【手続補正書】
【提出日】令和2年2月20日(2020.2.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１０，０００コピーの関連野生型ＤＮＡ標的配列の存在下で少なくとも２つの異なる目的とする類縁希少突然変異体ＤＮＡ標的配列のそれぞれの僅か１０コピーを試料中で増幅および検出可能である多重アッセイ法において、前記突然変異体ＤＮＡ標的配列が、僅か一塩基多型により、互いに、および前記野生型ＤＮＡ標的配列とは異なり、
（ａ）非対称プライマー依存的増幅反応混合物を調製することであって、前記試料と、ＤＮＡポリメラーゼと、デオキシリボヌクレオシド三リン酸と、増幅に必要とされる他の試薬と、各希少突然変異体ＤＮＡ標的配列の増幅産物に特異的である識別可能に標識される均一な蛍光検出プローブと、前記類縁突然変異体標的配列に対する過剰濃度のリバースプライマーと、各目的とする希少突然変異体標的配列に対する限定濃度のユニークなマルチパートプライマーと、を含み、各マルチパートプライマーの配列が、５’から３’方向に、前記リバースプライマーの伸長によりコピーされる次の４つの近接ＤＮＡ配列：
前記リバースプライマーにより開始されるアンプリコン鎖における相補体が、前記プローブの標的であり、個別に同定しようとする各標的配列または標的配列群にユニークである、何れの標的ＤＮＡ配列にも相補的ではないタグＤＮＡ配列と；
プライマーアニーリング中に、前記類縁突然変異体ＤＮＡ標的配列および前記関連野生型ＤＮＡ標的配列とハイブリッド形成可能であるように十分に長いアンカーＤＮＡ配列と；
プライマーアニーリング中に前記ユニークなマルチパートプライマーの目的とするＤＮＡ標的配列と、何らかの他の類縁突然変異体標的ＤＮＡ配列と、またはプライマーアニーリング中に前記関連野生型ＤＮＡ標的配列とハイブリッド形成しない、少なくとも６ヌクレオチド長のユニークなブリッジＤＮＡ配列と；
７〜１４ヌクレオチド長であり、前記目的とするＤＮＡ標的配列と完全に相補的であるが、他の各突然変異体ＤＮＡ標的配列および前記関連野生型ＤＮＡ配列と１個以上のヌクレオチドにより互いにミスマッチがあり、これらのうち少なくとも１個が３’末端ヌクレオチドまたは前記３’末端の最後から２番目のヌクレオチドである、ユニークなフットＤＮＡ配列と、
を含み、
（ｉ）前記マルチパートプライマーのアンカーＤＮＡ配列およびフットＤＮＡ配列が両方ともその目的とする標的ＤＮＡ配列とハイブリッド形成し、それによってプライマー標的ハイブリッドを生成させる場合、前記プライマー標的ハイブリッドが、前記マルチパートプライマーの５’から３’方向に：アンカー標的ハイブリッド、バブルおよびフット標的ハイブリッドを含み、前記バブルが、１８〜４０ヌクレオチドの周縁を有し、少なくとも８ヌクレオチド長でありプライマーアニーリング中に前記ブリッジＤＮＡ配列とハイブリッド形成しない、前記標的ＤＮＡ配列中の介在ＤＮＡ配列により形成され、
（ｉｉ）前記バブルが、前記アンカー標的ハイブリッドから前記フット標的ハイブリッドを分離し、分離されたフット標的ハイブリッドが、１５〜４０ヌクレオチド長でありプライマーアニーリング条件下でハイブリッドを形成する従来のプライマーを使用して生じる閾値（ＣＴ）と比較した場合のＣＴにおける少なくとも５サイクルの遅延により明らかにされるように、前記目的とする標的ＤＮＡ配列のコピーの可能性を低下させる弱いハイブリッドであり；
（ｉｉｉ）ＰＣＲ増幅中にその目的とする標的ＤＮＡ配列に対する前記マルチパートプライマーが何らかの類縁突然変異体標的ＤＮＡ配列または前記関連する野生型標的ＤＮＡ配列のコピーを開始する可能性が、少なくとも１０回の熱サイクルの閾値の差（ΔＣＴ）により明らかなるように、その目的とする標的配列のコピーを開始する可能性よりも少なくとも１，０００倍低く；
（ｉｖ）アンプリコン鎖を生じさせたマルチパートプライマーが、前記アンプリコン鎖の相補鎖と完全に相補的であるブリッジおよびフットＤＮＡ配列を有し；
（ｖ）その目的とする標的ＤＮＡ配列の介在ＤＮＡ配列の長さと一緒に、各マルチパートプライマーのブリッジＤＮＡ配列の長さおよび配列によって、６０サイクルの指数関数的増幅内で生じ、コピーを含有しない試料から観察されるＣＴとは識別可能である、僅か１０コピーのその目的とする標的ＤＮＡ配列を含有する試料に対する閾値（ＣＴ）が観察される、
非対称プライマー依存的増幅反応混合物を調製することと；
（ｂ）前記試料中に存在する前記類縁希少突然変異体標的ＤＮＡ配列を増幅させるために、前記反応混合物を反復してサイクル化し、リアルタイムまたはエンドポイント検出により各識別可能に標識されるプローブからの蛍光強度を測定することによって、これらのＤＮＡ配列の存在を検出することと、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、サイクル化が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法での温度サイクル化であることを特徴とする、方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の方法において、前記増幅反応混合物が、アレル選択性促進試薬を含有せず、各マルチパートプライマーのフットＤＮＡ配列が７〜９ヌクレオチド長であることを特徴とする、方法。
【請求項４】
請求項１または請求項２に記載の方法において、前記増幅反応混合物が、塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）または別のアレル選択性促進試薬を含有し、各マルチパートプライマーのフットＤＮＡ配列が８〜１０ヌクレオチド長であることを特徴とする、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法において、前記フットＤＮＡ配列が、１つ以上のヌクレオチドにより前記類縁野生型ＤＮＡ配列とミスマッチがあり、これらのうちの少なくとも１つが３’末端ヌクレオチドであることを特徴とする、方法。
【請求項６】
請求項２に記載の方法において、ある標的ＤＮＡ配列に対するＣＴ値が、何らかの他の標的ＤＮＡ配列に対する場合と同じ出発鋳型数に相当することを特徴とする、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法において、前記少なくとも２つの類縁突然変異体標的ＤＮＡ配列と類縁ではない参照野生型ＤＮＡ配列を増幅し、検出することを含み、前記プライマー依存的増幅反応混合物が、前記参照ＤＮＡ配列に対する、限定マルチパートプライマーと、過剰なリバースプライマーと、均一な蛍光検出プローブと、を含み、前記参照ＤＮＡ配列に対する前記マルチパートプライマーが、請求項１に記載の構造および機能的な制限を有し、前記参照ＤＮＡ配列に対する前記マルチパートプライマーのブリッジＤＮＡ配列の長さおよびヌクレオチド配列が前記突然変異体標的ＤＮＡ配列に対する前記マルチパートプライマーの配列と調和しており、各突然変異体標的ＤＮＡ配列に対して得られるＣＴ値と前記参照野生型ＤＮＡ配列に対して得られるＣＴ値との間の差が、前記試料中に存在するＤＮＡ量に関わりなく、前記参照野生型ＤＮＡ配列の存在量に対するその突然変異体標的ＤＮＡ配列の存在量を反映するようになることを特徴とする、方法。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか一項に記載の方法において、前記反応混合物のサイクル化が機器により行われ、標的ＤＮＡ配列の数が、前記機器が個別に検出し得る色の数を超え、複数の異なるプローブが、同じフルオロフォアを有するが異なる融解温度を有する温度特異的ハイブリッド形成プローブであることを特徴とする、方法。
【請求項９】
請求項１〜７の何れか一項に記載の高度多重アッセイ法において、増幅および検出がデジタルＰＣＲ法であり、前記プローブが、色分けされた分子ビーコンプローブであることを特徴とする、高度多重アッセイ法。
【請求項１０】
請求項１〜７の何れか一項に記載の高度多重スクリーニングアッセイ法において、増幅および検出が分光蛍光分析サーマルサイクラーにおいて行われ、前記プローブが色分けされた分子ビーコンプローブであることを特徴とする、高度多重スクリーニングアッセイ法。
【請求項１１】
前記少なくとも２つの類縁希少突然変異体標的ＤＮＡ配列のうち何れかの１０コピー未満を増幅および検出可能である請求項１に記載の方法において、前記マルチパートプライマーアンカーＤＮＡ配列および前記突然変異体標的ＤＮＡ配列により形成されるハイブリッドが、前記リバースプライマーおよび前記突然変異体標的ＤＮＡ配列により形成されるハイブリッドのＴｍよりも低い融解温度（Ｔｍ）を有し、段階（ｂ）の前に、前記リバースプライマーを利用した直線的増幅の多重サイクルが、前記リバースプライマーはハイブリッド形成するが、前記マルチパートプライマーのハイブリッド形成の可能性が非常に低いプライマーアニーリング温度を使用して行われ、段階（ｂ）が、前記マルチパートプライマーおよび前記リバースプライマーがハイブリッド形成する温度より低いプライマーアニーリング温度を使用して行われることを特徴とする、方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１の何れか一項に記載の増幅および検出を行うのに十分な試薬を含むことを特徴とする、試薬キット。
【請求項１３】
請求項１〜１１の何れか一項に記載の増幅および検出を行うために必要とされるプライマーおよびプローブを含むことを特徴とする、オリゴヌクレオチドのセット。