症において本質的に重要である。ＣＲ１は、補体活性化制御因子（ＲＣＡ）遺伝子クラスターに属する膜結合補体阻害因子である。
【００１４】
本発明の別の態様においては、工程ｂ）をＲＴ−ＰＣＲ、例えば、逆転写リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴｑＰＣＲ）で実施することが好ましい。
【００１５】
しかし、ＲＴ−ＰＣＲに基づく定量的遺伝子発現研究の重要な課題は、十分な量の使用可能なメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を抽出すること、そしてその分解を防止し、転写産物の正確な数を計算するための解析を可能にすることである。試料の採取、輸送、処理および保存の各工程が、ｍＲＮＡの著しい分解に繋がることがある（Hartel, Bein et al. 2001）。臨床試料中のｍＲＮＡが易変性なので、逆転写リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴｑＰＣＲ）およびマイクロアレイ解析などのダウンストリームアプリケーションによる処理を実施する前には、ｍＲＮＡの完全性を調べることが必須である。いずれの技術も非常に高感度であり、細やか且つ一貫した試料処理に依存する（Lockhart and Winzeler 2000、Stordeur, Zhou et al. 2003）。転写産物存在量の正しい判断のためには、遺伝子発現の再現可能な検出を達成するために重要な、試料採取の時点ならびに保存中および輸送中のトランスクリプトームの安定化が必要である（Thach, Lin et al. 2003）。
【００１６】
本発明の方法のための高品質ＲＮＡは、PAXgeneTM 血液ＲＮＡシステム（PAXgeneTM Blood RNA System）というキット（ドイツ国、QIAGEN社、PreAnalytiX製）を用いて採取することが好ましい。このキットには、安定化添加剤の入った真空血液回収チューブであるPAXgeneTM 血液ＲＮＡチューブ（PAXgeneTM Blood RNA Tube）、および複数の試料処理用試薬を含むPAXgeneTM 血液ＲＮＡキット（PAXgeneTM Blood RNA Kit）が含まれる。PAXgeneTM チューブに入った添加剤は、真空チューブ内の２．５ｍＬの血液中のＲＮＡ分解を減少させる。更には、全血中のＲＮＡが、室温で５日間の保存後、−２０℃または−８０℃で１２ヶ月間の保存後、あるいは凍結融解を繰り返した後でも安定であることが示されている（Rainen, Oelmueller et al. 2002）。
【００１７】
特定の遺伝子発現の量は、相対定量値に対する比較閾値サイクル（Ｃｔ）法によって解析することが可能であり、この方法の実施に際しては、遺伝子発現結果を正規化しなければならない。正規化においては、１８Ｓ遺伝子（Hs99999901_s1）、ＡＣＴＢ遺伝子（Hs99999903_m1）、Ｂ２Ｍ遺伝子（Hs99999907_m1）、ＧＡＰＤＨ遺伝子（Hs99999905_m1）、ＧＵＳＢ遺伝子（Hs99999908_m1）、ＨＭＢＳ遺伝子（Hs00609297_m1）、ＨＰＲＴ１遺伝子（Hs99999909_m1）、ＩＰＯ８遺伝子（Hs00183533_m1）、ＰＧＫ１遺伝子（Hs99999906_m1）、ＰＯＬＲ２Ａ遺伝子（Hs00172187_m1）、ＰＰＩＡ遺伝子（Hs99999904_m1）、ＲＰＬＰ０遺伝子（Hs99999902_m1）、ＴＢＰ遺伝子（Hs99999910_m1）、ＴＦＲＣ遺伝子（Hs99999911_m1）、ＵＢＣ遺伝子（Hs00824723_m1）、ＹＷＨＡＺ遺伝子（Hs00237047_m1）などの公知のハウスキーピング遺伝子、他の遺伝子、またはそれらの組み合わせのＣT値をマーカー遺伝子のＣT値から減じ、デルタＣT（ｄＣT）値を得る。次にこれらデルタＣT値を統計処理に使用する。しかし、未処理の（plain）ＣT値、即ち、正規化度が０のＣT値を、統計解析の出発材料として用いることもできる。
【００１８】
本発明においては、工程ｃ）を、得られた結果のコンピューター解析によって実施する。このようなコンピューター解析は、線形予測法または非線形予測法で実施することが好ましい。線形予測法としては、回帰分析や線形判別分析が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、非線形予測法としては、人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。上記およびその他の本発明において有用な統計解析方法は、例えば、以下の特許出願に記載されている： WO 01/31579、WO 02/06829、WO 02/42733、US 2004/0073376、US 2004/0137471、US 2006/0195269、US 2007/0198198およびUS 2007/0094168。
【００１９】
本発明の好ましい態様においては、統計解析方法は学習相と識別相に分かれている。学習相においては、識別すべき種々のクラスに属するメンバーを含むデータセットに学習アルゴリズムを適用する。このデータセットは、例えば、関節リウマチと診断された患者から得た複数の試料に関するデータ、および健常な対照者（即ち、自己免疫疾患または他の進行性炎症性疾患に罹患していない個体）から得た複数の試料に関するデータを含むものである。データの解析に使用する方法には、人工ニューラルネットワーク、回帰、フィッシャー判別および分類・回帰木解析が含まれるが、これらに限定されるものではない。これらの方法は、例えば、上述した先行技術文献に記載されている。学習アルゴリズムは識別アルゴリズムを生成する。識別器は、未知の試料を２つのクラスのいずれかに識別することが可能なデータ成分、例えば、特定のマーカーおよびマーカーの特定の強度、通常はこれらの組み合わせに同調させる。その後、識別器を診断試験に使用する。データーにおけるこのようなパターンを解析するためのソフトウエアとしては、市販のものとフリーウエアの両方が容易に入手可能である。
【００２０】
従って本発明の方法は、対象者における自己免疫疾患の存在または不存在を検出するために識別器を使用する。識別器は、ｍＲＮＡ発現結果に基づく遺伝子マーカープロファイルを包含する入力データを受け取った後に、対象者における自己免疫疾患の存在または不存在を示す出力データを提供することができる限り、いかなる適切なパターン認識方法（即ち、統計方法）に基づくものでもよい。識別器は、始めに、病態が既知の対象者群（即ち、健康な対照者および所望の自己免疫疾患を発症している患者からなる群）から得たｍＲＮＡ発現結果に基づく訓練データによって訓練する。訓練データは、各対象者について、ａ）適切な生物学的試料（例えば、対象者から得た全血試料）に含まれる遺伝子産物の測定値を包含するマーカープロファイル、およびｂ）対象者の病態（即ち、所望の自己免疫疾患に罹患しているか、あるいは健康な対照であるか）に関する情報を包含する。その後、訓練された識別器は、別の対象者における自己免疫疾患の存在または不存在に関する指標を生成させるために使用することができるが、但し、識別器に導入する入力データが該別の対象者の適切な試料から誘導したものであり、且つ訓練相においても使用したマーカー遺伝子のｍＲＮＡ発現結果を包含しなければならない。
【００２１】
本発明の特定の態様においては、発現レベルの変化が関節リウマチと最も高い相関性を示す遺伝子転写産物を同定するために、以下の手法を使用した。始めに識別器を構築し、訓練するために、対照例の発現パターンおよび患者試料の発現パターンを訓練セットとして使用した。次に、最大６個の隠れ端末を有するＭＬＰ−ＡＮＮ、線形判別、線形回帰、ＫＮＮおよび決定木を使用し、発現レベルが訓練セットの識別ベクトル特性と最も高い相関性を示す遺伝子を同定した。続いて、可能な全ての遺伝子の組み合わせを含む予想セットを「一つ抜き交差検定」（ＬＯＯＣＶ）で評価することで、訓練セット内の試料の識別について最も高い精度を示す予想セットを同定した。ＩＦＮ−γ遺伝子、ＣＲ１遺伝子、ＧＩＴＲ遺伝子およびＣ３遺伝子は、最も精度の高い識別器において他の遺伝子よりも頻繁に存在が確認された上位の遺伝子である。更に、ＩＦＮ−γ遺伝子、Ｆｏｘｐ３遺伝子およびＧＩＴＲ遺伝子は、線形判別法および線形回帰法において頻繁に存在が確認された上位の遺伝子であり、ＩＦＮ−γ遺伝子、ＣＲ１遺伝子、Ｃ３遺伝子およびＴＩＭ−３遺伝子は、ＭＬＰ−ＡＮＮにおいて頻繁に存在が確認された上位の遺伝子である。
【００２２】
一つ抜き交差検定（ＬＯＯＣＶ）および受信者動作特性（ＲＯＣ）解析によって測定したところ、本発明においてデータ解析法として最も優れていたのは線形回帰法および線形判別法であり、続いてＡＮＮであった。発現結果と関節リウマチとの相関性が確立されるのは、ＲＯＣ解析によって得られる曲線下面積が少なくとも０．８、好ましくは少なくとも０．９、より好ましくは少なくとも０．９１または０．９２の場合である。
【００２３】
本発明の特に好ましい態様は、少なくともＣ３遺伝子、ＣＲ１遺伝子、Ｆｏｘｐ３遺伝子、ＧＩＴＲ遺伝子、ＩＣＯＳ遺伝子、ＩＦＮ−γ遺伝子、ＩＬ−２遺伝子、ＩＬ−１２Ｒｂ１２遺伝子およびＴＩＭ−３遺伝子を含む標的遺伝子群のそれぞれの遺伝子に対応するｍＲＮＡ産物を定量し、そして得られたデータを線形予測法（回帰分析および線形判別分析を含む線形回帰モデルなど）に基づく識別器に入力することを包含する方法である。
【００２４】
本願明細書に引用した出版物および特許出願について、本記載をもってそれらの内容が本願明細書に組み込まれたものとし、これは、各出版物および各特許出願について、具体的且つ個別にその内容を本願明細書に記載して組み込んだ場合と同様とみなす。次の実施例は、本発明およびその原理や利点を当業者がより深く理解するのを助けるものである。実施例は本発明を例証するためのものであり、その範囲を減縮するためのものではない。
【実施例】
【００２５】
材料と方法
新たに慢性関節リウマチと診断された患者（ｎ＝３６）および健康な成人（ｎ＝３８）の末梢全血試料（２．５ｍＬ）を、PAXgene 血液ＲＮＡチューブ（Becton Dickinson製）に導入した。試料をゆっくりと反転させた後、室温で２時間放置し、−２０℃で最大６ヶ月間保存した。
【００２６】
ＲＮＡ抽出に先立ち、試料を−２０℃から取り出し、室温で２時間インキュベートすることで完全な融解を確実にした。総ＲＮＡは、製造者のマニュアルに従って使用するPAXgene 血液ＲＮＡシステムキット（Qiagen製）および追加のＤＮａｓｅオプション（Qiagen製）を用いて抽出した。ＲＮＡの収率と純度は、NanoDrop ND-1000 分光光度計（英国、リングマー、Labtech International製）によって決定した。
【００２７】
濃度１０ｎｇ／μｌのＲＮＡの逆転写は、TaqMan 逆転写試薬（米国、カリフォルニア州、フォスターシティー、Applied Biosystems製）を用いて行った。
【００２８】
リアルタイム定量ＰＣＲは、TaqMan ユニバーサルＰＣＲマスターミックスのプロトコルに従い、ABI 7700 シーケンス検出システム（Sequence Detection System）（Applied Biosystems製）で行った。ヒト遺伝子用のプライマーおよびTaqMan プローブは、TaqMan 遺伝子発現アッセイの一部としてApplied Biosystemsより入手した（表２）。５２μｌの反応混合物を、各１５μｌずつ３つのＰＣＲプレートにピペッテイングした。反応混合物は、２μｌのｃＤＮＡ産物（但し、ＩＮＯＳ遺伝子とＩＬ−２遺伝子は２０μｌ）、２６μｌのTaqMan ２×ユニバーサルＰＣＲマスターミックス、および２．６μｌの２０× TaqMan 遺伝子発現アッセイマスターミックスからなり、反応容積の残りは脱イオン水とした。ＰＣＲサイクルのパラメータは次のように設定した：９５℃で１０分、続いて９５℃で１５秒を４０サイクル、そして６０℃で１分。外因性ｃＤＮＡプール標準物質をＰＨＡで刺激したＰＢＭＣから回収し、各プレートにおいて測定するアッセイ間アッセイ用標準とした。
【００２９】
特定遺伝子の発現量は、相対的定量のための比較閾値サイクル（Ｃｔ）法で解析した。発現量の正規化については、ハウスキーピング遺伝子ｌ８Ｓを標的遺伝子のＣT値から減じてデルタＣT（ｄＣT）値を得た。デルタＣT値を統計解析に用いた。
【００３０】
ＩＮＯＳ遺伝子においては、７２試料中の合計１７試料が信頼できる検出限界を超えていた。検出は、３重に行ったＰＣＲの全てにおいて得られたＣT値とそのＳＤ値が１未満の時に、信頼性があるとみなした。検出限界を超えた試料には人為的ｄＣT値（２６．５）を付与した。本研究においては、この人為的ｄＣT値は、ＩＮＯＳ遺伝子について得られた最も低い遺伝子コピーレベルを表している。
【００３１】
データ解析
データセットは、７４例の試料（患者が３６例と対照が３８例）から測定した、１５個の遺伝子とハウスキーピング遺伝子１８Ｓからなる。
【００３２】
解析の目的は、個別の患者例または対照例にとって最適な識別器を見つけることである。種々の診断研究に個別に用いられている予測法（ニューラルネットワーク、決定木、ｋ近傍分類、線形判別および線形回帰）のスペクトルに対して、一つ抜き交差検定スキーマを使用した。
【００３３】
ＡＮＮ
ＡＮＮは入力変数の組み合わせの影響を受けやすく、自動次元削減を実施することはできないことが知られているが（Haykin 1998）、例えば、決定木なら実施可能である。従って、ＡＮＮの訓練のために、３２，７６７通りの遺伝子の全組み合わせを用いる方法を使用した。使用したＡＮＮ法は、多層パーセプトロン（ＭＬＰ）ニューラルネットワーク（Haykin, 1998）である。ＭＬＰにおいて重要なパラメータは、隠れ端末の数である。各遺伝子の組み合わせについて、入力遺伝子数と同じ数の隠れ端末について試験したが、但し、入力遺伝子数が６を超えた場合には、６個の隠れ端末についてのみ試験した。その結果、合計１９３，９５２個のＭＬＰニューラルネットワークを訓練した。各ネットワークについて、入力データ（ＬＯＯＣＶ訓練データ）の９５％をＭＬＰネットワークの訓練に使用し、５％を、過学習を防止するために、ＭＬＰの訓練を止める時期を決定する試験に使用した。ＭＬＰネットワークを訓練した後には、訓練から省いた試料にそれを適用した。ＭＬＰネットワーク用の他のパラメータについては次に説明する。tansig変換関数を使用し、出力を最も近い成績に概数した（−１は対照例を意味し、＋１は患者例を意味した）。ニューラルネットワークについては、訓練データはＬＯＯＣＶループ内で−１と１の間でスケーリングし（Haykin 1998）、変換パラメータは保存した。ＬＯＯＣＶ用の試料は、保存したスケーリングパラメータを用いてスケーリングし、次に、ＭＬＰニューラルネットワークに適用した。可能な遺伝子の組み合わせの全てについて、上記パラメータを含むＭＬＰネットワークを用いたＬＯＯＣＶによって解析した。ネットワークの初期化に使用したものと同じシードを用いて、ＭＬＰ識別器をＭＡＴＬＡＢ ｖ．７．４．０．２８７およびニューラルネットワークツールボックス ｖ．５．０．２に構築した(9.85337161E8)。ネットワークは、‘newff’コマンドで作製し、試験セットに使用したデータポイントの割合は５％だった。試験セットは、起こりうる過学習のモニタリングおよびそのような現象が検出された際には訓練を停止するために使用した。開始したネットワークは、コマンド‘train’で訓練した。訓練から省いた試料のクラスは、訓練したネットワークとコマンド‘sim’で決定した。
【００３４】
他の識別器のパラメーターは次の通りである。
１．判別解析： ＭＡＴＬＡＢコマンド‘classify’を使用した。
２．回帰分析： ＭＡＴＬＡＢコマンド‘regress’を使用した（回帰式中の定数項を考慮するために、１で埋めた列を有するデータ行列を追加した）。
３．ｋＮＮ： ‘相互（correlation）’距離測定および‘ボリューム（volumetric）’最終決定法によってｋＮＮ識別器を組み立てた。
４．決定木： 分類木アルゴリズムと共にＭＡＴＬＡＢ関数‘treefit’、およびジニ係数分裂判定基準を使用した。少なくとも１５個の観察が分裂には必要だった。
【００３５】
最適な識別器を同定するためのＬＯＯＣＶ推定に、ＲＯＣ解析を使用した。基準は曲線下面積（ＡＵＣ）だった。ＡＵＣは０から１の間であり、１は完璧な試験を表し、０．５は無意味な試験を表す。別の基準は精度、即ち、表３に示したような正しく識別された試料の数である。
【００３６】
臨床的に妥当な識別器が、線形判別法および線形回帰法のみならず、人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）法によっても得られた。これらは、一つ抜き交差検定（ＬＯＯＣＶ）および受信者動作特性（ＲＯＣ）解析によって測定した結果である（表３）。
【００３７】
線形回帰は、独立変数（Ｘ、遺伝子）と依存変数（Ｙ、ＲＡの存在または不存在）の間に、線形回帰式によって関係を築く（Hastie, Tibshirani et al. 2001）。数学的には、ｙ＝Ｘｂであり、Ｘはｎ×ｐ型の計画行列であり、但し、行は観測値に対応し、列は予測変数に対応するものであり、ｙは応答観測のｎ×１ベクトルであり、そしてｂは回帰係数であり、典型的には最小二乗法解析によって推定した値である（Ｘの第１列は、モデルに定数項が含まれることを確実にするために、１で埋めている）。本研究において最適な線形回帰（表３）を達成するためのｂベクトルを、次に列挙する。
【００３８】
係数 遺伝子
０．４８６５                  定数項
−０．１３２１                  Ｆｏｘｐ３
−０．２１２０                  ＴＩＭ−３
−０．１８０６                  ＩＦＮ−γ
０．１４６３                  ＩＬ−２
０．１６７１                  Ｌ−１２Ｒβ２
０．０９２１                  ＧＩＴＲ
０．０６９２                  ＩＣＯＳ
０．１５２１                  Ｃ３
−０．２５６６                  ＣＲ１
【００３９】
線形判別分析の目的は、最適な２つの出力クラス（ここではＲＡと健常例）を分離することのできる変数の線形結合を見出すことにある。線形判別関数は、以下の式によって定義されている。
【００４０】
【数１】
2012510265.tif 000002
【００４１】
但し、上記式中のＳyの二乗は、次の式で表される、変数の統計的な推定値である。
【００４２】
【数２】
2012510265.tif 000003
【００４３】
線形判別の出力は分散行列である。本願において最適な識別器は、表３に示した遺伝子によって得られたものである。
【００４４】
【表１】
2012510265.tif 000004
【００４５】
表１に列挙したマーカー遺伝子の塩基配列は、公共のデータベースより入手可能である。表１には、アクセッションナンバーと共に各配列の名称を記載した。ＧｅｎＢａｎｋに登録されている遺伝子については、本記載をもって、本願出願日におけるそれらの配列の全てが本願明細書に組み込まれたものとする（www.ncbi.nlm.nih.gov を参照）。 
【００４６】
【表２】
2012510265.tif 000005
【００４７】
【表３】
2012510265.tif 000006
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００４８】
【非特許文献１】Bartosch-Harlid, A., B. Andersson, U. Aho, J. Nilsson and R. Andersson (2008). "Artificial neural networks in pancreatic disease." Br J Surg 95(7): 817-26.
【非特許文献２】Cucchetti, A., M. Vivarelli, N. D. Heaton, S. Phillips, F. Piscaglia, L. Bolondi, G. La Barba, M. R. Foxton, M. ReIa, J. OGrady and A. D. Pinna (2007).  "Artificial neural network is superior to MELD in predicting mortality of patients with end-stage liver disease." Gut 56(2): 253-8.
【非特許文献３】Eden, P., C. Ritz, C. Rose, M. Ferno and C. Peterson (2004). "‘Good Old’clinical markers have similar power in breast cancer prognosis as microarray gene expression profilers." Eur J Cancer 40(12): 1837-41.
【非特許文献４】Hartel, C, G. Bein, M. Muller-Steinhardt and H. Kluter (2001). "Ex vivo induction of cytokine mRNA expression in human blood samples." J Immunol Methods 249(1-2): 63-71.
【非特許文献５】Hastie, T., R. Tibshirani and J. Friedman (2001). The elements of statistical learning: data mining, interference, and prediction, Springer.
【非特許文献６】Haykin, S. (1998). Neural Networks: A Comprehensive Foundation, Prentice Hall.
【非特許文献７】Heden, B., H. Ohlin, R. Rittner and L. Edenbrandt (1997). "Acute myocardial infarction detected in the 12-lead ECG by artificial neural networks." Circulation 96(6): 1798-802.
【非特許文献８】Lockhart, D. J. and E. A. Winzeler (2000). "Genomics, gene expression and DNA arrays." Nature 405(6788): 827-36.
【非特許文献９】Okroj, M., D. Heinegard, R. Holmdahl and A. M. Blom (2007). "Rheumatoid arthritis and the complement system." Ann Med 39(7): 517-30.
【非特許文献１０】Papadopoulos, A., D. I. Fotiadis and A. Likas (2005). "Characterization of clustered microcalcifications in digitized mammograms using neural networks and support vector machines." Artif Intell Med 34(2): 141-50.
【非特許文献１１】Rainen, L., U. Oelmueller, S. Jurgensen, R. Wyrich, C. Ballas, J. Schram, C. Herdman, D. Bankaitis-Davis, N. Nicholls, D. Trollinger and V. Tryon (2002). "Stabilization of mRNA expression in whole blood samples." Clin Chem 48(11): 1883-90.
【非特許文献１２】Selaru, F. M., Y. Xu, J. Yin, T. Zou, T. C. Liu, Y. Mori, J. M. Abraham, F. Sato, S. Wang, C. Twigg, A. Olaru, V. Shustova, A. Leytin, P. Hytiroglou, D. Shibata, N. Harpaz and S. J. Meltzer (2002). "Artificial neural networks distinguish among subtypes of neoplastic colorectal lesions." Gastroenterology 122(3): 606-13.
【非特許文献１３】Skapenko, A., P. E. Lipsky and H. Schulze-Koops (2006). "T cell activation as starter and motor of rheumatic inflammation." Curr Top Microbiol Immunol 305: 195-211.
【非特許文献１４】Stordeur, P., L. Zhou, B. ByI, F. Brohet, W. Burny, D. de Groote, T. van der Poll and M. Goldman (2003). "Immune monitoring in whole blood using real-time PCR." J Immunol Methods 276(1-2): 69-77.
【非特許文献１５】Thach, D. C, B. Lin, E. Walter, R. Kruzelock, R. K. Rowley, C. Tibbetts and D. A. Stenger (2003). "Assessment of two methods for handling blood in collection tubes with RNA stabilizing agent for surveillance of gene expression profiles with high density microarrays." J Immunol Methods 283(1-2): 269-79.
【手続補正書】
【提出日】平成23年2月3日(2011.2.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象者における関節リウマチまたはその疾病素質の存在または不存在を検出するための、以下の工程ａ）〜ｃ）を包含する方法。
ａ）対象者から採取した全血試料から総ＲＮＡまたはｍＲＮＡを単離し、
ｂ）工程ａ）で単離した総ＲＮＡまたはｍＲＮＡについて、少なくともＣ３遺伝子、ＣＲ１遺伝子、Ｆｏｘｐ３遺伝子、ＧＩＴＲ遺伝子、ＩＣＯＳ遺伝子、ＩＦＮ−γ遺伝子、ＩＬ−２遺伝子、ＩＬ−１２Ｒｂ１２遺伝子およびＴＩＭ−３遺伝子を含む標的遺伝子群のそれぞれの遺伝子に対応するｍＲＮＡ産物を定量し、そして
ｃ）対象者における該自己免疫疾患の存在または不存在、あるいは対象者が該自己免疫疾患を発症する傾向にあるかどうかを検出するように訓練した識別器に、工程ｂ）で得たｍＲＮＡ産物の定量データを入力する。
【請求項２】
該識別器が、健康な対照者および自己免疫疾患を発症している患者からなる、病態が既知の対象者群から得たデータによって訓練されており、訓練データは、工程ｂ）で使用した標的遺伝子と実質的に同じ遺伝子のｍＲＮＡ発現結果に基づくデータであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ｂ）で使用する標的遺伝子群が、ＣＤ２５遺伝子、ガレクチン−９遺伝子、ＧＡＴＡ−３遺伝子、ＩＬ−４Ｒ遺伝子、ＩＮＯＳ遺伝子およびＴＢＥＴ遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子を更に包含することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程ｂ）を、逆転写リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴｑＰＣＲ）で実施することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
工程ｃ）で使用する識別器が、線形予測法であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該線形予測法が、回帰分析および線形判別分析を含む線形回帰モデルであることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
患者における関節リウマチの進行のモニタリング用である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
対象者における関節リウマチまたはその疾病素質の存在または不存在の検出を目的とした識別器を構築するための、以下の工程ａ）〜ｅ）を包含する方法。
ａ）少なくともＣ３遺伝子、ＣＲ１遺伝子、Ｆｏｘｐ３遺伝子、ＧＩＴＲ遺伝子、ＩＣＯＳ遺伝子、ＩＦＮ−γ遺伝子、ＩＬ−２遺伝子、ＩＬ−１２Ｒｂ１２遺伝子およびＴＩＭ−３遺伝子を含む標的遺伝子群を選択し、
ｂ）健康な対照者および関節リウマチを発症している患者からなる、病態が既知の対象者群のそれぞれの対象者から全血試料を採取し、総ＲＮＡまたはｍＲＮＡを単離し、
ｃ）工程ｂ）で単離した総ＲＮＡまたはｍＲＮＡについて、工程ａ）で選択した標的遺伝子群のそれぞれの遺伝子に対応するｍＲＮＡ産物を定量することによって、ｍＲＮＡプロファイルを包含する試験データを提供し、
ｄ）多重データ識別器に試験データを入力し、
ｅ）工程ｄ）で得られる結果をまとめることによって、識別器の訓練には使用していない別の患者試料から得た、工程ｃ）のｍＲＮＡプロファイルと実質的に類似した患者ｍＲＮＡプロファイルに基づいて、該自己免疫疾患の存在または不存在を検出することが可能な訓練された識別器を得る。
【請求項９】
工程ｄ）の多重データ識別器が、人工ニューラルネットワーク、分類木と回帰木、ｋ近傍分類法および回帰法を包含することを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【国際調査報告】
2012510265.tif 000007
2012510265.tif 000008
2012510265.tif 000009
2012510265.tif 000010
2012510265.tif 000011
2012510265.tif 000012
2012510265.tif 000013
2012510265.tif 000014