【手続補正書】
【提出日】令和1年12月19日(2019.12.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、幹細胞集団を、有効量のＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤および有効量のＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と接触させるステップ、およびさらに前記細胞集団を、有効量の迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、少なくとも約２日間接触させて、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する分化細胞集団を生成するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と約６日間接触させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から約８日間以内に、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と最初に接触させるステップを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から少なくとも約２日目に、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と最初に接触させるステップを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から約４日目に、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と最初に接触させるステップを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記幹細胞集団が、それらと前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から約１１日目またはそれより後に、前記１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する分化細胞集団に分化している、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記幹細胞集団を、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触させるステップを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記幹細胞集団を、前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤および前記ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と同時に接触させるステップを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記幹細胞集団と前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から約４日間以内に、前記細胞集団を、前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と最初に接触させるステップを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記幹細胞集団と前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から約２日目に、前記細胞集団を、前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と最初に接触させるステップを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触と同日に、前記幹細胞集団を、前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と最初に接触させるステップを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤が、ＳＢ４３１５４２、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である；かつ／または
（ｂ）前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子が、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化のために、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を低減する；かつ／もしくは前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子が、ＣＨＩＲ９９０２１、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である；かつ／または
（ｃ）前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子が、レチノイン酸、レチノール、レチナール、トレチノイン、イソトレチノイン、アリトレチノイン、エトレチネート、アシトレチン、タザロテン、ベキサロテン、アダパレン、ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子、Ｗｎｔ活性化因子、およびそれらの組合せからなる群から選択される、もしくは前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子が、ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子、およびそれらの組合せからなる群から選択される、
請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞集団を、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種の分子と接触させるステップを含み、必要に応じて、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種の分子が、レチノイン酸である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞集団を、迷走神経堤パターン形成を誘導する２種またはそれよりも多い分子種と接触させるステップを含み、必要に応じて、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する２種またはそれよりも多い分子種が、ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子および１種または複数のＷｎｔ活性化因子であり、必要に応じて、ａ）前記ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子が、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ７、およびＦＧＦ８からなる群から選択される：かつ／またはｂ）前記Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子が、ＣＨＩＲ９９０２１およびＷＮＴ３Ａからなる群から選択される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記迷走神経堤パターン形成が、１種または複数の領域特異的ホメオボックス（ＨＯＸ）遺伝子の発現によって特徴付けられ、必要に応じて、前記１種または複数の領域特異的ＨＯＸ遺伝子が、ＨＯＸＢ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ４、およびＨＯＸＢ５からなる群から選択される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記１種または複数の腸神経堤系統マーカーが、ＰＡＸ３、ＥＤＮＲＢ、ＲＥＴ、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＮＴＲＫ−３、ＨＡＮＤ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ５およびＡＳＣＬ１からなる群から選択される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記分化細胞集団が、１種または複数のＳＯＸ１０＋神経堤系統マーカーをさらに発現し、必要に応じて、前記ＳＯＸ１０＋神経堤系統マーカーが、ＣＤ４９Ｄである、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記幹細胞が、ヒト幹細胞であり、必要に応じて、前記ヒト幹細胞が、ヒト胚幹細胞、ヒト人工多能性幹細胞、ヒト単為生殖幹細胞、始原胚細胞様の多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、およびＦクラス多能性幹細胞からなる群から選択される、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
さらに前記分化細胞を１種または複数の腸ニューロンマーカーを発現する細胞集団に成熟させるのに好都合な条件に、前記分化細胞集団を晒すステップを含み、必要に応じて、前記分化細胞を前記腸ニューロン集団に成熟させるのに好都合な前記条件が、前記分化細胞を適切な細胞培養培地中で培養することを含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記適切な細胞培養培地が、腸ニューロンへの腸神経堤（ＥＮＣ）前駆体の成熟を増強する１種または複数の分子を含み、必要に応じて、前記腸ニューロンへのＥＮＣ前駆体の成熟を増強する１種または複数の分子が、成長因子およびＷｎｔ活性化因子からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記成長因子が、ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、およびアスコルビン酸からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記適切な細胞培養培地が、ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子およびＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子を含み、必要に応じて、前記分化細胞が、前記ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子および前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子を含む前記適切な細胞培養培地中で約４日間培養される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子が、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ８、およびＦＧＦ７からなる群から選択される、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記１種または複数の腸ニューロンマーカーが、Ｔｕｊ１、ＭＡＰ２、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＴＲＫＣ、ＡＳＣＬ１、ＨＡＮＤ２、ＥＤＮＲＢ、５ＨＴ、ＧＡＢＡ、ＮＯＳ、ＳＳＴ、ＴＨ、ＣＨＡＴ、ＤＢＨ、サブスタンスＰ、ＶＩＰ、ＮＰＹ、ＧｎＲＨ、およびＣＧＲＰからなる群から選択される、請求項１９から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現するｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞集団であって、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法にしたがって幹細胞集団から誘導される、分化細胞集団。
【請求項２６】
１種または複数の腸ニューロンマーカーを発現するｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞集団であって、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する請求項２５に記載の細胞集団から誘導され、必要に応じて、請求項１９から２４のいずれか一項に記載の方法にしたがって、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する前記細胞集団から誘導される、分化細胞集団。
【請求項２７】
請求項２５または２６に記載の細胞集団を含む、組成物。
【請求項２８】
対象の腸神経系障害の予防および／または処置において使用するための、請求項２５もしくは２６に記載の細胞集団または請求項２７に記載の組成物であって、必要に応じて、前記腸神経系障害が、ヒルシュスプルング病である、細胞集団または組成物。
【請求項２９】
ヒルシュスプルング病、ヒルシュスプルング病関連遺伝的欠陥、および／または別の腸神経系障害を予防および／または処置するのに適した化合物を同定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する請求項４０から６９のいずれか一項に記載の細胞集団、１種または複数の腸神経のマーカーを発現する請求項７１から８３のいずれか一項に記載の細胞集団、およびそれらの組合せから選択される細胞集団によって提示される少なくとも１つの遊走欠損を救済することができる化合物を同定するステップを含み、事前分化した幹細胞が、エンドセリン受容体Ｂ型（ＥＤＮＲＢ）においてホモ接合性機能喪失変異を含む、方法。
【請求項３０】
（ａ）（ｉ）前記細胞集団、および（ｉｉ）試験化合物を提供するステップと、
（ｂ）前記細胞集団を、前記試験化合物と接触させるステップと、
（ｃ）前記細胞集団の遊走挙動を測定するステップと
を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞集団が、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する請求項４０から６９のいずれか一項に記載の細胞集団である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞集団が、前記試験化合物と少なくとも約６時間、少なくとも約１２時間、または少なくとも約２４時間接触される、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、
（ａ）ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤であって、必要に応じて、前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤が、ＳＢ４３１５４２、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、
（ｂ）Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子であって、必要に応じて、前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子が、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化のためにグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を低減する；かつ／または前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子が、ＣＨＩＲ９９０２１、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子、
（ｃ）迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子であって、必要に応じて、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子が、レチノイン酸、レチノール、レチナール、トレチノイン、イソトレチノイン、アリトレチノイン、エトレチネート、アシトレチン、タザロテン、ベキサロテン、アダパレン、ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子、Ｗｎｔ活性化因子、およびそれらの組合せからなる群から選択される；または前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子が、ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子、およびそれらの組合せからなる群から選択され、必要に応じて、前記ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子が、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ７、およびＦＧＦ８からなる群から選択される、かつ／または前記Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子が、ＣＨＩＲ９９０２１およびＷＮＴ３Ａからなる群から選択される、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子；ならびに必要に応じて、
（ｄ）１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する分化細胞集団への前記幹細胞の分化を誘導するための指示書であって、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、少なくとも約２日間接触させるための指示を含み、必要に応じて、前記指示書が請求項２から１８のいずれか一項に記載の方法を含む指示書、および
（ｅ）ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤であって、必要に応じて、前記ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤が、ＬＤＮ１９３１８９、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤
を含む、キット。
【請求項３４】
幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、幹細胞集団を、有効量のＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤および有効量のＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と接触させるステップ、およびさらに前記細胞集団を、有効量の迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、少なくとも約２日間、約２日間〜約２０日間の間、または約２日間〜約６日間の間接触させて、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する分化細胞集団を生成するステップを含み、前記細胞集団と前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子との初期接触が、前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から約８日間以内に行われ、必要に応じて、前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触が、前記幹細胞集団と前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から始まる約４日間以内に行われる、方法。
【請求項３５】
１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現するｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団であって、請求項３４に記載の方法にしたがって幹細胞集団から誘導される、分化細胞集団。
【請求項３６】
幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、（ａ）ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｂ）Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子、（ｃ）迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子、および必要に応じて（ｄ）１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する分化細胞集団への前記幹細胞の分化を誘導するための指示書であって、前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から約８日間以内に、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と最初に接触させ、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、少なくとも約２日間、約２日間〜約２０日間の間、または約２日間〜約６日間の間接触させるための指示を含む指示書を含み、必要に応じて、前記指示書が、前記幹細胞集団と前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から約４日間以内に、前記細胞集団を、前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と最初に接触させるための指示を含む、キット。
【請求項３７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団を含む組成物であって、
前記細胞集団の少なくとも約７０％が、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現し、
前記細胞集団の約１５％未満が、幹細胞マーカー、ＣＮＳマーカー、脳神経堤（ＣＮＣ）マーカー、メラニン形成細胞コンピテント神経堤（ＭＮＣ）マーカー、神経細胞マーカー、および間葉系前駆体マーカーからなる群から選択される１種または複数のマーカーを発現する、組成物。
【請求項３８】
（ａ）前記腸神経堤系統マーカーが、ＰＡＸ３、ＥＤＮＲＢ、ＲＥＴ、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＮＴＲＫ−３、ＨＡＮＤ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ５およびＡＳＣＬ１からなる群から選択される；かつ／または
（ｂ）前記幹細胞マーカーが、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、ＳＳＥＡ４およびＳＳＥＡ３からなる群から選択される；かつ／または
（ｃ）前記ＣＮＳマーカーが、ＰＡＸ６、ＮＥＳＴＩＮ、ビメンチン、ＦＯＸＧ１、ＳＯＸ２、ＴＢＲ１、ＴＢＲ２およびＳＯＸ１からなる群から選択される；かつ／または
（ｄ）前記ＣＮＣマーカーが、ＰＡＸ６、ＮＥＳＴＩＮ、ビメンチン、ＦＯＸＧ１、ＳＯＸ２、ＴＢＲ１、ＴＢＲ２およびＳＯＸ１からなる群から選択される；かつ／または
（ｅ）前記ＭＮＣマーカーが、ＰＡＸ６、ＮＥＳＴＩＮ、ビメンチン、ＦＯＸＧ１、ＳＯＸ２、ＴＢＲ１、ＴＢＲ２およびＳＯＸ１からなる群から選択される；かつ／または
（ｆ）前記神経細胞マーカーが、ＴＵＪ１、ＭＡＰ２、ＮＦＨ、ＢＲＮ３Ａ、ＩＳＬ１、ＴＨ、ＡＳＣＬ１、ＣＨＡＴ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＨＯＸ２Ａ、ＴＲＫＡ、ＴＲＫＢ、ＴＲＫＣ、５ＨＴ、ＧＡＢＡ、ＮＯＳ、ＳＳＴ、ＴＨ、ＣＨＡＴ、ＤＢＨ、サブスタンスＰ、ＶＩＰ、ＮＰＹ、ＧｎＲＨ、およびＣＧＲＰからなる群から選択される；かつ／または
（ｇ）前記間葉系前駆体マーカーが、ＳＭＡ、ビメンチン、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＣＤ１０５、ＣＤ９０およびＣＤ７３からなる群から選択される；かつ／または
（ｈ）前記１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する約１×１０４〜約１×１０１０個の細胞集団を含む、
請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団を含む組成物であって、
前記細胞集団の少なくとも約７０％が、１種または複数の腸ニューロンマーカーを発現し、
前記細胞集団の約１５％未満が、幹細胞マーカー、腸神経堤系統マーカー、ＣＮＳマーカー、脳神経堤（ＣＮＣ）マーカー、メラニン形成細胞コンピテント神経堤（ＭＮＣ）マーカー、神経細胞マーカー、および間葉系前駆体マーカーからなる群から選択される１種または複数のマーカーを発現する、組成物。
【請求項４０】
（ａ）前記腸神経堤系統マーカーが、ＰＡＸ３、ＥＤＮＲＢ、ＲＥＴ、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＮＴＲＫ−３、ＨＡＮＤ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ５およびＡＳＣＬ１からなる群から選択される；かつ／または
（ｂ）前記腸ニューロンマーカーが、Ｔｕｊ１、ＭＡＰ２、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＴＲＫＣ、ＡＳＣＬ１、ＨＡＮＤ２、ＥＤＮＲＢ、５ＨＴ、ＧＡＢＡ、ＮＯＳ、ＳＳＴ、ＴＨ、ＣＨＡＴ、ＤＢＨ、サブスタンスＰ、ＶＩＰ、ＮＰＹ、ＧｎＲＨ、およびＣＧＲＰからなる群から選択される；かつ／または
（ｃ）前記幹細胞マーカーが、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、ＳＳＥＡ４およびＳＳＥＡ３からなる群から選択される；かつ／または
（ｄ）前記ＣＮＳマーカーが、ＰＡＸ６、ＮＥＳＴＩＮ、ビメンチン、ＦＯＸＧ１、ＳＯＸ２、ＴＢＲ１、ＴＢＲ２およびＳＯＸ１からなる群から選択される；かつ／または
（ｅ）前記ＣＮＣマーカーが、ＰＡＸ６、ＮＥＳＴＩＮ、ビメンチン、ＦＯＸＧ１、ＳＯＸ２、ＴＢＲ１、ＴＢＲ２およびＳＯＸ１からなる群から選択される；かつ／または
（ｆ）前記ＭＮＣマーカーが、ＰＡＸ６、ＮＥＳＴＩＮ、ビメンチン、ＦＯＸＧ１、ＳＯＸ２、ＴＢＲ１、ＴＢＲ２およびＳＯＸ１からなる群から選択される；かつ／または
（ｇ）前記神経細胞マーカーが、ＴＵＪ１、ＭＡＰ２、ＮＦＨ、ＢＲＮ３Ａ、ＩＳＬ１、ＴＨ、ＡＳＣＬ１、ＣＨＡＴ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＨＯＸ２Ａ、ＴＲＫＡ、ＴＲＫＢ、ＴＲＫＣ、５ＨＴ、ＧＡＢＡ、ＮＯＳ、ＳＳＴ、ＴＨ、ＣＨＡＴ、ＤＢＨ、サブスタンスＰ、ＶＩＰ、ＮＰＹ、ＧｎＲＨ、およびＣＧＲＰからなる群から選択される；かつ／または
（ｈ）前記間葉系前駆体マーカーが、ＳＭＡ、ビメンチン、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＣＤ１０５、ＣＤ９０およびＣＤ７３からなる群から選択される；かつ／または
（ｉ）前記１種または複数の腸ニューロンマーカーを発現する約１×１０５〜約１×１０７個の細胞集団を含む、
請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
ＥＮＳ障害（例えば、ＨＤ）の予防および／または処置において使用するための、β−セクレターゼ（ＢＡＣＥ）の阻害剤を含む組成物。
【請求項４２】
前記ＢＡＣＥの阻害剤が、ＢＡＣＥ２の阻害剤、ＬＹ４５０１３９、ＬＹ２８８６７２１、ＬＹ２８１１３７６、ベルベセスタット（ＭＫ−８９３１）、およびＡＺＤ３８３９からなる群から選択され、必要に応じて、前記ＢＡＣＥの阻害剤が、ＢＡＣＥ２の阻害剤であり、必要に応じて、前記ＢＡＣＥ２の阻害剤が、ＢＡＣＥ阻害剤ＩＶ（ＢＡＣＥ阻害剤Ｃ３）である、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
ＥＮＳ障害（例えば、ＨＤ）の予防および／または処置において使用するための、酸性プロテアーゼの阻害剤を含む組成物。
【請求項４４】
前記酸性プロテアーゼの阻害剤が、ペプスタチンＡ、リトナビル、インジナビル、ザンキレン、アリスキレンおよびＬＹ−４５０１３９からなる群から選択され、必要に応じて、前記酸性プロテアーゼの阻害剤が、ペプスタチンＡである、請求項４３に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１７】
Ｗ．ある特定の実施形態では、本開示の主題は、ＥＮＳ障害を予防および／または処置するための、酸性プロテアーゼの阻害剤の使用を提供する。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、幹細胞集団を、有効量のＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤および有効量のＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と接触させるステップ、およびさらに前記細胞集団を、有効量の迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、少なくとも約２日間接触させて、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する分化細胞集団を生成するステップを含む、方法。
（項目２）
前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と約６日間接触させるステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から約８日間以内に、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と最初に接触させるステップを含む、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から少なくとも約２日目に、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と最初に接触させるステップを含む、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から約４日目に、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と最初に接触させるステップを含む、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記幹細胞集団が、それらと前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から約１１日目またはそれより後に、前記１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する分化細胞集団に分化している、項目１から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記幹細胞集団を、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触させるステップを含む、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記幹細胞集団を、前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤および前記ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と同時に接触させるステップを含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記幹細胞集団と前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から約４日間以内に、前記細胞集団を、前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と最初に接触させるステップを含む、項目１から８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記幹細胞集団と前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から約２日目に、前記細胞集団を、前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と最初に接触させるステップを含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触と同日に、前記幹細胞集団を、前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と最初に接触させるステップを含む、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤が、ＳＢ４３１５４２、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、項目１から１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤が、ＬＤＮ１９３１８９、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子が、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化のために、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を低減する、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子が、ＣＨＩＲ９９０２１、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、項目１から１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子が、レチノイン酸、レチノール、レチナール、トレチノイン、イソトレチノイン、アリトレチノイン、エトレチネート、アシトレチン、タザロテン、ベキサロテン、アダパレン、ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子、Ｗｎｔ活性化因子、およびそれらの組合せからなる群から選択される、項目１から１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子が、ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子、およびそれらの組合せからなる群から選択される、項目１から１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記細胞集団を、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種の分子と接触させるステップを含む、項目１６または１７に記載の方法。
（項目１９）
前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種の分子が、レチノイン酸である、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記細胞集団を、迷走神経堤パターン形成を誘導する２種またはそれよりも多い分子種と接触させるステップを含む、項目１７に記載の方法。
（項目２１）
前記迷走神経堤パターン形成を誘導する２種またはそれよりも多い分子種が、ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子および１種または複数のＷｎｔ活性化因子である、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子が、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ７、およびＦＧＦ８からなる群から選択される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子が、ＣＨＩＲ９９０２１およびＷＮＴ３Ａからなる群から選択される、項目２１または２２に記載の方法。
（項目２４）
前記迷走神経堤パターン形成が、１種または複数の領域特異的ホメオボックス（ＨＯＸ）遺伝子の発現によって特徴付けられる、項目１から２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記１種または複数の領域特異的ＨＯＸ遺伝子が、ＨＯＸＢ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ４、およびＨＯＸＢ５からなる群から選択される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記１種または複数の腸神経堤系統マーカーが、ＰＡＸ３、ＥＤＮＲＢ、ＲＥＴ、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＮＴＲＫ−３、ＨＡＮＤ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ５およびＡＳＣＬ１からなる群から選択される、項目１から２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記分化細胞集団が、１種または複数のＳＯＸ１０＋神経堤系統マーカーをさらに発現する、項目１から２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記ＳＯＸ１０＋神経堤系統マーカーが、ＣＤ４９Ｄである、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記幹細胞が、ヒト幹細胞である、項目１から２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記ヒト幹細胞が、ヒト胚幹細胞、ヒト人工多能性幹細胞、ヒト単為生殖幹細胞、始原胚細胞様の多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、およびＦクラス多能性幹細胞からなる群から選択される、項目１から２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
さらに前記分化細胞を１種または複数の腸ニューロンマーカーを発現する細胞集団に成熟させるのに好都合な条件に、前記分化細胞集団を晒すステップを含む、項目１から３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記分化細胞を前記腸ニューロン集団に成熟させるのに好都合な前記条件が、前記分化細胞を適切な細胞培養培地中で培養することを含む、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記適切な細胞培養培地が、腸ニューロンへの腸神経堤（ＥＮＣ）前駆体の成熟を増強する１種または複数の分子を含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記腸ニューロンへのＥＮＣ前駆体の成熟を増強する１種または複数の分子が、成長因子およびＷｎｔ活性化因子からなる群から選択される、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記成長因子が、ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、およびアスコルビン酸からなる群から選択される、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記適切な細胞培養培地が、ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子およびＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子を含む、項目３４に記載の方法。
（項目３７）
前記分化細胞が、前記ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子および前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子を含む前記適切な細胞培養培地中で約４日間培養される、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子が、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ８、およびＦＧＦ７からなる群から選択される、項目３５から３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記１種または複数の腸ニューロンマーカーが、Ｔｕｊ１、ＭＡＰ２、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＴＲＫＣ、ＡＳＣＬ１、ＨＡＮＤ２、ＥＤＮＲＢ、５ＨＴ、ＧＡＢＡ、ＮＯＳ、ＳＳＴ、ＴＨ、ＣＨＡＴ、ＤＢＨ、サブスタンスＰ、ＶＩＰ、ＮＰＹ、ＧｎＲＨ、およびＣＧＲＰからなる群から選択される、項目３１から３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現するｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団であって、
幹細胞集団を、有効量のＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤および有効量のＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と接触させるステップ、および
さらに前記細胞集団を、有効量の迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、少なくとも約２日間接触させるステップ
の後に幹細胞集団から誘導される、分化細胞集団。
（項目４１）
前記細胞集団が、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と約６日間接触される、項目４０に記載の分化細胞集団。
（項目４２）
前記細胞集団と前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子との初期接触が、前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から約８日間以内に行われる、項目４０または４１に記載の分化細胞集団。
（項目４３）
前記細胞集団と前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子との初期接触が、前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から少なくとも約２日目に行われる、項目４２に記載の分化細胞集団。
（項目４４）
前記幹細胞集団と前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子との初期接触が、前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から約４日目に行われる、項目４３に記載の分化細胞集団。
（項目４５）
前記幹細胞集団が、それらと前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触後、約１１日目またはそれより後に、前記１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する分化細胞集団に分化している、項目４０から４４のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
（項目４６）
前記幹細胞集団が、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触される、項目４０から４５のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
（項目４７）
前記幹細胞集団が、前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤および前記ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と同時に接触される、項目４６に記載の分化細胞集団。
（項目４８）
前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触が、前記幹細胞集団と前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から始まる約４日間以内に行われる、項目４０から４７のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
（項目４９）
前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触が、前記幹細胞集団と前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から約２日目に行われる、項目４８に記載の分化細胞集団。
（項目５０）
前記幹細胞集団と前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触が、前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触と同日に行われる、項目４８に記載の分化細胞集団。
（項目５１）
前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤が、ＳＢ４３１５４２、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、項目４０から５０のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
（項目５２）
前記ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤が、ＬＤＮ１９３１８９、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、項目４７から５１のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
（項目５３）
前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子が、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化のためにグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を低減する、項目４０から５２のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
（項目５４）
前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子が、ＣＨＩＲ９９０２１、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、項目４０から５３のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
（項目５５）
前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子が、レチノイン酸、レチノール、レチナール、トレチノイン、イソトレチノイン、アリトレチノイン、エトレチネート、アシトレチン、タザロテン、ベキサロテン、アダパレン、およびそれらの組合せからなる群から選択される、項目４０から５４のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
（項目５６）
前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子が、ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子、およびそれらの組合せからなる群から選択される、項目４０から５４のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
（項目５７）
前記細胞集団が、迷走神経堤パターン形成を誘導する１種の分子と接触される、項目５６に記載の分化細胞集団。
（項目５８）
前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種の分子が、レチノイン酸である、項目５７に記載の分化細胞集団。
（項目５９）
前記細胞集団が、迷走神経堤パターン形成を誘導する２種またはそれよりも多い分子種と接触される、項目５６に記載の分化細胞集団。
（項目６０）
前記迷走神経堤パターン形成を誘導する２種またはそれよりも多い分子種が、ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子および１種または複数のＷｎｔ活性化因子である、項目５９に記載の分化細胞集団。
（項目６１）
前記ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子が、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ７、およびＦＧＦ８からなる群から選択される、項目５６または６０に記載の分化細胞集団。
（項目６２）
前記Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子が、ＣＨＩＲ９９０２１およびＷＮＴ３Ａからなる群から選択される、項目５６または６０に記載の分化細胞集団。
（項目６３）
前記１種または複数の腸神経堤系統マーカーが、ＰＡＸ３、ＥＤＮＲＢ、ＲＥＴ、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＮＴＲＫ−３、ＨＡＮＤ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ５およびＡＳＣＬ１からなる群から選択される、項目４０から６２のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
（項目６４）
前記迷走神経堤パターン形成が、１種または複数の領域特異的ホメオボックス（ＨＯＸ）遺伝子の発現によって特徴付けられる、項目４０から６３のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
（項目６５）
前記１種または複数の領域特異的ＨＯＸ遺伝子が、ＨＯＸＢ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ４、およびＨＯＸＢ５からなる群から選択される、項目６４に記載の分化細胞集団。
（項目６６）
１種または複数のＳＯＸ１０＋神経堤系統マーカーをさらに発現する、項目４０から６５のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
（項目６７）
前記ＳＯＸ１０＋神経堤系統マーカーが、ＣＤ４９Ｄである、項目６６に記載の分化細胞集団。
（項目６８）
前記幹細胞が、ヒト幹細胞である、項目４０から６７のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
（項目６９）
前記ヒト幹細胞が、ヒト胚幹細胞、ヒト人工多能性幹細胞、ヒト単為生殖幹細胞、始原胚細胞様の多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、およびＦクラス多能性幹細胞からなる群から選択される、項目４０から６７のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
（項目７０）
１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する項目４０から６９のいずれか一項に記載の分化細胞集団を含む、組成物。
（項目７１）
１種または複数の腸ニューロンマーカーを発現するｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団であって、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する項目４０から６９のいずれか一項に記載の細胞集団から誘導される、分化細胞集団。
（項目７２）
１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する前記細胞集団を、適切な細胞培養培地中で培養した後、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する前記細胞集団から誘導される、項目７１に記載の分化細胞集団。
（項目７３）
１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する前記細胞集団を、適切な細胞培養培地中で少なくとも約１日間培養した後、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する前記細胞集団から誘導される、項目７１または７２に記載の分化細胞集団。
（項目７４）
前記適切な細胞培養培地が、腸ニューロンへのＥＮＣ前駆体の成熟を増強する１種または複数の分子を含む、項目７３に記載の分化細胞集団。
（項目７５）
前記腸ニューロンへのＥＮＣ前駆体の成熟を増強する１種または複数の分子が、成長因子およびＷｎｔ活性化因子からなる群から選択される、項目７４に記載の分化細胞集団。
（項目７６）
前記成長因子が、ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子、ＧＤＮＦ、およびアスコルビン酸からなる群から選択される、項目７５に記載の分化細胞集団。
（項目７７）
前記適切な細胞培養培地が、ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子およびＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子を含む、項目７６に記載の分化細胞集団。
（項目７８）
１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する前記細胞集団を、前記ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子および前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子を含む適切な細胞培養培地中で約４日間培養した後、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞集団から誘導される、項目７７に記載の分化細胞集団。
（項目７９）
前記適切な細胞培養培地が、ＧＤＮＦおよびアスコルビン酸を含む、項目７２から７６のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
（項目８０）
１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する前記細胞集団が、ＧＤＮＦおよびアスコルビン酸を含む適切な細胞培養培地中で約１０日間、約２５日間、または約４５日間培養した後、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する細胞集団から誘導される、項目７９に記載の分化細胞集団。
（項目８１）
前記ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子が、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ８、およびＦＧＦ７からなる群から選択される、項目７６から７８のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
（項目８２）
前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子が、ＣＨＩＲ９９０２１およびＷＮＴ３Ａからなる群から選択される、項目７６から７８のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
（項目８３）
前記１種または複数の腸ニューロンマーカーが、Ｔｕｊ１、ＭＡＰ２、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＴＲＫＣ、ＡＳＣＬ１、ＨＡＮＤ２、ＥＤＮＲＢ、５ＨＴ、ＧＡＢＡ、ＮＯＳ、ＳＳＴ、ＴＨ、ＣＨＡＴ、ＤＢＨ、サブスタンスＰ、ＶＩＰ、ＮＰＹ、ＧｎＲＨ、およびＣＧＲＰからなる群から選択される、項目７１から８２のいずれか一項に記載の分化細胞集団。
（項目８４）
１種または複数の腸ニューロンマーカーを発現する項目７１から８３のいずれか一項に記載の細胞集団を含む、組成物。
（項目８５）
対象の腸神経系障害を予防および／または処置する方法であって、腸神経系障害に罹患している対象に、有効量の、以下：
（ａ）１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する項目４０から６９のいずれか一項に記載の細胞集団、
（ｂ）項目７０に記載の組成物、
（ｃ）１種または複数の腸ニューロンマーカーを発現する項目７１から８３のいずれか一項に記載の細胞集団、および
（ｄ）項目８４に記載の組成物
の１つを投与するステップを含む、方法。
（項目８６）
前記腸神経系障害が、ヒルシュスプルング病である、項目８５に記載の方法。
（項目８７）
対象の腸神経系障害を予防および／または処置するための、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する、項目４０から６９のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目８８）
前記腸神経系障害が、ヒルシュスプルング病である、項目８７に記載の分化細胞集団。
（項目８９）
腸神経系障害を予防および／または処置するための医薬の製造における、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する項目４０から６９のいずれか一項に記載の細胞集団の使用。
（項目９０）
前記腸神経系障害が、ヒルシュスプルング病である、項目８９に記載の使用。
（項目９１）
対象の腸神経系障害を予防および／または処置するための、項目７０に記載の組成物。
（項目９２）
前記腸神経系障害が、ヒルシュスプルング病である、項目９１に記載の組成物。
（項目９３）
対象の腸神経系障害を予防および／または処置するための、１種または複数の腸ニューロンマーカーを発現する、項目７１から８３のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目９４）
前記腸神経系障害が、ヒルシュスプルング病である、項目９３に記載の細胞集団。
（項目９５）
腸神経系障害を予防および／または処置するための医薬の製造における、１種または複数の腸ニューロンマーカーを発現する項目７１から８３のいずれか一項に記載の細胞集団の使用。
（項目９６）
前記腸神経系障害が、ヒルシュスプルング病である、項目９５に記載の使用。
（項目９７）
対象の腸神経系障害を予防および／または処置するための、項目８４に記載の組成物。
（項目９８）
前記腸神経系障害が、ヒルシュスプルング病である、項目９７に記載の組成物。
（項目９９）
ヒルシュスプルング病、ヒルシュスプルング病関連遺伝的欠陥、および／または別の腸神経系障害を予防および／または処置するのに適した化合物を同定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する項目４０から６９のいずれか一項に記載の細胞集団、１種または複数の腸神経のマーカーを発現する項目７１から８３のいずれか一項に記載の細胞集団、およびそれらの組合せから選択される細胞集団によって提示される少なくとも１つの遊走欠損を救済することができる化合物を同定するステップを含み、事前分化した幹細胞が、エンドセリン受容体Ｂ型（ＥＤＮＲＢ）においてホモ接合性機能喪失変異を含む、方法。
（項目１００）
（ａ）（ｉ）前記細胞集団、および（ｉｉ）試験化合物を提供するステップと、
（ｂ）前記細胞集団を、前記試験化合物と接触させるステップと、
（ｃ）前記細胞集団の遊走挙動を測定するステップと
を含む、項目９９に記載の方法。
（項目１０１）
前記細胞集団が、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する項目４０から６９のいずれか一項に記載の細胞集団である、項目１００に記載の方法。
（項目１０２）
前記細胞集団が、前記試験化合物と少なくとも約６時間、少なくとも約１２時間、または少なくとも約２４時間接触される、項目１００または１０１に記載の方法。
（項目１０３）
幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、
（ａ）ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、
（ｂ）Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子、
（ｃ）迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子、および
（ｄ）１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する分化細胞集団への前記幹細胞の分化を誘導するための指示書であって、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、少なくとも約２日間接触させるための指示を含む指示書
を含む、キット。
（項目１０４）
前記指示書が、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と約６日間接触させるための指示を含む、項目１０３に記載のキット。
（項目１０５）
前記指示書が、前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から約８日間以内に、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と最初に接触させるための指示を含む、項目１０３または１０４に記載のキット。
（項目１０６）
前記指示書が、前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から少なくとも約２日目に、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と最初に接触させるための指示を含む、項目１０５に記載のキット。
（項目１０７）
前記指示書が、前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から約４日目に、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と最初に接触させるための指示を含む、項目１０６に記載のキット。
（項目１０８）
ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤を含む、項目１０３から１０７のいずれか一項に記載のキット。
（項目１０９）
前記指示書が、前記幹細胞集団を、前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤および前記ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と同時に接触させるための指示を含む、項目１０８に記載のキット。
（項目１１０）
前記指示書が、前記幹細胞集団と前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から約４日間以内に、前記細胞集団を、前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と最初に接触させるための指示を含む、項目１０３から１０９のいずれか一項に記載のキット。
（項目１１１）
前記指示書が、前記幹細胞集団と前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から約２日目に、前記細胞集団を、前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と最初に接触させるための指示を含む、項目１１０に記載のキット。
（項目１１２）
前記指示書が、前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触と同日に、前記幹細胞集団を、前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と最初に接触させるための指示を含む、項目１１０に記載のキット。
（項目１１３）
前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤が、ＳＢ４３１５４２、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、項目１０３から１１２のいずれか一項に記載のキット。
（項目１１４）
前記ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤が、ＬＤＮ１９３１８９、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、項目１０８から１１３のいずれか一項に記載のキット。
（項目１１５）
前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子が、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化のためにグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を低減する、項目１０３から１１４のいずれか一項に記載のキット。
（項目１１６）
前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子が、ＣＨＩＲ９９０２１、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、項目１０３から１１５のいずれか一項に記載のキット。
（項目１１７）
前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子が、レチノイン酸、レチノール、レチナール、トレチノイン、イソトレチノイン、アリトレチノイン、エトレチネート、アシトレチン、タザロテン、ベキサロテン、アダパレン、ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子、Ｗｎｔ活性化因子、およびそれらの組合せからなる群から選択される、項目１０３から１１６のいずれか一項に記載のキット。
（項目１１８）
前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子が、ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子、およびそれらの組合せからなる群から選択される、項目１０３から１１６のいずれか一項に記載のキット。
（項目１１９）
迷走神経堤パターン形成を誘導する１種の分子を含む、項目１１７に記載のキット。
（項目１２０）
前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種の分子が、レチノイン酸である、項目１１９に記載のキット。
（項目１２１）
迷走神経堤パターン形成を誘導する２種またはそれよりも多い分子種を含む、項目１１８に記載のキット。
（項目１２２）
前記迷走神経堤パターン形成を誘導する２種またはそれよりも多い分子種が、ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子およびＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子である、項目１２１に記載のキット。
（項目１２３）
前記ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子が、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ７、およびＦＧＦ８からなる群から選択される、項目１２２に記載のキット。
（項目１２４）
前記Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子が、ＣＨＩＲ９９０２１およびＷＮＴ３Ａからなる群から選択される、項目１２２に記載のキット。
（項目１２５）
幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、幹細胞集団を、有効量のＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤および有効量のＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と接触させるステップ、およびさらに前記細胞集団を、有効量の迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、少なくとも約２日間、約２日間〜約２０日間の間、または約２日間〜約６日間の間接触させて、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する分化細胞集団を生成するステップを含み、前記細胞集団と前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子との初期接触が、前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から約８日間以内に行われる、方法。
（項目１２６）
前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触が、前記幹細胞集団と前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から始まる約４日間以内に行われる、項目１２５に記載の方法。
（項目１２７）
１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現するｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団であって、幹細胞集団を、有効量のＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤および有効量のＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と接触させるステップ、さらに、前記細胞集団を、有効量の迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、少なくとも約２日間、約２日間〜約２０日間の間、または約２日間〜約６日間の間接触させるステップの後に幹細胞集団から誘導され、前記細胞集団と前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子との初期接触が、前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から約８日間以内に行われる、分化細胞集団。
（項目１２８）
前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触が、前記幹細胞集団と前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から始まる約４日間以内に行われる、項目１２７に記載の分化細胞集団。
（項目１２９）
幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、（ａ）ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｂ）Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子、（ｃ）迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子、および（ｄ）１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する分化細胞集団への前記幹細胞の分化を誘導するための指示書であって、前記細胞集団と前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子との初期接触から約８日間以内に、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と最初に接触させ、前記細胞集団を、前記迷走神経堤パターン形成を誘導する１種または複数の分子と、少なくとも約２日間、約２日間〜約２０日間の間、または約２日間〜約６日間の間接触させるための指示を含む指示書を含む、キット。
（項目１３０）
前記指示書が、前記幹細胞集団と前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触から約４日間以内に、前記細胞集団を、前記Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と最初に接触させるための指示を含む、項目１２９に記載のキット。
（項目１３１）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団を含む組成物であって、
前記細胞集団の少なくとも約７０％が、１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現し、
前記細胞集団の約１５％未満が、幹細胞マーカー、ＣＮＳマーカー、脳神経堤（ＣＮＣ）マーカー、メラニン形成細胞コンピテント神経堤（ＭＮＣ）マーカー、神経細胞マーカー、および間葉系前駆体マーカーからなる群から選択される１種または複数のマーカーを発現する、組成物。
（項目１３２）
前記腸神経堤系統マーカーが、ＰＡＸ３、ＥＤＮＲＢ、ＲＥＴ、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＮＴＲＫ−３、ＨＡＮＤ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ５およびＡＳＣＬ１からなる群から選択される、項目１３１に記載の組成物。
（項目１３３）
前記幹細胞マーカーが、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、ＳＳＥＡ４およびＳＳＥＡ３からなる群から選択される、項目１３１または１３２に記載の組成物。
（項目１３４）
前記ＣＮＳマーカーが、ＰＡＸ６、ＮＥＳＴＩＮ、ビメンチン、ＦＯＸＧ１、ＳＯＸ２、ＴＢＲ１、ＴＢＲ２およびＳＯＸ１からなる群から選択される、項目１３１から１３３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１３５）
前記ＣＮＣマーカーが、ＰＡＸ６、ＮＥＳＴＩＮ、ビメンチン、ＦＯＸＧ１、ＳＯＸ２、ＴＢＲ１、ＴＢＲ２およびＳＯＸ１からなる群から選択される、項目１３１から１３４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１３６）
前記ＭＮＣマーカーが、ＰＡＸ６、ＮＥＳＴＩＮ、ビメンチン、ＦＯＸＧ１、ＳＯＸ２、ＴＢＲ１、ＴＢＲ２およびＳＯＸ１からなる群から選択される、項目１３１から１３５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１３７）
前記神経細胞マーカーが、ＴＵＪ１、ＭＡＰ２、ＮＦＨ、ＢＲＮ３Ａ、ＩＳＬ１、ＴＨ、ＡＳＣＬ１、ＣＨＡＴ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＨＯＸ２Ａ、ＴＲＫＡ、ＴＲＫＢ、ＴＲＫＣ、５ＨＴ、ＧＡＢＡ、ＮＯＳ、ＳＳＴ、ＴＨ、ＣＨＡＴ、ＤＢＨ、サブスタンスＰ、ＶＩＰ、ＮＰＹ、ＧｎＲＨ、およびＣＧＲＰからなる群から選択される、項目１３１から１３６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１３８）
前記間葉系前駆体マーカーが、ＳＭＡ、ビメンチン、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＣＤ１０５、ＣＤ９０およびＣＤ７３からなる群から選択される、項目１３１から１３７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１３９）
前記１種または複数の腸神経堤系統マーカーを発現する約１×１０４〜約１×１０１０個の細胞集団を含む、項目１３１から１３８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１４０）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団を含む組成物であって、
前記細胞集団の少なくとも約７０％が、１種または複数の腸ニューロンマーカーを発現し、
前記細胞集団の約１５％未満が、幹細胞マーカー、腸神経堤系統マーカー、ＣＮＳマーカー、脳神経堤（ＣＮＣ）マーカー、メラニン形成細胞コンピテント神経堤（ＭＮＣ）マーカー、神経細胞マーカー、および間葉系前駆体マーカーからなる群から選択される１種または複数のマーカーを発現する、組成物。
（項目１４１）
前記腸神経堤系統マーカーが、ＰＡＸ３、ＥＤＮＲＢ、ＲＥＴ、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＮＴＲＫ−３、ＨＡＮＤ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ５およびＡＳＣＬ１からなる群から選択される、項目１４０に記載の組成物。
（項目１４２）
前記腸ニューロンマーカーが、Ｔｕｊ１、ＭＡＰ２、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＴＲＫＣ、ＡＳＣＬ１、ＨＡＮＤ２、ＥＤＮＲＢ、５ＨＴ、ＧＡＢＡ、ＮＯＳ、ＳＳＴ、ＴＨ、ＣＨＡＴ、ＤＢＨ、サブスタンスＰ、ＶＩＰ、ＮＰＹ、ＧｎＲＨ、およびＣＧＲＰからなる群から選択される、項目１４０または１４１に記載の組成物。
（項目１４３）
前記幹細胞マーカーが、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、ＳＳＥＡ４およびＳＳＥＡ３からなる群から選択される、項目１４０から１４２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１４４）
前記ＣＮＳマーカーが、ＰＡＸ６、ＮＥＳＴＩＮ、ビメンチン、ＦＯＸＧ１、ＳＯＸ２、ＴＢＲ１、ＴＢＲ２およびＳＯＸ１からなる群から選択される、項目１４０から１４３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１４５）
前記ＣＮＣマーカーが、ＰＡＸ６、ＮＥＳＴＩＮ、ビメンチン、ＦＯＸＧ１、ＳＯＸ２、ＴＢＲ１、ＴＢＲ２およびＳＯＸ１からなる群から選択される、項目１４０から１４４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１４６）
前記ＭＮＣマーカーが、ＰＡＸ６、ＮＥＳＴＩＮ、ビメンチン、ＦＯＸＧ１、ＳＯＸ２、ＴＢＲ１、ＴＢＲ２およびＳＯＸ１からなる群から選択される、項目１４０から１４５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１４７）
前記神経細胞マーカーが、ＴＵＪ１、ＭＡＰ２、ＮＦＨ、ＢＲＮ３Ａ、ＩＳＬ１、ＴＨ、ＡＳＣＬ１、ＣＨＡＴ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＨＯＸ２Ａ、ＴＲＫＡ、ＴＲＫＢ、ＴＲＫＣ、５ＨＴ、ＧＡＢＡ、ＮＯＳ、ＳＳＴ、ＴＨ、ＣＨＡＴ、ＤＢＨ、サブスタンスＰ、ＶＩＰ、ＮＰＹ、ＧｎＲＨ、およびＣＧＲＰからなる群から選択される、項目１４０から１４６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１４８）
前記間葉系前駆体マーカーが、ＳＭＡ、ビメンチン、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＣＤ１０５、ＣＤ９０およびＣＤ７３からなる群から選択される、項目１４０から１４７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１４９）
前記１種または複数の腸ニューロンマーカーを発現する約１×１０５〜約１×１０７個の細胞集団を含む、項目１４０から１４８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１５０）
ＥＮＳ障害（例えば、ＨＤ）を予防および／または処置する方法であって、対象に有効量のβ−セクレターゼ（ＢＡＣＥ）の阻害剤を投与するステップを含む、方法。
（項目１５１）
前記ＢＡＣＥの阻害剤が、ＢＡＣＥ２の阻害剤、ＬＹ４５０１３９、ＬＹ２８８６７２１、ＬＹ２８１１３７６、ベルベセスタット（ＭＫ−８９３１）、およびＡＺＤ３８３９からなる群から選択される、項目１５０に記載の方法。
（項目１５２）
前記ＢＡＣＥの阻害剤が、ＢＡＣＥ２の阻害剤である、項目１５１に記載の方法。
（項目１５３）
前記ＢＡＣＥ２の阻害剤が、ＢＡＣＥ阻害剤ＩＶ（ＢＡＣＥ阻害剤Ｃ３）である、項目１５１に記載の方法。
（項目１５４）
ＥＮＳ障害（例えば、ＨＤ）を予防および／または処置する方法であって、対象に有効量の酸性プロテアーゼの阻害剤を投与するステップを含む、方法。
（項目１５５）
前記酸性プロテアーゼの阻害剤が、ペプスタチンＡ、リトナビル、インジナビル、ザンキレン、アリスキレンおよびＬＹ−４５０１３９からなる群から選択される、項目１５４に記載の方法。
（項目１５６）
前記酸性プロテアーゼの阻害剤が、ペプスタチンＡである、項目１５５に記載の方法。
（項目１５７）
ＥＮＳ障害を予防および／または処置するための、ＢＡＣＥ阻害剤の使用。
（項目１５８）
ＥＮＳ障害を予防および／または処置するための、酸性プロテアーゼの阻害剤の使用。
４．図面の簡単な説明