【手続補正書】
【提出日】令和2年4月10日(2020.4.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的微小物体又はそれから生成される生物学的微小物体の集団による検体の分泌のレベルを評価する方法であって、
前記生物学的微小物体をマイクロ流体デバイスの隔離ペンに導入することであって、前記マイクロ流体デバイスが、フロー領域を有するエンクロージャを含み、前記隔離ペンは、前記フロー領域に流体的に接続され、前記隔離ペンは、第１の流体媒体を含む、導入することと、
前記生物学的微小物体又はそれから生成される前記生物学的微小物体の集団に、前記隔離ペン内の前記第１の流体媒体内に前記検体を分泌させることと、
第１の時間期間にわたり、第２の流体媒体を前記フロー領域に導入することであって、前記第２の流体媒体が、複数のリポーター分子を含み、各リポーター分子が、
前記分泌検体に結合するように構成される結合成分、及び
検出可能な標識
を含む、導入することと、
前記複数のリポーター分子の一部を前記隔離ペン内に拡散させ、且つそこに分泌された前記検体に結合させ、それにより、複数のリポーター分子：分泌検体（ＲＭＳＡ）複合体を生成することと、
前記マイクロ流体デバイス内の対象エリア内に位置するリポーター分子を検出することであって、前記対象エリアが、前記隔離ペンの少なくとも一部を含む、検出することとと、
を含む方法。
【請求項２】
前記隔離ペンは、分離領域及び前記分離領域を前記フロー領域に流体的に接続する接続領域を有し、前記分離領域及び前記接続領域は、前記分離領域内の流体媒体の成分が、実質的に拡散によってのみ前記フロー領域内の流体媒体の成分と交換されるように構成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記隔離ペン内の前記生物学的微小物体を増殖させて、生物学的微小物体のクローン集団にすることを更に含み、任意で、培養媒体で前記フロー領域を灌流させることをさらに更に含み、前記灌流が、前記生物学的微小物体を前記隔離ペンに導入した後且つ前記第２の流体媒体を前記フロー領域に導入する前に行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の流体媒体が、可溶性フィーダ細胞成分、定義された溶解酸素成分、定義されたｐＨ成分、排出成長媒体成分及び／又は可溶性刺激成分の１つ又は複数を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の時間期間が、約３０分から約６０分である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
第２の時間期間にわたり、第３の流体媒体を前記フロー領域に導入することであって、前記第３の流体媒体が、リポーター分子を含まない、導入することと、
非結合リポーター分子の少なくとも一部を前記隔離ペンから拡散させることと
を更に含み、
前記対象エリア内の前記リポーター分子を検出することが、前記隔離ペンから拡散した非結合リポーター分子の量が、前記隔離ペンから拡散したＲＭＳＡ複合体の量の少なくとも２倍だけ大きいように選択された時間において行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第２の時間期間が、非結合リポーター分子及びＲＭＳＡ複合体の拡散プロファイルのモデリングに基づいて選択されるか、及び／又は前記第２の時間期間が、約２０分から約５０分である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記対象エリアが、前記隔離ペン内から前記フロー領域への拡散軸に沿って整列された前記隔離ペンの少なくとも一部を含む、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記対象エリア内に位置する前記リポーター分子を検出することが、前記対象エリアから到来する検出可能な信号の強度を測定することを含み、前記検出可能な信号の少なくとも幾つかが、前記対象エリア内に位置するリポーター分子の前記検出可能な標識から発せられる、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象エリア内に位置する前記リポーター分子を検出することが、前記生物学的微小物体を前記隔離ペンに導入する前の時間において、前記対象エリア内の背景信号の強度を測定することと、前記検出可能な信号の前記測定された強度から前記背景信号の強度を減算することにより、背景減算信号強度を特定することを更に含み、任意で、前記検出可能な信号の前記測定された強度が、前記隔離ペン内で観測された細胞数について正規化される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記検体の前記分泌のレベルを定量化することを更に含み、及び／又は前記隔離ペンの分泌スコアを提供することを更に含み、
前記分泌スコアが、
フロー領域及び前記フロー領域に流体的に接続される複数の隔離ペンを含むマイクロ流体デバイスの撮像データを受信することであって、前記撮像データが、検体アッセイ画像と、背景ノイズ画像及び信号基準画像の一方又は両方とを含む、受信することと、
各隔離ペンの対象エリアを定義することであって、前記対象エリアが、検体濃度変動の測定について影響を最も受けやすく、検体変動が測定されるとき、前記隔離ペン内の生物学的微小物体の位置の影響を最も受けにくく、及び／又は、前記隔離ペンと前記フロー領域との間で拡散軸に沿って延在する、前記隔離ペン内の画像エリアを含む、定義することと、
各隔離ペンの前記対象エリアの前記画像エリアの少なくとも一部を分析することにより、各隔離ペン内の前記検体の数量を示すスコアを決定することと、
により決定される、
請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記リポーター分子の前記結合成分が、
少なくとも１つのアミノ酸及び／又は少なくとも１つ核酸と、
ペプチド又はタンパク質；配列番号１から１０のいずれか１つの配列を有するペプチド；タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、又はタンパク質Ａ若しくはタンパク質ＧのＩｇＧ結合断片；及びアプタマーからなる群から選択される１つ又は複数と、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記生物学的微小物体によって分泌される前記検体が、タンパク質、サッカリド、核酸、タンパク質、サッカリド若しくは核酸以外の有機分子、小胞又はウィルスを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記マイクロ流体デバイスが、複数の隔離ペンを含み、生物学的微小物体が、前記複数のうちの少なくとも２つの隔離ペンに導入され、前記方法の残りは、前記少なくとも２つの隔離ペンのそれぞれに対して実行され、
前記複数のうちの前記少なくとも２つの隔離ペンの隔離ペンの分泌のレベルを比較することを更に含む、
請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも２つの隔離ペンのうちの１つ又は複数を選択することと、
前記選択された隔離ペンのそれぞれから１つ又は複数の生物学的微小物体を搬出することと、
を更に含み、
前記選択された隔離ペンのそれぞれからの前記１つ又は複数の生物学的微小物体が、前記マイクロ流体デバイスから更に搬出される、
請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象エリアが、検体濃度変動の測定について影響を最も受けやすく、検体変動が測定されるとき、前記隔離ペン内の生物学的微小物体の位置の影響を最も受けにくく、且つ前記隔離ペンと前記フロー領域との間で拡散軸に沿って延在する前記隔離ペン内のエリアに対応する画像エリアを含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
自動化される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
コンピュータに、生物学的微小物体によって生成される検体の数量を特定する方法を実行するようにシステムに指示させるプログラムが記憶される非一時的コンピュータ可読媒体であって、前記方法が、請求項１６に記載の方法である、非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項１９】
前記フロー領域がマイクロ流体チャネルを備え、
前記接続領域が、約２０ミクロンから約１００ミクロンの幅Ｗｃｏｎを有する、前記マイクロ流体チャネルへの基端開口部と、前記分離領域への先端開口部と、を備え、
前記基端開口部から前記先端開口部までの前記接続領域の長さＬｃｏｎが、前記接続領域の前記基端開口部の幅Ｗｃｏｎの少なくとも１．０倍であり、
任意で、前記接続領域の長さＬｃｏｎが、前記接続領域の前記基端開口部の幅Ｗｃｏｎの少なくとも１．５倍、又は少なくとも２．０倍である、
請求項２に記載の方法。
【請求項２０】
前記接続領域の前記基端開口部の幅Ｗｃｏｎが、約２０ミクロンから約１００ミクロンであり、
前記接続領域の長さＬｃｏｎが、約２０ミクロンから約５００ミクロンであり、及び／又は
前記隔離ペンの体積が、約５×１０５から約１×１０７立方ミクロンである、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記フロー領域が、前記隔離ペンが開口するマイクロ流体チャネルを備え、
前記接続領域の前記基端開口部における前記マイクロ流体チャネルの幅が、約５０ミクロンから約５００ミクロンであり、及び／又は
前記接続領域の前記基端開口部における前記マイクロ流体チャネルの高さが、約２０ミクロンから約１００ミクロンである、
請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記生物学的微小物体が真核細胞であり、任意で、哺乳類細胞又は真菌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記検出可能な標識が蛍光標識である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記分泌検体が、前記リポーター分子の分子量の少なくとも２倍の大きさの分子量を有する、請求項１に記載の方法。