【手続補正書】
【提出日】令和2年8月11日(2020.8.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（ＩＥ）又は（ＩＦ）：
2019532275.tif 000001
［式中、
「ハプテン」は、ピラゾール類、ニトロフェニル化合物、ベンゾフラザン類、ベンゾフラン類、トリテルペン類、尿素類、チオウレア類、ロテノン及びロテノン誘導体、オキサゾール、チアゾール類、クマリン及びクマリン誘導体、ニトロアリール類、シクロリグナン類、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、２−ヒドロキシキノキサリン及びジ−ニトロフェノールから選択されるハプテンであり；
Ｙは、ヒドラジン、ヒドラジン誘導体、アミン、活性エステル、イソチオシアネート類、イソシアネート類、アシルアジド類、スルホニルクロリド類、アルデヒド類、グリオキサル類、エポキシド類、オキシラン類、カーボネート類、ハロゲン化アリール類、イミドエステル類、無水物、非重合性Ｍｉｃｈａｅｌ受容体、ハロアセチル基、ハロゲン化アルキル、マレイミド類、アジリジン類、アクリロイル基、ビニルスルホン類、ベンゾキノン類、フルオロベンゼン基、及びＥｌｌｍａｎ試薬で活性化されたジスルフィド基又はチオール類から選択され；
Ａは、１から１５個の炭素原子を有し、Ｏ、Ｎ、若しくはＳからなる群より選択される一又は複数のヘテロ原子を有してもよい、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基を含む基であり；
Ｘは、結合であるか、又は、１から３０個の炭素原子を有し、Ｏ、Ｎ、若しくはＳからなる群より選択される一又は複数のヘテロ原子を有してもよい、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基を含む基であり；
Ｗは、５、６、又は７員の置換又は無置換の芳香族又は複素環式基であり；
各Ｒ１は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−Ｏ−メチル、−Ｏ−エチル、−Ｏ−ｎ−プロピル、−Ｏ−イソプロピル；−Ｏ−ｎ−ブチル、−Ｏ−ｓｅｃ−ブチル、又は−Ｏ−イソ−ブチル；１から４個の炭素原子を有する−Ｓ−アルキル基；１から４個の炭素原子を有する−Ｏ−アルキル基；１から４個の炭素原子を有する−Ｎ（Ｈ）−アルキル基；１から６個の炭素原子を有する−Ｎ−（アルキル）２基；１から４個の炭素原子を有し、Ｎ又はＳで置換されていてもよいアルキル基；シアノ基；及びカルボキシル基から独立して選択され；
Ｖは、結合、１から４個の炭素原子を有する置換若しくは無置換のアルキル基、又は置換若しくは無置換の−Ｏ−アルキル基であり；
Ｒ３は酵素基質であり；
ｑは０又は１であり；
ｓは０、又は１から４の範囲の整数であり；且つ
ｔは０又は１である。］
を有するケージドハプテン。
【請求項２】
ハプテンは、７−（ジエチルアミノ）クマリン−３−カルボン酸（ＤＣＣ）、ビオチン、ニトロピラゾール、チアゾールスルホンアミド、ベンゾフラザン及び２−ヒドロキシキノキサリンからなる群から選択される、請求項１に記載のケージドハプテン。
【請求項３】
酵素基質が、リン酸基、エステル基、アミド基、硫酸基、グリコシド基、尿素基及びニトロ基からなる群より選択される、請求項１又は２に記載のケージドハプテン。
【請求項４】
各Ｒ１基が異なる、請求項１又は２に記載のケージドハプテン。
【請求項５】
Ｘが式（ＩＩＩＡ）：
2019532275.tif 000002
［式中、ｄ及びｅは、各々独立して４から１８の範囲の整数であり；Ｑは、結合、Ｏ、Ｓ又はＮ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり；Ｒａ及びＲｂは、独立してＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキル基、Ｆ、Ｃｌ又はＮ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり；Ｒｃ及びＲｄは、独立してＣＨ３又はＨである。］の構造を有する、請求項１又は２に記載のケージドハプテン。
【請求項６】
ｔが１であり、Ｖが−ＣＨ２−であるか、
ｔが１であり、Ｖが−Ｏ−ＣＨ２−であるか、
ｔが１であり、Ｖが−Ｃ（Ｒ３）２［式中、Ｒ３はＣ１−Ｃ４アルキル基である。］であるか、又は
ｔが１であり、Ｖが−Ｏ−Ｃ（Ｒ３）２［式中、Ｒ３はＣ１−Ｃ４アルキル基である。］である、
請求項１又は２に記載のケージドハプテン。
【請求項７】
ｓが２であり、Ｒ１が−Ｏ−ＣＨ３−であり、ｔが１であり、Ｖが−ＣＨ２−である、請求項１又は２に記載のケージドハプテン。
【請求項８】
ケージドハプテンが
2019532275.tif 000003
、
2019532275.tif 000004
又は
2019532275.tif 000005
である、請求項１に記載のケージドハプテン。
【請求項９】
式（ＩＶＣ）又は（ＩＶＤ）：
2019532275.tif 000006
［式中、
「抗体」は抗体であり；
「ハプテン」はハプテンであり；
Ａは、１から１５個の炭素原子を有し、Ｏ、Ｎ、若しくはＳからなる群より選択される一又は複数のヘテロ原子を有してもよい、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基を含む基であり；
Ｗは、５、６、又は７員の置換又は無置換の芳香族又は複素環式基であり；
Ｚは、結合であるか、又は、１から３０個の炭素原子を有し、Ｏ、Ｎ、若しくはＳからなる群より選択される一又は複数のヘテロ原子を有してもよい、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基を含む基であり、
各Ｒ１は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−Ｏ−メチル、−Ｏ−エチル、−Ｏ−ｎ−プロピル、−Ｏ−イソプロピル；−Ｏ−ｎ−ブチル、−Ｏ−ｓｅｃ−ブチル、又は−Ｏ−イソ−ブチル；１から４個の炭素原子を有する−Ｓ−アルキル基；１から４個の炭素原子を有する−Ｏ−アルキル基；１から４個の炭素原子を有する−Ｎ（Ｈ）−アルキル基；１から６個の炭素原子を有する−Ｎ−（アルキル）２基；１から４個の炭素原子を有し、Ｎ又はＳで置換されていてもよいアルキル基；シアノ基；及びカルボキシル基から独立して選択され；
Ｖは、結合、１から４個の炭素原子を有する置換若しくは無置換のアルキル基、又は置換若しくは無置換の−Ｏ−アルキル基であり；
Ｒ３は酵素基質であり；
ｎは１から２５の範囲の整数であり；
ｑは０又は１であり；
ｓは１から４の範囲の整数であり；且つ
ｔは０又は１である。］
の構造を有する、ケージドハプテン−抗体コンジュゲート。
【請求項１０】
ハプテンは、７−（ジエチルアミノ）クマリン−３−カルボン酸（ＤＣＣ）、ビオチン、ニトロピラゾール、チアゾールスルホンアミド、ベンゾフラザン及び２−ヒドロキシキノキサリンからなる群から選択される、請求項９に記載のケージドハプテン。
【請求項１１】
酵素基質が、リン酸基、エステル基、アミド基、硫酸基、グリコシド基、尿素基及びニトロ基からなる群より選択される、請求項９又は１０に記載のケージドハプテン。
【請求項１２】
抗体が、請求項１から８のいずれか一項に記載のケージドハプテンにコンジュゲートされている、 請求項９に記載のケージドハプテン−抗体コンジュゲート。
【請求項１３】
第一の標的が第二の標的に近接しているかを決定するために試料を分析するための方法であって、
（ａ）試料を、第一の標的に特異的である、請求項９から１２のいずれか一項に記載のケージドハプテン−抗体コンジュゲートと接触させ、第一の標的−ケージドハプテン−抗体コンジュゲート複合体を形成すること；
（ｂ）試料を第二の標的に特異的な非マスキング酵素−抗体コンジュゲートと接触させ、第二の標的−非マスキング酵素−抗体コンジュゲート複合体を形成することであって、非マスキング酵素−抗体コンジュゲートの非マスキング酵素がケージドハプテン−抗体コンジュゲートの酵素基質部分と反応することができるように選択され、第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート複合体を形成する、試料を第二の標的に特異的な非マスキング酵素−抗体コンジュゲートと接触させ、第二の標的−非マスキング酵素−抗体コンジュゲート複合体を形成すること；
（ｃ）試料を第一の検出試薬と接触させ、第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート複合体又は第一の標的を標識すること；及び
（ｄ）標識された第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート複合体又は標識された第一の標的を検出すること
を含む、方法。
【請求項１４】
非マスキング酵素−抗体コンジュゲートの非マスキング酵素が、アルカリホスファターゼ、Ｂ−グルコシダーゼ、Ｂ−ガラクトシダーゼ、Ｂ−グルクロニダーゼ、リパーゼ、スルファターゼ、アミダーゼ、プロテアーゼ、ニトロレダクターゼ、ベータ−ラクタマーゼ＆ノイラミニダーゼ、及びウレアーゼからなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
第一の検出試薬が（ｉ）第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体複合体を第一の酵素で標識するように第一の酵素にコンジュゲートしている二次抗体であって、第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体複合体の非マスク化ハプテンに特異的な二次抗体；及び（ｉｉ）第一の発色性基質又は蛍光性基質を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
第一の酵素が非マスキング酵素とは異なる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
第一の酵素がペルオキシダーゼである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
第一の発色性基質が、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、ＨＲＰ−Ｓｉｌｖｅｒ、及びチラミド−色素原からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
試料を第二の標的−非マスキング酵素−抗体コンジュゲート複合体の非マスキング酵素に特異的な第二の発色性基質又は蛍光性基質と接触させることをさらに含み、第一の発色性基質と第二の発色性基質が異なる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
第一の検出試薬が、第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート複合体に導入される標識の数を増幅させるための成分を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
第一の標的がＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１の一方であり、第二の標的がＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１のもう一方である、請求項１３に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１２】
いくつかの実施態様では、反応基Ｙはカルボニル−反応基である。適切なカルボニル−反応基は、ヒドラジン、ヒドラジン誘導体、及びアミンを含む。他の実施態様では、反応基Ｙはアミン−反応基である。適切なアミン−反応基は、活性エステル、例えばＮＨＳ又はスルホ−ＮＨＳ、イソチオシアネート類、イソシアネート類、アシルアジド類、スルホニルクロリド類、アルデヒド類、グリオキサル類、エポキシド類、オキシラン類、カーボネート類、アリールハロゲン化物、イミドエステル類、無水物等を含む。さらなる実施態様では、反応基Ｙはチオール−反応基である。適切なチオール−反応基は、非重合性Ｍｉｃｈａｅｌ受容体、ハロアセチル基（例えばヨードアセチル）、ハロゲン化アルキル、マレイミド類、アジリジン類、アクリロイル基、ビニルスルホン類、ベンゾキノン類、フルオロベンゼン基のような求核置換を受けることができる芳香族基、並びにＥｌｌｍａｎ試薬で活性化された、ピリジルジスルフィド基等のジスルフィド基及びチオール類を含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２８】
本開示は数多くの例示的な実施態様を参照して記載してきたが、多くの他の修正及び実施態様が、本開示の原理の精神及び範囲内となる当該技術分野の当業者によって考案され得ることを理解されたい。より具体的には、合理的な変更及び修正は、本開示の精神から逸脱することなく、先述の開示、図面及び添付の特許請求の範囲の範囲内で、主題の組み合わせ構成の構成要素部分及び／又は配置において可能である。構成要素部分及び／又は構成における変更及び修正に加えて、代替的な使用もまた当業者には明らかであろう。
＜さらなる実施態様＞
［実施態様１］
第一の標的が第二の標的に近接しているかを決定するために試料を分析するための方法であって、
（ａ）試料を第二の非マスキング酵素−抗体コンジュゲートと接触させ、第二の標的−非マスキング酵素−抗体コンジュゲート複合体を形成すること；
（ｂ）試料を第一のケージドハプテン−抗体コンジュゲートと接触させ、第一の標的−ケージドハプテン−抗体コンジュゲート複合体を形成すること；
（ｃ）第一の標的−ケージドハプテン−抗体コンジュゲート複合体のケージドハプテンを非マスク化し、第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート複合体を形成すること；
（ｄ）試料を第一の検出試薬と接触させ、第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート複合体又は第一の標的を標識すること；及び
（ｅ）標識された第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート複合体又は標識された第一の標的を検出すること
を含み、
第一のケージドハプテン−抗体コンジュゲートが、式（ＩＶＣ）又は（ＩＶＤ）：
2019532275.tif 000007
［式中、
「抗体」は抗体であり；
「ハプテン」はハプテンであり；
Ａは、１から１５個の炭素原子を有し、Ｏ、Ｎ、若しくはＳからなる群より選択される一又は複数のヘテロ原子を有してもよい、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基を含む基であり；
Ｗは、５、６、又は７員の置換又は無置換の芳香族又は複素環式基であり；
Ｚは、結合であるか、又は、１から３０個の炭素原子を有し、Ｏ、Ｎ、若しくはＳからなる群より選択される一又は複数のヘテロ原子を有してもよい、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基を含む基であり、
各Ｒ１は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−Ｏ−メチル、−Ｏ−−エチル、−Ｏ−ｎ−プロピル、−Ｏ−−イソプロピル；−Ｏ−ｎ−ブチル、−Ｏ−ｓｅｃ−ブチル、又は−Ｏ−イソ−ブチル；１から４個の炭素原子を有する−Ｓ−アルキル基；１から４個の炭素原子を有する−Ｏ−アルキル基；１から４個の炭素原子を有する−Ｎ（Ｈ）−アルキル基；１から６個の炭素原子を有する−Ｎ−（アルキル）２基；１から４個の炭素原子を有し、Ｎ又はＳで置換されていてもよいアルキル基；シアノ基；及びカルボキシル基から独立して選択され；
Ｖは、結合、１から４個の炭素原子を有する置換若しくは無置換のアルキル基、又は置換若しくは無置換の−Ｏ−アルキル基であり；
Ｒ３は酵素基質であり；
ｎは１から２５の範囲の整数であり；
ｑは０又は１であり；
ｓは１から４の範囲の整数であり；且つ
ｔは０又は１である。］
の構造を有する、方法。
［実施態様２］
第一の検出試薬が（ｉ）第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体複合体を第一の酵素で標識するように第一の酵素にコンジュゲートしている二次抗体であって、第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体複合体の非マスク化ハプテンに特異的な二次抗体；及び（ｉｉ）第一の酵素の第一の基質を含む、実施態様１に記載の方法。
［実施態様３］
第一の基質が発色性基質又は蛍光性基質である、実施態様２に記載の方法。
［実施態様４］
第一の検出試薬が、第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート複合体の非マスク化酵素を複数の第一のレポーター部分で標識するための増幅成分を含む、実施態様１に記載の方法。
［実施態様５］
複数の第一のレポーター部分がハプテンである、実施態様４に記載の方法。
［実施態様６］
第一の検出試薬が、それぞれ第二のレポーター部分にコンジュゲートしている二次抗体であって、複数の第一のレポーター部分に特異的な二次抗体をさらに含む、実施態様５に記載の方法。
［実施態様７］
第二のレポーター部分が増幅酵素又はフルオロフォアからなる群より選択される、実施態様５に記載の方法。
［実施態様８］
第二のレポーター部分が増幅酵素であり、第一の検出試薬が増幅酵素の第一の発色性基質又は蛍光性基質をさらに含む、実施態様７に記載の方法。
［実施態様９］
試料を第二の標的−非マスキング酵素−抗体コンジュゲート複合体の非マスキング酵素に特異的な第二の基質と接触させることと、第二の基質と非マスキング酵素との間の反応の生成物に相当するシグナルを検出することとをさらに含む、実施態様１に記載の方法。
［実施態様１０］
第一の標的が第二の標的に近接しているかを決定するために試料を分析するための方法であって、
（ａ）試料を第二の非マスキング酵素−抗体コンジュゲートと接触させ、第二の標的−非マスキング酵素−抗体コンジュゲート複合体を形成すること；
（ｂ）試料を第一のケージドハプテン−抗体コンジュゲートと接触させ、第一の標的−ケージドハプテン−抗体コンジュゲート複合体を形成すること；
（ｃ）第一の標的−ケージドハプテン−抗体コンジュゲート複合体のケージドハプテンを非マスク化し、第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート複合体を形成すること；
（ｄ）シグナル増幅工程を実施し、第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート複合体を複数のレポーター部分で標識すること；及び
（ｅ）複数のレポーター部分を検出すること
を含み、
第一のケージドハプテン−抗体コンジュゲートが、式（ＩＶＣ）又は（ＩＶＤ）：
2019532275.tif 000008
［式中、
「抗体」は抗体であり；
「ハプテン」はハプテンであり；
Ａは、１から１５個の炭素原子を有し、Ｏ、Ｎ、若しくはＳからなる群より選択される一又は複数のヘテロ原子を有してもよい、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基を含む基であり；
Ｗは、５、６、又は７員の置換又は無置換の芳香族又は複素環式基であり；
Ｚは、結合であるか、又は、１から３０個の炭素原子を有し、Ｏ、Ｎ、若しくはＳからなる群より選択される一又は複数のヘテロ原子を有してもよい、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基を含む基であり、
各Ｒ１は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−Ｏ−メチル、−Ｏ−−エチル、−Ｏ−ｎ−プロピル、−Ｏ−−イソプロピル；−Ｏ−ｎ−ブチル、−Ｏ−ｓｅｃ−ブチル、又は−Ｏ−イソ−ブチル；１から４個の炭素原子を有する−Ｓ−アルキル基；１から４個の炭素原子を有する−Ｏ−アルキル基；１から４個の炭素原子を有する−Ｎ（Ｈ）−アルキル基；１から６個の炭素原子を有する−Ｎ−（アルキル）２基；１から４個の炭素原子を有し、Ｎ又はＳで置換されていてもよいアルキル基；シアノ基；及びカルボキシル基から独立して選択され；
Ｖは、結合、１から４個の炭素原子を有する置換若しくは無置換のアルキル基、又は置換若しくは無置換の−Ｏ−アルキル基であり；
Ｒ３は酵素基質であり；
ｎは１から２５の範囲の整数であり；
ｑは０又は１であり；
ｓは１から４の範囲の整数であり；且つ
ｔは０又は１である。］
の構造を有する、方法。
［実施態様１１］
複数のレポーター部分がハプテンであり、それぞれ第二のレポーター部分にコンジュゲートしている二次抗体であって、複数の第一のレポーター部分に特異的な二次抗体を導入することをさらに含む、実施態様１０に記載の方法。
［実施態様１２］
第二のレポーター部分が増幅酵素であり、増幅酵素の発色性基質又は蛍光性基質を導入することをさらに含む、実施態様１１に記載の方法。
［実施態様１３］
試料中の標的の総量を検出することをさらに含む、実施態様１０に記載の方法。
［実施態様１４］
第一の標的が第二の標的に近接しているかを決定するために試料を分析するための方法であって、
（ａ）試料を第二の非マスキング酵素−抗体コンジュゲートと接触させ、第二の標的−非マスキング酵素−抗体コンジュゲート複合体を形成すること；
（ｂ）試料を第一のケージドハプテン−抗体コンジュゲートと接触させ、第一の標的−ケージドハプテン−抗体コンジュゲート複合体を形成すること；
（ｃ）第二の標的−非マスキング酵素−抗体コンジュゲート複合体の非マスキング酵素が第一の標的−ケージドハプテン−抗体コンジュゲート複合体の酵素基質部分と反応するように、脱ケージ化工程を実施し、第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート複合体を形成すること；
（ｄ）試料を第一の検出試薬と接触させ、第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート複合体又は第一の標的を標識すること；及び
（ｅ）標識された第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート複合体又は標識された第一の標的を検出すること
を含み、
第一のケージドハプテン−抗体コンジュゲートが、式（ＩＶＣ）又は（ＩＶＤ）：
2019532275.tif 000009
［式中、
「抗体」は抗体であり；
「ハプテン」はハプテンであり；
Ａは、１から１５個の炭素原子を有し、Ｏ、Ｎ、若しくはＳからなる群より選択される一又は複数のヘテロ原子を有してもよい、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基を含む基であり；
Ｗは、５、６、又は７員の置換又は無置換の芳香族又は複素環式基であり；
Ｚは、結合であるか、又は、１から３０個の炭素原子を有し、Ｏ、Ｎ、若しくはＳからなる群より選択される一又は複数のヘテロ原子を有してもよい、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基を含む基であり、
各Ｒ１は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−Ｏ−メチル、−Ｏ−−エチル、−Ｏ−ｎ−プロピル、−Ｏ−−イソプロピル；−Ｏ−ｎ−ブチル、−Ｏ−ｓｅｃ−ブチル、又は−Ｏ−イソ−ブチル；１から４個の炭素原子を有する−Ｓ−アルキル基；１から４個の炭素原子を有する−Ｏ−アルキル基；１から４個の炭素原子を有する−Ｎ（Ｈ）−アルキル基；１から６個の炭素原子を有する−Ｎ−（アルキル）２基；１から４個の炭素原子を有し、Ｎ又はＳで置換されていてもよいアルキル基；シアノ基；及びカルボキシル基から独立して選択され；
Ｖは、結合、１から４個の炭素原子を有する置換若しくは無置換のアルキル基、又は置換若しくは無置換の−Ｏ−アルキル基であり；
Ｒ３は酵素基質であり；
ｎは１から２５の範囲の整数であり；
ｑは０又は１であり；
ｓは１から４の範囲の整数であり；且つ
ｔは０又は１である。］
の構造を有する、方法。
［実施態様１５］
脱ケージ化工程が試料の温度を変化させることを含む、実施態様１４に記載の方法。
［実施態様１６］
脱ケージ化工程が試料のｐＨを変更することを含む、実施態様１４に記載の方法。
［実施態様１７］
脱ケージ化工程が一又は複数の洗浄工程を導入することを含む、実施態様１４に記載の方法。
［実施態様１８］
脱ケージ化工程が非マスキング酵素の補助因子を添加することを含む、実施態様１４に記載の方法。
［実施態様１９］
試料中の標的の総量を検出することをさらに含む、実施態様１４に記載の方法。
［実施態様２０］
第一の標的が第二の標的に近接しているかを決定するために試料を分析するための方法であって、
（ａ）試料を第一の標的に特異的なケージドハプテン−抗体コンジュゲートと接触させ、第一の標的−ケージドハプテン−抗体コンジュゲート複合体を形成すること；
（ｂ）試料を第二の標的に特異的な非マスキング酵素−抗体コンジュゲートと接触させ、第二の標的−非マスキング酵素−抗体コンジュゲート複合体を形成することであって、非マスキング酵素−抗体コンジュゲートの非マスキング酵素がケージドハプテン−抗体コンジュゲートの酵素基質部分と反応することができるように選択され、第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート複合体を形成すること；
（ｃ）試料を第一の検出試薬と接触させ、第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート複合体又は第一の標的を標識すること；及び
（ｄ）標識された第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート複合体又は標識された第一の標的を検出すること
を含み、
第一のケージドハプテン−抗体コンジュゲートが、式（ＩＶＣ）又は（ＩＶＤ）：
2019532275.tif 000010
［式中、
「抗体」は抗体であり；
「ハプテン」はハプテンであり；
Ａは、１から１５個の炭素原子を有し、Ｏ、Ｎ、若しくはＳからなる群より選択される一又は複数のヘテロ原子を有してもよい、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基を含む基であり；
Ｗは、５、６、又は７員の置換又は無置換の芳香族又は複素環式基であり；
Ｚは、結合であるか、又は、１から３０個の炭素原子を有し、Ｏ、Ｎ、若しくはＳからなる群より選択される一又は複数のヘテロ原子を有してもよい、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基を含む基であり、
各Ｒ１は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−Ｏ−メチル、−Ｏ−−エチル、−Ｏ−ｎ−プロピル、−Ｏ−−イソプロピル；−Ｏ−ｎ−ブチル、−Ｏ−ｓｅｃ−ブチル、又は−Ｏ−イソ−ブチル；１から４個の炭素原子を有する−Ｓ−アルキル基；１から４個の炭素原子を有する−Ｏ−アルキル基；１から４個の炭素原子を有する−Ｎ（Ｈ）−アルキル基；１から６個の炭素原子を有する−Ｎ−（アルキル）２基；１から４個の炭素原子を有し、Ｎ又はＳで置換されていてもよいアルキル基；シアノ基；及びカルボキシル基から独立して選択され；
Ｖは、結合、１から４個の炭素原子を有する置換若しくは無置換のアルキル基、又は置換若しくは無置換の−Ｏ−アルキル基であり；
Ｒ３は酵素基質であり；
ｎは１から２５の範囲の整数であり；
ｑは０又は１であり；
ｓは１から４の範囲の整数であり；且つ
ｔは０又は１である。］
の構造を有する、方法。
［実施態様２１］
ケージドハプテン−抗体コンジュゲートのケージドハプテン部分が、ＤＣＣ、ビオチン、ニトロピラゾール、チアゾールスルホンアミド、ベンゾフラザン、及び２−ヒドロキシキノキサリンからなる群より選択されるハプテンに由来する、実施態様２０に記載の方法。
［実施態様２２］
非マスキング酵素−抗体コンジュゲートの非マスキング酵素が、アルカリホスファターゼ、Ｂ−グルコシダーゼ、Ｂ−ガラクトシダーゼ、Ｂ−グルクロニダーゼ、リパーゼ、スルファターゼ、アミダーゼ、プロテアーゼ、ニトロレダクターゼ、ベータ−ラクタマーゼ＆ノイラミニダーゼ、及びウレアーゼからなる群より選択される、実施態様２０に記載の方法。
［実施態様２３］
第一の検出試薬が（ｉ）第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体複合体を第一の酵素で標識するように第一の酵素にコンジュゲートしている二次抗体であって、第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体複合体の非マスク化ハプテンに特異的な二次抗体；及び（ｉｉ）第一の発色性基質又は蛍光性基質を含む、実施態様２０に記載の方法。
［実施態様２４］
第一の酵素が非マスキング酵素とは異なる、実施態様２３に記載の方法。
［実施態様２５］
第一の酵素がペルオキシダーゼである、実施態様２４に記載の方法。
［実施態様２６］
第一の発色性基質が、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、ＨＲＰ−Ｓｉｌｖｅｒ、及びチラミド−色素原からなる群より選択される、実施態様２３に記載の方法。
［実施態様２７］
試料を第二の標的−非マスキング酵素−抗体コンジュゲート複合体の非マスキング酵素に特異的な第二の発色性基質又は蛍光性基質と接触させることをさらに含み、第一の発色性基質と第二の発色性基質が異なる、実施態様２６に記載の方法。
［実施態様２８］
第一の検出試薬が、第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート複合体に導入される標識の数を増幅させるための成分を含む、実施態様２０に記載の方法。
［実施態様２９］
第一の標的がＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１の一方であり、第二の標的がＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１のもう一方である、実施態様２０に記載の方法。
［実施態様３０］
第一の標的が第二の標的に近接しているかを決定するために試料を分析するための方法であって、
（ａ）試料をケージドハプテン−抗体コンジュゲート又は非マスキング酵素−抗体コンジュゲートの一方を含む第一の検出プローブと接触させること；
（ｂ）試料をケージドハプテン−抗体コンジュゲート又は非マスキング酵素−抗体コンジュゲートのもう一方を含む第二の検出プローブと接触させること；
（ｃ）試料を少なくとも第一の検出試薬と接触させ、形成された非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート標的複合体を標識すること；及び
（ｄ）標識された非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート標的複合体からシグナルを検出すること
を含み、
第一のケージドハプテン−抗体コンジュゲートが、式（ＩＶＣ）又は（ＩＶＤ）：
2019532275.tif 000011
［式中、
「抗体」は抗体であり；
「ハプテン」はハプテンであり；
Ａは、１から１５個の炭素原子を有し、Ｏ、Ｎ、若しくはＳからなる群より選択される一又は複数のヘテロ原子を有してもよい、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基を含む基であり；
Ｗは、５、６、又は７員の置換又は無置換の芳香族又は複素環式基であり；
Ｚは、結合であるか、又は、１から３０個の炭素原子を有し、Ｏ、Ｎ、若しくはＳからなる群より選択される一又は複数のヘテロ原子を有してもよい、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基を含む基であり、
各Ｒ１は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−Ｏ−メチル、−Ｏ−−エチル、−Ｏ−ｎ−プロピル、−Ｏ−−イソプロピル；−Ｏ−ｎ−ブチル、−Ｏ−ｓｅｃ−ブチル、又は−Ｏ−イソ−ブチル；１から４個の炭素原子を有する−Ｓ−アルキル基；１から４個の炭素原子を有する−Ｏ−アルキル基；１から４個の炭素原子を有する−Ｎ（Ｈ）−アルキル基；１から６個の炭素原子を有する−Ｎ−（アルキル）２基；１から４個の炭素原子を有し、Ｎ又はＳで置換されていてもよいアルキル基；シアノ基；及びカルボキシル基から独立して選択され；
Ｖは、結合、１から４個の炭素原子を有する置換若しくは無置換のアルキル基、又は置換若しくは無置換の−Ｏ−アルキル基であり；
Ｒ３は酵素基質であり；
ｎは１から２５の範囲の整数であり；
ｑは０又は１であり；
ｓは１から４の範囲の整数であり；且つ
ｔは０又は１である。］
の構造を有する、方法。
［実施態様３１］
試料中の標的の総量を検出する工程をさらに含む、実施態様３０に記載の方法。
［実施態様３２］
第一の検出試薬が、第一の標的−非マスク化ハプテン−抗体コンジュゲート複合体の非マスク化酵素を複数の第一のレポーター部分で標識するための増幅成分を含む、実施態様３０に記載の方法。
［実施態様３３］
複数の第一のレポーター部分がハプテンである、実施態様３２に記載の方法。
［実施態様３４］
第一の検出試薬が、それぞれ第二のレポーター部分にコンジュゲートしている二次抗体であって、複数の第一のレポーター部分に特異的な二次抗体をさらに含む、実施態様３３に記載の方法。
［実施態様３５］
第二のレポーター部分が増幅酵素又はフルオロフォアからなる群より選択される、実施態様３４に記載の方法。
［実施態様３６］
第二のレポーター部分が増幅酵素であり、第一の検出試薬が増幅酵素の第一の発色性基質又は蛍光性基質をさらに含む、実施態様３４に記載の方法。
［実施態様３７］
脱ケージ化工程をさらに含む、実施態様３０に記載の方法。
［実施態様３８］
式（ＩＥ）又は（ＩＦ）：
2019532275.tif 000012
［式中、
「ハプテン」はハプテンであり；
Ｙは、カルボニル反応基、アミン反応基又はチオール反応基から選択され；
Ａは、１から１５個の炭素原子を有し、Ｏ、Ｎ、若しくはＳからなる群より選択される一又は複数のヘテロ原子を有してもよい、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基を含む基であり；
Ｘは、結合であるか、又は、１から３０個の炭素原子を有し、Ｏ、Ｎ、若しくはＳからなる群より選択される一又は複数のヘテロ原子を有してもよい、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基を含む基であり；
Ｗは、５、６、又は７員の置換又は無置換の芳香族又は複素環式基であり；
各Ｒ１は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−Ｏ−メチル、−Ｏ−−エチル、−Ｏ−ｎ−プロピル、−Ｏ−−イソプロピル；−Ｏ−ｎ−ブチル、−Ｏ−ｓｅｃ−ブチル、又は−Ｏ−イソ−ブチル；１から４個の炭素原子を有する−Ｓ−アルキル基；１から４個の炭素原子を有する−Ｏ−アルキル基；１から４個の炭素原子を有する−Ｎ（Ｈ）−アルキル基；１から６個の炭素原子を有する−Ｎ−（アルキル）２基；１から４個の炭素原子を有し、Ｎ又はＳで置換されていてもよいアルキル基；シアノ基；及びカルボキシル基から独立して選択され；
Ｖは、結合、１から４個の炭素原子を有する置換若しくは無置換のアルキル基、又は置換若しくは無置換の−Ｏ−アルキル基であり；
Ｒ３は酵素基質であり；
ｑは０又は１であり；
ｓは０、又は１から４の範囲の整数であり；且つ
ｔは０又は１である。］
を有するケージドハプテン。
［実施態様３９］
酵素基質が、リン酸基、エステル基、アミド基、硫酸基、グリコシド基、尿素基及びニトロ基からなる群より選択される、実施態様３８に記載のケージドハプテン。
［実施態様４０］
各Ｒ１基が異なる、実施態様３８に記載のケージドハプテン。
［実施態様４１］
Ｘが式（ＩＩＩＡ）：
2019532275.tif 000013
［式中、ｄ及びｅは、各々独立して４から１８の範囲の整数であり；Ｑは、結合、Ｏ、Ｓ又はＮ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり；Ｒａ及びＲｂは、独立してＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキル基、Ｆ、Ｃｌ又はＮ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり；Ｒｃ及びＲｄは、独立してＣＨ３又はＨである。］の構造を有する、実施態様３８に記載のケージドハプテン。いくつかの実施態様では、ｄ及びｅは、各々独立して１から２４の範囲の整数である。
［実施態様４２］
ｔが１であり、Ｖが−ＣＨ２−である、実施態様３８に記載のケージドハプテン。
［実施態様４３］
ｔが１であり、Ｖが−Ｏ−ＣＨ２−である、実施態様３８に記載のケージドハプテン。
［実施態様４４］
ｔが１であり、Ｖが−Ｃ（Ｒ３）２［式中、Ｒ３はＣ１−Ｃ４アルキル基である。］である、実施態様３８に記載のケージドハプテン。
［実施態様４５］
ｔが１であり、Ｖが−Ｏ−Ｃ（Ｒ３）２［式中、Ｒ３はＣ１−Ｃ４アルキル基である。］である、実施態様３８に記載のケージドハプテン。
［実施態様４６］
ｓが２であり、Ｒ１が−Ｏ−ＣＨ３−であり、ｔが１であり、Ｖが−ＣＨ２−である、実施態様３８に記載のケージドハプテン。