(57)【要約】  本発明の目的は、フィテプシン（ｐｈｙｔｅｐｓｉｎ）を含有する調製物、より具体的には、シナラ・カルズンクルス（Ｃｙｎａｒａ  ｃａｒｄｕｎｃｕｌｕｓ）の花から抽出及び部分精製される天然物、又は、シプロシンの異種産生のために遺伝子改変されたサッカロミセス・セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の培養物に由来する上清から抽出される組換え体であっても、ヘテロダイマー、そのＮ末端プロペプチド、成熟Ｎ末端ペプチド及び成熟Ｃ末端ペプチド、同様にまた、他の前駆体化学種、プロセシング産物及び集合化学種を、分離されて、又は、前者の任意の組合せでのいずれかで含有するシプロシン（ｃｙｐｒｏｓｉｎ）を含有する調製物の、治療的適用のための使用、より正確には、抗腫瘍剤としてのその使用のための使用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質シプロシン（ｃｙｐｒｏｓｉｎ）を含有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
前記タンパク質シプロシンが、精製の有無にかかわりなく、天然供給源から、より具体的には、これに限定するものではないが、シナラ・カルズンクルス（Ｃｙｎａｒａ  ｃａｒｄｕｎｃｕｌｕｓ）から直接抽出されることを特徴とする請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
酵素シプロシンをコードするＤＮＡ配列又はその任意の一部が組み換えられており、結果として、翻訳及び翻訳後プロセシングの産物が、前記産物を異種的に発現する微生物、より具体的には、これらに限定するものではないが、サッカロミセス・セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）から得られ、かつ、精製されることを特徴とする請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記酵素シプロシンをコードする前記ＤＮＡ配列又はその任意の一部が組み換えられており、結果として、前記翻訳及び翻訳後プロセシングの産物が、培養されている遺伝子改変された細胞株、例えば、これに限定するものではないが、ヒト細胞株を含めて、昆虫又は哺乳動物に由来する細胞株から得られ、かつ、精製されることを特徴とする、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項５】
ホロ酵素、すべての構造サブユニット／ポリペプチド鎖、前駆体及び最終産物を組み合わせて又は分離して、又は、これらを任意の組合せ及び割合で含有する混合物を形成してなるもののいずれか、あるいは、特有のポリペプチド実体を含有する組成物において、いずれの場合でも、シプロシン転写物の翻訳産物、すなわち、いずれかの前駆体シプロシン転写物又は前駆体シプロシンポリペプチドの転写後プロセシング又は翻訳後プロセシングのどちらかに由来するシプロシン転写物の翻訳産物を有することを特徴とする請求項１乃至請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
シプロシンプレプロペプチド、ならびに／あるいは、Ｎ末端サブユニット／ペプチド鎖及び／又は成熟Ｎ末端サブユニット／ペプチド鎖を含有するシプロシンプロペプチド、ならびに／あるいは、植物フィテプシン（ｐｈｙｔｅｐｓｉｎ）の特異的なＣ末端ドメイン及び／若しくはＰＳＩドメイン、及び／又は、成熟Ｃ末端サブユニット／ペプチド鎖を含有する前記シプロシンプロペプチド、ならびに／あるいは、前記ＰＳＩドメインを含有する単離されたポリペプチド、ならびに／あるいは、初期プレプロペプチドのプロセシング又は分解に由来する任意の他の二次産物を含有することを特徴とする請求項１乃至請求項５記載の医薬組成物。
【請求項７】
得られる配列の発現に対応する産物のアミノ酸配列が、天然シプロシンのアミノ酸配列と比較されたとき、変化させられているように、シプロシン酵素をコードするＤＮＡヌクレオチド配列又はその任意の一部が遺伝子操作によって改変されることを特徴とする請求項乃至請求項６記載の医薬組成物。
【請求項８】
任意の大きさのペプチドを含有し、ただし、そのアミノ酸配列が前記シプロシンプレプロペプチドのアミノ酸配列から推定され得ること、及び／又は、そのアミノ酸配列が、事前に改変されたＤＮＡ配列から誘導され得ること、及び又は、そのアミノ酸配列がポリペプチド分解により誘導され得ること、及び／又は、そのアミノ酸配列が前記プレプロペプチドの酵素消化に誘導され得ること、及び／又は、そのアミノ酸配列がその天然のプロセシングに誘導され得ること、及び／又は、そのアミノ酸配列が化学合成によって合成的に誘導され得ることを特徴とする請求項１乃至請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
免疫系と相互作用する要素、例えば、抗体、あるいは、その鎖／サブユニット又は断片のいずれか、又は、任意の性質の免疫刺激因子、例えば、抗原、細胞毒性を有するＴリンパ球、及び／又は、樹状細胞のどちらかと複合化された前記化学種のいずれかを含有することを特徴とする請求項１乃至請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
組合せ、複合化、あるいは、輸送用分子又は輸送用ビヒクル、例えば、これらに限定するものではないが、封入用ナノ粒子における挿入により投与されることを特徴とする請求項１乃至請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
添加剤、希釈剤、溶媒、フィルター、滑剤、賦形剤又は安定剤との組合せ又は複合化されて投与されることを特徴とする請求項１乃至請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１２】
動物に対して、優先的には哺乳動物に対して、すなわち、ヒトに対して投与されることを特徴とする請求項１乃至請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
全身的様式又は局所的様式、静脈内投与、経口投与、あるいは、何らかの他の様式で投与されることを特徴とする請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１４】
抗腫瘍活性を有することを特徴とする請求項１２又は請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１５】
インビトロでの抗腫瘍活性を細胞株、例えば、これに限定するものではないが、結腸ガン腫に由来するヒト上皮細胞株（ＨＣＴ）、腺ガンに由来するヒト上皮細胞株（ＨｅＬａ）、線維肉腫に由来するヒト細胞株（ＨＴ）、及び、横紋筋肉腫に由来するヒト上皮細胞株（ＴＥ）において有することを特徴とする請求項１４記載の医薬組成物。
【請求項１６】
腫瘍細胞株、例えば、これに限定するものではないが、結腸ガン腫に由来するヒト上皮細胞株（ＨＣＴ）、腺ガンに由来するヒト上皮細胞株（ＨｅＬａ）、線維肉腫に由来するヒト細胞株（ＨＴ）、及び、横紋筋肉腫に由来するヒト上皮細胞株（ＴＥ）の成長を、１〜１００μｇ／ｍｌの範囲のシプロシン調製物の濃度で５０％阻害することを特徴とする請求項１４記載の医薬組成物。
【請求項１７】
ヒト腫瘍細胞株の成長を、０．００１〜１μｇ／ｍｌの範囲のシプロシン調製物の濃度で５０％阻害することを特徴とする請求項１４記載の医薬組成物。
【請求項１８】
種々の癌型に対して適用されることを特徴とする請求項１４乃至請求項１８に記載される医薬組成物の使用。
【請求項１９】
前記癌型が、結腸直腸ガン、小腸ガン、子宮頸部ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、胃ガン、乳ガン、膀胱ガン、リンパガン、肉腫、膵臓ガン、メラノーマ、神経膠腫、神経芽細胞腫、肺ガン、口腔ガン、頭頸部ガン、肝臓ガン、子宮頸ガン及び血液学的ガンを含有する群に含まれることを特徴とする請求項１８に記載される医薬組成物の使用。
【請求項２０】
生理学的状態又はヒト病理を回復するために、すなわち、これに限定するものではないが、高血圧、レトロウイルス感染、ヘモグロビン分解及び消化不良を回復するために使用されることを特徴とする請求項１２又は請求項１３記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の目的は、フィテプシン（ｐｈｙｔｅｐｓｉｎ）の調製物を含有する医薬配合物、より具体的には、シナラ・カルズンクルス（Ｃｙｎａｒａ  ｃａｒｄｕｎｃｕｌｕｓ）の花に由来する天然のアスパラギン酸プロテアーゼであるとして特徴づけられるシプロシン（ｃｙｐｒｏｓｉｎ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬにおけるアクセス番号：Ｑ３９４７６）の調製物を含有する医薬配合物を開発することにある。
【０００２】
本発明の目的は、ヘテロダイマー、シプロシンプレプロペプチド、ならびに／あるいは、Ｎ末端サブユニット及び／又はローブ（ｌｏｂｅ）／鎖／Ｎ末端成熟サブユニットを含有するシプロシンプロペプチド、ならびに／あるいは、植物フィテプシンの特異的なＣ末端ドメイン及び／若しくはＰＳＩドメイン、及び／又は、ローブ／ポリペプチド鎖／Ｎ末端成熟サブユニットを含有するシプロシンプロペプチド、ならびに／あるいは、ＰＳＩドメインを含有する単離されたポリペプチド、あるいは、初期プレプロペプチドのプロセシング又は分解に由来する任意の他の二次産物、同様にまた、他の前駆体化学種、プロセシング産物及び集合化学種を、分離されて、又は、前者の任意の組合せのもとでのいずれかで含有する言及されたシプロシンの調製物を提供することにある。
【０００３】
本発明の目的は、シナラ・カルズンクルスの花から抽出される天然シプロシン、又は、異種タンパク質の産生のために遺伝子改変されたサッカロミセス・セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の培養物に由来する上清から抽出される組換えシプロシンのいずれかの調製物を提供することにある。
【０００４】
本発明の目的は、言及されたシプロシンを含有する調製物を、ヒト上皮細胞株（すなわち、結腸由来細胞株（ＨＣＴ）、腺ガン由来細胞株（ＨｅＬａ）、線維肉腫由来細胞株（ＨＴ）及び横紋筋肉腫由来細胞株（ＴＥ））においてインビトロで明らかにされる抗腫瘍活性を有する医薬配合物を提供することを含む。
【背景技術】
【０００５】
正常（非腫瘍）細胞の増殖及び老化の機構と、腫瘍細胞の増殖及び老化の機構とは類似している。これらの機構の１つの異常な調節により、腫瘍形成が誘導されることがある。因子、例えば、化学的作用因又は放射線作用因などはＤＮＡに損傷を与え、プログラム化された細胞死（ＰＣＤ）、すなわち、アポトーシスに関与する遺伝子の発現を変化させることができ、これにより、増殖因子の非存在下での制御されない細胞増殖を生じさせる。
【０００６】
ペプチダーゼ、プロテアーゼ又はプロテイナーゼと呼ばれるタンパク質分解酵素はペプチド結合を加水分解する。エキソペプチダーゼは末端のポリペプチド領域の近くで作用し、一方、エンドペプチダーゼは、ポリペプチド鎖を、酵素の性質に依存して、より大きい特異性又はより低い特異性で内部において切断する。エンドペプチダーゼが、ＰＣＤプログラムの正しい機能のために要求される生化学的シグナルの伝達において重要な役割を果たす。それらの触媒作用機構によれば、エンドペプチダーゼは、セリンペプチダーゼ、システインペプチダーゼ、アスパラギン酸ペプチダーゼ、トレオニンペプチダーゼ及びメタロペプチダーゼの５つの異なるサブクラスに分けられる（非特許文献１及び非特許文献２参照）。ＰＣＤに関与するプロセスが、誘導シグナルの合成及び放出（細胞外）、誘導シグナルの伝達（細胞内）、そして、最後に、執行経路と称される、すべての細胞に共通する細胞内経路の３つの異なる関連した経路で生じる。エンドペプチダーゼは、ＰＣＤを誘導するための特異的なシグナルを、生物活性分子のプロセシング及び送達と、細胞表面における受容体の活性化とによって生じさせる［例えば、サイトカイン（ＴＮＦ−α、γ−インターフェロン（ＩＦＮ−γ）、ＴＧＦ−β）、及び、Ｆａｓ／ＡＰＯ−１のための受容体リガンド］（非特許文献３参照）。
【０００７】
ＰＣＤ誘導シグナルを伝達することに関するエンドペプチダーゼ（すなわち、カスパーゼ）の役割が広く実証されている。カスパーゼは、例えば、エンドヌクレアーゼ阻害剤タンパク質の切断及びその結果としての阻害により、核ＤＮＡの切断を間接的に促進させる。これにより、アポトーシスに入る細胞において観測される形態学的変化、すなわち、サイズにおける低下、及び、細胞の核の凝縮が説明される（Ｍｕｚｚｉｏ（１９９８）及びＨｏｒｔａ（１９９９）参照）。
【０００８】
執行経路が何に関係するかにおいて、プロテアーゼが、２つの異なる機能的グループに由来する２つのタイプの分子をプロセシング／切断することによって、すなわち、細胞構造の組織化及び維持に関して関与する分子と、恒常性に関して関与する酵素とをプロセシング／切断することによって作用し得る（Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙら（１９９７）参照）。
【０００９】
Ｌｏｕｉｓ  Ｄｅｉｓｓら（１９９６）は、サイトカインにさらされた細胞から調製されるアンチセンスｃＤＮＡによるランダム遺伝子サイレンシング法を使用して、アスパラギン酸プロテアーゼのカテプシンＤ（ＣａｔＤ）に由来するアンチセンスＲＮＡが、腺ガン由来のヒト上皮細胞株（ＨｅＬａ細胞）を、ＩＦＮ−γ、Ｆａｓ／ＡＰＯ−１及びＴＮＦ−αを介するＰＣＤから保護することができたことを示した（非特許文献３参照）。これは、サイトカインによって媒介されるか、又は、サイトカインによって媒介されないプログラム化された細胞死の誘導に関するＣａｔＤの直接的な役割を明らかにした多くの研究の中で最初のものであった。それ以降、多くの他の機構が、ＰＣＤの誘導におけるＣａｔＤの機能を説明するために提案されている。Ｗｕら（１９９８）は、ｐ５３因子に依存する腫瘍の抑制に関するＣａｔＤの役割を指摘した（非特許文献４参照）。さらに後に、Ｂｉｄｅｒｅら（２００３）は、ＣａｔＤを介するヒトＴリンパ球のアポトーシス表現型の誘導が、アポトーシス開始プロセスの活性化因子として特異的に機能するＡＩＦ因子（ミトコンドリアのタンパク質）の選択的な放出を誘導するＢａｘタンパク質の不活性化から生じることを提案した（非特許文献５参照）。Ｐｉｗｎｉｃａら（２００４）によれば、ＣａｔＤはヒトプロラクチンをプロセシングすることができ、それにより、そのＮ末端に類似する小さいフラグメントを生じさせる（非特許文献６参照）。その血管形成活性のために、これらのフラグメントは腫瘍発達に関して阻害的役割を果たす。同年には、Ｉａｃｏｂｕｚｉｏ−Ｄｏｎａｈｕｅらは、ウエスタンブロッティング、免疫組織化学及びグリコシル化分析の技術を使用して、結腸腫瘍の５９のサンプルにおけるＣａｔＤの発現パターンを研究した（非特許文献７参照）。ＣａｔＤの含有量及び発現を調べることによって、Ｉａｃｏｂｕｚｉｏ−Ｄｏｎａｈｕｅらは、ＣａｔＤ発現の喪失を、観測されたサンプルの５０％超において病理学と相間させることができた。さらに後に、Ｈａｅｎｄｅｌｅｒら（２００５）は、チオレドキシン−１（Ｔｒｘ）（反応性酸素ラジカル（ＲＯＲ）を封鎖するその能力に由来する不可欠なアポトーシス防止タンパク質）の分解を介するＰＣＤに関するカテプシンＤの役割を報告した（非特許文献８参照）。より近年には、ＣａｔＤがカスパーゼ依存的アポトーシスをラット腫瘍胚性細胞株（３Ｙ１−Ａｄ１２系統）及びヒト慢性骨髄性白血病（Ｋ５６２）において刺激することが明らかにされている。最初の場合には、ＣａｔＤ媒介のアポトーシスがその触媒活性とは無関係であり、このことから、構造的特徴との関連性が説明される（非特許文献９及び非特許文献１０参照）。
【００１０】
現在、動物細胞のアポトーシスにおけるＣａｔＤの根本的な役割を予見することができず、従って、そのアポトーシス活性が１つだけの機構に起因するかどうかの結論を下すことができない。最終的な影響は、一部の癌型に対する新しい作用因／分子を見出すために詳しく探索され得るいくつかの相互に関連した経路に起因するかもしれない。
【００１１】
動物モデルにおけるＰＣＤに関して存在する知識と対照的に、ペプチダーゼと、植物細胞におけるＰＣＤとの間での直接的な関連性に関しては何ら報告されていない。Ｄｕｎｎ（２００２）は、動物細胞との類推を指摘して、植物でのＰＣＤにおける植物ペプチダーゼの関与が及ばない機構に関して報告している（非特許文献１１参照）。今回の革新技術のために特に関連性がある植物ペプチダーゼの一例が、フィテプシン類（ペプシン様アスパラギン酸エンドペプチダーゼのファミリーＡ１）のペプチドである（非特許文献２参照）。フィテプシンは、植物におけるＰＣＤに関連するものとして記載される、ＭＥＲＯＰＳデータベース（ペプチダーゼ及びそれに対応する特異的阻害剤の参照データベース）に載せられる唯一のアスパラギン酸エンドペプチダーゼである（非特許文献１２参照）。そのような仮定に対する証拠が、これらの酵素のｍＲＮＡ発現のレベルが老化に沿って葉及び花弁において増大することである（非特許文献１３及び非特許文献１４参照）。フィテプシンが、ＰＳＩ（植物特異的挿入）ドメインによって示されるＣ末端付近の１００残基を除いて、動物のＣａｔＤとの大きい相同性を有するプレプロペプチドとして合成される。その名が示唆するように、このドメインはフィテプシンについて特異的である（非特許文献１５参照）。ＰＳＩドメインは、サポシン（動物におけるスフィンゴ脂質の活性化因子であることが知られている酵素）との大きい相同性を示す。ＰＳＩドメインは、プロペプチドを２つのほぼ等しい部分に切断する翻訳後プロセシングの期間中に生じる切断によってプロペプチドのＣ末端から分離される（非特許文献１６参照）。この最初の切断は、コムギのフィテプシンに関してはたまたまそうであるように自己触媒的であり得る。この最初の切断は、成熟タンパク質のエンドペプチダーゼ活性のためには不可欠なものである。
【００１２】
その結果として、成熟タンパク質が、最初の切断から生じるＮ末端プロペプチドのプロセシングに由来する１つの重鎖と、ＰＳＩドメインを含有する第２の部分のＣ末端からなる軽鎖との２つの鎖の集合から生じる。ＰＳＩドメインが存在しないため、Ｎ末端プロペプチドは、動物及び微生物のアスパラギン酸エンドペプチダーゼ（例えば、ＣａｔＤなど）のすべてのプロ形態（ｐｒｏ−ｆｏｒｍ）に共通する典型的な構造を示す（非特許文献１６参照）。
【００１３】
ＣａｔＤとの大きい相同性を有するフィテプシンの典型的な場合がシプロシンファミリーであり、これは以前には、シナラ・カルズンクルス（アザミ）の花からＨｅｉｍｇａｒｔｎｅｒら（１９８９）によって初めて単離されているシナラーゼ（ｃｙｎａｒａｓｅ）又はシナリン（ｃｙｎａｒｉｎ）によって示されたものである（非特許文献１７参照）。イベリア半島においてチーズを製造するために従来から使用されるカルドシン（ｃａｒｄｏｓｉｎ）とよく類似するように、シプロシンが、カゼインを基質として使用するとき、ｐＨ５．１において最大活性を有する、ヘテロダイマーのグリコシル化されたアスパラギン酸エンドペプチダーゼであるとして初めて記載されている（非特許文献１８参照）。それ以降、ｃＤＮＡライブラリーが構築され、シプロシン３をコードするｃＤＮＡ及びＣＹＰＲＯ１１遺伝子の配列を含有するクローンが解読された。これらの結果に続いて、シプロシン３の特徴づけが行われており、Ｃ．ｃａｒｄｕｎｃｕｌｕｓの花の種々の器官におけるその組織化学的局在化が研究された（非特許文献１８〜非特許文献２２参照）。より近年には、これらのプロテアーゼの全体的構造（それらのプレドメイン及びプロドメインの配列）だけでなく、それらのグリコシル化パターンを、それらの典型的なプロセシング機構と同様に解明する他の研究が行われている（非特許文献１６、非特許文献２３〜非特許文献２８参照）。最後に、産業的適用のためのシプロシンの大規模製造を目指すＣＹＰＲＯ１１遺伝子が酵母において発現することが引き金となり、アスパラギン酸エンドペプチダーゼのますますの経済的関心及び治療的関心が増加されている（非特許文献２９及び特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開第１１９６５４２号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｒａｗｌｉｎｇｓ  Ｎ．  Ｄ．，  Ｍｏｒｔｏｎ  Ｆ．  Ｒ．  ａｎｄ  Ａ．  Ｊ．  Ｂａｒｒｅｔｔ（２００６）．  ＭＥＲＯＰＳ：  ｔｈｅ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｄａｔａｂｅｓｅ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３４：Ｄ２７０−Ｄ２７２
【非特許文献２】Ｂｅｅｒｓ  Ｅ．Ｐ．，Ｂｏｎｎｉｅ  Ｊ．Ｗ．ａｎｄ  Ｃ．Ｚｈａｏ（２０００）．Ｐｌａｎｔ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ：ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｒｏｌｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ．Ｐｌａｎｔ  ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．４４：３９９−４１５．
【非特許文献３】Ｄｅｉｓｓ  Ｌ．Ｐ．，Ｇａｌｉｎｋａ  Ｈ．，Ｂｅｒｉｓｓｉ  Ｈ．，Ｃｏｈｅｎ  Ｏ．ａｎｄ  Ａ．Ｋｉｍｃｈｉ（１９９６）．Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｄ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−Ｙ，ＦＡＳ／ＡＰＯ−１  ａｎｄ  ＴＮＦ−ａ  ．ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：３８６１−３８７０．
【非特許文献４】Ｗｕ  Ｇ．Ｓ．，Ｓａｆｔｉｇ  Ｐ．，Ｐｅｔｅｒｓ  Ｃ．ａｎｄ  Ｗ．Ｓ．Ｅｌ−Ｄｅｉｒｙ（１９９８）．Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｄ  ｉｎ  ｐ５３−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １７：２１７７−２１８３．
【非特許文献５】Ｂｉｄｅｒｅ  Ｎ．，Ｌｏｒｅｎｚｏ  Ｈ．Ｋ．，Ｃａｒｍｏｎａ  Ｓ．，Ｌａｆｏｒｇｅ  Ｍ．，Ｈａｒｐｅｒ  Ｆ．，Ｄｕｍｏｎｔ  Ｃ．ａｎｄ  Ａ．Ｓｅｎｉｋ（２００３）．Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｄ  ｔｒｉｇｇｅｒｓ  Ｂａｘ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ  ｉｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ（ＡＩＦ）ｒｅｌｏｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｅｎｔｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅａｒｌｙ  ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ  ｐｈａｓｅ  ｔｏ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３３：３１４０１−３１４１１．
【非特許文献６】Ｐｉｗｎｉｃａ  Ｄ．，Ｔｏｕｒａｉｎｅ  Ｐ．，Ｓｔｒｕｍａｎ  Ｌ，Ｔａｂｒｕｙｎ  Ｓ．，Ｂｏｌｂａｃｈ  Ｇ．，Ｃｌａｐｐ  Ｃ，Ｍａｔｉａｌ  Ｊ．Ａ．，Ｋｅｌｌｙ  Ｐ．Ａ．ａｎｄ  Ｖ．Ｇｏｆｆｉｎ（２００４）．Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｌａｃｔｉｎ  ｉｎｔｏ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  １６Ｋ−ｌｉｋｅ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ：ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ．ＭｏＩ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１０：２５２２−２５４２．
【非特許文献７】Ｉａｃｏｂｕｚｉｏ−Ｄｏｎａｈｕｅ  Ｃ．，Ｓｈｕｊａ  Ｓ．，Ｃａｉ  Ｊ．，Ｐｅｎｇ  Ｐ．，Ｗｉｌｌｅｔｔ  Ｊ．ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｍｕｒｎａｎｅ（２００４）Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｔｕｍｏｒｓ：ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｓｕｇｇｅｓｔ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．３：４７３−４８５．
【非特許文献８】Ｈａｅｎｄｅｌｅｒ  Ｊ．，Ｐｏｐｐ  Ｒ．，Ｇｏｙ  Ｃ，Ｔｉｓｃｈｌｅｒ  Ｖ．，Ｚｅｉｈｅｒ  Ａ．Ｍ．ａｎｄ  Ｓ．Ｄｉｍｍｅｌｅｒ（２００５）．Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｄ  ａｎｄ  Ｈ２Ｏ２  ｓｉｍｕｌａｔｅ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ−ｌ  ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：４２９４５−４２９５１．
【非特許文献９】Ｂｅａｕｊｏｕｉｎ  Ｍ．，Ｂａｇｈｄｉｇｕｉａｎ  Ｓ．，Ｇｌｏｎｄｕ−Ｌａｓｓｉｓ  Ｍ．，Ｂｅｒｃｈｅｍ  Ｇ．ａｎｄ  Ｅ．Ｌｉａｕｄｅｔ−  Ｃｏｏｐｍａｎ（２００６）．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｔｈ  ｃａｔａｌｉｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  −ｉｎａｃｔｉｖｅ  ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｄ  ｂｙ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｈｅｍｏ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２５：１９６７−１９７３．
【非特許文献１０】Ｗａｎｇ  Ｚ．，Ｌｉａｎｇ  Ｒ．，Ｈｕａｎｇ  Ｇ．Ｓ．，Ｐｉａｏ  Ｙ．，Ｚｈａｎｇ  Ｙ．Ｑ．，Ｗａｎｇ  Ａ．Ｑ．，Ｄｏｎｇ  Ｂ．Ｘ．，Ｆｅｎｇ  Ｊ．Ｌ．，Ｙａｎｇ  Ｇ．Ｒ．ａｎｄ  Ｙ．Ｇｕｏ（２００６）．Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ  ｓｕｌｆａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｋ５６２  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｄ  ａｎｄ  ｄｏｗｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｃｌ−ｘＬ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  １０：１８５１−６０
【非特許文献１１】Ｄｕｎｎ  Ｂ．Ｍ．（２００２）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｅｐｓｉｎ−ｌｉｋｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ａｓｐａｒｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０２：４４３１−４４５８．
【非特許文献１２】Ｒａｗｌｉｎｇｓ  Ｎ．Ｄ．，Ｍｏｒｔｏｎ  Ｆ．Ｒ．ａｎｄ  Ａ．Ｊ．Ｂａｒｒｅｔｔ（２００６）．ＭＥＲＯＰＳ：ｔｈｅ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｄａｔａｂａｓｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ３４：Ｄ２７０−Ｄ２７２．
【非特許文献１３】Ｂｕｃｈａｎａｎ−Ｗｏｌｌａｓｔｏｎ  Ｖ．（１９９７）．Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｌｅａｆ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．４８：１８１−１９９．
【非特許文献１４】Ｐａｎａｖａｓ  Ｔ．，Ｐｉｋｌａ  Ａ．，Ｒｅｉｄ  Ｐ．Ｄ．，Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ  Ｂ．ａｎｄ  Ｅ．Ｌ．Ｗａｌｋｅｒ（１９９９）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｄａｙｌｉｌｙ  ｐｅｔａｌｓ．Ｐｌａｎｔ  ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．４０：２３７−２４８．
【非特許文献１５】Ｒｕｎｅｂｅｒｇ−Ｒｏｏｓ  Ｐ．，Ｔｏｒｍａｋａｎｇａｓ，Ｋ．ａｎｄ  Ａ．Ｏｓｔｍａｎ（１９９１）．Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｂａｒｌｅｙ−ｇｒａｉｎ  ａｓｐａｒｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ：ａ  ｐｌａｎｔ  ａｓｐａｒｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｒｅｓｅｍｂｌｉｎｇ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｄ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０２：１０２１−１０２７．
【非特許文献１６】Ｒａｍａｌｈｏ−Ｓａｎｔｏｓ  Ｍ．，Ｖｅｒiｓｓｉｍｏ  Ｐ．，Ｃｏｒｔｅｓ  Ｌ．，Ｓａｍｙｎ  Ｂ．，Ｖａｎ  Ｂｅｅｕｍｅｎ  Ｊ．ａｎｄ  Ｅ．Ｐｉｒｅｓ（１９９８）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｃａｒｄｏｓｉｎ  Ａ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５５：１３３−１３８．
【非特許文献１７】Ｈｅｉｍｇａｒｔｎｅｒ  Ｕ．，Ｐｉｅｔｒｚａｋ  Ｍ．，Ｇｅｅｒｓｔｓｅｎ  Ｒ．，Ｂｒｏｄｅｌｉｕｓ  Ａ．Ｃ．，Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ  Ａ．Ｃ．ｄａ  Ｓｉｌｖａ  ａｎｄ  Ｍ．Ｓ．Ｓ．Ｐａｉｓ（１９８９）．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐａｒｔｉａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｌｋ  ｃｌｏｔｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  ｆｌｏｗｅｒｓ  ｏｆ  Ｃｙｎａｒａ  ｃａｒｄｕｎｃｕｌｕｓ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９：１４０５−１４１０．
【非特許文献１８】Ｃｏｒｄｅｉｒｏ  Ｍ．Ｃ，Ｘｕｅ  Ｚ．Ｔ．，Ｐｉｅｔｒｚａｋ  Ｍ．，Ｐａｉｓ  Ｍ．Ｓ．ａｎｄ  Ｐ．Ｅ．Ｂｒｏｄｅｌｉｕｓ（１９９４）．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｆｌｏｗｅｒｓ  ｏｆ  Ｃｙｎａｒａ  ｃａｒｄｕｎｃｕｌｕｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｃｙｐｒｏｓｉｎ（ａｎ  ａｓｐａｒｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）ａｎｄ  ｉｔｓ  ｕｓｅ  ｔｕ  ｓｔｕｄｙ  ｔｈｅ  ｏｒｇａｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｐｒｏｓｉｎ．Ｐｌａｎｔ  ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２４：７３３−７４１．
【非特許文献１９】Ｃｏｒｄｅｉｒｏ  Ｍ．Ｃ，Ｘｕｅ  Ｚ．Ｔ．，Ｐｉｅｔｒｚａｋ  Ｍ．，Ｐａｉｓ  Ｍ．Ｓ．ａｎｄ  Ｐ．Ｅ．Ｂｒｏｄｅｌｉｕｓ（１９９５）．Ｐｌａｎｔ  ａｓｐａｒｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｙｎａｒａ  ｃａｒｄｕｎｃｕｌｕｓ  ｓｐｐ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ  ｃｖ．ｃａｒｄｏｏｎ；ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｃＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｃｙｐｒｏｓｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｏｒｇａｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３６２：３６７−７２
【非特許文献２０】Ｃｏｒｄｅｉｒｏ  Ｍ．Ｃ．，Ｌｏｗｔｈｅｒ  Ｔ．，Ｄｕｎｎ  Ｂ．Ｍ．，Ｇｕｒｕｐｒａｓａｄ  Ｋ．，Ｂｌｕｎｄｅｌｌ  Ｔ．，Ｐａｉｓ  Ｍ．Ｓ．ａｎｄ  Ｐ．Ｅ．Ｂｒｏｄｅｌｉｕｓ（１９９８）．Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ａｓｐａｒｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ（Ｃｙｐｒｏｓｉｎｓ）ｆｒｏｍ  ｆｌｏｗｅｒｓ  ｏｆ  Ｃｙｎａｒａ  ｃａｒｄｕｎｃｕｌｕｓ  ｓｕｂｓｐ．Ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ  ｃｖ．Ｃａｒｄｏｏｎ．Ａｓｐａｒｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ４３６：４７３−４７９．
【非特許文献２１】Ｂｒｏｄｅｌｉｕｓ  Ｐ．Ｅ．，Ｃｏｒｄｅｉｒｏ  Ｍ．Ｃ  ａｎｄ  Ｍ．Ｓ．Ｐａｉｓ（１９９５）．Ａｓｐａｒｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ（ｃｙｐｒｏｓｉｎｓ）ｆｒｏｍ  Ｃｙｎａｒａ  ｃａｒｄｕｎｃｕｌｕｓ  ｓｐｐ．Ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ  ｃｖ．ｃａｒｄｏｏｎ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３６２：２５５−６６．
【非特許文献２２】Ｂｒｏｄｅｌｉｕｓ  Ｐ．Ｅ．，Ｃｏｒｄｅｉｒｏ  Ｍ．，Ｍｅｒｃｋｅ  Ｐ．，Ｄｏｍｉｎｇｏｓ  Ａ．，Ｃｌｅｍｅｎｔｅ  Ａ．ａｎｄ  Ｍ．Ｓ．Ｐａｉｓ（１９９８）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａｓｐａｒｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  ｆｌｏｗｅｒｓ  ｏｆ  Ｃｙｎａｒａ  ｃａｒｄｕｎｃｕｌｕｓ  ＳＵＢＳＰ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ  ＣＶ．ｃａｒｄｏｏｎ  ａｎｄ  Ｃｅｎｔａｕｒｅａ  ｃａｌｃｉｔｒａｐａ．Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．４３６：４３５−４３９．
【非特許文献２３】Ｆａｒｏ  Ｃ．，Ｖｅｒｉｓｓｉｍｏ  Ｐ．，Ｌｉｎ  Ｙ．，Ｔａｎｇ  Ｊ．ａｎｄ  Ｅ．Ｐｉｒｅｓ（１９９５）．Ｃａｒｄｏｓｉｎ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ，ａｓｐａｒｔｉｃ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｆｌｏｗｅｒｓ  ｏｆ  ｃａｒｄｏｏｎ．Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３６２：３７３−７．
【非特許文献２４】Ｖｅｒｉｓｓｉｍｏ  Ｐ．，Ｆａｒｏ  Ｃ，Ｍｏｉｒ  Ａ．Ｊ．，Ｌｉｎ  Ｙ．，Ｔａｎｇ  Ｊ．ａｎｄ  Ｅ．Ｐｉｎｅｓ（１９９６）．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐａｒｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｎｅｗ  ａｓｐａｒｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  ｆｒｅｓｈ  ｆｌｏｗｅｒｓ  ｏｆ  Ｃｙｎａｒａ  ｃａｒｄｕｎｃｕｌｕｓ  Ｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３５：７６２−８．
【非特許文献２５】Ｃｏｓｔａ  Ｊ．，Ａｓｈｆｏｒｄ  Ｄ．Ａ，Ｎｉｍｔｚ  Ｍ．，Ｂｅｎｔｏ  Ｉ．，Ｆｒａｚaｏ  Ｃ．，Ｅｓｔｅｖｅｓ  Ｃ．Ｌ．，Ｆａｒｏ  Ｃ．Ｊ．，Ｋｅｒｖｉｎｅｎ  Ｊ．，Ｐｉｒｅｓ  Ｅ．，Ｖｅｒｉｓｓｉｍｏ  Ｐ．，Ｗｌｏｄａｗｅｒ  Ａ．ａｎｄ  Ｍ．Ａ．Ｃａｒｒｏｎｄｏ（１９９７）．Ｔｈｅ  ｇｌｙ−  ｃｏｓｉｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｓｐａｒｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  ｂａｒｌｅｙ（Ｈｏｒｄｅｕｉｎ  ｖｕｌｇｃｉｒｅ  Ｌ．）ａｎｄ  ｃａｒｄｏｏｎ（Ｃｙｎａｒａ  ｃａｒｄｕｎｃｕｌｕｓ  Ｌ．）．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４３：６９５−７００．
【非特許文献２６】Ｒａｍａｌｈｏ−Ｓａｎｔｏｓ  Ｍ．，Ｐｉｓｓａｒｒａ  Ｊ．，Ｖｅｒｉｓｓｉｍｏ  Ｐ．，Ｐｅｒｅｉｒａ  Ｓ．，Ｓａｌｅｍａ  Ｒ．，Ｐｉｒｅｓ  Ｅ．ａｎｄ  Ｃ．Ｊ．Ｆａｒｏ．（１９９７）．Ｃａｒｄｏｓｉｎ  Ａ，ａｎ  ａｂｕｎｄａｎｔ  ａｓｐａｒｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ，ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｖａｃｕｏｌｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｉｇｍａｔｉｃ  ｐａｐｉｌｌａｅ  ｏｆ  Ｃｙｎａｒａ  ｃａｒｄｕｎｃｕｌｕｓ  Ｌ．Ｐｌａｎｔａ，２０３：２０４−１２．
【非特許文献２７】Ｂｅｎｔｏ  Ｉ．，Ｃｏｅｌｈｏ  Ｒ．，Ｆｒａｚａｏ  Ｃ，Ｃｏｓｔａ  Ｊ．，Ｆａｒｏ  Ｃ．，Ｖｅｒｉｓｓｉｍｏ  Ｐ．，Ｐｉｒｅｓ  Ｅ．，Ｃｏｏｐｅｒ  Ｊ．，Ｄａｕｔｅｒ  Ｚ．，Ｗｉｌｓｏｎ  Ｋ．ａｎｄ  Ｍ．Ａ．Ｃａｒｒｏｎｄｏ（１９９８）．Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｓａｔｉｏｎ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｉｎｉｔｉａｌ  ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｌａｎｔ  ｃａｒｄｏｓｉｎ−Ａ．Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．４３６：４４５−５２．
【非特許文献２８】Ｆｒａｚaｏ  Ｃ．，Ｂｅｎｔｏ  Ｉ．，Ｃｏｓｔａ  Ｊ．，Ｓｏａｒｅｓ  Ｊ．Ｍ．，Ｖｅｒｉｓｓｉｍｏ  Ｐ．，Ｆａｒｏ  Ｃ，Ｐｉｒｅｓ  Ｅ．，Ｃｏｏｐｅｒ  Ｊ．ａｎｄ  Ｍ．Ａ．Ｃａｒｒｏｎｄｏ（１９９９）．Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｃａｒｄｏｓｉｎ  Ａ，ａ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ａｎｄ  Ａｒｇ−  ＧＩｙ−  Ａｓｐ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａｓｐａｒｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｆｌｏｗｅｒｓ  ｏｆ  Ｃｙｎａｒａ  ｃａｒｄｕｎｃｕｌｕｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２７６９４−２７７０１．
【非特許文献２９】Ｐａｉｓ  Ｍ．Ｓ．Ｓ．，Ｃｏｎｃｅｉｃaｏ  Ｆ．Ｃ．Ｃ．ａｎｄ  Ｊ．Ｒｕｄｙ（２０００）．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｙｅａｓｔｓ  ｏｆ  ａｓｐａｒｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐａｎｔ  ｏｒｉｇｉｎ  ｗｉｔｈ  ｓｈｅｅｐ’ｓ，ｃｏｗ’ｓ，ｇｏａｔ’ｓ  ｍｉｌｋ，ｅｔｃ．ｃｌｏｔｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．ＷＯ／２０００／０７５２８３．
【非特許文献３０】Ｓｋｅｈａｎ  Ｐ．，Ｓｔｏｒｅｎｇ  Ｒ．，Ｓｃｕｄｉｅｒｏ  Ｄ．，Ｍｏｎｋｓ  Ａ．，ＭｃＭａｈｏｎ  Ｊ．，Ｖｉｓｔｉｃａ  Ｄ．，Ｗａｒｒｅｎ  Ｊ．Ｔ．，Ｂｏｋｅｓｃｈ  Ｈ．，Ｋｅｎｎｅｙ  Ｓ．ａｎｄ  Ｍ．Ｒ．Ｂｏｙｄ（１９９０）．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｍａｓｓ  ｓｔａｉｎｓ  ｆｏｒ  ａｓｓａｙｉｎｇ  ｄｒｕｇ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｕｐｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ａｍｅｒ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１３：１１０７−１１１２．
【非特許文献３１】Ｍｏｎｋｓ  Ａ．，Ｓｃｕｄｉｅｒｏ  Ｄ．，Ｓｋｅｈａｎ  Ｐ．，Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ  Ｒ．，Ｐａｕｌｌ  Ｋ．，Ｖｉｓｔｉｃａ  Ｄ．，Ｈｏｓｅ  Ｃ．，Ｌａｎｇｌｅｙ  Ｊ．，Ｃｒｏｎｉｓｅ  Ｐ．，Ｖａｉｇｒｏ−Ｗｏｌｆｆ  Ａ．，Ｇｒａｙ−Ｇｏｏｄｒｉｃｈ  Ｍ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ  Ｈ．，Ｍａｙｏ  Ｊ．ａｎｄ  Ｍ．Ｂｏｙｄ（１９９１）．Ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｆｌｕｘ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ  ｓｃｒｅｅｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｐａｎｅｌ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎ．Ｉｎｓｔ．Ｖｏｌ．８３，Ｎ°  １１．
【非特許文献３２】Ｆａｒｏ  Ｃ，Ｒａｍａｌｈｏ−Ｓａｎｔｏｓ  Ｍ．，Ｖｉｅｉｒａ  Ｍ．，Ｍｅｎｄｅｓ  Ａ．，Ｓｉｍoｅｓ  Ｉ．，Ａｎｄｒａｄｅ  Ｒ．，Ｖｅｒiｓｓｉｍｏ  Ｐ．，Ｌｉｎ  Ｘ．，Ｔａｎｇ  Ｊ  ａｎｄ  Ｅ．Ｐｉｒｅｓ（１９９９）Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｏｎｇ  Ｃａｒｄｏｓｉｎ  Ａ，ａｎ  ＲＧＤ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｐｌａｎｔ  Ａｓｐａｒｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２８７２４−２８７２９
【非特許文献３３】Ｇｌａｔｈｅ  Ｓ．，Ｋｅｒｖｉｎｅｎ  Ｊ．，Ｎｉｍｔｚ  Ｍ．，Ｌｉ  Ｇ．Ｈ．，Ｔｏｂｉｎ  Ｇ．Ｊ．，Ｃｏｐｅｌａｎｄ  Ｔ．Ｄ．，Ａｓｈｆｏｒｄ  Ｄ．Ａ．，Ｗｌｏｄａｗｅｒ  Ａ．ａｎｄ  Ｊ．Ｃｏｓｔａ（１９９８）Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖａｃｕｏｌａｒ  ａｓｐａｒｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｐｈｙｔｅｐｓｉｎ  ｉｎ  ｂａｒｌｅｙ（Ｈｏｒｄｅｕｉｎ  ｖｕｌｇａｒｅ  Ｌ．）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：３１２３０−３１２３６．
【非特許文献３４】Ｋｅｒｖｉｎｅｎ  Ｊ．，Ｔｏｂｉｎ  Ｇ．Ｊ．，Ｃｏｓｔａ  Ｊ．，Ｗａｕｇｈ  Ｄ．Ｓ．，Ｗｌｏｄａｗｅｒ，Ａ．ａｎｄ  Ａ．Ｚｄａｎｏｖ（１９９９）．Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐｌａｎｔ  ａｓｐａｒｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｐｒｏｐｈｙｔｅｐｓｉｎ：ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｖａｃｕｏｌａｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．ＥＭＢＯ  Ｊ．１８：３９４７−３９５５．
【非特許文献３５】Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ  Ｅ．（１９９６）．ＲＧＤ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１２：６９７−７１５．
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、シナラ・カルズンクルスの花又は組換えサッカロミセス・セレビジアエ培養物（ＢＪ１９９１）の上清のどちらかからそれぞれ抽出される天然シプロシン調製物及び組換えシプロシン調製物（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬにおけるアクセス番号：Ｑ３９４７６）の細胞毒性研究に基づく。
【００１７】
これらの酵素調製物は、両方の構造的ポリペプチド鎖、すなわち、Ｎ末端鎖（これはＮ末端プロペプチド又はＮ末端成熟ペプチドであり得るか、あるいは、両方の組合せでさえあり得る）と、Ｃ末端鎖（成熟Ｃ末端ペプチド）とを含有する。
【００１８】
天然タンパク質及び組換えタンパク質の両方が、以前に記載された方法に従って抽出及び精製された（非特許文献２１及び非特許文献２９参照）。
【００１９】
本発明をもたらした細胞毒性研究は、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）の方法を使用して行われた。この方法は、ＳＲＢにより着色される、培養されたヒト細胞株における総細胞タンパク質バイオマスの比色測定定量によって製造物の細胞毒性を測定するための迅速かつ正確な方法である。酸性条件下において、ＳＲＢは、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）により事前に固定処理された細胞における塩基性タンパク質のアミノ酸に結合し、これにより、培養プレートにおける細胞密度に比例している固定処理細胞内の総タンパク質含有量が示される。結果として、培養プレートでの細胞数における増減が、測定される染色量に比例する変化をもたらし、そのような変化は結果的には、研究されている化合物の細胞毒性影響を示す（非特許文献３０参照）。
【００２０】
ＳＲＢ量が、光を５６５ｎｍの波長で吸収するその能力によって測定される。この方法を使用することにより、同じ条件のもとで成長させられるコントロール細胞に対する、研究されている化合物により処理される細胞の相対的な成長／生存性を評価することが可能である（非特許文献３１参照）。
【００２１】
シプロシンの細胞毒性影響を、ヒトの腫瘍細胞株及び非腫瘍細胞株を使用して、細胞の形態学観察、及び、対応するＩＣ５０（細胞増殖が５０％阻害されるシプロシン濃度を示すパラメータ）をインビトロで求めることによって評価した。
【００２２】
シプロシンの影響について得られる結果を腫瘍細胞株対非腫瘍細胞株に関して比較するとき、１００μｇ／ｍＬの濃度については、この酵素が、アッセイされたすべての腫瘍細胞株において形態学的変化を誘導し、この形態学的変化には、溶解が伴ったことが確認されている。そしてまた、非腫瘍細胞株は、同じ（１００μｇ／ｍＬの）シプロシン濃度に付された場合、形態学及び細胞成長における著しい変化を何ら示さなかった。腫瘍細胞株におけるシプロシンの影響についてのＩＣ５０値が、非腫瘍細胞株に関して得られたＩＣ５０値と比較されたとき、一般に、酵素調製物が、非腫瘍細胞株の生存性／成長に著しい影響を及ぼすことなく、腫瘍細胞株に対してより大きい致死的影響を示すことが観測された。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】コントロール非腫瘍細胞ＦＨｓ７４Ｉｎｔの培養及び腫瘍細胞ＨＣＴの培養。Ａ−天然シプロシン溶液を添加する前のＦＨｓ７４細胞；Ｂ−１００μｇ／ｍＬの天然シプロシン溶液を添加した後４８時間でのＦＨｓ７４Ｉｎｔ細胞；Ｃ−天然シプロシン調製物の天然シプロシン溶液を添加する前のＨＣＴ細胞；Ｄ−１００μｌ／ｍＬを添加した後４８時間でのＨＣＴ細胞。天然シプロシンの添加によって影響を受けないＦＨｓ７４Ｉｎｔ細胞とは対照的に、ＨＣＴ細胞は、酵素添加後４８時間で、溶解の証拠を示す。スケールバー＝１００μｍ。
【図２】ＳＢＲによる細胞染色によって評価され、アッセイされた腫瘍細胞株のそれぞれについて試験された天然シプロシンの濃度（μｇ／ｍｌ）の対数に対してプロットされる細胞生存性：Ａ−ＨＣＴ、Ｂ−ＨＴ、Ｃ−ＴＥ、Ｄ−Ｈｅｌａ。
【図３】ＳＢＲによる細胞染色によって評価され、試験された非腫瘍細胞株のそれぞれについて天然シプロシンの濃度（μｇ／ｍｌ）の対数に対してプロットされる細胞の生存性：Ａ−Ｖｅｒｏ細胞、Ｂ−ＦＨｓ７４Ｉｎｔ細胞。
【図４】コントロール非腫瘍細胞ＦＨ７４Ｉｎｔ細胞及び腫瘍細胞ＨＣＴ。Ａ−組換えシプロシンを添加する前のＦＨｓ７４Ｉｎｔ細胞；Ｂ−１００μｇ／ｍＬの組換えシプロシン調製物を添加した後４８時間でのＦＨｓ７４Ｉｎｔ細胞；Ｃ−組換えシプロシン調製物を添加する前のＨＣＴ細胞；Ｄ−１００μｇ／ｍＬの組換えシプロシン調節物を添加した後４８時間でのＨＣＴ細胞。組換えシプロシンの添加に対する影響を示さないＦＨｓ７４Ｉｎｔ細胞とは対照的に、ＨＣＴ細胞は、組換えシプロシン調製物を添加した後４８時間で、溶解の明瞭な証拠を示す。スケールバー＝１００μｍ。
【図５】アッセイされた細胞株のそれぞれについて組換えシプロシンの濃度（μｇ／ｍｌ）の対数に対してプロットされる、ＳＢＲによる細胞染色による細胞生存性の表示：Ａ−ＨＣＴ腫瘍細胞；Ｂ−ＦＨｓ７４Ｉｎｔ非腫瘍細胞。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の性質によれば、以下に詳細に説明する実施例によって、よりよく達成される。
【００２５】
下記の実施例は、例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
［実施例］
［実施例Ｉ］
両方の構造的な鎖、すなわち、Ｎ末端鎖（これはＮ末端プロペプチド及び成熟Ｎ末端からなる）と、Ｃ末端鎖（成熟ペプチドのＣ末端）とを含有し、乾燥したシナラ・カルズンクルスの花から単離及び精製される天然シプロシンの調製物の抗腫瘍活性。
【００２６】
シプロシン調製物を、Ｂｒｏｄｅｌｉｕｓら（１９９５）によって以前に記載されたように、乾燥したシナラ・カルズンクルスの花から得た（非特許文献２１参照）。酵素調製物の抗腫瘍活性を、４つのヒト腫瘍細胞株、すなわち、ガン腫に由来する上皮細胞株（ＨＣＴ１１６、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４７）、線維肉腫に由来する上皮細胞株（ＨＴ１０８０、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１２１）、横紋筋肉腫に由来する上皮細胞株（ＴＥ６７１、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１３６）、及び、腺ガンに由来する上皮細胞株（Ｈｅｌａ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２（商標））と、２つの非腫瘍細胞株、すなわち、ヒト腸（上皮）細胞からなる非腫瘍細胞株（ＦＨｓ７４Ｉｎｔ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４１）、及び、アフリカミドリザルの腎臓上皮細胞からなる別の非腫瘍細胞株（Ｖｅｒｏ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）とを使用して評価した。
【００２７】
ＨＣＴ１１６、ＨＴ１０８０及びＴＥ６７１の腫瘍細胞株を、５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ−Ｇｉｂｃｏ社製）が補充された基礎培地ＤＭＥＭ（Ｃａｍｂｒｅｘ社製）に接種した。グルコース（Ｓｉｇｍａ社製）及びＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ社製）の最終濃度をそれぞれ、４．５ｇ／Ｌ及び６．０ｍＭとした。培養培地には、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社製）溶液が補充された。
【００２８】
腫瘍のＨｅｌａ細胞株を、１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社製）、２．１ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３−Ｓｉｇｍａ社製）、１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｃ３Ｈ３ＮａＯ３−Ｓｉｇｍａ社製）及び０．１ｍＭの非必須アミノ酸溶液（ＮＥＡＡ−Ｃａｍｂｒｅｘ社製）が補充されたＤＭＥＭ（Ｃａｍｂｒｅｘ社製）基礎培地に接種した。グルコース（Ｓｉｇｍａ社製）及びＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ社製）の最終濃度をそれぞれ、１．０ｇ／Ｌ及び２．０ｍＭとした。培養培地には、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社製）が補充された。
【００２９】
非腫瘍のＶｅｒｏ細胞を、１０％の胎児ウシ血清（ＦＢＳ−Ｇｉｂｃｏ社製）及び３．５６ｍＭのＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ社製）が補充された基礎培地ＤＭＥＭ（Ｃａｍｂｒｅｘ社製）に接種した。培養培地にはまた、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社製）が補充された。
【００３０】
非腫瘍細胞株ＦＨｓ７４Ｉｎｔを、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ−Ｇｉｂｃｏ社製）、２．１ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３（Ｓｉｇｍａ社製）溶液、２．０ｍＭのＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ社製）及び３０ｎｇ／ｍＬの上皮増殖因子（ＥＧＦ−Ｓｉｇｍａ社製）が補充されたＨｙｂｒｉｃａｒｅ（ＡＴＣＣ；Ｃａｔ．４６−Ｘ）に接種した。培地には、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社製）が補充された。
【００３１】
細胞を、バッチ様式で操作される静置培養システムで増殖させた。細胞の濃度及び生存性を、トリパンブルー排除法を使用して評価した。
【００３２】
表ＩＩＩは、それぞれの細胞培養についての比成長速度（μ）及び対応する倍加時間（ＤＴ）を示す。
【表１】
2012510428.tif 000002
【００３３】
ＩＣ５０値を、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）法を使用してこれらの培養された異なる細胞株について求めた。
【００３４】
それぞれの細胞株からの１００μＬの総体積を９６ウェルプレートに三連（ｔｒｉｐｒｉｃａｔｅ）で接種した。対応する密度を、２４時間の処理の後でそれぞれの培養物がおよそ５０％のコンフルエンスを示したような様式でそれぞれの複製物の比成長速度に基づいて推定した。この方策に従った場合、ＨＣＴ１１６細胞及びＨｅｌａ細胞について得られた接種密度が３．１×１０４細胞／ｃｍ２であり、ＨＴ１０８０細胞及びＶｅｒｏ細胞については４×１０３細胞／ｃｍ２であり、ＴＥ６７１細胞株については１．６×１０４細胞／ｃｍ２であり、ＦＨｓ７４Ｉｎｔ細胞株については２．５×１０４細胞／ｃｍ２であった。
【００３５】
培養物を７％ＣＯ２雰囲気及び９０％湿度において３７℃で２４時間インキュベーションした。
【００３６】
接種後２４時間で、１００μＬのシプロシン調製物を、ＩＣ５０を計算するために、１０００μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．０１μｇ／ｍＬ及び０．００１μｇ／ｍＬに濃度を低下させて、それぞれのウェルに加えた。
【００３７】
プレートを７％ＣＯ２雰囲気及び９０％湿度において３７℃で４８時間インキュベーションした。
【００３８】
コントロールアッセイを、シプロシン調製物の非存在下、使用されたすべての細胞株について行った。
【００３９】
酵素調製物を添加した４８時間後、細胞培養物を光学顕微鏡で観察して、細胞のコンフルエンス及び形態学的特徴を記録した。
【００４０】
１００μｇ／ｍＬのシプロシン濃度については、非腫瘍のＦＨｓ７４Ｉｎｔ細胞と、ＨＣＴ腫瘍細胞との間における違いが顕著になった。非腫瘍のＦＨｓ７４Ｉｎｔ細胞と、ＨＣＴ腫瘍細胞との間における違いを図１に示す。
【００４１】
一般には、１０００μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬの間に及ぶシプロシン調製物の濃度のみが、これらの異なる細胞株の形態学に関して違いを誘導した。最大濃度（１０００μｇ／ｍＬ）では、溶解がすべての細胞株集団（腫瘍及び非腫瘍）において誘導された。
【００４２】
１００μｇ／ｍＬの濃度での酵素調製物は、目に見える溶解の徴候を伴って顕著な形態学的変化をすべての腫瘍細胞に誘導し、より長く、かつ、より薄くした（図１）。
【００４３】
そしてまた、非腫瘍のＦＨｓ７４Ｉｎｔ細胞及びＶｅｒｏ細胞は、同じ１００μｇ／ｍＬの酵素調製物に付された場合には、形態学的変化を示さなかった（図１）。
【００４４】
上述した方法を使用した場合、１０μｇ／ｍＬ未満の酵素濃度についてはアッセイされたこれらの異なる細胞株に対して、酵素調製物の毒性の徴候が何ら観測されなかった。
【００４５】
顕微鏡観察の後、プレートのウェルすべてに５０μＬの５０％（ｗ／ｖ）ＴＣＡ溶液（Ｆｌｕｋａ）を加え、４℃で１時間インキュベーションした。その後、プレートを蒸留水により５回洗浄した。
【００４６】
最後の洗浄の後、プレートを乾燥し、１００μＬの新たに調製された０．４％（ｗ／ｖ）ＳＲＢ（Ｓｉｇｍａ社製）をそれぞれのウェルに加えた。
【００４７】
プレートを室温で３０分間インキュベーションし、遮光した。
【００４８】
ＳＲＢ染料を、２５０μＬの１％酢酸（Ｒｉｅｌｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ）により５回洗浄することによって細胞から除いた。
【００４９】
その後、それぞれのプレートウェルを、絶えず振とうしながら、室温で１０分間、遮光しながら、２００μＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｚｍａ塩基（Ｆｌｕｋａ）溶液と共にインキュベーションした。細胞を破砕し、ＳＲＢ染色されたタンパク質を放出させた。
【００５０】
アッセイは、シプロシン調製物及びコントロールにさらされたときの相対的な成長及び細胞生存性を評価するために吸光度を測定することにより終了した。
【００５１】
ＩＣ５０値を計算するために、細胞タンパク質におけるＳＲＢの取り込み（％ＳＲＢ）を、下記の式（１）（式中、ＳＲＢＥは酵素調製物のそれぞれの濃度についての吸光度平均値を表し、ＳＲＢＢはブランクアッセイについての吸光度平均値を表し、ＳＲＢＣはコントロールアッセイについての吸光度平均値を表す）に従って、コントロール細胞に対して評価した。
【００５２】
％ＳＲＢ＝（ＳＲＢＥ−ＳＲＢＢ）／（ＳＲＢＣ−ＳＲＢＢ）×１００  （１）
【００５３】
酵素濃度（μｇ／ｍＬ）の対数に対する％ＳＲＢの図における曲線を、バックグラウンド及びシグナルのパラメータがそれぞれ、０％及び１００％である生物統計学プログラムのＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用Ｐｒｉｓｍ５（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）によって決定される下記のＨｉｌｌ関数（２）を使用して合致させた。
【００５４】
Ｙ＝バックグラウンド＋（シグナル−バックグラウンド）／（１＋１０（ｌｏｇＩＣ５０−Ｘ）＊Ｈｉｌｌ傾き）  （２）
【００５５】
それぞれの細胞株についての、シプロシン濃度（μｇ／ｍＬ）の対数に対して関連づけられる、ＳＲＢにより染色された細胞の生存性のグラフ表示を図２において認めることができる。対応するＩＣ５０の値を表ＩＶに示す。
【００５６】
【表２】
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【００５７】
研究された腫瘍細胞株については、ＨＣＴ１１６細胞が酵素調製物の抗腫瘍効果に対して最も敏感であり、一方、ＴＥ６７１細胞が最も抵抗性であることが観測された。非腫瘍細胞株については、ＦＨｓ７４Ｉｎｔ細胞がＶｅｒｏ細胞よりも敏感であることが観測された。
【００５８】
腫瘍細胞株の方が一貫して、シプロシン調製物に対して感受性であるという事実は、（絶対的に見て、非腫瘍細胞について得られるＩＣ５０値の１／５以下である）それらのＩＣ５０値によって明らかであり、形態学的な観測結果と一致している。
【００５９】
一般には、これらの結果は、同じ濃度のシプロシン調製物に付された非腫瘍細胞と比較したとき、シナラ・カルズンクルスの乾燥した花から精製される天然酵素の腫瘍細胞特異的な致死的効果を表す。
【００６０】
報告されるこれらの結果は、天然シプロシン調製物の潜在的な抗腫瘍の細胞毒性効果が１０００μｇ／ｍＬまでの濃度で存在することを示す。
【００６１】
［実施例ＩＩ］
２つの構造的な鎖、すなわち、Ｎ末端鎖（これはＮ末端プロペプチド及び成熟Ｎ末端ペプチドからなる）と、Ｃ末端鎖（これは成熟Ｃ末端ペプチドからなる）とを含有し、ＣＹＰＲＯ１１遺伝子により形質転換されたサッカロミセス・セレビジアエ菌株の培養培地から単離及び精製される組換えシプロシンの調製物の抗腫瘍活性。
【００６２】
シプロシン調製物を、以前の記載（Ｐａｉｓら、２０００）のように、シプロシンをコードするＣＹＰＲＯ１１遺伝子により形質転換されたサッカロミセス・セレビジアエ菌株（ＢＪ１９９１）の培養物に由来する上清から得た（非特許文献２９参照）。酵素調製物の抗腫瘍活性を、ガン腫に由来するヒト腫瘍上皮細胞株（ＨＣＴ１１６、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４７）に対して、同様にまた、ヒト腸由来の上皮細胞からなる非腫瘍細胞株（ＦＨｓ７４Ｉｎｔ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４１）に対して試験した。
【００６３】
腫瘍細胞株ＨＣＴ１１６を、ウシ胎児血清（ＦＢＳ−Ｇｉｂｃｏ社製）が補充された基礎培地ＤＭＥＭ（Ｃａｍｂｒｅｘ社製）に接種した。グルコース（Ｓｉｇｍａ社製）及びＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ社製）の最終濃度をそれぞれ、４．５ｇ／Ｌ及び６．０ｍＭとした。
【００６４】
培地には、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社製）が補充された。
【００６５】
非腫瘍細胞株ＦＨｓ７４Ｉｎｔを、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ−Ｇｉｂｃｏ社製）、２．１０ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）（Ｓｉｇｍａ社製）、２．０ｍＭのＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ社製）及び３０ｎｇ／ｍＬの上皮増殖因子（ＥＧＦ−Ｓｉｇｍａ社製）が補充された基礎培地Ｈｙｂｒｉｃａｒｅ（ＡＴＣＣ；Ｃａｔ．４６−Ｘ）に接種した。
【００６６】
培地には、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社製）が補充された。
【００６７】
細胞を、不連続的に操作される静置培養システムにより増殖させた。細胞の濃度及び生存性を、トリパンブルー排除法を使用して評価した。
【００６８】
腫瘍細胞株及び非腫瘍細胞株（それぞれ、ＨＣＴ１１６及びＦＨｓ７４Ｉｎｔ）の比成長速度（μ）及び倍加時間を上記（実施例Ｉ）における表ＩＩＩに示す。
【００６９】
実施例Ｉの場合と同様に、細胞の形態学的分析を光学顕微鏡によって行い、ＩＣ５０の決定を、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）法を使用して行った。
【００７０】
１００μｇ／ｍＬの酵素調製物により処理された細胞についての形態学的分析の結果を図４に示す。組換えシプロシン調製物の添加によって影響を受けない非腫瘍細胞株ＦＨｓ７４Ｉｎｔとは対照的に、ＨＣＴ細胞は、酵素調製物の添加後４８時間で、溶解の明瞭な証拠を示す。
【００７１】
実施例Ｉの場合のように、ＩＣ５０パラメータを、形態学的研究の後、両方の培養物について求めた。
【００７２】
それぞれの培養された細胞株についての、シプロシン濃度（μｇ／ｍＬ）の対数に対して関連づけられる、ＳＲＢにより染色された細胞のパーセント細胞生存性の変動が図５において表される。
【００７３】
ＩＣ５０の値が、腫瘍細胞株ＨＣＴ１１６については２０．５１μｇ／ｍＬであり、ＦＨｓ７４Ｉｎｔ細胞株については７０．５０μｇ／ｍＬであった。このことは、組換えシプロシンに対する腫瘍細胞株の感受性が、コントロールの非腫瘍細胞株ＦＨｓ７４Ｉｎｔに関して観測された感受性よりも３倍大きいことを示している。
【００７４】
結果はまた、天然シプロシン調製物と比較されたとき、組換えシプロシン調製物より大きい致死的効果（一貫してより低いＩＣ５０値）を示す。
【００７５】
これらの結果は、組換えシプロシン調製物の潜在的な抗腫瘍の細胞毒性効果が１００μｇ／ｍＬまでの酵素濃度で存在することを示唆する。
【図３】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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