(57)【要約】光源１３と、光源１３から離隔された位置に設置される光受光部１４と、光源１３と光受光部１４との間に設置され、反応部１２を有するデバイス１１とを備え、反応部１２が、固相支持体１２１と、固相支持体１２１に固定され検体中の被検物質と特異的に結合する特異結合物質１２２とを有する測定装置において、特異結合物質１２２は、検体と、検体あるいは特異結合物質１２２と反応する反応試薬とが反応部１２に導入されることにより、固相支持体１２１の表面に凹凸１２３を形成し、光源１３から発せられる光が固相支持体１２１の表面を透過するよう、光源１３およびデバイス１１のうち少なくとも一方が走査され、固相支持体１２１の表面を透過した光は、固相支持体１２１の表面の凹凸１２３に対応した信号を含み、光受光部１４は、固相支持体１２１の表面を透過した光に含まれる信号を検出する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源と、
前記光源から離隔された位置に設置される光受光部と、
前記光源と前記光受光部との間に設置され、反応部を有するデバイスとを備え、
前記反応部が、固相支持体と、前記固相支持体に固定され検体中の被検物質と特異的に結合する特異結合物質とを有する測定装置において、
前記特異結合物質は、前記検体と、前記検体あるいは前記特異結合物質と反応する反応試薬とが前記反応部に導入されることにより、前記固相支持体の表面に凹凸を形成し、
前記光源から発せられる光が前記固相支持体の表面を透過するよう、前記光源および前記デバイスのうち少なくとも一方が走査され、
前記固相支持体の表面を透過した光は、前記固相支持体の表面の凹凸に対応した信号を含み、
前記光受光部は、前記固相支持体の表面を透過した光に含まれる前記信号を検出することを特徴とする測定装置。
【請求項２】
前記固相支持体の表面に凹凸を形成する物質は、光透過性を有することを特徴とする請求項１記載の測定装置。
【請求項３】
前記光受光部は、２分割光受光部によって構成されており、前記２分割光受光部は、前記固相支持体の表面に凹凸を形成する物質の凹凸に応じた透過光強度を検出することを特徴とする請求項１記載の測定装置。
【請求項４】
前記固相支持体の表面に形成された凹凸は、前記光源または前記デバイスによって一定間隔の位置ごとに走査されることを特徴とする請求項１記載の測定装置。
【請求項５】
前記デバイスは、回転体盤によって構成されており、前記回転体盤が回転運動を行っているときに凹凸が検出されることを特徴とする請求項１記載の測定装置。
【請求項６】
前記デバイスは、反応試薬導入後、非特異的吸着物質が洗浄されるよう、前記回転運動の速度および回転時間が制御されることを特徴とする請求項５記載の測定装置。
【請求項７】
前記デバイスは、反応試薬を乾燥担持するための試薬担持部をさらに有し、前記反応部と前記試薬担持部は相互に流路で連結されていることを特徴とする請求項１記載の測定装置。
【請求項８】
前記反応試薬は、前記固相支持体の表面に凹凸を形成する形状物質に、前記被検物質もしくは前記被検物質と類似の構造領域をもつ物質を標識したものであることを特徴とする請求項７記載の測定装置。
【請求項９】
前記反応試薬は、前記固相支持体の表面に凹凸を形成する形状物質に、前記被検物質に対する特異結合物質を標識したものであることを特徴とする請求項７記載の測定装置。
【請求項１０】
形状物質に標識された被検物質もしくは前記被検物質と類似の構造を有する物質を、検体中の前記被検物質と固相支持体に固定された特異結合物質に競合的に作用させ、前記固相支持体の表面に凹凸を形成することを特徴とする請求項８記載の測定装置。
【請求項１１】
形状物質に標識された被検物質に対する他の特異結合物質を、検体中の被検物質を介して前記固相支持体に固定された特異的結合物質と結合させることにより、前記固相支持体の表面に凹凸を形成することを特徴とする請求項９記載の測定装置。
【請求項１２】
前記固相支持体の表面に形成された凹凸に応じた特異信号を表わす画像を表示する表示手段をさらに備えることを特徴とする請求項１記載の測定装置。
【請求項１３】
検体中に含まれる被検物質量を測定する方法であって、被検物質と特異的に結合する特異結合物質が固定化された固相支持体上に対して、前記被検物質もしくは前記特異結合物質に反応する反応試薬および前記検体を作用させることで、前記固相支持体上の表面に凹凸を形成し、前記凹凸を光の強度の変化として検出することにより、前記凹凸に由来する特異信号を検出することを特徴とする測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、主として臨床検査分野に属する測定装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  近年、分析・解析・検査技術の進歩により、様々な物質を測定することが可能となってきている。特に、臨床検査分野においては、生化学反応、酵素反応、もしくは、免疫反応等の特異反応に基づく測定原理の開発により、病態に反映する体液中の物質を測定できるようになった。【０００３】  その中で、ポイント・オブ・ケアテスティング（以下、単にＰＯＣＴという）と呼ばれる臨床検査分野が注目されている。ＰＯＣＴは、簡易迅速測定を第一の目的とし、検体を採取してから検査結果が出るまでの時間の短縮を目指した取組が行われている。従って、ＰＯＣＴには、簡易な測定原理、および小型で携帯性があり操作性が良い測定装置が要求される。【０００４】  近年の技術の進歩により、例えば、血糖センサに代表されるように簡単に測定できる小型の測定機器が開発されてきている。ＰＯＣＴの波及効果は、迅速な測定結果の取得による迅速正確な診断を可能とすることに加え、検査にかかるコストの低減、血液等の検体の少量化に伴う被検者の負担の軽減及び感染性廃棄物の少量化等が考えられる。現在、臨床検査はＰＯＣＴへの移行が急速に起こっており、そのニーズに応える形で、ＰＯＣＴ対応測定機器の開発が行なわれてきている。【０００５】  ＰＯＣＴ対応測定機器は、上記に述べた血糖センサに代表される酵素電極反応を利用した酵素センサの他に、妊娠診断薬に代表される免疫抗原抗体反応を利用した定性免疫センサがある。さらには、最近ではキャピラリー電気泳動法に代表されるマイクロ・トータル・アナライシス・システム（μ−Ｔｏｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ、以下、単にμ−ＴＡＳという）の開発が行われている。いずれも、簡易測定原理の構築、それに伴う生体成分の固相化技術、センサデバイス化技術、センサシステム化技術、微細加工技術、及びマイクロ流体制御技術の進歩によるものである。【０００６】  しかしながら、μ−ＴＡＳにおいては、そのシステムが備える測定用のデバイスを小型化すると、そのデバイスに使用される試薬の量や検出部の領域等も微量・微細となり、結果として、従来からある吸光分光計や蛍光分光計等の分光計で測定する場合と比較して、検出感度が低下するという問題が出てくる。【０００７】  代表的なμ−ＴＡＳとして知られるキャピラリー電気泳動を用いたデバイスでは、その検出部の光路長の大きさは、マイクロチップ電気泳動の場合、特に光をチップの表面に対する垂直方向から入射させた場合、光路長は１０μｍ程度であり、汎用キャピラリー電気泳動を用いたデバイスの検出部の光路長と比べてもその１／５となる。汎用キャピラリー電気泳動の検出部にしても光路長は５０μｍ程度である。以上のことを踏まえて、検出感度向上は、一つの重要課題となっている。【０００８】  これまでに、上記の検出感度の低下に対する補償策として、光の反射を利用して光路長を伸長する（例えば、特許文献１、２参照）、前処理的に被測定対象物を濃縮する（例えば、特許文献３参照）、あるいは、化学発光方式で検出する（例えば、特許文献４参照）等の対応が取られてきた。
【特許文献１】特開平９−３０４３３８号公報
【特許文献２】特開平９−２１８１４９号公報
【特許文献３】特開平９−２１０９６０号公報
【特許文献４】特開２０００−３３８０８５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】  しかしながら、特許文献１および２が示すような光路長伸長においては、同時再現性が得られにくいという問題があった。即ち、光路長伸長を行う以前でも、検出部の厚みのバラツキは検出のバラツキに大きく反映されてくる。そこに、光路長伸長を行うために、光が反射角を有するよう検出部に反射板を設けると、反射板の角度や反射板同士の距離等のバラツキが加わる。さらに、光の入射角等のバラツキにより、同時再現性のバラツキは倍増されるという課題があった。【００１０】  また、特許文献３が示すように、前処理として被測定対象物を濃縮する方法は、検出部に加えられる電圧を制御するような付加操作が要求される。例えば、イムノクロマト法に代表されるように、ニトロセルロースメンブレン上に固定化抗体ラインを設け、それに対して、検体液を流動させ、随時、固定化抗体と反応させることで、固定化抗体ラインで簡易的に一種の濃縮効果が得られる。しかしながら、測定の精度を高めるためには、検体液の流速のバラツキを抑える必要があり、また、光学的に高いシグナルの方では、感度が頭打ちになってしまうという第２の課題があった。【００１１】  特許文献４が示すように、化学・生物・酵素発光系の検出系を使用する測定装置においては、検出部がフォトン１つの検出を可能とするため、高感度の検出が期待できるが、光学系に発光系用の光電子倍増管が必要となり、装置が比較的高価になる。さらに、発光させるために特別の反応試薬が必要となり、検出までに多段階の反応ステップが要求され、操作性に優れているとは言えない。マイクロチップ電気泳動に見られるように、検出部に加えられる電圧を制御することで、多段階の反応ステップを制御することも可能だが、それをコントロールする制御系も複雑であるという第３の課題があった。【００１２】  従って、μ−ＴＡＳの検出系において、光路長に依存せず、濃縮等の前処理も必要とせずに、高感度に、広範囲に検出できる測定装置および測定方法を構築する必要がある。【００１３】  本発明は、前記従来の課題を解決するもので、簡易かつ高精度の測定装置および測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】  本発明の測定装置は、光源と、前記光源から離隔された位置に設置される光受光部と、前記光源と前記光受光部との間に設置され、反応部を有するデバイスとを備え、前記反応部が、固相支持体と、前記固相支持体に固定され検体中の被検物質と特異的に結合する特異結合物質とを有する測定装置において、前記特異結合物質は、前記検体と、前記検体あるいは前記特異結合物質と反応する反応試薬とが前記反応部に導入されることにより、前記固相支持体の表面に凹凸を形成し、前記光源から発せられる光が前記固相支持体の表面を透過するよう、前記光源および前記デバイスのうち少なくとも一方が走査され、前記固相支持体の表面を透過した光は、前記固相支持体の表面の凹凸に対応した信号を含み、前記光受光部は、前記固相支持体の表面を透過した光に含まれる前記信号を検出する構成を有している。【００１５】  また、本発明の測定装置は、前記固相支持体の表面に凹凸を形成する物質は、光透過性を有する構成を有している。【００１６】  また、本発明の測定装置は、前記光受光部は、２分割光受光部によって構成されており、前記２分割光受光部は、前記固相支持体の表面に凹凸を形成する物質の凹凸に応じた透過光強度を検出する構成を有している。【００１７】  また、本発明の測定装置は、前記固相支持体の表面に形成された凹凸は、前記光源または前記デバイスによって一定間隔の位置ごとに走査される構成を有している。【００１８】  また、本発明の測定装置は、前記デバイスは、回転体盤によって構成されており、前記回転体盤が回転運動を行っているときに凹凸が検出される構成を有している。【００１９】  また、本発明の測定装置は、前記デバイスは、反応試薬導入後、非特異的吸着物質が洗浄されるよう、前記回転運動の速度および回転時間が制御される構成を有している。【００２０】  また、本発明の測定装置は、前記デバイスは、反応試薬を乾燥担持するための試薬担持部をさらに有し、前記反応部と前記試薬担持部は相互に流路で連結されている構成を有している。【００２１】  また、本発明の測定装置は、前記反応試薬は、前記固相支持体の表面に凹凸を形成する形状物質に、前記被検物質もしくは前記被検物質と類似の構造領域をもつ物質を標識したものである構成を有している。【００２２】  また、本発明の測定装置は、前記反応試薬は、前記固相支持体の表面に凹凸を形成する形状物質に、前記被検物質に対する特異結合物質を標識したものである構成を有している。【００２３】  また、本発明の測定装置は、形状物質に標識された被検物質もしくは前記被検物質と類似の構造を有する物質を、検体中の前記被検物質と固相支持体に固定された特異結合物質に競合的に作用させ、前記固相支持体の表面に凹凸を形成する構成を有している。【００２４】  また、本発明の測定装置は、形状物質に標識された被検物質に対する他の特異結合物質を、検体中の被検物質を介して前記固相支持体に固定された特異的結合物質と結合させることにより、前記固相支持体の表面に凹凸を形成する構成を有している。【００２５】  また、本発明の測定装置は、前記固相支持体の表面に形成された凹凸に応じた特異信号を表わす画像を表示する表示手段をさらに備える構成を有している。【００２６】  さらに、本発明の測定方法は、検体中に含まれる被検物質量を測定する方法であって、被検物質と特異的に結合する特異結合物質が固定化された固相支持体上に対して、前記被検物質もしくは前記特異結合物質に反応する反応試薬および前記検体を作用させることで、前記固相支持体上の表面に凹凸を形成し、前記凹凸を光の強度の変化として検出することにより、前記凹凸に由来する特異信号を検出することを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００２７】  本発明は、表面形状由来の特異信号の数に基いて固相支持体表面の凹凸数を測定することを特徴とし、表面形状の変化のみを捉えているので、光学測定において重要な要素となる光路長に依存せず、測定用のデバイスを小型化しても、十分な測定感度が得られる測定装置を提供することができるものである。さらに、濃縮等の前処理工程を必要とせず、測定装置として簡易なものを構築できる。使用される試薬も、高感度のために測定環境に厳密な条件を有し注意を必要とする試薬を使用せずに、簡易な形状物質標識試薬を使用することによって、高感度な測定結果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１（ａ）は本発明の一実施の形態における測定装置の一部を示す構成図であり、図１（ｂ）は反応部の拡大図である。
【図２】図２は本発明の一実施の形態におけるデバイスを模式的に示す図である。
【図３】図３は図２で示すデバイスの作製工程を模式的に示す図である。
【図４】図４は図３で示すデバイスの表面に凹凸を形成させた図である。
【図５】図５は図４で形成した凹凸数を測定するためのシステムを模式的に示す図である。
【図６】図６は実際に粒子の希釈比に対して凹凸数をＳ字カーブ数としてプロットした図である。
【図７】図７はイムノアッセイを行うための抗体が固定化されたデバイスの作製工程を模式的に示す図である。
【図８】図８は図７でイムノアッセイすることで形成させた凹凸数を測定するためのシステムを模式的に示す図である。
【図９】図９は図８に示すシステムにおいてＨＳＡ濃度とＳ字カーブ数との関係を示す図である。
【図１０】図１０（ａ）は抗原抗体反応がある場合において、遠心条件に対する洗浄状態を調べた顕微鏡の像を示す図であり、図１０（ｂ）は抗原抗体反応がない場合において、遠心条件に対する洗浄状態を調べた顕微鏡の像を示す図である。
【図１１】図１１はラテックス試薬フリーを実現することができる測定用のデバイスを模式的に示す図である。
【符号の説明】
【００２９】  １１、３９、７１、１１０  デバイス
１２  反応部
１２１  固相支持体
１２２  特異結合物質
１２３  凹凸
１３、５１  光源
１４  光受光部
１５  制御部
２１  回転体盤
２２  検出チャンバー
２３、１１４、１１６  空気孔
２４、１１５  注入口
３１、３５  剥離紙
３２、３４  粘着層
３３  芯
３６  粘着性シート層（両面粘着性シート）
３７  トップカバー
３８  ベース基盤
４１  ラテックス粒子
５２  ２分割光受光部
５３  オシロスコープ
７２  抗体
８１  ラッテクス標識抗原
１１１  チャンバー（乾燥担持用）
１１２  チャンバー（検出用）
１１３  流路
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】  以下、本発明を実施するための最良の形態について、図面を用いて説明する。【００３１】  本発明の測定装置において、重要な要素として３つの要素がある。【００３２】  １）均一な凹凸のない固相支持体の表面に凹凸を形成させることである。２）凹凸形状のパターンを、固相支持体の表面上に固定化される特異結合物質と、反応試薬・被検物質の相互作用によって生成させることである。３）生体材料が、形状物質に標識されたものを反応試薬としていることである。【００３３】  １）について説明する。固相支持体の表面に凹凸を形成させ、その形状の範囲に光を照射すると、凹凸に応じた光の屈折率・反射率の変化により、光の強度が変化するので、その強度変化を形状特異的な信号として生成させることができる。その形状特異的な信号を光受光部により抽出し、計数することで、表面形状の凹凸数を数値化する。凹凸数の形成パターンとしては、均一な表面から凸へ形成する場合、均一な表面から凹へ形成する場合、もしくは、凸から凹へ、または、その逆で凹から凸へ形成する場合がある。【００３４】  ２）について説明する。凹凸形状のパターンを固相支持体の表面上に固定化される特異結合物質と、反応試薬・被検物質の相互作用によって生成させる。特異結合物質とは、例えば、抗原、抗体、核酸、レセプター等の生体材料である。【００３５】  本発明でいう表面形状に凹凸を形成させる方法とは、形状物質に標識された被検物質もしくは被検物質と同等の構造領域を含む物質を、検体中の被検物質と固相支持体上の特異結合物質に競合的に作用させることにより、固相支持体の表面に形状変化を生じさせることである。この場合は、表面形状は均一状態から凸へ変化し、検体中の被検物質の量が多くなるに従い、凸数は減ってくる。また、凹から均一表面状態への変化で、検体中の被検物質の量が多くなるに従い、凹が増えるようにしてもよい。もしくは、形状物質に標識された被検物質に対する別の特異結合物質と検体中の被検物質を、固相支持体上の特異結合物質に作用させることにより生じる形状変化も考えられる。この場合も、上記競合的に作用させる場合と同様に均一状態から凸への変化で、異なるのは検体中の被検物質の量が多くなってくるに従い、凸数も増えてくる。さらに、凹から均一表面状態への変化も考えられて、検体中の被検物質の量が多くなってくるに従い、凹が減ってくる。【００３６】  ３）について説明する。生体材料が、形状物質に標識されたものを反応試薬としている点である。前記形状物質とは、球状・楕円状・多角体状、あるいは、それらが集合体を形成するもの等が考えられる。本発明において、形状物質とは、測定システムの光のスポット径と凹凸物質の大きさを比較したときに、スポット径以上の大きさの凹凸形状を有する物質のことである。形状としては、球状であると、シンプルな信号が得られやすいので好ましい。【００３７】  以下、本発明の一実施の形態の測定装置について、図１および図２を用いて説明する。【００３８】  図１（ａ）は本実施の形態における測定装置の一部を示す構成図であり、図１（ｂ）は光が照射されていない状態における反応部１２周辺の拡大図である。本実施の形態の測定装置は、光源１３と、光源１３から離隔された位置に設置される光受光部１４と、光源１３と光受光部１４との間に設置され、反応部１２を有するデバイス１１とを備えている。反応部１２は、固相支持体１２１と、固相支持体１２１に固定され検体中の被検物質と特異的に結合する特異結合物質１２２とを有している。特異結合物質１２２は、検体と、検体あるいは特異結合物質１２２と反応する反応試薬とが反応部１２に導入されることにより、固相支持体１２１の表面に凹凸１２３を形成し、光源１３から発せられる光が固相支持体１２１の表面を透過するよう、光源１３およびデバイス１１のうち少なくとも一方が走査され、固相支持体１２１の表面を透過した光は、固相支持体１２１の表面の凹凸１２３に対応した信号を含み、光受光部１４は、固相支持体１２１の表面を透過した光に含まれる前記信号を検出するようになっている。【００３９】  なお、図１では、デバイス１１を駆動する駆動部および結果を表示する表示部等は省略されている。【００４０】  光源１３は、一般的に分光光度計等の光源に使用されるキセノンランプ・タングステンランプよりも、集光された光、例えばレーザー光（ＬＥＤ等）を光源とすることが好ましい。集光を用いると非常に微小な領域の形状変化を見ることが出来る。即ち、分子レベルで形成される凹凸１２３の変化を信号の変化として捉えることができる。ここで、重要なのは、集光位置が測定デバイス１１の固相支持体１２１付近に設定させることで、凹凸数を信号として読取る前には、目的の位置へフォーカス作用が必要となる。また、本発明の測定装置は、光受光部１４から得られる信号を演算処理するための制御部１５をさらに備えている。【００４１】  次に検出対象物について説明する。検出対象物は図１に示す固相支持体１２１上に検体中の被検物質と特異的に結合する特異結合物質（図示せず）が固定化されて凹凸１２３を形成した形状物質である。【００４２】  形状物質とは、上記集光に形状物質を作用させたときに前記形状物質から発せられる光の物理量を変化させることができるものである。測定装置の中にある光受光部１４は、形状物質によって変化された光の物理量、主として強度の変化を検出するようになっている。表面に凹凸１２３が形成されていない場合、光源１３からの光は、その強度に近い値で光受光部１４に到達する。表面に凹凸１２３が形成されると、光受光部１４は、形状物質の性質により光の強度が、屈折率・反射率・透過率等の要因により変化することを読みとるようになっている。従って、形状物質の性質として光に対して透過性のあるもの、もしくは非透過性のものが考えられ、いずれの形状物質も、本発明への適用が可能である。しかしながら、光受光部１４を光源１３と相対する方向に設置する場合においては、光に対して透過性のある形状物質を用いると、光受光部１４が透過光を充分に受光でき、形状物質に光が照射されたときの屈折率の影響が受けやすく、より詳細な光信号が得られるため好ましい。【００４３】  光受光部１４は、２分割されたものが好ましい。こうすることで、特に球状の形状物質の場合、形状物質に特異的な信号であるシンプルなＳ字カーブを得ることができる。Ｓ字カーブの生成は、２分割光受光部から得られ��２つの信号値の差信号をとることによって実現できる。Ｓ字カーブの検出方法については実施例において説明する。【００４４】  つまり、本発明に係る測定装置は、測定用のデバイス１１を走査させることで、光源１３から出る光を凹凸形状に作用させ、光の強度の変化を光受光部１４で検出させ、形状に特異的な信号を生成・抽出させ、信号の数を計数することで検体中の被検物質量を測定することを特徴とするものである。【００４５】  ここで、光源１３から出る光と凹凸１２３とを作用させる方法としては、光源１３を固定して固相支持体１２１を往復させる方法、光と固相支持体１２１を２次元的に移動させる方法、もしくは、固相支持体１２１を固定して光を往復させる方法が考えられる。本発明においては、測定用のデバイス１１を回転体盤ベースにより構成し、回転運動の中で行う方法が好ましい。これは、光源１３もしくは測定用のデバイス１１を２次元方向に走査させる機構よりも、回転運動の中で光源１３を半径方向に走査させる方が機構的に簡易となるからである。例えば、コンパクトディスク（ＣＤ）等にみられるような機構がよい。【００４６】  また、本実施の形態の測定装置のように、回転体盤ベースを用いて走査を行う場合、本発明のポイントとなる凹凸形状を、固相支持体１２１の表面に１ステップで形成することができる。即ち、回転運動の速度を制御することで遠心力の強さを調節し、形状変化に作用されない反応物質を分離し、さらに、特異的な凹凸形成とは関係なく非特異的吸着されるものを洗浄させることができる。ここで、回転運動速度は、その速度と形状変化を行わせる領域の半径位置から割り出される遠心力の強さと固相支持体１２１に固定化される特異結合定数によって設定される。【００４７】  回転運動速度は、さらには、反応試薬である形状物質に標識される生体材料の標識数によって設定される。あるいは、形状物質の重量・大きさの条件を加味してもよい。要は、十分に形状生成を伴わない未反応物質を分離させ、特異結合に関与しない非特異的に吸着されているような物質を遠心力によって洗浄させることができる条件を検討することが重要である。この作業は、測定用のデバイス及び測定システム全体に与えられるノイズ成分が小さくなるよう、十分に考慮しなければならない。【００４８】  デバイス１１は、凹凸１２３を形成させる領域とは別に、反応試薬を乾燥担持された空間を含む領域を有してもよい。この場合、凹凸１２３を形成させる領域と反応試薬を乾燥担持された空間を含む領域とは、相互に流路で連結させている。【００４９】  このようなデバイス１１を用いると、測定装置の利用者は、検体をデバイス１１に導入する操作のみで、被検物質量を測定することができる。即ち、デバイス１１に導入された検体は、回転運動によって生じる遠心力により移送させられて、反応試薬が乾燥担持される空間に導入させられ、反応試薬と混合される。再び、遠心力により移送させて、凹凸形状を形成させる反応部１２へ移送し、凹凸１２３を形成させるのに十分な時間放置した後に、さらに、遠心力で未反応試薬を除去することで、被検物質量依存性の凹凸形状数を得られる。要するに回転運動の速度・時間を制御することで、簡易に測定結果を��ることができる。ここでは、回転運動を流体移送の駆動力としているが、これに限定されるものではなく、例えば、毛細管力や電気泳動力等を用いてもよい。【００５０】  本発明の測定用のデバイス１１に乾燥担持される反応試薬とは、表面に凹凸１２３を形成させる形状物質に被検物質もしくは前記被検物質と類似の構造領域をもつ物質を標識させたもの、もしくは表面に凹凸１２３を形成させる形状物質に被検物質に対する特異結合物質を標識させたものがある。【００５１】  表面上に固定化される特異結合物質１２２への反応試薬・被検物質の作用の形態は、前記特異結合物質１２２に対して競合的に作用させる場合、もしくは、前記特異結合物質１２２と反応試薬を、被検物質を介してサンドイッチ型に作用させる場合がある。いずれにおいても、表面に対して凹凸１２３を形成させるための手段である。【００５２】  上記２つの作用形態においては、反応試薬の種類が異なり、前者の競合的に作用させる場合の反応試薬は、凹凸１２３を形成させる形状物質に標識される物質が被検物質もしくは前記被検物質と類似の構造領域を含む物質である。【００５３】  例えば、固定化される特異結合物質１２２が抗原の場合は形状物質に標識される物質は抗体、抗体の場合は抗原、核酸の場合はそれと対になる塩基配列をもつ核酸である。また、後者のサンドイッチ型に作用させる場合は、凹凸を形成させる形状物質に標識される物質が被検物質に対して特異的に結合する他の特異結合物質である。【００５４】  例えば、固定化される特異結合物質１２２が抗体の場合は他の抗原決定基を認識する抗体、被検物質が多量体である場合は固定化される抗体と同種であってもよい。いずれの形態においても、生体材料特有の特異性をもつ物質が選ばれ、上記にあげる抗原と抗体もしくは核酸塩基対の関係のほかに、ホルモンとレセプターや糖鎖同士の関係等が考えられる。【００５５】  特異的な結合の結果としては、結合複合体が得られる形態が好ましい。酵素と基質が用いられた場合は、表面形状において凹凸の形成は望めず、基質の性質変化を伴う場合が多く、光学性質・電気化学的性質を捉えるもので本発明では不向きである。ただし、酵素と基質の反応の中で、基質の構造変化がおこる場合、構造変化した基質のみに反応する抗体を使用することができれば、本発明の測定装置に適用することができる。【００５６】  本発明においては、固相支持体１２１の表面形状を均一な表面から凸状へ変化させることが、最も好ましい。表面形状が均一な表面である方が、表面形状が均一でない場合に比べて、固相支持体１２１の表面上に特異結合物質１２２を均一に固定化しやすいので、精度良く作製できる。また、均一な表面から凸状に変化をさせると、表面形状の変化を捉えやすい。ここで、固相支持体１２１は、生体材料が物理的に吸着、もしくは化学的に結合されるような材質によって形成されることが好ましい。例えば、生体材料を物理的に吸着させる場合には、ポリスチレン、スチレンアクリルレート、スチレン−ブタジエン、ジビニルベンゼン、ポリビニルベンゼンのような材質が好ましい。特に、ポリスチレンは、従来からの生体材料の吸着性の実績（酵素免疫測定法に用いられるマイクロタイタープレート）を有するため好ましい。【００５７】  また、本発明は、様々な種類の形状物質を使用することで多項目測定を行うことも可能である。即ち、様々な種類の形状物質、例えば、大きさが異なる、もしくは、形が異なる形状物質を使用することで、異なる形状変化を誘導させることができる。前記異なる形状物質のそれぞれに、別の被検物質に対する特異結合物質を標識させることで、同時に、検体中の被検物質を複数の項目を測定できることが可能となる。【００５８】  また、本発明は得られた信号を基にして、画像として出力することも可能である。この場合、上記に示す複数の被検物質を測定する場合は、大きさの異なる形状を視覚的に認識でき、複数の被検物質を同定することができる。【００５９】  また、本発明でいう検体とは、血液、血漿、尿、唾液、汗等、現在の臨床検査分野で対象となる生体由来のものであり、本発明でいう被検物質とは、前記検体中に含まれるホルモン、蛋白質等である。この場合、固相支持体に固定化される特異結合物質は、前記ホルモンや蛋白質に対する抗体、もしくは、ホルモンに対して特異的に結合するレセプターが好ましい。また、反応試薬である形状物質に標識させる物質においては、抗原を使用する場合は、ホルモンや蛋白質そのものであるか、もしくは、ホルモンや蛋白質の構造の中でエピトープに相当するものを用い、抗体を使用する場合は、固定化される抗体と同じ抗体、もしくは、異なるエピトープを認識する抗体を用いる。【００６０】  本発明の測定装置は、上記臨床検査分野以外にも適用可能で、例えば、遺伝子検査分野、環境検査分野等にも利用可能である。遺伝子検査分野の場合、検体は、臨床検査で使用されるものに加えて、細胞内から抽出された液であってもよい。凹凸の形状の形成に必要である固相支持体に固定化される生体物質及び形状物質に標識される生体物質はＤＮＡになる。一方、環境検査分野においては、水道水、河川水もしくは海水等が検体として用いられるが、使用される生体物質は、臨床検査分野で用いられる試薬である場合が多く、抗原抗体反応原理に基づくものである。【００６１】  以上のように、本発明に係る測定装置は、光のスポット径以上の大きさを有する形状物質を反応試薬に用いるので、反応試薬に遠心力を加えることにより未反応の試薬を容易に洗浄できるという利点を有している。つまり、従来の反応試薬を用いた測定装置においては、反応試薬の分子サイズが小さく、回転運動による未反応試薬の除去が不可能であったため、水による洗浄を必要としたが、本発明に係る測定装置においては、未反応の試薬の水による洗浄を必要としないため、小型で携帯性があり操作性が良い測定装置を実現できる。
【実施例】
【００６２】  以下に、本発明の測定装置の実施例を、ヒト血清アルブミンの測定でもって詳細に説明する。ただし、ここで挙げる例は、本発明の全てを示すものではないことを追記しておく。【００６３】  （実施例１）
本発明の具体的な実施例を説明するための基本的なデバイスについて、図２を用いて詳細に説明する。図２は、回転体盤２１上に検出チャンバー２２を設けたデバイスを示すものである。検出チャンバー２２には、形状物質標識試薬と検体とが混合されて注入されている。なお、検出チャンバー２２に接するように空気孔２３、注入口２４がある。【００６４】  図３（ａ）〜（ｃ）は、図２に示されたデバイスの作製方法および完成状態を示す断面図である。本実施例で示すデバイスは３層構造としている。【００６５】  検出チャンバー２２は、図３（ａ）に示すように、カッテイングプロッター（ＧＲＡＰＨＴＥＣ製、ＣＥ３０００−４０）を用いて両面粘着性シート（芯５０μｍ、接着剤層、両面それぞれ２５μｍ、ＦＬＥＸＣＯＮ社製）の下面の接着剤層の剥離紙３５以外の層に切り込みを入れ、チャンバーが形成される部分を剥ぎ取るようにして作製した。【００６６】  一方、図３（ｂ）に示すベース基盤３８はポリスチレン（ＰＳ）をコーティングした。即ち、ポリカーボネート製の円盤状基盤に対して、ポリスチレン（シグマアルドリッチ製）の２−アセトキシ−１−メトキシプロパンの７０ｗ／ｖ％溶液をスピンコートした。スピンコートしたベース基盤３８（ＰＳコートしたベース基盤）は、一晩、真空状態で十分に乾燥させた。【００６７】  また、トップカバー３７には、注入口２４と空気孔２３を開けておく。こうして調整した３つの層を、両面粘着性シート３６を介して貼り合せて検討用のデバイス３９を作製した。なお、図３（ｃ）においては、空気孔２３は略されている。【００６８】  （実施例２）
図３の測定用のデバイス３９を用いて、表面上の凹凸から特異的な信号を生成・抽出する方法を、形状物質として球状で光透過性のラテックス粒子４１（バングス・ラボラトリー製）２．０６、４．８４、７．３３μｍを用いて詳細に説明する。【００６９】  測定用のデバイス３９に上記３種類の大きさの粒子を固定したものを準備する。これは、デバイス３９のベース基盤３８がＰＳコートされており、一方でラテックス粒子４１もＰＳ製のものであるので、注入口２４からラテックス粒子４１懸濁液を注入して６分間放置することで、非特異的な吸着で表面上に凹凸を得た。この様子を図４に示す。【００７０】  次に、図５に示す測定装置を用いて検出方法を説明する。光源５１と２分割光受光部５２との間にデバイス３９が設置されている。２分割光受光部５２からの信号は処理を経て、オシロスコープ５３に表示される。ここで、オシロスコープ５３は、表示手段を構成する。なお、駆動部は省略した。【００７１】  この凹凸を形成したデバイス３９の下側から集束させた光５１を照射し、デバイス３９を回転運動によって走査させ、照射された光を上側に設けられた２分割光受光部５２によって受光することで、Ｓ次信号波形を生成し抽出した。信号の確認は、オシロスコープ５３で行った。【００７２】  ここで、３種類の大きさのラテックス粒子懸濁液は、それぞれ希釈系列を作製し、粒子個数に対するＳ字カーブ数をプロットしたものを、図６に示す。縦軸のＳ字カーブはオシロスコープ５３で表示されたＳ字カーブを計測することにより得た。横軸はラテックス粒子１０％ソリット液に対する希釈である。以上より、表面凹凸数は、右肩上がりの結果が得られ、粒子数依存性を示すことがわかった。【００７３】  （実施例３）
次に、ラテックス標識抗原を用いたイムノアッセイを例に本発明の測定方法について説明する。本実施例は、基本イムノアッセイ原理を競合アッセイとし、リン酸（ＰＢＳ）緩衝液中のヒト血清アルブミン（Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎｅ、略してＨＳＡ）の測定を行う。【００７４】  まず、デバイス７１の作製について図７（ａ）〜（ｄ）を用いて説明する。図７（ａ）〜（ｂ）に示すように、デバイス７１の基本的な作製方法は、実施例１で示した作製方法と同じではあるが、検出チャンバー内で抗原抗体反応が行われるよう、トップカバー３７を貼り合せる前にベース基盤３８に抗体７２を固定化する必要がある。そこで、図７（ｃ）に示すように、ベース基盤３８のチャンバー内に、ウサギ由来抗ヒト血清アルブミンポリクローナル抗体（抗ＨＳＡポリ抗体）・リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）１．０ｍｇ／ｍｌを１０μｌ点着して、３ｈ放置することで、ベース基盤３８に抗ＨＳＡポリ抗体７２の固定化を行った。その後、ベース基盤３８を超純水で洗浄し、ブロッキングをスタビリガードで３ｈ行って、再度、洗浄を行い、チャンバー内のエッジ等に残る水を真空ポンプで完全に吸い取った。【００７５】  こうして、抗体７２が固定化されたベース基盤３８をトップカバー３７に貼り付けて、図７（ｄ）示すように本実施例のデバイス７１とした。【００７６】  次にラテックス標識試薬の調整方法を詳細に説明する。【００７７】  ラテックスは本発明でいう形状物質に相当するものである。ラテックスは、本実施例では７．３３μｍの粒子を使用した（バングス・ラボラトリー製）。【００７８】  まず、前記ラテックス粒子を洗浄する必要がある。そこで、遠心分離で上清を除去した後にＰＢＳで懸濁させ、洗浄を行った。この操作は、５回繰り返した。洗浄後、ラテックスのＰＢＳ懸濁液４００ｕｌに対してヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）ＰＢＳ溶液３ｍｇ／ｍｌを１００μｌ加えて、３ｈボールミルで攪拌放置した。その後、遠心分離で未結合のＨＳＡを除去して、さらに、スタビリガードで３ｈ攪拌放置し、ブロッキングを行い、その後、同様に遠心分離で洗浄した。【００７９】  次に、本実施例で作製した測定用のデバイスとラテックス標識試薬を用いて、実際にＨＳＡ溶液の測定を行った。ＨＳＡ濃度は０、１、１０、３０、５０、１２０ｍｇ／ｄｌの濃度９０μｌに対して、先程調整したラテックス試薬１０μｌを混合し、デバイス７１に導入し、３５（×Ｇ）の条件で１５分間回転させたあと、図８のような構成を作製させて、実施例２で示す方法でＳ次カーブ数を測定した。【００８０】  測定結果を図９に示す。ＨＳＡの濃度依存的に右肩下がりの結果を得た。検出されたＳ字カーブ数が約５００から１００００となり、２０倍のレンジを有していることから、十分測定できるレベルである。【００８１】  従来の測定装置においてデバイスを小型化すると、光路長が小さくなり、光の出力では２０倍のレンジは得られない。また、この場合、前方散乱の影響で、さらに感度は小さくなる。しかしながら、本発明の測定装置においては、本実施例に示したように、光路長の影響を受けることなく、通常の分光計と同等の測定レンジを得ることができ、測定精度が向上する。【００８２】  本実��例では説明していないが、サンドイッチ免疫アッセイにおいても同様に濃度依存的な結果が得られた。【００８３】  （実施例４）
さらに、デバイスの回転速度を実施例３に示した値から変えることにより、抗原抗体反応において、未反応物質の除去を、短時間で完璧に完了させることができる。【００８４】  図１０は、非特異的吸着物質を導入したデバイスにおいて、未反応物質に加えられる遠心力（×Ｇ）が３４、１３５、４７３、８４１×Ｇとなるよう、デバイスをそれぞれ５分間回転させたときの洗浄状態を示す。図１０（ａ）は抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体（Ｅｘｏｃｅｌｌ社製）とラテックス標識糖化ペプチド結合ＨＳＡの反応を陽性コントロールした場合（免疫反応がおこる場合）、図１０（ｂ）はラテックス標識ＨＳＡとの反応を陰性コントロールした場合（免疫反応がおこらない場合）において、それぞれデバイスを回転させた後、チャンバー内を撮影した顕微鏡の像（２００倍）である。なお、図１０（ａ）、（ｂ）において、左側の図はそれぞれデバイスを回転させる前の像であり、右側の図はそれぞれデバイスを５分間回転させた後の像である。【００８５】  この際、実施例３で説明したデバイスを使用し、固定化抗体には抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体を用いた。【００８６】  この結果から、未反応物質は、４７３×Ｇ以上の遠心力が加えられることにより、完全に洗浄されることが分かる。本実施例では、このような結果が得られたが、固定化される抗体の結合定数、ラテックス標識試薬の１個のラテックス粒子（本実施例では粒径；７．２μｍを使用）ごとに標識される量によって、洗浄に必要な遠心力の値は変わると予想される。【００８７】  以上より、デバイスの回転速度を制御することで未反応物質に加わる遠心力を調節することにより、完全にノイズ成分を除去することができ、測定精度の高精度化が期待できる。しかも、デバイスの回転速度および回転時間の制御のみの１ステップで実現できることから、簡易な測定装置が提供できる。【００８８】  ここで、糖化ペプチド結合ＨＳＡの作製方法について説明しておく。２００ｍｇ（２．９８×１０３ｍｏｌ）ＨＳＡを１０ｍｌのＰＢＳに溶解し、攪拌しながら１ｍｌのスクシンイミジルピリジルジチオプロピオネート（和光製、以下ＳＰＤＰと略称する）のエタノール溶液（ＳＰＤＰ＝４６．６ｍｇ、０．１４９ｍｏｌ、５０倍量）を加えた。室温で３０分間攪拌した後に、生じた沈殿物を０．２２μｍフィルターでろ過した後に、得られたろ液をセファデックスＧ２５Ｍカラム（ファルマシア社製）でゲルろ過し、１４ｍｌのＨＳＡ−ＳＰＤＰを得た。これに、１３．８ｍｇの１−デオキシフルクトシル−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（ペプチド研究所製、以下ＦＶＨＬＴＣと略する）を加え、４℃で一晩反応させた。反応後、反応液中における副生成物ピリジン−２−チオンの量を、３４３ｎｍにおける吸光度により算出することで、ＦＶＨＬＴＣのＨＳＡに対する結合数を求めた。その結果、ＨＳＡ１分子あたり約１５個のＦＶＨＬＴＣが結合された糖化ペプチド結合ＨＳＡが得られた。上記の実施例は、同仁化学カタログ（ＤＯＪＩＮＤＯ  ＬＡＢＯＲＡＴＲＩＥＳ  ２３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｐ２５３〜２５４、２００２）に記載された代表的な反応例とその参考文献を参照して行われた。【００８９】  （実施例５）
本実施例のデバイスにもう一つチャンバー１１１を形成し、実施例３で作製した試薬をチャンバー１１１内に乾燥担持させることにより、専用試薬フリーの測定装置へ適用することが可能となる。図１１は、チャンバー１１１が形成されたデバイスを示す。空気孔１１４、１１６がチャンバー１１１、１１２の近傍にそれぞれ配置されている。また、注入口１１５がチャンバー１１１の近傍に配置されている。【００９０】  本実施例のデバイス１１０の作製手順は、実施例１に示したデバイスの作製手順と基本的に同じである。本実施例のデバイス１１０は、さらに、試薬を乾燥担持させるチャンバー１１１と、検出させるチャンバー１１２と連結させるための流路１１３を有している。【００９１】  測定方法としては、ラテックス標識試薬が含まれる試薬に、検体液を導入し、検体でラテックス標識試薬を懸濁・混合させ、遠心力をかけ、検出チャンバー１１２へと移送させる。ここで、実施例４で示すように、デバイスの回転を制御することで、未結合物質を取り除き、実施例２の方法で検出する。得られる結果としては、実施例３と同様であった。【００９２】  この結果から、検体を加え、デバイスの回転速度および回転時間を制御するのみで簡便かつ高精度な結果が得られた。
【産業上の利用可能性】
【００９３】  本発明にかかる測定装置および測定方法は簡便かつ高精度に血液中のタンパク質を計測することが可能となり、臨床検査分野などに有用である。
【図１】
2006028174.tif 000002
【図２】
2006028174.tif 000003
【図３】
2006028174.tif 000004
【図４】
2006028174.tif 000005
【図５】
2006028174.tif 000006
【図６】
2006028174.tif 000007
【図７】
2006028174.tif 000008
【図８】
2006028174.tif 000009
【図９】
2006028174.tif 000010
【図１０】
2006028174.tif 000011
【図１１】
2006028174.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成19年2月16日(2007.2.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源と、
前記光源から離隔された位置に設置される光受光部と、
前記光源と前記光受光部との間に設置され、反応部を有するデバイスとを備え、
前記反応部が、固相支持体と、前記固相支持体に固定され検体中の被検物質と特異的に結合する特異結合物質とを有する測定装置において、
前記特異結合物質は、前記検体と、前記検体あるいは前記特異結合物質と反応する反応試薬とが前記反応部に導入されることにより、前記固相支持体の表面に凹凸を形成し、
前記光源から発せられる光が前記固相支持体の表面を透過するよう、前記光源および前記デバイスのうち少なくとも一方が走査され、
前記固相支持体の表面を透過した光は、前記固相支持体の表面の凹凸に対応した信号を含み、
前記光受光部は、前記固相支持体の表面を透過した光に含まれる前記信号を検出することを特徴とする測定装置。
【請求項２】
前記固相支持体の表面に凹凸を形成する物質は、光透過性を有することを特徴とする請求項１記載の測定装置。
【請求項３】
前記光受光部は、２分割光受光部によって構成されており、前記２分割光受光部は、前記固相支持体の表面に凹凸を形成する物質の凹凸に応じた透過光強度を検出することを特徴とする請求項１記載の測定装置。
【請求項４】
前記固相支持体の表面に形成された凹凸は、前記光源または前記デバイスによって一定間隔の位置ごとに走査されることを特徴とする請求項１記載の測定装置。
【請求項５】
前記デバイスは、回転体盤によって構成されており、前記回転体盤が回転運動を行っているときに凹凸が検出されることを特徴とする請求項１記載の測定装置。
【請求項６】
前記デバイスは、反応試薬導入後、非特異的吸着物質が洗浄されるよう、前記回転運動の速度および回転時間が制御されることを特徴とする請求項５記載の測定装置。
【請求項７】
前記デバイスは、反応試薬を乾燥担持するための試薬担持部をさらに有し、前記反応部と前記試薬担持部は相互に流路で連結されていることを特徴とする請求項１記載の測定装置。
【請求項８】
前記反応試薬は、前記固相支持体の表面に凹凸を形成する形状物質に、前記被検物質もしくは前記被検物質と類似の構造領域をもつ物質を標識したものであることを特徴とする請求項７記載の測定装置。
【請求項９】
前記反応試薬は、前記固相支持体の表面に凹凸を形成する形状物質に、前記被検物質に対する特異結合物質を標識したものであることを特徴とする請求項７記載の測定装置。
【請求項１０】
形状物質に標識された被検物質もしくは前記被検物質と類似の構造を有する物質を、検体中の前記被検物質と固相支持体に固定された特異結合物質に競合的に作用させ、前記固相支持体の表面に凹凸を形成することを特徴とする請求項８記載の測定装置。
【請求項１１】
形状物質に標識された被検物質に対する他の特異結合物質を、検体中の被検物質を介して前記固相支持体に固定された特異的結合物質と結合させることにより、前記固相支持体の表面に凹凸を形成することを特徴とする請求項９記載の測定装置。
【請求項１２】
前記固相支持体の表面に形成された凹凸に応じた特異信号を表わす画像を表示する表示手段をさらに備えることを特徴とする請求項１記載の測定装置。
【請求項１３】
検体中に含まれる被検物質量を測定する方法であって、被検物質と特異的に結合する特異結合物質が固定化された固相支持体上に対して、前記被検物質もしくは前記特異結合物質に反応する反応試薬および前記検体を作用させることで、前記固相支持体上の表面に凹凸を形成し、前記凹凸を光の強度の変化として検出することにより、前記凹凸に由来する特異信号を検出することを特徴とする測定方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】  明細書
【発明の名称】  測定装置および測定方法
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主として臨床検査分野に属する測定装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、分析・解析・検査技術の進歩により、様々な物質を測定することが可能となってきている。特に、臨床検査分野においては、生化学反応、酵素反応、もしくは、免疫反応等の特異反応に基づく測定原理の開発により、病態に反映する体液中の物質を測定できるようになった。
【０００３】
その中で、ポイント・オブ・ケアテスティング（以下、単にＰＯＣＴという）と呼ばれる臨床検査分野が注目されている。ＰＯＣＴは、簡易迅速測定を第一の目的とし、検体を採取してから検査結果が出るまでの時間の短縮を目指した取組が行われている。従って、ＰＯＣＴには、簡易な測定原理、および小型で携帯性があり操作性が良い測定装置が要求される。
【０００４】
近年の技術の進歩により、例えば、血糖センサに代表されるように簡単に測定できる小型の測定機器が開発されてきている。ＰＯＣＴの波及効果は、迅速な測定結果の取得による迅速正確な診断を可能とすることに加え、検査にかかるコストの低減、血液等の検体の少量化に伴う被検者の負担の軽減及び感染性廃棄物の少量化等が考えられる。現在、臨床検査はＰＯＣＴへの移行が急速に起こっており、そのニーズに応える形で、ＰＯＣＴ対応測定機器の開発が行なわれてきている。
【０００５】
ＰＯＣＴ対応測定機器は、上記に述べた血糖センサに代表される酵素電極反応を利用した酵素センサの他に、妊娠診断薬に代表される免疫抗原抗体反応を利用した定性免疫センサがある。さらには、最近ではキャピラリー電気泳動法に代表されるマイクロ・トータル・アナライシス・システム（μ−Ｔｏｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ、以下、単にμ−ＴＡＳという）の開発が行われている。いずれも、簡易測定原理の構築、それに伴う生体成分の固相化技術、センサデバイス化技術、センサシステム化技術、微細加工技術、及びマイクロ流体制御技術の進歩によるものである。
【０００６】
しかしながら、μ−ＴＡＳにおいては、そのシステムが備える測定用のデバイスを小型化すると、そのデバイスに使用される試薬の量や検出部の領域等も微量・微細となり、結果として、従来からある吸光分光計や蛍光分光計等の分光計で測定する場合と比較して、検出感度が低下するという問題が出てくる。
【０００７】
代表的なμ−ＴＡＳとして知られるキャピラリー電気泳動を用いたデバイスでは、その検出部の光路長の大きさは、マイクロチップ電気泳動の場合、特に光をチップの表面に対する垂直方向から入射させた場合、光路長は１０μｍ程度であり、汎用キャピラリー電気泳動を用いたデバイスの検出部の光路長と比べてもその１／５となる。汎用キャピラリー電気泳動の検出部にしても光路長は５０μｍ程度である。以上のことを踏まえて、検出感度向上は、一つの重要課題となっている。
【０００８】
これまでに、上記の検出感度の低下に対する補償策として、光の反射を利用して光路長を伸長する（例えば、特許文献１、２参照）、前処理的に被測定対象物を濃縮する（例えば、特許文献３参照）、あるいは、化学発光方式で検出する（例えば、特許文献４参照）等の対応が取られてきた。
【特許文献１】特開平９−３０４３３８号公報
【特許文献２】特開平９−２１８１４９号公報
【特許文献３】特開平９−２１０９６０号公報
【特許文献４】特開２０００−３３８０８５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、特許文献１および２が示すような光路長伸長においては、同時再現性が得られにくいという問題があった。即ち、光路長伸長を行う以前でも、検出部の厚みのバラツキは検出のバラツキに大きく反映されてくる。そこに、光路長伸長を行うために、光が反射角を有するよう検出部に反射板を設けると、反射板の角度や反射板同士の距離等のバラツキが加わる。さらに、光の入射角等のバラツキにより、同時再現性のバラツキは倍増されるという課題があった。
【００１０】
また、特許文献３が示すように、前処理として被測定対象物を濃縮する方法は、検出部に加えられる電圧を制御するような付加操作が要求される。例えば、イムノクロマト法に代表されるように、ニトロセルロースメンブレン上に固定化抗体ラインを設け、それに対して、検体液を流動させ、随時、固定化抗体と反応させることで、固定化抗体ラインで簡易的に一種の濃縮効果が得られる。しかしながら、測定の精度を高めるためには、検体液の流速のバラツキを抑える必要があり、また、光学的に高いシグナルの方では、感度が頭打ちになってしまうという第２の課題があった。
【００１１】
特許文献４が示すように、化学・生物・酵素発光系の検出系を使用する測定装置においては、検出部がフォトン１つの検出を可能とするため、高感度の検出が期待できるが、光学系に発光系用の光電子倍増管が必要となり、装置が比較的高価になる。さらに、発光させるために特別の反応試薬が必要となり、検出までに多段階の反応ステップが要求され、操作性に優れているとは言えない。マイクロチップ電気泳動に見られるように、検出部に加えられる電圧を制御することで、多段階の反応ステップを制御することも可能だが、それをコントロールする制御系も複雑であるという第３の課題があった。
【００１２】
従って、μ−ＴＡＳの検出系において、光路長に依存せず、濃縮等の前処理も必要とせずに、高感度に、広範囲に検出できる測定装置および測定方法を構築する必要がある。
【００１３】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、簡易かつ高精度の測定装置および測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の測定装置は、光源と、前記光源から離隔された位置に設置される光受光部と、前記光源と前記光受光部との間に設置され、反応部を有するデバイスとを備え、前記反応部が、固相支持体と、前記固相支持体に固定され検体中の被検物質と特異的に結合する特異結合物質とを有する測定装置において、前記特異結合物質は、前記検体と、前記検体あるいは前記特異結合物質と反応する反応試薬とが前記反応部に導入されることにより、前記固相支持体の表面に凹凸を形成し、前記光源から発せられる光が前記固相支持体の表面を透過するよう、前記光源および前記デバイスのうち少なくとも一方が走査され、前記固相支持体の表面を透過した光は、前記固相支持体の表面の凹凸に対応した信号を含み、前記光受光部は、前記固相支持体の表面を透過した光に含まれる前記信号を検出する構成を有している。
【００１５】
また、本発明の測定装置は、前記固相支持体の表面に凹凸を形成する物質は、光透過性を有する構成を有している。
【００１６】
また、本発明の測定装置は、前記光受光部は、２分割光受光部によって構成されており、前記２分割光受光部は、前記固相支持体の表面に凹凸を形成する物質の凹凸に応じた透過光強度を検出する構成を有している。
【００１７】
また、本発明の測定装置は、前記固相支持体の表面に形成された凹凸は、前記光源または前記デバイスによって一定間隔の位置ごとに走査される構成を有している。
【００１８】
また、本発明の測定装置は、前記デバイスは、回転体盤によって構成されており、前記回転体盤が回転運動を行っているときに凹凸が検出される構成を有している。
【００１９】
また、本発明の測定装置は、前記デバイスは、反応試薬導入後、非特異的吸着物質が洗浄されるよう、前記回転運動の速度および回転時間が制御される構成を有している。
【００２０】
また、本発明の測定装置は、前記デバイスは、反応試薬を乾燥担持するための試薬担持部をさらに有し、前記反応部と前記試薬担持部は相互に流路で連結されている構成を有している。
【００２１】
また、本発明の測定装置は、前記反応試薬は、前記固相支持体の表面に凹凸を形成する形状物質に、前記被検物質もしくは前記被検物質と類似の構造領域をもつ物質を標識したものである構成を有している。
【００２２】
また、本発明の測定装置は、前記反応試薬は、前記固相支持体の表面に凹凸を形成する形状物質に、前記被検物質に対する特異結合物質を標識したものである構成を有している。
【００２３】
また、本発明の測定装置は、形状物質に標識された被検物質もしくは前記被検物質と類似の構造を有する物質を、検体中の前記被検物質と固相支持体に固定された特異結合物質に競合的に作用させ、前記固相支持体の表面に凹凸を形成する構成を有している。
【００２４】
また、本発明の測定装置は、形状物質に標識された被検物質に対する他の特異結合物質を、検体中の被検物質を介して前記固相支持体に固定された特異的結合物質と結合させることにより、前記固相支持体の表面に凹凸を形成する構成を有している。
【００２５】
また、本発明の測定装置は、前記固相支持体の表面に形成された凹凸に応じた特異信号を表わす画像を表示する表示手段をさらに備える構成を有している。
【００２６】
さらに、本発明の測定方法は、検体中に含まれる被検物質量を測定する方法であって、被検物質と特異的に結合する特異結合物質が固定化された固相支持体上に対して、前記被検物質もしくは前記特異結合物質に反応する反応試薬および前記検体を作用させることで、前記固相支持体上の表面に凹凸を形成し、前記凹凸を光の強度の変化として検出することにより、前記凹凸に由来する特異信号を検出することを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００２７】
本発明は、表面形状由来の特異信号の数に基いて固相支持体表面の凹凸数を測定することを特徴とし、表面形状の変化のみを捉えているので、光学測定において重要な要素となる光路長に依存せず、測定用のデバイスを小型化しても、十分な測定感度が得られる測定装置を提供することができるものである。さらに、濃縮等の前処理工程を必要とせず、測定装置として簡易なものを構築できる。使用される試薬も、高感度のために測定環境に厳密な条件を有し注意を必要とする試薬を使用せずに、簡易な形状物質標識試薬を使用することによって、高感度な測定結果が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、本発明を実施するための最良の形態について、図面を用いて説明する。
【００２９】
本発明の測定装置において、重要な要素として３つの要素がある。
【００３０】
１）均一な凹凸のない固相支持体の表面に凹凸を形成させることである。２）凹凸形状のパターンを、固相支持体の表面上に固定化される特異結合物質と、反応試薬・被検物質の相互作用によって生成させることである。３）生体材料が、形状物質に標識されたものを反応試薬としていることである。
【００３１】
１）について説明する。固相支持体の表面に凹凸を形成させ、その形状の範囲に光を照射すると、凹凸に応じた光の屈折率・反射率の変化により、光の強度が変化するので、その強度変化を形状特異的な信号として生成させることができる。その形状特異的な信号を光受光部により抽出し、計数することで、表面形状の凹凸数を数値化する。凹凸数の形成パターンとしては、均一な表面から凸へ形成する場合、均一な表面から凹へ形成する場合、もしくは、凸から凹へ、または、その逆で凹から凸へ形成する場合がある。
【００３２】
２）について説明する。凹凸形状のパターンを固相支持体の表面上に固定化される特異結合物質と、反応試薬・被検物質の相互作用によって生成させる。特異結合物質とは、例えば、抗原、抗体、核酸、レセプター等の生体材料である。
【００３３】
本発明でいう表面形状に凹凸を形成させる方法とは、形状物質に標識された被検物質もしくは被検物質と同等の構造領域を含む物質を、検体中の被検物質と固相支持体上の特異結合物質に競合的に作用させることにより、固相支持体の表面に形状変化を生じさせることである。この場合は、表面形状は均一状態から凸へ変化し、検体中の被検物質の量が多くなるに従い、凸数は減ってくる。また、凹から均一表面状態への変化で、検体中の被検物質の量が多くなるに従い、凹が増えるようにしてもよい。もしくは、形状物質に標識された被検物質に対する別の特異結合物質と検体中の被検物質を、固相支持体上の特異結合物質に作用させることにより生じる形状変化も考えられる。この場合も、上記競合的に作用させる場合と同様に均一状態から凸への変化で、異なるのは検体中の被検物質の量が多くなってくるに従い、凸数も増えてくる。さらに、凹から均一表面状態への変化も考えられて、検体中の被検物質の量が多くなってくるに従い、凹が減ってくる。
【００３４】
３）について説明する。生体材料が、形状物質に標識されたものを反応試薬としている点である。前記形状物質とは、球状・楕円状・多角体状、あるいは、それらが集合体を形成するもの等が考えられる。本発明において、形状物質とは、測定システムの光のスポット径と凹凸物質の大きさを比較したときに、スポット径以上の大きさの凹凸形状を有する物質のことである。形状としては、球状であると、シンプルな信号が得られやすいので好ましい。
【００３５】
以下、本発明の一実施の形態の測定装置について、図１および図２を用いて説明する。
【００３６】
図１（ａ）は本実施の形態における測定装置の一部を示す構成図であり、図１（ｂ）は光が照射されていない状態における反応部１２周辺の拡大図である。本実施の形態の測定装置は、光源１３と、光源１３から離隔された位置に設置される光受光部１４と、光源１３と光受光部１４との間に設置され、反応部１２を有するデバイス１１とを備えている。反応部１２は、固相支持体１２１と、固相支持体１２１に固定され検体中の被検物質と特異的に結合する特異結合物質１２２とを有している。特異結合物質１２２は、検体と、検体あるいは特異結合物質１２２と反応する反応試薬とが反応部１２に導入されることにより、固相支持体１２１の表面に凹凸１２３を形成し、光源１３から発せられる光が固相支持体１２１の表面を透過するよう、光源１３およびデバイス１１のうち少なくとも一方が走査され、固相支持体１２１の表面を透過した光は、固相支持体１２１の表面の凹凸１２３に対応した信号を含み、光受光部１４は、固相支持体１２１の表面を透過した光に含まれる前記信号を検出するようになっている。
【００３７】
なお、図１では、デバイス１１を駆動する駆動部および結果を表示する表示部等は省略されている。
【００３８】
光源１３は、一般的に分光光度計等の光源に使用されるキセノンランプ・タングステンランプよりも、集光された光、例えばレーザー光（ＬＥＤ等）を光源とすることが好ましい。集光を用いると非常に微小な領域の形状変化を見ることが出来る。即ち、分子レベルで形成される凹凸１２３の変化を信号の変化として捉えることができる。ここで、重要なのは、集光位置が測定デバイス１１の固相支持体１２１付近に設定させることで、凹凸数を信号として読取る前には、目的の位置へフォーカス作用が必要となる。また、本発明の測定装置は、光受光部１４から得られる信号を演算処理するための制御部１５をさらに備えている。
【００３９】
次に検出対象物について説明する。検出対象物は図１に示す固相支持体１２１上に検体中の被検物質と特異的に結合する特異結合物質（図示せず）が固定化されて凹凸１２３を形成した形状物質である。
【００４０】
形状物質とは、上記集光に形状物質を作用させたときに前記形状物質から発せられる光の物理量を変化させることができるものである。測定装置の中にある光受光部１４は、形状物質によって変化された光の物理量、主として強度の変化を検出するようになっている。表面に凹凸１２３が形成されていない場合、光源１３からの光は、その強度に近い値で光受光部１４に到達する。表面に凹凸１２３が形成されると、光受光部１４は、形状物質の性質により光の強度が、屈折率・反射率・透過率等の要因により変化することを読みとるようになっている。従って、形状物質の性質として光に対して透過性のあるもの、もしくは非透過性のものが考えられ、いずれの形状物質も、本発明への適用が可能である。しかしながら、光受光部１４を光源１３と相対する方向に設置する場合においては、光に対して透過性のある形状物質を用いると、光受光部１４が透過光を充分に受光でき、形状物質に光が照射されたときの屈折率の影響が受けやすく、より詳細な光信号が得られるため好ましい。
【００４１】
光受光部１４は、２分割されたものが好ましい。こうすることで、特に球状の形状物質の場合、形状物質に特異的な信号であるシンプルなＳ字カーブを得ることができる。Ｓ字カーブの生成は、２分割光受光部から得られる２つの信号値の差信号をとることによって実現できる。Ｓ字カーブの検出方法については実施例において説明する。
【００４２】
つまり、本発明に係る測定装置は、測定用のデバイス１１を走査させることで、光源１３から出る光を凹凸形状に作用させ、光の強度の変化を光受光部１４で検出させ、形状に特異的な信号を生成・抽出させ、信号の数を計数することで検体中の被検物質量を測定することを特徴とするものである。
【００４３】
ここで、光源１３から出る光と凹凸１２３とを作用させる方法としては、光源１３を固定して固相支持体１２１を往復させる方法、光と固相支持体１２１を２次元的に移動させる方法、もしくは、固相支持体１２１を固定して光を往復させる方法が考えられる。本発明においては、測定用のデバイス１１を回転体盤ベースにより構成し、回転運動の中で行う方法が好ましい。これは、光源１３もしくは測定用のデバイス１１を２次元方向に走査させる機構よりも、回転運動の中で光源１３を半径方向に走査させる方が機構的に簡易となるからである。例えば、コンパクトディスク（ＣＤ）等にみられるような機構がよい。
【００４４】
また、本実施の形態の測定装置のように、回転体盤ベースを用いて走査を行う場合、本発明のポイントとなる凹凸形状を、固相支持体１２１の表面に１ステップで形成することができる。即ち、回転運動の速度を制御することで遠心力の強さを調節し、形状変化に作用されない反応物質を分離し、さらに、特異的な凹凸形成とは関係なく非特異的吸着されるものを洗浄させることができる。ここで、回転運動速度は、その速度と形状変化を行わせる領域の半径位置から割り出される遠心力の強さと固相支持体１２１に固定化される特異結合定数によって設定される。
【００４５】
回転運動速度は、さらには、反応試薬である形状物質に標識される生体材料の標識数によって設定される。あるいは、形状物質の重量・大きさの条件を加味してもよい。要は、十分に形状生成を伴わない未反応物質を分離させ、特異結合に関与しない非特異的に吸着されているような物質を遠心力によって洗浄させることができる条件を検討することが重要である。この作業は、測定用のデバイス及び測定システム全体に与えられるノイズ成分が小さくなるよう、十分に考慮しなければならない。
【００４６】
デバイス１１は、凹凸１２３を形成させる領域とは別に、反応試薬を乾燥担持された空間を含む領域を有してもよい。この場合、凹凸１２３を形成させる領域と反応試薬を乾燥担持された空間を含む領域とは、相互に流路で連結させている。
【００４７】
このようなデバイス１１を用いると、測定装置の利用者は、検体をデバイス１１に導入する操作のみで、被検物質量を測定することができる。即ち、デバイス１１に導入された検体は、回転運動によって生じる遠心力により移送させられて、反応試薬が乾燥担持される空間に導入させられ、反応試薬と混合される。再び、遠心力により移送させて、凹凸形状を形成させる反応部１２へ移送し、凹凸１２３を形成させるのに十分な時間放置した後に、さらに、遠心力で未反応試薬を除去することで、被検物質量依存性の凹凸形状数を得られる。要するに回転運動の速度・時間を制御することで、簡易に測定結果を得ることができる。ここでは、回転運動を流体移送の駆動力としているが、これに限定されるものではなく、例えば、毛細管力や電気泳動力等を用いてもよい。
【００４８】
本発明の測定用のデバイス１１に乾燥担持される反応試薬とは、表面に凹凸１２３を形成させる形状物質に被検物質もしくは前記被検物質と類似の構造領域をもつ物質を標識させたもの、もしくは表面に凹凸１２３を形成させる形状物質に被検物質に対する特異結合物質を標識させたものがある。
【００４９】
表面上に固定化される特異結合物質１２２への反応試薬・被検物質の作用の形態は、前記特異結合物質１２２に対して競合的に作用させる場合、もしくは、前記特異結合物質１２２と反応試薬を、被検物質を介してサンドイッチ型に作用させる場合がある。いずれにおいても、表面に対して凹凸１２３を形成させるための手段である。
【００５０】
上記２つの作用形態においては、反応試薬の種類が異なり、前者の競合的に作用させる場合の反応試薬は、凹凸１２３を形成させる形状物質に標識される物質が被検物質もしくは前記被検物質と類似の構造領域を含む物質である。
【００５１】
例えば、固定化される特異結合物質１２２が抗原の場合は形状物質に標識される物質は抗体、抗体の場合は抗原、核酸の場合はそれと対になる塩基配列をもつ核酸である。また、後者のサンドイッチ型に作用させる場合は、凹凸を形成させる形状物質に標識される物質が被検物質に対して特異的に結合する他の特異結合物質である。
【００５２】
例えば、固定化される特異結合物質１２２が抗体の場合は他の抗原決定基を認識する抗体、被検物質が多量体である場合は固定化される抗体と同種であってもよい。いずれの形態においても、生体材料特有の特異性をもつ物質が選ばれ、上記にあげる抗原と抗体もしくは核酸塩基対の関係のほかに、ホルモンとレセプターや糖鎖同士の関係等が考えられる。
【００５３】
特異的な結合の結果としては、結合複合体が得られる形態が好ましい。酵素と基質が用いられた場合は、表面形状において凹凸の形成は望めず、基質の性質変化を伴う場合が多く、光学性質・電気化学的性質を捉えるもので本発明では不向きである。ただし、酵素と基質の反応の中で、基質の構造変化がおこる場合、構造変化した基質のみに反応する抗体を使用することができれば、本発明の測定装置に適用することができる。
【００５４】
本発明においては、固相支持体１２１の表面形状を均一な表面から凸状へ変化させることが、最も好ましい。表面形状が均一な表面である方が、表面形状が均一でない場合に比べて、固相支持体１２１の表面上に特異結合物質１２２を均一に固定化しやすいので、精度良く作製できる。また、均一な表面から凸状に変化をさせると、表面形状の変化を捉えやすい。ここで、固相支持体１２１は、生体材料が物理的に吸着、もしくは化学的に結合されるような材質によって形成されることが好ましい。例えば、生体材料を物理的に吸着させる場合には、ポリスチレン、スチレンアクリルレート、スチレン−ブタジエン、ジビニルベンゼン、ポリビニルベンゼンのような材質が好ましい。特に、ポリスチレンは、従来からの生体材料の吸着性の実績（酵素免疫測定法に用いられるマイクロタイタープレート）を有するため好ましい。
【００５５】
また、本発明は、様々な種類の形状物質を使用することで多項目測定を行うことも可能である。即ち、様々な種類の形状物質、例えば、大きさが異なる、もしくは、形が異なる形状物質を使用することで、異なる形状変化を誘導させることができる。前記異なる形状物質のそれぞれに、別の被検物質に対する特異結合物質を標識させることで、同時に、検体中の被検物質を複数の項目を測定できることが可能となる。
【００５６】
また、本発明は得られた信号を基にして、画像として出力することも可能である。この場合、上記に示す複数の被検物質を測定する場合は、大きさの異なる形状を視覚的に認識でき、複数の被検物質を同定することができる。
【００５７】
また、本発明でいう検体とは、血液、血漿、尿、唾液、汗等、現在の臨床検査分野で対象となる生体由来のものであり、本発明でいう被検物質とは、前記検体中に含まれるホルモン、蛋白質等である。この場合、固相支持体に固定化される特異結合物質は、前記ホルモンや蛋白質に対する抗体、もしくは、ホルモンに対して特異的に結合するレセプターが好ましい。また、反応試薬である形状物質に標識させる物質においては、抗原を使用する場合は、ホルモンや蛋白質そのものであるか、もしくは、ホルモンや蛋白質の構造の中でエピトープに相当するものを用い、抗体を使用する場合は、固定化される抗体と同じ抗体、もしくは、異なるエピトープを認識する抗体を用いる。
【００５８】
本発明の測定装置は、上記臨床検査分野以外にも適用可能で、例えば、遺伝子検査分野、環境検査分野等にも利用可能である。遺伝子検査分野の場合、検体は、臨床検査で使用されるものに加えて、細胞内から抽出された液であってもよい。凹凸の形状の形成に必要である固相支持体に固定化される生体物質及び形状物質に標識される生体物質はＤＮＡになる。一方、環境検査分野においては、水道水、河川水もしくは海水等が検体として用いられるが、使用される生体物質は、臨床検査分野で用いられる試薬である場合が多く、抗原抗体反応原理に基づくものである。
【００５９】
以上のように、本発明に係る測定装置は、光のスポット径以上の大きさを有する形状物質を反応試薬に用いるので、反応試薬に遠心力を加えることにより未反応の試薬を容易に洗浄できるという利点を有している。つまり、従来の反応試薬を用いた測定装置においては、反応試薬の分子サイズが小さく、回転運動による未反応試薬の除去が不可能であったため、水による洗浄を必要としたが、本発明に係る測定装置においては、未反応の試薬の水による洗浄を必要としないため、小型で携帯性があり操作性が良い測定装置を実現できる。
【実施例】
以下に、本発明の測定装置の実施例を、ヒト血清アルブミンの測定でもって詳細に説明する。ただし、ここで挙げる例は、本発明の全てを示すものではないことを追記しておく。
【００６０】
（実施例１）
本発明の具体的な実施例を説明するための基本的なデバイスについて、図２を用いて詳細に説明する。図２は、回転体盤２１上に検出チャンバー２２を設けたデバイスを示すものである。検出チャンバー２２には、形状物質標識試薬と検体とが混合されて注入されている。なお、検出チャンバー２２に接するように空気孔２３、注入口２４がある。
【００６１】
図３（ａ）〜（ｃ）は、図２に示されたデバイスの作製方法および完成状態を示す断面図である。本実施例で示すデバイスは３層構造としている。
【００６２】
検出チャンバー２２は、図３（ａ）に示すように、カッテイングプロッター（ＧＲＡＰＨＴＥＣ製、ＣＥ３０００−４０）を用いて両面粘着性シート（芯５０μｍ、接着剤層、両面それぞれ２５μｍ、ＦＬＥＸＣＯＮ社製）の下面の接着剤層の剥離紙３５以外の層に切り込みを入れ、チャンバーが形成される部分を剥ぎ取るようにして作製した。
【００６３】
一方、図３（ｂ）に示すベース基盤３８はポリスチレン（ＰＳ）をコーティングした。即ち、ポリカーボネート製の円盤状基盤に対して、ポリスチレン（シグマアルドリッチ製）の２−アセトキシ−１−メトキシプロパンの７０ｗ／ｖ％溶液をスピンコートした。スピンコートしたベース基盤３８（ＰＳコートしたベース基盤）は、一晩、真空状態で十分に乾燥させた。
【００６４】
また、トップカバー３７には、注入口２４と空気孔２３を開けておく。こうして調整した３つの層を、両面粘着性シート３６を介して貼り合せて検討用のデバイス３９を作製した。なお、図３（ｃ）においては、空気孔２３は略されている。
【００６５】
（実施例２）
図３の測定用のデバイス３９を用いて、表面上の凹凸から特異的な信号を生成・抽出する方法を、形状物質として球状で光透過性のラテックス粒子４１（バングス・ラボラトリー製）２．０６、４．８４、７．３３μｍを用いて詳細に説明する。
【００６６】
測定用のデバイス３９に上記３種類の大きさの粒子を固定したものを準備する。これは、デバイス３９のベース基盤３８がＰＳコートされており、一方でラテックス粒子４１もＰＳ製のものであるので、注入口２４からラテックス粒子４１懸濁液を注入して６分間放置することで、非特異的な吸着で表面上に凹凸を得た。この様子を図４に示す。
【００６７】
次に、図５に示す測定装置を用いて検出方法を説明する。光源５１と２分割光受光部５２との間にデバイス３９が設置されている。２分割光受光部５２からの信号は処理を経て、オシロスコープ５３に表示される。ここで、オシロスコープ５３は、表示手段を構成する。なお、駆動部は省略した。
【００６８】
この凹凸を形成したデバイス３９の下側から集束させた光５１を照射し、デバイス３９を回転運動によって走査させ、照射された光を上側に設けられた２分割光受光部５２によって受光することで、Ｓ次信号波形を生成し抽出した。信号の確認は、オシロスコープ５３で行った。
【００６９】
ここで、３種類の大きさのラテックス粒子懸濁液は、それぞれ希釈系列を作製し、粒子個数に対するＳ字カーブ数をプロットしたものを、図６に示す。縦軸のＳ字カーブはオシロスコープ５３で表示されたＳ字カーブを計測することにより得た。横軸はラテックス粒子１０％ソリット液に対する希釈である。以上より、表面凹凸数は、右肩上がりの結果が得られ、粒子数依存性を示すことがわかった。
【００７０】
（実施例３）
次に、ラテックス標識抗原を用いたイムノアッセイを例に本発明の測定方法について説明する。本実施例は、基本イムノアッセイ原理を競合アッセイとし、リン酸（ＰＢＳ）緩衝液中のヒト血清アルブミン（Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎｅ、略してＨＳＡ）の測定を行う。
【００７１】
まず、デバイス７１の作製について図７（ａ）〜（ｄ）を用いて説明する。図７（ａ）〜（ｂ）に示すように、デバイス７１の基本的な作製方法は、実施例１で示した作製方法と同じではあるが、検出チャンバー内で抗原抗体反応が行われるよう、トップカバー３７を貼り合せる前にベース基盤３８に抗体７２を固定化する必要がある。そこで、図７（ｃ）に示すように、ベース基盤３８のチャンバー内に、ウサギ由来抗ヒト血清アルブミンポリクローナル抗体（抗ＨＳＡポリ抗体）・リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）１．０ｍｇ／ｍｌを１０μｌ点着して、３ｈ放置することで、ベース基盤３８に抗ＨＳＡポリ抗体７２の固定化を行った。その後、ベース基盤３８を超純水で洗浄し、ブロッキングをスタビリガードで３ｈ行って、再度、洗浄を行い、チャンバー内のエッジ等に残る水を真空ポンプで完全に吸い取った。
【００７２】
こうして、抗体７２が固定化されたベース基盤３８をトップカバー３７に貼り付けて、図７（ｄ）示すように本実施例のデバイス７１とした。
【００７３】
次にラテックス標識試薬の調整方法を詳細に説明する。
【００７４】
ラテックスは本発明でいう形状物質に相当するものである。ラテックスは、本実施例では７．３３μｍの粒子を使用した（バングス・ラボラトリー製）。
【００７５】
まず、前記ラテックス粒子を洗浄する必要がある。そこで、遠心分離で上清を除去した後にＰＢＳで懸濁させ、洗浄を行った。この操作は、５回繰り返した。洗浄後、ラテックスのＰＢＳ懸濁液４００ｕｌに対してヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）ＰＢＳ溶液３ｍｇ／ｍｌを１００μｌ加えて、３ｈボールミルで攪拌放置した。その後、遠心分離で未結合のＨＳＡを除去して、さらに、スタビリガードで３ｈ攪拌放置し、ブロッキングを行い、その後、同様に遠心分離で洗浄した。
【００７６】
次に、本実施例で作製した測定用のデバイスとラテックス標識試薬を用いて、実際にＨＳＡ溶液の測定を行った。ＨＳＡ濃度は０、１、１０、３０、５０、１２０ｍｇ／ｄｌの濃度９０μｌに対して、先程調整したラテックス試薬１０μｌを混合し、デバイス７１に導入し、３５（×Ｇ）の条件で１５分間回転させたあと、図８のような構成を作製させて、実施例２で示す方法でＳ次カーブ数を測定した。
【００７７】
測定結果を図９に示す。ＨＳＡの濃度依存的に右肩下がりの結果を得た。検出されたＳ字カーブ数が約５００から１００００となり、２０倍のレンジを有していることから、十分測定できるレベルである。
【００７８】
従来の測定装置においてデバイスを小型化すると、光路長が小さくなり、光の出力では２０倍のレンジは得られない。また、この場合、前方散乱の影響で、さらに感度は小さくなる。しかしながら、本発明の測定装置においては、本実施例に示したように、光路長の影響を受けることなく、通常の分光計と同等の測定レンジを得ることができ、測定精度が向上する。
【００７９】
本実施例では説明していないが、サンドイッチ免疫アッセイにおいても同様に濃度依存的な結果が得られた。
【００８０】
（実施例４）
さらに、デバイスの回転速度を実施例３に示した値から変えることにより、抗原抗体反応において、未反応物質の除去を、短時間で完璧に完了させることができる。
【００８１】
図１０は、非特異的吸着物質を導入したデバイスにおいて、未反応物質に加えられる遠心力（×Ｇ）が３４、１３５、４７３、８４１×Ｇとなるよう、デバイスをそれぞれ５分間回転させたときの洗浄状態を示す。図１０（ａ）は抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体（Ｅｘｏｃｅｌｌ社製）とラテックス標識糖化ペプチド結合ＨＳＡの反応を陽性コントロールした場合（免疫反応がおこる場合）、図１０（ｂ）はラテックス標識ＨＳＡとの反応を陰性コントロールした場合（免疫反応がおこらない場合）において、それぞれデバイスを回転させた後、チャンバー内を撮影した顕微鏡の像（２００倍）である。なお、図１０（ａ）、（ｂ）において、左側の図はそれぞれデバイスを回転させる前の像であり、右側の図はそれぞれデバイスを５分間回転させた後の像である。
【００８２】
この際、実施例３で説明したデバイスを使用し、固定化抗体には抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体を用いた。
【００８３】
この結果から、未反応物質は、４７３×Ｇ以上の遠心力が加えられることにより、完全に洗浄されることが分かる。本実施例では、このような結果が得られたが、固定化される抗体の結合定数、ラテックス標識試薬の１個のラテックス粒子（本実施例では粒径；７．２μｍを使用）ごとに標識される量によって、洗浄に必要な遠心力の値は変わると予想される。
【００８４】
以上より、デバイスの回転速度を制御することで未反応物質に加わる遠心力を調節することにより、完全にノイズ成分を除去することができ、測定精度の高精度化が期待できる。しかも、デバイスの回転速度および回転時間の制御のみの１ステップで実現できることから、簡易な測定装置が提供できる。
【００８５】
ここで、糖化ペプチド結合ＨＳＡの作製方法について説明しておく。２００ｍｇ（２．９８×１０３ｍｏｌ）ＨＳＡを１０ｍｌのＰＢＳに溶解し、攪拌しながら１ｍｌのスクシンイミジルピリジルジチオプロピオネート（和光製、以下ＳＰＤＰと略称する）のエタノール溶液（ＳＰＤＰ＝４６．６ｍｇ、０．１４９ｍｏｌ、５０倍量）を加えた。室温で３０分間攪拌した後に、生じた沈殿物を０．２２μｍフィルターでろ過した後に、得られたろ液をセファデックスＧ２５Ｍカラム（ファルマシア社製）でゲルろ過し、１４ｍｌのＨＳＡ−ＳＰＤＰを得た。これに、１３．８ｍｇの１−デオキシフルクトシル−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（ペプチド研究所製、以下ＦＶＨＬＴＣと略する）を加え、４℃で一晩反応させた。反応後、反応液中における副生成物ピリジン−２−チオンの量を、３４３ｎｍにおける吸光度により算出することで、ＦＶＨＬＴＣのＨＳＡに対する結合数を求めた。その結果、ＨＳＡ１分子あたり約１５個のＦＶＨＬＴＣが結合された糖化ペプチド結合ＨＳＡが得られた。上記の実施例は、同仁化学カタログ（DOJINDO LABORATRIES  ２３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｐ２５３〜２５４、２００２）に記載された代表的な反応例とその参考文献を参照して行われた。
【００８６】
（実施例５）
本実施例のデバイスにもう一つチャンバー１１１を形成し、実施例３で作製した試薬をチャンバー１１１内に乾燥担持させることにより、専用試薬フリーの測定装置へ適用することが可能となる。図１１は、チャンバー１１１が形成されたデバイスを示す。空気孔１１４、１１６がチャンバー１１１、１１２の近傍にそれぞれ配置されている。また、注入口１１５がチャンバー１１１の近傍に配置されている。
【００８７】
本実施例のデバイス１１０の作製手順は、実施例１に示したデバイスの作製手順と基本的に同じである。本実施例のデバイス１１０は、さらに、試薬を乾燥担持させるチャンバー１１１と、検出させるチャンバー１１２と連結させるための流路１１３を有している。
【００８８】
測定方法としては、ラテックス標識試薬が含まれる試薬に、検体液を導入し、検体でラテックス標識試薬を懸濁・混合させ、遠心力をかけ、検出チャンバー１１２へと移送させる。ここで、実施例４で示すように、デバイスの回転を制御することで、未結合物質を取り除き、実施例２の方法で検出する。得られる結果としては、実施例３と同様であった。
【００８９】
この結果から、検体を加え、デバイスの回転速度および回転時間を制御するのみで簡便かつ高精度な結果が得られた。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明にかかる測定装置および測定方法は簡便かつ高精度に血液中のタンパク質を計測することが可能となり、臨床検査分野などに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図１（ａ）は本発明の一実施の形態における測定装置の一部を示す構成図であり、図１（ｂ）は反応部の拡大図である。
【図２】図２は本発明の一実施の形態におけるデバイスを模式的に示す図である。
【図３】図３は図２で示すデバイスの作製工程を模式的に示す図である。
【図４】図４は図３で示すデバイスの表面に凹凸を形成させた図である。
【図５】図５は図４で形成した凹凸数を測定するためのシステムを模式的に示す図である。
【図６】図６は実際に粒子の希釈比に対して凹凸数をＳ字カーブ数としてプロットした図である。
【図７】図７はイムノアッセイを行うための抗体が固定化されたデバイスの作製工程を模式的に示す図である。
【図８】図８は図７でイムノアッセイすることで形成させた凹凸数を測定するためのシステムを模式的に示す図である。
【図９】図９は図８に示すシステムにおいてＨＳＡ濃度とＳ字カーブ数との関係を示す図である。
【図１０】図１０（ａ）は抗原抗体反応がある場合において、遠心条件に対する洗浄状態を調べた顕微鏡の像を示す図であり、図１０（ｂ）は抗原抗体反応がない場合において、遠心条件に対する洗浄状態を調べた顕微鏡の像を示す図である。
【図１１】図１１はラテックス試薬フリーを実現することができる測定用のデバイスを模式的に示す図である。
【符号の説明】
【００９２】
１１、３９、７１、１１０  デバイス
１２  反応部
１２１  固相支持体
１２２  特異結合物質
１２３  凹凸
１３、５１  光源
１４  光受光部
１５  制御部
２１  回転体盤
２２  検出チャンバー
２３、１１４、１１６  空気孔
２４、１１５  注入口
３１、３５  剥離紙
３２、３４  粘着層
３３  芯
３６  粘着性シート層（両面粘着性シート）
３７  トップカバー
３８  ベース基盤
４１  ラテックス粒子
５２  ２分割光受光部
５３  オシロスコープ
７２  抗体
８１  ラッテクス標識抗原
１１１  チャンバー（乾燥担持用）
１１２  チャンバー（検出用）
１１３  流路
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
2006028174.tif 000013
【図３】
2006028174.tif 000014
【図４】
2006028174.tif 000015
【図５】
2006028174.tif 000016
【図１】
2006028174.tif 000017
【図６】
2006028174.tif 000018
【図７】
2006028174.tif 000019
【図８】
2006028174.tif 000020
【図９】
2006028174.tif 000021
【図１０】
2006028174.tif 000022
【図１１】
2006028174.tif 000023
【国際調査報告】
2006028174.tif 000024
2006028174.tif 000025