【手続補正書】
【提出日】令和2年5月15日(2020.5.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）タンパク質またはＢｏＮＴの受容体結合ドメインを含むポリペプチドを溶液から単離及び精製するのに使用するための、
異種親和性部分に共有結合した、非毒性非赤血球凝集素（ＮＴＮＨＡ）ポリペプチド
を含む、分子。
【請求項２】
前記ＮＴＮＨＡ及び親和性部分が融合タンパク質として発現される、請求項１に記載の分子。
【請求項３】
ｉ）前記親和性部分が、ＮＴＮＨＡアミノ酸配列のＮ末端、ＮＴＮＨＡアミノ酸配列のＣ末端、及び前記ＮＴＮＨＡアミノ酸配列の内部から成る群から選択される位置に位置する；
ｉｉ）前記親和性部分が、約ｐＨ６〜約ｐＨ８の条件下で結合標的に効果的に結合する；及び／または
ｉｉｉ）前記親和性部分が、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、Ｃ−ｍｙｃタグ、キチン結合ドメイン、ストレプトアビジン結合タンパク質（ＳＢＰ）、セルロース結合ドメイン、カルモジュリン結合ペプチド、Ｓ−ｔａｇ、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩ、ＦＬＡ、プロテインＡ、プロテインＧ、ヒスチジンアフィニティータグ（ＨＡＴ）、ポリ−Ｈｉｓ、及びマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）から成る群から選択される、
請求項１〜２のいずれか１項に記載の分子。
【請求項４】
ｉ）前記ＮＴＮＨＡが、血清型Ｂ、Ａ、Ｃ１、Ｄ、Ｅ、Ｆ、またはＧ由来である；または
ｉｉ）前記ＮＴＮＨＡが血清型Ｂ由来である、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の分子。
【請求項５】
前記分子が、適合性のボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）またはその受容体結合ドメインを含むポリペプチドと複合体を形成している、請求項１〜４のいずれか１項に記載の分子。
【請求項６】
ｉ）前記分子が前記親和性部分を介して結合標的にさらに結合している；または
ｉｉ）前記分子が前記親和性部分を介して結合標的にさらに結合しており、かつ前記結合標的がマトリックスに安定的に結合している、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の分子。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の分子を含む、水溶液。
【請求項８】
請求項２〜６のいずれか１項に記載のＮＴＮＨＡ及び親和性部分の融合タンパク質をコードする、核酸。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項１０】
請求項８に記載の核酸または請求項９に記載の発現ベクターを含みかつ発現する、宿主細胞。
【請求項１１】
ｉ）適合性のボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）をさらに発現する；
ｉｉ）原核生物または真核生物である；
ｉｉｉ）細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、または両生類細胞である；
ｉｖ）適合性のボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）をさらに発現し、かつ原核生物または真核生物である；または
ｖ）適合性のボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）をさらに発現し、かつ細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、または両生類細胞である、
請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）を精製する方法であって、
（ａ）ＢｏＮＴを、異種親和性部分に共有結合した適合性の非毒性非赤血球凝集素（ＮＴＮＨＡ）ポリペプチドを含む分子に、前記ＢｏＮＴと前記ＮＴＮＨＡの結合に適した条件下で接触させることによって、ＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体を形成する工程
を含む、前記方法。
【請求項１３】
前記ＢｏＮＴが溶液中に存在し、前記分子がマトリックスに結合していることにより、前記溶液を前記マトリックスに接触させることで前記ＢｏＮＴが前記ＮＴＮＨＡに接触する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ｂ）前記マトリックスを洗浄して、非結合物質を除去する工程；及び
（ｃ）前記マトリックスを、前記ＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体から前記ＢｏＮＴを解離する水溶液と接触させることによって、前記マトリックスから前記ＢｏＮＴを溶出する工程
をさらに含む、
あるいは
（ｂ）前記マトリックスを洗浄して非結合物質を除去する工程；
（ｃ）前記ＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体を保存し、前記ＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体内の前記ＢｏＮＴを切断するのに適切な条件下で、前記マトリックスをプロテアーゼと接触させる工程；
（ｄ）前記マトリックスを洗浄して前記プロテアーゼ及び非結合物質を除去する工程；及び
（ｅ）前記マトリックスを、前記ＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体から前記切断されたＢｏＮＴを解離させる水溶液と接触させることにより、前記マトリックスから前記切断されたＢｏＮＴを溶出する工程
をさらに含む、
請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記マトリックスが前記親和性部分の結合標的に連結され、かつ前記分子が、前記親和性部分と前記結合標的との相互作用を介して前記マトリックスに非共有結合している、請求項１３〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記水溶液が≧７．５のｐＨを有する、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
ｉ）前記ＢｏＮＴを含む前記溶液が、ＢｏＮＴ発現細胞に由来する清澄化細胞抽出物である；または
ｉｉ）前記ＢｏＮＴを含む前記溶液が、ＢｏＮＴ発現細胞に由来する清澄化細胞抽出物であり、かつ前記清澄化細胞抽出物が、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）をさらに含む、
請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
結合に適切な前記条件が、生理学的イオン強度及び＜７．５のｐＨを有する結合緩衝液という環境下で前記ＢｏＮＴを接触させることを含む、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記洗浄が、＜７．５のｐＨを有する生理学的イオン強度の洗浄緩衝液による、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
ｉ）前記結合緩衝液及び／または洗浄緩衝液が、１００〜２００ｍＭのＫＣｌまたはＮａＣｌである；
ｉｉ）前記結合緩衝液及び／または洗浄緩衝液が約６のｐＨを有する；
ｉｉｉ）前記結合緩衝液及び／または洗浄緩衝液が、５０ｍＭのＭＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６を含む；
ｉｖ）前記水溶液が、約５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌの溶出緩衝液である；及び／または
ｖ）前記水溶液が約ｐＨ８の溶出緩衝液である、
請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
ｉ）前記親和性部分が、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、Ｃ−ｍｙｃタグ、キチン結合ドメイン、ストレプトアビジン結合タンパク質（ＳＢＰ）、セルロース結合ドメイン、カルモジュリン結合ペプチド、Ｓ−ｔａｇ、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩ、ＦＬＡ、プロテインＡ、プロテインＧ、ヒスチジンアフィニティータグ（ＨＡＴ）、ポリ−Ｈｉｓ、及びマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）から成る群から選択される；及び／または
ｉｉ）前記親和性部分がＧＳＴであり、前記結合標的がグルタチオンである、
請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
ｉ）前記プロテアーゼがトリプシンまたはＬｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼである；
ｉｉ）前記プロテアーゼが、前記ＮＴＮＨＡに対して約１：２〜約１：１０００のモル比で添加される；
ｉｉｉ）前記プロテアーゼを室温でマトリックスに接触させる；及び／または
ｉｖ）前記プロテアーゼを前記マトリックスに約１０分間〜１８時間接触させる、
請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記分子がグルタチオン被覆マトリックスに結合しており、前記親和性部分がグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼであり；
接触させる工程である工程（ａ）が、
前記ＢｏＮＴを含有する清澄化細胞抽出物を、約６のｐＨを有する結合緩衝液中で、前記マトリックスと接触させる工程であって、それによって前記ＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体を形成する、工程；
を含み、かつさらに
前記方法が以下の工程：
（ｂ）約６のｐＨを有する洗浄緩衝液で前記マトリックスを洗浄し、それによって非結合物質を除去する工程；及び
（ｃ）ｐＨが≧７．５である溶出緩衝液と前記マトリックスを接触させることにより、前記マトリックスから前記ＢｏＮＴを溶出し、それにより、前記ＢｏＮＴを前記ＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体から解離させる、工程；
を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記分子がグルタチオン被覆マトリックスに結合しており、前記親和性部分がグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼであり；
接触させる工程である工程（ａ）が、
前記ＢｏＮＴを含有する清澄化細胞抽出物を、約６のｐＨを有する結合緩衝液中で、前記マトリックスと接触させる工程であって、それによってＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体を形成する、工程；
を含み、かつさらに
前記方法が以下の工程：
（ｂ）約６のｐＨを有する洗浄緩衝液で前記マトリックスを洗浄し、それによって非結合物質を除去する工程；
（ｃ）約６のｐＨを有する緩衝液中で前記マトリックスをプロテアーゼと接触させることにより、前記ＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体内の前記ＢｏＮＴを切断する工程；
（ｄ）約６のｐＨを有する洗浄緩衝液で前記マトリックスを洗浄することによって前記プロテアーゼ及び非結合物質を除去する工程；及び
（ｅ）ｐＨが≧７．５である溶出緩衝液と前記マトリックスを接触させることにより、前記ＢｏＮＴを前記マトリックスから溶出し、それにより、前記ＢｏＮＴを前記ＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体から解離させる工程
を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
ｉ）前記結合緩衝液及び／または洗浄緩衝液が、５０ｍＭのＭＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む；
ｉｉ）前記結合緩衝液及び／または洗浄緩衝液が、５０ｍＭのＭＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌを含み、かつ前記結合緩衝液が、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）をさらに含む；
ｉｉｉ）前記溶出緩衝液が５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含み、約８のｐＨを有する；
ｉｖ）前記グルタチオン被覆マトリックスがグルタチオン結合アガロースビーズである、または前記グルタチオン被覆マトリックスがカラムである；
ｖ）前記グルタチオン被覆マトリックスが、約５ｍｇ／ｍｌの結合ＮＴＮＨＡを有する；及び／または
ｖｉ）前記プロテアーゼがトリプシンまたはＬｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼである、
請求項２３または２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
ボツリヌス神経毒素の受容体結合ドメイン（Ｈｃポリペプチド）を含むポリペプチドを精製する方法であって、以下の工程：
（ａ）前記Ｈｃポリペプチドを含む溶液を、前記ＮＴＮＨＡを前記Ｈｃポリペプチドに結合させてＮＴＮＨＡ−Ｈｃポリペプチド複合体を形成するのに適した条件下で、それに適合する非毒性非赤血球凝集素（ＮＴＮＨＡ）が結合したマトリックスに接触させる工程；
（ｂ）前記マトリックスを洗浄して非結合物質を除去する工程；
（ｃ）前記マトリックスを、前記ＮＴＮＨＡ−Ｈｃポリペプチド複合体から前記Ｈｃポリペプチドを解離させる水溶液と接触させることによって、前記マトリックスから前記Ｈｃポリペプチドを溶出する工程
を含む、前記方法。
【請求項２７】
前記Ｈｃポリペプチドが、ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）ポリペプチドである、または前記Ｈｃポリペプチドが、キメラボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）ポリペプチドである、
請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＢｏＮＴまたは前記ポリペプチドが、クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）血清型Ｂ（Ｂ−Ｈｃ）の改変受容体結合ドメインを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の分子。
【請求項２９】
前記ＢｏＮＴまたは前記ポリペプチドが、クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）血清型Ｂ（Ｂ−Ｈｃ）の改変受容体結合ドメインを含む、請求項１０もしくは１１に記載の宿主細胞。
【請求項３０】
前記ＢｏＮＴまたは前記ポリペプチドが、クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）血清型Ｂ（Ｂ−Ｈｃ）の改変受容体結合ドメインを含む、請求項１５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）ポリペプチドを精製する方法における、請求項１〜６のいずれか１項に記載の分子の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
本発明の別の態様は、方法またはボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）ポリペプチドの精製において、本明細書に記載される分子の使用に関する。
[本発明1001]
異種親和性部分に共有結合した、非毒性非赤血球凝集素（ＮＴＮＨＡ）ポリペプチド
を含む、分子。
[本発明1002]
前記ＮＴＮＨＡ及び親和性部分が融合タンパク質として発現される、本発明1001の分子。
[本発明1003]
前記親和性部分が、ＮＴＮＨＡアミノ酸配列のＮ末端、ＮＴＮＨＡアミノ酸配列のＣ末端、及び前記ＮＴＮＨＡアミノ酸配列の内部から成る群から選択される位置に位置する、本発明1001〜1002のいずれかの分子。
[本発明1004]
前記親和性部分が、約ｐＨ6〜約ｐＨ8の条件下で結合標的に効果的に結合する、本発明1001〜1003のいずれかの分子。
[本発明1005]
前記親和性部分が、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、Ｃ−ｍｙｃタグ、キチン結合ドメイン、ストレプトアビジン結合タンパク質（ＳＢＰ）、セルロース結合ドメイン、カルモジュリン結合ペプチド、Ｓ−ｔａｇ、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩ、ＦＬＡ、プロテインＡ、プロテインＧ、ヒスチジンアフィニティータグ（ＨＡＴ）、ポリ−Ｈｉｓ、及びマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）から成る群から選択される、本発明1001〜1004のいずれかの分子。
[本発明1006]
前記ＮＴＮＨＡが、血清型Ｂ、Ａ、Ｃ1、Ｄ、Ｅ、Ｆ、またはＧ由来である、本発明1001〜1005のいずれかの分子。
[本発明1007]
前記ＮＴＮＨＡが血清型Ｂ由来である、本発明1001〜1006のいずれかの分子。
[本発明1008]
前記分子が、適合性のボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）またはその受容体結合ドメインを含むポリペプチドと複合体を形成している、本発明1001〜1007のいずれかの分子。
[本発明1009]
前記ＢｏＮＴまたは前記ポリペプチドが、クロストリジアル・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）血清型Ｂ（Ｂ−Ｈｃ）の改変受容体結合ドメインを含む、本発明1008の分子。
[本発明1010]
前記親和性部分を介して結合標的にさらに結合している、本発明1001〜1009のいずれかの分子。
[本発明1011]
前記結合標的がマトリックスに安定的に結合している、本発明1009の分子。
[本発明1012]
本発明1001〜1011のいずれかの分子を含む、水溶液。
[本発明1013]
本発明1002〜1007のいずれかの機能性ＮＴＮＨＡ及び親和性部分の融合タンパク質をコードする、核酸。
[本発明1014]
本発明1013の核酸を含む、発現ベクター。
[本発明1015]
本発明1013〜1014のいずれかの核酸を含みかつ発現する、宿主細胞。
[本発明1016]
適合性のボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）をさらに発現する、本発明1014の宿主細胞。
[本発明1017]
前記ＢｏＮＴが、クロストリジアル・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）血清型Ｂ（Ｂ−Ｈｃ）の改変受容体結合ドメインを含む、本発明1016の宿主細胞。
[本発明1018]
原核生物または真核生物である、本発明1015〜1016のいずれかの宿主細胞。
[本発明1019]
細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、または両生類細胞である、本発明1015〜1016のいずれかの宿主細胞。
[本発明1020]
ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）を精製する方法であって、
（ａ）ＢｏＮＴを適合性の非毒性非赤血球凝集素（ＮＴＮＨＡ）に、前記ＢｏＮＴと前記ＮＴＮＨＡの結合に適した条件下で接触させることによって、ＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体を形成する工程
を含む、前記方法。
[本発明1021]
前記ＢｏＮＴが溶液中に存在し、前記ＮＴＮＨＡがマトリックスに結合していることにより、前記溶液を前記マトリックスに接触させることで前記ＢｏＮＴが前記ＮＴＮＨＡに接触する、本発明1020の方法。
[本発明1022]
（ｂ）前記マトリックスを洗浄して、非結合物質を除去する工程、及び
（ｃ）前記マトリックスを、前記ＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体から前記ＢｏＮＴを解離する水溶液と接触させることによって、前記マトリックスから前記ＢｏＮＴを溶出する工程
をさらに含む、本発明1021の方法。
[本発明1023]
（ｂ）前記マトリックスを洗浄して非結合物質を除去する工程、
（ｃ）前記ＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体を保存し、前記ＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体内の前記ＢｏＮＴを切断するのに適切な条件下で、前記マトリックスをプロテアーゼと接触させる工程、
（ｄ）前記マトリックスを洗浄して前記プロテアーゼ及び非結合物質を除去する工程、ならびに
（ｅ）前記マトリックスを、前記ＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体から前記ＢｏＮＴを解離させる水溶液と接触させることにより、前記マトリックスから前記ＢｏＮＴを溶出する工程
をさらに含む、本発明1021の方法。
[本発明1024]
前記ＮＴＮＨＡが親和性部分に共有結合しており、前記マトリックスが前記親和性部分の結合標的に連結され、かつ前記ＮＴＮＨＡが、前記親和性部分と前記結合標的との相互作用を介して前記マトリックスに非共有結合している、本発明1021〜1023の方法。
[本発明1025]
前記ＢｏＮＴが、クロストリジアル・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）血清型Ｂ（Ｂ−Ｈｃ）の改変受容体結合ドメインを含む、本発明1020〜1024の方法。
[本発明1026]
前記水溶液が≧7．5のｐＨを有する、本発明1022または1023の方法。
[本発明1027]
前記ＢｏＮＴを含む前記溶液が、ＢｏＮＴ発現細胞に由来する清澄化細胞抽出物である、本発明1021〜1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
前記清澄化細胞抽出物が、1ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）をさらに含む、本発明1027の方法。
[本発明1029]
結合に適切な条件が、生理学的イオン強度及び＜7．5のｐＨを有する結合緩衝液という環境下で前記ＢｏＮＴを接触させることを含む、本発明1020〜1027のいずれかの方法。
[本発明1030]
洗浄が、＜7．5のｐＨを有する生理学的イオン強度の洗浄緩衝液による、本発明1020〜1029のいずれかの方法。
[本発明1031]
前記結合緩衝液及び／または洗浄緩衝液が、100〜200ｍＭのＫＣｌまたはＮａＣｌである、本発明1029または1030の方法。
[本発明1032]
前記結合緩衝液及び／または洗浄緩衝液が約6のｐＨを有する、本発明1029〜1031のいずれかの方法。
[本発明1033]
前記結合緩衝液及び／または洗浄緩衝液が、50ｍＭのＭＥＳ、150ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ6を含む、本発明1029〜1032のいずれかの方法。
[本発明1034]
前記水溶液が、約50ｍＭトリス、150ｍＭ  ＮａＣｌの溶出緩衝液である、本発明1029〜1033のいずれかの方法。
[本発明1035]
前記水溶液が約ｐＨ8の溶出緩衝液である、本発明1029〜1034のいずれかの方法。
[本発明1036]
前記親和性部分が、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、Ｃ−ｍｙｃタグ、キチン結合ドメイン、ストレプトアビジン結合タンパク質（ＳＢＰ）、セルロース結合ドメイン、カルモジュリン結合ペプチド、Ｓ−ｔａｇ、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩ、ＦＬＡ、プロテインＡ、プロテインＧ、ヒスチジンアフィニティータグ（ＨＡＴ）、ポリ−Ｈｉｓ、及びマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）から成る群から選択される、本発明1024〜1035のいずれかの方法。
[本発明1037]
前記親和性部分がＧＳＴであり、前記結合標的がグルタチオンである、本発明1024〜1036のいずれかの方法。
[本発明1038]
前記プロテアーゼがトリプシンまたはＬｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼである、本発明1024〜1037のいずれかの方法。
[本発明1039]
前記プロテアーゼが、前記ＮＴＮＨＡに対して約1：2〜約1：1000のモル比で添加される、本発明1024〜1038のいずれかの方法。
[本発明1040]
前記プロテアーゼを室温でマトリックスに接触させる、本発明1024〜1039のいずれかの方法。
[本発明1041]
前記プロテアーゼを前記マトリックスに約10分間〜18時間接触させる、本発明1024〜1039のいずれかの方法。
[本発明1042]
ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）を精製する方法であって、
（ａ）前記ＢｏＮＴを含有する清澄化細胞抽出物を、約6のｐＨを有する結合緩衝液中で、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼに融合した適合性の非毒性非赤血球凝集素（ＮＴＮＨＡ）が結合しているグルタチオン被覆マトリックスと接触させ、それによってＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体を形成する工程、
（ｂ）約6のｐＨを有する洗浄緩衝液で前記マトリックスを洗浄し、それによって非結合物質を除去する工程、
（ｃ）ｐＨが≧7．5である溶出緩衝液と前記マトリックスを接触させることにより、前記マトリックスから前記ＢｏＮＴを溶出し、それにより、前記ＢｏＮＴを前記ＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体から解離させる工程
を含む、前記方法。
[本発明1043]
ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）を精製する方法であって、
（ａ）前記ＢｏＮＴを含有する清澄化細胞抽出物を、約6のｐＨを有する結合緩衝液中で、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼに融合した適合性の非毒性非赤血球凝集素（ＮＴＮＨＡ）が結合しているグルタチオン被覆マトリックスと接触させ、それによってＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体を形成する工程、
（ｂ）約6のｐＨを有する洗浄緩衝液で前記マトリックスを洗浄し、それによって非結合物質を除去する工程、
（ｃ）約6のｐＨを有する緩衝液中で前記マトリックスをプロテアーゼと接触させることにより、前記ＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体内の前記ＢｏＮＴを切断する工程、
（ｄ）約6のｐＨを有する洗浄緩衝液で前記マトリックスを洗浄することによって前記プロテアーゼ及び非結合物質を除去する工程、
（ｅ）ｐＨが≧7．5である溶出緩衝液と前記マトリックスを接触させることにより、前記ＢｏＮＴを前記マトリックスから溶出し、それにより、前記ＢｏＮＴを前記ＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体から解離させる工程
を含む、前記方法。
[本発明1044]
前記ＢｏＮＴが、クロストリジアル・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）血清型Ｂ（Ｂ−Ｈｃ）の改変受容体結合ドメインを含む、本発明1042または1043のいずれかの方法。
[本発明1045]
前記結合緩衝液及び／または洗浄緩衝液が、50ｍＭのＭＥＳ、150ｍＭのＮａＣｌを含む、本発明1042または1043のいずれかの方法。
[本発明1046]
前記結合緩衝液が、1ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）をさらに含む、本発明1045の方法。
[本発明1047]
前記溶出緩衝液が50ｍＭトリス、150ｍＭ  ＮａＣｌを含み、約8のｐＨを有する、本発明1042〜1046のいずれかの方法。
[本発明1048]
前記グルタチオン被覆マトリックスがグルタチオン結合アガロースビーズである、本発明1042〜1047のいずれかの方法。
[本発明1049]
前記グルタチオン被覆マトリックスがカラムである、本発明1042〜1047のいずれかの方法。
[本発明1050]
前記グルタチオン被覆マトリックスが、約5ｍｇ／ｍｌの結合ＮＴＮＨＡを有する、本発明1042〜1049の方法。
[本発明1051]
前記プロテアーゼがトリプシンまたはＬｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼである、本発明1043〜1050のいずれかの方法。
[本発明1052]
ボツリヌス神経毒素の受容体結合ドメイン（Ｈｃポリペプチド）を含むポリペプチドを精製する方法であって、
（ａ）前記Ｈｃポリペプチドを含む溶液を、前記ＮＴＮＨＡを前記Ｈｃポリペプチドに結合させてＮＴＮＨＡ−Ｈｃポリペプチド複合体を形成するのに適した条件下で、それに適合する非毒性非赤血球凝集素（ＮＴＮＨＡ）が結合したマトリックスに接触させる工程、
（ｂ）前記マトリックスを洗浄して非結合物質を除去する工程、
（ｃ）前記マトリックスを、前記ＮＴＮＨＡ−Ｈｃポリペプチド複合体から前記Ｈｃポリペプチドを解離させる水溶液と接触させることによって、前記マトリックスから前記Ｈｃポリペプチドを溶出する工程
を含む、前記方法。
[本発明1053]
前記Ｈｃポリペプチドの受容体結合ドメインが、クロストリジアル・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）血清型Ｂ（Ｂ−Ｈｃ）の改変受容体結合ドメインである、本発明1052の方法。
[本発明1054]
前記Ｈｃポリペプチドが、ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）ポリペプチドである、本発明1052〜1053の方法。
[本発明1055]
前記Ｈｃポリペプチドが、キメラボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）ポリペプチドである、本発明1052〜1053の方法。
[本発明1056]
ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）ポリペプチドを精製する方法における、本発明1001〜1019のいずれかの分子の使用。