【手続補正書】
【提出日】令和2年1月27日(2020.1.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a.光学的性質改変試薬をそれぞれが含む1つまたは複数の反応チャンバを含む試料受け入れカートリッジ；
b. i.加熱要素と、
ii.該加熱要素に動作的に結合された電源と
を含む基板；および
c.該試料受け入れカートリッジと該基板とを動作的に接続し、それにより、該1つまたは複数の反応チャンバそれぞれの壁を形成する接着層
を含み、任意で、該試料受け入れカートリッジが、該1つまたは複数の反応チャンバそれぞれを動作的に接続する試料入口を含み、かつ任意で、該1つまたは複数の反応チャンバそれぞれがマイクロ流体反応チャンバである、生物学的試料アッセイ用光学的性質改変装置。
【請求項２】
1つまたは複数の反応チャンバそれぞれが、試料受け入れカートリッジの第一の面にある第一の開口と、該試料受け入れカートリッジの第二の面にある第二の開口とを含み、該第一の面が該第二の面とは反対側であり、接着層が、該1つまたは複数の反応チャンバそれぞれの壁を形成し、かつ各第二の開口を封止し、任意で、前記装置が、各第一の開口を封止する選択的通気要素をさらに含む、請求項1記載の装置。
【請求項３】
ハウジングをさらに含み、任意で、該ハウジングが、試料受け入れカートリッジ、基板、および接着層を封入するために、第一の部分と、該第一の部分と嵌合可能な第二の部分とを含む、請求項1または2記載の装置。
【請求項４】
試料受け入れカートリッジが透明であり、かつ任意で、該試料受け入れカートリッジがポリエチレンなどのポリマー材料を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の装置。
【請求項５】
接着層が透明であり、または反射性であり、または乳白色であり、かつ任意で、アクリル系接着剤を含み、かつ任意で、該接着層が0.1W/m-K〜10W/m-Kの熱伝導率を有する、請求項1〜4のいずれか一項記載の装置。
【請求項６】
1つまたは複数の反応チャンバそれぞれが核酸増幅組成物を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の装置。
【請求項７】
接着層が酸を含まない、請求項1〜6のいずれか一項記載の装置。
【請求項８】
接着層が、第二の層と貼り合わされた第一の層を含み、該第一の層が酸を含まず、かつ任意で、該第二の層が乳白色である、請求項1〜7のいずれか一項記載の装置。
【請求項９】
以下の工程を含む、生物学的試料アッセイにおいて光学的性質を改変する方法：
a.生物学的試料を、生物学的試料アッセイ用光学的性質改変装置の試料受け入れカートリッジの、光学的性質改変試薬を含む1つまたは複数の反応チャンバの中に移す工程であって、それにより反応混合物を生成する、工程；
b.該反応混合物を該装置の加熱要素によって加熱する工程、およびそれにより、反応生成物を生成する工程；ならびに
c.該反応生成物を該光学的性質改変試薬と反応させる工程であって、該反応チャンバ内容物の光学的性質を、改変された光学的性質の検出を可能にするのに十分なほど改変する工程。
【請求項１０】
光学的性質改変装置が選択的通気要素をさらに含み、前記方法が、該選択的通気要素によって試料を1つまたは複数の反応チャンバ中に収容する工程をさらに含み、任意で、生物学的試料を該1つまたは複数の反応チャンバの中に移す工程が、気体、例えば空気を選択的通気要素を通じて流す工程を含む、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
反応生成物を光学的性質改変試薬と反応させたのち、該反応生成物の比色分析を実行する工程をさらに含む、請求項9または10記載の方法。
【請求項１２】
光学的性質改変装置が、試料受け入れカートリッジに動作的に接続された接着層をさらに含み、任意で、前記方法が、反応生成物を光学的性質改変試薬と反応させたのち該反応生成物の比色分析を実行する工程をさらに含み、該接着層が乳白色であり、該比色分析を実行する工程が、チャンバを目視検査して、改変された光学的性質を検出する工程を含む、請求項9〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
以下の工程を含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の生物学的試料アッセイ用光学的性質改変装置によって光学的性質を改変する方法：
a.生物学的試料から反応生成物を生成する工程；
b.該反応生成物を該光学的性質改変試薬と反応させる工程であって、反応チャンバ内容物の光学的性質を、改変された光学的性質の検出を可能にするのに十分なほど改変する工程。
【請求項１４】
以下の工程を含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の生物学的試料アッセイ用光学的性質改変装置を製造する方法：
a.試料受け入れカートリッジと基板とを接着層によって動作的に結合する工程。
【請求項１５】
光学的性質改変試薬を1つまたは複数の反応チャンバそれぞれに挿入し、該光学的性質改変試薬の機能性を保持しながら該光学的性質改変試薬をその中に貯蔵する工程を含む、請求項14記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
また、生物学的試料アッセイ用光学的性質改変装置を製造する方法が含まれる。そのような方法は、試料受け入れカートリッジと基板とを接着層によって動作的に結合する工程を含むことができる。いくつかの変形態様において、接着層は、第一の面と、第一の面とは反対の第二の面とを含み、試料受け入れカートリッジと基板とを動作的に結合する工程は、試料受け入れカートリッジを第一の面に接着的に取り付け、基板を第二の面に接着的に取り付ける工程を含む。
[本発明1001]
a.光学的性質改変試薬をそれぞれが含む1つまたは複数の反応チャンバを含む試料受け入れカートリッジ；
b. i.加熱要素と、
ii.該加熱要素に動作的に結合された電源と
を含む基板；および
c.該試料受け入れカートリッジと該基板とを動作的に接続し、それにより、該1つまたは複数の反応チャンバそれぞれの壁を形成する接着層
を含む、生物学的試料アッセイ用光学的性質改変装置。
[本発明1002]
試料受け入れカートリッジが、1つまたは複数の反応チャンバそれぞれを動作的に接続する試料入口を含む、本発明1001の装置。
[本発明1003]
1つまたは複数の反応チャンバそれぞれがマイクロ流体反応チャンバである、本発明1001または1002の装置。
[本発明1004]
1つまたは複数の反応チャンバそれぞれの壁を形成する選択的通気要素をさらに含む、本発明1001〜1003のいずれかの装置。
[本発明1005]
選択的通気要素が、多孔質ポリマーマトリックスと、受動的に調整可能な気孔率を有するヒドロゲルとを含む、本発明1004の装置。
[本発明1006]
1つまたは複数の反応チャンバそれぞれが、試料受け入れカートリッジの第一の面にある第一の開口と、該試料受け入れカートリッジの第二の面にある第二の開口とを含み、該第一の面が該第二の面とは反対側であり、接着層が、該1つまたは複数の反応チャンバそれぞれの壁を形成し、かつ各第二の開口を封止する、本発明1001〜1005のいずれかの装置。
[本発明1007]
各第一の開口を封止する選択的通気要素をさらに含む、本発明1006の装置。
[本発明1008]
加熱要素が1つまたは複数の反応チャンバに近接している、本発明1001〜1007のいずれかの装置。
[本発明1009]
基板がプリント回路基板である、本発明1001〜1008のいずれかの装置。
[本発明1010]
電源が電池である、本発明1001〜1009のいずれかの装置。
[本発明1011]
基板が制御ユニットを含む、本発明1001〜1010のいずれかの装置。
[本発明1012]
基板がセンサを含む、本発明1011の装置。
[本発明1013]
基板が加熱要素を含み、センサが試料を検出したときに制御ユニットが該加熱要素をアクティブ化して1つまたは複数の反応チャンバ中の試料を加熱する、本発明1012の装置。
[本発明1014]
基板が、センサが試料を検出したときに光を放出する光源を含む、本発明1012の装置。
[本発明1015]
制御ユニットが、1つまたは複数の反応チャンバ中の試料の比色分析を実行するように構成されている、本発明1011の装置。
[本発明1016]
ハウジングをさらに含む、本発明1001〜1015のいずれかの装置。
[本発明1017]
ハウジングが、試料受け入れカートリッジ、基板、および接着層を封入するために、第一の部分と、該第一の部分と嵌合可能な第二の部分とを含む、本発明1016の装置。
[本発明1018]
ハンドヘルド型装置である、本発明1001〜1017のいずれかの装置。
[本発明1019]
ハウジングが300cm3以下の容積を有する、本発明1016の装置。
[本発明1020]
試料受け入れカートリッジが透明である、本発明1001〜1019のいずれかの装置。
[本発明1021]
試料受け入れカートリッジがポリマー材料を含む、本発明1001〜1020のいずれかの装置。
[本発明1022]
ポリマー材料がポリエチレンである、本発明1021の装置。
[本発明1023]
接着層が透明である、本発明1001〜1022のいずれかの装置。
[本発明1024]
接着層が反射性である、本発明1001〜1023のいずれかの装置。
[本発明1025]
接着層がアクリル系接着剤を含む、本発明1001〜1024のいずれかの装置。
[本発明1026]
1つまたは複数の反応チャンバそれぞれが核酸増幅組成物を含む、本発明1001〜1025のいずれかの装置。
[本発明1027]
生物学的試料が核酸増幅試料である、本発明1001〜1026のいずれかの装置。
[本発明1028]
光学的性質改変試薬がハロクロミック試薬である、本発明1001〜1027のいずれかの装置。
[本発明1029]
接着層が0.1W/m-K〜10W/m-Kの熱伝導率を有する、本発明1001〜1028のいずれかの装置。
[本発明1030]
接着層が酸を含まない、本発明1001〜1029のいずれかの装置。
[本発明1031]
接着層が乳白色である、本発明1001〜1030のいずれかの装置。
[本発明1032]
接着層が、第二の層と貼り合わされた第一の層を含む、本発明1001〜1031のいずれかの装置。
[本発明1033]
第一の層が酸を含まない、本発明1032の装置。
[本発明1034]
第二の層が乳白色である、本発明1032の装置。
[本発明1035]
以下の工程を含む、生物学的試料アッセイにおいて光学的性質を改変する方法：
a.生物学的試料を、生物学的試料アッセイ用光学的性質改変装置の試料受け入れカートリッジの、光学的性質改変試薬を含む1つまたは複数の反応チャンバの中に移す工程であって、それにより反応混合物を生成する、工程；
b.該反応混合物を該装置の加熱要素によって加熱する工程、およびそれにより、反応生成物を生成する工程；ならびに
c.該反応生成物を該光学的性質改変試薬と反応させる工程であって、該光学的性質改変試薬の光学的性質を、改変された光学的性質の検出を可能にするのに十分なほど改変する工程。
[本発明1036]
生物学的試料が核酸を含む、本発明1035の方法。
[本発明1037]
反応チャンバが増幅組成物をさらに含む、本発明1036の方法。
[本発明1038]
加熱する工程が、核酸および増幅組成物を含む核酸増幅反応を促進し、該反応が、増幅された核酸および反応生成物を生成し、該反応生成物が複数のプロトンを含む、本発明1037の方法。
[本発明1039]
1つまたは複数の反応チャンバがそれぞれマイクロ流体反応チャンバである、本発明1035〜1038のいずれかの方法。
[本発明1040]
光学的性質改変装置がハンドヘルド型装置である、本発明1035〜1039のいずれかの方法。
[本発明1041]
光学的性質改変装置が、300cm3以下の容積を有するハウジングを含む、本発明1035〜1040のいずれかの方法。
[本発明1042]
生物学的試料を1つまたは複数の反応チャンバの中に移す工程が、該試料を、該1つまたは複数の反応チャンバそれぞれを動作的に接続する試料入口を通じて流す工程を含む、本発明1035〜1041のいずれかの方法。
[本発明1043]
光学的性質改変装置が選択的通気要素をさらに含み、前記方法が、該選択的通気要素によって試料を1つまたは複数の反応チャンバ中に収容する工程をさらに含む、本発明1035〜1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
生物学的試料を1つまたは複数の反応チャンバの中に移す工程が、気体を選択的通気要素を通じて流す工程を含む、本発明1043の方法。
[本発明1045]
気体が空気である、本発明1044の方法。
[本発明1046]
反応混合物を加熱する工程が、熱を、加熱要素に動作的に結合された基板を通じて光学的性質改変装置の1つまたは複数の反応チャンバに流す工程を含む、本発明1035〜1045のいずれかの方法。
[本発明1047]
基板がセンサを含み、生物学的試料を1つまたは複数の反応チャンバの中に移す工程が、該1つまたは複数の反応チャンバ中の該試料を該センサによって検出する工程を含む、本発明1046の方法。
[本発明1048]
基板が光源を含み、生物学的試料を試料受け入れカートリッジの中に移す工程が、該光源をアクティブ化して光を放出する工程を含む、本発明1046の方法。
[本発明1049]
反応混合物を加熱する工程が、基板上のプリント回路を作動させる工程を含む、本発明1046の方法。
[本発明1050]
反応混合物を加熱する工程が、加熱要素に動作的に結合した電源から電力を流す工程を含む、本発明1046の方法。
[本発明1051]
光学的性質改変装置が、試料受け入れカートリッジおよび加熱要素を封入するための、レセプタクルを含む第一の部分と、該第一の部分と嵌合可能な第二の部分とを含むハウジングをさらに含み、生物学的試料を1つまたは複数の反応チャンバの中に移す工程が、該試料を該レセプタクルを通じて流す工程を含む、本発明1035〜1050のいずれかの方法。
[本発明1052]
基板が制御ユニットを含み、生物学的試料の光学的性質の改変が、1つまたは複数の反応チャンバ中の試料の比色分析を制御ユニットによって実行することを含む、本発明1046の方法。
[本発明1053]
反応生成物を光学的性質改変試薬と反応させたのち、該反応生成物の比色分析を実行する工程をさらに含む、本発明1035〜1052のいずれかの方法。
[本発明1054]
試料受け入れカートリッジが透明であり、比色分析を実行する工程が、該試料受け入れカートリッジを透過した光の1つまたは複数の特性を検出する工程を含む、本発明1053の方法。
[本発明1055]
光学的性質改変装置が、試料受け入れカートリッジに動作的に接続された接着層をさらに含む、本発明1035〜1054のいずれかの方法。
[本発明1056]
反応生成物を光学的性質改変試薬と反応させたのち、該反応生成物の比色分析を実行する工程をさらに含み、接着層が乳白色であり、該比色分析を実行する工程が、チャンバを目視検査して、改変された光学的性質を検出する工程を含む、本発明1055の方法。
[本発明1057]
1つまたは複数の反応チャンバそれぞれが、試料受け入れカートリッジの第一の面にある第一の開口と、該試料受け入れカートリッジの第二の面にある第二の開口とを含み、該第一の面が該第二の面とは反対側である、本発明1035〜1056のいずれかの方法。
[本発明1058]
光学的性質改変装置が、各第二の開口を封止することによって1つまたは複数の反応チャンバそれぞれの壁を形成する接着層をさらに含み、生物学的試料を1つまたは複数の反応チャンバの中に移す工程が、該接着層によって該試料を該1つまたは複数の反応チャンバ中に収容する工程を含む、本発明1057の方法。
[本発明1059]
接着層が透明であり、検出する工程が、該接着層を透過した光を目視検査する工程を含む、本発明1055の方法。
[本発明1060]
接着層が反射性であり、検出する工程が、該接着層から反射した光を目視検査する工程を含む、本発明1055の方法。
[本発明1061]
接着層がアクリル系接着剤を含む、本発明1055の方法。
[本発明1062]
光学的性質改変試薬がハロクロミック試薬である、本発明1035の方法。
[本発明1063]
接着層が0.1W/m-K〜10W/m-Kの熱伝導率を有する、本発明1055の方法。
[本発明1064]
接着層が酸を含まない、本発明1055の方法。
[本発明1065]
接着層が乳白色である、本発明1055の方法。
[本発明1066]
接着層が、第二の層と貼り合わされた第一の層を含む、本発明1055の方法。
[本発明1067]
第一の層が酸を含まない、本発明1066の方法。
[本発明1068]
第二の層が乳白色である、本発明1066の方法。
[本発明1069]
以下の工程を含む、本発明1001〜1034のいずれかの生物学的試料アッセイ用光学的性質改変装置によって光学的性質を改変する方法：
a.生物学的試料から反応生成物を生成する工程；
b.該反応生成物を該光学的性質改変試薬と反応させる工程であって、該光学的性質改変試薬の光学的性質を、改変された光学的性質の検出を可能にするのに十分なほど改変する工程。
[本発明1070]
以下の工程を含む、本発明1001〜1034のいずれかの生物学的試料アッセイ用光学的性質改変装置を製造する方法：
a.試料受け入れカートリッジと基板とを接着層によって動作的に結合する工程。
[本発明1071]
接着層が、第一の面と、該第一の面とは反対の第二の面とを含み、試料受け入れカートリッジと基板とを動作的に結合する工程が、該試料受け入れカートリッジを該第一の面に接着的に取り付け、該基板を該第二の面に接着的に取り付ける工程を含む、本発明1070の製造方法。
[本発明1072]
基板がプリント回路基板である、本発明1070の製造方法。
[本発明1073]
多孔質ポリマーマトリックスがポリエチレンを含む、本発明（Error! Reference source not found.）の装置。
[本発明1074]
ヒドロゲルがカルボキシメチルセルロースを含む、本発明（Error! Reference source not found.）の装置。
[本発明1075]
光学的性質改変試薬が酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）試薬である、本発明1001〜1034、1073または1074のいずれかの装置。
[本発明1076]
ELISA試薬が、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、BCIP/NBT（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-ホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム）、TMB（3,3',5,5'テトラメチルベンジジン）、DAB（3,3',4,4'ジアミノベンジジン）、4CN（4-クロロ-1-ナフトール）、TMB（二重機能基質）、ABTS（2,2'-アジノ-ジ［3-エチルベンズチアゾリン］スルホネート）、OPD（o-フェニレンジアミン）、MUG（4-メチルウンベリフェリルガラクトシド）、HPA（ヒドロキシフェニル酢酸）およびHPPA（3-p-ヒドロキシフェニルプロピオン酸）からなる群から選択される、本発明1075の装置。
[本発明1077]
光学的性質改変試薬が酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）試薬である、本発明1035〜1068のいずれかの方法。
[本発明1078]
ELISA試薬が、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、BCIP/NBT（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-ホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム）、TMB（3,3',5,5'テトラメチルベンジジン）、DAB（3,3',4,4'ジアミノベンジジン）、4CN（4-クロロ-1-ナフトール）、TMB（二重機能基質）、ABTS（2,2'-アジノ-ジ［3-エチルベンズチアゾリン］スルホネート）、OPD（o-フェニレンジアミン）、MUG（4-メチルウンベリフェリルガラクトシド）、HPA（ヒドロキシフェニル酢酸）およびHPPA（3-p-ヒドロキシフェニルプロピオン酸）からなる群から選択される、本発明1077の方法。
[本発明1079]
反応させる工程が、光学的性質改変試薬の光学的性質を、改変された光学的性質のヒトの裸眼による検出を可能にするのに十分なほど改変する、本発明1035〜1068または1077のいずれかの方法。
[本発明1080]
反応させる工程が、光学的性質改変試薬の光学的性質を、改変された光学的性質のヒトの裸眼による検出を可能にするのに十分なほど改変する、本発明1069の方法。
[本発明1081]
光学的性質改変試薬を1つまたは複数の反応チャンバそれぞれに挿入し、該光学的性質改変試薬の機能性を保持しながら該光学的性質改変試薬をその中に貯蔵する工程を含む、本発明1070の方法。
[本発明1082]
加熱要素が、互いに混合されると熱を発生させる2つ以上の発熱性反応体を含む、本発明1001〜1034、1073または1074のいずれかの装置。
[本発明1083]
加熱要素が、互いにまたは反応混合物と混合されると熱を発生させる1つまたは複数の発熱性反応体を含み、該反応混合物を加熱する工程が、該1つまたは複数の発熱性反応体を互いにまたは該反応混合物と混合する工程を含む、本発明1035〜1068、1077または1079の方法。
[本発明1084]
接着層が不透明であり、反応開始色に対して補色である、本発明1001〜1034、1073、1074または1082のいずれかの装置。
[本発明1085]
接着層が不透明であり、反応開始色に対して補色である、本発明1055の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
【図１】本開示の態様による装置の斜視図を提供する。
【図２】本開示の態様による装置の例示的な断面図を提供する。
【図３】ある態様による、マンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni）からの鋳型核酸分子標的領域のDNA配列（SEQ ID NO: 5）を示す。
【図４】ある態様による、陽性および陰性の等温増幅反応についてのpH測定値を示すグラフである。
【図５】ある態様による、陽性および陰性の等温増幅反応の反応終点での色（色相）の検出を示すグラフである。
【図６】ある態様による、陽性および陰性の等温増幅反応産物のゲル電気泳動アッセイの結果を示す。
【図７】ある態様による、種々のトリス緩衝液濃度を用いた増幅反応についての正規化された色相値を示す。
【図８】ある態様による、様々な量の追加のヒドロニウムイオン等価物を用いた増幅反応についての正規化された色相値を示す。
【図９Ａ】ある態様による、種々の造塩発色剤濃度を用いた増幅反応についての正規化された色相値を示す。
【図９Ｂ】ある態様による、種々の造塩発色剤濃度を用いた増幅反応についての正規化された色相値を示す。
【図９Ｃ】ある態様による、種々の造塩発色剤濃度を用いた増幅反応についての正規化された色相値を示す。
【図９Ｄ】ある態様による、種々の造塩発色剤濃度を用いた増幅反応についての正規化された色相値を示す。
【図１０】ある態様による、様々なポリメラーゼと、LAMP増幅の視覚的検出との適合性を示す。
【図１１】図11Aおよび11Bは、ある態様による、様々なチャネル深さを用いた増幅反応についての正規化された色相値を示す。
【図１２】ある態様による、SDAについての経時的な正規化された色相値を示す。
【図１３】ある態様による、PCRについての経時的な正規化された色相値を示す。
【図１４】図14Aおよび14Bは、ある態様による、造塩発色剤の組み合わせを用いた増幅反応についての正規化された対比変化を示す。
【図１５】ある態様による、様々なDNA鋳型濃度についての経時的な正規化された対比変化を示す。
【図１６】選択的通気要素を有する装置中の増幅からのLAMP増幅データを提供する。
【図１７】本開示の態様による光学的性質改変装置中の6つの異なる反応チャンバの間での核酸増幅反応時間を提供する。
【図１８】本開示の態様の光学的性質改変装置中の6つの異なる反応チャンバの間での核酸増幅反応から生じた、CIE94 Delta-Eスケールを使用して計測された色変化を提供する。
【図１９】本開示の態様による、前記やり方で加熱要素に動作的に結合された反応チャンバ、たとえば流体貯留部の温度プロフィールを提供する。
【図２０】本開示の態様による多重化核酸増幅アッセイと動作的に結合した加熱要素、たとえば電子加熱ボード上の6つの加熱位置の間での温度均一性を提供する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６７】
（表２）使用した配列
2019512694.tif 000001
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７０】
実施例5：視覚的造塩発色剤を用いた鎖置換増幅（SDA）の検出
SDA反応を、以下を含む反応ミックスを用いて行った：1.3 mMの最終トリス緩衝液濃度（pH 8.8に配合した緩衝液）、10 mM (NH4)2SO4、50 mM KCl（pH 8.5に調節）、8 mM MgSO4、各々4.4 mMのdATP、dGTP、dTTP、0.8 mM dCTP-αS（TriLink Biotechnologies）、0.1％ v/v Tween-20、0.8 Mベタイン、0.32 U/μl Bst DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）、0.2U/uL BSoBI（New England Biolabs）、および0.2 mMニュートラルレッド造塩発色剤。ヒトBRCA1用に設計したプライマー（SDAf、SDAr、BF、BR）を、各々0.5μMの最終濃度で反応物に添加した。5 ngのHeLa gDNAを25μLの最終反応物体積に添加して、65℃で様々なインキュベーション時間の間保持した。経時的な正規化された色相値における変化（図12）により、この視覚的検出ケミストリーがSDAで機能することが示される。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７１】
実施例6：視覚的造塩発色剤を用いたPCR増幅の検出
PCR反応を、以下を含む反応ミックスを用いて行った：50 mM KClおよび2 mM MgCl2（8.5に調節したpH）、各々0.5 mMのdNTP、5U Taq DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）、および0.2 mMニュートラルレッド造塩発色剤。酵素保存緩衝液およびプライマーからの持ち越し総トリス-HCl濃度は、最終反応ミックスにおいて1.15 mMであった。プライマーを、大腸菌（Escherichia coli）16s rRNA遺伝子用に設計し、各々0.5μMの最終濃度で反応物に添加した。10 ngの大腸菌gDNAを25μLの最終反応物体積に添加して、最初に95℃ホールドで2分間保持し、その後、95℃で10秒間、55℃で30秒間、68℃で30秒間の50サイクルを行った。経時的な正規化された色相値における変化（図13）により、この視覚的検出ケミストリーがPCRで機能することが示される。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019512694000001.app