(57)【要約】培養の安定が多数種類のサイトカイン等の因子に依存しておらず、より安定な雄性生殖系列幹細胞の増殖方法を提供する。具体的には、本発明は、実質的にＧＤＮＦ作動性化合物のみを増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階にある雄性生殖系列幹細胞の増殖方法を提供する。本発明の増殖方法を用いれば、培養の安定が従来法と比較してより少数の因子に依存しているので、雄性生殖幹細胞としての能力を維持した状態で、雄性生殖系列幹細胞をより安定に増殖させることが可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階にある雄性生殖系列幹細胞を、ＧＤＮＦレセプター作動性化合物を含む培地（Ｂ）中で培養することを含む、雄性生殖系列幹細胞の増殖方法。
【請求項２】
培養に供される雄性生殖系列幹細胞が精細管の基底膜に接触している分化段階にある、請求の範囲１に記載の増殖方法。
【請求項３】
培養に供される雄性生殖系列幹細胞が精原細胞である、請求の範囲１に記載の増殖方法。
【請求項４】
培養に供される雄性生殖系列幹細胞が哺乳動物由来である、請求の範囲１に記載の増殖方法。
【請求項５】
哺乳動物がげっ歯類である、請求の範囲４に記載の増殖方法。
【請求項６】
培地（Ｂ）が白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含まない、請求の範囲１に記載の増殖方法。
【請求項７】
培地（Ｂ）が実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む、請求の範囲１に記載の増殖方法。
【請求項８】
雄性生殖系列幹細胞をフィーダー細胞の存在下で培養することを含む、請求の範囲１に記載の増殖方法。
【請求項９】
以下の工程を含む、実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階にある雄性生殖系列幹細胞の製造方法：
ａ）インビトロ増殖のための増殖補助因子としてＧＤＮＦレセプター作動性化合物及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）を要する分化段階にある雄性生殖系列幹細胞（Ａ）を提供する工程；
ｂ）ａ）で提供された雄性生殖系列幹細胞（Ａ）をＧＤＮＦレセプター作動性化合物及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む培地中で培養し、実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階にある雄性生殖系列幹細胞（Ｂ）を得る工程。
【請求項１０】
雄性生殖系列幹細胞（Ａ）は精細管の管腔に存在している分化段階にある、請求の範囲９に記載の製造方法。
【請求項１１】
雄性生殖系列幹細胞（Ａ）は雄性生殖細胞（ｇｏｎｏｃｙｔｅ）である、請求の範囲９に記載の製造方法。
【請求項１２】
請求の範囲９に記載の方法により製造された、実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階にある雄性生殖系列幹細胞。
【請求項１３】
以下の工程を含む、雄性生殖系列幹細胞の増殖方法：
ａ）インビトロ増殖のための増殖補助因子としてＧＤＮＦレセプター作動性化合物及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）を要する分化段階にある雄性生殖系列幹細胞を提供する工程；
ｂ）ａ）で提供された雄性生殖系列幹細胞をＧＤＮＦレセプター作動性化合物及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む培地中で培養し、実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階にある雄性生殖系列幹細胞を得る工程；
ｃ）ｂ）で得られた雄性生殖系列幹細胞をＧＤＮＦレセプター作動性化合物を含む培地中で培養する工程。
【請求項１４】
請求の範囲１〜８又は１３の何れか１項に記載の増殖方法を用いて、生体外で増殖された雄性生殖系列幹細胞。
【請求項１５】
請求の範囲１４に記載の雄性生殖系列幹細胞を含んでなる不妊治療剤。
【請求項１６】
以下の工程を含む、移植された雄性生殖系列幹細胞に由来する精子を形成する非ヒト動物の製造方法：
ａ）実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階にある雄性生殖系列幹細胞を、ＧＤＮＦレセプター作動性化合物を含む培地中で培養することによって、雄性生殖系列幹細胞を増殖させる工程；
ｂ）ａ）で増殖させた雄性生殖系列幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、当該雄性生殖系列幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程。
【請求項１７】
以下の工程を含む、精子の製造方法：
ａ）実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階にある雄性生殖系列幹細胞を、ＧＤＮＦレセプター作動性化合物を含む培地中で培養することによって、雄性生殖系列幹細胞を増殖させる工程；
ｂ）ａ）で増殖させた雄性生殖系列幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、当該雄性生殖系列幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程；
ｃ）当該非ヒト動物から精子を得る工程。
【請求項１８】
以下の工程を含む、雄性生殖系列幹細胞に由来する胚の製造方法：
ａ）実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階にある雄性生殖系列幹細胞を、ＧＤＮＦレセプター作動性化合物を含む培地中で培養することによって、雄性生殖系列幹細胞を増殖させる工程；
ｂ）ａ）で増殖させた雄性生殖系列幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、当該雄性生殖系列幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程；
ｃ）当該非ヒト動物から精子を得る工程；
ｄ）当該精子を卵に受精させ、胚を得る工程。
【請求項１９】
以下の工程を含む、雄性生殖系列幹細胞に由来する非ヒト子孫の製造方法：
ａ）実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階にある雄性生殖系列幹細胞を、ＧＤＮＦレセプター作動性化合物を含む培地中で培養することによって、雄性生殖系列幹細胞を増殖させる工程；
ｂ）ａ）で増殖させた雄性生殖系列幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、当該雄性生殖系列幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程；
ｃ）当該非ヒト動物から精子を得る工程；
ｄ）当該精子を卵に受精させ、胚を得る工程；
ｅ）当該胚を宿主雌動物の子宮又は卵管に移入し、非ヒト子孫を得る工程。
【請求項２０】
以下の工程を含む、雄性生殖系列幹細胞に由来する非ヒト子孫の製造方法：
ａ）実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階にある雄性生殖系列幹細胞を、ＧＤＮＦレセプター作動性化合物を含む培地中で培養することによって、雄性生殖系列幹細胞を増殖させる工程；
ｂ）ａ）で増殖させた雄性生殖系列幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、当該雄性生殖系列幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程；
ｃ）当該非ヒト動物を雌と自然交配し、非ヒト子孫を得る工程。
【請求項２１】
実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階の雄性生殖系列幹細胞を生体外で増殖させるための剤であって、ＧＤＮＦレセプター作動性化合物を含んでなる剤。
【請求項２２】
白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含まない、請求の範囲２１に記載の剤。
【請求項２３】
実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む、請求の範囲２１に記載の剤。
【請求項２４】
雄性生殖系列幹細胞の増殖用キットであって、以下を含むキット：
ａ）ＧＤＮＦレセプター作動性化合物を含んでなる剤；
ｂ）上記ａ）の剤は、実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階にある雄性生殖系列幹細胞を増殖させるのに用いることができる、又は用いるべきであることを記載した記載物。
【請求項２５】
実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階にある雄性生殖系列幹細胞を更に含む、請求の範囲２４に記載のキット。
【請求項２６】
実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階にある雄性生殖系列幹細胞を、ＧＤＮＦレセプター作動性化合物を含む培地（Ｂ）中で培養することを含む、雄性生殖系列幹細胞の製造方法。
【請求項２７】
不妊治療剤を製造するための、請求の範囲１４に記載の雄性生殖系列幹細胞の使用。
【請求項２８】
請求の範囲１４に記載の雄性生殖系列幹細胞を用いる、不妊の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階にある雄性生殖系列幹細胞の増殖方法、該増殖方法により生体外で増殖された雄性生殖系列幹細胞、該雄性生殖系列幹細胞に由来する精子を形成する非ヒト動物の製造方法、該雄性生殖系列幹細胞に由来する精子の製造方法、該雄性生殖系列幹細胞に由来する胚の製造方法、該雄性生殖系列幹細胞に由来する非ヒト子孫の製造方法、実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階の雄性生殖系列幹細胞の製造方法等に関する。
【背景技術】  哺乳類精巣の雄性生殖系列幹細胞（ｍａｌｅ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、例えば精原幹細胞（ｓｐｅｒｍａｔｏｇｏｎｉａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）は、成体で無限に増殖し続け、減数分裂を経て精子形成に至る源となる細胞である。雄性生殖系列幹細胞は、次世代へ遺伝子を引き継ぐために分配される成体における唯一の幹細胞であるため、生体実験、医学的研究、バイオテクノロジー等に有用である。
Ｂｒｉｎｓｔｅｒらは、１９９４年にｉｎ  ｖｉｖｏで精原幹細胞を移植することに成功した（ブリンスター，ＲＬ（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，ＲＬ）ら著、プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス  オブ  ザ  ユナイテッド  ステイツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、米国、第９１巻、第２４号、ｐ．１１２９８−１１３０２、１９９４年）。この方法では精巣を形成する精細管内に幹細胞を移植するとコロニーをつくり、ドナー細胞由来の精子形成を起こし、仔をつくることができるというものである。これによって、ＥＳ細胞以外にも生殖系列細胞を操作する新しい可能性が切り開かれ、雄性生殖系列幹細胞を用いた発生工学という新しい分野が確立された。
一方、精原幹細胞の生体内における自己増殖や分化は、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）等のサイトカインによって制御されていることが明らかにされた（サリオラ，Ｈ（Ｓａｒｉｏｌａ，Ｈ）ら著、セルラー  アンド  モレキュラー  ライフ  サイエンシズ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、スイス国、第５８巻、第８号、ｐ．１０６１−１０６６、２００１年、メング，Ｘ（Ｍｅｎｇ，Ｘ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、米国、第２８７巻、第５４５７号、ｐ．１４８９−１４９３、２０００年参照）。
しかし、精原幹細胞等の雄性生殖系列幹細胞をインビトロにおいて増殖させることは極めて困難であった。仁科行雄著、「胚性幹細胞などの生体内移植系による未分化・分化状態の維持機構の解析」、ライフサイエンス振興財団年報  平成１４年版、財団法人ライフサイエンス振興財団、平成１５年３月１日、ｐ．１７−１９には、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を添加した培地中での培養により、形態学的基準に基づき有意に精原細胞数が維持されたことが記載されているが、精原幹細胞の確認アッセイは形態ではなく、精細管内移植による機能的アッセイによらねばならないため、この報告により維持された細胞が分化した精原細胞であるのか、幹細胞であるのか不明である。
このような状況のもと、本願発明者らは、精原幹細胞等の雄性生殖系列幹細胞のインビトロ長期培養方法を開発した（カナツ−シノハラ，Ｍ（Ｋａｎａｔｓｕ−Ｓｈｉｎｏｈａｒａ，Ｍ）ら著、バイオロジー  オブ  レプロダクション（Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、米国、第６９巻、第２号、ｐ．６１２−６１６、２００３年、ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００４６１２）。新生児の精巣細胞をグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）等の存在下で培養すると、生殖細胞が固有の形状のコロニーを形成し、幹細胞が５ヶ月以上にわたり増殖した。不妊マウスの精細管に移植すると、培養した細胞は精子形成コロニーをつくり、正常な精子及び子孫を産出した。これにより、雄性生殖系列幹細胞を実用可能な程度にまで増殖させ、操作し、バイオテクノロジー等へ応用することが可能となった。
しかしながら、上記培養方法は、雄性生殖系列幹細胞を長期間増殖、維持することが可能な優れた方法であるが、培養の安定が複数種類のサイトカイン等の因子に依存していることから、培地中のサイトカイン濃度等の変動が培養系の不安定化を招く可能性があり得るという問題点を有していた。
そこで、培養の安定が多数種類のサイトカイン等の因子に依存していない、より安定で効率的な雄性生殖系列幹細胞の増殖方法の開発が求められていた。
【発明の開示】
上記事情に鑑み、本発明は、培養の安定が多数種類のサイトカイン等の因子に依存していない、より安定で効率的な雄性生殖系列幹細胞の増殖方法を提供することを目的とする。
上記目的を達成すべく鋭意研究した結果、新生動物の雄性生殖系列幹細胞の増殖にはＧＤＮＦレセプター作動性化合物、および白血病抑制因子（ＬＩＦ）の培地への添加が必須であるが、出生後一定期間以上経過した動物（例えば雄性生殖系列幹細胞が精細管の基底膜へ接触した分化段階にある動物）由来の雄性生殖系列幹細胞等は実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを増殖補助因子として含む培地中で増殖可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は以下に関する。
（１）実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階にある雄性生殖系列幹細胞を、ＧＤＮＦレセプター作動性化合物を含む培地（Ｂ）中で培養することを含む、雄性生殖系列幹細胞の増殖方法。
（２）培養に供される雄性生殖系列幹細胞が精細管の基底膜に接触している分化段階にある、上記（１）に記載の増殖方法。
（３）培養に供される雄性生殖系列幹細胞が精原細胞である、上記（１）に記載の増殖方法。
（４）培養に供される雄性生殖系列幹細胞が哺乳動物由来である、上記（１）に記載の増殖方法。
（５）哺乳動物がげっ歯類である、上記（４）に記載の増殖方法。
（６）培地（Ｂ）が白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含まない、上記（１）に記載の増殖方法。
（７）培地（Ｂ）が実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む、上記（１）に記載の増殖方法。
（８）雄性生殖系列幹細胞をフィーダー細胞の存在下で培養することを含む、上記（１）に記載の増殖方法。
（９）以下の工程を含む、実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階にある雄性生殖系列幹細胞の製造方法：
ａ）インビトロ増殖のための増殖補助因子としてＧＤＮＦレセプター作動性化合物及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）を要する分化段階にある雄性生殖系列幹細胞（Ａ）を提供する工程；
ｂ）ａ）で提供された雄性生殖系列幹細胞（Ａ）をＧＤＮＦレセプター作動性化合物及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む培地中で培養し、実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階にある雄性生殖系列幹細胞（Ｂ）を得る工程。
（１０）雄性生殖系列幹細胞（Ａ）は精細管の管腔に存在している分化段階にある、上記（９）に記載の製造方法。
（１１）雄性生殖系列幹細胞（Ａ）は雄性生殖細胞（ｇｏｎｏｃｙｔｅ）である、上記（９）に記載の製造方法。
（１２）上記（９）に記載の方法により製造された、実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階にある雄性生殖系列幹細胞。
（１３）以下の工程を含む、雄性生殖系列幹細胞の増殖方法：
ａ）インビトロ増殖のための増殖補助因子としてＧＤＮＦレセプター作動性化合物及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）を要する分化段階にある雄性生殖系列幹細胞を提供する工程；
ｂ）ａ）で提供された雄性生殖系列幹細胞をＧＤＮＦレセプター作動性化合物及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む培地中で培養し、実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階にある雄性生殖系列幹細胞を得る工程；
ｃ）ｂ）で得られた雄性生殖系列幹細胞をＧＤＮＦレセプター作動性化合物を含む培地中で培養する工程。
（１４）上記（１）〜（８）又は（１３）の何れかに記載の増殖方法を用いて、生体外で増殖された雄性生殖系列幹細胞。
（１５）上記（１４）に記載の雄性生殖系列幹細胞を含んでなる不妊治療剤。
（１６）以下の工程を含む、移植された雄性生殖系列幹細胞に由来する精子を形成する非ヒト動物の製造方法：
ａ）実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階にある雄性生殖系列幹細胞を、ＧＤＮＦレセプター作動性化合物を含む培地中で培養することによって、雄性生殖系列幹細胞を増殖させる工程；
ｂ）ａ）で増殖させた雄性生殖系列幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、当該雄性生殖系列幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程。
（１７）以下の工程を含む、精子の製造方法：
ａ）実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階にある雄性生殖系列幹細胞を、ＧＤＮＦレセプター作動性化合物を含む培地中で培養することによって、雄性生殖系列幹細胞を増殖させる工程；
ｂ）ａ）で増殖させた雄性生殖系列幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、当該雄性生殖系列幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程；
ｃ）当該非ヒト動物から精子を得る工程。
（１８）以下の工程を含む、雄性生殖系列幹細胞に由来する胚の製造方法：
ａ）実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階にある雄性生殖系列幹細胞を、ＧＤＮＦレセプター作動性化合物を含む培地中で培養することによって、雄性生殖系列幹細胞を増殖させる工程；
ｂ）ａ）で増殖させた雄性生殖系列幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、当該雄性生殖系列幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程；
ｃ）当該非ヒト動物から精子を得る工程；
ｄ）当該精子を卵に受精させ、胚を得る工程。
（１９）以下の工程を含む、雄性生殖系列幹細胞に由来する非ヒト子孫の製造方法：
ａ）実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階にある雄性生殖系列幹細胞を、ＧＤＮＦレセプター作動性化合物を含む培地中で培養することによって、雄性生殖系列幹細胞を増殖させる工程；
ｂ）ａ）で増殖させた雄性生殖系列幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、当該雄性生殖系列幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程；
ｃ）当該非ヒト動物から精子を得る工程；
ｄ）当該精子を卵に受精させ、胚を得る工程；
ｅ）当該胚を宿主雌動物の子宮又は卵管に移入し、非ヒト子孫を得る工程。
（２０）以下の工程を含む、雄性生殖系列幹細胞に由来する非ヒト子孫の製造方法：
ａ）実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階にある雄性生殖系列幹細胞を、ＧＤＮＦレセプター作動性化合物を含む培地中で培養することによって、雄性生殖系列幹細胞を増殖させる工程；
ｂ）ａ）で増殖させた雄性生殖系列幹細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植し、当該雄性生殖系列幹細胞に由来する精子形成を起こした非ヒト動物を得る工程；
ｃ）当該非ヒト動物を雌と自然交配し、非ヒト子孫を得る工程。
（２１）実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階の雄性生殖系列幹細胞を生体外で増殖させるための剤であって、ＧＤＮＦレセプター作動性化合物を含んでなる剤。
（２２）白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含まない、上記（２１）に記載の剤。
（２３）実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む、上記（２１）に記載の剤。
（２４）雄性生殖系列幹細胞の増殖用キットであって、以下を含むキット：
ａ）ＧＤＮＦレセプター作動性化合物を含んでなる剤；
ｂ）上記ａ）の剤は、実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階にある雄性生殖系列幹細胞を増殖させるのに用いることができる、又は用いるべきであることを記載した記載物。
（２５）実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階にある雄性生殖系列幹細胞を更に含む、上記（２４）に記載のキット。
（２６）実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階にある雄性生殖系列幹細胞を、ＧＤＮＦレセプター作動性化合物を含む培地（Ｂ）中で培養することを含む、雄性生殖系列幹細胞の製造方法。
（２７）不妊治療剤を製造するための、上記（１４）に記載の雄性生殖系列幹細胞の使用。
（２８）上記（１４）に記載の雄性生殖系列幹細胞を用いる、不妊の治療方法。
本発明の増殖方法を用いれば、従来法と比較して、培養の安定がより少数の因子に依存しているので、雄性生殖系列幹細胞を、雄性生殖幹細胞としての能力を維持した状態で、より安定で効率的に増殖させることが可能である。従って本発明の増殖方法は、遺伝子改変動物（遺伝子導入動物、遺伝子欠損動物等）の作製、雄性不妊の治療方法および雄性不妊の治療剤の開発、生殖細胞レベルにおける遺伝子治療のための研究および薬剤の開発などに有用である。
【図面の簡単な説明】  図１は、実施例における、マウスの精巣細胞からの雄性生殖系列幹細胞増殖コロニーの発達を顕微鏡で観察した結果を示す写真である。左上図は新生児のマウス精巣細胞のＬＩＦ（−）培地による培養、右上図は新生児マウス精巣細胞のＬＩＦ（＋）培地による培養、左下図は５日齢仔マウス精巣細胞のＬＩＦ（−）培地による培養、右下図は５日齢仔マウス精巣細胞のＬＩＦ（＋）培地による培養をそれぞれ示す。スケールバーは５０μｍに相当する。
図２は、実施例において培養された雄性生殖系列幹細胞の増殖を示すグラフであり、具体的には、ＧＦＰ標識でフィーダー細胞と区別できる雄性生殖系列幹細胞の数を測定したものである。縦軸には培養開始時の細胞数を１としたときの相対的細胞数（倍）を、横軸には培養開始後の日数を示す。
図３は、実施例においてラミニンコートプレート上で培養された雄性生殖系列幹細胞の増殖を示すグラフである。縦軸には培養開始時の細胞数を１としたときの相対的細胞数（倍）を、横軸には培養開始後の日数を示す。
図４は、１５％ＦＣＳ含有ＧＤＮＦ含有ＥＧＦ、ｂＦＧＦ及びＬＩＦ不含培地中での雄性生殖系列幹細胞の増殖を示すグラフである。縦軸には培地転換時の細胞数を１としたときの相対的な細胞数（平均値±標準誤差）を、横軸には培地転換後の日数を示す。
図５の（ａ）〜（ｈ）は、実施例において、各分子マーカーを用いて、フローサイトメトリーによって培養細胞の性質を試験した結果を示すグラフである。縦軸には細胞数（個）を、横軸には相対的蛍光強度を示す。白色カラムは一次抗体を用いずに細胞を染色した場合（ネガティブコントロール）のヒストグラムを、黒色カラムは一次抗体を用いて細胞を染色した場合のヒストグラムを示す。（ａ）〜（ｈ）に示す各グラフは、分子マーカーとして、（ａ）から順に、α６−インテグリン、β１−インテグリン、ＥｐＣＡＭ、ＥＥ２、ｃ−ｋｉｔ、ＳＳＥＡ−１、ＣＤ９、フォルスマン抗原をそれぞれ用いた場合である。細胞数全体に対するゲート中の細胞の割合（％）は、それぞれ、（ａ）９５．９１％、（ｂ）９８．１２％、（ｃ）９６．７５％、（ｄ）９９．８９％、（ｅ）１２．７４％、（ｆ）０．０６％、（ｇ）９９．８４％、（ｈ）０．８０％である。
図６は、実施例における、移植後の雄性生殖系列幹細胞からの精子形成を示す写真である。ＵＶ照射下で蛍光を示すＧＦＰ標識された雄性生殖系列幹細胞由来の精子形成コロニーを示す。
図７は、精巣の巨視的（上段（ａ）〜（ｃ））及び組織学的（下段（ｄ）〜（ｆ））外観を示す写真である。新生児（０日齢）、仔（５日齢）及び成体（４〜５週齢）の精巣を、それぞれ左、中央、右に示す。新生児から成体へ成熟するに伴い、精巣内に間質系細胞がより多く存在する。下段の挿入図内の矢印は生殖細胞（雄性生殖系列幹細胞）を示す。上段のスケールバーは２ｍｍ、下段挿入図のスケールバーは２０μｍに相当する。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明の雄性生殖系列幹細胞の増殖方法は、実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階にある雄性生殖系列幹細胞を、ＧＤＮＦレセプター作動性化合物を含む培地中で培養することを含む。
また、本発明の増殖方法は、既存の実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階にある雄性生殖系列幹細胞から、新たな雄性生殖系列幹細胞を製造する方法でもある。
本発明において、雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子とは、雄性生殖系列幹細胞としての能力を維持した状態での雄性生殖系列幹細胞の増殖を補助する物質をいい、より具体的には、雄性生殖系列幹細胞としての能力を維持した状態での雄性生殖系列幹細胞の増殖を誘導する物質、雄性生殖系列幹細胞としての能力を維持した状態での雄性生殖系列幹細胞の増殖を増強する物質、雄性生殖系列幹細胞としての能力の維持に寄与する物質等が含まれる。
該増殖補助因子としては、通常ＧＤＮＦレセプター作動性化合物の他に、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）等の増殖因子、白血病抑制因子（ＬＩＦ）等の分化抑制性サイトカイン等が挙げられるが、本発明の増殖方法に用いられる雄性生殖系列幹細胞は、実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能である。
「実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地」とは、下記に記す基礎培地、添加物、血清（血清代替物を含む）、フィーダー細胞等に由来する成分を除き、ＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として、雄性生殖系列幹細胞の増殖を補助しうる濃度で含む培地をいう。
即ち、該培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）等のＧＤＮＦレセプター作動性化合物以外の増殖補助因子を雄性生殖系列幹細胞の増殖を補助しうる濃度では含まない。
「実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地」としては、例えば下記に記す基礎培地、添加物、血清（血清代替物を含む）及びＧＤＮＦレセプター作動性化合物からなる培地が挙げられる。
ＧＤＮＦレセプター作動性化合物とは、ＧＤＮＦレセプター又は該レセプターの補助レセプターに結合して、該レセプターを介して細胞や生体を活性化し得る化合物を意味する。例えば、本発明の雄性生殖系列幹細胞の増殖方法において用いられたときに、ＧＤＮＦレセプターを介して雄性生殖系列幹細胞の増殖を補助し、該細胞の増殖を達成し得る物質をいう。
ＧＤＮＦレセプター作動性化合物としては、例えば、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ノルトリン（Ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）、ペルセフィン（Ｐｅｒｓｅｐｈｉｎ）、アルテミン（Ａｒｔｅｍｉｎ）等が挙げられる。ＧＤＮＦレセプター作動性化合物は、好ましくはグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）である。
グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）レセプターとは、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）の結合物質であって、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）のシグナルを細胞内や生体内へ伝達可能な化合物を意味する。該レセプターとしては、特に、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）のシグナル媒介性レセプターであるｃＲｅｔレセプターチロシンキナーゼが挙げられる。
グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）の補助レセプターとは、ＧＤＮＦレセプター作動性化合物のシグナルを直接は細胞内や生体内へ伝達しないが、ＧＤＮＦレセプター作動性化合物のシグナルを伝達するレセプターを活性化する化合物を意味する。このような化合物は、特に、そのメンバーがＧＤＮＦファミリーレセプターα：ｓ（ＧＦＲα）と称されるレセプターである。これらはまた、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ペルセフィン、アルテミンおよびノルトリンのシグナル伝達レセプター複合体（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ）と関係する。該ファミリーのレセプターとしては４メンバー（ＧＦＲα１〜４）（Ｊｉｎｇ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，８５，９−１０（１９９６）；Ｊｉｎｇ，Ｓ．Ｑ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，３３１１１−３３１１７（１９９７）；Ｔｒｅａｎｏｒ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３８２，８０−８３（１９９６）；Ｓｕｂａｎｔｏ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，６，１２６７−１２７３（１９９７））が既知である。これらは独立してシグナルを伝達することができるが、すべてがリガンド結合およびｃＲｅｔ活性化に不可欠である。
また、ＧＤＮＦレセプター作動性化合物としては、ＧＤＮＦレセプター又は該レセプターの補助レセプターを特異的に認識する抗体やその結合性フラグメント等も含まれる。
本発明の雄性生殖系列幹細胞の増殖方法において、培地中に含まれるＧＤＮＦレセプター作動性化合物の濃度は、雄性生殖系列幹細胞の増殖を補助し、該細胞の増殖を達成しうる濃度であれば特に限定されないが、通常０．０５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、例えば０．５ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、更に好ましくは０．５〜２００ｎｇ／ｍｌ、よりいっそう好ましくは０．５〜５０ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは２〜２０ｎｇ／ｍｌである。
本発明の雄性生殖系列幹細胞の増殖方法において用いられる培地は、更に上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）及び塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の少なくともいずれかを含むことが出来る。
上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）及び塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）は、雄性生殖系列幹細胞の増殖の補助、特に増殖の誘導又は増強に有用であり、当該因子を培地に添加することで、より安定且つ効率的に雄性生殖系列幹細胞を増殖させることが出来る。
本発明の雄性生殖系列幹細胞の増殖方法において、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）が培地中に含まれる場合、その濃度は、雄性生殖系列幹細胞の増殖を補助し、該細胞の増殖を達成しうる濃度であれば特に限定されないが、通常濃度０．０５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、例えば０．５ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、更に好ましくは０．５〜２００ｎｇ／ｍｌ、よりいっそう好ましくは０．５〜５０ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは２〜３０ｎｇ／ｍｌである。
本発明の雄性生殖系列幹細胞の増殖方法において、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）が培地中に含まれる場合、その濃度は、雄性生殖系列幹細胞の増殖を補助し、該細胞の増殖を達成しうる濃度であれば特に限定されないが、通常濃度０．０５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、例えば０．５ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、更に好ましくは０．５〜２００ｎｇ／ｍｌ、よりいっそう好ましくは０．５〜５０ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは２〜２０ｎｇ／ｍｌである。
本発明の雄性生殖系列幹細胞の増殖方法において用いられる培地は、実質的に白血病阻害因子（ＬＩＦ）を含まなくてもよい。
実質的に白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含まない培地とは、白血病抑制因子（ＬＩＦ）を雄性生殖系列幹細胞の増殖を補助し得る濃度では含まない培地をいう。
本発明の増殖方法に供される雄性生殖系列幹細胞は、実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階にあるので、該細胞の増殖には白血病抑制因子（ＬＩＦ）を要さないからである。
なお、本発明の雄性生殖系列幹細胞の増殖方法において用いられる培地は、更に白血病阻害因子（ＬＩＦ）を含んでいても悪影響はない。
本発明の雄性生殖系列幹細胞の増殖方法において、白血病阻害因子（ＬＩＦ）が培地中に含まれる場合、その濃度は、通常１０〜１０６ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、例えば１０〜１０５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、好ましくは１０２〜１０４ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、より好ましくは３×１０２〜５×１０３ｕｎｉｔｓ／ｍｌである。
本発明の雄性生殖系列幹細胞の増殖方法において培地に含まれうる増殖補助因子（ＧＤＮＦレセプター作動性化合物、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）及び塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）等）は、動物由来のもの、好ましくは後述の哺乳動物由来のものであれば特に限定されない。
グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）としては、例えば、ヒト及びラット（ＷＯ９３／０６１１６号パンフレット）、マウス（例えばＧｅｎｅ  ２０３，２，１４９−１５７，１９９７参照）等のグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）が例示される。
白血病阻害因子（ＬＩＦ）としては、例えば、ヒト（特開平１−５０２９８５号公報）、マウス（特開平１−５０２９８５号公報）、ヒツジ（特開平４−５０２５５４号公報）、ブタ（特開平４−５０２５５４号公報）、ウシ（特開平８−１５４６８１号公報）等の白血病阻害因子（ＬＩＦ）が例示される。
上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）としては、例えば、マウス（例えばＮａｔｕｒｅ，２５７，３２５−３２７，１９７５参照）、ヒト（例えばＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，４１５，１９９１参照）等の上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）が例示される。
塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）としては、例えば、ヒトｂＦＧＦ（例えばＥｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ．，８，９５，１９８７参照）、ウシｂＦＧＦ（例えばＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，６９６３，１９８４参照）、マウスｂＦＧＦ（例えばＤｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１３８，４５４−４６３，１９９０参照）、ラットｂＦＧＦ（例えばＢｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１５７，２５６−２６３，１９８８参照）等が例示される。
また、当該増殖補助因子は、本発明の雄性生殖系列幹細胞の増殖方法において用いられた際に、雄性生殖系列幹細胞の増殖を補助し、該細胞の増殖を達成し得る範囲において、精製された天然、合成又は組換えタンパク質、変異体タンパク質（挿入、置換および欠失変異体を含む）、フラグメント、および化学修飾されたそれらの誘導体を含む。また、同様の範囲内において、上述の各増殖補助因子の野生型のアミノ酸配列と実質的に相同なタンパク質も含む。
変異タンパク質における挿入、置換又は欠失されるアミノ酸の数は通常１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、最も好ましくは１又は２個である。
「実質的に相同」とは、野生型のアミノ酸配列に対する相同性の程度が、好ましくは、７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上であることを意味する。相同性の割合（％）は、（Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｖ．５，ｐ．１２４，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９７２））に記載されているとおり、配列の整列を助するために１００アミノ酸長中に４個のギャップを導入しうる場合には、比較する配列中の同一のアミノ酸残基であって整列する２種の配列の小さい方に存在するアミノ酸残基の割合（％）として算出される。また、野生型のアミノ酸配列を有する上記各サイトカインに対する抗体との交差反応性に基づいて単離しうる任意のタンパク質、あるいは上記各サイトカインの野生型のアミノ酸配列をコードする遺伝子又は遺伝子セグメントとのストリンジェントな条件下におけるハイブリダイゼーションにより単離される遺伝子によりコードされるタンパク質が、実質的に相同なものとして含まれる。
上記ストリンジェントな条件としては、例えばサムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）の「大腸菌におけるクローン遺伝子の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（１９８９））Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，９．４７−９．６２及び１１．４５−１１．６１」等に記載されたハイブリダイゼーション条件（例えば、ハイブリダイゼーション緩衝液（６．０×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性断片化サケ精子ＤＮＡ）中６８℃にてハイブリダイゼーションの後、以下の条件にて洗浄：洗浄液（２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ）中室温５分間、洗浄液（２×ＳＳＣ×０．１％ＳＤＳ）中室温１５分、洗浄液（０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ）中３７℃１時間、洗浄液（０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ）中６８℃１時間）が例示される。
また、本発明の雄性生殖系列幹細胞の増殖方法において用いられる培地は、実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地であってもよい。
このように、培地中に添加する増殖補助因子の種類を限定することにより、操作性及び経済性に優れ、安定且つ効率的な培養系を構築することができる。
本発明の雄性生殖系列幹細胞の増殖方法において用いられる培地の基礎培地は、自体公知のものを用いることができ、特に限定されないが、例えばＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｆ−１０、Ｍ−１９９、ＨＡＭ、ＡＴＣＣ−ＣＲＣＭ３０、ＤＭ−１６０、ＤＭ−２０１、ＢＭＥ、ＳＦＭ−１０１、Ｆｉｓｃｈｅｒ、ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ−１５、ＲＩＴＣ８０−７、ＨＦ−Ｃ１、ＭＣＤＢ１０７、ＮＣＴＣ１３５、Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓ  ＭＢ７５２／１、ＳｔｅｍＰｒｏ−３４  ＳＦＭ等が挙げられる。また、ＥＳ細胞培養用等に改変された培地を用いてもよく、上記基礎培地の混合物を用いてもよい。
本発明の雄性生殖系列幹細胞の増殖方法において用いられる培地は、通常の細胞培養で用いられる自体公知の添加物を含むことができる。添加物としては、特に限定されないが、例えば成長因子（例えばインスリン等）、鉄源（例えばトランスフェリン等）、ポリアミン類（例えばプトレシン等）、ミネラル（例えばセレン酸ナトリウム等）、糖類（例えばグルコース等）、有機酸（例えばピルビン酸、乳酸等）、血清蛋白質（例えばアルブミン等）、アミノ酸（例えばＬ−グルタミン等）、還元剤（例えば２−メルカプトエタノール等）、ビタミン類（例えばアスコルビン酸、ｄ−ビオチン等）、ステロイド（例えばβ−エストラジオール、プロゲステロン等）、抗生物質（例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ等）、栄養添加物（例えばＳｔｅｍＰｒｏ−Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ等）等が挙げられる。
当該添加物は、それぞれ自体公知の濃度範囲内で培地に含まれることが好ましい。
また、本発明の雄性生殖系列幹細胞の増殖方法において用いられる培地は、血清を含むことができる。血清としては、動物由来の血清であれば特に限定されないが、好ましくは後述の哺乳動物由来の血清（例えばウシ胎児血清、ヒト血清等）である。また血清の代替添加物（例えばＫｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等）を用いてもよい。
血清は非動化等の処理が加えられていることが好ましい。
血清の濃度は特に限定されないが、通常、０．１〜３０（ｖ／ｖ）％の範囲である。
本発明の雄性生殖系列幹細胞の増殖方法においては、雄性生殖系列幹細胞をフィーダー細胞の存在下で培養してもよい。
フィーダー細胞とは、雄性生殖系列幹細胞と共に培養された際に、雄性生殖系列幹細胞としての能力を維持した状態での雄性生殖系列幹細胞の増殖を補助する環境を提供する、非雄性生殖系列幹細胞をいう。
フィーダー細胞としては、特に限定されないが、自体公知のものを用いることができ、例えば、線維芽細胞（マウス胎児線維芽細胞、マウス線維芽細胞株ＳＴＯ等）が挙げられる。
フィーダー細胞は自体公知の方法、例えば放射線（ガンマ線等）照射や抗癌剤（マイトマイシンＣ等）処理等で不活化されていることが好ましい。
フィーダー細胞を用いる場合には、通常例えば６穴プレートの１穴あたり、１０５〜１０６個程度の細胞数が用いられる。
雄性生殖系列幹細胞をフィーダー細胞の存在下で培養することにより、雄性生殖系列幹細胞がフィーダー細胞に接着し、より効率的に増殖コロニーを形成することができる。
あるいは、フィーダー細胞を用いる代わりに、雄性生殖系列幹細胞をラミニンなどの細胞外マトリクスに接触させた状態で培養してもよい。
例えば、ラミニンをコーティングした細胞培養容器中で雄性生殖系列幹細胞を培養することにより、該細胞はラミニンに接触、接着し、より効率的に増殖コロニーを形成することができる。
用いられるラミニンの量は、本発明の増殖方法において、雄性生殖系列幹細胞の増殖を達成しうる範囲において適宜設定される。例えば、細胞培養容器に０．０５〜２００μｇ／ｍＬの濃度でラミニンを含む中性リン酸緩衝生理食塩水を加え０．５〜２４時間程度室温にて静置することによって、細胞培養容器をラミニンによりコーティングし、培養に用いる。
本発明において用いられる雄性生殖系列幹細胞は、脊椎動物由来の細胞であれば特に限定されない。
該脊椎動物としては、例えば、哺乳動物、鳥、魚、両生動物および爬虫類動物が挙げられる。哺乳動物としては、特に限られないが、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類を挙げることが出来る。鳥類としては、ニワトリ、ウズラ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、オーストリッチ、エミュ、ホロホロ鳥、ハト等を挙げることができる。脊椎動物は、好ましくは哺乳動物である。
本発明において、雄性生殖系列幹細胞とは、自己複製し、精子又はその前駆細胞（例えば精原細胞、精細胞、精祖細胞、精母細胞、精娘細胞等）へ分化し得る能力（雄性生殖系列幹細胞としての能力）を有する生殖系列細胞をいう。
雄性生殖系列幹細胞としては、例えば、始原生殖細胞（ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ）、雄性生殖細胞（ｇｏｎｏｃｙｔｅ）、精原幹細胞等が挙げられる。本発明において、雄性生殖系列幹細胞は、好ましくは、雄性生殖細胞（ｇｏｎｏｃｙｔｅ）又は精原幹細胞である。
細胞が雄性生殖系列幹細胞であるか否かは、例えば、ブリンスター，ＲＬ（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，ＲＬ）ら著、プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス  オブ  ザ  ユナイテッド  ステイツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、米国、第９１巻、第２４号、ｐ．１１２９８−１１３０２、１９９４年等に記載された方法に従って、不妊の雄性動物の精細管内に対象の細胞を移入し、該細胞が精細管内で精子形成コロニーを形成する能力を有するか否かを試験することにより判別することができる。該試験の結果、精子形成コロニーを形成する能力を有する細胞は雄性生殖系列幹細胞であると判別される。
また、細胞が雄性生殖系列幹細胞であるか否かは、例えば、フローサイトメーター等を用いて、細胞表面マーカー等の発現を解析することによっても判別し得る。有用な細胞表面マーカーとしては、β１−インテグリン、α６−インテグリン、ＥＥ２、ＥｐＣＡＭ、ＳＳＥＡ−１、ｃ−ｋｉｔ、ＣＤ９、フォルスマン抗原等が挙げられる。
本発明における雄性生殖系列幹細胞は、例えばマウス由来の細胞であれば、β１−インテグリン、α６−インテグリン、ＥＥ２、ＥｐＣＡＭ及びｃ−ｋｉｔからなる群から選ばれる少なくともいずれかの抗原が陽性であり、好ましくは、全てが陽性である。また、ｃ−ｋｉｔは好ましくは弱陽性である。
また、本発明における雄性生殖系列幹細胞は、例えばマウス由来の細胞であれば、ＳＳＥＡ−１及びフォルスマン抗原からなる群から選ばれる少なくともいずれかの抗原が陰性であり、好ましくはいずれの抗原も陰性である。
ここで細胞表面マーカーの発現が「陽性」とは、細胞表面マーカーが細胞表面上に発現しており、当該細胞表面マーカーに対する特異的抗体による特異的結合が確認できることをいう。「弱陽性」とは、他の細胞と比較して、細胞表面マーカーの発現量が相対的に弱い、細胞表面マーカーの発現量の弱い集団が相対的に多い、又は細胞表面マーカーを発現している細胞集団の割合が相対的に少ないこと等をいう。
マウス以外の動物種の雄性生殖系列幹細胞においても、細胞表面マーカーの発現様式はマウスと同様である。ただし、当該動物種が生来的に保有していないマーカーがある場合は、当該マーカーは解析から除外されるなど、種差が考慮される。
本発明のポイントは、雄性生殖系列幹細胞の分化段階には、以下の２つが存在することを見出したことにある。
（Ａ）インビトロ増殖のための増殖因子としてＧＤＮＦレセプター作動性化合物及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）を要する分化段階（以下分化段階（Ａ）とする）。
（Ｂ）実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階（以下分化段階（Ｂ）とする）。
換言すれば、分化段階（Ａ）にある雄性生殖系列幹細胞のインビトロにおけるＧＤＮＦレセプター作動性化合物依存的増殖には、白血病抑制因子（ＬＩＦ）を要するが、分化段階（Ｂ）にある雄性生殖系列幹細胞のインビトロにおけるＧＤＮＦレセプター作動性化合物依存的増殖には白血病抑制因子（ＬＩＦ）を要しない。
雄性生殖系列幹細胞が上述のいずれの分化段階にあるかは、例えば下記に詳述する培養方法によって、雄性生殖系列幹細胞をＧＤＮＦレセプター作動性化合物及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む培地（培地（Ａ）とする）、又は実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地（培地（Ｂ）とする）中で培養し、雄性生殖系列幹細胞が増殖するか否かを試験することで、当業者であれば容易に判別することが出来る。
分化段階（Ａ）の雄性生殖系列幹細胞は、上記培地（Ａ）中で増殖することができるが、上記（Ｂ）中では増殖することができない。
一方、分化段階（Ｂ）の雄性生殖系列幹細胞は、上記培地（Ａ）中及び上記培地（Ｂ）中で増殖することができる。
上記試験においては、その感度を増幅させるため、上記培地（Ａ）及び（Ｂ）に上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）及び塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の少なくとも何れか若しくは両方を添加してもよい。
また、種々の発生（成長）段階又は齢にある雄性動物の精巣から雄性生殖系列幹細胞を採取し、下記に詳述する培養方法によって、該細胞を上記培地（Ａ）及び培地（Ｂ）中で培養し、雄性生殖系列幹細胞の増殖の有無を試験することで、上述の各分化段階の雄性生殖系列幹細胞を含む雄性動物の発生（成長）段階又は齢を、当業者であれば容易に決定することが出来る。
一態様において、雄性動物の精巣の組織切片を顕微鏡下観察し（例えばＩｎｔ．Ｊ．Ａｎｄｒｏｌ．，ｖｏｌ．４，ｐ．４７５−４９３（１９８１）、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓ．Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．１５４，ｐ．４４３−４７０（１９７４）などに記載の方法による）、そこに含まれる雄性生殖系列幹細胞の組織学的特徴等を指標として、雄性生殖系列幹細胞が上述のいずれの分化段階にあるかを判別することが出来る。
組織学的には、雄性生殖系列幹細胞は、雄性動物の出生前〜新生時期には精細管の管腔に存在しており、この時期の雄性生殖系列幹細胞を雄性生殖細胞（ｇｏｎｏｃｙｔｅ）という。その後、雄性生殖細胞（ｇｏｎｏｃｙｔｅ）は精細管の基底膜へ移動し、該基底膜と接触し、精原細胞へと分化し、精子形成を開始する。ここで、精細管の基底膜と接触している、精子形成能のある生殖細胞を精原細胞といい、精原細胞である雄性生殖系列幹細胞を精原幹細胞という。
ここで、雄性生殖系列幹細胞が精細管の管腔に存在している分化段階にあることを指標として、該細胞が上記分化段階（Ａ）にあるとし得る。
また、雄性生殖系列幹細胞が精細管の基底膜に接触している分化段階にあることを指標として、該細胞が上記分化段階（Ｂ）にあるとし得る。
即ち、雄性生殖系列幹細胞が雄性生殖細胞（ｇｏｎｏｃｙｔｅ）であることを指標として、該細胞が上記分化段階（Ａ）にあるとし得る。
また、雄性生殖系列幹細胞が精原細胞であることを指標として、該細胞が上記分化段階（Ｂ）にあるとし得る。
より具体的には、上記分化段階（Ａ）にある雄性生殖系列幹細胞として、例えばマウスでは出生後４〜６日（例えば４日）、ラットでは出生後４〜６日（例えば４日）より前の分化段階にある雄性生殖系列幹細胞を挙げることができる。
また、上記分化段階（Ｂ）にある雄性生殖系列幹細胞として、上述の時期以降の分化段階にある雄性生殖系列幹細胞を挙げることができる。
本発明の増殖方法に供される上記分化段階（Ｂ）にある雄性生殖系列幹細胞は、上述の指標等に基づいて、当該雄性生殖系列幹細胞を含む雄性動物の精巣より精巣細胞を採取することにより、該雄性生殖系列幹細胞を含む細胞集団として得ることが出来る。
精巣細胞とは、精巣を構成する全ての細胞を含み、例えば、雄性生殖系列幹細胞（雄性生殖細胞、精原幹細胞等）、精原細胞、精細胞、精祖細胞、精母細胞、精娘細胞、精子、ライディヒ細胞、セルトリ細胞、間細胞、生殖細胞等が挙げられる。
上記分化段階（Ｂ）にある雄性生殖系列幹細胞を、ＧＤＮＦレセプター作動性化合物を含む培地中で培養することによって、従来法と比較して培養の安定がより少数の因子に依存した条件において、雄性生殖系列幹細胞の安定かつ効率的な増殖を達成することが出来る。
以下、本発明の雄性生殖系列幹細胞の増殖方法における培養操作例について更に詳述する。
まず、上述の指標等に基づき、上記分化段階（Ｂ）にある雄性生殖系列幹細胞を含む精巣より、精巣細胞を自体公知の方法で採取する。
ここで、「上記分化段階（Ｂ）にある雄性生殖系列幹細胞を含む精巣」とは、含まれる雄性生殖系列幹細胞のうち、少なくとも１０％、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上、最も好ましくは１００％が上記分化段階（Ｂ）にある雄性生殖系列幹細胞である精巣をいう。
例えば当該精巣を摘出し、摘出された精巣をコラゲナーゼ、トリプシン、ＤＮａｓｅ等の分解酵素で消化することにより、精巣細胞を分散させる（例えば、カナツ−シノハラ，Ｍ（Ｋａｎａｔｓｕ−Ｓｈｉｎｏｈａｒａ，Ｍ）ら著、バイオロジー  オブ  レプロダクション（Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、米国、第６９巻、第２号、ｐ．６１２−６１６、２００３年等を参照）。精巣細胞は培地等により洗浄され、本発明の増殖方法に供せられる。
また、当該精巣細胞から、上記分化段階（Ｂ）にある雄性生殖系列幹細胞を濃縮してもよい。当該濃縮方法としては、例えば雄性生殖系列幹細胞に特異的に発現する細胞表面抗原を認識する抗体を用いて、セルソーターや、抗体磁性マイクロビーズ等により該細胞を濃縮する方法などが挙げられる。例えば、α６−インテグリン、ｃ−ｋｉｔ、ＣＤ９等の細胞表面抗原を指標に雄性生殖系列幹細胞を濃縮することができる（例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，８３４６−８３５１，２００１等を参照）。あるいはヘキスト等のｄｙｅを用いて雄性生殖系列幹細胞を濃縮することも可能である（例えば、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３１，４７９−４８７，２００４等を参照）。
次に、上述の精巣細胞を、上記培地中に懸濁し、細胞培養用容器内に播種し、培養する（第一の培養）。
当該細胞培養用容器は、通常の細胞培養において使用されるものを用いることができるが、好ましくは、精巣細胞の容器への接着を促進させるために、ゼラチン等によってコーティングされている。以下の培養に用いられる容器も同様である。
第一の培養を継続することのみによっても、雄性生殖系列幹細胞を増殖させることは可能であるが、好ましくは、第一の培養の開始から約６〜１８時間後（例えば一晩培養後）に、第一の培養における培養細胞、好ましくは浮遊している培養細胞（少なからず雄性生殖系列幹細胞を含む）を、別の細胞培養用容器へ継代する（第二の培養）。
継代された細胞は、培養条件によっても異なるが、通常継代後１週間以内に、細胞培養用容器の底面にコロニーを形成する。コロニー形成は顕微鏡等を用いて確認することができる。該コロニーは、細胞間架橋（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｒｉｄｇｅ）と桑実胚（ｍｏｒｕｌａ）様構造により特徴付けられる形態を有している。
好ましくは、第二の培養の開始から通常５〜１４日後、細胞をトリプシン処理等により分散し、培地中に再度懸濁して、更に新しい培養用プレートへ継代する（第三の培養）。同様に継代を繰り返すことで、平坦な形状の体細胞は消滅する。従って、２度目あるいは３度目の継代以降（例えば培養開始から４週間経過後等）は、細胞をフィーダー細胞の存在下で培養することが好ましい。継代の間隔、細胞の希釈率は、培養条件によって適宜判断されるが、例えば２〜５日間隔、１〜１／４希釈（培養初期においては好ましくは１〜１／２希釈）が例示される。また、確立された雄性生殖系列幹細胞の継代の間隔、細胞の希釈率としては、例えば２〜５日間隔、１／４〜１／１０希釈が例示される。
ここで、第一の培養において、培養開始時の細胞数が少ない場合（例えば、上記分化段階（Ｂ）にある雄性生殖系列幹細胞の濃縮操作を行った場合）等は、培養開始時より細胞をフィーダー細胞の存在下で培養することが好ましい。
また、フィーダー細胞に換えてラミニンをコーティングした細胞培養容器中で雄性生殖系列幹細胞を培養する場合には、例えば、あらかじめ細胞培養容器に０．０５〜２００μｇ／ｍＬの濃度でラミニンを含む中性リン酸緩衝生理食塩水を加え０．５〜２４時間程度室温にて静置することによって、細胞培養容器をラミニンによりコーティングし、該細胞培養容器中に培養細胞を播種する。
培養開始後、通常約３〜６週間で、雄性生殖系列幹細胞のコロニーは安定する。
本発明の雄性生殖系列幹細胞の増殖方法において、血清が培地中に含まれる場合、当該血清は雄性生殖系列幹細胞の培養開始時（例えば第一の培養時）の培地には、好ましくは濃度０．１〜５（ｖ／ｖ）％、より好ましくは０．３〜３（ｖ／ｖ）％という低濃度で含まれ、上記雄性生殖系列幹細胞を継代した後（例えば第二の培養以降）の培地中には、通常０．１〜３０％、好ましくは濃度２〜３０（ｖ／ｖ）％、より好ましくは１０〜２０（ｖ／ｖ）％という濃度で含まれ得る。
培地に血清が高濃度（例えば１０〜３０（ｖ／ｖ）％）で含まれる場合、培地に上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）及び塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）のうちの何れか若しくは両者が含まれなくても、極めて安定した雄性生殖系列幹細胞の増殖が達成され得る。
上記継代後も、培地に含まれる血清濃度は低濃度（例えば０．１〜５（ｖ／ｖ）％）であってもよいが、この場合、培地に上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）及び塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）のうちの何れか若しくは両者が含まれることが好ましい。
本発明の雄性生殖系列幹細胞の増殖方法を用いることにより、雄性生殖系列幹細胞は、通常２ヶ月以上、好ましくは４ヶ月以上、より好ましくは６ヶ月以上にわたり、雄性生殖系列幹細胞としての能力を維持しながら安定に増殖することができる。
また、本発明の増殖方法を用いれば、雄性生殖系列幹細胞を、通常５日間で２〜１００倍程度、好ましくは５日間で１０〜１００倍程度、より好ましくは５日間で２０〜１００倍程度にまで、雄性生殖系列幹細胞としての能力を維持しながら増殖させることが出来る。
なお、本発明の雄性生殖系列幹細胞の増殖方法における細胞培養条件は、細胞培養技術において通常用いられている培養条件を用いることができる。例えば、培養温度は通常約３０〜４０℃の範囲であり、好ましくは約３７℃が例示される。ＣＯ２濃度は通常約１〜１０％の範囲であり、好ましくは約５％が例示される。湿度は通常約７０〜１００％の範囲であり、好ましくは約９５〜１００％が例示される。
本発明の増殖方法により増殖された雄性生殖系列幹細胞は、半永久的に凍結保存することが可能であって、必要に応じて融解・起眠して使用することができる。当該雄性生殖系列幹細胞は凍結保存・融解後も雄性生殖系列幹細胞としての能力を維持する。凍結保存においては、ジメチルスルホキシドとウシ胎児血清アルブミンを含有するセルバンカー（ＤＩＡ−ＩＡＴＲＯＮ社製）等の自体公知の細胞凍結保存用組成物中に細胞を懸濁し、−８０〜−２００℃、好ましくは−１９６℃（液体窒素中）の条件で細胞を保存する。
本発明の増殖方法により増殖された雄性生殖系列幹細胞を凍結保存後起眠させる際には、常法に従って溶媒中で融解し、懸濁して細胞浮遊液とする。融解の方法も特に限定されないが、例えば、３７℃の恒温槽中で、１０％胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ／ＦＣＳ）を用いて行うことができる。具体的には、恒温槽に凍結チューブを浮かべ、凍結させた細胞へＤＭＥＭ／ＦＣＳを滴下して融解する。細胞を遠心して洗浄した後、培地に再度懸濁する。
一度起眠した当該雄性生殖系列幹細胞を、培養後、再度凍結しても、当該細胞の雄性生殖系列幹細胞としての能力は維持される。
上記分化段階（Ｂ）にある雄性生殖系列幹細胞を、本発明の方法に従って、ＧＤＮＦレセプター作動性化合物を含む培地中で培養することにより増殖させた結果として得られる新たな雄性生殖系列幹細胞も分化段階（Ｂ）を維持している。
また、上記分化段階（Ｂ）にある雄性生殖系列幹細胞は、上記分化段階（Ａ）にある雄性生殖系列幹細胞を、ＧＤＮＦレセプター作動性化合物及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む培地中で培養することにより得ることが出来る。本発明はこのような上記分化段階（Ａ）にある雄性生殖幹細胞から、上記分化段階（Ｂ）にある雄性生殖系列幹細胞を製造する方法を提供する。
以下に、上記分化段階（Ａ）にある雄性生殖幹細胞から、上記分化段階（Ｂ）にある雄性生殖系列幹細胞を製造する方法の例について詳述する。
分化段階（Ａ）にある雄性生殖系列幹細胞は、上述の指標等に基づいて、当該雄性生殖系列幹細胞を含む雄性動物の精巣より精巣細胞を採取することにより、該雄性生殖系列幹細胞を含む細胞集団として供される。
また、精巣細胞から分化段階（Ａ）にある雄性生殖系列幹細胞を濃縮してもよい。
精巣細胞の採取方法及び雄性生殖系列幹細胞の濃縮方法は上述と同様である。
ここで、「上記分化段階（Ａ）にある雄性生殖系列幹細胞を含む精巣」とは、含まれる雄性生殖系列幹細胞のうち、少なくとも１０％、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上、最も好ましくは１００％が上記分化段階（Ａ）にある雄性生殖系列幹細胞である精巣をいう。
該分化段階（Ａ）にある雄性生殖系列幹細胞を培養し、上記分化段階（Ｂ）にある雄性生殖系列幹細胞を得る際の培養条件は、以下の点を除き、上述の本発明の雄性生殖系列幹細胞の増殖方法における培養条件と同様である。
（１）培地がＧＤＮＦレセプター作動性化合物及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含むこと。
（２）培養期間が１〜３０日間程度で分化段階（Ｂ）に到達すること。
該方法により得られた雄性生殖系列幹細胞が、上記分化段階（Ｂ）にあるか否かは、上述の培養方法によって、該細胞を実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で培養し、雄性生殖系列幹細胞の増殖の有無を試験することで、当業者であれば容易に判定することができる。
また、該製造方法により得られた上記分化段階（Ｂ）にある雄性生殖幹細胞を、上述の本発明の雄性生殖系列幹細胞の増殖方法によって更に増殖させることが出来る。
本発明の増殖方法によって増殖された雄性生殖系列幹細胞は、雄性生殖系列幹細胞としての能力を維持しているので、該細胞を不妊非ヒト動物の精細管の中に移植することにより、該移植された細胞に由来する精子を形成する非ヒト動物を製造することが出来る。移植された雄性生殖系列幹細胞は、精細管内において増殖し、精子形成コロニーを形成する。
不妊非ヒト動物としては、ブスルファン等の抗癌剤投与によって不妊化された非ヒト雄性動物や、遺伝的に精子形成能力を欠損している非ヒト雄性動物（例えばＷマウスなど）等が挙げられる（ブリンスター，ＲＬ（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，ＲＬ）ら著、プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス  オブ  ザ  ユナイテッド  ステイツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、米国、第９１巻、第２４号、ｐ．１１２９８−１１３０２、１９９４年、カナツ−シノハラ，Ｍ（Ｋａｎａｔｓｕ−Ｓｈｉｎｏｈａｒａ，Ｍ）ら著、バイオロジー  オブ  レプロダクション（Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、米国、第６９巻、第２号、ｐ．６１２−６１６、２００３年等を参照）。
移植された雄性生殖系列幹細胞を高い効率で生着させる観点から、該不妊非ヒト動物の動物種は、移植される雄性生殖系列幹細胞の動物種と同一であることが好ましい。また、該不妊非ヒト動物の系統も、移植される雄性生殖系列幹細胞の系統と同一であることが更に好ましい。
動物種及び／又は系統が不妊非ヒト動物と移植される雄性生殖系列幹細胞との間で異なっている場合は、移植された細胞が拒絶される可能性を減弱する目的で、不妊非ヒト動物は免疫不全動物であることが好ましい。
該免疫不全動物としては、遺伝的に免疫機能を欠損している非ヒト動物（例えばヌードマウス等）や、Ｔ細胞等の免疫担当細胞の細胞表面抗原（例えばＣＤ４等）に対する抗体を投与すること等により免疫寛容を誘導した非ヒト動物等が挙げられる。
また、上述の方法によって得られた、移植された雄性生殖系列幹細胞に由来する精子を形成する非ヒト動物から精子を採取することにより、本発明の増殖方法によって増殖された雄性生殖系列幹細胞由来の精子を製造することが出来る。
更に、上述の方法により得られた精子を卵に受精させ、胚を得ることにより、本発明の増殖方法によって増殖された雄性生殖系列幹細胞由来の胚を製造することが出来る。
卵とは精子が受精可能な雌性配偶子をいう。卵としては、例えば、卵細胞、卵母細胞等が挙げられる。
精子と卵の受精は、顕微受精、ＩＶＦ等の周知の方法により行うことができる。
また、上述の方法により得られた胚を、宿主雌動物の子宮又は卵管に移入し、非ヒト子孫を得ることにより、本発明の増殖方法によって増殖された雄性生殖系列幹細胞由来の非ヒト子孫を製造することが出来る。
宿主雌動物は、特に限定されないが、好ましくは偽妊娠動物である。偽妊娠動物は、正常性周期の雌動物を、精管結紮などにより去勢した雄動物と交配することにより得ることができる。
胚が移入された宿主雌動物は、妊娠し、本発明の増殖方法によって増殖された雄性生殖系列幹細胞由来の非ヒト子孫を出産する。
また、上述の方法により得られた、移植された雄性生殖系列幹細胞に由来する精子を形成する非ヒト動物と雌とを自然交配し、非ヒト子孫を得ることによっても、本発明の増殖方法によって増殖された雄性生殖系列幹細胞に由来する非ヒト子孫を製造することが出来る。
該自然交配に用いられる雌は、通常、野生型雌動物である。
本発明の増殖方法を用いれば、雄性生殖系列幹細胞としての能力を維持した状態で長期間にわたって、安定に、雄性生殖系列幹細胞を増殖させることが可能であるので、自体公知の方法で、本発明の増殖方法により増殖された雄性生殖系列幹細胞の遺伝子を改変し、例えば、特定の外来遺伝子が導入された雄性生殖系列幹細胞や、特定の遺伝子を欠損した雄性生殖系列幹細胞等の遺伝子改変雄性生殖系列幹細胞を製造することができる。
雄性生殖系列幹細胞への遺伝子導入の方法としては、例えば、特定の遺伝子が機能的に発現できるように構築されたベクターを雄性生殖系列幹細胞に導入する。ベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター等を用いることができる。また、ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、センチウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、パルボウイルス、セムリキ森林ウイルス、ワクシニアウイルス等が挙げられる。
ベクターを雄性生殖系列幹細胞に導入する方法としては、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、又はリポフェクション法等の一般的な遺伝子導入法が挙げられる。ウイルスをベクターに用いる場合には、上述の一般的な遺伝子導入法によりウイルスのゲノムを細胞に導入してもよいし、ウイルス粒子を、細胞へ感染させることによっても、該ウイルスのゲノムを細胞に導入することができる。
また、本発明の雄性生殖系列幹細胞の増殖方法を用いれば、外来遺伝子が安定に導入された安定な遺伝子改変雄性生殖系列幹細胞を選択することが出来る。例えば、ベクターと同時にマーカー遺伝子を細胞へ導入し、マーカー遺伝子の性質に応じた方法で細胞を培養すればよい。例えば、マーカー遺伝子が、宿主細胞に致死活性を示す選抜薬剤に対する薬剤耐性を付与する遺伝子である場合には、該薬剤を添加した培地を用いて、ベクターが導入された細胞を培養すれば良い。薬剤耐性付与遺伝子と選抜薬剤の組み合わせとしては、例えば、ネオマイシン耐性付与遺伝子とネオマイシンとの組み合わせ、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子とハイグロマイシンとの組み合わせ、ブラストサイジンＳ耐性付与遺伝子とブラストサイジンＳとの組み合わせなどをあげることができる。
また、同様の方法を用いて、特定の遺伝子を欠損した雄性生殖系列幹細胞を得ることも可能である。特定の遺伝子を欠損した雄性生殖系列幹細胞を得る方法としては、例えばターゲッティングベクターを用いた相同的組換え（ジーンターゲッティング法）が挙げられる。即ち、特定の遺伝子の染色体ＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ｐｏｌｙＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成できなくすること等によって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（ターゲッティングベクター）を、相同組換え法により多能性幹細胞の染色体に導入し、得られた細胞について当該特定の遺伝子のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した特定の遺伝子のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、特定の遺伝子を欠損した多能性幹細胞を選択することにより得ることができる。或いは、組織特異的又は発達段階特異的な様式で特定の遺伝子を欠失させるＣｒｅ−ｌｏｘＰ系等を用いてもよい（Ｍａｒｔｈ，Ｊ．Ｄ．（１９９６）Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：１９９９−２００２；Ｗａｇｎｅｒ，Ｋ．Ｕ．ら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：４３２３−４３３０）。
このようにして得られた、遺伝子改変雄性生殖系列幹細胞を用いて、上述と同様の方法によって、遺伝子改変雄性生殖系列幹細胞に由来する精子を形成する非ヒト動物、遺伝子改変雄性生殖系列幹細胞に由来する精子（遺伝子改変精子）、遺伝子改変雄性生殖系列幹細胞に由来する胚（遺伝子改変胚）、遺伝子改変雄性生殖系列幹細胞に由来する非ヒト子孫（遺伝子改変非ヒト子孫あるいは遺伝子改変非ヒト動物）等を製造することが出来る。
また、本発明の増殖方法、該方法により増殖された雄性生殖系列幹細胞は、雄の不妊治療に有用である。
例えば、不妊患者の精巣からバイオプシーで雄性生殖系列幹細胞を採取し、本発明の増殖方法によって試験管中で培養させる。そして、当該不妊患者の精細管中に増殖した雄性生殖系列幹細胞を注入（マイクロインジェクション）して、患者の精巣の精細管の中に培養細胞由来の精子形成を起させるという手法によって、実施することができる。この手法は、例えば、化学療法や放射線治療によって不妊になった場合に、特に効果的である。
このように、上記雄性生殖系列幹細胞は雄性動物の不妊治療に利用可能であるため、上記雄性生殖系列幹細胞を含む特に男性を対象とした不妊治療剤も本発明の範囲内である。
また、本発明の増殖方法、該方法により増殖された雄性生殖系列幹細胞は、生殖細胞レベルにおける遺伝子治療に有用である。
例えば、特定の遺伝子に変異を有する患者から、バイオプシーで雄性生殖系列幹細胞を採取し、本発明の増殖方法によって試験管中で培養させる。そして、上述の遺伝子改変方法等により、該変異遺伝子を正常に機能する遺伝子と置換した雄性生殖系列幹細胞を作製し、その変異が子孫に伝わらないようにするという治療方法である。このような治療方法においても、雄性生殖系列幹細胞の維持および増殖が必要となるが、この場合に、本発明の雄性生殖系列幹細胞の増殖方法を有効に利用することができる。
また、本発明は実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階の雄性生殖系列幹細胞を生体外で増殖させるための剤であって、ＧＤＮＦレセプター作動性化合物を含んでなる剤に関する。
また、該剤は、更に上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）及び塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の少なくともいずれか、好ましくは全てを含むことができる。
該剤は白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含まなくてもよいが、白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含んでいても悪影響はない。
該剤は、更に生理学的に許容される担体、賦形剤、防腐剤、安定剤、結合剤、溶解補助剤、非イオン性界面活性剤、緩衝剤、保存剤、酸化防止剤、上述の添加物、血清、基礎培地などを含むことができる。
また、該剤は、実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含んでいてもよい。
該剤は、等張な水溶液、あるいは粉末等の状態であって、本発明の増殖方法に用いる培地に添加される等して用いられる。
あるいは該剤は、本発明の増殖方法に用いられる培地であり得る。
該剤に含まれる上記各構成成分の混合割合は、該剤が本発明の増殖方法に用いられる培地に添加されるなどして用いられた場合に、各構成成分の培地中の濃度が、上述の好適な範囲に入るように構成されていることが好ましい。
また、本発明は、雄性生殖系列幹細胞の増殖用キットであって、以下を含むキットを提供する：
ａ）ＧＤＮＦレセプター作動性化合物を含んでなる剤；
ｂ）上記ａ）の剤は、実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階にある雄性生殖系列幹細胞を、上述の方法により増殖させるのに用いることができる、又は用いるべきであることを記載した記載物。
上記ａ）の剤の構成等は上述の剤と同様である。
上述のキットには更に実質的にＧＤＮＦレセプター作動性化合物のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階にある雄性生殖系列幹細胞が含まれ得る。
上述のキットの構成要素は、全体が一つのパッケージとして提供されていてもよいが、複数のパッケージに分離して提供されてもよい。
本発明のキットを用いれば、上述の方法により、容易に雄性生殖系列細胞を安定且つ効率的に増殖させることが出来る。
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】〔１〕実験方法および実験材料
（１）実験に用いた動物について
先ず、本実験に使用された動物について説明する。
精巣細胞は、ＤＢＡ／２マウス、あるいはＤＢＡ／２バックグラウンドへかけあわせたトランスジェニックマウス系統Ｃ５７ＢＬ６／Ｔｇ１４（ａｃｔ−ＥＧＦＰ−Ｏｓｂｙ０１）（以下Ｇｒｅｅｎ  ｍｉｃｅと呼ぶことがある）（大阪大学、岡部博士より提供）（Ｏｋａｂｅ  Ｍ  ｅｔ．ａｌ．，‘Ｇｒｅｅｎ  ｍｉｃｅ’ａｓ  ａ  ｓｏｕｒｓｅ  ｏｆ  ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ  ｇｒｅｅｎ  ｃｅｌｌｓ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，４０７巻、３１３−３１９頁、１９９７年）の新生児（０日齢）、仔（５日齢）又は成体（４〜５週齢）から、２段階酵素分解によって集められ、培養に使用された。
Ｇｒｅｅｎ  ｍｉｃｅはＥＧＦＰ遺伝子を実質的に全ての細胞型において発現しているので、ＥＧＦＰの蛍光を指標に当該マウス由来の細胞を追跡することが可能である。
培養された細胞は、Ｗマウス（４週齢、Ｊａｐａｎ  ＳＬＣ製）へ移植された。Ｗレシピエントを使用した実験では、５０μｇの抗ＣＤ４抗体（ＧＫ１．５）が、移植から０、２、４日後に腹腔内に投与され、異質遺伝的なドナー細胞への耐性が誘導された。全ての動物実験のプロトコルは、京都大学の動物保護および使用制度委員会によって承認されたものである。
（２）培養条件
続いて、本実験における雄性生殖系列幹細胞の培養条件について説明する。
培養培地は、ＳｔｅｍＰｒｏサプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、２５μｇ／ｍｌ  インスリン、１００μｇ／ｍｌ  トランスフェリン、６０μＭ  プトレシン、３０ｎＭ  セレン酸ナトリウム、６ｍｇ／ｍｌ  Ｄ−（＋）−グルコース、３０μｇ／ｍｌ  ピルビン酸、１μｌ／ｍｌ  ＤＬ−乳酸（シグマ社製）、５ｍｇ／ｍｌ  ウシアルブミン（ＩＣＮ  バイオメディカル社製）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５×１０−５Ｍ  ２−メルカプトエタノール、ＭＥＭ非必須ビタミン溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、１０−４Ｍ  アスコルビン酸、１０μｇ／ｍｌ  ｄ−ビオチン、３０ｎｇ／ｍｌ  β−エストラジオール、６０ｎｇ／ｍｌ  プロゲステロン（シグマ社製）が添加されたＳｔｅｍＰｒｏ−３４  ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）培地を使用した。グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）としては組換えラットＧＤＮＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）を使用し、１０ｎｇ／ｍｌの濃度で常に培地に添加した。また、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）としてはマウスＥＧＦ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）としてはＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製のものを、白血病抑制因子（ＬＩＦ）としてはＥＳＧＲＯ（マウス白血病抑制因子、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、血清としては胎児ウシ血清（ＪＲＨ  バイオサイエンス社製）をそれぞれ使用し、適宜培地に添加した。各因子の添加濃度は、特にことわりのある場合を除き、ＥＧＦ：２０ｎｇ／ｍｌ、ｂＦＧＦ：１０ｎｇ／ｍｌ、ＬＩＦ：１０３ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ＦＣＳ：１（ｖ／ｖ）％であった。
細胞は５％の二酸化炭素を含む空気中で、３７℃で維持された。
（３）雄性生殖系列幹細胞の採取
精巣細胞はコラゲナーゼ（タイプＩＶ、シグマ社製）およびトリプシン（インビトロゲン社製）を用いた２段階酵素分解によって採集された。
即ち、マウスの精巣を摘出し、ＰＢＳ中で白膜を除去し、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ（Ｉ型）を含むハンクス液中、３７℃にて適宜振蘯しながら１５分間インキュベートし、精細管をほぐした。ＰＢＳにより２回洗浄してはがれた間質の細胞を除去した後、１．４ｍｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅを含む０．２５％トリプシン液中で３７℃にて適宜振蘯しながら１５分間インキュベートし、精細管をばらばらにした。ＰＢＳを加え、トリプシンを不活性化した後、ピペッティングを行って細胞浮遊液を得た。
新生児の精巣を用いた場合には、上記細胞浮遊液をそのまま培養に用いた。
一方、仔又は成体の精巣を用いた場合は、上記細胞浮遊液を２０〜３０μｍのナイロンメッシュに通して未消化細胞塊を除去し、６００×ｇで５分間遠心して精巣細胞を回収し、更に、該精巣細胞から抗ＣＤ９抗体を用いて磁気ビーズ法により、ＣＤ９陽性細胞として雄性生殖系列幹細胞を濃縮した。
回収された雄性生殖系列幹細胞は培地中に分散され、ゼラチンコートされたプレート、ラミニンコートされたプレートあるいはマイトマイシンＣで不活性化されたマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）上へ移された（第一の培養）。
第一の培養の開始から一晩培養後に、第一の培養における培養細胞、好ましくは浮遊している培養細胞（少なからず雄性生殖系列幹細胞を含む）を、別の細胞培養用容器へ継代した（第二の培養）。
継代された細胞は、培養条件によっても異なるが、通常継代後１週間以内に、細胞培養用容器の底面にコロニーを形成した。
第二の培養の開始から５〜１４日後、細胞をトリプシン処理等により分散し、培地中に再度懸濁して、更に新しい培養用プレートへ継代した（第三の培養）。同様に継代を繰り返すことで、平坦な形状の体細胞は消滅した。２度目あるいは３度目の継代以降は、細胞をフィーダー細胞の存在下で培養した。細胞は２〜５日毎に、１〜１／４希釈（培養初期においては好ましくは１〜１／２希釈）で継代された。３〜４週間までには、細胞は比較的安定した状態におちついた。その後、細胞は２〜５日毎に、１／４〜１／１０希釈で継代された。
ラミニンコートプレートは、培養ディッシュを２０μｇ／ｍＬの濃度でラミニン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を含むＰＢＳにより３７℃で一晩処理した後、該溶液を除去し、ＰＢＳで２回洗浄し、更に０．５ｍｇ／ｍｌの濃度でＢＳＡを含むＰＢＳにより３７℃で１時間処理し、ＰＢＳで３回洗浄することにより調製した。
ラミニンコートプレートを用いた場合の、培養条件は、フィーダー細胞を用いないことを除き、上述と同様である。
一部の実験においては、培養によって得られた雄性生殖系列幹細胞を増殖補助因子としてＧＤＮＦのみを含み、ＬＩＦ、ＥＧＦ及びｂＦＧＦを含有しない培地中で培養した。
（４）抗体染色
上記条件で培養された細胞の性質を確認するために、従来公知の精子形成細胞に対する分子マーカーの発現を調べるフローサイトメトリーが、以下のようにして実施された。
一次抗体として、ラット抗ＥｐＣＡＭ（Ｇ８．８）、マウス抗ＳＳＥＡ−１（ＭＣ−４８０）（発生研究ハイブリドーマバンク、アイオワ大学）、ラット抗マウスフォルスマン（Ｆｏｒｓｓｍａｎ）抗原（Ｍ１／８７）、ラット抗ヒトα６−インテグリン（ＣＤ４９ｆ）（ＧｏＨ３）、ビオチン標識された抗ラットβ１−インテグリン（ＣＤ２９）（Ｈａ２／５）、ＡＰＣ−接合ラット抗マウスｃ−ｋｉｔ（ＣＤ１１７）（２Ｂ８）（ＢＤバイオサイエンス製）、ラット抗マウスＣＤ９抗体（ＢＤバイオサイエンス社製）、ラット抗ＴＤＡ抗原（ＥＥ２）（大阪大学西宗博士より提供）が使用された。
ＡＰＣ−接合ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ研究所製）、ＡＰＣ−接合ストレプトアビジン（ＢＤバイオサイエンス製）、あるいは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３−接合ヤギ抗マウスＩｇＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ製）が、二次抗体として使用された。細胞染色技術は、（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９９年、９６巻、５５０４−５５０９頁）の記載に従って実施した。細胞はＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒシステム（ＢＤバイオサイエンス製）で分析した。
精巣細胞から、雄性生殖系列幹細胞を濃縮する際には、磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、ダイナル製）を用いて行った。濃縮操作は（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９９年、９６巻、５５０４−５５０９頁）の記載に従って実施した。
（５）培養された雄性生殖系列幹細胞の移植
上記の培養方法によって得られた雄性生殖系列幹細胞を含む約２μｌのドナー細胞懸濁液は、輸出管を通してＷマウスの精巣へ導入された。各レシピエントの精巣では、注入物が細管の７５〜８０％を占めた。成体のレシピエントマウスは、アバーティンインジェクソン（６４０ｍｇ／ｋｇ）によって麻酔された。
コロニーをカウントするために、レシピエントマウスのテストでは、ドナー細胞移植後７〜８週間でレシピエント精巣を摘出し、紫外線下で蛍光を観察することによって解析された。ホストの精巣細胞は内因性の蛍光発光を有しないため、ドナー細胞は、明確に特定された。細胞の集団は、精細管の全周囲を占め、少なくとも０．１ｍｍの長さを有する場合に、コロニーと定義された。
（６）顕微受精
レシピエントマウスの精巣の中から培養細胞由来の精子を取り出し、以下のような方法で顕微授精は実施される。
移植実験の精細管は、精密に分析され、精子形成細胞は機械的に集められる。顕微受精は、（Ｋｉｍｕｒａ  Ｙ，Ｙａｎａｇｉｍａｃｈｉ  Ｒ，Ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｓｐｅｒｍ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ，Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｏｒｄ，１９９５年、５２巻、７０９−７２０頁）に記載のように実施される。培養において２４時間経過後の四細胞段階に達した胚（胎児）は、ｄａｙ−１の偽妊娠したＩＣＲ雌の輸卵管へ移送される。１９．５日目に取り出された生育胎児は、ＩＣＲ親マウスの授乳によって育てられる。
一部のレシピエントマウスは、そのまま維持され、生殖力を回復するかどうかを決定するために野生型の雌と自然交配される。
（７）組織学的解析
新生児（０日齢）、仔（５日齢）および成体（４〜５週齢）のマウスの精巣が採取され、常法により組織切片が作成された。切片はヌクレアー・ファスト・レッド（ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｓｔ  ｒｅｄ）にて染色され、顕微鏡下観察された。
〔２〕結果
上記の方法で行った本実験の実験結果を以下に示す。
（１）雄性生殖系列幹細胞の試験管内増殖について
新生児マウス（０日齢）由来の雄性生殖系列幹細胞はＧＤＮＦ、ＥＧＦ及びｂＦＧＦ含有ＬＩＦ不含培地中でフィーダー細胞と共に培養しても増殖は確認されず、コロニーを形成しなかったが（図１左上参照）、ＧＤＮＦ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ及びＬＩＦ含有培地中においては、有意な増殖が観察され、コロニーを形成した（図１右上参照）。
一方、仔（５日齢）マウス由来の雄性生殖系列幹細胞はＧＤＮＦ、ＥＧＦ及びｂＦＧＦ含有ＬＩＦ不含培地並びにＧＤＮＦ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ及びＬＩＦ含有培地のいずれを用いた場合においても有意な増殖が観察され、コロニーを形成した（図１左下及び右下）。
また、成体（４〜５週齢）マウス由来の雄性生殖系列幹細胞も、仔マウスと同様に、ＧＤＮＦ、ＥＧＦ及びｂＦＧＦ含有ＬＩＦ不含培地並びにＧＤＮＦ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ及びＬＩＦ含有培地のいずれを用いても有意な増殖が観察され、コロニーを形成した（データ示さず）。
雄性生殖系列幹細胞をラミニンコートプレート上で培養した場合においても、同様の結果を得た（データ示さず）。
この実験における培養細胞（すなわち、雄性生殖系列幹細胞）のフィーダー細胞上での増殖の様子を図２のグラフに示す。このグラフにおいて、横軸は培養開始からの経過日数を、縦軸には相対的な細胞数を示す。図２に示すように、仔マウス由来の雄性生殖系列幹細胞はＧＤＮＦ、ＥＧＦ及びｂＦＧＦ含有ＬＩＦ不含培地を用いた場合においても、約４ヶ月間にわたって、ログ・スケールで細胞増殖が持続することが確認された。培養開始から４ヶ月間で細胞数は約１０９倍に増殖した。ＧＤＮＦ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ及びＬＩＦ含有培地を用いた場合においても、同様の増殖が確認された（データ示さず）。
一方、新生児マウス由来の雄性生殖系列幹細胞は、ＧＤＮＦ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ及びＬＩＦ含有培地を用いた場合は、４ヶ月間にわたって、ログ・スケールで細胞増殖が持続することが確認されたが、ＧＤＮＦ、ＥＧＦ及びｂＦＧＦ含有ＬＩＦ不含培地を用いた場合には、ほとんど細胞増殖は観察されなかった（データ示さず）。
また、ラミニンコートプレート上での雄性生殖系列幹細胞の増殖の様子を図３のグラフに示す。このグラフにおいて、横軸は培養開始からの経過日数を、縦軸には細胞数を示す。図３に示すように、仔マウス由来の雄性生殖系列幹細胞はＧＤＮＦ、ＥＧＦ及びｂＦＧＦ含有ＬＩＦ不含培地を用いた場合においても、約６ヶ月間にわたって、ログ・スケールで細胞増殖が持続することが確認された。培養開始から６ヶ月間で細胞数は約１０１０倍に増殖した。ＧＤＮＦ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ及びＬＩＦ含有培地を用いた場合においても、同様の増殖が確認された（データ示さず）。
更に、新生児マウス由来の雄性生殖系列幹細胞は、フィーダー細胞との共培養と同様に、ラミニンコートプレート上での培養においても、ＧＤＮＦ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ及びＬＩＦ含有培地を用いた場合は、４ヶ月間にわたって、ログ・スケールで細胞増殖が持続することが確認されたが、ＧＤＮＦ、ＥＧＦ及びｂＦＧＦ含有ＬＩＦ不含培地を用いた場合には、細胞増殖は観察されなかった（データ示さず）。
また、新生児のマウス由来の雄性生殖系列幹細胞をＧＤＮＦ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ及びＬＩＦ含有培地で５〜１５日間培養した後に、培養細胞を回収し、該細胞をＧＤＮＦ、ＥＧＦ及びｂＦＧＦ含有ＬＩＦ不含培地中でフィーダー細胞と共培養すると、仔マウス由来の雄性生殖系列幹細胞と同様に長期間にわたって細胞増殖が持続し、コロニーを形成した（データ示さず）。
更に、上記にて調製された新生児マウス（０日齢）由来の雄性生殖系列幹細胞は、培養開始から４ヶ月後に、培地を１５％ＦＣＳ含有ＧＤＮＦ含有ＥＧＦ、ｂＦＧＦ及びＬＩＦ不含培地に転換して、引続きフィーダー細胞と共培養することによっても、引き続き増殖を維持した（図４）。雄性生殖系列幹細胞の細胞数は、培地変換後５日で５．９７±０．５３倍（ｎ＝３）、１１日で３８．９０±８．４４倍（ｎ＝３）（いずれの値も平均値±標準誤差で示す）に増加した。
以上の結果から、雄性生殖系列幹細胞の分化段階には、以下の２つが存在することが示唆された。
（Ａ）インビトロ増殖のための増殖因子としてグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）を要する分化段階（分化段階（Ａ））。
（Ｂ）実質的にグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）のみを雄性生殖系列幹細胞の増殖補助因子として含む培地中で増殖可能な分化段階（分化段階（Ｂ））。
また、新生動物の雄性生殖系列幹細胞は分化段階（Ａ）にあり、仔及び成体動物の雄性生殖系列幹細胞は分化段階（Ｂ）にあることが明らかとなった。
更に、分化段階（Ａ）にある雄性生殖系列幹細胞を、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む培地中で培養することにより、分化段階（Ｂ）へと分化することが示唆された。
（２）培養細胞の性質について
仔グリーンマウス（Ｇｒｅｅｎ  Ｍｏｕｓｅ）の雄性生殖系列幹細胞をフィーダー細胞の存在下、ＬＩＦ（−）培地により増殖させ、細胞の表面の特徴をフローサイトメトリーによって解析した。このマウスのＧＦＰ遺伝子は、雄性生殖系列幹細胞を含むあらゆる場所で発現する。それゆえ、培養されたＧＦＰを含む細胞は、ＵＶ照射下での観察によってフィーダー細胞から区別することができる。
結果を図５に示す。図５に示す各図は、（ａ）から順にα６−インテグリン、β１−インテグリン、ＥｐＣＡＭ、ＥＥ２、ｃ−ｋｉｔ、ＳＳＥＡ−１、ＣＤ９、フォルスマン抗原という分子マーカーを用いて解析を行った結果である。なお、黒の実線で囲む白色のカラムがコントロール免疫グロブリンの場合の結果であり、黒色カラムが各分子マーカー（抗体）の場合の結果である。
培養された細胞は、α６−インテグリン、β１−インテグリン、ＥｐＣＡＭ、ＥＥ２、ＣＤ９に対してポジティブであった。
また、多くの細胞はｃ−ｋｉｔに対してネガティブであったが、弱い発現が確認され、これによっていくつかのコロニーが分化していることが示唆された。
培養された細胞は、ＳＳＥＡ−１及びフォルスマン抗原が陰性であった。
これらの結果から、本発明の増殖方法により増殖された細胞の大部分は未分化の精原細胞の性質を有するということが分かった。
（３）精原細胞移植技術による幹細胞活性の決定
上記（２）の結果に基づき、続いて、培養された細胞が本当に雄性生殖系列幹細胞であるか確認するために、精原細胞移植が実施された。
雄性生殖系列幹細胞には、形態学上のはっきりした判定基準あるいは特異的マーカーがないため、信頼できる唯一の分析法は、不妊動物での精子形成の回復を確認することである。この実験では、グリーンマウスから培養が確立された。
具体的には、仔グリーンマウス（Ｇｒｅｅｎ  Ｍｏｕｓｅ）の雄性生殖系列幹細胞がフィーダー細胞の存在下、ＬＩＦ（−）培地により２９〜５８日の期間培養され、収穫された細胞が、Ｗマウスの精細管へ移植された。移植実験におけるコロニーは、移植から７〜８週間後にＵＶ照射下で蛍光によって確認された。
結果を図６に示す。本実験によって得られたＷレシピエント精巣の解析では、外見上正常な精子形成を有する多数の精細管を満たした培養細胞によって、広大なコロニー形成が行われることが実証された（図６）。この結果、培養された細胞が雄性生殖系列幹細胞であることが確認された。
（４）組織学的解析
新生児（０日齢）、仔（５日齢）及び成体（４〜５週齢）のそれぞれのマウスの組織学的解析結果を図７に示す。
新生児の雄性生殖系列幹細胞は精細管の管腔に存在しているが（図７ｄ）、５日齢の仔においては、雄性生殖系列幹細胞は精細管の基底膜に接触しており（図７ｅ）、成体においては雄性生殖系列幹細胞が精細管の基底膜に強固に接着している様子が観察された（図７ｆ）。
以上より、上記組織学的特徴を指標として、雄性生殖系列幹細胞が上述のいずれの分化段階にあるかを判別可能であることが示唆された。
【産業上の利用可能性】  本発明の増殖方法を用いれば、培養の安定が従来法と比較してより少数の因子に依存しているので、雄性生殖幹細胞としての能力を維持した状態で、雄性生殖系列幹細胞をより安定に増殖させることが可能である。従って本発明の増殖方法は、遺伝子改変動物（トランスジェニック動物、ノックアウト動物等）の作製、雄性不妊の治療方法および雄性不妊の治療剤の開発、生殖細胞レベルにおける遺伝子治療のための研究および薬剤の開発などに有用である。
本出願は、日本で出願された特願２００４−２６３０２７（出願日：２００４年９月９日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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