【手続補正書】
【提出日】令和2年6月26日(2020.6.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種またはこれより多くの異種核酸を含むナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を生成する方法であって、前記方法は、
単離されたＮＫ細胞の集団を、１種またはこれより多くのサイトカインの存在下で培養して、活性化ＮＫ細胞の集団を生成する工程；
前記活性化ＮＫ細胞の集団を、１種またはこれより多くの異種核酸を含むウイルスベクターで形質導入して、形質導入されたＮＫ細胞の集団を生成する工程；ならびに
前記形質導入されたＮＫ細胞の集団を、１種もしくはこれより多くのサイトカインおよび／または照射されたフィーダー細胞の存在下で培養して、形質導入されたＮＫ細胞の拡大増殖された集団を生成する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記単離されたＮＫ細胞の集団を、１種またはこれより多くのサイトカインの存在下で培養する工程は、前記単離されたＮＫ細胞の集団を、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、およびインターロイキン−２１（ＩＬ−２１）のうちの１種またはこれより多くを含む細胞培養培地中で培養する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞培養培地は、５００  ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１５、および２０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−２１のうちの１種またはこれより多くを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記単離されたＮＫ細胞の集団を、１種またはこれより多くのサイトカインの存在下で培養する工程は、前記単離されたＮＫ細胞の集団を、照射されたフィーダー細胞の存在下で培養する工程を包含する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記単離されたＮＫ細胞の集団を、１種またはこれより多くのサイトカインの存在下で培養する工程は、前記単離されたＮＫ細胞の集団を、照射されたフィーダー細胞の存在下で培養する工程を包含しない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記単離されたＮＫ細胞の集団を、１種またはこれより多くのサイトカインの存在下で培養する工程は、前記単離されたＮＫ細胞の集団を、１種またはこれより多くのサイトカインを含む細胞培養培地中で１〜１４日間培養する工程を包含する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記活性化ＮＫ細胞の集団を、１種またはこれより多くの異種核酸を含むウイルスベクターで形質導入する工程は、前記ＮＫ細胞の集団と、前記ウイルスベクターを含むウイルス粒子とを接触させる工程を包含する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記１種またはこれより多くの異種核酸を含むウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記活性化ＮＫ細胞の集団は、前記ウイルスベクターを含むウイルス粒子と約６時間〜５日間接触される、請求項７または請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記形質導入されたＮＫ細胞の集団を、１種もしくはこれより多くのサイトカインおよび／または照射されたフィーダー細胞の存在下で培養する工程は、前記形質導入されたＮＫ細胞の集団を、ＩＬ−２を含む培養培地中で培養する工程を包含する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記培養培地は、５００  ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記形質導入されたＮＫ細胞の集団を、１種もしくはこれより多くのサイトカインおよび／または照射されたフィーダー細胞の存在下で培養する工程は、前記形質導入されたＮＫ細胞の集団を、照射されたフィーダー細胞の存在下で培養する工程を包含する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記照射されたフィーダー細胞  対  前記形質導入されたＮＫ細胞の比は、１０：１である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記照射されたフィーダー細胞は、エプスタイン・バーウイルスで形質転換されたリンパ芽球系細胞株またはＫ５６２細胞を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記形質導入されたＮＫ細胞の集団を、１種もしくはこれより多くのサイトカインおよび／または照射されたフィーダー細胞の存在下で培養する工程は、前記形質導入されたＮＫ細胞の集団を、前記１種またはこれより多くのサイトカインおよび／または前記照射されたフィーダー細胞の存在下で１〜４０日間培養する工程を包含する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記単離されたＮＫ細胞の集団は、被験体から得られた単核細胞から単離される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記異種核酸は、高親和性ＣＤ１６（ＣＤ１６−Ｖ１５８）、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ３、ＣＤ３４、ダブルネガティブＴＧＦβタイプＩＩレセプター、ＶＬＡ−４、ＬＦＡ−１、または腫瘍細胞上で発現される抗原に特異的に結合するキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）をコードする、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記異種核酸は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ１３８、ＣＳ１、ＧＤ２、ＨＥＲ２、ｅｒｂＢ２−、ＣＥＡ、ＥｐＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄ−Ｌ、またはＴＲＡＩＬ−Ｒ１に特異的に結合するＣＡＲをコードする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記異種核酸は、細胞内ドメインを欠く短縮型ＣＤ３４タンパク質をコードする核酸分子をさらに含む、請求項１７または請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記形質導入されたＮＫ細胞の集団は、前記形質導入されたＮＫ細胞の集団を培養して、富化された形質導入されたＮＫ細胞の拡大増殖された集団を生成する工程の前に、ＣＤ３４発現ＮＫ細胞の選択によって富化される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記異種核酸は、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、またはアンチセンス核酸である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記異種核酸は、ＮＫＧ２Ａ  ｓｈＲＮＡである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
腫瘍、過剰増殖性疾患、またはウイルス感染を有する被験体を処置するための、形質導入されたナチュラルキラー細胞の拡大増殖された集団を含む組成物であって、前記形質導入されたナチュラルキラー細胞の拡大増殖された集団が、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法によって生成され、前記単離されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の集団が、前記被験体またはドナーから得られる、組成物。
【請求項２４】
前記組成物は、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記組成物は、静脈内に、または前記腫瘍への局所注射によって前記被験体に投与される、請求項２３または請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記組成物は、１０６〜１０１２個の形質導入されたＮＫ細胞を含む、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記被験体は、血液悪性疾患または固形腫瘍を含む腫瘍または過剰増殖性疾患を有する、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記被験体は、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、ＲＳウイルス、エプスタイン・バーウイルス、またはヒト免疫不全ウイルスでのウイルス感染を有する、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
１種またはこれより多くの異種核酸を含むナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を生成する方法であって、前記方法は、
単離されたＮＫ細胞の集団を、５００  ＩＵ  インターロイキン−２（ＩＬ−２）の存在下で、２〜３日間培養して、活性化ＮＫ細胞の集団を生成する工程；
前記活性化ＮＫ細胞の集団を、１種またはこれより多くの異種核酸を含むレンチウイルスベクターを含むウイルス粒子で１〜５日間形質導入して、形質導入されたＮＫ細胞の集団を生成する工程；ならびに
前記形質導入されたＮＫ細胞の集団を、５００  ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２および照射されたフィーダー細胞の存在下で１４〜２８日間培養して、形質導入されたＮＫ細胞の拡大増殖された集団を生成する工程、
を包含する、方法。
【請求項３０】
腫瘍または過剰増殖性疾患を有する被験体を処置するための、請求項２９に記載の方法によって生成される形質導入されたナチュラルキラー細胞の拡大増殖された集団を含む組成物であって、前記単離されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の集団が、前記被験体またはドナーから得られ、前記組成物が、１０６〜１０１２個の前記拡大増殖された形質導入されたＮＫ細胞を含む、組成物。
【請求項３１】
請求項１、３〜２２、または２９のいずれか１項に記載の方法によって生成される１種またはこれより多くの異種核酸を含む、ナチュラルキラー細胞。
【請求項３２】
１種またはこれより多くの異種核酸を含むナチュラルキラー細胞および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物であって、ここで前記ナチュラルキラー細胞は、請求項１、３〜２２、または２９のいずれか１項に記載の方法によって生成される、組成物。
【請求項３３】
前記薬学的に受容可能なキャリアは、平衡塩類溶液またはＰｌａｓｍａＬｙｔｅである、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
ＰＧＫプロモーターに作動可能に連結されたＣＸＣＲ４をコードする異種核酸を含む、改変されたＮＫ細胞。
【請求項３５】
ＰＧＫプロモーターに作動可能に連結された高親和性ＣＤ１６をコードする異種核酸を含む、改変されたＮＫ細胞。
【請求項３６】
ＰＧＫプロモーターに作動可能に連結されたＣＸＣＲ４および高親和性ＣＤ１６をコードする異種核酸を含む、改変されたＮＫ細胞。
【請求項３７】
短縮型ＣＤ３４レセプターをコードする異種核酸をさらに含む、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の改変されたＮＫ細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
１種またはこれより多くの目的の核酸を含むウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）で形質導入されたＮＫ細胞のような、１種またはこれより多くの異種核酸を含む改変されたＮＫ細胞（例えば、改変されたＮＫ細胞の集団）がまた、本明細書で開示される。いくつかの例では、上記異種核酸は、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ３、またはＣＤ１６（例えば、高親和性ＣＤ１６またはＣＤ１６−Ｖ１５８）をコードする。目的のさらなる核酸は、以下の表１に示される。改変されたＮＫ細胞（例えば、改変されたＮＫ細胞の集団）および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物がまた、開示される。いくつかの実施形態において、上記改変されたＮＫ細胞は、本明細書で開示される方法によって生成される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
１種またはこれより多くの異種核酸を含むナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を生成する方法であって、前記方法は、
単離されたＮＫ細胞の集団を、１種またはこれより多くのサイトカインの存在下で培養して、活性化ＮＫ細胞の集団を生成する工程；
前記活性化ＮＫ細胞の集団を、１種またはこれより多くの異種核酸を含むウイルスベクターで形質導入して、形質導入されたＮＫ細胞の集団を生成する工程；ならびに
前記形質導入されたＮＫ細胞の集団を、１種もしくはこれより多くのサイトカインおよび／または照射されたフィーダー細胞の存在下で培養して、形質導入されたＮＫ細胞の拡大増殖された集団を生成する工程、
を包含する、方法。
（項目２）
腫瘍、過剰増殖性疾患、またはウイルス感染を有する被験体を処置する方法であって、前記方法は、
前記被験体またはドナーから単離されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の集団を得る工程；
前記単離されたＮＫ細胞の集団を、１種またはこれより多くのサイトカインの存在下で培養して、活性化ＮＫ細胞の集団を生成する工程；
前記活性化ＮＫ細胞の集団を、１種またはこれより多くの異種核酸を含むウイルスベクターで形質導入して、形質導入されたＮＫ細胞の集団を生成する工程；
前記形質導入されたＮＫ細胞の集団を、１種もしくはこれより多くのサイトカインおよび／または照射されたフィーダー細胞の存在下で培養して、形質導入されたＮＫ細胞の拡大増殖された集団を生成する工程；ならびに
前記形質導入されたＮＫ細胞の拡大増殖された集団を含む組成物を、前記被験体に投与する工程、
を包含する、方法。
（項目３）
前記単離されたＮＫ細胞の集団を、１種またはこれより多くのサイトカインの存在下で培養する工程は、前記単離されたＮＫ細胞の集団を、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、およびインターロイキン−２１（ＩＬ−２１）のうちの１種またはこれより多くを含む細胞培養培地中で培養する工程を包含する、項目１または項目２に記載の方法。
（項目４）
前記細胞培養培地は、５００  ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１５、および２０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−２１のうちの１種またはこれより多くを含む、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記単離されたＮＫ細胞の集団を、１種またはこれより多くのサイトカインの存在下で培養する工程は、前記単離されたＮＫ細胞の集団を、照射されたフィーダー細胞の存在下で培養する工程を包含する、項目１〜４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
前記単離されたＮＫ細胞の集団を、１種またはこれより多くのサイトカインの存在下で培養する工程は、前記単離されたＮＫ細胞の集団を、照射されたフィーダー細胞の存在下で培養する工程を包含しない、項目１〜４のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
前記単離されたＮＫ細胞の集団を、１種またはこれより多くのサイトカインの存在下で培養する工程は、前記単離されたＮＫ細胞の集団を、１種またはこれより多くのサイトカインを含む細胞培養培地中で１〜１４日間培養する工程を包含する、項目１〜６のいずれか１項に記載の方法。
（項目８）
前記活性化ＮＫ細胞の集団を、１種またはこれより多くの異種核酸を含むウイルスベクターで形質導入する工程は、前記ＮＫ細胞の集団と、前記ウイルスベクターを含むウイルス粒子とを接触させる工程を包含する、項目１〜７のいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
前記１種またはこれより多くの異種核酸を含むウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである、項目１〜８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記活性化ＮＫ細胞の集団は、前記ウイルスベクターを含むウイルス粒子と１〜３日間接触される、項目８または項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記形質導入されたＮＫ細胞の集団を、１種もしくはこれより多くのサイトカインおよび／または照射されたフィーダー細胞の存在下で培養する工程は、前記形質導入されたＮＫ細胞の集団を、ＩＬ−２を含む培養培地中で培養する工程を包含する、項目１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２）
前記培養培地は、５００  ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記形質導入されたＮＫ細胞の集団を、１種もしくはこれより多くのサイトカインおよび／または照射されたフィーダー細胞の存在下で培養する工程は、前記形質導入されたＮＫ細胞の集団を、照射されたフィーダー細胞の存在下で培養する工程を包含する、項目１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
前記照射されたフィーダー細胞  対  前記形質導入されたＮＫ細胞の比は、１０：１である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記照射されたフィーダー細胞は、エプスタイン・バーウイルスで形質転換されたリンパ芽球系細胞株またはＫ５６２細胞を含む、項目１３または項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記形質導入されたＮＫ細胞の集団を、１種もしくはこれより多くのサイトカインおよび／または照射されたフィーダー細胞の存在下で培養する工程は、前記形質導入されたＮＫ細胞の集団を、前記１種またはこれより多くのサイトカインおよび／または前記照射されたフィーダー細胞の存在下で１〜４０日間培養する工程を包含する、項目１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７）
前記単離されたＮＫ細胞の集団は、被験体から得られた単核細胞から単離される、項目１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８）
前記異種核酸は、高親和性ＣＤ１６（ＣＤ１６−Ｖ１５８）、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ３、ＣＤ３４、ダブルネガティブＴＧＦβタイプＩＩレセプター、ＶＬＡ−４、ＬＦＡ−１、または腫瘍細胞上で発現される抗原に特異的に結合するキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）をコードする、項目１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９）
前記異種核酸は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ１３８、ＣＳ１、ＧＤ２、ＨＥＲ２、ｅｒｂＢ２−、ＣＥＡ、ＥｐＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄ−Ｌ、またはＴＲＡＩＬ−Ｒ１に特異的に結合するＣＡＲをコードする、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記異種核酸は、細胞内ドメインを欠く短縮型ＣＤ３４タンパク質をコードする核酸分子をさらに含む、項目１８または項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記形質導入されたＮＫ細胞の集団は、前記形質導入されたＮＫ細胞の集団を培養して、富化された形質導入されたＮＫ細胞の拡大増殖された集団を生成する工程の前に、ＣＤ３４発現ＮＫ細胞の選択によって富化される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記異種核酸は、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、またはアンチセンス核酸である、項目１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３）
前記異種核酸は、ＮＫＧ２Ａ  ｓｈＲＮＡである、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記形質導入されたＮＫ細胞の拡大増殖された集団を含む組成物は、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、項目２〜２３のいずれか１項に記載の方法。
（項目２５）
前記形質導入されたＮＫ細胞の拡大増殖された集団を含む組成物は、静脈内に、または前記腫瘍への局所注射によって前記被験体に投与される、項目２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
前記形質導入されたＮＫ細胞の拡大増殖された集団を含む組成物は、１０６〜１０１２個の形質導入されたＮＫ細胞を含む、項目２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目２７）
前記被験体は、血液悪性疾患または固形腫瘍を含む腫瘍または過剰増殖性疾患を有する、項目２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８）
前記被験体は、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、ＲＳウイルス、エプスタイン・バーウイルス、またはヒト免疫不全ウイルスでのウイルス感染を有する、項目２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９）
１種またはこれより多くの異種核酸を含むナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を生成する方法であって、前記方法は、
単離されたＮＫ細胞の集団を、５００  ＩＵ  インターロイキン−２（ＩＬ−２）の存在下で、２〜３日間培養して、活性化ＮＫ細胞の集団を生成する工程；
前記活性化ＮＫ細胞の集団を、１種またはこれより多くの異種核酸を含むレンチウイルスベクターを含むウイルス粒子で１〜５日間形質導入して、形質導入されたＮＫ細胞の集団を生成する工程；ならびに
前記形質導入されたＮＫ細胞の集団を、５００  ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２および照射されたフィーダー細胞の存在下で１４〜２８日間培養して、形質導入されたＮＫ細胞の拡大増殖された集団を生成する工程、
を包含する、方法。
（項目３０）
腫瘍または過剰増殖性疾患を有する被験体を処置する方法であって、前記方法は、
単離されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の集団を、前記被験体またはドナーから得る工程；
前記単離されたＮＫ細胞の集団を、５００  ＩＵ  インターロイキン−２（ＩＬ−２）の存在下で２〜３日間培養して、活性化ＮＫ細胞の集団を生成する工程；
前記活性化ＮＫ細胞の集団を、１種またはこれより多くの異種核酸を含むレンチウイルスベクターを含むウイルス粒子で１〜５日間形質導入して、形質導入されたＮＫ細胞の集団を生成する工程；
前記形質導入されたＮＫ細胞の集団を、５００  ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２および照射されたフィーダー細胞の存在下で１４〜２８日間培養して、拡大増殖された形質導入されたＮＫ細胞を生成する工程；ならびに
１０６〜１０１２個の前記拡大増殖された形質導入されたＮＫ細胞を含む組成物を、前記被験体に投与する工程、
を包含する、方法。
（項目３１）
項目１、３〜２３、または２９のいずれか１項に記載の方法によって生成される１種またはこれより多くの異種核酸を含む、ナチュラルキラー細胞。
（項目３２）
１種またはこれより多くの異種核酸を含むナチュラルキラー細胞および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物であって、ここで前記ナチュラルキラー細胞は、項目１、３〜２３、または２９のいずれか１項に記載の方法によって生成される、組成物。
（項目３３）
前記薬学的に受容可能なキャリアは、平衡塩類溶液またはＰｌａｓｍａＬｙｔｅである、項目３２に記載の組成物。
（項目３４）
ＰＧＫプロモーターに作動可能に連結されたＣＸＣＲ４をコードする異種核酸を含む、改変されたＮＫ細胞。
（項目３５）
ＰＧＫプロモーターに作動可能に連結された高親和性ＣＤ１６をコードする異種核酸を含む、改変されたＮＫ細胞。
（項目３６）
ＰＧＫプロモーターに作動可能に連結されたＣＸＣＲ４および高親和性ＣＤ１６をコードする異種核酸を含む、改変されたＮＫ細胞。
（項目３７）
短縮型ＣＤ３４レセプターをコードする異種核酸をさらに含む、項目３４〜３６のいずれか１項に記載の改変されたＮＫ細胞。