【手続補正書】
【提出日】令和2年10月8日(2020.10.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) ヒト細胞に、
(i) 操作されたヌクレアーゼがヒトTCRアルファ定常領域遺伝子内の認識配列の位置で切断を生じ、切断により検出不能なレベルまでαβ-TCRの細胞表面発現の阻害がもたらされる、操作されたヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列または操作されたヌクレアーゼタンパク質、
(ii) CARまたは組み換えTCRをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む第2の核酸配列
を導入する段階
を含み、
該外因性ポリヌクレオチドの配列が該切断部位で該ヒトゲノムTCRアルファ定常領域遺伝子に挿入され、該ヒトゲノムTCRアルファ定常領域遺伝子に挿入された該外因性ポリヌクレオチドが、PCRによって増幅され得る、SEQ ID NO:8を含み; かつさらに非改変対照細胞と比較した場合に、該遺伝子改変細胞が内因性TCRの細胞表面発現を低減させる、
エンドヌクレアーゼ改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞を産生するための方法。
【請求項２】
エンドヌクレアーゼ誘導性オンサイトおよびオフサイトを、好ましくはpcrによっておよび/またはガイド配列によって検出する段階をさらに含む、請求項1記載のエンドヌクレアーゼ改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞を産生するための方法。
【請求項３】
操作されたヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALE-ヌクレアーゼ)、CRISPR/Casヌクレアーゼ、またはmegaTALヌクレアーゼである、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
操作されたヌクレアーゼがTALE-ヌクレアーゼである、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
外因性ポリヌクレオチドが、自己切断ペプチドおよびキメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
キメラ抗原受容体が、細胞外リガンド結合ドメインおよび1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
少なくとも第2の核酸配列が、該第2の核酸配列を含む組み換えアデノ随伴ウイルス(AAV6)ベクターと細胞を接触させることにより該細胞に導入される、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
組み換えAAVベクターが自己相補的AAVベクターである、好ましくは少なくとも部分的にAAV6に由来する、請求項7記載の方法。
【請求項９】
TALE-ヌクレアーゼが、野生型ヒトTCRアルファ定常領域中の配列ttgtcccacagATATCを認識する、請求項4記載の方法。
【請求項１０】
エンドヌクレアーゼが、
5'から3'方向に
2019531742.tif 000001
を認識しかつAAATCT内で切断するジンクフィンガー；以下の配列:
2019531742.tif 000002
2019531742.tif 000003
のいずれか1つに相補的な配列を認識するCrispr/Cas 9；MegaTAL；野生型ヒトTCRアルファ定常領域の残基番号93〜208内の認識配列を認識かつ切断するメガヌクレアーゼ
であり、
組み換えメガヌクレアーゼが第1サブユニットおよび第2サブユニットを含み、該第1サブユニットが、該認識配列の第1の認識半部位に結合しかつ第1の超可変(HVR1)領域を含み、かつ該第2サブユニットが、該認識配列の第2の認識半部位に結合しかつ第2の超可変(HVR2)領域を含む、請求項3記載の方法。
【請求項１１】
メガヌクレアーゼが、リンカーを含む一本鎖メガヌクレアーゼであり、該リンカーが第1サブユニットおよび第2サブユニットを共有結合する、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
請求項1〜11のいずれか一項記載の方法によって取得可能なエンドヌクレアーゼ改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞。
【請求項１３】
非改変対照細胞と比較した場合に、内因性TCRの細胞表面発現が低減されている、エンドヌクレアーゼ改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞。
【請求項１４】
前記配列SEQ ID NO:8がPCRによって増幅され得る、請求項13記載のエンドヌクレアーゼ改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞。
【請求項１５】
CARまたは組み換えTCRが抗原結合ドメインを含み、該抗原結合ドメインが疾患に関連する抗原に結合し、かつ該腫瘍抗原がCD19分子(CD19); 膜貫通4-ドメインA1(CD20としても知られるMS4A1); CD22分子(CD22); CD24分子(CD24); CD248分子(CD248); CD276分子(CD276またはB7H3); CD33分子(CD33); CD38分子(CD38); CD44v6; CD70分子(CD70); CD72; CD79a; CD79b; インターロイキン3受容体サブユニットα(CD123としても知られるIL3RA); TNF受容体スーパーファミリーメンバー8(CD30としても知られるTNFRSF8); KITがん原遺伝子受容体チロシンキナーゼ(CD117); V-setプレB細胞代替軽鎖1(VPREB1またはCD179a); 接着Gタンパク質共役受容体E5(ADGRE5またはCD97); TNF受容体スーパーファミリーメンバー17(BCMAとしても知られるTNFRSF17); SLAMファミリーメンバー7(CS1としても知られるSLAMF7); L1細胞接着分子(L1CAM); C型レクチンドメインファミリー12メンバーA(CLL-1としても知られるCLEC12A); 上皮増殖因子受容体の腫瘍特異的変種(EGFRvIII); 甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR); Fms様チロシンキナーゼ3(FLT3); ガングリオシドGD3(GD3); Tn抗原(Tn Ag); リンパ球抗原6ファミリーメンバーG6D(LY6G6D); デルタ様標準Notchリガンド3(DLL3); インターロイキン13受容体サブユニットα-2(IL-13RA2); インターロイキン11受容体サブユニットα(IL11RA); メソテリン(MSLN); 受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1); 前立腺幹細胞抗原(PSCA); erb-b2受容体チロシンキナーゼ2(ERBB2またはHer2/neu); プロテアーゼセリン21(PRSS21); キナーゼ挿入ドメイン受容体(VEGFR2としても知られるKDR); ルイスy抗原(LewisY); 溶質輸送体ファミリー39メンバー6(SLC39A6); 線維芽細胞活性化タンパク質α(FAP); Hsp70ファミリーシャペロン(HSP70); 血小板由来増殖因子β(PDGFR-beta); ニコチン様コリン作動性受容体α2サブユニット(CHRNA2); 時期特異的胚抗原-4(SSEA-4); ムチン1、細胞表面結合(MUC1); ムチン16、細胞表面結合(MUC16); クローディン18(CLDN18); クローディン6(CLDN6); 上皮増殖因子受容体(EGFR); 黒色腫において選択的に発現される抗原(PRAME); 神経細胞接着分子(NCAM); ADAMメタロペプチダーゼドメイン10(ADAM10); 葉酸受容体1(FOLR1); 葉酸受容体β(FOLR2); 炭酸脱水酵素IX(CA9); プロテアソームサブユニットβ9(PSMB9またはLMP2); エフリン受容体A2(EphA2); テトラスパニン10(TSPAN10); フコシルGM1(Fuc-GM1); シアリルルイス接着分子(sLe); TGS5; 高分子量黒色腫関連抗原(HMWMAA); o-アセチル-GD2ガングリオシド(OAcGD2); 腫瘍内皮マーカー7関連(TEM7R); Gタンパク質-共役受容体クラスCグループ5、メンバーD(GPRC5D); 染色体Xオープンリーディングフレーム61 (CXORF61); ALK受容体チロシンキナーゼ(ALK); ポリシアル酸; 胎盤特異的1 (Placenta-specific 1; PLAC1); globoHグリコセラミド(GloboH)の六糖部分; NY-BR-1抗原; ウロプラキン2(UPK2); ヘパタイティスAウイルス細胞受容体1(HAVCR1); アドレナリン受容体β3(ADRB3); パンネキシン3(PANX3); Gタンパク質-共役受容体20(GPR20); リンパ球抗原6ファミリーメンバーK(LY6K); 嗅覚受容体ファミリー51サブファミリーEメンバー2(OR51E2); TCRガンマ代替リーディングフレームタンパク質(TARP); ウィルムス腫瘍タンパク質(WT1); 12;21染色体転座によるETV6-AML1融合タンパク質(ETV6-AML1); 精子自己抗原タンパク質17(SPA17); X抗原ファミリー、メンバー1E(XAGE1E); TEK受容体フチロシンキナーゼ(Tie2); 黒色腫がん精巣抗原1(MAD-CT-1); 黒色腫がん精巣抗原2(MAD-CT-2); Fos関連抗原1; p53変異体; ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT); 肉腫転座切断点; アポトーシスの黒色腫阻害物質(ML-IAP); ERG(膜貫通プ��テアーゼ、セリン2(TMPRSS2)ETS融合遺伝子); N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼV(NA17); ペアボックスタンパク質Pax-3(PAX3); アンドロゲン受容体; サイクリンB1; v-mycトリ骨髄細胞腫ウイルスがん遺伝子神経芽腫由来ホモログ(MYCN); RasホモログファミリーメンバーC(RhoC); シトクロムP450 1B 1(CYP1B1); CCCTC結合因子(ジンクフィンガータンパク質)様(BORIS); T細胞によって認識される扁平上皮がん抗原3 (SART3); ペアボックスタンパク質Pax-5(PAX5); プロアクロシン結合タンパク質sp32(OY-TES1); リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(LCK); Aキナーゼアンカータンパク質4(AKAP-4); 滑膜肉腫、X切断点2(SSX2); 白血球関連免疫グロブリン様受容体1(LAIR1); IgA受容体のFc断片(FCAR); 白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーAメンバー2(LILRA2); CD300分子様ファミリーメンバーf(CD300LF); 骨髄間質細胞抗原2(BST2); EGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様2(EMR2); リンパ球抗原75(LY75); グリピカン-3(GPC3); Fc受容体様5(FCRL5); 免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド1(IGLL1)、および熱ショックタンパク質70(HSP70)からなる群より選択される、請求項13記載のエンドヌクレアーゼ改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞。
【請求項１６】
組み換えTCRが抗原結合ドメインを含み、該抗原結合ドメインが疾患に関連する腫瘍抗原に結合し、かつ該腫瘍抗原がPCTA-l/ガレクチン8、CD171、TAG72、CEA、EPCAM、PSCA、PRSS21、PDGFR-ベータ、プロスターゼ(Prostase)、PAP、ELF2M、エフリンB2、IGF-I受容体、CAIX, gp100、bcr-abl、チロシナーゼ、GM3、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、レグマイン、HPV E6,E7、MAGE Al、プロステイン、サバイビンおよびテロメラーゼ、PCTA-l/ガレクチン8、MelanA/MARTl、Ras変異体、TRP-2、RAGE-1、RU1、RU2、ならびに腸管カルボキシルエステラーゼからなる群より選択される、請求項13記載のエンドヌクレアーゼ改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞。
【請求項１７】
CARが疾患に関連する腫瘍抗原に結合する抗原結合ドメインを含み、かつ該腫瘍抗原がCD22、CD123、CS-1、CLL-1、CD38、HSP70、MUC-1、CD30、FAP、HER2、CD79aおよびCD79bからなる群より選択される、請求項13記載のエンドヌクレアーゼ改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞。
【請求項１８】
外因性ポリヌクレオチドが、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10またはSEQ ID NO:11と少なくとも80%の同一性を有する、抗CD22 CARをコードする配列を含む、請求項13記載のエンドヌクレアーゼ改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞。
【請求項１９】
外因性ポリヌクレオチドが、SEQ ID NO:12と少なくとも80%の同一性を有する、抗CD123 CARをコードする配列を含む、請求項13記載のエンドヌクレアーゼ改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５３８】
本発明は、SEQ ID NO：13〜22のいずれか1つ、それらの組み合わせのエンドヌクレアーゼによるオンサイトおよび/またはオフサイト切断を検出するための上記のような手段を提供する。
[本発明1001]
ゲノムTCR遺伝子(TRAC遺伝子)の定常領域が、
TALENにより生成されかつ内因性アルファベータTCRの細胞表面発現に影響を与える遺伝子改変
を含み、該ゲノムTRAC遺伝子が5'から3'方向に、
(a) 該ヒトゲノムTRAC遺伝子上流の5'領域、
(b) 半TALEN用の認識ドメイン、
(c) アルファベータTCRの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインの細胞表面発現に影響を与える野生型TRAC遺伝子と比較したギャップまたは挿入であって、挿入が、終止コドン、IRES、TRACオープンリーディングフレームとインフレームの自己切断ペプチドをコードする配列のようなコード配列、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする配列、TCRをコードする配列、薬物に対する感受性を付与するタンパク質をコードする配列、薬物に対する耐性を付与するタンパク質をコードする配列、サイトカイン、終結配列、それらの組み合わせのような非コード配列から選択される外因性ポリヌクレオチドを含む、ギャップまたは挿入、
(c') 任意でもう一方の半TALEN用の認識ドメイン、
(d) ゲノムTRAC遺伝子の3'領域
を含む、TALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト初代細胞。
[本発明1002]
ヒト初代細胞が、ヒト初代T細胞、またはヒトリンパ系初代細胞、またはヒト初代幹細胞、またはヒト初代前駆細胞である、本発明1001のTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト初代細胞。
[本発明1003]
ヒト初代細胞が、ヒト初代T細胞またはヒト初代T細胞の集団である、本発明1001〜1002のいずれかのTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト初代細胞。
[本発明1004]
ヒトT初代細胞またはその集団が、ヒト初代CD8 T細胞、ヒト初代CD4 T細胞、それらの組み合わせを含むかまたはそれからなる、本発明1001〜1003のいずれかのTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト初代細胞。
[本発明1005]
TALEN用の認識ドメインが以下の配列
2019531742.tif 000004
および任意で
2019531742.tif 000005
を含む、本発明1001〜1004のいずれかのTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト初代細胞。
[本発明1006]
TRAC遺伝子中の以下の配列:
2019531742.tif 000006
またはTRAC遺伝子中のSEQ ID NO：9、10、11もしくは12のいずれか1つを含む、本発明1001〜1005のいずれかのTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト初代細胞。
[本発明1007]
CAR配列が、抗CD22 CAR配列、抗CD123 CAR配列、抗CD30 CAR配列、抗HSP-70 CAR配列、抗o-アセチル-GD2 CAR配列、抗CS-1 CAR配列、抗CLL-1 CAR配列、抗CD38 CAR配列、抗5T4 CAR配列、抗MUC1 CAR配列、抗FAP CAR配列、抗HER2 CAR配列、抗CD79a CAR配列、抗CD79b CARを含む、本発明1001〜1006のいずれかのTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト初代細胞。
[本発明1008]
ポリヌクレオチド配列が、以下の配列: SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12のうち1つを含む、本発明1001〜1007のいずれかのTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト初代細胞。
[本発明1009]
改変されていない対照細胞と比較して検出不能なレベルのMHC分子と、ベータ2ミクログロブリン分子のまたはCIITA分子の細胞表面発現に機能的に影響を与える欠失とをさらに含む、本発明1001〜1008のいずれかのTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞。
[本発明1010]
前記挿入が、TCRアルファをコードする遺伝子の不活性化および内因性αβ-TCRの検出不能な細胞表面発現を、全細胞の少なくとも96％において、全細胞の少なくとも97％において、全細胞の少なくとも98％において、全細胞の少なくとも99％において引き起こした、本発明1001〜1009のいずれかのTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞。
[本発明1011]
SEQ ID NO：3と少なくとも100％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％〜80％の同一性を有する配列を有する第1の半TALENであって、該第1のTALEN結合ドメインが
2019531742.tif 000007
に結合することを条件とする、第1の半TALENと、
SEQ ID NO：4と少なくとも100％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％〜80％の同一性を有する配列を有する第2の半TALENであって、該第2の半TALENが、
2019531742.tif 000008
に結合し、かつ該TALENのオフターゲット切断の頻度が検出未満であることを条件とする、第2の半TALENと
を含む、本発明1001〜1010のいずれかのTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞。
[本発明1012]
少なくとも1つの挿入が、wt TRACに存在する配列
2019531742.tif 000009
のTALEN結合ドメインの下流に位置する外因性ポリヌクレオチド配列を含む、本発明1001〜1011のいずれかのTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞。
[本発明1013]
少なくとも1つの挿入が、2Aペプチド、2A様ペプチド、P2Aペプチド、E2Aペプチド、F2Aペプチド、好ましくは2Aペプチド、より好ましくは配列
2019531742.tif 000010
の2Aペプチド、さらにより好ましくは配列
2019531742.tif 000011
の2Aペプチドから選択されるゲノムTRACコード配列とインフレームの自己切断ペプチドをコードする配列を含む、本発明1001〜1012のいずれかのTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞。
[本発明1014]
少なくとも1つの挿入が、ゲノムTRACコード配列とインフレームの配列
2019531742.tif 000012
の2Aペプチドをコードする配列、キメラ抗原受容体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列、ポリアデニル化シグナルの転写終結配列、任意でTALEN結合ドメインを含む、本発明1001〜1013のいずれかのTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞。
[本発明1015]
外因性ポリヌクレオチド配列が、以下の抗原: 好ましくはCD22、CD123、CS-1、CLL-1、CD38、HSP70、MUC-1、CD30、o-アセチル-GD2の少なくとも1つに特異的なCARから選択されるキメラ抗原受容体(CAR)およびゲノムTRACコード配列とインフレームの配列
2019531742.tif 000013
、ポリアデニル化シグナルの転写終結配列を含む、本発明1001〜1014のいずれかのTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞。
[本発明1016]
(CAR)が、細胞外リガンド結合ドメイン、モノクローナル抗体に特異的なエピトープ、膜貫通ドメイン、および1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、本発明1001〜1015のいずれかのTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞。
[本発明1017]
少なくとも1つの挿入が、IRES、キメラ抗原受容体(CAR)を含む外因性ポリヌクレオチド配列、ポリアデニル化シグナルの転写終結配列、任意でTALEN結合ドメインを含む、本発明1001〜1011のいずれかのTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞。
[本発明1018]
キメラ抗原受容体(CAR)が、モノクローナル抗体に特異的な少なくとも1つの抗原、好ましくはモノクローナル抗体に特異的な2つの抗原を含む、本発明1001〜1016のいずれかのTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞。
[本発明1019]
外因性ポリヌクレオチドが、RNAポリメラーゼの活性を停止させる転写終結シグナルを含む、本発明1001〜1013のいずれかのTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞。
[本発明1020]
CD52、dCK GR、TCRのベータサブユニット遺伝子(TCRB1またはTCRB2)、サイトカイン誘導性SH2含有(CISH)遺伝子、アデノシンA2a受容体(ADORA)遺伝子、CD276遺伝子、Vセットドメイン含有T細胞活性化阻害物質1(VTCN1)遺伝子、BおよびTリンパ球関連(BTLA)遺伝子、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4(CTLA4)遺伝子、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ1(IDO l)遺伝子、キラー細胞免疫グロブリン様受容体, 3ドメイン, 長い細胞質尾部1(KIR3DL1)遺伝子、リンパ球活性化遺伝子3(LAG3)遺伝子、プログラム細胞死1(PD-1)遺伝子、A型肝炎ウイルス細胞受容体2(HAVCR2)遺伝子、T細胞活性化Vドメイン免疫グロブリンサプレッサー(VISTA)遺伝子、ナチュラルキラー細胞受容体2B4(CD244)遺伝子、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ1(HPRT)遺伝子、ならびにケモカイン(C-Cモチーフ)受容体5(遺伝子/偽遺伝子)(CCR5)遺伝子、CXCR4、それらの組み合わせからなる群より選択される内因性遺伝子
における少なくとも1つのさらなる破壊を含む、本発明1001〜1019のいずれかのTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞。
[本発明1021]
本発明1001〜1020のいずれかのTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞を含む、ヒト細胞の集団。
[本発明1022]
本発明1001〜1020のいずれかのTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞または本発明1021のヒト細胞の集団と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物。
[本発明1023]
医薬として用いるための、本発明1001〜1020のいずれかのTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞または本発明1021のヒト細胞の集団または本発明1022の薬学的組成物。
[本発明1024]
がんの処置で用いるための、本発明1001〜1020のいずれかのTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞または本発明1021のヒト細胞の集団または本発明1022の薬学的組成物。
[本発明1025]
がん腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、および白血病からなる群より選択されるがんの処置で用いるための、本発明1001〜1020のいずれかのTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞または本発明1021のヒト細胞の集団または本発明1022の薬学的組成物。
[本発明1026]
B細胞由来のがん、T細胞由来のがん、乳がん、胃がん、神経芽細胞腫、骨肉腫、肺がん、黒色腫、前立腺がん、結腸がん、腎細胞がん、卵巣がん、横紋筋肉腫、白血病、およびホジキンリンパ腫からなる群より選択されるがんの処置で用いるための、本発明1001〜1020のいずれかのTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞または本発明1021のヒト細胞の集団または本発明1022の薬学的組成物。
[本発明1027]
B細胞由来のがんが、B系統急性リンパ芽球性白血病、B細胞慢性リンパ性白血病、およびB細胞非ホジキンリンパ腫からなる群より選択される、がんの処置で用いるための、本発明1001〜1020のいずれかのTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞または本発明1021のヒト細胞の集団または本発明1022の薬学的組成物。
[本発明1028]
AML、ALL、T細胞リンパ腫、CLLであるがんの処置で用いるための、本発明1001〜1020のいずれかのTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞または本発明1021のヒト細胞の集団または本発明1022の薬学的組成物。
[本発明1029]
改変ヒトゲノムTRAC遺伝子が5'から3'方向に、
(a) 野生型TRAC遺伝子に存在するレアカットエンドヌクレアーゼ用の認識ドメイン上流のヒトゲノムTRAC遺伝子の5'領域、
(b) アルファベータTCRの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインの細胞表面発現に影響を与える野生型TRAC遺伝子と比較したギャップまたは挿入であって、挿入が、非コード配列、終止コドン、TRACオープンリーディングフレームとインフレームの自己切断ペプチドをコードする配列、IRES、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする配列、TCRをコードする配列、薬物に対する感受性を付与するタンパク質をコードする配列、薬物に対する耐性を付与するタンパク質をコードする配列、サイトカインをコードする配列、終結配列、それらの組み合わせから選択される外因性ポリヌクレオチドを含む、ギャップまたは挿入、
(c') 任意で第2のレアカットエンドヌクレアーゼ認識ドメイン、
(d) ゲノムTRAC遺伝子の3'領域
を含む、野生型TRAC遺伝子と比較したエンドヌクレアーゼ改変ゲノムTRAC遺伝子を含むエンドヌクレアーゼ改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞を検出するための手段。
[本発明1030]
エンドヌクレアーゼが、CRISPR/Cas 9、CRISPR/Cpfl、TALEN、トランスポザーゼ、ZEN、ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはMegaTALからなる群より選択され、かつ手段が、該ヌクレアーゼに特異的なエンドヌクレアーゼ改変TRACの配列におよび/または該ヌクレアーゼに特異的な該配列の上流に結合する、本発明1029の手段。
[本発明1031]
エンドヌクレアーゼがTALENである、本発明1029または1030の手段。
[本発明1032]
エンドヌクレアーゼ結合ドメインもしくはエンドヌクレアーゼ認識ドメインの上流の改変ゲノムTRAC遺伝子中の配列におよび/またはタグをコードする配列に結合する、プローブ
を含むTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞を検出するための、本発明1031の手段。
[本発明1033]
TALEN改変ゲノムTRAC遺伝子が、
(a) ヒトゲノムTRAC遺伝子の5'領域、
(b) (半？) TALEN用の認識ドメイン、好ましくは以下の配列
2019531742.tif 000014
を含む(半？) TALEN用の認識ドメイン、または
(c) アルファベータTCRの細胞外ドメインもしくは膜貫通ドメインの細胞表面発現に影響を与える野生型TRAC遺伝子と比較したギャップもしくは挿入であって、挿入が、非コード配列、終止コドン、TRACオープンリーディングフレームとインフレームの自己切断ペプチドをコードする配列、IRES、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする配列、TCRをコードする配列、薬物に対する感受性を付与するタンパク質をコードする配列、薬物に対する耐性を付与するタンパク質をコードする配列、終結配列、それらの組み合わせから選択される外因性ポリヌクレオチドを含む、ギャップまたは挿入、
(c') 任意で第2の(半？) TALEN認識ドメイン、
(d) ゲノムTRAC遺伝子の3'領域
を含み、かつ手段が該TALEN改変ゲノムTRAC遺伝子に特異的に結合する、本発明1031または1032の手段。
[本発明1034]
改変ゲノムTRAC遺伝子中の、配列
2019531742.tif 000015
の少なくとも10塩基に結合するプローブ
を含む、TALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞を検出するための、本発明1031〜1033のいずれかの手段。
[本発明1035]
ポリメラーゼ連鎖反応(pcr)または潜在的なオフサイト改変により、好ましくはガイド配列により、エンドヌクレアーゼ改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞を検出するための、本発明1031〜1034のいずれかの手段。
[本発明1036]
本発明1001〜1020のいずれかのTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞を検出するための、本発明1031〜1035のいずれかの手段。
[本発明1037]
不活性化ゲノムTCRA遺伝子を含み、
CARをコードする外因性配列が、レンチウイルスベクターまたはAAVベクターを用いてゲノムTCRA遺伝子に組み込まれ、かつゲノム破壊が、CRISPR/CAS9、CRISPR/Cpf1 メガヌクレアーゼ、MegaTAL、ZFN、TALEN、それらの組み合わせから選択されるエンドヌクレアーゼを用いて行われた、
本発明1001〜1016のいずれかのTALEN改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞。
[本発明1038]
(a) ヒト細胞に、
(i) 操作されたヌクレアーゼがヒトTCRアルファ定常領域遺伝子内の認識配列の位置で切断を生じ、切断により検出不能なレベルまでαβ-TCRの細胞表面発現の阻害がもたらされる、操作されたヌクレアーゼをコードする第1の核酸配列または操作されたヌクレアーゼタンパク質、
(ii) CARをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む第2の核酸配列、
(iii) 任意でプローブ
を導入する段階
を含み、
該外因性ポリヌクレオチドの配列が該切断部位で該ヒトゲノムTCRアルファ定常領域遺伝子に挿入され; かつさらに非改変対照細胞と比較した場合に、該遺伝子改変細胞が内因性TCRの細胞表面発現を低減させる、
エンドヌクレアーゼ改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞を産生するための方法。
[本発明1039]
エンドヌクレアーゼ誘導性オンサイトおよびオフサイトを、好ましくはpcrによっておよび/またはガイド配列によって検出する段階を含む、本発明1038のエンドヌクレアーゼ改変内因性αβ-TCR陰性ヒト細胞を産生するための方法。
[本発明1040]
操作されたヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、CRISPR/Casヌクレアーゼ、またはmegaTALヌクレアーゼである、本発明1038〜1039のいずれかの方法。
[本発明1041]
操作されたヌクレアーゼがTALENである、本発明1038〜1040の方法。
[本発明1042]
外因性ポリヌクレオチドが、自己切断ペプチドおよびキメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含む、本発明1038〜1041の方法。
[本発明1043]
キメラ抗原受容体が、細胞外リガンド結合ドメインおよび1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、本発明1038〜1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
外因性ポリヌクレオチドが、該外因性ポリヌクレオチドの発現を駆動するプロモーター配列を含む、本発明1038〜1043のいずれかの方法。
[本発明1045]
少なくとも第2の核酸配列が、該第2の核酸配列を含む組み換えアデノ随伴ウイルス(AAV6)ベクターと細胞を接触させることにより該細胞に導入される、本発明1038〜1044のいずれかの方法。
[本発明1046]
組み換えAAVベクターが自己相補的AAVベクターである、本発明1040〜1045のいずれかの方法。
[本発明1047]
組み換えAAVベクターが少なくとも部分的にAAV6に由来する、本発明1040〜1046のいずれかの方法。
[本発明1048]
組み換えTALENが第1サブユニットおよび第2サブユニットを含み、該第1サブユニットが第1の認識半部位に結合し、かつ該第2サブユニットが第2の認識半部位に結合する、本発明1040〜1047のいずれかの方法。
[本発明1049]
組み換えTALENが、野生型ヒトTCRアルファ定常領域中の配列ttgtcccacagATATCを認識する、本発明1040〜1048のいずれかの方法。
[本発明1050]
エンドヌクレアーゼが、
5'から3'方向に
2019531742.tif 000016
を認識しかつAAATCT内で切断するジンクフィンガー；以下の配列:
2019531742.tif 000017
2019531742.tif 000018
のいずれか1つに相補的な配列を認識するCrispr/Cas 9；MegaTAL；野生型ヒトTCRアルファ定常領域の残基番号93〜208内の認識配列を認識かつ切断するメガヌクレアーゼ
であり、
組み換えメガヌクレアーゼが第1サブユニットおよび第2サブユニットを含み、該第1サブユニットが、該認識配列の第1の認識半部位に結合しかつ第1の超可変(HVR1)領域を含み、かつ該第2サブユニットが、該認識配列の第2の認識半部位に結合しかつ第2の超可変(HVR2)領域を含む、本発明1038〜1040のいずれかの方法。
[本発明1051]
メガヌクレアーゼが、リンカーを含む一本鎖メガヌクレアーゼであり、該リンカーが第1サブユニットおよび第2サブユニットを共有結合する、本発明1050の方法。
[本発明1052]
本発明1038〜1051の方法のいずれか1つによって得られた細胞を検出するための手段。
[本発明1053]
SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、それらの組み合わせ、または任意の縮重されたSEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、それらの組み合わせの配列から選択される、本発明1052の手段。
[本発明1054]
エンドヌクレアーゼによるオンサイトおよび/またはオフサイト切断を検出するための、本発明1052の手段。
[本発明1055]
SEQ ID NO：13〜22のいずれか1つ、それらの組み合わせを有するエンドヌクレアーゼによるオンサイトおよび/またはオフサイト切断を検出するための、本発明1054の手段。
[本発明1056]
以下の配列:
2019531742.tif 000019
2019531742.tif 000020
の少なくとも1つを含む配列と、そのいずれか1つの相補配列とを含む、手段。