【手続補正書】
【提出日】令和2年6月12日(2020.6.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的オリゴヌクレオチド及び生成物関連不純物を含有する混合物から前記標的オリゴヌクレオチドを分離するための方法であって、
ａ）前記混合物に塩を添加するステップと、
ｂ）疎水性吸着剤の容量の約３２〜約７８％の動的負荷容量において、希釈された前記混合物を前記疎水性吸着剤に接触させるステップと、
ｃ）前記疎水性吸着剤を塩水溶液で洗浄するステップと、
ｄ）前記標的オリゴヌクレオチドを溶離液で溶離するステップと、
ｅ）前記標的オリゴヌクレオチドを含む溶出液を収集するステップと
を含み、前記生成物関連不純物が少なくとも１つのｎ−１不純物を含み、これにより前記生成物関連不純物から前記標的オリゴヌクレオチドが分離される、前記方法。
【請求項２】
標的のチオール化オリゴヌクレオチド及び生成物関連不純物を含有する混合物から前記標的オリゴヌクレオチドを分離するための方法であって、
ａ）前記混合物に塩を添加するステップと、
ｂ）疎水性吸着剤の容量の約４０〜約１００％の動的負荷容量において、希釈された前記混合物を前記疎水性吸着剤に接触させるステップと、
ｃ）前記疎水性吸着剤を塩水溶液で洗浄するステップと、
ｄ）前記標的オリゴヌクレオチドを溶離液で溶離するステップと、
ｅ）前記標的オリゴヌクレオチドを含む溶出液を収集するステップと
を含み、前記生成物関連不純物が少なくとも１つのＰ＝Ｏ不純物を含み、これにより前記生成物関連不純物から前記標的オリゴヌクレオチドが分離される、前記方法。
【請求項３】
前記塩が前記混合物に塩水溶液として添加されるか、または前記塩が前記混合物に直接溶解され、かつ、前記洗浄ステップの流速が負荷流速よりも遅い、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記溶離液が、水、塩水溶液、エチレングリコール、もしくはプロピレングリコール、またはそれらの混合物から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記溶出液の収集が、前記生成物の溶出ピークの最初の１〜２５％、１０〜２５％もしくは５〜１０％を含まないように遅延されるか、または前記溶出液の収集が、前記生成物の溶出ピークの最後の１〜２５％、５〜１０％もしくは１０〜２５％を含まない、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記疎水性吸着剤が、フェニル、ブチル、またはヘキシルを含み、前記疎水性吸着剤が少なくとも１５ｃｍの床高で充填される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記塩が、ＮＨ４＋、Ｋ＋、またはＮａ＋のうちのいずれかのカチオン、及びＦ−、［ＳＯ４］−２、［ＨＰＯ４］−２、酢酸イオン、もしくはＣｌ−からなるいずれかのアニオン、またはそれらの組み合わせを含むか、あるいは前記塩が、硫酸アンモニウムである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記標的オリゴヌクレオチドが１５〜２５個のヌクレオチドを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記標的オリゴヌクレオチドが、アデニン、グアニン、チミン（５−メチルウラシル）、シトシン、ヒポキサンチン、キサンチン、７−メチルグアニン、５，６−ジヒドロウラシル、５−メチルシトシン、７−デアザプリン、及び５−ヒドロキシメチルシトシンからなる群から独立して選択される核酸塩基を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的オリゴヌクレオチドが、置換されていてもよい糖を含むか、２つの非ジェミナル環原子が架橋して二環式核酸（ＢＮＡ）を形成しているか、または、前記糖の環酸素原子が、Ｓ、Ｎ（Ｒ）、もしくはＣ（Ｒ１）（Ｒ）２（式中、ＲはＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルである）、及びこれらの組み合わせに置き換えられている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記糖が、２’位において、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、ＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）ＣＨ３、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［ＣＨ２）ｎＣＨ３］２（式中、ｎ及びｍは独立して、１〜約１０である）で置換されているか、または前記糖が、２’においてＯ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３で置換されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡのみ、ＤＮＡのみ、ＲＮＡ及びＤＮＡの組み合わせ、またはギャップマーを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的オリゴヌクレオチドが、ホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的オリゴヌクレオチドの配列が（配列番号１）または（配列番号２）である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的オリゴヌクレオチドが、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記生成物関連不純物が、少なくとも１つのＰ＝Ｏ不純物を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記生成物関連不純物が、少なくとも１つのｎ−１不純物を更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
前記生成物関連不純物が、少なくとも１つの脱塩基不純物、少なくとも１つのＣＮＥｔ不純物、または少なくとも１つのＮ＋１不純物を更に含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
表４、５、及び６に記載の結果に基づくと、ＨＩＣカラムの動的結合容量の中心で負荷を行うことで、脱塩基不純物、ＣＮＥｔ不純物、及びＮ＋１不純物の除去が可能になる。
発明の態様
［態様１］標的オリゴヌクレオチド及び生成物関連不純物を含有する混合物から前記標的オリゴヌクレオチドを分離するための方法であって、
ａ）前記混合物に塩を添加するステップと、
ｂ）疎水性吸着剤の容量の約３２〜約７８％の動的負荷容量において、希釈された前記混合物を前記疎水性吸着剤に接触させるステップと、
ｃ）前記疎水性吸着剤を塩水溶液で洗浄するステップと、
ｄ）前記標的オリゴヌクレオチドを溶離液で溶離するステップと、
ｅ）前記標的オリゴヌクレオチドを含む溶出液を収集するステップと
を含み、前記生成物関連不純物が少なくとも１つのｎ−１不純物を含み、これにより前記生成物関連不純物から前記標的オリゴヌクレオチドが分離される、前記方法。
［態様２］標的のチオール化オリゴヌクレオチド及び生成物関連不純物を含有する混合物から前記標的オリゴヌクレオチドを分離するための方法であって、
ａ）前記混合物に塩を添加するステップと、
ｂ）疎水性吸着剤の容量の約４０〜約１００％の動的負荷容量において、希釈された前記混合物を前記疎水性吸着剤に接触させるステップと、
ｃ）前記疎水性吸着剤を塩水溶液で洗浄するステップと、
ｄ）前記標的オリゴヌクレオチドを溶離液で溶離するステップと、
ｅ）前記標的オリゴヌクレオチドを含む溶出液を収集するステップと
を含み、前記生成物関連不純物が少なくとも１つのＰ＝Ｏ不純物を含み、これにより前記生成物関連不純物から前記標的オリゴヌクレオチドが分離される、前記方法。
［態様３］前記塩が前記混合物に塩水溶液として添加されるか、または前記塩が前記混合物に直接溶解される、態様１または２に記載の方法。
［態様４］前記洗浄ステップの流速が負荷流速よりも遅い、先行態様のいずれかに記載の方法。
［態様５］前記溶離液が、水、塩水溶液、エチレングリコール、もしくはプロピレングリコール、またはそれらの混合物から選択される、先行態様のいずれかに記載の方法。
［態様６］前記溶出液の収集が、前記生成物の溶出ピークの最初の１〜２５％を含まないように遅延される、先行態様のいずれかに記載の方法。
［態様７］前記溶出液の収集が、前記生成物の溶出ピークの最初の１０〜２５％を含まないように遅延される、先行態様のいずれかに記載の方法。
［態様８］前記溶出液の収集が、前記生成物の溶出ピークの最初の５〜１０％を含まないように遅延される、態様１〜６のいずれかに記載の方法。
［態様９］前記溶出液の収集が、前記生成物の溶出ピークの最後の１〜２５％を含まない、態様１〜８のいずれかに記載の方法。
［態様１０］前記溶出液の収集が、前記生成物の溶出ピークの最後の５〜１０％を含まない、態様９に記載の方法。
［態様１１］前記溶出液の収集が、前記生成物の溶出ピークの最後の１０〜２５％を含まない、態様９に記載の方法。
［態様１２］前記疎水性吸着剤が少なくとも１５ｃｍの床高で充填される、先行態様のいずれかに記載の方法。
［態様１３］前記塩が、ＮＨ４＋、Ｋ＋、またはＮａ＋のうちのいずれかのカチオン、及びＦ−、［ＳＯ４］−２、［ＨＰＯ４］−２、酢酸イオン、もしくはＣｌ−からなるいずれかのアニオン、またはそれらの組み合わせを含む、先行態様のいずれかに記載の方法。
［態様１４］前記塩が硫酸アンモニウムである、先行態様のいずれかに記載の方法。
［態様１５］前記疎水性吸着剤が、フェニル、ブチル、またはヘキシルを含む、先行態様のいずれかに記載の方法。
［態様１６］前記標的オリゴヌクレオチドが１５〜２５個のヌクレオチドを含む、先行態様のいずれかに記載の方法。
［態様１７］前記標的オリゴヌクレオチドが、アデニン、グアニン、チミン（５−メチルウラシル）、シトシン、ヒポキサンチン、キサンチン、７−メチルグアニン、５，６−ジヒドロウラシル、５−メチルシトシン、７−デアザプリン、及び５−ヒドロキシメチルシトシンからなる群から独立して選択される核酸塩基を含む、先行態様のいずれかに記載の方法。
［態様１８］前記標的オリゴヌクレオチドが、アデニン、グアニン、チミン（５−メチルウラシル）、及び５−メチルシトシンからなる群から独立して選択される核酸塩基を含む、先行態様のいずれかに記載の方法。
［態様１９］前記標的オリゴヌクレオチドが、任意選択で置換されている糖を含むか、２つの非ジェミナル環原子が架橋して二環式核酸（ＢＮＡ）を形成しているか、または、前記糖の環酸素原子が、Ｓ、Ｎ（Ｒ）、もしくはＣ（Ｒ１）（Ｒ）２（式中、ＲはＨまたはＣ１〜Ｃ１２アルキルである）、及びこれらの組み合わせに置き換えられている、先行態様のいずれかに記載の方法。
［態様２０］前記糖が、２’位において、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、ＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）ＣＨ３、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［ＣＨ２）ｎＣＨ３］２（式中、ｎ及びｍは独立して、１〜約１０である）で置換されている、態様１９に記載の方法。
［態様２１］前記糖が、２’においてＯ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３で置換されている、態様１９に記載の方法。
［態様２２］前記標的オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡのみ、ＤＮＡのみ、またはＲＮＡ及びＤＮＡの組み合わせを含む、先行態様のいずれかに記載の方法。
［態様２３］前記標的オリゴヌクレオチドがギャップマーである、先行態様のいずれかに記載の方法。
［態様２４］前記標的オリゴヌクレオチドが、ホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）、またはそれらの組み合わせを含む、先行態様のいずれかに記載の方法。
［態様２５］前記標的オリゴヌクレオチドの配列が（配列番号１）である、先行態様のいずれかに記載の方法。
［態様２６］前記標的オリゴヌクレオチドの配列が（配列番号２）である、先行態様のいずれかに記載の方法。
［態様２７］前記標的オリゴヌクレオチドが、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）を含む、先行態様のいずれかに記載の方法。
［態様２８］前記標的オリゴヌクレオチドが、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）を含まない、態様１〜２７のいずれかに記載の方法。
［態様２９］前記生成物関連不純物が、少なくとも１つのＰ＝Ｏ不純物を更に含む、態様１に記載の方法。
［態様３０］前記生成物関連不純物が、少なくとも１つのｎ−１不純物を更に含む、態様２に記載の方法。
［態様３１］前記生成物関連不純物が、少なくとも１つの脱塩基不純物を更に含む、態様１〜３０のいずれかに記載の方法。
［態様３２］前記生成物関連不純物が、少なくとも１つのＣＮＥｔ不純物を更に含む、態様１〜３１のいずれかに記載の方法。
［態様３３］前記生成物関連不純物が、少なくとも１つのＮ＋１不純物を更に含む、態様１〜３２のいずれかに記載の方法。