【手続補正書】
【提出日】令和2年3月23日(2020.3.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数コピーの構造タンパク質（SP）によって形成された管状または円柱状の生物学的構造を含む蛍光マーカーであって、該生物学的構造が、該生物学的構造の長さに沿って規則的に点在する複数コピーの蛍光標識されたタンパク質（FP）を含む、蛍光マーカー。
【請求項２】
生物学的構造の長さ96nm当たり2個のFPを含む、請求項1記載の蛍光マーカー。
【請求項３】
（a）構造タンパク質がらせん状の配置で集合している、かつ／または
（b）構造タンパク質がチューブリンを含む、
請求項1または2記載の蛍光マーカー。
【請求項４】
チューブリンが、αチューブリン（SEQ ID NO:6もしくはそのバリアント）、βチューブリン（SEQ ID NO:7もしくはそのバリアント）、またはヘテロダイマーとしてのαチューブリンとβチューブリンとの組み合わせである、請求項3記載の蛍光マーカー。
【請求項５】
（a）生物学的構造が微小管もしくはダブレット微小管である、かつ／または
（b）生物学的構造がタンパク質性微小管もしくはタンパク質性ダブレット微小管である、かつ／または
（c）生物学的構造が、A微小管およびB微小管を含むダブレット微小管である、
請求項1〜4のいずれか一項記載の蛍光マーカー。
【請求項６】
蛍光標識されたタンパク質が、
蛍光タンパク質のアミノ酸配列に融合した、微小管に関連したラジアルスポークタンパク質（RSP）のアミノ酸配列
を含む融合タンパク質である、請求項1〜5のいずれか一項記載の蛍光マーカー。
【請求項７】
（a）蛍光タンパク質のアミノ酸配列が、RSPのアミノ酸配列のC末端に融合している、かつ／または
（b）蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質（GFP）、mNeonGreenタンパク質（NG）、もしくはそれらの蛍光性バリアントである、
請求項6記載の蛍光マーカー。
【請求項８】
RSPが、微小管構造へと集合するラジアルスポークタンパク質3（RSP3）またはそのバリアントである、請求項6または7記載の蛍光マーカー。
【請求項９】
RSP3が、SEQ ID NO:1、またはSEQ ID NO:1と少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を有するそのバリアントのアミノ酸配列を含む、請求項8記載の蛍光マーカー。
【請求項１０】
蛍光タンパク質が、SEQ ID NO:2もしくはSEQ ID NO:3、またはSEQ ID NO:2もしくはSEQ ID NO:3と少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を有するそれらのバリアントのアミノ酸配列を含む、請求項6〜9のいずれか一項記載の蛍光マーカー。
【請求項１１】
融合タンパク質が、SEQ ID NO:4もしくはSEQ ID NO:5、またはSEQ ID NO:4もしくはSEQ ID NO:5と少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を有するそれらのバリアントのアミノ酸配列を含む、請求項6〜8のいずれか一項記載の蛍光マーカー。
【請求項１２】
蛍光標識されたタンパク質が、
蛍光標識に結合するアダプタータンパク質のアミノ酸配列に融合した、ラジアルスポークタンパク質（RSP）のアミノ酸配列
を含む融合タンパク質である、請求項1〜11のいずれか一項記載の蛍光マーカー。
【請求項１３】
（a）生物学的構造が、複数コピーの前記管状もしくは円柱状の生物学的構造を含む軸糸である、かつ／または
（b）生物学的構造が、9+2構造を含む軸糸である、かつ／または
（c）生物学的構造が、軸糸を含む鞭毛である、かつ／または
（d）生物学的構造が、複数コピーの前記管状もしくは円柱状の生物学的構造を含む軸糸を含む鞭毛である、
請求項1〜12のいずれか一項記載の蛍光マーカー。
【請求項１４】
請求項1〜13のいずれか一項記載の蛍光マーカーが固定化されている、固体基板。
【請求項１５】
スライドである、請求項14記載の固体基板。
【請求項１６】
蛍光顕微鏡法の実施中に、請求項1〜13のいずれか一項記載の蛍光マーカーからの、または該蛍光マーカーが固定化されている請求項14もしくは15記載の固体基板からの蛍光を検出する工程を含む、蛍光顕微鏡法を実施するための方法。
【請求項１７】
請求項1〜13のいずれか一項記載の蛍光マーカーを基板に適用する工程、および蛍光顕微鏡法の実施中に該蛍光マーカーからの蛍光を検出する工程を含む、蛍光顕微鏡法を実施するための方法。
【請求項１８】
固体基板がスライドである、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
蛍光試料を同じ基板または異なる基板に適用する工程、および蛍光顕微鏡法の実施中に該試料からの蛍光を検出する工程をさらに含む、請求項17または18記載の方法。
【請求項２０】
（a）マーカーの蛍光標識が試料の蛍光標識と同じである、または
（b）マーカーの蛍光標識が試料の蛍光標識と異なる、
請求項19記載の方法。
【請求項２１】
（a）微小管に関連し、蛍光タンパク質のアミノ酸配列に融合した、または
（b）蛍光標識に結合するアダプタータンパク質のアミノ酸配列に融合した、
ラジアルスポークタンパク質（RSP）のアミノ酸配列を含む、
融合タンパク質。
【請求項２２】
（a）蛍光タンパク質のアミノ酸配列が、RSPのアミノ酸配列のC末端に融合している、かつ／または
（b）蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質（GFP）、mNeonGreenタンパク質（NG）、もしくはそれらの蛍光性バリアントである、
請求項21記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
RSPが、微小管構造へと集合するラジアルスポークタンパク質3（RSP3）またはそのバリアントである、請求項21または22記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
RSP3が、SEQ ID NO:1、またはSEQ ID NO:1と少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を有するそのバリアントのアミノ酸配列を含む、請求項23記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
蛍光タンパク質が、SEQ ID NO:4もしくはSEQ ID NO:5、またはSEQ ID NO:4もしくはSEQ ID NO:5と少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を有するそれらのバリアントのアミノ酸配列を含む、請求項21〜24のいずれか一項記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
SEQ ID NO:4またはSEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含む、請求項21〜25のいずれか一項記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
請求項21〜26のいずれか一項記載の融合タンパク質のアミノ酸配列をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項２８】
プロモーターに機能的に連結された請求項27記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項２９】
請求項28記載の発現ベクターを含む、単離された細胞。
【請求項３０】
原核細胞である、請求項29記載の単離された細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
蛍光顕微鏡法を実施するための開示された方法において、開示された蛍光マーカーを、顕微鏡スライドなどの固体基板に適用することができる。その後、蛍光顕微鏡法を実施する前に、蛍光標識された試料をスライドに適用することができる。次いで、蛍光マーカーからの蛍光を検出することができ、および/または蛍光マーカーを画像化することができる。次いで、同時にまたは非同時に、蛍光顕微鏡法の実施中に、蛍光標識された試料からの蛍光を検出することができ、および/または蛍光標識された試料を画像化することができる。蛍光顕微鏡法を実施する方法において、マーカーの蛍光標識は、試料の蛍光標識と同じであってもよいしまたは異なっていてもよい。蛍光マーカーを、蛍光標識された試料と別々に画像化してもよいし、および/または蛍光マーカーを、蛍光標識された試料と一緒に画像化してもよい。
[本発明1001]
複数コピーの構造タンパク質（SP）によって形成された管状または円柱状の生物学的構造を含む蛍光マーカーであって、該生物学的構造が、該生物学的構造の長さに沿って規則的に点在する複数コピーの蛍光標識されたタンパク質（FP）を含む、蛍光マーカー。
[本発明1002]
生物学的構造の長さ96nm当たり2個のFPを含む、本発明1001の蛍光マーカー。
[本発明1003]
構造タンパク質がらせん状の配置で集合している、本発明1001または1002の蛍光マーカー。
[本発明1004]
構造タンパク質がチューブリンを含む、前記本発明のいずれかの蛍光マーカー。
[本発明1005]
チューブリンが、αチューブリン（SEQ ID NO:6もしくはそのバリアント）、βチューブリン（SEQ ID NO:7もしくはそのバリアント）、またはヘテロダイマーとしてのαチューブリンとβチューブリンとの組み合わせである、本発明1004の蛍光マーカー。
[本発明1006]
生物学的構造が微小管またはダブレット微小管である、前記本発明のいずれかの蛍光マーカー。
[本発明1007]
生物学的構造がタンパク質性微小管またはタンパク質性ダブレット微小管である、前記本発明のいずれかの蛍光マーカー。
[本発明1008]
生物学的構造が、A微小管およびB微小管を含むダブレット微小管である、前記本発明のいずれかの蛍光マーカー。
[本発明1009]
蛍光標識されたタンパク質が、
蛍光タンパク質のアミノ酸配列に融合した、微小管に関連したラジアルスポークタンパク質（RSP）のアミノ酸配列
を含む融合タンパク質である、前記本発明のいずれかの蛍光マーカー。
[本発明1010]
蛍光タンパク質のアミノ酸配列が、RSPのアミノ酸配列のC末端に融合している、本発明1009の蛍光マーカー。
[本発明1011]
蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質（GFP）、mNeonGreenタンパク質（NG）、またはそれらの蛍光性バリアントである、本発明1009または1010の蛍光マーカー。
[本発明1012]
RSPが、微小管構造へと集合するラジアルスポークタンパク質3（RSP3）またはそのバリアントである、本発明1009〜1011のいずれかの蛍光マーカー。
[本発明1013]
RSP3が、SEQ ID NO:1、またはSEQ ID NO:1と少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を有するそのバリアントのアミノ酸配列を含む、本発明1012の蛍光マーカー。
[本発明1014]
蛍光タンパク質が、SEQ ID NO:2もしくはSEQ ID NO:3、またはSEQ ID NO:2もしくはSEQ ID NO:3と少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を有するそれらのバリアントのアミノ酸配列を含む、本発明1009〜1013のいずれかの蛍光マーカー。
[本発明1015]
融合タンパク質が、SEQ ID NO:4もしくはSEQ ID NO:5、またはSEQ ID NO:4もしくはSEQ ID NO:5と少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を有するそれらのバリアントのアミノ酸配列を含む、本発明1009〜1012のいずれかの蛍光マーカー。
[本発明1016]
蛍光標識されたタンパク質が、
蛍光標識に結合するアダプタータンパク質のアミノ酸配列に融合した、ラジアルスポークタンパク質（RSP）のアミノ酸配列
を含む融合タンパク質である、前記本発明のいずれかの蛍光マーカー。
[本発明1017]
生物学的構造が、複数コピーの前記管状または円柱状の生物学的構造を含む軸糸である、前記本発明のいずれかの蛍光マーカー。
[本発明1018]
生物学的構造が、9+2構造を含む軸糸である、本発明1017の蛍光マーカー。
[本発明1019]
生物学的構造が、軸糸を含む鞭毛である、前記本発明のいずれかの蛍光マーカー。
[本発明1020]
軸糸が、複数コピーの前記管状または円柱状の生物学的構造を含む、本発明1019の蛍光マーカー。
[本発明1021]
前記本発明のいずれかの蛍光マーカーが固定化されている、固体基板。
[本発明1022]
スライドである、本発明1021の固体基板。
[本発明1023]
蛍光顕微鏡法の実施中に、本発明1001〜1020のいずれかの蛍光マーカーからの、または該蛍光マーカーが固定化されている本発明1021もしくは1022の固体基板からの蛍光を検出する工程を含む、蛍光顕微鏡法を実施するための方法。
[本発明1024]
本発明1001〜1020のいずれかの蛍光マーカーを基板に適用する工程、および蛍光顕微鏡法の実施中に該蛍光マーカーからの蛍光を検出する工程を含む、蛍光顕微鏡法を実施するための方法。
[本発明1025]
固体基板がスライドである、本発明1024の方法。
[本発明1026]
蛍光試料を同じ基板または異なる基板に適用する工程、および蛍光顕微鏡法の実施中に該試料からの蛍光を検出する工程をさらに含む、本発明1024または1025の方法。
[本発明1027]
マーカーの蛍光標識が試料の蛍光標識と同じである、本発明1026の方法。
[本発明1028]
マーカーの蛍光標識が試料の蛍光標識と異なる、本発明1026の方法。
[本発明1029]
蛍光タンパク質のアミノ酸配列に融合した、微小管に関連したラジアルスポークタンパク質（RSP）のアミノ酸配列
を含む、融合タンパク質。
[本発明1030]
蛍光タンパク質のアミノ酸配列が、RSPのアミノ酸配列のC末端に融合している、本発明1029の融合タンパク質。
[本発明1031]
蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質（GFP）、mNeonGreenタンパク質（NG）、またはそれらの蛍光性バリアントである、本発明1029または1030の融合タンパク質。
[本発明1032]
RSPが、微小管構造へと集合するラジアルスポークタンパク質3（RSP3）またはそのバリアントである、本発明1029〜1031のいずれかの融合タンパク質。
[本発明1033]
RSP3が、SEQ ID NO:1、またはSEQ ID NO:1と少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を有するそのバリアントのアミノ酸配列を含む、本発明1032の融合タンパク質。
[本発明1034]
蛍光タンパク質が、SEQ ID NO:4もしくはSEQ ID NO:5、またはSEQ ID NO:4もしくはSEQ ID NO:5と少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を有するそれらのバリアントのアミノ酸配列を含む、本発明1029〜1033のいずれかの融合タンパク質。
[本発明1035]
SEQ ID NO:4またはSEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含む、本発明1029〜1034のいずれかの融合タンパク質。
[本発明1036]
蛍光標識に結合するアダプタータンパク質のアミノ酸配列に融合した、ラジアルスポークタンパク質（RSP）のアミノ酸配列
を含む、融合タンパク質。
[本発明1037]
本発明1029〜1036のいずれかの融合タンパク質のアミノ酸配列をコードする、ポリヌクレオチド。
[本発明1038]
プロモーターに機能的に連結された本発明1037のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
[本発明1039]
本発明1038の発現ベクターを含む、単離された細胞。
[本発明1040]
原核細胞である、本発明1039の単離された細胞。