【手続補正書】
【提出日】令和2年10月12日(2020.10.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
阻害剤耐性ルシフェラーゼであって、配列番号３のルシフェラーゼと比べてデヒドロルシフェリン及びその誘導体による阻害に対して向上した耐性を備えており、
配列番号３との少なくとも７０％の配列同一性を備え、且つ、配列番号３の３９６、２４４、３００、３４４、２４０、及び／または２５４から選択される位置で配列番号３に対して少なくとも１つの置換を含む、阻害剤耐性ルシフェラーゼ。
【請求項２】
デヒドロルシフェリンに曝された際の活性において、配列番号３のルシフェラーゼより小さな相対低下を示すか、または、
阻害剤耐性ルシフェラーゼも配列番号３のルシフェラーゼもデヒドロルシフェリンに曝されていない場合、配列番号３のルシフェラーゼの少なくとも１０％の生物発光活性を備える、請求項１に記載の阻害剤耐性ルシフェラーゼ。
【請求項３】
配列番号３に対して少なくとも１つの置換を含み、前記少なくとも１つの置換がＩ３９６Ｋ、Ｈ２４４Ｒ、Ｃ３００Ｇ、Ｔ３４４Ａ、Ｉ２４０Ｌ、Ｙ２５４Ｓ、及び／またはそのような置換の保存的なまたは半保存的な変異から選択される、請求項１または２に記載の阻害剤耐性ルシフェラーゼ。
【請求項４】
I) 配列番号３の３９６位にて配列番号３に対して置換を含み、任意で、配列番号３に対してＩ３９６Ｋの置換、またはその保存的なもしくは半保存的な変異を含むか、
II) 配列番号５との少なくとも７０％の配列同一性を備え、且つ、配列番号３に対して少なくとも１つの置換を含み、前記置換が、配列番号３の２４４、３００、及び／または３９６から選択される位置にあり、任意で、配列番号３に対して少なくとも１つの置換を含み、前記少なくとも１つの置換が、Ｈ２４４Ｒ、Ｃ３００Ｇ、Ｉ３９６Ｋ、及び／またはそのような置換の保存的なまたは半保存的な変異から選択されるか、または、
III) 配列番号７との少なくとも７０％の配列同一性を備え、且つ、配列番号３に対して少なくとも１つの置換を含み、前記置換が、配列番号３の２４０、２５４、３４４、及び／または３９６から選択される位置にあり、任意で、配列番号３に対して少なくとも１つの置換を含み、前記少なくとも１つの置換が、Ｉ２４０Ｌ、Ｙ２５４Ｓ、Ｔ３４４Ａ、Ｉ３９６Ｋ、及び／またはそのような置換の保存的なまたは半保存的な変異から選択される、
請求項３に記載の阻害剤耐性ルシフェラーゼ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の阻害剤耐性ルシフェラーゼと、ルシフェリン基質とを含む、試薬組成物。
【請求項６】
ルシフェリンの分解産物を含む混入物をさらに含み、任意で、前記混入物が、デヒドロルシフェリンであり、及び／または、
マグネシウムをさらに含み、及び／または、
緩衝剤、消泡剤、ＡＴＰアーゼ阻害剤、Ｌ−ルシフェリン、アミノチオチミジン、酵素安定剤、界面活性剤、ＡＴＰ生成酵素の阻害剤、細胞溶解剤、ＡＴＰ抽出剤、補酵素Ａ、チオール試薬、金属イオンキレート剤、プロテアーゼ阻害剤、及び塩から成る群から選択される１種以上の追加の成分をさらに含み、及び／または、
単一の液体試薬である、
請求項５に記載の試薬組成物。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の阻害剤耐性ルシフェラーゼと、カチオン性界面活性剤とを含む試薬組成物であって、任意で、前記カチオン性界面活性剤が、ＤＴＡＢ（臭化ドデシルトリメチルアンモニウム）、ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウム）、塩化ベンザルコニウム、またはＢＤＤＡＢｒ（臭化ベンジルジメチルドデシルアンモニウム）である、試薬組成物。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１項に記載の試薬組成物を含むキットであって、任意で、緩衝剤、消泡剤、ＡＴＰアーゼ阻害剤、酵素安定剤、界面活性剤、ＡＴＰ生成酵素の阻害剤、細胞溶解剤、ＡＴＰ抽出剤、補酵素Ａ、チオール試薬、金属イオンキレート剤、プロテアーゼ阻害剤、及び塩から成る群から選択される１種以上の追加の成分をさらに含み、及び／または、ＡＴＰの検出アッセイまたはＡＴＰの定量アッセイを行うための使用説明書をさらに含む、キット。
【請求項９】
試料にてＡＴＰを検出または定量するためのアッセイシステムであって、
（ａ）請求項５〜７のいずれか１項に記載の試薬組成物と
（ｂ）ＡＴＰを含むまたはＡＴＰを含むことが疑われる試料と
を含む、アッセイシステムであって、任意で、前記アッセイシステムが発光の検出及び／または測定のための装置をさらに含むか、または、前記試料が細胞溶解物である、アッセイシステム。
【請求項１０】
試料にてＡＴＰを検出する方法であって、
（ａ）請求項５〜７のいずれか１項に記載の試薬組成物を前記試料に添加する工程と、
（ｂ）発光を検出する工程とを含み、
任意で、前記試料が、細胞を含み、前記方法が、細胞を溶解して細胞溶解物を生成する工程をさらに含む、方法。
【請求項１１】
試料にてＡＴＰの量または濃度を定量する方法であって、
（ａ）請求項５〜７のいずれか１項に記載の試薬組成物を前記試料に添加する工程と、
（ｂ）前記試料からの発光を定量する工程と、
（ｃ）前記発光を対照値と比較して前記試料における前記ＡＴＰの量または濃度を決定する工程とを含む、方法。
【請求項１２】
I) 前記対照値が、既知の濃度のＡＴＰを含む対照試料によって生成される発光の別の定量から決定されるか、
II) 前記方法が、前記試料に既知の濃度のＡＴＰを添加する工程をさらに含むか、
III) 発光が複数の時点で定量されるか、または
IV) 発光がリアルタイムで定量される、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
試料におけるＡＴＰの検出及び／または定量のための、請求項５〜７のいずれか１項に記載の試薬組成物の使用。
【請求項１４】
アッセイにて請求項１〜４のいずれか１項に記載の阻害剤耐性ルシフェラーゼの見かけのシグナル安定性を向上させる方法であって、存在する前記ルシフェラーゼの１種以上の阻害剤と共に前記アッセイを行う工程を含み、
任意で、前記阻害剤が、デヒドロルシフェリン、オキシルシフェリン、及びＬ−ルシフェリンの１種以上から選択されるか、または、前記阻害剤耐性ルシフェラーゼが、天然野生型バージョンのルシフェラーゼと比べて見かけのシグナル安定性の向上における増大を示す、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１３】
反応物を室温で３分間インキュベートし、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）−Ｍｕｌｔｉ＋ルミノメーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて発光を測定した。ミカエリス・メンテンの競合阻害酵素動態モデルにデータを当て嵌めることによって非線形回帰を用いてＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ７にてデータを解析した。
表１
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本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕阻害剤耐性ルシフェラーゼであって、配列番号３のルシフェラーゼと比べてデヒドロルシフェリン及びその誘導体による阻害に対して向上した耐性を備えている、阻害剤耐性ルシフェラーゼ。
〔２〕デヒドロルシフェリンに曝された際の活性において、配列番号３のルシフェラーゼより小さな相対低下を示す、前記〔１〕に記載の阻害剤耐性ルシフェラーゼ。
〔３〕配列番号３との少なくとも７０％の配列同一性を含み、且つ、配列番号３の２４０、２４４、２５４、３００、３４４、及び／または３９６から選択される位置で配列番号３に対して少なくとも１つの置換を含む、前記〔１〕に記載の阻害剤耐性ルシフェラーゼ。
〔３〕配列番号３に対して少なくとも１つの置換を含み、前記少なくとも１つの置換がＩ２４０Ｌ、Ｈ２４４Ｒ、Ｙ２５４Ｓ、Ｃ３００Ｇ、Ｔ３４４Ａ、Ｉ３９６Ｋ、及び／またはそのような置換の保存的なまたは半保存的な変異から選択される、前記〔３〕に記載の阻害剤耐性ルシフェラーゼ。
〔４〕配列番号３の３９６位にて配列番号３に対して置換を含む、前記〔３〕に記載の阻害剤耐性ルシフェラーゼ。
〔５〕配列番号３に対してＩ３９６Ｋの置換、またはその保存的なもしくは半保存的な変異を含む、前記〔４〕に記載の阻害剤耐性ルシフェラーゼ。
〔６〕配列番号５との少なくとも７０％の配列同一性を含み、且つ、配列番号３に対して少なくとも１つの置換を含み、前記置換が、配列番号３の２４４、３００、及び／または３９６から選択される位置にある、前記〔３〕に記載の阻害剤耐性ルシフェラーゼ。
〔７〕配列番号３に対して少なくとも１つの置換を含み、前記少なくとも１つの置換が、Ｈ２４４Ｒ、Ｃ３００Ｇ、Ｉ３９６Ｋ、及び／またはそのような置換の保存的なまたは半保存的な変異から選択される、前記〔６〕に記載の阻害剤耐性ルシフェラーゼ。
〔８〕配列番号７との少なくとも７０％の配列同一性を含み、且つ、配列番号３に対して少なくとも１つの置換を含み、前記置換が、配列番号３の２４０、２５４、３４４、及び／または３９６から選択される位置にある、前記〔３〕に記載の阻害剤耐性ルシフェラーゼ。
〔９〕配列番号３に対して少なくとも１つの置換を含み、前記少なくとも１つの置換が、Ｉ２４０Ｌ、Ｙ２５４Ｓ、Ｔ３４４Ａ、Ｉ３９６Ｋ、及び／またはそのような置換の保存的なまたは半保存的な変異から選択される、前記〔８〕に記載の阻害剤耐性ルシフェラーゼ。
〔１０〕阻害剤耐性ルシフェラーゼも配列番号３のルシフェラーゼもデヒドロルシフェリンに曝されていない場合、配列番号３のルシフェラーゼの少なくとも１０％の生物発光活性を備える、前記〔１〕に記載の阻害剤耐性ルシフェラーゼ。
〔１１〕前記〔１〕〜〔１０〕のいずれか１項に記載の阻害剤耐性ルシフェラーゼと、ルシフェリン基質とを含む、試薬組成物。
〔１２〕ルシフェリンの分解産物を含む混入物をさらに含む、前記〔１１〕に記載の試薬組成物。
〔１３〕前記混入物が、デヒドロルシフェリンである、前記〔１２〕に記載の試薬組成物。
〔１４〕マグネシウムをさらに含む、前記〔１１〕〜〔１３〕のいずれか１項に記載の試薬組成物。
〔１５〕緩衝剤、消泡剤、ＡＴＰアーゼ阻害剤、Ｌ−ルシフェリン、アミノチオチミジン、酵素安定剤、界面活性剤、ＡＴＰ生成酵素の阻害剤、細胞溶解剤、ＡＴＰ抽出剤、補酵素Ａ、チオール試薬、金属イオンキレート剤、プロテアーゼ阻害剤、及び塩から成る群から選択される１種以上の追加の成分をさらに含む、前記〔１１〕〜〔１４〕のいずれか１項に記載の試薬組成物。
〔１６〕単一の液体試薬である、前記〔１１〕〜〔１５〕のいずれか１項に記載の試薬組成物。
〔１７〕前記〔１〕〜〔１０〕のいずれか１項に記載の阻害剤耐性ルシフェラーゼと、カチオン性界面活性剤とを含む、試薬組成物。
〔１８〕前記カチオン性界面活性剤が、ＤＴＡＢ（臭化ドデシルトリメチルアンモニウム）、ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウム）、塩化ベンザルコニウム、またはＢＤＤＡＢｒ（臭化ベンジルジメチルドデシルアンモニウム）である、試薬組成物。
〔１９〕前記〔１１〕〜〔１６〕または〔１７〕〜〔１８〕のいずれか１項に記載の試薬組成物を含むキット。
〔２０〕緩衝剤、消泡剤、ＡＴＰアーゼ阻害剤、酵素安定剤、界面活性剤、ＡＴＰ生成酵素の阻害剤、細胞溶解剤、ＡＴＰ抽出剤、補酵素Ａ、チオール試薬、金属イオンキレート剤、プロテアーゼ阻害剤、及び塩から成る群から選択される１種以上の追加の成分をさらに含む、前記〔１９〕に記載のキット。
〔２１〕ＡＴＰの検出アッセイまたはＡＴＰの定量アッセイを行うための使用説明書をさらに含む、前記〔１９〕または〔２０〕に記載のキット。
〔２２〕試料にてＡＴＰを検出または定量するためのアッセイシステムであって、
（ａ）前記〔１１〕〜〔１６〕または〔１７〕〜〔１８〕のいずれか１項に記載の試薬組成物と
（ｂ）ＡＴＰを含むまたはＡＴＰを含むことが疑われる試料とを含む、アッセイシステム。
〔２３〕発光の検出及び／または測定のための装置をさらに含む、前記〔２２〕に記載のアッセイシステム。
〔２４〕前記試料が、細胞溶解物である、前記〔２２〕に記載のアッセイシステム。
〔２５〕試料にてＡＴＰを検出する方法であって、
（ａ）前記〔１１〕〜〔１６〕または〔１７〕〜〔１８〕のいずれか１項に記載の試薬組成物を前記試料に添加する工程と、
（ｂ）発光を検出する工程とを含む、方法。
〔２６〕前記試料が、細胞を含み、前記方法が、細胞を溶解して細胞溶解物を生成する工程をさらに含む、前記〔２５〕に記載の方法。
〔２７〕試料にてＡＴＰの量または濃度を定量する方法であって、
（ａ）前記〔１１〕〜〔１６〕または〔１７〕〜〔１８〕のいずれか１項に記載の試薬組成物を前記試料に添加する工程と、
（ｂ）前記試料からの発光を定量する工程と、
（ｃ）前記発光を対照値と比較して前記試料における前記ＡＴＰの量または濃度を決定する工程とを含む、方法。
〔２８〕前記対照値が、既知の濃度のＡＴＰを含む対照試料によって生成される発光の別の定量から決定される、前記〔２７〕に記載の方法。
〔２９〕前記試料に既知の濃度のＡＴＰを添加する工程をさらに含む、前記〔２７〕に記載の方法。
〔３０〕発光が複数の時点で定量される、前記〔２７〕に記載の方法。
〔３１〕発光がリアルタイムで定量される、前記〔２７〕に記載の方法。
〔３２〕試料におけるＡＴＰの検出及び／または定量のための、前記〔１１〕〜〔１６〕または〔１７〕〜〔１８〕のいずれか１項に記載の試薬組成物の使用。
〔３３〕アッセイにて前記〔１〕〜〔１０〕のいずれか１項に記載の阻害剤耐性ルシフェラーゼの見かけのシグナル安定性を向上させる方法であって、存在する前記ルシフェラーゼの１種以上の阻害剤と共に前記アッセイを行う工程を含む、方法。
〔３４〕前記阻害剤が、デヒドロルシフェリン、オキシルシフェリン、及びＬ−ルシフェリンの１種以上から選択される、前記〔３３〕に記載の方法。
〔３５〕前記阻害剤耐性ルシフェラーゼが、天然野生型バージョンのルシフェラーゼと比べて見かけのシグナル安定性の向上における増大を示す、前記〔３３〕に記載の方法。