【手続補正書】
【提出日】令和2年2月25日(2020.2.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能的な内因性ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）及び／又はグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）を発現しないヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞株。
【請求項２】
第１の異種核酸配列で安定に又は一過性にトランスフェクトされ、任意選択で、第２の異種核酸配列で安定に又は一過性にトランスフェクトされた、請求項１に記載のＨＥＫ細胞株。
【請求項３】
第１の異種核酸配列及び第１の選択可能なマーカーで安定に又は一過性にトランスフェクトされ、任意選択で、第２の異種核酸配列及び第２の選択可能なマーカーで安定に又は一過性にトランスフェクトされた、請求項１に記載のＨＥＫ細胞株。
【請求項４】
前記第１の異種核酸配列が、治療用タンパク質又はポリヌクレオチド配列をコードし、任意選択の第２の異種核酸配列が、治療用タンパク質又はポリヌクレオチド配列をコードする、請求項２又は３に記載のＨＥＫ細胞株。
【請求項５】
前記第１の又は第２の選択可能なマーカーが、抗生物質に対する耐性を提供しない、請求項３に記載のＨＥＫ細胞株。
【請求項６】
前記第１の又は第２の選択可能なマーカーが、前記第１の及び／又は第２の異種核酸配列を増幅する手段を提供する、請求項３に記載のＨＥＫ細胞株。
【請求項７】
前記第１の又は第２の選択可能なマーカーが、ＤＨＦＲ機能を有するタンパク質をコードする核酸を含む、請求項３に記載のＨＥＫ細胞株。
【請求項８】
前記第１の又は第２の選択可能なマーカーが、ＧＳ機能を有するタンパク質をコードする核酸を含む、請求項３に記載のＨＥＫ細胞株。
【請求項９】
前記第１の異種核酸配列が第１のベクターを含み、前記任意選択の第２の異種核酸配列が第２のベクターを含む、請求項２〜８のいずれか一項に記載のＨＥＫ細胞株。
【請求項１０】
前記第１のベクターが第１のウイルスベクターを含み、任意選択の第２のベクターが第２のウイルスベクターを含む、請求項９に記載のＨＥＫ細胞株。
【請求項１１】
前記第１の又は第２のウイルスベクターが、ＡＡＶベクターゲノムを含む、請求項９に記載のＨＥＫ細胞株。
【請求項１２】
前記ＡＡＶベクターゲノムが、前記異種核酸配列の５’及び／又は３’末端に隣接する１つ又は２つのＡＡＶのＩＴＲを含む、請求項１１に記載のＨＥＫ細胞株。
【請求項１３】
前記ＨＥＫ細胞株中における前記ＡＡＶベクターゲノムのコピー数が、細胞１つ当たり１〜５コピー、細胞１つ当たり５〜１０コピー、１０〜５０コピー／細胞、細胞１つ当たり５０〜１００コピー、細胞１つ当たり１００〜２５０コピー、細胞１つ当たり２５０〜５００コピー、細胞１つ当たり５００〜１，０００コピー、細胞１つ当たり１，０００〜２，０００コピー、又は細胞１つ当たり約２，０００、３，０００、４，０００若しくは５，０００コピーであるか若しくはそれよりも多い、任意選択で、コピー数は、多くの継代、例えば、少なくとも５又はそれを超えて、１０、１５又はそれを超える継代にわたって安定であると思われる、請求項３〜１２のいずれか一項に記載のＨＥＫ細胞株。
【請求項１４】
前記ＨＥＫ細胞株中における前記ＡＡＶベクターゲノムのコピー数が、細胞１つ当たり少なくとも１，０００コピーであり、前記ｒＡＡＶベクター粒子の収率が、ＨＥＫ細胞株のローラーボトルから、任意選択で少なくとも１×１０８ｖｇ／ｍｌ、又は少なくとも１×１０９ｖｇ／ｍｌ、又は少なくとも１×１０１０ｖｇ／ｍｌ、又は少なくとも１×１０１１ｖｇ／ｍｌ又は少なくとも２×１０１１ｖｇ／ｍｌである、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のＨＥＫ細胞株。
【請求項１５】
ＡＡＶのｒｅｐ及び／又はｃａｐ配列をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＨＥＫ細胞株。
【請求項１６】
ＨＥＫ２９３である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のＨＥＫ細胞株。
【請求項１７】
培養培地又は成長培地中の、又は長期貯蔵に適当な培地中の、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＨＥＫ細胞株。
【請求項１８】
メトトレキセート（ＭＴＸ）及び／又はメチオニンスルホキサミン（ＭＳＸ）を含む培養培地又は成長中の、請求項７〜１７のいずれか一項に記載のＨＥＫ細胞株。
【請求項１９】
前記異種核酸配列をパッケージングされたｒＡＡＶベクター粒子を産生する、請求項５〜１８のいずれか一項に記載のＨＥＫ細胞株。
【請求項２０】
前記ｒＡＡＶベクター粒子が、機能的な内因性ＤＨＦＲ及び／又はＧＳを発現し、前記異種核酸配列を有するＡＡＶベクターゲノムで一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞により産生される量を超える量で、産生される、請求項１９に記載のＨＥＫ細胞株。
【請求項２１】
産生された前記ＡＡＶベクター粒子が、ＡＡＶの空のカプシド及び／又は機能的な内因性ＤＨＦＲ及び／又はＧＳを発現しており、前記異種核酸配列を有するｒＡＡＶベクターゲノムで一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞により産生された混入ＤＮＡをパッケージングしているｒＡＡＶ粒子の量よりも少ない量のｒＡＡＶの空のカプシド、及び／又はそれよりも少ない量の混入ＤＮＡをパッケージングしているｒＡＡＶ粒子を含有する、請求項１９に記載のＨＥＫ細胞株。
【請求項２２】
前記第１の異種核酸配列が、治療用タンパク質又は阻害性核酸配列をコードする、請求項２〜２１のいずれか一項に記載のＨＥＫ細胞株。
【請求項２３】
前記第１の異種核酸配列を安定にトランスフェクトされた、請求項２〜２２のいずれか一項に記載のＨＥＫ細胞株。
【請求項２４】
ｒＡＡＶベクター粒子を製造する方法であって、請求項４〜２３のいずれか一項に記載のＨＥＫ細胞株を、前記治療用タンパク質、ウイルスベクター又はｒＡＡＶベクター粒子の産生及び／又は分泌を可能にする条件下で培養して、前記治療用タンパク質、ウイルスベクター又はｒＡＡＶベクター粒子を、前記細胞培養物、培養培地、又は細胞培養物及び培養培地から単離又は精製するステップを含む、方法。
【請求項２５】
前記第１の及び／又は第２の異種核酸配列が、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛膜性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦα）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）、ＴＧＦβ、アクチビン、インヒビン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ−３及びＮＴ４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、ネトリン−１及びネトリン−２、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグ並びにチロシンヒドロキシラーゼからなる群から選択される遺伝子生成物をコードする、請求項２〜２４のいずれか一項に記載のＨＥＫ細胞株。
【請求項２６】
前記ｒＡＡＶベクター粒子が、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛膜性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦα）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）、ＴＧＦβ、アクチビン、インヒビン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ−３及びＮＴ４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、ネトリン−１及びネトリン−２、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグ並びにチロシンヒドロキシラーゼからなる群から選択される遺伝子生成物をコードする前記第１の及び／又は前記第２の異種核酸配列を含む、請求項２に記載のＨＥＫ細胞株。
【請求項２７】
前記第１の及び／又は第２の異種核酸配列が、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ１〜ＩＬ−１７）、単球走化性タンパク質、白血病阻止因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子α及びβ、インターフェロンα、β、及びγ、幹細胞因子、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンド、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、単鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩ及びクラスＩＩのＭＨＣ分子からなる群から選択される遺伝子生成物をコードする、請求項２〜２４のいずれか一項に記載のＨＥＫ細胞株。
【請求項２８】
前記ｒＡＡＶベクター粒子が、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ１〜ＩＬ−１７）、単球走化性タンパク質、白血病阻止因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子α及びβ、インターフェロンα、β、及びγ、幹細胞因子、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンド、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、単鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩ及びクラスＩＩのＭＨＣ分子からなる群から選択される遺伝子生成物をコードする前記第１の及び／又は前記第２の異種核酸配列を含む、請求項２に記載のＨＥＫ細胞株。
【請求項２９】
前記第１の及び／又は第２の異種核酸配列が、カルバモイルシンテターゼＩ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノスクシネートシンテターゼ、アルギノスクシネートリアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセトアセテートヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ−１アンチトリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、シスタチオンベータ−シンターゼ、分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル−ｃｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インスリン、ベータ−グルコシダーゼ、ピルベートカルボキシレート、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、ＲＰＥ６５、Ｈ−タンパク質、Ｔ−タンパク質、嚢胞性線維症膜貫通制御因子（ＣＦＴＲ）配列、及びジストロフィンｃＤＮＡ配列からなる群から選択される、先天性のエラーの修正に有用なタンパク質をコードする、請求項２〜２４のいずれか一項に記載のＨＥＫ細胞株。
【請求項３０】
前記ｒＡＡＶベクター粒子が、カルバモイルシンテターゼＩ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノスクシネートシンテターゼ、アルギノスクシネートリアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセトアセテートヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ−１アンチトリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、シスタチオンベータ−シンターゼ、分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル−ｃｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インスリン、ベータ−グルコシダーゼ、ピルベートカルボキシレート、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、ＲＰＥ６５、Ｈ−タンパク質、Ｔ−タンパク質、嚢胞性線維症膜貫通制御因子（ＣＦＴＲ）配列、及びジストロフィンｃＤＮＡ配列からなる群から選択される、先天性のエラーの修正に有用なタンパク質をコードする前記第１の及び／又は前記第２の異種核酸配列を含む、請求項２に記載のＨＥＫ細胞株。
【請求項３１】
機能的な内因性ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）及びグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）を発現しないヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞株を製造する方法であって、前記内因性ＤＨＦＲ遺伝子及びＧＳ遺伝子を突然変異させるか又はノックアウトするステップを含む、方法。