(57)【要約】  中性やアルカリ性領域においても有効な食品の保存や殺菌・消毒等に用いられる抗菌剤として好適なMet−Ala−Gly−Phe−Leu−Lys−Val−Val−Gln−Leu−Leu−Ala−Lys−Tyr−Gly−Ser−Lys−Ala−Val−Gln−Trp−Ala−Trp−Ala−Asn−Lys−Gly−Lys−Ile−Leu−Asp−Trp−Leu−Asn−Ala−Gly−Gln−Ala−Ile−Asp−Trp−Val−Val−Ser−Lys−Ile−Lys−Gln−Ile−Leu−Gly−Ile−Lysアミノ酸配列から成る一次構造を有する新規な抗菌性ペプチド（バクテリオシン）が開示されている。新規なラクトコッカス・ラクティス菌株QU1005菌株（NITE BP-23）によって生産される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のアミノ酸配列：
Met−Ala−Gly−Phe−Leu−Lys−Val−Val−Gln−Leu−Leu−Ala−Lys−Tyr−Gly−Ser−Lys−Ala−Val−Gln−Trp−Ala−Trp−Ala−Asn−Lys−Gly−Lys−Ile−Leu−Asp−Trp−Leu−Asn−Ala−Gly−Gln−Ala−Ile−Asp−Trp−Val−Val−Ser−Lys−Ile−Lys−Gln−Ile−Leu−Gly−Ile−Lys
から成る一次構造を有することを特徴とする抗菌性ペプチド。
【請求項２】
請求項１のペプチドをコードすることを特徴とするDNA。
【請求項３】
請求項１の抗菌性ペプチドを産生するラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）QU 1005菌株（NITE  BP-23）。
【請求項４】
請求項１の抗菌性ペプチドを有効成分として含有することを特徴とする抗菌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な乳酸菌株と該菌株によって生産される新規な抗菌性ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌が生産する抗菌物質としては、乳酸などの有機酸、過酸化水素、ジアセチル等の低分子がすでに知られている。その他、ペプチドからなる抗菌物質（バクテリオシン）の存在も知られており、例えば、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）が生産するナイシンＡ（J. Am. Chem. Soc. 1971 Sep 8; 93(18): 4634-5）、ナイシンZ（Eur. J.
Biochem. 1991 Nov 1; 201(3): 581-4）などが挙げられている。ナイシンは乳酸菌由来で、ヒトの消化酵素により分解される、安全性の高い抗菌物質として、欧米を中心に広く食品保存剤として使用されている。しかし、ナイシンは酸性域では安定であるが、中性、アルカリ性域では不安定であるため、食品保存剤として利用できる食品が酸性、弱酸性のものに限られる。
また医療分野では、抗生物質の多用による多剤耐性菌の出現により、MRSAやVREなどの弱毒微生物による院内感染症が問題となっている。現在は主にエタノール製剤での殺菌・消毒が主であるが、高濃度のエタノールは手荒れの原因となり、その部分からの感染や、付着細菌の伝播が懸念されるため、高濃度のエタノール製剤に代わる殺菌・消毒薬が求められている。
【非特許文献１】J. Am. Chem. Soc. 1971 Sep 8; 93(18): 4634-5
【非特許文献２】Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1; 201(3): 581-4
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、従来から知られていない抗菌物質を生産し得る新規な乳酸菌を見出し、中性やアルカリ性領域においても有効な、食品の保存や、殺菌・消毒等に有用な技術を提供することにある。【０００４】
本発明者は乳酸菌が生産する抗菌物質に着目し研究を重ねた結果、バチルス（Bacillus）属、ミクロコッカス（Micrococcus）属、リステリア（Listeria）属、ペディオコッカス（Pediococcus）属、エンテロコッカス（Enterococcus）属、ラクトコッカス（Lactococcus）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属に属する、食品劣化の原因微生物に対して抗菌性を有する（すなわち、感受性グラム陽性細菌に対する阻害活性を有する）物質を生産する新規な乳酸菌株ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）を見出し、該抗菌性物質（ペプチド）の精製・同定、一次構造の解明、および諸性質の解明を行うことにより、本発明を導き出した。
かくして、本発明は、下記のアミノ酸配列（配列番号１）からなる一次構造を有する抗菌性ペプチドを提供するものである。なお、Ｎ末端のメチオニンはホルミル化されている。【０００５】
【化１】
2006033352.tif 000002
【０００６】
さらに、本発明に従えば、上記の抗菌性ペプチドを生産するラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）新規菌株、すなわちQU 1005菌株（受託番号：NITE BP-23）が提供される。
【発明の効果】
【０００７】
本発明に従えば、食品保存や抗菌・消毒などの目的に有用な抗菌剤の素材として好適な抗菌性ペプチドが提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の抗菌性ペプチド（ラクティシンＱ）をナイシンＺと比較したｐＨ安定性試験の結果を示す。
【図２】本発明の抗菌性ペプチド（ラクティシンＱ）をナイシンＺと比較した熱安定性試験の結果を示す。
【図３】本発明の抗菌性ペプチド（ラクティシンＱ）をナイシンＺと比較したエタノール安定性試験の結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明によって得られる抗菌性物質は、熊本県阿蘇市産のトウモロコシから分離されたラクトコッカス・ラクティス菌株によって生産される新規なペプチド（バクテリオシン）であり、従来知られているナイシンやラクトコッシンなどとは異なるアミノ酸配列から構成される新しいタイプのバクテリオシン類と考えられる。
以下、新規菌株の単離やその特性分析、該菌株からの抗菌性ペプチドの生産や精製、コードするDNAの配列の決定、および該ペプチドの諸性質の解明などに沿って本発明の実施の形態を詳細に説明する。【００１０】
（１）乳酸菌の単離方法
乳酸菌の天然野生株を取得するために、様々な食材を分離源として、乳酸菌選択性の高いMRS培地（OXOID社製）やM17（MERCK社製）培地、または滅菌蒸留水を用いて集積培養を行った。集積培養液から分離した菌を用いて抗菌活性を指標としたスクリーニングを行った。すなわち、MRS寒天培地にコロニーを増殖させた後、指標菌となる各種グラム陽性細菌（上記の食品劣化の原因微生物）の培養液を混釈した軟寒天培地を重層し、至適温度にて培養後、コロニー周辺に形成される指標菌の増殖阻止円が観察された菌株を単離した。【００１１】
（２）分離菌株の性質分析
スクリーニングの結果、優れた抗菌性を有する菌株を発見した。本菌株は、熊本県阿蘇市にて収穫されたトウモロコシから分離されたものである。グラム染色、カタラーゼ活性試験、運動性試験、細胞の形態観察、糖類発酵性試験、生産乳酸量、生産乳酸旋光性、グルコースからのガス発生テストについて調査した。菌株の特性は、通性嫌気性、グラム陽性、カタラーゼ陰性、運動性なし、細胞の形態は楕円双球菌、ホモ型発酵性菌であった。また、49種類の糖類発酵性テスト（APIシステム）を行った結果、本菌株は表１に示される糖類発酵性を示した。この結果より、本菌株をラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）であると同定し、これをLactococcus lactis QU 1005菌株と命名した。本QU
1005菌株は特許微生物寄託センターに寄託しており、受託番号はNITE BP-23（原寄託日２００４年９月１５日）である。【００１２】
【表１】
2006033352.tif 000003
【００１３】
16S rDNAシーケンス解析による菌株の同定
現在、微生物の系統分類の指標として最も広く用いられている方法が16S rRNAをコードする遺伝子の塩基配列（16S rDNA）である。QU 1005の系統分類学的位置を明確にするために16S rRNAをコードする遺伝子の塩基配列（16S rDNA）を決定し、データベースによる相同性検索を行った。すなわち、16S rDNAの約1.5 kbpのうち上流部分の約500bpについて検討を行った。
QU 1005菌株の培養液よりMagExtractor Kit -Genome-（TOYOBO社製）を用いて全ゲノムDNAを抽出した。これを鋳型として配列番号Ａに示すプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応により単一な増幅断片を得た。その後、増幅断片をpGEM-T cloning vector（プロメガ社製）にライゲーションし、このライゲーション産物を用いて、ヒートショック法によりE. coli JM109を形質転換した。形質転換体をLB培地で8時間培養後、MagExtractor-Plasmid（TOYOBO社製）を用い、プラスミドを抽出した。このプラスミドをシーケンス反応の鋳型とした。シーケンス反応にはThermo Sequence fluorescent labeled primer cycle
sequencing kit（ファルマシア社製）を使用した。
結果として、配列番号Ｂの塩基配列（ヌクレオチド配列）が得られた。配列番号Ｂの塩基配列のデータベースによる相同性検索を行った結果、Lactococcus lactisと100%の相同性を示した。【００１４】
【化２】
2006033352.tif 000004
【００１５】
【化３】
2006033352.tif 000005
【００１６】
（３）抗菌活性試験
QU 1005菌株により抗菌物質が液体培地中に生産されているか検討するため、MRS液体培地にて18時間培養後、遠心分離を行って得た培養液上清を回収した。1M NaOHを用いてpHを６に調整した後、濾過滅菌したものを試験サンプルとした。試験サンプルを２倍段階希釈し、抗菌活性試験に用いた。指標菌を混釈した軟寒天培地上に試験サンプルの段階希釈液を10μl滴下した。抗菌活性は輪郭の明瞭な増殖阻止円が観察された最大希釈倍率をXとし、X×1000/10（A.U./ml）として算出した。この結果、QU 1005菌株の培養液上清は表２に示される抗菌スペクトルを示した。QU 1005菌株によって生産される抗菌物質（抗菌性ペプチド）をここではラクティシンＱと称する。【００１７】
【表２】
2006033352.tif 000006
【００１８】
（４）抗菌物質の生産および精製方法
分離株QU 1005菌株をMRS培地にて前培養し、前培養液8mlを250mlのMRS培地に植菌した。30℃で12時間静置培養を行い、6000rpmで遠心分離後、上清を回収した。培養液上清（200ml）の指標菌Bacillus coagulans JCM 2257Tに対する活性は、2.56×106（A.U./ml）であった。培養液上清に対して３倍量（600ml）の冷却アセトンを添加し、１時間−30℃で冷却した後、6000rpmで遠心分離し、抗菌物質を沈殿回収した。回収した沈殿物を20mMのリン酸ナトリウムバッファー（pH 5.7）100mlに再溶解した。SP-セファロース陽イオン交換樹脂（ファルマシア社製）を16mlをカラムに充填し、再溶解したサンプル100mlを添加し、リン酸ナトリウムバッファーでカラムを平衡化した。流速2ml/分で0.25、0.5、0.75、1.0M NaCl含有リン酸ナトリウムバッファー（各40ml）を用いて段階的に分画溶出した。
それぞれの溶出画分の抗菌活性を測定した結果、最も活性の強かった0.25M NaCl溶出画分の活性は2.05×106（A.U./ml）であった。0.25M NaCl溶出液（40ml）を逆相HPLC（カラム：ファルマシア社製RESOURCE RPC 3ml）に供した。移動相には、0.1%トリフルオロ酢酸含有MilliQ水を用い、アセトニトリルの直線的濃度勾配（グラジエント20〜80%）、流速1ml/分、１画分あたり1mlで30分画した。検出器には紫外可視分光光度計（波長220、280nm）を使用した。30の分画サンプルの抗菌活性を測定し、活性の強かった画分を取得した。
このようにして得られた精製後の抗菌物質は表３に示される抗菌スペクトルを示した。既知のバクテリオシンであるナイシンＡと比較すると、ラクティシンQはEnteroocccus属に対して高い抗菌活性（小さいMIC（最小生育阻止濃度）値）が認められた。【００１９】
【表３】
2006033352.tif 000007
【００２０】
（５）ESI-TOF MS分析
上記のようにして精製した抗菌物質について、エレクトロスプレー飛行時間型質量分析計（ESI-TOF MS、日本電子社製）を用いて質量分析を行った。その結果、ラクティシンＱは質量5926の物質であることが明らかとなった。【００２１】
（６）Ｎ末端アミノ酸配列解析
上記のようにして精製した抗菌物質について、エドマン分解法を利用したアミノ酸シーケンサーを用い、Ｎ末端のアミノ酸分析を行った。結果として、エドマン分解は進行せず、アミノ酸の配列を得ることは出来なかった。【００２２】
（７）抗菌性ペプチドの臭化シアン処理
上記（６）にてエドマン分解が進行しなかったため、抗菌性ペプチドのＮ末端のメチオニン残基を切断する目的で、臭化シアン処理を行い、逆相HPLCにより再度精製を行った。精製したペプチドの質量分析を行った結果、5767の実測値が得られた。臭化シアン処理前後での質量の差である159はホルミルメチオニンの質量と一致していた。この結果より抗菌性ペプチドのＮ末端はホルミルメチオニンによりブロックされており、そのためエドマン分解が進行しなかったことが示された。
また、臭化シアン処理で得られたペプチドのＮ末端アミノ酸分析を上記と同様の方法で行った。結果として配列番号２に示す、ペプチドのＮ末端より50のアミノ酸残基が明らかとなった。得られたアミノ酸配列から推定される抗菌性ペプチドの質量を算出した結果、上記（５）の質量と一致しなかったことから、得られたアミノ酸配列が不十分であることが示唆された。【００２３】
【化４】
2006033352.tif 000008
【００２４】
（８）抗菌性ペプチドの構造遺伝子の決定
上記のようにして得られた抗菌性ペプチドのアミノ酸配列の一部より、ディジェネレートプライマーを構築し、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により抗菌ペプチドの構造遺伝子の取得を行った。QU 1005菌株から全ゲノムDNAをCTAB法により抽出し、これを鋳型としてＰＣＲに用いた。ネスティッドPCR法により単一な増幅断片を得た。
その後、増幅断片をpGEM-T cloning vector（プロメガ社製）にライゲーションし、このライゲーション産物を用いて、ヒートショック法によりE. coli JM109を形質転換した。形質転換体をLB培地で8時間培養後、MagExtractor-Plasmid（TOYOBO社製）を用い、プラスミドを抽出した。このプラスミドをシーケンス反応の鋳型とした。シーケンス反応にはThermo Sequence fluorescent labeled primer cycle
sequencing kit（ファルマシア社製）を使用した。
結果として、配列番号３の塩基配列（ヌクレオチド配列）が得られた。得られた塩基配列を転換して得られるアミノ酸配列は、配列番号２の10〜39残基目の配列と一致していた。【００２５】
【化５】
2006033352.tif 000009
【００２６】
さらに、ここで得られた塩基配列をもとに新たなプライマーを構築し、抗菌性ペプチドのＣ末端部分をコードする塩基配列の取得をアンカーPCR法により行った。すなわち、QU 1005菌株の全ゲノムDNAを制限酵素で消化し、同様にMCS（マルチクローニングサイト）を制限酵素処理したpUC18 cloning vectorにランダムにライゲーションした。このようにして得られたライゲーション産物を用いてネスティッドPCR法により単一の増幅断片を得た。得られたPCR増幅断片を上記と同様の方法で、E. coli JM109に形質転換し、シーケンス解析を行った。
結果として、配列番号４の塩基配列が得られた。得られた塩基配列を転換して得られるアミノ酸配列は、配列番号２の36〜50残基目の配列と一致していた。また、配列番号２の50番目のグリシン残基の後にイソロイシンとリジン残基の存在が確認され、その後にストップコドンが確認された。【００２７】
【化６】
2006033352.tif 000010
【００２８】
このようにして得られたアミノ酸塩基配列から推定される抗菌物質の分子量の理論値を算出（配列番号１の１残基目のメチオニンをホルミルメチオニンとして算出）したところ、5926となり、この理論値が（５）で得られた実測値と一致したことから、この抗菌物質が配列番号１で示される５３アミノ酸残基からなるペプチドであることが明らかとなった。【００２９】
（９）抗菌性ペプチドの諸性質の解明
（抗菌物質の生産および試験用サンプルの調製方法）
分離株QU 1005菌株および、ナイシンＺ生産菌株をグルコース、酵母エキス、炭酸カルシウムを含む基本培地にて培養した。培養液を遠心分離後、得られた培養液上清より、合成吸着剤を用いて、ラクティシンＱおよびナイシンＺを粗精製した。得られた粗精製サンプルを用いて以下の試験を行った。なお、HPLC分析において、ナイシン１ユニット（精製ナイシン25ng）と同じピークエリアを示す量を各バクテリオシンの１ユニットとした。【００３０】
ｐＨ安定性試験
粗精製したラクティシンＱとナイシンＺを、それぞれ4200ユニット/mlとなるように滅菌蒸留水を用いて調製した。N/5の塩酸、N/10の水酸化ナトリウムを用いてpHを3〜9に調整したサンプルを45℃で保存し、経時的に残存するラクティシンＱおよびナイシンＺの量をHPLCにて分析した。
結果を図１に示す。図１中、残存率は、残存率（％）＝（ｎ日経過後のバクテリオシン量／実験開始日（0日目）のバクテリオシン量）×100として求めたものである。結果として、pH7、pH9において、ナイシンＺは実験開始後５日目までにほぼ全てが分解されていたのに対し、ラクティシンＱは、そのような中性およびアルカリ性領域において47日経過後でも５〜８割程度が分解されずに残存していた。【００３１】
熱安定性試験
粗精製したラクティシンＱとナイシンＺを、それぞれ4200ユニット/mlとなるように滅菌蒸留水を用いて調製し、N/5の塩酸、N/10の水酸化ナトリウムを用いてpHを3〜9に調整した。サンプルを90℃ 30分間、あるいは110℃ 10分間で加熱処理し、加熱処理後に残存するラクティシンＱおよびナイシンＺの量をHPLCにて分析した。
結果を図２に示す。図２中、残存率は、残存率（％）＝（加熱処理後のバクテリオシン量／加熱処理前のバクテリオシン量）×100として求めたものである。結果として、pH7、pH9の中性〜アルカリ性域においてナイシンＺよりも高い熱安定性を示した。【００３２】
エタノール安定性試験
ラクティシンＱおよびナイシンＺの粗精製物を40%、50%、60％のエタノール溶液にそれぞれ4200ユニット/mlとなるように添加した。N/10の水酸化ナトリウムを用いてpH5に調整した各サンプルを45℃で保存し、経時的に残存するラクティシンＱおよびナイシンＺの量をHPLCにて分析した。
結果を図３に示す。図３中、残存率は、残存率（％）＝（ｎ日経過後のバクテリオシン量／実験開始日（0日目）のバクテリオシン量）×100として求めたものである。結果として、ナイシンＺは保存開始30日後に、すべてのサンプルで残存するナイシンＺ量が10%程度となっているのに対して、ラクティシンＱは50、60%エタノール中で50％程度、40％のエタノール中では70%が残存していた。この結果より、ラクティシンＱはナイシンＺに比べ、エタノール中での安定性に優れていることが示された。【００３３】
海外で実際に食品保存料として使用されているナイシンは、酸性では安定であるが、中性、アルカリ性域では不安定で、分解されやすいという性質を持つ。本発明の抗菌性ペプチド（ラクティシンＱ）は中性、アルカリ性域の安定性に優れているため、そのような食材の静菌効果が期待できる。また、ラクティシンＱはエタノールでの安定性にも優れているため、エタノールベースの抗菌剤の素材としても利用が可能である。そこで、以下に実施例を上げてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００３４】
食品保存性試験（卵焼きの保存性試験）
弱アルカリ性食材である卵焼きに対するラクティシンＱの静菌効果について、ナイシンＺとの比較検討を行った。
ラクティシンＱとナイシンＺの粗精製物（4200ユニット/mlとなるように滅菌蒸留水で調製）を使用し、表４の割合で材料を混合し、卵焼きを作成した。卵焼きを作成後、25℃で24時間保存し、保存後の一般生菌数を調べた。（バクテリオシン溶液の添加量は対卵1.5%とした。）【００３５】
【表４】
2006033352.tif 000011
結果を表５に示す。結果としてラクティシンＱを弱アルカリ性食材である卵焼きに添加した場合、ナイシンＺを添加した場合よりも一般生菌数を１オーダー程度低く抑えることができた。【００３６】
【表５】
2006033352.tif 000012
【実施例２】
【００３７】
エタノールベースラクティシンＱの抗菌活性試験
ラクティシンＱの粗精製サンプルを、終濃度が200μg/mlとなるように30%のエタノールに添加した。N/5の塩酸を用いてpHを3.5に調整した。30%のエタノール溶液、200μg/mlラクティシンＱ水溶液をコントロールとして、バイオアッセイにて抗菌活性を評価した。調製したサンプル200μlに指標菌の培養液（107CFU/ml）を20μl添加し、１分間接触させた。その後、指標菌と混合したサンプル100μlをSCDLP培地（栄研器材株式会社製）100μlと混合し、各指標菌の至適温度にて培養を行った。24、48、72時間後に指標菌の増殖の有無を目視で確認した。指標菌には大腸菌（Escherichia coli）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、リステリア菌（Listeria
innocua）を用いた。
結果を表６に示す。結果として、ラクティシンＱのみを含む水溶液では、指標菌に対して静菌効果を示さなかったが、ラクティシンＱを30%エタノールと組み合わせることにより、ブドウ球菌やリステリア菌、さらにはグラム陰性細菌である大腸菌に対しても、72時間以上の静菌効果を示した。また、この効果は30％エタノール単独使用よりも優れていた。
ラクティシンＱはEnterococcus属細菌に対する抗菌効果に優れているため、VREやMRSAといった院内感染の原因菌に対しても、抗菌効果を示すと考えられ、優れた抗菌剤の素材として期待できる。【００３８】
【表６】
2006033352.tif 000013
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明の新菌株およびそれにより生産される抗菌性ペプチドは、食品の保存や殺菌・消毒等の目的の抗菌剤の素材として多くの分野において利用することができ、特に、中性やアルカリ性領域において使用されても有効である。
【図１】
2006033352.tif 000014
【図２】
2006033352.tif 000015
【図３】
2006033352.tif 000016
【配列表】
2006033352000001.app
【国際調査報告】
2006033352.tif 000017
2006033352.tif 000018