(57)【要約】光合成微細藻類からキサントフィルを製造する方法であって、キサントフィルを含有する光合成微細藻類、好ましくはシスト化した微細藻類を栄養培地に接種して増殖させる工程、および、該増殖した微細藻類をシスト化させる工程を含む方法が提供される。窒素源濃度が低い栄養培地を用いて、増殖工程およびシスト化工程を連続的に行う、１段階培養法、あるいは、窒素源濃度が高い栄養培地で増殖し、シスト化培地に移植する２段階培養法が適用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
光合成微細藻類からキサントフィルを製造する方法であって、
キサントフィルを含有する光合成微細藻類を栄養培地に接種して増殖させる工程；および、該増殖した微細藻類をシスト化させる工程を含む、方法。
【請求項２】
前記キサントフィルを含有する光合成微細藻類が、シスト化された光合成微細藻類である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記増殖工程およびシスト化工程が同一培養槽内で行なわれる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記増殖工程およびシスト化工程が、低栄養培地を用いて行われる、請求項１から３のいずれかの項に記載の方法。
【請求項５】
前記増殖工程およびシスト化工程が回分培養で行われる、請求項１から４のいずれかの項に記載の方法。
【請求項６】
前記増殖工程およびシスト化工程が、それぞれ異なる培地を用いて行なわれる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記増殖工程およびシスト化工程が、それぞれ回分培養で行なわれる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記増殖工程およびシスト化工程が、光照射下行われる、請求項１から７のいずれかの項に記載の方法。
【請求項９】
前記微細藻類がヘマトコッカス属に属する緑藻である、請求項１から８のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１０】
前記緑藻がヘマトコッカス・プルビアリスである、請求項１から９のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１１】
前記キサントフィルがアスタキサンチンである、請求項１から１０のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１２】
キサントフィルを含有する遊走子を有する光合成微細藻類。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、キサントフィルの効率的な生産方法に関する。
【背景技術】  カロチノイドの一種であるキサントフィル（例えば、アスタキサンチン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、アドニルピン、アドニキサンチン、クリプトキサンチンなど）は、種々の用途に使用されている。例えば、アスタキサンチンは、赤色のカロチノイドの一種であり、強力な抗酸化作用を有することが知られている。そのため、食材用色素、化粧品、健康食品、医薬品などとして使用されている。アスタキサンチンは、化学合成されるものの他、天然物由来のものがある。天然物由来のアスタキサンチンは、オキアミ、アマエビなどのエビ類、ファフィア酵母、藻類などから抽出されている。しかし、オキアミなどのエビ類あるいは酵母のアスタキサンチン含量は低いため、効率よくアスタキサンチンが抽出されない。
他方、藻類、例えば、ヘマトコッカスは、外部環境の変化に応じてシスト化し、藻体内にアスタキサンチンを蓄積する。そのため、藻類によるアスタキサンチンの生産研究が行われている。
例えば、Ｊ．Ｆａｂｒｅｇａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｖｏｌ．８９，ｐ６６，（２００１）には、ヘマトコッカスを２段階で培養し、アスタキサンチンを生産する方法が記載されている。この方法では、第１段階で、１日に１０〜４０％の培養液を交換しながら（すなわち、半回分培養しながら）ヘマトコッカスの栄養細胞を得る。第２段階では、さらに１５日間、光を照射しながら回分培養を行い、栄養細胞の休眠細胞化（すなわち、シスト化）と細胞内部へのアスタキサンチンの蓄積を誘発する。
Ｒ．Ｔ．Ｌｏｒｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ，ｖｏｌ．１８（Ａｐｒｉｌ），ｐ１６０−１６７，（２０００）には、アスタキサンチンの商業的生産のために、ヘマトコッカスの２段階培養方法が記載されている。この方法においては、第１段階で、密閉されたバイオリアクター内で光照射しながらヘマトコッカスを培養して栄養細胞を得る。そして、次の第２段階では、この栄養細胞を、培地中の窒素とリンを欠乏させた屋外培養池に移し、培養池の温度を上昇させながら照射光の強度を上げて培養するか、屋外培養池の培地に塩化ナトリウムを添加して培養することにより、栄養細胞の休眠細胞化（すなわち、シスト化）と細胞内部へのアスタキサンチンの蓄積を誘発する。
特開２０００−６０５３２号公報には、第１段階で、密閉されたバイオリアクター内で光照射しながらヘマトコッカスを培養して栄養細胞を得、そして、次の第２段階では、屋外培養池で休眠細胞に移行させてアスタキサンチンの生成、蓄積を誘発させ、ヘマトコッカスを捕食するあるいはヘマトコッカスに寄生する生物が増殖する前に、ヘマトコッカスを回収する方法が記載されている。
しかし、上記のような２段階の反応においては、第２段階において、レースウェイ式大気開放型培養液などの開放または屋外培養池で培養を行う場合、培地に雑菌が増殖する可能性が高い。そのため、短期間にシスト化を行わなければならず、シスト化細胞のアスタキサンチン含量も低い。アスタキサンチンの生産効率を高めるためには、大量の栄養細胞を準備しなければならない。
他方、特開２００４−１２９５０４号公報には、暗所でもしくは光を照射しないで、かつ好気的な条件下でヘマトコッカスを培養することにより、アスタキサンチンを生産する方法が記載されているが、アスタキサンチンの生産性は低いという問題がある。
そこで、藻類からの効率的なアスタキサンチンの製造方法が望まれている。
【発明の開示】
本発明は、光合成微細藻類からキサントフィルを製造する方法であって、
キサントフィルを含有する光合成微細藻類を栄養培地に接種して増殖させる工程；および、該増殖した微細藻類をシスト化させる工程を含む方法を提供する。
１つの実施形態では、上記キサントフィルを含有する光合成微細藻類が、シスト化された光合成微細藻類である
別の実施形態では、上記増殖工程およびシスト化工程が同一培養槽内で行なわれる。
また、別の実施形態では、上記微細藻類の増殖およびシスト化が、前記増殖工程およびシスト化工程が、低栄養培地を用いて行われる。
さらに別の実施形態では、上記増殖工程およびシスト化工程が回分培養で行われる。
さらに異なる実施形態では、上記増殖工程およびシスト化工程が、それぞれ異なる培地を用いて行なわれる。
別の実施態様では、上記増殖工程およびシスト化工程が、それぞれ回分培養で行なわれる。
また、一つの実施形態では、上記増殖工程およびシスト化工程が、光照射下行われる。
さらに別の実施形態では、上記記微細藻類がヘマトコッカス属に属する緑藻である。
また、別の実施形態では、上記緑藻がヘマトコッカス・プルビアリスである。
さらに異なる実施形態では、上記キサントフィルがアスタキサンチンである。
また、本発明は、キサントフィルを含有する遊走子を有する光合成微細藻類を提供する。
【図面の簡単な説明】  図１は、栄養培地に接種するヘマトコッカスのシスト化細胞の顕微鏡写真である。
図２は、培養開始から５０時間目のヘマトコッカス細胞の顕微鏡写真である。
図３は、培養開始から２００時間目のヘマトコッカス細胞の顕微鏡写真である。
図４は、培養開始から３５０時間目のヘマトコッカス細胞の顕微鏡写真である。
図５は、本発明の１段階培養方法における、藻類の増殖およびアスタキサンチン含量の経時変化を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明の方法は、キサントフィルを含有する光合成微細藻類、好ましくはシスト化した光合成微細藻類を増殖培地に接種して増殖させ、ついで、シスト化させることを特徴とする。以下、本明細書において、光合成微細藻類を単に「微細藻類」ということがある。
キサントフィルを含有する微細藻類、好ましくはキサントフィルを多く蓄積した、シスト化した微細藻類を増殖培地に接種して増殖させた場合、シスト化した微細藻類は、キサントフィルを含有する遊走子を放出する。この遊走子がキサントフィルを含有したまま、栄養細胞となる。栄養細胞は、さらにキサントフィルを含有したまま、分裂によっても増殖する。従って、微細藻類の数は、単純な細胞分裂による場合よりも、早く増加する。そして、この増殖（増加）した、キサントフィルを含有する微細藻類（栄養細胞）をさらにシスト化することにより、更なるキサントフィルが微細藻類内で、生産され、蓄積される。従って、本発明の方法でシスト化した微細藻類中には、もともと存在していたキサントフィルに加えて、新たに生産されたキサントフィルが含まれるので、単に微細藻類の栄養細胞からシスト化させた場合に比べて、キサントフィル含量が高くなる。以下、本発明について、詳細に説明する。
（光合成微細藻類）
本発明に用いられる光合成微細藻類としては、光合成をすることができ、かつキサントフィルを生産する能力がある藻類であれば、特に制限はない。緑藻類が、キサントフィル類の生産の点から、好ましく用いられる。
本発明に用いられる緑藻類としては、例えば、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する単細胞藻類が好ましく用いられる。好ましいヘマトコッカス属の藻類としては、ヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）、ヘマトコッカス・ラクストリス（Ｈ．ｌａｃｕｓｔｒｉｓ）、ヘマトコッカス・カペンシス（Ｈ．ｃａｐｅｎｓｉｓ）、ヘマトコッカス・ドロエバケンシ（Ｈ．ｄｒｏｅｂａｋｅｎｓｉ）、ヘマトコッカス・ジンバブエンシス（Ｈ．ｚｉｍｂａｂｗｉｅｎｓｉｓ）などが挙げられる。  ヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）としては、独立行政法人国立環境研究所に寄託されているＮＩＥＳ１４４株、米国テキサス大学藻類保存施設に寄託されているＵＴＥＸ２５０５株、デンマークのコペンハーゲン大学のＳｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ，Ｂｏｔａｎｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに保存されているＫ００８４株などが挙げられる。
ヘマトコッカス・ラクストリス（Ｈ．ｌａｃｕｓｔｒｉｓ）としては、ＡＴＣＣに寄託されているＡＴＣＣ３０４０２株および同３０４５３株、東京大学応用微生物研究所に寄託されているＩＡＭ  Ｃ−３９２株、同Ｃ−３９３株、同Ｃ−３９４株および同Ｃ−３３９株、あるいはＵＴＥＸ  １６株および同２９４株などが挙げられる。
ヘマトコッカス・カペンシス（Ｈ．ｃａｐｅｎｓｉｓ）としては、ＵＴＥＸ  ＬＢ１０２３株などが挙げられる。
ヘマトコッカス・ドロエバケンシ（Ｈ．ｄｒｏｅｂａｋｅｎｓｉ）としては、ＵＴＥＸ  ５５株が挙げられる。
ヘマトコッカス・ジンバブエンシス（Ｈ．ｚｉｍｂａｂｗｉｅｎｓｉｓ）としては、ＵＴＥＸ  ＬＢ１７５８株などが挙げられる。
これらの中でも、ヘマトコッカス・プルビアリスが好ましく用いられる。
（シスト化）
本発明においては、上記微細藻類であって、キサントフィルを含有する微細藻類が、栄養培地に接種される。キサントフィルを含有する微細藻類には、キサントフィルを含有する栄養細胞およびシスト化した微細藻類が含まれる。キサントフィルを含有する微細藻類の栄養細胞は、その微細藻類が、かつてシスト化していた（休眠状態にあった）ことを意味する。
微細藻類は、例えば、光照射、栄養飢餓状態、酸化物の存在など、生育環境からのストレスを受けると、細胞内にキサントフィルなどを蓄積し、休眠胞子化する。この休眠状態に入ることをシスト化という。本明細書では、シスト化は、休眠状態に入りキサントフィルを蓄積し始めた状態から完全にシスト化し休眠胞子となった状態までのいずれかの状態を含む。キサントフィル含量を高める観点からは、できるだけシスト化が進行し、キサントフィルを多く蓄積した微細藻類を用いることが好ましい。
（培地）
微細藻類の培養に用いる培地としては、特に制限がない。一般に、増殖に必要な窒素と、微量金属の無機塩（例えば、リン、カリウム、マグネシウム、鉄など）、ビタミン類（例えば、チアミンなど）などを含む培地が用いられる。例えば、ＶＴ培地、Ｃ培地、ＭＣ培地、ＭＢＭ培地、ＭＤＭ培地などの培地（これらは、藻類研究法  千原光雄・西澤一俊編、共立出版（１９７９）を参照のこと）、ＯＨＭ培地（これは、非特許文献１を参照のこと）、ＢＧ−１１培地およびこれらの改変培地などが用いられる。
これらの培地は、増殖を目的とする培地、シスト化を目的とする培地など、用途に応じて使用することができる。例えば、微細藻類の増殖を目的とする場合は、窒素源となる成分の多い培地（富栄養培地：窒素として、０．１５ｇ／Ｌ以上を含む培地）を用いる。シスト化を目的とする場合は、窒素源となる成分をほとんど含まない培地（シスト化培地：窒素として、０．０２ｇ／Ｌ未満）を用いる。あるいは、その中間の濃度の窒素源を含む培地（低栄養培地：窒素として、０．０２ｇ／Ｌ以上で、０．１５ｇ／Ｌ未満）を用いてもよい。
培地中の窒素源濃度、リン濃度などは、接種する微細藻類の量に依存して、決めればよい。例えば、培養開始時の微細藻類（ヘマトコッカス）の濃度が１０５オーダーの場合、低栄養培地を用いると、ある程度まで、微細藻類は増殖するが、窒素源の量が少ないため、増殖はすぐに止まる。このような場合、低栄養培地は、後述するように、一段階で（回分的に）増殖とシスト化を連続して行う場合に適した培地である。さらに、Ｎ／Ｐ比（モル比）を１０〜３０に、好ましくは１５〜２０に調整することにより、シスト化へスムーズに導くことができる。
培養開始時の微細藻類の濃度がさらに高い場合、上記富栄養培地を用いて、上記培養を行うことができる。
このように、培地の組成は、種々の条件を考慮して決定することができる。
なお、本発明で用いる培地には、酢酸、グルコースなどの有機炭素源がほとんど含まれないため、長期間の培養でも、雑菌の混入はほとんどない。
（培養装置）
微細藻類の培養装置は、二酸化炭素が供給でき、かつ培養液に光照射ができる装置であれば、特に制限はない。例えば、小スケールの場合は、扁平培養ビン、大スケールの場合は、ガラス製、プラスチック製などの透明板で構成された平板培養槽、照明器を備えた撹拌機つきのタンク型培養槽、チューブ型培養槽、エアドーム型培養槽、中空円筒型培養槽などが用いられる。また、密閉容器が好ましく用いられる。
（培養条件）
培養条件に特に制限はなく、一般に、微細藻類の培養に用いられる温度、ｐＨが用いられる。微細藻類の培養は、例えば１５〜３５℃で行われ、好ましくは２０〜２５℃で行われる。培養中のｐＨは、６〜８に保たれることが好ましい。二酸化炭素は、１〜３ｖ／ｖ％濃度の二酸化炭素を含有するガスを、例えば、０．２〜２ｖｖｍとなるように吹き込むことで、供給される。平板培養槽を用いる場合、この二酸化炭素の供給により、培養液が撹拌され、微細藻類に対して光照射が均一に行われる。
（光照射）
微細藻類の培養においては、通常、光合成有効光量子束密度（ＰＰＦＤ）を１００μｍｏｌ−ｐｈｏｔｏｎ／ｍ２ｓ（以下、単位をμｍｏｌ−ｐ／ｍ２ｓと略す）程度となるように光を照射するが、キサントフィルの生成量を増加させる観点からは、３００μｍｏｌ−ｐ／ｍ２ｓ以上であることが好ましく、５００μｍｏｌ−ｐ／ｍ２ｓ以上であることがより好ましい。このようなＰＰＦＤが大きい光を培養開始時からシスト化までの培養過程全般に亘って照射することにより、アスタキサンチンの生産量が大きくなる。なお、ＰＰＦＤは、ＬＩＣＯＲ−１９０ＳＡ平面光量子センサー（ＬＩＣＯＲ  Ｉｎｃ．，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＵＳＡ）を用いて、測定した光量子束密度であり、培地を入れていない培養装置の中央部にセンサーを配置し、光を照射して測定した値である。ガラス、アクリル樹脂などの透明板で構成された装置の場合、透明板を通過してくるＰＰＦＤを測定し、所定のＰＰＦＤとなるように光の照度あるいは光源の距離を決定し、光源を配置すればよい。
（培養方法）
培養は、上記培地、培養装置、培養条件などを適宜選択して組合せ、光照射下、行われる。培養方法には、２つの方法がある。一つは、シスト化した微細藻類を栄養培地に接種して増殖させ、シスト化させるまでを連続して、同一の培地で行う、１段階培養法である。他の一つは、シスト化した微細藻類を増殖させる培地とシスト化させる培地とを分離し、増殖とシスト化を別々に行う２段階培養法である。
１段階培養法は、シスト化した微細藻類を接種してから培養終了までの間、培地を交換することなく連続的に培養する方法である。すなわち、所定の培地で、同一培養槽内で、微細藻類の増殖およびシスト化を行う方法である。この１段階培養法は、連続培養には不向きであり、回分的に行われることが好ましい。この１段階培養法では、微細藻類はいったん増殖するが、培地中の栄養成分の消費による栄養飢餓ストレス、光照射によるストレス、高温による温度ストレス、塩化ナトリウムの添加によるストレスなどを受けて、増殖後、シスト化状態にスムーズに移行する。
キサントフィルを含有する微細藻類、好ましくはシスト化した微細藻類が栄養培地に接種されると、キサントフィルを含む遊走子を２ｎ個（ｎ＝１〜４）放出する。この遊走子がキサントフィルを含んだまま栄養細胞となるので、キサントフィルを含む栄養細胞の数が増加する（微細藻類が増殖する）。さらに、栄養細胞は、細胞分裂により、増殖する。このキサントフィルを含有する栄養細胞をシスト化することにより、もともと有していたキサントフィルに加えて、新たにキサントフィルが蓄積されることから、キサントフィル含量が高められる。
ところで、栄養細胞が増殖を続けると、細胞内のキサントフィル濃度が低下すると考えられるので、増殖は、キサントフィルが細胞内に残っている状態で停止させることが好ましい。
ある程度栄養細胞が増殖した時点で、微細藻類の増殖を停止させるためには、培地を栄養飢餓になるように設計することが好ましい。そのため、１段階培養法では、培地として、窒素源濃度が低い培地、例えば、上記低栄養培地が好ましく用いられる。接種するシスト化細胞の量が多い場合は、上記のように、窒素源濃度が高い培地、例えば、上記富栄養培地を用いてもよい。
なお、低栄養培地で微細藻類の生育が不十分である場合、富栄養培地あるいは低栄養培地を追加して、所望の濃度まで微細藻類を増殖させてもよい。
また、低栄養培地を用いる場合、Ｎ／Ｐ比（モル比）を１０〜３０の間に調整しておくと、増殖後スムーズにシスト化させることができる。
１段階培養法は、工程の管理が簡便であること、高濃度のキサントフィルを含有する微細藻類が簡便に得られること、別の培養槽に移し替える必要がないため、雑菌の混入が防止できること、培養槽が一つで済むことなどの利点がある。
２段階培養法は、シスト化した微細藻類を増殖させ、ついで、シスト化培地に移送して、シスト化を行う方法である。すなわち、２段階培養法では、まず、シスト化した微細藻類を富栄養培地または低栄養培地に、好ましくは富栄養培地に接種して微細藻類を増殖させる第１工程と、この微細藻類を回収して、窒素源をほとんど含まないシスト化培地に移行して、シスト化する第２工程からなる。
第１工程における微細藻類の増殖は、キサントフィルが栄養細胞に残存している間に終了させる必要があるため、栄養培地での培養は短時間で行われる。培養の開始時に富栄養培地を用いて培養すると、栄養細胞の増殖速度が、低栄養培地で培養した場合増殖速度よりも速いので、富栄養培地を用いることが好ましい。増殖終了後、微細藻類は回収され、シスト化培地に移し替えられ、第２工程のシスト化が行われる。
この第１工程と第２工程は、それぞれ、別の培養槽で回分的に行ってもよい。第１工程終了後、増殖した微細藻類を洗浄、回収し、同一培養槽に戻して、第２工程を行ってもよい。
この２段階培養法でも、キサントフィル含量が高い微細細胞が得られる。この２段階培養法は、１段階培養法に比べて、増殖工程が短時間ですむという利点があるが、途中に増殖した微細藻類を移し替える操作が必要となる。
得られたシスト化微細藻類の一部はキサントフィルの回収に、残りの一部は、再度、栄養培地への接種のために用いてもよい。
（キサントフィルの回収）
微細藻類のシスト化により、キサントフィルが微細藻類内に蓄積されるので、藻類を回収後、常法により、キサントフィルを回収することができる。例えば、機械的に微細藻類を破壊した後、有機溶媒により抽出するなどの方法が適用される。
【実施例】  以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、この実施例が本発明を制限するものではない。
なお、この実施例において、クロロフィル、キサントフィル、および乾燥藻体を測定したが、その測定法は以下の通りである。
（クロロフィルの測定）
培養液を５ｍｌ採取し、遠心分離（３５００ｒｐｍ、５分）して、微細藻類を回収する。微細藻類をボルテックスして分散させ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を５ｍｌ加えて分散して、３０分間遮光静置した。その後、７０℃の恒温槽で１０分間、加熱処理し、遠心分離でＤＭＳＯ画分を回収した。沈殿部分が着色している場合、さらにＤＭＳＯを５ｍｌ添加して、上記操作を繰り返す。この操作は、細胞の色が白色になるまで、繰り返す。回収したＤＭＳＯ画分を併せ、６７２ｎｍの吸光度を、分光光度計（日立分光光度計Ｕ−３２１０）を用いて測定する。クロロフィルの濃度は、以下の式で求められる。
クロロフィル濃度（μｇ／ｍｌ）＝１３．９×希釈倍率×吸光度
（キサントフィルの測定）
培養液を５ｍｌ採取し、遠心分離（３５００ｒｐｍ、５分）して、微細藻類を回収する。微細藻類をボルテックスして分散させ、５質量％のＫＯＨを含む３０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液を５ｍｌ加えて、緑藻をボルテックスし、分散させ、７０℃の恒温水槽で１０分間処理する。この処理により、クロロフィルが分解される。再度、遠心分離（３５００ｒｐｍ、５分）を行い、沈殿を回収する。ボルテックス後、酸（例えば酢酸）を用いて、残留アルカリを中和する。中和後、ＤＭＳＯを５ｍｌ加え、２０分間遮光静置し、さらに７０℃で１０分間、処理する。遠心分離（３５００ｒｐｍ、５分）により、上清を回収する。沈殿部分が着色している場合、さらにＤＭＳＯを５ｍｌ添加して、上記操作を繰り返す。この操作を細胞の色が白色になるまで、繰り返す。回収したＤＭＳＯ画分を併せ、４９２ｎｍの吸光度を測定する。キサントフィルの濃度は、以下の式で求められる。
キサントフィル濃度（μｇ／ｍｌ）＝４．５×希釈倍率×吸光度
なお、以下の実施例で使用するヘマトコッカス・プルビアリスが生産するキサントフィルは、ほとんどがアスタキサンチンである。上記キサントフィルの測定方法がアスタキサンチンの測定にも適用される。
（微細藻類の乾燥質量）
所定量の培養液を採取し、ＧＣ５０ガラス繊維ろ紙（ＴＯＹＯ・ＡＤＶＡＮＴＥＣ製）上で吸引濾過し、無機塩類を溶解するため、ｐＨ４の塩酸水溶液５ｍｌで２回洗浄した。その後、ろ紙ごと、１０５℃の恒温乾燥機で３時間乾燥させ、真空デシケーター中で１時間、室温まで冷却し、乾燥質量を測定した。なお、ＧＣ５０ガラス繊維ろ紙は、予め、上記恒温乾燥機で、１０５℃、１時間乾燥させて、その質量を測定しておいた。
（実施例１）
（前培養：増殖のためのシスト化細胞の取得）
キサントフィルのひとつであるアスタキサンチンを生産するヘマトコッカス・プルビアリスＫ００８４株（以下、単にＫ００８４株という）を用いた。１．５Ｌ、ライトパス２５ｍｍの密閉式扁平培養瓶に、以下の表１に示すＭＢＧ−１１培地を１Ｌ入れ、初発の濃度が０．６ｇ／ＬとなるようにＫ００８４株を接種した。なお、ＭＢＧ−１１培地のＮ／Ｐ比は２０である。
【表１】
2005116238.tif 000002
３容積％のＣＯ２を含むガスを６００ｍｌ／分の速度で（すなわち、０．６ｖｖｍで）通気しながら、培養温度２５℃、ｐＨを６〜８の間で調整し、以下に示す光照射条件下で５日間培養した。
光照射は、光源として白色蛍光灯（Ｎａｔｉｏｎａｌ製、ＦＬ４０ＳＳＷ／３７）を用いた。光照射の強度は、ＬＩＣＯＲ−１９０ＳＡ平面光量子センサーを用いて測定した培養槽受光方向のＰＰＦＤが１００μｍｏｌ−ｐ／ｍ２ｓとなるように、光照射の強度を調整した。
培養後のＫ００８４株は、緑色から、茶色ないし茶褐色に変色しており、シスト化したことが確認された。このシスト化したＫ００８４株は、乾燥質量あたり１．２％のアスタキサンチンを含有していた。この方法で得られた、栄養培地への接種に用いるシスト化細胞の顕微鏡写真を図１に示す。
（本培養：シスト化細胞の増殖および増殖した細胞のシスト化）
上記と同じ扁平培養瓶を用い、同じ培地（ＭＢＧ−１１培地）に、初発の濃度が０．６ｇ／Ｌとなるようにシスト化したＫ００８４株を接種し、上記と同じ培養条件で培養した。
培養の経過を、図１〜４および図５を参照しながら説明する。培養開始時のＫ００８４株は、図１に示すように褐色をしており、上記のように、アスタキサンチンの含有量は約１．２％であった。培養開始後、図５（ｃ）および（ｄ）に示すように、アスタキサンチンの含有率（乾燥藻体あたりのアスタキサンチン含量）はいったん低下するのに対して、クロロフィルの含有率（乾燥藻体あたりのクロロフィル量）は上昇する。そして、約５０時間目からは、これが反転する。すなわち、５０時間目以降、アスタキサンチンの含有率は上昇に転じ、クロロフィルの含有率は減少に転じる。この５０時間目は、増殖が停止し、シスト化に転じる時期と思われる。
５０時間目の細胞の顕微鏡写真を図２に示す。図２からわかるように、シスト化したヘマトコッカス細胞は、赤色を帯びた遊走子を含んでいる。この遊走子が放出され、栄養細胞に変化していることもわかる。すなわち、遊走子から生じた細胞の細胞壁の内側にクロロフィルの蓄積と思われる緑色の層が見られた。
さらに培養を続けると、アスタキサンチン含有率は徐々に上昇し、クロロフィルは減少する。培養開始から２００時間目の細胞の顕微鏡写真を図３に、３５０時間目の顕微鏡写真を図４に示す。２００時間経過した図３の細胞は細胞のサイズが大きくなるとともに、細胞の内側に形成された緑層（クロロフィル層）のさらに内側に褐色のアスタキサンチンが蓄積していることがわかる。３５０時間目には、さらに細胞のサイズが増大し、細胞壁の内側が赤色の内容物で占められていることがわかる。これらの経過は、図５（Ａ）の細胞濃度の経時的増加、図５（Ｂ）のアスタキサンチン濃度の経時的増加とよく一致する。３５０時間目の培養結果を表２に示す。
（比較例１）
Ｋ００８４株のシスト化していない栄養細胞をＭＢＧ−１１培地に接種したこと以外は実施例１と同様にして、３５０時間培養した。結果を表２に示す。
【表２】
2005116238.tif 000003
表２からわかるように、シスト化した微細藻類（ヘマトコッカス）を接種して増殖させ、シスト化させることにより、栄養細胞を接種して増殖させてた場合に比べて、アスタキサンチンの濃度および含有率が高くなることがわかる。
（実施例２）
シスト化した微細藻類を栄養培地で増殖させ、ついで、シスト化培地に移し替える２段階培養について、検討した。
以下の表３に示す培地を調製した。表３のＢＧ−１１培地は、実施例１の１段階培養に用いたＭＢＧ−１１培地の硝酸カリウム（ＫＮＯ３）０．４１ｇの代わりに、硝酸ナトリウムを１．５ｇ／Ｌ含む富栄養培地である。一方、ＮＢＧ−１１培地は、硝酸ナトリウムあるいは硝酸カリウムという窒素源を含まず、また、リンも含まない、シスト化培地である。
【表３】
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実施例１と同一条件で培養し、シスト化したＫ００８４株を回収し、洗浄して、表３のＢＧ−１１培地１Ｌに、初発の濃度が０．６ｇ／Ｌとなるように接種し、ＰＰＦＤが３００μｍｏｌ−ｐ／ｍ２ｓとなるように、光照射の強度を調整したこと以外は実施例１と同様の培養条件で、培養を開始した。１２０時間（５日）後にＫ００８４株を回収し、ＮＢＧ−１１培地（シスト化用培地）に接種して、同じ扁平培養瓶を用い、同じ培養条件でさらに培養を継続した。４００時間培養後の結果を表４に示す。
（実施例３）
一方、培地としてＭＢＧ−１１を用い、ＰＰＦＤが３００μｍｏｌ−ｐ／ｍ２ｓとなるように光照射の条件を調整したこと以外は実施例１と同様の培養条件で、シスト化細胞を接種して１段階で培養を行った。４００時間培養後の結果を表４に示す。
（比較例２）
栄養細胞をＢＧ−１１培地に接種したこと以外は、実施例２と同様にして、２段階培養を行った。４００時間培養後の結果を表４に示す。
【表４】
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この結果は、シスト化した微細藻類あるいはアスタキサンチンを含む微細藻類を増殖させ、シスト化させることにより、アスタキサンチン含量が高い微細藻類を得ることができることを示している。そして、１段階培養法および２段階培養法のいずれの方法も、アスタキサンチン含量の高い微細藻類を得る方法として、有用であることを示している。
【産業上の利用可能性】  本発明は、キサントフィルを含有する微細藻類、例えば、シスト化した微細藻類を接種して増殖させ、シスト化させることにより、キサントフィルを高濃度で含有する、シスト化した微細藻類が得られる。また、得られたシスト化した微細藻類の一部は、次の培養に用いられる。そのため、微細藻類による、効率的なキサントフィルの培養生産方法として、産業上有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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