【手続補正書】
【提出日】令和2年2月21日(2020.2.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における気道炎症の発生を低減または防止するための医薬の製造における、薬学的に許容可能なキャリアと生弱毒化ペルタクチン欠失ボルデテラ細菌とを含む組成物の使用。
【請求項２】
請求項１に記載の使用において、前記気道炎症が、気道抵抗により特徴付けられ、前記医薬が、前記被験体における気道抵抗の発生の低減または防止のための医薬であることを特徴とする、使用。
【請求項３】
請求項１に記載の使用において、前記気道炎症が、前記被験体の肺における好酸球浸潤により特徴付けられ、前記医薬が、前記好酸球浸潤の低減または防止のための医薬であることを特徴とする、使用。
【請求項４】
請求項１に記載の使用において、前記気道炎症が、前記被験体の肺における増大した量の炎症性サイトカインにより特徴付けられ、前記医薬が、前記増大した量の炎症性サイトカインの発生の低減または防止のための医薬であることを特徴とする、使用。
【請求項５】
請求項１に記載の使用において、前記生弱毒化ペルタクチン欠失ボルデテラ細菌が、ペルタクチンをコードする機能的遺伝子を欠くことを特徴とする、使用。
【請求項６】
請求項１に記載の使用において、前記生弱毒化ペルタクチン欠失ボルデテラ細菌が、気管細胞毒素（ＴＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴＸ）、および皮膚壊死毒素（ＤＮＴ）からなる群から選択される少なくとも１つの毒性因子を欠失していることを特徴とする、使用。
【請求項７】
請求項１に記載の使用において、前記生弱毒化ペルタクチン欠失ボルデテラ細菌が、気管細胞毒素（ＴＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴＸ）、および皮膚壊死毒素（ＤＮＴ）からなる群から選択される少なくとも２つの毒性因子を欠失していることを特徴とする、使用。
【請求項８】
請求項１に記載の使用において、前記生弱毒化ペルタクチン欠失ボルデテラ細菌が、気管細胞毒素（ＴＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴＸ）、および皮膚壊死毒素（ＤＮＴ）を欠失していることを特徴とする、使用。
【請求項９】
請求項１に記載の使用において、前記生弱毒化ペルタクチン欠失ボルデテラ細菌が、受託番号ＣＮＣＭ−Ｉ−５１５０でＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓに寄託されたＢＰＺＥ１Ｐ菌株であることを特徴とする、使用。
【請求項１０】
請求項１に記載の使用において、前記気道炎症が、アレルゲンへの曝露に起因することを特徴とする、使用。
【請求項１１】
請求項１に記載の使用において、前記被験体が、喘息と診断されていることを特徴とする、使用。
【請求項１２】
請求項１に記載の使用において、前記被験体が、間質性肺疾患と診断されていることを特徴とする、使用。
【請求項１３】
請求項１に記載の使用において、前記被験体が、アレルギー性鼻炎と診断されていることを特徴とする、使用。
【請求項１４】
請求項１に記載の使用において、前記被験体が、血清中に１０ｎｇ／ｍｌより多くの抗ペルタクチン抗体を有することを特徴とする、使用。
【請求項１５】
請求項１に記載の使用において、前記被験体が、ペルタクチンまたはペルタクチン様抗原を含有するワクチンで予め免疫されていることを特徴とする、使用。
【請求項１６】
被験体における気道炎症の発生を低減または防止するための組成物であって、前記組成物が、薬学的に許容可能なキャリアと、前記被験体の気道にコロニーを形成することが可能な生弱毒化ペルタクチン欠失ボルデテラ細菌とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の組成物において、前記ボルデテラ細菌が、ペルタクチンをコードする機能的遺伝子を欠くことを特徴とする、組成物。
【請求項１８】
請求項１６に記載の組成物において、前記生弱毒化ペルタクチン欠失ボルデテラ細菌が、気管細胞毒素（ＴＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴＸ）、および皮膚壊死毒素（ＤＮＴ）からなる群から選択される少なくとも１つの毒性因子を欠失していることを特徴とする、組成物。
【請求項１９】
請求項１６に記載の組成物において、前記生弱毒化ペルタクチン欠失ボルデテラ細菌が、気管細胞毒素（ＴＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴＸ）、および皮膚壊死毒素（ＤＮＴ）を欠失していることを特徴とする、組成物。
【請求項２０】
受託番号ＣＮＣＭ−Ｉ−５１５０でＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓに寄託されていることを特徴とするＢＰＺＥ１Ｐ菌株。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
ペルタクチンの存在を、正確なバンドサイズについてのコントロールとして精製Ｐｒｎ（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、ＢＰＺＥ１およびＢＰＺＥ１Ｐの溶解産物および上清の免疫ブロットにより試験した。タンパク質抽出のために、ＢＰＺＥ１およびＢＰＺＥ１Ｐ菌株をＢＧ血液寒天上に播種（ｐｌａｔｅ）し、３７℃で４８時間インキュベートした。培養後、細菌をプレートから掻き取り、１０ｍｌのＳｔａｉｎｅｒ−Ｓｃｈｏｌｔｅ培地に再懸濁させ、３７℃で４日間培養した。次いで、遠心分離により細菌を採取した。上清を回収し、タンパク質濃縮のために、以前に記述された（Ｓｏｌａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ２０１４；１０：ｅ１００４１８３）ように、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で処理した。細菌ペレットを、ＥＤＴＡ非含有プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）で補完したＰＢＳに再懸濁させ、フレンチ（Ｆｒｅｎｃｈ）圧力セルを用いて溶解させた。１５，０００×ｇでの３０分間の遠心分離により細菌破片を除去し、免疫ブロットのために上清を回収した。タンパク質を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、次いで、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ（商標）セルシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてニトロセルロース膜上に移動させた。３０分間のＰＢＳ０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ２０中５％ｗ／ｖ脱脂粉乳でのブロッキング後に、膜を、１：１，０００希釈で抗ペルタクチンモノクローナル抗体と共にインキュベートした。次いで、ヤギ抗マウス−ＨＲＰ（Ａｂｃａｍ）を１：１０，０００希釈で添加し、化学発光基質（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてブロットを展開した。図１Ｃに示すように、精製ペルタクチンと共に移動した抗ペルタクチン抗体反応性タンパク質は、ＢＰＺＥ１の上清では検出されたが、ＢＰＺＥ１Ｐの上清では検出されなかった。このタンパク質は、ＢＰＺＥ１またはＢＰＺＥ１Ｐのどちらの細菌細胞溶解産物においても検出されなかった。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
実施例４−ＢＰＺＥ１ＰはａＰｖワクチン接種マウスにおいて肺によるワクチン取り込みを増加させる。
ペルタクチンに対する既存の抗体を有するマウスの肺にコロニーを形成するＢＰＺＥ１Ｐの能力を調べた。８匹の６週齢のマウスの群に、ヒト用量の１／５の無細胞百日咳ワクチン（ａＰｖ；Ｉｎｆａｎｒｉｘ，ＧＳＫ；不活性化百日咳毒素、糸状血球凝集素およびペルタクチンを含有）を皮下ワクチン接種した。４週間後に、同用量のａＰｖをマウスに追加接種（ｂｏｏｓｔ）した。追加接種の４週間後に、マウスを１０６個のＢＰＺＥ１またはＢＰＺＥ１Ｐに鼻腔内感染させた。感染の３時間後に３匹のマウスを安楽死させ、肺を採取してＣＦＵ数を決定した。感染の７日後に、残りの５匹のマウスを安楽死させ、肺を採取し、ＣＦＵ数を測定した。統計分析を、９５％信頼区間で事後ボンフェローニ比較検定を用いて、パラメトリック二元配置分散分析検定を適用して行った。＊＊＊、ｐ＜０．０００１。図５を参照すると、投与の３時間後には、２つの菌株の間にコロニー形成について有意差は見られなかった。それに比べて、接種の７日後には、ＢＰＺＥ１Ｐは、ＢＰＺＥ１よりも有意に良好に肺にコロニーを形成していた。ＢＰＺＥ１Ｐに感染させたマウスは、投与の７日後に肺に約１０４ＣＦＵを有していたのに対して、ＢＰＺＥ１を投与されたマウスの肺におけるＣＦＵ数は１０２ＣＦＵになった。これらのデータは、ペルタクチン含有ａＰｖで予め免疫されたマウスにおいて、ｐｒｎ遺伝子の欠失が、肺によるＢＰＺＥ１の獲得を改善することを示している。