【手続補正書】
【提出日】令和2年8月26日(2020.8.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
【図１Ａ】図１Ａは、本開示による例示的な抗原特異的療法が、ＮＯＤマウスにおいて新規発症糖尿病を安定的に後退させることを実証するグラフである。指し示す通りに新規発症糖尿病ＮＯＤマウスを治療し、治療開始後１４週にわたって血中グルコース濃度を追跡した。治療後に糖尿病のままであったマウスのパーセンテージを示す。「†」は、死亡または瀕死のマウスを指し示す。全てのカプラン・マイヤー生存曲線において、群間の統計的有意性は、マンテル・コックスのログランク検定によって決定した；＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本開示による例示的な抗原特異的療法が、ＮＯＤマウスにおいて残留ベータ細胞機能を保存することを実証するグラフを描写する。治療終了の１〜２週前にＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）に加えて新規発症糖尿病ＮＯＤマウスに対して腹腔内耐糖能試験（ＩＰＧＴＴ）を行った。２時間にわたる耐糖能曲線（ＡＵＣグルコース；ｍｇ／ｄｌ×１２０分）下の対応する面積を示す。レスポンダーは、治療後に正常血糖（例えば、糖尿なしかつ血中グルコース測定値＞２００ｍｇ／ｄｌ）に戻る対象として本明細書では使用される。
【図１Ｃ】図１Ｃは、本開示による例示的な抗原特異的療法がＮＯＤマウスにおいて膵島炎の進行を停止させることを実証するグラフである。治療の終了時に、指し示す通りに、新規発症糖尿病マウスおよびＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）のパラフィン包埋膵臓切片に対して盲検で膵島炎スコア付けを行った。群間の統計的有意性はマン・ホイットニーｔ検定を使用して算出した；＊＊Ｐ＜０．０１。
【図２Ａ】図２Ａは、開始時血中グルコース濃度による糖尿病寛解率を示すグラフである。試験加入時の開始時血糖が３５０ｍｇ／ｄｌより低いのか、それとも高いのかに基づいて新規発症糖尿病ＮＯＤマウスを層化した。本開示の臨床グレードのＬ．ラクチス（L. lactis）株を用いる併用治療（ＣＴ）後に糖尿病のままであったマウスのパーセンテージを示す。カプラン・マイヤー生存曲線において、群間の統計的有意性をマンテル・コックスのログランク検定によって決定した；＊＊Ｐ＜０．０１。
【図２Ｂ】図２Ｂは、試験加入時のインスリン自己抗体（ＩＡＡ）陽性性に応じた糖尿病寛解率を示すグラフである。試験加入時の開始時血糖が３５０ｍｇ／ｄｌより低いのか、それとも高いのかに基づいて新規発症糖尿病ＮＯＤマウスを層化した。本開示の臨床グレードのＬ．ラクチス（L. lactis）株を用いる併用治療（ＣＴ）後に糖尿病のままであったマウスのパーセンテージを示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、加入時の開始時血糖およびＩＡＡ陽性性が治療の成功と関係することを示すグラフである。試験加入時の開始時血糖が３５０ｍｇ／ｄｌより低いのか、それとも高いのかおよびＩＡＡ陽性性に基づいて新規発症糖尿病ＮＯＤマウスを層化した。治療後に寛容化されたマウスのパーセンテージを示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、治療前後の間のＩＡＡ陽性性の変化が治療レスポンダーにおいて有意に異なったことを示すグラフを描写する。治療レスポンダー（上パネル）およびノンレスポンダー（下パネル）における糖尿病診断時およびＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用治療の追跡後のＩＡＡレベルを示す。群間の統計的有意性は、マン・ホイットニーｔ検定を使用して算出した；＊＊Ｐ＜０．０１。１匹のマウスについてＩＡＡの開始レベルは１３９とｙ軸の限度外であったので、示していない。
【図３Ａ】図３Ａは、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法がより高レベルのＦｏｘｐ３＋  Ｔ細胞を誘導することを示すグラフを描写する。新規発症糖尿病マウスおよびＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）の末梢血中のＣＤ４＋  Ｔ細胞集団内のＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞（左パネル）、ＣＤ２５−Ｆｏｘｐ３＋細胞（中央パネル）、および全Ｆｏｘｐ３＋細胞（右パネル）のパーセンテージ。各記号は１匹のマウスを表し、水平バーは中央値を指し示す。統計的有意性は、マン・ホイットニーｔ検定を使用して算出した；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。
【図３Ｂ】図３Ｂは、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法がより高レベルのＦｏｘｐ３＋  Ｔ細胞を誘導することを示すグラフを描写する。新規発症糖尿病マウスおよびＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）の膵臓の灌流リンパ節中のＣＤ４＋  Ｔ細胞集団内のＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞（左パネル）、ＣＤ２５−Ｆｏｘｐ３＋細胞（中央パネル）、および全Ｆｏｘｐ３＋細胞（右パネル）のパーセンテージ。各記号は１匹のマウスを表し、水平バーは中央値を指し示す。統計的有意性は、マン・ホイットニーｔ検定を使用して算出した；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。
【図３Ｃ】図３Ｃは、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法がより高レベルのＦｏｘｐ３＋  Ｔ細胞を誘導することを示すグラフを描写する。新規発症糖尿病マウスおよびＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）の膵臓中のＣＤ４＋  Ｔ細胞集団内のＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞（左パネル）、ＣＤ２５−Ｆｏｘｐ３＋細胞（中央パネル）、および全Ｆｏｘｐ３＋細胞（右パネル）のパーセンテージ。各記号は１匹のマウスを表し、水平バーは中央値を指し示す。統計的有意性は、マン・ホイットニーｔ検定を使用して算出した；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。
【図３Ｄ】図３Ｄは、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法がより高レベルのＦｏｘｐ３＋  Ｔ細胞を誘導することを示すグラフを描写する。新規発症糖尿病マウスおよびＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）の末梢血中のＣＤ４＋  Ｔ細胞集団内のＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＴＬＡ４＋細胞（左パネル）、ＣＤ２５−Ｆｏｘｐ３＋ＣＴＬＡ４＋細胞（中央パネル）、およびＦｏｘｐ３＋ＣＴＬＡ４＋細胞（右パネル）のパーセンテージ。各記号は１匹のマウスを表し、水平バーは中央値を指し示す。統計的有意性は、マン・ホイットニーｔ検定を使用して算出した；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。
【図３Ｅ】図３Ｅは、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法がより高レベルのＦｏｘｐ３＋  Ｔ細胞を誘導することを示すグラフを描写する。新規発症糖尿病マウスおよびＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）の膵臓の灌流リンパ節中のＣＤ４＋  Ｔ細胞集団内のＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＴＬＡ４＋細胞（左パネル）、ＣＤ２５−Ｆｏｘｐ３＋ＣＴＬＡ４＋細胞（中央パネル）、およびＦｏｘｐ３＋ＣＴＬＡ４＋細胞（右パネル）のパーセンテージ。各記号は１匹のマウスを表し、水平バーは中央値を指し示す。統計的有意性は、マン・ホイットニーｔ検定を使用して算出した；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。
【図３Ｆ】図３Ｆは、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法がより高レベルのＦｏｘｐ３＋  Ｔ細胞を誘導することを示すグラフを描写する。新規発症糖尿病マウスおよびＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）の膵臓中のＣＤ４＋  Ｔ細胞集団内のＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＴＬＡ４＋細胞（左パネル）、ＣＤ２５−Ｆｏｘｐ３＋ＣＴＬＡ４＋細胞（中央パネル）、およびＦｏｘｐ３＋ＣＴＬＡ４＋細胞（右パネル）のパーセンテージ。各記号は１匹のマウスを表し、水平バーは中央値を指し示す。統計的有意性は、マン・ホイットニーｔ検定を使用して算出した；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。
【図４】図４は、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法が、レスポンダーおよびノンレスポンダーにおいて抑制性ＩＬ１０分泌Ｆｏｘｐ３＋  Ｔ細胞を誘導することを示すグラフを描写する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのポリクローナルサプレッサーアッセイのために、ＣＤ４＋ＣＤ２５−エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）を正常血糖ＮＯＤマウスから単離し、色素標識し、指し示した６週の治療の終了時にＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療ＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ｈＣＤ２マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）から単離した、アクセサリー細胞および増加させた比のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋またはＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｆｏｘｐ３＋  Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の存在下で、可溶性抗ＣＤ３を使用して７２時間刺激した。色素希釈のフローサイトメトリー解析によってＴｅｆｆ細胞の増殖を測定し、エフェクターのみの培養物に対して正規化した、２回またはそれより多く分裂したＴｅｆｆ細胞のパーセンテージとして示した。ＣＤ６９のフローサイトメトリー解析によってＴｅｆｆ細胞の活性化を測定し、エフェクターのみの培養物に対して正規化したＭＦＩとして示した。Ｔｒｅｇ：Ｔｅｆｆ培養物中のＩＦＮ−γおよびＩＬ１０濃度のＭＳＤ高感度マルチプレックスアッセイ。群間の統計的有意性は、クラスカル・ウォリス検定の後にダネットの多重検定を使用して算出した；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図５】図５Ａは、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法で誘導されたＴｒｅｇがＣＴＬＡ４およびＴＧＦ−βに依存してＴエフェクター細胞応答を制御することを示すグラフである。２回またはそれより多く分裂したＴエフェクター（Ｔｅｆｆ）細胞のパーセンテージとして示す、エフェクターのみの培養による増殖に対して正規化したＴｅｆｆの増殖。Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療ＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ｈＣＤ２マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）から単離したアクセサリー細胞およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋、および指し示した中和抗体（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で抗ＣＤ３（０．５μｇ／ｍｌ）を用いて、色素標識したＣＤ４＋ＣＤ２５−  Ｔ細胞（Ｔｅｆｆ）を刺激した。群間の統計的有意性は、クラスカル・ウォリス検定の後にダネットの多重検定を使用して算出した；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。図５Ｂは、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法で誘導されたＴｒｅｇがＣＴＬＡ４およびＴＧＦ−βに依存してＴエフェクター細胞応答を制御することを示すグラフである。２回またはそれより多く分裂したＴエフェクター（Ｔｅｆｆ）細胞のパーセンテージとして示す、エフェクターのみの培養による増殖に対して正規化したＴｅｆｆの増殖。Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療ＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ｈＣＤ２マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）から単離したアクセサリー細胞およびＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｆｏｘｐ３＋  細胞（Ｔｒｅｇ）、および指し示した中和抗体（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で抗ＣＤ３（０．５μｇ／ｍｌ）を用いて、色素標識したＣＤ４＋ＣＤ２５−  Ｔ細胞（Ｔｅｆｆ）を刺激した。群間の統計的有意性は、クラスカル・ウォリス検定の後にダネットの多重検定を使用して算出した；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。図５Ｃは、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法で誘導されたＴｒｅｇがＣＴＬＡ４およびＴＧＦ−βに依存してＴエフェクター細胞応答を制御することを示すグラフである。Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法で治癒したマウスに抗ＣＴＬＡ４および抗ＴＧＦ−β抗体（ｎ＝５）を注射し、糖尿病の再発（糖尿および血中グルコース測定値＞２００ｍｇ／ｄｌ）について追跡した。
【図６Ａ】図６Ａは、新規発症糖尿病ＮＯＤマウスにおけるＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）および特異的ＦＯＸＰ３阻害剤Ｐ６０（腹腔内、５０μｇ／日）の同時投与の処理スキームである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、Ｔｒｅｇ機能の特異的阻害が治療誘導性の寛容を損なうことを示すグラフである。治療後に糖尿病のままであったマウスのパーセンテージを示す。カプラン・マイヤー生存曲線において、群間の統計的有意性はマンテル・コックスのログランク検定によって決定した；＊Ｐ＜０．０５。
【図７Ａ】図７Ａは、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）で治癒したＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ＤＴＲマウスにおけるジフテリア毒素（ＤＴ）によるＦｏｘｐ３＋  Ｔ細胞枯渇の処理スキームである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、Ｆｏｘｐ３＋  Ｔ細胞枯渇がＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ＤＴＲマウスにおいてＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法誘導性の寛容を破壊することを示すグラフである。Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ｎ＝７）の間およびＤＴ処理後の新規発症糖尿病ＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ＤＴＲマウス（ｎ＝４）における血中グルコース測定値。無作為の血中グルコース濃度が２００ｍｇ／ｄｌ未満に回復した時にマウスは治癒した（白い記号）と考え、またはマウスが２００ｍｇ／ｄｌより高い血中グルコース濃度を維持した時に治癒されなかった（黒い記号）と考えた。
【図７Ｃ】図７Ｃは、治療で治癒したＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ＤＴＲマウスの膵臓におけるＤＴ処理の前後の膵島炎スコア付けを示すグラフである。
【図７Ｄ】図７Ｄは、治療で治癒したＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ＤＴＲマウスの膵臓におけるＤＴ処理の前後の膵島内Ｆｏｘｐ３＋  Ｔ細胞の定量化を示すグラフである。併用療法寛容化マウスからの膵臓切片をインスリン（赤）、ＣＤ４（紫色）およびＦｏｘｐ３（緑）について染色し、白い矢頭は、一部インスリン陽性のランゲルハンス島内のＦｏｘｐ３＋  Ｔ細胞の存在を指し示す。囲った区画のより高倍率はＦｏｘｐ３＋細胞がＣＤ４＋  Ｔ細胞であることを明確に指し示す。統計的有意性は、マン・ホイットニーｔ検定を使用して算出した；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。
【図８Ａ】図８Ａは、新規発症糖尿病マウスおよびＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）の末梢血中のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋（左）、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｆｏｘｐ３＋（中央）、およびＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋（右）Ｔ細胞集団内のＣＴＬＡ４＋細胞のパーセンテージを示すグラフを描写する。各記号は１匹のマウスを表し、水平バーは中央値を指し示す。統計的有意性は、マン・ホイットニーｔ検定を使用して算出した；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。
【図８Ｂ】図８Ｂは、新規発症糖尿病マウスおよびＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）の膵臓の灌流リンパ節中のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋（左）、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｆｏｘｐ３＋（中央）、およびＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋（右）Ｔ細胞集団内のＣＴＬＡ４＋細胞のパーセンテージを示すグラフを描写する。各記号は１匹のマウスを表し、水平バーは中央値を指し示す。統計的有意性は、マン・ホイットニーｔ検定を使用して算出した；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。
【図８Ｃ】図８Ｃは、新規発症糖尿病マウスおよびＬ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法（ＣＴ）治療マウス（レスポンダーおよびノンレスポンダーの両方）の膵臓中のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋（左）、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｆｏｘｐ３＋（中央）、およびＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋（右）Ｔ細胞集団内のＣＴＬＡ４＋細胞のパーセンテージを示すグラフを描写する。各記号は１匹のマウスを表し、水平バーは中央値を指し示す。統計的有意性は、マン・ホイットニーｔ検定を使用して算出した；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。
【図９】図９は、Ｌ．ラクチス（L. lactis）ベースの併用療法寛容化マウスでは病的Ｔエフェクター細胞が枯渇されていないことを示すグラフである。明白に糖尿病（白の菱形）、併用療法（ＣＴ）レスポンダー（白丸）またはノンレスポンダー（クロスした丸）から単離した全脾臓細胞（１×１０７）の養子移入。統計計算はマンテル・コックスのログランク検定を使用して行った；「ｎｓ」：有意でない。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ＤＴＲマウスにおいてＤＴを用いてＦｏｘｐ３＋細胞を枯渇させる図式的なスキームである。４回の連続的な腹腔内ＤＴ注射（１、２、５および７日目（ｄ））（４０μｇ／ｋｇ体重／ｄ）をスキーム中に指し示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ＤＴＲマウスにおけるＤＴを用いたＦｏｘｐ３＋細胞の枯渇を示すグラフを描写する。末梢血のフローサイトメトリー解析は、ＤＴ処理ＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ＤＴＲマウスにおけるＦｏｘｐ３＋細胞の効率的な枯渇を実証した。膵臓切片のＦｏｘｐ３染色は、ＤＴ処理ＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ＤＴＲマウスにおいて膵島内Ｆｏｘｐ３＋細胞の効果的な枯渇を示した。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、ＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ＤＴＲマウス（左パネル）の２回の連続的なＤＴ注射の前（ｄ０）および後（ｄ３およびｄ５）のＦｏｘｐ３およびＤＴＲ−ＧＦＰ融合タンパク質について陽性のＣＤ４＋  Ｔ細胞のパーセンテージを示す代表的なフローサイトメトリープロファイルを描写する。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、ＮＯＤ．Ｆｏｘｐ３．ＤＴＲマウスにおける急性Ｆｏｘｐ３＋  Ｔｒｅｇ枯渇時の急速な糖尿病の発症を実証するグラフである。
【図１１】図１１は、ｈｌｌＡプロモーター（ＰｈｌｌＡ）、ＩＬ−１０分泌配列（ＳＳｕｓｐ４５）、およびヒトＩＬ−１０をコードする例示的な核酸配列を含む例示的なＩＬ−１０発現カセット（配列番号１３）（および対応するアミノ酸配列）を表したものであり、該配列は、その天然のシグナルペプチドなしで使用され、指し示したＩＬ−１０配列の２位において（ＰｒｏからＡｌａへの）点変異を含む（ｈＩＬ１０ａＰｘＡ）。配列番号１４は、ヒトＩＬ−１０配列に連結されたＩＬ−１０分泌配列のアミノ酸配列である。
【図１２Ａ】図１２Ａおよび図１２Ｂは合わせて、ｇａｐＢプロモーター（ＰｇａｐＢ）、ｇａｐＢ遺伝子、例示的な遺伝子間領域（ｒｐｍＤ）、ヒトＰＩＮＳをコードする例示的な核酸配列に翻訳上連結された例示的なＰＩＮＳ分泌配列（ＳＳｕｓｐ４５）を含有する例示的なＰＩＮＳポリシストロン性発現カセット（配列番号１５）を表したものである。配列番号１６は、ｇａｐＢ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列である。配列番号１７は、ＰＩＮＳ分泌配列によってコードされるアミノ酸配列、および翻訳上連結されたヒトＰＩＮＳ配列である。
【図１２Ｂ】図１２Ａおよび図１２Ｂは合わせて、ｇａｐＢプロモーター（ＰｇａｐＢ）、ｇａｐＢ遺伝子、例示的な遺伝子間領域（ｒｐｍＤ）、ヒトＰＩＮＳをコードする例示的な核酸配列に翻訳上連結された例示的なＰＩＮＳ分泌配列（ＳＳｕｓｐ４５）を含有する例示的なＰＩＮＳポリシストロン性発現カセット（配列番号１５）を表したものである。配列番号１６は、ｇａｐＢ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列である。配列番号１７は、ＰＩＮＳ分泌配列によってコードされるアミノ酸配列、および翻訳上連結されたヒトＰＩＮＳ配列である。
【図１３Ａ】図１３Ａ、図１３Ｂ、および図１３Ｃ（配列番号１８）は合わせて、トレハロース−６−リン酸ホスホリラーゼ遺伝子（ｔｒｅＰＰ；遺伝子ＩＤ：４７９７１４０）の欠失、トレハロースオペロン中の推定上のホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｔｒｅＰＴＳ；ｌｌｍｇ＿０４５３およびｌｌｍｇ＿０４５４；ｐｔｓＩおよびｐｔｓＩＩ；それぞれ、遺伝子ＩＤ：４７９７７７８および遺伝子ＩＤ：４７９７０９３）に先行するＨＵ様ＤＮＡ結合タンパク質遺伝子の構成的プロモーター（ＰｈｌｌＡ；遺伝子ＩＤ：４７９７３５３）の挿入、ｐｔｓＩとｐｔｓＩＩとの間の高発現されるＬ．ラクチス（L. lactis）ＭＧ１３６３  ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３０遺伝子（ｒｐｍＤ；遺伝子ＩＤ：４７９７８７３）に先行する遺伝子間領域の挿入を表したものである。
【図１３Ｂ】図１３Ａ、図１３Ｂ、および図１３Ｃ（配列番号１８）は合わせて、トレハロース−６−リン酸ホスホリラーゼ遺伝子（ｔｒｅＰＰ；遺伝子ＩＤ：４７９７１４０）の欠失、トレハロースオペロン中の推定上のホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｔｒｅＰＴＳ；ｌｌｍｇ＿０４５３およびｌｌｍｇ＿０４５４；ｐｔｓＩおよびｐｔｓＩＩ；それぞれ、遺伝子ＩＤ：４７９７７７８および遺伝子ＩＤ：４７９７０９３）に先行するＨＵ様ＤＮＡ結合タンパク質遺伝子の構成的プロモーター（ＰｈｌｌＡ；遺伝子ＩＤ：４７９７３５３）の挿入、ｐｔｓＩとｐｔｓＩＩとの間の高発現されるＬ．ラクチス（L. lactis）ＭＧ１３６３  ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３０遺伝子（ｒｐｍＤ；遺伝子ＩＤ：４７９７８７３）に先行する遺伝子間領域の挿入を表したものである。
【図１３Ｃ】図１３Ａ、図１３Ｂ、および図１３Ｃ（配列番号１８）は合わせて、トレハロース−６−リン酸ホスホリラーゼ遺伝子（ｔｒｅＰＰ；遺伝子ＩＤ：４７９７１４０）の欠失、トレハロースオペロン中の推定上のホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｔｒｅＰＴＳ；ｌｌｍｇ＿０４５３およびｌｌｍｇ＿０４５４；ｐｔｓＩおよびｐｔｓＩＩ；それぞれ、遺伝子ＩＤ：４７９７７７８および遺伝子ＩＤ：４７９７０９３）に先行するＨＵ様ＤＮＡ結合タンパク質遺伝子の構成的プロモーター（ＰｈｌｌＡ；遺伝子ＩＤ：４７９７３５３）の挿入、ｐｔｓＩとｐｔｓＩＩとの間の高発現されるＬ．ラクチス（L. lactis）ＭＧ１３６３  ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３０遺伝子（ｒｐｍＤ；遺伝子ＩＤ：４７９７８７３）に先行する遺伝子間領域の挿入を表したものである。
【図１４Ａ】図１４Ａおよび図１４Ｂ（配列番号１９）は合わせて、未同定分泌４５ｋＤａタンパク質遺伝子（ｕｓｐ４５；遺伝子ＩＤ：４７９７２１８）の下流のトレハロース−６−リン酸ホスファターゼ遺伝子（ｏｔｓＢ；遺伝子ＩＤ：１０３６９１４）の挿入を表したものである。ｕｓｐ４５とｏｔｓＢとの間の高発現されるＬ．ラクチス（L. lactis）ＭＧ１３６３  ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３０遺伝子（ｒｐｍＤ；遺伝子ＩＤ：４７９７８７３）に先行する遺伝子間領域の挿入。
【図１４Ｂ】図１４Ａおよび図１４Ｂ（配列番号１９）は合わせて、未同定分泌４５ｋＤａタンパク質遺伝子（ｕｓｐ４５；遺伝子ＩＤ：４７９７２１８）の下流のトレハロース−６−リン酸ホスファターゼ遺伝子（ｏｔｓＢ；遺伝子ＩＤ：１０３６９１４）の挿入を表したものである。ｕｓｐ４５とｏｔｓＢとの間の高発現されるＬ．ラクチス（L. lactis）ＭＧ１３６３  ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３０遺伝子（ｒｐｍＤ；遺伝子ＩＤ：４７９７８７３）に先行する遺伝子間領域の挿入。
【図１５Ａ】図１５Ａおよび図１５Ｂ（配列番号２０、２１および２５）は合わせて、４４６のうちのコドン位置３０におけるｔｇａ（ｔｇａ３０）の挿入と共に、その傍らの、セロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩＣコンポーネントをコードする遺伝子（ｐｔｃＣ；遺伝子ＩＤ：４７９６８９３）を破壊するためのＥｃｏＲＩ制限部位の導入を表したものである。
【図１５Ｂ】図１５Ａおよび図１５Ｂ（配列番号２０、２１および２５）は合わせて、４４６のうちのコドン位置３０におけるｔｇａ（ｔｇａ３０）の挿入と共に、その傍らの、セロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩＣコンポーネントをコードする遺伝子（ｐｔｃＣ；遺伝子ＩＤ：４７９６８９３）を破壊するためのＥｃｏＲＩ制限部位の導入を表したものである。
【図１６】図１６（配列番号２２）は、高発現されるグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇａｐＢ；遺伝子ＩＤ：４７９７８７７）の下流の、ヒトプロインスリン（ＰＩＮＳ；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０１３０８、アミノ酸２５〜１１０）をコードする、ｐｉｎｓ遺伝子とのｕｓｐ４５分泌リーダー（ＳＳｕｓｐ４５）の融合物をコードする遺伝子の挿入を表したものである。ｇａｐＢとｐｉｎｓとの間の高発現されるＬ．ラクチス（L. lactis）ＭＧ１３６３  ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３０遺伝子（ｒｐｍＤ；遺伝子ＩＤ：４７９７８７３）に先行する遺伝子間領域の挿入。
【図１７】図１７（配列番号２３）は、チミジル酸シンターゼ遺伝子（ｔｈｙＡ；遺伝子ＩＤ：４７９８３５８）の欠失を表したものである。ＨＵ様ＤＮＡ結合タンパク質遺伝子の構成的プロモーター（ＰｈｌｌＡ；遺伝子ＩＤ：４７９７３５３）の下流に、ヒトインターロイキン−１０（ｈＩＬ−１０；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ２２３０１、ａａ  １９〜１７８、バリアントＰ２Ａ、Steidler et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21(7): 785-789）をコードするｈｉｌ−１０遺伝子とのＳＳｕｓｐ４５の融合物（配列番号２４）をコードする遺伝子の挿入物を挿入してｈＩＬ−１０の発現および分泌を可能にする。
【図１８】図１８は、記載された通りのｓＡＧＸ０４０７の関連する遺伝子座：ｔｒｅＰＴＳ、ΔｔｒｅＰＰ；ｏｔｓＢ；ｐｔｃＣ−；ｇａｐＢ＞＞ｐｉｎｓおよびΔｔｈｙＡ、ｈＩＬ−１０の図式的な概要であり、関連するオリゴヌクレオチド結合部位（ｏＡＧＸｎｏ）、ＥｃｏＲＩ制限部位、（／切断／）遺伝子の特徴、遺伝子間領域（ＩＲ）、ＰＣＲ増幅産物の大きさ（ｂｐ）を指し示している。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2019526262000001.app