(57)【要約】本発明は、新規なＭＲＩ用造影剤及びそれを用いた映像化方法に関するものである。少なくとも１つの常磁性物質と結合された少なくとも２つのリン酸基を有するキレート化分子を含む新規なＭＲＩ用造影剤に関するものである。
2012520871.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの常磁性金属陽イオンと結合された少なくとも二つのリン酸基を有するキレート分子を含む磁気共鳴映像(ＭＲＩ)用造影剤。
【請求項２】
前記キレート分子は、フィテート、イノシトールフォスフェートまたはフォスファチジル イノシトールフォスフェートからなる群から選択される、請求項１に記載のＭＲＩ用造影剤。
【請求項３】
前記フィテートは、デ−ミオーイノシトール−１、２、３、４、５、６−六リン酸(d-myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisphosphate)である、請求項２に記載のＭＲＩ用造影剤。
【請求項４】
前記デ−ミオ−イノシトール−１、２、３、４、５−ペンタフォスフェート(d-myo-inositol-1、2、3、4、5-pentaphosphate)、デ−ミオ−イノシトール−１、３、４、５−テトラフォスフェート(d-myo-inositol-1、3、4、5-tetraphosphate)、デ−ミオ−イノシトール−１、４、５−トリスフォスフェート(d-myo-inositol-1、4、5-trisphosphate)及びデ−ミオ−イノシトール−１、３、４−トリスフォスフェート(d-myo-inositol-1、3、4-trisphosphate)からなる群から選択される、請求項２に記載のＭＲＩ用造影剤。
【請求項５】
前記フォスファチジルイノシトールフォスフェートは、フォスファチジルイノシトール−３、４、５−トリフォスフェート(phosphatidylinositol-3、4、5-trisphosphate)及びフォスファチジル イノ−シトル−４、５−ビスフォスフェート(phosphatidylinositol-4、5-bisphosphate)からなる群から選択される、請求項２に記載のＭＲＩ用造影剤。
【請求項６】
前記常磁性金属陽イオンは、転移元素である、請求項１に記載のＭＲＩ用造影剤。
【請求項７】
前記転移元素は、Ｃｒ３＋、Ｃｏ２＋、Ｍｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｕ２＋及びＣｕ３＋からなる群から選択される、請求項６に記載のＭＲＩ用造影剤。
【請求項８】
前記転移元素は、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋及びＭｎ２＋  からなる群から選択される、請求項７に記載のＭＲＩ用造影剤。
【請求項９】
前記常磁性金属陽イオンは、ランタニド系列元素である、請求項１に記載のＭＲＩ用造影剤。
【請求項１０】
前記ランタニド系列元素は、Ｌａ３＋、Ｇｄ３＋、Ｃｅ３＋、Ｔｂ３＋、Ｐｒ３＋、Ｄｙ３＋、Ｎｄ３＋、Ｈｏ３＋、Ｐｍ３＋、Ｅｒ３＋、Ｓｍ３＋、Ｔｍ３＋、Ｅｕ３＋、Ｙｂ３＋及びＬｕ３＋からなる群から選択される、請求項９に記載のＭＲＩ用造影剤。
【請求項１１】
前記ランタニド系列元素は、Ｇｄ３＋である、請求項９に記載のＭＲＩ用造影剤。
【請求項１２】
対象の体内の関心の部位近くでＴ１またはＴ２弛緩時間を減少させるように設計された、請求項１０に記載のＭＲＩ用造影剤。
【請求項１３】
前記常磁性金属陽イオンは、常磁性金属陽イオンの放射性同位元素形態または  ＰＥＴ−ＭＲＩ造影剤として９９テクネチウムイオンを使うことを特徴とする請求項１に記載のＭＲＩ用造影剤。
【請求項１４】
前記キレート分子のｐＨ範囲は、４〜９である、請求項１に記載のＭＲＩ用造影剤。
【請求項１５】
前記キレート分子のｐＨ範囲は、６〜８である、請求項１４に記載のＭＲＩ用造影剤。
【請求項１６】
前記常磁性金属イオンと前記キレート化合物とのモル比は、０．５〜３．０である、請求項１に記載のＭＲＩ用造影剤。
【請求項１７】
前記キレート化合物と前記常磁性金属イオンとのモル比は、０．５〜３．０である、請求項１に記載のＭＲＩ用造影剤。
【請求項１８】
前記ＭＲＩ用造影剤と同一のモル比に該当する量のカルシウムを更に含む、請求項１に記載のＭＲＩ用造影剤。
【請求項１９】
請求項１のＭＲＩ用造影剤を対象に投与して臓器と組織を映像化することを含み、磁気共鳴映像で必要に応じて対象の器官または組織を映像化する方法。
【請求項２０】
前記対象の脂肪肝、肝硬変症または粥状斑硬化症(atherosclerosis)に前記ＭＲＩ用造影剤を静脈投与する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象の多様な腫瘍の転移監視リンパ節に前記ＭＲＩ用造影剤を皮下に投与する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象の腫瘍に、前記ＭＲＩ用造影剤を皮下に投与する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記腫瘍は、乳癌、悪性黒色腫、外陰部癌、頭頸部扁平上皮細胞癌(ＳＣＣ)、子宮内膜癌、子宮頸部癌、咽頭癌、肝癌、胃癌、大腸癌または前立腺癌からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＭＲＩ用造影剤は、Ｆｅ−フィテート複合体であり、Ｆｅ−フィテート複合体は、抗癌剤に添付するものある、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗癌剤は、ドキソルビシン(doxorubicine)である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１のＭＲＩ用造影剤を必要に応じて対象に投与し、ここで、臓器または組織の感染と炎症を診断できる、臓器と組織を映像化することを含み、関心のある臓器または組織を磁気共鳴映像で大食細胞の活性を測定する方法。
【請求項２７】
請求項１のＭＲＩ用造影剤を必要に応じて対象に投与し、その部位を映像化することを含み、磁気共鳴映像を介して患者の臓器または組織の炎症の部位へ大食細胞の移動を非侵襲的に測定する方法。
【請求項２８】
請求項１のＭＲＩ用造影剤を細胞に添加し、対象の部位に細胞を移植し、及び、磁気共鳴映像を用いて前記部位を映像化する段階を含む、磁気共鳴映像を介して生体内で移植した細胞の存在を視覚化する方法。
【請求項２９】
請求項１３のＰＥＴ−ＭＲＩ用造影剤を細胞に添加し、対象の部位に細胞を移植し、及び、ＰＥＴ−ＭＲＩスキャナを用いて前記部位を映像化する段階を含む、ＰＥＴ−ＭＲＩスキャナ映像のための造影剤を共整合(co-registering)する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般的に新規な磁気共鳴映像用造影剤に関し、具体的には、少なくとも１つの常磁性物質と結合された少なくとも２つのリン酸基を有する新規な磁気共鳴映像用造影剤である。また、本発明は、それを用いた映像化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フィテート(phytate)は、数多い植物組織でリンの主な貯蔵形態として、穀物の特に、米、小麦、トウモロコシ、豆などに存在し、総穀物含量の１−５％を占め、穀類の総リン含量の約７０−８０％を占める。
【０００３】
フィテートは、フィチン酸(phytic acid)の塩の形態であって、ミオ−イノシトール(myo-inositol)に最大６個のフォスフェートなどが結合し、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｆｅ２＋、及びＺｎ２＋などのようなミネラルイオンなどが結合されて不溶性複合体を形成し、ヒト、鶏、豚、マウスのような単位動物に普遍的に生物学的に利用可能であり、その理由は不溶性複合体からリンを分離するために要求される消化酵素が足りないからである(Reddy et al 1982)。むしろ、消化できなかったフィテートは、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｆｅ２＋、及びＺｎ２＋のようなミネラルイオンの内臓吸収を阻害する抗栄養要素(anti-nutritional factor)として作用する。従って、多量のフィテート穀物を取る人々は、ミネラルフィテート 複合体がミネラル欠乏症を誘発することと知られている(Torre et al 1991)。
【０００４】
最近の研究では、植物の種子から精製されたフィテートは、抗癌剤(Kennedy 1995; Kennedy & Manzone 1995)、抗酸化剤(Graf & Eaton 1990)、そして、心臓病のを防止(Thompson 1994)のような役割を含む様々な効果を有することを示す。フィテートはまた、酵素的フィテート加水分解によって調節され得ると信じられる過程である、小嚢の軟骨内の骨化遅延無機化に参与する(Caffrey et al 1999)。泌尿器のフィチン酸は、非常に低濃度で、腎臓の石灰化の発達防止を介したカルシウム尿路結石症のようないくつかの病理学の過程に興味深い有益な効果を有する。低濃度のフィテートは、カルシウム腎臓結石再発の危険を(Grases et al 2000a)減らし、高濃度のフィテートは、尿路カルシウム結石を誘発する危険を増加させること(Grases et al 2000b)と報告された。最近の研究はまた、フィチン酸がＤＮＡの修復(repair)を担当する酵素の活性剤(Hanakahi et al 2000)、Ｌ−型カルシウムチャンネルの活性剤(TJ et al 1997)、ｍＲＮＡ移動(export)(York et al 1999)の調節剤として多くの重要な細胞内機能の調節に関与することを提案する。
【０００５】
核医学では、テクネチウム−９９(technetium-99、 99mTc)膠質(colloid)と標識させたフィチン酸、すなわち、Ｔｃ−フィテート膠質を１９７３年から肝及び脾臓の陽電子放射断層撮影(Positron Emission Tomography、ＰＥＴ)の放射性核種映像剤として広く使用されている。肝、脾臓、及び骨髄に吸収されるＴｃ−フィテートの放射性膠質の水準及び分布は、慢性肝疾患の進行及び予後を決定し、肝機能の程度の観察に重要な尺度として用いられている。例えば、健常者に比べて、慢性肝不全を有した患者にＴｃ−フィテートを投与する時、肝でＴｃ−フィテートの非常に低い水準を示し、これはクッパー細胞(Kupffer cell)の機能低下によるものとして推正している(Hoefs et al 1995a; Hoefs et al 1997; Hoefs et al 1995b; Huet et al 1980)。
【０００６】
肝機能検査に追加的に、Ｔｃ−フィテートは乳房癌(breast cancer) (Hino et al 2008; Ichihara et al 2003; Ikeda et al 2004; Kinoshita 2007; Koizumi et al 2006; Koizumi et al 2004a; Koizumi et al 2004b; Masiero et al 2005; Morota et al 2006; Noguchi 2001; Ohta et al 2004; Ohtake et al 2005; Takei et al 2006; Takei et al 2002; Tavares et al 2001; Tozaki et al 2003; Tsunoda et al 2002; Wada et al 2007; Yoshida et al 2002)、悪性黒色腫(malignant melanoma、 Tavares et al 2001)、外陰癌(vulvar cancer)(Tavares et al 2001)、頭頸部扁平上皮細胞癌(squamous cell carcinoma(SCC) of the head and neck)(Kosuda et al 2003; Ohno et al 2005)、子宮内膜癌(endometrial cancer)(Nakayama et al 2004; Niikura et al 2004b; Niikura & Yaegashi 2004)、子宮頚部癌(cervical cancer)(Nakayama et al 2004; Niikura et al 2004a; Silva et al 2005)、咽頭癌(pharyngeal carcinoma)(Ohno et al 2005)、前立腺癌(prostate cancer)(Nakayama et al 2004; Niikura et al 2004a; Silva et al 2005)などのような様々な異なる種類の癌の患者中の監視リンパ節(sentinel lymph node、ＳＬＮ)のマッピングに放射性医薬品として使用されている。リンパ節のうちでＴｃ−フィテートは、特異的に吸収及び／または蓄積されて確認可能であり、これらのリンパ節根部から癌地域までの転移と生検を介した癌転移(cancer metastasis)の検事が可能である。従って、このようなＳＬＮ確認技術の長所の中で最も目で最も重要なことは、良性リンパ節の最小限の不必要な切開で、転移されたリンパ節のみ標的することによって、この手術の手続きの普遍的な合併症であるリンパ水腫の危険を減らすことができる。このような観点から、Ｔｃ−フィテートを接木したＰＥＴ映像は、癌患者のＳＬＮを視覚化するための選択の方法である。しかし、癌患者観察のためのＰＥＴの反複的露出の要求は、その技術の限界が明確である。また、ＰＥＴの低解像度によって癌転移情報の提供は可能であるが、転移されたリンパ節の正確な位置を指摘することはできない。
【０００７】
磁気共鳴映像(magnetic resonance imaging、ＭＲＩ)は、試料に低い電磁気エネルギーを照射(irradiate)して、主に水陽子から出た核磁気共鳴映像(ＮＭＲ)信号を検出する急速に発展する映像様相分野である。これまでは、ＭＲＩの映像様相が水陽子を興奮させるのに低い量のエネルギーを要求するため、短い時間間隔に様々な時点で患者の診断と観察が可能な最も適していると考えられ、従って、ＭＲ映像は非侵襲的(non-invasive)及び高解像度(ＰＥＴより１０倍以上の)で得ることができる。ＮＭＲ信号の強度は、水の陽子の量によって主に決定される。ＭＲＩ用造影剤は、しばしば映像造影強化のために使用する。
【０００８】
一般に、ＭＲＩ用造影剤は、近いに位置した陽子のＴ１またはＴ２弛緩時間のそれらの減縮に従って常磁性(paramagnetic)、超常磁性(super-paramagnetic)製剤に区分される。常磁性ＭＲＩ用造影剤は、Ｔ１弛緩時間を減少させて組織／器官の明るい映像を招来する一方、超常磁性ＭＲＩ用造影剤のＴ１弛緩時間を減少は、暗い映像を招来する。超常磁性酸化鉄粒子(ＳＰＩＯ)は、Ｔ２弛緩時間を変更させるＭＲＩ用造影剤が代表的である(Low 1997)。それらは、大食細胞(macrophage)の吸収で臓器に蓄積されるものと知られており(Stoll et al 2004)、従って、臓器の映像の造影を高めると知られているが、臓器の暗い映像を招来する。なぜならば、ネガティブ造影剤(dark imaging; negative contrast agent)よりもポジティブ造影剤(bright imaging; positive contrast agent)が関心の地域をより良く定義し、短い時間のＭＲ映像撮影時間を要求するので、Ｔ１物質の開発が疑いなく、価値があるだろう。
【０００９】
ガドリニウム(Ｇｄ)物質は、現在、臨床的に広く使われているＴ１物質が代表的である。ガドリニウム自体は毒性が高いから、現在使用中のほとんどのガドリニウム物質は、リガンドとキレートとの形態である。例えば、Ｇｄをジエチレントリアミペンタアセテート酸(ＤＴＡＰ)とキレート化させてポジティブＭＲＩ用造影剤(Ｇｄ−ＤＴＡＰ)を得る。更に、Ｍｎ２＋とＧｄ３＋とのような金属のキレートがＭＲＩＴ１造影剤としてそれらの潜在的な応用に対して特別な注意を受ける。このような努力は、血管及び外部血管空間の両方において、配分されて細胞外のＭＲＩ用造影剤などの開発に先行した(Modo & BulteAime J.W.M. 2007)。
【００１０】
現在まで開発されたほとんどのＴ１物質は、特定の組織または細胞に特異的なものでなく、組織の血管視覚化機能をする。組織特異または細胞特異ＭＲＩ用造影剤の開発は、組織特異または細胞特異的抗体を造影剤に結合させて作ろうとする試みがあって来た。例えば、Ｇｄ−ＤＴＡＰで組織にモノクローナル抗体を標識して組織特異的なＭＲＩ用造影剤を準備した(Unger et al. 1985. Investigative Radiol 20(7):693-700)。しかし、Ｇｄローディング水準が非常に低いだけでなく(１．５Ｇｄ３＋／抗体分子)、生体内モデルでは抗体−ＤＴＰＡ−Ｇｄによる映像の増進を全然確認することができなかった。このように、映像造影剤を抗体のような標的分子に直接接合させる接近法は、造影剤が低水準で維持されなければならないという欠点が普通の問題であり、そうではない場合には、抗体の特異性が否定的な影響を受け得る。ＭＲＩ用造影剤が少量で伝達されて所望の映像の低い造影を引き起こすことができる。
【００１１】
一般的に、既存の映像造影剤の滞留時間を増加させるために、造影剤の担体として重合体を使用して来た。例えば、ヒトアルブミン及びポリリシンなどのような担体をＤＴＰＡ共役(conjugated)してＭＲＩ用造影剤の金属を担持するのに用いた(例えば、ポリリシンに結合されたＧｄ−ＤＴＡＰ(Gerhard et al (1994), MRM 32:622-628)。牛血清アルブミンまたは牛免疫グロブリン(immunoglobuline )をＤＴＰＡ及びＧｄで標識する(Lauffer et al., (1985) Magnetic Resonance Imaging 3(1):11-16)。ポリ−Ｌ−リシン主鎖(backbone)基盤のポリペプチドをＤＴＰＡａと反応させ、複合体をＭＲ映像化目的のために１１１Ｉｎをキレート化させるのに用いた(Pimm et al (1992), Eur J Nucl Med 19:449-452)。これらの研究において、担体と結合されたＭＲＩ用造影剤は、血液プール中での滞留時間が増加したと明らかになった。しかし、別の担体を造影剤に結合させて使わなければならないので、煩わしくて追加費用が要求される。
【００１２】
従って、組織または細胞特異性があり、生体内増加された滞留時間として残っており、熱力学的、生物学的に安定を維持し、鮮明なＴ１映像(bright contrast)を許すＭＲＩ用造影剤開発が要求されている。本発明では、本発明者らが効果的なＭＲＩ用造影剤を開発するために、集中的で、徹底的な研究下で、常磁性物質と２つまたは多重結合方式で結合できる少なくとも２つのリン酸基を有するキレート分子である造影剤を見出すことを引き起こし、これは現在用いられるガドリニウム(Ｇｄ)複合体より安定しており、より良いＴ１造影効果を示し、更に、細胞または組織であるので、様々な疾病の診断と臨床適用に非常に臨床的に適用され得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の一つの目的は、少なくとも１つの常磁性金属陽イオンと結合された少なくとも２つのリン酸基を有したキレート分子を含むＭＲＩ用造影剤を提供するものである。
【００１４】
本発明の他の目的は、前記ＭＲＩ用造影剤を必要に応じて投与し、臓器と組織を映像化することによって磁気共鳴映像で対象の器官または組織を視覚化する方法を提供するものである。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、前記ＭＲＩ用造影剤を必要に応じて対象に投与し、ここで、臓器または組織の感染(infection)と炎症(inflammation)を診断するのが可能な、臓器と組織を映像化することを含む、関心のある臓器または組織を磁気共鳴映像で大食細胞(macrophage)の活性を測定する方法を提供するものである。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、前記ＭＲＩ用造影剤を必要に応じて対象に投与し、その部位を映像化するのを含む、磁気共鳴映像を介して炎症の部位に大食細胞の移動(macrophage infiltration)を非侵襲的に測定する方法を提供するものである。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、ＭＲＩ用造影剤を細胞(cells)に添加し；対象の部位に細胞を移植し；及び磁気共鳴映像を用いて前記部位を映像化する段階を含む、磁気共鳴映像を介して生体内で移植した細胞(transplanted cells)の存在を視覚化する方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、強い弛緩性を有し、関心の目的とする部位の組織の特性を視覚化する、大食細胞によって吸収される細胞特異的ＭＲＩ用造影剤を提供する。また、本発明は、容易に投与可能であり、比較的長時間生体内に留まり(すなわち、理想的な半減期を持つ生分解可能な)、細胞毒性のないＭＲＩ用造影剤を提供する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によるＭＲＩ用造影剤及びこれを用いた映像化方法は、容易に注入可能な常磁性または超常磁性金属イオンを含むイノシトールフォスフェートの複合体のコロイド懸濁物(colloid suspension)で長所を享受しながら提供することができ、組織特異性(例えば、肝、脾臓、肺など)があり、アレルギー反応を潜在的に誘発することができる界面活性剤を使わず、造影剤を変わらないで分泌されるようにすることができる熱力学的に安定した物質(例えば、ＥＤＴＡとＤＴＰＡより安定する)であって、このような造影剤は、それぞれの金属イオンよりはるかに少ない毒性がある傾向があるから重要な性質を有し、本願発明のイノシトールフォスフェート金属イオン複合体が目的の器官または組織に濃縮されるので、相対的に少ない量(例えば、１−４μｍｏｌ／ｋｇ)で注入しても良い質のＭＲ映像の獲得が可能である。また、投与方法に応じて、本発明の造影剤は多様な目的とする器官または組織に分布され、特定器官または組織を対象で疾病診断に適用され得る。例えば、造影剤を血管注入の時(intravenous or intra-arterial)、それらは肝、脾臓、リンパ節、骨髄、肺を含む特定器官に造影効果をあらわす。ここで、造影剤は大食細胞によって摂取される。一方、造影剤を経口投与の時、それらは胃腸管のＭＲ映像の造影を強化させ得る。更に、造影剤を乳房癌、前立腺癌、子宮頸部癌のような多様な種類の癌の部位に皮下注入の時(subcutaneous)、それが特異的に蓄積される性質によって癌転移を確認する監視リンパ節(sentinel lymph node)のマップ(map)に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１Ａと１Ｂは、フィテート溶液に結合されるＧｄ３＋イオンに対する結合力、結合個数、結合形態の等温滴定熱量測定(isothermal titration calorimetry(ＩＴＣ))’分析結果である。図１Ａは、Ｇｄ３＋イオンが二座配位子の形態でフィテートのリン酸基から２つの酸素陰イオンに結合したがＧｄ−フィテート複合体を説明する模式図である。図１Ｂは、Ｇｄ３＋がフィテート溶液に結合するＩＴＣ分析結果である。図１Ｂの上段は、０．５ｍＭのフィテート溶液(ｐＨ７．０、３７℃)に１０ｍＭのＧｄ３＋イオンを１μｌずつ間歇的に注入して測定した熱量滴定(calorimetric titration)を示す。図１Ｂの下段は、全体フィテート溶液の濃度に対するリガンドの全体濃度の比に対する滴定のモル当りの熱交換を示す。赤色実線は、数学的に計算された部位モデルの２つのセットに対する最適合(best-fit)を示す。
【図２】図２は、フィテート溶液とＭｎ２＋に対する結合力、結合個数、結合形態のＩＴＣ分析結果である。図２の上段は、０．５ｍＭのフィテート溶液(ｐＨ７．０、３７℃)に１５ｍＭのＭｎ２＋１．５μｌの熱量滴定を示す。下段は、全体フィテート溶液の濃度に対するリガンドの全体濃度の比に対する滴定のモル当りの熱交換を示す。赤色実線は、数学的に計算されたシーケンシャル結合部位モデルに対する最適合である。
【図３】図３は、フィテート溶液とＣａ２＋に対する結合力、結合個数、結合形態のＩＴＣ分析結果である。上段は、０．５ｍＭのフィテート溶液(ｐＨ７．０、３７℃)に１５ｍＭのＣａ２＋１．５μｌの熱量滴定を示す。下段は、全体フィテート溶液の濃度に対するリガンドの全体濃度の比に対する滴定のモル当りの熱交換を示す。赤色実線は、数学的に計算された部位モデルの２つのセットに対する最適合である。
【図４】図４は、フィテート溶液とＭｇ２＋に対する結合力、結合個数、結合形態のＩＴＣ分析結果である。上段は、０．５ｍＭのフィテート溶液(ｐＨ７．０、３７℃)に３０ｍＭのＭｇ２＋１．５μｌの熱量滴定を示す。下段は、全体フィテート溶液の濃度に対するリガンドの全体濃度の比に対する滴定のモル当りの熱交換を示す。赤色実線は、数学的に計算された部位モデルの１つのセットに対する最適合である。
【図５】図５は、イノシトール−１、３、４−トリフォスフェート(inositol-1,3,4-trisphosphate)とＧｄ３＋に対する結合力、結合個数、結合形態のＩＴＣ分析結果である。上段は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ(ｐＨ７．０、２５℃)の０．２ｍＭのイノシトール−１、３、４−トリフォスフェート溶液に５ｍＭのＧｄ３＋１．５μｌの熱量滴定を示す。下段は、全体イノシトール−１、３、４−トリフォスフェートの濃度に対するリガンドの全体濃度の比に対する滴定のモル当りの熱交換を示す。赤色実線は、数学的に計算された部位モデルの１つのセットに対する最適合である。
【図６】図６は、イノシトール−１、４、５−トリフォスフェートとＧｄ３＋に対する結合力、結合個数、結合形態のＩＴＣ分析結果である。上段は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ(ｐＨ７．０、２５℃)中の０．２ｍＭのイノシトール−１、４、５−トリフォスフェート溶液に５ｍＭのＧｄ３＋１．５μｌの熱量滴定を示す。下段は、全体イノシトール−１、４、５−トリフォスフェートの濃度に対するリガンドの全体濃度の比に対する滴定のモル当りの熱交換を示す。赤色実線は、数学的に計算された部位モデルの１つのセットに対する最適合である。
【図７】図７は、イノシトール−１、３、４、５−テトラフォスフェート(inositol-1、3、4、5-tetraphosphate)とＧｄ３＋に対する結合力、結合個数、結合形態のＩＴＣ分析結果である。上段は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ(ｐＨ７．０、２５℃)中の０．２ｍＭのイノシトール−１、３、４、５−テトラフォスフェート溶液に５ｍＭのＧｄ３＋１．５μｌの熱量滴定を示す。下段は、全体イノシトール−１、３、４、５−テトラフォスフェートの濃度に対するリガンドの全体濃度の比に対する滴定のモル当りの熱交換を示す。赤色実線は、数学的に計算された部位モデルの２つのセットに対する最適合である。
【図８】図８Ａ及び８Ｂは、フィテート溶液とＦｅ３＋に対する結合力、結合個数、結合形態のＩＴＣ分析結果である。図８Ａは、フィテート溶液に結合するＦｅ３＋のＩＴＣ分析である。図８Ａの上段は、０．５ｍＭのフィテート溶液(ｐＨ７．０、３７℃)に５ｍＭのＦｅ３＋を１．５μｌずつ間歇的に注入して得た熱量滴定を示す。図８Ａの下段は、全体フィテート溶液の濃度に対するリガンドの全体濃度の比に対する滴定のモル当りの熱交換を示す。赤色実線は、数学的に計算された部位モデルの２つのセットに対する最適合である。図８Ｂは、二座配位子の形態でフィテートのリン酸基から２つの酸素陰イオンにＦｅ３＋イオンが結合したＦｅ−フィテート複合体を示したものである。
【図９】図９は、ＥＤＴＡ溶液とＧｄ３＋に対する結合力、結合個数、結合形態のＩＴＣ分析結果である。上段は、１０ｍＭのＭＥＳ(ｐＨ５．６、２５℃)中の０．４ｍＭのＥＤＴＡ溶液に５ｍＭのＧｄ３＋１．５μｌの熱量滴定を示す。下段は、全体ＥＤＴＡ溶液の濃度に対するリガンドの全体濃度の比に対する滴定のモル当りの熱交換を示す。赤色実線は、数学的に計算されたモデル部位の１つのセットに対する最適合である。
【図１０】図１０は、ジエチレントリアミン五酢酸(diethylene triamine pentaacetic acid、 ＤＴＰＡ)とＧｄ３＋に対する結合力、結合個数、結合形態のＩＴＣ分析結果である。上段は、１０ｍＭの酢酸ナトリウム(ｐＨ４．８、２５℃)中の０．２ｍＭのＤＴＰＡ溶液に５ｍＭのＧｄ３＋１．５μｌの熱量滴定を示す。下段は、全体ＤＴＰＡ溶液の濃度に対するリガンドの全体濃度の比に対する滴定のモル当りの熱交換を示す。赤色実線は、数学的に計算された部位モデルの２つのセットに対する最適合である。
【図１１】図１１は、ジエチレントリアミン五酢酸(ＤＴＰＡ)とＧｄ３＋に対する結合力、結合個数、結合形態のＩＴＣ分析結果である。上段は、１０ｍＭのトリス(ｐＨ７．８、２５℃)中の０．２ｍＭのＤＴＰＡ溶液に５ｍＭのＧｄ３＋１．５μｌの熱量滴定を示す。下段は、全体ＤＴＰＡ溶液の濃度に対するリガンドの全体濃度の比に対する滴定のモル当りの熱交換を示す。赤色実線は、数学的に計算されたもののような部位モデルの２つのセットに対する最適合である。
【図１２】図１２Ａと図１２Ｂは、９．４ＴのＭＲＩスキャナで多様な濃度のＭｎ２＋、Ｇｄ−ＤＴＰＡ、Ｍｎ−フィテート及びＧｄ−フィテート複合体に対する弛緩率(relaxation rates、Ｒ１)測定を示した結果である。（Ａ）は、多様な濃度のＭｎ２＋、Ｇｄ−ＤＴＰＡ、Ｍｎ−フィテート及びＧｄ−フィテート複合体に対する２４個のファントム (phantom)などの３０００ｍｓの反複回復時間(inversion recovery time、Ｔ１)でのＭＲ映像の例である。（Ｂ）は、前記のファントムなどのそれぞれを互いに比較して秒(sec)単位で示した結果である。本実施例のすべての濃度において、Ｍｎ−フィテート、Ｇｄ−フィテートの弛緩率(Ｒ１)は、Ｍｎ２＋及びＧｄ−ＤＴＰＡよりはるかに高く示された。
【図１３】図１３Ａと図１３Ｂは、９．４ＴでＲＡＷ２６４．７大食細胞細胞株(macrophage cell line)でＧｄ−フィテートの濃度にＭＲ信号の変化を測定した結果である。（Ａ）は、０、０．１２５、０．２５、０．３７５、０．５及び０．７５ｍＭのＧｄ−フィテート溶液を使って準備された大食細胞を含む６つのファントムに対するＴ１−強調ＭＲ映像の結果である。Ｇｄ−フィテートの濃度増加に応じて信号の強度がはっきりと増加した。（Ｂ）は、関心のある部分を目標とする生体内(in vivo)メカニズムを示す大略的な概念図である。
【図１４】図１４Ａ〜図１４Ｃは、９．４ＴでＭｎ−フィテート複合体を静脈注射投与後にラットの肝の時間−依存的変化によるＴ１−強調ＭＲ信号を示す結果である。正常なラットの肝のＴ１−強調ＭＲ映像をＭｎ−フィテート(５μｍｏｌ／ｋｇ)を静脈注射投与の前（Ａ）、４０分後（Ｂ）、１日後（Ｃ）で示した結果である。静脈注射４０分後の肝実質組織の信号強度（Ｂ）は、投与前の肝（Ａ）と比較する時、約３２％向上したものとして示された。投与２４時間の後、肝の信号強度がベースラインの下に減少し、これは投与された造影剤が２４時間内にラットの肝から除去されることを提案する。
【図１５】図１５は、９．４ＴでＧｄ−フィテート複合体を静脈注射投与後にラットの肝の時間−依存的変化によるＴ２強調ＭＲ信号を示す結果である。正常ラットの肝のＴ２−強調ＭＲ映像をＧｄ−フィテート(４μｍｏｌ／ｋｇ)の静脈注射投与の前（Ａ）、３時間後（Ｂ）、２４時間後（Ｃ）及び５日後（Ｄ）で示した結果である。投与３時間（Ｂ）及び２４時間（Ｃ）後の肝実質組織の信号強度は、投与の前（Ａ）と比較する時、１４％及び２６％がそれぞれ減少されたものとして示された。投与５日後、肝の減少された信号強度がベースラインの〜９５％まで増加し、これは投与された造影剤が約５日後にラットの肝から除去されたことを提案する。
【図１６】図１６Ａ〜図１６Ｄは、１．５及び４．７ＴでＧｄ−フィテート複合体を静脈注射投与後にラットの肝のＭＲ信号の時間−依存的変化を示す。１．５Ｔ（Ａ及びＢ）及び４．７Ｔ（Ｃ及びＤ）で正常ラットの肝の前後造影−Ｔ１−強調ＭＲ映像である。Ｇｄ−フィテート(４μｍｏｌ／ｋｇ)の低い服量は皮下に投与された。ポジティブ造影剤(positive contrast agent)としてＧｄ−フィテートの効能はこのような低い磁場強度でよく証明される。
【図１７】図１７は、一次腫瘍の巨視的な検査及びリンパ節の切開を示す。ラットの左側前肢に注入された一次腫瘍の大きさは約１ｃｍであった。左側腋窩のリンパ節及び上腕のリンパ節は、拡張され、黒い点を含んだ。しかし、右側腋窩及び上腕のリンパ節は、変化せずに残っていた。
【図１８】図１８は、監視リンパ節のＴ１−強調ＭＲ映像を示す。上腕リンパ節前−造影(pre-contrast)（Ａ）、Ｆｅ−フィテートの皮下投与後、４時間（Ｂ）、８時間（Ｃ）、そして、２４時間（Ｄ）後の映像である。矢印は、監視リンパ節でのハイポインテンス(hypointense)部分を示す。
【図１９】図１９は、監視リンパ節のＴ２−強調ＭＲ映像を示す。上腕リンパ節前−造影（Ａ）、Ｆｅ−フィテートの皮下投与後、４時間（Ｂ）、８時間（Ｃ）、そして、２４時間（Ｄ）後の映像である。矢印は、監視リンパ節でのハイポインテンス部分を示す。
【図２０】図２０は、映像化されたマウスから得られた左腕リンパ節の病理組織学的特徴を示す。（Ａ）Ｈ＆Ｅで染色した上腕リンパ節、（Ｂ）プルシアンブルー で染色した上腕リンパ節、（Ｃ）Ａで示した関心のある矩形部位の拡大図。（Ｄ）一次腫瘍の拡大図。スケールバー (scale bars)、５００μｍ（Ａ、Ｂ）；１００μｍ（Ｃ、Ｄ）。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
一つの態様として、本発明は、少なくとも１つの常磁性物質と結合された少なくとも２つのリン酸基を有するキレート分子を含むＭＲＩ用造影剤に関する。
【００２２】
本発明において、用語“磁気共鳴映像(ＭＲＩ)”とは、試料に低い電磁気エネルギーを照射した後に水陽子から出た核磁気共鳴信号を検出する血行力学-基盤医学映像化方法である。磁気共鳴信号を利用するということから、分子科学とまた血行力学に基盤に基づき、放射性同位元素に基づき陽電子放射断層撮影(ＰＥＴ)と差がある。
【００２３】
本発明において、用語“造影剤(contrast agent)”とは、血管または器官のような内部のボディ構造を強調する磁気共鳴映像を行う時、可視度を高めるのに使われる製剤(medium)をいう。造影剤は、関心対象表面の可視度及び造影を増加させることによって、疾患及び/または損傷の量及び質を決定するのに役に立つ。
【００２４】
本発明において、用語“常磁性物質”とは、熱運動は不対電子(unpaired electron)のスピンがそれなしにはランダム配列になるようにするため、外部からかける磁場のない時は磁化が維持されなかったが、外部の磁場をかけた場合、磁場の方向へ磁気モーメントを形成する物質をいう。水分子の磁気弛緩時間を短縮させるこの性質の長所を取って、このような常磁性物質をＭＲＩ造影剤の有効成分として使用可能である。
【００２５】
好ましくは、本発明において、前記常磁性物質は転移元素(transition element)である。より好ましくは、Ｃｒ３＋、Ｃｏ２＋、Ｍｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｕ２＋及びＣｕ３＋からなる群から選択され、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋及びＭｎ２＋ が最も好ましい。
【００２６】
これと異なり、常磁性物質はランタニド系列元素(lanthanide element)である。好ましくは、前記ランタニド系列元素は、Ｌａ３＋、Ｇｄ３＋、Ｃｅ３＋、Ｔｂ３＋、Ｐｒ３＋、Ｄｙ３＋、Ｎｄ３＋、Ｈｏ３＋、Ｐｍ３＋、Ｅｒ３＋、Ｓｍ３＋、Ｔｍ３＋、Ｅｕ３＋、Ｙｂ３＋及びＬｕ３＋からなる群から選択され、Ｇｄ３＋が最も好ましい。
【００２７】
前記常磁性物質の代わりに、同位元素、すなわち、放射性または常磁性物質が使用され得る。例えば、本発明に有用な放射性同位元素は１１Ｃ、１３Ｎ、１８Ｆ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、９９ｍＴｃ、９５Ｔｃ、１１１Ｉｎ、７６Ｂｒ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｇａ及び６８Ｇａを含むが、これに制限されるのではない。
【００２８】
本発明によって、前記造影剤は対象のボディ内の関心の部位近くでＴ１またはＴ２弛緩時間の減少を引き起こす。
【００２９】
本発明において、用語“キレート分子”または“キレーター(chelator)”とは、少なくとも１つの供与体原子を介して金属イオンに結合され得る化合物または物質の残基をいう。常磁性キレート複合体のＴ１磁気弛緩時間を減少及び常磁性物質の安定化能力は、常磁性物質に結合されるキレート物質の化学的構造に完全に依存している。
【００３０】
本願において、本発明において有用なキレート分子は、少なくとも２つのリン酸基を有し、好ましい例としては、フィテート、イノシトールフォスフェート及びフォスファチジル イノシトールフォスフェートがある。より好ましい例としては、前記キレート分子は、ｄ−ミオ−イノシトール−１、２、３、４、５、６−六リン酸、ｄ−ミオ−イノシトール−１、２、３、４、５−五リン酸、ｄ−ミオ−イノシトール−１、３、４、５−四リン酸、ｄ−ミオ−イノシトール−１、４、５−三リン酸、ｄ−ミオ−イノシトール−１、３、４−三リン酸、フォスファチジル イノシトール−３、４、５−三リン酸、およびフォスファチジル イノシトール−４、５−二リン酸を含む。
【００３１】
生理的条件下で適するために、 前記キレート分子はｐＨ範囲が４〜９であり、最も適するには６〜８である。
【００３２】
本願発明の一つの態様は、前記キレート分子に対する金属のモル比範囲が０．５〜３．０の範囲であるＭＲＩ用造影剤であり、または金属に対するキレート分子のモル比範囲が０．５〜３．０である。
【００３３】
本発明の造影剤が診断条件で使用される時、キレート化合物に血中に存在する内生のカルシウムが結合することは好ましくない。従って、前記造影剤のキレート分子が血中カルシウムとキレート化されることを最小化するために対象で診断に使用される時、造影剤製造時にＣａ２＋イオンが添加され得る。ＭＲＩまたはＰＥＴ診断の間に、対象のボディ内の内生のカルシウムと造影剤との間の有害なキレート化を成功的に防げるならば、任意のカルシウムの量が造影剤と混合することができる。カルシウムの量は造影剤と同一のモル比で添加されるのが好ましい。
【００３４】
本発明の造影剤は、当業界で一般的に知られている常磁性物質とキレート物質の方法で製造され得る。例えば、少なくとも２つのリン酸基を有するキレート物質を滅菌水に溶解させ、ｐＨ滴定をした後、これを常磁性イオンコロイドと混合して製造することができる。
【００３５】
また他の方法は、常磁性のフィテート複合体溶液をカルシウムイオンとともに低温で乾燥して容器に保管することもできる。常磁性のフィテート複合体溶液及びカルシウムイオン溶液はともに使われる前にそれぞれ分離された容器でまたは１つの容器に保管されて低温でそれぞれ乾燥される。これとは異なって、フィテート溶液を容器に先に入れ、続いて常磁性イオンを入れるのも可能である。常磁性フィテート複合体は、溶液形態だけでなく粉であり得る。本願発明の造影剤において、常磁性フィテートキレートは特定腫瘍のための単一クローン抗体(monoclonal antibidies)と選択的に結合され得る。
【００３６】
また一つの態様として、本発明は前記ＭＲＩ用造影剤を対象に投与して臓器と組織を映像化することにより、磁気共鳴映像で必要に応じて対象の器官または組織を視覚化する方法に関するものである。
【００３７】
本発明において、用語“投与”または“投与する”は、適切な方法を介して対象に所望の物質を導入する行動を意味する。有効量及び投与方式は、患者の年齢、体重及び治療される特定部位だけでなく使用される造影剤の種類、考慮される診断用途及び造影剤の製剤の形態(例えば、懸濁液、エマルジョン、マイクロスフェア、リポソームなど)のような多様な因子に依存し、これは当業者に既に明白であるだろう。典型的に、造影剤の投与量は、最初は低い水準で投与し、所望の診断効果を得るまで漸進的に増加させる。映像化は当業者に公知された典型的な技術を用いて達成する。一般的に、造影剤の水溶液は１ｋｇ(体重)当り造影剤の約１０〜１、０００μｍｏｌｅの用量で(すべての用量組合、下位組合、及びこれに含まれる特定用量の範囲含み)対象に静脈内投与することができる。
【００３８】
本発明の一つの実施態様によれば、本発明の造影剤はＴｃ−フィテートと常磁性陽イオンを含み、陽電子放射断層撮影(ＰＥＴ)映像化と磁気共鳴映像(ＭＲＩ)に適用可能である。
【００３９】
好ましくは、前記視覚化方法は、ＭＲＩ用造影剤は対象が脂肪肝、肝硬変症または粥状斑硬化症(atherosclerosis)の発病が疑われる時、静脈投与するのが好ましい。
【００４０】
監視リンパ節の映像化を介して癌の転移を決定するために、前記ＭＲＩ用造影剤は皮下に投与するのが好ましい。
【００４１】
また、器官または組織が癌と疑われる時、前記ＭＲＩ用造影剤は皮下に投与することができる。好ましくは、前記癌は、乳癌、悪性黒色腫、外陰部癌、頭頸部扁平上皮細胞癌(ＳＣＣ)、子宮内膜癌、子宮頸部癌、咽頭癌、肝癌、胃癌、結腸直腸癌または前立腺癌であるのが好ましい。
【００４２】
また、ＭＲＩ用造影剤は、例えば、Ｆｅ−フィテート複合体を多様な腫瘍の治療のためにドキソルビシン(doxorubicine)(商標名は、アドリアマイシン(Adriamycine)；また、ヒドロキシダウノルビシン(hydroxydaunorubicine)と知られている)のような抗癌剤とともに、ここでドキソルビシンＦｅ−フィテート複合体は、乳癌、悪性黒色腫、外陰部癌、頭頸部扁平上皮細胞癌(ＳＣＣ)、子宮内膜癌、子宮頸部癌、咽頭癌、肝癌、胃癌、大膓癌または前立腺癌からなる群から一次的腫瘍に皮下に投与することができる。
【００４３】
本発明のＭＲＩ用造影剤は、既存の造影剤などと比較する時、熱力学及び生物学的のいずれも安定した長所を持ち、組織及び細胞特異的であり、高い弛緩性を持つ鮮かなＴ１造影効果(明るい造影(bright contrast))を提供し、生体内の残留時間が長いという特徴がある。
【００４４】
第一に、本発明の造影剤は常磁性物質とキレート化合物との非常に高い親和力のため、既存の造影剤などよりもさらに安定した特徴を持つ。次の実施例において、ＩＴＣ熱力学的分析を介してフィテートまたはイノシトールフォスフェートと常磁性イオン結合親和力を測定するために行い、フィテートまたはイノシトールフォスフェートがＧｄイオンと強く結合し、また、マンガンイオンとイノシトールフォスフェート誘導体がＧｄイオンにまた強く結合することを示した。従って、常磁性物質とのフィテート複合体は非常に安定して造影剤として適合に使用され得ることがを分かる(表１〜表４参照)。
【００４５】
フィテートに対するＧｄ３＋の結合力は、ＤＴＰＡに対するＧｄ３＋より約１０倍以上強く、ＥＤＴＡに対するＧｄ３＋より約１０〜１００倍以上強いので、本発明によるＧｄ−フィテート複合体は、既存に使われた造影剤であるＧｄ−ＥＤＴＡ及びＧｄ−ＤＴＰＡの両方よりもはるかに安定的で力学的に不活性であることを提案する(表５参照)。
【００４６】
第二に、本発明の造影剤はＭＲＩで特定部位の映像造影を効率的に強化させる。次の実施例では、Ｍｎ−フィテート及びＧｄ−フィテートの弛緩率(Ｒ１＝１／Ｔ１)をそれぞれの異なる濃度で測定し、既存のＭＲ研究に広く使われるＭｎ２＋及びＧｄ−ＤＴＰＡと互いに比較した。Ｍｎ−フィテート及びＧｄ−フィテートは、ほとんどすべての実験した濃度でＭｎ２＋及びＧｄ−ＤＴＰＡより撹乱局所磁場にもっと効果的であるということを見つけた(図１１)。  
このように、高いＴ１弛緩性を持つ常磁性造影剤は、相対的に少ない量でも既存の造影剤のような程度の造影効果を示し、常磁性元素として主に使われる重金属であるＧｄの量を大幅に減らすことにより、結果的に人体に及ぶ潜在的な安全性問題を縮小させる。少ない量でも造影強化を保証するから、前記本発明による造影剤はＭＲＩ研究に非常に重要な意味を持つ。
【００４７】
第三に、本発明の造影剤は生体内により長時間留まり、生体からはるかに速く除去される。次の実施例では、肝の信号強度の変化は、Ｍｎ−フィテートの投入後約４０分で最大(約３２％まで向上)に逹することを観察した。本発明の物質は、現在まで報告された細胞内物質(例えば、ＳＰＩＯ)よりかなり短い２４時間で肝から除去された。従って、本発明の造影剤は、滞留時間を増加させるために別の担体を必要とする既存の造影剤に比べてより効果的であることが分かる。
【００４８】
最後に、本発明の造影剤は、組織または細胞特異的に映像化を許す。次の実施例で証明された、大食細胞によって本発明のＧｄ−フィテート複合体の殺菌作用は、特定疾病の診断において関心の組織または器官の視覚化に使用され得る。
【００４９】
大食細胞は、リンパ節と脾臓で豊富に見出される。肝のクッパー細胞と筋肉組織の組織球(histiocytes)などのような大食細胞が造影剤の吸収の原因である。本発明の造影剤に関して、それらは血流からクッパー細胞によって吸収され、映像造影生成のために、局所磁場を撹乱させる。本発明の造影剤は、大食細胞による食菌作用を介して特定組織に導入され、それによって、粥状斑硬化症、臓器移植、多発性硬化症、及び癌の多様な種類を見つける監視リンパ節のような多様な疾病を診断するのに応用され得る。
【００５０】
従って、さらなる一つの態様として、本発明は、本発明によるＭＲＩ用造影剤を必要に応じて対象に投与し、ここで、臓器または組織の感染と炎症を診断するのが可能な、臓器と組織を映像化することを含む関心のある臓器または組織を磁気共鳴映像で大食細胞の活性を測定する方法を提供するものである。
【００５１】
また一つのさらなる態様として、本発明は、本発明によるＭＲＩ用造影剤を必要に応じて対象に投与し、その部位を映像化することを含む、磁気共鳴映像を介して炎症の部位に大食細胞の移動を非侵襲的に測定する方法を提供する。
【００５２】
また一つのさらなる態様として、本発明は、本発明によるＭＲＩ用造影剤を 細胞に添加し、対象の部位に細胞を移植し、磁気共鳴映像を用いて前記部位を映像化する段階を含む、磁気共鳴映像を介して生体内で移植した細胞の存在を視覚化する方法を提供する。
発明形態
【００５３】
以下、本発明の理解を助けるために図面及び表と共に好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は本発明をより容易に理解するために提供されるもののみでありる、実施例によって本発明の内容が制限されるのではない。
【００５４】
実施例１：フィテートまたはイノシトールフォスフェートと常磁性イオンの熱力学的結合
フィテート溶液またはイノシトールフォスフェート誘導体に対するＧｄ３＋、Ｍｎ２＋及びＣａ２＋のような常磁性金属イオンなどの結合等温線数量化のために、Ｍｉｃｒｏｃａｌ２００等温線の適定微細熱量分析機(Microcal, Inc., Northhampton, MA. USA)でＩＴＣ実験を行った。資料収集、分析及びプロッティング は、Ｍｉｃｒｏｃａｌ社で提供するオリジンバージョン７．０のソフトウェアパッケージに依存して行った。微細熱量分析機内での毎回常磁性物質がその中に注入される時の試料細胞と対照細胞との熱の差に基づく。対照群は蒸留水で満たした。典型的な適定方法は、５〜１０ｍＭの常磁性金属イオン溶液を１〜５μｌで分株したものを異なるｐＨのフィテート溶液にそれぞれ規則的な２分間隔で注入しながら結合エネルギー差を測定した。この時、シリンジは、フィテート試料と常磁性物質との安定した結合のために、１０００ｒｐｍ速度で混合した。毎回注入される時の吸熱または発熱は、熱量計で測定した。これらの適定等温線は、各注入ごとにエンタルピー変化を提供するために統合した。等温線は、部位モデルの２つの数学的に異なるセットに対してよく合うように分析された。熱力学的分析を通じて結合定数(Ｋａ)、エンタルピー変化(ΔＨ)、結合の化学量論(Ｎ)を含む変数を計算した。自由エネルギー(ΔＧ)変化とエントロピー(ΔＳ)変化を次の数式：ΔＧ＝−ＲＴｌｎＫａ＝ΔＨ−ＴΔＳを介して決定し、ここで、Ｒは一般的な気体定数であり、Ｔは絶対温度の温度である。
【００５５】
実施例１．１：フィテートとガドリニウム(Ｇｄ３＋)に対するＩＴＣ分析
Ｇｄ３＋溶液(１０ｍＭ)とフィテート(０．５ｍＭ)の熱力学的適定反応は、ｐＨ範囲３．０〜８．０による３７℃で測定した。Ｇｄ３＋／フィテートモール比による統合された熱の直線に該当する結合等温線は、図１Ｂに示した。この図面で、実線は数学的に決定された部位モデルの２つの異なるセットに対するフィテート分子とＧｄ３＋の間にデータの最適合カーブに該当し、リガンドＧｄ３＋が３つの非−同一の独立的部位に結合するということを示す。データの分析を介して解離定数(Ｋｄ)、フィテート分子当りＧｄ３＋の結合個数(ｎ)、及びエンタルピー変化連関(ΔＨ)を得た。フィテート溶液にＧｄ３＋イオンの結合に該当する熱力学的変数などは、表１に与えられた。表１のデータから明らかな１０−９〜１０−７Ｍの強い親和力のＧｄ−フィテート複合体を形成するために、Ｇｄ３＋イオンが二座配位子(bidentate)形態で(図１Ａ)フィテートのリン酸基からの２つの酸素陰イオン(oxianion)に強く結合する。
【００５６】
【表１】
2012520871.tif 000003
【００５７】
(前記実験は、０．１ＮのＨＣｌで適用された各ｐＨにおいて、０．５ｍＭのフィテート溶液で３１０Ｋで行った。ｎ値は、フィテート分子当り結合されたＧｄ３＋の数を示す。熱力学変数などは、フィテート溶液に結合するＧｄ３＋の分析のために提供された。）
【００５８】
実施例１．２：フィテートとマンガン(Ｍｎ２＋)に対するＩＴＣ分析
Ｍｎ２＋溶液(１０ｍＭ)とフィテート(０．５ｍＭ)の熱力学的適定反応は、３７℃とｐＨ範囲３．０〜８．０で行った。Ｍｎ２＋／フィテートモル比による統合された熱の直線に該当する結合等温線は、図２に示した。この直線で、実線は数学的に決定された、順次結合部位に対するデータの最適合カーブを示し、リガンド(Ｍｎ２＋)が４つの異なる独立的部位に結合することを示した。データ分析を介して解離定数(Ｋｄ)、フィテート分子当りＧｄ３＋の結合個数(ｎ)、及びエンタルピー変化連関(ΔＨ)を得た。このような分析を介した熱力学的変数などは、フィテートの１モル当り４モルのＭｎ２＋が結合できることに提案され、Ｍｎ２＋に対する結合力は、それぞれ９．５２×１０−６Ｍ、１．１×１０−６Ｍ、２．２１×１０−５Ｍ、及び１．２×１０−４Ｍである。分析の結果から明らかに、Ｍｎ２＋イオンもフィテート分子に強く結合するように見られた。
【００５９】
実施例１．３：フィテートとＣａ２＋及びＭｇ２＋に対するＩＴＣ分析
Ｃａ２＋及びＭｇ２＋イオンなどは血中に存在する最も豊富な無機質イオンであるから、フィテートと多様な常磁性物質に対するこのイオンの相対的な結合力を比較するのが非常に重要である。この点に係って、Ｃａ２＋溶液(１５ｍＭ)またはＭｇ２＋溶液(３０ｍＭ)とフィテート(０．５ｍＭ)の熱力学的適定反応は、ｐＨ範囲３．０〜８．０による３７℃で行った。Ｃａ２＋／フィテートモル比による統合された熱の直線に該当する結合等温線は、図３に示した。この直線で、実線は数学的に決定された部位モデルの２つのセットに対するデータの最適合カーブを示し、リガンド(Ｃａ２＋)が３つの非−同一の独立的部位に結合するということを示す。データ分析を介して解離定数(Ｋｄ)、フィテート分子当りＧｄ３＋イオンの結合個数(ｎ)及びエンタルピー変化連関(ΔＨ)を得た。フィテートにＣａ２＋の結合に該当する熱力学的変数などは表２に示した。
【００６０】
【表２】
2012520871.tif 000004
【００６１】
(前記実験は、０．１ＮのＨＣｌで適用された各ｐＨにおいて、０．５ｍＭのフィテート溶液で３１０Ｋで行った。ｎ値は、フィテート分子当り結合されたＣｄ２＋の数を示す。熱力学変数などは、フィテート溶液に結合するＣｄ２＋の分析のために提供された。)
【００６２】
Ｍｇ２＋／フィテートモル比による統合された熱の直線に該当する結合等温線は、図４に示した。実線は、数学的に決定された部位モデルの１つのセットに対するデータの最適合カーブを示し、リガンド(Ｍｇ２＋)が１つまたは２つの同一の独立的部位に結合することを示す。フィテートにＭｇ２＋の結合に該当する熱力学的変数などは、下記表３に示した。データから明らかな、フィテートに対するＣａ２＋の結合力がＭｇ２＋より１００倍強いことと確認された。
【００６３】
【表３】
2012520871.tif 000005
【００６４】
(前記実験は、０．１ＮのＨＣｌで適用された各ｐＨにおいて、０．５ｍＭのフィテート溶液で３１０Ｋで行った。ｎ値は、フィテート分子当り結合されたＭｇ２＋の数を示す。熱力学変数などは、フィテート溶液に結合するＭｇ２＋の分析のために提供された。)
【００６５】
様々な金属イオンとの結合に対するフィテートのＩＴＣ分析結果から、酸性ｐＨ値でもＧｄ３＋がフィテートに最も強く結合するということを確認し、この複合体が熱力学的に最も安定している化合物であることを示し、酸性ｐＨで金属損失に対する力学的不活性(Kinetic inertness)を示す。これにより、Ｇｄ−フィテート複合体を毒性の低い造影剤として使用可能である。
【００６６】
実施例１．４：イノシトールフォスフェートとＧｄ３＋の熱力学結合に対するＩＴＣ分析
イノシトールフォスフェート(イノシトール−１、３、４−トリスフォスフェート(inositol-1,3,4-trisphosphate)、イノシトール−１、４、５−トリスフォスフェート(inositol-1,4,5-trisphosphate)、またはイノシトール−１、３、４、５−テトラキスフォスフェート(inositol-1,3,4,5-tetrakisphosphate))(０．２ｍＭ)とＧｄ３＋(５ｍＭ)の熱力学的適定反応は、２５℃、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０で行った。Ｇｄ３＋／イノシトールフォスフェートモル比による統合された熱の直線に該当する結合等温線は、図５、図６、図７にそれぞれ示した。各イノシトールフォスフェート誘導体１モル当りＧｄ３＋の結合に該当する熱力学的変数などは、下記表４に要約した。本結果は、イノシトールフォスフェートも  Ｇｄ３＋と強く結合するということを示した。
【００６７】
【表４】
2012520871.tif 000006
【００６８】
(前記実験は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ及びｐＨ７．０において、０．２ｍＭのフィテート溶液で２９８Ｋで行った。ｎ値は、フィテート分子当り結合されたＧｄ３＋の数を示す。熱力学変数などは、フィテート溶液に結合するＧｄ３＋の分析のために提供された。）
【００６９】
実施例１．５：フィテートとＦｅ３＋の熱力学結合に対するＩＴＣ分析
Ｆｅ３＋溶液(５ｍＭ)とフィテート(０．５ｍＭ)の熱力学的適定反応は、ｐＨ範囲４．０〜６．０による３７℃で測定した。Ｆｅ３＋／フィテートモル比による統合された熱の直線に該当する結合等温線は、図８Ａに示した。この図面では、実線は、数学的に決定された部位モデルの２つの異なるセットに対するフィテートと鉄イオンの間の最適合カーブに該当し、リガンド(Ｆｅ３＋)が２つの非−同一の独立的部位に結合するということを示す。このようなデータの分析を介して解離定数(Ｋｄ)、フィテート分子当りＦｅ３＋の結合個数(ｎ)及びエンタルピー変化連関(ΔＨ)を得た。フィテート溶液にＦｅ３＋の結合に該当する熱力学的変数などは、表５に示した。表１のデータから明らかなように、１０−６〜１０−５Ｍの強い親和力でＦｅ−フィテート複合体を形成するために、Ｆｅ３＋イオンが二座配位子形態(図８Ｂ)でフィテートのリン酸基から２つの酸素陰イオンに強く結合する。
【００７０】
【表５】
2012520871.tif 000007
【００７１】
(前記実験は、それぞれ０．１ＮのＨＣｌにｐＨを調節して３１０Ｋの０．５ｍＭのフィテート溶液で行った。ｎ値は、フィテート分子当り結合されたＦｅ３＋の数を示す。前記熱力学変数などは、フィテート溶液に結合するＦｅ３＋の分析のために提供された。)
【００７２】
実施例２：ＥＤＴＡ溶液とＧｄ３＋の熱力学結合に対するＩＴＣ分析
Ｇｄ３＋溶液(５ｍＭ)とＥＤＴＡ(０．４ｍＭ)との熱力学的適定反応は、２５℃で１０ｍＭのＭＥＳ中でｐＨ５．６で行った。Ｇｄ３＋／ＥＤＴＡモル比に対する統合された熱の直線に該当する結合等温線は、図９に示した。この直線で、実線は、数学的に決定された部位モデルの１つのセットに対する最適合カーブに該当し、１つのリガンド(Ｇｄ３＋)が１つのＥＤＴＡ分子に結合するということを示す。データ分析を介して解離定数(Ｋｄ)、ＥＤＴＡ分子当りＧｄ３＋の結合個数(ｎ)、及びエンタルピー変化連関(ΔＨ)を得た。解離定数は、１．４７×１０−７Ｍに決定された。これは、既知のキレート剤であるＥＤＴＡとの相対的な安全性を比較して決定するのに重要な現実的な接近方法である。また、本結果は、Ｇｄ３＋の結合力がＥＤＴＡに対する結合力よりフィテートに対して１０倍以上の強い結合力を有しているということを提案し、これは、従って、本発明の造影剤(Ｇｄ−フィテート複合体)がＧｄ−ＥＤＴＡより１０倍安定した造影剤であることを示す。
【００７３】
実施例３：ジエチレントリアミン五酢酸(ＤＴＰＡ)とＧｄ３＋の熱力学結合に対するＩＴＣ分析
Ｇｄ−フィテート複合体と相対的な安全性を比較するために、Ｇｄ３＋溶液(５ｍＭ)とＤＴＰＡ(０．２ｍＭ)との熱力学的適定反応は、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で、または１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０で２５℃で行った。Ｇｄ３＋／ＤＴＰＡのモル比による統合された熱の直線に該当する結合等温線は、図１０(ｐＨ４．８)及び図１１(ｐＨ７．０)に示した。
数学的に決定されたように、実線は部位モデルの２つのセットに対するデータの最適合カーブを示し、リガンド(Ｇｄ３＋)が２つの非−同一の独立的部位に結合することを説明する。データ分析を介して解離定数(Ｋｄ)、ＥＤＴＡ分子当りＧｄ３＋結合個数(ｎ)、及びエンタルピー変化連関(ΔＨ)を得た。ＤＴＰＡにＧｄ３＋の結合に該当する熱力学的変数などは、下記の表６に要約した。この表で見られるように、Ｇｄ３＋の結合力がフィテートに対してＧｄ３＋のＤＴＰＡに対するものより１０−１００倍の強い結合力を示したし、これは、Ｇｄ−フィテート複合体がＧｄ−ＤＴＰＡより力学的に不活性であることを提案する。
【００７４】
【表６】
2012520871.tif 000008
【００７５】
(前記実験は、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８でまたは１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．８で、０．２ｍＭのＤＴＰＡ溶液で２９８Ｋで行った。ｎ値は、イノシトールフィテート１モル当り結合されたＧｄ３＋の数を示す。熱力学変数などは、フィテート溶液に結合するＧｄ３＋の分析のために提供された。)
【００７６】
実施例４：常磁性フィテート複合体の製造
常磁性フィテート複合体の製造のために、どんな常磁性元素、分子、イオンまたは物質が使用され得る。常磁性物質は、少なくとも１つ以上の下記の元素：Ｃｒ３＋、Ｃｏ２＋、Ｍｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｕ２＋、及びＣｕ３＋のような転移元素のイオン；またはＬａ３＋、Ｇｄ３＋、Ｃｅ３＋、Ｔｂ３＋、Ｐｒ３＋、Ｄｙ３＋、Ｎｄ３＋、Ｈｏ３＋、Ｐｍ３＋、Ｅｒ３＋、Ｓｍ３＋、Ｔｍ３＋、Ｅｕ３＋、Ｙｂ３＋、及びＬｕ３＋のようなランタニド系列の元素；好ましくはＦｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｍｎ２＋またはＧｄ３＋を含む。最も強い常磁性を有したＧｄ３＋が最も好ましい。しかし、Ｇｄは非常に高価で、生理的な条件下で自由イオンで存在時には非常に毒性が強い。強力なキレーターであるフィテートがＧｄ３＋をキレート化して、生理的に耐えられ、安定したＧｄの形態を生成して造影剤として使用可能である。
【００７７】
実施例４．１：Ｇｄ−フィテート複合体の製造
ＩＴＣ測定のように、Ｇｄ３＋イオンに対するフィテートの結合力は、フィテートとＧｄ３＋が同一モル濃度である時に最も強いと示された。ＩＴＣ研究(図１と表１)に基づいて、Ｇｄ−フィテート溶液(２０ｍＭ)は、Ｇｄ３＋とフィテートを同一モル濃度で使って製造した。その点に係って、３００ｍｌの滅菌水に７．２４ｇのナトリウムフィテート(Sigma chemical Co.，USA)を溶解させた後、１Ｎの塩酸溶液を使ってｐＨを７．０に適定し、１００ｍｌの２００ｍＭのＧｄＣｌ３(Sigma chemical Co.，USA)溶液で混合し、最終的に１、０００ｍｌのＧｄ−フィテート溶液を製造した。この溶液は１５ｍｌの試料びんに１０ｍｌの用量で分株した。生理水溶液のｐＨ範囲は、４〜９であり得り、生理的条件で前記造影剤を診断用として使用するの時、最も好ましくは６〜８であり得る。また、Ｇｄ−フィテート複合体は、  Ｇｄ３＋とフィテートの任意のモル比が０．５〜３．０の範囲で製造可能であり、または、逆も可能である。最も好ましい濃度は、同一モル濃度のＧｄ３＋とフィテートである。また、Ｇｄ−フィテート複合体を診断用として使用する時、Ｇｄ−フィテート複合体の血中Ｃａ２＋キレート化を最小化するために、Ｇｄ−フィテート複合体にＣａ２＋を添加することもできる。最も好ましくは、Ｃａ２＋濃度は、Ｇｄ３＋及びフィテートと同一モル濃度である。
【００７８】
実施例４．２：Ｍｎ−フィテート複合体の製造
ＩＴＣ分析は、Ｍｎ２＋イオンに対するフィテートの結合力は、フィテートとＭｎ２＋が同一モル濃度である時に最も強いことを提案する。このような結果(図２)に基づいて、Ｍｎ−フィテート溶液(２０ｍＭ)は、Ｍｎ２＋とフィテートを同一モル濃度で使って製造した。このために、３００ｍｌの滅菌水に７．２４ｇのナトリウムフィテート(Sigma chemical Co.，USA)を溶解させた後、１Ｎの塩酸溶液を使ってｐＨを７．０に適定し、１００ｍｌの２００ｍＭのＭｎＣｌ２(Sigma chemical Co.，USA)溶液で混合し、最終的に１、０００ｍｌのＭｎ−フィテート溶液を製造した。そして、この溶液は、１５ｍｌの試料びんに１０ｍｌの用量で分株した。水溶液のｐＨ範囲は、４〜９であり得り、生理的条件で前記造影剤を診断用として使用するの時に最も好ましくは６〜８であり得る。また、Ｍｎ−フィテート複合体の製造時、Ｍｎ２＋とフィテートとの任意のモルビが０．５〜４．０の範囲で製造可能であり、または逆も可能である。最も好ましい濃度は、同一モル濃度のＭｎ２＋とフィテートである。また、Ｍｎ−フィテート複合体を診断用として使用する時、血中Ｍｎ−フィテート複合体のＣａ２＋キレート化を最小化するために、Ｍｎ−フィテート複合体にＣａ２＋を添加することもできる。最も好ましくは、濃度はＭｎ２＋及びフィテートと同一モル濃度である。
【００７９】
実施例４．３：Ｆｅ−フィテート複合体の製造
Ｆｅ３＋イオンに対するフィテートの結合力は、フィテートとＦｅ３＋が同一モル濃度である時に最も強いと示された。  ＩＴＣ研究(図８、表５)に基づいて、Ｆｅ−フィテート溶液(２０ｍＭ)は、Ｆｅ３＋とフィテートを同一モル濃度を使って製造した。その点に係って、３００ｍｌの滅菌水に７．２４ｇのナトリウムフィテート(Sigma chemical Co.，USA)を溶解させた後、１Ｎの塩酸溶液を使ってｐＨを６．０に適定し、１００ｍｌの２００ｍＭのＦｅＣｌ３(Sigma chemical Co.，USA)溶液で統合して、最終的に１、０００ｍｌのＧｄ−フィテート溶液を製造した。この溶液は、１５ｍｌの試料びんに１０ｍｌの用量で分株した。水溶液のｐＨ範囲は、４〜９であり得り、生理的条件で前記造影剤を診断用として使用する時に最も好ましくは６〜８であり得る。また、Ｆｅ−フィテート複合体は、Ｆｅ３＋とフィテートの任意のモル比が０．５〜３．０の範囲で製造可能であり、または、逆も可能である。最も好ましい濃度は、同一モル濃度のＦｅ３＋とフィテートである。また、Ｆｅ−フィテート複合体を診断用として使用する時、Ｆｅ−フィテート複合体の血中Ｃａ２＋キレート化を最小化するために、  Ｆｅ−フィテート複合体にＣａ２＋イオンを添加することもできる。最も好ましくは、Ｃａ２＋濃度はＦｅ３＋及びフィテートと同一モル濃度である。
【００８０】
実施例５：常磁性イノシトールフォスフェートの製造
常磁性イノシトールフォスフェート複合体を製造するために、常磁性さえすれば、どんな元素、分子、イオンまたは物質が使用され得る。本発明で有用な常磁性物質は、少なくとも１つ以上の下記の元素：Ｃｒ３＋、Ｃｏ２＋、Ｍｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｕ２＋、及びＣｕ３＋のような転移元素のイオン；またはＬａ３＋、Ｇｄ３＋、Ｃｅ３＋、Ｔｂ３＋、Ｐｒ３＋、Ｄｙ３＋、Ｎｄ３＋、Ｈｏ３＋、Ｐｍ３＋、Ｅｒ３＋、Ｓｍ３＋、Ｔｍ３＋、Ｅｕ３＋、Ｙｂ３＋、及びＬｕ３＋のようなランタニド系列元素のイオン；好ましくはＦｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｍｎ２＋またはＧｄ３＋を含む。最も好ましくは強い常磁性を有したＧｄ３＋が最も好ましい。
【００８１】
イノシトールフォスフェートに基づいた造影剤は、任意のデ−ミオ−イノシトール−１、２、３、４、５−ペンタフォスフェート(d-myo-inositol-1、2、3、4、5-pentaphosphate)、デ−ミオ−イノシトール−１、３、４、５−テトラフォスフェート(d-myo-inositol-1、3、4、5-tetraphosphate)、デ−ミオ−イノシトール−１、４、５−トリスフォスフェート(d-myo-inositol-1、4、5-trisphosphate)及びデ−ミオ−イノシトール−１、３、４−トリスフォスフェート(d-myo-inositol-1、3、4-trisphosphate)を含む。
【００８２】
実施例５．１：Ｇｄ−イノシトールフォスフェートの製造
Ｇｄ３＋に対するイノシトールフォスフェート(デ−ミオ−イノシトール−１、３、４−トリスフォスフェート、デ−ミオ−イノシトール−１、４、５−トリスフォスフェート、またはデ−ミオ−イノシトール−１、３、４、５−テトラキスフォスフェート)の結合力は、最も強いものであって、ＩＴＣで測定した。この結果に基づいて(図５、図６、図７と表４)、Ｇｄ−イノシトールフォスフェートは、Ｇｄ３＋とイノシトールフォスフェートを同一モル濃度で使って製造した。この点に係って、５ｍｌの滅菌水に２０ｍＭのイノシトールフォスフェート(Sigma chemical Co.，USA)を溶解させた後、１Ｎの塩酸溶液を使ってｐＨを７．０に適定し、５ｍｌの２０ｍＭのＧｄ３＋(Sigma chemical Co.，USA)溶液と混合して、Ｇｄ−イノシトールフォスフェートの水溶液を得た。水溶液のｐＨ範囲は、４〜９であり得り、生理的条件で前記造影剤を診断用として使用する時に最も好ましくは６〜８であり得る。Ｇｄ−イノシトールフォスフェートは、Ｇｄ３＋とイノシトールフォスフェートの任意のモル比が０．５〜４．０の範囲で製造可能であり、または、逆も可能である。最も好ましい濃度は、同一モル濃度のＧｄ３＋とイノシトールフォスフェートである。
【００８３】
実施例６：常磁性フォスファチジル イノシトールフォスフェートリポソーム(paramagnetic-phosphatidylinositol phosphates liposomes)の製造
常磁性フォスファチジル イノシトールフォスフェートリポソームを製造するために、常磁性物質さえすれば、どんな元素、分子、イオンまたは物質が使用され得る。本発明で有用な常磁性物質は、少なくとも１つ以上の下記の元素：Ｃｒ３＋、Ｃｏ２＋、Ｍｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｕ２＋、及びＣｕ３＋のような転移元素のイオン；またはＬａ３＋、Ｇｄ３＋、Ｃｅ３＋、Ｔｂ３＋、Ｐｒ３＋、Ｄｙ３＋、Ｎｄ３＋、Ｈｏ３＋、Ｐｍ３＋、Ｅｒ３＋、Ｓｍ３＋、Ｔｍ３＋、Ｅｕ３＋、Ｙｂ３＋、及びＬｕ３＋のようなランタニド系列元素のイオン；好ましくはＦｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｍｎ２＋またはＧｄ３＋を含む。最も好ましくは強い常磁性を有したＧｄ３＋が最も好ましい。
【００８４】
フォスファチジル イノシトールフォスフェート誘導体に基づいた造影剤は、任意のフォスファチジル イノシトール−３、４、５−トリフォスフェート(phosphatidylinositol-3、4、5-trisphosphate)及びフォスファチジル イノ−シトル−４、５−ビスフォスフェート(phosphatidylinositol-4、5-bisphosphate)を含み得る。
【００８５】
実施例７：ＩＴＣ分析の熱力学変数からＧｄ−フィテート、Ｇｄ−ＤＴＡＰ、Ｇｄ−ＤＯＴＡ及びＧｄ−ＥＤＴＡの安定度定数(Ｋ)の測定
安定化定数(生成定数、結合定数)は、溶液上で複合体の形成のための平衡定数である。これは複合体を形成するために合される試薬などの間の相互作用の力の測定である。金属イオン複合体形成の熱力学は、非常に重要な情報を提供する。下記に、キレート効果は熱力学の用語で最も良く説明される。平衡定数は反応のための標準ギブス自由エネルギー変化と関連がある。
【００８６】
ΔＧo＝−２．３０３ＲＴｌｏｇ１０Ｋ、ここで、Ｒは気体定数であり、Ｔはケルビン温度である。２５℃で、ΔＧｋＪｍｏｌ−１は、５．７０８ｌｏｇＫ(１ｋＪｍｏｌ−１＝１０００Ｊ／ｍｏｌ)と一致する。この式から、安定度定数(Ｋ)は、計算された、表７に記録された。Ｇｄ−フィテートの安定度定数は、他のＧｄ−混合物よりはるかに高い。これはＧｄ−フィテートが生理的条件で非常に安定して、高い熱力学的安定度及び金属損失と係わる力学的不活性を引き起こすということを指示した。
【００８７】
【表７】
2012520871.tif 000009
【００８８】
実施例８：９．４ＴのＭＲＩスキャナで多様な濃度のＭｎ２＋、Ｇｄ−ＤＴＰＡ、Ｍｎ−フィテート、Ｇｄ−フィテートに対する弛緩率(ＲＩ)の測定
造影剤を使った造影強化ＭＲＩにおいて、弛緩率(Ｒ１＝１／Ｔ１)は、映像造影を生成する局所磁場を造影剤がどれくらい妨害するかどうかの効率の測定である。これに係って、Ｍｎ−フィテート及びＧｄ−フィテートの弛緩率をそれぞれの他の濃度で測定し、ＭＲ研究に広く用いられるＭｎ２＋及びＧｄ−ＤＴＰＡの弛緩率と互いに比較した。  
【００８９】
総６つのチューブファントムを０．０１２５、０．０２５、０．０５、０．１、０．５及び１ｍＭの濃度で４つの化学物質(Ｍｎ２＋、Ｇｄ−ＤＴＰＡ、Ｍｎ−フィテート、Ｇｄ−フィテート)のそれぞれに作った。伝送及び受信のためのボリュームコイル(直径７ｃｍ)が設けられた９．４ＴのBRUKER biospec ＭＲＩスキャナを用いて実験を行った。Ｔ１は、１１個の反転回復時間(inversion recovery time；Ｔ１；Ｔ１'ｓ＝１６、２０、３０、５０、１００、２００、４００、７００、１５００、３０００及び６０００ｍｓ)でスポイルドグラジェントエコーシーケンス(spoiled gradient echo sequence；ＳＰＧＲ)を使って測定した。Ｔ１が３０００ｍｓで得られた映像を図１２Ａに示した。その他のシーケンス変数などは、以下の通りである；ＴＲ／ＴＥ＝８０００／４．４１ｍｓ、フリップ角度(flip angle；ＦＡ)＝９０゜、撮像視野(field of view；ＦＯＶ)＝６０×４０ｍｍ、マトリックス・サイズ＝２５６×２５６、１枚の厚さ(slice with a thickness)１ｍｍ、２の信号平均(signal averages)。
【００９０】
図１２のように、Ｍｎ−フィテートとＧｄ−フィテートの両方ともすべての濃度でＭｎ２＋とＧｄ−ＤＴＰＡよりも高い造影効果を生成する。
【００９１】
実施例９：９．４ＴのスキャナでＲＡＷ２６４．７大食細胞株にＧｄ−フィテートの濃度によるＭＲ信号変化
本実施例において、大食細胞によるＧｄ−フィテートの大食作用(phogocytosis)と物質の濃度による映像造影強化を立証した。
【００９２】
ＲＡＷ２６４．７大食細胞株は、アメリカ細胞株銀行(American Type Culture Collection，Manassas，VA，USA）から購入した。細胞は、３７℃で５％ＣＯ２培養器内で１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、１％グルタミン及び１％ピルビン酸塩ナトリウムを含有する完全なＤＭＥＭ培地を使って培養した。ＭＲ映像実験のために、細胞を１×１０５細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートにプレーティングした。２４時間培養の後、細胞をＰＢＳで洗浄した。その後、各ウェルを(０、０．１２５、０．２５、０．３７５、０．５及び０．７５ｍＭ)異なる濃度でＧｄ−フィテートを３時間培養した後、ＰＢＳで３回洗浄した。細胞ペラットを１ｍｌのＰＢＳで懸濁させた後に０．２ｍｌのマイクロチューブに移した。伝送及び受信のためのボリュームコイル(直径７ｃｍ)が設けられた９．４ＴのBRUKER biospec ＭＲＩスキャナを用いてＴ１強調映像を得た。ＳＰＧＲを用いて得られたＴ１強調映像は、図１３Ａに示した。シーケンス変数は、以下の通りである：ＴＲ／ＴＥ＝１２．８／１．４ｍｓ、ＦＡ＝９０゜、１枚の厚さ(slice with a thickness)１ｍｍ、３２の信号平均。
【００９３】
本実施例は、Ｇｄ−フィテートがポジティブ造影剤、すなわち、Ｔ１造影剤として提案されたＭＲ特徴とＧｄ複合体の大食細胞による摂取を証明した。Ｇｄ−フィテートの濃度増加に応じてＲＡＷ２６４．７大食細胞株のＴ１強調信号強度が増加した。それゆえに、本発明の造影剤は、図１３Ｂに示されたメカニズムで生体内で関心のある目的の部位の組織特性を視覚化が潜在的にできるだろう。すなわち、血管に造影剤を投与した後、Ｇｄ−フィテートとＭｎ−フィテート複合体は、肝、脾臓、骨髄、リンパ節のような単核食細胞系の臓器に位置する大食細胞によって選択的に摂取され、血管からのクッパー細胞がＧｄ−フィテートを直接的に吸収することを提案する。肝のクッパー細胞に摂取された後、本発明の造影剤は特定微細分野不均等を誘発して強いＴ１及びＴ２弛緩率を示す。
【００９４】
実施例１０：９．４ＴでＭｎ−フィテート複合体の静脈注射投与後のラットの肝でＴ１強調ＭＲ信号の時間−依存性変化
本実施例は、ポジティブ造影剤としてＭｎ複合体のＭＲ特性とクッパー細胞によるＭｎ−フィテートの食菌作用の生体内立証を試みた。
【００９５】
２０ｍＭのＭｎ−フィテート溶液(Ｍｎ２＋及びフィテートの濃度が同一モル比)をイソフルラン(isoflurane)で痲酔した雄ＳＤ(Sprague Dawley)ラット(ｗｔ＝３００ｇ)の尾静脈に５μｍｏｌ／ｋｇ用量を投与した。ラットは、伝送及び受信のためのボリュームコイル(直径７ｃｍ)が設けられたＭＩＲスキャナ(９．４ＴのBRUKER biospec)のアイソセンタ(isocenter)に伏せた姿勢で位置するようにし、呼吸同期と組み合わせたＳＰＧＲを用いて肝のＴ１強調映像を得た。シーケンス変数は、以下の通りである：ＴＲ／ＴＥ＝３．５２／１．５６ｍｓ、ＦＡ＝９０゜、ＦＯＶ＝７０×５８、マトリクスサイズ＝２５６×２５６、３枚の厚さ(slice with a thickness)１ｍｍ、３２の信号平均。  
【００９６】
映像は図１４Ａに示し、Ｍｎ−フィテートがポジティブ造影剤、すなわち、Ｔ１造影剤として作用することを証明した。一般に、現在使われる細胞外ＭＲ造影剤(例えば、Ｇｄ−ＤＴＡＰ)は、注入後、肝で数分後にその濃度が大きく減少すると知られている。言い換えると、従来の造影剤は、短い時間の間だけ造影効果を保証する。Ｍｎ−フィテートは、注入後約４０分のところに肝の信号強度変化が最大(約３２％まで強化)に到逹する。その後、約２４時間内で肝からほとんど除去されると確認され、これは他の細胞内物質で、今まで報告された(例えば、ＳＰＩＯ)よりもかなり短い。
【００９７】
実施例１１：９．４ＴでＧｄ−フィテート複合体の静脈注射投与後のラットの肝でＴ１強調ＭＲ信号の時間−依存性変化
本実施例は、Ｇｄ複合体がポジティブ造影剤、すなわち、Ｔ１造影剤として作用するＭＲ特徴とＧｄ−フィテートが肝のクッパー細胞の食菌作用を生体内証明を提供しようと試みた。
【００９８】
２０ｍＭのＧｄ−フィテート溶液(Ｇｄ３＋及びフィテートの濃度が同一モル比)を雄ＳＤラット(ｗｔ．＝３００ｇ)の尾静脈に４  μｍｏｌ／ｋｇの用量を投与した。ラットは、伝送及び受信の両方とものためのボリュームコイル(直径７ｃｍ)が設けられた磁石(９．４ＴのBRUKER biospec)のアイソセンタに伏せた姿勢で位置するようにし、呼吸同期と組み合わせた高速スピンエコー(fast spin echo；ＦＳＥ)を用いて肝のＴ２強調映像を得た。予備実験(データは図示せず)を介して、高磁場(９．４Ｔ)でＲ１(縦弛緩)よりもＧｄ−フィテート複合体のＲ２(横弛緩)がはるかに強いため、Ｔ１−強調ＳＰＧＲの代りにＴ２強調ＦＳＥの選択を提供した。ポジティブ造影剤のような物質、すなわち、Ｔ１造影剤のＭＲ特性は、下記実施例の低磁場(１．５Ｔと４．７Ｔ)で証明した。
【００９９】
シーケンス変数は、以下の通りである：ＴＲ／ＴＥ＝６０００／１２．８ｍｓ、ＦＡ＝９０゜／１８０゜、ＦＯＶ＝６５×５５、マトリクスサイズ＝２５６×１９２、３枚の厚さ(slice with a thickness)１ｍｍ、２の信号平均。
【０１００】
映像は、図１５に示した。見られるように、Ｇｄ−フィテートは、注入後、約２４時間後に肝の信号強度変化が最大(４μｍｏｌ／ｋｇで約２６％まで減少)に到逹する(図１５Ｃ)。肝組織の信号強度は、投与後、約５日後にその基準値に回復することを観察し(図１５Ｄ)、さらに、他の外部−細胞剤と共に単調な除去の代りにクッパー細胞によってＧｄ−フィテートの食菌作用での信号変化結果支持する。
【０１０１】
すなわち、Ｇｄ−フィテートが時間とともに肝に徐徐に蓄積され、Ｔ２強調信号強度が増加することをゆっくり生成する。また、静脈投与または皮下投与後、正常臓器に摂取されるＭＲ映像造影剤として、Ｇｄ−フィテート複合体は、臨床的に非常に有用だろう。大食細胞に対するそれの生体内食菌作用を観察し得るＭＲ映像の保証は、Ｇｄ−フィテート複合体が粥状硬化斑、臓器移植片の拒絶反応、多発性硬化症、及び多様な癌種類発見監視リンパ節のような多様な疾病の診断に適用され得る。
【０１０２】
実施例１２：１．５Ｔと４．７Ｔでポジティブ造影剤としてのＧｄ−フィテート複合体の静脈注射投与後のラットの肝でＴ１−強調映像ＭＲ信号の時間−依存性変化
Ｇｄ−フィテート複合体が低磁場でポジティブ造影剤の機能を証明するために、低磁場１．５Ｔ(Siemens Avanto system)と４．７Ｔ(Bruker Biospec system)のＳＰＧＲを用いてＴ１強調映像を得た。
【０１０３】
シーケンス変数は、以下の通りである：１．５Ｔ；ＴＲ／ＴＥ＝４００／８ｍｓ、ＦＡ＝９０゜、ＦＯＶ＝７０×７０、マトリクスサイズ＝２５６×２５６、１１枚の厚さ(slice with a thickness)３ｍｍ、３の信号平均、４．７Ｔ；ＴＲ／ＴＥ＝３．３／１．２ｍｓ、ＦＡ＝９０゜、ＦＯＶ＝７０×７０、マトリクスサイズ＝１９２×１２８、３枚の厚さ(slice with a thickness)１ｍｍ、３２の信号平均。  
【０１０４】
映像は、図１６に示した。この図で見られる、４μｍｏｌ／ｋｇの用量のＧｄ−フィテートの投与は、正常の肝のＴ１を主に短くし、１．５と４．７ＴでＭＲ信号強度を増加させた。このような事実は、静脈投与したＧｄ−フィテート複合体が血中でクッパー細胞によって吸収されるという事実を提案した。クッパー細胞によって吸収されると、Ｇｄ−フィテート複合体は、高いＴ１弛緩性示し、このような低磁場では微細領域分野不均等を誘発して高い磁気モーメントを生成するということを示した。
【０１０５】
実施例１３：９．４ＴのスキャナでＢ１６Ｆ１／Ｂ１６Ｆ１−ＧＦＰ黒色鍾癌に注射したＣ５７ＢＬ／６マウスで監視／転移リンパ節の発見のための新しいＭＲＩ造影剤としてのＦｅ−フィテート複合体
本実施例で、黒色腫癌のマウスモデルのＡＴ一次腫瘍ＭＲＩ造影剤としてのＦｅ−フィテート複合体の皮下投与を介して監視／転移リンパ節の測定を証明しようと試みた。
【０１０６】
雄のＣ５７ＢＬ／６マウス(重さ２５−３０ｇ、年６−７週)をオリエントバイオ(Orient Bio)(Seoul, South Korea)から購入し、嘉泉醫科學大學校(Gachon University of Medicine and Science)、李吉女癌及び糖尿病研究研究院(Lee Gil Ya Cancer and Diabetes Institute；ＬＣＤＩ)の動物施設で交配させた。
【０１０７】
Ｂ１６Ｆ１黒色腫癌細胞は、アメリカ細胞株銀行(Manassas，VA，USA)から購入した。Ｂ１６Ｆ１−ＧＦＰ癌細胞は、緑色蛍光タンパク質発現のために細胞で感染させ、これは腫瘍のマーカーとしての機能を行うことができる。細胞は、３７℃で５％のＣＯ２培養器内で１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、１％グルタミン及び１％ナトリウムピルビン酸塩を含有する完全なＤＭＥＭ培地を使って培養した。
【０１０８】
黒色腫癌モデルの場合、癌細胞を洗浄し、注入のために培養液に個数を数えて分株した。動物は、誘導チャンバで４％のイソフルランで痲酔させた。痲酔された後に、細胞培養液の２０μｌ中の約４〜５×１０５細胞が雄のＣ５７／ＢＬ／６マウスの左側前肢の関節に皮下で注入させた。マウスでの腫瘍の成長は、毎日モニターした。成長した一次的腫瘍のサイズが約１ｃｍの時、Ｂ１６Ｆ１またはＢ１６Ｆ１−ＧＦＰ細胞の注入１３〜１８日後にＭＲＩを行った。
【０１０９】
監視リンパ節の実験は、９．４ＴのBruker animal ＭＲスキャナ(Biospec 94/20 USR；Bruker BioSpin，Ettlingen，Germany)で行った。転送専用ボリュームコイルが励起のために使用された(Bruker，Ettlingen，Germany)。信号受信のためにマウスブレーン表面コイルに捧げられたものを使用した。
【０１１０】
マウスは、誘導チャンバで４％イソフルランで最初に痲酔され、その次に、仰臥した姿勢で動物用ベッド(Bruker，Ettlinger，Germany)に置かれた。マウスは、その次にノーズコーン(nose cone)を介した吸入で１．５−２．０％のイソフルランで痲酔された。マウスの体温を安定させるために動物保温システム(Bruker，Ettlingen，Germany)を使用し、これは動物ベッドの下に流れるホース及びポンプからなった温水(３９℃)の貯蔵所の構成である。ＭＲ−互換性の動物監視及びゲートシステム(SA instrument，USA)が実験始終に使われた。
【０１１１】
横状(transverse)、冠状(coronal)、及び矢状(sagittal)の映像は、２次元(２Ｄ)のスポイルドグラジェントエコーシーケンス(ＳＰＧＲ)を使って得た。リンパ節映像のために、脂肪−抑圧された、呼吸−ゲートＴ１−強調軸映像をＳＰＧＲを使って得た。シーケンス変数は；繰り返し時間＝３３５ｍｓ、エコー時間(ＴＥ)＝６．７ｍｓ、フリップ角(ＦＡ)＝９０°、マトリックスサイズ＝３８４×３８４、励起数(ＮＥＸ)＝８である。脂肪−抑圧された、呼吸−ゲートＴ２−強調軸映像は、また、高速スピンエコー(ＦＳＥ)を使って得た。シーケンス変数は；ＴＲ／ＴＥ＝４０００／１４．５ｍｓ、効果的なＴＥ＝５８ｍｓ、エコートレーン長さ(ＥＴＬ)＝８、マトリックスサイズ＝３８４×３８４、ＮＥＸ＝８である。ＳＰＧＲ及びＦＳＥのシーケンスクォスの両方のスライス(１０−１５のスライス)が０．５ｍｍのスライス厚さで得られた。典型的な視野(ＦＯＶ)は、７０×７０ｍｍであった。マウス当りの全体スキャン時間は、約１時間であった。
Ｂ１６Ｆ１細胞に注入は同側の上腕及び腋窩リンパ節に転移を引き起こした。Ｂ１６Ｆ１細胞に皮下注入後に約１４日後、一次腫瘍のサイズは、直径約１ｃｍに到逹した(図１７)。
【０１１２】
上腕リンパ節のＴ１−強調及びＴ２−強調ＭＲ映像は、それぞれ図１８及び図１９に示した。映像プロトコルの両方において、ハイポインテンス(hypointense)部位は、Ｆｅ−フィテート複合体が監視リンパ節の部分に蓄積されるということを明らかに提案する。監視リンパ節のハイポインテンス信号は、Ｆｅ−フィテート投与後に４時間〜２４時間(図１８Ｂ−Ｄ及び図１９Ｂ−Ｄ)に示された。
【０１１３】
ＭＲ映像(図１８及び図１９)を得るために使われる同じマウスから左側の上腕リンパ節の病理組織学的結果を図２０に示した。リンパ節(図２０Ａ及びＢ)において、転移部位の形態学は、一次腫瘍(図２０Ｄ)の形態学とほとんど類似する。図２０Ｂにおいて、転移された癌細胞の部位は、プルシアンブルーでポジティブ的に染色され、これはＦｅ３＋イオンの染色のために使用されるものである。このようなデータは、ＭＲ映像(図１８及び図１９)において、ハイポインテンス部位が監視リンパ節にある転移腫瘍部位の周りでＦｅ−フィテート複合体の蓄積から起因するということを強く裏付ける。従って、Ｆｅ−フィテート複合体は、黒色腫癌のマウスモデルでＭＲＩによって転移リンパ節を発見することができ、ヒト患者のための臨床的適用において、転移リンパ節の発見のための従来のナノ粒子(ＳＰＩＯ)でＰＥＴ及びＭＲＩに有用することができる。
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【０１６１】
ここで引用されたすべての参考文献は、その内容全体が参考として組み入れられる。
【０１６２】
本願発明は、ここで記述した具体的な実施態様によって範囲が制限されるのではない。実際に、ここで記述されたものに加えて多様な発明の変形が前記の明細書及び伴った図面から当業者に明らかになる。このような変形は、添付の特許請求の範囲内で一致する。以下の例などは、本願発明を表現する一つの方式であるだけであり、発明の範囲を狭めるのではない。
【図１】
2012520871.tif 000010
【図２】
2012520871.tif 000011
【図３】
2012520871.tif 000012
【図４】
2012520871.tif 000013
【図５】
2012520871.tif 000014
【図６】
2012520871.tif 000015
【図７】
2012520871.tif 000016
【図８】
2012520871.tif 000017
【図９】
2012520871.tif 000018
【図１０】
2012520871.tif 000019
【図１１】
2012520871.tif 000020
【図１２】
2012520871.tif 000021
【図１３】
2012520871.tif 000022
【図１４】
2012520871.tif 000023
【図１５】
2012520871.tif 000024
【図１６】
2012520871.tif 000025
【図１７】
2012520871.tif 000026
【図１８】
2012520871.tif 000027
【図１９】
2012520871.tif 000028
【図２０】
2012520871.tif 000029
【国際調査報告】
2012520871.tif 000030
2012520871.tif 000031
2012520871.tif 000032