【手続補正書】
【提出日】令和2年2月17日(2020.2.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、男性に由来する精子試料を受精能獲得条件に曝露するステップと；
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を、少なくとも０．５時間、固定剤で固定するステップと；
前記固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を、ＧＭ１局在パターンのための標識分子で処理するステップであって、前記標識分子が検出可能な標識を有する、ステップと；
前記標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料における２つ以上の標識されたＧＭ１局在パターンを特定するステップであって、前記標識されたＧＭ１局在パターンが、先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターン、先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、先体後方細胞膜（ＰＡＰＭ）のＧＭ１局在パターン、先体頂部／先体後方（ＡＡ／ＰＡ）のＧＭ１局在パターン、中間（ＩＮＴＥＲ）のＧＭ１局在パターン、赤道セグメント（ＥＳ）のＧＭ１局在パターン、および散在性（ＤＩＦＦ）のＧＭ１局在パターンからなる群より選択される、ステップと；
前記先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターンおよび前記先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターンを、受精能を獲得した状態に割り当て、（ｉ）前記獲得状態に割り当てられた、標識されたＧＭ１局在パターンの数と、（ｉｉ）標識されたＧＭ１局在パターンの総数との比に対応する受精能の閾値を決定するステップと；
前記受精能の閾値を、基準値と比較するステップと
を含み、前記比較に基づき、前記男性の受精能状態が示される、方法。
【請求項２】
前記受精能の閾値が、
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率であり、
［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の前記基準値が、公知の受精能を有する集団の分布統計に基づき、（ｉ）基準値の１標準偏差下である百分率より大きい受精能の閾値は、受精能があることを示し；（ｉｉ）前記基準値の１標準偏差下である百分率未満であり、かつ前記基準値の２標準偏差下である百分率より大きい受精能の閾値は、受精能が低いことを示し；（ｉｉｉ）前記基準値の２標準偏差下である百分率未満である受精能の閾値は、不妊であることを示す、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＧＭ１局在パターンの比を、公知の受精能状態を有する男性に対するＧＭ１局在パターンの比と比較するステップ
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記比較するステップが、
所定数の、前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する各標識されたＧＭ１局在パターンの数を決定するステップと、
標識されたＧＭ１局在パターンの総数の合計に対する、ＡＡのＧＭ１局在パターンの数とＡＰＭのＧＭ１局在パターンの数の合計の比を計算するステップと
を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記受精能獲得条件が、重炭酸イオン、カルシウムイオン、およびステロール流出メディエーターのうちの１つまたは複数への曝露を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ステロール流出メディエーターが、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、血清アルブミン、高密度リポタンパク質、リン脂質小胞、胎仔臍帯血清限外濾過液、脂肪酸結合タンパク質、またはリポソームである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ステロール流出メディエーターが、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリンである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記公知の受精能状態が、受精能を有する男性に対応する、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記公知の受精能状態が、不妊男性に対応する、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記固定剤が、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＧＭ１局在パターンのための前記標識分子が、蛍光標識されたコレラ毒素ｂサブユニットである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記特定するステップが、前記曝露するステップの２〜２４時間後に実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記曝露するステップの前に、非金属材料から作製されたワイドオリフィスピペットを使用し、精子膜に損傷を与えない試薬を使用して、精液試料を処理して、精液の粘度を低下させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件に曝露され、少なくとも０．５時間、固定剤で固定され、かつＧＭ１局在パターンのための標識分子で染色された、男性に由来する精子試料の第１の部分を得るステップであって、前記標識分子が検出可能な標識を有する、ステップと；
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する２つ以上の標識されたＧＭ１局在パターンを特定するステップであって、前記ＧＭ１局在パターンが、先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターン、先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、先体後方細胞膜（ＰＡＰＭ）のＧＭ１局在パターン、先体頂部／先体後方（ＡＡ／ＰＡ）のＧＭ１局在パターン、中間（ＩＮＴＥＲ）のＧＭ１局在パターン、赤道セグメント（ＥＳ）のＧＭ１局在パターン、および散在性（ＤＩＦＦ）のＧＭ１局在パターンからなる群より選択される、ステップと；
前記先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターンおよび前記先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターンを、受精能を獲得した状態に割り当て、（ｉ）前記獲得状態に割り当てられた、標識されたＧＭ１局在パターンの数と、（ｉｉ）標識されたＧＭ１局在パターンの総数との比に対応する受精能の閾値を決定するステップと；
前記受精能の閾値を、基準値と比較するステップと
を含み、前記比較に基づき、前記男性の受精能状態が示される、方法。
【請求項１５】
前記受精能の閾値が、
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率であり、
［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の前記基準値が、公知の受精能を有する集団の分布統計に基づき、（ｉ）基準値の１標準偏差下である百分率より大きい受精能の閾値は、受精能がある受精能状態を示し；（ｉｉ）前記基準値の１標準偏差下である百分率未満であり、かつ前記基準値の２標準偏差下である百分率より大きい受精能の閾値は、受精能が低い受精能状態を示し；（ｉｉｉ）前記基準値の２標準偏差下である百分率未満である受精能の閾値は、不妊の受精能状態を示す、
請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＧＭ１局在パターンの比を、公知の受精能状態を有する男性に対するＧＭ１局在パターンの比と比較するステップ
をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記比較するステップが、
所定数の、前記標識され、固定された受精能を獲得した精子試料に対する各標識されたＧＭ１局在パターンの数を決定するステップと、
標識されたＧＭ１局在パターンの総数の合計に対する、ＡＡのＧＭ１局在パターンの数とＡＰＭのＧＭ１局在パターンの数の合計の比を計算するステップと
を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記受精能獲得条件が、重炭酸イオン、カルシウムイオン、およびステロール流出メディエーターのうちの１つまたは複数への曝露を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記ステロール流出メディエーターが、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、血清アルブミン、高密度リポタンパク質、リン脂質小胞、胎仔臍帯血清限外濾過液、脂肪酸結合タンパク質、またはリポソームである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ステロール流出メディエーターが、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記公知の受精能状態が、受精能を有する男性に対応する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記公知の受精能状態が、不妊男性に対応する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記固定剤が、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
ＧＭ１局在パターンのための前記標識分子が、蛍光標識されたコレラ毒素ｂサブユニットである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
前記特定するステップが、前記曝露するステップの２〜２４時間後に実施される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２６】
前記得るステップの前に、非金属材料から作製されたワイドオリフィスピペットを使用し、精子膜に損傷を与えない試薬を使用して、精液試料を処理して、精液の粘度を低下させるステップをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３７】
本開示を１つまたは複数の特定の実施形態に関して説明したが、本開示の他の実施形態が、本開示の精神および範囲を逸脱することなくなされ得、このような他の実施形態が本開示の範囲内であると意図されていることが理解されるであろう。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
男性に由来する精子試料の第１の部分を非受精能獲得条件に曝露して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料を得るステップと；
前記精子試料の第２の部分を受精能獲得条件に曝露して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を得るステップと；
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料および前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を、少なくとも１時間の期間、固定剤でそれぞれ固定するステップと；
前記固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料および前記固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を、ＧＭ１局在パターンのための標識分子でそれぞれ処理するステップであって、前記標識分子が検出可能な標識を有する、ステップと；
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料および前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する２つ以上の標識されたＧＭ１局在パターンを特定するステップであって、前記標識されたＧＭ１局在パターンが、先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターン、先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、および全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンである、ステップと；
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料に対する前記標識されたＧＭ１局在パターンを、前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する前記標識されたＧＭ１局在パターンと比較するステップと；
前記比較に基づいて、前記先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターンおよび前記先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターンを、受精能を獲得した状態に割り当て、前記Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンおよび前記全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンを、受精能を獲得していない状態に割り当てるステップと；
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料および前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対して、前記特定され、標識されたＧＭ１局在パターンに基づいて、前記男性の受精能状態を特徴付けるステップと
を含む、方法。
（項目２）
前記特徴付けるステップが、
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率に関連する受精能の閾値を決定するステップであって、
公知の受精能を有する集団の分布統計に基づく［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率が、以下に対応する：基準平均百分率の１標準偏差下である百分率より大きいと受精能があることを示し；前記基準平均百分率の１標準偏差下である百分率未満であり、かつ前記基準平均百分率の２標準偏差下である百分率より大きいと受精能が低いことを示し；前記基準平均百分率の２標準偏差下である百分率未満であると不妊であることを示す、ステップと；
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の前記百分率を、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の前記基準百分率と比較するステップと；
前記受精能の閾値を、前記比較に基づいて特定するステップと
を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記特徴付けるステップが、
所定数の、前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料に対する各標識されたＧＭ１局在パターンの数を決定するステップと；
所定数の、前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する各標識されたＧＭ１局在パターンの数を決定するステップと；
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料に対する標識されたＧＭ１局在パターンの総数の合計に対する、ＡＡのＧＭ１局在パターンの数とＡＰＭのＧＭ１局在パターンの数の合計の比を計算するステップと；
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する標識されたＧＭ１局在パターンの総数の合計に対する、ＡＡのＧＭ１局在パターンの数とＡＰＭのＧＭ１局在パターンの数の合計の比を計算するステップと
をさらに含む、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記２つ以上の標識されたＧＭ１局在パターンが、ＡＡのＧＭ１局在パターン、ＡＰＭのＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、中間（ＩＮＴＥＲ）のＧＭ１局在パターン、先体後方細胞膜（ＰＡＰＭ）のＧＭ１局在パターン、先体頂部／先体後方（ＡＡ／ＰＡ）のＧＭ１局在パターン、赤道セグメント（ＥＳ）のＧＭ１局在パターン、および散在性（ＤＩＦＦ）のＧＭ１局在パターンを含む、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記受精能獲得条件が、重炭酸イオン、カルシウムイオン、およびステロール流出メディエーターのうちの１つまたは複数への曝露を含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記ステロール流出メディエーターが、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、血清アルブミン、高密度リポタンパク質、リン脂質小胞、胎仔臍帯血清限外濾過液、脂肪酸結合タンパク質、またはリポソームである、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記ステロール流出メディエーターが、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリンである、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記非受精能獲得条件が、重炭酸イオン、カルシウムイオン、およびステロール流出メディエーターのうちの１つまたは複数への曝露の欠如を含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記固定剤が、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはそれらの組み合わせを含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記２つ以上の標識されたＧＭ１局在パターンのための前記標識分子が、蛍光標識されたコレラ毒素ｂサブユニットである、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記特定するステップが、前記曝露するステップの２〜２４時間後に実施される、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記精子試料の前記第１の部分を非受精能獲得条件に曝露することと前記精子試料の前記第２の部分を受精能獲得条件に曝露することとが同時に起こる、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子の比を、公知の受精能状態を有する、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子の比と比較するステップと；
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子の比を、公知の受精能状態を有する、標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子の比と比較するステップと
をさらに含む、項目３に記載の方法。
（項目１４）
前記曝露するステップの前に、非金属材料から作製されたワイドオリフィスピペットを使用し、精子膜に損傷を与えない試薬を使用して、精液試料を処理して、精液の粘度を低下させるステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１５）
男性の受精能状態を特定するためのキットであって、
受精能を獲得した精子の１つまたは複数のＧＭ１局在パターンと受精能を獲得していない精子の１つまたは複数のＧＭ１局在パターンとを示す図であって、前記受精能を獲得した精子のＧＭ１局在パターンと前記受精能を獲得していない精子のＧＭ１局在パターンが公知の受精能状態を反映する、図と；
精子膜のせん断を妨げるのに十分な直径サイズのオリフィスを有するワイドオリフィスピペットと；
以下：受精能獲得培地、非受精能獲得培地、固定剤組成物、ＧＭ１局在パターンを決定するための標識試薬のうちの１つまたは複数とを含み、
但し、前記組成物は精子膜に損傷を与えず、前記受精能獲得培地および前記非受精能獲得培地は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで精子細胞に適用される場合、前記図に反映されるように、受精能を獲得した精子を示すＧＭ１局在パターンおよび受精能を獲得していない精子を示すパターンを生じる、キット。
（項目１６）
前記ワイドオリフィスピペットが、少なくとも１８ゲージのオリフィスサイズを有する、項目１５に記載のキット。
（項目１７）
前記ワイドオリフィスピペットが、非金属材料から作製されている、項目１５および１６のいずれかに記載のキット。
（項目１８）
精子膜に損傷を与える可能性のある試薬が、（ｉ）プロテアーゼ、（ｉｉ）ヌクレアーゼ、（ｉｉｉ）粘液溶解剤、（ｉｖ）リパーゼ、（ｖ）エステラーゼ、および（ｖｉ）グリコシドヒドロラーゼからなる群より選択される、項目１５から１７のいずれかに記載のキット。
（項目１９）
前記精子膜に損傷を与えるのを避けるために精子の取り扱いのための指示をさらに含む、項目１５から１８のいずれかに記載のキット。
（項目２０）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの非受精能獲得条件に曝露され、少なくとも１時間、固定剤で固定され、かつＧＭ１局在パターンのための標識分子で処理された、男性に由来する精子試料の第１の部分を得るステップであって、前記標識分子が検出可能な標識を有する、ステップと；
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件に曝露され、固定剤で固定され、かつＧＭ１局在パターンのための前記標識分子で処理された、前記精子試料の第２の部分を得るステップと；
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料および前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する２つ以上の標識されたＧＭ１局在パターンを特定するステップであって、前記標識されたＧＭ１局在パターンが、先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターン、先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、および全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンである、ステップと；
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料に対する前記標識されたＧＭ１局在パターンを、前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する前記標識されたＧＭ１局在パターンと比較するステップと；
前記比較に基づいて、前記先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターンおよび前記先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターンを、受精能を獲得した状態に割り当て、前記Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンおよび前記全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンを、受精能を獲得していない状態に割り当てるステップと；
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料および前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対して、前記特定され、標識されたＧＭ１局在パターンに基づいて、前記男性の受精能状態を特徴付けるステップと
を含む、方法。
（項目２１）
前記特徴付けるステップが、
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率に関連する受精能の閾値を決定するステップであって、
公知の受精能を有する集団の分布統計に基づく［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率が、以下に対応する：基準平均百分率の１標準偏差下である百分率より大きいと受精能があることを示し；前記基準平均百分率の１標準偏差下である百分率未満であり、かつ前記基準平均百分率の２標準偏差下である百分率より大きいと受精能が低いことを示し；前記基準平均百分率の２標準偏差下である百分率未満であると不妊であることを示す、ステップと；
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の前記百分率を、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の前記基準百分率と比較するステップと
前記受精能の閾値を、前記比較に基づいて特定するステップと
を含む、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記特徴付けるステップが、
所定数の、前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料および前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する各標識されたＧＭ１局在パターンの数を決定するステップと；
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料および前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料のそれぞれに対するＧＭ１局在パターンの総数の合計に対する、ＡＡのＧＭ１局在パターンの数とＡＰＭのＧＭ１局在パターンの数の合計の比を計算するステップと
を含む、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
前記特徴付けるステップが、
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料の比を、公知の受精能状態を有する男性に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子のＧＭ１局在パターンの比と比較するステップと；
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子試料の比を、公知の受精能状態を有する男性に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得していない精子のＧＭ１局在パターンの比と比較するステップと
をさらに含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記公知の受精能状態が、受精能を有する、受精能を有さない、およびそれらの組み合わせを含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記２つ以上の標識されたＧＭ１局在パターンが、ＡＡのＧＭ１局在パターン、ＡＰＭのＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、中間（ＩＮＴＥＲ）のＧＭ１局在パターン、先体後方細胞膜（ＰＡＰＭ）のＧＭ１局在パターン、先体頂部／先体後方（ＡＡ／ＰＡ）のＧＭ１局在パターン、赤道セグメント（ＥＳ）のＧＭ１局在パターン、および散在性（ＤＩＦＦ）のＧＭ１局在パターンである、項目２０に記載の方法。
（項目２６）
前記受精能獲得条件が、重炭酸イオン、カルシウムイオン、およびステロール流出メディエーターのうちの１つまたは複数への曝露を含む、項目２０に記載の方法。
（項目２７）
前記ステロール流出メディエーターが、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、血清アルブミン、高密度リポタンパク質、リン脂質小胞、胎仔臍帯血清限外濾過液、脂肪酸結合タンパク質、またはリポソームである、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記ステロール流出メディエーターが、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリンである、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記非受精能獲得条件が、重炭酸イオン、カルシウムイオン、およびステロール流出メディエーターのうちの１つまたは複数への曝露の欠如を含む、項目２０に記載の方法。
（項目３０）
前記固定剤が、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはそれらの組み合わせを含む、項目２０に記載の方法。
（項目３１）
前記ＧＭ１局在パターンのための前記標識分子が、蛍光標識されたコレラ毒素ｂサブユニットである、項目２０に記載の方法。
（項目３２）
前記特定するステップが、前記曝露するステップの２〜２４時間後に実施される、項目２０に記載の方法。
（項目３３）
前記精子試料の前記第１の部分を非受精能獲得条件に曝露することと前記精子試料の前記第２の部分を受精能獲得条件に曝露することとが同時に起こる、項目２０に記載の方法。
（項目３４）
前記得るステップの前に、非金属材料から作製されたワイドオリフィスピペットを使用し、精子膜に損傷を与えない試薬を使用して、精液試料を処理して、精液の粘度を低下させるステップをさらに含む、項目２０に記載の方法。
（項目３５）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、男性に由来する精子試料を受精能獲得条件に曝露するステップと；
前記受精能を獲得した精子試料を、少なくとも１時間、固定剤で固定するステップと；
前記固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料を、ＧＭ１局在パターンのための標識分子で処理するステップであって、前記標識分子が検出可能な標識を有する、ステップと；
前記標識され、固定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する２つ以上の標識されたＧＭ１局在パターンを特定するステップであって、前記標識されたＧＭ１局在パターンが、先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターン、先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、および全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンである、ステップと；
前記先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターンおよび前記先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターンを、受精能を獲得した状態に割り当て、前記Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンおよび前記全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンを、受精能を獲得していない状態に割り当てるステップと；
前記男性の受精能状態を特徴付けるステップと
を含む、方法。
（項目３６）
前記特徴付けるステップが、
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率に関連する受精能の閾値を決定するステップであって、
公知の受精能を有する集団の分布統計に基づく［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率が、以下に対応する：基準平均百分率の１標準偏差下である百分率より大きいと受精能があることを示し；前記基準平均百分率の１標準偏差下である百分率未満であり、かつ前記基準平均百分率の２標準偏差下である百分率より大きいと受精能が低いことを示し；前記基準平均百分率の２標準偏差下である百分率未満であると不妊であることを示す、ステップと；
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の前記百分率を、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の前記基準百分率と比較するステップと
前記受精能の閾値を、前記比較に基づいて特定するステップと
を含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
ＧＭ１局在パターンの比を、公知の受精能状態を有する男性に対するＧＭ１局在パターンの比と比較するステップ
をさらに含む、項目３５に記載の方法。
（項目３８）
前記比較するステップが、
所定数の、前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する各標識されたＧＭ１局在パターンの数を決定するステップと、
標識されたＧＭ１局在パターンの総数の合計に対する、ＡＡのＧＭ１局在パターンの数とＡＰＭのＧＭ１局在パターンの数の合計の比を計算するステップと
を含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記２つ以上のＧＭ１局在パターンが、ＡＡのＧＭ１局在パターン、ＡＰＭのＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、中間（ＩＮＴＥＲ）のＧＭ１局在パターン、先体後方細胞膜（ＰＡＰＭ）のＧＭ１局在パターン、先体頂部／先体後方（ＡＡ／ＰＡ）のＧＭ１局在パターン、赤道セグメント（ＥＳ）のＧＭ１局在パターン、および散在性（ＤＩＦＦ）のＧＭ１局在パターンである、項目３５から３８のいずれかに記載の方法。
（項目４０）
前記受精能獲得条件が、重炭酸イオン、カルシウムイオン、およびステロール流出メディエーターのうちの１つまたは複数への曝露を含む、項目３５に記載の方法。
（項目４１）
前記ステロール流出メディエーターが、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、血清アルブミン、高密度リポタンパク質、リン脂質小胞、胎仔臍帯血清限外濾過液、脂肪酸結合タンパク質、またはリポソームである、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記ステロール流出メディエーターが、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリンである、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記公知の受精能状態が、受精能を有する男性に対応する、項目３７に記載の方法。
（項目４４）
前記公知の受精能状態が、不妊男性に対応する、項目３７に記載の方法。
（項目４５）
前記固定剤が、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはそれらの組み合わせを含む、項目３５に記載の方法。
（項目４６）
ＧＭ１局在パターンのための前記標識分子が、蛍光標識されたコレラ毒素ｂサブユニットである、項目３５に記載の方法。
（項目４７）
前記特定するステップが、前記曝露するステップの２〜２４時間後に実施される、項目３５に記載の方法。
（項目４８）
前記曝露するステップの前に、非金属材料から作製されたワイドオリフィスピペットを使用し、精子膜に損傷を与えない試薬を使用して、精液試料を処理して、精液の粘度を低下させるステップをさらに含む、項目３５に記載の方法。
（項目４９）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件に曝露され、少なくとも１時間、固定剤で固定され、かつＧＭ１局在パターンのための標識分子で染色された、男性に由来する精子試料の第１の部分を得るステップであって、前記標識分子が検出可能な標識を有する、ステップと；
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する２つ以上の標識されたＧＭ１局在パターンを特定するステップであって、前記ＧＭ１局在パターンが、先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターン、先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、および全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンである、ステップと；
前記先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターンおよび前記先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターンを、受精能を獲得した状態に割り当て、前記Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンおよび前記全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンを、受精能を獲得していない状態に割り当てるステップと；
前記男性の受精能状態を特徴付けるステップと
を含む、方法。
（項目５０）
前記特徴付けるステップが、
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率に関連する受精能の閾値を決定するステップであって、
公知の受精能を有する集団の分布統計に基づく［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率が、以下に対応する：基準平均百分率の１標準偏差下である百分率より大きいと受精能があることを示し；前記基準平均百分率の１標準偏差下である百分率未満であり、かつ前記基準平均百分率の２標準偏差下である百分率より大きいと受精能が低いことを示し；前記基準平均百分率の２標準偏差下である百分率未満であると不妊であることを示す、ステップと；
前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料に対する［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の前記百分率を、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の前記基準百分率と比較するステップと
前記受精能の閾値を、前記比較に基づいて特定するステップと
を含む、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
ＧＭ１局在パターンの比を、公知の受精能状態を有する男性に対するＧＭ１局在パターンの比と比較するステップ
をさらに含む、項目４９に記載の方法。
（項目５２）
前記比較するステップが、
所定数の、前記標識され、固定された受精能を獲得した精子試料に対する各標識されたＧＭ１局在パターンの数を決定するステップと、
標識されたＧＭ１局在パターンの総数の合計に対する、ＡＡのＧＭ１局在パターンの数とＡＰＭのＧＭ１局在パターンの数の合計の比を計算するステップと
を含む、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記２つ以上のＧＭ１局在パターンが、ＡＡのＧＭ１局在パターン、ＡＰＭのＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、中間（ＩＮＴＥＲ）のＧＭ１局在パターン、先体後方細胞膜（ＰＡＰＭ）のＧＭ１局在パターン、先体頂部／先体後方（ＡＡ／ＰＡ）のＧＭ１局在パターン、赤道セグメント（ＥＳ）のＧＭ１局在パターン、および散在性（ＤＩＦＦ）のＧＭ１局在パターンである、項目４９から５２のいずれかに記載の方法。
（項目５４）
前記受精能獲得条件が、重炭酸イオン、カルシウムイオン、およびステロール流出メディエーターのうちの１つまたは複数への曝露を含む、項目４９に記載の方法。
（項目５５）
前記ステロール流出メディエーターが、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、血清アルブミン、高密度リポタンパク質、リン脂質小胞、胎仔臍帯血清限外濾過液、脂肪酸結合タンパク質、またはリポソームである、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記ステロール流出メディエーターが、２−ヒドロキシ−プロピル−β−シクロデキストリンである、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記公知の受精能状態が、受精能を有する男性に対応する、項目５１に記載の方法。
（項目５８）
前記公知の受精能状態が、不妊男性に対応する、項目５１に記載の方法。
（項目５９）
前記固定剤が、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはそれらの組み合わせを含む、項目４９に記載の方法。
（項目６０）
ＧＭ１局在パターンのための前記標識分子が、蛍光標識されたコレラ毒素ｂサブユニットである、項目４９に記載の方法。
（項目６１）
前記特定するステップが、前記曝露するステップの２〜２４時間後に実施される、項目４９に記載の方法。
（項目６２）
前記得るステップの前に、非金属材料から作製されたワイドオリフィスピペットを使用し、精子膜に損傷を与えない試薬を使用して、精液試料を処理して、精液の粘度を低下させるステップをさらに含む、項目４９に記載の方法。
（項目６３）
精子試料を得るステップであって、前記精子試料の少なくとも一部が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子を得るためにｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精能獲得条件に曝露され、少なくとも１時間、固定剤に曝露され、かつＧＭ１に対して染色されている、ステップと；
前記精子試料の１つまたは複数の精液パラメータに対する値を得るステップと；
１つまたは複数の標識されたＧＭ１局在パターンに基づいて、前記標識され、固定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子試料のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅを決定するステップであって、前記標識されたＧＭ１局在パターンが、先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターン、先体後方細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、および全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンである、ステップと；
前記決定されたＣＡＰ−Ｓｃｏｒｅおよび前記１つまたは複数の得られた精液パラメータに基づいて、前記男性の受精能指数（ＭＦＩ）値を計算するステップと
を含む、方法。
（項目６４）
前記精子試料の前記１つまたは複数の精液パラメータが、元の精子試料の体積、精子濃度、精子の運動性、および精子の形態からなる群より選択される、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
前記Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅが、ＡＡのＧＭ１局在パターン、ＡＰＭのＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンおよび中間（ＩＮＴＥＲ）のＧＭ１局在パターン、先体後方細胞膜（ＰＡＰＭ）のＧＭ１局在パターン、先体頂部／先体後方（ＡＡ／ＰＡ）のＧＭ１局在パターン、赤道セグメント（ＥＳ）のＧＭ１局在パターン、ならびに散在性（ＤＩＦＦ）のＧＭ１局在パターンに基づく、項目６３に記載の方法。
（項目６６）
前記得るステップの前に、非金属材料から作製されたワイドオリフィスピペットを使用し、精子膜に損傷を与えない試薬を使用して、精液試料を処理して、精液の粘度を低下させるステップをさらに含む、項目６３に記載の方法。
（項目６７）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子細胞の試料を蛍光標識で処理するステップと；
蛍光標識されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子細胞と関連する１つまたは複数のＧＭ１局在パターンを示す、１つまたは複数の受精能を獲得した蛍光画像を得るステップと；
先体頂部（ＡＡ）のＧＭ１局在パターンおよび先体細胞膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在パターンを、前記受精能獲得蛍光画像において示された受精能を獲得した状態に割り当て、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターンおよび全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンを、前記受精能獲得蛍光画像において示された受精能を獲得していない状態に割り当てるステップと；
［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率を決定するために、前記受精能獲得蛍光画像で示された、前記蛍光標識されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子細胞に対するＡＡのＧＭ１局在パターン、ＡＰＭのＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、および全ての他の標識されたＧＭ１局在パターンを含むＧＭ１局在パターンの数を測定するステップと；
［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の百分率と関連する受精能の閾値を決定するステップであって；
公知の受精能を有する集団の分布統計に基づく［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の基準百分率が、以下に対応する：基準平均百分率の１標準偏差下である百分率より大きいと受精能があることを示し；前記基準平均百分率の１標準偏差下である百分率未満であり、かつ前記基準平均百分率の２標準偏差下である百分率より大きいと受精能が低いことを示し；前記基準平均百分率の２標準偏差下である百分率未満であると不妊であることを示す、ステップと；
［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の前記百分率を、［（ＡＡのＧＭ１局在パターン＋ＡＰＭのＧＭ１局在パターン）／全体のＧＭ１局在パターン］の前記基準百分率と比較するステップと；
前記受精能の閾値を、前記比較に基づいて特定するステップと
を含む、方法。
（項目６８）
前記特定するステップが、以下：患者の人口統計、女性パートナーの生殖状態、精子濃度、総運動性、直進運動性、精液の体積、精液のｐＨ、精液の粘度および／または精子の形態、ならびにそれらの組み合わせのうちの１つまたは複数にも基づく、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
２つ以上のＧＭ１局在パターンが、ＡＡのＧＭ１局在パターン、ＡＰＭのＧＭ１局在パターン、Ｌｉｎｅｄ−ＣｅｌｌのＧＭ１局在パターン、ＩＮＴＥＲのＧＭ１局在パターン、ＰＡＰＭのＧＭ１局在パターン、ＡＡ／ＰＡのＧＭ１局在パターン、ＥＳのＧＭ１局在パターン、およびＤＩＦＦのＧＭ１局在パターンを含む、項目６７に記載の方法。
（項目７０）
前記精子細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、少なくとも１時間、少なくとも３時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間の受精能獲得期間；０．５時間から３時間、３時間から１２時間、６時間から１２時間、３時間から２４時間、１２時間から２４時間、または１８時間から２４時間の間の範囲の受精能獲得期間、受精能獲得条件で処理される、項目６７に記載の方法。
（項目７１）
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精能を獲得した精子細胞が、少なくとも０．５時間、少なくとも３時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも３０時間、少なくとも３６時間、または少なくとも４８時間の固定期間、０．５時間から３時間、３時間から１２時間、６時間から１２時間、３時間から１８時間、６〜１８時間、６〜２４時間、１２時間から２４時間、１８時間から２４時間、１８〜３０時間、１８〜３６時間、２４〜３０時間、２４〜２６時間、１８〜４８時間、２４〜４８時間、または３６〜４８時間の間の範囲の固定期間、固定剤で処理される、項目６７に記載の方法。