(57)【要約】  本発明は、血管形成関連の障害の治療および／または予防のためのシクロペンタベンゾフラン誘導体に関する。
2012510964.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管形成関連の障害の処置および／または予防のための、一般式（Ｉ）：
【化１】
2012510964.tif 000021
（Ｉ）
［式中；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、相互に独立して、−Ｈ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＯ２；−ＣＮ；−ＯＨ；−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル；−Ｏ−フェニル；−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル−フェニル；−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ１−８−アルキル；−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−フェニル；−Ｃ５−１２−糖質（その酸素原子の一つを介在して結合）；６−（１,２−ジヒドロキシ−エチル）−３−メトキシ−２−ヒドロキシ−１,４−ジオキサン−２−イルであるか；あるいは
Ｒ１とＲ２、Ｒ２とＲ３、またはＲ３とＲ４は、その結合する２つの炭素原子と一緒になって、−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−を有する５員環を、または−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−を有する６員環を形成し、その一方で残りの基のＲ１ないしＲ４は、独立して、上記した基より選択され；
Ｒ５およびＲ６はフェニルであり；
Ｒ７は−ＯＨ；−Ｏ−Ｃ１−１２−アルキル；−Ｏ−フェニル；−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル−フェニル；−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ１−８−アルキル；−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−フェニルであり；
Ｒ８は−Ｈ；−ＯＨ；−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル；−Ｏ−フェニル；−ＮＨ２；−ＮＨ−Ｃ１−８−アルキル；−Ｎ（Ｃ１−８−アルキル）２であり；
Ｒ９は−Ｈ；−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＨ；−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル；−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−フェニル；−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ１−８−アルキル；−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル；−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ２；−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｃ１−８−アルキル；−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ−（Ｃ１−８−アルキル）２であるか；または−Ｃ（＝Ｏ）−ヘテロシクリルを意味し、ここで該ヘテロシクリルは該−Ｃ（＝Ｏ）−基に結合した少なくとも１個のＮ−原子を含有し；
Ｒ１０およびＲ１１は−Ｈであるか；あるいは
Ｒ８およびＲ１０は一緒になって＝Ｏ、＝Ｓまたは＝ＮＲ１５を意味し、
ここでＲ１５は−Ｃ１−８−アルキル；−ＯＨ；−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル；または−Ｏ−フェニルであるか；
あるいはＲ１０およびＲ１１は一緒になって単結合を形成し、Ｒ８およびＲ９は一緒になって、式（ＩＩ）：
【化２】
2012510964.tif 000022
（ＩＩ）
（式中；
１＊および２＊は、各々、Ｒ８およびＲ９を介する結合であり；
点線は単結合または二重結合であり、二重結合の場合には、Ｒ１２は存在せず；
Ｒ１２は−Ｈまたは−Ｃ１−３−アルキルであり；
Ｒ１３は−Ｈ；−Ｃ１−８−アルキル；−ＯＨ；−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル；または−Ｏ−フェニルであり；
Ｒ１４は−Ｈ、−Ｃ１−８−アルキルであるか；または
Ｒ１３およびＲ１４は、その結合する炭素および窒素原子と一緒になって、ヘテロシクリルを形成する）
で示される基を形成し、
ここで、各基中の「アルキル」なる語は、置換されていなくても、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｏ−ＣＨ２−フェニル、−ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ３、−ＣＨＯ、−ＣＯ２Ｈ、−ＮＨ２、−ＮＨ−（Ｃ１−８−アルキル）、−ＮＨ−（フェニル）、−ＮＨ−（ＣＨ２−フェニル）、−Ｎ（Ｃ１−８−アルキル）２およびヘテロシクリルからなる群より相互に独立して選択される１、２または３種の置換基で置換されていてもよく、ここで該ヘテロシクリルはアルキル残基に結合する少なくとも１個のＮ−原子を含有し；
ここで、各基中の「フェニル」は、置換されていなくても、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ３、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＣＨ３、ＣＦ３、−ＣＨＯおよび−ＣＯ２Ｈからなる群より相互に独立して選択される１、２または３種の置換基で置換されていてもよい］
で示される化合物またはその生理学的に許容される塩。
【請求項２】
血管形成関連の障害が尿生殖器の疾患からなる群より選択される、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
尿生殖器の疾患が、女性の生殖器の非炎症性疾患、子宮内膜症、卵巣子宮内膜症、卵管子宮内膜症、腸子宮内膜症、瘢痕部子宮内膜症、直腸膣中隔子宮内膜症、膣子宮内膜症および骨盤腹膜子宮内膜症からなる群より選択される、請求項２記載の化合物。
【請求項４】
血管形成関連の障害が眼病からなる群より選択される、請求項１記載の化合物。
【請求項５】
眼病が、黄斑変性、卵黄様ジストロフィ（ベスト病）、網膜症、糖尿病性網膜症、緑内障、血管新生緑内障、脈絡膜血管新生、潜在性脈絡膜血管新生、角膜血管新生、後水晶体繊維増殖症および虹彩ルベオーシスからなる群より選択される、請求項４記載の化合物。
【請求項６】
血管形成関連の障害が肺病からなる群より選択される、請求項１記載の化合物。
【請求項７】
肺病が、気道リモデリング、ＣＯＰＤ（慢性閉塞性呼吸器障害）、ＡＲＤＳ（急性呼吸窮迫症候群）、新生児呼吸窮迫症候群、肺高血圧、肺サルコイドーシスおよび突発性肺線維症からなる群より選択される、請求項６記載の化合物。
【請求項８】
血管形成関連の障害が腎疾患からなる群より選択される、請求項１記載の化合物。
【請求項９】
腎疾患が、ネフロパシー、慢性低酸素誘発性疾患、ＥＳＲＤ、腎線維症、腎動脈狭窄症および糸球体腎炎からなる群より選択される、請求項８記載の化合物。
【請求項１０】
血管形成関連の障害が骨関節炎からなる群より選択される、請求項１記載の化合物。
【請求項１１】
骨関節炎が、変形性膝関節炎、変形性股関節症、ポリ関節症、リズ関節症およびさらなる関節症からなる群より選択される、請求項１０記載の化合物。
【請求項１２】
血管形成関連の障害がリウマチ障害からなる群より選択される、請求項１記載の化合物。
【請求項１３】
リウマチ障害が関節リウマチからなる群より選択される、請求項１２記載の化合物。
【請求項１４】
請求項１−１３のいずれかに記載の血管形成関連の障害を処置および／または予防するための化合物であって、ここで
Ｒ１ないしＲ７が請求項１の記載と同意義であり；
Ｒ８がＨ；−ＯＨ；−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル；−Ｏ−フェニル；−ＮＨ２；−ＮＨ−Ｃ１−８−アルキル；−Ｎ（Ｃ１−８−アルキル）２であり；
Ｒ９がＨ；−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＨ；−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル；−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−フェニル；−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ１−８−アルキル；−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル；−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ２；−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｃ１−８−アルキル；−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ−（Ｃ１−８−アルキル）２であるか；または−Ｃ（＝Ｏ）−ヘテロシクリルを意味し、ここで該ヘテロシクリルは該−Ｃ（＝Ｏ）−基に結合する少なくとも１個のＮ−原子を含有し；
Ｒ１０およびＲ１１が−Ｈであるか；または
Ｒ８およびＲ１０が一緒になって＝Ｏ、＝Ｓまたは＝ＮＲ１５を意味し、
ここでＲ１５が−Ｃ１−８−アルキル；−ＯＨ；−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル；または−Ｏ−フェニルである；
上記した請求項のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
請求項１−１３のいずれかに記載の血管形成関連の障害を処置および／または予防するための化合物であって、ここで
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が、相互に独立して、−Ｈ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＯ２；−ＣＮ；−ＯＨ；−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル；−Ｏ−フェニル；−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル−フェニル；−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ１−８−アルキル；−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−フェニルであり；
Ｒ５およびＲ６がフェニルであり；
Ｒ７およびＲ８が、相互に独立して、−ＯＨまたは−Ｏ−Ｃ１−８−アルキルであり；
Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１が−Ｈである；
上記した請求項のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１６】
請求項１−１３のいずれかに記載の血管形成関連の障害を処置および／または予防するための化合物であって、ここで
Ｒ１およびＲ３が、相互に独立して、Ｈ；−ＯＨ；−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル；−Ｏ−フェニル；−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル−フェニル；−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ１−８−アルキル；−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−フェニルを意味する；
ただし、基Ｒ１およびＲ３のうち少なくとも１個は−Ｈ以外の基であり；
Ｒ２およびＲ４がＨであり；
Ｒ５およびＲ６がフェニルであり；
Ｒ７およびＲ８が、相互に独立して、−ＯＨまたは−Ｏ−Ｃ１−８−アルキルであり；
Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１が−Ｈである；
上記した請求項のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１７】
請求項１−１３のいずれかに記載の血管形成関連の障害を処置および／または予防するための化合物であって、ここで
Ｒ１およびＲ３が、相互に独立して、−Ｈ；−ＯＨ；−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル；Ｏ−フェニル；−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル−フェニルを意味する；
ただし、基Ｒ１およびＲ３のうち少なくとも１個は−Ｈ以外の基であり；
Ｒ２およびＲ４が−Ｈであり；
Ｒ５およびＲ６がフェニルであり；
Ｒ７およびＲ８が−ＯＨであり；
Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１が−Ｈである；
上記した請求項のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１８】
請求項１−１３のいずれかに記載の血管形成関連の障害を処置および／または予防するための化合物であって、上記した請求項のいずれかに記載されており、一般式（Ｉｅ）：
【化３】
2012510964.tif 000023
（Ｉｅ）
［式中：
Ｒ１は−Ｈ；置換されていないか、または−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＮＨ２、−ＮＨ（ＣＨ３）、−ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）、−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２、
【化４】
2012510964.tif 000024
からなる群より選択される１種の置換基により置換されている−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル；または置換されていない−Ｏ−ＣＨ２−フェニルを意味し；
Ｒ３は−ＯＨ；置換されていない−Ｏ−フェニル；置換されていないか、または−Ｆ、−Ｃｌ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＮＨ２、−ＮＨ（ＣＨ３）、−ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）、−ＮＨ（ＣＨ（ＣＨ３）２）、−ＮＨ（Ｃ（ＣＨ３）３）、−ＮＨ（ＣＨ２−フェニル）または−ＮＨ（フェニル）（ここで各置換基のフェニルは置換されていない）、−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２、
【化５】
2012510964.tif 000025
からなる群より選択される１種の置換基により置換されている−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル；または置換されていない−Ｏ−ＣＨ２−フェニルを意味し；
Ｒ５およびＲ６は、置換されていないか、または−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−ＮＨ２、−ＣＨ３および−ＣＦ３からなる群より相互に独立して選択される１、２または３種の置換基で置換されているフェニルである］
で示される化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管形成関連の障害、好ましくは肺高血圧の処置および／または予防に有用なシクロペンタベンゾフラン誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
低酸素誘導因子１（ＨＩＦ−１）は、細胞不死化、肝細胞プールの維持、細胞の脱分化、赤血球産生、遺伝的不安定性、血管形成、代謝性再プログラミング、自己分泌増殖因子のシグナル伝達および浸潤／転移を含む、低酸素圧に対する適応反応の鍵となる態様に含まれる数種の遺伝子の発現を制御する転写因子である。
【０００３】
ＨＩＦ−１転写因子は、酸素制御のＨＩＦ−１αおよび構成的に発現しているＨＩＦ−１βによって、ヘテロ二量体として形成される。後者はまた、標的遺伝子のバッテリーの重複を制御する、構造的または機能的に関連するＨＩＦ−２α蛋白と二量体を形成する。該ＨＩＦ−１複合体は、例えばＶＥＧＦ、ＥＰＯ、ＬＤＨ、ＰＤＫ１等などの多くの遺伝子の発現を媒介し、上記した生体内作用における鍵となる媒介物質であると考えられる。
【０００４】
ＨＩＦ−１の転写活性は低酸素刺激により密接に制御される。標準的な酸素圧（約２０％Ｏ２）の条件下では、プロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＤ）による酸素媒介のプロリルヒドロキシル化に対する対象としてのＨＩＦ−１α（ならびにＨＩＦ−１β）は、高いターンオーバー（半減期：約５分間）を受ける。ＰＨＤによる修飾はフォン・ヒッペル−リンドウ・サプレッサー蛋白（ＶＨＬ）の結合を要件とし、それはエロンギンＣ（Elongin C）にも結合し、それによりＨＩＦ−１αをユビキチン化することを標的とする、ユビキチンリガーゼ複合体をリクルートする。ついで、ユビキチン化されたＨＩＦ−１α蛋白はプロテアソーム複合体により分解される。反対に、ヒドロキシル化およびユビキチン化の割合は低酸素圧の条件下では減少し、例えば、ＨＩＦ−１αのニトロシル化により蓄積および安定化がもたらされる（図１ａ：低酸素またはＶＥＧＦ刺激によるＨＩＦ−１蛋白介在の（プロ血管形成）活性の模式図を参照のこと）。
【０００５】
ＨＩＦ−１依存性転写を特異的に調節することで、血管新生および血管リモデリングの特異的調節／処置が可能となるであろう。病理学的血管新生および血管リモデリングは、癌（すなわち、腫瘍血管新生）または肺高血圧などの複数のヒト障害と関連付けられ、例えば酸素の欠如により誘発され得る（低酸素：図１ａを比較のこと）。ＨＩＦ−１活性は持続的低酸素、間欠的低酸素、成長因子刺激に対する応答にて誘発され、例えば、慢性持続的および間欠的低酸素に対する不適応な応答を媒介し、肺性および全身性高血圧を発症する基礎となる（非特許文献１）。つい最近になって、ＨＩＦ−１、ＥＰＯおよびＶＥＧＦ活性が幼児の肺高血圧と関連付けられた（非特許文献２）。
【０００６】
ＨＩＦ−１は酸素依存的に制御され、それにより組織の酸素化における変化に対する適応反応を媒介すると報告されている（非特許文献３を参照のこと）。
【０００７】
ＨＩＦ−１はまた、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の転写活性を刺激し、ＶＥＧＦ受容体ファミリーのリガンドは、順次、細胞増殖および血管形成を刺激すると報告されている（非特許文献４を参照のこと）。ＨＩＦ−１の抑制および機能喪失は、腫瘍の増殖、血管新生および転移の減少と関連付けられると報告されている（非特許文献５を参照のこと）。
【０００８】
ＨＩＦ−１の過剰発現が、腫瘍増殖、血管新生の増加および転移に関する動物実験にて観察されている。局所的に進行した充実性腫瘍の大部分は酸素利用度の小さな領域を含有する。この腫瘍内低酸素状態は、腫瘍細胞を機能的な血管から遠ざけ、腫瘍細胞が迅速に増殖した結果として、適量の酸素の拡散を防止し、血管形成が阻害される。その一方で、ＨＩＦ−１αの過剰発現の生検断片での免疫組織学的検出が、多くの癌における主たる因子となった。多くの新規な抗癌剤が種々の分子機構を介してＨＩＦ−１を阻害することが明らかにされた（非特許文献６）。所定の患者に投与する薬物のコンビネーションを決定することは癌治療の結果を改善するのに大きな障害が残っている。
【０００９】
これらの知見とは反対に、ＨＩＦ−１介在の転写を阻害することは反対の作用があり、かくしてＨＩＦ−１が低酸素および血管形成（新規な血管新生）関連の障害を治療するための標的として有効であることが分かった。
【００１０】
ＨＩＦ−１の作用部位は、例えば低酸素、および例えばＶＥＧＦ受容体シグナルなどの他の刺激によって開始される調節経路内でより下流に位置するため、本発明の化合物によって標的とされる介入点は、例えばスニチニブ（Sunitinib）；ソラフェニブ（Sorafenib）およびアバスチン（Avastin）などの市販のＶＥＧＦ受容体阻害剤と比べて、より特異的な作用をもたらすであろう（図１ｂを参照のこと）。さらには、本発明の化合物は、例えば、ＶＥＧＦまたは他の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）阻害剤よりもより直接的かつ正確に低酸素誘導の生理学的なシグナル伝達に影響を及ぼすか、または修飾することができる。このように、本発明の化合物を用いて、新規な治療法を設計することができ、例えば、併用療法により療法を（個々に）最適化することができ、副作用を軽減することができる。さらには、本発明の化合物の薬理学的に有用な作用は細胞膜を貫通することができるため、本発明の化合物は抗原などの生体物質と比べてより優れた効果を示すであろう。したがって、抗体を基剤とするエフェクターは、通常、細胞の内部にさえ達することができないが、本発明の化合物は哺乳動物細胞の内部にてその作用を発揮することができる。
【００１１】
ＨＩＦ−１発現ならびに関連するＨｉｆ蛋白の産生に依存するものとしてのさらに具体的な疾患も当該分野にて知られている。
【００１２】
子宮内膜症は子宮腔の外側に異所性子宮内膜組織が存在することを意味する。子宮内膜症は生殖年齢の間にある女性に影響を与える一般的な疾患である。
【００１３】
Ｈｉｆ−１は子宮内膜症の制御に一の役割があると報告されている（非特許文献７を参照のこと）。ＶＥＧＦおよび／またはＨＩＦ−１（シグナル）のＶＥＧＦ発現の伝達物質としての阻害剤は、当該分野にて、例えば慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および肺高血圧症などの肺障害を治療するための可能性のある治療法として記載されている（例えば、非特許文献８を参照のこと）。
【００１４】
当該分野にて、ＨＩＦ−１は、低酸素およびアンジオテンシン受容体発現を介する炎症プロセスと関連付けられると記載されている（非特許文献９を参照のこと）。
【００１５】
ＨＩＦ−１は低酸素誘導性腎線維症およびＥＳＲＤに対する治療法の標的として記載されている（非特許文献１０を参照のこと）。
【００１６】
ＨＩＦのアップレギュレーションは当該分野にてペイロニー病と関連付けて記載されている（非特許文献１１を参照のこと）。
【００１７】
Ｈｉｆ−１アルファの過剰発現は当該分野にて勃起不全と関連付けられている（非特許文献１２を参照のこと）。
【００１８】
当該分野にて、ＨＩＦ−１の過剰発現は線維症を促進すると記載されている（非特許文献１３を参照のこと）。
【００１９】
当該分野にて、低酸素誘導のＨＩＦ−１は強皮症の進行に起因するものとして記載されている（非特許文献１４を参照のこと）。
【００２０】
低酸素症に起因するＨＩＦ−１の過剰発現は、臨床的にはＡＲＤＳ進行と関連付けられる（非特許文献１５を参照のこと）。
【００２１】
当該分野にて、ＨＩＦ−１はアテローム性動脈硬化症と関連付けられている（非特許文献１６および１７を参照のこと）。ＨＩＦ−１発現は血管芽細胞腫とも関連付けられる（非特許文献１８および１９を参照のこと）。
【００２２】
当該分野にて、ＨＩＦ−１は腫瘍細胞の転移性表現型に寄与する因子として記載されている（非特許文献２０を参照のこと）。
【００２３】
ＨＩＦ−１は当該分野にて黄斑変性症を治療するための標的として記載されている（非特許文献２１を参照のこと）。
【００２４】
ヒトの治療剤として既に使用されている既知の血管新生阻害剤がある。ソラフェニブ（Sorafenib）（ネキサバル（Nexavar）、Bayer Health Careの登録商標）が、当該分野にて、とりわけ、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）受容体を阻害することで血管形成（例えば、腫瘍血管新生）を顕著に減少させるキナーゼ阻害剤として記載されている（非特許文献２２を参照のこと）。
【００２５】
スニチニブ（Sunitinib）（ステント（Sutent）、Pfizerの登録商標；以前は、SU11248で特定されていた）は、当該分野にて、直接的な抗腫瘍活性および受容体チロシンキナーゼ血小板誘導の成長因子受容体、血管内皮成長因子受容体、ＫＩＴおよびＦＬＴ３の阻害を通して抗血管形成活性を示す、抗血管形成エフェクターとして記載されている（非特許文献２３および２４を参照のこと）。PTK787／ZK222584（バタラニブ（Vatalanib）、NovartisとBayer Schering AGの共同製品）が、以前に、抗血管形成ＶＥＧＦ受容体阻害剤として作用すると報告されていた（非特許文献２５を参照のこと）
【００２６】
他のＶＥＧＦ受容体阻害剤がバンデタニブ（Vandetanib）（ザクチマ（Zactima）、AstraZenecaの登録商標；前はZD6474として流通していた）、AZD2171（レセンチン（Recentin）、AstraZenecaの登録商標）および抗体のベバシズマブ（Bevacizumab）（アバスチン、Genentech／Rocheの登録商標）である。
【００２７】
しかしながら、ＨＩＦ阻害剤として用いられる既知のＶＥＧＦおよびＲＴＫ阻害剤の特性はあらゆる点で満足のいくものではなく、したがって、さらなるＨＩＦ阻害剤に対する、特に低酸素症および血管形成（新規な血管新生）関連の障害の治療に有用である、ＨＩＦ１阻害剤に対する要求がある。
【００２８】
従来の化合物よりも利点のある化合物を提供することが本発明の目的である。比較的に低容量でＨＩＦを効果的に阻害する化合物は、血管形成関連の障害の治療および／または予防に有用である。
【００２９】
この目的は特許請求の範囲に記載の発明により達成される。
【００３０】
意外にも、特定のシクロペンタベンゾフランがＨＩＦ阻害活性を示すことが見出された。これらのシクロペンタベンゾフランは、すなわち、種々の種のアグライア植物より抽出され得る、ロカグラオール（rocaglaol）またはロカグラミド（rocaglamide）と称される一連の天然の産物より誘導され得る。
【００３１】
当該分野では、多くのシクロペンタベンゾフラン誘導体、すなわち、炎症プロセスおよび発癌作用にて中心的役割を果たすＮＦ  ＫＢ転写因子に対して阻害活性を示す、誘導体が知られている。例えば、シクロペンタベンゾフランが強力な抗癌剤（非特許文献２６）として、すなわち抗白血病剤（非特許文献２７；特許文献１）として知られている。さらには、シクロペンタベンゾフラン誘導体はまた、痛みの治療（特許文献２）に、炎症および／または自己免疫疾患の治療（特許文献３；特許文献４；特許文献５）に有用であることも知られている。
【００３２】
特許文献６はマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤として有用なヒドロキサム酸化合物を開示する。
【００３３】
特許文献７は、慢性の難治性炎症および関節リウマチを含む、特定の障害を治療するための医薬の製造におけるある種のＣ−Ｃケモカイン産生阻害剤の使用に関する。
【００３４】
本発明の化合物は、ＨＩＦ−１依存性ルシフェラーゼ転写の極めて強力な（低ｎＭの）阻害剤であり、ＨＩＦ−１依存性標的遺伝子（例えば、ＰＤＫ１）の転写を一桁のナノモル量で阻害することが明らかにされた。これらの効果は転写（ｍＲＮＡ）レベルで媒介されず、一の治療方法（シグナル誘発後の化合物の投与）にて達成され得ることが明らかにされた。さらには、ＨＩＦ依存性作用はＨＩＦ−１α蛋白そのものを強力に阻害することで開始されることが明らかにされた。この作用はＨｉｆ−１ａ蛋白に特異的であり、翻訳工程の非特異的な阻害の結果によるものではないことが分かった。本発明の化合物は、インビトロにて、二桁のナノモルのＩＣ５０でＨＵＶＥＣの成長（血管形成；血管モデリング）において強力な阻害を示した。このインビトロ実験にて、該化合物はスニチニブ（ステント（登録商標））およびソラフェニブ（ネキサバル（登録商標））などの市販の対照よりも優れた作用を示した。ＶＥＧＦ誘導のＨＵＶＥＣの成長アッセイにおいて、本発明の化合物はステントよりも２．５ないし６倍優れた（小さな）値に達し、ネキサバルよりも５０ないし１００倍小さな値に達した。ＨＵＶＥＣがデフェロキサミン（Deferoxzmine）により誘発された時（低酸素）であっても、これらの値は改善された。これらのケースにおいて、本発明の化合物のＩＣ５０はステントよりも３３−１００倍小さく、ネキサバルは全く活性を示さなかった。これらの知見は、低酸素刺激およびＶＥＧＦ刺激（経路：図１ａおよびｂも参照のこと）がある程度の特徴を共有するが、顕著な違いもあることを示すものであり、本発明の化合物が、例えば、スニチニブ（ステント（登録商標））およびソラフェニブ（ネキサバル（登録商標））などのＶＥＧＦ受容体阻害剤よりも、例えば新規な血管形成および／または血管リモデリングの治療に対して全く新たにアクセスし得ることを証明するものである。
【００３５】
例えば、このようなＨＩＦ−１シグナル伝達のＶＥＧＦ／受容体チロシンキナーゼ阻害剤または他の上流のモジュレータでは、例えば下痢、湿疹、抜け毛、出血、高血圧、甲状腺機能低下、吐き気、嘔吐、紅斑、かゆみ、疲れ、痛みならびにアミラーゼおよびリパーゼ活性の増加などの一般的副作用を伴う。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３６】
【特許文献１】米国特許第４５３９４１４号
【特許文献２】ＷＯ２００８／０１４０６６
【特許文献３】ＥＰ１６９３０５９
【特許文献４】ＷＯ２００５／１１３５２９
【特許文献５】ＷＯ２００６／１２９３１８
【特許文献６】ＷＯ０１／１２５９２
【特許文献７】ＥＰ１０１６４０８
【非特許文献】
【００３７】
【非特許文献１】Semenza GL.、Physiology（Bethesda）, 2009；24：97−1006
【非特許文献２】Lemus−Varela ML etら、Expression of HIF−1alpha, VEGF and EPO in peripheral blood from patients with two cardiac abnormalities associated with hypoxia. Clin Biochem. 2009
【非特許文献３】J.J. Haddad、Oxygen−sensing mechanisms and the regulation of redox−responsive transcription factors in development and pathophysiology. Respir Res 2002, 3:26 and G. Semenza, Targeting HIF−1 for Cancer Therapy. NatRevCancer 2003, 3：721−732
【非特許文献４】J.M.G. LarkinおよびT. Eisen、Renal cell carcinoma and the use of Sorafenib. 2006, Therapeutics and Clinical Risk Management, 2（1）：87-98
【非特許文献５】G. Semenza、Evaluation of HIF−1 inhibitors as anticancer agents. Drug Discovery Today 2007, 12（19/20）：853−859
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３８】
しかしながら、ＨＩＦ阻害活性を示すシクロペンタベンゾフランは未だ文献に報告されていない。
【課題を解決するための手段】
【００３９】
本発明の第一の態様は、一般式（Ｉ）：
【化１】
2012510964.tif 000003
（Ｉ）
［式中；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、相互に独立して、−Ｈ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＯ２；−ＣＮ；−ＯＨ；−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル；−Ｏ−フェニル；−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル−フェニル；−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ１−８−アルキル；−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−フェニル；−Ｃ５−１２−糖質（その酸素原子の一つを介在して結合）；６−（１,２−ジヒドロキシ−エチル）−３−メトキシ−２−ヒドロキシ−１,４−ジオキサン−２−イルであるか；あるいは
Ｒ１とＲ２、Ｒ２とＲ３、またはＲ３とＲ４は、その結合する２つの炭素原子と一緒になって、−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−を有する５員環を、または−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−を有する６員環を形成し、その一方で残りの基のＲ１ないしＲ４は、独立して、上記した基より選択され；
Ｒ５およびＲ６はフェニルであり；
Ｒ７は−ＯＨ；−Ｏ−Ｃ１−１２−アルキル；−Ｏ−フェニル；−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル−フェニル；−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ１−８−アルキル；−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−フェニルであり；
Ｒ８は−Ｈ；−ＯＨ；−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル；−Ｏ−フェニル；−ＮＨ２；−ＮＨ−Ｃ１−８−アルキル；−Ｎ（Ｃ１−８−アルキル）２であり；
Ｒ９は−Ｈ；−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＨ；−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル；−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−フェニル；−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ１−８−アルキル；−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル；−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ２；−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｃ１−８−アルキル；−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ−（Ｃ１−８−アルキル）２であるか；または−Ｃ（＝Ｏ）−ヘテロシクリルを意味し、ここで該ヘテロシクリルは該−Ｃ（＝Ｏ）−基に結合した少なくとも１個のＮ−原子を含有し；
Ｒ１０およびＲ１１は−Ｈであるか；あるいは
Ｒ８およびＲ１０は一緒になって＝Ｏ、＝Ｓまたは＝ＮＲ１５を意味し、
ここでＲ１５は−Ｃ１−８−アルキル；−ＯＨ；−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル；または−Ｏ−フェニルであるか；
あるいはＲ１０およびＲ１１は一緒になって単結合を形成し、Ｒ８およびＲ９は一緒になって、式（ＩＩ）：
【化２】
2012510964.tif 000004
（ＩＩ）
（式中；
１＊および２＊は、各々、Ｒ８およびＲ９を介する結合であり；
点線は単結合または二重結合であり、二重結合の場合には、Ｒ１２は存在せず；
Ｒ１２は−Ｈまたは−Ｃ１−３−アルキルであり；
Ｒ１３は−Ｈ；−Ｃ１−８−アルキル；−ＯＨ；−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル；または−Ｏ−フェニルであり；
Ｒ１４は−Ｈ、−Ｃ１−８−アルキルであるか；または
Ｒ１３およびＲ１４は、その結合する炭素および窒素原子と一緒になって、ヘテロシクリルを形成する）
で示される基を形成し、
ここで、各基中の「アルキル」なる語は、置換されていなくても、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｏ−ＣＨ２−フェニル、−ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ３、−ＣＨＯ、−ＣＯ２Ｈ、−ＮＨ２、−ＮＨ−（Ｃ１−８−アルキル）、−ＮＨ−（フェニル）、−ＮＨ−（ＣＨ２−フェニル）、−Ｎ（Ｃ１−８−アルキル）２およびヘテロシクリルからなる群より相互に独立して選択される１、２または３種の置換基で置換されていてもよく、ここで該ヘテロシクリルはアルキル残基に結合する少なくとも１個のＮ−原子を含有し；
ここで、各基中の「フェニル」は、置換されていなくても、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ３、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＣＨ３、ＣＦ３、−ＣＨＯおよび−ＣＯ２Ｈからなる群より相互に独立して選択される１、２または３種の置換基で置換されていてもよい］
で示される化合物またはその生理学的に許容される塩であって、血管形成関連の障害、好ましくは尿生殖器疾患、眼病、肺疾患、腎疾患、骨関節炎およびリウマチ障害；特に好ましくは肺高血圧症より選択される障害の治療および／または予防のための化合物またはその生理学的に許容される塩に関する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
原文に記載なし
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本願明細書では便宜上、「アルキル」または「Ｃ１−８−アルキル」は、飽和または不飽和の、直線または分岐状および／または環状炭化水素をいう。したがって、「アルキル」なる語は「アルキル」、「アルケニル」および「アルキニル」 ならびに「シクロアルキル」、「シクロアルケニル」および「シクロアルキニル」を包含する。好ましいアルキル残基の例は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、sec.−ブチル、iso.−ブチル、tert.−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチルおよびｎ−オクチルである。好ましいアルケニル残基の例はビニル、アリルおよびブタジエニルを包含する。好ましいアルキニル残基の例はエチニルおよびプロパルギルを包含する。環状の炭化水素が少なくとも３個の環原子を必要とすることを当業者は理解する。好ましいシクロアルキル残基の例がシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルである。アルキル残基は置換されていなくても、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｏ−ＣＨ２−フェニル、−ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ３、−ＣＨＯおよび−ＣＯ２Ｈ、−ＮＨ２、−ＮＨ−（Ｃ１−８−アルキル）、−ＮＨ−（フェニル）、−ＮＨ−（ＣＨ２−フェニル）、−Ｎ（Ｃ１−８−アルキル）２およびヘテロシクリルからなる群より相互に独立して選択される１、２または３種の置換基により置換されていてもよく、ここで該ヘテロシクリルはアルキル残基に結合する少なくとも１個のＮ−原子を含有し、好ましくは、アジリジニル、アゼチジニル、ピロリジニルおよびピペリジニルからなる群より選択されるのが好ましい。好ましくは、−ＮＨ（Ｃ１−８−アルキル）は−ＮＨ（ＣＨ３）、−ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）および−ＮＨ（ＣＨ（ＣＨ３）２）からなる群より選択される。好ましくは、−Ｎ（Ｃ１−８−アルキル）２は−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ（ＣＨ３）２）２および−Ｎ（Ｃ３Ｈ７）２からなる群より選択される。好ましい置換されたアルキル残基の例は−ＣＦ３、−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ（ＣＨ３）、−ＣＨ２ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）、−ＣＨ２ＣＨ２−Ｎ （ＣＨ２ＣＨ３）２、−ＣＨ２−ＣＨ２−ピロリジニル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ピロリジニル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−アゼチジニルまたは−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−アジリジニルである。
【００４２】
本願明細書では便宜上、「フェニル」は、置換されていないか、または−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ３、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＣＨ３、−ＣＦ３、−ＣＨＯおよび−ＣＯ２Ｈからなる群より相互に独立して選択されるベンゼン基；例えば、フェニル、ｏ−フルオロフェニル、ｍ−フルオロフェニル、ｐ−フルオロ−フェニル、ｏ−クロロフェニル、ｍ−クロロフェニル、ｐ−クロロフェニル、ｏ−アニシル、ｍ−アニシル、ｐ−アニシル等をいう。
【００４３】
本願明細書では便宜上、「ヘテロシクリル」または「ヘテロサイクル」は、Ｎ、ＯおよびＳ、好ましくはＮからなる群より選択される１種または２種のヘテロ原子、好ましくは１種のヘテロ原子を含有する、飽和、不飽和または芳香族の３ないし７員環、すなわち、３−、４−、５−、６−または７−員環をいい、ここで該環は置換されていなくても、または−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ３、−ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ２（ＣＨ３）２、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ３、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ３、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ（ＣＨ３）２からなる群より選択される１または２種の置換基を含有する。好ましいヘテロシクリルまたはヘテロサイクルの例がアジリジニル、アゼチジニル、ピロリジニル、イミダゾリル、ピペリジニル、モルホリニルおよびピリジニルである。
【００４４】
本願明細書では便宜上、「糖質」または「Ｃ５−１２−糖質」は、その各々がデスオキシの形態であってもよい、１または２個のペントース（Ｃ５−糖質またはＣ１０−糖質）および／または１または２個のヘキソース（Ｃ６−糖質またはＣ１２−糖質）からなる単糖または二糖をいい、該二糖は各形態がグリコシド結合を介して相互に結合し、置換されていないか、またはメチル、エチル、アセチル、ベンゾイルまたは３,４,５−トリヒドロキシベンゾイルからなる群より独立して選択される１、２、３、４または５種の置換基で置換されている。好ましいペントースの例がピラノシドまたはフラノシド形態の各々の、キシロース、アラビノースである。好ましいヘキソースの例が、ピラノシドまたはフラノシド形態の各々の、グルコース、６−デオキシグルコース、ラムノースである。好ましいグリコシド結合の例が１→４および１→６である。「糖質」または「Ｃ５−１２−糖質」残基はその酸素原子の一つを介して結合し、より高度な一般式で示される糖となる。
一般式（Ｉ）の化合物の生理学的に許容される塩は、生理学的に許容される酸との塩ならびに生理学的に許容される塩基との塩を包含する。生理学的に許容される酸は、ＨＣｌ、ＨＢｒ、Ｈ２ＳＯ４、Ｈ３ＰＯ４等の無機酸；およびフマル酸、酢酸、プロピオン酸、クエン酸、マレイン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸等の有機酸を包含する。生理学的に許容される塩基はアンモニアおよび有機アミンを包含する。
【００４５】
本発明はまた、一般式（Ｉ）の化合物の立体異性体、例えばエナンチオマーまたはジアステレオマー、互変異性体、塩、溶媒和物、例えば水和物、多形体等に関する。
【００４６】
一般式（Ｉ）の化合物の好ましい実施形態において、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、相互に独立して、−Ｈ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＯ２；−ＣＮ；−ＯＨ；−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル；−Ｏ−フェニル；−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル−フェニル；−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ１−８−アルキル；−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−フェニル；その酸素原子の一つを介して結合した−Ｃ５−１２−糖質；６−（１,２−ジヒドロキシ−エチル）−３−メトキシ−２−ヒドロキシ−１,４−ジオキサン−２−イルを示すか；または
Ｒ１とＲ２、Ｒ２とＲ３、またはＲ３とＲ４がそれらの結合する２個の炭素原子と一緒になって−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−を有する５員環を、あるいは−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−を有する６員環を形成し、その一方で他の基Ｒ１ないしＲ４は上記した基より独立して選択され；
Ｒ８はＨ；−ＯＨ；−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル；−Ｏ−フェニル；−ＮＨ２；−ＮＨ−Ｃ１−８−アルキル；−Ｎ（Ｃ１−８−アルキル）２であり；
Ｒ９はＨ；−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＨ；−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル；−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−フェニル；−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ１−８−アルキル；−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル；−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ２；−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｃ１−８−アルキル；−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ−（Ｃ１−８−アルキル）２であるか；または−Ｃ（＝Ｏ）−ヘテロシクリルを示し、ここで該ヘテロシクリルは少なくとも１個のＮ−原子を含有し、それが−Ｃ（＝Ｏ）−基に結合し；
Ｒ１０およびＲ１１は−Ｈであるか；または
Ｒ８およびＲ１０は一緒になって＝Ｏ、＝Ｓまたは＝ＮＲ１５を示し、
ここでＲ１５は−Ｃ１−８−アルキル；−ＯＨ；−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル；または−Ｏ−フェニルである。
【００４７】
一般式（Ｉ）の好ましい化合物は、一般式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）または（Ｉｄ）:
【化３】
2012510964.tif 000005
で示される化合物である。
【００４８】
一般式（Ｉ）または（Ｉａ）の一つの化合物の好ましい実施形態において、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、相互に独立して、−Ｈ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＯ２；−ＣＮ；−ＯＨ；−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル；−Ｏ−フェニル；−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル−フェニル；−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ１−８−アルキル；−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−フェニルを示し；
Ｒ５およびＲ６はフェニルであり；
Ｒ７およびＲ８は、相互に独立して、−ＯＨまたは−Ｏ−Ｃ１−８−アルキルであり；
Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１は−Ｈである。
【００４９】
一般式（Ｉ）、（Ｉａ）または（Ｉｂ）の一つの化合物の好ましい実施形態において、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、相互に独立して、−Ｈ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＯ２；−ＣＮ；−ＯＨ；−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル；−Ｏ−フェニル；−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル−フェニル；−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ１−８−アルキル；−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−フェニルを示し；
Ｒ５およびＲ６はフェニルであり；
Ｒ７は−ＯＨまたは−Ｏ−Ｃ１−８−アルキルであり；
Ｒ８は−ＯＨであり；
Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１は−Ｈである。
【００５０】
一般式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）または（Ｉｄ）の一つの化合物の好ましい実施形態において、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、相互に独立して、−Ｈ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＮＯ２；−ＣＮ；−ＯＨ；−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル；−Ｏ−フェニル；−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル−フェニル；−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ１−８−アルキル；−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−フェニルを示し；
Ｒ５およびＲ６はフェニルであり；
Ｒ７およびＲ８は−ＯＨであり；
Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１は−Ｈである。
【００５１】
一般式（Ｉ）の化合物のもう一つ別の好ましい実施形態において、
Ｒ１およびＲ３は、相互に独立して、−Ｈ；−ＯＨ；−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル；−Ｏ−フェニル；−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル−フェニル；−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ１−８−アルキル；−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−フェニルを示す：
ただし、Ｒ１およびＲ３基のうち少なくとも１つは−Ｈ以外の基であり；
Ｒ２およびＲ４はＨであり；
Ｒ５およびＲ６はフェニルであり；
Ｒ７およびＲ８は、相互に独立して、−ＯＨまたは−Ｏ−Ｃ１−８−アルキルであり；
Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１は−Ｈである。
【００５２】
一般式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）または（Ｉｄ）の一つの化合物のさらにもう一つ別の好ましい実施形態において、
Ｒ１およびＲ３は、相互に独立して、−Ｈ；−ＯＨ；−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル；−Ｏ−フェニル；−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル−フェニル；−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ１−８−アルキル；−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−フェニルを示す；
ただし、Ｒ１およびＲ３の少なくとも１個は−Ｈ以外の基であり；
Ｒ２およびＲ４は−Ｈであり；
Ｒ５およびＲ６はフェニルであり；
Ｒ７およびＲ８は−ＯＨであり；
Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１は−Ｈである。
【００５３】
一般式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）または（Ｉｄ）の一つの化合物のもう一つ別の好ましい実施形態において、
Ｒ１およびＲ３は、相互に独立して、−Ｈ；−ＯＨ；−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル；−Ｏ−フェニル；−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル−フェニルである；
ただし、Ｒ１およびＲ３基の少なくとも１個は−Ｈ以外の基であり；
Ｒ２およびＲ４は−Ｈであり；
Ｒ５およびＲ６はフェニルであり；
Ｒ７およびＲ８は−ＯＨであり；
Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１は−Ｈである。
【００５４】
一般式（Ｉ）のもう一つ別の好ましい化合物は、一般式（Ｉｅ）：
【化４】
2012510964.tif 000006
（Ｉｅ）
で示される化合物である。
【００５５】
一般式（Ｉｅ）の化合物の好ましい実施形態において、
Ｒ１はＨ；置換されていないか、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＮＨ２、−ＮＨ（ＣＨ３）、−ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）、−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２、
【化５】
2012510964.tif 000007
からなる群より選択される１個の置換基で置換された−Ｏ−Ｃ１−８−アルキル；非置換の−Ｏ−ＣＨ２−フェニル；好ましくは−Ｎ（ＣＨ３）２または
【化６】
2012510964.tif 000008
で置換された−ＯＣＨ２ＣＨ２−であり；
Ｒ３は−ＯＨ；非置換の−Ｏ−フェニル；非置換の、または−Ｆ、−Ｃｌ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＮＨ２、−ＮＨ（ＣＨ３）、−ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）、−ＮＨ（ＣＨ（ＣＨ３）２）、−ＮＨ（Ｃ（ＣＨ３）３）、−ＮＨ（ＣＨ２−フェニル）または−ＮＨ（フェニル）（ここで、各基中のフェニルは非置換であるか、−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２、
【化７】
2012510964.tif 000009
で置換されている）からなる群より選択される１種の置換基で置換されている−Ｏ−Ｃ１−８−アルキルを；非置換の−Ｏ−ＣＨ２−フェニルを示し；
Ｒ５およびＲ６は、非置換の、あるいは−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−ＮＨ２、−ＣＨ３および−ＣＦ３からなる群より相互に独立して選択される１、２または３種の置換基で置換されているフェニルである。
【００５６】
本発明の化合物であって、一般式（Ｉｆ）：
【化８】
2012510964.tif 000010
（Ｉｆ）
で示される特に好ましい化合物を、以下の表（表１）に要約する。
【００５７】
【表１−１】
2012510964.tif 000011
【表１−２】
2012510964.tif 000012
【００５８】
本発明の特に好ましい化合物は、一般式（Ｉｇ）：
【化９】
2012510964.tif 000013
（Ｉｇ）
［式中：
Ｒ１は−Ｈおよび−ＯＣＨ３より選択され；
Ｒ３’は−Ｈ；−ＣＨ２ＮＨＣＨ３；−ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２；および
【化１０】
2012510964.tif 000014
で置換された−ＣＨ２−より選択され；
Ｒａは−Ｆ、−Ｃｌまたは−ＯＣＨ３であり；および
Ｒｄは−Ｈ、−Ｆまたは−Ｃｌである。
【００５９】
式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、（Ｉｆ）または（Ｉｇ）の一つの特に好ましい化合物は、
（１,３,３ａ,８ｂ）−３−（３−フルオロフェニル）−６,８−ジメトキシ−３ａ−（４−メトキシフェニル）−２,３,３ａ,８ｂ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］シクロペンタ［ｂ］フラン−１,８ｂ−ジオール（本願明細書では便宜上、「ＩＭＤ−０１９０６４」とも称される）：
【化１１】
2012510964.tif 000015
；
（１,３ａ,８ｂ）−３ａ−（４−クロロフェニル）−３−フェニル−６−（２−（ピロリジン−１−イル）エトキシ）−２,３,３ａ,８ｂ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］シクロペンタ［ｂ］フラン−１,８ｂ−ジオール（本願明細書では便宜上、「ＩＭＤ−０２６２５９」とも称される；ＷＯ  ２００５／１１３５２９、実施例３３を参照のこと）:
【化１２】
2012510964.tif 000016
；および
（１,３ａ,８ｂ）−３ａ−（４−クロロフェニル）−６−（２−（メチルアミノ）エトキシ）−３−フェニル−２,３,３ａ,８ｂ−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］シクロペンタ［ｂ］フラン−１,８ｂ−ジオール（本願明細書では便宜上、「ＩＭＤ−０２６２６０」とも称される；ＷＯ２００５／１１３５２９、実施例３４を参照のこと）:
【化１３】
2012510964.tif 000017
；およびその生理学的に許容される塩からなる群より選択される。
【００６０】
本発明のさらなる態様は、本発明の、一般式（Ｉ）の、好ましくは一般式（１ａ）、（１ｂ）、（１ｃ）、（１ｅ）、（１ｆ）または（１ｇ）の少なくとも１種の化合物の、血管形成関連の障害、好ましくは肺高血圧症の治療および／または予防のための医薬の製造における使用に関する。一般式（Ｉ）の化合物の好ましい全ての実施態様はまた本発明の医薬にも適用可能であり、かくして以下にて繰り返して記載されない。
【００６１】
好ましくは、該医薬は、上記した本発明の一般式（Ｉ）の少なくとも１種の化合物と、生理学的に許容される担体とを含む、医薬組成物である。
【００６２】
本発明のさらなる態様は、血管形成に関連する障害、好ましくは肺高血圧症の治療および／または予防のための、上記した医薬組成物の製造における本発明の一般式（Ｉ）の少なくとも１種の化合物の使用に関する。一般式（Ｉ）の化合物の好ましい全ての実施態様はまた本発明の医薬組成物にも適用可能であり、かくして以下にて繰り返して記載されない。
【００６３】
本発明の医薬組成物は、液体、例えば液剤、分散液、懸濁液またはエマルジョンであっても；または固体、例えば散剤、ペースト、ゲル等であってもよい。
【００６４】
適当な生理学的に許容される担体は当業者に知られている。適当な液体担体としては、水、エタノール等が挙げられる。適当な固体担体は、充填剤、結合剤、滑剤、崩壊剤等の典型的な医薬賦形剤を包含する。この点において、例えば、D.E. Bugayら、Pharmaceutical Excipients、Informa Healthcare；第１版（December 1、1998）を参照できる。一般に、本発明の医薬組成物は、例えば、賦形剤、溶媒、ベヒクル、乳化剤および／または分散剤などの不活性な非毒性の医薬上適当な補助剤を含有してもよい。
【００６５】
例示として、以下の補助剤：水、粉砕した天然または合成の鉱物（例えば、タルクまたはシリケート）などの固体賦形剤、ショ糖（例えば、ラクトース）、非毒性の有機溶媒、例えばパラフィン、植物油（例、ゴマ油）、アルコール（例、エタノール、グリセロール）、グリコール（例、ポリエチレングリコール）、乳化剤、分散剤（例、ポリビニルピロリドン）および滑沢剤（例、硫酸マグネシウム）に言及しうる。
【００６６】
一般式（Ｉ）の化合物と、生理学的に許容される担体の相対的な重量比は、好ましくは、９９.９：０.１ないし０.１：９９.９の割合の範囲内にあることが好ましい。
【００６７】
本発明のさらなる態様は、本発明の一般式（Ｉ）の少なくとも一種の化合物の、血管形成関連の障害の治療および／または予防のための上記した医薬組成物を含有する医薬剤形の製造における使用に関する。一般式（Ｉ）の化合物の好ましい全ての実施態様はまた本発明の医薬剤形にも適用可能であり、かくして以下にて繰り返して記載されない。
【００６８】
本発明の医薬剤形は、例えば全身、局所または局部投与用に適合され得る。全身投与は、例えば、静脈内、吸入または経口投与を包含する。
【００６９】
本発明の化合物は、非全身性または全身性活性を示すことができ、ここでは後者が好ましい。全身性活性を得るために、活性な化合物を含有する医薬剤形は、とりわけ、経口、非経口または吸入投与することができ、ここでは経口投与が好ましい。非全身性活性を得るには、活性化合物を含有する医薬剤形が、とりわけ、局所投与され得る。
【００７０】
非経口投与の場合、粘膜（すなわち、頬側、舌側、舌下、直腸、鼻、肺、結腸または膣内）に、または体内に投与するための医薬剤形が特に適している。投与は吸収を回避すること（心臓内、動脈内、静脈内、髄腔内または脊椎内投与）により、あるいは吸収を含めること（皮内、皮下、経皮、筋肉内または腹腔内投与）により実施され得る。
【００７１】
上記した目的の場合、活性化合物を含有する医薬剤形はそのままで、あるいは医薬剤形（投与形態）にて投与され得る。
【００７２】
経口投与用の適当な医薬剤形は、とりわけ、通常の、腸溶性コーティング錠、カプセル、コーティング剤、ピル、顆粒、ペレット、散剤、固体および液体エアロジル、シロップ、エマルジョン、懸濁液および溶液である。適当な非経口投与用の医薬剤形は注射および注入用溶液である。
【００７３】
活性な化合物は、医薬剤形中、０.００１−１００重量％の濃度で配合することができ；好ましくは活性な化合物の濃度は０.５−９０重量％、すなわち特定の用量範囲を満たすのに十分な量とすべきである。
【００７４】
経口投与の場合には、錠剤はまた、もちろん、クエン酸ナトリウムなどの添加剤、ならびに澱粉、ゼラチンなどの添加剤を含有しうる。フレーバーエンハンサーまたは着色剤もまた、経口投与用の水性製剤に添加され得る。
【００７５】
非経口投与の場合にて効果的な結果を得るためには、一般に、体重１ｋｇに付き、約０．０００１ないし１００ｍｇ、好ましくは約０．００１ないし１０ｍｇ、より好ましくは約０．０１ないし１ｍｇの量を投与することが有利であることが確認された。経口投与の場合には、その量は、体重１ｋｇに付き、約０．００１ないし１００ｍｇ、好ましくは約０．１ないし５０ｍｇである。
【００７６】
これにも拘わらず、状況によっては、上記した量を、すなわち、体重、投与経路、個々の活性化合物に対する作用；調製方法および投与が行われる時期または間隔の関数としての量を逸脱する必要もあり得る。例えば、ある場合には、上記した最低量よりも少ない量で十分であり得るし、別の場合では、上記した上限を越えるであろう。より多くの量を投与する場合には、その量を一日を通して複数の個々の用量に分けることが望ましい。
【００７７】
以下の試験例および実施例におけるパーセントは、特記しない限り、重量％であり；部は重量部である。液体／液体溶液について報告されている溶媒割合、希釈割合および濃度は、各々、容量に基づく。
【００７８】
医薬剤形は、例えばその中に含まれる活性化合物の即時または徐放特性を示してもよい。
【００７９】
本発明の化合物はＨＩＦ−１蛋白の蓄積を阻害する剤であり、したがってＨＩＦ−１蛋白の蓄積を阻害することを意図とする医薬の製造に用いられ得る。
【００８０】
本発明の化合物は、予測できない、有用な薬理学的かつ薬物動態学的活性スペクトルを示す。したがって、該化合物はヒトおよび動物の障害の治療および／または予防用の医薬として用いるのに適している。
【００８１】
一般式（Ｉ）の化合物はＨＩＦ阻害剤であり、したがって種々の血管形成関連の障害の治療および／または予防に適しているか、または血管形成関連の障害の治療および／または予防用の医薬の製造に有用である。
【００８２】
一般に、本発明の一般式（Ｉ）の化合物は、血管形成関連の障害の治療および／または予防に用いることができるか、または血管形成関連の障害の治療および／または予防用の医薬の製造に有用である。
【００８３】
血管形成関連の障害は、尿生殖器疾患、好ましくは女性の生殖器の非炎症性疾患、子宮内膜症、卵巣子宮内膜症、卵管子宮内膜症、腸子宮内膜症、瘢痕部子宮内膜症、直腸膣中隔子宮内膜症、膣子宮内膜症および骨盤腹膜子宮内膜症；眼病、好ましくは黄斑変性、卵黄様ジストロフィ（ベスト病）、網膜症、糖尿病性網膜症、緑内障、血管新生緑内障（neuroscular glaucoma）、脈絡膜血管新生、潜在性脈絡膜血管新生、角膜血管新生、後水晶体繊維増殖症および虹彩ルベオーシス；肺疾患、好ましくは気道リモデリング、ＣＯＰＤ（慢性閉塞性呼吸器障害）、ＡＲＤＳ（急性呼吸窮迫症候群）、新生児呼吸窮迫症候群、肺高血圧、肺サルコイドーシスおよび突発性肺線維症；腎疾患、好ましくはネフロパシー、慢性低酸素誘発性疾患、ＥＳＲＤ、腎線維症、腎動脈狭窄症および糸球体腎炎；骨関節炎、好ましくは変形性膝関節炎、変形性股関節症、ポリ関節症（polyarthrosis）、リズ関節症（rhizarthrosis）およびさらなる関節症；リウマチ障害、好ましくは関節リウマチ；骨疾患、好ましくは骨粗鬆症および軟骨細胞関連の障害；心筋血管新生；転移；子宮内膜症；創傷治癒；勃起不全、好ましくはペーロニー病；良性増殖性疾患、好ましくは良性腫瘍；血管腫、好ましくは肝血管腫、海綿状血管腫およびクリッペル・トレナウナイ・ウェーバー（ＫＴＷ）症候群；皮膚障害、好ましくは強皮症；貧血、好ましくは赤血球産生；全身性疾患、好ましくは全身性硬化症およびサルコイドーシス；耐性軽減、好ましくは放射線増感、化学増感および薬物耐性軽減；小児悪性腫瘍；組織エンジニアリング；アポトーシス刺激からなる群より選択されるのが好ましい。
【００８４】
特に好ましい実施態様において、該化合物は、肺高血圧、肺サルコイドーシスおよび突発性肺線維症からなる群より選択される肺障害を治療または防止するものである。かかる疾患は、一般に、血管形成に関連していると考えられる。それでも、本願明細書の目的のためには、「肺高血圧」、「肺サルコイドーシス」および「突発性肺線維症」なる語は、血管形成と関係しているか、いないかに関わりなく、各々、肺高血圧、肺サルコイドーシスおよび突発性肺線維症をいう。
【００８５】
本発明の好ましい実施態様において、血管形成関連の障害は、尿生殖器疾患、好ましくは女性の生殖器の非炎症性疾患、子宮内膜症、卵巣子宮内膜症、卵管子宮内膜症、腸子宮内膜症、瘢痕部子宮内膜症、直腸膣中隔子宮内膜症、膣子宮内膜症および骨盤腹膜子宮内膜症からなる群より選択される。
【００８６】
本発明のもう一つ別の好ましい実施態様において、血管形成関連の障害は、眼病からなる群より選択され、好ましくは黄斑変性、卵黄様ジストロフィ（ベスト病）、網膜症、糖尿病性網膜症、緑内障、血管新生緑内障、脈絡膜血管新生、潜在性脈絡膜血管新生、角膜血管新生、後水晶体繊維増殖症および虹彩ルベオーシスからなる群より選択される。
【００８７】
本発明のもう一つ別の好ましい実施態様において、血管形成関連の障害は、肺疾患からなる群より選択され、好ましくは気道リモデリング、ＣＯＰＤ（慢性閉塞性呼吸器障害）、ＡＲＤＳ（急性呼吸窮迫症候群）、新生児呼吸窮迫症候群、肺高血圧、肺サルコイドーシスおよび突発性肺線維症からなる群より選択される。
【００８８】
本発明のもう一つ別の好ましい実施態様において、血管形成関連の障害は、腎疾患、好ましくはネフロパシー、慢性低酸素誘発性疾患、ＥＳＲＤ、腎線維症、腎動脈狭窄症および糸球体腎炎からなる群より選択される。
【００８９】
本発明のもう一つ別の好ましい実施態様において、血管形成関連の障害は、骨関節炎、好ましくは変形性膝関節炎、変形性股関節症、ポリ関節症、リズ関節症およびさらなる関節症からなる群より選択される。
【００９０】
本発明のもう一つ別の好ましい実施態様において、血管形成関連の障害は、リウマチ障害、好ましくは関節リウマチからなる群より選択される。
【００９１】
本発明の一般式（Ｉ）の化合物は、種々の経路により合成され得る。例えば、該化合物は商業的に入手可能なビルディングブロックより出発して完全に合成操作により調製され得る。さらには、該化合物は植物、好ましくは種々のアグライア植物より単離され得るか、あるいは該植物より単離された前駆体の生成物は合成（半合成経路）における出発物質として用いられ得る。かくして、一般式（Ｉ）の化合物は、単離により、あるいは既に公開されいる経路または新規な合成経路により得ることのできる化合物を単離または半合成で誘導化することで得ることができる。換言すれば、本発明の化合物は、例えば、天然産物、これらの天然産物の誘導体または完全な合成アナログであり得る。
【００９２】
本願明細書では便宜上、「Ｈｉｆ−１」が遺伝子／ｍＲＮＡを記載するのに対して、「ＨＩＦ−１」は蛋白を記載する。
【００９３】
一般式（Ｉ）の化合物を調製する好ましい方法を以下に記載する：
【００９４】
実施例
実施例１：低酸素誘導のＨＩＦ−１依存性ルシフェラーゼ発現の抑制
２細胞系統（Ｊｕｒｋａｔ  Ｔおよび２９３Ｔ細胞）における化合物のＨＩＦ−１ルシフェラーゼ依存性レポータ遺伝子活性に対する用量応答曲線
【００９５】
ＨＩＦ−１−依存性ルシフェラーゼレポータ遺伝子を、R otifect（登録商標）（Carl Roth GmbH；Karlsruhe、Germanyの登録商標）と一緒に形質移入することで２９３Ｔ細胞にトランスフェクトするか、あるいは別法としてエレクトロポレーションでＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞にトランスフェクトした。両方の細胞系統をＨＩＦ−１−依存性レポータ遺伝子でトランスフェクトした。その次の日に、細胞を所定のマイクロモル以下の濃度の試験化合物と一緒に１時間プレインキュベートし、ついで標準酸素または低酸素圧（１％Ｏ２）条件下でさらに８時間インキュベートした。その後で、細胞を収穫し、つづいてルミノメータにてルシフェラーゼ活性を解析した。
【００９６】
３種の例示としての化合物の結果を図２ａ（２９３Ｔ細胞）および２ｂ（Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞）に示す。相対光単位が示され、該実験を３回行い、平均値を得る。
【００９７】
239T細胞（図２ａ）およびＪｕｒｋａｔ細胞（図２ｂ）におけるＨＩＦ−１介在ルシフェラーゼ活性の阻害を示す、ルミノメータにおけるルシフェラーゼ活性の解析では、各化合物は５０ｎＭ以上の濃度で顕著にＨＩＦ−１活性を遮断したのに対して、１０ｎＭではＨＩＦ−１依存性転写に対してわずかな衝撃を示すに過ぎなかった。
【００９８】
実施例２：化合物のＨＩＦ−１ルシフェラーゼ阻害活性についてのＩＣ５０値の測定
【００９９】
ＨＩＦ−１−依存性ルシフェラーゼレポータ遺伝子を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。その翌朝に、細胞を所定の濃度の化合物で１時間にわたって前処置し、つづいて低酸素圧（低酸素チャンバ）にて８時間誘導させた。その後、細胞を収穫し、溶解させた。２０μＬのアッセイバッファを２０μＬの細胞抽出液に注入することで、該抽出液におけるルシフェラーゼ活性をルミノメータ（Duo Lumat LB 9507、Berthold）で測定した。発光を１０秒間測定し、相対光単位を得る。その結果が図３に示されており、各々、ＩＭＤ−０２６２５９、ＩＭＤ−０２６２６０およびＩＭＤ−０１９０６４について認められる、１９、１８および２３ｎＭのＩＣ５０値を示す。
【０１００】
実施例３：ＨＲＥ−ルシフェラーゼ発現に対する化合物干渉の時間依存性
２９３Ｔ細胞をＨＩＦ−１−依存性ルシフェラーゼレポータ遺伝子でトランスフェクトした後、細胞を図４に示すように標準酸素圧または低酸素圧（８時間、１％Ｏ２）条件下でさらにインキュベートした。低酸素とする１時間前に、または低酸素を誘導した２および４時間後のいずれかにて、有効遮断濃度（各２５０ｎＭ）のＩＭＤを添加した。
【０１０１】
ＩＭＤ−０１９０６４；ＩＭＤ−０２６２５９およびＩＭＤ−０２６２６０は、低酸素誘導の４時間後に添加した場合であっても、ＨＩＦ−１−依存性ルシフェラーゼ発現を阻害し得ることを示した。これらの結果は、本発明の化合物がＨＩＦ−１応答の誘導を防止するだけでなく、蛋白が既に安定化されている場合のＨＩＦ−１−依存性転写の継続に干渉することを、明らかにするものである（図４）。
【０１０２】
実施例４：化合物のＨｉｆ−１のｍＲＮＡ発現についての効果
本発明の化合物がそのＨＩＦ−１−１転写の阻害を介してそのＨＩＦ−１−１抑制作用を発揮するかどうかを試験するのに、該化合物をＨＩＦ−１αのｍＲＮＡ産生についてのその作用について試験した。実験は全て、有効遮断濃度（２５０ｎＭ）の試験化合物にヒト細胞を３時間曝露した。ついで、さらに細胞を、各々、標準酸素圧または低酸素圧（４５分、１％Ｏ２）下で、培養させた。その後、細胞サンプルを収穫し、ＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡを特異的プライマーおよびＰＥアプライド・バイオシステムズ・リバース・トランスクリプション・リージェント（PE Applied Biosystems Reverse Transcription Reagents）を用いて合成した。SYBR Green I検出化学システム（Applied Biosystems）およびABI Prism 7300システムを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。Ｈｉｆ−１αの発現を定量し、結果をＨｐｒｔ１およびβ−アクチン（「ハウスキーピング遺伝子」）発現に対して正規化した。異なる遺伝子の相対存在度を比較ＣＴ法により計算した。標準酸素圧の対照細胞のＨＩＦ−１α転写を任意に１に設定した。代表的な実験例を図５に示す。低酸素圧は利用した条件下でＨＩＦ−１α転写を約３倍適度に増加させるが、ＨＩＦ−１αｍＲＮＡ発現のｑＰＣＲによる定量では、試験した化合物の顕著な効果は見られなかった。試験物質（ＩＭＤ−０１９０６４；ＩＭＤ−０２６２５９およびＩＭＤ−０２６２６０）は、標準酸素圧でも低酸素圧の条件下でもＨｉｆ−１αのｍＲＮＡ産生についていずれの効果も示さなかった。従って、ＩＭＤ−化合物のＨＩＦ−１−依存性遺伝子発現についての効果はＨＩＦ−１α転写を介していないようである（図５）。
【０１０３】
実施例５：ＩＭＤ化合物のＨＩＦ−１標的遺伝子発現についての効果
ヒト２９３Ｔ細胞を、標準酸素圧条件または低酸素圧条件（１％酸素）下で、各々、４および８時間、培養した。細胞を集め、つづいてＲＮＡを単離し、逆転写酵素キットを用いてオリゴ（ｄＴ）２０プライマーよりｃＤＮＡを生成した。ついで、遺伝子発現を、次の２種の選択したＨＩＦ−１α標的遺伝子：ＬＤＨ−Ａ（ラクタート脱水素酵素イソフォームＡ）およびＰＤＫ１（ピルバート脱水素酵素キナーゼ１）についてリアルタイムＰＣＲに付すことで測定した。リアルタイムＰＣＲは、特異的なプライマーおよびSYBR Green I検出化学システム（Applied Biosystems）を用い、ABI Prism７３００システムを利用してｃＤＮＡで行われた。内部対照としてアクチンも測定した。異なる遺伝子の相対存在度を比較ＣＴ法により計算した。比較を容易にするために、標準酸素圧条件下の遺伝子発現を３種の遺伝子の各々について任意に１に設定した。２回の独立した実験で、ＰＤＫ１がＬＤＨと比べて最も顕著に誘導される遺伝子であることを確認した。結果を図６ａに示す。
【０１０４】
化合物のＰＤＫ１を阻害する能力を検査するために、３種の異なる濃度の各阻害剤（ＩＭＤ−０１９０６４；ＩＭＤ−０２６２５９；およびＩＭＤ−０２６２６０）で１時間、２９３Ｔ細胞を前処置した。その後で、細胞を標準酸素圧／低酸素圧の条件下でさらに８時間インキュベートし、ＰＤＫ１発現を上記したリアルタイムＰＣＲで定量した。結果を図６ｂに示し、それは３種のすべての阻害剤が内在性ＰＤＫ１遺伝子の活性化を強力に抑制することを示す。ＩＣ５０値が８ないし１２ｎＭの範囲（ＩＭＤ０２６２５９、９ｎＭ；ＩＭＤ０２６２６０、８ｎＭ；およびＩＭＤ０１９０６４、１２ｎＭ）にあるように測定され、このことは内在性遺伝子（例えば、ＰＤＫ１）がレポータ遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）よりもなおさら強力に抑制されることを示す。
【０１０５】
その上さらに、ＩＭＤ−０１９０６４、ＩＭＤ−０２６２５９およびＩＭＤ−０２６２６０がＨＩＦ−１α−依存性標的遺伝子発現を特異的に抑制する能力を有することも明らかにされた。
【０１０６】
実施例６：低酸素誘発のＨＩＦ−１α蛋白の蓄積の抑制
低酸素誘発のＨＩＦ−１安定化の防止について化合物が用量依存性であることの測定
ＩＭＤ−０２６２５９、ＩＭＤ−０２６２６０およびＩＭＤ−０１９０６４のＨＩＦ−１α蛋白の安定化／蓄積についての効果を検査した。２９３Ｔ細胞を所定の濃度の３種すべての化合物と共にプレインキュベートした。プレインキュベーションの１時間後に、２９３Ｔ細胞を所定の濃度の化合物と一緒にプレインキュベートし、ついでさらに標準酸素圧または低酸素圧（４時間、１%Ｏ２）条件下で各々インキュベートした。細胞を１ｘＳＤＳサンプルバッファおよび超音波処理に付して溶解させた後、該サンプルを免疫ブロット法によりＨＩＦ−１α存在度について分析した。溶解物に含まれる等量の蛋白を還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ついでさらにＨＩＦ−１αを特異的に認識する抗体およびローディング対照のアクチン（等しい蛋白量のローディングを示す）を用いる免疫ブロット法により分析した。
【０１０７】
図７にて示されるように、ＨＩＦ−１α蛋白の蓄積は標準酸素圧条件（−）では検出できず、低酸素圧条件（＋）で誘導された。ＨＩＦ−１α蛋白の蓄積は、化合物の濃度が５０ｎＭ以上で、顕著かつ特異的に防止された。２５０ｎＭの濃度のＩＭＤ−０１９０６４およびＩＭＤ−０２６２６０は、ＨＩＦ−１α蛋白の蓄積をほぼ完全に遮断した。
【０１０８】
実施例７：無細胞蛋白翻訳の阻害
ＩＭＤ−０１９０６４のインビトロにおける無細胞蛋白翻訳に対する効果を調べた（図８のアッセイ原理も参照のこと）。４種のウイルス蛋白をコードするブロムモザイクウイルス（ＢＭＶ）ｍＲＮＡをＩＭＤ−０１９０６４（図９ａ）、ＩＭＤ−０２６２５９、ＩＭＤ−０２６２６０（図９ｂ）またはシクロヘキシミド（Ｃｈｘ、１０μＭ）（正対照）の存在下で、またはなしでリボソームと一緒にインキュベートし、形成された蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０１０９】
図９ａに示されるように、ＩＭＤ−０１９０６４はインビトロにおける蛋白合成に影響しないのに対して、シクロヘキシミドは新たに合成される蛋白の形成を強く抑制した（図９ａ、レーン：Ｃｈｘ）。ＩＭＤ−０１９０６４（図９ａ）、ＩＭＤ−０２６２５９、ＩＭＤ−０２６２６０（図９ｂ）の、インビトロでの蛋白翻訳における顕著な効果は関連する（ｎＭ）濃度で観察されなかったが、シクロヘキシミド（Ｃｈｘ；正の対照）は蛋白翻訳を抑制した。パネルは代表的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ蛋白ゲルを示す。ビヒクル含有の翻訳反応物（Ｖｅｈ）は１００％の翻訳効率を示し、それに対して正の対照として用いられた蛋白翻訳の既知の阻害剤である、シクロヘキシミド（Ｃｈｘ；１０μｇ／ｍｌ）は顕著な蛋白の減少を示す。
【０１１０】
実施例８：無細胞蛋白翻訳の阻害
化合物のインビトロ翻訳についての効果。ＴＮＴ（登録商標）Coupled Reticulocyte Lysate Systems（無細胞蛋白発現）を用いて翻訳に対する潜在的効果を試験した。フラッグのタグを付したＮＦ−κＢ  ｐ５０蛋白をインビトロにて産生した。各１００ｎＭの化合物（ＩＭＤ−０１９０６４；ＩＭＤ−０２６２５９およびＩＭＤ−０２６２６０）および溶媒対照としてのＤＭＳＯを含む、網状赤血球システムを用いた。フラッグのタグを付したＮＦ−κＢ  ｐ５０蛋白を非放射性のインビトロ翻訳に供した後、蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、産生されたｐ５０蛋白をフラッグ抗体を用いる免疫ブロット法により検出した（図１０を参照のこと）。
【０１１１】
これらの結果は、無細胞のインビトロ翻訳について、本発明の化合物の検出可能な効果を示さず、実施例７の結果と一緒になって、試験化合物の蛋白合成／翻訳に対する直接的かつ非特異的な効果をほとんどありそうもないようにする。
【０１１２】
実施例９：細胞におけるシグナル依存性アミノ酸取り込みの特異的阻害
式（Ｉ）の化合物は、文献中、蛋白合成の非特異的阻害剤であると報告されている。かくして、ＩＭＤ−０１９０６４（ロカグラオール（rocaglaol）誘導体）が蛋白合成の直接的阻害剤であるかどうかの問題は異なるレベルで対処されている。活性化されたシグナル化カスケード（例えば、ＩＬ−１シグナル化経路）の阻害がＩＭＤ−０１９０６４の阻害活性に起因するかどうかを調べるために、細胞アッセイ（放射性標識されたアミノ酸の非刺激およびＩＬ−１ｂ−刺激の内皮細胞への取り込み）を行った。この実験において、アミノ酸の組み込みについて、ＩＬ−１刺激細胞に比べて非刺激細胞では２０倍の用量応答曲線のより高い濃度へのシフトが観察された。このことはＩＬ−１依存性シグナル伝達が実際にＩＭＤ−０１９０６４の蛋白合成−阻害活性に起因することを示すものである。ＩＭＤ−０１９０６４が作用する細胞蛋白翻訳についてのＩＣ５０値はＩＬ−１の前誘導の後で顕著に低下する。この細胞アッセイは、これにより、ＩＭＤ−０１９０６４の細胞蛋白合成についての阻害活性が、例えばＩＬ−１依存性シグナル化カスケードを特異的に遮断することで媒介されることを示す（図１１を参照のこと）。
【０１１３】
実施例１０：細胞（インビボ）蛋白翻訳の阻害
２９３Ｔ細胞を既知の翻訳阻害剤であるシクロヘキシミド（１０μｇ／ｍｌ）および、各々、１００ｎＭのＩＭＤ−０１９０６４、ＩＭＤ−０２６２５９およびＩＭＤ−０２６２６０の存在下で増殖させた。後者の用量は、（例えば、実施例２と５を比較して）遺伝子発現実験からのＩＣ５０値よりも十分に高い濃度（約５ないし１０倍）を示す場合に選択されるが、非特異的な効果を惹起しうる濃度より下でも選択され得る。細胞を１０時間および２４時間後に収穫し、細胞溶解物を生成した。該細胞溶解物に含まれる等量の蛋白を、図１２に示されるように、抗−ＩＫＫγ／ＮＥＭＯ抗体での免疫ブロットに用いた。ＩＫＫγ／ＮＥＭＯは構造的に発現される相対的に不安定な蛋白である。かくして、細胞蛋白翻訳の阻害が成功すると、抗−ＩＫＫγ／ＮＥＭＯシグナルの顕著な低下がもたらされるはずである。２９３Ｔ細胞のＩＭＤ−０１９０６４、ＩＭＤ−０２６２５９およびＩＭＤ−０２６２６０化合物での処置は、抗−ＩＫＫγ／ＮＥＭＯシグナルの減少をもたらさなかった。これらの実験はシクロヘキシミドによる蛋白翻訳の強力な阻害を確認するが、試験した３種の化合物による非特異的阻害を示さなかった。
【０１１４】
実施例１１：低酸素刺激後のＨＵＶＥＣ細胞における血管新生発芽の抑制
先行の出願では、ＩＭＤ−０１９０６４のストック溶液［１００ｍＭ］はＤＭＳＯにて１：１０に希釈され、１００％ＤＭＳＯを用いて１０ｍＭないし１μＭの濃度範囲をカバーする半対数工程にて連続して希釈された。最後に該アッセイにてＤＭＳＯ濃度を１％とし、最終アッセイ濃度は１００μＭから１０ｎＭの範囲にあった。実験を最初に公開されたプロトコルに変更を加えて続けた（KorffおよびAugustin：J Cell Sci 112: 3249-58, 1999）。簡単には、KorffおよびAugustin：J Cell Biol 143：1341-52, 1998に記載されるように、５００の内皮細胞（ＥＣ）を懸滴にてプラスチック皿上にピペットで取り、スフェロイドを調製し、該スフェロイドを一夜凝集させた。ついで、５０のＥＣスフェロイドを０．９ｍＬの３Ｄコラーゲンマトリックスに埋め込み、２４ウェルプレートの個々のウェルにピペットで取り、高分子化させた。デフェロキサミン［１００μＭ；化学的に誘発される低酸素状態の誘導］と組み合わせて、ＨＵＶＥＣについての試験化合物を、３０分後に、高分子化ゲルの上に１００μｌの１０倍濃縮した希釈体をピペットを用いて加えた（化合物の最終濃度については表２を参照のこと）。
【０１１５】
【表２】
2012510964.tif 000018
【０１１６】
プレートを３７℃で２４時間インキュベートし、４％パラホルムアルデヒドを添加することで固定した。データポイント当たり無作為に選択された１０個のスフェロイドの累積的な発芽の長さを分析し、試験化合物による相対阻害を測定した。ＩＣ５０曲線のフィッティングおよびＩＣ５０値の算定をGraphPad Prism 5.01で行った。ＥＣおよび線維芽スフェロイドの発芽度を倒立顕微鏡およびデジタル式画像ソフトウェアAnalysis3.2（Soft imaging system, Munster, Germany）を用いる画像分析システムで定量した。並行して、ＮＨＤＦ（線維芽）スフェロイドを３Ｄコラーゲンゲルに埋め込み、異なる濃度のＩＭＤ−０１９０６４で２４時間処置した。データポイントに付き無作為に選択した１０個のスフェロイドの累積的な発芽の長さを、ＨＵＶＥＣ実験で用いた操作に従って分析した。
【０１１７】
試験化合物ＩＭＤ−０１９０６４は、コラーゲンマトリックスを用いるスフェロイドをベースとする血管形成において用量依存的方法にて化学的に［デフェロキサミン；１００μＭ］誘導される低酸素状態により刺激されるヒト臍帯静脈内皮細胞（ＥＣ）の発芽および線維芽分散を阻害する。デフェロキサミン誘導のＨＵＶＥＣスフェロイドの発芽は、ＩＭＤ−０１９０６４処置により顕著に阻害された。３０ｎＭのＩＣ５０値が測定され得た（図１３）。ＮＨＤＦ（線維芽細胞）スフェロイドの発芽が、１８０ｎＭのＩＣ５０値付近でＩＭＤ−０１９０６４で阻害されることが判明した（図１３）。該知見はＨＵＶＥＣと線維芽細胞のＩＭＤ−０１９０６４に対する感受性で６倍の違いがあることを明らかにした。このことは、低酸素誘導の血管形成作用（ＨＵＶＥＣ発芽）の阻害が非特異的な細胞毒性に依存するものではないことを示す。
【０１１８】
同じアッセイをＩＭＤ−０２６２６０；ＩＭＤ−０２６２５９；ステント（登録商標）（スニチニブ）およびソラフェニブ（ネキサバル（登録商標））で行った（最終の化合物濃度については表３を参照のこと）。
【０１１９】
【表３】
2012510964.tif 000019
【０１２０】
１３ｎＭのＩＣ５０値（図１３：低酸素誘導のＥＣ発芽）および１８０ｎＭのＩＣ５０値（図１３：ＮＨＤＦ線維芽分散）を示す、各々の結果を図１３に示す。これらのデータ（ＩＭＤ−０１９０６４との比較）はＨＵＶＥＣの感受性の均一な増加を示し、その結果、ＩＭＤ−０２６２６０に対して１３倍よりも大きなＨＵＶＥＣと線維芽細胞の感受性の違いが生じる。このことはＩＭＤ−０１９０６４の知見の正当性を立証するものであり、ＩＭＤ−０２６２６０による非特異的細胞毒性に依存しない低酸素誘導の血管形成作用（ＨＵＶＥＣ発芽）の阻害を改善することを明らかにする（結果の要約については図１４ｂを参照のこと）。
【０１２１】
実施例１２：ＶＥＧＦ−Ａ刺激の後のＨＵＶＥＣ細胞における血管形成発芽の抑制
実施例４に記載されるように、ＨＵＶＥＣスフェロイドを生成し、培養し、３Ｄコラーゲンゲルに埋め込み、デフェロキサミンの代わりに血管内皮成長因子アルファ［ＶＥＧＦ−Ａ；２５ｎｇ／ｍｌ］で刺激した。細胞スフェロイドを異なる濃度のＩＭＤ−０２６２５９；ＩＭＤ−０２６２６０；ステント（登録商標）（スニチニブ）およびソラフェニブ（ネキサバル（登録商標）で２４時間処置した（モル［Ｍ］にて、表４に示す；図１４Ａも参照のこと）。
【０１２２】
【表４】
2012510964.tif 000020
【０１２３】
データポイント当たり無作為に選択された１０個のスフェロイドの累積的な発芽の長さを分析し、試験化合物による相対阻害を測定した。ＩＣ５０曲線のフィッティングおよびＩＣ５０値の算定をGraphPad Prism 5.01（GraphPad Software Inc.）で行った。ＶＥＧＦ−Ａ誘導のＨＵＶＥＣスフェロイドの発芽はＩＭＤ−０２６２６０の処置により顕著に阻害された。２８ｎＭのＩＣ５０値を測定することができた（図１４ａ）。上記した実施例の結果を図１４ｂに要約する。ＩＣ５０値は、低酸素状態またはＶＥＧＦ誘導後のインビトロにおける血管形成（ＨＵＶＥＣ発芽）実験にてｎＭで示される。これらのデータにより、ＩＭＤ−０１９０６４；ＩＭＤ−０２６２５９およびＩＭＤ−０２６２６０がインビトロにて血管形成発芽び強力な阻害剤として作用することが明らかにされる。さらには、本発明の化合物がステント（登録商標）（スニチニブ）およびソラフェニブ（ネキサバル（登録商標）に比べてインビトロにおけるＨＵＶＥＣ発芽（血管新生）に対して強力な阻害作用を有することも明らかにされた。
【０１２４】
実施例１３：スフェロイドをベースとするインビボでの血管形成アッセイにおける抗血管形成試験項目の抗血管形成効能の評価
ヒト内皮細胞（ＥＣ；ＨＵＶＥＣ）を、平滑筋細胞（ＳＭＣ）および線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の存在下で、細胞外マトリックス成分が埋め込まれたＳＣＩＤマウス（ｎ＝１０）にて皮下的に適用する。移植されたヒトＥＣ（ＥＣと組み合わされた懸濁状態のＥＣスフェロイド）は、マウス血管系および宿主（マウス）被覆周皮細胞と吻合する（結合する）、ヒト起源の毛細血管の複雑に灌流した三次元ネットワークを形成する。新たに形成される血管系の特性は微小血管密度計数によりモニター観察される。この実験の目的は、スフェロイドをベースとするインビボでの血管形成アッセイにおける試験項目の抗血管形成能を検討することである。この目的のために、ＨＵＶＥＣスフェロイドを、記載（KorffおよびAugustin：J Cell Biol 143：1341-52、1998）に従い、１００のＥＣを懸滴にてプラスチック皿にピペットで取り、スフェロイドを一夜で形成させることで調製した。翌日、ＥＣスフェロイドを収穫し、マトリゲル／フィブリン溶液にて、懸濁状態のＨＵＶＥＣ、ＳＭＣおよびＮＨＤＦと混合した。プラグとして用いられる最終混合物は、１０００００のスフェロイドＥＣおよび２０００００の単懸濁のＥＣ、３０００００のＳＭＣおよび１０００００のＮＨＤＦを含有した。ＳＣＩＤマウスに５００μｌの細胞／マトリックス懸濁液を皮下注射した。
【０１２５】
標準アッセイ（ＶＥＧＦ−ＡおよびＦＧＦ−２刺激、およびＥＣのみ）にて、最初の灌流血管は、通常、第４日ないし第６日に検出される。インビボにて２０日間増殖させると、ウェルは約５０−６０％の被覆周皮細胞の血管系を確立し、通常、灌流血管が観察される。ＳＣＩＤマウスを３日毎に経口投与で、各々、ビヒクルまたはＩＭＤ−０２６２６０（０．３ｍｇ／ｍｌ；第３群）で処置した。
【０１２６】
すべての動物を秤量し、麻酔処理した後に剖検を行った。マウスを頸椎脱臼で殺してから、マトリゲル（登録商標）（BD Biosciencesの登録商標）プラグを取り出した。該マトリゲル（登録商標）プラグを撮影し、４％Roti-Histofix（Roth、Karlsruhe、Germany）中、室温で４−１２時間固定した。その後で、半閉鎖性組織プロセッサーLeica TP1020を用いて、該プラグをパラフィン包埋した。
【０１２７】
ヒト血管系の組織学的検査のために、すべてのプラグのパラフィン断面（厚み＝８−１０μｍ）を調製した。ヒトＣＤ３４（NCL-END、Menarini、Berlin、Germany）の断面を染色することで血管形成を検出した。プラグ当たり３個の断面を分析し、各断面で、３個の画像をEclipse TE2000-U顕微鏡（日本、神奈川県、ニコン）を用いて２００ｘの倍率で撮影した。断面に付き解析される面積（３個の画像）は０．４４ｍｍ２であった。血管の数（ＣＤ３４陽性）をＮＩＳ−エレメントベーシックリサーチソフトウェア（日本、神奈川県、ニコン）を用いて手動で測定した。ＩＭＤ−０２６２６０での処置は、ビヒクル対照と比べて、有意な（ｐ値＝０.０００１）４２％のヒト血管数の減少をもたらした。該実験の結果を、図１５に示されるように、散布図（中央線を含む）としてグラフで示す。
【０１２８】
実施例１４：虚血性傷害後の神経学的損傷の減少（STROKE実験）
Longa E.Z.ら（Stroke、20、84-91、1989）に記載され、Esneaultら（Neuroscience、18；152（2）：308-20、2008）と適合した、神経保護活性を検出する方法を用いた。ラット（雄Ｒｊ：スプレーグ−ドーリーラット、体重２５０−３５０ｇ）をイソフルラン麻酔（導入には５％、維持には２％、３０％Ｏ２）の下に置く。体温を直腸温度プローブを用いてモニター観察し、実験の間を通して、加熱パッドを用い、３７℃±１℃に維持する。脳虚血の誘発をカバーする期間（ＭＣＡｏの１０−１５分前から５分後）の間、レーザードップラー流量計（Moor Instruments MoorLAB）を用いて、脳血流を連続して記録する。顕微鏡の操作の下で、眼球孔と耳の間に皮膚切開を設け、側頭筋を細かく調べる。レーザードップラープローブを頭部右側面に配置する。
【０１２９】
頚部を正中切開した後、右総頸動脈（ＣＣＡ）、外部頸動脈（ＥＣＡ）および内部頸動脈（ＩＣＡ）を隣接する静脈および神経より単離する。ついで、ＣＣＡを結紮し、ＥＣＡをそのＣＣＡの分岐から±２ｍｍでエレクトロコアグレートさせる。先端が透明な熱溶融接着剤で被覆されたナイロンスレッド（０．１８ｍｍ径）で塞栓（３ｍｍ長、０．３６−０．３８ｍｍ径）を構成する。該塞栓を小孔を介してＥＣＡの中に挿入し、脳血流が３０−５０％減少するか、あるいはわずかな抵抗が観察されるまで、ゆっくりとＩＣＡまで進める。
【０１３０】
腔内を結紮した後、頚部開口部を縫合する。レーザードップラープローブおよび直腸温度プローブを取り外す。ラットは麻酔より醒め、その元のケージに戻される。
【０１３１】
９０分後、ラットを再び麻酔処理に付す。ＣＣＡの塞栓および結紮を取り外し、再び灌流させる。傷口を縫合し、ラットをその元のケージに戻す。ラットに、生理食塩水（１ｍｌ／日）を５日間腹腔内（ｉ．ｐ．）投与し、脱水症状を防止する。
【０１３２】
ＩＭＤ−０２６２５９を、再灌流の０、２、４および２４時間後に、３種の用量（１、１０および１００μｇ／ｋｇ）で静脈内投与し、ビヒクル対照と比較して評価する。実験は同じ実験条件下でビヒクルを投与した擬似対照群を含む。従って、実験は５群からなる。一群１２匹のラットで実験する。試験は盲検で行った。
【０１３３】
神経学的評点
神経学的評点をBedersonら（Stroke、1986、17（3）：472-476）の方法の修飾形に従って評価する。
【０１３４】
該試験は以下に記載の１４のサブセットからなる（表１）：
【０１３５】
最初に麻痺側（paretic side）に無意識に歩き出し、旋回することが観察される。ついで、尾部を掴んでラットを粗面上に置き、同側および反対側に連続してゆっくりと押し、押しに対する抵抗を評価する。最後に、ラットを尾部で、連続して試験者の両手で吊し、ベンチの上に上げ、体の回転および前脚および後脚の屈曲を評価する。
【０１３６】
各サブセットを０ないし２に階級付けする（０＝応答なし、または総合的に異常な応答；１＝弱い応答、または異常な応答；２＝正常な応答）。損傷がなければ、最大２８の神経学的評点で示される。
【０１３７】
試験を術後２４時間および４８時間で行う。
【０１３８】
梗塞の評価
術後４８時間で動物をイソフルランで麻酔処理に付し、断頭により殺す。脳を摘出し、イソペンタン溶液（Sigma）中、−２０℃で迅速に冷凍した。脳をTissue−Tek（Raymond A Lamb Ltd、C/101.25）に埋め込み、クリオスタットで切断した。冠状断（２０μｍ）を８００μｍの間隔で５分間、チオニン（Sigma、0.05%）で染色する。その断面をスキャンし、梗塞の体積を画像Ｊソフトウェア（http://rsb.info.nih.gov/ij/）を用いて測定する。梗塞の体積を全脳および浮腫の体積（同側および反対側の半球の体積の間の違い）に関連して矯正する。
【０１３９】
統計分析
神経学的評点にて得られた定量的データは、２ウェイＡＮＯＶＡ（時間ｘ処置）に、つづいて１ウェイＡＮＯＶＡ（処置）および非対応性スチューデントｔ試験を用いる事後比較に付して分析されるであろう。
【０１４０】
対象の認識試験では、処置群と適当な対照群とを非対応性スチューデントｔ試験を用いて比較することでデータは解析されるであろう。加えて、各群について、ファミリーに属する対象を調べるのに要する時間（Ｅ２Ｆ）を新規な対象を調べるのに要する時間（Ｅ２Ｎ）と比較し、対応性スチューデントｔ試験を用いてＲＩはチャンス値（すなわち、ＲＩ＝０）と比較されるであろう。
【０１４１】
梗塞評価の後に得られる定量データは、処置群と適当な対照群とを非対応性スチューデントｔ試験を用いて比較することで分析されるであろう。
【０１４２】
実施例１５：肺低酸素（エクスビボ）（予測）
ＩＭＤ０２６２５９の低酸素肺血管収縮（ＨＰＶ）に対する効能
この実験により、ＩＭＤ０２６２５９がＨＰＶの具体的な制御機構に対して阻害剤として作用するかどうかを試験することができる。ＩＭＤ０２６２５９が内在センサー／酸素の感受性を阻害することでＨＰＶを抑制するかどうかを試験することができる。
【０１４３】
Ｉ）急性ＨＰＶでの用量応答（ＤＲ）の関係（図１６を参照）
ＩＭＤ−０２６２５９のＨＰＶに対する効果は、低酸素性でない血管収縮実験にて比較され得る。後者はトロンボキサンに似たＵ４６６１９をボーラス投与することで誘発され得る。
【０１４４】
実験群：
ａ）連続ＨＰＶ下でのＤＲ曲線（図１６を参照）（連続低酸素血管収縮）
ｂ）プラセボ投与での連続ＨＰＶ
ｃ）連続Ｕ４６６１９誘導性血管収縮でのＤＲ曲線
ｄ）プラセボ投与での連続Ｕ４６６１９投与の対照
【０１４５】
ＩＩ）ＩＭＤ０２６２５９のＨＰＶの長期化に対する効果の研究（１８０分に及ぶ連続的な低酸素供給）
群
ａ）ＩＭＤ０２６２５９を用いる１８０分の低酸素供給        ｎ＝８
ｂ）プラセボを用いる１８０分の低酸素供給                  ｎ＝８
【０１４６】
方法Ｉ）
麻酔処理したマウスの肺を手術により胸部より摘出する。肺を単離した状態で灌流し、通気する。灌流には、クレブス−ヘンゼライト緩衝液を用いる。肺を特定の混合気体（２１％Ｏ２、５．３％ＣＯ２）で通気する。低酸素血管収縮が低酸素供給（１％Ｏ２、５．３％ＣＯ２）を繰り返すことで誘導される。低酸素供給を、各々、１０分間続け、正常な酸素供給の相では各々１５分間繰り返す。阻害剤（試験項目）を正常な酸素供給の終わった５分後に灌流培地に導入する。ＨＰＶの強度に対する効果を定量する。
【０１４７】
ＨＰＶ度は測定され得、肺圧の上昇として示され得る（ＰＡＰ：Weissmannら、Respir Physiol. 1995からの図１６を参照）。肺は一定容量で灌流されるため、ＰＡＰは血液抵抗と正比例の関係にある（Rothら、Am J Respir Crit Care Med 2009、in press；Weissmannら、Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 103: 19093）。
【０１４８】
方法ＩＩ）
この実験においては、３時間以上、肺に低酸素供給（１％Ｏ２）を行い、方法Ｉで見られるような、ＨＰＶ保護についての所定の試験項目の用量の効果を調べる（例えば、Weissmannら、Am J Respir Cell Mol Biol：34：505-13、2006）。.
【０１４９】
実施例１６：肺高血圧（インビボ）（予測）
ＩＭＤ−０２６２５９の低酸素誘導の肺高血圧に対する効果を測定するために、マウスを慢性的な低酸素状態（１０%Ｏ２、normobar）に維持する。それで、肺高血圧を３週間以内に発症する（Mittalら、Circ Res. 2007 101: 258；Circulation. 2008 118: 1183）。
【０１５０】
この実験での肺高血圧を、右心室収縮期圧および血管の形態的変化を測定することにより、心臓肥大を測定することで定量する
【０１５１】
ＩＭＤ−０２６２５９の投与は、３週間の低血圧の間、一日に２回、２種の異なる用量（各々、１および３ｍｇ／ｋｇ）で強制的経口投与を介してなされる。
【０１５２】
これが４種の実験群をもたらす（study branches）:
１）標準的酸素圧対照（３週間の標準酸素圧状態）                   ｎ＝１０
２）低酸素圧対照（ビヒクル処置；３週間の低酸素圧状態、１０%Ｏ２）ｎ＝１０
３）低酸素圧（ＩＭＤ−０２６２５９、１ｍｇ／ｋｇ；３週間の低酸素圧状態、１０%Ｏ２）                                                             ｎ＝１０
４）低酸素圧（ＩＭＤ−０２６２５９、３ｍｇ／ｋｇ；週間の低酸素圧状態、１０%Ｏ２）                                                              ｎ＝１０
【０１５３】
上記した実験は、ＩＭＤ−０２６２５９が肺高血圧を低下または阻害しうるかどうかとの疑問、特にＨＩＦ−１を阻害することで、低酸素誘導の肺高血圧の発症が抑制され得るかの疑問に解答することができる。
【図１Ａ】
2012510964.tif 000026
【図１Ｂ】
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【図２】
2012510964.tif 000028
【図３】
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【図４】
2012510964.tif 000030
【図５】
2012510964.tif 000031
【図６Ａ】
2012510964.tif 000032
【図６Ｂ】
2012510964.tif 000033
【図７】
2012510964.tif 000034
【図８】
2012510964.tif 000035
【図９】
2012510964.tif 000036
【図１０】
2012510964.tif 000037
【図１１】
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【図１２】
2012510964.tif 000039
【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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