(57)【要約】可溶性グアニル酸シクラーゼ（２）の二つのサブユニット（２１，２２）に、各々、サイクリックグアノシン３’，５’−リン酸を認識してシグナルを発するｃＧＭＰ可視化プローブ（３）が連結されていることを特徴とする一酸化窒素検出・定量用プローブ（１）とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
可溶性グアニル酸シクラーゼの二つのサブユニットに、各々、サイクリックグアノシン３’，５’−一リン酸を認識してシグナルを発するｃＧＭＰ可視化プローブが連結されていることを特徴とする一酸化窒素検出・定量用プローブ。
【請求項２】
可溶性グアニル酸シクラーゼの二つのサブユニットαおよびβに、各々、サイクリックグアノシン３’，５’−一リン酸を認識してシグナルを発するｃＧＭＰ可視化プローブが連結されてなる二つのハイブリッド蛋白質が、二量化することにより得られる請求項１のプローブ。
【請求項３】
ｃＧＭＰ可視化プローブは、ｃＧＭＰ結合蛋白の両末端に互いの接近が検出可能な二つのマーカー部位が連結されてなるものである請求項１または２のいずれかのプローブ。
【請求項４】
ｃＧＭＰ可視化プローブにおけるｃＧＭＰ結合蛋白は、ｃＧＭＰ依存性キナーゼＩαである請求項３のプローブ。
【請求項５】
ｃＧＭＰ可視化プローブにおける互いの接近が検出可能な二つのマーカー部位は、シアン蛍光蛋白質と黄色蛍光蛋白質である請求項３または４のいずれかのプローブ。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれかのプローブとグアノシン５’−三リン酸を共存させ、該プローブのシグナル変化を測定することを特徴とする一酸化窒素の検出・定量方法。
【請求項７】
請求項１ないし５のいずれかのプロープを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入することにより、該プローブとグアノシン５’−三リン酸を細胞内で共存させる請求項６の検出・定量方法。
【請求項８】
細胞内に、可溶性グアニル酸シクラーゼの二つのサブユニットαおよびβの各々にｃＧＭＰ可視化プローブを連結してなる二種類のハイブリッド蛋白質を発現する二種類のポリヌクレオチドを導入することにより、請求項１ないし５のいずれかのプローブとグアノシン５’−三リン酸を細胞内で共存させる請求項６の検出・定量方法。
【請求項９】
請求項１ないし５のいずれかのプローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することにより、この非ヒト動物またはその子孫動物の全細胞において該プローブとグアノシン５’−三リン酸を共存させる請求項６の検出・定量方法。
【請求項１０】
細胞内に、可溶性グアニル酸シクラーゼの二つのサブユニットαおよびβの各々にｃＧＭＰ可視化プローブを連結してなる二種類のハイブリッド蛋白質を発現する二種類のポリヌクレオチドを導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することにより、この非ヒト動物またはその子孫動物の全細胞において請求項１ないし５のいずれかのプローブとグアノシン５’−三リン酸を共存させる請求項６の検出・定量方法。
【請求項１１】
可溶性グアニル酸シクラーゼと一酸化窒素の結合に影響を与える物質をスクリーニングする方法であって、請求項１ないし５のいずれかのプローブとグアノシン５’−三リン酸と候補物質と一酸化窒素を共存させて、候補物質存在下および非存在下におけるシグナル変化を測定することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項１２】
請求項１ないし５のいずれかのプローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、さらに候補物質を導入することにより、請求項１ないし５のいずれかのプローブとグアノシン５’−三リン酸と候補物質と一酸化窒素を細胞内において共存させる請求項１１のスクリーニング方法。
【請求項１３】
細胞内に、可溶性グアニル酸シクラーゼの二つのサブユニットαおよびβの各々にｃＧＭＰ可視化プローブを連結してなる二種類のハイブリッド蛋白質を発現する二種類のポリヌクレオチドを導入し、さらに候補物質を導入することにより、請求項１ないし５のいずれかのプローブとグアノシン５’−三リン酸と候補物質と一酸化窒素を細胞内において共存させる請求項１１のスクリーニング方法。
【請求項１４】
請求項１ないし５のいずれかのプローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生して得られる非ヒト動物またはその子孫動物に、候補物質を投与することにより、該非ヒト動物またはその子孫動物の全細胞において該プローブとグアノシン５’−三リン酸と候補物質と一酸化窒素を共存させる請求項１１のスクリーニング方法。
【請求項１５】
細胞内に、可溶性グアニル酸シクラーゼの二つのサブユニットαおよびβの各々にｃＧＭＰ可視化プローブを連結してなる二種類のハイブリッド蛋白質を発現する二種類のポリヌクレオチドを導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生して得られる非ヒト動物またはその子孫動物に、候補物質を投与することにより、該非ヒト動物またはその子孫動物の全細胞において該プローブとグアノシン５’−三リン酸と候補物質と一酸化窒素を共存させる請求項１１のスクリーニング方法。
【請求項１６】
刺激による細胞内での一酸化窒素濃度の変化をモニタリングするための方法であって、請求項１ないし５のいずれかのプローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入して得られる細胞に、刺激を付与し、刺激付与前後におけるシグナル変化を測定することを特徴とする細胞内一酸化窒素濃度のモニタリング方法。
【請求項１７】
刺激による細胞内での一酸化窒素濃度の変化をモニタリングするための方法であって、細胞内に、可溶性グアニル酸シクラーゼの二つのサブユニットの各々にｃＧＭＰ可視化プローブを連結してなる二種類のハイブリッド蛋白質を発現する二種類のポリヌクレオチドを導入して得られる細胞に、刺激を付与し、刺激付与前後におけるシグナル変化を測定することを特徴とするモニタリング方法。
【請求項１８】
刺激による生体内での一酸化窒素濃度の変化をモニタリングするための方法であって、請求項１ないし５のいずれかのプローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することにより得られる非ヒト動物またはその子孫動物に、刺激を付与し、この非ヒト動物またはその子孫動物での刺激付与前後におけるシグナル変化を測定することを特徴とするモニタリング方法。
【請求項１９】
細胞内に、可溶性グアニル酸シクラーゼの二つのサブユニットαおよびβの各々にｃＧＭＰ可視化プローブを連結してなる二種類のハイブリッド蛋白質を発現する二種類のポリヌクレオチドを導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生して得られる非ヒト動物またはその子孫動物に、刺激を付与し、この非ヒト動物またはその子孫動物での刺激付与前後におけるシグナル変化を測定することを特徴とするモニタリング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  この出願の発明は、細胞内の一酸化窒素を検出するためのプローブと、それを用いた一酸化窒素の検出・定量方法、可溶性グアニル酸シクラーゼと一酸化窒素の結合に影響を与える物質のスクリーニング方法、並びに一酸化窒素濃度変化のモニタリング方法に関するものである。
【背景技術】  一酸化窒素（Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ；ＮＯ）については、１９８７年に血管内皮由来の血管弛緩因子であることが報告されて以来、その生理活性物質としての役割が次々に見出されている。アミノ酸のＬ−アルギニンを基質としてＮＯ合成酵素（ＮＯｓｙｎｔｈａｓｅ；ＮＯＳ）により合成されたＮＯは、心血管系のみならず、免疫系、中枢神経系においても、それぞれマクロファージによる生体防御反応、記憶・学習におけるシナプスの可塑性獲得のメカニズムなど、多様な生物応答を制御していることが明らかになっている。また、疾患に関しても、心血管系では動脈硬化、脳卒中、高血圧、免疫系では感染疾患、中枢神経系では痴呆、アルツハイマー病等にＮＯが関係していると考えられている。
このようなＮＯは、生体内において酵素や活性酸素による酸化を受けやすく、不安定で短寿命な分子である。そのため、生理的濃度のＮＯを検出するのは困難であり、生体内におけるＮＯの動態は未知の領域であったのが実情である。
生体内においてＮＯを検出する方法として、ＮＯと化学反応するジアミノ基を有するフルオレセイン骨格の有機分子（ｄｉａｍｉｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ；ＤＡＦ）が報告されている（非特許文献１）。ＤＡＦは、通常は無蛍光であるが、酸素存在下でＮＯと反応すると蛍光性のトリアゾール体となり、緑色蛍光を呈するようになる。したがって、このような有機分子を用いることにより、細胞内に生成したＮＯを蛍光顕微鏡下で可視化分析することが可能となった。また、同様の原理により赤色蛍光を呈するローダミン骨格の有機分子（ＤＡＲ）も報告されている（非特許文献２）。
しかしながら、これら従来の有機分子は、細胞内に導入する際に脂質膜に非特異的に吸着してＮＯに非依存的な蛍光を発するため、ＮＯに対する検出下限が大幅に上昇するという問題があった。また、これら有機分子は、ＮＯと不可逆的に化学反応するため、ＮＯ濃度の変化など、複雑なＮＯの生体内動態を追跡できないという問題もあった。
そこで、この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、ｎＭオーダーのＮＯの濃度変化を、精度高く、簡便に可逆的に可視化検出するための新たな手法を提供することを課題としている。
文献
【非特許文献１】Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０；２４４６−２４５３，１９９８．
【非特許文献２】Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３；１９６７−１９７３，２００１．
【非特許文献３】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７；７３８０−７３８４，１９８０
【特許文献１】特開２００２−０１７３５９
【特許文献２】ＰＣＴ／ＪＰ０１／５６３１
【発明の開示】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、第１には、可溶性グアニル酸シクラーゼ（以下、ｓＧＣと記載する）の二つのサブユニットに、各々、サイクリックグアノシン３’，５’−一リン酸（以下、ｃＧＭＰと記載する）を認識してシグナルを発するｃＧＭＰ可視化プローブが連結されていることを特徴とする一酸化窒素（以下、ＮＯと記載する）検出・定量用プローブを提供する。
この出願の発明は、第２には、ｓＧＣの二つのサブユニットαおよびβに、各々、ｃＧＭＰを認識してシグナルを発するｃＧＭＰ可視化プローブが連結されてなる二つのハイブリッド蛋白質が、二量化することにより得られる前記のプローブを提供する。
さらに、この出願の発明は、第３には、ｃＧＭＰ可視化プローブが、ｃＧＭＰ結合蛋白の両末端に互いの接近が検出可能な二つのマーカー部位が連結されてなるものである前記いずれかのプローブを、第４には、ｃＧＭＰ可視化プローブにおけるｃＧＭＰ結合蛋白が、ｃＧＭＰ依存性キナーゼＩαであるプローブを、そして、第５には、ｃＧＭＰ可視化プローブにおける互いの接近が検出可能な二つのマーカー部位が、シアン蛍光蛋白質と黄色蛍光蛋白質であるプローブを提供する。
また、この出願の発明は、第６には、前記いずれかのプローブとグアノシン５’−三リン酸（以下、ＧＴＰと記載する）を共存させ、該プローブのシグナル変化を測定することを特徴とする一酸化窒素の検出・定量方法を提供する。
さらに、この出願の発明は、第７には、前記いずれかのプローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入することにより、該プローブとＧＴＰを細胞内で共存させる前記の検出・定量方法を、第８には、細胞内に、ｓＧＣの二つのサブユニットαおよびβの各々にｃＧＭＰ可視化プローブを連結してなる二種類のハイブリッド蛋白質を発現する二種類のポリヌクレオチドを導入することにより、前記いずれかのプローブとＧＴＰを細胞内で共存させる前記の検出・定量方法を提供する。
この出願の発明は、第９には、前記いずれかのプローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することにより、この非ヒト動物またはその子孫動物の全細胞において該プローブとＧＴＰを共存させる前記の検出・定量方法を、第１０には、細胞内に、ｓＧＣの二つのサブユニットαおよびβの各々にｃＧＭＰ可視化プローブを連結してなる二種類のハイブリッド蛋白質を発現する二種類のポリヌクレオチドを導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することにより、この非ヒト動物またはその子孫動物の全細胞において前記いずれかのプローブとＧＴＰを共存させる前記の検出・定量方法を提供する。
この出願の発明は、第１１には、ｓＧＣとＮＯの結合に影響を与える物質をスクリーニングする方法であって、前記いずれかのプローブとＧＴＰと候補物質とＮＯを共存させて、候補物質存在下および非存在下におけるシグナル変化を測定することを特徴とするスクリーニング方法を提供する。
また、この出願の発明は、第１２には、前記いずれかのプローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、さらに候補物質を導入することにより、プローブとＧＴＰと候補物質とＮＯを細胞内において共存させる前記のスクリーニング方法を、第１３には、細胞内に、ｓＧＣの二つのサブユニットαおよびβの各々にｃＧＭＰ可視化プローブを連結してなる二種類のハイブリッド蛋白質を発現する二種類のポリヌクレオチドを導入し、さらに候補物質を導入することにより、前記いずれかのプローブとＧＴＰと候補物質とＮＯを細胞内において共存させる前記のスクリーニング方法を提供する。
この出願の発明は、第１４には、前記いずれかのプローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生して得られる非ヒト動物またはその子孫動物に、候補物質を投与することにより、該非ヒト動物またはその子孫動物の全細胞において該プローブとＧＴＰと候補物質と一酸化窒素を共存させる前記のスクリーニング方法を、そして、第１５には、細胞内に、ｓＧＣの二つのサブユニットαおよびβの各々にｃＧＭＰ可視化プローブを連結してなる二種類のハイブリッド蛋白質を発現する二種類のポリヌクレオチドを導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生して得られる非ヒト動物またはその子孫動物に、候補物質を投与することにより、該非ヒト動物またはその子孫動物の全細胞において該プローブとＧＴＰと候補物質と一酸化窒素を共存させる前記のスクリーニング方法を提供する。
さらに、この出願の発明は、第１６には、刺激による細胞内でのＮＯ濃度の変化をモニタリングするための方法であって、前記いずれかのプローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入して得られる細胞に、刺激を付与し、刺激付与前後におけるシグナル変化を測定することを特徴とする細胞内ＮＯ濃度のモニタリング方法を、第１７には、刺激による細胞内でのＮＯ濃度の変化をモニタリングするための方法であって、細胞内に、ｓＧＣの二つのサブユニットの各々にｃＧＭＰ可視化プローブを連結してなる二種類のハイブリッド蛋白質を発現する二種類のポリヌクレオチドを導入して得られる細胞に、刺激を付与し、刺激付与前後におけるシグナル変化を測定することを特徴とするモニタリング方法を提供する。
この出願の発明は、さらに、第１８には、刺激による生体内でのＮＯ濃度の変化をモニタリングするための方法であって、前記いずれかのプローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することにより得られる非ヒト動物またはその子孫動物に、刺激を付与し、この非ヒト動物またはその子孫動物での刺激付与前後におけるシグナル変化を測定することを特徴とするモニタリング方法を、そして、第１９には、細胞内に、ｓＧＣの二つのサブユニットαおよびβの各々にｃＧＭＰ可視化プローブを連結してなる二種類のハイブリッド蛋白質を発現する二種類のポリヌクレオチドを導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生して得られる非ヒト動物またはその子孫動物に、刺激を付与し、この非ヒト動物またはその子孫動物での刺激付与前後におけるシグナル変化を測定することを特徴とするモニタリング方法を提供する。
そして、上記第１の発明のＮＯ検出定量用プローブでは、ｓＧＣの二つのサブユニットに、各々、ｃＧＭＰを認識してシグナルを発するｃＧＭＰ可視化プローブが連結されていることから、ＮＯが共存すると、プローブ中のｓＧＣ部位におけるヘム鉄にＮＯが配位結合し、ｓＧＣの酵素活性が２００倍以上に上昇する。このとき、ＧＴＰが系内に共存すれば、このＧＴＰを基質としてセカンドメッセンジャーのｃＧＭＰが大量に生成される。このｃＧＭＰは、プロープ中のｃＧＭＰ可視化プローブ部位により認識され、ｃＧＭＰ可視化プローブがシグナルを発する。したがって、このシグナル変化を測定することにより、系内のＮＯを精度高く検出することが可能となる。
また、上記第２の発明のプローブは、ｓＧＣの二つのサブユニットαおよびβに、各々、ｃＧＭＰを認識してシグナルを発するｃＧＭＰ可視化プローブが連結されてなる二つのハイブリッド蛋白が、二量化し、ｓＧＣが再構築されることにより得られる。
上記第３の発明のプローブでは、ｃＧＭＰ可視化プローブは、ｃＧＭＰ結合蛋白の両末端に互いの近接が検出可能な二つのマーカー部位が連結されてなるものであることから、ＮＯがプローブ中のｓＧＣのヘム鉄に配位結合し、酵素活性が増大してｃＧＭＰが生成されると、ｃＧＭＰがｃＧＭＰ結合蛋白と結合し、ｃＧＭＰ結合蛋白の立体構造が変化し、両末端に連結された二つのマーカー部位が近接するようになる。これによりシグナルが発信され、ＮＯを精度高く検出することが可能となる。
さらに、このようなプローブの態様として、上記第４の発明では、ｃＧＭＰ結合蛋白をｃＧＭＰ依存性蛋白キナーゼＩα（以下、ＰＫＧ  Ｉαと記載することがある）とし、上記第５の発明では、ｃＧＭＰ可視化プローブにおける互いの近接が検出可能な二つのマーカー部位を、シアン蛍光蛋白質と黄色蛍光蛋白質とする。
また、上記第６の発明のＮＯの検出・定量方法では、前記いずれかのプローブとＧＴＰを共存させ、該プローブのシグナル変化を測定することにより、ＮＯを検出することが可能となる。すなわち、ＮＯが存在する場合、プローブ中のｓＧＣ部位におけるヘム鉄にＮＯが配位結合し、ｓＧＣの酵素活性が上昇し、共存するＧＴＰを基質としてｃＧＭＰが大量に生成される。そして、このｃＧＭＰが、プローブ中のｃＧＭＰ可視化プローブ部位により認識され、シグナルが発信されるのである。そして、予めＮＯ濃度とシグナル変化量との関係を検量しておくことにより、ＮＯの定量も可能となる。
さらに、上記第７の発明では、前記いずれかのプローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入することにより、該プローブとＧＴＰを細胞内で共存させることが可能となる。また、上記第８の発明では、細胞内に、ｓＧＣの二つのサブユニットαおよびβの各々にｃＧＭＰ可視化プローブを連結してなる二種類のハイブリッド蛋白質を発現する二種類のポリヌクレオチドを導入することにより、細胞内でｓＧＣのαおよびβ二つのサブユニットが二量化し、ｓＧＣが構築される。したがって、前記のプローブとＧＴＰを細胞内で共存させることが可能となる。
上記第９の発明では、前記いずれかのプローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することにより、この非ヒト動物またはその子孫動物の全細胞において該プローブとＧＴＰを共存させることができる。また、上記第１０の発明では、細胞内に、ｓＧＣの二つのサブユニットαおよびβの各々にｃＧＭＰ可視化プローブを連結してなる二種類のハイブリッド蛋白質を発現する二種類のポリヌクレオチドを導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することにより、この非ヒト動物またはその子孫動物の全細胞においてｓＧＣのαおよびβ二つのサブユニットが二量化し、ｓＧＣが構築される。したがって、前記のプローブとＧＴＰを、この非ヒト動物またはその子孫動物の全細胞において共存させることが可能となる。
さらに、上記第１１の発明のスクリーニング方法では、前記いずれかのプローブと、ＧＴＰと、候補物質と、ＮＯを共存させて、候補物質存在下および非存在下におけるシグナル変化を測定することにより、ｓＧＣとＮＯの結合に影響を与える物質をスクリーニングすることができる。
上記第１２の発明のスクリーニング方法では、前記いずれかのプローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、さらに候補物質を導入することにより、プローブとＧＴＰと候補物質とＮＯを、この細胞内において共存させることが可能となる。
また、上記第１３の発明のスクリーニング方法では、細胞内に、ｓＧＣの二つのサブユニットαおよびβの各々にｃＧＭＰ可視化プローブを連結してなる二種類のハイブリッド蛋白質を発現する二種類のポリヌクレオチドを導入し、さらに候補物質を導入することにより、細胞内でｓＧＣのαおよびβ二つのサブユニットが二量化し、ｓＧＣが構築され、前記いずれかのプローブとＧＴＰと候補物質とＮＯを、細胞内において共存させることが可能となる。
上記第１４の発明のスクリーニング方法では、さらに、前記いずれかのプローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生して得られる非ヒト動物またはその子孫動物に、候補物質を投与することにより、該非ヒト動物またはその子孫動物の全細胞において該プローブとＧＴＰと候補物質と一酸化窒素を共存させることが可能となる。
上記第１５の発明のスクリーニング方法では、細胞内に、ｓＧＣの二つのサブユニットαおよびβの各々にｃＧＭＰ可視化プローブを連結してなる二種類のハイブリッド蛋白質を発現する二種類のポリヌクレオチドを導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生して得られる非ヒト動物またはその子孫動物に、候補物質を投与することにより、該非ヒト動物またはその子孫動物の全細胞において該プローブとＧＴＰと候補物質と一酸化窒素を共存させることが可能となる。
上記第１６の発明では、前記いずれかのプローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入して得られる細胞に、刺激を付与し、刺激付与前後におけるシグナル変化を測定することにより、刺激による細胞内でのＮＯ濃度の変化をモニタリングすることが可能となる。
また、上記第１７の発明では、細胞内に、ｓＧＣの二つのサブユニットの各々にｃＧＭＰ可視化プローブを連結してなる二種類のハイブリッド蛋白質を発現する二種類のポリヌクレオチドを導入して得られる細胞に、刺激を付与し、刺激付与前後におけるシグナル変化を測定することにより、刺激による細胞内でのＮＯ濃度の変化をモニタリングすることが可能となる。
さらに、上記第１８の発明では、前記いずれかのプローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することにより得られる非ヒト動物またはその子孫動物に刺激を付与し、この非ヒト動物またはその子孫動物での刺激付与前後におけるシグナル変化を測定することにより、刺激による生体内でのＮＯ濃度の変化をモニタリングすることが可能となる。
そして、上記第１９の発明では、細胞内に、ｓＧＣの二つのサブユニットαおよびβの各々にｃＧＭＰ可視化プローブを連結してなる二種類のハイブリッド蛋白質を発現する二種類のポリヌクレオチドを導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生して得られる非ヒト動物またはその子孫動物に、刺激を付与し、この非ヒト動物またはその子孫動物での刺激付与前後におけるシグナル変化を測定することにより、刺激による生体内でのＮＯ濃度の変化をモニタリングすることが可能となる。
【図面の簡単な説明】  図１Ａは、この出願の発明の一酸化窒素検出・定量用プローブの構成を例示した概略模式図と、図１Ｂはこの出願の発明の一酸化窒素検出・定量用プローブによるシグナル検出の原理を例示した概略模式図である。
図２は、この出願の発明の実施例において使用されたｃＤＮＡの構成を示した概略模式図であり、「Ａ」はＣＧＹ、α−ＣＧＹ、β−ＣＧＹそれぞれの構成を示し、「Ｂ」はＣＧＹとα−ＣＧＹとを連結した「ｓＧＣ  α−ＣＧＹ」およびＣＧＹとβ−ＣＧＹとを連結した「ｓＧＣ  β−ＣＧＹ」（ＮＯＡ−１）の構成を示している。
図３は、この出願の発明の実施例において、一酸化窒素検出・定量用プローブ発現した細胞をＮＯの供与体であるＮＯＣ−７（５ｎＭ）で刺激した際のＣＦＰとＹＦＰの蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）の経時変化を示した図である。（ａ：細胞未処理、ｂ：１００μＭ  ＮＳ２０２８で細胞を前処理、ｃ：２００μＭ  Ｚａｐｒｉｎａｓｔで細胞を前処理）
図４Ａは、この出願の発明の実施例において、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に、前記のα−ＣＧＹとβ−ＣＧＹを各々単独で発現させ、１０ｎｍ  ＮＯＣ−７でその細胞を刺激した際のＣＦＰとＹＦＰの蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）の経時変化を示した図であり、図４Ｂは、５０ｎｍ  ＮＯＣ−７でその細胞を刺激し、約４００秒後にさらに８−Ｂｒ−ｃＧＭＰを添加した際のＣＦＰとＹＦＰの蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）の経時変化を示した図である。
図５は、この出願の発明の実施例において、一酸化窒素検出・定量用プローブ発現した細胞をＮＯの供与体であるＮＯＣ−７（５ｎＭ）で繰り返し刺激した際のＣＦＰとＹＦＰの蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）の経時変化を示した図である。
図６は、この出願の発明の実施例において、一酸化窒素検出・定量用プローブ発現した細胞を各濃度のＮＯＣ−７で刺激した際のＮＯＣ−７濃度とＣＦＰとＹＦＰの蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）の経時変化を示した図である。
図７は、ＮＯＡ−１を発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞を、各種濃度のＮＯＣ−７で刺激し、ＮＯに対する蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）の変化を測定するとともに、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰの添加による蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）の変化を測定した結果の図であり、「Ａ」はＮＯＣ−７刺激した際の細胞のシュードカラーイメージを示した図であり、「Ｂ」は可逆的なＮＯＡ−１の応答の様子を示した図である。
図８は、ｎＭ範囲のＮＯに対するＮＯＡ−１の応答を示した図である。
図９は、一酸化炭素（ＣＯ）によるＮＯＡ−１のＦＲＥＴ応答への影響を検証し、ＮＯＡ−１の選択性について検証した結果を示した図であり、「Ａ」は時間経過における蛍光強度比の変化を示し、「Ｂ」は各種濃度のＣＯにおける蛍光強度比を示している。
図１０は、ＡＮＰおよびｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ刺激に対するＮＯＡ−１の応答を示した図であり、「Ａ」はＣＨＯ−Ｋ１細胞でのＡＮＰ刺激における応答を示し、「Ｂ」はＣＨＯ−Ｋ１細胞でのｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ刺激における応答を示している。
図１１は、細胞におけるｎＭ範囲のＮＯの安定生成について検証した結果を示した図であり、「Ａ」はｂｒａｄｙｋｉｎｉｎまたはずり応力を与えた血管内皮細胞におけるＮＯＡ−１の応答を、「Ｂ」はＮＯＡ−１を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞および血管内皮細胞のシュードカラーイメージを示した図である。
図１２は、細胞におけるｎＭ範囲のＮＯの安定生成について検証した結果を示した図であり、「Ａ」はＬ−ＮＡＭＥ刺激を与えたＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＮＯＡ−１の応答の時間経過を示し、「Ｂ」はＬ−ＮＡＭＥ刺激を与えたＣＨＯ−Ｋ１細胞および内皮細胞におけるＮＯＡ−１の蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）の変化を示した図である。
図１３は、細胞におけるｎＭ範囲のＮＯの安定生成について検証した結果を示した図であり、「Ａ」はＮＯＣ−７刺激を与え、その後にさらに８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ刺激を与えたＣＨＯ−Ｋ１細胞（白丸）および内皮細胞（黒丸）におけるＮＯＡ−１の応答の時間経過を示し、「Ｂ」はＮＯＣ−７刺激を与えたＣＨＯ−Ｋ１細胞および内皮細胞におけるＮＯＡ−１の蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）の変化を示した図である。
図１４は、細胞におけるｎＭ範囲のＮＯの安定生成について検証した結果を示した図であり、「Ａ」はｚａｐｒｉｎａｓｔ刺激を与え、その後にさらに８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ刺激を与えた内皮細胞におけるＮＯＡ−１の応答の時間経過を示し、「Ｂ」はｚａｐｒｉｎａｓｔ刺激を与えたＣＨＯ−Ｋ１細胞および内皮細胞におけるＮＯＡ−１の蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）の変化を示した図である。
図１５は、血管内皮細胞における基礎濃度ＮＯの安定生成について検証した結果を示した図である。
図１６は、ＰＩ（３）Ｋ−Ａｋｔ経路による、血管内皮細胞においての基礎ＮＯの生成制御について検証した結果を示した図であり、「Ａ」はＬＹ  ２９４００２刺激を与えた内皮細胞におけるＮＯＡ−１の応答の時間経過を示し、「Ｂ」はＬ−ＮＡＭＥとＬＹ  ２９４００２とによる刺激を与えた内皮細胞におけるＮＯＡ−１の蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）の変化を示した図である。
図１７は、ＮＯＣ−７刺激を与えた内皮細胞におけるＮＯＡ−１の応答の時間経過を示した図である。なお、ビークル溶液（コントロール）、Ｌ−ＮＡＭＥ、ＭＡＡ−Ａｋｔをコードするアデノウイルスベクター、ｍｙｒ−Ａｋｔをコードするアデノウイルスベクターそれぞれによる前処理を行った。
図１８は、ＮＯＣ−７刺激を与えた内皮細胞におけるＮＯＡ−１の蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）の変化を示した図である。なお、ビークル溶液（コントロール）、Ｌ−ＮＡＭＥ、ＭＡＡ−Ａｋｔをコードするアデノウイルスベクター、ｍｙｒ−Ａｋｔをコードするアデノウイルスベクターそれぞれによる前処理を行った。
図１９は、各種の刺激を与えた内皮細胞におけるＮＯＡ−１の応答を示した図であり、「Ａ」は過剰発現ｍｙｒ−Ａｋｔの存在または非存在下（白丸：ｍｙｒ−Ａｋｔなし、黒丸：ｍｙｒ−Ａｋｔあり）でのＬ−ＮＡＭＥ刺激を与えた内皮細胞におけるＮＯＡ−１の応答の時間経過を示し、「Ｂ」は過剰発現ｍｙｒ−Ａｋｔの存在または非存在下で、Ｌ−ＮＡＭＥによる刺激を与えた内皮細胞におけるＮＯＡ−１の蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）の変化を示し、「Ｃ」はインスリン刺激を与えた内皮細胞におけるＮＯＡ−１の応答の時間経過を示した図である。
図２０は、この出願の発明の実施例において使用されたｃＤＮＡの構成を示した概略模式図であり、「Ａ」はＣＧＹ（Ｔ１７８Ａ／Ｔ３０２Ａ）の構成を示し、「Ｂ」はＣＧＹ（Ｔ１７８Ａ／Ｔ３０２Ａ）とα−ＣＧＹとを連結した「ｓＧＣ  α−ＣＧＹ（Ｔ１７８Ａ／Ｔ３０２Ａ）」およびＣＧＹ（Ｔ１７８Ａ／Ｔ３０２Ａ）とβ−ＣＧＹとを連結した「ｓＧＣ  β−ＣＧＹ（Ｔ１７８Ａ／Ｔ３０２Ａ）」（ＮＯＡ−２）の構成を示している。
図２１は、図２に例示したＮＯＡ−１と、図２０に例示したＮＯＡ−２との蛍光強度比を比較検証した結果を示した図であり、「Ａ」はＣＨＯ−Ｋ１細胞における各種濃度のＮＯＣ−７によるＮＯＡ−１とＮＯＡ−２の応答、「Ｂ」はＣＨＯ−Ｋ１細胞における各種濃度の８−Ｂｒ−ｃＧＭＰによるＣＧＹとＣＧＹ（Ｔ１７８Ａ／Ｔ３０２Ａ）の応答、「Ｃ」は内皮細胞におけるＮＯＣ−７刺激によるＮＯＡ−１とＮＯＡ−２の時間経過における変化、「Ｄ」は内皮細胞におけるｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ刺激によるＮＯＡ−１とＮＯＡ−２の時間経過における変化を示している。
なお、図中の符号は以下のものを示している。
１  一酸化窒素検出・定量用プローブ
２  可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）
２１  α（サブユニット）
２２  β（サブユニット）
２３  ヘム鉄
３  ｃＧＭＰ可視化プローブ
３１  ｃＧＭＰ結合蛋白
３２ａ  マーカー部位
３２ｂ  マーカー部位
【発明を実施するための最良の形態】  この出願の発明の一酸化窒素検出・定量用プローブ（１）は、図１Ａに示されるとおり、ｓＧＣ（２）の二つのサブユニットα（２１）およびβ（２２）に、各々、ｃＧＭＰを認識してシグナルを発するｃＧＭＰ可視化プローブ（３）が連結されていることを特徴とするものである。
このようなプローブ（１）は、ＮＯが存在する場合には、プローブ（１）におけるｓＧＣ（２）部位のヘム鉄（２３）にＮＯが配位結合し、これによりｓＧＣ（２）の酵素活性が増大し、ＧＴＰを基質として大量のｃＧＭＰが生成され、プローブ（１）内のｃＧＭＰ可視化プローブ（３）部位がｃＧＭＰを認識し、シグナルを発信するという原理に基づき作用するものである。なお、図１Ｂは、この原理の概略を模式的に例示した概略模式図である。
したがって、言い換えれば、この出願の発明の一酸化窒素検出・定量用プローブ（１）は、ＮＯの濃度変化を、ｓＧＣ（２）部位で増幅し、ｃＧＭＰ濃度の変化としてｃＧＭＰ可視化プローブ（３）部位からのシグナル変化として検出するものといえる。
また、ＮＯのｓＧＣ（２）部位のヘム鉄（２３）への配位結合は、平衡反応であり、可逆的であることから、ＮＯがｓＧＣ（２）部位のヘム鉄（２３）に配位結合し、遊離のＮＯが減少すると、ｓＧＣ（２）部位のヘム鉄（２３）からＮＯが解離するようになり、ｓＧＣ（２）部位の酵素活性が失われる。そのため、ｃＧＭＰ生成が行われなくなる。また、系内にホスホジエステラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ；ＰＤＥ）が存在する場合には、ＰＤＥによるｃＧＭＰの分解だけが進行するようになるため、ｃＧＭＰ濃度が減少し、ｃＧＭＰ可視化プロープ（３）部位のシグナル変化として現れる。
したがって、この出願の発明のプローブ（１）は、ＮＯ濃度依存的に可逆的な応答を示すといえる。
このようなＮＯ検出・定量用プローブ（１）において、ｃＧＭＰ可視化プローブ（３）部位は、ｃＧＭＰを認識してシグナルを発するものであればよく、とくに限定されないが、好ましくは、この出願の発明者らが報告しているもの（特許文献１および２）、すなわち、ｃＧＭＰ結合蛋白（３１）の両末端に互いの近接が検出可能な二つのマーカー部位（３２ａ，３２ｂ）が連結されてなるものとすることが望ましい。このようなｃＧＭＰ可視化プローブ（３）部位は、ｃＧＭＰが共存するとき、ｃＧＭＰ結合蛋白（３１）がｃＧＭＰと結合し、それにより生じる二つのマーカー部位（３２ａ，３２ｂ）の立体配置の変化が光学的変化として現れる。したがって、この光学的変化を測定することにより、ＮＯを検出・定量できるのである。
このようなｃＧＭＰ可視化プローブ（３）部位において、ｃＧＭＰ結合蛋白（３１）としては、ｃＧＭＰ依存性蛋白キナーゼＩα（ＰＫＧ  Ｉα）が例示される。哺乳動物のＰＫＧ  Ｉαは、４種の機能性ドメインを有する二つの同一モノマーからなり、Ｎ−末端側に存在する二量体化ドメインは、ロイシン／イソロイシンジッパーモチーフからなる。ｃＧＭＰが共存しない場合、ＰＫＧ  Ｉαは、キナーゼ不活性で、触媒中心が自己阻害ドメインによって占有されるクローズドコンホメーションを示すが、ｃＧＭＰと結合した場合には、自己阻害ドメインが活性中心から除去され、ＰＫＧ  Ｉαは、オープンコンホメーションを示す。したがって、このようなｃＧＭＰとの結合によりＰＫＧ  Ｉαの両末端のマーカー部位（３２ａ，３２ｂ）の立体配置が変化し、光学的変化を生じて、ｃＧＭＰとの結合が可視的に検出されるのである。
もちろん、ｃＧＭＰ可視化プローブ（３）部位におけるｃＧＭＰ結合蛋白（３１）は、ＰＫＧ  Ｉαに限定されず、合成および天然のあらゆるペプチド鎖を用いることができる。
また、この出願の発明の一酸化窒素検出・定量用プローブ（１）におけるｃＧＭＰ可視化プローブ（３）部位が、前記のように、ｃＧＭＰ結合蛋白（３１）の両末端に互いの近接が検出可能な二つのマーカー部位（３２ａ，３２ｂ）が連結されてなるものである場合、互いの近接が検出可能な二つのマーカー部位（３２ａ，３２ｂ）としては、種々の発色団が考慮される。このとき、発色団は、ｃＧＭＰとｃＧＭＰ結合蛋白の結合により生じる立体構造の変化に応答して精度高く波長変化を生じなければならない。生化学の分野においては、一般的に種々の蛍光発色団が用いられるが、構造変化に敏速に応答するものとしては、蛍光共鳴エネルギー移動（以下、ＦＲＥＴ）の生起により蛍光強度比に変化を来たす発色団がある。したがって、二つのマーカー部位（３２ａ，３２ｂ）としては、異なる蛍光波長を有する二つの蛍光発色団、具体的には、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）のＧＦＰのブルーシフト変異蛋白質であるシアン蛍光蛋白質（ＣＦＰ）や、レッドシフト変異蛋白質である黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）が適用できる。これにより、ｃＧＭＰの生成を、蛍光波長の変化として、通常行われる種々の化学的、生化学的分析方法により検出することが可能となる。もちろん、このような二つのマーカー部位（３２ａ，３２ｂ）としては、ＣＦＰとＹＦＰの組み合わせ以外にも、各種の蛍光蛋白質やスプリットしたレニラルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ等が適用できる。
一方、この出願の発明のＮＯ検出・定量用プロープ（１）において、ｓＧＣ（２）部位は、可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓｏｌｕｂｌｅ  ｇｕａｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ）であり、広く生物一般に存在するものである。
この出願の発明のＮＯ検出・定量用プローブ（１）を用いてＮＯを測定するには、任意の系内で、プローブ（１）とＧＴＰとＮＯを共存させ、シグナル変化を測定すればよい。プローブ（１）とＧＴＰとＮＯを共存させる方法としては、例えば、細胞を破壊して、細胞内からＧＴＰを溶出させ、その溶液にプローブ（１）を添加する方法があげられる。このような方法によりプローブ（１）とＧＴＰを共存させる場合には、ＮＯをｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出・定量できる。
あるいは、一酸化窒素検出・定量用プローブ（１）を発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入することにより、該細胞内でプローブ（１）とＧＴＰを共存させることもできる。このとき、発現ベクターとしては、動物細胞発現用のプラスミドベクターが好ましく用いられる。このようなプラスミドベクターを細胞に導入する方法としては、電気穿孔法、リン酸化カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の公知の方法を採用することができる。このように、ｃＧＭＰ可視化プローブ（３）部位を組み込んだ発現ベクターを、内在的にＧＴＰを有する細胞に導入する方法を用いることにより、細胞内でプローブ（１）とＧＴＰを共存させることができる。なお、ＧＴＰは通常生細胞内に十分量存在しており、あえて添加しなくてもよい。もちろん、必要に応じて添加してもよい。
さらに、この出願の発明のＮＯ検出・定量用プローブ（１）は、ｓＧＣ（２）部位の二つのサブユニットα（２１）およびβ（２２）の各々にＧＭＰ可視化プローブ（３）を連結してなる二種類のハイブリッド蛋白質が、二量化してなるものであってもよい。
したがって、プローブ（１）とＧＴＰとＮＯを共存させるために、ｓＧＣ（２）部位の二つのサブユニットα（２１）およびβ（２２）の各々にＧＭＰ可視化プローブ（３）を連結してなる二種類のハイブリッド蛋白質を発現する二種類のポリヌクレオチドを細胞内に導入し、該細胞内で、ｓＧＣ（２）部位の二つのサブユニットα（２１）およびβ（２２）が二量化してα（２１）およびβ（２２）サブユニットに各々ＧＭＰ可視化プローブ（３）部位が連結されたｓＧＣ（２）部位が構築されるようにしてもよい。
このように、細胞内において細胞内でプローブ（１）とＧＴＰを共存させることにより、細胞内に存在または侵入したＮＯを検出・定量することが可能となる。
また、前記のようにプローブ（１）とＧＴＰを共存させた細胞を用いて、ｓＧＣとＮＯの結合に影響を与える阻害剤や拮抗剤をスクリーニングしたり、刺激による細胞内ＮＯ濃度変化への影響をモニタリングしたりすることも可能となる。
例えば、プローブ（１）とＧＴＰと候補物質を共存させ、候補物質存在下および非存在下におけるシグナル変化を測定することにより、この候補物質が、ｓＧＣ（２）部位へのＮＯの結合を阻害するか否かを判断することができる。このとき、プローブ（１）とＧＴＰと候補物質を細胞内において共存させれば、ｉｎ  ｖｉｖｏでのスクリーニングが可能となる。
また、通常の条件で発せされるシグナルを測定した後、特定の刺激を付与し、その際のシグナル変化を測定することにより、該刺激の細胞内ＮＯ濃度変化に与える影響をモニタリングすることが可能となる。具体的には、プローブ（１）におけるｃＧＭＰ可視化プローブ（３）部位を、前記のｃＧＭＰ結合蛋白（３１）の両末端に互いの近接が検出可能な二つのマーカー部位（３２ａ，３２ｂ）が連結されてなるものとし、二つのマーカー部位（３２ａ，３２ｂ）がＣＦＰとＹＦＰの組み合わせとした場合、刺激によりＮＯ濃度が増大すれば、ＣＦＰとＹＦＰの蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）は減少する。もちろん、測定を連続して行うことにより、刺激の時間的な影響、すなわち、刺激によるＮＯ濃度の経時変化を観察することも可能となる。このとき付与される刺激は、ホルモン、内分泌攪乱物質等の生化学的刺激であってもよいし、電気、放射線、熱等の物理的刺激であってもよい。
この出願の発明では、さらに、トランスジェニック非ヒト動物の全細胞において、プローブ（１）とＧＴＰを共存させることもできる。すなわち、前記のいずれかの方法により細胞内でプローブ（１）とＧＴＰを共存させ、公知の方法（例えば、非特許文献３）に従って非ヒト全能性細胞を個体発生することにより、全細胞においてプローブ（１）とＧＴＰが共存している非ヒト動物またはその子孫動物が得られる。
このようなトランスジェニック非ヒト動物は、すべての体細胞にプローブ（１）とＧＴＰを保有しているため、実体蛍光顕微鏡や多光子レーザー走査顕微鏡によりシグナル変化を測定することにより、生体内におけるＮＯを検出・定量することが可能となる。また、例えば、その体内に医薬品等の検査物質を投与したり、熱、電気、放射線等の刺激を与えたりし、細胞、組織、臓器等におけるＮＯ濃度を測定することにより、生体における各種物質のスクリーニングを行ったり、生体への刺激の影響をモニタリングしたりすることが可能となる。さらに、ＮＯの生命活動に対する影響を調査することも可能となる。あるいは、このようなトランスジェニック非ヒト動物を遺伝子破壊動物等の疾患モデル動物とし、ＮＯ産生について正常動物との差異を観察することにより、ＮＯの生理作用に関する基礎生物学的知見を得ることも可能となる。
以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
【実施例】＜実施例１＞
ｓＧＣの二つのサブユニットα、βの両方のＣ末側に、各々、特許文献１および２に記載の方法で作製したｃＧＭＰ可視化プローブ（以下、ＣＧＹと記載する）を、配列番号１のリンカー（ＧＧＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＬＥＳＲ）を介して連結したハイブリッド蛋白質（特に、上記サブユニットα、βが二量体を形成したものを「ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｆｏｒ  ＮＯ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｉｇｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｅｒ；ＮＯＡ−１」とする）を発現するｃＤＮＡを遺伝子学的手法により作製した（図２Ａ、Ｂ）。また、このＮＯＡ−１のＮ末側に、配列番号２のＦＬＡＧタグ（ＭＤＹＫＤＤＤＤＫ）を付してもよい。
ｓＧＣを発現していないＣＨＯ−Ｋ１細胞に二つのｃＤＮＡを導入し、α−ＣＧＹおよびβ−ＣＧＹを共発現させた。ＮＯの供与体である３−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ−２−ｎｉｔｒｏｓｏｈｙｄｒａｚｉｎｏ）−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｒｏｐａｎａｍｉｎｅ（ＮＯＣ−７）５ｎＭで細胞を刺激したところ、蛍光強度比ＣＦＰ／ＹＦＰが急激に減少し、極小値に達した後、再び徐々に回復した（図３−ａ）。
一方、予めこの細胞を、ｓＧＣの阻害剤であるＮＳ  ２０２８で細胞を処理し、同様に５ｎｍのＮＯＣ−７で細胞を刺激したところ、蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）は有意な変化を見せなかった（図３−ｂ）。
また、リン酸ジエステラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ、ＰＤＥ：ＮＯ除去後に生成されたｃＧＭＰ分子を直ちに加水分解する酵素）の阻害剤であるＺａｐｒｉｎａｓｔで細胞を前処理し、同様にＮＯＣ−７（５ｎｍ）で刺激したところ、ＣＦＰ／ＹＦＰが急激に減少し、プラトーに達したまま初期値に回復しなかった（図３−ｃ）。
以上より、細胞内では、ＮＯＣ−７（５ｎｍ）刺激によりＮＯが増加してｓＧＣの酵素活性が高まり、細胞内でｃＧＭＰが増加したことによりＣＦＰ／ＹＦＰが極小値に達したこと、また、時間の経過に伴いＮＯの酸化によるＮＯ濃度の低下と細胞内のＰＤＥによるｃＧＭＰの分解が起こり、ＣＦＰ／ＹＦＰが初期値に回復したことが示唆された。
＜実施例２＞
（１）  さらに、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に、前記のα−ＣＧＹとβ−ＣＧＹを各々単独で発現させ、１０ｎＭ  ＮＯＣ−７でその細胞を刺激したところ、ＣＦＰ／ＹＦＰは変化しなかった（図４）。
ＮＯの配位するヘムはβ−サブユニットに結合していることが知られているが、図４の結果から、β−サブユニットのみでは酵素活性を有さず、α−ＣＧＹとβ−ＣＧＹが細胞内で二量化してｓＧＣ部位が再構築されることにより初めてＮＯ依存的な酵素活性が上昇することが確認された。
（２）  また、上記（１）と同様に、ｓＧＣを発現していないＣＨＯ−Ｋ１細胞に二つのｃＤＮＡ（α−ＣＧＹとβ−ＣＧＹ）を導入し、α−ＣＧＹおよびβ−ＣＧＹそれぞれを発現させた。この細胞を、５０ｎＭのＮＯＣ−７で刺激を与えたところ、図４Ａと同様に、α−ＣＧＹおよびβ−ＣＧＹともに、蛍光強度比ＣＦＰ／ＹＦＰの顕著な変化は観察されなかった（図４Ｂ）。このことは、ＣＧＹドメインにおけるＦＲＥＴの変化がなかったことを意味する。
しかし、続いてさらにｃＧＭＰの膜浸透性アナログ物質である８−Ｂｒｏｍｏｇｕａｎｏｓｉｎｅ  ３’，５’−ｃｙｃｌｉｃ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ）２ｍＭを添加したところ、直ちにＣＧＹドメインにおけるＦＲＥＴが誘導され、蛍光強度比ＣＦＰ／ＹＦＰが急激に減少した（図４Ｂ）。
この結果から、α−ＣＧＹおよびβ−ＣＧＹそれぞれは、単独状態では、ｃＧＭＰ生成の触媒作用を発揮することができないことが確認できた。その一方で、ＣＧＹドメインについては、ｓＧＣ  αまたはｓＧＣ  βと連結された状態でも、効果的にｃＧＭＰ検出作用を発揮することが確認することができた。
＜実施例３＞
さらに、実施例１と同様に、α−ＣＧＹおよびβ−ＣＧＹを共発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞をＮＯＣ−７（５ｎｍ）で刺激し、プローブによる一過性の応答を観察した後、蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）が初期値に戻ったところで、再度ＮＯＣ−７（５ｎｍ）で刺激したところ、１回目の刺激に対する応答と同様の一過性の応答が観察された（図５）。
これより、この出願の発明のＮＯ検出・定量用プローブにより、このＮＯ濃度変化に相関したｃＧＭＰ濃度変化を可逆的に測定することができることが示された。
＜実施例４＞
さらに、実施例１と同様に、α−ＣＧＹおよびβ−ＣＧＹを共発現（すなわち、ＮＯＡ−１として発現）させたＣＨＯ−Ｋ１細胞を、各種濃度のＮＯＣ−７で刺激することで各種濃度のＮＯに対する蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）の変化を測定した（図６）。
ＮＯＣ−７を１ｎＭおよび５ｎＭ添加した場合には、濃度依存的な一過性の応答が見られ、１０ｎＭのＮＯＣ−７では、飽和応答が観察されたが、その後ＮＯ濃度の減少に伴って徐々に初期値にまで回復した。一方、５０ｎＭ、１００ｎＭのＮＯＣ−７では、飽和応答が観察された後、２０分経過後も蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）は回復傾向を示さなかった。
これにより、５０ｎＭ、１００ｎＭのＮＯＣ−７による刺激では、細胞内に大量のｃＧＭＰが生成し、ＮＯが減少したりＰＤＥによるｃＧＭＰの分解が起こったりした後もＣＧＹの飽和に十分なｃＧＭＰとその生成を刺激するのに十分なＮＯが残存することが示唆された。
以上より、この出願の発明のＮＯ検出・定量用プローブが、ｎＭオーダーのＮＯ濃度の変化を可視化検出できる高感度のプローブであることが明らかになった。
＜実施例５＞
さらにまた、実施例４と同様に、ＮＯＡ−１を発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞を、各種濃度のＮＯＣ−７で刺激して、ＮＯに対する蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）の変化を測定するとともに、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰの添加による蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）の変化を測定した（図７Ａ、Ｂ）。
結果は、実施例４とほぼ同様であった。すなわち、図７Ａ、Ｂに示したとおり、ＮＯＣ−７を１ｎＭおよび５ｎＭ添加した場合には、濃度依存的な一過性の応答が見られ、１０ｎＭのＮＯＣ−７では、飽和応答が観察されたが、その後ＮＯ濃度の減少に伴って徐々に初期値にまで回復した。一方、１００ｎＭのＮＯＣ−７では、飽和応答が観察された後、１０分経過後も蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）は回復傾向を示さなかった。
そして、この１００ｎＭのＮＯＣ−７添加後に、２ｍＭの８−Ｂｒ−ｃＧＭＰを添加したところ、蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）の回復傾向は示さなかった（図７Ｂ）。
これにより、１００ｎＭのＮＯＣ−７による刺激では、細胞内に大量のｃＧＭＰが生成し、ＮＯが減少したりＰＤＥによるｃＧＭＰの分解が起こったりした後もＣＧＹの飽和に十分なｃＧＭＰとその生成を刺激するのに十分なＮＯが残存することが、改めて示唆された。
＜実施例６＞
ＮＯＡ−１のＮＯ依存性のＦＲＥＴ応答について、ＮＯガス注入によって調製したＮＯ溶液を用いてさらに検証した。
この結果として、ＣＨＯ−Ｋ１細胞内の各種濃度のＮＯにおけるＮＯＡ−１のピーク応答の平均を示した（図８）。この結果から、この出願の発明のＮＯＡ−１は、ｎＭ範囲のＮＯを検出できることを確認できた。
なお、このようなＮＯＡ−１の応答は、ＮＯの濃度が増加することだけを起因しているのではなく、酸化や気化の影響も受けていることも起因としている。
このＮＯ依存性であるＮＯＡ−１の可逆的応答は、ＮＯＡ−１のヘムグループへのＮＯの可逆的結合と、内因性のリン酸ジエステラーゼ（ＰＤＥ）によるものである。
＜実施例７＞
ＮＯＡ−１の選択性について検証した。具体的には、一酸化炭素（ＣＯ）によるＮＯＡ−１のＦＲＥＴ応答への影響を検証した。
ＮＯＡ−１を発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞を、１０μＭまでのＣＯで刺激したところ、顕著な蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）の変化が観察された（図９Ａ）。
次に、１００μＭのＣＯで刺激したところ、５ｎＭのＮＯで刺激した場合と比ベて、一過性の小さい変化が観察された（図９Ｂ）。
このことは、＜１＞ＣＯは、ＮＯに比べてｓＧＣとの親和力が弱いことから、ｓＧＣ活性物質としての作用効果が乏しいこと、＜２＞ＣＯ結合性ｓＧＣは、ＮＯ結合性ｓＧＣよりもサイクラーゼ活性が、ヘム鉄へのそれぞれの異なったコーディネートのために弱いこと、の２点が起因となっている。その結果、ＮＯＡ−１の応答には、生理学的濃度のＣＯによる大きな影響を受けることはないと考えられる。
＜実施例８＞
ナトリウム利尿ペプチド刺激、または、ｃＡＭＰ生成によるＮＯＡ−１のＦＲＥＴ応答について、検証した。
（１）  ナトリウム利尿ペプチド受容体はｃＧＭＰを生成するサイクラーゼドメインを有していることから、ナトリウム利尿ペプチドは、ＮＯＡ−１のＦＲＥＴ応答に影響を与えると予想されたが、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を含む複数種の細胞を、過剰濃度の心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）で刺激を与えたところ、顕著な蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）の変化は観察されなかった（図１０Ａ）。
（２）  また、ｃＡＭＰ生成のために過剰濃度のｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌによる刺激を、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を含む複数種の細胞に与えても、顕著な蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）の変化は観察されなかった（図１０Ｂ）。
この結果から、ナトリウム利尿ペプチド刺激、もしくは、ｃＡＭＰ生成によっては、ＮＯＡ−１のＦＲＥＴ応答に対して大きな影響を与えないということが確認された。このことは、ＮＯＡ−１の発現は、ＮＯ受容体の過剰発現と同時に起こるが、ナトリウム利尿ペプチド受容体の過剰発現とは起こらないことに起因する。また、ＮＯＡ−１のＣＧＹドメインは、ｃＡＭＰとの親和力はｃＧＭＰと比べて約１００倍弱く、生理学的濃度のｃＡＭＰでは検出するにはいたらない。
＜実施例９＞
ＮＯＡ−１による血管内皮細胞中のｎＭ範囲でのＮＯを測定した。
（１）  ＮＯＡ−１を、血清含有の培養液で培養した内皮細胞（ウシ肺動脈由来）で発現させ、生理学的濃度の血管弛緩性ホルモン、すなわち、１ｎＭのブラジキニン（ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ）を添加したところ、一過性の蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）の変化が観察できた（図１１Ａ）。また、ずり応力（擬似血流）を細胞に与えたところ、一過性の蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）の変化が観察できた（図１１Ｂ）。
これは、ＮＯＡ−１が、血管弛緩性ホルモンおよびずり応力等の生理学的な刺激によって、血管内皮細胞の中で一過性のＮＯの生成を検出しすることができることを意味している。
（２）  しかしながら、ＮＯＡ−１の蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）は、図１１Ｂに示したように、非内皮細胞であるＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いた場合よりも、血管内皮細胞を用いた場合の方が弱かった。これは、ＣＨＯ−Ｋ１細胞と血管内皮細胞とにおける、基本的なＮＯ濃度の差異によるものである。
（３）  内皮細胞とＣＨＯ−Ｋ１細胞に対して、ＮＯＳ阻害剤であるＬ−ＮＡＭＥ処理（１ｍＭ）をし、ＮＯＡ−１の蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）変化を観察した。
その結果、図１２Ａ、Ｂに示したとおり、非内皮細胞であるＣＨＯ−Ｋ１細胞では、内因性ｅＮＯＳが十分でないことから、蛍光強度比は顕著な変化は見られなかった。これとは対照的に、内皮細胞での蛍光強度比は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞と同レベル程度という顕著な増加が見られた。
（４）  次に、内皮細胞とＣＨＯ−Ｋ１細胞とにおける、過剰ＮＯＣ−７によるＮＯＡ−１の応答を比較検証した。
内皮細胞とＣＨＯ−Ｋ１細胞を１０μＭのＮＯＣ−７で刺激したところ、急激なＮＯＡ−１の飽和応答に十分な濃度のＮＯが生成された。この両者の細胞間における基本的な蛍光強度比に相違しているにも関わらず、１０μＭのＮＯＣ−７による刺激によって、両者の細胞ともに蛍光強度比は、プラトーレベルにまで減少した（図１３Ａ）。
過剰濃度のＮＯＣ−７刺激による内皮細胞における蛍光強度比変化は、実際にはＣＨＯ−Ｋ１細胞の蛍光強度比変化の１／３であった（図１３Ｂ）。
これらの結果は、ｎＭ範囲でのＮＯは血管内皮細胞において安定に生成されることを示している。また、約２／３の発現したＮＯＡ−１は、内皮細胞におけるＮＯ検出に包含されることも示している。
（５）  ＮＯＡ−１を発現させた内皮細胞を２００μＭのｚａｐｒｉｎａｓｔで処理して、蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）を減少させ、また、ＮＯＡ−１応答を飽和状態にさせた（図１４Ａ）。
その対照に、ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＮＯＡ−１では、ｚａｐｒｉｎａｓｔ処理により顕著な蛍光強度比変化が見られ、また、ＣＨＯ−Ｋ１細胞は内因的にＰＤＥを発現した（図１４Ｂ）。このことは、内皮細胞においてＮＯが生成されることをサポートする結果である。
（６）  さらに、血管内皮細胞におけるＮＯの基礎濃度を測定した。
まず、１ｍＭのＮ？−ｎｉｔｒｏ−Ｌａｒｇｉｎｉｎｅｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ（Ｌ−ＮＡＭＥ）による内因性ｅＮＯＳを阻害することで基本ＮＯを除去して、基本ＮＯによるＣＧＭＰの生成を除去した。
図１５に示したとおり、蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）は、内因性ｅＮＯＳの阻害前および阻害後は、内皮細胞中でそれぞれ基本および０（ゼロ）濃度のＮＯを示した。また、基礎濃度のＮＯを定量するため、続いて、各種濃度のＮＯを内皮細胞に加えた（Ｌ−ＮＡＭＥによってｅＮＯＳの活性は阻害されている）。得られたＮＯＡ−１のピークの応答は、各種濃度のＮＯでプロットした。
ＮＯ濃度は、ＮＯＡ−１の応答と対応する、基礎ＮＯ濃度として引き出されたＬ−ＮＡＭＥ処理前の基本応答を与えた。
以上の結果から、内皮細胞において、１ｎＭの基礎ＮＯ濃度を測定することができた。
＜実施例１０＞
次に、血清含有の培養液で培養した血管内皮細胞におけるＮＯの基礎濃度の安定生成について検証した。
（１）  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ３−ｋｉｎａｓｅ（ＰＩ（３）Ｋ）に特異的な阻害剤であるＬＹ  ２９４００２で処理による薬理学的検証を行ったところ、内皮細胞におけるＮＯ基礎濃度の除去作用に影響を与えた。ＮＯＡ−１を発現する内皮細胞に、１００μＭの２−（４−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）−８−ｐｈｅｎｙｌ−１（４Ｈ）−ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ−４−ｏｎｅ（ＬＹ  ２９４００２）を加えて、蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）、すなわち、細胞中のＮＯ濃度をモニターした。
結果は、ＬＹ  ２９４００２の添加により、蛍光強度比は有意に増加し、２５分間でプラトーに達した（図１６Ａ）。このＬＹ  ２９４００２による蛍光強度比の増加は、Ｌ−ＮＡＭＥによるｅＮＯＳの阻害の場合とほぼ同範囲であり、これは、ＬＹ  ２９４００２は、基礎ＮＯ生成を阻害する作用を有することを意味する（図１６Ｂ）。
このことから、血管内皮細胞における基礎濃度のＮＯの安定生成には、ＰＩ（３）Ｋの活性が深く関与していることが確認できた。
（２）  基礎濃度のＮＯ生成に関わる、ＰＩ（３）Ｋ活性とｅＮＯＳ活性との間のシグナル伝達を担うプロテインキナーゼＡｋｔを用いた検証も行った。Ａｋｔを含めた多くのプロテインキナーゼは、ｅＮＯＳの活性化させる。
基礎ＮＯ生成における内因性Ａｋｔの作用効果を検証するため、Ａｋｔのドミナントナガティブ変異体（ＭＡＡ−Ａｋｔ；たとえば、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９，４００８−４０１８，１９９９参照）を、ＮＯＡ−１と内皮細胞に共発現させた。なお、ＭＡＡ−Ａｋｔは、第１７９のリシンをメチオニンに、また第３０８のチロシンと第４７３のセリンをアラニンに置換したものである。
ＭＡＡ−Ａｋｔが発現する内皮細胞において、ＮＯＡ−１の蛍光強度比はＬ−ＮＡＭＥによる前処理を行った結果とほぼ同様であったが、ネガティブコントロールとして調製たコントロール内皮細胞と比べて、有意な変化を確認することができた（図１７）。
図１７に示したとおり、これら前処理を施した細胞に、１０μＭのＮＯＣ−７を添加して刺激を与えたところ、蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）は、直ちにプラトーレベル付近にまで達した。
また、図１７および図１８に示したとおり、得られたＭＡＡ−Ａｋｔ発現細胞における蛍光強度比変化は、コントロール細胞と比べて３倍大きく、Ｌ−ＮＡＭＥによる前処理を行った細胞の場合とほぼ同じであった。
この結果は、ＭＡＡ−Ａｋｔは、基礎ＮＯの生成を阻害することを意味する。
（３）  ＭＡＡ−Ａｋｔの対照として、Ａｋｔの構造活性変異体（ｍｙｒ−Ａｋｔ；たとえば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，２８３１２−２８３２３，２００３参照）を発現させた内皮細胞を用いた検証も行った。
図１８に示したとおり、ｍｙｒ−Ａｋｔの場合は、コントロール細胞と比べたところ、基礎蛍光強度比よりも低いことが確認された。ｍｙｒ−Ａｋｔ発現細胞における、１０μＭのＮＯＣ−７によるＮＯＡ−１の応答は完全に喪失していた。
さらに、ｍｙｒ−Ａｋｔ発現細胞は、１ｍＭのＬ−ＮＡＭＥ添加による蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）よりも、ｍｙｒ−Ａｋｔが存在しない方が大きく増加することが確認された（図１９Ａ、Ｂ）。このことは、Ａｋｔ活性は、ＮＯの基礎濃度を増加することを意味する。
これらの結果を考慮すると、ＰＩ（３）Ｋ活性によってＡｋｔ活性が誘導され、そして、血管内皮細胞内での基礎濃度ＮＯ生成のためのｅＮＯＳ活性を制御することを示唆している。また、インスリンによる刺激は、ＰＩ（３）Ｋ−Ａｋｔ経路の刺激を活性化し、内皮細胞におけるＮＯ濃度をさらに増加することも観察された（図１９Ｃ）。
＜実施例１１＞
上記ＮＯＡ−１のＣＧＹドメインにおける第１７８と第３０２のスレオニンを、アラニンに置換したｃＤＮＡ（ＣＧＹ（Ｔ１７８Ａ／Ｔ３０２Ａ））を作製した。そして、このＣＧＹ（Ｔ１７８Ａ／Ｔ３０２Ａ）を有するｓＧＣ  α−ＣＧＹ（Ｔ１７８Ａ／Ｔ３０２Ａ）とｓＧＣ  β−ＣＧＹ（Ｔ１７８Ａ／Ｔ３０２Ａ）との二量体を「ＮＯＡ−２」とし、ＮＯＡ−１との蛍光強度比について比較検証した。なお、図２０にて、ＣＧＹ（Ｔ１７８Ａ／Ｔ３０２Ａ）ドメインおよびＮＯＡ−２の概略構成図を示した。また、実験条件は、基本的には上記各実施例とほぼ同じである。
（１）  ＮＯＡ−１、ＮＯＡ−２を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞に、各種濃度のＮＯＣ−７を加えて刺激を与えた。
その結果、ＮＯＡ−１とは若干異なる変化パターンではあるが、ＮＯＡ−２においても蛍光強度変化（ＣＦＰ／ＹＦＰ）を確認することができた（図２１Ａ）。
（２）  ＣＧＹ、ＣＧＹ（Ｔ１７８Ａ／Ｔ３０２Ａ）を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞に、各種濃度の８−Ｂｒ−ｃＧＭＰを加えて刺激を与えたところ、ＣＧＹ（Ｔ１７８Ａ／Ｔ３０２Ａ）の８−Ｂｒ−ｃＧＭＰに対する親和力は、ＣＧＹと比べて２オーダー低いことが確認できた（図２１Ｂ）。
（３）  １０μＭ  ＮＯＣ−７を内皮細胞に加え、ＮＯＡ−１、ＮＯＡ−２の時間経過における変化を観察したところ、ＮＯＡ−１よりも高い蛍光強度比を示した（図２１Ｃ）。
（４）  １μＭ  ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎによる刺激を内皮細胞に与え、ＮＯＡ−２の時間経過における変化を観察したところ、ＮＯＡ−２は、ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎによる刺激に対しても反応を示した（図２１Ｄ）。
（５）  以上の結果をまとめると、ｓＧＣ  α−ＣＧＹ（Ｔ１７８Ａ／Ｔ３０２Ａ）とｓＧＣ  β−ＣＧＹ（Ｔ１７８Ａ／Ｔ３０２Ａ）から構成されるＮＯＡ−２は、ＮＯＡ−１と比べ、ＮＯに対する反応が約１オーダー高いことが確認された。
また、ＮＯＡ−２とＮＯＡ−１とを内皮細胞にて別々に発現させた時、ＮＯＡ−２の蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）は、ＮＯＡ−１のそれよりも高かった。このことは、ＮＯＡ−１と比較すると、ＮＯＡ−２は内皮細胞における基礎ＮＯから回避していることを意味している。また、ＮＯＡ−２は、ＮＯＡ−１と比べ、１０μＭのＮＯＣ−７による刺激に対する反応が大きいことも確認された。さらに、ＮＯＡ−２は、内皮細胞に対する１μＭのｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ刺激によって、一過性の反応も示した。
【産業上の利用可能性】  以上詳しく説明したとおり、この発明によって、低濃度のＮＯを精度高く、簡便に検出・定量できるプローブが提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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