(57)【要約】  癌の判定法及び癌原発巣の特定化法を提供する。  生体試料中の、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列からなり、ＨＮＦ４αの機能を有するタンパク質を免疫学的手法により検出することを特徴とする癌原発巣の特定化方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１４記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列からなり、ＨＮＦ４αの機能を有するタンパク質。
【請求項２】
配列番号１６記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１６記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列からなり、ＨＮＦ４αの機能を有するタンパク質。
【請求項３】
配列番号１８記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１８記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列からなり、ＨＮＦ４αの機能を有するタンパク質。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項５】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列からなり、ＨＮＦ４αの機能を有するタンパク質、又はこれらのタンパク質を構成するアミノ酸配列のうちの連続した１０〜１００アミノ酸からなるペプチドに対する抗体。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項記載のタンパク質、又はそれらのタンパク質を構成するアミノ酸配列のうちの連続した１０〜１００アミノ酸からなるペプチドに対する抗体。
【請求項７】
生体試料中の、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列からなり、ＨＮＦ４αの機能を有するタンパク質を免疫学的手法により検出することを特徴とする癌、偽胆管及び腸上皮仮性の判定方法。
【請求項８】
生体試料中の、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列からなり、ＨＮＦ４αの機能を有するタンパク質を免疫学的手法により検出することを特徴とする癌原発巣の特定化方法。
【請求項９】
生体試料が、生体組織である請求項７又は８記載の方法。
【請求項１０】
生体組織が癌あるいはその他疾患組織である請求項７又は８記載の方法。
【請求項１１】
判定または特定化の対象が、胃癌、肝癌、膵臓癌、大腸癌、腎癌及び胆管癌・胆嚢癌から選ばれる癌、偽胆管及び腸上皮仮性である請求項７〜１０のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌（胃癌、肝癌、膵臓癌、大腸癌、腎癌、胆管癌・胆嚢癌）および偽胆管、腸上皮仮性に特異的なマーカーＨＮＦ４αに関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者らは、癌をはじめとする疾患の診断及び治療の標的を同定するために、正常組織、癌細胞株及び各種癌組織におけるＤＮＡチップによる遺伝子の発現解析を行ってきた。その結果、各種癌で発現が亢進している遺伝子群を抽出することに成功した。その中でも、ＨＮＦ４αのｍＲＮＡが多くの癌組織で発現が亢進していることが確認された。【０００３】
ＨＮＦ４とはＨｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒの略称であり、ＨＮＦ４αとＨＮＦ４βが存在する。ラットＨＮＦ４αにおける遺伝子配列は１９９１年に（特許文献１）、ヒトＨＮＦ４αに関しては１９９４年にｃＤＮＡがクローニングされ（非特許文献１）、代謝調節や内胚葉の発生に関与する核内受容体スーパーファミリーの一つであり（非特許文献２、３）、ＭＯＤＹ１（ｍａｔｕｒｉｔｙ−ｏｎｓｅｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｙｏｕｎｇ  ｔｙｐｅ  １）の原因遺伝子であることが明らかにされたが、腫瘍マーカーとしての知見は知られていなかった。ヒトＨＮＦ４αはａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇに加え、ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｕｓａｇｅ（Ｐ１およびＰ２プロモーター）により多数のアイソフォームが存在し、組織毎に異なる機能を有するアイソフォームが発現していることが示唆されている（非特許文献４）。Ｐ１プロモーター由来のＨＮＦ４αには１〜６が存在することが報告され、それらの遺伝子配列についてはＨＮＦ４α１から３は登録されているが、ＨＮＦ４α４〜６については未登録である。一方、Ｐ２プロモーター由来のヒトＨＮＦ４αの遺伝子配列および組織における分布ならびにその機能については不明である。【０００４】
癌は世界的に増加傾向にあり、日本における死亡率第１位の疾患である。また癌の内でも、胃癌、肝癌、膵臓癌、大腸癌、腎癌、胆管癌・胆嚢癌の占める割合は極めて高い。さらに、それらの癌による転移は頻繁に見られ、原発癌を特定することは治療方針を立てる上で重要な因子となっている。また、原発不明の転移性癌の６０％は腺癌であり、原発巣として肺癌と膵臓癌が最も多く、一般に予後不良であるにも関わらず、決して稀ではないことから臨床的に大きな問題となっている（非特許文献５）。
【特許文献１】ＷＯ９２１１３６５
【非特許文献１】Ｇｅｎｅ，１９９４，Ｓｅｐ．３０；１４７（２）：２６９−７２
【非特許文献２】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｃｒｉｎｏｌ．，２００１，２７：１１−２９
【非特許文献３】Ｅｎｄｃｒ．Ｒｅｖ．，１９９９，２０：６８９−７２５
【非特許文献４】Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．，２００１，１０９：１８３−１９３
【非特許文献５】ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａ  ＰＣ，Ｐｅｓｔａｎａ  ＣＢ：ＡＭＢ  Ｒｅｖ  Ａｓｓｏｃ  Ｍｅｄ  Ｂｒａｓ．１９８９；３５（３）：８４−７．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
原発不明癌の原発巣特定には病理学的、放射線学的検索が行われ、正確な診断にたどり着くこともあるが、多くの場合、原発巣は不明のままで、病理解剖でようやく明らかになる。この場合、臓器別に鑑別する方法であり、特定の腫瘍のマーカーを用いた検討は多くの時間を費やすばかりでなく、十分な情報を提供できないことから、新たな方法の医療現場への導入が望まれている。そのような背景から、マイクロアレイ解析による癌種別の発現プロフィール解析も試みられつつあるが、その実用化の見通しはたっていない。従って、本発明は原発不明癌の原発巣を、簡便で精度良く判定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ＨＮＦ４αには相同性の高い１から６のアイソフォームが存在することが知られていたが、本発明者が類似遺伝子を探索したところ、従来から知られたＰ１プロモーター由来のＨＮＦ４α１〜６とは異なるＰ２プロモーター由来ＨＮＦ４α７、ＨＮＦ４α８およびＨＮＦ４α９を発見するに至った。さらに、Ｐ１プロモーター由来のＨＮＦ４αを特異的に認識するが、Ｐ２プロモーター由来ＨＮＦ４αを認識しない抗体、Ｐ２プロモーター由来のＨＮＦ４αを特異的に認識するが、Ｐ１プロモーター由来ＨＮＦ４αを認識しない抗体および両者を認識する抗体の作製に成功した。それら抗体による免疫学的手法によって、それらアイソフォームの発現が組織により異なることを発見した。この結果をもとに、癌および偽胆管、腸上皮仮性の判定および原発不明癌の原発巣の特定化に成功し、本発明を完成するに至った。【０００７】
すなわち、本発明は、配列番号１４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１４記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列からなり、ＨＮＦ４αの機能を有するタンパク質を提供するものである。
また、本発明は、配列番号１６記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１６記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列からなり、ＨＮＦ４αの機能を有するタンパク質を提供するものである。
また、本発明は、配列番号１８記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１８記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列からなり、ＨＮＦ４αの機能を有するタンパク質を提供するものである。
また、本発明は、上記３種のタンパク質をコードする遺伝子を提供するものである。
また、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列からなり、ＨＮＦ４αの機能を有するタンパク質、又はこれらのタンパク質を構成するアミノ酸配列のうちの連続した１０〜１００アミノ酸からなるペプチドに対する抗体を提供するものである。
また、本発明は、生体試料中の、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列からなり、ＨＮＦ４αの機能を有するタンパク質を免疫学的手法により検出することを特徴とする癌、偽胆管及び腸上皮仮性の判定方法を提供するものである。
さらに本発明は、生体試料中の、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列からなり、ＨＮＦ４αの機能を有するタンパク質を免疫学的手法により検出することを特徴とする癌原発巣の特定化方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、Ｐ１およびＰ２プロモーター由来ＨＮＦ４αをそれぞれあるいは両者を特異的に認識する抗体による免疫学的手法により、多くの癌の診断および転移癌における原発巣を簡便に精度よく特定することを可能とし、医療現場でのニーズに答えることのできる技術を提供可能とした。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】Ｐ１抗体Ｋ９２１８、Ｐ２抗体Ｈ６９３９及びＣ端抗体Ｈ１４１５とＨＮＦ４αアイソフォーム１〜９との反応性を示す図である。
【図２】正常大腸の抗体による組織免疫染色像を示す。
【図３】正常膵臓の抗体による組織免疫染色像を示す。
【図４】正常腎臓の抗体による組織免疫染色像を示す。
【図５】正常肺の抗体による組織免疫染色像を示す。
【図６】胃癌の抗体による組織免疫染色像を示す。
【図７】大腸癌及び甲状腺癌の抗体による組織免疫染色像を示す。
【図８】膵癌及び肝癌の抗体による組織免疫染色像を示す。
【図９】腎細胞癌及び肺腺癌の抗体による組織免疫染色像を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、生体試料中のＨＮＦ４αアイソフォームを検出することで、各種癌の診断および原発不明癌の原発巣を特定する方法を提供するものである。【００１１】
本発明の検出対象であるＨＮＦ４αのアイソフォームは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８に記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列からなり、ＨＮＦ４αの機能を有するタンパク質である。このうち、配列番号２、４、６、８、１０及び１２のタンパク質は、既知のＨＮＦ４αのアイソフォームである、Ｐ１プロモーター由来のＨＮＦ４α１〜６にそれぞれ対応する。一方、配列番号１４、１６及び１８のタンパク質は、本発明者らが新たに見出したＰ２プロモーター由来のＨＮＦ４αアイソフォームである。これらをそれぞれＨＮＦ４α７〜９と称する。【００１２】
ＨＮＦ４α７、ＨＮＦ４α８及びＨＮＦ４α９のクローニングは、例えばヒト由来の癌細胞から得られたｃＤＮＡライブラリーからＨＮＦ４α１〜６遺伝子の塩基配列を基にして設計したプライマーを用いたＰＣＲ反応によりクローニングすることができる。用いる癌細胞としては、Ｃａｃｏ−２、Ｋａｔｏ  ＩＩＩ等が挙げられる。プライマーとしては、フォワードプライマーとして配列番号１９のプライマーを、リバースプライマーとして配列番号２０又は２１のプライマーを用いるのが好ましい。ＰＣＲは、ＲＴ−ＰＣＲが好ましい。さらにＰＣＲ産物は、Ｔベクターにサブクローニングし、ｃＤＮＡを断片化し、公知のプラスミドに挿入することにより、組換えベクターとすることができる。組換えベクターの遺伝子を解析することにより、ＨＮＦ４α７、ＨＮＦ４α８、ＨＮＦ４α９遺伝子がクローニングできる。【００１３】
得られたＨＮＦ４α７、ＨＮＦ４α８又はＨＮＦ４α９遺伝子の発現には、公知の発現用ウィルス、発現用プラスミド等を用いた発現系が用いられる。例えば、発現ベクターとしてバキュロウィルス、ファージ、プラスミド等が用いられる。また宿主細胞としては、昆虫細胞、酵母、哺乳動物細胞、大腸菌等が用いられる。【００１４】
本発明で用いるＨＮＦ４α１〜ＨＮＦ４α９には、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質だけでなく、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８に記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸配列が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列からなり、ＨＮＦ４αの機能を有するタンパク質も含まれる。また、ＨＮＦ４α１〜９には翻訳後修飾されたタンパク質も含まれる。翻訳後修飾される位置、種類は１又は複数個である。翻訳後修飾としては、リン酸化、糖化、アセチル化、ミリストイル化等が挙げられる。ＨＮＦ４α１〜９には、医薬的に許容される塩も含まれる。前記１又は数個のアミノ酸配列が欠失、置換又はアミノ酸配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６又は１８に記載のアミノ酸配列と相同性が８０％以上、より好ましくは９０％以上のものが含まれる。【００１５】
またＨＮＦ４α７、ＨＮＦ４α８又はＨＮＦ４α９をコードする遺伝子には、配列番号１３、１５又は１７に記載の塩基配列からなる遺伝子、又は配列番号１３、１５又は１７に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＨＮＦ４αの機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。ここでストリンジェントな条件としては、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中５０℃、０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中６０℃の条件が挙げられる。このようなストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡには、配列番号１３、１５又は１７に記載の塩基配列と相同性が８０％以上、より好ましくは９０％以上のものが含まれる。【００１６】
本発明の判定方法は、臨床検体におけるＨＮＦ４α１〜９のいずれかの発現亢進が関与する疾患に罹患しているか否かを判定する。疾患としては、例えば、癌（胃癌、肝癌、膵臓癌、大腸癌、腎癌、胆管癌・胆嚢癌）および偽胆管、腸上皮仮性が挙げられる。本発明は、ＨＮＦ４αアイソフォームのタンパク質の検出のみで判定する場合に限定されず、他の診断方法と併せて使用される場合も含まれる。【００１７】
本発明の癌の判定方法及び癌原発巣の特定化方法に用いられる生体試料としては、（ａ）組織、（ｂ）採取した組織の培養物、（ｃ）組織抽出物、（ｄ）癌患者の喀痰、（ｅ）尿、又は（ｆ）血液等が挙げられる。免疫組織化学による判断では（ａ）〜（ｄ）を用いるのが望ましい。当該組織は、バイオプシーにより採取できる。採取した組織は、免疫組織染色する場合にはパラフィン包埋又は凍結して用いることもできる。【００１８】
本発明の癌の判定方法及び癌原発巣の特定化方法は、抗体を用いた免疫学的手法に基づく。免疫学的手法は当業者に公知の数多くの手段によって達成され、免疫組織化学法、ウェスタン・ブロッティング法、酵素免疫測定法（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、放射能免疫測定法（ＲＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）が含まれる。【００１９】
具体的には、免疫組織化学であれば、バイオプシー又は手術により切除された組織などに抗ＨＮＦ４αアイソフォーム抗体を用いて組織中のＨＮＦ４αアイソフォームを検出する。同時に、ヘマトキシリンエオジン（ＨＥ）染色を行うことで、組織型とＨＮＦ４αアイソフォームの発現量の関係を知ることができる。
ウェスタン・ブロッティングであれば、当該臨床検体から得られたタンパク質をポリアクリルアミド電気泳動で分子量の違いで分離し、ポリビリニデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜又はニトロセルロース膜に転写を行う。その後、抗ＨＮＦ４αアイソフォーム抗体を作用させ、引き続き、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ蛍光色素、ビオチンなどで標識された抗ＨＮＦ４αアイソフォーム抗体を認識する抗体、すなわち二次抗体を作用させることで検出を行う。検出は抗ＨＮＦ４αアイソフォーム抗体を直接標識して行っても良い。タンパク質のサイズでＨＮＦ４αアイソフォームであることを確認する。このサイズはＨＮＦ４αアイソフォームの全長のタンパク質であってもよいし、翻訳後修飾されたＨＮＦ４αアイソフォーム、又は分解されたＨＮＦ４αアイソフォームの断片のいずれでもよい。
免疫測定法では、物理吸着や化学結合により抗体を結合させた固相単体（例えば、イムノプレート、ラテックス粒子等）を用いて、検体中のＨＮＦ４α１〜９のいずれかを捕捉した後、捕捉されたＨＮＦ４α１〜９のいずれかを、固相担体に固定化された抗体とは別の抗原認識部位をもつ標識化抗体を用いて検出、定量ができる。また、固相担体に検体を固相し、標識化抗体を用いて検出、定量することも可能である。【００２０】
抗体は大別してポリクローナル抗体とモノクローナル抗体に分けられる。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位を認識することより、特異性が高いことが知られている。本発明による免疫学的手法は、モノクローナル抗体を用いることが望ましい。すなわち、本発明には、モノクローナル抗体単独、複数のモノクローナル抗体、又はモノクローナル抗体とポリクローナル抗体の組み合わせによりＨＮＦ４α１〜９を検出する場合が含まれる。【００２１】
本発明に用いる抗体は、生体から得られた内在性タンパク質又は組換えタンパク質のいずれを免疫原としたものでもよい。抗体を作製する際の免疫原であるが、ＨＮＦ４αタンパク質のアイソフォームの一種類以上の全長又はその断片のいずれでもよい。また、合成ペプチドを免疫原としてもよいが、その長さは配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８記載のアミノ酸配列のうちの連続した１０アミノ酸以上、さらの１０〜１００アミノ酸、特に１０〜８０アミノ酸が望ましい。このような合成ペプチドの例としては、ＨＮＦ４α２のＮ末端側１０〜１００アミノ酸のペプチド（例えば後記３〜４９番目のアミノ酸のペプチド）、ＨＮＦ４α８のＣ末端側１０〜１００アミノ酸のペプチド（例えば後記３８０〜４４９番目のアミノ酸のペプチド）、ＨＮＦ４α８のＮ末端側１０〜１００アミノ酸のペプチド（例えば後記１〜１６番目のアミノ酸のペプチド）が挙げられる。【００２２】
組換えタンパク質を産生する宿主は限定されるものではなく、例えば、ウィルス、大腸菌、酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞などであり、無細胞合成系によるタンパク質の産生も含む。組換えタンパク質には、融合タンパク質も含まれる。融合タンパク質とは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース融合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン、ポリヒスチジン、ＦＬＡＧ配列、Ｘｐｒｅｓｓ配列等との融合タンパク質である。抗体を産生する動物は、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ、モルモット、ラクダなどの哺乳動物があるが、ＨＮＦ４αを特異的に認識する抗体であれば動物種は限定しない。【００２３】
本発明によるＨＮＦ４α１〜９の検出結果により、癌、偽胆管及び腸上皮仮性が判定できる。これには、例えば、Ｐ１プロモーター由来のＨＮＦ４αアイソフォーム、すなわちＨＮＦ４α１〜６と反応する抗体（Ｐ１抗体）と、Ｐ２プロモーター由来のＨＮＦ４αアイソフォーム、すなわちＨＮＦ４α７〜９と反応する抗体（Ｐ２抗体）とを組み合せて検出するのが好ましい。さらに必要に応じてＨＮＦ４α１〜６の一部及びＨＮＦ４α７〜９の一部の両方に反応する抗体（Ｃ端抗体）を組み合せて検出するのが好ましい。判定の例としては、Ｐ１抗体は肝癌、胃癌のほとんど全例が陽性であり、Ｐ２抗体は胃癌、大腸癌の１００％が陽性であった。また、Ｐ１抗体は胃癌、大腸癌のほぼ半数が陽性であり、胆道癌、胆嚢癌でも陽性例があった。さらにＰ２抗体は膵臓癌でも陽性例があった。一方、肺癌、子宮癌、甲状腺癌、卵巣癌はＰ１抗体、Ｐ２抗体ともに陰性であった。【００２４】
また、本発明によるＨＮＦ４α１〜９の検出結果により、癌原発巣が後記表３のように特定化できる。
【実施例】
【００２５】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。【００２６】
［実施例１］ＨＮＦ４α７、ＨＮＦ４α８およびＨＮＦ４α９のクローニング
全ＲＮＡはいくつかの細胞種からＩＳＯＧＥＮ（Ｗａｋｏケミカル）を用いて抽出した。すなわち、ＨＮＦ４α７および８はＣａｃｏ−２細胞から、ＨＮＦ４α９はＫａｔｏ  ＩＩＩ細胞からＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、クローニングした。ｃＤＮＡを合成するためには、ＲＮＡをランダムヘキサマーによりアニーリングし、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて伸長反応を行った。用いたプライマーはフォワードプライマーに配列番号１９とＨＮＦ４α７および８のリバースプライマーに配列番号２０、ＨＮＦ４α９のリバースプライマーに配列番号２１を用いた。ＰＣＲ産物はＴベクター（プロメガ）にサブクローニングして、ｃＤＮＡを制限酵素Ｎｏｔ  Ｉで切断した断片をｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン）に挿入した。作製した組換え体の遺伝子はダイターミネーター法（ＡＢＩ）により遺伝子の配列を確認した。【００２７】
［実施例２］ＨＮＦ４α２のアミノ酸配列３番目〜４９番目までのペプチドおよびＨＮＦ４α８のアミノ酸配列３８０〜４４８番目までのペプチド発現ウィルスの調製と培養
（精製ウィルス発現物の取得）
目的のペプチドはＡｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａの核多角体ウィルス（ＡｃＭＮＰＶ）のｇｐ６４融合タンパク質の組換え体により作製した。ＨＮＦ４α２のアミノ酸配列３番目〜４９番目について、フォワードプライマーとして、配列番号２２、リバースプライマーとして配列番号２３を用いた。ＨＮＦ４α８のアミノ酸配列３８０番目〜４４８番目について、フォワードプライマーとして、配列番号２４、リバースプライマーとして配列番号２５を用いた。ヒトＨＮＦ４α８のｃＤＮＡを鋳型にそれぞれのペプチドに対応する部位をＰＣＲ法により増幅させ、ｇｐ６４遺伝子の融合タンパク質となるように組換え体遺伝子の作成を行った。作製した組換え体遺伝子をバキュロウィルスのＤＮＡに挿入することで、組換え体遺伝子の発現を行った。すなわち、トランスファーベクターとバキュロウィルスＤＮＡ（Ｂａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ  ＤＮＡ）（インビトロジェン）をＳｆ９細胞に挿入することにより組換体ウィルスを作製した。次いで、Ｓｆ９細胞の培養にはＧｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉａ、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を用い、組換え後７２から１２０時間２７℃で培養し、培養上清中に組換えウィルスを産生し、プラークアッセイ法によりウィルスの精製を行った。プラークアッセイ法は次のように実施した。１０％ＦＢＳの培地に１００ｍｍディッシュに５×１０６の細胞を培養し、１０倍希釈のウィルス液系列を作製したものを、感染させ、一時間後に、培地を取り除き、寒天入り培地をのせた。２７℃で６日間培養し、ニュートラルレッドで染色を３時間行った後、パスツールピペットでプラークを採り、１ｍＬの培地に入れて攪拌しウィルスを溶出した。この操作を２度行うことにより、ウィルスの精製をおこなった。精製ウィルスを２×１０６個のＳｆ９細胞に感染させ、１０日間２７℃で培養を行った。さらに、５００ｍＬの２×１０６Ｓｆ９細胞／ｍＬサスペンジョンカルチャーに、ウィルス液の上記５ｍＬを懸濁した。１０日間培養後、遠心操作１０００×ｇ、２０分を行い、上清のウィルス液を得た。タイターは上記プラークアッセイ法で測定し、ＭＯＩを５になるように、ウィルス液を、５００ｍＬの２×１０６Ｓｆ９細胞／ｍＬサスペンジョンカルチャーに感染させた。続いて、ｇｐ６４融合タンパク質として発現させるために、培養３日後に、４５０００×ｇで３０分の遠心操作を行い、沈澱画分にあるウィルスを得た後、ＰＢＳで懸濁し、精製バキュロウィルス発現物を得た。【００２８】
［実施例３］ＨＮＦ４α８のアミノ酸配列１番目〜１６番目までのペプチドの入手
ＨＮＦ４α７のアミノ酸配列１番目〜１６番目までのペプチドは株式会社ペプチド研究所に合成を委託し、入手した。【００２９】
［実施例４］ＨＮＦ４α２のアミノ酸配列３番目〜４９番目までのペプチド、および、ＨＮＦ４α８のアミノ酸配列３８０〜４４８番目までのペプチドに対する抗体の作製
ヒトＨＮＦ４α２のアミノ酸配列３番目〜４９番目の配列、及びＨＮＦ４α８のアミノ酸配列３８０〜４４８番目までの配列を組み込んだ精製バキュロウィルス発現物（ｇｐ６４−ｆｕｓｉｏｎ発現ウィルス粒子）を免疫原とした。
マウス（ＢＡＬＢ／ｃ雌６週齢）に１００μｇ／匹で３回免疫した後、７２時間後に脾臓細胞を採取し、骨髄腫細胞（Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａｇ４−１）と細胞融合（Ｋｏｈｌｅｒ  Ｇ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ：Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５（１９７５））を行った。ＨＡＴ選択培地で培養を行うことにより、ハイブリドーマを得た。
ハイブリドーマの培養上清について、免疫抗原（ｇｐ６４発現ウィルス粒子）固相ＥＬＩＳＡと野生型ウィルス粒子固相ＥＬＩＳＡ行い、免疫抗原に対してのみ反応するものを一次選択した。【００３０】
ＥＬＩＳＡ法の概略は、免疫原および野生型のウィルス粒子０．５μｇ／ｗｅｌｌを固相化したＥＬＩＳＡ用プレートに、ハイブリドーマの培養上清を反応させ、ＨＲＰ標識抗マウス抗体の反応を経て、基質添加後に得られた発色について４５０ｎｍの吸光度を測定する方法（免疫抗原固相ＥＬＩＳＡ法）を使用した。【００３１】
一次選択されたバイブリドーマについて、免疫抗原と野生型の各ウィルス粒子を用いたウエスタンブロットを行い二次選択した。ウエスタンブロットの概略は、免疫原および野生型のウィルス粒子を０．６μｇ／ｌａｎｅとなるようにアプライして、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。次に、Ｈｙｂｏｎｄ  ＥＣＬ膜（アマシャムバイオサイエンス社製）に転写し、転写膜をブロッキング後、ハイブリドーマの培養上清を反応させた。次にＨＲＰ標識抗マウス抗体を反応させ、ＥＣＬ検出試薬（アマシャムバイオサイエンス社）を添加後に得られた化学発光について、Ｘ線フイルムを感光させて検出した。【００３２】
免疫抗原のＨＮＦ４α発現物に特異的なバンドのみと反応する株として二次選択されたものについて限界希釈法にてクローニングを行い、モノクローナル抗体産生株を樹立した。【００３３】
抗体産生ハイブリドーマをＢＡＬＢ／ｃマウスに接種することによってマウス腹水を得た。そのようにして得た腹水から硫安塩析法で精製し、モノクローナル精製抗体を得た。【００３４】
［実施例５］ＨＮＦ４α８のアミノ酸配列１番〜１６番目までのペプチドに対する抗体の作製
ＨＮＦ４α８のアミノ酸配列１番目〜１６番目までのペプチドをキーホールリンペットヘモシアニン（以下ＫＬＨ；カルビオケム社製）にコンジュゲートさせたものを免疫原とした。
マウス（ＢＡＬＢ／ｃ雌６週齢）に１００μｇ／匹で３回免疫した後、７２時間後に脾臓細胞を採取し、骨髄腫細胞（Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａｇ４−１）と細胞融合（Ｋｏｈｌｅｒ  Ｇ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ：Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５（１９７５））を行った。ＨＡＴ選択培地で培養を行うことにより、ハイブリドーマを得た。ハイブリドーマの培養上清について、免疫抗原ペプチド固相ＥＬＩＳＡを行い、免疫抗原ペプチドに対して反応するものを一次選択した。【００３５】
ＥＬＩＳＡ法の概略は、ＨＮＦ４α８のアミノ酸配列１番目〜１６番目のペプチドを０．５μｇ／ｗｅｌｌを固相化したＥＬＩＳＡ用プレートに、ハイブリドーマの培養上清を反応させ、ＨＲＰ標識抗マウス抗体の反応を経て、基質添加後に得られた発色について４５０ｎｍの吸光度を測定する方法（免疫抗原固相ＥＬＩＳＡ法）を使用した。【００３６】
一次選択されたバイブリドーマについては、ＣＨＯ発現系にてＨＮＦ４α８完全長発現物を強制発現させた細胞のライセートを用いてウエスタンブロットを行い、完全長ＨＮＦ４α８と反応する株を二次選択した。二次選択陽性のものについて限界希釈法にてクローニングを行い、モノクローナル抗体産生株を樹立した。抗体産生ハイブリドーマをＢＡＬＢ／ｃマウスに接種することによってマウス腹水を得た。次いで、硫安塩析法で精製し、精製モノクローナル抗体を得た。【００３７】
［実施例６］ウエスタンブロティングによるモノクローナル抗体の特性
多数得られた抗体について、ＣＨＯ発現系にてＨＮＦ４α１から９の各アイソフォームの完全長蛋白質を強制発現させた細胞のライゼートを用いたウエスタンブロットを行って、完全長蛋白質を認識できること、およびアイソフォーム特異性を確認した。【００３８】
ウエスタンブロットの概略は、ＨＮＦ４α８完全長発現物を強制発現させたＣＨＯ細胞と、陰性コントロールとしての宿主ＣＨＯ細胞のライセートを、６μｇ／ｌｅｎｅとなるようにアプライして、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。次に、Ｈｙｂｏｎｄ  ＥＣＬ膜（アマシャムバイオサイエンス社製）にゲルを転写し、転写膜をブロッキング後、ハイブリドーマの培養上清を反応させた。次にＨＲＰ標識抗マウス抗体を反応させ、ＥＣＬ検出試薬（アマシャムバイオサイエンス社）を添加後に得られた化学発光について、Ｘ線フイルムを感光させて検出した。【００３９】
細胞ライセート調製は以下の手順に従った。
ＣＨＯ細胞は１００ｍｍのディッシュに６×１０５で培養を開始して、１８時間後にＴｒａｎｓＩＴ  ＬＴ−１トランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ）と８μｇのｐｃＤＮＡ３−ＨＮＦ４α１〜９の発現ベクターを形質転換した。形質転換したＨＮＦ４α発現の培養細胞を４８時間培養した後、氷冷したＰＢＳで二度洗浄し、細胞をスクレイピングによって回収した。細胞は２０００×ｇで５分間遠心操作を行い、沈澱として得た細胞を、氷冷した溶解用緩衝液で懸濁した。緩衝液の組成は２０ｍｍ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．９）、２０％（ｖ／ｖ）グリセロール、４００ｍｍ  Ｋｃｌ，０．５ｍｍ  ＥＤＴＡ，１ｍｍ  ＤＴＴ，２μｇ／ｍＬ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，ｐｅｐｓｔａｔｉｎ  Ａ，ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，０．５ｍｍ  ＰＭＳＦを用いた。細胞は液体窒素と３７℃のフリーズソーの操作を行った。この操作は３分間を３回繰り返すことで溶解させた。溶解後、２０，０００×ｇで１０分間遠心操作を行い、遠心後の上清をブラッドフォード法（バイオラッド）によりタンパク質の濃度を測定し、ＨＮＦ４α１〜９の標品とした。【００４０】
多数得られた抗体の中でも特に、ＨＮＦ４α２のアミノ酸配列３番目〜４９番目までのペプチドに対する抗体（Ｐ１抗体）としてＫ９２１８、ＨＮＦ４α８のアミノ酸配列３８０〜４４８番目までペプチドに対する抗体（Ｃ端抗体）としてＨ１４１５およびＨＮＦ４α８のアミノ酸配列１番〜１６番目までのペプチドに対する抗体（Ｐ２抗体）としてＨ６９３９が選択された。すなわち、Ｐ１抗体Ｋ９２１８はα１、２、３、４、５、６と、Ｃ端抗体Ｈ１４１５はα１、２、４、５、７、８と、Ｐ２抗体Ｈ６９３９はα７、８、９と、それぞれ特異的に反応することが確認された（図１）。Ｋ９２１８を産生するハイブリドーマ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０３６３）、Ｈ１４１５を産生するハイブリドーマ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０３６１）及びＨ６９３９を産生するハイブリドーマ（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０３６２）を、２００４年９月１日にそれぞれ独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に寄託した。【００４１】
［実施例７］癌の判定
（１）免疫染色
組織を適当な大きさに整えてからホルマリン固定を行い、当業者に良く知られた方法にてパラフィンに包埋した。４μｍに細切した標本をオートクレーブ処理し、非特異的反応を抑制するため、馬血清処理後、ＨＮＦ４αを１％ＢＳＡ／ＰＢＳで最終濃度１０μｇ／ｍＬで２時間２５℃または４℃で一晩反応した。ＰＢＳで洗浄後、０．３％過酸化水素含有メタノールで３０分内因性ペルオキシダーゼ反応の阻止を行い、２次抗体（ＭｕｌｔｉＰＯＸ，ニチレイ、東京）は室温で１時間反応させた。最後に０．１ｍｇ／ｍＬの３，３′−ジアミノベンジディン（ＤＡＢ）テトラハイドロクロライドに５分反応させ、核の染色はヘマトキシレンで行った。【００４２】
（２）各種癌組織
新潟大学医学部病理学教室および新潟大学医歯学総合病院病理部の手術例、生検例、を用いた。胃癌１４例、大腸癌１８例、膵癌３例、子宮内膜癌６例、卵巣癌９例、肺癌２１例、甲状腺癌１０例、肝癌２例、腎癌２５例である。【００４３】
（３）各種正常組織における免疫染色
正常組織における各種ＨＮＦ４αアイソフォームの発現を検討した。
その結果、ＨＮＦ４αアイソフォーム全体として腎臓の近位地尿細管を例外として内胚葉組織に発現した。表１に示すように、Ｐ１、Ｐ２およびＣ端抗体のいずれも陰性の組織としては、舌、唾液腺、食道、膀胱、精巣、前立腺、卵巣、子宮、乳腺、胎盤、気管・気管支、肺、心筋、骨格筋および平滑筋、さらに、肝臓（洞様毛細血管壁細胞、クッパー細胞）および腎臓（内皮細胞、有足突起細胞、メサンギウム細胞、傍糸球体細胞、遠位尿細管、集合管、ヘンレ係蹄太上行脚）であった。一方、全ての抗体で強陽性所見が認められた組織として、十二指腸（杯細胞、表層吸収細胞、）空腸・回腸（杯細胞、表層吸収細胞、ＡＰＵＤ細胞）大腸であり、Ｃ端抗体のみ陰性は肝臓（肝細胞）および腎臓（近位尿細管）であり、Ｐ１抗体のみ陰性としては膵臓であった。なお、個体発生では卵黄嚢内胚葉細胞に発現した。【００４４】
【表１】
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【００４５】
全ての抗体で強陽性を示した組織免疫染色例として大腸組織を、Ｐ２とＣ端抗体陽性例として膵臓を、１部位のみＰ１およびＰ２陽性例として腎臓、いずれの抗体でも陰性例として図２〜５に示した。【００４６】
（４）各種腫瘍における免疫染色
腫瘍におけるＨＮＦ４αのアイソフォームの発現を検討した結果は下記の通りである。【００４７】
【表２】
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【００４８】
上記結果を要約すると、Ｐ１抗体は肝癌、腎癌のほとんど全例が陽性で、Ｐ２抗体は胃癌、大腸癌で１００％陽性であった。また、Ｐ１抗体は胃癌、大腸癌のほぼ半数に陽性所見を呈した。膵臓癌は予想より率は低かったがＰ２抗体陽性所見が得られ、胆道癌や胆嚢癌でもＰ１抗体陽性症例があることを確認している。肺癌、子宮癌、甲状腺癌、卵巣癌はすべて陰性であった。【００４９】
［実施例８］原発不明癌の原発巣の特定化
実施例７の結果から下記の癌が原発巣であることが高い確率で推定できる。【００５０】
【表３】
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【００５１】
上記表におけるＰ１抗体、Ｐ２抗体およびＣ端抗体による代表的免疫染色結果を図６から９に示す。そのうち腫瘍について染色像を以下に示す。【００５２】
【表４】
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【００５３】
ブラインドをかけて行った転移癌の推定結果が剖検によって正解であった例を以下に示す。【００５４】
【表５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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