(57)【要約】  本開示は、肝細胞に対する本明細書に定義された候補分子の毒性を特性化する方法、本明細書に定義された代謝的に活性な肝細胞をバイオセンサに培養する方法及び本明細書に定義されたバイオセンサ肝細胞培養システムを提供する。
2012510059.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝細胞に対する分子の毒性を間接的に特性化する方法であって、
前記方法は、
ａ．表面に固定せしめられた肝細胞を含むバイオセンサを設けるステップと、
ｂ．前記固定せしめられた肝細胞を分子に接触せしめるステップと、
ｃ．当該分子により処理され固定せしめられた肝細胞を増幅マーカに接触せしめるステップと、
ｄ．前記分子が存在する場合と存在しない場合とにおける前記増幅マーカによって誘起された前記肝細胞のバイオセンサ応答を検出し且つ比較するステップと、を含むこと特徴とする方法。
【請求項２】
前記固定せしめられた肝細胞は、前記バイオセンサの表面に被覆された第１の細胞外基質物質のナノスケールのクラスタ又はマイクロスケールクラスタと、第２の細胞外基質物質のオーバレイとの間に固定されていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１及び第２の細胞外基質物質は、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ラミニン、ゼラチン、多糖類、フィブロネクチン、マトリゲル、又はそれらの組合せことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の細胞外基質物質はコラーゲンＩを含み、前記第２の細胞外基質物質はマトリゲルを含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記固定せしめられた肝細胞は、自身の代謝機能の少なくとも一部を維持することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記肝細胞は、原発生肝細胞、形質転換肝細胞、不死化肝細胞又はそれらの組合せのうち少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記肝細胞は、繊維芽細胞、肝星細胞、又はＫｕｐｆｆｅｒ細胞から選択されたヘルパー細胞をさらに含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記増幅マーカは、過酸化水素、エタノール、肝毒素、カルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾン、ジメチルスルホキシド又はそれらの組合せのうちの少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記増幅マーカは過酸化水素を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記検出されたバイオセンサ応答は、前記肝細胞の前記動的質量再分布を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
肝毒素が存在する場合と存在しない場合における前記分子によって誘起された前記肝細胞のバイオセンサ応答を検出し且つ比較するステップをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
肝細胞に対する分子の毒性を直接的に特性化する方法であって、
前記方法は、
ａ．表面に固定された生細胞を含むバイオセンサを設けるステップと、
ｂ．前記固定せしめられた肝細胞を分子に接触せしめるステップと、
ｃ．肝毒素が存在する場合と存在しない場合における前記分子によって誘起された前記肝細胞のバイオセンサ応答を検出し且つ比較するステップと、を含み、
前記ａ．において、前記固定せしめられた肝細胞は、前記バイオセンサの表面に被覆された第１の細胞外基質物質のナノスケールのクラスタ又はマイクロスケールクラスタと、第２の細胞外基質物質のオーバレイとの間に固定されており、前記固定せしめられた肝細胞は自身の代謝機能の少なくとも一部を維持することを特徴とする方法。
【請求項１３】
前記第１及び第２の細胞外基質物質は、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、マトリゲル又はそれらの組合せのうち少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の細胞外基質物質はコラーゲンＩを含み、前記第２の細胞外基質物質はマトリゲルを含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
原発生肝細胞、形質転換肝細胞、不死化肝細胞又はそれらの組合せのうち少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
代謝的に活性な肝細胞をバイオセンサに培養する方法であって、
前記方法は、
ａ．第１の細胞外基質物質を含む第１の水溶液をバイオセンサの前記表面に塗布するステップと、
ｂ．前記第１の水溶液を乾燥せしめるステップと、
ｃ．肝細胞を、前記第１の細胞外基質物質被覆バイオセンサ表面に培養して、前記肝細胞を固定せしめるステップと、
ｄ．第２の細胞外基質物質を含む第２の水溶液を前記固定された肝細胞に塗布するステップと、を含み、
前記ｂ．において、前記乾燥せしめるステップは前記第１の細胞外基質物質のスケールクラスタ又はマイクロスケールクラスタを含む前記表面に皮膜を生じせしめ、
前記ｄ．において、前記第２の細胞外基質物質は、前記バイオセンサの前記表面上に前記肝細胞を有するオーバレイを形成することを特徴とする方法。
【請求項１７】
前記第１及び第２の細胞外基質物質は、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、マトリゲル又はそれらの組合せのうち少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の細胞外基質物質はコラーゲンＩを含み、前記第２の細胞外基質物質はマトリゲルを含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１の水溶液は、約１μｇ／ｍｌから約２０μｇ／ｍｌまでの範囲の量の前記第１の細胞外基質物質を含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記乾燥せしめるステップは、少なくとも４時間真空下で乾燥せしめるステップを含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２の水溶液は、約０．０１重量％から約１重量％の範囲内の量の前記第２の細胞外基質物質を含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記肝細胞は、原発生肝細胞、形質転換肝細胞、不死化肝細胞又はそれらの組合せのうち少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
バイオセンサ肝細胞培養システムであって、
前記システムは、
ａ．第１の細胞外基質物質のナノスケールクラスタ又はマイクロスケールクラスタにより被覆されたバイオセンサ表面と、
ｂ．前記第１の細胞外基質物質被覆バイオセンサ表面に固定せしめられた肝細胞と、
ｃ．前記固定せしめられた肝細胞が自身の代謝機能の少なくとも一部を維持するように第２の細胞外基質物質を含むオーバレイと、を含み、
前記固定せしめられた肝細胞は、原発生肝細胞、形質転換肝細胞、不死化肝細胞又はそれらの組合せのうち少なくとも１つを含むことを特徴とするシステム。
【請求項２４】
前記バイオセンサ表面は金属フィルムを含むことを特徴とする請求項２３に記載のシステム。
【請求項２５】
前記第１及び第２の細胞外基質物質は、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、マトリゲル又はそれらの組合せのうち少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項２３に記載のシステム。
【請求項２６】
前記第１の細胞外基質物質はコラーゲンＩを含み、前記第２の細胞外基質物質は、マトリゲルを含むことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記オーバレイは、約０．０１重量％から約１重量％の範囲内の量の前記第２の細胞外基質物質を含むことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【先に出願された米国出願の利益の請求】
【０００１】
本出願は２００８年１１月２５日に出願された米国仮出願第６１／１１７６９５号の利益を主張する。この出願の内容及びこの明細書で引用された全ての公報、特許、及び特許出願が参考として組み込まれている。
【０００２】
本明細書で引用された全ての公報、特許、及び特許出願の全開示が、参考として組み込まれている。
【背景技術】
【０００３】
本開示は、共鳴導波グレーティング（ＲＷＧ）バイオセンサ若しくは表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサ等又は電気バイオセンサ等のバイオセンサの分野に関し、特に、無標識肝細胞分析を使用して、分子の毒性を検査（スクリーニング）する方法に関する。また、本開示は、バイオセンサ肝細胞培養システム及び肝細胞を培養する方法に関する。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、無標識肝細胞分析を使用して、分子の毒性を直接的又は間接的に特性化する方法を提供する。また、本開示は、肝細胞の代謝機能及び輸送機能を回復し又は維持しつつ、肝細胞をバイオセンサ表面に呈するバイオセンサ肝細胞培養システム及び肝細胞を培養する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】図１は、本開示の実施形態における、肝細胞の動的質量再分布又は動的細胞性物質の再分布信号等のバイオセンサ信号を検出するバイオセンサ肝細胞培養システムの側面概略図を示している。
【図２】図２は、本開示の実施形態における、０．５％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が存在しない場合と存在する場合における（Ａ）コラーゲンＩにより被覆された生体組織培養表面上に培養された原発生肝細胞及び（Ｂ）コラーゲンＩの一連のクラスタを有するバイオセンサ表面上に培養された原発生肝細胞のリファンピン誘起の結果を示している。双方の実施例において、肝細胞は、溶液中で、コラーゲンの表面と皮膜されたマトリゲルとの間でサンドイッチされた。
【図３】図３は、本開示の実施形態における、１ｍＭの過酸化水素と５ｍＭの過酸化水素を用いて誘起されたバイオセンサ肝臓細胞培養システムにおける原発生肝細胞のＤＭＲ信号を、それぞれ示している。各々の曲線は８つの曲線の平均を表しており、各時間ポイントにおけるエラーバーが示されている。
【図４】図４は、本開示の実施形態における、（Ａ）６２５ｎＭから４００００ｎＭまでの範囲の投与量のリファンピシンを用いて誘起され及び（Ｂ）６２５ｎＭから４００００ｎＭまでの範囲の投与量のリファンピシンを用いた細胞の前処理後３時間１ｍＭの過酸化水素水を用いて誘起されたバイオセンサ肝臓細胞培養システムにおける原発生肝細胞のＤＭＲ信号を、それぞれ示している。（Ｂ）の動的応答は、Ｈ2Ｏ2の添加前に２分の時間ポイントにて規格化された。
【図５】図５は、本開示の実施形態における、（Ａ）２．５ｎＭから２５００ｎＭまでの範囲の投与量のアセトアミノフェノンを用いて誘起され及び（Ｂ）１０μＭから２５００μＭまでの範囲の投与量のアセトアミノフェノンを用いた細胞の前処理後３時間１ｍＭの過酸化水素水を用いて誘起されたバイオセンサ肝臓細胞培養システムにおける原発生肝細胞のＤＭＲ信号を、それぞれ示している。（Ｂ）の動的応答は、Ｈ2Ｏ2の添加前に２分の時間ポイントにて規格化された。
【図６】図６は、本開示の実施形態における（Ａ）６２５ｎＭから１００００ｎＭまでの範囲の投与量のＳＢ−２０３８５０を用いて誘起され及び（Ｂ）６２５ｎＭから１００００ｎＭまでの範囲の投与量のＳＢ−２０３８５０を用いた前処理後３時間、１ｍＭの過酸化水素水を用いて誘起されたバイオセンサ肝臓細胞培養システムにおける原発生肝細胞のＤＭＲ信号を、それぞれ示している。（Ｂ）の動的応答は、Ｈ2Ｏ2の添加前に２分の時間ポイントにて規格化された。
【図７】図７は、１ユニット／ｍｌから１６ユニット／ｍｌまでの範囲の投与量のトロビンを用いて前処理した後に、１時間、２ｍＭの過酸化水素水を用いて誘起されたヒト癌細胞株Ａ５４９細胞のＤＭＲ信号を示している。動的応答は、Ｈ2Ｏ2の添加前に２分の時間ポイントにて規格化された。
【発明の詳細な説明】
【０００６】
本発明の様々な実施形態が、添付の図面を参照して詳細に説明されるであろう。様々な実施形態に対する言及は、本発明の範囲を制限するものではなく、本発明は、添付した請求の範囲によってのみ限定される。さらに、本明細書に述べられたいかなる実施例も、限定することを目的とはしていないし、特許請求の範囲に記載された発明の多くの実施形態の内、いくつかについて説明しているにすぎない。
【０００７】
Ａ．定義
１．分子
本明細書に使用されるように、「分子」等の用語は、明確な分子量を有する化学的分子又は分子の形態で存在する生物学的又は生化学的若しくは化学的エンティティを意味する。分子等の用語は、そのサイズに関係なく、化学的、生化学的又は生物学的分子である。
【０００８】
いくつかの分子が炭素を含んでいないものの（分子性酸素等の単純な分子性気体と、いくつかの硫黄ベースの高分子等のより複雑な分子を含む）、多くの分子は、（共有結合によって結合された炭素原子を特に含む）有機分子を意味するタイプのものである。「分子」という一般的な用語は、タンパク質、核酸、炭水化物、ステロイド、有機薬剤、小分子、受容体、抗体、脂質等、多数の記述的なクラス又はグループの分子を含む。適切である場合には、これらのより記述的な用語の１つ以上（その多くが「タンパク質」等、自身が重複した分子グループの分子を記述する）は、本明細書において使用されるだろう。これは、タンパク質等の一般的なクラスの「分子」と指定されたサブクラスの双方を代表するかかる分子を有する意図を損なうことなく、分子のサブグループに対する方法の適用のためである。特に示さない限り、分子という単語は、特定の分子を含み、薬学的に許容し得る塩等の分子の塩を含むであろう。
【０００９】
２．リガンド
リガンド等の用語は、生物学的目的について有益となるように生物分子と結合し且つ生物分子と錯体を形成する物質若しくは成分又は分子である。リガンドとその標的分子との間における実際の不可逆性共有結合は生物系においてまれである。受容体に対するリガンド結合は化学的な立体構造、すなわち、受容体タンパク質の３次元形状を変更せしめる。受容体タンパク質の立体構造の状態は受容体の機能的状態を決定づける。結合の傾向又は強さは、親近性と称されている。リガンドは、基板、抑制物質、活性剤及び神経伝達物質を含む。放射性リガンドは放射性同位元素標識リガンドである。一方、蛍光リガンドは蛍光するようにタグ付けをされたリガンドである。双方が受容体生物学及び生化学研究の追跡子として使用される。リガンド及び修飾物質は互いに相互作用するように使用される。
【００１０】
３．分子混合物
分子混合物等の用語は、少なくとも２つの分子を含む混合物である。２つの分子は、構造的に異なり得るし（すなわち、エナンチオマ）若しくは組成的に異なり得る（例えば、タンパク質イソ型、糖型、又は異なるポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ：ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ））修飾）、又は、構造的に又は組成的に異なり得る（例えば、精製されていない天然の抽出物又は精製されていない合成化合物。）ものの、これらに限定されない。本開示の特定の実施形態によれば、分子の混合体は、分子として取り扱われ得る。
【００１１】
４．テスト分子
テスト分子等の用語は、テスト分子に関するいくつかの情報を獲得するために使用される分子である。テスト分子は、未知の分子であり又は周知の分子であり得る。
【００１２】
５．薬物候補分子
薬物候補分子等の用語は、薬物又はファルマコホアとして機能する性能がないかどうかテストされるテスト分子である。この分子は、リード分子として考慮され得る。
【００１３】
６．変調
変調する等の用語は、細胞ターゲットを介して調節された細胞活性を増大せしめ、低減せしめ又は維持せしめることを意味する。これらの用語の１つが使用される限り、それは例えば制御値から１％、５％、１０％、２０％、５０％、１００％、５００％又は１０００％増加され得るし又はそれは例えば制御値から１％、５％、１０％、２０％、５０％又は１００％低減され得るとも開示されていると理解される。
【００１４】
７．細胞
細胞等の用語は、１つ以上の細胞核と他の多種の細胞小器官を任意で含み、生命の基本的な機能を単独で実行し又は生命の基本的な機能を実行する他の同等の集団と相互作用することができ、独立的に機能することができる生物の最小構造ユニットを形成する半透明の膜によって外部的に結合された通常小なる微小質量の原形質を意味し、合成細胞構造体、細胞モデルシステム、人工の細胞システムを含む。
【００１５】
細胞は異なる細胞タイプを含み得る。当該異なる細胞タイプとは、例えば、特定の疾患に関連づけられた細胞、特定の起源からの一つのタイプの細胞、特定のターゲットに関連づけられた一つのタイプの細胞、又は、特定の生理機能に関連づけられた一つのタイプの細胞である。細胞は、天然の細胞、設計された細胞、形質転換された細胞、不死化肝細胞、一次細胞、胚幹細胞、成体幹細胞、癌腫幹細胞、又は、幹細胞由来の細胞でもあり得る。
【００１６】
人間は約２１０個の周知の異なる細胞タイプから成る。細胞がどのように準備されるか（例えば、人体からどのように設計されるか、形質転換されるか、不死化されるか、又は新たに分離されるか）及び細胞がどこで取得されるか（例えば、異なる年齢又は異なる疾病段階にある人体）について考慮すると、細胞のタイプの数はほぼ限定されていない。
【００１７】
８．検出
「検出」等の用語は、刺激によって誘起された細胞応答を発見し又は検出して、異なる刺激に対して検出された応答を区別する本開示の装置及び方法の能力を意味する。
【００１８】
９．刺激
「刺激」、「治療候補分子」、「治療候補物質」、「予防的候補物質」、「予防的物質」、「リガンド候補物質」、「候補分子」等の用語は、バイオセンサーに付着された細胞と相互作用するようなその潜在能力の対象となる天然の分子若しくは材料又は合成的な分子若しくは材料を意味する。治療候補物質又は予防候補物質は、例えば、化合物、生物学的分子、ペプチド、タンパク質、生物試料、薬物候補の小分子、薬物候補の生物学的分子、薬物候補小分子‐生物の結合体等の物質又は実在の分子又はそれらの組み合わせを含み、少なくとも１つのタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、イオン、脂質又は生細胞等の構造体若しくは要素等の細胞ターゲット又は病原菌ターゲットと特に結合し又は相互作用し得る。
【００１９】
１０．細胞外基質物質
「細胞外基質物質」等の用語は、構造的なサポートを細胞に提供することができる生体組織内で見出され又は細胞外で見出された生体学的材料を意味している。細胞外基質物質は、タンパク質、多糖類又は糖タンパク質であり得る。実施形態において、細胞外基質物質は、例えば、コラーゲン（例えば、コラーゲンＩ又はコラーゲンＩＶ）、ラミニン、ゼラチン、フィブロネクチン、マトリゲル又はそれらの組み合わせであり得る。
【００２０】
１１．増幅マーカ
「増幅マーカ」、「マーカ」等の用語は、毒性又は保護性を間接的に決定するのに使用され得るあらゆる化合物を意味する。増幅マーカは、毒性又は保護性を調べるのに使用され得るあらゆる物質であり得る。増幅マーカは、毒性又は保護性を増幅するのに使用され得るあらゆる物質でもあり得る。具体的には、肝細胞の毒素に対して、増幅マーカは、候補分子への暴露の結果、細胞が影響されやすくなり得るあらゆる物質であり得る。増幅マーカは、候補分子への暴露の結果、細胞が抵抗力を有するようになり得るあらゆる物質であり得る。増幅マーカは、候補分子と相乗作用を呈するあらゆる物質であり得る。かかる増幅マーカは、例えば、過酸化水素、肝毒素、カルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾン、エタノール及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。
【００２１】
１２．オーバレイ
「オーバレイ」等の用語は、肝細胞と細胞外基質物質を含む固定された複合構造を意味する。オーバレイ基質物質は、複合構造を有する肝細胞をサポートし得る。オーバレイ基質物質は、肝細胞を被覆し得る。オーバレイは、ＥＣＭが細胞表面受容体に結合するよう、肝細胞を被覆する溶液にＥＣＭを添加することによって、生じ得る。
【００２２】
１３．代謝機能
「代謝機能」等の用語は、化学化合物を代謝物に破壊する細胞、生体組織、臓器又は有機体の能力を意味する。
【００２３】
１４．部分
「部分」等の用語は、総量の約１０％から約９０％の範囲の値を意味する。部分は、総量の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％又は約９０％であり得る。
【００２４】
１５．含む
"含む（Ｉｎｃｌｕｄｅ）"、"含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）"等は、含んで（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）を意味するがこれに限定されない。
【００２５】
１６．細胞の培養
「細胞の培養」又は「細胞培養」とは、原核生物細胞若しくは真核性細胞が一定条件下で培養される処理を意味する。「細胞の培養」とは、多細胞の真正核細胞から得られた細胞、特に動物細胞の培養だけではなく、複合生体組織及び臓器の培養をも意味する。
【００２６】
１７．バイオセンサ
「バイオセンサー」等の用語は、生物学的要素を物理化学的検出構成要素に結合せしめ得る分析物を検出するデバイスを意味する。バイオセンサは、通常３つの部分から構成される。当該３つの部分は、（生体組織、微生物、病原体、細胞、又はこれらの組合せ等の）生物学的構成部又は要素、（例えば、光学的、圧電的、電気化学的、熱測定、若しくは磁気的な物理化学的手法で動作する）検出要素及び双方の構成部に関連付けられたトランスデューサである。生物学的構成部若しくは生物学的要素は、例えば生体細胞、病原体又はそれらの組合せであり得る。実施形態において、光学バイオセンサは、生体細胞、病原体若しくはそれらの組合せにおける分子認識事象又は分子刺激事象を定量化可能な信号に変換する光学変換装置を含み得る。
【００２７】
１８．分析
「分析する（ａｓｓａｙｉｎｇ）」、「分析（ａｓｓａｙ）」等の用語は、例えば、リガンド若しくはマーカ等の一つ以上の外因性刺激を用いた刺激に対する細胞の光学的応答又はバイオインピーダンス応答の存在の有無、量、程度、反応速度、動特性、及びタイプ等、分子若しくは細胞等の物質の特徴を決定する分析を意味する。刺激に対する細胞の応答に関するバイオセンサー信号を生成することが分析であり得る。例えば、光学バイオセンサを使用して刺激に対する細胞応答のＤＭＲ分布を形成することは、分析であり得る。
【００２８】
１９．処理
処置又は処理等の用語は、少なくとも２通りに使用され得る。第１に、処置又は処理等の用語は、被検体に対して取られた処理又は操作を意味し得る。第２に、処置又は処理等の用語は、分子及び細胞等２つ以上のあらゆる物質等、２つのあらゆる物を一緒に混合することを意味し得る。この混合は、少なくとも２つの物質の間において接触が生じ得るように少なくとも２つの物質を一緒にするであろう。
【００２９】
処置又は処理等の用語が、疾病の被検体の内容で使用されるとき、それは治療を意味していないし、例えば兆候の低減さえも意味していない。治療という用語等が処置又は処理等の用語と伴に使用されるとき、それは、原疾患の徴候が低減されること及び／又は潜在的な細胞性、生理的若しくは生化学的原因又兆候を引き起こす機構の一つ以上が低減されることを意味する。低減されるとは、この内容において用いられるように、疾病の生理的状態だけではなく疾病の分子状態を含む疾病の状態に対するものを意味すると理解される。
【００３０】
２０．接触
接触等の用語は、分子の相互作用が少なくとも２つのもの（例えば、分子、細胞、マーカ、少なくとも化合物又は組成物又は少なくとも２つの組成物又は製品又は機械を有するこれらのすべて）の間で生じ得る場合、分子の相互作用は生じ得るように近傍に移動せしめることを意味する。例えば、接触は、少なくとも２つの組成物を、分子、物品又は物を接触するよう移動させることを意味する。すなわち。少なくとも２つの組成物は混合若しくは接触するよう近接する。例えば、組成物Ａと培養細胞Ｂの溶液を有すること及び組成物Ａの溶液を培養細胞Ｂに注入し又は添加することは、組成物Ａの溶液を細胞培養Ｂと接触するように移動せしめることであろう。生細胞をリガンドに接触せしめることは、リガンドを細胞に移動させて、細胞がリガンドに対するアクセスを確実に有するようにせしめることであろう。
【００３１】
本明細書に開示されているあらゆるものが他のあらゆるものと接触するように移動せしめられるであろうと理解される。例えば、細胞は、マーカ分子、バイオセンサ等と接触するように移動せしめられ得る。
【００３２】
２１．トリガ
トリガ等の用語は、応答等のイベントを引き起こし又は開始する動作を意味する。
【００３３】
２２．応答
応答等の用語は、あらゆる刺激に対するあらゆる応答である。
【００３４】
２３．細胞応答
「細胞応答」等の用語は、刺激に対する細胞のあらゆる反応である。
【００３５】
２４．バイオセンサ応答
「バイオセンサ応答」、「バイオセンサ出力信号」、「バイオセンサ信号」等の用語は、細胞を有するセンサーシステムの細胞応答に対するあらゆる反応である。バイオセンサは、細胞の応答を定量化可能なセンサ応答に変換する。バイオセンサの応答は、ＲＷＧ又はＳＰＲ等の光学バイオセンサによって測定されるように、刺激に対する光学的応答であり、又は、バイオセンサの応答は、刺激のときにそれは電気バイオセンサによって測定されるように、刺激に対する細胞の生物インピーダンス応答である。バイオセンサの応答は、刺激に対する細胞の応答に直接的に関連しているので、バイオセンサの応答及び細胞の応答は、実施形態において交互に使用され得る。
【００３６】
２５．ＤＭＲ応答
「ＤＭＲ応答」等の用語は、光学バイオセンサを使用するバイオセンサの応答である。ＤＭＲは、動的な質量再分布又は動的な細胞体の再分布をいう。Ｐ−ＤＭＲは、正のＤＭＲ応答であり、Ｎ−ＤＭＲは、負のＤＭＲ応答であり、ＲＰ−ＤＭＲは、リカバリＰ−ＤＭＲ応答である。
【００３７】
２６．応答を分析する
「応答を分析する」等の用語は、応答を特性化する手段を使用することを意味する。例えば、分子が細胞と接触するように移動せしめられるとき、バイオセンサは、分子の暴露に対する細胞の応答を分析するのに使用され得る。
【００３８】
２７．分布
分布等の用語は、細胞等の組成物に対して収集されたデータを意味する。分布は、本明細書において説明されているように、無標識バイオセンサから収集され得る。
【００３９】
２８．初期分布
「初期分布」等の用語は、分子が細胞に接触するときに生成されるバイオセンサの出力信号又は分布を意味する。通常、初期分布は、正味ゼロのバイオセンサ信号（すなわち、ベースライン）に対する初期の細胞応答の規格化後に取得される。
【００４０】
２９．分子が存在する場合
「分子が存在する場合」等の用語は、分子との培養細胞の接触又は分子との培養細胞の暴露を意味する。接触又は暴露は、刺激が細胞と接触するような状態に至らせられる前に又は刺激が細胞と接触するような状態に至らせられる時に生じせしめられ得る。
【００４１】
３０．バイオセンサ信号
「バイオセンサー信号」等の用語は、刺激に対する細胞の応答により生成され且つバイオセンサを用いて測定された細胞に関する信号を意味する。
【００４２】
３１．ＤＭＲ信号
「ＤＭＲ信号」等の用語は、刺激に対する細胞の応答により生成され且つ光学バイオセンサを用いて測定された細胞の信号を意味する。
【００４３】
３２．制御
制御若しくは「制御レベル」「制御細胞」等の用語は、変化が測定される基準として定義されている。例えば、制御は実験に影響されにくく、代わりに定義されたセットのパラメータに影響され、又は、制御は、前処理レベル又は後処理レベルに基づいている。それらは、テスト駆動と伴に又はテスト駆動の前若しくは後において並列して駆動され得るし、又は、それらは所定の基準であり得る。例えば、制御は、実験から得られた結果を意味し得る。当該実験において、テスト下の処理手順又は物質若しくは変数等の省略を除いて、被検体、物又は試薬等が並列実験において処理され、実験的効果を判断する際の比較のための基準として、使用される。したがって、制御は、処理手順、物質又は変数等に関連する効果を決定するのに使用され得る。例えば、テスト分子の細胞への効果が問題となっている場合、ａ）分子が存在する場合、細胞の特徴を単に記録し、ｂ）ａを実行して、周知の活性を有し若しくは活性に欠如した制御分子又は制御組成物（例えば、分析緩衝水溶液（賦形剤））を添加する効果をも記録し、そして、テスト分子の効果をコントロール分子と比較する。特定の状況において、一旦、制御が実行されると、制御は、基準として使用され得る。当該基準において、制御実験は、再度実行される必要はない。他の状況において、制御実験は、平行に実行されるべきであり、各実験の都度、比較がなされるであろう。
【００４４】
３３．正の制御
「正の制御」等の用語は、データ収集の条件がデータ収集を生じせしめることを示す制御である。
【００４５】
３４．特性化する
特性化するという用語は、リガンド、分子、マーカ又は細胞等の物質のあらゆる特性について情報を集めることを意味すし、例えば、リガンド、分子、マーカ又は細胞の分布を取得等することを意味する。
【００４６】
３５．薬効を高める
薬効を高める、薬効を高められた等の用語は、分子によって生じさせしめられた細胞におけるマーカのバイオセンサ応答の特定のパラメータの増大を意味する。分子が存在する場合において同じ細胞における同じマーカの二次分布をマーカの一次分布と比較することによって、分子による細胞についてマーカ誘起のバイオセンサ応答の変調が計算され得る。正の変調は、マーカによって誘起されたバイオセンサ信号における増大を生じせしめる分子を意味する。
【００４７】
３６．より高い、抑制等の用語
より高い、増加する、上昇する、上昇等の用語又はこれら用語の変形語は、例えば、制御値と比較された場合の基礎レベルを超えた増加を意味する。より低い、低減する、減少する、低減等の用語又はこれら用語の変形語は、例えば、制御値と比較された場合の基礎レベルより下の減少を意味する。例えば、基礎レベルは、細胞に対する作用薬又は拮抗薬等の物質の添加する前の又は添加しない場合の通常の生体内のレベルである。抑制若しくは抑制の形態等の用語は、低減すること又は抑制することを意味する。
【００４８】
３７．細胞ターゲット
細胞ターゲット」等の用語は、タンパク質又は核酸等の生物ポリマである。その活性は、外的刺激により修飾され得る。細胞ターゲットは、酵素、キナーゼ、イオンチャネル、受容体等の多くの通常のタンパク質である。
【００４９】
３８．分子処理された細胞
分子処理された細胞等の用語は、分子に暴露された細胞である。
【００５０】
３９．細胞プロセス
細胞プロセス等の用語は、細胞内において又は細胞の近傍において生じるプロセスである。細胞プロセスの例は、増殖、アポプトーシス、壊死、分化、細胞シグナル形質導入、極性変化、移行又は変形を含むものの、これらに限定されない。
【００５１】
４０．付着する
「付着する（Ａｔｔａｃｈ）」、「付着（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）」、「付着（ａｄｈｅｒｅ）」、「付着され（ａｄｈｅｒｅｄ）」、「固定された（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）」等の用語は、例えば、本開示の表面修飾物質、相溶剤、細胞、リガンド候補分子等のエンティティを、物理吸着、化学結合等のプロセス若しくはそれらの組み合わせのプロセスによって、表面に固定若しくは固着せしめることを通常意味する。特に、「細胞の付着（ｃｅｌｌ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）」、「細胞の付着（ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ）」等の用語は、表面との細胞の相互作用若しくは表面への結合を意味する。当該相互作用又は結合は、細胞固定材料、相溶剤（例えば、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミン、ゼラチン、ポリリジン等）若しくはそれら双方を用いて培養し又は相互作用せしめること等によって行われる。
【００５２】
４１．付着性細胞
「付着性細胞」、「固定された細胞」等の用語は、基板の外部表面に関連付けられ、基板の外部表面上に固定され、又は特定の接触を維持する原核細胞若しくは真核細胞等の細胞、細胞株又は細胞システムを意味する。培養後のかかるタイプの細胞は、洗浄媒質交換処理、すなわち、多くの細胞ベースの分析に必須である処理に対して抵抗力を有し、耐性を有し得る。「弱付着性細胞」とは、細胞培養中に、基板の外部表面と弱く相互作用し、基板の外部表面と弱く関連し、基板の外部表面と弱く接触する原核生物の細胞又は真核性細胞等の細胞、細胞株又は細胞システムを意味する。しかしながら、これらのタイプの細胞、例えば、人間の胎児性腎臓（ＨＥＫ）細胞は、洗浄液若しくは媒質の交換等の物理的に妨害的な手法により、基板の表面から容易に解離する傾向がある。「懸濁細胞」とは、望ましくは、媒質で培養される細胞又は細胞株を意味する。当該媒質において、細胞は、培養中に、基板の表面に付着若しくは固着しない。「細胞の培養」又は「細胞培養」とは、原核生物細胞若しくは真核性細胞が一定条件下で培養される処理を意味する。「細胞の培養」とは、多細胞の真正核細胞から得られた細胞、特に動物細胞の培養だけではなく、複合生体組織及び臓器の培養をも意味する。
【００５３】
４２．細胞システム
「細胞システム」等の用語は、互いに相互作用して生物学的病態生理学的機能又は生理的病態生理学的機能を発揮する１より多い数のタイプの細胞（又は単一タイプの細胞の異なる形態）の集合を意味する。かかる細胞システムは、器官、生体組織、幹細胞、分化した肝細胞等を含む。例えば、肝細胞システムは、肝細胞実質細胞及び非肝細胞実質細胞を含む細胞システムを意味するだろう。
【００５４】
４３．肝細胞
「肝細胞」等用語は、肝臓組織から派生したか又は肝臓組織から取得された細胞を意味する。肝細胞は、原発生肝細胞、肝細胞ＨｅｐＧ２Ｃ３Ａ等の形質転換肝細胞及びＦ２Ｎ４細胞等の不死化細胞を含み得る。実施形態において、肝細胞は、ヘルパー細胞を含み得る。適切なヘルパー細胞の例は、ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞、ネズミの３Ｔ３−Ｊ２繊維芽細胞又はヒト線維芽細胞細胞等の繊維芽細胞、人間又はネズミ肝星細胞及びＫｕｐｆｆｅｒ細胞を含む。
【００５５】
４４．被検体
本明細書に使用されるように、被検者問等の用語は固体を意味する。したがって、「被検体」は、例えば、猫、犬等の家畜、家畜（例えば、牛、馬、ブタ、羊、ヤギ等）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット等）及び哺乳動物、非人間哺乳動物、霊長類、非人間霊長類、齧歯動物、鳥、爬虫類の動物、両生類、魚並びに他のあらゆる動物を含み得る。１つの態様において、被検体は、霊長類又は哺乳動物等の人間である。被検体は、非人間であり得る。
【００５６】
４５．任意の
「任意の」、「任意で」等の用語は、次に説明された事象又は状況が、生じ得るし又は生じ得ないこと及び説明が事象又は状況が生じる例及び事象又は状況が生じない例を含むことを意味する。例えば、「任意で、構成が組み合わせを含み得る」という語句は、説明が組み合わせ（すなわち、組み合わせの個々の一部）と組み合わせがないことの双方を含むよう、構成が異なる分子の組み合わせを含み得るし又は含み得ないことを意味している。
【００５７】
４６．Ａ
明細書及び添付された特許請求の範囲において使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は文脈上明らかにそうでないことが示されない限り、複数の目的物を包含する。したがって、例えば、「製薬キャリヤ」への言及は、かかるキャリヤ等の２つ以上の混合物を含む。
【００５８】
４７．簡略名
当業者にはよく知られた簡略名が使用され得る（例えば、時間又は数時間に対しては「ｈ」又は「ｈｒ」、グラムに対しては「ｇ」又は「ｇｍ」、ミリリットルに対しては「ｍＬ」、室温に対しては「ｒｔ」、ナノメートルに対しては「ｎｍ」、モルに対しては「Ｍ」等の簡略名）。
【００５９】
４８．範囲
範囲は、「およそ」１つの特定の値からおよび／または「およそ」他の特定の値までとしてここに示される。そのような範囲が示されたとき、他の実施例は、当該１つの特定の値からおよび／または当該他の特定の値までを含む。同様に、値が近似値として示されたとき、前例の「およそ」の使用により、特定の値は、他の実施例を形成すると理解されるであろう。範囲の各々の終点が、他の終点との関係においておよび他の終点と独立して、有意であるとさらに理解されるであろう。また、ここに明らかにされた多くの値があり、そして、各値がその値自体に加えて特定の値である「およそ」としてここに開示されていることも理解されるであろう。例えば、もし値１０が開示されているとき、約１０もまた同時に開示されている。熟練した職人によって適切に理解されるように、ある値が「その値よりも小さいまたは等しい」と開示されているとき、その値は、「その値より大きいまたは等しい」および値の間のとりえる範囲も開示されていると理解される。例えばもし、値「１０」が開示されている場合、「１０未満または１０に等しい」および「１０より大きいまたは１０に等しい」も開示される。この出願のいたるところに、データはいくつかの異なるフォーマットで提供されており、このデータは、終点および始点およびデータポイントのあらゆる組み合わせに関する範囲を示していることも理解される。例えば、もし、特定のデータポイント「１０」および特定のデータポイント「１５」が開示されている場合、より大きい、より大きいまたは等しい、より少ない、より少ないまたは等しい、１０および１５に等しい値が１０と１５の間の値と同様に開示されているものと考えられると理解される。２つの特定のユニット間の各ユニットも開示されていると理解される。例えば、もし、１０および１５が開示されているとき、１１、１２、１３および１４も開示される。
【００６０】
４９．からなる（Ｃｏｍｐｒｉｓｅ）
記述および本明細書の請求の範囲を通して、語「からなる」およびその語の変形は、「含むがこれに限定されるものではない」を意味し、例えば、他の追加的な、構成要素、整数またはステップを排除することを意図していない。
【００６１】
５０．本質的に〜からなる（Ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）
実施例における「本質的に〜からなる（Ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」とは、例えば、表面組成、表面組成を形成もしくは使用する方法、構築、またはバイオセンサの表面組成、および本開示の製品、デバイスまたは装置をいい、特許請求の範囲に記載された構成要素またはステップを含み得る。さらに、特定の反応物、特定の添加物もしくは成分、特定の薬剤、特定の細胞もしくは株化細胞、特定の表面変更因子または表面状態、特定のリガンド候補等、の変更可能な構造、材料またはプロセスなどのように、組成、物品、装置および本開示の作製および使用の方法の基本的且つ新規な性質に物質的に作用しない他の構成またはステップを含み得る。本開示の構成またはステップの基本的な性質に物質的に作用し得るかまたは本開示に望ましくない特徴を与え得る要素は、例えば、バイオセンサ表面に対する細胞の親和性の減少、細胞表面受容体または細胞内受容体に対する刺激の異常親和性、リガンド候補等の刺激物に反応する異常または反対の細胞活動、及びこれらと同様の特徴を含む。
【００６２】
５１．安定な（Ｓｔａｂｌｅ）
医薬品組成物に関して使われるとき、「安定な」などの用語は、定まった期間の特定の貯蔵条件下における有効成分の特定の損失量（通常１０％）未満の意味として技術的に理解される。組成が安定であると思われることを要求される時間は各々の製品の使用に関連し、製品を生産することの商業的実用性によって決定される。品質管理と点検のためにそれを保持し、最終的な使用の前に再びそれが貯蔵庫に保持されたところで、卸売業者に、または、直接顧客に出荷される。２、３ヵ月の時間の安全係数を含んで、医薬のための最小限の製品寿命は、通常１年、望ましくは１８ヵ月以上である。ここに使われる場合、「安定な」という語は、これらの市場現実性および、すぐに達成できる環境状況（例えば２℃〜８℃の冷蔵状態）で製品を格納および輸送する能力に及ぶ。
【００６３】
５２．構成要素（Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）
開示された組成を準備するのに使用される構成要素およびここに開示された方法の中で使用される構成要素自体が開示されている。これらおよび他の材料がここに開示され、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループなどが開示されているとき、様々な個々のおよび全体的な組合せの各々の特定の言及と、これらの分子の順列とがはっきりと開示されない場合であっても、各々はここにおいて熟慮され、記載されていることが理解される。従って、もし、分子Ａ、ＢおよびＣのクラスと、分子Ｄ、ＥおよびＦのクラスと、組み合わせ分子の例Ａ−Ｄとが開示され、各々が個々に列挙されていない場合でさえ、各々が個々におよび全体的に考慮された意味のある組み合わせ、Ａ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−ＥおよびＣ−Ｆが開示されているものと考えられる。従って、例えばＡ−Ｅ、Ｂ−ＦおよびＣ−Ｅのサブグループは開示されているものと考えられる。この概念は、開示された組成の作製および使用する方法におけるステップを含む本出願のすべてのアスペクトに適用されるが、これに限定されるものではない。従って、もし、実施され得る追加のステップの多様性がある場合、これらの追加のステップの各々は、あらゆる特定の実施例または開示された方法の実施例の組み合わせで実施され得ることが理解される。
【００６４】
５３．または（Ｏｒ）
語「または」などはここで使用されているように、特定のリストのあらゆる１のメンバーを意味し、そのリストのメンバーのあらゆる組み合わせをも含む。
【００６５】
５４．刊行物（Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）
本出願を通して、様々な刊行物が参照されている。これらの刊行物の開示の全体は、これが関係する到達技術水準について、より完全に説明するために参照によってこの出願に組み入れられる。開示された引用例は、その引用例に含まれる信頼されている文章中で論じられている材料に関し、個々におよび具体的に参照によってここに組み入れられる。
【００６６】
５５．サンプル（Ｓａｍｐｌｅ）
サンプルなどの用語は、動物、植物、菌類などを意味する。すなわち、天産物、天産物抽出物など；動物からの組織または器官；細胞（対象内、対象から直接とられる、または培養内に維持されたまたは培養された細胞株からの細胞のどちらでも）；  細胞可溶化物（または溶解物フラクション）または細胞抽出物；または細胞または細胞材料（例えばポリペプチドまたは核酸）に由来する一つ以上の分子を含んでいる溶液。サンプルは、ここに記載されるように分析される。また、サンプルは、細胞または細胞成分を含むどんな体液や排出物（例えば、限定されないが、血液、尿、便、唾液、涙、胆汁）であってもよい。
【００６７】
５６．約（Ａｂｏｕｔ）
例えば、構成要素の中の成分の数、濃度、体積、プロセス温度、プロセス時間、収率、流速、圧力などの値およびそれらの範囲を修飾している本開示の実施例の記述において使用されている「約」は、起こることがありえる数の量における変化に言及している。（たとえば、合成物、組成、濃縮物または使用製剤を作るために使用される典型的な測定および処理手順；これらの手順における不注意によるエラー；  方法を実行するのに用いられる製品、ソース、出発材料または成分の純度における違い；などの考慮点を通して）。用語「約」は、特定の初期濃度または混合物を含む組成または製剤の老化によって異なっている量、特定の初期濃度または混合物を含む組成または製剤を混合するまたは処理することによって異なっている量を包含する。「約」という用語によって修飾されたかどうかにかかわらず、ここに添付された請求の範囲は、これらの量と等価なものを含む。
【００６８】
５７．値（Ｖａｌｕｅｓ）
組成、要素、添加物、細胞タイプ、マーカなどのアスペクトおよびそれらの範囲のために開示された特定且つ好ましい値は、説明のためにのみ用いられる。それらは、定義された他の値または定義された範囲の中の他の値を除外しない。組成、装置および開示の方法は、それらが有するどんな値または値のどんな組み合わせ、特定の値、さらなる特定の値およびここに開示された好ましい値も含む。
【００６９】
５８．合成物および組成
合成物および組成は、この技術において標準的な意味を有する。特定の指定物（分子、物質、マーカ、細胞または試薬組成など）からなる、またこれらの指定物により構成される、また本質的にこれらの指定物からなる組成が開示されることが理解される。従って、特定の指定マーカが使用されている場合、そのマーカからなり、そのマーカにより構成され、または本質的にそのマーカからなる組成が開示されることが理解される。適正な特定の指定がなされた場合は常に、その指定物の合成物も開示されるものと理解される。例えば、もし、ＥＧＦなどの特定の生物学的材料が開示された場合、その合成物形式におけるＥＧＦも開示される。
【００７０】
Ｂ．組成、方法、製品および装置
合成分子の毒性のスクリーニングは、薬物の発見プロセスにおいてボトルネックを示し得る。新技術は、薬理学的な潜在能力を有する化合物数の急激な増大を引き起こしたが、毒性のスクリーニングの遅延は、多くの化合物が今までにテストされることを遅延させ、薬物の発見のプロセスを遅延させ、新規薬物を市場にもたらすことを遅延させている。多くの場合、研究者は限られた情報に基づいて、研究対象の薬物候補を選択しなければならない。したがって、ヒトの代謝を再現し、これら潜在的薬物及び重要なことにそれら代謝物の細胞に特殊な毒素を試験し得る急速な生体外試験方法の需要が存在する。
【００７１】
１．肝組織
肝組織は、血液、多くの化合物の合成及び分泌からの多くの有害物質の解毒作用に関する一次部位である。肝臓は、人間が日課で暴露される膨大な数及びタイプの化学物質に関する代謝の主要な部位である。肝臓における代謝酵素の最も重要なクラスは、薬物のクリアランスに盛んに必要とされているシトクロムＰ４５０である。Ｐ４５０は、分泌され得るので、化学物質を破壊する処理を開始する。肝臓における代謝は、所望の薬理効果を有する活性代謝物を生成し得る。重要なことに、肝臓代謝は、通常の鎮痛性アセトアミノフェンの破壊等、毒性代謝物をも生成し得る。
【００７２】
肝細胞、すなわち、肝組織の細胞質質量の７０−８０％を占める細胞は、肝臓における代謝性プロセス及び生合成プロセスの大部分を実行する。したがって、生体外培養された肝細胞は、薬物の代謝作用研究及び毒性研究に利用され得る。代謝作用及び毒性のためのスクリーニングの多くが、動物性肝細胞と動物個体を含む一次ヒト肝細胞（肝臓から分離された細胞）又は人間の肝臓代用薬において実行される。動物で実行された毒物学研究は、しばしば誤解を招いているものの、より重要なことに、薬物の発見競争においてリアルタイムのフィードバックに遅すぎて使用されない。最適な先導開発は、化合物又は分子の薬理特性が治療特性と同時に最大化されることを必要とする。初期のヒットは、すぐにランク付けされ且つ迅速に調べられる必要があるので、情報が新規な合成を誘導するのに使用され得る。
【００７３】
２．生体外分析
生体外細胞ベースの分析は、特定の細胞の特性に与える化学的な潜在的効果に関する本質的な情報を提供し得るし、従来の実験室動物のモデルよりも、分子及び機械学的研究により関連し且つより処理しやすい基礎を提供し得る。肝細胞の毒性判定のための細胞分析のほとんどが、代謝酵素（例えば、ＣＹＰ）又は肝細胞から分泌されたタンパク質の発現等、特定の特異なリードアウトを利用する。しかしながら、細胞は、複雑な経路を介して外部刺激に応答する微細にバランスのとれたホメオスタシスのマシンである。したがって、毒性は、細胞の形態、分化、増殖、機能、興奮性及び／又はコミュニケーションの変化等、多数の細胞イベントの結果であり得るので、かかるシステムは、リスクの評価目的には不十分であり得る。例えば、細胞培養システムは、多くの場合、全体的吸収、分配、代謝及び排泄（ＡＤＭＥ）及び複合体相互作用に対する本質的全身性コントリビュータ並びに免疫内分泌性神経システムの効果を欠いている。
【００７４】
サブ細胞又は細胞代謝システムを付加し及び周知の代謝物の生成を評価することによって、代謝能力に関する問題は、回避され得る。これは、フェーズＩの代謝に大幅に依存する脂肪親和性化合物の除去を考慮するとき、特に重要である。当該フェーズＩの代謝は、親である無毒性化学物質から毒性の中間介在物を生成し得る。かかる代謝において必要とされる最も重要な酵素は、広範な基質特異性を有するチトクロームＰ４５０遺伝子混合機能モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰｓ）であり、生体組織及び種に応じて性質及び活性を変更せしめる。代謝性細胞システムは、３つの主要なカテゴリに分割され得る。当該カテゴリは、（ｉ）代謝的に有能な指標細胞（例えば、肝細胞）、（ｉｉ）非有能指標細胞（例えば、繊維芽細胞）及び代謝的に有能な細胞（例えば、肝細胞）を含む共生培養システム及び（ｉｉｉ）選択された代謝経路及び毒素の双方の指標として同時に作用し得る遺伝子的に組み替えられた細胞株である。
【００７５】
毒性のスクリーニングに対するゲノム（又は転写的）アプローチ、プロテオミクスアプローチ及び代謝性アプローチは、生理的、薬理学的及び毒物学的なイベントが細胞のタンパク質の組成及び活性度並びにそれら構造的且つ機能的特徴を変化せしめ得るという前提に基づいている。これらの技術は、毒性の特異的機構を解読する手段を提供することによって並びに毒性に対する感受性の個々の変動及び毒性の被曝と作用の早期指標としての使用に対してバイオマーカを与えることによって、従来の毒物学を転換することを目的としている。テスト化合物に暴露に続いて、転写性（ゲノム）レベル又はトランスレーショナル（プロテオミクス）レベルにおける遺伝子発現を、周知毒素への暴露に特有な発現プロフィールと比較することによって、達成され得る。差動転写は、微量分析によって測定され得る、当該微量分析において、抽出されたリボ核酸は、逆転写を受け、ラベルが付されたｃＤＮＡを取得し、又は、標識ｃＲＮＡを生成するＲＮＡポリメラーゼ増幅を受ける。これら種は、マイクロアレイのオリゴヌクレオチドに混成される、レーザ光下でスキャンされて、遺伝子発現の数百から何十万もの測定値が記録される。オリゴヌクレオチドの特殊なパネルの設計は、投与量に依存し且つ生体組織に依存した時間的及び空間的パターンが観測されることを可能にし得る。残念ながら、このアプローチは、現時点で制限された転写情報に大きく依存したままである。
【００７６】
毒性のスクリーニングへのプロテオミックアプローチは、機能的、構造的又は解剖学的に関連したタンパク質（タンパク質クラスタ）の分析に基づいており、タンパク質発現の生理的又は病理学的な重要なパターンを判定する。かかるアプローチは、タンパク質分解分裂、ペプチド質量測定及びペプチドの識別に続いて、サイズと電荷に応じたタンパク質の２Ｄ電気泳動解像度に主に基づいている。残念ながら、プロテオミックスには、２つの重要な制限が存在する。（ｉ）生体組織又は細胞サンプルの細分画のプロセスが複雑であって、汚染の問題があり、（ｉｉ）タンパク質発現パターンは、２４時間周期のサイクル、年齢、性別及び疾病に応じて、サンプル間で大いに異なる。
【００７７】
現在の創薬アプローチ及び方法は、本明細書に開示された方法要素のいずれをも使用し得る。当該要素は、調節、細胞培養、分析、長期分析、短期分析、２つのステップ分析、パルス刺激分析、処理、接触、トリガ、検出、応答分析、規格化、特徴化、薬効効果の強化、バイオセンサ信号の調節、ＤＭＲ信号の調節、及び付着を含むがこれらに限定されない。
【００７８】
構成要素のいずれもが、いかなる組み合わせにおいても、本明細書において使用され得るし、各順列は、上記構成要素のリストに挙げられた構成要素に対して少なくとも本明細書において特に列挙されていると理解される。
【００７９】
４．毒性を特性化する間接的方法
化合物毒性は、ゲノムの経路、プロテオミック経路、代謝性経路、細胞レベル、又は有機体レベル等の異なるレベルで生じ得る。理想的な化合物毒性スクリーニングは、ＣＹＰ誘起、Ｐ‐ｇｐ抑制及び多重毒性分析を含む一連の分析を必要とする。残念ながら、化合物毒性は複雑であるので、細胞の化合物の全体的毒性を表示することは実際に困難であり得る。
【００８０】
通常、無標識細胞ベースの分析は、バイオセンサを利用して、化合物又は刺激によって誘起された生細胞内の応答を観測する。これらの無標識細胞分析は、積分された細胞応答を通常測定する。例えば、無標識光学バイオセンサ細胞分析は、リガンドによって誘起された細胞内の動的質量再分布（ＤＭＲ：ｄｙｎａｍｉｃ  ｍａｓｓ  ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）信号を測定し得る。得られたＤＭＲ信号は、受容体の信号伝達及び化合物によって誘起された毒性を含む細胞応答のリアルタイムな動的測定値である。ＤＭＲ信号は、システム細胞生物学情報及びシステム細胞薬理学情報を含み得るし、薬物薬理学及び毒性に関する全体的な表示を提供し得る。残念ながら、無標識バイオセンサ、特に、エバネッセント波ベースの光学バイオセンサの検出ボリュームは小さいので、バイオセンサ表面に培養された細胞の低部に対して、細胞内の直接検出可能な変化を制限し得る。これは、化合物によって誘起された毒性を含む細胞の活性を調べるには大きな欠点である。
【００８１】
したがって、本開示は、一次肝細胞等の肝細胞に対する候補分子の毒性を間接的に特性化する方法を提供する。当該方法は、例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ登録商標Ｅｐｉｃ登録商標バイオセンサシステム又は他のバイオセンサシステムを使用する。
【００８２】
実施形態において、本開示は、肝細胞に対する候補分子の毒性を特性化する方法を提供する。当該方法は、表面に固定された生細胞を含むバイオセンサを設けるステップと、前記固定せしめられた肝細胞を候補分子に接触せしめるステップと、候補分子により処理され固定せしめられた肝細胞を増幅マーカに接触せしめるステップと、前記分子が存在する場合と存在しない場合とにおける前記増幅マーカによって誘起された前記肝細胞のバイオセンサ応答を検出し且つ比較するステップと、を含む。
【００８３】
実施形態において、前記固定せしめられた肝細胞は、例えば、細胞外のマトリツクス（ＥＣＭ）の二重層の間のサンドイッチ培養システムの中で固定できる。当該サンドイッチ培養システムにおいて、基板面はコラーゲンＩなどのＥＣＭタンパク質によって被覆される。
【００８４】
コラーゲンＩ等のＥＣＭコーティングは、培養中の一次肝細胞生存率を維持するのに必要であり得る。しかしながら、細胞とＥＣＭ接触のマイクロスケールのトポロジは、肝細胞表現型（Ｂｈａｔｉａ他、１９９９）を変更せしめ得る。これは、細胞組織を制御する方法が重要であることを示す。したがって、特定の実施形態において、本発明は、肝細胞を用いる。当該肝細胞は、前記バイオセンサの表面に被覆された第１の細胞外基質物質のナノスケールのクラスタ又はマイクロスケールクラスタと、第２の細胞外基質物質のオーバレイとの間に固定されている。ＥＣＭ材料のクラスタのコーティングを有するバイオセンサ表面の使用により、適切なマイクロスケールの又はナノスケールのＥＣＭトポロジが、所定の肝細胞表現型に提供され得るし、これら無標識バイオセンサ細胞分析を用いた化合物毒素及び肝臓細胞機能の強固な検出が可能にされ得る。したがって、実施形態において、前記固定せしめられた肝細胞は、自身の代謝機能の少なくとも一部を維持する。
【００８５】
代替実施形態において、バイオセンサ表面は、アミン反応性高分子を用いて被覆され得る。当該アミン反応性高分子において、肝細胞は、表面に共有結合され得る。ポリマ表面は、分子（ポリエチレングリコール等）に抵抗力がある細胞を用いて、さらに修飾され得る。よって、表面のアミン反応性部位の数は比較的少なく、そして、細胞は拡散していない状態を維持する。
【００８６】
実施形態において前記第１及び第２の細胞外基質物質は、生体組織内で見出され且つ細胞外で見出されたいかなるタイプの生体試料をも基本的に含む。当該生体試料は、構造的なサポートを細胞に提供し得る。細胞外基質物質は、タンパク質、多糖類又は糖タンパク質であり得る。実施形態において、細胞外基質物質は、例えば、コラーゲン（例えば、コラーゲンＩ又はコラーゲンＩＶ）、フィブロネクチン、ラミニン、ゼラチン、マトリゲルＴＭ又はそれらの組合せであり得る。特定の実施形態において、前記第１の細胞外基質物質はコラーゲンＩを含み、前記第２の細胞外基質物質はマトリゲルＴＭを含む。
【００８７】
実施形態において、前記肝細胞は、原発生肝細胞、形質転換肝細胞、不死化肝細胞又はそれらの組合せのうち少なくとも１つを含む。
【００８８】
実施形態において、増幅マーカは、基本的には、候補分子に対する暴露の結果、感受可能となり且つ抵抗力を有するようになり得るいかなる物質をも含む。前記マーカは、例えば、過酸化水素、エタノール、カルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾン、ジメチルスルホキシド又はそれらの組合せのうち少なくとも１つを含み得。
【００８９】
実施形態において、前記検出されたバイオセンサ応答は、前記肝細胞の前記動的質量再分布を含む。方法は、前記分子が存在する場合と存在しない場合とにおける前記増幅マーカによって誘起された前記肝細胞のバイオセンサ応答を検出し且つ比較するステップをさらに含み得る。
【００９０】
分子で固定された肝細胞を分子に接触せしめるステップと、分子により処理された肝細胞を増幅マーカに接触せしめるステップとの間の期間は、例えば、約数秒から約数分の期間、約数分から約数時間の期間、約数日から約数週間の期間、及びそれらの組み合わせの期間のうち少なくとも１つの期間を含み得る。実施形態において、肝細胞を分子に接触せしめるステップと、当該分子により処理された肝細胞を増幅マーカに接触せしめるステップとの間の期間は、例えば、１時間から４時間であり得る。
【００９１】
５．毒性を特性化する直接的方法
一般に、化学物質の代謝によってなされる肝臓による中心的役割は、毒素によって誘起された損傷に対する感受を可能にすることである。例えば、アセトアミノフェンの過剰投与は、肝臓がアセトアミノフェンをＮ‐アセチル‐ｐ‐ベンゾキノン（ＮＡＰＱＩ）と称される毒性中間体に代謝するようせしめ得る。残念ながら、毒性は多くの場合肝臓で代謝物の形成を必要とするので毒性スクリーニングは、代謝的に活性でない細胞に対して実行される場合、効果的であり得ない。
【００９２】
したがって、本開示は、例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ登録商標Ｅｐｉｃ登録商標バイオセンサシステムを用いて、代謝的に活性な肝細胞に対する原発生肝細胞等の分子の毒性を直接的に特性化する方法を提供する。
【００９３】
実施形態において、本開示は、肝細胞に対する分子の毒性を直接的に特性化する方法を提供する。方法は、以下のステップを含む。
【００９４】
その方法は、表面に固定された生細胞を含むバイオセンサを設けるステップを含み、前記固定せしめられた肝細胞は、前記バイオセンサの表面に被覆された第１の細胞外基質物質のナノスケールのクラスタ又はマイクロスケールクラスタと、第２の細胞外基質物質のオーバレイとの間に固定されており、前記固定せしめられた肝細胞は、自身の代謝機能の少なくとも一部を維持する；
その方法は、前記固定せしめられた肝細胞を分子に接触せしめるステップを含む。
【００９５】
その方法は、既知の肝毒素が存在する場合と存在しない場合における前記分子によって誘起された前記肝細胞のバイオセンサ応答を検出し且つ比較するステップを含む。
【００９６】
実施形態において、前記第１及び第２の細胞外基質物質は、基本的に、構造的なサポートを細胞に提供することができる生体組織内で見い出され又は細胞外で見い出されたいかなるタイプの生体材料をも含む。細胞外基質物質は、タンパク質、多糖類又は糖タンパク質であり得る。実施形態において、細胞外基質物質は、例えば、コラーゲン（例えば、コラーゲンＩ又はコラーゲンＩＶ）、フィブロネクチン、マトリゲルＴＭ又はそれらの組合せであり得る。特定の実施形態において、前記第１の細胞外基質物質はコラーゲンＩを含み、前記第２の細胞外基質物質はマトリゲルＴＭを含む。
【００９７】
実施形態において、前記肝細胞は、原発生肝細胞、形質転換肝細胞、不死化肝細胞又はそれらの組合せのうち少なくとも１つを含む。
【００９８】
６．肝細胞をバイオセンサに培養する方法
一般に、肝細胞は、薬物の毒性をスクリーニングするための生理的に関連するモデルを表し得る。しかしながら、細胞外基質被膜は、肝細胞の生存率と代謝活性を維持するのに必要である。その結果、ほとんどの生体外の肝培養細胞システムが三次元の培養に基づいており、一般に、バイオセンサによる検出に影響を受け易い。これは、バイオセンサ表面における又はバイオセンサ表面付近の比較的小さなセンシング容積及び／又は細胞変化に対する感度に起因する。
【００９９】
したがって、本開示は、代謝的に活性な肝細胞をバイオセンサに培養する方法を提供する。細胞外基質材料のクラスタのコーティングを有するバイオセンサ表面の使用は、肝細胞代謝活性に対して適切なトポロジを提供し得るし、バイオセンサ細胞分析における分子毒性のロバスト検出を可能にし得る。
【０１００】
実施形態において、本開示は、代謝的に活性な肝細胞をバイオセンサに培養する方法を提供する。
【０１０１】
その方法は、第１の細胞外基質物質を含む第１の水溶液をバイオセンサの前記表面に対して利用するステップを含む。
【０１０２】
その方法は、前記第１の水溶液を乾燥せしめるステップを含む。当該乾燥せしめるステップは、前記第１の細胞外基質物質のスケールクラスタ又はマイクロスケールクラスタを含む前記表面に皮膜を生じせしめて、被覆されたバイオセンサ表面を形成する。
【０１０３】
その方法は、被覆バイオセンサ表面に肝細胞を培養するステップを含む。
【０１０４】
その方法は、培養された細胞を覆う媒質に第２の細胞外基質物質を塗布するステップを含む。前記第２の細胞外基質物質は、前記バイオセンサの前記表面上に前記肝細胞を有するオーバレイを形成する。
【０１０５】
実施形態において、前記第１及び第２の細胞外基質物質は、構造的なサポートを細胞に提供することができる組織の中と細胞の外で見つけられた本質的にはどんなタイプの生体試料も含む。細胞外基質物質は、タンパク質、多糖類又は糖タンパク質であり得る。実施形態において、細胞外基質物質は、例えば、コラーゲン（例えば、コラーゲンＩ又はコラーゲンＩＶ）、フィブロネクチン、マトリゲルＴＭ又はそれらの組合せであり得る。特定の実施形態において、前記第１の細胞外基質物質はコラーゲンＩを含み、前記第２の細胞外基質物質はマトリゲルＴＭを含む。
【０１０６】
実施形態において、前記第１の水溶液は、第１の細胞外基質物質を含み得る。前記第１の水溶液は、例えば、約１μｇ／ｍｌから約２０μｇ／ｍｌまでの範囲の量の前記第１の細胞外基質物質を含み、約５μｇ／ｍｌから約５０μｇ／ｍｌまでの範囲の量の前記第１の細胞外基質物質を含み、約１０μｇ／ｍｌの量の前記第１の細胞外基質物質を含む。
【０１０７】
実施形態において、乾燥せしめるステップは、約１時間から約２４時間までの範囲で、約１２時間から約２４時間までの範囲で又は約１６時間から約２４時間までの範囲等、一定の期間、真空下で培養するステップを含み得る。この乾燥期間は、細胞外基質物質の低速な自己組織化を利用し得るし、一連のクラスタから成る不規則なコーティングを生じせしめ得る。これは、蛍光タグ付け抗体染色法又は原子間力顕微鏡によって図示されている（データは図示せず）。
【０１０８】
実施形態において、前記第２の水溶液は、例えば、例えば、約０．０１重量％から約１重量％の範囲内の量、約０．０５重量％から約０．５重量％の範囲内の量又は約０．１重量％の量の第２の細胞外基質物質を含み得る。
【０１０９】
実施形態において、前記肝細胞は、原発生肝細胞、形質転換肝細胞、不死化肝細胞又はそれらの組合せのうち少なくとも１つを含む。
【０１１０】
７．バイオセンサ肝細胞培養システム
さらに、本開示は、バイオセンサ肝細胞培養システムを提供する。前記固定せしめられた肝細胞は自身の代謝機能の少なくとも一部を維持する。
【０１１１】
実施形態において、本開示は、バイオセンサ肝細胞培養システムを提供する。
【０１１２】
そのシステムは、第１の細胞外基質物質のナノスケールクラスタ又はマイクロスケールクラスタにより被覆されたバイオセンサ表面を含む。
【０１１３】
そのシステムは、バイオセンサ表面に固定された肝細胞を含む。前記固定せしめられた肝細胞は、原発生肝細胞、形質転換肝細胞、不死化肝細胞又はそれらの組合せのうち少なくとも１つを含む。
【０１１４】
そのシステムは、第２の細胞外基質物質を含むオーバレイを含む。前記挟まれた肝細胞は自身の代謝機能の少なくとも一部を維持する。
【０１１５】
実施形態において、前記バイオセンサ表面は金属フィルムを含む。例えば、バイオセンサ表面は金フィルムを含み得る。
【０１１６】
実施形態において、前記第１及び第２の細胞外基質物質は、構造的なサポートを細胞に提供することができる生体組織内及び細胞外で見出されたあらゆるタイプの生体試料をも、基本的には含む。細胞外基質物質は、タンパク質、多糖類又は糖タンパク質であり得る。実施形態において、細胞外基質物質は、例えば、コラーゲン（例えば、コラーゲンＩ又はコラーゲンＩＶ）、フィブロネクチン、マトリゲル又はそれらの組合せであり得る。特定の実施形態において、前記第１の細胞外基質物質はコラーゲンＩを含み、前記第２の細胞外基質物質はマトリゲルを含む。
【０１１７】
実施形態において、前記オーバレイは、例えば、約０．０１重量％から約１重量％の範囲内の量、約０．０５重量％から約０．５重量％の範囲内の量又は約０．１重量％の量の第２の細胞外基質物質を含み得る。
【０１１８】
図１が、バイオセンサ肝細胞培養システム（１００）の側面概略図を示している。バイオセンサ肝細胞培養システムは、一連のクラスタの含む表面被覆を有するバイオセンサ、ＥＣＭ材料（１６０）またはＥＣＭ混合物（１６０）、肝細胞（１４０）のレイヤ及び第２のＥＣＭ材料（１７０）を含む。肝細胞は、バイオセンサ表面（１６０）と第２のＥＣＭ材料（１７０）との間に挟まれている。バイオセンサは、グレーティング構造は埋め込まれた基板（１２０）と、導波フィルム（１３０）と、から成る。光学バイオセンサが使用されるとき、光学バイオセンサにおいて、前記バイオセンサは、センサ表面から約１５０ｎｍ−２００ｎｍである検出ゾーンを形成するバイオセンサ表面から離間された短エバネセント波（１３５）は放射し得る。細胞は、結合錯体（１５０）を介して表面に接触せしめられている。光学バイオセンサが使用されるとき、細胞は、バイオセンサ表面（１４５）に対して垂直な方向の動的質量再分布を伴う化合物刺激に対して応答する。ＤＭＲ信号は、照明光（１１０）から成る光検出器を用いて検出され得るし、反射光（１１５）の光学成分が、受信システムを用いて記録され得るし、ＤＭＲ信号の指標として利用され得る。
【０１１９】
８．バイオセンサ及びバイオセンサ分析
一般に、無標識細胞ベースの分析は、バイオセンサを利用して、生体細胞における化合物によって誘起された応答を観測する。化合物は、天然に生ずるもの又は合成物であり得るし、精製された混合物又は未精製の混合物であり得る。バイオセンサーは、光学的、電気的、熱的、音響的、磁気的トランスデューサ等のトランスデューサを通常利用して、分子認識事象又はバイオセンサーに接触せしめられた細胞における化合物誘起の変化を定量化可能な信号に変換する。これら無標識バイオセンサは、分子の相互作用の分析に使用され得る。当該分子の相互作用の分析とは、分子複合体が時間とともに或いは細胞応答に対してどのように形成し且つ分離するのかを特性化することを含み、細胞が刺激に対してどのように反応するのかを特性化することを含む。本願発明に利用可能なバイオセンサは、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサ及び共鳴導波グレーティング（ＲＷＧ）バイオセンサ、共鳴ミラー、エリプソメータ、又は、バイオインピーダンスシステム等の電気バイオセンサシステム等の光学バイオセンサシステムを含み得る。
【０１２０】
ａ）ＳＰＲバイオセンサ及びシステム
ＳＰＲは、電気的に伝導する金属膜（例えば、金）を有する平面ガラス基板に偏光のウェッジを指向させて、表面プラズモンを励起するプリズムに依存している。得られたエバネセント波は、金の層内の自由電子雲と相互作用し、且つかかる自由電子雲によって吸収され、電子電荷密度波（すなわち、表面プラズモン）を生成し且つ反射光の強度の低減を生じせしめる。この強度が最小となる共鳴角度は、センサ表面の反対表面における金層近傍にある溶液の屈折率の関数となる。
【０１２１】
ｂ）ＲＷＧバイオセンサー及びシステム
ＲＷＧバイオセンサは、例えば、基板（例えば、ガラス）、埋め込まれたグレーティング構造を有する導波薄膜、及び、細胞層を含み得る。ＲＷＧバイオセンサーは回折格子によって導波部に対する光の共鳴結合を利用し、溶液表面の界面において全内反射が生ずる。全内反射は、界面において次々に電磁場を形成する。この電磁場は、事実上エバネッセントであり、電磁場はセンサの表面から指数関数的に減衰することを意味している。電磁場が初期値に関して１／ｅに減衰する距離は、侵入深さとして知られており、特定のＲＷＧバイオセンサーに関する設計の関数であるものの、通常約２００ｎｍのオーダーである。このタイプのバイオセンサーは、かかるエバネセント波を利用して、センサの表面の近傍の若しくはセンサの表面における細胞層のリガンドによって誘起された変化を特性化している。
【０１２２】
ＲＷＧ装置は角度シフト測定若しくは波長シフト測定に基づいて複数のシステムに細分化され得る。波長シフト測定において、一定の角度で入射波長の範囲に及ぶ偏光が、導波路を照明するのに使用される。特定波長の光は導光路内に結合され、導波導光路に沿って伝播する。あるいは、角度シフト装置において、センサは単色光を用いて照明され、光が共鳴結合される角度が測定される。共鳴条件は、バイオセンサーの表面と直接的に接触している細胞層（例えば、細胞の密集度、細胞の付着性、及び細胞状態）によって影響される。リガンド又は分析物が生体細胞内の細胞ターゲット（例えば、ＧＰＣＲ、キナーゼ）と相互作用するときに、細胞層の局所的な屈折率変化が、共鳴角度のシフト（又は共鳴波長のシフト）として検知され得る。
【０１２３】
Ｃｏｒｎｉｎｇ社登録商標Ｅｐｉｃ社登録商標システムは、無標識生化学的又は細胞ベースの分析にＲＷＧバイオセンサーを使用している（コーニング株式会社、コーニング、ＮＹ）。Ｅｐｉｃ登録商標システムは、ＲＷＧプレートリーダーと、ＳＢＳ（Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）規格サイズのマイクロタイタープレートと、から成る。プレートリーダーにおける検出システムは、細胞内におけるリガンド誘起の変化の結果として入射光の波長シフトを測定するために、統合ファイバ光学装置を利用している。一連の照明‐検出ヘッドが直線的に配置されているので、反射スペクトルが、３８４ウェルのマイクロプレートのカラム内の各ウェルから同時に収集される。プレート全体が走査されるので、各センサが複数回扱われ、各カラムが順番に扱われる。入射光の波長は、収集されて、分析に使用される。温度変動に帰属する入射波長の不要なシフトを最小にするために、温度制御装置が装置に含まれ得る。測定された応答は、多数の細胞の平均化された応答を表している。
【０１２４】
ｃ）電気バイオセンサ及びシステム
電気バイオセンサーは、基板（例えば、プラスチック）、電極、及び細胞層から成る。この電気的な検知手法において、細胞は基板上に並べられた小さな金の電極上に培養され、システムの電気インピーダンスが経時的に調べられる。インピーダンスは細胞層の電気伝導率の変化の指標である。通常、固定周波数若しくは変動周波数におけるわずかに一定の電圧が、電極又は一連の電極に印加され、回路を介した電流が時間が時間とともに観測される。リガンド誘起の電流変化によって、細胞の応答に関する指標が与えられる。細胞全体について検出するためのインピーダンス測定は１９８４年に最初に実現された。それ以来、インピーダンスベースの測定は、細胞の付着及び拡散、細胞の微小運動、細胞の構造変化、及び細胞の死を含む広い範囲における細胞の事象を研究するために利用されてきた。古典的なインピーダンスシステムは、小さな検出電極及び大きな基準電極の使用に帰属して、分析に関する変動性が高いという欠点を有する。この変動性を克服するために、ＣｅｌｌＫｅｙ  ｓｙｓｔｅｍ（ＭＤＳ  Ｓｃｉｅｘ、南サンフランシスコ、カリフォルニア州））やＲＴ‐ＣＥＳ（ＡＣＥＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ株式会社、サンディエゴ、カリフォルニア州）等のシステムの最新世代は、ミクロ電極アレイを有する集積回路を利用している。
【０１２５】
ｄ）高空間分解能バイオセンサ画像システム
ＳＰＲ画像システム、エリプソメトリ画像システム及びＲＷＧ画像システムを含む光学バイオセンサ画像システムにより、高空間分解能が得られ、本発明において用いられえる。例えば、ＳＰＲイメージャ登録商標ＩＩ（ＧＷＣ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ）は、プリズム結合ＳＰＲを使用して、固定入射角でＳＰＲ測定を行い、ＣＣＤカメラを用いて反射光を収光している。表面の変化は反射率の変化として記録される。したがって、ＳＰＲ撮像は同時に、アレイのすべての要素に対して測定値を同時に収集する。
【０１２６】
あるいは、ＲＷＧバイオセンサーに基づく可変波長光学送受観察システムは、撮像ベースのアプリケーションに使用され得る。このシステムにおいて、高速可変波長レーザ源は、センサ又はマイクロプレートの形態のＲＷＧバイオセンサーアレイを照明するのに使用され得る。レーザ波長がスキャンされると、時間の関数としてセンサから反射された光の強度を検出することによって、センサのスペクトルが得られ得る。コンピュータ化された共振波長送受モデリング用いて測定されたデータに関する分析によって、固定された受容体又は細胞層を有するバイオセンサーの空間分解画像が形成される。画像センサの使用によって、撮像ベースの送受観測スキームが必然的に得られる。２次元の無標識画像が部品を移動させることなく取得され得る。
【０１２７】
あるいは、垂直偏波モード又はｐ‐偏光ＴＭ０モードを用いた角度型送受観測システムが使用され得る。このシステムは一連の光ビームを生成するための発光システムから成るので、各々が、約２００μｍｘの３０００μｍまたは２００μｍｘ２０００μｍの寸法のＲＷＧセンサ及びこれらセンサから反射された光ビームの角度変化を記録するＣＣＤカメラベースの受信システムを照明する。一連の光ビームが回折光学レンズと組み合わせたビーム分割器によって得られる。このシステムによって、最大４９のセンサ（７×７のウェルセンサアレイ）が３秒毎に同時にサンプリングされ得るし、又は、センサマイクロプレートのすべてが１０秒毎に同時にサンプリングされ得る。
【０１２８】
あるいは、走査型波長送受システムが使用され得る。このシステムにおいて、一定の角度で入射波長の範囲に及ぶ偏光が、導波グレイティングバイオセンサを照明し且つ走査するのに使用され、各位置における反射光が同時に記録され得る。走査を通して、バイオセンサの全域において高分解能画像が得られる。
【０１２９】
以下の実施例は、上述した開示を使用する手法をより完全に説明し、かつ、本開示の種々の態様を実施するよう意図された最良の態様を説明することに用いる。これら実施例は、本開示の真の範囲を何等限定するものではなく、むしろ例示の目的で与えられるものと理解すべきである。
【０１３０】
ｅ）バイオセンサ細胞分析
細胞ターゲットを介した刺激に対する細胞の応答は、ダウンストリーム信号伝達ネットワークの空間的且つ時間的ダイナミクスによってコード化され得る。このため、一体的な細胞信号伝達をリアルタイムで観測することは、細胞生物学及び細胞生理学を理解する際に有用であり生理学的に関連した情報を提供し得る。
【０１３１】
共鳴導波グレーティング（ＲＷＧ）バイオセンサを含む光学バイオセンサは、細胞体の動的な再分配に関連する積分された細胞応答は検出して、その結果、細胞情報伝達を研究する非観血的な手段を提供し得る。すべての光学バイオセンサが、センサ表面における局所的な屈折率又はセンサ表面に極近傍の局所的な屈折率の変化を測定する点で共通する。原則、細胞検出には、ほとんどすべての光学バイオセンサが、細胞におけるリガンド誘起の変化を特性化するのにエバネッセント波を用いることができるので、適切である。エバネセント波は、溶液‐表面界面における光の全反射によって形成された電磁場である。当該電磁場は、侵入深さ若しくは検出ボリュームと称される特性距離における溶液中の短い距離まで、通常、延在する。
【０１３２】
最近、リガンドによる刺激に応答した生細胞内で測定された光学信号のパラメータと特性を記述する理論モデル及び数学的モデルが開発された。細胞生物物理学を組み合わせた３層導波システムに基づくこれらモデルは、リガンド誘起の光信号を、受容体を介して調節された特定の細胞プロセスにリンクする。
【０１３３】
バイオセンサーが入射光によって照射される領域に位置する細胞の平均的な応答を測定するので、高密集層からなる細胞が、最適の分析結果を獲得するのに使用され得る。細胞のバイオセンサーの短い侵入深さと比べて大なる寸法に帰属して、センサ構成は、従来にはない３層システムであるとみなされる。３層とは、基板、グレーティング構造を有する導波薄膜、及び、細胞層である。したがって、リガンドによって誘起された有効屈折率の変化（すなわち、検出信号）は、細胞層の底部の屈折率の変化に一次的に正比例し得る。
【０１３４】
【数１】
2012510059.tif 000003
【０１３５】
Ｓ（Ｃ）は細胞層に対するシステムの感度である。ｎｃはバイオセンサーによって検知された細胞層の局所的な屈折率における配位子誘起の変化である。細胞内の所定の容積の屈折率は、タンパク質等の生物分子の濃度によって主に決定されるので、ｎｃは、検出ボリューム内の細胞性ターゲット又は分子集合のリガンド誘起の局所的な濃度変化に正比例すると想定され得る。センサ表面から離間するに従って指数関数的に減衰するエバネッセント波の特性を考慮すると、リガンドによって誘起された光信号は数式２によって支配される。
【０１３６】
【数２】
2012510059.tif 000004
【０１３７】
ここで、ΔＺｃは細胞層への侵入深さであり、αは特定の屈折率の増大（タンパク質に対しては約０．１８／ｍＬ／ｇ）であり、ｚｉは、質量の再分配が生ずる距離であり、ｄは細胞層内の薄片の架空の厚さである。ここで、細胞層は垂直方向において均等に離間された部分に分割される。上記の数式は、リガンドによって誘起された光学信号は、センサの表面から異なる距離で生じる質量再分布の和であり、各々が全ての応答に対して不均一に貢献することを示している。その上、波長若しくは角度シフトに関して検出された信号は、主としてセンサ表面に対して垂直の質量再分布に対して敏感である。その動的特性の故に、それは、動的質量再分布（ＤＭＲ：ｄｙｎａｍｉｃ  ｍａｓｓ  ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）と称される。
【０１３８】
９．細胞とバイオセンサ
細胞は、自身が受けた情報を処理し、コード化し、集積する複数の細胞経路又は機構に依存している。特に分析物のタンパク質ターゲットへの結合を測定する光学バイオセンサを有する親和性分析と異なり、生細胞は、はるかに複雑であって、動的である。
【０１３９】
細胞情報伝達を研究するために、細胞は、細胞培養を介して達成され得るバイオセンサー表面と接触するように移動され得る。これら培養された細胞は、３つのタイプの接触を介してバイオセンサ表面に付着され得る。当該３つのタイプの接触とは、焦点接触、近接接触、及び細胞外接触、であり、各々が、表面からの特徴的離間距離を有する。その結果、基底細胞膜は、通常、表面から〜１０−１００ｎｍに位置している。このため、バイオセンサは、細胞の底部を検知することができる。
【０１４０】
細胞は、多くの場合、表面に依存した接着性及び増殖性を呈する。強健な細胞分析を達成するために、バイオセンサ表面は、細胞接着と増殖を高めるためのコーティングを必要とし得る。しかしながら、表面特性は、細胞生物学に直接的な影響を有し得る。例えば、細胞によって印加された力の下で細胞がどのように変形するかを決定付ける基板材料の機械的整合性が細胞の応答に影響を及ぼすように、表面結合されたリガンドは、細胞の応答に影響を及ぼし得る。異なる培養条件（時間、血清中濃度、密集度等）に起因して、得られた細胞の状態は、表面によって異なり得るし、条件によっても異なり得る。したがって、細胞の状態を制御する特別な作用が、バイオセンサーベースの細胞分析を開発するのに必要であり得る。
【０１４１】
細胞は、通常数十ミクロンの比較的大きい寸法の動的な物体である。刺激がない場合でさえ、細胞は、絶えず、微小運動、すなわち、動的運動及び細胞構造のリモデリングを受ける。これは、例えは、サブ細胞解像にて経時的顕微鏡検査法によって並びにナノメータレベルのバイオインピーダンス測定によってて、生体組織の培養において観察される。
【０１４２】
未刺激条件下において、細胞は、ＲＷＧバイオセンサを用いて調べられるように、正味ゼロのＤＭＲ応答を通常生成する。これは、部分的には、光学バイオセンサの低空間分解能が原因である。これは、レーザスポットの大なるサイズと結合光の長距離伝搬長によって決定されるからである。レーザスポットのサイズは、調べられた領域のサイズを決定し、通常、一つのみの分析ポイントが、一度に、追跡され得る。したがって、バイオセンサーは、入射光領域に位置付けられた大なる細胞集団の平均された応答を通常測定する。細胞は単一細胞レベルで微小運動を受けるが、細胞の大集団は平均した正味ゼロＤＭＲ応答を生じせしめる。その上、細胞内の巨大分子は、非常に組織化されており、ほ乳動物細胞においては適切なサイトに空間的に限定されている。細胞上及び細胞内のタンパク質の制御化された局在性は、特定の細胞機能と応答を決定する。なぜならば、局在性によって、細胞は、自身の適切なパートナーと相互作用するタンパク質の特異性と効率性を調節することが可能となり、タンパク質の活性化及び脱活性化機構を空間的に分離することが可能となるからである。この制御の故に、未刺激条件下において、検出ボリューム内の細胞の局所的な質量密度は、平衡状態に達して、正味ゼロの光学応答を生じせしめる。一定の光学応答を達成するために、調べられた細胞は、一定の期間、従来の培養条件下で培養され得るので、細胞の大部分は、一つのサイクルの分離を完了している。
【０１４３】
生細胞は、外因性信号を検出し且つ応答する良好な能力を有する。細胞情報伝達が直線的なルートを介して機能すると以前は考えられた。当該直線的なルートにおいて、周囲のキューは単一の明確な応答を生ずる直鎖の反応を引き起こすであろう。しかしながら、研究は、外部刺激に対する細胞応答がはるかに複雑であることを示した。細胞が受信する情報は、処理され、信号伝達タンパク質のリン酸化及びトポロジカルな再配置に関する複雑な時間的及び空間的パターンに暗号化され得ることが明らかになった。適切なサイトに対する空間的及び時間的タンパク質の標的化は、タンパク質−タンパク質相互作用の特異性及び効率を調節するのに重要であり得る。その結果、細胞情報伝達と応答のタイミング及び強度が決定される。細胞の再組織化、細胞サイクルチェックポイント及びアポプトーシス等、重要な細胞の決定は、活性化された信号トランスデューサの正確な時間的制御及び相対的な空間分布に依存する。したがって、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）等の細胞ターゲットを介して調節された細胞情報伝達は、秩序化され且つ調節されように通常進行し、一連の空間的及び時間的な事象からなる。その多くが、局所的な質量密度における変化を生じせしめ又は細胞の局所的な細胞性物質の再分配を生じせしめる。これらの変化又は再分布は、検出ボリューム内で生ずる時、光学バイオセンサを使用してリアルタイムで直接的に進行され得る
１０．バイオセンサパラメータ
ＲＷＧバイオセンサー又はバイオインピーダンスバイオセンサ等の無標識バイオセンサは、リガンド誘起の細胞応答をリアルタイムで追従することができる。非侵襲的及び無操作バイオセンサ細胞分析は細胞信号伝達の事前知識を必要としない。得られたバイオセンサ信号は、受容体信号伝達及びリガンド薬理学に関連する高度な情報を含む。複数パラメータが、刺激に対する細胞の動的バイオセンサー応答から抽出され得る。これらパラメータは、全体的な動特性、フェーズ、信号振幅、１つのフェーズから別のフェーズまでの遷移時間を含む動的パラメータ及び各フェーズの動力学を含むものの、これらに限定されない（Fang, Y., and Ferrie, A.M. (2008) “label-free optical biosensor for ligand-
directed functional selectivity acting on β2 adrenoceptor in living cells”.FEB
S Lett.582, 558-564;Fang, Y., et al., (2005) “Characteristics of dynamic mass 
redistribution of EGF receptor signaling in living cells measured with label free optical biosensors”.Anal.Chem., 77, 5720-5725;Fang, Y., et al., (2006) “Reso
nant waveguide grating biosensor for living cell sensing”.Biophys.J., 91, 1925-
1940を参照されたい）。
【０１４４】
ＩＩ．実施例
Ａ．実験手順
１．材料
リファンピン、ＳＢ２０３５８０，過酸化水素、アセトアミノフェン、トロンビンはシグマ・ケミカル社（ミズリー州、セントルイス）から入手した。マトリゲルＴＭは、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手した。Ｃｏｒｎｉｎｇ登録商標Ｅｐｉｃ登録商標３８４バイオセンサーマイクロプレート細胞培養コンパチブルは、コーニング株式会社（コーニング、ニューヨーク州）から入手した。コラーゲンＩ被覆の９６ウェルプレートは、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｃａｔ＃３５４４０７）から入手し、コントロールとして使用された。
【０１４５】
２．バイオセンサーマイクロプレートのコーティング
バイオセンサマイクロプレートのコラーゲン被膜は１０μｌのコラーゲンＩ（１０μｇ／ｍｌ）を各ウェルに投与することによって達成された。それに続いて、制御された真空条件下で一晩ゆっくりと乾燥された。この被膜プロセスは、コラーゲンＩの低速な自己組織化を利用しており、一連のクラスタから成る不規則な被膜が得られた。被膜プロセスにより、ＥＣＭ材料のマイクロスケール又はナノスケールのトポロジが肝細胞に提供されて、Ｅｐｉｃ登録商標３８４ウェルバイオセンサマイクロプレートコラーゲン被膜が形成される。
【０１４６】
３．サンドイッチ原発生肝細胞培養
ヒト原発生肝細胞は、ＸｅｎｏＴｅｃｈ（Ｈ１５００．Ｈ１５Ａ＋ロット番号７７０）から、購入した。細胞は、製造者命令に応じてＸｅｎｏｔｅｃｈの肝細胞分離キット（Ｃａｔ＃：Ｋ２０００）を使用して解凍され精製された。１日目、細胞（５０，０００／ウェル）は、１０％のＦＢＳを含む無ガラクトースのＭＦＥ培養媒質（コーニング株式会社）を使用して、Ｅｐｉｃ３８４ウェルコラーゲンＩ被覆バイオセンサーマイクロプレートにおいて被膜され、又は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅコラーゲン被膜９６ウェルマイクロプレートにおいて被膜された。２日目、媒質は、０．２５ｍｇ／ｍｌのマトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｃａｔ＃３５６２３４）を有する１０％のＦＢＳを含むＭＦＥ管理媒質に変化された。細胞は、１日から８日間、５％のＣＯ2を用いて３７℃にて培養された。５日目から、細胞は７２時間ＤＭＳＯの１０Ｍリファンピン（Ｃａｔ＃  Ｒ３５０１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ株式会社）又は等容積で処理された。８日目に、ＣＹＰ３Ａ４分析が、Ｐ４５０−ＧｌｏＴＭＣＹＰ３Ａ４分析キット（Ｃａｔ＃  Ｖ８９０２，  Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、行われた。分析結果は、細胞数を規格化した後に誘起の層として記録された。細胞数は、ＣｙｔｏＴｏｘ９６登録標章Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｃａｔ＃Ｇ１７８０，  Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、規格化された。
【０１４７】
４．光学的バイオセンサシステム及び細胞分析
コーニング登録商標Ｅｐｉｃ登録商標波長送受観測システムのベータバージョンが細胞全体についての検出に使用された。このシステムは、温度制御ユニット、光学検知ユニット、及びロボティックスを有するオンボード液体処理ユニットから構成される。検知ユニットが、統合されたファイバオプティクスの中心に設けられ、〜１５秒の時間間隔で細胞反応の動的測定を可能にする。すべての分子化合物添加は、単にオンボード液体ハンドラーを使用してピペットを介して行われた。
【０１４８】
ＲＷＧバイオセンサーは、そのエバネッセント波を、細胞内のリガンド誘起のＤＭＲ信号を測定することに利用している。エバネセント波は、細胞内部に広がり且つ距離とともに指数関数的に減衰し、約１５０ｎｍの特性的な検出ボリュームが得られる。これは、受容体の活性化を介して調節されたいかなる光学応答も、エバネセント波がサンプリングする細胞部分にわたる平均を表しているにすぎないことを意味している。これらの事象に関する凝集によって、リガンドによって誘起されたＤＭＲの動特性及び振幅が決定される。
【０１４９】
バイオセンサ細胞分析に対して、２分間のベースラインが最初に確立された。化合溶液は、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．１）を含むハンクス均衡塩類溶液において維持された細胞を有するセンサープレートに搬送された。細胞応答が継続して記録された。すべての研究が被制御温度（２６℃）にて行われた。少なくとも２つの独立したセットの実験において、少なくとも１６回の再現性を有する実験が、各測定に対して実行された。分析係数の変移は、通常約１０％未満であることが見出された。
【０１５０】
Ｂ．実施例１
バイオセンササンドウィッチ培養システムにおいて一旦培養されると、原発生肝細胞は、自身の代謝機能を回復させる
得られたヒト原発生肝細胞は、コラーゲンＩの一連のクラスタの含むセンサ表面上に培養するのに直接的に使用された。数時間から一晩までの培養後、培養溶液に０．１％のマトリゲルを有する原発生肝細胞の溶液オーバレイが利用された。その結果、原発生肝細胞は、コラーゲンＩを呈するバイオセンサ表面と、第２のＥＣＭ材料（すなわち、マトリゲル）との間でサンドイッチにされた単分子膜を形成した。
【０１５１】
バイオセンサ表面に培養された原発生肝細胞の代謝機能を、バイオセンサ肝細胞培養システムを用いてテストするために、供給者によって推薦された実験手順に従い、５日間の培養により、Ｐ４５０−ＧｌｏＴＭＣＹＰ３Ａ４分析キットを使用して、リファンピン誘起の実験が行われた。細胞数を規格化した後、誘起のフォールドが計算された。比較のために、原発生肝細胞の同じロットが、コラーゲンＩ被覆されたＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅの９６ウェルマイクロプレートに培養され、マトリゲル溶液オーバレイを使用してサンドイッチされた。リファンピン誘起のための２つの異なる条件が調べられた。細胞は、誘起プロセスを介して、０．５％のＤＭＳＯが存在しない場合と存在する場合におけるリファンピンによって処理された。
【０１５２】
図２Ａ及び２Ｂは、の誘起のフォールドのプロットを示している。双方の培養システムにおいて、リファンピンの処理はＣＹＰ機能の増加を生じせしめたことを示した。ＤＭＳＯが存在する場合と存在しない場合における誘起のフォールドは、同程度であった。これは、培養された原発生肝細胞が、自身の代謝機能を回復させたことを示している。その上、誘起のフォールドは、バイオセンササンドイッチシステムよりも、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅの規則的なコラーゲンＩマトリゲルサンドイッチシステムにおいて、より高い。しかしながら、分析はバイオセンササンドイッチシステムにおいて非常に再現性がある（図２ｂ）。これは、バイオセンサ表面のコラーゲンＩクラスタのマイクロスケール又はナノスケールのトポロジは原発生肝細胞の代謝機能を調節するのに重要であることを示している。
【０１５３】
Ｃ．実施例２  過酸化水素は、バイオセンササンドイッチシステムに培養された原発生肝細胞のアポプトーシスを生じせしめた
超酸化物アニオンラジカル、過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）及びヒドロキシルラジカル等の反応性酸素種（ＲＯＳ）は、ミトコンドリアにおける呼吸作用を介して内生的に生成される。ミトコンドリアからのＲＯＳの漏出に加えて、イオンの放射を含む多くの外因性酸化剤は、タンパク質、脂質及び核酸等の細胞組成と反応し得る。反応性酸素種は、酸化残基、デオキシリボースの損傷及びほ乳動物細胞におけるＤＮＡ鎖の損傷を生成する。８‐ヒドロキシグアニン等の酸化ベースは、ベース切除修復経路によって支配的に修復されることが信じられている。ＲＯＳは、デオキシリボースからの水素抽出により砂糖質の損傷をも直接的に誘起し、ＤＮＡ鎖の損傷を頻繁に引き起こす。細胞毒性及びミトコンドリアＤＮＡ損傷における二つのモードのＨ2Ｏ2投与量応答関係は、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ：Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ）に対して知られている。その上、Ｈ2Ｏ2は鉄が存在する場合精製されたＤＮＡに一本鎖の破壊を生じせしめ２相性投与量応答曲線を有するＣＨＯ細胞においてミトコンドリアＤＮＡ損傷を誘起することが示された。
【０１５４】
Ｈ2Ｏ2を含む反応性酸素種は、腫瘍促進プロセスにおいて重要な役割を果たす。腫瘍促進プロセスにおいて、反応性酸素種、特に、Ｈ2Ｏ2の関与は、生体内及び生体外の双方の研究において支持されている。Ｈ2Ｏ2は、ネズミ尿路上皮細胞、ネズミの骨髄性祖先細胞、マウス表皮細胞及びマウスはい線維芽細胞を含むいくつかの二相性形質転換システムにおいて新生物的形質転換を促進し得る。生体内研究は、Ｈ2Ｏ2はマウス皮膚腫瘍プロモータであることを示している。腫瘍促進プロセスにおいて、Ｈ2Ｏ2を含むＲＯＳの役割をサポートする間接的な証拠は、腫瘍プロモータによって生成されたＲＯＳの抑制は変化を大幅に抑制することである。中国緑茶の抗酸化分留は、Ｈ2Ｏ2の生成を抑制し得る。培養された肺細胞において、それは酸化剤誘起ＤＮＡ鎖の破壊を抑制し得る。その上、ＲＯＳとＨ2Ｏ2の生成は、例えば、ＴＰＡ、ＴＣＤＤ、ＵＶ，ペルオキシゾーム増殖因子、ステロイドのエステロゲン、フェノバルビタール、クロルダン及びアロクロール等の腫瘍プロモータの共通する特徴である。例えば、Ｈ2Ｏ2はネズミ肝臓上皮性Ｔ５１Ｂ細胞において腫瘍プロモータとして機能する。Ｈ2Ｏ2によるその腫瘍促進は、ギャップ接合コミュニケーションの中断と迅速な初期遺伝子の誘起を伴い得る。したがって、Ｈ2Ｏ2を含むＲＯＳは、腫瘍促進プロセスにおいて重要な役割を果たし得る。
【０１５５】
例えば、炎症、虚血／再潅流損傷及びアテローム性動脈硬化等の病理学的事象は、脈管構造内の大量な反応性酸素種の生成によっても達成される。ＲＯＳのソース及び酸化剤に対する暴露濃度及び暴露時間に依存して、ＲＯＳに対する内皮細胞の応答は、増殖及び生存から機能障害及び細胞死に到るまで、異なる。これらの応答を支配する分子信号の伝達経路が出現し始め、Ａｋｔ，ｅＮＯＳ，Ｓｒｃ等キナーゼ、成長因子受容体、及びＭＡＰキナーゼの活性化を含む。例えば、Ｓｒｃキナーゼ、ｅＮＯＳ及びＲａｓは、ＲＯＳに応答して活性化される。さらに、ＲＯＳは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）のトランス活性を生じさせることが示された。
【０１５６】
過酸化水素は、あらゆる細胞に対して有毒であり、投与量に依存して、細胞アポトーシスを生じせしめ得る。図３Ａ及び３Ｂは、１ｍＭ（図３Ａ）及び５ｍＭ（図３Ｂ）の２つの異なる投与量におけるＨ2Ｏ2の暴露に対する、本バイオセンササンドウィッチ培養システムを用いて培養された原発生肝細胞のリアルタイム動的ＤＭＲ応答を示している。各々の動的ＤＭＲ応答は８つの曲線の平均を表しており、エラーバーは標準偏差を示している。バイオセンサ表面の細胞がアポプトーシスを受けるとき、重大な損失（すなわち、陰性のＤＭＲ信号）が予想される。１ｍＭにおいて、Ｈ2Ｏ2はセンシング容積またはバイオセンサ検出ゾーンにおいて局所的生成量に少しも顕著な変化をも誘発しなかった。これは、原発生肝細胞がＨ2Ｏ2に殺されないことを示している。逆に、５ｍＭのＨ2Ｏ2は顕著な負のＤＭＲ（Ｎ−ＤＭＲ）信号を生じせしめ、これは、培養された原発生肝細胞のアポプトーシスを示している。生ずるＮ−ＤＭＲ信号の開始時間は５ｍＭのＨ2Ｏ2を用いた処理後約３０分であることが見出された。
【０１５７】
Ｄ．実施例３  過酸化水素は、バイオセンササンドイッチシステムに培養された原発生肝細胞に作用するリファンピンの毒性を増幅する
人体は、ほとんどすべての薬を外来性物質（すなわち、生体内異物）として認識し、それらを様々な化学プロセス（すなわち、代謝）にかけて、それらを排除に適したものにし得る。これは、生物活性を変化させるように（ａ）脂肪溶解性を低減せしめ且つ（ｂ）生物活性を変化せしめる化学的形質転換を伴う。体内のほとんどすべての生体組織が化学物質を代謝する何らかの能力を有するものの、肝組織における滑面小胞体は、内因性化学物質（例えば、コレステロール、ステロイドホルモン、脂肪酸、およびタンパク質）と外因性物質（例えば、薬物）の双方に対する主要な「代謝性クリアリングハウス」である。
【０１５８】
薬物代謝は、通常、２つのフェーズ、すなわち、フェーズ１及びフェーズ２に分割されている。フェーズ１反応は、フェーズ２の薬物を準備すると考えられている。しかしながら、多くの分子は、フェーズ２によって直接的に代謝され得る。フェーズ１反応は、酸化、減数分裂、加水分解、水和及び他の多くの稀な化学反応を伴う。これらプロセスは、薬物の水溶性を増加させる傾向があり、化学的により活性的であり本来的に毒性である代謝物を生成し得る。たいていのフェーズ２反応は、細胞質ゾルにおいて生じ、トランスフェラーゼ酵素を介した内因性物質との接合を伴う。化学的に活性なフェーズ１生成物は、比較的不活性にされ、このステップによる排出に適している。
【０１５９】
チトクロームＰ−４５０として知られた小胞体内に存在する酵素群は、肝組織における酵素を代謝する最も重要な群である。チトクロームＰ−４５０は、電子伝達鎖の末端酸化酵素の構成部である。それは、単一の酵素ではないものの、５０の密接に関連した一群のアイソフォームから構成されており、それらの６つが９０％の薬を代謝する。個々のＰ−４５０遺伝子生成物は、非常に多様的であり、この不均一性によって、巻組織は、（ほとんどすべての薬物を含む）広範なアレイの化学物質を酸化せしめる。Ｐ４５０システムの３つの重要な特性、すなわち、遺伝子の多様性、酵素活性度の変化及び拮抗阻害は、薬物によって誘起された毒性において役割を有する。多くの物質がＰ−４５０酵素機構に影響を及ぼし得る。薬物は、いくつかの手法によって酵素群と相互作用する。チトクロームＰ−４５０酵素を修飾する薬物は、抑制物質又は誘発物質と称されている。ＣＹＰ抑制物質は、１つまたは数個のＰ−４５０酵素の代謝活性を阻止する。この効果は通常迅速に生ずる。一方、誘起物質は、自身の合成を強化することによって、Ｐ−４５０の活性を増大せしめる。薬物の半減期を誘発せしめることに依存して、酵素の活性度が増大する前に通常遅延がある。
【０１６０】
化学物質のクリアランス及び形質転換における肝組織による中心的役割は、薬物による損傷（肝毒性と称する）を誘起しやすくすることでもある。特定の薬剤は、過剰投与され、及び、治療領域において導入されると、臓器を損傷させ得る。実験室及び工場において使用される物質、天然の化学物質（例えば、ミクロシスチン）及び薬草剤等の他の化学物質も、肝毒性を誘発し得る。肝組織の損傷を生じさせる化学物質は、肝毒素と称される。
【０１６１】
９００より多くの薬物が、肝組織の損傷を生じせしめることに関与しており、それは、薬物が市場から回収される最も一般的な理由である。化学物質は、異常な肝組織酵素試験としてのみ現れる肝組織に対して無症候性損傷を多くの場合生じせしめる。薬物によって誘起された肝組織の損傷は、全入院患者のうち５％の原因となっており、すべての急性肝不全障害のうち５０％の原因となっている。いくつかの機構が、肝組織を誘発させ又は損傷プロセスを悪化させる原因となっている。多くの化学物質が、ミトコンドリア、すなわち、エネルギーを生成する細胞内オルガネラに損傷を与える。その機能不全は、肝細胞を傷つける過剰な量の酸化剤を放出する。ＣＹＰ２Ｅ１等のチトクロームＰ−４５０システムにおけるいくつかの酵素の活性化は、酸化的ストレスをも引き起こす。肝細胞及び胆管細胞に対する損傷は、肝組織内部の胆汁酸を蓄積させてしまう。これは更なる肝組織障害を促進する。Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞、脂肪摂取星細胞及び白血球（すなわち、好中球及び単核細胞）等の非実質細胞も、機構に関与している。
【０１６２】
有害な薬物反応は、（本質的又は薬理学的）タイプＡ又は（特異体質性の）タイプＢに分類される。タイプＡの薬物反応はすべての毒性の８０％を占める。薬理学的（タイプＡ）肝組織毒性を有する薬物又は毒素は、予測可能な投与量応答曲線を有する（高濃度はより多くの肝組織障害を生じさせる）ものであり、肝組織を直接的に破壊し又は代謝プロセスを阻止する等、毒性の機構を良好に特性化するものである。アセトアミノフェンの過剰投与の場合のように、このタイプの損傷は、毒性の閾値に達した後にすぐ生じる。物質が感受性を有する個体において、物質が予測できない肝毒性を生じさせるとき、特異体質性の損傷は、突然生ずる。当該個体は、投与量に関連しておらず、不定量の潜伏期間を有する。このタイプの損傷は、明確な投与量応答又は経時的相関を有しておらず、多くの場合、予測モデルを有していない。ＦＤＡ承認プロセスの一部が完了された厳格な臨床試験の後であっても、特異体質性の肝毒性によって、いくつかの薬物が市場から回収された。Ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ（Ｒｅｚｕｌｉｎ登録商標）とｔｒｏｖａｆｌｏｘａｃｉｎ（Ｔｒｏｖａｎ登録商標）は特異体質性の肝毒素に関する２つの主要例である。抗凝血物質ｘｉｍｅｌａｇａｔｒａｎ（Ｅｘａｎｔａ登録商標）の開発は肝組織の損傷のために中止された。
【０１６３】
リファンピンは、リボ核酸の合成を妨げるリファマイシンの形態から派生した半合成抗生物質であり、細菌性疾患とウイルス疾患を治療するのに使用される。リファンピシンは、結核と癩病を含むマイコバクテリウム属感染症を治療するのに通常使用され、また、フシジン酸と共同して、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）の治療において役割を有する。また、それは髄膜炎菌（髄膜炎菌性）感染症に対する予防的治療において使用される。
【０１６４】
リファンピシンは、ベータサブユニットに結合することによって、バクテリア細胞内のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを抑制するので、したがって、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）とタンパク質への後続の変換の転写を防止する。親脂性はそれを結核の脳膜炎形成を処置する良好な候補にせしめ、当該脳膜炎形成には、中枢神経系への分配及び脳血液関門を介した浸透を必要とする。
【０１６５】
しかしながら、リファンピンは、主として薬物の肝毒性に関連した副作用を示し、リファンピシンを受け入れる患者は、多くの場合、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ：ａｓｐａｒｔａｔｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を含む肝臓機能試験を行う。リファンピシンは、肝臓チトクロームＰ４５０酵素群（ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ３Ａ４等）の強力な誘発物質であり、この酵素システムを介して肝組織によって遊離される多くの薬の代謝を増大せしめるであろう。これにより、ホルモン避妊の低減効果等、多くの薬物相互作用が生ずる。例えば、リファンピンは、副腎ホルモン、甲状腺ホルモン濃度及びビタミンＤを含む内因性基板の代謝を高めることができる。
【０１６６】
図４は、リファンピンによって誘起された一次肝細胞の毒性を調べる無標識バイオセンサ細胞分析を使用して取得された結果をまとめている。図４Ａは、６２５ｎＭから４００００ｎＭまでの範囲の異なる投与量のリファンピシンの暴露に対するバイオセンササンドウィッチ培養システムを用いて培養された原発生肝細胞のリアルタイム動的ＤＭＲ応答を示している。調べられたすべての投与量において、リファンピンは、局所的な生物質量密度において顕著な損失を生じせしめず、顕著なＤＭＲ信号を全く生じせしめなかった。これによれば、リファンピンによって誘起された肝細胞の損傷は、もしあるならば、バイオセンサ細胞分析によって直接的に検出され得ないことを示している。
【０１６７】
興味深いことに、比較的短い期間（〜１‐４時間）、異なる投与量のリファンピンを用いた原発生肝細胞の前処理の後に、図４Ｂに示されているように、原発生肝細胞は、リファンピンの投与量に依存して、１ｍＭのＨ2Ｏ2の暴露に対して敏感になった。１ｍＭのＨ2Ｏ2は、顕著なＤＭＲ信号を全く生じせしめなかった（図３ａ）いかなる前処理も行っていないものと比較すると、原発生肝細胞は、１ｍＭのＨ2Ｏ2の暴露に応答して、リファンピンの投与量に依存したＮ−ＤＭＲを示した。図４Ａ及び４Ｂに示されているように、リファンピンの濃度がより高くなるにつれて、より大であり且つより高速なＨ2Ｏ2誘起のＮ−ＤＭＲ信号が生じた。これは、調べられた高投与量リファンピンは、脂質分子の酸化が増大することに起因して、恐らく原発生肝細胞に対して損傷を与えること、及び、Ｈ2Ｏ2が、リファンピン誘起の肝細胞毒性を増幅する薬理学的プルーブとして使用され得ることを示している。
【０１６８】
Ｅ．実施例４  過酸化水素は、バイオセンササンドイッチシステムに培養された原発生肝細胞に作用するアセトアミノフェンの毒性をも増幅する
化学物質は、様々な広範の臨床的及び病理学的な肝臓障害を生成する。生化学的マーカ（すなわち、アラニン転移酵素（ＡＬＴ）、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）及びビリルビン）は、肝障害を示すのに多くの場合使用される。肝障害は、高ＡＬＴ又はＡＬＰと関連付けられている場合、（ａ）正常レベルの上限（ＵＬＮ）の３倍より大なるＡＬＴレベル、（ｂ）ＵＬＮの２倍より大なるＡＬＴレベル、又は（ｃ）ＵＬＮの２倍より大なる総ビリルビンレベルにおける上昇として定義される。肝障害は、肝細胞タイプ（支配的な初期のアラニントランスフェラーゼの上昇）及び胆汁うっ滞タイプ（初期のアルカリホスファターゼの上昇）に、さらに特性化される。多くの薬草の自然発生肝毒素、Ｊｉｎ  Ｂｕ  Ｈｕａｎ及びＭａ−ｈｕａｎ等の漢方薬を含む代替的治療薬も、高投与量において肝損傷を生じせしめ得る。
【０１６９】
アセトアミノフェン（タイレノール登録商標というブランド名でも知られるパラセタモール）、すなわち、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は、５０年間にもわたり疼痛と発熱の治療に広く使用され、これら徴候に関して有効な鎮静を提供する。治療投与量にて使用されるときには、それは安全である。しかしながら、（意図的な若しくは偶発的な）過剰投与は、重大であり且つ致命的でさえある肝毒性を生じせしめ得る。アセトアミノフェンの過剰投与は、薬物誘発性肝臓疾患と世界中の急性肝不全を引き起こす最も一般的な原因である。米国において、アセトアミノフェンは、急性肝不全のすべての成人症例のうちの５０％までの原因となっている。
【０１７０】
アセトアミノフェンの過剰投与は、深刻な肝損傷、小葉中心性細胞損傷及び実験動物と人間の肝不全さえをも生じせしめ得る。毒性は、反応性代謝物、おそらくはＮ−アセチルベンゾキノンイミン（ＮＡＰＱＩ：Ｎ−ａｃｅｔｙｌｂｅｎｚｏｑｕｉｎｏｎｅ  ｉｍｉｎｅ）又は利用可能なグルタチオンを超えたそれに類似した中間介在物、の形成を必要とする。グルタチオンの消費の後に、ＮＡＰＱＩは、ミトコンドリア損傷、ＡＴＰ枯渇及びミトコンドリア酸化ストレスを含むさまざまな細胞機能不全を引き起こす多くの細胞内ターゲットタンパク質に共有結合し得る。近年、ますます多くの著者が、アポプトーシスはＡＡＰによって誘起された肝不全において主要な役割を果たすと仮定している。肝組織において、４０％以上の肝細胞がアポプトーシスにより実際に死滅することが、仮定された。過剰投与後の生体内でのアポトーシス細胞死に関する明確な実験的証拠は、ＤＮＡ断片化及びＤＮＡのラダリング、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの分裂、ＤＮＡ鎖の損傷及び個々の肝細胞のアポプトーシスに関する形態学的証拠を含んだ。
【０１７１】
肝組織において、アセトアミノフェンは、非毒性共役代謝体アセトアミノフェングルクロニド及びアセトアミノフェン硫酸に代謝される。これらの解毒経路は、肝臓はアセトアミノフェン代謝の９０％をわたって占める。通常の条件下において、アセトアミノフェンの１０％未満が、チトクロームＰ４５０酵素（主としてＣＹＰ２Ｅ１，１Ａ２及び３Ａ４）によって代謝されて、Ｎ‐アセチル‐ｐ‐ベンゾキノン（ＮＡＰＱＩ）と称される毒性の代謝中間体が生成される。形成された少量のＮＡＰＱＩが、通常、細胞内のグルタチオンによってさらに解毒される。薬物による高投与（意図的又は偶然的な過剰投与等）及び／又は低細胞内グルタチオンの高蓄積（例えば、絶食又はアルコール飲用後の）の場合、ＮＡＰＱＩは、細胞性タンパク質のチオール基の共有結合を変更し得る。従来の考えは、かかる共有結合タンパク質の付加体は肝細胞又は肝細胞損傷の原因となるというものである。しかしながら、ＮＡＰＱＩの生成は、必要とされているものの、アセトアミノフェンによって誘起された肝臓の損傷を説明するには十分でないことが示された。アセトアミノフェンのｍ−ヒドロキシ異性体、３'−ヒドロキシアセトアニリドは、共有結合の量がほとんど同等であるものの、ネズミにおいては肝毒性でない。３'−ヒドロキシアセトアニリドの共有結合も、小葉中心性肝細胞、すなわち、肝毒性異性体アセトアミノフェンによるその後壊死と共有結合の領域において位置づけられた。これら研究及び他の研究が、共有結合の量が、最終的な毒性結果の決定因子ではないという可能性を示唆している。
【０１７２】
最近、ゲノムアプローチ、メタボノミクスアプローチ及びプロテオームアプローチムが、ヒト肝細胞キメラマウスモデルにおいて適用されて、アセトアミノフェンによって誘起された毒性の機構と及び経路が調査されてきた。この動物モデルにおいて、ヒト肝細胞は、遺伝子導入マウスに移植された。キメラマウスにおける人間の肝組織とのマウスの肝組織の置換率は、７５−９５％と見積もられ、薬物に対する人間の特定の代謝反応が観測された。アセトアミノフェンで処理された動物において、脂質代謝、脂肪酸輸送及び糖分解における攪乱は、脂肪酸のβ酸化経路の抑圧を示し、アセチルＣｏＡの喪失を引き起こした。ペルオキシレドキシン１及びカタラーゼ糖の酸化ストレス性タンパク質における攪乱が観測された。これらの調査結果は、アセトアミノフェンを用いて処理された通常のネズミで観測されたものと一致している。これらデータは、細胞内ミトコンドリア性経路と酸化ストレス経路の双方がアセトアミノフェンの処理によって攪乱されたことを示している。
【０１７３】
親のアセトアミノフェン又はＮＡＰＱＩ代謝物がミトコンドリアエネルギー状態及び酸化ストレスについて観察された変化の原因となっているかどうかという問題はまだ残っている。新たに単離したマウス肝細胞の生体外処理から得られたデータは、機構的洞察を提供した。このイン・ビトロモデルにおいて、アセトアミノフェンによって誘起された細胞の死は、２つの段階、代謝段階及び酸化段階において生ずる。
代謝フェーズは、ＮＡＰＱＩの形成、グルタチオンの喪失及びタンパク質の共有結合とともに生じる。酸化フェーズは、高酸化ストレス、ミトコンドリア膜電位の損失、ミトコンドリアの透過性変化及び生じる毒性とともに生じる。第２のフェーズにおけるアセトアミノフェンの添加が毒性を変更しなかったので、酸化フェーズは、アセトアミノフェン又はＮＡＰＱＩ代謝物の一方の存在を必要としない。この研究は、アセトアミノフェン及び３'−ヒドロキシアセトアニリドの双方が同様の代謝フェーズを先導し得るものの、アセトアミノフェンが、少なくともマウス肝細胞において酸化フェーズに進行する能力において固有であるという興味深い可能性を示唆している。２つの異性化学物質を使用する更なる経路研究及びマウス肝細胞モデルは、引き金となるイベントにおいて差を描写することが必要とされ、代謝フェーズを酸化フェーズに至らしめる。少量の肝組織における一酸化窒素（ＮＯ）の配送は、胆汁酸ウルソデオキシコール酸の新規派生物を介して、アセトアミノフェンによって誘起された損傷から肝細胞が大幅に保護される結果となったということが最近報告されている。ＮＯは、いくつかの機構を介して、いくつかの炎症誘発サイトカインの合成の抑制を含むこれらの有益な作用を生成するようである。したがって、アセトアミノフェンは、単一の経路（すなわち、シトクロムＰ４５０による代謝活性）から代謝フェーズ、酸化フェーズ、先天性免疫システムのいくつかの細胞質分裂及びサイトカイン反応の調整で重要なストレスキナーゼを伴う複数の経路への理解から始まる十分研究された薬物の典型例である。現在、生体外及び生体内の集合的証拠は、アセトアミノフェンによって誘起された肝細胞の損傷の複数段階又はステップがアセトアミノフェン処理による肝組織損傷生物マーカの遅発と一致することを示している。
【０１７４】
図５は、アセトアミノフェンによって誘起された一次肝細胞の毒性を調べる無標識バイオセンサ細胞分析を使用して取得された結果をまとめている。図５Ａは、２．５μＭから２．５ｍＭまでの範囲の異なる投与量のアセトアミノフェンの暴露に対するバイオセンササンドウィッチ培養システムを用いて培養された原発生肝細胞のリアルタイム動的ＤＭＲ応答を示している。調べられたすべての投与量において、アセトアミノフェンは、顕著なＤＭＲ信号を全く生じせしめなかった。これによれば、リファンピンと同様に、アセトアミノフェンによって誘起された肝細胞の損傷は、もしあるならば、バイオセンサ細胞分析によって直接的に検出され得ないことを示している。
【０１７５】
興味深いことに、比較的短い期間（〜１‐４時間）、異なる投与量のアセトアミノフェンを用いた原発生肝細胞の前処理の後に、原発生肝細胞は、図５Ｂに示されているように、アセトアミノフェンの投与量に大きく依存して、１ｍＭのＨ2Ｏ2の暴露に対して敏感になった。１ｍＭのＨ2Ｏ2は、顕著なＤＭＲ信号を全く生じせしめなかった（図３ａ）いかなる前処理も行っていないものと比較すると、原発生肝細胞は、高投与量のアセトアミノフェンで処理された後に、１ｍＭのＨ2Ｏ2の暴露に対して応答し、Ｎ−ＤＭＲを示した。アセトアミノフェンの濃度がより高くなるにつれて、Ｈ2Ｏ2誘起のＮ−ＤＭＲ信号はより大きくなり、Ｎ−ＤＭＲのオンセットタイムがより速くなる。これは、調べられた高投与量のアセトアミノフェンは原発生肝細胞の損傷を生じせしめること及びＨ2Ｏ2がアセトアミノフェン誘起の肝細胞毒性を増幅する薬理学的プルーブとして使用され得ることを示している。
【０１７６】
Ｆ．実施例５  過酸化水素は、バイオセンササンドイッチシステムに培養された原発生肝細胞に作用するＳＢ２０３５８０の毒性を増幅する
ＳＢ２０３５８０及びＳＢ−２０２１９０は、人間の単球におけるインターロイキン−１（ＩＬ−１）及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の生成を阻止し得る有効なｐ３８ＭＡＰＫ抑制物質である・これまで、２０の化合物が、市場に出す低分子抑制物質を用いることなく、臨床試験にかけられた。製造中止されたｐ３８抑制物質の大部分は、安全に関する事項、最も顕著なのは肝酵素増加及び皮疹に起因して、不合格となった。ｐ３８と報告された有害事象とのリンクに関して、比較的ほとんど知られていない。
【０１７７】
ｐ３８ストレスによって活性化されたタンパク質キナーゼは、細胞成長、細胞分化、増殖、アポプトーシス並びに炎症及びストレスに対する応答を調節することに関わっている。タンパク質キナーゼのｐ３８ファミリーは、細胞ストレス、Ｔｏｌｌ様受容体リガンド及びＩＬ−１に応答して、複数のアップストリームキナーゼ、ＭＫＫ３，ＭＫＫ６，およびＭＫＫ４によって調節される。異なる生体組織発現パターンを有する４つの高度に関連したｐ３８アイソフォーム（α、β、δ及びγ）がある。ｐ３８α及びβは、ヒトリンパ性組織、白血球、膵及び肝臓を含むほとんどの生体組織において発現せしめられ、一方、γ及びδは、骨格筋、心臓肺、胸腺、及び精巣を含むより限られた分布を有する。
【０１７８】
ヒト血漿における肝酵素増加は、多くのｐ３８ＭＡＰＫ抑制物質に対して報告されている。継続研究は、細胞外基質の生成、成長の調節、細胞の容積調節、イオン及び胆汁酸塩の輸送、糖新生及び脂質生成を含む多数の肝臓細胞機能におけるｐ３８の役割を示した。ｐ３８のこれらの機能的役割がｐ３８抑制物質を用いたヒト血漿における肝酵素の増加に機械学的にリンクされるかどうかは、未決問題である。
【０１７９】
肝線維形成は、慢性的刺激に応じて回復する過度の損傷の一部として、細胞外基質蛋白質の堆積によって特性化される。この応答の一部として、ｐ３８からの信号伝達及び焦点的密着性、キナーゼホスファチジルイノシトール３ｋｉｎａｓｅ−Ａｋｔ−ｐ７０Ｓ６キナーゼ（ＦＡＫ−ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ−Ｓ６Ｋ）カスケードは、増殖、細胞周期進行並びに活性肝星細胞におけるコラーゲン遺伝子発現を調節する。ｐ３８信号伝達は、転写活性化及びｍＲＮＡの安定性を増加させることによる１コラーゲン遺伝子発現を調節することが見出され、これは、タイプＩコラーゲンの合成増加及び堆積増加に貢献する。
【０１８０】
ｐ３８は、ＳＢ２０３５８０を用いた処理を介して示されるように、成長調節、ラット肝細胞を成長させる生育阻害効果の調節において役割を果たすと例証された。ＰＧＣ−１及びペルオキシソーム増殖薬（ＰＰＡＲ）は、ｐ３８のダウンストリームターゲットである。ｐ３８は、Ｓｅｒ６，１２及び／又は２１のＰＰＡＲのＡ／Ｂドメインをりん酸化する。ＰＰＡＲは、ペルオキシゾーム増殖因子に対する応答に関連する遺伝子を直接的に調節し、細胞周期調節タンパク質の発現、細胞の増殖及びアポプトーシスを変更する。したがって、ＰＰＡＲを介したｐ３８による残存する信号伝達は、ｐ３８の抑制と、壊死性の及び／又はアポトーシス肝臓障害とのリンクを提供し得る。
【０１８１】
増殖性変化に加えて、肝再生及び胆汁うっ滞は、ギャップ及び密着接合の発現における適応変化に関連づけられている。部分的な肝切除に続いて肝細胞の再生の間、ギャップ及び密着接合の構成における動的変化は、ｐ３８によって部分的に調節され且つ細胞成長には依存しなかった。ギャップ接合蛋白質、Ｃｘ３２，及び密着接合タンパク質、ｃｌａｕｄｉｎ−１の発現及び機能における変化が、ＳＢ２０３５８０処理の後で、観測された。
【０１８２】
肝細胞を調節する障害は、アルコール、虚血／再潅流及び臓器保存から生じる肝細胞の損傷に関連づけられている。肝細胞において、非選択性陽イオンチャネルは細胞容積を維持する際に重要な役割を果たし、その多くがｐ３８の影響下にあると例証されている。低張性暴露は、細胞の容積を増加せしめ、ＨＴＣネズミ肝細胞細胞株にけるｐ３８活性を増大せしめた。構成ｐ３８活性は、細胞の容積を維持するのに必要とされる低Ｎａ＋透過性を維持することに関係していることが例証されている。Ｎａ＋電流は、ＳＢ２０３５８０を用いたｐ３８の活性を抑制することによって、増大せしめられ得た。潅流ラットの肝細胞において、ＳＢ２０３５８０を用いた処理は、細胞容積調節の調整を介して低浸透圧性の暴露に応答したｐ３８の役割を示すために、使用された。ｐ３８の膨張誘起の活性化は、肝組織における容積調節Ｋ（＋）流出に関わっている。調整イオン輸送における更なる役割はＳＢ２０２１９０と共に解明され、ＳＢ２０２１９０の存在下で精製された肝組織ベシクルは、タンパク質キナーゼＣ信号伝達の活性化の後、イントラ小胞性ナトリウム（＋）と交換にＭｇ（２＋）を蓄積する能力を喪失したことを示している。
【０１８３】
イオン輸送における役割を補足しつつ、ｐ３８は間接的に胆汁酸塩の移動をも間接的に調節する。胆汁酸塩輸出ポンプ（ＢＳＥＰ：ｂｉｌｅ  ｓａｌｔ  ｅｘｐｏｒｔ  ｐｕｍｐ）をゴルジから小管膜まで往還せしめることは、ラット肝細胞におけるｐ３８信号伝達を介して調節されると示されている。その結果、ｔａｕｒｏｕｒｓｏｄｅｓｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ（ＴＵＤＣ）によって誘起された胆汁分泌は、ｐ３８の二重調節と細胞外で調節されたキナーゼ（ＥＲＫ）の調整下にあると例証された。ＳＢ２０２１９０は、潅流ラット肝臓におけるタウロコール酸塩排泄に対するＴＵＤＣの刺激効果を無効化した。
【０１８４】
最終的に、ｐ３８は、肝細胞代謝のリポ−及びグルコース新生の態様の双方を調節する。肝臓の脂質生成は、過剰な炭水化物を脂肪酸に変換する主要なルートであり、調節異常の際に、脂肪性肝組織を生じせしめる。このプロセスは、インスリン及びグルカゴンによって同格的に調節され、刺激の役割及び抑制の役割を果たす。ｐ３８の抑制に続いて、肝組織内の血漿トリグリセリド及び中性脂肪の蓄積のレベルが、ネズミにおいて上昇せしめられた。一次肝細胞におけるｐ３８の抑制に続いて、主要な脂質生成遺伝子（ＳＲＥＢＰ−１，脂肪酸シンターゼ、ヒドロキシル−３−メチルグルタリル補酵素Ａレダクターゼ、ファルネシルピロリン酸シンターゼ、およびチトクロームＰ−４５０−５１）の発現が、増加した。ｐ３８活性は、インシュリンによって誘起された脂質生成遺伝子を抑制すると示された。インスリンによって誘起されたＰＧＣ−１β遺伝子、すなわち、ＳＲＥＢＰ−１ｃの主要なコアクチベータの発現は、ｐ３８の抑制によって高められ、ｐ３８の活性により抑制された。
【０１８５】
同様に、ｐ３８は、遊離脂肪酸によって誘起されたグルコース新生遺伝子の転写において重要な信号伝達要素として特定されている。ｐ３８活性は、中間鎖及び長鎖脂肪酸によって誘起されたＰＧＣ−１及びＣＲＥＢ（既知のグルコース新生レギュレータ）の転写に必要であると示された。ｐ３８の抑制は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ及びグルコース−６−ホスファターゼを含む、主要なグルコース新生遺伝子に伴う肝臓におけるグルコース新生を抑制した。その上、ｐ３８抑制は、ＰＧＣ−１の転写及びＣＲＥＢのリン酸化を防止した。
【０１８６】
図６は、ＳＢ２０３５８０によって誘起された一次肝細胞の毒性を調べる無標識バイオセンサ細胞分析を使用して取得された結果をまとめている。図６Ａは、６２５ナノモルから１００００ナノモルまでの範囲の異なる投与量のアセトアミノフェンの暴露に対する、バイオセンササンドウィッチ培養システムを用いて培養された原発生肝細胞のリアルタイム動的ＤＭＲ応答を示している。調べられたすべての投与量において、ＳＢ２０３５８０は、顕著なＤＭＲ信号を全く生じなかった。これによれば、リファンピンと同様に、ＳＢ２０３５８０によって誘起された肝細胞の損傷は、もしあればバイオセンサ細胞分析によって直接的に検出され得ないことが示された。
【０１８７】
興味深いことに、比較的短い期間（〜１‐４時間）、異なる投与量のＳＢ２０３５８０を用いた原発生肝細胞の前処理の後に、原発生肝細胞は、ＳＢ２０３５８０の投与量に大きく依存して、１ｍＭのＨ2Ｏ2の暴露に対して敏感になった。１ｍＭのＨ2Ｏ2は、顕著なＤＭＲ信号を全く生じせしめなかった（図３ａ）いかなる前処理も行っていないものと比較すると、ＳＢ２０３５８０の高投与量を用いた処理後の原発生肝細胞は、１ｍＭのＨ2Ｏ2の暴露に応答して、Ｎ−ＤＭＲを示した。ＳＢ２０３５８０の濃度がより高くなるにつれて、Ｈ2Ｏ2誘起のＮ−ＤＭＲ信号はより大きくなり、Ｎ−ＤＭＲのオンセットタイムがより速くなる。これは、調べられた高投与量のＳＢ２０３５８０が原発生肝細胞の損傷を生じせしめること及びＨ2Ｏ2がＳＢ２０３５８０誘起の肝細胞毒性を増幅する薬理学的プルーブとして使用され得ることを示している。
【０１８８】
まとめると、３つの異なるクラスの化合物、リファンピン、アセトアミノフェン及びＳＢ２０３５８０は、投与量に依存したＨ2Ｏ2誘起のアポトーシスに対して、バイオセンササンドウィッチ培養システム内で培養された原発生肝細胞の感受性を増加せしめる。これは、これら毒性化合物を用いて投与された後、肝細胞の高酸化レベルに帰属して可能である肝細胞毒性を生じせしめるこれら化合物の共通の機構を示している。これら研究は、本発明は、いかなる化合物によっても誘起された細胞毒性、特に肝細胞を増幅する方法を開示しているだけでなく、化合物により誘起された肝細胞毒性の細胞機構の研究をも可能にせしめることを示している。
【０１８９】
Ｇ．実施例６
低酸素状態又は過酸化水素の曝露によって誘起された損傷に対する細胞の感受性を変更する化合物をスクリーニングし且つターゲットを特定する
低酸素血症は、体内の酸素欠乏である。低酸素血症は、脈管形成及び血栓症等の多用な生物プロセスの重要な調節刺激である。動脈硬化性プラークの発現は、血小板における新生血管形成に関連している。新生内膜脈管形成に対しては、容器壁の低酸素血症は、有力な刺激であると考えられている。これは、新生血管形成は、厚い血管内膜を介して不十分なかん流に応答して発現するからである。低酸素血症によって誘起された遺伝子発現を制御する分子の機構が精力的に研究されてきた。低酸素下において、様々な細胞は、例えば、プラスミノーゲン活性化抑制因子−１（ＰＡＩ−１）及び血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）等、多くの血管作用薬を生成する。これら遺伝子の発現は、低酸素誘導因子‐１（ＨＩＦ−１）、そのレベルは酸素濃度によってしっかりと調節される転写因子によって調節される。正常酸素圧条件下において、ＨＩＦ−１はユビキチン化され、プロテアソームに低減される。一旦、酸素濃度が低減されると、ＨＩＦ−１はユビキチン化／劣化を逃れる。そのタンパク質レベルは十分になり、ヘテロ二量体パートナーＨＩＦ−１βと伴に核に転移し、そして、それは低酸素血症反応性要素に結合して、その結果、低酸素血症感受性遺伝子を活性化する。
【０１９０】
過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）やスーパオキシドアニオン（Ｏ2-）等の反応性酸素種は、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）増殖の誘起、パラクリン因子の開放／活性化、及び、内皮機能不全を含む心臓血管システムの多様的病態生理学的応答に関係した。生体内研究により例証されたＲＯＳは、人間の動脈硬化性プラークにおいて生成された。
【０１９１】
図７は、トロンビンを用いて前処理した場合と前処理していない場合における、２ｍＭのＨ2Ｏ2を暴露した場合のヒト肺癌細胞系Ａ５４９のリアルタイム動特性を示している。Ａ５４９がトロンビンを用いて前処理されなかったとき、細胞は、４つのフェーズからなる複雑なＤＭＲ信号により応答した。当該４つのフェーズとは、初期の高信号Ｐ−ＤＭＲと、それに続いて、急激に低減した信号（Ｎ−ＤＭＲ）、わずかに増加する信号又は約１時間継続するプラトーＤＭＲ、及び持続的な第２のＮ−ＤＭＲ信号である。第２のＮ−ＤＭＲ信号の大なる振幅は、バイオセンサーの検出ゾーン内の局所的な生物体密度の大幅な損失を示しており、これは、バイオセンサ表面に培養された細胞の低部からの細胞体の放出を生じせしめる細胞アポトーシスを示している。しかしながら、トロンビンの濃度が増大するのにつれ、初期の急激な応答は部分的に抑圧されるようになり、プラトー相は高くなった。第２のＮ−ＤＭＲ事象の開始時間は少なくとも１５分、遅延される。これら結果が提案することは、トロンビンはＨ2Ｏ2誘起のＡ５４９アポプトーシスに関して保護的である。急激なＰ−ＤＭＲ事象の振幅に基づいて、かかる応答を変化せしめるトロンビン濃度は、〜４ユニット／ｍｌであると推定された。この値は、内因性プロテアーゼ活性化受容体のサブタイプ１（ＰＡＲ１）を活性化する（データは図示せず）ＥＣ５０に対応し、ＰＡＲ１の活性化がＨ2Ｏ2誘起のＡ５４９アポプトーシスに与えるトロンビンの効果について重要な役割を果たしていることを示している。
【０１９２】
対照的に、Ａ４３１細胞における内因性ベータ２−アドレナリン受容体の活性化は、バイオセンサ表面に培養されたＡ４３１細胞のＨ2Ｏ2誘起アポトーシスを可能にせしめた（図示せず）。本発明が、保護的であり得るし又はＨ2Ｏ2によって誘起された細胞アポプトーシスを可能にせしめ得る化合物のスクリーニングを可能にし、活性化が保護的であり又はＨ2Ｏ2によって誘起された細胞アポプトーシスを可能にせしめ得るターゲットを特定することを可能にすることを、これら結果は、示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年7月28日(2011.7.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝細胞に対する分子の毒性を間接的に特性化する方法であって、
前記方法は、
ａ．表面に固定せしめられた肝細胞を含むバイオセンサを設けるステップと、
ｂ．前記固定せしめられた肝細胞を分子に接触せしめるステップと、
ｃ．当該分子により処理され固定せしめられた肝細胞を増幅マーカに接触せしめるステップと、
ｄ．前記分子が存在する場合と存在しない場合とにおける前記増幅マーカによって誘起された前記肝細胞のバイオセンサ応答を検出し且つ比較するステップと、を含むこと特徴とする方法。
【請求項２】
肝細胞に対する分子の毒性を直接的に特性化する方法であって、
前記方法は、
ａ．表面に固定された生細胞を含むバイオセンサを設けるステップと、
ｂ．前記固定せしめられた肝細胞を分子に接触せしめるステップと、
ｃ．肝毒素が存在する場合と存在しない場合における前記分子によって誘起された前記肝細胞のバイオセンサ応答を検出し且つ比較するステップと、を含み、
前記バイオセンサを設けるステップにおいて、前記固定せしめられた肝細胞は、前記バイオセンサの表面に被覆された第１の細胞外基質物質のナノスケールのクラスタ又はマイクロスケールクラスタと、第２の細胞外基質物質のオーバレイとの間に固定されており、前記固定せしめられた肝細胞は自身の代謝機能の少なくとも一部を維持することを特徴とする方法。
【請求項３】
代謝的に活性な肝細胞をバイオセンサに培養する方法であって、
前記方法は、
ａ．第１の細胞外基質物質を含む第１の水溶液をバイオセンサの前記表面に塗布するステップと、
ｂ．前記第１の水溶液を乾燥せしめるステップと、
ｃ．肝細胞を、前記第１の細胞外基質物質被覆バイオセンサ表面に培養して、前記肝細胞を固定せしめるステップと、
ｄ．第２の細胞外基質物質を含む第２の水溶液を前記固定された肝細胞に塗布するステップと、を含み、
前記ｂ．において、前記乾燥せしめるステップは前記第１の細胞外基質物質のスケールクラスタ又はマイクロスケールクラスタを含む前記表面に皮膜を生じせしめ、
前記ｄ．において、前記第２の細胞外基質物質は、前記バイオセンサの前記表面上に前記肝細胞を有するオーバレイを形成することを特徴とする方法。
【請求項４】
前記第１の細胞外基質物質はコラーゲンＩを含み、
前記第２の細胞外基質物質はマトリゲルを含み、
前記増幅マーカは過酸化水素を含むことを特徴とする請求項１乃至９に記載の方法。
【請求項５】
バイオセンサ肝細胞培養システムであって、
前記システムは、
ａ．第１の細胞外基質物質のナノスケールクラスタ又はマイクロスケールクラスタにより被覆されたバイオセンサ表面と、
ｂ．前記第１の細胞外基質物質被覆バイオセンサ表面に固定せしめられた肝細胞と、
ｃ．前記固定せしめられた肝細胞が自身の代謝機能の少なくとも一部を維持するように第２の細胞外基質物質を含むオーバレイと、を含み、
前記固定せしめられた肝細胞は、原発生肝細胞、形質転換肝細胞、不死化肝細胞又はそれらの組合せのうち少なくとも１つを含むことを特徴とするシステム。
【国際調査報告】
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2012510059.tif 000014