(57)【要約】  本発明は、ポリグルタミン酸を産生する形質転換植物を作成する方法、及び前記方法によって作成された形質転換植物を提供することを目的とする。  本発明の方法は、植物に、ポリグルタミン酸合成酵素Ａをコードする核酸（ｐｇｓＡ）、ポリグルタミン酸合成酵素Ｂをコードする核酸（ｐｇｓＢ）及びポリグルタミン酸合成酵素Ｃをコードする核酸（ｐｇｓＣ）を導入することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリグルタミン酸を産生する形質転換植物を作成する方法であって、
植物に、ポリグルタミン酸合成酵素Ａをコードする核酸（ｐｇｓＡ）、ポリグルタミン酸合成酵素Ｂをコードする核酸（ｐｇｓＢ）及びポリグルタミン酸合成酵素Ｃをコードする核酸（ｐｇｓＣ）を導入する
ことを含む方法。
【請求項２】
ポリグルタミン酸合成酵素Ａが、配列番号１又は配列番号１において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列を有しており、ポリグルタミン酸合成酵素Ｂが、配列番号３又は配列番号３において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列を有しており、ポリグルタミン酸合成酵素Ｃが、配列番号５又は配列番号５において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列を有しており、そして
当該ポリグルタミン酸合成酵素Ａ、Ｂ、Ｃは３種類でポリグルタミン酸を産生する機能を有する
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ポリグルタミン酸合成酵素Ａが、配列番号１又は配列番号１と少なくとも７０％の同一のアミノ酸配列を有しており、ポリグルタミン酸合成酵素Ｂが、配列番号３又は配列番号３と少なくとも７０％の同一のアミノ酸配列を有しており、ポリグルタミン酸合成酵素Ｃが、配列番号５又は配列番号５と少なくとも７０％の同一のアミノ酸配列を有しており、そして
当該ポリグルタミン酸合成酵素Ａ、Ｂ、Ｃは３種類でポリグルタミン酸を産生する機能を有する
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ポリグルタミン酸合成酵素Ａをコードする核酸（ｐｇｓＡ）、ポリグルタミン酸合成酵素Ｂをコードする核酸（ｐｇｓＢ）及びポリグルタミン酸合成酵素Ｃをコードする核酸（ｐｇｓＣ）のうち、１種又はそれより多くの核酸が挿入されたベクターを含有するアグロバクテリウムを感染させることによって、植物に上記核酸を導入する、
請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ及びｐｇｓＣの３種類の核酸の植物への導入を、以下のａ）−ｃ）のいずれかの工程によって行う請求項４に記載の方法
ａ）ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ及びｐｇｓＣの３種類の核酸が挿入された単一のベクターを含有するアグロバクテリウムを植物に感染させる；
ｂ）ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ及びｐｇｓＣが各々別個に挿入されたベクターを有する、３種類のアグロバクテリウムを植物に感染させる；あるいは
ｃ）ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ及びｐｇｓＣが各々別個に挿入されたベクターを有するアグロバクテリウムを植物に感染させ、ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ及びｐｇｓＣのうち１種又は２種を有する形質転換植物を作成し、そして、これらの形質転換植物を掛け合わせる。
【請求項６】
リーフディスク法、減圧湿潤法及び直接注入法からなる群から選択される方法によって、アグロバクテリウムを植物に感染させる、請求項４又は５５に記載の方法。
【請求項７】
植物がタバコ、シロイヌナズナ、イネ、ダイズ及びミヤコグサからなる群から選択される、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法によって作成された、ポリグルタミン酸を産生する形質転換植物。
【請求項９】
成体、種子又はカルスの状態である、請求項８に記載の形質転換植物。
【請求項１０】
タバコ又はシロイヌナズナである、請求項８又は９に記載の形質転換植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリグルタミン酸を産生する形質転換植物、及びその作成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＧＡ（γ−ポリグルタミン酸）はバチルス属細菌が生産する粘性高分子であり、ＤおよびＬグルタミン酸がアミノ基とγ位のカルボキシル基との間でアミド結合した一本鎖構造の高度重合体である。【０００３】
現在地球上で４０％を占める酸性土壌は、比較的気温の高いところで長期降雨した酸性雨が土壌中の塩基を溶脱させるため土壌が酸性化することにより生成する。また、化成肥料の過剰使用、作物収穫によるアルカリ養分の収奪も酸性化の要因になっている。酸性土壌中では大量に存在するアルミニウムがイオン化し、このアルミニウムイオンの毒性により植物が生育阻害を起こす。【０００４】
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおいてＰＧＡ合成に関わる遺伝子は一つのオペロンにコードされている（図７）。ＰＧＡ合成に必要な遺伝子はｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣであり、３つ全ての遺伝子（図１−３）がないとＰＧＡが合成できないことがＥ．ｃｏｌｉの形質転換系で明らかにされている（Ａｓｈｉｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）。予想アミノ酸配列から、３つすべてが膜貫通ドメインを持つと推測される（Ａｓｈｉｕｃｈｉ  及び  Ｍｉｓｏｎｏ  ２００２）。また、ｐｇｓＢはアミドリガーゼに特徴的なＡＴＰ／ＧＴＰ結合部位モチーフを持つことが示唆されている。【０００５】
ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ及びｐｇｓＣの遺伝子産物は細菌の細胞膜に局在してＰＧＡ合成活性を持つことが、形質転換大腸菌の単離細胞膜分画の解析から示唆されている（Ａｓｈｉｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１）。原核生物の遺伝子産物を真核生物に導入して正常な機能を持たせるためには、遺伝子産物が膜構造に組み込まれる必要があると推定される。しかしながら、真核生物の形質転換植物を得るための一般的な方法は知られているが、ある特定の遺伝子を特に植物体において機能可能なように発現させることは現実にはなかなか成功せず、種々の創意工夫が必要となる。
【特許文献１】特開２００３−４２００４６
【特許文献２】特開２００３−４３２３８３
【非特許文献１】Ａｓｈｉｕｃｈｉ，Ｍ．，  Ｎａｗａ，Ｃ．，  Ｋａｍｅｉ，Ｔ．，  Ｓｏｎｇ，Ｊ．Ｊ．，  Ｈｏｎｇ，Ｓ．Ｐ．，  Ｓｕｎｇ，Ｍ．Ｈ．，  Ｓｏｄａ，Ｋ．  ａｎｄ  Ｍｉｓｏｎｏ，Ｈ．  （２００１）  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙ−γ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ．  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２６８：  ５３２１５３２８
【非特許文献２】Ｈｏｒｓｃｈ，Ｒ．Ｂ．，  Ｆｒｙ，Ｊ．，  Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｎ．，  Ｎｅｉｄｅｒｍｅｒｙｅｒ，Ｊ．，  Ｒｏｇｅｒｓ，Ｓ．Ｇ．  ａｎｄ  Ｆｒａｌｅｙ，Ｒ．Ｔ．  （１９８８）  Ｌｅａｆ  ｄｉｓｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｎｎｕａｌ  Ａ５：  １９
【非特許文献３】Ｊｏｈａｎｓｅｎ，Ｌ．Ｋ．  ａｎｄ  Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．  （２００１）  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｐｏｔ．  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １２６：  ９３０９３８
【非特許文献４】Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｆ．，  Ｏｇａｗａ，Ｙ，  Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｍ．，  Ｙｕａｓａ，  Ｋ．  ａｎｄ  Ｍｏｔａｉ，Ｈ．  （１９９６）  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  γ−ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ  （γ−ＰＧＡ）  ｂｙ  ＳＤＳＰＡＧＥ．  Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６０：  ２５５２５８
【非特許文献５】Ｙｅｎｏｆｓｋｙ，Ｒ．Ｌ．，  Ｆｉｎｅ，Ｍ．  ａｎｄ  Ｐｅｌｌｏｗ，Ｊ．Ｗ  （１９９０）  Ａ  ｍｕｔａｎｔ  ｎｅｏｍｙｃｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ＩＩ  ｇｅｎｅ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｔｈｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ  ｔｏ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：  ３４５５３４３９
【非特許文献６】Ａｓｈｉｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ａ  ｐｏｌｙ−γ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＩＦＯ  ３３３６：ｇｅｎｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙ−γ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｃｌｏｎｅ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２６３，３８７−３９３
【非特許文献７】Ａｓｈｉｕｃｈｉ  及び  Ｍｉｓｏｎｏ  ２００２，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙ−γ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．  Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５９，９−１４
【非特許文献８】下西ら、新・生物化学実験のてびき３、（１２２−１２４頁、化学同人、１９９６年）
【非特許文献９】Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，６，  ｐ．２７１−２８２（１９９４）
【非特許文献１０】Ｋｏｍａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１０，  ｐ．１６５−１７４（１９９６）
【非特許文献１１】ｖａｎ  Ｅｎｇｅｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅａｓｅｒｃｈ  ４，  ２８８−２９０，  １９９５
【非特許文献１２】Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）  ＧＵＳ  ｆｕｓｉｏｎ：β−ｇｌｃｏｓｉｄａｓｅ  ａｓ  ａ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｇｅｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒ  ｉｎ  ｈｉｇｈｅｒ  ｐｌａｎｔｓ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ６，３９０１−３９０７）
【非特許文献１３】松本及び町田（１９９０）  植物形質転換法、現代化学、２５−２９
【非特許文献１４】荒木（２００１）  減圧浸潤法による形質転換、細胞工学別冊  植物細胞工学シリーズ１５、１０９−１１３
【非特許文献１５】大隅（２００１）  アグロバクテリウム直接注入法、細胞工学別冊  植物細胞工学シリーズ１５、１０５−１０８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）を産生する形質転換植物を作成する方法を提供することを目的とする。本発明の方法は、植物に、ポリグルタミン酸合成酵素Ａをコードする核酸（ｐｇｓＡ）、ポリグルタミン酸合成酵素Ｂをコードする核酸（ｐｇｓＢ）及びポリグルタミン酸合成酵素Ｃをコードする核酸（ｐｇｓＣ）を導入することを含む。実際に、ＰＧＡ合成活性機能を奏するようにｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ及びｐｇｓＣ遺伝子が発現された植物体は未だ得られておらず、ＰＧＡ生産遺伝子導入によるＰＧＡ合成機能を有する形質転換植物が得られれば、植物の耐性を向上させることのみならず、植物自身による環境改善も期待できる。さらに、そのような形質転換植物は今までとは異なる機能を有している可能性もある。
本来バチルス属細菌が分泌するＰＧＡが高等植物の根で分泌されると、アルミニウムイオンとのイオン結合により水溶性の錯化合物となりアルミニウムイオンの根からの吸収を防ぐ効果が考えられる。また、ＰＧＡでは植物の栄養素となる硝酸体窒素、リン酸、カリウムなどの吸収は阻害されないため、酸性土壌における植物の生育阻害を軽減することが考えられる。またＰＧＡは粘性を持ち、保水性があることが知られているため、葉でも合成されると、植物の保水性が向上することも考えられ、耐乾燥性の高い植物が得られる可能性もある。【０００７】
本発明の方法は、一態様において、ポリグルタミン酸合成酵素Ａをコードする核酸（ｐｇｓＡ）、ポリグルタミン酸合成酵素Ｂをコードする核酸（ｐｇｓＢ）及びポリグルタミン酸合成酵素Ｃをコードする核酸（ｐｇｓＣ）のうち、１種又はそれより多くの核酸が挿入されたベクターを含有するアグロバクテリウムを感染させることによって、植物に上記核酸を導入する。【０００８】
好ましくは、ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ及びｐｇｓＣの３種類の核酸の植物への導入は、以下のａ）−ｃ）のいずれかの工程によって行う
ａ）ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ及びｐｇｓＣの３種類の核酸が挿入された単一のベクターを含有するアグロバクテリウムを植物に感染させる；
ｂ）ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ及びｐｇｓＣが各々別個に挿入されたベクターを有する、３種類のアグロバクテリウムを植物に感染させる；あるいは
ｃ）ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ及びｐｇｓＣが各々別個に挿入されたベクターを有するアグロバクテリウムを植物に感染させ、ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ及びｐｇｓＣのうち１種又は２種を有する形質転換植物を作成し、そして、これらの形質転換植物を掛け合わせる。【０００９】
本発明はまた、上記方法によって作成された、ポリグルタミン酸を産生する形質転換植物を提供する。本発明の形質転換植物は、好ましくはタバコ又はシロイヌナズナである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記問題の解決のために鋭意研究に努めた結果、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）を植物生体内で産生する形質転換植物の作成に成功し、本発明を想到した。【００１１】
まず、ＰＧＡ合成酵素をコードする３つの遺伝子（ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ及びｐｇｓＣ）を、それぞれ納豆に存在する菌からＰＣＲ、電気泳動で取り出し、ＴＡ  クローニングを行いｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクターに組み込んだ。シークエンスの後、ｐＧＥＭ（Ｔ−ＢＨ）ΔＳＳＳベクターにＥｃｏＲＩカットで組み込み、最後にＢａｍＨＩ／ＳａｃＩカットでバイナリーベクターであるｐＢＩ１２１にまで組み込んだ。植物に感染するとプラスミド中のＴ−ＤＮＡを植物体に組み込む細菌であるアグロバクテリウムを利用し、ｐＢＩ１２１をアグロバクテリウムに導入した後タバコを材料にしたリーフディスク法、シロイヌナズナを材料にした減圧湿潤法を用いて、植物に感染させ形質転換植物を作出した。またタバコを材料に、体細胞中において一時的に形質転換を発現させることができる直接注入法で３つの遺伝子発現を調べ、作出した形質転換植物でも導入遺伝子が発現しているかどうかをＲＴ−ＰＣＲ法で確認した。【００１２】
さらに、単一の植物形質転換用バイナリーベクターにｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ及びｐｇｓＣの３つの遺伝子が組み込まれた構築物を作成し、アグロバクテリウムを利用したリーフディスク法を用いて導入した。その結果、３つの遺伝子全てが導入された形質転換植物を得ることができた。【００１３】
よって、本発明は、ポリグルタミン酸を産生する形質転換植物を作成する方法を提供することを目的とする。本発明の方法は、植物に、ポリグルタミン酸合成酵素Ａをコードする核酸（ｐｇｓＡ）、ポリグルタミン酸合成酵素Ｂをコードする核酸（ｐｇｓＢ）及びポリグルタミン酸合成酵素Ｃをコードする核酸（ｐｇｓＣ）を導入することを含む。【００１４】
ポリグルタミン酸合成のための酵素をコードする核酸
本発明では、ポリグルタミン酸を産生する形質転換植物を作成するために、形質転換植物に、ポリグルタミン酸合成酵素Ａをコードする核酸（ｐｇｓＡ）、ポリグルタミン酸合成酵素Ｂをコードする核酸（ｐｇｓＢ）及びポリグルタミン酸合成酵素Ｃをコードする核酸（ｐｇｓＣ）の３種類の核酸を導入することを特徴とする。ポリグルタミン酸が植物体で産生されるためには、３種類の核酸が単一の植物体に導入されることが必要である。【００１５】
本発明に利用可能な核酸は、ゲノムＤＮＡ（その対応するｃＤＮＡも含む）、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ、およびそれらの組み合わせが含まれる。【００１６】
ｐｇｓＡをコードする核酸は、好ましくは配列番号２の塩基配列を有する。ｐｇｓＢをコードする核酸は、好ましくは配列番号４の塩基配列を有する。ｐｇｓＣをコードする核酸は、好ましくは配列番号６の塩基配列を有する。これらはＰＧＡ合成に関わる遺伝子として、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓから得られた核酸の塩基配列であり、例えば、。Ａｓｈｉｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９９に開示されている。【００１７】
１つ以上のコドンが同一のアミノ酸をコードする場合があり、遺伝暗号の縮重と呼ばれている。このため、配列番号２、４又は６と完全には一致していないＤＮＡ配列が、配列番号１、３又は５と全く同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードすることがあり得る。こうした変異体ＤＮＡ配列は、サイレント（ｓｉｌｅｎｔ）突然変異（例えば、ＰＣＲ増幅中に発生する）から生じてもよいし、または天然配列の意図的な突然変異誘発の産物であってもよい。【００１８】
ｐｇｓＡ遺伝子は、好ましくは配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする。ｐｇｓＢ遺伝子は、好ましくは配列番号３に記載のアミノ酸配列をコードする。ｐｇｓＣ遺伝子は、好ましくは配列番号５に記載のアミノ酸配列をコードする。しかしながら、これに限定されることなく、１またはそれ以上のアミノ酸配列が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列を有していてもよい。ポリグルタミン酸合成酵素Ａ、Ｂ、Ｃが３種類でポリグルタミン酸を産生する機能を有する限り、全ての相同タンパク質を含むことが意図される。本発明は、ポリグルタミン酸合成のための３種類の核酸を植物に導入することを特徴としており、３種類の核酸の配列は、列番号１、３及び５と同等の機能を有するアミノ酸配列をコードする限り、配列番号２、４及び６に限定されるものではない。「アミノ酸変異」は１から複数個、好ましくは、１ないし２０個、より好ましくは１ないし１０個、最も好ましくは１ないし５個である。【００１９】
ｐｇｓＡ遺伝子にコードされるアミノ酸配列は、配列番号１に記載のアミノ酸配列と、少なくとも約７０％、好ましくは約８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する。【００２０】
ｐｇｓＢ遺伝子にコードされるアミノ酸配列は、配列番号３に記載のアミノ酸配列と、少なくとも約７０％、好ましくは約８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する。【００２１】
ｐｇｓＣ遺伝子にコードされるアミノ酸配列は、配列番号５に記載のアミノ酸配列と、少なくとも約７０％、好ましくは約８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する。【００２２】
アミノ酸の同一性パーセントは、視覚的検査及び数学的計算により決定してもよい。あるいは、２つのタンパク質配列の同一性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．及びＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３，１９７０）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９，１９９２）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；及び（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。【００２３】
当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。同一性のパーセントは、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５．，ｐ．３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる相同性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。【００２４】
本発明の方法において、好ましくは、ポリグルタミン酸合成酵素Ａが、配列番号１又は配列番号１と少なくとも７０％の同一のアミノ酸配列を有しており、ポリグルタミン酸合成酵素Ｂが、配列番号３又は配列番号３と少なくとも７０％の同一のアミノ酸配列を有しており、ポリグルタミン酸合成酵素Ｃが、配列番号５又は配列番号５と少なくとも７０％の同一のアミノ酸配列を有しており、そして、当該ポリグルタミン酸合成酵素Ａ、Ｂ、Ｃは３種類でポリグルタミン酸を産生する機能を有する。【００２５】
同一の機能を有するタンパク質であっても、由来する品種の相違によって、そのアミノ酸配列に相違が存在しうることは当業者にとって周知の事実である。ポリグルタミン酸合成酵素Ａ、Ｂ、Ｃが３種類でポリグルタミン酸を産生する機能を有する限り、ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ及びｐｇｓＣ遺伝子は、各々配列番号２，４、６の塩基配列のこのような相同体、変異体も含みうる。【００２６】
「ポリグルタミン酸を産生する」とは、当該３種の核酸が導入された場合に、植物個体において、非遺伝子導入植物（非形質転換植物）と比較して、統計学的に有意な差のＰＧＡを産生することを意味する。ＰＧＡは本来は植物では産生されない物質であり、本発明の形質転換植物は極微量のＰＧＡを産生する場合でも、非形質転換植物と比較して何らかの有利な効果を奏すると期待される。限定されるわけではないが、本発明によって作成された形質転換植物は、当該３種の核酸が導入された場合に、非遺伝子導入植物（非形質転換植物）と比較して１．５倍、好ましくは２倍、より好ましくは３倍、さらにより好ましくは５倍、最も好ましくは７倍のＰＧＡを産生する。【００２７】
本発明の好ましいポリグルタミン酸合成酵素Ａ、Ｂ、Ｃをコードする核酸はまた、配列番号２、４又は６の塩基配列にストリンジェントな条件下、例えば、中程度又は高程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であり、かつ、当該ポリグルタミン酸合成酵素Ａ、Ｂ、Ｃは３種類でポリグルタミン酸を産生する機能を有する核酸を含む。【００２８】
「ストリンジェントな条件下」とは、中程度または高程度にストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，第６−７章，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０−５０℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ−６×ＳＳＣ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。好ましくは中程度にストリンジェントな条件は、約５０℃、６×ＳＳＣのハイブリダイゼーション条件を含む。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。一般に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度および／または低い塩濃度でのハイブリダイゼーション（例えば、約６５℃、６×ＳＳＣないし０．２×ＳＳＣ、好ましくは６×ＳＳＣ、より好ましくは２×ＳＳＣ、最も好ましくは０．２×ＳＳＣのハイブリダイゼーション）および／または洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、およびおよそ６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液では、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）にＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、および１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を代用することが可能であり、洗浄はハイブリダイゼーションが完了した後で１５分間行う。【００２９】
当業者に知られていて、以下にさらに記載したように、ハイブリダイゼーション反応と二本鎖の安定性を支配する基本原理を適用することによって望ましい度合いのストリンジェンシーを達成するためには、洗浄温度と洗浄塩濃度を必要に応じて調整することが可能であると理解すべきである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１を参照されたい）。核酸を未知配列の標的核酸へハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さはハイブリダイズする核酸のそれであると仮定される。既知配列の核酸をハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さは核酸の配列を並列し、最適な配列相補性をもつ単数または複数の領域を同定することによって決定可能である。５０塩基対未満の長さであることが予測されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔm）より５−２５℃低くなければならず、Ｔmは、以下の等式により決定される。長さ１８塩基対未満のハイブリッドに関して、Ｔm（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基数）。１８塩基対を超える長さのハイブリッドに関しては、Ｔm＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ10［Ｎａ+］）＋４１（モル分率［Ｇ＋Ｃ］）−０．６３（％ホルムアミド）−５００／ｎであり、ここで、Ｎはハイブリッド中の塩基数であり、そして［Ｎａ+］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオン濃度である（１×ＳＳＣの［Ｎａ+］＝０．１６５Ｍ）。好ましくは、こうしたハイブリダイズする核酸は各々、少なくとも８ヌクレオチド（または、より好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチド、または少なくとも２０ヌクレオチド、または少なくとも２５ヌクレオチド、または少なくとも３０ヌクレオチド、または少なくとも４０ヌクレオチド、または最も好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド）、またはそれがハイブリダイズする核酸の長さの少なくとも１％（より好ましくは少なくとも２５％、または少なくとも５０％、または少なくとも７０％、そして最も好ましくは少なくとも８０）である長さを有し、それがハイブリダイズする核酸と少なくとも５０％（より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも  ７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、または少なくとも９９％、そして最も好ましくは少なくとも９９．５％）の配列同一性を有する。ここで配列同一性は、上記により詳しく記載されるように、重複部分と同一性を最大化する一方、配列ギャップを最小化するように並列された、ハイブリダイズする核酸の配列を比較することによって決定される。【００３０】
核酸の同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算によって決定することが可能である。あるいは、２つの核酸配列のパーセント同一性は、目視検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マジソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７）。この「ＧＡＰ」プログラムの使用により、２つの核酸配列の比較の他に、２つのアミノ酸配列の比較、核酸配列とアミノ酸配列との比較を行うことができる。ここで、「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドについての（同一物について１、および非同一物について０の値を含む）一元（ｕｎａｒｙ）比較マトリックスのＧＣＧ実行と、ＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修「ポリペプチドの配列および構造のアトラス（Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ＳｅｑｕｅｎｃｅおよびＳｔｒｕｃｔｕｒｅ）」国立バイオ医学研究財団、３５３−３５８頁、１９７９により記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６７４５，１９８６の加重アミノ酸比較マトリックス；または他の比較可能な比較マトリックス；（２）アミノ酸の各ギャップについて３０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の１のペナルティ；またはヌクレオチド配列の各ギャップについて５０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の３のペナルティ；（３）エンドギャップへのノーペナルティ：および（４）長いギャップへは最大ペナルティなし、が含まれる。当業者により使用される他の配列比較プログラムでは、例えば、国立医学ライブラリーのウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌｓ．ｈｔｍｌにより使用が利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．２．７、またはＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが使用可能である。ＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕに記載されている。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア付けマトリックスを使用し、使用可能である選択パラメーターは以下の通りである：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎのＳＥＧプログラム（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）により決定され；ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ，１９９６「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ｂｉａｓｅｄ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：５４４−７１も参照されたい）、または、短周期性の内部リピートからなるセグメント（ＣｌａｖｅｒｉｅおよびＳｔａｔｅｓ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）のＸＮＵプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、および（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、またはＥ−スコア（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない）；好ましいＥ−スコア閾値の数値は０．５であるか、または好ましさが増える順に、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ−５、１ｅ−１０、１ｅ−１５、１ｅ−２０、１ｅ−２５、１ｅ−３０、１ｅ−４０、１ｅ−５０、１ｅ−７５、または１ｅ−１００である。【００３１】
同様に、本発明の核酸には、１つまたは複数の塩基の欠失、挿入または置換のため、配列番号２、４、６の塩基配列とは異なるが、ポリグルタミン酸合成酵素Ａ，Ｂ及びＣの３種類でポリグルタミン酸を産生する機能を有する核酸を含む。ポリグルタミン酸を産生する機能を有する限り、欠失、挿入または置換される塩基の数は特に制限されないが、好ましくは１個ないし数千個、より好ましくは１個ないし千個、さらにこのましくは１個ないし５００個、さらにより好ましくは１個ないし２００個、最も好ましくは１個ないし１００個である。【００３２】
既定のアミノ酸を、例えば同様の物理化学的特性を有する残基により置換してもよい。こうした保存的置換の例には、１つの脂肪族残基を互いに、例えばＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａを互いに置換するもの；ＬｙｓおよびＡｒｇ、ＧｌｕおよびＡｓｐ、またはＧｌｎおよびＡｓｎ間といった、１つの極性残基から別のものへの置換；あるいは芳香族残基の別のものでの置換、例えばＰｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒを互いに置換するものが含まれる。他の保存的置換、例えば、同様の疎水性特性を有する領域全体の置換が、周知である。当業者は、周知の遺伝子工学的手法により、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１）（上述）等に記載の、例えば部位特異的突然変異誘発法を使用して、所望の欠失、挿入または置換を施すことが可能である。【００３３】
よって、本発明の方法の一態様において、ポリグルタミン酸合成酵素Ａが、配列番号１又は配列番号１において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列を有しており、ポリグルタミン酸合成酵素Ｂが、配列番号３又は配列番号３において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列を有しており、ポリグルタミン酸合成酵素Ｃが、配列番号５又は配列番号５において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列を有しており、そして、当該ポリグルタミン酸合成酵素Ａ、Ｂ、Ｃは３種類でポリグルタミン酸を産生する機能を有する。【００３４】
核酸の植物体への導入
本発明において、ポリグルタミン酸合成酵素をコードする核酸Ａ、Ｂ及びＣを植物に導入する方法は特に限定されず、植物の種類に応じた公知の方法を使用することが可能である。遺伝子工学的手法による形質導入のためにはいかなる適切な発現系を使用してもよい。組換え発現ベクターは、適切な転写または翻訳制御ヌクレオチド配列、例えば、哺乳動物、微生物、ウイルス、または昆虫遺伝子由来のものなどに、機能可能であるように連結されている、植物に導入されうるポリグルタミン酸合成酵素をコードする核酸Ａ、Ｂ及びＣを含む核酸を含む。【００３５】
制御配列の例には、転写プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、並びに転写および翻訳開始および終結を調節する適切な配列が含まれる。ヌクレオチド配列は、制御配列が該ＤＮＡ配列に機能的に関連しているとき、機能可能であるように連結されている。したがって、プロモーターヌクレオチド配列は、該プロモーターヌクレオチド配列がＤＮＡ配列の転写を調節するならば、ＤＮＡ配列に、機能可能であるように連結されている。植物において複製する能力を与える複製起点、および形質転換体を同定する選択遺伝子が、一般的に発現ベクターに取り込まれている。選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシンもしくはネオマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子などが例示される。【００３６】
さらに、必要に応じて適切なシグナルペプチド（天然または異種性）をコードする配列を、発現ベクターに取り込んでもよい。シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡ配列を、インフレームで核酸配列に融合させ、ＤＮＡがまず転写され、そしてｍＲＮＡがシグナルペプチドを含む融合タンパク質に翻訳されるようにしてもよい。【００３７】
プラスミドなどのベクターに遺伝子のＤＮＡ断片を組み込む方法としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｄ．Ｗ．  （２００１）．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄ．  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。このようにして得られる組換えベクター（例えば、組換えプラスミド）は、宿主細胞である植物に導入される。【００３８】
べクターは、簡便には当業界において入手可能な組換え用べクター（例えば、プラスミドＤＮＡなど）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。本願発明の核酸を用いて植物に形質転換する場合には、特に、植物形質転換用ベクターが有用である。植物用ベクターとしては、植物細胞中で当該遺伝子を発現し、当該タンパク質を生産する能力を有するものであれば特に限定されないが、例えば、ｐＢＩ２２１、ｐＢＩ１２１（以上Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、及びこれらから派生したベクターが挙げられる。また、特に単子葉植物の形質転換には、ｐＩＧ１２１Ｈｍ、ｐＴＯＫ２３３（以上Ｈｉｅｉら，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，６，  ２７１−２８２（１９９４））、ｐＳＢ４２４（Ｋｏｍａｒｉら，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１０，  １６５−１７４（１９９６））などが例示される。【００３９】
形質転換植物は、上述のベクターのβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子の部位に本願発明の核酸断片を入れ替えて植物形質転換用ベクターを構築し、これを植物に導入することで調整することができる。植物形質転換用ベクターは、少なくともプロモーター、翻訳開始コドン、所望の遺伝子（ポリグルタミン酸合成遺伝子Ａ、Ｂ又はＣの核酸配列またはその一部）、翻訳終始コドンおよびターミネーターを含んでいることが好ましい。また、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、所望の遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、選抜マーカー領域などを適宜含んでいてもよい。プロモーター、ターミネーターは植物細胞で機能するものであれば特に限定されないが、構成的発現をするプロモーターとしては、上記ベクターに予め組み込まれている３５Ｓプロモーターの他に、アクチン、ユビキチン遺伝子のプロモーターなどが例示される。【００４０】
本明細書中の実施例２で用いたｐＢ１１２１ベクターは、植物細胞内で導入遺伝子を高レベルで構成的に発現するカリフラワーモザイクウィルス由来の３５Ｓプロモーターを持っており、導入されたｐｇｓＢはＲＮＡ転写されていることがＲＴ−ＰＣＲにより明らかになった。また、植物体へのベクター導入をスクリーニングするため、ｐＢＩ１２１にはＮＯＳプロモーター調節下のネオマイシン  ホスフォトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子によるＫａｎ耐性が付与されている。Ｙｅｎｏｆｓｋｙら（１９９０）は、ｐＢＩ１２１のＮＰＴＩＩ遺伝子には点突然変異が存在するため、Ｋａｎ耐性が弱いことを報告している。しかし、本発明では１００μｇ／ｍｌのカナマイシンで容易にスクリーニングすることが可能であり、問題なくｐＢＩ１２１ベクターを用いることができた。【００４１】
プラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（２００１）（上述）に記載のリン酸カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。【００４２】
特に植物への遺伝子導入法としては、アグロバクテリウムを用いる方法（Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，６，  ｐ．２７１−２８２（１９９４）、Ｋｏｍａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１０，  ｐ．１６５−１７４（１９９６））、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ法、マイクロインジェクション法、微小物衝突法などが挙げられる。所望の植物に核酸を導入する方法であれば特に限定されない。【００４３】
本発明において好ましくは、アグロバクテリウム法を使用する。より具体的には、ポリグルタミン酸合成酵素Ａをコードする核酸（ｐｇｓＡ）、ポリグルタミン酸合成酵素Ｂをコードする核酸（ｐｇｓＢ）及びポリグルタミン酸合成酵素Ｃをコードする核酸（ｐｇｓＣ）のうち、１種又はそれより多くの核酸が挿入されたベクターを含有するアグロバクテリウムを感染させることによって、植物に上記核酸を導入する。【００４４】
より好ましくは、ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ及びｐｇｓＣの３種類の核酸の植物への導入は、以下のａ）−ｃ）のいずれかの工程によって行うことができる。【００４５】
ａ）ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ及びｐｇｓＣの３種類の核酸が挿入された単一のベクターを含有するアグロバクテリウムを植物に感染させる；
ｂ）ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ及びｐｇｓＣが各々別個に挿入されたベクターを有する、３種類のアグロバクテリウムを植物に感染させる；あるいは
ｃ）ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ及びｐｇｓＣが各々別個に挿入されたベクターを有するアグロバクテリウムを植物に感染させ、ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ及びｐｇｓＣのうち１種又は２種を有する形質転換植物を作成し、そして、これらの形質転換植物を掛け合わせる。【００４６】
本発明の方法は、ｂ）の工程の改変、例えば、ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ及びｐｇｓＣのうち２種、（例えば、ｐｇｓＡ＋ｐｇｓＢ）が挿入されたベクター、と残りの１種（例えば、ｐｇｓＣ）が挿入されたベクターの２種類のアグロバクテリウムを植物に感染させる態様も含む。【００４７】
本発明の方法はまた、ｃ）の工程の改変、例えば、先ず、ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ及びｐｇｓＣのうち２種、（例えば、ｐｇｓＡ＋ｐｇｓＢ）が挿入されたベクターを有するアグロバクテリウムを単一の植物に感染させ、ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ及びｐｇｓＣのうち２種（ｐｇｓＡ＋ｐｇｓＢ）を有する形質転換植物を作成し、一方、残りの１種（例えば、ｐｇｓＣ）が挿入されたベクターを有するアグロバクテリウムを植物に感染させ、残りの１種（例えば、ｐｇｓＣ）を有する形質転換植物を作成し、双方の形質転換植物を掛け合わせる態様も含む。２種の核酸を有する形質転換植物の作成には、２種の核酸が含まれたベクターを用いてもよく、あるいは、各々別個のベクターを有する２種類のアグロバクテリウムを単一の植物に感染させてもよい。【００４８】
本発明の方法において、工程ａ）、即ち、ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ及びｐｇｓＣの３種類の核酸が全て単一のベクターに挿入したものを利用する態様が好ましい。【００４９】
限定されるわけではないが、アグロバクテリウムを用いる植物への遺伝子の挿入の一般的な方法は、例えば、下西ら、新・生物化学実験のてびき３、（１２２−１２４頁、化学同人、１９９６年）、Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，６，  ｐ．２７１−２８２（１９９４）、Ｋｏｍａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１０，  ｐ．１６５−１７４（１９９６）等に記載されている。【００５０】
先ず、所期の挿入したい核酸断片を含むプラスミドベクターを作成する。プラスミドベクターは、例えば、ＳＢ１１、ｐＳＢ２２、ｐＢＩ１２１（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）  ＧＵＳ  ｆｕｓｉｏｎ：β−ｇｌｃｏｓｉｄａｓｅ  ａｓ  ａ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｇｅｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒ  ｉｎ  ｈｉｇｈｅｒ  ｐｌａｎｔｓ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ６，３９０１−３９０７）、ｐＳＰＢ１７６（特開２００３−４３２３８３）、ｐＳＰＢ５４１（特開２００３−４２００４６）、ｐＳＦＬ２０３（特開２００３−４２００４６）等が使用可能である。あるいは、当業者は例えば前記プラスミドベクターを基に、自ら適当なベクターを構築する事も可能である。次いで、挿入核酸を含む組換えベクターを用いて大腸菌（例えばＤＨ５α、ＪＭ１０９、ＭＶ１１８４等、いずれも例えばＴＡＫＡＲＡ社より購入可能）を形質転換する。【００５１】
さらに、形質転換された大腸菌を用いて、アグロバクテリウム菌株を好ましくはヘルパー大腸菌株とともに、例えば、Ｄｉｔｔａ  ｅｔ  ａｌ（１９８０）の方法に従い、三菌系交雑（ｔｒｉｐａｒｅｎｔｉａｌ  ｍａｔｉｎｇ）を行う。限定されるわけではないが、アグロバクテリウムは例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌株ＬＢＡ４４０４／ｐＳＢ１、ＬＢＡ４４０４／ｐＮＢ１、ＬＢＡ４４０４／ｐＳＢ３等を使用することが可能である。いずれも前述のＫｏｍａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１０，  ｐ．１６５−１７４（１９９６）にプラスミドマップが記載されており、当業者は例えば自らベクター構築を行うことにより使用可能である。限定されるわけではないが、ヘルパー大腸菌は、例えばＤＨ１、ｐＲＫ２０１３（クローンテック社より入手可能）等が使用可能である。また、より一般的ではないがｐＲＫ２０７３を保有する大腸菌もヘルパー大腸菌として使用可能との報告がある。【００５２】
本発明において、アグロバクテリウムの植物への感染は、公知の方法を用いて行うことができる。好ましくは、リーフディスク法（松本及び町田（１９９０）  植物形質転換法、現代化学、２５−２９）、減圧湿潤法（荒木（２００１）  減圧浸潤法による形質転換、細胞工学別冊  植物細胞工学シリーズ１５、１０９−１１３）、並びに直接注入法（大隅（２００１）  アグロバクテリウム直接注入法、細胞工学別冊  植物細胞工学シリーズ１５、１０５−１０８）からなる群から、適宜、形質転換される植物等に応じて、選択することができる。最も好ましくはリーフディスク法である（実施例１４）。【００５３】
本明細書中の実施例におけるタバコを用いた形質転換では、一般的なリーフディスク法を用いた。この方法では、ナス科やアブラナ科、マメ科、キク科、アオイ科、セリ科、ヤナギ科などで比較的容易に形質転換個体を得られることが報告されている（Ｈｏｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．１９８８）。本明細書中の実施例においても１葉切片あたり１．５〜２個程度のＫａｎ耐性個体の再生が見られた。再生個体の約３０％に異常な茎葉体の形成が見られたが、異常な再生体の生育速度は正常な再生個体に比べて遅く、植え継ぎの時点で除去することができるため、形質転換植物の作成に影響を及ぼすことはないと考えられる。また、この異常な茎葉体は対照としてＧＵＳ遺伝子を持つｐＢＩ１２１で形質転換した場合でも同様の頻度で現われることから、導入遺伝子によりもたらされた表現型ではなく、体細胞から再生する際に一定頻度であらわれる形態異常と考えられる。また、再生シュートの新たな培地、あるいはホルモンフリー培地への移植後の生育は形態、速度ともに対照形質転換体とほぼ同じで、少なくとも個々の遺伝子導入により変化は見られなかった。【００５４】
また、アグロバクテリウムをタバコ植物の展開した葉に注入すると、葉肉細胞に遺伝子が導入されて一過的に遺伝子発現することが報告されている（Ｊｏｈａｎｓｅｎ  ａｎｄ  Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ２００１）。この報告では、異なる遺伝子を持つアグロバクテリウムを注入した場合、おそらく一つの葉肉細胞に複数のアグロバクテリウムが感染して遺伝子を導入するため、複数の遺伝子による効果を発現させることが可能であることが示唆されている。【００５５】
一方、本明細書中の実施例ではシロイヌナズナへの遺伝子導入には減圧浸潤法を用いたが、数枚のロゼット葉が出ている段階で、野生株よりもやや葉身の幅が狭いこと以外に形態的異常は見られない。【００５６】
ポリグルタミン酸合成酵素Ａ、Ｂ及びＣ遺伝子、及び／又は、ポリグルタミン酸の発現の確認
本発明に方法によって作成された形質転換植物における、ポリグルタミン酸合成酵素Ａ、Ｂ及びＣ遺伝子、及び／又は、ポリグルタミン酸の発現の確認は、公知の方法を用いて行うことが可能である。【００５７】
ポリグルタミン酸合成酵素Ａ、Ｂ及びＣ遺伝子の発現の確認は公知の核酸増幅方法を用いて、行うことができる。好ましくは、３種の遺伝子のうち２種以上、より好ましくは、３種類全ての遺伝子の発現が確認される。【００５８】
核酸増幅反応は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓａｉｋｉ  Ｒ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０−１３５４（１９８５））、ライゲース連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ  Ｄ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４，５６０−５６９（１９８９））および転写に基づく増幅（Ｋｗｏｈ  Ｄ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，１１７３−１１７７（１９８９））等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反応（ＳＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒ  Ｇ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，３９２−３９６（１９９２））、自己保持配列複製（３ＳＲ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  Ｊ．Ｃ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，１８７４−１８７８（１９９０））およびＱβレプリカーゼシステム（Ｌｉｚａｒｄｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６，ｐ．１１９７−１２０２（１９８８））等の恒温反応を含む。また、欧州特許第０５２５８８２号に記載されている標的核酸と変異配列の競合増幅による核酸配列に基づく増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＳＡＢＡ）反応等も利用可能である。好ましくはＰＣＲ法である。【００５９】
ＰＣＲ法は、ポリグルタミン酸合成酵素Ａ、Ｂ又はＣの遺伝子のコード領域又はその近傍の領域の塩基配列から選択される、約１４ないし約３０の塩基配列に基づいて作成されたプライマーを利用し、例えば、形質転換植物の葉、カルス等から抽出されたＲＮＡを鋳型にして行うことができる（ＲＴ−ＰＣＲ）。内部対照として、形質転換に利用した植物の天然型で一般に広範囲に発現している遺伝子、例えば、タバコのユビキチン遺伝子、アクチン遺伝子等の発現を指標とすることができる。好ましくは、本発明で作成された形質転換植物において、ポリグルタミン酸合成酵素Ａ、Ｂ又はＣの遺伝子はＲＮＡレベルで内部対照遺伝子の１／１０以上、１／５以上、１／２以上、内部対照遺伝子と同等程度発現する。より好ましくは、内部対照遺伝子と同等程度、２倍以上、５倍以上発現する。【００６０】
本発明に方法によって作成された形質転換植物におけるポリグルタミン酸の発現の確認は、公知の方法を用いて行うことができる。ポリグルタミン酸が溶液中に分泌される場合には、加水分解によるグルタミン酸のＨＰＬＣ分析（Ａｓｃｈｉｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９）や，メチレンブルー染色を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６）による検出も可能である。【００６１】
本発明においては、ＰＧＡは形質転換植物の組織内で生合成されることが期待される。よって、植物由来の細胞壁成分やタンパク質などと分画する必要なしに、生合成されたＰＧＡを検出するには、免疫化学的手法による検出が好ましい。例えば、限定される訳ではないが、ＰＧＡを認識するポリクローナル抗体（抗血清）若しくはモノクローナル抗体を用いたウェスタン分析（ドットプロット、ｉｎ  ｓｉｔｕブロットなど）等が含まれる。【００６２】
ＰＧＡを使用して、常法によりＰＧＡを認識するのポリクローナル抗体（抗血清）を作製することができる。例えば、ＰＧＡを、ＲＩＢＩアジュバント（ＭＲＬ＋ＴＤＭの乳液）、フロイント完全アジュバント又は不完全アジュバント、あるいはミョウバン等の補助剤と混合したものを、免疫用抗原として動物に免疫することによって得ることができる。免疫される動物としては当該分野で常用されるものをいずれも使用できるが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等を挙げることができる。免疫は１回又は適当な間隔で、好ましくは１週間ないし５週間の問隔で複数回行うことができる。免疫した動物から血液を採取し、そこから分離した血清を用い、ＰＧＡと反応するポリクローナル抗体の存在を評価することができる。【００６３】
本明細書中の実施例では、粘性が低く腫脹を引き起こしにくいＲＩＢＩ  アジュバントとＰＧＡを混合してマウスに二週間おきに皮下注射により投与を繰り返し、ポリクローナル抗体を調製した（実施例１１）。【００６４】
ＰＧＡを認識するモノクローナル抗体も、同様に公知の方法により作製することができる。モノクローナル抗体の製造にあたっては、少なくとも下記のような作業工程が必要である。（ａ）免疫用抗原として使用するフタル酸エステル類ハプテンと高分子化合物との結合体の作製；（ｂ）動物への免疫；（ｃ）血液の採取、アッセイ、及び抗体産生細胞の調製
（ｄ）ミエローマ細胞の調製；（ｅ）抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合とハイブリドーマの選択的培養；（ｆ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングと細胞クローニング；（ｇ）ハイブリドーマの培養又は動物へのハイブリドーマの移植によるモノクローナル抗体の調製；及び（ｈ）調製されたモノクローナル抗体の反応性の測定等。【００６５】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するための常法は、例えば、ハイブリドーマ  テクニックス（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリーズ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８０年版）に記載されている。抗体を利用したＰＧＡの免疫化学的検出は公知の方法に従って行うことができる。【００６６】
後述の本実施例では、ドットプロット法でＰＧＡを検出しようと試みたが、当初得られた抗血清の力価が低かったため、ニトロセルロースメンブレンに直接ブロットしたＰＧＡは検出できなかった。よって、可溶性カルボジイミドであるＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩］を用いてＢＳＡとクロスリンクし、ＢＳＡを介してメンブレンに結合する方法を開発した。【００６７】
本発明によって作成された形質転換植物は、非遺伝子導入植物（非形質転換植物）と比較して、統計学的に有意な差のＰＧＡを産生、蓄積する植物である。ＰＧＡは本来は植物では産生されない物質であり、本発明の形質転換植物は極微量のＰＧＡを産生する場合でも、非形質転換植物と比較して何らかの有利な効果を奏すると期待される。例えば、上記免疫化学的手法を用いてＰＧＡの産生を検出することが可能である。【００６８】
限定されるわけではないが、本発明によって作成された形質転換植物は、非遺伝子導入植物（非形質転換植物）と比較して１．５倍、好ましくは２倍、より好ましくは３倍、さらにより好ましくは５倍、最も好ましくは７倍のＰＧＡを検出を産生する。【００６９】
形質転換植物
本発明はまた、本発明の方法によって作成された、ポリグルタミン酸を産生する形質転換植物を提供することを目的とする。【００７０】
本発明の方法によって得られる植物の種類は特に限定されない。好ましくは、タバコ、シロイナズナ、イネ、ダイズ、ミヤコグサ、ペチュニア、トレニア及びトマトからなる群から選択される。より好ましくは、タバコ、シロイナズナ、イネ、ダイズ及びミヤコグサからなる群から選択される。最も好ましくは、タバコ又はシロイヌナズナである。【００７１】
本発明における形質転換植物の状態は特に限定されない。好ましくは、成体、種子又はカルスのいずれか状態である。より好ましくは成体である。【００７２】
なお、好ましくは本発明の形質転換植物はアルミニウムイオンの存在下で、非形質転換植物と比較して緑化効果を奏し、及び／また、アルミニウムイオンによる成長阻害を軽減する効果を奏する（実施例１５）。これは、理論に限定されるわけではないが、形質転換植物の根においてＰＧＡが分泌されると、アルミニウムイオンとのイオン結合により水溶性の錯化合物となり、アルミニウムイオンの根からの吸収を防ぐためと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図１は、ｐｇｓＡ遺伝子塩基配列と予測アミノ酸配列を示す。
【図２】図２は、ｐｇｓＢ遺伝子塩基配列と予測アミノ酸配列を示す。
【図３】図３は、ｐｇｓＣ遺伝子塩基配列と予測アミノ酸配列を示す。
【図４】図４は、直接注入法によってＰＧＡ合成酵素を導入したタバコ葉片のウェスタンブロット（上清部）の結果を示す。上のスポットから１／１００倍サンプル、１／１０サンプル、等倍サンプルの結果である。
【図５】図５は、直接注入法によってＰＧＡ合成酵素を導入したタバコ葉片のウェスタンブロット（沈殿部）の結果を示す。上のスポットから１／１００倍サンプル、１／１０サンプル、等倍サンプルの結果である。
【図６】図６は、ＰＧＡ−ＢＳＡ架橋体を用いたウェスタンブロットの結果を示す。
【図７】図７は、ＰＧＡ代謝に関与するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ染色体上のＯＲＦの構造を示す。ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ及びｐｇｓＣは各々ＰＧＡ合成遺伝子Ａ、Ｂ及びＣのコード領域を示す。Ｙｗｔｃは機能未知の遺伝子を示す。ｐｇｄＳは、ＰＧＡは脱重合酵素を示す。
【図８】図８は、三種のｐｇｓ遺伝子を構成的に発現するように遺伝子を導入した形質転換タバコにおける、導入遺伝子発現を示す。具体的には、導入された三種のｐｇｓ遺伝子の発現を確認するために、各ｐｇｓ遺伝子に特異的なプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。その結果、形質転換タバコ（ＰＧＳｏｘ．）の系統１０、１１及び２１で三種のｐｇｓ遺伝子の異所的な発現を確認した（ＮＴ：非形質転換体、ＮｔＵＢＱ：たばこユビキチン遺伝子（内部標準遺伝子）
【図９】図９は、図８で３種のｐｇｓ遺伝子異所的な発現を確認したタバコ形質転換系統１０、１１及び２１の葉粗抽出液内において、ウェスタンブロットによりＰＧＳタンパク質の蓄積を確認した。結果である。
【図１０】図１０は、アルミニウムイオンの存在下（０．０４％  ＡｌＣｌ3）で発芽させた本発明の形質転換タバコの芽生えを示す。
【図１１】図１１は、アルミニウムイオンの存在下０．０４％  ＡｌＣｌ3）で発芽させた本発明の形質転換タバコのクロロフィルの量を示す。
【実施例】
【００７４】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。【００７５】
実施例１  ＰＧＡ合成遺伝子の単離
本実施例では、納豆菌よりＰＧＡ合成のための３種の遺伝子（ＰＧＡ合成遺伝子）、ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ及びｐｇｓＣを単離した。【００７６】
先ず、市販の納豆一粒を１ｍｌの蒸留水に入れ、激しく撹拌して納豆菌の縣濁液を調製した。１μｌにＡｄｖａｎｔａｇｅ  ｃＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ  ０．２μｌ、１０×ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ  １μｌ  、ＤＮＴＰｓ（２ｍＭ  ｄＡＴＰ  ｄＣＴＰ  ｄＧＴＰ  ｄＴＴＰ  ｅａｃｈ）１μｌ  、ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣそれぞれの５０μＭプライマー  フォワード、リバース（配列番号７−１２）ともに０．５μｌを加えて滅菌水で全量を１０μｌとし、９４℃２分を１回、９４℃３０秒、５９℃３０秒、７２℃６０秒のＰＣＲサイクルを３３回、７２℃５分のインキュベートを行った。【００７７】
６×Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｄｙｅ  ２μｌを加え、ゲルプレート（１×ＴＡＥ  ２％、ＡｇａｒｏｓｅＳ）で電気泳動後、エチジウムブロマイド溶液（０．２μｌ／ｍｌ）に３０分浸けて、ＵＶで見られたバンド部分のゲルを切り取った。【００７８】
ゲル重量の３倍以上の溶出液（ＮａＩ：Ｓｏｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ）を加え、５０℃で１０分置いた。ゲルが溶けきったらボルテックスしたＧｌａｓｓ  ｍｉｌｋを５μｌ加え、緩やかに回転撹拌させつつ３０分おいた（あるいは、ゲル量が少ない場合は手で振って５分でもよい）。１５，０００回転で１分遠心させた後、上澄みを捨てた。Ｎｅｗ  Ｗａｓｈ（エタノールと水の混合物）を１８０−２００μｌ加えてピペッティングし、１５，０００回転、１分で遠心した後、上澄みを捨てる操作を３回繰り返した。５０℃で沈殿を２０分乾かした。１５μｌ蒸留水を加え、１５，０００回転、１分遠心したのち上澄みを回収した。同じ操作を行い、２０μｌのＤＮＡ溶液を得た。【００７９】
実施例２  ＤＮＡ断片の配列決定用ベクターへの組込み
本実施例では、アガロースゲルから精製したインサートＤＮＡ（ＰｇｓＡ、ＰｇｓＢ、ＰｇｓＣそれぞれ）をシークエンス解析のためｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ
（プロメガ社製）に組み込んだ。【００８０】
インサートＤＮＡはＴａｑポリメラーゼの作用によりＡオーバーハングを付加してある。よって、ベクターＤＮＡは、末端を平滑化し、さらに粘着末端（−Ｔ）が付加されている必要がある。プロメガ社製から市販されているｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒはこのような処理がすでにされているので、直接以下のクローニングに供した。【００８１】
ベクターＤＮＡ  ０．５μｌ対し、２×ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ、インサートＤＮＡ  ３．５μｌ、Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  １μｌを加えて全量を１０μｌにし、４℃で一晩インキュベートした。反応後、ライゲーションした反応液に対して２５０μｌのコンピテントセルを加えて軽く混合し、氷上に２０分間静置した。その後４２℃で５０秒間のヒートショックを与え、すぐに氷上に戻し２分間静置した。そのサンプルにＳＯＣ培地（２％トリプトン、５％酵母エキストラクト、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２０ｍＭグルコース、ｐＨ７．０）を加えて、よく撹拌し、３７℃で９０分間、時折転倒させながら培養した。ＬＢ寒天培地（Ф９５ｍｍ；１．５％寒天、１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキストラクト、５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、２００μｇ／ｍｌアンピシリン、０．４ｍＭ  ＩＰＴＧ、５０μｇ／ｍｌ  Ｘ−Ｇａｌ）に２００μｌの形質転換させた大腸菌を接種し、３７℃で一晩インキュベートした。そのプレート上に生えたコロニーから青／白選抜を行い白色または薄青のコロニーに本当にインサートが存在するか確認のため、ベクターに含まれる配列であるＴ７とＳｐ６−２（配列番号１３，１４）をプライマーとしてＰＣＲを行った。【００８２】
実施例３  インサートＤＮＡの塩基配列解析
本実施例では、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒに組み込んだＰＧＡ合成酵素遺伝子のＤＮＡの塩基配列決定を行った。詳細には、ＰＣＲ後、先ず電気泳動しバンドが確認されたコロニーを５ｍｌ  ＬＢ培地に縣濁し、３７℃で一晩培養した。培養液を遠心して、集菌し、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｐｌａｓｍｉｄ−  Ｋｉｔを用いてＤＮＡを精製、シークエンスを行った。【００８３】
まず大腸菌ペレットに１５０μｌの再縣濁液を加え、ピペッティングでよく縣濁した。次に１５０μｌの溶解液を加え、チューブを転倒して撹拌し、氷上に５分静置した。１２０・ｌの中和液を加え、チューブを転倒して撹拌し、再び氷上に５分置いた。遠心を２０，０００×ｇ、５分間遠心し、上清を別のチューブに移した。そのチューブに５００μｌ吸着液、３０μｌ磁性ビーズＩＩを加え、６０秒撹拌した後、チューブを磁気スタンドにセットし、磁性ビーズを磁石に寄せ、磁気スタンドごと軽く振り、蓋に付いた溶液を落とした。ピペットで上清を取り除いた。７０％エタノールを７２０μｌ加え３０秒撹拌した後、再び上記と同じように磁気スタンドで上清を取り除いた。これを２回繰り返した。９９％エタノールを５００μｌ加え、３０秒撹拌した後２０，０００×ｇで１分間遠心した。磁気スタンドを用いて上清を取り除いた後、３７℃、１時間で磁性ビーズを乾燥させた。溶出液を５０μｌ加え、６０秒撹拌した後、２０，０００×ｇで、５分間遠心を行い、磁気スタンドで４０μｌの上清を回収し、以下のプラスミドサンプルとして用いた。【００８４】
Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＵＳＢ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、配列を読むための配列試料を調製した。１つのプラスミドサンプル５．５５μｌに対し、Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  １μｌ、１０ｍＭ  Ｔ７−Ｃｙ５プライマー（配列番号１３）  ０．６μｌ、１０ｍＭ  ＳＰ６−２Ｃｙ５．５プライマーー（配列番号１４）  １μｌ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ０．８５μｌを加え、良く混合した後２μｌずつ４本の０．５ｍｌマイクロチューブへ分注し、そこへそれぞれｄｄＡ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ、ｄｄＴ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ、ｄｄＧ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ、ｄｄＣ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｍｉｘを２μｌずつ加えて全量を４μとし良く混合した。ミネラルオイルを重層した後、それを９５℃で２分間プレヒートし、９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分のインキュベートを６０サイクル繰り返した。反応後、３μｌのローディングダイを加え７５℃で２分暖めた後、氷上で良く冷ました。これを配列決定用試料としてシークエンサー（Ｌｏｎｇ  Ｒｅａｄ  ＴｏｗｅｒTM  ＤＮＡシークエンサー；アマーシャム）にかけ、配列を解読した。【００８５】
ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣはそれぞれ、１１４９、１１８５、４６１ｂｐの塩基長で、３８０、３９３、１５３アミノ酸長のポリペプチドをコードしていた（図１−３）。いずれもＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＩＦＯ３３３６株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎａｔｔｏ）で報告された配列と、ほぼ完全に一致した（Ａｓｈｉｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）。ＳＯＳＵＩアルゴリズム（ＳＯＳＵＩ：ｈｔｔｐ／／：ｓｏｓｕｉ．ｐｒｏｔｅｏｍｅ．ｂｉｏ．ｔｕａｔ．ａｃ．ｊｐ）により、ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣポリペプチドはそれぞれ１、１、５ヵ所の膜貫通ドメインが予想された（図１−３のボックスで囲んだ部分）。また、モチーフ検索（ＰＲＯＳＩＴＥ  ＰＳ０００６１，ｈｔｔｐ：／／ｍｏｔｉｆ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／）からは、ｐｇｓＢの５６〜６３アミノ酸部分にＡＴＰ／ＧＴＰ結合部位モチーフの存在が示唆された（図２の下線を引いた部分）。【００８６】
実施例４  形質転換用ベクター（ｐＢＩ１２１）の構築
実施例３の配列決定後、本実施例ではアグロバクテリウムに導入し、植物を形質転換するためのベクターを作成するために、インサートＤＮＡ（ＰｇｓＡ、ＰｇｓＢ、ＰｇｓＣそれぞれ）を、実施例２で作成したｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒから、ｐＧＥＭ（Ｔ−ＢＨ）ΔＳＳＳベクターへ、次いでｐＢＩ１２１ベクターに移した。【００８７】
まず、実施例２のｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  ＤＮＡ溶液  ８μｌにＨｉｇｈ  Ｂｕｆｆｅｒ  １μｌ、制限酵素ＥｃｏＲＩ  １μｌを加えて１０μｌとし、３７℃で２時間反応させた。その後ライゲーションを行うため上記同様インサートＤＮＡを抽出精製した。制限酵素で切断したインサートＤＮＡ  ６μｌに、２×ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  １μｌ、ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  １μｌ、同様にＥｃｏＲＩで切断し、脱リン酸化したｐＧＥＭ（Ｔ−ＢＨ）ΔＳＳＳ  ベクター  ２μｌを加えて全量を１０μｌにし、４℃で一晩インキュベートした。【００８８】
２５０μｌのコンピテントセルにライゲーションした反応液を加えて形質転換し、ＳＯＣ培地を加えてＬＢ寒天培地に接種し、３７℃で一晩インキュベートした。そのプレート上に生えたコロニーから青／白選択を行い、確認のためＴ７とｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣいずれか該当する部位の反対向きをプライマーとしてＰＣＲを行い、Ｔ７側に遺伝子のセンス配列の５’側が挿入されたコンストラクトを選択した。【００８９】
次にＰＣＲ、電気泳動で該当したコロニーをＬＢ培地で増殖させ、プラスミドＤＮＡを精製した。抽出したＤＮＡ  ４０μｌにＬｏｗ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ、制限酵素ＳａｃＩ  ５μｌを加え全量を５０μｌとし、３７℃、２時間で反応させた。さらにこのサンプル５０μｌにＨｉｇｈ  Ｂｕｆｆｅｒ  １０μｌ、制限酵素ＢａｍＨＩ  ５μｌを加え全量を１００μｌとし、再び３７℃、２時間で反応させた。その後電気泳動によりＳａｃＩ、ＢａｍＨＩで切り出されたインサートを分離し、上記同様ＤＮＡを抽出した。制限酵素で切断したＤＮＡ  ７μｌに、２×ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  ２μｌ、ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  １μｌ、同様にＳａｃＩ、ＢａｍＨＩで切断したｐＢＩ１２１  １０μｌを加えて全量を  ２０μｌにし、４℃で一晩インキュベートした。反応後、ライゲーションした反応液に対して２５０μｌのコンピテントセルに入れＳＯＣ培地を加えたものを、抗生物質カナマイシンを含むＬＢ寒天培地に接種し、３７℃で一晩インキュベートした。そのプレート上に生えたコロニーを確認のためｐＢＩ−ＬとｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ  ｐｇｓＣいずれか該当する部位の反対向きをプライマーとして９４℃２分を１回、９４℃３０秒６６℃３０秒７２℃６０秒を５回、９４℃３０秒、６３℃３０秒、７２℃６０秒を５回、９４℃３０秒、５９℃３０秒、７２℃６０秒を２８回ＰＣＲを行った。【００９０】
実施例５  アグロバクテリウムへの導入
接合伝達用のヘルパー大腸菌を共存させることによって大腸菌中にあるベクターをアグロバクテリウムへ移動させた。【００９１】
まず１００μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含む３ｍｌのＬＢ液体培地に上記のＰＣＲ、電気泳動で形質転換が確認された大腸菌のコロニーを縣濁した。一晩振盪培養した後、２００μｌを分取し遠心をした（９，０００×ｇ、１分）。上清を取り除き、ＬＢ液体培地を２００μｌ加え再び遠心する操作を２回行い、抗生物質を除去した。このサンプル２０μｌに同様にして調製したヘルパー大腸菌（ＤＨ１、ｐＲＫ２０１３株）  ２０μｌ、アグロバクテリウム縣濁液（ＬＢＡ４４０４株）  ２０μｌを加え撹拌した後、ＬＢ寒天培地に接種した。２８℃で一晩インキュベートした。できたコロニーをＬＢ液体培地  １ｍｌに縣濁した。このサンプルをＬＢ液体培地に５００倍希釈した後、１００μｇ／ｍｌカナマイシン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗り広げ、２８℃で２晩インキュベートした。ＰＣＲ、電気泳動を行いアグロバクテリウムに導入されたＤＮＡを確認した。【００９２】
実施例６  リーフディスク法による植物体への感染
タバコを材料としたリーフディスク法を用いて目的ＤＮＡを導入したアグロバクテリウムを植物体に感染させた。真核生物は原核生物とは異なり、ＯＲＦは個々のｍＲＮＡとして発現し、オペロンの形ではタンパク質合成ができないことから、個々の遺伝子を別々の植物体に導入し、その後に交配によって複数の遺伝子を持つ植物体を作ることを目指し、形質転換植物の作出を試みた。【００９３】
まず１ｃｍ角程度のタバコの切片を蒸留水に浮かべた後、葉の裏側を上にして１μｇ／ｍｌ  ＢＡ、０．１μｇ／ｍｌ  ＮＡＡを含むＭＳ寒天培地（１×ＭＳ培地、３％スクロース、０．８％寒天）にのせ、サージカルテープで封をし、２５℃で３日間培養した。切片を茶こしに移し、１００μｇ／ｍｌカナマイシン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＬＢ液体培地で２８℃、一晩振盪培養した実施例５のアグロバクテリウムの縣濁液に３分間浸した。１μｇ／ｍｌ  ＢＡ、０．１μｇ／ｍｌ  ＮＡＡを含むＭＳ寒天培地に切片を移し、サージカルテープで封をした後、暗室で３日間培養した。１μｍｏｌ／ｍｌ  ＢＡ、０．１μｇ／ｍｌ  ＮＡＡと２００μｇ／ｍｌカナマイシン、３００μｇ／ｍｌカルベニシリンを含むＭＳ寒天培地に移した。サージカルテープで封をし、２−３週間、明８時間、暗１６時間で培養した。【００９４】
葉切片をＫａｎ添加培地で約３週間、明暗条件下で培養したところ、切片の切り口や操作中に開いた穴などから多数のコロニー形成が見られた。部分的に緑色を呈してＫａｎ耐性となったと考えられるコロニーが出現していたので、その部分を切り出し、新しいＫａｎ添加培地でさらに培養した。【００９５】
緑色で小さいシュートの出てきた個体を選び、シュートの周りのカルスや葉片を切り取った後、１μｍｏｌ／ｍｌ  ＢＡ、０．１μｇ／ｍｌ  ＮＡＡと１００μｇ／ｍｌカナマイシン、３００μｇ／ｍｌカルベニシリンを含むＭＳ寒天培地に再び移し、サージカルテープで封をした。１００μｇ／ｍｌカナマイシン、１５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを含むＭＳ寒天培地を入れた管びん（Ф３９ｍｍ）にカルス部分をカットした個体を移し、根が出るまで培養した。土に移し、ビニールをかぶせて数日置いた後、ビニールを外し育て、種を回収した。【００９６】
詳細には、ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢを導入したカルスからは複数の緑色シュートが再生したので、ホルモンフリー培地にシュートを移して発根を促した。ｐｇｓＢ導入シュートでは発根が確認された。ｐｇｓＣ導入に関しては、Ｋａｎ耐性コロニーの出現と、耐性シュートと考えられる構造が確認された。ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢを導入した場合、異常な形態を示すシュートも見られたが、これはコントロールとしてｐＢＩ１２１を導入した場合でも見られたことから、カルスからの植物再生で一般的に見られる一過的な異常と考えられ、事実、一度完全に再生したシュートからは異常な形態を示す器官は形成されていない。【００９７】
Ｋａｎ耐性カルスの発達から、リーフディスク法によってｐｇｓＢ遺伝子が導入されたと考えられるタバコカルスにおけるｐｇｓＢ遺伝子発現を調べるため、後述の実施例１０の方法に従ってＲＴ−ＰＣＲを行なった。【００９８】
逆転写にはｍＲＮＡのｐｏｌｙ（Ａ）鎖に相補的なｏｌｉｇｏ（Ｔ）を持つＣＤＳ−ＰＲＩＭ（配列番号１５）を用いた。また、混在するＤＮＡを鋳型としたＰＣＲではないことを確認するため、ネガティブコントロールとしてＲＮａｓｅ処理をしたＲＮＡを用いて逆転写した。使用したＲＮＡ濃度は、０．２５ｍｇ／ｍｌ、０．０２５ｍｇ／ｍｌ、又はが０．００２５ｍｇ／ｍｌであった。【００９９】
ＰＣＲプライマーとしてｐｇｓＢのフォワード、およびリバースのプライマー（配列番号９，１０）を用いて増幅したところ、いずれの場合でもバンドが観察された。これは比較的多量にＤＮＡが混在するためにＰＣＲ増幅されたためと考えられるので、ｐｇｓＢのフォワードおよびリバースのプライマー（配列番号９，１０）の代わりに、ｐｇｓＢフォワードプライマーとＣＤＳ−ＰＲＩＭの５’側部分に相同なＳＭＡＲＴ−ＰＲ（配列番号１６）とをプライマーとしてＰＣＲ増幅したところ、ＲＮａｓｅ処理したＲＮＡからの逆転写産物は増幅されず、ＲＮａｓｅ処理していないＲＮＡの逆転写産物は用量依存的なシグナルを示すバンドが確認された。このことから、ｐｇｓＢ遺伝子を導入したタバコ葉片、およびカルス中ではｐｇｓＢ遺伝子のｍＲＮＡが発現していることが確かめられた。【０１００】
実施例７  減圧湿潤法による植物体への感染
シロイヌナズナを材料とした減圧湿潤法を用いて目的ＤＮＡを導入したアグロバクテリウムを植物体に感染させた。具体的には、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  Ｃｏｌの花序に、アグロバクテリウムを浸潤・感染させ、種子形成初期の細胞に遺伝子を直接導入する方法でＰＧＡ合成遺伝子の導入を試みた。【０１０１】
先ず、メッシュで覆った土にシロイヌナズナの種を蒔き、花茎の高さが数センチになるまで育て、同じ長さになるよう一定の高さで摘心を行い、小さい花芽を切り取った。鉢の用土は十分吸水させ、花茎が再び伸長するまで１週間程度培養した。すでに開花した花は切除した。１００μｇ／ｍｌカナマイシン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＬＢ液体培地で２８℃、一晩振盪培養した実施例５のアグロバクテリウムの縣濁液を集菌し、縣濁用培地（１／２  ＭＳ塩、１／２  Ｇａｍｂｏｒｇ  Ｂ５  ビタミン、５％  ショ糖、０．５ｇ／ｌ  ＭＥＳ、ＢＡＰ  １０ｍｌ／ｌ、０．０２％  Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７）に、ＯＤ６００が０．８になるように縣濁した。４００ｍｌビーカーに分取し、鉢を逆さにして植物体を縣濁液に浸けた。デシケーターに入れ、１０分減圧下に置いた。その後余分な縣濁液を落とし、トレイに横倒しに置き、トレイに少量の蒸留水を滴下して覆いを被せ１日置いた。覆いを外して、鉢を起こし、１週間水をやらずに育てた後、１０００倍希釈したハイポネックスでさらに２−３週間培養した。さやを収穫し、シリカゲルを入れた袋と共に置き、中の種子を収穫した。８０−１００μｌ乾燥種子を７０％エタノール中に２分、５％アンチホルミン−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中に１５分置き、滅菌水で水洗を３−５回行い、０．１％寒天水溶液（無菌）９ｍｌに縣濁した。１００μｇ／ｍｌカナマイシン、１００μｇ／ｍｌカルベニシリンを含む選択培地（ＭＳ塩、Ｇａｍｂｏｒｇ  Ｂ５  ｖｉｔａｍｉｎ、１％ショ糖、０．５ｇ／ｌ  ＭＥＳ、０．８％寒天）に広げ、サージカルテープで封をし、４℃で１週間静置した。その後２４℃で１週間程度培養し、耐性植物を上記と同様の選択培地に移した。本葉が５、６枚展開したら土に移し、種子を収穫した。【０１０２】
ｐｇｓＣの導入を試みた植物から採取した種子から、Ｋａｎ添加培地上で緑色の子葉・本葉を持って生育する芽生えが得られたので、現在バーミキュライトを用いた用土で培養している。ｐｇｓＡ及びｐｇｓＢについては耐性植物を選択している最中である。【０１０３】
実施例８  直接注入法による植物体への感染
本実施例では、タバコを材料にした直接注入法を用いて目的ＤＮＡを導入したアグロバクテリウムを植物体に感染させた。シリンゴシン存在下で培養したアグロバクテリウムはタバコ葉に注入すると、葉肉細胞に感染して一過的に導入遺伝子を発現することが知られている（Ｊｏｈａｎｓｅｎ  ａｎｄ  Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ２００１）。この方法で、一つの植物細胞に複数のアグロバクテリウムが感染して異種の遺伝子が同時に導入・発現できることが示唆されていることから、本研究でもｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣを別々に持つアグロバクテリウムを同時に感染させることによって一過的に葉肉中で同時に発現できるかどうかを調べた。【０１０４】
まず１００μｇ／ｍｌカナマイシン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２０μＭアセトシリンゴンを含むＬＢ液体培地で２８℃、一晩振盪培養した実施例５のアグロバクテリウム縣濁液を集菌し、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５．７）、１５０μＭアセトシリンゴンをＯＤ600が０．５になるように再懸濁した。３時間常温でインキュベートした後、タバコの葉に注射針で穴をあけ１ｍｌツベルクリンシリンジで葉肉中に注入した。３日後、葉を切り取り回収し、−８０℃で凍結保存した後、下記のＲＮＡ抽出に用いた。また、その葉を液体窒素で冷却した乳鉢で丹念にすりつぶし、１５ｍｌ  ＴＵＢＥに入れ、１００ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ４．５）３ｍｌを加えた。これを１．５ｍｌエッペンチューブに移し、２，０００×ｇ、４℃、１０分間遠心し、上清と沈殿に分けた。上清は−２０℃で保存し、沈殿部には１００ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ４．５）１５０μｌ加え、−２０℃で保存し、下記のＰＧＡ検定に用いた。【０１０５】
タバコの葉に注射針で穴を開け、シリンジでｐｇｓＡ＋ｐｇｓＢ、ｐｇｓＢ＋ｐｇｓＣ、ｐｇｓＣ＋ｐｇｓＡ、ｐｇｓＡ＋ｐｇｓＢ＋ｐｇｓＣの組合わせでアグロバクテリウムを注入した。３日後に葉からＲＮＡを抽出し、導入遺伝子からｍＲＮＡ転写が行われているかＲＴ−ＰＣＲによって確認した。ＰＣＲプライマーとして、ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣのフォワードプライマー（各々配列番号７、９、１１）と、逆転写に用いたプライマーの一部分に相同性のあるＳＭＡＲＴ−ＰＲ（配列番号１６）を用いた。電気泳動ではスメアが見られるのみで、予想される分子量のバンドは得られなかった。【０１０６】
後述の実施例１１で作成された、抗ＰＧＡポリクローナル抗血清を用いてＰＧＡ生産の有無を検定した（図４、５）。当初調製された抗血清は力価が低く、直接メンブレンにドットブロットしたＰＧＡを検出できなかった。そこで、ＥＤＣによる架橋によりＢＳＡと種々のタンパク質（ＰＧＡを検出を含む）との凝集が生成する、という性質を利用して、タバコ葉抽出液中のＰＧＡとＢＳＡをＥＤＣを用いて共有結合させた。次いで、遠心により上清と沈殿を分けた。【０１０７】
それぞれ架橋体サンプル等倍、１／１０、１／１００倍をメンブレンにスポットした。ＡＢＣ法を用いた免疫化学的検出により、沈殿部のサンプル等倍、１／１０倍に薄い発色が見られた。【０１０８】
実施例９  形質転換植物のＲＮＡ抽出
実施例６−８によって形質転換した個体における、導入遺伝子のＲＮＡ発現を調べるため、ＲＮＡを抽出した。【０１０９】
形質転換した個体のカルス部分、もしくは葉を液体窒素で冷却した乳鉢で丹念にすりつぶした。次にＲＮＡ抽出Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、３％  ＳＤＳ）  ３ｍｌ、フェノール（０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で飽和）  １ｍｌを加え、室温で２０分振盪した。次にクロロホルム：イソアミルアルコール混合溶液１ｍｌ（ｖ／ｖ、２４：１）を加えて激しく縣濁した後、２，０００×ｇ、室温で２０分間遠心した。中間層のタンパク質の沈殿を吸わないように注意しながら水相（上層）を滅菌した蓋付き遠沈管に移し、これに対し１／３倍量の１０Ｍ  ＬｉＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）２００μｌを加え−２０℃で一晩静置した。再び２，０００×ｇ、４℃、６０分間遠心し、上清を完全に除去した後、沈殿に２Ｍ  ＬｉＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）１ｍｌを加え−２０℃で１時間静置した。再び２，０００×ｇ、４℃、６０分間遠心し、上清を完全に除去した後、滅菌水を４００μｌ加えて沈殿を溶かし、溶液を１．５ｍｌのマイクロチューブに移した。フェノール・クロロホルム抽出法に従い、核酸の精製を行った。３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）２０μｌ、９９％エタノール１ｍｌを加えてよく混ぜた後、−２０℃で一晩静置した。１５，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心して生じた沈殿を７０％エタノールで洗った後エタノールを完全に除去し、沈殿を風乾させた後に滅菌水を５０μｌ加えてこれを溶解させた。【０１１０】
実施例１０  ＲＮＡ発現を調べるＲＴ−ＰＣＲ法
導入遺伝子の発現を調べるため、上記のように抽出したＲＮＡを鋳型にしてＲＴ−ＰＣＲ法を行った。【０１１１】
まず溶液中のＲＮＡ量を量るため、１μｌを１ｍｌの滅菌水に溶かし、分光光度計で吸光度を測った。Ａ260＝２０のとき、ＲＮＡ量を１ｍｇ／ｍｌとして濃度を計算した。【０１１２】
次にＲＮＡの逆転写を行うため、ＲＮＡ  ２μｌ（５ｍｇ／ｍｌ）にＣＤＳ  ｐｒｉｍ  （配列番号１５）１μｌを加え、全量を５μｌとし、軽く遠心した後、９５℃で５分間インキュベートした。５０℃に冷却してからｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ  各２ｍＭ）１０μｌ、５×ＲＴ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４μｌ、ＲＮＡ阻害剤  ０．５μｌ、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ）  １μｌを加え、５０℃、６０分インキュベートした。【０１１３】
できたサンプル１μｌにｒＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ０．０５μｌ、１０×ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ  １μｌ、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ  各２ｍＭ）１μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2  １μｌ  、ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣそれぞれの１０μＭプライマーｆｏｗａｒｄ（配列番号７、９、１１）、１０μＭ、  ＳＭＡＲＴ−ＰＲ  ２Ｍ（配列番号１６）ともに０．５μｌを加えて滅菌水で全量を１０μｌとし、９４℃２分を１回、９４℃３０秒、５９℃３０秒、７２℃９０秒のＰＣＲサイクルを３３回インキュベートを行った。これを上記同様電気泳動し、ＵＶでバンドを確認した。【０１１４】
実施例１１  マウスを用いたポリクローナル抗体の作成
ＰＧＡに対する抗体を作成するため、マウスを用いてポリクローナル抗体を作成した。【０１１５】
乾固したＲＩＢＩ  アジュバント（ＭＲＬ＋ＴＤＭ  乳液）にＰＢＳ（１００ｍＭ  ｐｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１５０μＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ  ７．２）２ｍｌを加え、回転板で数分回転して十分に縣濁した。アジュバント  ２００μｌにＰＧＡ（ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍｌ）を１：１（ｖ／ｖ）で加えた。初回は７０％エタノールで消毒したマウスの腹部に２カ所、１００μｌずつ皮下注射した。その後２週間毎に、１カ所に１５０μｌ皮下注射した。３回目の一週間後からマウスの尾を切り、採血を行った。この血を３０分放置して固め、１０，０００ｒｐｍ、１０分間遠心した。上清を取り、等量のＰＢＳを加えたものを抗血清として以下の実験に用いた。【０１１６】
実施例１２  ＰＧＡとＢＳＡの結合タンパク質の調製
ウエスタンブロッティングを行う際にニトロセルロース膜とＰＧＡを結合させるため、ＥＤＣを用いてＢＳＡとの結合タンパク質を調製した。【０１１７】
結合バッファー（０．１Ｍ  ＭＥＳ，ｐＨ４．５）２００μｌに溶かしたＢＳＡ  ２ｍｇと、結合バッファー  ５００μｌに溶かしたＰＧＡ  ２ｍｇを混合した。【０１１８】
１０ｍｇ／ｍｌＥＤＣ［１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩］を１００μｌ加え、常温で２時間反応させた。１５，０００ｒｐｍ、１分遠心し、上清を捨てた。結合バッファーをピペッティングで混合し、再び遠心し、上清を捨てた。この操作を３回繰り返した。ＰＢＳを１ｍｌ加えて良く縣濁したものをＰＧＡ−ＢＳＡ結合タンパク質として実施例１３の実験に用いた。【０１１９】
実施例１３  マウス血清を用いたＰＧＡの免疫学的検出
実施例１１の血清と実施例１２の結合タンパク質を用いたＡＢＣ法によるドットブロッテイングを行った。即ち、天然のＰＧＡを抗原に、アジュバンドとともにマウスに皮下注射を繰り返し、抗ＰＧＡ血清の抗原抗体反応をドットプロットで検出することを試みた。【０１２０】
まずニトロセルロース膜を適当な大きさに切り、ＰＢＳで１倍、１０倍、１００倍希釈したＰＧＡ−ＢＳＡ結合タンパクを膜にスポットし、乾くまで静置した。膜にＵＶを３０秒照射してメンブレンバックに入れ、軽く遠心した飽和カゼインを５００μｌ加え、口を閉じ３０分間室温で振盪した。バックからカゼインを除き、カゼインで２００倍希釈した血清を加え、口を閉じ３０分間室温で振盪した。その後、バックから取り出した膜をＰＢＳＴ（ＰＢＳ中、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）を３ｍｌ加えたタッパーで、５分洗浄することを３回繰り返した。新しいバックにメンブレンを入れ、カゼイン溶液で希釈した０．６％  ２次抗体（ウマ中で作成された、ビオチン化万能性抗体）を５００μｌ加え、口を閉じて３０分間室温で振盪した。バックから取り出したメンブレンをＰＢＳＴ  を３ｍｌ加えたタッパーで、５分洗浄することを３回繰り返した。新しいバックにメンブレンを入れ、予め５００μｌのカゼインにアビジン（ＡＢＣ−ＡＰ  ＲＥＡＧＥＮＴ  Ａ）３μｌとビオチン化アルカリホスファターゼ（ＡＢＣ−ＡＰ  ＲＥＡＧＥＮＴ  Ｂ）３μｌを混合して３０分静置したものを加えて口を閉じて３０分間室温で振盪した。バックから取り出したメンブレンをＰＢＳＴを３ｍｌ加えたタッパーで、５分洗浄することを３回繰り返した。１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを浸したタッパーで５分洗浄し、新しいバックにメンブレンを入れ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで希釈した１．２％（ｖ／ｖ）基質（ＢＣＩＰ、ＮＢＴ、ＭｇＣｌ2）５００μｌを加えた後、口を閉じ、一晩暗所に置いて発色させた。【０１２１】
始めにメンブレンに直接ＰＧＡをスポットして反応を検出しようと数回実験を繰り返したが、シグナルは検出されなかった。この理由をアミドブラック染色により検討したところ、抗体の力価が当初低かったことに加え、ＰＧＡのメンブレンヘの結合が弱く、操作中にメンブレンから遊離してしまうためと考えられた。そこで、ＥＤＣを用いてＰＧＡをＢＳＡに共有結合的に結合させ、ＢＳＡを介してメンブレンへ結合させたところ、２．５ｍｇ／ｍｌＰＧＡを含むＢＳＡ複合体の２μ１スポットに強いシグナルが観察された（図６）。０．２５ｍｇ／ｍｌＰＧＡではごく弱いシグナルが見られ、０．０２５ｍｇ／ｍｌ  ＰＧＡや陰性対照の２ｍｇ／ｍｌＢＳＡではシグナルは観察されなかった。【０１２２】
当初用いた１次抗血清は抗原投与から９週目のもので、それ以前の血清ではシグナルは得られなかった。ＰＧＡは可溶性の比較的単純なポリペプチドであることから、力価がなかなか上がらなかったと考えられる。より反応性の高い抗血清を得るため、継続的に抗原（ＰＦＡ）を投与し続けた結果、力価の高い抗血清が得られ、ＰＧＡとＢＳＡを架橋しない場合でもメンブレン上でシグナルを検出可能となった。【０１２３】
実施例１４  植物細胞におけるｐｇｓ遺伝子群の機能解析
前述の三種のポリグルタミン酸生合成酵素遺伝子（ｐｇｓＡ，ｐｇｓＢ，ｐｇｓＣ）の植物細胞内での機能を明らかにするために、三種のｐｇｓ遺伝子を構成的に発現する形質転換タバコ（Ｎ．ｔａｂａｃｃｕｍ）を作出した。【０１２４】
実施例２で作成した各ｐｇｓ遺伝子を含むプラスミドベクター（ｐＧＥＭ−Ｔ  ＥＡＳＹ，  Ｐｒｏｍｅｇａ社）を０．１ｎｇを鋳型とし、以下の条件でＰＣＲによる増幅を行った。ＰＣＲ反応液（５０μｌ）は、各ｐｇｓ遺伝子を含むプラスミド  ０．１ｎｇ、１×ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ｂｕｆｆｅｒ（ＴＯＹＯＢＯ）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、制限酵素サイトを含むプライマー（配列番号１７−２２）各０．４ｐｍｏｌ／μｌ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ4、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  １Ｕからなる。９４℃で５分間反応させた後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の反応を３０サイクル行った。この各ｐｇｓ遺伝子の完全長を含む増幅断片を、ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ  ＩＩ  ＴＯＰＯベクター（インヴィトロジェン社）のマルチクローニングサイトに挿入し、ＴＯＰＯ−ｐｇｓＡ（ｐＳＰＢ２６６７）、ＴＯＰＯ−ｐｇｓＢ（ｐＳＰＢ２６６８）、およびＴＯＰＯ−ｐｇｓＣ（ｐＳＰＢ２６６９）を得た。プライマーウォーキング法により、これらのサブクローニングしたｐｇｓ遺伝子の塩基配列を決定し、ＰＣＲによる変異がないことを確認した。【０１２５】
配列番号１７：（ＢａｍＨＩ−ｐｇｓＡ−ＦＷ）
５’−ａｇｇ  ｇｇａ  ｔｃｃ  ａｃｇ  ａｔｇ  ａａａ  ａａａ  ｇａａ  ｃｔｇ  ａｇｃ  ｔｔｔ  ｃａｔ  ｇａａ−３’
配列番号１８：（ＳａｃＩ−ｐｇｓＡ−ＲＶ）
５’−ａｇｇ  ｇａｇ  ｃｔｃ  ｔｔａ  ｔｔｔ  ａｇａ  ｔｔｔ  ｔａｇ  ｔｔｔ  ｇｔｃ  ａｃｔ  ａｔｇ  ａｔｃ  ａ−３’
配列番号１９：（ＢａｍＨＩ−ｐｇｓＢ−ＦＷ）
５’−ａｇｇ  ｇｇａ  ｔｃｃ  ｇｃａ  ａｔｇ  ｔｇｇ  ｔｔａ  ｃｔｃ  ａｔｔ  ａｔａ  ｇｃｃ  ｔｇｔ  ｇｃｔ−３’
配列番号２０：（ＸｈｏＩ−ｐｇｓＢ−ＲＶ）
５’−ａｇｇ  ｃｔｃ  ｇａｇ  ｃｔａ  ｇｃｔ  ｔａｃ  ｇａｇ  ｃｔｇ  ｃｔｔ  ｔａｃ  ｃｔｔ  ｇｔａ  ｔｔ−３’
配列番号２１：（ＫｐｎＩ−ｐｇｓＣ−ＦＷ）
５’−ａｇｇ  ｇｇｔ  ａｃｃ  ｇａｃ  ａｔｇ  ｔｔｃ  ｇｇａ  ｔｃａ  ｇａｔ  ｔｔａ  ｔａｃ  ａｔｃ  ｇｃａ−３’
配列番号２２：（ＢａｍＨＩ−ｐｇｓＣ−ＲＶ）
５’−ａｇｇ  ｇｇａ  ｔｃｃ  ｔｔａ  ａａｔ  ｔａａ  ｇｔａ  ｇｔａ  ａａｃ  ａａａ  ｃａｔ  ｇａｔ−３’。【０１２６】
ｐＳＰＢ２６６８をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩによって消化して得られるｐｇｓＢのＯＲＦを含む約１．２ｋｂのＤＮＡ断片を植物形質転換用バイナリーベクターであるｐＳＰＢ１７６（特開２００３−４３２３８３、ｖａｎ  Ｅｎｇｅｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅａｓｅｒｃｈ  ４，  ２８８−２９０，  １９９５）のＢａｍＨＩ部位およびＳａｌＩ部位に連結して、バイナリーベクターｐＳＰＢ２６７２を得た。ｐＳＰＢ１７６のマルチクローニングサイトは、ＣａＭＶ３５ＳプロモーターとＮＯＳターミネーターとの間にあり、この部位に挿入された断片は、植物細胞内においてＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下で構成的に過剰発現する。【０１２７】
次にｐＳＰＢ２６６７をＢａｍＨＩおよびＳａｃＩによって消化して得られるｐｇｓＡのＯＲＦを含む約１．１ｋｂのＤＮＡ断片をｐＳＰＢ５４１（特開２００３−４２００４６）のＢａｍＨＩ部位およびＳａｃＩ部位に連結して、ｐＵＣベクターｐＳＰＢ２６７０を得た。ｐＳＰＢ５４１のＢａｍＨＩおよびＳａｃＩサイトは、ＣａＭＶ３５ＳプロモーターとＮＯＳターミネーターとの間にあり、この部位に挿入された断片は、植物細胞内においてＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下で構成的に過剰発現する。【０１２８】
次に、ｐＳＰＢ２６６９をＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩによって消化して得られるｐｇｓＣのＯＲＦを含む約０．４５ｋｂのＤＮＡ断片をｐＳＦＬ２０３（特開２００３−４２００４６）のＫｐｎＩ部位およびＢａｍＨＩ部位に連結して、ｐＵＣベクターｐＳＰＢ２６７３を得た。ｐＳＦＬ２０３のＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩサイトは、ＣａＭＶ３５ＳプロモーターとＮＯＳターミネーターとの間にあり、この部位に挿入されたインサートは、植物細胞内においてＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下で構成的に過剰発現する。【０１２９】
次に、前述のｐＳＰＢ２６７３をＰａｃＩ消化することで得られる３５Ｓプロモーター、ｐｇｓＣ、およびＮＯＳターミネーターを含む約１．５ｋｂの断片を、前述のｐＳＰＢ２６７２ベクターのＰａｃＩサイトへ挿入し、バイナリーベクターｐＳＰＢ２６７４を得た。本バイナリーベクターは前述の配列番号１９及び２２を用いたＰＣＲにより、ｐｇｓＢと同じ転写報告にｐｇｓＣが挿入されていることを確認した。
次に、前述のｐＳＰＢ２６７０をＡｓｃＩ消化することで得られる３５Ｓプロモーター、ｐｇｓＡ、およびＮＯＳターミネーターを含む約２．１ｋｂの断片を、前述のｐＳＰＢ２６７４ベクターのＡｓｃＩサイトへ挿入し、最終的に、ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ、およびｐｇｓＣを構成的に発現するバイナリーベクターｐＳＰＢ２６８０を得た。本バイナリーベクターは前述の配列番号１７及び２０を用いたＰＣＲにより、ｐｇｓＢと同じ転写報告にｐｇｓＡが挿入されていることを確認した。【０１３０】
公知の方法（下西ら、新・生物化学実験のてびき３．化学同人（１２２−１２４頁））に従って、ｐＳＰＢ２６８０を用いてアグロバクテリウム（菌株：Ａｇｌｏ）を形質転換し、このｐＳＰＢ２６８０を有する形質転換体アグロバクテリウムをタバコリーフディスクに感染させた。カナマイシン選抜により、最終的に独立した２０系統の形質転換タバコを得た。【０１３１】
次に、この形質転換タバコからＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した後、このｔｏｔａｌＲＮＡ１μｇを鋳型として製造業者が推奨する条件に従って逆転写反応（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔTM  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（インヴィトロジェン社））を行い、ｃＤＮＡを得た。引き続き、このｃＤＮＡを用いて配列番号１７−２２のプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲによる発現解析を行った。ＰＣＲ反応液（２５μｌ）は、各ｃＤＮＡ  １μｌ、１×Ｅｘ−Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、プライマー各０．２ｐｍｏｌ／μｌ、およびＥｘ−Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  １．２５Ｕからなる。９４℃で３分間反応させた後、９４℃で１分間、５３℃で１分間、７２℃で２分間の反応を２８サイクル行った。【０１３２】
発現量を比較するための内部標準遺伝子としてのタバコのユビキチン遺伝子（ＮｔＵＢＱアクセッション番号：Ｕ６６２６４）を、配列番号２３および２４に示されるヌクレオチド配列からなるプライマー（それぞれＮｔＵＢＱ−ＦＷおよびＮｔＵＢＱ−ＲＷ）を用いて増幅した。【０１３３】
配列番号２３  ＮｔＵＢＱ−ＦＷ
５’−ｇｇａａｔｇｃａｇａ  ｔｃｔｔｃｇｔｃａａ−３’
配列番号２４    ＮｔＵＢＱ−ＲＷ
５’−  ｃｃｔａｇａａａｃｃ  ａｃｃａｃｇｇａ−３’。【０１３４】
ＲＴ−ＰＣＲ産物を１％アガロースで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色により、増殖断片を解析した。その結果を図８に示す。形質転換タバコ（ＰＧＳｏｘ．）の形質転換系統１０、１１及び２１で三種のｐｇｓ遺伝子の異所的な発現が確認された。一方、コントロールの非形質転換タバコ（ＮＴ）においてはｐｇｓ遺伝子の発現は認められなかった。このように、３種のｐｇｓ遺伝子を共発現する形質転換タバコが得られた。また、これ以外に、３種のｐｇｓ遺伝子のうち、２種を発現しているものが４つ、１種を発現しているものが４つ得られた。【０１３５】
さらに、３種のｐｇｓ遺伝子の異所的な発現を確認した形質転換系統の葉粗抽出液内において、ウエスタンブロットを用いて疫学的にｐｇｓタンパク質の蓄積を確認した。ウエスタンブロットは具体的には以下のように行った。【０１３６】
１．液体窒素を加えながら植物をすりつぶす。【０１３７】
２．氷上中、１００ｍＭ  ＭＥＳを３ｍｌ加える。【０１３８】
３．１５，０００ｒｐｍ、１０分  遠心を行う。【０１３９】
４．上澄みをＭＥＳで希釈したものをウエスタンブロットサンプルする。【０１４０】
５．ニトロセルロースメンブレン*1に２μｌスポットし、３０分程度放置する。【０１４１】
６．メンブレンバック（厚手のビニール袋）に入れ、カゼイン飽和液*2を適量（膜全体が浸かる程度）入れ、室温で３０分間振盪する。【０１４２】
７．カゼイン飽和液を捨て１次抗体（血清をカゼイン飽和液で２００倍希釈したもの）を適量加え、室温で３０分間振盪する。【０１４３】
８．メンブレンを取り出し、ＰＢＳＴ（ＰＢＳにＴｗｅｅｎ２０を０．１％加えたもの）を適量浸して５分間振盪洗浄する。【０１４４】
９．８を３回繰り返す
１０．２次抗体液［２次抗体（ＢＩＯＴＩＮＹＴＥＤ  ＵＮＩＶＥＲＳＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＹ*3）３μｌに対しカゼイン飽和液０．５ｍｌの割合で加えたもの］を新しいメンブレンバックに入れ、室温で３０分振盪する。【０１４５】
１１．メンブレンを取り出し、ＰＢＳＴを適量浸して５分間振盪洗浄する。【０１４６】
１２．１１を３回繰り返す。【０１４７】
１３．アビジン、ビオチン混合液［アビジン（ＡＢＣ−ＡＰ−Ａ*3）３μｌ、ビオチン（ＡＢＣ−ＡＰ−Ｂ*3）３μｌに対しカゼイン飽和液０．５ｍｌを加えたもの］を作り、３０分程度放置したものを新しいメンブレンバックに入れ、室温で３０分振盪する。【０１４８】
１４．メンブレンを取り出し、ＰＢＳＴを適量浸して５分間振盪洗浄する。【０１４９】
１５．１１を３回繰り返す。【０１５０】
１６．１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌを適量メンブレンに浸し、５分間振盪洗浄する。【０１５１】
１７．基質液［基質１（ＢＣＩＰ−１*3）６μｌ、基質２（ＢＣＩＰ−２*3）６μｌ、基質３（ＢＣＩＰ−３*3）６μｌに対し１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ  ０．５ｍｌを加えたもの］を新しいメンブレンバックに入れ、室温でオーバーナイト放置する。
＊１  ＭＳＩ社のＮＩＴＯＲＯ  ＰＬＵＳを使用。【０１５２】
＊２  カゼイン（乳製）をＰＢＳに飽和量溶かしたもの。カゼインは和光純薬工業株式会社のものを使用。【０１５３】
＊３  ｔｈｅ  ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ社のＡＢＣ  ｓｙｓｔｅｍを使用。【０１５４】
結果を図９に示す。図９に示されたように、形質転換系統１０、１１及び２１のいずれでもｐｇｓタンパク質の蓄積が確認された。【０１５５】
実施例１５  形質転換タバコのアルミニウムイオン存在下での効果
本実施例では、本発明の形質転換タバコをアルミニウム存在下での緑化効果及び成長阻害に対する効果を調べた。【０１５６】
プラスチックシャーレ（φ８５ｘ１３ｍｍ）にろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ，１）を１枚敷き、０，０．０４又は０．０８％のＡｌＣｌ3（ＫＯＨにてｐＨ３．７５に調製）を３ｍｌ加えて、３ｍｍ幅のプラスチックシートでろ紙を４等分するように区分けした。各区に野生型（ＷＴ）、ｐｇｓＡＢＣで形質転換したタバコ系統１、１０、２１の種子を播種し、ふたをしてサージカルテープで周囲を閉じて、連続白色光照射、２５℃で１０日間インキュベートした。【０１５７】
６日目に１ｍｌの０，０．０４又は０．０８％  ＡｌＣｌ3を追加して、乾燥を防いだ。ＡｌＣｌ3を含まないコントロールでは、いずれも根は伸長し、子葉にも差はなかった。また、０．０８％  ＡｌＣｌ3では、いずれも根の伸張が著しく抑制され、子葉はほとんど褐変して系統間に差は認められなかった。【０１５８】
しかし、０．０４％  ＡｌＣｌ3で子葉に差が見られた。代表的な芽生えを図１０に示す。子葉の緑化がＷＴでは強く抑えられていたのに対し、本発明の形質転換タバコ１、１０、２１では緑化されていた。【０１５９】
クロロフィル量を測定するため、０．０４％  ＡｌＣｌ3実験区から芽生え１２個体をランダムに収穫し、１２０μｌアセトン存在下でホモジナイズした。２０，０００ｘｇで５分間遠心し、上清の６５２ｎｍの吸光度を分光光度計で測定した。吸光係数を３４．５ｍｇ-1ｍｌｃｍ-1とし、クロロフィル濃度を求めたところ、図１１のようになり、形質転換体は野生型に比べて有意にクロロフィル量が多く（Ｐ＜０．０５）、ＡｌＣｌ3による成長阻害が軽減されていることが明らかになった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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