(57)【要約】  【課題】    運動ニューロン変性疾患や脊髄損傷等の神経疾患の予防又は治療のための薬剤を提供する。  【解決手段】    HDGFのラットの脊髄組織培養への影響を調べたところ、HDGFが顕著に神経軸索突起の伸長を加速し、培養系で脊髄運動ニューロンの生存を促進した。即ち、本発明は、肝ガン細胞由来成長因子(HDGF)を有効成分とする神経疾患の治療又は予防するための薬剤である。  【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝ガン細胞由来成長因子(HDGF)を有効成分とする神経疾患の予防又は治療薬。
【請求項２】
前記神経疾患が運動ニューロン変性又は脊髄損傷による疾患である請求項１に記載の神経疾患の予防又は治療薬。
【請求項３】
前記肝ガン細胞由来成長因子(HDGF)が、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ運動ニューロンに対して栄養効果を有するタンパク質、又はこれらの塩である請求項１又は２に記載の神経疾患の予防又は治療薬。
【請求項４】
配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ運動ニューロンに対して栄養効果を有するタンパク質を発現させるベクターを有効成分とする神経疾患の予防又は治療薬。
【請求項５】
神経疾患の予防又は治療薬の製造のための請求項１〜４のいずれか一項に記載の予防又は治療薬の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、運動ニューロン変性疾患や脊髄損傷等の神経疾患の予防又は治療のための薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝ガン細胞由来成長因子(HDGF: hepatoma-derived growth factor)は肝癌細胞株HuH-7の培養液より精製され、その後クローニングがなされた分子で（非特許文献１）、核に存在する特異な栄養因子である。これまで、血管内皮紬胞、平滑筋紬胞、繊維芽細胞、ヘパトーム細胞に分裂促進効果があることが知られている（非特許文献２〜４）。また、HDGFが多くの細胞で成長因子として働き、HDGFが主にニューロンで発現し、HDGFタンパク質がその核に局在することも知られている（非特許文献２）。
また、HDGFに類似するヘパトーム誘導増殖因子様タンパク質(HDGFX)にはニューロン発達を促す効果があることや、これを用いてパーキンソン病やアルツハイマー病等の神経疾患を治療・診断することが可能であることが知られている（特許文献１）。
一方、HDGFタンパク質を遺伝子工学的に大量に得る方法も試みられている（特許文献５）。【０００３】
【特許文献１】特表2003-528583
【特許文献２】特開平11-103859
【非特許文献１】Nakamura H. et al., JBC 269: 25143-25149 (1994)
【非特許文献２】Nakamura H. et al., Clin. Chim. Acta. 183: 273-284 (1989)
【非特許文献３】Everett A.D. et al., J. Clin. Invest. 105: 567-575 (2000)
【非特許文献４】Oliver J.A. et al., J. Clin. Invest. 102: 1208-1210 (1998)
【非特許文献５】Zhiwei Zhou et. al., JBC (2004) 279: 27320-27326
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、運動ニューロン変性疾患や脊髄損傷等の神経疾患の予防又は治療のための薬剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、polyQ病の病理に関与すると考えられる(Hum. Mol. Genet. 8, 977-987 (1999))候補分子であるPQBP-1(ポリグルタミン鎖結合タンパク質)のトランスジェニックマウスを作成して調べたところ、遅発型運動ニューロン疾患に類似の表現系を示すことがわかった（Okuda et al., Human Molecular Genetics 2003, vol.12, page 711-725,）。PQBP-1は、突然変異体ataxin-1と相互作用し、凝集体の中で突然変異体huntingtinあるいはataxin-1と共局在する核タンパク質である。
本発明者らは、ヒト患者の神経変成によく似た症状を示す神経細胞死の分子機構を調べるために、このトランスジェニックマウス及び対照として症状が出る以前のマウスからの脊髄の前角組織を用いたミクロアレイ分析を行った。その結果、1.5倍以上変化したスポットの半数はミトコンドリア・ゲノムの遺伝子ということがわかった。更に、電子顕微鏡による解析の結果、脊椎運動ニューロンのミトコンドリアに形態異常が明らかとなった。更に、初代培養の神経細胞におけるPQBP-1の過剰発現により、アポトーシス死に先行することで知られているミトコンドリア膜電位の過分極が誘導された（以上結果は示さない）。これらの結果は、PQBP-1の過剰発現がミトコンドリア機能不全を起こし、これにより脊髄運動ニューロンが変化し、細胞死が起こり易くなることを示している。またガン細胞株に栄養因子的な効果を有するHDGFの発現が昂進していることが明らかとなった。【０００６】
そこで、本発明者は、HDGFのラットの脊髄組織培養への影響を調べたところ、HDGFが顕著に神経軸索突起の伸長を加速し、培養系で脊髄運動ニューロンの生存を促進することを見いだし、本発明を完成させるに至った。HDGFの促進的な調節は変性過程にある脊髄ニューロンを保護する役割を果たしたおり、この運動ニューロンを保護するというHDGFの機能は運動ニューロン変成の治療に有用であると考えられる。【０００７】
即ち、本発明は、肝ガン細胞由来成長因子(HDGF)を有効成分とする神経疾患の治療又は予防するための薬剤である。
この肝ガン細胞由来成長因子(HDGF)は、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ運動ニューロンに対して栄養効果を有するタンパク質、又はこれらの塩であってもよい。
また本発明は、神経疾患の予防又は治療薬の製造のための上記予防又は治療薬の使用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
「肝ガン細胞由来成長因子(HDGF)」とは、肝ガン細胞株HuH-7の培養上清よりSwiss3T3細胞に対する分裂促進効果を指標に精製・クローニングされた因子のことをいう。
また、HDGFは、(1) 配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、又は(2) 配列番号１に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ運動ニューロンに対して栄養効果を有するタンパク質、又は(3) これらの塩である。【０００９】
「運動ニューロン」は筋肉を直接的に動かす神経系を構成し、上位運動ニューロン（錐体路をつくるもの）と下位運動ニューロン（脊髄前角の大型ニューロンで筋肉に軸索を投射している）によりなる。上位運動ニューロンは大脳皮質から下位運動ニューロンに対して投射している。【００１０】
「栄養効果」とは、神経細胞生存維持及び神経突起伸張の両者を併せ持つ効果をのことをいう。この栄養効果は、例えば、ラット胎児の脊髄切片を血清も栄養因子もない培地(Dulbecco's modified eagles medium (DMEM))でHDGF（3-30ng/mL）存在下及び非存在下で培養し、培養約10日目に脊髄組織を観察し、運動ニューロンの軸索突起の伸長が観察されることによりその効果を確認することができる。【００１１】
本発明の予防又は治療薬の対象となる「神経疾患」とは、様々な病態によって神経細胞、神経膠細胞、神経突起、シナプス、ミエリン等の障害と機能低下をきたす疾病のことをいい、例えば、運動ニューロン変性又は脊髄損傷による疾患である。
「運動ニューロン変性疾患」とは、運動ニューロン死を伴う進行性神経疾患のことをいう。
「脊髄損傷」とは、外傷による脊髄及び脊髄根の組織障害のことをいう。
このような神経疾患として、例えば、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、球脊髄型筋萎縮症(Kennedy病）、脊髄小脳変性症（家族性を含む）、脊髄性筋萎縮症(spinal muscular atrophy)、脊髄損傷(交通外傷など）、変型性脊椎症に伴なう筋萎縮などが挙げられる。【００１２】
本発明の神経疾患の予防又は治療薬には、必要に応じて、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加してもよい。
また、本発明の神経疾患の予防又は治療薬の投与量は、投与目的（例えば、疾患の種類）、投与対象の個体の年齢及び体重、有効成分の種類等により適宜選択される。前記投与量は、有効成分(HDGF)が、例えば、0.01〜100mg、好ましくは3〜100mgであることが望ましい。
本発明の神経疾患の予防又は治療薬の投与方法としては、直接体内に導入するin vivo法等が挙げられる。投与形態は、投与目的（例えば、疾患の種類）、投与対象の個体の年齢及び体重、有効成分の種類等により適宜選択され、例えば、静脈注射、鼻粘膜吸入、髄液注入等が挙げられる。この投与形態として、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与してもよいし、あるいは、溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口に局所に投与してもよいし、スプレー剤の型で鼻孔内投与してもよい。【００１３】
また、HDGFを組織や細胞内で発現させるために発現ベクターを用いてもよい。このようなベクターとしては、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルス(HSV)ベクター、アデノウイルスベクター、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)ベクター等のウイルスベクターを挙げることができる。発現ベクターは遺伝子工学の常法に基づいて構成すればよい。このように構成した発現ベクターを神経疾患の予防又は治療薬として用いることができる。【００１４】
また、HDGFをもとに有効ドメインのみを使用したより分子量の小さなペプチド、及びペプチドと担体との融合物質及びこれをミミックした物質を治療薬として用いてもよい。
以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものではない。【００１５】
試験例１
まず、PQBP-1(ポリグルタミン鎖結合タンパク質)トランスジェニックマウスを以下のようにして作成した。
human PQBP-1 full-length cDNA (Hum. Mol. Genet. 1999, vol. 8, page 977-987 Waragai et al.）を供与されたpCAGGS (Niwa et al, Gene 1991, vol. 108, 193-200)のXbaIとXhoIの間に挿入し、得られたプラスミドのSalI-HindIII 断片3.1kbを切り出して、C57BL/6の受精卵に注入した。【００１６】
このトランスジェニックマウスにおけるHDGFのタンパク質発現を吟味するために、それぞれヒト及びラットC-末端配列に対する２種類の抗体を以下の手順で作成した。
システインにより担体タンパク質と結合したペプチドKEEAEAPGVRDHESL（マウスHDGFのC-末端15アミノ酸、配列番号２）又はペプチドKEDAEAPGIRDHESL（ヒトHDGFのC-末端15アミノ酸、配列番号３）でウサギを免疫化しHDGFに対する抗血清を得た。マウスに対する抗体をmC15-1及びmC15-2、ヒトに対する抗体をhC15-1及びhC15-2とした。【００１７】
この抗体の特異性を検定し、ニューロンに対するHDGFの効果を調べるために、組換えマウスHDGFを以下の手順で作成した。
GST-HDGF融合タンパク質を発現するために、HDGF-Fプライマー:AAAGGGATCCGATCCAACCGGCAGAAAGAG（配列番号４）及びHDGF-Rプライマー：AAAGAATTCTACAGGCTCTCATGATCTCT（配列番号５）を用いてPCRにより増幅したマウス全長HDGFcDNA(配列番号６、BC005713)をpGEX-3X(Amersham Biosciences)のBamHI及びEcoRI制限酵素サイトの間にサブクローニングした。このサブクローニングによって、HDGFの最初の2個のN-末端のアミノ酸はM-S-からG-I-に変わった。0.1mMのITPGを用いた5時間の誘導後、E.Coliを遠心で集め、超音波破壊した。組換えHDGF(GST-HDGF)はグルタチオン・セファローズ４Ｂカラム(Amersham Biosciences)により溶菌液から回収した。
また、HDGFは因子Xaにより融合タンパク質から切断し、ヘパリン−セファローズカラム(HiTrap Heparin Hp. Amersham Biosciences)により精製した。【００１８】
HDGFに対する４種の抗体を、融合タンパク質発現したバクテリア又は非発現バクテリアの抽出物を用い、ウェスタンブロットにより特徴づけた。その結果を図１に示す。上記４種の抗体が全てHDGFを検出することを確認した。これらの抗体の特異性については繰り返し確認した。mC15-2及びhC15-2抗体はフィルムの長時間露出によりバクテリア抽出物において弱い非特異的なバンドを検出したので、以後mC15-1又はhC15-1を用いた。【００１９】
トランスジェニックマウスの脊髄組織を用いてmC15-1によるウェスタンブロットを行った。その結果を図２に示す。HDGFに対応する37kDバンドがトランスジェニックマウス（Ｔｇ）の脊髄において増加していることがわかる。即ち、HDGFタンパク質発現はトランスジェニックマウスの脊髄前角で増加している。【００２０】
試験例２
HDGFタンパク質が運動ニューロンにおいて増加するかどうかを更に検証するために、次に我々はPQBP-1トランスジェニックマウス及び対照マウスの腰部脊髄組織の免疫組織化学(IHC)を以下の手順で行った。
冷却した4%パラホルムアルデヒド(PFA)でマウスを心臓経由で潅流し、脳、脊髄及び筋肉を4%PFAで固定後処理した。5-10μｍのパラフィン切片はキシレンで脱パラフィンし、エタノール希釈シリーズを用いて脱水させた。PBS中0.3%過酸化水素30分間処理で内因性のパーオキシダーゼを不活化した。HDGF染色のために、パラフィン切片を３％山羊血清と30分間処理した。１次抗体として、抗-HDGF・C-末端・ポリクローナルウサギ血清（1:1000希釈）及び/あるいは抗-GFAPウサギポリクローナル抗体(Chemicon,1:500)を用いた。HRP-結合の抗-ウサギ抗体(Envision,DAKO)を２次抗体として用い、ジアミノベンチジン(DAB,Sigma)で発色させた。【００２１】
その結果を図３に示す。高倍率像（図３の第２及び第４のライン）において、HDGFがトランスジェニックマウスの運動ニューロン（白色矢印）の核で強く染色されているのに対し、細胞質は対照マウスの大部分の運動ニューロンにおいて強く染色されている（黒色矢印）。HDGFはニューロンとグリアル細胞の核で発現していることがわかる。
また、前角ニューロンにおける核（染色）陽性の運動ニューロンの割合は、対照マウス(control)では17%(4/24)であり、トランスジェニックマウス(Tg)では89%(17/19)であった。他の部分の脊髄ニューロンでは染色の差異は２群の間ではっきりしなかった。グリアル細胞では染色は同程度であった。
これらのデータからHDGFは特異的に変性過程の脊髄の運動ニューロン内でPQBP-1により促進的に調節されていることがわかる。
【実施例１】
【００２２】
本実施例ではHDGFが脊髄運動ニューロンに対して栄養因子的効果を有するかどうか調べた。HDGFは非神経細胞に対し分裂促進的であるので(Clin. Chim. Acta. 183, 273-284 (1989)等)、HDGFは変成ストレス下の運動ニューロンの生存を保護すると推測される。この仮説を検証するために以下の実験を行った。【００２３】
E14Sprague-Dawleyラット胎児の脊髄を切り裂き、脊髄神経節後根と髄膜を切り取った。脊髄の腹側の半分は顕微鏡下で分離し、1mm立方体に切断し、他方、脊髄の背側半分は廃棄した。腹部組織を、ポリ-L-リジンで覆いDMEMを加え一晩インキュベートした、35mmディッシュ(Falcon)に播き、5%CO2下、37℃で培養した。
3、10及び30ng/mlの3種のHDGF濃度で組換えHDGF(GST-HDGF)を添加し、神経軸索促進活性を検定した。各濃度について6〜10移植体を用いた。培地は１日おきに取り換えた。
対照として、非融合GSTタンパク質から精製したモック溶液を同様に加えた。
移植体の軸索伸長は7日後にWinROOFソフト(Mitani Corportion)により測定した。抗ChAT抗体染色のために、組織を0.1％パラホルムアルデヒドにより固定し、希釈率1:500の山羊抗ChATポリクローナル抗体(Chemicon)と4℃12〜24時間インキュベートした。
染色はAlexa Fluor488(Molecular Probes)で標識したロバ抗−山羊IgGで可視化し、蛍光顕微鏡(OLYMPUS,IX-71)及びソフトAQUACOSMOS(HAMAMATSU)により測定した。
更に、運動ニューロンの神経軸索突起とこれらの細胞の伸長した繊維と区別するために、この切片を抗-ChAT（コリン・アセチルトランスフェラーゼ）抗体で染色した。【００２４】
この結果を図４に示す。位相差顕微鏡(PC)で観測した場合、明らかに軸索の伸長が促進された。これらの軸索の中で、ChAT-陽性の原繊維(α-ChAT)もまたHDGFにより伸長し、運動ニューロンの軸索はHDGFに対し反応性があることがわかる。神経軸索突起の伸長に対してHDGFが顕著な効果を有することが明らかである。【００２５】
次に、神経軸索突起の長さを非染色像及びChAT染色像において定量し、その値をHDGF存在下及び非存在下で比較した。
軸索の長さをソフトWinROOF (Mitani Cooporation)を用いて定量し、様々な濃度のHDGFについて対照と比較した。精製したHDGFはヘパリンカラムの溶出液で希釈して用いた。
その結果を図５に示す。星印及び二重星印はDuunetテストにより対照と比較すると有意に異なることがわかる（それぞれ、ｐ<0.05及びｐ<0.01）。
これらの結果は、HDGFが脊髄ニューロンと脊髄運動ニューロンにおいて神経軸索突起促進効果を有することを示している。【００２６】
次に、他の栄養因子なしの培地でHDGFがChAT-陽性のニューロンの生存を促進するかどうか調べた。
脊髄切片を血清も栄養因子もない培地(DMEM)で培養し、培養10日目にChAT陽性のニューロンの単位面積(0.02mm2)当たりの数を脊髄組織を取り巻く10視野について計数した。その値をHDGF存在下及び非存在下で比較した。
その結果を図６に示す。二重星印はt-テストにより、対照から有意に差（ｐ<0.01）があることを示している。HDGFの添加により運動ニューロンの生存数が増加し、HDGFが脊髄運動ニューロンに対し栄養因子として働くことが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】HDGFに対する４種の抗体を用いたウェスタンブロットを示す図である。矢印は組換えHDGFの特異的バンドを示す。
【図２】トランスジェニックマウスの脊髄組織を用いたウェスタンブロット分析を示す図である。Ｔｇは月齢１２のトランスジェニックマウスを示し、Contは年齢をマッチした同腹仔を示す。それぞれｎ＝３の結果を示す。下の数字は、GAPDHにより補正した強度比を示す。
【図３】PQBP-1トランスジェニックマウスの腰部脊髄組織の免疫組織化学(IHC)をを示す図である。上部２本のラインは抗-HDGF抗体(mC15-1)の免疫組織化学を示し、下部２本のラインは抗-HDGF抗体（褐色）と抗-ＧＦＡＰ（青色）による二重染色を示す。図中の横棒の長さは５０μmを示す。
【図４】脊髄運動ニューロンに対するSDGFの効果を示す図である。PCは位相差顕微鏡像を示し、α-ChATはChAT染色を示す。
【図５】運動ニューロン移植体培養における軸索伸長を示す図である。ContはHDGF非存在下、数字はHDGFの濃度を示す。
【図６】培養10日目におけるChAT-陽性の細胞体の生存数を示す図である。縦軸は、培養10日目におけるChAT陽性のニューロンの単位面積(0.02mm2)当たりの数を示す。
【図５】
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【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年6月21日(2006.6.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝ガン細胞由来成長因子(HDGF)を有効成分とする神経疾患の予防又は治療薬。
【請求項２】
前記神経疾患が運動ニューロン変性又は脊髄損傷による疾患である請求項１に記載の神経疾患の予防又は治療薬。
【請求項３】
前記肝ガン細胞由来成長因子(HDGF)が、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ運動ニューロンに対して栄養効果を有するタンパク質、又はこれらの塩である請求項１又は２に記載の神経疾患の予防又は治療薬。
【請求項４】
配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ運動ニューロンに対して栄養効果を有するタンパク質を発現させるベクターを有効成分とする神経疾患の予防又は治療薬。
【請求項５】
神経疾患の予防又は治療薬の製造のための肝ガン細胞由来成長因子(HDGF)の使用。
【請求項６】
前記神経疾患が運動ニューロン変性又は脊髄損傷による疾患である請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記肝ガン細胞由来成長因子(HDGF)が、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ運動ニューロンに対して栄養効果を有するタンパク質、又はこれらの塩である請求項５又は６に記載の使用。
【国際調査報告】
2006006337.tif 000008
2006006337.tif 000009
2006006337.tif 000010