【手続補正書】
【提出日】令和2年2月14日(2020.2.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０５】
三量体型H-NOX L144Fの局在を評価するために、単一用量の三量体型H-NOX L144F(240mg/kg)をpMCAOから1時間後に投与し、動物をpMCAOから2時間後に安楽死させ、脳を切片化し、抗H-NOX抗体及び抗CD31抗体で染色した。pMCAOから1時間後に投与したとき、三量体型H-NOX L144Fは、pMCAOから早くも2時間後に、梗塞周囲脳実質に局在した(図17A)。正常脳組織(対側)では、三量体型H-NOX L144Fは血管に制限されていた。その後、虚血病変に対する三量体型H-NOX L144Fの効果を試験した。閉塞から1時間後、動物に単一用量の三量体型H-NOX L144F(240mg/kg)を投与し、pMCAOから6時間後に脳を摘出し、先に記載されている通りに、低酸素については、ピモニダゾールのELISAにより、カスパーゼ9活性については、ルミノメトリーによりアッセイした。図17Bに示されているように、三量体型H-NOX L144F投与は、pMCAOから6時間後、低酸素状態及びカスパーゼ9活性を軽減し、三量体型H-NOX L144Fが脳卒中を治療するための有望な薬剤であることを示している。
(配列)
核酸配列は5'から3'へと示されている。
アミノ酸配列はN-末端からC-末端へと示されている。
(サーモアナエロバクター・テングコンジェンシスH-NOX-野生型)
(核酸)
【化１】
2019511567.tif 000001
(アミノ酸)
【化２】
2019511567.tif 000002
(フォルドンドメイン)
(核酸)
【化３】
2019511567.tif 000003
(アミノ酸)
【化４】
2019511567.tif 000004
(サーモアナエロバクター・テングコンジェンシスH-NOX-L144F)
(核酸)
【化５】
2019511567.tif 000005
(アミノ酸)
【化６】
2019511567.tif 000006
(サーモアナエロバクター・テングコンジェンシスH-NOX-L144F-フォルドン)
【化７】
2019511567.tif 000007
(アミノ酸)
【化８】
2019511567.tif 000008
本件出願は、以下の構成の発明を提供する。
（構成１）
個体の脳卒中を治療する方法であって、該個体にH-NOXの治療有効量を投与することを含み、ここで、該H-NOXが、ポリエチレングリコール(PEG)に共有結合しているH-NOX及びポリエチレングリコールに共有結合していないH-NOXを含む、前記方法。
（構成２）
脳卒中後の個体に酸素を送達する方法であって、該個体にH-NOXの治療有効量を投与することを含み、ここで、N-NOXが、ポリエチレングリコールに共有結合しているH-NOX及びPEGに共有結合していないH-NOXを含む、前記方法。
（構成３）
前記脳卒中が虚血性脳卒中又は出血性脳卒中である、構成1又は2記載の方法。
（構成４）
個体の一過性虚血発作を治療する方法であって、該個体にH-NOXの治療有効量を投与することを含み、ここで、該H-NOXが、PEGに共有結合しているH-NOX及びPEGに共有結合していないH-NOXを含む、前記方法。
（構成５）
一過性虚血発作後の個体に酸素を送達する方法であって、該個体にH-NOXの治療有効量を投与することを含み、ここで、該H-NOXが、PEGに共有結合しているH-NOX及びPEGに共有結合していないH-NOXを含む、前記方法。
（構成６）
個体の低酸素脳損傷を治療する方法であって、該個体にH-NOXの治療有効量を投与することを含み、ここで、該H-NOXが、PEGに共有結合しているH-NOX及びPEGに共有結合していないH-NOXを含む、前記方法。
（構成７）
低酸素脳損傷後の個体に酸素を送達する方法であって、該個体にH-NOXの治療有効量を投与することを含み、ここで、該H-NOXが、PEGに共有結合しているH-NOX及びPEGに共有結合していないH-NOXを含む、前記方法。
（構成８）
前記H-NOXが前記脳卒中と関連する低酸素ペナンブラにO2を送達する、構成1〜3のいずれか一項記載の方法。
（構成９）
前記H-NOXが前記一過性虚血発作と関連する低酸素ペナンブラにO2を送達する、構成4又は5記載の方法。
（構成１０）
前記H-NOXが前記低酸素脳損傷と関連する低酸素ペナンブラにO2を送達する、構成6又は7記載の方法。
（構成１１）
前記H-NOXの投与が前記低酸素ペナンブラにおける炎症を軽減する、構成8〜10のいずれか一項記載の方法。
（構成１２）
前記個体が、前記脳卒中、一過性虚血発作、又は低酸素脳損傷の結果として、脳の持続的低灌流を示す、構成1〜11のいずれか一項記載の方法。
（構成１３）
閉塞の部位又は脳卒中、一過性虚血発作、もしくは低酸素脳損傷と関連する低酸素ペナンブラへのH-NOXの送達が、該閉塞の部位又は該ペナンブラにおけるアストロサイト、ミクログリア、及び/又はマクロファージの活性化を低下させる、構成8〜12のいずれか一項記載の方法。
（構成１４）
閉塞の部位又は脳卒中、一過性虚血発作、もしくは低酸素脳損傷と関連する低酸素ペナンブラへのH-NOXの送達が、脳卒中、低酸素脳損傷、又は一過性虚血発作と関連する感覚運動障害を軽減する、構成8〜12のいずれか一項記載の方法。
（構成１５）
前記PEGに共有結合しているH-NOXが前記PEGに共有結合していないH-NOXとともに投与される、構成1〜14のいずれか一項記載の方法。
（構成１６）
PEGに共有結合しているH-NOXとPEGに共有結合していないH-NOXの比が、約9:1、約8:2、約7:3、約6:4;約5:5;約4:6;約3:7;約2:8;又は約1:9である、構成15記載の方法。
（構成１７）
前記PEGに共有結合しているH-NOX及び前記PEGに共有結合していないH-NOXが組成物中にある、構成15又は16記載の方法。
（構成１８）
前記PEGに共有結合しているH-NOX及び前記PEGに共有結合していないH-NOXが同時に又は順次送達される、構成1〜14のいずれか一項記載の方法。
（構成１９）
前記PEGに共有結合しているH-NOX及び前記PEGに共有結合していないH-NOXが同時に送達される、構成18記載の方法。
（構成２０）
前記PEGに共有結合しているH-NOX及び前記PEGに共有結合していないH-NOXが順次送達される、構成18記載の方法。
（構成２１）
前記PEGに共有結合しているH-NOXが前記PEGに共有結合していないH-NOXの投与の前に投与される、構成20記載の方法。
（構成２２）
前記PEGに共有結合しているH-NOXが前記PEGに共有結合していないH-NOXの投与の後に投与される、構成20記載の方法。
（構成２３）
前記PEGに共有結合しているH-NOXが、前記PEGに共有結合していないH-NOXの投与から約1時間後、約2時間後、約4時間後、約6時間後、約8時間後、約10時間後、約12時間後、約24時間後、又は約24時間よりも長い時間の後に投与される、構成22記載の方法。
（構成２４）
前記PEGに結合しているH-NOXが、PEGに結合していないH-NOXの投与から1時間後、1日後、2日後、又は3日後のうちの1つ又は複数で投与される、構成22記載の方法。
（構成２５）
前記PEGに結合しているH-NOXが、PEGに結合していないH-NOXの投与から約1時間後、約1日後、及び約2日後に投与される、構成22記載の方法。
（構成２６）
前記個体が哺乳動物である、構成1〜25のいずれか一項記載の方法。
（構成２７）
前記哺乳動物がヒトである、構成26記載の方法。
（構成２８）
前記PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び前記PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質が同じH-NOXタンパク質に由来する、構成1〜27のいずれか一項記載の方法。
（構成２９）
前記PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び前記PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質が異なるH-NOXタンパク質に由来する、構成1〜27のいずれか一項記載の方法。
（構成３０）
前記PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び/又は前記PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質が、T.テングコンジェンシスH-NOX、L.ニューモフィラ2群H-NOX、ヒトβ1、ラットβ1、タイリクオオカミH-NOX、キイロショウジョウバエβ1、キイロショウジョウバエCG14885-PA、線虫GCY-35、N.パンクチフォルムH-NOX、C.クレセンツスH-NOX、S.オネイデンシスH-NOX、又はC.アセトブチリクムH-NOXである、構成1〜29のいずれか一項記載の方法。
（構成３１）
前記PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び/又は前記PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質が、配列番号2に示されるT.テングコンジェンシスのH-NOXドメインに対応するH-NOXドメインを含む、構成1〜30のいずれか一項記載の方法。
（構成３２）
前記PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び/又は前記PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質が1以上の遠位ポケット突然変異を含む、構成1〜31のいずれか一項記載の方法。
（構成３３）
前記遠位ポケット突然変異がT.テングコンジェンシスH-NOXのL144に対応する部位におけるアミノ酸置換である、構成32記載の方法。
（構成３４）
前記H-NOXが位置144におけるアミノ酸置換を含むT.テングコンジェンシスH-NOXである、構成32又は33記載の方法。
（構成３５）
前記位置144におけるアミノ酸置換がL144F置換である、構成34記載の方法。
（構成３６）
前記PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び/又は前記PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質が重合体型H-NOXタンパク質である、構成1〜35のいずれか一項記載の方法。
（構成３７）
前記重合体型H-NOXタンパク質が単量体を含み、ここで、該単量体がH-NOXドメイン及び重合ドメインを含む、構成36記載の方法。
（構成３８）
前記H-NOXドメインが前記重合ドメインに共有結合している、構成37記載の方法。
（構成３９）
前記重合体型H-NOXタンパク質が三量体型H-NOXタンパク質である、構成36〜38のいずれか一項記載の方法。
（構成４０）
前記三量体型H-NOXタンパク質が1以上の三量体化ドメインを含む、構成39記載の方法。
（構成４１）
前記三量体型H-NOXタンパク質が3つの単量体を含み、ここで、該単量体がH-NOXドメイン及び三量体化ドメインを含み、ここで、該三量体化ドメインがバクテリオファージT4三量体化ドメインである、構成40記載の方法。
（構成４２）
前記三量体化ドメインがフォルドンドメインである、構成40又は41記載の方法。
（構成４３）
前記フォルドンドメインが配列番号4のアミノ酸配列を含む、構成42記載の方法。
（構成４４）
前記H-NOXタンパク質が免疫グロブリンのFcドメインに融合している、構成1〜43のいずれか一項記載の方法。
（構成４５）
前記H-NOXタンパク質のO2解離定数がヘモグロビンのO2解離定数の2桁以内であり、かつ該H-NOXタンパク質のNO反応性がヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも10倍低い、構成1〜44のいずれか一項記載の方法。
（構成４６）
前記重合体型H-NOXタンパク質のO2解離定数が20℃で約1nM〜約1000nMである、構成1〜45のいずれか一項記載の方法。
（構成４７）
前記H-NOXタンパク質のO2解離定数が20℃で約1μM〜約10μMである、構成1〜46のいずれか一項記載の方法。
（構成４８）
前記H-NOXタンパク質のO2解離定数が20℃で約10μM〜約50μMである、構成1〜47のいずれか一項記載の方法。
（構成４９）
前記H-NOXタンパク質のNO反応性が20℃で約700s-1未満である、構成1〜48のいずれか一項記載の方法。
（構成５０）
前記H-NOXタンパク質のNO反応性がヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも100倍低い、構成1〜49のいずれか一項記載の方法。
（構成５１）
前記H-NOXタンパク質のNO反応性がヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも1,000倍低い、構成50記載の方法。
（構成５２）
前記H-NOXタンパク質の酸素に対するkoffが20℃で約0.65s-1以下である、構成1〜51のいずれか一項記載の方法。
（構成５３）
前記H-NOXタンパク質の酸素に対するkoffが20℃で約0.21s-1〜約0.65s-1である、構成1〜52のいずれか一項記載の方法。
（構成５４）
前記H-NOXタンパク質の酸素に対するkoffが20℃で約1.35s-1〜約2.9s-1である、構成1〜53のいずれか一項記載の方法。
（構成５５）
前記H-NOXタンパク質のヘム自動酸化の速度が37℃で約1h-1未満である、構成1〜54のいずれか一項記載の方法。
（構成５６）
前記H-NOXが別の療法と組み合わせて投与される、構成1〜55のいずれか一項記載の方法。
（構成５７）
前記他の療法が組織プラスミノーゲン活性化因子及び/もしくは再疎通又は神経保護物質による治療である、構成56記載の方法。
（構成５８）
前記H-NOX投与が、前記他の治療の前、その間、又はその後に行われる、構成56又は57記載の方法。
（構成５９）
H-NOXの治療有効量を含む組成物であって、該H-NOXがポリエチレングリコール(PEG)に共有結合しているH-NOX及びポリエチレングリコールに共有結合していないH-NOXを含む、前記組成物。
（構成６０）
PEGに共有結合しているH-NOXとPEGに共有結合していないH-NOXの比が、約9:1、約8:2、約7:3、約6:4;約5:5;約4:6;約3:7;約2:8;又は約1:9である、構成59記載の組成物。
（構成６１）
前記PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び前記PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質が同じH-NOXタンパク質に由来する、構成59又は60記載の組成物。
（構成６２）
前記PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び前記PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質が異なるH-NOXタンパク質に由来する、構成59〜61のいずれか一項記載の組成物。
（構成６３）
前記PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び/又は前記PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質が、T.テングコンジェンシスH-NOX、L.ニューモフィラ2群H-NOX、ヒトβ1、ラットβ1、タイリクオオカミH-NOX、キイロショウジョウバエβ1、キイロショウジョウバエCG14885-PA、線虫GCY-35、N.パンクチフォルムH-NOX、C.クレセンツスH-NOX、S.オネイデンシスH-NOX、又はC.アセトブチリクムH-NOXである、構成59〜62のいずれか一項記載の組成物。
（構成６４）
前記PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び/又は前記PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質が配列番号2に示されるT.テングコンジェンシスのH-NOXドメインに対応するH-NOXドメインを含む、構成59〜63のいずれか一項記載の組成物。
（構成６５）
前記PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び/又は前記PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質が1以上の遠位ポケット突然変異を含む、構成59〜64のいずれか一項記載の組成物。
（構成６６）
前記遠位ポケット突然変異がT.テングコンジェンシスH-NOXのL144に対応する部位におけるアミノ酸置換である、構成65記載の組成物。
（構成６７）
前記H-NOXが位置144におけるアミノ酸置換を含むT.テングコンジェンシスH-NOXである、構成65又は66記載の組成物。
（構成６８）
前記位置144におけるアミノ酸置換がL144F置換である、構成67記載の組成物。
（構成６９）
前記PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び/又は前記PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質が重合体型H-NOXタンパク質である、構成59〜68のいずれか一項記載の組成物。
（構成７０）
前記重合体型H-NOXタンパク質が単量体を含み、ここで、該単量体がH-NOXドメイン及び重合ドメインを含む、構成69記載の組成物。
（構成７１）
前記H-NOXドメインが前記重合ドメインに共有結合している、構成70記載の組成物。
（構成７２）
前記重合体型H-NOXタンパク質が三量体型H-NOXタンパク質である、構成69〜71のいずれか一項記載の組成物。
（構成７３）
前記三量体型H-NOXタンパク質が1以上の三量体化ドメインを含む、構成72記載の組成物。
（構成７４）
前記三量体型H-NOXタンパク質が3つの単量体を含み、ここで、該単量体がH-NOXドメイン及び三量体化ドメインを含み、ここで、該三量体化ドメインがバクテリオファージT4三量体化ドメインである、構成73記載の組成物。
（構成７５）
前記三量体化ドメインがフォルドンドメインである、構成73又は74記載の組成物。
（構成７６）
前記フォルドンドメインが配列番号4のアミノ酸配列を含む、構成75記載の組成物。
（構成７７）
前記H-NOXタンパク質が免疫グロブリンのFcドメインに融合している、構成59〜76のいずれか一項記載の組成物。
（構成７８）
前記H-NOXタンパク質のO2解離定数がヘモグロビンのO2解離定数の2桁以内であり、かつ該H-NOXタンパク質のNO反応性がヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも10倍低い、構成59〜77のいずれか一項記載の組成物。
（構成７９）
前記重合体型H-NOXタンパク質のO2解離定数が20℃で約1nM〜約1000nMである、構成59〜78のいずれか一項記載の組成物。
（構成８０）
前記H-NOXタンパク質のO2解離定数が20℃で約1μM〜約10μMである、構成59〜79のいずれか一項記載の組成物。
（構成８１）
前記H-NOXタンパク質のO2解離定数が20℃で約10μM〜約50μMである、構成59〜80のいずれか一項記載の組成物。
（構成８２）
前記H-NOXタンパク質のNO反応性が20℃で約700s-1未満である、構成59〜81のいずれか一項記載の組成物。
（構成８３）
前記H-NOXタンパク質のNO反応性がヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも100倍低い、構成59〜82のいずれか一項記載の組成物。
（構成８４）
前記H-NOXタンパク質のNO反応性がヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも1,000倍低い、構成83記載の組成物。
（構成８５）
前記H-NOXタンパク質の酸素に対するkoffが20℃で約0.65s-1以下である、構成59〜84のいずれか一項記載の組成物。
（構成８６）
前記H-NOXタンパク質の酸素に対するkoffが20℃で約0.21s-1〜約0.65s-1である、構成59〜85のいずれか一項記載の組成物。
（構成８７）
前記H-NOXタンパク質の酸素に対するkoffが20℃で約1.35s-1〜約2.9s-1である、構成59〜86のいずれか一項記載の組成物。
（構成８８）
前記H-NOXタンパク質のヘム自動酸化の速度が37℃で約1h-1未満である、構成59〜87のいずれか一項記載の組成物。
（構成８９）
構成1〜58のいずれか一項記載の方法による個体の脳卒中、低酸素脳損傷、又は一過性虚血発作の治療のためのH-NOXを含む医薬組成物。
（構成９０）
個体の脳卒中、低酸素脳損傷、又は一過性虚血発作の治療のためのH-NOXを含む医薬組成物であって、構成59〜88のいずれか一項記載の組成物を含む、前記医薬組成物。
（構成９１）
個体の脳卒中、低酸素脳損傷、又は一過性虚血発作の治療のためのH-NOXを含む医薬組成物であって、構成59〜88のいずれか一項記載の組成物を含む、前記医薬組成物の使用。
（構成９２）
個体の脳卒中、低酸素脳損傷、又は一過性虚血発作の治療のための医薬の製造における、構成59〜88のいずれか一項記載の組成物を含む、H-NOXを含む組成物の使用。
（構成９３）
ポリエチレングリコール(PEG)に共有結合しているH-NOXの治療有効量及びポリエチレングリコールに共有結合していないH-NOXの治療有効量を含むキット。
（構成９４）
PEGに共有結合しているH-NOXとPEGに共有結合していないH-NOXの比が、約9:1、約8:2、約7:3、約6:4;約5:5;約4:6;約3:7;約2:8;又は約1:9である、構成93記載のキット。
（構成９５）
脳卒中、一過性虚血発作、又は低酸素脳損傷後の個体に酸素を送達する方法で使用される、構成93又は94記載のキット。
（構成９６）
個体の脳卒中、一過性虚血発作、又は低酸素脳損傷を治療する方法で使用される、構成93〜95のいずれか一項記載のキット。
（構成９７）
前記H-NOXが、前記脳卒中、一過性虚血発作、又は低酸素脳損傷と関連する低酸素ペナンブラにO2を送達する、構成95又は96記載のキット。
（構成９８）
前記個体が、前記脳卒中、一過性虚血発作、又は低酸素脳損傷の結果として、脳の持続的低灌流を示す、構成95〜97のいずれか一項記載のキット。
（構成９９）
閉塞の部位又は脳卒中、一過性虚血発作、もしくは低酸素脳損傷と関連する低酸素ペナンブラへのH-NOXの送達が、該閉塞の部位又は該ペナンブラにおけるアストロサイト、ミクログリア、及び/又はマクロファージの活性化を低下させる、構成95〜98のいずれか一項記載のキット。
（構成１００）
閉塞の部位又は脳卒中、一過性虚血発作、もしくは低酸素脳損傷と関連する低酸素ペナンブラへのH-NOXの送達が、脳卒中、低酸素脳損傷、又は一過性虚血発作と関連する感覚運動障害を軽減する、構成95〜99のいずれか一項記載のキット。
（構成１０１）
前記PEGに共有結合しているH-NOXが前記PEGに共有結合していないH-NOXとともに投与される、構成93〜100のいずれか一項記載のキット。
（構成１０２）
前記H-NOXが、約9:1、約8:2、約7:3、約6:4;約5:5;約4:6;約3:7;約2:8;又は約1:9である、PEGに共有結合しているH-NOXとPEGに共有結合していないH-NOXの比で送達される、構成101記載のキット。
（構成１０３）
前記PEGに共有結合しているH-NOX及び前記PEGに共有結合していないH-NOXが組成物中にある、構成101又は102記載のキット。
（構成１０４）
前記PEGに共有結合しているH-NOX及び前記PEGに共有結合していないH-NOXが同時に又は順次送達される、構成93〜103のいずれか一項記載のキット。
（構成１０５）
前記PEGに共有結合しているH-NOX及び前記PEGに共有結合していないH-NOXが同時に送達される、構成104記載のキット。
（構成１０６）
前記PEGに共有結合しているH-NOX及び前記PEGに共有結合していないH-NOXが順次送達される、構成104記載のキット。
（構成１０７）
前記PEGに共有結合しているH-NOXが前記PEGに共有結合していないH-NOXの投与の前に投与される、構成106記載のキット。
（構成１０８）
前記PEGに共有結合しているH-NOXが前記PEGに共有結合していないH-NOXの投与の後に投与される、構成106記載のキット。
（構成１０９）
前記PEGに共有結合しているH-NOXが、前記PEGに共有結合していないH-NOXの投与から約1時間後、約2時間後、約4時間後、約6時間後、約8時間後、約10時間後、約12時間後、約24時間後、又は約24時間よりも長い時間の後に投与される、構成108記載のキット。
（構成１１０）
前記PEGに結合しているH-NOXが、PEGに結合していないH-NOXの投与から1時間後、1日後、2日後、又は3日後のうちの1つ又は複数で投与される、構成108記載のキット。
（構成１１１）
前記PEGに結合しているH-NOXが、PEGに結合していないH-NOXの投与から約1時間後、約1日後、及び約2日後に投与される、構成108記載のキット。
（構成１１２）
前記個体が哺乳動物である、構成93〜111のいずれか一項記載のキット。
（構成１１３）
前記哺乳動物がヒトである、構成112記載のキット。
（構成１１４）
前記PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び前記PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質が同じH-NOXタンパク質に由来する、構成93〜113のいずれか一項記載のキット。
（構成１１５）
前記PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び前記PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質が異なるH-NOXタンパク質に由来する、構成93〜114のいずれか一項記載のキット。
（構成１１６）
前記PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び/又は前記PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質が、T.テングコンジェンシスH-NOX、L.ニューモフィラ2群H-NOX、ヒトβ1、ラットβ1、タイリクオオカミH-NOX、キイロショウジョウバエβ1、キイロショウジョウバエCG14935-PA、線虫GCY-35、N.パンクチフォルムH-NOX、C.クレセンツスH-NOX、S.オネイデンシスH-NOX、又はC.アセトブチリクムH-NOXである、構成93〜115のいずれか一項記載のキット。
（構成１１７）
前記PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び/又は前記PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質が、配列番号2に示されるT.テングコンジェンシスのH-NOXドメインに対応するH-NOXドメインを含む、構成93〜116のいずれか一項記載のキット。
（構成１１８）
前記PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び/又は前記PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質が1以上の遠位ポケット突然変異を含む、構成93〜117のいずれか一項記載のキット。
（構成１１９）
前記遠位ポケット突然変異がT.テングコンジェンシスH-NOXのL144に対応する部位におけるアミノ酸置換である、構成118記載のキット。
（構成１２０）
前記H-NOXが、位置144におけるアミノ酸置換を含むT.テングコンジェンシスH-NOXである、構成118又は119記載のキット。
（構成１２１）
前記位置144におけるアミノ酸置換がL144F置換である、構成120記載のキット。
（構成１２２）
前記PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び/又は前記PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質が重合体型H-NOXタンパク質である、構成93〜121のいずれか一項記載のキット。
（構成１２３）
前記重合体型H-NOXタンパク質が単量体を含み、ここで、該単量体がH-NOXドメイン及び重合ドメインを含む、構成122記載のキット。
（構成１２４）
前記H-NOXドメインが前記重合ドメインに共有結合している、構成123記載のキット。
（構成１２５）
前記重合体型H-NOXタンパク質が三量体型H-NOXタンパク質である、構成122〜124のいずれか一項記載のキット。
（構成１２６）
前記三量体型H-NOXタンパク質が1以上の三量体化ドメインを含む、構成125記載のキット。
（構成１２７）
前記三量体型H-NOXタンパク質が3つの単量体を含み、ここで、該単量体がH-NOXドメイン及び三量体化ドメインを含み、ここで、該三量体化ドメインがバクテリオファージT4三量体化ドメインである、構成126記載のキット。
（構成１２８）
前記三量体化ドメインがフォルドンドメインである、構成126又は127記載のキット。
（構成１２９）
前記フォルドンドメインが配列番号4のアミノ酸配列を含む、構成128記載のキット。
（構成１３０）
前記H-NOXタンパク質が免疫グロブリンのFcドメインに融合している、構成93〜129のいずれか一項記載のキット。
（構成１３１）
前記H-NOXタンパク質のO2解離定数がヘモグロビンのO2解離定数の2桁以内であり、かつ該H-NOXタンパク質のNO反応性がヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも10倍低い、構成93〜130のいずれか一項記載のキット。
（構成１３２）
前記重合体型H-NOXタンパク質のO2解離定数が20℃で約1nM〜約1000nMである、構成93〜131のいずれか一項記載のキット。
（構成１３３）
前記H-NOXタンパク質のO2解離定数が20℃で約1μM〜約10μMである、構成93〜132のいずれか一項記載のキット。
（構成１３４）
前記H-NOXタンパク質のO2解離定数が20℃で約10μM〜約50μMである、構成93〜133のいずれか一項記載のキット。
（構成１３５）
前記H-NOXタンパク質のNO反応性が20℃で約700s-1未満である、構成93〜134のいずれか一項記載のキット。
（構成１３６）
前記H-NOXタンパク質のNO反応性がヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも100倍低い、構成93〜135のいずれか一項記載のキット。
（構成１３７）
前記H-NOXタンパク質のNO反応性がヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも1,000倍低い、構成136記載のキット。
（構成１３８）
前記H-NOXタンパク質の酸素に対するkoffが20℃で約0.65s-1以下である、構成93〜137のいずれか一項記載のキット。
（構成１３９）
前記H-NOXタンパク質の酸素に対するkoffが20℃で約0.21s-1〜約0.65s-1である、構成93〜138のいずれか一項記載のキット。
（構成１４０）
前記H-NOXタンパク質の酸素に対するkoffが20℃で約1.35s-1〜約2.9s-1である、構成93〜139のいずれか一項記載のキット。
（構成１４１）
前記H-NOXタンパク質のヘム自動酸化の速度が37℃で約1h-1未満である、構成93〜140のいずれか一項記載のキット。
（構成１４２）
使用のための指示をさらに含む、構成93〜141のいずれか一項記載のキット。
（構成１４３）
脳卒中、一過性虚血発作、又は低酸素脳損傷を治療するための組成物を調製する方法であって、PEGと共有結合しているH-NOXをPEGに共有結合していないH-NOXと混合することを含む、前記方法。
（構成１４４）
PEGに共有結合しているH-NOXとPEGに共有結合していないH-NOXの比が、約9:1、約8:2、約7:3、約6:4;約5:5;約4:6;約3:7;約2:8;又は約1:9である、構成143記載の方法。
（構成１４５）
前記組成物が構成59〜88のいずれか一項記載の組成物である、構成143又は144記載の方法。