【手続補正書】
【提出日】令和2年9月29日(2020.9.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ配列中の標識ヌクレオチドを検出するための方法であって、
ａ）核酸鋳型ならびに前記鋳型にハイブリダイズしてプライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体を形成することが可能なプライマー、ジメルカプトプロパンスルホネートを含む切断試薬、ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにＡ、Ｇ、ＣおよびＴまたはＵのアナログを表す、４種の異なって標識されたデオキシヌクレオシド三リン酸化合物の集団、ならびに切断スカベンジャー試薬を提供するステップであって、ここで、前記標識されたデオキシヌクレオシド三リン酸化合物の各々が核酸塩基および糖を含み、前記糖が３’−Ｏに切断可能な保護基を含み、前記切断可能な保護基がメチレンジスルフィドを含み、前記標識されたデオキシヌクレオシド三リン酸化合物が、切断可能なオキシメチレンジスルフィド含有リンカーを介して前記核酸塩基に結合した標識を含む、ステップと、
ｂ）前記ＤＮＡポリメラーゼおよび前記デオキシヌクレオシド三リン酸化合物の標識された集団を前記プライマーおよび鋳型に添加して反応混合物を作製するステップと、
ｃ）前記反応混合物を、ＤＮＡポリメラーゼ触媒プライマー伸長反応を可能にする条件に供して改変プライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体を作製するステップであって、ここで、第１の標識されたデオキシヌクレオシド三リン酸が組み込まれる、ステップと、
ｄ）前記改変プライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体中の前記第１の標識されたデオキシヌクレオシド三リン酸の前記標識を検出するステップであって、前記検出するステップが、前記組み込まれた第１のデオキシヌクレオシド三リン酸の核酸塩基の決定を可能とする、ステップと、
ｅ）前記切断可能な保護基および前記検出可能な標識を前記改変プライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体から除去する条件下で前記切断試薬を導入するステップと、
ｆ）前記切断スカベンジャー試薬を導入するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記ステップａ）がフローセルをさらに提供し、前記フローセルが第１のリザーバーおよび第２のリザーバーと流体連通しており、前記第１のリザーバーが前記切断試薬を含み、前記第２のリザーバーが酸化的洗浄液を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酸化的洗浄液が、前記第２のリザーバーから前記フローセルに導入される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップｂ）の前記反応混合物が前記フローセル中にある、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記フローセルが移動支持体上に配置されている、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記移動支持体が回転ステージである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記フローセルの少なくとも一部が透明である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記フローセルが機器内に組み込まれている、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記切断スカベンジャーが酸化的スカベンジャーである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップｂ）からステップｆ）を少なくとも５０回繰り返すことをさらに含み、誤った塩基を同定することの発生が、前記切断試薬の使用によって低減する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記酸化的スカベンジャーが過酸化水素である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記過酸化水素が緩衝液中にある、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記緩衝液がＴＲＩＳである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＴＲＩＳ緩衝液が、８．５〜９．０の間のｐＨにある、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＴＲＩＳ緩衝液が８．８のｐＨにある、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記酸化的スカベンジャーがｔｅｒｔ−ブチルペルオキシドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
ステップｂ）の繰り返しの間に、第２のデオキシヌクレオシド三リン酸を添加するステップをさらに含み、前記第２のデオキシヌクレオシド三リン酸が切断可能なオキシメチレンジスルフィドリンカーを介して結合した第２の検出可能な標識を含み、前記第２の検出可能な標識が前記第１の検出可能な標識と異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ジメルカプトプロパンスルホネートがＣＨＥＳ緩衝液中にあり、前記切断試薬のｐＨが９．０〜１０．０の間である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
１つまたは複数のＤＮＡ配列決定試薬、使用説明書、酸化的スカベンジャー、およびジメルカプトプロパンスルホネートを含む切断試薬を含むキット。
【請求項２０】
前記酸化的スカベンジャーが過酸化水素である、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記酸化的スカベンジャーがｔｅｒｔ−ブチルペルオキシドである、請求項１９に記載のキット。
【請求項２２】
前記１つまたは複数のＤＮＡ配列決定試薬が、ポリメラーゼ、プライマー、鋳型およびヌクレオチドを含む群から選択される、請求項１９に記載のキット。
【請求項２３】
溶液中で鋳型にハイブリダイズしたプライマーを含むフローセルであって、前記溶液がジメルカプトプロパンスルホネートおよび酸化的スカベンジャーを含む、フローセル。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
反応は、様々は場所、例えば、ウェル、チャネル、スライド、フローセルなどで起こり得る。フローセルは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，９４０，４８１号に記載されるチャネルを有することができる。フローセルは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，９００，８１０号に記載される機器内の移動支持体上に存在し得る。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
ＤＮＡ配列中の標識ヌクレオチドを検出するための方法であって、
ａ）核酸鋳型および前記鋳型にハイブリダイズしてプライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体を形成することが可能なプライマー、チオール含有化合物を含む切断試薬および切断スカベンジャー試薬を提供するステップと、
ｂ）ＤＮＡポリメラーゼおよび第１のデオキシヌクレオシド三リン酸を前記プライマーおよび鋳型に添加して反応混合物を作製するステップであって、前記第１のデオキシヌクレオシド三リン酸が核酸塩基および糖を含み、前記糖が３’−Ｏに切断可能な保護基を含み、前記切断可能な保護基がメチレンジスルフィドを含み、前記デオキシヌクレオシド三リン酸が、切断可能なオキシメチレンジスルフィド含有リンカーを介して前記核酸塩基に結合した第１の検出可能な標識をさらに含む、ステップと、
ｃ）前記反応混合物を、ＤＮＡポリメラーゼ触媒プライマー伸長反応を可能にする条件に供して改変プライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体を作製するステップであって、前記第１のデオキシヌクレオシド三リン酸が組み込まれている、ステップと、
ｄ）前記改変プライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体中の前記デオキシヌクレオシド三リン酸の前記第１の検出可能な標識を検出するステップと、
ｅ）前記切断可能な保護基および前記検出可能な標識を前記改変プライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体から除去する条件下で前記切断試薬を導入するステップと、
ｆ）前記切断スカベンジャー試薬を導入するステップと
を含む方法。
（項目２）
前記切断試薬がジメルカプトプロパンスルホネートを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ジメルカプトプロパンスルホネートが緩衝液中にある、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記緩衝液がＣＨＥＳである、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記切断試薬のｐＨが９．０〜１０．０の間である、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記切断試薬の前記ｐＨが９．５である、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記切断スカベンジャーが酸化的スカベンジャーである、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記酸化的スカベンジャーが過酸化水素である、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記過酸化水素が緩衝液中にある、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記緩衝液がＴＲＩＳである、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記ＴＲＩＳ緩衝液が、８．５〜９．０の間のｐＨにある、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記ＴＲＩＳ緩衝液が８．８のｐＨにある、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記酸化的スカベンジャーがｔｅｒｔ−ブチルペルオキシドである、項目７に記載の方法。
（項目１４）
ステップｂ）の前記反応混合物がフローセル中にある、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記フローセルが移動支持体上に配置されている、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記移動支持体が回転ステージである、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記フローセルの少なくとも一部が透明である、項目１４に記載の方法。
（項目１８）
前記フローセルが機器内に組み込まれている、項目１４に記載の方法。
（項目１９）
ステップｂ）の繰り返しの間に、第２のデオキシヌクレオシド三リン酸を添加するステップをさらに含み、前記第２のデオキシヌクレオシド三リン酸が第２の切断可能なオキシメチレンジスルフィドリンカーを介して結合した第２の検出可能な標識を含み、前記第２の検出可能検出可能な（detectible  detectable）標識が前記第１の検出可能検出可能な（detectible  detectable）標識と異なる、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記チオール含有化合物がビシナルジチオール系化合物である、項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記第２のデオキシヌクレオシド三リン酸の前記核酸塩基が、前記第１のデオキシヌクレオシド三リン酸の前記核酸塩基と異なる、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
Ａ、Ｇ、ＣおよびＴまたはＵのアナログを表す、少なくとも４種の異なって標識された、３’−Ｏメチレンジスルフィドでキャップされたデオキシヌクレオシド三リン酸化合物の混合物が、ステップｂ）で使用される、項目１に記載の方法。
（項目２３）
前記検出するステップが、前記組み込まれた第１のデオキシヌクレオシド三リン酸の核酸塩基の決定を可能とする、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
ＤＮＡ配列中の標識ヌクレオチドを検出するための方法であって、
ａ）核酸鋳型および前記鋳型にハイブリダイズしてプライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体を形成することが可能なプライマー、ならびにフローセルを提供するステップであって、前記フローセルが、チオール含有化合物を含む切断試薬を含む第１のリザーバーおよび酸化的洗浄液を含む第２のリザーバーと流体連通する、ステップと、
ｂ）ＤＮＡポリメラーゼおよび第１のデオキシヌクレオシド三リン酸を前記プライマーおよび鋳型に添加して、前記フローセル中で反応混合物を作製するステップであって、前記第１のデオキシヌクレオシド三リン酸が核酸塩基および糖を含み、前記糖が３’−Ｏに切断可能な保護基を含み、前記切断可能な保護基がメチレンジスルフィドを含み、前記デオキシヌクレオシド三リン酸が切断可能なオキシメチレンジスルフィド含有リンカーを介して前記核酸塩基に結合した第１の検出可能な標識をさらに含む、ステップと、
ｃ）前記反応混合物を、ＤＮＡポリメラーゼ触媒プライマー伸長反応を可能にする条件に供して改変プライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体を作製するステップであって、前記第１のデオキシヌクレオシド三リン酸が組み込まれている、ステップと、
ｄ）前記改変プライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体中の前記デオキシヌクレオシド三リン酸の前記第１の検出可能な標識を検出するステップと、
ｅ）前記切断可能な保護基および前記検出可能な標識を前記改変プライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体から除去する条件下で前記切断試薬を前記第１のリザーバーから前記フローセルに導入するステップと、
ｆ）前記酸化的洗浄液を、前記第２のリザーバーから、前記フローセルに導入するステップと
を含む方法。
（項目２５）
前記切断試薬が、ジメルカプトプロパンスルホネートを含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記ジメルカプトプロパンスルホネートが緩衝液中にある、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記緩衝液がＣＨＥＳである、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記切断試薬のｐＨが９．０〜１０．０の間である、項目２４に記載の方法。
（項目２９）
前記切断試薬の前記ｐＨが９．５である、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記酸化的洗浄液が過酸化水素を含む、項目２４に記載の方法。
（項目３１）
前記過酸化水素が緩衝液中にある、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記緩衝液がＴＲＩＳである、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記酸化的洗浄液がｔｅｒｔ−ブチルペルオキシドを含む、項目２４に記載の方法。
（項目３４）
１つまたは複数のＤＮＡ配列決定試薬、使用説明書、酸化的スカベンジャー、およびチオール含有化合物を含む切断試薬を含むキット。
（項目３５）
前記チオール含有化合物がジメルカプトプロパンスルホネートである、項目３４に記載のキット。
（項目３６）
前記酸化的スカベンジャーが過酸化水素である、項目３４に記載のキット。
（項目３７）
前記酸化的スカベンジャーがｔｅｒ−ブチルペルオキシドである、項目３４に記載のキット。
（項目３８）
前記１つまたは複数のＤＮＡ配列決定試薬が、ポリメラーゼ、プライマー、鋳型およびヌクレオチドを含む群から選択される、項目３４に記載のキット。
（項目３９）
溶液中で鋳型にハイブリダイズしたプライマーを含むフローセルであって、前記溶液がチオール含有化合物および酸化的スカベンジャーを含む、フローセル。