(57)【要約】被覆対象である粒子を、その間に空間が形成された２枚の脂質膜で被覆することができる方法を提供することを目的とし、この目的を達成するために、正帯電性粒子を２枚の脂質膜で被覆する方法であって、前記正帯電性粒子に複数の負帯電性ＳＵＶ型リポソームを接触させ、前記正帯電性粒子と前記正帯電性粒子に静電的に結合した前記負帯電性ＳＵＶ型リポソームとを含む負帯電性複合体を形成させ、前記負帯電性複合体をカチオンで処理する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
正帯電性粒子を２枚の脂質膜で被覆する方法であって、
前記正帯電性粒子に複数の負帯電性ＳＵＶ型リポソームを接触させ、前記正帯電性粒子と前記正帯電性粒子に静電的に結合した前記負帯電性ＳＵＶ型リポソームとを含む負帯電性複合体を形成させ、前記負帯電性複合体をカチオンで処理することを特徴とする前記方法。
【請求項２】
前記正帯電性粒子が目的物質の凝集体であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記正帯電性粒子が正帯電性ｎ枚膜リポソーム（ｎは１以上の整数である。）であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記正帯電性粒子のゼータ電位が２０〜３０ｍＶであり、前記負帯電性ＳＵＶ型リポソームのゼータ電位が−２０〜−３０ｍＶであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記正帯電性粒子の粒径が５０ｎｍ以上であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
負帯電性粒子を２枚の脂質膜で被覆する方法であって、
前記負帯電性粒子に複数の正帯電性ＳＵＶ型リポソームを接触させ、前記負帯電性粒子と前記負帯電性粒子に静電的に結合した前記正帯電性ＳＵＶ型リポソームとを含む正帯電性複合体を形成させ、前記正帯電性複合体をアニオンで処理することを特徴とする前記方法。
【請求項７】
前記負帯電性粒子が目的物質の凝集体であることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記負帯電性粒子が負帯電性ｎ枚膜リポソーム（ｎは１以上の整数である。）であることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記負帯電性粒子のゼータ電位が−２０〜−３０ｍＶであり、前記正帯電性ＳＵＶ型リポソームのゼータ電位が２０〜３０ｍＶであることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項１０】
前記負帯電性粒子の粒径が５０ｎｍ以上であることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項１１】
正帯電性粒子を請求項１〜５のいずれかに記載の方法により２枚の脂質膜で被覆して得られるリポソーム。
【請求項１２】
負帯電性粒子を請求項６〜１０のいずれかに記載の方法により２枚の脂質膜で被覆して得られるリポソーム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、粒子を脂質膜で被覆する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  近年、薬物、核酸、ペプチド、タンパク質、糖等を標的部位に確実に送達するためのベクターの開発が盛んに行われている。例えば、遺伝子治療においては、目的の遺伝子を標的細胞へ導入するためのベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス等のウイルスベクターが開発されている。しかしながら、ウイルスベクターは、大量生産の困難性、抗原性、毒性等の問題があるため、このような問題点が少ないリポソームベクターが注目を集めている。リポソームベクターは、その表面に抗体、タンパク質、糖鎖等の機能性分子を導入することにより、標的部位に対する指向性を向上させることができるという利点も有している。【０００３】  リポソームの調製方法としては、例えば、脂質膜の単純水和法が知られている。脂質膜の単純水和法によれば、遺伝子等の目的物質の存在下、脂質膜を水和させることにより目的物質が封入された多重膜リポソームを調製することができる（非特許文献１）。こうして調製された多重膜リポソームに対して脂質膜の単純水和法を再度適用することにより、多重膜リポソームの外側にさらに新たな脂質膜を重層することができる。このように脂質膜の単純水和法を繰り返し行うことにより、多重膜リポソームに含まれる脂質膜の数を増加させることができる。
【非特許文献１】Ｋｏｇｕｒｅ等，「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ」，２００４年，９８巻，３１７−３２３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】  しかしながら、脂質膜の単純水和法等の従来の方法では、脂質膜が不均一に重層されるため、多重膜リポソームに含まれる脂質膜の数を制御することは困難であった。また、脂質膜の単純水和法等の従来の方法では、脂質膜が地層のように何層にも重ねられるだけであり、脂質膜の間に空間を形成させることは困難であった。【０００５】  そこで、本発明は、被覆対象である粒子を、その間に空間が形成された２枚の脂質膜で被覆することができる方法、及び該方法によって被覆対象である粒子を２枚の脂質膜で被覆して得られるリポソームを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】  本発明の第１の方法は、正帯電性粒子を２枚の脂質膜で被覆する方法であって、前記正帯電性粒子に複数の負帯電性ＳＵＶ型リポソームを接触させ、前記正帯電性粒子と前記正帯電性粒子に静電的に結合した前記負帯電性ＳＵＶ型リポソームとを含む負帯電性複合体を形成させ、前記負帯電性複合体をカチオンで処理することを特徴とする。【０００７】  本発明の第１の方法によれば、正帯電性粒子を、その間に空間が形成された２枚の脂質膜で被覆することができる。正帯電性粒子を本発明の第１の方法により被覆して得られるリポソームにおいて、正帯電性粒子を被覆する２枚の脂質膜（正帯電性粒子の外側に形成された第１の脂質膜及び第１の脂質膜の外側に形成された第２の脂質膜）の間には空間が形成されており、この空間には所望の物質を保持させることができる。【０００８】  本発明の第１の方法において、前記正帯電性粒子が目的物質の凝集体であることが好ましい。この場合、目的物質の凝集体が封入されており、目的物質の凝集体を被覆する２枚の脂質膜の間に空間が形成された２枚膜リポソームを作製することができる。【０００９】  本発明の第１の方法において、前記正帯電性粒子が正帯電性ｎ枚膜リポソーム（ｎは１以上の整数である。）であることが好ましい。この場合、正帯電性ｎ枚膜リポソームを被覆する２枚の脂質膜の間に空間が形成された（ｎ＋２）枚膜リポソームを作製することができる。【００１０】  本発明の第１の方法において、前記正帯電性粒子のゼータ電位が２０〜３０ｍＶであり、前記負帯電性ＳＵＶ型リポソームのゼータ電位が−２０〜−３０ｍＶであることが好ましい。この場合、正帯電性粒子と該正帯電性粒子に静電的に結合した複数の負帯電性ＳＵＶ型リポソームとを含む負帯電性複合体を効率よく形成させることができる。【００１１】  本発明の第１の方法において、前記正帯電性粒子の粒径が５０ｎｍ以上であることが好ましい。この場合、正帯電性粒子と該正帯電性粒子に静電的に結合した複数の負帯電性ＳＵＶ型リポソームとを含む負帯電性複合体を効率よく形成させることができる。【００１２】  本発明の第２の方法は、負帯電性粒子を２枚の脂質膜で被覆する方法であって、前記負帯電性粒子に複数の正帯電性ＳＵＶ型リポソームを接触させ、前記負帯電性粒子と前記負帯電性粒子に静電的に結合した前記正帯電性ＳＵＶ型リポソームとを含む正帯電性複合体を形成させ、前記正帯電性複合体をアニオンで処理することを特徴とする。【００１３】  本発明の第２の方法によれば、負帯電性粒子を、その間に空間が形成された２枚の脂質膜で被覆することができる。負帯電性粒子を本発明の第２の方法により被覆して得られるリポソームにおいて、負帯電性粒子を被覆する２枚の脂質膜の間（負帯電性粒子の外側に形成された第１の脂質膜及び第１の脂質膜の外側に形成された第２の脂質膜）には空間が形成されており、この空間には所望の物質を保持させることができる。【００１４】  本発明の第２の方法において、前記負帯電性粒子が目的物質の凝集体であることが好ましい。この場合、目的物質の凝集体が封入されており、目的物質の凝集体を被覆する２枚の脂質膜の間に空間が形成された２枚膜リポソームを作製することができる。【００１５】  本発明の第２の方法において、前記負帯電性粒子が負帯電性ｎ枚膜リポソーム（ｎは１以上の整数である。）であることが好ましい。この場合、負帯電性ｎ枚膜リポソームを被覆する２枚の脂質膜の間に空間が形成された（ｎ＋２）枚膜リポソームを作製することができる。【００１６】  本発明の第２の方法において、前記負帯電性粒子のゼータ電位が−２０〜−３０ｍＶであり、前記正帯電性ＳＵＶ型リポソームのゼータ電位が２０〜３０ｍＶであることが好ましい。この場合、負帯電性粒子と該負帯電性粒子に静電的に結合した複数の正帯電性ＳＵＶ型リポソームとを含む正帯電性複合体を効率よく形成させることができる。【００１７】  本発明の第２の方法において、前記負帯電性粒子の粒径が５０ｎｍ以上であることが好ましい。この場合、負帯電性粒子と該負帯電性粒子に静電的に結合した複数の正帯電性ＳＵＶ型リポソームとを含む正帯電性複合体を効率よく形成させることができる。
【発明の効果】
【００１８】  本発明の方法によれば、被覆対象である粒子を、その間に空間が形成された２枚の脂質膜で被覆することができる。したがって、被覆対象である粒子として目的物質の凝集体を使用すれば、目的物質の凝集体が封入されており、目的物質の凝集体を被覆する２枚の脂質膜の間に空間が形成された２枚膜リポソームを作製することができ、被覆対象である粒子としてｎ枚膜リポソーム（ｎは１以上の整数である。）を使用すれば、ｎ枚膜リポソームを被覆する２枚の脂質膜の間に空間が形成された（ｎ＋２）枚膜リポソームを作製することができる。正帯電性粒子又は負帯電性粒子を本発明の方法により被覆して得られるリポソームにおいて、正帯電性粒子又は負帯電性粒子を被覆する２枚の脂質膜の間には空間が形成されており、この空間には所望の物質を保持させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】（ａ）は各フラクションのＤＮＡ含量をＤＮＡアガロースゲル電気泳動によって測定した結果を示す図であり、（ｂ）は各フラクションのローダミン含量及びＮＢＤ含量を蛍光強度によって測定した結果を示す図である。
【図２】（ａ）は各フラクションのＤＮＡ含量をＤＮＡアガロースゲル電気泳動によって測定した結果を示す図であり、（ｂ）は各フラクションのローダミン含量及びＮＢＤ含量を蛍光強度によって測定した結果を示す図である。
【図３】各種多重リポソームによって細胞内に導入されたルシフェラーゼ遺伝子の発現活性を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】  本発明の第１の方法においては、まず、正帯電性粒子に複数の負帯電性ＳＵＶ型リポソームを接触させ、正帯電性粒子と正帯電性粒子に静電的に結合した負帯電性ＳＵＶ型リポソームとを含む負帯電性複合体を形成させる。
本発明の第２の方法においては、まず、負帯電性粒子に複数の正帯電性ＳＵＶ型リポソームを接触させ、負帯電性粒子と負帯電性粒子に静電的に結合した正帯電性ＳＵＶ型リポソームとを含む正帯電性複合体を形成させる。【００２１】  正帯電性粒子のゼータ電位は正である限り特に限定されるものではないが、通常１０〜６０ｍＶ、好ましくは２０〜５０ｍＶ、さらに好ましくは２０〜３０ｍＶである。負帯電性粒子のゼータ電位は負である限り特に限定されるものではないが、通常−１０〜−６０ｍＶ、好ましくは−２０〜−５０ｍＶ、さらに好ましくは−２０〜−３０ｍＶである。ゼータ電位の測定条件は特に限定されるものはないが、温度条件は通常２５℃である。【００２２】  正帯電性粒子及び負帯電性粒子の粒径は特に限定されるものではないが、粒径の下限値は、好ましくは５０ｎｍ、さらに好ましくは７０ｎｍであり、粒径の上限値は、好ましくは５００ｎｍ、さらに好ましくは２００ｎｍである。正帯電性粒子の粒径が上記範囲にあると、正帯電性粒子に静電的に結合した負帯電性ＳＵＶ型リポソームをカチオンで処理したときに、正帯電性粒子を２枚の脂質膜で効率よく被覆することができる。また、負帯電性粒子の粒径が上記範囲にあると、負帯電性粒子に静電的に結合した正帯電性ＳＵＶ型リポソームをアニオンで処理したときに、負帯電性粒子を２枚の脂質膜で効率よく被覆することができる。【００２３】  正帯電性粒子は、全体として正に帯電する限り、カチオン性物質に加え、中性物質及び／又はアニオン性物質を含んでいてもよい。負帯電性粒子は、全体として負に帯電する限り、アニオン性物質に加え、中性物質及び／又はカチオン性物質を含んでいてもよい。【００２４】  正帯電性又は負帯電性粒子としては、例えば、目的物質（例えば細胞内又は核内に送達すべき物質）の凝集体を使用することができる。正帯電性又は負帯電性粒子として目的物質の凝集体を使用する場合、正帯電性又は負帯電性粒子を２枚の脂質膜で被覆することにより、目的物質が封入された２枚膜リポソームを作製することができる。目的物質の凝集体は、目的物質のみから構成されていてもよいし、目的物質以外の物質（例えば、目的物質を保持する担体）を含んでいてもよい。【００２５】  目的物質が正に帯電している場合、例えば、目的物質とアニオン性物質とを静電的に結合させて複合体化することにより、目的物質の凝集体を調製することができる。目的物質が負に帯電している場合、例えば、目的物質とカチオン性物質とを静電的に結合させて複合体化することにより、目的物質の凝集体を調製することができる。目的物質が負及び正のいずれにも帯電していない場合、目的物質とカチオン性物質とを適当な様式（例えば、物理的吸着、疎水結合、化学結合等）で結合させて複合体化することにより、目的物質の凝集体を調製することができる。複合体化の際、目的物質とカチオン性物質又はアニオン性物質との混合比率を調整することにより、全体として正又は負に帯電する目的物質の凝集体を調製することができる。【００２６】  目的物質は特に限定されるものではなく、例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、薬物、糖、これらの複合体等が挙げられる。なお、「核酸」には、ＤＮＡ又はＲＮＡに加え、これらの類似体又は誘導体（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡ等）が含まれる。また、核酸は一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよいし、線状又は環状のいずれであってもよい。【００２７】  目的物質が核酸である場合、核酸とカチオン性物質と静電的に結合させて複合体化することにより、核酸の凝集体を調製することができる。複合体化の際、核酸とカチオン性物質との混合比率を調整することにより、全体として正又は負に帯電する核酸の凝集体を調製することができる。【００２８】  目的物質の凝集体を調製する際に使用するカチオン性物質は、分子中にカチオン性基を有する物質である限り特に限定されるものではない。カチオン性物質としては、例えば、カチオン性脂質（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製））；カチオン性基を有する高分子；ポリリジン、ポリアルギニン、リジンとアルギニンの共重合体等の塩基性アミノ酸の単独重合体若しくは共重合体又はこれらの誘導体（例えばステアリル化誘導体）；ポリエチレンイミン、ポリ（アリルアミン）、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロライド）、グルコサミン等のポリカチオン性ポリマー；硫酸プロタミン等を使用することができる。カチオン性物質が有するカチオン性基の数は特に限定されるものではないが、好ましくは２個以上である。カチオン性基は正に荷電し得る限り特に限定されるものではなく、例えば、アミノ基；メチルアミノ基、エチルアミノ基等のモノアルキルアミノ基；ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基等のジアルキルアミノ基；イミノ基；グアニジノ基等が挙げられる。【００２９】  目的物質の凝集体を調製する際に使用するアニオン性物質は、分子中にアニオン性基を有する物質である限り特に限定されるものではない。アニオン性物質としては、例えば、アニオン性脂質；アニオン性基を有する高分子；ポリアスパラギン酸等の酸性アミノ酸の単独重合体若しくは共重合体又はこれらの誘導体；キサンタンガム、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースポリスチレンスルホン酸塩、ポリサッカライド、カラギーナン等のポリアニオン性ポリマー等を使用することができる。アニオン性物質が有するアニオン性基の数は特に限定されるものではないが、好ましくは２個以上である。アニオン性基は負に荷電し得る限り特に限定されるものではなく、例えば、末端カルボキシル基を有する官能基（例えば、コハク酸残基、マロン酸残基等）、リン酸基、硫酸基等が挙げられる。【００３０】  正帯電性又は負帯電性粒子としては、例えば、正帯電性又は負帯電性ｎ枚膜リポソーム（ｎは１以上の整数である。）を使用することができる。正帯電性又は負帯電性粒子としてｎ枚膜リポソームを使用する場合、正帯電性又は負帯電性粒子を２枚の脂質膜で被覆することにより、（ｎ＋２）枚膜リポソームを作製することができる。正帯電性又は負帯電性ｎ枚膜リポソームの内部には目的物質（例えば細胞内又は核内に送達すべき物質）が封入されていてもよいし、封入されていなくてもよい。正帯電性ｎ枚膜リポソームは、全体として正に帯電する限り、カチオン性物質に加え、中性物質及び／又はアニオン性物質を含んでいてもよい���負帯電性ｎ枚膜リポソームは、全体として負に帯電する限り、アニオン性物質に加え、中性物質及び／又はカチオン性物質を含んでいてもよい。【００３１】  ｎ枚膜リポソームは、例えば、水和法、超音波処理法、エタノール注入法、エーテル注入法、逆相蒸発法、界面活性剤法、凍結・融解法等の公知の方法を用いて作製することができる。また、ｎ枚膜リポソームは、本発明の方法を使用して正帯電性又は負帯電性粒子を２枚の脂質膜で被覆することにより作製することができる。【００３２】  ｎ枚膜リポソームを構成する物質（例えば、脂質膜構成成分、リポソーム内部に封入される物質等）の種類及び含有量を調節することにより、正帯電性又は負帯電性ｎ枚膜リポソームを作製することができる。また、負帯電性ｎ枚膜リポソーム又は中性ｎ枚膜リポソームの表面をカチオン性物質で修飾することにより、正帯電性ｎ枚膜リポソームを作製することができ、正帯電性ｎ枚膜リポソーム又は中性ｎ枚膜リポソームの表面をアニオン性物質で修飾することにより、負帯電性ｎ枚膜リポソームを作製することができる。【００３３】  ｎ枚膜リポソームは、例えば、水和法により次のように作製することができる。脂質膜の構成成分を有機溶剤に溶解した後、有機溶剤を蒸発除去することにより脂質膜を得る。この際、有機溶剤としては、例えば、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン等の炭化水素類；塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；メタノール、エタノール等の低級アルコール類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；アセトン等のケトン類等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。次いで、脂質膜を水和させ、攪拌又は超音波処理することにより、多重膜リポソームに転換することができる。多重膜リポソームから１枚膜リポソームへの転換又は１枚膜リポソームから多重膜リポソームへの転換は公知の方法に従って行うことができる。ｎ枚膜リポソームを所定のポアサイズのフィルターで通過させることにより、一定の粒度分布を持ったｎ枚膜リポソームを得ることができる。【００３４】  目的物質が水溶性である場合、ｎ枚膜リポソームの製造にあたり脂質膜を水和する際に使用される水性溶媒に目的物質又はその凝集体を添加することにより、リポソーム内部の水相に目的物質を封入することができる。また、目的物質が脂溶性である場合には、ｎ枚膜リポソームの製造にあたり使用される有機溶剤に目的物質又はその凝集体を添加することにより、リポソームの脂質膜に目的物質を封入することができる。【００３５】  負帯電性ｎ枚膜リポソーム又は中性ｎ枚膜リポソームの表面をカチオン性物質で修飾する場合、例えば、負帯電性ｎ枚膜リポソーム又は中性ｎ枚膜リポソームの外液に、疎水性基を有するカチオン性物質を添加する。これにより、カチオン性物質が脂質膜から露出するように疎水性基が脂質膜に挿入され、負帯電性ｎ枚膜リポソーム又は中性ｎ枚膜リポソームの表面にカチオン性物質を導入することができる。【００３６】  正帯電性ｎ枚膜リポソーム又は中性ｎ枚膜リポソームの表面をアニオン性物質で修飾する場合、例えば、正帯電性ｎ枚膜リポソーム又は中���ｎ枚膜リポソームの外液に、疎水性基を有するアニオン性物質を添加する。これにより、アニオン性物質が脂質膜から露出するように疎水性基が脂質膜に挿入され。正帯電性ｎ枚膜リポソーム又は中性ｎ枚膜リポソームの表面にアニオン性物質を導入することができる。【００３７】  疎水性基は、脂質膜に挿入され得る限り特に限定されるものでない。疎水性基としては、例えば、ステアリル基等の飽和又は不飽和の脂肪酸基、コレステロール残基等のステロール残基、リン脂質残基、糖脂質残基、長鎖脂肪族アルコール残基（例えば、フォスファチジルエタノールアミン残基等）、ポリオキシプロピレンアルキル基、グリセリン脂肪酸エステル残基等が挙げられるが、これらのうち特に炭素数１０〜２０の脂肪酸基（例えば、パルミトイル基、オレイル基、ステアリル基、アラキドイル基等）が好ましい。【００３８】  ｎ枚膜リポソームにおける脂質膜構成成分は、脂質二重層の形成を阻害しない限り特に限定されるものではなく、脂質膜構成成分としては、例えば、脂質、膜安定化剤、抗酸化剤、荷電物質、膜タンパク質等が挙げられる。【００３９】  正帯電性ｎ枚膜リポソームにおける脂質膜構成成分の種類及び含有量は、ｎ枚膜リポソームが全体として正に帯電するように調節され、負帯電性ｎ枚膜リポソームにおける脂質膜構成成分の種類及び含有量は、ｎ枚膜リポソームが全体として負に帯電するように調節される。正の電荷を付与する脂質膜構成成分としては、例えば、カチオン性脂質、カチオン性膜安定化剤等が挙げられ、負の電荷を付与する脂質膜構成成分としては、アニオン性脂質、アニオン性膜安定化剤等が挙げられる。なお、ｎ枚膜リポソームの内部に所定の物質（例えば目的物質の凝集体）が封入されている場合、ｎ枚膜リポソームにおける脂質膜構成成分の種類及び含有量は、ｎ枚膜リポソームの内部に封入されている物質全体の電荷を考慮して調節される。【００４０】  ＳＵＶ（ｓｍａｌｌ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）型リポソームは、粒径（直径）が１００ｎｍ以下である１枚膜リポソームである。ＳＵＶ型リポソームの粒径（直径）は１００ｎｍ以下である限り特に限定されるものではないが、通常３０〜１００ｎｍ、好ましくは３０〜７０ｎｍ、さらに好ましくは３０〜５０ｎｍである。【００４１】  多重膜リポソーム（ＭＬＶ）、ＳＵＶ以外の１枚膜リポソーム（例えばＬＵＶ（ｌａｒｇｅ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）、ＧＵＶ（ｇｉａｎｔ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）等）は、粒子径が１００ｎｍ以上であるため（一般的に１００ｎｍ以上の粒子径を有する脂質膜は平面膜として考えられる）、膜の曲率及び表面エネルギーが小さく、リポソーム同士の凝集が生じ難い。これに対して、ＳＵＶ型リポソームは、粒子径が１００ｎｍ未満であるため、膜の曲率及び表面エネルギーが大きく、リポソーム同士の凝集が生じ易い。したがって、正帯電性粒子に静電的に結合した負帯電性ＳＵＶ型リポソームをカチオンで処理すると、効率よく負帯電性ＳＵＶ型リポソーム同士を膜融合させることができる。また、負帯電性粒子に静電的に結合した正帯電性ＳＵＶ型リポソームをアニオンで処理すると、効率よく正帯電性ＳＵＶ型リポソーム同士を膜融合させることができる。【００４２】  ＳＵＶ型リポソームは、例えば、超音波法により次のようにして作製することができる。脂質膜の構成成分を有機溶剤に溶解した後、有機溶剤を蒸発除去することにより脂質膜を得る。この際、有機溶剤としては、例えば、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン等の炭化水素類；塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；メタノール、エタノール等の低級アルコール類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；アセトン等のケトン類等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。次いで、脂質膜を水和させ、攪拌又は超音波槽を用いた超音波処理により多重膜リポソームを作製することができる。得られた多重膜リポソームを、さらにプローブ型超音波装置によって超音波処理することにより、小さい１枚膜リポソームであるＳＵＶ型リポソームを調製することができる。【００４３】  ＳＵＶ型リポソームにおける脂質膜構成成分は、脂質二重層の形成を阻害しない限り特に限定されるものではなく、脂質膜構成成分としては、例えば、脂質、膜安定化剤、抗酸化剤、荷電物質、膜タンパク質等が挙げられる。【００４４】  正帯電性ＳＵＶ型リポソームにおける脂質膜構成成分の種類及び含有量は、ＳＵＶ型リポソームが全体として正に帯電するように調節され、負帯電性ＳＵＶ型リポソームにおける脂質膜構成成分の種類及び含有量は、ＳＵＶ型リポソームが全体として負に帯電するように調節される。正の電荷を付与する脂質膜構成成分としては、例えば、カチオン性脂質、カチオン性膜安定化剤等が挙げられ、負の電荷を付与する脂質膜構成成分としては、アニオン性脂質、アニオン性膜安定化剤等が挙げられる。正帯電性ＳＵＶ型リポソームは、全体として正に帯電する限り、正の電荷を付与する脂質膜構成成分に加え、負の電荷を付与する脂質膜構成成分及び／又は中性の脂質膜構成成分を含んでいてもよく、負帯電性ＳＵＶ型リポソームは、全体として負に帯電する限り、負の電荷を付与する脂質膜構成成分に加え、正の電荷を付与する脂質膜構成成分及び／又は中性の脂質膜構成成分を含んでいてもよい。【００４５】  正帯電性ＳＵＶ型リポソームが正の電荷を付与する脂質膜構成成分としてカチオン性脂質を含む場合、カチオン性脂質の配合量は脂質の総配合量の通常５〜３０％（モル比）、好ましくは１０〜２０％（モル比）、さらに好ましくは１０〜１５％（モル比）である。
負帯電性ＳＵＶ型リポソームが負の電荷を付与する脂質膜構成成分としてアニオン性脂質を含む場合、アニオン性脂質の配合量は脂質の総配合量の通常５〜３０％（モル比）、好ましくは１０〜２０％（モル比）、さらに好ましくは１０〜１５％（モル比）である。【００４６】  正帯電性ＳＵＶ型リポソームのゼータ電位は正である限り特に限定されるものではないが、通常１０〜６０ｍＶ、好ましくは２０〜５０ｍＶ、さらに好ましくは２０〜３０ｍＶであり、負帯電性ＳＵＶ型リポソームのゼータ電位は負である限り特に限定されるものではないが、通常−１０〜−６０ｍＶ、好ましくは−２０〜−５０ｍＶ、さらに好ましくは−２０〜−３０ｍＶである。ゼータ電位の測定条件は特に限定されるものはないが、温度条件は通常２５℃である。【００４７】  ｎ枚膜リポソーム又はＳＵＶ型リポソームにおいて、脂質は脂質膜の必須成分であり、その配合量は脂質膜構成成分の総配合量の通常３０〜１００％（モル比）、好ましくは５０〜１００％（モル比）、さらに好ましくは７０〜１００％（モル比）である。【００４８】  脂質としては、例えば、リン脂質、糖脂質、ステロール、飽和又は不飽和の脂肪酸等が挙げられる。リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン（例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン等）、ホスファチジルグリセロール（例えば、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジグリセロール等）、ホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジエタノールアミン等）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、これらの水素添加物等が挙げられる。糖脂質としては、例えば、グリセロ糖脂質（例えば、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド）、スフィンゴ糖脂質（例えば、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシド）等が挙げられる。ステロールとしては、例えば、動物由来のステロール（例えば、コレステロール、コレステロールコハク酸、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール）、植物由来のステロール（フィトステロール）（例えば、スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール）、微生物由来のステロール（例えば、チモステロール、エルゴステロール）等が挙げられる。飽和又は不飽和の脂肪酸としては、例えば、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸等の炭素数１２〜２０の飽和又は不飽和の脂肪酸が挙げられる。【００４９】  脂質は、中性脂質、カチオン性脂質及びアニオン性脂質に分類され、中性脂質としては、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、コレステロール、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、セレブロシド等が挙げられ、カチオン性脂質としては、例えば、例えば、ＤＯＤＡＣ（ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−（２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）、ＤＤＡＢ（ｄｉｄｏｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ  ｐｒｏｐａｎｅ）、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’，−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅ）−ｃａｒｂａｍｏｌ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）、ＤＭＲＩＥ（１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ）、ＤＯＳＰＡ（２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ−Ｎ−［２（ｓｐｅｒｍｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｅｔｈｙｌ］−Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｒｏｐａｎａｍｉｎｕｍ  ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ）等が挙げられ、アニオン性脂質としては、例えば、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン（Ｎ−スクシニルＰＥ）、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエチレングリコール、コレステロールコハク酸等が挙げられる。【００５０】  ｎ枚膜リポソーム又はＳＵＶ型リポソームにおいて、膜安定化剤は、脂質膜を物理的又は化学的に安定させたり、脂質膜の流動性を調節したりするために添加する任意の成分であり、その配合量は脂質膜構成成分の総配合量の通常１０〜５０％（モル比）、好ましくは２０〜５０％（モル比）、さらに好ましくは３０〜５０％（モル比）である。【００５１】  膜安定化剤としては、例えば、ステロール、グリセリン又はその脂肪酸エステル等が挙げられる。ステロールとしては、上記と同様の具体例が挙げられ、グリセリンの脂肪酸エステルとしては、例えば、トリオレイン、トリオクタノイン等が挙げられる。【００５２】  ｎ枚膜リポソーム又はＳＵＶ型リポソームにおいて、抗酸化剤は、脂質膜の酸化を防止するために添加する任意の成分であり、その配合量は脂質膜構成成分の総配合量の通常５〜３０％（モル比）、好ましくは１０〜３０％（モル比）、さらに好ましくは２０〜３０％（モル比）である。【００５３】  抗酸化剤としては、例えば、トコフェロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシトルエン等が挙げられる。【００５４】  ｎ枚膜リポソーム又はＳＵＶ型リポソームにおいて、荷電物質は、脂質膜に正荷電又は負荷電を付与するために添加する任意の成分であり、その配合量は脂質膜構成成分の総配合量の通常５〜３０％（モル比）、好ましくは１０〜２０％（モル比）、さらに好ましくは１０〜１���％（モル比）である。【００５５】  正荷電を付与する荷電物質としては、例えば、ステアリルアミン、オレイルアミン等の飽和又は不飽和脂肪族アミン；ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン等の飽和又は不飽和カチオン性合成脂質等が挙げられ、負電荷を付与する荷電物質としては、例えば、ジセチルホスフェート、コレステロールコハク酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸等が挙げられる。【００５６】  ｎ枚膜リポソーム又はＳＵＶ型リポソームにおいて、膜タンパク質は、脂質膜の構造を維持したり、脂質膜に機能性を付与したりするために添加する任意の成分であり、その配合量は脂質膜構成成分の総配合量の通常０．１〜２％（モル比）、好ましくは０．５〜２％（モル比）、さらに好ましくは１〜２％（モル比）である。【００５７】  膜タンパク質としては、例えば、膜表在性タンパク質、膜内在性タンパク質等が挙げられる。【００５８】  正帯電性又は負帯電性粒子にそれぞれ負帯電性又は正帯電性ＳＵＶ型リポソームを接触させる条件は特に限定されるものではないが、温度は通常１０〜４０℃、好ましくは２０〜３０℃であり、ｐＨは通常６．５〜８．０、好ましくは７．０〜７．５であり、時間は通常１〜２０分間、好ましくは５〜１０分間である。接触させる際に用いる溶媒は特に限定されるものではないが、例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液、生理食塩水、ショ糖溶液等を用いることができる。溶媒中に分散させる負帯電性又は正帯電性ＳＵＶ型リポソームの量は、通常、正帯電性又は負帯電性粒子に対して過剰量であり、例えば、正帯電性又は負帯電性粒子の封入に理論上最低限必要な負帯電性又は正帯電性ＳＵＶ型リポソーム量の２〜４倍量である。【００５９】  正帯電性粒子に負帯電性ＳＵＶ型リポソームを接触させると、正帯電性粒子と負帯電性ＳＵＶ型リポソームとは静電的相互作用を介して結合し、正帯電性粒子の表面は複数の負帯電性ＳＵＶ型リポソームによって覆われる。これにより、正帯電性粒子と正帯電性粒子に静電的に結合した複数の負帯電性ＳＵＶ型リポソームとを含む負帯電性複合体が形成される。この際、ゼータ電位が−２０〜−５０ｍＶの負帯電性複合体が形成されることが好ましく、ゼータ電子が−２０〜−３０ｍＶの負帯電性複合体が形成されることがさらに好ましい。これにより、正帯電性粒子に静電的に結合した負帯電性ＳＵＶ型リポソームを効率よくカチオンで処理することができる。負帯電性複合体のゼータ電位は、正帯電性粒子及び負帯電性ＳＵＶ型リポソームのゼータ電位、粒径等を調節することにより調節することができる。【００６０】  負帯電性粒子に正帯電性ＳＵＶ型リポソームを接触させると、負帯電性粒子と正帯電性ＳＵＶ型リポソームとは静電的相互作用を介して結合し、負帯電性粒子の表面は複数の正帯電性ＳＵＶ型リポソームによって覆われる。これにより、負帯電性粒子と負帯電性粒子に静電的に結合した複数の正帯電性ＳＵＶ型リポソームとを含む正帯電性複合体が形成される。この際、ゼータ電位が２０〜５０ｍＶの正帯電性複合体が形成されることが好ましく、ゼータ電子が２０〜３０ｍＶの正帯電性複合体が形成されることがさらに好ましい。これにより、負帯電性粒子に���電的に結合した正帯電性ＳＵＶ型リポソームを効率よくアニオンで処理することができる。正帯電性複合体のゼータ電位は、負帯電性粒子及び正帯電性ＳＵＶ型リポソームのゼータ電位、粒径等を調節することにより調節することができる。【００６１】  本発明の第１の方法においては、次いで、形成された負帯電性複合体をカチオンで処理する。
本発明の第２の方法においては、次いで、形成された正帯電性複合体をアニオンで処理する。【００６２】  カチオンは特に限定されるものではなく、例えば、Ｈ＋等の１価のカチオン；Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋等の２価のカチオン；Ａｌ３＋等の３価のカチオン等が挙げられる。Ｈ＋を生じる物質としては、例えば、塩酸、酢酸等の酸を使用することができ、Ｃａ２＋を生じる物質としては、例えば、塩化カルシウム等を使用することができ、Ｍｇ２＋を生じる物質としては、例えば、塩化マグネシウム等を使用することができ、Ａｌ３＋を生じる物質としては、例えば、塩化アルミニウム等を使用することができる。【００６３】  アニオンは特に限定されるものではなく、例えば、ＯＨ−、ＳＯ４２−、ＰＯ４３−、解離型短鎖脂肪酸等が挙げられる。ＯＨ−を生じる物質としては、例えば、水酸化ナトリウム等を使用することができ、ＳＯ４２−を生じる物質としては、例えば、硫酸ナトリウム等を使用することができ、ＰＯ４３−を生じる物質としては、例えば、リン酸ナトリウム等を使用することができ、解離型短鎖脂肪酸を生じる物質としては、例えば、カプリル酸（ＣＨ３（ＣＨ２）６ＣＯＯＨ）等を使用することができる。【００６４】  負帯電性複合体をカチオンで処理する条件は特に限定されるものではないが、温度は通常１０〜４０℃、好ましくは２０〜３０℃であり、ｐＨは通常６．５〜８．０、好ましくは７．０〜７．５であり、時間は通常１〜２０分間、好ましくは５〜１０分間である。カチオン処理の際に用いる溶媒は水溶液である限り特に限定されるものではなく、例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液等を用いることができる。溶媒中に添加するカチオンの量は、カチオンの性質等に応じて適宜調節することができるが、通常、脂質量の５０倍量（カチオンモル／脂質モル）以上である。【００６５】  正帯電性複合体をアニオンで処理する条件は特に限定されるものではないが、温度は通常１０〜４０℃、好ましくは２０〜３０℃であり、ｐＨは通常６．５〜８．０、好ましくは７．０〜７．５であり、時間は通常１〜２０分間、好ましくは５〜１０分間である。アニオン処理の際に用いる溶媒は水溶液である限り特に限定されるものではなく、例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液等を用いることができる。溶媒中に添加するアニオンの量は、アニオンの性質等に応じて適宜調節することができるが、通常、脂質量の５０倍量（アニオンモル／脂質モル）以上である。【００６６】  負帯電性複合体をカチオンで処理すると、正帯電性粒子に静電的に結合した負帯電性ＳＵＶ型リポソームの表面の負電荷が消失し、負帯電性ＳＵＶ型リポソームの表面の疎水性が増加し、隣接する負帯電性ＳＵＶ型リポソーム同士の膜融合が誘起され、正帯電性粒子が２枚の脂質膜で被覆される。また、正帯電性複合体をアニオンで処理すると、負帯電性粒子に静電的に結合した正帯電性ＳＵＶ型リポソームの表面の正電荷が消失し、正帯電性ＳＵＶ型リポソームの表面の疎水性が増加し、隣接する正帯電性ＳＵＶ型リポソーム同士の膜融合が誘起され、負帯電性粒子が２枚の脂質膜で被覆される。こうして正帯電性又は負帯電性粒子の外側には、正帯電性又は負帯電性粒子を被覆する２枚の脂質膜が新たに形成されるが、このとき、２��の脂質膜はその間に空間が形成されるように形成される。【００６７】  正帯電性又は負帯電性粒子として目的物質の凝集体を使用した場合、目的物質の凝集体が封入されており、目的物質の凝集体を被覆する２枚の脂質膜の間に空間が形成された２枚膜リポソームが作製され、正帯電性又は負帯電性粒子としてｎ枚膜リポソーム（ｎは１以上の整数である。）を使用した場合、ｎ枚膜リポソームを被覆する２枚の脂質膜の間に空間が形成された（ｎ＋２）枚膜リポソームが作製される。【００６８】  本発明の第１の方法を用いて正帯電性粒子を２枚の脂質膜で被覆することにより得られるリポソームは、通常、負帯電性である。但し、負帯電性複合体のゼータ電位の大きさ、カチオンの種類等によっては、正帯電性である場合もあると考えられる。本発明の第２の方法を用いて負帯電性粒子を２枚の脂質膜で被覆することにより得られるリポソームは、通常、正帯電性である。但し、正帯電性複合体のゼータ電位の大きさ、アニオンの種類等によっては、負帯電性である場合もあると考えられる。【００６９】  本発明の第１又は第２の方法を用いて正帯電性又は負帯電性粒子を２枚の脂質膜で被覆することにより正帯電性リポソームが得られた場合、得られた正帯電性リポソームを本発明の第１の方法における正帯電性粒子として使用することができる。負帯電性リポソーム又は中性リポソームが得られた場合、得られた負帯電性リポソーム又は中性リポソームの表面をカチオン性物質で修飾して正帯電性リポソームを調製し、調製された正帯電性リポソームを本発明の第１の方法における正帯電性粒子として使用することができる。このように、本発明の第１及び／又は第２の方法を繰り返し行うことにより、脂質膜の数を制御しながら多重膜リポソームを作製することができる。【００７０】  本発明の第１又は第２の方法を用いて正帯電性又は負帯電性粒子を２枚の脂質膜で被覆することにより負帯電性リポソームが得られた場合、得られた負帯電性リポソームを本発明の第２の方法における負帯電性粒子として使用することができる。正帯電性リポソーム又は中性リポソームが得られる場合、正帯電性リポソーム又は中性リポソームの表面をアニオン性物質で修飾して負帯電性リポソームを調製し、調製された負帯電性リポソームを本発明の第２の方法における負帯電性粒子として使用することができる。このように、本発明の第１及び／又は第２の方法を繰り返し行うことにより、既に形成されている２枚の脂質膜の外側に新たな２枚の脂質膜を形成させることができ、脂質膜の数を制御しながら多重膜リポソームを作製することができる。なお、既に形成されている２枚の脂質膜の外側に新たな２枚の脂質膜が形成される際、既に形成されている２枚の脂質膜及び当該２枚の脂質膜の間に形成されている空間はそのまま保持される。【００７１】  本発明の第１又は第２の方法によって正帯電性又は負帯電性粒子を２枚の脂質膜で被覆することにより得られるリポソームには、目的物質が封入されていることが好ましい。目的物質が細胞内又は核内に送達すべき物質（例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、薬物、糖、これらの複合体等）である場合、目的物質が封入されたリポソームを、目的物質の細胞内又は核内���達用ベクターとして使用することができる。目的物質が封入されたリポソームは、正帯電性又は負帯電性粒子として目的物質の凝集体を使用することにより、また、正帯電性又は負帯電性粒子として目的物質が封入されたｎ枚膜リポソームを使用することにより得ることができる。また、正帯電性又は負帯電性粒子の外側に新たに形成される２枚の脂質膜の間に目的物質を保持させることにより（例えば、目的物質を含有する液体を保持させることにより）得ることができる。【００７２】  目的物質を送達すべき細胞が由来する生物種は特に限定されるものではなく、動物、植物、微生物等のいずれであってもよいが、動物であることが好ましく、哺乳動物であることがさらに好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモット等が挙げられる。また、目的物質を送達すべき細胞の種類は特に限定されるものではなく、例えば、体細胞、生殖細胞、幹細胞又はこれらの培養細胞等が挙げられる。【００７３】  目的物質が封入されたリポソームは、例えば、分散液の状態で使用することができる。分散溶媒としては、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝液，クエン緩衝液，酢酸緩衝液等の緩衝液を使用することができる。分散液には、例えば、糖類、多価アルコール、水溶性高分子、非イオン界面活性剤、抗酸化剤、ｐＨ調節剤、水和促進剤等の添加剤を添加して使用してもよい。【００７４】  目的物質が封入されたリポソームは、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれにおいても使用することもできる。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて使用する場合、投与経路としては、例えば、静脈、腹腔内、皮下、経鼻等の非経口投与が挙げられ、投与量及び投与回数は、リポソームに封入された目的物質の種類や量等に応じて適宜調節することができる。
【実施例】
【００７５】〔実施例１〕
（１）ＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リシン複合体の形成
ＤＮＡ及びポリ−Ｌ−リシンをそれぞれ５ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）に溶解した。なお、ＤＮＡとしては、プラスミドＤＮＡ（ＣＭＶプロモータ及びその下流に連結されたルシフェラーゼ遺伝子を含有する全長約７ｋｂｐのプラスミドＤＮＡ）を用いた。次いで、ＤＮＡ溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ）及びポリ−Ｌ−リシン溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ）を混合し、室温下、ボルテックスを用いて攪拌し、ＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リシン複合体含有液（ＤＮＡ濃度０．０５ｍｇ／ｍＬ）を調製した。こうして調製されたＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リシン複合体の粒径は約７０〜１００ｎｍであり、ゼータ電位は約３０〜４０ｍＶであった。なお、流体力学的直径は準弾性光散乱方法によって測定し、ゼータ電位は、電気泳動的光散乱分光測光器（ＥＬＳ−８０００）によって分析した（以下同様）。【００７６】（２）ＳＵＶ型リポソームの調製
卵黄ホスファチジルコリン／コレステロールコハク酸（９：２（モル比））をクロロホルム０．５ｍＬに溶解し、溶解液をガラス試験管に収容した。窒素ガスの吹き付けにより溶媒を除去した後、デシケーター内に１時間収納して乾燥させた。得られた脂質膜（０．５５μモル）を、予め２５℃まで温めておいたＨＥＰＥＳ緩衝液１ｍＬを用いて水和させ、超音波槽で超音波処理することにより脂質膜を剥離した。さらにプローブ型超音波装置により１０分間超音波処理を行うことによって、ＳＵＶ型リポソームを調製した。こうして調製されたＳＵＶ型リポソームの粒径は約５０〜１００ｎｍであり、ゼータ電位は約−３０ｍＶであった。【００７７】  ＳＵＶ型リポソームの蛍光標識は、ローダミン（赤）又はＮＢＤ（４−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏ−２−ｏｘａ−１，３−ｄｉａｚｏｌｅ）標識化ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（青）を取り込ませることにより行った。この際、水相マーカーとしてのローダミンは脂質膜を水和する溶媒中に溶かし（１０ｍＭ）、脂質マーカーとしてのＮＢＤ標識化脂質はクロロホルム溶液に溶かした（総脂質に対して０．１モル％）。【００７８】（３）ＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リシン複合体の脂質膜による被覆
ＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リシン複合体含有液２５０μＬにＳＵＶ型リポソーム５００μＬを添加して、両者を接触させた。これにより、ＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リシン複合体と、ＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リシン複合体に静電的に結合した複数のＳＵＶ型リポソームとを含む複合体が形成されると考えられる。この複合体の粒径は約５００〜３０００ｎｍであり、ゼータ電位は約−３０ｍＶであった。なお、接触は室温（約２５℃）で５分間行った。【００７９】  接触後、０．１Ｎ塩酸５５μＬを添加し、上記複合体をＨ＋で処理した。これにより、ＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リシン複合体に静電的に結合したＳＵＶ型リポソームの表面の負電荷が消失し、ＳＵＶ型リポソームの表面の疎水性が増加し、隣接するＳＵＶ型リポソーム同士の膜融合が誘起されると考えられる。Ｈ＋処理後の粒径は約８５〜１３０ｎｍであり、ゼータ電位は約−２０〜−４０ｍＶであった。Ｈ＋処理によって粒径が小さくなっていることから、ＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リシン複合体に静電的に結合したＳＵＶ型リポソーム同士の膜融合が誘起され、ＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リシン複合体が脂質膜で被覆され、ＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リシン複合体が封入されたリポソームが形成されたことが示された。【００８０】  Ｈ＋処理後の懸濁液を不連続ショ糖密度勾配（０，３０，６０％）上に重層し、２０℃、１６０，０００ｇの条件で２時間、超遠心分離を行った。上部から１ｍＬずつ画分を回収し、蛍光強度を測定した。不連続ショ糖密度勾配超遠心分離によって回収された画分のうち、ＤＮＡ含量の高い画分をリポソーム含有画分とした。リポソーム含有画分は、ショ糖３０〜６０％の境界から回収することができた。【００８１】〔実施例２〕
実施例１と同様にして、ＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リシン複合体を脂質膜で被覆し、ＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リシン複合体が封入されたリポソーム（以下「第１のリポソーム」という）を調製した。なお、この際、ＳＵＶ型リポソームとしてＮＢＤ標識化脂質（青）で蛍光標識したものを使用した。【００８２】  第１のリポソームの外液に１ｍｇ／ｍＬステアリル化オクタアルギニン溶液１２μＬを添加し、室温で３０分間放置することにより、第１のリポソームの表面にオクタアルギニン（総脂質の５モル％）を導入した（以下「第２のリポソーム」という）。なお、第１のリポソームのゼータ電位は負（約−３０ｍＭ）であったが、第１のリポソームの表面にオクタアルギニンを導入して得られた第２のリポソームのゼータ電位は正（約３０〜５０ｍＶ）であった。【００８３】  実施例１と同様にして、第２のリポソーム含有液（０．３７ｍＭ，７５０μＬ）にＳＵＶ型リポソーム（粒径：約５０〜１００ｎｍ，ゼータ電位：約−３０ｍＶ，脂質濃度：０．５５ｍＭ，添加量：１．５ｍＬ）を添加し、両者を接触させた。これにより、第２のリポソームと、第２のリポソームに静電的に結合した複数のＳＵＶ型リポソームとを含む複合体が形成されると考えられる。なお、この際、ＳＵＶ型リポソームとしてローダミンで内水相を蛍光標識したものを使用した。形成された複合体の粒径は約３４０〜１５００ｎｍであり、ゼータ電位は約−３０ｍＶであった。【００８４】  接触後、０．１Ｎ塩酸１６５μＬを添加し、上記複合体をＨ＋で処理した。これにより、第２のリポソームに静電的に結合したＳＵＶ型リポソームの表面の負電荷が消失し、ＳＵＶ型リポソームの表面の疎水性が増加し、隣接するＳＵＶ型リポソーム同士の膜融合が誘起されると考えられる。Ｈ＋処理後の粒径は約１７０〜２４０ｎｍであり、ゼータ電位は約−６０ｍＶであった。Ｈ＋処理によって粒径が小さくなっていることから、第２のリポソームに静電的に結合したＳＵＶ型リポソーム同士の膜融合が誘起され、第２のリポソームが脂質膜で被覆されたことが示された。【００８５】  Ｈ＋処理後の懸濁液を不連続ショ糖密度勾配（０，５，３０％）上に重層し、２０℃、１６０，０００ｇの条件で２時間、超遠心分離を行った。上部から１ｍＬずつ画分を回収した。各フラクションのＤＮＡ含量をＤＮＡアガロースゲル電気泳動によって測定するとともに（図１（ａ）参照）、ローダミン及びＮＢＤの蛍光強度を測定してローダミン含量及びＮＢＤ含量を算出した（図１（ｂ）参照）。【００８６】  不連続ショ糖密度勾配超遠心分離によって回収された画分のうち、ＤＮＡ含量の高い画分（フラクション１１）をリポソーム含有画分とした。リポソーム含有画分は、ショ糖５〜３０％の境界から回収することができた。【００８７】  また、リポソーム含有画分において、ＮＢＤ、ローダミン及びＤＮＡが共存していたことから、ＳＵＶ型リポソームは、ローダミンを含有する内水相を保持したまま融合し、融合後のリポソームにおいて、ローダミンを含有する内水相が保持された空間が形成されていることが示された。【００８８】  さらに、リポソーム含有画分において、ＮＢＤとローダミンとの間に蛍光エネルギー移動は観察されなかった。第２のリポ���ームの脂質膜にはＮＢＤ標識化脂質（青）が含有されているので、第２のリポソームの脂質膜と、ローダミンを含有する内水相とは接触していないことが示された。すなわち、第２のリポソームに静電的に結合したＳＵＶ型リポソーム同士の膜融合により、第２のリポソームは２枚の脂質膜で被覆され、ローダミンを含有する内水相は、第２のリポソームの外側に新たに形成された２枚の脂質膜の間の空間に保持されていることが示された。仮に、第２のリポソームに静電的に結合したＳＵＶ型リポソーム同士の膜融合により、第２のリポソームが１枚の脂質膜で被覆されたとすれば、ローダミンを含有する内水相は、第２のリポソームの脂質膜と、第２のリポソームの外側に形成された脂質膜との間に保持されていると考えられるが、そうすると、ＮＢＤとローダミンとの間に蛍光エネルギー移動が観察されるはずである。また、仮に、第２のリポソームに静電的に結合したＳＵＶ型リポソーム同士の膜融合により、第２のリポソームの脂質膜とＳＵＶ型リポソームの脂質膜とが融合したとすれば（脂質膜の数に変化なし）、ローダミンを含有する内水相は、第２のリポソームの内部に保持されていると考えられるが、そうすると、ＮＢＤとローダミンとの間に蛍光エネルギー移動が観察されるはずである。【００８９】〔実施例３〕
ＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リシン複合体を脂質膜で被覆し、ＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リシン複合体が封入されたリポソーム（第１のリポソーム）を調製する際、ＳＵＶ型リポソームとしてローダミンで内水相を蛍光標識したものを使用した点、及び、第２のリポソームと、第２のリポソームに静電的に結合した複数のＳＵＶ型リポソームとを含む複合体を形成する際に、ＳＵＶ型リポソームとしてＮＢＤ標識化脂質で蛍光標識したものを使用した点を除き、実施例２と同様の試験を行った。【００９０】  なお、実施例２の結果から、第１のリポソーム及び第２のリポソームにおいては、ＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リシン複合体が２枚の脂質膜で被覆されており、この２枚の脂質膜の間にローダミンを含有する内水相が保持されていると考えられる。
Ｈ＋処理後の懸濁液を不連続ショ糖密度勾配（０，５，３０％）上に重層し、２０℃、１６０，０００ｇの条件で２時間、超遠心分離を行った。上部から１ｍＬずつ画分を回収した。各フラクションのＤＮＡ含量をＤＮＡアガロースゲル電気泳動によって測定するとともに（図２（ａ）参照）、ローダミン及びＮＢＤの蛍光強度を測定してローダミン含量及びＮＢＤ含量を算出した（図２（ｂ）参照）。【００９１】  不連続ショ糖密度勾配超遠心分離によって回収された画分のうち、ＤＮＡ含量の高い画分（フラクション１１）をリポソーム含有画分とした。リポソーム含有画分は、ショ糖５〜３０％の境界から回収することができた。【００９２】  また、リポソーム含有画分において、ＮＢＤ、ローダミン及びＤＮＡが共存していたこと、及びＮＢＤとローダミンとの間に蛍光エネルギー移動は観察されなかったことから、第２のリポソームに静電的に結合したＳＵＶ型リポソームが膜融合する際、第２のリポソームにおいて２枚の脂質膜の間に形成された空間（ローダミンを含有する内水相が保持された空間）が保持されることが示された。【００９３】〔実施例４〕
実施例１（１）に従って、ＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リシン複合体を形成した。なお、ＤＮＡとしては、実施例（１）と同様に、プラスミドＤＮＡ（ＣＭＶプロモータ及びその下流に連結されたルシフェラーゼ遺伝子を含有する全長７０３７ｂｐのプラスミドＤＮＡ（ＣＭＶプロモーターを有するｐｃＤＮＡ３．１プラスミドにルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだもの））を用いた。【００９４】  実施例１（２）に従って、卵黄ホスファチジルコリン／コレステロールコハク酸（９：２（モル比））からなる脂質膜を有するＳＵＶ型リポソーム（以下「第１のＳＵＶ型リポソーム」という。）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン／コレステロールコハク酸（９：２（モル比））からなる脂質膜を有するＳＵＶ型リポソーム（以下「第２のＳＵＶ型リポソーム」という。）を調製した。【００９５】  実施例１（３）に従って、第１のＳＵＶ型リポソームを用いてＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リシン複合体を脂質膜で被覆し、リポソームＡ（２枚膜）を調製した。また、第２のＳＵＶ型リポソームを用いてＤＮＡ／ポリ−Ｌ−リシン複合体を脂質膜で被覆し、リポソームＢ（２枚膜）を調製した。また、第２のＳＵＶ型リポソームを用いてリポソームＡを脂質膜で被覆し、リポソームＣ（４枚膜）を調製した。また、第１のＳＵＶ型リポソームを用いてリポソームＢを脂質膜で被覆し、リポソームＤ（４枚膜）を調製した。【００９６】  リポソームＡ〜Ｄの外液に１ｍｇ／ｍＬステアリル化オクタアルギニン溶液１２μＬを添加し、室温で３０分間放置することにより、各リポソームの表面にオクタアルギニン（総脂質の５モル％）を導入した。なお、各リポソームの表面にオクタアルギニンを導入することにより、全てのリポソームの細胞内移行経路は統一される（マクロピノサイトーシス）。【００９７】  各リポソーム（ＤＮＡ０．４μｇ相当）を懸濁した０．２５ｍＬの血清不含ＤＭＥＭ培地を、２４ウェルプレートで培養したＮＩＨ３Ｔ３細胞（４×１０４細胞／ウェル）に添加し、３７℃で３時間インキュベートした。３時間後、１０％ウシ胎児血清を含む培地１ｍＬを添加し、さらに４５時間インキュベートした。その後、細胞を溶解し、細胞溶解液にルシフェラーゼ活性測定試薬（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を加え、ルシフェラーゼ活性をルミノメーター（ＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒＰＳＮ、ＡＴＴＯ）を用いて測定した。細胞溶解液中のタンパク質量はＢＣＡタンパク質定量キット（ＰＩＥＲＣＥ、ロックフォード（ＩＬ））を使用して測定した。【００９８】  その結果を図３に示す。図３に示すように、リポソームを構成する脂質膜の組成、数等を変化させることにより、リポソームの機能（遺伝子導入能力）が変化することが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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