【手続補正書】
【提出日】令和2年1月10日(2020.1.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号９〜２６２のいずれか１つにより示されるＣａｓ９のアミノ酸配列と少なくとも９０パーセント同一であるアミノ酸配列を含み、
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２６２、２６７、２９４、４０５、４０９、４８０、５４３、６９４、１２１９、１２２４、１２５６および１３６２からなる群から選択されるアミノ酸残基において、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応するアミノ酸残基において、少なくとも１つの変異を含み、
Ｃａｓ９蛋白質が、古典的ＰＡＭを含まない標的配列に対する増加した活性を示す、組み換えＣａｓ９蛋白質。
【請求項２】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ２６２Ｔ、Ｘ２６７Ｇ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４０５Ｉ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４Ｉ、Ｘ１２１９Ｖ、Ｘ１２２４Ｋ、Ｘ１２５６ＫおよびＸ１３６２Ｐ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、からなる群から選択される少なくとも１つの変異を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項３】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＡ２６２Ｔ、Ｓ２６７Ｇ、Ｋ２９４Ｒ、Ｆ４０５Ｉ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４Ｉ、Ｅ１２１９Ｖ、Ｎ１２２４Ｋ、Ｑ１２５６ＫおよびＬ１３６２Ｐ、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、からなる群から選択される少なくとも１つの変異を含む、請求項１または２に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項４】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＸ１２１９Ｖ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項５】
Ｘ１２１９Ｖ変異が、Ｅ１２１９Ｖ変異である、請求項４に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項６】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列の以下の群の変異のいずれか１つ：
Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３ＤおよびＸ１２１９Ｖ変異；
Ｘ２６２Ｔ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４ＩおよびＸ１２１９Ｖ変異；
Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１２１９Ｖ、Ｘ１２５６ＫおよびＸ１３６２Ｐ変異；
Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１２１９ＶおよびＸ１２５６Ｋ変異；
Ｘ２６７Ｇ、Ｘ２９４Ｒ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ１２１９Ｖ、Ｘ１２２４ＫおよびＸ１２５６Ｋ変異；ならびに
Ｘ２６２Ｔ、Ｘ４０５Ｉ、Ｘ４０９Ｉ、Ｘ４８０Ｋ、Ｘ５４３Ｄ、Ｘ６９４ＩおよびＸ１２１９Ｖ変異、
または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含み、Ｘがいずれかのアミノ酸を表す、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項７】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列の以下の群の変異のいずれか１つ：
Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３ＤおよびＥ１２１９Ｖ変異；
Ａ２６２Ｔ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４ＩおよびＥ１２１９Ｖ変異；
Ｋ２９４Ｒ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ１２１９Ｖ、Ｑ１２５６ＫおよびＬ１３６２Ｐ変異；
Ｋ２９４Ｒ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ１２１９ＶおよびＱ１２５６Ｋ変異；
Ｓ２６７Ｇ、Ｋ２９４Ｒ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ１２１９Ｖ、Ｎ１２２４ＫおよびＱ１２５６Ｋ変異；ならびに
Ａ２６２Ｔ、Ｆ４０５Ｉ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４ＩおよびＥ１２１９Ｖ変異、
または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項８】
Ｃａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のＤＩＯＡおよび／またはＨ８４０Ａ変異、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する変異、を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項９】
Ｃａｓ９蛋白質が、配列番号９に示されるStreptococcus pyogenesのＣａｓ９と比較して、３’末端に古典的ＰＡＭ（５’−ＮＧＧ−３’）を含まない標的配列に対する増加した活性を示す、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１０】
Ｃａｓ９蛋白質が、ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインを含む、請求項９に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１１】
Ｃａｓ９蛋白質が、古典的ＰＡＭ配列（５’−ＮＧＧ−３’）と直接隣接していない３’末端を有する標的配列に対する活性を示し、同じ標的配列に対する、配列番号９に示されるStreptococcus pyogenesのCas９の活性と比較し、少なくとも５倍増加している、請求項９または１１に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１２】
標的配列の３’末端が、ＡＧＣ、ＧＡＧ、ＴＴＴ、ＧＴＧ、ＣＡＡ、ＣＡＣ、ＧＡＴ、ＴＡＡ、ＡＣＧ、ＣＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＴ、ＡＡＡ、ＡＡＣ、ＡＡＧ、ＡＡＴ、ＣＡＧ、ＣＡＴ、ＧＡＡ、ＧＡＣ、ＴＡＣ、ＴＡＧ、ＴＡＴ、ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＴ、ＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＴ、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＴ、ＴＣＡ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、ＴＣＴ、ＡＧＡ、ＡＧＴ、ＣＧＣ、ＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＴ、ＴＧＡ、ＴＧＣ、ＴＧＴ、ＡＴＡ、ＡＴＣ、ＡＴＧ、ＡＴＴ、ＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＣＴＴ、ＧＴＡ、ＧＴＣ、ＧＴＴ、ＴＴＡ、ＴＴＣ、またはＴＴＧ配列と直接隣接している、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質。
【請求項１３】
配列番号９〜２６２のいずれか１つにより示されるＣａｓ９のアミノ酸配列と少なくとも９０パーセント同一であるアミノ酸配列を含み、
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１２２、１３７、１８２、６６０および１３２９からなる群から選択されるアミノ酸残基、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応するアミノ酸残基において、少なくとも１つの変異を含み、
組み換えＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、天然に存在するＣａｓ９蛋白質のアミノ酸配列と同一でない、組み換えＣａｓ９蛋白質。
【請求項１４】
Ｃａｓ９蛋白質またはその断片がエフェクタードメインと融合し、それにより融合蛋白質を形成する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質を含む融合蛋白質。
【請求項１５】
Ｃａｓ９蛋白質およびエフェクタードメインが、リンカーを介して融合する、請求項１４に記載の融合蛋白質。
【請求項１６】
エフェクタードメインが、核酸編集ドメインである、請求項１４または１５に記載の融合蛋白質。
【請求項１７】
核酸編集ドメインが、デアミナーゼドメインである請求項１６に記載の融合蛋白質。
【請求項１８】
デアミナーゼドメインが、シトシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼである、請求項１７に記載の融合蛋白質。
【請求項１９】
デアミナーゼドメインが、アポリポ蛋白質Ｂ ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーのデアミナーゼを含む、請求項１８に記載の融合蛋白質。
【請求項２０】
リンカーが、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５）、（Ｇ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号６）、（ＧＧＳ）ｎ、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号７）または（ＸＰ）ｎモチーフ、またはこれらのいずれかの組合せを含み、ｎが独立に１〜３０の整数である、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項２１】
エフェクタードメインが、ヌクレアーゼドメイン、ニッカーゼドメイン、リコンビナーゼドメイン、デアミナーゼドメイン、メチルトランスフェラーゼドメイン、メチラーゼドメイン、アセチラーゼドメイン、アセチルトランスフェラーゼドメイン、転写アクチベータードメインまたは転写リプレッサードメインを含む、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項２２】
エフェクタードメインが、ヌクレアーゼドメインである、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項２３】
ヌクレアーゼドメインが、ＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメインである、請求項２２に記載の融合蛋白質。
【請求項２４】
請求項１４〜２３のいずれか一項に記載の融合蛋白質の二量体。
【請求項２５】
第２のＣａｓ９蛋白質に融合した請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質を含む、融合蛋白質。
【請求項２６】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質または請求項１４〜２３のいずれか一項に記載の融合蛋白質と、当該Ｃａｓ９蛋白質または当該Ｃａｓ９融合蛋白質と結合するガイドＲＮＡと、を含む複合体。
【請求項２７】
ＤＮＡ分子に：
（ａ）請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質または請求項１４〜２３のいずれか一項に記載の融合蛋白質と、約１５〜１００ヌクレオチド長であり、標的配列と相補的な少なくとも１０の連続するヌクレオチドを含む、ガイドＲＮＡと、を接触させること、または、
（ｂ）請求項２６に記載の複合体を接触することを含む方法。
【請求項２８】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質または請求項１４〜２３のいずれか一項に記載の融合蛋白質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項２９】
請求項２８に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項３０】
請求項２８に記載のポリヌクレオチドおよびガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む、ベクター。
【請求項３１】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＣａｓ９蛋白質、請求項１４〜２３のいずれか一項に記載の融合蛋白質、請求項２６に記載の複合体、または請求項２８に記載のポリヌクレオチドを含む、細胞。
【請求項３２】
Ｃａｓ９蛋白質のアミノ酸配列が、配列番号９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２６２、２６７、２９４、４０５、４０９、４８０、５４３、６９４、１２１９、１２２４、１２５６および１３６２からなる群から選択されるアミノ酸残基において、または配列番号１０〜２６２に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応するアミノ酸残基において、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つの変異を含み、
Ｃａｓ９蛋白質が、古典的ＰＡＭを含まない標的配列に対する増加した活性を示す、請求項１に記載の組み換えＣａｓ９蛋白質。
【請求項３３】
医薬としての使用のための、請求項１４〜２３のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項３４】
医薬としての使用のための、請求項２６に記載の複合体。