(57)【要約】  本発明は、GPR92/93作動薬を有効成分とする耐糖能異常改善薬もしくは抗糖尿病薬、被験物質がGPR92/93リガンドであることを指標とする、耐糖能異常改善薬もしくは抗糖尿病薬等のスクリーニング方法等を提供するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
GPR92/93作動薬を有効成分として含有する、インスリン分泌促進薬。
【請求項２】
GPR92/93作動薬がリゾホスファチジン酸、その誘導体、L-NASPA又はそれらの薬学上許容される塩である、請求項１に記載のインスリン分泌促進薬。
【請求項３】
リゾホスファチジン酸又はその誘導体が、式（１）：
【化１１】
2006003877.tif 000017
〔式中、Ｒ1は、水素原子、炭素数８〜２２のアシル基又は炭素数８〜２２の1−アルケニル基を表し、
Ｒ2は水素原子、myo−イノシトール−１−イル基、２−アンモニオエチル基又はホスホノ基を表し、
Ｒ3は水素原子又は炭素数２〜２２のアシル基を表し、Ｒ1及びＲ3の少なくとも一方は炭素数８〜２２のアシル基もしくは炭素数８〜２２の1−アルケニル基を表す。〕
で表される化合物である、請求項２に記載のインスリン分泌促進薬。
【請求項４】
式（１）で表される化合物が、リゾホスファチジン酸、1-Acyl-PAF又はそれらの薬学上許容される塩である、請求項３に記載のインスリン分泌促進薬。
【請求項５】
式（１）において、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3が以下の組み合わせを表すことを特徴とする、請求項３に記載のインスリン分泌促進薬：
１）Ｒ1がオレオイル基を表し、Ｒ2及びＲ3が水素原子を表す；
２）Ｒ1がパルミトイル基を表し、Ｒ2がアセチル基を表し、Ｒ3が２−アンモニオエチル基を表す；
３）Ｒ1がドコサヘキサエノイル基を表し、Ｒ2及びＲ3が水素子を表す；
４）Ｒ3がドコサヘキサエノイル基を表し、Ｒ2及びＲ1が水素原子を表す；
５）Ｒ1がステアロイル基を表し、Ｒ3が水素原子を表し、Ｒ2が、myo−イノシトール−１−イル基を表す；
６）Ｒ3がステアロイル基を表し、Ｒ1が水素原子を表し、Ｒ2が、myo−イノシトール−１−イル基を表す；又は
７）Ｒ2がホスホノ基を表し、Ｒ1及びＲ3がオクタノイル基を表す。
【請求項６】
血糖調節薬であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載のインスリン分泌促進薬。
【請求項７】
耐糖能異常改善薬であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載のインスリン分泌促進薬。
【請求項８】
生活習慣病治療薬であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載のインスリン分泌促進薬。
【請求項９】
糖尿病治療薬であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載のインスリン分泌促進薬。
【請求項１０】
リゾホスファチジン酸、その誘導体、L-NASPA又はそれらの薬学上許容される塩を有効成分として含有する、GPR92/93作動薬。
【請求項１１】
リゾホスファチジン酸又はその誘導体が、式（１）：
式（１）：
【化１２】
2006003877.tif 000018
〔式中、Ｒ1は、水素原子、炭素数８〜２２のアシル基又は炭素数８〜２２の1−アルケニル基を表し、
Ｒ2は水素原子、myo−イノシトール−１−イル基、２−アンモニオエチル基又はホスホノ基を表し、
Ｒ3は水素原子又は炭素数２〜２２のアシル基を表し、Ｒ1及びＲ3の少なくとも一方は炭素数８〜２２のアシル基もしくは炭素数８〜２２の1−アルケニル基を表す。〕
で表される化合物である、請求項１０に記載のGPR92/93作動薬。
【請求項１２】
式（１）で表される化合物が、リゾホスファチジン酸、1-Acyl-PAF又はそれらの薬学上許容される塩である、請求項１１に記載のGPR92/93作動薬。
【請求項１３】
式（１）において、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3が以下の組み合わせを表すことを特徴とする、請求項１１に記載のGPR92/93作動薬：
１）Ｒ1がオレオイル基を表し、Ｒ2及びＲ3が水素原子を表す；
２）Ｒ1がパルミトイル基を表し、Ｒ2がアセチル基を表し、Ｒ3が２−アンモニオエチル基を表す；
３）Ｒ1がドコサヘキサエノイル基を表し、Ｒ2及びＲ3が水素原子を表す；
４）Ｒ3がドコサヘキサエノイル基を表し、Ｒ2及びＲ1が水素原子を表す；
５）Ｒ1がステアロイル基を表し、Ｒ3が水素原子を表し、Ｒ2が、myo−イノシトール−１−イル基を表す；
６）Ｒ3がステアロイル基を表し、Ｒ1が水素原子を表し、Ｒ2が、myo−イノシトール−１−イル基を表す；又は
７）Ｒ2がホスホノ基を表し、Ｒ1及びＲ3がオクタノイル基を表す。
【請求項１４】
GPR92/93又はリガンドが結合し得るそのフラグメントに、被験物質及び／又はリゾホスファチジン酸、その誘導体及びそれらの薬学上許容される塩から選択される基準物質を接触させ、該GPR92/93又はリガンドが結合し得るそのフラグメントに対する結合活性が、前記基準物質よりも高い化合物を選択することを含む、GPR92/93リガンドのスクリーニング方法。
【請求項１５】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程：
（ａ）  被験物質と、GPR92/93又はリガンドが結合し得るそのフラグメントを接触させる工程、
（ｂ）  （ａ）における被験物質とGPR92/93又はリガンドが結合し得るそのフラグメントに対する結合活性を測定する工程、
（ｃ）  前記（ｂ）の測定値を、被験物質として基準物質を用いた場合の測定値と比較する工程、及び
（ｄ）  前記（ｃ）の結果に基づき、前記（ｂ）の測定値が前記（ｃ）の測定値と同等以上である被験物質をGPR92/93リガンドとして選択する工程、
を含む、請求項１４に記載のスクリーニング方法。
【請求項１６】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程：
（ａ）  被験物質の存在下及び非存在下で、基準物質、及びGPR92/93又はリガンドが結合し得るそのフラグメントを接触させる工程、
（ｂ）  （ａ）における基準物質とGPR92/93又はリガンドが結合し得るそのフラグメントに対する結合活性を測定し、被験物質存在下における測定値と被験物質非存在下における測定値とを比較する工程、及び
（ｃ）  被験物質存在下における前記（ｂ）の測定値が、被験物質非存在下における前記（ｂ）の測定値よりも大きい被験物質を、GPR92/93リガンドとして選択する工程、
を含む、請求項１４に記載のスクリーニング方法。
【請求項１７】
GPR92/93を含む脂質二重層及びGPR92/93に共役し得るＧ蛋白質のαサブユニットを含んでなる反応系において、被験物質及び／又はリゾホスファチジン酸、その誘導体及びそれらの薬学上許容される塩から選択される基準物質を接触させ、該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応又は該Ｇ蛋白質の細胞刺激活性が、前記基準物質よりも高い化合物を選択することを含む、GPR92/93リガンドのスクリーニング方法。
【請求項１８】
反応系が、
(i) GPR92/93をコードするＤＮＡを含む発現ベクターをトランスフェクトした宿主真核生物細胞、(ii) GPR92/93のＣ末端側にGPR92/93に共役し得るＧ蛋白質のαサブユニットが融合したポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトした宿主真核生物細胞、(iii) GPR92/93をコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトした、GPR92/93に共役し得るＧ蛋白質を内因的に発現する宿主動物細胞、又は(iv) GPR92/93及びGPR92/93に共役し得るＧ蛋白質を内因的に発現する動物細胞、それらの細胞のホモジネート又はそれらの細胞由来の膜画分である、請求項１７に記載のスクリーニング方法。
【請求項１９】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程：
（ａ）  被験物質と、GPR92/93を含む脂質二重層及びGPR92/93に共役し得るＧタンパク質のαサブユニットを含んでなる反応系を接触させる工程、
（ｂ）  （ａ）における該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応又は該Ｇタンパク質の細胞刺激活性を測定する工程、
（ｃ）  前記（ｂ）の測定値を、被験物質としてリゾホスファチジン酸、その誘導体及びそれらの薬学上許容される塩から選択される基準物質を用いた場合の測定値と比較する工程、及び
（ｄ）  前記（ｃ）の結果に基づき、前記（ｂ）の測定値が前記（ｃ）の測定値と同等以上である被験物質をGPR92/93作動薬として選択する工程、
を含む、請求項１７又は１８に記載のスクリーニング方法。
【請求項２０】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程：
（ａ）  被験物質の存在下及び非存在下で、リゾホスファチジン酸、その誘導体及びそれらの薬学上許容される塩から選択される基準物質、及びGPR92/93を含む脂質二重層及びGPR92/93に共役し得るＧタンパク質のαサブユニットを含んでなる反応系を接触させる工程、
（ｂ）  （ａ）における該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応又は該Ｇタンパク質の細胞刺激活性を測定し、被験物質存在下における測定値と被験物質非存在下における測定値とを比較する工程、及び
（ｃ）  被験物質存在下における前記（ｂ）の測定値が、被験物質非存在下における前記（ｂ）の測定値よりも小さい被験物質を、GPR92/93拮抗薬として選択する工程、
を含む、請求項１７又は１８に記載のスクリーニング方法
【請求項２１】
リゾホスファチジン酸又はその誘導体が、式（１）：
式（１）：
【化１３】
2006003877.tif 000019
〔式中、Ｒ1は、水素原子、炭素数８〜２２のアシル基又は又は炭素数８〜２２の1−アルケニル基を表し、
Ｒ2は水素原子、myo−イノシトール−１−イル基、２−アンモニオエチル基又はホスホノ基を表し、
Ｒ3は水素原子又は炭素数２〜２２のアシル基を表し、Ｒ1及びＲ3の少なくとも一方は炭素数８〜２２のアシル基もしくは炭素数８〜２２の1−アルケニル基を表す。〕
で表される化合物である、請求項１７〜２０のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項２２】
式（１）で表される化合物が、リゾホスファチジン酸、1-Acyl-PAF又はそれらの薬学上許容される塩である、請求項２１に記載のスクリーニング方法。
【請求項２３】
式（１）において、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3が以下の組み合わせを表すことを特徴とする、請求項２１に記載のスクリーニング方法：
１）Ｒ1がオレオイル基を表し、Ｒ2及びＲ3が水素原子を表す；
２）Ｒ1がパルミトイル基を表し、Ｒ2がアセチル基を表し、Ｒ3が２−アンモニオエチル基を表す；
３）Ｒ1がドコサヘキサエノイル基を表し、Ｒ2及びＲ3が水素原子を表す；
４）Ｒ3がドコサヘキサエノイル基を表し、Ｒ2及びＲ1が水素原子を表す；
５）Ｒ1がステアロイル基を表し、Ｒ3が水素原子を表し、Ｒ2が、myo−イノシトール−１−イル基を表す；
６）Ｒ3がステアロイル基を表し、Ｒ1が水素原子を表し、Ｒ2が、myo−イノシトール−１−イル基を表す；又は
７）Ｒ2がホスホノ基を表し、Ｒ1及びＲ3がオクタノイル基を表す。
【請求項２４】
被験物質がGPR92/93作動薬であることを指標として化合物を選択することを含む、インスリン分泌促進薬のスクリーニング方法。
【請求項２５】
GPR92/93、又はリガンドが結合し得るそのフラグメントに被験物質を接触させ、該GPR92/93又は該フラグメントに結合する化合物を選択することを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
GPR92/93を含む脂質二重層及びGPR92/93に共役し得るＧ蛋白質のαサブユニットを含んでなる反応系において、該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応又は該Ｇ蛋白質の細胞刺激活性を、被験物質の存在下と非存在下で比較する工程を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
反応系が、
(i) GPR92/93をコードするＤＮＡを含む発現ベクターをトランスフェクトした宿主真核生物細胞、(ii) GPR92/93のＣ末端側にGPR92/93に共役し得るＧ蛋白質のαサブユニットが融合したポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトした宿主真核生物細胞、(iii) GPR92/93をコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトした、GPR92/93に共役し得るＧ蛋白質を内因的に発現する宿主動物細胞、又は(iv) GPR92/93及びGPR92/93に共役し得るＧ蛋白質を内因的に発現する動物細胞、それらの細胞のホモジネート又はそれらの細胞由来の膜画分である、請求項２６に記載のスクリーニング方法。
【請求項２８】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程：
（ａ）  被験物質と、GPR92/93を含む脂質二重層及びGPR92/93に共役し得るＧタンパク質のαサブユニットを含んでなる反応系を接触させる工程、
（ｂ）  （ａ）における該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応又は該Ｇタンパク質の細胞刺激活性を測定する工程、及び
（ｃ）  （ｂ）の結果に基づき、細胞刺激活性を有する被験物質をGPR92/93作動薬として選択する工程、
を含む、請求項２６又は２７に記載のスクリーニング方法。
【請求項２９】
請求項１４〜１９のいずれかに記載の方法で、被験物質がGPR92/93作動薬であるか否かを評価することを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
インスリン分泌促進薬が血糖調節薬である、請求項２４〜２９のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項３１】
インスリン分泌促進薬が耐糖能異常改善薬である、請求項２４〜２９のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項３２】
インスリン分泌促進薬が糖尿病治療薬である、請求項２４〜２９のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項３３】
請求項２４〜３２のいずれかに記載の方法により得られるインスリン分泌促進薬。
【請求項３４】
血糖調節薬であることを特徴とする、請求項３３に記載のインスリン分泌促進薬。
【請求項３５】
耐糖能異常改善薬であることを特徴とする、請求項３３に記載のインスリン分泌促進薬。
【請求項３６】
生活習慣病治療薬であることを特徴とする、請求項３３に記載のインスリン分泌促進薬。
【請求項３７】
糖尿病治療薬であるであることを特徴とする、請求項３３に記載のインスリン分泌促進薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はGタンパク質結合受容体（GPCR）：GPR92/93の新規用途及びそのリガンド等に関する。より詳細には、GPR92/93のアゴニストリガンドを同定したこと、及び当該アゴニストリガンドのインスリン分泌促進薬としての医薬用途を見出したことに基づく。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病はその病態から１型と２型に分類される。すなわち、１型は膵臓におけるインスリン分泌機能不全に基づく病態であり、２型はインスリン感受性組織におけるインスリン抵抗性と膵臓におけるインスリン分泌異常が主たる病態である。近年、食生活の西洋化や社会的ストレスの増加等により、肥満とそれに付随する生活習慣病、特に２型糖尿病患者の増加が著しい。【０００３】
血糖調節において膵臓は中心的役割をはたすと考えられている。主要な血糖調節ホルモンであるインスリンは膵臓のランゲルハンス島のβ細胞から分泌される。β細胞は食後などに一過的に上昇する血糖に応答して迅速に必要量のインスリンを分泌する。筋肉、脂肪等の末梢組織では膵臓から分泌されたインスリンに応答して糖を取り込むことにより、上昇した血糖の調節を行っている。さらに、肝臓ではインスリンに応答して糖新生が抑制され、血糖の調節が行われている。このようなサイクルに破綻が生じることにより糖尿病が発症すると考えられている。事実、１型糖尿病の多くは、膵臓が自己免疫的に破壊されインスリン分泌不全になることにより血糖コントロールが不能になるものであり、２型糖尿病ではインスリン分泌における第一相の分泌不良が高血糖を招来することが知られている。【０００４】
上述のような観点から、膵臓におけるインスリン分泌の促進は糖尿病病態の改善効果に大きく貢献すると考えられる。このような作用機序を持つ薬剤としては、現在のところスルホニルウレア剤などが上市されているが、血糖値に応じたインスリン分泌調節作用がないため、血糖が低下してもなおインスリン分泌促進効果が持続して低血糖に陥り、昏睡、さらには死亡を招く危険性がある。現在、血糖値に応じたインスリン分泌促進効果が得られるというような特徴をもつ安全な薬剤は上市されておらず、このような薬剤の開発が望まれている。【０００５】
ところで、GPR92/93は、生体内におけるリガンドが不明の、オーファンGタンパク質結合受容体（G protein coupled receptor; GPCR）として知られている（非特許文献１を参照）。GPR92/93は脳をはじめとする組織に発現していることが報告されていた（非特許文献２を参照）が、その機能は知られていない。
一方リゾホスファチジン酸（LPA）はリン脂質の一種であり、リン脂質の生合成中間体として知られていたが、その後様々な生体反応の細胞外シグナル伝達分子であることがわかってきた。当該生体反応としては、細胞分裂促進、アポトーシス抑制、アクチン細胞骨格再構築や細胞の形態変化の誘導、腫瘍細胞浸潤等が挙げられる（非特許文献３を参照）。しかしながら、LPAのインスリン分泌促進作用については、知られていなかった。
【非特許文献１】Lee, D. K. ら、 Gene, 2001 Sep 5; 275(1):83-91.
【非特許文献２】Demetrios, K. Vassilatisら、 Proc. Nat. Acad. Science, USA, 2003 April 15; 100(8):4903-4908.
【非特許文献３】Yoh Takuwaら、J. Biochem., 767-771(2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、Gタンパク質結合受容体（GPCR）：GPR92/93作動薬となり得るアゴニストリガンド、GPR92/93作動薬を有効成分として含有する医薬、具体的にはインスリン分泌促進薬、GPR92/93作動薬もしくは拮抗薬をスクリーニングする方法、及びインスリン分泌促進薬のスクリーニング方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題に鑑みて鋭意検討を行い、正常人の膵臓ランゲルハンス氏島において発現局在する因子を同定した。すなわち、本発明者らは正常人の膵臓ランゲルハンス氏島に発現する遺伝子と正常状態のその他の諸組織に発現する遺伝子を比較することにより、正常人の膵臓ランゲルハンス氏島において発現局在する遺伝子を同定した。次に、該遺伝子がコードする蛋白質を調べたところ、オーファンGPCRである、GPR92/93であることがわかった。【０００８】
本発明者らは、次に、GPR92/93を介したシグナル伝達を生じさせるリガンドとなる物質を探索した。その結果、生体内脂質の一種である、リゾホスファチジン酸（以下LPAと略す場合がある）及びその誘導体がGPR92/93のリガンドであることがわかった。更に、リゾホスファチジン酸が膵臓細胞におけるインスリン分泌促進作用を有することがわかった。すなわち、GPR92/93はインスリン分泌調節作用を有するGPCRであり、そのアゴニストリガンドがLPAであることを見出した。
本発明は、上記の知見を元に完成するに至ったものである。【０００９】
すなわち本発明は、GPR92/93作動薬の医薬用途等に関する：
〔１〕  GPR92/93作動薬を有効成分として含有する、インスリン分泌促進薬；
〔２〕  GPR92/93作動薬がリゾホスファチジン酸、その誘導体、L-NASPA又はそれらの薬学上許容される塩である、〔１〕に記載のインスリン分泌促進薬；
〔３〕  リゾホスファチジン酸又はその誘導体が、式（１）：【００１０】
【化１】
2006003877.tif 000002
〔式中、Ｒ1は、水素原子、炭素数８〜２２のアシル基又は炭素数８〜２２の1−アルケニル基を表し、
Ｒ2は水素原子、myo−イノシトール−１−イル基、２−アンモニオエチル基又はホスホノ基を表し、
Ｒ3は水素原子又は炭素数２〜２２のアシル基を表し、Ｒ1及びＲ3の少なくとも一方は炭素数８〜２２のアシル基もしくは炭素数８〜２２の1−アルケニル基を表す。〕
で表される化合物である、〔２〕に記載のインスリン分泌促進薬；
〔４〕  式（１）で表される化合物が、リゾホスファチジン酸、1-Acyl-PAF又はそれらの薬学上許容される塩である、〔３〕に記載のインスリン分泌促進薬；
〔５〕  式（１）において、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3が以下の組み合わせを表すことを特徴とする、〔３〕に記載のインスリン分泌促進薬：
１）Ｒ1がオレオイル基を表し、Ｒ2及びＲ3が水素原子を表す；
２）Ｒ1がパルミトイル基を表し、Ｒ2がアセチル基を表し、Ｒ3が２−アンモニオエチル基を表す；
３）Ｒ1がドコサヘキサエノイル基を表し、Ｒ2及びＲ3が水素原子を表す；
４）Ｒ3がドコサヘキサエノイル基を表し、Ｒ2及びＲ1が水素原子を表す；
５）Ｒ1がステアロイル基を表し、Ｒ3が水素原子を表し、Ｒ2が、myo−イノシトール−１−イル基を表す；
６）Ｒ3がステアロイル基を表し、Ｒ1が水素原子を表し、Ｒ2が、myo−イノシトール−１−イル基を表す；又は
７）Ｒ2がホスホノ基を表し、Ｒ1及びＲ3がオクタノイル基を表す；
〔６〕  血糖調節薬であることを特徴とする、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のインスリン分泌促進薬；
〔７〕  耐糖能異常改善薬であることを特徴とする、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のインスリン分泌促進薬；
〔８〕  生活習慣病治療薬であることを特徴とする、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のインスリン分泌促進薬；
〔９〕  糖尿病治療薬であることを特徴とする、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のインスリン分泌促進薬；
〔１０〕  リゾホスファチジン酸、その誘導体、L-NASPA又はそれらの薬学上許容される塩を有効成分として含有する、GPR92/93作動薬；
〔１１〕  リゾホスファチジン酸又はその誘導体が、式（１）：【００１１】
【化２】
2006003877.tif 000003
〔式中、Ｒ1は、水素原子、炭素数８〜２２のアシル基又は炭素数８〜２２の1−アルケニル基を表し、
Ｒ2は水素原子、myo−イノシトール−１−イル基、２−アンモニオエチル基又はホスホノ基を表し、
Ｒ3は水素原子又は炭素数２〜２２のアシル基を表し、Ｒ1及びＲ3の少なくとも一方は炭素数８〜２２のアシル基もしくは炭素数８〜２２の1−アルケニル基を表す。〕
で表される化合物である、〔１０〕に記載のGPR92/93作動薬；
〔１２〕  式（１）で表される化合物が、リゾホスファチジン酸、1-Acyl-PAF又はそれらの薬学上許容される塩である、〔１１〕に記載のインスリン分泌促進薬；
〔１３〕  式（１）において、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3が以下の組み合わせを表すことを特徴とする、〔１１〕に記載のGPR92/93作動薬：
１）Ｒ1がオレオイル基を表し、Ｒ2及びＲ3が水素原子を表す；
２）Ｒ1がパルミトイル基を表し、Ｒ2がアセチル基を表し、Ｒ3が２−アンモニオエチル基を表す；
３）Ｒ1がドコサヘキサエノイル基を表し、Ｒ2及びＲ3が水素原子を表す；
４）Ｒ3がドコサヘキサエノイル基を表し、Ｒ2及びＲ1が水素原子を表す；
５）Ｒ1がステアロイル基を表し、Ｒ3が水素原子を表し、Ｒ2が、myo−イノシトール−１−イル基を表す；
６）Ｒ3がステアロイル基を表し、Ｒ1が水素原子を表し、Ｒ2が、myo−イノシトール−１−イル基を表す；又は
７）Ｒ2がホスホノ基を表し、Ｒ1及びＲ3がオクタノイル基を表す；
〔１４〕  GPR92/93又はリガンドが結合し得るそのフラグメントに、被験物質及び／又はリゾホスファチジン酸、その誘導体及びそれらの薬学上許容される塩から選択される基準物質を接触させ、該GPR92/93又はリガンドが結合し得るそのフラグメントに対する結合活性が、前記基準物質よりも高い化合物を選択することを含む、GPR92/93リガンドのスクリーニング方法；
〔１５〕  以下の（ａ）〜（ｄ）の工程：
（ａ）  被験物質と、GPR92/93又はリガンドが結合し得るそのフラグメントを接触させる工程、
（ｂ）  （ａ）における被験物質とGPR92/93又はリガンドが結合し得るそのフラグメントに対する結合活性を測定する工程、
（ｃ）  前記（ｂ）の測定値を、被験物質として基準物質を用いた場合の測定値と比較する工程、及び
（ｄ）  前記（ｃ）の結果に基づき、前記（ｂ）の測定値が前記（ｃ）の測定値と同等以上である被験物質をGPR92/93リガンドとして選択する工程、
を含む、〔１４〕に記載のスクリーニング方法；
〔１６〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程：
（ａ）  被験物質の存在下及び非存在下で、基準物質、及びGPR92/93又はリガンドが結合し得るそのフラグメントを接触させる工程、
（ｂ）  （ａ）における基準物質とGPR92/93又はリガンドが結合し得るそのフラグメントに対する結合活性を測定し、被験物質存在下における測定値と被験物質非存在下における測定値とを比較する工程、及び
（ｃ）  被験物質存在下における前記（ｂ）の測定値が、被験物質非存在下における前記（ｂ）の測定値よりも大きい被験物質を、GPR92/93リガンドとして選択する工程、
を含む、〔１４〕に記載のスクリーニング方法；
〔１７〕  GPR92/93を含む脂質二重層及びGPR92/93に共役し得るＧ蛋白質のαサブユニットを含んでなる反応系において、被験物質及び／又はリゾホスファチジン酸、その誘導体及びそれらの薬学上許容される塩から選択される基準物質を接触させ、該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応又は該Ｇ蛋白質の細胞刺激活性が、前記基準物質よりも高い化合物を選択することを含む、GPR92/93リガンドのスクリーニング方法；
〔１８〕  反応系が、
(i) GPR92/93をコードするＤＮＡを含む発現ベクターをトランスフェクトした宿主真核生物細胞、(ii) GPR92/93のＣ末端側にGPR92/93に共役し得るＧ蛋白質のαサブユニットが融合したポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトした宿主真核生物細胞、(iii) GPR92/93をコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトした、GPR92/93に共役し得るＧ蛋白質を内因的に発現する宿主動物細胞、又は(iv) GPR92/93及びGPR92/93に共役し得るＧ蛋白質を内因的に発現する動物細胞、それらの細胞のホモジネート又はそれらの細胞由来の膜画分である、〔１７〕に記載のスクリーニング方法；
〔１９〕  以下の（ａ）〜（ｄ）の工程：
（ａ）  被験物質と、GPR92/93を含む脂質二重層及びGPR92/93に共役し得るＧタンパク質のαサブユニットを含んでなる反応系を接触させる工程、
（ｂ）  （ａ）における該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応又は該Ｇタンパク質の細胞刺激活性を測定する工程、
（ｃ）  前記（ｂ）の測定値を、被験物質としてリゾホスファチジン酸、その誘導体及びそれらの薬学上許容される塩から選択される基準物質を用いた場合の測定値と比較する工程、及び
（ｄ）  前記（ｃ）の結果に基づき、前記（ｂ）の測定値が前記（ｃ）の測定値と同等以上である被験物質をGPR92/93作動薬として選択する工程、
を含む、〔１７〕又は〔１８〕に記載のスクリーニング方法；
〔２０〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程：
（ａ）  被験物質の存在下及び非存在下で、リゾホスファチジン酸、その誘導体及びそれらの薬学上許容される塩から選択される基準物質、及びGPR92/93を含む脂質二重層及びGPR92/93に共役し得るＧタンパク質のαサブユニットを含んでなる反応系を接触させる工程、
（ｂ）  （ａ）における該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応又は該Ｇタンパク質の細胞刺激活性を測定し、被験物質存在下における測定値と被験物質非存在下における測定値とを比較する工程、及び
（ｃ）  被験物質存在下における前記（ｂ）の測定値が、被験物質非存在下における前記（ｂ）の測定値よりも小さい被験物質を、GPR92/93拮抗薬として選択する工程、
を含む、〔１７〕又は〔１８〕に記載のスクリーニング方法；
〔２１〕  リゾホスファチジン酸又はその誘導体が、式（１）：【００１２】
【化３】
2006003877.tif 000004
〔式中、Ｒ1は、水素原子、炭素数８〜２２のアシル基又は炭素数８〜２２の1−アルケニル基を表し、
Ｒ2は水素原子、myo−イノシトール−１−イル基、２−アンモニオエチル基又はホスホノ基を表し、
Ｒ3は水素原子又は炭素数２〜２２のアシル基を表し、Ｒ1及びＲ3の少なくとも一方は炭素数８〜２２のアシル基もしくは炭素数８〜２２の1−アルケニル基を表す。〕
で表される化合物である、〔１７〕〜〔２０〕に記載のスクリーニング方法；
〔２２〕  式（１）で表される化合物が、リゾホスファチジン酸、1-Acyl-PAF又はそれらの薬学上許容される塩である、〔２１〕に記載のスクリーニング方法；
〔２３〕  式（１）において、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3が以下の組み合わせを表すことを特徴とする、〔２１〕に記載のインスリン分泌促進薬：
１）Ｒ1がオレオイル基を表し、Ｒ2及びＲ3が水素原子を表す；
２）Ｒ1がパルミトイル基を表し、Ｒ2がアセチル基を表し、Ｒ3が２−アンモニオエチル基を表す；
３）Ｒ1がドコサヘキサエノイル基を表し、Ｒ2及びＲ3が水素原子を表す；
４）Ｒ3がドコサヘキサエノイル基を表し、Ｒ2及びＲ1が水素原子を表す；
５）Ｒ1がステアロイル基を表し、Ｒ3が水素原子を表し、Ｒ2が、myo−イノシトール−１−イル基を表す；
６）Ｒ3がステアロイル基を表し、Ｒ1が水素原子を表し、Ｒ2が、myo−イノシトール−１−イル基を表す；又は
７）Ｒ2がホスホノ基を表し、Ｒ1及びＲ3がオクタノイル基を表す；
〔２４〕  被験物質がGPR92/93作動薬であることを指標として化合物を選択することを含む、インスリン分泌促進薬のスクリーニング方法；
〔２５〕  GPR92/93、又はリガンドが結合し得るそのフラグメントに被験物質を接触させ、該GPR92/93又は該フラグメントに結合する化合物を選択することを特徴とする、〔２４〕に記載の方法；
〔２６〕  GPR92/93を含む脂質二重層及びGPR92/93に共役し得るＧ蛋白質のαサブユニットを含んでなる反応系において、該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応又は該Ｇ蛋白質の細胞刺激活性を、被験物質の存在下と非存在下で比較する工程を含む、〔２４〕に記載の方法；
〔２７〕  反応系が、
(i) GPR92/93をコードするＤＮＡを含む発現ベクターをトランスフェクトした宿主真核生物細胞、(ii) GPR92/93のＣ末端側にGPR92/93に共役し得るＧ蛋白質のαサブユニットが融合したポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトした宿主真核生物細胞、(iii) GPR92/93をコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトした、GPR92/93に共役し得るＧ蛋白質を内因的に発現する宿主動物細胞、又は(iv) GPR92/93及びGPR92/93に共役し得るＧ蛋白質を内因的に発現する動物細胞、それらの細胞のホモジネート又はそれらの細胞由来の膜画分である、〔２６〕に記載のスクリーニング方法；
〔２８〕  以下の（ａ）〜（ｄ）の工程：
（ａ）  被験物質と、GPR92/93を含む脂質二重層及びGPR92/93に共役し得るＧタンパク質のαサブユニットを含んでなる反応系を接触させる工程、
（ｂ）  （ａ）における該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応又は該Ｇタンパク質の細胞刺激活性を測定する工程、及び
（ｃ）  （ｂ）の結果に基づき、細胞刺激活性を有する被験物質をGPR92/93作動薬として選択する工程、
を含む、〔２６〕又は〔２７〕に記載のスクリーニング方法；
〔２９〕  〔１４〕〜〔１９〕のいずれかに記載の方法で、被験物質がGPR92/93作動薬であるか否かを評価することを含む、〔２４〕に記載の方法；
〔３０〕  インスリン分泌促進薬が血糖調節薬である、〔２４〕〜〔２９〕のいずれかに記載のスクリーニング方法；
〔３１〕  インスリン分泌促進薬が耐糖能異常改善薬である、〔２４〕〜〔２９〕のいずれかに記載のスクリーニング方法；
〔３２〕  インスリン分泌促進薬が糖尿病治療薬である、〔２４〕〜〔２９〕のいずれかに記載のスクリーニング方法；
〔３３〕  〔２４〕〜〔２９〕のいずれかに記載の方法により得られるインスリン分泌促進薬；
〔３４〕  血糖調節薬であることを特徴とする、〔３３〕に記載のインスリン分泌促進薬；
〔３５〕  耐糖能異常改善薬であることを特徴とする、〔３３〕に記載のインスリン分泌促進薬；
〔３６〕  生活習慣病治療薬であることを特徴とする、〔３３〕に記載のインスリン分泌促進薬；
〔３７〕  糖尿病治療薬であるであることを特徴とする、〔３３〕に記載のインスリン分泌促進薬；
〔３８〕  GPR92/93拮抗薬を有効成分として含有する、脂肪蓄積抑制薬；
〔３９〕  抗肥満薬であることを特徴とする、〔３８〕に記載の脂肪蓄積抑制薬；
〔４０〕  被験物質がGPR92/93拮抗薬であることを指標として化合物を選択することを含む、脂肪蓄積抑制薬のスクリーニング方法；
〔４１〕  被験物質の存在下又は非存在下で、GPR92/93又はリガンドが結合し得るそのフラグメントに、リゾホスファチジン酸、その誘導体及びそれらの薬学上許容される塩から選択される基準物質を接触させ、基準物質と該GPR92/93又は該フラグメントの結合を阻害する化合物を選択することを特徴とする、〔４０〕に記載の方法；
〔４２〕  被験物質の存在下又は非存在下で、GPR92/93を含む脂質二重層及びGPR92/93に共役し得るＧ蛋白質のαサブユニットを含んでなる反応系にリゾホスファチジン酸、その誘導体及びそれらの薬学上許容される塩から選択される基準物質を接触させ、当該基準物質の該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応又は該Ｇ蛋白質の細胞刺激活性を阻害する化合物を選択することを特徴とする、〔４０〕に記載の方法；
〔４３〕  反応系が、
(i) GPR92/93をコードするＤＮＡを含む発現ベクターをトランスフェクトした宿主真核生物細胞、(ii) GPR92/93のＣ末端側にGPR92/93に共役し得るＧ蛋白質のαサブユニットが融合したポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトした宿主真核生物細胞、(iii) GPR92/93をコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトした、GPR92/93に共役し得るＧ蛋白質を内因的に発現する宿主動物細胞、又は(iv) GPR92/93及びGPR92/93に共役し得るＧ蛋白質を内因的に発現する動物細胞、それらの細胞のホモジネート又はそれらの細胞由来の膜画分である、〔４２〕に記載のスクリーニング方法；
〔４４〕  脂肪蓄積抑制薬が抗肥満薬である、〔４０〕〜〔４３〕のいずれかに記載のスクリーニング方法；
〔４５〕  〔４０〕〜〔４３〕のいずれかに記載の方法により得られる脂肪蓄積抑制薬；
〔４６〕  抗肥満薬であることを特徴とする、〔４５〕に記載の脂肪蓄積抑制薬；
〔４７〕  以下の工程を含むことを特徴とする生体由来脂肪酸誘導体の製造方法：
（ａ）固相抽出樹脂と生体由来サンプルを接触させ、生体由来脂肪酸誘導体および低分子成分を吸着させる工程、及び
（ｂ）10％〜95％の親水性有機溶媒を含む水溶液により、生体由来脂肪酸誘導体含有画分および低分子成分を溶出する工程。
本発明のさらなる特徴及び本発明の利点について、以下により詳細に説明する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、オーファンGタンパク質結合受容体（GPCR）：GPR92/93のアゴニストリガンド、当該リガンドを用いてGPR92/93作動薬もしくは拮抗薬をスクリーニングする方法等を提供することが可能になった。また、本発明のGPR92/93作動薬は、インスリン分泌促進活性を示し、耐糖能異常改善薬、糖尿病治療薬となり得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本明細書において、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984) 〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）、および当該分野における慣用記号に従う。【００１５】
本明細書において、「GPR92/93」とは、GPCRの一種として知られているタンパク質であり、具体的には配列番号２で表されるタンパク質（ヒトGPR92/93）を例示することができる〔Genbank Acc. No. NM_020400；Gene, 275(1), p83-91(2001)を参照〕。
また、本明細書において、GPR92/93には、同族体（ホモログ）および変異体等が包含される。例えば、同族体（ホモログ）としては、ヒトのタンパク質に対応するマウスなど他生物種のタンパク質が例示でき、これらはHomoloGene（http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/HomoloGene/）により同定された遺伝子の塩基配列から演繹的に同定することができる。具体的には、配列番号４もしくは１０で表されるマウスGPR92/93（Genbank Acc. No. XM_355812）を挙げることができる。
また変異体としては、天然に存在するアレル変異体及び天然に存在しない変異体が挙げられ、具体的には（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、GPCRの機能を保持するタンパク質、（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、GPCRの機能を保持するタンパク質、（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、GPCRの機能を保持するタンパク質が挙げられる。【００１６】
ここで、「GPCRの機能を保持する」とは、具体的には配列番号２で表される天然のヒトGPR92/93と同じリガンド−レセプター相互作用を示し、且つ共役するＧαを活性化して該ＧαのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応を促進する活性を有するタンパク質をいう。
また、前記（ａ）における、アミノ酸の「欠失、付加もしくは置換」や前記（ｄ）における「８０％以上の配列同一性」には、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質が細胞内で受けるプロセシング、該蛋白質が由来する生物の種差、個体差、組織間の差異等により天然に生じる変異や、人為的なアミノ酸の変異等が含まれる。前記（ｂ）におけるアミノ酸の「欠失、付加もしくは置換」（以下、総じてアミノ酸の改変と記すこともある。）を人為的に行う場合の手法としては、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードするDNAに対して慣用の部位特異的変異導入を施し、その後このDNAを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Nucleic Acids Res., 12, 9441-9456(1984)）、変異導入用プライマーを用いたPCRによる方法等が挙げられる。前記で改変されるアミノ酸の数については、少なくとも１残基、具体的には1若しくは数個、又はそれ以上である。かかる改変の数は、GPCRの機能を保持することのできる範囲であれば良い。【００１７】
前記（ｂ）における「配列同一性」とは、２つのＤＮＡ又は２つの蛋白質間における配列の同一性及び相同性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のＤＮＡ又は蛋白質は、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような配列同一性に関しては、例えば、Vector NTIを用いて、ClustalWアルゴリズム(Nucleic Acid Res., 22(22):4673-4680(1994)を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、配列解析ソフト、具体的にはVector NTI、GENETYX-MACや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスhttp://www.ddbj.nig.ac.jpにおいて一般的に利用可能である。本発明における配列同一性は、８０％以上であればよいが、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％である。【００１８】
また、前記（ｃ）における「ストリンジェントな条件」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションは、例えば、Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）等に記載される通常の方法に準じて行うことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６ｘSSC（１．５M  NaCl、０．１５M  クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０ｘSSCとする）、50％フォルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、2ｘSSCで５０℃にて洗浄するような条件（Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6）等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度は、例えば、２ｘSSCで５０℃の条件（低ストリンジェンシーな条件）から０．２ｘSSCで５０℃までの条件（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温（低ストリンジェンシーな条件）から６５℃（高ストリンジェンシーな条件）までの温度から選択することができる。また、塩濃度と温度の両方を変えることもできる。
前記（ｃ）における「相補的な塩基配列」とは、GPR92/93をコードするＤＮＡの塩基配列に対して、A:TおよびG:Cといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味するものである。
本明細書において、GPR92/93には、前記GPR92/93をコードするＤＮＡを含む組換え細胞から製造される組換えGPR92/93、それらの機能的フラグメントの全てを包含する意味で使用される。【００１９】
「GPR92/93をコードする塩基配列からなるＤＮＡ」は、前記GPR92/93のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを表し、ヒト及び他の哺乳動物由来のGPR92/93、あるいは該GPR92/93のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加または修飾されたアミノ酸配列からなり、天然GPR92/93と同じリガンド−レセプター相互作用を示し、且つ共役するＧαを活性化して該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応を促進する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであれば特に制限はない。ヒトGPR92/93 ｃＤＮＡのコーディング領域の他、ウシ、ブタ、サル、マウス、ラット等のヒト以外の哺乳動物由来のGPR92/93をコードするＤＮＡ等が例示され、これらは、哺乳動物の膵臓、もしくは腎臓、肺の細胞由来のｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノミックライブラリーから、ヒトGPR92/93のｃＤＮＡクローンをプローブとして単離され得る。また、GPR92/93は、ヒトGPR92/93のｃＤＮＡクローンを基に、部位特異的変異誘発等の人為的処理により一部に変異を導入したものであってもよい。
具体的には、配列番号１で表されるヒト由来のGPR92/93をコードするDNA、配列番号３もしくは９で表されるマウス由来のGPR92/93をコードするDNA等が挙げられる。【００２０】
GPR92/93は、GPR92/93又はそのフラグメントをコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトされた細胞の膜含有画分から、抗GPR92/93抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより単離することができる。あるいは、当該細胞由来のｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノミックライブラリーから、GPR92/93のｃＤＮＡクローンをプローブとして単離されるＤＮＡクローンを適当な発現ベクター中にクローニングし、宿主細胞に導入して発現させ、細胞培養物の膜含有画分から抗GPR92/93抗体や、His-tag、GST-tag等を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製することもできる。また、GFP等の蛍光物質とGPR92/93の融合タンパク質を発現させることにより、GFP陽性細胞、すなわちGPR92/93がトランスフェクトされた細胞のみを選択してスクリーニングに用いることも可能である（Xu et al., Nat. Cell Biol., 2, 261-267 (2000) ）。また、GPR92/93のｃＤＮＡクローンを基に、部位特異的変異誘発等の人為的処理により一部に変異を導入したものであってもよい。しかしながら、リガンド結合ドメインは高度に保存されている必要があるので、このような領域には変異を導入しないことが望ましい。保存的アミノ酸置換は周知であり、当業者はGPR92/93の特性を変化させない範囲で、GPR92/93に適宜変異を導入することができる。【００２１】
「GPR92/93リガンド」とは、特にことわらない限り、後述するリゾホスファチジン酸及びその誘導体だけでなく、アゴニスト（即ち、レセプターの生理的リガンド結合部位に結合して、リガンド様の活性を示す物質）やアンタゴニスト（レセプターの生理的リガンド結合部位に結合するが、リガンド様の活性を示さない物質）及びインバースアゴニスト（レセプターのいずれかの部位に結合してそのコンフォメーションを変化させ、レセプターを不活性化する物質）をも包含するものとする。【００２２】
本明細書において、「GPR92/93作動薬」とは、GPR92/93に結合して該レセプターの活性を促進する物質の総称として用いられ、後述するリゾホスファチジン酸に代表されるリゾホスファチジン酸誘導体等の他、GPR92/93に対するアゴニスト活性を有するあらゆる化合物を包含する。
本明細書において、「GPR92/93拮抗薬」とは、GPR92/93に結合して該レセプターのシグナル伝達活性を阻害する物質の総称として用いられ、前記のGPR92/93アンタゴニスト及びGPR92/93インバースアゴニストに相当する。【００２３】
（I）GPR92/93作動薬
本発明の第一の態様は、リゾホスファチジン酸、その誘導体又はそれらの薬学上許容される塩を有効成分とするGPR92/93作動薬、及びGPR92/93作動薬からなるインスリン分泌促進薬等に関する。
本明細書において、リゾホスファチジン酸（以下LPAと略する場合がある）とは、１−アシル−sn−グリセロール−３−ホスフェート（1-Acyl-sn-glycerol-3-phosphate）を表す。ここで「アシル」は、炭素数１４〜２２であり、０〜６の二重結合を有する直鎖のアシル基を表す。具体的には、式（２）：【００２４】
【化４】
2006003877.tif 000005
で表されるLPA（18:1）、式（３）：【００２５】
【化５】
2006003877.tif 000006
で表されるLPA（22:6）が挙げられる。【００２６】
本明細書において、リゾホスファチジン酸誘導体（LPA誘導体）とは、LPAにおいて、以下の(i)〜(vii)の１又は複数の改変が施された化合物等が挙げられる：
(i)１位アシルオキシ基を水酸基、メルカプト基、アミノ基、炭素数１〜４のアルコキシ基、炭素数１〜４のアルキルチオ基、炭素数１〜４のアルキルアミノ基又は炭素数１〜４のジアルキルアミノ基に変換する改変、
(ii)1位炭素原子を、カルボニル基もしくはチオカルボニル基に変換する改変、
(iii)1位アシルオキシ基におけるエステルをアミドもしくはチオエステルに変換する改変、
(iv)2位水酸基をアシルオキシ基、メルカプト基、アミノ基、炭素数１〜４のアルコキシ基、炭素数１〜４のアルキルチオ基、炭素数１〜４のアルキルアミノ基又は炭素数１〜４のジアルキルアミノ基に変換する改変、
(v)2位水酸基がアシル化された化合物において、エステルをアミドもしくはチオエステルに変換する改変、
(vi)3位リン酸基とコリン、リン酸もしくはイノシトールを縮合させる改変、又は
(vii)1位アシルオキシ基におけるエステル結合部分が、ビニルエーテル結合に変換されたプラズマローゲン（plasmalogen）への改変。【００２７】
LPA又はLPA誘導体として具体的には、以下の式（１）：【００２８】
【化６】
2006003877.tif 000007
〔式中、Ｒ1は、水素原子、炭素数８〜２２のアシル基又は炭素数８〜２２の1−アルケニル基を表し、
Ｒ2は水素原子、myo−イノシトール−１−イル基、２−アンモニオエチル基又はホスホノ基を表し、
Ｒ3は水素原子又は炭素数２〜２２のアシル基を表し、Ｒ1及びＲ3の少なくとも一方は炭素数８〜２２のアシル基もしくは炭素数８〜２２の1−アルケニル基を表す。〕で表される化合物が挙げられる。
ここで炭素数８〜２２のアシル基としては０〜６の二重結合を有していてもよい直鎖のアシル基が挙げられる。炭素数２〜２２のアシル基としては、０〜６の二重結合を有していてもよい直鎖のアシル基が挙げられる。
また、炭素数８〜２２の１−アルケニル基としては、前記アシル基のエステル部分構造が、ビニルエーテルに改変された基が挙げられる。即ち、Ｒ1が1−アルケニル基を表す式（１）の化合物としては、Plasmalogenが挙げられる。
式（１）で表される化合物としては、上述のLPAの他、式（５）：【００２９】
【化７】
2006003877.tif 000008
で表される１−O-パルミトイル−２−O-アセチル−ｓｎ−グリセリル−３−ホスホリルコリン（1-O-palmitoyl-2-O-acetyl-sn-glyceryl-3-phosphorylcholine;1-Acyl-PAF)、
式（６）：【００３０】
【化８】
2006003877.tif 000009
で表される1-リゾホスファチジル-sn-グリセロ-3-ホスホノ-(1-D-myo-イノシトール)（以下LPI（18：0）と略する場合がある）、式（７）：【００３１】
【化９】
2006003877.tif 000010
で表されるジアシルグリセロールピロホスフェート〔Diacylglycerol-pyrophosphate；DGPP(8:0)と称する場合がある〕、ホスファチジン酸（Phosphatidic acid；PA）、又はリゾホスファチジルコリン（Lysophosphatidylcholine；LPC）等が挙げられる。ここで、ＰＡとしては、1,2-ジ（シス−９−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロール  ３−ホスフェート  ナトリウム塩（1,2-Di(cis-9-octadecenoyl)-sn-glycerol 3-phosphate sodium salt）等が挙げられる。また、LPCとしては、市販ウシ由来LPC〔ウシ脳L-α−リゾホスファチジルコリン〕が挙げられる。
また、式（１）で表される化合物として、リゾホスファチジルコリン  プラズマロゲン（Lysophosphatidylcholine plasmalogen；例えば市販ウシ心臓L-α−リゾホスファチジルコリン  プラズマロゲン）が挙げられる。
更に、上記式（５）〜式（７）で表される化合物において、グリセロール骨格の1位アシルオキシ基、2位水酸基もしくはアシルオキシ基又は3位リン酸基が改変された化合物もまたLPA誘導体に含まれ、改変としては前記の(i)〜(vii)が挙げられる。
また、LPAもしくはLPIにおいて1位アシル基が2位水酸基に転移した2位アシルオキシ体もまた、本発明におけるLPA又はLPIの範疇である。【００３２】
又は以下の式（４）：【００３３】
【化１０】
2006003877.tif 000011
で表されるＮ−パルミトイル−Ｌ−セリンホスホリックアシッド（N-Palmitoyl-L-serine-phosphoric acid; L-NASPA）も又、本発明のGPR92/93作動薬に含まれる。
本発明のLPA、LPA誘導体及びL-NASPAは、薬学上許容される塩を形成していてもよく、具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩もしくはセシウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩もしくはマグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、亜鉛塩等の無機金属塩、トリエチルアミン塩、トリエタノールアミン塩、トリヒドロキシメチルアミノメタン塩もしくはピリジニウム塩等の有機塩、アンモニウム塩等が挙げられる。【００３４】
本発明において、GPR92/93作動薬として具体的には、上記のLPA、LPA誘導体又はL-NASPAが挙げられる。すなわち上記LPA、LPA誘導体又はL-NASPAは、GPR92/93に対するアゴニスト活性を有する化合物である。ここでGPR92/93に対するアゴニスト活性とは、後述するGPR92/93に結合することによってGPCRの機能を生じさせる活性を表す。【００３５】
本明細書実施例に示すとおり、GPR92/93作動薬は膵臓ランゲルハンス氏島細胞においてインスリン分泌促進活性を示し、耐糖能異常改善薬、糖尿病治療薬等として有効である。【００３６】
本発明のGPR92/93作動薬、好ましくはLPA、LPA誘導体、L-NASPAもしくはそれらの薬学上許容される塩、又は後述する本発明のスクリーニング方法により得られるGPR92/93作動薬もしくは拮抗薬は、医薬上許容される担体とともに経口的もしくは非経口的投与に適した剤形に製剤化される。医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウムーグリコールースターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。【００３７】
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量のGPR92/93作動薬を溶解させた液剤、有効量のGPR92/93作動薬を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量のGPR92/93作動薬を懸濁させた懸濁液剤、有効量のGPR92/93作動薬を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。ここで「有効量」とは、GPR92/93作動薬を耐糖能異常患者、糖尿病患者または他の生活習慣病患者の治療のために使用する場合にそれぞれの疾患を改善させるのに十分な量をいう。【００３８】
非経口的な投与（例えば、静脈内注射、動脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。あるいは、コラーゲン等の生体親和性の材料を用いて、徐放性製剤とすることもできる。【００３９】
当該GPR92/93作動薬の製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、GPR92/93作動薬、および医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。【００４０】
GPR92/93作動薬を有効成分とする本発明の製剤の投与量は、有効成分の種類、投与経路、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、GPR92/93作動薬を、例えば、成人１日あたり約０．０１〜約１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．１〜約５００ｍｇ／ｋｇ投与することができる。【００４１】
（ＩＩ）スクリーニング方法
本発明のGPR92/93作動薬はまた、以下に述べるとおり、GPR92/93リガンド、すなわちGPR92/93作動薬もしくはGPR92/93拮抗薬をスクリーニングするためのスクリーニングツールとして有用である。
すなわち本発明の第２の態様は、GPR92/93リガンド、すなわちGPR92/93作動薬又は拮抗薬のスクリーニング方法に関する。
本発明はまた、GPR92/93作動薬のスクリーニング系及びそれを用いた当該リガンドのスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法における被験物質としては、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。被験物質は好ましくは分子量２００〜２０００の化合物であり、更に好ましくは分子量３００〜８００の化合物である。例えば、被験物質として上記LPA誘導体などの脂肪酸誘導体を用いることにより、効率良くGPR92/93作動薬を評価することができる。【００４２】
(1)  結合活性の測定によるスクリーニング
本発明のスクリーニング方法は、LPA、LPA誘導体、L-NASPA及びこれらの薬学上許容される塩から選択される基準物質のGPR92/93に対する結合活性を指標として、当該基準物質よりも結合活性が大きい被験物質をGPR92/93リガンドとして選択することを特徴とする方法である。  すなわち、本発明のスクリーニング方法は、GPR92/93又はリガンドが結合し得るそのフラグメント（以下これらを併せて「GPR92/93等」と称する場合がある）に、被験物質及び／又はリゾホスファチジン酸、その誘導体及びそれらの薬学上許容される塩から選択される基準物質を接触させ、該GPR92/93又はリガンドが結合し得るそのフラグメントに対する結合活性が、前記基準物質よりも高い化合物を選択することを含む。
具体的には、以下の（ａ）〜（ｄ）の工程：
（ａ）  被験物質と、GPR92/93又はリガンドが結合し得るそのフラグメントを接触させる工程、
（ｂ）  （ａ）における被験物質とGPR92/93又はリガンドが結合し得るそのフラグメントに対する結合活性を測定する工程、
（ｃ）  前記（ｂ）の測定値を、被験物質として基準物質を用いた場合の測定値と比較する工程、及び
（ｄ）  前記（ｃ）の結果に基づき、前記（ｂ）の測定値が前記（ｃ）の測定値と同等以上である被験物質をGPR92/93リガンドとして選択する工程、
を含む、スクリーニング方法が挙げられる。
この場合、被験物質とGPR92/93等との結合活性は、例えば、GPR92/93等の細胞膜画分をチップ上に固定し、該チップ上に被験物質溶液をロードして、表面プラズモン共鳴法により被験物質の膜への結合及び解離を測定し、結合及び解離の速度あるいは結合量から、被験物質とGPR92/93等との親和性を算出することにより導かれる。  【００４３】
また、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程：
（ａ）  被験物質の存在下及び非存在下で、基準物質、及びGPR92/93又はリガンドが結合し得るそのフラグメントを接触させる工程、
（ｂ）  （ａ）における基準物質とGPR92/93又はリガンドが結合し得るそのフラグメントに対する結合活性を測定し、被験物質存在下における測定値と被験物質非存在下における測定値とを比較する工程、及び
（ｃ）  被験物質存在下における前記（ｂ）の測定値が、被験物質非存在下における前記（ｂ）の測定値よりも大きい被験物質を、GPR92/93リガンドとして選択する工程、
を含む、スクリーニング方法が挙げられる。
ここで用いられる例えばLPA、L-NASPA、1-Acyl-PAF、LPI、DGPP(8:0)、LPC、LPC  plasmalogen等の基準物質は下記に述べるように適宜放射性同位元素等で標識することができ、標識された化合物もLPA又はLPA誘導体の概念に含まれる。
上記の方法で選択されるGPR92/93リガンドが、GPR92/93作動薬であるか、GPR92/93拮抗薬であるかについては、以下に述べるＧ蛋白質を用いるスクリーニング方法等により確認することができる。【００４４】
上記のいずれの態様においても、GPR92/93又はそのフラグメントは、それらの発現細胞、該細胞の細胞膜画分、あるいはアフィニティーカラムに結合した形態で提供され得る。GPR92/93の発現細胞としては、GPR92/93又はそのフラグメントをコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトされた細胞等が挙げられる。また、アフィニティーカラムとしては、抗GPR92/93抗体カラム、リガンドを用いたカラム、また、GPR92/93が組換えタンパク質として提供される場合、HisタグやGSTタグと特異的親和性を有する金属キレートもしくはグルタチオンカラムを用いることができる。【００４５】
GPR92/93またはそのフラグメントとリガンドとの結合活性の検出する方法としては、例えば、リガンド量を検出する方法、またはリガンドを標識して、GPR92/93またはそのフラグメントに結合した標識量を測定する方法が挙げられる。
リガンドの標識方法としては、3H、14C、32Pおよび33P等の放射性同位元素で標識する方法等が挙げられる。具体的には、脂肪酸部分の水素原子が3HでラベルされたLPA誘導体またはリン原子が32PでラベルされたLPA誘導体等を用いることができ、例えば、32P-labelled LPA、及び1-オレオイル［オレオイル-9,10-3H］LPA（1-Oleoyl[oleoyl-9,10-3H]LPA；NEN Life Science Products市販品；Songzhu An,et al  J Biol Chem, Vol. 273, Issue 14, 7906-7910, April 3, 1998）を用いることができる。
また、アセチル基の水素原子がトリチウムでラベルされた1-Acyl-PAF（Registry No.:163005-42-3の化合物）や、パルミトイル基の水素原子がトリチウムでラベルされた1-Acyl-PAF（Registry No.:112602-69-4の化合物）、パルミトイル基のカルボニル基の炭素原子が14Cでラベルされた1-Acyl-PAF （Registry No.:112015-19-7の化合物）を挙げることができる［Methods in Enzymology (1987), 141(Cell. Regul., Pt. B), 301-13を参照］。【００４６】
(2)  シグナル伝達の測定によるスクリーニング
GPR92/93は、ある種の三量体Ｇ蛋白質と共役して細胞内にシグナルを伝達する。従って、本発明はまた、GPR92/93を含む脂質二重層と、GPR92/93と共役するＧ蛋白質（特にＧαサブユニット）とを用いたGPR92/93リガンドのスクリーニング方法を提供する。すなわち、本発明はGPR92/93を含む脂質二重層及びGPR92/93に共役し得るＧ蛋白質のαサブユニットを含んでなる反応系において、被験物質及び／又はリゾホスファチジン酸、その誘導体、L-NASPA及びそれらの薬学上許容される塩から選択される基準物質を接触させ、該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応又は該Ｇ蛋白質の細胞刺激活性が、前記基準物質よりも高い化合物を選択することを含む、GPR92/93リガンドのスクリーニング方法を包含する。
具体的には、以下の（ａ）〜（ｄ）の工程：
（ａ）  被験物質と、GPR92/93を含む脂質二重層及びGPR92/93に共役し得るＧタンパク質のαサブユニットを含んでなる反応系を接触させる工程、
（ｂ）  （ａ）における該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応又は該Ｇタンパク質の細胞刺激活性を測定する工程、
（ｃ）  前記（ｂ）の測定値を、被験物質として基準物質を用いた場合の測定値と比較する工程、及び
（ｄ）  前記（ｃ）の結果に基づき、前記（ｂ）の測定値が前記（ｃ）の測定値と同等以上である被験物質をGPR92/93作動薬として選択する工程、
を含む、GPR92/93作動薬のスクリーニング方法が挙げられる。
また、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程：
（ａ）  被験物質の存在下及び非存在下で、基準物質、及びGPR92/93を含む脂質二重層及びGPR92/93に共役し得るＧタンパク質のαサブユニットを含んでなる反応系を接触させる工程、
（ｂ）  （ａ）における該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応又は該Ｇタンパク質の細胞刺激活性を測定し、被験物質存在下における測定値と被験物質非存在下における測定値とを比較する工程、及び
（ｃ）  被験物質存在下における前記（ｂ）の測定値が、被験物質非存在下における前記（ｂ）の測定値よりも小さい被験物質を、GPR92/93拮抗薬として選択する工程、
を含む、GPR92/93拮抗薬のスクリーニング方法が挙げられる。【００４７】
上記において、「GPR92/93を含む脂質二重層及びGPR92/93に共役し得るＧ蛋白質のαサブユニットを含んでなる反応系」として、具体的には、(i) GPR92/93をコードするＤＮＡを含む発現ベクターをトランスフェクトした宿主真核生物細胞、(ii) GPR92/93のＣ末端側にGPR92/93に共役し得るＧ蛋白質のαサブユニットが融合したポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトした宿主真核生物細胞、(iii) GPR92/93をコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトした、GPR92/93に共役し得るＧ蛋白質を内因的に発現する宿主動物細胞、又は(iv) GPR92/93及びGPR92/93に共役し得るＧ蛋白質を内因的に発現する動物細胞、それらの細胞のホモジネート又はそれらの細胞由来の膜画分等が挙げられる。【００４８】
一般に、ＧＰＣＲ作動薬のスクリーニングは、ＧαにおけるＧＴＰ・ＧＤＰ交換反応または共役するＧ蛋白質の細胞刺激活性を指標として行われる。Ｇ蛋白質の細胞刺激活性を指標とする場合、共役させるＧαの態様に応じて、エフェクターの選択や活性測定方法等の具体的な手順が決定されるが、通常、アデニル酸シクラーゼと相互作用する領域を含むＧα（具体的にはＧｉファミリー又はＧｓファミリーに属するＧαのエフェクター相互作用領域を含む）を用いる場合には例えばｃＡＭＰ量を測定することにより、ホスホリパーゼＣβと相互作用する領域を含むＧα（具体的にはＧｑファミリーに属するＧαのエフェクター相互作用領域を含む）を用いる場合には例えば細胞内カルシウムイオンの量を測定することにより、ＧＰＣＲ作動薬をスクリーニングすることができる。
本発明実施例が示すとおり、GPR92/93のＧαはＧｓファミリーに属すると考えられる。【００４９】
また、Ｇαの供給源として該Ｇαを含む三量体Ｇ蛋白質（Ｇαβγ）を内因的に発現する動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、Ｌ１．２細胞等）を用いる場合、GPR92/93によって活性化されたＧαβγはＧαとＧβγに解離するが、遊離のＧβγはホスホリパーゼＣβに相互作用して細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させ得るので、共役するＧαのファミリーに関係なく細胞内カルシウムイオンを指標にしてリガンドスクリーニングを行うことも可能である。【００５０】
本発明のスクリーニングで用いられるGPR92/93は、GPR92/93又はそのフラグメントをコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトされた細胞の膜含有画分から、抗GPR92/93抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより単離することができる。あるいは、当該細胞由来のｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノミックライブラリーから、GPR92/93のｃＤＮＡクローンをプローブとして単離されるＤＮＡクローンを適当な発現ベクター中にクローニングし、宿主細胞に導入して発現させ、細胞培養物の膜含有画分から抗GPR92/93抗体や、His-tag、GST-tag等を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製することもできる。また、GFP等の蛍光物質とGPR92/93の融合蛋白質を発現させることにより、GFP陽性細胞、すなわちGPR92/93がトランスフェクトされた細胞のみを選択してスクリーニングに用いることも可能である（Xu et al., Nat. Cell Biol., 2, 261-267 (2000) ）。また、GPR92/93のｃＤＮＡクローンを基に、部位特異的変異誘発等の人為的処理により一部に変異を導入したものであってもよい。しかしながら、リガンド結合ドメインは高度に保存されている必要があるので、このような領域には変異を導入しないことが望ましい。保存的アミノ酸置換は周知であり、当業者はGPR92/93の特性を変化させない範囲で、GPR92/93に適宜変異を導入することができる。【００５１】
GPR92/93を保持する脂質二重層膜の由来は、当該レセプターが本来の立体構造をとることができる限り特に制限されないが、好ましくはヒト、ウシ、ブタ、サル、マウス、ラット等の哺乳動物細胞の細胞膜を含有する画分、例えば、無傷細胞、細胞ホモジネート、あるいは該ホモジネートから遠心分離等により分画される細胞膜画分が挙げられる。また、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、コレステロール等の各種脂質を適当な比率、好ましくは哺乳動物細胞の細胞膜におけるそれに近い比率で混合した溶液から常法により調製される人工脂質二重膜もまた、本発明の一実施態様において好ましく使用され得る。【００５２】
GPR92/93と共役するＧαは、少なくとも該ＧαのＧＰＣＲとの結合に関与する領域及び任意のＧαのグアニンヌクレオチドとの結合に関与する領域を有することが必要である。具体的には、GPR92/93と共役するＧαはＧｓファミリーに属する（Ｇｓα）と考えられるので、用いるＧαはＧｓαのＧＰＣＲ結合領域を少なくとも有し、Ｇｓαのグアニンヌクレオチド結合領域もしくは他のファミリーに属するＧα由来のグアニンヌクレオチド結合領域を有するものである。ＧαのＸ線結晶構造解析の結果等から、ＧＰＣＲとの結合にはＣ末端の約５アミノ酸程度の配列が重要であり、一方、グアニンヌクレオチド結合領域は、ｒａｓ蛋白質のヌクレオチド結合部位と相同な領域（Ｎ末端側から、Ｐボックス、Ｇ’ボックス、Ｇボックス、Ｇ”ボックスと呼ばれるアミノ酸モチーフ、並びに高度にヘリックス化したドメイン内のαＥヘリックスの先頭及びαＦヘリックスなど）であることが明らかになっている。
一方ＧＰＣＲと共役するＧαがＧｉファミリーに属する場合（Ｇｉα）や、Ｇｑファミリーに属する場合（Ｇｑα）も同様に、用いるＧαはそれぞれＧｉαもしくはＧｑαのＧＰＣＲ結合領域を少なくとも有し、対応するファミリーに属するＧαのグアニンヌクレオチド結合領域もしくは他のファミリーに属するＧα由来のグアニンヌクレオチド結合領域を有するものである。【００５３】
GPR92/93に対する生理的リガンド又はアゴニストが該レセプターに結合すると、該レセプターのＧα活性化ドメインとＧαのＧＰＣＲ結合領域とが相互作用してＧαのコンフォメーション変化を生じ、グアニンヌクレオチド結合領域からＧＤＰが解離して速やかにＧＴＰを結合する。一方、インバースアゴニストが結合すると、レセプターのコンフォメーション変化によりＧα活性化ドメインが不活性化されるので、活性化型のＧα−ＧＴＰレベルが減少する。ここで、ＧＴＰの代わりに35Ｓ標識したＧＴＰγＳなどのＧαのＧＴＰａｓｅ活性によって加水分解を受けないＧＴＰアナログを系に添加しておけば、被験物質の存在下と非存在下での膜に結合した放射活性を測定・比較することにより、GPR92/93のアゴニスト又はインバースアゴニストをスクリーニングすることができる。即ち、被験物質の存在下で放射活性が増加すれば、該被験物質はアゴニストであり、放射活性が減少すればインバースアゴニストである。35Ｓ標識したＧＴＰγＳ（ＧＴＰ［γ35Ｓ］）を用いる方法については、Heise et al., Molecular Pharmacology, 60, 1173-1180 (2001)、又はIm et al., Molecular Pharmacology, 57, 753-759 (2000)に記載されている。
尚、LPA、その誘導体等の生理活性リガンドを共存させた系で、被験物質の存在下と非存在下での膜に結合した放射活性を測定・比較することにより、GPR92/93のアンタゴニストをスクリーニングすることができる。即ち、被験物質の存在下で、被験物質の非存在下よりも放射活性が減少すれば、該被験物質はアンタゴニストである。【００５４】
あるいは、ＧαへのＧＴＰアナログの結合を、表面プラズモン共鳴法等を用いてモニタリングすることによってもスクリーニングが可能である。【００５５】
前述の細胞刺激活性は、共役するＧαのエフェクターへの作用を指標として測定することもできる。この場合、本発明のスクリーニング系は、GPR92/93に加えて、さらにエフェクターを含む脂質二重層膜を構成要素として含む必要がある。また、共役するＧαは該エフェクターと相互作用するための領域をさらに含む必要がある。当該領域はそのＧα本来のエフェクター相互作用領域であってもよいし、異なるファミリーに属するＧαのエフェクター相互作用領域であってもよい。例えばＧｓαに対しては異なるファミリーに属するＧαとしてＧｑα、Ｇｉα、Ｇ１２α等が挙げられる。異なるファミリーに属するＧα（例えばＧｑα）のエフェクター相互作用領域を含むＧα（例えばＧｓα）キメラの最も簡便な例としては、ＧｑαのＣ末端の約５アミノ酸程度を、ＧｓαのＣ末端配列で置換したもの（Ｇｑｓα）が挙げられる。【００５６】
GPR92/93と共役するＧαがＧｓαのエフェクター相互作用領域を含む場合、エフェクターとしてアデニル酸シクラーゼを含む脂質二重層膜が用いられる。一方、共役ＧαがＧｑαのエフェクター相互作用領域を含む場合は、エフェクターとしてホスホリパーゼＣβを含む脂質二重層膜を用いる必要がある。
尚、共役ＧαがＧｓαのエフェクター相互作用領域を含む場合には、エフェクターとしてアデニル酸シクラーゼを含む脂質二重層膜が用いられ、Ｇｉαの場合とは逆に、アデニル酸シクラーゼ活性の促進作用を指標としてリガンド活性が評価される。【００５７】
エフェクターとしてアデニル酸シクラーゼ（以下、ＡＣともいう）を含むスクリーニング系（即ち、ＧαがＧｓαもしくはＧｉαであるか又はＧｓαもしくはＧｉαのエフェクター相互作用領域を含むキメラ蛋白質（キメラＧｓαもしくはキメラＧｉα）の場合）においては、Ｇαのエフェクターへの作用は、ＡＣ活性を直接測定することにより評価することができる。ＡＣ活性の測定には公知のいかなる手法を用いてもよく、例えば、ＡＣを含む膜画分にＡＴＰを添加し、生成するｃＡＭＰ量を、抗ｃＡＭＰ抗体を用いてＲＩ（125Ｉ）、酵素（アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ等）、蛍光物質（ＦＩＴＣ、ローダミン等）等で標識したｃＡＭＰとの競合イムノアッセイにより測定する方法や、ＡＣを含む膜画分に［α-32Ｐ］ＡＴＰを添加し、生成する［32Ｐ］ｃＡＭＰをアルミナカラム等で分離後、その放射活性を測定する方法が挙げられるが、これに限定されない。ＧαがＧｓαの場合、被験物質の存在下及び非存在下でＡＣ活性を測定・比較し、被験物質存在下でＡＣ活性が減少すれば被験物質はGPR92/93のインバースアゴニストであり、活性が増加すればアゴニストである。また、LPA等の生理活性リガンドを共存させた系で、被験物質の存在下及び非存在下でＡＣ活性を測定・比較し、被験物質存在下で被験物質非存在下よりもＡＣ活性が減少すれば被験試料はGPR92/93のアンタゴニストである。
一方、ＧαがＧｉαの場合、被験物質の存在下及び非存在下でＡＣ活性を測定・比較し、被験物質存在下でＡＣ活性が増加すれば被験物質はGPR92/93のインバースアゴニストであり、活性が減少すればアゴニストである。また、LPA等の生理活性リガンドを共存させた系で、被験物質の存在下及び非存在下でＡＣ活性を測定・比較し、被験物質存在下で被験物質非存在下よりもＡＣ活性が増加すれば被験試料はGPR92/93のアンタゴニストである。【００５８】
スクリーニング系として無傷真核生物細胞を用いる場合は、ＧαのＡＣへの作用は、細胞内のｃＡＭＰ量を測定するか、あるいは細胞を［3Ｈ］アデニンで標識し、生成した［3Ｈ］ｃＡＭＰの放射活性を測定することによっても評価することができる。細胞内ｃＡＭＰ量は、被験物質の存在下及び非存在下で細胞を適当な時間インキュベートした後、細胞を破砕して得られる抽出液について、上記の競合イムノアッセイを実施することにより測定することができるが、公知の他のいかなる方法も使用することができる。【００５９】
別の態様として、ｃＡＭＰ量をｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）の制御下にあるリポーター遺伝子の発現量を測定することにより、評価する方法もある。ここで使用される発現ベクターについては後に詳述するが、概説すると、ＣＲＥを含むプロモーターの下流にリポーター蛋白質をコードするＤＮＡを連結した発現カセットを含むベクターを導入された動物細胞を、被験物質の存在下及び非存在下で適当な時間培養し、細胞を破砕して得られた抽出液におけるリポーター遺伝子の発現を公知の手法を用いて測定・比較することにより、細胞内ｃＡＭＰ量を評価するというものである。【００６０】
従って、ＧαがＧｓαの場合、被験物質の存在下で細胞内ｃＡＭＰ量（もしくはＣＲＥ制御下にあるリポーター遺伝子の発現量）が減少すれば、該被験物質はGPR92/93のインバースアゴニストであり、増加すればアゴニストである。また、LPA、その誘導体等の生理活性リガンドを共存させた系で、被験物質の存在下と非存在下でのｃＡＭＰ量を測定・比較することにより、GPR92/93のアンタゴニストをスクリーニングすることができる。即ち、被験物質の存在下で被験物質の非存在下よりもｃＡＭＰ量が減少すれば該被験物質はアンタゴニストである。
一方、ＧαがＧｉαの場合、被験物質の存在下で細胞内ｃＡＭＰ（もしくはＣＲＥ制御下にあるリポーター遺伝子の発現量）が増加すれば、該被験物質はGPR92/93のインバースアゴニストであり、減少すればアゴニストである。また、LPA等の生理活性リガンドを共存させた系で、被験物質の存在下と非存在下でのｃＡＭＰ量を測定・比較することにより、GPR92/93のアンタゴニストをスクリーニングすることができる。即ち、被験物質の存在下で被験物質の非存在下よりもｃＡＭＰ量が増加すれば該被験物質はアンタゴニストである。【００６１】
一方、エフェクターとしてホスホリパーゼＣβ（以下、ＰＬＣβともいう）を含むスクリーニング系（即ち、ＧαがＧｑαであるか又はＧｑαのエフェクター相互作用領域を含むキメラ蛋白質（キメラＧｑα）の場合）においては、該Ｇｑα又はキメラＧｑαのエフェクターへの作用は、ＰＬＣβ活性を直接測定することにより評価することができる。ＰＬＣβ活性は、例えば、3Ｈ標識したホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸をＰＬＣβ含有膜画分に添加し、生成するイノシトールリン酸量を、公知の手法を用いて測定することにより評価することができる。被験物質の存在下及び非存在下でＰＬＣβ活性を測定・比較し、被験物質存在下でＰＬＣβ活性が増加すれば該被験物質はGPR92/93のアゴニストであり、活性が減少すればインバースアゴニストである。また、LPA等の生理活性リガンドを共存させた系で、被験物質の存在下と非存在下でのＰＬＣβ活性を測定・比較することにより、GPR92/93のアンタゴニストをスクリーニングすることができる。即ち、被験物質の存在下で被験物質の非存在下よりもＰＬＣβ活性が減少すれば該被験物質はアンタゴニストである。【００６２】
スクリーニング系として無傷真核生物細胞を用いる場合は、Ｇｑα又はキメラＧｑαのＰＬＣβへの作用は、細胞に［3Ｈ］イノシトールを添加し、生成した［3Ｈ］イノシトールリン酸の放射活性を測定したり、細胞内のＣａ2+量を測定したりすることによっても評価することができる。細胞内Ｃａ2+量は、被験物質の存在下及び非存在下で細胞を適当な時間インキュベートした後、蛍光プローブ（fura-2、indo-1、fluor-3、Calcium-Green I等）を用いて分光学的に測定するか、カルシウム感受性発光蛋白質であるエクオリン等を用いて測定することができるが、公知の他のいかなる方法を使用してもよい。蛍光プローブを用いた分光学的測定に適した装置として、FLIPR（Molecular Devices社）システムが挙げられる。【００６３】
別の態様として、Ｃａ2+によりアップレギュレートされるＴＰＡ（12−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−13−アセテート）応答エレメント（ＴＲＥ）の制御下にあるリポーター遺伝子の発現量を測定することにより、Ｃａ2+量を評価する方法もある。ここで使用される発現ベクターについては後に詳述するが、概説すると、ＴＲＥを含むプロモーターの下流にリポーター蛋白質をコードするＤＮＡを連結した発現カセットを含むベクターを導入された真核生物細胞を、被験物質の存在下及び非存在下で適当な時間培養し、細胞を破砕して得られた抽出液におけるリポーター遺伝子の発現を公知の手法を用いて測定・比較することにより、細胞内Ｃａ2+量を評価するというものである。【００６４】
従って、被験物質の存在下で細胞内Ｃａ2+量（もしくはＴＲＥ制御下にあるリポーター遺伝子の発現量）が増加すれば、該被験物質はGPR92/93のアゴニストであり、減少すればインバースアゴニストである。また、LPA等の生理活性リガンドを共存させた系で、被験物質の存在下と非存在下でのＣａ2+量（もしくはＴＲＥ制御下にあるリポーター遺伝子の発現量）を測定・比較することにより、GPR92/93のアンタゴニストをスクリーニングすることができる。即ち、被験物質の存在下で被験物質の非存在下よりもＣａ2+量（もしくはＴＲＥ制御下にあるリポーター遺伝子の発現量）が減少すれば該被験物質はアンタゴニストである。【００６５】
上記のGPR92/93と共役Ｇαとを用いたGPR92/93リガンドのスクリーニング方法を、GPR92/93に対するリガンド、例えば、LPAの共存下で行えば、さらにGPR92/93に対するニュートラルアンタゴニストを容易に選抜することができる。【００６６】
また、別の態様として、GPR92/93依存的な種々の生理作用を指標として、GPR92/93リガンドをスクリーニングすることも可能である。該生理作用としては、MAPキナーゼの一種であるERKの活性化が挙げられる。具体的には、GPR92/93の存在下に、被験物質がERKのリン酸化を促進するか否かを、リン酸化ERK量をウェスタンブロッティング等で検出することによって測定する方法（Kabarowski et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97, 12109-12114 (2000) ）が挙げられる。【００６７】
また、GPR92/93依存的なDNA合成促進活性（細胞増殖促進活性）を測定することによって、GPR92/93リガンドをスクリーニングする方法が挙げられる。また、GPR92/93依存的なDNA合成抑制活性（細胞増殖抑制活性）を測定することによって、GPR92/93リガンドをスクリーニングする方法が挙げられる。
具体的には、GPR92/93の存在下に、[3H]チミジン取り込み量、もしくはMTT（(3-4、5-dimethylthazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）の還元反応を測定することができる（J. Biol. Chem., 276(44), p41325-p41335（2001））。【００６８】
また、血清応答エレメント（Serum-response element; SRE）の制御下にあるリポーター遺伝子の発現量を測定することにより、G蛋白質の細胞刺激活性を評価する方法もある（An et al., J. Biol., Chem., 273,7906-7910, (1999); An et al., Mol. Pharmacol., 55, 787-794 (1999)）。ここで使用される発現ベクターについては後に詳述するが、概説すると、SREを含むプロモーターの下流にリポーター蛋白質をコードするDNAを連結した発現カセットを含むベクターを導入された真核生物細胞を、被験物質の存在下及び非存在下で適当な時間培養し、細胞を破砕して得られる抽出液におけるリポーター遺伝子の発現を公知の方法を用いて測定・比較することにより、細胞内Ca2+量を評価するというものである。従って、SRE制御下にあるリポーター遺伝子の量が増加すれば、該被験物質はGPR92/93のアゴニストであり、減少すればインバースアゴニストである。また、LPA等の生理活性リガンドを共存させた系で、被験物質の存在下と非存在下でのＣａ2+量（もしくはＳＲＥ制御下にあるリポーター遺伝子の発現量）を測定・比較することにより、GPR92/93のアンタゴニストをスクリーニングすることができる。即ち、被験物質の存在下で被験物質の非存在下よりもＣａ2+量（もしくはＳＲＥ制御下にあるリポーター遺伝子の発現量）が減少すれば該被験物質はアンタゴニストである。【００６９】
本発明のスクリーニング法のために提供される、GPR92/93を含む脂質二重層膜、及びGPR92/93と共役するＧαを構成要素として含有するスクリーニング系の好ましい一実施態様は、GPR92/93をコードするＤＮＡを含む発現ベクターと、共役ＧαのＧＰＣＲとの結合に関与する領域及び任意のＧαのグアニンヌクレオチドとの結合に関与する領域を少なくとも含むポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターとでトランスフェクトした宿主真核生物細胞、該細胞のホモジネートまたは該細胞由来の膜画分である。【００７０】
Ｇαとしては、GPR92/93と共役するものであれば特に制限はない。Ｇαの各遺伝子は公知であり、容易に入手可能である。GPR92/93と共役するＧαを含むポリペプチドをコードするＤＮＡは、少なくとも共役ＧαのＧＰＣＲとの結合に関与する領域をコードする配列と、任意のＧαのグアニンヌクレオチドとの結合に関与する領域をコードする配列を有することが必要である。上述の通り、ＧαのＸ線結晶構造解析の結果から、ＧＰＣＲ結合領域及びグアニンヌクレオチド結合領域はよく知られており、当業者は、所望によりＧαのコーディング配列の一部を欠失したフラグメントを容易に構築することができる。【００７１】
Ｇαのエフェクターへの作用を指標とするスクリーニング系においては、GPR92/93と共役するＧαをコードするＤＮＡは、所望のエフェクターと相互作用するための領域をコードするヌクレオチド配列をさらに含む必要がある。エフェクターとしてアデニル酸シクラーゼを用いる場合は、該ＤＮＡはＧｉαもしくはＧｓαのエフェクター相互作用領域をコードするヌクレオチド配列を含む。一方、エフェクターとしてホスホリパーゼＣβを用いる場合には、該ＤＮＡはＧｑαのエフェクター相互作用領域をコードするヌクレオチド配列を含む。各Ｇα遺伝子は公知であり、それらのエフェクター相互作用領域もよく知られている。従って、当業者は、公知の遺伝子工学的手法を適宜組み合わせることにより、容易にキメラＧα蛋白質をコードするＤＮＡを構築することもできる。当該キメラ蛋白質（例えば、Ｇｑｓα）をコードするＤＮＡの最も簡便な例としては、ＧｑαのｃＤＮＡのＣ末端の約５アミノ酸をコードする配列を、ＰＣＲ等の公知の手法を用いてＧｓαのＣ末端配列をコードするＤＮＡ配列に置換したものが挙げられる。【００７２】
GPR92/93をコードするＤＮＡ、及びGPR92/93と共役するＧαをコードするＤＮＡは、宿主真核生物細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されていなければならない。使用されるプロモーターは、宿主真核生物細胞内で機能し得るものであれば特に制限はないが、例えば、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来ＬＴＲ、アデノウイルス由来初期プロモーター、バキュロウイルス由来ポリヘドリンプロモーター等のウイルスプロモーター、並びにβ−アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の真核生物由来細胞の構成蛋白質遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。使用される発現ベクターは、上記プロモーターに加えて、その下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有することが好ましく、プロモーター領域とターミネーター領域の間にコーディングＤＮＡを挿入し得るように、適当な制限酵素認識部位、好ましくは該ベクターを１箇所のみで切断するユニークな制限酵素認識部位を有することが望ましい。さらに、該発現ベクターは、選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤抵抗性遺伝子、栄養要求性変異相補遺伝子等）をさらに含有していてもよい。【００７３】
本発明のスクリーニング系に使用されるベクターとしてはプラスミドベクターの他、ヒト等の哺乳動物での使用に好適なレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス等、あるいは昆虫細胞での使用に好適なバキュロウイルスベクター等も挙げられる。【００７４】
GPR92/93をコードするＤＮＡと、GPR92/93と共役するＧαをコードするＤＮＡは、２つの別個の発現ベクター上に担持されて宿主細胞に共トランスフェクトされてもよいし、あるいは、１つのベクター上に、ジシストロニックもしくはモノシストロニックに挿入されて、宿主細胞内に導入されてもよい。【００７５】
宿主細胞は、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター等の哺乳動物細胞、あるいは昆虫細胞であれば特に制限はない。具体的には、COP、L、C127、Sp2/0、NS-1、NIH3T3、ST2等のマウス由来細胞、ラット由来細胞、BHK、CHO等のハムスター由来細胞、COS1、COS3、COS7、CV1、Vero等のサル由来細胞、HeLa、HEK293、MCF10A等のヒト由来細胞、およびSf9、Sf21、High Five等の昆虫由来細胞などが例示される。【００７６】
宿主細胞への遺伝子導入は、真核生物細胞の遺伝子導入に使用できる公知のいかなる方法を用いて行ってもよく、例えば、リン酸カルシウム共沈殿法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。【００７７】
遺伝子を導入された宿主細胞は、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、Ham’s F-12培地、RPMI1640培地、199培地、Grace’s昆虫細胞培養用培地等を用いて培養することができる。培地のｐＨは約６〜約８であるのが好ましく、培養温度は、通常約２７〜約４０℃である。【００７８】
上記のようにして得られる、GPR92/93をコードするＤＮＡ及びGPR92/93と共役するＧαをコードするＤＮＡを導入された真核生物細胞は、使用するスクリーニング法に応じてそのまま無傷細胞として使用してもよいし、あるいは適当な緩衝液中で該細胞を破砕して得られる細胞ホモジネートや、該ホモジネートを適当な条件で遠心分離するなどして（例えば、約１，０００×ｇ程度で遠心して上清を回収した後、約１００，０００×ｇ程度で遠心して沈渣を回収する）単離される膜画分の形態であってもよい。【００７９】
例えば、ＧＴＰγＳ結合アッセイや、エフェクターの活性を直接測定することにより、被験物質のリガンド特性を評価する場合には、使用するスクリーニング系は、好ましくは、上記のようにして細胞から調製される膜画分である。一方、細胞内ｃＡＭＰ量（もしくはｃＡＭＰ応答性リポーターの発現量）や細胞内Ｃａ2+量（もしくはＣａ2+応答性リポーターの発現量）を測定することにより、被験物質のリガンド特性を評価する場合には、使用するスクリーニング系は無傷真核生物細胞である。【００８０】
尚、リガンド活性の評価を、ｃＡＭＰ応答性リポーター（エフェクターがアデニル酸シクラーゼの場合）もしくはＣａ2+応答性リポーター（エフェクターがホスホリパーゼＣβの場合）の発現量を指標として行う場合には、宿主真核生物細胞は、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）またはＴＰＡ応答エレメント（ＴＲＥ）を含むプロモーター領域の下流にリポーター蛋白質をコードするＤＮＡが機能的に連結した発現カセットを含むベクターを導入されたものである必要がある。ＣＲＥはｃＡＭＰの存在下に遺伝子の転写を活性化するシスエレメントであり、コンセンサス配列としてTGACGTCAを含む配列が挙げられるが、ｃＡＭＰ応答性を保持する限り当該配列の一部に欠失、置換、挿入または付加を含む配列であってもよい。一方、ＴＲＥはＣａ2+の存在下に遺伝子の転写を活性化するシスエレメントであり、コンセンサス配列としてTGACTCAを含む配列が挙げられるが、Ｃａ2+応答性を保持する限り当該配列の一部に欠失、置換、挿入または付加を含む配列であってもよい。ＣＲＥ又はＴＲＥを含むプロモーター配列としては、上記のようなウイルスプロモーターや哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーターが同様に使用可能であり、制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いて、あるいはＰＣＲ等を利用して、該プロモーター配列の下流にＣＲＥまたはＴＲＥ配列を挿入することができる。ＣＲＥ又はＴＲＥの制御下におかれるリポーター遺伝子としては、迅速且つ簡便に遺伝子発現を検出・定量できる公知のいかなる遺伝子を使用してもよく、例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ等のリポーター蛋白質をコードするＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。リポーター遺伝子の下流にはターミネーター配列が配置されることがより好ましい。このようなＣＲＥ（又はＴＲＥ）−リポーター発現カセットを担持するベクターとしては、公知のプラスミドベクター又はウイルスベクターを使用することができる。血清応答エレメント（SRE）の制御下にあるリポーター遺伝子含む発現ベクターについても、上記と同様に調製することができる。【００８１】
本発明のスクリーニング法のために提供される、GPR92/93を含む脂質二重層膜、及びGPR92/93と共役するＧαを構成要素として含有するスクリーニング系の別の好ましい実施態様は、GPR92/93のＣ末端側に、共役ＧαのＧＰＣＲ結合領域及び任意のＧαのグアニンヌクレオチド結合領域を少なくとも含むポリペプチドが連結した融合蛋白質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトした宿主真核生物細胞、該細胞のホモジネートまたは該細胞由来の膜画分である。【００８２】
GPR92/93をコードするＤＮＡ、及びGPR92/93と共役するＧαのＧＰＣＲ結合領域及び任意のＧαのグアニンヌクレオチド結合領域を含むポリペプチドをコードするＤＮＡは、上述のようにして取得することができる。当業者は、これらのＤＮＡ配列をもとにして、公知の遺伝子工学的手法を適宜組み合わせることにより、GPR92/93とＧαとの融合蛋白質をコードするＤＮＡを構築することができる。簡潔にいえば、ＰＣＲ等を用いてGPR92/93をコードするＤＮＡの終始コドンを除去したものに、ＧαをコードするＤＮＡを読み枠が合うように、即ちインフレームに、ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションする。この際、GPR92/93のＣ末の一部を欠失させたり、GPR92/93とＧαとの間にHisタグ等のリンカー配列を挿入したりしてもよい。【００８３】
得られた融合蛋白質をコードするＤＮＡは、上述のような発現ベクター中に挿入され、宿主真核生物細胞に上記の遺伝子導入技術を用いて導入される。得られた真核生物細胞の膜上に当該融合蛋白質が発現すると、レセプターの細胞内第３ループ上のＧα活性化ドメインと共役Ｇαのレセプター結合領域とは、GPR92/93に対する生理的リガンドの非存在下に相互作用して、ＧαにおけるＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応を促進し得る。従って、Ｇαは恒常的に活性化された状態となる。【００８４】
レセプター−Ｇα融合蛋白質発現細胞を、Ｇαのエフェクターへの作用を指標にしたスクリーニングに使用する場合において、Ｇαがレセプターと連結していることがエフェクターとの相互作用の妨げとなる場合には、レセプターとＧαとのジャンクション部位に、特異的なプロテアーゼによって切断されるアミノ酸配列（例えば、トロンビン感受性配列等）を導入し、融合蛋白質を膜上に発現させた後に当該プロテアーゼを作用させてレセプターとＧαとを切り離すことができる。【００８５】
レセプター−Ｇα融合蛋白質発現細胞についても、使用するスクリーニング法に応じて、無傷細胞、細胞ホモジネート、膜画分のいずれかの形態を適宜選択して用いることができる。【００８６】
本発明のスクリーニング法のために提供される、GPR92/93を含む脂質二重層膜、及びGPR92/93と共役するＧαを構成要素として含有するスクリーニング系のさらに別の実施態様は、共役Ｇ蛋白質を内因的に発現する宿主動物細胞を、GPR92/93をコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトすることにより調製される細胞、該細胞のホモジネートまたは該細胞由来の膜画分である。
GPR92/93をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを挿入する発現ベクター、該発現ベクターの宿主細胞への導入法は、上述の通りのものを使用することができる。【００８７】
本発明のさらに別の態様においては、本発明のスクリーニング系は、GPR92/93及びGPR92/93と共役するＧ蛋白質を内因的に発現する動物細胞、該細胞のホモジネートまたは該細胞由来の膜画分である。このような細胞としては、哺乳動物の膵臓もしくは腎臓、肺由来細胞が好ましく例示される。【００８８】
本発明のさらに別の態様においては、GPR92/93を含む脂質二重層膜、及びGPR92/93と共役するＧαを構成要素として含有するスクリーニング系として、精製したGPR92/93と共役Ｇα、あるいは精製した該レセプターと共役Ｇαとの融合蛋白質を、人工脂質二重層膜中に再構成させたものを使用することができる。GPR92/93は、ヒト又は他の哺乳動物の膵臓もしくは腎臓、肺由来細胞から得られる膜画分から、抗GPR92/93抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィー等により精製することができる。あるいは、該レセプターは、GPR92/93をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを導入された組換え細胞から、抗GPR92/93抗体や、His-tag、GST-tag等を用いたアフィニティークロマトグラフィー等により精製することもできる。同様に、該レセプターと共役Ｇαとの融合蛋白質も、該融合蛋白質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを導入された組換え細胞から、抗GPR92/93抗体や、His-tag、GST-tag等を用いたアフィニティークロマトグラフィー等により精製することができる。【００８９】
人工脂質二重層膜を構成する脂質としては、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、コレステロール（Ｃｈ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）等が挙げられ、これら１種または２種以上を適当な比率で混合したものが好ましく使用される。【００９０】
例えば、レセプターとＧα、又はレセプター−Ｇα融合蛋白質を組み込んだ人工脂質二重層膜（プロテオリポソーム）は、ＰＣ：ＰＩ：Ｃｈ＝１２：１２：１の混合脂質クロロホルム溶液を適当量ガラスチューブに分取し、窒素ガス蒸気でクロロホルムを蒸発させて脂質をフィルム状に乾燥させた後、適当な緩衝液を加えて懸濁、次いで超音波処理により均一に分散させ、コール酸ナトリウム等の界面活性剤を含む緩衝液をさらに加えて脂質を完全に懸濁する。ここに、精製したレセプターとＧα、又はレセプター−Ｇα融合蛋白質を、適量添加し、氷中で時々攪拌しながら２０〜３０分間程度インキュベートした後、適当な緩衝液に対して透析する。約１００，０００×ｇで３０〜６０分間遠心して沈渣を回収することにより、プロテオリポソームを調製することができる。【００９１】
上記の本発明のスクリーニング法により選択されるGPR92/93アゴニスト、すなわちGPR92/93作動薬は、GPR92/93の生理的リガンドと同様に、膵臓ランゲルハンス氏島においてインスリン分泌促進活性を示し、その結果耐糖能異常改善作用を示す。従って、これらを適当な添加剤と組み合わせることにより、耐糖能異常改善薬とすることができる。従って、本発明はまた、本発明のスクリーニング法により選抜されたGPR92/93作動薬と、医薬上許容される担体とを配合させることによる、耐糖能異常改善薬、又は生活習慣病治療、特に糖尿病治療を提供する。
また、上記の本発明のスクリーニング法により選択されるGPR92/93アンタゴニストもしくはインバースアゴニスト等のGPR92/93拮抗薬は、インスリン分泌を抑制することから、脂肪細胞における糖取り込みを抑制すると考えられる。従って、GPR92/93拮抗薬は、抗肥満作用を示すことは明白であり、従って、これらを適当な添加剤と組み合わせることにより、抗肥満薬とすることができる。【００９２】
（III）  生体由来脂肪酸誘導体および低分子化合物の製造方法
生体由来脂肪酸誘導体は、多数の幾何異性体や光学異性体を含むことから、化学合成で製造することが困難であることが知られている。一方、動物の臓器等の生体由来サンプルから、タンパク質等多量に含まれる物質を除去して低分子有機化合物を精製する方法としては、逆相HPLCを用いる方法、ゲルろ過法、有機溶媒で抽出する方法、およびタンパク質を加熱変性および酸変性することにより除去する方法等が知られているが、多量の生体試料を処理しがたいため多量のタンパク質から微量生体成分を精製するのは効率が非常に悪く、一部の生体活性成分しか回収できない、また生体活性成分が変性および失活することから回収できないなど、問題点があった。【００９３】
本発明者らは、ブタ脳もしくは膵臓といった生体由来サンプルから、生体由来脂肪酸誘導体を効率良く精製する方法を見出した。
すなわち本発明はまた、固相抽出樹脂を用いる抽出と逆相HPLCを組み合わせた精製工程を含むことを特徴とする、生体由来脂肪酸誘導体および低分子成分の製造方法を提供する。すなわち、以下の工程：
（ａ）  固相抽出樹脂と生体由来サンプルを接触させ、生体由来脂肪酸誘導体および低分子成分を吸着させる工程、及び
（ｂ）10％〜95％の親水性有機溶媒を含む水溶液により、生体由来脂肪酸誘導体含有画分および低分子成分を溶出する工程、
を含む生体由来脂肪酸誘導体および低分子成分の製造方法もまた、本発明の範疇である。
ここで、固相抽出樹脂とは、脂肪酸誘導体含有画分および低分子成分を吸着しタンパク質を吸着しない樹脂であり、具体的にはOasis HLB樹脂（ウォーターズ社製）等を例示することができる。
生体由来サンプルとしては特に限定は無く、哺乳動物由来の臓器サンプル等が挙げられる。哺乳動物としては、特に限定は無いが、マウスもしくはラット等のげっ歯類動物、ウサギ、イヌ、ブタ、牛、ヒト等が挙げられる。臓器としては、特に限定は無いが、脳、膵臓、肝臓、心臓、腎臓、肺、胃、副腎等が挙げられる。【００９４】
生体由来脂肪酸誘導体としては、炭素数５〜３０の直鎖もしくは分枝の、飽和もしくは不飽和の脂肪酸誘導体が挙げられる。具体的には、炭素数５〜３０の直鎖もしくは分枝の飽和脂肪酸、炭素数５〜３０の直鎖もしくは分枝の１〜１０個の二重結合もしくは三重結合を含む不飽和脂肪酸、前記飽和脂肪酸もしくは不飽和脂肪酸のエステルが挙げられる。前記エステルとが挙げられる。前記グリセライドには、前記飽和脂肪酸もしくは不飽和脂肪酸が１〜３個エステル結合していてもよい。また、前記グリセライドには、グリセリン構造の任意の水酸基はリン酸エステルを形成していてもよく、当該リン酸エステルしては、炭素数１〜６のアルキルエステル、グリセライド、等のリン酸としては、リン酸（−OP(=O)(OH)2）、ジリン酸（−OP(=O)O-P(=O)(OH)2)、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンもしくはホスファチジルイノシトール等が挙げられる。【００９５】
前記親水性有機溶媒としては、メタノール、アセトニトリル又はこれらの混合溶媒が挙げられる。好ましくは、10％〜95％メタノール、10％〜95％アセトニトリル等が挙げられる。溶出液として用いられるこれらの親水性有機溶媒を含む水溶液としては、水、緩衝液等が挙げられ、ｐHは適宜2〜10に調節することが好ましい。具体的には、0.05M〜0.5酢酸、0.03％〜  0.3％TFA、0.03％〜0.3％ギ酸、0.1％〜1％アンモニア等を含有していてもよい。
通常は生体由来サンプル１ｋｇあたり、固相抽出樹脂100〜500ｇを用い、親水性有機溶媒を含む溶出液は通常0.5L〜5L用いて溶出する。溶出液は適宜分画し、生物活性等を指標にして、目的とする生体由来脂肪酸誘導体を含む画分を取得することができる。
取得された画分は適宜当業者に知られた精製方法で更に精製し、単一化合物とすることができる。当該精製方法としては逆相HPLC、順相HPLC、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、再結晶等が挙げられる。好ましくは、逆相HPLCが挙げられる。【００９６】
例えば、式（３）で表されるLPA(22:6)もしくはその異性体（2−アシル体）については、Oasis HLB樹脂カラムを水、次いで2％〜10％メタノール水で洗浄した後に、10％〜90％アセトニトリル-10％〜90％メタノールを溶出液として用いてLPA(22:6)含有画分を取得することができる。
式（６）で表されるLPI(18:0)もしくはその異性体（2−アシル体）等の本発明のリガンドについても、同様の方法で単一化合物として得ることができる。【００９７】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例１】
【００９８】
（正常人の膵臓ランゲルハンス氏島におけるGPR92/93の発現局在）
(1)ウサギ由来ポリクローナル抗体の作成
GPR92/93抗原ペプチドとして、アミノ酸配列：AQSERSAVTTDATRPD（配列番号：５）の部分ペプチドを公知の方法で合成し、マススペクトル及びHPLCにより配列を確認した。
公知の方法に従い、以下のスケジュールで動物を免疫し、抗血清からポリクローナル抗体の作成を行った。すなわち、ウサギ（KBL  JW  11週齢）２匹を用い、飼育１日目にFCA（Completeウサギ（KBL JW 11週令）２匹を用い、飼育１日目にFCA（Complete Freund`s Adjuvant）に溶解させた抗原ペプチド200 μg/匹を腹腔内に注入した。更に、飼育１４、２８、４２、５７、７０、８４日目にFCA（Complete Freund’s Adjuvant）に溶解させた抗原ペプチド100 μg/匹を腹腔内に注入した。飼育１、４９、６３日に抗体力価確認のための採血を行った。抗体力価の上昇を確認後、飼育77日目に２０〜３０ml/匹、飼育91日目に５０〜７０ml/匹の採血を行い、抗血清を得て抗原ペプチドを固定したカラムでアフィニティー精製を行い、1次抗体を得た。精製された抗体は0.01% アジ化ナトリウム を含むPBSに置換し使用まで冷凍保存した。
(2)ウサギ抗体を用いた免疫組織染色
生検組織サンプル（57歳男性、95歳男性等）のパラフィンブロックから4〜5μmの厚さで組織切片を作成した。スライドサンプルはキシレンで除パラフィンを行い、アルコール処理を経て再度水和させた。その後Target Retrieval Solution（DAKO社）中でオートクレーブ処理による抗原賦活化を行った。以降の操作はVectastain ABC-AP kit（Vector社）を用いた。添付試薬でブロッキング後、上記(1)で作成した１次抗体で45分インキュベートした。洗浄後、5μl/mlに希釈した抗ウサギ２次抗体（BA-1000）で30分インキュベートした。洗浄後Vector ABC-AP (AK-5000) reagentを添加し、Vector Red (SK-5100)にて発色させた。
結果を表１に示した。表１のとおり、GPR92/93は他組織と比較して膵臓に強く発現していることがわかった。更に、膵臓組織中での発現分布を詳細に検討したところ、腺房などではほとんど発現しておらず、ランゲルハンス島に発現が局在していることが明らかとなった。
さらに、GPR92/93抗原ペプチドとしてTLARPDATQSQRRRKTVRL（配列番号：６）を用い、同様の手法で発現局在を検討した結果、ランゲルハンス氏島に有意に発現していることが明らかとなった。【００９９】
【表１】
2006003877.tif 000012
【実施例２】
【０１００】
（cDNAの調製）
RNeasy Mini Kit(QIAGEN)を用いて、マウスIslet組織からtotal RNAを抽出した。得られたtotal RNA 10μg、T7-(dT)24プライマー(Amersham社製) 100pmolを含む11μlの混合液を、70℃、10分間加熱後、氷上で冷却した。冷却後、当該混合液に、SuperScript Choice System for cDNA Synthesis(Gibco-BRL社製)に含まれる5ｘFirst Strand cDNA Buffer 4μl、該キットに含まれる0.1M DTT 2μl及び当該キットに含まれる10mM dNTP Mix 1μlを添加し、この混合液を42℃、2分間加熱した。更に、当該混合液に、当該キットに含まれるSuper ScriptII RT 2μl(400U)を添加し、この混合液を42℃、1時間加熱後、氷上で冷却した。冷却後、当該混合液にDEPC処理滅菌蒸留水91μl、当該キットに含まれる5ｘSecond Strand Reaction Buffer 30μl、10mM dNTP Mix 3μl、当該キットに含まれるE. coli  DNA Ligase 1μl(10U)、当該キットに含まれるE. coli DNA Polymerase I 4μl(40U)及び当該キットに含まれるE. coli RNaseH 1μl(2U)を添加し、この混合液を16℃、2時間反応させた。次いで、当該混合液に当該キットに含まれるT4 DNA Polymerase 2μl(10U)を加え、この混合液を16℃、5分間反応させた後、当該混合液に0.5M EDTA 10μlを添加した。次いで、この混合液にフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール溶液（ニッポンジーン社製）162μlを添加し、混合した。当該混合液を、予め室温、14,000rpm、30秒間遠心分離しておいたPhase Lock Gel Light(エッペンドルフ社製)に移し、これを室温、14,000rpm、2分間遠心分離した。遠心分離後、145μlの水層をエッペンドルフチューブに回収した。回収された水層に、7.5M酢酸アンモニウム溶液72.5μl及びエタノール362.5μlを加え混合した後、この混合液を4℃、14,000rpm、20分間遠心分離した。遠心分離後、上清を捨て、DNAペレットを得た。その後、DNAペレットに80%エタノール0.5mLを添加した。この混合液を4℃、14,000rpm、5分間遠心分離した後、上清を捨て、ＤＮＡペレットを再び得た。得られたDNAペレットに再度80%エタノール0.5mLを添加した。この混合液を4℃、14,000rpm、5分間遠心分離した後、上清を捨て、ＤＮＡペレットを得た。得られたＤＮＡペレットを乾燥させた後、DEPC処理滅菌蒸留水12μlに溶解することにより、ｃDNA溶液を得た。
【実施例３】
【０１０１】
（マウス由来の遺伝子のクローニング）
実施例２で調整したcDNA  1μL、配列番号７で示される塩基配列からなるプライマー１  20pmol、配列番号８で示される塩基配列からなるプライマー２  20pmol、TaKaRa Ex-Taqポリメラーゼ（宝酒造社）2U、TaKaRa Ex-Taqポリメラーゼ添付のバッファー 5μL及びTaKaRa Ex-Taqポリメラーゼ添付のdNTP mixture（2.5mM）4μLを含む50μLの反応液を調製した。PCRは、まず94℃で30秒間、次いで65℃で30秒間、更に72℃で1.5分間からなる保温サイクルを40回繰り返し、最後に72℃で5分間保温する条件にて行われた。ＰＣＲ後、アガロース電気泳動で約1.2kbpを示すPCR産物を回収した。回収されたPCR産物をpT7-Blue vector(Novagen社)にサブクローニングした後、当該プラスミドでE.coliJM109株コンピテントセル（東洋紡社）を形質転換した。形質転換された細胞を50μg/mLアンピシリン含有LB培地100mLで培養することにより得られる培養菌体からQIAGEN Plasmid Maxi kit(QIAGEN社)を用いて分離・精製することにより、マウス由来の遺伝子（mGPR92）の塩基配列を含むプラスミドを得た。
【実施例４】
【０１０２】
（マウス由来の遺伝子の塩基配列の決定）
実施例３で得られたPCR産物（約1.2kbp）を含むプラスミドを鋳型として、Thermo Sequenase IIダイ・ターミネーターキット（Amersham Pharmacia Biotech社）及びABI373DNA配列読み取り装置（PE Applied Biosystems社）を用いて、サンガーの方法〔F.Sanger,S.Nicklen,A.R.Coulson著、Proceedings of National Academy of Science U.S.A.(1977), 74, 5463-5467〕により、配列番号９で示される塩基配列からなるマウス由来の本遺伝子（mGPR92）の塩基配列を決定した。
【実施例５】
【０１０３】
（マウス由来の遺伝子発現ベクターの構築）
実施例３で調製したcDNAを鋳型として配列番号１１で示される塩基配列からなるプライマー３  20pmol、配列番号１２で示される塩基配列からなるプライマー４  20pmol、Pfx Platinumポリメラーゼ（インビトロジェン社）2.5U、Pfx Platinumポリメラーゼ添付のバッファー 5μL及びdNTP mixture （2mM）7.5μLを含む50μLの反応液を調製した。PCRは、まず94℃で1分間の熱処理を行い、続いて94℃で15秒間、55℃で30秒間、68℃で1分20秒間からなる保温サイクルを30回繰り返す条件にて行われた。ＰＣＲ後、アガロース電気泳動で約1.2kbpを示すPCR産物を回収した。回収されたPCR産物をGATEWAYシステムのBP反応（インビトロジェン社）を用いてpDONR221（インビトロジェン社）に挿入した後、当該プラスミドでE.coli DH5α株コンピテントセル（東洋紡社）を形質転換した。形質転換された細胞をカナマイシン含有培地で培養することにより得られる培養菌体からプラスミドを精製することにより、マウス由来の本遺伝子（mGPR92）のORF部分の塩基配列を含むエントリーベクターpENTR/mGPR92/93を得た。塩基配列に誤りのないことを確認した後、pENTR/mGPR92/93をGATEWAYシステムのLR反応（インビトロジェン社）を用いてデスティネーションベクターpCAGGS-DEST（後述）に挿入した後、E.coli DH5α株コンピテントセル（東洋紡社）を形質転換した。形質転換にて得られたコロニーをアンピシリン含有培地で培養することにより得られる培養菌体からQIAGEN Plasmid Maxi kit(QIAGEN社)を用いて分離・精製することにより、動物細胞導入用プラスミドを調製した。目的の発現ベクターが得られたことは制限酵素による切断にて確認し、本プラスミドをpCAGGS/mGPR92/93と命名した。
なお、デスティネーションベクターpCAGGS-DEST は哺乳動物細胞発現ベクターpCAGGSのXhoI部位を平滑化後、GATEWAYリーディングフレームBをプロモーターと同じ方向に挿入したものである。
【実施例６】
【０１０４】
（ヒト由来遺伝子発現ベクター）
市販ESTクローン〔IMAGE  クローン：ID=4335693 (5')（ResGen社）〕から制限酵素を用いてタンパク質コード領域を切り出し、ベクターにつなげることにより調製した。ここで導入したコード領域がコードするアミノ酸配列が配列番号２に記載のアミノ酸配列と同一であることを、配列分析により確認した。
【実施例７】
【０１０５】
（共役Gタンパク質）
(1) 細胞へのGPR92/93の一過的導入
一過性遺伝子導入のために、遺伝子と導入用試薬を以下のように混合調製した。すなわち、96wellプレートの1wellにつき、実施例６で調製したGPR92/93組み込みベクター 0.05μg／Opti-MEM培地 5μlとLipofectamine 0.3μl／Opti-MEM培地 5μlを混合し、室温で30分間静置した後にF-12培地40μlを加えて遺伝子導入用溶液とした。前日に96wellプレートに2 x 104 cells/100μl/well（培地：10% FBS／F-12）で捲き込んで5% CO2、37℃で22〜24時間培養したCHO-Ｋ1細胞の培地を吸引除去し、F-12培地で2回洗浄した後、上述の遺伝子導入用溶液50μl/wellを添加して、5% CO2、37℃で3.5時間培養した。培地を吸引除去し、10% FBS ／F-12培地で一回洗浄後、100μl/wellの 10% FBS／F-12培地を添加して5% CO2、37℃でさらに24時間培養した。
(2) cAMP産生量の測定
上記(1)の方法で一過的に遺伝子導入した細胞の培養上清を除去し、PBS(−)で洗浄した。0.5mM IBMX／1mg/ml BSA／PBS(−) 50μl/wellを添加して室温で30分間静置した後、溶液を除去し、80μl/wellのlysis buffer(1M KF／1.25% Triton X100／50mM リン酸緩衝液(pH7.0))を加えて細胞を溶解させた。この溶解液20μl/wellを384well白色プレートに移し、同じ384wellプレートに標準曲線作成用のcAMP希釈液(0, 0.8, 2.4, 8, 24, 80, 320 nM)を各20μl / well添加した。cAMP定量キットであるHTRF reagent set (CIS bio international)のcAMP-XL665 conjugateおよびanti-cAMP cryptate conjugate溶液を1mg/ml BSA／PBS(−)で40倍希釈して各10μl / well添加し、シールして室温で一晩静置した。シールをはがし、測定機ARVOにて、cryptate から出る620nm の長寿命蛍光と、励起されたcryptateからエネルギー転移を受けたXL665が生じる665nmの長寿命蛍光の強度を、時間分解2波長測定した。
測定結果から算出したcAMP量を、表１に示した。表１のとおり、ヒトおよびマウスのGPR92/93を一過性導入した細胞でcAMP産生量が増加しており、GPR92/93はGsと共役するGPCRであると推定された。【０１０６】
【表２】
2006003877.tif 000013
（ここで、データはｎ＝３で測定した平均値を表す）
【実施例８】
【０１０７】
（LPAの添加による、濃度依存的なcAMPの上昇）
実施例２の(1)に示した方法でGPCR92/93遺伝子を細胞に一過的に導入した。実施例２の(2)の方法でcAMP量を定量する際、冒頭のPBS(−)洗浄後に、種々の濃度のLPA／0.5mM IBMX／1mg/ml BSA／PBS(−) 50μl/wellを添加し、室温で30分間静置した。以降は、同 (2)の方法でcAMP量を定量した。
結果を表３に示したが、GPR92/93導入細胞では添加したLPA濃度に依存したcAMP量の増加が見られた。【０１０８】
【表３】
2006003877.tif 000014
（ここで測定値はｎ＝３の平均値である。）
ここで、LPAのかわりに、被験物質を用いることによって、GPR92/93リガンド（アゴニスト及びインバースアゴニスト）を評価することができる。
【実施例９】
【０１０９】
（単離ラ氏島でのインスリン分泌）
ICRマウス（日本クレア、SPF、♂）から、コラゲナーゼ消化法により膵臓ラ氏島を単離した。手順を以下に示す。自由摂食状態で飼育したICRマウスをネンブタール麻酔下にて開腹し、下腹部大静脈を切断して脱血死させる。総胆管が露出するように十二指腸を配置し、総胆管を十二指腸直前部分で結紮する。総胆管の肝臓側よりカニューレを挿入し、0.02%コラゲナーゼ液3mlを注入した後に膵臓を摘出する。5mlのコラゲナーゼ液中に浸漬した状態で37℃、20分間消化した後、激しく浸透して膵臓を破砕する。RPMI1640培地(10%FCS、抗生物質入り)にて50mlにメスアップし、懸濁した後に1000rpm×1分間遠心し、上清を除去する。同じ作業をさらに2回繰り返した後に、実態顕微鏡観察下、ピペットマンを用いてラ氏島をピックアップし、RIMI培地中、37℃、5％ CO2／95％ Airにて一晩インキュベートした後に実験に供した。
ラ氏島をKRB（0.5％BSAを含む）中に移し、サイズを揃えた後に、37℃設定の恒温機中にて30分間インキュベートした。予め各条件のLPAを添加したKRBを37℃恒温槽にセットし、予熱しておく。インキュベートの終了したラ氏島を5個／チューブにて添加し、正確に30分インキュベートした後に氷中に移し、分泌反応を停止させた。各チューブの上清を回収し、レビス−インスリンキット マウス（シバヤギ）を用いてインスリン濃度を測定した。結果を表４に示した。【０１１０】
【表４】
2006003877.tif 000015
表２おいてDMSOは溶媒のみのネガティブコントロールであり、GLP-1はインスリン分泌促進作用を有することが公知のペプチド化合物、すなわちポジティブコントロールである。表２からわかるようにLPAは用量依存的にインスリン分泌促進活性を示し、LPA：１０μＭにおけるインスリン分泌促進活性はGLP-1(100μＭ）とほぼ同程度であった。
【実施例１０】
【０１１１】
（バインディングアッセイによるスクリーニング）
(1)細胞膜画分の調製
実施例２（1)で調製したGPR92/93発現株をフラスコに播種し、10%FBS（Gibco社製）を培地中で60〜70%コンフルエントになるまで培養する。細胞を回収しbuffer A(50mM HEPES(pH7.0), 10mM 2-ME, 1mM PMSF, 0.25M sucrose)に懸濁する。Potter型ホモジェナイザーでホモジナイズ（400rpm、20ストローク）したのち、100000ｇで60分遠心分離を行い、得られた沈殿を再度buffer Aに懸濁する。この懸濁液を35%(mass/vol)sucrose in buffer Aの上に重層し45000ｇで45分遠心分離を行う。界面の画分を回収しbuffer Aに懸濁し、100000ｇで60分遠心分離を行う。得られた沈殿を20μg/ml aprotininを含むbuffer Aに懸濁し以下のアッセイに用いる。
(2)レセプターバインディングアッセイ
MultiscreenGVPlate(Miripore)に反応バッファー(50mM Hepes pH7.4、12.5mM酢酸マグネシウム、3.125ｍM 塩化マグネシウム、0.125mg/ml BSA)に懸濁した[3H]LPAと希釈した被験物質(DMSO溶液)とを添加しする。30℃でインキュベートしたのち上記の手順で調整した膜画分を添加する。30℃でインキュベートしたのち等量の20％TCAを添加し、上清を吸引除去しタンパク質を沈殿させる。10％TCAで数回洗浄した後、37℃で乾燥させた膜をパンチアウトしγカウンターで測定する。被験物質における放射活性が、被験物質としてDMSOのみを用いた対照における放射活性よりも大きければ、当該被験物質は、GPR92/93リガンドであると決定できる。
【実施例１１】
【０１１２】
（ビアコアを用いたスクリーニング）
(1)細胞膜画分の調製
実施例２(1)に記載のGPR92/93発現株をフラスコに播種し、10%FBS（Gibco）を培地中で60〜70%コンフルエントになるまで培養する。細胞を回収しbuffer A(50mM HEPES(pH7.0), 10mM 2-ME, 1mM PMSF, 0.25M sucrose)に懸濁する。Potter型ホモジェナイザーでホモジナイズ（400rpm、20ストローク）したのち、100000ｇで60分遠心分離を行い、得られた沈殿を再度buffer Aに懸濁する。この懸濁液を35%(mass/vol)sucrose in buffer Aの上に重層し45000ｇで45分遠心分離を行う。界面の画分を回収しbuffer Aに懸濁し、100000ｇで60分遠心分離を行う。得られた沈殿を20μg/ml aprotininを含むbuffer Aに懸濁し以下のアッセイに用いる。
(2)ビアコアでの結合測定
文献[Anal Biochem. 1998 Dec 15;265(2):340-50. Markgren PO et al.]に記載されている一般的な方法を用いる。上記手順で調整したGPR92/93発現細胞膜画分（例えば1〜10μｇ）を10ｍＭの酢酸バッファー（pH4）に溶解し、ビアコアのセンサーチップＣＭ５の表面のマトリックスにカルボキシル基を介して固定化する。
ＨＢＳバッファー（アマシャム  ファルマシア  バオテク株式会社製）をセンサーチップに20μｌ／分の流速で流し、バックグラウンドの値を記録する。途中からＨＢＳバッファーに10ｎＭ〜10μＭの濃度で溶解した被験物質に切り替えて１分間流し、薬剤の結合に伴う値の変化を記録する。再び、薬剤を含まないＨＢＳバッファーに切り替え、結合した薬剤の解離に伴う値の変化を記録する。結合と解離の速度、あるいは最大結合量から被験物質とGPR92/93との親和性を計算する。
【実施例１２】
【０１１３】
プラスミドDNA作製方法
GPR92/93（NM_020400；配列番号１３）を以下のプライマーを用いたPCRを行うことで増幅した。
atGPR92M：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCACCatgttagccaacagctcctcaac（配列番号１５）
atGPR92R：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCAtcagagggcggaatcctggggacac（配列番号１６）
得られた断片をpDONR201とGATEWAYシステムのBP反応（いずれもインビトロジェン社）を行うことによりpENTR/GPR92/93を得た。得られたクローンについて塩基配列を確認した。さらに、pENTR/GPR92/93から、当業者に汎用されている方法でGPR92/93発現ベクターを構築した。このようにして得られたクローンを拡大培養し、キアゲンMAXIキットを利用して導入用プラスミドDNAを精製した。
【実施例１３】
【０１１４】
アッセイ方法
CHO-K1細胞を2x104個/wellで96穴プレートにまき、抗生物質を含まない培地を用いてCO2インキュベータで24時間培養した。50 ngのGPR92/93発現プラスミドDNA（GPR92/93/pCAGGS）を5 μlのOPTI-MEMに希釈し、また0.3 μlのLipofectAmineを5 μlのOPTI-MEMに希釈した。両者を混合し室温で30分間静置後、 40 μlの血清無添加のF12培地を加え、血清無添加のF12培地で1回洗浄したwellに添加した。CO2インキュベータで4時間培養後、10% FBS添加F12培地に置き換え（1回洗浄）、CO2インキュベータで24時間培養した。細胞をPBS(-)で洗浄し、ブタ臓器活性画分を含む50 μl の0.5 mM IBMXを含んだHanks Hepes液に置換した。15分後に、Hanks Hepes液を吸引し、40 μlのLysis buffer（1% TritonX100、50 mMリン酸バッファー(pH7.0)、0.2％ BSA）を添加し、細胞を溶解した。細胞溶解液うち10μlをcAMP定量アッセイに使用した。10μlの反応液を384-well white plateに入れ、5μlずつのcAMP-XL665 conjugateとMab anti-cAMP-Cryptate conjugateを添加した。室温で2時間反応させた後、マルチプレートリーダーARVOを用いて、TR-FRET法によるcAMPの定量をおこなった。
【実施例１４】
【０１１５】
ブタ脳組織由来活性成分LPAおよびLPIの単離
ブタ新鮮脳9個（湿重量924.9 g）を採取した。当日、新鮮脳9個に生理食塩水5Lを加えホモゲナイズした後に、4℃に冷却し9,000Gで30分間高速遠心して上清4,277gを取得した。
ウオーターズ社Oasis HLB樹脂300ｇを充填したカラム（容量900ｍｌ）にメタノール1Lを流し予め洗浄し、次いで水2L以上を流して平衡化させた。平衡化させたOasis HLB樹脂カラムに上記の遠心上清を通液し吸着させた。カラムを水5Lで洗浄し（C1とラベル）、5％メタノール水5Lで洗浄した後に（C2とラベル）、90％アセトニトリル-10％メタノール4Lを通液して活性成分を溶出させた（C3とラベル）。その後にアセトニトリル-10％メタノール-10％  0.1M酢酸3Lを通液し（C4とラベル） 、80％アセトニトリル-10％メタノール-10％  0.1％ギ酸3Lを通液し（C5とラベル） 、80％アセトニトリル-10％メタノール-10％  0.1％トリクロロ酢酸ＴFA3Lを通液した（C6とラベル）。それぞれの溶出液について活性測定した結果、活性成分はC3に溶出されていることが判った。
溶出液C3について逆相液体クロマトグラフィー法により精製した。4Lの溶出液C3をエバポレーターで減圧濃縮し、濃縮液を少量のメタノールに溶解した。濃縮液をAgilent社製のZORBAX Eclipse XDB-C18カラムに通液し、0.1％トリクロロ酢酸/アセトニトリル溶媒系でアセトニトリル濃度を増加させて活性成分を溶出した。グラジエント条件は下記の条件に従って実施した。
（Zorbax-C18-HPLC条件）
LC装置：Applied Biosystems Integral HPLC
カラム：ZORBAX Eclipse XDB-C18  4.6x250mm (Agilent)
移動相：A: 0.1%TFA-H2O  B: 0.08%TFA-90％ACN
0%B(0min)-20%B(10min)-60%B(40min)-100%B(40min)-100%B(5min)  
流速： 1.0mL/min 
分画： 1.0min/Fr
検出：UV220nm,280nm
各フラクション50μlについてスピードバック濃縮装置を用いて減圧濃縮した後に、1μlのDMSOに溶解しGPR92/93発現CHO-K1細胞を使用するアッセイ法により活性を測定した。活性はフラクション64およびフラクション65に溶出された。それぞれのcAMP生成量は1.9nMおよび3.1nMであった。
上記のフラクション64およびフラクション65それぞれ800μlをスピードバック濃縮装置により減圧濃縮した後に、200μlのメタノールに溶解し、Waters社製のXterraカラムに通液し、0.1％トリクロロ酢酸/アセトニトリル溶媒系でアセトニトリル濃度を増加させて活性成分を溶出した。グラジエント条件は下記の条件に従って実施した。
（Xterra-HPLC条件）
LC装置：Applied Biosystems Integral HPLC
カラム：Xterra(登録商標) RP18  4.6x150mm (Waters)
移動相：A: 0.1%TFA-H2O  B: 0.08%TFA-90％ACN
0%B(0min)-50%B(5min)-58%B(8min)-70%B(24min)-75%B(5min)-100%B(10min)
-100%(3min)
流速： 0.8mL/min 
分画： 1.0min/Fr
検出：UV220nm,280nm
各フラクション10μlについてスピードバック濃縮装置を用いて減圧濃縮した後に、1μlのDMSOに溶解しGPR92/93発現CHO-K1細胞を使用するアッセイ法（実施例１３を参照）により活性を測定した。活性はフラクション16に溶出された。cAMP生成量は32nMであった。
フラクション16（700μl）をスピードバック濃縮装置により減圧濃縮した後に、200μlのメタノールに溶解し、Waters社製のAtlantisカラムに通液し、0.1％トリクロロ酢酸/アセトニトリル溶媒系でアセトニトリル濃度を増加させて活性成分を溶出した。グラジエント条件は下記の条件に従って実施した。
（Atlantis -HPLC条件）
LC装置：Applied Biosystems Integral HPLC
カラム：Atlantis（登録商標）dC18   4.6x150mm (Waters)
移動相：A: 0.1%TFA-H2O  B: 0.08%TFA-90％ACN
0%B(0min)-50%B(5min)-58%B(8min)-70%B(24min)-100%B(5min)
流速： 0.8mL/min 
分画： 0.3min/Fr
検出：UV220nm,280nm
各フラクション20μlについてスピードバック濃縮装置を用いて減圧濃縮した後に、1μlのDMSOに溶解しGPR92/93発現CHO-K1細胞を使用するアッセイ法により活性を測定した。活性はフラクション41およびフラクション47に溶出された。それぞれのcAMP生成量は4.3nMおよび5.1nMであった。
【実施例１５】
【０１１６】
ブタ脳組織由来活性成分LPAおよびLPIの構造解析
質量分析にはNanosprayイオン源を装着したMicomass社QTOF2質量分析計およびThermo Electoron社イオントラップ質量分析計LCQを解析に使用した。試料は0.1%AcOH-H2O/MeOH/AcCN(1:1:1)に溶解し、流速200nL/minにてNanospray測定を行った。LCQではキャピラリー温度150℃、イオン化電圧1.8kVに設定し、positive測定およびnegative測定の両モードでの測定を行った。QTOF2ではpositiveイオンモードのみ測定を行った。
（１）活性フラクション41の構造解析
活性フラクション41のマススペクトルを取得したところ、負イオンモードでは[M-H]-と考えられるピークm/z599.9が検出され、正イオンモードでは[M+H]+=601.7, [M+Na]+, [2M+H]+, [M+H-H2O]+が検出され、本成分の分子量は600と決定でき、単一成分に精製されていることがわかった。負イオンMS/MSスペクトルで検出されたフラグメントイオンm/z419, m/z241からイノシトールリン脂質と推定され、さらに、m/z315, m/z341のフラグメントイオンから、本リガンド候補成分はlysophosphatidylinositol (LPI（18:0）)と推定することができた。lysophosphatidylinositol (LPI（18:0）)標品のMS/MSスペクトルを取得したところ、フラグメントイオンが一致し、MW600活性成分はlysophosphatidylinositol (LPI（18:0）)と決定した。
（２）活性フラクション47の構造解析
活性フラクション47のマススペクトルを取得したところ、負イオンスペクトルでは、[M-H]-および[2M-H]-のピークが検出され、正イオンスペクトルでは、[M+H]+, [2M+H]+, [3M+H]+, [M+Na]+, [M+H-H2O]+のピークが検出されたことから、本成分の分子量は482と決定でき、単一成分に精製されていることがわかった。正イオンm/z483.8からのMS/MSスペクトルでは-98フラグメントが検出され、リン酸基があることが示唆された。負イオンm/z481.8からのMS/MSスペクトルでは、グリセロールリン酸に特徴的なm/z153のフラグメントイオンが検出され、本成分はリゾリン脂質の一種であるリゾフォスファチジン酸Docosahexaenoyl-LPA (LPA（22:6）)と推定できた。本MS/MSスペクトルでは、アシル基の結合部位（sn-1あるいはsn-2）は確定できず、両方の可能性がある。酵素合成法（Tokumur, A.ら、Biochem J. 2002 Aug 1;365(Pt 3):617-28.）により調製したDocosahexaenoyl-LPA (LPA（22:6）)標品のMS/MSスペクトルを取得したところ、フラグメントイオンが一致し、MW482活性成分はDocosahexaenoyl-LPA (LPA（22:6）)と決定した。
【実施例１６】
【０１１７】
各種類縁化合物の活性
上記活性化合物の構造類似化合物についてGPR92/93発現CHO-K1細胞を使用するアッセイ法（実施例１３を参照）により活性を測定した。活性測定結果を表１に示した。【０１１８】
【表５】
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*（被験物質存在下でのcAMP量）−（被験物質非存在下でのcAMP量）
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明のGPR92/93作動薬は、インスリン分泌促進活性を示し、耐糖能異常改善薬、糖尿病治療薬として有用である他、研究用試薬として利用することもできる。また、本発明のスクリーニング方法により、医薬品の候補化合物となり得る、GPR92/93作動薬及び拮抗薬を探索することが可能になった。
【配列表フリーテキスト】
【０１２０】
配列番号５：抗原ペプチド
配列番号６：抗原ペプチド
配列番号７：PCR用プライマー
配列番号８：PCR用プライマー
配列番号１１：PCR用プライマー
配列番号１２：PCR用プライマー
配列番号１５：PCR用プライマー
配列番号１６：PCR用プライマー
【配列表】
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【国際調査報告】
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