(57)【要約】  本発明は、組み換え微生物、より具体的には溶剤生産微生物、より具体的にはクロストリジウム・アセトブチリカムに関して、サッカロファガス・デグラダンスのセルラーゼＣｅｌ５Ｈ及びその相同体、その機能的断片及び／又は変異体並びにその改変形態の適用に関する。本発明は、推定上のセルロース結合モジュール機能を有するＣｅｌ５Ｈセルラーゼの新規のドメイン、及びセルロース含有基質の脱重合のためのキメラタンパク質におけるそのドメインの使用も特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロースの分解が可能である、サッカロファガス・デグラダンス２−４０株のＣｅｌ５Ｈポリペプチド若しくはその相同体、又は前記Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくは前記相同体の機能的断片及び／又は変異体を発現する組み換え細菌。
【請求項２】
微生物中での発現を可能にする調節配列に操作可能に結合した、Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくはその相同体をコードする組み換え核酸分子、又は前記Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくは前記相同体の機能的断片及び／又は変異体をコードする組み換え核酸分子を含む、請求項１に記載の組み換え細菌。
【請求項３】
溶剤生産細菌、より具体的にはエタノール生産細菌である、請求項１又は２に記載の組み換え細菌。
【請求項４】
クロストリジウム・アセトブチリカムである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組み換え細菌。
【請求項５】
Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくはその相同体、又は前記Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくは前記相同体の機能的断片及び／又は変異体が、グリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）触媒ドメイン、炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）ドメイン、ドッケリンドメイン等のコヒーシン結合ドメイン、及びセルロソームのスキャフォルディンタンパク質の親水性（Ｘモジュール）ドメインから選択された、該Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド又はその相同体に対して非相同の１つ又は複数のドメインと融合した、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組み換え細菌。
【請求項６】
Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくはその相同体、又は前記Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくは前記相同体の機能的断片及び／又は変異体、並びに任意でセルロースを含有する物質を分解可能な１つ又は複数の酵素が、ハイブリッドセルロソーム及び／若しくは共有結合セルロソーム又はミニセルロソーム中に含まれる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組み換え細菌。
【請求項７】
サッカロファガス・デグラダンス２−４０株のＣｅｌ５Ｈポリペプチドの単離ドメイン（ＤＺドメイン）（前記Ｃｅｌ５Ｈポリペプチドのアミノ酸４９６〜アミノ酸５９６）若しくはそれに相同な単離ドメイン、又は前記ＤＺドメイン若しくは前記相同ドメインの機能的断片及び／又は変異体。
【請求項８】
構造ＥＰＲ−ＤＺ、構造ＣＢＭ６−ＥＰＲ−ＤＺ又は構造ＰＳＬ−ＣＢＭ６−ＥＰＲ−ＤＺ（ここで、ＥＰＲはグルタミン酸−プロリンリッチ領域を表し、ＰＳＬはポリセリンリンカーを表す）を有するＣｅｌ５Ｈポリペプチドの単離断片、又はその相同体若しくは変異体の単離断片。
【請求項９】
請求項７に記載の単離ドメイン又はその機能的断片及び／若しくは変異体、又はＣｅｌ５Ｈポリペプチドの請求項８に記載の単離断片を含み、並びにＧＨ触媒ドメイン、ＣＢＭドメイン、ドッケリンドメイン等のコヒーシン結合ドメイン及びセルロソームのスキャフォルディンタンパク質の親水性（Ｘモジュール）ドメインから選択された、Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド又はその相同体に対して非相同の１つ又は複数のドメインをさらに含む、キメラポリペプチド。
【請求項１０】
請求項７に記載の単離ドメイン又はその機能的断片及び／若しくは変異体、又はＣｅｌ５Ｈポリペプチドの請求項８に記載の単離断片、又は請求項９に記載のキメラポリペプチドをコードする組み換え核酸。
【請求項１１】
宿主細菌中での発現を可能にする調節配列をさらに含む、請求項１０に記載の組み換え核酸。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の組み換え核酸で形質転換した宿主細菌。
【請求項１３】
クロストリジウム・アセトブチリカムである請求項１２に記載の宿主細菌。
【請求項１４】
セルロースを含む物質を分解する方法であって、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組み換え細菌によって又は請求項７に記載の単離ドメイン又はその機能的断片及び／若しくは変異体によって、又はＣｅｌ５Ｈポリペプチドの請求項８に記載の単離断片によって、又は請求項９に記載のキメラポリペプチドによって、又は請求項９に記載のキメラポリペプチドによって、又は請求項１２又は１３に記載の宿主細菌と前記物質を接触させることを含む、方法。
【請求項１５】
セルロースを含む物質から溶剤、燃料又は化学中間体を生産する方法であって、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組み換え微生物又は請求項１１若しくは１２に記載の宿主細菌で前記物質を処理することを含む、方法。
【請求項１６】
前記物質が結晶性セルロースを含んでいるか、又はそれについて濃縮されている、請求項１４又は１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオテクノロジー及び遺伝子工学の分野に関し、特に好適な酵素物質及びそれを発現する微生物を用いて、セルロース系材料及びリグノセルロース系材料を利用する戦略に関する。より具体的には、本発明は溶剤生産微生物に関して、サッカロファガス・デグラダンス（Saccharophagus degradans）のセルラーゼＣｅｌ５Ｈ及びその相同体、機能的断片及び／又は変異体の適用に加えて、新規ドメイン、並びにＣｅｌ５Ｈ及びその相同体に由来する試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロース系材料及びリグノセルロース系材料は植物バイオマスの主成分であり、その中に見られるセルロースポリマーは、グルコース又は他の発酵性単糖類及びオリゴ糖類（エタノール、アセトン又はブタノール等の有用な溶剤を産生する溶剤生産微生物によって代謝することができる）の重要な供給源をもたらすことができる。
【０００３】
セルロースポリマーは、一般にセルロース分解性酵素又はセルラーゼとして知られるセルロース脱重合酵素によって加水分解することができる。例えば、天然セルロースの加水分解は主に以下の４つのセルラーゼ型が関与する：セロビオヒドロラーゼ（１，４−β−Ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼ、ＥＣ  ３．２．１．９１）、エンド−β−１，４−グルカナーゼ（エンド−１，４−β−Ｄ−グルカン４−グルカノヒドロラーゼ、ＥＣ  ３．２．１．４）、エンド−プロセッシブセルラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４．／３．２．１．９１）及びβ−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２１）。セルラーゼ及び関連酵素は、食品産業、ビール産業、ワイン産業、動物飼料産業、織物の生産及び洗浄産業、紙パルプ工業、農産業等を含む様々なバイオテクノロジーの領域で広く利用されている（概要については、非特許文献１を参照されたい）。
【０００４】
セルラーゼは、その特性の点で異なる場合がある（例えば特に、エンドグルカナーゼとして働く場合も又はプロセッシブエキソグルカナーゼとして働く場合もあり、様々な長さのモノマー又はオリゴマーを生成することがあり、結晶性セルロース、半結晶性セルロース、非結晶性セルロース又はヘミセルロース等といった異なるセルロース形態を加水分解する点で対照的な能力を有することがあり、セルロース基質に対する異なる結合強度、異なる動態パラメータ等を示すことがある）。したがって、これらの酵素の興味深い特性を根底に持つ機能的部分又はそのドメインを同定するように、セルラーゼのさらなる特徴づけを大幅な努力をして行う必要がある。かかる機能的ドメインは、有利には、他のセルラーゼ又はそのドメインと組み合わせて所望の活性を有するキメラ酵素を生成することができる。
【０００５】
さらに、溶剤生産微生物におけるセルラーゼの組み換え発現（直接セルロース含有材料からこれらの微生物によって、とりわけエタノールを含む有用な溶剤の産生を可能にすること）は、まだ満足に進歩していない。さらなる改善を達成するために、かかる適用に特に適切な又は有利なセルラーゼを、認知し特徴づけて選択する必要がある。
【０００６】
ミクロビフルバー・デグラダンス（Microbifulber degradans）２−４０株として従来より既知であり、アクセッション番号ＡＴＣＣ  ４３９６１下でアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された、サッカロファガス・デグラダンス２−４０株は、とりわけセルロースを含む少なくとも１０の異なる複合多糖類を分解することができる海洋性γ−プロテオバクテリアである（非特許文献２、非特許文献３）。
【０００７】
サッカロファガス・デグラダンスのゲノムは配列決定され、そのセルラーゼシステムは同定され、多くのものの中でもＣｅｌ５Ｈと称されるセルラーゼを含む（非特許文献４）。さらに、特許文献１は、サッカロファガス・デグラダンスからのセルロース分解タンパク質を発現するエタノール生産細菌を含む組み換え微生物を一般的に企図する。しかしながら、サッカロファガス・デグラダンスによって発現された酵素の活性のみが実証されており、エタノール生産細菌において発現させた場合、これらの酵素のいずれかが適切に機能するかどうかは明らかではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００７／０２９２９２９号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Bhat 2000. Biotechnical Advances 18: 355-383
【非特許文献２】Andrykovitch & Marx 1988. Appl Environ Microbiol 54: 3-4
【非特許文献３】Ensor et al. 1999. J IndMicrobiol Biotechnol 23: 123-126
【非特許文献４】Taylor et al. 2006. J Bacteriol 188: 3849-61
【発明の概要】
【００１０】
本発明者は、サッカロファガス・デグラダンス２−４０株のＣｅｌ５Ｈセルラーゼの構造及び活性の広範囲な特徴づけを行い、Ｃｅｌ５Ｈが結晶性セルロースに対して上昇した活性を示すことを最終的に決定した。したがって、Ｃｅｌ５Ｈは、溶剤を産生する（溶剤生産）微生物における、より具体的にはクロストリジウム・アセトブチリカム（C. acetobutylicum）を含むクロストリジウム種のエタノール生産細菌等のエタノール生産微生物における異種生産のために有利である。したがって、これらの微生物におけるＣｅｌ５Ｈの発現（及び任意で分泌）は、結晶性セルロース、半結晶性セルロース又は非結晶性セルロースを含んでいるか、又はそれについて濃縮されているセルロース基質上でのそれらの増殖を可能にし、それによってセルロース含有基質からのエタノール等の有用な溶剤の直接的な産生を可能にする。
【００１１】
本発明者によって出されたさらなるデータから、Ｃｅｌ５Ｈは、そのグリコシドヒドロラーゼファミリー５（ＧＨ５）の触媒ドメインから期待されるように、エンドグルカナーゼではなく、エキソグルカナーゼ又はエンドプロセッシブセルラーゼとして作用する可能性が指摘された。さらに、Ｃｅｌ５Ｈは、セルロースから主としてグルコース、セロビオース及びセロトリオースを遊離すると考えられる。Ｃｅｌ５Ｈの一見したところプロセッシブな性質及び低複雑度のセルロース誘導体の生成を考慮すると、それによって、溶剤生産細菌におけるＣｅｌ５Ｈの組み換え発現は非常に有利になり得る。例えば、Ｃｅｌ５Ｈ作用の産物は、溶剤生産微生物によって直接利用されるか、又はさらなる非相同セルラーゼ（複数可）による最小限の作用を必要とし、それによって、組み換え微生物の設計は単純化され、プロセスの有効性は増加する。
【００１２】
本発明は、その様々な態様において、上述したことの意外な実現を組み込む。
【００１３】
したがって、１つの態様は、サッカロファガス・デグラダンス２−４０株のＣｅｌ５Ｈポリペプチド若しくはその相同体、又は上記Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体を発現する組み換え微生物を提供する。より具体的には、本発明は上記発現されたＣｅｌ５Ｈポリペプチドによってセルロース又はセルロース含有材料を分解可能なこのような組み換え微生物を提供する。
【００１４】
特定の実施の形態によれば、微生物は、細菌、より具体的には溶剤生産細菌である。
【００１５】
特定の実施の形態では、組み換え微生物は、上記微生物中での発現を可能にする調節配列に操作可能に結合した、Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくはその相同体をコードする組み換えか、又は上記Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体をコードする組み換え核酸分子を含む。
【００１６】
さらなる特定の実施の形態では、組み換え微生物は、１つ又は複数の溶剤、燃料及び／又は化学中間体、より具体的にはエタノール、アセトン、ブタノール、プロピオン酸、酪酸、エーテル及びグリセリンから選択された溶剤を産生する。
【００１７】
さらなる実施の形態では、組み換え溶剤生産微生物は、少なくとも又は主にエタノールを産生するものであっても、又は産生するように改変されていてもよい。エタノールの工業的重要性は、主に環境的に許容可能な燃料としてのその有用性のために急増している。
【００１８】
したがって、一実施の形態では、組み換え溶剤生産微生物はエタノール生産微生物であり得る。
【００１９】
特定の実施の形態では、組み換え微生物は細菌であり得る。一実施の形態では、組み換え溶剤生産細菌はエタノール生産細菌であり得る。代替的には、組み換え溶剤生産微生物は酵母、より具体的にはエタノール生産酵母であり得る。
【００２０】
例えば、上記細菌は、グラム陽性細菌、例えば、クロストリジウム種の細菌等であり得る。したがって、本発明には、以前は提案されていなかった、グラム陰性細菌に由来するセルラーゼをグラム陽性細菌に導入することも含まれる。代替的には、上記細菌はグラム陰性細菌であり得る。
【００２１】
特定の実施の形態では、組み換え溶剤生産微生物（好ましくはエタノール生産）微生物は、クロストリジウム種、好ましくはクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）である。これらの細菌は、溶剤（特にエタノール）を産生する細菌として秀でている。
【００２２】
一実施の形態では、上記微生物によって、Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくはその相同体、又は上記Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体を分泌することができる。このように分泌されたポリペプチドは、有利なことには、微生物が曝露されるセルロースポリマーに対して直接作用することができ、それによってこのセルロースポリマーを脱重合するか、又はそうでなければ、このセルロースポリマーと相互作用若しくはこのセルロースポリマーを変化させることができる。しかしながら、ポリペプチドを細胞内で発現させる実施の形態も企図される。例えば、そのように発現されたポリペプチドは、そうでなければ微生物によって内面化されるセルロースポリマーに対して作用することができるか、又は少なくとも微生物のごく一部分の溶解に際して放出することができる。
【００２３】
本明細書において意図される組み換え微生物は、分泌シグナル配列に操作可能に結合し、任意で１つ又は複数の追加モジュール（該微生物における分泌を可能にする）と組み合わせ、該微生物中での発現を可能にする調節配列に操作可能に結合した、Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくはそのホモログをコードする組み換えか、又は上記Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体をコードする組み換え核酸分子を含むことができる。
【００２４】
前述のように、本発明はＣｅｌ５Ｈの相同体並びに該相同体の機能的断片及び／又は変異体、並びに組み換え微生物、より具体的には溶剤生産微生物におけるそれらの使用も教示する。好ましくは、本明細書において企図されるようなＣｅｌ５Ｈ相同体は、Ｃｅｌ５ＨのＤＺドメインに相同なドメインを含むことができる。
【００２５】
特定の実施の形態は本明細書において教示されるような組み換え微生物を提供し、そこではＣｅｌ５Ｈポリペプチドの上記相同体がシュードモナス種ＮＤ１３７のＡＣＬＡポリペプチドである。
【００２６】
さらに、本発明者らによって実現されたように、天然のＣｅｌ５Ｈポリペプチドのドメイン構造はＧＨ５−ＰＳＬ−ＣＢＭ６−ＥＰＲ−ＤＺとして略述することができ、ここで、ＧＨ５はそのグリコシドヒドロラーゼファミリー５ドメインを、ＰＳＬはポリセリンリンカーを、ＣＢＭ６は炭水化物結合モジュールファミリー６ドメインを、ＥＰＲはグルタミン酸−プロリンリッチ領域を表し（この解釈に限定されない）、ＤＺは、推定上の炭水化物結合モジュールとして本発明者らによって同定されたＣ末端ドメインを表す。
【００２７】
したがって、特定の実施の形態では、本明細書において教示されるような組み換え微生物は、Ｃｅｌ５ＨのＧＨ５ドメイン、ＣＢＭ６ドメイン及びＤＺドメインから選択されるか、又はそれらに対応する１つ又は複数のドメインを含む、機能的断片を発現することができる。断片中に１つ又は複数の上記ドメインが存在することによって、それぞれのドメインに起因する機能性が断片に与えられ得る。
【００２８】
本発明は、さらに炭水化物ポリマー代謝、特にセルロース代謝において有用なさらなる機能及び活性（セルロース脱重合活性、セルロース結合活性、セルロソーム形成活性又は他の活性等）を与えることのできる１つ又は複数の非相同ドメインと融合した、Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド、その相同体、断片及び／又は変異体の改変形態を企図する。したがって、特定の実施の形態は、組み換えＣｅｌ５Ｈポリペプチド若しくはその相同体、又は上記Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体が、Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド又はその相同体に対して非相同の１つ又は複数のドメイン（グリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）触媒ドメイン、炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）ドメイン、ドッケリンドメイン等のコヒーシン結合ドメイン、及びセルロソームのスキャフォルディンタンパク質の親水性（Ｘモジュール）ドメインから選択される）と誘導した、本明細書中で教示されるような組み換え溶剤生産微生物を提供する。付加的又は代替的には、Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくはその相同体、又は上記Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体が、非相同シグナルペプチド又はその天然シグナルペプチドと融合する。
【００２９】
さらに、本発明によって、Ｃｅｌ５Ｈ又は関連ポリペプチドを、炭水化物ポリマー代謝、特にセルロース代謝において有用な他のポリペプチド又は酵素、好ましくは組み換えポリペプチド又は酵素、例えばセルロース脱重合ポリペプチド、セルロース結合ポリペプチド、セルロソーム形成ポリペプチド（例えばスキャフォルディン等）又は他のポリペプチドと共発現させることの利点も企図される。かかる共発現(及び任意で、具体的には共分泌）によって相加的又は相補的な活性及び機能を提供され、本発明の微生物によるセルロースの脱重合及び利用がより効率的となる。
【００３０】
したがって、さらなる実施の形態は、Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくはその相同体、又は上記Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体を、１つ又は複数のポリペプチド（本明細書中で「共発現ポリペプチド」とも称される）、好ましくは炭水化物ポリマー代謝（特にセルロース代謝）に関与する組み換えポリペプチド、具体的にはリグノセルロース系材料を分解することが可能な１つ又は複数の酵素、より具体的には１つ又は複数のグリコシドヒドロラーゼ、さらにより具体的には１つ又は複数のセルラーゼと共発現し、任意で共分泌する、本明細書中で教示されるような組み換え微生物を提供する。
【００３１】
特定の実施の形態では、上記１つ又は複数の共発現ポリペプチド、例えば共発現酵素、より具体的には共発現セルラーゼの触媒作用が、Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくはその相同体、又は上記Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体の酵素活性に相加的又は相補的、好ましくは相補的である。例としては限定するものではないが、第１及び第２のセルラーゼが異なる基質（例えば、結晶性セルロース、半結晶性セルロース、非結晶性セルロース又はヘミセルロース等）に選択的に作用するか、又は第１及び第２のセルラーゼが異なる産物（例えば糖モノマー及び／又はオリゴマーの異なる集団）を産生するか、又は第１のセルラーゼが第２のセルラーゼの反応産物に選択的に作用するか、若しくはその逆である等といった場合、第１のセルラーゼが第２のセルラーゼに対して相補的な活性を有するとみなされ得る。
【００３２】
さらなる実施の形態では、１つ又は複数の共発現セルラーゼは、ファミリー５、６、８、９及び４８セルラーゼから選択することができる。さらなる特定の実施の形態では、１つ又は複数の共発現セルラーゼは、クロストリジウム・セルロリティカム（Clostridium cellulolyticum）のセルラーゼのＣｅｌ４８Ｆ、Ｃｅｌ９Ｇ、Ｃｅｌ９Ｒ、Ｃｅｌ９Ｐ、Ｃｅｌ９Ｅ、Ｃｅｌ９Ｈ、Ｃｅｌ９Ｊ、Ｃｅｌ９Ｍ、Ｃｅｌ８Ｃ、Ｃｅｌ５Ｎ及びＣｅｌ５Ａ、並びにサッカロファガス・デグラダンス２−４０株のセルラーゼＣｅｌ９Ａ、Ｃｅｌ９Ｂ、Ｃｅｌ５Ｊ、Ｃｅｌ５ｌ、Ｃｅｌ５Ｆ、Ｃｅｌ５Ｄ、Ｃｅｌ５Ｂ、Ｃｅｌ９Ｇ、Ｃｅｌ５Ｅ、Ｃｅｌ５Ａ、Ｃｅｌ５Ｃ及びＣｅｌ６Ａ、並びに上記セルラーゼのいずれか１つの機能的断片及び／又は変異体から選択され得る。
【００３３】
さらなる実施の形態は、組み換え組み換えＣｅｌ５Ｈポリペプチド若しくはその相同体、又は上記Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体、並びに任意で１つ又は複数の共発現ポリペプチド、より具体的には上記で教示されるような１つ又は複数の共発現セルラーゼが、ハイブリッド及び／又は共有結合セルロソーム、又はミニセルロソーム（どちらも本明細書全体を通して「セルロソーム」総称表現に包含される）に含まれる、本明細書中で教示されるような組み換え微生物、より具体的には溶剤生産組み換え微生物を提供する。セルロソームは、特にセルロース結合活性及びセルロース脱重合活性の超分子構成をもたらすことができ、それにより炭水化物ポリマー代謝、特にセルロース代謝の効率の向上を達成する。
【００３４】
さらなる態様において、本発明は、リグノセルロース系材料若しくはセルロース系材料又はバイオマス等のセルロースを含む物質を分解する方法であって、本明細書において教示されるような組み換え微生物と上記物質を接触させることを含む、方法を提供する。特定の実施の形態では、該物質は結晶性セルロースを含んでいるか又はそれについて濃縮されている。
【００３５】
関連した態様は、リグノセルロース系材料若しくはセルロース系材料又はバイオマス等のセルロースを含む物質から溶剤、燃料又は化学中間体を生産する方法であって、本明細書において教示されるような１つ又は複数の微生物で上記物質を処理することを含む、方法を提供する。特定の実施の形態では、該物質は結晶性セルロースを含んでいるか又はそれについて濃縮されている。大部分の特定の実施の形態では、溶剤はエタノールであり、微生物はエタノール生産微生物である。
【００３６】
特定の実施の形態では、本発明の方法は、本明細書において記載されるような組み換え微生物を、結晶性セルロース、半結晶性セルロース又は非結晶性セルロースを含んでいるか、又はそれについて濃縮されているセルロース基質上で組み換え増殖させることを含み、それによりセルロース含有基質からのエタノール等の有用な溶剤の直接産生が確実となる。
【００３７】
上述の態様及び実施の形態は、主に組み換え微生物に関連して開示されているが、組み換え微生物を得るのに有用な組み換え手段及び試薬、かかる組み換え手段及び試薬を用いて組み換え微生物を得る方法、組み換え微生物において所望のポリペプチドを発現させる方法、並びに発現させたポリペプチド及びそれ自体の組み合わせ、及びそれを調製する方法に関する態様も本発明に包含されることも認識されよう。
【００３８】
したがって、さらなる態様は、サッカロファガス・デグラダンス２−４０株の単離Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくはその相同体、又は上記Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体を提供する。別の態様は、Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくはその相同体をコードする組み換えか、又は上記Ｃｅｌ５Ｈ若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体をコードする組み換え核酸分子を提供する。
【００３９】
本発明のこの態様のさらなる実施の形態は、対象となる宿主微生物中での発現を可能にする調節配列に操作可能に結合した、Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくはその相同体をコードする組み換えか、又は上記Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体をコードする組み換え核酸分子を提供する。特定の実施の形態では、上記宿主は溶剤生産微生物である。さらに特定の実施の形態では、上記宿主はこの明細書の他の部分で教示されるようなエタノール生産微生物である。本明細書において提供される組み換え核酸分子の特定の実施の形態では、Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくはその相同体をコードするか、又は上記Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体をコードする核酸配列は、宿主微生物のコドンバイアスに適合している。
【００４０】
さらなる実施の形態は、対象となる宿主微生物における、特に組み換え微生物における、より具体的には溶剤生産微生物における、より好ましくは本明細書の他の部分で教示されるようなエタノール生産微生物における分泌を可能にする分泌シグナル配列に操作可能に結合した、Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくはその相同体をコードする組み換えか、又は上記Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体をコードする組み換え核酸分子を提供する。
【００４１】
さらなる実施の形態は、対象となる宿主微生物における分泌を可能にする分泌シグナル配列に操作可能に結合し、対象となる宿主微生物における、特に溶剤生産微生物における、より具体的には本明細書の他の部分で教示されるようなエタノール生産微生物中での発現を可能にする調節配列に操作可能に結合した、Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくはその相同体をコードする組み換えか、又は上記Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体をコードする組み換え核酸分子を提供する。
【００４２】
さらなる態様は、上記で開示されるような１つ又は複数の組み換え核酸を含む、例えば、クローニングベクター、シャトルベクター及び／又は発現ベクター等のベクターである。
【００４３】
さらなる態様は、１つ又は複数の組み換え核酸又は上記されるようなベクターで形質転換した対象となる宿主微生物を提供する。一実施の形態では、微生物は、細菌、より具体的には大腸菌（Escherichia coli）、サルモネラ・ティムフィムリウム（Salmonella tymphimurium）、霊菌（Serratiamarcescens）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）及び枯草菌（Bacillussubtilis）から選択された細菌であり得る。かかる細菌は、例えば精製を目的とした組み換えポリペプチドの過剰産生に特に適切である。特定の実施の形態では、宿主微生物は溶剤生産微生物、好ましくは本明細書の他の部分で教示されるようなエタノール生産微生物である。さらなる態様は、そのように形質転換した微生物から直接得られるか、又は得ることが可能な細胞溶解物又は細胞抽出液を提供する。
【００４４】
したがって、本発明による組み換え微生物、好ましくは溶剤生産微生物、より好ましくは本明細書の他の部分で教示されるようなエタノール生産微生物を得る方法であって、本明細書において教示されるような組み換え核酸又はベクターで宿主微生物を形質転換することを含む、方法も提供される。
【００４５】
１つ又は複数のＣｅｌ５Ｈポリペプチド若しくはその相同体、又は上記Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体を産生させる（及び任意で、最も具体的にはを分泌させる）方法であって、本明細書において教示されるような１つ又は複数のそれぞれの組み換え核酸又はベクターで宿主微生物を形質転換すること、及びそれぞれのポリペプチドの発現を引き起こすのに効果的な条件下でそのように形質転換した微生物を培養又は維持することを含む、方法がさらに提供される。有利なことには、それぞれのポリペプチドは生物学的に活性のある形態で産生される。任意で、該方法はそれぞれのポリペプチドを単離する工程を含むことができる。
【００４６】
したがって、Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくはその相同体、又は上記Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体の産生（及び任意で、具体的には分泌させる）に対する、本明細書において開示されるような組み換え核酸、ベクター、又は宿主細胞の使用も企図される。好ましくは、それぞれのポリペプチドは生物学的に活性のある形態で産生される。
【００４７】
上述のポリペプチドの特定の実施の形態では、組み換え核酸、ベクター、形質転換した宿主微生物、方法及び使用法は、１つ又は複数の以下の特徴によって特徴づけられる。
Ｃｅｌ５Ｈ相同体はＣｅｌ５ＨのＤＺドメインに相同なドメインを含む、及び／又は
Ｃｅｌ５Ｈ相同体はシュードモナス種ＮＤ１３７のＡＣＬＡポリペプチドである、及び／又は
機能的断片は、Ｃｅｌ５ＨのＧＨ５ドメイン、ＣＢＭ６ドメイン及びＤＺドメインから選択されるか、又はそれらに対応する１つ又は複数のドメインを含む、及び／又は
１つ又は複数のＣｅｌ５Ｈポリペプチド若しくはその相同体、又は１つ又は複数のＣｅｌ５Ｈポリペプチド若しくは上記ホモログ相同体の機能的断片及び／若しくは変異体は、ＧＨ触媒ドメイン、ＣＢＭドメイン、ドッケリンドメイン等のコヒーシン結合ドメイン、及びセルロソームのスキャフォルディンタンパク質のＸモジュールドメインから選択された、Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド又はその相同体に対して非相同である１つ又は複数のドメインと融合する、及び／又は
１つ又は複数のＣｅｌ５Ｈポリペプチド若しくはその相同体、又は上記１つ又は複数のＣｅｌ５Ｈポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体は、炭水化物ポリマー代謝、特にセルロース代謝に関与する１つ又は複数のポリペプチド、好ましくは組み換えポリペプチド又は酵素、好ましくはリグノセルロース系材料を分解可能な１つ又は複数の酵素、より好ましくは本明細書において教示されるような１つ又は複数の非相同セルラーゼと共発現、及び任意で共分泌され得る、及び／又は
１つ又は複数のＣｅｌ５Ｈポリペプチド若しくはその相同体、又は上記Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体、並びに任意で１つ又は複数の共発現させたポリペプチド、より具体的には上で教示されるような共発現させたセルラーゼは、ハイブリッド及び／又は共有結合セルロソームに含まれる。
【００４８】
したがって、１つの態様は、Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくはその相同体、又は上記Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくは上記相同体の機能的断片及び／又は変異体を含み、炭水化物ポリマー代謝、特にセルロース代謝に関与する１つ又は複数のポリペプチド、好ましくはリグノセルロース系材料を分解可能な１つ又は複数の酵素、より好ましくは本明細書において教示されるような１つ又は複数の非相同セルラーゼをさらに含む単離組成物を提供する。上記組成物の特定の実施の形態では、列挙されたコンポーネントは、個別の又は遊離したポリペプチドとして存在する。他の実施の形態では、列挙されたポリペプチドは、ハイブリッド及び／又は共有結合セルロソームに含まれる。
【００４９】
本発明者らは、Ｃｅｌ５Ｈポリペプチドの構造及び構成の徹底解析をさらに行い、Ｃｅｌ５ＨポリペプチドのＣ末端付近に、これまでにそれ自体は同定されていない新たなドメイン（以下で「ドメインＤＺ」と称される）の存在を同定した。限定されるものではないが、本発明者のデータから、ＤＺドメインに対する推定上の炭水化物結合モジュール（及び／又はオリゴマー化モジュール機能）が示唆され、その存在が少なくとも部分的に、結晶性セルロースを脱重合するＣｅｌ５Ｈの優れた能力に関与し得ることが示される。したがって、結晶性セルロースを消化及び分解する能力を改善するために様々な酵素系においてＤＺドメイン又はＤＺドメインを含むＣｅｌ５Ｈポリペプチドの一部分を用いることができることは、本発明のさらなる実現例である。
【００５０】
したがって、さらなる態様は、サッカロファガス・デグラダンス２−４０株のＣｅｌ５Ｈポリペプチドの単離ドメイン（上記Ｃｅｌ５Ｈポリペプチドのアミノ酸４９６〜アミノ酸５９６）（ＤＺドメイン）（例えば、例示的に図１Ｃにおいて示される成熟Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド配列番号３等）若しくはそれに相同な単離ドメイン、又は上記ＤＺドメイン又は上記相同なドメインの機能的断片及び／若しくは変異体である。
【００５１】
特定の実施の形態では、Ｃｅｌ５Ｈ  ＤＺに相同なドメインは、シュードモナス種ＮＤ１３７のＡＣＬＡポリペプチドのアミノ酸４６３〜アミノ酸５５８のドメインストレッチである（例えば、例示的に図１Ｅにおいて示される成熟ＡＣＬＡポリペプチド配列番号５等）。
【００５２】
特定の実施の形態は、ＥＰＲ−ＤＺ、ＣＢＭ６−ＥＰＲ−ＤＺ又はＰＳＬ−ＣＢＭ６−ＥＰＲ−ＤＺ（ここでＥＰＲ、ＣＢＭ６及びＰＳＬは本明細書の他の部分で説明されるような意味を有する）という構造をを有するＣｅｌ５Ｈポリペプチド又はその相同体若しくは変異体の単離断片を提供する。かかる断片は有利な機能を提供するＤＺドメインを含み、任意で、かかる断片は結晶性セルロース又はヘミセルロース基質を分解する能力をさらに刺激し得るＣｅｌ５Ｈ炭水化物結合モジュールＣＢＭ６を含んでいてもよい。さらに、内在性リンカー配列は、他のポリペプチドにＤＺドメイン及び任意でＣＢＭ６ドメインを、これらのドメインの構造及び機能を保持しながら、融合させるための有利な手段を提供することができる。
【００５３】
したがって、特定の実施の形態は、Ｃｅｌ５ＨのＤＺドメインに相同なドメインを含むＡＣＬＡポリペプチドの単離断片を提供する。
【００５４】
さらに、単離ＤＺドメイン又はその機能的断片及び／若しくは変異体、又は上で教示されるような単離断片の炭水化物結合モジュールとしての使用が企図される。かかる使用によって、様々な酵素系に対して新規の炭水化物結合特性又はセルロース結合特性が与えられ得る。
【００５５】
別の態様は、最も具体的にはＣｅｌ５Ｈの単離ＤＺドメイン又はその機能的断片及び／若しくは変異体を含むか、又はＤＺドメインを含むＣｅｌ５Ｈの単離断片を含み、ＧＨ触媒ドメイン、ＣＢＭドメイン、ドッケリンドメイン等のコヒーシン結合ドメイン、及びセルロソームのスキャフォルディンタンパク質のＸモジュールドメインから選択された、Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド又はその相同体に対して非相同である１つ又は複数のドメインをさらに含むキメラポリペプチドに関する。かかるモジュールの組み合わせは、結晶性セルロース又はヘミセルロース基質に向けて有用な活性を有する新規のセルロース分解酵素の生成を可能にする。
【００５６】
他の態様は、炭水化物ポリマー代謝、特にセルロース代謝に関与する１つ又は複数のポリペプチド、好ましくはリグノセルロース系材料を分解可能な１つ又は複数の酵素、より好ましくは１つ又は複数のグリコシドヒドロラーゼ、さらにより好ましくは１つ又は複数のセルラーゼ（このポリペプチド（複数可）はＣｅｌ５Ｈポリペプチド又はその相同体に対して非相同である）に融合した、単離ＤＺドメイン又はその機能的断片及び／若しくは変異体、又はＤＺドメインを含むＣｅｌ５Ｈの単離断片を含むキメラポリペプチドを提供する。しかしながら、Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくはその相同体、又は本明細書において記載されるようなその断片及び／若しくは変異体との追加のＤＺドメイン（複数可）の融合も企図される。
【００５７】
さらなる態様は、単離ＤＺドメイン若しくはそれに相同な単離ドメイン又はその機能的断片及び／若しくは変異体をコードする組み換えか、又はＤＺドメイン若しくはその相同体を含むＣｅｌ５Ｈの単離断片をコードする組み換えか、又は上記されるようなキメラポリペプチドをコードする組み換え核酸分子を提供する。
【００５８】
本態様の特定の実施の形態は、対象となる宿主微生物における、好ましくは溶剤生産微生物における、及びより好ましくは本明細書の他の部分で教示されるようなエタノール生産微生物中での発現を可能にする調節配列に操作可能に結合した、単離ＤＺドメイン若しくはそれに相同な単離ドメイン又はその機能的断片及び／若しくは変異体をコードする組み換えか、又はＤＺドメイン若しくはその相同体を含むＣｅｌ５Ｈの単離断片をコードす組み換えか、又は上記されるようなキメラポリペプチドをコードする組み換え核酸分子を提供する。
【００５９】
さらなる実施の形態は、対象となる宿主微生物における、好ましくは溶剤生産微生物における、より好ましくは本明細書の他の部分で教示されるようなエタノール生産微生物における分泌を可能にする分泌シグナル配列に操作可能に結合した、単離ＤＺドメイン若しくはそれに相同な単離ドメイン又はその機能的断片及び／若しくは変異体をコードする組み換えか、又はＤＺドメイン若しくはその相同体を含むＣｅｌ５Ｈの単離断片をコードする組み換えか、又は上記されるようなキメラポリペプチドをコードする組み換え核酸分子を提供する。
【００６０】
本態様のいっそうさらなる実施の形態は、対象となる宿主微生物における分泌を可能にする分泌シグナル配列に操作可能に結合し、対象となる宿主微生物における、好ましくは溶剤生産微生物における、より好ましくは本明細書の他の部分で教示されるようなエタノール生産微生物中での発現を可能にする調節配列に操作可能に結合した、単離ＤＺドメイン若しくはそれに相同な単離ドメイン又はその機能的断片及び／若しくは変異体をコードする組み換えか、又はＤＺドメインもしくその相同体を含むＣｅｌ５Ｈの単離断片をコードする組み換えか、又は上記されるようなキメラポリペプチドをコードする組み換え核酸分子を提供する。
【００６１】
さらなる態様は、上述の組み換え核酸分子のいずれかを含む、例えば、クローニングベクター、シャトルベクター及び／又は発現ベクター等のベクターを提供する。
【００６２】
さらなる態様は、上記の組み換え核酸分子又はベクターで形質転換した対象となる宿主微生物を提供する。特定の実施の形態では、微生物は、細菌、より好ましくは大腸菌、サルモネラ・ティムフィムリウム、霊菌、ネズミチフス菌及び枯草菌から選択された細菌である。特定の実施の形態では、微生物は溶剤生産微生物、好ましくは本明細書の他の部分で教示されるようなエタノール生産微生物であり得る。さらなる態様は、そのように形質転換した微生物から直接得られるか又は得ることが可能な細胞溶解物又は細胞抽出液を提供する。
【００６３】
特定の実施の形態では、単離ＤＺドメイン若しくはそれに相同な単離ドメイン又はその機能的断片及び／若しくは変異体、又はＤＺドメイン若しくはその相同体を含むＣｅｌ５Ｈの単離断片、又は上記されるようなキメラポリペプチド、及び任意で炭水化物ポリマー代謝、特にセルロース代謝に関与する１つ又は複数の共発現ポリペプチドは、ハイブリッド及び／又は共有結合セルロソームに含まれ得る。
【００６４】
さらなる態様において、本発明は、リグノセルロース系材料若しくはセルロース系材料又はバイオマス等のセルロースを含む物質を分解する方法であって、単離ＤＺドメイン若しくはそれに相同な単離ドメイン又はその機能的断片及び／若しくは変異体と、又はＤＺドメイン若しくはその相同体を含むＣｅｌ５Ｈの単離断片と、又は上記されるようなキメラポリペプチドと、又はそれを発現する組み換え微生物と、上記物質を接触させることを含む、方法を提供する。一実施の形態では、該物質は結晶性セルロース又は半結晶性セルロース又は非結晶性セルロースを含んでいても、又はそれについて濃縮されていてもよい。
【００６５】
関連した態様は、リグノセルロース系材料若しくはセルロース系材料又はバイオマス等のセルロースを含む物質から溶剤、燃料又は化学中間体を生産する方法であって、上記物質を単離ＤＺドメイン若しくはそれに相同な単離ドメイン又はその機能的断片及び／若しくは変異体により、又はＤＺドメイン若しくはその相同体を含むＣｅｌ５Ｈの単離断片により、又は上記されるようなキメラポリペプチドにより、又はそれを発現する組み換え溶剤生産微生物で、処理することを含む、方法を提供する。一実施の形態では、該物質は結晶性セルロースを含んでいても、又はそれについて濃縮されていてもよい。特定の実施の形態では、溶剤、より具体的にはエタノールを生産する方法が提供され、微生物はエタノール生産微生物であり得る。
【００６６】
さらなる態様は、本明細書において記載された方法によって得られるか又は得ることが可能なセルロース分解産物及び／又は溶剤、より具体的にはエタノールを含む組成物を提供する。かかる組成物は、粗製培養培地であり得るか、又はＣｅｌ５Ｈポリペプチド（又はその相同体若しくは断片）の産物について（少なくとも）部分的に濃縮及び／又は精製され得るか、又は溶剤、燃料若しくは化学中間体について部分的に濃縮及び／又は精製され得る。特定の実施の形態では、かかる組成物は、グルコース及びセロビオース及びセロトリオース含有量の増加を特徴とする。さらなる特定の実施の形態では、グルコース、セロビオース及び／又はセロトリオースの含有量が、１０ｗｔ％超、２０ｗｔ％超、３０ｗｔ％超、４０ｗｔ％超、５０ｗｔ％超、６０ｗｔ％超、７０ｗｔ％超、８０ｗｔ％超、９０ｗｔ％超、又はそれ以上であることを組成物が提供される。
【００６７】
さらに特定の実施の形態では、かかる組成物は、対象となる溶剤、燃料又は化学中間体中の高含有量を特徴とする。さらに特定の実施の形態では、溶剤、燃料又は化学中間体の含有量が、１０ｗｔ％超、２０ｗｔ％超、３０ｗｔ％超、４０ｗｔ％超、５０ｗｔ％超、６０ｗｔ％超、７０ｗｔ％超、８０ｗｔ％超、９０ｗｔ％超、９５ｗｔ％超、又は９６ｗｔ％〜９９．９ｗｔ％である組成物が提供される。特定の実施の形態では、組成物中の溶剤、燃料又は化学中間体の濃度は、約１０ｇ／Ｌ超、好ましくは約１５ｇ／Ｌ超である。
【００６８】
本発明のこれらの及び他の態様及び実施形態は、本明細書において以下に、及び添付された特許請求の範囲においてさらに説明され、加えて非限定的な実施例によって例証される。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図Ｉ−１】図１Aを示す。例示的なコード領域の核酸配列を示した図である。
【図Ｉ−２】図１B,C,Dを示す。Bは、Ｎ末端分泌シグナル配列を含有するサッカロファガス・デグラダンス２−４０株の天然のＣｅｌ５Ｈポリペプチドの例示的なアミノ酸配列を示した図である。Cは、Ｎ末端分泌シグナル配列を含有しないサッカロファガス・デグラダンス２−４０株の天然のＣｅｌ５Ｈポリペプチドの例示的なアミノ酸配列を示した図である。Dは、Ｎ末端分泌シグナル配列を含有するシュードモナス種ＮＤ１３７の天然のＡＣＬＡタンパク質の例示的なアミノ酸配列を示した図である。
【図Ｉ−３】図１E、Fを示す。Eは、Ｎ末端分泌シグナル配列を含有しないシュードモナス種ＮＤ１３７の天然のＡＣＬＡタンパク質の例示的なアミノ酸配列を示した図である。Fは、クロストリジウム・アセトブチリカムのコドンバイアスに適合し、３’末端に６×Ｈｉｓコドンを含有する、例示的な改変したＣｅｌ５Ｈをコードする核酸配列を示した図である。
【図Ｉ−４】図１Gを示す。クロストリジウム・アセトブチリカムのコドンバイアスに適合し、Ｃ末端に６×Ｈｉｓタグを含有する、例示的な改変したＣｅｌ５Ｈアミノ酸配列を示した図である。
【図ＩＩ】図２を示す。本発明の特定の実施形態による、発現のために改変した又は改変するＣｅｌ５Ｈの様々な断片及び派生物を概略的に示した図である。Cwl5H-doc:Ｃｅｌ５Ｈ−ドッケリンCat.Module  GH5:触媒モジュールＧＨ５Legend:凡例Dockerin  module  from  clostridia:クロストリジウムからのドッケリンモジュールFamily  3a  CBM  from  clostridial  scaffoldin:クロストリジウムのスキャフォルディンからのファミリー３ａ  ＣＢＭHis  tag:ＨｉｓタグX  module  of  the  scaffoldin  CipA  from  C.acetobutylicum:クロストリジウム・アセトブチリカムからのスキャフォルディンＣｉｐＡのＸモジュール
【図ＩＩＩ】図３と４を示す。図３は、本発明の特定の実施形態による、ＣＭＣに対するＣｅｌ５Ｈの様々な形態の３７℃での活性を示した図である。図４は、本発明の特定の実施形態による、リン酸膨潤セルロースに対するＣｅｌ５Ｈの様々な形態の３７℃での活性を示した図である。図３縦軸：放出された還元糖（μＭ）横軸：時刻（分）図４縦軸：放出された可溶性糖（μＭ）横軸：時刻（分）
【図ＩＶ】図５と６を示す。図５は、本発明の特定の実施形態による、Ａｖｉｃｅｌ  ＰＨ１０１に対するＣｅｌ５Ｈの様々な形態の３７℃での活性を示した図である。図６は、本発明の特定の実施形態による、Ｃｅｌ５Ｈアビセラーゼ活性の比較をクロストリジウム・セルロリティカムからの野生型セルラーゼ及び改変セルラーゼで例証した図である。図５縦軸：放出された可溶性糖（μＭ）横軸：時刻（分）図６縦軸：３７℃でのインキュベーションの２４時間後に放出された可溶性糖（μＭ）covalent  cellulosome:共有結合セルロソーム
【図Ｖ】図７と８を示す。図７は、本発明の特定の実施形態による、Ｃｅｌ５Ｈの追加ドメインを含むクロストリジウム・セルロリティカムからのＣｅｌ５Ａの改変形態を示した概略図である。凡例については図２を参照。図８は、本発明の特定の実施形態による、Ｃｅｌ５Ｈの追加ドメインを含むクロストリジウム・セルロリティカムからのＣｅｌ５Ａの異なる改変形態によるＡｖｉｃｅｌ（２０ｍＭトリス−マレイン酸塩ｐＨ６及び１ｍＭ  ＣａＣｌ２で３．５ｇ／Ｌ）の分解を示した図である。凡例については図２を参照。図７Cat.Module  GH5:触媒モジュールＧＨ５dockerine:ドッケリン図８縦軸：遊離された可溶性糖（μＭ）横軸：時刻（時間）
【図ＶＩ】図９と１０を示す。図９は、本発明の特定の実施形態による、Ｃｅｌ５Ｈ及び少なくとも１つの他のセルラーゼ酵素によるＡｖｉｃｅｌの分解を示した図である。図１０は、本発明の特定の実施形態による、Ｃｅｌ５Ｈを含むハイブリッドミニセルロソームを示した概略図である。図９縦軸：Ａｖｉｃｅｌ分解の２４時間後に遊離された糖（μＭ）theo:理論値mesure:測定値図１０Cel5H-doc:Ｃｅｌ５Ｈ−ドッケリンCatalytic  module:触媒モジュールdockerin:ドッケリンcohesin:コヒーシンHybrid  scaffoldin:ハイブリッドスキャフォルディン
【図ＶＩＩ】図１１と１２を示す。図１１は、本発明の特定の実施形態による、３ｇ／Ｌの２ＹＴ−ＰＡＳＣ（ｐＨ５．５）を含む発酵槽中のクロストリジウム・アセトブチリカムの、ＰＡＳＣの分解、残存セロビオースの完了状態、及び細菌増殖を示した図である。クロストリジウム・アセトブチリカムのＣｅｌ５Ｈシグナルペプチド配列はクロストリジウム・セルロリティカムのＣｅｌ５Ｈシグナルペプチド配列によって置換された。図１２は、本発明の特定の実施形態による、ｐＨ５．５の２ＹＴ（ただし、いかなるＰＡＳＣも含有しない）の存在する発酵槽中の残存するセロビオースの完了状態、及びクロストリジウム・アセトブチリカムの細菌増殖を示した図である。クロストリジウム・アセトブチリカムのＣｅｌ５Ｈシグナルペプチド配列はクロストリジウム・セルロリティカムのＣｅｌ５Ｈシグナルペプチド配列によって置換された。図１１縦軸：残存する糖（ｇ／Ｌ）Celleobiose:セロビオースOD  equivalent:ＯＤ相当横軸：時刻（時間） 図１２縦軸：残存する糖（ｇ／Ｌ）Celleobiose:セロビオースOD  equivalent:ＯＤ相当横軸：時刻（時間）
【図ＶＩＩＩ】図１３を示す。図１３は、本発明の特定の実施形態による異なる構築物の概略図である。構築物は、キャリアードメイン及びシグナル配列に融合した対象となるポリペプチド（セルラーゼ「Ｃｅｌ５Ｈ」）を含む。キャリアードメインは、１つ又は２つのＸモジュール（Ｘａ）に融合した、セルロソームのスキャフォールドタンパク質からの炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ３ａ）を含む。セルラーゼＣｅｌ５Ｈは、グリコシドヒドロラーゼファミリー５ドメイン（「５」）、ポリセリンリンカー（「ｓｓｓ」）、炭水化物結合モジュールファミリー６ドメイン（「６」）、グルタミン酸−プロリンリッチ領域（「ｅｐｐｖ」）、及び推定上の炭水化物結合モジュールとして本発明者によって同定されたＣ末端ドメイン（「ＤＺ」）を含む。Cel5H  Wild-type:Ｃｅｌ５Ｈ野生型
【図ＩＸ】図１４は、対照株と比較した、野生型Ｃｅｌ５Ｈ及びキャリアードメインに融合したＣｅｌ５Ｈの分泌を示した図である。キャリアードメインは、２つの親水性ドメイン（Ｘａ）に融合した、セルロソームのスキャフォールドタンパク質からの炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ３ａ）を包含する。培養上清の活性を可溶性基質パラ−ニトロフェニル−セロビオースに対して測定した。縦軸：加水分解されたｐＮＰ−セロビオース（μｍｏｌ／Ｌ）横軸：時刻（秒）Cel5H  Wild-type:Ｃｅｌ５Ｈ野生型Control  strain:対照株
【図Ｘ】図１５ａを示す。異なるセルロース基質に対する、本発明の特定の実施形態による融合タンパク質を含む異なるタンパク質の活性を示した図である。可溶性基質パラ−ニトロフェニル−セロビオースに対するＣｅｌ５Ｈを含むタンパク質の活性である。野生型Ｃｅｌ５Ｈ（実線）、１つのＸモジュールと融合したタンパク質（ＣＢＭ−Ｘａ−５Ｈ；点線）、２つのＸモジュールと融合したタンパク質（ＣＢＭ−Ｘａ−Ｘａ−５Ｈ、破線）である。縦軸：加水分解されたｐＮＰ−セロビオース（μｍｏｌ／Ｌ）横軸：時刻（秒）Cel5H  Wild-type:Ｃｅｌ５Ｈ野生型
【図ＸＩ】図１５ｂを示す。異なるセルロース基質に対する、本発明の特定の実施形態による融合タンパク質を含む異なるタンパク質の活性を示した図である。結晶性セルロースＡｖｉｃｅｌに対する、ｃｅｌ５Ｈを含むタンパク質の活性である。線）である。縦軸：放出された可溶性糖（μＭ）横軸：時刻（時間）Cel5H  Wild-type:Ｃｅｌ５Ｈ野生型
【図ＸＩＩ】図１６を示す。本発明の特定の実施形態による、Ｃｅｌ５Ｈ及びＡＣＬＡのドメインの比較を示した概略図である。S.degradans:サッカロファガス・デグラダンスP.sp  ND137:シュードモナス種ＮＤ１３７
【発明を実施するための形態】
【００７０】
本明細書において使用される時、単数形の「１つの（a）」、「１つの（an）」及び「その（the）」は、文脈上明らかに他の指示がない限り、単数及び複数の指示対象の両方を含む。
【００７１】
「含む（comprising）」、「含む（comprises）」及び「から構成される（comprised of）」という用語は、本明細書中で使用される場合、「含む（including）」、「含む（includes）」又は「含有する（containing）」、「含有する（contains）」と同義であり、包括的又はオープンエンドであり、追加の列挙されなかった成員、エレメント又は方法工程を除外しない。
【００７２】
端点による数値範囲の列挙は、列挙された端点に加えて、それぞれの範囲内に含まれる全ての数及び端数を含む。
【００７３】
本明細書において使用される「約」という用語は、パラメータ、量、期間等といった測定可能な値を指す場合、所定値の及びその所定値から、±１０％以下、好ましくは±５％以下、より好ましくは±１％以下、さらにより好ましくは±０．１％以下の変動を包含することを、かかる変動が開示された発明の実行に適切である限りにおいて意味する。修飾語「約」が表す値自体も、具体的かつ好適に開示されることが理解される。
【００７４】
本明細書に引用された全ての文献は、それら全体が参照により本明細書に援用される。
【００７５】
特別に定義されない限り、専門用語及び科学用語を含む本発明の開示に使用される全ての用語は、本発明が属する技術分野の通常の技術を有する者（当業者）によって一般に理解される意味を有する。さらなる指針によって、用語の定義は、本発明の教示をさらに認識するために含まれる。
【００７６】
本明細書中で使用される場合、「Ｃｅｌ５Ｈ」、「Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド」又は「Ｃｅｌ５Ｈタンパク質」という用語は、当該技術分野におけるこれらの名称の下で一般に知られるサッカロファガス・デグラダンス２−４０株のポリペプチド又はタンパク質を表す（特に非特許文献４を参照）。上述の名称は特に、天然の配列を有するかかるポリペプチド（すなわち、一次配列が、サッカロファガス・デグラダンス２−４０株のＣｅｌ５Ｈタンパク質の天然に見出される又は天然に由来する一次配列と同じポリペプチド）を指す。当業者は、遺伝的多様性又は自然突然変異（複数可）に起因して、サッカロファガス・デグラダンス２−４０株の異なる亜株又は継代培養株の間でＣｅｌ５Ｈの天然の配列が異なるかもしれないことを理解する。Ｃｅｌ５Ｈの天然の配列は、転写後修飾又は翻訳後修飾に起因してさらに多様性を有し得る。したがって、天然に見出されるか又は天然に由来する全てのＣｅｌ５Ｈ配列は、「天然」と判断される。
【００７７】
上述の名称は、生物体、微生物又は細胞の一部を形成する場合の、加えてかかる源から少なくとも部分的に単離された場合のＣｅｌ５Ｈポリペプチドを包含する。この用語は、組み換え手段又は合成手段によって産生された場合のＣｅｌ５Ｈポリペプチドも包含する。
【００７８】
Ｃｅｌ５Ｈポリペプチドは通常分泌性であり、切断可能なＮ末端分泌シグナル配列を含む前駆体形態で、又は上記シグナル配列を欠損する成熟形態で存在することができる。当業者によって容易に理解される文脈に応じて、Ｃｅｌ５Ｈポリペプチドに対する本明細書における参照は、上記成熟形態及び／又は上記前駆体形態を包含することができる。
【００７９】
例示的なＣｅｌ５Ｈポリペプチドは、ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gene）遺伝子座タグＳｄｅ＿３２３７（遺伝子番号３９６５７１０）の下で、及びＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html）アクセッション番号ＮＣ００７９１２（配列バージョン１、データベースエントリーは２００８年７月２０日にアップデート）の下で、注釈され、図１Ａにおいても転載されるような核酸コード配列（配列番号１）によってコードされたポリペプチド；並びにＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＹＰ５２８７０６（配列バージョン１、データベースエントリーは２００８年７月２０日にアップデート）及びＵｎｉｐｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ（http://www.expasy.org/）アクセッション番号Ｑ２１ＦＮ５（配列バージョン１は２００６年４月１８日に登録）の下で注釈され、図１Ｂにおいて典型的に転載されるようなＣｅｌ５Ｈポリペプチド（配列番号２）を含むが、これらに限定されない。
【００８０】
この配列はシグナル配列を含むＣｅｌ５Ｈ前駆体に対応する。図１Ｃにおいて典型的に転載されるように（配列番号３）、例示的な成熟Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド（すなわち、シグナル配列がプロセシングされて除かれた）は、上記前駆体配列のアミノ酸の位置３５〜６３０によって表される。
【００８１】
図１Ｂにおいて示されるような前駆体Ｃｅｌ５Ｈのアミノ酸３４と３５との間の予測される切断部位近傍のペプチド結合で、シグナルペプチターゼによる実際の切断が潜在的に起こり得ることが理解されるであろう。例えば、実際の切断は、図１Ｂにおいて示されるような前駆体Ｃｅｌ５Ｈの位置３０〜４０、好ましくは３１〜３９、より好ましくは３２〜３８、なおより好ましくは３２〜３７、さらにより好ましくは３３〜３６のアミノ酸領域内のペプチド結合のいずれかで起こり得る。
【００８２】
さらに、明らかに又は文脈による特別の指示のない限り、本明細書においてＣｅｌ５Ｈのドメイン又は他のモチーフがアミノ酸位置に対する言及によって同定される場合は常に、かかる言及は、特に配列番号３において示されるもの等のＣｅｌ５Ｈの成熟形態に対するものである。
【００８３】
本明細書において使用される時、「相同性」という用語は、同じ分類群又は異なる分類群からの、２つのマクロ分子間の、特に２つのポリペプチド又はポリヌクレオチド間の構造類似性（該類似性は共通祖先に起因する）を意味する。したがって、「相同体」という用語は、上記構造類似性を有する非常に関連したマクロ分子を意味する。好ましくは、本明細書において意図されるＣｅｌ５Ｈポリペプチドの相同体は、天然の配列を有する上記相同体を包含する。
【００８４】
Ｃｅｌ５Ｈポリペプチドのポリペプチド相同体は、本明細書の他の部分でＣｅｌ５Ｈポリペプチドに対して定義したように、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも４０％、なおより好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、いっそうより好ましくは少なくとも７０％、例えば非常に好ましくは少なくとも８０％若しくは少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を示し得る。代替的に又は付加的に好ましくは、Ｃｅｌ５Ｈポリペプチドのポリペプチド相同体は、本明細書の他の部分でＣｅｌ５Ｈポリペプチドに対して定義したように、少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも６０％、なおより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、いっそうより好ましくは少なくとも９０％、例えば非常に好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を示し得る。さらに好ましくは、Ｃｅｌ５Ｈポリペプチドのポリペプチド相同体は、Ｃｅｌ５Ｈポリペプチドのドメインに対応する１つ又は複数の機能的ドメイン、並びに好ましくは１つ又は複数のＧＨファミリー５触媒ドメイン、ＣＢＭファミリー６ドメイン及びＤＺドメインを含むことができる。好ましくは、上記ドメインは、通常はリンカーを介して、Ｃｅｌ５Ｈに類似の構成、特にＧＨ５−ＣＢＭ６−ＤＺを有することができる。
【００８５】
前述のように、Ｃｅｌ５Ｈポリペプチドの好ましい相同体はシュードモナス種ＮＤ１３７のＡＣＬＡポリペプチドである。例示的なＡＣＬＡポリペプチドは、Ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ８ＶＵＴ３（配列バージョン１は２００２年３月１日に登録）の下で注釈され、図１Ｄにおいても転載されるような配列（配列番号４）を含むが、これに限定されない。この配列はシグナル配列を含むＡＣＬＡ前駆体に対応する。図１Ｅにおいて例示として転載されるように（配列番号５）、例示的な成熟ＡＣＬＡポリペプチド（すなわち、シグナル配列がプロセシングされて除かれた）は、それぞれの前駆体のアミノ酸の位置２８〜５８５によって表される。
【００８６】
図１Ｄ（配列番号４）において示されるような前駆体ＡＣＬＡのアミノ酸２７と２８との間の予測される切断部位近傍のペプチド結合で、シグナルペプチターゼによる実際の切断が潜在的に起こり得ることが理解されるであろう。例えば、実際の切断は、図１Ｄにおいて示されるような前駆体ＡＣＬＡの位置２３〜３２、好ましくは２４〜３１、より好ましくは２５〜３０、なおより好ましくは２６〜２９のアミノ酸領域内のペプチド結合のいずれかで起こり得る。
【００８７】
当業者によって容易に理解される文脈に応じて、ＡＣＬＡポリペプチドに対する本明細書における言及は、上記成熟形態及び／又は上記前駆体形態を包含することができる。さらに、明らかに又は文脈による特別の指示のない限り、本明細書においてＡＣＬＡのドメイン又は他のモチーフがアミノ酸位置に対する言及によって同定される場合は常に、かかる言及は、特に配列番号５において示されるもの等のＡＣＬＡの成熟形態に対するものである。
【００８８】
Ｃｅｌ５Ｈ若しくはその相同体等の既定のポリペプチドに関して、又はＣｅｌ５Ｈ若しくはその相同体のＤＺドメイン等の既定のドメインに関して、「断片」という用語は、上記Ｃｅｌ５Ｈ若しくは相同体又は上記ドメイン等の上記ポリペプチドと比較して、１つ又は複数のアミノ酸残基のＮ末端欠失及び／又はＣ末端欠失を有するが、残存する断片の一次配列が上記Ｃｅｌ５Ｈ若しくは相同体又は上記ドメイン等の上記ポリペプチドのアミノ酸配列中の対応する位置に同一である、上記ポリペプチドの短縮形態を一般的に指す。
【００８９】
例えば、Ｃｅｌ５Ｈ又はその相同体等の既定のポリペプチドの断片は、上記Ｃｅｌ５Ｈ又は相同体等の上記ポリペプチドの約５以上の連続するアミノ酸、好ましくは１０以上の連続するアミノ酸、より好ましくは２０以上の連続するアミノ酸、なおより好ましくは３０以上の連続するアミノ酸、例えば、４０以上の連続するアミノ酸、及び最も好ましくは５０以上の連続するアミノ酸、例えば、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、１００以上、２００以上、又は５００以上の連続するアミノ酸の配列を含むことができる。
【００９０】
例えば、Ｃｅｌ５Ｈ又はその相同体のＤＺドメインの断片は、上記ＤＺドメイン又はその相同体の約５以上の連続するアミノ酸、好ましくは１０以上の連続するアミノ酸、より好ましくは２０以上の連続するアミノ酸、なおより好ましくは３０以上の連続するアミノ酸、例えば４０以上の連続するアミノ酸、及び最も好ましくは５０以上の連続するアミノ酸、例えば、６０以上、７０以上、８０以上、又は９０以上の連続するアミノ酸の配列を含むことができる。
【００９１】
さらに、Ｃｅｌ５Ｈ若しくはその相同体又はＤＺドメイン等の既定のポリペプチドの断片は、上記Ｃｅｌ５Ｈ若しくは相同体又はＤＺドメイン等の上記ポリペプチドのアミノ酸配列の、少なくとも約３０％、例えば、少なくとも５０％若しくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、及びいっそうより好ましくは少なくとも９５％又はさらには約９９％を表すことができる。
【００９２】
Ｃｅｌ５Ｈ若しくはその相同体等の既定のポリペプチド、又はＤＺドメインの「変異体」という用語は、上記Ｃｅｌ５Ｈ若しくはその相同体又はＤＺドメイン等の上記ポリペプチドの天然の配列に対して、そのアミノ酸配列が実質的に同一である（すなわち、大部分は同一であるが完全に同一ではない）ポリペプチドを指す。「実質的に同一の」は、少なくとも約８５％同一、例えば、好ましくは少なくとも９０％同一、例えば、少なくとも９１％同一、９２％同一、より好ましくは少なくとも９３％同一、例えば、９４％同一、なおより好ましくは少なくとも９５％同一、例えば、少なくとも９６％同一、いっそうより好ましくは少なくとも９７％同一、例えば、少なくとも９８％同一、及び最も好ましくは少なくとも９９％同一であることを指す。
【００９３】
２つのポリペプチド間の配列同一性は、ポリペプチドのアミノ酸配列を至適にアライメントさせること（２つのタンパク質配列の至適アライメントは、導入したギャップについての任意のペナルティをより少なくしてペア−スコアの合計を最大限にするアライメントであり、好ましくはNeedleman and Wunsch 1970 (J Mol Biol 48: 443-453)のアルゴリズムを使用する「Ｇａｐ」、又は、例えば、Accelrys社からのＧＣＧ（商標）ｖ．１１．１．２パッケージにおいて利用可能なものとして、Smith and Waterman 1981 (J Mol Biol 147: 195-197)のアルゴリズムを使用する「Ｂｅｓｔｆｉｔ」等のアルゴリズムのコンピューター化した実装によって行うことができる）、並びに一方ではポリペプチドが同じアミノ酸残基を含有するアライメント中の位置の数及び他方では２つのポリペプチドの配列が異なるアライメント中の位置の数をスコアリングすることによって決定することができる。ポリペプチドがその位置で異なるアミノ酸残基を含有する場合（アミノ酸置換）、又はポリペプチドの１つはその位置でアミノ酸残基を含有するが他のポリペプチドはそこでアミノ酸残基を含有しないか、若しくはその逆の場合（アミノ酸の挿入又は欠失）、２つのポリペプチドはアライメント中の既定の位置でそれらの配列が異なる。配列同一性は、アライメント中の位置の総数に対するポリペプチドが同じアミノ酸残基を含有するアライメント中の位置の比率（パーセンテージ）として計算される。配列アライメントを行うため及び配列同一性の決定のためにさらに適切なアルゴリズムは、Tatusova and Madden 1999 (FEMS Microbiol Lett 174: 247-250)によって記載された「Ｂｌａｓｔ  ２配列」アルゴリズム（そのデフォルト設定を使用するような）等の、Altschul et al. 1990 (J Mol Biol 215: 403-10)によって初めに記載されたベーシックローカルアライメントサーチツール（ＢＬＡＳＴ）に基づくものを含む。
【００９４】
Ｃｅｌ５Ｈ若しくはその相同体又はＤＺドメイン等の既定のポリペプチドの変異体は、本明細書において使用される場合、上記Ｃｅｌ５Ｈ若しくはその相同体又はＤＺドメイン等の上記ポリペプチドに対する一定の程度の類似性を有するポリペプチドも特異的に包含する。好ましくは、かかる変異体は少なくとも約９０％類似、例えば、好ましくは少なくとも９１％類似、例えば、少なくとも９２％類似、９３％類似、より好ましくは少なくとも９４％類似、例えば、９５％類似、なおより好ましくは少なくとも９６％類似、例えば、少なくとも９７％類似、いっそうより好ましくは少なくとも９８％類似、例えば、少なくとも９９％類似し得る。
【００９５】
２つのポリペプチド間の配列類似性は、ポリペプチドのアミノ酸配列を至適にアライメントさせること（上を参照）、並びに一方ではポリペプチドが同じか又は類似した（すなわち、保存的に置換された）アミノ酸残基を含有するアライメント中の位置の数、及び他方ではそうでなければ２つのポリペプチドの配列が異なるアライメント中の位置の数をスコアリングすることによって決定することができる。そうでなければ、ポリペプチドがその位置で非保存的アミノ酸残基を含有する場合、又はポリペプチドの１つはその位置でアミノ酸残基を含有するが、他のポリペプチドはそこでアミノ酸残基を含有しないか、若しくはその逆の場合（アミノ酸の挿入又は欠失）、２つのポリペプチドはアライメント中の既定の位置でそれらの配列が異なる。配列類似性は、アライメント中の位置の総数に対するポリペプチドが同じか又は類似したアミノ酸残基を含有するアライメント中の位置の比率（パーセンテージ）として計算される。
【００９６】
断片及び／又は変異体に対する参照の下では、本明細書は、Ｃｅｌ５Ｈ若しくはその相同体又はＤＺドメイン等の既定のポリペプチドの変異体の断片、かかるポリペプチドの断片の変異体も広範囲に企図することが理解されるだろう。
【００９７】
Ｃｅｌ５Ｈ若しくはその相同体又はＤＺドメイン等の既定のポリペプチドの断片及び／又は変異体に関して、「機能的である」という用語は、かかる断片及び変異体が、少なくとも部分的に上記Ｃｅｌ５Ｈ若しくはその相同体又はＤＺドメイン等の対応するポリペプチドの生物学的な活性又は機能性を保持することを意味する。好ましくは、かかる機能的断片及び／又は変異体は、上記Ｃｅｌ５Ｈ若しくはその相同体又はＤＺドメイン等の対応するポリペプチドの活性の、少なくとも約２０％、例えば、少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、例えば、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、例えば、少なくとも８０％、いっそうより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、及び最も好ましくは少なくとも９５％又はさらには１００％保持することができる。潜在的に、かかる機能的断片及び／又は変異体は、上記Ｃｅｌ５Ｈ若しくは相同体又はＤＺドメイン等の対応するポリペプチドより高い活性でさえも有することができる。
【００９８】
Ｃｅｌ５Ｈ若しくはその相同体又はＤＺドメイン等の既定のポリペプチドの機能的断片及び／又は変異体は、その生物学的な活性又は機能のうちの少なくとも１つ及び好ましくはより多くの又は全ての態様において、上記ポリペプチドに機能的に同等であってもよい。上記Ｃｅｌ５Ｈ又はその相同体の生物学的機能に関連する態様は、セルロース脱重合活性又はセルラーゼ活性、異なるセルロース基質（例えば、結晶性セルロース、半結晶性セルロース若しくは非結晶性セルロース、又はヘミセルロース）に関する活性プロファイル、結晶性セルロース基質を分解する能力又は優先性、及びセルロース基質に相互作用又は結合する能力を特に含むが、これらに限定されない。Ｃｅｌ５Ｈ又はその相同体の上記ＤＺドメインの生物学的機能の関連態様は、セルロース結合活性、並びに特に結晶性セルロース結合活性及び／又はオリゴマー化活性を特に含むが、これらに限定されない。かかる活性の上述の態様を含む、Ｃｅｌ５Ｈの既定の断片及び／若しくは変異体又はその相同体の既定の断片及び／若しくは変異体又はＤＺドメインの既定の断片及び／若しくは変異体の生物学的活性は、例えば、実施例セクションにおいて示される酵素活性試験等の標準試験によって決定することができる。
【００９９】
「溶剤生産」又は「溶剤を産生する」という用語は、当該技術分野で確立された意味を有しており、例えば、ヘキソース、ペントース又はオリゴ糖類等の炭水化物源から、とりわけエタノール、アセトン、ブタノール、プロピオン酸、酪酸、エーテル又はグリセリン等の１つ又は複数の非ガスの有機液体又は溶剤を産生する細菌（すなわち溶剤生産細菌）等の微生物の能力を特に意味する。特に、この用語は、天然に存在する溶剤生産生物、天然に存在する変異又は誘導された変異を有する溶剤生産生物、及び遺伝的に修飾された溶剤生産生物を包含する。
【０１００】
「エタノール生産」又は「エタノールを産生する」という用語は、例えば、ヘキソース、ペントース又はオリゴ糖類等の炭水化物源から、少なくとも又は好ましくは主としてエタノールを産生する、好ましくは炭水化物から最も多量にある非ガスの発酵産物としてエタノールを産生する細菌（すなわちエタノール生産細菌）等の微生物の能力を意味することが意図される。特に、この用語は、天然に存在するエタノール生産生物、天然に存在する変異又は誘導された変異を有するエタノール生産生物、及び遺伝的に修飾されたエタノール生産生物を包含する。適切な溶剤生産微生物の例は、本明細書において例示されたもの等であるがこれらに限定されないクロストリジウム属及びザイモモナス属の株を含むが、これらに限定されない。
【０１０１】
特定のコンポーネントに関して、「単離すること」という用語は、そのコンポーネントを組成物の少なくとも１つの他のコンポーネントから分離し、それによって他のコンポーネントから前者のコンポーネントが「単離される」ことを一般的に意味する。特に、「単離すること」及び「単離される」という用語は、本明細書において試料中の所望のタンパク質（複数可）又はポリペプチド（複数可）の量の増加を指すことができる。相対量は、単離される所望のタンパク質（複数可）又はポリペプチド（複数可）の濃度又は量と試料中の全タンパク質の濃度又は量との比として表現することができる。加えて、この用語は、非タンパク質の細胞性のコンポーネント（例えば、細胞壁、脂質及び核酸等）から所望のタンパク質（複数可）又はポリペプチド（複数可）を分離することを包含することができる。
【０１０２】
本明細書において使用される場合、「組み換え核酸」又は「組み換え核酸分子」という用語は、例えば、分子クローニング及び核酸増幅等の組み換えＤＮＡ技術を使用して、生成されたセグメント及び／又はともに連結されたセグメントを含む核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡ分子等）を一般的に指す。通常、組み換え核酸分子は、１つ又は複数の天然に存在しない配列を含むことができる、及び／又は修飾されていない供給源のゲノムにおいて位置するように位置していない天然に存在する配列に対応するセグメントを含むことができる。組み換え核酸分子が導入された宿主生物において複製する場合、子孫の核酸分子（複数可）も「組み換え核酸分子」という用語の内に包含される。
【０１０３】
特定の実施形態では、組み換え核酸分子は安定的に宿主生物のゲノムの中へ組込むことができる（例えば１つ又は複数のランダムな位置等で組込まれるか、又は例えば相同組み換えを用いた標的化様式等で組込まれる）か、又は組み換え核酸分子は染色体外エレメントとして存在するか若しくは染色体外エレメント内に含めることができ、後者の場合は自己複製することができる。
【０１０４】
組み換えＤＮＡ技術の一般原則を説明する標準的な参考資料は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、１〜３巻、Sambrook el al.編、Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989；CurrentProtocols in Molecular Biology、Ausubel et al.編、Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992（定期的な改訂あり）；Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications、Academic Press: San Diego, 1990を含む。微生物学の一般原則は、例えば、Davis, B. D. et al., Microbiology、第３版、Harper& Row, publishers、Philadelphia, Pa(1980)中で説明される。
【０１０５】
本明細書中で使用される場合、「組み換えポリペプチド」という用語は、組み換え核酸分子の発現を介して宿主生物によって産生されたポリペプチド又はタンパク質を指し、組み換え核酸分子は上記宿主生物又はその祖先の中へ導入されており、上記ポリペプチド又はタンパク質をコードする配列を含む。
【０１０６】
さらに、宿主生物、微生物又は細胞に関連する「組み換え」又は「形質転換した」という用語は、本明細書中で使用される場合、組み換え核酸分子を導入したかかる宿主生物、微生物又は細胞、及びかかる宿主生物、微生物又は細胞の組み換え子孫を包含する。
【０１０７】
したがって、「形質転換」という用語は、宿主生物、微生物又は細胞への組み換え核酸等の外来核酸の導入又は移入を包含する。そのように導入した核酸は、好ましくは上記宿主生物、微生物又は細胞のさらなる増殖及び細胞分裂を通じて維持することができる。エレクトロポレーション、エレクトロパーミエーション、化学的形質転換、リポフェクション、ウイルス又はバクテリオファージ媒介性トランスフェクション等の（これらに限定されない）任意の従来の遺伝子移入方法を使用して、形質転換を達成することができる。
【０１０８】
「コードする」とは、核酸配列又はその一部分（複数可）が、当該生物の遺伝子コードに基づいて、特定のアミノ酸配列、例えば、所望のポリペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列に対応することを意味する。例としては、特定のポリペプチド又はタンパク質を「コードする」核酸は、ゲノム核酸、ｈｎＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、組み換え核酸又は合成核酸を包含し得る。
【０１０９】
好ましくは、特定のポリペプチド又はタンパク質をコードする核酸は、上記ポリペプチド又はタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み得る。「オープンリーディングフレーム」すなわち「ＯＲＦ」とは、翻訳開始コドンから開始して、それ自体既知の翻訳終止コドンで終了し、いかなる内部インフレーム翻訳終止コドンも含有せず、潜在的にポリペプチドをコードすることが可能な一連のコードヌクレオチドトリプレット（コドン）を指す。したがって、この用語は当該技術分野で使用される「コード配列」と同義であり得る。
【０１１０】
一実施形態では、本発明のポリペプチド（複数可）をコードする核酸配列又はＯＲＦは、対象となる特定の生物、例えば微生物、より具体的には細菌中での発現についてそれ自体が既知であるように最適化されたコドンであり得る。様々な生物からのコドン使用バイアス及びコドン頻度が、例えばNakamura et al. 2000 (Nucl Acids Res 28: 292)によって記載されるコドン使用データベース（http://www.kazusa.or.jp/codon/）を介して利用可能である。
【０１１１】
本明細書中で教示されるような組み換え微生物中での対象となるポリペプチドの発現は、上記ポリペプチドをコードする核酸配列又はＯＲＦ（複数可）を、上記微生物中での発現を可能とする調節配列と操作可能に結合することによって達成することができる。これに関し、組み換え生物に言及する場合のポリペプチドを「発現する」という用語は、例えば好適な培養条件下で、又は（例えば誘導性の調節配列を使用する場合）誘導因子の添加によってポリペプチドを発現することが可能な組み換え生物を包含する。
【０１１２】
「操作可能な結合」とは、調節核酸配列と発現させることが求められる配列とが上記発現が可能となるように結合した結合である。例えば、配列、例えばプロモーター及びＯＲＦ等は、上記配列間の結合の性質が、（１）フレームシフト突然変異の導入を引き起こさない、（２）ＯＲＦの転写を指示するプロモーターの能力を妨げない、（３）プロモーター配列から転写されるＯＲＦの能力を妨げない場合に操作可能に結合すると言うことができる。
【０１１３】
発現に必要とされる調節配列又は調節要素の正確な性質は生物間で異なり得るが、典型的にはプロモーター及び転写ターミネーター、任意でエンハンサーを含むことができる。
【０１１４】
「プロモーター」又は「エンハンサー」への言及は、その最も広い文脈で解釈され、正確な転写開始、並びに適用可能な場合、遺伝子発現の正確な空間的及び／又は時間的制御、又は例えば内的若しくは外的（例えば、外因性）刺激への応答に必要とされる転写調節配列を含む。より具体的には、「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼが結合し、転写を開始する核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子上の領域を表す場合がある。プロモーターは必ずではないが、それが転写を制御する配列の上流（すなわち５’）に位置するのが好ましい。典型的には、原核生物では、プロモーター領域はプロモーター自体、及びＲＮＡへと転写された場合にタンパク質合成の開始を合図する配列（例えばシャイン・ダルガノ配列）の両方を含有し得る。
【０１１５】
実施形態では、本明細書中で企図されるプロモーターは、構成的又は誘導性であり得る。
【０１１６】
例としては、クロストリジウム・アセトブチリカム等のクロストリジウム種中での発現のために好適な構成的プロモーターとしては、クロストリジウム・アセトブチリカムのチオラーゼ遺伝子のプロモーター（Ｐｔｈｌプロモーター）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子のプロモーター（Ｐａｄｃプロモーター）、ホスホトランスブチリラーゼ遺伝子のプロモーター（Ｐｐｔｂプロモーター）、スタフィロコッカス・キシローサス（Staphylococcus xylosus）キシロースオペロンのキシロース誘導性プロモーター（Ｐｘｙｌプロモーター）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１７】
したがって、特定の実施形態では、オペレーターによって制御されるプロモーターであるプロモーターが提供される。本明細書中で使用される場合、「オペレーター」という用語は、プロモーターからの配列の転写の開始及び／又は維持を制御するヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡ配列を指す。典型的には、オペレーターは概して、プロモーターと、プロモーターが転写を制御する下流の配列との間に位置し得る。通常、オペレーターはリプレッサーポリペプチドに結合することが可能であり、それにより上記プロモーターからの転写を低減する。有用なリプレッサーは、オペレーターに結合している状態と、結合していない状態とを繰り返すことができ、かかる交替は外的条件、例えば、外部物質又は特定の代謝産物によって有利に制御され得る。したがって、適合するリプレッサーを含む宿主細胞では、オペレーターを本発明の核酸に組み入れることによって、プロモーターの活性及びプロモータからの発現を制御することが可能となり得る。オペレーター配列は概して、細菌染色体に由来し得る。
【０１１８】
本発明の核酸が、対象となる１つ又は２つ以上のポリペプチドをコードし得ることも理解されよう。さらに、２つ以上のポリペプチドの発現が意図される場合、上記発現は、独立した発現単位に由来するものであっても、又は共通の調節要素によって制御される２つ以上の連続ＯＲＦを含む単一発現単位（すなわち多シストロン性（multi-cistronic）発現）に由来するものであってもよい。例としては、２つ以上のポリペプチドをコードする発現単位は、それぞれのＯＲＦの翻訳開始コドンを、翻訳開始を制御する配列（例えばリボソーム侵入配列）と結合させることによって生成され得る。
【０１１９】
「ターミネーター」又は「転写ターミネーター」という用語は概して、転写単位の終わりにある、転写の終止を合図する配列要素を指す。例えば、ターミネーターは通常、対象となるポリペプチドをコードするＯＲＦ（複数可）の下流、すなわち、３’の下流に位置している。例えば、組み換え核酸が、例えば連続して並んだ、一緒に多シストロン性転写単位を形成する２つ以上のＯＲＦを含有する場合、転写ターミネーターは有利には最も下流のＯＲＦの３’に位置し得る。
【０１２０】
好ましい実施形態では、本明細書中で教示されるようなポリペプチド（複数可）の発現を制御する調節配列が、有利には、本発明の微生物を形質転換するのに使用される組み換え核酸上に与えられ得る。しかしながら、組み換え核酸が１つ又は複数の調節配列を欠いたコード配列（複数可）を与える一方で、必要とされる調節配列は形質転換した微生物によって与えられる実施形態（例えば、組み換え核酸が、好適な調節配列を含む染色体領域又はエピソーム領域に挿入される場合）も企図される。
【０１２１】
「クロストリジウム」及び「クロストリジウム・アセトブチリカム」は、本明細書中で使用される場合、当該技術分野においてそれ自体既知の細菌分類群を指し、特に上記分類群に属する細菌、細菌種、株、亜種及び培養株、並びに修飾又は改変した、例えば突然変異又は遺伝子操作した天然又は野生型の標本の誘導体を包含する。指針としては、限定するものではないが、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能なクロストリジウムの単離株を、特にクロストリジウム・アセトブチリカムについてはアクセッション番号ＡＴＣＣ  ８２４、ＡＴＣＣ  ４２５９、ＡＴＣＣ  ３９２３６又はＡＴＣＣ  ４３０８４で注文することができる。クロストリジウム・ベエイジェリンキー（Clostridium beijerinckii）の単離株は、例えば特にアクセッション番号ＡＴＣＣ  ８５８及びＡＴＣＣ  ２５７５２で注文することができる。
【０１２２】
先述のように、本発明の溶剤生産微生物によって発現させたポリペプチドを分泌の標的とすることができる。分泌を達成するために、ポリペプチドをコードする核酸配列を、分泌シグナル配列をコードする配列に操作可能に結合することができる。これに関連して、「操作可能に結合する」とは、シグナル配列をコードする配列と、分泌されるポリペプチドをコードする配列とがインフレーム又はインフェーズ（in phase）で結合している（これにより、発現時にシグナルペプチドがシグナルペプチドにそのように結合したポリペプチドの分泌を促進する）ことを表す。
【０１２３】
好適なシグナル配列は、分泌が所望される微生物の種類によって異なり得ることが理解されよう。例えば、グラム陽性細菌とグラム陰性細菌とで異なるシグナル配列が必要とされ得る。
【０１２４】
例としては、限定するものではないが、グラム陽性細菌、特にクロストリジウム・アセトブチリカム等のクロストリジウムにおける分泌は、クロストリジウム・セルロリティカムのＣｅｌ５Ａ前駆体ポリペプチドのシグナル配列（例示的な配列：Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ５１４４４、１９９４年１０月３１日に改訂された配列バージョン１）、又はクロストリジウム・セルロリティカムのＣｉｐＣ前駆体足場タンパク質のシグナル配列（例示的な配列：Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ２８８９９、２００５年１２月５日に改訂された配列バージョン２）、又はクロストリジウム・アセトブチリカムのＣｉｐＡ前駆体足場タンパク質のシグナル配列（例示的な配列：Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＫ７８８８６、２００６年１月１９日に改訂された配列バージョン１）を用いて達成することができる。
【０１２５】
さらに、限定するものではないが、グラム陰性細菌における分泌は、例えばザイモモナス・モビリスのグルコノラクトナーゼ前駆体ポリペプチドのシグナル配列（例示的な配列：Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ４７６３７、２００６年１０月１９日に改訂された配列バージョン１）、若しくは炭水化物選択的ポリン（porine）ＯｐｒＢのシグナル配列（例示的な配列：Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＶ８８６８８、２００５年１月２５日に改訂された配列バージョン１）を用いて、分泌経路（Sec pathway）を介して達成することができるか、又は例えばザイモモナス・モビリスのグルコースフルクトースオキシドレダクターゼ（gluco fructose oxidoreductase）前駆体ポリペプチドのシグナル配列（例示的な配列：Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＢ０２４９６、２００６年１０月１９日に改訂された配列バージョン１）を用いて、ツインアルギニン（twin-arginine）転座（Ｔａｔ）経路を介して達成することができる。
【０１２６】
本明細書中で教示されるような微生物によって発現させるポリペプチドの天然（又は相同、内因性）シグナルペプチドを、それらが上記微生物中で機能的である限りにおいて利用してもよいことも理解されよう。したがって、例としては、Ｃｅｌ５Ｈ又は関連ポリペプチドの分泌を、Ｃｅｌ５Ｈ前駆体ポリペプチドの内因性又は相同分泌シグナル配列を用いて達成することができる。特に、サッカロファガス・デグラダンスはグラム陰性細菌であるため、Ｃｅｌ５Ｈの内因性又は相同シグナル配列は、特に他のグラム陰性細菌における分泌に適している可能性がある。他の実施形態では、Ｃｅｌ５Ｈ及び関連ポリペプチド等のポリペプチドを非相同シグナル配列を用いて分泌させることができる。
【０１２７】
天然Ｃｅｌ５Ｈポリペプチドのドメイン構造は、ＧＨ５−ＰＳＬ−ＣＢＭ６−ＥＰＲ−ＤＺとして略述することができ、成熟Ｃｅｌ５Ｈにおけるドメイン境界の概略は図９に示される。Ｃｅｌ５Ｈ又はその相同体の機能的断片は、好ましくはＧＨ５ドメイン、ＣＢＭ６ドメイン及びＤＺドメインの１つ又は複数、又はそれに相当するドメイン（例えば、Ｃｅｌ５Ｈの相同体及び／又は変異体中の類似ドメイン）を含有する。好ましくは、かかる断片に含まれるドメインは本明細書中で意図されるように機能的であり得る。したがって、特定の実施形態では、本発明は以下のドメイン構成に相当するもののような断片を企図する：ＧＨ５、ＧＨ５−ＰＳＬ、ＧＨ５−ＰＳＬ−ＣＢＭ６、ＧＨ５−ＰＳＬ−ＣＢＭ６−ＥＰＲ、ＰＳＬ−ＣＢＭ６、ＰＳＬ−ＣＢＭ６−ＥＰＲ、ＰＳＬ−ＣＢＭ６−ＥＰＲ−ＤＺ、ＣＢＭ６、ＣＢＭ６−ＥＰＲ、ＣＢＭ６−ＥＰＲ−ＤＺ及びＥＰＲ−ＤＺ、ＤＺ。本発明は、ＥＰＲ−ＤＺ−ＥＰＲ−ＤＺ等（これらに限定されない）といった成熟Ｃｅｌ５Ｈのドメインの組み合わせに相当する断片をさらに想定する。
【０１２８】
先述のように、本発明はＣｅｌ５Ｈ及び関連ポリペプチドと、有用な非相同ドメインとの様々な融合にも関する。この文脈で、「非相同」という用語は、上記ドメイン（複数可）がＣｅｌ５Ｈポリペプチド又はその相同体以外のポリペプチドに由来することを表す。したがって、ドメインの組み合わせに言及する場合の「非相同」は、これらの種々のドメインが同じタンパク質に由来しない（又は天然に存在しない）という事実を指す。しかしながら、さらなるＣｅｌ５Ｈ由来ドメイン（複数可）と、Ｃｅｌ５Ｈポリペプチド若しくはその相同体、又はその断片及び／又は変異体との融合も企図され得る。
【０１２９】
「融合」という用語は、特に遺伝子融合（すなわち、種々の部分を単一のオープンリーディングフレームへと融合させること）、並びに化学的及び／又は物理的手段（例えば、化学的架橋又は光カップリング）によって誘導される融合を包含することが本明細書中で広く企図される。さらに、融合には直接的融合又はリンカーを介した融合が含まれる。好適なリンカーとしては、非荷電アミノ酸（好ましくはグリシン、セリン、システイン、アスパラギン、チロシン、グルタミン、アラニン、バリン、プロリン、トレオニン、より好ましくはグリシン又はセリンから選択される）を含んでいるか、それらについて濃縮されているか、又はそれらからなる、少なくとも３、好ましくは少なくとも４又は５、より好ましくは少なくとも７、さらにより好ましくは少なくとも１２アミノ酸、例えば３〜１５アミノ酸のペプチド配列を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１３０】
例示的なグリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）触媒ドメインは、それ自体が既知であるか、又は特に確立された手順を用いて将来同定及び単離されるグリコシドヒドロラーゼ（グリコシダーゼ）に由来し得る。例示的なグリコシダーゼとしては、ＮＣ−ＩＵＢＭＢのＥＣ３．２．１．「グリコシダーゼ」の分類に分けられるもの、より好ましくはセルロース系基質及びリグノセルロース系（lingo-cellulosic）基質を脱重合することが可能なグリコシダーゼ、例えばセルラーゼ（ＥＣ３．２．１．４．）、セルロース１，４−β−セロビオシダーゼ（ＥＣ３．２．１．９１）及びプロセッシブエンドセルラーゼ（ＥＣ３．２．１．４．／ＥＣ３．２．１．９１．）が挙げられる。
【０１３１】
「炭水化物結合モジュール（複数可）（ＣＢＭ）」という用語は当該技術分野で既知であり、グリコシドヒドロラーゼ中に見られるか、又はそれに由来する全ての非触媒糖又は炭水化物結合モジュールを一般に広く包含する。本明細書中で好ましいＣＢＭモジュールとしては、セルロース又はセルロース基質に特異的に結合するもの（代替的にはセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）と称される）を挙げることができる。ＣＭＢ並びにそれらの構造的特性及び機能的特性は、特にTomme et al. 1995 ("Cellulose-binding domains: classificationand properties", in Enzymatic Degradation of Insoluble Polysaccharides,Saddler JN & Penner M, eds., pp. 142-163, American Chemical Society,Washington)、及びBoraston et al. 2004("Carbohydrate-binding modules: fine tuning polysacchariderecognition". Biochem J 382: 769-81)において概説されている。
【０１３２】
「コヒーシン結合ドメイン」は、本明細書中で使用される場合、概してセルロソームスキャフォルディンサブユニットの１つ又は複数の受容体（コヒーシン）ドメインに特異的に結合することが可能な全てのポリペプチドドメインを指す。例示的なコヒーシン結合ドメインとしては、セルロソームに集合するグリコシドヒドロラーゼ中に見られるか、又はそれに由来するドッケリンドメインが挙げられる。タイプＩ及びタイプＩＩの両方のドッケリンドメインが本明細書中で企図される。ドッケリンドメインは、特にLytle et al. 2001 ("Solution structure of a type I dockerindomain, a novel prokaryotic, extracellular calcium-binding domain". J MolBiol 307: 745-753)、Adams et al. 2005 ("Structuralcharacterization of type II dockerin module from the cellulosome of Clostridiumthermocellum: calcium-induced effects on conformation and targetrecognition". Biochemistry 44: 2173-82)、及びBayer etal. 1998 ("Cellulosomes-structure and ultrastructure". J Struct Biol124: 221-234)に記載されている。本明細書中で好適なドッケリンドメインの選択の指針となるような、ドッケリン−コヒーシン相互作用を決定する好適なアッセイは、特にHaimovitz et al. 2008 ("Cohesin-dockerin microarray: Diversespecificities between two complementary families of interacting proteinmodules". Proteomics 8: 968-979)に記載されている。
【０１３３】
さらに、本明細書中で教示されるポリペプチドと、炭水化物ポリマー代謝、特にセルロース代謝に有用な他のポリペプチド又は酵素、好ましくは組み換えポリペプチド又は酵素との共発現、任意で共分泌が企図される。「共発現」という用語は概して、同じ微生物、特に上記微生物の同じ細胞による２つ以上のタンパク質又はポリペプチドの発現（「共発現した」と言われる）に関する。２つ以上のポリペプチドの共発現を達成するのに好適な系はそれ自体既知である。限定するものではないが、共発現ポリペプチドは、同じか又は異なる調節要素によって制御される別個のシストロンによってコードされ得るか、又は単一の多シストロン性要素によってコードされ得る。かかるシストロンは、染色体上にあっても、又は同じか若しくは異なる後成的要素上にあっても、又はその組み合わせ等であってもよい。
【０１３４】
「グリコシドヒドロラーゼ」又は「グリコシダーゼ」という用語は概して、グリコシド結合、より具体的にはＯ−、Ｎ−又はＳ−グリコシド結合、さらにより好ましくはオリゴ糖及び／又は多糖基質中のかかる結合を加水分解することが可能な酵素及び酵素複合体を包含する。この用語はエキソグリコシダーゼ及びエンドグリコシダーゼを包含する。この用語は、特にＮＣ−ＩＵＢＭＢのＥＣ  ３．２．１．「グリコシダーゼ」の分類に分けられるグリコシダーゼを包含する。
【０１３５】
「セルラーゼ」という用語は概して、セルロース及びセルロース含有基質を加水分解することが可能な酵素及び酵素複合体を包含する。この用語は、以下のセルラーゼ型を包含するが、これらに限定されない：セロビオヒドロラーゼ（１，４−β−Ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼ、ＥＣ  ３．２．１．９１）、エンド−β−１，４−グルカナーゼ（エンド−１，４−β−Ｄ−グルカン４−グルカノヒドロラーゼ、ＥＣ  ３．２．１．４）、プロセッシブエンドセルラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４．／ＥＣ  ３．２．１．９１．）及びβ−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２１）。セルラーゼは、エンドグルカナーゼ及び（プロセッシブ）エキソグルカナーゼをさらに包含し、様々な長さのモノマー及び／又はオリゴマーを産生する酵素を包含する。この用語は、セロビアーゼ、酸化的（oxidative）セルラーゼ、グルコシダーゼ、セルロースホスホリラーゼ、及びそれにより一般に表される他の酵素も包含し得る。この用語は、結晶性セルロース、半結晶性セルロース、非結晶性セルロース、ヘミセルロース及び／又は化学的に若しくは生物学的に修飾したセルロース形態等（これらに限定されない）の様々な形態のセルロースを分解することが可能な酵素を包含する。
【０１３６】
例としては、限定するものではないが、クロストリジウム・セルロリティカムのセルロース分解系は、Belaich et al. 1997 ("The cellulolytic system of Clostridiumcellulolyticum". J Biotechnol 57: 3-14)において概説されており、サッカロファガス・デグラダンスのセルロース分解系は非特許文献４（上掲）に概説されている。
【０１３７】
本発明は、ポリペプチド、特にＣｅｌ５Ｈ及び関連ポリペプチド（例えばＤＺドメイン及びそれを含むポリペプチド）を含む、本明細書中で教示されるような改変セルロソームをさらに企図する。当該技術分野で既知のように、天然セルロソームは、或る特定の細菌分類群、特にクロストリジウム及びバクテロイデス等の細胞外の多酵素セルロース分解複合体を表す。天然セルロソームの基本構成には、一般に１つ又は複数の同じか又は異なる炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）、並びにグリコシダーゼ又はセルロース分解酵素のセルロソーム複合体への組み込みを、上記酵素中の同族ドッケリンドメインとの相互作用によって促進する、１つ又は複数の同じか又は異なる受容体（コヒーシン）ドメインを含む組織化（organising）ポリペプチド（スキャフォルディン）が含まれる。
【０１３８】
天然セルロソームのこれらの構造的特徴を改変セルロソームにおいても利用することができ、それにより所望の炭水化物結合活性及び炭水化物脱重合活性を改変セルロソームに組み込むことができる。改変セルロソームを作製する技法は当該技術分野で確立されている（例えば、Fierobe et al. 2002 ("Degradation of cellulose substrates bycellulosome chimeras. Substrate targeting versus proximity of enzymecomponents". J Biol Chem 277: 49621-30)、Fierobe etal. 2005 ("Action of designer cellulosomes on homogeneous versus complexsubstrates: controlled incorporation of three distinct enzymes into a definedtrifunctional scaffoldin". J Biol Chem 280: 16325-34、及びPerret et al. 2004 ("Production of heterologous and chimericscaffoldins by Clostridium acetobutylicum ATCC 824". J Bacteriol 186:253-7)を参照されたい）。
【０１３９】
一般に、改変セルロソームは、炭水化物基質特異性が同じか又は相違する１つ又は複数のＣＢＭモジュール、及び同じか又は相違する同族ドッケリンドメインに結合することが可能な１つ又は複数のコヒーシンドメインを含むハイブリッドスキャフォルディンポリペプチド又はキメラスキャフォルディンポリペプチドを含有し得る。特にグリコシダーゼ又はセルロース分解酵素等の酵素は、スキャフォルディンポリペプチド中に見られるコヒーシンドメインについて同族のドッケリンモジュール（通常は上記酵素中に存在する、及び／又はそれに組み込まれている）を用いて、セルロソーム中に組み入れることができる。上記酵素はＣＢＭ又は他の非触媒ドメインも含み得る。かかる改変セルロソームは、当該技術分野で「キメラ」若しくは「ハイブリッド」セルロソーム又は「ミニセルロソーム」として一般に既知である。
【０１４０】
代替的又は付加的には、グリコシダーゼ又はセルロース分解酵素等の１つ又は複数の酵素を、スキャフォルディン骨格と、例えば同じポリペプチド鎖の一部として発現させること（すなわち遺伝子融合）によって共有結合させることができる。かかるセルロソームは、「共有結合」セルロソームとして一般に既知である（Mingardon et al. 2007, "Exploration of new geometries incellulosome-like chimeras" Appl. Environ. Microbiol. 73: 7138-7149）。
【０１４１】
したがって、ハイブリッドセルロソーム、キメラセルロソーム、ミニセルロソーム、若しくは共有結合セルロソーム等の改変セルロソーム、又はこれらの形式（modalities）の任意の組み合わせ、又は任意の他の改変セルロソーム形態を、本明細書中で教示されるポリペプチドと共に使用することが企図される。
【０１４２】
「セルロース」という用語は当該技術分野でそれ自体既知である。限定するものではないが、さらに説明すると、この用語は、天然に存在するセルロース及び天然に存在しないセルロース形態、例えば結晶性セルロース、半結晶性セルロース、微結晶性セルロース、非結晶性セルロース、ヘミセルロース、再生セルロース、及び／又は化学的若しくは生物学的に修飾若しくは誘導体化されたセルロース形態、例えばそのエーテル若しくはエステル等といったセルロースの全ての形態を包含し得る。
【０１４３】
結晶性セルロースについて濃縮されている物質は、少なくとも約１％（ｗ／ｗ）、例えば、５％（ｗ／ｗ）以上、好ましくは少なくとも約１０％（ｗ／ｗ）以上、例えば２０％（ｗ／ｗ）以上、３０％（ｗ／ｗ）以上又は４０％（ｗ／ｗ）以上、より好ましくは少なくとも約５０％（ｗ／ｗ）、例えば６０％（ｗ／ｗ）以上又は７０％（ｗ／ｗ）以上、さらにより好ましくは少なくとも約８０％（ｗ／ｗ）、例えば９０％（ｗ／ｗ）以上の当該技術分野で理解されるような結晶性セルロース、半結晶性及び／又は微結晶性セルロース）、より好ましくは結晶性セルロースを含み得るが、これらに限定されない。
【０１４４】
本明細書において教示されるような組み換え微生物でセルロース含有物質を処理するか、又は当該微生物と当該物質を接触させる方法及びプロセスは、当該技術分野で一般に既知であり、様々なスケールの工業的発酵プロセスを含み得るが、これに限定されない。そのように発酵させる材料は、例えば、固体、半固体、液体若しくは可溶性の形態で、又はホモジネート若しくは抽出物として、又は（水性の）分散物若しくは懸濁物として、又は（部分的に）単離若しくは精製した、及び／又は（例えば希酸前処理、水酸化ナトリウム前処理、石灰前処理、有機溶剤と水とを用いた前処理、熱水プロセス又はＡＦＥＸによって）前処理したリグノセルロース基質若しくはセルロース基質若しくはセルロースとして、又はそれ自体がセルロース系材料及びバイオマスの脱重合及び／又は発酵に使用される他の好適な形態で提供され得る。したがって、本発明は、任意で１つ又は複数の他の所望の微生物と組み合わせた、本発明の微生物を含むスターター培養物も企図する。セルロース利用のためのバイオテクノロジー的手法は、特にLynd et al. 2002 ("Microbial cellulose utilization:fundamentals and biotechnology". Microbiol Mol Biol Rev 66: 506-77)、及びHimmel et al. 2007 ("Biomass recalcitrance: engineering plantsand enzymes for biofuels production" Science 315: 804-807)において概説されている。
【０１４５】
上記の態様及び実施形態は、以下の非限定的な実施例によってさらに支持される。
【実施例】
【０１４６】
実施例１：Ｃｅｌ５Ｈの新規ＤＺドメインの同定
サッカロファガス・デグラダンスによって産生された推定上のセルラーゼの公開された解析（非特許文献４）から、Ｃｅｌ５Ｈについての以下の構成（酵素のＮ末端からＣ末端）が示された：シグナル配列／触媒モジュール（ＧＨファミリー５）／セリンリッチリンカー／ＣＢＭファミリー６に属する炭水化物結合モジュール／グルタミン酸及びプロリンリッチリンカー（他の表示では、シグナル配列−ＧＨ５−ＰＳＬ−ＣＢＭ６−ＥＰＲ）。
【０１４７】
ＤＺドメインと称されるＣｅｌ５ＨのＣ末端での新規の約１００アミノ酸長ドメイン（すなわち、配列番号２中の４９６番目〜５９６番目）の存在を明らかにするより完全な配列解析を実行した（図１Ｂ）。したがって、Ｃｅｌ５Ｈの構成は、シグナル配列−ＧＨ５−ＰＳＬ−ＣＢＭ６−ＥＰＲ−ＤＺとして表示することができる。ＤＺドメインが芳香族残基（Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）に富んでいるので、それはおそらく新しいタイプの炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）を表すことができる。
【０１４８】
非冗長ＤＮＡ配列データベース中の相同ドメインについての検索により、シュードモナス細菌種ＮＤ１３７由来のａｃｌＡ遺伝子によってコードされる推定上のセルラーゼ中の高度に相同なドメインが明らかになった（配列番号４の４６５番目〜５５８番目、図１Ｄ）。この特定のドメインを含有する他のタンパク質はサッカロファガス・デグラダンスを起源とする。
【０１４９】
Ｃｅｌ５Ｈの別の非定型的な特徴はＧＨ５触媒モジュールと関連しており、この触媒モジュールの長さは３００アミノ酸と推定されるが、他のファミリー５酵素は３８０残基〜４５０残基の触媒モジュールを示す。したがって、このモジュールは異常に短く、ファミリー５酵素間で高度に保存された残基の重要なストレッチを欠いている。
【０１５０】
実施例２：完全な（野生型）Ｃｅｌ５Ｈ、切断型Ｃｅｌ５Ｈ及びＣｅｌ５Ｈの改変形態の大腸菌における産生
分子生物学技法を使用して、Ｃｅｌ５Ｈの成熟形態をコードするＤＮＡ（シグナル配列を有しない）を増幅し、大腸菌発現ベクター（ｐＥＴ２２ｂ（＋）、Novagen）中にクローニングした。得られたベクターを使用して、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Novagen）を形質転換した。同様に、Ｃｅｌ５Ｈの切断又は改変形態をコードする修飾された遺伝子をＰＣＲによって得てｐＥＴ２２ｂ（＋）にクローニングし、その後大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。全ての場合において、６つのＨｉｓコドンを組み換えタンパク質のＣ末端に移植して、ニッケル樹脂（Ｎｉ−ＮＴＡ、Qiagen）での組み換えタンパク質の精製を容易にした。Ｃｅｌ５Ｈの様々な改変形態を図２に要約する。
【０１５１】
組み換え株をルリア・ベルターニの培地中で増殖させ、クローニングした遺伝子の発現は誘導因子としてＩＰＴＧを使用して誘導した。組み換えＣｅｌ５Ｈの合成は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって確認した。培養物は遠心分離し、採取した細胞はフレンチプレスで破壊した。
【０１５２】
実施例３：Ｃｅｌ５Ｈの様々な形態の精製及び特徴づけ、並びにカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、リン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）、Ａｖｉｃｅｌ及び未加工の基質（毛羽立たせたワラ（hatched straw））を含む様々な基質に対する活性の評価
Ｃｅｌ５Ｈ、Ｃｅｌ５Ｈｔ及びＣｅｌ５Ｈｔ−ＣＢＭ３ａは、Ｎｉ−ＮＴＡ（Qiagen）に粗抽出物をロードし、イミダゾリウムの濃度を増加させて対象となるタンパク質を溶出することによって精製した。以下に記載されるようなＦＰＬＣ  Ｑ−セファロース（Ｈｉｔｒａｐ  Ｑ  ＨＰ樹脂、GE Healthcare）を使用して精製を行った。
【０１５３】
代替的には、Ｃｅｌ５Ｈ構築物、同様にＣｅｌ５Ｈ−ＣＢＭ３ａ構築物及びＣＢＭ３ａ−Ｃｅｌ５Ｈ構築物も、異なる手順を使用して精製した。これらのタンパク質を含有する粗抽出物を４℃でＰＡＳＣと共にインキュベーションし、遠心分離した。セルロースのペレットをリン酸バッファー中の遠心分離によって数回洗浄し、セルラーゼと特異的に結合したタンパク質を純水又は１％のトリエチルアミンを使用してマトリックスから溶出した。ＦＰＬＣ装置を使用し、ｐＨ８で陰イオン交換体樹脂（Ｈｉｔｒａｐ  Ｑ  ＨＰ、GE healthcare）上に対象となるタンパク質を含有する画分をロードすることによって、精製を行った。タンパク質はＮａＣｌの直線状勾配を使用してカラムから溶出した。全ての場合において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって純度をチェックし、タンパク質を濃縮し、小分けにして、−８０℃で保存した。
【０１５４】
標準条件（３７℃）を使用して、ＣＭＣ、ＰＡＳＣ、Ａｖｉｃｅｌ、及び毛羽立たせたワラに対する精製した酵素の活性を試験した。
【０１５５】
ＣＭＣに対する活性の試験に関しては、酵素濃度は１ｎＭであり、基質は８ｇ／ＬのＣＭＣ（ｐＨ６．０）であった。ＣＭＣに対するＣｅｌ５Ｈの様々な形態の３７℃での活性を図３に示す。全ての場合で得られた活性パターンから、Ｃｅｌ５Ｈはエンド作用モードではなくエキソ作用モードであることが示唆される。図３に示すように、全ての酵素は反応速度の最初の数分又は数秒以内の糖の重要な放出によって特徴づけられ、次いで酵素活性は大幅に減少し（プラトーが５分後に観察される）、この減少はエキソ作用のある酵素又はプロセッシブ酵素でより典型的である。
【０１５６】
初速度に基づいて、Ｃｅｌ５Ｈの比活性はＣＭＣに対して２００００ｉｕ／μｍｏｌと推定された。
【０１５７】
ＰＡＳＣに対する活性の試験に関しては、酵素濃度は５ｎＭであり、基質は３．５ｇ／Ｌ（ｐＨ６．０）であった。ＰＡＳＣに対するＣｅｌ５Ｈの様々な形態の３７℃での活性を図４に示す。
【０１５８】
ＤＺドメインの除去（Ｃｅｌ５Ｈｔ）により比活性はおよそ７０％減少し、このドメインがＣｅｌ５ＨによるＰＡＳＣの加水分解の間に重要な役割を果たすことを示す。これらの反応速度に基づいて、ＰＡＳＣに対するＣｅｌ５Ｈｗｔの比活性はおよそ１０００ｉｕ／μｍｏｌである。ＣＢＭ３ａを、Ｎ末端で移植（ＣＢＭ３ａ−Ｃｅｌ５Ｈ）、Ｃ末端で移植（Ｃｅｌ５Ｈ−ＣＢＭ３ａ）、又はＤＺモジュールの代わりに移植（Ｃｅｌ５Ｈｔ−ＣＢＭ３ａ）すると、酵素活性はさらに減少した。
【０１５９】
Ａｖｉｃｅｌに対する活性の試験に関しては、酵素濃度は１００ｎＭであり、基質は３．５ｇ／Ｌ（ｐＨ６．０）であった。Ａｖｉｃｅｌに対するＣｅｌ５Ｈの様々な形態の３７℃での活性を図５に示す。
【０１６０】
２つの他の基質について観察されるように、改変形態、特にＣ末端ＤＺドメインを欠く切断型形態と比較して、野生型Ｃｅｌ５Ｈの活性は高く、結晶性セルロースの分解におけるＤＺドメインの役割がさらに確認された。強力なＣＢＭ３ａによってＤＺドメインを置換しても、アビセラーゼ活性は、野生型Ｃｅｌ５Ｈと比較して部分的にしか回復しない。Ａｖｉｃｅｌに対するＣｅｌ５Ｈの活性は上昇し、反応速度の最初の時間の間に得られたデータに対する計算から８．５±２ｉｕ／μｍｏｌの比活性が明らかにされる。
【０１６１】
Ｃｅｌ５Ｈの酵素活性は可溶性発色基質（パラ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビオシド）に対しても試験された。パラ−ニトロフェニル基とセロビオースとの間の結合の酵素による切断に際して、パラ−ニトロフェノール及びセロビオースは遊離し、その濃度は分光光度分析を用いて直接求めることができる。この基質に対するＣｅｌ５Ｈの比活性は約１４ｕｉ／μｍｏｌであった。この活性は、クロストリジウム・セルロリティカム由来のＣｅｌ５Ａの活性よりも約１３倍高く、この酵素もグリコシドヒドロラーゼのファミリー５に属する。
【０１６２】
実施例４：クロストリジウム・セルロリティカム由来の野生型セルラーゼ及び改変セルラーゼによるＣｅｌ５Ｈアビセラーゼ活性の比較
実施例３中に記載されるようなアッセイデザインを使用して、Ｃｅｌ５Ｈアビセラーゼ活性を、クロストリジウム・セルロリティカム由来の野生型セルラーゼ及び改変セルラーゼで比較した。
【０１６３】
酵素濃度は１００ｎＭであり、基質は３．５ｇ／Ｌ（ｐＨ６．０）であった。
【０１６４】
図６に示すように、Ｃｅｌ５Ｈｗｔは、Ｃｅｌ９Ｇ（Ａｖｉｃｅｌに対して最も活性のあるクロストリジウム・セルロリティカム由来のセルラーゼの１つ）よりも約６倍活性が高い。ＣＢＭ３ａ及びＸ２モジュールを含有するＣｅｌ９Ｇの改変形態（ＣＢＭ−Ｘ−Ｃｅｌ９Ｇ、Mingardon et al. 2007. Appl Environ Microbiol 73: 7138-49.）と比較しても、Ｃｅｌ５Ｈｗｔは結晶性セルロースに対する活性が２５％高い。これに対して、共有結合セルロソーム（Ｃｅｌ９Ｇ及びＣｅｌ４８Ｆの触媒モジュール並びに強力なＣＢＭ３ａを含む；Mingardon et al. 2007（上掲））は、Ｃｅｌ５Ｈよりも単に３６％活性が高いだけである。
【０１６５】
Ａｖｉｃｅｌ上でＣｅｌ５Ｈｗｔによって放出された可溶性糖のｄｉｏｎｅｘによる解析から、２４時間のインキュベーション後に、後者の酵素はセロビオース（６７％）、セロトリオース（２６．５％）及びグルコース（６．５％）（すなわち、比較的低複雑度の可溶性糖）を主として放出するが、セロテトラオースは放出しないことが示される。
【０１６６】
Ｃｅｌ５Ｈ（Ｃｅｌ５Ｈｗｔ）の活性を毛羽立たせたワラに対しても試験した（酵素及び基質はそれぞれ１００ｎＭ及び３．５ｇ／Ｌ）。２４時間のインキュベーション後に、約７０μＭの可溶性糖がＣｅｌ５Ｈｗｔによって放出された。ｄｉｏｎｅｘによる可溶性糖の解析から、この未加工の基質に対してＣｅｌ５Ｈによってグルコース（９０％）が主として放出されることが示された。
【０１６７】
上記の全ての反応速度実験は、２０ｍＭトリスマレイン酸塩ｐＨ６．０、１ｍＭ  ＣａＣｌ２（アジド０．０１％（ｗ／ｖ））バッファー中で３７℃で実行した。Ｃｅｌ５Ｈのアビセラーゼ活性を、同じバッファー中で１％の塩化ナトリウム（１７１ｍＭ  ＮａＣｌ）の存在下においても測定した。ＮａＣｌの存在下において、Ｃｅｌ５Ｈは１０％活性が高いことが見出された。
【０１６８】
酵素活性は、おそらく５０℃での酵素の変性のために、３７℃と比較して５０℃では大幅に減少する。
【０１６９】
結論として、Ｃｅｌ５Ｈは結晶性セルロースに対して上昇した活性を示し、したがってクロストリジウム・アセトブチリカム等の溶剤産生細菌における非相同産生に好適な候補であり、結晶性セルロース又は非結晶性セルロース上でのこの株の増殖を可能にする。この結果は、ＤＺモジュールがセルロース結合モジュール（ＣＢＭ）として働き、基質の表面にセルラーゼを有利にアンカーさせることを示唆する。これまでに得られたデータは、この酵素が、エキソグルカナーゼ又はエンドプロセッシブセルラーゼである可能性が高いこと（及びエンドグルカナーゼではない）を示す。通常ファミリー５セルラーゼはエンドグルカナーゼとして記載されることは注目に値する。Ｃｅｌ５Ｈは、純粋なセルロースからセロテトラオースを放出しないが、セロビオース、グルコース及びセロトリオースを産生する。
【０１７０】
実施例５：他の酵素（複数可）へのＣｅｌ５Ｈのアクセサリードメイン及び／又はリンカーの４つの移植
サッカロファガス・デグラダンスのＤＺモジュールは、単独で、又は上流のＣＢＭ６と共に、及び任意でリンカー（図１におけるＣｅｌ５Ｈｗｔを参照）を、分子遺伝学的技法を使用して、かかるモジュールを欠損する他の酵素（複数可）に隣接させた。
【０１７１】
これらの実験のために選択されたセルラーゼは、クロストリジウム・セルロリティカムからのＣｅｌ５Ａ（Ｃｅｌ５Ｈに類似してこれもＮ末端でファミリー５触媒モジュールを示す）であった。Ｃｅｌ５ＡはＡｖｉｃｅｌに対して中等度の活性を有する真のエンドグルカナーゼである（Fierobe et al. 1991. J Bacteriol 173: 7956-62）。構築されたハイブリッド酵素を図７において示す。
【０１７２】
Ｃｅｌ５Ａの様々な改変形態を精製し、それらの活性をＡｖｉｃｅｌに対して試験し、Ｃｅｌ５Ａｗｔ及びＣｅｌ５Ａｔと比較した（図８）。ＤＺ
【０１７３】
観察された活性プロファイルから、ＤＺドメインの存在はＣｅｌ５Ａ活性（すなわち、Ｃｅｌ５ＡによるＡｖｉｃｅｌの加水分解）を改善することが示された。特に、２４時間のインキュベーション後に、Ｃｅｌ５Ａｔ−ＤＺ又はＣｅｌ５Ａｔ−ＤＺ２によって遊離される糖の量は、Ｃｅｌ５Ａｔによって遊離される糖の量よりも３倍高い。これらの結果は、酵素がＤＺドメインによってセルロース上へ固定又は付着されることを示唆する。したがって、ＤＺドメインが新規タイプの固定ドメインであることが示唆される。
【０１７４】
しかしながら、観察された活性は、Ｃｅｌ５Ａｔ−ＣＢＭ３の活性よりも２０％低い。したがってスキャフォルディンＣＢＭドメインは、結晶性セルロースに対するＣｅｌ５Ａ活性の改善にも関連すると思われる。
【０１７５】
ＤＺドメインを２つ追加しても、１つのみＤＺドメインを有する酵素構築物と比較して、酵素活性は有意に増加しない。
【０１７６】
１つ又は複数の追加のＤＺドメインを有するＣｅｌ５Ａ構築物は、結晶性セルロースに対して野生型Ｃｅｌ５Ｈセルラーゼよりもまだ４倍活性が低いことも示される。
【０１７７】
したがって、Ｃｅｌ５ＨからのＣＢＭドメイン（ＣＢＭ６）及びＤＺドメインの両方を含むＣｅｌ５Ａ構築物を作製する。触媒Ｃｅｌ５ＡドメインとＣｅｌ５Ｈ  ＤＺドメインとの間へのＣＢＭ６ドメインの導入は、結晶性セルロースの分解に関して酵素活性を増加させる。
【０１７８】
実施例６：Ｃｅｌ５Ｈ活性は、遊離状態において、又はハイブリッドセルロソームの中へ取り込まれて、結晶性セルロースに対する他のセルラーゼの活性に相補的又は相加的である
反応速度実験を行って、Ｃｅｌ５Ｈ活性が純粋な結晶性セルロースの分解において、他のセルラーゼ酵素の活性に相補的か又は相加的かどうかを調べる。
【０１７９】
これらの実験において、以下の酵素を試験した。
クロストリジウム・セルロリティカムからの野生型酵素：Ｃｅｌ５Ａ（エンド）、Ｃｅｌ９Ｇ（エンド）、Ｃｅｌ９Ｍ（エンド）、Ｃｅｌ９Ｐ（エンド）、Ｃｅｌ４８Ｆ（プロセッシブ）及びＣｅｌ９Ｅ（プロセッシブ）；
クロストリジウム・セルロリティカムからの修飾された酵素：Ｃｉｐ０−Ｇ（エンド）；
クロストリジウム・セルロリティカム以外の生物から単離された酵素：ネオカリマスチクス・パトリシアラム（Neocallimastix patriciarum）（真菌（muschroom））に由来するＣｅｌ６Ａ（エキソ）。
【０１８０】
Ａｖｉｃｅｌ結晶性セルロース（３．５ｇ／Ｌタンポン、２０ｍＭトリスマレイン酸塩ｐＨ６、１ｍＭ  ＣａＣｌ２  １）に対する２４時間のインキュベーション後に、酵素によって遊離された可溶性糖の量を、図９において示す。酵素の各組み合わせについては、第１のバーは両方の酵素の個別の活性の合計を示すが、第２のバーは両方の酵素（０．１ｍＭの濃度で存在する各酵素）の混合物の活性を示す。
【０１８１】
これらの結果は、大部分の事例において、他のセルロースの活性がＣｅｌ５Ｈセルロースの活性に相補的か又は相加的であることを示す。
【０１８２】
追加実験は、適切なドッケリンモジュールが添付されたＣｅｌ５Ｈ（例えば図２におけるような）、同族のドッケリンを保持し、省略可能なＣＢＭ３ａモジュールを示すハイブリッドスキャフォルディンに結合された１つ又は２つの他の相補的なセルラーゼを含むハイブリッドのミニセルロソームによるＡｖｉｃｅｌの分解を含む（図１０を参照）。Ｃｅｌ５Ｈ又は他のセルラーゼ単独と比較して、基質の分解が増加したことが実証される。
【０１８３】
実施例７：Ｃｅｌ５Ｈ（修飾されたシグナル配列により改変された野生型）単独の、又は他のセルラーゼ（及び／又はスキャフォルディン）との、クロストリジウム・アセトブチリカムによる産生及び分泌
Ｃｅｌ５Ｈをコードする野生型遺伝子を、株サッカロファガス・デグラダンスからＰＣＲによって増幅し、大腸菌−クロストリジウム・アセトブチリカムｐＳＯＳ９５２シャトルベクター中にクローン化した。このプラスミドはクロストリジウム・アセトブチリカムのための発現ベクターである（Perret et al. 2004. J Bacteriol 186: 253-7）。対象となる遺伝子の発現は、チオラーゼ酵素をコードする遺伝子の強い構成的プロモーター（ｐｔｈｌ）下で制御される。２つのｌａｃオペレーターをｐｔｈｌの上流及び下流に導入して、大腸菌における遺伝子の発現を防止した。ベクターは続いてメチル化し（ｉｎ  ｖｉｖｏでは株ＥＲ２２７５［ｐＡＮ１］を使用して、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏではメチラーゼＣｐＧを使用して）、このベクターを使用して前に記載されるようにクロストリジウム・アセトブチリカム株を電気的に形質転換した。組み換えクローンを得てコロニーのＰＣＲ試験を行い、ベクターが溶剤生産クロストリジウム属において無傷のままであることが示された。複数のクローンを２ＹＴＣ培地において増殖させたが、追加のＣＭＣａｓｅ活性は、「空の」ｐＳＯＳ９５２を保持する対照株と比較して、培養上清において検出されなかった（プレート上のＣＭＣａｓｅ試験）。
【０１８４】
サッカロファガス・デグラダンスのＧＣ含量が約４６％であり、一方でクロストリジウム・アセトブチリカムが３１％のＧＣ含量を示すので、Ｃｅｌ５Ｈをコードする野生型遺伝子がクロストリジウム・アセトブチリカムコドンバイアスに適合しない可能性があると予測した。野生型Ｃｅｌ５Ｈをコードするが、クロストリジウム・アセトブチリカムのコドンバイアスに適合した合成遺伝子を作製し、上記されるようにｐＳＯＳ９５２中にクローン化した。
【０１８５】
Ｃｅｌ５Ｈコード配列がクロストリジウム・アセトブチリカムについて最適化されたコドンを図１Ｆにおいて示し（配列番号６）、対応するポリペプチド配列を図１Ｇにおいて示す（配列番号７）。この配列は、検出及び／又は単離を容易にする改変されたＣ末端６×Ｈｉｓタグを含有する。
【０１８６】
（メチル化後に）この新規ベクターでクロストリジウム・アセトブチリカムを形質転換して、組み換えコロニーを生成した。２ＹＴＣ中で増殖後の上清の解析から、ＣＭＣａｓｅ活性の改善が明らかになり、したがって活性のあるＣｅｌ５Ｈが組み換え株によって分泌されたことを示す。分泌収量は、現時点で１ｍｇ／Ｌ未満のままであるように思われる。
【０１８７】
サッカロファガス・デグラダンスは２つの膜（外膜及び細胞膜）を提示するグラム陰性細菌であるが、クロストリジウム・アセトブチリカム（グラム陽性細菌）は細胞膜のみを有する。したがって、Ｃｅｌ５Ｈの天然のシグナル配列は２つの膜を横切る分泌に対処するように設計されているが、クロストリジウム・アセトブチリカムによる効率的な分泌には適切ではない可能性がある。この理由のために、クロストリジウム・セルロリティカムからＣｅｌ５Ａのシグナル配列はクロストリジウム・アセトブチリカムによってよく分泌されるので（最大５ｍｇ／Ｌ）、分子生物学技法を使用して、Ｃｅｌ５Ｈの天然のシグナル配列をクロストリジウム・セルロリティカムからのＣｅｌ５Ａのシグナル配列によって置換した。ハイブリッド遺伝子を含有するベクターでクロストリジウム・アセトブチリカムを形質転換した。Ｃｅｌ５Ａシグナル配列を使用するＣｅｌ５Ｈの分泌収量を調べた。クロストリジウム・セルロリティカムからＣｅｌ５Ａのシグナル配列によるＣｅｌ５Ｈの天然のシグナル配列の置換によって、分泌レベルが増加したことが示された。ｐＮＰ−セロビオシドに対する強いＣｅｌ５Ｈ活性に起因して、約０．５ｍｇ／Ｌの分泌レベルを測定することができた。
【０１８８】
組み換え細菌株の培養物を、ｐＨ５．５に固定した３ｇ／Ｌの２ＹＴ−ＰＡＳＣの環境の発酵槽中で増殖させた。ＰＡＳＣの分解、残留セロビオースの消費及び細菌増殖を測定した。結果を図１１及び図１２において示す。
【０１８９】
０．４５のＯＤ値が到達されるまでの最初の４０時間の間に、有意な細菌増殖が観察された。続いて、細胞溶解が起こった。同時に、ＰＡＳＣの分解の増加が観察された。１１７時間後に、６８％のＰＡＳＣは消費されたが、単糖類又はオリゴ糖類を検出することができなかった。これは、ＰＡＳＣの加水分解でＣｅｌ５Ｈによって遊離される糖が細菌によって直ちに消費されることを示唆した。これらの結果は、ＰＡＳＣ補給培地上で増殖可能な株の構築に成功したことを示した。
【０１９０】
組み換え細菌株の第２の培養物を、ｐＨ５．５に固定した２ＹＴ（しかしながらＰＡＳＣを含有しない）の環境の発酵槽中で増殖させた。この実験の目的は、細菌増殖とＰＡＳＣの消費との間の相関関係をチェックすることであった。結果を図１２において示す。期待されるように、この事例において細菌増殖を観察することができなかった。
【０１９１】
したがって、観察された細菌増殖は、ＰＡＳＣの分解、及び続いて起こる遊離糖質の消費に起因すると結論を下すことができる。
【０１９２】
さらに、第３の培養物を設定して、観察された細菌増殖が、クロストリジウム・アセトブチリカムの内在性の酵素システムの活性に起因するのではなく、Ｃｅｌ５Ｈの活性に起因するかどうかをチェックした。したがって、空ベクター（ｐＳＯＳ）を含有する株の培養物を、ｐＨ５．５に固定した３ｇ／Ｌの２ＹＴ−ＰＡＳＣの環境の発酵槽中で増殖させた。
【０１９３】
最終的に、第４の培養物をｐＨ５．５に固定した５ｇ／Ｌの２ＹＴ−ＰＡＳＣの環境の発酵槽中で増殖させて、ＰＡＳＣ濃度が細菌増殖のための限定因子かどうかをチェックした。したがって、ＰＡＳＣのより高い濃度はより高いＯＤ値をもたらす可能性がある（すなわち、以前の実験において観察された最大のＯＤ値０．４５よりも高い）。
【０１９４】
Ｃｅｌ５Ｈをコードする遺伝子は、他のセルラーゼ（遊離状態でＣｅｌ５Ｈから独立して作用する）をコードする遺伝子と組み合わせてクローン化されている。代替的には、Ｃｅｌ５Ｈ（ドッケリンが添付された）、スキャフォルディン、及び適切なドッケリンを保有する１つ又は２つの他のセルラーゼからなる効率的なミニセルロソームをコードする遺伝子をクローン化し、クロストリジウム・アセトブチリカムにおいて発現させた。
【０１９５】
３又は４の異なる遺伝子をクローン化する場合、ｐＭＴＬと称される第２の発現ベクターも使用する。このベクターは、クロストリジウム・アセトブチリカムにおいてｐＳＯＳ９５２と適合することが示された。代替的には、遺伝子は、特異的部位（特に、国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６６９９７号における教示等）で、又はランダムに、染色体中に組込まれる。
【０１９６】
さらに、Ｃｅｌ５Ｈの追加モジュールを有するセルラーゼ（特にＤＺ、及び任意でＣＢＭ６、実施例４を参照）をクローン化して、クロストリジウム・アセトブチリカムにおいて発現させ、結晶性セルロースの分解及び利用の増加を達成する。
【０１９７】
クロストリジウム・アセトブチリカムの野生型及び様々な改変株（例えば、修飾された分泌機構を有する株、非相同タンパク質の分泌について最適化された株、及び／又は、エタノール（又はブタノール）の最適化された産生のために修飾された代謝を有する株等）の両方を使用する。
【０１９８】
対応する組み換えクロストリジウム・アセトブチリカムは、改変酵素を産生及び分泌し、１つ又は複数のセルロース基質上で増殖及び／又は分解する能力を提示することが示される。
【０１９９】
実施例８：クロストリジウム・アセトブチリカムによるＣｅｌ５Ｈの分泌の改善
異なるスキャフォールドタンパク質から得られたモジュールを使用する様々な構造を作製し、図１３で概略的に表す。
【０２００】
第１の構築物において、クロストリジウム・アセトブチリカムのコドンバイアスに適合し、サッカロファガス・デグラダンスからのセルラーゼＣｅｌ５Ｈをコードする合成ポリ核酸を、キャリアードメインをコードし、ＣＢＭ３ａモジュール、クロストリジウム・アセトブチリカムのＣｉｐＡタンパク質から得られた第１（Ｘａ）及び第２（Ｘａ’）のＸモジュール、並びにクロストリジウム・セルロリティカムのＣｉｐＣスキャフォールドタンパク質のシグナルペプチドを含むポリ核酸に融合した。適切なリンカー配列を使用して異なるモジュールを互いに連結する。
【０２０１】
天然のＣｅｌ５Ｈポリペプチドのドメイン構造はＧＨ５−ＰＳＬ−ＣＢＭ６−ＥＰＲ−ＤＺと略述することができる（ＧＨ５はグリコシドヒドロラーゼファミリー５ドメイン、ＰＳＬはポリセリンリンカー、ＣＢＭ６は炭水化物結合モジュールファミリー６ドメイン、ＥＰＲはグルタミン酸−プロリンリッチ領域を表し、この解釈に限定されずに、ＤＺは、本発明者によって推定上の炭水化物結合モジュールとして同定されたＣ末端ドメインを表す）。
【０２０２】
この構築物はオーバーラップ伸長ＰＣＲ技法を使用して構築し、シャトル発現ベクターｐＳＯＳ９５２（抗生物質エリスロマイシンに対する耐性を付与する）中にクローン化し、それによってプラスミドｐＳＯＳ９５２−ＣＢＭ−Ｘａ−Ｘａ’−５Ｈを生成した。構築物を配列決定によってチェックし、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでメチル化した。続いてメチル化されたベクターを使用して、クロストリジウム・アセトブチリカム株ＡＴＴＣ８２４を電気的に形質転換した。
【０２０３】
クロストリジウム・セルロリティカムからのスキャフォルディンＣｉｐＣのシグナルペプチドが添付された野生型Ｃｅｌ５Ｈタンパク質のクロストリジウム・アセトブチリカムによる分泌は、０．５〜０．９ｍｇ／Ｌ（パラ−ニトロフェニル−セロビオシドに対する培養上清の活性に基づく値）であった。しかしながら、キャリアードメインに連結したＣｅｌ５Ｈタンパク質を含む融合タンパク質をコードする２つの構築物を保有するクロストリジウム・アセトブチリカム株は、有意により高い量で、より具体的には最大６．１ｍｇ／Ｌで（パラ−ニトロフェニル−セロビオシドに対する培養上清の活性に基づいた値、図１４（３）を参照）、セルラーゼ５Ｈを含有する融合タンパク質を増殖培地中に分泌した。これらの結果は、クロストリジウム・アセトブチリカムによるＣｅｌ５Ｈの産生及び分泌を実証する。
【０２０４】
実施例９：セルロースに対する本発明による融合タンパク質の活性の実証。
分子生物学技法を使用して、実施例８において記載される異なるタンパク質構築物をコードするＤＮＡを増幅し、大腸菌発現ベクター（ｐＥＴ２２ｂ（＋）、Novagen社）中でクローン化した。もたらされたベクターを使用して、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Novagen社）を形質転換した。全ての事例において、６つのＨｉｓコドンを組み換えタンパク質のＣ末端に移植して、ニッケル樹脂（Ｎｉ−ＮＴＡ、Qiagen社）上での精製を容易にした。
【０２０５】
組み換え株をルリア・ベルターニの培地中で増殖させ、クローン化された遺伝子の発現は誘発物質としてＩＰＴＧを使用して誘導した。組み換えタンパク質の合成は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって確認した。培養物を遠心分離し、採取した細胞はフレンチプレスで破壊した。
【０２０６】
組み換えタンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡ（Qiagen社）に粗抽出物をロードし、イミダゾリウムの濃度を増加させて対象となるタンパク質を溶出することによって精製した。ＦＰＬＣ  Ｑセファロース（Ｈｉｔｒａｐ  Ｑ  ＨＰ樹脂、GE Healthcare社）を使用して精製を行った。
【０２０７】
精製されたｃｅｌ５Ｈ酵素の活性をパラ−ニトロフェニル−セロビオシドに対して試験し、結果を図１５ａにおいて示す。代替的に、標準条件（３７℃）を使用して、Ａｖｉｃｅｌ（微結晶性セルロース）に対する活性を測定した。結果を図１５ｂにおいて図示する。
【０２０８】
実施例１０：実施例２〜７において記載されるようなクローニング及び発現の戦略は、Ｃｅｌ５Ｈ相同体で、特に遺伝子ａｃｌＡによってコードされたシュードモナス種ＮＤ１３７からのＡＣＬＡで使用される。
同じ戦略は、サッカロファガス・デグラダンスからのＣｅｌ５Ｈと重要な全体的相同性を示し、特にＤＺドメインを保持する酵素に適用される。
【０２０９】
これは、シュードモナス種ＮＤ１３７からの遺伝子ａｃｌＡによってコードされた酵素（ＡＣＬＡ）によって例証される。図１６は、ＡＣＬＡの一般的な構成をＣｅｌ５Ｈの構成と比較する。ＡＣＬＡをコードする遺伝子は既にクローン化され、大腸菌において過剰発現されたが、対応する酵素は完全には特徴づけられなかった（Aoki & Kamei 2006. European Journal of Phycology 41 : 321-328）。
【０２１０】
これらの２つの酵素間の高度な相同性（リンカーを例外として）に関して、２つの酵素が類似した特性／活性を共有することが予想される。したがって、実施例２〜７において記載されたクローニング及び発現の戦略はＡＣＬＡに適用され、特にクロストリジウム・アセトブチリカムにおいてさらなるセルロース分解システムをもたらす。
【０２１１】
実施例１１：パラ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビオシド（ｐＮＰＣ）、リン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）及びＡｖｉｃｅｌを含む様々な基質に対するＡＣＬＡの活性の評価
精製されたＡＣＬＡ酵素の活性を標準条件（３７℃）を使用して様々な基質に対して試験し、精製された組み換えＣｅｌ５Ｈの同じ基質に対する活性と比較した。
【０２１２】
ＡＣＬＡの酵素活性を可溶性発色基質（パラ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビオシド（ｐＮＰＣ））に対して試験し、Ｃｅｌ５Ｈ（９５％純度）の活性と比較した。パラ−ニトロフェニル基とセロビオースとの間の連結の酵素による切断に際して、パラ−ニトロフェノール及びセロビオースは遊離し、その濃度は分光光度分析を用いて直接決定することができる。パラ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビオシドに対するＡＣＬＡの酵素活性は１７．９ｕｉ／μｍｏｌであったが、同じ基質に対するＣｅｌ５Ｈの酵素活性は１８．２ｕｉ／μｍｏｌであった。したがって、ＡＣＬＡは、Ｃｅｌ５Ｈと比較して、パラ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビオシド基質に対する９８％の酵素活性を示した。
【０２１３】
ＰＡＳＣ（非結晶性セルロース）に対する活性の試験に関しては、使用される酵素濃度は５ｎＭであり、基質濃度は３．５ｇ／Ｌ（ｐＨ６．０）であった。ＰＡＳＣに対するＡＣＬＡの酵素活性は７８０ｕｉ／μｍｏｌであったが、同じ基質に対するＣｅｌ５Ｈの酵素活性は１６００ｕｉ／μｍｏｌであった。したがって、ＡＣＬＡは、Ｃｅｌ５Ｈと比較して、ＰＡＳＣに対する４９％の酵素活性を示した。
【０２１４】
Ａｖｉｃｅｌ（結晶性セルロース）に対する活性の試験に関しては、酵素濃度は１００ｎＭであり、基質は３．５ｇ／Ｌ（ｐＨ６．０）であった。Ａｖｉｃｅｌに対するＡＣＬＡの酵素活性は５６μＭ／２４時間であったが、同じ基質に対するＣｅｌ５Ｈの酵素活性は１４０μＭ／２４時間であった。したがって、ＡＣＬＡは、Ｃｅｌ５Ｈと比較して、Ａｖｉｃｅｌに対する４０％の酵素活性を示した。
【図Ｉ−１】
2012510262.tif 000002
【図Ｉ−２】
2012510262.tif 000003
【図Ｉ−３】
2012510262.tif 000004
【図Ｉ−４】
2012510262.tif 000005
【図ＩＩ】
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【図ＩＩＩ】
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【図ＩＶ】
2012510262.tif 000008
【図ＶＩＩ】
2012510262.tif 000009
【図ＶＩＩＩ】
2012510262.tif 000010
【図ＩＸ】
2012510262.tif 000011
【図Ｘ】
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【図ＸＩ】
2012510262.tif 000013
【図ＸＩＩ】
2012510262.tif 000014
【図Ｖ】
2012510262.tif 000015
【図ＶＩ】
2012510262.tif 000016
【配列表】
2012510262000001.app
【国際調査報告】
2012510262.tif 000017
2012510262.tif 000018
2012510262.tif 000019
2012510262.tif 000020
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