【手続補正書】
【提出日】令和2年8月26日(2020.8.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）Ｎ末端のトレフォイル因子（ＴＦＦ）ポリペプチドおよび（ｂ）細胞壁アンカー性ドメインを含むＣ末端の細胞付着ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする第１の外因性核酸を含む、組換え乳酸菌（ＬＡＢ）。
【請求項２】
前記細胞付着ポリペプチドが、細胞および粘液結合プロテインＡ（ＣｍｂＡ）、粘液結合タンパク質（Ｍｕｂ）、粘液付着促進タンパク質（ＭａｐＡ）およびラクトコッカスのムチン結合タンパク質（ＭｂｐＬ）からなる群から選択される、請求項１に記載の組換えＬＡＢ。
【請求項３】
前記細胞付着ポリペプチドが、ＣｍｂＡである、請求項２に記載の組換えＬＡＢ。
【請求項４】
前記ＣｍｂＡが、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）のＣｍｂＡである、請求項３に記載の組換えＬＡＢ。
【請求項５】
前記ＣｍｂＡが、配列番号１に対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の組換えＬＡＢ。
【請求項６】
前記ＴＦＦポリペプチドが、ＴＦＦ１、ＴＦＦ２、およびＴＦＦ３からなる群から選択される、請求項１に記載の組換えＬＡＢ。
【請求項７】
前記ＴＦＦポリペプチドが、配列番号３に対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組換えＬＡＢ。
【請求項８】
前記融合タンパク質がＣｍｂＡおよびヒトＴＦＦ３ポリペプチドを含む、請求項１に記載の組換えＬＡＢ。
【請求項９】
前記融合タンパク質が、分泌シグナルペプチドをさらに含む、請求項１に記載の組換えＬＡＢ。
【請求項１０】
前記分泌シグナルペプチドが、未同定分泌４５ｋＤａタンパク質（ＳＳｕｓｐ４５）の分泌リーダーである、請求項９に記載の組換えＬＡＢ。
【請求項１１】
前記第１の外因性核酸が、ｔｈｙＡプロモーター（ＰｔｈｙＡ）、ｈｌｌａプロモーター（ＰｈｌｌＡ）、およびｇａｐＢプロモーター（ＰｇａｐＢ）からなる群から選択されるプロモーターの制御下に置かれる、請求項１に記載の組換えＬＡＢ。
【請求項１２】
ａ）サイトカイン；
ｂ）インターロイキン（ＩＬ）；
ｃ）抗体またはその機能的断片；
ｄ）抗原；
ｅ）ホルモン；
ｆ）ＴＦＦ；および
ｇ）酵素またはその機能的断片；
からなる群から選択される少なくとも１つの治療用ポリペプチドをコードする第２の外因性核酸をさらに含む、請求項１に記載の組換えＬＡＢ。
【請求項１３】
ｂ）前記インターロイキン（ＩＬ）が、ＩＬ−２、ＩＬ−１０およびＩＬ−１８からなる群から選択され；
ｃ）前記抗体が、抗ＴＮＦα抗体、ＩＬ−４に対する抗体、ＩＬ−５に対する抗体、ＩＬ−１３に対する抗体、ＩＬ−１５に対する抗体および免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に対する抗体からなる群から選択され；
ｄ）前記抗原が、プロインスリン（ＰＩＮＳ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ６５）、インスリノーマ関連タンパク質２（ＩＡ−２）、膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ触媒性サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ）、亜鉛トランスポーター８（ＺｎＴ８）、クロモグラニンＡ、（プレプロ）膵島アミロイドポリペプチド（ｐｐＩＡＰＰ）、ペリフェリン、シトルリン化グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）、樹木花粉アレルゲン、雑草花粉アレルゲン、草花粉アレルゲン、食物アレルゲン、チリダニアレルゲン、カビアレルゲンおよび動物鱗屑アレルゲンからなる群から選択され；
ｅ）前記ホルモンが、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）、グルカゴン、エキセンジン−４、上皮成長因子および成長ホルモンからなる群から選択され；
ｆ）前記ＴＦＦが、ＴＦＦ１、ＴＦＦ２、およびＴＦＦ３からなる群から選択され；および
ｇ）前記酵素が、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）およびアミノ酸デカルボキシラーゼからなる群から選択される； 
請求項１２に記載の組換えＬＡＢ。
【請求項１４】
少なくとも１つの治療用ポリペプチドがＰＡＬである、請求項１３に記載の組換えＬＡＢ。
【請求項１５】
前記第２の外因性核酸がｇａｐＢプロモーター（ＰｇａｐＢ）の制御下に置かれる、請求項１２に記載の組換えＬＡＢ。
【請求項１６】
前記組換えＬＡＢが、ラクトバチルス（Lactobacillus）種細菌、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）種細菌、ストレプトコッカス（Streptococcus）種細菌、エンテロコッカス（Enterococcus）種細菌、およびラクトコッカス（Lactococcus）種細菌からなる群から選択される、請求項１に記載の組換えＬＡＢ。
【請求項１７】
前記組換えＬＡＢが、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）である、請求項１６に記載の組換えＬＡＢ。
【請求項１８】
前記組換えＬＡＢがが、前記第１の外因性核酸を欠く対応するＬＡＢと異なる少なくとも１つの特徴を有し、前記少なくとも１つの特徴が；
ａ．少なくとも１０％増加した胃腸（ＧＩ）通過時間；
ｂ．少なくとも１０％増加した腸粘膜への付着；
ｃ．少なくとも２０％増加したｉｎ  ｖｉｔｒｏムチン結合能力；および
ｄ．少なくとも１０％増加したｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃａｃｏ−２細胞結合能力
からなる群から選択される、請求項１に記載の組換えＬＡＢ。
【請求項１９】
前記組換えＬＡＢが、前記第１の外因性核酸を欠く対応する前記ＬＡＢと比べた時に、少なくとも２０％増加したｉｎ  ｖｉｔｒｏムチン結合能力を有する、請求項１８に記載の組換えＬＡＢ。
【請求項２０】
前記組換えＬＡＢが、前記第１の外因性核酸を欠く対応する前記ＬＡＢと比べた時に、少なくとも１０％増加したｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃａｃｏ−２細胞結合能力を有する、請求項１８に記載の組換えＬＡＢ。
【請求項２１】
トレハロース蓄積を増加させる少なくとも１つの変異または挿入をさらに含み、前記少なくとも１つの変異または挿入が：
ａ）ｕｓｐ４５プロモーター、ｕｓｐ４５遺伝子、ｒｐｍＤ遺伝子のすぐ５’にある遺伝子領域および大腸菌（Escherichia coli）のＯｔｓＢをコードする核酸を５’から３’の順に含む、第１のポリシストロン性発現カセットの挿入；
ｂ）ｈｌｌＡプロモーター（ＰｈｌｌＡ）、並びにトレハローストランスポーター遺伝子ｌｌｍｇ＿０４５３およびｌｌｍｇ＿０４５４を含む核酸を５’から３’の順に含む、第２のポリシストロン性発現カセットの挿入；
ｃ）不活性化された内因性のトレハロース−６−リン酸ホスホリラーゼ遺伝子（ｔｒｅＰＰ）であって、前記ｔｒｅＰＰ遺伝子は遺伝子の欠失により不活性化されることにより、前記組換えＬＡＢがＴｒｅＰＰ活性を欠く、前記不活性化された内因性のｔｒｅＰＰ遺伝子；並びに
ｄ）不活性化された内因性のセロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩＣコンポーネント遺伝子（ｐｔｃＣ）であって、前記ｐｔｃＣ遺伝子は、未成熟終止コドンを挿入することによって不活性化されることにより、前記組換えＬＡＢがＰｔｃＣ活性を欠く、前記不活性化された内因性のｐｔｃＣ遺伝子；
からなる群から選択される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組換えＬＡＢ。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組換えＬＡＢおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２３】
自己免疫疾患、アレルギー、代謝性疾患、胃腸疾患および栄養欠陥からなる群から選択される疾患の治療のための医薬の調製のための、請求項１から２１のいずれか１項に記載の組換えＬＡＢの使用。
【請求項２４】
自己免疫疾患、アレルギー、代謝性疾患、胃腸疾患および栄養欠陥からなる群から選択される疾患を治療するための、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記疾患が、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、セリアック病、炎症性腸疾患、およびフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）から選択される、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
ａ）細胞および粘液結合プロテインＡ（ＣｍｂＡ）、粘液結合タンパク質（Ｍｕｂ）、粘液付着促進タンパク質（ＭａｐＡ）およびラクトコッカスのムチン結合タンパク質（ＭｂｐＬ）からなる群から選択される細胞付着ポリペプチドをコードする配列、ならびに
ｂ）トレフォイル因子（ＴＦＦ）ポリペプチドおよびＭｕｃＢＰポリペプチドから選択されるムチン結合ポリペプチドをコードする配列
を含む、融合タンパク質をコードする核酸。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３９】
一部の実施形態を本明細書に示して記載したが、そのような実施形態は単に例として与
えるものである。本発明から離れることなく、多数の変形、変更、および置換が当業者に
ここで想起されるであろう。本明細書に記載される発明の実施形態に対して様々な代替手
段が本発明の実施において用いられることが理解されるべきである。
本発明は以下の態様を含み得る。
［１］
（Ａ）Ｎ末端のムチン結合ポリペプチドおよび（Ｂ）細胞壁アンカー性ドメインを含むＣ末端の細胞付着ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする外因性核酸を含む乳酸菌（ＬＡＢ）。
［２］
前記細胞付着ポリペプチドが、細胞および粘液結合プロテインＡ（ＣｍｂＡ）、粘液結合タンパク質（Ｍｕｂ）、粘液付着促進タンパク質（ＭａｐＡ）、ラクトコッカス（Lactococcus）ムチン結合タンパク質（ＭｂｐＬ）、および任意のこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の菌。
［３］
前記細胞付着ポリペプチドが、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）のＣｍｂＡなどのＣｍｂＡである、請求項２に記載の菌。
［４］
前記ＣｍｂＡポリペプチドが、配列番号１に対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の菌。
［５］
前記ムチン結合ポリペプチドが、トレフォイル因子（ＴＦＦ）１、ＴＦＦ２、およびＴＦＦ３から選択されるＴＦＦである、請求項１に記載の菌。
［６］
前記ＴＦＦポリペプチドが、配列番号３に対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の菌。
［７］
前記融合タンパク質がＣｍｂＡおよびＴＦＦを含む、請求項１に記載の菌。
［８］
前記融合タンパク質が、ＳＳｕｓｐ４５などの分泌シグナルペプチドをさらに含む、請求項１に記載の菌。
［９］
融合タンパク質をコードする前記外因性核酸が、ｔｈｙＡプロモーター（ＰｔｈｙＡ）、ｈｌｌａプロモーター（ＰｈｌｌＡ）、およびｇａｐＢプロモーター（ＰｇａｐＢ）からなる群から選択されるプロモーターによって転写調節される、請求項１に記載の菌。
［１０］
ａ．サイトカイン、
ｂ．インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８などの、ＩＬ、
ｃ．抗ＴＮＦα抗体、ＩＬ−４に対する抗体、ＩＬ−５に対する抗体、ＩＬ−１３に対する抗体、ＩＬ−１５に対する抗体、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に対する抗体などの、抗体またはその断片、
ｄ．プロインスリン（ＰＩＮＳ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ６５）、インスリノーマ関連タンパク質２（ＩＡ−２）、膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ触媒性サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ）、亜鉛トランスポーター８（ＺｎＴ８）、クロモグラニンＡ、（プレプロ）膵島アミロイドポリペプチド（ｐｐＩＡＰＰ）、ペリフェリン、シトルリン化グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ）、樹木花粉アレルゲン（カバノキ花粉アレルゲンまたはスギ花粉アレルゲンなど）、雑草花粉アレルゲン、草花粉アレルゲン、食物アレルゲン（ピーナッツアレルゲン、乳アレルゲン、卵アレルゲン、グルテンアレルゲン（グリアジンエピトープ）、チリダニアレルゲン、カビアレルゲン、動物鱗屑アレルゲンなどの、抗原、
ｅ．グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）、グルカゴン、エキセンジン−４、上皮成長因子および成長ホルモンなどの、ホルモン、
ｆ．ＴＦＦ１、ＴＦＦ２、およびＴＦＦ３などの、ＴＦＦ、
ｇ．フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、アミノ酸デカルボキシラーゼなどの、酵素、ならびに
ｈ．任意のこれらの組合せ
から選択される少なくとも１つの治療用ポリペプチドをコードする外因性核酸をさらに含む、請求項１に記載の菌。
［１１］
少なくとも１つの治療用ポリペプチドがＰＡＬである、請求項１０に記載の菌。
［１２］
少なくとも１つの治療用ポリペプチドをコードする前記外因性核酸がｇａｐＢプロモーター（ＰｇａｐＢ）によって転写調節される、請求項１０に記載の菌。
［１３］
ラクトバチルス（Lactobacillus）種細菌、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）種細菌、ストレプトコッカス（Streptococcus）種細菌、およびエンテロコッカス（Enterococcus）種細菌、およびラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）などのラクトコッカス（Lactococcus）種細菌からなる群から選択される、請求項１に記載のＬＡＢ。
［１４］
融合タンパク質をコードする外因性核酸を含む前記菌が、前記融合タンパク質をコードする前記外因性核酸を含まない対応する菌と比べた時に、
ａ．少なくとも１０％増加した胃腸（ＧＩ）通過時間、および／または
ｂ．少なくとも１０％増加した腸粘膜への付着、および／または
ｃ．少なくとも２０％増加したｉｎ  ｖｉｔｒｏムチン結合能力、および／または
ｄ．少なくとも１０％増加したｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃａｃｏ−２細胞結合能力
を有する、請求項１に記載の菌。
［１５］
ａ．大腸菌（Escherichia coli）ｏｔｓＢの挿入、
ｂ．ｕｓｐ４５プロモーター、ｕｓｐ４５、およびトレハロース−６−リン酸ホスファターゼをコードする外因性核酸、および任意選択で、前記ｕｓｐ４５とトレハロース−６−リン酸ホスファターゼをコードする前記外因性核酸との間の、ｒｐｍＤなどの、遺伝子間領域を含むポリシストロン性発現カセットの挿入、
ｃ．ｈｌｌＡプロモーター（ＰｈｌｌＡ）の３’に位置する、トレハローストランスポーターｌｌｍｇ＿０４５３およびｌｌｍｇ＿０４５４を含むポリシストロン性発現カセットの挿入、
ｄ．ｔｒｅＰＰの不活性化、
ｅ．ｐｔｃＣの不活性化、ならびに
ｆ．（ａ）〜（ｅ）のいずれかの組合せ
から選択される、トレハロース蓄積を増加させる少なくとも１つの変異または挿入をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の菌。
［１６］
先行請求項１のいずれか１項に記載の菌、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
［１７］
自己免疫疾患、アレルギー、代謝性疾患、および胃腸疾患からなる群から選択される疾患の治療または予防における、請求項１から１５のいずれか１項に記載の菌、または請求項１６に記載の医薬組成物の使用。
［１８］
自己免疫疾患、アレルギー、代謝性疾患、胃腸疾患、および栄養欠陥からなる群から選択される疾患の治療または予防のための医薬の調製のための、請求項１から１５のいずれか１項に記載の菌、または請求項１６に記載の医薬組成物の使用。
［１９］
それを必要とする対象において疾患を治療する方法であって、前記対象に治療有効量の請求項１から１５のいずれか１項に記載の菌、または請求項１６に記載の組成物を投与することを含み、前記疾患が、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、セリアック病、炎症性腸疾患、およびフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）から選択される、方法。
［２０］
ａ．細胞および粘液結合プロテインＡ（ＣｍｂＡ）、Ｍｕｂ、ＭａｐＡ、ＭｂｐＬ、および任意のこれらの組合せからなる群から選択される細胞付着ポリペプチドをコードする配列、ならびに
ｂ．ＴＦＦポリペプチド、ＭｕｂＢＰ、およびこれらの組合せから選択されるムチン結合ポリペプチドをコードする配列
を含む、融合タンパク質をコードする核酸。