【手続補正書】
【提出日】令和2年10月30日(2020.10.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
空のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドおよび完全ＡＡＶカプシドを含む濃縮ＡＡＶ画分から完全ＡＡＶカプシドを精製する方法であって、
（ｉ）ａ）濃縮ＡＡＶ画分、およびｂ）それぞれ異なる糖濃度を有し、かつそれぞれ約４５％（ｗ／ｗ）〜約６５％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む少なくとも２つの糖溶液を、ゾーナルロータにロードするステップ、
（ｉｉ）バッチモードで前記ゾーナルロータを含む超遠心機を運転して、糖密度勾配を形成するステップ、および
（ｉｉｉ）前記糖密度勾配の画分を取得して、ＡＡＶ画分中のＡＡＶ粒子の少なくともまたは約６０％が完全ＡＡＶカプシドであるＡＡＶ画分を得るステップ
を含む、方法。
【請求項２】
（Ａ）糖溶液の体積がゾーナルロータの容積の約５０％以上であるか、（Ｂ）糖溶液およびＡＡＶ画分の総体積がゾーナルロータの容積以下であるか、（Ｃ）ＡＡＶ画分の体積に対する糖溶液の体積の比が１以下であるか、あるいは（Ｄ）それらの組合せである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
各糖溶液は、約５０％（ｗ／ｗ）〜約６０％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
各糖溶液は、約５５％（ｗ／ｗ）〜約６０％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
１つの糖溶液は約５２％（ｗ／ｗ）〜約５８％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含み、第２の糖溶液は約５７％（ｗ／ｗ）〜約６３％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
第３の糖溶液は約４７％（ｗ／ｗ）〜約５３％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
２つの糖溶液がゾーナルロータにロードされる、請求項１〜５に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも３つの糖溶液がゾーナルロータにロードされる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
３つの糖溶液がゾーナルロータにロードされる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｉ）において、濃縮ＡＡＶ画分は、約５２％（ｗ／ｗ）〜約５８％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液の前にロードされ、さらにその約５２％（ｗ／ｗ）〜約５８％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液は、約５７％（ｗ／ｗ）〜約６３％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液の前にロードされる、請求項１、２および５〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｉ）において、濃縮ＡＡＶ画分は、約４７％（ｗ／ｗ）〜約５３％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液の前にロードされ、その約４７％（ｗ／ｗ）〜約５３％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液は、約５２％（ｗ／ｗ）〜約５８％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液の前にロードされ、さらにその約５２％（ｗ／ｗ）〜約５８％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液は、約５７％（ｗ／ｗ）〜約６３％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液の前にロードされる、請求項１、２、５、６、８および９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
（ｉ）各糖溶液が、等体積でゾーナルロータにロードされる、
（ｉｉ）最も低い糖濃度を有する糖溶液が、ゾーナルロータ中の他の糖溶液の少なくとも１つの体積の２倍の体積でゾーナルロータにロードされる、
（ｉｉｉ）最も低い糖濃度を有する糖溶液が、ゾーナルロータ中で組み合わされた全ての他の糖溶液の体積以上の体積でゾーナルロータにロードされる、
（ｉｖ）最も低い糖濃度を有する糖溶液が、最も高い糖濃度を有する糖溶液の体積の少なくとも２倍の体積でゾーナルロータにロードされる、
（ｖ）最も高い糖濃度を有する糖溶液の体積が、中間の糖濃度を有する糖溶液の体積に等しい、
（ｖｉ）最も低い糖濃度を有する糖溶液が、ゾーナルロータ中の少なくとも１つの他の糖溶液の体積の少なくとも２倍の体積でゾーナルロータにロードされる、
（ｖｉｉ）最も低い糖濃度を有する糖溶液が、ゾーナルロータ中の少なくとも１つの他の糖溶液の体積と同じ体積でゾーナルロータにロードされる、および／または
（ｖｉｉｉ）最も低い糖濃度を有する糖溶液が、濃縮ＡＡＶ画分の体積の半分の体積でゾーナルロータにロードされる、
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
全糖密度勾配の体積とゾーナルロータにロードされるＡＡＶ画分の体積との比が約１：１〜約１：５である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＡＡＶ画分は緩衝溶液を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記緩衝溶液は４５〜５５％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
各糖溶液は、ショ糖、麦芽糖、乳糖、またはそれらの組合せを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
各糖溶液はショ糖を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
各糖溶液および／またはＡＡＶ画分は、
（ｉ）約１０〜約１００ｍＭの濃度のＴｒｉｓ−ＨＣｌおよび約１００ｍＭ〜１Ｍの濃度のＮａＣｌを含む、および／または
（ｉｉ）７．０〜９．０のｐＨを有する、
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは約２０〜約５０ｍＭの濃度である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＮａＣｌは約１５０ｍＭ〜約７５０ｍＭの濃度である、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＮａＣｌは約１５０ｍＭ〜約５００ｍＭの濃度である、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
各糖溶液および／またはＡＡＶ画分は７．４〜約８．５のｐＨを有する、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
超遠心機を、１０，０００ｒｐｍ未満の第１の回転速度で６０分未満、および約３０，０００〜約４０，０００ｒｐｍの範囲内の第２の回転速度で少なくとも４時間運転することを含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
超遠心機を、１０，０００ｒｐｍ未満の第１の回転速度で６０分未満、および約３０，０００〜約４０，０００ｒｐｍの範囲内の第２の回転速度で少なくとも１２時間運転することを含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１の回転速度は約３，０００ｒｐｍ〜約６，０００ｒｐｍである、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１の回転速度は約４，０００ｒｐｍである、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記第２の回転速度は約３５，０００ｒｐｍである、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記第２の回転速度は、約４〜約６時間、または少なくとも約１６時間維持される、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記第２の回転速度は少なくとも約２０時間維持される、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記第２の回転速度は約３５，０００ｒｐｍであり、約１６〜約２０時間維持される、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ゾーナルロータにロードされる濃縮ＡＡＶ画分は、少なくとも１ｘ１０１２／ｍＬのＡＡＶカプシドを含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
（ｉ）３つのプラスミドを用いて宿主細胞をトランスフェクトし、（ｉｉ）トランスフェクト宿主細胞を含む細胞培養物の上清を回収し、さらに（ｉｉｉ）請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法を実施することを含む、ＡＡＶ生成物を製造する方法。
【請求項３３】
約５５％のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む第１の糖溶液、および約６０％のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む第２の糖溶液を含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
約５０％のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む第３の糖溶液をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１８】
本開示を実施するために発明者に分かっているベストモードを含む、本開示の好ましい実施形態を明細書中に記載する。それら好ましい実施形態の変形は、上記の説明を読むことにより当業者に明らかになるであろう。発明者は、当業者がそのような変形が適切であるとして利用することを予測し、さらに発明者は、具体的に明細書中に記載されているものとは別のやり方でその発明が実施されることを意図している。従って、本開示は、適用法に容認される、添付の特許請求の範囲に記載の主題の全ての変形および等価物を包含する。さらには、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈において明らかに矛盾しない限り、上記の要素のあらゆる組合せもその全ての可能な変形において本開示に包含される。
最後に、本発明の好ましい実施態様を項分け記載する。
［実施態様１］
［実施態様１］
空ＡＡＶカプシドおよび完全ＡＡＶカプシドを含む濃縮ＡＡＶ画分から完全アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドを精製する方法であって、
（ｉ）ａ）濃縮ＡＡＶ画分、およびｂ）それぞれ異なる糖濃度を有し、かつそれぞれ約４５％（ｗ／ｗ）〜約６５％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む少なくとも２つの糖溶液を、ゾーナルロータにロードするステップ、
（ｉｉ）バッチモードで前記ゾーナルロータを含む超遠心機を運転して、糖密度勾配を形成するステップ、および
（ｉｉｉ）前記糖密度勾配の画分を取得して、ＡＡＶ画分中のＡＡＶ粒子の少なくともまたは約６０％が完全ＡＡＶカプシドであるＡＡＶ画分を得るステップ
を含み、（Ａ）糖溶液の体積はゾーナルロータの容積の約５０％以上であるか、（Ｂ）糖溶液およびＡＡＶ画分の総体積はゾーナルロータの容積以下であるか、（Ｃ）ＡＡＶ画分の体積に対する糖溶液の体積の比は１以下であるか、または（Ｄ）それらの組合せである、方法。
［実施態様２］
各糖溶液は、約５０％（ｗ／ｗ）〜約６０％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む、実施態様１に記載の方法。
［実施態様３］
各糖溶液は、約５５％（ｗ／ｗ）〜約６０％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む、実施態様１または２に記載の方法。
［実施態様４］
前記糖溶液の少なくとも１つは、約５０％（ｗ／ｗ）ショ糖より高いショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む、実施態様１または２に記載の方法。
［実施態様５］
前記糖溶液の少なくとも１つは、約５５％（ｗ／ｗ）ショ糖より高いショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む、実施態様１〜４のいずれかに記載の方法。
［実施態様６］
前記糖溶液の少なくとも１つは、約６０％（ｗ／ｗ）〜約６５％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む、実施態様１〜５のいずれかに記載の方法。
［実施態様７］
１つの糖溶液は約５２％（ｗ／ｗ）〜約５８％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含み、第２の糖溶液は約５７％（ｗ／ｗ）〜約６３％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含み、さらに任意選択で、第３の糖溶液は約４７％（ｗ／ｗ）〜約５３％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む、実施態様１、２および４〜６のいずれかに記載の方法。
［実施態様８］
２つの糖溶液がゾーナルロータにロードされる、実施態様１〜７のいずれかに記載の方法。
［実施態様９］
２つの糖溶液がゾーナルロータにロードされ、１つの糖溶液は約５２％（ｗ／ｗ）〜約５８％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含み、第２の糖溶液は約５７％（ｗ／ｗ）〜約６３％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む、実施態様１、２および４〜８のいずれかに記載の方法。
［実施態様１０］
少なくとも３つの糖溶液がゾーナルロータにロードされる、実施態様１〜７のいずれかに記載の方法。
［実施態様１１］
３つの糖溶液がゾーナルロータにロードされる、実施態様１〜７および１０のいずれかに記載の方法。
［実施態様１２］
３つの糖溶液がゾーナルロータにロードされ、１つの糖溶液は約４７％（ｗ／ｗ）〜約５３％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含み、第２の糖溶液は約５２％（ｗ／ｗ）〜約５８％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含み、第３の糖溶液は約５７％（ｗ／ｗ）〜約６３％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む、実施態様１、２、４〜７、１０および１１のいずれかに記載の方法。
［実施態様１３］
ステップ（ｉ）において、濃縮ＡＡＶ画分は、約５２％（ｗ／ｗ）〜約５８％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液の前にロードされ、さらにその約５２％（ｗ／ｗ）〜約５８％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液は、約５７％（ｗ／ｗ）〜約６３％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液の前にロードされる、実施態様１、２および４〜１２のいずれかに記載の方法。
［実施態様１４］
ステップ（ｉ）において、濃縮ＡＡＶ画分は、約４７％（ｗ／ｗ）〜約５３％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液の前にロードされ、その約４７％（ｗ／ｗ）〜約５３％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液は、約５２％（ｗ／ｗ）〜約５８％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液の前にロードされ、さらにその約５２％（ｗ／ｗ）〜約５８％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液は、約５７％（ｗ／ｗ）〜約６３％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液の前にロードされる、実施態様１、２、４〜７、および１０〜１３のいずれかに記載の方法。
［実施態様１５］
各糖溶液は、等体積でゾーナルロータにロードされる、実施態様１〜１４のいずれかに記載の方法。
［実施態様１６］
最も低い糖濃度を有する糖溶液が、ゾーナルロータ中の他の糖溶液の少なくとも１つの体積の２倍の体積でゾーナルロータにロードされる、実施態様１〜１４のいずれかに記載の方法。
［実施態様１７］
最も低い糖濃度を有する糖溶液が、ゾーナルロータ中で組み合わされた全ての他の糖溶液の体積以上の体積でゾーナルロータにロードされる、実施態様１〜１４および１６のいずれかに記載の方法。
［実施態様１８］
最も低い糖濃度を有する糖溶液が、最も高い糖濃度を有する糖溶液の体積の少なくとも２倍の体積でゾーナルロータにロードされ、任意選択で、最も高い糖濃度を有する糖溶液の体積は、中間の糖濃度を有する糖溶液の体積に等しい、実施態様１〜１４、１６および１７のいずれかに記載の方法。
［実施態様１９］
少なくとも２つの糖溶液がゾーナルロータにロードされ、最も低い糖濃度を有する糖溶液が、ゾーナルロータ中の少なくとも１つの他の糖溶液の体積の少なくとも２倍の体積でゾーナルロータにロードされる、実施態様１〜１４、および１６〜１８のいずれかに記載の方法。
［実施態様２０］
少なくとも２つの糖溶液がゾーナルロータにロードされ、最も低い糖濃度を有する糖溶液が、ゾーナルロータ中の少なくとも１つの他の糖溶液の体積と同じ体積でゾーナルロータにロードされる、実施態様１〜１９のいずれかに記載の方法。
［実施態様２１］
最も低い糖濃度を有する糖溶液が、濃縮ＡＡＶ画分の体積の半分の体積でゾーナルロータにロードされる、実施態様１〜２０のいずれかに記載の方法。
［実施態様２２］
全糖密度勾配の体積のゾーナルロータにロードされるＡＡＶ画分の体積に対する比が約１：１〜約１：５である、実施態様１〜２１のいずれかに記載の方法。
［実施態様２３］
前記ＡＡＶ画分は緩衝溶液を含む、実施態様１〜２２のいずれかに記載の方法。
［実施態様２４］
前記緩衝溶液はＴｒｉｓ−ＨＣｌおよびＮａＣｌを含む、実施態様２３に記載の方法。実施態様２３に記載の方法。
［実施態様２５］
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは約２０〜約５０ｍＭの濃度であり、かつＮａＣｌは約１５０ｍＭ〜約９００ｍＭの濃度である、実施態様２４に記載の方法。
［実施態様２６］
前記緩衝溶液は約７．４〜約９．０のｐＨを有する、実施態様２３〜２５のいずれかに記載の方法。
［実施態様２７］
前記緩衝溶液は４５〜５５％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む、実施態様２３〜２６のいずれかに記載の方法。
［実施態様２８］
各糖溶液は二糖または三糖を含む、実施態様１〜２７のいずれかに記載の方法。
［実施態様２９］
前記二糖は、ショ糖、麦芽糖、乳糖、およびそれらの組合せを含む、実施態様２８に記載の方法。
［実施態様３０］
各糖溶液はショ糖を含む、実施態様１〜２９のいずれかに記載の方法。
［実施態様３１］
前記糖溶液はそれぞれ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよびＮａＣｌをさらに含む、実施態様１〜３０のいずれかに記載の方法。
［実施態様３２］
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは約２０〜約５０ｍＭの濃度であり、かつＮａＣｌは約１５０ｍＭ〜約５００ｍＭの濃度である、実施態様３１に記載の方法。
［実施態様３３］
前記緩衝溶液は約７．４〜約８．５のｐＨを有する、実施態様３１または３２に記載の方法。
［実施態様３４］
超遠心機を、１０，０００ｒｐｍ未満の第１の回転速度で６０分未満、および約３０，０００〜約４０，０００ｒｐｍの範囲内の第２の回転速度で少なくとも４時間運転することを含む、実施態様１〜３３のいずれかに記載の方法。
［実施態様３５］
超遠心機を、１０，０００ｒｐｍ未満の第１の回転速度で６０分未満、および約３０，０００〜約４０，０００ｒｐｍの範囲内の第２の回転速度で少なくとも１２時間運転することを含む、実施態様１〜３４のいずれかに記載の方法。
［実施態様３６］
前記第１の回転速度は約３，０００ｒｐｍ〜約６，０００ｒｐｍであり、任意選択で約４，０００ｒｐｍである、実施態様３４または３５に記載の方法。
［実施態様３７］
前記第２の回転速度は約３５，０００ｒｐｍであり、任意選択で、約４〜約６時間維持される、実施態様３４または３６に記載の方法。
［実施態様３８］
前記第２の回転速度は少なくとも約１６時間または少なくとも２０時間維持される、実施態様３４〜３６のいずれかに記載の方法。
［実施態様３９］
前記第２の回転速度は約３５，０００ｒｐｍであり、任意選択で、約１６〜約２０時間維持される、実施態様３４〜３６および３８のいずれかに記載の方法。
［実施態様４０］
ゾーナルロータにロードされる濃縮ＡＡＶ画分は、少なくとも１ｘ１０１２／ｍＬのＡＡＶカプシドを含む、実施態様１〜３９のいずれかに記載の方法。
［実施態様４１］
トリプルプラスミドシステムでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を含む細胞培養物から上清を採取することを含む、実施態様１〜４０のいずれかに記載の方法。
［実施態様４２］
ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションの約３〜約５日後、あるいは細胞培養物が約５ｘ１０６細胞／ｍＬ以上の細胞密度を有しかつ５０％超の細胞生存率を有するときに、上清を採取することを含む、実施態様４１に記載の方法。
［実施態様４３］
デプスろ過を介して採取した上清をろ過することを含む、実施態様４１または４２に記載の方法。
［実施態様４４］
セルロースおよびパーライトを含みかつ約５００Ｌ／ｍ２の最小透過性を有するフィルターを通して採取した上清をろ過することを含む、実施態様４３に記載の方法。
［実施態様４５］
約０．２μｍの最小孔径を有するフィルターを通して採取した上清をろ過することを含む、実施態様４３に記載の方法。
［実施態様４６］
（ｉ）ＡＡＶがＡＥＸクロマトグラフィカラムを素通りする条件下でＡＡＶ画分を陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィカラムに添加し、さらに（ｉｉ）ＡＡＶを含む素通り液を回収することを含む、実施態様１〜４５のいずれかに記載の方法。
［実施態様４７］
ＡＡＶ画分は、約１００ｍＭ〜約１５０ｍＭのＮａＣｌを含むローディングバッファーを用いてＡＥＸクロマトグラフィカラムに添加され、任意選択で、前記ローディングバッファーのｐＨは約８〜約９である、実施態様４６に記載の方法。
［実施態様４８］
前記ローディングバッファーは約１１５ｍＭ〜約１３０ｍＭのＮａＣｌを含み、任意選択で、前記ローディングバッファーは約１２０ｍＭ〜約１２５ｍＭのＮａＣｌを含む、実施態様４７に記載の方法。
［実施態様４９］
限外濾過／ダイアフィルトレーションシステムを用いてＡＡＶ画分を濃縮することを含む、実施態様１〜４８のいずれかに記載の方法。
［実施態様５０］
ＡＡＶがＡＥＸクロマトグラフィカラムを素通りする条件下でＡＡＶ画分を陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィカラムに添加することを含むステップの前、後、または前後に、限外濾過／ダイアフィルトレーションシステムを用いてＡＡＶ画分を濃縮することを含む、実施態様４９に記載の方法。
［実施態様５１］
宿主細胞タンパク質が除去される、実施態様１〜５０のいずれかに記載の方法。
［実施態様５２］
前記宿主細胞タンパク質はＨＳＰ７０および／またはＬＤＨである、実施態様５１に記載の方法。
［実施態様５３］
溶媒および／または界面活性剤を用いてＡＡＶ画分の脂質エンベロープウイルスを不活化することをさらに含む、実施態様１〜５２のいずれかに記載の方法。
［実施態様５４］
ＡＡＶ画分をナノろ過して、３５ｎｍより大きいウイルスを除去することを含む、実施態様１〜５３のいずれかに記載の方法。
［実施態様５５］
テンタクルゲルを含むカラムを用いてＡＥＸクロマトグラフィを実施することを含むポリッシングステップをさらに含む、実施態様１〜５４のいずれかに記載の方法。
［実施態様５６］
（ｉ）３つのプラスミドを用いて宿主細胞をトランスフェクトし、（ｉｉ）トランスフェクト宿主細胞を含む細胞培養物の上清を回収し、さらに（ｉｉｉ）実施態様１〜５５のいずれかに記載の方法を実施することを含む、ＡＡＶ生成物を製造する方法。
［実施態様５７］
前記方法のステップが図１に示す順序で行われる、実施態様５６に記載の方法。
［実施態様５８］
ＡＡＶ画分をＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡにより試験することを含む、実施態様１〜５７のいずれかに記載の方法。
［実施態様５９］
定量ＰＣＲにより力価を測定するステップを含まない、実施態様５８に記載の方法。
［実施態様６０］
前記ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡはＡＡＶに特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡである、実施態様５８または５９に記載の方法。
［実施態様６１］
約５５％のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む第１の糖溶液、約６０％のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む第２の糖溶液、および任意選択で、約５０％のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む第３の糖溶液を含む、実施態様１〜６０のいずれかに記載の方法。
［実施態様６２］
ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ１０である、実施態様１〜６１のいずれかに記載の方法。
［実施態様６３］
ＡＡＶはＡＡＶ８である、実施態様１〜６２のいずれかに記載の方法。
［実施態様６４］
実施態様１〜６３のいずれかに記載の方法により製造されたＡＡＶ生成物。
［実施態様６５］
実施態様１〜６３のいずれかに記載の方法により製造されたＡＡＶ生成物を含む医薬組成物。