(57)【要約】  RXXX(Xは疎水性アミノ酸)のアミノ酸配列を有し、８〜４０個のアミノ酸残基からなり、アミノ酸配列に含まれる塩基性アミノ酸の残基数が５以下であるペプチド、または、YQVARMLRRVADQMASのアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分とする、Bcl-xLとBakまたはBadとのヘテロダイマーの形成を阻害することにより、抗癌剤治療を助長する薬剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
RXXX(Xは疎水性アミノ酸)(配列番号４８)のアミノ酸配列を有し、８〜４０個のアミノ酸残基からなり、アミノ酸配列に含まれる塩基性アミノ酸の残基数が５以下であるペプチドを有効成分とするBcl-xLヘテロダイマー形成阻害剤。
【請求項２】
配列番号４、５、６、７、９、１０、１１、１２および１６のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分とするBcl-xLヘテロダイマー形成阻害剤。
【請求項３】
配列番号１８のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分とするBcl-xLヘテロダイマー形成阻害剤。
【請求項４】
RXXX(Xは疎水性アミノ酸)(配列番号４８)のアミノ酸配列を有し、８〜４０個のアミノ酸残基からなり、アミノ酸配列に含まれる塩基性アミノ酸の残基数が５以下であるペプチドを有効成分とする抗癌剤作用助長剤。
【請求項５】
配列番号４、５、６、７、９、１０、１１、１２および１６のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分とする抗癌剤作用助長剤。
【請求項６】
配列番号１８のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分とする抗癌剤作用助長剤。
【請求項７】
(1)ペプチドをコードするDNAのライブラリーを準備し、(2)そのライブラリーから、DNAとそのDNAによりコードされるペプチドとが結合した分子のライブラリーを調製し、(3)Bcl-xLに結合するペプチドを含む分子を選択し、(4)選択された分子のDNAをテンプレートとしてPCRによりDNAを増幅し、(5)増幅されたDNAを工程(2)のライブラリーとして用いて、(2)から(4)の工程を繰り返すことを含む、Bcl-xLに結合するペプチドをスクリーニングする方法であって、DNAのライブラリーは、(NNS)n（Nは、A,T,GおよびCの等量混合物、SはGおよびCの等量混合物、nは８〜２４の整数）の塩基配列を有するDNAからなる前記方法。
【請求項８】
DNAのライブラリーが、XXVXRXLXXXXDXIXX（Xは、NNS(Nは、A,T,GおよびCの等量混合物、SはGおよびCの等量混合物)によりコードされるアミノ酸）（配列番号２９）のアミノ酸配列からなるペプチドをコードするDNAからなる請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌剤作用を助長するBcl-xLへテロダイマー阻害ペプチド及びそのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗癌治療として化学療法や放射線療法が用いられている。これらの治療により、癌細胞はアポトーシスを起こし死滅する。しかし、Bcl-2やBcl-xLなどのアポトーシス抑制性タンパク質が過剰に発現している癌細胞においては、これらのタンパク質がアポトーシスを阻害し、抗癌治療の効率を低下させる。したがって、Bcl-2やBcl-xLの機能を阻害する薬剤は、抗癌治療を助長する機能をもつと期待される（非特許文献１）。例えば、Bcl-2遺伝子を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドによるBcl-2の発現抑制により、抗癌剤の効果が増大した例が知られている（非特許文献２）。【０００３】
Bcl-2やBcl-xLはアポトーシス促進性のタンパク質であるBak, Bax, Bad, およびBad などとヘテロダイマーを形成し、これらのアポトーシス促進作用を消失させる。したがって、Bcl-2やBcl-xLのアポトーシス抑制作用を消失させるには、ヘテロダイマー形成を阻害すればよいものと推測できる。これらのヘテロダイマーは、Bcl-2やBcl-xLのBH1、BH2、およびBH3ドメインが形成する疎水性のポケットに、Bak, Bax, Bad, およびBadのBH3ドメインがはまり込むことによって形成される。Bak, Bax, Bad, およびBadのBH3ドメインから抽出した16残基程度からなるペプチドは、Bcl-2およびBcl-xLの疎水性ポケットに結合できる。これらのペプチドは競合的にヘテロダイマーの形成を阻害し、アポトーシス促進作用を示す。したがって、これらのペプチドは抗癌治療を助長する潜在的な能力をもつ。【０００４】
Bcl-2およびBcl-xLの疎水性ポケットに結合する小分子化合物が報告されている。それらはantimycin A、BH3I-1、およびBH3I-2である（非特許文献３）。上に述べたペプチドのBcl-2およびBcl-xLへの親和性は、解離定数で10-7M程度であるのに対し、これらの小分子化合物の結合は10-6 M程度であり、薬剤として利用するには親和性が弱い。
【非特許文献１】Huang, Oncogene (2000), 19, 6627-6631
【非特許文献２】Jansen et al., Nature Medicine (1998), 4, 232-234
【非特許文献３】Zheng, Nature Cell Biology (2001) 3, E1-E3
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、ヘテロダイマーの形成を阻害することにより、抗癌剤治療を助長する薬剤を提供することを目的とする。
【０００６】
非特許文献３に記載されている、Bcl-2およびBcl-xLの疎水性ポケットに結合する化合物の構造は似ていないため、結合部位がわずかにずれている可能性がある。このような場合は、小分子化合物とBcl-2あるいはBcl-xLが結合した複合体の構造を解析し、結合様式を正確に把握することが重要である。２つの異なる結合様式を組み合わせた様式で結合する化合物を設計することにより、より高い親和性でBcl-2やBcl-xLに結合する薬剤を開発できると考えられるからである。
【０００７】
このような背景を踏まえ、試験管内ウイルス(in vitro virus)法を用い、Bcl-xLに結合するペプチドの取得を試みた。その結果、Badタンパク質に対して競合的にBcl-xLに結合する数種類の新規のペプチドが取得された。これらのペプチドは天然に存在するBH3ドメイン由来のペプチドと配列が異なっており、Bcl-xLへの結合様式が異なると推測される。これらの知見に基づき、本発明は完成した。本発明は、下記のものを提供する。
【０００８】
１．  RXXX(Xは疎水性アミノ酸)(配列番号４８)のアミノ酸配列を有し、８〜４０個のアミノ酸残基からなり、アミノ酸配列に含まれる塩基性アミノ酸の残基数が５以下であるペプチドを有効成分とするBcl-xLヘテロダイマー形成阻害剤。
【０００９】
２．  配列番号４、５、６、７、９、１０、１１、１２および１６のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分とするBcl-xLヘテロダイマー形成阻害剤。
【００１０】
３．  配列番号１８のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分とするBcl-xLヘテロダイマー形成阻害剤。
【００１１】
４．  RXXX(Xは疎水性アミノ酸)(配列番号４８)のアミノ酸配列を有し、８〜４０個のアミノ酸残基からなり、アミノ酸配列に含まれる塩基性アミノ酸の残基数が５以下であるペプチドを有効成分とする抗癌剤作用助長剤。
【００１２】
５．  配列番号４、５、６、７、９、１０、１１、１２および１６のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分とする抗癌剤作用助長剤。
【００１３】
６．  配列番号１８のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分とする抗癌剤作用助長剤。
【００１４】
７．  (1)ペプチドをコードするDNAのライブラリーを準備し、(2)そのライブラリーから、DNAとそのDNAによりコードされるペプチドとが結合した分子のライブラリーを調製し、(3)Bcl-xLに結合するペプチドを含む分子を選択し、(4)選択された分子のDNAをテンプレートとしてPCRによりDNAを増幅し、(5)増幅されたDNAを工程(2)のライブラリーとして用いて、(2)から(4)の工程を繰り返すことを含む、Bcl-xLに結合するペプチドをスクリーニングする方法であって、DNAのライブラリーは、(NNS)n（Nは、A,T,GおよびCの等量混合物、SはGおよびCの等量混合物、nは８〜２４の整数）の塩基配列を有するDNAからなる前記方法。
【００１５】
８．  DNAのライブラリーが、XXVXRXLXXXXDXIXX（Xは、NNS(Nは、A,T,GおよびCの等量混合物、SはGおよびCの等量混合物)によりコードされるアミノ酸）（配列番号２９）のアミノ酸配列からなるペプチドをコードするDNAからなる７記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】NNSライブラリーの模式図
【図２】NNSライブラリーの塩基配列
【図３】NNSライブラリーの構築方法
【図４】Bakライブラリーの説明
【図５】試験管内選択実験
【図６】DHFR融合ペプチドの構築
【図７】取得ペプチドの結合実験
【図８】プルダウンアッセイ実験方法
【図９】プルダウンアッセイ実験結果（電気泳動写真）
【図１０】Badと取得ペプチドのBcl-xL結合に関する競合実験結果（電気泳動写真）
【図１１】GST-Bcl-xLと蛍光化Bakペプチドの結合実験結果
【図１２】Bakペプチドと取得ペプチドのBcl-xL結合に関する競合実験結果
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本明細書における、塩基およびアミノ酸の一文字記号は、WIPO Standard ST.25によるものである。【００１８】
本発明の阻害剤および助長剤の有効成分は、RXXX(Xは疎水性アミノ酸)(配列番号４８)のアミノ酸配列を有し、８〜４０個のアミノ酸残基からなり、アミノ酸配列に含まれる塩基性アミノ酸の残基数が５以下であるペプチドである。【００１９】
疎水性アミノ酸とは、疎水性の側鎖をもつアミノ酸で、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、システイン、メチオニン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリンなどを示す。
塩基性アミノ酸とは、アルギニン、リジンなどを示す。塩基性アミノ酸の残基数は５以下、好ましくは４以下である。また、塩基性アミノ酸の残基数は、ペプチドを構成する全残基の２５％以下であることが好ましい。塩基性アミノ酸含有量が多いと、Bcl-xLの正電荷部分と反発してしまい、Bcl-xLと結合できないことがある。【００２０】
上記ペプチドの例としては、配列番号４、５、６、７、９、１０、１１、１２および１６のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
上記ペプチドは、血液等の生物学的液体に可溶のものが好ましい。【００２１】
本発明の阻害剤および助長剤の有効成分は、また、配列番号１８のアミノ酸配列を有するペプチドである。【００２２】
有効成分のペプチドは、医薬的に許容可能な担体を用いて製剤（医薬組成物）にすることができる。医薬的に許容可能な担体としては、賦形剤または基剤などが挙げられる。また、製剤は、通常に用いられる添加剤を含んでいてもよい。剤形は、投与経路に応じて適宜選択される。製剤には、有効成分のペプチドと、他の抗癌剤と別個に包装して一体としたものも包含される。また、有効成分の投与量は、対象とする抗癌剤治療、患者の状態などにより適宜選択される。本発明の阻害剤または助長剤は、抗癌剤治療を受けているまたは受ける予定の患者に投与することができる。【００２３】
本発明は、また、Bcl-xLに結合するペプチドをスクリーニングする方法、すなわち、(1)ペプチドをコードするDNAのライブラリーを準備し、(2)そのライブラリーから、DNAとそのDNAによりコードされるペプチドとが結合した分子のライブラリーを調製し、(3)Bcl-xLに結合するペプチドを含む分子を選択し、(4)選択された分子のDNAをテンプレートとしてPCRによりDNAを増幅し、(5)増幅されたDNAを工程(2)のライブラリーとして用いて、(2)から(4)の工程を繰り返すことを含む、Bcl-xLに結合するペプチドをスクリーニングする方法を提供する。【００２４】
本発明の方法においては、標的物質として、Bcl-xLを用いること、DNAのライブラリーとして特定の構成のものを用いる他は、in vitro virus法に基づくスクリーニング法（例えば、WO 02/48347、特開2002-176987参照）に従って行うことができる。in vitro virusおよびスクリーニング法について説明する。【００２５】
in vitro virusは、対応付け分子とも呼ばれ、in vitro virus法による対応付け分子は、機能解析、機能改変等の対象となるタンパク質を含む表現型分子と、該タンパク質をコードする核酸を含む遺伝子型分子とが結合してなる。遺伝子型分子は、タンパク質をコードする領域を、その領域の塩基配列が翻訳され得るような形態で有するコード分子と、スペーサー部とが結合してなる。説明の便宜のため、対応付け分子における、表現型分子に由来する部分、スペーサー分子に由来する部分、および、コード分子に由来する部分をそれぞれ、デコード部、スペーサー部およびコード部と呼ぶ。また、遺伝子型分子における、スペーサー分子に由来する部分、および、コード分子に由来する部分をそれぞれ、スペーサー部およびコード部と呼ぶ。【００２６】
この態様におけるスペーサー分子は、核酸の3'末端に結合できるドナー領域と、ドナー領域に結合した、ポリエチレングリコールを主成分としたPEG領域と、PEG領域に結合した、ペプチド転移反応によってペプチドと結合し得る基を含むペプチドアクセプター領域とを含む。PEG領域はなくてもよい。【００２７】
核酸の3'末端に結合できるドナー領域は、通常、１以上のヌクレオチドからなる。ヌクレオチドの数は、通常には１〜１５、好ましくは１〜２である。ヌクレオチドはリボヌクレオチドでもデオキシリボヌクレオチドでもよい。【００２８】
ドナー領域の5'末端の配列は、ライゲーション効率を左右する。コード部とスペーサー部をライゲーションさせるためには、少なくとも1残基以上を含むことが必要であり、ポリA配列をもつアクセプターに対しては、少なくとも１残基のdC(デオキシシチジル酸)または２残基のdCdC(ジデオキシシチジル酸)が好ましい。塩基の種類としては、C>U又はT>G>Aの順で好ましい。【００２９】
PEG領域はポリエチレングリコールを主成分とするものである。ここで、主成分とするとは、PEG領域に含まれるヌクレオチドの数の合計が20塩基以下、又は、ポリエチレングリコールの平均分子量が400以上であることを意味する。好ましくは、ヌクレオチドの合計の数が10塩基以下、又は、ポリエチレングリコールの平均分子量が2000以上であることを意味する。【００３０】
PEG領域のポリエチレングリコールの平均分子量は、通常には、400〜30,000、好ましくは1,000〜10,000、より好ましくは2,000〜8,000である。ここで、ポリエチレングリコールの分子量が約400より低いと、このスペーサー分子に由来するスペーサー部を含む遺伝子型分子を対応付け翻訳したときに、対応付け翻訳の後処理が必要となることがあるが（Liu, R., Barrick, E., Szostak, J.W., Roberts, R.W. (2000) Methods in Enzymology, vol. 318, 268-293）、分子量1000以上、より好ましくは2000以上のPEGを用いると、対応付け翻訳のみで高効率の対応付けができるため、翻訳の後処理が必要なくなる。また、ポリエチレングリコールの分子量が増えると、遺伝子型分子の安定性が増す傾向があり、特に分子量1000以上で良好であり、分子量400以下ではDNAスペーサーと性質がそれほどかわらず不安定となることがある。【００３１】
ペプチドアクセプター領域は、ペプチドのＣ末端に結合できるものであれば特に限定されないが、例えば、ピューロマイシン、3'-N-アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（3'-N-Aminoacylpuromycin aminonucleoside, PANS-アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのPANS-Gly、バリンのPANS-Val、アラニンのPANS-Ala、その他、全アミノ酸に対応するPANS-全アミノ酸が利用できる。また、化学結合として3'-アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合した結果形成されたアミド結合でつながった3'-N-アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（3'-Aminoacyladenosine aminonucleoside, AANS-アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのAANS-Gly、バリンのAANS-Val、アラニンのAANS-Ala、その他、全アミノ酸に対応するAANS-全アミノ酸が利用できる。また、ヌクレオシドまたはヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども利用できる。その他、ヌクレオシドまたはヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質と、アミノ酸またはアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質を化学的に結合可能な結合様式のものなら全て利用することができる。【００３２】
ペプチドアクセプター領域は、好ましくは、ピューロマイシンもしくはその誘導体、又は、ピューロマイシンもしくはその誘導体と1残基もしくは２残基のデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドからなることが好ましい。ここで、誘導体とはタンパク質翻訳系においてペプチドのＣ末端に結合できる誘導体を意味する。ピューロマイシン誘導体は、ピューロマイシン構造を完全に有しているものに限られず、ピューロマイシン構造の一部が欠落しているものも包含する。ピューロマイシン誘導体の具体例としては、PANS-アミノ酸、AANS-アミノ酸などが挙げられる。【００３３】
ペプチドアクセプター領域は、ピューロマイシンのみの構成でもかまわないが、5'末端側に1残基以上のDNAおよび/またはRNAからなる塩基配列を持つことが好ましい。配列としては、dC-ピューロマイシン, rC-ピューロマイシンなど、より好ましくはdCdC-ピューロマイシン, rCrC-ピューロマイシン, rCdC-ピューロマイシン, dCrC-ピューロマイシンなどの配列で、アミノアシル-tRNAの3'末端を模倣したCCA配列（Philipps, G.R. (1969) Nature 223, 374-377）が適当である。塩基の種類としては、C>U又はT>G>Aの順で好ましい。【００３４】
スペーサー分子は、ドナー領域とPEG領域との間に、少なくとも１つの機能付与ユニットを含むことが好ましい。機能付与ユニットは、好ましくは、少なくとも1残基のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドの塩基に機能修飾を施したものである。例えば、機能修飾物質として、蛍光物質、ビオチン、またはHis-tagなど各種分離タグなどを導入したものが可能である。【００３５】
この態様におけるコード分子は、転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む5'非翻訳領域と、5'非翻訳領域の3'末端側に結合した、タンパク質をコードするORF領域と、ORF領域の3'末端側に結合したポリA配列を持ち、かつポリA配列の5'上流に親和性タグ配列を含む核酸である。【００３６】
コード分子は、DNAでもRNAでもよく、RNAの場合、5'末端にCap構造があってもなくても良い。また、コード分子は任意のベクターやプラスミドに組み込まれたものとしてもよい。【００３７】
3'末端領域は、親和性タグ配列とその下流にポリA配列を含む。スペーサー分子とコード分子とのライゲーション効率に影響を与える要素としては3'末端領域のポリA配列が重要であり、ポリA配列は、少なくとも２残基以上のdAおよび/またはrAの混合または単一のポリA連続鎖であり、好ましくは、3残基以上、より好ましくは６以上、さらに好ましくは８残基以上のポリA連続鎖である。【００３８】
コード分子の翻訳効率に影響する要素としては、転写プロモーターと翻訳エンハンサーからなる5'UTR、および、ポリA配列を含む3'末端領域の組み合わせがある。3'末端領域のポリA配列の効果は通常には10残基以下で発揮される。5'UTRの転写プロモーターはT7/T3またはSP6などが利用でき、特に制限はない。好ましくはSP6であり、特に、翻訳のエンハンサー配列としてオメガ配列やオメガ配列の一部を含む配列を利用する場合はSP6を用いることが特に好ましい。翻訳エンハンサーは好ましくはオメガ配列の一部であり、オメガ配列の一部としては、TMVのオメガ配列の一部(O29; Gallie D.R., Walbot V. (1992) Nucleic Acids Res., vol. 20, 4631-4638、及び、WO 02/48347の図３参照)を含んだものが好ましい。【００３９】
親和性タグ配列としては、抗原抗体反応など、タンパク質を検出できるいかなる手段を用いるための配列であればよく、制限はない。好ましくは、抗原抗体反応によるアフィニティー分離分析用タグであるFlag-tag配列やHis-tag配列である。【００４０】
ORF領域については、DNAおよび/またはRNAからなるいかなる配列でもよい。遺伝子配列、エキソン配列、イントロン配列、ランダム配列、または、いかなる自然界の配列、人為的配列が可能であり、配列の制限はない。また、コード分子の5'UTRをSP6+O29とし、3'末端領域を、たとえば、Flag+XhoI+Aｎ(n=8)とすることで、各長さは、5'UTRで約60bp、3'末端領域で約32bpであり、PCRのプライマーにアダプター領域として組み込める長さである。このため、あらゆるベクターやプラスミドやcDNAライブラリーからPCRによって、5'UTRと3'末端領域をもったコード分子を簡単に作成できる。コード分子において、翻訳はORF領域を超えてされてもよい。すなわち、ORF領域の末端に終止コドンがなくてもよい。【００４１】
この態様におけるコード分子は、転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む5'非翻訳領域と、5'非翻訳領域の3'末端側に結合した、タンパク質をコードするORF領域と、ORF領域の3'末端側に結合した、ポリA配列を含む3'末端領域を含む核酸である。【００４２】
遺伝子型分子は、上記コード分子を、必要により、タンパク質をコードする領域の塩基配列が翻訳され得るような形態に変換した後（例えば転写した後）、コード分子の3'末端と、スペーサー分子のドナー領域を、通常のリガーゼ反応により結合させることにより製造できる。反応条件としては、通常、４〜２５℃で４〜４８時間の条件が挙げられ、PEG領域を含むスペーサー分子のPEG領域内のポリエチレングリコールと同じ分子量のポリエチレングリコールを反応系に添加する場合には、15℃で0.5〜４時間に短縮することも可能である。【００４３】
スペーサー分子とコード分子の組み合わせはライゲーション効率に重要な効果をもたらす。アクセプターにあたるコード部の3'末端領域において、少なくとも２残基以上、好ましくは３残基以上、さらに好ましくは６〜８残基以上のDNAおよび/またはRNAのポリA配列があること、さらに、5'UTRの翻訳エンハンサーとしては、オメガ配列の部分配列(O29)が好ましく、スペーサー部のドナー領域としては、少なくとも１残基のdC(デオキシシチジル酸)または２残基のdCdC(ジデオキシシチジル酸)が好ましい。このことによって、RNAリガーゼを用いることでDNAリガーゼのもつ問題点を回避し、かつ効率を60〜80%に保つことができる。【００４４】
(a)転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む5'非翻訳領域と、5'非翻訳領域の3'末端側に結合した、タンパク質をコードするORF領域と、ORF領域の3'末端側に結合した、ポリA配列を含む3'末端領域を含むRNAであるコード分子の3'末端と、(b)上記スペーサー分子のドナー領域であってRNAからなるものとを、スペーサー分子内のPEG領域を構成するポリエチレングリコールと同じ分子量をもつ遊離のポリエチレングリコールの存在下で、RNAリガーゼにより結合させることが好ましい。【００４５】
ライゲーション反応時に、PEG領域を含むスペーサー部のPEG領域と同じ分子量のポリエチレングリコールを添加することによって、スペーサー部のポリエチレングリコールの分子量によらずライゲーション効率が80〜90%以上に向上し、反応後の分離工程も省略することができる。【００４６】
この態様の対応付け分子は、上記の遺伝子型分子を無細胞翻訳系で翻訳することにより、ペプチド転移反応で、遺伝子型分子内のORF領域によりコードされたタンパク質である表現型分子と連結することができる。無細胞翻訳系は、好ましくは、小麦胚芽又はウサギ網状赤血球のものである。翻訳の条件は通常に採用される条件でよい。例えば、25〜37℃で15〜240分の条件が挙げられる。また、この態様の対応付け分子の核酸部分は、翻訳後に逆転写によりRNAとDNAとのハイブリッドとすることができる。【００４７】
in vitro virus法に基づくスクリーニング方法は、通常には、核酸ライブラリーから、標的物質と相互作用するタンパク質をコードする核酸をスクリーニングする方法であって、前記核酸ライブラリーから、本発明の製造方法により対応付け分子のライブラリーを製造する工程、前記対応付け分子のライブラリーと標的物質とを混合する工程、標的物質に結合した対応付け分子を分離する工程、分離した対応付け分子のリンカーを、前記核酸の塩基配列が変化しない条件で切断して前記核酸を遊離させる工程、および、遊離した核酸を回収する工程を含む。【００４８】
対応付け分子のライブラリーと標的物質との混合は、対応付け分子の被標的タンパク質が標的物質と相互作用する条件で混合すればよい。この条件は、検出しようとする相互作用および標的物質の種類に応じて適宜選択される。【００４９】
標的物質に結合した対応付け分子の分離は、標的物質に結合した対応付け分子と、標的物質に結合しない対応付け分子を分離する工程であり、通常には、標的物質を固相に固定化しておくことによって、対応付け分子と混合後の標的分子を固定化した固相を洗浄することにより分離を行うことができる。洗浄の条件は、検出しようとする相互作用および標的物質の種類に応じて適宜選択される。ここで固相に固定化するとは、対応付け分子と標的物質との結合体が非結合の分子から分離可能になっていることを意味し、例えば、標的物質が膜タンパク質の場合、細胞の細胞膜等に発現した膜タンパク質や人工膜中に埋め込まれたタンパク質も、固相に固定化された標的物質に包含される。【００５０】
分離した対応付け分子のリンカーを、前記核酸の塩基配列が変化しない条件で切断して前記核酸を遊離させることは、開裂型リンカーを用い、それに応じた条件で行うことができる。標的物質が固相に固定化されている場合、核酸を遊離させることは、溶出とも呼ばれる。本発明において「遊離」とは「溶出」も包含する意味で用いる。また、遊離される核酸は、核酸の塩基配列が解析可能な限り、改変されたものであってよい。【００５１】
遊離した核酸の回収は、通常の方法によって行うことができる。例えば、電気泳動により回収する方法、遊離した核酸以外の成分を沈殿させて上清を回収する方法などが挙げられる。回収された核酸は、機能解析、進化工学などの目的に応じて増幅や配列の解析が行われる。目的に応じて、回収されたDNAの配列解析を行ったり、PCRにより増幅して、上記の工程を繰り返したりすることができる。【００５２】
本発明のスクリーニング方法で用いられるDNAのライブラリーは、(NNS)n（Nは、A,T,GおよびCの等量混合物、SはGおよびCの等量混合物、nは８〜２４の整数）の塩基配列を有するDNAからなる。DNAのライブラリーは、好ましくは、XXVXRXLXXXXDXIXX（Xは、NNS(Nは、A,T,GおよびCの等量混合物、SはGおよびCの等量混合物)によりコードされるアミノ酸）（配列番号２９）のアミノ酸配列からなるペプチドをコードするDNAからなる。【００５３】
上記の方法でスクリーニングされたBcl-xLに結合するペプチドに対して、BakまたはBadタンパク質に対して競合するか否かを測定することにより、本発明の阻害剤または助長剤の有効成分となるペプチドを同定することができる。競合するか否かは、後述の実施例に記載したような方法によって測定することができる。【００５４】
以下、具体的に本発明の実施例を記述するが、下記の実施例は本発明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものでない。
【実施例１】
【００５５】
・  DNAライブラリーの構築
２種類のDNAライブラリーを構築した。１つはNNSライブラリー、もう１つはBakライブラリーである。これらのDNAライブラリーの特徴と構築方法を以下に述べる。【００５６】
・  NNSライブラリー
・   NNSライブラリーの特徴
NとはA, T, G, Cの4種類のヌクレオチドの等量混合物である。SとはG, Cの2種類のヌクレオチドの等量混合物である。NNSにより指定され得るコドンは全64種類のうち32種類であり、20種類全てのアミノ酸がコードされ得る。32種類のコドンのうち終止コドンは1つである。したがって、終止コドンの出現確率は1/32である。NNNの場合、終止コドンの出現確率は3/64であるため、NNSの方が終止コドンの出現確率が低い。例えば16アミノ酸残基からなるペプチドをコードするNNSライブラリーの場合、終止コドンを含まない完全長のDNA分子が得られる確率は60%である。一方、NNNライブラリーの場合は46%である。【００５７】
・  NNSライブラリーの構造
NNSライブラリーを、小麦胚芽無細胞翻訳系を用いたin vitro virus法と大腸菌無細胞翻訳系であるPURESYSTEM（株式会社 ポストゲノム研究所）を用いたin vitro virus法の両方に適用した。小麦胚芽無細胞翻訳系用のNNSライブラリーの全長は、Sp6プロモーター、Ω29配列、開始コドン、グリシン／セリンリンカー、NNSライブラリー、フラッグタグおよび A x 6配列からなる。一方、PURESYSTEM用のNNSライブラリーの全長はT7プロモーター、SD配列、開始コドン、グリシン／セリンリンカー、NNSライブラリー、フラッグタグおよびA x 6配列からなる。これらの配列の模式図を図１に、塩基配列を図2に示す。NNSライブラリーは8アミノ酸をコードする(NNS)8、16アミノ酸をコードする(NNS)16、および24アミノ酸をコードする(NNS)24を等モル数含む。【００５８】
・  NNSライブラリーの構築
小麦胚芽系無細胞翻訳系用のNNSライブラリーの構築方法を図3に示す。まず、グリシン／セリンリンカー、NNSライブラリー、フラッグタグおよび A x 6配列をコードするDNAのマイナス鎖（G4SG4S(NNS)8FLAGA6r、G4SG4S(NNS)16FLAGA6r、G4SG4S(NNS)2FLAGA6r）を設計し、ファスマック社から購入した。その配列は5’-ttt ttt ctt atc gtc gtc atc ttt gta gtc (snn) 8, 16, 24 tga gcc tcc gcc tcc tga acc gcc gcc acc-3’(配列番号３１、３２、３３)である。次にSp6プロモーター、Ω29配列、開始コドンおよびグリシン／セリンリンカーの一部を含むプラス鎖のDNA(priSP6OGf)を設計し、ファスマック社から購入した。その配列は、5’- att tag gtg aca cta tag aac aac aac aac aac aaa caa caa caa aat ggg tgg cgg cgg tt-3'(配列番号３４)である。また、フラッグタグとA x 6配列をコードするDNAのマイナス鎖(priFLAGA6r)を設計し、ダテコンセプト社から購入した。その配列は5’-ttt ttt ctt atc gtc gtc atc ttt gta gtc-3’ (配列番号３５)である。上に記したG4SG4S(NNS)8[FLAG]A6r、G4SG4S(NNS)16[FLAG]A6r、G4SG4S(NNS)24[FLAG]A6rを鋳型DNA、priSP6OGfとpriFLAGA6rをプライマーとしてPCRを行ない、二本鎖DNAのライブラリーを得た。PCRの反応液（100μｌ）はKOD DNA ポリメラーゼを2ユニット、200μMのdNTP、2 mMのMgSO4、3 pmolのフォワードおよびリバースプライマー、1 pmolの鋳型DNA、および添付の緩衝液からなる。反応条件は、第一段階（1サイクル）94℃/5分、第二段階(15サイクル) 94℃/30秒、58℃/30秒、68℃/30秒、第三段階(1サイクル) 68℃/5分からなる。【００５９】
PURESYSTEM用のNNSライブラリーの構築方法も同様である。ただし、フォワードプライマーとして、priSP6OGfの代わりにT7プロモーター配列、SD配列、開始コドン、およびグリシン／セリンリンカーの一部を含むpriUniv2を設計し用いた。このDNAはファスマック社から購入した。その塩基配列は5’-gaa att aat acg act cac tat agg gag acc aca acg gtt tcc ctc tag aaa taa ttt tgt tta act tta aga agg aga tat acc aat ggg tg-3’ (配列番号３６)である。【００６０】
・  Bakライブラリー
・  Bakライブラリーの特徴
BakはBcl-2ファミリータンパク質のメンバーの１つであり、Bcl-xLとヘテロダイマーを形成する。Bakタンパク質のBH3ドメインから抽出した16残基のアミノ酸からなるペプチドは、340 nMの解離定数でBcl-xLと結合する。BH3ドメイン内のいくつかのアミノ酸は、ファミリー内の種々のタンパク質の間で保存されている。これらのアミノ酸はBcl-xLとの結合に必須であると推測される。そこでこれら5残基のアミノ酸を固定し、それ以外の11残基のアミノ酸をNNSとしたライブラリーを構築し、Bakライブラリーと命名した。このライブラリーからは、比較的高頻度でBcl-xLと結合するペプチドが取得されると期待される。【００６１】
・  Bakライブラリーの構造
Bakタンパク質由来の16アミノ酸残基からなるペプチドと、本研究で用いたBakライブラリーのアミノ酸配列の比較を図4(1)に示す。固定したアミノ酸は、3番目のバリン、5番目のアルギニン、7番目のロイシン、12番目のアスパラギン酸、および14番目のイソロイシンである。【００６２】
BakライブラリーはPURESYSTEMを用いたin vitro virus法のみに適用した。全長の模式図および塩基配列を図4(2)、(3)に示した。【００６３】
・  Bakライブラリーの構築
Bakライブラリーの構築はPURESYSTEM用のNNSライブラリーの構築と同様に行なった。ただし、用いた鋳型DNAはグリシン／セリンリンカー、Bakライブラリー、フラッグタグおよび A x 6配列をコードするDNAのマイナス鎖(G4SG4SBAK16MFLAGA6r)である。この一本鎖DNAはファスマック社から購入した。塩基配列は5’ -ttt ttt ctt atc gtc gtc atc ttt gta gtc snn snn aat snn atc snn snn snn snn cag snn gcg snn aac snn snn tga gcc tcc gcc tcc tga acc gcc gcc acc-3’ (配列番号３７)である。【００６４】
・  試験管内ウイルス(in vitro virus)ライブラリーの作製
SP6プロモーターをもつ小麦胚芽無細胞翻訳系用のDNAライブラリーをRiboMAX Large Scale RNA Production System（Promega社製）を用いて転写し、RNAライブラリーに変換した。反応液(50μｌ)は、5μｇのDNAライブラリー、添付の反応緩衝液、5μｌのSP6 Enzyme mix 、5mMの基質（ＡTP、ＵTP、CTP）、400μMのGTPおよび、2mMのm7G(5’)ppp(5’)G capアナログ（Invitrogen社製）を含む。反応は37℃で3時間行なった。また、T7プロモーターをもつPURESYSTEM用のDNAライブラリーを、T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System（Promega社製）を用いて転写し、RNAライブラリーに変換した。反応液(25μｌ)は、2.5μｇのDNAライブラリー、添付の反応緩衝液、および2. 5μｌのEnzyme mixを含む。反応は37℃で30分行なった。鋳型DNAをDNaseI（Promega社製）で分解した後、RNeasy Mini Kit（QIAGEN社製）を用いて精製した。方法はキットに添付のマニュアルに従った。RNAとスペーサーピューロマイシン（p(dCp)2T(FI)pPEG(2000)p(dCp)2 Puro(記号はWO 02/48347に定義された通りである)）は、T4 RNAリガーゼ（宝酒造製）を用い、WO 02/48347の実施例1に記載の方法に従い連結した。連結反応は25℃で1時間行なった。ライゲーション産物をRNeasy Mini Kit（QIAGEN社製）を用いて精製した。精製されたライゲーション産物を無細胞翻訳系に加えて翻訳を行ない、in vitro virusライブラリーを構築した。無細胞翻訳反応液の組成は、小麦胚芽系を用いた場合、10μｌの小麦胚芽抽出液（Promega社製）、80μMのアミノ酸混合液、50 mMの酢酸カリウム、10ユニットのRNA分解酵素阻害剤（Invitrogen社製）、および2 pmolのライゲーション産物を含む。反応は25℃で40分行なった。PURESYSTEMを用いた場合、反応液は添付の反応液AとB、および5から10 pmolのライゲーション産物を含む。反応は37℃で30分行なった。【００６５】
・  ベイトの調製
Bcl-xLをグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）融合タンパク質として発現させ、グルタチオン結合樹脂上にGSTを介して提示することにより、選択実験に用いることとした。Bcl-xLはヒト脳のRNAライブラリー（クローンテック社製）から逆転写反応とPCRにより取得した。逆転写反応液60μｌは500μMのdNTP、0.6 pMのプライマー（priBcl-xLr1、5’-tac agt ctc gag cta gtt gaa gcg ttc ctg gcc ct-3’ (配列番号３８)、ダテコンセプト社製）、10mMのDTT、600ユニットのSuperScript II逆転写酵素および添付の反応緩衝液（Invitrogen社製）を含む。反応は37℃で1時間行なった。PCRにはKOD Plusを用いた。PCRの反応液（100μｌ）はKOD DNA ポリメラーゼを2ユニット、200μMのdNTP、2 mMのMgSO4、3 pmolのフォワードプライマー（priBcl-xLf1:5’-agt atc gaa ttc atg tct cag agc aac cgg-3’ (配列番号３９)、ダテコンセプト社製）、およびリバースプライマー（priBcl-xLr1）、鋳型DNA、および添付の緩衝液からなる。得られたPCR産物をTOPO TA Cloningキット（Invitrogen社製）を用いクローニングした後、DNAシークエンサーにより塩基配列を確認した（CEQ2000、ベックマンコールター社製）。得られたBcl-xLをコードするDNAをEcoRIとXhoI（東洋紡）で消化後、同酵素で消化したグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）融合タンパク質発現用ベクター（pGEX-4T-1、Amersham Bioscience社製）と連結した。連結反応にはリガファースト（プロメガ社製）を用いた。得られたベクターで大腸菌JM109株を形質転換した。液体培養後、発現用ベクターを回収した。発現ベクターの構造遺伝子部分の塩基配列をDNAシークエンシングにより確認後、発現用宿主細胞大腸菌BL21(DE3)pLysS株を形質転換した。大量発現はOD600=0.6に到達後0.4 mMのイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）（ナカライテスク社製）により発現を誘導し、25℃で終夜培養することにより行なった。培養スケールは通常5 mL程度である。培地は50 μｇ／ｍｌのカルベニシリンと30 μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む。液体培地1.5 mlから回収した菌体を200μｌのリシスバッファーに懸濁し、超音波により菌体を破砕した。遠心した後、約200μｌの可溶性画分を600μｌスラリーのグルタチオン結合樹脂と結合させた。十分な洗浄の後、1 mlのTBSTE緩衝液（Tris-HCl(pH7.4), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.2% Tween20）を加え、Bcl-xL結合樹脂を平衡化し、保存した。【００６６】
4. 試験管内選択実験の遂行
試験管内選択実験の実験手順の概略を図５に示す。翻訳反応産物をMicro Bio-Spin Column P-30 Tris, RNase-Free（BIO-RAD社製）を用いて精製した。TBSTE緩衝液を180 μｌ加え、15,000 rpmで10分間遠心した。上清に20μｌスラリーのANTI-FLAG M2-アガロース（SIGMA社製）を加え、4℃で1時間撹拌し、結合反応を行なった。200μｌのTBSTE緩衝液を用いて4回洗浄した後、樹脂に結合したin vitro virus分子のmRNA部分の逆転写反応を行なった。逆転写反応液60μｌは500μMのdNTP、0.6 pMのpriFLAGA6r、10 mMのDTT、600ユニットのSuperScript II逆転写酵素および添付の反応緩衝液を含む。反応は37℃で1時間行なった。反応液をMicro Bio-Spin Column P-30 Tris, RNase-Freeを用いて精製した。この際、このカラムを予めTBSTE緩衝液もしくはTBSTE2緩衝液（Tris-HCl(pH7.4), 450 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.2% Tween20）で置換しておいた。その後、TBSTE緩衝液もしくはTBSTE2緩衝液を加え反応液の総体積を300μｌとした。この反応液に15μｌスラリーのBcl-xL結合樹脂を混合し、4℃で1時間撹拌し、結合反応を行なった。150μｌのTBSTE緩衝液もしくはTBSTE2緩衝液を用いて4回洗浄し、非特異的吸着している分子を除いた。Bcl-xLに結合した分子を回収する方法として以下の二通りの方法を行なった。10ユニットのトロンビン（Amersham Bioscience社製）を添加し、Bcl-xLとGSTの間を切断しBcl-xLごとin vitro virus分子を回収する方法、あるいは0.1 MのKOHを作用し、タンパク質部分を変性しin vitro virus分子を回収する方法である。【００６７】
小麦胚芽無細胞翻訳系を用いて合成したライブラリーにはTBSTE緩衝液を用いて結合・洗浄を行ない、トロンビンを用いてin vitro virus分子を回収した。PURESYSTEMを用いて合成したライブラリーに対してはTBSTE2緩衝液を用いて結合・洗浄を行ない、KOHを用いてin vitro virus分子を回収した。回収したin vitro virus分子はエタノール沈澱により濃縮し、PCRによりそのcDNA部分を増幅した。PCRのプライマーにはpriSP6OGfとpriFLAGA6r（小麦胚芽無細胞翻訳系用ライブラリー）およびpriSDG4Sf（5’-aag gag ata tac caa tgg gtg gcg gcg gtt-3’ (配列番号４０)、ダテコンセプト社から購入）とpriFLAGA6r（PURESYSTEM用ライブラリー）を用いた。反応液の組成は1.2.3項のものと同一である。反応条件は、第一段階（1サイクル）94℃/5分、第二段階(20〜25サイクル) 94℃/30秒、58℃/30秒、68℃/30秒、第三段階(1サイクル) 68℃/5分からなる。【００６８】
・  選択されたペプチドのアミノ酸配列
選択されたin vitro virus分子のcDNA部分を、上で述べた方法によりPCRで増幅し、TOPO TA Cloning Kit（Invitrogen社製）を用いてクローニングした。クローニング後、塩基配列を解析した。【００６９】
NNSライブラリーと小麦胚芽無細胞翻訳系を用いた選択実験では、7ラウンドの選択実験の後に塩基配列を解析した。この選択実験で取得されたペプチドのアミノ酸配列を表１に記す。クローン06と10はそれぞれ4、5回出現した。特にクローン10から13の配列は1アミノ酸のみが異なる相同性が高い配列であった。クローン3〜７および9〜13の13から16番目の部位において、アルギニン(R)に続き、3個の連続した疎水性アミノ酸からなるモチーフが見られた。【００７０】
NNSライブラリーとPURESYSTEMを用いた選択実験では、5ラウンドの選択実験の後に塩基配列を解析した。この選択実験で取得されたペプチドのアミノ酸配列を表２に示す。9個のクローンを解析したところ、クローン16と17がそれぞれ3個と6個取得された。クローン16の配列は小麦胚芽無細胞翻訳系を用いて得られたクローン04の配列と同一であった。【００７１】
BakライブラリーとPURESYSTEMを用いた選択実験では、5ラウンドの選択実験の後に塩基配列を解析した。この選択実験で取得されたペプチドのアミノ酸配列を表３に記す。ここではクローン18、19、20の3種類のペプチドが得られた。クローン18は解析した9個のクローンのうち7回出現した配列である。また、クローン18と19においては、保存したはずの14番目のロイシンがメチオニンに変異していた。クローン18の3から11番目のアミノ酸配列は、クローン17の4から12番目のアミノ酸配列と相同性があった。【００７２】
【表１】
2006062173.tif 000002
【００７３】
【表２】
2006062173.tif 000003
【００７４】
【表３】
2006062173.tif 000004
【００７５】
・  選択されたペプチドのBcl-xLへの親和性の確認
・  リアルタイムPCR法を用いた回収率の測定
リアルタイムPCR法で定量を正確に行なうためには共通配列が必要である。共通配列として大腸菌のジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）を用いた。DHFRのＣ末端側にグリシン／セリンリンカーを介し、取得されたペプチドを連結した（図6a）。この融合タンパク質をコードする遺伝子を図6bに示した手順により構築した。DHFRの遺伝子は東洋紡社製のプロテイオス無細胞翻訳キットに添付のプラスミドからPCRにより増幅した。PCRの反応液（100μｌ）はKOD DNA ポリメラーゼを2ユニット、200μMのdNTP、2 mMのMgSO4、3 pmolのフォワードおよびリバースプライマー、1μｌの鋳型DNA、および添付の緩衝液からなる。フォワードプライマーはpriSP6ODf、5’-att tag gtg aca cta tag aac aac aac aac aac aaa caa caa caa aat gat cag tct gat tgc ggc gtt a-3’ (配列番号４１)（ファスマック社製）、リバースプライマーはpriG4S1-2Dr:5’-tga gcc tcc gcc tcc tga acc gcc gcc acc ccg ccg ctc cag aat ct-3’ (配列番号４２)（ダテコンセプト社製）である。フォワードプライマーにはSP6プロモーター、Ω29配列、開始コドン、およびDHFRの一部がコードされている。リバースプライマーはグリシン／セリンリンカーとDHFRの一部がコードされている。反応条件は、第一段階（1サイクル）94℃/5分、第二段階(15サイクル) 94℃/30秒、58℃/30秒、68℃/30秒、第三段階(1サイクル) 68℃/5分からなる。【００７６】
結合能を解析したいペプチドの遺伝子は、クローニング用のベクター上にある。この遺伝子をpriG4S1f、5’-ggt ggc ggc ggt tca g-3’ (配列番号４３)（ダテコンセプト社製）およびpriFLAGA6rでPCRし増幅した。PCRの条件は上記と同様である。ここで増幅した２つのDNA断片は共にグリシン／セリンリンカーを含んでいるので、オーバーラップエクステンション(overlap extension) PCRにより、これらの断片を連結した。フォワードプライマーとしてpsiSP6ODf、リバースプライマーとしてpriFLAGA6rを用いた。PCRの条件は上記と同様である。この方法により構築したDHFR融合ペプチドの遺伝子は、クローン03, 04, 06, 07, 08, 09, 10である。【００７７】
ポジティブコントロールとして、Bcl-xLに強く結合することが知られている28アミノ酸残基からなるBadペプチドのDHFR融合ペプチドを構築した。グリシンセリンリンカー、Badペプチドおよびフラッグタグをコードするプラス鎖の一本鎖DNA、 G4SG4SmBadf、5’-ggt ggc ggc ggt tca gga ggc gga ggc tca aat ctc tgg gca gcg cag cgc tac ggc cgt gag ctc cga agg atg agc gat gag ttt gag ggt tcc ttc aag gac tac aaa gat gac gac gat aag-3’ (配列番号４４)（ファスマック社製）を化学合成し、priG4S1fとpriFLAGA6rを用いてPCRを行ない二本鎖のDNAを得た。さらにオーバーラップエクステンションPCRによりDHFR部分と連結した。PCRの条件は上記と同様である。ネガティブコントロールは、選択実験を行なう前のNNSライブラリーをpriG4S1fとpriFLAGA6rを用いたPCRにより増幅した後、オーバーラップエクステンションPCRによりDHFR部分と連結して得た。【００７８】
構築した種々のペプチドをコードしたDNAをin vitro virusに変換し、図７に示した実験手順により、Bcl-xL結合樹脂への結合能を調べた。この実験手順は図５に示した選択実験の手順と同じであるが、リアルタイムPCRによって樹脂に混合するin vitro virusの分子数と洗浄後に樹脂から回収されるin vitro virusの分子数を測定するところが異なっている。【００７９】
リアルタイムPCRはロッシュ社製のLightCyclerを用いて行なった。反応液はライトサイクラーファストスタートDNAマスターSYBERグリーンI（ロッシュ社製）を用い、添付のマニュアルに従い調製した。反応条件は第１段階（１サイクル）94度／10分、第２段階（40サイクル）94度／10秒、60度／10秒、72度／10秒であった。検量線は濃度が100倍ずつ異なる標準物質を３種調製し作成した。フォワードプライマーとしてpriEDHFRf、5’-atg atc agt ctg att gcg gcg tta gcg gta-3’ (配列番号４５)、リバースプライマーとしてproEDHFR211r、5’-gat cgt ccg tac ccg gtt gac tgc t-3’ (配列番号４６)（いずれもダテコンセプト社製）を用いた。これらのプライマーはDHFR遺伝子の1から211塩基対の領域を増幅する。【００８０】
ポジティブコントロールの回収率を100、ネガティブコントロールの回収率を1とし、種々のペプチドの回収率を規格化して求めた。その結果を表４に示した。28アミノ酸からなるBadペプチドの結合能よりは低かったが、クローン4と10のペプチドは特に高い結合能を示した。これらのペプチドの結合の様式を解析することによって、これのペプチドをリード化合物とし、新規の薬剤が開発されることが期待できる。【００８１】
【表４】
2006062173.tif 000005
【００８２】
・  プルダウンアッセイを用いた結合実験
クローン16、17、18、Badペプチド、Bakペプチド、およびネガティブコントロールとして、上記のリアルタイムPCRによる結合解析により、弱い結合能しか認められなかった配列（VVQPVSLREWADLWWL(配列番号４７)）についてPURESYSTEM用のin vitro virus分子を構築し、プルダウンアッセイを試みた。【００８３】
プルダウンアッセイの実験手順は図８に示した。PURESYSTEMを用いた翻訳反応後、翻訳反応液をTBSTE2緩衝液で緩衝液置換を行なったゲルろ過スピンカラムを用いて精製した。TBSTE2緩衝液およそ200μｌを加えて総体積を300μｌとした。Bcl-xL結合樹脂15μｌスラリーを混合し、4℃で1時間結合反応を行なった後に150μｌのTBSTE2緩衝液で4回洗浄した。その後樹脂に電気泳動用緩衝液20μｌを加え99℃で5分間加熱した後、10% / 8 M尿素SDS-PAGEにアプライした。泳動後蛍光イメージャー（Bio-Rad社製、Molecular Imager FX）を用い、樹脂に結合したin vitro virus分子を検出した。対照実験として、Bcl-xL結合樹脂を予めトロンビンで処理し、大部分のBcl-xLを除いた樹脂を調製し、同様のプルダウンアッセイを行なった。これらの実験結果を図9に示す。【００８４】
Badペプチドはin vitro virus分子の形成が明確に認められた。Bcl-xL結合樹脂に明確な結合が見られた。トロンビン処理後の樹脂にも結合は見られたが、その量はBcl-xL結合樹脂に結合したものに比べて少量であった。したがって、BadペプチドはBcl-xLに特異的に結合している可能性が高い。トロンビン処理後の樹脂に結合が見られたが、その理由の１つとして、トロンビン処理により、Bcl-xLが完全には除けなかった可能性が考えられる。ネガティブコントロールのペプチドでは、in vitro virus分子の形成は認められたが、どちらの樹脂にも結合は見られなかった。BakペプチドではBcl-xL結合樹脂にのみに結合が見られた。以上の結果から本プルダウンアッセイが正確に行なわれていることを示している。【００８５】
クローン16と18は明確なin vitro virus分子の形成が認められた。特にクローン18のin vitro virus分子形成効率は高かった。いずれのクローンに関してもBcl-xL結合樹脂に明確な結合が見られた。一方で、トロンビン処理後の樹脂にはわずかな結合しか見られなかった。クローン17はin vitro virus分子は他と比べて著しく高分子側にバンドが現れた。これはこのペプチドがアルギニンを多く含み高い等電点（pI=10）を示すためと考えられる。このペプチドに関しては、そのためバンドがスミアになり明確ではないが、Bcl-xL結合樹脂に結合が見られた。以上の結果は、本選択実験で取得されたクローン16、17、18がBcl-xL結合能を有することを示唆している。これらのペプチドの結合の様式を解析することによって、これのペプチドをリード化合物とし、新規の薬剤が開発されることが期待できる。【００８６】
・  選択されたペプチドとBadのBcl-xL結合に関する競合実験
取得されたペプチドが抗癌治療を助長するには、Bcl-xLの疎水ポケットに結合することにより、Bcl-xLとBakやBadタンパク質とのヘテロダイマー形成を阻害する必要がある。このヘテロダイマー形成阻害により、BakやBadタンパク質は遊離し、アポトーシス促進作用を発揮すると推測されるからである(Zheng, Nature Cell Biology (2000) 3, E1-E3) 。本実験では選択実験により取得されたペプチドとBadペプチドとの、Bcl-xL結合に関する競合実験を行ない、取得ペプチドのBcl-xLへの結合部位を検証した。【００８７】
上記の6と同様の手順でBadペプチド、クローン16、17および18のin vitro virus分子を調製した。クローン16、17および18を単独で用いてBcl-xL結合樹脂に対するプルダウンアッセイを行なった結果と、Badと混合し、競合させてプルダウンアッセイを行なった結果を比較し図１０に示す。この結果から、競合させた場合では単独の場合と比較して、取得ペプチドのバンド強度が減少していることが分かる。これは、これらの取得ペプチドとBadペプチドが、Bcl-xLの共通部位に対して競合的に結合していることを示している。したがって、ここに述べたペプチドは、Bcl-xLとBakやBadタンパク質とのヘテロダイマー形成を阻害し、BakやBadタンパク質のアポトーシス促進作用を回復させ、抗癌剤治療を助長する機能をもつと推測される。【００８８】
また、クローン16は表１に示したクローン4と１残基を除いて同一の配列である。表１において、クローン4からクローン13では、ペプチドのＣ末端側に、R, X, X, X（Xは疎水性アミノ酸）(配列番号４８)からなる共通のモチーフが見られた。これはクローン4からクローン13が共通の様式でBcl-xLに結合していることを示唆している。このことと、クローン４とほぼ同一のクローン16がBadペプチドと競合的にBcl-xLと結合することから、表１に示したクローン5からクローン13もBadペプチドと競合的にBcl-xLに結合することが推測できる。よってクローン5からクローン13も、Bcl-xLとBadやBakタンパク質などとのヘテロダイマー形成を阻害し、これらのアポトーシス促進作用を回復させ、抗癌治療を助長すると推測される。【００８９】
・  BakペプチドとBcl-xLの結合に対する取得ペプチドの阻害活性
選択実験により取得されたペプチドとBakペプチドを用い、Bcl-xLに対する結合の競合実験を行なった。この競合実験により、BakペプチドとBcl-xLの結合が阻害されれば、取得ペプチドが、Bcl-xLとBakあるいはBadタンパク質とのヘテロダイマー形成を阻害すると期待できる。蛍光ラベルF-Bakペプチド、非修飾のBakペプチド、および取得ペプチドであるクローン10, 16, 17, 18に相当するペプチドは、Invitrogen社に外注した。なお、4種の取得ペプチドには水系緩衝液への溶解性を増大させるためにFLAGタグが連結されている。【００９０】
8. 1. 蛍光化BakペプチドとGST-Bcl-xLの結合
まず、F-BakのGST-Bcl-xLへの結合を蛍光偏光度を測定することにより解析した（BEACON 2000、Invitrogen社）。一定量のF-Bakと種々の濃度のGST-Bcl-xLを混合し、偏光度（Polarization）を測定した。図１１のAにはB vs LFプロットを示す。カーブフィッティングには（１）式を用いた。【００９１】
F(x) = {x * (Pmax - Pmin)} / (Kd + x) + Pmin    (1)
ここで未知係数はPmax、Pmin、およびKd（解離定数）、独立変数はx（GST-Bcl-xL濃度）である。【００９２】
カーブフィッティングから解離定数は337 ± 32 nMと求まった。BakペプチドのBcl-xLに対する結合の解離定数は340 nMと報告されているので、この結果は過去の文献値とよく一致した。【００９３】
次に横軸を対数で表したKlotsプロットを図１１のBに示す。カーブフィッティングは(1)式を用いて行なうことができる。これらのプロットが各々双曲線、シグモイド曲線に乗ったことから、F-BakとGST-Bcl-xLの結合反応は、協同効果が関与しないClarkの理論と一致することが推測される。【００９４】
次に、Scatchardプロットを行なった結果を図１１のCに示す。横軸には結合した分子の割合、つまり(P - Pmin) / (Pmax - Pmin)を、縦軸はこの値をGST-Bcl-xL濃度で割った値をプロットした。プロットが直線上に乗ったことから、F-BakとGST-Bcl-xLの結合は1 : 1の反応であると解釈できる。Scatchardプロットから得られた解離定数は370 nMであり、この値も文献値とよく一致した。以上の結果から、F-BakとGST-Bcl-xLを用いた本解析方法は、取得ペプチドの阻害活性を検証するのに適した方法であると結論できる。なお、同様の結果は2% DMSO存在下でも確認された（図１１のD〜F）。【００９５】
8. 2. 取得ペプチドの阻害活性の解析
阻害実験は、一定量のF-Bak(186 nM)およびGST-Bcl-xL(400 nM)を混合した後、種々の濃度の取得ペプチドを反応液に加え、偏光度を測定することによって行なった。取得したペプチドが阻害作用を示せば、F-BakがGST-Bcl-xLから遊離し、その結果偏光度が減少する。実験結果を図１２に示す。この図からクローン10および18は阻害活性をもつことが分かった。次に（2）式を用いてカーブフィッティングを行ない、IC50を求めた。【００９６】
F(x) = - {x * (Pmax - Pmin)} / (Kd + x) + Pmax    (2)
ここで未知係数はPmax、Pmin、およびIC50、独立変数はx（ペプチド濃度）である。【００９７】
本条件下ではBakペプチドのIC50は29.7μM（PBS緩衝液中）および11.8μM（2% DMSOを含むPBS緩衝液中）であった。これに対しクローン18ペプチドのIC50は6.4μM（PBS緩衝液中）であり、一方クローン10ペプチドのIC50は0.9μM（2% DMSOを含むPBS緩衝液中）であった。いずれも同一条件下でのBakペプチドよりもGST-Bcl-xLに対して高い親和性を有していると推測できる。また、クローン17ペプチドには、このような阻害活性が見られなかった。クローン16ペプチドには若干の阻害活性が見られたものの、溶解度が極めて低く、高濃度側での解析が困難であり、IC50を求めることができなかった。【００９８】
以上の解析結果をまとめると、クローン10と18のペプチドはBcl-xLとBakおよびBadタンパク質のヘテロダイマー形成を阻害する機能をもつと推測できる。クローン16は溶解度が低いもののやはり阻害活性を有すると推測できる。クローン17はin vitro virus分子の状態では阻害活性がプルダウンアッセイから示唆されたが、ペプチドレベルではそのような活性は認められなかった。この理由は以下のように考えられる。クローン17のペプチドは、塩基性アミノ酸含有量が多く、Bcl-xLの正電荷部分と反発してしまい、Bcl-xLと結合できない。しかし、in vitro virus分子の状態では、核酸部分のリン酸基により、ペプチドの正電荷が遮蔽され、Bcl-xLとの反発が起きず、結合できる。【００９９】
阻害の様式は前述のように取得ペプチドがBcl-xLの疎水性ポケットに結合し、BakやBadペプチドの結合を直接阻害している可能性があるが、Bcl-xLの他の部分に結合することで、Bcl-xLの構造が変化し、それによってBakやBadペプチドの結合を阻害している可能性も考えられる。
【産業上の利用の可能性】
【０１００】
本発明によれば、Bcl-xLとBakやBadタンパク質とのヘテロダイマーの形成を阻害し、BakやBadタンパク質のアポトーシス促進作用を回復させ、抗癌剤治療を助長できる。また、有効成分のペプチドとBcl-xLとの複合体の立体構造が解析されれば、これらのペプチドをリード化合物として新規の薬剤の設計が可能となる。また部分的な結合の様式を、既存のペプチドや小分子化合物のものと組み合わせることにより、より親和性が高い薬剤を設計できる可能性がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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