(57)【要約】  インテグラーゼと関連する1個以上のHIV配列変異体の低頻度出現を検出するための方法であって、(a)HIVサンプル集団中の複数のRNA分子からcDNA種を作製する工程；(b)cDNA種から複数の第1のアンプリコンを増幅し、それぞれの第1のアンプリコンを一対の核酸プライマーを用いて増幅する工程；(c)第1のアンプリコンの増幅されたコピーをクローン的に増幅して、複数の第2のアンプリコンを作製する工程；(d)第2のアンプリコンの核酸配列組成を決定する工程；(e)第2のアンプリコンの核酸配列組成において5％以下の頻度で生じる1個以上の配列変異体を検出する工程；および(f)検出された配列変異体を、HIVインテグラーゼと関連する変異と相関させる工程を含む前記方法の実施形態を記載する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インテグラーゼと関連する1個以上のHIV配列変異体の低頻度出現を検出するための方法であって、
(a)HIVサンプル集団中の複数のRNA分子からcDNA種を作製する工程；
(b)前記cDNA種から複数の第1のアンプリコンを増幅させる工程であって、それぞれ第1のアンプリコンを一対の核酸プライマーを用いて増幅する、前記工程；
(c)第1のアンプリコンの増幅されたコピーをクローン的に増幅して、複数の第2のアンプリコンを作製する工程；
(d)第2のアンプリコンの核酸配列組成を決定する工程；
(e)第2のアンプリコンの核酸配列組成において5％以下の頻度で生じる1個以上の配列変異体を検出する工程；および
(f)検出された配列変異体を、HIVインテグラーゼと関連する変異と相関させる工程、
を含む、前記方法。
【請求項２】
HIVインテグラーゼと関連する変異が、インテグラーゼ阻害剤に対する耐性と関連することが知られている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
HIVサンプル集団が1人の患者に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
複数の第1のアンプリコンが6個のアンプリコンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
第1のアンプリコンのためのプライマー対が低い突然変異頻度の領域を標的化する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
第1のアンプリコンがHIVインテグラーゼ機能と関連するHIVの領域を標的化する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
第2のアンプリコンを一対の一般プライマーを用いて増幅する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
1個以上の配列変異体を99％の信頼レベルで検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも400個の固定化された集団に由来する実質的に同一のコピーの核酸組成を決定し、1個以上の検出された配列変異体が1.85％以下の頻度で生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも10000個の固定化された集団に由来する実質的に同一のコピーの核酸組成を決定し、1個以上の検出された配列変異体が0.74％以下の頻度で生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも200000個の固定化された集団に由来する実質的に同一のコピーの核酸組成を決定し、1個以上の検出された配列変異体が0.003％以下の頻度で生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
検出工程が、単一の基板上での複数の配列決定反応から生成したシグナルを検出することができる1個の検出装置を含む機器を用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
単一の基板が複数の反応部位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の第1のアンプリコンを増幅するために用いられる複数の核酸プライマー対を含む、インテグラーゼ領域と関連する1個以上のHIV配列変異体を検出するためのキット。
【請求項１５】
IN12F (配列番号1)とIN2R (配列番号3); IN1F (配列番号2)とIN2R (配列番号3); IN3F (配列番号4)とIN3R (配列番号5); IN4F (配列番号6)とIN4R (配列番号7); IN5F (配列番号8)とIN5R (配列番号9); およびIN6F (配列番号10)とIN6R (配列番号11)からなる群より選択される1対以上のプライマーを含む、インテグラーゼ領域と関連する1個以上のHIV配列変異体を検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、HIV-1、特に、HIVクレードBおよびクレードCサブタイプのものに関連する配列変異体を検出および分析するための方法、試薬および系を提供する。この変異体は、同時に、標的ポリヌクレオチド集団における単一ヌクレオチド多型(SNP)、挿入／欠失変異体(「indels」と呼ぶ)および対立遺伝子頻度を含んでもよい。本発明はまた、既知および未知の配列の両方の突然変異および多型の同定のための、平行ピロリン酸配列決定によるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により複製された核酸を調査する方法にも関する。本発明は、ウイルスDNAを細胞DNAに組込むHIVの能力と関連するインテグラーゼ領域などの特定のHIV特性または機能に関連するHIV RNAまたはその相補的DNAの特定の領域および／または一連の重複領域を増幅するように特異的に設計された核酸プライマーの使用を含む。また、プライマーの標的部位は、個々のアンプリコンを生成する変異体(準種とも呼ばれる)を含むことが疑われる標的HIV核酸集団中での核酸の一貫した増幅を可能にする、低い突然変異速度を有する。以前に用いられた方法よりも高い検出感度を可能にするアンプリコンの集団中に認められる配列変異体の分布を作製するために、数千個の個々のHIVアンプリコンを、大規模並列的、効率的、および費用効果的様式で配列決定する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト免疫不全ウイルス(一般的には、HIVと呼ばれる)は、世界中で主要な問題であり続けているが、多量の化合物が治療のために認可されている。ウイルス逆転写酵素の誤りがちな性質および高いウイルス代謝回転(t1/2=1-3日)に起因して、HIVゲノムは非常に速く突然変異する。例えば、逆転写酵素は、平均で、9.7 Kbのゲノムの複製あたり1回の突然変異を生成し、ウイルスが増殖する能力に劇的に影響しないと見積もられている。これは多くの異なる突然変異が動的関係で存在する「準種」の形成をもたらす。
【０００３】
HIVウイルス粒子は、LatailladeおよびKozal (あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとするLataillade, M.およびKozal, M.J., The hunt for HIV-1 integrase inhibitors, AIDS Patient Care and STDs (2006) 20:489)により記載のように、CD4受容体とコレセプター分子を介して細胞に進入し、進入後、HIVインテグラーゼがHIVプロウイルスの細胞機構への組込みのための機能を実行する。組込みは、(1)インテグラーゼタンパク質とウイルスゲノムの末端にある特定のDNA配列との間で安定な複合体の集合；(2)ウイルスゲノムの3'プロセッシング；(3)鎖移転；および(4)DNAギャップ修復と連結の工程を含む。
【０００４】
HIVインテグラーゼ遺伝子コード配列は、ゲノム中で逆転写酵素RNaseおよびVif(後者はインテグラーゼの3'末端で始まる部分的に重複する読み枠を有する)によりフランキングするPol領域の3'末端の近くに位置する。インテグラーゼタンパク質は、288アミノ酸(32 kDa)によりコードされ、ウイルスプロテアーゼによりPolポリタンパク質から放出される。それは3個のドメイン：亜鉛フィンガーモチーフを含むN末端ドメイン、C末端ドメイン、およびその間の触媒コアドメインから構成される。このコアは、酵素機能にとって必要であるDDEモチーフを含む(あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとするFreed, E.O., HIV-1 replication, Somat. Cell and Mol. Genet. (2001) 26:13)。
【０００５】
FDAは、効力が臨床試験において示された後(Grinsztejnら、Protocol 005 Team. Safety and efficacy of the HIV-1 integrase inhibitor raltegravir (MK-0518) in treatment-experienced patients with multidrug-resistant virus: a phase II randomised controlled trial. Lancet (2007) 369:1261; およびSteigbigelら、Raltegravir with optimized background therapy for resistant HIV-1 infection. N. Engl. J. Med. (2008). 359:339(それぞれ、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする))、Merck & Co.から入手可能なアイセントレス(ラルテグラビル)として商業的に知られるインテグラーゼ阻害剤の使用を認可した。ラルテグラビルは、ウイルスゲノム組込みの第3工程、鎖移転を標的化し、この薬剤に対する感受性を低下させるいくつかの突然変異が記載されている(LatailladeおよびKozal、上記の参照により組み入れられる; Van Laethemら、A genotypic assay for the amplification and sequencing of integrase from diverse HIV-1 group M subtypes. J. Virol. Methods (2008) 153:176 ; ならびにPaarら、Genotypic antiretroviral resistance testing for human immunodeficiency virus type 1 integrase inhibitors on the TruGene(商標)sequencing system, J. Clin. Microbiol. 2008 Dec; 46(12):4087-90. Epub 2008 Oct 22(それぞれあらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする))。ラルテグラビルに加えて、多くのインテグラーゼ阻害剤が主要な製薬会社で準備中である(上記の参照により組み入れられるLatailladeおよびKozal)。プロテアーゼおよび逆転写酵素遺伝子における耐性関連突然変異のための遺伝子型決定と同様の様式で、HIVインテグラーゼ阻害剤に対する応答を予測するために耐性関連突然変異を検出することができることが非常に興味深い(Kuritzkes, D.R.ら、Performance characteristics of the TRUGENE HIV-1 genotyping kit and the Opengene DNA sequencing system, J. Clin. Microbiol. (2003) 41:1594(あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする))。
【０００６】
現在のHIV薬剤耐性アッセイは、典型的には、その性質により、それぞれのウイルス株のクローン分離に基づくアッセイよりも感度が低い集団アッセイ(Kuritzkes, D.R.ら、Van Laethemら、Paarら(それぞれ、上記の参照により本明細書に組み入れられるものとする))として実施される。しかしながら、以前に用いられたクローン分析アッセイは、極端に労働集約的であり、高い感度を達成するためにはそれぞれの被験者から得た数千個の細胞クローンを別々に試験する必要がある。
【０００７】
長いリード長454の配列決定が、1回の配列決定実行において複数の被験者に由来する数千のクローンリードを作製するのに理想的に適合している。従って、クローン配列を労働集約的クローニング工程を用いずにウイルスRNA準種から直接取得する、配列に基づくHIVインテグラーゼ阻害剤耐性決定アッセイを介するこれらの突然変異の効率的欠失が非常に望ましく、早期検出からの疾患の知識および治療可能性における実質的な前進を可能にする。さらに、高効率配列決定技術の具体化により、「大規模並列」プロセッシングと呼ばれるものが以前の配列決定技術よりも実質的により強力な分析、感度、および効率特性を有することが可能になった。例えば、本発明のHIV特異的プライマーを用いる高効率配列決定技術は、集団中に1％以下の頻度の対立遺伝子変異体を含む少量の対立遺伝子の検出感度を達成することができる。上記のように、これは、HIV変異体、特に、高感度が実質的な治療的利益をもたらす重要な早期検出機構を提供するインテグラーゼ変異体を検出する文脈において重要である。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の実施形態は、核酸配列の決定に関する。より具体的には、本発明の実施形態は、高効率配列決定技術を用いて配列変異体を検出するための方法および系に関する。
【０００９】
(a)HIVサンプル集団中の複数のRNA分子からcDNA種を作製する工程；(b)cDNA種から複数の第1のアンプリコンを増幅する工程であって、それぞれの第1のアンプリコンを一対の核酸プライマーを用いて増幅する前記工程；(c)第1のアンプリコンの増幅されたコピーをクローン的に増幅して複数の第2のアンプリコンを作製する工程；(d)第2のアンプリコンの核酸配列組成を決定する工程；(e)第2のアンプリコンの核酸配列組成中、5％以下の頻度で生じる1個以上の配列変異体を検出する工程；および(f)検出された配列変異体をHIVインテグラーゼに関連する変異(バリエーション；variation)と相関させる工程を含む、インテグラーゼに関連する出現頻度の低い1個以上のHIV配列変異体を検出するための方法の一実施形態が記載される。
【００１０】
また、IN12F (配列番号1)とIN2R (配列番号3); IN1F (配列番号2)とIN2R (配列番号3); IN3F (配列番号4)とIN3R (配列番号5); IN4F (配列番号6)とIN4R (配列番号7); IN5F (配列番号8)とIN5R (配列番号9); およびIN6F (配列番号10)とIN6R (配列番号11)からなる群より選択される1個以上のプライマー対を含むキットの実施形態が記載される。
【００１１】
上記の実施形態および実施は、必ずしも包括的ではなく、または互いに排他的でもなく、それらが同じか、または異なる実施形態または実施と関連して提供されようと、相反するものではなく、さもなければ可能である任意の様式で組合わせることができる。一実施形態または実施の説明は、他の実施形態および／または実施に関して限定的であると意図されるものではない。また、本明細書の他の場所に記載の任意の1個以上の機能、工程、操作、または技術を、代替的な実施において、発明の概要に記載の任意の1個以上の機能、工程、操作、または技術と組合わせることができる。かくして、上記の実施形態および実施は限定的というよりもむしろ例示的なものである。
【００１２】
上記の特徴およびさらなる特徴は、添付の図面と共に取得した場合、以下の詳細な説明からより明確に理解されるであろう。図面において、同様の参照数値は同様の構造、要素、または方法工程を示し、参照数値の最も左側の数字は参照要素が初めて出現する図面の番号を示す(例えば、要素160は図1に初めて出現する)。しかしながら、これらの慣例は全て、限定的というよりもむしろ、典型的または例示的であることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】コンピューター制御下での配列決定機器と反応基板の一実施形態の機能ブロック図である。
【図２】HIVインテグラーゼ領域に対するアンプリコンの位置関係の実施形態の単純化された図式例である。
【図３】HIVインテグラーゼ領域の断片に関するコンセンサス配列に対する複数のHIV RNAから得られた配列データの比較の一実施形態の単純化された図式例である。図3に提供される配列は、上から下に向かって、以下の通りである：配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号14、配列番号14、配列番号15、配列番号14、配列番号14、配列番号14、配列番号14、配列番号14、配列番号14、配列番号14、配列番号13、配列番号14、配列番号14、配列番号14、配列番号14、配列番号14、および配列番号15。
【図４】HIVインテグラーゼに関連する変異を同定するための方法の一実施形態の機能ブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下により詳細に説明するように、本発明の実施形態は、HIV変異体に特異的な標的特異的配列またはプライマー種を設計するための系および方法、ならびに配列変異体の高感度検出のためのこれらのプライマーの使用を含む。
【００１５】
a. 一般
用語「フローグラム」は一般的には、SBS方法、特に、ピロリン酸に基づく配列決定方法(「ピロ配列決定」とも呼ばれる)により作製された配列データのグラフ表示を指し、より具体的には、「プログラム」と呼んでもよい。
【００１６】
本明細書で用いられる用語「リード(read)」または「配列リード」は、一般的には、1個の核酸鋳型分子または鋳型核酸分子の複数の実質的に同一のコピーの集団から得られた全配列データを指す。
【００１７】
本明細書で用いられる用語「実行」または「配列決定実行」は、一般的には、1個以上の鋳型核酸分子の配列決定操作において実施される一連の配列決定反応を指す。
【００１８】
本明細書で用いられる用語「フロー」は、一般的には、鋳型核酸分子を含む環境への溶液の添加の連続的または反復的周期を指し、ここで、溶液は、配列決定反応において、またはヌクレオチド種の以前のフロー周期からの繰り越しまたはノイズ効果を低下させるために用いることができるバッファーまたは酵素などの新生分子または他の試薬への添加のためのヌクレオチド種を含んでもよい。
【００１９】
本明細書で用いられる用語「フロー周期」は、一般的には、ヌクレオチド種が周期の間に1回流出する一連のフローを指す(すなわち、フロー周期はT、A、C、Gヌクレオチド種の順序での連続的添加を含んでもよいが、他の配列の組合せも定義の一部と考えられる)。典型的には、フロー周期は、周期から周期への同じ配列のフローを有する反復周期である。
【００２０】
本明細書で用いられる用語「リード長」は、一般的には、信頼性が高く配列決定することができる鋳型分子の長さの上限を指す。限定されるものではないが、鋳型核酸分子中のGC含量の程度などの、系および／またはプロセスのリード長に寄与するいくつかの因子が存在する。
【００２１】
本明細書で用いられる用語「試験断片」または「TF」とは、一般的には、品質制御、補正、または他の関連する目的に用いることができる既知の配列組成の核酸エレメントを指す。
【００２２】
「新生分子」は、一般的には、鋳型分子中での対応するヌクレオチド種と相補的であるヌクレオチド種の組込みにより鋳型依存的DNAポリメラーゼによって伸長されるDNA鎖を指す。
【００２３】
用語「鋳型核酸」、「鋳型分子」、「標的核酸」または「標的分子」は、一般的には、配列データまたは情報が作成された配列決定反応の対象である核酸分子を指す。
【００２４】
本明細書で用いられる用語「ヌクレオチド種」は一般的には、新生核酸分子に典型的に組込まれるプリン(アデニン、グアニン)およびピリミジン(シトシン、ウラシル、チミン)などの核酸モノマーの同一性を指す。
【００２５】
本明細書で用いられる用語「モノマー反復」または「ホモポリマー」は、一般的には、同じヌクレオチド種を含む2個以上の配列位置(すなわち、反復ヌクレオチド種)を指す。
【００２６】
本明細書で用いられる用語「均一伸長」は、一般的には、実質的に同一の鋳型分子の集団の各メンバーが、伸長反応において同じ伸長工程を均一に実施する伸長反応の関係または段階を指す。
【００２７】
本明細書で用いられる用語「完了効率」は、一般的には、所与のフローの間に適切に伸長される新生分子の割合を指す。
【００２８】
本明細書で用いられる用語「不完全伸長率」は、一般的には、適切に伸長されない新生分子数と全ての新生分子数の比率を指す。
【００２９】
本明細書で用いられる用語「ゲノムライブラリー」または「ショットガンライブラリー」は、一般的には、生物または個体の全ゲノム(すなわち、ゲノムの全領域)から誘導された、および／またはそれを表す分子の集団を指す。
【００３０】
本明細書で用いられる用語「アンプリコン」は、一般的には、ポリメラーゼ連鎖反応またはリガーゼ連鎖反応技術から作製されたものなどの選択された増幅産物を指す。
【００３１】
本明細書で用いられる用語「変異体」または「対立遺伝子」は、一般的には、それぞれ類似する配列組成をコードするが、互いにある程度の差異を有する複数の種の1つを指す。この差異は、関連する当業者には公知の任意の型の遺伝子変異を含んでもよく、限定されるものではないが、単一ヌクレオチド多型(SNP)、挿入または欠失(挿入／欠失事象の組合せは「indels」とも呼ばれる)、反復配列(タンデムリピートとも呼ばれる)の数の差異、および構造的変異が挙げられる。
【００３２】
本明細書で用いられる用語「対立遺伝子頻度」は、一般的には、特定の変異体から構成される集団中の全ての変異体の割合を指す。
【００３３】
本明細書で用いられる用語「キー配列」または「キーエレメント」は、一般的には、鋳型分子から作製された配列データに関する品質制御参照として用いられる既知の配列組成を含む既知の位置の鋳型核酸分子(すなわち、典型的には、連結されたアダプターエレメント中に含まれる)に結合した核酸配列エレメント(典型的には、約4個の配列位置、すなわち、TGACまたは他の組合せのヌクレオチド種)を指す。配列データは、それが正確な位置にキーエレメントに結合した既知の配列組成を含む場合、品質制御を通過する。
【００３４】
本明細書で用いられる用語「キーパス」または「キーパスウェル」は、一般的には、反応ウェル中での既知の配列組成の完全長核酸試験配列(すなわち、上記の「試験断片」または「TF」)の配列決定を指し、キーパス試験配列から誘導された配列の正確性を、既知の配列組成と比較し、配列決定の正確性を測定するため、および品質制御のために用いる。典型的な実施形態においては、配列決定実行におけるウェルの総数の割合は、いくつかの実施形態においては、領域的に分布させることができるキーパスウェルであろう。
【００３５】
本明細書で用いられる用語「平滑末端」は、当業者の理解と一致して解釈され、一般的には、一対の相補的ヌクレオチド塩基種で終結する末端を有する線状二本鎖核酸分子であって、一対の平滑末端が常に互いの連結にとって適合する前記分子を指す。
【００３６】
本明細書で用いられる用語「付着末端」または「突出末端」は、当業者の理解と一致して解釈され、一般的には、分子の一方の鎖の末端に1個以上の非対ヌクレオチド種を有する線状二本鎖核酸分子であって、非対ヌクレオチド種がいずれかの鎖上に存在してもよく、単一の塩基位置または複数の塩基位置を含む前記分子を指す(「付着末端」とも呼ばれることがある)。
【００３７】
本明細書で用いられる用語「ビーズ」または「ビーズ基板」は、一般的には、任意の都合のよい大きさで、セルロース、セルロース誘導体、アクリル樹脂、ガラス、シリカゲル、ポリスチレン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ビニルとアクリルアミドのコポリマー、ジビニルベンゼンと架橋したポリスチレンなど(例えば、Merrifield, Biochemistry 1964, 3, 1385-1390に記載)、ポリアクリルアミド、ラテックスゲル、ポリスチレン、デキストラン、ゴム、シリコン、プラスチック、ニトロセルロース、天然スポンジ、シリカゲル、制御孔ガラス、金属、架橋デキストラン(例えば、Sephadex(商標))アガロースゲル(Sepharose(商標))、ならびに当業者には公知の他の固相ビーズ支持体などの公知の材料の任意のメンバーから製造された任意の型のビーズを指す。
【００３８】
サンプルの調製および加工、配列データの作成、ならびに配列データの分析に関連する系および方法のいくつかの例示的な実施形態を以下に一般的に記載するが、そのいくつかまたは全部は本発明の実施形態と共に使用しやすい。特に、鋳型核酸分子の調製、鋳型分子の増幅、標的特異的アンプリコンおよび／またはゲノムライブラリーの作製のための系および方法、配列決定方法および機器、ならびにコンピューターシステムの例示的実施形態を記載する。
【００３９】
典型的な実施形態においては、実験サンプルまたは診断サンプルに由来する核酸分子を、その生の形態から、高効率配列決定に従う鋳型分子に調製および加工しなければならない。加工方法は用途に応じて変化してもよく、様々な特徴を含む鋳型分子をもたらす。例えば、高効率配列決定のいくつかの実施形態においては、少なくとも特定の配列決定方法が配列データを正確にもたらすことができる長さである配列またはリード長を有する鋳型分子を作製することが好ましい。本発明の例においては、その長さは、約25-30塩基対、約50-100塩基対、約200-300塩基対、約350-500塩基対、500塩基対を超えるか、または特定の配列決定用途に従う他の長さを含んでもよい。いくつかの実施形態においては、ゲノムサンプルなどのサンプルに由来する核酸を、当業者には公知のいくつかの方法を用いて断片化する。好ましい実施形態においては、核酸を無作為に断片化する(すなわち、特異的配列もしくは領域を選択しない)方法としては、噴霧化または超音波処理方法と呼ばれるものが挙げられる。しかしながら、制限エンドヌクレアーゼを用いる消化などの他の断片化方法を、断片化のために用いることができることが明らかであろう。また、本発明の例においては、いくつかの加工方法は、所望の長さの核酸断片を選択的に単離するための当業界で公知のサイズ選択方法を用いることができる。
【００４０】
また、いくつかの実施形態においては、さらなる機能的エレメントをそれぞれの鋳型核酸分子と結合させることが好ましい。このエレメントを、限定されるものではないが、増幅および／もしくは配列決定方法のためのプライマー配列、品質制御エレメント、元のサンプルもしくは患者サンプルなどとの様々な結合をコードするユニークな識別子(多重識別子もしくは「MID」とも呼ばれる)、または他の機能的エレメントなどの様々な機能のために用いることができる。いくつか、または全部の記載された機能的エレメントを、特定の加工工程においてヌクレオチド配列に結合させるアダプターエレメント中に結合することができる。例えば、いくつかの実施形態は、相補的配列組成を含むプライミング配列エレメントまたは領域を、増幅および／または配列決定に用いられるプライマー配列に結合させることができる。さらに、同じエレメントを、「鎖選択」と呼ばれるものおよび固相基板への核酸分子の固定に用いることができる。いくつかの実施形態においては、2セットのプライミング配列領域(以後、プライミング配列Aおよびプライミング配列Bと呼ぶ)を鎖選択に用いることができるが、1コピーのプライミング配列Aと1コピーのプライミング配列Bを有する一方の鎖のみを選択し、調製されたサンプル中に含有させる。代替的な実施形態においては、アダプターエレメントに特徴的な設計は、鎖選択の必要性を排除する。同じプライミング配列領域を、例えば、プライミング配列Bを固相基板上に固定し、増幅産物をそこから伸長させる、増幅および固定のための方法において用いることができる。
【００４１】
断片化、鎖選択、ならびに機能的エレメントおよびアダプターの付加のためのサンプル加工のさらなる例は、2004年1月28日に出願された「Method for preparing single-stranded DNA libraries」の表題の米国特許出願第10/767,894号；2008年5月29日に出願された「System and Method for Identification of Individual Samples from a Multiplex Mixture」の表題の米国特許出願第12/156,242号；および2009年2月23日に出願された「System and Method for Improved Processing of Nucleic Acids for Production of Sequencable Libraries」の表題の米国特許出願第12/380,139号(それぞれ、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)に記載されている。
【００４２】
実質的に同一のコピーの集団を作製するための鋳型核酸分子の増幅を実施するための系および方法の様々な例を記載する。SBSのいくつかの実施形態においては、1個以上のヌクレオチド種が、鋳型分子のコピーと結合したそれぞれの新生分子中に組込まれる場合により強いシグナルを生成するそれぞれの核酸エレメントの多くのコピーを作製することが望ましいことが当業者には明らかであろう。例えば、細菌ベクターと呼ばれるものを用いる増幅、「ローリングサークル」増幅(参照により本明細書に組み入れられるものとする米国特許第6,274,320号および第7,211,390号に記載)ならびにポリメラーゼ連鎖反応(PCR)方法(これらの技術はそれぞれ、本発明と共に使用するために適用可能である)などの、核酸分子のコピーを作製するための当業界で公知の多くの技術が存在する。特に、高効率用途に従う1つのPCR技術としては、エマルジョンPCR方法(emPCR(商標)方法とも呼ばれる)とも呼ばれるものが挙げられる。
【００４３】
エマルジョンPCR方法の典型的な実施形態は、反応が起こり得る水性液滴を作る2種の非混和性物質の安定な乳濁液を作ることを含む。特に、PCR方法における使用に従う乳濁液の水性液滴は、典型的には、いくつかの型の油を含む疎水性液体(連続相とも呼ばれる)などの別の液体内に液滴として懸濁もしくは分散された水に基づく液体(不連続相とも呼ばれる)などの第1の液体を含んでもよい。用いることができる油の例としては、限定されるものではないが、鉱物油、シリコンに基づく油、またはフッ素化油が挙げられる。
【００４４】
さらに、いくつかの乳濁液の実施形態は、PCRなどの特異的加工方法にとって特に有用であり得る、乳濁液を安定化するように働く界面活性剤を用いてもよい。界面活性剤のいくつかの実施形態としては、1種以上のシリコンまたはフッ素化界面活性剤が挙げられる。例えば、1種以上の非イオン性界面活性剤を用いることができ、限定されるものではないが、モノオレイン酸ソルビタン(Span(商標)80とも呼ばれる)、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン(Tween(商標)80とも呼ばれる)、またはいくつかの好ましい実施形態においては、ジメチコンコポリオール(Abil(登録商標)EM90とも呼ばれる)、ポリシロキサン、ポリアルキルポリエーテルコポリマー、ポリグリセロールエステル、ポロキサマー、およびPVP/ヘキサデカンコポリマー(Unimer U-151とも呼ばれる)、またはより好ましい実施形態においては、シクロペンタシロキサン中の高分子量シリコンポリエーテル(Dow Corning社製DC 5225Cとも呼ばれる)が挙げられる。
【００４５】
乳濁液の液滴を、コンパートメント、マイクロカプセル、マイクロリアクター、微小環境、または関連する業界で一般的に用いられる他の名称として呼ぶこともできる。水性液滴は、乳濁液成分もしくは組成物の組成、そこに含まれる含量、および用いられる形成技術に応じてサイズに幅があってもよい。記載の乳濁液は、PCRなどの化学反応を実施することができる微小環境を作る。例えば、鋳型核酸および所望のPCR反応を実施するのに必要な全ての試薬を封入し、乳濁液の液滴中で化学的に単離することができる。いくつかの実施形態においては、さらなる界面活性剤または他の安定化剤を用いて、上記の液滴のさらなる安定性を促進することができる。PCR方法に典型的な熱サイクリング操作を、前記液滴を用いて実行して、多くの実質的に同一のコピーの鋳型核酸を含む集団の生成をもたらす封入された核酸鋳型を増幅することができる。いくつかの実施形態においては、液滴内の集団を、「クローン的に単離された」、「区分化された」、「隔離された」、「封入された」または「局在化された」集団と呼ぶことができる。また、本発明の例においては、いくつか、または全ての記載された液滴はさらに、鋳型および増幅された鋳型のコピー、鋳型と相補的な増幅されたコピー、またはその組合せの付着のためのビーズなどの固体基板を封入することができる。さらに、この固体基板に、他の型の核酸、試薬、標識、または目的の他の分子を結合させることができる。
【００４６】
本発明と共に有用な乳濁液の実施形態は、大規模並列様式で記載の化学反応を実施することができる非常に高密度の液滴またはマイクロカプセルを含んでもよい。増幅に用いられる乳濁液のさらなる例および配列決定用途のためのその使用は、それぞれ、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする米国特許出願第10/861,930号；第10/866,392号(現在は米国特許第7,622,280号)；第10/767,899号；第11/045,678号に記載されている。
【００４７】
また、配列決定のために標的特異的アンプリコンを作製する実施形態を、特異的核酸プライマーのセットを用いて、標的核酸を含むサンプルから選択された領域を増幅することを含む本発明と共に用いることができる。さらに、このサンプルは、配列変異体を含むことが知られるか、またはそれが疑われる核酸分子の集団を含んでもよく、前記プライマーを用いて増幅することができ、サンプル中の配列変異体の分布への洞察を提供する。例えば、特異的増幅により配列変異体を同定し、核酸サンプル中の複数の対立遺伝子を配列決定する方法を実施することができる。まず、前記核酸を、目的の領域または核酸集団に共通する断片の周囲の領域を増幅するように設計された一対のPCRプライマーによる増幅にかける。続いて、PCR反応の生成物の各々(第1のアンプリコン)を、上記の乳濁液に基づく容器などの別々の反応容器中で個別にさらに増幅させる。それぞれ、第1の集団のアンプリコンの1つのメンバーから誘導される、得られるアンプリコン(本明細書では第2のアンプリコンと呼ぶ)を配列決定し、異なるエマルジョンPCR方法に由来する配列の集団(すなわち、第2のアンプリコン)を用いて、対立遺伝子頻度を決定する。
【００４８】
記載の標的特異的増幅および配列決定方法のいくつかの利点としては、以前に達成されたものよりも高いレベルの感度が挙げられる。さらに、例えば、454 Life Sciences Corporationにより提供されるウェルのPicoTiterPlate(登録商標)アレイ(PTP(商標)プレートまたはアレイと呼ばれることもある)と呼ばれるものを用いる実施形態などの、高効率配列決定装置を用いる実施形態に記載の方法を用いて、実行もしくは実験あたり、100,000を超える、300,000を超える、500,000を超える、または1,000,000を超える核酸領域について配列組成を作製することができ、これは少なくとも部分的には、ガスケットなどの使用により可能になるレーン配置などの使用者の選択に依存する。また、記載の方法は、1％以下の対立遺伝子変異体である少量の対立遺伝子の検出感度を提供する。前記方法の別の利点としては、分析される領域の配列を含むデータの作成が挙げられる。重要なことに、分析される配列の座に関する従来の知識を有する必要はない。
【００４９】
配列決定のための標的特異的アンプリコンのさらなる例は、2005年4月12日に出願された「Methods for determining sequence variants using ultra-deep sequencing」の表題の米国特許出願第11/104,781号；2008年3月14日に出願された「System and Method for Detection of HIV Drug Resistant Variants」の表題のPCT特許出願第US 2008/003424号；および2009年6月17日に出願された「System and Method for Detection of HIV Tropism Variants」の表題の米国特許出願第12/456,528号(それぞれあらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)に記載されている。
【００５０】
さらに、配列決定の実施形態として、一般的にはハイブリダイゼーションによる配列決定(SBH)、連結による配列決定(SBL)、または組込みによる配列決定(SBI)技術と呼ばれる、Sanger型技術が挙げられる。さらに、配列決定技術としては、ポロニー配列決定技術；ナノ孔、導波管および他の単一分子検出技術；または可逆性ターミネーター技術と呼ばれるものが挙げられる。上記のように、好ましい技術としては、合成方法による配列決定が挙げられる。例えば、実質的に同一のコピーの核酸鋳型の配列集団のいくつかのSBS実施形態は、典型的には、サンプル鋳型分子または鋳型分子に結合した1個以上のアダプターの所定の相補的位置にアニーリングするように設計された1個以上のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。プライマー／鋳型複合体を、核酸ポリメラーゼ酵素の存在下でヌクレオチド種と共に提供する。ヌクレオチド種が、オリゴヌクレオチドプライマーの3'末端に直接隣接するサンプル鋳型分子上の配列位置に対応する核酸種と相補的である場合、前記ポリメラーゼはヌクレオチド種と共にプライマーを伸長させるであろう。あるいは、いくつかの実施形態においては、プライマー／鋳型複合体を、目的の複数のヌクレオチド種(典型的には、A、G、CおよびT)と共に一度に提供し、オリゴヌクレオチドプライマーの3'末端に直接隣接するサンプル鋳型分子上の対応する配列位置で相補的であるヌクレオチド種を組込ませる。記載の実施形態のいずれかにおいては、ヌクレオチド種を化学的に遮断して(3'-O位置などで)、さらなる伸長を防止し、次の周回の合成の前に脱遮断する必要がある。また、新生分子の末端にヌクレオチド種を付加するプロセスは、プライマーの末端への付加に関する上記のプロセスと実質的に同じであることが理解されるであろう。
【００５１】
上記のように、ヌクレオチド種の組込みを、当業界で公知の様々な方法により、例えば、ピロリン酸(PPi)の遊離を検出することにより(例えば、それぞれあらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする米国特許第6,210,891号；第6,258,568号；および第6,828,100号に記載されている)、またはヌクレオチドに結合した検出可能な標識を介して検出することができる。検出可能な標識のいくつかの例としては、限定されるものではないが、マスタグおよび蛍光標識または化学発光標識が挙げられる。典型的な実施形態においては、組込まれなかったヌクレオチドを、例えば、洗浄により除去する。さらに、いくつかの実施形態においては、組込まれなかったヌクレオチドを、例えば、2008年6月27日に出願された「System and Method for Adaptive Reagent Control in Nucleic Acid Sequencing」の表題の米国特許出願第12/215,455号；および2009年1月29日に出願された「System and Method for Improved Signal Detection in Nucleic Acid Sequencing」の表題の米国特許出願第12/322,284号(それぞれあらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)に記載されたアピラーゼまたはピロホスファターゼ酵素を用いる分解などの酵素的分解にかけることができる。
【００５２】
検出可能な標識を用いる実施形態においては、典型的には、その後の合成サイクルの前にそれらを不活化しなければならないであろう(例えば、化学的切断または光漂白による)。次いで、鋳型／ポリメラーゼ複合体中の次の配列位置を、上記のように、別のヌクレオチド種、または目的の複数のヌクレオチド種について問い合わせることができる。ヌクレオチド付加、伸長、シグナル獲得、および洗浄の反復サイクルは、鋳型鎖のヌクレオチド配列の決定をもたらす。本発明の例を続けて、典型的には、多数の実質的に同一の鋳型分子またはその集団(例えば、103、104、105、106もしくは107個の分子)を任意の1回の配列決定反応において同時に分析して、信頼性の高い検出にとって十分強いシグナルを達成する。
【００５３】
さらに、いくつかの実施形態においては、「ペアエンド」配列決定戦略と呼ばれるものを用いることにより、リード長能力および配列決定プロセスの品質を改善することが有利であるかもしれない。例えば、配列決定方法のいくつかの実施形態は、高品質かつ信頼性の高いリードを作製することができる分子の全長に関する制限を有する。換言すれば、信頼性の高いリード長に関する配列位置の総数は、用いられる配列決定の形態に応じて25、50、100、または500塩基を超えないかもしれない。ペアエンド配列決定戦略は、リンカー配列により中心で結合した各末端に元の鋳型核酸分子の断片を含む分子のそれぞれの末端(「タグ」末端と呼ばれることもある)を別々に配列決定することにより、信頼性の高いリード長を伸長させる。鋳型断片の元の位置的関係が知られており、かくして、配列リードに由来するデータを、より長い高品質のリード長を有する単一のリード中で再度組合わせることができる。ペアエンド配列決定の形態のさらなる例は、「Paired end sequencing」の表題の米国特許第7,601,499号および2009年1月28日に出願された「Paired end sequencing」の表題の米国特許出願第12/322,119号(それぞれあらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)に記載されている。
【００５４】
SBS装置のいくつかの例は、上記の方法のいくつかまたは全部を実装し、電荷結合素子(すなわち、CCDカメラ)もしくは共焦点型構造などの1個以上の検出デバイス、マイクロ流体チャンバーもしくはフローセル、反応基板、ならびに／またはポンプおよびフローバルブを含んでもよい。ピロリン酸に基づく配列決定の例を取り上げれば、装置の形態は、本質的に低レベルのバックグラウンドノイズを生成する化学発光検出戦略を用いてもよい。
【００５５】
いくつかの実施形態においては、配列決定のための反応基板は、それぞれ、実質的に同一の鋳型分子の集団を保持することができる数十万個以上の非常に小さいウェル(すなわち、いくつかの好ましい実施形態は、ウェルピッチに対して35μmのウェルの70 x 75 mmのPTP(商標)アレイ上に約330万個のウェルを含む)を得るように酸でエッチングされた光ファイバー面板から形成された、上記の454 Life Sciences Corporation社製のPTP(商標)アレイと呼ばれるものを含んでもよい。いくつかの実施形態においては、実質的に同一の鋳型分子のそれぞれの集団を、それぞれ1個の前記ウェル中に配置することができるビーズなどの固体基板上に配置することができる。例えば、装置は、液体試薬をPTPプレートホルダーに供給するための試薬送達エレメント、ならびにPTPプレート上の各ウェルから放出された光の光子を収集することができるCCD型検出デバイスを含んでもよい。改善されたシグナル認識のための特性を含む反応基板の例は、2005年8月30日に出願された「THIN-FILM COATED MICROWELL ARRAYS AND METHODS OF MAKING SAME」の表題の米国特許出願第11/215,458号(あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)に記載されている。SBS型配列決定およびピロリン酸配列決定を実施するための装置および方法のさらなる例は、米国特許第7,323,305号および米国特許出願第11/195,254号(両方とも上記のように参照により本明細書に組み入れられるものとする)に記載されている。
【００５６】
さらに、上記のemPCR(商標)プロセスなどの1個以上のサンプル調製プロセスを自動化する系および方法を用いることができる。例えば、自動化系を用いて、emPCRプロセッシングのための乳濁液の作製、PCR熱サイクリング操作の実施、および配列決定のための核酸分子の上手く調製された集団の濃縮のための効率的な溶液を提供することができる。自動化サンプル調製系の例は、2005年1月28日に出願された「Nucleic acid amplification with continuous flow emulsion」の表題の米国特許出願第11/045,678号(あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)に記載されている。
【００５７】
また、本発明の実施形態の系および方法は、コンピューターシステム上での実行のために保存されたコンピューターで読み取り可能な媒体を用いるいくつかの設計、分析、または他の操作の実施を含んでもよい。例えば、検出されたシグナルを加工し、ならびに／または加工および分析の実施形態がコンピューターシステム上に実装可能であるSBS系および方法を用いて作製されたデータを分析するいくつかの実施形態を以下に詳細に記載する。
【００５８】
本発明と共に使用するためのコンピューターシステムの例示的実施形態としては、ワークステーション、パーソナルコンピューター、サーバー、または任意の他の現在もしくは未来のコンピューターなどの任意の型のコンピュータープラットフォームが挙げられる。しかしながら、当業者であれば、本明細書に記載の上記コンピュータープラットフォームが記載された本発明の特殊な操作を実施するように特異的に配置されるものであり、一般的な目的のコンピューターを考慮していないことを理解できるであろう。コンピューターは、典型的には、プロセッサ、オペレーティングシステム、システムメモリー、メモリー保存デバイス、入出力コントローラー、入出力デバイス、およびディスプレーデバイスなどの公知の構成要素を含む。また、関連する業界の当業者であれば、多くの可能な配置および構成要素のコンピューターが存在し、キャッシュメモリー、データバックアップユニット、および多くの他のデバイスを含んでもよいことを理解できるであろう。
【００５９】
ディスプレーデバイスとしては、視覚的情報を提供するディスプレーデバイスが挙げられ、この情報を、典型的には、ピクセルのアレイとして論理的および／または物理的に体系化することができる。また、入力および出力インターフェースを提供するための任意の様々な既知または未来のソフトウェアプログラムを含んでもよいインターフェースコントローラーを含有させることもできる。例えば、インターフェースは、ユーザーに1個以上の図式的表示を提供する「グラフィカルユーザーインターフェース」(GUIと呼ばれることが多い)と一般的に呼ばれるものを含んでもよい。インターフェースは、典型的には、選択の手段を用いるユーザー入力または関連する業界の当業者には公知の入力を受け入れることができる。
【００６０】
同じか、または代替的な実施形態においては、コンピューター上のアプリケーションは、「コマンドラインインターフェース」(CLIと呼ばれることが多い)と呼ばれるものを含むインターフェースを用いることができる。CLIは典型的には、アプリケーションとユーザーの間の相互作用に基づくテキストを提供する。典型的には、コマンドラインインターフェースは、ディスプレーデバイスを介してテキストのラインとして出力を提供し、入力を受容する。例えば、いくつかのデバイスは、関連する業界の当業者には公知のUnix (登録商標) Shells、またはMicrosoft.NETフレームワークなどのオブジェクト指向型プログラミング構造を用いるMicrosoft Windows (登録商標) Powershellなどの「シェル」と呼ばれるものを含んでもよい。
【００６１】
関連する業界の当業者であれば、インターフェースが1個以上のGUI、CLIまたはその組合せを含んでもよいことを理解するであろう。
【００６２】
プロセッサは、Intel Corporationにより製造されるCentrino(登録商標)、Core(商標)2、Itanium(登録商標)またはPentium(登録商標)プロセッサ、Sun Microsystemsにより製造されるSPARC(登録商標)プロセッサ、AMD corporationにより製造されるAthalon(商標)またはOpteron(商標)プロセッサなどの市販のプロセッサを含んでもよいか、またはそれは利用可能であるか、もしくは利用可能になるであろう他のプロセッサの1つであってもよい。プロセッサのいくつかの実施形態は、マルチコアプロセッサと呼ばれるものを含んでもよく、および／またはシングルコアもしくはマルチコア配置中で並行プロセッシング技術を用いることができる。例えば、マルチコア構造は、典型的には、2個以上のプロセッサ「実行コア」を含む。本発明の例においては、それぞれの実行コアは、複数のスレッドの並行的実行を可能にする独立したプロセッサとして実施し得る。さらに、関連業界の当業者であれば、プロセッサを、一般的に32もしくは64ビット構造と呼ばれるものに配置するか、または現在知られているか、もしくは将来開発され得る他の構造的配置に配置することができることを理解するであろう。
【００６３】
典型的には、プロセッサは、例えば、Microsoft CorporationのWindows(登録商標)型オペレーティングシステム(Windows(登録商標)XPもしくはWindows Vista(登録商標)など)；Apple Computer Corp.のMac OS Xオペレーティングシステム(Mac OS X v10.5「Leopard」もしくは「Snow Leopard」オペレーティングシステムなど)；多くのベンダーから入手可能なUnix(登録商標)もしくはLinux型オペレーティングシステムまたはオープンソースと呼ばれるもの；別の、もしくは未来のオペレーティングシステム；またはそのいくつかの組合せであってよいオペレーティングシステムを実行する。オペレーティングシステムはよく知られた様式でファームウェアおよびハードウェアと連動し、プロセッサが様々なプログラミング言語で書かれていてもよい様々なコンピュータープログラムの機能と協働し、それを実行するのを容易にする。オペレーティングシステムは、典型的には、プロセッサと協働して、コンピューターの他の構成要素の機能と協働し、それを実行する。オペレーティングシステムはまた、全て既知の技術に従って、スケジューリング、入出力制御、ファイルおよびデータ管理、メモリー管理、ならびにコミュニケーション制御および関連サービスを提供する。
【００６４】
システムメモリーは、様々な既知または未来のメモリー保存デバイスのいずれかを含んでもよい。例としては、任意の市販のランダムアクセスメモリー(RAM)、常駐ハードディスクもしくはテープなどの磁気媒体、読み書き可能なコンパクトディスクなどの光媒体、または他のメモリー保存デバイスが挙げられる。メモリー保存デバイスは、コンパクトディスクドライブ、テープドライブ、取り出し可能なハードディスクドライブ、USBもしくはフラッシュデバイス、またはディスクドライブなどの様々な既知または未来のデバイスのいずれかを含んでもよい。そのような型のメモリー保存デバイスは、典型的には、それぞれ、コンパクトディスク、磁気テープ、取り出し可能なハードディスク、USBもしくはフラッシュデバイス、またはフロッピー(登録商標)ディスクなどのプログラム保存媒体(示さず)から読み取る、および／またはそれに書き込む。任意のこれらのプログラム保存媒体、または現在使用されているか、もしくは後に開発され得る他のものは、コンピュータープログラム製品であると考えられる。理解されるように、これらのプログラム保存媒体は、典型的には、コンピューターソフトウェアプログラムおよび／またはデータを保存する。コンピューター制御ロジックとも呼ばれるコンピューターソフトウェアプログラムは、典型的には、システムメモリーおよび／またはメモリー保存デバイスと共に用いられるプログラム保存デバイス中に保存される。
【００６５】
いくつかの実施形態においては、そこに保存された制御ロジックを有するコンピューターで利用可能な媒体(プログラムコードを含むコンピューターソフトウェアプログラム)を含むコンピュータープログラム製品が記載される。プロセッサにより実行される場合、制御ロジックは、プロセッサが本明細書に記載の機能を実施する原因となる。他の実施形態においては、いくつかの機能を、例えば、ハードウェア状態機械を用いて、主にハードウェア中に実装する。本明細書に記載の機能を実施するためのハードウェア状態機械の実装は、関連業界の当業者には明らかであろう。
【００６６】
入出力コントローラーは、人であろうと機械であろうと、ローカルであろうとリモートであろうと、ユーザーからの情報を受容し、加工するための様々な既知のデバイスのいずれかを含んでもよい。そのようなデバイスとしては、例えば、モデムカード、ワイヤレスカード、ネットワークインターフェースカード、サウンドカード、または様々な既知の入力デバイスのいずれかのための他の型のコントローラーが挙げられる。出力コントローラーとしては、人であろうと機械であろうと、ローカルであろうとリモートであろうと、ユーザーに情報を提供するための様々な既知のディスプレーデバイスのいずれかのためのコントローラーが挙げられる。本発明の実施形態においては、コンピューターの機能的エレメントは、システムバスを介して互いに通信する。いくつかの形態のコンピューターは、ネットワークまたは他の型の遠隔コミュニケーションを用いていくつかの機能的エレメントと通信することができる。
【００６７】
関連業界の当業者には明らかなように、ソフトウェア中に実装されている場合、機器制御および／またはデータ処理アプリケーションをロードし、システムメモリーおよび／またはメモリー保存デバイスから実行することができる。機器制御および／またはデータ処理アプリケーションの全部または一部はまた、メモリー保存デバイスの読み取り専用メモリーまたは同様のデバイス中に存在してもよく、そのようなデバイスは、機器制御および／またはデータ処理アプリケーションを最初に入出力コントローラーを介してロードする必要がない。当業者であれば、機器制御および／もしくはデータ処理アプリケーション、またはその一部を、実行にとって有利なものとして、システムメモリー、もしくはキャッシュメモリー、またはその両方中に、公知の様式でプロセッサーによりロードすることができることを理解できるであろう。
【００６８】
また、コンピューターは、システムメモリー中に保存された1個以上のライブラリーファイル、実験データファイル、およびインターネットクライアントを含んでもよい。例えば、実験データは、検出されたシグナル値、または1回以上のSBS実験もしくはプロセスに関連する他の値などの1回以上の実験またはアッセイに関連するデータを含んでもよい。さらに、インターネットクライアントは、ネットワークを用いて別のコンピューター上の遠隔サービスにアクセスすることができるアプリケーションを含んでもよく、例えば、「ウェブブラウザ」と一般的に呼ばれるものを含んでもよい。本発明の例においては、いくつかの一般的に用いられるウェブブラウザとして、Microsoft Corporationから入手可能なMicrosoft(登録商標)Internet Explorer 7、Mozilla Corporationから入手可能なMozilla Firefox(登録商標)、Apple Computer Corp.から入手可能なSafari 1.2、Google(商標)Corporationから入手可能なGoogle Chrome、または現在当業界で公知であるか、もしくは将来開発される他の型のウェブブラウザが挙げられる。また、同じか、または他の実施形態においては、インターネットクライアントは、生物学的用途のためのデータ処理アプリケーションなどのネットワークを介して遠隔情報にアクセスすることができる特殊なソフトウェアアプリケーションのエレメントを含むか、またはそれであってもよい。
【００６９】
ネットワークは、当業者にはよく知られた1種以上の多くの様々な型のネットワークを含んでもよい。たとえば、ネットワークは、TCP/IPプロトコルスイートと一般的に呼ばれるものを用いて通信するローカルネットワークまたは広域ネットワークを含んでもよい。ネットワークは、インターネットと一般的に呼ばれる相互接続されたコンピューターネットワークのワールドワイドシステムを含むネットワークを含んでもよく、または様々なイントラネット構造を含んでもよい。また、関連業界の当業者であれば、ネットワーク環境にあるいくらかのユーザーが、ハードウェアおよび／またはソフトウェアシステムへの、およびそこからの情報往来を制御するために「ファイアウォール」と一般的に呼ばれるもの(パケットフィルター、もしくはボーダープロテクションデバイスと呼ばれることもある)を用いることを好むことを理解できるであろう。例えば、ファイアウォールは、ハードウェアもしくはソフトウェアエレメントまたはそのいくつかの組合せを含んでもよく、典型的には、例えば、ネットワーク管理者などのユーザーにより導入されたセキュリティポリシーを実行するように設計される。
【００７０】
b. 本発明の実施形態
上記のように、本発明の実施形態は、サンプルに由来するHIVインテグラーゼ配列変異体を検出する方法ならびに変異体配列組成をインテグラーゼ薬剤耐性および／または感受性型と関連させることによる、存在するHIVインテグラーゼ機能を標的化する薬剤に対する耐性および／または感受性の補正に関する。当業者であれば、この補正が、検出された変異体と、薬剤耐性および／または感受性と関連することが知られる変異との診断的補正、ならびに検出された変異体と、サンプルの薬剤耐性および／または感受性表現型との発見的補正を含んでもよいことを理解するであろう。逆転写酵素領域および指向性型を決定するための領域などの、代替的なHIV領域を標的化する他の発明は、2008年3月14日に出願された「SYSTEM AND METHOD FOR DETECTION OF HIV DRUG RESISTANT VARIANTS」の表題のPCT特許出願第US 2008/003424号；および2009年6月17日に出願された「SYSTEM AND METHOD FOR DETECTION OF HIV TROPISM VARIANTS」の表題の米国特許出願第12/456,528号(それぞれ上記のように参照により本明細書に組み入れられるものとする)に記載されている。
【００７１】
本発明の実施形態は、サンプル中で低頻度で生じる型であっても、HIVインテグラーゼ型の出現の同定(インテグラーゼ型と、サンプル中の変異体の検出された配列組成との関連に基づく)を可能にする、数千個のウイルス粒子から同時に配列情報をもたらす配列決定技術と組合わせた、薬剤耐性および／または感受性型と関連することが知られるHIVインテグラーゼの領域に標的化された2段階のPCR技術(すなわち、上記のように第1および第2のアンプリコンを作製すること)を含む。実際、本発明の実施形態は、例えば、50％を超えて、50％未満、25％未満、10％未満、5％未満または1％未満で存在するHIVインテグラーゼ変異体などの、非化学量論的対立遺伝子量のHIVウイルス粒子を含むサンプル中に存在するインテグラーゼ配列変異体を検出することができる。記載された実施形態は、迅速で信頼性が高く、費用効果的な様式でそのような同定を可能にする。
【００７２】
典型的には、1つ以上のプロセス工程を自動化する1個以上の機器エレメントを用いることができる。例えば、配列決定方法の実施形態を、いくつか、または全てのプロセス工程を自動化し、実行する機器を用いて実行することができる。図1は、反応基板105上で起こる配列決定反応とデータ捕捉の実行のための光サブシステムと流体サブシステムを含む配列決定機器100の実例を提供する。配列決定プロセスを実行するのに用いられる配列決定機器100の実施形態は、流体サブシステム中に様々な流体成分を、光サブシステム中に様々な光成分を、ならびにいくつかの機能の局所制御のためのマイクロプロセッサおよび／またはマイクロコントローラー成分を含んでもよい図1に示されていないさらなる成分を含んでもよい。いくつかの実施形態においては、必要に応じて、機器100を用いる配列決定のための必要な調製のいくつか、または全てを実施するために配置されたサンプル調製機器180を用いて、自動化されたか、または部分的に自動化された様式で配列決定のためにサンプルを調製することができる。さらに、図1に例示されるように、配列決定機器100を、例えば、配列決定機器100もしくはサンプル調製機器180などの1個以上の機器の機器制御、および／またはいくつかのデータ分析機能を提供することができるアプリケーション135などのシステムソフトウェアまたはファームウェアを実行することができるコンピューター130などの1個以上の外部コンピューター成分と機能し得る形で連結することができる。さらに、コンピューター130を、機器系の遠隔操作と保存および処理することができる系への大量のデータの輸出とを可能にし得るネットワーク150を介して他のコンピューターまたはサーバーに機能し得る形で接続することができる。本発明の例においては、配列決定機器100および／またはコンピューター130は、上記に一般的に記載された実施形態のいくつか、または全ての成分および特徴を含んでもよい。
【００７３】
本発明の一態様においては、標的特異的プライマーを、極端に低いバイアス様式で、記載の配列決定用途において直接使用するためのアンプリコンを生成するように設計された1,300個を超える既知のHIV-1 pol配列のアラインメントから設計した。既知のHIV配列のアラインメントを、関連業界の当業者には公知の方法を用いて実施することができる。例えば、いくつかの配列アラインメント方法、アルゴリズム、およびアプリケーションが、当業界で利用可能であり、限定されるものではないが、Smith-Waterman algorithm (あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとするSmith, T.F., Waterman, M.S. (1981). Identification of Common Molecular Subsequences, J. Mol. Biol. 147: 195-197)、BLASTアルゴリズム (あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとするAltschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215:403-410)、およびClustal (あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとするThompson, J.D., Gibson, T.J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D.G. (1997). The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Res. 25:4876-4882)が挙げられる。単一の配列への配列のアラインメントは、HIV配列の集団の最も多い配列組成のコンセンサスを提供する。また、本発明の例においては、ソフトウェアアプリケーションは、インテグラーゼ型決定のための目的の領域と整列されたコンセンサス配列に対するプライマー配列のための標的領域をプロットすることができる。目的の領域は、突然変異しやすいことが知られ、インテグラーゼ阻害剤のウイルス耐性に寄与し得る領域を含む。次いで、プライマーセットを、既知の突然変異しやすい領域よりも保存された(すなわち、突然変異する可能性が低い)コンセンサス配列の領域に対して設計することができる。また、プライマー設計は、増幅産物の配列組成を決定するのに用いられる配列技術のリード長能力に関して、得られる増幅産物の長さなどのさらなる考慮を含む。本明細書に開示されるプライマーセットは、既知の突然変異しやすい領域よりも保存された(すなわち、突然変異する可能性が低い)コンセンサス配列の領域に対して設計されたものである。プライマー設計に関して低い突然変異率を有する配列領域を標的化する利点としては、プライマーが結合できなくなる標的領域での変異に起因する失敗の実質的な危険なしに設計されたプライマーを確実に使用する能力、ならびに複数のクレードに対して同じプライマーセットを用いる可能性が挙げられる。さらに、当業者であれば、コンセンサス配列の「保存された」領域と考えられる領域内の特定の位置が、その組成において依然として可変的であり、「縮重」位置であると考えられることを理解するであろう。いくつかの好ましい実施形態においては、プライマー設計に用いられるパラメーターとしては、コンセンサス配列を決定するのに用いられる複数の配列アラインメント中のその位置に98％未満の頻度のヌクレオチド種が存在する場合、プライマー組成中の位置に縮重塩基を挿入することが挙げられる。さらに、結合標的領域およびプライマー組成の選択に影響する他のパラメーターとしては、縮重位置を2個の代替ヌクレオ���ド種のみを有するものに制限すること、ならびにプライマー組成を、増幅反応においてプライマーダイマーを形成する危険性を低下させる2個以下の縮重位置に制限することが挙げられる。また、いくつかの実施形態においては、結合効率について高度に保存された最後の5個の位置を有することが有利であるため、縮重位置を、プライマー組成の最後の5個の配列位置(すなわち、フォワードプライマーの3'末端およびリバースプライマーの5'末端)に制限することが望ましい。例えば、縮重配列位置は、典型的には、その位置で代替配列組成として生じる複数の可能な異なるヌクレオチド種を有する。縮重塩基は当業界でよく知られており、様々な型の縮重性が、その型に関連する代替ヌクレオチド組成を表すIUPAC記号により表されている。例えば、IUPAC記号Rは、プリン塩基(すなわち、AおよびG)が代替可能であることを表す。
【００７４】
記載の本発明の実施形態は、高効率配列決定に従うアンプリコンを作製するために設計された以下のプライマー種を含む：
2012510257.tif 000002
当業者であれば、プライマーセットに関して配列組成のいくらかの可変性が存在すること、および開示されるプライマー配列と90％以上相同な配列が、本発明の範囲内にあると考えられることを理解するであろう。例えば、プライマーセットのための標的領域をわずかにシフトさせることができ、かくして、プライマー配列組成のいくらかの差異が予想される。また、コンセンサス配列に対する改良を行うか、または特定の位置の新しい配列縮重性を探索し、標的領域における配列組成のわずかな差異をもたらすことができ、同様に、プライマー配列組成のいくらかの変動が予想される。
【００７５】
図2は、上記に例示されたプライマーから作製されるアンプリコン205およびアンプリコン215の実例を提供する。図2において、アンプリコン210、220、230、240、250および260は、インテグラーゼ領域205に広がって互い違いの関係で整列されているが、図2中の例示されたアンプリコンの正確な関係が、例示目的で提供されるものであり、限定的であると考えるべきではないことが理解されるであろう。また、異なるアンプリコン産物を、本明細書に開示されるプライマー配列の異なる組合せを用いて作製し、図2に例示されるものと異なる長さおよび範囲を有するアンプリコンをもたらすことができることも理解されるであろう。
【００７６】
本発明のいくつかの実施形態においては、品質制御において実質的な利益を提供することができる「二重範囲」、ならびにアンプリコン産物の1つが適切に増幅することができないか、またはいくつかの他の型の実験人工物を被る事象における冗長性を提供する、重複する範囲のインテグラーゼ領域を有するアンプリコン産物を作製することが有利である。典型的な実施形態においては、それぞれのアンプリコンを、所望のアンプリコンについて関連するプライマーの組合せを用いて別々の反応において作製する。さらに、いくつかの実施形態においては、前記アンプリコンは、PCRなどの増幅技術から信頼性が高く作製することができる(すなわち、低率の増幅エラーなど)長さよりも長く、かくして、各アンプリコンは同じプライマーの組合せを用いる2個の増幅産物の結果であってよい。例えば、図2に例示されるように、アンプリコン210は、生成物205と207の組合せであってよい；220は生成物215と217の組合せであってよい；230は生成物225と227の組合せであってよい；240は生成物235と237の組合せであってよい；250は生成物245と247の組合せであってよい；ならびに260は生成物255と257の組合せであってよい。本発明の例においては、前記生成物は、典型的には、アンプリコン産物の集合および品質制御を再び提供する重複の尺度を有するであろう。以下の表1は、アンプリコン、アンプリコンの長さ、およびその作製に用いられるプライマーの関係の例を提供する。
【表１】
2012510257.tif 000003
【００７７】
いくつかの実施形態においては、アダプターエレメントを、クローンコピーの集団を産生する個々のアンプリコンからの2回目の周回の増幅に用いられる別の一般プライマーを含むプロセッシングの間にアンプリコンの末端に連結する(すなわち、第2のアンプリコンを作製するため)。このアダプターはまた、品質制御エレメントなどの本明細書の他の場所に記載される他のエレメント、配列決定プライマーおよび／または増幅プライマー(もしくは増幅および配列決定プライマーの両方として機能することができる単一のプライマー)などの他のプライマー、ユニークな識別子エレメント(すなわち、上記のMIDエレメント)などを含んでもよいことが理解されるであろう。また、いくつかの実施形態においては、上記の標的特異的プライマーを、その後のプロセス工程で使用可能な1個以上の他のエレメントと組合わせることができる。例えば、一本鎖核酸分子は、一方の末端に標的特異的プライマー配列と、隣接するさらなる配列エレメントとを含んでもよい。標的特異的プライマーは、標的領域の隣にあるフランキング配列とのその配列組成の非相補的性質に起因して後方にある他のエレメントと共に標的領域にハイブリダイズし、ここで、増幅産物は目的の領域のコピー、ならびにさらなる配列エレメントを含む。
【００７８】
本発明の実施形態においては、第1鎖cDNAを、標的特異的プライマーを用いてHIV RNAから作製する。一実施形態においては、第1鎖cDNAを、上記の配列決定アダプター(「SAD」よも呼ばれる)を欠くIN5Rプライマーなどの単一のプライマーを用いて作製することができる。続いて、6個の「第1の」アンプリコンを、標的特異的プライマー／プロセッシングエレメント戦略を用いて作製する。かくして、得られるアンプリコンは、プライマーとのその結合に起因して、必要なプロセッシングエレメントを含む。
【００７９】
また、好ましい実施形態においては、2回目の周回の増幅を、典型的には、乳濁液が破壊される時に拡散を防止する第2のアンプリコンを効率的に隔離するビース基板上に「第2の」アンプリコンの固定されたクローン集団をもたらす、上記のエマルジョンに基づくPCR増幅戦略を用いて行う。次いで、典型的には、数千個の第2のアンプリコンを本明細書の他の場所に記載のように同時に配列決定する。例えば、第2のアンプリコンの固定された集団を含むビーズを、反応基板105上に充填し、各サンプルから1000個未満のクローンリードを生成し、処理のために配列データをコンピューター130に出力する配列決定機器100を用いて処理する。コンピューター130は、特殊なソフトウェア(例えば、アプリケーション135など)を実行して、サンプルに由来する1％以下の量の変異体を同定する。
【００８０】
図3は、インターフェース300を含み、ユーザー101に、個々のHIV RNA分子に由来する単一のリードをそれぞれ表す複数の配列305と整列させたコンセンサス配列303の視覚的表示を提供する複数のウインドウ枠を含むアプリケーション135の出力の実例を提供する。インターフェース300はまた、コンセンサス配列303と配列組成において異なるベースコール310を同定し、そのような同定は、異なる色、太字、斜体、または関連業界では公知の表示の他の視覚的手段でベースコール310を強調することを含んでもよい。インターフェース300はまた、ユーザー101に、参照配列303中の塩基位置によるサンプル中の検出された変動320のレベルの視覚的表示、ならびにそれらの塩基位置での配列リード330の数の表示を提供する。図3の例において、サンプル中で1％以下の頻度で生じる変異体は、クローンリードの試験により容易に決定される。示される例においては、完全な、または部分的なインテグラーゼ範囲を有する3-15,000個のリード(フォワードもしくはリバースの配列決定方向)を、臨床サンプルから作製した。
【００８１】
また、個々のリードに由来する配列データが、コンセンサス配列からの変動を含んでも、または含まなくてもよい場合、各リードに由来する配列情報を、インテグラーゼ型に関連する既知のハプロタイプと関連させるソフトウェアアプリケーションの同じか、または異なる実施形態により、配列データをさらに分析することができる。本明細書で用いられる用語「ハプロタイプ」とは、一般的には、HIVの場合、HIV RNA配列を含む核酸配列と結合した対立遺伝子の組合せを指す。当業者であれば、結合が、例えば、ハプロタイプおよび／またはインテグラーゼ関連情報を保存する1個以上のデータベースなどの1個以上の特殊化されたデータ構造の使用を含んでもよいことを理解するであろう。前記ソフトウェアアプリケーションは、データ構造中の新しい情報から情報を抽出し、および／またはそれを提供する公知の方法でデータ構造を含むか、またはそれと通信することができる。
【００８２】
上記のように、多くの核酸鋳型を同時に配列決定することは、本発明にとって必要な感度を提供する。例えば、二項統計値に基づけば、完全に充填された60 mm x 60 mmのPicoTiterPlate(200,000 x 100塩基リードから構成される、2 x 106個の高品質塩基)に関する検出の下限(すなわち、1個の事象)は、95％信頼区間については、少なくとも0.002％の対立遺伝子頻度を有する集団に関するものであり、99％信頼区間については、少なくとも0.003％の対立遺伝子頻度を有する集団に関するものである(さらに多い数のリードおよびかくして感度の増加を可能にする、70 x 75 mmのPicoTiterPlateを上記のように用いることができることも理解されるであろう)。比較のために、ピロリン酸に基づく配列決定を介するSNP検出は、少なくとも高頻度の対立遺伝子が集団の10％以上において存在する限り、4倍体ゲノム上での別々の対立遺伝子状態の検出を報告している(Rickertら、2002 BioTechniques. 32:592-603)。従来の蛍光DNA配列決定はさらに感度が低く、50/50(すなわち、50％)のヘテロ接合体対立遺伝子を分解する困難を経験する(Ahmadianら、2000 Anal. BioChem. 280:103-110)。
【００８３】
表2は、所与の数N(=100)の配列決定されたアンプリコンに関する、全集団中でのSNPの発生率に基づいて0、または1個以上の事象を検出する確率を示す。「*」は、発生率が5.0％である場合に少なくとも1個の事象を検出することができない確率が3.7％であることを示す；同様に、「**」は、発生率が7％である場合に1個以上の事象を検出することができない確率が0.6％であることを示す。
【００８４】
かくして、この表は、5％のレベルで存在するSNPを検出する信頼レベルが95％以上であり、同様に、7％のレベルで存在するSNPを検出する信頼性が99％以上であることを示している。
【表２】
2012510257.tif 000004
【００８５】
自然では、多重分析は検出の深さよりも高い適用性を有し、表3は、95％および99％信頼性で検出可能な最少の対立遺伝子頻度と共に、1個のPicoTiterPlateアレイ上で同時にスクリーニングすることができるSNPの数を示す。
【表３】
2012510257.tif 000005
【００８６】
図4は、最初のサンプル入力のための工程403を含むHIVインテグラーゼ領域中の低頻度の変異(バリエーション)の同定のための方法の一実施形態の実例を提供する。3％の頻度まで下がる少ない変異体を一貫して検出するためには、前記方法において用いられるHIV-1 RNAサンプルはArtus HIVリアルタイム定量的PCRアッセイ(Artus Biotech GmbHから入手可能)を用いて決定した場合160 IU/μlの最少ウイルス含量を必要とする。1％の頻度まで下がる検出については、最少ウイルス含量は少なくとも500 IU/μlであるべきである。当業者であれば、例えば、PCRプロセスから導入される少量のエラーなどの、システムエラーのさらなる起源を導入することができ、1％が変異の頻度を指し、システムエラーを指すものではないことを理解するであろう。
【００８７】
RNAサンプルを定量することが実用的でない場合、血漿中の元のウイルス負荷が1 mlあたり100,000コピーである場合、少なくとも140μlの血漿に対して最大60μlの全溶離液にRNA抽出を行うことができる。より少ないウイルス負荷については、血漿の量を相応に増減し、ウイルスを4℃、20,600 rpmで1時間30分間沈降させることができる。抽出手順のために十分な上清を除去して、140μlの濃縮液にしなければならない。いくつかのサンプルに関するPCRおよび配列複製反応を設定して、低頻度の変異体の一貫した検出を検証する。
【００８８】
次に、RNAサンプルを工程405において例示のように処理して、HIVサンプル集団からcDNA鋳型を作製する。サンプルからのcDNAの作製を、以下の手順を用いて実施することができる：
1. 冷却器中に96穴プレートを入れる、
2. ウェルあたり11.5μlのRNAを添加する、
3. 0.5μlのプライマーIN5Rを添加する、
cDNA-IN5R:
5’  GTGTTTTACTAAACTDTTCCATG  3’ (配列番号9)。
【００８９】
65℃で10分間インキュベートした後、チューブをすぐに氷上に置く。
【００９０】
チューブ数のためにスケールアップした逆転写酵素(RT)ミックスを調製する：
1. 転写因子RT反応バッファー(Rocheから入手可能)4μl
2. 保護剤RNase阻害剤(Rocheから入手可能)0.5μl
3. dNTP  2μl
4. DTT(Rocheから入手可能)1μl
5. 転写因子逆転写酵素(Rocheから入手可能)0.5μl。
【００９１】
ボルテックスにより簡単に混合し、RNAサンプルに添加するまで氷上で保持する。
【００９２】
6. ウェルあたり8μlのRTミックスを添加する
7. プレートを密閉し、簡単に遠心分離する
8. サーモサイクラーに入れ、以下のcDNAプログラム：
60分、50℃
5分、85℃
以後4℃
を実行する
9. ウェルあたり1μlのRNAse H(New England Biolabsから入手可能)を添加する
10. サーモサイクラーに入れ、37℃で20分間ブロックする(50℃以上に設定してフタをして加熱)
11. すぐにアンプリコン作製を行うか、または-80℃でcDNAを保存する。
【００９３】
続いて、工程410に例示されるように、領域特異的プライマー対を用いて、以下の手順を用いて工程405で作製されたcDNA鋳型から標的領域を増幅する。
【００９４】
1. 以下に記載の13xミックスが1個の96穴プレートにとって十分である(6個のアンプリコン、47個のサンプル + 1個の対照)。この方法を必要に応じて規模を拡大または縮小することができる。
【００９５】
2. 6個の1.5 mlチューブに、「IN1A」、「IN1B」、「IN3」、「IN4」、「IN5」および「IN6」と標識する。これらの標識は、以下のアンプリコン／プライマーセットを指す：
IN1A      IN12F + IN2R
IN1B      IN1F + IN2R
IN3       IN3F + IN3R
IN4       IN4F + IN4R
IN5       IN5F + IN5R
IN6       IN6F + IN6R
(注記：上記の標的特異的プライマー配列に加えて、以下のプライマーは以下のエレメント：フォワードおよびリバースプライマーに特異的なSAD配列；ならびにキーエレメント＝TCAGを含む)。
【００９６】
IN12F
GCCTCCCTCGCGCCATCAGCTATTTTTAGATGGAATAGANAARGC 
(配列番号*1)
IN1F
GCCTCCCTCGCGCCATCAGGTACCAGCACACAAAGGRATTGG
(配列番号2)
IN2R
GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTTGATCCCTGCCCACCARCA
(配列番号3)
IN3F
GCCTCCCTCGCGCCATCAGGGAAAAATTATCCTRGTAGCAGT
(配列番号4)
IN3R
GCCTTGCCAGCCCGCTCAGCCTGCACTGTAYCCCCCAAT
(配列番号5)
IN4F
GCCTCCCTCGCGCCATCAGGTAAAAACAATACATACAGAYAATGG
(配列番号6)
IN4R
GCCTTGCCAGCCCGCTCAGCTGTCCCTGTAATAAACCCGAA
(配列番号7)
IN5F
GCCTCCCTCGCGCCATCAGGACAGCAGTACAAATGGCAGT
(配列番号8)
IN5R
GCCTTGCCAGCCCGCTCAGGTGTTTTACTAAACTDTTCCATG
(配列番号9)
IN6F
GCCTCCCTCGCGCCATCAGGAATAATAGACATAATAGCAWCAGA
(配列番号10)
IN6R
GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTGTTCTAATCCTCATCCTGTC
(配列番号11)。
【００９７】
3. 実験に多重識別子(MID)が必要な場合、各セットのアンプリコンにつき、対応するMIDプライマー中に添加する。例えば、MID1を用いる場合、プライマーセットAの全プライマーは、フォワードおよびリバース方向の両方のためのプライマー中に添加されたMID1を有するべきである。MID配列は10塩基対の長さであり、配列アダプター配列の後ろ、かつ標的プライマー配列の直前でプライマー中に挿入すべきである。
【００９８】
4. 各チューブ中に、下記標識により示されるプライマーセットを含むPCRマスターミックスを調製する：
2012510257.tif 000006
【００９９】
5. 1行目の各ウェルに22μlの「IN1A」PCRマスターミックスをピペットで入れる。
【０１００】
6. 2行目の各ウェルに22μlの「IN1B」PCRマスターミックスをピペットで入れる。
【０１０１】
7. 3行目の各ウェルに22μlの「IN3」PCRマスターミックスをピペットで入れる。
【０１０２】
8. 4行目の各ウェルに22μlの「IN4」PCRマスターミックスをピペットで入れる。
【０１０３】
9. 5行目の各ウェルに22μlの「IN5」PCRマスターミックスをピペットで入れる。
【０１０４】
10. 6行目の各ウェルに22μlの「IN6」PCRマスターミックスをピペットで入れる。
【０１０５】
11. 以下のスキームに従ってウェルあたり3μlのcDNAを添加する(カラムあたり1個のサンプル)。
【０１０６】
12. カラム11中の陽性対照は既知のサンプルcDNAであり、カラム12中の陰性対照はcDNA合成プレートに由来する水対照である。
【０１０７】
13. プレートをプレートシールで被覆する。
【０１０８】
14. 900xgで30秒間、プレートを遠心分離する。
【０１０９】
15. プレートをサーモサイクラー中に入れ、プログラム「HIV_INT」：
94℃で3分間
40サイクル：
94℃で15秒間
55℃で20秒間
72℃で45秒間
72℃で8分間
以後4℃
を実行する。
【０１１０】
16. 次の工程にすぐに進まない場合、プレートを氷上(同じ日に処理する場合)、または-20℃で保存する。
【０１１１】
次いで、工程410で作製されたアンプリコンを、いくつかの実施形態においては、固相可逆的固定化(SPRIとも呼ばれる)または関連業界では公知のサイズ選択のためのゲル切断方法を用いて工程413に例示されるように洗浄または精製することができる。例えば、アンプリコン精製を、以下のプロセスを用いて実施することができる：
1. 900xgで30秒間、プレートを遠心分離する。
【０１１２】
2. 8チャンネルのマルチピペッターを用いて、96穴、丸底、PPプレート(Fisher Scientificから入手可能)のカラム1〜11中の各ウェルに、22.5μlの分子等級水を注入する。
【０１１３】
3. 丸底PPプレートの各ウェルに、PCRプレートに由来する22.5μlのPCR産物を移す；2個のプレートについてレイアウトを同じに保持する。
【０１１４】
4. 各ウェルに72μlのSPRIビーズを添加し、SPRIビーズ／PCR混合物が均一になるまで、ピペットを少なくとも12回上下することにより完全に混合する。
【０１１５】
5. 上清が透明になるまで、室温で10分間、プレートをインキュベートする。
【０１１６】
6. 96穴磁気リングスタンド(Ambion, Inc.から入手可能)上にプレートを置き、室温で5分間インキュベートする。
【０１１７】
7. プレートを磁気リングスタンド上に置いたまま、ビーズを乱すことなく上清を注意深く除去し、廃棄する。
【０１１８】
8. 磁気リングスタンドからPPプレートを取り出し、200μlの新鮮に調製された70％エタノールを添加する。
【０１１９】
9. 磁気リングスタンドにPPプレートを戻す。磁気リングスタンド上で約10回、前後に／円状の動きでPPプレートをタップするか、または動かして溶液を攪拌し、ペレットの分散を補助する(ペレットは完全には分散しないかもしれないが、これは許容し得る)。
【０１２０】
10. PPプレートを磁気リングスタンド上に置き、1分間インキュベートする。
【０１２１】
11. プレートを磁気リングスタンド上に置いたまま、ビーズを乱すことなく上清を注意深く除去し、廃棄する。
【０１２２】
12. 工程8-11を繰り返す。できるだけ多くの上清を除去する。
【０１２３】
13. 全てのペレットが完全に乾燥するまで(10〜20分間)、40℃に設定したヒートブロック上に一緒に磁気リングスタンドにPPプレートを置く。
【０１２４】
14. 各ウェルに10μlの1X TE(pH 7.6±0.1)を添加する。全てのペレットが分散するまで、磁気リングスタンド上で同じように前後に／円状の動きでPPプレートをタップする／動かす。
【０１２５】
15. 磁気リングスタンド上にPPプレートを置き、2分間インキュベートする。
【０１２６】
16. 各ウェルから新鮮な96穴(黄色)プレート中に上清をピペットで注入する。いくつかのウェルにおいてはペレットの移動を回避するのが困難であるが、これは許容し得る。
【０１２７】
17. プレートをプレートシールで被覆し、-20℃で保存する。
【０１２８】
1以上の実施形態においては、アンプリコンを定量することも有利であり得る。本発明の例においては、アンプリコン定量を、以下のプロセスを用いて実施することができる：
1. 当業界で公知の方法を用いて、PicoGreen(登録商標)試薬を用いて1μlのこれらのアンプリコンを定量する。
【０１２９】
2. 5 ng/μl以下で定量されたアンプリコンを、2100 Bioanalyzer(Agilent Technologiesから入手可能)上でさらに評価するべきである：1μlのそれぞれ精製されたアンプリコンをBioanalyzer DNAチップ上に充填し、DNA-1000シリーズIIアッセイを実行する。
【０１３０】
a. 予想されるサイズのバンドが存在し、プライマーダイマーが3:1以下のモル比で明らかである場合、PicoGreen定量を使用し、アンプリコンプーリングを進める。
【０１３１】
b. 予想されるサイズのバンドが存在し、プライマーダイマーが3:1を超えるモル比で明らかである場合、SPRIおよびPicoGreen定量を繰り返し、次いで、Bioanalyzer分析を行って、プライマーダイマーの除去を確認する。
【０１３２】
3. Bioanalyzer上の1μlの陰性PCR対照反応を分析する。プライマーダイマー以外のバンドは見えるべきではない。
【０１３３】
次に、工程415に例示されるように、アンプリコンに由来する核酸鎖を選択し、乳濁液滴中に導入し、本明細書の他の場所に記載のように増幅する。いくつかの実施形態においては、サンプルあたり2種の乳濁液を設定し、一方はAmplicon Aキットを使用し、一方はAmplicon Bキットを用いることができる(両方とも454 Life Sciences Corporationから入手可能)。異なる実施形態においては、異なる数の乳濁液および／または異なるキットを用いることができる。アンプリコンを、以下のプロセスを用いて最終ミックスのために選択することができる：
1. 各サンプルにつき6個のアンプリコンを作製し、理想的には、それぞれ、emPCR反応のために等モル量で混合するべきである。全てのアンプリコンが等しい効率で作製されるわけではなく、場合によっては作られるアンプリコンが非常に少ないが、その代わりに大量のプライマーダイマーが存在することもある。最適な配列決定結果を達成するためには、いくらかのアンプリコンの品質が低水準である場合でも、各サンプルの最終ミックスのために、上手く定量され、比較的純粋な(以下を参照)アンプリコンのみを使用することが重要である。様々なアンプリコン間のかなりの重複に起因して、ただ6個のアンプリコンだけが所与のサンプルの完全な範囲にとって必要であるため、これは可能である。6個の高品質アンプリコンのセットが入手可能でない場合、各サンプルの最終ミックスのためのアンプリコンの選択については以下の規則に従う：
i. アンプリコンがBioanalyzer上で定量可能なバンドとして認識されない場合、6.2に記載の最終アンプリコンミックスのためにそれを使用しない。
【０１３４】
ii. プライマーダイマー：アンプリコンのモル比が3:1以上である場合、最終アンプリコンミックスのために使用しない。この尺度は、6.1に記載のAgilent Bioanalyzerアッセイを用いてさらに定量された低濃度のアンプリコンについてのみ利用可能であろう。
【０１３５】
iii. アンプリコンが上記の基準を満たさないか、または完全に欠落している場合、以下のスキームに従って他の重複するアンプリコンの量を増加させる。
【０１３６】
2. アンプリコンIN3およびIN4が両方とも欠落している場合、インテグラーゼ領域の小部分を配列決定することができない。2倍量のIn1AおよびIN5を用いることができるが、インテグラーゼ遺伝子のコドン130-181に対応する、位置484-636に関する配列データは存在しないことに留意されたい。あるいは、これらのアンプリコンについてPCRを繰り返す。
【０１３７】
3. アンプリコンIN1AおよびIN1Bが両方とも欠落している場合、インテグラーゼ領域を完全に配列決定することができない。これらのアンプリコンについてPCRを繰り返す。
【０１３８】
4. アンプリコンIN5およびIN6が両方とも欠落している場合、インテグラーゼ領域を完全に配列決定することができない。これらのアンプリコンについてPCRを繰り返す。
【０１３９】
5. アンプリコンIN1AおよびIN3が両方とも欠落している場合、アンプリコンIN1BおよびIN4の量を2倍にする。
【０１４０】
6. アンプリコンIN5およびIN4が両方とも欠落している場合、インテグラーゼ領域の小部分を配列決定することができない。2倍量のIN6およびIN3を用いることができるが、インテグラーゼ領域のそれぞれコドン191-208または284-290に対応する、位置667-717または領域947-965に関する配列データが存在しないことに留意されたい。あるいは、これらのアンプリコンについてPCRを繰り返す。
【０１４１】
また、工程415の一部として、アンプリコンの混合および希釈のための以下のプロセスを、emPCRにおける使用のために用いることができる。
【０１４２】
1. 以下の式を用いて所与のサンプルに由来する6個のアンプリコンのそれぞれについて、1μlあたりの分子の濃度を算出する：
2012510257.tif 000007
【０１４３】
2. 6個のアンプリコンのそれぞれの109分子／μl希釈液を作製する：
1μlのアンプリコン溶液に、以下の容量の1 x TEを添加する：
2012510257.tif 000008
【０１４４】
3. 等量のそれぞれの6個のアンプリコン希釈液、例えば、10μlを混合する。いずれかのアンプリコンが欠落している場合、工程405の指針に従って重複するアンプリコンの容量を増加させる。
【０１４５】
4. 499μlの1xTEに1μlの109分子／μlの溶液を添加することにより、混合したアンプリコンのさらなる希釈液を作製し、2 x 106分子／μlにする。
【０１４６】
5. o-リングキャップを備えた0.5 mlのチューブ中、-20℃で最終希釈液(2 x 106分子／μl)を保存する。
【０１４７】
増幅後、乳濁液を破壊し、固定された核酸の増幅された集団を含むビーズを、工程420に例示されるように濃縮する。例えば、DNAを含有するビーズを本明細書の他の場所に記載のように濃縮することができ、以下のプロセスエレメントを含んでもよい：
1. 乳濁液を設定する直前に、10μlを90μlのビーズ洗浄バッファーに添加することにより、6.3.4に由来する2 x 106分子／μl溶液の10倍希釈液を作製する。5秒間ボルテックスして混合する。
【０１４８】
2. 各サンプルにつき、1 cpb(すなわち、乳濁液あたり12μlの上記希釈液(2,400,000個のビーズ))を有する1個のAおよび1個のBの乳濁液を作製する。
【０１４９】
3. 所与のサンプルについて2種の乳濁液を、より容易に取り扱うために破壊の間にプールすることができる。
【０１５０】
次いで、濃縮されたビーズを、工程430に例示されるように配列決定する。いくつかの実施形態においては、各サンプルを本明細書の他の場所に記載のように配列決定する。例えば、配列決定のための濃縮およびプロセッシング後、80,000個のビーズ(陽性対照サンプルを含む)を、16レーンのガスケットを固定した70 x 75の金属化PTP上にレーンあたり混合した乳濁液から充填し、GS-FLX機器(454 Life Sciences Corporationから入手可能)上で配列決定することができる。
【０１５１】
GS-FLX配列決定機器は、3個の主要なアセンブリ：流体サブシステム、光ファイバースライドカートリッジ／フローチャンバー、および画像化サブシステムを含む。試薬注入ライン、多バルブ連結管、および蠕動ポンプが流体サブシステムの一部を形成する。個々の試薬を好適な試薬注入ラインに接続し、予めプログラムされた流速および期間で、1つの試薬を一度に、フローチャンバーへの試薬の送達を可能にする。光ファイバースライドカートリッジ／フローチャンバーは、スライドのエッチング処理された側とフローチャンバーの天井の間に250μmの空間を有する。フローチャンバーはまた、試薬および光ファイバースライド、ならびに光が入らない筺体の温度制御のための手段も含む。スライドの研磨された(エッチング処理されていない)側を、画像化系と直接接触させて置く。
【０１５２】
光ファイバースライドウェルへの配列決定試薬の循環的送達と、ウェルからの配列決定反応副産物の洗浄を、流体系の予めプログラムされた操作により達成する。このプログラムは典型的には、試薬名(Wash、dATPαS、dCTP、dGTP、dTTP、およびPPi標準)、流速および各スクリプト工程の期間を特定するInterface Control Language (ICL)スクリプトの形態で書かれる。例えば、1つの可能な実施形態においては、流速を、約1 cm/sのフローチャンバー内で直線的速度で全ての試薬につき4 mL/分に設定することができる。配列決定試薬の流動順序を、第1のカーネルがPPi流動(21秒)、次いで、14秒の基質流動、28秒のアピラーゼ洗浄および21秒の基質流動から構成されるカーネル中で体系化することができる。第1のPPi流動の次に、21サイクルのdNTP流動(dC-基質-アピラーゼ洗浄-基質dA-基質-アピラーゼ洗浄-基質-dG-基質-アピラーゼ、洗浄-基質-dT-基質-アピラーゼ、洗浄-基質)(ここで各dNTP流動は4個の個々のカーネルから構成される)を行うことができる。各カーネルは84秒の長さ(dNTP-21秒、基質流動-14秒、アピラーゼ洗浄-28秒、基質流動-21秒)である。画像を21秒後および63秒後に捕捉する。21サイクルのdNTP流動の後、PPiカーネルを導入した後、別の21サイクルのdNTP流動を行う。配列決定実行が終わった後、3回目のPPiカーネルを行う。合計実行時間は244分であった。この実行を完了するのに必要な試薬容量は以下の通りである：500 mLの各洗浄溶液、100 mLの各ヌクレオチド溶液。実行の間、全ての試薬を室温で保持した。フローチャンバーとフローチャンバー注入管の温度を30℃に制御し、フローチャンバーに進入する全ての試薬を30℃に予め加熱する。
【０１５３】
続いて、出力配列データを工程440に例示されるように分析する。いくつかの実施形態においては、高品質で濾過されたフローグラムデータを含むSFFファイルを、特異的アンプリコンソフトウェアを用いて処理し、データを分析した。
【０１５４】
上記の工程は例示のためだけのものであり、限定的なものとして意図されないこと、さらに、前記工程のいくつか、または全部を様々な組合せで様々な実施形態において用いることができることが理解されるであろう。例えば、上記の方法において用いられるプライマーを、他のHIV特性／領域を問い合わせるためのさらなるプライマーセットと組合わせて、より包括的な診断的または治療的利益を提供することができる。本発明の例においては、そのような組合せをプレート上で「乾燥した」状態で提供することができ、記載のインテグラーゼプライマーならびにHIV薬剤耐性または指向性領域、ならびに目的の任意の他の領域の検出のためのいくつか、または全部のプライマーが挙げられる。さらなる例は、2008年3月14日に出願された「System and Method for Detection of HIV Drug Resistant Variants」の表題のPCT出願第US 2008/003424号；および2009年6月17日に出願された「System and Method for Detection of HIV Tropism Variants」の表題の米国特許出願第12/456,528号(それぞれあらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)に開示されている。
【０１５５】
様々な実施形態および実施を記載してきたが、前記のものは例示に過ぎず、限定的ではなく、例によってのみ提供されたものであることを関連業界の当業者であれば理解するべきである。例示された実施形態の様々な機能的エレメント間に機能を分布させるための多くの他のスキームが可能である。任意のエレメントの機能を、代替的な実施形態において様々な方法で実行することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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