【手続補正書】
【提出日】令和1年12月6日(2019.12.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
外来ＤＮＡ配列を細胞のゲノムに組み込むｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ｉ）トランスポゾン系であって、
配列番号１からなる核酸配列を有する第１の逆方向反復、
前記第１の逆方向反復の下流の外来ＤＮＡ配列、及び、
前記外来ＤＮＡ配列の下流の第２の逆方向反復、ここで当該第２の逆方向反復は配列番号２からなる核酸配列を有する、を含有する第１のベクターと、
配列番号４のアミノ酸配列を有するトランスポザーゼをコードする核酸に操作可能に連結したプロモーターを含有する第２のベクターと、
を含むトランスポゾン系を得ることと、
（ｉｉ）前記外来ＤＮＡ配列が前記細胞のゲノムに組み込まれるように、前記第１のベクター及び前記第２のベクターを前記細胞に導入することと、
を含み、
前記トランスポザーゼが前記細胞中で発現され、前記第１のベクターからの前記外来ＤＮＡ配列の切出し及び切り出された外来核酸の前記細胞のゲノムへの組込みを触媒する、方法。
【請求項２】
前記外来ＤＮＡ配列が抗生物質耐性タンパク質、ｓｉＲＮＡ、レポータータンパク質、サイトカイン、キナーゼ、抗原、抗原特異的受容体、サイトカイン受容体又は自殺ポリペプチドをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１のベクターが、前記外来ＤＮＡ配列に操作可能に連結した非原核生物プロモーターを更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記非原核生物プロモーターがサイトメガロウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、シミアンウイルス４０プロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子１−αプロモーター、ヒトＨ１プロモーター及びＵ６プロモーターからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１のベクターがエンハンサー、サイレンサー又はインシュレーターを更に含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記第２のベクター中の前記プロモーターがサイトメガロウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、シミアンウイルス４０プロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子１−αプロモーター、ヒトＨ１プロモーター及びＵ６プロモーターからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第１のベクターが、細菌複製に必要とされる原核生物配列を欠き、前記外来ＤＮＡ配列を除いて５００ｂｐ〜１５００ｂｐの長さを有するミニサークルＤＮＡである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ミニサークルＤＮＡが前記外来ＤＮＡ配列を除いて７００ｂｐ〜１２００ｂｐの長さを有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ミニサークルＤＮＡが前記外来ＤＮＡ配列を除いて８００ｂｐ〜１０００ｂｐの長さを有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞がＴ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ又はマスト細胞からなる群から選択される免疫細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が骨髄、脂肪組織、末梢血、臍帯血又は歯髄に由来する幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
導入工程の前に前記第１のベクターを線状化することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１のベクター及び前記第２のベクターをリン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、細胞スクイージング、ソノポレーション、光学トランスフェクション、インペールフェクション、遺伝子銃、マグネトフェクション、ウイルス形質導入、又はデンドリマー、リポソーム若しくはカチオン性ポリマーによるトランスフェクションによって前記細胞に導入する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１のベクターが、細菌複製に必要とされる原核生物配列を欠き、前記外来ＤＮＡ配列を除いて５００ｂｐ〜１５００ｂｐの長さを有するミニサークルＤＮＡである、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ミニサークルＤＮＡが前記外来ＤＮＡ配列を除いて７００ｂｐ〜１２００ｂｐの長さを有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ミニサークルＤＮＡが前記外来ＤＮＡ配列を除いて８００ｂｐ〜１０００ｂｐの長さを有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞がヒト細胞である、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１８】
外来ＤＮＡ配列を細胞のゲノムに組み込むためのキットであって、
容器と、
トランスポゾン系であって、
配列番号１からなる核酸配列を有する第１の逆方向反復、
前記第１の逆方向反復の下流の配列番号２からなる核酸配列を有する第２の逆方向反復、及び、
前記外来ＤＮＡ配列を導入するための前記第１の逆方向反復と前記第２の逆方向反復との間のクローニング部位を含有する第１のベクターと、
配列番号４のアミノ酸配列を有するトランスポザーゼをコードする核酸に操作可能に連結したプロモーターを含有する第２のベクターと、
を含むトランスポゾン系と、
前記容器に付随し、前記トランスポゾン系の使用方法を示す取扱説明書と、
を含み、前記トランスポザーゼが、前記第１のベクターからの前記外来ＤＮＡ配列の切出し及び切り出された外来ＤＮＡ配列の前記細胞のゲノムへの組込みを触媒する、キット。
【請求項１９】
前記第２のベクター中の前記プロモーターがサイトメガロウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、シミアンウイルス４０プロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子１−αプロモーター、ヒトＨ１プロモーター及びＵ６プロモーターからなる群から選択される、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記第１のベクターが、前記第１の逆方向反復の下流かつ前記クローニング部位の上流に非原核生物プロモーターを更に含み、該非原核生物プロモーターがサイトメガロウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、シミアンウイルス４０プロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子１−αプロモーター、ヒトＨ１プロモーター及びＵ６プロモーターからなる群から選択される、請求項１８に記載のキット。
【請求項２１】
前記第１のベクターが細菌複製に必要とされる原核生物配列を欠くミニサークルＤＮＡである、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２２】
免疫関連疾患を有する又は有する疑いがある被験体の治療を準備する方法であって、
（１）免疫細胞を、請求項１８に記載のキットを使用して外来遺伝子を保有するように改変することと、
（２）前記被験体に投与して、前記免疫関連疾患の症状を改善又は緩和するための、有効量の工程（１）の改変免疫細胞を準備することと、
を含む、方法。
【請求項２３】
前記被験体がヒトである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記免疫細胞が前記被験体又はドナーに由来する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記外来遺伝子が前記被験体における免疫応答を増強し、前記免疫関連疾患が腫瘍又は感染性疾患である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記外来遺伝子が前記被験体における免疫応答を阻害し、前記免疫関連疾患がアレルギー、自己免疫疾患、移植片対宿主病又は炎症性疾患である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫細胞がＴ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ又はマスト細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記外来遺伝子が抗生物質耐性タンパク質、レポータータンパク質、サイトカイン、キナーゼ、抗原、抗原特異的受容体、サイトカイン受容体、自殺ポリペプチド又は調節要素をコードする、請求項２２に記載の方法。