【手続補正書】
【提出日】令和1年12月2日(2019.12.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードするＤＮＡにライゲートされた標的化配列をコードするＤＮＡをそれぞれ含む核酸の収集物を作製する方法であって、
ａ．ＰＡＭ配列に対し５’にある目的の配列および反対の鎖におけるその逆相補的配列をそれぞれ含む二本鎖ＤＮＡ分子を提供するステップと、
ｂ．前記二本鎖ＤＮＡ分子において酵素消化反応を実行するステップであって、切断が、前記ＰＡＭ配列および／または反対の鎖におけるその逆相補的配列に生成されるステップと、
ｃ．認識配列を含むアダプタをステップ（ｂ）の結果生じたＤＮＡ分子にライゲートするステップと、
ｄ．ステップ（ｃ）の前記認識配列を認識する制限酵素とステップ（ｃ）の前記ＤＮＡ分子とを接触させるステップであって、それによって、前記ＰＡＭ配列に対してすぐ接して５’にある平滑末端化された二本鎖切断を含むＤＮＡ断片を生成し、それによって、前記ＰＡＭ配列および酵素認識部位を含有する前記アダプタを除去するステップと、
ｅ．ステップ（ｄ）の結果生じた二本鎖ＤＮＡ断片を、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードするＤＮＡとライゲートするステップであって、それによって、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードするＤＮＡにライゲートされた標的化配列をコードするＤＮＡをそれぞれ含む複数のＤＮＡ断片を生成するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記収集物の出発ＤＮＡ分子が、前記ＰＡＭ配列に対し５’にある前記目的の配列の上流の調節配列をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記調節配列が、プロモーターを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記二本鎖ＤＮＡ分子が、ゲノムＤＮＡ、インタクトなＤＮＡまたは剪断されたＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
標的化配列をコードするＤＮＡセグメントが、１５〜２５０ｂｐのサイズ範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＰＡＭ配列が、ＡＧＧ、ＣＧＧまたはＴＧＧである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＡＭ配列が、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２およびＣｍ５からなる群から選択されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質に特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｂ）が、（１）ＣＣＤ部位において一本鎖にニックを作製することができる酵素と前記ＤＮＡ分子とを接触させるステップであって、それによって、目的の配列およびそれに続くＨＧＧ配列をそれぞれ含む複数のニック二本鎖ＤＮＡ分子を生成し、前記ＤＮＡ分子が、前記ＣＣＤ部位においてニックを入れられるステップと、（２）エンドヌクレアーゼと前記ニック二本鎖ＤＮＡ分子とを接触させるステップであって、それによって、目的の配列およびそれに続くＨＧＧ配列をそれぞれ含む複数の二本鎖ＤＮＡ断片を生成し、ＨＧＧおよび／またはＣＣＤ配列由来の残っているヌクレオチドが取り残されるステップとをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｄ）が、ステップ（ｃ）の前記認識配列を認識する前記制限酵素により切断する前のステップ（ｃ）由来の、前記アダプタがライゲートされたＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅をさらに含み、ＰＣＲ後に、前記認識配列が、前記ＰＡＭ配列の３’に位置し、調節配列が、前記ＰＡＭ配列の５’遠位端に位置する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｂ）の酵素反応が、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ酵素およびＴ７エンドヌクレアーゼＩ酵素の使用を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ライゲートされるべき前記アダプタが、オーバーハングを含まない場合、ステップ（ｃ）が、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼによる平滑末端反応をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｃ）の前記アダプタが、（１）前記アダプタがＹ字型であり、オーバーハングを含む場合、一方の鎖に制限酵素認識配列を、他方の鎖に調節配列を含む二本鎖である；または（２）前記アダプタがＹ字型でない場合、両方の鎖にパリンドローム酵素認識配列を有する、のいずれかである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｄ）の前記制限酵素が、ＭｌｙＩである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ｄ）が、ＸｈｏＩ酵素と前記ＤＮＡ分子とを接触させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ｅ）において、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードする前記ＤＮＡが、配列、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号１）を含むＲＮＡをコードするか、または配列、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵＣ（配列番号２）を含むＲＮＡをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記目的の標的化された配列が、生物のゲノムにわたって１０，０００ｂｐまたはそれ未満毎の間隔にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードするＤＮＡにライゲートされた標的化配列をコードするＤＮＡをそれぞれ含む核酸の収集物を作製する方法であって、ａ．目的の配列、ＮＧＧ部位およびその相補体ＣＣＮ部位をそれぞれ含む複数の二本鎖ＤＮＡ分子を提供するステップと、
ｂ．ＣＣＮ部位において一本鎖にニックを作製することができる酵素と前記分子とを接触させるステップであって、それによって、前記ＮＧＧ部位に対して５’に目的の配列をそれぞれ含む複数のニック二本鎖ＤＮＡ分子を生成し、前記ＤＮＡ分子が、前記ＣＣＤ部位にニックを入れられるステップと、
ｃ．エンドヌクレアーゼと前記ニック二本鎖ＤＮＡ分子とを接触させるステップであって、それによって、目的の配列をそれぞれ含む複数の二本鎖ＤＮＡ断片を生成し、前記断片が、末端オーバーハングを含むステップと、
ｄ．５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性がない酵素と前記二本鎖ＤＮＡ断片とを接触させるステップであって、前記二本鎖ＤＮＡ断片を平滑末端化し、それによって、目的の配列をそれぞれ含む複数の平滑末端化二本鎖断片を生成するステップと、
ｅ．末端ＮＧＧ部位を切断する酵素とステップｄの前記平滑末端化二本鎖断片とを接触させるステップと、
ｆ．ステップｅの結果生じた二本鎖ＤＮＡ断片を、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードするＤＮＡとライゲートするステップであって、それによって、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードするＤＮＡにライゲートされた標的化配列をそれぞれ含む複数のＤＮＡ断片を生成するステップと
を含む方法。
【請求項１９】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記複数の二本鎖ＤＮＡ分子が、前記ＮＧＧ部位の５’上流にプロモーターを含む調節配列を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ＮＧＧ部位が、ＡＧＧ、ＣＧＧまたはＴＧＧを含み、ＣＣＮ部位が、ＣＣＴ、ＣＣＧまたはＣＣＡを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記複数の二本鎖ＤＮＡ分子が、目的の配列を含む、ゲノムＤＮＡの剪断された断片を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
ステップ（ａ）における前記複数の二本鎖ＤＮＡ分子が、少なくとも５００ｂｐである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
ステップｂにおける前記酵素が、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ酵素であり、
ステップｃにおける前記酵素が、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩであり、
ステップｄにおける前記酵素が、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
ステップｆにおいて、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードする前記ＤＮＡが、配列、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号１）を含むＲＮＡをコードするか、または配列、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵＣ（配列番号２）を含むＲＮＡをコードする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記ステップｅが、ＭｌｙＩ認識部位を保有するアダプタをライゲートするステップと、ＭｌｙＩ酵素により消化するステップとを追加で含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
前記目的の配列が、ゲノムにわたって、１０，０００ｂｐまたはそれ未満毎の間隔にある、請求項１８に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
別の態様では、本明細書に記載されている本発明は、本明細書に記載されている態様の方法を実施するための、あらゆる必須の試薬および説明書を含むキットを提供する。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
核酸の収集物であって、前記収集物中の複数の前記核酸が、
ａ．調節領域を含む第１のセグメントと、
ｂ．標的化配列をコードする第２のセグメントと、
ｃ．核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードする第３のセグメントと
を含み、前記収集物中の前記核酸の少なくとも１０％のサイズが変動する、核酸の収集物。
（項目２）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である、項目１に記載の収集物。
（項目３）
前記第２のセグメントのサイズが、前記核酸の収集物にわたって１５〜２５０ｂｐ変動する、項目１に記載の収集物。
（項目４）
前記収集物中の前記第２のセグメントの少なくとも１０％が、２１ｂｐを超える、項目１に記載の収集物。
（項目５）
前記第２のセグメントのサイズが、２０ｂｐではない、項目１に記載の収集物。
（項目６）
前記第２のセグメントのサイズが、２１ｂｐではない、項目１に記載の収集物。
（項目７）
前記核酸の収集物が、ＤＮＡの収集物である、項目１に記載の収集物。
（項目８）
前記第２のセグメントが、一本鎖ＤＮＡである、項目７に記載の収集物。
（項目９）
前記第３のセグメントが、一本鎖ＤＮＡである、項目７に記載の収集物。
（項目１０）
前記第２のセグメントが、二本鎖ＤＮＡである、項目７に記載の収集物。
（項目１１）
前記第３のセグメントが、二本鎖ＤＮＡである、項目７に記載の収集物。
（項目１２）
前記調節領域が、転写因子に結合することができる領域である、項目１に記載の収集物。
（項目１３）
前記調節領域が、プロモーターを含む、項目１に記載の収集物。
（項目１４）
前記プロモーターが、Ｔ７、ＳＰ６およびＴ３からなる群から選択される、項目１３に記載の収集物。
（項目１５）
前記標的化配列が、哺乳動物ゲノム、真核生物ゲノム、原核生物ゲノムまたはウイルスゲノムへと向けられている、項目１に記載の収集物。
（項目１６）
前記標的化配列が、反復性または豊富なＤＮＡへと向けられている、項目１に記載の収集物。
（項目１７）
前記標的化配列が、ミトコンドリアＤＮＡ、リボソームＤＮＡ、Ａｌｕ  ＤＮＡ、セントロメアＤＮＡ、ＳＩＮＥ  ＤＮＡ、ＬＩＮＥ  ＤＮＡまたはＳＴＲ  ＤＮＡへと向けられている、項目１に記載の収集物。
（項目１８）
前記第２のセグメントの配列が、表３および／または表４から選択される、項目１に記載の収集物。
（項目１９）
少なくとも１０２個の特異な核酸分子を含む、項目１に記載の収集物。
（項目２０）
前記標的化配列が、ＰＡＭ配列に対し５’にあるヌクレオチドの配列の反対の鎖に対し少なくとも８０％相補的である、項目１に記載の収集物。
（項目２１）
生物のゲノムにわたって約１０，０００ｂｐまたはそれ未満毎の間隔にある目的の配列に向けられた標的化配列を含む、項目１に記載の収集物。
（項目２２）
前記ＰＡＭ配列が、ＡＧＧ、ＣＧＧまたはＴＧＧである、項目２０に記載の収集物。
（項目２３）
前記ＰＡＭ配列が、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２およびＣｍ５からなる群から選択されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質に特異的である、項目２０に記載の収集物。
（項目２４）
前記第３のセグメントが、ｇＲＮＡステムループ配列をコードするＤＮＡを含む、項目１に記載の収集物。
（項目２５）
前記第３のセグメントの配列が、配列、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号１）を含むＲＮＡをコードするか、または配列、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵＣ（配列番号２）を含むＲＮＡをコードする、項目１に記載の収集物。
（項目２６）
前記第３のセグメントの配列が、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをコードする、項目１に記載の収集物。
（項目２７）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、細菌種に由来する、項目１に記載の収集物。
（項目２８）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、古細菌種に由来する、項目１に記載の収集物。
（項目２９）
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型タンパク質である、項目２に記載の収集物。
（項目３０）
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２、Ｃｍ５、ｄＣａｓ９およびｃａｓ９ニッカーゼからなる群から選択される、項目２に記載の収集物。
（項目３１）
前記第３のセグメントが、Ｃａｓ９結合配列をコードするＤＮＡを含む、項目１に記載の収集物。
（項目３２）
前記収集物の複数の第３のセグメントが、第１の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードし、前記収集物の複数の前記第３のセグメントが、第２の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードする、項目１に記載の収集物。
（項目３３）
前記収集物の前記第３のセグメントが、複数の異なる核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質の複数の異なる結合配列をコードする、項目１に記載の収集物。
（項目３４）
核酸の収集物であって、前記収集物中の複数の前記核酸が、
ａ．調節領域を含む第１のセグメントと、
ｂ．標的化配列をコードする第２のセグメントであって、そのサイズが２１ｂｐを超える第２のセグメントと、
ｃ．核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードする第３のセグメントと
を含む、核酸の収集物。
（項目３５）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である、項目３４に記載の収集物。
（項目３６）
前記収集物中の前記核酸の少なくとも１０％のサイズが変動する、項目３４に記載の収集物。
（項目３７）
前記第２のセグメントのサイズが、前記核酸の収集物にわたって２２〜２５０ｂｐ変動する、項目３４に記載の収集物。
（項目３８）
前記収集物中の前記第２のセグメントの少なくとも１０％が、３０ｂｐを超える、項目３４に記載の収集物。
（項目３９）
前記核酸の収集物が、ＤＮＡの収集物である、項目３４に記載の収集物。
（項目４０）
前記第２のセグメントが、一本鎖ＤＮＡである、項目３９に記載の収集物。
（項目４１）
前記第３のセグメントが、一本鎖ＤＮＡである、項目３９に記載の収集物。
（項目４２）
前記第２のセグメントが、二本鎖ＤＮＡである、項目３９に記載の収集物。
（項目４３）
前記第３のセグメントが、二本鎖ＤＮＡである、項目３９に記載の収集物。
（項目４４）
前記調節領域が、転写因子に結合することができる領域である、項目３４に記載の収集物。
（項目４５）
前記調節領域が、プロモーターを含む、項目３４に記載の収集物。
（項目４６）
前記プロモーターが、Ｔ７、ＳＰ６およびＴ３からなる群から選択される、項目４５に記載の収集物。
（項目４７）
前記標的化配列が、哺乳動物ゲノム、真核生物ゲノム、原核生物ゲノムまたはウイルスゲノムへと向けられている、項目３４に記載の収集物。
（項目４８）
前記標的化配列が、反復性または豊富なＤＮＡへと向けられている、項目３４に記載の収集物。
（項目４９）
前記標的化配列が、ミトコンドリアＤＮＡ、リボソームＤＮＡ、Ａｌｕ  ＤＮＡ、セントロメアＤＮＡ、ＳＩＮＥ  ＤＮＡ、ＬＩＮＥ  ＤＮＡまたはＳＴＲ  ＤＮＡへと向けられている、項目３４に記載の収集物。
（項目５０）
前記第２のセグメントの配列が、表３および／または表４から選択される、項目３４に記載の収集物。
（項目５１）
少なくとも１０２個の特異な核酸分子を含む、項目３４に記載の収集物。
（項目５２）
生物のゲノムにわたって約１０，０００ｂｐまたはそれ未満毎の間隔にある目的の配列に向けられた標的化配列を含む、項目３３に記載の収集物。
（項目５３）
前記標的化配列が、ＰＡＭ配列に対し５’にあるヌクレオチドの配列の反対の鎖に対し少なくとも８０％相補的である、項目３４に記載の収集物。
（項目５４）
前記ＰＡＭ配列が、ＡＧＧ、ＣＧＧまたはＴＧＧである、項目５３に記載の収集物。
（項目５５）
前記ＰＡＭ配列が、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２およびＣｍ５からなる群から選択されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質に特異的である、項目５３に記載の収集物。
（項目５６）
前記第３のセグメントが、ｇＲＮＡステムループ配列をコードするＤＮＡを含む、項目３４に記載の収集物。
（項目５７）
前記第３のセグメントが、配列、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号１）を含むＲＮＡをコードするか、または配列、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵＣ（配列番号２）を含むＲＮＡをコードする、項目３４に記載の収集物。
（項目５８）
前記第３のセグメントが、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをコードする、項目３４に記載の収集物。
（項目５９）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、細菌種に由来する、項目３４に記載の収集物。
（項目６０）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、古細菌種に由来する、項目３４に記載の収集物。
（項目６１）
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型タンパク質である、項目３５に記載の収集物。
（項目６２）
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２、Ｃｍ５、ｄＣａｓ９およびｃａｓ９ニッカーゼからなる群から選択される、項目３５に記載の収集物。
（項目６３）
前記第３のセグメントが、Ｃａｓ９結合配列をコードするＤＮＡを含む、項目３４に記載の収集物。
（項目６４）
前記収集物の複数の第３のセグメントが、第１の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードし、前記収集物の複数の前記第３のセグメントが、第２の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードする、項目３４に記載の収集物。
（項目６５）
前記収集物の前記第３のセグメントが、複数の異なる核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質の複数の異なる結合配列をコードする、項目３４に記載の収集物。
（項目６６）
ａ．標的化配列を含む第１のＲＮＡセグメントと、
ｂ．核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含む第２のＲＮＡセグメントと
を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の収集物であって、前記収集物中の前記ｇＲＮＡの少なくとも１０％のサイズが変動する、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の収集物。
（項目６７）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である、項目６６に記載の収集物。
（項目６８）
前記第１のセグメントのサイズが、前記ｇＲＮＡの収集物にわたって１５〜２５０ｂｐ変動する、項目６６に記載の収集物。
（項目６９）
前記収集物中の前記第１のセグメントの少なくとも１０％が、２１ｂｐを超える、項目６６に記載の収集物。
（項目７０）
前記第１のセグメントのサイズが、２０ｂｐではない、項目６６に記載の収集物。
（項目７１）
前記第１のセグメントのサイズが、２１ｂｐではない、項目６６に記載の収集物。
（項目７２）
前記標的化配列が、哺乳動物ゲノム、真核生物ゲノム、原核生物ゲノムまたはウイルスゲノムへと向けられている、項目６６に記載の収集物。
（項目７３）
前記標的化配列が、反復性または豊富なＤＮＡへと向けられている、項目６６に記載の収集物。
（項目７４）
前記標的化配列が、ミトコンドリアＤＮＡ、リボソームＤＮＡ、Ａｌｕ  ＤＮＡ、セントロメアＤＮＡ、ＳＩＮＥ  ＤＮＡ、ＬＩＮＥ  ＤＮＡまたはＳＴＲ  ＤＮＡへと向けられている、項目６６に記載の収集物。
（項目７５）
前記第１のセグメントの配列が、表３および／または表４から選択される配列によってコードされるＲＮＡである、項目６６に記載の収集物。
（項目７６）
少なくとも１０２個の特異なｇＲＮＡを含む、項目６６に記載の収集物。
（項目７７）
前記ｇＲＮＡが、シトシン、グアニンおよびアデニンを含む、項目６６に記載の収集物。
（項目７８）
前記ｇＲＮＡのサブセットが、チミンをさらに含む、項目７７に記載の収集物。
（項目７９）
前記ｇＲＮＡのサブセットが、ウラシルをさらに含む、項目７７に記載の収集物。
（項目８０）
前記第１のセグメントが、目的の標的ゲノム配列に対し少なくとも８０％相補的である、項目６６に記載の収集物。
（項目８１）
前記標的化配列が、ＰＡＭ配列に対し５’にあるヌクレオチドの配列の反対の鎖に対し少なくとも８０％相補的である、項目６６に記載の収集物。
（項目８２）
前記ＰＡＭ配列が、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２およびＣｍ５からなる群から選択されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質に特異的である、項目６６に記載の収集物。
（項目８３）
前記第２のセグメントが、ｇＲＮＡステムループ配列を含む、項目６６に記載の収集物。
（項目８４）
前記第２のセグメントの配列が、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号１）を含むか、またはＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵＣ（配列番号２）を含む、項目６６に記載の収集物。
（項目８５）
前記第２のセグメントが、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、項目６６に記載の収集物。
（項目８６）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、細菌種に由来する、項目６６に記載の収集物。
（項目８７）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、古細菌種に由来する、項目６６に記載の収集物。
（項目８８）
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型タンパク質である、項目６７に記載の収集物。
（項目８９）
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２、Ｃｍ５、ｄＣａｓ９およびｃａｓ９ニッカーゼならびにそれらの操作されたバージョンからなる群から選択される、項目６７に記載の収集物。
（項目９０）
前記第２のセグメントが、Ｃａｓ９結合配列を含む、項目６６に記載の収集物。
（項目９１）
前記収集物中の前記ｇＲＮＡの少なくとも１０％が、それらの５’末端の配列が変動する、項目６６に記載の収集物。
（項目９２）
生物のゲノムにわたって１０，０００ｂｐまたはそれ未満毎の間隔にある目的の配列に向けられた標的化配列を含む、項目６６に記載の収集物。
（項目９３）
前記収集物の複数の第２のセグメントが、第１の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含み、前記収集物の複数の前記第２のセグメントが、第２の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含む、項目６６に記載の収集物。
（項目９４）
前記収集物の前記第２のセグメントが、複数の異なる核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質の複数の異なる結合配列を含む、項目６６に記載の収集物。
（項目９５）
前記収集物の複数の前記ｇＲＮＡが、基材に付着された、項目６６に記載の収集物。
（項目９６）
前記収集物の複数の前記ｇＲＮＡが、標識を含む、項目６６に記載の収集物。
（項目９７）
前記収集物の前記複数のｇＲＮＡが、異なる標識を含む、項目９６に記載の収集物。
（項目９８）
ａ．調節領域を含む第１のセグメントと、
ｂ．標的化配列をコードする第２のセグメントであって、前記標的化配列が、３０ｂｐを超える、第２のセグメントと、
ｃ．核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードする核酸をコードする第３のセグメントと
を含む核酸。
（項目９９）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である、項目９８に記載の核酸。
（項目１００）
ＤＮＡである、項目９８に記載の核酸。
（項目１０１）
前記第２のセグメントが、一本鎖ＤＮＡである、項目９８に記載の核酸。
（項目１０２）
前記第３のセグメントが、一本鎖ＤＮＡである、項目９８に記載の核酸。
（項目１０３）
前記第２のセグメントが、二本鎖ＤＮＡである、項目９８に記載の核酸。
（項目１０４）
前記第３のセグメントが、二本鎖ＤＮＡである、項目９８に記載の核酸。
（項目１０５）
前記調節領域が、転写因子に結合することができる領域である、項目９８に記載の核酸。
（項目１０６）
前記調節領域が、プロモーターを含む、項目９８に記載の核酸。
（項目１０７）
前記プロモーターが、Ｔ７、ＳＰ６およびＴ３からなる群から選択される、項目１０６に記載の収集物。
（項目１０８）
前記標的化配列が、哺乳動物ゲノム、真核生物ゲノム、原核生物ゲノムまたはウイルスゲノムへと向けられている、項目９８に記載の核酸。
（項目１０９）
前記標的化配列が、豊富なまたは反復性ＤＮＡへと向けられている、項目９８に記載の核酸。
（項目１１０）
前記標的化配列が、ミトコンドリアＤＮＡ、リボソームＤＮＡ、Ａｌｕ  ＤＮＡ、セントロメアＤＮＡ、ＳＩＮＥ  ＤＮＡ、ＬＩＮＥ  ＤＮＡまたはＳＴＲ  ＤＮＡへと向けられている、項目９８に記載の核酸。
（項目１１１）
前記標的化配列が、ＰＡＭ配列に対し５’にあるヌクレオチドの配列の反対の鎖に対し少なくとも８０％相補的である、項目９８に記載の収集物。
（項目１１２）
目的の標的ゲノム配列が、ＰＡＭ配列の５’上流にある、項目１１１に記載の核酸。
（項目１１３）
前記ＰＡＭ配列が、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２およびＣｍ５からなる群から選択されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質に特異的である、項目１１２に記載の核酸。
（項目１１４）
前記第３のセグメントが、ｇＲＮＡステムループ配列をコードするＤＮＡを含む、項目９８に記載の核酸。
（項目１１５）
前記第３のセグメントの配列が、配列、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号１）を含むＲＮＡをコードするか、または配列、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵＣ（配列番号２）を含むＲＮＡをコードする、項目９８に記載の核酸。
（項目１１６）
前記第３のセグメントが、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをコードする、項目９８に記載の核酸。
（項目１１７）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、細菌種に由来する、項目９８に記載の核酸。
（項目１１８）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、古細菌種に由来する、項目９８に記載の核酸。
（項目１１９）
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型タンパク質である、項目９９に記載の核酸。
（項目１２０）
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２、Ｃｍ５、ｄＣａｓ９およびｃａｓ９ニッカーゼからなる群から選択される、項目９９に記載の核酸。
（項目１２１）
前記第３のセグメントが、Ｃａｓ９結合配列をコードするＤＮＡを含む、項目９８に記載の核酸。
（項目１２２）
ａ．標的化配列を含む第１のセグメントであって、そのサイズが３０ｂｐを超える第１のセグメントと
ｂ．核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含む第２のセグメントと
を含むガイドＲＮＡ。
（項目１２３）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である、項目１２２に記載のガイドＲＮＡ。
（項目１２４）
アデニン、グアニンおよびシトシンを含む、項目１２２に記載のガイドＲＮＡ。
（項目１２５）
チミンをさらに含む、項目１２３に記載のガイドＲＮＡ。
（項目１２６）
ウラシルをさらに含む、項目１２３に記載のガイドＲＮＡ。
（項目１２７）
前記第１のＲＮＡセグメントのサイズが、３０〜２５０ｂｐの間である、項目１２２に記載のガイドＲＮＡ。
（項目１２８）
前記標的化配列が、哺乳動物ゲノム、真核生物ゲノム、原核生物ゲノムまたはウイルスゲノムへと向けられている、項目１２２に記載のガイドＲＮＡ。
（項目１２９）
前記標的化配列が、反復性または豊富なＤＮＡへと向けられている、項目１２２に記載のガイドＲＮＡ。
（項目１３０）
前記標的化配列が、ミトコンドリアＤＮＡ、リボソームＤＮＡ、Ａｌｕ  ＤＮＡ、セントロメアＤＮＡ、ＳＩＮＥ  ＤＮＡ、ＬＩＮＥ  ＤＮＡまたはＳＴＲ  ＤＮＡへと向けられている、項目１２２に記載のガイドＲＮＡ。
（項目１３１）
前記第１のセグメントが、目的の標的ゲノム配列に対し少なくとも８０％相補的である、項目１２２に記載のガイドＲＮＡ。
（項目１３２）
前記標的化配列が、ＰＡＭ配列に対し５’にあるヌクレオチドの配列の反対の鎖に対し少なくとも８０％相補的である、項目１２２に記載のガイドＲＮＡ。
（項目１３３）
前記第２のセグメントが、ｇＲＮＡステムループ配列を含む、項目１２２に記載のガイドＲＮＡ。
（項目１３４）
前記第２のセグメントの配列が、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号１）を含むか、またはＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵＣ（配列番号２）を含む、項目１２２に記載のガイドＲＮＡ。
（項目１３５）
前記第２のセグメントの配列が、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、項目１２２に記載のガイドＲＮＡ。
（項目１３６）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、細菌種に由来する、項目１２２に記載のガイドＲＮＡ。
（項目１３７）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、古細菌種に由来する、項目１２２に記載のガイドＲＮＡ。
（項目１３８）
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型タンパク質である、項目１２３に記載のガイドＲＮＡ。
（項目１３９）
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２、Ｃｍ５、ｄＣａｓ９およびｃａｓ９ニッカーゼ、ならびにそれらの操作されたバージョンからなる群から選択される、項目１２３に記載のガイドＲＮＡ。
（項目１４０）
前記第２のセグメントが、Ｃａｓ９結合配列である、項目１２２に記載のガイドＲＮＡ。
（項目１４１）
Ｃａｓ９タンパク質と、項目１２２に記載のｇＲＮＡとを含む複合体。
（項目１４２）
試料における標的化された配列の枯渇および分配、非宿主核酸についての試料の濃縮、または試料における標的化された核酸の連続的な枯渇のための方法であって、
ａ．試料から抽出された核酸を提供するステップと、
ｂ．（ｉ）項目６６に記載のｇＲＮＡの収集物、および（ｉｉ）核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質を含む複数の複合体と前記試料とを接触させるステップと
を含む方法。
（項目１４３）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質を含む、項目１４２に記載の方法。
（項目１４４）
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃａｓ９を含む、項目１４３に記載の方法。
（項目１４５）
核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードするＤＮＡにライゲートされた標的化配列をコードするＤＮＡをそれぞれ含む核酸の収集物を作製する方法であって、
ａ．ＰＡＭ配列に対し５’にある目的の配列および反対の鎖におけるその逆相補的配列をそれぞれ含む二本鎖ＤＮＡ分子を提供するステップと、
ｂ．前記二本鎖ＤＮＡ分子において酵素消化反応を実行するステップであって、切断が、前記ＰＡＭ配列および／または反対の鎖におけるその逆相補的配列に生成されるが、前記二本鎖ＤＮＡから前記ＰＡＭ配列および／または反対の鎖におけるその逆相補的配列を完全に除去しないステップと、
ｃ．認識配列を含むアダプタをステップ（ｂ）の結果生じたＤＮＡ分子にライゲートするステップと、
ｄ．ステップ（ｃ）の前記認識配列を認識する制限酵素とステップ（ｃ）の前記ＤＮＡ分子とを接触させるステップであって、それによって、前記ＰＡＭ配列に対してすぐ接して５’にある平滑末端化された二本鎖切断を含むＤＮＡ断片を生成し、それによって、前記ＰＡＭ配列および酵素認識部位を含有する前記アダプタを除去するステップと、
ｅ．ステップ（ｄ）の結果生じた二本鎖ＤＮＡ断片を、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードするＤＮＡとライゲートするステップであって、それによって、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードするＤＮＡにライゲートされた標的化配列をコードするＤＮＡをそれぞれ含む複数のＤＮＡ断片を生成するステップと
を含む方法。
（項目１４６）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である、項目１４５に記載の方法。
（項目１４７）
前記収集物の出発ＤＮＡ分子が、前記ＰＡＭ配列に対し５’にある前記目的の配列の上流の調節配列をさらに含む、項目１４５に記載の方法。
（項目１４８）
前記調節配列が、プロモーターを含む、項目１４６に記載の方法。
（項目１４９）
前記プロモーターが、Ｔ７、Ｓｐ６またはＴ３配列を含む、項目１４８に記載の方法。
（項目１５０）
前記二本鎖ＤＮＡ分子が、ゲノムＤＮＡ、インタクトなＤＮＡまたは剪断されたＤＮＡである、項目１４５に記載の方法。
（項目１５１）
前記ゲノムＤＮＡが、ヒト、マウス、鳥類、魚類、植物、昆虫、細菌またはウイルスである、項目１５０に記載の方法。
（項目１５２）
標的化配列をコードするＤＮＡセグメントが、少なくとも２２ｂｐである、項目１４５に記載の方法。
（項目１５３）
標的化配列をコードするＤＮＡセグメントが、１５〜２５０ｂｐのサイズ範囲である、項目１４５に記載の方法。
（項目１５４）
前記ＰＡＭ配列が、ＡＧＧ、ＣＧＧまたはＴＧＧである、項目１４５に記載の方法。
（項目１５５）
前記ＰＡＭ配列が、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２およびＣｍ５からなる群から選択されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質に特異的である、項目１４５に記載の方法。
（項目１５６）
ステップ（ｂ）が、（１）ＣＣＤ部位において一本鎖にニックを作製することができる酵素と前記ＤＮＡ分子とを接触させるステップであって、それによって、目的の配列およびそれに続くＨＧＧ配列をそれぞれ含む複数のニック二本鎖ＤＮＡ分子を生成し、前記ＤＮＡ分子が、前記ＣＣＤ部位においてニックを入れられるステップと、（２）エンドヌクレアーゼと前記ニック二本鎖ＤＮＡ分子とを接触させるステップであって、それによって、目的の配列およびそれに続くＨＧＧ配列をそれぞれ含む複数の二本鎖ＤＮＡ断片を生成し、ＨＧＧおよび／またはＣＣＤ配列由来の残っているヌクレオチドが取り残されるステップとをさらに含む、項目１４５に記載の方法。
（項目１５７）
ステップ（ｄ）が、ステップ（ｃ）の前記認識配列を認識する前記制限酵素により切断する前のステップ（ｃ）由来の、前記アダプタがライゲートされたＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅をさらに含み、ＰＣＲ後に、前記認識配列が、前記ＰＡＭ配列の３’に位置し、調節配列が、前記ＰＡＭ配列の５’遠位端に位置する、項目１４５に記載の方法。
（項目１５８）
ステップ（ｂ）の酵素反応が、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ酵素およびＴ７エンドヌクレアーゼＩ酵素の使用を含む、項目１４５に記載の方法。
（項目１５９）
ライゲートされるべき前記アダプタが、オーバーハングを含まない場合、ステップ（ｃ）が、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼによる平滑末端反応をさらに含む、項目１４５に記載の方法。
（項目１６０）
ステップ（ｃ）の前記アダプタが、（１）前記アダプタがＹ字型であり、オーバーハングを含む場合、一方の鎖に制限酵素認識配列を、他方の鎖に調節配列を含む二本鎖である；または（２）前記アダプタがＹ字型でない場合、両方の鎖にパリンドローム酵素認識配列を有する、のいずれかである、項目１４５に記載の方法。
（項目１６１）
ステップ（ｄ）の前記制限酵素が、ＭｌｙＩである、項目１４５に記載の方法。
（項目１６２）
ステップ（ｄ）が、ＸｈｏＩ酵素と前記ＤＮＡ分子とを接触させるステップをさらに含む、項目１４５に記載の方法。
（項目１６３）
ステップ（ｅ）において、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードする前記ＤＮＡが、配列、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号１）を含むＲＮＡをコードするか、または配列、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵＣ（配列番号２）を含むＲＮＡをコードする、項目１４５に記載の方法。
（項目１６４）
前記目的の標的化された配列が、生物のゲノムにわたって１０，０００ｂｐまたはそれ未満毎の間隔にある、項目１４５に記載の方法。
（項目１６５）
核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードするＤＮＡにライゲートされた標的化配列をコードするＤＮＡをそれぞれ含む核酸の収集物を作製する方法であって、ａ．目的の配列、ＮＧＧ部位およびその相補体ＣＣＮ部位をそれぞれ含む複数の二本鎖ＤＮＡ分子を提供するステップと、
ｂ．ＣＣＮ部位において一本鎖にニックを作製することができる酵素と前記分子とを接触させるステップであって、それによって、前記ＮＧＧ部位に対して５’に目的の配列をそれぞれ含む複数のニック二本鎖ＤＮＡ分子を生成し、前記ＤＮＡ分子が、前記ＣＣＤ部位にニックを入れられるステップと、
ｃ．エンドヌクレアーゼと前記ニック二本鎖ＤＮＡ分子とを接触させるステップであって、それによって、目的の配列をそれぞれ含む複数の二本鎖ＤＮＡ断片を生成し、前記断片が、末端オーバーハングを含むステップと、
ｄ．５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性がない酵素と前記二本鎖ＤＮＡ断片とを接触させるステップであって、前記二本鎖ＤＮＡ断片を平滑末端化し、それによって、目的の配列をそれぞれ含む複数の平滑末端化二本鎖断片を生成するステップと、
ｅ．末端ＮＧＧ部位を切断する酵素とステップｄの前記平滑末端化二本鎖断片とを接触させるステップと、
ｆ．ステップｅの結果生じた二本鎖ＤＮＡ断片を、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードするＤＮＡとライゲートするステップであって、それによって、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードするＤＮＡにライゲートされた標的化配列をそれぞれ含む複数のＤＮＡ断片を生成するステップと
を含む方法。
（項目１６６）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である、項目１６５に記載の方法。
（項目１６７）
前記複数の二本鎖ＤＮＡ分子が、前記ＮＧＧ部位の５’上流に調節配列を有する、項目１６５に記載の方法。
（項目１６８）
調節配列が、Ｔ７、ＳＰ６またはＴ３配列を含む、項目１６６に記載の方法。
（項目１６９）
ＮＧＧ部位が、ＡＧＧ、ＣＧＧまたはＴＧＧを含み、ＣＣＮ部位が、ＣＣＴ、ＣＣＧまたはＣＣＡを含む、項目１５３に記載の方法。
（項目１７０）
目的の配列をそれぞれ含む前記複数の二本鎖ＤＮＡ分子が、ゲノムＤＮＡの剪断された断片を含む、項目１６５に記載の方法。
（項目１７１）
前記ゲノムＤＮＡが、哺乳動物、原核生物、真核生物、鳥類、細菌またはウイルスである、項目１７０に記載の方法。
（項目１７２）
ステップ（ａ）における前記複数の二本鎖ＤＮＡ分子が、少なくとも５００ｂｐである、項目１６５に記載の方法。
（項目１７３）
ステップｂにおける前記酵素が、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ酵素である、項目１６５に記載の方法。
（項目１７４）
ステップｃにおける前記酵素が、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩである、項目１６５に記載の方法。
（項目１７５）
ステップｄにおける前記酵素が、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼである、項目１６５に記載の方法。
（項目１７６）
ステップｆにおいて、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードする前記ＤＮＡが、配列、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号１）を含むＲＮＡをコードするか、または配列、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵＣ（配列番号２）を含むＲＮＡをコードする、項目１６５に記載の方法。
（項目１７７）
前記ステップｅが、ＭｌｙＩ認識部位を保有するアダプタをライゲートするステップと、ＭｌｙＩ酵素により消化するステップとを追加で含む、項目１６５に記載の方法。
（項目１７８）
前記目的の配列が、ゲノムにわたって、１０，０００ｂｐまたはそれ未満毎の間隔にある、項目１６５に記載の方法。
（項目１７９）
標的化配列をコードするＤＮＡおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードするＤＮＡをそれぞれ含む核酸の収集物を作製する方法であって、
ａ．ＮＧＧおよびＣＣＮ部位を含む複数の目的の配列を含むゲノムＤＮＡを提供するステップと、
ｂ．前記ゲノムＤＮＡにニックを作製することができる酵素と前記ゲノムＤＮＡとを接触させるステップであって、それによって、ＣＣＮ部位にニックを入れられたニックゲノムＤＮＡを生成するステップと、
ｃ．エンドヌクレアーゼと前記ニックゲノムＤＮＡとを接触させるステップであって、それによって、オーバーハングを有する二本鎖ＤＮＡ断片を生成するステップと、
ｄ．ステップｃ由来のオーバーハングを有する前記ＤＮＡをＹ字型アダプタにライゲートステップであって、これによって、前記ＮＧＧ部位の３’のみに制限酵素認識配列を、前記目的の配列の５’に調節配列を導入するステップと、
ｅ．前記酵素認識配列を保有する前記アダプタと共に前記ＮＧＧ部位を切断除去する酵素とステップｄ由来の産物とを接触させるステップと、
ｆ．ステップｅの結果生じた二本鎖ＤＮＡ断片を、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードするＤＮＡとライゲートするステップであって、それによって、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードするＤＮＡにライゲートされた目的の配列をそれぞれ含む複数のＤＮＡ断片を生成するステップと
を含む方法。
（項目１８０）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である、項目１７９に記載の方法。
（項目１８１）
前記ＮＧＧ部位が、ＡＧＧ、ＣＧＧまたはＴＧＧを含み、ＣＣＮ部位が、ＣＣＴ、ＣＣＧまたはＣＣＡを含む、項目１７９に記載の方法。
（項目１８２）
前記調節配列が、プロモーター配列を含む、項目１７９に記載の方法。
（項目１８３）
前記プロモーター配列が、Ｔ７、ＳＰ６またはＴ３配列を含む、項目１８２に記載の方法。
（項目１８４）
前記ＤＮＡ断片が、ゲノムＤＮＡの剪断された断片である、項目１７９に記載の方法。
（項目１８５）
前記ゲノムＤＮＡが、哺乳動物、原核生物、真核生物またはウイルスである、項目１７９に記載の方法。
（項目１８６）
前記断片が、少なくとも２００ｂｐである、項目１７９に記載の方法。
（項目１８７）
ステップｂにおける前記酵素が、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ酵素である、項目１７９に記載の方法。
（項目１８８）
ステップｃにおける前記酵素が、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩである、項目１７９に記載の方法。
（項目１８９）
ステップｄが、前記アダプタがライゲートされたＤＮＡのＰＣＲ増幅をさらに含む、項目１７９に記載の方法。
（項目１９０）
ステップｆにおいて、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードする前記ＤＮＡが、配列、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号１）を含むＲＮＡをコードするか、または配列、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵＣ（配列番号２）を含むＲＮＡをコードする、項目１７９に記載の方法。
（項目１９１）
ステップｅにおいてＮＧＧ部位を除去する前記酵素が、ＭｌｙＩである、項目１７９に記載の方法。
（項目１９２）
前記収集物の前記目的の標的が、ゲノムにわたって、１０，０００ｂｐまたはそれ未満毎の間隔にある、項目１７９に記載の方法。
（項目１９３）
項目１に記載の核酸の収集物を含むキット。
（項目１９４）
項目３４に記載の核酸の収集物を含むキット。
（項目１９５）
項目６６に記載のガイドＲＮＡの収集物を含むキット。
（項目１９６）
ガイド核酸の収集物を作製する方法であって、
ａ．供給源試料における豊富な細胞を得るステップと、
ｂ．前記豊富な細胞から核酸を収集するステップと、
ｃ．前記核酸からガイド核酸（ｇＮＡ）の収集物を調製するステップと
を含む方法。
（項目１９７）
前記豊富な細胞が、前記供給源試料における１または複数の最も豊富な細菌種由来の細胞を含む、項目１９６に記載の方法。
（項目１９８）
前記豊富な細胞が、２以上の種由来の細胞を含む、項目１９６に記載の方法。
（項目１９９）
前記豊富な細胞が、ヒト細胞を含む、項目１９６に記載の方法。
（項目２００）
前記豊富な細胞が、動物細胞を含む、項目１９６に記載の方法。
（項目２０１）
前記豊富な細胞が、植物細胞を含む、項目１９６に記載の方法。
（項目２０２）
前記豊富な細胞が、細菌細胞を含む、項目１９６に記載の方法。
（項目２０３）
ｇＮＡの前記ライブラリーと核酸ガイド化ヌクレアーゼとを接触させるステップであって、核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体を形成するステップをさらに含む、項目１９６に記載の方法。
（項目２０４）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ−ｇＮＡ複合体を使用するステップをさらに含み、標的部位において標的核酸を切断し、前記ｇＮＡが、前記標的部位に対して相補的である、項目２０３に記載の方法。
（項目２０５）
前記標的核酸が、前記供給源試料に由来する、項目２０４に記載の方法。
（項目２０６）
前記標的核酸の種が、前記供給源試料の種と同じである、項目２０４に記載の方法。
（項目２０７）
前記標的核酸の前記種および前記供給源試料の前記種が、ヒトである、項目２０６に記載の方法。
（項目２０８）
前記標的核酸の前記種および前記供給源試料の前記種が、動物である、項目２０６に記載の方法。
（項目２０９）
前記標的核酸の前記種および前記供給源試料の前記種が、植物である、項目２０６に記載の方法。
（項目２１０）
標的化配列をそれぞれ含む核酸の収集物を作製する方法であって、
ａ．供給源ＤＮＡを得るステップと、
ｂ．ニッキング酵素認識部位においてニッキング酵素により前記供給源ＤＮＡにニックを入れるステップであって、これによって、近位ニックに二本鎖切断を生成するステップと、
ｃ．前記二本鎖切断のオーバーハングを修復するステップであって、これによって、（ｉ）標的化配列および（ｉｉ）前記ニッキング酵素認識部位を含む二本鎖断片を生成するステップと
を含む方法。
（項目２１１）
標的化配列をそれぞれ含む核酸の収集物を作製する方法であって、
ａ．供給源ＤＮＡを得るステップと、
ｂ．ニッキング酵素認識部位においてニッキング酵素により前記供給源ＤＮＡにニックを入れるステップであって、これによって、ニックを生成するステップと、
ｃ．前記ニックから新しい鎖を合成するステップであって、これにより、標的化配列を含む前記供給源ＤＮＡの一本鎖断片を生成するステップと
を含む方法。
（項目２１２）
前記一本鎖断片から前記標的化配列を含む二本鎖断片を生成するステップをさらに含む、項目２１１に記載の方法。
（項目２１３）
前記二本鎖断片を生成するステップが、ランダムプライミングおよび伸長を含む、項目２１２に記載の方法。
（項目２１４）
前記ランダムプライミングが、ランダムｎ−ｍｅｒ領域およびプロモーター領域を含むプライマーにより行われる、項目２１３に記載の方法。
（項目２１５）
前記ランダムｎ−ｍｅｒ領域が、ランダムヘキサマー領域である、項目２１４に記載の方法。
（項目２１６）
前記ランダムｎ−ｍｅｒ領域が、ランダムオクタマー領域である、項目２１４に記載の方法。
（項目２１７）
前記プロモーター領域が、Ｔ７プロモーター領域である、項目２１４に記載の方法。
（項目２１８）
ヌクレアーゼ認識部位を含むヌクレアーゼ認識部位核酸を前記二本鎖断片にライゲートするステップをさらに含む、項目２１０または２１２に記載の方法。
（項目２１９）
前記ヌクレアーゼ認識部位が、前記ニッキング酵素認識部位の長さに等しい前記ヌクレアーゼ認識部位からの距離において切断するヌクレアーゼに対応する、項目２１８に記載の方法。
（項目２２０）
前記ヌクレアーゼ認識部位が、ＭｌｙＩ認識部位である、項目２１９に記載の方法。
（項目２２１）
前記ヌクレアーゼ認識部位が、ＢａｅＩ認識部位である、項目２１９に記載の方法。
（項目２２２）
前記ヌクレアーゼにより前記二本鎖断片を消化するステップをさらに含み、これによって、前記二本鎖断片から前記ニッキング酵素認識部位を除去する、項目２１９に記載の方法。
（項目２２３）
前記二本鎖断片を、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質認識部位を含む核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質認識部位核酸にライゲートするステップをさらに含む、項目２２２に記載の方法。
（項目２２４）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質認識部位が、ガイドＲＮＡステムループ配列を含む、項目２２３に記載の方法。
（項目２２５）
前記ヌクレアーゼ認識部位が、前記標的化配列の長さに等しい前記ヌクレアーゼ認識部位からの距離において切断するヌクレアーゼに対応する、項目２１８に記載の方法。
（項目２２６）
前記標的化配列の前記長さが、２０塩基対である、項目２２５に記載の方法。
（項目２２７）
前記ヌクレアーゼ認識部位が、ＭｍｅＩ認識部位である、項目２２５に記載の方法。
（項目２２８）
前記ヌクレアーゼにより前記二本鎖断片を消化するステップをさらに含む、項目２２５に記載の方法。
（項目２２９）
前記ヌクレアーゼ認識部位が、前記標的化配列の長さプラス前記ニッキング酵素認識部位の長さに等しい前記ヌクレアーゼ認識部位からの距離において切断するヌクレアーゼに対応する、項目２１８に記載の方法。
（項目２３０）
前記標的化配列の前記長さプラス前記ニッキング酵素認識部位の長さが、２３塩基対である、項目２２９に記載の方法。
（項目２３１）
前記ヌクレアーゼ認識部位が、ＥｃｏＰ１５Ｉ認識部位である、項目２２９に記載の方法。
（項目２３２）
前記ヌクレアーゼにより前記二本鎖断片を消化するステップをさらに含む、項目２２９に記載の方法。
（項目２３３）
前記二本鎖断片を、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質認識部位を含む核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質認識部位核酸にライゲートするステップをさらに含む、項目２１２に記載の方法。
（項目２３４）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質認識部位が、ガイドＲＮＡステムループ配列を含む、項目２３３に記載の方法。
（項目２３５）
項目１４５、１６５、１７９、１９６、２１０または２１１に記載の方法を実施するための、あらゆる必須の試薬および説明書を含むキット。