(57)【要約】本発明は、アガロースが塗布された、胚性幹細胞培養容器、及び当該容器を用いて胚性幹細胞を培養することを特徴とする、胚幹細胞の培養方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アガロースを含む、胚性幹細胞培養用容器。
【請求項２】
請求項１に記載の容器を用いて胚性幹細胞を培養することを特徴とする、胚性幹細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、胚葉体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ、以下ＥＢと称する）形成のための胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ、以下ＥＳ細胞と称する）培養用容器（アガロースプレート）、及び当該容器を用いることを特徴とするＥＳ細胞培養方法に関する。
【背景技術】  ＥＳ細胞は、胚盤胞とよばれる初期胚から誘導される未分化の細胞であり、自己複製能と分化における全能性を有する細胞である。ＥＳ細胞は、インビトロにおいて集合塊として培養するだけで生殖細胞を含む全ての細胞に分化することが可能である。したがって、ヒトを含む哺乳動物の再生医療、創薬、遺伝子治療などにおいて利用可能なあらゆる型の細胞あるいは組織を供給しうるものとして期待されている。
ＥＳ細胞から細胞療法などの再生医療に必要とされる機能細胞を分化させる場合、まず三次構造を有するＥＢを形成させる必要がある。
従来からのＥＢ形成のためのＥＳ細胞培養方法として、（１）液体培地による浮遊培養、（２）メチルセルロースなどを含む半固形培地による培養、（３）液体培地による接着培養、（４）ハンギングドロップ法などがあげられる（Ｍｅｔｚｇｅｒ  ＪＭ，  Ｌｉｎ  ＷＩ，Ｓａｍｕｅｌｓｏｎ  ＬＣ．Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９４  Ａｕｇ；１２６（３）：７０１−７１１．）。
上記の培養方法のうち、ＥＢは、従来、ハンギングドロップ法と呼ばれる手法により形成されていた。しかし、ハンギングドロップ法は、胚葉体を含む培地の液滴を培地から吊る（垂らす）作業が必要であり、（１）操作が複雑で技術的に難度が高いこと、（２）コンタミネーションの危険性が高いこと、（３）均一なＥＢが作製しにくいこと、（４）ＥＢの形成率が低いこと、（５）ＥＢ形成後の分化誘導操作が困難であること、（６）培養中の細胞の顕微鏡観察ができないこと、などの点が指摘されていた（図１）。
したがって、従来からの方法、特にハンギングドロップ法と比較して簡便かつハンギングドロップ法と同等またはそれ以上の効率でＥＢを形成することができる培養基材とそれを用いた培養方法の開発・提供が望まれていた。
【発明の開示】
本発明は、アガロースを含む培養容器を用いて胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を培養することを特徴とするＥＳ細胞培養法、及びＥＳ細胞培養用アガロースプレートを提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、通常の動物細胞培養には使用しないアガロースを含む培養容器を用いると、簡便にＥＢを形成する方法を見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、アガロースを含む、胚性幹細胞培養用容器である。
また、本発明は、上記容器を用いて胚性幹細胞を培養することを特徴とする、胚性幹細胞の培養方法である。
【図面の簡単な説明】  図１は、ハンギングドロップ法及びアガロース法によるＥＢ形成法の概要図である。
図２は、アガロースディッシュによるＥＢ形成過程を示す図である。
図３は、アガロース法、ハンギングドロップ法で形成したＥＢから分化誘導させた細胞の遺伝子発現を示す図である。
図４は、アガロース法、ハンギングドロップ法で形成した各ＥＢから分化誘導させた肝細胞の尿素合成能を示す図である。
図５は、アガロース法、ハンギングドロップ法で形成した各ＥＢから分化誘導させた心筋細胞数の測定結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下に本発明を詳細に説明する。
本発明は、胚葉体形成のための、ＥＳ細胞培養用容器である。
本発明の培地に用いるアガロースは市販のいずれのアガロースも用いることができるが、成果の再現性もしくは精度の理由から、核酸電気泳動用あるいはそれに相当するアガロースが、またコストの面からは精製寒天（アガー）が好ましく用いられる。本発明では、アガーが好ましく用いられる。
本発明の培地を固形化するためのアガロースの濃度は、０．５％〜３％の範囲から選択され、好ましくは１．０％〜２．０％範囲で用いられる。
本発明は、上記アガロースを含む培養プレートを用いてＥＳ細胞を培養する方法を提供する。この方法は、ＥＳ細胞の増殖の工程および分化誘導の工程からなる。
まず、ＥＳ細胞の増殖の工程は、未分化状態にあるＥＳ細胞を培養し増殖させるために行われる。本発明では、マウス由来ＴＴ２細胞をＥＳ細胞のモデルとして使用することができる（以下ＥＳ細胞）。ＥＳ細胞を、ウシ胎児血清含有動物細胞培地（例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０等）中で３７℃、５％ＣＯ２／９５％気下でコンフルエントになるまで培養後、トリプシン処理して細胞を調製する。培地には、１０ｍＭ非必須アミノ酸混液（ＩＣＮ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製）、２−メルカプトエタノール（１ｍＭ）、１０００Ｕ／ｍｌ白血病細胞増殖阻害因子（ＬＩＦ，Ｅｓｇｒｏ，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）等を添加してもよい。
本発明で用いるＥＳ細胞株は、ヒトを含むいずれの動物種に由来するものであってもよい。特に、倫理上の理由からマウスに由来するＥＳ細胞株の使用が好ましい。ＥＳ細胞株は、白血病細胞増殖阻害因子（ＬＩＦ）含有培地を用いて、フィーダー細胞上で維持される。
分化誘導工程では、上記工程を経て増殖させたＥＳ細胞を、本発明の培養器に移植し、例えば３７℃、５％ＣＯ２／９５％気下で２０％ウシ胎児血清，０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール添加イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）を用いて培養し、各測定を行って、ＥＢ形成、さらに細胞分化の状態を検査する。本発明の培養法によれば、細胞の回収率は９０〜９５％、生存率は９５〜９８％である。
ＥＳ細胞から分化誘導される細胞を特定するために、各細胞で固有に発現する遺伝子あるいは遺伝子産物がマーカーとして用いられる。例えば、肝細胞に分化させたときは、アルブミン（ＡＬＢ）、α−フェトプロテイン（α−Ｆｅｔ）、α１−抗トリプシン（ＡＡＴ）、トランスサイレチン（ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ：ＴＴＲ）、アミノトランスフェラーゼ（ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＴＡＴ）、サイトケラチン−１９（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ−１９：ＣＫ１９）などから適宜選択されるマーカーが用いられ、心筋細胞に分化させたときはＣＭＡ（心筋アクチン：ｃａｒｄｉａｃ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ）などが用いられる。
それぞれのマーカーの発現を確認するためには、ＲＴ−ＰＣＲ法、ウエスタンブロット法等を用いる。それぞれのマーカー遺伝子の情報から、プライマーが設計、合成される。具体的には、以下の分化マーカー遺伝子（ＡＡＴ，ＴＴＲ，ＧＡＰＤＨ，ＣＫ−１９，ＴＡＴ，ＣＭＡ，アルブミン（Ａｌｂｕｍｉｎ），ａｌｆａ−ＦＰ）の発現の確認のため、以下のプライマーを使用することができる。
ＡＡＴ遺伝子発現の確認に用いるプライマー
上流プライマー  ５’  ＴＧＴ  ＣＣＣ  ＴＣＴ  ＣＴＧ  ＧＡＡ  ＡＣＴ  ＡＴ  ３’（配列番号１）
下流プライマー  ５’  ＴＧＴ  ＴＧＡ  ＡＧＴ  ＴＣＡ  ＧＧＡ  ＴＡＧ  ＧＧ  ３’（配列番号２）
最適アニーリング温度：５４．２℃、サイクル数；２８
ＴＴＲ遺伝子発現の確認に用いるプライマー
上流プライマー  ５’  ＣＧＴ  ＧＧＣ  ＴＧＴ  ＡＡＡ  ＡＧＴ  ＧＴＴ  ＣＡ  ３’（配列番号３）
下流プライマー  ５’  ＡＧＡ  ＧＴＣ  ＧＴＴ  ＧＧＣ  ＴＧＴ  ＧＡＡ  ＡＡ  ３’（配列番号４）
最適アニーリング温度：５５．２℃、サイクル数；２０
ＧＡＰＤＨ遺伝子発現の確認に用いるプライマー
上流プライマー  ５’  ＡＣＣ  ＡＣＡ  ＧＴＣ  ＣＡＴ  ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＡＣ  ３’（配列番号５）
下流プライマー  ５’  ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＣＴＧ  ＴＴＧ  ＣＴＧ  ＴＡ  ３’（配列番号６）
最適アニーリング温度：６０℃、サイクル数；１８
ＣＫ−１９遺伝子発現の確認に用いるプライマー
上流プライマー  ５’  ＡＡＧ  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＡＴＧ  ＧＡＣ  ＡＴＣ  ＡＡ  ３’（配列番号７）
下流プライマー  ５’  ＣＴＴ  ＴＴＡ  ＴＣＡ  ＣＣＣ  ＣＡＧ  ＴＣＡ  ＧＧ  ３’（配列番号８）
最適アニーリング温度：５７．６℃、サイクル数；２２
ＴＡＴ遺伝子発現の確認に用いるプライマー
上流プライマー  ５’  ＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＴＧＴＧＡＣＡＡＡＴ３’（配列番号９）
下流プライマー  ５’  ＡＧＣＣＧＡＡＴＡＡＴＧＧＧＡＧＡＡＴＣ３’（配列番号１０）
最適アニーリング温度：５６．１℃、サイクル数；２５
ＣＭＡ遺伝子発現の確認に用いるプライマー
上流プライマー  ５’ＡＡＡＴＣＡＣＴＧＣＡＣＴＧＧＣＴＣＣ３’（配列番号１１）
下流プライマー  ５’ＴＧＧＧＣＣＴＧＣＣＴＣＡＴＣＡＴＡＣ３’（配列番号１２）
最適アニーリング温度：５６．０℃、サイクル数；２４
アルブミン遺伝子発現の確認に用いるプライマー
上流プライマー  ５’ＴＴＣＣＴＣＣＴＴＴＧＣＣＴＣＧＣＴＧＧＡＣＴＧＧＴＡＴＴＴ  ３’（配列番号１３）
下流プライマー  ５’ＧＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＡＣＧＧＧＧＡＡＡＴＧＣＣＡＡＧＴ３’（配列番号１４）
最適アニーリング温度：６０．０℃、サイクル数；１９
ａｌｆａ−ＦＰ遺伝子発現の確認に用いるプライマー
上流プライマー  ５’ＣＣＣＣＣＡＴＴＣＴＣＴＧＡＧＧＡＴＡＡ３’（配列番号１５）
下流プライマー  ５’ＣＴＴＴＧＧＡＣＣＣＴＣＴＴＣＴＧＴＧＡ３’（配列番号１６）
最適アニーリング温度：５５．２℃、サイクル数；１９
これらのプライマーは、通常の化学合成により得ることができる。
ＲＴ−ＰＣＲは、具体的には以下のような条件で行われる：
市販のＲＴ−ＰＣＲキット並びにサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用い、ｃＤＮＡの増幅は変性（９４℃，１分間）アニーリング（各温度，１分間）伸長（７２℃，１分間）を１サイクルとした。
反応終了後、反応産物をエチジウムブロマイド（０．６μｇ／ｍｌ）含有１．５％アガロースゲル電気泳動で分離し、解析する。
肝細胞への分化を確認するために、ジアセチルモノオキシム法により尿素合成量を測定する。得られた結果から、ＥＢから分化を誘導した細胞に尿素合成能が確認できれば、肝細胞特異的なアンモニア除去能、すなわち肝細胞への分化が認められると判断できる。
心筋細胞への分化を確認するには、拍動する心筋細胞数を光学顕微鏡による観察下で計測する。具体的には、光学顕微鏡にて５０倍〜２００倍の倍率、好ましくは１００倍の倍率で、ランダムに選択した５〜１０視野、好ましくは２０〜３０の視野の拍動する細胞を、１〜３日ごと、好ましくは１日ごとに経時的に計測する。
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実  施例により限定されるものではない。
【実施例１】  培地組成並びにアガロースを用いたＥＢ作成法の検討
本実施例では、マウス由来ＴＴ２細胞をＥＳ細胞のモデルとして使用した（以下ＥＳ細胞）。ＥＳ細胞を２０％ウシ胎児血清、１０ｍＭ非必須アミノ酸混液（ＩＣＮ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製）、２−メルカプトエタノール（１ｍＭ）、１０００Ｕ／ｍｌ白血病細胞増殖阻害因子（ＬＩＦ，Ｅｓｇｒｏ，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）添加ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で３７℃、５％ＣＯ２／９５％気下でコンフルエントになるまで培養後トリプシン処理して細胞を調製し、以下の実験に使用した。
アガロース（ナカライテスク社製、精製アガー）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に１．５％の濃度で溶解して、オートクレーブ処理後、９６ウエルプレートもしくは６ｃｍプラスチックディッシュにコートした。
ハンギングドロップは１０００細胞１３０μｌ（１滴）、アガロース培養ではアガロースコート９６ウエルプレート、アガロースコート６ｃｍディッシュにそれぞれ１０００細胞／ウエル、もしくは１．０×１０４細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種した（図１）。播種後、２０％ウシ胎児血清，０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール添加イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中で５日間培養し、形成されるＥＢを経時的に光学顕微鏡下で観察した。
その結果を図２に示す。図２において、ＨＤ５はハンギングドロップ法で５日間培養後に形成されたＥＢの形態を示す。写真右下の棒線は２００μｍのサイズを示す。細胞同士が接着しながら培養経過と共にＥＢを形成した。５日後の標本では、アガロース法、ハンギングドロップ法両者により形成されたＥＢに形態的な差異はほとんど見られなかった。
【実施例２】  アガロース法により形成したＥＢの分化能の検討
実施例１に述べたアガロースを用いた方法によりＥＳ細胞からＥＢを作製した。作製したＥＢは、Ｉ型コラーゲンをコートしたディッシュに６０個／ディッシュの割合で播種し、ＩＭＤＭ培地中で９日、１２日、１５日及び１８日間培養し、分化誘導を行った。比較対照としてハンギングドロップ法により作製したＥＢについて同様な実験を行った。それぞれの細胞から、ＩＳＯＧＥＮＴＭ（和光純薬社製）を用いて全ＲＮＡを回収後、ＲＴ−ＰＣＲにより各種分化マーカー遺伝子の発現を観察した。その結果、肝分化マーカー遺伝子であるアルブミンの発現は培養９日から、ＴＴＲ、ＡＡＴは１８日以降発現が観察され、心筋細胞のマーカーであるＣＭＡ遺伝子は６日から発現が観察された（図３）。
図３において、ＣＫ−１９は、サイトケラチン−１９を、α−Ｆｅｔは、α−フェトプロテインを、ＡＬＢはアルブミンを、ＴＴＲはトランスサイレチンを、ＡＡＴは、α−抗トリプシンを、ＣＭＡは、心筋アクチンをそれぞれ示す。
アガロース法（図３中「ＡＧ」）で形成したＥＢ由来の分化細胞は、ハンギングドロップ法（図３中「ＨＤ」）で形成したＥＢ由来の分化細胞と各種マーカー遺伝子の発現に顕著な差異は観察されず、アガロース法で形成したＥＢがハンギングドロップ法で形成したＥＢと同様な分化能を有することが明らかになった。
【実施例３】  肝細胞の分化機能（尿素合成能）の測定
ハンギングドロップ法とアガロース法で作製したＥＢをコラーゲンコートしたディッシュにそれぞれ６０個播種し、ＩＭＤＭ培地中で１８日間培養し、分化誘導を行った。培養中にＥＳ細胞から分化した肝細胞の機能を尿素合成能を測定して判定し、両培養法の比較を行った。
その結果を図４に示す。図の結果より、ＥＳ細胞には発現していない尿素合成能が、９日目から確認された。また、アガロース（ＡＧ）法、ハンギングドロップ（ＨＤ）法により形成されたそれぞれのＥＢ由来の肝細胞の尿素合成能に差異は見られなかった。なお、図４のグラフは平均±ＳＥで示し、試料数は、ｎ＝３で行った。
【実施例４】  心筋細胞への分化能の測定
ハンギングドロップ法とアガロース法で作製したそれぞれＥＢをコラーゲンコートしたディッシュにそれぞれ６０個播種し、ＩＭＤＭ培地中で１８日間培養し、分化誘導を行った。光学顕微鏡下（１００倍）で２０視野を無作為に選択し、拍動している細胞数を測定することにより、培養中にＥＳ細胞から分化した心筋細胞（拍動細胞）数を計測し、ハンギングドロップ法とアガロース法で作製したＥＢの心筋細胞への分化能を比較した。
その結果を図５に示す。拍動する心筋細胞は分化誘導後１２日目まで増加しその後減少した。ハンギングドロップ法とアガロース法で作製したＥＢの拍動細胞への分化能にはほとんど差異はなかった。以上の結果より、アガロース法で形成されたＥＢはハンギングドロップ法により形成されたＥＢと構造的、機能的に差異がないことが確認された。なお、図５のグラフは平均±ＳＥで示し、試料数は、ｎ＝３で行った。
【産業上の利用可能性】  本発明により、再生医療（細胞療法）に必要とされる各種機能細胞の生産が容易となり、また本発明を再生医学にかかわる基礎研究用キットなどの開発へ応用することが可能となった。
【配列表フリーテキスト】  配列番号１：合成ＤＮＡ
配列番号２：合成ＤＮＡ
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
配列番号６：合成ＤＮＡ
配列番号７：合成ＤＮＡ
配列番号８：合成ＤＮＡ
配列番号９：合成ＤＮＡ
配列番号１０：合成ＤＮＡ
配列番号１１：合成ＤＮＡ
配列番号１２：合成ＤＮＡ
配列番号１３：合成ＤＮＡ
配列番号１４：合成ＤＮＡ
配列番号１５：合成ＤＮＡ
配列番号１６：合成ＤＮＡ
【図１】
2006003802.tif 000002
【図２】
2006003802.tif 000003
【図３】
2006003802.tif 000004
【図４】
2006003802.tif 000005
【図５】
2006003802.tif 000006
【配列表】
2006003802000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年2月23日(2006.2.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】培養培地中に０．５％〜３％の範囲のアガロースを含む、胚性幹細胞培養用容器。
【国際調査報告】
2006003802.tif 000013
2006003802.tif 000014
2006003802.tif 000015