【手続補正書】
【提出日】令和2年3月4日(2020.3.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液脳関門を通過することができるヒト未成熟歯髄幹細胞（ｈＩＤＰＳＣ）を生成する方法であって、
ａ）歯髄（ＤＰ）を得ること；
ｂ）抗生物質を含有する溶液でＤＰを洗浄すること；
ｃ）培地中のプラスチック表面にＤＰを置くことにより、外植片培養物を確立すること；
ｄ）培地中の異なるプラスチック表面にＤＰを機械的に移すこと；
ｅ）ステップｃ）およびｄ）を反復すること；および
ｆ）第２またはその後の採取サイクルからの外植片培養物からプラスチック表面に接着するｈＩＤＰＳＣを収集すること
を含む方法。
【請求項２】
ステップｃ）およびｄ）を５回を超えて反復し、ＤＰの５回の移動後に生成された外植片培養物からｈＩＤＰＳＣを収集する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップｃ）およびｄ）を１０回を超えて反復し、ＤＰの１０回の移動後に生成された外植片培養物からｈＩＤＰＳＣを収集する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップｃ）およびｄ）を１５回を超えて反復し、ＤＰの１５回の移動後に生成された外植片培養物からｈＩＤＰＳＣを収集する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ステップｃ）からのｈＩＤＰＳＣの外植片培養物を収集前に継代することをさらに含み、継代が、ｈＩＤＰＳＣを酵素処理することおよび外植片培養物を拡大増殖することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
（ｇ）収集したｈＩＤＰＳＣの試料を、ＣＤ４４、ＣＤ１３、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＨＬＡ−ＡＢＣからなる群より選択される少なくとも１つのマーカーについて免疫染色し、ＣＤ４４および／またはＣＤ１３の発現、ＨＬＡ−ＤＲおよび／またはＨＬＡ−ＡＢＣの発現の欠如、あるいはそれらの組み合わせを確認すること
をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
抗生物質が、ペニシリンおよびストレプトマイシンからなり、培地が、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２、ウシ胎仔血清、およびＬ−グルタミンを含み、プラスチック表面が、培養皿またはプラスチックビーズにより提供され、かつＤＰが、ヒト乳歯由来である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
外植片培養物が、ｈＩＤＰＳＣの半コンフルエントなコロニーを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＣＤ４４およびＣＤ１３を発現するヒト未成熟歯髄幹細胞（ｈＩＤＰＳＣ）を含む組成物。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法に従って得られたヒト未成熟歯髄幹細胞（ｈＩＤＰＳＣ）を含む組成物。
【請求項１１】
約８０％のｈＩＤＰＳＣが、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）ならびにドーパミンおよびｃＡＭＰ調節性のリン酸化タンパク質（ＤＡＲＰＰ−３２）を分泌する、請求項９または１０に記載の組成物。
【請求項１２】
少なくとも７５％のｈＩＤＰＳＣが、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧメンバー２（ＡＢＣＧ２）を発現する、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
ｈＩＤＰＳＣが、ＣＫ３／１２の発現を欠く、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
ｈＩＤＰＳＣが、ＨＬＡ−ＤＲおよびＨＬＡ−ＡＢＣの発現を欠く、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
ｈＩＤＰＳＣが、複数回の継代の後にコロニーを形成する能力を維持している、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７０】
【表１８−６】
2019507772.tif 000001
発明の態様
［態様１］ＣＤ４４およびＣＤ１３を発現し、ＣＤ１４６の発現を欠くヒト未成熟歯髄幹細胞（ｈＩＤＰＳＣ）を生成する方法であって、
ａ）ヒト乳歯から歯髄（ＤＰ）を得ること；
ｂ）抗生物質を含有する溶液でＤＰを洗浄し、培地を含む容器にＤＰを入れること；
ｃ）ｈＩＤＰＳＣの増殖および接着が観察された後に、培地を含む別の容器にＤＰを機械的に移して、外植片培養物を確立すること；
ｄ）ステップｂ）およびｃ）を反復して、ＣＤ４４およびＣＤ１３を発現し、ＣＤ１４６の発現を欠くｈＩＤＰＳＣを収集すること
を含む方法。
［態様２］ｅ）ｈＩＤＰＳＣの試料を免疫染色して、ＣＤ４４、ＣＤ１３、およびＣＤ１４６を検出することにより、ｈＩＤＰＳＣにおけるＣＤ４４およびＣＤ１３の発現、ならびにＣＤ１４６の発現の欠如を確認すること
をさらに含む、態様１に記載の方法。
［態様３］免疫染色が、フローサイトメトリーを用いた試料の分析を伴う、態様２に記載の方法。
［態様４］ステップｂ）およびｃ）を５回を超えて反復し、ＤＰの５回の移動後に生成された外植片培養物からｈＩＤＰＳＣを収集する、態様１〜３のいずれかに記載の方法。
［態様５］ステップｂ）およびｃ）を１０回を超えて反復し、ＤＰの１０回の移動後に生成された外植片培養物からｈＩＤＰＳＣを収集する、態様４に記載の方法。
［態様６］ＣＤ４４およびＣＤ１３の発現、ならびにＣＤ１４６の発現の欠如により、ｈＩＤＰＳＣが血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができる、態様１〜５のいずれかに記載の方法。
［態様７］外植片培養物が、ｈＩＤＰＳＣの半コンフルエントなコロニーを含む、態様１〜６のいずれかに記載の方法。
［態様８］ステップｃ）からのｈＩＤＰＳＣの外植片培養物が収集前に継代される、態様１〜７のいずれかに記載の方法。
［態様９］ｈＩＤＰＳＣの外植片培養物の継代が、ｈＩＤＰＳＣの酵素処理、および外植片培養を拡大増殖するためのｈＩＤＰＳＣの移動を含む、態様８に記載の方法。
［態様１０］態様１〜９のいずれかに記載の方法に従って得られたｈＩＤＰＳＣを含む組成物。
［態様１１］パーキンソン病（ＰＤ）、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脳卒中、自己免疫性脳脊髄炎、糖尿病性神経障害、緑内障性神経障害、アルツハイマー病、ハンチントン病（ＨＤ）、自閉症、統合失調症、脳卒中、虚血、運動障害、およびけいれん性障害からなる群から選択される神経学的疾患または状態の治療に使用するための、態様１０に記載の組成物。
［態様１２］ＣＤ４４およびＣＤ１３を発現し、ＣＤ１４６、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＨＬＡ−ＡＢＣの発現を欠くヒト未成熟歯髄幹細胞（ｈＩＤＰＳＣ）を生成する方法であって、
ａ）ヒト乳歯から歯髄（ＤＰ）を得ること；
ｂ）抗生物質を含有する溶液でＤＰを洗浄し、培地を含む容器にＤＰを入れること；
ｃ）ｈＩＤＰＳＣの増殖および接着が観察された後に、培地を含む別の容器にＤＰを機械的に移して、外植片培養物を確立すること；
ｄ）ステップｂ）およびｃ）を反復して、ＣＤ４４およびＣＤ１３を発現し、ＣＤ１４６、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＨＬＡ−ＡＢＣの発現を欠くｈＩＤＰＳＣを収集すること
を含む方法。
［態様１３］ｅ）ｈＩＤＰＳＣの試料を免疫染色して、ＣＤ４４、ＣＤ１３、ＣＤ１４６、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＨＬＡ−ＡＢＣを検出することにより、ｈＩＤＰＳＣにおけるＣＤ４４およびＣＤ１３の発現、ならびにＣＤ１４６、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＨＬＡ−ＡＢＣの発現の欠如を確認すること
をさらに含む、態様１２に記載の方法。
［態様１４］免疫染色が、フローサイトメトリーを用いた試料の分析を伴う、態様１３に記載の方法。
［態様１５］ステップｂ）およびｃ）を５回を超えて反復し、ＤＰの５回の移動後に生成された外植片培養物からｈＩＤＰＳＣを収集する、態様１２〜１４のいずれかに記載の方法。
［態様１６］ステップｂ）およびｃ）を１０回を超えて反復し、ＤＰの１０回の移動後に生成された外植片培養物からｈＩＤＰＳＣを収集する、態様１５に記載の方法。
［態様１７］ＣＤ４４およびＣＤ１３の発現、ならびにＣＤ１４６の発現の欠如が、ｈＩＤＰＳＣのＢＢＢの通過を可能にし、ＣＤ１４６、ＨＬＡ−ＤＲ、および／またはＨＬＡ−ＡＢＣの発現の欠如が、免疫細胞によるｈＩＤＰＳＣの拒絶反応を予防する、態様１２〜１６のいずれかに記載の方法。
［態様１８］外植片培養物が、ｈＩＤＰＳＣの半コンフルエントなコロニーを含む、態様１２〜１７のいずれかに記載の方法。
［態様１９］ステップｃ）からのｈＩＤＰＳＣの外植片培養物が収集前に継代される、態様１２〜１８のいずれかに記載の方法。
［態様２０］ｈＩＤＰＳＣの外植片培養物の継代が、ｈＩＤＰＳＣの酵素処理、および外植片培養を拡大増殖するためのｈＩＤＰＳＣの移動を含む、態様１９に記載の方法。
［態様２１］態様１２〜２０のいずれかに記載の方法に従って得られたｈＩＤＰＳＣを含む組成物。
［態様２２］パーキンソン病（ＰＤ）、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脳卒中、自己免疫性脳脊髄炎、糖尿病性神経障害、緑内障性神経障害、アルツハイマー病、ハンチントン病（ＨＤ）、自閉症、統合失調症、脳卒中、虚血、運動障害、およびけいれん性障害からなる群から選択される神経学的疾患または状態の治療に使用するための、態様２１に記載の組成物。
［態様２３］態様１〜９または１２〜２０のいずれかに記載の方法に従って得られたヒト未成熟歯髄幹細胞（ｈＩＤＰＳＣ）。
［態様２４］ＣＤ４４およびＣＤ１３を発現するヒト未成熟歯髄幹細胞（ｈＩＤＰＳＣ）。
［態様２５］実施例のいずれか１つまたは添付の図面のいずれか１つを参照して本明細書中で先に実質的に記載されたｈＩＤＰＳＣ、組成物または方法。