【手続補正書】
【提出日】令和2年3月2日(2020.3.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト患者からのヒト腫瘍細胞クラスターの集団を含む培地懸濁液であって、約１４日以内に前記腫瘍細胞クラスターの少なくとも約１０％の増殖をもたらす、培地懸濁液。
【請求項２】
約１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５日以内に前記ヒト腫瘍細胞クラスターの少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％の増殖をもたらす、請求項１に記載の培地懸濁液。
【請求項３】
約７日以内に前記ヒト腫瘍細胞クラスターの少なくとも約２０〜３０％の増殖をもたらす、請求項１または２に記載の培地懸濁液。
【請求項４】
約７日以内に前記ヒト腫瘍細胞クラスターの少なくとも約６０％の増殖をもたらす、請求項１〜３のいずれか１項に記載の培地懸濁液。
【請求項５】
合成培地を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の培地懸濁液。
【請求項６】
無血清である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の培地懸濁液。
【請求項７】
ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、Ｗｎｔ３Ａ、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、インスリン、トランスフェリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、コレステロール、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、及び２−メルカプトエタノールから選択される１つ以上の構成成分を含む、請求項５または６に記載の培地懸濁液。
【請求項８】
ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、Ｗｎｔ３Ａ、ｂＦＧＦ、インスリン、トランスフェリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、コレステロール、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、及び２−メルカプトエタノールから選択される構成成分のうちの２、３、４、５、６、７、８、または９つを含む、請求項７に記載の培地懸濁液。
【請求項９】
ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、Ｗｎｔ３Ａ、ｂＦＧＦ、インスリン、トランスフェリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、コレステロール、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、及び２−メルカプトエタノールを含む、請求項８に記載の培地懸濁液。
【請求項１０】
ニコチンアミド、ノギン、Ｒ−スポンジン−１、Ｙ２７６３２、線維芽細胞成長因子１０（ＦＧＦ１０）、及びＶＯ−ＯＨｐｉｃから選択される１つ以上の構成成分を含む、請求項５〜９のいずれか１項に記載の培地懸濁液。
【請求項１１】
ニコチンアミド、ノギン、Ｒ−スポンジン−１、Ｙ２７６３２、ＦＧＦ１０、及びＶＯ−ＯＨｐｉｃから選択される構成成分のうちの２、３、４、５、または６つを含む、請求項１０に記載の培地懸濁液。
【請求項１２】
ニコチンアミド、ノギン、Ｒ−スポンジン−１、Ｙ２７６３２、ＦＧＦ１０、及びＶＯ−ＯＨｐｉｃを含む、請求項１１に記載の培地懸濁液。
【請求項１３】
上皮成長因子（ＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、Ｎ２サプリメント、Ｂ２７、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ−２）、及びＮ−アセチル−Ｌ−システインから選択される１つ以上の構成成分を含む、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の培地懸濁液。
【請求項１４】
ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、Ｎ２、Ｂ２７、ＰＧＥ２、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインから選択される構成成分のうちの２、３、４、５、６、７、８、または９つを含む、請求項１３に記載の培地懸濁液。
【請求項１５】
ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、Ｎ２、Ｂ２７、ＰＧＥ２、及びＮ−アセチル−Ｌ−システインを含む、請求項１４に記載の培地懸濁液。
【請求項１６】
ニコチンアミド、ノギン、Ｒ−スポンジン−１、Ｙ２７６３２、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、Ｎ２、Ｂ２７、ＰＧＥ２、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、ＦＧＦ１０、及びＶＯ−ＯＨｐｉｃを含む、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の培地懸濁液。
【請求項１７】
細胞外基質構成成分、任意選択でマトリゲル、コラーゲン、ラミニン、またはフィブロネクチンを含まない、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の培地懸濁液。
【請求項１８】
前記ヒト腫瘍細胞クラスターが、ヒト患者からの肺癌細胞、結腸癌細胞、胃癌細胞、または乳癌細胞である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の培地懸濁液。
【請求項１９】
前記ヒト腫瘍細胞クラスターが、ヒト腫瘍細胞及び／またはヒト患者からの組織で異種移植された免疫不全動物から単離される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の培地懸濁液。
【請求項２０】
前記ヒト腫瘍細胞クラスターが、任意選択で、外科試料、生検、胸水、及び腹水から選択される、ヒト患者から除去された腫瘍試料から直接単離される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の培養懸濁液。
【請求項２１】
ヒト腫瘍細胞の増殖方法であって、試料からヒト腫瘍細胞の集団を得ることと、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の培地懸濁液中でヒト腫瘍細胞クラスターの集団を培養することと、を含む、方法。
【請求項２２】
約１４日以内の間、前記培養懸濁液中で前記ヒト腫瘍細胞クラスターを培養することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
約１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５日以内の間、前記培養懸濁液中で前記ヒト腫瘍細胞クラスターを培養することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
約７日以内の間、前記培養懸濁液中で前記ヒト腫瘍細胞クラスターを培養することを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ヒト患者から得られた腫瘍細胞クラスターの集団における腫瘍細胞増殖及び／または腫瘍細胞アポトーシスを、前記ヒト患者の治療薬に対する応答性の指標とする方法であって、
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の培地懸濁液中で前記腫瘍細胞クラスターの集団を培養することと、
前記治療薬を前記培地懸濁液に与薬することと、
前記腫瘍細胞の集団における腫瘍細胞増殖及び／または腫瘍細胞アポトーシスを測定することと、を含み、
腫瘍細胞増殖の減少及び／または腫瘍細胞アポトーシスの誘導が、ヒト患者の治療薬に対する応答性を示し、腫瘍細胞増殖の減少の欠如及び／または腫瘍細胞アポトーシスの誘導の欠如が、ヒト患者の治療薬に対する耐性を示す、方法。
【請求項２６】
前記治療薬を、前記培地懸濁液中で前記腫瘍細胞クラスターの集団を培養した日と同日に与薬することを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記治療薬を、前記培地懸濁液中で前記腫瘍細胞クラスターの集団を培養した少なくとも１日後に与薬することを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記治療薬を、前記培地懸濁液中で前記腫瘍細胞クラスターの集団を培養した約１、２、３、４、５、６、または７日後、またはそれ以内に与薬することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記治療薬の与薬約１４日以内に、前記腫瘍細胞の集団における腫瘍細胞増殖及び／または腫瘍細胞アポトーシスを測定することを含む、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記治療薬の与薬約１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５日以内に、前記腫瘍細胞の集団における腫瘍細胞増殖及び／または腫瘍細胞アポトーシスを測定することを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記治療薬の与薬約７、６、または５日以内に、前記腫瘍細胞の集団における腫瘍細胞増殖及び／または腫瘍細胞アポトーシスを測定することを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
腫瘍細胞増殖の測定ステップが、細胞増殖マーカーを測定することを含む、請求項２５〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞増殖マーカーが、３Ｈ−チミジン、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）、５−エチニル−２’−デオキシウリジン（Ｅｄｕ）、Ｋｉ−６７、及び増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）のうちの１つ以上から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記腫瘍細胞アポトーシスの測定ステップが、細胞アポトーシスマーカーを測定することを含む、請求項２５〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞アポトーシスマーカーが、カスパーゼの蛍光色素標識阻害剤（ＦＬＩＣＡ）、カスパーゼ活性化、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）切断、ＤＲＡＱ５、ＤＲＡＱ７、及び末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイのうちの１つ以上から選択される、請求項３４に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
ある特定の態様では、これらの応答性試験または方法は、診断研究所で行われ、その後、結果を患者に提供するか、または患者の医療及び癌治療において役割を担う医師または他の医療提供者に提供される。よって、特定の実施形態は、腫瘍細胞クラスター応答性試験の結果を患者、または医師もしくは他の医療提供者に提供するための方法に含む。これらの結果またはデータは、ハードコピーもしくは紙コピーの形態、またはコンピュータ可読媒体などの電子形態であってもよい。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ヒト患者からのヒト腫瘍細胞クラスターの集団を含む培地懸濁液であって、約１４日以内に前記腫瘍細胞クラスターの少なくとも約１０％の増殖をもたらす、培地懸濁液。
（項目２）
約１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５日以内に前記ヒト腫瘍細胞クラスターの少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％の増殖をもたらす、項目１に記載の培地懸濁液。
（項目３）
約７日以内に前記ヒト腫瘍細胞クラスターの少なくとも約２０〜３０％の増殖をもたらす、項目１または２に記載の培地懸濁液。
（項目４）
約７日以内に前記ヒト腫瘍細胞クラスターの少なくとも約６０％の増殖をもたらす、項目１〜３のいずれか１項に記載の培地懸濁液。
（項目５）
合成培地を含む、項目１〜４のいずれか１項に記載の培地懸濁液。
（項目６）
無血清である、項目１〜５のいずれか１項に記載の培地懸濁液。
（項目７）
ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、Ｗｎｔ３Ａ、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、インスリン、トランスフェリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、コレステロール、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、及び２−メルカプトエタノールから選択される１つ以上の構成成分を含む、項目５または６に記載の培地懸濁液。
（項目８）
ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、Ｗｎｔ３Ａ、ｂＦＧＦ、インスリン、トランスフェリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、コレステロール、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、及び２−メルカプトエタノールから選択される構成成分のうちの２、３、４、５、６、７、８、または９つを含む、項目７に記載の培地懸濁液。
（項目９）
ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、Ｗｎｔ３Ａ、ｂＦＧＦ、インスリン、トランスフェリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、コレステロール、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、及び２−メルカプトエタノールを含む、項目８に記載の培地懸濁液。
（項目１０）
ニコチンアミド、ノギン、Ｒ−スポンジン−１、Ｙ２７６３２、線維芽細胞成長因子１０（ＦＧＦ１０）、及びＶＯ−ＯＨｐｉｃから選択される１つ以上の構成成分を含む、項目５〜９のいずれか１項に記載の培地懸濁液。
（項目１１）
ニコチンアミド、ノギン、Ｒ−スポンジン−１、Ｙ２７６３２、ＦＧＦ１０、及びＶＯ−ＯＨｐｉｃから選択される構成成分のうちの２、３、４、５、または６つを含む、項目１０に記載の培地懸濁液。
（項目１２）
ニコチンアミド、ノギン、Ｒ−スポンジン−１、Ｙ２７６３２、ＦＧＦ１０、及びＶＯ−ＯＨｐｉｃを含む、項目１１に記載の培地懸濁液。
（項目１３）
上皮成長因子（ＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、Ｎ２サプリメント、Ｂ２７、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ−２）、及びＮ−アセチル−Ｌ−システインから選択される１つ以上の構成成分を含む、項目７〜１２のいずれか１項に記載の培地懸濁液。
（項目１４）
ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、Ｎ２、Ｂ２７、ＰＧＥ２、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインから選択される構成成分のうちの２、３、４、５、６、７、８、または９つを含む、項目１３に記載の培地懸濁液。
（項目１５）
ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、Ｎ２、Ｂ２７、ＰＧＥ２、及びＮ−アセチル−Ｌ−システインを含む、項目１４に記載の培地懸濁液。
（項目１６）
ニコチンアミド、ノギン、Ｒ−スポンジン−１、Ｙ２７６３２、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、Ｎ２、Ｂ２７、ＰＧＥ２、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、ＦＧＦ１０、及びＶＯ−ＯＨｐｉｃを含む、項目１０〜１５のいずれか１項に記載の培地懸濁液。
（項目１７）
細胞外基質構成成分、任意選択でマトリゲル、コラーゲン、ラミニン、またはフィブロネクチンを含まない、項目１〜１６のいずれか１項に記載の培地懸濁液。
（項目１８）
前記ヒト腫瘍細胞クラスターが、ヒト患者からの肺癌細胞、結腸癌細胞、胃癌細胞、または乳癌細胞である、項目１〜１７のいずれか１項に記載の培地懸濁液。
（項目１９）
前記ヒト腫瘍細胞クラスターが、ヒト腫瘍細胞及び／またはヒト患者からの組織で異種移植された免疫不全動物から単離される、項目１〜１８のいずれか１項に記載の培地懸濁液。
（項目２０）
前記ヒト腫瘍細胞クラスターが、任意選択で、外科試料、生検、胸水、及び腹水から選択される、ヒト患者から除去された腫瘍試料から直接単離される、項目１〜１８のいずれか１項に記載の培養懸濁液。
（項目２１）
ヒト腫瘍細胞の増殖方法であって、試料からヒト腫瘍細胞の集団を得ることと、項目１〜２０のいずれか１項に記載の培地懸濁液中でヒト腫瘍細胞クラスターの集団を培養することと、を含む、方法。
（項目２２）
約１４日以内の間、前記培養懸濁液中で前記ヒト腫瘍細胞クラスターを培養することを含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
約１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５日以内の間、前記培養懸濁液中で前記ヒト腫瘍細胞クラスターを培養することを含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
約７日以内の間、前記培養懸濁液中で前記ヒト腫瘍細胞クラスターを培養することを含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
ヒト患者の治療薬に対する応答性の試験方法であって、
前記ヒト患者から腫瘍細胞クラスターの集団を得るまたは受け取ることと、
項目１〜２４のいずれか１項に記載の培地懸濁液中で前記腫瘍細胞クラスターの集団を培養することと、
前記治療薬を前記培地懸濁液に与薬することと、
前記腫瘍細胞の集団における腫瘍細胞増殖及び／または腫瘍細胞アポトーシスを測定することと、を含み、
腫瘍細胞増殖の減少及び／または腫瘍細胞アポトーシスの誘導が、ヒト患者の治療薬に対する応答性を示し、腫瘍細胞増殖の減少の欠如及び／または腫瘍細胞アポトーシスの誘導の欠如が、ヒト患者の治療薬に対する耐性を示す方法も含まれる。
（項目２６）
前記治療薬を、前記培地懸濁液中で前記腫瘍細胞クラスターの集団を培養した日と同日に与薬することを含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記治療薬を、前記培地懸濁液中で前記腫瘍細胞クラスターの集団を培養した少なくとも１日後に与薬することを含む、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
前記治療薬を、前記培地懸濁液中で前記腫瘍細胞クラスターの集団を培養した約１、２、３、４、５、６、または７日後、またはそれ以内に与薬することを含む、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記治療薬の与薬約１４日以内に、前記腫瘍細胞の集団における腫瘍細胞増殖及び／または腫瘍細胞アポトーシスを測定することを含む、項目１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
（項目３０）
前記治療薬の与薬約１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５日以内に、前記腫瘍細胞の集団における腫瘍細胞増殖及び／または腫瘍細胞アポトーシスを測定することを含む、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記治療薬の与薬約７、６、または５日以内に、前記腫瘍細胞の集団における腫瘍細胞増殖及び／または腫瘍細胞アポトーシスを測定することを含む、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
腫瘍細胞増殖の測定ステップが、細胞増殖マーカーを測定することを含む、項目１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
前記細胞増殖マーカーが、３Ｈ−チミジン、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）、５−エチニル−２’−デオキシウリジン（Ｅｄｕ）、Ｋｉ−６７、及び増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）のうちの１つ以上から選択される、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記腫瘍細胞アポトーシスの測定ステップが、細胞アポトーシスマーカーを測定することを含む、項目１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
前記細胞アポトーシスマーカーが、カスパーゼの蛍光色素標識阻害剤（ＦＬＩＣＡ）、カスパーゼ活性化、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）切断、ＤＲＡＱ５、ＤＲＡＱ７、及び末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイのうちの１つ以上から選択される、項目３４に記載の方法。