【手続補正書】
【提出日】令和2年5月15日(2020.5.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子固体構造を形成することが出来る組換えスパイダーシルクタンパク質で固体表面をコーティングする方法であって、
前記組換えスパイダーシルクタンパク質の水性溶液に前記固体表面を曝し、それによって、前記組換えスパイダーシルクタンパク質と前記固体表面の間に共有結合を形成すること無く、前記固体表面上に吸着された前記組換えスパイダーシルクタンパク質の表面層を形成する工程; 及び
前記固体表面の前記表面層を前記組換えスパイダーシルクタンパク質の水性溶液にさらに曝し、それによって、前記表面層上に前記組換えスパイダーシルクタンパク質の集合したシルク構造層を形成する工程
を含み、ここで、当該方法は、スパイダーシルクタンパク質の乾燥を含まない、方法。
【請求項２】
前記固体表面又は前記表面層を前記組換えスパイダーシルクタンパク質の水性溶液に曝す工程の間又は後に1つ以上の洗浄工程をさらに含み、ここで、各洗浄工程が、前記コーティングされた表面に隣接する可溶性組換えスパイダーシルクタンパク質の除去を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記固体表面が、疎水性であり、例えば30°超の水との接触角θを有する材料であり、及び/又は前記固体表面が、その露出されたヒドロキシル基のpKaが7未満である材料である、請求項1又は2の何れか1項に記載の方法。
【請求項４】
前記固体表面が、金属、金属合金、ポリマー、ミネラル、ガラス及びガラス様材料、アミノシラン、及び疎水性炭化水素からなる群から選択される材料であり、例えば、チタニウム、ステンレス・スティール、ポリスチレン、ヒドロキシアパタイト、二酸化ケイ素、APTES機能化二酸化ケイ素、金、及びアルキルチオール機能化金から選択される材料である、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記組換えスパイダーシルクタンパク質が、機能的に露出された非スピドロインタンパク質部分又は非スピドロインポリペプチド部分を含む、請求項1〜4の何れか1項に記載の方法。
【請求項６】
前記組換えスパイダーシルクタンパク質が、前記タンパク質部分REP及びCT並びに任意で機能的に露出した非スピドロインタンパク質/ポリペプチド部分を含み、ここで、
REPが、L(AG)nL、L(AG)nAL、L(GA)nL、及びL(GA)nGLからなる群から選択される70〜300アミノ酸残基の反復フラグメントであり、ここで、
nが、2〜10の整数であり;
各個々のAセグメントが、8〜18アミノ酸残基のアミノ酸配列であり、ここで、0〜3アミノ酸残基がAlaではなく、残りのアミノ酸残基がAlaであり;
各個々のGセグメントが、12〜30アミノ酸残基のアミノ酸配列であり、ここで、少なくとも40%のアミノ酸残基がGlyであり; 及び
各個々のLセグメントが、0〜30アミノ酸残基のリンカーアミノ酸配列であり;並びに
CTが、配列番号3又は配列番号69に対して少なくとも70%の同一性を有する70〜120アミノ酸残基のフラグメントである、
請求項1〜5の何れか1項に記載の方法。
【請求項７】
高分子固体構造を形成することが出来る組換えスパイダーシルクタンパク質でコーティングされた固体表面であって、ここで、前記組換えスパイダーシルクタンパク質コーティングが、
前記組換えスパイダーシルクタンパク質と前記固体表面の間に共有結合を形成すること無く前記固体表面に吸着された前記組換えスパイダーシルクタンパク質の表面層; 及び
前記表面層上の前記組換えスパイダーシルクタンパク質の集合したシルク構造層;
を含み、ここで、前記組換えスパイダーシルクタンパク質が、50nm未満の厚さを有する、
固体表面。
【請求項８】
前記集合したシルク構造層が、前記表面層より粘性が高い、請求項7に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質でコーティングされた固体表面。
【請求項９】
前記集合したシルク構造層が、好ましくは20nm未満、例えば10〜20nmの直径を有するナノフィブリルの物理形態である、請求項7〜8の何れか1項に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質でコーティングされた固体表面。
【請求項１０】
前記組換えスパイダーシルクタンパク質コーティングが、10〜40nmの厚さを有する、請求項7〜9の何れか1項に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質でコーティングされた固体表面。
【請求項１１】
前記固体表面が、疎水性であり、例えば30°超の水との接触角θを有する材料であり、及び/又は前記固体表面が、その露出されたヒドロキシル基のpKaが7未満である材料である、請求項7〜10の何れか1項に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質でコーティングされた固体表面。
【請求項１２】
前記固体表面が、金属、金属合金、ポリマー、ミネラル、ガラス及びガラス様材料、アミノシラン、及び疎水性炭化水素等からなる群から選択される材料であり、例えば、チタニウム、ステンレス・スティール、ポリスチレン、ヒドロキシアパタイト、二酸化ケイ素、APTES機能化二酸化ケイ素、金、及びアルキルチオール機能化金からなる群から選択される材料である、請求項11に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質でコーティングされた固体表面。
【請求項１３】
前記固体表面が、生体材料、インプラント又は医療機器の表面である、請求項7〜12の何れか1項に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質でコーティングされた固体表面。
【請求項１４】
前記組換えスパイダーシルクタンパク質が、機能的に露出された非スピドロインタンパク質部分又は非スピドロインポリペプチド部分を含む、請求項7〜13の何れか1項に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質でコーティングされた固体表面。
【請求項１５】
前記組換えスパイダーシルクタンパク質が、前記タンパク質部分REP及びCT並びに任意で機能的に露出した非スピドロインタンパク質/ポリペプチド部分を含み、ここで、
REPが、L(AG)nL、L(AG)nAL、L(GA)nL、及びL(GA)nGLからなる群から選択される70〜300アミノ酸残基の反復フラグメントであり、ここで、
nが、2〜10の整数であり;
各個々のAセグメントが、8〜18アミノ酸残基のアミノ酸配列であり、ここで、0〜3アミノ酸残基がAlaではなく、残りのアミノ酸残基がAlaであり;
各個々のGセグメントが、12〜30アミノ酸残基のアミノ酸配列であり、ここで、少なくとも40%のアミノ酸残基がGlyであり; 及び
各個々のLセグメントが、0〜30アミノ酸残基のリンカーアミノ酸配列であり; 並びに
CTが、配列番号3又は配列番号69に対して少なくとも70%の同一性を有する70〜120アミノ酸残基のフラグメントである、
請求項7〜14の何れか1項に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質でコーティングされた固体表面。
【請求項１６】
請求項1〜6の何れか1項に記載の処理によって調製可能である、請求項7〜15の何れか1項に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質でコーティングされた固体表面。
【請求項１７】
前記組換えスパイダーシルクタンパク質コーティング上に付着して増殖する真核細胞をさらに含む、請求項7〜16の何れか1項に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質でコーティングされた固体表面。
【請求項１８】
インビトロ細胞培養のためのマトリックスとしての、請求項7〜16の何れか1項に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質でコーティングされた固体表面の使用。