【手続補正書】
【提出日】令和2年10月9日(2020.10.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外ベシクル（ＥＶ）の医薬調製物を製造する方法であって、
複数の体液調製物から、または細胞培養の馴化培地からＥＶを単離するステップと、
単離されたＥＶから、所定のＥＶ濃度の１つまたは複数のサンプルを調製するステップと、
力価試験において、各ＥＶサンプルの活性を試験するステップと、
所定の活性を超えるサンプルを、医薬調製物へのさらなる処理用に選択するステップと
を含み、
２つ以上の活性ＥＶサンプルをプールするステップを含んでもよい、方法。
【請求項２】
ＥＶがヒト細胞由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
血管新生促進治療による虚血性疾患もしくは虚血性傷害の処置または創傷癒合における使用のための、血液成分から単離された細胞外ベシクル（ｓＥＶ）の組成物。
【請求項４】
血管新生促進治療により良好な影響を受ける疾患または傷害の処置における使用のための、または創傷癒合における使用のための細胞外ベシクル（ＥＶ）の組成物であって、
−  ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイにより組成物の活性を測定するステップ；
−  ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイにより陰性対照の活性を測定するステップ；
−  ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイにより陽性対照の活性を測定するステップ；
−  以下の式：
【数１】
2019530714.tif 000001
を適用することにより、ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイにおける組成物の活性％を算出するステップ
を含む力価試験において測定したとき、少なくとも５０％の活性％を有する組成物。
【請求項５】
陽性対照が、１０％の血清を補充した内皮基本培地を使用し、細胞当たり１００００個のＥＶによるＨＭＥＣ細胞の刺激を含む、ＨＭＥＣ細胞ベースのＢｒｄＵ細胞増殖アッセイであり、
陰性対照が、同じ細胞および血清を補充されない培地を使用したＢｒｄＵ細胞増殖アッセイである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
力価試験が本明細書の例１．４．１に従い実施される、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項７】
血管新生促進治療により良好な影響を受ける疾患または傷害の処置における使用のための、または創傷癒合における使用のための細胞外ベシクル（ＥＶ）の組成物であって、
−  細管形成アッセイにより組成物の活性を測定するステップ；
−  細管形成アッセイにより陰性対照の活性を測定するステップ；
−  細管形成アッセイにより陽性対照の活性を測定するステップ；
−  以下の式：
【数２】
2019530714.tif 000002
を適用することにより、細管形成アッセイにおける組成物の活性％を算出するステップ
を含む力価試験において測定したとき、少なくとも５０％の活性％を有する組成物。
【請求項８】
陽性対照が、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを補充した内皮基本培地を使用し、細胞当たり５００００個のＥＶによる細胞の刺激を含む、ＨＵＶＥＣ細胞ベースのインビトロ細管形成アッセイであり、
陰性対照が、同じ細胞およびＶＥＧＦを補充されない培地を使用したインビトロ細管形成アッセイである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
力価試験が本明細書の例１．４．２に従い実施される、請求項７または８に記載の組成物。
【請求項１０】
力価試験が請求項７から９のいずれか１項に定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
請求項４から６のいずれか１項に記載のＢｒｄＵ細胞増殖アッセイと、請求項７から９のいずれか１項に記載の細管形成インビトロアッセイの両方を含む力価試験において測定したとき、少なくとも５０％の活性％を有する、請求項４から９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
ＥＶが、血液成分から単離された細胞外ベシクル（ｓＥＶ）である、請求項４から９及び１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
健常なドナーの供血から調製される、請求項４から９、１１及び１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
ＥＶが、細胞培養の馴化培地から単離された細胞外ベシクルである、請求項４から９及び１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
医薬調製物である、請求項３から９及び１１から１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
処置される対象の体重１ｋｇあたり１×１０11〜５×１０12個のＥＶを含む、請求項３から９及び１１から１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
血清または血漿または馴化培地に存在する全てのＥＶを捕捉しているバルク調製物である、請求項３から９及び１１から１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
ＥＶがヒト細胞由来である、請求項３から９及び１１から１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
疾患または傷害が、血管の疾患または傷害である、請求項３から９及び１１から１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
疾患または傷害が、急性心筋梗塞、急性脳血管疾患、急性および慢性末梢動脈疾患または急性腎臓虚血である、請求項３から９及び１１から１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
培養細胞の増殖を促進するための培養培地への添加剤としての、請求項３から９及び１１から１８のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
ｓＥＶ処置と関連する分子事象を詳細に吟味するため、種々のＧｅｎｅオントロジー（ＧＯ）データベースを参照した。ＧＯベースの機能解析では、ｓＥＶに応答して形成された毛細管様構造から回収されたＥＣにおいて、ＴＧＦｂ１シグナル伝達経路に関連する遺伝子の富化が観察された（Ｐ＜０．００１）（図１４）。留意すべきは、さらに詳細なＧＯ解析の結果、ｓＥＶ投与が、ＴＧＦｂ／ＡＬＫ１媒介血管新生の活性化段階に関係する遺伝子の発現と相関することがわかったことである（図１５）。実際、最も代表的な遺伝子クラスターは、ＡＬＫ１シグナル伝達イベントおよび経路（図１５）に関係する遺伝子からなるものであった。後者の結果は、最も高発現する遺伝子の１つとしてＩＤ１（図１１または図１３）を同定したトランスクリプトーム解析をさらに裏付けるものである。図１６（ｓＥＶおよびＶＥＧＦにより媒介される生物学的経路間の比較を示す）は、ｓＥＶの作用機構中、ＡＬＫ１カスケードが最も関連性が深いことをさらに裏付けるものである。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕細胞外ベシクル（ＥＶ）の医薬調製物を製造する方法であって、
複数の体液調製物から、または細胞培養の馴化培地からＥＶを単離するステップと、
単離されたＥＶから、所定のＥＶ濃度の１つまたは複数のサンプルを調製するステップと、
力価試験において、各ＥＶサンプルの活性を試験するステップと、
所定の活性を超えるサンプルを、医薬調製物へのさらなる処理用に選択するステップと
を含み、
２つ以上の活性ＥＶサンプルをプールするステップを含んでもよい、方法。
〔２〕力価試験が前記〔２〕から〔８〕までのいずれか１項に定義される、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕ＥＶがヒト細胞由来である、前記〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔４〕血管新生促進治療による虚血性疾患もしくは虚血性傷害の処置または創傷癒合における使用のための、血液成分から単離された細胞外ベシクル（ＥＶ）（ＥＶ）の組成物。
〔５〕血管新生促進治療により良好な影響を受ける疾患または傷害の処置における使用のための、または創傷癒合における使用のための細胞外ベシクル（ＥＶ）の組成物であって、
−  ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイにより組成物の活性を測定するステップ；
−  ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイにより陰性対照の活性を測定するステップ；
−  ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイにより陽性対照の活性を測定するステップ；
−  以下の式：
【数１】
2019530714.tif 000003
を適用することにより、ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイにおける組成物の活性％を算出するステップ
を含む力価試験において測定したとき、少なくとも５０％の活性％を有する組成物。
〔６〕陽性対照が、１０％の血清を補充した内皮基本培地を使用し、細胞当たり１００００個のＥＶによるＨＭＥＣ細胞の刺激を含む、ＨＭＥＣ細胞ベースのＢｒｄＵ細胞増殖アッセイであり、
陰性対照が、同じ細胞および血清を補充されない培地を使用したＢｒｄＵ細胞増殖アッセイである、前記〔５〕に記載の組成物。
〔７〕力価試験が本明細書の例１．４．１に従い実施される、前記〔５〕または〔６〕に記載の組成物。
〔８〕血管新生促進治療により良好な影響を受ける疾患または傷害の処置における使用のための、または創傷癒合における使用のための細胞外ベシクル（ＥＶ）の組成物であって、
−  細管形成アッセイにより組成物の活性を測定するステップ；
−  細管形成アッセイにより陰性対照の活性を測定するステップ；
−  細管形成アッセイにより陽性対照の活性を測定するステップ；
−  以下の式：
【数２】
2019530714.tif 000004
を適用することにより、細管形成アッセイにおける組成物の活性％を算出するステップ
を含む力価試験において測定したとき、少なくとも５０％の活性％を有する組成物。
〔９〕陽性対照が、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを補充した内皮基本培地を使用し、細胞当たり５００００個のＥＶによる細胞の刺激を含む、ＨＵＶＥＣ細胞ベースのインビトロ細管形成アッセイであり、
陰性対照が、同じ細胞およびＶＥＧＦを補充されない培地を使用したインビトロ細管形成アッセイである、前記〔８〕に記載の組成物。
〔１０〕力価試験が本明細書の例１．４．２に従い実施される、前記〔８〕または〔９〕に記載の組成物。
〔１１〕前記〔２〕から〔４〕までのいずれか１項に記載のＢｒｄＵ細胞増殖アッセイと、前記〔５〕からまで７のいずれか１項に記載の細管形成インビトロアッセイの両方を含む力価試験において測定したとき、少なくとも５０％の活性％を有する、前記〔５〕から〔１０〕までのいずれか１項に記載の組成物。
〔１２〕ＥＶが、血液成分から単離された細胞外ベシクル（ｓＥＶ）である、前記〔５〕から〔１１〕までのいずれか１項に記載の組成物。
〔１３〕健常なドナーの供血から調製される、前記〔５〕から〔１２〕までのいずれか１項に記載の組成物。
〔１４〕ＥＶが、細胞培養の馴化培地から単離された細胞外ベシクルである、前記〔５〕から〔１１〕までのいずれか１項に記載の組成物。
〔１５〕医薬調製物である、前記〔４〕から〔１４〕までのいずれか１項に記載の組成物。
〔１６〕処置される対象の体重１ｋｇあたり１×１０11〜５×１０12個のＥＶを含む、前記〔４〕から〔１５〕までのいずれか１項に記載の組成物。
〔１７〕血清または血漿または馴化培地に存在する全てのＥＶを捕捉しているバルク調製物である、前記〔４〕から〔１６〕までのいずれか１項に記載の組成物。
〔１８〕ＥＶがヒト細胞由来である、前記〔４〕から〔１７〕までのいずれか１項に記載の組成物。
〔１９〕疾患または傷害が、血管の疾患または傷害である、前記〔４〕から〔１８〕までのいずれか１項に記載の組成物。
〔２０〕疾患または傷害が、急性心筋梗塞、急性脳血管疾患、急性および慢性末梢動脈疾患または急性腎臓虚血である、前記〔４〕から〔１８〕までのいずれか１項に記載の組成物。
〔２１〕培養細胞の増殖を促進するための培養培地への添加剤としての、前記〔４〕から〔１８〕までのいずれか１項に記載の組成物の使用。