(57)【要約】本発明は、虚血後の再灌流による心筋細胞の再灌流性細胞死（アポトーシス性細胞死）を防御・救済する方法、再灌流性細胞死（心筋アポトーシス性細胞死）抑制剤ならびにその再灌流性細胞死抑制剤を含む再灌流性細胞死（アポトーシス性細胞死）に起因する疾患の治療薬剤・予防薬剤を提供することを目的としている。本発明は、虚血処理を行なった心筋細胞について、再流灌時に、ＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーまたはＲＯＳスカベンジャーを投与することによって、再灌流性細胞死（アポトーシス性細胞死）を有意に抑制することができるというものである。上記ＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーとしては、例えばＤＩＤＳやＮＰＰＢが好ましい。また上記ＲＯＳスカベンジャーとしては、例えばＴｉｒｏｎ，カタラーゼ，ＮＡＣが好ましい。本発明は、再灌流性細胞死に起因する各種疾患の治療・予防に有効である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を、グルコースを含まない緩衝液中で、無酸素条件下で培養する虚血処理工程と、
前記虚血処理を行なった細胞を、グルコースを含む培養液中で、有酸素条件下で培養する再灌流処理工程とを含んでおり、
前記いずれかの処理工程時に被検物を添加した場合の細胞死の評価結果と、前記いずれかの処理工程時に被検物を添加していない場合の細胞死の評価結果とを比較することを特徴とする再灌流性細胞死抑制効果の評価方法。
【請求項２】
上記いずれかの処理工程時が再灌流処理工程時であることを特徴とする請求項１に記載の再灌流性細胞死抑制効果の評価方法。
【請求項３】
上記被検物が、Ｃｌ−チャネルブロッカーまたはＲＯＳスカベンジャーであることを特徴とする請求項１または２に記載の再灌流性細胞死抑制効果の評価方法。
【請求項４】
上記細胞が心筋細胞であることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１項に記載の再灌流性細胞死抑制効果の評価方法。
【請求項５】
上記再灌流性細胞死がアポトーシス性の細胞死であることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載の再灌流性細胞死抑制効果の評価方法。
【請求項６】
上記細胞死の評価を、ミトコンドリア脱水素酵素の活性を指標に行なうことを特徴とする請求項１ないし５のいずれか１項に記載の再灌流性細胞死抑制効果の評価方法。
【請求項７】
上記細胞死の評価を、核内ＤＮＡの断片化を指標に行なうことを特徴とする請求項１ないし５のいずれか１項に記載の再灌流性細胞死抑制効果の評価方法。
【請求項８】
上記細胞死の評価を、細胞死を引き起こす細胞内タンパク質分解酵素の活性を指標に行なうことを特徴とする請求項１ないし５のいずれか１項に記載の再灌流性細胞死抑制効果の評価方法。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載の再灌流性細胞死抑制効果の評価方法を行なうためのキットであって、
細胞、グルコースを含まない緩衝液、およびグルコースを含む培養液
を包含することを特徴とするキット。
【請求項１０】
上記細胞が、心筋細胞であることを特徴とする請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
再灌流時にＣｌ−チャネルブロッカーまたはＲＯＳスカベンジャーを細胞に投与することを特徴とする再灌流性細胞死の抑制方法。
【請求項１２】
上記再灌流性細胞死が、アポトーシス性の細胞死であることを特徴とする請求項１１に記載の再灌流性細胞死の抑制方法。
【請求項１３】
上記再灌流性細胞死が、ミトコンドリア脱水素酵素の活性の低下を伴うものであることを特徴とする請求項１１または１２に記載の再灌流性細胞死の抑制方法。
【請求項１４】
上記再灌流性細胞死が、核内ＤＮＡの断片化を伴うものであることを特徴とする請求項１１または１２に記載の再灌流性細胞死の抑制方法。
【請求項１５】
上記再灌流性細胞死が、細胞死を引き起こす細胞内タンパク質分解酵素の活性化を伴うものであることを特徴とする請求項１１または１２に記載の再灌流性細胞死の抑制方法。
【請求項１６】
上記Ｃｌ−チャネルブロッカーが、ＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーであることを特徴とする請求項１１ないし１５のいずれか１項に記載の再灌流性細胞死の抑制方法。
【請求項１７】
上記ＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーが、ＤＩＤＳであることを特徴とする請求項１６に記載の再灌流性細胞死の抑制方法。
【請求項１８】
上記ＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーが、ＮＰＰＢであることを特徴とする請求項１６に記載の再灌流性細胞死の抑制方法。
【請求項１９】
上記ＲＯＳスカベンジャーが、Ｔｉｒｏｎであることを特徴とする請求項１１ないし１５のいずれか１項に記載の再灌流性細胞死の抑制方法。
【請求項２０】
上記ＲＯＳスカベンジャーが、カタラーゼであることを特徴とする請求項１１ないし１５のいずれか１項に記載の再灌流性細胞死の抑制方法。
【請求項２１】
上記ＲＯＳスカベンジャーが、ＮＡＣであることを特徴とする請求項１１ないし１５のいずれか１項に記載の再灌流性細胞死の抑制方法。
【請求項２２】
上記細胞が心筋細胞であることを特徴とする請求項１１ない２１のいずれか１項に記載の再灌流性細胞死の抑制方法。
【請求項２３】
ＲＯＳスカベンジャーを含むことを特徴とする再灌流性細胞死抑制剤。
【請求項２４】
Ｃｌ−チャネルブロッカーを含むことを特徴とする再灌流性細胞死抑制剤。
【請求項２５】
上記Ｃｌ−チャネルブロッカーが、ＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーであることを特徴とする請求項２４に記載の再灌流性細胞死抑制剤
【請求項２６】
上記再灌流性細胞死が、アポトーシス性の細胞死であることを特徴とする請求項２３ないし２５のいずれか１項に記載の再灌流性細胞死抑制剤。
【請求項２７】
上記再灌流性細胞死が、ミトコンドリア脱水素酵素の活性の低下を伴うものであることを特徴とする請求項２３ないし２６のいずれか１項に記載の再灌流性細胞死抑制剤。
【請求項２８】
上記再灌流性細胞死が、核内ＤＮＡの断片化を伴うものであることを特徴とする請求項２３ないし２６のいずれか１項に記載の再灌流性細胞死抑制剤。
【請求項２９】
上記再灌流性細胞死が、細胞死を引き起こす細胞内タンパク質分解酵素の活性化を伴うものであることを特徴とする請求項２３ないし２６のいずれか１項に記載の再灌流性細胞死抑制剤。
【請求項３０】
上記ＲＯＳスカベンジャーが、Ｔｉｒｏｎであることを特徴とする請求項２３、２６、２７、２８、または２９のいずれか１項に記載の再灌流性細胞死抑制剤。
【請求項３１】
上記ＲＯＳスカベンジャーが、カタラーゼであることを特徴とする請求項２３、２６、２７、２８、または２９のいずれか１項に記載の再灌流性細胞死抑制剤。
【請求項３２】
上記ＲＯＳスカベンジャーが、ＮＡＣであることを特徴とする請求項２３、２６、２７、２８、または２９のいずれか１項に記載の再灌流性細胞死抑制剤。
【請求項３３】
請求項２３ないし３２のいずれか１項に記載の再灌流性細胞死抑制剤を含み、再灌流性細胞死に起因する疾患の治療に使用される治療薬剤。
【請求項３４】
心筋細胞死に起因する疾患の治療に使用される請求項３３に記載の治療薬剤。
【請求項３５】
請求項２３ないし３２のいずれか１項に記載の再灌流性細胞死抑制剤を含み、再灌流性細胞死に起因する疾患の予防薬剤。
【請求項３６】
心筋細胞死に起因する疾患の予防に使用される請求項３５に記載の予防薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は細胞死、特に心筋細胞における血流障害による虚血後の再灌流で生じるアポトーシス性細胞死の抑制方法、および細胞死抑制剤、並びに上記細胞死に起因する疾患の治療薬剤・予防剤に関するものである。さらには、虚血後の再灌流で生じるアポトーシス性細胞死（以下、適宜「再灌流性細胞死」という）抑制効果の評価方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  多くの心・血管疾患の発生・増悪において、心筋細胞のアポトーシスが重要な役割を果たしていることが、よく知られている（例えば非特許文献１、２参照）。殊に、心臓の虚血後の再灌流傷害あるいは低酸素・再酸素化傷害の部位に見られる心筋細胞死の多くは、アポトーシスによることが明らかにされている（例えば非特許文献３〜５参照）。これまで、この虚血後に再灌流を行なった心筋細胞のアポトーシス性細胞死の防御・抑制のための薬剤の開発に多くの努力がはらわれてきたが、未だ決定的なものを得るには到っていない。【０００３】  アポトーシス時には初期に細胞縮小化がみられることが知られているが、ミトコンドリア仲介性刺激物質スタウロスポリン（Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎ：ＳＴＳ）やデスレセプター仲介性刺激物質の腫瘍壊死因子α（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ−α：ＴＮＦα）やＦａｓリガンドによって誘導されたアポトーシスにおけるこのアポトーシス性容積減少（Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｄｅｃｒｅａｓｅ：ＡＶＤ）の原因に、Ｃｌ−チャネルとＫ＋チャネルの働きによるＫＣｌ流出が関与することを、本発明者等は明らかにした（非特許文献６参照）。【０００４】  そしてこのＣｌ−チャネルの働きをブロックする薬剤を投与することによって、アポトーシス性細胞死を救済する方法を開発した（特許文献１参照）。【０００５】  更には、培養心筋細胞・血管内皮細胞にＳＴＳでアポトーシスを誘導し、これをＣｌ−チャネルブロッカー（阻害剤）を投与することによって救済するシステムを用いた心疾患治療薬または予防薬のスクリーニング方法について開発した（例えば特許文献８参照）。【０００６】  その後、ラット心臓の異所性移植時の心筋細胞アポトーシス性細胞死にもＣｌ−チャネルブロッカー（心摘出前と移植直後に投与）が抑制的に作用することについて報告がなされた（非特許文献７参照）。【０００７】  しかし、このストラテジーによる心筋細胞の、一定期間のグルコース除去・無酸素処理後にグルコース再投与・再酸素化処理をするという、いわゆる虚血後の再灌流性のアポトーシス性細胞死の防御・救済を（虚血時ではなく）行なう方法の開発については、未だ全く行なわれていない。【０００８】  心筋細胞の虚血後の再灌流性のアポトーシスの発生には、活性酸素種（Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｓｐｉｅｃｅｓ：ＲＯＳ）が関与することが知られている（非特許文献８参照）。【０００９】  最近本発明者等は、ＳＴＳによるミトコンドリア刺激による場合も、ＴＮＦα（腫瘍壊死因子α）やＦａｓリガンドによるデスレセプター刺激による場合も、アポトーシス初期のＡＶＤ時に、容積感受性外向整流性Ｃｌ−チャネル（Ｖｏｌｕｍｅ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｏｕｔｗａｒｄｌｙ  Ｒｅｃｔｉｆｙｉｎｇ  Ｃｌ−  ｃｈａｎｎｅｌ：ＶＳＯＲ  Ｃｌ−  ｃｈａｎｎｅｌ）が活性化されることを証明し、ミトコンドリア刺激の場合の本チャネルの活性化シグナルはＲＯＳであることを明らかにした（非特許文献９参照）。【００１０】  なお、ＲＯＳ産生を抑制することによって心臓疾患・血管障害などを抑えるという方法の開発は行われてきた（例えば特許文献２〜７参照）。しかし、未だＲＯＳをターゲット��した虚血後の再灌流性心筋細胞アポトーシス死の防御・救済法の開発については行なわれていない。【００１１】  また特許文献９には、（Ｉ）Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ（以下「ＲＯＭ」という）の生成を抑制する化合物（ヒスタミン等）を用いればＲＯＭに起因して生じる疾患を抑制および低減することができること；（ＩＩ）必要に応じて、ＲＯＭの生成を抑制する化合物に加えてＲＯＭを捕捉するＲＯＭスカベンジャー（カタラーゼ等）を用いること；および（ＩＩＩ）ＲＯＭに起因して生じる疾患の１つとして、虚血または再灌流障害が挙げられ、その具体例として「卒中」が挙げられることが列挙されている。しかし、上記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）は、「ＲＯＭの生成を抑制する」または「生成したＲＯＭを補足する」ことによって、「ＲＯＭに起因して生じる疾患」を抑制することができるであろうという、示唆がなされているに過ぎず、後述するように再灌流性細胞死抑制効果の評価系が本願出願当時において公知ではなかった以上、特許文献８に示唆される事項を検証するための手段を有さない当業者は、本発明を容易に完成することはできないといえる。【００１２】  その他、特許文献１０には、マンガン；コバルト；銅；鉄などを含む新ｓａｌｅｎ−ｍｅｔａｌ複合体は抗酸化作用を有しており、心筋梗塞などの治療に有効であることが記載されている。【００１３】〔非特許文献１〕
Ｗ．Ｒ．ＭａｃＬｅｌｌａｎ  ＆  Ｍ．Ｄ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ「Ｄｅａｔｈ  ｂｙ  ｄｅｓｉｇｎ．Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｉｎ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．」Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８１，１３７−１４４，１９９７
〔非特許文献２〕
Ａ．Ｈａｕｎｓｔｅｔｔｅｒ  ＆  Ｓ．Ｉｚｕｍｏ「Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ｂａｓｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．」Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８２，１１１１−１１２９，１９９８
〔非特許文献３〕
Ｒ．Ａ．Ｇｏｔｔｌｉｅｂ，Ｋ．Ｏ．Ｂｕｒｌｅｓｏｎ，Ｒ．Ａ．Ｋｌｏｎｅｒ，Ｂ．Ｍ．Ｂａｂｉｏｒ  ＆  Ｒ．Ｌ．Ｅｎｇｌｅｒ「Ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｒａｂｂｉｔ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ．」Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４，１６２１−１６２８，１９９４
〔非特許文献４〕
Ｈ．Ｆｌｉｓｓ  ＆  Ｄ．Ｇａｔｔｉｎｇｅｒ「Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ａｎｄ  ｒｅｐｅｒｆｕｓｅｄ  ｒａｔ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ．」Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７９，９４９−９５６，１９９６
〔非特許文献５〕
Ａ．Ｅｌｓａｓｓｅｒ，Ｋ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｓ．Ｌｏｒｅｎｚ−Ｍｅｙｅｒ，Ｃ．Ｂｏｄｅ  ＆  Ｊ．Ｓｃｈａｐｅｒ「Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ：ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ａｐｐｒａｉｓａｌ．」Ｂａｓｉｃ  Ｒｅｓ．Ｃａｒｄｉｏｌ．９６，２１９−２２６，２００１
〔非特許文献６〕
Ｅ．Ｍａｅｎｏ，Ｙ．Ｉｓｈｉｚａｋｉ，Ｔ．Ｋａｎａｓｅｋｉ，Ａ．Ｈａｚａｍａ  ＆  Ｙ．Ｏｋａｄａ「Ｎｏｒｍｏｔｏｎｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｈｒｉｎｋａｇｅ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｓ  ａｎ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｅｒｅｑｕｉｓｉｔｅ  ｔｏ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７，９４８７−９４９２，２０００
〔非特許文献７〕
Ｋ．Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ，Ｈ．Ｈａｅｔａ，Ａ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｍ．Ｏｅ  ＆  Ｈ．Ｋｏｓａｋａ「Ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｇｌｏｂａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｗｉｔｈ  ｖｏｌｕｍｅ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．」Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７３，１１８５−１１９３，２００２
〔非特許文献８〕
Ｄ．Ｋｕｍａｒ  ＆  Ｂ．Ｉ．Ｊｕｇｄｕｔｔ「Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｏｘｉｄａｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｅａｒｔ．」Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１４２，２８８−２９７，２００３
〔非特許文献９〕
Ｔ．Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｔ．Ｎｕｍａｔａ  ＆  Ｙ．Ｏｋａｄａ「Ａ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｎ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｏｌｕｍｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｃｌ−ｃｈａｎｎｅｌ．」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１，６７７０−６７７３，２００４）
〔特許文献１〕
特開２００２−３４０２号公報（公開日：平成１４年１月９日（２００２．１．９））
〔特許文献２〕
特表２００３−５０５３４１号公報（公表日：平成１５年２月１２日（２００３．２．１２）、国際公開日：平成１２年１０月１２日（２０００．１０．１２））
〔特許文献３〕
特表２００３−５１３０９２号公報（公表日：平成１５年４月８日（２００３．４．８）、国際公開日：平成１３年５月１０日（２００１．５．１０））
〔特許文献４〕
特表２００３−５１８４７７号公報（公表日：平成１５年６月１０日（２００３．６．１０）、国際公開日：平成１３年５月２５日（２００１．５．２５））
〔特許文献５〕
特表２００３−５１９１９１号公報（公表日：平成１５年６月１７日（２００３．６．１７）、国際公開日：平成１３年７月１２日（２００１．７．１２））
〔特許文献６〕
特表２００３−５２７３９１号公報（公表日：平成１５年９月１６日（２００３．９．１６）、国際公開日：平成１３年９月２０日（２００１．９．２０））
〔特許文献７〕
特表２００２−５３０３９６号公報（公表日：平成１４年９月１７日、国際公開日：平成１２年６月２日）
〔特許文献８〕
国際公開第０３／０１４７２７号パンフレット（国際公開日：２００３年２月２０日）
〔特許文献９〕
特表２００２−５３４３８４号公報（公表日：平成１４年１０月１５日公表）
〔特許文献１０〕
国際公開第９６／４０１４９号パンフレット（国際公開日：１９９６年１２月１９日）【００１４】  心疾患が日本国内の死因の上位に位置する現状では、心筋梗塞等を引き起こす虚血後の再灌流による心筋細胞のアポトーシス性細胞死の防御・救済法の開発は、きわめて緊急な課題である。また上述のように、そのアポトーシス性細胞死を防御・救済する効果的な薬剤が開発されていない。【００１５】  かかる事情に鑑み、本発明は、アポトーシスシグナルおよびＲＯＳにより活性化されるＣｌ−チャネルの活性制御に着目し、Ｃｌ−チャネルブロッカー（阻害剤）およびＲＯＳスカベンジャー（除去剤）を用いて、虚血後の再灌流による心筋細胞のアポトーシス性細胞死を防御・救済する方法、心筋アポトーシス性細胞死抑制剤ならびにその細胞死抑制剤を含むアポトーシス性細胞死に起因する疾患の治療薬剤・予防薬剤を提供することを目的とする。
【発明の開示】
【００１６】  本願発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行なった。より具体的には、新生仔マウスの心室筋細胞の初代培養系を用いて、（ａ）Ｃｌ−チャネルブロッカーを投与することによって、虚血後の再灌流性心筋細胞アポトーシスを抑制することができるかどうか、（ｂ）できるとすれば、その投与は虚血時に行なうべきか、それとも再灌流時に行なうべきか、（ｃ）ＲＯＳスカベンジャーを投与することによっても虚血後の再灌流性心筋細胞アポトーシスを抑制することができるかどうか、という点について検討を行なった。
【００１７】  本発明者らは、上記検討を行なうための評価系をまず考案し、確立した。すなわち、これまでは再灌流性細胞死抑制効果の適当な評価系がなかったために、薬剤を虚血時に投与することが好ましいのか、または再灌流時に投与するのが好ましいのかを検討することができなかった。本発明は上記評価系の開発により初めて完成されたものといえる。
【００１８】  すなわち本発明にかかる虚血後の再灌流性細胞死の抑制方法は、上記課題を解決すべく、再灌流時にＣｌ−チャネルブロッカーまたはＲＯＳスカベンジャーを細胞に投与することを特徴としている。
【００１９】  また本発明にかかる再灌流性細胞死の抑制方法は、上記再灌流性細胞死が、アポトーシス性の細胞死であってもよい。
【００２０】  本発明者らが実施した上記検討によれば、Ｃｌ−チャネルブロッカーまたはＲＯＳスカベンジャーが、マウス培養心筋細胞の虚血後の再灌流傷害時のアポトーシス性細胞死に対して救済的に作用すること、およびＣｌ−チャネルブロッカーまたはＲＯＳスカベンジャーの投与は、虚血時においてではなく、再灌流時において行われた時にのみ有効であることが分かった。それゆえ、本発明にかかる再灌流性細胞死の抑制方法を上記構成とすることによって、虚血後の再灌流時に起こる細胞死、特にアポトーシス性細胞死を効果的に抑制することができるという効果を奏する。
【００２１】  また本発明にかかる再灌流性細胞死の抑制方法は、上記再灌流性細胞死が、ミトコンドリア脱水素酵素の活性の低下を伴うものであることが好ましい。これはつまり、本発明においては、細胞死の判断を、ミトコンドリア脱水素酸素活性を指標として行なうことができるということを意味する。
【００２２】  また本発明にかかる再灌流性細胞死の抑制方法は、上記再灌流性細胞死が、核内ＤＮＡの断片化を伴うものであることが好ましい。これはつまり、本発明においては、細胞死の判断を、核内ＤＮＡの断片化を指標として行なうことができるということを意味する。
【００２３】  また本発明にかかる再灌流性細胞死の抑制方法は、上記再灌流性細胞死が、細胞死を引き起こす細胞内タンパク質分解酵素（カスパーゼ）の活性化を伴うものであることが好ましい。これはつまり、本発明においては、細胞死の判断を、細胞死を引き起こす細胞内タンパク質分解酵素の活性化を指標として行なうことができるということを意味する。
【００２４】  また本発明にかかる再灌流性細胞死の抑制方法は、上記Ｃｌ−チャネルブロッカーが、ＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーであることが好ましい。
【００２５】  また本発明にかかる再灌流性細胞死の抑制方法は、上記ＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーが４，４’−ｄｉｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎｏｓｔｉｌｂｅｎｅ−２，２’−ｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＤＩＤＳ）であることが好ましい。
【００２６】  また本発明にかかる再灌流性細胞死の抑制方法は、上記ＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーが、５−ｎｉｔｒｏ−２−（３−ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｏ）−ｂｅｎｚｏａｔｅ（ＮＰＰＢ）であることが好ましい。
【００２７】  上記のごとくＣｌ−チャネルブロッカーとして、ＤＩＤＳ、ＮＰＰＢ等のＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーを用いることによって、虚血後の再灌流時に起こる細胞死、特にアポトーシス性細胞死をより効果的に抑制することができるという効果を奏する。
【００２８】  また本発明にかかる虚血・再灌流性細胞死の抑制方法は、上記ＲＯＳスカベンジャーが、５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１，２−ｂｅｎｚｅｎｅ  ｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（Ｔｉｒｏｎ）であることが好ましい。
【００２９】  また本発明にかかる虚血・再灌流性細胞死の抑制方法は、上記ＲＯＳスカベンジャーが、カタラーゼであることが好ましい。
【００３０】  また本発明にかかる虚血・再灌流性細胞死の抑制方法は、上記ＲＯＳスカベンジャーが、Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ（ＮＡＣ）であることが好ましい。
【００３１】  上記のごとくＲＯＳスカベンジャーとして、Ｔｉｒｏｎ、カタラーゼ、ＮＡＣを用いることによって、虚血後の再灌流時に起こる細胞死、特にアポトーシス性細胞死をより効果的に抑制することができるという効果を奏する。
【００３２】  また本発明にかかる再灌流性細胞死の抑制方法は、上記細胞が心筋細胞であることが好ましい。本発明を心筋細胞に適用することによって、心移植時に起こる心筋細胞死、心筋梗塞等の心疾患における心筋細胞死を効果的に抑制することができる。それゆえ、本発明は心疾患の治療において有用であるといえる。
【００３３】  一方、本発明にかかる再灌流性細胞死抑制剤は、上記課題を解決するために、ＲＯＳスカベンジャーを含むことを特徴としている。
【００３４】  また本発明にかかる再灌流性細胞死抑制剤は、上記課題を解決するために、Ｃｌ−チャネルブロッカーを含むことを特徴としている。
【００３５】  また本発明にかかる再灌流性細胞死抑制剤は、上記課題を解決するために、Ｃｌ−チャネルブロッカーが、ＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーであってもよい。
【００３６】  また本発明にかかる再灌流性細胞死抑制剤は、上記再灌流性細胞死が、アポトーシス性の細胞死であってもよい。
【００３７】  細胞が虚血後に再灌流処理を受けた際に起こるアポトーシス等の細胞死（再灌流性細胞死）の際に起こるＣｌ−チャネルの活性化は、ＲＯＳによって引き起こされることを、本発明者等は突き止めた。したがってＲＯＳスカベンジャー（除去剤）によって、細胞からＲＯＳを除去すれば、Ｃｌ−チャネルの活性化が起こり難くなり、再灌流性細胞死を抑制することが可能となる。
【００３８】  またＣｌ−チャネルブロッカー（例えばＤＩＤＳ、ＮＰＰＢ等のＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカー）を用いることによって、再灌流性細胞死を効果的に抑制することができる。
【００３９】  また本発明にかかる再灌流性細胞死抑制剤は、上記再灌流性細胞死が、ミトコンドリア脱水素酵素の活性の低下を伴うものであることが好ましい。これはつまり、本発明においては、再灌流性細胞死の判断を、ミトコンドリア脱水素酸素活性を指標として行なうことができるということを意味する。
【００４０】  また本発明にかかる再灌流性細胞死抑制剤は、上記再灌流性細胞死が、核内ＤＮＡのヌクレオソーム断片化（ラダー化）を伴うものであることが好ましい。これはつまり、本発明においては、再灌流性細胞死の判断を、核内ＤＮＡの断片化を指標として行なうことができるということを意味する。
【００４１】  また本発明にかかる再灌流性細胞死抑制剤は、上記再灌流性細胞死が、再灌流性細胞死を引き起こす細胞内タンパク質分解酵素（カスパーゼ）の活性化を伴うものであることが好ましい。これはつまり、本発明においては、再灌流性細胞死の判断を、再灌流性細胞死を引き起こす細胞内タンパク質分解酵素の活性化を指標として行なうことができるということを意味する。
【００４２】  また本発明にかかる再灌流性細胞死抑制剤は、上記ＲＯＳスカベンジャーが、Ｔｉｒｏｎであることが好ましい。
【００４３】  また本発明にかかる再灌流性細胞死抑制剤は、上記ＲＯＳスカベンジャーが、カタラーゼであることが好ましい。
【００４４】  また本発明にかかる再灌流性細胞死抑制剤は、上記ＲＯＳスカベンジャーが、ＮＡＣであることが好ましい。
【００４５】  上記のごとくＲＯＳスカベンジャーとして、Ｔｉｒｏｎ、カタラーゼ、ＮＡＣを用いることによって、虚血後の再灌流時に起こる再灌流性細胞死、特にアポトーシス性細胞死をより効果的に抑制することができるという効果を奏する。
【００４６】  一方、本発明にかかる治療薬剤は、上記いずれかの再灌流性細胞死抑制剤を含み、再灌流性細胞死に起因する疾患の治療に使用されるものである。
【００４７】  また本発明にかかる治療薬剤は、心筋細胞死に起因する疾患の治療に使用されることが好ましい。
【００４８】  上記構成によれば、Ｃｌ−チャネルの活性化を抑え、再灌流性細胞死を抑制することができる。それゆえ、心移植時に起こる心筋細胞死、心筋梗塞等の心疾患における心筋細胞死等の治療薬として効果的である。
【００４９】  一方、本発明にかかる予防薬剤は、上記いずれかの再灌流性細胞死抑制剤を含み、再灌流性細胞死に起因する疾患の予防薬剤である。
【００５０】  また本発明にかかる予防薬剤は、心筋細胞死に起因する疾患の予防に使用されるものであることが好ましい。
【００５１】  上記構成によれば、Ｃｌ−チャネルの活性化を抑え、再灌流性細胞死を抑制することができる。それゆえ、心移植時に起こる心筋細胞死、心筋梗塞等の心疾患における心筋細胞死等の予防薬剤として効果的である。
【００５２】  一方、本発明にかかる再灌流性細胞死抑制効果の評価方法は、細胞を、グルコースを含まない緩衝液中で、無酸素条件下で培養する虚血処理工程と、前記虚血処理を行なった細胞を、グルコースを含む培養液中で、有酸素条件下で培養する再灌流処理工程とを含んでおり、前記いずれかの処理工程（虚血処理工程または再灌流処理工程）時に被検物を添加した場合の細胞死の評価結果と、前記いずれかの処理工程（虚血処理工程または再灌流処理工程）時に被検物を添加していない場合の細胞死の評価結果とを比較することを特徴としている。
【００５３】  さらに本発明にかかる再灌流性細胞死抑制効果の評価方法は、上記いずれかの処理工程（虚血処理工程または再灌流処理工程）時が再灌流処理工程時であることが好ましい。
【００５４】  これまで再灌流性細胞死を評価する適当な系が無かったために、被検物の再灌流性細胞死抑制効果の評価を行なうことができなかったが、上記本発明にかかる再灌流性細胞死抑制効果の評価方法によれば、簡便かつ正確に当該評価を行なうことができる。それゆえ、再灌流性細胞死の抑制剤・アポトーシス性細胞死に起因する疾患の治療薬および予防薬剤の検索（スクリーニング）を行なうことができるという効果を奏する。
【００５５】  また本発明にかかる再灌流性細胞死抑制効果の評価方法は、上記被検物が、Ｃｌ−チャネルブロッカーまたはＲＯＳスカベンジャーであることが好ましい。
【００５６】  アポトーシス性細胞死は、Ｃｌ−チャネルの活性化を伴うことが分かっているため、当該Ｃｌ−チャネルの活性化を抑制するＣｌ−チャネルブロッカーまたはＲＯＳスカベンジャーを本発明にかかる再灌流性細胞死抑制効果の評価方法にて評価を行なえば、より効率的に、再灌流性細胞死の抑制剤、更にはアポトーシス性細胞死に起因する疾患の治療薬および予防薬剤の検索を行なうことができるものといえる。
【００５７】  また本発明にかかる再灌流性細胞死抑制効果の評価方法は、上記細胞が心筋細胞であってもよい。
【００５８】  また本発明にかかる再灌流性細胞死抑制効果の評価方法は、上記再灌流性細胞死がアポトーシス性の細胞死であってもよい。
【００５９】  上記構成とすることで、特に心筋細胞の再灌流性細胞死抑制効果を評価することができる。よって、心移植や心筋梗塞等によって起こる心筋細胞アポトーシスの抑制剤や、治療剤、予防薬剤等を検索（スクリーニング）することができるという効果を奏する。
【００６０】  また本発明にかかる再灌流性細胞死抑制効果の評価方法は、上記再灌流性細胞死の評価を、ミトコンドリア脱水素酵素の活性を指標に行なうことを特徴としている。
【００６１】  上記構成とすることで、再灌流性細胞死の評価をより簡便に行なうことができる。それゆえ、再灌流性細胞死の抑制剤、更にはアポトーシス性細胞死に起因する疾患の治療薬および予防薬剤の検索（スクリーニング）を行なうことができるという効果を奏する。
【００６２】  また本発明にかかる再灌流性細胞死抑制効果の評価方法は、上記再灌流性細胞死の評価を、核内ＤＮＡの断片化を指標に行なうことを特徴としている。
【００６３】  上記構成とすることで、再灌流性細胞死の評価をより簡便に行なうことができる。それゆえ、再灌流性細胞死の抑制剤、更にはアポトーシス性細胞死に起因する疾患の治療薬および予防薬剤の検索（スクリーニング）を行なうことができるという効果を奏する。
【００６４】  また本発明にかかる再灌流性細胞死抑制効果の評価方法は、上記再灌流性細胞死の評価を、再灌流性細胞死を引き起こす細胞内タンパク質分解酵素（カスパーゼ）の活性を指標に行なうことを特徴としている。
【００６５】  上記構成とすることで、再灌流性細胞死の評価をより簡便に行なうことができる。それゆえ、再灌流性細胞死の抑制剤、更にはアポトーシス性細胞死に起因する疾患の治療薬および予防薬剤の検索（スクリーニング）を行なうことができるという効果を奏する。
【００６６】  一方、本発明にかかるキットは、上記本発明にかかる再灌流性細胞死抑制効果の評価方法を行なうためのキットであって、細胞、グルコースを含まない緩衝液、およびグルコースを含む培養液を包含することを特徴としている。
【００６７】  また本発明にかかるキットは、上記細胞が、心筋細胞であってもよい。
【００６８】  上記キットによれば、細胞死の評価をより簡便に行なうことができる。それゆえ、再灌流性細胞死の抑制剤、更にはアポトーシス性細胞死に起因する疾患の治療薬および予防薬剤の検索（スクリーニング）を行なうことができるという効果を奏する。
【００６９】  なお本発明にかかるキットには、上記構成の他に、細胞生存率を評価する方法（例えばミトコンドリア脱水素酵素活性測定法（ＭＴＴ法））を行なうための試薬類が含まれていてもよい。より具体的にはＭＴＴ法を行なうための試薬としては、テトラゾリウム塩（２−（２−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ：Ｄｏｊｉｎｄｏ社）等が挙げられる。また被験細胞の核内ＤＮＡの断片化を検出するために用いられる試薬、機器類が含まれていてもよい。上記試薬、機器としては例えば、細胞を溶解するための緩衝液（ＥＤＴＡ；Ｎａ−Ｎ−ラウオイルサルコシネート；ＲＮａｓｅおよびＴｒｉｓ−ＨＣｌ含有、ｐＨ７．８）、プロテイナーゼＫ、アガロースゲル、臭化エチジウム、電気泳動装置、ＵＶ検出器等が挙げられる。またカスパーゼ３／７活性の測定に必要な試薬、キット類（例えば、ＣａｓｐＡＳＥＴＭアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））が含まれていてもよい。
【００７０】  本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、次の説明で明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１（ａ）】実施例１において各種処理を行なった被検細胞の細胞生存率をＭＴＴ法によって評価した結果を示す図である。
【図１（ｂ）】実施例１において各種処理を行なった被検細胞についてＤＮＡラダー試験を行なった結果を示す図である。
【図２（ａ）】虚血処理時にＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカー（ＤＩＤＳ）を５０μＭあるいは２００μＭ添加した場合の細胞生存率（ＭＴＴ法）を示す図である。
【図２（ｂ）】虚血処理時にＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカー（ＤＩＤＳ）を５０μＭあるいは２００μＭ添加した場合のＤＮＡラダー試験の結果を示す図である。
【図２（ｃ）】再灌流処理時にＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカー（ＤＩＤＳ）を５０μＭあるいは２００μＭ添加した場合の細胞生存率（ＭＴＴ法）を示す図である。
【図２（ｄ）】再灌流処理時にＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカー（ＤＩＤＳ）を５０μＭあるいは２００μＭ添加した場合のＤＮＡラダー試験の結果を示す図である。
【図３（ａ）】虚血処理時にＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカー（ＮＰＰＢ）を５０μＭあるいは１００μＭ添加した場合の細胞生存率（ＭＴＴ法）を示す図である。
【図３（ｂ）】虚血処理時にＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカー（ＮＰＰＢ）を５０μＭあるいは１００μＭ添加した場合のＤＮＡラダー試験の結果を示す図である。
【図３（ｃ）】再灌流処理時にＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカー（ＮＰＰＢ）を５０μＭあるいは１００μＭ添加した場合の細胞生存率（ＭＴＴ法）を示す図である。
【図３（ｄ）】再灌流処理時にＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカー（ＮＰＰＢ）を５０μＭあるいは１００μＭ添加した場合のＤＮＡラダー試験の結果を示す図である。
【図４（ａ）】実施例２において６時間虚血処理＋２４時間再灌流処理を行なった被検細胞についてカスパーゼ−３／７の活性を測定した結果を示す図である。
【図４（ｂ）】実施例２において６時間虚血処理＋９６時間再灌流処理を行なった被検細胞の細胞生存率の検定（ＭＴＴ法）した結果を示す図である。
【図５】虚血後の再灌流処理時における心筋細胞の活性酸素種（ＲＯＳ）レベルを測定した結果を示す図である。
【図６（ａ）】実施例３において再灌流処理時に１ｍＭ  Ｔｉｒｏｎ，２ｍＭ  ＮＡＣ，２００Ｕ／ｍｌカタラーゼをそれぞれ添加した場合のカスパーゼ−３／７の活性を測定した結果を示す図である。
【図６（ｂ）】実施例３において再灌流処理時に１ｍＭ  Ｔｉｒｏｎ，２ｍＭ  ＮＡＣ，２００Ｕ／ｍｌカタラーゼをそれぞれ添加した場合における細胞生存率（ＭＴＴ法）の結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７２】  本発明は、細胞死、特に虚血後の再灌流性細胞死の抑制に関するものである。【００７３】  ここで「再灌流性細胞死」とは、細胞が虚血状態に陥り、再び血液が流れる再灌流状態を経ることによって起こる細胞死のことをいう。これらの細胞死の多くは、アポトーシスによる細胞死（以下、適宜「アポトーシス性細胞死」という）であることが知られている。再灌流性細胞死の例としては、心移植の際に起こる心筋細胞のアポトーシス性細胞死や、心筋梗塞が原因でおこる心筋細胞のアポトーシス性細胞死等が挙げられる。【００７４】  細胞死は生体内の各所で起こり、各種疾患の原因となるため、かかる細胞死、特にアポトーシス性細胞死を抑制する方法、抑制剤等を開発することができれば、当該細胞死が原因で起こる各種疾患の有効な治療薬剤・予防薬剤とすることができ、非常に有益であるといえる。【００７５】  既述のとおり本発明者等は、これまでにアポトーシスをはじめとする細胞死の発生の機構について研究を行なってきており、アポトーシスが起こる際にＣｌ−チャネルが活性化されること、当該Ｃｌ−チャネルの活性化シグナルは活性酸素種（Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｓｐｅｃｉｅｓ：ＲＯＳ）であることを明らかにしている（非特許文献６、９等参照）。【００７６】  したがってＣｌ−チャネルの活性化を抑制するＣｌ−チャネルブロッカーを細胞に投与する、あるいはＣｌ−チャネルの活性化シグナルであるＲＯＳを除去する薬剤（ＲＯＳスカベンジャー）を細胞に投与することにって、アポトーシス性細胞死を抑制することができるということがいえる。【００７７】  本発明にかかる再灌流性細胞死の抑制方法、再灌流性細胞死抑制剤、治療薬剤、予防薬剤は、上記の考えに基づき完成されたものである。【００７８】  これまで、再灌流性細胞死を簡便に評価する方法が確立されていなかった。そこで本発明者等は、まず再灌流性細胞死の評価系を確立することとした。【００７９】  〔再灌流性細胞死の評価系〕
本発明者らが確立した再灌流性細胞死の評価系は、評価対象となる細胞を、グルコースを含まない緩衝液中で、無酸素条件下で培養する虚血処理工程と、前記虚血処理を行なった細胞を、グルコースを含む培養液中で、有酸素条件下で培養する再灌流処理工程とを含んでいる。上記２工程を経ることによって、評価対象となる細胞は虚血後の再灌流を経験することとなる。したがって、虚血後に再灌流処理を行なう前後で細胞の生存率等の細胞死の評価を行ない比較することによって、再灌流性細胞死の評価を簡便に行なうことができるというものである。【００８０】  評価の対象となる細胞としては、特に限定されるものではなく、心筋細胞、脳神経細胞、脳グリア細胞が好適に用いることが可能である。心筋細胞を用いることによって、心筋梗塞等が原因で起こる再灌流性細胞死を評価することができ、脳神経細胞及び脳グリア細胞を用いることによって、脳梗塞等が原因で起こる再灌流性細胞死を評価することができるものといえる。なお取り扱いが容易である等の理由から、評価の対象となる細胞は、培養可能な細胞を用いることが好ましい。【００８１】  また上記虚血処理工程において使用する緩衝液は、グルコースを含まない緩衝液であれば特に限定されるものではない。上記緩衝液の組成としては、例えば、後述する実施例において使用した緩衝液（１０８ｍＭ  ＮａＣｌ，０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，５．４ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ＣａＣｌ２，５ｍＭ  ＨＥＰＥＳにＮａＨＣＯ３を加えてｐＨ７．４にあわせた）が好適に使用可能である。【００８２】  また上記虚血処理工程では細胞を無酸素条件下で培養を行なうが、かかる「無酸素条件下」とは、酸素濃度が１％以下のことを意味する。特に虚血処理工程では、酸素が全く含まれていないこと（０．０１％）が好ましい。したがって、炭酸ガス、窒素ガス、アルゴンガス下で細胞培養を行なえばよい。例えば、後述する実施例においては、９５％アルゴンガス＋５％炭酸ガスの条件下で細胞培養を行なっている。なお細胞培養に用いる器具・方法等は、公知のものを適宜選択の上、用いればよい。【００８３】  また虚血処理工程における培養温度については、通常の細胞培養に好適な温度条件を採用すればよく、２８〜４０℃が好ましく、３７℃が最も好ましい条件である。【００８４】  また虚血処理工程における培養時間（処理時間）については、細胞が虚血状態になるまで行なえばよく、例えば１時間〜２４時間が好ましく、２時間〜１８時間がさらに好ましく、４時間〜１２時間が最も好ましい。なお後述する実施例おいては、６時間虚血処理を行なっている。【００８５】  再灌流処理工程は、上記虚血処理を行なった細胞を、グルコースを含む培養液（培地）中で、有酸素条件下で培養する工程である。かかる再灌流処理工程に用いる培養液（培地）はグルコースを含むものであれば特に限定されるものではなく、公知の培地を適宜選択の上、用いればよい。かかる公知の培地としては、例えば１０％ＦＢＳを添加したＤ−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ培地、ＭＥＭ培地、ＥＭ培地等が好適に用いることができる。【００８６】  また上記有酸素条件とは、酸素が５％以上の条件のことをいい、１０％以上の条件がさらに好ましく、１５％以上の条件が最も好ましい。後述する実施例においては、９５％空気（酸素約２０％）＋５％炭酸ガスの条件下で再灌流処理を行なっている。【００８７】  また再灌流処理工程における培養時間については、少なくとも細胞が虚血状態から灌流状態になるのに必要な時間以上培養すればよく、１２時間〜１４４時間が好ましく、２４時間〜１２０時間がさらに好ましく、４８時間〜９６時間が最も好ましい。なお、再灌流処理工程における培養温度は、上記虚血処理工程と同様にして行なえばよい。後述する実施例においては、３７℃で９６時間培養することにより再灌流処理を行っている。【００８８】  上記再灌流性細胞死の評価系は、再灌流性細胞死の抑制剤・アポトーシス性細胞死に起因する疾患の治療薬および予防薬剤の検索（スクリーニング）に有効に利用が可能である。すなわち、前記いずれかの処理工程時（虚血処理工程または再灌流処理工程時）に被検物を添加した場合の細胞死の評価結果と、前記いずれかの処理工程時（虚血処理工程または再灌流処理工程時）前記再灌流処理工程時に被検物を添加していない場合の細胞死の評価結果とを比較することによって被検物の再灌流性細胞死抑制効果の評価することができる。【００８９】  なお、本発明者らの検討によれば、再灌流処理工程時に被検物（Ｃｌ−チャネルブロッカーまたはＲＯＳスカベンジャー）を培養液に添加した場合にのみ、有意な再灌流性細胞死抑制効果が見られた。したがって、被検物（特に被検物がＣｌ−チャネルブロッカーまたはＲＯＳスカベンジャーである場合）は、再灌流処理工程時に加える方がより好ましい態様であるといえる。【００９０】  また再灌流性細胞死の評価系における細胞死の評価方法については、特に限定されるものではないが、例えば、ミトコンドリア脱水素酵素の活性を指標に行なう方法（ＭＴＴ法、ＭＴＳ法）や、核内ＤＮＡの断片化を指標に行なう方法（ＤＮＡラダー試験）や、細胞死を引き起こす細胞内タンパク質分解酵素（カスパーゼ）の活性を指標とする方法や、ミトコンドリアから細胞質へのシトクロームｃの放出を指標とする方法や、  核の濃縮や細片化といった核の形態変化を指標とする方法等がある。【００９１】  ミトコンドリア脱水素酵素の活性を指標に細胞死の評価する原理は、簡単には以下のとおりである。細胞が死滅するとミトコンドリア脱水素酵素の活性が低下することがわかっているので、当該酵素活性が低下すれば細胞の死滅率が高いと判断できる。【００９２】  また核内ＤＮＡの断片化を指標に細胞死を評価する原理は、簡単には以下のとおりである。アポトーシスにより細胞が死滅すれば、核内ＤＮＡがラダー状に断片化するので、電気泳動等で核内ＤＮＡの状態を観察すれば簡単にアポトーシス性細胞死の判定ができる。【００９３】  さらにカスパーゼ活性を指標に細胞死を評価する原理は、簡単には以下のとおりである。アポトーシスにより細胞が死滅すれば、カスパーゼが活性化（活性が上昇）することがわかっているので、当該酵素活性が上昇すればアポトーシス性細胞の死滅率が高いと判断できる。【００９４】  またミトコンドリアから細胞質へのシトクロームｃの放出を指標に細胞死を評価する原理は、簡単には以下のとおりである。アポトーシスにより細胞が死滅すれば、ミトコンドリアから細胞質へのシトクロームｃが放出するので、シトクロームｃの放出量を測定すれば簡単にアポトーシス性細胞死の判定ができる。【００９５】  また核の形態変化を指標に細胞死を評価する原理は、簡単には以下のとおりである。アポトーシスにより細胞が死滅すれば、核の濃縮や細片化といった核の形態変化が起こるので、電子顕微鏡等で核の形態変化を観察すれば簡単にアポトーシス性細胞死の判定ができる。【００９６】  なお、上記ミトコンドリア脱水素酵素の活性を指標に行なう方法（ＭＴＴ法）や、核内ＤＮＡの断片化を指標に行なう方法（ＤＮＡラダー試験）や、細胞死を引き起こす細胞内タンパク質分解酵素（カスパーゼ）の活性を指標とする方法については実施例において具体的に記載する。【００９７】  また、上記本発明にかかる再灌流性細胞死抑制効果の評価方法を行なうために必要な、細胞；グルコースを含まない緩衝液；およびグルコースを含む培養液によって、本発明にかかる「再灌流性細胞死抑制効果の評価方法を行なうためのキット」を構成することができる。本発明にかかるキットには、上記の他、本発明にかかる再灌流性細胞死抑制効果の評価方法を行なうために必要な試薬、機器類が含まれていてもよい。【００９８】  〔本発明にかかる再灌流性細胞死の抑制剤および抑制方法〕
本発明者らは、上記再灌流性細胞死の評価系を用いて、（ａ）Ｃｌ−チャネルブロッカーを投与することによって、再灌流性心筋細胞アポトーシスを抑制することができるかどうか、（ｂ）できるとすれば、その投与は虚血時（虚血処理時）に行なうべきか、それとも再灌流時（再灌流処理時）に行なうべきか、（ｃ）ＲＯＳスカベンジャーを投与することによっても再灌流性心筋細胞アポトーシスを抑制することができるかどうか、という点について検討を行なった。【００９９】  その結果、ＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカー（容積感受性外向整流性Ｃｌ−イオンチャネルブロッカー）およびＲＯＳスカベンジャーが再灌流性細胞死を有意に抑制することができるということ、すなわち前記ＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーおよびＲＯＳスカベンジャーが再灌流性細胞死の抑制剤として有効に機能することを発見した。さらには、かかる前記Ｃｌ−チャネルブロッカーおよびＲＯＳスカベンジャー（再灌流性細胞死抑制剤）は、再灌流時において細胞に対して投与することが好ましいということを発見した。【０１００】  ここで「Ｃｌ−チャネル」とは、細胞の容積変化により活性化され、その容積を変化させるべく作用するＣｌ−チャネル一種を意味する。また、「Ｃｌ−チャネルブロッカー」とは、Ｃｌ−チャネルの活性化を抑制する一群の薬剤等を意味する。【０１０１】  また「ＲＯＳスカベンジャー」とは、ＲＯＳを消去・除去することができる一群の薬剤等を意味する。【０１０２】  ここで本発明にかかる再灌流性細胞死の抑制方法に用いることができるＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーとしては、４，４’−ｄｉｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎｏｓｔｉｌｂｅｎｅ−２，２’−ｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＤＩＤＳ）、５−ｎｉｔｒｏ−２−（３−ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｏ）−ｂｅｎｚｏａｔｅ（ＮＰＰＢ）、グリベンクラミド、二フルミン酸、フロレチン等が挙げられる。【０１０３】  一方、本発明にかかる再灌流性細胞死の抑制方法に用いることができるＲＯＳスカベンジャーとしては、５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１，２−ｂｅｎｚｅｎｅ  ｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（Ｔｉｒｏｎ）、カタラーゼ、Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ（ＮＡＣ）等が挙げられる。【０１０４】  上記ＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーおよびＲＯＳスカベンジャーを用いて再灌流性細胞死を抑制する場合において使用する濃度条件は、薬剤の種類、細胞の種類、細胞の状態等によって異なるために特に限定されるものではない。したがって、適宜最適な条件を検討の上、採用すればよい。【０１０５】  例えば新生仔マウスの心室筋細胞を用いた再灌流性細胞死の評価系において、ＤＩＤＳで再灌流性細胞死を抑制する場合には、１０μＭ〜３００μＭが好ましく、２５μＭ〜２５０μＭがさらに好ましく、５０μＭ〜２００μＭが最も好ましい。後述する実施例においては、５０μＭおよび２００μＭのＤＩＤＳを細胞に投与することによって、再灌流性細胞死の抑制に成功している。【０１０６】  また、ＮＰＰＢの場合においては、１０μＭ〜２００μＭが好ましく、２５μＭ〜１５０μＭがさらに好ましく、５０μＭ〜１００μＭが最も好ましい。後述する実施例においては、５０μＭおよび１００μＭのＮＰＰＢを細胞に投与することによって、再灌流性細胞死の抑制に成功している。【０１０７】  またＴｉｒｏｎの場合においては、０．０５ｍＭ〜１０ｍＭが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭがさらに好ましく、０．５ｍＭ〜２ｍＭが最も好ましい。後述する実施例においては、１ｍＭのＴｉｒｏｎを細胞に投与することによって、再灌流性細胞死の抑制に成功している。【０１０８】  またカタラーゼの場合においては、５０Ｕ／ｍｌ〜３００Ｕ／ｍｌが好ましく、１００Ｕ／ｍｌ〜２５０Ｕ／ｍｌがさらに好ましく、１５０Ｕ／ｍｌ〜２００Ｕ／ｍｌが最も好ましい。後述する実施例においては、２００Ｕ／ｍｌのカタラーゼを細胞に投与することによって、再灌流性細胞死の抑制に成功している。ここでカタラーゼの活性１Ｕとは、毎分１μｍｏｌ（マイクロモル）の基質（過酸化水素：Ｈ２Ｏ２）を、水と酸素に分解する反応を触媒することができる酵素の活性のことである。【０１０９】  またＮＡＣの場合においては、０．１ｍＭ〜１０ｍＭが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭがさらに好ましく、１ｍＭ〜２ｍＭが最も好ましい。後述する実施例においては、２ｍＭのＮＡＣを細胞に投与することによって、再灌流性細胞死の抑制に成功している。【０１１０】  またＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーおよびＲＯＳスカベンジャーを用いて再灌流性細胞死を抑制する場合において、上記各種薬剤の細胞への投与方法については特に限定されるものではなく、適当な溶媒に溶解した溶液を用い所望する濃度となるように細胞培養液等に添加してもよいし、各種薬剤の粉末を所望する濃度となるように細胞培養液等に添加してもよい。【０１１１】  上記ＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーおよびＲＯＳスカベンジャー（再灌流性細胞死抑制剤）の投与時期については、既述のとおり、再灌流時（再灌流処理時）であることが好ましい。後述する実施例において説示するように、虚血時（虚血処理時）に上記ＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーおよびＲＯＳスカベンジャー（再灌流性細胞死抑制剤）を細胞に投与しても、有意な再灌流性細胞死抑制効果が見られなかった。一方、再灌流時（再灌流処理時）に上記ＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーおよびＲＯＳスカベンジャー（再灌流性細胞死抑制剤）を細胞に投与した場合は、有意な再灌流性細胞死抑制効果が見られた。【０１１２】  ところで、上記ＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーおよびＲＯＳスカベンジャー（再灌流性細胞死抑制剤）を用いて、心移植する場合には、例えば、心血管縫合後の血流再開時にその血流を介して再灌流性細胞死抑制剤を投与すればよい。上記のごとくＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーおよびＲＯＳスカベンジャー（再灌流性細胞死抑制剤）を用いて心移植をすることによって、移植心の細胞死が抑制され、移植後の定着率が格段に向上するものといえる。【０１１３】  なお上記ＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーおよびＲＯＳスカベンジャーは、再灌流性細胞死の抑制にのみ有効であるのではなく、他の原因によるアポトーシス性細胞死にも有効であることは言うまでもない。【０１１４】  〔本発明にかかる治療薬剤・予防薬剤〕
上記のとおりＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーおよびＲＯＳスカベンジャーは、再灌流性細胞死等のアポトーシス性細胞死を有意に抑制することができる。よってＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーおよびＲＯＳスカベンジャーは、哺乳動物（例、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル等）に対し、細胞死に起因する疾患（例えばアポトーシスの促進が関わる疾患）の予防薬剤または治療薬剤として用いることが可能である。【０１１５】  上記疾患としては、例えば虚血性疾患（心筋梗塞、脳虚血など）、神経変性疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病など）、うっ血性心不全などが挙げられる。本発明においては、前記疾患が１種であっても、複数の疾患が併発したものであっても、さらに別の疾患と合併したものであっても、本発明にかかる治療薬剤・予防薬剤の適用の対象となる。そして、本発明にかかる治療薬剤・予防薬剤は、特に虚血性疾患の遅発性細胞死の予防または治療のために好適に用いられる。【０１１６】  本発明にかかる治療薬剤・予防薬剤は、ＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーおよびＲＯＳスカベンジャーをそのまま用いてもよいが、通常、ＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーおよびＲＯＳスカベンジャーまたはその塩と、薬理学的に許容される担体などとを用いて、医薬組成物の製造法として公知の手段に従って製造することができる。具体的には、ＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーおよびＲＯＳスカベンジャーまたはその塩と担体とを常法に従って混合し、医薬組成物として用いることができる。【０１１７】  ここで、薬理学的に許容される担体には、製剤素材として使用可能な各種有機または無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、または液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などとして配合される。【０１１８】  賦形剤としては、例えば乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール、デンプン、結晶セルロースなどが挙げられ、滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。【０１１９】  また、結合剤としては、例えばα化デンプン、メチルセルロース、結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、トレハロース、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。【０１２０】  崩壊剤としては、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウムなどが挙げられる。【０１２１】  溶剤としては、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、トリカプリリンなどが挙げられる。【０１２２】  溶解補助剤としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる��【０１２３】  懸濁剤としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤、あるいは、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子が挙げられる。【０１２４】  等張化剤としては、例えば塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトールなどが挙げられる。緩衝剤としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。【０１２５】  無痛化剤としては、例えばベンジルアルコールなどが挙げられる。【０１２６】  防腐剤としては、例えばパラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。【０１２７】  抗酸化剤としては、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸などが挙げられる。【０１２８】  本発明にかかる治療薬剤・予防薬剤におけるＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーおよびＲＯＳスカベンジャーの含量は、例えば約５〜約１００重量％、好ましくは、約１０〜約８０重量％である。【０１２９】  本発明にかかる治療薬剤・予防薬剤は、製剤技術分野において慣用の方法により製造することができる。本発明にかかる治療薬剤・予防薬剤の剤形としては、例えば錠剤、カプセル剤（ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）、散剤、顆粒剤、シロップ剤等の経口剤のほか、注射剤、坐剤、ペレット、点滴剤等の非経口剤が挙げられ、これらは毒性も低く、それぞれ経口的または非経口的に投与できる。【０１３０】  本発明にかかる治療薬剤・予防薬剤の投与量は、投与対象、投与ルート、症状などによっても異なる。したがって、上記投与量は、最適な条件を適宜検討の上、採用すればよい。【０１３１】  以下添付した図面に沿って実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。【０１３２】  以下に示す実施例では、新生仔マウスの心室筋細胞の初代培養系を用いて、（１）ＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーを投与することによって再灌流性心筋細胞アポトーシスを抑制することができるかどうか、（２）できるとすれば、その投与は虚血時に行なうべきか、それとも再灌流時に行なうべきか、（３）ＲＯＳスカベンジャーを投与することによっても再灌流性心筋細胞アポトーシスを抑制することができるかどうか、という３点について明らかにした。
【実施例】
【０１３３】  〔実施例１：マウス心筋細胞のアポトーシス死もＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーによって救済されるか〕
ラットの培養心筋細胞のスタウロスポリン（ＳＴＳ）によって誘導されたアポトーシスは、ＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルのブロッカーである４，４’−ｄｉｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎｏｓｔｉｌｂｅｎｅ−２，２’−ｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＤＩＤＳ）によって救済されることを、本発明者等は既に明らかにしている（Ｓ．Ｔａｎａｂｅ，Ｅ．Ｍａｅｎｏ  ＆  Ｙ．Ｏｋａｄａ「Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｂｙ  ＤＩＤＳ  ａｎｄ  ＳＩＴＳ  ｉｎ  ｒａｔ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｕｌｔｕｒｅ．」Ｊｐｎ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５２（Ｓｕｐｐｌ），Ｓ３４，２００２）。そこで今回、マウスの培養心筋細胞のＳＴＳによるアポトーシスもＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーで抑制されるかどうかをまず検討した。【０１３４】  （方法）
（１−１）細胞および細胞培養方法
以下の実施例においては新生仔マウスの心臓から酵素処理により調製した初代培養心室筋細胞を用いた。より具体的には、以下のようにして前記初代培養心筋細胞を調製した。【０１３５】  新生仔マウスより摘出した心臓から心室部分を採取し、これを細片化した上で、０．０５％トリプシン＋１０ｍＭ  ＥＤＴＡ液中（３７℃）で一定時間インキュベートした後に遊離してきた心筋細胞を遠心分離によって回収した。この細胞をコラーゲンコートしたプレートに１〜８×１０５細胞／ｃｍ２の密度で培養を行なった。【０１３６】  また上記マウス培養心筋細胞は、Ｄ−ＭＥＭ培地（＋１０％ＦＢＳ）にて、３７℃、７２〜９６時間培養したものを使用した。【０１３７】  （１−２）ＳＴＳ処理
上記マウス培養心筋細胞についてＳＴＳ処理を行ない、アポトーシスを誘導した。ＳＴＳ処理は、４μＭのＳＴＳ（シグマ社）を用い、次のようにした。通常条件（３７℃、５％炭酸ガス）で培養中の心筋細胞に所定の濃度のＳＴＳを含むＤ−ＭＥＭ（＋１０％ＦＢＳ）を加え、一定時間培養を行なった。【０１３８】  （１−３）ＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカー
アポトーシス抑制効果を調べるＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーとして、４，４’−ｄｉｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎｏｓｔｉｌｂｅｎｅ−２，２’−ｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＤＩＤＳ、シグマ社）、５−ｎｉｔｒｏ−２−（３−ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｏ）−ｂｅｎｚｏａｔｅ（ＮＰＰＢ、シグマ社、）を用いた。【０１３９】  上記ＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーのアポトーシスの抑制効果は、上記ＳＴＳ処理時に２５０μＭ  ＤＩＤＳを添加する、あるいは１００μＭ  ＮＰＰＢを添加することにより評価した。【０１４０】  （１−４）ミトコンドリア脱水素酵素活性測定法（ＭＴＴ法）
細胞生存率を評価する方法としてミトコンドリア脱水素酵素活性測定法（ＭＴＴ法）を用いた。ＭＴＴ法は、次のようにして行なった。所定の処理を行なったマウス培養心筋細胞の培地１００μｌに対して高感度水溶性ホルマザンを生成するテトラゾリウム塩（２−（２−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ：Ｄｏｊｉｎｄｏ社）の溶液を１０μｌ加え、３７℃で４時間インキュベートを行なった。その後、ミトコンドリア脱水素酵素の活性に応じて生じたホルマザンの量を４５０ｎｍの吸光度により測定した。【０１４１】  （１−５）ＤＮＡラダー試験
被検細胞のＤＮＡヌクレオソームの断片化をＤＮＡラダー検出法により検出した。すなわち、細胞を溶解緩衝液（ＥＤＴＡ  １０ｍＭ、０．５％  Ｎａ−Ｎ−ラウオイルサルコシネート、ＲＮａｓｅ  ５００μｇ／ｍｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍＭ、ｐＨ７．８）中、３７℃で１時間分解させ、プロテイナーゼＫ  ５００μｇ／ｍｌを用いて３７℃で１時間処理した。次いで、２％アガロースゲル電気泳動により染色体ＤＮＡを分析し、臭化エチジウムで染色した。【０１４２】  （結果）
図１（ａ）および（ｂ）に結果を示す。図１（ａ）は、各種処理を行なった被検細胞の細胞生存率をＭＴＴ法によって評価した結果を示しており、左端のレーンからコントロール（ＳＴＳ処理なし）；２５０μＭ  ＤＩＤＳ処理を行なった細胞（同図中「ＤＩＤＳ（２５０μＭ）」で示す）；１００μＭ  ＮＰＰＢ処理を行なった細胞（同図中「ＮＰＰＢ（１００μＭ）」で示す）；４μＭ  ＳＴＳ処理を行なった細胞（同図中「ＳＴＳ（４μＭ）」で示す）；４μＭ  ＳＴＳ＋２５０μＭ  ＤＩＤＳで処理を行なった細胞（同図中「ＳＴＳ＋ＤＩＤＳ」で示す）；４μＭ  ＳＴＳ＋１００μＭ  ＮＰＰＢで処理を行なった細胞（同図中「ＳＴＳ＋ＮＰＰＢ」で示す）の結果を示す。なお図１（ａ）における細胞生存率は、コントロールの細胞生存率を１００とした場合の各試験区の相対比（％）で示した。また同図において２つの棒グラフを線でつなぎ、その上に「ｐ＜０．０５」を付したものは、その両棒グラフが示すデータ間に５％未満の危険率において有意差があったことを示している。【０１４３】  また図１（ｂ）は、各種処理を行なった被検細胞についてＤＮＡラダー試験を行なった結果を示しており、左端のレーンから、ＤＮＡマーカー（同図中「１０００ｂｐ  ＤＮＡラダー」で示す）；コントロール（ＳＴＳ処理なし）；２５０μＭ  ＤＩＤＳ処理を行なった細胞（同図中「ＤＩＤＳ（２５０μＭ）」で示す）；１００μＭ  ＮＰＰＢ処理を行なった細胞（同図中「ＮＰＰＢ（１００μＭ）」で示す）；４μＭ  ＳＴＳ処理を行なった細胞（同図中「ＳＴＳ（４μＭ）」で示す）；４μＭ  ＳＴＳ＋２５０μＭ  ＤＩＤＳで処理を行なった細胞（同図中「ＳＴＳ＋ＤＩＤＳ」で示す）；４μＭ  ＳＴＳ＋１００μＭ  ＮＰＰＢで処理を行なった細胞（同図中「ＳＴＳ＋ＮＰＰＢ」で示す）の結果を示す。【０１４４】  図１（ａ）に示すように、４μＭ  ＳＴＳを８時間投与したときの細胞生存率は２９．８％にまで減少し、その細胞のＤＮＡはアポトーシス死に特徴的なラダー状の断裂を示した（図１（ａ）および図１（ｂ）中の「ＳＴＳ（４μＭ）」参照）。【０１４５】  一方、ＳＴＳ処理と同時に、ＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーであるＤＩＤＳ（２５０μＭ）を投与しておくと、その細胞生存率は５９．７％に上昇し、その細胞にはＤＮＡラダーが見られなくなった（図１（ａ）および図１（ｂ）中の「ＳＴＳ＋ＤＩＤＳ」参照）。同様に、ＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーであるＮＰＰＢ（１００μＭ）は、生存率を４７．２％にまで上昇させ、ＤＮＡラダーが見られなくなった（図１（ａ）および図１（ｂ）中の「ＳＴＳ＋ＮＰＰＢ」参照）。【０１４６】  これらの結果は、ＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーであるＤＩＤＳもＮＰＰＢも、マウス培養心筋細胞のアポトーシスに対して救済的に作用することを示している。【０１４７】  〔実施例２：虚血後の再灌流傷害時の心筋細胞アポトーシスも、ＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーによって救済されるか〕
（虚血後の再灌流試験）
既述の培養マウス心筋細胞について、外液をグルコースが含まれない液（１０８ｍＭ  ＮａＣｌ，０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，５．４ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ＣａＣｌ２，５ｍＭ  ＨＥＰＥＳにＮａＨＣＯ３を加えてｐＨ７．４にあわせた液）に置換し、外気を無酸素（９５％アルゴンガス＋５％炭酸ガス）として、３７℃で６時間培養することによって虚血（グルコース除去・無酸素）処理を行なった。【０１４８】  その後ただちに、グルコースを含む正常培養液（Ｄ−ＭＥＭ液＋１０％  ＦＢＳ）に置換し、酸素を含む外気（９５％空気＋５％炭酸ガス）を与え、３７℃で９６時間培養することにより、再灌流（グルコース再投与・再酸素化）処理を行なった。【０１４９】  （カスパーゼ−３／７活性測定）
アポトーシス性細胞死に特異的な現象であるカスパーゼ−３／７の活性測定は、蛍光測定アッセイを用いて測定した。なお関連するその他のプロテアーゼの関与を排除するため、カスパーゼ−３／７の特異的抑制因子の不在下または存在下における蛍光の違いを観察した。カスパーゼ−３／７（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ）、およびカスパーゼ−３／７のテトラペプチド抑制因子（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ）について、蛍光色素７−アミノ４−メチルクマリン（ＡＭＣ）で標識した蛍光発色物質をＣａｓｐＡＳＥＴＭアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）に供した。【０１５０】  （結果）
図２（ａ），（ｂ）には、虚血処理時にＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカー（ＤＩＤＳ）を５０μＭあるいは２００μＭ添加した場合の細胞生存率（ＭＴＴ法）、およびＤＮＡラダー試験の結果を示す。また図２（ｃ），（ｄ）には、再灌流処理時にＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカー（ＤＩＤＳ）を５０μＭあるいは２００μＭ添加した場合の細胞生存率（ＭＴＴ法）、およびＤＮＡラダー試験の結果を示す。なお、図２（ａ）〜（ｄ）においては、左端からコントロール（虚血後に再灌流処理なし）、５０μＭ  ＤＩＤＳ処理を行なった細胞（同図中「ＤＩＤＳ（５０μＭ）」で示す）；２００μＭ  ＤＩＤＳ処理を行なった細胞（同図中「ＤＩＤＳ（２００μＭ）」で示す）；虚血後に再灌流処理を行なった細胞（同図中「Ｉ／Ｒ」で示す）；虚血処理時または再灌流処理時に５０μＭ  ＤＩＤＳを添加した細胞（同図中「Ｉ／Ｒ＋ＤＩＤＳ（５０μＭ）」で示す）；虚血処理時または再灌流処理時に２００μＭ  ＤＩＤＳを添加した細胞（同図中「Ｉ／Ｒ＋ＤＩＤＳ（２００μＭ）」で示す）の結果を示す。【０１５１】  なお図２（ｂ）および（ｄ）における細胞生存率は、コントロールの細胞生存率を１００とした場合の各試験区の相対比（％）で示した。また同図において２つの棒グラフを線でつなぎ、その上に「ｐ＜０．０５」を付したものは、その両棒グラフが示すデータ間に５％未満の危険率において有意差があったことを示している。【０１５２】  図２に示すように、６時間虚血（Ｉ）後に９６時間再灌流（Ｒ）を行なうと、細胞の生存率は５０．２％にまで減少し（図２（ａ）および図２（ｃ）中の「Ｉ／Ｒ」参照）、その細胞はアポトーシスに特徴的なＤＮＡラダーを示した（図２（ｂ）および図２（ｄ）中の「Ｉ／Ｒ」参照）。【０１５３】  ＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーＤＩＤＳ（５０または２００μＭ）を虚血処理時に投与しても、アポトーシス性細胞死は有意に抑制されなかった（図２（ａ）および（ｂ）中の「Ｉ／Ｒ＋ＤＩＤＳ（５０μＭ）」、「Ｉ／Ｒ＋ＤＩＤＳ（２００μＭ）」参照）。これに対し、ＤＩＤＳを再灌流処理時に投与しておくと、アポトーシス性細胞死は有意に抑制された（図２（ｃ）および図２（ｄ）中の「Ｉ／Ｒ＋ＤＩＤＳ（５０μＭ）」、「Ｉ／Ｒ＋ＤＩＤＳ（２００μＭ）」参照）。【０１５４】  図３（ａ）〜（ｄ）に、ＮＰＰＢについて上記と同様の試験を行なった結果を示す。図３（ａ），（ｂ）には、虚血処理時にＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカー（ＮＰＰＢ）を５０μＭあるいは１００μＭ添加した場合の細胞生存率（ＭＴＴ法）、およびＤＮＡラダー試験の結果を示す。また図３（ｃ），（ｄ）には、再灌流処理時にＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカー（ＮＰＰＢ）を５０μＭあるいは１００μＭ添加した場合の細胞生存率（ＭＴＴ法）、およびＤＮＡラダー試験の結果を示す。なお、図３（ａ）〜（ｄ）においては、左端からコントロール（虚血後に再灌流処理なし）；虚血後に再灌流処理を行なった細胞（同図中「Ｉ／Ｒ」で示す）；虚血処理時または再灌流処理時に５０μＭ  ＮＰＰＢを添加した細胞（同図中「Ｉ／Ｒ＋ＮＰＰＢ（５０μＭ）」で示す）；虚血処理時または再灌流処理時に１００μＭ  ＮＰＰＢを添加した細胞（同図中「Ｉ／Ｒ＋ＮＰＰＢ（１００μＭ）」で示す）の結果を示す。また図３（ａ）および（ｃ）における細胞生存率は、コントロールの細胞生存率を１００とした場合の各試験区の相対比（％）で示した。また同図において２つの棒グラフを線でつなぎ、その上に「ｐ＜０．０５」を付したものは、その両棒グラフが示すデータ間に５％未満の危険率において有意差があったことを示している。【０１５５】  図３によれば、ＮＰＰＢについてもＤＩＤＳの場合と全く同様の結果であった。したがって、ＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーであるＤＩＤＳもＮＰＰＢも、マウス培養心筋細胞の虚血・再灌流傷害時のアポトーシス性細胞死に対して救済的に作用すること、これらのＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーの投与は虚血時においてではなく、再灌流時に投与が行なわれた時にのみ有効であるということが分かった。【０１５６】  一方、図４（ａ）には、アポトーシス性細胞死に特徴的なカスパーゼ−３／７の活性を測定した結果について示す。図４（ａ）は、再灌流処理時に５０μＭ  ＤＩＤＳまたは５０μＭ  ＮＰＰＢ添加した場合のカスパーゼ−３／７の活性を測定した結果を示している（図４（ａ）中「＋ＨＣＯ３」を付した棒グラフ群参照）。また再灌流液からＮａＨＣＯ３を除去した場合の結果についても示す（図４（ａ）中「−ＨＣＯ３」を付した棒グラフ群参照）。なお、図４（ａ）の「＋ＨＣＯ３」を付した棒グラフ群において、左端からコントロール（虚血後に再灌流処理なし）；虚血後に再灌流処理を行なった細胞（同図中「Ｉ／Ｒ」で示す）；再灌流処理時に５０μＭ  ＮＰＰＢを添加した細胞（同図中「Ｉ／Ｒ＋ＤＩＤＳ（５０μＭ）」で示す）；再灌流処理時に５０μＭ  ＮＰＰＢを添加した細胞（同図中「Ｉ／Ｒ＋ＮＰＰＢ（５０μＭ）」で示す）の結果を示す。上記結果の並び方は、図４（ｂ）の「−ＨＣＯ３」を付した棒グラフ群、図４（ｂ）の「＋ＨＣＯ３」を付した棒グラフ群、および図４（ｂ）の「−ＨＣＯ３」を付した棒グラフ群においてそれぞれ同じである。【０１５７】  なお図４（ａ）およびにおけるカスパーゼ−３／７比活性は、コントロールのカスパーゼ−３／７活性を１００とした場合の各試験区の相対比（％）で示した。また図４（ｂ）における細胞生存率は、コントロールの細胞生存率を１００とした場合の各試験区の相対比（％）で示した。さらに図４（ａ）において２つの棒グラフを線でつなぎ、その上に「ｐ＜０．０１」を付したものは、その両棒グラフが示すデータ間に１％未満の危険率において有意差があったことを示し、図４（ｂ）において２つの棒グラフを線でつなぎ、その上に「ｐ＜０．０５」を付したものは、その両棒グラフが示すデータ間に５％未満の危険率において有意差があったことを示している。【０１５８】  図４（ａ）によれば、細胞を６時間虚血処理＋２４時間再灌流処理することによって、カスパーゼ−３／７活性が上昇することが分かる（図４（ａ）中の「Ｉ／Ｒ」参照）。このカスパーゼ３／７活性の上昇についても、５０μＭ  ＤＩＤＳまたは５０μＭ  ＮＰＰＢを再灌流処理時に投与することによって、著しく抑制することができるということが分かった（図４（ａ）中の「Ｉ／Ｒ＋ＤＩＤＳ（５０μＭ）」、「Ｉ／Ｒ＋ＮＰＰＢ（５０μＭ）」��照）。【０１５９】  また再灌流液からＮａＨＣＯ３を除去した場合（ｐＨは、Ｔｒｉｓによって調整）も、同様に虚血後の再灌流処理によってカスパーゼ３／７活性の上昇が見られた（図４（ａ）中「Ｉ／Ｒ」参照）。さらに、このカスパーゼ３／７活性の上昇は、５０μＭ  ＤＩＤＳまたは５０μＭ  ＮＰＰＢを再灌流処理時に投与することによって、著しく抑制された（図４（ａ）中「Ｉ／Ｒ＋ＤＩＤＳ（５０μＭ）」、「Ｉ／Ｒ＋ＮＰＰＢ（５０μＭ）」）参照）。【０１６０】  上記と同様の結果は、６時間虚血処理＋９６時間再灌流処理後の細胞生存率の検定（ＭＴＴ法）においても示された（図４（ｂ）参照）。【０１６１】  これらの結果は、ＨＣＯ３−を除去してＣｌ−／ＨＣＯ３−アンチポータ（アニオンエクスチェンジャー：ＡＥ）やＮａ＋−ＨＣＯ３−シンポータ（Ｎａ＋−ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｃｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ：ＮＢＣ）が殆ど働かない条件にしておいても、ＤＩＤＳが有効であることを示している。したがって、ＤＩＤＳはＣｌ−チャネルブロッカーであると共にＡＥブロッカーやＮＢＣブロッカーとしても知られているが、この場合はＣｌ−チャネルブロッカーとして働いていることが分かった。【０１６２】  〔実施例３：虚血・再灌流傷害時の心筋細胞アポトーシスは、ＲＯＳスカベンジャーによって救済されるか〕
本発明者らは、ＨｅＬａ細胞をＳＴＳによってアポトーシス誘導したときに、ＲＯＳの産生が高まり、その結果ＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルが活性化されてＡＶＤが発生すること、そしてＲＯＳスカベンジャーの投与によってＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルの活性化，ＡＶＤ，カスパーゼ３／７の活性の上昇，および細胞死が著しく抑制されることを明らかにした（非特許文献９参照）。そこで、虚血および再灌流時に心筋細胞はＲＯＳを産生するかどうかを、ＤＣＦ蛍光測定法（非特許文献９）によって検討を行なった。【０１６３】  ＤＣＦ蛍光測定法は、次のようにして行なった。所定の虚血および再灌流処理を行なったマウス培養心筋細胞に、１０μＭＤＣＦを含む培養液を加えて３０分間インキュベートをし、ＲＯＳと反応して生じた酸化型ＤＣＦが４８５ｎｍの励起によって発する５３８ｎｍの蛍光の大きさを測定した。【０１６４】  その結果を図５に示す。図５に示すように、再灌流処理開始直後からマウス培養心筋細胞内のＲＯＳレベルは急速に上昇し、再灌流開始の２７時間後（計３６時間後）にピークを示し、計９６時間後にかけてゆっくりとそのレベルは元へと戻っていくことが明らかとなった。なお同図中「＊」を付したデータは、虚血時のマウス培養心筋細胞内のＲＯＳレベルに対して１％未満（ｐ＜０．０１）の危険率において有意差があったことを示している。【０１６５】  そこでＲＯＳスカベンジャーを再灌流処理時に投与した時に、マウス培養心筋細胞のアポトーシス死は救済されるかどうかを次に検討した。用いたＲＯＳスカベンジャーは、スーパーオキサイドアニオンのスカベンジャー４，５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１，２−ｂｅｎｚｅｎｅ  ｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（Ｔｉｒｏｎ、和光純薬工業株式会社）、過酸化水素スカベンジャーであるカタラーゼ（Ｃａｔａｌａｓｅ、シグマ社）、そして非特異的なＲＯＳのスカベンジャーであるＮ−ａｃｅｔｙｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ（ＮＡＣ、シグマ社）の３種である。【０１６６】  結果を図６に示す。図６（ａ）は、再灌流処理時に１ｍＭ  Ｔｉｒｏｎ，２ｍＭ  ＮＡＣ，２００Ｕ／ｍｌカタラーゼをそれぞれ添加した場合のカスパーゼ−３／７の活性を測定した結果を示しており、同図の左端からコントロール（虚血後に再灌流処理なし）；虚血後に再灌流処理を行なった細胞（同図中「Ｉ／Ｒ」で示す）；再灌流処理時に１ｍＭ  Ｔｉｒｏｎを添加した細胞（同図中「Ｉ／Ｒ＋Ｔｉｒｏｎ（１ｍＭ）」で示す）；再灌流処理時に２ｍＭ  ＮＡＣを添加した細胞（同図中「Ｉ／Ｒ＋ＮＡＣ（２ｍＭ）」で示す）；再灌流処理時に２００Ｕ／ｍｌカタラーゼを添加した細胞（同図中「Ｉ／Ｒ＋Ｃａｔａｌａｓｅ（２００Ｕ／ｍｌ）」で示す）の結果を示している。また図６（ｂ）は、前記と同様の場合における細胞生存率（ＭＴＴ法）の結果を示している。図６（ｂ）におけるデータの並びは、図６（ａ）に同じである。【０１６７】  なお図６（ａ）およびにおけるカスパーゼ−３／７比活性は、コントロールのカスパーゼ−３／７活性を１００とした場合の各試験区の相対比（％）で示した。また図６（ｂ）における細胞生存率は、コントロールの細胞生存率を１００とした場合の各試験区の相対比（％）で示した。さらに図６（ａ）および��ｂ）において２つの棒グラフを線でつなぎ、その上に「ｐ＜０．０５」を付したものは、その両棒グラフが示すデータ間に５％未満の危険率において有意差があったことを示している。【０１６８】  図６に示すように、虚血後に再灌流処理を行なった場合に起こるカスパーゼ−３／７活性の上昇（図６（ａ）参照）、および細胞死（図６（ｂ）参照）は、Ｔｉｒｏｎ（１ｍＭ）、ＮＡＣ（２ｍＭ）およびカタラーゼ（２００Ｕ／ｍｌ）によって著しく抑制されるということが分かった（図６（ａ）および（ｂ）参照）。以上の結果は、虚血後の再灌流によるマウス培養心筋細胞のアポトーシスは、再灌流処理時に産生されるＲＯＳを消失させることによって救済されることを示している。【０１６９】  よって、ＲＯＳスカベンジャー（Ｔｉｒｏｎ，ＮＡＣ，カタラーゼ）を再灌流処理時に細胞に投与することによって、アポトーシス性細胞死を有意に抑制することができるということが分かった。
【産業上の利用可能性】
【０１７０】  上記本発明にかかる再灌流性細胞死抑制効果の評価方法は、培養心筋細胞にグルコース除去・無酸素処理（虚血処理工程）後に、グルコース再投与・再酸素化処理（再灌流処理）を行なうという虚血後の再灌流モデル実験を行ない、このときの心筋細胞アポトーシス死をカスパーゼ活性測定やＤＮＡラダー観察や細胞生存率測定を行なうことによって評価するものである。本発明にかかる再灌流性細胞死抑制効果の評価方法を用いて、各種薬剤を評価することによって、心筋梗塞や心移植時の心筋細胞アポトーシス死に対する治療・防御薬剤の検索（スクリーニング）が可能となった。【０１７１】  また上記本発明にかかる再灌流性細胞死抑制効果の評価方法を用いることによって、虚血後の再灌流によってもたらされる心筋細胞のアポトーシス死は、再灌流時にＣｌ−チャネルブロッカーを投与したり、ＲＯＳスカベンジャーを投与したりすることによって抑制できることが明らかとなった。よってＣｌ−チャネルブロッカーおよびＲＯＳスカベンジャーが、再灌流性細胞死抑制剤，再灌流性細胞死に起因する疾患の治療薬剤、予防薬剤として利用可能であるということが分かった。【０１７２】  上記この救済メカニズムは、アポトーシス初期に見られるアポトーシス性細胞容積減少（ＡＶＤ）をもたらすＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルの活性化を抑制することによって達成されるものと考えられる。本発明は、アポトーシスの最も初期の反応であるＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネル活性化とその活性化シグナルをターゲットにした虚血後の再灌流性心筋傷害に対する防御策であり、全く新しいものである。【０１７３】  また本発明は、虚血発作時ではなく、その後の再灌流時にＣｌ−チャネルブロッカーやＲＯＳスカベンジャーを投与することによって奏功するものであるため、臨床的治療への適用が比較的容易であるという特徴を有している。また、心臓移植に不可避的な虚血後の再灌流傷害にも、移植直後の再灌流時に本発明を適用することによって、移植心の定着率を高めることも可能となる。【０１７４】  以上のように、本発明は、再灌流性細胞死の有効な抑制方法、細胞死抑制剤、再灌流性細胞死に起因する各種疾患の治療薬剤・予防薬剤等を提供することができる。また再灌流性細胞死抑制効果の評価方法を提供する。【０１７５】  したがって本発明は、製薬業をはじめとする医療産業において幅広く利用が可能である。また本発明は、再灌流性細胞死に関する基礎的研究にも大いに寄与するものである。
【図１（ａ）】
2006011273.tif 000002
【図１（ｂ）】
2006011273.tif 000003
【図２（ａ）】
2006011273.tif 000004
【図２（ｂ）】
2006011273.tif 000005
【図２（ｃ）】
2006011273.tif 000006
【図２（ｄ）】
2006011273.tif 000007
【図３（ａ）】
2006011273.tif 000008
【図３（ｂ）】
2006011273.tif 000009
【図３（ｃ）】
2006011273.tif 000010
【図３（ｄ）】
2006011273.tif 000011
【図４（ａ）】
2006011273.tif 000012
【図４（ｂ）】
2006011273.tif 000013
【図５】
2006011273.tif 000014
【図６（ａ）】
2006011273.tif 000015
【図６（ｂ）】
2006011273.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】平成17年12月5日(2005.12.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】請求の範囲
【請求項１】（削除）
【請求項２】細胞を、グルコースを含まない緩衝液中で、無酸素条件下で培養する虚血処理工程と、
前記虚血処理を行なった細胞を、グルコースを含む培養液中で、有酸素条件下で培養する再灌流処理工程と、
前記再灌流処理工程時に被検物を、前記グルコースを含む培養液へ添加する工程とを含んでおり、
前記再灌流処理工程時に被検物を添加した場合の細胞死の評価結果と、前記再灌流処理工程時に被検物を添加していない場合の細胞死の評価結果とを比較することを特徴とする、アポトーシス性細胞死である再灌流性細胞死の抑制効果の評価方法。
【請求項３】上記被検物が、Ｃｌ−チャネルブロッカーまたはＲＯＳスカベンジャーであることを特徴とする請求項２に記載の再灌流性細胞死の抑制効果の評価方法。
【請求項４】上記細胞が心筋細胞であることを特徴とする請求項２または３に記載の再灌流性細胞死の抑制効果の評価方法。
【請求項５】（削除）
【請求項６】上記細胞死の評価を、ミトコンドリア脱水素酵素の活性を指標に行なうことを特徴とする請求項２ないし４のいずれか１項に記載の再灌流性細胞死の抑制効果の評価方法。
【請求項７】上記細胞死の評価を、核内ＤＮＡの断片化を指標に行なうことを特徴とする請求項２ないし４のいずれか１項に記載の再灌流性細胞死の抑制効果の評価方法。
【請求項８】上記細胞死の評価を、細胞死を引き起こす細胞内タンパク質分解酵素の活性を指標に行なうことを特徴とする請求項２ないし４のいずれか１項に記載の再灌流性細胞死の抑制効果の評価方法。
【請求項９】請求項２、３、４、６、７、または８に記載の再灌流性細胞死の抑制効果の評価方法を行なうためのキットであって、
細胞、グルコースを含まない緩衝液、およびグルコースを含む培養液を包含し、上記グルコースを含まない緩衝液は、１０８ｍＭ  ＮａＣｌ，０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，５．４ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ＣａＣｌ２，５ｍＭ  ＨＥＰＥＳにＮａＨＣＯ３を加えてｐＨ７．４にあわせた緩衝液であり、かつ
グルコースを含む培養液は、１０％ＦＢＳを添加したＤ−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ培地、ＭＥＭ培地およびＥＭ培地から選択される１つ以上のものである、キット。
【請求項１０】上記細胞が、心筋細胞であることを特徴とする請求項９に記載のキット。
【請求項１１】虚血後の細胞に対して再灌流時に、Ｃｌ−チャネルブロッカーまたはＲＯＳスカベンジャーを投与することを特徴とする、アポトーシス性細胞死である再灌流性細胞死の抑制方法。
【請求項１２】（削除）
【請求項１３】上記再灌流性細胞死、ミトコンドリア脱水素酵素の活性の低下を伴うものであることを特徴とする請求項１１に記載の再灌流性細胞死の抑制方法。
【請求項１４】上記再灌流性細胞死が、核内ＤＮＡの断片化を伴うものであることを特徴とする請求項１１に記載の再灌流性細胞死の抑制方法。
【請求項１５】上記再灌流性細胞死が、細胞死を引き起こす細胞内タンパク質分解酵素の活性化を伴うものであることを特徴とする請求項１１に記載の再灌流性細胞死の抑制方法。
【請求項１６】上記Ｃｌ−チャネルブロッカーが、ＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーであることを特徴とする請求項１１、１３、１４、または１５に記載の再灌流性細胞死の抑制方法。
【請求項１７】上記ＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーが、ＤＩＤＳであることを特徴とする請求項１６に記載の再灌流性細胞死の抑制方法。
【請求項１８】上記ＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーが、ＮＰＰＢであることを特徴とする請求項１６に記載の再灌流性細胞死の抑制方法。
【請求項１９】上記ＲＯＳスカベンジャーが、Ｔｉｒｏｎであることを特徴とする請求項１１、１３、１４、または１５に記載の再灌流性細胞死の抑制方法。
【請求項２０】上記ＲＯＳスカベンジャーが、カタラーゼであることを特徴とする請求項１１、１３、１４、または１５項に記載の再灌流性細胞死の抑制方法。
【請求項２１】上記ＲＯＳスカベンジャーが、ＮＡＣであることを特徴とする請求項１１、１３、１４、または１５に記載の再灌流性細胞死の抑制方法。
【請求項２２】上記細胞が心筋細胞であることを特徴とする請求項１１、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１に記載の再灌流性細胞死の抑制方法。
【請求項２３】アポトーシス性細胞死である再灌流性細胞死の抑制剤であって、
虚血後の細胞に対して再灌流時に投与されることを特徴とする、ＲＯＳスカベンジャーを含む再灌流性細胞死抑制剤。
【請求項２４】アポトーシス性細胞死である再灌流性細胞死抑制剤であって、
虚血後の細胞に対して再灌流時に投与されることを特徴とする、Ｃｌ−チャネルブロッカーを含む再灌流性細胞死抑制剤。
【請求項２５】上記Ｃｌ−チャネルブロッカーが、ＶＳＯＲ  Ｃｌ−チャネルブロッカーであることを特徴とする請求項２４に記載の再灌流性細胞死抑制剤
【請求項２６】（削除）
【請求項２７】上記再灌流性細胞死が、ミトコンドリア脱水素酵素の活性の低下を伴うものであることを特徴とする請求項２３ないし２５のいずれか１項に記載の再灌流性細胞死抑制剤。
【請求項２８】上記再灌流性細胞死が、核内ＤＮＡの断片化を伴うものであることを特徴とする請求項２３ないし２５のいずれか１項に記載の再灌流性細胞死抑制剤。
【請求項２９】上記再灌流性細胞死が、細胞死を引き起こす細胞内タンパク質分解酵素の活性化を伴うものであることを特徴とする請求項２３ないし２５のいずれか１項に記載の再灌流性細胞死抑制剤。
【請求項３０】上記ＲＯＳスカベンジャーが、Ｔｉｒｏｎであることを特徴とする請求項２３、２７、２８、または２９に記載の再灌流性細胞死抑制剤。
【請求項３１】上記ＲＯＳスカベンジャーが、カタラーゼであることを特徴とする請求項２３、２７、２８、または２９に記載の再灌流性細胞死抑制剤。
【請求項３２】上記ＲＯＳスカベンジャーが、ＮＡＣであることを特徴とする請求項２３、２７、２８、または２９に記載の再灌流性細胞死抑制剤。
【請求項３３】請求項２３、２４、２５、２７、２８、２９、３０、３１、または３２に記載の再灌流性細胞死抑制剤を含み、再灌流性細胞死に起因する疾患の治療に使用される治療薬剤。
【請求項３４】心筋細胞死に起因する疾患の治療に使用される請求項３３に記載の治療薬剤。
【請求項３５】請求項２３、２４、２５、２７、２８、２９、３０、３１、または３２に記載の再灌流性細胞死抑制剤を含み、再灌流性細胞死に起因する疾患の予防薬剤。
【請求項３６】心筋細胞死に起因する疾患の予防に使用される請求項３５に記載の予防薬剤。
【国際調査報告】
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