(57)【要約】本明細書の特定の実施形態では、インビボ循環の増加した選択的輸送分子が開示される。一部の実施形態では、本明細書で開示される選択的輸送分子は、式（Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｃ）−Ｍを有し、式中、Ｃは積荷成分であり；Ａは５〜９個の連続した酸性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり、該アミノ酸はアスパルタートおよびグルタマートから選択され；Ｂは５〜２０個の連続した塩基性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり；Ｘはリンカーであり；かつＭは高分子キャリアである。2012533560.tif 000022
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造（Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｃ）−Ｍの分子であって、
式中、
Ｃは、少なくとも１つの造影剤であり；
Ａは、５〜９個の連続した酸性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり、該アミノ酸はアスパルタートおよびグルタマートから選択され；
Ｂは、５〜２０個の連続した塩基性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり；
Ｘは、リンカーであり；かつ
Ｍは、高分子キャリアであり；
ここでＭは、ＡまたはＢに結合している、
前記分子。
【請求項２】
Ａが５〜９個の連続したグルタマートを含む配列を有する、請求項１記載の分子。
【請求項３】
Ｂが５〜１２個の連続したアルギニンを含む配列を有する、請求項１記載の分子。
【請求項４】
Ｂが９個の連続したアルギニンを含む配列を有する、請求項１記載の分子。
【請求項５】
（ａ）Ａが８〜９個の連続したグルタマートを含む配列を有し、かつ（ｂ）Ｂが９個の連続したアルギニンを含む配列を有する、請求項１記載の分子。
【請求項６】
ＡおよびＢがＤ−アミノ酸を含む、請求項１記載の分子。
【請求項７】
Ｘが切断可能なリンカーである、請求項１記載の分子。
【請求項８】
Ｘがペプチド結合を含む、請求項１記載の分子。
【請求項９】
Ｘが６−アミノヘキサノイル、５−アミノ−３−オキサペンタノイル、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１記載の分子。
【請求項１０】
Ｘがジスルフィド結合を含む、請求項１記載の分子。
【請求項１１】
Ｘが約６〜約３０原子の長さである、請求項１記載の分子。
【請求項１２】
ＸがｐＨ感受性リンカーである、請求項１記載の分子。
【請求項１３】
Ｘが細胞外空間で切断される、請求項１記載の分子。
【請求項１４】
Ｘがプロテアーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、またはそれらの組み合わせにより切断される、請求項１記載の分子。
【請求項１５】
Ｘが還元剤により切断される、請求項１記載の分子。
【請求項１６】
Ｘが、
ＰＬＧＬＡＧ、ｘが任意のアミノ酸であるＰＬＧＬＡｘ、ＰＬＧ−Ｃ（ｍｅ）−ＡＧ、ＥＳＰＡＹＹＴＡ、およびＲＬＱＬＫＬ、ＡＮＤ  ＲＬＱＬＫ（ＡＣ）
から選択される、請求項１記載の分子。
【請求項１７】
Ｍが、デンドリマー、デキストラン、ＰＥＧポリマー、またはアルブミンから選択される高分子キャリアである、請求項１記載の分子。
【請求項１８】
ＭがＰＥＧポリマーである、請求項１記載の分子。
【請求項１９】
Ｃが造影剤、治療薬、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１記載の分子。
【請求項２０】
Ｃが、蛍光成分、発光成分、リン光成分、蛍光消光成分、放射性成分、放射線不透過性成分、常磁性成分、コントラスト剤、またはそれらの組み合わせから選択される造影剤を含む、請求項１記載の分子。
【請求項２１】
Ｃが、化学療法剤、放射線増感剤、アポトーシスを調節する薬剤、および細胞周期を調節する薬剤、シグナル伝達カスケードを調節する薬剤、またはそれらの組み合わせから選択される治療薬を含む、請求項１記載の分子。
【請求項２２】
積荷がインドカルボシアニン染料である、請求項１記載の分子。
【請求項２３】
積荷がインドカルボシアニン染料、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＩＲＤＹＥ８００ＣＷ、ＡＬＥＸＡ６４７、またはそれらの組み合わせである、請求項１記載の分子。
【請求項２４】
積荷がＭＲＩコントラスト剤である、請求項１記載の分子。
【請求項２５】
積荷が［４，７，１０−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカ−１−イル］アセチルのＧｄ錯体である、請求項１記載の分子。
【請求項２６】
構造（Ａ−Ｘ−Ｂ）ｎ−Ｌの分子であって、
式中、
Ｌは、脂質または脂質コート治療薬または造影剤を含み；
Ａは、５〜９個の連続した酸性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり、該アミノ酸はアスパルタートおよびグルタマートから選択され；
Ｂは、５〜２０個の連続した塩基性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり；
Ｘは、リンカーであり；かつ
Ｎは、１〜２０の整数であり；かつ
ここでＬは、Ｂとの結合により（Ａ−Ｘ−Ｂ）成分に結合している、
前記分子。
【請求項２７】
Ａが５〜９個の連続したグルタマートを含む配列を有する、請求項２６記載の分子。
【請求項２８】
Ｂが５〜１２個の連続したアルギニンを含む配列を有する、請求項２６記載の分子。
【請求項２９】
Ｂが９個の連続したアルギニンを含む配列を有する、請求項２６記載の分子。
【請求項３０】
（ａ）Ａが８〜９個の連続したグルタマートを含む配列を有し、かつ（ｂ）Ｂが９個の連続したアルギニンを含む配列を有する、請求項２６記載の分子。
【請求項３１】
ＡおよびＢがＤ−アミノ酸を含む、請求項２６記載の分子。
【請求項３２】
Ｘが切断可能なリンカーである、請求項２６記載の分子。
【請求項３３】
Ｘがペプチド結合を含む、請求項２６記載の分子。
【請求項３４】
Ｘが６−アミノヘキサノイル、５−（アミノ）−３−オキサペンタノイル、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２６記載の分子。
【請求項３５】
Ｘがジスルフィド結合を含む、請求項２６記載の分子。
【請求項３６】
Ｘが約６〜約３０原子の長さである、請求項２６記載の分子。
【請求項３７】
ＸがｐＨ感受性リンカーである、請求項２６記載の分子。
【請求項３８】
Ｘが細胞外空間で切断される、請求項２６記載の分子。
【請求項３９】
Ｘがプロテアーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、またはそれらの組み合わせにより切断される、請求項２６記載の分子。
【請求項４０】
Ｘが還元剤により切断される、請求項２６記載の分子。
【請求項４１】
Ｘが、
ＰＬＧＬＡＧ、ｘが任意のアミノ酸であるＰＬＧＬＡｘ、ＰＬＧ−Ｃ（ｍｅ）−ＡＧ、ＥＳＰＡＹＹＴＡ、およびＲＬＱＬＫＬ、ＡＮＤ  ＲＬＱＬＫ（ＡＣ）
から選択される、請求項２６記載の分子。
【請求項４２】
脂質がペグ化されている、請求項２６記載の分子。
【請求項４３】
脂質がＰＥＧ（２Ｋ）−ホスファチジルエタノールアミンである、請求項２６記載の分子。
【請求項４４】
治療薬が疎水性である、請求項２６記載の分子。
【請求項４５】
治療薬が化学療法剤、放射線増感剤、アポトーシスを調節する薬剤、および細胞周期を調節する薬剤、シグナル伝達カスケードを調節する薬剤、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項２６記載の分子。
【請求項４６】
治療薬がドキソルビシンまたはパクリタキセルである、請求項２６記載の分子。
【請求項４７】
構造（Ａ−Ｘ−Ｂ）ｎ−Ｄの分子であって、
式中、
Ｄは、デンドリマーであり；
Ａは、５〜９個の連続した酸性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり、該アミノ酸はアスパルタートおよびグルタマートから選択され；
Ｂは、５〜２０個の連続した塩基性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり；
Ｘは、リンカーであり；かつ
ｎは、１〜２０の整数であり；かつ
ここでＤは、Ｂとの結合により（Ａ−Ｘ−Ｂ）成分に結合している、
前記分子。
【請求項４８】
Ｄが少なくとも１つの積荷成分を含む、請求項４７記載の分子。
【請求項４９】
少なくとも１つの積荷成分が造影剤、治療薬、またはそれらの組み合わせである、請求項４７記載の分子。
【請求項５０】
少なくとも１つの積荷成分が、蛍光成分、発光成分、リン光成分、蛍光消光成分、放射性成分、放射線不透過性成分、常磁性成分、コントラスト剤、またはそれらの組み合わせから選択される造影剤である、請求項４７記載の分子。
【請求項５１】
少なくとも１つの積荷成分が、化学療法剤、放射線増感剤、アポトーシスを調節する薬剤、および細胞周期を調節する薬剤、シグナル伝達カスケードを調節する薬剤、またはそれらの組み合わせから選択される治療薬である、請求項４７記載の分子。
【請求項５２】
少なくとも１つの積荷成分がインドカルボシアニン染料である、請求項４７記載の分子。
【請求項５３】
少なくとも１つの積荷成分がインドカルボシアニン染料、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ａｌｅｘａ６４７、ＩＲＤＹＥ８００ＣＷ、またはそれらの組み合わせである、請求項４７記載の分子。
【請求項５４】
少なくとも１つの積荷成分がＭＲＩコントラスト剤である、請求項４７記載の分子。
【請求項５５】
少なくとも１つの積荷成分が［４，７，１０−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカ−１−イル］アセチルのＧｄ錯体である、請求項４７記載の分子。
【請求項５６】
Ａが５〜９個の連続したグルタマートを含む配列を有する、請求項４７記載の分子。
【請求項５７】
Ｂが５〜１２個の連続したアルギニンを含む配列を有する、請求項４７記載の分子。
【請求項５８】
Ｂが９個の連続したアルギニンを含む配列を有する、請求項４７記載の分子。
【請求項５９】
（ａ）Ａが８〜９個の連続したグルタマートを含む配列を有し、かつ（ｂ）Ｂが９個の連続したアルギニンを含む配列を有する、請求項４７記載の分子。
【請求項６０】
ＡおよびＢがＤ−アミノ酸を含む、請求項４７記載の分子。
【請求項６１】
Ｘが切断可能なリンカーである、請求項４７記載の分子。
【請求項６２】
Ｘがペプチド結合を含む、請求項４７記載の分子。
【請求項６３】
Ｘが６−アミノヘキサノイル、５−（アミノ）−３−オキサペンタノイル、またはそれらの組み合わせを含む、請求項４７記載の分子。
【請求項６４】
Ｘがジスルフィド結合を含む、請求項４７記載の分子。
【請求項６５】
Ｘが約６〜約３０原子の長さである、請求項４７記載の分子。
【請求項６６】
ＸがｐＨ感受性リンカーである、請求項４７記載の分子。
【請求項６７】
Ｘが細胞外空間で切断される、請求項４７記載の分子。
【請求項６８】
Ｘがプロテアーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、またはそれらの組み合わせにより切断される、請求項４７記載の分子。
【請求項６９】
Ｘが還元剤により切断される、請求項４７記載の分子。
【請求項７０】
Ｘが、
ＰＬＧＬＡＧ、ｘが任意のアミノ酸であるＰＬＧＬＡｘ、ＰＬＧ−Ｃ（ｍｅ）−ＡＧ、ＥＳＰＡＹＹＴＡ、およびＲＬＱＬＫＬ、ＡＮＤ  ＲＬＱＬＫ（ＡＣ）
から選択される、請求項４７記載の分子。
【請求項７１】
構造（Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｃ）−Ｍの分子を患者に投与した後に腫瘍を画像化することを含む、患者の腫瘍を画像化する方法であって、
式中、
Ｃは、少なくとも１つの造影剤であり；
Ａは、５〜９個の連続した酸性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり、該アミノ酸はアスパルタートおよびグルタマートから選択され；
Ｂは、５〜２０個の連続した塩基性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり；
Ｘは、リンカーであり；かつ
Ｍは、高分子キャリアであり；
ここでＭは、ＡまたはＢに結合している、
前記方法。
【請求項７２】
腫瘍の画像化を、それを必要としている患者において行うための構造（Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｃ）−Ｍの分子の使用であって、
式中、
Ｃは、少なくとも１つの造影剤であり；
Ａは、５〜９個の連続した酸性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり、該アミノ酸はアスパルタートおよびグルタマートから選択され；
Ｂは、５〜２０個の連続した塩基性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり；
Ｘは、リンカーであり；かつ
Ｍは、高分子キャリアであり；
ここでＭは、ＡまたはＢに結合している、
前記使用。
【請求項７３】
構造（Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｃ）−Ｍの分子を患者に投与した後に外科的縁を画像化することを含む、患者の腫瘍切除または組織切除のための外科的縁を画像化する方法であって、
式中、
Ｃは、少なくとも１つの造影剤であり；
Ａは、５〜９個の連続した酸性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり、該アミノ酸はアスパルタートおよびグルタマートから選択され；
Ｂは、５〜２０個の連続した塩基性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり；
Ｘは、リンカーであり；かつ
Ｍは、高分子キャリアであり；
ここでＭは、ＡまたはＢに結合している、
前記方法。
【請求項７４】
腫瘍切除または組織切除のための外科的縁の画像化を、それを必要としている患者において行うための構造（Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｃ）−Ｍの分子の使用であって、
式中、
Ｃは、少なくとも１つの造影剤であり；
Ａは、５〜９個の連続した酸性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり、該アミノ酸はアスパルタートおよびグルタマートから選択され；
Ｂは、５〜２０個の連続した塩基性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり；
Ｘは、リンカーであり；かつ
Ｍは、高分子キャリアであり；
ここでＭは、ＡまたはＢに結合している、
前記使用。
【請求項７５】
構造（Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｃ）−Ｍの分子を患者に投与した後に腫瘍を除去することを含む、患者の腫瘍を除去する方法であって、
式中、
Ｃは、少なくとも１つの造影剤であり；
Ａは、５〜９個の連続した酸性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり、該アミノ酸はアスパルタートおよびグルタマートから選択され；
Ｂは、５〜２０個の連続した塩基性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり；
Ｘは、リンカーであり；かつ
Ｍは、高分子キャリアであり；かつ
ここでＭは、ＡまたはＢに結合している、
前記方法。
【請求項７６】
腫瘍の除去を、それを必要としている患者において行うための構造（Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｃ）−Ｍの分子の使用であって、
式中、
Ｃは、少なくとも１つの造影剤であり；
Ａは、５〜９個の連続した酸性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり、該アミノ酸はアスパルタートおよびグルタマートから選択され；
Ｂは、５〜２０個の連続した塩基性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり；
Ｘは、リンカーであり；かつ
Ｍは、高分子キャリアであり；
ここでＭは、ＡまたはＢに結合している、
前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２００９年７月１５日出願の米国仮出願第６１／２２５，８７２号の利益を主張する。この出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、米国防総省認可番号Ｗ８１ＸＷＨ−０５−１−０１８３、および米国立衛生研究所認可番号ＮＩＢＩＢ−Ｋ０８ＥＢ００８１２２に基づく政府の支援により行われた。政府は本発明に対し一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
細胞膜は細胞外部との境界を定め、細胞内に出入りする輸送を調節する。膜は、主に脂質およびタンパク質からできていて、疎水性の内側を取り囲む形で親水性の表面を提供し、物質は細胞に入る前にそこを通過しなければならない。多くの小さい親油性化合物は細胞膜を受動的に通過可能であるが、大抵の化合物、粒子および物質は、能動的機構を頼りにして生細胞中に入らなければならない。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書中の特定の実施形態では、（Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｃ）−Ｍの構造の分子が開示され、式中、
Ｃは、少なくとも１つの造影剤であり；
Ａは、５〜９個の連続した酸性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり、該アミノ酸はアスパルタートおよびグルタマートから選択され；
Ｂは、５〜２０個の連続した塩基性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり；
Ｘは、リンカーであり；かつ
Ｍは、高分子キャリアであり；
ここでＭは、ＡまたはＢに結合している。
【０００５】
一部の実施形態では、Ａは、５〜９個の連続したグルタマートを含む配列を有している。一部の実施形態では、Ｂは、５〜１２個の連続したアルギニンを含む配列を有する。一部の実施形態では、Ｂは、９個の連続したアルギニンを含む配列を有する。一部の実施形態では、（ａ）Ａは８〜９個の連続したグルタマートを含む配列を有し、（ｂ）Ｂは９個の連続したアルギニンを含む配列を有する。一部の実施形態では、ＡおよびＢは、Ｄ−アミノ酸を含む。一部の実施形態では、Ｘは、切断可能なリンカーである。一部の実施形態では、Ｘは、ペプチド結合を含む。一部の実施形態では、Ｘは、６−アミノヘキサノイル、５−アミノ−３−オキサペンタノイル、またはその組み合わせを含む。一部の実施形態では、Ｘは、ジスルフィド結合を含む。一部の実施形態では、Ｘは、約６〜約３０原子の長さである。一部の実施形態では、Ｘは、ｐＨ感受性リンカーである。一部の実施形態では、Ｘは、細胞外空間で切断される。一部の実施形態では、Ｘは、プロテアーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、またはこれらの組み合わせにより切断される。一部の実施形態では、Ｘは、還元剤により切断される。一部の実施形態では、Ｘは、ＰＬＧＬＡＧ、ＰＬＧＬＡｘ（ｘは任意のアミノ酸）、ＰＬＧ−Ｃ（ｍｅ）−ＡＧ、ＥＳＰＡＹＹＴＡ、およびＲＬＱＬＫＬ、ＡＮＤ  ＲＬＱＬＫ（ＡＣ）から選択される。一部の実施形態では、Ｍは、デンドリマー、デキストラン、ＰＥＧポリマー、またはアルブミンから選択される高分子キャリアである。一部の実施形態では、Ｍは、ＰＥＧポリマーである。一部の実施形態では、Ｃは、造影剤、治療薬、またはその組み合わせを含む。一部の実施形態では、Ｃは、蛍光成分、発光成分、リン光成分、蛍光消光成分、放射性成分、放射線不透過性成分、常磁性成分、コントラスト剤、またはその組み合わせから選択される造影剤を含む。一部の実施形態では、Ｃは、化学療法剤、放射線増感剤、アポトーシスを調節する薬剤、および細胞周期を調節する薬剤、シグナル伝達カスケードを調節する薬剤、またはこれらの組み合わせから選択される治療薬を含む。一部の実施形態では、積荷は、インドカルボシアニン染料である。一部の実施形態では、積荷は、インドカルボシアニン染料、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＩＲＤＹＥ８００ＣＷ、ＡＬＥＸＡ６４７、またはこれらの組み合わせである。一部の実施形態では、積荷は、ＭＲＩコントラスト剤である。一部の実施形態では、積荷は、［４，７，１０−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカ−１−イル］アセチルのＧｄ錯体である。
【０００６】
本明細書中の特定の実施形態では、（Ａ−Ｘ−Ｂ）ｎ−Ｌの構造の分子が開示され、式中、
Ｌは、脂質または脂質コート治療薬または造影剤を含み；
Ａは、５〜９個の連続した酸性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり、該アミノ酸は、アスパルタートおよびグルタマートから選択され；
Ｂは、５〜２０個の連続した塩基性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり；
Ｘは、リンカーであり；かつ
ｎは、１〜２０の整数であり；かつ
ここでＬは、Ｂとの結合により（Ａ−Ｘ−Ｂ）成分に結合している。
【０００７】
一部の実施形態では、Ａは、５〜９個の連続したグルタマートを含む配列を有する。一部の実施形態では、Ｂは、５〜１２個の連続したアルギニンを含む配列を有する。一部の実施形態では、Ｂは、９個の連続したアルギニンを含む配列を有する。一部の実施形態では、（ａ）Ａは、８〜９個の連続したグルタマートを含む配列を有し、（ｂ）Ｂは、９個の連続したアルギニンを含む配列を有する。一部の実施形態では、ＡおよびＢは、Ｄ−アミノ酸を含む。一部の実施形態では、Ｘは、切断可能なリンカーである。一部の実施形態では、Ｘは、ペプチド結合を含む。一部の実施形態では、Ｘは、６−アミノヘキサノイル、５−（アミノ）−３−オキサペンタン酸、またはこれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、Ｘは、ジスルフィド結合を含む。一部の実施形態では、Ｘは、約６〜約３０原子の長さである。一部の実施形態では、Ｘは、ｐＨ感受性リンカーである。一部の実施形態では、Ｘは、細胞外空間で切断される。一部の実施形態では、Ｘは、プロテアーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、またはこれらの組み合わせにより切断される。一部の実施形態では、Ｘは、還元剤により切断される。一部の実施形態では、Ｘは、ＰＬＧＬＡＧ、ＰＬＧＬＡｘ（ｘは任意のアミノ酸）、ＰＬＧ−Ｃ（ｍｅ）−ＡＧ、ＥＳＰＡＹＹＴＡ、およびＲＬＱＬＫＬ、ＡＮＤ  ＲＬＱＬＫ（ＡＣ）から選択される。一部の実施形態では、脂質は、ペグ化されている。一部の実施形態では、脂質は、ＰＥＧ（２Ｋ）−ホスファチジルエタノールアミンである。一部の実施形態では、治療薬は、疎水性である。一部の実施形態では、治療薬は、化学療法剤、放射線増感剤、アポトーシスを調節する薬剤、および細胞周期を調節する薬剤、シグナル伝達カスケードを調節する薬剤、またはこれらの組み合わせから選択される。一部の実施形態では、治療薬は、ドキソルビシンまたはパクリタキセルである。
【０００８】
本明細書中の特定の実施形態では、（Ａ−Ｘ−Ｂ）ｎ−Ｄの構造の分子が開示され、式中、
Ｄは、デンドリマーであり；
Ａは、５〜９個の連続した酸性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり、該アミノ酸は、アスパルタートおよびグルタマートから選択され；
Ｂは、５〜２０個の連続した塩基性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり；
Ｘは、リンカーであり；かつ
ｎは、１〜２０の整数であり；かつ
ここでＤは、Ｂとの結合により（Ａ−Ｘ−Ｂ）成分に結合している。
【０００９】
一部の実施形態では、Ｄは、少なくとも１つの積荷成分を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの積荷成分は造影剤、治療薬、またはこれらの組み合わせである。一部の実施形態では、少なくとも１つの積荷成分は、蛍光成分、発光成分、リン光成分、蛍光消光成分、放射性成分、放射線不透過性成分、常磁性成分、コントラスト剤、またはこれらの組み合わせから選択される造影剤である。一部の実施形態では、少なくとも１つの積荷成分は、化学療法剤、放射線増感剤、アポトーシスを調節する薬剤、および細胞周期を調節する薬剤、シグナル伝達カスケードを調節する薬剤、またはこれらの組み合わせから選択される治療薬である。一部の実施形態では、少なくとも１つの積荷成分は、インドカルボシアニン染料である。一部の実施形態では、少なくとも１つの積荷成分は、インドカルボシアニン染料、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＩＲＤＹＥ８００ＣＷ、ＡＬＥＸＡ６４７、またはこれらの組み合わせである。一部の実施形態では、少なくとも１つの積荷成分は、ＭＲＩコントラスト剤である。一部の実施形態では、少なくとも１つの積荷成分は、［４，７，１０−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカ−１−イル］アセチルのＧｄ錯体である。一部の実施形態では、Ａは、５〜９個の連続したグルタマートを含む配列を有する。一部の実施形態では、Ｂは、５〜１２個の連続したアルギニンを含む配列を有する。一部の実施形態では、Ｂは、９個の連続したアルギニンを含む配列を有する。一部の実施形態では、（ａ）Ａは、８〜９個の連続したグルタマートを含む配列を有し、かつ（ｂ）Ｂは、９個の連続したアルギニンを含む配列を有する。一部の実施形態では、ＡおよびＢは、Ｄ−アミノ酸を含む。一部の実施形態では、Ｘは、切断可能なリンカーである。一部の実施形態では、Ｘは、ペプチド結合を含む。一部の実施形態では、Ｘは、６−アミノヘキサノイル、５−（アミノ）−３−オキサペンタン酸、またはこれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、Ｘは、ジスルフィド結合を含む。一部の実施形態では、Ｘは、約６〜約３０原子の長さである。一部の実施形態では、Ｘは、ｐＨ感受性リンカーである。一部の実施形態では、Ｘは、細胞外空間で切断される。一部の実施形態では、Ｘは、プロテアーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、またはこれらの組み合わせにより切断される。一部の実施形態では、Ｘは、還元剤により切断される。一部の実施形態では、Ｘは、ＰＬＧＬＡＧ、ＰＬＧＬＡｘ（ｘは任意のアミノ酸）、ＰＬＧ−Ｃ（ｍｅ）−ＡＧ、ＥＳＰＡＹＹＴＡ、およびＲＬＱＬＫＬ、ＡＮＤ  ＲＬＱＬＫ（ＡＣ）から選択される。
【００１０】
本明細書中の特定の実施形態では、患者の腫瘍を画像化する方法が開示される。この方法は、（Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｃ）−Ｍの構造の分子を患者に投与した後に腫瘍を画像化することを含み、式中、
Ｃは、少なくとも１つの造影剤であり；
Ａは、５〜９個の連続した酸性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり、該アミノ酸は、アスパルタートおよびグルタマートから選択され；
Ｂは、５〜２０個の連続した塩基性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり；
Ｘは、リンカーであり；かつ
Ｍは、高分子キャリアであり；
ここでＭは、ＡまたはＢに結合している。
【００１１】
本明細書中の特定の実施形態では、腫瘍の画像化を、それを必要としている患者において行うための（Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｃ）−Ｍの構造の分子の使用が開示されており、式中、
Ｃは、少なくとも１つの造影剤であり；
Ａは、５〜９個の連続した酸性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり、該アミノ酸は、アスパルタートおよびグルタマートから選択され；
Ｂは、５〜２０個の連続した塩基性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり；
Ｘは、リンカーであり；かつ
Ｍは、高分子キャリアであり；
ここでＭは、ＡまたはＢに結合している。
【００１２】
本明細書中の特定の実施形態では、患者の腫瘍切除または組織切除のための外科的縁を画像化する方法が開示されており、（Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｃ）−Ｍの構造の分子を患者に投与した後に外科的縁を画像化することを含み、式中、
Ｃは、少なくとも１つの造影剤であり；
Ａは、５〜９個の連続した酸性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり、該アミノ酸は、アスパルタートおよびグルタマートから選択され；
Ｂは、５〜２０個の連続した塩基性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり；
Ｘは、リンカーであり；かつ
Ｍは、高分子キャリアであり；
ここでＭは、ＡまたはＢに結合している。
【００１３】
本明細書中の特定の実施形態では、腫瘍切除または組織切除のための外科的縁を画像化することを、それを必要としている患者において行うための（Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｃ）−Ｍ構造の分子の使用が開示され、式中、
Ｃは、少なくとも１つの造影剤であり；
Ａは、５〜９個の連続した酸性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり、該アミノ酸は、アスパルタートおよびグルタマートから選択され；
Ｂは、５〜２０個の連続した塩基性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり；
Ｘは、リンカーであり；かつ
Ｍは、高分子キャリアであり；
ここでＭは、ＡまたはＢに結合している。
【００１４】
本明細書中の特定の実施形態では、患者の腫瘍を除去する方法が開示され、（Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｃ）−Ｍの構造の分子を患者に投与した後に腫瘍を除去することを含み、式中、
Ｃは、少なくとも１つの造影剤であり；
Ａは、５〜９個の連続した酸性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり、該アミノ酸は、アスパルタートおよびグルタマートから選択され；
Ｂは、５〜２０個の連続した塩基性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり；
Ｘは、リンカーであり；かつ
Ｍは、高分子キャリアであり；
ここでＭは、ＡまたはＢに結合している。
【００１５】
本明細書中の特定の実施形態では、腫瘍の除去を、それを必要としている患者において行うための（Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｃ）−Ｍの構造の分子の使用が開示されており、式中、
Ｃは、少なくとも１つの造影剤であり；
Ａは、５〜９個の連続した酸性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり、該アミノ酸は、アスパルタートおよびグルタマートから選択され；
Ｂは、５〜２０個の連続した塩基性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり；
Ｘは、リンカーであり；かつ
Ｍは、高分子キャリアであり；
ここでＭは、ＡまたはＢに結合している。
【００１６】
本発明の新規性は添付の特許請求の範囲で詳細に説明される。本発明の原理とそれに付随する図を使った下記の実施形態の詳細な説明により、本発明の特色と利点に関し、より良き理解が得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】アルブミン反応性選択的輸送分子は、天然アルブミンと強固な反応を作り出し、また、選択的輸送分子はＭＭＰ９により切断されうる。（Ａ）は、マウスまたはヒトのアルブミンのＣ３４と反応可能なチオール反応性基を有する遊離ペプチド選択的輸送分子の模式図であり、（Ｂ）は、Ｃ末端マレイミド基、次にｅ９−（ＭＭＰ切断基質）−ｒ９ｃ（ペイロード）配列を有するアルブミン反応性選択的輸送分子の化学構造であり、この場合、ｏＰＬＧ（Ｃｍｅ）ＡＧが基質で、Ｃｙ５が近赤外タグである。（Ｃ）アルブミン反応性ペプチドは、水性の精製マウス血清アルブミンおよび新規凍結マウス血漿の両方に１時間で反応する。血漿は、１５：１のアルブミン対ペプチド（２ｎｍｏｌのペプチドを有する５０μＬの４０ｍｇ／ｍＬ  ＭＳＡ）比率によりほぼ完全に反応した。（Ｄ）反応した選択的輸送分子は、４時間未満の時間でアルブミンからほぼ完全に切断される。ゲルは、５０ｎＭ  ＭＭＰ−９酵素で２０分および４時間処理した場合の、アルブミンが結合した非切断ペプチド、および切断されたペプチドを示す。
【図２】アルブミン反応性ペプチドは、ＨＴ１０８０担腫瘍マウスおよびポリオーマ腫瘍で顕著なコントラストを作り出す。（Ａ）ＨＴ１０８０マウスに、切断可能および切断不可能選択的輸送分子と共に３ｎｍｏｌのアルブミン反応性ペプチドを同じ日にＩＶ注入した。マウスを画像化し２４時間後に屠殺した。皮膚の剥離前および皮膚の剥離後の各ペプチド当たり２匹のマウスの蛍光画像および腫瘍を矢印で指して示す。（Ｂ）上記マウスの腫瘍および筋肉をホモジナイズし、上清をゲル濾過アッセイで測定後、腫瘍中の切断および非切断アルブミン結合ペプチドの両方の存在が認められた。（Ｃ）ＨＴ１０８０マウスに、同用量の遊離ペプチドを注入し、取り込みの２４時間目に画像化したが、アルブミン反応性ペプチドに比べてコントラストは極わずかであった（白色矢印が腫瘍を指している）。（Ｄ）また、アルブミン反応性ペプチドをポリオーマミドルＴ自然発生腫瘍に注入することもでき、切断可能および切断不可能ペプチドの間で差異が認められる。
【図３】ＨＴ１０８０腫瘍の組織像は、ほとんどの取り込みは、腫瘍ストローマ界面で起こったことを示している。（Ａ）ＨＴ１０８０腫瘍の低および高倍率の蛍光組織像およびＨ＆Ｅ染色像で、切断可能なペプチドでは多くの取り込みが腫瘍ストローマ界面の腫瘍莢膜近傍にあることを示す。（Ｂ）切断不可能なペプチドは、切断可能な腫瘍に比べ取り込みが少なかった。
【図４】アルブミン反応性選択的輸送分子では、４Ｔ１．２マウス乳房腺癌移植組織で大きなコントラストが得られた。６匹のマウスに３ｎｍｏｌのアルブミン反応性選択的輸送分子を注入した。３匹のマウスは、切断可能なペプチドで、３匹は切断不可能ペプチドとした。マウスを２４時間後屠殺し、皮膚を除去し、マウスを画像化した。肺への転移を検出するため、１セットのマウスは非常に大きな腫瘍に成長させた。
【図５】４Ｔ１．２マウスにおけるアルブミン反応性選択的輸送分子の腫瘍組織像。（Ａ）は、低および高倍率の４Ｔ１．２腫瘍の蛍光組織像およびＨ＆Ｅ像で、切断可能なアルブミン反応性ペプチドの腫瘍実質での大きな取り込みおよび間質性侵入領域でのさらに大きな取り込みを示す。壊死領域では、前述の遊離ペプチド注入でみられたような大きな取り込みはなかった。（Ｂ）は、取り込みの少ない、切断不可能ペプチドを注入したマウスからの腫瘍の蛍光像およびＨ＆Ｅ像を示す。
【図６】アルブミン反応性選択的輸送分子は、特異的な様式で肺転移に取り込まれる。（Ａ）大きな４Ｔ１．２腫瘍を有するマウスの肺の全体像で、肺全体にわたり明るい蛍光小斑点が認められる。シグナルは、切断不可能ペプチド注入に比べ、切断可能なペプチドを注入したマウスの小斑点および実質中の方が明るい。（Ｂ）肺の蛍光組織像およびＨ＆Ｅ像により転移の存在が確認される。（Ｃ）切断可能な選択的輸送分子ペプチドで染色された小さい転移。
【図７】３つの主要タイプの選択的輸送分子の比較で、アルブミン反応性選択的輸送分子は、他の構成に対して改善とまではいかないまでも、同等であることを示す。ここに示される３匹の４Ｔ１．２担腫瘍マウスを用い、３つの異なる選択的輸送分子デザインを試験し、どれが最良のコントラストを与え、背景組織への特異的取り込みを低減させるかを判定した。左パネルは、最適コントラストになる注入６時間後の遊離ペプチド、次に中央パネルは４８時間後のＰＡＭＡＭデンドリマー、さらに右パネルは、注入２４時間後のアルブミン反応性ペプチドを示す。
【図８】選択的輸送分子の血漿に対する前反応により半減期および腫瘍取り込みが大きく増加する。（Ａ）４Ｔ１．２担腫瘍マウスへの注入前の選択的輸送分子の新鮮凍結血漿との３０分間の前反応により、前反応していない反応ペプチドに比べて、注入の３、２４および４８時間後の血中濃度が大きく増加した。これらの蛍光像は、前反応なしのアルブミン反応性選択的輸送分子、および血漿と前反応させた選択的輸送分子をそれぞれ有する２匹のマウスのＩＶ注入後の上記の異なる時点で描画した毛細血管を示す。（Ｂ）前反応なしと前反応ありのアルブミン反応性選択的輸送分子を有する４Ｔ１．２腫瘍の注入４８時間後の蛍光像。２匹のマウスに対しそれぞれ同時に注入処置をした。（Ｃ）Ｃｙ５−マレイミド対照は、選択的輸送分子ペプチドよりも腫瘍中の蓄積が少ない。画像は輝度を５倍にした。
【図９】１１１Ｉｎ標識付けしたアルブミン反応性選択的輸送分子を使って臨床的コントラストが達成できる。（Ａ）０．３ｎｍｏｌの切断可能および切断不可能アルブミン反応性選択的輸送分子を注入したマウスの平面ガンマ画像。黒矢印は、注入４８時間後、腫瘍が良いコントラストを呈することを示す。青矢印は、ペプチドが腎臓を通って除去される場合、多くのペプチドは保持され、ゆっくり除去されることを示す。（Ｂ）注入４８時間後に画像化した、１１１ＩｎおよびＣｙ５で二重標識したアルブミン結合ペプチドからの腫瘍の蛍光画像。腫瘍蛍光は、標準光学的用量よりも１０倍低い用量で検出可能であった。（Ｃ）％ＩＤ／ｇで表した複数の組織の体内分布で、切断可能および切断不可能ペプチドの間のわずかな差を示す。さらに大きなペプチドの分布が、肝臓および腎臓でのみ認められた。（Ｄ）以前の調査で試験したデンドリマーベースの選択的輸送分子に比べ、アルブミン反応性選択的輸送分子で組織のより大きなコントラストが認められたことを示す表。
【図１０】遊離ペプチド薬剤は、重大な毒性を有し、ほとんど治療の活性は持たなかった。（Ａ）遊離ペプチド選択的輸送分子ベース薬剤結合の模式図。蛋白質分解時にポリアルギニン−薬剤が放出され、細胞による取り込みが可能になり、治療活性が付与される。（Ｂ）Ｓｕｃ−ｅ８−ｘＰＬＧＬＡＧ−ｒ９−ｃ（ｓｓ−ポドフィロトキシン）（選択的輸送分子−Ｐｏｄｏ）の構造。（Ｃ）ＨＴ１０８０異種移植組織を、選択的輸送分子−Ｐｏｄｏ薬剤共役体および賦形剤、選択的輸送分子、ならびにＰｏｄｏ対照のＩＰ注入により１０μｍｏｌ／ｋｇで３回処置した（矢印＝注入日）。遊離ペプチドＰｏｄｏの治療活性は選択的輸送分子治療の毒性と関連し、３回投与後重量減少および瀕死が発生した。Ｐｏｄｏ単独では、治療活性も毒性もなかった。（Ｄ）実験期間を通してのマウス体重により、選択的輸送分子および選択的輸送分子−Ｐｏｄｏ治療が、体重の減少から判断される重大な毒性につながることが示されている。
【図１１】ドキソルビシン共役化デンドリマーの構造と品質管理。（Ａ）抗腫瘍活性に対し選別されたデンドリマーを含む４つのドキソルビシンの構造。チオエーテルは安定なチオール共役体である。芳香族化合物、尿素、およびＰｅｇは、試験した種々のドキソルビシン酸不安定性ヒドラゾンリンカーである。（Ｂ）ｐＨ７．４およびｐＨ５で１８時間処理した種々のデンドリマーのゲル濾過アッセイにより、どのリンカーが最も酸反応性が大きいかを判定する。チオエーテルは、遊離ドキソルビシン混入がほとんど検出できず、かなりデンドリマーに付着した。芳香族化合物と尿素ヒドラゾンリンカーは、それほど酸反応性ではなく、多くの遊離薬剤混入物があった。Ｐｅｇリンカーは、ずっと好ましい加水分解能力を有していた。
【図１２】尿素およびＰｅｇドキソルビシンヒドラゾンリンカーを試験した動物では画像化が可能となり、治療活性が生じた。（Ａ）ドキソルビシン、尿素ＰＡＭＡＭヒドラゾン−Ｄｏｘ、ＰｅｇＰＡＭＡＭヒドラゾン−Ｄｏｘ、およびＰＢＳ対照で治療したマウスの画像。動物を４６７／４７励起光で励起し、スペクトラムキューブ（ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｃｕｂｅ）データを集めた。ドキソルビシン蛍光を画像からデコンボリュートし、自発蛍光に重ね合わせた。（Ｂ）両セットのマウスの腫瘍を、切開後のマウスと同様に画像化した。デコンボリュートした蛍光画像を、重ね合わせの画像の下にグレースケールで示す。４つの治療群は、（Ａ）の場合と同じ順番で、実験からの両セットの腫瘍を示す。下のパネルは、明視野像で、１つのセットの半分をカットした腫瘍をスペクトル的にデコンボリュートした画像で、Ｐｅｇ  ｄｏｘデンドリマーの重要な壊死性コアを示す。（Ｃ）１日１回注入を行う尿素およびＰｅｇリンカー試験実験の全部で８匹のマウスの腫瘍成長曲線。（Ｄ）体重実験の継続期間を通して大きな体重の変化はなかった。
【図１３】ドキソルビシンデンドリマー結合選択的輸送分子の品質管理とマウス実験。（Ａ）多くの大分子量凝集体および遊離ドキソルビシンがこの精製法により除去されたことを示すカラム濾過前後の再懸濁ドキソルビシンデンドリマーのゲル。（Ｂ）酸性条件下でドキソルビシンの加水分解される能力を示す合成された３つのデンドリマーのゲル。ゲルは、Ｐｅｇ８でキャップした選択的輸送分子Ｇ５ＰＡＭＡＭデンドリマー、Ｐｅｇ４−ＯＨでキャップした選択的輸送分子デンドリマー、および選択的輸送分子を持たないＰｅｇ８でキャップしたドキソルビシンデンドリマーを示している。（Ｃ）１ｍｇ／ｋｇのデンドリマー含有選択的輸送分子を注入したＨＴ１０８０異種移植マウスの腫瘍成長曲線で、ドキソルビシン単独およびドキソルビシン被覆デンドリマーの低用量投与では腫瘍成長を大きく阻害するには不十分であることを示している。
【図１４】ｐＤｏｘ結合Ｃｙ５デンドリマーの検証。（Ａ）中性ｐＨまたはｐＨ５で一晩処理したｐＤｏｘＣｙ５ＰＡＭＡＭデンドリマーのＨＰＬＣ結果。ｐＤｏｘおよびＣｙ５標識付けしたデンドリマーそれぞれの特定に有用な４７０〜４９０ｎｍおよび６４５〜６５５ｎｍ両方の吸光度出力を示す。ｐＨ５でインキュベーション後、４７０〜４９０チャンネルにｐＤｏｘであることが確実な新しいピークが現れた。（Ｂ）は、ｐＤｏｘ結合および加水分解デンドリマーの高感度蛍光検出および定量に使った異なるＨＰＬＣに対するＣｙ５吸光度およびｐＤｏｘ蛍光ＨＰＬＣ結果を示す。（Ｃ）ｐＤｏｘ較正用標準の複数の分解ピークがあることがわかった。
【図１５】ｐＤｏｘデンドリマーは、腫瘍成長を遅延させＣｙ５デンドリマー蛍光は注入１１日後に検出可能である。（Ａ）は、ＨＴ１０８０異種移植組織の腫瘍成長曲線で、より高用量のｐＤｏｘデンドリマーは、賦形剤およびより低用量のものより腫瘍成長を遅延させたことを示している。（Ｂ）ｐＤｏｘデンドリマー治療マウスの屠殺および解剖時に蛍光像を採取し、１１日後でも実質的な量のデンドリマーがマウス全体に残されていたことを示す。
【図１６】選択的輸送分子を合成して、パクリタキセルのアルブミン懸濁液をコートすることが可能である。（Ａ）は、アブラキサンのＡｂｒａｘｉｓウエブサイトから引用した模式図で、１３０ｎｍアルブミン外皮でコートして懸濁したコロイド状パクリタキセルおよびそのナノ粒子の透過電子顕微鏡を示す。ここで、選択的輸送分子をアブラキサンの表面に対して反応させることが可能なことが示されており、これは、腫瘍に対するアブラキサンの標的化を強化するのに使用可能であると思われる。（Ｂ）アルブミンに対して１および１０％モルパーセントの選択的輸送分子を、３０分の再懸濁の間に、アブラキサン表面の選択的輸送分子の８４％までと反応させることができることを示している。この強力な反応は、より長いインキュベーション時間または超音波処理とは無関係である。（Ｃ）アブラキサンと反応した時点で、選択的輸送分子はＭＭＰ−９酵素で治療時にナノ粒子から切断可能で、１時間以内にほぼ完了する。（Ｄ）は、選択的輸送分子ペプチドの有無の場合の再懸濁したアブラキサンは、単分散であって、１３０ｎｍのｚ−平均直径を有することを確認する、動的光散乱の結果である。
【図１７】ドキソルビシン含有ペグ化リポソームは選択的輸送分子でコート可能である。（Ａ）選択的輸送分子でコートされたリポソームの模式図。ＭＭＰ酵素による切断によりＣＰＰ特性の回復および細胞の取り込み強化がなされる。（Ｂ）製剤の間にペグ化リポソームへの組み込み用に合成したＤＳＰＥ選択的輸送分子−Ｃｙ５の化学構造。（Ｃ）ドキソルビシン含有の選択的輸送分子でコートしたペグ化リポソームの代表的なサイズと容量％の関係の動的光散乱プロット。これは、リポソームがｚ−平均サイズ１３０ｎｍを有する単分散であることを示している。（Ｄ）選択的輸送分子でコートされるドキソルビシンリポソームは、ＭＭＰ−９とのインキュベーション時にリポソーム表面から切断できる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ＤＳＰＥ−選択的輸送分子Ｃｙ５から多くのＣｙ５−ｅ９が切断されたことが確認された。
【図１８】リポソーム上の表面選択的輸送分子および培養中の取り込みの間では線形関係があるが、インビボではそれが無い。（Ａ）ＨＴ１０８０ヒト線維肉腫細胞を選択的輸送分子コートペグ化リポソーム中で５０μＭのドキソルビシンと共に３０分間インキュベートし、次いで３回洗浄した後、最初の治療１時間後に画像化した。共焦点顕微鏡により、より多くのモル％の選択的輸送分子含有ペグ化脂質で、より多くのドキソルビシン（緑）の細胞への取り込みあることが示された。０．３％および選択的輸送分子リポソーム無しの場合は、画像の再設定なしでは検出困難であった（挿入図）。（Ｂ）０．３、１、および３モル％の選択的輸送分子でコートされたリポソームをＨＴ１０８０担腫瘍異種移植マウスにドキソルビシンの３ｍｇ／ｋｇ当量をＩＶ注入した。この治療を、賦形剤対照（３００ｍＭショ糖緩衝液）および非標的化ドキソルビシンリポソームと比較した。０．３％選択的輸送分子は、１０〜１７日目からドキソルビシンリポソームに比べて統計的に有意であった（ｐ値＜０．０２、ｔ検定）。それぞれ２つの腫瘍を持つ４匹のマウスを群毎に処置した（３％選択的輸送分子の３匹のマウスを除く）。
【図１９】凝集は治療効果を無くさせる。（Ａ）動的光散乱結果により、リポソームの調製の際、遠心分離で濃縮後に凝集したことが示された。この凝集は、０．２μｍフィルターを通過後も存在した。左パネルは、０．３モル％ドキソルビシンリポソーム調製物の微小凝集を示し、右パネルは、新しい非濃縮調製物を示す。（Ｂ）非凝集調製物と一対一で試験した際、凝集したリポソームは動物で治療効果が無かった。それぞれ２つの腫瘍を有する４匹のマウスに、３ｍｇ／ｋｇの０．３％新しい調製物、非標的化ドキソルビシンリポソーム、および賦形剤単独を注入した。
【図２０】より少ない選択的輸送分子で、より大きな治療効果が得られる；切断不可能対照ペプチドは、切断可能なペプチドほど効果的ではない。（Ａ）治療群当たり８匹の１つの腫瘍保持ＨＴ１０８０マウスに、３ｍｇ／ｋｇドキソルビシン当量を８および２２日目に注入した。１リポソーム当たり約９または２７選択的輸送分子として、０．１および０．３モル％ペプチドを標識付けした。このデータは、選択的輸送分子の数を減らすと、腫瘍成長曲線に関する治療効果がさらに増すことを示している。（Ｂ）チャートは、１８、２１、２５、および２９日目にｔ検定により決定したｐ値を示す。それぞれの時点で、９選択的輸送分子および非標的化対照の間で統計的有意性があり、腫瘍容量で４倍にもなる差異があった。このデータは、ペプチドの０．１および０．３モル％の非標的化リポソームに対する比較、ならびに切断可能タイプ対切断不可能タイプの比較を示す。（Ｃ）全治療群は実験の終わりまでに重量減があった。
【図２１】血液中半減期およびキャリアサイズの間の関係。３０ｋＤ以上の分子における変動は、キャリアの形による（線状ｖｓ球状）。
【図２２】リンパ節取り込みは腫瘍および切断の両方に依存する。デキストラン切断可能選択的輸送分子の注入４８時間後における担腫瘍マウス由来（Ａ）および非担腫瘍マウス（Ｂ）の暴露リンパ節の全体像を示す。このような構造の素性は、凍結切片断面組織像（Ｃ）および（Ｄ）により確認された（スケールバー＝１ｍｍ）。（Ｅ）および（Ｆ）は、切断可能（Ｅ）および切断不可能（Ｆ）デキストラン結合ペプチドを注入後４８時間後のマウス由来のリンパ節である（スケールバー＝２００μｍ）。
【図２３】リンパ節染色はＦ４／８０産生貪食細胞に限定される。（Ａ）は、リンパ節のｃｙ５像の拡大を示す。（Ｂ）は、Ｆ４／８０に対するＦＩＴＣ−標識抗体で染色した連続切片を示す。（Ｃ）は、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した連続切片を示す。挿入図は、明るく染色した領域の細胞形態を示す（スケールバー＝２００μｍ）。
【図２４】ＰＥＧ−１２ｋＤに結合したペプチド。（Ａ）は、４．８ｎｍｏｌの切断可能ＰＥＧ−１２に結合したペプチドを注入２時間後のマウスを示す。挿入図は、注入構築物の純粋さを証明する分析ゲルである。（Ｂ）は、切断不可能ｄ−アミノ酸ペプチドに対する同様の結果である。（Ｃ）は、時間に対する指示領域の相対強度を示す。
【図２５】アルブミンに結合したペプチド。（Ａ）分析ゲル結果で、注入液の純度および４．５ｎｍｏｌのアルブミンに結合した切断可能ペプチドを注入後３６時間のマウスを示す。（Ｂ）は、切断不可能ｄ−アミノ酸ペプチドに関して同様の結果を示す。（Ｃ）は、時間に対する示される領域の正規化強度を示す。
【図２６】７０ｋＤデキストランに結合したペプチド。（Ａ）は、６ｎｍｏｌの７０ｋＤデキストランに結合した切断可能ペプチドを注入３６時間後のマウスを示す。注入液の分析ゲルを各マウスの左側に示す。暗黒色矢印は、所望の生成物と思われるものを指している；明るい色の矢印は、遊離ペプチドを指している。（Ｂ）は、切断不可能ｄ−アミノ酸ペプチドに関して同様の内容を示している。（Ｃ）は、時間に対する示される領域の正規化強度を示す。
【図２７】ＰＡＭＡＭデンドリマーに結合したペプチド。（Ａ）は、４．５ｎｍｏｌの第５世代サクシニルキャップＰＡＭＡＭデンドリマーに結合した切断可能な（ＰＬＧＬＡＸ）ペプチドを注入３６時間後のマウスを示す。注入液の分析ゲルを、各マウスの左側に示す。暗黒色矢印は、所望の生成物を示す；明るい色の矢印は、遊離ペプチドを指している。（Ｂ）は、類似のＰＥＧ−４キャップデンドリマーに関して同様の内容を示す。（Ｃ）は、時間に対する示される領域の正規化強度を示す。最初の画像はオレンジフィルターで撮影し、２番目のものは赤色フィルターで撮影したことに注意されたい。
【図２８】より急速に切断する配列は、ＰＥＧ−４でキャップされた選択的輸送分子の取り込みを増加させる。（Ａ）注入液純度、および３ｎｍｏｌの第５世代ＰＥＧ−４キャップＰＡＭＡＭデンドリマーに結合した切断可能（ＰＬＧ（ＭｅＣ）ＡＧ）ペプチドを注入４８時間後のマウスを示す分析ゲルである。暗黒色矢印は、所望の生成物を示す；明るい色の矢印は、遊離ペプチドを指している。（Ｂ）は、ＰＬＧＬＡＧを切断配列として使った類似の構築物に関して同様の内容を示す。（Ｃ）は、時間に対する示される領域の正規化強度を示す。
【図２９】選択的輸送分子が結合したデキストランの注入後の動物のＴ１−ＭＲＩ画像化。（Ａ）は、注入前および４８時間後のＰｙＭＴマウスの比較を示す。腫瘍対ファントム比率の比較に有意差がないことに注意されたい。（Ｂ）は、注入前および４８時間後の野生型マウスの比較を示す。（Ｃ）は、非注入野生型およびＰｙＭＴ注入マウスの推定頚部リンパ節領域の緩和速度を示す。
【図３０】ＰＡＭＡＭ構築物用純度ゲル。グリシジルおよびＰＥＧ−１６構築物は、この方法を使った動物への注入用としては許容できないと思われる。
【図３１】スルホベンゾイルキャップ化合物を注入したマウスのインビボ経時変化。挿入図は、採取した器官の蛍光像を示す。
【図３２】アセチルおよびサクシニルでキャップしたデンドリマーを注入したマウスのインビボ像。（Ａ）は、アセチルキャップデンドリマー注入直後、２４時間後および４８時間後のマウスの像を示す。蛍光解剖像を示し、Ｔ（腫瘍）、Ｌ（肝臓）およびＫ（腎臓）の符号が付されている。（Ｂ）は、胸郭上に描画された腫瘍およびバックグラウンド領域の相対強度を示す。比較を容易にするため、最高のバックグラウンド値を１に正規化した。（Ｃ）と（Ｄ）は、サクシニルキャップ化合物に対して、類似のデータを示す。
【図３３】ＰＥＧ−２、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−８およびＰＥＧ−１２でキャップされたデンドリマーを注入したマウスの代表的インビボ像。（Ａ）は、ＰＥＧ−２でキャップされたデンドリマー注入直後、２４時間後および４８時間後のマウスの像を示す。蛍光解剖像を示し、Ｔ（腫瘍）、Ｌ（肝臓）およびＫ（腎臓）の符号が付されている。（Ｂ）は、胸郭上に描画された腫瘍およびバックグラウンド領域の相対強度を示す。比較を容易にするため、最高のバックグラウンド値を１に正規化した。（Ｃ）と（Ｄ）は、ＰＥＧ−４でキャップされた化合物に対して、類似のデータを、（Ｅ）と（Ｆ）は、ＰＥＧ−８でキャップされた化合物に対して、類似のデータを示す。ＰＥＧ−１２はＰＥＧ−８と類似の挙動をした。
【図３４】示されたキャップを有するデンドリマーに対する器官組織像。
【図３５】デンドリマーナノ粒子に結合した選択的輸送分子は、腫瘍中への４８時間後もそのままとどまっている局所的取り込みを引き起こす。（Ａ）は新規分子の模式図である。選択的輸送分子は、ポリアニオンを介して結合される。切断時、ポリアニオンが放出され、残された高帯電分子が細胞に付着し、侵入する。（Ｂ〜Ｄ）は、１０ｎｍｏｌのｃｙ５を注入４８時間後の像を示す。（Ｅ）は、デンドリマーナノ粒子に結合した切断可能および全ｄ−アミノ酸選択的輸送分子を注入した動物由来のスキンバリュー（ｓｋｉｎ  ｖａｌｕｅ）を、切断可能遊離ペプチドを注入した動物のものと比較したコマ撮りデータを示す。（Ｆ）は、３つのペプチド由来の腫瘍、肝臓、腎臓および筋肉を比較して、標準化取り込み値を示す。遊離ペプチドデータは、６時間後のＰＬＧ−Ｃ（ｍｅ）−ＡＧペプチド由来である（ＭｅＣ＝Ｓ−メチルシステイン）。
【図３６】プロテアーゼ依存性取り込みにより、ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴマウスに切断可能プローブを注入後の残留腫瘍が強調される。（Ａ）は、プローブ注入および皮膚除去後、４８時間のＰｙＭＴマウスを示す。（Ｂ）は、腫瘍の全体除去後の同じマウスを示す。胸筋肉上に腫瘍片が残っている。（Ｃ）は、胸筋肉除去後のマウスを示し、挿入図は筋肉である。小片の残留腫瘍が存在する。（Ｄ）は、腫瘍と胸筋肉の間の界面で強いプロテアーゼ活性化バンドを示す腫瘍片の断面を示す。（Ｅ）は、ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴモデルの切断可能で全ｄ−アミノ酸プローブに対する標準化した取り込み値を、ＰＡＭＡＭデンドリマー単独に比較して示す。
【図３７】デンドリマーナノ粒子コントラスト剤に結合した選択的輸送分子は輝度が大きく、匹敵する脱消光剤よりも大きなコントラストを示す。（Ａ）および（Ｂ）は、選択的輸送分子弾（Ａ）またはＰｒｏｓｅｎｓｅ、細胞内のカテプシンにより活性化された脱消光プローブ（Ｂ）のいずれかを注入した代表的マウスを示す。各マウスは、最良のコントラストになると思われる時間で屠殺された（メーカーのインストラクションに従って、選択的輸送分子は４８時間、Ｐｒｏｓｅｎｓｅでは、２４時間）。（Ｅ〜Ｇ）および（Ｈ〜Ｊ）は、それぞれ（Ａ）および（Ｂ）のマウス由来肺転移全体像および凍結切片組織像を示す（スケールバー＝２００μｍ）。（Ｋ）および（Ｌ）は、それぞれ（Ｅ）および（Ｈ）で示された肺転移の定量的取り込みデータおよび蛍光比を示す。
【図３８】ガドリニウム含有のデンドリマーナノ粒子に結合した選択的輸送分子は、Ｔ１  ＭＲＩによるプロテアーゼ活性の可視化を可能とする。（Ａ）プローブ無し（左）、切断可能プローブ（ＰＬＧ−Ｃ（ｍｅ）−ＡＧ：中央）または全ｄ−アミノ酸対照プローブ（ｐｌｇ−（ｍｅＣ）ａｇ：右）を注入４８時間後のＨＴ−１０８０異種移植組織を有する動物の画像。（Ｂ）は、注入を受けなかったマウスの値に比較した、切断可能および切断不可能プローブの強度とＴ１測定値の差を示す。Ｔ１および緩和能を水ファントム強度に正規化しスキャン間の変動を考慮に入れた。（Ｃ）は、切断可能なまたは全ｄ−アミノ酸対照プローブを注入した動物由来の組織中のガドリニウムの標準化取り込み値を示す。ガドリニウムはＩＣＰＭＳを使って定量化した。
【図３９】高い局所的ガドリニウム取り込みのある腫瘍領域は、マクロファージ媒介による筋肉への腫瘍侵入と相互に関係がある。（Ａ）は、Ｔ１強調ＭＲ像で、周辺筋肉への腫瘍の浸潤を示す。アキシャル、コロナルおよびサジタルスライスを示す。（Ｂ）は、対応する光学像を示す。（Ｃ〜Ｆ）：（Ｃ）は、ｃｙ５蛍光を調べるために画像化した同じ腫瘍の組織切片を示す。（Ｄ）は、同じスライスのインサイチュー酵素電気泳動を示す。スケールバーは２００μｍを示す。（Ｅ）は、さらに高い出力でインサイチュー酵素電気泳動を重ね合わせたｃｙ５領域を示す。（Ｆ）は、素性を確認する目的のための（Ｅ）に示す領域のＨ／Ｅ画像を示す。
【図４０】Ｔ１  ＭＲＩを使った肺のプローブの可視化。高輝度細胞の素性は未確認である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
選択的輸送分子は、治療薬および／または造影剤の特定細胞および／または組織を標的にした送達を可能にする。選択的輸送分子は、（ａ）分子輸送配列（Ｂ部）、（ｂ）Ｂ部に結合した積荷（ＣまたはＤ部）および（ｃ）細胞への取り込みを抑制または防ぐのに有効である酸性のＡ部を含む。Ｂ部からＡ部の分離を可能にするリンカーＸの切断は、Ｂ部および付随する積荷を細胞中に取り込ませるのに有効である。しかし、選択的輸送分子は、短い血漿中半減期、広範囲への分布、および特異的および非特異的取り込みを有する複数の組織からの遅い洗い流しを伴った急速な薬物動態学的送達にさらされる可能性がある。このように、インビボ循環の増加および血管外漏出選択性の調節がなされた選択的輸送分子に対するニーズが存在する。
【００１９】
本明細書中の特定の実施形態では、インビボで循環性が増加した選択的輸送分子が開示される。
【００２０】
一部の実施形態では、本明細書で開示の選択的輸送分子は、式（Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｃ）−Ｍを有し、Ｃは、積荷成分；Ａは、５〜９個の連続した酸性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり、該アミノ酸はアスパルタートおよびグルタマートから選択され；Ｂは、５〜２０個の連続した塩基性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり；Ｘは、リンカーであり；かつＭは、高分子キャリアである。
【００２１】
一部の実施形態では、本明細書で開示の選択的輸送分子は、式（Ａ−Ｘ−Ｂ）−Ｄを有し、Ｃは、積荷成分；Ａは、５〜９個の連続した酸性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり、該アミノ酸はアスパルタートおよびグルタマートから選択され；Ｂは、５〜２０個の連続した塩基性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり；Ｘは、リンカーであり；Ｄは、デンドリマーである。一部の実施形態では、Ｄは、積荷成分を含む。
【００２２】
定義
下記の用語は、特に他に定めがなければ、そこに記された意味を持つ。
【００２３】
用語の細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、膜輸送配列（ＭＴＳ）およびタンパク質伝達ドメインは同義に使われる。本明細書で使われるこの用語は、細胞の細胞膜を通過して転移させるペプチド（ポリペプチドまたはタンパク質）配列を意味する。一部の実施形態では、ＣＰＰは、細胞の細胞膜を通過して細胞外の分子を転移させる。一部の実施形態では、ＣＰＰは、細胞膜への直接侵入、エンドサイトーシス媒介侵入、または一時的構造の形成、により細胞膜を通過して転移させる。
【００２４】
本明細書で使用されるように、用語の「アプタマー」は、標的分子との非ワトソン・クリック相互作用に基づく高親和性と特異性を有する他の分子との結合能力に基づいてランダムプールから選択されるＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す（例えば、Ｃｏｘ  ａｎｄ  Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．９：２５２５−２５３１（２００１）；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：Ｄ９５−Ｄ１００（２００４））を参照。一部の実施形態では、アプタマーは、核酸、タンパク質、低分子有機化合物、ビタミン、無機化合物、細胞、および生命体そのものにも、結合する。
【００２５】
用語の「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書では同義に使われ、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、天然アミノ酸ポリマーならびに１つまたは複数のアミノ酸残基が非天然アミノ酸（例えば、アミノ酸類似体）であるアミノ酸ポリマーに適用される。この用語は、完全長タンパク質（すなわち、抗原）を含む任意の長さのアミノ酸鎖を包含し、アミノ酸残基は、ペプチド結合により共有結合されている。本明細書で使われる用語「ペプチド」は、アミノ酸残基のポリマーを指し、通常は、長さは２〜約５０残基の範囲である。特定の実施形態では、ペプチドは約２、３、４、５、７、９、１０、または１１残基〜約５０、４５、４０、４５、３０、２５、２０、または１５残基の長さの範囲である。特定の実施形態では、ペプチドは８、９、１０、１１、または１２残基〜約１５、２０または２５残基の長さの範囲である。本明細書でアミノ酸配列が提供されている場合は、Ｌ−、Ｄ−、またはベータアミノ酸の配列タイプ、ならびに逆、反転、および逆反転イソ型も同様に意図されている。また、ペプチドは、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸、ならびに天然アミノ酸ポリマーの人工的化学類似体であるアミノ酸ポリマーを含む。さらに、この用語は、ペプチド結合または他の修飾された結合（例えば、ペプチド結合がα−エステル、β−エステル、チオアミド、ホスホンアミド、カルバマート、ヒドロキシラート、等で置換されている結合（例えば、Ｓｐａｔｏｌａ、（１９８３）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ７：２６７−３５７を参照）、アミドが飽和アミンで置換されている結合（例えば、Ｓｋｉｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第４，４９６，５４２号（この特許は、参照により本明細書に組み込まれる）、およびＫａｌｔｅｎｂｒｏｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９０）Ｐｐ．９６９−９７０  ｉｎ  Ｐｒｏｃ．１１ｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、ＥＳＣＯＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、等を参照））、により結合されているアミノ酸に適用される。
【００２６】
用語の「アミノ酸」は、天然および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と類似の方式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸は、遺伝暗号によりコードされているもの、ならびに後で修飾されたもので、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタマート、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち、水素に結合したαカーボン、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルフォキシド、を有する化合物を指す。このような類似体は、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または修飾ペプチド骨格を有し、しかも天然アミノ酸と同じ基本的化学構造を維持している。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と類似の方式で機能する化学的化合物を指す。アミノ酸は、Ｄアミノ酸またはＬアミノ酸であってもよい。明細書中のペプチド配列で、小文字はアミノ酸のＤ異性体を示している（逆に、大文字はアミノ酸のＬ異性体を示している）。
【００２７】
本明細書では、アミノ酸は、通常よく知られた３文字記号でも、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ推奨の１文字記号で呼んでもよい。同様に、ヌクレオチドは、通常受け入れられている１文字コードで呼んでもよい。
【００２８】
コード化配列中の単一アミノ酸または小さいパーセンテージのアミノ酸を変更、追加、または削除する、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列への個々の置換、欠失または付加は、「保存的改変変異体」であり、この場合、変更により化学的に類似のアミノ酸によるアミノ酸の置換が生ずることは同業者なら認識しているであろう。機能的に類似のアミノ酸を与える保存的置換表は当技術分野でよく知られている。このような保存的改変変異体は、本発明の多形性変異体、種間相同体、および対立遺伝子を追加し、排除しない。
【００２９】
下記の８つのグループはそれぞれ相互に保存的置換できるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照）。
【００３０】
本明細書で使われる「リンカー」は、本明細書で開示の選択的輸送分子のＡ部とＢ部を結合（例えば、共有結合で）できる任意の分子である。リンカーには、限定されないが、直鎖または分岐鎖炭素リンカー、複素環式炭素リンカー、ペプチドリンカー、およびポリエーテルリンカーが含まれる。例えば、ポリ（エチレングリコール）リンカーは、Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ、Ｐｏｗｅｌｌ、ＯＨから入手可能である。これらのリンカーは、任意選択で、アミドリンケージ、スルフヒドリルリンケージ、またはヘテロ官能化リンケージを持ってもよい。
【００３１】
本明細書で使われる用語の「標識」は、本明細書で開示の選択的輸送分子の可視化および／または検出を促進する任意の分子を指す。一部の実施形態では、標識は、蛍光成分である。
【００３２】
用語の「キャリア」は、（ａ）血漿中半減期および（ｂ）溶解度を増加させる不活性の分子を意味する。一部の実施形態では、キャリアは糸球体濾過を減らすことにより血漿中半減期および溶解度を増加させる。一部の実施形態では、キャリアは腫瘍血管系の血管透過性・滞留性亢進（ＥＰＲ）による腫瘍取り込みを増加させる。
【００３３】
用語の「個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）」、「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」または「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は同意義に使われる。本明細書で使われるように、これらは任意の哺乳動物（すなわち、分類学による分類の動物界：脊索動物門：脊椎動物亜門：哺乳綱の任意の目、科、および属の種）を意味する。一部の実施形態では、哺乳動物はヒトである。この用語は、健康ケアワーカー（例えば、医師、登録看護師、上級看護師、医師の助手、看護士、またはホスピスワーカー）の監督（例えば、定常的または断続的な）を特徴とする状況を要求しない、またはこの状況に限定されないことに留意されたい。
【００３４】
用語の「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ）」「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」、「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」、等は、本明細書で使用されるように、生物学的な作用を行う所望の部位に薬剤または組成物を送達させるために使用可能な方法を指す。これらの方法には、限定されないが、非経口の注入（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、血管内、鞘内、硝子体内、温浸、または局所）が含まれる。任意選択で本明細書の薬剤と方法と共に採用される投与技術には、例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｅｄ．（治療薬の薬理学的基礎、最新版）；Ｐｅｒｇａｍｏｎ；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （ｃｕｒｒｅｎｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ）（レミントンの薬学（最新版））、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ、で考察されている技術が含まれる。
【００３５】
本明細書で使用されるように、用語の「薬学的に許容可能な」は、本明細書記載の薬剤の生物活性または特性を抑制しない材料で、相対的に無毒（すなわち、その材料の毒性がその材料の利益を大きく凌いでいる）である材料を指す。一部の例では、薬学的に許容可能な材料は、大きな望ましくない生物学的影響を与えることなく、または有害な形で含まれている組成物の構成成分と大きく相互作用することなく、個体に投与可能である。
【００３６】
本明細書で使われる用語の「手術」は、物理的介入により作用を操作し、変更し、または引き起こすために使用することが可能な方法を指す。これらの方法には、限定されないが、観血療法、内視鏡外科手術、腹腔鏡下手術、低侵襲手術、およびロボット手術が含まれる。
【００３７】
下記の記号が使われる場合は、以下に示す意味を有する：Ｆｌ＝フルオレセイン；ａｃａ＝ａｈｘ＝Ｘ＝アミノカプロン酸リンカー（−ＨＮ−（ＣＨ２）５−ＣＯ−）；Ｃ＝Ｌ−システイン；Ｅ＝Ｌ−グルタマート；Ｒ＝Ｌ−アルギニン；Ｄ＝Ｌ−アスパルタート；Ｋ＝Ｌ−リジン；Ａ＝Ｌ−アラニン；ｒ＝Ｄ−アルギニン；ｃ＝Ｄ−システイン；ｅ＝Ｄ−グルタマート；Ｐ＝Ｌ−プロリン；Ｌ＝Ｌ−ロイシン；Ｇ＝グリシン；Ｖ＝バリン；Ｉ＝イソロイシン；Ｍ＝メチオニン；Ｆ＝フェニルアラニン；Ｙ＝チロシン；Ｗ＝トリプトファン；Ｈ＝ヒスチジン；Ｑ＝グルタミン；Ｎ＝アスパラギン；Ｓ＝セリン；およびＴ＝トレオニン。
【００３８】
選択的輸送分子
細胞内へのおよび外への輸送の調節は細胞の生存継続のために重要である。例えば、細胞膜は、多くの重要な物質の膜透過を促進することができるイオンチャネル、ポンプ、および交換体を含む。しかし、膜貫通輸送は選択的である：所望の物質の細胞内への侵入を促進し、他のものの退出を促進することに加えて、細胞膜の主要な役割は、物質の無制御な細胞内への侵入を防ぐことである。この細胞膜のバリア機能が、マーカー、薬剤、核酸、および他の外部発生材料の細胞への送達を困難にしている。
【００３９】
複数の膜転移シグナル（ＭＴＳ）が特定された。例えば、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）のＴａｔタンパク質は、細胞外の環境から細胞内へ入ることができる。アンテナペディアホメオボックスタンパク質由来のドメインは、同様に、細胞に侵入可能である。
【００４０】
ＭＴＳを含む分子も同様に他の分子を一緒に細胞中に運び込むために使用可能である。最も重要なＭＴＳは、例えば、正に帯電した側鎖を有するアルギニンアミノ酸を多く含むものである。このような陽イオン性ペプチドにより細胞中に輸送される分子は、「積荷」と命名されてもよく、可逆的または非可逆的に陽イオン性ペプチドに結合してもよい。
【００４１】
ＭＴＳを含む分子により促進された取り込みは、現状では特異性は無く、多くのまたは全部の細胞への取り込みを強化する。積荷の送達に関し、動物の身体の中の細胞のタイプ、または組織、または位置もしくは領域を標的にする能力を有することが望ましい。従って、我々は、インビボ循環を増加させた選択的輸送分子の必要性を特定した。
【００４２】
一部の実施形態では、本明細書で開示される選択的輸送分子は、式（Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｃ）−Ｍを有し、式中、Ｃは、積荷成分であり；Ａは、５〜９個の連続した酸性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり、該アミノ酸は、アスパルタートおよびグルタマートから選択され；Ｂは、５〜２０個の連続した塩基性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり；Ｘは、リンカーであり；かつＭは、高分子キャリアである。
【００４３】
一部の実施形態では、本明細書で開示される選択的輸送分子は、式（Ａ−Ｘ−Ｂ）−Ｄを有し、Ｃは、積荷成分であり；Ａは、５〜９個の連続した酸性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり、該アミノ酸は、アスパルタートおよびグルタマートから選択され；Ｂは、５〜２０個の連続した塩基性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり；Ｘは、リンカーであり；Ｄは、デンドリマーである。一部の実施形態では、Ｄは、積荷成分を含む。
【００４４】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される選択的輸送分子は、直鎖分子である。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される選択的輸送分子は、図１Ｂに模式的に記されたような環式分子である。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される選択的輸送分子は、環式部と直鎖部を含む。
【００４５】
本明細書で開示される選択的輸送分子は、任意の長さであってよい。一部の実施形態では、本明細書で開示される選択的輸送分子は、リンカーＸおよび積荷成分Ｃの長さを含まずに、約７〜約４０アミノ酸長さである。他の実施形態では、特に、複数の非酸性（Ａ部の）または非塩基性（Ｂ部の）アミノ酸がＡ部およびＢ部の１つまたは両方中に含まれる場合は、本明細書で開示される選択的輸送分子のＡ部およびＢ部は合わせて約５０、または約６０、または約７０アミノ酸長さであってもよい。本明細書で開示される選択的輸送分子の環式部は、リンカーＸおよび積荷成分Ｃの長さを含まずに、約１２〜約６０アミノ酸を含んでもよい。例えば、本明細書で開示される直鎖選択的輸送分子は、約５〜約２０個の塩基性アミノ酸（好ましくは、約９〜約１６個の塩基性アミノ酸）の塩基性Ｂ部および約２〜約２０個の酸性アミノ酸の酸性Ａ部（例えば、約５〜約２０個、好ましくは、約５〜約９個の酸性アミノ酸）を有してもよい。一部の好ましい実施形態では、本明細書で開示される選択的輸送分子は、約９〜約１６個の塩基性アミノ酸の塩基性Ｂ部および約５〜約９個の酸性アミノ酸を有してもよい。一部の実施形態では、Ａは８個の連続したグルタマート（すなわち、ＥＥＥＥＥＥＥＥ、Ｅ９、ｅｅｅｅｅｅｅｅ、またはｅ９）で、Ｂは９個の連続したアルギニン（すなわち、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、Ｒ９、ｒｒｒｒｒｒｒｒｒ、またはｒ９）、およびＸはＰＬＧＬＡＧである。
【００４６】
一部の実施形態では、選択的輸送分子は、下記に示す式を有する。一部の例では、ペプチド配列は、アミノ酸記号と数で与えられることに注意されたい。この数は、アミノ酸の数を示す（例えば、Ｒ９はＲＲＲＲＲＲＲＲＲまたは９個の連続したＬ−アルギニンとなり；ｒ９は９個の連続したＤ−アルギニンまたはｒｒｒｒｒｒｒｒｒとなる）。
2012533560.tif 000003
2012533560.tif 000004
【００４７】
【表１】
2012533560.tif 000005
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2012533560.tif 000007
【００４８】
ペプチドの合成
本明細書で開示される、選択的輸送分子は、例えば、固相ペプチド合成を含む固相合成等の任意の適切な方法により合成される。Ｆｍｏｃを使ったペプチド合成の例を下記の実施例１に示す。例えば、従来のペプチド合成の固相法は、結晶化形態で調製されるか、または溶液中で新しく調製され、Ｎ末端での連続的アミノ酸付加に使われるＮ−アルファ保護アミノ酸無水物から始めてもよい。各残基追加時に、成長しているペプチド（固体支持上の）を酸処理して、Ｎ−アルファ保護基を除去し、数回洗浄して残っている酸を除去し、ペプチド末端の反応媒体に対するアクセシビリティーを良くする。次にペプチドを活性化Ｎ−保護アミノ酸対称無水物と反応させ、固体支持体を洗浄した。各残基付加ステップで、合わせて２つまたは３つの別々の付加反応に対し、アミノ酸付加反応を繰り返し、成長中のペプチド分子の到達％を増やすことができる。典型的には、１〜２反応サイクルを使って最初の１２残基付加を行い、２〜３反応サイクルで残りの残基の付加を行う。
【００４９】
ペプチド鎖の成長が完了後、保護されたペプチド樹脂を液体塩酸またはトリフルオロ酢酸等の強酸で処理してブロック解除し支持体からペプチドを放出させる。アミド化されたペプチドを調製するために、合成に使用する樹脂支持体を、樹脂からペプチド切断後にＣ末端アミドが得られるように選択する。強酸の除去後、ペプチドを１Ｍ酢酸溶液中に抽出し凍結乾燥できる。ペプチドをゲル濾過の初期分離により単離して、ペプチドダイマーおよび高分子量ポリマー、さらに望ましくない塩を除去できる。部分精製ペプチドを、分取ＨＰＬＣクロマトグラフィーでさらに精製し、ペプチドの純度と素性をアミノ酸組成物分析、質量分析および分析ＨＰＬＣにより確認可能である（例えば、２つの異なる溶媒系を使って）。
【００５０】
ポリヌクレオチドの合成
本明細書の特定の実施形態で、本明細書記載の選択的輸送分子をコードしたポリヌクレオチドが開示される。用語の「ポリヌクレオチド」は、少なくとも１０塩基長さのヌクレオチドの重合体を指す。ヌクレオチドには、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、またはどちらかのタイプのヌクレオチドの修飾物が含まれる。この用語には、１本鎖および２本鎖型のＤＮＡが含まれる。従って、この用語には、例えば、ベクター、例えば、発現ベクター；自律的に複製するプラスミドまたはウイルス；または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ、中に組み込まれる、または他の配列とは無関係な別の分子（例えば、ｃＤＮＡ）として存在する、組換えＤＮＡが含まれる。
【００５１】
これらポリヌクレオチドには、明細書記載の選択的輸送分子、またはその一部をコードしたＤＮＡ、ｃＤＮＡ、およびＲＮＡ配列が含まれる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドには、プロモーターおよび他の配列が含まれ、宿主細胞中で形質移入（安定でも一時的であってもよい）するためにベクター中に取り込むことができる。
【００５２】
発現ベクターの作製および形質移入した細胞中での遺伝子の発現には、当技術分野でよく知られた分子クローニング技術の使用を必要とする。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  -−  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（分子クローニング−−実験マニュアル）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、（１９８９）および、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学の最新プロトコル）、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、ｅｄｓ．、（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、最近の増刊）を参照。細胞に目的のポリペプチドの発現をコードした配列を形質移入するために使われる核酸は、通常、ポリペプチドの発現をコードしたヌクレオチド配列に動作可能なように結合した発現制御配列を含む発現ベクターの形態である。本明細書で使われる「動作可能なように結合した（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」は、記述された成分が意図したように機能させる関係にあるような近位を指す。コード配列に動作可能なように結合した制御配列は、制御配列に適合する条件下、コード配列の発現が達成されるように連結される。「制御配列」は、それらが連結したコードおよび非コード配列の発現に影響を与えるポリヌクレオチド配列を指す。制御配列には、通常、プロモーター、リボソーム性結合部位、および転写終止配列が含まれる。「制御配列」という用語は、少なくとも発現に影響を与えることができる成分を含むことが意図され、また、その存在が好都合な、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列、等の追加の成分を含む。本明細書で使われる用語：ポリペプチド「の発現をコードしたヌクレオチド配列」は、ｍＲＮＡの転写および翻訳に際しポリペプチドを産生する配列を指す。これには、例えば、イントロンを含む配列が含まれる。本明細書で使われる用語の「発現制御配列」は、動作可能なように結合されている核酸配列の発現を調節する核酸配列を指す。発現制御配列は、それらが核酸配列の転写や、必要に応じ、翻訳の制御、調節を行う場合、核酸配列に動作可能なように結合している。従って、発現制御配列には、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質コード遺伝子の直前の開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンや、その遺伝子の正しい読み枠を維持しｍＲＮＡ、および停止コドンの正しい翻訳をさせるためのスプライシングシグナル、が含まれる。
【００５３】
蛍光指示薬コード配列および適切な転写／翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築するための任意の方法が使用される。これらの方法には、インビトロ組換ＤＮＡ技術、合成技術およびインビボ組換え／遺伝的組換えが含まれる（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ、ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（分子クローニング−実験マニュアル）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ．Ｙ．、１９８９、に記載されている技術を参照）。組換えＤＮＡによる宿主細胞の遺伝子導入を当業者にはよく知られている従来技術により行うことができる。
【００５４】
宿主が大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）等の原核生物の場合、コンピテント細胞（すなわち、ＤＮＡ取り込み可能な細胞）は、指数関数的増殖相から採取し、その後ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２またはＲｂＣｌで処理した細胞から調製される。特定の例では、宿主細胞のプロトプラスト形成の後に、または電気穿孔により遺伝子導入を行う。
【００５５】
宿主が真核生物の場合は、リン酸カルシウム共沈、従来の機械的な手法、例えば、微量注入、電気穿孔、リポソーム封入プラスミドの挿入、またはウイルスベクター等のＤＮＡ形質移入方法が使用可能である。特定の例では、真核細胞は、本明細書で開示の分子をコードしたＤＮＡ配列、および選択可能表現型、例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子をコードした第２の外来ＤＮＡ分子を同時形質移入される。別の方法は、真核生物ベクター、例えば、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）またはウシパピローマウイルス、を使って一時的に真核細胞に感染させるまたはこれを遺伝子導入し、タンパク質を発現させることである（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ（真核生物ウイルスベクター）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｇｌｕｚｍａｎ  ｅｄ．、１９８２）。原核生物または真核生物中に発現した本発明のポリペプチドの単離と精製技術には、任意の従来の手段、例えば、分取クロマトグラフ分離および、モノクローナルまたはポリクローナル抗体もしくは抗原の使用を含む方法等の免疫学的な分離を使うことが可能である。
【００５６】
Ａ部
本明細書中の特定の実施形態では、インビボで循環を増加させた選択的輸送分子が開示される。
【００５７】
一部の実施形態では、本明細書で開示の選択的輸送分子は、式（Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｃ）−Ｍを有し、式中、Ｃは、積荷成分であり；Ａは、５〜９個の連続した酸性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり、該アミノ酸は、アスパルタートおよびグルタマートから選択され；Ｂは、５〜２０個の連続した塩基性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり；Ｘは、リンカーであり；かつＭは、高分子キャリアである。
【００５８】
一部の実施形態では、本明細書で開示の選択的輸送分子は、式（Ａ−Ｘ−Ｂ）−Ｄを有し、式中、Ｃは、積荷成分であり；Ａは、５〜９個の連続した酸性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり、該アミノ酸は、アスパルタートおよびグルタマートから選択され；Ｂは、５〜２０個の連続した塩基性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり；Ｘは、リンカーであり；かつＤは、デンドリマーである。一部の実施形態では、Ｄは、積荷成分を含む。
【００５９】
一部の実施形態では、本明細書で開示の選択的輸送分子は、式（Ａ−Ｘ−Ｂ）ｎ−Ｄを有し、式中、Ｄは、少なくとも２つの積荷成分を含み；Ａは、５〜９個の連続した酸性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり、該アミノ酸は、アスパルタートおよびグルタマートから選択され；Ｂは、５〜２０個の連続した塩基性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり；Ｘは、リンカーであり；ｎは、１〜２０の整数である。
【００６０】
一部の本発明の特徴を有する分子の実施形態では、ペプチド部Ａは、約２〜約２０個の、または約５〜約２０個の酸性アミノ酸を含み、一連の酸性アミノ酸（例えば、グルタマートおよびアスパルタートまたは他の酸性アミノ酸）であってもよい。一部の実施形態では、Ａは、５〜９個の連続したグルタマートを含む配列を有する。
【００６１】
一部の実施形態では、Ａ部は、８個の連続したグルタマート（すなわち、ＥＥＥＥＥＥＥＥまたはｅｅｅｅｅｅｅｅ）を含む。
【００６２】
酸性のＡ部は、酸性でないアミノ酸を含んでもよい。酸性のＡ部は、他の成分、例えば、負に帯電した成分を含んでもよい。本明細書で開示の選択的輸送分子の実施形態では、酸性のＡ部は、負に帯電した部分、好ましくは、アミノ酸を含まない、生理的なｐＨ下で約２〜約２０の負電荷を有する部分であってもよい。好ましい実施形態では、Ａ部の負電荷は、Ｂ部の正電荷量とおよそ同じである。 
【００６３】
Ａ部は、Ｌ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸である。本発明のいくつかの実施形態では、免疫原性、および付随するペプチダーゼまたはプロテアーゼによる非特異的切断を最小限にとどめるためにＤ−アミノ酸が好ましい。オリゴ−Ｄ−アルギニン配列の細胞による取り込みは、オリゴ−Ｌ−アルギニンと同等またはそれより優れていることが知られている。
【００６４】
Ａ部は、例えば、ヒドロキシリジン、デスモシン、イソデスモシン、またはその他の非標準的アミノ酸、等の非標準的アミノ酸を含んでもよいことは理解されよう。Ａ部は、例えば、メチル化アミノ酸（例えば、メチルヒスチジン、リジンのメチル化型、等）、アセチル化アミノ酸、アミド化アミノ酸、ホルミル化アミノ酸、ヒドロキシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸、またはその他の修飾アミノ酸、等の翻訳後修飾アミノ酸を含む修飾アミノ酸を含んでもよい。Ａ部は、同様に、非ペプチド結合により結合された部分を含むペプチド模倣成分、および非アミノ酸部により結合されたまたはこれに結合したアミノ酸を含んでもよい。
【００６５】
Ａがアミノ末端にある場合またはＡがカルボキシ末端にある場合、一般的な構造Ａ−Ｘ−Ｂおよび−Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｃが、有効である。すなわち、ペプチド結合のいずれの向きも許容される。
【００６６】
Ｂ部（膜透過配列）
本明細書中の特定の実施形態では、インビボ循環の増加した選択的輸送分子が開示される。 
【００６７】
一部の実施形態では、本明細書で開示されている選択的輸送分子は、式（Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｃ）−Ｍを有し、式中、Ｃは、積荷成分であり；Ａは、５〜９個の連続した酸性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり、該アミノ酸は、アスパルタートおよびグルタマートから選択され；Ｂは、５〜２０個の連続した塩基性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり；Ｘは、リンカーであり；かつＭは、高分子キャリアである。
【００６８】
一部の実施形態では、本明細書で開示されている選択的輸送分子は、式（Ａ−Ｘ−Ｂ）−Ｄを有し、式中、Ｃは、積荷成分であり；Ａは、５〜９個の連続した酸性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり、該アミノ酸は、アスパルタートおよびグルタマートから選択され；Ｂは、５〜２０個の連続した塩基性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり；Ｘは、リンカーであり；かつＤは、デンドリマーである。一部の実施形態では、Ｄは、積荷成分を含む。
【００６９】
一部の実施形態では、本明細書で開示されている選択的輸送分子は、式（Ａ−Ｘ−Ｂ）ｎ−Ｄを有し、式中、Ｄは、少なくとも２つの積荷成分を含み；Ａは、５〜９個の連続した酸性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり、該アミノ酸は、アスパルタートおよびグルタマートから選択され；Ｂは、５〜２０個の連続した塩基性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり；Ｘは、リンカーであり；かつｎは１〜２０の整数である。一部の実施形態では、Ｂは、５〜１２個の連続したアルギニンを含む配列を有する。一部の実施形態では、Ｂは、９個の連続したアルギニンを含む配列を有する。
【００７０】
一部の本発明の特徴を有する分子の実施形態では、ペプチド部Ｂは、約５〜約２０個の、または約９〜約１６個の塩基性アミノ酸を含み、一連の塩基性アミノ酸（例えば、アルギニン、ヒスチジン、リジン、またはその他の塩基性アミノ酸）であってもよい。
【００７１】
一部の実施形態では、Ｂ部は、９個の連続したアルギニン（すなわち、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲまたはｒｒｒｒｒｒｒｒｒ）を含む。
【００７２】
塩基性Ｂ部は、塩基性でないアミノ酸を含んでもよい。塩基性Ｂ部は、他の成分、例えば、正に帯電した成分を含んでもよい。いくつかの実施形態では、塩基性Ｂ部は、正電荷部、好ましくは生理的なｐＨ下で約５〜約２０の陽電荷を有する、アミノ酸を含まない正電荷部であってもよい。好ましい実施形態では、Ａ部の負電荷の量はＢ部の正電荷の量とおよそ同じである。
【００７３】
Ｂ部は、Ｌ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸のいずれかである。本発明のいくつかの実施形態では、免疫原性、および付随するペプチダーゼまたはプロテアーゼによる非特異的切断を最小限にとどめるためにＤ−アミノ酸が好ましい。細胞によるオリゴ−Ｄ−アルギニン配列の取り込みは、オリゴ−Ｌ−アルギニンに対する場合と同じか、それより優れていることが知られている。
【００７４】
Ｂ部は、例えば、ヒドロキシリジン、デスモシン、イソデスモシン、またはその他の非標準的アミノ酸、等の非標準的アミノ酸を含んでもよいことは理解されよう。Ｂ部は、例えば、メチル化アミノ酸（例えば、メチルヒスチジン、リジンのメチル化型、等）、アセチル化アミノ酸、アミド化アミノ酸、ホルミル化アミノ酸、ヒドロキシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸、またはその他の修飾アミノ酸、等の翻訳後修飾アミノ酸を含む修飾アミノ酸を含んでもよい。Ｂ部は、同様に、非ペプチド結合により結合された部分を含むペプチド模倣成分、および非アミノ酸部により結合されたまたはこれに結合したアミノ酸を含んでもよい。
【００７５】
Ｘがプロテアーゼにより切断可能なペプチドである実施形態では、Ｘの切断により生成する新規アミノ末端がＢにすでに存在する正電荷に追加する追加正電荷を与えるように、ＸのＣ末端がＢのＮ末端へ結合するのが好ましいであろう。
【００７６】
Ｘ部（リンカー）
本明細書中の特定の実施形態では、インビボ循環の増加した選択的輸送分子が開示される。
【００７７】
一部の実施形態では、本明細書で開示されている選択的輸送分子は、式（Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｃ）−Ｍを有し、式中、Ｃは、積荷成分であり；Ａは、５〜９個の連続した酸性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり、該アミノ酸は、アスパルタートおよびグルタマートから選択され；Ｂは、５〜２０個の連続した塩基性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり；Ｘは、リンカーであり；かつＭは、高分子キャリアである。
【００７８】
一部の実施形態では、本明細書で開示されている選択的輸送分子は、式（Ａ−Ｘ−Ｂ）−Ｄを有し、式中、Ｃは、積荷成分であり；Ａは、５〜９個の連続した酸性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり、該アミノ酸は、アスパルタートおよびグルタマートから選択され；Ｂは、５〜２０個の連続した塩基性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり；Ｘは、リンカーであり；かつＤは、デンドリマーである。一部の実施形態では、Ｄは、積荷成分を含む。
【００７９】
切断条件
一部の実施形態では、Ｘは、切断可能なリンカーである。
【００８０】
一部の実施形態では、リンカーＸは、特定の条件または特定の環境の存在下での切断が意図されている。好ましい実施形態では、リンカーＸは、生理学的条件下で切断可能である。このようなリンカーＸの切断は、例えば、積荷送達が望まれる細胞に関連した特定の病理学的シグナルまたは特定の環境により促進され、または影響を受けてもよい。特異的酵素等の特異的条件によるリンカーＸの切断のための設計は、細胞による取り込みのこのような条件が生じている特異的位置への標的化を可能にする。従って、選択的輸送分子が所望の細胞、組織、または領域に対する細胞による取り込みの特異的標的化を提供する１つの重要な手段は、このような標的化細胞、組織、または領域の近傍の状態下で切断されるリンカーＸ部の設計である。リンカーＸの切断後、分子のＢ〜Ｃ部はＢおよびＣの単純な共役体になり、ある場合には、比較的小さい、不活性のリンカーＸの残部の切れ残りがある。
【００８１】
一部の実施形態では、ＸはｐＨ感受性リンカーである。一部の実施形態では、Ｘは、塩基性ｐＨ条件下で切断される。一部の実施形態では、Ｘは、酸性ｐＨ条件下で切断される。一部の実施形態では、Ｘは、プロテアーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、またはこれらの組み合わせにより切断される。一部の実施形態では、Ｘは、還元剤により切断される。
【００８２】
１つの重要なクラスのシグナルは、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の加水分解活性で、これは転移性腫瘍細胞の侵襲的移動に非常に重要である。特定の例では、ＭＭＰは、炎症の近傍部位に認められる。特定の例では、ＭＭＰは、脳卒中（すなわち、血流減少後の脳損傷を特徴とする障害）の部位近傍で認められる。一部の実施形態では、Ｘは、ＭＭＰにより切断される。従って、本発明の特徴を有する分子の取り込みを、細胞外の環境中の活性ＭＭＰを有する特定細胞、組織、または領域に対する、細胞による積荷Ｃの取り込みに方向付けることができる。
【００８３】
一部の実施形態では、アミノ酸配列ＰＬＧＬＡＧ（配列番号１）を含むリンカーＸは、メタロプロテアーゼ酵素ＭＭＰ−２（癌および炎症中の主要ＭＭＰ）により切断される。このようなリンカーＸの切断は、中央のＧとＬ残基の間で起こり、細胞による取り込みを１０〜２０倍増加させる（実施例４参照）。一部の実施形態では、膜に固定されたＭＭＰにより切断されるように設計されたリンカーＸは、その活性が発現細胞の外表面に局在して残るため、特に好ましい。別の実施形態では、積荷Ｃが厳密な切断位置から拡散し、それによって積荷が空間的に分布することが望まれる場合は、可溶性分泌型ＭＭＰにより切断されるように設計されたリンカーＸが好ましい。他のＭＭＰで切断可能なその他のリンカーＸについては実施例９で考察する。
【００８４】
一部の実施形態では、リンカーは、癌細胞近傍で認められるタンパク分解性酵素または還元性環境により切断されるように設計される。通常、このような環境、またはこのような酵素は正常細胞近傍では見出されない。
【００８５】
低酸素は、重要な病理学的シグナルである。例えば、低酸素が癌細胞を照射および化学療法に対しより高い耐性にし、また血管新生を開始させると考えられている。一部の実施形態では、低酸素下にある組織中またはその近傍での切断に適したリンカーＸは、Ｂ部およびＣ部に対し癌細胞、癌組織、梗塞領域、および他の低酸素領域を標的にすることを可能にする。一部の実施形態では、ジスルフィド結合を含むリンカーＸは、低酸素性の領域中で選択的に切断され、このような領域中で細胞を積荷送達の標的にする。例えば、漏出細胞または壊死細胞、の存在下の低酸素性環境では、遊離チオール類および他の還元剤が細胞外で利用可能となり、一方、通常は細胞外の環境を酸化性に保つＯ２は、当然枯渇する。一部の実施形態では、このレドックスバランスの変化がリンカーＸ内のジスルフィド結合の還元および切断を促進する。チオールジスルフィド平行を利用するジスルフィド結合に加え、ヒドロキノンに還元されると分解するキノンを含む結合が低酸素性環境で切断されるように設計されたリンカーＸで使われる。
【００８６】
壊死は、リンカーＸの切断を引き起こすのに用いることができる酵素または他の細胞含有物の放出をもたらすことが多い。一部の実施形態では、低酸素でない環境下の壊死領域で切断するように設計されたリンカーＸは、カルパイン（または他の壊死細胞から放出されたプロテアーゼ）を含む。このようなリンカーＸのカルパインによる切断は、Ａ部から結合しているＢ−Ｃ部を放出し、まだ完全には漏出性になっていない疾患細胞および隣接細胞に積荷を取り込ませるであろう。
【００８７】
アシドーシスは、同様に、酸化的リン酸化から嫌気性解糖および乳酸産生へのワールブルグシフトによって、損傷を受けたまたは低酸素性の組織の部位によく観察される。このような局所的酸性は、酸不安定なリンカーＸを作る（例えば、Ｘ中にアセタールまたはビニルエーテル結合を含むことにより）ことにより検知することが可能である。あるいは、または、それに追加して、アシドーシスは、Ｂ内のアルギニンの一部をヒスチジン（唯一ｐＨ７以下の陽イオン性になる）で置換することにより、積荷取り込みを引き起こすものとして使用することができる。
【００８８】
リンカー
一部の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸から成るリンカーが、ペプチド配列Ａ（細胞中への取り込みを防ぐように設計された配列）およびペプチド配列Ｂ（すなわち、ＭＴＳ）を結合するために使用される。一般的に、ペプチドリンカーは、分子を結合させる、または分子間のある程度の最小距離または他の空間的関係を保持することの他に特異的生物活性を持たない。しかし、リンカー成分のアミノ酸は、影響一部の分子特性、例えば、折り畳み構造、正味電荷、または疎水性に影響を与えるように選択可能である。
【００８９】
一部の実施形態では、Ｘは、切断可能なリンカーである。
【００９０】
一部の実施形態では、リンカーは、可撓性である。一部の実施形態では、リンカーは、剛直である。
【００９１】
一部の実施形態では、リンカーは、直鎖構造を含む。一部の実施形態では、リンカーは、非直鎖構造を含む。一部の実施形態では、リンカーは、分岐構造を含む。一部の実施形態ではリンカーは、環式構造を含む。
【００９２】
一部の実施形態では、Ｘは、約５〜約３０原子の長さである。一部の実施形態では、Ｘは、約６原子の長さである。一部の実施形態では、Ｘは、約８原子の長さである。一部の実施形態では、Ｘは、約１０原子の長さである。一部の実施形態では、Ｘは、約１２原子の長さである。一部の実施形態では、Ｘは、約１４原子の長さである。一部の実施形態では、Ｘは、約１６原子の長さである。一部の実施形態では、Ｘは、約１８原子の長さである。一部の実施形態では、Ｘは、約２０原子の長さである。一部の実施形態では、Ｘは、約２５原子の長さである。一部の実施形態では、Ｘは、約３０原子の長さである。
【００９３】
一部の実施形態では、リンカーは結合ペプチドＡ部（すなわち、細胞による取り込みを防ぐペプチド配列）をペプチドＢ部（すなわち、ＭＴＳ配列）に共有結合により結合する。一部の実施形態では、共有結合は、エーテル結合、チオエーテル結合、アミン結合、アミド結合、炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、炭素−酸素結合、または炭素−硫黄結合を含む。
【００９４】
一部の実施形態では、Ｘはペプチド結合を含む。ペプチド結合は、Ｌ−アミノ酸および／またはＤ−アミノ酸を含む。本発明のいくつかの実施形態では、付随するペプチダーゼまたはプロテアーゼによる免疫原性および非特異的切断を最小限にとどめるためにＤ−アミノ酸が好ましい。細胞によるオリゴ−Ｄ−アルギニン配列の取り込みは、オリゴ−Ｌ−アルギニンの場合と同等か、またはそれより優れていることが知られている。
【００９５】
本明細書で開示されるリンカーは、例えば、ヒドロキシリジン、デスモシン、イソデスモシン、またはその他の非標準的アミノ酸、等の非標準的アミノ酸を含んでもよいことは理解されよう。本明細書で開示されるリンカーは、例えば、メチル化アミノ酸（例えば、メチルヒスチジン、リジンのメチル化型、等）、アセチル化アミノ酸、アミド化アミノ酸、ホルミル化アミノ酸、ヒドロキシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸、またはその他の修飾アミノ酸、等の翻訳後修飾アミノ酸を含む修飾アミノ酸を含んでもよい。本明細書で開示されるリンカーは、同様に、非ペプチド結合により結合された部分を含むペプチド模倣成分、および非アミノ酸部により結合されたまたはこれに結合したアミノ酸を含んでもよい。
【００９６】
一部の実施形態では、Ｘは、ＰＬＧＬＡＧ、ＰＬＧＬＡＸ、ＰＬＧ−Ｃ（ｍｅ）−ＡＧ、ＥＳＰＡＹＹＴＡ、およびＲＬＱＬＫＬ、ＡＮＤ  ＲＬＱＬＫ（ＡＣ）から選択されるペプチドを含む。
【００９７】
一部の実施形態では、Ｘは、以下から選択されるペプチドを含む：ＰＲ（Ｓ／Ｔ）（Ｌ／Ｉ）（Ｓ／Ｔ）（配列番号２９、括弧中の文字は、示したアミノ酸のどちらかが配列のその位置にあることを示す）；
2012533560.tif 000008
、ここでＣ（Ｅｔ）はＳ−エチルシステイン（チオールに結合したエチル基を有するシステイン）を示し、「−」は、この配列および以降の配列の典型的切断部位を示す）；
2012533560.tif 000009
、ここで「ｆ」はＤ−フェニルアラニンを示し、「Ｐｉｐ」はピペリジン−２−カルボン酸（ピペコリン酸、６員環を持つプロリン類似体）を示す；ＤＥＶＤ（配列番号４２）；ＧＷＥＨＤ−Ｇ（配列番号４３）；またはこれらの組み合わせ。
【００９８】
一部の実施形態では、Ｘは、低酸素性条件下で切断される。一部の実施形態では、Ｘは、ジスルフィド結合を含む。一部の実施形態では、Ｘは、キニーネを含む。
【００９９】
一部の実施形態では、Ｘは、壊死の条件下で切断される。一部の実施形態では、Ｘは、カルパインにより切断可能な分子を含む。
【０１００】
一部の実施形態では、Ｘは、６−アミノヘキサノイル、５−（アミノ）−３−オキサペンタノイル、またはこれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、Ｘは、ジスルフィド結合を含む。
【０１０１】
一部の実施形態では、リンカーはアルキルである。一部の実施形態では、リンカーはヘテロアルキルである。
【０１０２】
一部の実施形態では、リンカーは、アルキレンである。一部の実施形態では、リンカーは、アルケニレンである。一部の実施形態では、リンカーは、アルキニレンである。一部の実施形態では、リンカーは、ヘテロアルキレンである。
【０１０３】
「アルキル」基は、脂肪族炭化水素基を指す。アルキル成分は、飽和アルキルであっても、不飽和アルキルであってもよい。構造に依存して、アルキル基は、モノラジカルまたはジラジカル（すなわち、アルキレン基）でありうる。
【０１０４】
「アルキル」成分は、１〜１０炭素原子であってもよい（本明細書に登場する場合は常に、数値の範囲、例えば、「１〜１０」は、示された範囲中の各整数を指す；例えば、「１〜１０炭素原子」は、アルキル基が、１炭素原子、２炭素原子、３炭素原子、等、１０炭素原子まで含んでもよいことを意味する。また、範囲が指定されていない場合の用語「アルキル」の出現にもこの定義が当てはまる）。また、アルキル基は、１〜６炭素原子を有する「低級アルキル」でもよい。本明細書記載の化合物のアルキル基は、「Ｃ１−Ｃ４アルキル」または類似の指定により示してもよい。単に例として説明するが、「Ｃ１−Ｃ４アルキル」は、１〜４炭素原子がアルキル鎖中にあることを示し、すなわち、アルキル鎖はメチル、エチル、プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、およびｔ−ブチルから選択されるということである。典型的なアルキル基には、これに全く限定されないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ターシャリブチル、ペンチル、ヘキシル、エテニル、プロペニル、ブテニル、等が含まれる。
【０１０５】
一部の実施形態では、リンカーは、環構造（例えば、アリール）を含む。本明細書で使われる用語の「環」は、任意の共有結合の閉じた構造を指す。環には、例えば、炭素環化合物（例えば、アリールおよびシクロアルキル）、ヘテロサイクル（例えば、ヘテロアリールおよび非芳香族ヘテロサイクル）、芳香族（例えば、アリールおよびヘテロアリール）、および非芳香族（例えば、シクロアルキルおよび非芳香族ヘテロサイクル）が挙げられる。環は、任意選択として、置換されてもよい。環は単環式でも多環式でもよい。
【０１０６】
本明細書で使われる「アリール」という用語は、環を成形している各原子が炭素原子である芳香族環を指す。アリール環は、５、６、７、８、９、または１０以上の炭素原子から形成され得る。アリール基は、任意選択として、置換されてもよい。アリール基の例には、限定されないが、フェニル、ナフタレニル、フェナントレニル、アントラセニル、フルオレニル、およびインデニルが含まれる。構造に依存するが、アリール基はモノラジカルでも、ジラジカル（すなわち、アリーレン基）でもよい。
【０１０７】
用語の「シクロアルキル」は、リングを形成している各原子（すなわち、骨格原子）が炭素原子である単環式または多環式非芳香族ラジカルを指す。シクロアルキルは、飽和でも部分的不飽和でもよい。シクロアルキル基には、３〜１０環原子を有する基が含まれる。シクロアルキルには、限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルが含まれる。
【０１０８】
一部の実施形態では、環はシクロアルカンである。一部の実施形態では、環はシクロアルケンである。
【０１０９】
一部の実施形態では、環は芳香族環である。用語の「芳香族」は、４ｎ＋２（ｎは整数）のπ電子を含む非局在化π電子系を有する平面環を指す。芳香族環は、５、６、７、８、９、または１０以上の原子から形成されてもよい。芳香族化合物は、任意選択で、置換されてもよい。用語の「芳香族」は、炭素環式アリール（例えば、フェニル）および複素環式アリール（または「ヘテロアリール」もしくは「ヘテロ芳香族」）基（例えば、ピリジン）の両方を含む。この用語は、単環または縮合環多環（すなわち、隣接炭素原子対を共有する環）基を含む。
【０１１０】
一部の実施形態では、環は、複素環である。用語の「複素環」は、それぞれＯ、ＳおよびＮから選択される１〜４ヘテロ原子を含むヘテロ芳香族およびヘテロ脂環式基を指し、ここで各複素環基はその環に４〜１０原子を有するが、但し、前記基の環は２つの隣接するＯまたはＳ原子を含まない。非芳香族複素環基は、環中に３原子のみを有する基を含むが、芳香族複素環基は、環中に少なくとも５原子がなければならない。複素環基はベンゾ縮合環系を含む。３員複素環基の例はアジリジニルである。４員複素環基の例はアゼチジニル（アゼチジンの誘導体）である。５員複素環基の例はチアゾリルである。６員複素環基の例はピリジルで、１０員複素環基の例はキノリニルである。非芳香族複素環基の例は、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペリジノ、モルホリノ、チオモルホリノ、チオキサニル、ピペラジニル、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ホモピペリジニル、オキセパニル、チエパニル、オキサゼピニル、ジアゼピニル、チアゼピニル、１，２，３，６−テトラヒドロピリジニル、２−ピロリニル、３−ピロリニル、インドリニル、２Ｈ−ピラニル、４Ｈ−ピラニル、ジオキサニル、１，３−ジオキソラニル、ピラゾリニル、ジチアニル、ジチオラニル、ジヒドロピラニル、ジヒドロチエニル、ジヒドロフラニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサニル、３−アザビシクロ［４．１．０］ヘプタニル、３Ｈ−インドリルおよびキノリジニルである。芳香族複素環基の例は、ピリジニル、イミダゾリル、ピリミジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、ピラジニル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソオキサゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、ピロリル、キノリニル、イソキノリニル、インドリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、シンノリニル、インダゾリル、インドリジニル、フタラジニル、ピリダジニル、トリアジニル、イソインドリル、プテリジニル、プリニル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、フラザニル、ベンゾフラザニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、キナゾリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル、およびフロピリジニルである。前述の基は、可能な場合はＣ−結合でもＮ−結合でもよい。例えば、ピロール由来の基は、ピロール−１−イル（Ｎ−結合）でもピロール−３−イル（Ｃ−結合）でもよい。さらに、イミダゾール由来の基は、イミダゾール−１−イルもしくはイミダゾール−３−イル（両方ともＮ−結合）またはイミダゾール−２−イル、イミダゾール−４−イルもしくはイミダゾール−５−イル（全てＣ−結合）であってもよい。複素環基は、ベンゾ縮合環系および１つまたは２つのオキソ（＝Ｏ）成分により置換された環系、例えば、ピロリジン−２−オンを含む。構造に依存して、複素環基は、モノラジカルでもジラジカル（すなわち、ヘテロシクレン基）でもよい。
【０１１１】
一部の実施形態では、環は縮合している。用語の「縮合」は、２つ以上の環が１つまたは複数の結合を共有する構造を指す。一部の実施形態では、環は二量体である。一部の実施形態では、環は三量体である。一部の実施形態では、環が置換されている。
【０１１２】
用語の「炭素環式」または「炭素環」は、環を形成している各原子が炭素原子である環を指す。炭素環は、アリールおよびシクロアルキルを含む。従って、この用語は、炭素環を、環の骨格が炭素以外の少なくとも１つの原子（すなわち、ヘテロ原子）を含む複素環（「複素環式」）から区別する。複素環は、ヘテロアリールおよびヘテロシクロアルキルを含む。炭素環および複素環は、任意選択で、置換されてもよい。
【０１１３】
一部の実施形態では、リンカーは置換される。用語の「任意選択で、置換」または「置換」は、参照基が、下記からそれぞれ独立に選択される１つまたは複数の別の基で置換されてもよいことを意味する。Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ２−Ｃ６ヘテロ脂環式、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ、アリールチオ、Ｃ１−Ｃ６アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、Ｃ１−Ｃ６アルキルスルホン、アリールスルホン、シアノ、ハロ、Ｃ２−Ｃ８アシル、Ｃ２−Ｃ８アシルオキシ、ニトロ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ６フルオロアルキル、およびＣ１−Ｃ６アルキルアミノを含むアミノ、および保護されたこれらの誘導体。例として挙げれば、任意選択による置換基は、ＬｓＲｓであってもよく、ここで各Ｌｓは、結合、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ（＝Ｏ）−、−Ｓ（＝Ｏ）２−、−ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＨ−、−ＮＨＳ（＝Ｏ）２−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−（Ｃ１−Ｃ６アルキル）−、または−（Ｃ２−Ｃ６アルケニル）−から独立に選択され；また、各Ｒｓは、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、（Ｃ３Ｃ８シクロアルキル）、ヘテロアリール、アリール、およびＣ１−Ｃ６ヘテロアルキルから独立に選択される。任意選択の置換非芳香族基は、１つまたは複数のオキソ（＝Ｏ）により置換されてもよい。上記の置換基の内で保護された誘導体を形成することができる保護基は当業者には既知である。
【０１１４】
一部の実施形態では、本明細書で開示される選択的輸送分子は、単一のリンカーを含む。その後の治療用量が標的組織中に正しく集中させられるか否かを試験することができるため、画像化用および治療用積荷の両方の取り込みの媒介に対して単一の機序を使用することは、特に有益である。
【０１１５】
一部の実施形態では、本明細書で開示される選択的輸送分子は、複数のリンカーを含む。本明細書で開示される選択的輸送分子が複数のリンカーＸを含む場合は、分子の他の部分からのＡ部の分離には、全てのリンカーＸの切断が必要である。複数のリンカーＸの切断は、同時でも逐次でもよい。複数のリンカーＸは、異なる特異性のリンカーＸを含んでもよく、その場合、Ａ部の分子の他の部分からの分離には、分子に２つ以上の条件または環境（「細胞外のシグナル」）が発生することが必要である。このように、複数のリンカーＸの切断は、このような細胞外シグナルの組み合わせの検出手段としての役目をする。例えば、選択的輸送分子は、塩基性Ｂ部と酸性のＡ部を結合する２つのリンカー部ＸａおよびＸｂを含んでもよい。両方のリンカーＸａおよびＸｂは、酸性のＡ部が塩基性Ｂ部から離れ、Ｂ部および積荷成分Ｃ（もしあれば）に対し細胞内へ入るための侵入を許す前に切断されなければならない。リンカー領域は、存在しうる別のリンカーとは無関係に塩基性Ｂ部または積荷成分Ｃに結合してもよく、また、必要なら、３つ以上のリンカー領域Ｘを含んでもよいことは、わかるであろう。
【０１１６】
２つ以上のリンカーＸを組み合わせて使用し、所望の細胞、組織または領域に対する分子の標的化および送達をさらに調節することができる。必要に応じ、細胞外のシグナルの組み合わせを使って、リンカーＸの切断特異性を広げるまたは狭めることができる。複数のリンカーＸが並列して結合される場合は、Ａ部が分子の残りの部分から分離する前に各リンカーＸが切断されなければならないために、切断特異性は狭められる。複数のリンカーＸが直列で結合される場合は、いずれか１つのリンカーＸの切断によりＡ部が分子の残りの部分から分離できるので、切断の特異性は広げられる。例えば、プロテアーゼまたは低酸素を検出するために（すなわち、プロテアーゼまたは低酸素の存在下Ｘを切断するために）、リンカーＸは、プロテアーゼ高感受性および低感受性の部位を直列に置くように設計され、どちらか一方が酸性のＡ部を分離させることになる。あるいは、プロテアーゼおよび低酸素の両方（すなわち、プロテアーゼおよび低酸素のどちらか単独ではなく両方の存在下Ｘを切断する）の存在を検出するために、リンカーＸを、プロテアーゼ感受性部位を少なくとも１対の相互にジスルフィド結合したシステインの間に置くように設計する。この場合、Ａ部の分離には、プロテアーゼ切断およびジスルフィド還元の両方が必要となる。
【０１１７】
細胞外の切断
健常細胞では、構造Ａ−Ｘ−ＢまたはＡ−Ｘ−Ｂ−Ｃの無傷の化合物は、Ａ部が存在するため、細胞中に入ることができないであろう。従って、Ａ部が、細胞への取り込みを妨害して、細胞中に取り込まれず、細胞内の酵素にアクセスできないので、健常細胞中でこのような酵素により効果的に切断されないことから、Ｘを切断するための厳密な細胞間プロセスは、健常細胞中ではＸを切断するには有効ではないであろう。しかし、細胞が傷付いたり、または病気である場合（例えば、癌細胞、低酸素性の細胞、虚血性細胞、アポトーシス性細胞、壊死の細胞）は、このような細胞内の酵素が細胞から漏出し、Ａの切断が起こり、Ｂ部またはＢ−Ｃの細胞内への侵入を可能とし、Ｂ部または積荷成分Ｃの隣接細胞への標的化送達をもたらすであろう。一部の実施形態では、Ｘは細胞外空間で切断される。
【０１１８】
腫瘍周辺の毛細血管および他の外傷部位から漏出することがよくあるという事実が、高分子量分子（例えば、約４０ｋＤａ以上の分子量）が間質コンパートメントに到達する能力を高めるはずである。リンカーＸの切断は通常細胞外であるから、ある程度の巻き添え標識化が期待される。すなわち、適切なプロテアーゼを発現しないが、発現細胞のすぐ近くにある細胞は一部の積荷を受け取る可能性がある。腫瘍に対しては、細胞の表現型の不均質性および疑わしい細胞を高い割合で除去したい望みのために、このような巻き添え標的化は、有益であると考えられる。
【０１１９】
高分子キャリア
本明細書の特定の実施形態では、インビボ循環の増加した選択的輸送分子が開示される。一部の実施形態では、本明細書で開示される選択的輸送分子は、式（Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｃ）−Ｍを有し、式中、Ｃは積荷成分であり；Ａは、５〜９個の連続した酸性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり、該アミノ酸は、アスパルタートおよびグルタマートから選択され；Ｂは、５〜２０個の連続した塩基性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり；Ｘは、リンカーであり；かつＭは、高分子キャリアである。
【０１２０】
用語の「キャリア」は、（ａ）血漿の半減期および（ｂ）溶解度を増やす不活性の分子を意味する。
【０１２１】
一部の実施形態では、キャリアは、選択的輸送分子の軟骨への取り込みを減らす。一部の実施形態では、キャリアは、選択的輸送分子の関節への取り込みを減らす。一部の実施形態では、キャリアは、選択的輸送分子の肝臓への取り込みを減らす。一部の実施形態では、キャリアは、選択的輸送分子の腎臓への取り込みを減らす。
【０１２２】
一部の実施形態では、キャリアは、糸球体濾過を減らすことにより血漿の半減期および溶解度を増加させる。一部の実施形態では、キャリアは、腫瘍血管系の血管透過性・滞留性亢進（ＥＰＲ）により腫瘍取り込みを増加させる。組織切除手術における遊離選択的輸送分子とキャリアに結合した選択的輸送分子の比較については表２および実施例８を参照。
【０１２３】
【表２】
2012533560.tif 000010
【０１２４】
一部の実施形態では、ＭはＡに結合している。一部の実施形態では、ＭはＮ末端ポリグルタマートの位置でＡに結合している。一部の実施形態では、Ｍは共有結合でＡ（または、Ｎ末端ポリグルタマート）に結合している。一部の実施形態では、共有結合は、エーテル結合、チオエーテル結合、アミン結合、アミド結合、炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、炭素−酸素結合、または炭素−硫黄結合を含む。 
【０１２５】
一部の実施形態では、ＭはＢに結合している。一部の実施形態では、ＭはＣ末端ポリアルギニンの位置でＢに結合している。一部の実施形態では、Ｍは共有結合によりＢ（または、Ｃ末端ポリアルギニン）に結合している。一部の実施形態では、共有結合は、エーテル結合、チオエーテル結合、アミン結合、アミド結合、炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、炭素−酸素結合、または炭素−硫黄結合を含む。
【０１２６】
一部の実施形態では、Ｍは、タンパク質、合成または天然ポリマー、またはデンドリマーから選択される。一部の実施形態では、Ｍは、デキストラン、ＰＥＧポリマー（例えば、ＰＥＧ  ５ｋＤａおよびＰＥＧ  １２ｋＤａ）、アルブミン、またはそれらの組み合わせから選択される。一部の実施形態では、ＭはＰＥＧポリマーである。
【０１２７】
一部の実施形態では、キャリアのサイズは、５０〜７０ｋＤである。一部の実施形態では、滑液の取り込みを生じることなく、少量の負電荷がペプチドを肝臓の外側に維持する。
【０１２８】
一部の実施形態では、選択的輸送分子は、アルブミンに結合している。特定の例では、アルブミンは正常な生理学的条件下で糸球体濾液から排出される。一部の実施形態では、選択的輸送分子は、アルブミンと共有結合共役体を形成することが可能なマレイミド等の反応性基を含む。アルブミン含有選択的輸送分子は、切断依存的な方法で腫瘍中の切断された選択的輸送分子の蓄積を強化する。実施例２参照。一部の実施形態では、アルブミン共役体は、良好な薬物動態学的特性を有するが、化学合成で取扱うのは難しい。
【０１２９】
一部の実施形態では、選択的輸送分子はＰＥＧポリマーに結合している。一部の実施形態では、選択的輸送分子はＰＥＧ５ｋＤａポリマーに結合している。一部の実施形態では、選択的輸送分子はＰＥＧ１２ｋＤａポリマーに結合している。一部の実施形態では、５ｋＤ  ＰＥＧ共役体は遊離ペプチドと同様の挙動を示した。一部の実施形態では、１２ｋＤ  ＰＥＧ共役体は、遊離ペプチドに比べ長い半減期を有していた。ＰＥＧポリマーを使った効果の詳細分析に関しては、実施例５を参照のこと。
【０１３０】
一部の実施形態では、選択的輸送分子はデキストランに結合している。一部の実施形態では、選択的輸送分子は７０ｋＤａデキストランに結合している。一部の実施形態では、種々分子量の混合体になるため、デキストラン共役体は合成と純度の再現が困難である。デキストランを使った効果の詳細分析に関しては、実施例５を参照のこと。
【０１３１】
一部の実施形態では、選択的輸送分子はストレプトアビジンに結合している。ストレプトアビジンを使った効果の詳細分析に関しては、実施例５を参照のこと。
【０１３２】
一部の実施形態では、選択的輸送分子は第５世代ＰＡＭＡＭデンドリマーに結合している。デンドリマーを使った効果の詳細分析に関しては、実施例５を参照のこと。
【０１３３】
血漿中半減期および取り込みの変化に関しては、表３を参照のこと。
【０１３４】
【表３】
2012533560.tif 000011
【０１３５】
一部の実施形態では、キャリアはキャップされている。キャッピング法については、実施例１参照。一部の実施形態では、キャリアのキャッピングは薬物動態学を改善し、親水性を与えることによりキャリアの細胞毒性を減少させる。一部の実施形態では、キャップはアセチル、スクシニル、３−ヒドロキシプロピオニル、２−スルホベンゾイル、グリシジル、ＰＥＧ−２、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−８およびＰＥＧ−１２から選択される。キャッピング効果の詳細分析については、実施例６を参照のこと。
【０１３６】
デンドリマー
本明細書の特定の実施形態では、選択的輸送分子が開示される。一部の実施形態では、本明細書で開示される選択的輸送分子は、式（Ａ−Ｘ−Ｂ）ｎ−Ｄを有し、Ｄは、デンドリマーであり；Ａは、５〜９個の連続した酸性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり、該アミノ酸は、アスパルタートおよびグルタマートから選択され；Ｂは、５〜２０個の連続した塩基性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり；Ｘは、リンカーであり；かつｎは１〜２０の整数であり；Ｄは、Ｂとの結合により（Ａ−Ｘ−Ｂ）成分と結合している。一部の実施形態では、Ｄは、ポリアルギニン末端との結合により（Ａ−Ｘ−Ｂ）成分と結合している。一部の実施形態では、Ｄは少なくとも１つの積荷成分を含む。ペプチドのデンドリマーとの共役化の方法に付いては、実施例１を参照のこと。
【０１３７】
本明細書で使われる「デンドリマー」は、多官能性（または多分岐）分子を意味する。一部の実施形態では、デンドリマーは、中心分子が何回も繰り返して分岐する構造である。一部の実施形態では、デンドリマーはナノ粒子である。
【０１３８】
一部の実施形態では、Ｄは、共有結合でＢ（またはＣ末端ポリアルギニン）に結合している。一部の実施形態では、共有結合は、エーテル結合、チオエーテル結合、アミン結合、アミド結合、炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、炭素−酸素結合、または炭素−硫黄結合を含む。
【０１３９】
一部の実施形態では、複数の（Ａ−Ｘ−Ｂ）成分がＤに結合している。実施例３を参照。一部の実施形態では、複数の積荷成分がＤに結合している。一部の実施形態では、（ａ）複数の（Ａ−Ｘ−Ｂ）成分がＤに結合し、（ｂ）複数の積荷成分がＤに結合している。
【０１４０】
一部の実施形態では、デンドリマーは、アルブミンと共有結合共役体を形成可能なマレイミド等の反応性基を含む。一部の実施形態では、デンドリマーは、選択的輸送分子のＣ末端でマレイミドリンカーを介して選択的輸送分子と共役される。
【０１４１】
一部の実施形態では選択的輸送分子のデンドリマーに対する共役により、非共役（または遊離）選択的輸送分子に比べ、血漿中半減期が増加する。一部の実施形態では、選択的輸送分子のデンドリマーに対する共役により、非共役選択的輸送分子に比べ、急性の毒性が減少する。一部の実施形態では、選択的輸送分子のデンドリマーに対する共役により、非共役選択的輸送分子に比べ、滑膜、軟骨および腎臓による取り込みが減少する。
【０１４２】
一部の実施形態では、デンドリマーナノ粒子に共役した選択的輸送分子は、マクロファージ関連腫瘍の標的化に使われる。一部の実施形態では、さらにリシンＡを含むデンドリマーナノ粒子に共役した選択的輸送分子は、皮下マクロファージを毒殺するのに使われる。デンドリマーナノ粒子使用効果の詳細分析については、実施例７を参照のこと。
【０１４３】
積荷
本明細書の特定の実施形態では、インビボ循環の増加した選択的輸送分子が開示される。
【０１４４】
一部の実施形態では、本明細書で開示される選択的輸送分子は、式（Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｃ）−Ｍを有し、式中、Ｃは積荷成分であり；Ａは、５〜９個の連続した酸性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり、該アミノ酸は、アスパルタートおよびグルタマートから選択され；Ｂは、５〜２０個の連続した塩基性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり；Ｘは、リンカーであり；かつＭは、高分子キャリアである。
【０１４５】
一部の実施形態では、本明細書で開示される選択的輸送分子は、式（Ａ−Ｘ−Ｂ）−Ｄを有し、式中、Ｃは積荷成分であり；Ａは、５〜９個の連続した酸性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり、該アミノ酸は、アスパルタートおよびグルタマートから選択され；Ｂは、５〜２０個の連続した塩基性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり；Ｘは、リンカーであり；かつＤは、デンドリマーである。一部の実施形態では、Ｄは、積荷成分を含む。選択的輸送分子に標識を付加する方法については実施例１を参照のこと。
【０１４６】
本明細書で開示される選択的輸送分子は、細胞への取り込みのための異なるタイプの積荷および同じタイプの積荷の異なる種を含む各種の積荷を運ぶのに適している。例えば、異なるタイプの積荷には、マーカー積荷（例えば、蛍光または放射性の標識成分）および治療用積荷（例えば、化学療法用分子、例えば、メトトレキサートまたはドキソルビシン）、またはその他の積荷を含むことができる。異常または病的細胞の破壊が治療で必要な場合、治療の積荷に、「細胞傷害性薬剤」、すなわち細胞の機能を阻害または防止しおよび／または細胞破壊を生じる物質を含むこともできる。
【０１４７】
蛍光分子等の積荷の送達は、特定の条件を有する細胞または特殊な状態を示す領域中の細胞を可視化するために使うことができる。例えば、血栓症（血栓形成）は、蛍光またはその他のマーカーを含む積荷をその領域に送達するために、リンカーＸが血液血栓形成カスケード中の多くのプロテアーゼ中のどれかにより切断されるように設計することにより可視化可能である。同様に、補体活性化も、蛍光またはその他のマーカーをその領域に送達するために、リンカーＸが補体活性化カスケード中のいずれか１つまたは複数のプロテアーゼにより切断されるように設計することにより可視化可能である。このように、蛍光分子は、リンカーＸの切断によるＡ部の放出の際に標的細胞および領域に送達されうるマーカーの一例である。
【０１４８】
一部の実施形態では、積荷成分は、造影剤、治療薬、脂質、またはこれらの組み合わせから選択される。
【０１４９】
一部の実施形態では、積荷部分は少なくとも２つの積荷成分を含む。一部の実施形態では、Ｃはマーカー積荷および治療用の積荷を含む。複数の積荷成分は、例えば、放射性マーカーおよび超音波またはコントラスト剤の両方の送達を可能とし、異なるモードで画像化できる。あるいは、例えば、抗癌薬剤と一緒の放射性積荷の送達により強化された抗癌活性が得られ、または蛍光積荷を伴った放射性積荷の送達により積荷を取り込んだ細胞を見つけ出し特定する複数の手段を可能にする。
【０１５０】
積荷成分の付加
積荷成分は、どのような位置でも配向ででもＢに付加される。積荷成分を、リンカーＸの反対側のＢ部末端に配置する必要はない。Ｘが切断された後にその付加部が残される限りは、積荷成分のＢへの付加の位置はどこであっても許容される。例えば、図２Ａおよび２Ｂに示すように、Ｂ部の反対側末端に結合したリンカーＸを有するＢ部の末端またはその近くに付加してもよい。また、積荷成分を、Ｂ部の同じ側の末端またはその近くに結合したリンカーＸを有するＢ部の末端またはその近くに付加してもよい。
【０１５１】
分子がデンドリマーを含む場合は、積荷は直接Ｄに付加される。非限定的例であるが、積荷は次のように付加される：
（Ａ−Ｘ−Ｂ）−Ｄ−積荷。
【０１５２】
一部の実施形態では、積荷成分は、Ｂ（もしくは、Ｃ末端ポリアルギニン）またはＤに共有結合する。一部の実施形態では、共有結合は、エーテル結合、チオエーテル結合、アミン結合、アミド結合、炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、炭素−酸素結合、または炭素−硫黄結合を含む。
【０１５３】
積荷としての造影剤
一部の実施形態では、積荷成分は蛍光分子、例えば、フルオレセインである。蛍光積荷成分は、蛍光顕微鏡または未固定培養細胞のフローサイトメトリーの測定を容易にする。
【０１５４】
一部の実施形態では、積荷成分を、下記を使って標識付けする：ポジトロン放射型断層撮影法（ＰＥＴ）用陽電子放出アイソトープ（例えば、１８Ｆ）、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）用ガンマ線アイソトープ（例えば、９９ｍＴｃ）、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）用常磁性分子またはナノ粒子（例えば、Ｇｄ３＋キレートまたは被覆マグネタイトナノ粒子）、近赤外（ｎｅａｒ−ＩＲ）画像化用近赤外フルオロフォア、バイオルミネセンス画像化用ルシフェラーゼ（ホタル、細菌、または腔腸動物）またはその他の発光分子、または超音波用パーフルオロカーボン充填小胞。
【０１５５】
一部の実施形態では、積荷成分は放射性の成分、例えば、２１１Ａｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ、Ｌｕの放射性アイソトープ、およびその他のもの等の放射性アイソトープである。
【０１５６】
一部の実施形態では、積荷成分は蛍光成分、例えば、蛍光タンパク質、ペプチド、または蛍光染料分子である。一般的な蛍光染料には、限定されないが、キサンテン、例えば、ローダミン、ロドールおよびフルオレセイン、およびそれらの誘導体；ビマン；クマリンおよびそれらの誘導体、例えば、ウンベリフェロンおよびアミノメチルクマリン；芳香族アミン、例えば、ダンシル；スクアラート染料；ベンゾフラン；蛍光シアニン；カルバゾール；ジシアノメチレンピラン、ポリメチン、オキサベンゾアントラン、キサンテン、ピリリウム、カルボスチル、ペリレン、アクリドン、キナクリドン、ルブレン、アントラセン、コロネン、フェナントレセン、ピレン、ブタジエン、スチルベン、ランタニド金属キレート錯体類、希土類金属キレート錯体類、およびこのような染料の誘導体が挙げられる。蛍光染料は、例えば米国特許第４，４５２，７２０号、米国特許第５，２２７，４８７号、および米国特許第５，５４３，２９５号で考察されている。
【０１５７】
一部の実施形態では、積荷成分はフルオレセイン染料である。典型的フルオレセイン染料には、限定されないが、５−カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン−５−イソチオシアナートおよび６−カルボキシフルオレセインが含まれる；他のフルオレセイン染料の例は、例えば、米国特許第６，００８，３７９号、米国特許第５，７５０，４０９号、米国特許第５，０６６，５８０号、および米国特許第４，４３９，３５６号に認められる。積荷成分Ｃには、ローダミン染料、例えば、テトラメチルローダミン−６−イソチオシアナート、５−カルボキシテトラメチルローダミン、５−カルボキシロドール誘導体、テトラメチルおよびテトラエチルローダミン、ジフェニルジメチルおよびジフェニルジエチルローダミン、ジナフチルローダミン、ローダミン１０１塩化スルホニル（ＴＥＸＡＳＲＥＤ（登録商標）の商品名で販売されている）、およびその他のローダミン染料等が含まれてもよい。他のローダミン染料は、例えば、米国特許第６，０８０，８５２号、米国特許第６，０２５，５０５号、米国特許第５，９３６，０８７号、米国特許第５，７５０，４０９号に認められる。積荷成分Ｃには、シアニン染料、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７等を含んでもよい。
【０１５８】
上記化合物またはその誘導体の一部には、蛍光に加えてリン光を、またはリン光のみを発するものがある。一部のリン光化合物には、ポルフィリン、フタロシアニン、多環芳香族化合物、例えば、ピレン、アントラセンおよびアセナフテン、等が含まれ、これらは積荷成分であっても、積荷成分に含まれてもよい。積荷成分は、同様に、蛍光消光剤、例えば、（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）基、等であっても、これを含んでもよい。
【０１５９】
一部の実施形態では、積荷成分は、蛍光標識である。一部の実施形態では、積荷成分は、インドカルボシアニン染料、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＩＲＤＹＥ８００ＣＷ、ＡＬＥＸＡ６４７、またはこれらの組み合わせである。一部の実施形態では、積荷成分は、ＭＲＩコントラスト剤である。一部の実施形態では、積荷成分は、［４，７，１０−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカ−１−イル］アセチルのＧｄ錯体である。
【０１６０】
一部の実施形態では、積荷成分は分子標識の全体または一部である。本明細書で使われる「分子標識」は、フルオロフォアおよび蛍光消光剤と相補的な領域を有する一対の結合化合物を意味し、フルオロフォアの蛍光は消光剤によって消光される。相補的な領域の１つまたは両方が積荷成分の一部であってもよい。相補的な領域（例えば、蛍光成分）の１つのみが積荷成分の一部であり、消光剤成分がリンカーＸまたは酸性のＡ部の一部である場合、リンカーＸの切断は、蛍光部分の蛍光発光を許容し、切断の検出を可能とするであろう。細胞による取り込みの場合は、分子標識の蛍光部分が細胞の検出を可能とするであろう。例えば、消光剤Ｑは酸性のＡ部に付加し本発明Ｑ−Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｃ（積荷は蛍光でＱによって消光される）の特徴を有する選択的輸送分子を形成できる。積荷成分のＱによる消光はＸの切断によって解放され、細胞が取り込んだＢ−Ｃ部のマーキングを可能にする。蛍光消光と選択的取り込みの組み合わせは、Ｘを切断できないものに比べ、Ｘ切断可能組織間のコントラストを増加させるはずである。 
【０１６１】
積荷としての治療薬
一部の実施形態では、積荷成分は治療薬、例えば、癌、虚血組織、または壊死組織の治療に有用な化合物である。
【０１６２】
治療用として、例えば、適切な種類の積荷には、限定されないが、ａ）化学療法剤；ｂ）放射線増感剤；またはｃ）アポトーシス、細胞周期、またはその他の重大なシグナル伝達カスケードを調節するペプチドまたはタンパク質、が含まれる。
【０１６３】
一部の実施形態では、積荷成分は細胞死（例えば、アポトーシスまたは壊死を介した）を調節する薬剤である。一部の実施形態では、積荷成分はアポトーシス促進剤である。一部の実施形態では、薬剤は抗アポトーシス剤である。一部の実施形態では、薬剤は、以下から選択される：ミノサイクリン；ＳＢ−２０３５８０（４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）１Ｈ−イミダゾール）；ＰＤ  １６９３１６（４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−ニトロフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール）；ＳＢ  ２０２１９０（４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−ピリジル）１Ｈ−イミダゾール）；ＲＷＪ  ６７６５７（４−［４−（４−フルオロフェニル）−１−（３−フェニルプロピル）−５−（４−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−３−ブチン−１−オール）；ＳＢ  ２２００２５（５−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−４−（４−フルオロフェニル）−１−（４−ピペリジンリル（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｌｙｌ））イミダゾール）；Ｄ−ＪＮＫＩ−１（（Ｄ）−ｈＪＩＰ１７５−１５７−ＤＰｒｏ−ＤＰｒｏ−（Ｄ）−ＨＩＶ−ＴＡＴ５７−４８）；ＡＭ−１１１（Ａｕｒｉｓ）；ＳＰ６００１２５（アントラ［１，９−ｃｄ］ピラゾール−６（２Ｈ）−オン）；ＪＮＫ阻害剤Ｉ（（Ｌ）−ＨＩＶ−ＴＡＴ４８−５７−ＰＰ−ＪＢＤ２０）；ＪＮＫ阻害剤ＩＩＩ（（Ｌ）−ＨＩＶ−ＴＡＴ４７−５７−ｇａｂａ−ｃ−Ｊｕｎδ３３−５７）；ＡＳ６０１２４５（１，３−ベンゾチアゾール−２−イル（２−［［２−（３−ピリジニル）エチル］アミノ］−４ピリミジニル）アセトニトリル）；ＪＮＫ阻害剤ＶＩ（Ｈ２Ｎ−ＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦ−ＮＨ２）；ＪＮＫ阻害剤ＶＩＩＩ（Ｎ−（４−アミノ−５−シアノ−６−エトキシピリジン−２−イル）−２−（２，５−ジメトキシフェニル）アセトアミド）；ＪＮＫ阻害剤ＩＸ（Ｎ−（３−シアノ−４，５，６，７−テトラヒドロ−１−ベンゾチエン−２−イル）−１−ナフトアミド）；ジクマロール（３，３'−メチレンビス（４−ヒドロキシクマリン））；ＳＣ−２３６（４−［５−（４−クロロフェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］ベンゼン−スルホンアミド）；ＣＥＰ−１３４７（Ｃｅｐｈａｌｏｎ）；ＣＥＰ−１１００４（Ｃｅｐｈａｌｏｎ）；少なくともＢｃｌ−２ポリペプチドの一部を含む人工タンパク質；組換え型ＦＮＫ；Ｖ５（Ｂａｘ阻害剤ペプチドＶ５としても知られる）；Ｂａｘチャンネル遮断薬（（±）−１−（３，６−ジブロモカルバゾール−９−イル）−３−ピペラジン−１−イル−プロパン−２−オール）；Ｂａｘ阻害ペプチドＰ５（Ｂａｘ阻害剤ペプチドＰ５としても知られる）；Ｋｐ７−６；ＦＡＩＭ（Ｓ）（Ｆａｓアポトーシス阻害性分子−ｓｈｏｒｔ）；ＦＡＩＭ（Ｌ）（Ｆａｓアポトーシス阻害性分子−ｌｏｎｇ）；Ｆａｓ：Ｆｃ；ＦＡＰ−１；ＮＯＫ２；Ｆ２０５１；Ｆ１９２６；Ｆ２９２８；ＺＢ４；ＦａｓＭ３ｍＡｂ；ＥＧＦ；７４０Ｙ−Ｐ；ＳＣ３０３６（ＫＫＨＴＤＤＧＹＭＰＭＳＰＧＶＡ）；ＰＩ３−キナーゼ活性化因子（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．）；Ｐａｍ３Ｃｙｓ（（Ｓ）−（２，３−ビス（パルミトイルオキシ）−（２ＲＳ）−プロピル）−Ｎ−パルミトイル−（Ｒ）−Ｃｙｓ−（Ｓ）−Ｓｅｒ（Ｓ）−Ｌｙｓ４−ＯＨ、トリヒドロクロリド）；Ａｃｔ１（ＮＦ−ｋＢ活性化因子１）；抗ＩｋＢ抗体；アセチル−１１−ケト−ｂ−ボスウェル酸；アンドログラホリド；カフェー酸フェネチルエステル（ＣＡＰＥ）；グリオトキシン；イソヘレニン；ＮＥＭＯ−結合ドメイン結合ペプチド
2012533560.tif 000012
；ＮＦ−ｋＢ活性化阻害剤（６−アミノ−４−（４−フェノキシフェニルエチルアミノ）キナゾリン）；ＮＦ−ｋＢ活性化阻害剤ＩＩ（４−メチル−Ｎ１−（３−フェニルプロピル）ベンゼン−１，２−ジアミン）；ＮＦ−ｋＢ活性化阻害剤ＩＩＩ（３−クロロ−４−ニトロ−Ｎ−（５−ニトロ−２−チアゾリル）−ベンズアミド）；ＮＦ−ｋＢ活性化阻害剤ＩＶ（（Ｅ）−２−フルオロ−４'−メトキシスチルベン）；ＮＦ−ｋＢ活性化阻害剤Ｖ（５−ヒドロキシ−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−１Ｈ−イソインドール−１，３−ジオン）；ＮＦ−ｋＢＳＮ５０
2012533560.tif 000013
；オリドニン；パルテノライド；ＰＰＭ−１８（２−ベンゾイルアミノ−１，４−ナフトキノン）；Ｒｏ１０６−９９２０；スルファサラジン；ＴＩＲＡＰ阻害剤ペプチド
2012533560.tif 000014
；ウィタフェリンＡ；ウォゴニン；ＢＡＹ１１−７０８２（（Ｅ）３−［（４−メチルフェニル）スルホニル］−２−プロペンニトリル）；ＢＡＹ１１−７０８５（（Ｅ）３−［（４−ｔ−ブチルフェニル）スルホニル］−２−プロペンニトリル）；（Ｅ）−カプサイシン；金チオリンゴ酸（ＡＴＭまたはＡｕＴＭ）；エボジアミン；ヒポエストキシド；ＩＫＫ阻害剤ＩＩＩ（ＢＭＳ−３４５５４１）；ＩＫＫ阻害剤ＶＩＩ；ＩＫＫ阻害剤Ｘ；ＩＫＫ阻害剤ＩＩ；ＩＫＫ−２阻害剤ＩＶ；ＩＫＫ−２阻害剤Ｖ；ＩＫＫ−２阻害剤ＶＩ；ＩＫＫ−２阻害剤（ＳＣ−５１４）；ＩｋＢキナーゼ阻害剤ペプチド；ＩＫＫ−３阻害剤ＩＸ；ＡＲＲＹ−７９７（Ａｒｒａｙ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ）；ＳＢ−２２００２５（５−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−４−（４−フルオロフェニル）−１−（４−ピペリジンリル）イミダゾール）；ＳＢ−２３９０６３（トランス−４−［４−（４−フルオロフェニル）−５−（２−メトキシ−４−ピリミジニル）−１Ｈ−イミダゾール−１−イル］シクロヘキサノール）；ＳＢ−２０２１９０（４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−ピリジル）１Ｈ−イミダゾール）；ＪＸ−４０１（−［２−メトキシ−４−（メチルチオ）ベンゾイル］−４−（フェニルメチル）ピペリジン）；ＰＤ−１６９３１６（４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−ニトロフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール）；ＳＫＦ−８６００２（６−（４−フルオロフェニル）−２，３−ジヒドロ−５−（４−ピリジニル）イミダゾ［２，１−ｂ］チアゾールジヒドロクロリド）；ＳＢ−２００６４６（Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−インドール−５−イル）−Ｎ'−３−ピリジニル尿素）；ＣＭＰＤ−１（２'−フルオロ−Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）−［１，１'−ビフェニル］−４−ブタンアミド）；ＥＯ−１４２８（（２−メチルフェニル）−［４−［（２−アミノ−４−ブロモフェニル）アミノ］−２−クロロフェニル］メタノン）；ＳＢ−２５３０８０（４−［５−（４−フルオロフェニル）−２−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］ピリジン）；ＳＤ−１６９（１Ｈ−インドール−５−カルボキサミド）；ＳＢ−２０３５８０（４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）１Ｈ−イミダゾール）；ＴＺＰ−１０１（Ｔｒａｎｚｙｍｅ  Ｐｈａｒｍａ）；ＴＺＰ−１０２（Ｔｒａｎｚｙｍｅ  Ｐｈａｒｍａ）；ＧＨＲＰ−６（成長ホルモン放出ペプチド−６）；ＧＨＲＰ−２（成長ホルモン放出ペプチド−２）；ＥＸ−１３１４（Ｅｌｉｘｉｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＭＫ−６７７（Ｍｅｒｃｋ）；Ｌ−６９２，４２９（ブタンアミド、３−アミノ−３−メチル−Ｎ−（２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−１−（（２'−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）（１，１'−ビフェニル）−４−イル）メチル）−１Ｈ−１−ベンゾアゼピン−３−イル）−、（Ｒ）−）；ＥＰ１５７２（Ａｉｂ−ＤＴｒｐ−ＤｇＴｒｐ−ＣＨＯ）；ジルチアゼム；ジルチアゼムの代謝物；ＢＲＥ（脳および生殖器官発現タンパク質）；ベラパミル；ニモジピン；��ルチアゼム；オメガコノトキシン；ＧＶＩＡ；アムロジピン；フェロジピン；ラシジピン；ミベフラジル；ＮＰＰＢ（５−ニトロ−２−（３−フェニルプロピルアミノ）安息香酸）；フルナリジン；エリトロポイエチン；ピペリン；ヘミン；ブラジリン；ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ（ベンジルオキシカルボニル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−フルオロメチルケトン）；ｚ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫ（ベンジルオキシカルボニル−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｈｉｓ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−フルオロメチルケトン）；Ｂ−Ｄ−ＦＭＫ（ｂｏｃ−アスパルチル（Ｏｍｅ）−フルオロメチルケトン）；Ａｃ−ＬＥＨＤ−ＣＨＯ（Ｎ−アセチル−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−ＣＨＯ）；Ａｃ−ＩＥＴＤ−ＣＨＯ（Ｎ−アセチル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−ＣＨＯ）；ｚ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫ（ベンジルオキシカルボニル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｔｈｒ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−フルオロメチルケトン）；ＦＡＭ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫ（ベンジルオキシカルボニルＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−フルオロメチルケトン）；ＦＡＭ−ＬＥＴＤ−ＦＭＫ（ベンジルオキシカルボニルＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−フルオロメチルケトン）；Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨ（キノリン−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ２−Ｏ−Ｐｈ）；ＸＩＡＰ；ｃＩＡＰ−１；ｃＩＡＰ−２；ＭＬ−ＩＡＰ；ＩＬＰ−２；ＮＡＩＰ；サバイビン；Ｂｒｕｃｅ；ＩＡＰＬ−３；ホルチリン；ロイペプチン；ＰＤ−１５０６０６（３−（４−ヨードフェニル）−２−メルカプト−（Ｚ）−２−プロペン酸）；ＭＤＬ−２８１７０（Ｚ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−ＣＨＯ）；カルペプチン；アセチルカルパスタチン；ＭＧ１３２（Ｎ−［（フェニルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−ロイシル−Ｎ−［（１Ｓ）−１−ホルミル−３−メチルブチル］−Ｌ−ロイシンアミド）；ＭＹＯＤＵＲ；ＢＮ８２２７０（Ｉｐｓｅｎ）；ＢＮ２２０４（Ｉｐｓｅｎ）；ＡＨＬｉ−１１（Ｑｕａｒｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ｍｄｍ２タンパク質、ピフィスリン−α（１−（４−メチルフェニル）−２−（４，５，６，７−テトラヒドロ−２−イミノ−３（２Ｈ）−ベンゾチアゾリル）エタノン）；トランス−スチルベン；シス−スチルベン；リスベラトロール；ピセタノール；ラポンチン；デオキシラポンチン；ブテイン；カルコン；イソリキルチゲン；ブテイン；４，２' ，４'−トリヒドロキシカルコン；３，４，２' ，４' ，６'−ペンタヒドロキシカルコン；フラボン；モリン；フィセチン；ルテオリン；ケルセチン；ケンフェロール；アピゲニン；ゴッシペチン；ミリセチン；６−ヒドロキシアピゲニン；５−ヒドロキシフラボン；５，７，３' ，４' ，５'−ペンタヒドロキシフラボン；３，７，３' ，４' ，５'−ペンタヒドロキシフラボン；３，６，３' ，４'−テトラヒドロキシフラボン；７，３' ，４' ，５'−テトラヒドロキシフラボン；３，６，２' ，４'−テトラヒドロキシフラボン；７，４'−ジヒドロキシフラボン；７，８，３' ，４'−テトラヒドロキシフラボン；３，６，２' ，３'−テトラヒドロキシフラボン；４'−ヒドロキシフラボン；５−ヒドロキシフラボン；５，４'−ジヒドロキシフラボン；５，７−ジヒドロキシフラボン；ダイゼイン；ゲニステイン；ナリンゲニン；��ラバノン；３，５，７，３' ，４'−ペンタヒドロキシフラバノン；ペラルゴニジン塩化物；シアニジン塩化物；デルフィニジン塩化物；（−）−エピカテキン（水酸基部位：３、５、７、３'、４'）；（−）−カテキン（水酸基部位：３、５、７、３'、４'）；（−）−ガロカテキン（水酸基部位：３、５、７、３'、４'、５'）（＋）−カテキン（水酸基部位：３、５、７、３'、４'）；（＋）−エピカテキン（水酸基部位：３、５、７、３'、４'）；ヒノキチオール（ｂ−ツジャプリシン；２−ヒドロキシ−４−イソプロピル−２，４，６−シクロヘプタトリエン−１−オン）；Ｌ−（＋）−エルゴチオネイン（（Ｓ）−ａ−カルボキシ−２，３−ジヒドロ−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチル−２−チオキソ−１Ｈ−イミダゾール４−エタンアミニウム内塩）；カフェー酸フェニルエステル；ＭＣＩ−１８６（３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン）；ＨＢＥＤ（Ｎ，Ｎ'−ジ−（２−ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ'−ジ酢酸・Ｈ２Ｏ）；アンブロキソール（トランス−４−（２−アミノ−３，５−ジブロモベンジルアミノ）シクロヘキサン−ＨＣｌ；およびＵ−８３８３６Ｅ（（−）−２−（（４−（２，６−ジ−１−ピロリジニル−４−ピリミジニル）−１−ピペルザイニル）メチル）−３，４−ジヒドロ−２，５，７，８−テトラメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−６−オール・２ＨＣｌ）；β−１'−５−メチルニコチンアミド−２'−デオキシリボース；β−Ｄ−１'−５−メチルニコチンアミド−２'−デオキシリボフラノシド；β−１'−４，５−ジメチルニコチンアミド−２'−デオキシリボース；β−Ｄ−１'−４，５−ジメチルニコチンアミド−２'−デオキシリボフラノシド；１−ナフチルＰＰ１（１−（１，１−ジメチルエチル）−３−（１−ナフタレニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン）；ラベンズスチンＡ（５−［［（２，５−ジヒドロキシフェニル）メチル］［（２−ヒドロキシフェニル）メチル］アミノ］−２−ヒドロキシ安息香酸）；ＭＮＳ（３，４−メチレンジオキシ−ｂ−ニトロスチレン）；ＰＰ１（１−（１，１−ジメチルエチル）−１−（４−メチルフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン）；ＰＰ２（３−（４−クロロフェニル）１−（１，１−ジメチルエチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン）；ＫＸ−００４（Ｋｉｎｅｘ）；ＫＸ−００５（Ｋｉｎｅｘ）；ＫＸ−１３６（Ｋｉｎｅｘ）；ＫＸ−１７４（Ｋｉｎｅｘ）；ＫＸ−１４１（Ｋｉｎｅｘ）；ＫＸ２−３２８（Ｋｉｎｅｘ）；ＫＸ−３０６（Ｋｉｎｅｘ）；ＫＸ−３２９（Ｋｉｎｅｘ）；ＫＸ２−３９１（Ｋｉｎｅｘ）；ＫＸ２−３７７（Ｋｉｎｅｘ）；ＺＤ４１９０（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ；Ｎ−（４−ブロモ−２−フルオロフェニル）−６−メトキシ−７−（２−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）エトキシ）キナゾリン−４−アミン）；ＡＰ２２４０８（Ａｒｉａｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＡＰ２３２３６（Ａｒｉａｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＡＰ２３４５１（Ａｒｉａｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＡＰ２３４６４（Ａｒｉａｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ���；ＡＺＤ０５３０（Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ）；ＡＺＭ４７５２７１（Ｍ４７５２７１；Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ）；ダサチニブ（Ｎ−（２−クロロ−６−メチルフネイル（ｍｅｔｈｙｌｐｈｎｅｙｌ））−２−（６−（４−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−１−イル）−２−メチルピリミジン−４−イルアミノ）チアゾール−５−カルボキサミド）；ＧＮ９６３（トランス−４−（６，７−ジメトキシキノキサリン−２イルアミノ）シクロヘキサノール硫酸塩）；ボスチニブ（４−（（２，４−ジクロロ−５−メトキシフェニル）アミノ）−６−メトキシ−７−（３−（４−メチル−１−ピペラジニル）プロポキシ）−３−キノリンカルボニトリル）；またはこれらの組み合わせ。
【０１６４】
一部の実施形態では、積荷成分は細胞傷害性薬剤である。一部の実施形態では、積荷成分は、マイタンシン、メトトレキサート（ＲＨＥＵＭＡＴＲＥＸ（登録商標）、アメトプテリン）；シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））；サリドマイド（ＴＨＡＬＩＤＯＭＩＤ（登録商標））；パクリタキセル；ペメトレキセド；ペントスタチン；ピポブロマン；ピクサントロン；プリカマイシン；プロカルバジン；プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）；ラルチトレキセド；レベッカマイシン；ルビテカン；ＳＮ−３８；サリノスポラミドＡ；サトラプラチン；ストレプトゾトシン；スウェインソニン；タリキダル；タキサン；テガフール−ウラシル；テモゾロミド；テストラクトン；チオテパ；チオグアニン；トポテカン；トラベクテジン；トレチノイン；トリプラチンテトラニトラート；トリス（２−クロロエチル）アミン；トロキサシタビン；ウラシルマスタード；バルルビシン；ビンブラスチン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ボリノスタット；ゾスキダル；またはそれらの組み合わせである。
【０１６５】
積荷としての脂質
本明細書の特定の実施形態では、選択的輸送分子が開示される。一部の実施形態では、本明細書で開示される選択的輸送分子は、式（Ａ−Ｘ−Ｂ）ｎ−Ｌを有し、Ｌは脂質であり；Ａは、５〜９個の連続した酸性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり、該アミノ酸は、アスパルタートおよびグルタマートから選択され；Ｂは、５〜２０個の連続した塩基性アミノ酸を含む配列を有するペプチドであり；Ｘは、リンカーである。脂質でカプセル化した治療薬を積荷として使用する効果の詳細分析については実施例４を参照のこと。
【０１６６】
一部の実施形態では、Ｌは共有結合によりＢ（または、Ｃ末端ポリアルギニン）に結合している。一部の実施形態では、共有結合には、エーテル結合、チオエーテル結合、アミン結合、アミド結合、炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、炭素−酸素結合、または炭素−硫黄結合が含まれる。一部の実施形態では、Ｌは非共有結合の相互作用でＢに結合している。
【０１６７】
一部の実施形態では、複数の（Ａ−Ｘ−Ｂ）成分がＬに結合している。実施例３参照。一部の実施形態では、複数の積荷成分がＬによりカプセル化される。一部の実施形態では、（ａ）複数の（Ａ−Ｘ−Ｂ）成分がＬに結合し；（ｂ）複数の積荷成分がＬによりカプセル化される。
【０１６８】
一部の実施形態では、脂質は疎水性の分子を封入する。一部の実施形態では脂質は治療成分または画像化成分からなる群より選択される少なくとも１つの薬剤を封入する。一部の実施形態では、薬剤はドキソルビシンである。一部の実施形態では、薬剤はパクリタキセルである。一部の実施形態では、薬剤はタモキシフェンである。一部の実施形態では、薬剤は下記から選択される：アロキシプリン、アセブトロール、アセタゾラミド、アセトヘキサミド、アクリバスチン、アルベンダゾール、アロプリノール、アルプラゾラム、アルプレノロール、アミロリド、アミノグルテチミド、アミオダロンＨＣｌ、アムロジピン、アモジアキン、アモキサピン、アンフェタミン、アムホテリシン、アムリノン、アムサクリン、アミルニトラート、アミロバルビトン、アステミゾール、アテノロール、アトロピン、アウラノフィン、アザプロパゾン、アザチオプリン、バルビトン、ベクルアミド、ベクロメタゾン、ベンドロフルアジド、ベニジピン、ベノリラート、ベンタゼパム、ベンズヘキソールＨＣｌ、ベンズニダゾール、ベフェニウムヒドロキシナフトアート、ベタカロテン、ベタメタゾン、ベザフィブラート、ビペリデン、ビサコジル、ブロマゼパム、ブロモクリプチンメシレート、ブロンペリドール、ブロチゾラム、ブデソニド、ブメタニド、ブスルファン、ブトバルビトン、ブトコナゾールニトラート、カンベンダゾール、カルバマゼピン、カルビマゾール、カルブロマール、クロランブシル、クロルジアゼポキシド、クロルメチアゾール、クロロキン、クロロチアジド、クロルプログアニルＨＣｌ、クロルプロマジン、クロルプロパミド、クロルタリドン、シメチジン、シンナリジン、シノキサシン、シプロフロキサシンＨＣｌ、シサプリド、クラリスロマイシン、クリオキノール、クロバザム、クロファジミン、クロフィブラート、クロミフェンシトラート、クロナゼパム、クロチアゼパム、クロトリマゾール、クロキサシリン、クロザピン、コデイン、抱合型エストロゲン、コルチゾンアセタート、シクリジン、シクロスポリン、シプロヘプタジンＨＣｌ、ダカルバジン、ダナゾール、ダロジピン、デコキナート、デメクロサイクリン、デスオキシメタゾン、デキサメタゾン、デキサンフェタミン、デキスフェンフルラミン、デキストロプロピオキシフェン、ジアモルヒネ、ジアゼパム、ジアゾキシド、ジクロロフェン、ジクマロール、ジフルニサール、ジギトキシン、ジゴキシン、ジヒドロコデイン、ジヒドロエルゴタミンメシレート、ジヨードヒドロキシキノリン、ジリタゼムＨＣｌ、ジロキサニドフロアート、ジメンヒドリナート、ジニトルミド、ジフェノキシラートＨＣｌ、ジピリダモール、ジソピラミド、ドンペリドン、ドキシサイクリン、ドロペリドール、エコナゾールニトラート、エノキシモン、エルゴタミン酒石酸塩、エリスロマイシン、エストラジオール、エストラムスチン、エタクリン酸、エチナマート、エチニルエストラジオール、エチオナミド、エトプロパジンＨＣｌ、エトトイン、エトドラク、エトポシド、ファモチジン、フェロジピン、フェンブフェン、フェンフルラミン、フェノフィブラート、フェノプロフェンカルシム、フレカイニドアセタート、フルコナゾール、フルコルトロン、フルシトシン、フルドロコルチゾンアセタート、フルナニソン、フルナリジンＨＣｌ、フルニソリド、フルニトラゼパム、フルオプロマジン、フルペンチキソールデカノアート、フルフェナジンデカノアート、フルラゼパム、フルルビプロフェン、フルチカソンプロピオナート、フルセミド、フルゾリドン、ゲムフィブロジル、グリベンクラミド、グリクラジド、グリピジド、グリセリルトリニトラート、グリセオフルビン、グアナベンズアセタート、ハロファントリンＨＣｌ、ハロペリドール、ヒドロコルチゾン、ヒヨスチアミン、イブプロフェン、イミペネム、インドメタシン、イソソルビドジニトラート、イソソルビドモノニトラート、イスラジピン、イトラコナゾール、イベルメクチン、ケトコナゾール、ケトプロフェン、ラベタロール、ラナトシドＣ、ロムスチン、ロペルアミド、ロラタジン、ロラゼパム、ロルメタゼパム、マレイン酸リスリド、マプロチリンＨＣｌ、マジンドール．、メベンダゾール、メクロフェナム酸、メクロジンＨＣｌ、メダゼパム、メジゴキシン、メドロキシプロゲステロンアセタート、メフェナム酸、メフロキンＨＣｌ、メルファラン、メペンゾラートブロミド、メプロバマート、メプタジノール、メルカプトプリン、メサラジン、メストラノール、メタドン、メタカロン、メトイン、メトトレキサート、メトスクシミド、メチルフェノバルビトン、メチルプレドニゾロン、メチルテストステロン、マレイン酸メチセルギド、メトラゾン、メトプロロール、メトロニダゾール、ミアンセリンＨＣｌ、ミコナゾール、ミダゾラム、ミノキシジル、マイトマイシン、ミトタン、ミトザントロン、モルヒネ、ナブメトン、ナドロール、ナルブフィン、ナリジクス酸、ナプロキセン、ナタマイシン、ニカルジピンＨＣｌ、ニコウマロン、ニフェジピン、ニモジピン、ニモラゾール、ニトラゼパム、ニトロフラントイン、ニトロフラゾン、ニザチジン、ノルエチステロン、ノルゲストレル、ノルトリプチリンＨＣｌ、ナイスタチン、オメプラゾール、オンダンセトロンＨＣｌ、オルニダゾール、オキサムニキン、オキサンテルエンボナート、オキサトミド、オキサゼパム、オクスカルバゼピン、オクスフェンダゾール、オクスプレノロール、オキシフェンブタゾン、オキシフェンシルシミンＨＣｌ、パクリタキセル、パラメタジオン、ペンタエリトリトールテトラニトラート、ペンタゾシン、ペントバルビトン、ペルフェナジンピモジド、フェナセミド、フェニンジオン、フェノバルビトン、フェノキシベンザミンＨＣｌ、フェンスクシミド、フェニルブタゾン、フェニトイン、ピンドロール、ピロキシカム、マレイン酸ピゾチフェン、プラジクアンテル、プラゾシンＨＣｌ、プレドニゾロン、プレドニゾン、プリミドン、プロベネシド、プロブコール、プロカルバジンＨＣｌ、プロクロルペラジン、プロゲステロン、プログアニルＨＣｌ、プロプラノロール、プロピルチオウラシル、ピランテルエンボナート、ピリメタミン、キニジンスルファート、抗細菌性薬剤：ベネタミンペニシリン、キニーネスルファート、ラニチジンＨＣｌ、レセルピン、リファンピシン、スピラマイシン、スピロノラクトン、スタノゾロール、スチベストロール、スルコナゾールニトラート、スリンダク、スルファベンズアミド、スルフアセトアミド、スルファジアジン、スルファドキシン、スルファフラゾール、スルファメラジン、スルファメトキサゾール、スルファピリジン、スルファサラジン、スルフィン−ピラゾン、スルピリド、スルチアム、スマトリプタンスクシナート、タモキシフェンシトラート、テマゼパム、テラゾシンＨＣｌ、テルビナフィンＨＣｌ、テルコナゾール、テルフェナジン、テストラクトン、テストステロン、テトラサイクリン、チアベンダゾール、チオリダジン、チボロン、チニダゾール、チオコナゾール、トラザミド、トルブタミド、トラゾドンＨＣｌ、トリアムシノロン、トリアムテレン、トリアゾラム、トリメトプリム、マレイン酸トリミプラミン、トロピカミド、ウンデセン酸、バルプロ酸、ビタミンＡ、ビタミンＢ２、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ゾピクロン、またはこれらの組み合わせ。
【０１６９】
一部の実施形態では、脂質はペグ化されている。一部の実施形態では、脂質はＰＥＧ（２Ｋ）−ホスファチジルエタノールアミンである。
【０１７０】
使用方法
組織の標識化
本明細書の特定の実施形態では、それを必要としている患者に本明細書記載の選択的輸送分子の投与することにより組織の標識化（例えば、腫瘍切除用の外科的縁を決めるために）を行う方法が開示される。一部の実施形態では、組織は腫瘍である。一部の実施形態では、組織は虚血性組織である。一部の実施形態では、組織は低酸素性の組織である。一部の実施形態では、組織は壊死の組織である。一部の実施形態では、組織はアシドーシス性組織である。一部の実施形態では、組織は病気の組織（例えば、感染病原体に感染した組織、有毒な薬剤に接触した組織、自己免疫障害に罹っている組織、炎症性組織）である。
【０１７１】
一部の実施形態では、手術中に特定し除去するために組織を標識付けする。一部の実施形態では、患者の腫瘍切除または組織切除のための外科的縁を画像化する方法が本明細書で開示され、この方法は、本明細書で開示される選択的輸送分子を患者に投与した後に外科的縁を画像化することを含む。一部の実施形態では、患者の腫瘍の画像化方法は、本明細書で開示される選択的輸送分子を患者に投与した後に腫瘍を画像化することを含む。一部の実施形態では、患者の腫瘍を除去する方法は、本明細書で開示される選択的輸送分子を患者に投与した後に腫瘍を除去することを含む。
【０１７２】
一部の実施形態では、方法は、手術を受ける予定の患者に本明細書記載の選択的輸送分子を投与することを含む。一部の実施形態では、方法は、手術を受けている患者に本明細書記載の選択的輸送分子を投与することを含む。一部の実施形態では、本明細書記載の選択的輸送分子が患者に全身投与される。一部の実施形態では、本明細書記載の選択的輸送分子が患者に局所的に投与される。
【０１７３】
一部の実施形態では、本明細書で開示の選択的輸送分子は、癌の評価および治療の複数の段階で使用される。一部の実施形態では、二重モダリティ（ＭＲおよび蛍光）選択的輸送分子は、特に、莢膜への浸潤が重要である前立腺等の癌のために、腫瘍学者と放射線科医による手術前のステージ分類を可能とし、非手術的治療の候補である患者の手術を防止できる。一部の実施形態では、二重標識選択的輸送分子から得られる解剖学的および生化学的情報は、複雑な外科手術を計画している外科医にとって有用である。一部の実施形態では、選択的輸送分子の切断部位への強い結合により腫瘍生物学に関する局所情報がもたらされ、これは手術中の蛍光画像化により外科医が最も侵襲的な腫瘍成長領域に集中することを可能にするのみならず、病理学者に手術中の組織像により同様の領域に集中させることも可能となる。手術後、一部の実施形態では、二重プローブは、第２のＭＲＩを使って腫瘍除去完成度の追加的評価も可能にする。
【０１７４】
薬剤送達
本明細書の特定の実施形態では、標的化薬剤送達の方法が開示される。一部の実施形態では、本明細書記載の選択的輸送分子は薬剤を特定の標的（例えば、１個の細胞または複数の細胞）に送達する。一部の実施形態では、本明細書記載の選択的輸送分子は薬剤を腫瘍に送達する。一部の実施形態では、本明細書記載の選択的輸送分子は薬剤を虚血性組織に送達する。一部の実施形態では、本明細書で開示の選択的輸送分子は薬剤を低酸素性組織に送達する。一部の実施形態では、本明細書記載の選択的輸送分子は薬剤を壊死の組織に送達する。一部の実施形態では、本明細書記載の選択的輸送分子は薬剤をアシドーシス性組織に送達する。一部の実施形態では、本明細書記載の選択的輸送分子は薬剤を病気の組織（例えば、感染病原体に感染した組織、有毒薬剤に接触した組織、自己免疫障害に罹っている組織、炎症性組織）に送達する。
【０１７５】
一部の実施形態では、薬剤は細胞の死亡（例えば、アポトーシスまたは壊死を介した）を調節する薬剤である。一部の実施形態では、薬剤は細胞傷害性薬剤である。一部の実施形態では、薬剤は、マイタンシン、メトトレキサート（ＲＨＥＵＭＡＴＲＥＸ（登録商標）、アメトプテリン）；シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））；サリドマイド（ＴＨＡＬＩＤＯＭＩＤ（登録商標））；パクリタキセル；メトレキセド；ペントスタチン；ピポブロマン；ピクサントロン；プリカマイシン；プロカルバジン；プロテアソーム阻害剤（例えば；ボルテゾミブ）；ラルチトレキセド；レベッカマイシン；ルビテカン；ＳＮ−３８；サリノスポラミドＡ；サトラプラチン；ストレプトゾトシン；スウェインソニン；タリキダル；タキサン；テガフール−ウラシル；テモゾロミド；テストラクトン；チオテパ；チオグアニン；トポテカン；トラベクテジン；トレチノイン；トリプラチンテトラニトラート；トリス（２−クロロエチル）アミン；トロキサシタビン；ウラシルマスタード；バルルビシン；ビンブラスチン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ボリノスタット；ゾスキダル；またはこれらの組み合わせである。一部の実施形態では、薬剤はアポトーシス促進剤である。一部の実施形態では、薬剤は抗アポトーシス剤である。一部の実施形態では、薬剤は以下から選択される：ミノサイクリン；ＳＢ−２０３５８０（４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）１Ｈ−イミダゾール）；ＰＤ１６９３１６（４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−ニトロフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール）；ＳＢ２０２１９０（４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−ピリジル）１Ｈ−イミダゾール）；ＲＷＪ６７６５７（４−［４−（４−フルオロフェニル）−１−（３−フェニルプロピル）−５−（４−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−３−ブチン−１−オール）；ＳＢ２２００２５（５−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−４−（４−フルオロフェニル）−１−（４−ピペリジンリル）イミダゾール）；Ｄ−ＪＮＫＩ−１（（Ｄ）−ｈＪＩＰ１７５−１５７−ＤＰｒｏ−ＤＰｒｏ−（Ｄ）−ＨＩＶ−ＴＡＴ５７−４８）；ＡＭ−１１１（Ａｕｒｉｓ）；ＳＰ６００１２５（アントラ［１，９−ｃｄ］ピラゾール−６（２Ｈ）−オン）；ＪＮＫ阻害剤Ｉ（（Ｌ）−ＨＩＶ−ＴＡＴ４８−５７−ＰＰ−ＪＢＤ２０）；ＪＮＫ阻害剤ＩＩＩ（（Ｌ）−ＨＩＶ−ＴＡＴ４７−５７−ｇａｂａ−ｃ−Ｊｕｎδ３３−５７）；ＡＳ６０１２４５（１，３−ベンゾチアゾール−２−イル（２−［［２−（３−ピリジニル）エチル］アミノ］−４ピリミジニル）アセトニトリル）；ＪＮＫ阻害剤ＶＩ（Ｈ２Ｎ−ＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦ−ＮＨ２）；ＪＮＫ阻害剤ＶＩＩＩ（Ｎ−（４−アミノ−５−シアノ−６−エトキシピリジン−２−イル）−２−（２，５−ジメトキシフェニル）アセトアミド）；ＪＮＫ阻害剤ＩＸ（Ｎ−（３−シアノ−４，５，６，７−テトラヒドロ−１−ベンゾチエン−２−イル）−１−ナフトアミド）；ジクマロール（３，３'−メチレンビス（４−ヒドロキシクマリン））；ＳＣ−２３６（４−［５−（４−クロロフェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］ベンゼン−スルホンアミド）；ＣＥＰ−１３４７（Ｃｅｐｈａｌｏｎ）；ＣＥＰ１１００４（Ｃｅｐｈａｌｏｎ）；Ｂｃｌ−２ポリペプチドの少なくとも一部を含む人工タンパク質；組換え型ＦＮＫ；Ｖ５（Ｂａｘ阻害剤ペプチドＶ５としても知られる）；Ｂａｘチャンネル遮断薬（（±）−１−（３，６−ジブロモカルバゾール−９−イル）−３−ピペラジン−１−イル−プロパン−２−オール）；Ｂａｘ阻害ペプチドＰ５（Ｂａｘ阻害剤ペプチドＰ５としても知られる）；Ｋｐ７−６；ＦＡＩＭ（Ｓ）（Ｆａｓアポトーシス阻害性分子−ｓｈｏｒｔ）；ＦＡＩＭ（Ｌ）（Ｆａｓアポトーシス阻害性分子−ｌｏｎｇ）；Ｆａｓ：Ｆｃ；ＦＡＰ−１；ＮＯＫ２；Ｆ２０５１；Ｆ１９２６；Ｆ２９２８；ＺＢ４；ＦａｓＭ３ｍＡｂ；ＥＧＦ；７４０Ｙ−Ｐ；ＳＣ３０３６（ＫＫＨＴＤＤＧＹＭＰＭＳＰＧＶＡ）；ＰＩ３−キナーゼ活性化因子（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．）；Ｐａｍ３Ｃｙｓ（（Ｓ）（２，３−ビス（パルミトイルオキシ）−（２ＲＳ）−プロピル）−Ｎ−パルミトイル−（Ｒ）−Ｃｙｓ−（Ｓ）−Ｓｅｒ（Ｓ）−Ｌｙｓ４−ＯＨ、トリヒドロクロリド）；Ａｃｔ１（ＮＦ−ｋＢ活性化因子１）；抗ＩｋＢ抗体；アセチル−１１−ケト−ｂ−ボスウェル酸；アンドログラホリド；カフェー酸フェネチルエステル（ＣＡＰＥ）；グリオトキシン；イソヘレニン；ＮＥＭＯ−結合ドメイン結合ペプチド
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；ＮＦ−ｋＢ活性化阻害剤（６−アミノ−４−（４−フェノキシフェニルエチルアミノ）キナゾリン）；ＮＦ−ｋＢ活性化阻害剤ＩＩ（４−メチル−Ｎ１−（３−フェニルプロピル）ベンゼン−１，２−ジアミン）；ＮＦ−ｋＢ活性化阻害剤ＩＩＩ（３−クロロ−４−ニトロ−Ｎ−（５−ニトロ−２−チアゾリル）−ベンズアミド）；ＮＦ−ｋＢ活性化阻害剤ＩＶ（（Ｅ）−２−フルオロ−４'−メトキシスチルベン）；ＮＦ−ｋＢ活性化阻害剤Ｖ（５−ヒドロキシ−（２，６−ジイソプロピルフェニル）−１Ｈ−イソインドール−１，３−ジオン）；ＮＦ−ｋＢＳＮ５０
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；オリドニン；パルテノライド；ＰＰＭ−１８（２−ベンゾイルアミノ−１，４−ナフトキノン）；Ｒｏ１０６−９９２０；スルファサラジン；ＴＩＲＡＰ阻害剤ペプチド
2012533560.tif 000017
；ウィタフェリンＡ；ウォゴニン；ＢＡＹ１１−７０８２（（Ｅ）３−［（４−メチルフェニル）スルホニル］−２−プロペンニトリル）；ＢＡＹ１１−７０８５（（Ｅ）３−［（４−ｔ−ブチルフェニル）スルホニル］−２−プロペンニトリル）；（Ｅ）−カプサイシン；金チオリンゴ酸（ＡＴＭまたはＡｕＴＭ）；エボジアミン；ヒポエストキシド；ＩＫＫ阻害剤ＩＩＩ（ＢＭＳ−３４５５４１）；ＩＫＫ阻害剤ＶＩＩ；ＩＫＫ阻害剤Ｘ；ＩＫＫ阻害剤ＩＩ；ＩＫＫ−２阻害剤ＩＶ；ＩＫＫ−２阻害剤Ｖ；ＩＫＫ−２阻害剤ＶＩ；ＩＫＫ−２阻害剤（ＳＣ−５１４）；ＩｋＢキナーゼ阻害剤ペプチド；ＩＫＫ−３阻害剤ＩＸ；ＡＲＲＹ−７９７（Ａｒｒａｙ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ）；ＳＢ−２２００２５（５−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−４−（４−フルオロフェニル）−１−（４−ピペリジンリル）イミダゾール）；ＳＢ−２３９０６３（トランス−４−［４−（４−フルオロフェニル）−５−（２−メトキシ−４−ピリミジニル）−１Ｈ−イミダゾール−１−イル］シクロヘキサノール）；ＳＢ−２０２１９０（４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール）；ＪＸ−４０１（−［２−メトキシ−４−（メチルチオ）ベンゾイル］−４−（フェニルメチル）ピペリジン）；ＰＤ−１６９３１６（４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−ニトロフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール）；ＳＫＦ−８６００２（６−（４−フルオロフェニル）−２，３−ジヒドロ−５−（４−ピリジニル）イミダゾ［２，１−ｂ］チアゾールジヒドロクロリド）；ＳＢ−２００６４６（Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−インドール−５−イル）−Ｎ'−３−ピリジニル尿素）；ＣＭＰＤ−１（２'−フルオロ−Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）−［１，１'−ビフェニル］−４−ブタンアミド）；ＥＯ−１４２８（（２−メチルフェニル）−［４−［（２−アミノ−４−ブロモフェニル）アミノ］−２−クロロフェニル］メタノン）；ＳＢ−２５３０８０（４−［５−（４−フルオロフェニル）−２−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］ピリジン）；ＳＤ−１６９（１Ｈ−インドール−５−カルボキサミド）；ＳＢ−２０３５８０（４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）１Ｈ−イミダゾール）；ＴＺＰ−１０１（Ｔｒａｎｚｙｍｅ  Ｐｈａｒｍａ）；ＴＺＰ−１０２（Ｔｒａｎｚｙｍｅ  Ｐｈａｒｍａ）；ＧＨＲＰ−６（成長ホルモン放出ペプチド−６）；ＧＨＲＰ−２（成長ホルモン放出ペプチド−２）；ＥＸ−１３１４（Ｅｌｉｘｉｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＭＫ−６７７（Ｍｅｒｃｋ）；Ｌ−６９２，４２９（ブタンアミド、３−アミノ−３−メチル−Ｎ−（２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−１−（（２'−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）（１，１'−ビフェニル）−４−イル）メチル）−１Ｈ−１−ベンゾアゼピン−３−イル）−、（Ｒ）−）；ＥＰ１５７２（Ａｉｂ−ＤＴｒｐ−ＤｇＴｒｐ−ＣＨＯ）；ジルチアゼム；ジルチアゼムの代謝物；ＢＲＥ（脳および生殖器官発現タンパク質）；ベラパミル；ニモジピン��ジルチアゼム；オメガコノトキシン；ＧＶＩＡ；アムロジピン；フェロジピン；ラシジピン；ミベフラジル；ＮＰＰＢ（５−ニトロ−２−（３−フェニルプロピルアミノ）安息香酸）；フルナリジン；エリトロポイエチン；ピペリン；ヘミン；ブラジリン；ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ（ベンジルオキシカルボニル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−フルオロメチルケトン）；ｚ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫ（ベンジルオキシカルボニル−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｈｉｓ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−フルオロメチルケトン）；Ｂ−Ｄ−ＦＭＫ（ｂｏｃ−アスパルチル（Ｏｍｅ）−フルオロメチルケトン）；Ａｃ−ＬＥＨＤ−ＣＨＯ（Ｎ−アセチル−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−ＣＨＯ）；Ａｃ−ＩＥＴＤ−ＣＨＯ（Ｎ−アセチル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−ＣＨＯ）；ｚ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫ（ベンジルオキシカルボニル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｔｈｒ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−フルオロメチルケトン）；ＦＡＭ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫ（ベンジルオキシカルボニルＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−フルオロメチルケトン）；ＦＡＭ−ＬＥＴＤ−ＦＭＫ（ベンジルオキシカルボニルＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−フルオロメチルケトン）；Ｑ−ＶＤ−ＯＰＨ（キノリン−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨ２−Ｏ−Ｐｈ）；ＸＩＡＰ；ｃＩＡＰ−１；ｃＩＡＰ−２；ＭＬ−ＩＡＰ；ＩＬＰ−２；ＮＡＩＰ；サバイビン；Ｂｒｕｃｅ；ＩＡＰＬ−３；ホルチリン；ロイペプチン；ＰＤ−１５０６０６（３−（４−ヨードフェニル）−２−メルカプト−（Ｚ）−２−プロペン酸）；ＭＤＬ−２８１７０（Ｚ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−ＣＨＯ）；カルペプチン；アセチルカルパスタチン；ＭＧ１３２（Ｎ−［（フェニルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−ロイシル−Ｎ−［（１Ｓ）−１−ホルミル−３−メチルブチル］−Ｌ−ロイシンアミド）；ＭＹＯＤＵＲ；ＢＮ８２２７０（Ｉｐｓｅｎ）；ＢＮ２２０４（Ｉｐｓｅｎ）；ＡＨＬｉ−１１（Ｑｕａｒｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ｍｄｍ２タンパク質、ピフィスリン−α（１−（４−メチルフェニル）−２−（４，５，６，７−テトラヒドロ−２−イミノ−３（２Ｈ）−ベンゾチアゾリル）エタノン）；トランス−スチルベン；シス−スチルベン；リスベラトロール；ピセタノール；ラポンチン；デオキシラポンチン；ブテイン；カルコン；イソリキルチゲン；ブテイン；４，２' ，４'−トリヒドロキシカルコン；３，４，２' ，４' ，６'−ペンタヒドロキシカルコン；フラボン；モリン；フィセチン；ルテオリン；ケルセチン；ケンフェロール；アピゲニン；ゴッシペチン；ミリセチン；６−ヒドロキシアピゲニン；５−ヒドロキシフラボン；５，７，３' ，４' ，５'−ペンタヒドロキシフラボン；３，７，３' ，４' ，５'−ペンタヒドロキシフラボン；３，６，３' ，４'−テトラヒドロキシフラボン；７，３' ，４' ，５'−テトラヒドロキシフラボン；３，６，２' ，４'−テトラヒドロキシフラボン；７，４'−ジヒドロキシフラボン；７，８，３' ，４'−テトラヒドロキシフラボン；３，６，２' ，３'−テトラヒドロキシフラボン；４'−ヒドロキシフラボン；５−ヒドロキシフラボン；５，４'−ジヒドロキシフラボン；５，７−ジヒドロキシフラボン；ダイゼイン；ゲニステイン；ナリンゲニン��フラバノン；３，５，７，３' ，４'−ペンタヒドロキシフラバノン；ペラルゴニジン塩化物；シアニジン塩化物；デルフィニジン塩化物；（−）−エピカテキン（水酸基部位：３、５、７、３'、４'）；（−）−カテキン（水酸基部位：３、５、７、３'、４'）；（−）−ガロカテキン（水酸基部位：３、５、７、３'、４'、５'）（＋）−カテキン（水酸基部位：３、５、７、３'、４'）；（＋）−エピカテキン（水酸基部位：３、５、７、３'、４'）；ヒノキチオール（ｂ−ツジャプリシン；２−ヒドロキシ−４−イソプロピル−２，４，６−シクロヘプタトリエン−１−オン）；Ｌ−（＋）−エルゴチオネイン（（Ｓ）−ａ−カルボキシ−２，３−ジヒドロ−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチル−２−チオキソ−１Ｈ−イミダゾール４−エタンアミニウム内塩）；カフェー酸フェニルエステル；ＭＣＩ−１８６（３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン）；ＨＢＥＤ（Ｎ，Ｎ'−ジ−（２−ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ'−ジ酢酸・Ｈ２Ｏ）；アンブロキソール（トランス−４−（２−アミノ−３，５−ジブロモベンジルアミノ）シクロヘキサン−ＨＣｌ；およびＵ−８３８３６Ｅ（（−）−２−（（４−（２，６−ジ−１−ピロリジニル−４−ピリミジニル）−１−ピペルザイニル）メチル）−３，４−ジヒドロ−２，５，７，８−テトラメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−６−オール・２ＨＣｌ）；β−１'−５−メチルニコチンアミド−２'−デオキシリボース；β−Ｄ−１'−５−メチルニコチンアミド−２'−デオキシリボフラノシド；β−１'−４，５−ジメチルニコチンアミド−２'−デオキシリボース；β−Ｄ−１'−４，５−ジメチルニコチンアミド−２'−デオキシリボフラノシド；１−ナフチルＰＰ１（１−（１，１−ジメチルエチル）−３−（１−ナフタレニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン）；ラベンズスチンＡ（５−［［（２，５−ジヒドロキシフェニル）メチル］［（２−ヒドロキシフェニル）メチル］アミノ］−２−ヒドロキシ安息香酸）；ＭＮＳ（３，４−メチレンジオキシ−ｂ−ニトロスチレン）；ＰＰ１（１−（１，１−ジメチルエチル）−１−（４−メチルフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン）；ＰＰ２（３−（４−クロロフェニル）１−（１，１−ジメチルエチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン）；ＫＸ−００４（Ｋｉｎｅｘ）；ＫＸ−００５（Ｋｉｎｅｘ）；ＫＸ−１３６（Ｋｉｎｅｘ）；ＫＸ−１７４（Ｋｉｎｅｘ）；ＫＸ−１４１（Ｋｉｎｅｘ）；ＫＸ２−３２８（Ｋｉｎｅｘ）；ＫＸ−３０６（Ｋｉｎｅｘ）；ＫＸ−３２９（Ｋｉｎｅｘ）；ＫＸ２−３９１（Ｋｉｎｅｘ）；ＫＸ２−３７７（Ｋｉｎｅｘ）；ＺＤ４１９０（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ；Ｎ−（４−ブロモ−２−フルオロフェニル）−６−メトキシ−７−（２−（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）エトキシ）キナゾリン−４−アミン）；ＡＰ２２４０８（Ａｒｉａｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＡＰ２３２３６（Ａｒｉａｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＡＰ２３４５１（Ａｒｉａｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＡＰ２３４６４（Ａｒｉａｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ���）；ＡＺＤ０５３０（Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ）；ＡＺＭ４７５２７１（Ｍ４７５２７１；Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ）；ダサチニブ（Ｎ−（２−クロロ−６−メチルフネイル）−２−（６−（４−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−１−イル）−２−メチルピリミジン−４−イルアミノ）チアゾール−５−カルボキサミド）；ＧＮ９６３（トランス−４−（６，７−ジメトキシキノキサリン−２イルアミノ）シクロヘキサノール硫酸塩）；ボスチニブ（４−（（２，４−ジクロロ−５−メトキシフェニル）アミノ）−６−メトキシ−７−（３−（４−メチル−１−ピペラジニル）プロポキシ）−３−キノリンカルボニトリル）；またはこれらの組み合わせ。
【０１７６】
その他の用途
一部の実施形態では、積荷成分が造影剤およびガドリニウムである選択的輸送分子が転移を画像化するのに使用される。一部の実施形態では、積荷成分が造影剤およびガドリニウムである選択的輸送分子が長期的実験に使われ、炎症が顕性転移の前に発生するのか、またはその直後なのか判断される（図４０）。一部の実施形態では、積荷成分が造影剤およびガドリニウムである選択的輸送分子がＭＭＰが重要な役割を果たし、ＭＭＰおよび炎症の可視化が疾患（例えば、腸疾患、関節リウマチ、または多発性硬化症）過程の理解を改善するために有用である障害の画像化に使用される。選択的輸送分子をデンドリマーナノ粒子に共役し、さらにナノ粒子がガドリニウムにも共役している効果の詳細分析については、実施例４０を参照のこと。
【０１７７】
一部の実施形態では、デンドリマーナノ粒子に結合した選択的輸送分子はマクロファージ関連腫瘍の標的化に使われる。一部の実施形態では、デンドリマーナノ粒子に結合し、ナノ粒子がさらにリシンＡを含む選択的輸送分子は皮下マクロファージを毒殺するのに使われる。
【０１７８】
医薬組成物
本明細書の特定の実施形態では、本明細書で開示の選択的輸送分子を含む医薬組成物が開示される。本明細書の医薬組成物は、医薬剤として使われる製剤中への活性薬剤の処理を促進する賦形剤および補助薬を含む１つまたは複数の生理学的に受容可能な担体と共に処方される。適切な処方は選択される投与経路に依存する。医薬組成物に関する概要が、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  Ｎｉｎｅｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄ（レミントン：薬学の科学と実践、第１９版）（Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５）；Ｈｏｏｖｅｒ、Ｊｏｈｎ  Ｅ．、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（レミントンの薬学）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  １９７５；Ｌｉｂｅｒｍａｎ、Ｈ．Ａ．ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎ、Ｌ．、Ｅｄｓ．、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ（医薬品の剤形）、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ、ＮｅｗＹｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９８０；およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｅｄ．（医薬品の剤形と薬剤デリバリーシステム、第７版）（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、１９９９）に記述されている。
【０１７９】
特定の実施形態では、本明細書で開示される医薬組成物は、さらに薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤、またはキャリアを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、他の薬物または医薬剤、キャリア、アジュバント、例えば、保存剤、安定化剤、湿潤剤または乳化剤、溶解推進剤、浸透圧調製塩、および／または緩衝剤を含む。さらに、医薬組成物は、他の治療的に価値のある物質も含む。
【０１８０】
特定の実施形態では、本明細書で開示される医薬組成物は、任意の適切な投与経路で患者に投与される。この投与経路には、限定されないが、非経口（静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、血管内、鞘内、硝子体内、注入、または局所）投与が含まれる。
【０１８１】
筋肉内、皮下、または静脈内注射に適した製剤には、生理学的に受容可能な無菌で水性のまたは非水性の溶液、分散物、懸濁液または乳剤、および無菌の注射可能溶液または分散液に再構成できる無菌の粉末が含まれる。適切な水性および非水性キャリア、希釈剤、溶剤、または賦形剤の例には、水、エタノール、ポリオール（プロピレングリコール、ポリエチレン−グリコール、グリセリン、クレモホール、等）、適切なそれらの混合物、植物油（例えば、オリーブ油）および注射可能有機エステル、例えば、エチルオレアートが含まれる。例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散液の場合は必要粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、適切な流動度が維持される。皮下注入に適した製剤も同様に、任意選択の添加物、例えば、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分配剤（ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を含む。
【０１８２】
静脈内注入用として、活性薬剤は、任意選択で、水溶液、好ましくは、生理学的に適合した緩衝液、例えば、ハンクス溶液、リンゲル液、または生理的食塩水の緩衝液中で処方される。
【０１８３】
非経口注入は、任意選択で、ボーラス注入または連続注入を含む。注入用製剤は、任意選択で、ユニット投与量剤形、例えば、アンプルまたは多数回用量容器に防腐剤を添加して用意される。一部の実施形態では、本明細書記載の医薬組成物は、油性または水性の賦形剤中の無菌の懸濁液、溶液または乳化物として非経口の注入に適した形であり、製剤化剤、例えば、懸濁、安定化および／または分散剤を含む。非経口の投与用医薬製剤には、水溶性型活性薬剤の水溶液が含まれる。さらに、懸濁液は、任意選択で、必要に応じて油性注入懸濁液として調製される。
【０１８４】
一部の実施形態では、本明細書記載の医薬組成物は、正確な投与量の単回投与に適したユニット剤形である。ユニット剤形では、製剤は、適切な量の本明細書で開示の活性薬剤を含むユニット用量に分割される。一部の実施形態では、ユニット投与量は、離散性の量の製剤を含むパッケージの形である。非限定的例は、パッケージ化した錠剤またはカプセル剤、およびバイアルまたはアンプルに入れた粉末である。一部の実施形態では、水性の懸濁液組成物は単回用量の再封できない容器に入れてパッケージ化される。あるいは、複数回用量の再封可能な容器が使用され、この場合、通常は組成物中に防腐剤を含める。単なる例ではあるが、非経口注入用製剤は、アンプル（これに限定されない）を含むユニット剤形で、または多数回用量容器で、防腐剤を添加して、用意される。
【実施例】
【０１８５】
実施例１：ペプチド合成
細胞による取り込みを調節できると思われる多くのペプチドを合成した。次の記号が使われている場合は、示された意味を有する：Ｆｌ＝フルオレセイン；ａｃａ＝ａｈｘ＝Ｘ＝アミノカプロン酸リンカー（−ＨＮ−（ＣＨ２）５−ＣＯ−）、Ｃ＝Ｌ−システイン、Ｅ＝Ｌ−グルタマート、Ｒ＝Ｌ−アルギニン、Ｄ＝Ｌ−アスパルタート、Ｋ＝Ｌ−リジン、Ａ＝Ｌ−アラニン、ｒ＝Ｄ−アルギニン、ｃ＝Ｄ−システイン、ｅ＝Ｄ−グルタマート、Ｐ＝Ｌ−プロリン、Ｌ＝Ｌ−ロイシン、Ｇ＝グリシン、Ｖ＝バリン、Ｉ＝イソロイシン、Ｍ＝メチオニン、Ｆ＝フェニルアラニン、Ｙ＝チロシン、Ｗ＝トリプトファン、Ｈ＝ヒスチジン、Ｑ＝グルタミン、Ｎ＝アスパラギン、Ｓ＝セリン、およびＴ＝トレオニン。
【０１８６】
下記で考察する配列で、小文字はアミノ酸のＤ異性体を示している。
【０１８７】
ペプチドを、ペプチド合成装置（Ｐｉｏｎｅｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）による固相合成法ならびに市場で入試可能なＦｍｏｃアミノ酸、樹脂、およびその他の薬剤を使って合成した。ペプチドをＴＦＡ／チオアヌソール／トリイソプロピルシランまたはＴＦＡ／チオアヌソール／トリイソプロピルシラン／エタンジチオールを使って切断した。
【０１８８】
５−（および−６）カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルでペプチドのアミノ基に、または５−ヨードアセトアミドフルオレセインでペプチドのチオール基にペプチドの標識付をした。
【０１８９】
粗製ペプチドをＨＰＬＣで精製し、一晩凍結乾燥した。
【０１９０】
各ペプチド組成物を質量分析により確認した。
【０１９１】
選択的輸送分子の合成（以降、ペプチド１と呼ぶ）
Ｓｕｃ−ｅ８−（Ａｏｐ）−ＰＬＧＣ９Ｍｅ）ＡＧ−ｒ９−ｃ−ＮＨ２を標準的Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成法により合成した。樹脂上にあるうちに、コハク酸無水物を使った反応により、Ｎ末端スクシニル基をペプチドに付加した。室温で標準的混合物（チオアヌソール、トリイソプロピルシランおよびエタンジチオール各２％を含むトリフルオロ酢酸）中で一晩置いてペプチドを樹脂から切断した。トリフルオロ酢酸の大部分をロータリーエバポレーターで除去し、５０％ヘキサンのジエチルエーテル溶液を添加し、ペプチドを遠心分離により回収した。集めた固形物を５０％ヘキサンのエーテル溶液で３回洗浄し一晩真空乾燥した。ペプチドをＨＰＬＣで１５％〜３０％アセトニトリルの水および０．０５％ＴＦＡ中溶液を使って精製し、粗製ペプチドからの３０％収率を得た。正確な生成物をエレクトロスプレー質量分析により確認した：計算値３２７１．５Ｄａ、測定値３２７１．８Ｄａ。
【０１９２】
ペプチド標識デンドリマー２の合成
２５ｍｇのペプチド１をＮ２中で２ｍＬＤＭＳＯに溶解し２．３ｍｇの２−ニトロ−４−スルホフェニル６−マレイミドヘキサノアートナトリウム塩および２０μＬのＮ−メチルモルホリンと反応させた。室温で３時間攪拌後、反応混合物のＬＣ−ＭＳ分析により９０％超反応が完了していることが示された。反応混合物を０℃に冷却し、１５０ｍｇのＰＡＭＡＭデンドリマーおよび２ｍｌの１Ｍヘペス緩衝液（ｐＨ７．８）を添加して５℃で２日間攪拌した（以降、反応混合物２と呼ぶ）。
【０１９３】
Ｃｙ５およびペプチド標識付けしたデンドリマー３の合成
１．２ｍｇ  Ｃｙ５モノ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）を反応混合物２に添加し、５℃で一晩攪拌した（以降、反応混合物３と呼ぶ）。
【０１９４】
キャップしたＣｙ５およびペプチド標識デンドリマー４の合成
１６６ｍｇのＭｅＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）エステルを５℃で反応混合物３に添加し、その温度で３日間攪拌した。粗製生成物を１０ｍＬの水で希釈し、１０ｋＤａ分画分子量の膜で８回濾過して低分子量混入物を除去した。サイズ排除カラムを使ったＨＰＬＣにより純度９９％で収率７２％の結果が得られた。既知の重量の精製した最終生成物を水に溶解し、２５０，０００Ｍ−１ｃｍ−１の消衰係数を仮定した６５０ｎｍのＣｙ５吸光度の測定では、デンドリマー当たり平均３個のフルオロフォアであった。７８５ｎｍの静的多角度光散乱では、見かけの分子量が７２．９ｋＤａであった。７８５ｎｍの静的光散乱では４．６ｎｍの流体力学的半径が得られた。
【０１９５】
ＤＯＴＡ、Ｃｙ５およびペプチド標識デンドリマー５の合成
３０当量のＤＯＴＡモノ−Ｎ−ヒドロキシスクシニムドエステルのヘペス緩衝液溶液を反応混合物３と反応させ、５℃で一晩攪拌した（以降、反応混合物５と呼ぶ）。
【０１９６】
キャップしたＤＯＴＡ、Ｃｙ５およびペプチド標識デンドリマー６の合成
反応混合物５を９５０当量のｍＰＥＧ４ＮＨＳと反応させ、５℃で３日間攪拌した。粗製生成物をキャップしたＣｙ５およびペプチド標識デンドリマー４の記載と同様に精製後、凍結乾燥した。収率は７８％であった。
【０１９７】
キャップしたＤＯＴＡ、Ｃｙ５およびペプチド標識デンドリマー６のＧｄ添加
２５ｍｇのキャップしたＤＯＴＡ、Ｃｙ５およびペプチド標識デンドリマー６を１ｍＬの０．５Ｍ酢酸アンモニウムおよび１ｍＬの水に溶解した。反応混合物を１００μＬの０．５ＧｄＣｌ３と混合し、光遮断下、室温で３日間攪拌した。５回の水洗により小分子を除去した。過剰の水を１０ｋＤａ分画分子量の膜フィルターを通した遠心分離により除去した。最終的に、Ｇｄ添加生成物７を一晩凍結乾燥し、青色のふわふわした固体を得た。純粋な生成物を秤量し、水に再溶解して２００μＭ溶液を得た。秤量した少量分量を０．５ｍＬの濃硝酸と２時間混合した。誘導結合プラズマ質量分析によりＧｄの定量測定を行い、デンドリマー当たり平均１５Ｇｄの結果を得た。６５０ｎｍの吸光度に基づいて、デンドリマー当たりのＣｙ５標識の数は３であることが確認された。
【０１９８】
実施例２：アルブミン共役選択的輸送分子
ペプチドの合成
遊離Ｎ末端およびＣ末端システインを有するペプチドを固相合性により合成した。ペプチド配列ｅ９−ｏＰＬＧＣ（ｍｅ）ＡＧ−ｒ９−ｃ−ＮＨ２を切断可能なペプチド（ｏは５−アミノ−３−オキサペンタノイルリンカー、Ｃ（ｍｅ）はＳ−メチルシステインである）として、またｅ９−（Ｐｅｇ２）２−ｒ９−ｃを切断不可能ペプチドとして合成した。ＨＰＬＣで切断および精製後、ペプチドをＮＭＭ添加ＤＭＦ中で過剰のＣｙ５−モノマレイミドと反応させた。反応完了後、ペプチドを同条件下、予備反応としてマレイミドプロピオン酸−ＰＦＰエステとさらに反応させた。ＨＰＬＣ質量分析で反応をモニターし、ＨＰＬＣで精製した。ＤＯＴＡ標識ペプチドを作るために、ペプチドペプチドのＮ末端およびペプチドのＣ末端上のアルギニンとシステインの間のｋ（Ｄｏｔａ）に（Ｐｅｇ４）を固相合成により付加した。これら２つの二重標識ペプチドの配列は、切断可能なペプチドはＭａｌ−Ｐｅｇ４−ｅ９−ｏＰＬＧ（Ｃｍｅ）ＡＧ−ｒ９−ｋ（ＤＯＴＡ）−ｃ（Ｃｙ５）であり、切断不可能ペプチドはｍａｌ−Ｐｅｇ４−ｅ９−Ｐｅｇ４−ｒ９−ｋ（ＤＯＴＡ）−ｃ（Ｃｙ５）である。
【０１９９】
アルブミンとの反応および酵素切断アッセイ
最初、マレイミドペプチドをマウス血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）４０ｍｇ／ｍＬまたは新しい凍結マウス血漿と１時間反応させた。試料をトリシン緩衝１０〜２０％ポリアクリルアミドゲルに供し、ＵＶＰゲルイメージャーでＣｙ５蛍光を調べるために画像化した。酵素切断アッセイのために、Ｃｙ５−モノマレイミドおよび切断可能なマレイミドペプチド２ｎｍｏｌを４０ｍｇ／ｍＬのマウス血清アルブミンと２５ｍＭヘペス緩衝液中で反応させた。次にストックを５０ｎＭの組換え型ＭＭＰ−９（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で１：１０に希釈し５ｍＭにして、４時間２０分消化させた後、トリシンゲルにかけＣｙ５を調べるために画像化した。
【０２００】
動物
ヌードマウスの左＃２乳房脂肪パッドに２Ｘ０６ＨＴ１０８０ヒト線維肉腫細胞を注入した。注入後５〜７日に実験を行った。ポリオーマミドルＴマウス（ＰｙＭＴ）をＬｅｓｌｅｙ  Ｅｌｌｉｅｓから入手し、中から大の大きさの腫瘍が各乳房脂肪パッドにある場合、９〜１２週齢にペプチドをＩＶ注入した。百万個のマウス乳房腺癌４Ｔ１．２細胞（Ｒｏｂｙｎ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅから入手）をヌードマウス（図４および７）とＢａｌｂ／ｃマウス（図８および９）の左乳房脂肪パッドに注入し、５〜２０日後ペプチドを注入し、画像化した。
【０２０１】
光学的画像化および組織加工
腫瘍細胞の注入後５〜２０日で腫瘍が十分な大きさになった場合は、ペプチドをＩＶ注入し、Ｍａｅｓｔｒｏ小動物イメージャー（ＣＲＩ）で画像化した。動物をイソフルランの過剰投与により屠殺後解剖した。肺転移を調べるため、肺をＯＣＴ凍結保護物質で満たし、小動物イメージャーで画像化した。屠殺時点で尾部静脈から出血させて血液測定を行い、毛細管に集めた。次に、この管をＣｙ５蛍光ペプチドの存在下、小動物イメージャーを使って画像化した。ゲル濾過アッセイ用の組織処理として、３０ｍｇの組織を１％ＳＤＳトリス緩衝液中でホモジナイズ後、８０℃で１０分間加熱し、遠心分離した。次に上清を１：１０に希釈し、トリシンゲルに供し蛍光画像化した。
【０２０２】
蛍光組織像
各マウス由来の腫瘍と肺を冷凍型に入れＯＣＴ媒質中で凍結後、１０μｍの凍結切片を切り出した。Ｃｙ５蛍光を使って、組織を蛍光解剖顕微鏡上で画像化した。次に、同じ切片または連続切片をヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
【０２０３】
１１１Ｉｎ放射性同位元素実験
３．６ｎｍｏｌの切断可能および切断不可能マレイミド選択的輸送分子を１．２ｍＣｉ１１１Ｉｎと１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ  ｐＨ７．０中、４０℃で１時間反応させた。反応後、１００ｎｍｏｌの非放射性ＩｎＣ１３を添加し、さらに１時間インキュベートし、未反応ＤＯＴＡとキレート形成させた。インキュベーション後、ペプチドストック反応物を５ｋＤａアミコンカラム（ａｍｉｃｏｎ  ｃｏｌｕｍｎ）を通して遠心分離し、未反応の非放射性および放射性Ｉｎを洗い流した。反応混合物のゲル濾過アッセイを行い、蛍光イメージャーを使って露光し、全ての１１１Ｉｎがペプチドと反応したことを確認した。カラム濾過後、放射能の１／３が回復した。次に、３匹のマウスに約５０μＣｉの０．３ｎｍｏｌペプチドをＩＶ注入した。次に、マウスをプラナーガンマ画像化および光学的画像化（Ｏｐｔｉｘ、ＧＥ  ｈｅａｔｈｃａｒｅ）を使って４８時間まで画像化した後、安楽死させた。マウス組織を採取し、シンチレーションバイアル中に入れ、秤量と計数カウントを行ってＩＤ／ｇ％を測定した。比較のため、ＩＤ／ｇ％の比を計算し、共同研究者のＥｄｍｕｎｄ  Ｗｏｎｇがデンドリマーを使って行った以前の同様の実験のレベルと比較した。
【０２０４】
アルブミン反応性マレイミド選択的輸送分子の合成
アルブミン反応性選択的輸送分子の合成には、標準的遊離ペプチド合成を凌ぐ、１段反応および精製が要求される。スクシニルキャップｅ８Ｎ末端ではなく、ＮＨ２−ｅ９−切断部位−ｒ９−ｃ（Ｃｙ５）−ＮＨ２としてペプチドを合成した。次に、ヘテロ二官能性リンカーを、マレイミド型のＮ末端上の遊離アミンおよびＮＨＳエステルと反応させることができる。リンカーは、短い親水性のｐｅｇ鎖、またはより高い疎水性の炭素鎖を含みうる。最初の合成時に、マレイミドプロプリオン酸ＰＦＰエステル、マレイミドＰｅｇ８スクシンイミジルエステル、およびマレイミドＰｅｇ２４スクシンイミジルエステルが全て作られる。ＰＦＰエステルは、古典的なＰｅｇスクシンイミジルエステルに比べ、反応が著しく速く、収率も高い。Ｐｅｇ８およびＰｅｇ２４を精製するのは困難で、反応は非効率的であったので、我々は、プロピオン酸リンカーに注力した。最終的配列：ｍａｌ−ｅ９−ｏＰＬＧ（Ｃｍｅ）ＡＧ−ｒ９−ｃ（ｃｙ５）が得られている模式的ペプチド構造を図１Ａと１Ｂに示す。親水性が高く、ｘＰＬＧＬＡＧ．５３よりもうまく動作するという理由で、ペプチドはｏＰＬＧ（Ｃｍｅ）ＡＧの切断部位を有するように作られた。
【０２０５】
マレイミド選択的輸送分子および酵素切断の試験管中での検証 
マレイミド選択的輸送分子をマウス血清アルブミンおよび血漿と水性の条件下で反応させ、ペプチドがアルブミンと試験管中で反応することを確認した。これらのデータは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）の結果によれば、ペプチドとアルブミンの混合の１時間の間に大部分のペプチドがＭＳＡまたは血漿アルブミンと反応することを示している（図１Ｃ）。血漿の方が完遂度が幾分高く反応が進むように見える。マレイミドＣｙ５とマレイミド選択的輸送分子のアルブミンへの予備的反応後、共役体をＭＭＰ−９で処理し、ｒ９−ｃ（Ｃｙ５）ペプチドが効果的にアルブミンから切断されることを確認した。これは、選択的輸送分子は生理学的条件下でアルブミンと反応するのみならず、ＭＭＰによって切断されうることを示唆している（図１Ｄ）。
【０２０６】
ＨＴ１０８０マウスを使った、マレイミド選択的輸送分子の担腫瘍マウスへの注入によって切断不可能ペプチドおよび遊離ペプチドに比較して、より優れたコントラストが得られる
検証されたインビトロ機序を使って、ＨＴ１０８０ヒト線維肉腫担腫瘍マウスにペプチドを注入し、前のバージョンの選択的輸送分子と比較して優れた腫瘍標的化能があるのかどうかを調べた。マレイミドペプチドが遊離の選択的輸送分子と構造的に類似であるため、最初の実験では、１０ｎｍｏｌの用量を使用した。このペプチドは、遊離ペプチドに比べ、遙かに長い半減期およびすっと大きな動物への取り込みを有することが明らかになった。そのため、用量を３ｎｍｏｌに減らした（データは示していない）。各２匹のマウスに切断可能なマレイミドペプチドを注入し、２匹のマウスに、切断不可能選択的輸送分子Ｍａｌ−ｅ９−（Ｐｅｇ２）２−ｒ９−ｃ（Ｃｙ５）を注入した。マウスを２４時間まで画像化した。各ペプチドに対し、皮膚をつけたまま、および皮膚を除去した後の２匹のマウスの画像を図２Ａに示す。切断可能なペプチドでは、切断不可能なペプチドに比べ取り込みが遙かに大きかった。次に、腫瘍および筋肉をホモジナイズし、上清に対しゲル濾過アッセイを行い、ペプチドが切断されたのか、切断されないのか、非切断でアルブミンに結合しているのかを判定した（図２Ｂ）。予想されるように、切断可能なペプチドを注入したマウスの腫瘍中に切断およびアルブミン結合ペプチドがみとめられ、切断不可能ペプチドを注入したマウス中では、非切断遊離ペプチドおよびアルブミン結合ペプチドが認められた。筋肉中には、検出可能なペプチドは認められなかった。低用量時のアルブミン反応遊離ペプチドとしてのこれの取り込みレベルは、遊離ペプチドよりも極めて大きかった。動物に３ｎｍｏｌのＳｕｃ−ｅ８−ｘＰＬＧＬＡＧ−ｒ９−ｃ（Ｃｙ５）を注入した場合、注入２４時間後に腫瘍取り込みを検出するのは困難であった（図２Ｃ）。ＰｙＭＴマウスの入手可能性が限られているため、これは２匹のマウスのみの結果であるが、２匹のＰｙＭＴ遺伝子導入マウスに切断可能および切断不可能ペプチドを注入した場合、取り込みは大きく、識別可能であった（図２Ｄ）。
【０２０７】
切断可能および切断不可能マレイミドペプチドを注入したマウスからＨＴ１０８０腫瘍を集め、蛍光組織像用の処理をした。凍結切片を、Ｃｙ５蛍光を調べるため画像化し、連続切片をＨ＆Ｅ染色して、特異な取り込み特性に関し顕微鏡レベルでより優れた感触を得た。ＨＴ１０８０腫瘍で前にみてきたように、腫瘍の無血管コア中への取り込みは極わずかであったが、むしろペプチドは腫瘍ストローマ界面の周辺の組織中で、より深い取り込みが少し増えた（図３Ａ）。この取り込み分布は、遊離ペプチドでみてきたものと非常に類似している。切断不可能なペプチドでは、切断可能なペプチドでみられた腫瘍実質の端部またはより深い内側の取り込みとはかなり異なっていた（図３Ｂ）。
【０２０８】
転移性の同系乳房腺癌腫瘍に関し、大および小腫瘍中でＨＴ１０８０と類似の分布を有する特異な取り込みがあった
アルブミン反応性ペプチドを４Ｔ１．２同系乳房腺癌腫瘍モデルに注入した。この腫瘍モデルは、いかに良好に選択的輸送分子が転移を標的化できるかを判定するのに使用可能である肺および硬骨を含む離れた組織に４Ｔ１．２細胞が生来的に転移するという事実を含む多くの利点がある。最初に、３ｎｍｏｌの切断可能および切断不可能ペプチドを、各３匹ずつのマウスに注入した。腫瘍がずっと大きくなり、コントラストが大きな腫瘍でも残存するかどうか、また肺その他への転移が検出できるかどうか判断できるようになった場合に、１セットのマウスで実験を行った。２４時間後、マウスを屠殺して、切断可能および切断不可能腫瘍の蛍光の間に明らかな差を認めた（図４）。図３のＨＴ１０８０腫瘍のように腫瘍を凍結後切片化し、この４Ｔ１．２モデルでさらに差が大きいことを示した。切断可能なペプチドを注入したマウスでは、ＨＴ１０８０と異なり、腫瘍全体にわたり明るい蛍光取り込みがあり、また、間質浸潤の領域ではさらに明るい取り込みが認められた（図５Ａ）。遊離ペプチドとは異なり、低倍率像でラベル表示されているように、壊死の腫瘍細胞中での取り込みはずっと小さかったが、これは古典的遊離ペプチドとは異なる。切断不可能ペプチド注入の腫瘍では、拡散した取り込みがあり、この取り込みは切断可能なペプチドより少なく、また明瞭でもなかった（７．５Ｂ）。
【０２０９】
図３に示す大きな腫瘍を有するマウスの肺を解剖した。肺葉の蛍光画像化で認められるように、肺全体にわたり小さな転移があるように見えた（図６Ａ）。次に肺を凍結して切片を切り出し、蛍光画像化を行ってＣｙ５ペプチドを検出した。この画像化により切断不可能なペプチドに比べて切断可能なペプチドを注入したマウスの転移中の選択的輸送分子取り込みの増加が認められた（図６Ｂ）。取り込みは、転移の端部でより多く、遊離ペプチドの場合のように病巣の深くへ侵入しているようには見えなかった。しかし、さらに小さいマイクロ転移が特定された場合は、より多くの選択的輸送分子取り込みが認められ、おそらくアルブミンペプチドが緻密なコア部よりも、露出端部と小さい転移に対しての標識化により適しているのであろうことが示唆される（図６Ｃ）。
【０２１０】
図３に示す大きな腫瘍を有するマウスの肺を解剖した。肺葉の蛍光画像化で認められるように、肺全体にわたり小さな転移があるように見えた（図６Ａ）。次に肺を凍結して切片を切り出し、蛍光画像化を行ってＣｙ５ペプチドを検出した。この画像化により、切断不可能なペプチドに比べて切断可能なペプチドを注入したマウスの転移中の選択的輸送分子取り込みの増加が認められた（図６Ｂ）。取り込みは、転移の端部でより多く、遊離ペプチドの場合のように病巣の深くへ侵入しているようには見えなかった。しかし、さらに小さいマイクロ転移が特定された場合は、より多くの選択的輸送分子取り込みが認められ、おそらくアルブミンペプチドが緻密なコア部よりも、露出端部と小さい転移に対しての標識化により適しているのであろうことが示唆される（図６Ｃ）。
【０２１１】
腫瘍のコントラスト創出に関して、アルブミン反応性選択的輸送分子は他の選択的輸送に比べよいとは言えないまでも同等である
アルブミン反応性ペプチドは、以前設計された選択的輸送分子よりも同等なのか、さらに良いのかを判定するために、１セットのマウスをそれらの最適の時間と用量を用いて並べて試験した。４Ｔ１．２細胞をヌードマウスに注入し、腫瘍が約６ｍｍのサイズの場合は、動物にＳｕｃ−ｅ８−ｘＰＬＧＬＡＧ−ｒ９−ｃ（Ｃｙ５）遊離ペプチド（１０ｎｍｏｌ）、Ｇ５−ＰＡＭＡＭ（選択的輸送分子）６（Ｃｙ５）３デンドリマー（２ｎｍｏｌ）、５３−およびＭａｌ−ｅ９−ｏＰＬＧ（Ｃｍｅ）ＡＧ−ｒ９−ｃ（Ｃｙ５）（３ｎｍｏｌ）を注入した。遊離ペプチド注入マウスを画像化し、６時間後、デンドリマーの場合は４８時間で、マレイミドの場合は２４時間で安楽死させた。皮膚剥がさない場合と剥がした場合の各マウスの画像を最大輝度にして図７に示す。この図は、種々の組織の相対的コントラストとバックグラウンド取り込みを示す。これらのデータは、アルブミン反応性およびマレイミドペプチドが特に良好に作用し、一方、遊離ペプチドは良好であるが、他の組織中でも大きな取り込みがあることを示している。
【０２１２】
マレイミドペプチドのさらなる最適化および分布特性
マレイミドペプチドの体内分布を調べる際、血漿とのインサイチュー反応のための遊離ペプチドとして注入した場合、注入後、ほとんどのペプチドは腎臓へ行くことが明らかになった。予備反応が血漿中半減期を延長し、おそらく腫瘍取り込みを増加させることを考えて、我々は、最初にマウス血清アルブミンとの予備反応を試みた。直感に反して、このことがさらに短い血漿半減期と低い腫瘍取り込みの原因であることが明らかになった。我々は、市販のマウス血清アルブミンは、ゲル電気泳動から明らかなように、マウス血液からより速く排出されるであろう他の分子に対してある種の化学状態にあるオリゴマーを含むのであろうと仮定をした。新鮮凍結マウス血漿がマウス血清アルブミンよりもペプチドと速く反応する（図１Ｃ）ことを観察した後で、我々は、新鮮凍結血漿と予備反応させたペプチドを注入することに決めた。２匹のマウスに未反応または血漿予備反応ペプチドのそれぞれを注入し、血液を３、２４および４８時間後に採取した。驚いたことに、予備反応させたペプチドを注入したマウスの全ての時点で、マレイミドを注入したマウスより高い血漿中ペプチドレベルが得られた（図８Ａ）。動物を画像化し、４８時間後に屠殺したとき、予備反応させたマウスの腫瘍で、明らかに大きな量の腫瘍中取り込みが認められた（図８Ｂ）。この一連の実験の一環として、蛍光非選択的輸送分子アルブミンのための対照としてＣｙ５−モノマレイミドを注入した。このマウスの蛍光画像化では、腫瘍の蛍光が有意に少なく、コントラストがＥＰＲ効果のみでなく、選択的輸送分子の存在にも関係していることを示唆している（図８Ｃ）。
【０２１３】
強いコントラストを得るための十分な腫瘍標的化体内分布に関して、Ｄｏｔａ（１１１Ｉｎ）選択的輸送分子ペプチドが臨床的に重要になる
アルブミン反応性選択的輸送分子で達成されるコントラストのレベルが臨床的画像化に十分かどうかを判断するために、ＤＯＴＡ標識マレイミドペプチドを合成し、ペプチドが１１１Ｉｎとキレートを作ることができるようにした。ペプチドは、Ｃｙ５およびＤＯＴＡの両方を含み、二重のモダリティの画像化を行うことができる。ペプチドを水性の条件下１１１Ｉｎで標識付けし５０μＣｉのペプチドを、血漿との予備反応をせずに、０．３ｎｍｏｌの用量（光学的画像化に使用した用量よりも１０倍少ないペプチド用量）で各動物に注入した。次にマウスをプラナーガンマカメラおよび光学的イメージャーで画像化し、４８時間までの種々の時点で放射能と蛍光の両方を検出した。図９Ａは、切断可能および切断不可能ペプチドを注入し、４８時間後の２匹のマウスである。黒色矢印は腫瘍を指し、際だったコントラストがよくわかる。また、青色の矢印は腎臓を指し、最大量の取り込みを示す臓器である。光学的画像化で、検出可能な唯一の器官は腫瘍であり、腎臓と肝臓は、蛍光浸透の限界のため、インタクトマウスでは認識できなかった（図９Ｂ）。治療当たり３匹のマウスから摘出した組織の体内分布を図９Ｃに示す。この図は、切断可能なペプチドでは、８％ＩＤ／ｇまでの選択的輸送分子が腫瘍に送達されたことを示す。予想外に、切断不可能なペプチドは、切断可能なペプチドより統計的に取り込みが少なくはなかったが、差は存在する。腫瘍コントラストが過去に試験した他の選択的輸送分子構築物と比較してどの程度良好かの感触を得るために、我々は、これらのアルブミン反応性選択的輸送分子およびＰＡＭＡＭデンドリマーに対する、重要な近くの組織を比較した腫瘍のコントラスト取り込み比を計算した。アルブミン反応性マレイミドペプチドの腫瘍の血液、皮膚、および筋肉に対する比は、我々が放射標識を使って過去に試験した全てのデンドリマーより優れている（図９Ｄ）。しかし、切断可能と切断不可能のコントラスト比はそれほど強い印象を与えるものではない。この理由の多くは、マレイミドおよびデンドリマーの両配置に対するＥＰＲ効果に起因するものであろう。
【０２１４】
実施例３：デンドリマー結合選択的輸送分子
ポドフィロトキシン動物実験
選択的輸送分子ポドフィロトキシン（選択的輸送分子−ｐｏｄｏ）共役体をｐｏｄｏ−ｓｓ−ピリジンとＳｕｃ−ｅ８−ｘＰＬＧＬＡＧ−ｒ９−ｃを反応させて合成後、ＨＰＬＣで精製し、質量分析で確認した。ペプチドをＴＦＡ塩として貯蔵し、収率を質量分析で測定した。動物実験のため、無胸腺のヌードマウスの乳房脂肪パッドに１Ｘ１０６ＨＴ１０８０ヒト線維肉腫細胞を注入した。１週間後、腫瘍が３０〜５０ｍｍ３になったときに、マウスに一日おきに１回、合計３回、１０μｍｏｌ／ｋｇのポドフィロトキシン、選択的輸送分子単独、または選択的輸送分子−ｐｏｄｏをＩＰ注入した。治療群あたり３匹のマウスを定期的に秤量し、腫瘍を測定した。選択的輸送分子および選択的輸送分子−ｐｏｄｏ治療群の著しい重量減少のために、１０日後マウスを安楽死させた。
【０２１５】
ドキソルビシンＰＡＭＡＭデンドリマーの品質管理
表面にドキソルビシンが結合したＰＡＭＡＭデンドリマーを使用した。簡単に述べれば、リンカーを合成し、Ｇ５ＰＡＭＡＭデンドリマーの表面に反応させた。最後に、ドキソルビシンをデンドリマーに反応させ、Ａｍｉｃｏｎ遠心分離カラムで精製した。収率を重量と消衰係数として１１，５００／（Ｍ・ｃｍ）を使って計算したドキソルビシン濃度から求めた。チオエーテルおよび３つの異なるヒドラゾンデンドリマーリンカーを図１１に示す（図中、チオエーテル、芳香族、尿素、またはＰｅｇリンカーと表示した）。デンドリマーからのドキソルビシンの加水分解に関し試験した全てのデンドリマーをＰＢＳｐＨ７．４または５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５に入れて１８〜２２時間かけて希釈し、トリシン緩衝ＳＤＳゲルに供した。その後、ゲルを４８８ｎｍ励起および６００ｎｍ発光のＵＶＰイメージャーで画像化した。選択的輸送分子ドキソルビシンデンドリマーをデンドリマー当たり６ドキソルビシンおよび６選択的輸送分子を使って合成した。選択的輸送分子の構造は、Ｓｕｃ−ｅ８−ｏＰＬＧＣ（ｍｅ）ＡＧ−ｒ９−ｃとしたが、理由はこれが高速切断ＭＭＰ基質であり、チオールを介してデンドリマーと反応したからである。さらなる精製のために、デンドリマーを凍結乾燥後、５０％プロピレングリコールおよび５０％２０ｍＭトリス緩衝液中で再懸濁した。デンドリマーを０．２μｍナイロンフィルターを通して遠心分離し、全ての凝集物を除去した。濾過前後の試料をゲル濾過アッセイに供し、精製を確認したが、驚いたことに、この精製により大量の遊離ドキソルビシンおよび高分子量凝集物が除去された。
【０２１６】
デンドリマーを１つのｐＤｏｘおよび３つのＣｙ５でコートして近赤外でデンドリマーを明るく蛍光発光させることを目的として、ｐＤｏｘデンドリマーを合成した。前に記載したようにｐＨ７．４とｐＨ５の緩衝液中で一晩インキュベートしたｐＤｏｘデンドリマー試料をＨＰＬＣ／質量分析に供した。３０〜６０％アセトニトリル水溶液を使って逆相カラムの０．５％ＴＦＡ勾配でＨＰＬＣを行った。ドキソルビシン（４７０〜４９０）およびＣｙ５（６４５〜６５５）吸光度ピークをモニターし、ｐＨ５試料の新しいドキソルビシンのピークを明らかにした。このピークは、質量分析から遊離ｐＤｏｘに基づくものと解明された。定量のため、デンドリマーに対し、前のものとは別の蛍光検出器を有する０．１４％ＴＦＡ含有１０〜９０％ＡＣＮ勾配カラムのＣ１８逆相カラムを使って、さらにＨＰＬＣを行った。デンドリマーに対し、異なるカラムおよび異なる条件になると考えられる２つのカラムの間で別々に実行した。デンドリマーから加水分解されたｐＤｏｘの定量のために、２００ｐｍｏｌの試料を注入し、１２、３６、および６０ｐｍｏｌのｐＤｏｘ単独の検量線と比較した。しかし、図１４からわかるように、ｐＤｏｘ標準は劣化していることがこの実験で明らかになった。
【０２１７】
ドキソルビシンデンドリマーを使った動物実験
複数の実験のなかで、ＨＴ１０８０含有ヌードマウスには特異的単回用量のドキソルビシンデンドリマーを注入した。ドキソルビシン／デンドリマーの注入、用量、数および治療／対照％を、この実験のそれぞれについて表４に示す。マウス重量と腫瘍容量を定期的に測定した。尿素およびＰｅｇヒドラゾンデンドリマーに対しては、注入７日目にマウスを分光的に画像化した。Ｍａｅｓｔｒｏ（ＣＲＩ）スペクトルデコンボルーションシステムおよびソフトウェアを使って、ドキソルビシン蛍光（赤）を自発蛍光（緑）から分離した。腫瘍を取り出し、スペクトルデコンボルーションおよび明視野で画像化した。芳香族とチオエーテルデンドリマーに対しては、各治療群あたり４匹のマウスの割り当てであったが、デンドリマー合成収率が限られているため、尿素とＰｅｇヒドラゾンデンドリマーには、２匹のマウスのみとなった。選択的輸送分子デンドリマー実験に対しては、治療あたり４匹のマウスに、各マウスへの単回用量として２ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンを注入した。この実験用として、各マウスは２つの腫瘍を有し、治療群あたり合計８腫瘍になる。ｐＤｏｘ−デンドリマー実験に対しては、治療あたり３匹のマウスに単回用量を注入し、各マウスは２つの腫瘍を有する。ｐＤｏｘデンドリマーマウスの注入後１１日目にｍａｅｓｔｒｏ小動物イメージャーで画像化し、デンドリマーマウス中のＣｙ５標識を検出した。これにより、実質的な量の蛍光がマウス中に残されていることが明らかになった。マウス中でＣｙ５が全身にわたり非常に多量に分布したため、皮膚が青色に見えた。
【０２１８】
遊離選択的輸送分子ポドフィロトキシン共役体はペプチドによって薬剤より大きな活性を示した
遊離ペプチド薬剤共役体の成功の見込みは低かったが、我々は、少なくとも１つの共役体を調査する価値はあると判断した。そのため、Ｓｕｃ−ｅ８−ｘＰＬＧＬＡＧ−ｒ９−ｃ（ｓｓ−ポドフィロトキシン）を合成し、細胞培養試験を行った。このペプチドが細胞に対しマイクロモル以下の毒性を有することが分かり、また、ペプチド合成が非常に難しいということはなかったので、動物で試験する価値があると判断した。そのため、選択的輸送分子を図１０Ａに示すように合成した。最終構造を図１０Ｂに示す。出発用量を決めるために、ポドフィロトキシン自体を試験し、腫瘍収縮のための有効量を測定した。治癒はしないが腫瘍成長を大きく遅らせるためには、４４μｍｏｌ／ｋｇの一日おき３回注入で十分であることがわかった。ポドフィロトキシンによる明らかな毒性の兆候はなかった（データは示さず）。これらの結果は、４８〜１００μｍｏｌ／ｋｇポドフィロトキシンの多数回投与後、極わずかな毒性が認められたとする文献中のデータと類似していた。最初の選択的輸送分子実験のために、４４μｍｏｌ／ｋｇの用量の選択的輸送分子−ｐｏｄｏを試みることにしたが、この用量では急性毒性であることがわかった。この用量で、まさに選択的輸送分子による大きな毒性があると判断された（４章で考察するように）。そのため、マウスに有毒でない値まで用量を減らす必要が生じた。
【０２１９】
繰り返された毒性の問題のために、ＨＴ１０８０担腫瘍マウスのＩＰ注入剤として投与する選択的輸送分子−ｐｏｄｏの用量を１０μｍｏｌ／ｋｇまで減らした。各治療群あたり３匹のマウスに一日おきに３回用量、１回用量を注入した。治療群は、ポドフィロトキシン（ｐｏｄｏ）単独、選択的輸送分子−ｐｏｄｏ、選択的輸送分子単独、およびＨ２Ｏ賦形剤とした。両方の選択的輸送分子ペプチドは中程度の腫瘍成長減速を起こしたが、ポドフィロトキシンのこの治療用量は効果的でないことが明らかになった（１０．１Ｃ）。これらの結果に基づいて、低下した腫瘍成長は、ポドフィロトキシンには関係なく、むしろ選択的輸送分子の存在に関係があることが明らかになった。この場合の選択的輸送分子は最大耐容ＩＶ用量でＩＰ投与されたことがわかっていた。腫瘍成長曲線の他に、選択的輸送分子および選択的輸送分子−Ｐｏｄｏ両方を注入したマウスは実験の間に大きな体重減少を生じ、ペプチドによる全身性の毒性があったことを示唆している（図１０Ｄ）。これらのデータは、さらに、選択的輸送分子毒性を理由として、ポドフィロトキシン等の薬剤共役体は遊離ペプチド形態を考慮に入れてはいけないことを示唆している。最後に、選択的輸送分子−ＧＦＬＧ−ドキソルビシンペプチドを試みたが、安全用量では、いかなる治療の活性も見いだすことができなかった（データは示さず）。
【０２２０】
ヒドラゾン結合を介したドキソルビシンのＰＡＭＡＭデンドリマーに対する共役により抗腫瘍効果が認められる
治療送達用に最も有望であると考えた選択的輸送分子配置は、薬剤のＧ５ＰＡＭＡＭデンドリマーへの直接結合であった。ｒ９−薬剤共役体の課題およびヒドラジンが作用しうるというヒントから、最初は、ドキソルビシンに付加した安定なチオエーテルリンカーまたは種々の酸不安定ヒドラゾンリンカーを有する共役体に的を絞ることにした。このことが、我々がこれらのタイプの共役体を有する動物の治療活性があるかどうか判断することを可能にした。前に考察したように、ヒドラゾンリンカーの利益は、ネイティブな薬剤がリンカーの加水分解により放出されることである。合成した４つのリンカーの構造を安定なチオエーテルリンカーおよび次の３つのドラゾンリンカーに関する図１１Ａに示す。これらのリンカーをＧ５ＰＡＭＡＭデンドリマーと反応させ、最終ステップとして、ドキソルビシンをリンカーと反応させた。純度および酸感受性を試験するため、デンドリマー共役体を酢酸ナトリウムｐＨ５またはリン酸塩緩衝食塩水ｐＨ７．４中で決められた時間インキュベートした。これらの実験は同時には行わなかったが、定性的差異は明らかで、ｐｅｇリンカーが最も加水分解感受性が高いことを示した。尿素と芳香族リンカーは、酸処理に対し感受性が特に高くはないが、尿素リンカーの方がやや安定性が高いようであった。チオエーテルは明らかに最も安定で、最低量の遊離ドキソルビシン混入物が認められた（図１１Ｂ）。不幸にも、我々はこれらのうちのいずれの分子も、遊離ドキソルビシン混入物の完全にない状態で得ることが出来ていないが、その割合は小さかったのでマウス中のこれらの分子の試験を続行した。
【０２２１】
全ての４つのドキソルビシン結合デンドリマーをＨＴ１０８０担腫瘍マウスへの単回用量注入により試験し、結果を表４にまとめた。この表は、実験の終わり時点での対照に対する治療の％体積であり、その薬剤がどの程度の抗腫瘍活性を有するかを示す。他の２つのヒドラゾンデンドリマーの６２％および６５％に比較して２７％の賦形剤対照に対する腫瘍体積を有し、チオエーテルリンカーは対照と差がないことにより、最大の酸感受性を有するｐｅｇ結合デンドリマーが最良の結果を得たことが明らかになった。図１２Ａ〜Ｄは、尿素およびｐｅｇヒドラゾンリンカーに対する、マウスの画像、腫瘍成長曲線、およびマウス体重の変化を示す。驚いたことに、これらｐｅｇおよび尿素リンカーｄｏｘデンドリマーの両方とも、注入７日後のスペクトルでコンボリュートションを使った蛍光画像化で検出可能であった（図１２Ａ、Ｂ）。腫瘍成長曲線を描画する際、ｐｅｇ−ヒドラゾン腫瘍では、注入後の過程の間に大きな腫瘍サイズ縮退があることが明らかになった（図１２Ｃ）。これらの２匹のマウスでは、わずか２．５（マウス１）および６．５ｍｇ／ｋｇ（マウス２）ドキソルビシン注入後、顕著な抗腫瘍効果が認められた。これらの実験からは毒性の兆候はなかった（図１２Ｄ）。この実験により、ｐｅｇリンカーが大きな腫瘍成長抑制を示し、試験した他の全てのドキソルビシンデンドリマーよりも優れていることが明らかになった。しかし、全ての実験の内で、対照薬剤ドキソルビシンおよびリポソームドキソルビシン（Ｄｏｘｉｌ）は、抗腫瘍活性に関していつもデンドリマーを打ち負かしている。これは、より高い用量の対照を使ったという事実による可能性があり、また、それらが非常に効果的な薬剤であるという理由にもよる。毒性判断するために用量漸増手法を使った、より多くのマウスによるさらに多くのデータと、それによる治療指数が出てくるまでは、これらのデータからは、デンドリマー薬剤共役体が対照よりも優れているかどうかは判定できない。
【０２２２】
【表４】
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【０２２３】
ドキソルビシン結合デンドリマーへの選択的輸送分子の付加が溶解度を顕著に減少させる
デンドリマー上で最も良く作動するヒドラゾンリンカーを選別後、新しいバッチの表面に結合した選択的輸送分子を有するデンドリマーを合成した。我々は、中程度の数であれば、以前Ｃｙ５含有デンドリマーであった溶解度の問題をもたらさないであろうことを期待して、６選択的輸送分子および６ドキソルビシンを有するＧ５ＰＡＭＡＭデンドリマーを合成した。原理的には、１００を超える薬剤を表面に付加することは可能であるが、我々は、ＭＲＩ調査用の３０ガドリニウム分子を有するデンドリマーで見られたような著しい溶解度の問題を予想したため、この選択肢を避けた。我々は、ＰＡＭＡＭデンドリマー上の全ての未反応アミノ基をキャッピングしてさらに溶解度を高めるためにＰｅｇ８またはＰｅｇ４−ＯＨキャップを有する２つの異なるデンドリマーを合成した。これは、キャッピング剤としてＰｅｇ４を使った光学的およびＭＲＩデンドリマーとも異なる。他の調査でのＰｅｇ４に比較して、Ｐｅｇ８およびＰｅｇ４−ＯＨでさらに凝集が少ないことが認められた（データは示さず）。最初に、デンドリマーを凍結乾燥後プロピレングリコールに懸濁させた。この画分は多くの量の遊離ドキソルビシンおよび凝集物を有しており、そのため０．２μｍフィルターを通して濾過し、凝集物と遊離ドキソルビシンの両方が減少したが完全ではなかった（１０．４Ａ）。次に、各デンドリマー、Ｐｅｇ８ｄｏｘデンドリマー単独、Ｐｅｇ８選択的輸送分子ｄｏｘデンドリマー、およびＰｅｇ４−ＯＨ選択的輸送分子ｄｏｘデンドリマーをｐＨ５およびｐＨ７．４で一晩インキュベートし、ドキソルビシンの加水分解を検出した。これらのデンドリマーのそれぞれで、低いｐＨの場合はドキソルビシンの加水分解が増加したが、これらのデータは劇的なものではなかった（１０．４Ｂ）。条件が極めて酸性であったことが理由で、トリス緩衝液の添加前のプロピレングリコールへの再懸濁中に多くのドキソルビシンを失った、と考えている。幾分落胆したが、供給および溶解度上の制約から、１ｍｇ／ｋｇのドキソルビシン当量をマウスに注入することにした。これらのデンドリマーは、おそらく遊離ドキソルビシンとしてさえ有効ではない低用量が理由で、腫瘍成長に対して顕著な効果が無いことがわかった（図１３Ｃ）。
【０２２４】
より強力な２−ピロリノドキソルビシンは選択的輸送分子デンドリマーの効力を高めるが、この薬剤は不安定である
選択的輸送分子コートデンドリマーに付随する溶解度と凝集問題が主要な問題であることが認識された。凝集の原因となると思われる複数の変数があり、その内最も重要な２つは、表面上の選択的輸送分子の数および結合した薬剤の数であると思われる。そのため、我々は、選択的輸送分子の数をデンドリマーあたりおよそ４に減らすことにした。さらに、ドキソルビシンをやめて５００倍強力な２−ピロリノドキソルビシン（ｐＤｏｘ）を使うことにした。これらの共役体は治療の活性のために注入が必要なデンドリマーの量を減らし、より少ない薬剤でのデンドリマーのコーティングを可能にし、またはこのような高濃度が必要でないようにし、最終的に溶解度の問題を少なくするであろう。最後に、我々はデンドリマーの凝集減少がデンドリマー表面上の負に帯電したＣｙ５に役立っていることを見出したが、そのため、Ｃｙ５をｐＤｏｘデンドリマーに添加した。このようにして、３つのＣｙ５、１つのｐＤｏｘを有し、さらに４つの選択的輸送分子が存在するまたは存在しない、Ｇ５デンドリマーを作製した。
【０２２５】
これらのデンドリマーの試験の前に、ｐＤｏｘに対するＨＴ１０８０含有マウス最大耐容用量は、腫瘍成長を顕著に遅らせる用量である０．１ｍｇ／ｋｇであることを見出した。２匹のマウスはそれぞれ０．３および１ｍｇ／ｋｇのｐＤｏｘ注入後２４時間以内に死亡した。この用量は、これらのマウスのドキソルビシンに対する最大耐容用量よりも約５０〜１００倍低い。
【０２２６】
ｐＤｏｘを合成し、前に考察したドキソルビシンデンドリマーと同様に、ヒドラゾンリンカーを介してデンドリマーと反応させた。ｐＤｏｘがデンドリマーと反応したことを確認するのは困難であった。標識化は極めて遅く、吸光度はＵＶ分光法で検出できなかった。検出は、プレートリーダーで測定する蛍光スペクトルによってのみ可能で、ｐＤｏｘがデンドリマーに結合したことは明らかであったが、定量は出来なかった。デンドリマーを、次にｐＨ５緩衝液中でインキュベートし、ＬＣ／ＭＳによりｐＤｏｘを検出することを試みた。加水分解後、ｐＤｏｘの吸光度はＨＰＬＣ吸光度検出器で検出可能で、ピークを質量分析により確認した（図１４Ａ）。しかし、濃度を確認することは出来なかった。次に、蛍光検出器付ＨＰＬＣを使ってｐＤｏｘの濃度を測定し、蛍光標準と比較した（図１４Ｂ）。これらのデータから、１倍数の範囲内でｐＤｏｘを定量出来る確信が持てたが、分解の問題からこれらの測定値が非常に正確であるとは言えない。高感度分析ＨＰＬＣおよび質量スペクトルを使って、ｐＤｏｘには厳しい安定性の問題があり、複数のピークに分解することを見付けた（図１４Ｃ）。安定性は、課題標識化収率がデンドリマーあたり１ｐＤｏｘ未満になるという十分大きな課題になる可能性があった。しかし、２、３のマウスに選択的輸送分子コートのないデンドリマーを注入し、少なくともある程度のレベルの抗腫瘍活性があるのかどうかを判断した。これらの実験により、０．１ｍｇ／ｋｇ未満の用量のｐＤｏｘデンドリマーで、実質的な抗腫瘍効果が示されたが、ｐＤｏｘの安定性と低い標識化効率のため、実験を放棄した（図１５Ａ）。注入後１１日目のマウスの画像化で、腫瘍中の実質的な量のｐＤｏｘＣｙ５デンドリマーが認められ、適切で安定なデンドリマー薬剤の組み合わせが合成されれば、この取り組みまだ価値のある将来性があることを示している（図１５Ｂ）。低標識化効率および選択的輸送分子ｐＤｏｘデンドリマーと同じ用量のｐＤｏｘデンドリマーを確実に注入することが不可能に近いという理由により、ｐＤｏｘデンドリマー含有選択的輸送分子は、試験されることはなかった。
【０２２７】
実施例４：リポソームに結合した選択的輸送分子
ナノ粒子のための選択的輸送分子ペプチド合成
選択的輸送分子をアブラキサンと反応させるために、次のペプチドを前の章で記載したように固相合成により合成した：ｃ−ｅ９−ｏＰＬＧ（Ｃｍｅ）ＡＧ−ｒ９−ｋ。次に、ＤＭＦおよびＮＭＭ中で粗製ペプチドのＮ末端システインにＣｙ５−モノマレイミドを反応させた。ペプチドをＨＰＬＣで精製し、ＤＭＦおよびＮＭＭ中でマレイミドプロピオン酸ＰＦＰエステルと反応させた。精製後、最終ペプチド構造は、ｃ（Ｃｙ５）−ｅ９−ｏＰＬＧ（Ｃｍｅ）ＡＧ−ｒ９−ｋ（ＣＯ（ＣＨ２）２−マレイミド）であった。ＤＳＰＥ−選択的輸送分子に対しては、−Ｃｙ５−ｅ９−ｏＰＬＧ（Ｃｍｅ）ＡＧ−ｒ９−ｃおよびｅ９−（Ｐｅｇ２）２−ｒ９−ｃを固相化学およびＨＰＬＣを用いた精製によりペプチドを合成した。ペプチドをＤＭＦおよびＮＭＭ中で１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［マレイミド（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−Ｐｅｇ（２０００）−マレイミド）（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）と反応させ、次に、反応をＨＰＬＣでモニターした。反応完了近くで、Ｃｙ５−ＮＨＳエステルを添加し、この反応をＨＰＬＣでモニターした。合成完了後、ＤＳＰＥ−選択的輸送分子−Ｃｙ５をＨＰＬＣにより精製した。
【０２２８】
選択的輸送分子のアブラキサンに対する反応およびペプチドの切断
Ｃｙ５−選択的輸送分子−マレイミドペプチドを、アルブミンに対し１および１０％モルパーセントを生理食塩水中で再懸濁したアブラキサン懸濁液に入れ、混合した。反応管をバスソニケーター（ｂａｔｈ  ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）で３０秒の超音波処理を３回行うか、または室温で触らずに３０分または２４時間放置する。最終時点で、トリシン試料緩衝液で反応を止め、９０℃で１０分間加熱する。次に、試料を１０〜２０％トリシン緩衝ゲルに供し、ＵＶＰゲルイメージャーでＣｙ５蛍光を調べるために画像化を行った。酵素切断アッセイ用として、選択的輸送分子リポソームおよびアブラキサンを２０ｍＭトリス１５０ｍＭＮａＣｌ中の５０ｎＭ組換え型ＭＭＰ−９（ＥＭＤ）と共に特定の時間インキュベートし、トリシン試料緩衝液を添加して反応を停止させ、９０℃で１０分間加熱した。次に、試料を１０〜２０％トリシン緩衝ゲルに供し、ＵＶＰゲルイメージャーで蛍光による画像化を行った。
【０２２９】
動的光散乱による選択的輸送分子ナノ粒子のキャラクタリゼーション
リポソームとアブラキサンの調製試料を合成した濃縮物から２ｍｇ／ｍＬのヒスチジンｐＨ６．５で緩衝した３００ｍＭショ糖溶液中に１：１００に希釈した。次に、試料をＺｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ）を使って動的光散乱により測定した。平均１０回の測定から２〜３の測定値を採取しサイズを強度と容量の関数として測定した。次に、容量％とサイズ（ｎｍ）で結果をプロットし試料が単分散ガウス分布のサイズを持つのか、または凝集しているかを示した。
【０２３０】
リポソーム選択的輸送分子の合成
水素添加大豆ホスファチジルコリン：コレステロール：１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−Ｐｅｇ（２０００）（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  ｌｉｐｉｄｓ）が１１：７：１の割合で前の調査と同様に合計３０μｍｏｌの脂質で脂質ケーキを作ることによりリポソームを合成した。リポソーム含有選択的輸送分子として、ＤＳＰＥ−選択的輸送分子−Ｃｙ５のＤＳＰＥ−Ｐｅｇ（２０００）に対するモル比率の異なるものをケーキ形成の前に混合した。２５０ｍＭ硫酸アンモニウムおよび５０ｍＭショ糖ヒスチジン緩衝液０．３３ｍｇ／ｍＬを使って加熱とバス超音波処理することにより脂質ケーキを水和した。多重層リポソーム（小胞）を６０℃に加熱し、プローブソニケータ（ｐｒｏｂｅ  ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を使って２分間超音波処理し小単層リポソーム（小胞）（ＳＵＶ）を作った。次に、ＳＵＶを６０℃でｈｅａｔ  ｂｌｏｃｋ  ｍｉｎｉ−ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）を使って最初０．２μｍ、次に０．１μｍ膜フィルター（Ｗｈａｔｍａｎ）を通して２０回押出を行った。押出後、セファデックスＧ２５（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）カラムを使って、リポソームをｐＨ６．５の３００ｍＭショ糖２ｍｇ／ｍＬショ糖緩衝液へ緩衝液交換を行って、全てのリポソーム外硫酸アンモニウムを除去した。その後、リポソームを１５ｍｇのドキソルビシンと共に６０℃で１時間インキュベートし、次に、セファロースＣＬ−４Ｂカラム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を通して濾過後、４℃で貯蔵した。濃度測定のため、リポソームを１．５％トリトン−Ｘ溶液で破壊し、バス超音波処理機で超音波処理して、１１，５００Ｍ−１ｃｍ−１を消衰係数として使って吸光度により総ドキソルビシン濃度を測定した。
【０２３１】
選択的輸送分子ドキソルビシンリポソーム中のドキソルビシンの細胞画像化
ＨＴ１０８０細胞を９６ウエルのカバーグラス底プレートに蒔き、種々のリポソーム製剤で２５分間、無血清の状態で治療した。次に、細胞を３０分かけて３回洗浄し、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、ＬＳＭ  ５  Ｌｉｖｅ）で４８８ｎｍレーザーと５５０ＬＰ発光フィルターを使ってドキソルビシン蛍光を調べるために画像化を行った。治療後、細胞に対し、正常成長培地中にある間および画像化間のインキュベーションの間、７２時間までの画像化を行った。
【０２３２】
選択的輸送分子リポソーム試験のための動物実験
ヌードマウスの右または／および左乳房脂肪パッドに１Ｘ１０６細胞を皮下注入し異種移植組織を作製した。１週間後の腫瘍が５０〜２５０ｍｍ３に成長後、マウスに、賦形剤、ドキソルビシンリポソーム、または選択的輸送分子コートドキソルビシンリポソームを約３ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンの量で静脈内（ＩＶ）注入した。マウス腫瘍測定および体重測定を定期的な間隔を置いて実施した。一部の実験マウスに対しては、第２の用量を注入した。腫瘍体積が最大近くになると、動物を屠殺し、腫瘍を秤量して画像化した。全動物プロトコルは、ＵＣＳＤ  ＩＡＣＵＣの承認を受けた。治療群を増やし、さらに大きなｎ数にするには、より多くのリソースが必要であったため、図２０の実験はＥｘｐｌｏｒａ  Ｂｉｏｌａｂｓで行った。
【０２３３】
選択的輸送分子コートアブラキサンの合成および検証
ナノ粒子を標的にするために選択的輸送分子を使う１つの方法は、アルブミンパクリタキセル懸濁物の表面をペプチドでコートすることである。７章で考察したものに類似の、アルブミンと反応可能な選択的輸送分子を合成した。この設計の配列は、（Ｃｙ５）ｃ−ｅ９−ｏＰＬＧ（Ｃｍｅ）ＡＧ−ｒ９−ｋ−マレイミドであり（図１６Ａ）、マレイミドがアルブミン上のＣ３４と反応し、次に、切断時にＣｙ５ｃ−ｅ９がアブラキサンから切り離されるであろうことを狙っている。合成と精製後、アルブミン分子に対し１％および１０％モル当量の選択的輸送分子を、新たに懸濁させたアブラキサンと、動物への注入に適した高濃度で混合した。３０分および２４時間後、並発反応を停止し、一部は超音波処理を行った。驚いたことに、超音波処理にもかかわらず、生理食塩水（注入緩衝液）中で反応は３０分未満に完結するまで進行したことがわかった（ゲル電気泳動法（図１６Ｂ））。１％および１０％の出発選択的輸送分子に対し、それぞれ８４％および７０％の選択的輸送分子がアルブミンと反応したことが明らかになった。これは、遊離ペプチドとして残ったものに対するアルブミンと反応したものの蛍光累積強度により測定した。ペプチドがアブラキサンと反応後、０．３％、１％、３％選択的輸送分子を含む、および選択的輸送分子を含まない反応混合物の動的光散乱測定によりナノ粒子が非凝集で約１３０ｎｍのｚ−平均を有することが示された（図１６Ｃ）。アブラキサンと反応した選択的輸送分子をＭＭＰ−９酵素と共にインキュベートすると、Ｃｙ５ｃ−ｅ９がナノ粒子から容易に切断された（ゲル電気泳動法による検出（図１６Ｄ））。これらの明瞭で単純な結果から、次の実験シリーズは、これらの共役体の動物中の治療活性を試験することになる。
【０２３４】
選択的輸送分子でコートされたリポソームの合成と検証
図１７Ａに示すように選択的輸送分子を表面に有するリポソームを合成するために、選択的輸送分子が結合したリン脂質を最初に合成する必要があった。このため、次のペプチドを合成した：Ｃｙ５−ｅ９−ｏＰＬＧ（Ｃｍｅ）ＡＧ−ｒ９−ｃ。この配列で、ペプチド上の遊離チオールは、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［マレイミド（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−Ｐｅｇ（２０００）マレイミド）と反応可能である。後の切断により、ガドリニウムデンドリマーが合成された方法では不可能であった事をインビトロで確認することが出来るという理由から、Ｃｙ５をＮ末端と反応させた５３。反応するとすぐ、ペプチドをＤＳＰＥ−選択的輸送分子−Ｃｙ５として精製し（構造図１７Ｂ）、リポソームに組み込むために使用した（図１７Ａ）。最初、我々はＤＳＰＥ−選択的輸送分子−Ｃｙ５を、あらかじめ作られた医薬グレードのドキシル（Ｄｏｘｉｌ）中に組み込むつもりであったが、ドキシル単独に比べ腫瘍の収縮の点で不成功であった。後でわかったのだが、選択的輸送分子を組み込まれたことを確認する方法がない時点では、我々はあまりにも多くの選択的輸送分子をリポソーム中に組み込みすぎていた。
【０２３５】
研究室で、リポソームを１１：７：１の水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）：コレステロール：ＤＳＰＥ−Ｐｅｇ（２０００）の組成で作製したが、これは医薬ドキシル製剤をできる限り反映している。水和および脂質を１００ｎｍ膜を通した押出を行う前に、混合種々のモル比の選択的輸送分子を混合することにより種々の濃度のＤＳＰＥ−選択的輸送分子−Ｃｙ５を含むリポソームを作製した。濃度はＤＳＰＥ−Ｐｅｇ（２０００）で０．１〜３モル％の範囲であり、これらはリポソームあたり約９〜２７０個の選択的輸送分子の範囲になる。動的光散乱測定によりリポソームの平均サイズ（ｚ−平均）が約１３０ｎｍである事が確認された。代表的％容量ＶＳサイズプロットを図１７Ｃに示す。選択的輸送分子が表面上に存在することを確認するために、リポソームを試験管中でＭＭＰ−９で処理し、酵素が選択的輸送分子にアクセスし、ペプチドが酵素により切断されたことを確認した（図１７Ｄ）。
【０２３６】
選択的輸送分子がドキソルビシンの細胞中への取り込みを増やす
リポソームに組み込まれた選択的輸送分子の検証の後で、我々は、選択的輸送分子がドキソルビシンの培養中の細胞への取り込みを増やすかどうか知ることを望んだ。このため、ＨＴ１０８０ヒト線維肉腫細胞を種々の量の選択的輸送分子を含むリポソームと共にインキュベートした。１時間の長いインキュベーションの後の細胞内ドキソルビシンの量は、選択的輸送分子表面上のリポソーム量の増加と共に増えた（図１８Ａ）。多くの量のドキソルビシン取り込みがあったが、全処理のほとんどの薬剤は主にエンドソームの窪み中にある様に見えた。しかし、画像を明るくすると、細胞の核の内部で検出できることが明らかになった（図１８Ａ挿入図）。
【０２３７】
選択的輸送分子でコートされたリポソームの抗腫瘍効力はリポソームをコーティングしている選択的輸送分子の数に依存する
これらの励みになるデータに基づいて、選択的輸送分子リポソームを担腫瘍マウスに注入し、選択的輸送分子でコートされたリポソームが非標的化リポソームよりも高い抗腫瘍効果を持ちうるがどうかを判断した。ＨＴ１０８０担腫瘍マウスの治療群あたり４マウスに３ｍｇ／ｋｇドキソルビシン当量のリポソームを注入した。治療群あたりの主要数を増やす目的で、各マウスは２つの腫瘍を有した。腫瘍が５０〜２００ｍｍ３であるときに、マウスにＤＳＰＥ−Ｐｅｇ（２０００）リポソーム、非標的化ドキソルビシンリポソームおよび賦形剤単独（ショ糖緩衝液）に対し０．３、１、および３モル％の選択的輸送分子を単回ＩＶ注入した。注入後１７日間定期的にマウス体重および腫瘍容量を定期的に測定した。腫瘍容量の％変化を時間に対しプロットし、最大の抗腫瘍活性が０．３％選択的輸送分子ドキソルビシンリポソームで得られたことが明らかになった。１％および非標的化リポソームは、抗腫瘍活性は類似しており、３％のものはずっと悪かった。これらのデータからは、より少ない数のリポソーム表面の選択的輸送分子が治療の活性を増加させることが示唆されるが、これは組織培養時の取り込みとは逆である（図１８Ａ、Ｂ）。１０日目から１７日目の０．３％および非標的化リポソームの間にはｐ値＜０．０２の両側ｔ−検定で統計的有意差があった。全実験継続期間中、全実験でマウスは健常のまま残り、リポソームの毒性による有意な重量減もなかった（データは示さず）。
【０２３８】
凝集が選択的輸送分子でコートされたリポソームの効果を抑止する
Ａｍｉｃｏｎカラムを使った遠心分離により濃縮したとき、リポソームの凝集の問題が生じる場合があることが明らかになった。凝集があると治療効果は消滅する。おそらく複数のタイプの標的化ナノ粒子に付随する問題であることを理解した上で、この問題を明確にし避ける必要がある。そのため、２つのバッチの０．３％選択的輸送分子リポソームのサイズおよび分散を動的光散乱により測定した。凝集のあった遠心分離したバッチおよび新しい非濃縮バッチは正常分散であることが確認された（図１９Ａ）。光散乱の測定をしないでも、リポソームを０．２μｍ膜フィルターを通して室温で押出して、大きな抵抗があるかどうかを測定することで凝集は定量的に測定可能である。凝集に関する問題がなければ、リポソームは容易に押出可能であるが、凝集が存在すれば抵抗が増える。凝集が腫瘍成長抑制に影響を与えるかどうかを試験するため、２つのバッチのＨＴ１０８０異種移植組織マウスに注入した。各２つの腫瘍を持つマウスに、分散０．３％選択的輸送分子リポソーム（４マウス）ならびに、残りの凝集０．３％選択的輸送分子リポソーム（３マウス）、非標的化リポソーム（４マウス）、および賦形剤対照（３マウス）の３ｍｇ／ｋｇドキソルビシン当量を注入した。この実験により、前に示したように、分散リポソームは非常に効果的であるが、リポソームが凝集すると全ての治療活性が消滅することが確認された（図１９Ｂ）。これらの結果から、効果が完全に消滅するので、全てのナノ粒子調製物の測定および凝集のないことの確認が重要であることが強調される。
【０２３９】
標的化選択的輸送分子リポソームは切断不可能選択的輸送分子および非標的化リポソームよりも大きな治療効果を有する
選択的輸送分子標的化リポソームで得られた有望な結果により、２つのさらなる変数の試験に至った。１つ目は、表面の選択的輸送分子の数をさらに減らすことであり、２つ目は、強化された治療活性が選択的輸送分子の切断依存であるか否かを判定することであった。そこで、リポソームを０．１と０．３％表面上選択的輸送分子（それぞれ、表面に約９個と２７個の選択的輸送分子）のＭＭＰ切断可能なペプチドおよび切断不可能なペプチド（Ｃｙ５−ｅ９−（Ｐｅｇ２）２−ｒ９−ｃ）として再作製した。実験群を治療当たり８マウスに増やし、実験は起こりうるどのようなバイアスも除くために独立業務請負人に行わせた。それぞれ１つの腫瘍を有する８匹のＨＴ１０８０担腫瘍マウスに３ｍｇ／ｋｇ当量のドキソルビシンリポソームを２回（８日目と２２日目）注入し、薬剤処方間の差を強調するようにした（図２０Ａ）。驚くべきことに、０．１％選択的輸送分子治療がこの群では最も効果的で、非標的化リポソーム（２１日目と２８日目）に比べ平均腫瘍容量で４倍超減少を示した。切断可能な選択的輸送分子が非標的化リポソームより優れていることに加えて、切断可能選択的輸送分子は、切断不可能選択的輸送分子より効果的であった。類似の付加数の選択的輸送分子と比較して、両セットの切断可能な選択的輸送分子リポソームは、切断不可能ペプチドよりも小さいマウス中の腫瘍容量を示し、これらの差は複数の時点で有意であった（ｐ値＜０．０５）（図２０Ｂ）。実験の終わりまでに、全治療群のマウスは病気になり、体重減があったが、薬剤治療が原因である、または選択的輸送分子含有マウスが未治療および賦形剤対照マウスよりも全て悪いという証拠はなかった（図２０Ｃ）。血小板数が０．１％の切断可能および切断不可能マウスで賦形剤単独治療群より少ないことを除いて、血液学的分析では、群間の有意差が無いことが明らかになった（データは示さず）。
【０２４０】
実施例５：キャリアの選別
構築物の合成
簡潔に述べれば、ペプチドをＮ末端チオアセトイミドＣ末端リジンを用いて合成した。リジンはＮＨＳエステル経由でＣｙ５に結合するために使われ、システインは示された高分子量キャリアにマレイミドリンカー経由で結合するために使われた。ストレプトアビジン結合分子を作るために、４個の選択的輸送分子をストレプトアビジンに直接結合させるために使用されるＣ末端のビオチンからペプチドを合成した。ＰＡＭＡＭデンドリマーベース構築物を除いて、種々の構築物をサイズ排除ＨＰＬＣで精製し、純度を独立にトリシンゲル電気泳動法により評価した。２つの技術の間に、いくつかの矛盾が観察されたが、おそらく遊離ペプチドの高分子分子量キャリアに対する非特異的固着およびマレイミドリンカーの切断によると思われる。電気泳動技術を使ってさらなる精製をする努力がなされたがこれはほとんどは効果的でなかった。ＰＡＭＡＭデンドリマーベースの構築物を１０ｋＤ分画分子量の膜を通して遠心分離により精製した。
【０２４１】
画像化
ＭＭＴＶプロモーターにより駆動されたポリオーマミドルＴ導入遺伝子（ＰｙＭＴ）を発現している動物をＬｅｓｌｅｙ  Ｅｌｌｉｅｓから入手した。ＨＴ−１０８０異種移植組織を有するヌード動物を社内で作るか、またはＥｘｐｌｏｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。どちらの場合も、３〜５ｃｍの直径になるとすぐその腫瘍を使った。動物にケタミン／ミダゾラム（８０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔をかけ、示された構築物を尾部静脈から注入した。例によって、動物を麻酔から覚める最初の１時間ずっと観察した。それらに再麻酔をかけ、６時間、１２時間、２４時間、および４８時間の時点で必要に応じ画像化した。最後の画像化の後で、ハロタンの過剰投与により動物を屠殺した。使った画像化システムは時間と共に進化した。ペグ化されているほとんどの共役体に対しては、簡単なライトボックスが使われるが、示されたイメージは、スペクトルデコンボリューションイメージャーで最初に得られたそのものである。アルブミン、デキストランおよびＰＡＭＡＭデンドリマー共役体を６２０／２０励起フィルターを使い、６８０ｎｍで画像を集めて試験した。ストレプトアビジン共役体を６４０／４８励起フィルターを使い、７００ｎｍで画像を集めて試験した。
【０２４２】
標準化取り込み値
標準化取り込み値を最初は組織特異的較正をしないで測定し、後で組織特異性および光源の変化を考慮するための再調整を行った。簡潔に述べれば、前に述べたように、３０ｍｇの組織をＳＤＳ緩衝液（２０ｍＭトリスｐＨ７．６、１％ＳＤＳ）中でホモジナイズした。管を凍結し、Ｍａｅｓｔｒｏマウスイメージャー（ｅｘ＝６２０／２０または６４０／４８、ｅｍ＝６８０ｎｍまたは７００ｎｍ）を使って画像化した。較正は両セットのフィルターに対し別々に行った。画像分析をＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使って行った。
【０２４３】
組織像
凍結切片を１０μｍに切り出し、蛍光解剖顕微鏡（ｃｙ５：ｅｘ６２０／６０、ｅｍ６４０／４８）を使って解析した。ＦＩＴＣタグ付きＦ−４８０抗体（１Ｎヤギ血清で１５分間ブロッキングし、１：５０で１％ヤギ血清のＰＢＳ溶液（Ｃａｌｔａｇ）中へ希釈し、４℃で一晩処理）を使って氷冷アセトン中、１０分間固定した組織に対し抗体染色を行った。
【０２４４】
磁気共鳴画像化
動物にイソフルランで麻酔をかけ（誘導３％、維持１〜１．５％）、磁場中にいる間、呼吸のモニタリングシステムを使ってモニターした。ＵＣＳＤの７Ｔ磁石とＧＥインターフェイスを使って画像化を行った。各動物に対し数回のスキャンを行った：脂肪抑制Ｔ１強調スピンエコー（Ｔｒ＝４００ｍｓ、Ｔｅ＝８ｍｓ、スライス厚さ０．３ｍｍ、マトリックス５１２ｘ５１２、１０ＮＥＸ）、Ｔ２アナトミカル（Ｔｒ＝３０００ｍｓ、Ｔｅ＝２０ｍｓ、スライス厚さ０．３ｍｍ、マトリックス５１２ｘ５１２）、１ＮＥＸ、およびＴ１シリーズ（Ｔｒ＝１５０ｍｓ、２５０ｍｓ、５００ｍｓ、１０００ｍｓ、４０００ｍｓ、Ｔｅ＝１２ｍｓ）。
【０２４５】
血液中半減期はキャリアの分子量とともに増加する
予想したように、血液中半減期はキャリアのサイズとともに変化し、遊離ペプチドおよび５ｋＤ  ＰＥＧ共役体の数分からＰＥＧ−４キャップ第５世代ＰＡＭＡＭデンドリマーに結合した選択的輸送分子の１０時間以上まで広がっている。デキストランおよびアルブミン共役体は中位にあり、血液中半減期はそれぞれ２〜３時間および６〜７時間であった。一般的に、高分子量共役体は主要不純物として遊離ペプチドを含んでいるので、血漿中半減期測定を、多くの場合、注入の約３０分後に開始した（図２１）。
【０２４６】
同じキャリアに結合した切断可能および切断不可能選択的輸送分子の間で、少なくとも２倍の腫瘍による取り込みの差が観察された。
【０２４７】
アルブミンおよびデキストラン両共役体を切断可能および切断不可能選択的輸送分子を使って合成した。両方のキャリアに対し、４８時間の時点で約２倍の取り込みの差が認められ（表３）、キャリアに結合した選択的輸送分子が切断されたことを示している。さらに、ゲル電気泳動法により、４８時間時点で腫瘍中に残っている主要蛍光種は切断生成物であることが明らかになった。
【０２４８】
【表３】
2012533560.tif 000019
【０２４９】
組織調査からはキャリア結合切断可能選択的輸送分子はＭＭＰ−２産生腫瘍ストローマにより大きく取り込まれるように見える
遊離ペプチドのように、シュラプネルベースのペプチド共役体の取り込みは、ＭＭＴＶプロモーターにより駆動されたポリオーマミドルＴ抗原を含む遺伝子導入マウス中のストローマに局在化した。抗体の染色により、このストローマ取り込みはＭＭＰ−２の存在と共存することが示された。一部の動物、特にｉＮＯＳ−／−遺伝子型の動物では、扁平上皮異形成のＭＭＰ−９発現領域が、特に、アルブミン結合プローブで強調された。これらの領域は活性のＭＭＰを含むことがインサイチュー酵素電気泳動によって確認された。
【０２５０】
センチネルリンパ節中で切断可能選択的輸送分子はマクロファージにより切断される
ポリグルタマート経由で高分子量キャリアに結合した選択的輸送分子の４８時間後の免疫適格性マウスのリンパ節への取り込みがあるということが早期に観察されている。従来、第５世代ＰＡＭＡＭデンドリマーならびに７０ｋＤデキストラン、ストレプトアビジンおよびアルブミンで、これが観察されたことがなかった。全ｄ−アミノ酸対照ペプチドを注入した動物では、ＰｙＭＴマウス中への腫瘍への取り込みが減少した（図２２）。また、このことは、非担腫瘍動物中ではすっと少ない程度で発生し、これが腫瘍依存性プロセスであることを示唆している。ｒ９−ＦＩＴＣおよびｅ９−ＸＰＬＧＬＡＧ−ｒ９−ｃｙ５の皮下同時注入がリンパ節中の同時染色をもたらさなかったので、ペプチドの切断もリンパ節自体で発生しているようである。フロイント完全アジュバントの事前注入による全身性活性炎症のある動物が、動物における腫瘍と類似の方式でペプチドを取り込んだが、このことは、選択的輸送分子を活性化しているリンパ節中の活性化したマクロファージに関係があることを示唆している。結局のところ、リンパ節への浸潤のある動物のセンチネルリンパ節中で、浸潤のない動物より多くの取り込みがあるが、取り込みはＦ−４８０発現マクロファージと共存し、従って、これは単純に浸潤腫瘍存在下のより多くのマクロファージの活性化が原因であるとすることが可能である（図２３）。
【０２５１】
ＰＥＧ（５ｋＤおよび１２ｋＤ）
５ｋＤ  ＰＥＧおよび１２ｋＤ  ＰＥＧに結合したペプチドをＨＴ−１０８０異種移植組織を有するヌードマウスに、動物あたり６ｎｍｏｌの用量で注入した（図２４）。通常、５ｋＤ  ＰＥＧ共役体は約５分の血液中半減期を有し、遊離ペプチドに類似した挙動を行うが、ｌ２ｋＤ  ＰＥＧ共役体は約２０分のさらに長い半減期を有する。対照として、スクランブルバージョンのＰＬＧＬＡＧ切断可能配列（ＬＡＬＧＰＧと表記）およびｄ−アミノ酸バージョンＰＬＧＬＡＧ配列（ｐｌｇｌａｇと表記）も注入した。２つの陰性対照はＨＴ−１０８０異種移植組織で類似の標準的取り込み値を示したが、我々はｄ−アミノ酸バージョンを以降の実験で使用することにした。そのときの入手の都合上、ポリオーマ遺伝子導入マウスを野生型およびｉＮＯＳ−／−バックグラウンドで試験した。得られた値が大きく違わなかったので、以下に示した取り込み値は両方のタイプのＰｙＭＴマウスプールに対するものとした。当時は組織特異的較正の必要性に気付かなかったので、これらのデータは単純に肝臓と腎臓組織からの較正を使ってはじめから処理した。表３のペグ化ペプチドのデータは、後で組織特異的較正を受けており、２つの因子により腫瘍値を減らし、２つの因子で脾臓値を増やして、Ｍａｅｓｔｒｏを使って集めた他のデータと大体同様のこれらのデータを得た。肝臓および腎臓は両方とも遊離ペプチドに比べ取り込み減少を示す。これは、約５０％の注入ペプチドが１時間までに尿排出されたことによると思われる。
【０２５２】
ペグ化ペプチドの初期の実験後、いくつかの変形したものを試験した。ファージディスプレイにより特定されたＭＭＰ−２のためのＥＳＰＡＹＹＴＡ切断配列は腫瘍への取り込みの改善をもたらさなかったが、肝臓への取り込みの増加につながった。ＰＬＧＷＡＧ配列も、ｕＰＡに対するＸＳＧＲＳＡＸ配列と同様に、腫瘍への取り込みの減少、および肝臓への取り込みの増加につながった。分子への全体的負電荷の付与が腫瘍を含む全器官からのより速い洗い流しの原因となった。チオルファンおよびアクチノニン等のメタロプロテアーゼおよびメタロペプチダーゼ阻害剤の事前注入は腎臓への取り込みを５０％まで減少させ、これらの器官への取り込みが切断依存性であることを示唆している。これらの他の器官中でゼラチン切断実体の存在が酵素電気泳動像ゲルにより確認された。予期されたように、腫瘍取り込みもまた、阻害剤の注入で減少する。
【０２５３】
アルブミン
次に、ＭＭＰ切断可能選択的輸送分子およびその全ｄ−アミノ酸対照ペプチドをアルブミン（正常な生理学的条件下で糸球体の濾液から排出されるタンパク質）と結合させた（図２５）。ペプチドはＨＰＬＣで純粋であるように見えたが、ゲル電気泳動法では、５０％ものｃｙ５が不純物に結合している可能性があることが示された。それでも、これらのペプチドをｎＮＯＳ−／−バックグラウンド中のポリオーママウス専用として試験した。遺伝的背景は、その時点ですぐに入手可能であることを基準にして選択したが、後でｎＮＯＳ−／−および野生型マウスからの腫瘍を酵素電気泳動像ゲルを使って比較したとき、腫瘍ＭＭＰ活性化は大きく違わなかった。皮膚に対する腫瘍の最大コントラストは３６時間付近であったが、動物を４〜６ｎｍｏｌペプチドを注入４８時間後屠殺した。ペグ化ペプチドと同様に、アルブミンペプチドに対する較正も、最初は単純に肝臓および腎臓基準を使って行い、他のペプチドと比較を行うため、後で調整する必要があった。アルブミンは試験した中で良好なキャリアの１つであった；しかし、当時の化学合成プロセスでは、ＤＯＴＡキレート剤にガドリニウムを挿入するのに加熱ステップが必要であった。アルブミンはタンパク質であるため、この加熱ステップはアルブミンを変性する可能性があり、Ｔ１  ＭＲＩ薬剤設計のためのその可能性を制約する。
【０２５４】
デキストラン
次に、ＭＭＰ切断可能および全ｄ−アミノ酸対照ペプチドを７０ｋＤデキストランに結合し、野生型バックグラウンドのＰｙＭＴマウスで試験した。デキストラン合成を目指していくつかの試みを行ったが、精製をＨＰＬＣ保持時間のカットオフにより行った。電気泳動法で解析すると、合成が信頼できるものかどうか確かではなかった。典型的例としては、ゲルのトップ部にスメアがあるもの（紫の矢印）が、遊離ペプチドと同様にゲルの底部にスミアがあるもの（緑の矢印）および遊離ペプチドのおよそ２倍の大きさのスミアがあるもの（ピンクの矢印）があった。各合成物は、比率は異なるが同じ３つの成分を含んでいるように思われる。最良のマウス画像は、図２６に示すように、高分子量種が多いバッチ由来のものであった。次のミドルターコイズ種が大部分であるインジウム標識バージョンはインビトロでＭＭＰ−９によりうまく切断されず、低分子量種は遊離ペプチドに結合していないと思われる。表３の取り込み値は、ＰＬＧＬＡＧおよびｐｌｇｌａｇの最初のバッチで得たものである。
【０２５５】
ストレプトアビジン
３つめの試験したキャリアはストレプトアビジンであった。このスキームでは、ビオチン化ペプチドが容易にストレプトアビジンに結合でき、その結果、構築物合成が大きく促進される。しかし、ＳＵＶ値は期待はずれで、注入液中での析出物は、ビオチン化選択的輸送分子の沈殿によると思われる極めて問題となるものであった。
【０２５６】
第５世代ＰＡＭＡＭデンドリマー
高分子量キャリアシリーズの最後の分子として、１７２５は２つのＭＭＰ切断可能選択的輸送分子に結合した第５世代ＰＡＭＡＭデンドリマーとした。残りの１２６結合部位はスクシニル基でキャップした。その前身物質の多くより純粋であるが、（遊離ペプチドを主要不純物としてゲル電気泳動法で６０％）、１０分未満のオーダーの第一相および１０〜１５時間オーダーの第２相という２相性の血液中半減期を有するように見えた。トリシンゲル電気泳動法で、７２時間までペプチドが腫瘍中に蓄積するように思われ（図２７）、その時点で腫瘍中に存在するほとんどのペプチドが切断されていることを示している。比較的合成が容易であることおよび有望なインビボで特性のため、第５世代ＰＡＭＡＭ−（ｅ９−ＸＰＬＧＬＡＸ−ｒ９−ｋ（ｃｙ５））２（ｓｕｃｃ）１２６を合成した。例によって、ＨＰＬＣ分析は分子が純粋である事を示したが、ゲル電気泳動法は注入液中に遊離ペプチドの存在を示した。電気泳動的技術および塩濃度を使った試料をさらに精製する努力は成功しなかった。この分子をＨＴ−１０８０担腫瘍ヌード遺伝子導入ＰｙＭＴマウスに種々の濃度で注入した。ＳＵＶ値は低濃度で上昇したが、我々の分子検出能力は低下した。最良の使用濃度は、３ｎｍｏｌ注入液または１．５ｎｍｏｌ注入液であるように見え、動物を２４時間後に屠殺した。ゲル電気泳動法は、腫瘍と器官中のほとんどのペプチドが切断され、どの器官にも出発物質が特定されないことを示した。
【０２５７】
スクシニル化ＰＡＭＡＭデンドリマー上の高速切断配列の試験
高速切断配列を使った効果を試験するために、スクシナートキャップを有する２つのデンドリマーを合成した。１つ目は標準的ＭＭＰ配列ＰＬＧＬＡＸを利用し、２つ目には、Ｐ１部位でＬをチエニルアラニン（ＴｈＡ）残基で置換した類似の配列を含めた。この変形により、肝臓への取り込みが２倍に増え腫瘍への取り込みが２．５倍減少した。
【０２５８】
ペグ化ＰＡＭＡＭデンドリマーおよびその変異体の試験
別の実験で、ＰＬＧＬＡＸを、ＰＥＧ４キャップを有するＰＬＧＬＡＧおよびＰＬＧ−Ｃ（ｍｅ）−ＡＧと比較した。これらの分子はゲル電気泳動法で約９０％の純度であった。ＰＬＧＬＡＧ配列の使用は、類似の肝臓への取り込みと同様に、ＰＬＧＬＡＸに比べて腫瘍取り込み低下の原因であると思われた。ロイシンをメチルシステイン（ＭｅＣ）の置換により肝臓への取り込みに２倍の減少が生じたが、腫瘍への取り込みはＰＬＧＬＡＸと同様であった。腫瘍の取り込みはＰＬＧＬＡＸおよびＰＬＧ−Ｃ（ｍｅ）−ＡＧの間で同じままであったが、肝臓への取り込みは２倍減少した。従って、ＰＬＧ−Ｃ（ｍｅ）−ＡＧは、高分子量キャリアに対する使用に優れた基材であると見なされる（図２８）。
【０２５９】
Ｔ１−ＭＲＩを使ったデキストラン結合選択的輸送分子の試験
最後に、大用量注入時にキャリア結合選択的輸送分子がＭＲＩで見ることが出来る十分な積荷を送達可能かどうかを試験するために、いくつかのバージョンのデキストラン結合ガドリニウム標識選択的輸送分子を合成した。ＤＯＴＡキレート化基中にガドリニウムを挿入するために必要な加熱ステップに耐えることができる最大の取り込みが可能なキャリアであるという理由で、デキストランを選んだ。次に、これらの分子を動物に注入し、７Ｔ  ＭＲＩスキャナを使って画像化した。エコー時定数を保持しておき、いくつかの緩和時間で画像を撮っていくつかの組織のＴ１値を算出した。腫瘍と筋肉平均のシグナルを腫瘍容量に対する強度を、Ａｍｉｒａソフトウェアを使って平均化することにより決定した。この手順で進めていて、我々は７Ｔでの水ファントムのＴ１値が、文献値の約３ｓに比べ、２．６±０．４ｓ（ｎ＝２１）であることを見出した。差は水の中のイオンの存在によると思われ、この水は２重に蒸留していないこと、および主に経時的な磁石の安定性を得るために使われていることから、このことはありうることである。スキャナは少し経時的な不整合があり、しばしば実験の途中でクラッシングしたので、毎日、水ファントムのＴ１値に対して腫瘍のＴ１値を正規化した。脂肪抑制画像から計算した強度値も同様に処理した。
【０２６０】
４バッチのデキストラン共役体をＭＲ画像化で試験し４つの異なる結果を得た。１つ目のバッチ（１７４６）は、かろうじて腫瘍に取り込まれたが、センチネルリンパ節には取り込まれたように見はえなかった。定量的には、４８時間後の腫瘍中には、通常１ｎｍｏｌ／ｇプローブ未満であったが、リンパ節中のプローブの存在が明らか（図２９）であったため、各デキストランに結合した４選択的輸送分子を用いてプローブを再合成した。このペプチド（１８１０）を、マウスに注入し、３ｎｍｏｌ／ｇの最大腫瘍取り込みを得た。このスキャナでは技術的に困難であることから、いずれの分子のＴ１値も取らなかった。前のペプチドと異なり、このペプチドは、また、インジウム１１１で放射標識を行った。３番目のデキストランベース光学的構築物（１９２１）をコントラスト剤注入の前後の両方で、Ｔ１で調査した。この分析で、腫瘍中のガドリニウムの存在は、Ｔ１強調画像上の腫瘍強度の増加および腫瘍Ｔ１の減少と相互に関係があるはずである。不幸にも、腫瘍中のガドリニウム取り込みは１ｎｍｏｌ／ｇ未満であり、腫瘍Ｔ１に何らかの変化があったにしても、ほとんど相互に関係づけられなかった。最後に、４つ目のデキストラン共役体を作製し、２０２４と名付けた。画像化データも集めず、腫瘍取り込みは、またしても約１ｎｍｏｌ／ｇであったが、リンパ節取り込みは、検出限界の１０ｎｍｏｌ／ｇを超えた。これは、我々の最初の観察をある程度検証したが、現段階では、低い腫瘍取り込み、および大きいバッチ間不整合のために、ＭＲ画像化用の候補としては、デキストランベースシュラプネルペプチドを放棄した。
【０２６１】
実施例６：キャリアのキャッピング
この実施例は、キャッピング基のデンドリマーの薬物動態学に与える効果を調査する。ここでは、いくつかの異なるキャッピング基を使ってキャッピングのマウス中の血漿中半減期、腫瘍取り込みおよび腫瘍浸透に与える効果を試験した。
【０２６２】
動物
２つのタイプの動物をこれらの実験に使用した。（ａ）注入時約５〜７ｍｍサイズのＨＴ−１０８０異種移植組織を有する無胸腺のヌードマウスおよび（ｂ）ＰｙＭＴマウス。
【０２６３】
血漿中半減期の測定
大凡の血漿中半減期を得るために、約１０μＬの血液を、３０分、１時間、２時間および６時間の時点でヘパリン添加毛細管に集めた。血液をＭａｅｓｔｒｏで画像化し、強度をＩｍａｇｅ  Ｊを使って計算した。自然対数を取って強度を線形化した。血漿中半減期＝０．６９３／ｍ；式中、ｍはラインの傾斜。
【０２６４】
結果と考察
我々は、最初、アセチル、スクシニル、３−ヒドロキシプロピオニル、２−スルホベンゾイル、グリシジル、ＰＥＧ−２、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−８およびＰＥＧ−１２、を含む「純粋な」キャップを有する分子で試験した。ＨＰＬＣを使って分子を精製し、純度をトリシンゲル電気泳動法で確認した（図３０）。動物への注入に際しては、プローブはいくつかのパターンのうちの１つに当てはまる挙動をした。３−ヒドロキシプロピオニル、２−スルホベンゾイル、およびグリシドール、を含む一部は、注入後最初の５分の間に血流から急速に除去された（図３１）。これらの分子では、取り込みはほとんど肝臓であり、それらは、程度の差はあれ、次の４８時間までに除去された。より少ないが、腎臓、唾液腺でも、限定的には腫瘍にも取り込まれている。 
【０２６５】
２つ目のパターンは、スクシニルおよびアセチルキャップ化合物で観察された。これらの分子は十分小さいので、やはり腎臓から排泄される。生理的なｐＨで、スクシニルキャップデンドリマーは高度に負に帯電しており、動物中の血漿中半減期３．２±０．９時間を有する。注入後４８時間で、関節、肝臓および腎臓での蓄積が大部分であった。対照的に、アセチルキャップデンドリマーは中性帯電で、より好ましい薬物動態学的特性を有し、平均血漿中半減期５．６±２．５時間であった。４８時間では、アセチルキャップデンドリマーは、何らの組織特異的蓄積もなかった。スクシニルおよびアセチルキャップデンドリマーの排出は、一部は肝胆性であり、一部は腎性である。注入直後、２４時間後および４８時間後のこれら各デンドリマーの画像を図３２に示す。
【０２６６】
３つめの取り込みパターンは、異なる長さのポリエチレングリコール成分でコートしたデンドリマーで生ずる。ＰＥＧ−２およびＰＥＧ−４デンドリマーは、それぞれ血漿中半減期８．４±１．３時間および１３．９±２．９時間で排出されるが、早い時点で、膀胱蛍光が少し観察されたので腎性排出は限られている可能性がある。ＰＥＧ−８およびＰＥＧ−１２コートデンドリマーの血液中半減期はそれぞれ１３．９±２．９時間、１１．６±１．６時間、および１８．１±３．７時間であった。全てのこれらデンドリマーは、スクシニルおよびアセチルキャップ分子よりもさらに固有性の大きい腫瘍標的指向化特性を有し、腫瘍中よりも肝臓中の標準化取り込み値が約２倍大きかった（表５）。このことは、画像から容易に見て取れ、腫瘍蓄積が時間と共に緩やかに増加した（図３３）。
【０２６７】
【表５】
2012533560.tif 000020
【０２６８】
高分子量キャリアの２つ目の懸念は、腫瘍への浸透の欠如である。ＨＴ−１０８０異種移植組織で試験した全てのデンドリマーの全体組織像で拡散した腫瘍浸透が観察され、このことがキャップＰＡＭＡＭデンドリマーに関しては課題ではないことがわかった。他の器官は、異なるキャップで非常に特徴的な取り込みパターンを示した。例えば、アセチルコートデンドリマーは、腎臓により取り込まれ、スクシナートコートデンドリマーは肝臓、腎臓および脾臓により取り込まれ、またＰＥＧコートデンドリマーは、腫瘍を含む全ての器官への拡散性取り込みを示す（図３４）。
【０２６９】
実施例７：選択的輸送分子のデンドリマーナノ粒子への結合
この実施例では、我々は、いくつかの選択的輸送分子をデンドリマーに結合させることにより、インビボでプロテアーゼ活性を検知し標的化することができる標的化二重標識プローブを設計し、動物全身の光学的、ＭＲＩおよび組織像的手法の両方を使ってそれらのマウス中の浸潤性腫瘍を強調する能力を試験した。
【０２７０】
合成
簡単に述べれば、ペプチドをＣ末端システインと合成し、マレイミド結合を介してＰＡＭＡＭデンドリマーに結合した。ペプチドに結合後、およそ３つのｃｙ５分子または１５〜２０のＤＯＴＡをアミド結合を介してデンドリマーに結合させた。最後に、残っているアミノ基をＰＥＧ−４でキャップした。ｃｙ５のない構築物のために、ガドリニウムのキレート化をグリシン緩衝液（ｐＨ６）中、８０℃で３時間行った。２重標識を有する構築物のために、ガドリニウムの冷温キレート化が必要であった（酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ６一晩）。全ての３つのケースで、精製を１０ｋＤ分画分子量の膜を通して遠心分離により行った。ｃｙ５標識構築物のために、デンドリマーの濃度を化合物の合計重量により評価した。デンドリマーの濃度をＣｙ５の吸光度と比較してデンドリマーに対するＣｙ５の数を評価した。ガドリニウム標識構築物のために、また合成直後と注入時に、デンドリマーの濃度を重量により評価し、誘導結合高周波プラズマ質量分析法によりガドリニウムの濃度を評価した。可能なときはいつでも、トリシンゲル電気泳動法により別々に純度を評価し、１００％に近いことがわかった。
【０２７１】
動物
ＨＴ−１０８０腫瘍（３〜８ｍｍ）含有ヌードマウスおよび遺伝子導入ＰｙＭＴマウスを使用した。
【０２７２】
光学的画像化
動物に８０ｍｇ／ｋｇのケタミンと４０ｍｇ／ｋｇのミダゾラムで麻酔をかけた。１〜３ｎｍｏｌの各プローブを静脈内に注入した。動物をＭａｅｓｔｒｏスペクトルデコンボリューションイメージャー（７００ｎｍ）で６４０／４８励起フィルター（ＣＲＩ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を使って最初の注入後１時間まで、１ｓおよび３ｓで画像化した。画像化後、動物をケージに戻し、デルタフェーズパッドを使って暖めた。６時間、２４時間および４８時間で、動物に再麻酔をかけ画像化した。４８時間後、動物を屠殺し、器官を採取し組織を凍結した。
【０２７３】
光学的標準化取り込み値
凍結組織を解凍し、蛍光誘導のない状況下で代表的３０ｍｇ試料を切り出した。ＰｙＭＴ腫瘍のように異種起源であるとわかっている一部の腫瘍に対しては、２〜３つのこのような３０ｍｇ試料を別々に処理し平均化した。次に、各３０ｍｇ組織切片を１００μＬ  ＳＤＳ溶解緩衝液（１％ＳＤＳ、２０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．６）に添加し、使い捨て乳棒を使って粉砕後、８０℃で１０分加熱した。次に、細胞溶解を確実にするため、試料を４秒間ずつ、２回レンジ加熱した。試料の均等の処置を確実にするため、管を１０分遠心分離し、凍結して、凍結している間にＭａｅｓｔｒｏスペクトルデコンボリューションイメージャーを使って画像化した。積算強度をＩｍａｇｅ  Ｊを使って計算した。デンドリマーあたりのｃｙ５標識数の変動のため、各共役体別々に２点の較正を行った。標準試料として非注入動物由来の腫瘍、肝臓、腎臓および筋肉から３０ｍｇ試料を切り出して調製し、それに１００ｎＭの最終濃度の注入ペプチドを注入して、前記のように処理した。共役体の１つからの濃度曲線に基づいて、濃度に対する信号の直線性を仮定した。標準化取り込み値（ＳＵＶ）を（ｃｙ５  ｎｍｏｌ／３０ｍｇ組織）／（合計注入ｎｍｏｌ／合計動物重量）として定義した。
【０２７４】
蛍光組織像
ＨＴ１０８０およびＰｙＭＴ腫瘍から２０μｍ、およびＰｙＭＴ転移から２５μｍの切片を切り出し、Ｚｅｉｓｓ  Ｌｕｍａｒ解剖顕微鏡（露光時間５〜１５秒、ｅｘ６２０／６０、ｅｍ７００／７５）を使って調べた。インサイチュー酵素電気泳動用として、ＤＱゼラチンをＥＭＤから入手し、メーカーのインストラクションに従って処理した。標準のヘマトキシリンおよびエオシン手続きを使って連続切片を染色した。
【０２７５】
ＭＲ画像化
動物に麻酔をかけ、光学的画像化で記載したように注入した。４８時間で、動物をＵＣＳＤの７Ｔ磁石に入れ、イソフルオラン（３％初期量、１％維持用量）を使って麻酔をかけ、Ｔ１強調ＲＡＲＥ（Ｔｒ＝２５９５ｍｓ、Ｔｅ＝７．５ｍｓ、ＮＥＸ＝１０、スライス厚さ０．３ｍｍ、収集マトリックス２５６ｘ２５６）、Ｔ１強調ＭＳＭＥ（Ｔｒ＝４９８ｍｓ、Ｔｅ＝８ｍｓ、１０ＮＥＸ、スライス厚さ０．３ｍｍ、収集マトリックス１２８ｘ２５６）およびＴｒｕ−ＦＩＳＰ（シングルショット、スライス厚さ０．５ｍｍ、Ｔｒ＝３、Ｔｅ＝１．５ｍｓ、４ＮＥＸ、収集マトリックス１２８ｘ１２８）を使って画像化し、Ｔ１値を得た。ＭＲ画像化データをＰａｒａｖｉｓｉｏｎ（Ｂｒｕｃｋｅｒ）またはＡｍｉｒａ４．１．１（Ｍｅｒｃｕｒｙ）を使って処理した。
【０２７６】
ガドリニウム標準化取り込み値
４８時間の画像化実行後、動物を屠殺し、組織を取り出して凍結した。その後、これらを解凍、秤量、硝酸への溶解後、Ｗｅｓｔ  Ｃｏａｓｔ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｓａｎｔａ  Ｆｅ  Ｓｐｒｉｎｇｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）へ送付し、ＩＣＰ−ＭＳを使ってガドリニウムの定量分析を行った。２μＬの注入液を同様に処理し、定量分析のため同所に送付した。標準化取り込み値（ＳＵＶ）を、（ガドリニウムｎｍｏｌ／組織重量）／（合計注入ｎｍｏｌ／合計動物重量）と定義した。
【０２７７】
デンドリマーナノ粒子に結合した選択的輸送分子は遊離選択的輸送分子より好ましい体内分布を有する
キャリア結合選択的輸送分子が腫瘍中で選択的に切断される能力を保持しているかどうかを判定するため、２つの構築物を合成し、ＨＰＬＣと蛍光ゲル電気泳動法を使って純度を評価した。１つ目は、マレイミドリンカーを介してペプチドＣ末端で切断可能なペプチドに結合したデンドリマーで、２つ目は、対照として使用する全ｄ−アミノ酸ペプチドを有する類似の化合物である（図３５ａ）。デンドリマーナノ粒子に結合し新しい選択的輸送分子をヌード異種移植動物に注入した場合は、皮膚蛍光が大幅に減少し、また関節取り込みがほとんど消滅し、胸郭に対する腫瘍の比率が劇的に増加して、ときには６倍にも達した（図３５ｂ〜ｄ）。さらに、蛍光は４８時間も残存し、一方、その時間までにほとんどの遊離選択輸送分子が洗い流された（図３５ｄ）。この新しい分子の血漿中半減期は、遊離ペプチドベースプローブの１０分未満に対して、約９時間に増えた。定量分析およびｄ−アミノ酸対照ペプチドとの比較により、現れた約半分のシグナルは、血管透過性・滞留性亢進のみによることが示された（切断可能ペプチドの腫瘍ＳＵＶは１．８±０．６、ｎ＝８であったのに対し切断不可能ペプチドでは０．９±０．３、ｎ＝５であった）。対照的に、切断可能遊離ペプチド（ｓｕｃ−ｅ８−ＯＰＬＧ−Ｃ（ｍｅ）−ＡＧ−ｒ９−ｃ（ｃｙ５））の６時間目の腫瘍ＳＵＶはすでに０．２±０．０（ｎ＝３）まで低下していた（両方の場合とも、６時間後、ｐ＜０．０５（図３５ｆ））。
【０２７８】
デンドリマーナノ粒子に結合した選択的輸送分子は自然発生乳癌モデル中の小領域の残存腫瘍に取り込まれる
我々は、次に、デンドリマーナノ粒子に結合した選択的輸送分子をＰｙＭＴ乳癌モデルで試験した。ＨＴ−１０８０異種移植組織を有するヌード動物はうまくカプセル化された腫瘍を有していたが、さらに浸潤性の高いＰｙＭＴモデルにより、われわれのプローブが、腫瘍減量後筋肉に浸潤した残存腫瘍の小さい領域でも検出可能かどうかを判定する機会が得られた（図３６ａ〜ｃ）。図３６ｄは、胸筋筋肉のすぐ隣の２００μｍの残存腫瘍片の組織分析を示す。前の実験のように、ほとんどの取り込みは腫瘍と筋肉の間のストローマ界面で起きている。最終的には、我々は、標準的取り込み値を使って、取り込みの約３３％は切断に起因し、残りの６６％は血管透過性・滞留性亢進に起因することを示すことができた（切断可能プローブの１．５±０．３、ｎ＝６に対し切断不可能プローブで１．０±０．３、ｎ＝５、ｐ＜０．０５）（図３６ｅ）。ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の両方に対し１体のＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ同種接合ヌル動物により腫瘍標準化取り込み値０．９が得られ、ＭＭＰ−２および−９が切断の原因である可能性があることを示している（データは示さず）。
【０２７９】
デンドリマーナノ粒子に結合した選択的輸送分子は現在利用可能な光学的脱消光技術を改善する
我々の新規光学的プローブが現在使用されている技術を改善するかどうかを試験するために、我々のデンドリマーナノ粒子に結合した選択的輸送分子の取り込みと、通常使用されている脱消光プローブ（Ｐｒｏｓｅｎｓｅ、ＶｉｓＥｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ）の取り込みと脱消光とを同じＰｙＭＴ動物モデルで比較した。我々のプローブがより少ない肝臓蛍光を使ってより強力な全体シグナルを発することのみならず（図３７ａ〜ｃ）、我々は、ＰｙＭＴマウスにおいて統計的に有意な筋肉対腫瘍比の改善を示すこともできた（図３７ｄ）。さらに、肺の転移の画像化では、我々のプローブは小さい（＜２００μｍ）転移を容易に検出でき、約半分のシグナルは微小転移周辺の明るいマクロファージ由来であり、残りの半分のシグナルは微小転移それ自身由来であった（図３７ｅ〜ｇ）。対照的に、Ｐｒｏｓｅｎｓｅは転移の中央部を主に染色し、端部をほとんど未染色のまま残し、さらに小さい転移をほとんど染色しなかった（図３７ｈ〜ｊ）。肺の定量結果を図３７ＨとＬに示す。Ｐｒｏｓｅｎｓｅはカテプシンを標的にするため、我々は、細胞外のＭＭＰを標的にする類似のプローブにも着目した。ＭＭＰ検知に関する文献の結果を再現することは出来たが、露光時間がＰｒｏｓｅｎｓｅまたはデンドリマーナノ粒子に結合した選択的輸送分子よりも５倍長く、また、ＰｙＭＴモデルで得られたコントラストはＰｒｏｓｅｎｓｅより質が悪いことがわかった（データは示さず）。
【０２８０】
デンドリマーナノ粒子に結合した選択的輸送分子はＴ１  ＭＲＩ用に十分な量のガドリニウムを腫瘍に送達できる
デンドリマーナノ粒子に結合した選択的輸送分子の理論的利点の１つは、異なるペイロード分子に結合する能力である。溶解度に関する潜在的懸念に対処するために、我々は、デンドリマーあたり１５〜３０ガドリニウム分子のみを結合させ、より可溶性の高いポリエチレングリコール成分を加えた。ＰｙＭＴマウスの大きく変動する腫瘍の問題に対処するため、ＨＴ−１０８０異種移植組織に切り替えた。一連のファントムを添加し、スキャン間の変動を抑えた。定量化のために、全強度を隣接水ファントムに対し正規化した。我々は、組織中に存在するガドリニウムによって、非注入対照に対しガドリニウム注入マウス由来腫瘍の強度の増加に相関があるＴ１の減少が認められることを期待した。実際、４８時間で腫瘍のＴ１が２２％低下し、強度が１５％上昇した（図３８ａ〜ｄ）。この結果は、誘導結合高周波プラズマ質量分析法を使って別に測定した腫瘍中の３０〜４０μＭのガドリニウムの存在と合致した。対照的に、全ｄ−アミノ酸陰性対照を注入した動物中のガドリニウム濃度は顕著に低かった（図３８ｅ、ｐ＜０．０５）。これらの変化は大きくないが、シグナル強度の統計的に有意な増加とＴ１の減少およびガドリニウムの存在との相関により、この差は本当であり、前に仮定したようにプローブが腫瘍を標的化していることが確認される。
【０２８１】
二重標識プローブは取り込みが腫瘍／ストローマ界面にある炎症のＭＭＰ産生領域に濃縮されていることを立証する
切断可能プローブを注入した動物のＭＲＩ画像の、時折発生するのであるが顕著な１つの特徴は、腫瘍周辺の明るいエッジの存在で、ときには隣の実質中へ潜り込んでいた。これらの明るいエッジが意味のあることなのかどうかを判断するために、ガドリニウムおよびｃｙ５の両方を有する二重標識プローブを合成し、ＨＴ−１０８０担腫瘍動物に注入した。この動物をＭＲＩと蛍光で画像化し（図３９ａとｂ）、屠殺後、小片の明るい領域を取り出し組織像用に凍結した。組織像では、２つのタイプの取り込みが存在することが明らかであった。予想されたように、腫瘍実質全体に拡散取り込みが起こった。しかし、腫瘍が筋肉に浸潤している領域での非常に明るいスポットの存在のために、ＭＲ上で認められるものに対する組織的相関の観点からは、この取り込みの多くは不明瞭である（図３９ｃ）。インサイチュー酵素電気泳動およびヘマトキシリンエオシン染色を使ってこれらの明るいスポットの原因を調査したが、予想したように、それらはＭＭＰ産生マクロファージの存在と相関関係があった（図３９ｄ〜ｆ）。よりうまくカプセル化され、浸潤性も少ない腫瘍中では、蛍光画像化およびＴ１強調ＭＲＩの両方を使って調べて、これらの明るいスポットは無かった。
【０２８２】
実施例８：腫瘍縁の可視化
この実施例では、選択的輸送分子を使って、手術の間にさらに客観的に可視化可能かどうかを調査する。我々は、選択的輸送分子の誘導のある場合と無い場合の手術に対する、外科床（ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｂｅｄ）での残存腫瘍細胞および無腫瘍生存を比較した。
【０２８３】
動物
ＨＴ１０８０ヒト線維肉腫細胞（ＡＴＣＣ）またはＭＤＡ−ＭＢ４３５ヒト黒色腫細胞を有する異種移植組織を使用した。８１１９マウス乳房腺癌細胞およびＢ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞を有する同種移植組織を実験室で作製した。１ｘ１０６細胞（８１１９またはＢ１６Ｆ１０）を白子Ｃ５７ＢＬ／６マウスの左脇腹に筋肉内注入した。腫瘍最大直径サイズが約１ｃｍになるまで（約７〜１０日）、腫瘍同種移植組織をモニターした。
【０２８４】
蛍光光学画像化
蛍光光学画像化を、蛍光解剖顕微鏡（Ｌｕｍａｒ、Ｚｅｉｓｓ（ＧＦＰ：露光時間０．５〜１秒、ｅｘ４７０／４０ｎｍ；ｅｍ５２５／５０ｎｍ；Ｃｙ５：露光時間０．５〜１秒、ｅｘ６２０／６０ｎｍ；ｅｍ７００／７５ｎｍ））またはＯＶ１００小動物イメージングシステム（オリンパス（ＧＦＰ：露光時間０．５〜１秒、ｅｘ４７５／４０；ｅｍ５３０／５０；Ｃｙ５：露光時間１．５〜３秒、ｅｘ６２０／６０ｎｍ；ｅｍ７００／７５ｎｍ）で行った。
【０２８５】
蛍光取り込み
簡単に述べると、３０ｍｇの組織をホモジナイズし、ＳＤＳ緩衝液中で加熱し、凍結後、蛍光で画像化した。ＳＵＶ値（（モル／ｇ組織）／（注入モル／動物重量））の蛍光実験値を同様に処理したペプチド注入組織から得た検量線と比較することにより測定した。 
【０２８６】
生存手術
上記で詳述した８１１０細胞またはＢ１６Ｆ１０細胞を有する同種移植組織で生存手術を行った。動物に８０ｍｇ／ｋｇのケタミンと４０ｍｇ／ｋｇのダゾラムで麻酔をかけた。脱毛クリーム剤で毛を除去後、動物に準備処置をして、滅菌した布で包んだ。腫瘍上の皮膚切開後、皮膚弁を大きく展開後、収縮させた。白色光照明を用いて、解剖顕微鏡（Ｌｕｍａｒ、Ｚｅｉｓｓ）下で顕微手術器具を使用して腫瘍切除を行った。止血を手持ち型焼灼器（Ａｃｃｕ−Ｔｅｍｐ、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ）で行った。白色光照明で判断して、完全な腫瘍除去後、動物をＣｙ５蛍光誘導治療群または分子誘導なしの標準手術治療群に無作為に割り付けた。選択的輸送分子誘導治療群に入っている動物に、Ｃｙ５標識デンドリマー選択的輸送分子（２ｎｍｏｌ）を腫瘍切除開始４８時間前に注入した。初期手術の間の偏りを除くために、手術外科医を動物が初期腫瘍除去後に受ける治療群に関し半盲検とした。このケースで半盲検は、手術外科医が、動物が後で受ける予定になっている治療群を特定しないように意識的努力をすることを意味する。しかし、尾部静脈注入により選択的輸送分子で動物を治療した人が腫瘍切除を行った人と同じ人であることが時折あったという理由で、個別の動物の視認特徴による動物の特定が避けられない場合もあった。
【０２８７】
白色光照明で判断して完全な腫瘍切除後、Ｃｙ５用励起および発光パラメーターを使って解剖範囲全体を評価した。蛍光シグナル像を隣接モニター上に表示し、全Ｃｙ５陽性の組織病巣を摘出した。蛍光誘導のある場合または無い場合の腫瘍除去が完了後、皮膚切開を断続的単純縫合で修復し（６−０絹、Ｅｔｈｉｃｏｎ）、動物をケージに戻し麻酔から回復させた。
【０２８８】
動物の腫瘍再発を週３回調べた。腫瘍再発のあるなしに拘わらず全動物を手術後６ヶ月で屠殺した。
【０２８９】
残存腫瘍細胞の定量化
手術後の残存腫瘍細胞の定量化を前に詳述したように作製したＨＴ１０８０の異種移植組織に対し行った。動物に８０ｍｇ／ｋｇのケタミンおよび４０ｍｇ／ｋｇのミダゾラムを使って麻酔をかけた。皮膚切開と収縮後、腫瘍を解剖顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ｌｕｍａｒ）を使った顕微手術の技術により除去した。
【０２９０】
ＧＦＰ、遊離選択的輸送分子（１０ｎｍｏｌ；手術前６時間）またはデンドリマー選択的輸送分子（２ｎｍｏｌ；手術前４８時間）を使った生存調査で前に詳述したように、腫瘍切除の蛍光誘導を行った。ＧＦＰ誘導治療群の動物に対し、ＧＦＰ用励起および発光パラメーターを使って解剖範囲全域にわたり手術野を評価した。蛍光シグナル像を隣接するモニター上に表示し、全ＧＦＰ陽性の組織病巣を摘出した。選択的輸送分子治療群の動物の治療を上述の生存と同様に行った。腫瘍切除の完了後、全ての近接範囲に少なくとも５ｍｍのマージンを持たせて残されている外科床を切除し、Ａｌｕ配列を解析した。残されている外科床に対し残存腫瘍細胞のＡｌｕ  ＰＣＲ解析を行った。ＰＣＲアッセイは、検出可能に至るまでに必要なサイクル数を測定し、サイクル数はソースＤＮＡ量の対数に比例するので、残存腫瘍ＤＮＡを対数単位で表した。
【０２９１】
二重標識ＡＣＰＰによる蛍光およびＭＲ画像化
上述のように、ＨＴ１０８０異種移植組織を作製した。マウスの手術前ＭＲ画像化を行った。次に、マウスに麻酔をかけ、上述のように蛍光誘導下、腫瘍を取り出した。腫瘍除去完了後、マウスをＭＲ画像化室に運び、手術後のＭＲスキャン像を得た。Ａｍｉｒａソフトウェア（Ｍｅｒｃｕｒｙ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使って腫瘍容量を手動で３次元的に定量化した。手術前および手術後の画像を使って腫瘍容量定量化を別の人による盲検方式で行った。
【０２９２】
Ｃｙ５標識ＡＣＰＰによる腫瘍画像化
選択的輸送分子が腫瘍および正常組織間で区別をつけて取り込まれるかどうかを試験するために、遺伝子導入マウス（ライン８１１９、ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ）中の自然発生乳腺癌由来の同種移植組織および免疫コンピテントマウス中に移植されたマウス黒色腫細胞株Ｂ１６Ｆ１０、ならびにヌードマウスに異種移植されたヒト癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ４３５黒色腫およびＨＴ１０８０線維肉腫）、にＣｙ５標識選択的輸送分子を静脈内注入して、切断不可能選択的輸送分子を除去するのに十分な時間後、画像化した。赤外領域近傍での組織による吸収が少ないことから、Ｃｙ５を標識マーカーとして選択した。我々は、単離選択的輸送分子ペプチド（遊離選択的輸送分子）およびＰＡＭＡＭデンドリマーに結合した選択的輸送分子ペプチド（デンドリマー選択的輸送分子）の両方を試験した。正常組織または切断不可能ペプチドで治療したどちらの組織よりも多い状態で、全腫瘍がＣｙ５標識遊離選択的輸送分子およびデンドリマー選択的輸送分子を保持していることがわかった。さらに、全腫瘍タイプで、正常組織に対する腫瘍の比率は、選択的輸送分子に比べ、デンドリマー選択的輸送分子の方が大きいことがわかった（表２）。
【０２９３】
【表２】
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【０２９４】
選択的輸送分子は切除断端で腫瘍の輪郭を描く
正常および腫瘍組織間のマージンの輪郭を描く選択的輸送分子の能力を評価するために、腫瘍の外科的切除の前に、ＧＦＰ形質移入細胞株ＭＤＡ−ＭＢ４３５を異種移植したヌードマウスにＣｙ５標識遊離選択的輸送分子を静脈内注入した。腫瘍がうまくカプセル化されている場合は、選択的輸送分子誘導のない標準的外科的技術で完全な腫瘍除去ができ（ＧＦＰ蛍光および組織分析からも明らかなように）、選択的輸送分子誘導が外科的切除の有効性を改善しないことが明らかになった（データは示さず）。しかし、腫瘍が周辺の組織への浸潤性がある場合は、選択的輸送分子誘導により、白色光では明瞭でない（他の組織の下に埋もれている、または腫瘍の外観が周辺の正常組織とは容易には区別できないために）腫瘍の領域を可視化する能力がもたらされた。
【０２９５】
蛍光画像化誘導に対する遊離およびデンドリマー選択的輸送分子の比較
遊離選択的輸送分子とデンドリマー選択的輸送分子の蛍光画像化誘導に対する腫瘍切除手術の間の有用性を評価するために、どちらかのバージョンのＣｙ５蛍光標識ペプチドをＧＦＰ形質移入ＭＤＡ−ＭＢ４３５を異種移植したマウスに注入した。遊離選択的輸送分子およびデンドリマー選択的輸送分子のバックグラウンドに対するその腫瘍の目視蛍光コントラストおよびインビボ手術の間の使用し易さを比較した（各条件ｎ＝１６）。遊離選択的輸送分子に比べて、デンドリマー選択的輸送分子のバックグラウンド蛍光に対する腫瘍のより高いコントラスト、および注入フルオロフォアの量で正規化したときの、デンドリマー選択的輸送分子のより強い絶対腫瘍蛍光が明らかになった。デンドリマー選択的輸送分子による治療で、皮膚と軟骨によるより少ない非特異的取り込みと共に、腫瘍によるより多い蛍光取り込みが生ずることが示された（表２）。我々は、癌細胞の存在に依存しないリンパ節ならびに脂肪組織への遊離およびデンドリマー選択的輸送両分子の限られた蛍光取り込みに言及しなかった。これは、これら両組織中に豊富に存在するマクロファージによる非特異的取り込みに起因すると思われる。
【０２９６】
Ａｌｕ ＰＣＲによる残存腫瘍脂肪の定量化
選択的輸送分子誘導による腫瘍切除の有効性を定量化するために、我々は、Ａｌｕ ＰＣＲを使い外科的切除後に腫瘍床中に残されている残存ヒト（癌）細胞数を測定した。ヒトＡｌｕ配列定量化により１ｘ１０６マウス細胞中の１つのヒト腫瘍細胞と等価物を検出することができることが示された。そのため、ヒトＡｌｕ ＰＣＲを使って腫瘍縁を感度良く検出可能である。標準的な方法で行った非誘導手術による残存腫瘍細胞数（ｌｏｇ［ＤＮＡ］＝４．６３±０．８２、ｎ＝１０、両側スチューデントｔ−検定、ｐ＝０．００５）に比べて、デンドリマー選択的輸送分子誘導による残存腫瘍細胞数（ｌｏｇ［ＤＮＡ］＝３．６７±０．４７、ｎ＝１０）が手術部位で１０倍少なくなったこと（すなわち、残存癌細胞の９０％減少）が明らかになった。対照的に、切除を誘導するために癌細胞に固有のＧＦＰ蛍光を使った手術（ｌｏｇ［ＤＮＡ］＝４．０±１．４、ｎ＝７）または遊離選択的輸送分子を使った手術（ｌｏｇ［ＤＮＡ］＝４．６７±０．３３、ｎ＝６）では、標準的非誘導手術（ｌｏｇ［ＤＮＡ］＝４．６３±０．８２、ｎ＝１０、それぞれ、ｐ＝０．２６および０．９１）に比べて、有効性の改善が示されなかった。異種移植組織内の細胞が選択圧のためにＧＦＰ発現が損なわれ、そのため腫瘍床のＧＦＰ蛍光調査中に一部の癌細胞が検出からはずれた可能性があり、結果的に不完全な腫瘍切除になったという仮説を立てている。さらに、ＧＦＰ蛍光は生きている動物中の組織とヘモグロビンにより吸収されるため、手術床の表面にない腫瘍は見逃される可能性がある。遊離選択的輸送分子誘導による癌除去有効性の改善の無いことは、腫瘍組織による少ない遊離選択的輸送分子取り込みを反映していると思われ、これにより、デンドリマー選択的輸送分子における腫瘍と隣接正常組織との間のコントラスト（４．４６倍）に比べ、遊離選択的輸送分子におけるコントラスト（２．４５倍）が低下した。この観察と整合性があるが、遊離選択的輸送分子誘導を使った場合と比べて、デンドリマー選択的輸送分子誘導によって残存腫瘍細胞が有意に減少している（両側スチューデントｔ−検定、ｐ＝０．０００５）。
【０２９７】
ＡＣＰＰ誘導手術により得られた外科的試料の組織学的解析
多い蛍光取り込みと悪性細胞の存在の間の相関を定量化するため、我々は、個別ＡＣＰＰ誘導切除試料の組織学的解析を行った。デンドリマー選択的輸送分子プローブは、９３．３３％の特異性割合である（すなわち、Ｈ＆Ｅ組織学的解析により、デンドリマー選択的輸送分子誘導切除から得られた１５試料中の１４試料で癌細胞が認められた）。
【０２９８】
デンドリマー選択的輸送分子誘導手術で、さらに小さいＭＲＩ測定残存腫瘍容量が得られた
標準的比誘導手術に対するデンドリマー選択的輸送分子誘導手術後の残存腫瘍容量を比較するために、Ｃｙ５およびガドリニウムキレートの両方を含むデンドリマー選択的輸送分子で治療したＨＴ１０８０細胞を異種移植したマウスのＭＲ画像化を行った。腫瘍容量を蛍光選択的輸送分子誘導腫瘍切除の前後でＭＲ画像を使って盲検方式により定量化した。ＭＲＩスキャンの容量分析によると、標準的非誘導手術（０．０１６±０．００８ｍｍ３（ｎ＝２））に比べて、Ｃｙ５選択的輸送分子蛍光誘導による手術（０．００３±０．００２ｍｍ３（ｎ＝２））により約５倍の残存腫瘍減少がもたらされたことがわかった。この結果からは、標本数が小さいことが原因と思われる理由で統計的有意性は得られなかったが（片側スチューデントｔ−検定、ｐ＝０．０８）、残存腫瘍細胞減少を示すＡｌｕ  ＰＣＲ定量化による上記の結果と一致している。
【０２９９】
選択的輸送分子誘導手術による無腫瘍生存の改善
手術が選択的輸送分子誘導によりなされた場合、腫瘍再発が影響を受けるかどうかを試験するために、Ｃｙ５標識デンドリマー選択的輸送分子を、遺伝子導入マウス中の自然発生腫瘍（ライン８１１９、ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ）由来、または黒色腫細胞株（Ｂ１６Ｆ１０）由来の細胞を同種移植した免疫適格性マウスに注入した。腫瘍がうまくカプセル化されている場合は、選択的輸送分子誘導があっても無くても完全な腫瘍切除が行えるため、選択的輸送分子誘導では、何らのさらなる生存のための恩恵が得られなかった（データは示さず）。しかし、腫瘍が周辺の組織へ浸潤している場合には、デンドリマー選択的輸送分子誘導なしで腫瘍を摘出したマウスに比べ、デンドリマー選択的輸送分子誘導により腫瘍を摘出したマウスでは、無腫瘍生存が改善されることが明らかになった。黒色腫細胞株Ｂ１６Ｆ１０を同種移植したマウスでは、デンドリマー選択的輸送分子誘導手術により無腫瘍生存の２倍の改善が短期間でもたらされ（手術後８週後で２０％に対する４０％）、また、長期間では５０％の無腫瘍生存がもたらされた（２４週後で２２％に対し３３％、ウィルコクソン検定、ｐ＝０．０５）。遺伝子導入８１１９乳癌細胞株で同種移植したマウスでは、標準的手術に比べて、デンドリマー選択的輸送分子誘導による手術により長期間（２４週）で５倍の無腫瘍生存改善が得られた（手術後２０週で１０％に比べ５０％、ウィルコクソン検定、ｐ＝０．０３）。
【０３００】
本明細書で本発明の好ましい実施形態を示し記載してきたが、このような実施形態が単に例としての目的のみで提供されていることは当業者には明らかであろう。当業者なら本発明から解離することなく多くの変化、改変、および置き換えを思いつくであろう。本発明の実施にあたって本明細書記載の本発明の実施形態に対する種々の選択肢を採用可能であることは理解されるべきである。添付の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義し、また、それによりこの特許請求の範囲の範囲内の方法および構造ならびにその等価物を包含することが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【国際調査報告】
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