【手続補正書】
【提出日】令和2年6月11日(2020.6.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）有効量のＴ３またはＴ４；および
ｂ）有効量の５−アザシチジン（ＡＺＴ）、３−デアザネプラノシンＡ（ＤＥＺＡ）またはそれらの組み合わせ
を含む培地において未成熟膵臓ベータ細胞を培養し、それにより、インスリンを発現する機能的ベータ細胞を産生することを含む、機能的ベータ細胞を産生する方法。
【請求項２】
前記機能的ベータ細胞が、グルコース刺激性インスリン分泌を呈する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記機能的ベータ細胞が、グルコース依存性ミトコンドリア呼吸を呈する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記グルコース刺激性インスリン分泌が、グルコース刺激に応答した二相性インスリン分泌を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記機能的ベータ細胞が、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、及びＳＬＣ２Ａ１を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記培地が、ＡＬＫ５阻害剤を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記未成熟ベータ細胞が、空気‐液体界面において培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記未成熟ベータ細胞が、懸濁培養で培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記二相性インスリン分泌の第１相が、前記機能的ベータ細胞からのインスリンの基礎分泌の４倍〜８倍に増加する、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記培地が、前記有効量のＤＥＺＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記培地が、前記有効量のＡＺＴを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記培地が、前記有効量のＴ３を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記培地が、前記有効量のＴ４を含む、請求項１１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５８】
以上、本発明を、様々な具体的な材料、手順及び実施例を参照しながら本明細書に記載及び例示したが、本発明は、その目的のために選択された特定の材料及び手順の組み合わせに限定されない点は理解されるであろう。当業者には理解されるように、このような細部には多くの変更が示唆される可能性がある。本明細書及び実施例はあくまで例示的なものとしてみなされるべきものであり、発明の真の範囲及び趣旨は以下の「特許請求の範囲」によって示されることが意図される。本出願において引用される全ての参照文献、特許及び特許出願は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
また、本発明は以下を提供する。
[１]
膵内胚葉細胞を、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、及びＳＬＣ２Ａ１を発現する機能的ベータ細胞へと分化させる方法であって、膵内分泌細胞を、ＵＮＣ０６３８、ＵＮＣ０６４２、ＵＣＮ０６４６、ＴＣ−Ｅ５００３、Ａ３６６、ＰＦ０３８１４７３５、ＺＭ４４７４３９、ＳＢ７４７６５１Ａ、ＰＦＩ１、ＬＹ３０３５１１、ＭＳ４３６、ＡＺＴ、ＤＥＺＡ、ピロキサミド、ＣＩ９９９４、又はＭＣ１５６８のうちの１つ又は２つ以上が補充された培地中で培養することを含む、方法。
[２]
前記培養培地に、ヘパリン、Ｎ−アセチルシステイン、製剤Ｉ、及びＴ３、Ｔ４、又はその類似体のうちの１つ若しくは２つ以上が更に補充される、上記[１]に記載の方法。
[３]
前記培養培地がＡＬＫ５阻害剤を欠く、上記[１]又は[２]に記載の方法。
[４]
前記培養培地にＡＬＫ５阻害剤が補充される、上記[１]又は[２]に記載の方法。
[５]
前記培地に、ＺＭ４４７４３９、ヘパリン、Ｎ−アセチルシステイン、及びＴ３、Ｔ４、又はその類似体のうちの１つ又は２つ以上が補充され、前記培地がＡＬＫ５阻害剤を含有しない、上記[１]に記載の方法。
[６]
前記培地にＴ３が補充される、上記[５]に記載の方法。
[７]
前記培地にＡＺＴが補充される、上記[６]に記載の方法。
[８]
前記培地にＤＥＺＡが補充される、上記[７]に記載の方法。
[９]
前記機能的ベータ細胞が、胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞、初期腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞、膵内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞、膵内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞、未成熟ベータ細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞、及び機能的ベータ細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞のうちの１つ又は２つ以上の段階的分化によって得られる、上記[１]に記載の方法。
[１０]
前記方法が、空気−液体界面で前記細胞を培養することを含む、上記[１]に記載の方法。
[１１]
前記方法が、懸濁クラスター中で前記細胞を培養することを含む、上記[１]に記載の方法。
[１２]
膵内分泌細胞のインビトロ分化によって得られた、単一ホルモンインスリン、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＭＡＦＡを発現する機能的ベータ細胞のインビトロ集団。
[１３]
前記細胞がＵＣＮ３及びＳＬＣ２Ａ１も発現する、上記[１２]に記載の集団。
[１４]
前記細胞が、グルコース刺激性インスリン分泌及びグルコース依存性ミトコンドリア呼吸を呈する、上記[１２]に記載の集団。
[１５]
前記グルコース刺激性インスリン分泌及びグルコース依存性ミトコンドリア呼吸が、ヒト膵島細胞のものに類似している、上記[１４]に記載の集団。
[１６]
ＵＮＣ０６３８、ＵＮＣ０６４２、ＵＣＮ０６４６、ＴＣ−Ｅ５００３、Ａ３６６、ＰＦ０３８１４７３５、ＺＭ４４７４３９、ＳＢ７４７６５１Ａ、ＰＦＩ１、ＬＹ３０３５１１、ＭＳ４３６、ＡＺＴ、ＤＥＺＡ、ピロキサミド、ＣＩ９９９４、又はＭＣ１５６８のうちの１つ又は２つ以上が補充された培地中で膵内分泌細胞を培養することによって得られる、単一ホルモンインスリン、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＭＡＦＡを発現する膵臓ベータ細胞のインビトロ集団。
[１７]
前記培地に、ヘパリン、Ｎ−アセチルシステイン、製剤Ｉ、及びＴ３、Ｔ４、又はその類似体のうちの１つ又は２つ以上が更に補充される、上記[１６]に記載の集団。
[１８]
前記培地がＡＬＫ５阻害剤を欠く、上記[１６]又は[１７]に記載の集団。
[１９]
前記培地にＴ３が補充される、上記[１６]又は[１７]に記載の集団。
[２０]
前記培地に、ＺＭ４４７４３９、ヘパリン、Ｎ−アセチルシステイン、製剤Ｉ、及びＴ３、Ｔ４、又はその類似体のうちの１つ又は２つ以上が補充され、前記培地がＡＬＫ５阻害剤を含有しない、上記[１６]に記載の集団。
[２１]
前記培地にＴ３が補充される、上記[１６]に記載の集団。
[２２]
前記培地にＡＺＴが補充される、上記[２１]に記載の集団。
[２３]
前記培地にＤＥＺＡが補充される、上記[２２]に記載の集団。
[２４]
前記細胞がＵＣＮ３及びＳＬＣ２Ａ１も発現する、上記[１６]に記載の集団。
[２５]
前記細胞が、グルコース刺激性インスリン分泌及びグルコース依存性ミトコンドリア呼吸を呈する、上記[１６]に記載の集団。
[２６]
前記グルコース刺激性インスリン分泌及びグルコース依存性ミトコンドリア呼吸が、膵島細胞のものに類似している、上記[１６]に記載の集団。
[２７]
多能性幹細胞を、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、及びＳＬＣ２Ａを発現する機能的ベータ細胞へと分化させる方法であって、
ａ．多能性幹細胞を未成熟ベータ細胞へと分化させ、かつ
ｂ．ＵＮＣ０６３８、ＵＮＣ０６４２、ＵＣＮ０６４６、ＴＣ−Ｅ５００３、Ａ３６６、ＰＦ０３８１４７３５、ＺＭ４４７４３９、ＳＢ７４７６５１Ａ、ＰＦＩ１、ＬＹ３０３５１１、ＭＳ４３６、ＡＺＴ、ＤＥＺＡ、ピロキサミド、ＣＩ９９９４、又はＭＣ１５６８のうちの１つ又は２つ以上が補充された培地中で前記未成熟ベータ細胞を培養することによって、前記未成熟ベータ細胞を、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、及びＳＬＣ２Ａ１を発現する機能的ベータ細胞へと分化させる、方法。
[２８]
前記機能的ベータ細胞が、ヒト膵島細胞と類似しているグルコース依存性ミトコンドリア呼吸を有する、上記[２７]に記載の方法。
[２９]
前記機能的ベータ細胞が、ヒト膵島細胞に類似しているグルコース刺激性インスリン分泌を有する、上記[２７]に記載の方法。
[３０]
前記機能的ベータ細胞が、複数の相においてインスリンを分泌する、上記[２７]に記載の方法。
[３１]
前記培養培地に、ヘパリン、Ｎ−アセチルシステイン、製剤Ｉ、及びＴ３、Ｔ４、又はその類似体のうちの１つ又は２つ以上が更に補充される、上記[２７]に記載の方法。
[３２]
前記培養培地がＡＬＫ５阻害剤を欠く、上記[２７]又は[３１]に記載の方法。
[３３]
前記培養培地にＴ３が補充される、上記[２７]又は[３１]に記載の方法。
[３４]
前記培地に、ＺＭ４４７４３９、ヘパリン、Ｎ−アセチルシステイン、及びＴ３、Ｔ４、又はその類似体のうちの１つ又は２つ以上が補充され、前記培地がＡＬＫ５阻害剤を含有しない、上記[２７]に記載の方法。
[３５]
前記培地にＴ３が補充される、上記[３４]に記載の方法。
[３６]
前記培地にＡＺＴが補充される、上記[３５]に記載の方法。
[３７]
前記培地にＤＥＺＡが補充される、上記[３６]に記載の方法。
[３８]
前記方法が、空気−液体界面で前記未成熟ベータ細胞を培養することを含む、上記[２７]に記載の方法。
[３９]
前記方法が、懸濁クラスター中で前記未成熟ベータ細胞を培養することを含む、上記[２７]に記載の方法。
[４０]
多能性幹細胞を分化させる前記工程が、
ａ．前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ステージ１細胞」）へと分化させる工程と、
ｂ．前記ステージ１細胞を、初期腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ステージ２細胞」）へと分化させる工程と、
ｃ．前記ステージ２細胞を、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ステージ３細胞」）へと分化させる工程と、
ｄ．前記ステージ３細胞を、膵内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ステージ４細胞」）へと分化させる工程と、
ｅ．前記ステージ４細胞を、膵内分泌前駆細胞（「ステージ５細胞」）へと分化させる工程と、
ｆ．前記ステージ５細胞を、未成熟ベータ細胞へと分化させる工程と、を含む、上記[２７]に記載の方法。
[４１]
前記工程ｅ．及びｆ．が、前記空気−液体界面で培養することを含む、上記[４０]に記載の方法。
[４２]
前記工程ｅ．及びｆ．が、懸濁クラスター中で前記細胞を培養することを含む、上記[４０]に記載の方法。
[４３]
前記方法が、前記多能性幹細胞をＭＣＸ化合物及びＧＤＦ−８が補充された培地中で培養することによって、多能性幹細胞をステージ１細胞へと分化させることを含む、上記[４０]に記載の方法。
[４４]
前記方法が、前記ステージ１細胞をＦＧＦ７及びアスコルビン酸が補充された培地中で培養することによって、前記ステージ１細胞をステージ２細胞へと分化させることを含む
、上記[４０]に記載の方法。
[４５]
前記方法が、前記ステージ２細胞をＦＧＦ７、レチノイン酸、ＳＡＮＴ−１、ＰＫＣ活性剤、ＢＭＰ阻害剤、及びアスコルビン酸が補充された培地中で培養することによって、前記ステージ２細胞をステージ３細胞へと分化させることを含む、上記[４０]に記載の方法。
[４６]
前記方法が、前記ステージ３細胞をＦＧＦ７、レチノイン酸、ＳＡＮＴ−１、ＰＫＣ活性剤、ＢＭＰ阻害剤、及びアスコルビン酸が補充された培地中で培養することによって、前記ステージ３細胞をステージ４細胞へと分化させることを含む、上記[４０]に記載の方法。
[４７]
前記方法が、前記ステージ４細胞をＳＡＮＴ−１、ＰＫＣ活性剤、ＢＭＰ阻害剤、及びアスコルビン酸が補充された培地中で培養することによって、前記ステージ４細胞をステージ５細胞へと分化させることを含む、上記[４０]に記載の方法。
[４８]
前記培地に、Ｔ３、Ｔ４、又はその類似体のうちの１つ又は２つ以上が更に補充される、上記[４７]に記載の方法。
[４９]
前記方法が、前記ステージ５細胞をＢＭＰ阻害剤、アスコルビン酸、Ｔ３、Ｔ４、又はその類似体のうちの１つ又は２つ以上が補充された培地中で培養することによって、前記ステージ５細胞を未成熟ベータ細胞へと培養することを含む、上記[４０]に記載の方法。
[５０]
前記培地にＡＬＫ５阻害剤又はガンマセクレターゼ阻害剤が更に補充される、上記[４９]に記載の方法。
[５１]
前記方法が、前記未成熟ベータ細胞をＡＬＫ５阻害剤を欠き、かつＺＭ４４７４３９、ＡＺＴ、Ｎ−アセチルシステイン、ＤＥＺＡ、製剤Ｉ、及びＴ３、Ｔ４、又はその類似体のうちの１つ又は２つ以上が補充された培地中で培養することによって、前記未成熟ベータ細胞をＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、及びＳＬＣ２Ａを発現している機能的ベータ細胞へと分化させることを含む、上記[２７]に記載の方法。
[５２]
前記グルコース依存性ミトコンドリア呼吸のグルコース刺激後の酸素消費速度応答が、基礎酸素消費速度を約２０％〜約８０％上回る範囲である、上記[１４]、[２５]、及び[２８]に記載の方法。
[５３]
前記酸素消費速度応答が、グルコース刺激の少なくとも１５分後に生じた、上記[５２]に記載の方法。
[５４]
前記グルコース刺激性インスリン分泌が、グルコース刺激に応答した急速な二相インスリン分泌を含む、上記[１４]、[２５]、及び[２８]に記載の方法。
[５５]
前記二相性インスリン分泌の第１相が、基礎分泌の少なくとも４倍〜少なくとも８倍増加し、第２相が、前記基礎分泌の少なくとも２倍〜少なくとも４倍増加する、上記[５４]に記載の方法。
[５６]
前記インスリン分泌が、前記グルコース刺激の少なくとも５分〜少なくとも１０分後に生じる、上記[５４]に記載の方法。
[５７]
前記機能的ベータ細胞がヒト膵島細胞と類似しているグルコース依存性ミトコンドリア
呼吸を有する、上記[５１]に記載の方法。
[５８]
前記機能的ベータ細胞が膵島細胞に類似しているグルコース刺激性インスリン分泌を有する、上記[５１]に記載の方法。
[５９]
前記グルコース依存性ミトコンドリア呼吸のグルコース刺激後の酸素消費速度応答が、基礎酸素消費速度を約２０％〜約８０％上回る範囲である、上記[５７]に記載の方法。
[６０]
前記酸素消費速度応答が、グルコース刺激の少なくとも１５分後に生じた、上記[５９]に記載の方法。
[６１]
前記グルコース刺激性インスリン分泌が、グルコース刺激に応答した急速な二相性インスリン分泌を含む、上記[５８]に記載の方法。
[６２]
前記二相性インスリン分泌の第１相が、基礎分泌の少なくとも４倍〜少なくとも８倍増加し、第２相が、前記基礎分泌の少なくとも２倍〜少なくとも４倍増加する、上記[６１]に記載の方法。
[６３]
前記インスリン分泌が、前記グルコース刺激の少なくとも５分〜少なくとも１０分後に生じる、上記[６１]に記載の方法。
[６４]
前記ステージ４細胞が凍結保存される、上記[４０]に記載の方法。
[６５]
前記工程ｅが、ステージ４凍結保存細胞を培養することを含む、上記[４０]に記載の方法。
[６６]
前記Ｔ３が１ｎＭ〜１００ｎＭの範囲である、上記[６]、[２１]、[３５]、及び[５１]に記載の方法。
[６７]
前記培地にＴ３が補充され、前記Ｔ３が１ｎＭ〜１μＭの範囲である、上記[４８]〜[５０]に記載の方法。
[６８]
多能性幹細胞を、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、及びＳＬＣ２Ａを発現する機能的ベータ細胞へと分化させる方法であって、
ａ．前記多能性幹細胞を、前記多能性幹細胞をアクチビンＡ及びＷＮＴ３Ａが補充された培地中で培養することによって得られた胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させ、
ｂ．前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する前記細胞を未成熟ベータ細胞へと分化させ、かつ
ｃ．ＵＮＣ０６３８、ＵＮＣ０６４２、ＵＣＮ０６４６、ＴＣ−Ｅ５００３、Ａ３６６、ＰＦ０３８１４７３５、ＺＭ４４７４３９、ＳＢ７４７６５１Ａ、ＰＦＩ１、ＬＹ３０３５１１、ＭＳ４３６、ＡＺＴ、ＤＥＺＡ、ピロキサミド、ＣＩ９９９４、又はＭＣ１５６８のうちの１つ又は２つ以上が補充された培地中で前記未成熟ベータ細胞を培養することによって、前記未成熟ベータ細胞を、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、及びＳＬＣ２Ａ１を発現する機能的ベータ細胞へと分化させる、方法。
[６９]
前記機能的ベータ細胞がヒト膵島細胞と類似しているグルコース依存性ミトコンドリア呼吸を有する、上記[６８]に記載の方法。
[７０]
前記機能的ベータ細胞がヒト膵島細胞に類似しているグルコース刺激性インスリン分泌を有する、上記[６８]に記載の方法。
[７１]
前記機能的ベータ細胞が、複数の相においてインスリンを分泌する、上記[６８]に記載の方法。
[７２]
前記培養培地に、ヘパリン、Ｎ−アセチルシステイン、製剤Ｉ、及びＴ３、Ｔ４、又はその類似体のうちの１つ又は２つ以上が更に補充される、上記[６８]に記載の方法。
[７３]
前記培養培地がＡＬＫ５阻害剤を欠く、上記[６８]又は[７２]に記載の方法。
[７４]
前記培養培地にＴ３が補充される、上記[６８]又は[７２]に記載の方法。
[７５]
前記培地に、ＺＭ４４７４３９、ヘパリン、Ｎ−アセチルシステイン、及びＴ３、Ｔ４、又はその類似体のうちの１つ又は２つ以上が補充され、また前記培地がＡＬＫ５阻害剤を含有しない、上記[６８]に記載の方法。
[７６]
前記培地にＴ３が補充される、上記[７５]に記載の方法。
[７７]
前記培地にＡＺＴが補充される、上記[７６]に記載の方法。
[７８]
前記培地にＤＥＺＡが補充される、上記[７７]に記載の方法。
[７９]
前記方法が、空気−液体界面において、懸濁クラスター中で、ローラボトル中で、又はマイクロキャリア上で前記未成熟ベータ細胞を培養することを含む、上記[６８]に記載の方法。
[８０]
前記方法が、ローラボトル中で前記未成熟ベータ細胞を培養することを含む、上記[６８]に記載の方法。
[８１]
前記方法が、マイクロキャリア上のローラボトル中で前記未成熟ベータ細胞を培養することを含む、上記[８０]に記載の方法。
[８２]
多能性幹細胞を分化させる前記工程が、
ａ．前記多能性幹細胞をアクチビンＡ及びＷＮＴ３Ａが補充された培地中で培養することによって、前記多能性幹細胞を前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ステージ１細胞」）へと分化させる工程と、
ｂ．前記ステージ１細胞を、初期腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ステージ２細胞」）へと分化させる工程と、
ｃ．前記ステージ２細胞を、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ステージ３細胞」）へと分化させる工程と、
ｄ．前記ステージ３細胞を、膵内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ステージ４細胞」）へと分化させる工程と、
ｅ．前記ステージ４細胞を、膵内分泌前駆細胞細胞（「ステージ５細胞」）へと分化させる工程と、
ｆ．前記ステージ５細胞を、未成熟ベータ細胞へと分化させる工程と、を含む、上記[６８]に記載の方法。
[８３]
前記工程ｅ．及びｆ．が、前記空気−液体界面において、懸濁クラスター中で、ローラボトル中で、又はマイクロキャリア上で培養することを含む、上記[８２]に記載の方法。
[８４]
前記工程ｅ．及びｆ．が、ローラボトル中で前記細胞を培養することを含む、上記[８２]に記載の方法。
[８５]
前記工程ｅ．及びｆ．が、マイクロキャリア上のローラボトル中で前記未成熟ベータ細胞を培養することを含む、上記[８２]に記載の方法。
[８６]
前記方法が、前記ステージ１細胞をＦＧＦ７及びアスコルビン酸が補充された培地中で培養することによって、前記ステージ１細胞をステージ２細胞へと分化させることを含む、上記[８２]に記載の方法。
[８７]
前記方法が、前記ステージ２細胞をＦＧＦ７、レチノイン酸、ＳＡＮＴ−１、ＰＫＣ活性剤、及びアスコルビン酸が補充された培地中で培養することによって、前記ステージ２細胞をステージ３細胞へと分化させることを含む、上記[８２]に記載の方法。
[８８]
前記培地がＢＭＰ阻害剤を欠く、上記[８７]に記載の方法。
[８９]
前記方法が、前記ステージ３細胞をＦＧＦ７、レチノイン酸、ＳＡＮＴ−１、ＰＫＣ活性剤、及びアスコルビン酸が補充された培地中で培養することによって、前記ステージ３細胞をステージ４細胞へと分化させることを含む、上記[８２]に記載の方法。
[９０]
前記培地がＢＭＰ阻害剤を欠く、上記[８９]に記載の方法。
[９１]
前記方法が、前記ステージ４細胞をＳＡＮＴ−１、ＰＫＣ活性剤、ＢＭＰ阻害剤、及びアスコルビン酸が補充された培地中で培養することによって、前記ステージ４細胞をステージ５細胞へと分化させることを含む、上記[８２]に記載の方法。
[９２]
前記培地に、Ｔ３、Ｔ４、又はその類似体のうちの１つ又は２つ以上が更に補充される、上記[９１]に記載の方法。
[９３]
前記方法が、前記ステージ５細胞をＢＭＰ阻害剤、アスコルビン酸、Ｔ３、Ｔ４、又はその類似体のうちの１つ又は２つ以上が補充された培地中で培養することによって、前記ステージ５細胞を未成熟ベータ細胞へと培養することを含む、上記[８２]に記載の方法。
[９４]
前記培地にＡＬＫ５阻害剤又はガンマセクレターゼ阻害剤が更に補充される、上記[９３]に記載の方法。
[９５]
前記方法が、前記未成熟ベータ細胞を、ＡＬＫ５阻害剤を欠き、かつＺＭ４４７４３９、ＡＺＴ、Ｎ−アセチルシステイン、ＤＥＺＡ、製剤Ｉ、及びＴ３、Ｔ４、又はその類似体のうちの１つ又は２つ以上が補充された培地中で培養することによって、前記未成熟ベータ細胞を、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、及びＳＬＣ２Ａを発現している機能的ベータ細胞へと分化させることを含む、上記[６８]に記載の方法。
[９６]
前記多能性幹細胞がヒトＨ１又はＨ９細胞である、上記[２７]に記載の方法。
[９７]
前記多能性幹細胞がヒトＣｙＴ４９細胞である、上記[６８]に記載の方法。