(57)【要約】生体環境を模した測定状態で、医薬品の危険性評価の信頼性が高い、医薬品安全性試験方法及びシステムを提供することを目的とする。  本発明の医薬品安全性試験方法は、ＨＥＲＧイオンチャネル及びその相同物で構成される細胞を用い、複数の測定電極を持つセンサを使用する医薬品安全性試験方法であって、Ａ）被試験医薬品を含まない対照溶液に接した状態で前記センサの電気応答を測定する工程、Ｂ）前記被試験医薬品を含む測定溶液に接した状態で前記センサの電気応答を測定する工程、Ｃ）工程Ｂ１の後、再び前記被試験医薬品を含まない前記対照溶液に接した状態で前記センサの電気応答を測定する工程を含み、前記工程Ａ及び前記工程Ｃで測定された電圧信号を比較し、その結果に基づいて、被試験医薬品の危険性を判断する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定電極を持つセンサを使用して、被試験医薬品の、ＨＥＲＧイオンチャネル又はその相同物を含む検体細胞に対する危険性を試験する医薬品安全性試験方法であって、
Ｏ）被試験医薬品を含まない対照溶液中に、ＨＥＲＧイオンチャネル又はその相同物を含む検体細胞を保持し、前記検体細胞近傍に前記測定電極を配置する工程と、
Ａ）前記対照溶液に接した状態で、前記測定電極によって電圧信号を測定する工程と、
Ｂ）工程Ａの後、前記対照溶液を、前記被試験医薬品を含む測定溶液に置換し、前記測定電極によって電圧信号を測定する工程と、
Ｃ）工程Ｂの後、前記測定溶液を、再び前記対照溶液に置換し、前記測定電極によって電圧信号を測定する工程と、
Ｄ）前記工程Ａと前記工程Ｃで測定された電圧信号を比較し、その結果に基づいて、前記被試験医薬品の危険性を判定する工程
を含む医薬品安全性試験方法。
【請求項２】
前記工程Ｄは、前記工程Ａによって測定された電圧値ａ１、及び前記工程Ｃによって測定された電圧値ｃ１からｃ１／ａ１を算出し、
ｃ１／ａ１が予め設定された設定値を超えるときは危険性ありと判定し、ｃ１／ａ１が前記設定値以下であるときは危険性なしと判定する工程である、請求項１に記載の医薬品安全性試験方法。
【請求項３】
前記工程Ａの前に、前記検体細胞に含まれるイオンチャネルであって、ＨＥＲＧイオンチャネル以外の少なくとも１種類以上のイオンチャネルを不活性化する化学物質を加える工程Ｅ、を含む請求項１に記載の医薬品安全性試験方法。
【請求項４】
所定の時間間隔で、前記工程Ｂ及び前記工程Ｃを２回以上繰り返す請求項１に記載の医薬品安全性試験方法。
【請求項５】
前記工程Ｂ及び前記工程Ｃを少なくとも２回以上くり返す場合において、
１回目に、前記測定溶液として第１の被試験医薬品が含まれる第１の測定溶液を用い、
２回目に、前記測定溶液として第２の被試験医薬品が含まれる第２の測定溶液を用いる請求項４に記載の医薬品安全性試験方法。
【請求項６】
前記第１の被試験医薬品と、前記第２の被試験医薬品が異なる医薬品である請求項５に記載の医薬品安全性試験方法。
【請求項７】
前記第１と第２の被試験医薬品が同一であり、第１の測定溶液に含まれる第１の被試験医薬品の濃度と、第２の測定溶液に含まれる第２の被試験医薬品の濃度とが異なる請求項５に記載の医薬品安全性試験方法。
【請求項８】
前記第１の測定溶液又は前記第２の測定溶液のどちらか一方の代わりに、陽性対照試薬又は陰性対照試薬を含む第３の測定溶液を用い、
前記工程Ｄにおいて、更に、前記第１の測定溶液又は前記第２の測定溶液を用いて前記工程Ａ及び前記工程Ｃで測定された電圧信号の比（ｃ１／ａ１）と、前記第３の測定溶液を用いて前記工程Ａ及び前記工程Ｃで測定された電圧信号の比（ｃ１’／ａ１’）とを対比することによって、医薬品の危険性を判定する請求項５に記載の医薬品安全性試験方法。
【請求項９】
前記検体細胞がＨＥＲＧイオンチャネルを定常発現させた細胞株である、請求項１に記載の医薬品安全性試験方法。
【請求項１０】
前記工程Ａ及び前記工程Ｃの前に、所定時間、前記検体細胞を第一の対照溶液に接触させた後、前記検体細胞が接する前記第一の対照溶液を第二の対照溶液に換える工程Ｆと、
前記工程Ｂの前に、所定時間、前記検体細胞を第一の測定溶液に接触させた後、前記検体細胞が接する前記第一の測定溶液を第二の測定溶液に換える工程Ｇとを含み、
前記第二の対照溶液及び前記第二の測定溶液が、それぞれ前記第一の対照溶液及び前記第一の測定溶液と比較して、共通して含まれるイオン濃度が異なる請求項１に記載の医薬品安全性試験方法。
【請求項１１】
前記電圧信号が、予め設定したサンプル時間毎の電圧信号の振幅の偏差値を計算する単位偏差値の集合の統計値を表す、請求項１に記載の医薬品安全性試験方法。
【請求項１２】
前記統計値が、前記単位偏差値の分布の平均値である、請求項１１に記載の医薬品安全性試験方法。
【請求項１３】
前記統計値が、前記単位偏差値の分布の分散値である、請求項１１に記載の医薬品安全性試験方法。
【請求項１４】
前記検体細胞が被試験医薬品を含む測定溶液に接した状態で測定された電圧信号が、予め設定したサンプル電圧閾値を超えた後に検出した電圧信号である、請求項１に記載の医薬品安全性試験方法。
【請求項１５】
ＨＥＲＧイオンチャネル又はその相同物を含む検体細胞を含む溶液を満たすことが可能な凹部を有する基板と、
前記凹部に設けられ、かつ、前記検体細胞の近傍に配置可能な１以上の測定電極と、
前記溶液に浸し、前記測定電極と離隔するように設けられた参照電極とを有するセンサと、
前記測定電極と前記参照電極との間の電圧を測定する電圧測定装置と、
前記凹部に対し複数種類の前記溶液を注入及び排出する溶液注入排出装置と、
制御装置と、を備え、
前記制御装置は、前記溶液注入排出装置を制御して前記凹部に第１の種類の前記溶液としての被試験医薬品を含まない対照溶液を前記凹部に満たし、この状態ａ２で前記電圧測定装置によって前記測定電極と前記参照電極との間の電圧を測定し、
その後、前記溶液注入排出装置を制御して前記凹部から前記対照溶液を排出しかつ前記凹部に第２の種類の前記溶液としての被試験医薬品を含む測定溶液を満たし、この状態ｂ２で前記電圧測定装置によって前記測定電極と前記参照電極との間の電圧を測定し、
その後、前記溶液注入排出装置を制御して前記凹部から前記測定溶液を排出しかつ前記凹部に前記対照溶液を再び満たし、この状態ｃ２で前記電圧測定装置によって前記測定電極と前記参照電極との間の電圧を測定し、
前記状態ａ２で測定された前記電圧と前記状態ｃ２で測定された前記電圧とを比較し、
前記比較結果に基づいて前記被試験医薬品の安全性を判定する、医薬品安全性試験システム。
【請求項１６】
前記各測定電極の近傍に前記検体細胞が複数配置されている、請求項１５に記載の医薬品安全性試験システム。
【請求項１７】
前記センサが、前記基板を厚み方向に貫通する貫通孔を有し、該貫通孔近傍に前記測定電極が配置されている、請求項１５に記載の医薬品安全性試験システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、不整脈を引き起こすＨＥＲＧチャネルを含む検体細胞に対する被試験医薬品の危険性を判断する、医薬品安全性試験方法及び医薬品安全性試験システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】  近年、医薬品による催不整脈作用が大きな問題となっている。この催不整脈作用は、薬物誘発性ＱＴ延長症候群（又は、後天性ＱＴ延長症候群）と呼ばれ、薬物が心筋細胞上のイオンチャネルに作用し、心電図においてＱＴ間隔を延長させ、重篤な不整脈を引き起こす。薬物によるＱＴ延長は、頻度は低いが、時にはｔｏｒｓａｄｅｓ  ｄｅ  ｐｏｉｎｔｅｓ型の心室頻拍や突然死といった重篤な副作用を誘発する。例えば、抗ヒスタミン薬であるテルフェナジン、アステミゾールは遅延整流性カリウムイオンチャネルを阻害し活動電位を延長することが知られており、心室頻拍や突然死が報告されている。【０００３】  国際的な医薬品承認審査資料の調和を目的とする日米ＥＵ医薬品規制調和国際会議（ＩＣＨ）においても、「安全性薬理試験ガイドライン」の中に、「再分極と伝達異常に対する手法を含むｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏの評価も考慮すべきである」との記載が盛り込まれた。安全性の高い医薬品の開発のためには、開発段階で効果的な催不整脈作用検出法を適用することが必要とされている。【０００４】  ＱＴ延長を引き起こす標的イオンチャネルは、遅延整流性のカリウムチャネルであると言われている。心筋細胞などの野生型細胞には、遅延整流性のカリウムチャネル以外にも様々なイオンチャネルが内在している。このため、現在最も感度が高く、信頼性の高い評価方法は、代表的な遅延整流性のカリウムチャネルであるＨＥＲＧ（Ｈｕｍａｎ  Ｅｎｔｅｒ−ａ−ｇｏｇｏ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｇｅｎｅ）チャネルを、アフリカツメガエルの卵母細胞などの宿主細胞、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯなどの哺乳類培養細胞に遺伝子導入技術により強制的に発現させた系を検体細胞として、パッチクランプ法で電気生理学的評価を行う方法である。なかでも、アフリカツメガエルの卵母細胞に導入されたＨＥＲＧイオンチャネルは薬剤感受性が低くなるため、特に、哺乳類培養細胞に発現させた系がより信頼性の高い評価手法となりえる。【０００５】  つまり、危険性を有する医薬品候補化合物は、ＨＥＲＧイオンチャネルを拮抗する。例えば、心筋細胞ならＨＥＲＧチャネルが拮抗されたことにより、カリウムイオンの出入りが阻害され、再分極が起こらなくなる。この一連の動作が、薬物によるＱＴ延長を発生するメカニズムである。この危険性を有する医薬品候補化合物に共通する特徴は、一度ＨＥＲＧチャネルに拮抗すると、ＨＥＲＧチャネルのイオンの出入り口である孔（ポア）にはまり込み、抜けなくなるオープンチャネル型拮抗薬である。【０００６】  新規医薬品の開発の初期段階で安全性試験を実施し、医薬品の選別を開発前に行うことは、開発投資コスト、開発時間、リソースの効率面などから望ましい。そのためには、大量の医薬品開発候補化合物に対し試験を実施する必要がある。この用途には、測定の迅速性、大量処理能力がより重視される。ところが、パッチクランプ手法は、電極の調製及びその操作などに熟練した技術を要し、一つの試料の測定に多くの時間を要するので、この目的には適していない。【０００７】  そのため、貫通孔を持った平面パッチクランプセンサを用い、ＨＥＲＧイオンチャネルを通過する電流を得、安全性を試験するセン���が既に開示されている（例えば、特許文献１、特許文献２、非特許文献２参照）。【０００８】  これら特許文献１から特許文献４に開示される平面パッチクランプセンサは、いずれも、生体内塩濃度組成に近い溶液中で被検体細胞を平面基板に設けた貫通孔へと誘導し、配置し、負圧により細胞を貫通孔へと密着（ギガシール）させた後、貫通孔と接する領域の細胞膜を更なる負圧吸引をもって破ることにより、細胞膜を通過する電流を膜の両側に配置した不分極性の電極（代表的には銀−塩化銀電極）、つまり、測定電極と参照電極にて測定するものである。【０００９】  測定では、細胞膜内外の電位差を、人工的にある設定値で保持した際のイオンチャネルを通過する電流が測定される。ここで、標的チャネルのひとつであるＨＥＲＧイオンチャネルを持った細胞を使った、従来の試験方法の具体的なプロトコールの一例を示す。【００１０】  測定電極側に細胞内と塩濃度や浸透圧を人工的に調製した擬似電極内液を充たし、参照電極側に細胞外と塩濃度や浸透圧を人工的に調製した擬似電極外液を満たして、これらの２種類を使用する。まず、測定電極のフィードバック機構を利用し、細胞内の電位を人工的に−８０ｍＶに保持する。そして、−８０ｍＶから＋２０ｍＶまでステップ状に細胞内の電位を人工的に上昇させ、１．５秒間その電位で保持した後、＋２０ｍＶから−５０ｍＶへと再度ステップ状に細胞内の電位を人工的に下降させる。その下降させた際に流れる外向き電流の大きさがＨＥＲＧチャネルを流れるイオンの流れとして扱え、上記電流ピーク値を指標に被試験医薬品の安全性が判断される。【００１１】  具体的には、医薬品の危険性は、危険性を有する候補薬剤の非存在下で、細胞内外の電圧を過渡的に変化させたときの膜を外向きに流れる電流を測定し、候補薬剤存在下で、繰り返し細胞内外の電圧を過渡的に変化させたときの同外向電流の減少を持って、ＱＴ延長を判断する。【００１２】  しかし、このような評価方法として用いられる短時間間隔でのステップ状の大きな電位変動は、生体環境では起こりえない。つまり、急激な電圧増減を使用する人工的な電位差プロトコールと、人工的成分が加えられた擬似内液を用いた状態での測定は、細胞本来の応答を測定しているとは必ずしも言えない。【００１３】  なお、非特許文献３によれば、カルシウムキレート剤等の人工的成分が加えられた擬似細胞内液を用いた測定は、ＱＴ延長に対する寄与が小さいＬ型カルシウムチャネル電流の増強が前面に出て、ＱＴ延長を引き起こす支配的な要因である遅延整流性カリウムチャネルの電流が減少したと報告されている。これは、細胞本来の細胞内溶液中には様々な細胞内情報伝達を担う生体分子が存在しているが、擬似内液は、それらを忠実に再現できないことによるものである。【００１４】  パッチクランプ方式の測定に際してホールセル状態を得るために、貫通孔と接する領域の細胞膜を破砕する必要がある。膜がきれいに破けない場合には、測定効率の減少とともに、漏れ電流による測定感度低下を引き起こす。しかも、細胞にも傷害を与えるという副次的な短所もあるが、もっと重要なことは、膜の破砕により細胞内機能性物質の流出が起こり、細胞本来の応答の消失をきたす。【��０１５】  また、特許文献２及び非特許文献２においては、アンフォテンシンβなどの造孔性の化学物質を使用して、細胞内機能性物質の流出を抑える改善を行っている。【００１６】  しかしながら、測定状態がＩｎ  ｖｉｔｒｏで、さらにＨＥＲＧイオンチャネル発現系を用いた理想測定系であるという仮定があり、さらに突然死をも引き起こす医薬品の除外という目的から考えると、人工的な電位刺激プロトコールを用いた測定状態での評価をするのは大きな問題となる。【００１７】  そこで、これら特許文献１から特許文献４に開示される平面パッチクランプセンサと異なる測定原理で細胞上のイオンチャネルの化学物質識別能を判定する平面基板センサが既に開示されている（特許文献５）。【００１８】  この特許文献５に開示される平面基板センサは、平面パッチクランプセンサと同様に、貫通孔を持つ。貫通孔は、微細加工技術で一括加工することにより一つの基板に多数作製できる。言い換えれば、パッチクランプに比べ、多数の細胞の同時並列測定が可能である。平面パッチクランプセンサとの違いは、電極が分極性電極である金電極からなることである。そして、被検体細胞を細胞外に配置した電極の電位変化で測定する原理に基づく。このため、細胞膜を破砕することなく、よって、人工的に調整した細胞内液を使用することがない。言い換えれば、平面パッチクランプセンサに比べ、より生体環境に近い測定条件で試験を実施できる。
【特許文献１】国際公開第０１／２５７６９号パンフレット
【特許文献２】米国特許第６４８８８２９号明細書
【特許文献３】国際公開第０１／５９４４７号パンフレット
【特許文献４】国際公開第９９／３１５０３号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０２／０５５６５３号パンフレット
【非特許文献１】細胞の分子生物学、第三版、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４，日本語版、中村桂子ら監訳、１８１〜１８２頁、１９９５年、教育社
【非特許文献２】ＡＳＳＡＹ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖｏｌ．１，Ｎｕｍｂｅｒ  １−２，ｐｐ１２７−１３５，２００３
【非特許文献３】Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ，Ｖｏｌ．４１７，ｐｐ１８５−１９３，１９９０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】  しかしながら、前記のセンサ構成では、ＨＥＲＧチャネルを拮抗するオープンチャネル型の拮抗剤を特定することができない。【００２０】  従来例として挙げられる特許文献１から特許文献４に開示される平面パッチクランプセンサでは、医薬品の危険性は、以下の工程で判断される。第一に、危険性を有する候補薬剤の非存在下で、細胞内外の電圧を過渡的に変化させる。つまり、細胞内を強制的に脱分極させてＨＥＲＧイオンチャネルを開けた時に外向きに流れる電流を測定する。第二に、候補薬剤存在下で、細胞内外の電圧を過渡的に変化させる。つまり、同様に、細胞内を強制的に脱分極させてＨＥＲＧイオンチャネルを開けた時に観測される同外向電流を測定する。危険性を有する候補薬剤の非存在下と候補薬剤存在下での外向電流の減少をもって、危険性候補薬剤がＨＥＲＧチャネルを拮抗する度合いを判断する。第三に、候補薬剤存在下で電圧印加を繰り返し、細胞内外の電圧を繰り返し変化させる。つまり、同様に、ＨＥＲＧイオンチャネルを何度も開けた時に観測される同外向電流を測定する。外向電流が変化しないことで、ＨＥＲＧイオンチャネルのポアに不可逆的にはまり込み、脱離しない、オープンチャネル型の拮抗剤であると判断できる。【００２１】  一方、特許文献５に開示した前述のセンサ構成では、細胞膜を破砕せず、細胞外に配した電極によって、細胞外の電位変化を測定するため、より生体環境に近い測定条件で試験を実施できるという長所を持つものの、外部から人工的に電気的な刺激を印加し、強制的にＨＥＲＧイオンチャネルを開くという操作を行うことはできない。つまり、危険性を有する候補薬剤存在下で、細胞内電位の変化に起因する電極電位は測定できるものの、その変化がオープンチャネル型拮抗剤に依るものか否かは判断できない。【００２２】  以上に見られるように、平面基板センサでは、ＨＥＲＧイオンチャネルを持つ被検体細胞を使って、不整脈を引き起こす危険性を有する被試験化合物を判別することができなかった。【００２３】  本発明は、前記従来の課題を解決するもので、外部から電気信号を新たに印加することなく、生体環境を模した測定状態で、不整脈を引き起こす危険性を有するオープンチャネル型ＨＥＲＧチャネル拮抗剤を判別する医薬品の安全性試験方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２４】上述した従来技術の課題を解決するために、本発明の医薬品安全性試験方法は、測定電極を持つセンサを使用して、被試験医薬品の、ＨＥＲＧイオンチャネル又はその相同物を含む検体細胞に対する危険性を試験する医薬品安全性試験方法であって、
Ｏ）被試験医薬品を含まない対照溶液中に、ＨＥＲＧイオンチャネル又はその相同物を含む検体細胞を保持し、前記検体細胞近傍に前記測定電極を配置する工程と、
Ａ）前記対照溶液に接した状態で、前記測定電極によって電圧信号を測定する工程と、
Ｂ）工程Ａの後、前記対照溶液を、前記被試験医薬品を含む測定溶液に置換し、前記測定電極によって電圧信号を測定する工程と、
Ｃ）工程Ｂの後、前記測定溶液を、再び前記対照溶液に置換し、前記測定電極によって電圧信号を測定する工程と、
Ｄ）前記工程Ａと前記工程Ｃで測定された電圧信号を比較し、その結果に基づいて、前記被試験医薬品の危険性を判定することを特徴とする。【００２５】  危険性を内在する被試験医薬品を本発明の医薬品評価方法を用いて評価すれば、ＱＴ延長を起こしていることに相当する測定電極での応答及び応答時間が、被試験医薬品非存在下にくらべ延長される。また、再び被試験医薬品非存在下に戻した時は、測定電極での応答及び応答時間が延長されたまま保持される。この応答の形式により、被試験医薬品が不可逆にイオンチャネル孔（ポア）に入ることに相当するオープンチャネル拮抗剤か否かが判別できる。また、標的生体構成要素を人工的に刺激する処理を経ることなく、より生体環境に近い測定条件で試験を実施できる。つまり、信頼性の高い安全性試験を実施することができる。【００２６】  前記工程Ｄは、前記工程Ａによって測定された電圧値ａ１、及び前記工程Ｃによって測定された電圧値ｃ１からｃ１／ａ１を算出し、
ｃ１／ａ１が予め設定された設定値を超えるときは危険性ありと判断し、ｃ１／ａ１が前記設定値以下であるときは危険性なしと判断する工程であっても良い。【００２７】  前記医薬品安全性試験方法において、Ｅ）前記工程Ａの前に、前記検体細胞に含まれるイオンチャネルであって、前記ＨＥＲＧイオンチャネル以外の少なくとも１種類以上のイオンチャネルを不活性化する化学物質を加える工程を含んでいても良い。【００２８】  前記医薬品安全性試験方法において、所定の時間間隔で、前記工程Ｂと前記工程Ｃとを少なくとも２回以上繰り返しても良い。また、この繰り返しにおいて、１回目に、前記測定溶液として第１の被試験医薬品が含まれる第１の測定溶液を用い、２回目に、前記測定溶液として第２の被試験医薬品が含まれる第２の測定溶液を用いることもできる。この場合、前記第１の被試験医薬品と前記第２の被試験医薬品が異なる医薬品であっても良い。また、前記第一の被試験医薬品と前記第２の被試験医薬品が同一であり、第１の測定溶液に含まれる第１の被試験医薬品の濃度と、第２の測定溶液に含まれる第２の被試験医薬品の濃度とが異なっていても良い。【００２９】  前記第１の測定溶液又は前記第２の測定溶液のどちらか一方の代わりに、陽性対照試薬又は陰性対照試薬を含む第３の測定溶液を用い、
前記工程Ｄにおいて、更に、前記第１の測定溶液又は前記第２の測定溶液を用いて前記工程Ａ及び前記工程Ｃで測定された電圧信号の比（ｃ１／ａ１）と、前記第３の測定溶液を用いて前記工程Ａ及び前記工程Ｃで測定された電圧信号の比（ｃ１’／ａ１’）を対比することによって、医薬品の危険性を判定しても良い。【００３０】  前記医薬品安全性試験方法において、前記検体細胞は、例えばＨＥＲＧイオンチャネルを定常発現させた細胞株であり得る。【００３１】  前記医薬品安全性試験方法において、Ｆ）前記工程Ａ及び前記工程Ｃの前に、所定時間、前記検体細胞を第一の対照溶液に接触させた後、前記検体細胞が接する前記第一の対照溶液を第二の対照溶液に換える工程があっても良い。また、Ｇ）前記工程Ｂの前に、所定時間、前記検体細胞を第一の測定溶液に接触させた後、前記検体細胞が接する前記第一の測定溶液を第二の測定溶液に換える工程を含み、前記第二の対照溶液及び前記第二の測定溶液が、それぞれ前記第一の対照溶液及び前記第一の測定溶液と、前記試験医薬品以外の共通に含まれる少なくとも一つのイオン濃度が異なるものであっても良い。【００３２】  前記医薬品安全性試験方法において、前記電圧信号が、予め設定したサンプル時間毎の電圧信号の振幅の偏差値を計算する単位偏差値の集合の統計値であっても良い。【００３３】  前記統計値が、前記単位偏差値の分布の平均値であっても良い。また、前記統計値が、前記単位偏差値の分布の分散値であっても良い。【００３４】  前記工程Ｂにおいて、前記検体細胞が被試験医薬品を含む測定溶液に接した状態で測定された電圧信号は、予め設定したサンプル電圧閾値を超えた後に検出した電圧信号であることが好ましい。【００３５】  さらに、本発明は、
ＨＥＲＧイオンチャネル又はその相同物を含む検体細胞を含む溶液を満たすことが可能な凹部を有する基板と、
前記凹部に設けられ、かつ、前記検体細胞の近傍に配置可能な１以上の測定電極と、
前記溶液に浸し、前記測定電極と隔離するように設けられた参照電極とを有するセンサと、
前記測定電極と前記参照電極との間の電圧を測定する電圧測定装置と、
前記凹部に対し複数種類の前記溶液を注入及び排出する溶液注入排出装置と、
制御装置と、を備え、
前記制御装置は、前記溶液注入排出装置を制御して前記凹部に第１の種類の前記溶液としての被試験医薬品を含まない対照溶液を前記凹部に満たし、この状態ａ２で前記電圧測定装置によって前記測定電極と前記参照電極との間の電圧を測定し、
その後、前記溶液注入排出装置を制御して前記凹部から前記対照溶液を排出しかつ前記凹部に第２の種類の前記溶液としての被試験医薬品を含む測定溶液を満たし、この状態ｂ２で前記電圧測定装置によって前記測定電極と前記参照電極との間の電圧を測定し、
その後、前記溶液注入排出装置を制御して前記凹部から前記測定溶液を排出しかつ前記凹部に前記対照溶液を再び満たし、この状態ｃ２で前記電圧測定装置によって前記測定電極と前記参照電極との間の電圧を測定し、
前記状態ａ２で測定された前記電圧と前記状態ｃ２で測定された前記電圧とを比較し、
前記比較結果に基づいて前記被試験医薬品の安全性を判定する、医薬品安全性試験システムである。【００３６】  上記医薬品安全性試験システムは、前記各測定電極の近傍に前記検体細胞が複数配置されている構成であっても良い。【００３７】  また、上記医薬品安全性試験システムは、前記センサが、前記基板を厚み方向に貫通する貫通孔を有し、前記貫通孔近傍に前記測定電極が配置されている構成であっても良い。
【発明の効果】
【００３８】  本発明の医薬品安全性試験方法及び医薬品安全性システムによれば、ＨＥＲＧチャネルに外部から人工的に電気信号を新たに印加する処理を経ることなく、ＱＴ延長を起こしていることに相当する測定電極での応答及び応答時間が医薬品非存在下にくらべ不可逆的に延長される、危険性を内在するオープンチャネル型候補医薬品を評価できる。【００３９】  また、本発明の医薬品安全性試験方法及び医薬品安全性試験システムによれば、細胞膜を破砕することなく、かつ、人工的に調整した細胞内液を使用することなく、１液系で測定できるので、より生体環境に近い測定条件で試験を実施できる。この両者の効果により、従来の方法に比べ、本発明の医薬品安全性試験方法は、より信頼性の高い試験となることができる。また、外部印加用電気回路等を省略でき、装置を簡便に構成することができる。さらに、装置の生産性、製造性の向上にも貢献する。【００４０】  本発明の上記目的、他の目的、特徴及び利点は、添付図面参照の下、以下の好適な実施態様の詳細な説明から明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１−Ａ】図１−Ａは、実施の形態１における医薬品安全性試験方法を示すフローチャートであって、ステップＳ１とステップＳ３の測定結果を比較する場合のフローチャートである。
【図１−Ｂ】図１−Ｂは、実施の形態１における医薬品安全性試験方法を示すフローチャートであって、ステップＳ２とステップＳ３の測定結果を比較する場合のフローチャートである。
【図２】図２は、実施の形態１における医薬品安全性試験センサを模式的に示す断面図である。
【図３】図３は、図２に示すセンサの上面図である。
【図４】図４は、実施の形態１における医薬品安全性試験方法の準備工程（ステップＳ０）を示すフローチャートである。
【図５】図５は、実施の形態１の別の実施の形態における医薬品安全性試験方法の工程を示すフローチャートである。
【図６−Ａ】図６−Ａは、実施の形態１に示した医薬品安全性試験システムを模式的に示す構成図であって、ウェル内溶液置換装置及びウェル内溶液排出装置を有する医薬品安全性試験システムの構成図である。
【図６−Ｂ】図６−Ｂは、実施の形態１に示した医薬品安全性試験システムを模式的に示す構成図であって、ウェル内溶液置換装置を有する医薬品安全性試験システムの構成図である。
【図６−Ｃ】図６−Ｃは、実施の形態１に示した医薬品安全性試験システムを模式的に示す構成図であって、ウェル内溶液置換装置及びウェル内溶液排出装置のいずれも有しない医薬品安全性試験システムの構成図である。
【図７−Ａ】図７−Ａは、本発明の医薬品安全性試験方法の工程を示すフローチャートであって、実施の形態２における医薬品安全性試験方法の工程を示すフローチャートである。
【図７−Ｂ】図７−Ｂは、本発明の医薬品安全性試験方法の工程を示すフローチャートであって、実施の形態３における医薬品安全性試験方法の工程を示すフローチャートである。
【図７−Ｃ】図７−Ｃは、本発明の医薬品安全性試験方法の工程を示すフローチャートであって、実施の形態４における医薬品安全性試験方法の工程を示すフローチャートである。
【図８】図８は、実施の形態５における医薬品安全性試験方法の工程を示すフローチャートである。
【図９】図９は、実施の形態６における医薬品安全性試験センサの構造を示す部分断面図である。
【図１０】図１０は、実施の形態６の医薬品安全性試験センサの構造を模式的に示す図（全体の斜視図）である。
【図１１】図１１は、実施の形態６の医薬品安全性試験センサのセンサ基板の詳細構造を示す部分断面図である。
【図１２】図１２は、実施の形態６の医薬品安全性試験センサのセンサ基板の詳細構造を示す下面図である。
【図１３】図１３は、実施の形態６に示した医薬品安全性試験システムの構成図である。
【図１４】図１４は、実施例１の実験プロトコール１におけるセンサ１２０電極電圧時系列波形の測定結果を示す図である。
【図１５】図１５は、実施例１の実験プロトコール２におけるセンサ１２０電極電圧時系列波形の測定結果を示す図である。
【図１６】図１６は、実施例１の薬剤溶液２に関する電圧ヒストグラムピーク値Ｊの変化量の測定結果を示す図である。
【図１７】図１７は、実施例１の対照溶液２に関する電圧ヒストグラムピーク値Ｊの変化量の測定結果を示す図である。
【図１８】図１８は、実施例１の薬剤溶液２に関する電圧ヒストグラム分散値Ｋの変化量における測定結果を示す図である。
【図１９】図１９は、実施例１の対照溶液２に関する電圧ヒストグラム分散値Ｋの変化量における測定結果を示す図である。
【図２０】図２０は、実施例１における電圧振幅値の変化の統計量の測定結果を示す図である。
【図２１】図２１は、実施例２におけるセンサ１２０電極電圧時系列波形の測定結果を示す図である。
【図２２】図２２は、実施例２における電圧ヒストグラムピーク値Ｊの変化量の測定結果を示す図である。
【図２３】図２３は、実施例２における電圧ヒストグラム分散値Ｋの変化量の測定結果を示す図である。
【図２４】図２４は、実施例３における電圧振幅値の変化の統計量の測定結果を示す図である。
【図２５】図２５は、実施の形態１に示したセンサ基板の製造方法における工程１を示す断面図である。
【図２６】図２６は、実施の形態１に示したセンサ基板の製造方法における工程２を示す断面図である。
【図２７】図２７は、実施の形態１に示したセンサ基板の製造方法における工程３を示す断面図である。
【図２８】図２８は、実施の形態１に示したセンサ基板の製造方法における工程４を示す断面図である。
【図２９】図２９は、実施の形態１に示したセンサ基板の製造方法における工程５を示す断面図である。
【図３０】図３０は、実施の形態１に示したセンサ基板の製造方法における工程６を示す断面図である。
【符号の説明】
【００４２】１  検体細胞
５１  測定溶液
５２  第一の溶液
１０１  基板
１０２  測定電極
１０３  参照電極
１０４  ウェル（第一のウェル）
１０５  リード線（測定電極１０２側）
１０６  絶縁膜
１０７  外部接続部（測定電極１０２側）
１０８  リード線（参照電極１０３側）
１０９  外部接続部（参照電極１０３側）
１１１  電極接点ピン
１１２  第二のウェル
１１３  交換口
１１４  チューブ
１１５  開口
１１６  微小くぼみ
１１７  貫通孔
１１８  底面基板
１１９  溶液保持部
１２０  医薬品安全性試験センサ
１２１  センサ設置台
１２２  センサ基板（小片基板）
１３１  ウェル形成体
１３１ａ  開口
１４０  基板
１４１  ベース
１４２  中間層
１４３  薄板
１４４  レジスト膜（ベース側）
１４５  レジスト膜（薄板側）
１４５ａ  パターン
１４６  保護膜
１５０  医薬品安全性試験システム
１５１  遮蔽箱
１５２  第一の増幅部
１５３  第二の増幅部
１５５  計算処理部（コンピュータ）
１５６  測定環境調節装置
１５７ａ  ウェル内溶液置換装置
１５７ｂ  ウェル内溶液排出装置
１５８  溶液切替装置
１５９  注入管
１６０  排出管
Ｌ１  測定溶液溜め
Ｌ２  陽性対照試薬溶液溜め
Ｌ３  試験医薬品Ａ溶液溜め
Ｌ４  試験医薬品Ｂ溶液溜め
Ｌ５  第二の溶液５３溜め
Ｌ６  第二の溶液５４溜め
Ｐ  検体細胞１導入装置
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】  以下、本発明の好ましい実施の形態を、図面を参照しながら説明する。【００４４】  （実施の形態１）
図１Ａ及び図１Ｂは、本発明の実施の形態１における医薬品安全性試験方法の工程を示すフローチャートである。以下、本実施の形態を、図１Ａ及び図１Ｂを参照しつつ説明する。【００４５】  本発明の医薬品安全性試験方法は、医薬品安全性試験センサの測定電極の近傍に検体細胞を用意（ステップＳ０）した後、測定電極からの電気信号に基づく電圧信号であって、検体細胞が接する溶液が、被試験医薬品が存在しない対照溶液である場合における検体細胞のＨＥＲＧチャネルの情報を含む電圧信号を測定する工程（ステップＳ１、ここでの電圧信号をａとする）と、検体細胞が接する溶液が、被試験医薬品が存在する測定溶液である場合における検体細胞のＨＥＲＧチャネルの情報を含む電圧信号を測定する工程（ステップＳ２、ここでの電圧信号をｂとする）と、検体細胞が接する溶液を再び被試験医薬品が存在しない対照溶液に戻した場合における検体細胞のＨＥＲＧチャネルの情報を含む電圧信号を測定する工程（ステップＳ３、ここでの電圧信号をｃとする）と、ステップＳ１とステップＳ３の電圧信号を比較する工程（ステップＳ４Ａ）、又はステップＳ２とＳ３の電圧信号を比較する工程（ステップＳ４Ｂ）と、かかる電圧信号の比較結果に基づいて、被試験医薬品の危険性を判断する工程（ステップＳ５、Ｓ６及びＳ７、並びにステップＳ８、Ｓ９及びＳ１０）からなる。【００４６】  ステップＳ１において検体細胞が接する対照溶液と、ステップＳ３において検体細胞が接する対照溶液とは、成分が同じものである。ステップＳ２において検体細胞が接する測定溶液と、ステップＳ１又はＳ３において検体細胞が接する対照溶液とは、被試験医薬品が存在するか否かのみが異なるものであるとする。また、ステップＳ１又はＳ３において、検体細胞が接する対照溶液は、測定溶液の被試験医薬品に換えて陽性対照試薬又は陰性対照試薬を添加したものであっても良い。【００４７】  ここで、ステップＳ２において、被試験医薬品がＨＥＲＧチャネルを拮抗すると、上述したようにカリウムイオンの出入りが阻害され、再分極が起こらなくなるため、電圧信号はａ＜ｂとなる。一方、被試験医薬品がオープンチャネル型の拮抗剤でなければ、ステップＳ３において、被試験医薬品がＨＥＲＧチャネルから離れるため、電圧信号はｂ＞ｃとなるが、オープンチャネル型の拮抗剤であればｂ≒ｃとなる。【００４８】  すなわち、ステップＳ４Ａにおける電圧信号の比較とは、例えば、（１）電圧信号ａ及びｃの差［ａ−ｃ］を検出し、その値が一定の基準値以下になるか否か判定すること、（２）電圧信号ａと電圧信号ｃの比［ｃ／ａ］を検出し、その値が一定の基準値以下になるか否か判定することをいう。同様に、ステップＳ４Ｂにおける電圧信号の比較とは、例えば、（１）電圧信号ｂ及びｃの差［ｂ−ｃ］を検出し、その値が一定の基準値以上になるか否か判定すること、電圧信号ｂとｃの比［ｃ／ｂ］を検出し、その値が一定の基準値を超えるか否か判定することをいう。【００４９】  図１Ａは、ステップＳ４ＡでステップＳ１とＳ３の測定結果を比較する場合のフローチャートを示す。図１Ａに示すフローチャートでは、ステップＳ４Ａの比較結果に基づき、ステップＳ５〜Ｓ７において被試験��薬品の安全性を評価する。ステップＳ４Ａでａ及びｃを比較した結果、ステップＳ５において測定結果（電圧信号）に差がない（例えば、［ｃ／ａ］が一定値以下である）と判断された場合、その被試験医薬品は、ＨＥＲＧチャネルを拮抗するオープンチャネル型の拮抗剤ではないために、「催不整脈作用なし」と判定される（ステップＳ６）。【００５０】  ステップＳ５において、測定結果（電圧信号）に差がある（例えば、［ｃ／ａ］が一定値を超える）と判断された場合、その被試験医薬品は、ＨＥＲＧチャネルを拮抗するオープンチャネル型の拮抗剤であることになり、「催不整脈作用あり」と判定される（ステップＳ７）。【００５１】  一方、図１Ｂは、ステップＳ４ＢでステップＳ２とＳ３の測定結果を比較する場合のフローチャートを示す。図１Ｂに示すフローチャートでは、ステップＳ４Ｂの比較結果に基づき、ステップＳ８〜Ｓ１０において被試験医薬品の安全性を評価する。ステップＳ４Ｂでｂ及びｃを比較した結果、ステップＳ８において測定結果（電圧信号）に差がある（例えば、［ｃ／ｂ］が一定の基準値以下である）と判断された場合、その被試験医薬品は、「催不整脈作用なし」と判定される（ステップＳ９）。【００５２】  ステップＳ８において、測定結果（電圧信号）に差がない（例えば、［ｃ／ｂ］が一定の基準値未満である）と判断された場合、その被試験医薬品は、ＨＥＲＧチャネルを拮抗するオープンチャネル型の拮抗剤であることになり、「催不整脈作用あり」と判定される（ステップＳ１０）。【００５３】  ［医薬品安全性試験システムのセンサ］
次に、本発明の医薬品安全性試験システムに用いるセンサの構造を説明する。図２は、本実施の形態の医薬品安全性試験システムに用いるセンサの構造を模式的に示す断面図である。また、図３は、図２に示すセンサの上面図である。本実施の形態のセンサ１２０は、基板１０１と、基板１０１の上に構築された溶液保持部１１９とからなる。溶液保持部１１９は、測定溶液５１を保持するための複数のウェル１０４と、参照電極１０３を備える。【００５４】  基板１０１の上面には、複数の島状の測定電極１０２が所定の位置に形成されている。また、基板１０１の上面には、縁部に位置するように各測定電極１０２に対応させて外部接続部１０７が形成され、この外部接続部１０７とその対応する測定電極１０２とを接続するようにリード線１０５が形成されている。そして、基板１０１の上面の、測定電極１０２及び外部接続部１０７が形成された部分を除く部分を覆うように絶縁膜１０６が形成されている。絶縁膜１０６の測定電極１０２の周囲に位置する部分は測定電極１０２に向けてすり鉢状に窪んで凹部１０６ａを形成している。絶縁膜１０６上には膜状のウェル形成体１３１が形成されている。【００５５】  ウェル形成体１３１には、各測定電極１０２の上面とその周囲の凹部１０６ａを含む絶縁膜１０６の上に位置するように開口１３１ａがそれぞれ形成されていて、各測定電極１０２の上面及びその周囲の絶縁膜１０６とこの開口１３１ａの内周面とで囲まれた空間がウェル１０４を構成している。この開口１３１ａの縁部及び内周面に沿うように鍔付き筒状の参照電極１０３が形成されている。また、ウェル形成体１３１の上面の縁部には、各ウェル１０４に対応させて外部接続部１０９が形成され、この外部接続部１０９がウェル形成体１３１の上面に形成されたリード線１０８によってその対応するウェル１０４の参照電極１０３に接続されている。そして測定時には、外部接続部１０７に第１の増幅部１５２が接続され、外部接続部１０９は接地される。【００５６】  電位測定時に、検体細胞１は、測定電極１０２の近傍に配置される。測定電極１０２からの電位信号は、リード線１０５、外部接続部１０７、第一の増幅部１５２を介して、参照電極１０３の電位を基準として測定される（以下、測定電極１０２からの電位信号と、参照電極１０３からの電位信号の差を、測定電極１０２からの電圧信号ともいう）。【００５７】  参照電極１０３の電位はリード線１０８、外部接続部１０９を介して検出される。これにより、測定電極１０２近傍に配置された検体細胞１に起因する電圧信号が測定電極１０２にて測定される（上述の工程Ｂ）。【００５８】  なお、電位測定時には、図２に示したように、測定電極１０２の近傍に検体細胞１が配置されるが、図３では、細胞は省略して、センサ１２０の構成のみを表示する。センサ１２０の詳細な構成及び作成方法については後述する。【００５９】  ［検体細胞］
本発明の医薬品安全性試験に用いられる検体細胞は、ＨＥＲＧチャネルを有する。検体細胞は、ＨＥＲＧチャネルを予め内在した細胞、ＨＥＲＧチャネルを後から導入した細胞のいずれであっても良い。【００６０】  ここで、ＨＥＲＧチャネルとは、細胞内及び細胞膜上に存在する生体構成要素であって、人体に対する危険性を有する被試験医薬品が作用する対象を指す。本発明の医薬品安全性試験が適用できるＨＥＲＧチャネルの作用は、危険性を有する被試験医薬品に対して、活性化される場合と、不活性化される場合の、どちらであっても良い。以下では、具体的にＨＥＲＧチャネルが不活性化される時に危険性が増大する場合にのみ記述するが、それだけに限定されない。【００６１】  そのようなＨＥＲＧチャネルとしては、細胞膜上に存在するイオンチャネル、細胞内に存在する情報伝達物質、代謝産物等の各種タンパク質、核酸類と、それらの改変物などが挙げられる。特に、本発明の主要な応用例である、薬物誘発性ＱＴ延長症候群を例にとると、ＨＥＲＧチャネルには、ＨＥＲＧイオンチャネルや遅延整流性カリウムイオンチャネル、先天性ＱＴ延長症候群の原因遺伝子ＬＱＴなどが挙げられる。また、前述のＨＥＲＧチャネルを予め内在した検体細胞としては、モルモット乳頭筋標本やイヌＰｕｒｋｉｎｊｅ線維の細胞、モルモット心筋細胞、モルモット心房筋細胞などが挙げられ、後からＨＥＲＧチャネルを導入される宿主細胞として利用可能な検体細胞は、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、アフリカツメガエルの卵母細胞などが挙げられる。【００６２】  ＨＥＲＧチャネルの導入は、ＨＥＲＧチャネルを発現する遺伝子を当業者に公知の遺伝子導入技術を用いて導入することができる。実験毎にベクターなどのＨＥＲＧチャネル発現遺伝子を導入する一過性発現細胞、ＨＥＲＧチャネル発現遺伝子を定常的に発現するように改変された定常発現細胞の両方を用いることができるが、定常発現細胞はＨＥＲＧチャネルの発現が定常的に起こっているので、測定誤差の観点から優れているため、定常発現細胞を用いることが望ましい。【００６３】  ［準備工程の詳細］
図４は、測定に先だって、ＨＥＲＧイオンチャネルを含む検体細胞を、医薬品安全試験センサの測定電極の近傍に用意する準備工程（工程Ｏ、図１のステップＳ０）の詳細を示すフローチャートである。この準備工程は、実線で示すように、センサ１２０のウェル１０４に溶液を満たす工程（ステップＳ２１）、ウェル１０４に満たされている溶液を、所望の検体細胞１を所定の量だけ懸濁させた細胞懸濁液に置換する工程（ステップＳ２３）からなる。このような工程により、測定電極１０２の近傍に検体細胞を配置することができる。【００６４】  なお、図４に点線矢印で示すように、準備工程（ステップＳ０）を、ステップＳ２１、測定電極１０２の近傍及び基板１０１表面の領域に固定化剤を固定化する工程（ステップＳ２２）、ステップＳ２３、細胞を培養する工程（ステップＳ２４）の順に遂行する工程としてもよい。【００６５】  本発明の医薬品安全性試験方法に用いる溶液とは、２０ｍＭ〜４００ｍＭの塩化ナトリウムを主成分とする生理食塩水溶液、及び種々の栄養素、成長因子、抗生物質などを含有する培養液、所定の化学物質、化合物、薬剤を溶解させた緩衝溶液などを指す。溶液は、予め脱気されているものを使用すると好ましい。また、溶液は、例えば、４℃から４０℃の範囲内に温度設定されているものを用いることができる。【００６６】  なお、固定化剤とは、細胞の固定化を容易及び／又は強固にする材料のことをいう。固定化剤の固定化は、センサ１２０の作製途中である、ウェル１０４を設置する前に行っても良い。【００６７】  細胞を固定化する固定化剤の固定化材料としては、通常、誘電体が用いられる。誘電体としては、強塩基性もしくは強酸性官能基を持つ高分子が好適に用いられる。具体的には、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリオルニチン（ＰＯ）、ポリリジン（ＰＬ）等の正荷電性ポリマーが好適に用いられる。正に荷電したこれらのポリマーは、負に荷電した細胞を引き付ける効果も併せ持つ。同様に、細胞接着能を併せ持つ材料は、ビグアニド基、もしくはカルバモイルグアニジド基を持つ高分子が上げられる。具体的にはアリルビグアニド−ｃｏ−アリルアミン（ＰＡＢ）、アリル−Ｎ−カルバモイルグアニジノ−ｃｏ−アリルアミン（ＰＡＣ）が好適に用いられる。また、マトリクス材料を用いることができる。マトリクス材料として、細胞接着性のタンパク質が好適に用いられ、かかるタンパク質としてはコラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン等が挙げられる。【００６８】  固定化剤による被覆は、上記固定化材料を所定の濃度で溶解させた固定化溶液を、測定電極１０２上に曝し、所定時間経過後、測定電極１０２の表面から固定化溶液を取り除き、表面を洗浄液で少なくとも１回以上洗浄し、乾燥することにより行うことができる。又は、上記固定化溶液を、測定電極１０２の上面だけにスポットし、被覆する方法であっても良い。【００６９】  培養液内に播種された細胞は、培養が進行すると同時に、付着性細胞が、固定化剤が固定化されている場合はこれを介して、測定電極１０２上に強固に固定化される。【００７０】  ［測定開始以降の工程の詳細］
上述した準備工程（図１のステップＳ０）の後、ステップＳ１（工程Ａ）として、センサ１２０の測定電極１０２において検体細胞１が発する電圧信号が、被試験医薬品との対照として、被試験医薬品だけを省いた対照溶液に対して測定される。【００７１】  次に、ステップＳ１の後、ステップＳ２（工程Ｂ）として、センサ１２０の測定電極１０２において検体細胞１が発する電圧信号が、被試験医薬品を所定の濃度で含有する測定溶液に対して測定される。【００７２】  次に、ステップＳ２の後、ステップＳ３（工程Ｃ）として、センサ１２０の測定電極１０２において検体細胞１が発する電圧信号が、再び対照溶液に戻した時に測定される。例えば、検体細胞１のＨＥＲＧチャネルが通常時に常時活性化している場合においては、そのまま測定電極１０２で電圧信号を測定するだけで良い。あるいは、例えば、検体細胞１のＨＥＲＧチャネルが通常時に不活化している場合においては、検体細胞１のＨＥＲＧチャネルを活性化するために、検体細胞には刺激が与えられる。【００７３】  なお、刺激を与える場合の試験方法については、実施の形態５に詳述する。また、工程Ａにおいて、電圧信号を検出する回数は任意であり、各測定溶液及び各対照溶液に対して複数回測定しうる。【００７４】  次に、ステップＳ４として、ステップＳ１において測定された測定電極１０２の電圧信号と、ステップＳ３において測定された測定電極１０２の電圧信号の測定結果を比較するか、又はステップＳ２において測定された測定電極１０２の電圧信号と、ステップＳ３において測定された測定電極１０２の電圧信号の測定結果を比較する。なお、両方の測定結果を比較しても良い。具体的な比較方法の一例は、上述した通りである。【００７５】  ここで、ステップＳ１で測定された測定電極１０２の電圧信号と、ステップＳ２で測定された測定電極１０２の電圧信号とを比較することによって、被試験医薬品が与える検体細胞１のチャネルへの拮抗影響を抽出することができる。【００７６】  また、ステップＳ２において測定された測定電極１０２の電圧信号と、ステップＳ３において測定された測定電極１０２の電圧信号と比較することによって、被試験医薬品が与える検体細胞１のチャネルへの拮抗形式を抽出することができる。【００７７】  対照溶液としては、上述した被試験医薬品が非存在の対照溶液の他に、陽性対照試薬又は陰性対照試薬存在下の対照溶液を、代わりに、もしくは、さらに、適用できる。【００７８】  ステップＳ４Ａにおける電圧信号の比較は、一つのウェル１０４内の溶液を交換することによって実現される（方法α）が、ステップＳ１〜Ｓ３に示した測定溶液及び対照溶液のそれぞれが入った異なるウェル１０４の測定電極１０２の電圧信号を、直接比較することによっても実現することができる（方法β）。方法αは、特に同じ細胞からの信号を測定することになり、信頼性の高い測定が実施でき、また、方法βは、溶液を交換することがないため、高い処理速度で電圧信号差を検出することができる。【００７９】  最後に、ステップＳ５として、ステップＳ４Ａにおける電圧信号の比較結果に基づいて、被試験医薬品の危険性を判定する。なお、ステップＳ４Ａにおける電圧信号の比較は、���圧信号の振幅値を比較して評価することが望ましい。ステップＳ４Ｂについても同様である。【００８０】  なお、以下においては、全て図１Ａに示すフローチャートの例、すなわち、ステップＳ１（工程Ａ）とステップＳ３（工程Ｃ）の電圧信号の差を比較することによって、被試験医薬品の安全性を評価する方法及びシステムについて説明する。【００８１】  ＨＥＲＧチャネルの拮抗形式は特徴的であるため、上述したように、ステップＳ４Ａで計算される、ステップＳ１及びステップＳ３における電圧信号の振幅の差で判定できる。催不整脈作用を有する拮抗剤（被試験医薬品）は、チャネルの孔（ポア）に拮抗剤が不可逆的にはまり込む、オープンチャネルブロッカー型である。このため、チャネル閉塞率に依存して、電圧信号の振幅値が変化する。よって、具体的には、電圧信号の振幅を、イオンチャネル開閉が現れる小区間に切り出して、小区間での電圧信号の振幅の標準偏差値を、その小区間の代表値として度数分布化させることによって、容易に被試験医薬品の危険性を定量的に解析できる。つまり、測定用電極１０２の電圧信号の振幅値が大きいほど、度数分布のピーク値が大きくなり、電圧信号の振幅値がばらつくほど、度数分布の半値幅は大きくなる。【００８２】  また、別の電圧信号の差の解析方法としては、予め設定した設定電圧閾値をまたぐゼロクロス時間を指標として評価しても良い。つまり、設定電圧閾値より大きい電圧信号を出している時間は、危険要素が活性化された時間を示すので、上記の時間が長いということは、被試験医薬品の危険性が増す。前述の小区間で区切って度数分布化する解析法で解析する全体の時間は、上記のゼロクロス時間と等しく設定しても良い。【００８３】  いずれの解析方法においても、測定電極の電圧信号を測定する本発明の医薬品安全性試験方法及びシステムにおいては、被試験医薬品の危険度が増大すると、電圧信号が増大する方向に表れるため、最低検知感度を高くすることができ、信頼性の高い安全性試験を実施することができるという特徴も備える。【００８４】  図５に、図１Ａに示すフローチャートに、さらに異なる工程を付加した医薬品安全性試験方法のフローチャートを示す。図５に示した方法においては、ステップＳ１（工程Ａ）の前に、検体細胞１のＨＥＲＧチャネルの活動に由来する電圧信号をさらに大きく測定するために、予め、同様に活性化している非ＨＥＲＧチャネルを不活化させる工程（ステップＳ１１）を持つ。これは、例えば、非ＨＥＲＧチャネルだけを選択的に拮抗する拮抗剤を溶液に混合させておくことにより実現される。かかる構成により、ＨＥＲＧチャネルの活性化電圧信号だけを測定することができ、目的の電圧信号を感度良く検出するために有効である。【００８５】  ［センサの詳細構成と作製方法］
本実施の形態に示された医薬品安全性試験方法に用いられるセンサ１２０の構成は、上述したように、図２及び図３に示した。ここで、図２及び図３を参照しつつ、さらにその構成を詳述し、また、センサ１２０の作成方法も説明する。【００８６】  測定電極１０２の数は、特に限定されず、各ウェル１０４に一つであっても、複数であっても良い。各ウェル１０４に一つの測定電極１０２が配置される場合には、一つのセンサ１２０上に多くのウェル１０４を集積化することができ、本発明の医薬品安全性試験を並列的に処理する能力が向上し、短時間で多数の試験を実施できる。また、各ウェル１０４に複数の測定電極１０２が配置される場合には、複数の測定データによる統計処理が可能となるので、各ウェル１０４で実施される試験の確度が向上し、高い信頼性を実現することができる。さらに、一つの測定電極１０２は、一つの細胞からの電位信号、及び複数の細胞の電位信号の集合を測定しても良い。【００８７】  測定電極１０２からの電位信号を伝えるリード線１０５を被覆し、絶縁するために絶縁層を設けても良い。絶縁層の材料としては、ポリイミド（ＰＩ）樹脂、エポキシ樹脂などの樹脂が挙げられる。好ましくは、ネガティブフォトセンシティブポリイミド（ＮＰＩ）などの感光性樹脂が用いられる。感光性樹脂を用いる場合、まず、センサ部上面全体に感光性樹脂を塗布し、その後、フォトエッチングによるパターン形成を利用して、測定電極１０２上及びリード線１０５の外部接続部１０７の上に形成された絶縁層を取り除くことにより、該電極１０２及び外部接続部１０７を露出させ、任意の領域に絶縁層を形成することが可能となる。生産効率の点から、上述した方法により、絶縁層を形成することが好ましい。【００８８】  溶液保持部１１９は、ウェル１０４を複数有し、その内部に測定溶液５１（ウェル１０４内部には、測定溶液及び対照溶液が添加されうるが、以下においては両者を区別することなく単に測定溶液ともいう）を蓄えることができる。また、参照電極１０３を有し、測定溶液５１を介して測定電極１０２と電気的に導通する。【００８９】  図示していないが、各ウェル１０４に測定溶液５１の導入及び置換を実現するために、注入管が溶液保持部１１９の近傍に配置されても良い。注入管は、各ウェル１０４に測定溶液５１を導入する目的を達成するのであれば、どのような形態でも取りうる。一例を挙げれば、ウェル形成体１３１に流路を形成し、この流路を通じて測定溶液５１を測定電極１０２に向けて流しても良いし、ウェル形成体１３１に注入管の外径とほぼ等しい穴を電極１０２に向けて掘り、そこに注入管を差し込み固定しても構わない。【００９０】  好適には、注入管は、溶液保持部１１９の上面に配置され、複数の各ウェル１０４に測定溶液５１が導入できるように移動機構を併設することが望ましい。また、必要に応じて、測定溶液５１を交換するための排出管を備えても良い。かかる構成により、細胞１の培養に際しては、ウェル１０４内で培養液５１にて長期培養することができ、また、測定に際しては、被試験医薬品剤不存在の測定溶液５１と被試験医薬品剤存在の測定溶液５１を交換することができるようになるため、医薬品安全性試験を迅��に測定することができる。【００９１】  参照電極１０３は、ウェル１０４内で測定溶液５１と一部分を接触し、かつ、測定電極１０２と直接導通しないように配置される。参照電極１０３は、ノイズを低減するためにその面積を十分大きくする必要がある。具体的には、参照電極１０３の面積の合計は、すべての測定電極１０２の面積の合計に対して５倍以上大きい構成となるように形成されているのが望ましい。参照電極１０３の最表面は、金、白金、銀−塩化銀などの材料で作製されたものであるが、図２に示すように、ウェル１０４と一体化して、細胞が固定される部分とその近傍を除いた面に形成させても良い。この場合、参照電極１０３は、ウェル１０４毎に個別に用意しても良いし、全面に形成させても良い。【００９２】  かかる構成は、複数の測定電極１０２を有するセンサ１２０を実現すること、参照電極１０３面積を大きくすることが容易であり、かつ、薄膜形成化技術を用いることでセンサ１２０の効率的な生産の面からも望ましい。また、参照電極１０３は、上記にこだわらず、棒状電極をウェル１０４内の測定溶液５１に浸すなど任意の形であり得る。【００９３】  次に、センサ１２０の作製方法の一例を示す。まず、電極材料を基板１０１上に蒸着した後、フォトレジストを用いてエッチングすることにより、電極１０２と、対応するリード線１０５及び外部接続部１０７を１セットとして、かかるセットを複数セット有する所望のパターンを形成する。その後、電極１０２上及び外部接続部１０７を除く上記パターンの上面と基板１０１の上面とを絶縁層で被覆する。そして、基板を所定角の小片基板１０１に切り出す。電極１０２のパターンは、予め前記パターンを形成させたステンシルマスクを通じて蒸着するマスク法や、リフトオフ法によって形成しても良い。このように形成された小片基板１０１の上面に、当業者に既知の方法で凹部１０６ａを作製し、参照電極１０３を形成した溶液保持部１１９（ウェル形成体１３１）を接着し、センサ１２０を得る。【００９４】  ［医薬品安全性試験システム（１）］
図６−Ａは、本実施の形態の医薬品安全性試験システムの一例を模式的に示すブロック図である。図６−Ａに示すように、医薬品安全性試験システム１５０Ａは、医薬品安全性試験センサ１２０と、少なくともセンサ１２０を静電的に遮蔽する遮蔽箱１５１と、センサ１２０上の測定電極１０２と参照電極１０３間の電圧信号を増幅処理する第一の増幅部１５２と、第一の増幅部１５２で増幅された電圧信号のうち、所定の周波数帯域だけの信号成分を更に増幅処理する第二の増幅部１５３、第二の増幅部１５３で増幅された電圧信号をデータ処理する計算処理部１５５と、測定環境調節装置１５６と、複数の測定溶液又は薬剤溶液をウェル１０４内に導入及び置換するためのウェル内溶液置換装置１５７ａと、ウェル１０４内の測定溶液又は薬剤溶液を排出するウェル内溶液排出装置１５７ｂと、溶液切替装置１５８とを有している。【００９５】  このような構成とすることにより、簡易なシステムで、多数の医薬品候補薬剤の危険性を迅速に検出するシステムを提供することができる。【００９６】  医薬品安全性試験センサ１２０において、センサ１２０内の参照電極１０３に対する測定電極１０２の電位信号は、測定電極１０２のリード線１０５を通じて、第一の増幅部１５２へと出力される。第一の増幅部１５２は、電位信号を高感度に増幅し、第二の増幅部１５３へと出力する。第二の増幅部１５３は、Ａ／Ｄ変換等を経て、計算処理部１５５へと電位信号を出力する。最後に、計算処理部１５５は、入力した電圧信号を所定の手順で比較することにより、センサ１２０内の被試験医薬品の安全性を判定する。すなわち、医薬品安全性試験システム１５０Ａにおいて、ウェル内溶液置換装置１５７ａの溶液注入及び排出によって提供される様々な薬剤に対する、標的生体構成成分の危険要素に起因する電位信号の変化を、細胞外に配置された電極１０２の電位変化として測定し得る。【００９７】  医薬品安全性試験システム１５０Ａは、医薬品安全性試験センサ１２０からの出力を処理するため、適切な測定用ソフトウェアを備えた計算処理部１５５によって一体として構成される。計算処理部１５５は、例えば、コンピュータによって構成され、測定用ソフトウェアは、コンピュータの記憶部に格納されていて、当該コンピュータの画面上に、信号処理・測定条件などを設定し得るパラメータ設定画面、細胞から検出された電位変化を記録し、リアルタイムで表示し得る記録画面、及び記録されたデータを解析し得るデータ解析画面などを与える。【００９８】  また、ウェル内溶液置換装置１５７ａ及びウェル内溶液排出装置１５７ｂは、計算処理部１５０に電気的に接続され、制御されている。計算処理部１５５は、溶液切換装置１５８に、所定のタイミングと手順でウェル内溶液置換装置１５７ａ内の溶液をセンサ１２０のウェル１０４に注入するように制御信号を送る。さらに、計算処理部１５５は、ウェル内溶液排出装置１５７ｂに、所定のタイミングと手順でウェル１０４内の溶液を排出するように制御信号を送る。このように構成されているため、予め設定した所定のタイミング、測定手順で各溶液の交換を自動的に行うことができる。【００９９】  遮蔽箱１５１は、センサ１２０を静電遮蔽するよ��設置される。遮蔽箱１５１は、センサ１２０のみならず、第一の増幅部１５２も一体として静電遮蔽することが望ましい。かかる構成により、測定電極１０２で観測される電位信号がよりノイズに対して強くなる。また、遮蔽箱１５１によりセンサ１２０は外環境から遮光されるので、光感受性の薬剤溶液を測定に用いる場合であっても、光分解を防ぐことができ、長期にわたる測定の安定性と、測定の再現性を向上させることができる。特に、上方からウェル１０４内の測定溶液５１をバッチ式に置換する方式では、遮蔽箱１５１の上方に位置する部分に開口が必要となるため、参照電極１０３をセンサ１２０上面の全面に形成させ、上記参照電極１０３を遮蔽箱１５１に接続することが好ましい。このように構成すると、信号が微小であってもＳ／Ｎ比を高くすることができ、より高感度に検出することが可能となる。【０１００】  測定環境調節装置１５６は、防振台の上に置かれ、さらに、ファラデーカゴ等の遮蔽箱で覆い、二重に静電遮蔽されている。【０１０１】  なお、医薬品安全性試験システム１５０Ａでは、センサ１２０で測定された出力信号は、第一の増幅部１５２によって初段増幅され、第二の増幅部１５３によって、さらに増幅され、周波数帯域を制限された後、Ａ／Ｄ変換器を介して計算処理部１５５であるコンピュータ（計算部）に入力される。このような構成とすることにより、センサ１２０に近い位置に第一の増幅部１５２を配置することができるので、医薬品安全性試験システム１５０Ａは、外来ノイズに強いという特徴を有する。【０１０２】  さらに、医薬品安全性試験システム１５０Ａは、所望の測定電極１０２からの電気信号を選択的に第一の増幅器に送るための回路選択器（図示せず）を備える。この回路選択器は、例えば、マルチプレクサで構成される。かかる回路選択器を備えることにより、電極の数が増えても、必ずしも第一の増幅器の数を増やす必要がなく、生産性の面から有用である。【０１０３】  ウェル内溶液置換装置１５７ａは、ここでは、ウェル１０４の上面から所定の量の溶液を注入する装置である。また、ウェル形成体１３１に固定され、各ウェル１０４から放射状に伸びて配置された注入管１５９に、薬剤種類の数だけ溶液切替装置１５８を備える。また、ウェル内溶液排出装置１５７ｂは、ウェル１０４に注入された溶液を、各ウェル１０４に接続された排出管１６０を通じて排出する装置である。これら二つの装置を有する構成により、医薬品安全性試験システム１５０Ａは、センサ１２０の細胞保持部近傍の溶液だけを迅速に置換できる。このため、複数種類の薬剤に対する、細胞の薬理特性を簡便に、かつ、精度良く検出することが可能である。【０１０４】  図６−Ａに示した、ウェル内溶液置換装置１５７ａにつながる各要素は、測定溶液溜め（Ｌ１）、陽性対照薬剤溶液溜め（Ｌ２）、被試験医薬品剤Ａ溶液溜め（Ｌ３）、被試験医薬品Ｂ溶液溜め（Ｌ４）を例示しているが、これらに限定されるものではなく、各要素を増やすことにより、複数種類の薬剤溶液を同時に判定することができる。【０１０５】  さらに、医薬品安全性試験システム１５０Ａは、センサ１２０を所定の温度、ガス濃度、湿度に保つための測定環境調節装置（図示せず��を備える。このため、細胞の播種から培養、そして測定までを一連のシステム上で行うことができ、移動に伴う滅菌などの煩雑な操作を経る必要がなく、全自動化による大量かつ効率的な測定及び判定を実施することができる。【０１０６】  図６−Ｂは、本実施の形態の医薬品安全性試験システムの別の構成例を模式的に示すブロック図である。図６−Ｂに示す医薬品安全性試験システム１５０Ｂは、ウェル内溶液排出装置１５７ｂ及び排出管１６０を有しない点でのみ、図６−Ａに示す医薬品安全性システム１５０Ａと異なる。以下、この相違点についてだけ説明する。【０１０７】  本構成例による医薬品安全性試験システム１５０Ｂでは、ウェル内溶液置換装置１５７ａがウェル１０４に溶液を予め設定した所定のタイミング、測定手順で注入し、必要な電圧信号を測定した後、ウェル１４０内の溶液を順次排出する。なお、ウェル内溶液置換装置１５７ａは、溶液の注入のみ行い、使用者がウェル１０４内の溶液を、ピペッティングやアスピレータ等を用いて排出するように構成しても良い。この場合、ウェル１０４内の溶液を排出した後、ウェル内溶液置換装置１５７ａを再び作動させ、測定を続行する。このような構成としても、医薬品安全性システム１５０Ａと同じ医薬品安全性評価機能を発揮できる。【０１０８】  図６−Ｃは、本実施の形態の医薬品安全性試験システムのさらに別の構成例を模式的に示すブロック図である。図６−Ｃに示す医薬品安全性試験システム１５０Ｃは、ウェル内溶液置換装置１５７ａ、ウェル内溶液排出装置１５７ｂ、溶液切換装置１５８、注入管１５９及び排出管１６０を有しない点でのみ、図６−Ａに示す医薬品安全性システム１５０Ａと異なる。以下、この相違点についてだけ説明する。【０１０９】  本構成例による医薬品安全性試験システム１５０Ｃでは、使用者がウェル１０４に所定のタイミング、測定手順で、溶液をピペッティング等の手段で注入し、必要な電圧信号を測定した後、ウェル１０４内の溶液を、マイクロチューブとアスピレータ等を用いて排出する。そして、別の溶液をピペッティング等の手段で注入し、電圧を測定する。このように、ウェル１０４への溶液の注入、溶液の排出、溶液の切換を全て手動としても、医薬品安全性システム１５０Ａと同じ医薬品安全性評価機能を発揮できる。【０１１０】  （実施の形態２）
図７−Ａは、本発明の実施の形態２の医薬品安全性試験方法の工程を示すフローチャートである。本実施の形態と実施の形態１との違いは、ステップＳ１２を含むことのみであるので、以下、本実施の形態については、この相違点だけ説明する。【０１１１】  ステップＳ１２は、検体細胞１が測定溶液と接した状態で電圧信号を測定する工程（ステップＳ２）と、測定溶液を対照溶液に再び交換した状態で電圧信号を測定する工程（ステップＳ３）を繰り返す工程である。ステップＳ１２によると、被試験医薬品の頻度刺激特性を知ることができる。一般に、危険要素が示す拮抗応答は、被試験医薬品によって、被試験医薬品が繰り返し与えられる時に増強する型と、減衰する型と、変わらない型の３種類が存在する。上記の頻度刺激情報は、被試験医薬品を実際に医薬品として長期間慢性的に人体に処方する際に、人体に対する危険性が発生するか否かの貴重な判断材料を提供する。なお、ステップＳ２及びステップＳ３において、電圧信号を検出する回数は任意であり、各被試験医薬品に対して複数回測定しうる。【０１１２】  ここで、ステップＳ１２では、ステップＳ２とステップＳ３を所定回数繰り返すまでは、ステップＳ２１からステップＳ２に戻る。そして、ステップＳ２とステップＳ３を所定回数繰り返せば、ステップＳ２１からステップＳ４Ａへと進み、ステップＳ１２は終了する。【０１１３】  なお、ステップＳ４Ａにおける測定結果の比較は、所定回数ごとのステップＳ２とステップＳ３の測定値を用いてもよいし、全ての測定値の平均値を用いても良い。前者の場合、ＣとＡの差が所定回数ごとにどのように変化するかがわかる。変化が回数を追う毎に増加すると、被試験医薬品を実際に医薬品として長期間慢性的に人体に処方する際に、蓄積効果により人体に対する危険性が発生する可能性があると判断できる。【０１１４】  （実施の形態３）
図７−Ｂは、本発明の実施の形態３の医薬品安全性試験方法の工程を示すフローチャートである。本実施の形態と実施の形態２との違いは、ステップＳ１２がステップＳ１３に代わることのみであるので、この相違点だけ説明する。【０１１５】  ステップＳ１３は、ステップＳ１２と同じく、検体細胞１が測定溶液５１と接した状態で電圧信号を測定する工程（ステップＳ２）と再び対照溶液に戻した状態で電圧信号を測定する工程（ステップＳ３）を繰り返す工程である。そして、ステップＳ１３では、ステップＳ２とステップＳ３において、同じ検体細胞１に対し、種類の異なる被試験医薬品を含む溶液に交換して電圧測定を行う。【０１１６】  ここで、ステップＳ１３では、ステップＳ２とステップＳ３を所定回数繰り返すまでは、被試験医薬品の種類を変更した測定溶液に交換し（ステップＳ２２，Ｓ２３）、その後、ステップＳ２に戻る。ステップＳ２とステップＳ３を所定回数繰り返せば、ステップＳ４Ａへと進み、ステップＳ１３は終了する。【０１１７】  ステップＳ１３によると、被試験医薬品の複合作用特性を知ることができる。一般に、危険要素が示す拮抗応答は、単独の被試験医薬品によって起こる型と、複数種の被試験医薬品が順番に作用して起こる型が存在する。上記の複合作用特性情報は、被試験医薬品を実際に医薬品として人体に処方する際に、人体に対する危険性が発生するか否かの貴重な判断材料を提供する。【０１１８】  なお、ステップＳ４Ａにおける測定結果の比較は、所定回数ごとのステップＳ２とステップＳ３の測定値を用いてもよいし、ステップＳ２とステップＳ３を所定回数繰り返した最終の測定値を用いても良い。後者の場合、初回の回数の測定値に差がなく、最終の測定値に差があるなら、単独の被試験医薬品ではなく、複数の被試験医薬品の組合せによって初めて、催不整脈作用を示すという情報が得られる。【０１１９】  （実施の形態４）
図７−Ｃは、本発明の実施の形態４の医薬品安全性試験方法の工程を示すフローチャートである。本実施の形態と実施の形態２との違いは、ステップＳ１２がステップＳ１４に代わることのみであるので、この相違点だけ説明する。【０１２０】  ステップＳ１４は、ステップＳ１２と同じく、検体細胞１が測定溶液５１と接した状態で電圧信号を測定する工程（ステップＳ２）と再び対照溶液に戻した状態で電圧信号を測定する工程（ステップＳ３）を繰り返す工程である。そして、ステップＳ１４では、ステップＳ２とステップＳ３が、同じ検体細胞１に対し、濃度の異なる同一被試験医薬品を含む溶液に交換して電圧測定を行う。通常は、濃度の薄い被試験医薬品から濃度の濃い被試験医薬品へと進める。これにより、どの濃度で催不整脈作用が起こり始めるかといった危険濃度を知ることができる。【０１２１】  ここで、ステップＳ１４では、ステップＳ２とステップＳ３を所定回数繰り返すまでは、被試験医薬品の濃度が異なる測定溶液に交換し（ステップＳ２４，Ｓ２５）、その後、ステップＳ２に戻る。ステップＳ２とステップＳ３を所定回数繰り返せば、ステップＳ４Ａへと進み、ステップＳ１４は終了する。【０１２２】  なお、ステップＳ４Ａにおける測定結果の比較は、所定回数ごとのステップＳ２とステップＳ３の測定値を用いてもよいし、全ての測定値の平均値を用いても良い。【０１２３】  ステップＳ１４によると、被試験医薬品の濃度依存性を算出することができる。上記の情報は、被試験医薬品を実際に医薬品として人体に処方する際の安全処方量を算出するための貴重な判断材料を提供する。【０１２４】  （実施の形態５）
図８は、本発明の実施の形態５の医薬品安全性試験方法のフローチャートを示す図である。本実施の形態と実施の形態２との違いは、ステップＳ１及びステップＳ３の前に、検体細胞１が接する対照溶液を、測定溶液と対照溶液の中に共通に含まれるイオンの濃度を異ならせた対照溶液に交換する工程（それぞれ、ステップＳ１５及びステップＳ１７）と、ステップＳ２の前に、検体細胞が接する測定溶液を、ステップＳ１５でイオン濃度を異ならせた対照溶液と同じイオン濃度の測定溶液に交換する工程（ステップＳ１６）を有することのみであるので、この相違点だけ説明する。【０１２５】  ステップＳ１１の次に、測定溶液と対照溶液の中に共通に含まれるイオンの濃度を異ならせた対照溶液をウェルに注入し（ステップＳ１５）、この対照溶液について電圧信号を測定する（ステップＳ１）。次に、ステップＳ１終了後、ウェル内の対照溶液を、イオン濃度が異なる測定溶液に交換し、（ステップＳ１６）、この測定溶液について電圧信号を測定する（ステップＳ２）。さらに、ステップＳ２終了後、ウェル内の測定溶液を、イオン濃度が異なる対照溶液に再び交換し（ステップＳ１７）、この対照溶液について電圧信号を測定する（ステップＳ３）。【０１２６】  そして、ステップＳ１６，Ｓ２，Ｓ１７，Ｓ３を所定回数繰り返す。そして、これらを所定回数繰り返せば、ステップＳ４Ａへと進み、ステップＳ１８（図７−ＡのステップＳ１２に相当する）は終了する。【０１２７】  本実施の形態における細胞への刺激は、溶液のイオン濃度を変化させることによる溶液刺激であり、電極を介する細胞への電気的刺激とは区別できる。つまり、本発明の医薬品安全性試験方法の効果の一つである、電気的刺激なしでの測定ができることは実現され、高感度な測定ができるという効果は十分に得られる。【０１２８】  ＨＥＲＧチャネルは、電位感受性カリウムイオンチャネルに分類されるが、活性化膜電位の閾値が静止膜電位付近にあり、浅い膜電位を持つ検体細胞では、平常時にもわずかに活性化しているため、活性化刺激は必要ないことが本発明者らによって発見された。平常時に不活化しているチャネルの例を具体的に挙げれば、受容体作動型イオンチャネル、ＧＴＰ結合タンパク、酵素や、高い閾値を持つ電位感受性イオンチャネルの一部に見られる。受容体作動型イオンチャネル、ＧＴＰ結合タンパク、酵素等のチャネルを活性化させる刺激は、受容体に結合する化学物質である。【０１２９】  このため、このチャネルを活性化させた時のセンサ応答は、具体的には、活性化物質を所定の濃度溶解させた活性化溶液をウェルに投入することによって実現することができる。また、電位感受性イオンチャネルを活性化させる場合は、溶液のイオン組成を変化させる溶液刺激が電気的刺激と同様の効果を持つということが本発明者らによって確認されている。【０１３０】  例えば、モルモット乳頭筋に存在する遅延整流性カリウムイオンチャネルは、電位感受性イオンチャネルに分類される。これらのイオンチャネルを活性化する際に溶液刺激を適用する場合には、溶液の成分中に占めるカリウムイオン濃度を上昇させることにより実現される。細胞の細胞内電位は、ネルンストの式に示されるように、細胞内外におけるカリウムイオン濃度の比によって決定されるため、細胞外に存在する溶液のカリウムイオン濃度を、例えば、２ｍＭから４０ｍＭに上昇させることにより、細胞内電位は上昇し、遅延整流性カリウムイオンチャネルが活性化される。【０１３１】  本発明の医薬品安全性試験方法は、電位感受性イオンチャネルをＨＥＲＧチャネルとする場合は、溶液刺激も適応できるが、溶液刺激は、一例として挙げたように、低カリウム濃度溶液から高カリウム濃度溶液への置換によるため、活性化応答速度が溶液拡散で律速されるため遅い。【０１３２】  なお、ステップＳ１において、電圧信号を検出する回数は任意であり、各被試験医薬品に対して複数回測定しうる。同じ大きさの溶液刺激を用い、同じタイミングで加えても良く、あるいは、刺激間隔を変化させ、複数回その応答を測定しても良い。異なるイオン濃度の刺激を用いても良い。【０１３３】  例えば、同じイオン濃度の刺激を同じタイミングで注入したときの応答を複数回測定する場合は、各々の応答の差を平均、偏差などの統計的に処理できることにより、突発的な外乱の印加による擬陽性成分を除去できることに貢献し、応答の差をより信頼性高く検出することが可能となる。【０１３４】  （実施の形態６）
本発明の実施の形態６は、本発明の医薬品安全性試験システムに使用される医薬品安全性試験センサに関する。以下、本実施の形態の医薬品安全性試験センサについて、図９から図１２を参照しながら説明する。【０１３５】  本実施の形態に示した医薬品安全性試験に用いられるセンサの構成を表す模式図を、図９から図１２に示す。本実施の形態のセンサと実施の形態１に用いられるセンサとの違いは、電極近傍に貫通孔を有することが大きな違いであるので、この相違点を中心に説明する。【０１３６】  本実施の形態のセンサは、測定電極の近傍に細胞を配置しやすいよう、貫通孔を持っている。貫通孔を持った本実施の形態の好適例であるセンサ全体の斜視図を、図１０に示す。また、センサ基板が接続された構成がより分かるよう、図１０に示す任意の３つのウェル付近を拡大表示した部分断面図を、図９に示す。また、貫通孔を持ったセンサ基板の構造がより分かるよう、図９に示す一つのセンサ基板とウェル底面近傍を拡大した部分断面図を、図１１に示す。同じく、一つのセンサ基板の下面図を、図１２に示す。図９から図１２において、図２及び図３と同一又は相当する部分には同一符号を付してその説明を省略する。【０１３７】  なお、図１０では、センサ右下付近のウェル１０４のみ、センサ基板１２２がウェル底面に固定されているように示されているが、これは、センサ基板１２２の取り付け状態を説明するために、便宜上この部分のウェル１０４についてのみ、センサ基板１２２を図示したに過ぎずない。また、図１０及び図１１では、参照電極と検体細胞等の一部構成を省略して示す。また、図９では、真ん中のセンサ基板だけにチューブ１１４が接続されているように示されているが、他のセンサ基板にも同様に接続されている。【０１３８】  本実施の形態のセンサ１２０は、図１０に示すように、多数の円柱状のウェル１０４が格子のノードに位置するように多数形成された溶液保持部１１９と、貫通孔１１７を有するセンサ基板１２２とを備えている。センサ基板１２２の取り付け方法は、センサ基板１２２の上面に測定溶液５２が溜まるのであれば任意でありうるが、好適には、図９に示すように、各ウェル（以下、第一のウェルという）１０４の底面に開口１０４ａを設け、この開口１０４ａに貫通孔１１７が位置するようにして溶液保持部１１９の下面にセンサ基板１２２が取り付けられる。測定溶液５２は、センサ基板１２２の上面に接するように、第一のウェル１０４内に満たされる。なお、本実施の形態では、センサ１２０を安定的に設置するため、図９及び図１０に示すように、センサ１２０を受けるためのセンサ設置台１２１が設けられる。もちろん、センサ設置第１２１を省略することもできる。【０１３９】  本実施の形態のセンサ１２０においては、センサ基板１２２（細胞固定化器）に、図１１に示すように、その一部に細胞保持部である微小くぼみ１１６が形成されている。また、センサ基板１２２には、微小くぼみ１１６と貫通孔１１７を介して連通する、第二の溶液を保持するための第二のウェル１１２が形成されている。溶液保持部１１９は、実施の形態１で説明したように、板状のウェル形成体１３１と参照電極１０３とを備える。センサ設置台１２１��は、電極接点ピン１１１が所定の位置に立設されており、その上にセンサ１２０が載置されている。【０１４０】  センサ基板１２２は、図１１に示すように、基板１０１を備えている。基板１０１の上面の所定位置には、１以上の半球形の微小くぼみ１１６が形成されている。基板１０１の下面の、微小くぼみ１１６が形成された領域の下方に位置する領域に、凹部からなる第二のウェル１１２が形成されている。そして、微小くぼみ１１６と第二のウェル１１２とを連通するように、基板１０１の厚み方向に貫通孔１１７が形成されている。また、基板１０１の下面には、第二のウェル１１２からその端面に至るように溝からなる交換口１１３が形成されている。そして、第二のウェル１１２の内面に膜状の測定電極１０２が形成されている。【０１４１】  一方、基板１０１の下面の縁部（端部）には膜状の外部接続部１０７が形成されている。そして、基板１０１の下面に測定電極１０２と外部接続部１０７とを接続するようにリード線１０５が形成されている。そして、外部接続部１０７を除きかつ基板１０１の下面と測定電極１０２とリード線１０５とを覆うように絶縁膜１０６が形成されている。測定電極１０２及び絶縁膜１０６には貫通孔１１７に連通するように貫通孔が形成されている。【０１４２】  そして、この絶縁膜が形成された基板１０１の下面に底面基板１１８が配設されている。底面基板１１８は、基板１０１の外部接続部１０７が露出するように配設されている。この底面基板１１８により第二のウェル１１２の開口が閉鎖されている。また、この底面基板１１８に溝状の交換口１１３の開放面が閉鎖されている。また、交換口１１３の外部側の端にチューブ１１４が接続されている。【０１４３】  そして、図９に示すように、センサ基板１２２の外部接続部が１０７が電極接点ピン１１１に当接するようにして、センサ１２０がセンサ設置台１２１に載置されている。【０１４４】  本実施の形態では、センサ基板１２２は、貫通孔１１７上部に設けられた微小くぼみ１１６により、生体試料である検体細胞１を密着して保持することができる。この結果、検体細胞１は、測定電極１０２近傍に配置され、検体細胞１からの電位信号が測定電極１０２にて測定される。【０１４５】  このように、貫通孔１１７の上に微小くぼみ１１６を形成することにより、検体細胞１を容易にセンサ基板１２２上に捕捉することができる。また、貫通孔１１７の下方から検体細胞１を吸引することや、貫通孔１１７の上方から検体細胞１を加圧することにより、検体細胞１の固定化をさらに容易にすることもできる。【０１４６】  測定電極１０２は、センサ基板１２２に形成された少なくとも一つの貫通孔１１７の孔内及び／又は基板１２２上面における貫通孔１１７の孔周囲に形成されることが好ましい。【０１４７】  センサ基板１２２上に形成する貫通孔１１７の数及び位置関係は任意であり、図１１及び図１２に示した数に限定されないが、貫通孔１１７は、一つの測定電極１０２に対して複数形成されている構成とすることが望ましい。具体的には、一つの測定電極１０２に対し、１個以上２０００個以下が望ましい。このような構成とすれば、検体細胞１の生存率に影響されない測定が可能となる���センサ基板１２２上における貫通孔１１７同士の位置関係は、例えば、図１２に示したように、格子のノードに位置するように配置し得る。その場合、複数の貫通孔１１７に保持された検体細胞１に起因する電気信号が、一つの電気信号として一つの測定電極１０２から検出されることになる。本実施の形態のセンサ１２０は、複数の検体細胞１の応答を同時に検出する薬品スクリーニング等において特に有用である。【０１４８】  貫通孔１１７の形状は、検体細胞１を保持しうるものであれば、特に限定されない。例えば、上面開口部が下面開口部より大きい円筒状であっても良いが、図１１に示したように、円筒状の貫通孔１１７の上部に微小くぼみ１１６を形成した形状は、微小くぼみ１１６の曲率によって、検体細胞１をより確実に貫通孔１１７との境界に密着及び保持しうるため、非常に望ましい。【０１４９】  微小くぼみ１１６は、目的の検体細胞１に依存した任意の大きさを採用することができ、目的の検体細胞１を保持しうる大きさであれば、特に制限されない。具体的な微小くぼみ１１６のサイズは、センサ基板１２２上面と同じ平面における直径が２〜５００μｍの範囲であることが好ましく、１０〜１００μｍの範囲であることがより好ましい。例えば、生体試料として用いる検体細胞１の長径が略３０μｍの場合、開口部上面の直径が略２０μｍであることが好ましい。【０１５０】  貫通孔１１７は、吸引によって測定溶液が通過し、かつ、検体細胞１が通過しない大きさであれば良い。貫通孔１１７の直径は、１〜１２５μｍの範囲であることが好ましく、直径が２〜２５μｍの範囲であることがより好ましい。例えば、貫通孔１１７の直径は、微小くぼみ１１６の直径が略２０μｍである場合には、略５μｍであることが好ましい。貫通孔１１７の長さは、任意である。【０１５１】  第二のウェル１１２には、第二の溶液が蓄えられている。第二のウェル１１２は、その底面（底面基板１１８）に開口部がない。このため、第二のウェル１１２に蓄えられた第二の溶液は、第二のウェル１１２内に重力によって保持され、貫通孔１１７及び貫通孔１１７近傍の電極１０２部から離れることがないため、安定な電圧測定が可能となる。【０１５２】  さらに、第二のウェル１１２には、第二の溶液を別の第三の溶液に交換するための交換口１１３を側面部に有している。かかる構成により、必要に応じて、ナイスタチンなどの小孔形成物質を第二のウェル１１２と接する部分の検体細胞１と接触させることができる。【０１５３】  以下、本実施の形態の医薬品安全性試験センサの作成方法について説明する。図９と図１０に示す医薬品安全性試験センサは、図１１と図１２に示すセンサ基板の作製工程、上部溶液保持部材の作製工程、及びセンサ基板と上部材の接着工程の３つの工程により形成される。【０１５４】  まず、医薬品安全性試験センサ１２０のセンサ基板１２２の作製方法について、図２５から図３０を参照しながら説明する。【０１５５】  センサ基板１２２を製造するには、まず、図２５に示すように、シリコンからなるベース１４１と、二酸化シリコンからなる中間層１４２と、シリコンからなる薄板１４３で構成される基板１４０を用意し（工程１）、次に、ベース１４１と薄板��４３の両側にレジスト膜１４４とレジスト膜１４５を積層させる。そして、ベース側のレジスト膜１４４を、所定のパターンを有するようにパターニングしてレジストマスクとする。なお、上記のような基板１４０は、ＳＯＩ基板と呼ばれ、半導体デバイスを作製する際に良く用いられ、入手は容易であるのでこの基板の製造方法については省略する。【０１５６】  次に、図２６に示すように、ベース１４１部分のエッチングを行い、第二のウェル１１２と下方が開放された溝状の交換口１１３を形成する（工程２）。このときのエッチング方法はドライエッチング、ウェットエッチングなど通常の方法を用いる。【０１５７】  次に、図２７に示すように、薄板１４３側のレジスト膜１４５を、所定位置に開口１４５ａを有するようにパターニングしてレジストマスクとする（工程３）。【０１５８】  次に、図２８に示すように、ドライエッチングによって、薄板１４３側からエッチングを行う（工程４）。このとき、エッチングガスとしてはエッチングを促進するガスのみを用いる。このため、エッチングを促進するガスにはＳＦ６、ＣＦ４、ＸｅＦ２などを用いることができる。これらはシリコンのエッチングを深さ方向だけでなく、横方向へのエッチングも促進する作用があるからである。実験ではＸｅＦ２を用いて効果を確認している。これによって、エッチングされた部分の形状は、図２８に示すようにレジスト膜１４５の開口１４５ａを中心とする半球形となり、この半球形の部分からなる微小くぼみ１１６が形成される。また、レジスト膜１４５（レジストマスク）は、ＸｅＦ２によってはほとんどエッチングされないので、図２８に示すように、最初の形状を保っている。【０１５９】  次に、図２９に示すように、再び薄板１４３側から、ドライエッチングを行って、微小くぼみ１１６の底面に薄板１１３を貫通する貫通孔１１７を形成する（工程５）。【０１６０】  このときのエッチング法は、ドライエッチングによる方法が最適であり、ドライエッチングの際にはエッチングを促進するガスと、エッチングを抑制するガスを用いる。エッチングを促進するガスとしては、ＸｅＦ２、ＣＦ４、ＳＦ６などがある。また、エッチングを抑制するガスとしてはＣＨＦ３、Ｃ４Ｆ８などがある。これらのガスを混合してエッチングすることで、エッチングされた壁面にＣＦ２のポリマーである保護膜が形成されるので、ドライエッチングによる微小貫通孔の形成をレジストマスクの下方のみに進行させることが可能となるので、微小くぼみ１１６及び貫通孔１１７が連結して形成される。【０１６１】  ここで、エッチングが下方のみに進行する仕組みを少し詳しく説明する。まず、エッチングを促進するガスによってエッチングを少しだけ行った後、エッチングを抑制するガスによって保護膜を少しだけ形成する工程を繰り返すことで、ほぼ垂直なエッチング形状とすることができるのである。この工程では、エッチングを促進するガスによるドライエッチングの際に、外部コイルによる誘導結合法によって生成されたプラズマ中で、高周波を基板１４０（正確には薄板１４３）に加えることで、基板１４０にマイナスのバイアス電圧が発生する。このことにより、プラズマ中のプラスイオンであるＳＦ５＋や��Ｆ３＋が基板１４０に向かって衝突するのでドライエッチングは垂直下方方向に進むことになる。【０１６２】  ドライエッチングを抑制させる際には、基板に高周波を加えなければ、基板１４０にバイアス電圧が全く発生しないので、保護膜の材料となるＣＦ＋が偏向を受けなくなり、基板１４０のドライエッチング穴の壁面へ均一な保護膜の形成ができることになる。実験ではエッチングを促進するガスとしてＳＦ６、抑制するガスとしてＣ４Ｆ８を用いて確認している。【０１６３】  これらガスを用いると、上述したようなそれぞれの作用によって、貫通孔１１７の形成をレジストマスクの下方のみに進行させることが可能となる。さらに同時にエッチングを抑制するガスを用いることにより、貫通孔１１７の側面には保護膜１４６が形成される。【０１６４】  次に、二酸化シリコンよりなる中間層１４２の第二のウェル１１２に露出している部分をベース１４１側からドライエッチング、ウェットエッチングなどの通常のエッチング方法によりエッチングする。その後、図３０に示すように、基板１４０のベース１４１側から通常の薄膜形成工程とパターニング工程により、金を主体とする測定電極１０２を形成する（工程６）。ここでは、例えば、電極をパターニングする方法としては、電極材料を基板上に蒸着した後、フォトレジストを用いてエッチングすることにより、測定電極１０２、及び対応するリード線１０５及び外部接続部１０７を１セットとしてかかるセットを複数セット有する所望のパターンを形成する。電極のパターン形成は、その他に、予め電極パターンを形成させたステンシルマスクを通じて蒸着するマスク法や、リフトオフ法も適応できる。【０１６５】  その後、基板１４０の下面の外部接続部１０７を除く（従って測定電極１０２及びリード線１０５を含む）部分を絶縁膜１０６（図１１参照）で被覆する。【０１６６】  最後に、平らな底面基板１１８をベース側より接着剤にて貼り付け、センサ基板１２２を得る。なお、センサ基板１２２は必ずしもこの構成に従う必要はなく、例えば、ベースに交換口を作製せず、底面基板１１８に交換口を第二のウェル１１２に連通するように形成し、その底面基板１１８を基板１４０の下面に貼り付けても良い。【０１６７】  底面基板１１８は、交換口１１３の溶液が漏れず、測定電極１０２がリード線１０５を介して接続される外部接続部１０７が露出していれば、特に形状は問わないが、図１１及び図１２に示したように、外部接続部１０７のみを切り欠いた平板形状とすることが好ましい。【０１６８】  その後、ウエハをダイシングし、所定角の小片に切り出し、一つの小片を上記センサ基板１２２とする。一つの小片には、電極１０２、リード線１０５、及び外部接続部１０７が１セット形成されているようにする。このように、センサ基板１２２は、一つのウエハ上に複数作成し、その後、ダイシングすることで所定角の小片に切り出し、一つの小片をセンサ基板とすることが、生産性の観点から望ましい。【０１６９】  なお、必要であれば、シリコンの表面に、熱酸化膜を通常の熱酸化工程によって形成する。この工程は、シリコンの表面抵抗を極力あげたい場合に用いれば良く、それほど高い表面抵抗を必要としないのであれ���、シリコンの表面に自然に形成される自然酸化膜だけで十分である。【０１７０】  次に、別途作成する樹脂よりなる第一のウェル１０４が多数設けられた板状の容器であるウェル形成体１３１と参照電極１０３とを備える溶液保持部１１９の底面に、センサ基板１２２の薄板１４３側を接着剤などで貼り付ける。なお、溶液保持部１１９のウェル形成体１３１の製造方法についてはプレス成形、光造形、切削加工など通常の手段が用いられる。これらの方法を用いればウェル形成体１３１に、凹部からなるウェル１０４と該凹部の底面の開口１０４ａとを所定の形状となるよう設けることは特に困難なことではないのでここでは説明を省略する。特に、ウェル形成体１３１は、例えば、商用として販売されているＳＢＳ規格に準ずる多穴プレート（９６穴、３８４穴等）等を開口部のみ加工することによって実現することもできる。これらは、製造コストの面からも有用である。【０１７１】  その後、センサ基板１２２の交換口１１３にチューブ１１４を接続する。【０１７２】  このようにして、本実施の形態で使用されるセンサが製造される。【０１７３】  なお、センサ基板１２２の第二のウェル１１２の形成において、それぞれの第二のウェル１１２と交換口１１３は、必ずしも一体形成されている必要はない。一例を示すと、第二のウェル１１２が設けられた底面基板１１８と、各第二のウェル１１２に交換口が連通したセンサ基板１２２から構成されている方が、生産性の面からは望ましい。【０１７４】  底面基板１１８の材料としては、絶縁材料が望ましい。例えば、好適には、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）が用いられる。かかる材料は、微細加工に優れ、軟質で粘着力もあるため、センサ基板１２２に接続が容易で、流路漏れは起こらない。【０１７５】  溶液保持部１１９の参照電極、及び第二のウェル１１２の測定電極１０２の作製工程は、蒸着、スパッタなどの金属堆積法、電解・無電解めっき等を用いることができる。金属堆積法を用いて参照電極１０３及び測定電極１０２を作製する場合には、溶液保持部１１９を堆積装置の回転ステージに対して傾斜させて取り付ける処置を施すことで、容易に第一のウェル１０４及び第二のウェル１１２の側壁にターゲット金属を堆積させることができる。【０１７６】  ［医薬品安全性試験システム（２）］
本実施の形態に示すセンサを用いた医薬品安全性試験システムのブロック図を図１３に示す。本実施の形態の医薬品安全性試験システム（２）と、実施の形態１に示した医薬品安全性試験システム（１）との違いは、溶液貯留部へ第二の溶液を注入及び交換する装置を備えることであるので、以下、図１３を参照しながら、その相違点を説明する。【０１７７】  本実施の形態の医薬品安全性試験システムは、第二のウェル１１２内の溶液を置換するための第二ウェル内溶液置換装置１５７ｃを備える。また、注入する溶液として、第二の溶液（図１３中Ｌ５）と第三の溶液（図１３中Ｌ６）を切り換えるための流路切替装置１５８ｃを備える。【０１７８】  流路切替装置１５８ｃは、計算処理部１５５に電気的に接続されており、計算処理部１５５は、所定のタイミングと手順で溶液の切替を行うように流路切替装置１５８ｃに制御信号を送る。このように構成すると、センサ１２０を設置した状態で、第二の溶液を第三の溶液に、逆に第三の溶液を第二の溶液に置換することができる。【０１７９】  さらに、第二ウェル内溶液置換装置１５７ｃは、検体細胞を貫通孔に誘導する装置（図１３中Ｐ）も併せ持つため、センサ１２０をシステムに取り付けた状態で、検体細胞の貫通孔への誘導と薬理応答測定が行える。【０１８０】  細胞を誘導する装置Ｐとしては、例えば、貫通孔内の溶液を負圧により吸引することを挙げることができる。図１３に示した、第二ウェル内溶液置換装置１５７ｃにつながる各要素は、第二の溶液溜め（Ｌ５）、第三の溶液溜め（Ｌ６）、細胞誘導用吸引装置（Ｐ）を表している。【０１８１】  さらに、測定環境調節装置１５６は、センサ１２０の第一のウェル中の溶液と、第二のウェル１１２中の溶液とを異なる所望の温度で、それぞれ調整する機能を備える。
【実施例】
【０１８２】  以下、本発明の医薬品安全性試験方法及びシステムの実施例を、具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を限定するものではない。【０１８３】  （実施例１）
実施例１として、図９から図１２に示す、実施の形態５の医薬品安全性試験センサ１２０を試作した。そして、このセンサ１２０を用いて、細胞の応答を測定する実験を行った。【０１８４】  ［医薬品安全性試験センサの作製］
まず、図９に示すセンサ基板及び溶液保持部の作成方法について説明する。【０１８５】  図９から図１２を参照して、センサ基板１２２の作製には、基板材料に４インチＳＯＩウエハを用いた。基板１０１の裏面（下面）をエッチング後、基板表面（上面）は、実施の形態５で説明したガスを用いたドライエッチングにより貫通孔１１７群を形成させた。次に、中間層である酸化シリコン層を除去し、表面と裏面とを貫通させた。裏面の上に、真空蒸着法あるいはスパッタ法を用いて、電極をパターニング形成した。電極材料には金を用いた。その後、３０ｍｍ角の小片にダイシングし、小片化した。これにより３０ｍｍ角の基板に１個の測定電極１０２が形成され、その電極１０２に貫通孔１１７がおよそ１００個形成されたセンサ基板１２２を得た。【０１８６】  実施例１のセンサのウェル形成体１３１には、ＳＢＳ規格に準ずる９６穴プレートのウェルを用いた。各第一のウェル１０４の底面に上面直径５ｍｍ、下面直径１ｍｍのテーパー形状の穴を開ける工程を経て開口１０４ａを設け、センサ基板１２２を薄板側から取り付けた。なお、接続した場所は、上述したセンサ基板１２２の貫通孔１１７群に対応する位置とした。各第一のウェル１０４の容量は、約２５０μＬである。電極面から電極接点ピン１１１が接触できるよう、配線（図示せず）を取り、参照電極１０３を、その先端が第一のウェル１０４中に浸すことができるように固定化した。この参照電極１３には、φ０．５ｍｍ金線を用いた。【０１８７】  センサ基板１２２には、さらに測定電極１０２側にスリット構造１１３を形成させた。裏面には、このスリット構造からなる幅１ｍｍ、高さ３６０μｍの流路１１３が形成されている。その両端に交換口を設け、外径３６０μｍ、内径１５０μｍのＰＥＥＫ製チューブ１１４を取り付けた。【０１８８】  検体細胞は、遺伝子改変技術によりＨＥＲＧ（Ｈｕｍａｎ  Ｅｎｔｅｒ−ａ−ｇｏｇｏ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｇｅｎｅ）チャネルを発現させたヒト腎臓胚細胞ＨＥＫ−２９３（以下、ＨＥＲＧ細胞）を用いた。ＨＥＲＧチャネルは、ＱＴ延長を引き起こす標的イオンチャネルであり、上記細胞を検体細胞として用い、医薬品安全性試験を行った。本実施例では、ＨＥＲＧチャネル及び検体細胞に、ＨＥＲＧイオンチャネル及びＨＥＲＧ発現細胞を用いて説明する。【０１８９】  センサ１２０の第一のウェル１０４内を培養液で満たし、その後、ＨＥＲＧ細胞を各第一のウェル１０４内に１０００００個播種した。培養液は、ＤＭＥＭ＋１０重量％ＦＢＳを用いた。検体細胞を裏面から吸引し、貫通孔に誘導した後、３７℃、ＣＯ２濃度５％に調整保持したインキュベータ内で培養した。所定時間、細胞を培養させ、その後、実施例１のセンサをインキュベータから取り出し、医薬品安全性試験システムに設置し、医薬品の安全性を試験する実験を行った。【０１９０】  本実施例では、ＨＥＲＧに対して選択的に拮抗する作用が既知であるＥ−４０３１（Ｓｉｇｍａ社Ｍ５０６０）を被試験医薬品として用いた。Ｅ−４０３１は、ＨＥＲＧチャネルを選択的に拮抗するため、後天性ＱＴ延長を引き起こすことが知られている。【０１９１】  センサ応答の測定に先立ち、第一のウェル１０４に残存する培養��を対照溶液に置換させた。これにより、大気中でも安定して測定を行うことができる。対照溶液の組成は、ハンクス液を基本とし、ＨＥＰＥＳにて緩衝作用を持たせてある。溶液のｐＨは、７．４に設定してある。【０１９２】  次に、実施例１のセンサ１２０に、速やかにナイスタチンを含む裏面対照液（第二の溶液）を交換口１１３に注入する。ナイスタチンの最終濃度は、２４０μｇ／ｍＬに調製して含有させている。裏面対照液の組成は、塩化カリウムをベースとし、ＥＧＴＡによってＣａイオンをキレートした緩衝溶液を用いている。そして、溶液のｐＨは、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳによって７．２に保つように調製した。【０１９３】  次に、実施例１の医薬品安全性センサ１２０を用いて、ＨＥＲＧイオンチャネルの電圧センサ応答を測定した。その内の被試験医薬品の交換時期の前後における電圧時系列データを、約４０秒間切り出して、図１４に表示する。実験は、下記に示す測定プロトコール１に従い、溶液を同じウェルで交換した。図中白抜き四角又は黒四角で表した時間だけ対照溶液１及び薬剤溶液１（Ｅ−４０３１  １μＭ含有の対照溶液１）を滴下した。【０１９４】  ＜実験プロトコール１＞
（Ａ１）    ０−１５秒対照溶液１（上記ハンクス液）
（Ｂ１）  １５−３０秒薬剤溶液１
（Ｃ１）  ３０−４０秒対照溶液１
つまり、上述した被試験医薬品非存在であるハンクス対照溶液を第一のウェル１０４に投入した状態で、電圧測定を時間０秒から開始した（図１４中Ａ１の状態、時間０〜１５秒）。その後、１５秒後（Ｇ１時）、上記対照溶液１から、薬剤溶液１（Ｅ−４０３１  １μＭを含有するハンクス液）に置換した（図１４中Ｂ１の状態、時間１５〜３０秒）。すると、Ｅ−４０３１の注入に伴い電圧振幅の増大が認められた（図１４中Ｅ１）。実験では、さらに、時間３０秒（Ｈ１時）にて、再び対照溶液１に戻した（図１４中Ｃ１の状態）が、その後、電圧振幅の増大は収まらなかった。これは、パッチクランプで測定したデータと整合する。【０１９５】  ここで、状態Ａ１における電圧信号の振幅は、薬剤溶液１と検体細胞を接触させることにより、状態Ｂ１における電圧信号の振幅にまで増大している。これは、Ｅ−４０３１がＨＥＲＧイオンチャネルに拮抗した結果である。次に、状態Ｃ１における電圧信号の振幅は、状態Ｂ１における電圧信号の振幅とほぼ同じであるが、この現象は、Ｅ−４０３１が不可逆的にＨＥＲＧイオンチャネルに拮抗しているため、対照溶液に戻した後も電圧信号の振幅が、元の状態Ａ１のレベルに戻らないためである。【０１９６】  この図１４のように、状態Ａ１及び状態Ｃ１の電圧信号の振幅を比較した結果、電圧信号の振幅に差があると判断される場合には、被試験医薬品は、不可逆的にＨＥＲＧイオンチャネルに拮抗しているため、「催不整脈作用あり」と判定することができる。電圧信号の振輻の比較は、例えば、図１４のようなグラフを測定者が見て行うこともできるし、電圧信号の振幅を測定した測定機器が、状態Ａ１及び状態Ｃ１における電圧信号の振幅の差が、一定の基準値以下又は基準値以上であるか否かを判定することに行うこともできる。【０１９７】  なお、上述したように、状態Ｂ１及び状態Ｃ１の電圧信号の振幅を比較した結果、電圧信号の振幅に差がないと判断される場合に、不可逆的にＨＥＲＧイオンチャネルに拮抗しているため、「催不整脈作用あり」と判定することもできる。【０１９８】  ここで、プロトコール１と同様にして、可逆的にＨＥＲＧイオンチャネルに拮抗する被試験医薬品の薬剤溶液を検体細胞と接触させた場合には、図２１に示すような実験結果が得られる。図２１において、Ａ３は対照溶液１、Ｂ３は可逆的にＨＥＲＧイオンチャネルに拮抗する被試験医薬品の薬剤溶液、Ｃ３は再び対照溶液１を、それぞれウェル１０４に投入した状態を表している。【０１９９】  薬剤溶液をウェル１０４に投入する（図２１中Ｂ３の状態）と、電圧信号の振幅はＡ３の状態よりも増大するが、薬剤溶液を対照溶液に戻す（図２１中Ｃ３の状態）と、電圧信号の振幅は、元の状態Ａ３とほぼ同じレベルに減少する。この場合、電圧信号の振幅が減少していることがわかるため、被試験医薬品のＨＥＲＧイオンチャネルに対する拮抗が、可逆的であること判断でき、催不整脈作用がないと判定される。【０２００】  なお、薬剤溶液中の被試験医薬品の濃度が低い場合には、Ａ１（又はＡ３）とＣ１（又はＣ３）の電圧信号の振幅の変化が小さくなる。このため、被試験医薬品の催不整脈作用は小さく、危険性は少ないと判断することができる。また、��試験薬剤溶液が催不整脈作用を持たない場合には、Ａ１（又はＡ３）とＣ１（又はＣ３）の電圧信号の振幅の変化はないため、危険性はないと判断することができる。つまり、対照溶液の電圧信号との振幅の比較を行うだけで、被試験医薬品を含む薬剤溶液の電圧信号を測定する工程を省略しても、危険性を判断することができる。【０２０１】  なお、今回の実験では、ＨＥＲＧイオンチャネルを活性化するための刺激は必要なかった。ＨＥＲＧはゆるやかな電位感受性イオンチャネルであるが、静止膜電位下においてもわずかに開いているためである。【０２０２】  上記の対照実験として、同様に、薬剤溶液中の成分であるＥ−４０３１を含有しない対照溶液に対して、ＨＥＲＧ細胞を用いて、同じセンサにて同じプロトコールで測定を実施した。そのプロトコールで観測された電圧時系列データを約４０秒間切り出して、図１５に表示する。実験は、具体的には、下記に示す実験の測定プロトコール２に従い、溶液を同じウェル１０４で交換した。図中白抜き四角又は黒四角で表した時間だけ対照溶液１及び対照溶液２（対照溶液１と同組成）を滴下した。【０２０３】  ＜実験プロトコール２＞
（Ａ２）    ０−１５秒対照溶液１（上記ハンクス液）
（Ｂ２）  １５−３０秒対照溶液２
（Ｃ２）  ３０−４０秒対照溶液１
つまり、上述した被試験医薬品非存在であるハンクス対照溶液を第一のウェル１０４に投入した状態で、電圧測定を時間０秒から開始した（図１５中Ａ２の状態、時間０〜１５秒）。その後、１５秒後（Ｇ２時）、上記対照溶液１から、対照溶液２（対照溶液１と同組成であるハンクス液）に置換した（図１５中Ｂ２の状態、時間１５〜３０秒）。対照溶液１から２への交換においても電圧信号の振幅の増大は認められなかった（図１５中Ｅ２）。実験では、さらに、時間３０秒（Ｈ２時）にて、再び対照溶液１に戻した（図１５中Ｃ２の状態）。ここでも、電圧信号の振幅の増大は認められなかった。【０２０４】  上記２つの実験により、対照溶液の交換では電圧信号の振幅に変化が見られず、薬剤溶液１に対してのみ、不可逆的な電圧信号の振幅の増大が認められた。つまり、プロトコール１において観測された電圧信号の振幅の増大Ｅ１は、流路を切り替えることによる溶液変動の擬陽性ではなく、活性化していたＨＥＲＧイオンチャネルが薬剤溶液１に含まれるＥ−４０３１により拮抗された薬理応答を、センサで検出した結果であることが明らかとなった。なお、ＨＥＲＧチャネルを発現していない細胞に関しても、同じセンサにて同じプロトコールで測定を実施し、Ｅ−４０３１によって拮抗されないことは確認した（図示しない）。【０２０５】  実験プロトコール１と実験プロトコール２の実験結果から、被試験医薬品の危険性を判断するための設定値（閾値）としては、ｃ／ａ＝２程度に設定すればよい。しかし、適切な閾値は、実験条件や危険度の判定レベルによっても異なる。一般的には、ｃ／ａが１．２〜５程度、より望ましくは、１．５〜２．５程度に設定するのがよい。【０２０６】  ［解法アルゴリズム］
実施例１では、対照溶液注入時の電圧信号の振幅値は約２μＶｐ−ｐとなり、薬剤溶液注入時の電圧信号の振幅値は、最大８μＶｐ−ｐと、約４倍となった。そこで、これらの電圧信号の振幅増大効果を定量的、かつ、自動的に評価するために、以下の解析アルゴリズムを開発した。【０２０７】  すなわち、電圧閾値を設け、この電圧閾値を越えるか否かで、定常状態から拮抗剤注入による危険性上昇状態に遷移する変化開始時間（図１４では、Ｇ１時）を感知する。変化開始時間から後の１０秒間の電圧時系列データ（図１４では、時間１５〜２５秒の電圧振幅）を危険性上昇状態とし、また、変化開始時間から前の１０秒間の電圧時系列データ（図１４では時間５〜１５秒の電圧振幅）も定常状態として同様に切り出し、統計的に解析する。ここでは、電圧閾値を±３μＶに設定した。さらに、薬剤溶液１から対照溶液１へ戻した後の１０秒間の電圧時系列データ（図１４では、時間２５〜３５秒の電圧振幅）も同様に切り出す。【０２０８】  まず、上記の方法によって自動的に切り出されたそれぞれの状態の時系列データに対し、ある小区間Ｙごとに標準偏差ＳＤ１を求める。それぞれのＳＤ１の度数分布を求め、分布のピーク値と分散（半値幅）を統計値として比較し、それぞれの増加率を、被試験医薬品の安全性を判定する指標とした。同様の解析区間、解析方法を図１５に示される対照溶液２に対する電圧時系列データに関しても、同様に解析を行った。その結果を、図１６から図２０に示す。【０２０９】  また、図２１に示される薬剤溶液２に対する電圧時系列データに関しても、同様に解析を行った。その結果を、図２２から図２４に示す。【０２１０】  薬剤溶液１（Ｅ−４０３１）に関して、状態Ａ１、状態Ｂ１及び状態Ｃ１の各ヒストグラムのピーク値Ｊの大きさを比較した結果を図１６に示し、同分散値Ｋの大きさを比較した結果を図１８に示す。また、対照となる対照溶液２に関して、状態Ａ２、状態Ｂ２及び状態Ｃ２の各ヒストグラムのピーク値Ｊの大きさを比較した結果を図１７に示し、同分散値Ｋの大きさを比較した結果を、図１９に示す。図１６から図１９において求められた薬剤溶液１（又は、対照溶液２）と対照溶液１のピーク値Ｊと同分散値Ｋに関して、状態ＡからＢへの変化率、及び状態Ａから状態Ｃへの変化率を求めた結果を図２０に示す。【０２１１】  ここで、ヒストグラム統計値のピーク値Ｊ及び分散値Ｋにおける状態Ａから状態Ｃへの変化率は、状態Ａのピーク値Ｊ（又は分散値Ｋ）を１００％とした時の百分率、つまり、状態Ａのピーク値Ｊａと状態Ｃのピーク値ＪｃによってＪｃ／Ｊａで算出される。個々の小区間Ｙは、イオンチャネルの開閉頻度が数ｍｓｅｃ程度だということを考慮し、１０ｍｓｅｃとした。この処理により、熱雑音などホワイトなノイズ成分は極力減じることができ、イオンチャネルに起因する成分だけの比較がより鮮明に行える。さらに、本実施例で医薬品の安全性を判断する指標として用いた、ヒストグラム統計値のピーク値Ｊ及び分散値Ｋは、いずれも、医薬品安全性試験の観点から見ると危険な状態（状態Ｂ１）に遷移すると、増加する指標である。一方、危険性の存在しない化学物質しか含まれていない溶液に対しては、増加しなかった。本センサは、危険な状態に遷移すると増加する側に出力するため、危険状態を認識する最小分解能を減少指標型出力に比べて大きく設定できる。【０２１２】  また、本実施例で医薬品の安全性を判断する指標として用いたヒストグラム統計値のピーク値Ｊ及び分散値Ｋは、状態Ｃ１に遷移しても、いずれの指標も状態Ｂ１に比べやや減少する傾向を見せるものの、薬剤溶液を導入する前の状態Ａ１に比べ有意に増加したままであった（図１６及び図１８）。一方、危険性の存在しない化学物質しか含まれていない溶液に対しては、増加しなかった（図１７及び図１９）。【０２１３】  危険性の存在する薬剤溶液の、状態Ａに対する状態Ｃの変化率は、ピーク値Ｊで２３６．１％、分散値Ｋで２３６．２％となり、いずれも２倍強増加した。ピーク値Ｊで２００％以上（状態Ｃのピーク値Ｊｃと状態Ｃのピーク値Ｊａで算出されるＪｃ／Ｊａが２以上）の変化率は、有意な差として認識された。同様に、ピーク値Ｋで２００％以上（状態Ｃのピーク値Ｋｃと状態Ｃのピーク値Ｋａで算出されるＫｃ／Ｋａが２以上）の変化率も、有意な差として認識された。【０２１４】  一方、危険性の存在しない化学物質しか含まれていない溶液の状態Ａを１００％とした時の状態Ｃの変化率は、ピーク値Ｊで７０．１％、分散値Ｋで７０．１％となり、いずれもわずかに減少するも、増加しなかった。【０２１５】  さらに、オープンチャネル型ではない拮抗剤として別のイオンチャネル、具体的にはω−コノトキシンＧＶＩＡを持つ細胞に対して、統計値のピーク値Ｊ及び分散値Ｋは、薬剤溶
液に対する指標の増大が起こり（状態Ｂ３）、対照溶液に戻すと元のレベルに戻った（状態Ｃ３）（図２２及び図２３）状態Ａに対する状態Ｃの変化率は、ピーク値Ｊで７．３％、分散値Ｋで７０．２％となり、いずれもわずかに減少するも、増加しなかった。（実施例２に詳述する。）本解析方法は、危険性の判別だけでなく、オープンチャネル型拮抗剤など拮抗の形式まで判定ができ、信頼性も高いことがいえる。【０２１６】  （実施例２）
実施例２は、実施の形態１にかかる医薬品安全センサの一例である。本実施例が実施例１と違う点の一つは、センサが貫通孔を持たない構造であり、溶液刺激を入れてチャネルを積極的に活性化するため、一つの細胞から出される信号を高感度に取得しうることである。【０２１７】  ［医薬品安全性試験センサの作製］
まず、本実施例に用いる医薬品安全性試験センサ１２０の作成方法を以下に説明する。【０２１８】  図２及び図を参照して、センサ１２０は、センサ基板１０１とウェル形成体１３１から構成される。まず、センサ基板１０１は、４インチＳｉウエハを用い、その上にフォトレジストをスピンコートする。６行６列の格子状の各ノードには直径５μｍの円形の測定電極１０２が位置し、かつ、電極１０２の中心間距離は２０μｍである。そして、各電極１０２から放射状に広がるリード線１０５を有するパターンを複数、Ｓｉウエハの所定の位置に露光し、現像した。次に、ウエハの全面に真空蒸着法により金薄膜を堆積させた。その後、リフトオフにより、Ｓｉウエハ上に金電極のパターニングが完了する。【０２１９】  そして、リード線１０５部のみに専用現像液を要する絶縁材料であるネガティブ感光性ポリイミド樹脂ＵＲ−８３００（東レ社製）で被覆した後、ダイシングし、４０ｍｍ角の小片に切り出した。各小片は、中心に６行６列で直径５μｍの円形の測定電極１０２が露出し、電極１０２から引き出されたリード線１０５が、四方周囲に配置された配線引出し端子（外部接続部１０７）に連通した構成であった。このように作製した各小片を、センサ基板と１０１した。次に、ウェル形成体１３１を作製した。ウェル１０４を構成する凹部は切削加工により作製し、その後、このウェル形成体１３１をセンサ基板１０１の測定電極１０２が形成された表面側に配設した。【０２２０】  次に、本実施例の医薬品安全性試験方法を以下に説明する。【０２２１】  検体細胞には、モルモット乳頭筋細胞をモルモットから急性単離して使用した。モルモット乳頭筋細胞に存在する遅延整流性カリウムチャネルＫｒが、被試験医薬品の標的生体構成要素となる。【０２２２】  まず、作製したセンサ１２０の測定電極１０２を含めた細胞播種予定の表面に生体親和性を持たせるための表面改質を行った。具体的には、細胞接着性タンパク質であるコラーゲン（Ｓｉｇｍａ社、Ｐ−４５１１）を固定化材として測定電極１０２の表面を含むセンサ基板１０１上に所定の方法で１時間被覆した（３７℃雰囲気下）。その後、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で数回リンスした。【０２２３】  単離した細胞を遠心操作により濃縮した後に培養液に再懸濁した細胞懸濁液を、センサ１２０の測定電極１０２上に１×１０５細胞／ｃｍ２の濃度で播種し、所定の時間の間、３７℃、ＣＯ２濃度５％下にて培養した。【０２２４】  その後、測定時に、ハンクス液を基本とし、ＨＥＰＥＳにて緩衝作用を持たせた対照溶液に置換した。溶液は、基本的に上記の他、２種類とした。まず、第一に、上述した対照溶液１である。陽性対照薬及び被試験医薬品は、上記対照溶液に所定の濃度溶かして使用した。第二に、上述した対照溶液１と組成が同じで、対照溶液１の特定のイオン濃度のみを高く設定した高イオン濃度対照溶液である。なお、細胞に対しては、破砕及び造孔などの操作はしていない。【０２２５】  測定に際しては、陽性対照薬として、テルフェナジン（Ｓｉｇｍａ社、Ｔ９６５２）を使用した。また、被試験試薬には、今回  ω−コノトキシンＧＶＩＡ（Ｓｉｇｍａ社、Ｃ９９１５）を１μＭの濃度で対照溶液１に混合して使用した。ω−コノトキシンＧＶＩＡは、電位依存性のカルシウムチャネルを特異的に阻害すること、さらに筋肉に存在するチャネルには反応せず、神経シナプスに存在する前述チャネルを阻害することが知られているので、モルモット乳頭筋細胞が持つ遅延整流性カリウムイオンチャネルには感応しないことが予想される。対照溶液１には、ＮａＣｌが１３７ｍＭ、ＫＣｌが４ｍＭのイオン濃度で含まれるが、高イオン濃度対照溶液のＫＣｌを８０ｍＭに設定し、これによる浸透圧の上昇を避ける目的で、ＮａＣｌを６１ｍＭに下げた。つまり、溶液から高イオン濃度対照溶液に置換することによって、間接的に細胞内電位を上昇させることができる。【０２２６】  本実施例が実施例１と違う点の一つは、溶液を対照溶液から高イオン濃度対照溶液に置換することによって、積極的に溶液刺激を起こし、標的生体構成成分を一定の量、活性化させることである。なお、実験結果を図２４に示す。【０２２７】  陽性対照薬であるテルフェナジン０．３μＭの電圧応答は、不可逆的に増大した。一方、試験試薬であるω−コノトキシンＧＶＩＡ１μＭの濃度では電圧応答は、変化しなかった。【０２２８】  このように、標的生体構成要素である遅延整流性カリウムチャネルの拮抗効果を、刺激に対する電極電圧応答の変化時間として検出することができ、これにより、被試験試薬であるω−コノトキシンはＱＴ延長を起こす危険性はないと判断することができた。【０２２９】  上記説明から、当業者にとっては、本発明の多くの改良や他の実施形態が明らかである。従って、上記説明は、例示としてのみ解釈されるべきであり、本発明を実行する最良の形態を当業者に教示する目的で提供されたものである。本発明の精神を逸脱することなく、その構造及び／又は機能の詳細を実質的に変更できる。
【産業上の利用可能性】
【０２３０】  本発明の医薬品安全性試験方法及びシステムは、ＨＥＲＧチャネルに外部から人工的に電気信号を新たに印加する処理を経ることなく、ＱＴ延長を起こしていることに相当する測定電極での応答及び、応答時間が医薬品非存在下にくらべ不可逆的に延長される、危険性を内在するオープンチャネル型候補医薬品の評価方法として有用である。【０２３１】  また、本発明の医薬品安全性試験方法及びシステムは、細胞膜を破砕することなく、かつ、人工的に調整した細胞内液を使用することなく、１液系で測定できるので、より生体環境に近い測定条件で試験を実施できる。この両者の効果により、従来の方法に比べ、本発明の医薬品安全性試験方法は、より信頼性の高い試験となることができる。また、外部印加用電気回路等を省略でき、装置を簡便に構成することができる。装置の生産性、製造性に貢献する。【０２３２】  また、本発明の医薬品安全性試験システムは、危険要素を内在する標的生体構成要素で構成される検体細胞の被試験医薬品に対する電圧応答差を指標として、被試験医薬品の危険性を判断するハイスループット医薬品安全性試験システムであり、例えば、新薬開発初期段階に人体に危険性を有する候補化合物を除外する高速薬品スクリーニング装置等に有用である。【０２３３】  さらに、本発明の医薬品安全性試験方法及びシステムは、先天性及び後天性のＱＴ延長症候群の迅速な診断手法等の用途にも応用することができる。
【図１−Ａ】
2005116242.tif 000002
【図１−Ｂ】
2005116242.tif 000003
【図２】
2005116242.tif 000004
【図３】
2005116242.tif 000005
【図４】
2005116242.tif 000006
【図５】
2005116242.tif 000007
【図６−Ａ】
2005116242.tif 000008
【図６−Ｂ】
2005116242.tif 000009
【図６−Ｃ】
2005116242.tif 000010
【図７−Ａ】
2005116242.tif 000011
【図７−Ｂ】
2005116242.tif 000012
【図７−Ｃ】
2005116242.tif 000013
【図８】
2005116242.tif 000014
【図９】
2005116242.tif 000015
【図１０】
2005116242.tif 000016
【図１１】
2005116242.tif 000017
【図１２】
2005116242.tif 000018
【図１３】
2005116242.tif 000019
【図１４】
2005116242.tif 000020
【図１５】
2005116242.tif 000021
【図１６】
2005116242.tif 000022
【図１７】
2005116242.tif 000023
【図１８】
2005116242.tif 000024
【図１９】
2005116242.tif 000025
【図２０】
2005116242.tif 000026
【図２１】
2005116242.tif 000027
【図２２】
2005116242.tif 000028
【図２３】
2005116242.tif 000029
【図２４】
2005116242.tif 000030
【図２５】
2005116242.tif 000031
【図２６】
2005116242.tif 000032
【図２７】
2005116242.tif 000033
【図２８】
2005116242.tif 000034
【図２９】
2005116242.tif 000035
【図３０】
2005116242.tif 000036
【手続補正書】
【提出日】平成18年9月22日(2006.9.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定電極を持つセンサを使用して、被試験医薬品の、ＨＥＲＧイオンチャネル又はその相同物を含む検体細胞に対する危険性を試験する医薬品安全性試験方法であって、
Ｏ）被試験医薬品を含まない対照溶液中に、ＨＥＲＧイオンチャネル又はその相同物を含む検体細胞を保持し、前記検体細胞近傍に前記測定電極を配置する工程と、
Ａ）前記対照溶液に接した状態で、前記測定電極によって電圧信号を測定する工程と、
Ｂ）工程Ａの後、前記対照溶液を、前記被試験医薬品を含む測定溶液に置換し、前記測定電極によって電圧信号を測定する工程と、
Ｃ）工程Ｂの後、前記測定溶液を、再び前記対照溶液に置換し、前記測定電極によって電圧信号を測定する工程と、
Ｄ）前記工程Ａと前記工程Ｃで測定された電圧信号を比較し、その結果に基づいて、前記被試験医薬品の危険性を判定する工程
を含む医薬品安全性試験方法。
【請求項２】
前記工程Ｄは、前記工程Ａによって測定された電圧値ａ１、及び前記工程Ｃによって測定された電圧値ｃ１からｃ１／ａ１を算出し、
ｃ１／ａ１が予め設定された設定値を超えるときは危険性ありと判定し、ｃ１／ａ１が前記設定値以下であるときは危険性なしと判定する工程である、請求項１に記載の医薬品安全性試験方法。
【請求項３】
前記工程Ａの前に、前記検体細胞に含まれるイオンチャネルであって、ＨＥＲＧイオンチャネル以外の少なくとも１種類以上のイオンチャネルを不活性化する化学物質を加える工程Ｅ、を含む請求項１に記載の医薬品安全性試験方法。
【請求項４】
所定の時間間隔で、前記工程Ｂ及び前記工程Ｃを２回以上繰り返す請求項１に記載の医薬品安全性試験方法。
【請求項５】
前記工程Ｂ及び前記工程Ｃを少なくとも２回以上くり返す場合において、
１回目に、前記測定溶液として第１の被試験医薬品が含まれる第１の測定溶液を用い、
２回目に、前記測定溶液として第２の被試験医薬品が含まれる第２の測定溶液を用いる請求項４に記載の医薬品安全性試験方法。
【請求項６】
前記第１の被試験医薬品と、前記第２の被試験医薬品が異なる医薬品である請求項５に記載の医薬品安全性試験方法。
【請求項７】
前記第１と第２の被試験医薬品が同一であり、第１の測定溶液に含まれる第１の被試験医薬品の濃度と、第２の測定溶液に含まれる第２の被試験医薬品の濃度とが異なる請求項５に記載の医薬品安全性試験方法。
【請求項８】
前記第１の測定溶液又は前記第２の測定溶液のどちらか一方の代わりに、陽性対照試薬又は陰性対照試薬を含む第３の測定溶液を用い、
前記工程Ｄにおいて、更に、前記第１の測定溶液又は前記第２の測定溶液を用いて前記工程Ａ及び前記工程Ｃで測定された電圧信号の比（ｃ１／ａ１）と、前記第３の測定溶液を用いて前記工程Ａ及び前記工程Ｃで測定された電圧信号の比（ｃ１’／ａ１’）とを対比することによって、医薬品の危険性を判定する請求項５に記載の医薬品安全性試験方法。
【請求項９】
前記検体細胞がＨＥＲＧイオンチャネルを定常発現させた細胞株である、請求項１に記載の医薬品安全性試験方法。
【請求項１０】
前記工程Ａ及び前記工程Ｃの前に、所定時間、前記検体細胞を第一の対照溶液に接触させた後、前記検体細胞が接する前記第一の対照溶液を第二の対照溶液に換える工程Ｆと、
前記工程Ｂの前に、所定時間、前記検体細胞を第一の測定溶液に接触させた後、前記検体細胞が接する前記第一の測定溶液を第二の測定溶液に換える工程Ｇとを含み、
前記第二の対照溶液及び前記第二の測定溶液が、それぞれ前記第一の対照溶液及び前記第一の測定溶液と比較して、共通して含まれるイオン濃度が異なる請求項１に記載の医薬品安全性試験方法。
【請求項１１】
前記電圧信号が、予め設定したサンプル時間毎の電圧信号の振幅の偏差値を計算する単位偏差値の集合の統計値を表す、請求項１に記載の医薬品安全性試験方法。
【請求項１２】
前記統計値が、前記単位偏差値の分布の平均値である、請求項１１に記載の医薬品安全性試験方法。
【請求項１３】
前記統計値が、前記単位偏差値の分布の分散値である、請求項１１に記載の医薬品安全性試験方法。
【請求項１４】
前記検体細胞が被試験医薬品を含む測定溶液に接した状態で測定された電圧信号が、予め設定したサンプル電圧閾値を超えた後に検出した電圧信号である、請求項１に記載の医薬品安全性試験方法。
【請求項１５】
ＨＥＲＧイオンチャネル又はその相同物を含む検体細胞を含む溶液を満たすことが可能な凹部を有する基板と、
前記凹部に設けられ、かつ、前記検体細胞の近傍に配置可能な１以上の測定電極と、
前記溶液に浸し、前記測定電極と離隔するように設けられた参照電極とを有するセンサと、
前記測定電極と前記参照電極との間の電圧を測定する電圧測定装置と、
前記凹部に対し複数種類の前記溶液を注入及び排出する溶液注入排出装置と、
制御装置と、を備え、
前記制御装置は、前記溶液注入排出装置を制御して前記凹部に第１の種類の前記溶液としての被試験医薬品を含まない対照溶液を前記凹部に満たし、この状態ａ2で前記電圧測定装置によって前記測定電極と前記参照電極との間の電圧を測定し、
その後、前記溶液注入排出装置を制御して前記凹部から前記対照溶液を排出しかつ前記凹部に第２の種類の前記溶液としての被試験医薬品を含む測定溶液を満たし、この状態ｂ2で前記電圧測定装置によって前記測定電極と前記参照電極との間の電圧を測定し、
その後、前記溶液注入排出装置を制御して前記凹部から前記測定溶液を排出しかつ前記凹部に前記対照溶液を再び満たし、この状態ｃ2で前記電圧測定装置によって前記測定電極と前記参照電極との間の電圧を測定し、
前記状態ａ2で測定された前記電圧と前記状態ｃ2で測定された前記電圧とを比較し、
前記比較結果に基づいて前記被試験医薬品の安全性を判定する、医薬品安全性試験システム。
【請求項１６】
前記各測定電極の近傍に前記検体細胞が複数配置されている、請求項１５に記載の医薬品安全性試験システム。
【請求項１７】
前記センサが、前記基板を厚み方向に貫通する貫通孔を有し、該貫通孔近傍に前記測定電極が配置されている、請求項１５に記載の医薬品安全性試験システム。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不整脈を引き起こすＨＥＲＧチャネルを含む検体細胞に対する被試験医薬品の危険性を判断する、医薬品安全性試験方法及び医薬品安全性試験システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、医薬品による催不整脈作用が大きな問題となっている。この催不整脈作用は、薬物誘発性ＱＴ延長症候群（又は、後天性ＱＴ延長症候群）と呼ばれ、薬物が心筋細胞上のイオンチャネルに作用し、心電図においてＱＴ間隔を延長させ、重篤な不整脈を引き起こす。薬物によるＱＴ延長は、頻度は低いが、時にはtorsades de pointes型の心室頻拍や突然死といった重篤な副作用を誘発する。例えば、抗ヒスタミン薬であるテルフェナジン、アステミゾールは遅延整流性カリウムイオンチャネルを阻害し活動電位を延長することが知られており、心室頻拍や突然死が報告されている。
【０００３】
国際的な医薬品承認審査資料の調和を目的とする日米ＥＵ医薬品規制調和国際会議（ＩＣＨ）においても、「安全性薬理試験ガイドライン」の中に、「再分極と伝達異常に対する手法を含むin vivo、in vitro、ex vivoの評価も考慮すべきである」との記載が盛り込まれた。安全性の高い医薬品の開発のためには、開発段階で効果的な催不整脈作用検出法を適用することが必要とされている。
【０００４】
ＱＴ延長を引き起こす標的イオンチャネルは、遅延整流性のカリウムチャネルであると言われている。心筋細胞などの野生型細胞には、遅延整流性のカリウムチャネル以外にも様々なイオンチャネルが内在している。このため、現在最も感度が高く、信頼性の高い評価方法は、代表的な遅延整流性のカリウムチャネルであるＨＥＲＧ（Human Enter-a-gogo-Related Gene) チャネルを、アフリカツメガエルの卵母細胞などの宿主細胞、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯなどの哺乳類培養細胞に遺伝子導入技術により強制的に発現させた系を検体細胞として、パッチクランプ法で電気生理学的評価を行う方法である。なかでも、アフリカツメガエルの卵母細胞に導入されたＨＥＲＧイオンチャネルは薬剤感受性が低くなるため、特に、哺乳類培養細胞に発現させた系がより信頼性の高い評価手法となりえる。
【０００５】
つまり、危険性を有する医薬品候補化合物は、ＨＥＲＧイオンチャネルを拮抗する。例えば、心筋細胞ならＨＥＲＧチャネルが拮抗されたことにより、カリウムイオンの出入りが阻害され、再分極が起こらなくなる。この一連の動作が、薬物によるＱＴ延長を発生するメカニズムである。この危険性を有する医薬品候補化合物に共通する特徴は、一度ＨＥＲＧチャネルに拮抗すると、ＨＥＲＧチャネルのイオンの出入り口である孔（ポア）にはまり込み、抜けなくなるオープンチャネル型拮抗薬である。
【０００６】
新規医薬品の開発の初期段階で安全性試験を実施し、医薬品の選別を開発前に行うことは、開発投資コスト、開発時間、リソースの効率面などから望ましい。そのためには、大量の医薬品開発候補化合物に対し試験を実施する必要がある。この用途には、測定の迅速性、大量処理能力がより重視される。ところが、パッチクランプ手法は、電極の調製及びその操作などに熟練した技術を要し、一つの試料の測定に多くの時間を要するので、この目的には適していない。
【０００７】
そのため、貫通孔を持った平面パッチクランプセンサを用い、ＨＥＲＧイオンチャネルを通過する電流を得、安全性を試験するセンサが既に開示されている（例えば、特許文献１、特許文献２、非特許文献２参照）。
【０００８】
これら特許文献１から特許文献４に開示される平面パッチクランプセンサは、いずれも、生体内塩濃度組成に近い溶液中で被検体細胞を平面基板に設けた貫通孔へと誘導し、配置し、負圧により細胞を貫通孔へと密着（ギガシール）させた後、貫通孔と接する領域の細胞膜を更なる負圧吸引をもって破ることにより、細胞膜を通過する電流を膜の両側に配置した不分極性の電極（代表的には銀―塩化銀電極）、つまり、測定電極と参照電極にて測定するものである。
【０００９】
測定では、細胞膜内外の電位差を、人工的にある設定値で保持した際のイオンチャネルを通過する電流が測定される。ここで、標的チャネルのひとつであるＨＥＲＧイオンチャネルを持った細胞を使った、従来の試験方法の具体的なプロトコールの一例を示す。
【００１０】
測定電極側に細胞内と塩濃度や浸透圧を人工的に調製した擬似電極内液を充たし、参照電極側に細胞外と塩濃度や浸透圧を人工的に調製した擬似電極外液を満たして、これらの２種類を使用する。まず、測定電極のフィードバック機構を利用し、細胞内の電位を人工的に-80mVに保持する。そして、-80mVから+20mVまでステップ状に細胞内の電位を人工的に上昇させ、1.5秒間その電位で保持した後、+20mVから-50mVへと再度ステップ状に細胞内の電位を人工的に下降させる。その下降させた際に流れる外向き電流の大きさがＨＥＲＧチャネルを流れるイオンの流れとして扱え、上記電流ピーク値を指標に被試験医薬品の安全性が判断される。
【００１１】
具体的には、医薬品の危険性は、危険性を有する候補薬剤の非存在下で、細胞内外の電圧を過渡的に変化させたときの膜を外向きに流れる電流を測定し、候補薬剤存在下で、繰り返し細胞内外の電圧を過渡的に変化させたときの同外向電流の減少を持って、ＱＴ延長を判断する。
【００１２】
しかし、このような評価方法として用いられる短時間間隔でのステップ状の大きな電位変動は、生体環境では起こりえない。つまり、急激な電圧増減を使用する人工的な電位差プロトコールと、人工的成分が加えられた擬似内液を用いた状態での測定は、細胞本来の応答を測定しているとは必ずしも言えない。
【００１３】
なお、非特許文献３によれば、カルシウムキレート剤等の人工的成分が加えられた擬似細胞内液を用いた測定は、ＱＴ延長に対する寄与が小さいＬ型カルシウムチャネル電流の増強が前面に出て、ＱＴ延長を引き起こす支配的な要因である遅延整流性カリウムチャネルの電流が減少したと報告されている。これは、細胞本来の細胞内溶液中には様々な細胞内情報伝達を担う生体分子が存在しているが、擬似内液は、それらを忠実に再現できないことによるものである。
【００１４】
パッチクランプ方式の測定に際してホールセル状態を得るために、貫通孔と接する領域の細胞膜を破砕する必要がある。膜がきれいに破けない場合には、測定効率の減少とともに、漏れ電流による測定感度低下を引き起こす。しかも、細胞にも傷害を与えるという副次的な短所もあるが、もっと重要なことは、膜の破砕により細胞内機能性物質の流出が起こり、細胞本来の応答の消失をきたす。
【００１５】
また、特許文献２及び非特許文献２においては、アンフォテンシンβなどの造孔性の化学物質を使用して、細胞内機能性物質の流出を抑える改善を行っている。
【００１６】
しかしながら、測定状態がIn vitroで、さらにＨＥＲＧイオンチャネル発現系を用いた理想測定系であるという仮定があり、さらに突然死をも引き起こす医薬品の除外という目的から考えると、人工的な電位刺激プロトコールを用いた測定状態での評価をするのは大きな問題となる。
【００１７】
そこで、これら特許文献１から特許文献４に開示される平面パッチクランプセンサと異なる測定原理で細胞上のイオンチャネルの化学物質識別能を判定する平面基板センサが既に開示されている（特許文献５）。
【００１８】
この特許文献５に開示される平面基板センサは、平面パッチクランプセンサと同様に、貫通孔を持つ。貫通孔は、微細加工技術で一括加工することにより一つの基板に多数作製できる。言い換えれば、パッチクランプに比べ、多数の細胞の同時並列測定が可能である。平面パッチクランプセンサとの違いは、電極が分極性電極である金電極からなることである。そして、被検体細胞を細胞外に配置した電極の電位変化で測定する原理に基づく。このため、細胞膜を破砕することなく、よって、人工的に調整した細胞内液を使用することがない。言い換えれば、平面パッチクランプセンサに比べ、より生体環境に近い測定条件で試験を実施できる。
【特許文献１】国際公開第０１／２５７６９号パンフレット
【特許文献２】米国特許第６４８８８２９号明細書
【特許文献３】国際公開第０１／５９４４７号パンフレット
【特許文献４】国際公開第９９／３１５０３号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０２／０５５６５３号パンフレット
【非特許文献１】細胞の分子生物学、第三版、Garland Publishing Inc.,New York, 1994,日本語版、中村桂子ら監訳、181〜182頁、1995年、教育社
【非特許文献２】ASSAY and Drug Development Technologies, Vol.1,Number 1-2, pp127-135, 2003
【非特許文献３】Pflugers Arch,Vol. 417, pp185-193,1990
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
しかしながら、前記のセンサ構成では、ＨＥＲＧチャネルを拮抗するオープンチャネル型の拮抗剤を特定することができない。
【００２０】
従来例として挙げられる特許文献１から特許文献４に開示される平面パッチクランプセンサでは、医薬品の危険性は、以下の工程で判断される。第一に、危険性を有する候補薬剤の非存在下で、細胞内外の電圧を過渡的に変化させる。つまり、細胞内を強制的に脱分極させてＨＥＲＧイオンチャネルを開けた時に外向きに流れる電流を測定する。第二に、候補薬剤存在下で、細胞内外の電圧を過渡的に変化させる。つまり、同様に、細胞内を強制的に脱分極させてＨＥＲＧイオンチャネルを開けた時に観測される同外向電流を測定する。危険性を有する候補薬剤の非存在下と候補薬剤存在下での外向電流の減少をもって、危険性候補薬剤がＨＥＲＧチャネルを拮抗する度合いを判断する。第三に、候補薬剤存在下で電圧印加を繰り返し、細胞内外の電圧を繰り返し変化させる。つまり、同様に、ＨＥＲＧイオンチャネルを何度も開けた時に観測される同外向電流を測定する。外向電流が変化しないことで、ＨＥＲＧイオンチャネルのポアに不可逆的にはまり込み、脱離しない、オープンチャネル型の拮抗剤であると判断できる。
【００２１】
一方、特許文献５に開示した前述のセンサ構成では、細胞膜を破砕せず、細胞外に配した電極によって、細胞外の電位変化を測定するため、より生体環境に近い測定条件で試験を実施できるという長所を持つものの、外部から人工的に電気的な刺激を印加し、強制的にＨＥＲＧイオンチャネルを開くという操作を行うことはできない。つまり、危険性を有する候補薬剤存在下で、細胞内電位の変化に起因する電極電位は測定できるものの、その変化がオープンチャネル型拮抗剤に依るものか否かは判断できない。
【００２２】
以上に見られるように、平面基板センサでは、ＨＥＲＧイオンチャネルを持つ被検体細胞を使って、不整脈を引き起こす危険性を有する被試験化合物を判別することができなかった。
【００２３】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、外部から電気信号を新たに印加することなく、生体環境を模した測定状態で、不整脈を引き起こす危険性を有するオープンチャネル型ＨＥＲＧチャネル拮抗剤を判別する医薬品の安全性試験方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
上述した従来技術の課題を解決するために、本発明の医薬品安全性試験方法は、
測定電極を持つセンサを使用して、被試験医薬品の、ＨＥＲＧイオンチャネル又はその相同物を含む検体細胞に対する危険性を試験する医薬品安全性試験方法であって、
Ｏ）被試験医薬品を含まない対照溶液中に、ＨＥＲＧイオンチャネル又はその相同物を含む検体細胞を保持し、前記検体細胞近傍に前記測定電極を配置する工程と、
Ａ）前記対照溶液に接した状態で、前記測定電極によって電圧信号を測定する工程と、
Ｂ）工程Ａの後、前記対照溶液を、前記被試験医薬品を含む測定溶液に置換し、前記測定電極によって電圧信号を測定する工程と、
Ｃ）工程Ｂの後、前記測定溶液を、再び前記対照溶液に置換し、前記測定電極によって電圧信号を測定する工程と、
Ｄ）前記工程Ａと前記工程Ｃで測定された電圧信号を比較し、その結果に基づいて、前記被試験医薬品の危険性を判定することを特徴とする。
【００２５】
危険性を内在する被試験医薬品を本発明の医薬品評価方法を用いて評価すれば、ＱＴ延長を起こしていることに相当する測定電極での応答及び応答時間が、被試験医薬品非存在下にくらべ延長される。また、再び被試験医薬品非存在下に戻した時は、測定電極での応答及び応答時間が延長されたまま保持される。この応答の形式により、被試験医薬品が不可逆にイオンチャネル孔（ポア）に入ることに相当するオープンチャネル拮抗剤か否かが判別できる。また、標的生体構成要素を人工的に刺激する処理を経ることなく、より生体環境に近い測定条件で試験を実施できる。つまり、信頼性の高い安全性試験を実施することができる。
【００２６】
前記工程Ｄは、前記工程Ａによって測定された電圧値ａ１、及び前記工程Ｃによって測定された電圧値ｃ１からｃ１／ａ１を算出し、
ｃ１／ａ１が予め設定された設定値を超えるときは危険性ありと判断し、ｃ１／ａ１が前記設定値以下であるときは危険性なしと判断する工程であっても良い。
【００２７】
前記医薬品安全性試験方法において、Ｅ）前記工程Ａの前に、前記検体細胞に含まれるイオンチャネルであって、前記ＨＥＲＧイオンチャネル以外の少なくとも１種類以上のイオンチャネルを不活性化する化学物質を加える工程を含んでいても良い。
【００２８】
前記医薬品安全性試験方法において、所定の時間間隔で、前記工程Ｂと前記工程Ｃとを少なくとも２回以上繰り返しても良い。また、この繰り返しにおいて、１回目に、前記測定溶液として第１の被試験医薬品が含まれる第１の測定溶液を用い、２回目に、前記測定溶液として第２の被試験医薬品が含まれる第２の測定溶液を用いることもできる。この場合、前記第１の被試験医薬品と前記第２の被試験医薬品が異なる医薬品であっても良い。また、前記第一の被試験医薬品と前記第２の被試験医薬品が同一であり、第１の測定溶液に含まれる第１の被試験医薬品の濃度と、第２の測定溶液に含まれる第２の被試験医薬品の濃度とが異なっていても良い。
【００２９】
前記第１の測定溶液又は前記第２の測定溶液のどちらか一方の代わりに、陽性対照試薬又は陰性対照試薬を含む第３の測定溶液を用い、
前記工程Ｄにおいて、更に、前記第１の測定溶液又は前記第２の測定溶液を用いて前記工程Ａ及び前記工程Ｃで測定された電圧信号の比（ｃ１／ａ１）と、前記第３の測定溶液を用いて前記工程Ａ及び前記工程Ｃで測定された電圧信号の比（ｃ１’／ａ１’）を対比することによって、医薬品の危険性を判定しても良い。
【００３０】
前記医薬品安全性試験方法において、前記検体細胞は、例えばＨＥＲＧイオンチャネルを定常発現させた細胞株であり得る。
【００３１】
前記医薬品安全性試験方法において、Ｆ）前記工程Ａ及び前記工程Ｃの前に、所定時間、前記検体細胞を第一の対照溶液に接触させた後、前記検体細胞が接する前記第一の対照溶液を第二の対照溶液に換える工程があっても良い。また、Ｇ）前記工程Ｂの前に、所定時間、前記検体細胞を第一の測定溶液に接触させた後、前記検体細胞が接する前記第一の測定溶液を第二の測定溶液に換える工程を含み、前記第二の対照溶液及び前記第二の測定溶液が、それぞれ前記第一の対照溶液及び前記第一の測定溶液と、前記試験医薬品以外の共通に含まれる少なくとも一つのイオン濃度が異なるものであっても良い。
【００３２】
前記医薬品安全性試験方法において、前記電圧信号が、予め設定したサンプル時間毎の電圧信号の振幅の偏差値を計算する単位偏差値の集合の統計値であっても良い。
【００３３】
前記統計値が、前記単位偏差値の分布の平均値であっても良い。また、前記統計値が、前記単位偏差値の分布の分散値であっても良い。
【００３４】
前記工程Ｂにおいて、前記検体細胞が被試験医薬品を含む測定溶液に接した状態で測定された電圧信号は、予め設定したサンプル電圧閾値を超えた後に検出した電圧信号であることが好ましい。
【００３５】
さらに、本発明は、
ＨＥＲＧイオンチャネル又はその相同物を含む検体細胞を含む溶液を満たすことが可能な凹部を有する基板と、
前記凹部に設けられ、かつ、前記検体細胞の近傍に配置可能な１以上の測定電極と、
前記溶液に浸し、前記測定電極と隔離するように設けられた参照電極とを有するセンサと、
前記測定電極と前記参照電極との間の電圧を測定する電圧測定装置と、
前記凹部に対し複数種類の前記溶液を注入及び排出する溶液注入排出装置と、
制御装置と、を備え、
前記制御装置は、前記溶液注入排出装置を制御して前記凹部に第１の種類の前記溶液としての被試験医薬品を含まない対照溶液を前記凹部に満たし、この状態ａ２で前記電圧測定装置によって前記測定電極と前記参照電極との間の電圧を測定し、
その後、前記溶液注入排出装置を制御して前記凹部から前記対照溶液を排出しかつ前記凹部に第２の種類の前記溶液としての被試験医薬品を含む測定溶液を満たし、この状態ｂ２で前記電圧測定装置によって前記測定電極と前記参照電極との間の電圧を測定し、
その後、前記溶液注入排出装置を制御して前記凹部から前記測定溶液を排出しかつ前記凹部に前記対照溶液を再び満たし、この状態ｃ２で前記電圧測定装置によって前記測定電極と前記参照電極との間の電圧を測定し、
前記状態ａ２で測定された前記電圧と前記状態ｃ２で測定された前記電圧とを比較し、
前記比較結果に基づいて前記被試験医薬品の安全性を判定する、医薬品安全性試験システムである。
【００３６】
上記医薬品安全性試験システムは、前記各測定電極の近傍に前記検体細胞が複数配置されている構成であっても良い。
【００３７】
また、上記医薬品安全性試験システムは、前記センサが、前記基板を厚み方向に貫通する貫通孔を有し、前記貫通孔近傍に前記測定電極が配置されている構成であっても良い。
【発明の効果】
【００３８】
本発明の医薬品安全性試験方法及び医薬品安全性システムによれば、ＨＥＲＧチャネルに外部から人工的に電気信号を新たに印加する処理を経ることなく、ＱＴ延長を起こしていることに相当する測定電極での応答及び応答時間が医薬品非存在下にくらべ不可逆的に延長される、危険性を内在するオープンチャネル型候補医薬品を評価できる。
【００３９】
また、本発明の医薬品安全性試験方法及び医薬品安全性試験システムによれば、細胞膜を破砕することなく、かつ、人工的に調整した細胞内液を使用することなく、１液系で測定できるので、より生体環境に近い測定条件で試験を実施できる。この両者の効果により、従来の方法に比べ、本発明の医薬品安全性試験方法は、より信頼性の高い試験となることができる。また、外部印加用電気回路等を省略でき、装置を簡便に構成することができる。さらに、装置の生産性、製造性の向上にも貢献する。
【００４０】
本発明の上記目的、他の目的、特徴及び利点は、添付図面参照の下、以下の好適な実施態様の詳細な説明から明らかにされる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
以下、本発明の好ましい実施の形態を、図面を参照しながら説明する。
【００４２】
（実施の形態１）
図１Ａ及び図１Ｂは、本発明の実施の形態１における医薬品安全性試験方法の工程を示すフローチャートである。以下、本実施の形態を、図１Ａ及び図１Ｂを参照しつつ説明する。
【００４３】
本発明の医薬品安全性試験方法は、医薬品安全性試験センサの測定電極の近傍に検体細胞を用意（ステップＳ０）した後、測定電極からの電気信号に基づく電圧信号であって、検体細胞が接する溶液が、被試験医薬品が存在しない対照溶液である場合における検体細胞のＨＥＲＧチャネルの情報を含む電圧信号を測定する工程（ステップＳ１、ここでの電圧信号をａとする）と、検体細胞が接する溶液が、被試験医薬品が存在する測定溶液である場合における検体細胞のＨＥＲＧチャネルの情報を含む電圧信号を測定する工程（ステップＳ２、ここでの電圧信号をｂとする）と、検体細胞が接する溶液を再び被試験医薬品が存在しない対照溶液に戻した場合における検体細胞のＨＥＲＧチャネルの情報を含む電圧信号を測定する工程（ステップＳ３、ここでの電圧信号をｃとする）と、ステップＳ１とステップＳ３の電圧信号を比較する工程（ステップＳ４Ａ）、又はステップＳ２とＳ３の電圧信号を比較する工程（ステップＳ４Ｂ）と、かかる電圧信号の比較結果に基づいて、被試験医薬品の危険性を判断する工程（ステップＳ５、Ｓ６及びＳ７、並びにステップＳ８、Ｓ９及びＳ１０）からなる。
【００４４】
ステップＳ１において検体細胞が接する対照溶液と、ステップＳ３において検体細胞が接する対照溶液とは、成分が同じものである。ステップＳ２において検体細胞が接する測定溶液と、ステップＳ１又はＳ３において検体細胞が接する対照溶液とは、被試験医薬品が存在するか否かのみが異なるものであるとする。また、ステップＳ１又はＳ３において、検体細胞が接する対照溶液は、測定溶液の被試験医薬品に換えて陽性対照試薬又は陰性対照試薬を添加したものであっても良い。
【００４５】
ここで、ステップＳ２において、被試験医薬品がＨＥＲＧチャネルを拮抗すると、上述したようにカリウムイオンの出入りが阻害され、再分極が起こらなくなるため、電圧信号はａ＜ｂとなる。一方、被試験医薬品がオープンチャネル型の拮抗剤でなければ、ステップＳ３において、被試験医薬品がＨＥＲＧチャネルから離れるため、電圧信号はｂ＞ｃとなるが、オープンチャネル型の拮抗剤であればｂ≒ｃとなる。
【００４６】
すなわち、ステップＳ４Ａにおける電圧信号の比較とは、例えば、（１）電圧信号ａ及びｃの差［ａ−ｃ］を検出し、その値が一定の基準値以下になるか否か判定すること、（２）電圧信号ａと電圧信号ｃの比［ｃ／ａ］を検出し、その値が一定の基準値以下になるか否か判定することをいう。同様に、ステップＳ４Ｂにおける電圧信号の比較とは、例えば、（１）電圧信号ｂ及びｃの差［ｂ−ｃ］を検出し、その値が一定の基準値以上になるか否か判定すること、電圧信号ｂとｃの比［ｃ／ｂ］を検出し、その値が一定の基準値を超えるか否か判定することをいう。
【００４７】
図１Ａは、ステップＳ４ＡでステップＳ１とＳ３の測定結果を比較する場合のフローチャートを示す。図１Ａに示すフローチャートでは、ステップＳ４Ａの比較結果に基づき、ステップＳ５〜Ｓ７において被試験医薬品の安全性を評価する。ステップＳ４Ａでａ及びｃを比較した結果、ステップＳ５において測定結果（電圧信号）に差がない（例えば、［ｃ／ａ］が一定値以下である）と判断された場合、その被試験医薬品は、ＨＥＲＧチャネルを拮抗するオープンチャネル型の拮抗剤ではないために、「催不整脈作用なし」と判定される（ステップＳ６）。
【００４８】
ステップＳ５において、測定結果（電圧信号）に差がある（例えば、［ｃ／ａ］が一定値を超える）と判断された場合、その被試験医薬品は、ＨＥＲＧチャネルを拮抗するオープンチャネル型の拮抗剤であることになり、「催不整脈作用あり」と判定される（ステップＳ７）。
【００４９】
一方、図１Ｂは、ステップＳ４ＢでステップＳ２とＳ３の測定結果を比較する場合のフローチャートを示す。図１Ｂに示すフローチャートでは、ステップＳ４Ｂの比較結果に基づき、ステップＳ８〜Ｓ１０において被試験医薬品の安全性を評価する。ステップＳ４Ｂでｂ及びｃを比較した結果、ステップＳ８において測定結果（電圧信号）に差がある（例えば、[ｃ／ｂ]が一定の基準値以下である）と判断された場合、その被試験医薬品は、「催不整脈作用なし」と判定される（ステップＳ９）。
【００５０】
ステップＳ８において、測定結果（電圧信号）に差がない（例えば、[ｃ／ｂ]が一定の基準値未満である）と判断された場合、その被試験医薬品は、ＨＥＲＧチャネルを拮抗するオープンチャネル型の拮抗剤であることになり、「催不整脈作用あり」と判定される（ステップＳ１０）。
【００５１】
［医薬品安全性試験システムのセンサ］
次に、本発明の医薬品安全性試験システムに用いるセンサの構造を説明する。図２は、本実施の形態の医薬品安全性試験システムに用いるセンサの構造を模式的に示す断面図である。また、図３は、図２に示すセンサの上面図である。本実施の形態のセンサ１２０は、基板１０１と、基板１０１の上に構築された溶液保持部１１９とからなる。溶液保持部１１９は、測定溶液５１を保持するための複数のウェル１０４と、参照電極１０３を備える。
【００５２】
基板１０１の上面には、複数の島状の測定電極１０２が所定の位置に形成されている。また、基板１０１の上面には、縁部に位置するように各測定電極１０２に対応させて外部接続部１０７が形成され、この外部接続部１０７とその対応する測定電極１０２とを接続するようにリード線１０５が形成されている。そして、基板１０１の上面の、測定電極１０２及び外部接続部１０７が形成された部分を除く部分を覆うように絶縁膜１０６が形成されている。絶縁膜１０６の測定電極１０２の周囲に位置する部分は測定電極１０２に向けてすり鉢状に窪んで凹部１０６ａを形成している。絶縁膜１０６上には膜状のウェル形成体１３１が形成されている。
【００５３】
ウェル形成体１３１には、各測定電極１０２の上面とその周囲の凹部１０６ａを含む絶縁膜１０６の上に位置するように開口１３１ａがそれぞれ形成されていて、各測定電極１０２の上面及びその周囲の絶縁膜１０６とこの開口１３１ａの内周面とで囲まれた空間がウェル１０４を構成している。この開口１３１ａの縁部及び内周面に沿うように鍔付き筒状の参照電極１０３が形成されている。また、ウェル形成体１３１の上面の縁部には、各ウェル１０４に対応させて外部接続部１０９が形成され、この外部接続部１０９がウェル形成体１３１の上面に形成されたリード線１０８によってその対応するウェル１０４の参照電極１０３に接続されている。そして測定時には、外部接続部１０７に第１の増幅部１５２が接続され、外部接続部１０９は接地される。
【００５４】
電位測定時に、検体細胞１は、測定電極１０２の近傍に配置される。測定電極１０２からの電位信号は、リード線１０５、外部接続部１０７、第一の増幅部１５２を介して、参照電極１０３の電位を基準として測定される（以下、測定電極１０２からの電位信号と、参照電極１０３からの電位信号の差を、測定電極１０２からの電圧信号ともいう）。
【００５５】
参照電極１０３の電位はリード線１０８、外部接続部１０９を介して検出される。これにより、測定電極１０２近傍に配置された検体細胞１に起因する電圧信号が測定電極１０２にて測定される（上述の工程Ｂ）。
【００５６】
なお、電位測定時には、図２に示したように、測定電極１０２の近傍に検体細胞１が配置されるが、図３では、細胞は省略して、センサ１２０の構成のみを表示する。センサ１２０の詳細な構成及び作成方法については後述する。
【００５７】
［検体細胞］
本発明の医薬品安全性試験に用いられる検体細胞は、ＨＥＲＧチャネルを有する。検体細胞は、ＨＥＲＧチャネルを予め内在した細胞、ＨＥＲＧチャネルを後から導入した細胞のいずれであっても良い。
【００５８】
ここで、ＨＥＲＧチャネルとは、細胞内及び細胞膜上に存在する生体構成要素であって、人体に対する危険性を有する被試験医薬品が作用する対象を指す。本発明の医薬品安全性試験が適用できるＨＥＲＧチャネルの作用は、危険性を有する被試験医薬品に対して、活性化される場合と、不活性化される場合の、どちらであっても良い。以下では、具体的にＨＥＲＧチャネルが不活性化される時に危険性が増大する場合にのみ記述するが、それだけに限定されない。
【００５９】
そのようなＨＥＲＧチャネルとしては、細胞膜上に存在するイオンチャネル、細胞内に存在する情報伝達物質、代謝産物等の各種タンパク質、核酸類と、それらの改変物などが挙げられる。特に、本発明の主要な応用例である、薬物誘発性ＱＴ延長症候群を例にとると、ＨＥＲＧチャネルには、ＨＥＲＧイオンチャネルや遅延整流性カリウムイオンチャネル、先天性ＱＴ延長症候群の原因遺伝子ＬＱＴなどが挙げられる。また、前述のＨＥＲＧチャネルを予め内在した検体細胞としては、モルモット乳頭筋標本やイヌPurkinje線維の細胞、モルモット心筋細胞、モルモット心房筋細胞などが挙げられ、後からＨＥＲＧチャネルを導入される宿主細胞として利用可能な検体細胞は、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、アフリカツメガエルの卵母細胞などが挙げられる。
【００６０】
ＨＥＲＧチャネルの導入は、ＨＥＲＧチャネルを発現する遺伝子を当業者に公知の遺伝子導入技術を用いて導入することができる。実験毎にベクターなどのＨＥＲＧチャネル発現遺伝子を導入する一過性発現細胞、ＨＥＲＧチャネル発現遺伝子を定常的に発現するように改変された定常発現細胞の両方を用いることができるが、定常発現細胞はＨＥＲＧチャネルの発現が定常的に起こっているので、測定誤差の観点から優れているため、定常発現細胞を用いることが望ましい。
【００６１】
［準備工程の詳細］
図４は、測定に先だって、ＨＥＲＧイオンチャネルを含む検体細胞を、医薬品安全試験センサの測定電極の近傍に用意する準備工程（工程Ｏ、図１のステップＳ０）の詳細を示すフローチャートである。この準備工程は、実線で示すように、センサ１２０のウェル１０４に溶液を満たす工程（ステップＳ２１）、ウェル１０４に満たされている溶液を、所望の検体細胞１を所定の量だけ懸濁させた細胞懸濁液に置換する工程（ステップＳ２３）からなる。このような工程により、測定電極１０２の近傍に検体細胞を配置することができる。
【００６２】
なお、図４に点線矢印で示すように、準備工程（ステップＳ０）を、ステップＳ２１、測定電極１０２の近傍及び基板１０１表面の領域に固定化剤を固定化する工程（ステップＳ２２）、ステップＳ２３、細胞を培養する工程（ステップＳ２４）の順に遂行する工程としてもよい。
【００６３】
本発明の医薬品安全性試験方法に用いる溶液とは、20mM〜400mMの塩化ナトリウムを主成分とする生理食塩水溶液、及び種々の栄養素、成長因子、抗生物質などを含有する培養液、所定の化学物質、化合物、薬剤を溶解させた緩衝溶液などを指す。溶液は、予め脱気されているものを使用すると好ましい。また、溶液は、例えば、４℃から40℃の範囲内に温度設定されているものを用いることができる。
【００６４】
なお、固定化剤とは、細胞の固定化を容易及び／又は強固にする材料のことをいう。固定化剤の固定化は、センサ１２０の作製途中である、ウェル１０４を設置する前に行っても良い。
【００６５】
細胞を固定化する固定化剤の固定化材料としては、通常、誘電体が用いられる。誘電体としては、強塩基性もしくは強酸性官能基を持つ高分子が好適に用いられる。具体的には、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリオルニチン（ＰＯ）、ポリリジン（ＰＬ）等の正荷電性ポリマーが好適に用いられる。正に荷電したこれらのポリマーは、負に荷電した細胞を引き付ける効果も併せ持つ。同様に、細胞接着能を併せ持つ材料は、ビグアニド基、もしくはカルバモイルグアニジド基を持つ高分子が上げられる。具体的にはアリルビグアニド−ｃｏ−アリルアミン（ＰＡＢ）、アリル−Ｎ−カルバモイルグアニジノ−ｃｏ−アリルアミン（ＰＡＣ）が好適に用いられる。また、マトリクス材料を用いることができる。マトリクス材料として、細胞接着性のタンパク質が好適に用いられ、かかるタンパク質としてはコラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン等が挙げられる。
【００６６】
固定化剤による被覆は、上記固定化材料を所定の濃度で溶解させた固定化溶液を、測定電極１０２上に曝し、所定時間経過後、測定電極１０２の表面から固定化溶液を取り除き、表面を洗浄液で少なくとも１回以上洗浄し、乾燥することにより行うことができる。又は、上記固定化溶液を、測定電極１０２の上面だけにスポットし、被覆する方法であっても良い。
【００６７】
培養液内に播種された細胞は、培養が進行すると同時に、付着性細胞が、固定化剤が固定化されている場合はこれを介して、測定電極１０２上に強固に固定化される。
【００６８】
［測定開始以降の工程の詳細］
上述した準備工程（図１のステップＳ０）の後、ステップＳ１（工程Ａ）として、センサ１２０の測定電極１０２において検体細胞１が発する電圧信号が、被試験医薬品との対照として、被試験医薬品だけを省いた対照溶液に対して測定される。
【００６９】
次に、ステップＳ１の後、ステップＳ２（工程Ｂ）として、センサ１２０の測定電極１０２において検体細胞１が発する電圧信号が、被試験医薬品を所定の濃度で含有する測定溶液に対して測定される。
【００７０】
次に、ステップＳ２の後、ステップＳ３（工程Ｃ）として、センサ１２０の測定電極１０２において検体細胞１が発する電圧信号が、再び対照溶液に戻した時に測定される。例えば、検体細胞１のＨＥＲＧチャネルが通常時に常時活性化している場合においては、そのまま測定電極１０２で電圧信号を測定するだけで良い。あるいは、例えば、検体細胞１のＨＥＲＧチャネルが通常時に不活化している場合においては、検体細胞１のＨＥＲＧチャネルを活性化するために、検体細胞には刺激が与えられる。
【００７１】
なお、刺激を与える場合の試験方法については、実施の形態５に詳述する。また、工程Ａにおいて、電圧信号を検出する回数は任意であり、各測定溶液及び各対照溶液に対して複数回測定しうる。
【００７２】
次に、ステップＳ４として、ステップＳ１において測定された測定電極１０２の電圧信号と、ステップＳ３において測定された測定電極１０２の電圧信号の測定結果を比較するか、又はステップＳ２において測定された測定電極１０２の電圧信号と、ステップＳ３において測定された測定電極１０２の電圧信号の測定結果を比較する。なお、両方の測定結果を比較しても良い。具体的な比較方法の一例は、上述した通りである。
【００７３】
ここで、ステップＳ１で測定された測定電極１０２の電圧信号と、ステップＳ２で測定された測定電極１０２の電圧信号とを比較することによって、被試験医薬品が与える検体細胞１のチャネルへの拮抗影響を抽出することができる。
【００７４】
また、ステップＳ２において測定された測定電極１０２の電圧信号と、ステップＳ３において測定された測定電極１０２の電圧信号と比較することによって、被試験医薬品が与える検体細胞１のチャネルへの拮抗形式を抽出することができる。
【００７５】
対照溶液としては、上述した被試験医薬品が非存在の対照溶液の他に、陽性対照試薬又は陰性対照試薬存在下の対照溶液を、代わりに、もしくは、さらに、適用できる。
【００７６】
ステップＳ４Ａにおける電圧信号の比較は、一つのウェル１０４内の溶液を交換することによって実現される（方法α）が、ステップＳ１〜Ｓ３に示した測定溶液及び対照溶液のそれぞれが入った異なるウェル１０４の測定電極１０２の電圧信号を、直接比較することによっても実現することができる（方法β）。方法αは、特に同じ細胞からの信号を測定することになり、信頼性の高い測定が実施でき、また、方法βは、溶液を交換することがないため、高い処理速度で電圧信号差を検出することができる。
【００７７】
最後に、ステップＳ５として、ステップＳ４Ａにおける電圧信号の比較結果に基づいて、被試験医薬品の危険性を判定する。なお、ステップＳ４Ａにおける電圧信号の比較は、電圧信号の振幅値を比較して評価することが望ましい。ステップＳ４Ｂについても同様である。
【００７８】
なお、以下においては、全て図１Ａに示すフローチャートの例、すなわち、ステップＳ１（工程Ａ）とステップＳ３（工程Ｃ）の電圧信号の差を比較することによって、被試験医薬品の安全性を評価する方法及びシステムについて説明する。
【００７９】
ＨＥＲＧチャネルの拮抗形式は特徴的であるため、上述したように、ステップＳ４Ａで計算される、ステップＳ１及びステップＳ３における電圧信号の振幅の差で判定できる。催不整脈作用を有する拮抗剤（被試験医薬品）は、チャネルの孔（ポア）に拮抗剤が不可逆的にはまり込む、オープンチャネルブロッカー型である。このため、チャネル閉塞率に依存して、電圧信号の振幅値が変化する。よって、具体的には、電圧信号の振幅を、イオンチャネル開閉が現れる小区間に切り出して、小区間での電圧信号の振幅の標準偏差値を、その小区間の代表値として度数分布化させることによって、容易に被試験医薬品の危険性を定量的に解析できる。つまり、測定用電極１０２の電圧信号の振幅値が大きいほど、度数分布のピーク値が大きくなり、電圧信号の振幅値がばらつくほど、度数分布の半値幅は大きくなる。
【００８０】
また、別の電圧信号の差の解析方法としては、予め設定した設定電圧閾値をまたぐゼロクロス時間を指標として評価しても良い。つまり、設定電圧閾値より大きい電圧信号を出している時間は、危険要素が活性化された時間を示すので、上記の時間が長いということは、被試験医薬品の危険性が増す。前述の小区間で区切って度数分布化する解析法で解析する全体の時間は、上記のゼロクロス時間と等しく設定しても良い。
【００８１】
いずれの解析方法においても、測定電極の電圧信号を測定する本発明の医薬品安全性試験方法及びシステムにおいては、被試験医薬品の危険度が増大すると、電圧信号が増大する方向に表れるため、最低検知感度を高くすることができ、信頼性の高い安全性試験を実施することができるという特徴も備える。
【００８２】
図５に、図１Ａに示すフローチャートに、さらに異なる工程を付加した医薬品安全性試験方法のフローチャートを示す。図５に示した方法においては、ステップＳ１（工程Ａ）の前に、検体細胞１のＨＥＲＧチャネルの活動に由来する電圧信号をさらに大きく測定するために、予め、同様に活性化している非ＨＥＲＧチャネルを不活化させる工程（ステップＳ１１）を持つ。これは、例えば、非ＨＥＲＧチャネルだけを選択的に拮抗する拮抗剤を溶液に混合させておくことにより実現される。かかる構成により、ＨＥＲＧチャネルの活性化電圧信号だけを測定することができ、目的の電圧信号を感度良く検出するために有効である。
【００８３】
［センサの詳細構成と作製方法］
本実施の形態に示された医薬品安全性試験方法に用いられるセンサ１２０の構成は、上述したように、図２及び図３に示した。ここで、図２及び図３を参照しつつ、さらにその構成を詳述し、また、センサ１２０の作成方法も説明する。
【００８４】
測定電極１０２の数は、特に限定されず、各ウェル１０４に一つであっても、複数であっても良い。各ウェル１０４に一つの測定電極１０２が配置される場合には、一つのセンサ１２０上に多くのウェル１０４を集積化することができ、本発明の医薬品安全性試験を並列的に処理する能力が向上し、短時間で多数の試験を実施できる。また、各ウェル１０４に複数の測定電極１０２が配置される場合には、複数の測定データによる統計処理が可能となるので、各ウェル１０４で実施される試験の確度が向上し、高い信頼性を実現することができる。さらに、一つの測定電極１０２は、一つの細胞からの電位信号、及び複数の細胞の電位信号の集合を測定しても良い。
【００８５】
測定電極１０２からの電位信号を伝えるリード線１０５を被覆し、絶縁するために絶縁層を設けても良い。絶縁層の材料としては、ポリイミド（ＰＩ）樹脂、エポキシ樹脂などの樹脂が挙げられる。好ましくは、ネガティブフォトセンシティブポリイミド（ＮＰＩ）などの感光性樹脂が用いられる。感光性樹脂を用いる場合、まず、センサ部上面全体に感光性樹脂を塗布し、その後、フォトエッチングによるパターン形成を利用して、測定電極１０２上及びリード線１０５の外部接続部１０７の上に形成された絶縁層を取り除くことにより、該電極１０２及び外部接続部１０７を露出させ、任意の領域に絶縁層を形成することが可能となる。生産効率の点から、上述した方法により、絶縁層を形成することが好ましい。
【００８６】
溶液保持部１１９は、ウェル１０４を複数有し、その内部に測定溶液５１（ウェル１０４内部には、測定溶液及び対照溶液が添加されうるが、以下においては両者を区別することなく単に測定溶液ともいう）を蓄えることができる。また、参照電極１０３を有し、測定溶液５１を介して測定電極１０２と電気的に導通する。
【００８７】
図示していないが、各ウェル１０４に測定溶液５１の導入及び置換を実現するために、注入管が溶液保持部１１９の近傍に配置されても良い。注入管は、各ウェル１０４に測定溶液５１を導入する目的を達成するのであれば、どのような形態でも取りうる。一例を挙げれば、ウェル形成体１３１に流路を形成し、この流路を通じて測定溶液５１を測定電極１０２に向けて流しても良いし、ウェル形成体１３１に注入管の外径とほぼ等しい穴を電極１０２に向けて掘り、そこに注入管を差し込み固定しても構わない。
【００８８】
好適には、注入管は、溶液保持部１１９の上面に配置され、複数の各ウェル１０４に測定溶液５１が導入できるように移動機構を併設することが望ましい。また、必要に応じて、測定溶液５１を交換するための排出管を備えても良い。かかる構成により、細胞１の培養に際しては、ウェル１０４内で培養液５１にて長期培養することができ、また、測定に際しては、被試験医薬品剤不存在の測定溶液５１と被試験医薬品剤存在の測定溶液５１を交換することができるようになるため、医薬品安全性試験を迅速に測定することができる。
【００８９】
参照電極１０３は、ウェル１０４内で測定溶液５１と一部分を接触し、かつ、測定電極１０２と直接導通しないように配置される。参照電極１０３は、ノイズを低減するためにその面積を十分大きくする必要がある。具体的には、参照電極１０３の面積の合計は、すべての測定電極１０２の面積の合計に対して５倍以上大きい構成となるように形成されているのが望ましい。参照電極１０３の最表面は、金、白金、銀−塩化銀などの材料で作製されたものであるが、図２に示すように、ウェル１０４と一体化して、細胞が固定される部分とその近傍を除いた面に形成させても良い。この場合、参照電極１０３は、ウェル１０４毎に個別に用意しても良いし、全面に形成させても良い。
【００９０】
かかる構成は、複数の測定電極１０２を有するセンサ１２０を実現すること、参照電極１０３面積を大きくすることが容易であり、かつ、薄膜形成化技術を用いることでセンサ１２０の効率的な生産の面からも望ましい。また、参照電極１０３は、上記にこだわらず、棒状電極をウェル１０４内の測定溶液５１に浸すなど任意の形であり得る。
【００９１】
次に、センサ１２０の作製方法の一例を示す。まず、電極材料を基板１０１上に蒸着した後、フォトレジストを用いてエッチングすることにより、電極１０２と、対応するリード線１０５及び外部接続部１０７を１セットとして、かかるセットを複数セット有する所望のパターンを形成する。その後、電極１０２上及び外部接続部１０７を除く上記パターンの上面と基板１０１の上面とを絶縁層で被覆する。そして、基板を所定角の小片基板１０１に切り出す。電極１０２のパターンは、予め前記パターンを形成させたステンシルマスクを通じて蒸着するマスク法や、リフトオフ法によって形成しても良い。このように形成された小片基板１０１の上面に、当業者に既知の方法で凹部１０６ａを作製し、参照電極１０３を形成した溶液保持部１１９（ウェル形成体１３１）を接着し、センサ１２０を得る。
【００９２】
［医薬品安全性試験システム(1)］
図６−Ａは、本実施の形態の医薬品安全性試験システムの一例を模式的に示すブロック図である。図６−Ａに示すように、医薬品安全性試験システム１５０Ａは、医薬品安全性試験センサ１２０と、少なくともセンサ１２０を静電的に遮蔽する遮蔽箱１５１と、センサ１２０上の測定電極１０２と参照電極１０３間の電圧信号を増幅処理する第一の増幅部１５２と、第一の増幅部１５２で増幅された電圧信号のうち、所定の周波数帯域だけの信号成分を更に増幅処理する第二の増幅部１５３、第二の増幅部１５３で増幅された電圧信号をデータ処理する計算処理部１５５と、測定環境調節装置１５６と、複数の測定溶液又は薬剤溶液をウェル１０４内に導入及び置換するためのウェル内溶液置換装置１５７ａと、ウェル１０４内の測定溶液又は薬剤溶液を排出するウェル内溶液排出装置１５７ｂと、溶液切替装置１５８とを有している。
【００９３】
このような構成とすることにより、簡易なシステムで、多数の医薬品候補薬剤の危険性を迅速に検出するシステムを提供することができる。
【００９４】
医薬品安全性試験センサ１２０において、センサ１２０内の参照電極１０３に対する測定電極１０２の電位信号は、測定電極１０２のリード線１０５を通じて、第一の増幅部１５２へと出力される。第一の増幅部１５２は、電位信号を高感度に増幅し、第二の増幅部１５３へと出力する。第二の増幅部１５３は、Ａ／Ｄ変換等を経て、計算処理部１５５へと電位信号を出力する。最後に、計算処理部１５５は、入力した電圧信号を所定の手順で比較することにより、センサ１２０内の被試験医薬品の安全性を判定する。すなわち、医薬品安全性試験システム１５０Ａにおいて、ウェル内溶液置換装置１５７ａの溶液注入及び排出によって提供される様々な薬剤に対する、標的生体構成成分の危険要素に起因する電位信号の変化を、細胞外に配置された電極１０２の電位変化として測定し得る。
【００９５】
医薬品安全性試験システム１５０Ａは、医薬品安全性試験センサ１２０からの出力を処理するため、適切な測定用ソフトウェアを備えた計算処理部１５５によって一体として構成される。計算処理部１５５は、例えば、コンピュータによって構成され、測定用ソフトウェアは、コンピュータの記憶部に格納されていて、当該コンピュータの画面上に、信号処理・測定条件などを設定し得るパラメータ設定画面、細胞から検出された電位変化を記録し、リアルタイムで表示し得る記録画面、及び記録されたデータを解析し得るデータ解析画面などを与える。
【００９６】
また、ウェル内溶液置換装置１５７ａ及びウェル内溶液排出装置１５７ｂは、計算処理部１５０に電気的に接続され、制御されている。計算処理部１５５は、溶液切換装置１５８に、所定のタイミングと手順でウェル内溶液置換装置１５７ａ内の溶液をセンサ１２０のウェル１０４に注入するように制御信号を送る。さらに、計算処理部１５５は、ウェル内溶液排出装置１５７ｂに、所定のタイミングと手順でウェル１０４内の溶液を排出するように制御信号を送る。このように構成されているため、予め設定した所定のタイミング、測定手順で各溶液の交換を自動的に行うことができる。
【００９７】
遮蔽箱１５１は、センサ１２０を静電遮蔽するよう設置される。遮蔽箱１５１は、センサ１２０のみならず、第一の増幅部１５２も一体として静電遮蔽することが望ましい。かかる構成により、測定電極１０２で観測される電位信号がよりノイズに対して強くなる。また、遮蔽箱１５１によりセンサ１２０は外環境から遮光されるので、光感受性の薬剤溶液を測定に用いる場合であっても、光分解を防ぐことができ、長期にわたる測定の安定性と、測定の再現性を向上させることができる。特に、上方からウェル１０４内の測定溶液５１をバッチ式に置換する方式では、遮蔽箱１５１の上方に位置する部分に開口が必要となるため、参照電極１０３をセンサ１２０上面の全面に形成させ、上記参照電極１０３を遮蔽箱１５１に接続することが好ましい。このように構成すると、信号が微小であってもＳ／Ｎ比を高くすることができ、より高感度に検出することが可能となる。
【００９８】
測定環境調節装置１５６は、防振台の上に置かれ、さらに、ファラデーカゴ等の遮蔽箱で覆い、二重に静電遮蔽されている。
【００９９】
なお、医薬品安全性試験システム１５０Ａでは、センサ１２０で測定された出力信号は、第一の増幅部１５２によって初段増幅され、第二の増幅部１５３によって、さらに増幅され、周波数帯域を制限された後、Ａ／Ｄ変換器を介して計算処理部１５５であるコンピュータ（計算部）に入力される。このような構成とすることにより、センサ１２０に近い位置に第一の増幅部１５２を配置することができるので、医薬品安全性試験システム１５０Ａは、外来ノイズに強いという特徴を有する。
【０１００】
さらに、医薬品安全性試験システム１５０Ａは、所望の測定電極１０２からの電気信号を選択的に第一の増幅器に送るための回路選択器（図示せず）を備える。この回路選択器は、例えば、マルチプレクサで構成される。かかる回路選択器を備えることにより、電極の数が増えても、必ずしも第一の増幅器の数を増やす必要がなく、生産性の面から有用である。
【０１０１】
ウェル内溶液置換装置１５７ａは、ここでは、ウェル１０４の上面から所定の量の溶液を注入する装置である。また、ウェル形成体１３１に固定され、各ウェル１０４から放射状に伸びて配置された注入管１５９に、薬剤種類の数だけ溶液切替装置１５８を備える。また、ウェル内溶液排出装置１５７ｂは、ウェル１０４に注入された溶液を、各ウェル１０４に接続された排出管１６０を通じて排出する装置である。これら二つの装置を有する構成により、医薬品安全性試験システム１５０Ａは、センサ１２０の細胞保持部近傍の溶液だけを迅速に置換できる。このため、複数種類の薬剤に対する、細胞の薬理特性を簡便に、かつ、精度良く検出することが可能である。
【０１０２】
図６−Ａに示した、ウェル内溶液置換装置１５７ａにつながる各要素は、測定溶液溜め（Ｌ１）、陽性対照薬剤溶液溜め（Ｌ２）、被試験医薬品剤Ａ溶液溜め（Ｌ３）、被試験医薬品Ｂ溶液溜め（Ｌ４）を例示しているが、これらに限定されるものではなく、各要素を増やすことにより、複数種類の薬剤溶液を同時に判定することができる。
【０１０３】
さらに、医薬品安全性試験システム１５０Ａは、センサ１２０を所定の温度、ガス濃度、湿度に保つための測定環境調節装置（図示せず）を備える。このため、細胞の播種から培養、そして測定までを一連のシステム上で行うことができ、移動に伴う滅菌などの煩雑な操作を経る必要がなく、全自動化による大量かつ効率的な測定及び判定を実施することができる。
【０１０４】
図６−Ｂは、本実施の形態の医薬品安全性試験システムの別の構成例を模式的に示すブロック図である。図６−Ｂに示す医薬品安全性試験システム１５０Ｂは、ウェル内溶液排出装置１５７ｂ及び排出管１６０を有しない点でのみ、図６−Ａに示す医薬品安全性システム１５０Ａと異なる。以下、この相違点についてだけ説明する。
【０１０５】
本構成例による医薬品安全性試験システム１５０Ｂでは、ウェル内溶液置換装置１５７ａがウェル１０４に溶液を予め設定した所定のタイミング、測定手順で注入し、必要な電圧信号を測定した後、ウェル１４０内の溶液を順次排出する。なお、ウェル内溶液置換装置１５７ａは、溶液の注入のみ行い、使用者がウェル１０４内の溶液を、ピペッティングやアスピレータ等を用いて排出するように構成しても良い。この場合、ウェル１０４内の溶液を排出した後、ウェル内溶液置換装置１５７ａを再び作動させ、測定を続行する。このような構成としても、医薬品安全性システム１５０Ａと同じ医薬品安全性評価機能を発揮できる。
【０１０６】
図６−Ｃは、本実施の形態の医薬品安全性試験システムのさらに別の構成例を模式的に示すブロック図である。図６−Ｃに示す医薬品安全性試験システム１５０Ｃは、ウェル内溶液置換装置１５７ａ、ウェル内溶液排出装置１５７ｂ、溶液切換装置１５８、注入管１５９及び排出管１６０を有しない点でのみ、図６−Ａに示す医薬品安全性システム１５０Ａと異なる。以下、この相違点についてだけ説明する。
【０１０７】
本構成例による医薬品安全性試験システム１５０Ｃでは、使用者がウェル１０４に所定のタイミング、測定手順で、溶液をピペッティング等の手段で注入し、必要な電圧信号を測定した後、ウェル１０４内の溶液を、マイクロチューブとアスピレータ等を用いて排出する。そして、別の溶液をピペッティング等の手段で注入し、電圧を測定する。このように、ウェル１０４への溶液の注入、溶液の排出、溶液の切換を全て手動としても、医薬品安全性システム１５０Ａと同じ医薬品安全性評価機能を発揮できる。
【０１０８】
（実施の形態２）
図７−Ａは、本発明の実施の形態２の医薬品安全性試験方法の工程を示すフローチャートである。本実施の形態と実施の形態１との違いは、ステップＳ１２を含むことのみであるので、以下、本実施の形態については、この相違点だけ説明する。
【０１０９】
ステップＳ１２は、検体細胞１が測定溶液と接した状態で電圧信号を測定する工程（ステップＳ２）と、測定溶液を対照溶液に再び交換した状態で電圧信号を測定する工程（ステップＳ３）を繰り返す工程である。ステップＳ１２によると、被試験医薬品の頻度刺激特性を知ることができる。一般に、危険要素が示す拮抗応答は、被試験医薬品によって、被試験医薬品が繰り返し与えられる時に増強する型と、減衰する型と、変わらない型の３種類が存在する。上記の頻度刺激情報は、被試験医薬品を実際に医薬品として長期間慢性的に人体に処方する際に、人体に対する危険性が発生するか否かの貴重な判断材料を提供する。なお、ステップＳ２及びステップＳ３において、電圧信号を検出する回数は任意であり、各被試験医薬品に対して複数回測定しうる。
【０１１０】
ここで、ステップＳ１２では、ステップＳ２とステップＳ３を所定回数繰り返すまでは、ステップＳ２１からステップＳ２に戻る。そして、ステップＳ２とステップＳ３を所定回数繰り返せば、ステップＳ２１からステップＳ４Ａへと進み、ステップＳ１２は終了する。
【０１１１】
なお、ステップＳ４Ａにおける測定結果の比較は、所定回数ごとのステップＳ２とステップＳ３の測定値を用いてもよいし、全ての測定値の平均値を用いても良い。前者の場合、ＣとＡの差が所定回数ごとにどのように変化するかがわかる。変化が回数を追う毎に増加すると、被試験医薬品を実際に医薬品として長期間慢性的に人体に処方する際に、蓄積効果により人体に対する危険性が発生する可能性があると判断できる。
【０１１２】
（実施の形態３）
図７−Ｂは、本発明の実施の形態３の医薬品安全性試験方法の工程を示すフローチャートである。本実施の形態と実施の形態２との違いは、ステップＳ１２がステップＳ１３に代わることのみであるので、この相違点だけ説明する。
【０１１３】
ステップＳ１３は、ステップＳ１２と同じく、検体細胞１が測定溶液５１と接した状態で電圧信号を測定する工程（ステップＳ２）と再び対照溶液に戻した状態で電圧信号を測定する工程（ステップＳ３）を繰り返す工程である。そして、ステップＳ１３では、ステップＳ２とステップＳ３において、同じ検体細胞１に対し、種類の異なる被試験医薬品を含む溶液に交換して電圧測定を行う。
【０１１４】
ここで、ステップＳ１３では、ステップＳ２とステップＳ３を所定回数繰り返すまでは、被試験医薬品の種類を変更した測定溶液に交換し（ステップＳ２２，Ｓ２３）、その後、ステップＳ２に戻る。ステップＳ２とステップＳ３を所定回数繰り返せば、ステップＳ４Ａへと進み、ステップＳ１３は終了する。
【０１１５】
ステップＳ１３によると、被試験医薬品の複合作用特性を知ることができる。一般に、危険要素が示す拮抗応答は、単独の被試験医薬品によって起こる型と、複数種の被試験医薬品が順番に作用して起こる型が存在する。上記の複合作用特性情報は、被試験医薬品を実際に医薬品として人体に処方する際に、人体に対する危険性が発生するか否かの貴重な判断材料を提供する。
【０１１６】
なお、ステップＳ４Ａにおける測定結果の比較は、所定回数ごとのステップＳ２とステップＳ３の測定値を用いてもよいし、ステップＳ２とステップＳ３を所定回数繰り返した最終の測定値を用いても良い。後者の場合、初回の回数の測定値に差がなく、最終の測定値に差があるなら、単独の被試験医薬品ではなく、複数の被試験医薬品の組合せによって初めて、催不整脈作用を示すという情報が得られる。
【０１１７】
（実施の形態４）
図７−Ｃは、本発明の実施の形態４の医薬品安全性試験方法の工程を示すフローチャートである。本実施の形態と実施の形態２との違いは、ステップＳ１２がステップＳ１４に代わることのみであるので、この相違点だけ説明する。
【０１１８】
ステップＳ１４は、ステップＳ１２と同じく、検体細胞１が測定溶液５１と接した状態で電圧信号を測定する工程（ステップＳ２）と再び対照溶液に戻した状態で電圧信号を測定する工程（ステップＳ３）を繰り返す工程である。そして、ステップＳ１４では、ステップＳ２とステップＳ３が、同じ検体細胞１に対し、濃度の異なる同一被試験医薬品を含む溶液に交換して電圧測定を行う。通常は、濃度の薄い被試験医薬品から濃度の濃い被試験医薬品へと進める。これにより、どの濃度で催不整脈作用が起こり始めるかといった危険濃度を知ることができる。
【０１１９】
ここで、ステップＳ１４では、ステップＳ２とステップＳ３を所定回数繰り返すまでは、被試験医薬品の濃度が異なる測定溶液に交換し（ステップＳ２４，Ｓ２５）、その後、ステップＳ２に戻る。ステップＳ２とステップＳ３を所定回数繰り返せば、ステップＳ４Ａへと進み、ステップＳ１４は終了する。
【０１２０】
なお、ステップＳ４Ａにおける測定結果の比較は、所定回数ごとのステップＳ２とステップＳ３の測定値を用いてもよいし、全ての測定値の平均値を用いても良い。
【０１２１】
ステップＳ１４によると、被試験医薬品の濃度依存性を算出することができる。上記の情報は、被試験医薬品を実際に医薬品として人体に処方する際の安全処方量を算出するための貴重な判断材料を提供する。
【０１２２】
（実施の形態５）
図８は、本発明の実施の形態５の医薬品安全性試験方法のフローチャートを示す図である。本実施の形態と実施の形態２との違いは、ステップＳ１及びステップＳ３の前に、検体細胞１が接する対照溶液を、測定溶液と対照溶液の中に共通に含まれるイオンの濃度を異ならせた対照溶液に交換する工程（それぞれ、ステップＳ１５及びステップＳ１７）と、ステップＳ２の前に、検体細胞が接する測定溶液を、ステップＳ１５でイオン濃度を異ならせた対照溶液と同じイオン濃度の測定溶液に交換する工程（ステップＳ１６）を有することのみであるので、この相違点だけ説明する。
【０１２３】
ステップＳ１１の次に、測定溶液と対照溶液の中に共通に含まれるイオンの濃度を異ならせた対照溶液をウェルに注入し（ステップＳ１５）、この対照溶液について電圧信号を測定する（ステップＳ１）。次に、ステップＳ１終了後、ウェル内の対照溶液を、イオン濃度が異なる測定溶液に交換し、（ステップＳ１６）、この測定溶液について電圧信号を測定する（ステップＳ２）。さらに、ステップＳ２終了後、ウェル内の測定溶液を、イオン濃度が異なる対照溶液に再び交換し（ステップＳ１７）、この対照溶液について電圧信号を測定する（ステップＳ３）。
【０１２４】
そして、ステップＳ１６，Ｓ２，Ｓ１７，Ｓ３を所定回数繰り返す。そして、これらを所定回数繰り返せば、ステップＳ４Ａへと進み、ステップＳ１８（図７−ＡのステップＳ１２に相当する）は終了する。
【０１２５】
本実施の形態における細胞への刺激は、溶液のイオン濃度を変化させることによる溶液刺激であり、電極を介する細胞への電気的刺激とは区別できる。つまり、本発明の医薬品安全性試験方法の効果の一つである、電気的刺激なしでの測定ができることは実現され、高感度な測定ができるという効果は十分に得られる。
【０１２６】
ＨＥＲＧチャネルは、電位感受性カリウムイオンチャネルに分類されるが、活性化膜電位の閾値が静止膜電位付近にあり、浅い膜電位を持つ検体細胞では、平常時にもわずかに活性化しているため、活性化刺激は必要ないことが本発明者らによって発見された。平常時に不活化しているチャネルの例を具体的に挙げれば、受容体作動型イオンチャネル、ＧＴＰ結合タンパク、酵素や、高い閾値を持つ電位感受性イオンチャネルの一部に見られる。受容体作動型イオンチャネル、ＧＴＰ結合タンパク、酵素等のチャネルを活性化させる刺激は、受容体に結合する化学物質である。
【０１２７】
このため、このチャネルを活性化させた時のセンサ応答は、具体的には、活性化物質を所定の濃度溶解させた活性化溶液をウェルに投入することによって実現することができる。また、電位感受性イオンチャネルを活性化させる場合は、溶液のイオン組成を変化させる溶液刺激が電気的刺激と同様の効果を持つということが本発明者らによって確認されている。
【０１２８】
例えば、モルモット乳頭筋に存在する遅延整流性カリウムイオンチャネルは、電位感受性イオンチャネルに分類される。これらのイオンチャネルを活性化する際に溶液刺激を適用する場合には、溶液の成分中に占めるカリウムイオン濃度を上昇させることにより実現される。細胞の細胞内電位は、ネルンストの式に示されるように、細胞内外におけるカリウムイオン濃度の比によって決定されるため、細胞外に存在する溶液のカリウムイオン濃度を、例えば、2mMから40mMに上昇させることにより、細胞内電位は上昇し、遅延整流性カリウムイオンチャネルが活性化される。
【０１２９】
本発明の医薬品安全性試験方法は、電位感受性イオンチャネルをＨＥＲＧチャネルとする場合は、溶液刺激も適応できるが、溶液刺激は、一例として挙げたように、低カリウム濃度溶液から高カリウム濃度溶液への置換によるため、活性化応答速度が溶液拡散で律速されるため遅い。
【０１３０】
なお、ステップＳ１において、電圧信号を検出する回数は任意であり、各被試験医薬品に対して複数回測定しうる。同じ大きさの溶液刺激を用い、同じタイミングで加えても良く、あるいは、刺激間隔を変化させ、複数回その応答を測定しても良い。異なるイオン濃度の刺激を用いても良い。
【０１３１】
例えば、同じイオン濃度の刺激を同じタイミングで注入したときの応答を複数回測定する場合は、各々の応答の差を平均、偏差などの統計的に処理できることにより、突発的な外乱の印加による擬陽性成分を除去できることに貢献し、応答の差をより信頼性高く検出することが可能となる。
【０１３２】
（実施の形態６）
本発明の実施の形態６は、本発明の医薬品安全性試験システムに使用される医薬品安全性試験センサに関する。以下、本実施の形態の医薬品安全性試験センサについて、図９から図１２を参照しながら説明する。
【０１３３】
本実施の形態に示した医薬品安全性試験に用いられるセンサの構成を表す模式図を、図９から図１２に示す。本実施の形態のセンサと実施の形態１に用いられるセンサとの違いは、電極近傍に貫通孔を有することが大きな違いであるので、この相違点を中心に説明する。
【０１３４】
本実施の形態のセンサは、測定電極の近傍に細胞を配置しやすいよう、貫通孔を持っている。貫通孔を持った本実施の形態の好適例であるセンサ全体の斜視図を、図１０に示す。また、センサ基板が接続された構成がより分かるよう、図１０に示す任意の３つのウェル付近を拡大表示した部分断面図を、図９に示す。また、貫通孔を持ったセンサ基板の構造がより分かるよう、図９に示す一つのセンサ基板とウェル底面近傍を拡大した部分断面図を、図１１に示す。同じく、一つのセンサ基板の下面図を、図１２に示す。図９から図１２において、図２及び図３と同一又は相当する部分には同一符号を付してその説明を省略する。
【０１３５】
なお、図１０では、センサ右下付近のウェル１０４のみ、センサ基板１２２がウェル底面に固定されているように示されているが、これは、センサ基板１２２の取り付け状態を説明するために、便宜上この部分のウェル１０４についてのみ、センサ基板１２２を図示したに過ぎずない。また、図１０及び図１１では、参照電極と検体細胞等の一部構成を省略して示す。また、図９では、真ん中のセンサ基板だけにチューブ１１４が接続されているように示されているが、他のセンサ基板にも同様に接続されている。
【０１３６】
本実施の形態のセンサ１２０は、図１０に示すように、多数の円柱状のウェル１０４が格子のノードに位置するように多数形成された溶液保持部１１９と、貫通孔１１７を有するセンサ基板１２２とを備えている。センサ基板１２２の取り付け方法は、センサ基板１２２の上面に測定溶液５２が溜まるのであれば任意でありうるが、好適には、図９に示すように、各ウェル（以下、第一のウェルという）１０４の底面に開口１０４ａを設け、この開口１０４ａに貫通孔１１７が位置するようにして溶液保持部１１９の下面にセンサ基板１２２が取り付けられる。測定溶液５２は、センサ基板１２２の上面に接するように、第一のウェル１０４内に満たされる。なお、本実施の形態では、センサ１２０を安定的に設置するため、図９及び図１０に示すように、センサ１２０を受けるためのセンサ設置台１２１が設けられる。もちろん、センサ設置第１２１を省略することもできる。
【０１３７】
本実施の形態のセンサ１２０においては、センサ基板１２２（細胞固定化器）に、図１１に示すように、その一部に細胞保持部である微小くぼみ１１６が形成されている。また、センサ基板１２２には、微小くぼみ１１６と貫通孔１１７を介して連通する、第二の溶液を保持するための第二のウェル１１２が形成されている。溶液保持部１１９は、実施の形態１で説明したように、板状のウェル形成体１３１と参照電極１０３とを備える。センサ設置台１２１には、電極接点ピン１１１が所定の位置に立設されており、その上にセンサ１２０が載置されている。
【０１３８】
センサ基板１２２は、図１１に示すように、基板１０１を備えている。基板１０１の上面の所定位置には、１以上の半球形の微小くぼみ１１６が形成されている。基板１０１の下面の、微小くぼみ１１６が形成された領域の下方に位置する領域に、凹部からなる第二のウェル１１２が形成されている。そして、微小くぼみ１１６と第二のウェル１１２とを連通するように、基板１０１の厚み方向に貫通孔１１７が形成されている。また、基板１０１の下面には、第二のウェル１１２からその端面に至るように溝からなる交換口１１３が形成されている。そして、第二のウェル１１２の内面に膜状の測定電極１０２が形成されている。
【０１３９】
一方、基板１０１の下面の縁部（端部）には膜状の外部接続部１０７が形成されている。そして、基板１０１の下面に測定電極１０２と外部接続部１０７とを接続するようにリード線１０５が形成されている。そして、外部接続部１０７を除きかつ基板１０１の下面と測定電極１０２とリード線１０５とを覆うように絶縁膜１０６が形成されている。測定電極１０２及び絶縁膜１０６には貫通孔１１７に連通するように貫通孔が形成されている。
【０１４０】
そして、この絶縁膜が形成された基板１０１の下面に底面基板１１８が配設されている。底面基板１１８は、基板１０１の外部接続部１０７が露出するように配設されている。この底面基板１１８により第二のウェル１１２の開口が閉鎖されている。また、この底面基板１１８に溝状の交換口１１３の開放面が閉鎖されている。また、交換口１１３の外部側の端にチューブ１１４が接続されている。
【０１４１】
そして、図９に示すように、センサ基板１２２の外部接続部が１０７が電極接点ピン１１１に当接するようにして、センサ１２０がセンサ設置台１２１に載置されている。
【０１４２】
本実施の形態では、センサ基板１２２は、貫通孔１１７上部に設けられた微小くぼみ１１６により、生体試料である検体細胞１を密着して保持することができる。この結果、検体細胞１は、測定電極１０２近傍に配置され、検体細胞１からの電位信号が測定電極１０２にて測定される。
【０１４３】
このように、貫通孔１１７の上に微小くぼみ１１６を形成することにより、検体細胞１を容易にセンサ基板１２２上に捕捉することができる。また、貫通孔１１７の下方から検体細胞１を吸引することや、貫通孔１１７の上方から検体細胞１を加圧することにより、検体細胞１の固定化をさらに容易にすることもできる。
【０１４４】
測定電極１０２は、センサ基板１２２に形成された少なくとも一つの貫通孔１１７の孔内及び／又は基板１２２上面における貫通孔１１７の孔周囲に形成されることが好ましい。
【０１４５】
センサ基板１２２上に形成する貫通孔１１７の数及び位置関係は任意であり、図１１及び図１２に示した数に限定されないが、貫通孔１１７は、一つの測定電極１０２に対して複数形成されている構成とすることが望ましい。具体的には、一つの測定電極１０２に対し、１個以上2000個以下が望ましい。このような構成とすれば、検体細胞１の生存率に影響されない測定が可能となる。センサ基板１２２上における貫通孔１１７同士の位置関係は、例えば、図１２に示したように、格子のノードに位置するように配置し得る。その場合、複数の貫通孔１１７に保持された検体細胞１に起因する電気信号が、一つの電気信号として一つの測定電極１０２から検出されることになる。本実施の形態のセンサ１２０は、複数の検体細胞１の応答を同時に検出する薬品スクリーニング等において特に有用である。
【０１４６】
貫通孔１１７の形状は、検体細胞１を保持しうるものであれば、特に限定されない。例えば、上面開口部が下面開口部より大きい円筒状であっても良いが、図１１に示したように、円筒状の貫通孔１１７の上部に微小くぼみ１１６を形成した形状は、微小くぼみ１１６の曲率によって、検体細胞１をより確実に貫通孔１１７との境界に密着及び保持しうるため、非常に望ましい。
【０１４７】
微小くぼみ１１６は、目的の検体細胞１に依存した任意の大きさを採用することができ、目的の検体細胞１を保持しうる大きさであれば、特に制限されない。具体的な微小くぼみ１１６のサイズは、センサ基板１２２上面と同じ平面における直径が2〜500μｍの範囲であることが好ましく、10〜100μｍの範囲であることがより好ましい。例えば、生体試料として用いる検体細胞１の長径が略30μｍの場合、開口部上面の直径が略20μｍであることが好ましい。
【０１４８】
貫通孔１１７は、吸引によって測定溶液が通過し、かつ、検体細胞１が通過しない大きさであれば良い。貫通孔１１７の直径は、1〜125μｍの範囲であることが好ましく、直径が2〜25μｍの範囲であることがより好ましい。例えば、貫通孔１１７の直径は、微小くぼみ１１６の直径が略20μｍである場合には、略5μｍであることが好ましい。貫通孔１１７の長さは、任意である。
【０１４９】
第二のウェル１１２には、第二の溶液が蓄えられている。第二のウェル１１２は、その底面（底面基板１１８）に開口部がない。このため、第二のウェル１１２に蓄えられた第二の溶液は、第二のウェル１１２内に重力によって保持され、貫通孔１１７及び貫通孔１１７近傍の電極１０２部から離れることがないため、安定な電圧測定が可能となる。
【０１５０】
さらに、第二のウェル１１２には、第二の溶液を別の第三の溶液に交換するための交換口１１３を側面部に有している。かかる構成により、必要に応じて、ナイスタチンなどの小孔形成物質を第二のウェル１１２と接する部分の検体細胞１と接触させることができる。
【０１５１】
以下、本実施の形態の医薬品安全性試験センサの作成方法について説明する。図９と図１０に示す医薬品安全性試験センサは、図１１と図１２に示すセンサ基板の作製工程、上部溶液保持部材の作製工程、及びセンサ基板と上部材の接着工程の３つの工程により形成される。
【０１５２】
まず、医薬品安全性試験センサ１２０のセンサ基板１２２の作製方法について、図２５から図３０を参照しながら説明する。
【０１５３】
センサ基板１２２を製造するには、まず、図２５に示すように、シリコンからなるベース１４１と、二酸化シリコンからなる中間層１４２と、シリコンからなる薄板１４３で構成される基板１４０を用意し（工程１）、次に、ベース１４１と薄板１４３の両側にレジスト膜１４４とレジスト膜１４５を積層させる。そして、ベース側のレジスト膜１４４を、所定のパターンを有するようにパターニングしてレジストマスクとする。なお、上記のような基板１４０は、ＳＯＩ基板と呼ばれ、半導体デバイスを作製する際に良く用いられ、入手は容易であるのでこの基板の製造方法については省略する。
【０１５４】
次に、図２６に示すように、ベース１４１部分のエッチングを行い、第二のウェル１１２と下方が開放された溝状の交換口１１３を形成する（工程２）。このときのエッチング方法はドライエッチング、ウエットエッチングなど通常の方法を用いる。
【０１５５】
次に、図２７に示すように、薄板１４３側のレジスト膜１４５を、所定位置に開口１４５ａを有するようにパターニングしてレジストマスクとする（工程３）。
【０１５６】
次に、図２８に示すように、ドライエッチングによって、薄板１４３側からエッチングを行う（工程４）。このとき、エッチングガスとしてはエッチングを促進するガスのみを用いる。このため、エッチングを促進するガスにはＳＦ６、ＣＦ４、ＸｅＦ２などを用いることができる。これらはシリコンのエッチングを深さ方向だけでなく、横方向へのエッチングも促進する作用があるからである。実験ではＸｅＦ２を用いて効果を確認している。これによって、エッチングされた部分の形状は、図２８に示すようにレジスト膜１４５の開口１４５ａを中心とする半球形となり、この半球形の部分からなる微小くぼみ１１６が形成される。また、レジスト膜１４５（レジストマスク）は、ＸｅＦ２によってはほとんどエッチングされないので、図２８に示すように、最初の形状を保っている。
【０１５７】
次に、図２９に示すように、再び薄板１４３側から、ドライエッチングを行って、微小くぼみ１１６の底面に薄板１１３を貫通する貫通孔１１７を形成する（工程５）。
【０１５８】
このときのエッチング法は、ドライエッチングによる方法が最適であり、ドライエッチングの際にはエッチングを促進するガスと、エッチングを抑制するガスを用いる。エッチングを促進するガスとしては、ＸｅＦ２、ＣＦ４、ＳＦ６などがある。また、エッチングを抑制するガスとしてはＣＨＦ３、Ｃ４Ｆ８などがある。これらのガスを混合してエッチングすることで、エッチングされた壁面にＣＦ２のポリマーである保護膜が形成されるので、ドライエッチングによる微小貫通孔の形成をレジストマスクの下方のみに進行させることが可能となるので、微小くぼみ１１６及び貫通孔１１７が連結して形成される。
【０１５９】
ここで、エッチングが下方のみに進行する仕組みを少し詳しく説明する。まず、エッチングを促進するガスによってエッチングを少しだけ行った後、エッチングを抑制するガスによって保護膜を少しだけ形成する工程を繰り返すことで、ほぼ垂直なエッチング形状とすることができるのである。この工程では、エッチングを促進するガスによるドライエッチングの際に、外部コイルによる誘導結合法によって生成されたプラズマ中で、高周波を基板１４０（正確には薄板１４３）に加えることで、基板１４０にマイナスのバイアス電圧が発生する。このことにより、プラズマ中のプラスイオンであるＳＦ５＋やＣＦ３＋が基板１４０に向かって衝突するのでドライエッチングは垂直下方方向に進むことになる。
【０１６０】
ドライエッチングを抑制させる際には、基板に高周波を加えなければ、基板１４０にバイアス電圧が全く発生しないので、保護膜の材料となるＣＦ＋が偏向を受けなくなり、基板１４０のドライエッチング穴の壁面へ均一な保護膜の形成ができることになる。実験ではエッチングを促進するガスとしてＳＦ６、抑制するガスとしてＣ４Ｆ８を用いて確認している。
【０１６１】
これらガスを用いると、上述したようなそれぞれの作用によって、貫通孔１１７の形成をレジストマスクの下方のみに進行させることが可能となる。さらに同時にエッチングを抑制するガスを用いることにより、貫通孔１１７の側面には保護膜１４６が形成される。
【０１６２】
次に、二酸化シリコンよりなる中間層１４２の第二のウェル１１２に露出している部分をベース１４１側からドライエッチング、ウエットエッチングなどの通常のエッチング方法によりエッチングする。その後、図３０に示すように、基板１４０のベース１４１側から通常の薄膜形成工程とパターニング工程により、金を主体とする測定電極１０２を形成する（工程６）。ここでは、例えば、電極をパターニングする方法としては、電極材料を基板上に蒸着した後、フォトレジストを用いてエッチングすることにより、測定電極１０２、及び対応するリード線１０５及び外部接続部１０７を１セットとしてかかるセットを複数セット有する所望のパターンを形成する。電極のパターン形成は、その他に、予め電極パターンを形成させたステンシルマスクを通じて蒸着するマスク法や、リフトオフ法も適応できる。
【０１６３】
その後、基板１４０の下面の外部接続部１０７を除く（従って測定電極１０２及びリード線１０５を含む）部分を絶縁膜１０６（図１１参照）で被覆する。
【０１６４】
最後に、平らな底面基板１１８をベース側より接着剤にて貼り付け、センサ基板１２２を得る。なお、センサ基板１２２は必ずしもこの構成に従う必要はなく、例えば、ベースに交換口を作製せず、底面基板１１８に交換口を第二のウェル１１２に連通するように形成し、その底面基板１１８を基板１４０の下面に貼り付けても良い。
【０１６５】
底面基板１１８は、交換口１１３の溶液が漏れず、測定電極１０２がリード線１０５を介して接続される外部接続部１０７が露出していれば、特に形状は問わないが、図１１及び図１２に示したように、外部接続部１０７のみを切り欠いた平板形状とすることが好ましい。
【０１６６】
その後、ウエハをダイシングし、所定角の小片に切り出し、一つの小片を上記センサ基板１２２とする。一つの小片には、電極１０２、リード線１０５、及び外部接続部１０７が１セット形成されているようにする。このように、センサ基板１２２は、一つのウエハ上に複数作成し、その後、ダイシングすることで所定角の小片に切り出し、一つの小片をセンサ基板とすることが、生産性の観点から望ましい。
【０１６７】
なお、必要であれば、シリコンの表面に、熱酸化膜を通常の熱酸化工程によって形成する。この工程は、シリコンの表面抵抗を極力あげたい場合に用いれば良く、それほど高い表面抵抗を必要としないのであれば、シリコンの表面に自然に形成される自然酸化膜だけで十分である。
【０１６８】
次に、別途作成する樹脂よりなる第一のウェル１０４が多数設けられた板状の容器であるウェル形成体１３１と参照電極１０３とを備える溶液保持部１１９の底面に、センサ基板１２２の薄板１４３側を接着剤などで貼り付ける。なお、溶液保持部１１９のウェル形成体１３１の製造方法についてはプレス成形、光造形、切削加工など通常の手段が用いられる。これらの方法を用いればウェル形成体１３１に、凹部からなるウェル１０４と該凹部の底面の開口１０４ａとを所定の形状となるよう設けることは特に困難なことではないのでここでは説明を省略する。特に、ウェル形成体１３１は、例えば、商用として販売されているＳＢＳ規格に準ずる多穴プレート（９６穴、３８４穴等）等を開口部のみ加工することによって実現することもできる。これらは、製造コストの面からも有用である。
【０１６９】
その後、センサ基板１２２の交換口１１３にチューブ１１４を接続する。
【０１７０】
このようにして、本実施の形態で使用されるセンサが製造される。
【０１７１】
なお、センサ基板１２２の第二のウェル１１２の形成において、それぞれの第二のウェル１１２と交換口１１３は、必ずしも一体形成されている必要はない。一例を示すと、第二のウェル１１２が設けられた底面基板１１８と、各第二のウェル１１２に交換口が連通したセンサ基板１２２から構成されている方が、生産性の面からは望ましい。
【０１７２】
底面基板１１８の材料としては、絶縁材料が望ましい。例えば、好適には、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）が用いられる。かかる材料は、微細加工に優れ、軟質で粘着力もあるため、センサ基板１２２に接続が容易で、流路漏れは起こらない。
【０１７３】
溶液保持部１１９の参照電極、及び第二のウェル１１２の測定電極１０２の作製工程は、蒸着、スパッタなどの金属堆積法、電解・無電解めっき等を用いることができる。金属堆積法を用いて参照電極１０３及び測定電極１０２を作製する場合には、溶液保持部１１９を堆積装置の回転ステージに対して傾斜させて取り付ける処置を施すことで、容易に第一のウェル１０４及び第二のウェル１１２の側壁にターゲット金属を堆積させることができる。
【０１７４】
［医薬品安全性試験システム(2)］
本実施の形態に示すセンサを用いた医薬品安全性試験システムのブロック図を図１３に示す。本実施の形態の医薬品安全性試験システム(2)と、実施の形態１に示した医薬品安全性試験システム(1)との違いは、溶液貯留部へ第二の溶液を注入及び交換する装置を備えることであるので、以下、図１３を参照しながら、その相違点を説明する。
【０１７５】
本実施の形態の医薬品安全性試験システムは、第二のウェル１１２内の溶液を置換するための第二ウェル内溶液置換装置１５７ｃを備える。また、注入する溶液として、第二の溶液（図１３中Ｌ５）と第三の溶液（図１３中Ｌ６）を切り換えるための流路切替装置１５８ｃを備える。
【０１７６】
流路切替装置１５８ｃは、計算処理部１５５に電気的に接続されており、計算処理部１５５は、所定のタイミングと手順で溶液の切替を行うように流路切替装置１５８ｃに制御信号を送る。このように構成すると、センサ１２０を設置した状態で、第二の溶液を第三の溶液に、逆に第三の溶液を第二の溶液に置換することができる。
【０１７７】
さらに、第二ウェル内溶液置換装置１５７ｃは、検体細胞を貫通孔に誘導する装置（図１３中Ｐ）も併せ持つため、センサ１２０をシステムに取り付けた状態で、検体細胞の貫通孔への誘導と薬理応答測定が行える。
【０１７８】
細胞を誘導する装置Ｐとしては、例えば、貫通孔内の溶液を負圧により吸引することを挙げることができる。図１３に示した、第二ウェル内溶液置換装置１５７ｃにつながる各要素は、第二の溶液溜め（Ｌ５）、第三の溶液溜め（Ｌ６）、細胞誘導用吸引装置（Ｐ）を表している。
【０１７９】
さらに、測定環境調節装置１５６は、センサ１２０の第一のウェル中の溶液と、第二のウェル１１２中の溶液とを異なる所望の温度で、それぞれ調整する機能を備える。
【実施例】
【０１８０】
以下、本発明の医薬品安全性試験方法及びシステムの実施例を、具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を限定するものではない。
【０１８１】
（実施例１）
実施例１として、図９から図１２に示す、実施の形態５の医薬品安全性試験センサ１２０を試作した。そして、このセンサ１２０を用いて、細胞の応答を測定する実験を行った。
【０１８２】
［医薬品安全性試験センサの作製］
まず、図９に示すセンサ基板及び溶液保持部の作成方法について説明する。
【０１８３】
図９から図１２を参照して、センサ基板１２２の作製には、基板材料に４インチＳＯＩウエハを用いた。基板１０１の裏面（下面）をエッチング後、基板表面（上面）は、実施の形態５で説明したガスを用いたドライエッチングにより貫通孔１１７群を形成させた。次に、中間層である酸化シリコン層を除去し、表面と裏面とを貫通させた。裏面の上に、真空蒸着法あるいはスパッタ法を用いて、電極をパターニング形成した。電極材料には金を用いた。その後、30mm角の小片にダイシングし、小片化した。これにより30mm角の基板に１個の測定電極１０２が形成され、その電極１０２に貫通孔１１７がおよそ100個形成されたセンサ基板１２２を得た。
【０１８４】
実施例１のセンサのウェル形成体１３１には、ＳＢＳ規格に準ずる96穴プレートのウェルを用いた。各第一のウェル１０４の底面に上面直径5mm、下面直径1mmのテーパー形状の穴を開ける工程を経て開口１０４ａを設け、センサ基板１２２を薄板側から取り付けた。なお、接続した場所は、上述したセンサ基板１２２の貫通孔１１７群に対応する位置とした。各第一のウェル１０４の容量は、約250μLである。電極面から電極接点ピン１１１が接触できるよう、配線（図示せず）を取り、参照電極１０３を、その先端が第一のウェル１０４中に浸すことができるように固定化した。この参照電極１３には、φ0.5mm金線を用いた。
【０１８５】
センサ基板１２２には、さらに測定電極１０２側にスリット構造１１３を形成させた。裏面には、このスリット構造からなる幅1mm、高さ360μmの流路１１３が形成されている。その両端に交換口を設け、外径360μm、内径150μmのPEEK製チューブ１１４を取り付けた。
【０１８６】
検体細胞は、遺伝子改変技術により  ＨＥＲＧ(Human Enter-a-gogo-Related Gene)チャネルを発現させたヒト腎臓胚細胞HEK-293（以下、ＨＥＲＧ細胞）を用いた。ＨＥＲＧチャネルは、ＱＴ延長を引き起こす標的イオンチャネルであり、上記細胞を検体細胞として用い、医薬品安全性試験を行った。本実施例では、ＨＥＲＧチャネル及び検体細胞に、ＨＥＲＧイオンチャネル及びＨＥＲＧ発現細胞を用いて説明する。
【０１８７】
センサ１２０の第一のウェル１０４内を培養液で満たし、その後、ＨＥＲＧ細胞を各第一のウェル１０４内に100000個播種した。培養液は、ＤＭＥＭ＋10重量％ＦＢＳを用いた。検体細胞を裏面から吸引し、貫通孔に誘導した後、37℃、ＣＯ２濃度5％に調整保持したインキュベータ内で培養した。所定時間、細胞を培養させ、その後、実施例１のセンサをインキュベータから取り出し、医薬品安全性試験システムに設置し、医薬品の安全性を試験する実験を行った。
【０１８８】
本実施例では、ＨＥＲＧに対して選択的に拮抗する作用が既知であるE-4031 (Sigma社 M5060) を被試験医薬品として用いた。E-4031は、ＨＥＲＧチャネルを選択的に拮抗するため、後天性ＱＴ延長を引き起こすことが知られている。
【０１８９】
センサ応答の測定に先立ち、第一のウェル１０４に残存する培養液を対照溶液に置換させた。これにより、大気中でも安定して測定を行うことができる。対照溶液の組成は、ハンクス液を基本とし、ＨＥＰＥＳにて緩衝作用を持たせてある。溶液のｐＨは、7.4に設定してある。
【０１９０】
次に、実施例１のセンサ１２０に、速やかにナイスタチンを含む裏面対照液（第二の溶液）を交換口１１３に注入する。ナイスタチンの最終濃度は、240μg/mLに調製して含有させている。裏面対照液の組成は、塩化カリウムをベースとし、ＥＧＴＡによってＣａイオンをキレートした緩衝溶液を用いている。そして、溶液のｐＨは、10mM ＨＥＰＥＳによって7.2に保つように調製した。
【０１９１】
次に、実施例１の医薬品安全性センサ１２０を用いて、ＨＥＲＧイオンチャネルの電圧センサ応答を測定した。その内の被試験医薬品の交換時期の前後における電圧時系列データを、約40秒間切り出して、図１４に表示する。実験は、下記に示す測定プロトコール１に従い、溶液を同じウェルで交換した。図中白抜き四角又は黒四角で表した時間だけ対照溶液１及び薬剤溶液１（E-4031  １μM含有の対照溶液１）を滴下した。
【０１９２】
＜ 実験プロトコール１＞
（Ａ１）    ０−１５秒対照溶液１（上記ハンクス液）
（Ｂ１）  １５−３０秒薬剤溶液１
（Ｃ１）  ３０−４０秒対照溶液１
つまり、上述した被試験医薬品非存在であるハンクス対照溶液を第一のウェル１０４に投入した状態で、電圧測定を時間0秒から開始した（図１４中Ａ１の状態、時間0〜15秒）。その後、15秒後（Ｇ１時）、上記対照溶液１から、薬剤溶液１（E-4031  １μMを含有するハンクス液）に置換した（図１４中Ｂ１の状態、時間15〜30秒）。すると、E-4031の注入に伴い電圧振幅の増大が認められた（図１４中Ｅ１）。実験では、さらに、時間30秒（Ｈ１時）にて、再び対照溶液１に戻した（図１４中Ｃ１の状態）が、その後、電圧振幅の増大は収まらなかった。これは、パッチクランプで測定したデータと整合する。
【０１９３】
ここで、状態Ａ１における電圧信号の振幅は、薬剤溶液１と検体細胞を接触させることにより、状態Ｂ１における電圧信号の振幅にまで増大している。これは、E-4031がＨＥＲＧイオンチャネルに拮抗した結果である。次に、状態Ｃ１における電圧信号の振幅は、状態Ｂ１における電圧信号の振幅とほぼ同じであるが、この現象は、E-4031が不可逆的にＨＥＲＧイオンチャネルに拮抗しているため、対照溶液に戻した後も電圧信号の振幅が、元の状態Ａ１のレベルに戻らないためである。
【０１９４】
この図１４のように、状態Ａ１及び状態Ｃ１の電圧信号の振幅を比較した結果、電圧信号の振幅に差があると判断される場合には、被試験医薬品は、不可逆的にＨＥＲＧイオンチャネルに拮抗しているため、「催不整脈作用あり」と判定することができる。電圧信号の振幅の比較は、例えば、図１４のようなグラフを測定者が見て行うこともできるし、電圧信号の振幅を測定した測定機器が、状態Ａ１及び状態Ｃ１における電圧信号の振幅の差が、一定の基準値以下又は基準値以上であるか否かを判定することに行うこともできる。
【０１９５】
なお、上述したように、状態Ｂ１及び状態Ｃ１の電圧信号の振幅を比較した結果、電圧信号の振幅に差がないと判断される場合に、不可逆的にＨＥＲＧイオンチャネルに拮抗しているため、「催不整脈作用あり」と判定することもできる。
【０１９６】
ここで、プロトコール１と同様にして、可逆的にＨＥＲＧイオンチャネルに拮抗する被試験医薬品の薬剤溶液を検体細胞と接触させた場合には、図２１に示すような実験結果が得られる。図２１において、Ａ３は対照溶液１、Ｂ３は可逆的にＨＥＲＧイオンチャネルに拮抗する被試験医薬品の薬剤溶液、Ｃ３は再び対照溶液１を、それぞれウェル１０４に投入した状態を表している。
【０１９７】
薬剤溶液をウェル１０４に投入する（図２１中Ｂ３の状態）と、電圧信号の振幅はＡ３の状態よりも増大するが、薬剤溶液を対照溶液に戻す（図２１中Ｃ３の状態）と、電圧信号の振幅は、元の状態Ａ３とほぼ同じレベルに減少する。この場合、電圧信号の振幅が減少していることがわかるため、被試験医薬品のＨＥＲＧイオンチャネルに対する拮抗が、可逆的であること判断でき、催不整脈作用がないと判定される。
【０１９８】
なお、薬剤溶液中の被試験医薬品の濃度が低い場合には、Ａ１（又はＡ３）とＣ１（又はＣ３）の電圧信号の振幅の変化が小さくなる。このため、被試験医薬品の催不整脈作用は小さく、危険性は少ないと判断することができる。また、被試験薬剤溶液が催不整脈作用を持たない場合には、Ａ１（又はＡ３）とＣ１（又はＣ３）の電圧信号の振幅の変化はないため、危険性はないと判断することができる。つまり、対照溶液の電圧信号との振幅の比較を行うだけで、被試験医薬品を含む薬剤溶液の電圧信号を測定する工程を省略しても、危険性を判断することができる。
【０１９９】
なお、今回の実験では、ＨＥＲＧイオンチャネルを活性化するための刺激は必要なかった。ＨＥＲＧはゆるやかな電位感受性イオンチャネルであるが、静止膜電位下においてもわずかに開いているためである。
【０２００】
上記の対照実験として、同様に、薬剤溶液中の成分であるE-4031を含有しない対照溶液に対して、ＨＥＲＧ細胞を用いて、同じセンサにて同じプロトコールで測定を実施した。そのプロトコールで観測された電圧時系列データを約40秒間切り出して、図１５に表示する。実験は、具体的には、下記に示す実験の測定プロトコール２に従い、溶液を同じウェル１０４で交換した。図中白抜き四角又は黒四角で表した時間だけ対照溶液１及び対照溶液２（対照溶液１と同組成）を滴下した。
【０２０１】
＜実験プロトコール２＞
（Ａ２）    ０−１５秒対照溶液１（上記ハンクス液）
（Ｂ２）  １５−３０秒対照溶液２
（Ｃ２）  ３０−４０秒対照溶液１
つまり、上述した被試験医薬品非存在であるハンクス対照溶液を第一のウェル１０４に投入した状態で、電圧測定を時間0秒から開始した（図１５中Ａ２の状態、時間0〜15秒）。その後、15秒後（Ｇ２時）、上記対照溶液１から、対照溶液２（対照溶液１と同組成であるハンクス液）に置換した（図１５中Ｂ２の状態、時間15〜30秒）。対照溶液１から２への交換においても電圧信号の振幅の増大は認められなかった（図１５中Ｅ２）。実験では、さらに、時間30秒（Ｈ２時）にて、再び対照溶液１に戻した（図１５中Ｃ２の状態）。ここでも、電圧信号の振幅の増大は認められなかった。
【０２０２】
上記２つの実験により、対照溶液の交換では電圧信号の振幅に変化が見られず、薬剤溶液１に対してのみ、不可逆的な電圧信号の振幅の増大が認められた。つまり、プロトコール１において観測された電圧信号の振幅の増大Ｅ１は、流路を切り替えることによる溶液変動の擬陽性ではなく、活性化していたＨＥＲＧイオンチャネルが薬剤溶液１に含まれるE-4031により拮抗された薬理応答を、センサで検出した結果であることが明らかとなった。なお、ＨＥＲＧチャネルを発現していない細胞に関しても、同じセンサにて同じプロトコールで測定を実施し、E-4031によって拮抗されないことは確認した（図示しない）。
【０２０３】
実験プロトコール１と実験プロトコール２の実験結果から、被試験医薬品の危険性を判断するための設定値（閾値）としては、ｃ／ａ＝２程度に設定すればよい。しかし、適切な閾値は、実験条件や危険度の判定レベルによっても異なる。一般的には、ｃ／ａが1.2〜5程度、より望ましくは、1.5 〜 2.5程度に設定するのがよい。
【０２０４】
［解法アルゴリズム］
実施例１では、対照溶液注入時の電圧信号の振幅値は約2μVp-pとなり、薬剤溶液注入時の電圧信号の振幅値は、最大8μVp-pと、約４倍となった。そこで、これらの電圧信号の振幅増大効果を定量的、かつ、自動的に評価するために、以下の解析アルゴリズムを開発した。
【０２０５】
すなわち、電圧閾値を設け、この電圧閾値を越えるか否かで、定常状態から拮抗剤注入による危険性上昇状態に遷移する変化開始時間（図１４では、Ｇ１時）を感知する。変化開始時間から後の10秒間の電圧時系列データ（図１４では、時間15〜25秒の電圧振幅）を危険性上昇状態とし、また、変化開始時間から前の10秒間の電圧時系列データ（図１４では時間5〜15秒の電圧振幅）も定常状態として同様に切り出し、統計的に解析する。ここでは、電圧閾値を±３μＶに設定した。さらに、薬剤溶液１から対照溶液１へ戻した後の10秒間の電圧時系列データ（図１４では、時間25〜35秒の電圧振幅）も同様に切り出す。      
【０２０６】
まず、上記の方法によって自動的に切り出されたそれぞれの状態の時系列データに対し、ある小区間Ｙごとに標準偏差ＳＤ１を求める。それぞれのＳＤ１の度数分布を求め、分布のピーク値と分散（半値幅）を統計値として比較し、それぞれの増加率を、被試験医薬品の安全性を判定する指標とした。同様の解析区間、解析方法を図１５に示される対照溶液２に対する電圧時系列データに関しても、同様に解析を行った。その結果を、図１６から図２０に示す。
【０２０７】
また、図２１に示される薬剤溶液２に対する電圧時系列データに関しても、同様に解析を行った。その結果を、図２２から図２４に示す。
【０２０８】
薬剤溶液１（E-4031）に関して、状態Ａ１、状態Ｂ１及び状態Ｃ１の各ヒストグラムのピーク値Ｊの大きさを比較した結果を図１６に示し、同分散値Ｋの大きさを比較した結果を図１８に示す。また、対照となる対照溶液２に関して、状態Ａ２、状態Ｂ２及び状態Ｃ２の各ヒストグラムのピーク値Ｊの大きさを比較した結果を図１７に示し、同分散値Ｋの大きさを比較した結果を、図１９に示す。図１６から図１９において求められた薬剤溶液１（又は、対照溶液２）と対照溶液１のピーク値Ｊと同分散値Ｋに関して、状態ＡからＢへの変化率、及び状態Ａから状態Ｃへの変化率を求めた結果を図２０に示す。
【０２０９】
ここで、ヒストグラム統計値のピーク値Ｊ及び分散値Ｋにおける状態Ａから状態Ｃへの変化率は、状態Ａのピーク値Ｊ（又は分散値Ｋ）を100%とした時の百分率、つまり、状態Ａのピーク値Ｊａと状態Ｃのピーク値ＪｃによってＪｃ／Ｊａで算出される。個々の小区間Ｙは、イオンチャネルの開閉頻度が数msec程度だということを考慮し、10 msecとした。この処理により、熱雑音などホワイトなノイズ成分は極力減じることができ、イオンチャネルに起因する成分だけの比較がより鮮明に行える。さらに、本実施例で医薬品の安全性を判断する指標として用いた、ヒストグラム統計値のピーク値Ｊ及び分散値Ｋは、いずれも、医薬品安全性試験の観点から見ると危険な状態（状態Ｂ１）に遷移すると、増加する指標である。一方、危険性の存在しない化学物質しか含まれていない溶液に対しては、増加しなかった。本センサは、危険な状態に遷移すると増加する側に出力するため、危険状態を認識する最小分解能を減少指標型出力に比べて大きく設定できる。
【０２１０】
また、本実施例で医薬品の安全性を判断する指標として用いたヒストグラム統計値のピーク値Ｊ及び分散値Ｋは、状態Ｃ１に遷移しても、いずれの指標も状態Ｂ１に比べやや減少する傾向を見せるものの、薬剤溶液を導入する前の状態Ａ１に比べ有意に増加したままであった（図１６及び図１８）。一方、危険性の存在しない化学物質しか含まれていない溶液に対しては、増加しなかった（図１７及び図１９）。
【０２１１】
危険性の存在する薬剤溶液の、状態Ａに対する状態Ｃの変化率は、ピーク値Ｊで236.1％、分散値Ｋで236.2％となり、いずれも２倍強増加した。ピーク値Ｊで200％以上（状態Ｃのピーク値Ｊｃと状態Ｃのピーク値Ｊａで算出されるＪｃ／Ｊａが２以上）の変化率は、有意な差として認識された。同様に、ピーク値Ｋで200％以上（状態Ｃのピーク値Ｋｃと状態Ｃのピーク値Ｋａで算出されるＫｃ／Ｋａが２以上）の変化率も、有意な差として認識された。
【０２１２】
一方、危険性の存在しない化学物質しか含まれていない溶液の状態Ａを100％とした時の状態Ｃの変化率は、ピーク値Ｊで70.1％、分散値Ｋで70.1％となり、いずれもわずかに減少するも、増加しなかった。
【０２１３】
さらに、オープンチャネル型ではない拮抗剤として別のイオンチャネル、具体的にはω―コノトキシンGVIAを持つ細胞に対して、統計値のピーク値Ｊ及び分散値Ｋは、薬剤溶液に対する指標の増大が起こり（状態Ｂ３）、対照溶液に戻すと元のレベルに戻った（状態Ｃ３）（図２２及び図２３）状態Ａに対する状態Ｃの変化率は、ピーク値Ｊで67.3％、分散値Ｋで70.2％となり、いずれもわずかに減少するも、増加しなかった。（実施例２に詳述する。）
本解析方法は、危険性の判別だけでなく、オープンチャネル型拮抗剤など拮抗の形式まで判定ができ、信頼性も高いことがいえる。
【０２１４】
（実施例２）
実施例２は、実施の形態１にかかる医薬品安全センサの一例である。本実施例が実施例１と違う点の一つは、センサが貫通孔を持たない構造であり、溶液刺激を入れてチャネルを積極的に活性化するため、一つの細胞から出される信号を高感度に取得しうることである。
【０２１５】
［医薬品安全性試験センサの作製］
まず、本実施例に用いる医薬品安全性試験センサ１２０の作成方法を以下に説明する。
【０２１６】
図2及び図を参照して、センサ１２０は、センサ基板１０１とウェル形成体１３１から構成される。まず、センサ基板１０１は、４インチＳｉウエハを用い、その上にフォトレジストをスピンコートする。６行６列の格子状の各ノードには直径5 μmの円形の測定電極１０２が位置し、かつ、電極１０２の中心間距離は20 μmである。そして、各電極１０２から放射状に広がるリード線１０５を有するパターンを複数、Ｓｉウエハの所定の位置に露光し、現像した。次に、ウエハの全面に真空蒸着法により金薄膜を堆積させた。その後、リフトオフにより、Ｓｉウエハ上に金電極のパターニングが完了する。
【０２１７】
そして、リード線１０５部のみに専用現像液を要する絶縁材料であるネガティブ感光性ポリイミド樹脂UR-8300（東レ社製）で被覆した後、ダイシングし、40mm角の小片に切り出した。各小片は、中心に６行６列で直径5μmの円形の測定電極１０２が露出し、電極１０２から引き出されたリード線１０５が、四方周囲に配置された配線引出し端子（外部接続部１０７）に連通した構成であった。このように作製した各小片を、センサ基板と１０１した。次に、ウェル形成体１３１を作製した。ウェル１０４を構成する凹部は切削加工により作製し、その後、このウェル形成体１３１をセンサ基板１０１の測定電極１０２が形成された表面側に配設した。
【０２１８】
次に、本実施例の医薬品安全性試験方法を以下に説明する。
【０２１９】
検体細胞には、モルモット乳頭筋細胞をモルモットから急性単離して使用した。モルモット乳頭筋細胞に存在する遅延整流性カリウムチャネルＫｒが、被試験医薬品の標的生体構成要素となる。
【０２２０】
まず、作製したセンサ１２０の測定電極１０２を含めた細胞播種予定の表面に生体親和性を持たせるための表面改質を行った。具体的には、細胞接着性タンパク質であるコラーゲン(Sigma社 、P-4511)を固定化材として測定電極１０２の表面を含むセンサ基板１０１上に所定の方法で１時間被覆した（37℃雰囲気下）。その後、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で数回リンスした。
【０２２１】
単離した細胞を遠心操作により濃縮した後に培養液に再懸濁した細胞懸濁液を、センサ１２０の測定電極１０２上に  1×10５細胞／ｃｍ２の濃度で播種し、所定の時間の間、37℃、ＣＯ２濃度5％下にて培養した。
【０２２２】
その後、測定時に、ハンクス液を基本とし、ＨＥＰＥＳにて緩衝作用を持たせた対照溶液に置換した。溶液は、基本的に上記の他、２種類とした。まず、第一に、上述した対照溶液１である。陽性対照薬及び被試験医薬品は、上記対照溶液に所定の濃度溶かして使用した。第二に、上述した対照溶液１と組成が同じで、対照溶液１の特定のイオン濃度のみを高く設定した高イオン濃度対照溶液である。なお、細胞に対しては、破砕及び造孔などの操作はしていない。
【０２２３】
測定に際しては、陽性対照薬として、テルフェナジン(Sigma社、T9652)を使用した。また、被試験試薬には、今回  ω−コノトキシンＧＶＩＡ(Sigma社、C9915)を1μMの濃度で対照溶液１に混合して使用した。ω―コノトキシンＧＶＩＡは、電位依存性のカルシウムチャネルを特異的に阻害すること、さらに筋肉に存在するチャネルには反応せず、神経シナプスに存在する前述チャネルを阻害することが知られているので、モルモット乳頭筋細胞が持つ遅延整流性カリウムイオンチャネルには感応しないことが予想される。対照溶液１には、ＮａＣｌが137mM、ＫＣｌが4mMのイオン濃度で含まれるが、高イオン濃度対照溶液のＫＣｌを80mMに設定し、これによる浸透圧の上昇を避ける目的で、ＮａＣｌを61mMに下げた。つまり、溶液から高イオン濃度対照溶液に置換することによって、間接的に細胞内電位を上昇させることができる。
【０２２４】
本実施例が実施例１と違う点の一つは、溶液を対照溶液から高イオン濃度対照溶液に置換することによって、積極的に溶液刺激を起こし、標的生体構成成分を一定の量、活性化させることである。なお、実験結果を図２４に示す。
【０２２５】
陽性対照薬であるテルフェナジン0.3μMの電圧応答は、不可逆的に増大した。一方、試験試薬であるω−コノトキシンＧＶＩＡ 1μMの濃度では電圧応答は、変化しなかった。
【０２２６】
このように、標的生体構成要素である遅延整流性カリウムチャネルの拮抗効果を、刺激に対する電極電圧応答の変化時間として検出することができ、これにより、被試験試薬であるω―コノトキシンはＱＴ延長を起こす危険性はないと判断することができた。
【０２２７】
上記説明から、当業者にとっては、本発明の多くの改良や他の実施形態が明らかである。従って、上記説明は、例示としてのみ解釈されるべきであり、本発明を実行する最良の形態を当業者に教示する目的で提供されたものである。本発明の精神を逸脱することなく、その構造及び／又は機能の詳細を実質的に変更できる。
【産業上の利用可能性】
【０２２８】
本発明の医薬品安全性試験方法及びシステムは、ＨＥＲＧチャネルに外部から人工的に電気信号を新たに印加する処理を経ることなく、ＱＴ延長を起こしていることに相当する測定電極での応答及び、応答時間が医薬品非存在下にくらべ不可逆的に延長される、危険性を内在するオープンチャネル型候補医薬品の評価方法として有用である。
【０２２９】
また、本発明の医薬品安全性試験方法及びシステムは、細胞膜を破砕することなく、かつ、人工的に調整した細胞内液を使用することなく、１液系で測定できるので、より生体環境に近い測定条件で試験を実施できる。この両者の効果により、従来の方法に比べ、本発明の医薬品安全性試験方法は、より信頼性の高い試験となることができる。また、外部印加用電気回路等を省略でき、装置を簡便に構成することができる。装置の生産性、製造性に貢献する。
【０２３０】
また、本発明の医薬品安全性試験システムは、危険要素を内在する標的生体構成要素で構成される検体細胞の被試験医薬品に対する電圧応答差を指標として、被試験医薬品の危険性を判断するハイスループット医薬品安全性試験システムであり、例えば、新薬開発初期段階に人体に危険性を有する候補化合物を除外する高速薬品スクリーニング装置等に有用である。
【０２３１】
さらに、本発明の医薬品安全性試験方法及びシステムは、先天性及び後天性のＱＴ延長症候群の迅速な診断手法等の用途にも応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０２３２】
【図１−Ａ】実施の形態１における医薬品安全性試験方法を示すフローチャートであり、ステップＳ１とステップＳ３の測定結果を比較する場合のフローチャートである。
【図１−Ｂ】実施の形態１における医薬品安全性試験方法を示すフローチャートであり、ステップＳ２とステップＳ３の測定結果を比較する場合のフローチャートである。
【図２】実施の形態１における医薬品安全性試験センサを模式的に示す断面図である。
【図３】図２に示すセンサの上面図である。
【図４】実施の形態１における医薬品安全性試験方法の準備工程（ステップＳ０）を示すフローチャートである。
【図５】実施の形態１の別の実施の形態における医薬品安全性試験方法の工程を示すフローチャートである。
【図６−Ａ】実施の形態１に示した医薬品安全性試験システムを模式的に示す構成図であって、ウェル内溶液置換装置及びウェル内溶液排出装置を有する医薬品安全性試験システムの構成図である。
【図６−Ｂ】実施の形態１に示した医薬品安全性試験システムを模式的に示す構成図であって、ウェル内溶液置換装置を有する医薬品安全性試験システムの構成図である。
【図６−Ｃ】実施の形態１に示した医薬品安全性試験システムを模式的に示す構成図であって、ウェル内溶液置換装置及びウェル内溶液排出装置のいずれも有しない医薬品安全性試験システムの構成図である。
【図７−Ａ】本発明の医薬品安全性試験方法の工程を示すフローチャートであって、実施の形態２における医薬品安全性試験方法の工程を示すフローチャートである。
【図７−Ｂ】本発明の医薬品安全性試験方法の工程を示すフローチャートであって、実施の形態３における医薬品安全性試験方法の工程を示すフローチャートである。
【図７−Ｃ】本発明の医薬品安全性試験方法の工程を示すフローチャートであって、実施の形態４における医薬品安全性試験方法の工程を示すフローチャートである。
【図８】実施の形態５における医薬品安全性試験方法の工程を示すフローチャートである。
【図９】実施の形態６における医薬品安全性試験センサの構造を示す部分断面図である。
【図１０】実施の形態６の医薬品安全性試験センサの構造を模式的に示す図（全体の斜視図）である。
【図１１】実施の形態６の医薬品安全性試験センサのセンサ基板の詳細構造を示す部分断面図である。
【図１２】実施の形態６の医薬品安全性試験センサのセンサ基板の詳細構造を示す下面図である。
【図１３】実施の形態６に示した医薬品安全性試験システムの構成図である。
【図１４】実施例１の実験プロトコール１におけるセンサ１２０電極電圧時系列波形の測定結果を示す図である。
【図１５】実施例１の実験プロトコール２におけるセンサ１２０電極電圧時系列波形の測定結果を示す図である。
【図１６】実施例１の薬剤溶液２に関する電圧ヒストグラムピーク値Ｊの変化量の測定結果を示す図である。
【図１７】実施例１の対照溶液２に関する電圧ヒストグラムピーク値Ｊの変化量の測定結果を示す図である。
【図１８】実施例１の薬剤溶液２に関する電圧ヒストグラム分散値Ｋの変化量における測定結果を示す図である。
【図１９】実施例１の対照溶液２に関する電圧ヒストグラム分散値Ｋの変化量における測定結果を示す図である。
【図２０】実施例１における電圧振幅値の変化の統計量の測定結果を示す図である。
【図２１】実施例２におけるセンサ１２０電極電圧時系列波形の測定結果を示す図である。
【図２２】実施例２における電圧ヒストグラムピーク値Ｊの変化量の測定結果を示す図である。
【図２３】実施例２における電圧ヒストグラム分散値Ｋの変化量の測定結果を示す図である。
【図２４】実施例３における電圧振幅値の変化の統計量の測定結果を示す図である。
【図２５】実施の形態１に示したセンサ基板の製造方法における工程１を示す断面図である。
【図２６】実施の形態１に示したセンサ基板の製造方法における工程２を示す断面図である。
【図２７】実施の形態１に示したセンサ基板の製造方法における工程３を示す断面図である。
【図２８】実施の形態１に示したセンサ基板の製造方法における工程４を示す断面図である。
【図２９】実施の形態１に示したセンサ基板の製造方法における工程５を示す断面図である。
【図３０】実施の形態１に示したセンサ基板の製造方法における工程６を示す断面図である。
【符号の説明】
【０２３３】
１  検体細胞
５１  測定溶液
５２  第一の溶液
１０１  基板
１０２  測定電極
１０３  参照電極
１０４  ウェル（第一のウェル）
１０５  リード線（測定電極１０２側）
１０６  絶縁膜
１０７  外部接続部（測定電極１０２側）
１０８  リード線（参照電極１０３側）
１０９  外部接続部（参照電極１０３側）
１１１  電極接点ピン
１１２  第二のウェル
１１３  交換口
１１４  チューブ
１１５  開口
１１６  微小くぼみ
１１７  貫通孔
１１８  底面基板
１１９  溶液保持部
１２０  医薬品安全性試験センサ
１２１  センサ設置台
１２２  センサ基板（小片基板）
１３１  ウェル形成体
１３１ａ  開口
１４０  基板
１４１  ベース
１４２  中間層
１４３  薄板
１４４  レジスト膜（ベース側）
１４５  レジスト膜（薄板側）
１４５ａ  パターン
１４６  保護膜
１５０  医薬品安全性試験システム
１５１  遮蔽箱
１５２  第一の増幅部
１５３  第二の増幅部
１５５  計算処理部（コンピュータ）
１５６  測定環境調節装置
１５７ａ  ウェル内溶液置換装置
１５７ｂ  ウェル内溶液排出装置
１５８  溶液切替装置
１５９  注入管
１６０  排出管
Ｌ１  測定溶液溜め
Ｌ２  陽性対照試薬溶液溜め
Ｌ３  試験医薬品Ａ溶液溜め
Ｌ４  試験医薬品Ｂ溶液溜め
Ｌ５  第二の溶液５３溜め
Ｌ６  第二の溶液５４溜め
Ｐ  検体細胞１導入装置
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１−Ａ】
2005116242.tif 000037
【図１−Ｂ】
2005116242.tif 000038
【図２】
2005116242.tif 000039
【図３】
2005116242.tif 000040
【図４】
2005116242.tif 000041
【図５】
2005116242.tif 000042
【図６−Ａ】
2005116242.tif 000043
【図６−Ｂ】
2005116242.tif 000044
【図６−Ｃ】
2005116242.tif 000045
【図７−Ａ】
2005116242.tif 000046
【図７−Ｂ】
2005116242.tif 000047
【図７−Ｃ】
2005116242.tif 000048
【図８】
2005116242.tif 000049
【図９】
2005116242.tif 000050
【図１０】
2005116242.tif 000051
【図１１】
2005116242.tif 000052
【図１２】
2005116242.tif 000053
【図１３】
2005116242.tif 000054
【図１４】
2005116242.tif 000055
【図１５】
2005116242.tif 000056
【図１６】
2005116242.tif 000057
【図１７】
2005116242.tif 000058
【図１８】
2005116242.tif 000059
【図１９】
2005116242.tif 000060
【図２０】
2005116242.tif 000061
【図２１】
2005116242.tif 000062
【図２２】
2005116242.tif 000063
【図２３】
2005116242.tif 000064
【図２４】
2005116242.tif 000065
【図２５】
2005116242.tif 000066
【図２６】
2005116242.tif 000067
【図２７】
2005116242.tif 000068
【図２８】
2005116242.tif 000069
【図２９】
2005116242.tif 000070
【図３０】
2005116242.tif 000071
【国際調査報告】
2005116242.tif 000072
2005116242.tif 000073