【誤訳訂正書】
【提出日】令和2年9月2日(2020.9.2)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出待ちの胚盤胞の栄養外胚葉細胞のゲノムに対してメチル化検出を行い、そのメチル化レベルが、基準となるガードナー分類システムにより判定された形態良好な胚のメチル化レベル及びパターンの違いがより少ない場合、検出待ちの胚盤胞の質が良好であり、前記ガードナー分類システムにより判定された形態良好な胚がグレードＡＡ、ＡＢ、ＢＡ、ＢＢの胚盤胞であることを特徴とする、発育良好な胚盤胞をスクリーニングする非侵襲的な検出方法。
【請求項２】
更に、ガードナー分類システムにより判定された形態良好な胚のメチル化パターンを基準とすることを特徴とする、請求項１に記載の非侵襲的な検出方法。
【請求項３】
更に、メチル化シーケンシングの結果により、胚盤胞の各染色体のコピー数が正常であるかどうかを判断し、標準の二倍体である場合、検出待ちの胚盤胞の染色体が正常であることを特徴とする、請求項１または２に記載の非侵襲的な検出方法。
【請求項４】
検出待ちの胚盤胞の栄養外胚葉細胞のゲノムに対してメチル化検出を行い、そのメチル化レベルが、基準となるガードナー分類システムにより判定された形態良好な胚のメチル化レベル及びパターンの違いがより少ない場合、検出待ちの胚盤胞の質が良好であり、前記ガードナー分類システムにより判定された形態良好な胚がグレードＡＡ、ＡＢ、ＢＡ、ＢＢの胚盤胞であることを特徴とする、妊娠率が高い胚盤胞をスクリーニングする非侵襲的な検出方法。
【請求項５】
胚盤胞のメチル化シーケンシングのキットであって、メチル化レベルが、基準となるガードナー分類システムにより判定された形態良好な胚のメチル化レベル及びパターンの違いがより少ない場合、検出待ちの胚盤胞の質が良好であり、前記ガードナー分類システムにより判定された形態良好な胚がグレードＡＡ、ＡＢ、ＢＡ、ＢＢの胚盤胞であることを特徴とする、発育良好な胚盤胞をスクリーニングするキット。
【請求項６】
胚盤胞のメチル化シーケンシングのキットであって、検出待ちの胚盤胞のメチル化シーケンシングの結果が、すべての染色体が標準二倍体であることを示す場合、検出待ちの胚盤胞が発育良好な胚盤胞であることを特徴とする、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
検出対象が胚盤胞の栄養外胚葉細胞である、請求項５または６に記載のキット。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００３】
（１）ガードナー分類システム（Ｇａｒｄｎｅｒ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ  ｇｒａｄｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）による方法。試験管ベビーの過程において、胚盤胞の育成と移植がとても重要な工程である。試験管ベビーの胚盤胞の品質の優劣は、成功を決定する重要な要素である。現在の臨床では、ガードナー分類システムにより、胚盤胞腔の大きさ及び孵化するか否かに基づき、胚盤胞の発育を下記の六つの段階に分けている。即ち、初期胚盤胞であって、胚盤胞腔が胚の総体積の１／２より小さい第１段階；胚盤胞腔の体積が胚の総体積の１／２、またはそれ以上である第２段階；完全胚盤胞であって、胚盤胞腔が完全に胚の総体積を占めている第３段階；拡張胚盤胞であって、胚盤胞腔が完全に胚を満たし、胚の総体積が大きくなり、透明帯が薄くなる第４段階；孵化中胚盤胞であって、胚盤胞の一部が透明帯から脱出した第５段階；孵化後胚盤胞であって、胚盤胞全体が透明帯から脱出した第６段階。第３〜６段階の胚盤胞では、それらの内部細胞塊及び栄養外胚葉細胞に対して、品質のグレード分類を行う必要がある。細胞塊のグレード分類には、細胞数が多く、緊密に配列するグレードＡ；細胞数が少なく、疎に配列するグレードＢ；細胞数がかなり少ないグレードＣがある。栄養外胚葉細胞のグレード分類には、上皮細胞層が比較的に多くの細胞からなり、構造が緻密であるグレードＡ；上皮細胞層が少ない細胞からなり、構造が稀疎であるグレードＢ；上皮細胞層が稀疎な細胞からなるグレードＣがある。このような分類法によれば、評価の最も良好な胚盤胞は５日目の胚盤胞３ＡＡと、６、７日目の胚盤胞４ＡＡである。ＡＲＴ治療において、グレードＡＡの胚が最も理想的な選択であるが、臨床上では、３３％の夫婦しかグレードＡＡの胚を得て移植に用いることができず、５２％の患者はグレードＢ*の胚盤胞（ＡＢ、ＢＡ、ＢＢを含む）しか得られない。グレードＡＡの胚の出生率が３９％で、グレードＢ*の胚の出生率が約２８％で、グレードＣ*（ＢＣ、ＣＢを含む）の胚の出生率が４％で、そのうち、グレードＣＣの出生率はほぼ０である。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００７】
現在、アメリカでは、約１２％の生殖期の女性は生殖補助技術ＡＲＴによって子を出産するニーズがある。自然に受胎した者の中にも、胚発育の異常のため流産してしまう者がかなりいる。ＡＲＴ術後に、大部分の胚は発育の異常のため流産してしまう。ゲノム不安定性、例えば、各種の遺伝子の突然変異、染色体構造や数の異常などは流産を招く重要な原因の１つである。遺伝子の欠陥を有する初期胚を排除するために、臨床上では着床前診断技術（ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉａｎｏｓｉｓ、ＰＧＤ）が用いられている。このような技術はマイクロマニピュレーションの方法で、移植前の胚の栄養外胚葉から複数の細胞を分離し、これらの細胞に対してゲノム検出を行うものである。現在、ＰＧＤ技術は臨床に広く使用され、「第三世代試験管ベビー」と呼ばれ、生殖補助治療を受ける反復流産者の流産率を大幅に低下させ、臨床妊娠率を向上させている。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１０】
本発明は、胚移植前のエピゲノムスクリーニング技術（ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ、ＰＥＧＥ）に基づく、世界で初めてエピジェネティック情報による方法を用いて胚の状態を鑑定する方法であって、体外培養段階の胚盤胞から複数の栄養外胚葉細胞を分離し、これらの複数の細胞を取ることが胚全体にとって非侵襲的であるが、胚全体のメチル化状態及び各染色体の倍数状態を代表することができる、発育良好な胚盤胞をスクリーニングする非侵襲的な検出方法を提供することを目的とする。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１１】
胚が桑実胚に発育した後、桑実胚がさらに分裂し、それと同時に、子宮腔中の分泌液が透明帯を通じて細胞内に浸み込んで、１つの▲のう▼腔が形成され、胚盤胞腔となる。胚盤胞腔外を包囲するものが扁平細胞層であり、当該層におけるサイズが比較的に小さい細胞は、胎盤の一部となり、栄養外胚葉細胞と呼ばれる。胚の一端に集まる、サイズが比較的に大きい細胞は、内部細胞塊（ｉｎｎｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍａｓｓ、ＩＣＭ）と呼ばれる。内部細胞塊の細胞は胚性幹細胞であり、未分化の細胞でもあって、発育多能性を有し、将来的には胎児の各種の組織に発育する。将来、栄養外胚葉細胞が胎膜と胎盤に発育するため、遺伝子診断を行う場合、一般的には少量の栄養外胚葉細胞を取リ出して検出を行う。このような操作は、正常な胎盤の形成に影響を与えず、胎児の発育を影響することもない。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１６】
また、複数の栄養外胚葉細胞を非侵襲的に獲得して測定したメチル化レベルは、胚全体のＤＮＡメチル化レベルを代表できる（図８）。そのため、本検出方法では、栄養外胚葉における複数の細胞を非侵襲的に獲得し、これら複数の栄養外胚葉細胞のメチル化プロファイルを測定することが最も望ましい。ガードナー分類におけるグレードＡＡの胚のメチル化レベルの平均値である０．３±０．０２を、発育良好な胚盤胞のスクリーニング基準とする。同じ親に由来する複数の胚について、メチル化レベルが０．３に近いほど、より胚移植に適する。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１８】
つまり、栄養外胚葉における複数の細胞を非侵襲的に獲得し、メチル化プロファイルを測定することで、メチル化レベル指標、メチル化パターン、及び染色体の状態を獲得できる。これにより、臨床医師は、染色体の倍数が正常で、かつより良好なエピジェネティックプロファイルを示す胚を選択して胚移植を行うことができる。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１９】
具体的には、本発明は、検出待ちの胚盤胞の栄養外胚葉細胞のゲノムに対してメチル化検出を行い、そのメチル化レベルが、基準となるガードナー分類システムにより判定された形態良好な胚のメチル化レベルに近いまたは等しい場合、検出待ちの胚盤胞の発育が良好であり、前記ガードナー分類システムにより判定された形態良好な胚がグレードＡＡ、ＡＢ、ＢＡ、ＢＢの胚盤胞である、発育良好な胚盤胞をスクリーニングする非侵襲的な検出方法を提供する。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２３】
本発明は、栄養外胚葉細胞のメチル化レベルが、ガードナー分類システムにより判定された形態良好な胚のメチル化レベル値に近いまたは等しい胚盤胞をスクリーニングして移植し、前記ガードナー分類システムにより判定された形態良好な胚がグレードＡＡ、ＡＢ、ＢＡ、ＢＢの胚盤胞である、試験管ベビーの出生率を向上させる方法を提供する。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２４】
本発明は、栄養外胚葉細胞のメチル化シーケンシングの結果により、検出待ちの胚盤胞のメチル化シーケンシング結果が、すべての染色体が標準二倍体であることを示す胚盤胞をスクリーニングして移植する、試験管ベビーの出生率を向上させる方法を提供する。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２７】
本発明のキットの検出対象が胚盤胞の栄養外胚葉細胞であることが好ましい。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２９】
具体的には、本発明の実施例のメチル化シーケンシング法で、検出待ちの胚盤胞の栄養外胚葉細胞のゲノムに対してメチル化シーケンシングを行い、検出待ちの胚盤胞の栄養外胚葉細胞のメチル化レベルを検出し、メチル化レベルが０．３±０．２の範囲内にある場合、検出待ちの胚盤胞の発育が良好である。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３０】
検出待ちの胚盤胞の栄養外胚葉細胞のメチル化レベルが０．３±０．０２の範囲内にある場合、検出待ちの胚盤胞の発育が良好であることが好ましい。
【誤訳訂正１４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３１】
検出待ちの胚盤胞の栄養外胚葉細胞のメチル化パターン（ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎ）がグレードＡＡの胚盤胞のパターンに近い場合、検出待ちの胚盤胞の発育が良好であることがより好ましい。
【誤訳訂正１５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３３】
更に、本発明は、本発明の実施例のメチル化シーケンシング法で、栄養外胚葉細胞のメチル化レベルが０．３±０．２である胚盤胞をスクリーニングして移植する、試験管ベビーの出生率を向上させる方法を提供する。
【誤訳訂正１６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３４】
栄養外胚葉細胞のメチル化レベルが０．３±０．０２である胚盤胞をスクリーニングして移植することが好ましい。
【誤訳訂正１７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３５】
栄養外胚葉細胞のメチル化シーケンシングの結果により、すべての染色体が標準二倍体である胚盤胞をスクリーニングして移植することを更に含むことがより好ましい。
【誤訳訂正１８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３８】
本発明のキットの検出対象は胚盤胞の栄養外胚葉細胞である。
【誤訳訂正１９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３９】
更に、本発明は、ガードナー分類におけるグレードＡＡの胚のメチル化レベル値の、発育良好な胚盤胞をスクリーニングするキットの製造における応用を提供する。本発明の実施例のメチル化検出方法で検出されたグレードＡＡの胚のメチル化レベル値が０．３±０．０２である。検出待ちの胚盤胞は、栄養外胚葉細胞のメチル化レベルが０．３に近いほど、より胚移植に適する。
【誤訳訂正２０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４９】
【図１】形態学的な分類におけるグレードが最も高いグレードＡＡの胚と、グレードが劣るグレードＣＣまたはＣＢの胚のメチル化レベルの図である。ＡＡ−１とＣＢ−１の胚は同じ夫婦に由来し、ＡＡ−３とＣＣ−６も同じ夫婦に由来するものである。結果によると、ＡＡのメチル化レベルが０．３０±０．０２の間にあるのに対し、ＣＣまたはＣＢのメチル化レベルはＡＡに比べて、全体的に非常に大きな差がある。
【図２】６個のグレードＢＢまたはＢＡの胚のメチル化レベルの図である。２つの破線は５個のグレードＡＡの胚のメチル化レベルのＳＤ誤差を示す。結果によると、３個のメチル化レベルがＡＡと近似していて（ＢＢ−３、ＢＢ−４、ＢＢ−５）、他の３個のメチル化レベルがＡＡに比べて非常に大きな差がある（ＢＡ−１、ＢＢ−２、ＢＢ−６）。
【図３】各胚のＣｐＧメチル化パターンによる主成分の分析図である（ＰＣＡ分析）。グレードＡＡの胚のメチル化パターンが非常に似ているのに対し、ＣＣまたはＣＢのメチル化パターンとＡＡのメチル化パターンとの差は比較的に大きく、且つ各胚同士の状態の差も比較的に大きい。
【図４】５個のグレードＡＡの胚と７個のグレードＣＢまたはＣＣの胚における、異なるゲノムの機能要素の平均メチル化レベルを示す図である。５個のグレードＡＡの胚の各機能要素のメチル化レベルは近似しているが、７個のグレードＣＣまたはＣＢの胚の各機能要素のメチル化レベルの差は非常に大きく、且つ複数の胚がＡＡと比べて比較的に大きな差がある。
【図５】異なる形態学的な分類の胚のメチル化リプログラミングの機能分析図である。形態学的な分類によるグレードの高い胚とグレードの低い胚とのメチル化可変領域に対して、機能エンリッチメント解析（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を行う。プロモーターがＤＭＲｓ領域にある遺伝子にはＤＡＶＩＤ  ＧＯエンリッチメント解析を用い、遺伝子内部のＤＭＲｓ領域のシスエレメントはＧＲＥＡＴ  ｔｏｏｌｓにより解析する。ＧＯ解析によるｐ値が０．０５より小さいものは、統計学的な意義を有する。結果によると、メチル化のエラーが発生する領域が、細胞の生存にとって非常に重要な基礎代謝遺伝子、または発育、特に神経の発育に係わる遺伝子によく発生し、正常のメチル化プロファイルが胚の発育にとって極めて重要であることが証明されている。
【図６】異なる胚におけるＩＤＨ２遺伝子附近のエンハンサーが異なるメチル化状態を呈することを示す図である。図には、グレードの高い胚とグレードの低い胚の平滑なメチル化レベルが延伸する遺伝子領域の上下５ｋｂの領域が示されている。サンプルＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３のエンハンサーの周囲のメチル化状態が近似していて、サンプルＣＣ５とＣＣ６のエンハンサーのメチル化状態に問題が生じている。黒い短柵はＣｐＧサイトを表す。
【図７】各グレードの胚における、メチル化レベルが０．３±０．０２の範囲内にある割合、及び異なるグレードの胚の出生率を示す図である。ＣＣとＣ*の出生率の代わりにＣ*の出生率を使用したため、図中のＣ*胚の出生率がＣＣとＣ*の合計出生率より高くなっている。当該図によると、メチル化状態が良好な胚は良好な出生率を得る傾向にもあることが証明されている。
【図８】非侵襲的に得られた複数の栄養外胚葉細胞のメチル化レベルが全胚のメチル化レベルに近似していることを示す図である。ＢＢ−７−ＴＥとＣＣ−８−ＴＥはそれぞれ胚ＢＢ−７とＣＣ−８から取り出した複数の栄養外胚葉細胞である。
【図９】メチル化プロファイルの結果により染色体のコピー数を分析することを示す図である。サンプルｓ−２５の５番目の染色体の１つのフラグメントにコピーが１つ多く、９番目の染色体の１つのフラグメントにコピーが１つ少なくなっている。これにより、当該胚の染色体に異常が生じ、胚移植に使用できないことが証明されている。
【誤訳訂正２１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５５】
栄養外胚葉細胞を胚から分離した後、５μｌ以下の胚専用培養液またはＰＢＳにて２００μｌのチューブに保存し、−８０℃まで急速に冷凍させて保存した。
【誤訳訂正２２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１０３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１０３】
実施例４  移植前のエピゲノムの検査は、マイクロマニピュレーションにより胚盤胞から複数の栄養外胚葉細胞を分離することで実現できる
【誤訳訂正２３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１０４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１０４】
臨床において、移植前の遺伝学診断（ＰＧＤ）技術は２０年以上の応用歴史を有し、当該技術は生活組織検出法で胚盤胞から複数の細胞を剥離し、遺伝子の突然変異と染色体の異常などの疾患の診断に用いるものである。本実施例では、各被検胚盤胞の栄養外胚葉細胞（ＴＥ）から複数の細胞を分離し、実施例１に記載の「Ｏｎｅ  Ｔｕｂｅ」、即ち、極少量の細胞の全ゲノムのメチル化ライブラリーの構築方法により、異なる胚盤胞のＴＥメチル化ライブラリーをそれぞれ構築するとともに、異なる胚盤胞の残りの細胞で平行のメチル化ライブラリーに作った。そして、Ｈｉｓｅｑシーケンスプラットホームで検出を行い、図８は、ＴＥ由来の少量の細胞のメチル化レベルが、当該胚盤胞のメチル化レベル全体と類似し、全胚盤胞のメチル化プロファイルを代表できることを示した。よって、このような非侵襲的な生活組織検出法により、より良好な移植前の胚のメチル化プロファイルを示す胚盤胞をスクリーニングすることができる。
【誤訳訂正２４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１１】
本発明は発育良好な胚盤胞をスクリーニングする非侵襲的な検出方法を提供する。胚盤胞における少量の栄養外胚葉細胞のＤＮＡメチル化プロファイルを検出し、ガードナー分類における形態良好な胚のメチル化レベルの平均値及びパターンを発育良好な胚盤胞のスクリーニング基準とし、検出待ちの胚盤胞の栄養外胚葉細胞のメチル化レベルが良好な胚のメチル化レベルまたは状態に近ければ近いほど、胚の発育が良好で、より母体への移植に適する。それと同時に、メチル化シーケンシングの結果の分析により、染色体が異常であるかどうかを判断し、染色体異常胚を直接に除去することができる。本発明が提供する発育良好な胚盤胞をスクリーニングする非侵襲的な検出方法により、臨床医師は、染色体の倍数が正常で、且つより良好なエピジェネティックプロファイルを示す胚を選択して胚移植を行うことができ、生殖補助技術の精度を大幅に向上させ、自然流産率の低下、妊娠の品質及び試験管ベビーの出生率の向上に有益であり、良好な経済価値及び応用前景を有する。