【手続補正書】
【提出日】令和2年3月12日(2020.3.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＩＩ型コラーゲン（Ｃ７）欠損症に罹患している患者を治療するための、自家遺伝子改変細胞を含む医薬組成物であって、前記遺伝子改変細胞が、
前記Ｃ７欠損症患者の真皮又は表皮から細胞を取得するステップと、
ＣＯＬ７Ａ１をコードするヌクレオチド配列又はその機能性変異体を含む形質導入用レンチウイルスベクター粒子と前記細胞を接触させて、特定のベクターコピー数を有する自家遺伝子改変細胞を形成するステップであって、前記レンチウイルスベクターが、細胞当たり０．１〜５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有するステップと、
前記自家遺伝子改変細胞を培養するステップにより得られる、前記組成物。
【請求項２】
前記細胞が、線維芽細胞及びケラチノサイトから選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記Ｃ７欠損症が、栄養障害型表皮水疱症である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記Ｃ７欠損症が、劣性栄養障害型表皮水疱症（ＲＤＥＢ）、優性栄養障害型表皮水疱症（ＤＤＥＢ）、アロポー・シーメンス（Ｈａｌｌｏｐｅａｕ−Ｓｉｅｍｅｎｓ）型ＲＤＥＢ、非アロポー・シーメンス（ｎｏｎ−Ｈａｌｌｏｐｅａｕ−Ｓｉｅｍｅｎｓ）型ＲＤＥＢ、異型ＲＤＥＢ、前脛骨性ＲＤＥＢ、末端性ＲＤＥＶ、又は求心型ＲＤＥＢである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記形質導入用レンチウイルスベクターが、レンチウイルスベクター粒子の形態である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記形質導入用レンチウイルスベクター粒子が、以下：（ａ）ＬＴＲ内の修飾５’長末端反復（前記修飾５’ＬＴＲのプロモータは、サイトメガロウイルスプロモータである）と、（ｂ）機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子と、（ｃ）少なくとも１つのレンチウイルス中央ポリプリン配列と、（ｄ）修飾３’ＬＴＲ（前記修飾３’ＬＴＲは、野生型３’ＬＴＲに対して欠失を含む）と、を含むトランスファーレンチウイルスベクターから構築され、肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＰＲＥ）が欠失しており、前記ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体は、前記細胞に組み込まれて、機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子を有する遺伝子改変細胞を形成する、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記遺伝子改変細胞が、注射、局所、経口、又は生体適合性マトリックスへの埋込みによって前記患者に投与される、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を含むレンチウイルスベクター粒子で形質導入され、且つＶＩＩ型コラーゲンを発現するＶＩＩ型コラーゲン欠損症患者由来の自家遺伝子改変線維芽細胞であって、前記レンチウイルスベクター粒子が、細胞当たり０．１〜５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有する、自家遺伝子改変線維芽細胞。
【請求項９】
以下：（ａ）ＬＴＲ内の修飾５’長末端（前記修飾５’ＬＴＲのプロモータは、サイトメガロウイルスプロモータである）と、（ｂ）前記ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体と、（ｃ）少なくとも１つのレンチウイルス中央ポリプリン配列エレメントと、（ｄ）修飾３’ＬＴＲ（前記修飾３’ＬＴＲは、前記野生型３’ＬＴＲに対して欠失を含む）と、を含むトランスファーベクターから形成される自己不活性型レンチウイルスベクターであって、肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＰＲＥ）が欠失している、自己不活性型レンチウイルスベクター。
【請求項１０】
ＩＧＥ−３０８と称される、トランスファーベクター。
【請求項１１】
ＩＮＸＮ−２００２又はＩＮＸＮ−２００４と称される、レンチウイルスベクター粒子。
【請求項１２】
請求項１１記載のＩＮＸＮ−２００２又はＩＮＸＮ−２００４レンチウイルスベクター粒子を産生する、安定なウイルスパッケージング細胞株。
【請求項１３】
ＩＮＸＮ−２００２又はＩＮＸＮ−２００４と称するレンチウイルスベクターで形質導入された、Ｃ７欠損症患者から得た線維芽細胞を含む、医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１１に記載のベクターを用いて、インビトロ又はエクスビボで形質導入される細胞。
【請求項１５】
偽合指症又はＶＩＩ型コラーゲン欠損症に罹患している患者を治療するための、前記患者由来の自家細胞集団を含む医薬組成物であって、前記細胞集団が、機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を含むレンチウイルスベクター粒子で形質導入され、且つＶＩＩ型コラーゲンを発現し、前記レンチウイルスベクター粒子が、細胞当たり０．１〜５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有する、組成物。
【請求項１６】
ＶＩＩ型コラーゲン（Ｃ７）を発現する、Ｃ７欠損症患者の自家遺伝子改変細胞の単離された集団を製造する方法であって、
前記Ｃ７欠損症患者の真皮又は表皮から細胞を採取するステップと、
ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を含む形質導入用レンチウイルスベクター粒子と前記細胞を接触させて、特定のベクターコピー数を有するＣＯＬ７Ａ１遺伝子を含む自家遺伝子改変細胞を形成するステップであって、前記レンチウイルスベクター粒子が、細胞当たり０．１〜５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有するステップと、
前記自家遺伝子改変細胞を培養して、Ｃ７を発現する遺伝子改変細胞の単離された集団を取得するステップと、を含む方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法により製造される、ＶＩＩ型コラーゲン（Ｃ７）を発現する遺伝子改変細胞の単離された集団。
【請求項１８】
請求項１７に記載の単離された集団を含む、医薬製剤。
【請求項１９】
遺伝子改変ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトにおける細胞当たりの組込みトランスジーンコピー数を増加する方法であって、
（ａ）ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体をコードするヌクレオチド配列を含む形質導入用レンチウイルスベクターを、Ｃ７欠損症患者から得たヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトと接触させて、第１の形質導入組成物を形成するステップと、
（ｂ）前記第１の形質導入組成物をスピノキュレーションに付して、形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトを形成するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトを第２の形質導入用レンチウイルスベクターと接触させて、第２の形質導入組成物を形成するステップと、
（ｄ）前記第１の形質導入組成物をスピノキュレーションに付して、形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトを形成するステップと、
を含み、
前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトの組込みトランスジーンコピー数が、スピノキュレーション又は第２の形質導入ステップに付していない形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトと比べて、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、若しくは５０倍多い、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３７５】
参考文献
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Ｂａｌｄｅｓｃｈｉ  Ｃ，Ｇａｃｈｅ  Ｙ，Ｒａｔｔｅｎｈｏｌｌ  ａ，Ｂｏｕｉｌｌｅ  Ｐ，Ｄａｎｏｓ  Ｏ，Ｏｒｔｏｎｎｅ  ＪＰ，Ｂｒｕｃｋｎｅｒ−Ｔｕｄｅｒｍａｎ  Ｌ，Ｍｅｎｅｇｕｚｚｉ  Ｇ．２００３．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｎｉｎｅ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ  ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ  ｂｕｌｌｏｓａ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２：１８９７−９０５．
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Ｂｕｒｇｅｓｏｎ  Ｒ．Ｅ．Ｔｙｐｅ  ＶＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ，ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｆｉｂｒｉｌｓ，ａｎｄ  ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ  ｂｕｌｌｏｓａ．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９９３；１０１：２５２−２５５．
Ｃｈｅｎ  Ｍ，Ｏ’Ｔｏｏｌｅ  ＥＡ，Ｍｕｅｌｌｅｎｈｏｆｆ  Ｍ，Ｍｅｄｉｎａ  Ｅ，Ｋａｓａｈａｒａ  Ｎ，Ｗｏｏｄｌｅｙ  ＤＴ．２０００．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｔｙｐｅ  ＶＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  “ｍｉｎｉｇｅｎｅ”．Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ  ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ  ｂｕｌｌｏｓａ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：２４４２９−３５．
Ｃｈｅｎ  Ｍ，Ｃｏｓｔａ  ＦＫ，Ｌｉｎｄｖａｙ  ＣＲ，Ｈａｎ  ＹＰ，Ｗｏｏｄｌｅｙ  ＤＴ．２００２ａ．Ｔｈｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｔｙｐｅ  ＶＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ  ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ  ｂｕｌｌｏｓａ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：２１１８−２４．
Ｃｈｅｎ  Ｍ，Ｋａｓａｈａｒａ  Ｎ，Ｋｅｅｎｅ  ＤＲ，Ｃｈａｎ  Ｌ，Ｈｏｅｆｆｌｅｒ  ＷＫ，Ｆｉｎｌａｙ  Ｄ，Ｂａｒｃｏｖａ  Ｍ，Ｃａｎｎｏｎ  ＰＭ，Ｍａｚｕｒｅｋ  Ｃ，Ｗｏｏｄｌｅｙ  ＤＴ．２００２ｂ．Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ＶＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ  ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ  ｂｕｌｌｏｓａ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３２：６７０−５．
Ｃｏｇａｎ  Ｊ，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ  Ｊ，Ｗａｎｇ  Ｘ，Ｈｏｕ  Ｙ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｓ，Ｓｏｕｔｈ  ＡＰ，Ｗｏｏｄｌｅｙ  ＤＴ，Ｃｈｅｎ  Ｍ．２０１４．Ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ  ｒｅｓｔｏｒｅ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｔｙｐｅ  ＶＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｂｙ  ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｃｏｄｏｎｓ：ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ  ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ  ｂｕｌｌｏｓａ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２２：１７４１−５２．
Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ  Ｐ，Ｒａｌｓｔｏｎ  ＤＲ，ａｎｄ  Ｓ  ＭｃＮｅｉｌ．Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｌｌｏｄｅｒｍｉｓ  ｐｒｅｐａｒｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｅｕｒｏ  ｓｋｉｎ  ｂａｎｋ  ｔｏ  ｐｒｅｐａｒｅ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｓｋｉｎ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｓｅ．Ｂｕｒｎｓ．２０１３．３９（６）：１１７０−１１７７．
Ｇｏｔｏ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｓｈｏｗ  ｍｏｒｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｓ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈａｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ＣＯＬ７ａ１  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ  ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ  ｂｕｌｌｏｓａ．Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ，２００６．１２６（４）：ｐ．７６６−７２．
Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ＫＰ，Ｅｄｗｉｎ  ＳＬ，Ｓｃｈａｆｆｅｒ  ＤＶ，Ｆｌａｎｎｅｒｙ  ＪＧ．２００６．Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｒｅｔｉｎａ  Ｕｓｉｎｇ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５７２：２５５−６６
Ｋｉｍ  ＹＨ，Ｗｏｏｄｌｅｙ  ＤＴ，Ｗｙｎｎ  ＫＣ，Ｇｉｏｍｉ  Ｗ，Ｂａｕｅｒ  ＥＡ．Ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ  Ｅｐｉｄｅｒｍｙｌｏｓｉｓ  Ｂｕｌｌｏｓａ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｓ  Ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ  ｉｎ  Ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ  Ｕｓｉｎｇ  ＳＣＩＤ  Ｍｉｃｅ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｍｏｄｅｌ．Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９９２  Ｆｅｂ；９８（２）：１９１−  ７．
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Ｌｅｉｇｈ  Ｉ．Ｍ．Ｅａｄｙ  Ｒ．ａ．Ｈｅａｇｅｒｔｙ  ａ．Ｈ．Ｐｕｒｋｉｓ  Ｐ．Ｅ．Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｐ．ａ．Ｂｕｒｇｅｓｏｎ  Ｒ．Ｅ．Ｔｙｐｅ  ＶＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｉｓ  ａ  ｎｏｒｍａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ，ｗｈｉｃｈ  ｓｈｏｗｓ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ  ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ  ｂｕｌｌｏｓａ．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９８８；９０：６３９−６４２．
Ｍａｖｉｌｉｏ  Ｆ．Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ  Ｇ．Ｆｅｒｒａｒｉ  Ｓ．Ｄｉ  Ｎｕｎｚｉｏ  Ｆ．Ｄｉ  Ｉｏｒｉｏ  Ｅ．Ｒｅｃｃｈｉａ  ａ．Ｍａｒｕｇｇｉ  Ｇ．Ｆｅｒｒａｒｉ  Ｇ．Ｐｒｏｖａｓｉ  Ｅ．Ｂｏｎｉｎｉ  Ｃ．Ｃａｐｕｒｒｏ  Ｓ．Ｃｏｎｔｉ  ａ．Ｍａｇｎｏｎｉ  Ｃ．Ｇｉａｎｎｅｔｔｉ  ａ．Ｄｅ  Ｌｕｃａ  Ｍ．Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ  ｂｕｌｌｏｓａ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００６；１２：１３９７−１４０２．
Ｏｒｔｉｚ−Ｕｒｄａ  Ｓ．Ｌｉｎ  Ｑ．Ｇｒｅｅｎ  Ｃ．Ｌ．Ｋｅｅｎｅ  Ｄ．Ｒ．Ｍａｒｉｎｋｏｖｉｃｈ  Ｍ．Ｐ．Ｋｈａｖａｒｉ  Ｐ．ａ．Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｃｏｒｒｅｃｔｓ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ  ｂｕｌｌｏｓａ  ｓｋｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００３；１１１：２５１−２５５．
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ  Ｊ．Ｗａｎｇ  Ｘ．Ｈｏｕ  Ｙ．Ｚｈｏｕ  Ｈ．Ｂｕｒｎｅｔｔ  Ｊ．Ｍｕｉｒｈｅａｄ  Ｔ．Ｕｉｔｔｏ  Ｊ．Ｋｅｅｎｅ  Ｄ．Ｒ．Ｗｏｏｄｌｅｙ  Ｄ．Ｔ．Ｃｈｅｎ  Ｍ．Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｔｙｐｅ  ＶＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｃｏｒｒｅｃｔｓ  ｔｈｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ  ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ  ｂｕｌｌｏｓａ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００９；１７：２６−３３．
Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅ  Ｐ，Ｋｅｅｎｅ  ＤＲ，Ｒｕｇｇｉｅｒｏ  Ｆ，Ｃｈａｍｐｌｉａｕｄ  ＭＦ，Ｒｅｓｔ  Ｍ，Ｂｕｒｇｅｓｏｎ  ＲＥ．１９９７．Ｌａｍｉｎｉｎ  ５  ｂｉｎｄｓ  ｔｈｅ  ＮＣ−１  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ＶＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ，１３８：７１９−２８．
Ｓｉｐｒａｓｈｖｉｌｉ  Ｚ，Ｎｇｏｎ  Ｔ．Ｎｇｕｙｅｎ，Ｍａｒｉａ  Ｙ．Ｂｅｚｃｈｉｎｓｋｙ，Ｍ．Ｐｅｔｅｒ  Ｍａｒｉｎｋｏｖｉｃｈ，Ａｌｆｒｅｄ  Ｔ．Ｌａｎｅ，ａｎｄ  Ｐａｕｌ  Ａ．Ｋｈａｖａｒｉ．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｔｙｐｅ  ＶＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍｙｌｏｓｉｓ  ｂｕｌｌｏｓａ  ｓｋｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．Ｏｃｔ  ２０１０；２１（１０）：１２９９−１３１０．
Ｔａｒｅｅｎ  Ｓ，Ｎｉｃｏｌａｉ  Ｃ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ  Ｄ，Ｆｌｙｎｎ  Ｐ，Ｓｌｏｕｇｈ  Ｍ，Ｖｉｎ  Ｃ，Ｋｅｌｌｙ−Ｃｌａｒｋｅ  ｂ，Ｏｄｅｇａｒｄ  Ｊ，Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｓ．２０１３．ａ  Ｒｅｖ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇａｇ／ｐｏｌ  Ｅｌｉｍｉｎａｔｅｓ  Ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ  ｐｓｉ−ｇａｇ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｂｉｏｒｅｓ  Ｏｐｅｎ  Ａｃｃｅｓｓ．２０１３  Ｄｅｃ  １；２（６）：４２１−４３０．
Ｗａｔｅｒｍａｎ  ＥＡ，Ｓａｋａｉ  Ｎ，Ｎｇｕｙｅｎ  ＮＴ，Ｈｏｒｓｔ  ＢＡ，Ｖｅｉｔｃｈ  ＤＰ，Ｄｅｙ  ＣＮ，Ｏｒｔｉｚ−Ｕｒｄａ  Ｓ，Ｋｈａｖａｒｉ  ＰＡ，Ｍａｒｉｎｋｏｖｉｃｈ  ＭＰ．２００７．ａ  ｌａｍｉｎｉｎ−ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｄｒｉｖｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｏｌ−３−ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６７：４２６４−７０．
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本発明は以下の態様を含み得る。
［１］
ＶＩＩ型コラーゲン（Ｃ７）欠損症に罹患している患者を治療する方法であって、
前記Ｃ７欠損症患者の真皮又は表皮から細胞を取得するステップと、
ＣＯＬ７Ａ１をコードするヌクレオチド配列又はその機能性変異体を含む形質導入用レンチウイルスベクター粒子と前記細胞を接触させて、特定のベクターコピー数を有する自家遺伝子改変細胞を形成するステップにおいて、前記レンチウイルスベクターが、細胞当たり０．１〜５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有するステップと、
前記自家遺伝子改変細胞を培養するステップと、
有効量の前記遺伝子改変細胞を前記Ｃ７欠損症患者に投与するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
［２］
請求項１に記載の方法において、前記細胞が、線維芽細胞及びケラチノサイトから選択されることを特徴とする方法。
［３］
請求項２に記載の方法において、前記細胞が、線維芽細胞であることを特徴とする方法。
［４］
請求項１に記載の方法において、前記Ｃ７欠損症が、栄養障害型表皮水疱症であることを特徴とする方法。
［５］
請求項４に記載の方法において、前記栄養障害型表皮水疱症が、劣性栄養障害型表皮水疱症（ＲＤＥＢ）及び優性栄養障害型表皮水疱症（ＤＤＥＢ）から選択されることを特徴とする方法。
［６］
請求項５に記載の方法において、前記Ｃ７欠損症が、ＲＤＥＢであることを特徴とする方法。
［７］
請求項６に記載の方法において、前記ＲＤＥＢが、アロポー・シーメンス（Ｈａｌｌｏｐｅａｕ−Ｓｉｅｍｅｎｓ）型、非アロポー・シーメンス（ｎｏｎ−Ｈａｌｌｏｐｅａｕ−Ｓｉｅｍｅｎｓ）型ＲＤＥＢ、異型ＲＤＥＢ、前脛骨性ＲＤＥＢ、末端性ＲＤＥＶ、及び求心型ＲＤＥＢからなる群から選択される亜型であることを特徴とする方法。
［８］
請求項５に記載の方法において、前記Ｃ７欠損症が、ＤＤＥＢであることを特徴とする方法。
［９］
請求項１に記載の方法において、前記形質導入用レンチウイルスベクターが、レンチウイルスベクター粒子の形態であることを特徴とする方法。
［１０］
請求項９に記載の方法において、前記形質導入用レンチウイルスベクター粒子が、以下：（ａ）ＬＴＲ内の修飾５’長末端反復（前記修飾５’ＬＴＲのプロモータは、サイトメガロウイルスプロモータである）と、（ｂ）機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子と、（ｃ）少なくとも１つのレンチウイルス中央ポリプリン配列と、（ｄ）修飾３’ＬＴＲ（前記修飾３’ＬＴＲは、野生型３’ＬＴＲに対して欠失を含む）と、を含むトランスファーレンチウイルスベクターから構築され、肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＰＲＥ）が欠失しており、前記ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体は、前記細胞に組み込まれて、機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子を有する遺伝子改変細胞を形成することを特徴とする方法。
［１１］
請求項１０に記載の方法において、少なくとも２つのレンチウイルス中央ポリプリン配列エレメントがあることを特徴とする方法。
［１２］
請求項１０に記載の方法において、前記欠失ＰＲＥが、ウッドチャック肝炎ウイルス（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）であることを特徴とする方法。
［１３］
請求項９に記載の方法において、形質導入用レンチウイルスベクター粒子が、ｐＳＭＰＵＷ及びｐＦＵＧＷからなる群から選択されるレンチウイルス発現プラスミドベクターから構築されることを特徴とする方法。
［１４］
請求項１３に記載の方法において、前記レンチウイルス発現プラスミドベクターが、ｐＦＵＧＷであることを特徴とする方法。
［１５］
請求項９に記載の方法において、前記形質導入用レンチウイルスベクター粒子が、ＩＮＸＮ−２００４であることを特徴とする方法。
［１６］
請求項９に記載の方法において、前記形質導入用レンチウイルスベクター粒子が、ＩＮＸＮ−２００２であることを特徴とする方法。
［１７］
請求項１に記載の方法において、前記遺伝子改変線維芽細胞が、注射、局所、経口、又は生体適合性マトリックスへの埋込みによって前記患者に投与されることを特徴とする方法。
［１８］
請求項１７に記載の方法において、前記遺伝子改変線維芽細胞が、注射により投与されることを特徴とする方法。
［１９］
請求項１８に記載の方法において、前記遺伝子改変細胞が、前記患者に皮内注射されることを特徴とする方法。
［２０］
請求項１７に記載の方法において、前記遺伝子改変線維芽細胞が、ポリマーカプセル中に封入されることを特徴とする方法。
［２１］
請求項１７に記載の方法において、前記遺伝子改変線維芽細胞が、コラーゲンマトリックス中に埋め込まれることを特徴とする方法。
［２２］
請求項１７に記載の方法において、前記遺伝子改変線維芽細胞が、ハイドロゲル又はメッシュ中に埋め込まれることを特徴とする方法。
［２３］
機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を含むレンチウイルスベクター粒子で形質導入され、且つＶＩＩ型コラーゲンを発現するＶＩＩ型コラーゲン欠損症患者由来の自家遺伝子改変線維芽細胞において、前記レンチウイルスベクター粒子が、細胞当たり０．１〜５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有することを特徴とする自家遺伝子改変線維芽細胞。
［２４］
機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を含むレンチウイルスベクター粒子で形質導入され、且つＶＩＩ型コラーゲンを発現する、劣性栄養障害型表皮水疱症患者由来の自家遺伝子改変線維芽細胞において、前記レンチウイルスベクター粒子が、細胞当たり０．１〜５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有することを特徴とする自家遺伝子改変線維芽細胞。
［２５］
機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を含むレンチウイルスベクター粒子で形質導入され、且つＶＩＩ型コラーゲンを発現する、優性栄養障害型表皮水疱症患者由来の自家遺伝子改変線維芽細胞において、前記レンチウイルスベクター粒子が、細胞当たり０．１〜５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有することを特徴とする自家遺伝子改変線維芽細胞。
［２６］
以下：（ａ）ＬＴＲ内の修飾５’長末端（前記修飾５’ＬＴＲのプロモータは、サイトメガロウイルスプロモータである）と、（ｂ）前記ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体と、（ｃ）少なくとも１つのレンチウイルス中央ポリプリン配列エレメントと、（ｄ）修飾３’ＬＴＲ（前記修飾３’ＬＴＲは、前記野生型３’ＬＴＲに対して欠失を含む）と、を含むトランスファーベクターから形成される自己不活性型レンチウイルスベクターにおいて、肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＰＲＥ）が欠失していることを特徴とする自己不活性型レンチウイルスベクター。
［２７］
請求項２６に記載のベクターにおいて、前記ベクターが、少なくとも２つのレンチウイルス中央ポリプリン配列エレメントを含むことを特徴とするベクター。
［２８］
請求項２６に記載のベクターにおいて、前記欠失したＰＲＥが、ウッドチャック肝炎ウイルス（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）であることを特徴とするベクター。
［２９］
請求項２６に記載のベクターにおいて、前記ベクターが、以下：（ａ）ＬＴＲ内の修飾５’長末端（前記修飾５’ＬＴＲのプロモータは、サイトメガロウイルスプロモータである）と、（ｂ）前記ＣＯＬ７Ａ１遺伝子と、（ｃ）２つのレンチウイルス中央ポリプリン配列エレメントと、（ｄ）さらにＷＰＲＥと、（ｅ）修飾３’ＬＴＲ（前記修飾３’ＬＴＲは、野生型３’ＬＴＲに対して欠失を含む）を含むことを特徴とするベクター。
［３０］
請求項２６に記載のベクターにおいて、前記ベクターが、ＩＮＸＮ−２００４と称されることを特徴とするベクター。
［３１］
請求項２６に記載のベクターにおいて、前記ベクターが、ＩＮＸＮ−２００２と称されることを特徴とするベクター。
［３２］
ＩＧＥ−３０８と称されることを特徴とするトランスファーベクター。
［３３］
ＩＮＸＮ−２００４と称されることを特徴とするレンチウイルスベクター粒子。
［３４］
ＩＮＸＮ−２００２と称されることを特徴とするレンチウイルスベクター粒子。
［３５］
ＩＮＸＮ−２００２レンチウイルスベクター粒子を産生することを特徴とする安定なウイルスパッケージング細胞株。
［３６］
ＩＮＸＮ−２００４レンチウイルスベクター粒子を産生することを特徴とする安定なウイルスパッケージング細胞株。
［３７］
ＩＧＥ３０８の配列を有する、ＩＮＸＮ−２００４と称するレンチウイルスベクターで形質導入されたＲＤＥＢ患者から得た線維芽細胞を含むことを特徴とする医薬組成物。
［３８］
ＩＮＸＮ−２００２と称するレンチウイルスベクターで形質導入されたＲＤＥＢ患者から得た線維芽細胞を含むことを特徴とする医薬組成物。
［３９］
ＩＧＥ３０８の配列を有する、ＩＮＸＮ−２００４と称するレンチウイルスベクターで形質導入されたＤＤＥＢ患者から得た線維芽細胞を含むことを特徴とする医薬組成物。
［４０］
ＩＮＸＮ−２００２と称するレンチウイルスベクターで形質導入されたＤＤＥＢ患者から得た線維芽細胞を含むことを特徴とする医薬組成物。
［４１］
請求項３３に記載のベクターを用いて、インビトロ又はエクスビボで形質導入されることを特徴とする細胞。
［４２］
請求項３４に記載のベクターを用いて、インビトロ又はエクスビボで形質導入されることを特徴とする細胞。
［４３］
偽合指症に罹患している患者の治療方法であって、機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を含むレンチウイルスベクター粒子で形質導入され、且つＶＩＩ型コラーゲンを発現する、前記患者由来の自家細胞集団を前記患者に投与するステップを含む方法において、前記レンチウイルスベクター粒子が、細胞当たり０．１〜５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有することを特徴とする方法。
［４４］
請求項４３に記載の方法において、前記自家細胞集団が、ケラチノサイト及び線維芽細胞から選択されることを特徴とする方法。
［４５］
請求項４３に記載の方法において、前記自家細胞集団が、線維芽細胞であることを特徴とする方法。
［４６］
請求項４３に記載の方法において、前記細胞の患者への投与が、注射、局所、経口、又は生体適合性マトリックスへの埋込みによって為されることを特徴とする方法。
［４７］
栄養障害型表皮水疱症（ＤＥＢ）患者の水疱形成を治療、阻害若しくは軽減する方法であって、機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を含むレンチウイルスベクター粒子で形質導入され、且つＶＩＩ型コラーゲンを発現する、前記患者由来の自家細胞集団を前記患者に投与するステップを含む方法において、前記レンチウイルスベクター粒子が、細胞当たり０．１〜５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有することを特徴とする方法。
［４８］
請求項４７に記載の方法において、前記自家細胞集団が、ケラチノサイト及び線維芽細胞から選択されることを特徴とする方法。
［４９］
請求項４８に記載の方法において、前記自家細胞集団が、線維芽細胞であることを特徴とする方法。
［５０］
請求項４７に記載の方法において、前記細胞の患者への投与が、注射、局所、経口、又は生体適合性マトリックスへの埋込みによって為されることを特徴とする方法。
［５１］
請求項４７に記載の方法において、前記患者が、劣性栄養障害型表皮水疱症に罹患していることを特徴とする方法。
［５２］
請求項４７に記載の方法において、前記患者が、優性栄養障害型表皮水疱症に罹患していることを特徴とする方法。
［５３］
劣性栄養障害型表皮水疱症患者の病変を治療する方法であって、機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を含むレンチウイルスベクター粒子で形質導入され、且つＶＩＩ型コラーゲンを発現する、前記患者由来の自家細胞集団を前記患者に投与するステップを含む方法において、前記レンチウイルスベクター粒子が、細胞当たり０．１〜５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有することを特徴とする方法。
［５４］
請求項５３に記載の方法において、前記自家細胞集団が、ケラチノサイト及び線維芽細胞から選択されることを特徴とする方法。
［５５］
請求項５３に記載の方法において、前記自家細胞集団が、線維芽細胞であることを特徴とする方法。
［５６］
請求項５３に記載の方法において、前記細胞の患者への投与が、注射、局所、経口、又は生体適合性マトリックスへの埋込みによって為されることを特徴とする方法。
［５７］
請求項５３に記載の方法において、前記病変が、口腔粘膜に存在することを特徴とする方法。
［５８］
請求項５３に記載の方法において、前記病変が、胃腸管に存在することを特徴とする方法。
［５９］
機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を含むレンチウイルスベクター粒子で形質導入され、且つＶＩＩ型コラーゲンを発現する、ＶＩＩ型コラーゲン欠損症患者の自家遺伝子改変線維芽細胞の単離された集団において、前記レンチウイルスベクター粒子が、細胞当たり０．１〜５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有することを特徴とする集団。
［６０］
請求項５９に記載の集団において、前記レンチウイルスベクター粒子が、ＩＮＸＮ−２００２であることを特徴とする集団。
［６１］
請求項５９に記載の集団において、前記レンチウイルスベクター粒子が、ＩＮＸＮ−２００４であることを特徴とする集団。
［６２］
機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を含むレンチウイルスベクター粒子で形質導入され、且つＶＩＩ型コラーゲンを発現する、劣性栄養障害型表皮水疱症患者の自家遺伝子改変線維芽細胞の単離された集団において、前記レンチウイルスベクター粒子が、細胞当たり０．１〜５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有することを特徴とする集団。
［６３］
請求項６２に記載の集団において、前記レンチウイルスベクター粒子が、ＩＮＸＮ−２００２であることを特徴とする集団。
［６４］
請求項６２に記載の集団において、前記レンチウイルスベクター粒子が、ＩＮＸＮ−２００４であることを特徴とする集団。
［６５］
機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を含むレンチウイルスベクター粒子で形質導入され、且つＶＩＩ型コラーゲンを発現する、優性栄養障害型表皮水疱症患者の自家遺伝子改変線維芽細胞の単離された集団において、前記レンチウイルスベクター粒子が、細胞当たり０．１〜５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有することを特徴とする集団。
［６６］
請求項６５に記載の集団において、前記レンチウイルスベクター粒子が、ＩＮＸＮ−２００２であることを特徴とする集団。
［６７］
請求項６５に記載の集団において、前記レンチウイルスベクター粒子が、ＩＮＸＮ−２００４であることを特徴とする集団。
［６８］
ＶＩＩ型コラーゲン（Ｃ７）を発現する、Ｃ７欠損症患者の自家遺伝子改変細胞の単離された集団を製造する方法であって、前記Ｃ７欠損症患者の真皮又は表皮から細胞を採取するステップと、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を含む形質導入用レンチウイルスベクター粒子と前記細胞を接触させて、特定のベクターコピー数を有するＣＯＬ７Ａ１遺伝子を含む自家遺伝子改変細胞を形成するステップにおいて、前記レンチウイルスベクター粒子が、細胞当たり０．１〜５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有するステップと、前記自家遺伝子改変細胞を培養して、Ｃ７を発現する遺伝子改変細胞の単離された集団を取得するステップと、を含むことを特徴とする方法。
［６９］
請求項６８に記載の方法において、前記細胞が、線維芽細胞及びケラチノサイトから選択されることを特徴とする方法。
［７０］
請求項６９に記載の方法において、前記細胞が、線維芽細胞であることを特徴とする方法。
［７１］
請求項６８に記載の方法において、前記Ｃ７欠損症が、栄養障害型表皮水疱症であることを特徴とする方法。
［７２］
請求項７１に記載の方法において、前記栄養障害型表皮水疱症が、劣性栄養障害型表皮水疱症（ＲＤＥＢ）及び優性栄養障害型表皮水疱症（ＤＤＥＢ）から選択されることを特徴とする方法。
［７３］
請求項７１に記載の方法において、前記Ｃ７欠損症がＲＤＥＢであることを特徴とする方法。
［７４］
請求項７３に記載の方法において、前記ＲＤＥＢが、アロポー・シーメンス（Ｈａｌｌｏｐｅａｕ−Ｓｉｅｍｅｎｓ）型、非アロポー・シーメンス（ｎｏｎ−Ｈａｌｌｏｐｅａｕ−Ｓｉｅｍｅｎｓ）型ＲＤＥＢ、異型ＲＤＥＢ、前脛骨性ＲＤＥＢ、末端性ＲＤＥＶ、及び求心型ＲＤＥＢからなる群から選択される亜型であることを特徴とする方法。
［７５］
請求項７１に記載の方法において、前記Ｃ７欠損症が、ＤＤＥＢであることを特徴とする方法。
［７６］
請求項６８に記載の方法において、前記形質導入用レンチウイルスベクター粒子が、ＩＮＸＮ−２００２であることを特徴とする方法。
［７７］
請求項６８に記載の方法において、前記形質導入用レンチウイルスベクター粒子が、ＩＮＸＮ−２００４であることを特徴とする方法。
［７８］
請求項６８に記載の方法により製造されることを特徴とする、ＶＩＩ型コラーゲン（Ｃ７）を発現する遺伝子改変細胞の単離された集団。
［７９］
請求項７６に記載の方法により製造されることを特徴とする、ＶＩＩ型コラーゲン（Ｃ７）を発現する遺伝子改変細胞の単離された集団。
［８０］
請求項７７に記載の方法により製造されることを特徴とする、ＶＩＩ型コラーゲン（Ｃ７）を発現する遺伝子改変細胞の単離された集団。
［８１］
請求項７８に記載の単離された集団を含むことを特徴とする医薬製剤。
［８２］
請求項７９に記載の単離された集団を含むことを特徴とする医薬製剤。
［８３］
請求項８０に記載の単離された集団を含むことを特徴とする医薬製剤。
［８４］
遺伝子改変ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトにおける細胞当たりの組込みトランスジーンコピー数を増加する方法であって、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体をコードするヌクレオチド配列を含む形質導入用レンチウイルスベクターを、Ｃ７欠損症患者から得たヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトと接触させて、形質導入組成物を形成するステップと、前記形質導入組成物をスピノキュレーションに付して、形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトを形成するステップを含む方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトの組込みトランスジーンコピー数が、スピノキュレーションに付していない形質導入組成物よりも多いことを特徴とする方法。
［８５］
請求項８４に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞を第２の形質導入レンチウイルスベクターとさらに接触させて、第２の形質導入組成物を形成することを特徴とする方法。
［８６］
請求項８５に記載の方法において、前記第２の形質導入組成物をスピノキュレーションに付すことを特徴とする方法。
［８７］
請求項８４に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、スピノキュレーションに付していない形質導入組成物と比べて、細胞当たり少なくとも１倍多い組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
［８８］
請求項８４に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、スピノキュレーションに付していない形質導入組成物と比べて、細胞当たり少なくとも２倍多い組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
［８８］
請求項８６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、スピノキュレーション又は第２の形質導入に付していない形質導入組成物と比べて、細胞当たり少なくとも５倍多い組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
［８８］
請求項８６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、スピノキュレーション又は第２の形質導入に付していない形質導入組成物と比べて、細胞当たり少なくとも１０倍多い組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
［８８］
請求項８６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、スピノキュレーション又は第２の形質導入に付していない形質導入組成物と比べて、細胞当たり少なくとも２０倍多い組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
［８８］
請求項８６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、スピノキュレーション又は第２の形質導入に付していない形質導入組成物と比べて、細胞当たり少なくとも２７倍多い組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
［８９］
請求項８４に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、細胞当たり少なくとも０．０５の組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
［９０］
請求項８４に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、細胞当たり少なくとも０．０９の組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
［９１］
請求項８５に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、細胞当たり少なくとも０．４１の組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
［９２］
請求項８６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、細胞当たり少なくとも０．７４の組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
［９３］
請求項８４に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、細胞当たり約０．１〜約５の組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
［９４］
請求項８４に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、細胞当たり約０．１〜約１の組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
［９５］
請求項８４に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、細胞当たり約０．４〜約１の組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
［９６］
請求項８４に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、細胞当たり約０．４〜約０．７５の組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
［１００］
請求項８４に記載の方法において、前記形質導入用レンチウイルスベクターが、レンチウイルスベクター粒子の形態であることを特徴とする方法。
［１０１］
請求項１００に記載の方法において、前記形質導入用レンチウイルスベクター粒子が、ＩＮＸＮ−２００２であることを特徴とする方法。
［１０２］
請求項１００に記載の方法において、前記形質導入用レンチウイルスベクター粒子が、ＩＮＸＮ−２００４であることを特徴とする方法。
［１０３］
請求項８６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又は前記ケラチノサイトが、スピノキュレーション又は第２の形質導入に付していない前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトと比べて、増大したＣ７の発現を有することを特徴とする方法。
［１０４］
請求項８６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又は前記ケラチノサイトが、スピノキュレーション又は第２の形質導入に付していない前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又は前記ケラチノサイトと比べて、少なくとも１００倍増大したＣ７の発現を有することを特徴とする方法。
［１０５］
請求項８６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又は前記ケラチノサイトが、スピノキュレーション又は第２の形質導入に付していない前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又は前記ケラチノサイトと比べて、少なくとも２００倍増大した発現を有することを特徴とする方法。
［１０６］
遺伝子改変ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトにおける細胞当たりの組込みトランスジーンコピー数を増加する方法であって、
（ａ）ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体をコードするヌクレオチド配列を含む形質導入用レンチウイルスベクターを、Ｃ７欠損症患者から得たヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトと接触させて、第１の形質導入組成物を形成するステップと、
（ｂ）前記第１の形質導入組成物をスピノキュレーションに付して、形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトを形成するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトを第２の形質導入用レンチウイルスベクターと接触させて、第２の形質導入組成物を形成するステップと、
（ｄ）前記第１の形質導入組成物をスピノキュレーションに付して、形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトを形成するステップと、
を含む方法において、
前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトの組込みトランスジーンコピー数が、スピノキュレーション又は第２の形質導入ステップに付していない形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトと比べて、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、若しくは５０倍多いことを特徴とする方法。
［１０７］
請求項１０６に記載の方法において、前記第１及び第２の形質導入用レンチウイルスベクターが、ＩＮＸＮ−２００４であることを特徴とする方法。
［１０８］
請求項１０６に記載の方法において、前記細胞が、ヒト皮膚線維芽細胞であることを特徴とする方法。
［１０９］
請求項１０６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトの組込みトランスジーンコピー数が、スピノキュレーション又は第２の形質導入ステップに付していない形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトと比べて、少なくとも５倍多いことを特徴とする方法。
［１１０］
請求項１０６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトの組込みトランスジーンコピー数が、スピノキュレーション又は第２の形質導入ステップに付していない形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトと比べて、少なくとも１０倍多いことを特徴とする方法。
［１１１］
請求項１０６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトの組込みトランスジーンコピー数が、スピノキュレーション又は第２の形質導入ステップに付していない形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトと比べて、少なくとも２７倍多いことを特徴とする方法。
［１１２］
請求項１０６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトの組込みトランスジーンコピー数が、スピノキュレーション又は第２の形質導入ステップに付していない形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトと比べて、約５倍多いことを特徴とする方法。
［１１３］
請求項１０６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトの組込みトランスジーンコピー数が、スピノキュレーション又は第２の形質導入ステップに付していない形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトと比べて、約１０倍多いことを特徴とする方法。
［１１４］
請求項１０６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトの組込みトランスジーンコピー数が、スピノキュレーション又は第２の形質導入ステップに付していない形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトと比べて、約２７倍多いことを特徴とする方法。