(57)【要約】積極的に骨形成を促進して骨疾患を予防・治療することができる顕著な効果を有する骨形成並びに骨塩量増進作用を有する骨形成促進並びに骨塩量増進組成物や、骨疾患の予防・治療薬や、骨疾患の予防・治療用機能性食品又は食品素材や、飼料用組成物を提供するものである。それぞれ単独では有意な骨カルシウム量の増加効果を奏しない濃度でβ-クリプトキサンチン及び亜鉛化合物とを有効成分とする骨形成並びに骨塩増進組成物や、骨疾患の予防・治療薬を調合する。また、食品若しくは食品素材又は飼料に、それぞれ単独では有意な骨カルシウム量の増加効果を奏しない濃度でβ-クリプトキサンチンと亜鉛化合物とを添加・配合する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−クリプトキサンチン及び亜鉛化合物を有効成分として含有することを特徴とする骨形成促進並びに骨塩量増進組成物。
【請求項２】
β−クリプトキサンチン及び亜鉛化合物が、それぞれ単独では骨組織中カルシウム量を増加する作用を発揮しない濃度で含有されていることを特徴とする請求項１記載の骨形成促進並びに骨塩量増進組成物。
【請求項３】
β−クリプトキサンチン及び亜鉛化合物を有効成分として含有することを特徴とする骨疾患の予防・治療薬。
【請求項４】
β−クリプトキサンチン及び亜鉛化合物が、それぞれ骨組織中カルシウム量を増加する作用を発揮しない濃度で含有されていることを特徴とする請求項３記載の骨疾患の予防・治療薬。
【請求項５】
骨疾患が骨粗鬆症であることを特徴とする請求項４記載の骨疾患の予防・治療薬。
【請求項６】
β−クリプトキサンチン及び亜鉛化合物を添加したことを特徴とする骨疾患の予防・治療用機能性食品又は食品素材。
【請求項７】
β−クリプトキサンチン及び亜鉛化合物が、それぞれ単独では骨組織中カルシウム量を増加する作用を発揮しない濃度で含有されていることを特徴とする請求項６記載の骨疾患の予防・治療用機能性食品又は食品素材。
【請求項８】
骨疾患が骨粗鬆症であることを特徴とする請求項７記載の飲食品。
【請求項９】
β−クリプトキサンチン及び亜鉛化合物を配合したことを特徴とする飼料用組成物。
【請求項１０】
β−クリプトキサンチン及び亜鉛化合物が、それぞれ単独では骨組織中カルシウム量を増加する作用を発揮しない濃度で配合されていることを特徴とする請求項９記載の飼料用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β−クリプトキサンチン及び亜鉛化合物を有効成分とする骨形成並びに骨塩量増進組成物、骨粗鬆症等の骨疾患の予防・治療薬、β−クリプトキサンチン及び亜鉛化合物を添加した骨粗鬆症等の骨疾患の予防・治療用機能性食品又は食品素材や飼料用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨の代謝異常や骨形成不全等により、骨中のカルシウム量の減少などが生じて、種々の骨疾患が起こると考えられており、骨疾患の代表として骨折、骨軟化症、骨減少症、骨粗鬆症、腰背痛等が知られている。特にこれら骨疾患の中でも骨粗鬆症は、加齢による骨吸収と骨形成のバランスが崩れることで、相対的に骨吸収が優位となるために骨量の減少が起こり、骨の微細構造の変化により骨の強度が低下し、骨折が起こりやすくなる病態を示す。特に女性の場合には、閉経や卵巣摘除などにより骨量の減少は急速に起こる。骨粗鬆症になると、骨折したり、激しい痛みなどを伴うだけでなく、特に老人の寝たきりの原因ともなるため、高齢化社会における生活の質の向上という観点からも、有効な治療法が求められている。骨粗鬆症は発症してから治療するのは困難であることから、予防に努めることが重要であり、若年期から骨量を増やすことが不可欠で、日常的に骨形成に必要な栄養成分や、骨形成を促進する食品を積極的に摂取するようにしなければならないことが深く認識されるようになった。骨を強化する食品としては、現在、主にカルシウムやマグネシウム、ビタミンＤが利用されている。また、カルシウムの腸管からの吸収を促進するカゼインホスホペプチドなども利用されている。【０００３】
骨粗鬆症等の骨疾患の治療薬としては、活性型ビタミンＤ３や女性ホルモン（エストロゲン）、カルシトニン、イプリフラボン類が臨床に用いられ、ビタミンＫ２に代表されるポリイソプレノイド誘導体の破骨細胞形成抑制作用に基づく抗骨粗鬆症剤（例えば、特許文献１参照。）も提案されている。また、カゼインホスホペプチド及びゲニステインを有効成分として含有する骨強化剤（例えば、特許文献２参照。）、サポニン、ダイジン、ダイゼイン、ゲニスチン及びゲニスティンを主たる有効成分とする骨形成促進及び抗骨粗鬆症組成物（例えば、特許文献３参照。）、ワサビ抽出物を有効成分とし、抗骨粗鬆症作用を発揮する骨量増進組成物（例えば、特許文献４参照。）、イソフラボンを主たる有効成分とする骨形成促進及び骨塩量減少防止用組成物（例えば、特許文献５参照。）が知られている。【０００４】
一方、β−クリプトキサンチン（β−cryptoxanthin；分子量５５２）はエタノール溶解性のカロテノイドとして知られ、カンキツ類の中では温州みかんに圧倒的に多く含まれ、果実１個に１〜２ｍｇ含まれている。このβ−クリプトキサンチンは、栄養成分としてプロビタミンＡの特性を備えているだけでなく、最近の抗癌性物質の研究においては、人参等の緑黄色野菜に含有されているカロチノイドであるβ−カロチンよりも高い抗癌作用を有することが明らかになり関心を集めている（例えば、非特許文献１参照。）。このようにβ−クリプトキサンチンは発癌抑制成分として重要であることから、β−クリプトキサンチンを強化した柑橘系統や柑橘加工食品の開発に役立てるため、温州みかんに匹敵するβ−クリプトキサンチン含量の高品質柑橘類作出や、β−クリプトキサンチンを合成する遺伝子の単離（例えば、特許文献６、特許文献７参照。）、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属の細菌種を用いてβ−クリプトキサンチン等のカロチン類を生産する方法（例えば、特許文献８参照。）、みかん果汁を圧搾して得られた原料沈澱物等から高純度β−クリプトキサンチンの製造方法（例えば、特許文献９参照。）等が提案されている。さらに最近、本発明者は、β−クリプトキサンチンを有効成分とする骨形成促進剤やβ−クリプトキサンチンは骨組織培養系で４８時間培養で、１０−８〜１０−６Ｍ濃度において骨形成を増進し、骨カルシウムが増加することを報告している（例えば、特許文献１０、非特許文献２参照。）。【０００５】
他方、骨形成に関し、微量元素の１つである亜鉛化合物が骨形成を増進し、骨吸収をも抑制することによって、各種の実験的骨病態モデル動物において、修復効果のあることが報告されている（例えば、非特許文献３参照。）。さらに、本発明者は、亜鉛が１０−４Ｍ以上の濃度で骨タンパク質合成を促進して、骨形成の増進に基づく骨カルシウム増量効果を発現することを報告している（例えば、非特許文献４参照。）。その他、骨形成促進剤として、イソフラボンと亜鉛塩（例えば、特許文献１１参照。）、イソフラボンと有機態亜鉛（例えば、特許文献１２参照。）や、抗骨粗鬆症組成物として、ビタミンＫと亜鉛（例えば、特許文献１３参照。）を用いることが知られている。【０００６】
しかしながら、β−クリプトキサンチンと亜鉛化合物の併用によって骨カルシウム量が相乗的に高められることについては全く不明であり、さらに、単独で有意な骨カルシウム量増加効果を発揮しない濃度（量）で、それら併用により相乗的効果が発現されることについても全く知られていない。【０００７】
【特許文献１】特開平７−２１５８４９号公報
【特許文献２】特開２００１−３０２５３９号公報
【特許文献３】特開２０００−１９１５２６号公報
【特許文献４】特開平１０−２７９４９２号公報
【特許文献５】特開平１０−１１４６５３号公報
【特許文献６】特開平１１−１５５５７７号公報
【特許文献７】特開平１１−４６７７０号公報参照
【特許文献８】特表２００１−５１２０３０号
【特許文献９】特開２０００−１３６１８１号公報
【特許文献１０】国際公開第２００４／０３７２３６号パンフレット
【特許文献１１】特開平１０−１１４６５３号公報
【特許文献１２】特開平１１−３４６７１６号公報
【特許文献１３】特開平１０−３６２５６号公報
【非特許文献１】「Biological & Pharmaceutical Bulletin」,18,2,227,1995
【非特許文献２】「Molecular and Cellular Biochemistry」,258,p137-144,2004
【非特許文献３】杉山産業化学研究所年報（平成８年）、財団法人杉山産業化学研究所、平成９年１月３０日、ｐ．８５−９３
【非特許文献４】「Biochemical Pharmacology 」，36，ｐ4007−4012，1987
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、骨粗鬆症に代表される骨疾患において我が国で現在認可されているいくつかの治療剤は骨吸収抑制剤（骨が溶けるのを抑制する）が主であり、唯一メバロン酸合成阻害剤であるスタチンに骨形成促進作用があるとの報じられたが、遺伝子レベルの知見であり、実際には、骨形成促進効果は弱いものであった。また、欧米ではヒト型遺伝子組み換え副甲状腺ホルモンが使用されているが、副作用の面からその使用は制限されている。本発明の課題は、積極的に骨形成を促進して骨疾患を予防・治療することができる顕著な効果を有する骨形成並びに骨塩量増進作用を有する骨粗鬆症等の骨疾患の予防・治療に有用な飲食品、薬剤、飼料を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、温州みかんの表皮と果肉に多く存在するβ−クリプトキサンチンに骨形成促進作用及び骨疾患の予防・治療作用があることを報告している（非特許文献３参照）。すなわち、β−クリプトキサンチンを含む培養液中で大腿骨の骨幹部と骨幹端部組織を培養し、その骨組織中のカルシウム量、骨石灰化促進酵素の発現量、骨組織中の細胞数指標となるＤＮＡ量を測定し、いずれにおいても有意な上昇を確認し、β−クリプトキサンチンが、大腿骨組織の海綿骨（骨幹端部組織）及び皮質骨（骨幹部組織）におけるタンパク質合成を増進し、骨形成を増大する作用を有することを見い出しているが、骨形成の増進作用や骨カルシウム量の増加作用に有効なβ−クリプトキサンチン濃度は、骨組織培養系での４８時間培養系において１０−８〜１０−６Ｍ濃度であった。しかし、β−クリプトキサンチンは、柑橘類特に温州みかんから分離、抽出する方法、遺伝子的方法、微生物培養による方法等種々の方法により得られるとしても、安価に得られるとはいえないので、できるだけ低濃度で同様の効果を奏する他の化合物との併用を検討した。【００１０】
一方、近年、骨組織中に亜鉛が多く含まれることから、亜鉛の骨形成との関わりが研究され、亜鉛の骨形成作用が確認されている。亜鉛は食品に広く含まれるが、日本人の平均摂取量は６〜１２ｍｇであり、推奨量（成人１５ｍｇ、四訂食品成分表１９９６、ｐ４４１  女子栄養出版部）に対し不足気味である。したがって、通常の食事による亜鉛単独の骨作用では十分とはいえない。本発明者は、かかる事情に鑑み、β−クリプトキサンチンと併用する化合物として前記の亜鉛化合物を選択し、検討したところ、意外にも両化合物単独では骨形成促進及び骨塩量増進効果を奏し得ない濃度において相乗的効果が発現されることを見い出し、本発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち本発明は、（１）β−クリプトキサンチン及び亜鉛化合物を有効成分として含有することを特徴とする骨形成促進並びに骨塩量増進組成物や、（２）β−クリプトキサンチン及び亜鉛化合物が、それぞれ単独では骨組織中カルシウム量を増加する作用を発揮しない濃度で含有されていることを特徴とする上記（１）記載の骨形成促進並びに骨塩量増進組成物や、（３）β−クリプトキサンチン及び亜鉛化合物を有効成分として含有することを特徴とする骨疾患の予防・治療薬に関する。【００１２】
また本発明は、（４）β−クリプトキサンチン及び亜鉛化合物が、それぞれ骨組織中カルシウム量を増加する作用を発揮しない濃度で含有されていることを特徴とする上記（３）記載の骨疾患の予防・治療薬や、（５）骨疾患が骨粗鬆症であることを特徴とする上記（４）記載の骨疾患の予防・治療薬や、（６）β−クリプトキサンチン及び亜鉛化合物を添加したことを特徴とする骨疾患の予防・治療用機能性食品又は食品素材や、（７）β−クリプトキサンチン及び亜鉛化合物が、それぞれ単独では骨組織中カルシウム量を増加する作用を発揮しない濃度で含有されていることを特徴とする上記（６）記載の骨疾患の予防・治療用機能性食品又は食品素材に関する。【００１３】
さらに本発明は、（８）骨疾患が骨粗鬆症であることを特徴とする上記（７）記載の飲食品や、（９）β−クリプトキサンチン及び亜鉛化合物を配合したことを特徴とする飼料用組成物や、（１０）β−クリプトキサンチン及び亜鉛化合物が、それぞれ単独では骨組織中カルシウム量を増加する作用を発揮しない濃度で配合されていることを特徴とする上記（９）記載の飼料用組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】骨組織培養系における骨組織（骨幹部及び骨幹端部）中のカルシウム量の測定結果を示す図である。
【図２】骨組織培養系における骨組織（骨幹部及び骨幹端部）中のカルシウム量の測定結果を示す図である。
【図３】骨組織培養系における骨組織（骨幹部及び骨幹端部）中のアルカリ性ホスファターゼ活性の測定結果を示す図である。
【図４】骨組織培養系における骨組織（骨幹部及び骨幹端部）中のＤＮＡ量の測定結果を示す図である。
【図５】経口投与における骨組織（骨幹部及び骨幹端部）中のカルシウム量の測定結果を示す図である。
【図６】経口投与における骨組織（骨幹部及び骨幹端部）中のアルカリ性ホスファターゼ活性の測定結果を示す図である。
【図７】経口投与における骨組織（骨幹部及び骨幹端部）中のＤＮＡ量の測定結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の骨形成並びに骨塩量増進組成物としては、β−クリプトキサンチンと亜鉛化合物を有効成分として含有するものであれば特に制限されるものではなく、また、本発明の骨疾患の予防・治療薬としては、β−クリプトキサンチンと亜鉛化合物を有効成分として含有するものであれば特に制限されるものではなく、また、本発明の骨疾患の予防・治療用機能性食品又は食品素材としては、β−クリプトキサンチンと亜鉛化合物を添加した骨疾患の予防・治療機能を有する食品や食品素材であれば特に制限されるものではなく、さらに、本発明の飼料用組成物としては、β−クリプトキサンチンと亜鉛化合物を配合したものであればどのようなものでもよく、上記骨疾患としては、骨折、骨軟化症、骨減少症、骨粗鬆症、腰背痛等を挙げることができ、中でも、閉経後骨粗鬆症、エストロゲン欠乏性骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、ステロイド誘発骨粗鬆症等の骨粗鬆症や骨軟化症などの代謝性骨疾患を好適に例示することができる。また、上記機能性食品又は食品素材における「骨疾患の予防・治療用」とは、例えば、食品又は食品素材の包装体や添付の説明書に、骨疾患の予防や治療に有効である旨の表示が付されていることを意味する。【００１６】
本発明におけるβ−クリプトキサンチンとしては、β−クリプトキサンチンの他、β−クリプトキサンチン含有物を有利に用いることができる。β−クリプトキサンチンの製法としては、柑橘類から抽出・生成する方法や、β−クリプトキサンチン産生酵素をコードする遺伝子を利用する方法、β−クリプトキサンチンを生産する微生物を培養して得るなど公知の方法を含め特に制限されないが、その供給源として、１個当たり１〜２ｍｇ含まれ、β−クリプトキサンチンを高含有する温州みかんを用いることが好ましく、温州みかんの中でも、果皮（フラベド）１００ｇ当たり約８ｍｇ、果汁１００ｇ当たり約１ｍｇのβ−クリプトキサンチンを含有する杉山温州等の高β−クリプトキサンチン含有品種の温州みかんや、温州みかんとの交配により作出された高β−クリプトキサンチン含有品種を用いることが好ましい。また、本発明においてβ−クリプトキサンチン含有物とは、人為的にβ−クリプトキサンチン含量が高められたβ−クリプトキサンチンの混在物をいい、例えば、温州みかんを処理してβ−クリプトキサンチン含有物を得る方法としては特に制限されず、濃縮処理、抽出処理等の公知の方法で得ることができる。【００１７】
本発明における亜鉛化合物としては、特に限定されず、亜鉛、硫酸亜鉛、塩化亜鉛などの無機亜鉛やグルコン酸亜鉛、亜鉛のキレート化合物などのほか、海水などから製造される天然塩や亜鉛結合蛋白質やペプチド類など食品中の亜鉛濃度を高めた製剤、さらに高濃度の亜鉛を含む食品、例えば乾燥酵母、乾燥レバー、スッポン、鮫軟骨、田七人参、牡蠣などそのまま亜鉛源として利用してもよい。【００１８】
本発明の骨形成促進並びに骨塩量増進組成物や、骨疾患の予防・治療薬や、骨疾患の予防・治療用機能性食品又は食品素材や、飼料用組成物におけるβ−クリプトキサンチンと亜鉛化合物は、それぞれ骨組織中カルシウム量を増加する作用を発揮しない濃度で含有・添加・配合され、かつ併用により骨組織中カルシウム量増加効果が奏される濃度が好ましい。具体的には、骨形成促進並びに骨塩量増進組成物や骨疾患の予防・治療薬としては、１日当たりの摂取量が、β−クリプトキサンチンは１〜１００ｍｇ、好ましくは１〜５０ｍｇ、亜鉛化合物は亜鉛換算で１０〜１０００ｍｇ、好ましくは１０〜１００ｍｇとなるように調合することができ、骨疾患の予防・治療用機能性食品又は食品素材や飼料用組成物としては、固形分１ｋｇ当たりβ−クリプトキサンチンは０．１〜２０ｍｇ、好ましくは１〜１０ｍｇ、亜鉛化合物は亜鉛換算で１〜３０ｍｇ、好ましくは１０〜２０ｍｇ添加・配合することができる。【００１９】
本発明のβ−クリプトキサンチンと亜鉛化合物とを有効成分として含有する骨形成促進並びに骨塩量増進組成物は、本発明の骨疾患の予防・治療薬として有利に用いることができる。本発明の骨疾患の予防・治療薬を医薬品として調製する場合、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。また、これらに加えて、上述した公知の骨形成促進作用及び／又は骨吸収抑制作用を有する物質や、カルシウム、マグネシウム、リン等のミネラルを併用することができる。これら予防若しくは治療薬は、通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することが好ましい。投与量は、予防か治療かの投与目的、骨疾患の種類や重篤度、患者の年齢等に応じて適宜選定することができる。【００２０】
本発明の骨疾患の予防・治療用機能性食品又は食品素材の調製方法としては、食品又は食品素材に、β−クリプトキサンチンと亜鉛化合物を個別に添加する方法や、β−クリプトキサンチンと亜鉛化合物を含有する組成物、例えば、本発明の骨形成促進並びに骨塩量増進組成物を添加する方法を挙げることができる。また、骨疾患の予防・治療に用いられる、本発明の骨疾患の予防・治療機能を有する食品や食品素材の種類としては特に制限されず、例えば、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、ジュース、牛乳、豆乳、酒類、コーヒー、紅茶、煎茶、ウーロン茶、スポーツ飲料等の各種飲料や、プリン、クッキー、パン、ケーキ、煎餅などの焼き菓子、羊羹などの和菓子、冷菓、ゼリー、チューインガム等のパン・菓子類や、うどん、そば等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、みそ、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、チーズ、バター等の乳製品や、豆腐、こんにゃく、その他佃煮、餃子、コロッケ、サラダ等の各種総菜や、蜂蜜、ローヤルゼリーなどを挙げることができる。これら食品や食品素材には、上述した公知の骨形成促進作用及び／又は骨吸収抑制作用を有する物質や、カルシウム、マグネシウム、リン等のミネラルを併用してもよい。【００２１】
本発明の飼料用組成物の調製方法としては、飼料配合成分として、β−クリプトキサンチンと亜鉛化合物を個別に配合する方法や、β−クリプトキサンチンと亜鉛化合物を含有する組成物、例えば、本発明の骨形成促進並びに骨塩量増進組成物を配合する方法を挙げることができる。β−クリプトキサンチンと亜鉛化合物を配合した飼料用組成物は、ブタ、ウシ、ニワトリ等の家畜・家禽や、イヌ、ネコ等のペット、養殖魚介類の飼育等に有利に用いることができ、かかる飼料用組成物には、上述したイプリフラボン類等の公知の骨形成促進作用及び／又は骨吸収抑制作用を有する物質や、カルシウム、マグネシウム、リン、鉄、亜鉛、マンガン、銅等のミネラルを併用することができる。本発明の飼料用組成物には、例えば、その包装体や添付の説明書に、骨疾患の予防や治療に有効である旨の表示を付すことができる。【００２２】
また、以下の実施例で示す骨組織培養系における結果は、経験的に、骨組織培養系においてのみ奏されるものではなく、生体に経口投与した場合においても奏されるものである。【００２３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
（骨組織培養系における骨組織中カルシウム量の測定）
ラット（ウイスター系雄性；４週齢、体重８５−９０ｇ）（日本ＳＬＣ（株）から購入、固形飼料オリエンタル酵母（ＭＦ））を軽いエーテル麻酔下で屠殺し、大腿骨の周囲の筋肉組織を完全に取り去り、大腿骨の骨幹部（皮質骨）と骨幹端部（海綿骨）組織に分け、冷０．２５Ｍショ糖溶液中で骨髄細胞を洗浄除去した。  骨組織片は、ダルベッコ変法イーグル培養液（無血清で５０units/mlペニシリン及び５０μｇ/mlストレプトマイシンを含み、４５ｍｇ/mlグルコースを添加したもの）中で、無菌的にＣＯ２インキュベーター中で３７℃で４８時間培養した。培養液中には、対照（無添加）、β−クリプトキサンチン（合成品で１００％純品；１０−９Ｍ）、亜鉛（硫酸亜鉛；１０−６Ｍ）並びにβ−クリプトキサンチン（１０−９Ｍ）と亜鉛混合液を添加した。骨組織は、２.０ｍｌの上記培養液を加えた培養用ディッシュ（３５ｍｍ直径のプラスチック製）中に入れ、培養した。培養後、骨組織は、冷０．２５Ｍショ糖溶液中でよく洗浄し、１００℃で５時間乾燥後、重量を測定した。乾燥した骨組織は試験管（１５ｍｌ用）に入れ、濃硝酸２．０ｍｌを加えて、１００℃で１６時間加熱分解した。分解後、液量を測定し、その一定量を精製蒸留水で希釈後、カルシウムを比色定量（和光純薬工業カルシウム測定用キット）した。骨組織中カルシウム量は、培養した骨組織の乾燥重量１ｇ当たりのｍｇ量として表示した。上記実験は、１匹のラットから得た骨組織を１枚の培養ディッシュに入れ、５匹分として５枚の培養ディッシュを用い、対照、β−クリプトキサンチン単独群、亜鉛単独群、並びにβ−クリプトキサンチンと亜鉛の併用群において、各５枚のディッシュを使用した。各群５匹のラットからの５枚ディッシュによる培養によって得られた値の平均値±標準誤差で示し、Student’s t-testで統計処理し、危険率５％以下を有意差ありとした。【００２５】
以上の、ラット大腿骨の骨幹部（皮質骨）あるいは骨幹端部組織をβ−クリプトキサンチン（１０−９Ｍ）、亜鉛（１０−６Ｍ）並びにβ−クリプトキサンチン（１０−９Ｍ）と亜鉛（１０−６Ｍ）の両方を含む培養液中で、４８時間培養した結果を表１と図１に示す。【００２６】
【表１】
2006054530.tif 000002
【００２７】
表１及び図１に示すように、骨組織中のカルシウム量は、骨幹部及び骨幹端部組織のいずれにおいても、対照群（無添加）と比較して、β−クリプトキサンチン（１０−９Ｍ）、亜鉛（１０−６Ｍ）単独添加群においては有意に変動しなかったが、β−クリプトキサンチン（１０−９Ｍ）と亜鉛（１０−６Ｍ）の両方を添加した群において、明らかに有意な増加がもたらされた。
【実施例２】
【００２８】
（骨組織培養系における骨組織中カルシウム量の測定）
骨組織培養系におけるβ−クリプトキサンチンと亜鉛、ゲニステイン及びメナキノン−７を補給したときの骨組織中カルシウム量に及ぼす効果について、実施例１と同様に大腿骨の骨幹部組織と骨幹端部組織を培養液中で４８時間培養し、骨組織カルシウム量を測定し、比較検討した。結果を表２と図２に示す。骨組織カルシウム量は、β−クリプトキサンチン（１０−９Ｍ），亜鉛（１０−６Ｍ），ゲニステイン（１０−６Ｍ），メナキノン−７（１０−６Ｍ）の存在下では、有意に増加しなかった。より高濃度の１０−５Ｍでは、ゲニステインとメナキノン−７は骨組織中カルシウム量を有意に増加させる効果を発現したが、それぞれ１０−６Ｍでは有意な効果は認められなかった。また、β−クリプトキサンチン（１０−９Ｍ）と亜鉛（１０−６Ｍ）を補給すると骨組織中カルシウム量は有意に増加したが、このような効果は、β−クリプトキサンチン（１０−９Ｍ）にゲニステイン（１０−６Ｍ）や、メナキノン−７（１０−６Ｍ）を加えても、亜鉛（１０−６Ｍ）にゲニステイン（１０−６Ｍ）や、メナキノン−７（１０−６Ｍ）を加えても発現せず、β−クリプトキサンチンと亜鉛以外の組合せでは骨組織中カルシウム量は有意に増加しなかった。このように、β−クリプトキサンチン（１０−９Ｍ）と亜鉛（１０−６Ｍ）との組み合せが、より効果的な相乗効果を発現することが見い出された。【００２９】
【表２】
2006054530.tif 000003
【実施例３】
【００３０】
（骨組織培養系における骨組織中アルカリ性ホスファターゼ活性の測定）
骨の石灰化の促進に関する最も重要な酵素であるアルカリ性ホスファターゼの発現量を調べた。実施例１と同様に骨組織をインキュベーター中で培養した後、組織片を０．２５Ｍの蔗糖液で洗浄し、６．５ｍＭのバルビタール緩衝液（ｐＨ７．４）３ｍｌ中で破砕し、超音波処理した。この液を遠心分離して上清を酵素液としてWalter及びSchuttの方法（in Method of Enzymatic Analysis, Vol1-2,p856, Academic Press, New York, 1965）に従って測定した。すなわち、ｐ−ニトロフェニール燐酸を基質として、ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．８）２ｍｌに酵素液０．０５ｍｌを添加し、３７℃で３０分間インキュベーションし、０．０５ＮのＮａＯＨを１０ｍｌ添加した後、分光光度計を用いて吸光度（４０５ｎｍ）を測定し、骨に対する治療剤及び骨に対する作用の知られている化合物の骨アルカリ性ホスファターゼ活性を調べた。結果を表３及び図３に示す。【００３１】
【表３】
2006054530.tif 000004
【００３２】
骨組織培養系における骨組織中アルカリ性ホスファターゼ活性は、β−クリプトキサンチン（１０−９Ｍ），亜鉛（１０−６Ｍ）の各単独添加群では、無添加の対照群と比べ有意に変動しなかったが、β−クリプトキサンチン（１０−９Ｍ）に亜鉛（１０−６Ｍ）を補給すると骨幹部及び骨幹端部組織中のアルカリ性ホスファターゼ活性が相乗的に高められることが認められた。この相乗効果は、蛋白質合成阻害剤（シクロヘキシイミド１０−６Ｍ）の存在下では発現されず（結果は示していない）、上記相乗効果は骨芽細胞の蛋白質合成が増進されたことに起因することがわかった。
【実施例４】
【００３３】
（骨組織培養系における骨組織中ＤＮＡ量の測定）
骨組織中の細胞数の指標として、ＤＮＡ量を定量した。実施例１と同様に骨組織をインキュベーター中で培養した後、組織片を０．２５Ｍの蔗糖溶液で洗浄し、湿重量を測定した。その後、０．１ＮのＮａＯＨ４ｍｌ中で粉砕して、４℃で２４時間浸透させた。この液を遠心分離し、上清を試料としてCeriottiらの方法（J.Biol.Chem., 241: 34-77, 1951）に従って定量した。即ち、試料２ｍｌに濃塩酸１ｍｌ及び０．０４％のインドール溶液１ｍｌを添加し沸騰水中で１００℃に加熱後、急冷して、クロロホルム４ｍｌで抽出し、クロロホルム層を採取して、分光光度計（４９０ｎｍ）を用いて骨中のＤＮＡ量を測定した。結果を表４及び図４に示す。【００３４】
【表４】
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【００３５】
骨組織培養系における骨組織中ＤＮＡ量は、β−クリプトキサンチン（１０−９Ｍ），亜鉛（１０−６Ｍ）の各単独添加群では、無添加の対照群と比べ有意に変動しなかったが、β−クリプトキサンチン（１０−９Ｍ）に亜鉛（１０−６Ｍ）を補給すると骨幹部及び骨幹端部組織中のＤＮＡ量が相乗的に高められることが認められた。この相乗効果は、蛋白質合成阻害剤（シクロヘキシイミド１０−６Ｍ）の存在下では発現されず（結果は示していない）、上記相乗効果は骨芽細胞の蛋白質合成が増進されたことに起因することがわかった。
【実施例５】
【００３６】
（経口投与における骨組織中カルシウム量の測定）
ラット（ウイスター系雄性；４週齢、体重８５−９０ｇ）（日本ＳＬＣ（株）から購入、固形飼料オリエンタル酵母（ＭＦ））に、β−クリプトキサンチン（５μｇ／１００ｇ体重）単独投与、亜鉛（０．１ｍｇ／１００ｇ体重）単独投与、β−クリプトキサンチン（５μｇ／１００ｇ体重）と亜鉛（０．１ｍｇ／１００ｇ体重）併用投与して、１日１回７日間胃ゾンデで、経口投与し、その最終投与の２４時間目に、大腿骨を摘出し、骨幹部と骨幹端部組織中のカルシウム量の変動を実施例１記載の方法で調べた。結果を表５及び図５に示す。【００３７】
【表５】
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【００３８】
β−クリプトキサンチン（５μｇ／１００ｇ体重）単独の経口投与は、骨幹部のカルシウム量の有意な変動を引き起さなかったが、骨幹端部のカルシウム量は有意に増加させた。また、亜鉛（０．１ｍｇ／１００ｇ体重）単独の経口投与は、骨幹部及び骨幹端部のカルシウム量の有意な変動を引き起さなかった。これに対して、β−クリプトキサンチン（５μｇ／１００ｇ体重）に亜鉛（０．１ｍｇ／１００ｇ体重）を補給して７日間経口投与すると、骨幹部及び骨幹端部組織中のカルシウム量が、β−クリプトキサンチン及び亜鉛の各単独投与の場合と比較して、相乗的に高められることが、骨組織培養系と同様に、ラットに経口投与した場合においても認められた。
【実施例６】
【００３９】
（経口投与における骨組織中アルカリ性ホスファターゼ活性の測定）
実施例５と同様にして摘出した骨幹部と骨幹端部組織中のアルカリ性ホスファターゼ活性の変動を実施例３記載の方法で調べた。結果を表６及び図６に示す。その結果、β−クリプトキサンチン（５μｇ／１００ｇ体重）単独の経口投与は、骨幹部及び骨幹端部のアルカリ性ホスファターゼ活性の有意な変動を引き起さなかった。また、亜鉛（０．１ｍｇ／１００ｇ体重）単独の経口投与は、骨幹部及び骨幹端部のアルカリ性ホスファターゼ活性の有意な変動を引き起さなかった。これに対して、β−クリプトキサンチン（５μｇ／１００ｇ体重）に亜鉛（０．１ｍｇ／１００ｇ体重）を補給して７日間経口投与すると、骨幹部及び骨幹端部組織中のアルカリ性ホスファターゼ活性が、β−クリプトキサンチン及び亜鉛の各単独投与の場合と比較して、相乗的に高められることが、骨組織培養系と同様に、ラットに経口投与した場合においても認められた。【００４０】
【表６】
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【実施例７】
【００４１】
（経口投与における骨組織中ＤＮＡ量の測定）
実施例５と同様にして摘出した骨幹部と骨幹端部組織中のＤＮＡ量の変動を実施例４記載の方法で調べた。結果を表７及び図７に示す。その結果、β−クリプトキサンチン（５μｇ／１００ｇ体重）単独の経口投与は、骨幹部のＤＮＡ量の有意な変動を引き起さなかったが、骨幹端部のＤＮＡ量は有意に増加させた。また、亜鉛（０．１ｍｇ／１００ｇ体重）単独の経口投与は、骨幹部及び骨幹端部のＤＮＡ量の有意な変動を引き起さなかった。これに対して、β−クリプトキサンチン（５μｇ／１００ｇ体重）に亜鉛（０．１ｍｇ／１００ｇ体重）を補給して７日間経口投与すると、骨幹部及び骨幹端部組織中のＤＮＡ量が、β−クリプトキサンチン及び亜鉛の各単独投与の場合と比較して、相乗的に高められることが、骨組織培養系と同様に、ラットに経口投与した場合においても認められた。【００４２】
【表７】
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【００４３】
また、β−クリプトキサンチン（１０μｇ／１００ｇ体重）及び亜鉛（０．５μｇ／１００ｇ体重）の併用投与の場合においても、骨成分（カルシウム量、アルカリ性ホスファターゼ活性及びＤＮＡ量）の相乗的効果が発現することを確認した（結果は示していない）。これらのことから、本発明により、骨組織中のカルシウム量、アルカリ性ホスファターゼ活性及びＤＮＡ量を増加する作用を発揮しない濃度（量）のβ−クリプトキサンチンと亜鉛を併用することにより、相乗的に骨組織中カルシウム量、アルカリ性ホスファターゼ活性及びＤＮＡ量を有意に増加する効果をもたらすことが、インビボ及びインビトロで確かめられた。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明のβ−クリプトキサンチンと亜鉛化合物をそれぞれ単独では量的に有効ではない量で用いることにより、積極的に骨形成を促進して骨疾患を予防・治療することができる顕著な効果を有する骨形成促進剤や、骨形成促進作用と骨吸収抑制作用の両作用を有する骨粗鬆症等の骨疾患の予防・治療に有用な飲食品、薬剤、飼料を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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