(57)【要約】コリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物、その薬理学的に許容できる塩、又はそれらの溶媒和物を含有する、神経再生促進剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物、その薬理学的に許容できる塩、又はそれらの溶媒和物を含有する、神経再生促進剤。
【請求項２】
コリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物が、下記一般式で表される環状アミン誘導体である、請求項１記載の神経再生促進剤。
2006004201.tif 000047
〔式中、
Ｊは（ａ）置換若しくは無置換の次に示す基；（１）フェニル基、（２）ピリジル基、（３）ピラジル基、（４）キノリル基、（５）シクロヘキシル基、（６）キノキサリル基又は（７）フリル基、
（ｂ）フェニル基が置換されていてもよい次の群から選択された基から誘導される一価又は二価の基；（１）インダニル、（２）インダノニル、（３）インデニル、（４）インデノニル、（５）インダンジオニル、（６）テトラロニル、（７）ベンズスベロニル、（８）インダノリル、（９）式
2006004201.tif 000048
（ｃ）環状アミド化合物から誘導される一価の基、
（ｄ）低級アルキル基、又は
（ｅ）式  Ｒ１−ＣＨ＝ＣＨ−（式中、Ｒ１は水素原子又は低級アルコキシカルボニル基を意味する）
で示される基を意味する。
2006004201.tif 000049
（式中、Ｒ３は水素原子、低級アルキル基、アシル基、低級アルキルスルホニル基、置換されてもよいフェニル基又はベンジル基を意味する）で示される基、
2006004201.tif 000050
｛以上の式中、ｎは０又は１〜１０の整数を意味する。Ｒ２は水素原子又はメチル基を意味する。｝、式＝（ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ）ｂ−（式中、ｂは１〜３の整数を意味する）で示される基、式＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｃ−（式中、ｃは０又は１〜９の整数を意味する）で示される基、式＝（ＣＨ−ＣＨ）ｄ＝（式中、ｄは０又は１〜５の整数を意味する）で示される基、
2006004201.tif 000051
で示される基、式−ＮＨ−で示される基、式−Ｏ−で示される基、式−Ｓ−で示される基、ジアルキルアミノアルキルカルボニル基又は低級アルコキシカルボニル基を意味する。
Ｔは窒素原子又は炭素原子を意味する。
2006004201.tif 000052
Ｋは水素原子、置換若しくは無置換のフェニル基、フェニル基が置換されてもよいアリールアルキル基、フェニル基が置換されてもよいシンナミル基、低級アルキル基、ピリジルメチル基、シクロアルキルアルキル基、アダマンタンメチル基、フリルメチル基、置換されてもよいシクロアルキル基、低級アルコキシカルボニル基又はアシル基を意味する。
ｑは１〜３の整数を意味する。
2006004201.tif 000053
【請求項３】
Ｊが置換若しくは無置換の（１）フェニル基、（２）ピリジル基、（３）ピラジル基、（４）キノリル基、（５）シクロヘキシル基、（６）キノキサリル基及び（７）フリル基からなる群から選択された一つの基である、請求項２記載の神経再生促進剤。
【請求項４】
Ｊが環状アミド化合物から誘導される一価の基である、請求項２記載の神経再生促進剤。
【請求項５】
コリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物が、下記一般式で表される環状アミン誘導体である、請求項１記載の神経再生促進剤。
2006004201.tif 000054
〔式中、
Ｊ１はフェニル基が置換されていてもよい次の群から選択された基から誘導される一価又は二価の基；（１）インダニル、（２）インダノニル、（３）インデニル、（４）インデノニル、（５）インダンジオニル、（６）テトラロニル、（７）ベンズスベロニル、（８）インダノリル、（９）式
2006004201.tif 000055
（式中、Ｒ３は水素原子、低級アルキル基、アシル基、低級アルキルスルホニル基、置換されてもよいフェニル基又はベンジル基を意味する）で示される基、
2006004201.tif 000056
｛以上の式中、ｎは０又は１〜１０の整数を意味する。Ｒ２は水素原子又はメチル基を意味する。｝、式＝（ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ）ｂ−（式中、ｂは１〜３の整数を意味する）で示される基、式＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｃ−（式中、ｃは０又は１〜９の整数を意味する）で示される基、式＝（ＣＨ−ＣＨ）ｄ＝（式中、ｄは０又は１〜５の整数を意味する）で示される基、
2006004201.tif 000057
で示される基、式−ＮＨ−で示される基、式−Ｏ−で示される基、式−Ｓ−で示される基、ジアルキルアミノアルキルカルボニル基又は低級アルコキシカルボニル基を意味する。
Ｔは窒素原子又は炭素原子を意味する。
2006004201.tif 000058
Ｋは水素原子、置換若しくは無置換のフェニル基、フェニル基が置換されてもよいアリールアルキル基、フェニル基が置換されてもよいシンナミル基、低級アルキル基、ピリジルメチル基、シクロアルキルアルキル基、アダマンタンメチル基、フリルメチル基、置換されてもよいシクロアルキル基、低級アルコキシカルボニル基又はアシル基を意味する。
ｑは１〜３の整数を意味する。
2006004201.tif 000059
【請求項６】
Ｂが式
2006004201.tif 000060
水素原子又はメチル基を意味する。〕で示される基、式−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ）ｎＲ２−（式中、ｎは０又は１〜１０の整数を意味し、Ｒ２は水素原子又はメチル基を意味する）で示される基、式＝（ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ）ｂ−（式中、ｂは１〜３の整数を意味する）で示される基、式＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｃ−（式中、ｃは０又は１〜９の整数を意味する）で示される基又は式＝（ＣＨ−ＣＨ）ｄ＝（式中、ｄは０又は１〜５の整数を意味する）で示される基である、請求項５記載の神経再生促進剤。
【請求項７】
コリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物が、下記一般式で表される環状アミン誘導体である、請求項１記載の神経再生促進剤。
2006004201.tif 000061
〔式中、
Ｊ１はフェニル基が置換されていてもよい次の群から選択された基から誘導される一価又は二価の基；（１）インダニル、（２）インダノニル、（３）インデニル、（４）インデノニル、（５）インダンジオニル、（６）テトラロニル、（７）ベンズスベロニル、（８）インダノリル、（９）式
2006004201.tif 000062
水素原子又はメチル基を意味する。〕で示される基、式−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ）ｎＲ２−（式中、ｎは０又は１〜１０の整数を意味し、Ｒ２は水素原子又はメチル基を意味する）で示される基、式＝（ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ）ｂ−（式中、ｂは１〜３の整数を意味する）で示される基、式＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｃ−（式中、ｃは０又は１〜９の整数を意味する）で示される基又は式＝（ＣＨ−ＣＨ）ｄ＝（式中、ｄは０又は１〜５の整数を意味する）で示される基、
Ｋは水素原子、置換若しくは無置換のフェニル基、フェニル基が置換されてもよいアリールアルキル基、フェニル基が置換されてもよいシンナミル基、低級アルキル基、ピリジルメチル基、シクロアルキルアルキル基、アダマンタンメチル基、フリルメチル基、置換されてもよいシクロアルキル基、低級アルコキシカルボニル基又はアシル基を意味する。〕
【請求項８】
Ｋが置換若しくは無置換のアリールアルキル基又はフェニル基である、請求項７記載の神経再生促進剤。
【請求項９】
Ｊ１がインダノニルから誘導される一価の基及び二価の基、インデニル並びにインダンジオニルからなる群から選択される一つの基である、請求項７又は８記載の神経再生促進剤。
【請求項１０】
Ｊ１が置換基として炭素数１〜６の低級アルキル基又は炭素数１〜６の低級アルコキシ基を有してもよいインダノニル基である、請求項７又は８記載の神経再生促進剤。
【請求項１１】
環状アミン誘導体が、１−ベンジル−４−（（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル）メチルピペリジン、１−ベンジル−４−（（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イリデニル）メチルピペリジン、１−ベンジル−４−（（５−メトキシ−１−インダノン）−２−イル）メチルピペリジン、１−ベンジル−４−（（５，６−メチレンジオキシ−１−インダノン）−２−イル）メチルピペリジン、１−（ｍ−ニトロベンジル）−４−（（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル）メチルピペリジン、１−シクロヘキシルメチル−４−（（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル）メチルピペリジン、１−（ｍ−フルオロベンジル）−４−（（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル）メチルピペリジン、１−ベンジル−４−（３−（（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル）プロピル）ピペリジン、１−ベンジル−４−（（５−イソプロポキシ−６−メトキシ−１−インダノン）−２−イル）メチルピペリジン、１−ベンジル−４−（（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イリデニル）プロペニルピペリジン、及び１−ベンジル−４−（（５，６−ジメトキシ−１，３−インダンジオン）−２−イル）プロペニルピペリジンからなる群から選ばれる少なくとも１つである、請求項２記載の神経再生促進剤。
【請求項１２】
環状アミン誘導体が、１−ベンジル−４−（（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル）メチルピペリジンである、請求項２記載の神経再生促進剤。
【請求項１３】
コリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物が、１−ベンジル−４−（（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル）メチルピペリジン・塩酸塩である、請求項１記載の神経再生促進剤。
【請求項１４】
コリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物が、ガランタミン、タクリン、フィゾスチグミン又はリバスチグミンである、請求項１記載の神経再生促進剤。
【請求項１５】
被験物質を神経幹細胞、神経幹細胞を含む組織又は非ヒト哺乳動物に投与し、候補物質の存在下及び非存在下における神経再生の表現型の変化を検出又は測定することを特徴とする、神経再生を促進する物質のスクリーニング方法。
【請求項１６】
候補物質が、コリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物、その薬理学的に許容できる塩、又はそれらの溶媒和物である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
コリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物が、アセチルコリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物、その薬理学的に許容できる塩、又はそれらの溶媒和物である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
神経再生の表現型変化が、神経幹細胞に由来する細胞の増殖能、細胞の分化能、細胞の形状、細胞の運動能、細胞の移動能及び移動調節能、細胞の成熟度、機能性タンパク質の発現度、樹状突起の形状、軸索の形状、シナプスの形状、シナプスの形成能、細胞の生存、細胞の保持並びに細胞死の抑制からなる群から選択される少なくとも一つを指標とするものである、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１９】
請求項１〜１４のいずれか１項記載のコリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物、その薬理学的に許容できる塩、又はそれらの溶媒和物の有効量を患者に投与することを特徴とする、神経再生促進方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、コリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物を含有する神経再生促進剤及びそのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】  コリンエステラーゼとは、生体内に広く分布し、神経伝達物質であるアセチルコリンなどのコリンエステル類を加水分解する酵素の総称であり、当該酵素活性は、フィゾスチグミン（１０−５ｍｏｌ／Ｌ）で阻害される。コリンエステラーゼの種類には、神経組織、赤血球、筋肉などに存在するアセチルコリンを特異的に分解する真性（ｔｒｕｅ）コリンエステラーゼ、及び血清、肝臓、膵臓などに存在するコリンエステルのほか、種々のエステルも分解する偽性（ｐｓｅｕｄｏ）コリンエステラーゼの二種類が知られている。前者は、アセチルコリンエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．７）と称され、アセチルコリンを他のコリンエステルより速やかに加水分解し、かつ基質阻害を受ける性質を有する。一方、後者はアセチルコリン以外の多くのコリンエステルや、コリンを含まないエステル類をも加水分解する性質を持つ。
コリンエステラーゼ阻害剤は、コリンエステラーゼによる生体内のアセチルコリンの加水分解を抑制し、シナプス間隙のアセチルコリンを増加させ、アセチルコリン伝達を増加させる作用を有する。特に、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤である塩酸ドネペジルは、脳内におけるアセチルコリンの量を増加し、アルツハイマー型老年性痴呆の治療薬として広く用いられている（日本国特許第２５７８４７５号公報）。
ところで、海馬は記憶の形成・維持に重要な役割を果たす脳の部位である（Ｅｒｉｃ  Ｒ．Ｋａｎｄｅｌ，Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｅｍｏｒｙ  Ｓｔｏｒａｇｅ：Ａ  Ｄｉａｌｏｇｕｅ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｓｙｎａｐｓｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４：１０３０−１０３８，２００１）。最近、成体海馬内の神経回路の一部である歯状回において、神経幹細胞（神経細胞のもとになる細胞）が存在し、神経細胞の再生（Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）が生涯にわたり維持されていることが分かってきた（Ｆｒｅｄ  Ｈ．Ｇａｇｅ，Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７：１４３３−１４３８，２０００、Ａｒｔｕｒｏ  Ａｌｖａｒｅｚ−Ｂｕｙｌｌａ，Ｂｅｔｔｉｎａ  Ｓｅｒｉ  ａｎｄ  Ｆｉｏｎａ  Ｄｏｅｔｓｃｈ，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｄｕｌｔ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｂｒａｉｎ，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，５７：７５１−７５８，２００２）。しかし、その神経再生を調節する標的分子は十分に解明されていない。
アセチルコリン神経系は歯状回に投射しており、記憶の形成・維持に重要な役割を果たしている（Ｍｉｃｈｅｌｌｅ  Ｌ．Ｇｉｌｍｏｒ，Ｓｃｏｔｔ  Ｅ．Ｃｏｕｎｔｓ，Ｒｏｎａｌｄ  Ｇ．Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  Ａｌｌａｎ  Ｉ．Ｌｅｖｅｙ，Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈｏｌｉｎｅ  Ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  Ｓｅｐｔｏｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｌｅｓｉｏｎｓ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７１：２４１１−２４２０，１９９８）。このアセチルコリン神経系を破壊すると、歯状回の神経再生が減少することが、米国神経科学会で報告されている（Ｃ．Ｍ．Ｃｏｏｐｅｒ−Ｋｕｈｎ，Ｊ．Ｗｉｎｋｌｅｒ，Ｈ．Ｋｕｈｎ，ＡＬＴＥＲＥＤ  ＮＵＥＲＯＧＥＮＥＳＩＳ  ＡＦＴＥＲ  ＣＨＯＬＩＮＥＲＧＩＣ  ＦＯＲＥＢＲＡＩＮ  ＬＥＳＩＯＮ  ＩＮ  ＴＨＥ  ＡＤＵＬＴ  ＲＡＴ．Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ａｂｓｔｒ．，Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｎｏ．３４８．９，２００３）。しかしながら、歯状回に投射しているアセチルコリン神経系を賦括化し、歯状回の神経再生を促進するような薬剤（神経系の再生促進剤）は報告されていない。
ところで、「社会不安障害」とは人前に出た時などに強い緊張や不安、恐怖などを感じて社会生活に支障をきたす病状である。最近の研究では人が一生のうちに社会不安障害にかかる確率はほぼ１０％であると言われており、この確率は日本、欧米で差は無い。この様に社会不安障害はうつと並んで最もポピュラーな精神疾患の１つである。
社会不安障害は全般性不安障害（ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  ａｎｘｉｅｔｙ）、パニック障害（ｐａｎｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、心的外傷後ストレス障害（ｐｏｓｔ−ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｓｔｒｅｓｓ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ，ＰＴＳＤ）、社会恐怖（ｓｏｃｉａｌ  ｐｈｏｂｉａ）、恐怖症（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｈｏｂｉａ）、強迫性障害（ｏｂｓｅｓｓｉｖｅ−ｃｏｍｐｕｌｓｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）等に分類される。社会不安障害の症状は各障害ごとに異なるが、比較的共通して見られる症状としては以下のものが挙げられる。即ち、非現実的で過度な長期に亘る不安、情動不安、神経過敏、睡眠障害、過度の警戒感、自律性緊張、嫌悪感、恐怖、反復する強迫観念あるいは強迫行為等である。
社会不安障害の薬物療法には古くからアルコール、バルビツール酸、アヘン剤、β−ブロッカー及びベンゾジアゼピン系マイナートランキライザーが用いられてきた。この内ベンゾジアゼピンは最も特異性が高く、種々の不安障害に有効であるため広く使われてきた。この薬剤は脳内の抑制性伝達物質であるγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の活性を上げることが知られている。これに加え、１９８０年代からはセロトニン特異的再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）が不安障害の治療に用いられるようになった。ＳＳＲＩはベンゾジアゼピンで見られる習慣性がないため現在広く普及している。
社会不安障害の病因は現在でも不明であるが、遺伝的素因及び環境的因子がその発症に複合的に関与する事が示唆されている。近年の動物実験あるいは臨床的な検討から、ストレスあるいは心的トラウマによって海馬における神経再生が低下することがその一因である可能性が指摘されている。例えば、心的外傷後ストレス障害患者では海馬の容量が健常人に比べて減少することが報告されており（Ｊ．Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｂｒｅｍｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＲＩ−ＢＡＳＥＤ  ＭＥＡＳＵＲＥＭＥＮＴ  ＯＦ  ＨＩＰＰＯＣＡＭＰＡＬ  ＶＯＬＵＭＥ  ＩＮ  ＰＯＳＴＴＲＡＵＭＡＴＩＣ  ＳＴＲＥＳＳ  ＤＩＳＯＲＤＥＲ．Ａｍ．Ｊ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  １５２：９７３−９８１，１９９５）、この一因として上記に挙げた神経再生反応の低下が示唆されている（Ｊ．Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｂｒｅｍｎｅｒ，ＮＥＵＲＯＩＭＡＧＩＮＧ  ＳＴＵＤＩＥＳ  ＩＮ  ＰＯＳＴ−ＴＲＡＵＭＡＴＩＣ  ＳＴＲＥＳＳ  ＤＩＳＯＲＤＥＲ．Ｃｕｒｒ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  Ｒｅｐ．４：２５４−２６３，２００２．）。
社会不安障害の治療薬であるＳＳＲＩの１つパロキセチン（ｐａｒｏｘｅｔｉｎｅ）の投与によりＰＴＳＤ患者の海馬容積が増加したという報告がある（Ｊ．Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｂｒｅｍｎｅｒ，ＮＥＵＲＯＩＭＡＧＩＮＧ  ＳＴＵＤＩＥＳ  ＩＮ  ＰＯＳＴ−ＴＲＡＵＭＡＴＩＣ  ＳＴＲＥＳＳ  ＤＩＳＯＲＤＥＲ．Ｃｕｒｒ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．Ｒｅｐ．４：２５４−２６３，２００２．）。また、動物実験の結果からＳＳＲＩが海馬における神経再生を促進する事が示されている（Ｊｅｓｓｉｃａ  Ｅ．Ｍａｌｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．，ＣＨＲＯＮＩＣ  ＡＮＴＩＤＥＰＲＥＳＳＡＮＴ  ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ  ＩＮＣＲＥＡＳＥＳ  ＮＥＵＲＯＧＥＮＥＳＩＳ  ＩＮ  ＡＤＵＬＴ  ＲＡＴ  ＨＩＰＰＯＣＡＭＰＵＳ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０：９１０４−９１１０，２０００）。よって、ＳＳＲＩはＰＴＳＤ患者の海馬における神経再生を促進する作用を介して治療効果を示している可能性がある。
【発明の開示】
本発明は、神経再生を促進する薬剤の提供を目的とする。
本発明者は、これまでの知見から、歯状回に投射しているアセチルコリン神経系を賦括するコリンエステラーゼ阻害剤は、歯状回の神経再生を促進するという仮説を構築し、以下のように検討を行った。まず、神経再生の促進効果を客観的に、かつ簡便に評価するために、さらには、神経再生促進剤を効率的に見出すために、神経幹細胞を含む非ヒト哺乳動物を用いた新規スクリーニング方法を構築した。本発明のスクリーニング方法は、５−ｂｒｏｍｏ−２’−ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ（ＢｒｄＵ）を神経幹細胞の標識マーカーとして用い、神経再生を免疫組織化学的に検出することを可能にするものであり、神経再生促進剤を正確にスクリーニングするのに適している。
本発明者は、本発明のスクリーニング方法を用いて、鋭意検討を行った結果、コリンエステラーゼ阻害剤が、歯状回に存在する神経幹細胞から再生された細胞の保持効果を有することを明らかにし、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）コリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物、その薬理学的に許容できる塩、又はそれらの溶媒和物を含有する、神経再生促進剤。
上記コリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物としては、例えば下記一般式で表される環状アミン誘導体が挙げられる。
2006004201.tif 000002
〔式中、
Ｊは（ａ）置換若しくは無置換の次に示す基；（１）フェニル基、（２）ピリジル基、（３）ピラジル基、（４）キノリル基、（５）シクロヘキシル基、（６）キノキサリル基又は（７）フリル基、
（ｂ）フェニル基が置換されていてもよい次の群から選択された基から誘導される一価又は二価の基；（１）インダニル、（２）インダノニル、（３）インデニル、（４）インデノニル、（５）インダンジオニル、（６）テトラロニル、（７）ベンズスベロニル、（８）インダノリル、（９）式
2006004201.tif 000003
（ｃ）環状アミド化合物から誘導される一価の基、
（ｄ）低級アルキル基、又は
（ｅ）式  Ｒ１−ＣＨ＝ＣＨ−（式中、Ｒ１は水素原子又は低級アルコキシカルボニル基を意味する）
で示される基を意味する。
2006004201.tif 000004
（式中、Ｒ３は水素原子、低級アルキル基、アシル基、低級アルキルスルホニル基、置換されてもよいフェニル基又はベンジル基を意味する）で示される基、
2006004201.tif 000005
｛以上の式中、ｎは０又は１〜１０の整数を意味する。Ｒ２は水素原子又はメチル基を意味する。｝、式＝（ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ）ｂ−（式中、ｂは１〜３の整数を意味する）で示される基、式＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｃ−（式中、ｃは０又は１〜９の整数を意味する）で示される基、式＝（ＣＨ−ＣＨ）ｄ＝（式中、ｄは０又は１〜５の整数を意味する）で示される基、
2006004201.tif 000006
で示される基、式−ＮＨ−で示される基、式−Ｏ−で示される基、式−Ｓ−で示される基、ジアルキルアミノアルキルカルボニル基又は低級アルコキシカルボニル基を意味する。
Ｔは窒素原子又は炭素原子を意味する。
2006004201.tif 000007
Ｋは水素原子、置換若しくは無置換のフェニル基、フェニル基が置換されてもよいアリールアルキル基、フェニル基が置換されてもよいシンナミル基、低級アルキル基、ピリジルメチル基、シクロアルキルアルキル基、アダマンタンメチル基、フリルメチル基、置換されてもよいシクロアルキル基、低級アルコキシカルボニル基又はアシル基を意味する。
ｑは１〜３の整数を意味する。
2006004201.tif 000008
上記式において、Ｊは、置換若しくは無置換の（１）フェニル基、（２）ピリジル基、（３）ピラジル基、（４）キノリル基、（５）シクロヘキシル基、（６）キノキサリル基及び（７）フリル基からなる群から選択された一つの基であることが好ましい。また、Ｊは環状アミド化合物から誘導される一価の基であってもよい。
さらに、本発明の神経再生促進剤において、コリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物としては、例えば下記一般式で表される環状アミン誘導体が挙げられる。
2006004201.tif 000009
〔式中、
Ｊ１はフェニル基が置換されていてもよい次の群から選択された基から誘導される一価又は二価の基；（１）インダニル、（２）インダノニル、（３）インデニル、（４）インデノニル、（５）インダンジオニル、（６）テトラロニル、（７）ベンズスベロニル、（８）インダノリル、（９）式
2006004201.tif 000010
（式中、Ｒ３は水素原子、低級アルキル基、アシル基、低級アルキルスルホニル基、置換されてもよいフェニル基又はベンジル基を意味する）で示される基、
2006004201.tif 000011
｛以上の式中、ｎは０又は１〜１０の整数を意味する。Ｒ２は水素原子又はメチル基を意味する。｝、式＝（ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ）ｂ−（式中、ｂは１〜３の整数を意味する）で示される基、式＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｃ−（式中、ｃは０又は１〜９の整数を意味する）で示される基、式＝（ＣＨ−ＣＨ）ｄ＝（式中、ｄは０又は１〜５の整数を意味する）で示される基、
2006004201.tif 000012
で示される基、式−ＮＨ−で示される基、式−Ｏ−で示される基、式−Ｓ−で示される基、ジアルキルアミノアルキルカルボニル基又は低級アルコキシカルボニル基を意味する。
Ｔは窒素原子又は炭素原子を意味する。
2006004201.tif 000013
Ｋは水素原子、置換若しくは無置換のフェニル基、フェニル基が置換されてもよいアリールアルキル基、フェニル基が置換されてもよいシンナミル基、低級アルキル基、ピリジルメチル基、シクロアルキルアルキル基、アダマンタンメチル基、フリルメチル基、置換されてもよいシクロアルキル基、低級アルコキシカルボニル基又はアシル基を意味する。
ｑは１〜３の整数を意味する。
2006004201.tif 000014
特に、Ｂが式
2006004201.tif 000015
水素原子又はメチル基を意味する。〕で示される基、式−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ）ｎＲ２−（式中、ｎは０又は１〜１０の整数を意味し、Ｒ２は水素原子又はメチル基を意味する）で示される基、式＝（ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ）ｂ−（式中、ｂは１〜３の整数を意味する）で示される基、式＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｃ−（式中、ｃは０又は１〜９の整数を意味する）で示される基又は式＝（ＣＨ−ＣＨ）ｄ＝（式中、ｄは０又は１〜５の整数を意味する）で示される基であることが好ましい。
さらに、本発明の神経再生促進剤において、コリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物としては、例えば下記一般式で表される環状アミン誘導体を挙げることができる。
2006004201.tif 000016
〔式中、
Ｊ１はフェニル基が置換されていてもよい次の群から選択された基から誘導される一価又は二価の基；（１）インダニル、（２）インダノニル、（３）インデニル、（４）インデノニル、（５）インダンジオニル、（６）テトラロニル、（７）ベンズスベロニル、（８）インダノリル、（９）式
2006004201.tif 000017
水素原子又はメチル基を意味する。〕で示される基、式−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ）ｎＲ２−（式中、ｎは０又は１〜１０の整数を意味し、Ｒ２は水素原子又はメチル基を意味する）で示される基、式＝（ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ）ｂ−（式中、ｂは１〜３の整数を意味する）で示される基、式＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｃ−（式中、ｃは０又は１〜９の整数を意味する）で示される基又は式＝（ＣＨ−ＣＨ）ｄ＝（式中、ｄは０又は１〜５の整数を意味する）で示される基、
Ｋは水素原子、置換若しくは無置換のフェニル基、フェニル基が置換されてもよいアリールアルキル基、フェニル基が置換されてもよいシンナミル基、低級アルキル基、ピリジルメチル基、シクロアルキルアルキル基、アダマンタンメチル基、フリルメチル基、置換されてもよいシクロアルキル基、低級アルコキシカルボニル基又はアシル基を意味する。〕
Ｋとしては、例えば置換若しくは無置換のアリールアルキル基又はフェニル基を挙げることができる。
また、Ｊ１は、インダノニルから誘導される一価の基及び二価の基、インデニル並びにインダンジオニルからなる群から選択される一つの基であってもよく、Ｊ１が置換基として炭素数１〜６の低級アルキル基又は炭素数１〜６の低級アルコキシ基を有してもよいインダノニル基であってもよい。
さらに、本発明の神経再生促進剤において、環状アミン誘導体としては、例えば、１−ベンジル−４−（（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル）メチルピペリジン、１−ベンジル−４−（（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イリデニル）メチルピペリジン、１−ベンジル−４−（（５−メトキシ−１−インダノン）−２−イル）メチルピペリジン、１−ベンジル−４−（（５，６−メチレンジオキシ−１−インダノン）−２−イル）メチルピペリジン、１−（ｍ−ニトロベンジル）−４−（（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル）メチルピペリジン、１−シクロヘキシルメチル−４−（（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル）メチルピペリジン、１−（ｍ−フルオロベンジル）−４−（（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル）メチルピペリジン、１−ベンジル−４−（３−（（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル）プロピル）ピペリジン、１−ベンジル−４−（（５−イソプロポキシ−６−メトキシ−１−インダノン）−２−イル）メチルピペリジン、１−ベンジル−４−（（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イリデニル）プロペニルピペリジン、及び１−ベンジル−４−（（５，６−ジメトキシ−１，３−インダンジオン）−２−イル）プロペニルピペリジンからなる群から選ばれる少なくとも１つが挙げられる。特に、環状アミン誘導体は、１−ベンジル−４−（（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル）メチルピペリジンが好ましい。
さらに、本発明の神経再生促進剤において、コリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物は、１−ベンジル−４−（（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル）メチルピペリジン・塩酸塩であることが好ましく、ガランタミン、タクリン、フィゾスチグミン又はリバスチグミンであってもよい。
（２）被験物質を神経幹細胞、神経幹細胞を含む組織又は非ヒト哺乳動物に投与し、候補物質の存在下及び非存在下における神経再生の表現型の変化を検出又は測定することを特徴とする、神経再生を促進する物質のスクリーニング方法。
ここで、候補物質としては、コリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物、その薬理学的に許容できる塩、又はそれらの溶媒和物が挙げられる。コリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物は、アセチルコリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物、その薬理学的に許容できる塩、又はそれらの溶媒和物であることが好ましい。
本発明のスクリーニング方法において、神経再生の表現型変化は、神経幹細胞に由来する細胞の増殖能、細胞の分化能、細胞の形状、細胞の運動能、細胞の移動能及び移動調節能、細胞の成熟度、機能性タンパク質の発現度、樹状突起の形状、軸索の形状、シナプスの形状、シナプスの形成能、細胞の生存、細胞の保持並びに細胞死の抑制からなる群から選択される少なくとも一つを指標とすることができる。
（３）上記コリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物、その薬理学的に許容できる塩、又はそれらの溶媒和物の有効量を患者に投与することを特徴とする、神経再生促進方法。
【図面の簡単な説明】  図１は、海馬歯状回の顆粒細胞層（ｇｒａｎｕｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌａｙｅｒ）（ＧＣＬ）におけるＢｒｄＵ陽性細胞を示した図である。黒い点は、ＢｒｄＵに対する免疫反応陽性の核を示す。ドネペジルを投与されたマウスではＢｒｄＵ陽性細胞数が、媒体投与マウスに比べて増加していた。
図２は、海馬歯状回のＧＣＬに存在するＢｒｄＵ陽性細胞上のアセチルコリン受容体（ムスカリンＭ２受容体）発現（白矢印）を示した図である。
図３は、ラット由来培養神経前駆細胞の細胞内カルシウムの上昇を示した図である。アセチルコリンもしくはカルバコール等のコリン作働薬刺激により神経前駆細胞の細胞内カルシウム濃度が上昇すること、この作用がアトロピン（ムスカリン受容体拮抗剤）で完全に阻害されることを示す。
図４は、ラット由来培養神経前駆細胞のアセチルコリン受容体（ムスカリンＭ２受容体）発現（白矢印）を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下に本発明の実施の形態について説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
本発明は、コリンエステラーゼ（ＣｈＥ）阻害剤が、アセチルコリンの分解を抑制し、シナプス間隙のアセチルコリンの濃度を高めることで、神経幹細胞から再生された細胞の数を保持するという機序を見出すことにより完成されたものである。
従って、本発明は、アセチルコリンの分解を抑制してアセチルコリンの濃度を高める作用を有する化合物、すなわちコリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物、その薬理学的に許容できる塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分とする神経再生促進剤を提供するものであり、さらにその薬剤のスクリーニング方法を提供するものである。
１．コリンエステラーゼ（ＣｈＥ）阻害作用を有する化合物
本発明の神経再生促進剤は、有効成分としてＣｈＥ阻害作用を有する化合物、その薬理学的に許容できる塩、又はそれらの溶媒和物を含有する。本発明におけるＣｈＥ阻害作用を有する化合物とは、ＣｈＥ阻害作用、すなわちＣｈＥの活性を可逆的に又は不可逆的に阻害する物質を意味する。本発明において、ＣｈＥにはアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）（ＥＣ３．１．１．７）、ブチリルコリンエステラーゼなどが含まれる。本発明のＣｈＥ阻害作用を有する化合物の好ましい特徴としては、ブチリルコリンエステラーゼに対してよりもＡＣｈＥに対して高い選択性を有していること、血液脳関門を通過する能力を有していること、治療に際して必要とされる用量においては重篤の副作用を生じさせることはないことなどを挙げることができる。
本発明において神経再生促進剤として使用するための好ましい化合物には、ＣｈＥ、特にＡＣｈＥ阻害作用を有する化合物であり、当該化合物には以下に記述されるようなＣｈＥ阻害作用を有する化合物の薬理学的に許容できる塩、それらの溶媒和物、それらのプロドラッグが含まれる。
（１）コリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物
本発明において、ＣｈＥ阻害作用を有する化合物としては、ドネペジル（ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ）（アリセプト（ＡＲＩＣＥＰＴ）（登録商標））、ガランタミン（レミニール（Ｒｅｍｉｎｙｌ）（登録商標））、タクリン（Ｔａｃｒｉｎｅ）（コグネックス（Ｃｏｇｎｅｘ）（登録商標））、リバスチグミン（エクセロン（Ｅｘｅｌｏｎ）（登録商標））、ジフロシロン（ｚｉｆｒｏｓｉｌｏｎｅ）（米国特許第５６９３６６８号明細書）、フィゾスチグミン（ｐｈｙｓｏｓｔｉｇｍｉｎｅ）（シナプトン（Ｓｙｎａｐｔｏｎ））（Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ  ２６（２００５）９３９−９４６）、イピダクリン（ｉｐｉｄａｃｒｉｎｅ）（米国特許第４５５０１１３号明細書）、キロスチグミン（ｑｕｉｌｏｓｔｉｇｍｉｎｅ）、メトリフォネート（Ｍｅｔｒｉｆｏｎａｔｅ）（プロメム（Ｐｒｏｍｅｍ））（米国特許第４９５０６５８号明細書）、エプタスチグミン、ベルナクリン、トルセリン（ｔｏｌｓｅｒｉｎｅ）、シムセリン（ｃｙｍｓｅｒｉｎｅ）（米国特許第６４１０７４７号明細書）、メスチノン、イコペジル（ｉｃｏｐｅｚｉｌ）（米国特許第５７５０５４２号明細書）、ＴＡＫ−１４７（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３７（１５），２２９２−２２９９，１９９４、日本国特許第２６５０５３７号公報、米国特許第５２７３９７４号明細書）、フペルジンＡ（ｈｕｐｅｒｚｉｎｅ  Ａ）（Ｄｒｕｇｓ  Ｆｕｔ．，２４，６４７−６６３，１９９９）、スタコフィリン（ｓｔａｃｏｆｙｌｌｉｎｅ）（米国特許第４５９９３３８号明細書）、チアトルセリン（ｔｈｉａｔｏｌｓｅｒｉｎｅ）、ネオスチグミン（Ｎｅｏｓｔｉｇｍｉｎｅ）、エセロリン（ｅｓｅｒｏｌｉｎｅ）もしくはチアシムセリン（ｔｈｉａｃｙｍｓｅｒｉｎｅ）などが挙げられる。また、前記化合物の誘導体又は前記化合物のプロドラッグであってもよい。あるいは、前記化合物、前記誘導体又は前記プロドラッグの薬理学的に許容できる塩又はそれらの溶媒和物などもＣｈＥ阻害作用を有する化合物の好ましい態様として含まれる。さらには、ＣｈＥ阻害作用を有する化合物には、国際公開第００／１８３９１号パンフレットに記載されたＣｈＥ阻害作用を有する化合物などが挙げられる。
ガランタミン及びその誘導体は、米国特許第４６６３３１８号明細書、国際公開第８８／０８７０８号パンフレット、国際公開第９７／０３９８７号パンフレット、米国特許第６３１６４３９号明細書、米国特許第６３２３１９５号明細書、米国特許第６３２３１９６号明細書などに記載されている。タクリン及びその誘導体は、米国特許第４６３１２８６号明細書、米国特許第４６９５５７３号明細書、米国特許第４７５４０５０号明細書、国際公開第８８／０２２５６号パンフレット、米国特許第４８３５２７５号明細書、米国特許第４８３９３６４号明細書、米国特許第４９９９４３０号明細書、国際公開第ＷＯ９７／２１６８１号パンフレットなどに記載されている。フィゾスチグミン及びその誘導体は、米国特許第５０７７２８９号明細書、米国特許第５１７７１０１号明細書、米国特許５３０２７２１号明細書、特開平５−３０６２８６号公報、米国特許第７１６６８２４号明細書、欧州特許第２９８２０２号明細書、国際公開第９８／２７０９６号パンフレット、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐ．，２４９（１），１９４〜２０２，１９８９などに記載されている。リバスチグミン及びその誘導体は、欧州特許第１９３９２６号明細書、国際公開第９８／２６７７号パンフレット、国際公開第９８／２７０５５号パンフレットなどに記載されている。
ここで、「プロドラッグ」とは、バイオアベイラビリティ（ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）の改善や副作用の軽減等を目的として、「薬剤の活性本体」（プロドラッグに対応する「薬剤」を意味する）を不活性な物質に化学修飾したものを意味し、吸収後、体内では活性本体へ代謝され、作用を発現する薬剤のことである。従って、「プロドラッグ」という用語は、対応する「薬剤」よりも固有活性（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）は低いが、生物学的な系に投与されると、自発的な化学反応又は酵素触媒反応又は代謝反応の結果、その「薬剤」物質を生成する任意の化合物を指す。当該プロドラッグとしては、上記例示した化合物又は下記の一般式で表される化合物のアミノ基、水酸基、カルボキシル基などがアシル化、アルキル化、リン酸化、ホウ酸化、炭酸化、エステル化、アミド化又はウレタン化された化合物などの種々のプロドラッグを例示することができる。但し、例示した群は包括的なものではなく、典型的なものに過ぎず、当業者は他の既知の各種プロドラッグを公知の方法によって上記例示した化合物又は下記一般式で示される化合物から調製することができる。上記例示した化合物又は下記の一般式で表される化合物からなるプロドラッグは、本発明の範囲内に含まれる。
（２）環状アミン誘導体
本発明において、ＣｈＥ阻害作用、特にＡＣｈＥ阻害作用を有する化合物のさらに好適な例としては、次の一般式（Ｉ）で表される環状アミン誘導体、その薬理学的に許容できる塩、又はそれらの溶媒和物が挙げられる。本発明において、ＣｈＥ阻害作用を有する化合物は、好ましくは１−ベンジル−４−〔（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル〕メチルピペリジン（ドネペジル）及びその薬理学的に許容できる塩並びにそれらの溶媒和物であり、特に好ましくは１−ベンジル−４−〔（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル〕メチルピペリジン・塩酸塩（塩酸ドネペジル）、すなわちアリセプト（ＡＲＩＣＥＰＴ）（登録商標）である。
＜一般式（Ｉ）について＞
一般式（Ｉ）
2006004201.tif 000018
〔式中、Ｊは以下のグループ（ａ）〜（ｅ）に示される基を意味する。
（ａ）置換若しくは無置換の次に示す基；
（１）フェニル基、
（２）ピリジル基、
（３）ピラジル基、
（４）キノリル基、
（５）シクロヘキシル基、
（６）キノキサリル基又は
（７）フリル基、
（ｂ）フェニル基が置換されていてもよい次の群から選択された基から誘導される一価又は二価の基；
（１）インダニル、
（２）インダノニル、
（３）インデニル、
（４）インデノニル、
（５）インダンジオニル、
（６）テトラロニル、
（７）ベンズスベロニル、
（８）インダノリル、
（９）式
2006004201.tif 000019
（ｃ）環状アミド化合物から誘導される一価の基、
（ｄ）低級アルキル基、又は
（ｅ）式  Ｒ１−ＣＨ＝ＣＨ−（式中、Ｒ１は水素原子又は低級アルコキシカルボニル基を意味する）
2006004201.tif 000020
（式中、Ｒ３は水素原子、低級アルキル基、アシル基、低級アルキルスルホニル基、置換されてもよいフェニル基又はベンジル基を意味する）で示される基、
2006004201.tif 000021
｛以上の式中、ｎは０又は１〜１０の整数を意味する。Ｒ２は水素原子又はメチル基を意味する。｝、式＝（ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ）ｂ−（式中、ｂは１〜３の整数を意味する）で示される基、式＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｃ−（式中、ｃは０又は１〜９の整数を意味する）で示される基、式＝（ＣＨ−ＣＨ）ｄ＝（式中、ｄは０又は１〜５の整数を意味する）で示される基、
2006004201.tif 000022
で示される基、式−ＮＨ−で示される基、式−Ｏ−で示される基、式−Ｓ−で示される基、ジアルキルアミノアルキルカルボニル基又は低級アルコキシカルボニル基を意味する。
Ｔは窒素原子又は炭素原子を意味する。
2006004201.tif 000023
Ｋは水素原子、置換若しくは無置換のフェニル基、フェニル基が置換されてもよいアリールアルキル基、フェニル基が置換されてもよいシンナミル基、低級アルキル基、ピリジルメチル基、シクロアルキルアルキル基、アダマンタンメチル基、フリルメチル基、置換されてもよいシクロアルキル基、低級アルコキシカルボニル基又はアシル基を意味する。
ｑは１〜３の整数を意味する。
2006004201.tif 000024
本明細書において、「低級アルキル基」とは、炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝状のアルキル基、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基：ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基（アミル基）、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、１，２−ジメチルプロピル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、１−メチルペンチル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、１，１−ジメチルブチル基、１，２−ジメチルブチル基、２，２−ジメチルブチル基、１，３−ジメチルブチル基、２，３−ジメチルブチル基、３，３−ジメチルブチル基、１−エチルブチル基、２−エチルブチル基、１，１，２−トリメチルプロピル基、１，２，２−トリメチルプロピル基、１−エチル−１−メチルプロピル基、１−エチル−２−メチルプロピル基などを意味する。これらのうち好ましい基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基などを挙げることができ、最も好ましいものはメチル基である。「低級アルキル基」は、本発明の化合物（Ｉ）における上記の定義において、例えばＪ，Ｋ，Ｒ３，Ｒ４の定義中に記載されている。
本明細書において、「低級アルコキシ基」とは、メトキシ基、エトキシ基など、上記の低級アルキル基に対応する低級アルコキシ基を意味する。
本明細書において、「低級アルコキシカルボニル基」とは、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ｎ−プロポキシカルボニル基、ｎ−ブチロキシカルボニル基など、前記低級アルコキシ基に対応する低級アルコキシカルボニル基を意味する。
本明細書において、「シクロアルキル基」とは、炭素数４〜１０の環状のアルキル基であり、例えば、限定するわけではないが、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等を挙げることができる。
＜Ｊについて＞
Ｊにおける（ａ）グループ「置換もしくは無置換の次に示す基；（１）フェニル基、（２）ピリジル基、（３）ピラジル基、（４）キノリル基、（５）シクロヘキシル基、（６）キノキサリル基又は（７）フリル基」という定義において、置換基としては、
メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基などの炭素数１〜６の低級アルキル基；
メトキシ基、エトキシ基など上記の低級アルキル基に対応する低級アルコキシ基；
ニトロ基；
塩素、臭素、フッ素などのハロゲン；
カルボキシル基；
メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ｎ−プロポキシカルボニル基、ｎ−ブチロキシカルボニル基など、上記の低級アルコキシ基に対応する低級アルコキシカルボニル基；
アミノ基；
モノ低級アルキルアミノ基；
ジ低級アルキルアミノ基；
カルバモイル基；
アセチルアミノ基、プロピオニルアミノ基、ブチリルアミノ基、イソブチリルアミノ基、バレリルアミノ基、ピバロイルアミノ基など、炭素数１〜６の脂肪族飽和モノカルボン酸から誘導されるアシルアミノ基；
シクロヘキシルオキシカルボニル基などのシクロアルキルオキシカルボニル基；
メチルアミノカルボニル基、エチルアミノカルボニル基などの低級アルキルアミノカルボニル基；
メチルカルボニルオキシ基、エチルカルボニルオキシ基、ｎ−プロピルカルボニルオキシ基など前記に定義した低級アルキル基に対応する低級アルキルカルボニルオキシ基；
トリフルオロメチル基などに代表されるハロゲン化低級アルキル基；
水酸基；
ホルミル基；
エトキシメチル基、メトキシメチル基、メトキシエチル基などの低級アルコキシ低級アルキル基
などを挙げることができる。上記の置換基の説明において、「低級アルキル基」、「低級アルコキシ基」とは、前記の定義から派生する基をすべて含むものとする。（ａ）グループの（１）〜（７）の基は、同一又は異なる１〜３個の上記の置換基で置換されていてもよい。
さらにフェニル基の場合は、次の場合も置換されたフェニル基に含まれるものとする。すなわち、
2006004201.tif 000025
される基、式−ＣＨ２−Ｏ−で示される基、式−ＣＨ２−ＳＯ２−で示される基、式
2006004201.tif 000026
Ｅは炭素原子又は窒素原子を意味する。
Ｄはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基などの炭素数１〜６の低級アルキル基；
メトキシ基、エトキシ基など上記の低級アルキル基に対応する低級アルコキシ基；
ニトロ基；
塩素、臭素、フッ素などのハロゲン；
カルボキシル基；
メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ｎ−プロポキシカルボニル基、ｎ−ブチロキシカルボニル基など、上記の低級アルコキシ基に対応する低級アルコキシカルボニル基；
アミノ基；
モノ低級アルキルアミノ基；
ジ低級アルキルアミノ基；
カルバモイル基；
アセチルアミノ基、プロピオニルアミノ基、ブチリルアミノ基、イソブチリルアミノ基、バレリルアミノ基、ピバロイルアミノ基など、炭素数１〜６の脂肪族飽和モノカルボン酸から誘導されるアシルアミノ基；
シクロヘキシルオキシカルボニル基などのシクロアルキルオキシカルボニル基；
メチルアミノカルボニル基、エチルアミノカルボニル基などの低級アルキルアミノカルボニル基；
メチルカルボニルオキシ基、エチルカルボニルオキシ基、ｎ−プロピルカルボニルオキシ基など前記に定義した低級アルキル基に対応する低級アルキルカルボニルオキシ基；
トリフルオロメチル基などに代表されるハロゲン化低級アルキル基；
水酸基；
ホルミル基；
エトキシメチル基、メトキシメチル基、メトキシエチル基などの低級アルコキシ低級アルキル基
などを挙げることができる。上記の置換基の説明において、「低級アルキル基」、「低級アルコキシ基」とは、前記の定義から派生する基をすべて含むものとする。）。
これらのうち、フェニル基に好ましい置換基としては、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ニトロ基、ハロゲン化低級アルキル基、低級アルコキシカルボニル基、ホルミル基、水酸基、低級アルコキシ低級アルキル基、ハロゲン、ベンゾイル基、ベンジルスルホニル基などを挙げることができ、置換基は同一又は相異なって２つ以上でもよい。
ピリジル基の置換基に好ましい基としては、低級アルキル基、アミノ基、ハロゲン原子などを挙げることができる。
ピラジル基の置換基に好ましい基としては、低級アルコキシカルボニル基、カルボキシル基、アシルアミノ基、カルバモイル基、シクロアルキルオキシカルボニル基などを挙げることができる。
また、Ｊとしてのピリジル基は、２−ピリジル基、３−ピリジル基又は４−ピリジル基が望ましく、ピラジル基は２−ピラジル基が望ましく、キノリル基は２−キノリル基又は３−キノリル基が望ましく、キノキサリル基は２−キノキサリル基又は３−キノキサリル基が望ましく、フリル基は２−フリル基が望ましい。
Ｊの定義において、（ｂ）グループに記載されている（１）〜（９）から誘導される一価又は二価の基について、その代表例を示せば以下のとおりである。
2006004201.tif 000027
2006004201.tif 000028
上記一連の式において、ｔは０又は１〜４の整数を意味し、フェニル基が０又は１〜４個の同一又は相異なるＳで示した基で置換されることを示す。Ｓは同一又は相異なる前記したＪ（ａ）グループの定義における置換基のうち１つ又は水素原子を意味するが、好ましくは水素原子（無置換）、低級アルキル基又は低級アルコキシ基をあげることができる。さらに、フェニル環の隣りあう炭素間でメチレンジオキシ基、エチレンジオキシ基などのアルキレンジオキシ基で置換されていてもよい。
これらのうち、好ましい場合は、無置換若しくはメトキシ基、イソプロポキシ基が１〜３個置換されている場合、メチレンジオキシ基が置換されている場合であり、最も好ましい場合は、無置換若しくはメトキシ基が１〜３個置換されている場合である。
なお、上記のインダノリデニルはＪ（ｂ）の定義におけるフェニル基が置換されていてもよい二価の基の例である。すなわちＪ（ｂ）の（２）のインダノニルから誘導される代表的な二価の基である。
Ｊの定義において、（ｃ）グループの環状アミド化合物から誘導される一価の基とは、例えばキナゾロン、テトラハイドロイソキノリン−オン、テトラハイドロベンゾジアゼピン−オン、ヘキサハイドロベンツアゾシン−オンなどを挙げることができるが、構造式中に環状アミドが存在すればよく、これらのみに限定されない。
環状アミドには、単環もしくは縮合ヘテロ環から誘導される環状アミドがありうるが、縮合ヘテロ環としては、フェニル環との縮合ヘテロ環が好ましい。この場合、フェニル環は炭素数１〜６の低級アルキル基、好ましくはメチル基、炭素数１〜６の低級アルコキシ基、好ましくはメトキシ基あるいはハロゲン原子によって置換されていてもよい。
好ましい例を挙げれば次の通りである。
2006004201.tif 000029
2006004201.tif 000030
上記の式中で、式（ｉ），（ｌ）におけるＹは水素原子又は低級アルキル基を意味し、式（ｋ）におけるＶは水素原子又は低級アルコキシ基、式（ｍ），（ｎ）におけるＷ１，Ｗ２は水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、Ｗ３は水素原子又は低級アルキル基を意味する。式（ｊ）におけるＵは、水素原子、低級アルキル基、又は低級アルコキシ基を意味する。
なお、式（ｊ），（ｌ）において、右側の環は７員環であり、式（ｋ）において右側の環は８員環である。
Ｊの定義において、（ｄ）グループ「低級アルキル基」は、前記した通りである。
Ｊの上記の定義のうち好ましいものは、（ａ）グループに含まれる基、（ｂ）グループに含まれる基、（ｃ）グループに含まれる基であり、最も好ましいものは、（ｂ）グループに含まれる、フェニル環が置換されてもよいインダノン（インダノニル）から誘導される一価の基、（ｃ）グループの環状アミド化合物から誘導される一価の基である。
＜Ｂについて＞
2006004201.tif 000031
Ｒ２が水素原子である場合は式−（ＣＨ２）ｎ−で表され、さらにアルキレン鎖のいずれかの炭素原子に１つ又はそれ以上のメチル基が結合していてもよいことを意味する。この場合、好ましくはｎは１〜３である。
Ｂにおいて、「ジアルキルアミノアルキルカルボニル基」は、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノアルキルカルボニル基、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノアルキルカルボニル基、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノアルキルカルボニル基、Ｎ−メチル−Ｎ−エチルアミノアルキルカルボニル基を挙げることができる。
また、Ｂの一連の基において、基内にアミド基を有する場合も好ましい基の一つである。
さらに好ましい基としては、式−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ）ｎＲ２−（式中、ｎは０又は１〜１０の整数を意味し、Ｒ２は水素原子又はメチル基を意味する）で示される基、式＝（ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ）ｂ−（式中、ｂは１〜３の整数を意味する）で示される基、式＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｃ−（式中、ｃは０又は１〜９の整数を意味する）で示される基、式＝（ＣＨ−ＣＨ）ｄ＝（式中、ｄは０又は１〜５の整数を意味する）で示される基、式−ＮＨ−で示される基、式−Ｏ−で示される基又は式−Ｓ−で示される基をあげることができる。
＜Ｔ、Ｑ、ｑについて＞
2006004201.tif 000032
Ｑ＝Ｎ）で表されるピペリジンの場合である。
＜Ｋ、結合について＞
Ｋの定義における「置換又は無置換のフェニル基」、「置換もしくは無置換の（フェニル基が置換されてもよい）アリールアルキル基」、「フェニル基が置換されてもよいシンナミル基」、「置換されてもよいシクロアルキル基」において、置換基は前記のＪの定義において（ａ）グループの（１）〜（７）において定義されたものと同一のものである。好ましくは、無置換であるか、又は、ニトロ基、メチルなどの低級アルキル基、もしくはフッ素などのハロゲンで置換されてもよい。
アリールアルキル基とは、フェニル環が上記の置換基で置換されるか、無置換のベンジル基、フェネチル基などを意味する。
ピリジルメチル基とは具体的には、２−ピリジルメチル基、３−ピリジルメチル基、４−ピリジルメチル基などを挙げることができる。
Ｋについては、フェニル基が置換されてもよいアリールアルキル基、置換若しくは無置換のフェニル基、フェニル基が置換されてもよいシンナミル基、置換されてもよいシクロアルキル基が最も好ましい。
好ましいアリールアルキル基は、具体的には例えばベンジル基、フェネチル基などをいい、これらはフェニル基が炭素数１〜６の低級アルコキシ基、炭素数１〜６の低級アルキル基、水酸基などで置換されていてもよい。
2006004201.tif 000033
二重結合である場合の例をあげれば、上記で述べたフェニル環が置換されてもよいインダノンから誘導される二価の基の場合、すなわちインダノリデニル基である場合をあげることができる。
＜化合物群（Ａ）について＞
これらの定義を総合して特に好ましい化合物群をあげれば次の一般式で表される化合物群（Ａ）をあげることができる。
2006004201.tif 000034
〔式中、Ｊ１はフェニル基が置換されていてもよい次の群から選択された基から誘導される一価又は二価の基；
（１）インダニル、
（２）インダノニル、
（３）インデニル、
（４）インデノニル、
（５）インダンジオニル、
（６）テトラロニル、
（７）ベンズスベロニル、
（８）インダノリル、
次式（９）
2006004201.tif 000035
で表される環状アミン、その薬理学的に許容できる塩、又はそれらの溶媒和物。
上記のＪ１の定義中、最も好ましい基としては、フェニル基が置換されていてもよいインダノニル基、インダンジオニル基、インダノリデニル基をあげることができる。また、この場合、フェニル基は置換されていないか、同一又は相異なる水酸基、ハロゲン、低級アルコキシ基で置換されている場合か、フェニル環の隣り合う炭素間でアルキレンジオキシ基で置換されている場合が最も好ましい。低級アルコキシ基とは、炭素数１〜６の例えばメトキシ基、エトキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−プロポキシ基、ｎ−ブトキシ基などをいい、１〜４置換をとりうるが、２置換の場合が好ましい。最も好ましい場合はメトキシ基が２置換となっている場合である。
＜化合物群（Ｂ）について＞
（Ａ）式に含まれる化合物の中でさらに好ましい化合物群としては、次の一般式で表される化合物群（Ｂ）をあげることができる。
2006004201.tif 000036
〔式中、Ｊ１は前記と同様の意味を有する。
2006004201.tif 000037
する。Ｒ２は水素原子又はメチル基を意味する。）で示される基、式−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ）ｎＲ２−（式中、ｎは０又は１〜１０の整数を意味し、Ｒ２は水素原子又はメチル基を意味する）で示される基、式＝（ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ）ｂ−（式中、ｂは１〜３の整数を意味する）で示される基、式＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｃ−（式中、ｃは０又は１〜９の整数を意味する）で示される基又は式＝（ＣＨ−ＣＨ）ｄ＝（式中、ｄは０又は１〜５の整数を意味する）で示される基を意味する。Ｂ１は、好ましくは式−（ＣＨ）ｎＲ２−（式中、ｎは０又は１〜１０の整数を意味する。Ｒ２は水素原子又はメチル基を意味する）で示される基であり、より好ましくはｎ＝１、Ｒ２は水素原子の−ＣＨ２−、又はｎ＝３、Ｒ２は水素原子の−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。また、Ｂ１は、好ましくは式−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ）ｎＲ２−（式中、ｎは０又は１〜１０の整数を意味し、Ｒ２は水素原子又はメチル基を意味する）で示される基であり、より好ましくはｎ＝１、Ｒ２は水素原子の−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−である。
2006004201.tif 000038
＜化合物群（Ｃ）について＞
（Ｂ）式に含まれる化合物群の中でさらに好ましい化合物群としては、次の一般式で表される化合物群（Ｃ）をあげることができる。
2006004201.tif 000039
れる基、即ちピペリジンの場合である。
＜化合物群（Ｄ）について＞
（Ｃ）式に含まれる化合物群の中でさらに好ましい化合物群としては、次の一般式で表される化合物群（Ｄ）をあげることができる。
2006004201.tif 000040
（式中、Ｊ２はフェニル基が置換されてもよいインダノニルから誘導される一価又は二価の基（例えば、インダノニル、インダノリデニル基）、インデニル及びインダンジオニルから選択された基を意味する。より好ましくは、Ｊ２が置換基として炭素数１〜６の低級アルキル基又は炭素数１〜６の低級アルコキシ基を有してもよいインダノニル基を意味する。
Ｋ１は置換若しくは無置換のフェニル基、置換されてもよいアリールアルキル基、置換されてもよいシンナミル基、置換されてもよいシクロアルキル基を意味する。
2006004201.tif 000041
本発明において、ＣｈＥ阻害作用を有する化合物としては、好ましくは、
１−ベンジル−４−（（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル）メチルピペリジン、
１−ベンジル−４−（（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イリデニル）メチルピペリジン、
１−ベンジル−４−（（５−メトキシ−１−インダノン）−２−イル）メチルピペリジン、
１−ベンジル−４−（（５，６−メチレンジオキシ−１−インダノン）−２−イル）メチルピペリジン、
１−（ｍ−ニトロベンジル）−４−（（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル）メチルピペリジン、
１−シクロヘキシルメチル−４−（（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル）メチルピペリジン、
１−（ｍ−フルオロベンジル）−４−（（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル）メチルピペリジン、
１−ベンジル−４−（３−（（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル）プロピル）ピペリジン、
１−ベンジル−４−（（５−イソプロポキシ−６−メトキシ−１−インダノン）−２−イル）メチルピペリジン、
１−ベンジル−４−（（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イリデニル）プロペニルピペリジン、及び
１−ベンジル−４−（（５，６−ジメトキシ−１，３−インダンジオン）−２−イル）プロペニルピペリジンであり、より好ましくは、１−ベンジル−４−（（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル）メチルピペリジンである。
（３）製造方法
本発明において用いるＣｈＥ阻害作用を有する化合物、その薬理学的に許容できる塩、又はそれらの溶媒和物は、公知の方法で製造することができ、前記一般式（Ｉ）で表される環状アミン誘導体（例えば、塩酸ドネペジル）は、その代表的な例として、特開平１−７９１５１号公報、日本国特許２５７８４７５号公報、日本国特許２７３３２０３号公報、日本国特許３０７８２４４号公報又は米国特許第４８９５８４１号公報などに開示されている方法により容易に製造することができる。また、塩酸ドネペジルは、細粒剤などの製剤としても入手できる。
ガランタミン及びその誘導体は、米国特許第４６６３３１８号明細書、国際公開第８８／０８７０８号パンフレット、国際公開第９７／０３９８７号パンフレット、米国特許第６３１６４３９号明細書、米国特許第６３２３１９５号明細書、米国特許第６３２３１９６号明細書などに開示されている方法により容易に製造することができる。
タクリン及びその誘導体は、米国特許第４６３１２８６号明細書、米国特許第４６９５５７３号明細書、米国特許第４７５４０５０号明細書、国際公開第８８／０２２５６号パンフレット、米国特許第４８３５２７５号明細書、米国特許第４８３９３６４号明細書、米国特許第４９９９４３０号明細書、国際公開第ＷＯ９７／２１６８１号パンフレットなどに開示されている方法により容易に製造することができる。
フィゾスチグミン及びその誘導体は、米国特許第５０７７２８９号明細書、米国特許第５１７７１０１号明細書、米国特許５３０２７２１号明細書、特開平５−３０６２８６号公報、米国特許第７１６６８２４号明細書、欧州特許第２９８２０２号明細書、国際公開第９８／２７０９６号パンフレット、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐ．，２４９（１），１９４〜２０２，１９８９などに開示されている方法により容易に製造することができる。
リバスチグミン及びその誘導体は、欧州特許第１９３９２６号明細書、国際公開第９８／２６７７５号パンフレット、国際公開第９８／２７０５５号パンフレットなどに開示されている方法により容易に製造することができる。
これらの化合物のうち商業上入手可能なものは、化学メーカー等から容易に入手することができる。
本発明において、薬理学的に許容できる塩とは、例えば塩酸塩、硫酸塩、臭化水素酸塩、燐酸塩などの無機酸塩、蟻酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。
また、置換基の選択によっては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩などの有機アミン塩、アンモニウム塩などを形成する場合もある。
本発明の神経再生促進剤の有効成分であるＣｈＥ阻害作用を有する化合物、又はその薬理学的に許容できる塩（例えば、塩酸ドネペジル）は、無水物であってもよく、水和物などの溶媒和物を形成していてもよい。本発明において、溶媒和物とは薬理学的に許容できる溶媒和物が好ましい。薬理学的に許容できる溶媒和物は、水和物、非水和物のいずれであってもよいが、水和物が好ましい。溶媒は水、アルコール（例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール）、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などを使用することができる。
なお、本発明において上記化合物は、置換基の種類によっては不斉炭素を有し、光学異性体が存在しうるが、これらは本発明の範囲に属することはいうまでもない。また、ドネペジルなど、上記化合物には結晶多型が存在することもあるがこれに限定されず、いずれかの結晶形が単一であってもよいし、結晶形混合物であってもよく、これらは本発明の範囲に属する。
具体的な例を一つ述べれば、Ｊがインダノン骨格を有する場合、不斉炭素を有するので幾何異性体、光学異性体、ジアステレオマーなどが存在しうるが、何れも本発明の範囲に含まれる。
２．神経再生促進剤
本発明において神経再生促進剤とは、ヒト由来の幹細胞又はヒト以外の生物、例えばウシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、イヌ、ウサギなどの非ヒト哺乳動物由来の幹細胞（例えば神経幹細胞、胚性幹細胞など）が神経前駆細胞に分化し、機能的に成熟した神経細胞として神経回路に組み込まれるまでの過程に作用し、神経再生を促進する作用を有する薬剤を意味する。本発明において、「神経再生」とは、神経幹細胞に対する自己複製促進作用、神経幹細胞に対する増殖促進作用、神経幹細胞に対する神経前駆細胞への分化促進作用、神経前駆細胞に対する増殖促進作用、神経前駆細胞に対する神経細胞への成熟促進作用、神経幹細胞又は神経前駆細胞に対する生存促進作用、神経幹細胞又は神経前駆細胞に対する細胞死抑制作用、及び再生した神経細胞に対するシナプス形成促進作用のうち、少なくとも一つの作用機序による神経再生を意味する。
前記ＣｈＥ阻害作用を有する化合物、その薬理学的に許容できる塩、又はそれらの溶媒和物は、神経再生を促進する作用を有する。また、海馬の神経機能が障害される疾患の治療薬の有効成分として有用である。
従って、本発明は、本発明のＣｈＥ阻害作用を有する化合物、その薬理学的に許容できる塩、又はそれらの溶媒和物の有効量を患者に投与することを特徴とする神経再生促進方法も提供する。
本発明の神経再生促進剤は、神経再生を促進するその作用により、社会不安障害の治療に用いることができる。
社会不安障害の病因は、ストレスあるいは心的トラウマによって海馬における神経再生が低下することがその一因である可能性が指摘されている。そして、以下の（ｉ）〜（ｖ）の事項は、ＳＳＲＩがＰＴＳＤ患者の海馬における神経再生を促進する作用を介して治療効果を示している可能性を示唆する。
（ｉ）心的外傷後ストレス障害ＰＴＳＤの患者では海馬の容量が減少することが報告されている。そして、この海馬容量の減少がＰＴＳＤ等、社会不安障害発症の一因となることが指摘されていること、
（ｉｉ）社会不安障害の動物モデルでは海馬における神経再生が減少していること、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の動物実験の結果等から（ｉ）の一因として海馬における神経再生の低下が関与する可能性が指摘されていること、
（ｉｖ）社会不安障害の治療に用いられるＳＳＲＩ（ｐａｒｏｘｅｔｉｎｅ）の投与によりＰＴＳＤ患者の海馬容積が増加することが報告されていること、及び
（ｖ）ＳＳＲＩは海馬の神経再生を促進する事が報告されていること
ＳＳＲＩは神経再生促進作用を介して社会不安障害への治療効果を示しているとすれば、神経再生を促進する作用を有する薬剤は、社会不安障害の治療薬となる可能性があるといえる。すなわち、上記の（ｉ）〜（ｖ）の事項は、本発明の神経再生促進剤がＰＴＳＤ等の社会不安障害の治療薬として有用であることを示すものである。従って、本発明の神経再生促進剤の適応症の１つとして、社会不安障害が適当であり、本発明の神経再生促進剤は社会不安障害の治療に用いることができる。
「治療」とは、一般的に、所望の薬理学的効果及び／又は生理学的効果を得ることを意味する。効果は、疾病及び／又は症状を完全に又は部分的に防止する点では予防的であり、疾病及び／又は疾病に起因する悪影響の部分的又は完全な治癒という点では治療的である。本明細書において「治療」とは、患者哺乳動物、特にヒトの疾病の任意の治療を意味し、上記一般的治療の意味も包含する。「治療」には、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）の事項を含む：
（ａ）疾病又は症状の素因を持ちうるが、まだ持っていると診断されていない患者において、疾病又は症状が起こることを予防すること；
（ｂ）疾病症状を阻害する、即ち、その進行を阻止又は遅延すること；
（ｃ）疾病症状を緩和すること、即ち、疾病又は症状の後退、消失、又は症状の進行の逆転を引き起こすこと。
ＣｈＥ阻害作用を有する化合物もしくはその塩又はそれらの溶媒和物あるいはそのプロドラッグもしくはその塩又はそれらの溶媒和物は、ヒト又は非ヒト哺乳動物に、種々の形態、経口又は非経口（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与）のいずれかの投与経路で投与することができる。ＣｈＥ阻害作用を有する化合物もしくはその塩又はそれらの溶媒和物あるいはそのプロドラッグもしくはその塩又はそれらの溶媒和物は、単独で用いることも可能であるが、投与経路に応じて慣用される方法により医薬用担体を用いて適当な剤形に製剤化することが可能である。
好ましい剤形としては、例えば錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、被覆錠剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤等による経口剤、吸入剤、坐剤、注射剤（点滴剤を含む）、軟膏剤、点眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、点耳剤、貼付剤、パップ剤、ローション剤、リポソーム剤等による非経口剤が挙げられる。
これらの製剤の製剤化に用いる担体には、例えば通常用いられる溶剤、賦形剤、コーティング剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤や、必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、抗酸化剤、増量剤、湿潤化剤、表面活性化剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、懸濁化剤、粘稠剤、無痛化剤、等張化剤等を使用することができ、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分を配合して常法により製剤化することが可能である。使用可能な無毒性のこれらの成分としては、例えば大豆油、牛脂、合成グリセライド等の動植物油；例えば流動パラフィン、スクワラン、固形パラフィン等の炭化水素；例えばミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル等のエステル油；例えばセトステアリルアルコール、ベヘニルアルコール等の高級アルコール；シリコン樹脂；シリコン油；例えばポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー等の界面活性剤；例えばヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリル酸、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース等の水溶性高分子；例えばエタノール、イソプロパノール等の低級アルコール；例えばグリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトール、ポリエチレングリコール等の多価アルコール（ポリオール）；例えばグルコース、ショ糖等の糖；例えば無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、ケイ酸アルミニウム等の無機粉体；塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムなどの無機塩；精製水等が挙げられる。
賦形剤としては、例えば乳糖、果糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、マンニトール、ソルビット、結晶セルロース、二酸化ケイ素等が、結合剤としては、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコール・ポリオキシエチレン・ブロックコポリマー、メグルミン等が、崩壊剤としては、例えば澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン、カルボキシメチルセルロース・カルシウム等が、滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油等が、着色剤としては医薬品に添加することが許可されているものが、矯味矯臭剤としては、ココア末、ハッカ脳、芳香散、ハッカ油、竜脳、桂皮末等が、ぞれぞれ用いられる。上記の成分は、その塩又はその溶媒和物であってもよい。
例えば経口製剤は、ＣｈＥ阻害作用を有する化合物もしくはその塩又はそれらの溶媒和物あるいはそのプロドラッグもしくはその塩又はそれらの溶媒和物に賦形剤、さらに必要に応じて例えば結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤等を加えた後、常法により例えば散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤等とする。
錠剤・顆粒剤の場合には、カルナウバロウ、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マクロゴール、ヒドロキシプロピルメチルフタレート、セルロースアセテートフタレート、白糖、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、リン酸カルシウムのようなコーティング剤を用い、周知の方法でコーティングしてもよい。
シロップ剤製造に用いられる担体の具体例としては、白糖、ブドウ糖、果糖のような甘味剤、アラビアゴム、トラガント、カルメロースナトリウム、メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、結晶セルロース、ビーガムのような懸濁化剤、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリソルベート８０のような分散剤が挙げられる。シロップ剤製造にあたっては、必要に応じて矯味剤、芳香剤、保存剤、溶解補助剤、安定化剤等を添加することができる。また、用時溶解又は懸濁するドライシロップの形であってもよい。
注射剤は、通常、例えば、ＣｈＥ阻害作用を有する化合物の塩を注射用蒸留水に溶解して調製するが、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、安定化剤等を添加し、常法により製剤化することができる。注射剤の無菌化は、フィルターによる濾過滅菌、殺菌剤の配合などにより行えばよい。また、注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。すなわち、凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水又は他の溶媒に溶解して使用することができる。
外用剤の場合は、特に製法が限定されず、常法により製造することができる。使用する基剤原料としては、医薬品、医薬部外品、化粧品等に通常使用される各種原料を用いることが可能であり、例えば動植物油、鉱物油、エステル油、ワックス類、高級アルコール類、脂肪酸類、シリコン油、界面活性剤、リン脂質類、アルコール類、多価アルコール類、水溶性高分子類、粘土鉱物類、精製水等の原料が挙げられ、必要に応じ、ｐＨ調整剤、抗酸化剤、キレート剤、防腐防黴剤、着色料、香料等を添加することができる。吸入剤は、吸入による投与のために、ＣｈＥ阻害作用を有する化合物もしくはその塩又はそれらの溶媒和物あるいはそのプロドラッグもしくはその塩又はそれらの溶媒和物は、注入器、噴霧器もしくは加圧パック又はエアロゾルスプレーを送達する他の都合のよい様式から送達することができる。加圧パックは、適当な噴射剤を含むことができる。また、吸入による投与のために、ＣｈＥ阻害作用を有する化合物もしくはその塩又はそれらの溶媒和物あるいはそのプロドラッグもしくはその塩又はそれらの溶媒和物は、乾燥粉末組成物の形又は液体スプレーの形態で投与することもできる。貼布剤として経皮吸収により投与する場合には、塩を形成しない、いわゆるフリー体を選択することが好ましい。表皮への局所投与のために、ＣｈＥ阻害作用を有する化合物は軟膏、クリームもしくはローションとして、又は経皮パッチのための活性成分として製剤化することができる。軟膏及びクリームは、例えば、水性又は油性基剤に適当な増粘及び／又はゲル化剤を加えて製剤化することができる。ローションは水性又は油性基剤を用いて製剤化することができ、また一般には１つ又は複数の乳化剤、安定化剤、分散剤、懸濁化剤、増粘剤、及び／又は着色剤を含むこともできる。ＣｈＥ阻害作用を有する化合物はイオン浸透療法によって投与することもできる。
さらに、必要に応じて血流促進剤、殺菌剤、消炎剤、細胞賦活剤、ビタミン類、アミノ酸、保湿剤、角質溶解剤等の成分を配合することもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。
本発明の神経再生促進剤は、通常、活性成分としてＣｈＥ阻害作用を有する化合物もしくはその塩又はそれらの溶媒和物あるいはそのプロドラッグもしくはその塩又はそれらの溶媒和物を０．５重量％以上、好ましくは１０〜７０重量％の割合で含有することができる。
ＣｈＥ阻害作用を有する化合物もしくはその塩又はそれらの溶媒和物あるいはそのプロドラッグもしくはその塩又はそれらの溶媒和物を前記治療に使用する場合は、少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
経口投与におけるＣｈＥ阻害作用を有する化合物もしくはその塩又はそれらの溶媒和物あるいはそのプロドラッグもしくはその塩又はそれらの溶媒和物の投与量は、例えば投与経路、疾患の種類、症状の程度、患者の年齢、性別、体重、塩の種類、疾患の具体的な種類、薬物動態及び毒物学的特徴などの薬理学的知見、薬物送達系が用いられるかどうか、ならびに他の薬物の組合せの一部として投与されるかどうかを含む様々な因子に従って選択されるため変動するが、当業者であれば適宜設定することができる。例えば、成人（６０ｋｇ）１人あたり、約０．００１〜１０００ｍｇ／日、好ましくは約０．０１〜５００ｍｇ／日、より好ましくは約０．１〜３００ｍｇ／日であり、１回又は数回に分けて投与することができる。小児に投与される場合は、用量は成人に投与される量よりも少ない可能性がある。実際に用いられる投与法は、大幅に変動することもあり、本明細書に記載の好ましい投与法から逸脱してもよい。例えば、塩酸ドネペジルの場合は、成人（体重６０ｋｇ）あたり、好ましくは約０．１〜３００ｍｇ／日であり、より好ましくは約０．１〜１００ｍｇ／日であり、さらに好ましくは約１．０〜５０ｍｇ／日である。塩酸ドネペジルの好ましい態様において、商品名アリセプト錠（エーザイ株式会社）として市販されている５ｍｇ錠又は１０ｍｇ錠の塩酸ドネペジル、商品名アリセプト細粒（エーザイ株式会社）の塩酸ドネペジルを投与することができる。例えば、錠剤は１日に１回から約４回で投与することができる。好ましい態様において、１日に１回、商品名アリセプト錠（エーザイ株式会社）の５ｍｇ錠又は１０ｍｇ錠を１錠投与する。当業者であれば、塩酸ドネペジルが小児に投与される場合は、用量は成人に投与される量よりも少ない可能性があり、好ましい態様において、小児には塩酸ドネペジルを約０．５〜１０ｍｇ／日、好ましくは約１．０〜３ｍｇ／日で投与することができる。また、タクリンの場合は、成人（体重６０ｋｇ）あたり、約０．１〜３００ｍｇ／日であり、好ましくは約４０〜１２０ｍｇ／日で、リバスチグミンの場合は、成人（体重６０ｋｇ）あたり、約０．１〜３００ｍｇ／日であり、好ましくは約３〜１２ｍｇ／日で、ガランタミンの場合は、成人（体重６０ｋｇ）あたり、約０．１〜３００ｍｇ／日であり、好ましくは約１６〜３２ｍｇ／日、フィゾスチグミンの場合は、成人（体重６０ｋｇ）あたり、約０．１〜３００ｍｇ／日であり、好ましくは約０．６〜２４ｍｇ／日で投与することが好ましい。それぞれ、小児に投与される場合は、用量は成人に投与される量よりも少ない可能性がある。
非経口投与において、貼布剤の場合、好ましい投与量としては、成人（６０ｋｇ）１人あたり、約５〜５０ｍｇ／日であり、さらに好ましくは約１０〜２０ｍｇ／日である。また、注射剤の場合には、生理食塩水又は市販の注射用蒸留水などの薬理学的に許容できる担体中に０．１μｇ／ｍｌ担体〜１０ｍｇ／ｍｌ担体の濃度となるように溶解又は懸濁することにより製造することができる。このようにして製造された注射剤の投与量は、処置を必要とする患者に対し、成人（６０ｋｇ）１人あたり、約０．０１〜５０ｍｇ／日であり、好ましくは約０．０１〜５．０ｍｇ／日であり、さらに好ましくは約０．１〜１．０ｍｇ／日であり、一日あたり１〜３回に分けて投与することができる。小児に投与される場合は、用量は成人に投与される量よりも少ない可能性がある。
３．神経再生を促進する物質、その薬理学的に許容できる塩、又はそれらの溶媒和物のスクリーニング方法
また、本発明は、神経再生を促進する物質、その薬理学的に許容できる塩、又はそれらの溶媒和物のスクリーニング方法を提供するものである。
本発明のスクリーニング方法は、その候補となる物質を、神経幹細胞、神経幹細胞を含む組織又は神経幹細胞を含む非ヒト哺乳動物に投与して、前記細胞に作用させ、前記候補物質の存在下及び非存在下における神経再生の表現型変化を検出又は測定することを含むものである。
本発明のスクリーニング方法において、候補物質はＣｈＥ（ＡＣｈＥを含む）阻害作用を有する物質、例えば前記ＣｈＥ阻害作用を有する化合物、抗ＣｈＥ抗体、ＣｈＥに対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなどを含む。当該物質は、その塩又はそれらの溶媒和物であってもよい。ＣｈＥ阻害作用を有する化合物は、前記の記載を参照することで製造、入手することができる。抗ＣｈＥ抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれを使用することもでき、当業者であれば、例えばＣｈＥを感作抗原として当該抗体を作製することができる。ＣｈＥ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなどは、ＣｈＥ遺伝子の発現を抑制することのできる核酸であればよく、当業者であればｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなどの配列を適宜設計し、製造することができる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１５，１８８−２００，２００１）。
神経幹細胞を調製する方法は、ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ法（Ｃｉｎｄｉ  Ｍ  Ｍｏｒｓｈｅａｄ  ａｎｄ  Ｄｅｒｅｋｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｏｏｙ，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１４，１２５−１３１，２００４）により行なうことができる。神経幹細胞を含む組織を調製する方法は、動物を深麻酔下に４％パラフォルムアルデヒド含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて経心臓的に灌流固定し、摘出した脳を滑走式ミクロト−ムにより４０μｍの厚さで薄切することにより行うことができる（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら，ＰＮＡＳ，９８，５８７４−５８７９，２００１、Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１２，１２０２−１２１０，２００３）。神経幹細胞を含む非ヒト哺乳動物は、例えばウシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、イヌ、ウサギなどが挙げられる。前記細胞に候補化合物を投与する場合、経口又は非経口的に行うことができる。
神経再生の表現型変化は、神経幹細胞に由来する細胞の増殖能、細胞の分化能、細胞の形状、細胞の運動能、細胞の移動能及び移動調節能、細胞の成熟度、機能性タンパク質の発現度、樹状突起の形状、軸索の形状、シナプスの形状、シナプスの形成能、細胞の生存、細胞の保持又は細胞死の抑制の少なくとも一つを指標とすることができる。以下の場合には、当該物質は神経再生を促進する作用を有すると判断することができる。
（ａ）神経幹細胞に由来する細胞の増殖能、細胞の分化能、細胞の運動能、細胞の移動能及び移動調節能、細胞の成熟度、機能性タンパク質の発現度、又はシナプスの形成能が、被検物質の非存在下に比べて存在下において増大している場合
（ｂ）細胞の形状、樹状突起の形状、軸索の形状、又はシナプスの形状が、被検物質の非存在下に比べて存在下で機能発現により適した状態になっている場合
（ｃ）細胞の生存、細胞の保持、又は細胞死の抑制の程度が、被検物質の非存在下に比べて存在下において増大している場合
神経幹細胞に由来する細胞の表現型の変化を検出又は測定するために、例えば神経幹細胞の細胞分裂時に取り込まれる標識物（例えば、ＢｒｄＵ、レトロウィルスベクターなど）を標識マーカーとして用いることができる。神経再生の表現型変化は、当該標識物を免疫染色法によって観察することで、検出又は測定することができる。例えば、ＢｒｄＵ存在下に被検物質を細胞に作用させたときのＢｒｄＵの取り込み量を、神経再生を促進する物質のスクリーニング方法の指標とすることができる。ＢｒｄＵは、１回あたり０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇの濃度で、０．５〜２４時間おきに、１〜１０回細胞に接触させることで、細胞に取り込ませることができる。ＢｒｄＵの取り込み量は、ＢｒｄＵに対する抗体を用いて検出すればよい（実施例２，３を参照）。神経再生の表現型変化を検出又は測定する方法としては、上記神経幹細胞の標識物と神経再生の表現型の指標との二重染色法などが挙げられる。
本発明は、上記方法に使用するための神経再生を促進する作用を有する物質、その薬理学的に許容できる塩、又はそれらの溶媒和物をスクリーニングするためのスクリーニングキットも提供する。本発明のスクリーニングキットには、神経再生の表現型変化を測定するために必要なものが含まれる。神経再生の表現型変化の測定時に使用される試薬類は、下記の実施例２、３において使用したものが好適に用いられる。このほかに、本発明のスクリーニングキットには、キットの取扱説明書、チューブ、フラスコなどが含まれていてもよい。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本実施例により本発明は限定されるものではない。
【実施例１】塩酸ドネペジルの製造
（ａ）１−ベンジル−４−ピペリジンカルバルデヒドの合成
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メトキシメチレントリフェニルホスホニウムクロライド２６．０ｇを無水エーテル２００ｍｌに懸濁させ、１．６Ｍ  ｎ−ブチルリチウムヘキサン溶液を室温にて滴下した。室温にて３０分間撹拌した後、０℃に冷却し、１−ベンジル−４−ピペリドン１４．３５ｇの無水エーテル３０ｍｌ溶液を加えた。室温にて３時間撹拌した後、不溶物を濾別し、濾液を減圧濃縮した。得られた残渣をエーテルに溶解し、１Ｎ塩酸にて抽出した。さらに水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１２とした後、塩化メチレンにて抽出した。硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムにて精製し、油状物質５．５０ｇ（収率３３％）を得た。
次に、得られた油状物質をメタノール４０ｍｌに溶解し、１Ｎ塩酸４０ｍｌを加えた。反応溶液を３時間加熱還流した後、減圧濃縮し、残渣を水に溶解した。その後、溶解液を水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１２とし、塩化メチレンにて抽出した。飽和食塩水で抽出液を洗浄後、硫酸マグネシウムにて乾燥し、減圧濃縮して得られた残渣をシリカゲルカラムにて精製し、１−ベンジル−４−ピペリジンカルバルデヒド２．７７ｇ（収率５４％）を油状物質として得た。
得られた化合物の構造をＮＭＲで確認した。
・分子式；Ｃ１３Ｈ１７ＮＯ・１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ；
１．４０〜２．４０（７Ｈ，ｍ）、２．７８（２Ｈ，ｄｔ）、３．４５（２Ｈ，ｓ）、７．２０（５Ｈ，ｓ）、９．５１（１Ｈ，ｄ）
（ｂ）１−ベンジル−４−〔（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イリデニル〕メチルピペリジン・塩酸塩の合成
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この反応はアルゴン雰囲気下で行った。
無水ＴＨＦ  １０ｍｌ中にジイソプロピルアミン２．０５ｍｌを加え、さらに０℃にて１．６Ｍ  ｎ−ブチルリチウムヘキサン溶液９．１２ｍｌを加えた。０℃にて１０分撹拌した後、−７８℃まで冷却し、５，６−ジメトキシ−１−インダノン２．５５ｇの無水ＴＨＦ３０ｍｌ溶液とヘキサメチルホスホルアミド２．３１ｍｌとを加えた。−７８℃にて１５分撹拌した後、（ａ）で得た１−ベンジル−４−ピペリジンカルバルデヒド２．７０ｇの無水ＴＨＦ３０ｍｌ溶液を加えた。室温まで徐々に昇温し、さらに室温にて２時間撹拌した後、１％塩化アンモニウム水溶液を加えて、有機層を分離した。続いて、水層を酢酸エチルにて抽出し、先に分離した有機層と合わせた後、さらに飽和食塩水にて洗浄した。溶液を硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラム（塩化メチレン：メタノール＝５００：１〜１００：１）にて精製した。溶出液を減圧濃縮した後、残渣を塩化メチレンに溶解し、１０％塩酸−酢酸エチル溶液を加え、さらに減圧濃縮して結晶を得た。これを塩化メチレン−ＩＰＥから再結晶化し、次の物性を有する１−ベンジル−４−〔（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イリデニル〕メチルピペリジン・塩酸塩３．４０ｇ（収率６２％）を得た。
・融点（℃）；２３７〜２３８（分解）
・元素分析値；Ｃ２４Ｈ２７ＮＯ３・ＨＣｌとして、ＣＨＮ理論値（％）：６９．６４６．８２  ３．３８、実測値（％）：６９．５１  ６．７８  ３．３０
（ｃ）１−ベンジル−４−〔（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル〕メチルピペリジン・塩酸塩
2006004201.tif 000044
（ｂ）で得た１−ベンジル−４−〔（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イリデニル〕メチルピペリジン０．４０ｇをＴＨＦ  １６ｍｌに溶解し、１０％パラジウム−炭素０．０４ｇを加えた。室温常圧にて６時間水素添加した後、触媒を濾別し、濾液を減圧濃縮した。この残渣をシリカゲルカラム（塩化メチレン：メタノール＝５０：１）にて精製し、溶出液を減圧濃縮した。その後、残渣を塩化メチレンに溶解し、１０％塩酸−酢酸エチル溶液を加え、さらに減圧濃縮して結晶を得た。これをエタノール−ＩＰＥから再結晶化し、次の物性を有する１−ベンジル−４−〔（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル〕メチルピペリジン・塩酸塩（塩酸ドネペジル）０．３６ｇ（収率８２％）を得た。
・融点（℃）；２１１〜２１２（分解）
・元素分析値；Ｃ２４Ｈ２９ＮＯ３・ＨＣｌとしてＣＨＮ理論値（％）：６９．３０  ７．２７  ３．３７、実測値（％）：６９．３３  ７．１５  ３．２２
【実施例２】  マウス海馬歯状回の神経再生に対するドネペジルによる促進効果
（１）動物の飼育
動物飼育は「実験動物の管理指針」ＳＯＰ  Ｎｏ．ＧＨＺ−３００１に従って実施した。日本エスエルシー（株）より購入したＣ５７ＢＬ／６系雄性ＳＰＦマウス（実験開始時８週齢）を使用した。温度（２３±１℃）、照明（１２時間、７：００〜１９：００）の管理された飼育室で５日間以上の予備飼育の後に実験に供した。飼育中は固形資料ＭＦ（オリエンタル酵母工業社製）及び水（水道水）を自由摂取させた。
（２）ＢｒｄＵ及びドネペジルの投与
神経幹細胞を標識するためのＢｒｄＵ（Ｓｉｇｍａ社製）は、５ｍｇ／ｍＬの濃度で０．００７Ｎ  ＨＣｌを含有するリン酸緩衝液（ＰＢＳ：Ｓｉｇｍａ社製）に溶解して用いた（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら，ＰＮＡＳ，９８，５８７４−５８７９，２００１、Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１２，１２０２−１２１０，２００３）。ＢｒｄＵは、１回あたり５０ｍｇ／ｋｇ（体重１０ｇあたりＢｒｄＵ溶液として０．１ｍｌ）の用量で、３回（４時間間隔）腹腔内に投与した。
媒体対照群及びドネペジル投与群の２群を設定した。ドネペジルは、実施例１で得た塩酸ドネペジルを使用した。ドネペジルは、０．１ｍｇ／ｍＬの濃度となるように、媒体として注射用蒸留水（大塚製薬社製）に用事溶解して用いた。ドネペジルは、ＢｒｄＵの最終投与から４時間後に、１ｍｇ／ｋｇ（体重１０ｇあたりドネペジル溶液として０．１ｍｌ）の用量で、経口投与された。その後、ドネペジルは、１ｍｇ／ｋｇの用量で、夜間に１日１回の割合で１４日間経口投与された。また、媒体対照群の動物には、注射用蒸留水を経口投与した。
（３）ＢｒｄＵの免疫組織化学的検出
免疫組織化学的評価のために、ドネペジルの最終投与の翌日に、動物をウレタン（Ｓｉｇｍａ社製）による深麻酔下で、４％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳ溶液を用いて、経心臓的に灌流固定した。摘出した脳は、凍結下で滑走式ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ社製、モデルＳＭ２０００Ｒ、Ｎｕｓｓｌｏｃｈ）により４０μｍの厚さで薄切した（ｃｏｒｏｎａｌ  ｓｅｃｔｉｏｎ）。薄切した脳組織は、１０セクションおきに１つのｗｅｌｌに集まるようにアジ化ナトリウム含有ＰＢＳ溶液中（１０ｗｅｌｌプレート）に連続的に採取した。
脳組織の免疫染色は、浮遊法により行った（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら，ＰＮＡＳ，９８，５８７４−５８７９，２００１、Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１２，１２０２−１２１０，２００３）。ＢｒｄＵの免疫組織化学的検出は、パーオキシダーゼ法（ＡＢＣシステム、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．製）を用いた（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら，ＰＮＡＳ，８，５８７４−５８７９，２００１、Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１２，１２０２−１２１０，２００３）。ＢｒｄＵに対する一次抗体は、ラット抗ＢｒｄＵ抗体（４００倍希釈、Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を用いた。二次抗体は、ウサギ抗ラットＩｇＧビオチン化抗体（２００倍希釈、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．製）を用いた。
（４）ＢｒｄＵ陽性細胞数の定量
定量には、１個体あたり４枚の海馬セクション（セクションの間隔は４００μｍごと、ｂｒｅｇｍａ−１．４ｍｍから−２．６ｍｍの間で４枚）を用いた。ＢｒｄＵ陽性細胞は、海馬歯状回のｓｕｂ−ｇｒａｎｕｌａｒ  ｚｏｎｅ（ＳＧＺ）及び顆粒細胞層（ｇｒａｎｕｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌａｙｅｒ）（ＧＣＬ）に存在するものをすべて計測した。ＳＧＺは、ＧＣＬの直下部（ｈｙｌｕｓ側）２０μｍ（細胞２個分）の幅の領域として定義した。ＧＣＬは、クレシルバイオレット染色に陽性の顆粒神経細胞層として定義した。各海馬セクションにおけるＧＣＬの面積は、クレシルバイオレット陽性のＧＣＬ領域として、画像解析ソフト（ＮＩＨ製、ｉｍａｇｅ  ｖｅｒ．１．６０）を用いて測定した。
ＧＣＬの体積（ＧＣＬＶ）は、ｂｒｅｇｍａ−１．４ｍｍから−２．６ｍｍの間の左側脳半球におけるＧＣＬの体積として計算した（Ｃａｖａｌｉｅｒｉ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）。ＧＣＬＶ中のＢｒｄＵ陽性細胞の数は、４枚の海馬セクション中のＢｒｄＵ陽性細胞数に、１０を乗じることにより算出した。この値を海馬歯状回あたりのＢｒｄＵ陽性細胞数とした（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１２，１２０２−１２１０，２００３）。
（５）統計学的解析
すべての定量的数値は、平均値±標準誤差（各群ｎ＝８）で表示した。媒体対照群とドネペジル群間の統計学的有意性については、対応のないｔ検定により解析し、有意水準は両側５％とした。結果を表１及び図１に示す。表１中「＊」は、ｐ＜０．０５、媒体対照群との比較を示す。
【表１】
2006004201.tif 000045
ＧＣＬの体積は、媒体対照群とドネペジル投与群との間で差はなかった（表１）。このことから、今回の投与条件において、ドネペジルは、海馬の神経細胞層の体積には影響しないことが示された。一方、海馬あたりのＢｒｄＵ陽性細胞の数は、ドネペジル投与群の方が媒体対照群に比べて、統計学的に有意に多かった（表１、図１）。以上のことから、ドネペジルは、歯状回に存在する神経幹細胞から再生された細胞（ＢｒｄＵ陽性細胞）の保持効果を有することが示された。
【実施例３】  ラット海馬歯状回の神経再生に対するドネペジルによる促進効果
（１）動物の飼育
日本エスエルシー（株）より購入したＳＤ系雄性ＳＰＦラット（実験開始時６週齢）を実施例２のマウスと同様の条件で飼育した。ラットは購入後５日間以上の予備飼育の後に実験に供した。
（２）ＢｒｄＵ及びドネペジルの投与
神経幹細胞を標識するためのＢｒｄＵ（Ｓｉｇｍａ社製）は１０ｍｇ／ｍＬの濃度で０．０１４Ｎ  ＨＣｌを含有するＰＢＳに溶解して用いた。ＢｒｄＵは１回あたり５０ｍｇ／ｋｇの用量で、３回（４時間間隔）腹腔内に投与した。
媒体対照群及びドネペジル投与群（０．５及び２ｍｇ／ｋｇ）の３群を設定した。ドネペジルは実施例２と同じ標品を用いた。ドネペジルを０．４ｍｇ／ｍｌ（２ｍｇ／ｋｇ群）あるいは０．１ｍｇ／ｍｌ（０．５ｍｇ／ｋｇ群）になるよう注射用蒸留水に溶解し、投与時まで冷凍保存した。ドネペジルは、ＢｒｄＵの最終投与から４時間後に０．５及び２ｍｇ／ｋｇの用量で体重１ｋｇあたり５ｍｌ経口投与した。その後は夜間に１日１回の割合で２８日間、同用量で経口投与した。また、媒体対照群の動物には注射用蒸留水を同用量で経口投与した。
（３）ＢｒｄＵの免疫組織化学的検出
免疫組織化学的評価のために、ドネペジルの最終投与の翌日に、動物をネンブタールによる深麻酔下で、４％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳ溶液を用いて、経心臓的に灌流固定した。摘出した脳から実施例２と同様に切片を作製し、免疫組織化学的検討に用いた。
脳組織の免疫染色は実施例２と同様に行った。
（４）ＢｒｄＵ陽性細胞数の定量
定量には、１個体あたり４枚の海馬セクション（厚さ４０μｍ、セクションの間隔は４００μｍごと、ｂｒｅｇｍａ−３．６ｍｍから−４．８ｍｍの間で４枚）を用いた。ＢｒｄＵ陽性細胞の計数は、実施例２と同様に行った。また、各海馬セクションにおけるＧＣＬの体積及び各海馬歯状回あたりのＢｒｄＵ陽性細胞総数も実施例２と同様に算出した。
（５）統計学的解析
すべての定量的数値は、平均値±標準誤差（媒体対照群ｎ＝１２、ドネペジル投与群ｎ＝１１）で表示した。媒体対照群と各ドネペジル群間の統計学的有意性については、一元配置分散分析後Ｄｕｎｎｅｔｔ型多重比較により解析し、有意水準は両側５％とした。結果を表２に示す。表２中「＊」は、ｐ＜０．０５、媒体対照群との比較を示す。
【表２】
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ＧＣＬの体積は、媒体対照群と各ドネペジル投与群との間で有意な差はなかった（表２）。このことから、今回の投与条件において、ドネペジルはラット海馬の神経細胞層の体積には影響しないことが示された。一方、海馬あたりのＢｒｄＵ陽性細胞の数は、媒体対照群に比べて、各ドネペジル投与群で増加しており、この効果は統計学的に有意であった（表２）。以上のことからドネペジルは、ラット歯状回に存在する神経幹細胞から再生された細胞（ＢｒｄＵ陽性細胞）の保持効果を有することが示された。
【実施例４】  ラット海馬歯状回の新生神経におけるアセチルコリン受容体の発現
実施例３で得た媒体対照群の脳切片を用いて、海馬歯状回のＢｒｄＵ腸性細胞におけるアセチルコリン受容体（ムスカリンＭ２受容体）の発現を検討した。脳切片の作製までは実施例２，３と同様の方法で行った。ＢｒｄＵの染色は一次抗体にマウス抗ＢｒｄＵ  ＩｇＧ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、２００倍）を、二次抗体にＲＲＸ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ社、２００倍）を用いて行った。ムスカリンＭ２受容体の検出は、一次抗体にウサギ抗ムスカリンＭ２受容体ＩｇＧ（ＡＬＯＭＯＮＥ  Ｌａｂｓ社、３００倍）を、二次抗体にビオチン標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ社、２００倍）＋ｃｙ２−標識ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ社、２００倍）を用いて行った。
図２に示すように、海馬歯状回のＧＣＬに存在するＢｒｄＵ陽性細胞（赤色の蛍光）上にムスカリンＭ２受容体（緑色の蛍光）が発現することが確認された。
【実施例５】  アセチルコリン受容体刺激によるラット胎児由来神経前駆細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇
（１）神経前駆細胞の調製
妊娠１４．５日の妊娠雌ＳＤラット（日本エスエルシー（株））より得た胎児から大脳を単離した。冷Ｌ−１５培地中で組織をピペッティングすることにより細胞を分離した。この細胞を無血清Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培地（事前にＢ−２７，Ｎ２（何れもｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及びｇｅｎｔａｍｙｃｉｎｅを添加した）中、ヒトベーシック線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）２０ｎｇ／ｍｌ存在下で浮遊培養した。ラット神経前駆細胞はこの培地中でＮｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを形成することが知られている。５〜７日後にこのＮｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを回収し、ピペッティングによりラット神経前駆細胞を分離した後、上記の培地を用いて継代した。
（２）細胞内カルシウム（Ｃａ＋＋）濃度の測定
実験前日に回収したＮｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅから神経前駆細胞を分離し、ｂＦＧＦを含まない上記培地中に懸濁した。細胞数を計数後、５０，０００個ずつを上記培地１００μＬに懸濁して、９６穴平底培養プレート中に分注した。細胞内Ｃａ＋＋濃度の測定は市販のキット（Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｋｉｔ−Ｆｌｕｏ−３、（株）同仁化学研究所）を用い、添付のマニュアルに従って測定した。いくつかのウェルにはアトロピン（ムスカリン受容体拮抗剤）を２５μｍｏｌ／Ｌになるよう添加し、事前に３７℃で３０分培養した。その後、アセチルコリン作働薬（アセチルコリンあるいはカルバコール）を２５μｍｏｌ／Ｌになるように添加した。細胞内Ｃａ＋＋濃度の変化は、各ウェルにおけるＦｌｕｏ−３の蛍光強度の変化として蛍光イメージ測定装置（ＦＤＳＳ６０００、浜松ホトニクス社）を用いて１秒間隔で測定した（励起フィルタ４８０ｎｍ、蛍光フィルタ５２０−５６０ｎｍ）。
図３に示すように、アセチルコリン（２５μｍｏｌ／Ｌ）及びカルバコール（２５μｍｏｌ／Ｌ）刺激によりラット神経前駆細胞標品の細胞内Ｃａ＋＋濃度が上昇した。いずれの薬剤の効果もアトロピンの前処置により完全に拮抗されたことより、この反応はムスカリン受容体を介したものであることが示された。
【実施例６】  ラット胎児由来神経前駆細胞上のアセチルコリン受容体の検出
（１）ラット神経前駆細胞のＢｒｄＵ標識
実施例５と同様に調製したラット神経前駆細胞をｂＦＧＦを含まない上記培地中に２００，０００個／ｍＬで懸濁した。ここにＢｒｄＵ（シグマ社）を最終１０μｍｏｌ／Ｌで加え、３７℃、５％ＣＯ２下で４時間培養した。この操作により細胞標品中に存在するＤＮＡ複製中の神経前駆細胞が標識される。培養後の細胞を回収、洗浄した後、同じ培地に懸濁し、カバーグラス（ポリ−Ｌ−オルニチン、フィブロネクチンでプレコート済み）を装着した２４穴培養プレート中に２００，０００個ずつ分注した。一晩培養した後、細胞を４％パラフォルムアルデヒドで固定した。
（２）免疫染色によるアセチルコリン受容体の検出。
上記で固定した細胞を０．３％トライトンＸ−１００で処理した後、ＰＢＳで洗浄した。各標品を２Ｎ塩酸で３７℃、３０分処理した後、ホウ酸緩衝液で２回洗浄した。１０％ヤギ血清を含むＰＢＳ（ＧＳ−ＰＢＳ）で希釈した一次抗体（ウサギ抗ムスカリンＭ２受容体ＩｇＧ（ＡＬＯＭＯＮＥ  Ｌａｂｓ社、２００倍）存在下、４℃で一晩静置した。０．１％トライトンＸ−１００を含むＰＢＳ（Ｔ−ＰＢＳ）で洗浄後、ＧＳ−ＰＢＳで希釈した二次抗体（Ａｌｅｘａ４８８標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ、モレキュラープローブ社、５０００倍）を加え、室温で一時間静置した。さらに、細胞中に取り込まれたＢｒｄＵをＡｌｅｘａ５４６標識抗ＢｒｄＵ抗体（モレキュラープローブ社、２５０倍）を用いて染色した。染色後の細胞標品は蛍光顕微鏡（カールツァイス社、型式Ａｘｉｏｖｅｒｔ２００Ｍ）を用いて観察した。
観察の結果、ＢｒｄＵ陽性（赤色の蛍光）の増殖中ラット神経前駆細胞上にムスカリンＭ２受容体（緑色の蛍光）の発現が確認された（図４）。したがって、ラットの神経前駆細胞上に、機能的なアセチルコリン受容体が発現していることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】  本発明により、コリンエステラーゼ（ＣｈＥ）阻害作用を有する化合物、その薬理学的に許容できる塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分とする神経再生促進剤及びそのスクリーニング方法が提供される。本発明の神経再生促進剤及びそのスクリーニング方法によって得られる化合物は、海馬の神経機能が障害される疾患に対する新たな治療薬として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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