【手続補正書】
【提出日】令和2年3月10日(2020.3.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１３】
（ａ）請求項１１に記載の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換する段階；
（ｂ）形質転換された宿主細胞を培養して抗体又は抗体の断片を生産する段階；及び
（ｃ）宿主細胞から生産された抗体又は抗体の断片を収得する段階を含むＡＩＭＰ２−ＤＸ２に特異的に結合する抗体又はその断片を製造する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
【図１Ａ】図１は、Ｈ５  ＦａｂのＡＩＭＰ２−ＤＸ２抗原ペプチドに対する結合特異性を確認するための実験を示す。図１のＡは、肺がん細胞株であるＨ４６０細胞溶解物を、抗原ペプチド（epitope peptide、１００μｇ／ｍｌ）存在下で、Ｈ５  Ｆａｂ（“＋”で表示）、又は抗原ペプチドを添加していない状態で、Ｈ５  Ｆａｂ（“−”で表示）で感知したウェスタンブロットの結果である。
【図１Ｂ】図１は、Ｈ５  ＦａｂのＡＩＭＰ２−ＤＸ２抗原ペプチドに対する結合特異性を確認するための実験を示す。図１のＢは、野生型ＡＩＭＰ２においてｅｘｏｎ２が欠損したＡＩＭＰ２−ＤＸ２のアミノ酸配列について、Ｈ５抗体の選別に使用した抗原ペプチドに該当する部分を示す（下線の部分、アミノ酸配列ＧＨＶＱＤＹＧＡＬＫＤ）。ｅｘｏｎ１、ｅｘｏｎ３、ｅｘｏｎ４はそれぞれ灰色、緑色、黒色で表示されている。
【図２Ａ】図２は、Ｈ５  ＦａｂとＮ−末端が欠損したＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の結合を確認するための実験を示す。図２のＡは、多様な形態のＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質を発現するように形質転換されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞溶解物を、抗原ペプチド（epitope peptide、１００μｇ／ｍｌ）存在下で、Ｈ５  Ｆａｂ（“Ｈ５＋ｅｐｉｔｏｐｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ”）、又は抗原ペプチドがない状態でＨ５  Ｆａｂ（“Ｈ５”）を利用して感知したウェスタンブロットの結果である。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現されたＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質は、ｓｔｒｅｐ  ｔａｇに接合されており、全体の長さのタンパク質（Ｆ−ＤＸ２、“Ｆ”）であるか又は、Ｎ−末端アミノ酸が欠損した形態のタンパク質（“△２”、アミノ酸２個欠損、△２−ＤＸ２；“△２３”、アミノ酸２３個欠損、△２３−ＤＸ２；“△３３”、アミノ酸３３個欠損、△３３−ＤＸ２）である。この結果は、Ｈ５  Ｆａｂがｅｐｉｔｏｐｅを含む多様な形態のＭＰ２−ＤＸ２を認識することを示している。“ＥＶ”は空のベクター（empty vector）を意味する。
【図２Ｂ】図２は、Ｈ５  ＦａｂとＮ−末端が欠損したＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の結合を確認するための実験を示す。図２のＢは、前記ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の模式図（ｅｘｏｎ１、ｅｘｏｎ３、ｅｘｏｎ４はそれぞれグレー、緑、黒で表示；ｓｔｒｅｐ  ｔａｇはオレンジ色で表示、リンカーを含む３０個のアミノ酸で構成される）と、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２アミノ酸配列での該当する部分を示す（黒い矢印と赤で表示されたアミノ酸）。
【図３Ａ】図３は、Ｈ５  ＦａｂのＡＩＭＰ２−ＤＸ２抗原に対する結合特異性を確認するための実験を示す。図３のＡは、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２のｓｉＲＮＡ（ｓｉＤＸ２、“ＤＸ２”；ｓｉ  ｅｘｏｎ４  ＃１、“＃１”、ｓｉ  ｅｘｏｎ４  ＃２、“＃２”）で形質転換されて、７２時間培養したＨ４６０細胞の溶解物とＨ５  Ｆａｂを利用したウェスタンブロットの結果である。
【図３Ｂ】図３は、Ｈ５  ＦａｂのＡＩＭＰ２−ＤＸ２抗原に対する結合特異性を確認するための実験を示す。図３のＢは、実験に使用したｓｉＲＮＡの標的部位を示す。ｓｉＤＸ２は、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２のｅｘｏｎ１−ｅｘｏｎ３接合部分、ｓｉ  ｅｘｏｎ４＃１と＃２は、それぞれｅｘｏｎ４の異なる部分を標的とする。“Ｃ”は対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）を意味する。
【図４Ａ】図４は、Ｈ５  ＩｇＧ抗体とＡＩＭＰ２−ＤＸ２抗原ペプチドの結合力を確認するための表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance）実験を示す。Ｈ５抗体とＩｇＧタンパク質をＣＭ５チップにコーティングして、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２抗原ペプチドを多様な濃度で流して、抗原ペプチドと抗体との間の結合反応の程度をセンサーグラム（sensorgram）で示した。センサーグラムのｘ軸は時間（秒、ｓ）、ｙ軸は反応単位（response unit、ＲＵ）を表示する。ボックスの中は、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２抗原ペプチドの濃度を示し（単位はすべてｎＭ）、図４のＡとＢで全て同じである。
【図４Ｂ】図４は、Ｈ５  ＩｇＧ抗体とＡＩＭＰ２−ＤＸ２抗原ペプチドとの結合力を確認するための表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance）実験を示す。Ｈ５抗体とＩｇＧタンパク質をＣＭ５チップにコーティングして、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２抗原ペプチドを多様な濃度で流して、抗原ペプチドと抗体との間の結合反応の程度をセンサーグラム（sensorgram）で示した。センサーグラムのｘ軸は時間（秒、ｓ）、ｙ軸は反応単位（response unit、ＲＵ）を表示する。ボックスの中は、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２抗原ペプチドの濃度を示し（単位はすべてｎＭ）、図４のＡとＢで全て同じである。
【図５Ａ】図５は、Ｈ５  Ｆａｂの結合特異性を確認するためのウェスタンブロット実験を示す。Ｈ４６０細胞溶解物を電気泳動したブロットを、野生型ＡＩＭＰ２とＡＩＭＰ２−ＤＸ２に全て結合する＃３２４抗体と反応させた結果を示す。ブロットにおいて、野生型ＡＩＭＰ２（“ＡＩＭＰ２”）とＡＩＭＰ２−ＤＸ２（“ＤＸ２”）のタンパク質バンドの位置は、それぞれ赤い矢印で示されている。
【図５Ｂ】図５は、Ｈ５  Ｆａｂの結合特異性を確認するためのウェスタンブロット実験を示す。Ｈ４６０細胞溶解物を電気泳動したブロットを、野生型ＡＩＭＰ２とＡＩＭＰ２−ＤＸ２に全て結合するＨ５  Ｆａｂと反応させた結果を示す。ブロットにおいて、野生型ＡＩＭＰ２（“ＡＩＭＰ２”）とＡＩＭＰ２−ＤＸ２（“ＤＸ２”）のタンパク質バンドの位置は、それぞれ赤い矢印で示されている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
さらにＨ４６０細胞において、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２の発現を抑制する方法で、Ｈ５  ＦａｂのＡＩＭＰ２−ＤＸ２に対する結合特異性を確認した（図３）。ＡＩＭＰ２−ＤＸ２のｅｘｏｎ１−ｅｘｏｎ３接合部分又はｅｘｏｎ４を標的とするｓｉＲＮＡ（図３のＢ、それぞれ”ｓｉＤＸ２”（配列番号５７）、”ｓｉ  ｅｘｏｎ４＃１”（配列番号５８）、”ｓｉ  ｅｘｏｎ４＃２”（配列番号５９））でＨ４６０細胞を形質転換して、７２時間培養した。培養された細胞の溶解物についてＨ５  Ｆａｂでウェスタンブロットを実施した結果（図３のＡ）、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２のｅｘｏｎ１−ｅｘｏｎ３接合部分だけではなく、ｅｘｏｎ４を標的とするｓｉＲＮＡで形質転換された細胞溶解物からも、Ｈ５  ＦａｂによってＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質バンドが感知されなかった。ｓｉＲＮＡによって、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２変異体のｍＲＮＡが全て分解されたからであると判断される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０４】
ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質のＮ−末端アミノ酸欠失がＨ５  ＦａｂとＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の結合に影響を与えるかを調べた（図２）。ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質のＮ−末端のアミノ酸残基は、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の溶解性に重要な影響を与えることが知られている（韓国特許出願第１０−２０１４−００５８６３４号）。ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質のＮ−末端から２個、２３個、又は３３個のアミノ酸が欠損した形態のＡＩＭＰ２−ＤＸ２（図２のＢ）にｓｔｒｅｐ  ｔａｇを接合して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞からそれぞれ発現させて、Ｈ５  Ｆａｂでウェスタンブロット実験を実施した。図２のＡに示した通り、Ｈ５  Ｆａｂは、全体の長さのＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質だけではなく、Ｎ−末端が欠損した形態のＡＩＭＰ２−ＤＸ２にも全てよく結合することが分かった。一方、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２抗原ペプチドが存在する条件において、Ｈ５  Ｆａｂ（“Ｈ５＋ｅｐｉｔｏｐｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ”）は、全体の長さ又はＮ−末端が欠損したＡＩＭＰ２−ＤＸ２のいずれにも結合していないので、Ｈ５  ＦａｂがＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質に特異的に結合することを再確認した。