【手続補正書】
【提出日】令和2年5月25日(2020.5.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
消化管由来上皮細胞を内胚葉幹細胞／前駆細胞に初期化するための低分子化合物の組み合わせであって、前記低分子化合物が、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路、エピジェネティック修飾因子、Ｃａ２＋チャネル活性化因子および代謝調節因子からなる機能的な群から選択され；低分子化合物の組み合わせは、ＦＢＰ、Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４（Ｂａｙ）、Ｂｉｘ０１２９４（Ｂｉｘ）、ＳＢ４３１５４２（ＳＢ）若しくはＡ８３−０１（Ａ８３）、ＶＰＡ、ＲＧ１０８（ＲＧ）、ＰＤ０３２５９０１、およびＰＳ４８の全てを含む、８個の低分子化合物（８Ｍ）；又は、ＢＢＲＳ組み合わせと呼ばれる、Ｂｉｘ０１２９４（Ｂｉｘ）、Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４（Ｂａｙ）、ＲＧ１０８（ＲＧ）およびＳＢ４３１５４２（ＳＢ）を含有する、４個の低分子化合物（４Ｍ）、若しくはＢＢＲＡ組み合わせと呼ばれる、Ｂｉｘ０１２９４（Ｂｉｘ）、Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４（Ｂａｙ）、ＲＧ１０８（ＲＧ）、および８３−０１（Ａ８３）を含有する、４個の低分子化合物（４Ｍ）である、低分子化合物の組み合わせ。
【請求項２】
８個の低分子化合物を含む前記組み合わせが、５０：１２５００：１２．５：１：１２．５：５０：１２５：８７５００のモル比のＳＢ４３１５４：ＶＰＡ：ＰＤ０３２５９０１：ＲＧ１０８：Ｂｉｘ０１２９４：Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４：ＰＳ４８：ＦＢＰの組み合わせ；または１２．５：１２５００：１２．５：１：１２．５：５０：１２５：８７５００のモル比のＡ８３：ＶＰＡ：ＰＤ０３２５９０１：ＲＧ１０８：Ｂｉｘ０１２９４：Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４：ＰＳ４８：ＦＢＰの組み合わせである、請求項１に記載の低分子化合物の組み合わせ。
【請求項３】
前記ＢＢＲＳ又はＢＢＲＡ組み合わせ中の各化合物が、１〜１０μＭのＳＢ４３１５２、０．４〜１μＭのＡ８３、０．０１〜１μＭのＲＧ１０８、０．１〜２μＭのＢｉｘ０１２９４、１〜４μＭのＢａｙ  Ｋ  ８６４４の濃度で使用される、請求項１に記載の低分子化合物の組み合わせ。
【請求項４】
前記ＢＢＲＳ組み合わせが、５０：１：１２．５：５０のモル比のＳＢ：ＲＧ：Ｂｉｘ：Ｂａｙの各化合物の組み合わせであり、前記ＢＢＲＡ組み合わせが、１２．５：１：１２．５：５０のモル比のＡ８３：ＲＧ：Ｂｉｘ：Ｂａｙの各化合物の組み合わせであり；好ましくは各化合物が、２μＭのＳＢ４３１５２、０．５μＭのＡ８３、０．０４ＭのＲＧ１０８、０．５μＭのＢｉｘ０１２９４および２μＭのＢａｙ  Ｋ  ８６４４の濃度で使用される、請求項１または３に記載の低分子化合物の組み合わせ。
【請求項５】
消化管由来上皮細胞を内胚葉幹細胞／前駆細胞に初期化するための初期化キットであって、請求項１〜４の何れか１項に記載の低分子化合物の組み合わせおよび前記化合物の使用のための説明書を含み；各化合物が個別に包装されるか、または各化合物が、８Ｍ組み合わせもしくはＢＢＲＳ組み合わせもしくはＢＢＲＡ組み合わせで混合および包装され、使用される各化合物の濃度が前記説明書に記載される、初期化キット
好ましくは、フィーダー細胞およびその使用のための説明書をさらに含み、前記フィーダー細胞が、胃上皮下筋線維芽細胞または腸上皮下筋線維芽細胞などの消化管由来間質細胞である、初期化キット。
【請求項６】
基本培地、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２、細胞培養のための基本的な構成成分、グルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ）および抗生物質（ＳＰ）およびその使用のための説明書をさらに含み、グルタミンが、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地に対して２ｍＭ（１ｘ）の濃度で使用され、前記抗生物質がペニシリン−ストレプトマイシンであり、ペニシリンが１００Ｕ／ｍＬの濃度で使用され、ストレプトマイシンがＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地に対して０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で使用され、各物質が個別に包装されるか、または挙げられた濃度に従い混合される、請求項５に記載の初期化キット。
【請求項７】
請求項１〜４の何れか１項に記載の低分子化合物の組み合わせを、請求項６に記載のように、基本培地および細胞培養のための基本的なさらなる構成成分とブレンドすることによって調製される、消化管由来上皮細胞を内胚葉幹細胞／前駆細胞に初期化するための初期化培地。
【請求項８】
請求項７に記載の初期化培地であって、
２ｍＭグルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ）、ペニシリン−ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン）、２μＭ  ＳＢ４３１５４または０．５μＭ  Ａ８３−０１、０．５ｍＭ  ＶＰＡ、０．５μＭ  ＰＤ０３２５９０１、０．０４μＭ  ＲＧ１０８、０．５μＭ  Ｂｉｘ０１２９４、２μＭ  Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４、５μＭ  ＰＳ４８、３．５ｍＭ  ＦＢＰを含有するＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２として処方されるか、
２ｍＭグルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ）、ペニシリン−ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン）、１〜１０μＭ  ＳＢ４３１５２、０．０１〜１μＭ  ＲＧ１０８、０．１〜２μＭ  Ｂｉｘ０１２９４、１〜４μＭ  Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４を含有するＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２；好ましくは、２ｍＭグルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ）、ペニシリン−ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン）、２μＭ  ＳＢ４３１５２、０．０４μＭ  ＲＧ１０８、０．５Ｍ  Ｂｉｘ０１２９４、２μＭ  Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４を含有するＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２として処方されるか、または
２ｍＭグルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ）、ペニシリン−ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン）、０．４〜１μＭ  Ａ８３−０１、０．０１〜１μＭ  ＲＧ１０８、０．１〜２μＭ  Ｂｉｘ０１２９４、１〜４μＭ  Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４を含有するＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２；好ましくは２ｍＭグルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ）、ペニシリン−ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン）、０．５μＭ  Ａ８３−０１、０．０４μＭ  ＲＧ１０８、０．５Ｍ  Ｂｉｘ０１２９４、２μＭ  Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４を含有するＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２として処方される、初期化培地。
【請求項９】
胃上皮細胞および十二指腸上皮細胞、好ましくは胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）、最も好ましくはＮＣＡＭ陽性ヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）を含む消化管由来上皮細胞を内胚葉幹細胞／前駆細胞に初期化するための、請求項１〜４の何れか１項に記載の低分子化合物の組み合わせ、または請求項５もしくは６に記載の初期化キット、または請求項７もしくは８に記載の初期化培地の適用。
【請求項１０】
請求項９に記載の適用の１つとしての、消化管由来上皮細胞を内胚葉幹細胞／前駆細胞に初期化するための方法であって、以下、
１）開始細胞として単離初代消化管由来上皮細胞を使用して、前記消化管由来上皮細胞を増殖させる工程；
２）前記フィーダー細胞をマイトマイシン−Ｃで処理し、洗浄し、後で使用するために酵素で前記細胞を消化する工程；
３）工程２）で調製した前記フィーダー細胞を、工程１）で培養し、増殖させた前記消化管由来上皮細胞に添加し、一晩同時培養を継続する工程；
４）第２日に請求項７または８に記載する初期化培地に交換し、２〜３日ごとに前記培地をリフレッシュし、７〜１５日間培養して、誘導性内胚葉幹細胞／前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）のコロニーを得る工程
を含む、方法。
【請求項１１】
工程１）における前記開始細胞が、胃上皮細胞および十二指腸上皮細胞を含む消化管由来上皮細胞、好ましくは胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）、特に好ましくはＮＣＡＭ（神経細胞接着分子）陽性胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）であり；
工程１）において、ＮＣＡＭ陽性胃上皮細胞が好ましくは開始細胞として使用され、５％ＣＯ２インキュベーター中で５日間、３７℃にてＫｕｂｏｔａ培地中で培養される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程２）における前記フィーダー細胞が、胃上皮下筋線維芽細胞または腸上皮下筋線維芽細胞を含む消化管由来間質細胞、好ましくはヒト胃上皮下筋線維芽細胞（ａＧＳＥＭＦ）であり；
工程２）において、ヒト胃上皮下筋線維芽細胞（ａＧＳＥＭＦ）を好ましくはマイトマイシン−Ｃで２〜３時間処理し、その後、前記細胞をＰＢＳで洗浄し、前記細胞をＴｒｙｐＬＥ酵素で消化し、
工程３）において、工程２）で調製した前記フィーダー細胞を好ましくは１〜３ｘ１０５個／ｃｍ２の密度で、工程１）で５日間にわたり培養した前記消化管由来上皮細胞に添加し、５％ＣＯ２インキュベーター中で一晩（１２〜１６時間）３７℃にて培養する、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
内胚葉幹細胞／前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）の継代のための方法であって、以下：
（１）継代前の準備：ウェルプレートにマイトマイシン−Ｃ（１０μｇ／ｍＬ）で処理した成体ヒト胃上皮下筋線維芽細胞（ａＧＳＥＭＦ）を播種するか、または約３時間前に前記ウェルプレートにおいてフィブロネクチン（ＦＮ）、Ｃｅｌｌ−ＴＡＫ（ＣＴ、細胞組織接着剤）ゲルをコーティングし、室温で乾燥させる工程；
（２）継代用培地の調製：Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／ＤＦ１２＋ＡＷＦ（Ａ８３−０１  ０．５μＭ＋Ｗｎｔ３ａ  ５０ｎｇ／ｍＬ＋ｂＦＧＦ  １０ｎｇ／ｍＬ）またはＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／ＤＦ１２＋Ａ（Ａ８３−０１、０．５μＭ）；
（３）請求項１０〜１２に記載する何れかに従って得られた内胚葉幹細胞／前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）のコロニーを拾い、それらを約１：３〜４の比率で小片に分割し、それらを、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃のＦＮ＋ＡＷＦ、ＣＴ＋ＡＷＦまたはフィーダー［フィーダー細胞、マイトマイシン−Ｃ（１０μｇ／ｍＬ）で処理した成体ヒト胃上皮下筋線維芽細胞（ａＧＳＥＭＦ）］＋Ａ培地に入れ、継代した内胚葉幹細胞／前駆細胞を得るために継代培養する工程
を含む、方法。
【請求項１４】
肝臓細胞、膵臓β細胞および腸細胞への分化誘導のための、請求項１０〜１２の何れか一項に従い得られた内胚葉幹細胞／前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）または請求項１３に従い得られた継代内胚葉幹細胞／前駆細胞の適用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２２】
【表７】
2019521669.tif 000001
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７５】
（２）ｈｉＥｎｄｏＰＣの腸細胞への分化誘導
古典的な腸細胞誘導プロトコール［Ｓｐｅｎｃｅ  ＪＲ，Ｍａｙｈｅｗ  ＣＮ，Ｒａｎｋｉｎ  ＳＡ，Ｋｕａｒ  ＭＦ，Ｖａｌｌａｎｃｅ  ＪＥ，Ｔｏｌｌｅ  Ｋら、Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１０；４７０：１０５−９．Ｗａｔｓｏｎ  ＣＬ，Ｍａｈｅ  ＭＭ，Ｍｕｎｅｒａ  Ｊ，Ｈｏｗｅｌｌ  ＪＣ，Ｓｕｎｄａｒａｍ  Ｎ，Ｐｏｌｉｎｇ  ＨＭら、Ａｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ｕｓｉｎｇ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１４；２０：１３１０−４］に従い、ｈｉＥｎｄｏＰＣの腸管への分化を検出した。誘導の２週間後、ｈｉＥｎｄｏＰＣ由来腸オルガノイド（ｈｉＥｎｄｏＰＣ−Ｉｎｔ）は、インビトロで初代腸培養の形態学的特徴を呈することが分かった（図３４Ａ）。ｈｉＥｎｄｏＰＣ−Ｉｎｔにおける腸特異的転写因子ＣＤＸ２、小腸細胞マーカーＶＩＬ１、杯細胞マーカーＭＵＣ２、小腸内分泌細胞マーカーＣＨＧＡおよび小腸パネート細胞マーカーＬＹＳＯの発現は、誘導後に顕著に上方制御された（図３４Ｂ）。さらに、タンパク質レベルで、腸の特徴的なマーカーであるＶＩＬ１、ＭＵＣ２、ＣＤＸ２、ＬＧＲ５およびＥＣＡＤも顕著に発現され（図３４Ｃ）、これによりｈｉＥｎｄｏＰＣ−Ｉｎｔが当初腸の特徴を有していたことが確認された。