(57)【要約】  本発明者らは、S1-5遺伝子の機能を失わせたノックアウトマウスが、加齢性の疾患又は症状を引き起こすことを見出した。また、組織学的解析により、該ノックアウトマウスの骨塩量、骨密度、骨強度が低下していること、並びに、骨組織において、破骨細胞数が増加していることが判明した。さらに、in vitroにおいて、該ノックアウトマウス由来骨髄細胞を用いた破骨細胞形成能の解析を行った結果、該ノックアウトマウスでは、野生型マウスに比べ、破骨細胞形成能が亢進し、さらに破骨細胞の大きさも大きくなっていることが判明した。また、このin vitroの系に、精製したS1-5タンパク質を添加したところ、破骨細胞形成能が抑制されることが判明した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
S1-5遺伝子の全部又は一部の機能を喪失させた、加齢性の疾患又は症状を呈する非ヒトノックアウト動物。
【請求項２】
S1-5遺伝子の全部又は一部の機能の喪失が、S1-5遺伝子の破壊又は変異によるものである請求項１記載の動物。
【請求項３】
加齢性の疾患又は症状が、骨変形、骨粗鬆症、脱毛、組織の損傷又は壊死、腫瘍、胸部肥大、腹水、貧血、出血、皮膚の老化及び爪の老化からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１記載の動物。
【請求項４】
動物が、ゼブラフィッシュ、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ウシ、サル、及びチンパンジーからなる群から選択されるいずれかのものである、請求項１記載の動物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の非ヒトノックアウト動物から単離された細胞。
【請求項６】
破骨細胞、角化上皮細胞、血液細胞、癌細胞、骨髄細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、真皮細胞、筋細胞、神経細胞、骨芽細胞、リンパ球、血管平滑筋細胞、滑膜細胞、毛乳頭細胞、肝細胞、色素細胞、脂肪細胞、子宮内皮細胞、または肺胞上皮細胞である、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
S1-5遺伝子の全部又は一部の機能を喪失させることを特徴とする、加齢性疾患を引き起こす非ヒトノックアウト動物の作製方法。
【請求項８】
S1-5遺伝子の全部又は一部の機能の喪失が、S1-5遺伝子の破壊又は変異によるものである請求項７記載の方法。
【請求項９】
加齢性の疾患又は症状が、骨変形、骨粗鬆症、脱毛、組織の損傷又は壊死、腫瘍、胸部肥大、腹水、貧血、出血、皮膚の老化及び爪の老化からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
動物が、ゼブラフィッシュ、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ウシ、サル、及びチンパンジーからなる群から選択されるいずれかのものである、請求項７記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の非ヒトノックアウト動物に加齢性の疾患又は症状の予防又は治療薬の候補物質を投与することを特徴とする、当該予防又は治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の非ヒトノックアウト動物から単離された細胞に、加齢性の疾患又は症状の予防又は治療薬の候補物質を接触させることを特徴とする、当該予防又は治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１３】
細胞が、破骨細胞、角化上皮細胞、血液細胞、癌細胞、骨髄細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、真皮細胞、筋細胞、神経細胞、骨芽細胞、リンパ球、血管平滑筋細胞、滑膜細胞、毛乳頭細胞、肝細胞、色素細胞、脂肪細胞、子宮内皮細胞、または肺胞上皮細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
加齢性の疾患又は症状が、骨変形、骨粗鬆症、脱毛、組織の損傷又は壊死、腫瘍、胸部肥大、腹水、貧血、出血、皮膚の老化及び爪の老化からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の非ヒトノックアウト動物由来の破骨細胞に、破骨細胞の機能抑制剤の候補物質を接触させることを特徴とする破骨細胞の機能抑制剤のスクリーニング法。
【請求項１６】
下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の単離されたタンパク質。
（ａ）配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質。
（ｂ）配列番号：１または３に記載の塩基配列のコード領域を含むDNAによりコードされるタンパク質。
（ｃ）配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
（ｄ）配列番号：１または３に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるタンパク質であって、配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
【請求項１７】
請求項１６に記載のタンパク質の部分ペプチド。
【請求項１８】
配列番号：６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のペプチド。
【請求項１９】
請求項１６に記載のタンパク質、または請求項１７もしくは１８に記載のペプチドを含有する、加齢性の疾患又は症状の予防又は治療薬。
【請求項２０】
加齢性の疾患又は症状が、骨変形、骨粗鬆症、脱毛、組織の損傷又は壊死、腫瘍、胸部肥大、腹水、貧血、出血、皮膚の老化及び爪の老化からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１９に記載の予防又は治療薬。
【請求項２１】
請求項１６に記載のタンパク質、または請求項１７もしくは１８に記載のペプチドを含有する、破骨細胞の機能抑制剤。
【請求項２２】
請求項１６に記載のタンパク質、または請求項１７もしくは１８に記載のペプチドに結合する抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、S1-5遺伝子を欠損させた、加齢性疾患又は症状を呈する非ヒトノックアウト動物及びその製造方法に関する。また、本発明は、上記動物に候補物質を投与することを特徴とする、加齢性疾患又は症状の予防又は治療薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ（rheumatoid arthritis、以下、RAと省略する）は、関節の滑膜組織に異常な増殖が見られる全身性の慢性炎症性疾患である。滑膜細胞（synovial cell）は、関節の滑膜で1〜6層の上皮様層を形成する繊維芽細胞様の細胞であり、滑液にプロテオグリカンやヒアルロン酸を供給するものとされている。RA患者の関節では、滑膜組織の増殖、その結果として引き起こされる多層構造、炎症性細胞の浸潤といった種々の症状が観察される。【０００３】
本発明者らは、RAの発症や進展の背後にある分子レベルの機序を解明する研究の過程において、RA患者の滑膜組織において強発現している新規遺伝子を見出した。この遺伝子によりコードされるタンパク質は、発現している組織である滑膜細胞（synovial cell）にちなみ、シノビオリン（Synoviolin）と名づけられた（特許文献１）。【０００４】
また本発明者らは、タンパク質の生化学的な結合実験により、シノビオリンの結合因子であるS1-5（EFEMP-1、FBNL、またはFBLN-3などの別名がある）の存在を明らかにした。S1-5は、シノビオリンの結合因子として本発明者らが初めて単離したタンパク質である。【０００５】
S1-5は、ヒト2倍体繊維芽細胞（human diploid fibroblast）で過剰発現している遺伝子として単離された（Lecka-Czernik, B. et al., Molecular and Cellular Biology, 15, 120-128, 1995）。構造的には、DNA合成を促進する（細胞増殖活性）EGF様ドメイン（Epidermal Growth Factor-like domein）、およびフィブリン様ドメインが見出されている。また、最近S1-5の変異が、Malattia Leventinese（ML）およびDoyne honeycomb retinal dystrophy（DHRD）と関連していることが報告されている（非特許文献１）。【０００６】
しかしながら、S1-5の詳細な機能は知られておらず、S1-5を欠損させたときの個体の表現型については明らかではない。
【特許文献１】国際公開第WO02/052007号パンフレット
【非特許文献１】Stone, E. M. et al., Nature Genetics 22, 199-202, 1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、S1-5遺伝子を欠損させた、加齢性疾患を引き起こす非ヒトノックアウト動物及びその製造方法を提供することを目的とする。また、上記動物に候補物質を投与することを特徴とする、加齢性疾患治療薬等のスクリーニング方法を提供することを目的とする。また、該非ヒトノックアウト動物から単離した細胞及びその用途、さらに、S1-5タンパク質およびその用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、S1-5遺伝子の機能を失わせたノックアウトマウスが、加齢性の疾患又は症状を引き起こすことを見出した。また、組織学的解析により、該ノックアウトマウスの骨塩量、骨密度、骨強度が低下していること、並びに、骨組織において、破骨細胞数が増加していることが判明した。さらに、in vitroにおいて、該ノックアウトマウス由来骨髄細胞を用いた破骨細胞形成能の解析を行った結果、該ノックアウトマウスでは、野生型マウスに比べ、破骨細胞形成能が亢進され、さらに該細胞の大きさが大きくなっていることが判明した。また、このin vitroの系に、精製したS1-5タンパク質を添加したところ、破骨細胞形成能が抑制されること、および該細胞の大きさが小さくなることが判明した。【０００９】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕S1-5遺伝子の全部又は一部の機能を喪失させた、加齢性の疾患又は症状を呈する非ヒトノックアウト動物。
〔２〕S1-5遺伝子の全部又は一部の機能の喪失が、S1-5遺伝子の破壊又は変異によるものである〔１〕記載の動物。
〔３〕加齢性の疾患又は症状が、骨変形、骨粗鬆症、脱毛、組織の損傷又は壊死、腫瘍、胸部肥大、腹水、貧血、出血、皮膚の老化及び爪の老化からなる群から選択される少なくとも１つである、〔１〕記載の動物。
〔４〕動物が、ゼブラフィッシュ、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ウシ、サル、及びチンパンジーからなる群から選択されるいずれかのものである、〔１〕記載の動物。
〔５〕〔１〕〜〔４〕のいずれか１項に記載の非ヒトノックアウト動物から単離された細胞。
〔６〕破骨細胞、角化上皮細胞、血液細胞、癌細胞、骨髄細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、真皮細胞、筋細胞、神経細胞、骨芽細胞、リンパ球、血管平滑筋細胞、滑膜細胞、毛乳頭細胞、肝細胞、色素細胞、脂肪細胞、子宮内皮細胞、または肺胞上皮細胞である、〔５〕に記載の細胞。
〔７〕S1-5遺伝子の全部又は一部の機能を喪失させることを特徴とする、加齢性疾患を引き起こす非ヒトノックアウト動物の作製方法。
〔８〕S1-5遺伝子の全部又は一部の機能の喪失が、S1-5遺伝子の破壊又は変異によるものである〔７〕記載の方法。
〔９〕加齢性の疾患又は症状が、骨変形、骨粗鬆症、脱毛、組織の損傷又は壊死、腫瘍、胸部肥大、腹水、貧血、出血、皮膚の老化及び爪の老化からなる群から選択される少なくとも１つである、〔７〕記載の方法。
〔１０〕動物が、ゼブラフィッシュ、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ウシ、サル、及びチンパンジーからなる群から選択されるいずれかのものである、〔７〕記載の方法。
〔１１〕〔１〕〜〔４〕のいずれか１項に記載の非ヒトノックアウト動物に加齢性の疾患又は症状の予防又は治療薬の候補物質を投与することを特徴とする、当該予防又は治療薬のスクリーニング方法。
〔１２〕〔１〕〜〔４〕のいずれか１項に記載の非ヒトノックアウト動物から単離された細胞に、加齢性の疾患又は症状の予防又は治療薬の候補物質を接触させることを特徴とする、当該予防又は治療薬のスクリーニング方法。
〔１３〕細胞が、破骨細胞、角化上皮細胞、血液細胞、癌細胞、骨髄細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、真皮細胞、筋細胞、神経細胞、骨芽細胞、リンパ球、血管平滑筋細胞、滑膜細胞、毛乳頭細胞、肝細胞、色素細胞、脂肪細胞、子宮内皮細胞、または肺胞上皮細胞である、〔１２〕に記載の方法。
〔１４〕加齢性の疾患又は症状が、骨変形、骨粗鬆症、脱毛、組織の損傷又は壊死、腫瘍、胸部肥大、腹水、貧血、出血、皮膚の老化及び爪の老化からなる群から選択される少なくとも１つである、〔１１〕〜〔１３〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１５〕〔１〕〜〔４〕のいずれか１項に記載の非ヒトノックアウト動物由来の破骨細胞に、破骨細胞の機能抑制剤の候補物質を接触させることを特徴とする破骨細胞の機能抑制剤のスクリーニング法。
〔１６〕下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の単離されたタンパク質。
（ａ）配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質。
（ｂ）配列番号：１または３に記載の塩基配列のコード領域を含むDNAによりコードされるタンパク質。
（ｃ）配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
（ｄ）配列番号：１または３に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるタンパク質であって、配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
〔１７〕〔１６〕に記載のタンパク質の部分ペプチド。
〔１８〕配列番号：６に記載のアミノ酸配列を含む、〔１７〕に記載のペプチド。
〔１９〕〔１６〕に記載のタンパク質、または〔１７〕もしくは〔１８〕に記載のペプチドを含有する、加齢性の疾患又は症状の予防又は治療薬。
〔２０〕加齢性の疾患又は症状が、骨変形、骨粗鬆症、脱毛、組織の損傷又は壊死、腫瘍、胸部肥大、腹水、貧血、出血、皮膚の老化及び爪の老化からなる群から選択される少なくとも１つである、〔１９〕に記載の予防又は治療薬。
〔２１〕〔１６〕に記載のタンパク質、または〔１７〕もしくは〔１８〕に記載のペプチドを含有する、破骨細胞の機能抑制剤。
〔２２〕〔１６〕に記載のタンパク質、または〔１７〕もしくは〔１８〕に記載のペプチドに結合する抗体。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、S1-5遺伝子を欠損させた、加齢性疾患を引き起こすノックアウト動物及びその製造方法が提供される。本発明の動物は骨変形、脱毛、組織損傷、腫瘍発生など、種々の加齢性疾患又は症状を呈するため、当該動物に加齢性疾患の治療または予防に有効な物質を投与することにより治療又は改善効果をもたらす医薬組成物をスクリーニングするためのモデル動物として使用することができる。また、本発明により、該ノックアウト動物から単離された細胞も提供される。該細胞を用いることで、加齢性疾患の治療または予防のための薬剤をスクリーニングできる。該ノックアウト動物から単離した骨髄細胞は、破骨細胞に分化させた際のTRAP陽性多核巨細胞の形成能が野生型マウスの骨髄細胞よりも高いため、TRAP陽性多核巨細胞の数および/もしくは大きさを指標として破骨細胞の機能抑制剤のスクリーニングを行うことができる。
さらに、単離されたS1-5タンパク質やS1-5タンパク質に結合する抗体も提供される。単離されたS1-5タンパク質を利用することにより、加齢性疾患の治療または予防、および破骨細胞の活性抑制を行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。【００１２】
１．S1-5遺伝子
S1-5をコードする遺伝子は公知であり、accession number AAA65590（nucleotide accession U03877）、I38449、NP_061489(nucleotide accession NM 018894)、NP_004096(nucleotide accession NM 004105)、または Q12805 に特定される S1-5タンパク質や、それらに類似したタンパク質であってヒトシノビオリンタンパク質に結合する活性を有するタンパク質をも用いることができる（Lecka-Czernik, B. et al., Mol. Cell. Biol. 15, 120-128, 1995; Heon, E. et al., Arch. Ophthalmol. 114, 193-198, 1996; Ikegawa, S. et al., Genomics 35, 590-592, 1996; Katsanis, N. et al., Hum. Genet. 106, 66-72, 2000; Giltay, R. et al., Matrix Biol. 18, 469-480, 1999; Stone, E. M. et al., Nat. Genet. 22, 199-202, 1999）。【００１３】
S1-5遺伝子は、マウス、ラット、等のゲノムライブラリーから得ることができる。例えば、細菌人工染色体(BAC)ライブラリーから、ハイブリダイゼーション法により目的クローンを得ることができる。また、PCR法により得ることも可能である。【００１４】
２．非ヒトノックアウト動物
本発明は、１）S1-5遺伝子の全部又は一部の機能を喪失させた、加齢性の疾患又は症状を呈する非ヒトノックアウト動物、および、２）S1-5遺伝子の全部又は一部の機能を喪失させることを特徴とする、加齢性疾患を引き起こす非ヒトノックアウト動物の作製方法を提供する。S1-5遺伝子の全部又は一部の機能の喪失は、S1-5遺伝子の破壊又は変異によるものを例示することができる。
本発明において、S1-5の全部又は一部の機能を喪失させたノックアウト動物を作製するためには、遺伝子ターゲッティングを採用することができる。【００１５】
S1-5遺伝子のターゲティングベクターは、S1-5遺伝子を破壊することにより当該遺伝子の全部又は一部の機能を喪失させるためのものである。ここで、「機能を喪失させる」とは、遺伝子の機能を完全に失わせること、あるいは遺伝子の機能が野生型と比較して低下している状態にすることの両者を含む意味である。【００１６】
機能を喪失させるためには、単純に遺伝子を破壊又は欠損させたり、あるいは、遺伝子に変異を導入して翻訳の段階で読み枠がずれるように操作する等の改変を施せばよい。【００１７】
本発明の「ノックアウト動物」は、以下の通り作製することができる。【００１８】
まず、S1-5遺伝子の塩基配列の一部または全てを改変したものを分化全能性細胞に導入し、改変S1-5遺伝子が導入された分化全能性細胞を選択する。次に、選択された遺伝子改変（欠損、破壊、変異等）が施された分化全能性細胞を受精卵に導入してキメラ個体を作製し、得られたキメラ個体を交配することにより相同染色体上の一方又は双方のS1-5遺伝子をノックアウトした個体を作出する。【００１９】
本発明に用いられる動物の種類は、特に限定されるものではない。たとえば、ヒトを除くゼブラフィッシュ、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ウシ、サル、及びチンパンジーなどが挙げられる。本発明では取り扱いが容易で繁殖しやすいマウスが好ましい。【００２０】
本明細書において、S1-5遺伝子の機能を失わせるために、S1-5遺伝子の塩基配列の一部または全部を改変することができる。「改変」とは、S1-5遺伝子のDNAの一部に、欠損、置換または付加を生じさせる変異を加えることをいう。これらの変異としては、例えば、遺伝子工学的手法による塩基配列の一部又は全部の削除（欠失）、あるいは他遺伝子又は塩基配列の挿入または置換があげられる。例えば、コドンの読み取り枠をずらすか、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより、S1-5欠損遺伝子を作製することができる。これにより、S1-5遺伝子の発現産物であるS1-5タンパク質の機能が発現しなくなる。【００２１】
本発明のノックアウトマウスは、公知の遺伝子組換え法（ジーンターゲッティング法）により作製することができる。ジーンターゲッティング法は、当分野においてはよく知られた技術であり、本分野の種々の実験書に開示されている。【００２２】
ターゲティングベクターを設計するにあたり、S1-5遺伝子の構造に変化をもたらす部位は、S1-5遺伝子の機能が欠損する限り、特に限定されるものではない。但し、S1-5遺伝子の機能及び構造を考慮して、S1-5遺伝子のEGF様ドメイン、またはフィブリン様ドメインの領域を欠失させるように設計することが特に好ましい。【００２３】
また、ベクターを導入した組換え体は、ターゲティングベクターにより導入した薬剤耐性遺伝子を用いたスクリーニングと、サザンブロット法やPCR法を用いたスクリーニングとを併用して選抜することが好ましい。薬剤選択のマーカー遺伝子として、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ遺伝子等を使用することができる。また、ネガティブ選択用遺伝子には、HSVチミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリア毒素A遺伝子等を使用することができる。【００２４】
上記の方法により作製したターゲッティングベクターを使用して、相同組換えを行う。本明細書において、「相同組換え」とは、改変されたS1-5遺伝子を、ゲノム中のS1-5遺伝子のDNA領域に、人工的に組換えさせることをいう。【００２５】
目的とする相同組換え体を得るためには、多数の組換え体をスクリーニングする必要がある。しかし、受精卵では多数のスクリーニングを行うことが技術的に困難である。そこで、受精卵と同様に多分化能を有し、かつin vitroで培養することができる細胞を使用することが好ましい。分化全能性細胞としては、マウス（Nature 292:154-156, 1981）、ラット（Iannaccone, P.M. et al, Dev. Biol. 163(1): 288-292, 1994）、サル（Thomson, J.A. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92(17):7844-7848, 1995）、ウサギ（Schoonjans, L. et al, Mol. Reprod. Dev. 45(4):439-443, 1996）についてはES細胞等が確立している。また、ブタについてはEG(embryonic germ)細胞が確立している（Shim H. et al, Biol. Reprod 57(5):1089-1095, 1997）。【００２６】
従って本発明においては、これらの動物種を対象に作製することが好ましいが、特にノックアウト動物の作製に関して技術が整っているマウスが最適である。マウスES細胞としては、現在マウス由来のES細胞株がいくつか確立されており、例えばTT-2細胞株、AB-1細胞株、J1細胞株、R1細胞株等を使用することができる。これらのどのES細胞株を用いるかは、実験の目的又は方法により適宜選択することができる。【００２７】
ES細胞を樹立する場合、一般には受精後3.5日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより、効率よく多数の初期胚を取得することができる。【００２８】
このようにして得られたES細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる再生能を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、STO繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でLIF(１〜10000U/ml）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、5%炭酸ガス、95%空気または5%酸素、5%炭酸ガス、90%空気）で約37℃で培養し、継代時には、例えば、トリプシン/EDTA溶液処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などが採用される。このような継代は、通常1〜3日毎に行なうとともに、細胞の形態的観察を行うことが好ましい。【００２９】
ES細胞への遺伝子導入は、リン酸カルシウム共沈殿法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、レトロウイルス感染法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法などの方法を採用することができるが、簡便に多数の細胞を処理できる点でエレクトロポレーション法が好ましい。【００３０】
得られた組換えES細胞につき、相同組換えが起こっているかどうかのスクリーニングを行う。即ち、まずネオマイシン等を導入した薬剤耐性因子によりスクリーニングを行う。薬剤耐性遺伝子としては、例えばネオマイシンホスホトランスフェラーゼII(nptII)遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(hpt)遺伝子などが挙げられ、レポーター遺伝子としては、例えばβ-ガラクトシダーゼ(lacZ)遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(cat)遺伝子などが挙げられる。【００３１】
さらに、得られた組換えES細胞について、S1-5遺伝子上またはその近傍のDNA配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析、あるいは、ターゲティングベクター上のDNA配列と、ターゲティングベクターに使用したマウス由来のS1-5遺伝子以外の近傍領域のDNA配列とをプライマーとしたPCRを行うことにより、相同組換えが起こっているかを確実にスクリーニングすることが出来る。【００３２】
これらのアッセイにより、染色体上に存在する野生型S1-5遺伝子と導入したS1-5遺伝子断片の間で正しく相同遺伝子組換えが起こり、染色体上のS1-5遺伝子に変異が移った細胞を選択することができる。【００３３】
導入遺伝子の組込みが確認されたES細胞を同種の非ヒト哺乳動物由来の胚内に戻すことにより、宿主胚の細胞塊に組み込まれたキメラ胚が形成される。ES細胞を胚盤胞等の胚に導入する方法としては、マイクロインジュクション法や凝集法が知られているが、いずれの方法を用いることも可能であり、当業者が適宜改変することができる。【００３４】
マウスの場合には、ホルモン剤（例えば、FSH様作用を有するPMSGおよびLH作用を有するhCGを使用）により過排卵処理を施した雌マウスを、雄マウスと交配させる。その後、胚盤胞を用いる場合には受精から3.5日目に、8細胞期胚を用いる場合には2.5日目に、それぞれ子宮から初期発生胚を回収する。このようにして回収した胚に対して、ターゲティングベクターを用いて相同組換えを行ったES細胞をin vitroにおいて注入し、キメラ胚を作製する。あるいはマウス2日胚(8細胞期胚)の透明帯を取り除き、ES細胞と一緒に培養して凝集塊を作らせる。その凝集塊を一日培養すると胚盤胞になる。これらを仮親に移植して発生及び生育させることにより、キメラマウスが得られる。仮親とするための偽妊娠雌マウスは、正常性周期の雌マウスを、精管結紮などにより去勢した雄マウスと交配することにより得ることができる。作出した偽妊娠マウスに対して、上記の方法により作製したキメラ胚を子宮内移植し、妊娠・出産させることによりキメラマウスを作製することができる。キメラ胚の着床、妊娠がより確実に起こるようにするため、受精卵を採取する雌マウスと仮親となる偽妊娠マウスとを、同一の性周期にある雌マウス群から作出することが望ましい。【００３５】
そして、仮親から産まれた仔のうちキメラマウスを選ぶ。ES細胞移植胚に由来するマウス個体が得られた場合、このキメラマウスを野生型のマウスと交配し、そして次世代個体にES細胞由来の形質が表れるか否かを確認する。次世代個体にES細胞由来の形質が表れた場合に、ES細胞がキメラマウス生殖系列へ導入された可能性があるとみなすことができる。ES細胞が生殖系列へ導入されたことを確認するには、様々な形質を指標として用いることができるが、確認の容易さを考慮して、好ましくは被毛色を指標とすることが望ましい。マウスにおいては野ネズミ色（アグーチ色）、黒色、黄土色、チョコレート色および白色などの被毛色が知られている。また、体の一部（例えば尾部先端）から染色体DNAを抽出し、サザンブロット解析やPCRアッセイを行うことにより、選抜を行うこともまた可能である。キメラの寄与率が高いマウスは、ES細胞がキメラマウス生殖系列へ導入された可能性が高い。上記のようにして、キメラマウスを選抜した後に、該キメラマウスを野生型な雌と交配し、F1を得て変異マウス系統を樹立する。【００３６】
上記のようにして得られるキメラ動物は、相同染色体の一方にのみ遺伝子欠損を有するヘテロ接合体として得られる。相同染色体上の双方のS1-5遺伝子が欠損したホモ接合体であるノックアウト動物を得るには、F1動物のうち相同染色体の一方にのみ遺伝子欠損を有するヘテロ接合体同士を交雑すればよい。【００３７】
ノックアウト動物が得られたことの確認は、組織から染色体DNAを抽出し、サザンハイブリダイゼーション解析あるいはPCRで行う。また解剖を行った際の諸組織−臓器の異常を観察することもできる。さらに、組織からRNAを抽出し、ノザンブロット解析により遺伝子の発現パターンを解析することもできる。さらに、必要に応じて血液を採取し、血液検査や血清生化学的検査を実施することも可能である。【００３８】
ここで、ホモ接合体であるノックアウト動物を作製すると、胎性致死に至るなど、成体まで成長せずにモデル動物として適切でない場合がある。その場合は、必要な時期にノックアウトさせることが好ましい。また生体内でのある特定の組織における遺伝子の機能を調べるには組織特異的に遺伝子をノックアウトすることが好ましい。このように特定の時期・特定の細胞系列だけをノックアウトさせた動物、および体細胞の限定された領域のみでノックアウトさせた動物を、コンディショナルノックアウト動物という（バイオマニュアルシリーズ８,ジーンターゲティング : ES細胞を用いた変異マウスの作製,相沢慎一著,羊土社,1995）。【００３９】
コンディショナルノックアウト動物を作製するための手法として、例えば遺伝子ターゲティング法のためにバクテリオファージP1由来の組換えシステムであるCre-loxPシステム（R. Kuhn et al. Science, 269, 1427-1429, 1995）を使用することができる。Creは組換え酵素であり、loxPと呼ばれる34塩基の配列を認識して、この部位で組換えを起こさせることが可能となる。従って、ターゲティングしたい遺伝子をloxP配列とloxP配列との間にはさみ、Creリコンビナーゼ遺伝子を特異的プロモーター下流に組み込むことにより、部位特異的及び時期特異的にCreが産生されてloxPで挟んだ遺伝子を切り取る（すなわち、特定の部位、時期において目的遺伝子の機能を喪失させる）ことができる。本発明において、Cre-loxPのシステムを用いてターゲティングベクターを設計するにあたり、S1-5遺伝子の構造に変化をもたらす部位は、S1-5遺伝子の機能が欠損する限り、特に限定されるものではない。但し、S1-5遺伝子の機能及び構造を考慮して、S1-5遺伝子のEGF様ドメイン、またはフィブリン様ドメインの領域を欠失させるように設計することが特に好ましい。【００４０】
３． 非ヒトノックアウト動物から単離された細胞
本発明は、本発明のノックアウト動物から単離された細胞もまた提供する。本発明のノックアウト動物から単離された細胞は、後述のように、加齢性の疾患又は症状の予防又は治療薬のスクリーニングに用いることができる。
該細胞としては、破骨細胞、角化上皮細胞、血液細胞、癌細胞、骨髄細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、真皮細胞、筋細胞、神経細胞、骨芽細胞、リンパ球、血管平滑筋細胞、滑膜細胞、毛乳頭細胞、肝細胞、色素細胞、脂肪細胞、子宮内皮細胞、または肺胞上皮細胞が例示できるが、これらに限定されない。
これら細胞は、当業者に周知の方法によって、該ノックアウト動物から単離することが可能である。【００４１】
４．加齢性疾患
本発明の非ヒトノックアウト動物は、加齢性の疾患又は症状を呈するものである。既知の老化モデルマウスとしては、Klotho変異マウス（Kuro-o, M. et al., Nature,6;390(6655):18-19, 1997）、老化促進モデルマウス（SAM）（Takeda, T. et al., Mech Ageing Dev., 17(2), 183-194, 1981）、ウェルナー症候群モデルマウス(Chen, L. et al., J. Biomed Biotechnol., 2(2), 46-54, 2002 )が知られているが、これらのマウスは早期老化を示し、その寿命も短い。本発明の非ヒトノックアウト動物（例えばS1-5ノックアウトマウス）の一つの特徴としては、野生型マウスと比べ、寿命は変わらないが、多彩な加齢性の疾患又は症状の重篤化がみられることを挙げることが出来る。本発明において「加齢性の疾患又は症状」とは、骨変形、骨粗鬆症、脱毛、組織の損傷又は壊死、腫瘍、胸部肥大、腹水、貧血、出血、皮膚の老化（シミ、くすみ、たるみ、小じわ、ほくろ等）及び爪の老化などが挙げられ、これらの疾患又は症状が単独で又は併発して表れることを意味する。「骨変形」とは、加齢、RA、骨粗鬆症により骨軟骨の強度が低下し、骨および軟骨が変形することを意味する。「骨粗鬆症」とは骨成分が全体として減少し、骨折しやすくなった状態をいう。骨粗鬆症の90%以上を占めるのは明らかな原因疾患が見つからない原発性骨粗鬆症であり、そのほとんどが中高年に起こる退行期性のものである。また、それとは区別される続発性骨粗鬆症は、バセドウ氏病、クッシング症候群、重症糖尿病、RA、胃の手術、アルコール多飲、ステロイド剤服用などが原因となり発症する。「腫瘍」とは、悪性又は良性に関わらず、全ての腫瘍形成細胞成長及び増殖、及び全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。本発明の腫瘍は、原発性腫瘍であってもよいし、転移性腫瘍であってもよい。「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には制御できなくなった細胞成長を特徴とする生理学的状態をいう。本発明において、「腫瘍」の例としては、癌腫、肉腫、白血病および悪性リンパ腫を挙げることが出来る。本発明において、癌腫としては、乳癌、前立腺癌、大腸癌、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、結腸直腸癌、子宮体癌、唾液腺癌、腎臓癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝癌及び様々な種類の頭部及び頸部の癌を挙げることができる。本発明において、肉腫としては、悪性骨腫瘍、悪性軟部肉腫、より具体的には、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、脂肪肉腫、平滑筋肉腫、または滑膜肉腫等を挙げることが出来る。【００４２】
５．加齢性疾患の治療薬または予防薬のスクリーニング
本発明は、非ヒトノックアウト動物に候補物質を投与することを特徴とする、加齢性疾患又は症状の治療薬または予防薬のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法では、加齢性の疾患又は症状の予防又は治療薬の候補物質の中から、ノックアウト動物の表現型を相補する活性を有する物質を選択する。ノックアウト動物の表現型の相補には、完全な相補だけでなく、不完全な相補も含まれる。【００４３】
具体的には、本発明のノックアウト動物又はその一部に候補物質を接触させ、前記候補物質を接触させた非ヒト動物又はその一部において標的とする疾患と相関関係を有する指標値を測定し、対照と比較し、この比較結果に基づき、候補物質の所望の加齢性疾患に対する効果を評価する。例えば、骨密度の上昇、抗腫瘍効果、血液細胞等の増加、止血能の向上、破骨細胞の活性抑制等を指標として候補物質の予防・治療・改善効果を試験することができる。また、皮膚の老化（シミ、くすみ、たるみ、小じわ、ほくろ等）を引き起こした動物に、美白及びアンチエイジング効果をもたらす化粧品をスクリーニングするために試験することも可能である。【００４４】
「ノックアウト動物又はその一部」とは、動物の生体の全身、及び限定された組織又は臓器の両者を含む。限定された組織又は臓器の場合は、動物から摘出されたものも含む。【００４５】
候補物質としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。これら候補物質は塩を形成していてもよく、候補物質の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。【００４６】
試験動物を候補物質で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射、塗布、皮下投与、皮内投与、腹腔投与などが用いられ、試験動物の症状、候補物質の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、候補物質の投与量は、投与方法、候補物質の性質などにあわせて適宜選択することができる。【００４７】
例えば、骨粗鬆症の予防・治療・改善薬をスクリーニングする場合、本発明のノックアウト動物等に候補物質を投与し、該動物の骨密度値、X線写真および体重変化などを経時的に測定することにより、有効性を示した物質をスクリーニングすることができる。特に本発明により、ノックアウト動物では骨粗鬆症と背骨の後弯が相関を持つことから、ノックアウト動物における後弯の程度が骨粗鬆症の進行度を測る一つの指標となることが明らかとなった。これらのことから、本発明のノックアウト動物に候補物質を投与し、該動物の背骨の後弯の程度をX線写真等で経時的に測定することにより、候補物質が骨粗鬆症に有効性を示すか否かを非侵襲的に効率良く判断することが出来る。【００４８】
また、本発明のノックアウト動物から単離された細胞を使用することで、加齢性の疾患又は症状の予防又は治療薬のスクリーニングが可能である。具体的には、本発明のノックアウト動物から単離された細胞に、加齢性の疾患又は症状の予防又は治療薬の候補物質を接触させる工程を含む、当該予防又は治療薬のスクリーニング方法を提供する。【００４９】
本発明において、「接触」は、例えば、本発明のノックアウト動物から単離された細胞の培養液に、該候補物質を添加することにより行うことができる。また、該候補物質がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質をコードするDNAを含むベクターを、ノックアウト動物から単離された細胞へ導入することで行うことも可能である。【００５０】
本発明では、加齢性の疾患又は症状の予防又は治療薬の候補物質の中から、ノックアウト動物から単離された細胞の表現型を相補する活性を有する物質を選択する。ノックアウト動物から単離された細胞の表現型としては、特に制限はないが、破骨細胞であれば破骨細胞活性抑制、骨髄細胞であれば破骨細胞形成抑制、角化上皮細胞であれば角化上皮細胞増殖、血液細胞であれば血液細胞分化促進、癌細胞であれば癌細胞増殖抑制、線維芽細胞であれば線維芽細胞増殖、血管内皮細胞であれば血管内皮細胞増殖、真皮細胞であれば毛髪形成、筋細胞であれば筋細胞変性の是正、神経細胞であれば神経細胞変性の是正、骨芽細胞であれば骨芽細胞増殖・分化促進、リンパ球であればリンパ球活性化抑制、血管平滑筋細胞であれば増殖抑制、滑膜細胞であれば機能正常化、毛乳頭細胞であれば発毛、肝細胞であれば機能正常化、色素細胞であればメラニン産生抑制、肺胞細胞であれば活性化異常是正、脂肪細胞であれば分化増殖抑制、子宮内皮細胞であれば内皮細胞増殖抑制等が例示できる。また、該細胞の表現型の相補には、完全な相補だけでなく、不完全な相補も含まれる。【００５１】
６．破骨細胞の機能抑制剤のスクリーニング
本発明は、ノックアウト動物から単離された破骨細胞に、破骨細胞の機能抑制剤の候補物質を接触させる工程を含む、当該破骨細胞の機能抑制剤のスクリーニング方法もまた提供する。「破骨細胞の機能」としては、吸収窩形成機能（吸収窩形成活性）、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（TRAP）陽性細胞形成抑制機能（TRAP陽性細胞形成抑制活性）が例示できるが、これらに限定されるものではなく、その機能が直接的又は間接的に骨の破壊を導く機能である限り、「破骨細胞の機能」に含まれる。【００５２】
破骨細胞の機能抑制剤は、例えば、本発明のノックアウト動物から単離された破骨細胞の形成数の程度、大きさ、TRAP活性値等を指標にスクリーニングすることができるが、この方法に限定されず、例えば、実施例に示すように、本発明のノックアウト動物から単離した骨髄細胞を多核巨細胞に分化させてTRAP陽性多核巨細胞数及びTRAP陽性多核巨細胞の大きさ等を指標にスクリーニングすることが可能である（Takahashi N. et al., Endocrinology,123(5):2600-2, 1988、Yasuda H. et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 31;95(7), 3597-602, 1998）。【００５３】
また、破骨細胞の機能抑制剤は、pit assay系においては吸収窩形成活性を指標にスクリーニングすることが可能である（Hirayama, T. et al, J Endocrinol. 2002 Oct;175(1):155-63、Udagawa, N. et al, Bone. 1999 Nov;25(5):517-23）。【００５４】
該スクリーニング方法によって選択される破骨細胞の活性を抑制する物質は、破骨細胞の機能抑制剤として、研究分野や医薬分野において使用できる。また、本発明の破骨細胞の活性抑制は、加齢性の疾患又は症状の予防又は治療薬として応用可能である。【００５５】
また、RA患者の骨破壊部において、増殖した滑膜が、骨内へと侵入していく最前線を病理学的に検討すると、多数の多核巨細胞が観察される。この細胞は、TRAP陽性、すなわち、破骨細胞としての表現型をみたすことが明らかになっており、RA骨破壊において破骨細胞が重要な役割を果たしていることが推察される（Arthritis Rheum. Mar;50(3):794-804, 2004、Biochem Biophys Res Commun. Nov 17;240(2):279-86, 1997）。従って、本発明の破骨細胞の機能抑制剤は、RAの予防又は治療薬としても利用することができる。【００５６】
７．単離されたS1-5タンパク質
本発明は、１）配列番号：１または３に記載の塩基配列のコード領域を含むDNAによりコードされる単離されたS1-5タンパク質、および、２）配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列を含む単離されたS1-5タンパク質を提供する。ここで「単離」とは、天然の環境から取り出された状態を指す。【００５７】
上記タンパク質は、例えば、組換え体として調製することもできる。例えば、ヒトS1-5タンパク質であれば、ヒトS1-5タンパク質を発現している細胞（例えば、ヒト2倍体繊維芽細胞（human diploid fibroblast）、滑膜組織や培養細胞として回収したRA患者に由来する滑膜細胞）から抽出したmRNAをもとにcDNAライブラリーを得る（Short, J.M. et al., Nucleic Acid Research, 16, 7583, 1988）。配列番号：１に示した塩基配列に基づいて設定したプローブを用いて、このライブラリーからハイブリダイズするクローンをスクリーニングすることによって、S1-5タンパク質をコードするDNAを単離することができる。該DNAからコードされるS1-5タンパク質は、当業者に周知のタンパク質発現系を利用することで得ることができる。また、ヒトS1-5タンパク質は、ヒトS1-5タンパク質を発現している細胞の培養物から回収・精製できる。【００５８】
本発明はまた、上記S1-5タンパク質と機能的に同等なタンパク質も提供する。このようなタンパク質が由来する生物種は、特に制限はなく、例えば、ヒト、ゼブラフィッシュ、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ウシ、サル、及びチンパンジー等が例示できる。【００５９】
上記S1-5タンパク質と機能的に同等なタンパク質としては、例えば、１）配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等な単離されたタンパク質、および、２）配列番号：１または３に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるタンパク質であって、配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等な単離されたタンパク質が挙げられる。
上記S1-5タンパク質と機能的に同等なタンパク質としては、ヒトの加齢性の疾患又は症状を抑制する機能を有するタンパク質、本発明のノックアウト動物、または本発明のノックアウト動物から単離された細胞の表現型を相補する機能を有するタンパク質が挙げられる。【００６０】
また、上記S1-5タンパク質と機能的に同等なタンパク質としては、免疫学的に同等なタンパク質を挙げることが出来る。本発明において「S1-5タンパク質と免疫学的に同等なタンパク質」とは、S1-5タンパク質を特異的に認識する抗体と反応するものであれば、特に限定されない。例えば、S1-5タンパク質のエピトープペプチド、該エピトープを含有するS1-5タンパク質のドメイン、あるいは該ドメインを含むタンパク質を、S1-5タンパク質と免疫学的に同等なタンパク質として挙げることができる。【００６１】
S1-5タンパク質の断片は、プロテアーゼを使った消化により得ることができる。また、配列番号：１または３に示したS1-5タンパク質をコードするDNAをランダムに切断し、それをファージベクターに挿入してドメインペプチドを提示したファージライブラリーを作成することによっても得ることができる。これらのライブラリーを、S1-5タンパク質を認識する抗体でイムノスクリーニングすれば、免疫学的に活性なドメインを決定することができる。クローニングしたファージについて、挿入断片の塩基配列を決定すれば、活性ドメインのアミノ酸配列も明らかにすることができる。【００６２】
本発明によるS1-5タンパク質と機能的に同等なタンパク質は、免疫学的な特性のみならずシノビオリンとの結合特性に基づいても定義される。すなわち本発明は、シノビオリンとの親和性を備えるS1-5タンパク質の断片を含む。このような変異体は、シノビオリンを使って候補タンパク質をスクリーニングすることによって当業者であれば容易に選択することができる。たとえば、S1-5タンパク質は、シノビオリンのcDNAにおいて1233-1592番目に相当する120アミノ酸残基をシノビオリンとの結合に必要な領域として要求する。したがって、この領域を構成するアミノ酸配列からなるタンパク質、あるいはこのアミノ酸配列を含むタンパク質に結合するタンパク質は、本発明によるS1-5タンパク質と機能的に同等なタンパク質を構成する。【００６３】
加えて本発明によるS1-5タンパク質と機能的に同等なタンパク質は、S1-5タンパク質が有する生化学的な活性に基づいても定義される。S1-5タンパク質の生化学的な活性とは、たとえば破骨細胞形成抑制活性、細胞増殖制御活性を示すことができる（Lecka-Czernik, B., Mol. Cell. Biol. 1995 15: 120-128）。【００６４】
これらのS1-5タンパク質に機能的に同等なタンパク質は、他のタンパク質との融合タンパク質とすることができる。たとえば、FLAGタグ、HAタグ、あるいはヒスチジンタグなどの付加的なアミノ酸配列が付加され、前記S1-5タンパク質に機能的に同等なタンパク質としての少なくとも一つの性状を維持したタンパク質は、前記機能的に同等なタンパク質に含まれる。付加するタンパク質が、S1-5タンパク質とは異なる活性を有している場合も、S1-5タンパク質が有する少なくとも一つの機能を維持している場合には、その融合タンパク質は、本発明における機能的に同等なタンパク質に含まれる。【００６５】
上記S1-5タンパク質と機能的に同等なタンパク質は、当業者によって公知の方法（実験医学別冊・遺伝子工学ハンドブック, pp246-251、羊土社、1991年発行）で単離することができる。たとえば所望のライブラリーを対象に、配列番号：１または３に示す塩基配列（またはその断片）をプローブとしてスクリーニングすれば、相同性の高い塩基配列を持ったDNAをクローニングすることが可能である。このようなライブラリーとしては、配列番号：１または３の塩基配列に対してランダムに変異を入れたもの、ヒトやヒト以外の種に由来する滑膜組織のcDNAライブラリー等を示すことができる。【００６６】
与えられた塩基配列に対してランダムに変異を加える方法としては、たとえばDNAの亜硝酸処理による塩基対の置換が知られている（Hirose, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 79:7258-7260, 1982）。この方法では、変異を導入したいセグメントを亜硝酸処理することにより、特定のセグメント内にランダムに塩基対の置換を導入することができる。あるいはまた、目的とする変異を任意の場所にもたらす技術としてはgapped duplex法等がある（Kramer W. and Fritz HJ., Methods in Enzymol., 154:350-367, 1987）。変異を導入すべき遺伝子をクローニングした環状２本鎖のベクターを１本鎖とし、目的とする部位に変異を持つ合成オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる。制限酵素により切断して線状化させたベクター由来の相補１本鎖DNAを、前記環状１本鎖ベクターにアニールさせ、前記合成ヌクレオチドとの間のギャップをDNAポリメラーゼで充填し、更にライゲーションすることにより完全な２本鎖環状ベクターとする。【００６７】
改変されるアミノ酸の数は、典型的には50アミノ酸以内であり、好ましくは30アミノ酸以内であり、さらに好ましくは5アミノ酸以内（例えば、1アミノ酸）であると考えられる。【００６８】
アミノ酸を人為的に置換する場合、性質の似たアミノ酸に置換すれば、もとのタンパク質の活性が維持されやすいと考えられる。本発明のタンパク質には、上記アミノ酸置換において保存的置換が加えられたタンパク質であって、ヒトS1-5タンパク質タンパク質（配列番号：２または４）と機能的に同等なタンパク質が含まれる。保存的置換は、タンパク質の活性に重要なドメインのアミノ酸を置換する場合などにおいて重要であると考えられる。このようなアミノ酸の保存的置換は、当業者にはよく知られている。【００６９】
保存的置換に相当するアミノ酸のグループとしては、例えば、塩基性アミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸 (例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性アミノ酸 (例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性アミノ酸 (例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐アミノ酸 (例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族アミノ酸 (例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）などが挙げられる。
また、非保存的置換によりタンパク質の活性などをより上昇（例えば恒常的活性化型タンパク質などを含む）または下降（例えばドミナントネガティブなどを含む）させることも考えられる。【００７０】
配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質は、天然に存在するタンパク質を含む。一般に真核生物の遺伝子は、インターフェロン遺伝子等で知られているように、多型現象(polymorphism)を有する。この多型現象によって生じた塩基配列の変化によって、１または複数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加される場合がある。このように自然に存在するタンパク質であって、かつ配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質は、本発明に含まれる。【００７１】
あるいは多型現象によって塩基配列に変化はあっても、アミノ酸配列が変わらない場合もある。このような塩基配列の変異は、サイレント変異と呼ばれる。サイレント変異を有する塩基配列からなるDNAよりコードされるタンパク質も、本発明に含まれる。なおここで言う多型現象とは、集団内において、ある遺伝子が個体間で異なる塩基配列を有することを言う。多型現象は、異なる遺伝子が見出される割合とは無関係である。【００７２】
この他、S1-5タンパク質と機能的に同等なタンパク質を得る方法として、ハイブリダイゼーションを利用する方法を挙げることができる。すなわち、配列番号：１または３に示すような本発明によるS1-5タンパク質をコードするDNA、あるいはその断片をプローブとし、これとハイブリダイズすることができるDNAを単離するのである。ハイブリダイゼーションをストリンジェントな条件下で実施すれば、塩基配列としては相同性の高いDNAが選択され、その結果として単離されるタンパク質にはS1-5タンパク質と機能的に同等なタンパク質が含まれる可能性が高まる。相同性の高い塩基配列とは、たとえば70%以上、望ましくは90%以上の同一性を示すことができる。【００７３】
なおストリンジェントな条件とは、具体的には例えば 6×SSC、40%ホルムアミド、25℃でのハイブリダイゼーションと、1×SSC、55℃での洗浄といった条件を示すことができる。ストリンジェンシーは、塩濃度、ホルムアミドの濃度、あるいは温度といった条件に左右されるが、当業者であればこれらの条件を必要なストリンジェンシーを得られるように設定することは自明である。【００７４】
ハイブリダイゼーションを利用することによって、たとえばヒト以外の動物種におけるS1-5タンパク質のホモログをコードするDNAの単離が可能である。ヒト以外の動物種、すなわちゼブラフィッシュ、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ウシ、サル、及びチンパンジー等の動物種から得ることができるDNAがコードするS1-5タンパク質のホモログは、本発明における機能的に同等なタンパク質を構成する。【００７５】
上記S1-5タンパク質（配列番号：２または４）に変異を導入して得たタンパク質や、上記のようなハイブリダイゼーション技術等を利用して単離されるDNAがコードするタンパク質は、通常、上記S1-5タンパク質（配列番号：２または４）とアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも30％以上、好ましくは50％以上、さらに好ましくは80％以上（例えば、95％以上）の配列の同一性を指す。塩基配列やアミノ酸配列の同一性は、インターネットを利用したホモロジー検索サイトを利用して行うことができる［例えば日本DNAデータバンク（DDBJ）において、FASTA、BLAST、PSI-BLAST、および SSEARCH 等の相同性検索が利用できる［例えば日本DNAデータバンク（DDBJ）のウェブサイトの相同性検索（Search and Analysis）のページ ; http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/homology-j.html］。また、National Center for Biotechnology Information (NCBI) において、BLASTを用いた検索を行うことができる（例えばNCBIのホームページのウェブサイトのBLASTのページ; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/; Altschul, S.F. et al., J. Mol. Biol., 1990, 215(3):403-10; Altschul, S.F. & Gish, W., Meth. Enzymol., 1996, 266:460-480; Altschul, S.F. et al., Nucleic Acids Res., 1997, 25:3389-3402）］。【００７６】
例えば Advanced BLAST 2.1におけるアミノ酸配列の同一性の算出は、プログラムにblastpを用い、Expect値を10、Filterは全てOFFにして、MatrixにBLOSUM62を用い、Gap existence cost、Per residue gap cost、および Lambda ratioをそれぞれ 11、1、0.85（デフォルト値）に設定して検索を行い、同一性（identity）の値（%）を得ることができる（Karlin, S. and S. F. Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68; Karlin, S. and S. F. Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-7）。【００７７】
本発明によるタンパク質、またはその機能的に同等なタンパク質は、糖鎖等の生理的な修飾、蛍光や放射性物質のような標識、あるいは他のタンパク質との融合といった各種の修飾を加えたタンパク質であることができる。ことに後に述べる遺伝子組換え体においては、発現させる宿主によって糖鎖による修飾に差異が生じる可能性がある。しかしたとえ糖鎖の修飾に違いを持っていても、本明細書中に開示されたS1-5タンパク質タンパク質と同様の性状を示すものであれば、いずれも本発明によるS1-5タンパク質、または機能的に同等なタンパク質である。【００７８】
S1-5タンパク質は、生体材料のみならず、これをコードする遺伝子を適当な発現系に組み込んで遺伝子組換え体（recombinant）として得ることもできる。S1-5タンパク質を遺伝子工学的な手法によって得るためには、先に述べたS1-5タンパク質をコードするDNAを適当な発現系に組み込んで発現させれば良い。本発明に応用可能なホスト／ベクター系としては、例えば、発現ベクターpGEXと大腸菌を示すことができる。pGEXは外来遺伝子をグルタチオン S-トランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質として発現させることができる（Gene, 67:31-40, 1988）ので、S1-5タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだpGEXをヒートショックでBL21のような大腸菌株に導入し、適当な培養時間の後に isopropylthio-β-D-galactoside（IPTG）を添加してGST融合S1-5タンパク質の発現を誘導する。S1-5タンパク質をコードする遺伝子は、滑膜細胞のcDNAライブラリー等を鋳型としてPCR等で増幅することにより得ることができる。本発明によるGSTはグルタチオンセファロース4Bに吸着するため、発現生成物はアフィニティクロマトグラフィーによって容易に分離・精製することが可能である。【００７９】
S1-5タンパク質の recombinant を得るためのホスト／ベクター系としては、この他にも次のようなものを応用することができる。まず細菌をホストに利用する場合には、ヒスチジンタグ、HAタグ、FLAGタグ等を利用した融合タンパクの発現用ベクターが市販されている。酵母では、Pichia属酵母が糖鎖を備えたタンパク質の発現に有効なことが公知である。糖鎖の付加という点では、昆虫細胞をホストとするバキュロウイルスベクターを利用した発現系も有用である（Bio/Technology, 6:47-55, 1988）。更に、哺乳動物の細胞を利用して、CMV、RSV、あるいはSV40等のプロモーターを利用したベクターのトランスフェクションが行われており、これらのホスト／ベクター系は、いずれもS1-5タンパク質の発現系として利用することができる。また、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等のウイルスベクターを利用して遺伝子を導入することもできる。【００８０】
得られた本発明のタンパク質は、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一なタンパク質として精製することができる。タンパク質の分離、精製は、通常のタンパク質の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればタンパク質を分離、精製することができる。【００８１】
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Marshak et al., Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。【００８２】
本発明のタンパク質は、無細胞系以外の発現系を用いることが好ましい。また、本発明のタンパク質は、生理的な高次構造、糖鎖付加、ジスルフィド結合、脂質付加、メチル化等の修飾が加えられたものが好ましい。また、本発明のタンパク質は、実質的に精製されたタンパク質であることが好ましい。ここで「実質的に精製された」とは、本発明のタンパク質の精製度（タンパク質成分全体における本発明のタンパク質の割合）が、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、100％若しくは100％に近いことを意味する。100％に近い上限は当業者の精製技術や分析技術に依存するが、例えば、99.999％、99.99％、99.9％、99％などである。【００８３】
また、上記の精製度を有するものであれば、如何なる精製方法によって精製されたものでも、実質的に精製されたタンパク質に含まれる。例えば、上述のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、または組み合わせることにより、実質的に精製されたタンパク質を例示できるが、これらに限定されるものではない。【００８４】
また、本発明は、上述した本発明のタンパク質の部分ペプチド（部分断片）もまた提供する。該部分ペプチドは、本発明のタンパク質と機能的に同等なものであれば、その長さ等は特に制限されない。本発明の部分ペプチドとしては、配列番号：６に記載のアミノ酸配列を含むペプチドであって、本発明のタンパク質より短いペプチドが例示できる。このようなペプチドを利用することで、加齢性の疾患又は症状の予防又は治療を行うことができ、また破骨細胞の活性を抑制することもできる。【００８５】
８．薬剤
本発明は、本発明のタンパク質またはその部分ペプチド（以下タンパク質等と称する）を含有する、加齢性の疾患又は症状の予防又は治療薬を提供する。「加齢性の疾患又は症状」は上記の通りである。さらに、本発明は、本発明のタンパク質等を含有する、破骨細胞の機能抑制剤を提供する。これら薬剤におけるタンパク質等は、単離されたものであれば、その状態に特に制限はなく、上記薬剤として使用できる限り、実質的に精製されたタンパク質等でも、クルードな状態のタンパク質等でも使用することができる。【００８６】
これら薬剤は、ヒトやヒト以外の動物（例えば実験動物、畜産動物、愛玩動物等）の加齢性の疾患又は症状の予防又は治療薬として、また破骨細胞の機能抑制剤として利用することができる。【００８７】
本発明のタンパク質は、例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、例えば、滅菌水や生理食塩水、安定剤、賦形剤、防腐剤、界面活性剤、キレート剤(EDTA等)、結合剤等などと適宜組み合わせて製剤化して投与することが考えられる。【００８８】
本発明の薬剤の形態（剤形）としては、注射剤形、凍結乾燥剤形、溶液剤形などが例示できるが、これらに限定されるものではない。【００８９】
患者への投与は経口、非経口投与のいずれでも可能であるが、好ましくは非経口投与であり、例えば、注射投与が可能である。注射投与の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。【００９０】
投与量は、患者の体重や年齢、投与方法、症状などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。一般的な投与量は、薬剤の有効血中濃度や代謝時間により異なるが、１日の維持量として約0.1mg/kg〜約1.0g/kg、好ましくは約0.1mg/kg〜約10mg/kg、より好ましくは約0.1mg/kg〜約1.0mg/kgであると考えられる。投与は１回から数回に分けて行うことができる。【００９１】
９．抗体
本発明は、S1-5タンパク質等を認識する抗体を提供する。本発明によるS1-5タンパク質あるいはその断片を免疫原として、公知の方法によりS1-5タンパク質等の抗体を得ることができる（Harlow, E. & Lane, D.; Antibodies; A Laboratry manual. Cold Spring Harbor, New York, 1988、Kohler, G. & Milstein, C., Nature 256: 495-7, 1975）。【００９２】
免疫には、本発明のS1-5タンパク質またはその断片を適当なアジュバントとともに免疫動物に免疫する。S1-5タンパク質の断片は、担体蛋白質と結合させて免疫原とすることも可能である。免疫原を得るための担体蛋白質には、スカシガイヘモシアニン(KLH)、あるいはウシ血清アルブミン(BSA)等を用いることができる。【００９３】
免疫動物には、ウサギ、マウス、ラット、ヤギ、あるいはヒツジなどが一般に利用される。アジュバントとしては、フロイントのコンプリートアジュバント（FCA）等が一般に用いられる（Adv. Tubercl. Res., 1:130-148, 1956）。適当な間隔で免疫を追加し、抗体価の上昇を確認したところで採血し抗血清を得ることができる。更にその抗体画分を精製すれば、精製抗体（ポリクローナル抗体）とすることもできる。【００９４】
あるいはまた、抗体産生細胞を採取して細胞融合法などによりクローニングすれば、モノクローナル抗体を得ることもできる。モノクローナル抗体はイムノアッセイにおいて高い感度と特異性を達成するための重要なツールである。また、別の方法として、シノビオリンをコードするDNAをランダムに切断し、それをファージベクターに挿入してドメインペプチドを提示したファージライブラリーを作成することによってもS1-5タンパク質等を認識する抗体を得ることが出来る。これらのライブラリーを、シノビオリンを認識する抗体でイムノスクリーニングすれば、免疫学的に活性を持つドメインを決定することが出来る。【００９５】
抗体産生細胞としては、免疫動物に由来するものを利用することもできる。更に、こうして得られた免疫動物に由来するモノクローナル抗体産生細胞の抗体遺伝子をもとに、キメラ抗体やヒト化抗体の構築が可能である。抗体をヒトに投与する場合、動物の抗体は異物として排除されるため望ましくない。そこで抗原性の強い抗体の定常領域をヒトの抗体で置換したキメラ抗体や、あるいは定常領域のみならず可変領域のフレームワークまでヒトの遺伝子で置換したヒト化抗体が必要になる。【００９６】
本発明に基づいて提供されるS1-5タンパク質等を認識するキメラ抗体、あるいはヒト化抗体は、薬物移送システム（Drug Delivery System; DDS）に有用である。本発明によるS1-5タンパク質等を認識する抗体を使ったDDSにおいて、抗体とリンクさせることにより有用性が期待できる物質としては、Fasリガンドや、抗シノビオリン抗体などを示すことができる。【００９７】
また、本発明の抗体は、S1-5タンパク質等の免疫学的検出用試薬とすることができる。組織や血中に存在するタンパク質等を、抗体を用いて免疫学的に検出する方法は公知である。【００９８】
また本発明の抗体は、S1-5タンパク質等、またはS1-5タンパク質等を発現する細胞の分離あるいは検出に利用することができる。抗体を用いたタンパク質等の単離精製方法は、当業者に周知である。また、本発明のS1-5タンパク質等は、滑膜細胞やヒト2倍体繊維芽細胞のマーカーとして使用されうる。すなわちS1-5タンパク質等の発現を指標に、滑膜細胞やヒト2倍体繊維芽細胞を検出したり分離したりすることができる。抗体は適宜蛍光等により標識される。例えば、S1-5タンパク質等に対する抗体を用い、セルソーティング等によりS1-5タンパク質等を発現する細胞を分離することができる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。【００９９】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０１００】
S1-5遺伝子のクローニング及びターゲティングベクターの作製
RA患者滑膜細胞由来のcDNA発現ライブラリーを用いて、シノビオリンに結合する因子のスクリーニングを行った（竹縄忠臣、渡邉俊樹編、バイオマニュアルUPシリーズ"タンパク質の分子間相互作用実験法"、pp. 66-67、羊土社; Kaelin, W. G. et al., Cell 70, 351-364, 1992; Skolnik, E. Y. et al., Cell 65, 83-90, 1991; Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, a laboratory manual second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press 12.16-12.20, 1989）。ライブラリーファージを大腸菌（XL1-Blue MRF'）に37 ℃20分間インキュベートして感染させ、Topアガロースと混和後プレートに広げた。42 ℃で3.5時間培養後、10mM IPTG に浸漬した後乾燥させたニトロセルロースメンブレンをプレートに載せ、さらに37℃で3.5 時間培養を行った。メンブレンを回収後、洗浄バッファー［10 mM Tris-HCl (pH8.0), 0.5% Skim milk, 0.1% TritonX-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, protease inhibitor（complete, Boehringer Mannheim社）］で5分間の洗浄を5回行った後、ブロッキングバッファー［10 mM Tris-HCl (pH8.0), 5% Skim milk, 0.1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 5% glycerol, protease inhibitor（complete, Boehringer Mannheim社）］に1時間浸漬した。洗浄バッファーで5分間の洗浄を5回行った後、プロテインキナーゼAで 32Pラベルした GST-シノビオリンをプローブとして加え（約106 cpm/ml）、インキュベートした。メンブレン1枚のカウントが約1 kcpmになるまで洗浄バッファーを変えながら洗浄を繰り返し、オートラジオグラフィーによりシグナルを検出した。その結果、シノビオリンに結合するクローンが得られた。このcDNAについて、その5'末端付近の100 bp、ならびに3'末端付近の100 bpについて塩基配列を決定した。得られた塩基配列情報を基にデータベースの検索を行ったところ、末端部分の100bpにおいてはS1-5（EFEMP-1、FBNL、またはFBLN-3とも呼ばれる）［Lecka-Czernik, B. et al., Molecular and Cellular Biology, 15, 120-128, 1995; accession number U03877 (cDNA), AAA65590 (protein)、Stone, E. M. et al., Nature Genetics 22, 199-202, 1999; accession number Q12805 (protein)］と呼ばれる公知の遺伝子と共通の配列であることが明らかとなった。両者の遺伝子とその翻訳産物の大きさはほぼ同じであり、同一のタンパク質であることが示唆された。本発明において、ヒトS1-5のcDNA配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号：１および２に示す。【０１０１】
マウスS1-5遺伝子断片の翻訳開始点（第一メチオニンを翻訳するATGコドン）にlacZ遺伝子を導入し、ターゲティングベクターを構築した。マーカー遺伝子としてネオマイシン耐性（neo）遺伝子を導入し、またジフテリア毒素A（DT-A）遺伝子も結合させ非相同的な組換えを起こした細胞株を排除できるようにした。本発明において、マウスS1-5のcDNA配列、アミノ酸配列およびゲノム配列を、それぞれ、配列番号：３、４および５に示す。
【実施例２】
【０１０２】
S1-5ノックアウトマウスの作製
実施例１のターゲティングベクターをマウスのTT-2細胞株にエレクトロポレーションにより導入し相同組換えを生じた細胞株を選抜した。得られた細胞を8細胞期胚に注入し直接仮親の卵管に移植するか、または一日培養して胚盤胞まで発生したものを仮親の子官に移植した。得られたヘテロ変異マウス（F1）同士を交配させ、ヘテロ及びホモ変異マウスを得た。こうして得られた変異マウスにおいては、本来S1-5が発現すべき組織で、S1-5に代わってLacZタンパク質（β-ガラクトシダーゼ）が発現する。【０１０３】
遺伝子型はサザンブロット解析により確認した。生後2週齢ほどのマウスの尾先端3mm程度からDNAを抽出し、得られたDNAを制限酵素BamHIでDNAを消化したものを用いた。野生型では2.4 kbp、ホモ変異マウスでは5.4 kbp、ヘテロ変異マウスでは両方の位置にバンドが検出された。また、ノーザンブロット解析により、S1-5遺伝子のmRNAの発現を確認した所、該遺伝子のmRNAの発現は確認されなかった。
【実施例３】
【０１０４】
S1-5ノックアウト動物の解析
13〜117週齢（3〜29ヶ月齢）のS1-5ノックアウトマウスについて、剖検およびX線写真による解析を行なったところ、高齢マウス（8ヶ月〜）において、背骨の後弯、骨量の減少、脱毛、顔面部の皮膚に傷、爪の壊死、胸部肥大、腹水、肝臓の腫瘍、眼底および脂肪組織内の出血塊、子宮肥大が見られた（図１〜６）。
【実施例４】
【０１０５】
S1-5ノックアウト動物の止血の解析8週齢〜111週齢（26ヶ月齢）のS1-5ノックアウトマウスについて、尾部を切断し、10秒ごとに湧出する血液をろ紙にて吸い取り、止血の程度を検討した。その結果、S1-5ノックアウトマウスにおいては、止血されにくい傾向にあることがわかった（図７）。
【実施例５】
【０１０６】
S1-5ノックアウト動物のヘマトクリット値解析
ヘマトクリット値測定用毛細管（Capillary tubes for microhematocrits 75 mm length heparinized, Drummond Scientific Co.）の一端を血液の中に入れ、適当な傾斜を保ち、毛細管現象で血液を上げ、毛細管全長の２／３に達するまで採血した。次いで、パテにて、血液を吸引した一端を封じた。一端を封じた毛細管を、遠心器で、11000 rpm、５分間遠心した後、計測板を用いて割合（％）を読んだ。その結果、S1-5ノックアウトマウスでは、ヘマトクリット値が低い傾向にあり、貧血状態であることがわかった（図８〜９）。
【実施例６】
【０１０７】
S1-5ノックアウト動物の末梢血のギムザ染色
15〜110週齢のS1-5ノックアウトマウスを用いて、尾静脈から採血後、PBSにて1000倍希釈し、サイトスピン（800 rpm、5分）を行ない、末梢血のギムザ染色を行なった。その結果、S1-5ノックアウトマウスにおいては貧血がみられ、具体的には、赤血球数の減少、赤血球の異常（環状赤血球）、染色性の違いが観察された（図１０）。
【実施例７】
【０１０８】
S1-5ノックアウトマウスの解析
S1-5ノックアウトマウスにおいて背骨の弯曲を数値化するために、X線写真を用いて弯曲している角度を計測した。その結果、野生型マウスでは95°以下の角度を示す個体は少なかったのに対し、S1-5ノックアウトマウスでは95°以下の角度を示す個体が頻出していた。そこで95°以下を後弯発症と定義し、２１週齢毎に発症率をまとめた。雄と比較して雌の方がより発症頻度が高く、また発症時期も22週齢頃からと早期から認められた(図１１、１２)。さらに骨吸収マーカーとなるNTｘ（type I collagen cross-linked N-telopeptide）を測定した結果、S1-5ノックアウトマウス雌において43週齢以降にこの値が高値を示すことが明らかとなり(図１３、１４)、S1-5ノックアウトマウスでは骨吸収が亢進していることが示唆された。なお、血清中あるいは尿中のNTxを測定することで、骨密度の低下を予測できる。NTxと骨密度は逆相関を示すことが知られている (Taguchi Y et al., Calcif Tissue Int 62; 395-399, 1998)。
【実施例８】
【０１０９】
S1-5ノックアウトマウスの骨組織の解析
S1-5ノックアウトマウスでは骨組織に異常が認められたため、エルクコーポレーションにてpQCT （peripheral quantitative Computed Tomography）を測定し詳細な解析を行った。その結果、S1-5ノックアウトマウスにおいては骨塩量・骨密度の低下が認められた（図１５）。この現象は特に雌個体において顕著であった。また、極座標断面係数は野生型マウスに比べS1-5ノックアウトマウスで顕著に減少しており、骨強度が低下していることが明らかとなった。
さらにTRAP染色を行い、組織中における破骨細胞数の確認を行った。また、等倍で撮影した各ウェルの画像をコンピューターに取り込み、Image J（NIHより配布）にて破骨細胞に相当する部分を線で囲み、その面積をピクセルで算出した。その結果、S1-5ノックアウトマウスにおいては破骨細胞数が増加し（図16A）、その大きさも大きくなっていた（図16B）。
【実施例９】
【０１１０】
S1-5ノックアウトマウス由来骨髄細胞における破骨細胞形成能の解析
S1-5ノックアウトマウス由来骨髄細胞を用いて、in vitroでの破骨細胞形成能の解析を行った。骨髄細胞1×105個を96ウェルプレートに播種し、M-CSF(macrophage colony stimulating facter)を終濃度50 ng/mLとなるように添加し、2日後にRANKL( Receptor Activator of NF-κB Ligand)を終濃度10,30,100 ng/mLとなるよう添加した。7日後に細胞を固定し、TRAP染色を行い破骨細胞形成能を検討した(図１７Ａ)。試験はn=6で実施した。その結果、RANKL終濃度30、100 ng/mL存在下で破骨細胞形成数が有意に上昇していることが確認された(図１７Ｂ)。TRAPソリューションアッセイを行ったところ、S1-5ノックアウトマウスにおいてTRAP活性値が上昇していた（図１７Ｃ）。また、RANKLを終濃度100 ng/mLで添加した際のTRAP染色の結果、野生型と比較し、S1-5ノックアウトマウスではTRAP陽性多核巨細胞の大きさがより大きくなっていた（図17DおよびE）。これらの結果は、S1-5が欠損することでRANKL存在下において破骨細胞形成に影響することを明らかにするものであり、S1-5が破骨細胞の分化抑制に関与していることが示唆された。
【実施例１０】
【０１１１】
S1-5-Hisの安定発現CHO-K1細胞の作製
分泌型タンパク質S1-5-Hisの大量精製を行うことを目的とし、ヒトS1-5-Hisの安定発現CHO-K1細胞の作製を行った。CHO-K1細胞（10 cm dish x 1）にLipofectamine2000を用いて20μgのpCAGGS-S1-5-Hisおよび0.7μg pcDNA3をコトランスフェクションし、翌日に10倍希釈にて10 cm dish 6枚に播種した。次いで翌日に800μg/mLのGeneticinにてセレクションを開始し、11日後にコロニーのピックアップを行った。10 cm dish 1枚につき16個のコロニー（合計96クローン）を96-well plateに播種し、24-well plate、6-well plateへとスケールアップしていった。同時にバルク6種類を10 cm dishにそれぞれ播種し、コンフルエントに達したバルク6種類を無血清培地に交換した後、24時間後に培養上清をTCA沈殿し、S1-5-Hisの発現チェックを行った（図１８）。一方、6-well plateにてコンフルエントに達したクローン化した細胞も同様にS1-5-Hisの発現チェックを行った（図１９）。6-well plateの1 wellに対して、無血清培地1 mLを用い、そのTCA沈殿物の半量を発現チェックに用いた。その結果、6種類のバルクはいずれも、S1-5-Hisの発現が細胞抽出液、培養上清において確認され、特にバルクNo.1、2、3において強い発現が認められた。さらに、CHO-K1細胞内在性のS1-5タンパク質が培養上清中に分泌されていることが認められた(図１８)。一方、ピックアップした96クローンのうち、増殖が認められた90クローンについてS1-5-Hisの発現チェックを行った（図１９）。このうち、クローンNo.1、6、10、11、13、25、38、43、44、61、96に対して、再度S1-5-Hisの発現チェックを行った（図２０）。その結果、クローンNo.1、6、44、96において、S1-5-Hisの発現がバルク1よりも強く検出された。最終的にクローンNo.96を選択し、以降の実験に用いた。
【実施例１１】
【０１１２】
S1-5-Hisの定常発現CHO-K1細胞培養上清からのS1-5-Hisの精製              
S1-5-Hisの定常発現CHO-K1細胞培養上清60 mLをフィルターろ過後、Centriplusにより約10 mLに濃縮した。濃縮した試料を精製用バッファー(20 mM Tris-HCl(pH 7.5),500 mM NaCl,10% glycerol)に透析した。透析後の試料を1 mLのHisTrapカラムに添加し、カラムを10 mLの精製用バッファーで洗浄した。吸着したタンパク質を10 mMおよび250 mM Imidazoleを含む精製用バッファーで溶出した（1 mL/fr.)。250 mM Imidazole溶出画分中に含まれるタンパク質を10% SDS-PAGEにより分離後、銀染色法（図２１Ａ）あるいは抗S1-5抗体を用いたWestern blot法により検出した（図２１Ｂ）。その結果、抗S1-5抗体により、一本のバンドが検出された。【０１１３】
さらに、S1-5-Hisの定常発現CHO-K1細胞培養上清280 mLをフィルターろ過(0.22μm)後、1 mLのHisTrapカラムに添加した。カラムを10 mLの精製用緩衝液(20 mM Tris-HCl(pH 7.5),500 mM NaCl,10% glycerol)および10 mM Imidazoleを含む精製用緩衝液で洗浄し、吸着したタンパク質を50 mMおよび100 mM Imidazoleを含む精製用緩衝液で溶出した（1 mL/fr.)。溶出画分を回収し(約4 ml)、1 LのPBSに対して一晩透析後、試料をフィルターろ過(0.22 μm)した。50 mMおよび100 mM Imidazole溶出画分中に含まれるタンパク質を10% SDS-PAGEにより分離後、銀染色法により検出した（図２２）。その結果、50 mM Imidazoleと比較して、100 mM  Imidazoleを含む精製用緩衝液での溶出画分では余分なバンドが消失し、より精製されたS1-5タンパク質が得られたことが示された。
【実施例１２】
【０１１４】
S1-5 truncateタンパク質の調製
S1-5は6個のEGF様ドメインを配列中に有する。ヒトS1-5の機能を調べるため、EGF様ドメインをC末端側から1個ずつ削除し、6個のコンストラクトを作製した(図２３)。【０１１５】
CHO-K1細胞にFuGENE6（ロシュ）を用いてS1-5-E1-His/pME18S、S1-5-E1-2-His/pME18S、S1-5-E1-3-His/pME18S、S1-5-E1-4-His/pME18S、S1-5-E1-5-His/pME18S、S1-5-E1-6-His/pME18S、S1-5 full-His/pME18Sをトランスフェクションした。トランスフェクションより8時間後、培地を無血清培地に交換し、24時間培養を行った。培養上清を回収し、Ni-アガロースを加え、4℃で8時間回転させた。Ni-アガロースを洗浄バッファー（20 mM Tris(pH7.5)、500 mM NaCl、10% Glycerol、10 mM Imidazole）で３回洗浄し、その後、溶出バッファー（20 mM Tris(pH7.5)、500 mM NaCl、10% Glycerol、250 mM Imidazole） を用いてS1-5タンパク質を溶出させた。溶出画分は透析によりバッファーをPBSに置換し、ウエスタンブロッティングによりS1-5タンパク質の濃度を算出した（図２４）。
【実施例１３】
【０１１６】
FLAG-S1-5の精製
HEK293細胞(大日本製薬)を80-90 %コンフルエントになるように150 mm dish (IWAKI)に播種した。翌日、FuGENE6を用いてトランスフェクションを行なった。操作方法は添付プロトコールに従った。さらに2日後、細胞を回収し、溶解バッファー (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 420 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 1 mM PMSF)を300 μL加えて氷上で20分間インキュベーションした。アガロースビーズに結合させた抗FLAG抗体(SIGMA)を100 μL加え、4℃でローテーターにて撹拌しながら一晩インキュベートした。洗浄バッファー(50 mM Tris-HCl (pH7.4), 150 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 1 mM PMSF)にて5回ビーズを洗浄した後に、100 μg/mL FLAG ペプチド（SIGMA）100μLを加えて4℃でローテーター上にて撹拌しながら2時間インキュベートした。遠心にて上清を回収し、そのうち10 μLについてSDS-PAGEを行い、ウエスタンブロッティングによる細胞内から精製したFLAG-S1-5の同定（図２５Ａ）およびCBB染色にて濃度を算出した。【０１１７】
一方、トランスフェクション48時間後に培養上清を回収し、アガロースビーズに結合させた抗FLAG抗体100 μlを加え、4℃でローテーターにて撹拌しながら一晩インキュベートした。その後上記と同様の操作を行って培養上清中より精製されたFLAG-S1-5を同定し濃度を算出した（図２５Ｂ）。その結果、細胞内及び培養上清からS1-5タンパク質が精製されたことが示された（図２５ＡＢ）。
【実施例１４】
【０１１８】
GST-S1-5の精製
GST融合S1-5-Hisを発現させるpGEXをトランスフォーメーションした大腸菌のコロニーを単離し、10 mLのLB-アンピシリン培地(50 mg/mLアンピシリン、以下同じ)に植菌し、37℃にて一晩培養した（前培養）。前培養した大腸菌を200 mLのLB-アンピシリン培地に加え、37℃で2時間半培養後（本培養）、最終濃度0.5 mM IPTGを加えて30℃でさらに3時間培養を行った。遠心にて菌体を回収し、BC500 (20 mM Tris-HCl (pH8), 0.5 mM EDTA,500 mM KCl, 20% glycerol, 1% NP-40, 1 mM DTT, 0.5 mM PMSF, 1 μg/mL of aprotinin, pepstatin, and leupeptin) 5 mLおよび100 mg/mLリゾチームを100 μL加えて懸濁し、ソニケーターにて菌を破砕した。遠心により上清を回収し、GSHレジン（glutathione S Transferase conjugated agarose beads (Pharmacia)）を500μL加えて4℃にてローテーター上で一晩インキュベートした。GSHレジンをBC500にて5回洗滌した後、マイクロカラム（バイオラッド）にアプライし、PreScission protease (Pharmacia) 溶液 (10U prescission protease, 50 mM Tris-HCl (pH7.0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) 500 μLを加えてキャップを閉め、静置して4℃で24時間インキュベートした。カラムから溶出した溶液を切断されたS1-5-His溶液として回収し、ウエスタンブロッティングにて同定（図２６）およびCBB染色にて濃度を測定した。その結果、大腸菌からS1-5タンパク質が精製されたことが示された（図２６)。
【実施例１５】
【０１１９】
S1-5ノックアウトマウス由来骨髄細胞におけるCHO-K1細胞培養上清由来S1-5が破骨細胞形成能に与える影響
S1-5ノックアウトマウス由来骨髄細胞および実施例１１でCHO-K1細胞より精製したS1-5タンパク質を用いて、精製したS1-5タンパク質がin vitroでの破骨細胞形成能に与える影響を検討した。骨髄細胞1×105個を96ウェルプレートに播種し、M-CSFを終濃度50 ng/mLとなるように添加し、2日後にRANKLを終濃度100 ng/mLとなるよう添加した。S1-5はPBSで希釈し、培養液に終濃度0,10,30,100 ng/mLとなるようにM-CSF添加時より継続的に添加した。5日後に細胞を固定し、TRAP染色を行いS1-5が破骨細胞形成能に与える影響を検討した。試験はn=５で実施した。その結果、S1-5の濃度依存的にTRAP陽性多核細胞数の有意な抑制が確認された(図２７、２９)。また、TRAP陽性多核巨細胞形成数もS1-5の濃度依存的に抑制されていた（図２８、２９）。さらに、S1-5を終濃度0、10、30、100、200、500 ng/mLで添加した他は実施例6と同様に行ったところ、S1-5濃度依存的にTRAP陽性多核巨細胞の大きさが小さくなっていた（図３０）。
【実施例１６】
【０１２０】
S1-5ノックアウトマウス由来骨髄細胞におけるS1-5 truncateの破骨細胞形成能に与える影響
S1-5ノックアウトマウス由来骨髄細胞および実施例１２でCHO-K1細胞より精製したS1-5-E1-2タンパク質を用いて、精製したS1-5-E1-2タンパク質がin vitroでの破骨細胞形成能に与える影響を検討した。方法は、S1-5-E1-2を終濃度0,10 ng/mLとなるように添加している他は、実施例１５と同様である。その結果、S1-5 truncateによるTRAP陽性多核細胞数の抑制が確認された(図３１、３３)。また、TRAP陽性多核巨細胞形成数もさらに顕著に抑制されることが確認された（図３２、３３）。S1-5-E1-2のアミノ酸配列を配列番号：６に示す。
【実施例１７】
【０１２１】
RAW264.7細胞におけるCHO-K1細胞培養上清由来S1-5の破骨細胞形成能に与える影響
RAW264.7細胞（マウスマクロファージ由来細胞）および実施例１１で精製したCHO-K1細胞培養上清由来S1-5を用いて、CHO-K1細胞培養上清由来S1-5がin vitroでの破骨細胞形成能に与える影響を検討した。RAW264.7細胞2.5×105 個を96ウェルプレートに播種し、RANKLを終濃度100 ng/mLとなるよう添加した。S1-5はPBSで希釈し、培養液に終濃度0,10,30,100,200,500 ng/mLとなるように継続的に添加した。3日後に細胞を固定し、TRAP染色を行いS1-5が破骨細胞形成能に与える影響を検討した。試験はn=５で実施した。その結果、S1-5の濃度依存的にTRAP陽性多核細胞数の抑制が確認された(図３４、３５)。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】26ヶ月齢のS1-5ノックアウトマウスの表現型を示す写真である。S1-5-/-雄(動物番号：1101)、2002/1/14B。背骨が後弯、脱毛、顔面部の皮膚に傷、爪の壊死、胸部肥大、解剖時に腹水、解剖時に肝臓に腫瘍。
【図２】26ヶ月齢のS1-5ノックアウトマウスの表現型を示す写真である。S1-5-/-雌(動物番号：1093)、2002/1/15B。背骨が後弯、止血しにくい、ヘマトクリット値低い、爪の壊死、眼底に出血塊、解剖時に子宮肥大、解剖時に脂肪組織内に出血塊。
【図３】26ヶ月齢のS1-5ノックアウトマウスの表現型を示す写真である。S1-5-/-雌(動物番号：1103)、2002/1/14B。背骨が後弯。
【図４】S1-5ノックアウトマウスの骨変形を示すX線写真である。
【図５】S1-5ノックアウトマウスの骨変形を示すX線写真である。
【図６】S1-5ノックアウトマウスの骨変形を示すX線写真である。
【図７】S1-5ノックアウトマウスのマウスの尾を切断して10秒毎に湧出する血液を、ろ紙で吸い取った結果を示す写真である。
【図８】S1-5ノックアウトマウスのへマトクリット値を示す写真である。
【図９】S1-5ノックアウトマウスのへマトクリット値を示す図である。
【図１０】S1-5ノックアウトマウスの尾静脈から採血した血液から作製した血液塗抹標本のギムザ染色写真である。2004/2/27  尾静脈より採血後、PBSにて1000倍希釈しサイトスピン(800 rpm, 5min)。2004/3/1  メイ・グリュンワルドギムザ染色(×200)
【図１１】Ａは、S1-5ノックアウトマウスの背骨弯曲角度を示す写真である。Ｂは、S1-5ノックアウトマウスの背骨弯曲角度の発症率を週齢毎にまとめた図である。各週齢のマウスのX線撮影を行った後、脊椎の弯曲の角度を計測し、95°以下を後弯の発症とした。
【図１２】S1-5ノックアウトマウスの背骨弯曲角度を週齢毎にまとめたグラフである。S1-5-/-雌マウスでは21週齢以降に後弯が発症し、また加齢とともに重篤化した。
【図１３】S1-5ノックアウトマウスの尿中NTx値を示すグラフである。各個体につき1週間のプール尿を測定した。
【図１４】S1-5ノックアウトマウスの尿中NTx値を週齢毎にまとめたグラフである。
【図１５】S1-5ノックアウトマウスのpQCT測定結果を示すグラフである。
【図１６−Ａ】S1-5ノックアウトマウスの組織切片中の破骨細胞の写真および図である。
【図１６−Ｂ】S1-5ノックアウトマウスにおける、破骨細胞の面積を測定した結果を示すグラフである。野生型と比較して、破骨細胞の面積が増加した。
【図１７Ａ−Ｃ】Ａは、実験工程を示す図である。Ｂは、S1-5ノックアウトマウス由来骨髄細胞の破骨細胞形成能を示すグラフである。Ｃは、S1-5ノックアウトマウスにおけるTRAPソリューションアッセイの結果を示す
【図１７Ｄ−Ｅ】Dは、TRAP陽性多核巨細胞の面積を測定した結果を示すグラフである。野生型と比較して、TRAP陽性多核巨細胞の面積が増加した。Eは、S1-5ノックアウトマウス由来骨髄細胞の破骨細胞形成能を示す写真である。S1-5ノックアウトマウス由来骨髄細胞は、高濃度のRANKL存在下において破骨細胞への分化促進能を有することが明らかとなった。
【図１８】S1-5-Hisの安定発現CHO-K1細胞株（バルク）におけるS1-5-Hisの発現を示す写真である。Nはトランスフェクションを行っていないCHO-K1細胞、Pは一過性にS1-5-Hisを発現したCHO-K1細胞を示す。
【図１９】クローン化したS1-5-Hisの安定発現CHO-K1細胞株におけるS1-5-Hisの発現を示す写真である。Nはトランスフェクションを行っていないCHO-K1細胞、Pは一過性にS1-5-Hisを発現したCHO-K1細胞を示す。
【図２０】クローン化したS1-5-Hisの安定発現CHO-K1細胞株におけるS1-5-Hisの発現を示す写真である。Nはトランスフェクションを行っていないCHO-K1細胞を示す。
【図２１】250 mM Imidazole溶出画分中に含まれるタンパク質を10% SDS-PAGEにより分離後、銀染色法（Ａ）および抗S1-5抗体を用いたWestern blot法（Ｂ）により検出した結果を示す写真である。
【図２２】50 mM（Ａ）および100 mM（Ｂ）Imidazole溶出画分中に含まれるタンパク質を10% SDS-PAGEにより分離後、銀染色法により検出した結果を示す写真である。
【図２３】S1-5 truncateタンパク質の模式図である。
【図２４】S1-5 truncateタンパク質の調製結果を示す写真である。
【図２５】抗FLAG抗体を使用して細胞内から精製したFLAG-S1-5（Ａ）、および抗FLAG抗体を使用して培養上清から精製したFLAG-S1-5（Ｂ）を、抗S1-5抗体を用いたWestern blot法により検出した結果を示す写真である。
【図２６】精製したGST-S1-5を抗S1-5抗体を用いたWestern blot法により検出した結果を示す写真である。
【図２７】Ａは、実験工程を示す図である。Ｂは、S1-5ノックアウトマウス由来骨髄細胞の破骨細胞形成能が、S1-5によって抑制されることを示すグラフである。
【図２８】Ａは、実験工程を示す図である。Ｂは、S1-5ノックアウトマウス由来骨髄細胞の破骨細胞形成能が、S1-5によって抑制されることを示すグラフである。
【図２９】S1-5ノックアウトマウス由来骨髄細胞の破骨細胞形成能がS1-5によって抑制されることを示す写真である。
【図３０Ａ−Ｂ】Ａは、実験工程を示す図である。Ｂは、TRAP陽性多核巨細胞の面積が、S1-5 によって減少することを示すグラフである。
【図３０Ｃ】Ｃは、S1-5濃度依存的に形成が抑制されたTRAP陽性多核巨細胞の染色写真を示す。
【図３１】Ａは、実験工程を示す図である。Ｂは、S1-5ノックアウトマウス由来骨髄細胞の破骨細胞形成能が、S1-5 truncateタンパク質によって抑制されることを示すグラフである。
【図３２】Ａは、実験工程を示す図である。Ｂは、S1-5ノックアウトマウス由来骨髄細胞の破骨細胞形成能が、S1-5 truncateタンパク質によって抑制されることを示すグラフである。
【図３３】S1-5ノックアウトマウス由来骨髄細胞の破骨細胞形成能が、S1-5 truncateタンパク質によって抑制されることを示す写真である。
【図３４】Ａは、実験工程を示す図である。Ｂは、RAW264.7細胞の破骨細胞形成能が、S1-5によって抑制されることを示すグラフである。
【図３５】RAW264.7細胞の破骨細胞形成能が、S1-5によって抑制されることを示す写真である。
【図９】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−Ｂ】
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【図１７Ａ−Ｃ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図３０Ａ−Ｂ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１６−Ａ】
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【図１７Ｄ−Ｅ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２９】
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【図３０Ｃ】
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【図３３】
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【図３５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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