【手続補正書】
【提出日】令和2年5月1日(2020.5.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第ＶＩＩＩ因子遺伝子のエクソン１−２２の逆位を特徴とする血友病Ａを有する被験体を治療するための医薬組成物であって、
前記医薬組成物は、薬学的に許容される担体と、操作されたヌクレアーゼをコードする核酸であって、前記操作されたヌクレアーゼがインビボで発現する、核酸と、を含み、
前記操作されたヌクレアーゼは、前記第ＶＩＩＩ因子遺伝子のｉｎｔ２２ｈ−１配列内に位置する第１の認識配列に対する特異性を有する、医薬組成物。
【請求項２】
前記ｉｎｔ２２ｈ−１配列が、配列番号３又は配列番号４と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ｉｎｔ２２ｈ−１配列が、配列番号３又は配列番号４を含む、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記第１の認識配列がＦ８Ａ１コード配列内にある、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記Ｆ８Ａ１コード配列が、配列番号５又は配列番号６と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記Ｆ８Ａ１コード配列が、配列番号５又は配列番号６を含む、請求項４又は５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記操作されたヌクレアーゼが、前記第１の認識配列と同一である第２の認識配列に対して特異性を有し、前記第２の認識配列が、Ｘ染色体の前記第ＶＩＩＩ因子遺伝子のテロメアの反復配列に位置し、前記反復配列は、前記ｉｎｔ２２ｈ−１配列に対して逆向きであることを除いて、前記ｉｎｔ２２ｈ−１配列と同一であるか、又は高度の相同性を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記反復配列が、ｉｎｔ２２ｈ−２配列又はｉｎｔ２２ｈ−３配列である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記核酸がｍＲＮＡである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記医薬組成物が、前記核酸を含む組換えＤＮＡ構築物を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記医薬組成物が、前記核酸を含むウイルスベクターを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記ウイルスベクターが組換えＡＡＶベクターである、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記操作されたヌクレアーゼが、操作されたメガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、コンパクトＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ、又はｍｅｇａＴＡＬである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記操作されたヌクレアーゼが操作されたメガヌクレアーゼである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記第１の認識配列が配列番号９を含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５２】
【図１Ａ−Ｂ】第ＶＩＩＩ因子遺伝子のエクソン１−２２の逆位を示す。ｉｎｔ２２ｈ−２及びｉｎｔ２２ｈ−３反復配列は、Ｘ染色体上のｉｎｔ２２ｈ−１配列のテロメアに位置する。更に、ｉｎｔ２２ｈ−２及びｉｎｔ２２ｈ−３は、不完全なパリンドロームの一部として互いに逆向きに見出される。このパリンドローム内の配列の組換えにより、ｉｎｔ２２ｈ−２とｉｎ２２ｈ−３はゲノム内の場所を交換し、結果としてｉｎｔ２２ｈ−１に対してそれらの向きを変えることができる。結果として、ｉｎｔ２２ｈ−１配列は、異なる状況において、ｉｎｔ２２ｈ−１に対して反対向きにあるものに応じて、ｉｎｔ２２ｈ−２反復又はｉｎｔ２２ｈ−３反復と再結合することができる。図１Ａは、ｉｎｔ２２ｈ−３がｉｎｔ２２ｈ−１に対して逆向きであり、これらの反復配列間で染色体内組換えが起こり、エクソン１−２２の図示された逆位を生じることを可能にする配置を示す。図１Ｂは、ｉｎｔ２２ｈ−２がｉｎｔ２２ｈ−１に対して逆向きであり、これらの反復配列間で染色体内組換えが起こり、エクソン１−２２の図示された逆位を生じることを可能にする配置を示す。
【図２】第ＶＩＩＩ因子遺伝子のＦ８Ｒ認識配列を示す。Ａ）本発明の組換えメガヌクレアーゼによって標的とされる各認識配列は、２つの認識ハーフサイトを含む。各認識ハーフサイトは、４塩基対の中央配列によって分離された９塩基対を含む。Ｆ８Ｒ１−２認識配列（配列番号７）は、Ｆ８Ｒ１及びＦ８Ｒ２と呼ばれる２つの認識ハーフサイトを含む。Ｆ８Ｒ３−４認識配列（配列番号９）は、Ｆ８Ｒ３及びＦ８Ｒ４と呼ばれる２つの認識ハーフサイトを含む。Ｆ８Ｒ９−１０認識配列（配列番号１１）は、Ｆ８Ｒ９及びＦ８Ｒ１０と呼ばれる２つの認識ハーフサイトを含む。Ｆ８Ｒ１１−１２認識配列（配列番号１３）は、Ｆ８Ｒ１１及びＦ８Ｒ１２と呼ばれる２つの認識ハーフサイトを含む。Ｆ８Ｒ１３−１４認識配列（配列番号１５）は、Ｆ８Ｒ１３及びＦ８Ｒ１４と呼ばれる２つの認識ハーフサイトを含む。Ｆ８Ｒ１５−１６認識配列（配列番号１７）は、Ｆ８Ｒ１５及びＦ８Ｒ１６と呼ばれる２つの認識ハーフサイトを含む。
【図３】本発明の組換えメガヌクレアーゼは、２つのサブユニットを含み、ＨＶＲ１領域を含む第１のサブユニットは、第１の認識ハーフサイト（例えば、Ｆ８Ｒ１、Ｆ８Ｒ３、Ｆ８Ｒ９、Ｆ８Ｒ１１、Ｆ８Ｒ１３、又はＦ８Ｒ１５）に結合し、ＨＶＲ２領域を含む第２のサブユニットは、第２の認識ハーフサイト（例えば、Ｆ８Ｒ２、Ｆ８Ｒ４、Ｆ８Ｒ１０、Ｆ８Ｒ１２、Ｆ８Ｒ１４、又はＦ８Ｒ１６）に結合する。組換えメガヌクレアーゼが一本鎖メガヌクレアーゼである実施形態では、ＨＶＲ１領域を含む第１のサブユニットは、Ｎ末端又はＣ末端サブユニットのいずれかとして位置することができる。同様に、ＨＶＲ２領域を含む第２のサブユニットは、Ｎ末端又はＣ末端サブユニットのいずれかとして位置することができる。
【図４】第ＶＩＩＩ因子遺伝子のイントロン２２に見られる認識配列を標的とする組換えメガヌクレアーゼを評価するためのＣＨＯ細胞におけるレポーターアッセイの模式図を示す。本明細書中に記載される組換えメガヌクレアーゼについては、レポーターカセットが細胞のゲノムに安定に組み込まれたＣＨＯ細胞株が産生された。レポーターカセットは、５’から３’の順序、即ち、ＳＶ４０初期プロモーター、ＧＦＰ遺伝子の５’２／３、本発明の操作されたメガヌクレアーゼの認識配列（例えば、Ｆ８Ｒ１−２認識配列）、ＣＨＯ−２３／２４メガヌクレアーゼの認識配列（国際公開第２０１２／１６７１９２号）、及びＧＦＰ遺伝子の３’２／３で構成されていた。このカセットで安定にトランスフェクトされた細胞は、ＤＮＡ切断誘発剤の非存在下ではＧＦＰを発現しなかった。メガヌクレアーゼは、各メガヌクレアーゼをコードするプラスミドＤＮＡ又はｍＲＮＡの形質導入によって導入された。メガヌクレアーゼ認識配列のいずれかでＤＮＡ切断が誘導されると、ＧＦＰ遺伝子の重複領域は互いに組換えられて機能的ＧＦＰ遺伝子を産生する。次いで、メガヌクレアーゼによるゲノム切断の頻度の間接的測定として、フローサイトメトリーによってＧＦＰ発現細胞の割合を決定することができる。
【図５Ａ−Ｇ】ＣＨＯ細胞レポーターアッセイで第ＶＩＩＩ因子遺伝子のｉｎｔ２２ｈ−１配列中の認識配列を認識し切断するための組換えメガヌクレアーゼの効率を示す。配列番号１９〜２１，２８〜３１，４０〜４３，５２〜５５，６４〜６７，及び７６〜７９に示される組換えメガヌクレアーゼを、Ｆ８Ｒ１〜２認識配列（配列番号７）、Ｆ８Ｒ３−４認識配列（配列番号９）、Ｆ８Ｒ９−１０認識配列（配列番号１１）、Ｆ８Ｒ１１−１２認識配列（配列番号１３）、Ｆ８Ｒ１３−１４認識配列（配列番号１５）、又はＦ８Ｒ１５−１６認識配列（配列番号１７）を標的とするように操作して、ＣＨＯ細胞レポーターアッセイで有効性についてスクリーニングした。示された結果は、各アッセイにおいて観察されたＧＦＰ発現細胞の割合を提供し、標的認識配列又はＣＨＯ−２３／２４認識配列を切断するための各メガヌクレアーゼの有効性を示す。更に、各アッセイの陰性対照（ｂｓ）が含まれていた。図５Ａは、Ｆ８Ｒ１−２認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。図５Ｂ及び図５Ｃは、Ｆ８Ｒ３−４認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。図５Ｄは、Ｆ８Ｒ９−１０認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。図５Ｅは、Ｆ８Ｒ１１−１２認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。図５Ｆは、Ｆ８Ｒ１３−１４認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。図５Ｇは、Ｆ８Ｒ１５−１６認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。
【図６Ａ−Ｆ】ＣＨＯ細胞レポーターアッセイで第ＶＩＩＩ因子遺伝子のｉｎｔ２２ｈ−１配列中の認識配列を認識し切断するための操作されたメガヌクレアーゼの効率を示す。本発明が包含する操作されたメガヌクレアーゼを、Ｆ８Ｒ１−２（配列番号７）、Ｆ８Ｒ３−４（配列番号９）、Ｆ８Ｒ９−１０（配列番号１１）、Ｆ８Ｒ１１−１２（配列番号１３）、Ｆ８Ｒ１３−１４（配列番号１５）、又はＦ８Ｒ１５−１６（配列番号１７）の認識配列を標的とするように操作し、ヌクレオフェクション後１２日間にわたる複数の時点で、ＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおいて有効性についてスクリーニングした。示された結果は、分析の１２日間にわたる各アッセイにおいて観察されたＧＦＰ発現細胞の割合を提供し、標的認識配列又はＣＨＯ−２３／２４認識配列を切断するための各メガヌクレアーゼの有効性を時間の関数として示す。図６Ａは、Ｆ８Ｒ１−２認識配列を標的とするＦ８Ｒ１−２メガヌクレアーゼを示す。図６Ｂは、Ｆ８Ｒ３−４認識配列を標的とするＦ８Ｒ３−４メガヌクレアーゼを示す。図６Ｃは、Ｆ８Ｒ９−１０認識配列を標的とするＦ８Ｒ９−１０メガヌクレアーゼを示す。図６Ｄは、Ｆ８Ｒ１１−１２認識配列を標的とするＦ８Ｒ１１−１２メガヌクレアーゼを示す。図６Ｅは、Ｆ８Ｒ１３−１４認識配列を標的とするＦ８Ｒ１３−１４メガヌクレアーゼを示す。図６Ｆは、Ｆ８Ｒ１５−１６認識配列を標的とするＦ８Ｒ１５−１６メガヌクレアーゼを示す。
【図７】哺乳動物細胞におけるＦ８Ｒ認識配列の切断を示す。メガヌクレアーゼＦ８Ｒ１−２及びＦ８Ｒ３−４を、ＨＥＫ２９３細胞におけるＴ７エンドヌクレアーゼアッセイによって切断し、それらの認識部位に挿入及び／又は欠失（ｉｎｄｅｌ）を引き起こす能力について試験した。
【図８Ａ−Ｂ】哺乳動物細胞の第ＶＩＩＩ因子遺伝子におけるエクソン１−２２の逆位を示す。この実験によって、Ｆ８Ｒ１−２及びＦ８Ｒ３−４メガヌクレアーゼによるゲノムＤＮＡの切断が、ＨＥＫ２９３細胞の第ＶＩＩＩ因子遺伝子におけるエクソン１−２２の逆位を刺激し得るかどうかを決定した。図８Ａでは、エクソン１−２２の正常な位置を検出することができるプライマーセット（Ｈ１Ｒ／Ｈ１Ｆ）を用いて、ＰＣＲによってゲノムＤＮＡを分析した。図８Ｂでは、エクソン１−２２の逆位を検出することができるプライマーセット（Ｈ１Ｆ／Ｈ２／３Ｒ）を用いて、ＰＣＲによってゲノムＤＮＡを分析した。
【図９】哺乳動物細胞の第ＶＩＩＩ因子遺伝子におけるエクソン１−２２の逆位を示す。この実験によって、Ｆ８Ｒ９−１０、Ｆ８Ｒ１１−１２、Ｆ８Ｒ１３−１４、及びＦ８Ｒ１５−１６メガヌクレアーゼによるゲノムＤＮＡの切断が、ＨＥＫ２９３細胞の第ＶＩＩＩ因子遺伝子におけるエクソン１−２２の逆位を刺激するかどうかを決定した。エクソン１−２２の正常な位置（Ｈ１Ｒ／Ｈ１Ｆ）又はエクソン１−２２の逆位（Ｈ１Ｆ／Ｈ２／３Ｒ）を検出することができるプライマーセットを用いて、ＰＣＲによってゲノムＤＮＡを分析した。２日目及び８日目からのＰＣＲ分析を各プライマーセットについて提供する。
【図１０】２９３細胞におけるＦ８Ｒヌクレアーゼによる第ＶＩＩＩ因子遺伝子の逆位及び逆デジタルＰＣＲによる効率の測定を示す。ＨＥＫ２９３細胞を、Ｆ８Ｒ１１−１２ｘ．６９又はＦ８Ｒ１３−１４ｘ．１３ヌクレアーゼをそれぞれコードするｍＲＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後に、ゲノムＤＮＡを細胞から単離し、逆デジタルＰＣＲを実施して第ＶＩＩＩ因子ゲノム編集を決定した。
【図１１】初代ヒトＴ細胞におけるＦ８Ｒヌクレアーゼによる第ＶＩＩＩ因子遺伝子の逆位及び長距離ＰＣＲによる編集の決定を示す。正常ヒトＴ細胞を、Ｆ８Ｒ３−４ｘ．４３ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後に、ゲノムＤＮＡを細胞から単離し、長距離ＰＣＲを実施して第ＶＩＩＩ因子ゲノム編集を決定した。
【図１２Ａ−Ｂ】図１２Ａ〜図１２Ｂは、初代ヒト患者Ｔ細胞におけるＦ８Ｒヌクレアーゼによる第ＶＩＩＩ因子遺伝子の復帰及び長距離ＰＣＲによる編集の決定を示す。血友病Ａ患者Ｔ細胞を、Ｆ８Ｒ３−４ｘ．４３、Ｆ８Ｒ１１−１２ｘ．６９又はＦ８Ｒ１５−１６ｘ．１４ヌクレアーゼをそれぞれコードするｍＲＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後に、ゲノムＤＮＡを細胞から単離し、長距離ＰＣＲを実施して第ＶＩＩＩ因子ゲノム編集を決定した。図１２Ａは、ＨＩＵ及びＨＩＤプライマーを用いて検出された、野生型第ＶＩＩＩ因子遺伝子配置に対応するＰＣＲバンドを示す。図１２Ｂは、Ｈ３Ｄ及びＨＩＤプライマーを用いて検出された、血友病Ａ関連第ＶＩＩＩ因子遺伝子逆位に対応するＰＣＲバンドを示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３９３】
Ｆ８Ｒ１−２及びＦ８Ｒ３−４メガヌクレアーゼによるゲノムＤＮＡの切断がエクソン１−２２の逆位を刺激するかどうかを決定するために、まず、Ｆ８Ｒ１−２又はＦ８Ｒ３−４メガヌクレアーゼをコードする２００ｎｇのｍＲＮＡでＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトし、７日後にｇＤＮＡを採取した。プライマーセットＨ１Ｒ／Ｈ１Ｆを用いたＰＣＲによってｇＤＮＡを分析して、正常エクソン１−２２の位置を検出し、プライマーセットＨ１Ｆ／Ｈ２／３Ｒを用いて逆位エクソン１−２２の位置を検出した（図８）。図８Ａは、モック処理（レーン１）、又はＦ８Ｒ１−２ｘ．１５（レーン２）、Ｆ８Ｒ１−２ｘ．２７（レーン３）、Ｆ８Ｒ３−４ｘ．４３（レーン４）、Ｆ８Ｒ３−４ｘ．７０（レーン５）で処理したＨＥＫ２９３細胞からのＨ１Ｒ／Ｈ１ＦプライムＰＣＲ反応を搭載したアガロースゲルを示す。レーン６は、未処理のヒト細胞ｇＤＮＡ鋳型を用いた対照ＰＣＲを含む。レーン７は鋳型なしのＰＣＲ陰性対照を含む。図８Ｂは、モック処理（レーン１）、又はＦ８Ｒ１−２ｘ．１５（レーン２）、Ｆ８Ｒ１−２ｘ．２７（レーン３）、Ｆ８Ｒ３−４ｘ．４３（レーン４）、Ｆ８Ｒ３−４ｘ．７０（レーン５）で処理したＨＥＫ２９３細胞からのＨ１Ｆ／Ｈ２／３ＲプライムＰＣＲ反応を搭載したアガロースゲルを示す。レーン６は、未処理のヒト細胞ｇＤＮＡ鋳型を用いた対照ＰＣＲを含む。レーン７は鋳型なしのＰＣＲ陰性対照を含む。図８ＢのＰＣＲ断片の存在は、本発明に包含されるＦ８Ｒメガヌクレアーゼを用いたエクソン１−２２の逆位の成功を示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３９４】
Ｆ８Ｒ９−１０、Ｆ８Ｒ１１−１２、Ｆ８Ｒ１３−１４、及びＦ８Ｒ１５−１６メガヌクレアーゼによるゲノムＤＮＡの切断がエクソン１−２２の逆位を刺激するかどうかを決定するために、まず、各個々のヌクレアーゼをコードする２００ｎｇのｍＲＮＡでＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトし、トランスフェクション後２日目及び８日目にｇＤＮＡを採取した。プライマーセットＨ１Ｒ／Ｈ１Ｆを用いたＰＣＲによって、ｇＤＮＡを分析して、正常エクソン１−２２の位置を検出し、プライマーセットＨ１Ｆ／Ｈ２／３Ｒで逆位エクソン１−２２の位置を検出した（図９）。図９は、モック処理（レーン１）、又はＦ８Ｒ９−１０ｘ．３８（レーン２）、Ｆ８Ｒ９−１０ｘ．７０（レーン３）、Ｆ８Ｒ１１−１２ｘ．５６（レーン４）、Ｆ８Ｒ１１−１２ｘ．６９（レーン５）、Ｆ８Ｒ１３−１４ｘ．３（レーン６）、Ｆ８Ｒ１３−１４ｘ．１３（レーン７）、Ｆ８Ｒ１５−１６ｘ．１４（レーン８）、Ｆ８Ｒ１５−１６ｘ．８５（レーン９）で処理したＨＥＫ２９３細胞からのＨ１Ｒ／Ｈ１ＦプライムＰＣＲ反応（上）及びＨ１Ｆ／Ｈ２／３ＲプライムＰＣＲ反応（下）を搭載したアガロースゲルを示す。レーン１０は、未処理のヒト細胞ｇＤＮＡ鋳型を用いた対照ＰＣＲを含む。レーン１１は鋳型なしのＰＣＲ陰性対照を含む。Ｈ１Ｆ／Ｈ２／３ＲプライムＰＣＲ反応（図９の下半分）におけるＰＣＲ断片の存在は、本発明に包含されるＦ８Ｒメガヌクレアーゼを用いたエクソン１−２２の逆位の成功を示している。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４２８】
２つの逆向きｉｎｔ２２ｈ反復間の患者Ｔ細胞におけるゲノム断片の首尾良い復帰の際に、逆位断片上に位置付けられているＨＩＵプライマー結合部位は、Ｈ３Ｄ及びＨＩＤプライマー結合部位に対して再配向される。ＨＩＵ／ＨＩＤ  ＰＣＲは、１２ｋｂアンプリコンを生じ、第ＶＩＩＩ因子遺伝子の野生型配置への復帰を示す。ＰＣＲ断片をアガロースゲル電気泳動で分析し、臭化エチジウムで可視化した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４３０】
Ｆ８Ｒ３−４ｘ．４３、Ｆ８Ｒ１１−１２ｘ．６９、又はＦ８Ｒ１５−１６ｘ．１４ヌクレアーゼ（又は対照としてのＧＦＰ）をコードするｍＲＮＡで処理した血友病Ａ患者Ｔ細胞由来のゲノムＤＮＡを、長距離ＰＣＲで分析した（図１２）。ＧＦＰ  ｍＲＮＡで処理した患者Ｔ細胞から単離されたゲノムＤＮＡからは、Ｈ３Ｄ／ＨＩＤ断片のみが増幅され得る（レーン１ａ及びレーン１ｂ）。Ｆ８Ｒ３−４ｘ．４３、Ｆ８Ｒ１１−１２ｘ．６９、又はＦ８Ｒ１５−１６ｘ．１４ヌクレアーゼ処理した患者Ｔ細胞のゲノムＤＮＡをＰＣＲ鋳型として使用すると、ＨＩＵ／ＨＩＤプライマー及びＨ３Ｄ／ＨＩＤプライマーの両方の組み合わせが、それぞれサイン野生型（約１２ｋｂ）及び逆位（約１１ｋｂ）のアンプリコンを生じた（レーン３ａ及びレーン３ｂ：Ｆ８Ｒ３−４ｘ．４３、レーン４ａ及びレーン４ｂ：Ｆ８Ｒ１１−１２ｘ．６９、レーン５ａ及びレーン５ｂ：Ｆ８Ｒ１５−１６ｘ．１４）。ヌクレアーゼ処理により、編集されたゲノムと編集されていないゲノムとの細胞の混合集団が生成されたため、Ｈ３Ｄ／ＨＩＤ断片は、Ｆ８Ｒヌクレアーゼ処理した患者Ｔ細胞のゲノムＤＮＡから依然として増幅されていた。