【手続補正書】
【提出日】令和2年7月10日(2020.7.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象となるカプサイシノイドのグルコシドを作製する生合成方法であって、
ａ）形質転換細胞系においてアシル−ＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＳ）およびカプサイシンシンセターゼ（ＣＳ）を発現させることと；
ｂ）前記形質転換細胞系においてＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼを発現させることであって、ここで、前記ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼが、Ｃ．ｒｏｓｅｕｓのＣａＵＧＴ２であり、配列番号５と少なくとも７５％のＤＮＡ配列類似性および／または配列番号６と少なくとも９０％のタンパク質配列類似性を有する、発現させることと；
ｃ）前記細胞系を培地中で成長させることと；
ｄ）前記対象となるカプサイシノイドのグルコシドを生成することとを含む方法。
【請求項２】
前記ＡＣＳおよびＣＳの両方が、Ｃａｐｓｉｃｕｍ属の植物からクローニングされ、ここで、前記Ｃａｐｓｉｃｕｍ属の植物が、ゴーストチリであってよい、請求項１に記載の生合成方法。
【請求項３】
前記発現されたＡＣＳが、ＬＣＡＳ４またはＬＣＡＳ５に基づいて、アラビドプシスからクローニングされた遺伝子に由来する、請求項１に記載の生合成方法。
【請求項４】
培地に加えて原材料を前記細胞系に供給することをさらに含み、前記原材料が、ノナン酸、ペラルゴニウムの油、オクタン酸およびデカン酸からなる群から選択されてよい、請求項３に記載の生合成方法。
【請求項５】
前記形質転換細胞系が、バニリンのバニリルアミンへの変換を触媒することができるアミノトランスフェラーゼをさらに含み、前記原材料が、バニリンおよびバニリアミンの少なくとも１つをさらに含む、請求項４に記載の生合成方法。
【請求項６】
前記形質転換細胞系が、酵母、非カプサイシノイド生成植物、藻類および細菌を含む群から選択される、請求項１に記載の生合成方法。
【請求項７】
前記細胞系がＥ．Ｃｏｌｉである、請求項６に記載の生合成方法。
【請求項８】
前記対象となるカプサイシノイドが、カプサイシンまたはノニバミドである、請求項１に記載の生合成方法。
【請求項９】
利用される前記ＡＣＳが、配列番号３と少なくとも７５％のＤＮＡ配列類似性を共有するＡＣＳである、請求項１に記載の生合成方法。
【請求項１０】
利用される前記ＡＣＳが、配列番号１と少なくとも９０％のタンパク質配列類似性を共有するＡＣＳである、請求項１に記載の生合成方法。
【請求項１１】
利用される前記ＣＳが、配列番号４と少なくとも７５％のＤＮＡ配列類似性を共有するＣＳである、請求項１に記載の生合成方法。
【請求項１２】
利用される前記ＣＳが、配列番号２と少なくとも９０％のタンパク質配列類似性を共有するＣＳである、請求項１に記載の生合成方法。
【請求項１３】
対象となるカプサイシノイドグルコシドを生成する方法であって、
１）配列番号１と少なくとも９０％のタンパク質配列類似性を有するＡＣＳ酵素、２）配列番号２と少なくとも９０％のタンパク質配列類似性を有するＣＳ酵素、および３）配列番号６と少なくとも９０％のタンパク質配列類似性を有するＣａＵＧＴ２酵素を発現することができる形質転換微生物培養物を提供することと；
前記形質転換微生物培養物に特定の脂肪酸前駆体を供給することとを含む方法。
【請求項１４】
前記対象となるカプサイシノイドグルコシドが、カプサイシングルコシドであり、前記脂肪酸前駆体が、６Ｅ−８−メチル−６−ノネン酸である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記対象となるカプサイシノイドグルコシドが、ノニバミドグルコシドであり、前記脂肪酸前駆体が、ノナン酸である、請求項１３に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
本発明の態様をさらに記載する：
［項１］
対象となるカプサイシノイドを作製する生合成方法であって、
ａ）形質転換細胞系においてＡＣＳおよびＣＳを発現させることと；
ｂ）前記細胞系を培地中で成長させることと；
ｃ）前記対象となるカプサイシノイドを生成することとを含む方法。
［項２］
前記ＡＣＳが、Ｃａｐｓｉｃｕｍ属の植物からクローニングされる、上記項１に記載の生合成方法。
［項３］
前記Ｃａｐｓｉｃｕｍ属の植物が、ゴーストチリである、上記項２に記載の生合成方法。
［項４］
前記発現されたＡＣＳが、ＬＣＡＳ４またはＬＣＡＳ５に基づいて、アラビドプシスからクローニングされた遺伝子に由来する、上記項１に記載の生合成方法。
［項５］
前記ＣＳが、前記Ｃａｐｓｉｃｕｍ属の植物からクローニングされる、上記項１に記載の生合成方法。
［項６］
前記Ｃａｐｓｉｃｕｍ属の植物が、前記ゴーストチリである、上記項５に記載の生合成方法。
［項７］
培地に加えて原材料を前記細胞系に供給することをさらに含む、上記項１に記載の生合成方法。
［項８］
前記原材料が、ノナン酸、ペラルゴニウムの油、オクタン酸、デカン酸、バニリン、およびビニリアミンからなる群から選択される、上記項７に記載の生合成方法。
［項９］
前記原材料が、ノナン、ペラルゴニウムの油、オクタン酸、デカン酸、バニリン、およびバニリアミンのうちの２つ以上の混合物である、上記項７に記載の生合成方法。
［項１０］
前記形質転換細胞系が、酵母、非カプサイシノイド生成植物、藻類および細菌を含む群から選択される、上記項１に記載の生合成方法。
［項１１］
前記細胞系がＥ．Ｃｏｌｉである、上記項１０に記載の生合成方法。
［項１２］
前記原材料がノナン酸である、上記項１に記載の生合成方法。
［項１３］
前記対象となるカプサイシノイドが、カプサイシンである、上記項１に記載の生合成方法。
［項１４］
前記対象となるカプサイシノイドが、ＮＶである、上記項１に記載の生合成方法。
［項１５］
前記対象となるカプサイシノイドが、ＤＨＣＰである、上記項１に記載の生合成方法。
［項１６］
前記生成されたカプサイシノイドが、ＣＰ、ＮＶ、およびＤＨＣＰを含む混合物である、上記項１に記載の生合成方法。
［項１７］
培地内で成長する形質転換細胞系によって生成される、対象となるカプサイシノイド。
［項１８］
前記形質転換細胞系が、酵母、非カプサイシノイド生成植物、藻類および細菌からなる群から選択される、上記項１７に記載の対象となるカプサイシノイド。
［項１９］
前記形質転換細胞系が、前記Ｃａｐｓｉｃｕｍ属の植物に由来するＡＣＳおよびＣＳの存在によって形質転換される、上記項１８に記載の対象となるカプサイシノイド。
［項２０］
前記製造方法が、前記形質転換細胞系に特定の原材料を供給することをさらに含む、上記項１７に記載の対象となるカプサイシノイド。
［項２１］
前記原材料が、ノナン、ペラルゴニウムの油、オクタン酸、デカン酸、バニリン、およびバニルアミンからなる群から選択される、上記項２０に記載のカプサイシノイド。
［項２２］
前記原材料が、ノナン、ペラルゴニウムの油、オクタン酸、デカン酸、バニリン、およびバニルアミンのうちの２つ以上を含有する混合物から選択される、上記項２０に記載の対象となるカプサイシノイド。
［項２３］
前記形質転換細胞系が、前記Ｃａｐｓｉｃｕｍ属の植物に由来するＡＣＳおよびＣＳの存在によって形質転換される、上記項１８に記載のカプサイシノイド。
［項２４］
前記細胞系に形質転換された前記ＡＣＳが、ＬＣＡＳ４またはＬＣＡＳ５に基づいて、アラビドプシス由来のＡＣＳである、上記項１８に記載の対象となるカプサイシノイド。
［項２５］
ＣＰである、上記項１７に記載の対象となるカプサイシノイド。
［項２６］
ＮＶである、上記項１７に記載の対象となるカプサイシノイド。
［項２７］
ＤＨＣＰである、上記項１７に記載の対象となるカプサイシノイド。
［項２８］
生成された前記カプサイシノイドが、ＣＰ、ＮＶ、およびＤＨＣＰの混合物である、上記項１７に記載のカプサイシノイド。
［項２９］
前記形質転換細胞系が、前記Ｃａｐｓｉｃｕｍ属の植物に由来するＡＣＳおよびＣＳの存在によって形質転換される、上記項１９に記載の対象となるカプサイシノイド。
［項３０］
前記形質転換細胞系が前記ゴーストチリに由来するＡＣＳおよびＣＳの存在によって形質転換される、上記項２９に記載の対象となるカプサイシノイド。
［項３１］
利用される前記ＡＣＳが、配列番号３と少なくとも７５％のＤＮＡ配列類似性を共有するＡＣＳである、上記項１に記載の生合成方法。
［項３２］
利用される前記ＡＣＳが、配列番号１と少なくとも９０％のタンパク質配列類似性を共有するＡＣＳである、上記項１に記載の生合成方法。
［項３３］
利用される前記ＣＳが、配列番号４と少なくとも７５％のＤＮＡ配列類似性を共有するＣＳである、上記項１に記載の生合成方法。
［項３４］
利用される前記ＣＳが、配列番号２と少なくとも９０％のタンパク質配列類似性を共有するＣＳである、上記項１に記載の生合成方法。
［項３５］
前記細胞系が、細菌、酵母、植物細胞、動物細胞、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記項１〜３４のいずれか１項に記載の生合成方法。
［項３６］
前記カプサイシノイドが、精製されたカプサイシンである、上記項１７に記載の対象となるカプサイシノイド。
［項３７］
前記カプサイシノイドが、７０％超の純度である、上記項３６に記載の対象となるカプサイシノイド。
［項３８］
前記カプサイシノイド含量が、乾燥基準で約８５重量％超である、上記項１７に記載の対象となるカプサイシノイド。
［項３９］
ステップｃ）が、ｉ）粗生成物を精製することと、ｉｉ）真空下で溶媒を除去して、濃縮カプサイシノイド生成物を提供することとを含む、上記項１に記載の生合成方法。
［項４０］
前記粗生成物が、カラムクロマトグラフィーにより精製される、上記項３９に記載の生合成方法。
［項４１］
前記粗生成物が、酸−塩基抽出によって精製される、上記項３９に記載の生合成方法。
［項４２］
前記粗生成物が、真空蒸留によって精製される、上記項３９に記載の生合成方法。
［項４３］
前記粗生成物が、半分取ＨＰＬＣによって精製される、上記項３９に記載の生合成方法。
［項４４］
対象となるカプサイシノイドを生成する方法であって、形質転換微生物培養物に特定の脂肪酸前駆体を供給することを含む方法。
［項４５］
前記対象となるカプサイシノイドが、カプサイシンであり、前記脂肪酸前駆体が、６Ｅ−８−メチル−６−ノネン酸である、上記項４４に記載の方法。
［項４６］
前記対象となるカプサイシノイドが、ジヒドロカプサイシンであり、前記脂肪酸前駆体が、８−メチルノナン酸である、上記項４４に記載の方法。
［項４７］
前記対象となるカプサイシノイドが、ノニバミドであり、前記脂肪酸前駆体が、ノナン酸である、上記項４４に記載の方法。
［項４８］
前記対象となるカプサイシノイドが、Ｎ−バニリオクタミドであり、前記脂肪酸前駆体が、オクタン酸である、上記項４４に記載の方法。
［項４９］
前記対象となるカプサイシノイドが、Ｎ−バニリルデカンアミドであり、前記脂肪酸前駆体が、デカン酸である、上記項４４に記載の方法。
［項５０］
前記形質転換培養物が、酵母または細菌の微生物培養物である、上記項４４に記載の方法。
［項５１］
前記細胞系が、バニリンのバニリルアミンへの変換を触媒することができるアミノトランスフェラーゼをさらに含む、上記項１０に記載の生合成方法。
［項５２］
前記原材料が、中鎖〜長鎖脂肪酸であるＣ６〜Ｃ１２炭化水素からなる群から選択される、上記項７に記載の生合成方法。
［項５３］
前記原材料が、中鎖〜長鎖脂肪酸である２種以上のＣ６〜Ｃ１２炭化水素の混合物である、上記項７に記載の生合成方法。
［項５４］
前記対象となるカプサイシノイドが、ノルジヒドロカプサイシンである、上記項１に記載の生合成方法。
［項５５］
前記形質転換細胞系が、Ｃ．ｒｏｓｅｕｓのＣａＵＧＴ２を含む、上記項１に記載の生合成方法。
［項５６］
前記形質転換細胞系が、配列番号５と少なくとも７５％のＤＮＡ配列類似性を共有するＣａＵＧＴ２を含む、上記項１〜１６、３１〜３５、および５１〜５５のいずれか１項に記載の生合成方法。
［項５７］
前記形質転換細胞系が、配列番号６と少なくとも９０％のタンパク質配列類似性を共有するＣａＵＧＴ２を含む、上記項１〜１６、３１〜３５、および５１〜５５のいずれか１項に記載の方法。
［項５８］
前記微生物培養物が、配列番号３と少なくとも７５％のＤＮＡ配列類似性を共有するＡＣＳを発現する、上記項４４に記載の方法。
［項５９］
前記微生物培養物が、配列番号１と少なくとも９０％のタンパク質配列類似性を共有するＡＣＳを発現する、上記項４４に記載の方法。
［項６０］
前記微生物培養物が、配列番号４と少なくとも７５％のＤＮＡ配列類似性を共有するＣＳを発現する、上記項４４に記載の方法。
［項６１］
前記微生物培養物が、配列番号２と少なくとも９０％のタンパク質配列類似性を共有するＣＳを発現する、上記項４４に記載の方法。
［項６２］
前記微生物培養物が、配列番号５と少なくとも７５％のＤＮＡ配列類似性を共有するＣａＵＧＴ２を発現する、上記項４４および５８〜６１のいずれか１項に記載の方法。
［項６３］
前記微生物培養物が、配列番号６と少なくとも９０％のタンパク質配列類似性を共有するＣａＵＧＴ２を発現する、上記項４４に記載の生合成方法。
［項６４］
疼痛の局所治療のための鎮痛組成物であって、前記組成物は、有効量のカプサイシノイドを含有し、前記鎮痛剤組成物は、上記項１〜１６、３１〜３５、および３９〜６３のいずれか１項に記載の方法によって生成され、改善は、微生物細胞系において前記カプサイシノイドを生成することを含む方法。
［項６５］
前記有効量が、対象となるカプサイシノイドの少なくとも０．０１２５パーセントである、上記項６４に記載の鎮痛組成物。
［項６６］
上記項１〜１６、３１〜３５および３９〜６３のいずれか１項に記載の方法に従って生成された少なくとも１種のカプサイシノイドを有する、香味剤および芳香剤組成物。
［項６７］
前記カプサイシノイドが、ノニバミド、Ｎ−バニリルノナンアミド、Ｎ−バニリルスルホンアミド、Ｎ−バニリルウレア、Ｎ−バニリルカルバメート、Ｎ［（置換フェニル）メチル］アルキルアミド、メチレン置換Ｎ［（置換フェニル）メチル］アルカンアミド、Ｎ［（置換フェニル）メチル］−シス−単飽和アルケンアミド、Ｎ［（置換フェニル）メチル］二不飽和アミド、３−ヒドロキシアセトアニリド、ヒドロキシフェニルアセトアミド、シュードカプサイシン、ジヒドロカプサイシン、ノルジヒドロカプサイシン、ホモカプサイシン、ホモジヒドロカプサイシンＩ、アナンダミド、ピペリン、ジンゲロン、ワーバーガナル、ポリゴジアール、アフラモジアール、シンナモジアール、シンナモスモライド、シンナモライド、シバムド、ノニバミド、オルバニル、Ｎ−オレイル−ホモバニルアミジア、イソベレラル、スカララジアール、アンシストロジアール、およびこれらの任意の組み合わせまたは混合物からなる群から選択される、上記項６６に記載の香味剤および芳香剤組成物。
本開示は様々な修正および代替形態をとり得るが、その特定の実施形態が図面において例として示され、本明細書において詳細に説明される。しかしながら、本明細書において示される図面および詳細な説明は、本開示を開示される特定の実施形態に限定するものではなく、逆に、本発明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の趣旨および範囲内の全ての修正、均等物、および代替物を包含するものであることを理解されたい。