【手続補正書】
【提出日】令和2年1月17日(2020.1.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体試料中のエンテロコッカス属種、クレブシエラ・ニューモニエ(K.ニューモニエ)細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、又は黄色ブドウ球菌細胞の存在を検出する方法であって、
(a)液体試料中の細胞を溶解させて、溶解物を形成するステップ、
(b)(i)溶解物中のエンテロコッカス属の標的核酸を、オリゴヌクレオチド配列:5'-GGT AGC TAT GTA GGG AAG GGA TAA ACG CTG A-3'(配列番号3)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-GCG CTA AGG AGC TTA ACT TCT GTG TTC G-3'(配列番号4)を含むリバースプライマーの存在下で増幅して、エンテロコッカス属の単位複製配列を含む増幅溶解物を形成するステップ、
(ii)溶解物中のK.ニューモニエの標的核酸を、オリゴヌクレオチド配列:5'-GAC GGT TGT CCC GGT TTA AGC A-3'(配列番号5)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-GCT GGT ATC TTC GAC TGG TCT-3'(配列番号6)を含むリバースプライマーの存在下で増幅して、K.ニューモニエの単位複製配列を含む増幅溶解物を形成するステップ、
(iii)溶解物中の緑膿菌の標的核酸を、オリゴヌクレオチド配列5'-AGG CTG GGT GTG TAA GCG TTG T-3'(配列番号7)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列5'-CAA GCA ATT CGG TTG GAT ATC CGT T-3'(配列番号8)を含むリバースプライマーの存在下で増幅して、緑膿菌の単位複製配列を含む増幅溶解物を形成するステップ、
(iv)溶解物中の大腸菌の標的核酸を、オリゴヌクレオチド配列:5'-GCA TTA ATC GAC GGT ATG GTT GAC C-3'(配列番号59)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-CCT GCT GAA ACA GGT TTT CCC ACA TA-3'(配列番号61)を含むリバースプライマーの存在下で増幅して、大腸菌の単位複製配列を含む増幅溶解物を形成するステップ、又は
(v)溶解物中の黄色ブドウ球菌の標的核酸を、第1のプライマー対又は第2のプライマー対の存在下で増幅して、黄色ブドウ球菌の単位複製配列を含む増幅溶解物を形成するステップであって、第1のプライマー対が、オリゴヌクレオチド配列:5'-GGT AAT GAA TTA CCT/i6diPr/TC TCT GCT GGTTTC TTC TT-3'(配列番号9)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-ACC AGC ATC TTC/i6diPr/GC ATC TTC TGT AAA-3'(配列番号10)を含むリバースプライマーを含み、かつ第2のプライマー対が、オリゴヌクレオチド配列:5'-GAA GTT ATG TTT/i6diPr/CT ATT CGA ATC GTG GTC CAGT-3'(配列番号11)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-GTT GTA AAG CCA TGA TGC TCG TAA CCA-3'(配列番号12)を含むリバースプライマーを含む、ステップ
(c)ステップ(b)に続き、磁性粒子を増幅溶解物へと添加して、混合物を形成するステップであって、磁性粒子が、それらの表面上に結合性部分を含み、結合性部分が、エンテロコッカス属の単位複製配列、K.ニューモニエの単位複製配列、緑膿菌の単位複製配列、大腸菌の単位複製配列、又は黄色ブドウ球菌の単位複製配列の存在下で、磁性粒子の凝集を変更するように作動する、ステップ、
(d)混合物を、デバイス内の検出チューブに用意するステップであって、デバイスが、混合物を含む検出チューブを保持するウェルを規定する支持体を含み、かつ混合物を、1つ以上の磁石及びRFパルス列を使用して創出されたバイアス磁界へと曝露することによりもたらされる信号を検出するように構成されたRFコイルを有する、ステップ、
(e)混合物を、バイアス磁界及びRFパルス列へと曝露するステップ、
(f)ステップ(e)に続き、検出チューブからの信号を測定するステップ、並びに
(g)ステップ(f)の結果に基づき、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、又は黄色ブドウ球菌細胞が、液体試料中に存在していたかどうかを決定するステップ
を含む方法。
【請求項２】
磁性粒子が、第1のプローブへとコンジュゲートされた、磁性粒子の第1の集団、及び第2のプローブへとコンジュゲートされた、磁性粒子の第2の集団を含み、第1のプローブが、エンテロコッカス属の単位複製配列の第1のセグメントに結合するように作動し、かつ第2のプローブが、エンテロコッカス属の単位複製配列の第2のセグメントに結合するように作動し、磁性粒子が、エンテロコッカス属の単位複製配列の存在下で、凝集物を形成する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
種が、エンテロコッカス・フェシウムであり、かつ第1のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-AAA ACT TAT GTG ACT TCA AAT CCA GTT TT-3'(配列番号111)を含み、かつ第2のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-TTT ACT CAA TAA AAG ATA ACA CCA CAG T-3'(配列番号112)を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
磁性粒子が、第1のプローブへとコンジュゲートされた、磁性粒子の第1の集団、及び第2のプローブへとコンジュゲートされた、磁性粒子の第2の集団を含み、第1のプローブが、K.ニューモニエの単位複製配列の第1のセグメントに結合するように作動し、かつ第2のプローブが、K.ニューモニエの単位複製配列の第2のセグメントに結合するように作動し、磁性粒子が、K.ニューモニエの単位複製配列の存在下で、凝集物を形成する、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
第1のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-TAC CAA GGC GCT TGA GAG AAC TC-3'(配列番号27)を含み、かつ第2のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-CTG GTG TGT AGG TGA AGT C-3'(配列番号28)を含む、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
磁性粒子が、第1のプローブへとコンジュゲートされた、磁性粒子の第1の集団、及び第2のプローブへとコンジュゲートされた、磁性粒子の第2の集団を含み、第1のプローブが、緑膿菌の単位複製配列の第1のセグメントに結合するように作動し、かつ第2のプローブが、緑膿菌の単位複製配列の第2のセグメントに結合するように作動し、磁性粒子が、緑膿菌の単位複製配列の存在下で、凝集物を形成する、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
第1のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-TCT GAC GAT TGT GTG TTG TAA GG-3'(配列番号114)を含み、かつ第2のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-GGA TAG ACG TAA GCC CAA GC-3'(配列番号115)を含む、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
磁性粒子が、第1のプローブへとコンジュゲートされた、磁性粒子の第1の集団、及び第2のプローブへとコンジュゲートされた、磁性粒子の第2の集団を含み、第1のプローブが、大腸菌の単位複製配列の第1のセグメントに結合するように作動し、かつ第2のプローブが、大腸菌の単位複製配列の第2のセグメントに結合するように作動し、磁性粒子が、大腸菌の単位複製配列の存在下で、凝集物を形成する、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
第1のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-AGT GAT GAT GAG TTG TTT GCC AGT G-3'(配列番号63)を含み、かつ第2のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-TGA ATT GTC GCC GCG TGA CCA G-3'(配列番号64)を含む、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
磁性粒子が、第1のプローブへとコンジュゲートされた、磁性粒子の第1の集団、及び第2のプローブへとコンジュゲートされた、磁性粒子の第2の集団を含み、第1のプローブが、黄色ブドウ球菌の単位複製配列の第1のセグメントに結合するように作動し、かつ第2のプローブが、黄色ブドウ球菌の単位複製配列の第2のセグメントに結合するように作動し、磁性粒子が、黄色ブドウ球菌の単位複製配列の存在下で、凝集物を形成する、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ(b)が、黄色ブドウ球菌の標的核酸を、第1のプライマー対の存在下で増幅することを含み、かつ第1のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-CCA TTT GAA GTT GTT TAT TAT GC-3'(配列番号35)を含み、かつ第2のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-GGG AAA TGA TTA ATT ATG CAT TAA ATC-3'(配列番号36)を含む、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ(b)が、黄色ブドウ球菌の標的核酸を、第2のプライマー対の存在下で増幅することを含み、かつ第1のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-TT TTT CAG ATT TAG GAT TAG TTG ATT-3'(配列番号39)を含み、かつ第2のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-GAT CCG TAT TGG TTA TAT CAT C-3'(配列番号40)を含む、請求項10に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ(b)が、第1の黄色ブドウ球菌の標的核酸を、第1のプライマー対の存在下で増幅して、第1の黄色ブドウ球菌の単位複製配列を形成すること、及び第2の黄色ブドウ球菌の標的核酸を、第2のプライマー対の存在下で増幅して、第2の黄色ブドウ球菌の単位複製配列を形成することを含み、かつステップ(g)が、第1の黄色ブドウ球菌の単位複製配列及び第2の黄色ブドウ球菌の単位複製配列を検出することを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
磁性粒子が、第1のプローブ及び第2のプローブへとコンジュゲートされた、磁性粒子の第1の集団、並びに第3のプローブ及び第4のプローブへとコンジュゲートされた、磁性粒子の第2の集団を含み、
第1のプローブ及び第3のプローブが、第1の黄色ブドウ球菌の単位複製配列の第1のセグメント及び第2のセグメントにそれぞれ結合するように作動し、かつ
第2のプローブ及び第4のプローブが、第2の黄色ブドウ球菌の単位複製配列の第1のセグメント及び第2のセグメントにそれぞれ結合するように作動し、
磁性粒子が、第1の黄色ブドウ球菌の単位複製配列の存在下で、凝集物を形成し、第2の黄色ブドウ球菌の単位複製配列の存在下で、凝集物を形成する、
請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
第1のプローブが、配列番号35のオリゴヌクレオチド配列を含み、第2のプローブが、配列番号39のオリゴヌクレオチド配列を含み、かつ第3のプローブが、配列番号36のオリゴヌクレオチド配列を含み、かつ第4のプローブが、配列番号40のオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ(b)が、少なくとも第3の単位複製配列の生成を結果としてもたらす、請求項13から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
第3の単位複製配列が、配列番号35のオリゴヌクレオチド配列に作動可能に結合する第1の領域、配列番号39のオリゴヌクレオチド配列に作動可能に結合する第2の領域、配列番号36のオリゴヌクレオチド配列に作動可能に結合する第3の領域、及び配列番号40のオリゴヌクレオチド配列に作動可能に結合する第4の領域を含む、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
第3の単位複製配列が、第1の単位複製配列のヌクレオチド配列及び第2の単位複製配列のヌクレオチド配列を含む、請求項16又は請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
第3の単位複製配列が、鎖合成の部分的なランスルーにより生成される、請求項16から18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
方法のステップ(a)から(g)が、3時間以内に完了する、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
液体試料中の10コロニー形成単位(CFU)/mL、3 CFU/mL、又は1 CFU/mLの濃度のA.バウマニ、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ、緑膿菌、又は黄色ブドウ球菌を検出することが可能である、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
液体試料が、全血、尿、液体生検、滑液、皮膚生検、脳脊髄液、痰、胃洗浄液、気管支肺胞洗浄液、又はホモジナイズされた組織から選択される、請求項1から21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
液体試料が、全血である、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
ステップ(a)が、対象に由来する全血試料中の赤血球を溶解させること、試料を遠心分離して、上清及びペレットを形成すること、上清の一部又は全部を廃棄すること、場合によりペレットを洗浄すること、並びにペレット中の細胞を溶解させて、溶解物を形成することを含む、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
ステップ(b)が、液体試料へと、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子を添加することを含む、請求項1から24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
液体試料中の種の存在を検出する方法であって、
(a)液体試料中の、第1の標的核酸及び第2の標的核酸を増幅して、第1の単位複製配列及び第2の単位複製配列を含む溶液を形成するステップであって、各標的核酸が、検出される種に特徴的である、ステップ、
(b)磁性粒子を液体試料へと添加して、混合物を形成するステップであって、磁性粒子が、それらの表面上に結合性部分を含み、結合性部分が、第1の単位複製配列又は第2の単位複製配列の存在下で、磁性粒子の凝集を変更するように作動する、ステップ、
(c)混合物を、デバイス内の検出チューブに用意するステップであって、デバイスが、混合物を含む検出チューブを保持するウェルを規定する支持体を含み、かつ混合物を、1つ以上の磁石及びRFパルス列を使用して創出されたバイアス磁界へと曝露することによりもたらされる信号を検出するように構成されたRFコイルを有する、ステップ、
(d)混合物を、バイアス磁界及びRFパルス列へと曝露するステップ、
(e)ステップ(d)に続き、信号を測定するステップ、並びに
(f)ステップ(e)の結果に基づき、種が、液体試料中に存在していたかどうかを決定するステップ
を含む方法。
【請求項２７】
種が、植物種、哺乳動物種、又は微生物種である、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
第1の標的核酸を、フォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、第1のプライマー対の存在下で増幅し、第2の標的核酸を、フォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、第2のプライマー対の存在下で増幅する、請求項26又は27に記載の方法。
【請求項２９】
磁性粒子が、第1のプローブ及び第2のプローブへとコンジュゲートされた、磁性粒子の第1の集団、並びに第3のプローブ及び第4のプローブへとコンジュゲートされた、磁性粒子の第2の集団を含み、
第1のプローブ及び第3のプローブが、第1の単位複製配列の第1のセグメント及び第2のセグメントにそれぞれ結合するように作動し、かつ
第2のプローブ及び第4のプローブが、第2の単位複製配列の第1のセグメント及び第2のセグメントにそれぞれ結合するように作動し、
磁性粒子が、第1の単位複製配列の存在下で、凝集物を形成し、かつ第2の単位複製配列の存在下で、凝集物を形成する、
請求項26から28のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ステップ(a)が、第3の単位複製配列を増幅することをさらに含み、第3の単位複製配列が、第1の標的核酸の核酸配列及び第2の標的核酸の核酸配列を含む核酸配列を含む、請求項26から29のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
第1の標的核酸及び第2の標的核酸が、染色体又はプラスミド上に位置する、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
第1の標的核酸及び第2の標的核酸が、約10〜約1000塩基対によって隔てられている、請求項30又は31に記載の方法。
【請求項３３】
第3の単位複製配列が、鎖合成の部分的なランスルーにより生成される、請求項30から32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
(i)方法が、液体試料中の10コロニー形成単位(CFU)/mL、3 CFU/mL、又は1 CFU/mLの濃度の微生物種を検出することが可能であり、(ii)方法のステップ(a)から(f)が、3時間以内に完了し、及び／又は(iii)微生物種が、A.バウマニ、E.フェカリス、E.フェシウム、K.ニューモニエ、緑膿菌、大腸菌、及び黄色ブドウ球菌から選択される、請求項27から33のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
液体試料が、全血、尿、液体生検、滑液、皮膚生検、脳脊髄液、痰、胃洗浄液、気管支肺胞洗浄液、又はホモジナイズされた組織から選択される、請求項26から34のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
液体試料が、全血である、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
(i)方法が、ステップ(a)の前に、対象に由来する全血試料を用意するステップ、全血試料中の赤血球を溶解させるステップ、試料を遠心分離して、上清及びペレットを形成するステップ、上清の一部又は全部を廃棄するステップ、場合によりペレットを洗浄するステップ、並びにペレット中の細胞を溶解させて、溶解物を形成するステップをさらに含み、及び／又は(ii)ステップ(b)が、液体試料へと、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子を添加することを含む、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
(i)磁性粒子が、700nm〜950nmの平均直径を有し、
(ii)磁性粒子が、粒子1つ当たり1×109〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、
(iii)磁性粒子が、実質的に単分散であり、
(iv)増幅が、非対称ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により実施される、
請求項1から37のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
(a1)(i)エンテロコッカス属の標的核酸を含有することが疑われるか、若しくは
(ii)エンテロコッカス属の標的核酸を増幅することにより生成された、エンテロコッカス属の単位複製配列を含有する、
液体試料、並びに
(b1)液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、
磁性粒子は、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、
磁性粒子は、オリゴヌクレオチド配列:5'-AAA ACT TAT GTG ACT TCA AAT CCA GTT TT-3'(配列番号111)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートされた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-TTT ACT CAA TAA AAG ATA ACA CCA CAG T-3'(配列番号112)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートされた、磁性粒子の第2の集団を含み、
場合により、エンテロコッカス属の標的核酸が、エンテロコッカス・フェシウムの標的核酸である、
磁性粒子、又は
(a2)(i)K.ニューモニエの標的核酸を含有することが疑われるか、又は
(ii)K.ニューモニエの標的核酸を増幅することにより生成された、K.ニューモニエの単位複製配列を含有する、
液体試料、並びに
(b2)液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、
磁性粒子は、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、
磁性粒子は、オリゴヌクレオチド配列:5'-TAC CAA GGC GCT TGA GAG AAC TC-3'(配列番号27)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートされた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-CTG GTG TGT AGG TGA AGT C-3'(配列番号28)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートされた、磁性粒子の第2の集団を含む、
磁性粒子、又は
(a3)(i)緑膿菌の標的核酸を含有することが疑われるか、又は
(ii)緑膿菌の標的核酸を増幅することにより生成された、緑膿菌の単位複製配列を含有する、
液体試料、並びに
(b3)液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、
磁性粒子は、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、
磁性粒子は、オリゴヌクレオチド配列:5'-TCT GAC GAT TGT GTG TTG TAA GG-3'(配列番号114)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートされた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-GGA TAG ACG TAA GCC CAA GC-3'(配列番号115)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートされた、磁性粒子の第2の集団を含む、
磁性粒子、又は
(a4)(i)大腸菌の標的核酸を含有することが疑われるか、又は
(ii)大腸菌の標的核酸を増幅することにより生成された、大腸菌の単位複製配列を含有する、
液体試料、並びに
(b4)液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、
磁性粒子は、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、
磁性粒子は、オリゴヌクレオチド配列:5'-AGT GAT GAT GAG TTG TTT GCC AGT G-3'(配列番号63)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートされた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-TGA ATT GTC GCC GCG TGA CCA G-3'(配列番号64)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートされた、磁性粒子の第2の集団を含む、
磁性粒子、又は
(a5)(i)黄色ブドウ球菌の標的核酸を含有することが疑われるか、又は
(ii)黄色ブドウ球菌の標的核酸を増幅することにより生成された、黄色ブドウ球菌の単位複製配列を含有する、
液体試料、並びに
(b5)液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、
磁性粒子は、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、
磁性粒子は、オリゴヌクレオチド配列:5'-CCA TTT GAA GTT GTT TAT TAT GC-3'(配列番号35)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートされた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-GGG AAA TGA TTA ATT ATG CAT TAA ATC-3'(配列番号36)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートされた、磁性粒子の第2の集団を含む、
磁性粒子、又は
(a6)(i)黄色ブドウ球菌の標的核酸を含有することが疑われるか、又は
(ii)増幅反応から生成された、黄色ブドウ球菌の標的核酸の単位複製配列を含有する、
液体試料、並びに
(b6)液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、
磁性粒子は、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、
磁性粒子は、オリゴヌクレオチド配列:5'-TT TTT CAG ATT TAG GAT TAG TTG ATT-3'(配列番号39)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートされた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-GAT CCG TAT TGG TTA TAT CAT C-3'(配列番号40)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートされた、磁性粒子の第2の集団を含む、
磁性粒子、又は
(a7)(i)黄色ブドウ球菌の標的核酸を含有することが疑われるか、又は
(ii)増幅反応から生成された、黄色ブドウ球菌の標的核酸の単位複製配列を含有する、
液体試料、並びに
(b7)液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、
磁性粒子は、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、
磁性粒子は、第1の集団及び第2の集団を含み、第1の集団が、それらの表面へとコンジュゲートされた、第1の核酸プローブ及び第2の核酸プローブを有し、かつ第2の集団が、それらの表面へとコンジュゲートされた、第3の核酸プローブ及び第4の核酸プローブを有し、
第1の核酸プローブが、配列番号35のオリゴヌクレオチド配列を含み、第2の核酸プローブが、配列番号39のオリゴヌクレオチド配列を含み、第3の核酸プローブが、配列番号36のオリゴヌクレオチド配列を含み、かつ第4の核酸プローブが、配列番号40のオリゴヌクレオチド配列を含む、
磁性粒子
を含む組成物。
【請求項４０】
(a)(i)第1の標的核酸及び第2の標的核酸を含有することが疑われ、各々の標的核酸が、微生物種に特徴的であるか、又は
(ii)第1の標的核酸及び第2の標的核酸を増幅することにより生成された、第1の単位複製配列及び第2の単位複製配列を含有する、
液体試料、並びに
(b)液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、
磁性粒子は、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、かつそれらの表面へとコンジュゲートされた結合性部分を有し、
磁性粒子は、第1の単位複製配列に作動可能に結合して、凝集物を形成することが可能であり、かつ第2の単位複製配列に結合して、凝集物を形成することが可能であり、
場合により、磁性粒子は、第1のプローブ及び第2のプローブへとコンジュゲートされた、磁性粒子の第1の集団、並びに第3のプローブ及び第4のプローブへとコンジュゲートされた、磁性粒子の第2の集団を含み、
第1のプローブ及び第3のプローブが、第1の標的核酸の第1のセグメント及び第2のセグメントにそれぞれ結合するように作動し、かつ第2のプローブ及び第4のプローブが、第2の標的核酸の第1のセグメント及び第2のセグメントにそれぞれ結合するように作動し、
場合により、磁性粒子は、粒子1つ当たり1×109〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有する、
磁性粒子
を含む組成物。
【請求項４１】
全血試料中の標的核酸を増幅する方法によって作製される増幅溶解物溶液であって、
前記方法は、
(a)対象に由来する、1つ以上の細菌細胞を含有することが疑われる全血試料中の赤血球を溶解させることにより作製される、第1の試料を用意し、第1の試料を遠心分離して、上清及びペレットを形成し、上清の一部又は全部を廃棄し、及びペレットを再懸濁させるステップ、
(b)ペレット中に残存する細胞を溶解させて、対象細胞の核酸及び細菌の核酸の両方を含む溶解物を形成するステップ、並びに
(c)ステップ(b)の溶解物を検出チューブ内に用意し、以下:
(i)オリゴヌクレオチド配列:5'-GGT AGC TAT GTA GGG AAG GGA TAA ACG CTG A-3'(配列番号3)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-GCG CTA AGG AGC TTA ACT TCT GTG TTC G-3'(配列番号4)を含むリバースプライマーを含む、エンテロコッカス属の標的核酸を増幅するプライマー対、
(ii)オリゴヌクレオチド配列:5'-GAC GGT TGT CCC GGT TTA AGC A-3'(配列番号5)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-GCT GGT ATC TTC GAC TGG TCT-3'(配列番号6)を含むリバースプライマーを含む、K.ニューモニエの標的核酸を増幅するプライマー対、
(iii)オリゴヌクレオチド配列5'-AGG CTG GGT GTG TAA GCG TTG T-3'(配列番号7)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列5'-CAA GCA ATT CGG TTG GAT ATC CGT T-3'(配列番号8)を含むリバースプライマーを含む、緑膿菌の標的核酸を増幅するプライマー対、
(iv)オリゴヌクレオチド配列:5'-GCA TTA ATC GAC GGT ATG GTT GAC C-3'(配列番号59)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-CCT GCT GAA ACA GGT TTT CCC ACA TA-3'(配列番号61)を含むリバースプライマーを含む、大腸菌の標的核酸を増幅するプライマー対、並びに/又は
(v)黄色ブドウ球菌の標的核酸を増幅する、第1のプライマー対及び/若しくは第2のプライマー対であって、第1のプライマー対が、オリゴヌクレオチド配列:5'-GGT AAT GAA TTA CCT/i6diPr/TC TCT GCT GGTTTC TTC TT-3'(配列番号9)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-ACC AGC ATC TTC/i6diPr/GC ATC TTC TGT AAA-3'(配列番号10)を含むリバースプライマーを含み、かつ第2のプライマー対が、オリゴヌクレオチド配列:5'-GAA GTT ATG TTT/i6diPr/CT ATT CGA ATC GTG GTC CAGT-3'(配列番号11)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-GTT GTA AAG CCA TGA TGC TCG TAA CCA-3'(配列番号12)を含むリバースプライマーを含む、第1のプライマー対及び/若しくは第2のプライマー対
から選択される、1つ以上のプライマー対を使用して、その中の標的の細菌核酸を増幅して、増幅溶解物溶液を形成するステップ
を含み、
場合により、ステップ(c)の増幅することが、溶解物中の黄色ブドウ球菌の標的核酸を、第1のプライマー対若しくは第２のプライマー対の存在下で増幅することを含み、又はステップ(c)の増幅することが、2つの黄色ブドウ球菌の標的核酸を、第1のプライマー対及び第2のプライマー対の存在下で増幅して、第1の単位複製配列及び第2の単位複製配列を生成させることを含み、さらに場合により、ステップ(c)の増幅することが、第3の単位複製配列の生成を結果としてもたらし、第3の単位複製配列の核酸配列が、第1の単位複製配列の核酸配列及び第2の単位複製配列の核酸配列を含み、さらに場合により、前記全血試料中の10 CFU/mL以下、5 CFU/mL以下、3 CFU/mL以下、若しくは1 CFU/mLの細菌が、標的の細菌核酸の増幅を可能とするのに十分である、
前記増幅溶解物溶液。
【請求項４２】
全血試料中の標的核酸を増幅する方法によって作製される増幅溶解物溶液であって、
前記方法は、
(a)対象に由来する、1つ以上の細菌細胞を含有することが疑われる全血試料中の赤血球を溶解させることにより作製される、第1の試料を用意し、第1の試料を遠心分離して、上清及びペレットを形成し、上清の一部又は全部を廃棄し、及びペレットを再懸濁させるステップ、
(b)ペレット中に残存する細胞を溶解させて、対象細胞の核酸及び細菌の核酸の両方を含む溶解物を形成するステップ、並びに
(c)ステップ(b)の溶解物を検出チューブ内に用意し、その中の2つ以上の標的の細菌核酸を増幅して、2つ以上の細菌の単位複製配列を含む増幅溶解物溶液を形成するステップであって、前記全血試料中の10 CFU/mL以下の細菌が、前記2つ以上の標的の細菌核酸の増幅を可能とするのに十分である、ステップ
を含み、
場合により、2つ以上の標的の細菌核酸が、単一の細菌病原体に特徴的であり、さらに場合により、ステップ(c)の増幅することが、第3の単位複製配列の生成を結果としてもたらし、場合により、第3の単位複製配列が、鎖合成の部分的なランスルーにより生成される、
前記増幅溶解物溶液。
【請求項４３】
(i)ステップ(a)が、先行する洗浄ステップを伴わずに、ペレットを再懸濁させることを含み、
(ii)ステップ(a)が、ペレットを再懸濁させる前に、洗浄ステップを含み、
(iii)前記全血試料中の約10 CFU/mL以下、約5 CFU/mL以下、約3 CFU/mL以下、又は約1 CFU/mLの細菌が、前記2つ以上の標的の細菌核酸の増幅を可能とするのに十分である、
請求項41又は42に記載の増幅溶解物溶液。
【請求項４４】
(a)(i)赤血球を溶解させ、(ii)試料を遠心分離して、上清及びペレットを形成し、(iii)上清の一部又は全部を廃棄し、及び(iv)洗浄せずに、残余の細胞を溶解させて、抽出物を形成することにより調製される、細菌病原体を含有することが疑われる全血試料からの抽出物の一部、
(b)配列番号110、3、5、7、9、11、又は59のうちのいずれか1つと、少なくとも80%、少なくとも90%、又は少なくとも95%同一であるオリゴヌクレオチド配列を含む、又は配列番号110、3、5、7、9、11、又は59のうちのいずれか1つから選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、フォワードプライマー、
(c)配列番号2、4、6、8、10、12、又は61のうちのいずれか1つと、少なくとも80%、少なくとも90%、又は少なくとも95%同一であるオリゴヌクレオチド配列を含む、又は配列番号2、4、6、8、10、12、又は61のうちのいずれか1つから選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、リバースプライマー、
(d)熱安定性ポリメラーゼ、並びに
(e)デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝液、及びマグネシウム
を含む組成物。
【請求項４５】
複数のウェルを含む着脱式カートリッジであって、
前記着脱式カートリッジは、以下:
(a)請求項39の(a1)及び(b2)に記載の組成物を含む第1のウェル、
(b)請求項39の(a2)及び(b2)に記載の組成物を含む第2のウェル、
(c)請求項39の(a3)及び(b3)に記載の組成物を含む第3のウェル、
(d)請求項39の(a4)及び(b4)に記載の組成物を含む第4のウェル、
(e)請求項39の(a7)及び(b7)に記載の組成物を含む第5のウェル
のうちの1つ以上を含み、
場合により、前記着脱式カートリッジは、(a)から(e)を含み、場合により、1つ以上のアッセイ試薬を保持する、複数の試薬モジュールを保持する、1つ以上のチャンバーをさらに含み、場合により、細胞を溶解させるビーズを含むチャンバーをさらに含み、場合により、ポリメラーゼを含むチャンバーをさらに含み、場合により、1つ以上のプライマーを含むチャンバーをさらに含み、さらに場合により、1つ以上のプライマーが、配列番号1〜14、59、61、及び110から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、
前記着脱式カートリッジ。
【請求項４６】
対象における血流感染又は敗血症を診断する方法であって、
前記方法は、
請求項25又は34に記載の方法に従い、患者から得られた液体試料中において、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、又は黄色ブドウ球菌細胞の存在を検出するステップ
を含み、
液体試料中の、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、又は黄色ブドウ球菌細胞の存在が、対象を、血流感染又は敗血症を有しうる対象として同定し、場合により、前記方法は、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、及び黄色ブドウ球菌細胞のうちの少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、又は5つ全部の存在を検出するステップを含み、場合により、エンテロコッカス属種が、エンテロコッカス・フェシウムである、
前記方法。
【請求項４７】
対象における血流感染又は敗血症を診断する方法であって、
前記方法は、請求項26から38のいずれか一項に記載の方法に従い、患者から得られた液体試料中において、微生物種の存在を検出するステップを含み、
液体試料中の微生物種の存在が、対象を、血流感染又は敗血症を有しうる対象として同定する、
前記方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
本発明の他の特色及び利点については、以下の詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲から明らかであろう。
本発明はまた、以下に関する。
［項目１］
液体試料中のアシネトバクター・バウマニ(A.バウマニ)細胞の存在を検出する方法であって、
(a)液体試料中の細胞を溶解させて、溶解物を形成するステップ、
(b)溶解物中のA.バウマニの標的核酸を、オリゴヌクレオチド配列:5'-GGA AGG GAT CAG GTG GTT CAC TCT T-3'(配列番号110)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-AGG ACG TTG ATA GG TTG GAT GTG GA-3'(配列番号2)を含むリバースプライマーの存在下で増幅して、A.バウマニの単位複製配列を含む増幅溶解物を形成するステップ、
(c)ステップ(b)に続き、磁性粒子を増幅溶解物へと添加して、混合物を形成するステップであって、磁性粒子が、それらの表面上に結合性部分を含み、結合性部分が、A.バウマニの単位複製配列の存在下で、磁性粒子の凝集を変更するように作動するステップ、
(d)混合物を、デバイス内の検出チューブに用意するステップであって、デバイスが、混合物を含む検出チューブを保持するウェルを規定する支持体を含み、混合物を、1つ以上の磁石及びRFパルス列を使用して創出されたバイアス磁界へと曝露することによりもたらされる信号を検出するように構成されたRFコイルを有するステップ、
(e)混合物を、バイアス磁界及びRFパルス列へと曝露するステップ、
(f)ステップ(e)に続き、検出チューブからの信号を測定するステップ、並びに
(g)ステップ(f)の結果に基づき、A.バウマニ細胞が、液体試料中に存在したかどうかを決定するステップ
を含む方法。
［項目２］
磁性粒子が、第1のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及び第2のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含み、第1のプローブが、A.バウマニの単位複製配列の第1のセグメントに結合するように作動し、第2のプローブが、A.バウマニの単位複製配列の第2のセグメントに結合するように作動し、磁性粒子が、A.バウマニの単位複製配列の存在下で、凝集物を形成する、項目1に記載の方法。
［項目３］
第1のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-TGA GGC TTG ACT ATA CAA CAC C-3'(配列番号15)を含み、第2のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-CTA AAA TGA ACA GAT AAA GTA AGA TTC AA-3'(配列番号16)を含む、項目2に記載の方法。
［項目４］
液体試料中のエンテロコッカス属種の存在を検出する方法であって、
(a)液体試料中の細胞を溶解させて、溶解物を形成するステップ、
(b)溶解物中のエンテロコッカス属の標的核酸を、オリゴヌクレオチド配列:5'-GGT AGC TAT GTA GGG AAG GGA TAA ACG CTG A-3'(配列番号3)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-GCG CTA AGG AGC TTA ACT TCT GTG TTC G-3'(配列番号4)を含むリバースプライマーの存在下で増幅して、エンテロコッカス属の単位複製配列を含む増幅溶解物を形成するステップ、
(c)ステップ(b)に続き、磁性粒子を増幅溶解物へと添加して、混合物を形成するステップであって、磁性粒子が、それらの表面上に結合性部分を含み、結合性部分が、エンテロコッカス属の単位複製配列の存在下で、磁性粒子の凝集を変更するように作動するステップ、
(d)混合物を、デバイス内の検出チューブに用意するステップであって、デバイスが、混合物を含む検出チューブを保持するウェルを規定する支持体を含み、混合物を、1つ以上の磁石及びRFパルス列を使用して創出されたバイアス磁界へと曝露することによりもたらされる信号を検出するように構成されたRFコイルを有するステップ、
(e)混合物を、バイアス磁界及びRFパルス列へと曝露するステップ、
(f)ステップ(e)に続き、検出チューブからの信号を測定するステップ、並びに
(g)ステップ(f)の結果に基づき、エンテロコッカス属種が、液体試料中に存在したかどうかを決定するステップ
を含む方法。
［項目５］
磁性粒子が、第1のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及び第2のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含み、第1のプローブが、エンテロコッカス属の単位複製配列の第1のセグメントに結合するように作動し、第2のプローブが、エンテロコッカス属の単位複製配列の第2のセグメントに結合するように作動し、磁性粒子が、エンテロコッカス属の単位複製配列の存在下で、凝集物を形成する、項目4に記載の方法。
［項目６］
種が、エンテロコッカス・フェシウムであり、第1のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-AAA ACT TAT GTG ACT TCA AAT CCA GTT TT-3'(配列番号111)を含み、第2のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-TTT ACT CAA TAA AAG ATA ACA CCA CAG T-3'(配列番号112)を含む、項目5に記載の方法。
［項目７］
種が、エンテロコッカス・フェカリスであり、第1のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-TGG ATA AGT AAA AGC AAC TTG GTT-3'(配列番号23)を含み、第2のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-AAT GAA GAT TCA ACT CAA TAA GAA ACA ACA-3'(配列番号24)を含む、項目5に記載の方法。
［項目８］
液体試料中のクレブシエラ・ニューモニエ(K.ニューモニエ)細胞の存在を検出する方法であって、
(a)液体試料中の細胞を溶解させて、溶解物を形成するステップ、
(b)溶解物中のK.ニューモニエの標的核酸を、オリゴヌクレオチド配列:5'-GAC GGT TGT CCC GGT TTA AGC A-3'(配列番号5)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-GCT GGT ATC TTC GAC TGG TCT-3'(配列番号6)を含むリバースプライマーの存在下で増幅して、K.ニューモニエの単位複製配列を含む増幅溶解物を形成するステップ、  (c)ステップ(b)に続き、磁性粒子を増幅溶解物へと添加して、混合物を形成するステップであって、磁性粒子が、それらの表面上に結合性部分を含み、結合性部分が、K.ニューモニエの単位複製配列の存在下で、磁性粒子の凝集を変更するように作動するステップ、  (d)混合物を、デバイス内の検出チューブに用意するステップであって、デバイスが、混合物を含む検出チューブを保持するウェルを規定する支持体を含み、混合物を、1つ以上の磁石及びRFパルス列を使用して創出されたバイアス磁界へと曝露することによりもたらされる信号を検出するように構成されたRFコイルを有するステップ、
(e)混合物を、バイアス磁界及びRFパルス列へと曝露するステップ、
(f)ステップ(e)に続き、検出チューブからの信号を測定するステップ、並びに
(g)ステップ(f)の結果に基づき、K.ニューモニエ細胞が、液体試料中に存在したかどうかを決定するステップ
を含む方法。
［項目９］
磁性粒子が、第1のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及び第2のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含み、第1のプローブが、K.ニューモニエの単位複製配列の第1のセグメントに結合するように作動し、第2のプローブが、K.ニューモニエの単位複製配列の第2のセグメントに結合するように作動し、磁性粒子が、K.ニューモニエの単位複製配列の存在下で、凝集物を形成する、項目8に記載の方法。
［項目１０］
第1のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-TAC CAA GGC GCT TGA GAG AAC TC-3'(配列番号27)を含み、第2のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-CTG GTG TGT AGG TGA AGT C-3'(配列番号28)を含む、項目9に記載の方法。
［項目１１］
液体試料中の緑膿菌細胞の存在を検出する方法であって、
(a)液体試料中の細胞を溶解させて、溶解物を形成するステップ、
(b)溶解物中の緑膿菌の標的核酸を、オリゴヌクレオチド配列5'-AGG CTG GGT GTG TAA GCG TTG T-3'(配列番号7)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列5'-CAA GCA ATT CGG TTG GAT ATC CGT T-3'(配列番号8)を含むリバースプライマーの存在下で増幅して、緑膿菌の単位複製配列を含む増幅溶解物を形成するステップ、
(c)ステップ(b)に続き、磁性粒子を増幅溶解物へと添加して、混合物を形成するステップであって、磁性粒子が、それらの表面上に結合性部分を含み、結合性部分が、緑膿菌の単位複製配列の存在下で、磁性粒子の凝集を変更するように作動するステップ、
(d)混合物を、デバイス内の検出チューブに用意するステップであって、デバイスが、混合物を含む検出チューブを保持するウェルを規定する支持体を含み、混合物を、1つ以上の磁石及びRFパルス列を使用して創出されたバイアス磁界へと曝露することによりもたらされる信号を検出するように構成されたRFコイルを有するステップ、
(e)混合物を、バイアス磁界及びRFパルス列へと曝露するステップ、
(f)ステップ(e)に続き、検出チューブからの信号を測定するステップ、並びに
(g)ステップ(f)の結果に基づき、緑膿菌細胞が、液体試料中に存在したかどうかを決定するステップ
を含む方法。
［項目１２］
磁性粒子が、第1のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及び第2のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含み、第1のプローブが、緑膿菌の単位複製配列の第1のセグメントに結合するように作動し、第2のプローブが、緑膿菌の単位複製配列の第2のセグメントに結合するように作動し、磁性粒子が、緑膿菌の単位複製配列の存在下で、凝集物を形成する、項目11に記載の方法。
［項目１３］
第1のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-TCT GAC GAT TGT GTG TTG TAA GG-3'(配列番号114)を含み、第2のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-GGA TAG ACG TAA GCC CAA GC-3'(配列番号115)を含む、項目12に記載の方法。
［項目１４］
液体試料中の大腸菌細胞の存在を検出する方法であって、
(a)液体試料中の細胞を溶解させて、溶解物を形成するステップ、
(b)溶解物中の大腸菌の標的核酸を、オリゴヌクレオチド配列:5'-GCA TTA ATC GAC GGT ATG GTT GAC C-3'(配列番号59)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-CCT GCT GAA ACA GGT TTT CCC ACA TA-3'(配列番号61)を含むリバースプライマーの存在下で増幅して、大腸菌の単位複製配列を含む増幅溶解物を形成するステップ、
(c)ステップ(b)に続き、磁性粒子を増幅溶解物へと添加して、混合物を形成するステップであって、磁性粒子が、それらの表面上に結合性部分を含み、結合性部分が、大腸菌の単位複製配列の存在下で、磁性粒子の凝集を変更するように作動するステップ、
(d)混合物を、デバイス内の検出チューブに用意するステップであって、デバイスが、混合物を含む検出チューブを保持するウェルを規定する支持体を含み、混合物を、1つ以上の磁石及びRFパルス列を使用して創出されたバイアス磁界へと曝露することによりもたらされる信号を検出するように構成されたRFコイルを有するステップ、
(e)混合物を、バイアス磁界及びRFパルス列へと曝露するステップ、
(f)ステップ(e)に続き、検出チューブからの信号を測定するステップ、並びに
(g)ステップ(f)の結果に基づき、大腸菌細胞が、液体試料中に存在したかどうかを決定するステップ
を含む方法。
［項目１５］
磁性粒子が、第1のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及び第2のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含み、第1のプローブが、大腸菌の単位複製配列の第1のセグメントに結合するように作動し、第2のプローブが、大腸菌の単位複製配列の第2のセグメントに結合するように作動し、磁性粒子が、大腸菌の単位複製配列の存在下で、凝集物を形成する、項目14に記載の方法。
［項目１６］
第1のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-AGT GAT GAT GAG TTG TTT GCC AGT G-3'(配列番号63)を含み、第2のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-TGA ATT GTC GCC GCG TGA CCA G-3'(配列番号64)を含む、項目15に記載の方法。
［項目１７］
液体試料中の黄色ブドウ球菌細胞の存在を検出する方法であって、
(a)液体試料中の細胞を溶解させて、溶解物を形成するステップ、
(b)溶解物中の黄色ブドウ球菌の標的核酸を、第1のプライマー対又は第2のプライマー対の存在下で増幅して、黄色ブドウ球菌の単位複製配列を含む増幅溶解物を形成するステップであって、第1のプライマー対が、オリゴヌクレオチド配列:5'-GGT AAT GAA TTA CCT/i6diPr/TC TCT GCT GGTTTC TTC TT-3'(配列番号9)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-ACC AGC ATC TTC/i6diPr/GC ATC TTC TGT AAA-3'(配列番号10)を含むリバースプライマーを含み、第2のプライマー対が、オリゴヌクレオチド配列:5'-GAA GTT ATG TTT/i6diPr/CT ATT CGA ATC GTG GTC CAGT-3'(配列番号11)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-GTT GTA AAG CCA TGA TGC TCG TAA CCA-3'(配列番号12)を含むリバースプライマーを含むステップ、
(c)ステップ(b)に続き、磁性粒子を増幅溶解物へと添加して、混合物を形成するステップであって、磁性粒子が、それらの表面上に結合性部分を含み、結合性部分が、黄色ブドウ球菌の単位複製配列の存在下で、磁性粒子の凝集を変更するように作動するステップ、  (d)混合物を、デバイス内の検出チューブに用意するステップであって、デバイスが、混合物を含む検出チューブを保持するウェルを規定する支持体を含み、混合物を、1つ以上の磁石及びRFパルス列を使用して創出されたバイアス磁界へと曝露することによりもたらされる信号を検出するように構成されたRFコイルを有するステップ、
(e)混合物を、バイアス磁界及びRFパルス列へと曝露するステップ、
(f)ステップ(e)に続き、検出チューブからの信号を測定するステップ、並びに
(g)ステップ(f)の結果に基づき、黄色ブドウ球菌細胞が、液体試料中に存在したかどうかを決定するステップ
を含む方法。
［項目１８］
磁性粒子が、第1のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及び第2のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含み、第1のプローブが、黄色ブドウ球菌の単位複製配列の第1のセグメントに結合するように作動し、第2のプローブが、黄色ブドウ球菌の単位複製配列の第2のセグメントに結合するように作動し、磁性粒子が、黄色ブドウ球菌の単位複製配列の存在下で、凝集物を形成する、項目17に記載の方法。
［項目１９］
ステップ(b)が、黄色ブドウ球菌の標的核酸を、第1のプライマー対の存在下で増幅することを含み、第1のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-CCA TTT GAA GTT GTT TAT TAT GC-3'(配列番号35)を含み、第2のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-GGG AAA TGA TTA ATT ATG CAT TAA ATC-3'(配列番号36)を含む、項目18に記載の方法。
［項目２０］
ステップ(b)が、黄色ブドウ球菌の標的核酸を、第2のプライマー対の存在下で増幅することを含み、第1のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-TT TTT CAG ATT TAG GAT TAG TTG ATT-3'(配列番号39)を含み、第2のプローブが、オリゴヌクレオチド配列:5'-GAT CCG TAT TGG TTA TAT CAT C-3'(配列番号40)を含む、項目18に記載の方法。
［項目２１］
ステップ(b)が、第1の黄色ブドウ球菌の標的核酸を、第1のプライマー対の存在下で増幅して、第1の黄色ブドウ球菌の単位複製配列を形成すること、及び第2の黄色ブドウ球菌の標的核酸を、第2のプライマー対の存在下で増幅して、第2の黄色ブドウ球菌の単位複製配列を形成することを含み、ステップ(g)が、第1の黄色ブドウ球菌の単位複製配列及び第2の黄色ブドウ球菌の単位複製配列を検出することを含む、項目17に記載の方法。
［項目２２］
磁性粒子が、第1のプローブ及び第2のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、並びに第3のプローブ及び第4のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含み、
第1のプローブ及び第3のプローブが、第1の黄色ブドウ球菌の単位複製配列の第1のセグメント及び第2のセグメントにそれぞれ結合するように作動し、
第2のプローブ及び第4のプローブが、第2の黄色ブドウ球菌の単位複製配列の第1のセグメント及び第2のセグメントにそれぞれ結合するように作動し、
磁性粒子が、第1の黄色ブドウ球菌の単位複製配列の存在下で、凝集物を形成し、第2の黄色ブドウ球菌の単位複製配列の存在下で、凝集物を形成する、
項目21に記載の方法。
［項目２３］
第1のプローブが、配列番号35のオリゴヌクレオチド配列を含み、第2のプローブが、配列番号39のオリゴヌクレオチド配列を含み、第3のプローブが、配列番号36のオリゴヌクレオチド配列を含み、第4のプローブが、配列番号40のオリゴヌクレオチド配列を含む、項目22に記載の方法。
［項目２４］
ステップ(b)が、少なくとも第3の単位複製配列の生成を結果としてもたらす、項目21から23のいずれか一項に記載の方法。
［項目２５］
第3の単位複製配列が、配列番号35のオリゴヌクレオチド配列に作動可能に結合する第1の領域、配列番号39のオリゴヌクレオチド配列に作動可能に結合する第2の領域、配列番号36のオリゴヌクレオチド配列に作動可能に結合する第3の領域、及び配列番号40のオリゴヌクレオチド配列に作動可能に結合する第4の領域を含む、項目24に記載の方法。
［項目２６］
第3の単位複製配列が、第1の単位複製配列のヌクレオチド配列及び第2の単位複製配列のヌクレオチド配列を含む、項目24又は項目25に記載の方法。
［項目２７］
第3の単位複製配列が、鎖合成の部分的なランスルーにより生成する、項目24から26のいずれか一項に記載の方法。
［項目２８］
方法のステップ(a)〜(g)を、3時間以内に完了する、項目1から27のいずれか一項に記載の方法。
［項目２９］
液体試料中の10コロニー形成単位(CFU)/mLの濃度のA.バウマニ、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ、緑膿菌、又は黄色ブドウ球菌を検出することが可能である、項目1から28のいずれか一項に記載の方法。
［項目３０］
3CFU/mLの濃度を検出することが可能である、項目29に記載の方法。
［項目３１］
1CFU/mLの濃度を検出することが可能である、項目30に記載の方法。
［項目３２］
液体試料が、全血、尿、液体生検、滑液、皮膚生検、脳脊髄液、痰、胃洗浄液、気管支肺胞洗浄液、又はホモジナイズされた組織から選択される、項目1から31のいずれか一項に記載の方法。
［項目３３］
液体試料が、全血である、項目32に記載の方法。
［項目３４］
ステップ(a)が、対象に由来する全血試料中の赤血球を溶解させること、試料を遠心分離して、上清及びペレットを形成すること、上清の一部又は全部を廃棄すること、任意選択で、ペレットを洗浄すること、並びにペレット中の細胞を溶解させて、溶解物を形成することを含む、項目33に記載の方法。
［項目３５］
ステップ(b)が、液体試料へと、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子を添加することを含む、項目1から34のいずれか一項に記載の方法。
［項目３６］
液体試料中の種の存在を検出する方法であって、
(a)液体試料中の、第1の標的核酸及び第2の標的核酸を増幅して、第1の単位複製配列及び第2の単位複製配列を含む溶液を形成するステップであって、各標的核酸が、検出される種に特徴的であるステップ、
(b)磁性粒子を液体試料へと添加して、混合物を形成するステップであって、磁性粒子が、それらの表面上に結合性部分を含み、結合性部分が、第1の単位複製配列又は第2の単位複製配列の存在下で、磁性粒子の凝集を変更するように作動するステップ、
(c)混合物を、デバイス内の検出チューブに用意するステップであって、デバイスが、混合物を含む検出チューブを保持するウェルを規定する支持体を含み、混合物を、1つ以上の磁石及びRFパルス列を使用して創出されたバイアス磁界へと曝露することによりもたらされる信号を検出するように構成されたRFコイルを有するステップ、
(d)混合物を、バイアス磁界及びRFパルス列へと曝露するステップ、
(e)ステップ(d)に続き、信号を測定するステップ、並びに
(f)ステップ(e)の結果に基づき、種が、液体試料中に存在したかどうかを決定するステップ
を含む方法。
［項目３７］
種が、植物種、哺乳動物種、又は微生物種である、項目36に記載の方法。
［項目３８］
種が、微生物種である、項目37に記載の方法。
［項目３９］
第1の標的核酸を、フォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、第1のプライマー対の存在下で増幅し、第2の標的核酸を、フォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、第2のプライマー対の存在下で増幅する、項目36から38のいずれか一項に記載の方法。
［項目４０］
磁性粒子が、第1のプローブ及び第2のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、並びに第3のプローブ及び第4のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含み、
第1のプローブ及び第3のプローブが、第1の単位複製配列の第1のセグメント及び第2のセグメントにそれぞれ結合するように作動し、
第2のプローブ及び第4のプローブが、第2の単位複製配列の第1のセグメント及び第2のセグメントにそれぞれ結合するように作動し、
磁性粒子が、第1の単位複製配列の存在下で、凝集物を形成し、第2の単位複製配列の存在下で、凝集物を形成する、
項目36から39のいずれか一項に記載の方法。
［項目４１］
ステップ(a)が、第3の単位複製配列を増幅することをさらに含み、第3の単位複製配列が、第1の標的核酸の核酸配列及び第2の標的核酸の核酸配列を含む核酸配列を含む、項目36から40のいずれか一項に記載の方法。
［項目４２］
第1の標的核酸及び第2の標的核酸が、染色体又はプラスミド上に位置する、項目41に記載の方法。
［項目４３］
第1の標的核酸及び第2の標的核酸が、約10〜約1000塩基対の間だけ隔てられている、項目41又は42に記載の方法。
［項目４４］
第3の単位複製配列が、鎖合成の部分的なランスルーにより生成する、項目41から43のいずれか一項に記載の方法。
［項目４５］
液体試料中の10コロニー形成単位(CFU)/mLの濃度の微生物種を検出することが可能である、項目37から44のいずれか一項に記載の方法。
［項目４６］
液体試料中の3CFU/mLの濃度の微生物種を検出することが可能である、項目45に記載の方法。
［項目４７］
液体試料中の1CFU/mLの濃度の微生物種を検出することが可能である、項目46に記載の方法。
［項目４８］
方法のステップ(a)〜(f)を、3時間以内に完了する、項目36から47のいずれか一項に記載の方法。
［項目４９］
微生物種が、A.バウマニ、E.フェカリス、E.フェシウム、K.ニューモニエ、緑膿菌、大腸菌、及び黄色ブドウ球菌から選択される、項目37から48のいずれか一項に記載の方法。
［項目５０］
液体試料が、全血、尿、液体生検、滑液、皮膚生検、脳脊髄液、痰、胃洗浄液、気管支肺胞洗浄液、又はホモジナイズされた組織から選択される、項目36から49のいずれか一項に記載の方法。
［項目５１］
液体試料が、全血である、項目50に記載の方法。
［項目５２］
ステップ(a)の前に、対象に由来する全血試料を用意するステップ、全血試料中の赤血球を溶解させるステップ、試料を遠心分離して、上清及びペレットを形成するステップ、上清の一部又は全部を廃棄するステップ、任意選択で、ペレットを洗浄するステップ、並びにペレット中の細胞を溶解させて、溶解物を形成するステップをさらに含む、項目51に記載の方法。
［項目５３］
ステップ(b)が、液体試料へと、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子を添加することを含む、項目36から52のいずれか一項に記載の方法。
［項目５４］
磁性粒子が、700nm〜950nmの平均直径を有する、項目1から53のいずれか一項に記載の方法。
［項目５５］
磁性粒子が、粒子1つ当たり1×109〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有する、項目1から54のいずれか一項に記載の方法。
［項目５６］
磁性粒子が、実質的に単分散である、項目1から55のいずれか一項に記載の方法。
［項目５７］
増幅するステップを、非対称ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により実施する、項目1から56のいずれか一項に記載の方法。
［項目５８］
(a)(i)A.バウマニの標的核酸を含有することが疑われるか、又は
(ii)A.バウマニの標的核酸を増幅することにより生成させた、A.バウマニの単位複製配列を含有する
液体試料、並びに
(b)液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、
オリゴヌクレオチド配列:5'-TGA GGC TTG ACT ATA CAA CAC C-3'(配列番号15)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-CTA AAA TGA ACA GAT AAA GTA AGA TTC AA-3'(配列番号16)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含む磁性粒子
を含む組成物。
［項目５９］
(a)(i)エンテロコッカス属の標的核酸を含有することが疑われるか、又は
(ii)エンテロコッカス属の標的核酸を増幅することにより生成させた、エンテロコッカス属の単位複製配列を含有する
液体試料、並びに
(b)液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、
オリゴヌクレオチド配列:5'-AAA ACT TAT GTG ACT TCA AAT CCA GTT TT-3'(配列番号111)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-TTT ACT CAA TAA AAG ATA ACA CCA CAG T-3'(配列番号112)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含む磁性粒子
を含む組成物。
［項目６０］
エンテロコッカス属の標的核酸が、エンテロコッカス・フェシウムの標的核酸である、項目59に記載の組成物。
［項目６１］
(a)(i)エンテロコッカス属の標的核酸を含有することが疑われるか、又は
(ii)エンテロコッカス属の標的核酸を増幅することにより生成させた、エンテロコッカス属の単位複製配列を含有する
液体試料、並びに
(b)液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、
オリゴヌクレオチド配列:5'-TGG ATA AGT AAA AGC AAC TTG GTT-3'(配列番号23)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-AAT GAA GAT TCA ACT CAA TAA GAA ACA ACA-3'(配列番号24)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含む磁性粒子
を含む組成物。
［項目６２］
エンテロコッカス属の標的核酸が、エンテロコッカス・フェカリスの標的核酸である、項目61に記載の組成物。
［項目６３］
(a)(i)K.ニューモニエの標的核酸を含有することが疑われるか、又は
(ii)K.ニューモニエの標的核酸を増幅することにより生成させた、K.ニューモニエの単位複製配列を含有する
液体試料、並びに
(b)液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、
オリゴヌクレオチド配列:5'-TAC CAA GGC GCT TGA GAG AAC TC-3'(配列番号27)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-CTG GTG TGT AGG TGA AGT C-3'(配列番号28)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含む磁性粒子
を含む組成物。
［項目６４］
(a)(i)緑膿菌の標的核酸を含有することが疑われるか、又は
(ii)緑膿菌の標的核酸を増幅することにより生成させた、緑膿菌の単位複製配列を含有する
液体試料、並びに
(b)液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、
オリゴヌクレオチド配列:5'-TCT GAC GAT TGT GTG TTG TAA GG-3'(配列番号114)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-GGA TAG ACG TAA GCC CAA GC-3'(配列番号115)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含む磁性粒子
を含む組成物。
［項目６５］
(a)(i)大腸菌の標的核酸を含有することが疑われるか、又は
(ii)大腸菌の標的核酸を増幅することにより生成させた、大腸菌の単位複製配列を含有する
液体試料、並びに
(b)液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、
オリゴヌクレオチド配列:5'-AGT GAT GAT GAG TTG TTT GCC AGT G-3'(配列番号63)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-TGA ATT GTC GCC GCG TGA CCA G-3'(配列番号64)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含む磁性粒子
を含む組成物。
［項目６６］
(a)(i)黄色ブドウ球菌の標的核酸を含有することが疑われるか、又は
(ii)黄色ブドウ球菌の標的核酸を増幅することにより生成させた、黄色ブドウ球菌の単位複製配列を含有する
液体試料、並びに
(b)液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、
オリゴヌクレオチド配列:5'-CCA TTT GAA GTT GTT TAT TAT GC-3'(配列番号35)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-GGG AAA TGA TTA ATT ATG CAT TAA ATC-3'(配列番号36)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含む磁性粒子
を含む組成物。
［項目６７］
(a)(i)黄色ブドウ球菌の標的核酸を含有することが疑われるか、又は
(ii)増幅反応から生成させた、黄色ブドウ球菌の標的核酸の単位複製配列を含有する液体試料、並びに
(b)液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、
オリゴヌクレオチド配列:5'-TT TTT CAG ATT TAG GAT TAG TTG ATT-3'(配列番号39)を含む第1の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-GAT CCG TAT TGG TTA TAT CAT C-3'(配列番号40)を含む第2の核酸プローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含む磁性粒子
を含む組成物。
［項目６８］
(a)(i)黄色ブドウ球菌の標的核酸を含有することが疑われるか、又は
(ii)増幅反応から生成させた、黄色ブドウ球菌の標的核酸の単位複製配列を含有する液体試料、並びに
(b)液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、第1の集団及び第2の集団を含み、第1の集団が、それらの表面へとコンジュゲートさせた、第1の核酸プローブ及び第2の核酸プローブを有し、第2の集団が、それらの表面へとコンジュゲートさせた、第3の核酸プローブ及び第4の核酸プローブを有し、
第1の核酸プローブが、配列番号35のオリゴヌクレオチド配列を含み、第2の核酸プローブが、配列番号39のオリゴヌクレオチド配列を含み、第3の核酸プローブが、配列番号36のオリゴヌクレオチド配列を含み、第4の核酸プローブが、配列番号40のオリゴヌクレオチド配列を含む磁性粒子
を含む組成物。
［項目６９］
(a)(i)第1の標的核酸及び第2の標的核酸を含有することが疑われ、各標的核酸が、微生物種に特徴的であるか、又は
(ii)第1の標的核酸及び第2の標的核酸を増幅することにより生成させた、第1の単位複製配列及び第2の単位複製配列を含有する
液体試料、並びに
(b)液体試料中の、液体試料1ミリリットル当たり1×106〜1×1013個の磁性粒子であって、700nm〜950nmの平均直径、粒子1つ当たり1×104〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有し、それらの表面へとコンジュゲートさせた結合性部分を有し、
第1の単位複製配列に作動可能に結合して、凝集物を形成することが可能であり、第2の単位複製配列に結合して、凝集物を形成することが可能である磁性粒子
を含む組成物。
［項目７０］
磁性粒子が、第1のプローブ及び第2のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第1の集団、並びに第3のプローブ及び第4のプローブへとコンジュゲートさせた、磁性粒子の第2の集団を含み、
第1のプローブ及び第3のプローブが、第1の標的核酸の第1のセグメント及び第2のセグメントにそれぞれ結合するように作動し、
第2のプローブ及び第4のプローブが、第2の標的核酸の第1のセグメント及び第2のセグメントにそれぞれ結合するように作動する、
項目69に記載の組成物。
［項目７１］
磁性粒子が、粒子1つ当たり1×109〜1×1012mM-1s-1のT2緩和度を有する、項目58から70のいずれか一項に記載の組成物。
［項目７２］
全血試料中の標的核酸を増幅する方法であって、
(a)対象に由来する、1つ以上の細菌細胞を含有することが疑われる全血試料中の赤血球を溶解させることにより作製される、第1の試料を用意し、第1の試料を遠心分離して、上清及びペレットを形成し、上清の一部又は全部を廃棄し、ペレットを再懸濁させるステップ、
(b)ペレット中に残存する細胞を溶解させて、対象細胞の核酸及び細菌の核酸の両方を含む溶解物を形成するステップ、並びに
(c)ステップ(b)の溶解物を検出チューブ内に用意し、以下:
(i)オリゴヌクレオチド配列:5'-GGA AGG GAT CAG GTG GTT CAC TCT T-3'(配列番号110)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-AGG ACG TTG ATA GG TTG GAT GTG GA-3'(配列番号2)を含むリバースプライマーを含む、A.バウマニの標的核酸を増幅するプライマー対、
(ii)オリゴヌクレオチド配列:5'-GGT AGC TAT GTA GGG AAG GGA TAA ACG CTG A-3'(配列番号3)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-GCG CTA AGG AGC TTA ACT TCT GTG TTC G-3'(配列番号4)を含むリバースプライマーを含む、エンテロコッカス属の標的核酸を増幅するプライマー対、
(iii)オリゴヌクレオチド配列:5'-GAC GGT TGT CCC GGT TTA AGC A-3'(配列番号5)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-GCT GGT ATC TTC GAC TGG TCT-3'(配列番号6)を含むリバースプライマーを含む、K.ニューモニエの標的核酸を増幅するプライマー対、
(iv)オリゴヌクレオチド配列5'-AGG CTG GGT GTG TAA GCG TTG T-3'(配列番号7)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列5'-CAA GCA ATT CGG TTG GAT ATC CGT T-3'(配列番号8)を含むリバースプライマーを含む、緑膿菌の標的核酸を増幅するプライマー対、
(v)オリゴヌクレオチド配列:5'-GCA TTA ATC GAC GGT ATG GTT GAC C-3'(配列番号59)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-CCT GCT GAA ACA GGT TTT CCC ACA TA-3'(配列番号61)を含むリバースプライマーを含む、大腸菌の標的核酸を増幅するプライマー対、並びに/又は
(vi)黄色ブドウ球菌の標的核酸を増幅する、第1のプライマー対及び/若しくは第2のプライマー対であり、第1のプライマー対が、オリゴヌクレオチド配列:5'-GGT AAT GAA TTA CCT/i6diPr/TC TCT GCT GGTTTC TTC TT-3'(配列番号9)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-ACC AGC ATC TTC/i6diPr/GC ATC TTC TGT AAA-3'(配列番号10)を含むリバースプライマーを含み、第2のプライマー対が、オリゴヌクレオチド配列:5'-GAA GTT ATG TTT/i6diPr/CT ATT CGA ATC GTG GTC CAGT-3'(配列番号11)を含むフォワードプライマー、及びオリゴヌクレオチド配列:5'-GTT GTA AAG CCA TGA TGC TCG TAA CCA-3'(配列番号12)を含むリバースプライマーを含む、第1のプライマー対及び/若しくは第2のプライマー対
から選択される、1つ以上のプライマー対を使用して、その中の標的の細菌核酸を増幅して、増幅溶解物溶液を形成するステップ
を含む方法により作製される増幅溶解物溶液。
［項目７３］
ステップ(c)の増幅することが、溶解物中の黄色ブドウ球菌の標的核酸を、第1のプライマー対の存在下で増幅することを含む、項目72に記載の増幅溶解物溶液。
［項目７４］
ステップ(c)の増幅することが、溶解物中の黄色ブドウ球菌の標的核酸を、第2のプライマー対の存在下で増幅することを含む、項目72に記載の増幅溶解物溶液。
［項目７５］
ステップ(c)の増幅することが、2つの黄色ブドウ球菌の標的核酸を、第1のプライマー対及び第2のプライマー対の存在下で増幅して、第1の単位複製配列及び第2の単位複製配列を生成させることを含む、項目72から74のいずれか一項に記載の増幅溶解物溶液。
［項目７６］
ステップ(c)の増幅することが、第3の単位複製配列の生成を結果としてもたらし、第3の単位複製配列の核酸配列が、第1の単位複製配列の核酸配列及び第2の単位複製配列の核酸配列を含む、項目75に記載の増幅溶解物溶液。
［項目７７］
前記全血試料中の10CFU/mL以下の細菌が、標的の細菌核酸の増幅を可能とするのに十分である、項目72から76のいずれか一項に記載の増幅溶解物溶液。
［項目７８］
前記全血試料中の5CFU/mL以下の細菌が、標的の細菌核酸の増幅を可能とするのに十分である、項目77に記載の増幅溶解物溶液。
［項目７９］
前記全血試料中の3CFU/mL以下の細菌が、標的の細菌核酸の増幅を可能とするのに十分である、項目78に記載の増幅溶解物溶液。
［項目８０］
前記全血試料中の1CFU/mLの細菌が、標的の細菌核酸の増幅を可能とするのに十分である、項目79に記載の増幅溶解物溶液。
［項目８１］
全血試料中の標的核酸を増幅する方法であって、
(a)対象に由来する、1つ以上の細菌細胞を含有することが疑われる全血試料中の赤血球を溶解させることにより作製される、第1の試料を用意し、第1の試料を遠心分離して、上清及びペレットを形成し、上清の一部又は全部を廃棄し、ペレットを再懸濁させるステップ、
(b)ペレット中に残存する細胞を溶解させて、対象細胞の核酸及び細菌の核酸の両方を含む溶解物を形成するステップ、並びに
(c)ステップ(b)の溶解物を検出チューブ内に用意し、その中の2つ以上の標的の細菌核酸を増幅して、2つ以上の細菌の単位複製配列を含む増幅溶解物溶液を形成するステップであって、前記全血試料中の10CFU/mL以下の細菌が、前記2つ以上の標的の細菌核酸の増幅を可能とするのに十分であるステップ
を含む方法により作製される増幅溶解物溶液。
［項目８２］
ステップ(a)が、先行する洗浄ステップを伴わずに、ペレットを再懸濁させることを含む、項目72から81のいずれか一項に記載の増幅溶解物溶液。
［項目８３］
ステップ(a)が、ペレットを再懸濁させる前に、洗浄ステップを含む、項目72から81のいずれか一項に記載の増幅溶解物溶液。
［項目８４］
2つ以上の標的の細菌核酸が、単一の細菌病原体に特徴的である、項目81から83のいずれか一項に記載の増幅溶解物溶液。
［項目８５］
ステップ(c)の増幅することが、第3の単位複製配列の生成を結果としてもたらす、項目81から84のいずれか一項に記載の増幅溶解物溶液。
［項目８６］
第3の単位複製配列が、鎖合成の部分的なランスルーにより生成する、項目85に記載の増幅溶解物溶液。
［項目８７］
前記全血試料中の約10CFU/mL以下の細菌が、前記2つ以上の標的の細菌核酸の増幅を可能とするのに十分である、項目72から86のいずれか一項に記載の増幅溶解物溶液。
［項目８８］
前記全血試料中の約5CFU/mL以下の細菌が、前記2つ以上の標的の細菌核酸の増幅を可能とするのに十分である、項目87に記載の増幅溶解物溶液。
［項目８９］
前記全血試料中の約3CFU/mL以下の細菌が、前記2つ以上の標的の細菌核酸の増幅を可能とするのに十分である、項目88に記載の増幅溶解物溶液。
［項目９０］
前記全血試料中の約1CFU/mLの細菌が、前記2つ以上の標的の細菌核酸の増幅を可能とするのに十分である、項目89に記載の増幅溶解物溶液。
［項目９１］
(a)(i)赤血球を溶解させ、(ii)試料を遠心分離して、上清及びペレットを形成し、(iii)上清の一部又は全部を廃棄し、(iv)洗浄せずに、残余の細胞を溶解させて、抽出物を形成することにより調製される、細菌病原体を含有することが疑われる全血試料からの抽出物の一部、
(b)配列番号110、3、5、7、9、11、又は59のうちのいずれか1つと、少なくとも80%同一であるオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマー、
(c)配列番号2、4、6、8、10、12、又は61のうちのいずれか1つと、少なくとも80%同一であるオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマー、
(d)熱安定性ポリメラーゼ、並びに
(e)デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝液、及びマグネシウム
を含む組成物。
［項目９２］
フォワードプライマーが、配列番号110、3、5、7、9、11、又は59のうちのいずれか1つと、少なくとも90%同一であるオリゴヌクレオチド配列を含む、項目91に記載の組成物。
［項目９３］
フォワードプライマーが、配列番号110、3、5、7、9、11、又は59のうちのいずれか1つと、少なくとも95%同一であるオリゴヌクレオチド配列を含む、項目92に記載の組成物。
［項目９４］
フォワードプライマーが、配列番号110、3、5、7、9、11、又は59のうちのいずれか1つから選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、項目92に記載の組成物。
［項目９５］
リバースプライマーが、配列番号2、4、6、8、10、12、又は61のうちのいずれか1つと、少なくとも90%同一であるオリゴヌクレオチド配列を含む、項目91から94のいずれか一項に記載の組成物。
［項目９６］
リバースプライマーが、配列番号2、4、6、8、10、12、又は61のうちのいずれか1つと、少なくとも95%同一であるオリゴヌクレオチド配列を含む、項目95に記載の組成物。
［項目９７］
リバースプライマーが、配列番号2、4、6、8、10、12、又は61のうちのいずれか1つから選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、項目95に記載の組成物。
［項目９８］
複数のウェルを含む着脱式カートリッジであって、以下:
(a)項目58に記載の組成物を含む第1のウェル、
(b)項目59に記載の組成物を含む第2のウェル、
(c)項目61に記載の組成物を含む第3のウェル、
(d)項目63に記載の組成物を含む第4のウェル、
(e)項目64に記載の組成物を含む第5のウェル、
(f)項目68に記載の組成物を含む第6のウェル
のうちの1つ以上を含む着脱式カートリッジ。
［項目９９］
複数のウェルを含む着脱式カートリッジであって、以下:
(a)項目58に記載の組成物を含む第1のウェル、
(b)項目59に記載の組成物を含む第2のウェル、
(c)項目65に記載の組成物を含む第3のウェル、
(d)項目63に記載の組成物を含む第4のウェル、
(e)項目64に記載の組成物を含む第5のウェル、
(f)項目68に記載の組成物を含む第6のウェル
のうちの1つ以上を含む着脱式カートリッジ。
［項目１００］
(a)〜(f)を含む、項目98又は99に記載の着脱式カートリッジ。
［項目１０１］
1つ以上のアッセイ試薬を保持する、複数の試薬モジュールを保持する、1つ以上のチャンバーをさらに含む、項目98から100のいずれか一項に記載の着脱式カートリッジ。
［項目１０２］
細胞を溶解させるビーズを含むチャンバーをさらに含む、項目98から101のいずれか一項に記載の着脱式カートリッジ。
［項目１０３］
ポリメラーゼを含むチャンバーをさらに含む、項目98から102のいずれか一項に記載の着脱式カートリッジ。
［項目１０４］
1つ以上のプライマーを含むチャンバーをさらに含む、項目98から103のいずれか一項に記載の着脱式カートリッジ。
［項目１０５］
1つ以上のプライマーが、配列番号1〜14、59、61、及び110から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、項目104に記載の着脱式カートリッジ。
［項目１０６］
対象における血流感染又は敗血症を診断する方法であって、
項目1から35又は54から57のいずれか一項に記載の方法に従い、患者から得られた液体試料中において、A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、又は黄色ブドウ球菌細胞の存在を検出するステップであって、
液体試料中の、A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、又は黄色ブドウ球菌細胞の存在が、対象を、血流感染又は敗血症を有しうる対象として同定するステップ
を含む方法。
［項目１０７］
A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、及び黄色ブドウ球菌細胞のうちの少なくとも2つの存在を検出するステップを含む、項目106に記載の方法。
［項目１０８］
A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、及び黄色ブドウ球菌細胞のうちの少なくとも3つの存在を検出するステップを含む、項目107に記載の方法。
［項目１０９］
A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、及び黄色ブドウ球菌細胞のうちの少なくとも4つの存在を検出するステップを含む、項目108に記載の方法。
［項目１１０］
A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、及び黄色ブドウ球菌細胞のうちの少なくとも5つの存在を検出するステップを含む、項目109に記載の方法。
［項目１１１］
A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、及び黄色ブドウ球菌細胞の存在を検出するステップを含む、項目110に記載の方法。
［項目１１２］
エンテロコッカス属種が、エンテロコッカス・フェシウム又はエンテロコッカス・フェカリスである、項目106から111のいずれか一項に記載の方法。
［項目１１３］
エンテロコッカス属種が、エンテロコッカス・フェシウムである、項目112に記載の方法。
［項目１１４］
対象における血流感染又は敗血症を診断する方法であって、
項目37から57のいずれか一項に記載の方法に従い、患者から得られた液体試料中において、微生物種の存在を検出するステップであって、
液体試料中の微生物種の存在が、対象を、血流感染又は敗血症を有しうる対象として同定するステップ
を含む方法。
［項目１１５］
対象における血流感染又は敗血症を処置する方法であって、
項目1から35又は54から57のいずれか一項に記載の方法に従い、患者から得られた液体試料中において、A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、又は黄色ブドウ球菌細胞の存在を検出するステップであって、液体試料中の、A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、又は黄色ブドウ球菌細胞の存在が、対象を、血流感染又は敗血症を有しうる対象として同定するステップ、及び
血流感染又は敗血症の治療を、血流感染又は敗血症を有しうる対象として同定された対象に施すステップ
を含む方法。
［項目１１６］
A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、及び黄色ブドウ球菌細胞のうちの少なくとも2つの存在を検出するステップを含む、項目115に記載の方法。
［項目１１７］
A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、及び黄色ブドウ球菌細胞のうちの少なくとも3つの存在を検出するステップを含む、項目116に記載の方法。
［項目１１８］
A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、及び黄色ブドウ球菌細胞のうちの少なくとも4つの存在を検出するステップを含む、項目117に記載の方法。
［項目１１９］
A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、及び黄色ブドウ球菌細胞のうちの少なくとも5つの存在を検出するステップを含む、項目118に記載の方法。
［項目１２０］
A.バウマニ細胞、エンテロコッカス属種、K.ニューモニエ細胞、緑膿菌細胞、大腸菌細胞、及び黄色ブドウ球菌細胞の存在を検出するステップを含む、項目117に記載の方法。
［項目１２１］
エンテロコッカス属種が、エンテロコッカス・フェシウム又はエンテロコッカス・フェカリスである、項目115から120のいずれか一項に記載の方法。
［項目１２２］
エンテロコッカス属種が、エンテロコッカス・フェシウムである、項目119に記載の方法。
［項目１２３］
対象における血流感染又は敗血症を処置する方法であって、
項目37から57のいずれか一項に記載の方法に従い、患者から得られた液体試料中において、微生物種の存在を検出するステップであって、液体試料中の微生物種の存在が、対象を、血流感染又は敗血症を有しうる対象として同定するステップ、及び
血流感染又は敗血症の治療を、血流感染又は敗血症を有しうる対象として同定された対象に施すステップ
を含む方法。
［項目１２４］
血流感染が、菌血症である、項目107から123のいずれか一項に記載の方法。
［項目１２５］
対象が、ヒトである、項目106から124のいずれか一項に記載の方法。