【手続補正書】
【提出日】令和2年7月8日(2020.7.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドのライブラリーからポリペプチドを選択するための方法であって、
ａ．第１の核酸ライブラリーを提供する工程であって、前記第１の核酸ライブラリーの各メンバーが、第１のポリペプチドライブラリーのメンバーをコードするポリペプチド−エンコーディング配列を含む工程；
ｂ．第２の核酸ライブラリーを提供する工程であって、前記第２の核酸ライブラリーが複数のメンバーを含み、各メンバーが、検出タグをコードするタグ−エンコーディング配列を含み、前記検出タグが、
ｉ．前記第２の核酸ライブラリーによりコードされたいずれの検出タグのアミノ酸配列とも相違するアミノ酸配列によって特徴付けられる；
ii．２００から５０００Ｄａの間、特に５００から２５００Ｄａの間、さらに特に約９００から２２００Ｄａの間の分子量によって特徴づけられる；かつ
iii．第１の分離可能なエレメントを含む
工程；
ｃ．前記第１の核酸ライブラリーの前記メンバーに含まれる前記ポリペプチド−エンコーディング配列を、前記第２の核酸ライブラリーのメンバーに挿入し、それにより、タグが付されたポリペプチドライブラリーをコードするタグが付された核酸ライブラリーを作製する工程であって、前記タグが付されたポリペプチドライブラリーの各メンバーが、ポリペプチドおよび前記ポリペプチドから前記第１の分離可能なエレメントにより分離された検出タグを含む工程；
ｄ．前記タグが付された核酸ライブラリーから複数の核酸配列を得る工程であって、前記複数の核酸配列の各々が、ポリペプチド−エンコーディング配列およびタグ−エンコーディング配列を含む工程；
ｅ．工程ｄにおいて得られたタグ−エンコーディング配列によりコードされた各検出タグについて質量分析フラグメンテーションパターンを予測する工程；
ｆ．前記タグが付された核酸ライブラリーから前記タグが付されたポリペプチドライブラリーを発現する工程；
ｇ．選択工程において前記タグが付されたポリペプチドライブラリーのメンバーを選択し、選択されたポリペプチドを得る工程；
ｈ．前記第１の分離可能なエレメントを切断し、それにより前記検出タグを前記選択されたポリペプチドから分離し、単離された検出タグを得る工程；
ｉ．前記単離された検出タグを、
ｉ．質量分析により前記単離された検出タグのフラグメンテーションパターンを記録すること；
ii．工程ｉで得られた前記フラグメンテーションパターンを、工程ｅにおいて予測された前記フラグメンテーションパターンと組み合わせること
により前記単離された検出タグを同定する工程；
ｊ．工程ｄにおいて得られた前記複数の核酸配列から、工程ｉにおいて同定された前記検出タグをコードするタグ−エンコーディング配列を含む核酸配列を選択し、それにより工程ｉにおいて同定された前記検出タグと結合した前記タグが付されたポリペプチドライブラリーのメンバーを同定する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記単離された検出タグが、−２７から１２８の間、特に−１から７０の間の疎水性値により特徴付けられる請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記単離された検出タグが、配列エレメントＩの収集物から選択される配列エレメントＩを含み、前記配列エレメントＩが、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、ＧおよびＰから各々独立して選択される５〜１０、特には７アミノ酸からなる請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記単離された検出タグが、
ａ．ＧＳである配列エレメントIII；
ｂ．Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、ＧおよびＰから各々独立して選択される５〜１０、特には７アミノ酸からなる前記配列エレメントＩ；および
ｃ．配列番号１（ＷＲ）、配列番号２（ＷＬＲ）、配列番号３（ＷＱＳＲ）、配列番号４（ＷＬＴＶＲ）および配列番号５（ＷＱＥＧＧＲ）から選択される配列エレメントII
を含み、
特に、前記配列エレメントのＮ−末端からＣ−末端への順番が、配列エレメントIII、配列エレメントＩ、配列エレメントIIである請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ポリペプチドの収集物であって、前記ポリペプチドの収集物の各メンバーは、検出タグと、特に少なくとも１つ、より特には少なくとも２つ、さらにより特には少なくとも５つ、さらにより特には少なくとも１０個、なおより特にはおおよそ２０個の検出タグと会合し、前記検出タグが、
ａ．前記複数の発現ベクターによりコードされたいかなる他の検出タグのアミノ酸配列とも異なるアミノ酸配列により特徴づけられ；
ｂ．２００から５０００Ｄａの間、特に５００から２５００Ｄａの間、より特にはおおよそ９００から２２００Ｄａの間の分子量により特徴づけられ；
ｃ．第１の分離可能なエレメントにより前記ポリペプチドの収集物の前記メンバーから分離される
ポリペプチドの収集物。
【請求項６】
前記単離された検出タグが、−２７から１２８の間、特に−１から７０の間の疎水性値により特徴づけられる請求項５記載のポリペプチドの収集物。
【請求項７】
前記検出タグが、
ａ．Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、ＧおよびＰから各々独立して選択される５〜１０、特には７アミノ酸からなる配列エレメントＩ；および
ｂ．配列番号１（ＷＲ）、配列番号２（ＷＬＲ）、配列番号３（ＷＱＳＲ）、配列番号４（ＷＬＴＶＲ）および配列番号５（ＷＱＥＧＧＲ）から選択される配列エレメントII
を含む請求項５または６記載のポリペプチドの収集物。
【請求項８】
４〜２０、特に７〜１８、より特には１１〜１５のアミノ酸からなる検出タグであって、
ａ．正に荷電した側鎖を有するアミノ酸をただ１つ含み；
ｂ．２００から５０００Ｄａの間、特に５００から２５００Ｄａの間、より特にはおおよそ９００から２２００Ｄａの間の分子量により特徴づけられる
検出タグ。
【請求項９】
前記検出タグが、本質的に
ａ．Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、ＧおよびＰから各々独立して選択される５〜１０、特には７アミノ酸からなる配列エレメントＩ；および
ｂ．配列番号１（ＷＲ）、配列番号２（ＷＬＲ）、配列番号３（ＷＱＳＲ）、配列番号４（ＷＬＴＶＲ）および配列番号５（ＷＱＥＧＧＲ）から選択される配列エレメントII
からなる請求項８記載の検出タグ。
【請求項１０】
少なくとも９６、より特には少なくとも５０００００、さらにより特には少なくとも１０7の検出タグ、なおさらにより特にはおおよそ１０8の請求項８または９記載の検出タグを含む検出タグの収集物であって、各検出タグは、４〜２０、特に７〜１８、より特には１１〜１５のアミノ酸からなり、前記検出タグの収集物に含まれるいかなる他の検出タグのアミノ酸配列とも異なるアミノ酸配列により特徴づけられる検出タグの収集物。
【請求項１１】
特に少なくとも９６、より特には少なくとも５０００００、さらにより特には少なくとも１０7のプラスミドベクター、なおさらにより特にはおおよそ１０8のプラスミドベクターを含むプラスミドベクターの収集物であって、前記プラスミドベクターの収集物の各メンバーは、検出タグをコードするタグ−エンコーディング核酸配列を含み、各検出タグは、４〜２０、特に７〜１８、より特には１１〜１５のアミノ酸からなり、前記プラスミドベクターの収集物によりコードされたいかなる他の検出タグのアミノ酸配列とも異なるアミノ酸配列によって特徴づけられる、プラスミドベクターの収集物。
【請求項１２】
前記検出タグが、本質的に
ａ．Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、ＧおよびＰから各々独立して選択される５〜１０、特には７アミノ酸からなる配列エレメントＩ；および
ｂ．配列番号１（ＷＲ）、配列番号２（ＷＬＲ）、配列番号３（ＷＱＳＲ）、配列番号４（ＷＬＴＶＲ）および配列番号５（ＷＱＥＧＧＲ）から選択される配列エレメントII
からなる請求項１１記載のプラスミドベクターの収集物。
【請求項１３】
ａ．ポリペプチドライブラリーをコードする核酸ライブラリーを提供する工程であって、
前記ポリペプチドライブラリーが複数のメンバーを含み、各メンバーが検出タグと会合し、前記検出タグが、
ｉ．前記核酸ライブラリーによりコードされたいかなる他の検出タグのアミノ酸配列とも異なるアミノ酸配列により特徴づけられ；
ii．２００から５０００Ｄａの間、特に５００から２５００Ｄａの間、より特にはおおよそ９００から２２００Ｄａの間の分子量により特徴づけられ；そして
iii．第１の分離可能なエレメントにより前記ポリペプチドの収集物の前記メンバーから分離され；
ｂ．
ｉ複数の核酸および／またはアミノ酸配列であって、前記複数の配列が前記核酸ライブラリーの全てのメンバーの配列を含み、前記配列の各々はポリペプチドを特定する配列および検出タグを特定する配列を含む複数の核酸および／またはアミノ酸配列；
ii．前記核酸ライブラリーによりコードされた各検出タグに対する予想された質量分析フラグメンテーションパターン
を含むデータベースを提供する工程；
ｃ．前記核酸ライブラリーから前記ポリペプチドライブラリーを発現する工程；
ｄ．選択工程において前記ポリペプチドライブラリーのメンバーを選択し、選択されたポリペプチドを得る工程、
ｅ．前記第１の分離可能なエレメントを切断し、それにより前記検出タグを前記選択されたポリペプチドから分離し、単離された検出タグを得る工程；
ｆ．前記単離された検出タグを
ｉ．質量分析法により前記単離された検出タグのフラグメンテーションパターンを記録する工程；
ii．工程ｉで得られた前記フラグメンテーションパターンを前記データベースにおいて予想された前記フラグメンテーションパターンと組み合わせ、それにより前記単離された検出タグを同定する工程
により同定する工程；
ｇ．前記データベースに含まれる前記複数の配列から、工程ｆで同定された前記検出タグを特定する配列を選択し、それにより、工程ｆで同定された前記検出タグと会合する前記ポリペプチドライブラリーのメンバーを同定する工程
を含むタンパク質検出方法。
【請求項１４】
前記ポリペプチドライブラリーの各メンバーまたは各検出タグが、アフィニティタグと、特にＨｉｓ−タグ、ＣＢＰ−タグ、ＣＹＤ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、ＳｔｒｅｐＩＩ−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、ＨＰＣ−タグ、ＧＳＴ−タグ、Ａｖｉ−タグ、ビオチン化タグ、Ｍｙｃ−タグ、３ｘＦＬＡＧタグ、およびＭＢＰ−タグを含む群から選択されるアフィニティタグと会合され、および／または、前記アフィニティタグが、好ましくは前記検出タグから第２の分離可能なエレメントにより分離され、前記第２の分離可能なエレメントが、工程ｆより前に分離される請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ポリペプチドを固有の検出タグと会合する方法であって、
ａ．第１の核酸ライブラリーを提供する工程であって、前記第１の核酸ライブラリーの各メンバーが、第１のポリペプチドライブラリーのメンバーをコードするポリペプチド−エンコーディング配列を含む工程、
ｂ．第２の核酸ライブラリーを提供する工程であって、前記第２の核酸ライブラリーの各メンバーが検出タグをコードするタグ−エンコーディング配列を含み、前記検出タグが：
ｉ．前記第２の核酸ライブラリーによりコードされたいかなる他の検出タグのアミノ酸配列とも異なるアミノ酸配列により特徴づけられ；
ii．２００から５０００Ｄａの間、特に５００から２５００Ｄａの間、より特にはおおよそ９００から２２００Ｄａの間の分子量により特徴づけられる工程、
ｃ．前記第１の核酸ライブラリーの前記メンバーに含まれる前記ポリペプチド−エンコーディング配列を、前記第２の核酸ライブラリーのメンバーに挿入する工程であって、
ｉ．前記第１の核酸ライブラリーが５〜１００，０００、特には１００〜５０，０００、より特には５００〜５，０００のサイズを有し、かつ
ii．前記第２の核酸ライブラリーが１０3〜１０11、特には１０5〜１０10、より特には１０6〜１０9、さらにより特にはおおよそ１０8のサイズを有し、
それにより複数のポリペプチド／タグ組み合わせプラスミドを生成する工程；
ｄ．前記複数のポリペプチド／タグ組み合わせプラスミドのサブセットを選択し、それにより、タグが付されたポリペプチドライブラリーをコードするタグが付された核酸ライブラリーを生成する工程
を含む方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】タンパク質のスクリーニングおよび検出方法
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質ライブラリーへの検出タグの結合方法、ならびにその後の定義された生物物理学的または薬理学的基準を満たすタンパク質を同定および定量するためのそのタグの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質スクリーニング方法およびタンパク質ディスプレイ方法は、ある特徴（例えば標的分子への高いアフィニティ結合）を示すタンパク質の同定または富化のための最新の方法である。
【０００３】
スクリーンにおいて、タンパク質は、一つずつ分析される。これには非常に時間と労力を必要とし、かつ比較的低い試験数に限定される。例えば、結合タンパク質のためのスクリーンにおいては、個々の結合剤候補は、ＥＬＩＳＡにより同定され、ポジティブＥＬＩＳＡヒットは、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、アンフォールディング試験により生物物理学的にさらに特徴づけられ、それらの治療能力は動物モデルにおいてインビボで検査される。
【０００４】
ディスプレイ法において、全タンパク質プール（ライブラリー由来）は、数選択ラウンドを経て富化される。プールの処理により、多くの労力を払わずに巨大なスループットが可能となる。しかし、ファージ、リボソームまたはイーストディスプレイ法などのディスプレイ法は、表現型（タンパク質）および遺伝子型（そのエンコーディング核酸）との間の物理的結合を必要とする。これは、ディスプレイを実行するために必要とされる物理的実体（すなわち、ファージ、リボソームおよびエンコーディングＤＮＡまたはＲＮＡ）は、通常、実際の結合分子（例えば、抗体フラグメント）よりも１００倍以上長いため、ほとんどの分析にとって深刻な欠点である。これは、選択バイアスを必然的に生じ、可能な選択圧を少数の亜群のイメージ化できる選択圧に制限する（ディスプレイ粒子の巨大分子により大きくは影響されない選択圧（例えば結合）のみが現行では適用することができる）。
【発明の概要】
【０００５】
上述の技術水準に基づき、本発明の目的は、物理的遺伝子型−表現型結合の存在なしに全タンパク質ライブラリーから定義された生物物理学的または薬理学的基準を満たす独立したタンパク質の同定のための手段および方法を提供することである。この目的は、本明細書の特許請求の範囲により達成される。
【０００６】
用語および定義
当業者は、本明細書の範囲内において、ライブラリーの大きさを示す数字がライブラリーメンバーの多様性に関連しているということに気付く。ライブラリーIIより大きいライブラリーＩは、ライブラリーIIより多数の独自のライブラリーメンバーを含むライブラリーＩに相当する。１００，０００メンバーを有する核酸ライブラリーは、数百万の核酸分子を含むことができるが、該ライブラリー内の核酸配列の独自のものによりそれぞれ特徴付けられるのは１００，０００個別ライブラリーメンバーのみである。同様に、１，０００メンバーを有するポリペプチドライブラリーは、１００万のポリペプチド分子を含むことができるが、独自のポリペプチドライブラリーメンバーは１，０００のみである。「ライブラリーの１メンバー」との表現は、複数の同一のコピーとして存在し得る１つの特定のライブラリーメンバーに関する。
【０００７】
本明細書の文脈内で、「２つの核酸配列がフレーム内にある」との表現は、第１の核酸配列の最後のコドンと第２の核酸配列の最初のコドンとの間の塩基対の数が３で割り切れるということを意味する。
【０００８】
本明細書の文脈内で、「ポリペプチドが検出タグと結合されている」、それぞれ「ポリペプチド／検出タグがアフィニティタグと結合されている」との表現は、両前述のメンバーが１つの一時アミノ酸配列、すなわち１つの連続したポリペプチド鎖内に含まれるということを意味する。とりわけ、前記検出タグおよび前記ポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸によって分離されてもよい。前記検出タグおよび前記アフィニティタグも、１つ以上のアミノ酸によって分離されてもよい。
【０００９】
本明細書の文脈内で、「分離可能なエレメント」との用語は、化学薬剤によりまたは酵素的手段、例えばプロテアーゼにより、切断しやすいペプチド配列を意味する。プロテアーゼは、配列特異的（例えばトロンビン）であってもよく、限定された配列特性（例えばトリプシン）を有してもよい。分離可能なエレメントＩおよびIIは、特に検出タグまたはポリペプチドの最後のアミノ酸がＫまたはＲである場合に、検出タグまたはポリペプチドのアミノ酸配列内に含まれてもよい。
【００１０】
本明細書の文脈内で、「アフィニティタグ」という用語は、生物化学混合物からポリペプチドの生成を可能にするためにそのポリペプチドに結合する部分を意味する。精製（アフィニティ精製）は、アフィニティタグとアフィニティタグの結合パートナーとの間の高度に特異的な相互作用（解離定数≦１０Ｅ−５）に基づく。アフィニティタグは、アミノ酸配列からなってもよく、あるいは化学的部分が翻訳後修飾により結合するアミノ酸配列を含んでいてもよい。非限定的な例により、アフィニティタグは、Ｈｉｓ−タグ、ＣＢＰ−タグ（ＣＢＰ：カルモジュリン結合タンパク質）、ＣＹＤ−タグ（ＣＹＤ：共有結合であるが解離可能なＮｏｒｐＤペプチド）、Ｓｔｒｅｐ−タグ、ＳｔｒｅｐII−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、ＨＰＣ−タグ（ＨＰＣ：タンパク質Ｃの重鎖）、ＧＳＴ−タグ（ＧＳＴ：グルタチオンＳトランスフェラーゼ）、Ａｖｉ−タグ、ビオチン化タグ、Ｍｙｃ−タグ、３×ＦＬＡＧタグおよびＭＢＰ−タグ（ＭＢＰ：マルトース結合タンパク質）を含む群から選択される。アフィニティタグのさらなる例は、Kimple et al., Curr Protoc Protein Sci. 2013 Sep 24;73:Unit 9.9に見出すことができる。
【００１１】
本明細書の文脈内で、「ディープシークエンシング」という用語は、≧５×、特に≧４０×の範囲での数千の異なる核酸分子のパラレルシークエンシングを意味する。「範囲」という用語は、所定のヌクレオチドがディープシークエンシングプロセス中に読み取られる回数の平均を意味する。
【００１２】
本明細書の文脈内で、抗体という用語は、細胞生物学および免疫学の分野において知られているその意味で使用される。全抗体は、少なくともジスルフィド結合により相互に結合した２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖とを含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてはＶＬと略称する。）および軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの宿主組織または因子（免疫系の種々の細胞（例えばエフェクター細胞）や古典的な補体系の第１成分など）への結合を仲介する。
【００１３】
本明細書の文脈内で、「ナノボディ」という用語は、「単一ドメイン抗体」、すなわち単一の可変抗体ドメインからなる抗体フラグメントと関係している。ナノボディは、特定の抗原に選択的に結合することができる。その分子量は、たった１２〜１５ｋＤａである（Harmsen et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 77(1): 13-22）。通常、ナノボディは、所望の抗原でヒトコブラクダ、ラクダ、ラマ、アルパカまたはサメを免疫し、その後、重鎖抗体をコードするｍＲＮＡを単離することにより得られる。ナノボディはまた、４つの鎖を有する一般的なマウスまたはヒトＩｇＧから導かれ得る。
【００１４】
本明細書の文脈内で、「シボディ（sybody）」という用語は、合成ナノボディと関係している。シボディは、抗原による免疫を経て得られるものではなく、合成ライブラリーからビトロにおいて選択される。
【００１５】
本明細書の文脈内で、「富化」という用語は、化合物の混合物内におけるある化合物の相対的な量を増加させるプロセスと関係している。
【００１６】
本明細書の文脈内で、「フライコードライブラリー」という用語は、複数の配列変異体を含む本発明に係るアミノ酸配列ライブラリーに関係している。
【００１７】
本明細書の文脈内で、「ＮｅｓｔＬｉｎｋ」という用語は、検出タグがタンパク質ライブラリーに結合される方法に関係している。その後、タグは、ライブラリー内の定義された生物物理学的または薬理学的基準を満たす個々のタンパク質を同定および定量するために使用される。ＮｅｓｔＬｉｎｋは、スクリーンおよびディスプレイ方法の主要な利点を含む。
【００１８】
本明細書の文脈内で、「疎水性値」という用語は、ペプチドを特徴づける予測値に関係している。疎水性値は、Krokhin et al., Mol Cell Proteomics. 2004 Sep; 3(9):908-19に記載された方法により、以下の式に従って計算される。
Ｈ＝ＫL*（ΣＲc＋０．４２Ｒ1cNt＋０．２２Ｒ2cNt＋０．０５Ｒ3cNt）  Ｈ＜３８の場合
および
Ｈ＝ＫL*（ΣＲc＋０．４２Ｒ1cNt＋０．２２Ｒ2cNt＋０．０５Ｒ3cNt）−０．３（ＫL*（ΣＲc＋０．４２Ｒ1cNt＋０．２２Ｒ2cNt＋０．０５Ｒ3cNt）−３８）  Ｈ≧３８の場合；
Ｈ＜３８の場合、Ｈfinal＝Ｈ；
Ｈ≧３８の場合、Ｈfinal＝Ｈ−０．３*（Ｈ−３８）；
式中、Ｈfinalは、疎水性値であり、Ｒcは、以下の表のようにアミノ酸型を特徴づける保持係数であり、
2020502493.tif 000001
アミノ酸ＸのＲXcNtは、
ＲXcNt＝（ΣＲc／２０）−ＲXC
と定義されており、
ＮはＮ末端から１から始まる検出タグの残基番号に対応する。ＫLは、
Ｎ＜１０の場合、ＫL＝１−０．０２７*（１０−Ｎ）
Ｎ＞２０の場合、ＫL＝１−０．０１４*（Ｎ−２０）
それ以外はＫL＝１
と定義される。
【００１９】
アミノ酸配列は、アミノ末端からカルボキシ末端へとなる。配列位置に対する大文字は、一文字コードのＬ−アミノ酸を意味する（Stryer, Biochemistry, 3rd ed. P.21）。
【００２０】
以下のさらなる実施形態および利点を引き出すことができる実施例および図面により本発明をさらに説明する。これらの実施例は、本発明を説明するためのものであるが、その範囲を限定するものではない。
【００２１】
さらなる実施態様において、本発明は、以下、［１］〜［４２］により規定される。
【００２２】
［１］ポリペプチドのライブラリーからポリペプチドを選択するための方法であって、
ａ．第１の核酸ライブラリーを提供する工程であって、前記第１の核酸ライブラリーの各メンバーが、第１のポリペプチドライブラリーのメンバーをコードするポリペプチド−エンコーディング配列を含む工程；
ｂ．第２の核酸ライブラリーを提供する工程であって、前記第２の核酸ライブラリーが複数のメンバーを含み、各メンバーが、検出タグをコードするタグ−エンコーディング配列を含み、前記検出タグが、
ｉ．前記第２の核酸ライブラリーによりコードされたいずれの検出タグのアミノ酸配列とも相違するアミノ酸配列によって特徴付けられる；
ii．２００から５０００Ｄａの間、特に５００から２５００Ｄａの間、さらに特に約９００から２２００Ｄａの間の分子量によって特徴づけられる；かつ
iii．第１の分離可能なエレメントを含む
工程；
ｃ．前記第１の核酸ライブラリーの前記メンバーに含まれる前記ポリペプチド−エンコーディング配列を、前記第２の核酸ライブラリーのメンバーに挿入し、それにより、タグが付されたポリペプチドライブラリーをコードするタグが付された核酸ライブラリーを作製する工程であって、前記タグが付されたポリペプチドライブラリーの各メンバーが、ポリペプチドおよび前記ポリペプチドから前記第１の分離可能なエレメントにより分離された検出タグを含む工程；
ｄ．前記タグが付された核酸ライブラリーから複数の核酸配列を得る工程であって、前記複数の核酸配列の各々が、ポリペプチド−エンコーディング配列およびタグ−エンコーディング配列を含む工程；
ｅ．工程ｄにおいて得られたタグ−エンコーディング配列によりコードされた各検出タグについて質量分析フラグメンテーションパターンを予測する工程；
ｆ．前記タグが付された核酸ライブラリーから前記タグが付されたポリペプチドライブラリーを発現する工程；
ｇ．選択工程において前記タグが付されたポリペプチドライブラリーのメンバーを選択し、選択されたポリペプチドを得る工程；
ｈ．前記第１の分離可能なエレメントを切断し、それにより前記検出タグを前記選択されたポリペプチドから分離し、単離された検出タグを得る工程；
ｉ．前記単離された検出タグを、
ｉ．質量分析により前記単離された検出タグのフラグメンテーションパターンを記録すること；
ii．工程ｉで得られた前記フラグメンテーションパターンを、工程ｅにおいて予測された前記フラグメンテーションパターンと組み合わせること
により前記単離された検出タグを同定する工程；
ｊ．工程ｄにおいて得られた前記複数の核酸配列から、工程ｉにおいて同定された前記検出タグをコードするタグ−エンコーディング配列を含む核酸配列を選択し、それにより工程ｉにおいて同定された前記検出タグと結合した前記タグが付されたポリペプチドライブラリーのメンバーを同定する工程
を含む方法。
【００２３】
［２］前記単離された検出タグが、−２７から１２８の間、特に−１から７０の間の疎水性値により特徴付けられる上記［１］記載の方法。
【００２４】
［３］前記タグが付されたポリペプチドライブラリーの前記メンバーが、アフィニティタグ、特に、Ｈｉｓ−タグ、ＣＢＰ−タグ、ＣＹＤ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、ＳｔｒｅｐII−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、ＨＰＣ−タグ、ＧＳＴ−タグ、Ａｖｉ−タグ、ビオチン化タグ、Ｍｙｃ−タグ、３ｘＦＬＡＧ−タグおよびＭＢＰ−タグを含む群より選択されるアフィニティタグと会合している上記［１］または［２］記載の方法。
【００２５】
［４］前記検出タグが、アフィニティタグ、特に、Ｈｉｓ−タグ、ＣＢＰ−タグ、ＣＹＤ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、ＳｔｒｅｐII−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、ＨＰＣ−タグ、ＧＳＴ−タグ、Ａｖｉ−タグ、ビオチン化タグ、Ｍｙｃ−タグ、３ｘＦＬＡＧ−タグおよびＭＢＰ−タグを含む群より選択されるアフィニティタグと会合している上記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
【００２６】
［５］前記アフィニティタグが、第２の分離可能なエレメントにより前記検出タグから分離され、前記第２の分離可能なエレメントが工程ｉの前に切断されている上記［４］記載の方法。
【００２７】
［６］工程ｉが、前記単離された検出タグをエレクトロスプレーイオン化質量分析計と接続された液体クロマトグラフィーにより分析することを含む上記［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
【００２８】
［７］工程ｄが、≧５倍の範囲で前記完全にタグが付された発現ライブラリーのシークエンシングを含む上記［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
【００２９】
［８］前記単離された検出タグが、５〜３０、特に７〜２１、より特には１１〜１５のアミノ酸からなり、正に荷電した側鎖を有するアミノ酸をただ１つ含む上記［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
【００３０】
［９］前記単離された検出タグが、配列エレメントＩの収集物から選択される配列エレメントＩを含み、前記配列エレメントＩが、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、ＧおよびＰから各々独立して選択される５〜１０、特には７アミノ酸からなる上記［１］〜［８］のいずれかに記載の方法。
【００３１】
［１０］前記正に荷電した側鎖を有する１つのアミノ酸が、前記単離された検出タグのＣ−末端に位置し、特に、前記正に荷電した側鎖を有する１つのアミノ酸がＣ−末端アルギニンであり、単離された検出タグに含まれる残りのアミノ酸がＡ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、ＧおよびＰから独立して選択される上記［１］〜［９］のいずれかに記載の方法。
【００３２】
［１１］前記単離された検出タグが、
ａ．Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、ＧおよびＰから各々独立して選択される５〜１０、特には７アミノ酸からなる配列エレメントＩ；および
ｂ．配列番号１（ＷＲ）、配列番号２（ＷＬＲ）、配列番号３（ＷＱＳＲ）、配列番号４（ＷＬＴＶＲ）および配列番号５（ＷＱＥＧＧＲ）から選択される配列エレメントII
を含む上記［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
【００３３】
［１２］前記単離された検出タグが、
ａ．ＧＳである配列エレメントIII；
ｂ．Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、ＧおよびＰから各々独立して選択される５〜１０、特には７アミノ酸からなる前記配列エレメントＩ；および
ｃ．配列番号１（ＷＲ）、配列番号２（ＷＬＲ）、配列番号３（ＷＱＳＲ）、配列番号４（ＷＬＴＶＲ）および配列番号５（ＷＱＥＧＧＲ）から選択される配列エレメントII
を含み、
特に、前記配列エレメントのＮ−末端からＣ−末端への順番が、配列エレメントIII、配列エレメントＩ、配列エレメントIIである上記［１］〜［１１］のいずれかに記載の方法。
【００３４】
［１３］前記第１の核酸ライブラリーに含まれる全ての配列エレメントＩが一緒に、配列エレメントＩの収集物を構築し、かつ前記配列エレメントＩの収集物内で、各アミノ酸が表１に特定される頻度で存在する上記［９］〜［１２］のいずれかに記載の方法。
【００３５】
［１４］前記第１のおよび／または第２の分離可能なエレメントがプロテアーゼ認識配列であるかまたはプロテアーゼ認識配列を含む上記［１］〜［１３］のいずれかに記載の方法。
【００３６】
［１５］ａ．前記第１の分離可能なエレメントが、トロンビン認識配列であるかまたはトロンビン認識配列を含む、および／または
ｂ．前記第２の分離可能なエレメントが、トリプシン認識配列であるかまたはトリプシン認識配列を含む、
上記［１］〜［１４］のいずれかに記載の方法。
【００３７】
［１６］ポリペプチドの収集物であって、前記ポリペプチドの収集物の各メンバーは、検出タグと、特に少なくとも１つ、より特には少なくとも２つ、さらにより特には少なくとも５つ、さらにより特には少なくとも１０個、なおより特にはおおよそ２０個の検出タグと会合し、前記検出タグが、
ａ．前記複数の発現ベクターによりコードされたいかなる他の検出タグのアミノ酸配列とも異なるアミノ酸配列により特徴づけられ；
ｂ．２００から５０００Ｄａの間、特に５００から２５００Ｄａの間、より特にはおおよそ９００から２２００Ｄａの間の分子量により特徴づけられ；
ｃ．第１の分離可能なエレメントにより前記ポリペプチドの収集物の前記メンバーから分離される
ポリペプチドの収集物。
【００３８】
［１７］前記単離された検出タグが、−２７から１２８の間、特に−１から７０の間の疎水性値により特徴づけられる上記［１６］記載のポリペプチドの収集物。
【００３９】
［１８］前記ポリペプチドの収集物の各メンバーが、アフィニティタグ、特に、Ｈｉｓ−タグ、ＣＢＰ−タグ、ＣＹＤ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、ＳｔｒｅｐII−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、ＨＰＣ−タグ、ＧＳＴ−タグ、Ａｖｉ−タグ、ビオチン化タグ、Ｍｙｃ−タグ、３ｘＦＬＡＧ−タグおよびＭＢＰ−タグを含む群より選択されるアフィニティタグと会合している上記［１６］または［１７］記載のポリペプチドの収集物。
【００４０】
［１９］前記検出タグが、アフィニティタグ、特に、Ｈｉｓ−タグ、ＣＢＰ−タグ、ＣＹＤ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、ＳｔｒｅｐII−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、ＨＰＣ−タグ、ＧＳＴ−タグ、Ａｖｉ−タグ、ビオチン化タグ、Ｍｙｃ−タグ、３ｘＦＬＡＧ−タグおよびＭＢＰ−タグを含む群より選択されるアフィニティタグと会合し、前記アフィニティタグが第２の分離可能なエレメントにより前記検出タグから分離される上記［１６］〜［１８］のいずれかに記載のポリペプチドの収集物。
【００４１】
［２０］前記検出タグが、４〜２０、特に７〜１８、より特には１１〜１５のアミノ酸からなり、正に荷電した側鎖を有するアミノ酸をただ１つ含む上記［１６］〜［１９］のいずれかに記載のポリペプチドの収集物。
【００４２】
［２１］前記検出タグが、
ａ．Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、ＧおよびＰから各々独立して選択される５〜１０、特には７アミノ酸からなる配列エレメントＩ；および
ｂ．配列番号１（ＷＲ）、配列番号２（ＷＬＲ）、配列番号３（ＷＱＳＲ）、配列番号４（ＷＬＴＶＲ）および配列番号５（ＷＱＥＧＧＲ）から選択される配列エレメントII
を含む上記［１６］〜［２０］のいずれかに記載のポリペプチドの収集物。
【００４３】
［２２］４〜２０、特に７〜１８、より特には１１〜１５のアミノ酸からなる検出タグであって、
ａ．正に荷電した側鎖を有するアミノ酸をただ１つ含み；
ｂ．２００から５０００Ｄａの間、特に５００から２５００Ｄａの間、より特にはおおよそ９００から２２００Ｄａの間の分子量により特徴づけられる
検出タグ。
【００４４】
［２３］前記検出タグが、本質的に
ａ．Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、ＧおよびＰから各々独立して選択される５〜１０、特には７アミノ酸からなる配列エレメントＩ；および
ｂ．配列番号１（ＷＲ）、配列番号２（ＷＬＲ）、配列番号３（ＷＱＳＲ）、配列番号４（ＷＬＴＶＲ）および配列番号５（ＷＱＥＧＧＲ）から選択される配列エレメントII
からなる上記［２２］記載の検出タグ。
【００４５】
［２４］少なくとも９６、より特には少なくとも５０００００、さらにより特には少なくとも１０7の検出タグ、なおさらにより特にはおおよそ１０8の請求項１９または２０記載の検出タグを含む検出タグの収集物であって、各検出タグは、４〜２０、特に７〜１８、より特には１１〜１５のアミノ酸からなり、前記検出タグの収集物に含まれるいかなる他の検出タグのアミノ酸配列とも異なるアミノ酸配列により特徴づけられる検出タグの収集物。
【００４６】
［２５］各検出タグが、正に荷電した側鎖を有するアミノ酸をただ１つ含み、残りのアミノ酸がＡ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、ＧおよびＰから選択される上記［２４］記載の検出タグの収集物。
【００４７】
［２６］各検出タグが、−２７から１２８の間、特に−１から７０の間の疎水性値により特徴づけられる上記［２４］または［２５］記載の検出タグの収集物。
【００４８】
［２７］各検出タグが、アフィニティタグ、特に、Ｈｉｓ−タグ、ＣＢＰ−タグ、ＣＹＤ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、ＳｔｒｅｐII−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、ＨＰＣ−タグ、ＧＳＴ−タグ、Ａｖｉ−タグ、ビオチン化タグ、Ｍｙｃ−タグ、３ｘＦＬＡＧ−タグおよびＭＢＰ−タグを含む群より選択されるアフィニティタグ、より特にはＨｉｓ−タグと会合し、前記アフィニティタグが分離可能なエレメントにより前記検出タグから分離される上記［２４］〜［２６］のいずれかに記載の検出タグの収集物。
【００４９】
［２８］特に少なくとも９６、より特には少なくとも５０００００、さらにより特には少なくとも１０7のプラスミドベクター、なおさらにより特にはおおよそ１０8のプラスミドベクターを含むプラスミドベクターの収集物であって、前記プラスミドベクターの収集物の各メンバーは、検出タグをコードするタグ−エンコーディング核酸配列を含み、各検出タグは、４〜２０、特に７〜１８、より特には１１〜１５のアミノ酸からなり、前記プラスミドベクターの収集物によりコードされたいかなる他の検出タグのアミノ酸配列とも異なるアミノ酸配列によって特徴づけられる、プラスミドベクターの収集物。
【００５０】
［２９］前記検出タグが、正に荷電した側鎖を有するアミノ酸をただ１つ含む上記［２８］記載のプラスミドベクターの収集物。
【００５１】
［３０］前記検出タグが、２００から５０００Ｄａの間、特に５００から２５００Ｄａの間、より特にはおおよそ９００からおおよそ２２００Ｄａの間の分子量により特徴づけられる上記［２８］または［２９］記載のプラスミドベクターの収集物。
【００５２】
［３１］前記コードされた検出タグが、−２７から１２８の間、特に−１から７０の間の疎水性値により特徴づけられる上記［２８］〜［３０］のいずれかに記載のプラスミドベクターの収集物。
【００５３】
［３２］各検出タグが、アフィニティタグ、特に、Ｈｉｓ−タグ、ＣＢＰ−タグ、ＣＹＤ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、ＳｔｒｅｐII−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、ＨＰＣ−タグ、ＧＳＴ−タグ、Ａｖｉ−タグ、ビオチン化タグ、Ｍｙｃ−タグ、３ｘＦＬＡＧ−タグおよびＭＢＰ−タグを含む群より選択されるアフィニティタグ、より特にはＨｉｓ−タグと会合し、前記アフィニティタグが分離可能なエレメントにより前記検出タグから分離される上記［２８］〜［３１］のいずれかに記載のプラスミドベクターの収集物。
【００５４】
［３３］前記検出タグが、本質的に
ａ．Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、ＧおよびＰから各々独立して選択される５〜１０、特には７アミノ酸からなる配列エレメントＩ；および
ｂ．配列番号１（ＷＲ）、配列番号２（ＷＬＲ）、配列番号３（ＷＱＳＲ）、配列番号４（ＷＬＴＶＲ）および配列番号５（ＷＱＥＧＧＲ）から選択される配列エレメントII
からなる上記［２８］〜［３２］のいずれかに記載のプラスミドベクターの収集物。
【００５５】
［３４］前記プラスミドベクターの収集物の各メンバーが、
ａ．５’で第１のエンドヌクレアーゼ制限酵素部位に、かつ３’で第２エンドヌクレアーゼ制限酵素部位に隣接したネガティブ選択カセット；
ｂ．前記第１のエンドヌクレアーゼ制限酵素部位の５’に位置するプロモータ
ｃ．前記第２のエンドヌクレアーゼ制限酵素部位の３’に位置し、前記検出タグをコードする前記核酸タグ配列
を含む上記［２８］〜［３３］のいずれかに記載のプラスミドベクターの収集物。
【００５６】
［３５］前記プラスミドベクターの収集物の各メンバーが
ａ．前記検出タグをコードする前記核酸タグ配列（ポリペプチドをコードする核酸配列と同じリーディングフレーム内で会合）
ｂ．ダイバーシティエレメント、特にシークエンシングの間のシグナル過負荷を防ぐための異なる塩基を含むダイバーシティエレメント
ｃ．プライマー結合部位、特にシークエンシングプライマーの結合のためのプライマー結合部位
ｄ．インデックスエレメント、特に多重化のための数個の規定された核酸配列の１つを含むプライマー結合部位
ｅ．アダプターエレメント、特にシークエンシングの間ＤＮＡ分子を固定するためのアダプターエレメント
ｆ．２つのエンドヌクレアーゼ制限酵素部位、特にエレメントａ〜ｅに隣接する、プラスミドからＤＮＡフラグメントを放出するための２つのエンドヌクレアーゼ制限酵素部位
を含む上記［２８］〜［３３］のいずれかに記載のプラスミドベクターの収集物。
【００５７】
［３６］ａ．ポリペプチドライブラリーをコードする核酸ライブラリーを提供する工程であって、
前記ポリペプチドライブラリーが複数のメンバーを含み、各メンバーが検出タグと会合し、前記検出タグが、
ｉ．前記核酸ライブラリーによりコードされたいかなる他の検出タグのアミノ酸配列とも異なるアミノ酸配列により特徴づけられ；
ii．２００から５０００Ｄａの間、特に５００から２５００Ｄａの間、より特にはおおよそ９００から２２００Ｄａの間の分子量により特徴づけられ；そして
iii．第１の分離可能なエレメントにより前記ポリペプチドの収集物の前記メンバーから分離され；
ｂ．
ｉ複数の核酸および／またはアミノ酸配列であって、前記複数の配列が前記核酸ライブラリーの全てのメンバーの配列を含み、前記配列の各々はポリペプチドを特定する配列および検出タグを特定する配列を含む複数の核酸および／またはアミノ酸配列；
ii．前記核酸ライブラリーによりコードされた各検出タグに対する予想された質量分析フラグメンテーションパターン
を含むデータベースを提供する工程；
ｃ．前記核酸ライブラリーから前記ポリペプチドライブラリーを発現する工程；
ｄ．選択工程において前記ポリペプチドライブラリーのメンバーを選択し、選択されたポリペプチドを得る工程、
ｅ．前記第１の分離可能なエレメントを切断し、それにより前記検出タグを前記選択されたポリペプチドから分離し、単離された検出タグを得る工程；
ｆ．前記単離された検出タグを
ｉ．質量分析法により前記単離された検出タグのフラグメンテーションパターンを記録する工程；
ii．工程ｉで得られた前記フラグメンテーションパターンを前記データベースにおいて予想された前記フラグメンテーションパターンと組み合わせ、それにより前記単離された検出タグを同定する工程
により同定する工程；
ｇ．前記データベースに含まれる前記複数の配列から、工程ｆで同定された前記検出タグを特定する配列を選択し、それにより、工程ｆで同定された前記検出タグと会合する前記ポリペプチドライブラリーのメンバーを同定する工程
を含むタンパク質検出方法。
【００５８】
［３７］前記ポリペプチドライブラリーの各メンバーが、アフィニティタグと、特にＨｉｓ−タグ、ＣＢＰ−タグ、ＣＹＤ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、ＳｔｒｅｐＩＩ−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、ＨＰＣ−タグ、ＧＳＴ−タグ、Ａｖｉ−タグ、ビオチン化タグ、Ｍｙｃ−タグ、３ｘＦＬＡＧタグ、およびＭＢＰ−タグを含む群から選択されるアフィニティタグと会合される上記［３６］記載の方法。
【００５９】
［３８］各検出タグが、アフィニティタグと、特にＨｉｓ−タグ、ＣＢＰ−タグ、ＣＹＤ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、ＳｔｒｅｐＩＩ−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、ＨＰＣ−タグ、ＧＳＴ−タグ、Ａｖｉ−タグ、ビオチン化タグ、Ｍｙｃ−タグ、３ｘＦＬＡＧタグ、およびＭＢＰ−タグを含む群から選択されるアフィニティタグと会合される上記［３６］記載の方法。
【００６０】
［３９］前記アフィニティタグが、前記検出タグから第２の分離可能なエレメントにより分離され、前記第２の分離可能なエレメントが、工程ｆより前に分離される上記［３８］記載の方法。
【００６１】
［４０］ポリペプチドを固有の検出タグと会合する方法であって、
ａ．第１の核酸ライブラリーを提供する工程であって、前記第１の核酸ライブラリーの各メンバーが、第１のポリペプチドライブラリーのメンバーをコードするポリペプチド−エンコーディング配列を含む工程、
ｂ．第２の核酸ライブラリーを提供する工程であって、前記第２の核酸ライブラリーの各メンバーが検出タグをコードするタグ−エンコーディング配列を含み、前記検出タグが：
ｉ．前記第２の核酸ライブラリーによりコードされたいかなる他の検出タグのアミノ酸配列とも異なるアミノ酸配列により特徴づけられ；
ii．２００から５０００Ｄａの間、特に５００から２５００Ｄａの間、より特にはおおよそ９００から２２００Ｄａの間の分子量により特徴づけられる工程、
ｃ．前記第１の核酸ライブラリーの前記メンバーに含まれる前記ポリペプチド−エンコーディング配列を、前記第２の核酸ライブラリーのメンバーに挿入する工程であって、
ｉ．前記第１の核酸ライブラリーが５〜１００，０００、特には１００〜５０，０００、より特には５００〜５，０００のサイズを有し、かつ
ii．前記第２の核酸ライブラリーが１０3〜１０11、特には１０5〜１０10、より特には１０6〜１０9、さらにより特にはおおよそ１０8のサイズを有し、
それにより複数のポリペプチド／タグ組み合わせプラスミドを生成する工程；
ｄ．前記複数のポリペプチド／タグ組み合わせプラスミドのサブセットを選択し、それにより、タグが付されたポリペプチドライブラリーをコードするタグが付された核酸ライブラリーを生成する工程
を含む方法。
【００６２】
［４１］前記複数のポリペプチド／タグ組み合わせプラスミドの前記サブセットが、前記第１の核酸ライブラリーのメンバーの数の少なくとも３倍、特に少なくとも５倍、より特には少なくとも１５倍、さらにより特には少なくとも２５倍である上記［４０］記載の方法。
【００６３】
［４２］前記複数のポリペプチド／タグ組み合わせプラスミドの前記サブセットが、前記第２の核酸ライブラリーのメンバーの数の５０％未満、特に５％未満、より特には０．５％未満、さらにより特には０．０５％未満である上記［４０］または［４１］記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１Ａ】ＮｅｓｔＬｉｎｋ技術の概観を示す図である。Ａ）ナノボディライブラリーは、発現ベクター上にコード化されたフライコードライブラリー内にネスト化される。その後、フライコード化されたナノボディ配列は、制限酵素消化により切断され、ｐＮＬｓ中に挿入され、ディープシークエンシングに必要なアダプター配列が結合する。フライコード化されたナノボディに結合されたアダプターは、その後、制限酵素消化により切断され、線形でディープシークエンシングに付される。
【図１Ｂ】ＮｅｓｔＬｉｎｋ技術の概観を示す図である。Ｂ）ｐＮＬｘにコード化されたネスト化ライブラリーが発現され、精製される。選択圧が適用され（この特別なケースにおいて、ナノボディ単量体の見かけの分子量を有するタンパク質がサイズ排除クロマトグラフィーにより選択される）、選択されたナノボディのフライコードがプロテアーゼの開裂により単離される。
【図１Ｃ】ＮｅｓｔＬｉｎｋ技術の概観を示す図である。Ｃ）ディープシークエンシングデータにより、データベースが生成され、すべてのフライコードがそれらの対応するナノボディに割り当てられる。各ナノボディのフライコードは連結される。事前に単離されたフライコード（Ｂ参照）は、ＬＣ−ＭＳに付され、記録されたＭＳ／ＭＳデータのピークリストが作成された。ＭＳ／ＭＳデータは、連結されたフライコードを含むデータベースについて調査され、選択されたナノボディの同定および相対的定量化がなされた。
【図２Ａ】ライブラリー挿入の前（上部文字列）および後（下部文字列）のＮｅｓｔＬｉｎｋ技術のための関連プラスミドデザインを示す図である。Ａ）標的分子に対するナノボディのファージディスプレイ選抜のために使用されたファージミド。ファージミドは、２つのＳａｐｌ制限部位を担持し、ナノボディライブラリーの挿入と、ファージディスプレイによる富化の後、ＮｅｓｔＬｉｎｋ発現ベクターｐＮＬｘへのそれらの効率的トランスファーとを可能とする。
【図２Ｂ】ライブラリー挿入の前（上部文字列）および後（下部文字列）のＮｅｓｔＬｉｎｋ技術のための関連プラスミドデザインを示す図である。Ｂ）おおよそ１０8変異体というフライコードの多様性を含むＮｅｓｔＬｉｎｋ発現ベクターｐＮＬｘ。Ｓａｐｌ部位はナノボディライブラリー挿入の際に消滅するように設計される。フライコードナノボディは、Ｓｆｉｌ制限を経て発現ベクターから特異的に切り出すことができる。Ｓｆｉ−部位の配置は、それらの対応するフライコードに結合した全ナノボディのディープシークエンシングを保証するが、ＰｅｌＢおよびＨｉｓ−タグなどの冗長配列の排除によりディープシークエンシング読み取り長さを最小化する。
【図２Ｃ】ライブラリー挿入の前（上部文字列）および後（下部文字列）のＮｅｓｔＬｉｎｋ技術のための関連プラスミドデザインを示す図である。Ｃ）多様な指標を有する一組のディープシークエンシングベクター（ｐＬＮｓ）が、各ＩＩＩｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｐシークエンシングのために必要な配列のすべてをそれぞれ含むように作成された。フライコードナノボディは、このベクター内にＳｆｉ制限およびライゲーションを経てこのベクターに挿入される。その後、それらは、ＢｓｅＲＩ制限により、すべてのＭｉＳｅｑアダプター領域を含む線形フラグメントとして除去される。このように、ＭｉＳｅｑ分析用ＤＮＡ断片を作製するためにＰＣＲを必要とせず、ナノボディ−フライコード配列において組み換え事象が生じ、それにより、フライコードとナノボディ配列との間の結合を破壊する。
【図２Ｄ】ライブラリー挿入の前（上部文字列）および後（下部文字列）のＮｅｓｔＬｉｎｋ技術のための関連プラスミドデザインを示す図である。Ｄ）ディープシークエンシングアダプターは、ｐＮＬｘにコードされるＳｆｉｌ制限部位に相補的な適切な一本鎖突出を介して合成二本鎖アダプターオリゴヌクレオチドを介して結合され得る。
【図３】ＬＣ−ＭＳを用いたフライコードを介したＰＬＯＩ−メンバーの絶対量測定を示す図である。フライコード化されたシボディの７つの既知量（ｘ−軸）をＥ．ｃｏｌｉまたはＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓいずれか由来の溶菌物をそれぞれ含む２つの異なる試料中に混ぜた（バックグラウンド）。フライコード化されたシボディは、０．２、０．４、１．３、４．１、８．５、１８．０および２７．５吸光度単位（２８０ｎｍ）で混ぜられ、ディープシークエンシングによって決定されたように、２８、５６、１１２、５６、１１２、８４および１１２フライコードを含んだ。単離されたフライコードは、ＬＣ−ＭＳにより分析された。各シボディのすべてのフライコードからＭＳ１強度がソフトウェアプロジェネシスを用いて合計された。
【図４】ＮｅｓｔＬｉｎｋを介して１’０８０の候補結合剤から最高のオフレートを示すシボディの同定を示す図である。Ａ：溶液におけるビオチン化標的タンパク質との単量体シボディ共溶出（ＳＥＣ）を、２つの等価なストレプトアビジンセファロースカラム上に固定した。一方のカラムをバッファーで洗浄し、他方のカラムを過剰な非−ビオチン化標的により３分間洗浄した。その後、残った結合したシボディのフライコードを単離し、ＬＣ−ＭＳ１強度により定量化した。Ｂ：ＬＣ−ＭＳ１強度（すべてのフライコードの合計）を各プールメンバーについて決定し、２つのカラムの間の比率を各個々のシボディ（ｘ軸）に対してｙ軸上にプロットした。発現しなかったシボディ、単量体でないシボディ、または溶液中で標的に結合しなかったシボディは、原理的な実験のプルーフに説明されているプレ−選択圧の結果として除去されたので、いずれのカラム上でも検出できなかった（シボディ３２０−１‘０８０）。弱く結合しているシボディは、バーファーでの洗浄後に検出可能であるのみならず、過剰な標的での競争下でも検出可能であった（シボディ１８７−３２０）。シボディ１−１８６は、両カラム上で検出され、それらのオフレートによりランク付けされた。下流適用に最も有望なシボディは、最も遅いオフレートのものであり、比率が１に近いものである。Ｃ：個々に選ばれたシボディのＮｅｓｔＬｉｎｋ読み出しとＳＰＲ実験との相関。Ｂ）で分析された１１個のシボディのＤＮＡ配列を合成し（遺伝子合成）、対応する結合剤を発現し、精製し、表面プラズモン共鳴により一つずつ分析した。ＳＰＲデータを、３分洗浄後の残余結合シグナルとして（オフレートの評価基準）、ｙ軸上にＢ）において示されるＮｅｓｔＬｉｎｋにより決定されるシボディの比率に対して、ｘ軸上にプロットする。
【図５】免疫されたアルパカ由来の３’４６９ナノボディの分析、および溶液中で最も強い高原結合を示すそれらの同定。低い発現レベル（工程１）と溶解性（工程２、単量体ナノボディの選択）それらのプールメンバーの排除後、プールの単量体画分を３つの異なる化学量論比で膜タンパク質抗原とインキュベートし、ＳＥＣにより分析した。ＬＣ−ＭＳサンプルを工程１（各個々のプールメンバーの発現レベルについて報告する）の後、工程２（各個々のメンバーの溶解性について報告する）で、そして工程３ですべての標的／複合体ピークから集めた。円グラフは、各ナノボディについての全ＭＳ１強度の合計（１００％＝全ナノボディの全フライコードの全ＭＳ１強度の合計）によって決定されるように、選択手順の異なる段階におけるプール中の各ナノボディの相対量（非結合剤または弱い結合剤はまとめて薄い灰色とし、プールメンバーの総量は１００％に相当する）を表す。工程３について予想されるように、抗原に対するプールの比率の増加は、限られた量の抗原に対する多くの結合プールメンバーの内部競合の増加をもたらす。したがって、最も強い親和性を有するプールメンバーの画分が、限られたエピトープに対するより高い競合で増加する。
【図６】Ａ：生成された外膜タンパク質標的に対するインビトロ選択（工程１）により生成された、目的のグラム陰性菌での細胞表面結合について（工程２）のプール由来の１’４５６シボディの分析。工程２（ＮｅｓｔＬｉｎｋ）において、低い発現レベルと溶解性を有するそれらのプールメンバーは、最初に集団から排除され、その後、４つの異なるプルダウン実験が目的の４つの異なる細菌株を用いて行われた。洗浄により高いアフィニティで細胞に結合しなかったプールメンバーの除去後、プールのすべてのフライコードを単離し、ＬＣ−ＭＳにより分析した。その後、シボディに対するすべてのフライコードのすべてのＭＳ１強度の合計は、各標的細胞でプール中の各個々のシボディの相対濃度についての評価基準として使用できた。これは、各シボディ（ｘ軸）について、４つの細胞型の各々でのその相対濃度（全プールと比較した）を報告する明白な細胞−特異的読み出し（Ｂ）を可能とした。明確にするため、すべての分析されたシボディのうち２５％のみがＢに示される。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
ポリペプチドのライブラリーからポリペプチドを選択する方法
第１の実施態様によれば、ポリペプチドのライブラリーからポリペプチドを選択する方法が提供される。その方法は、以下の工程を含む。
【００６６】
ａ．第１の核酸ライブラリーが提供される。その第１の核酸ライブラリーの各メンバーは、第１のポリペプチドライブラリーのメンバーをコードするポリペプチド−エンコーディング配列を含む。その第１の核酸ライブラリーの各メンバーは、第１の核酸ライブラリーのいずれの他のメンバーとも異なる。
【００６７】
ｂ．第２の核酸ライブラリーが提供される。その第２のライブラリーは複数のメンバーを含む。各メンバーは、検出タグをコードするタグ−エンコーディング配列を含む。各検出タグは、以下の特徴を有する。
【００６８】
ｉ．タグは、第２の核酸ライブラリーによりコードされたいずれの他の検出タグのアミノ酸配列とも相違するアミノ酸配列によって特徴付けられる。
ii．タグは、２００Ｄａから５０００Ｄａの間の分子量によって特徴づけられる。特定の実施形態においては、タグは、５００Ｄａから２５００Ｄａの間の分子量によって特徴づけられる。特定の実施形態においては、タグは、９００Ｄａから２２００Ｄａの間の分子量によって特徴づけられる。特定の実施形態においては、タグは、９０３Ｄａから２１８０Ｄａの間の分子量によって特徴づけられる。
iii．タグは、第１の分離可能なエレメントを含む。
【００６９】
ｃ．前記第１の核酸ライブラリーの前記メンバーに含まれる前記ポリペプチド−エンコーディング配列が、前記第２の核酸ライブラリーのメンバーに挿入される。それにより、タグが付されたポリペプチドライブラリーをコードするタグが付された核酸ライブラリーを作製する。前記タグが付されたポリペプチドライブラリーの各メンバーが、ポリペプチドおよび検出タグを含む。その検出タグは、前記第１の分離可能なエレメントにより前記ポリペプチドから分離される。
【００７０】
タグが付されたポリペプチドライブラリーは、第１の核酸ライブラリーのポリペプチド−エンコーディング配列が第２の核酸ライブラリーのメンバー内に「ネスト化」されるため、「ネスト化ライブラリー」である。第２の核酸ライブラリーは、タグが付された核酸ライブラリーよりも数倍大きい。タグが付された核酸ライブラリーは、第１の核酸ライブラリーよりも数倍大きい。
【００７１】
タグが付された核酸ライブラリー内において、第１の核酸ライブラリーの各ポリペプチド−エンコーディング配列は、第２の核酸ライブラリーのタグ−エンコーディング配列と結合される。結合はフレーム内で生じる。ポリペプチド−エンコーディング配列は、タグが付された核酸ライブラリーのメンバーが適切な宿主に導入された後、適切な宿主において転写およびその後の翻訳に付される位置に挿入される。細菌細胞への導入は、形質転換によって達成することができる。非細菌細胞への導入は、トランスフェクションによって達成することができる。当業者は、翻訳には宿主が必ずしも必要でないということは認識している。インビトロ翻訳技術も用いることができる。無細胞発現系についての総説については、Rosenblum, FEBS Lett. 2014 Jan21; 588(2):261-8およびZemella, Chembiochem. 2015 Nov; 16(17):2420-31を参照。ポリペプチド−エンコーディング配列およびタグ−エンコーディング配列は、同一の発現された配列内に形質転換される。
【００７２】
タグが付された核酸ライブラリーは、第１の核酸ライブラリーの全てのポリペプチド−エンコーディング配列を含むが、第２の核酸ライブラリーのタグ−エンコーディング配列のサブセットのみを含む。タグが付された核酸ライブラリーの各メンバーは、１つのポリペプチド−エンコーディング配列と１つのタグ−エンコーディング配列とのみを含む。各タグエンコーディング配列は、タグが付された核酸ライブラリーの１つのメンバーにのみ含まれる。言い換えれば、各タグ−エンコーディング配列は、タグが付された核酸ライブラリーのなかで唯一のものである。しかしながら、各ポリペプチド−エンコーディング配列は、タグが付された核酸ライブラリーの数個のメンバー内に含まれ得る（冗長タグ）。ある実施形態において、第１の核酸ライブラリーの各ポリペプチド−エンコーディング配列は、第２の核酸ライブラリーの少なくとも１つのタグ−エンコーディング配列と会合する。ある実施形態において、第１の核酸ライブラリーの各ポリペプチド−エンコーディング配列は、第２の核酸ライブラリーの少なくとも２つのタグ−エンコーディング配列と会合する。ある実施形態において、第１の核酸ライブラリーの各ポリペプチド−エンコーディング配列は、第２の核酸ライブラリーの少なくとも５つの異なるタグ−エンコーディング配列と会合する。ある実施形態において、第１核酸ライブラリーの各ポリペプチド−エンコーディング配列は、第２の核酸ライブラリーの少なくとも１０の異なるタグ−エンコーディング配列と会合する。ある実施形態において、第１の核酸ライブラリーの各ポリペプチド−エンコーディング配列は、平均して、第２の核酸ライブラリーの１０〜３０の異なるタグ−エンコーディング配列と会合する。ある実施形態において、第１の核酸ライブラリーの各ポリペプチド−エンコーディング配列は、平均して、第２の核酸ライブラリーのおおよそ２０の異なるタグ−エンコーディング配列と会合する。
【００７３】
ｄ．複数の核酸配列が、タグが付された核酸ライブラリーからを得られる。特に、核酸配列は、タグが付された核酸ライブラリーの全てのメンバーに対して得られる。上記複数の核酸配列の各々が、ポリペプチド−エンコーディング配列およびタグ−エンコーディング配列を含む。
【００７４】
工程ｄで得られた配列情報に基づいて、データベースが構築される。データベースは、タグが付された核酸ライブラリーに含まれる全てのポリペプチドおよび全ての検出タグの配列を含む。当業者は、技術的な理由からデータベースは、タグが付された核酸ライブラリーの全ての単一メンバーを含むものではないということを認識している。配列は、核酸配列および／またはアミノ酸配列の形態とすることができる。データベースは、第２の核酸ライブラリーのタグ−エンコーディング配列のどのサブセットが、タグが付された核酸ライブラリーに含まれるかの情報を含む。データベースはまた、どのタグ−エンコーディング配列（複数の場合はそれぞれ）が所定のポリペプチド−エンコーディング配列と会合するかの情報を含む。
【００７５】
ｅ．質量分析フラグメンテーションパターンが、工程ｄにおいて得られたタグ−エンコーディング配列によりコードされた各検出タグについて予測される。当業者は、そのフラグメンテーションパターンが、単離された検出タグについて予測されるということ、第１の分離可能なエレメントを供することによりその会合されたポリペプチドから遊離される検出タグについて予測されるということを認識している。当業者は、フラグメンテーションパターンを予測することはまた、単離された検出タグの総質量を予測することを含むということを認識している。
【００７６】
ｆ．タグが付されたポリペプチドライブラリーは、タグが付された核酸ライブラリーから発現される。工程ｃに記載される冗長タグ化アプローチの結果として、タグが付されたポリペプチドライブラリーは、数個の異なる検出タグ（しかし、分子につきただ１つのタグ）を有する上記第１のポリペプチドライブラリーの所定のメンバーを含むことができる。複数の検出タグを介した第１のポリペプチドライブラリーのメンバーの曖昧な検出を容易にし、タグが付されたポリペプチドライブラリーのメンバーの生物物理学的特性への検出タグの潜在的な影響を最小化するため、冗長タグ化が好ましい。技術的な理由から、冗長性がさらに必要とされ、いくつかの検出タグは、それらが発現レベルを低下させるために検出されないことがあり、それらはサンプル調製中に失われるか、または質量分析計により分析される逆相カラムの疎水性ウィンドウ内に溶出されない。
【００７７】
ｇ．タグが付されたポリペプチドライブラリーのメンバーが選択工程において選択され、選択されたポリペプチドを得る。この選択工程は、規定の生物化学的基準を満たすタグが付されたポリペプチドライブラリーのそれらのメンバーを単離することを含む。言い換えれば、選択圧が、タグが付されたポリペプチドライブラリーにかけられる。この選択圧は、タンパク質の物理的分離を導かなければならず、それにより物理的に分離されたサブプールが生み出され、集められる。本発明の方法の重要な利点は、可能な選択基準の範囲が、タンパク質ディスプレイ法におけるよりも非常に高いことである。非限定的例によれば、基準は、標的分子に規定のアフィニティで結合する能力、規定の条件でのポリペプチドの安定性、規定の条件での特定の凝集挙動（例えば、モノマーとして優先的に存在など）、プロテアーゼへの耐性、組織浸透能力、血流からの速いまたは遅いクリアランス、血液脳関門を通過する能力、および主張における蓄積能力を含む。
【００７８】
ｈ．第１の分離可能なエレメントが切断される。それにより検出タグが選択されたポリペプチドから分離され、単離された検出タグが産生される。
【００７９】
ｉ．単離された検出タグが、次のやり方で同定、定量される。
ｉ．単離された検出タグのフラグメンテーションパターンが質量分析により記録される。フラグメンテーションパターンは、単離された検出タグの質量および疎水性に関する情報を提供する。フラグメンテーションパターンは単離された検出タグのアミノ酸配列に関する情報を生み出す。
ii．工程ｉで得られた質量およびフラグメンテーションパターンは、工程ｅにおいて予測された質量およびフラグメンテーションパターンと組み合わされる。それにより、単離された検出タグが同定される。質量分析により得られる情報とタグが付された核酸ライブラリーのシークエンシングにより得られる情報との組み合わせにより、所定の検出タグの曖昧でない同定が可能となる。
【００８０】
予測されたフラグメンテーションパターンと記録されたフラグメンテーションパターンとのマッチング精度は得点化でき、ポリペプリドライブラリーメンバーをランク付けすることができる。異なる選択条件間のポリペプチドランキングの比較は、ポリペプチドの種々の特徴（例えば、オフレート、組織分布、コンフォメーション特異的結合など）の相対的な評価基準として使用することができる。その比較は、冗長的にタグが付されたポリペプチドライブラリーメンバーについて最も正確であり、個々のタグの効率性を記録するフラグメンテーションパターンにおける相違点が平均化される。
【００８１】
予測されたフラグメンテーションパターンと記録されたフラグメンテーションパターンとのマッチング精度のスコアは、選択後にポリペプチドライブラリーメンバーの相対量の評価基準として使用することができる。相対量は、冗長的にタグが付されたポリペプチドライブラリーメンバーについて最も正確であり、個々のタグの効率性を記録するフラグメンテーションパターンにおける相違点が平均化される。
【００８２】
ｊ．工程ｉにおいて同定された検出タグをコードするタグ−エンコーディング配列を含む核酸配列は、工程ｄにおいて得られた複数の核酸配列から選択される。それにより工程ｉにおいて同定された検出タグと結合したタグが付されたポリペプチドライブラリーのメンバーを同定する工程
【００８３】
当業者は、工程ｇ〜工程ｊは、タグが付されたポリペプチドライブラリーの多数の異なるメンバーに対して並行して行われることを認識している。規定された基準を表示する数個のポリペプチドのプールは、工程ｇにおいて選択され、これらのポリペプチドの全てが、それらの検出タグの質量分析を経て同定される。当業者は、技術的な理由のために、すべての単一ポリペプチドがこの工程において同定され得るのではないことを認識している。
【００８４】
工程ｉにおいて行われる質量分析は定量的であり、したがって本発明の方法は、ポリペプチドの同定を可能とするのみならず、サンプルにおけるこのポリペプチドの量の定量も可能とする。
【００８５】
冗長的かつ独自のタグ化を確実にするために、以下の点が重要である。
ｉ）第１のライブラリーは、制限され規定されたサイズを有する。ある実施形態において、第１の核酸ライブラリーは、５〜１００，０００のサイズを有する。ある実施形態においては、第１の核酸ライブラリーは、１００〜５０，０００のサイズを有する。ある実施形態においては、第１の核酸ライブラリーは、５００〜５，０００のサイズを有する。
ii）第２の核酸ライブラリーは、第１のライブラリーの挿入工程の前で１０3〜１０11、とりわけ１０５〜１０１０、より特には１０６〜１０９、なおより特にはおおよそ１０８のサイズを有する。
iii）挿入工程後には、複数のポリペプチド／タグ組み合わせプラスミドの選択されたサブセットが、上記第１の核酸ライブラリーのメンバーの数の少なくとも３倍、特に少なくとも５倍、より特に少なくとも１５倍、なおより特に少なくとも２５倍である。
iv）複数のポリペプチド／タグ組み合わせプラスミドの選択されたサブセットは、上記第２の核酸ライブラリーのメンバーの数の５０％未満、特に５％未満、より特に０．５％未満、なおより特に０．０５％未満である。
【００８６】
ライブラリーのサイズは、工程ａに先立つ多様性制限工程により制御することができ、そこでは第１のライブラリーがより大きなプレーライブラリー由来のサブセットとして選択される。
【００８７】
本発明の方法は、タンパク質ディスプレイ法に要求される物理的遺伝型−表現型連鎖の非存在下でタンパク質ライブラリーの分析を可能とする。これは、タンパク質ライブラリーのメンバーに結合した大きな物理的実体（例えば、ファージやリボソームおよびエンコーディングＤＮＡやＲＮＡ）を有するという不利益を排除する。タンパク質スクリーニングでは通常のように個々のタンパク質を試験する代わりに、タンパク質ライブラリー全体を選択基準のプールとしてスクリーニングすることができる。しかしながら、たとえ全タンパク質プールが処理されたとしても、あらゆる単一タンパク質が個々に特徴付けられるので、読み出しはスクリーニングと同様である。これは、結合タンパク質（薬物、診断薬、研究ツールなど）の開発の分野において特に関連がある。さまざまなタンパク質特性を一度に何千もの候補で分析することができる。例示的な質問は、どの結合剤候補が安定で、可溶性で、そして単量体であるかであろう。
【００８８】
本発明の方法は、タンパク質治療の開発チェーンのまさに最初の段階で、「どの結合剤がインビボで最大の治療可能性を有するか」という関連する疑問に取り組むことを可能にする。治療可能性に関する疑問とは、どの結合剤が経口投与時に腸内の過酷な条件に耐えられるか？、どの結合剤が血液脳関門を通過するか？、どの結合剤が血液からの最適な腎クリアランス特性を示すか？、何千ものうちのどの結合剤が関連組織において良好な組織浸透を示すのか？である。
【００８９】
特定の実施形態において、検出タグは、−２７から１２８の間の疎水性値によって特徴付けられる。特定の実施形態において、検出タグは、−１から７０の間の疎水性値によって特徴付けられる。疎水性値は、それが単離された後の、すなわち第１の分離可能なエレメントの切断後の検出タグの質量に関連する。疎水性値は、会合されたアフィニティタグを含まない。
【００９０】
特定の実施形態では、タグが付されたポリペプチドライブラリーのメンバーが、アフィニティタグと会合される。そのようなアフィニティタグは、質量分析に先立ち、タグが付されたポリペプチドライブラリーの選択されたメンバーの、および／または検出タグそれ自身の精製を平易にすることができる。アフィニティタグおよびタグが付されたポリペプチドライブラリーのメンバーは、１つの一次アミノ酸配列内に含まれる。タグが付されたポリペプチドライブラリーの各メンバーは、ポリペプチドおよび検出タグを含む。アフィニティタグは、ポリペプチドまたは検出タグのいずれと会合していてもよい。
【００９１】
特定の実施形態では、アフィニティタグは、Ｈｉｓ−タグ、ＣＢＰ−タグ、ＣＹＤ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、ＳｔｒｅｐII−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、ＨＰＣ−タグ、ＧＳＴ−タグ、Ａｖｉ−タグ、ビオチン化タグ、Ｍｙｃ−タグ、３ｘＦＬＡＧ−タグおよびＭＢＰ−タグを含む群から選択される。
【００９２】
特定の実施形態では、検出タグはアフィニティタグと会合している。これらの例では、アフィニティタグは検出タグのＣ−末端に位置している。この配置は、検出タグがペプチダーゼによる分解から保護され、完全な検出タグと会合した分解していないポリペプチドのみがタンパク質精製中に確実に単離されるというさらなる利点を有する。当業者は、「アフィニティタグが検出タグのＣ−末端に位置する」という表現が必ずしもアフィニティタグが検出タグのＣ−末端に直接に位置することを意味するのではなく、アフィニティタグと検出タグとを分離するいくつかのアミノ酸のリンカーが存在し得ることを意味する。
【００９３】
特定の実施形態では、アフィニティタグは上記検出タグから第２の分理可能エレメントによって分離されており、上記第２の分理可能エレメントは、工程ｉの前に切断される。したがって、会合したアフィニティタグを含まない検出タグのみが質量分析法によって分析される。
【００９４】
検出タグの質量およびフラグメンテーションパターンの仕様は、会合したポリペプチドおよびアフィニティタグから分離された後、すなわち第１および第２の分離可能なエレメントの切断後のタグの質量およびフラグメンテーションパターンに関する。当業者は、質量分析に先立ち、検出タグが会合したアフィニティタグから遊離していない場合には、そのことが質量分析の結果に影響を与えることを認識している。すべての検出タグが同じアフィニティタグに会合されている場合、質量およびフラグメンテーションパターンの変化を考慮に入れることができるため、検出タグが第２の分離可能なエレメントの切断によりアフィニティタグから分離されている場合ほど効率的で明確ではないが、検出タグを同定することは依然として可能であろう。
【００９５】
特定の実施形態では、アフィニティタグはＨｉｓ−タグである。
【００９６】
特定の実施形態において、工程ｈは、エレクトロスプレーイオン化質量分析に連結された液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ）を介して単離された検出タグを分析することを含む。特定の実施形態において、この工程は液体逆相クロマトグラフィーを含む。単離された検出タグは、サンプルの複雑さを軽減するために逆相クロマトグラフィーによってそれらの疎水性に従って分離される。続いて、それらの質量およびペプチドフラグメンテーションパターンを質量分析法によって記録する。
【００９７】
特定の実施形態では、工程ｄは、５倍以上の範囲で完全なタグが付された発現ライブラリーのシークエンシングを含む。特定の実施形態では、工程ｄはタグが付された発現ライブラリーのディープシークエンシングを含む。
【００９８】
特定の実施形態では、工程ｄは、タグが付された核酸ライブラリーに含まれるポリペプチド−エンコーディング配列およびタグ−エンコーディング配列を一緒にシークエンシングベクターに挿入することを含む。ディープシークエンシングは通常、ＰＣＲ増幅工程を含む。本発明者らは、ＰＣＲ増幅が、タグが付されたライブラリーのメンバーの遺伝子セグメント間に有意な数の組換え事象をもたらすことに気付いた。したがって、彼らは、制限酵素消化およびライゲーションによるディープシークエンシングに必要な配列エレメントの結合を可能にする一組のディープシークエンシングプラスミドを構築し、それによりディープシークエンシングに先立ちネスト化ライブラリーをＰＣＲ増幅する必要性を排除した。
【００９９】
特定の実施形態では、単離された検出タグは、５〜３０個の連続したアミノ酸からなり、そして正に荷電した側鎖を有するアミノ酸を１つ、かつただ１つ含む。特定の実施形態において、単離された検出タグは７〜２１個の連続したアミノ酸からなり、そして正に荷電した側鎖を有するアミノ酸を１つ、かつただ１つ含む。特定の実施形態では、単離された検出タグは１１〜１５個の連続したアミノ酸からなり、そして正に荷電した側鎖を有するアミノ酸を１つ、かつただ１つ含む。
【０１００】
特定の実施形態では、正に荷電した側鎖を有するアミノ酸は、単離された検出タグのＣ−末端に位置する。特定の実施形態では、正に荷電した側鎖を有するアミノ酸は、アルギニン（Ｒ）およびリジン（Ｋ）から選択される。特定の実施形態では、正に荷電した側鎖を有するアミノ酸は、単離された検出タグのＣ−末端に位置するアルギニン（Ｒ）である。
【０１０１】
当業者は、正に荷電した側鎖を有するアミノ酸に加えて、単離された検出タグが中性のｐＨで別の正電荷を帯び、それが単離された検出タグのＮ末端の第一級アミンであることを認識している。
【０１０２】
特定の実施形態において、単離された検出タグは、配列エレメントＩの収集物から選択される配列エレメントＩを含み、上記配列エレメントＩは、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、ＧおよびＰから各々独立して選択される５〜１０、特には７アミノ酸からなる。
【０１０３】
特定の実施形態では、１つ、かつただ１つの正に荷電した側鎖を有するアミノ酸は、単離された検出タグのＣ−末端に位置し、残りのアミノ酸はＡ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、ＧおよびＰから独立して選択される。特定の実施形態では、正に荷電した側鎖を有する唯一のアミノ酸は、単離された検出タグのＣ−末端に位置するＲである。前記正に荷電した側鎖を有する１つのアミノ酸が、前記単離された検出タグのＣ−末端に位置し、特に、前記正に荷電した側鎖を有する１つのアミノ酸がＣ−末端アルギニンであり、単離された検出タグに含まれる残りのアミノ酸がＡ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、ＧおよびＰから独立して選択される
【０１０４】
単離された検出タグは、質量分析法、特にＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳと連結した液体逆相クロマトグラフィー）によって最適に検出可能である。アミノ酸ＣおよびＭは、酸化されやすいので、検出タグの設計において除外された。アミノ酸Ｋ、ＲおよびＨは、それらがタグに正に荷電した側鎖を有するさらなるアミノ酸を付加するであろうことから、配列エレメントＩにおいて除外された。これは、タグがＥＳＩ−ＭＳ検出中にさらなる電荷を帯び、最適な検出範囲を外れるため望ましくなかった。ＫおよびＲは付加的なトリプシン切断部位をタグ配列に付加するであろうが、これは望ましくない。
【０１０５】
検出タグのアミノ酸配列にＫを付加すると、もう１つ第一級アミンが付加されることとなり、ＮＨＳ化学を用いた質量分析による相対的および絶対的定量のための同重体タグによる検出タグの標識化を複雑にするであろう。
【０１０６】
特定の実施形態では、単離された検出タグは、
ａ．Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、ＧおよびＰから各々独立して選択される５〜１０、特には７連続アミノ酸からなる配列エレメントＩ；および
ｂ．配列番号１（ＷＲ）、配列番号２（ＷＬＲ）、配列番号３（ＷＱＳＲ）、配列番号４（ＷＬＴＶＲ）および配列番号５（ＷＱＥＧＧＲ）から選択される配列エレメントII
を含む。
【０１０７】
特定の実施形態では、単離された検出タグは、
ａ．ＧＳである配列エレメントIII；
ｂ．Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、ＧおよびＰから各々独立して選択される５〜１０、特には７アミノ酸からなる前記配列エレメントＩ；および
ｃ．配列番号１（ＷＲ）、配列番号２（ＷＬＲ）、配列番号３（ＷＱＳＲ）、配列番号４（ＷＬＴＶＲ）および配列番号５（ＷＱＥＧＧＲ）から選択される配列エレメントII
からなる。
【０１０８】
Ｎ−末端からＣ−末端への配列エレメントの順番は、配列エレメントIII、配列エレメントＩ、配列エレメントIIである。これらの検出タグは、ＥＳＩ−ＭＳによる感度の高い検出に最適な９０３から２１８０Ｄａの間の質量範囲内にあった。単離されたタグは、生理的ｐＨ以下で２つの正電荷、すなわち、Ｃ−末端およびＮ−末端第１級アミンにＲを担持する。単離された検出タグのＣ−末端の正電荷は、質量分析検出のためのタグのイオン化を容易にし、特有のトリプシン切断部位として作用するＣ−末端にアルギニンまたはリジンを有するペプチドは、質量分析により特に良好に検出することができる（好ましいイオン化特性）。各単離された検出タグにおいて、Ｎ−末端アミンは、第１級アミンのみであり、ＮＨＳ化学によりアミン結合に使用される。これは、例えばｉＴＲＡＱ（相対的定量および絶対的定量に対する同重体タグ）を行うために量的質量分析のためのラベルを取り付けることを可能とする。検出タグを標準逆相クロマトグラフィーカラムによるペプチド分離に理想的に適した疎水性の範囲を表示するように設計した。
【０１０９】
特定の実施形態では、第１の核酸ライブラリーに含まれる全ての配列エレメントＩは一緒に配列エレメントＩの収集物を構築する。配列エレメントＩの収集物内で、各アミノ酸は表１に特定された頻度で存在する。
【０１１０】
【表１】
2020502493.tif 000002
【０１１１】
特定の実施形態では、上記第１および／または第２の分離可能なエレメントの１つがプロテアーゼ認識配列であるかまたはプロテアーゼ認識配列を含む。特定の実施形態では、上記第１および上記第２の分離可能なエレメントの両方がプロテアーゼ認識配列であるかまたはプロテアーゼ認識配列を含む。
【０１１２】
特定の実施形態では、第１の分離可能なエレメントは、トロンビン認識配列であるかまたはトロンビン認識配列を含み、および／または上記第２の分離可能なエレメントは、トリプシン認識配列であるかまたはトリプシン認識配列を含む、
【０１１３】
ポリペプチドの収集物
第２の実施態様によれば、ポリペプチドの収集物が提供される。ポリペプチドの収集物の各メンバーは、検出タグと会合する。特定の実施形態では、ポリペプチドの収集物の各メンバーは、少なくとも１つの検出タグと会合する。「少なくとも１つの検出タグと会合」との表現は、ポリペプチドの収集物の各メンバーは１つよりも多い検出タグと会合することができるが、ポリペプチド分子につきただ１つのタグのみという事実を意味する。言い換えれば、ポリペプチドの収集物は、検出タグＸと会合したポリペプチドＡ、および検出タグＹと会合したポリペプチドＡを含むが、検出タグＸとＹの両方と会合したポリペプチドは含まない。特定の実施形態では、ポリペプチドの収集物の各メンバーは少なくとも２つの検出タグと会合する。特定の実施形態では、ポリペプチドの収集物の各メンバーは、少なくとも５つの検出タグと会合する。特定の実施形態では、ポリペプチドの収集物の各メンバーは、少なくとも１０個の検出タグと会合する。特定の実施形態では、ポリペプチドの収集物の各メンバーは、おおよそ２０個の検出タグと会合する。各検出タグは、次の特徴を有する。
ａ．タグは、複数の発現ベクターによりコードされたいかなる他の検出タグのアミノ酸配列とも異なるアミノ酸配列により特徴づけられる。
ｂ．タグは、２００から５０００Ｄａの間の分子量により特徴付けられる。特定の実施形態では、タグは、５００から２５００Ｄａの間の分子量により特徴付けられる。特定の実施形態では、タグは、おおよそ９００からおおよび２２００Ｄａの間の分子量により特徴づけられる。特定の実施形態では、タグは、９０３から２１８０Ｄａの間の分子量により特徴付けられる。
ｃ．タグは、第１の分離可能なエレメントにより上記ポリペプチドの収集物の上記メンバーから分離される。
【０１１４】
本発明の第２の実施態様の特定の実施形態では、検出タグは、−２７から１２８の間の疎水性値により特徴付けられる。特定の実施形態では、−１から７０の間の疎水性値により特徴付けられる。
【０１１５】
本発明の第２の実施形態の特定の実施形態では、ポリペプチドの収集物のメンバーはアフィニティタグと会合される。
【０１１６】
本発明の第２の実施形態の特定の実施形態では、検出タグはアフィニティタグと会合される。アフィニティタグおよび検出タグは、同一の一次アミノ酸配列内に含まれる。アフィニティタグは、第２の分離可能なエレメントにより検出タグから分離される。検出タグは、第２の分離可能なエレメントの切断によりアフィニティタグから遊離することができる。特定の実施形態では、アフィニティタグは、Ｈｉｓ−タグ、ＣＢＰ−タグ、ＣＹＤ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、ＳｔｒｅｐII−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、ＨＰＣ−タグ、ＧＳＴ−タグ、Ａｖｉ−タグ、ビオチン化タグ、Ｍｙｃ−タグ、３ｘＦＬＡＧ−タグおよびＭＢＰ−タグを含む群より選択される。特定の実施形態では、アフィニティタグはＨｉｓ−タグである。
【０１１７】
特定の実施形態では、単離された検出タグは、５〜３０個の連続したアミノ酸からなり、そして正に荷電した側鎖を有するアミノ酸を１つ、かつただ１つ含む。特定の実施形態において、単離された検出タグは７〜２１個の連続したアミノ酸からなり、そして正に荷電した側鎖を有するアミノ酸を１つ、かつただ１つ含む。特定の実施形態では、単離された検出タグは１１〜１５個の連続したアミノ酸からなり、そして正に荷電した側鎖を有するアミノ酸を１つ、かつただ１つ含む。
【０１１８】
特定の実施形態では、正に荷電した側鎖を有するアミノ酸は、単離された検出タグのＣ−末端に位置する。特定の実施形態では、正に荷電した側鎖を有するアミノ酸は、アルギニン（Ｒ）およびリジン（Ｋ）から選択される。特定の実施形態では、正に荷電した側鎖を有するアミノ酸は、単離された検出タグのＣ−末端に位置するアルギニン（Ｒ）である。
【０１１９】
本発明の第２の実施態様の特定の実施形態では、検出タグは、
ａ．Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、ＧおよびＰから各々独立して選択される５〜１０、特には７連続アミノ酸からなる配列エレメントＩ；および
ｂ．配列番号１（ＷＲ）、配列番号２（ＷＬＲ）、配列番号３（ＷＱＳＲ）、配列番号４（ＷＬＴＶＲ）および配列番号５（ＷＱＥＧＧＲ）から選択される配列エレメントII
を含む。
【０１２０】
検出タグ
第３の実施態様によれば、ペプチド検出タグが提供され、質量分析による最適な検出のために設計される。検出タグは、４〜２０のアミノ酸からなり、次の特徴を有する。
ａ．検出タグは、正に荷電した側鎖を有するアミノ酸をただ１つ含む。
ｂ．検出タグは、２００から５０００Ｄａの間の分子量により特徴付けられる。特定の実施形態では、検出タグは、５００から２５００Ｄａの間の分子量により特徴付けられる。特定の実施形態では、検出タグは、おおよそ９００からおおよび２２００Ｄａの間の分子量により特徴づけられる。特定の実施形態では、検出タグは、９０３から２１８０Ｄａの間の分子量により特徴付けられる。
【０１２１】
第３の実施態様の特定の実施形態では、検出タグは７〜１８アミノ酸からなる。第３の実施態様の特定の実施形態では、検出タグは、１１〜１５アミノ酸からなる。
【０１２２】
第３の実施態様の特定の実施形態では、検出タグは、本質的には、
ａ．Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、ＧおよびＰから各々独立して選択される５〜１０、特には７アミノ酸からなる配列エレメントＩ；および
ｂ．配列番号１（ＷＲ）、配列番号２（ＷＬＲ）、配列番号３（ＷＱＳＲ）、配列番号４（ＷＬＴＶＲ）および配列番号５（ＷＱＥＧＧＲ）から選択される配列エレメントII
からなる。
【０１２３】
検出タグの収集物
別の実施態様によれば、ペプチドタグの収集物が提供される。ペプチドタグの収集物は、本発明の第３の実施態様にしたがいペプチドタグを含む。ペプチドタグの収集物に含まれる各検出タグは、４〜２０アミノ酸からなり、上記検出タグの収集物に含まれるいかなる他の検出タグのアミノ酸配列とも異なるアミノ酸配列によって特徴づけられる。特定の実施形態では、各検出タグは、７〜１８アミノ酸からなる。特定の実施形態では、各検出タグは、１１〜１５アミノ酸からなる。特定の実施形態では、ペプチドタグの収集物は、少なくとも９６個のペプチドタグを含む。特定の実施形態では、ペプチドタグの収集物は、少なくとも５０００００個のペプチドタグを含む。特定の実施形態では、ペプチドタグの収集物は、少なくとも１０7個のペプチドタグを含む。特定の実施形態では、ペプチドタグの収集物はおおよそ１０8個のペプチドタグを含む。
【０１２４】
本発明のこの特定の実施形態では、検出タグは、正に荷電した側鎖を有するアミノ酸をただ１つ含み、残りのアミノ酸はＡ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、ＧおよびＰから選択される。
【０１２５】
本発明のこの実施態様の特定の実施形態では、検出タグは、−２７から１２８の間の疎水性値により特徴付けられる。特定の実施形態では、検出タグは−１から７０の間の疎水性値により特徴付けられる。
【０１２６】
本発明のこの実施形態の特定の実施形態では、検出タグはアフィニティタグと会合される。特定の実施形態では、アフィニティタグは、Ｈｉｓ−タグ、ＣＢＰ−タグ、ＣＹＤ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、ＳｔｒｅｐII−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、ＨＰＣ−タグ、ＧＳＴ−タグ、Ａｖｉ−タグ、ビオチン化タグ、Ｍｙｃ−タグ、３ｘＦＬＡＧ−タグおよびＭＢＰ−タグを含む群より選択される。特定の実施形態では、アフィニティタグはＨｉｓ−タグである。アフィニティタグおよび検出タグは、同一の一次アミノ酸配列内に含まれる。アフィニティタグは、分離可能なエレメントにより検出タグから分離される。
【０１２７】
本発明のこの実施形態の特定の実施形態では、検出タグは、本質的には、
ａ．Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、ＧおよびＰから各々独立して選択される５〜１０、特には７アミノ酸からなる配列エレメントＩ；および
ｂ．配列番号１（ＷＲ）、配列番号２（ＷＬＲ）、配列番号３（ＷＱＳＲ）、配列番号４（ＷＬＴＶＲ）および配列番号５（ＷＱＥＧＧＲ）から選択される配列エレメントII
からなる。
【０１２８】
プラスミドベクターの収集物
また別の実施態様によれば、プラスミドベクターの収集物が提供される。上記プラスミドベクターの収集物の各メンバーは、検出タグをコードする核酸配列を含む。プラスミドベクターの収集物に含まれる各検出タグは、４〜２０アミノ酸からなり、上記プラスミドベクターの収集物に含まれるいかなる他の検出タグのアミノ酸配列とも異なるアミノ酸配列によって特徴づけられる。特定の実施形態では、各検出タグは、７〜１８アミノ酸からなる。特定の実施形態では、各検出タグは、１１〜１５アミノ酸からなる。特定の実施形態では、プラスミドベクターの収集物は、少なくとも９６個のプラスミドベクターを含む。特定の実施形態では、プラスミドベクターの収集物は、少なくとも５０００００個のプラスミドベクターを含む。特定の実施形態では、プラスミドベクターの収集物は、少なくとも１０7個のプラスミドベクターを含む。特定の実施形態では、プラスミドベクターの収集物はおおよそ１０8個のプラスミドベクターを含む。
【０１２９】
本発明のこの特定の実施形態では、検出タグは、正に荷電した側鎖を有するアミノ酸をただ１つ含む。
【０１３０】
本発明のこの実施態様の特定の実施形態では、検出タグは２００から５０００Ｄａの間の分子量により特徴付けられる。特定の実施形態では、検出タグは５００から２５００Ｄａの間の分子量により特徴付けられる。特定の実施形態では、検出タグは９００から２２００Ｄａの間の分子量により特徴づけられる。特定の実施形態では、検出タグは９０３から２１８０Ｄａの分子量により特徴付けられる。
【０１３１】
本発明のこの実施態様の特定の実施形態では、検出タグは、−２７から１２８の間の疎水性値により特徴付けられる。特定の実施形態では、検出タグは−１から７０の間の疎水性値により特徴付けられる。
【０１３２】
本発明のこの実施形態の特定の実施形態では、検出タグはアフィニティタグと会合される。特定の実施形態では、アフィニティタグは、Ｈｉｓ−タグ、ＣＢＰ−タグ、ＣＹＤ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、ＳｔｒｅｐII−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、ＨＰＣ−タグ、ＧＳＴ−タグ、Ａｖｉ−タグ、ビオチン化タグ、Ｍｙｃ−タグ、３ｘＦＬＡＧ−タグおよびＭＢＰ−タグを含む群より選択される。特定の実施形態では、アフィニティタグはＨｉｓ−タグである。アフィニティタグおよび検出タグは、同一の一次アミノ酸配列内に含まれる。アフィニティタグは、第２の分離可能なエレメントにより検出タグから分離される。
【０１３３】
本発明のこの実施形態の特定の実施形態では、検出タグは、本質的には、
ａ．Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、ＧおよびＰから各々独立して選択される５〜１０、特には７アミノ酸からなる配列エレメントＩ；および
ｂ．配列番号１（ＷＲ）、配列番号２（ＷＬＲ）、配列番号３（ＷＱＳＲ）、配列番号４（ＷＬＴＶＲ）および配列番号５（ＷＱＥＧＧＲ）から選択される配列エレメントII
からなる。
【０１３４】
本発明のこの実施形態の特定の実施形態では、プラスミドベクターの収集物の各メンバーは、
ａ．５’で第１のエンドヌクレアーゼ制限酵素部位に、かつ３’で第２エンドヌクレアーゼ制限酵素部位に隣接したネガティブ選択カセット；
ｂ．第１のエンドヌクレアーゼ制限酵素部位の５’に位置するプロモータ
ｃ．第２のエンドヌクレアーゼ制限酵素部位の３’に位置し、検出タグをコードする核酸タグ配列を含む。特定の実施形態では、検出タグおよび第２のエンドヌクレアーゼ制限酵素部位をコードする核酸配列は、１００個未満の塩基により隔たれている。特定の実施形態では、検出タグおよび第２のエンドヌクレアーゼ制限酵素部位をコードする核酸配列は、５０個未満の塩基対により隔たれている。特定の実施形態では、検出タグおよび第２のエンドヌクレアーゼ制限酵素部位をコードする核酸配列は、２０個未満の塩基対により隔たれている。特定の実施形態では、検出タグおよび第２のエンドヌクレアーゼ制限酵素部位をコードする核酸配列の間に位置する塩基対は、第１の分離可能なエレメントをコードする。
【０１３５】
本発明のこの実施形態の特定の実施形態では、プラスミドベクターの収集物の各メンバーは、
ａ．検出タグをコードする核酸タグ配列（ポリペプチドをコードする核酸配列と同じリーディングフレーム内で会合）；
ｂ．シークエンシングの間のシグナル過負荷を防ぐための異なる塩基を含むダイバーシティエレメント；
ｃ．シークエンシングプライマーの結合のためのプライマー結合部位；
ｄ．多重化のための数個の規定された核酸配列の１つを含むプライマー結合部位；
ｅ．シークエンシングの間ＤＮＡ分子を固定するためのアダプターエレメント；
ｆ．シークエンシングに先立ちプラスミドベクターからＤＮＡフラグメントを放出するための、エレメントａ〜ｅに隣接する２つのエンドヌクレアーゼ制限酵素部位
を含む。
【０１３６】
上述の実施形態において説明されたプラスミドベクターは、ディープシークエンシングプラスミドとして供される。好ましくは、これらのベクターは、シークエンシングされるフラグメントの長さを短くするためアフィニティタグを含まない。
【０１３７】
タンパク質検出方法
別の実施態様によれば、タンパク質検出の方法が提供される。この方法は、次の工程を含む。
ａ．ポリペプチドライブラリーをコードする核酸ライブラリーが提供される。ポリペプチドライブラリーに含まれる各ポリペプチドが検出タグと会合される。ポリペプチドおよび検出タグが、同一の一次アミノ酸配列内に含まれる。各検出タグは、以下の特徴を有する。
ｉ．タグは、核酸ライブラリーによりコードされたいかなる他の検出タグのアミノ酸配列とも異なるアミノ酸配列により特徴づけられる。
ii．タグは、２００から５０００Ｄａの間の分子量により特徴付けられる。特定の実施形態では、タグは、５００および２５００Ｄａの間の分子量により特徴付けられる。特定の実施形態では、タグはおおよそ９００からおおよそ２２００Ｄａの間の分子量により特徴づけられる。特定の実施形態では、タグは、９０３から２１８０Ｄａの間の分子量により特徴付けられる。
iii．タグは、第１の分離可能なエレメントにより会合したポリペプチドから分離される。
【０１３８】
核酸ライブラリーによりコードされた各検出タグは、核酸ライブラリーによりコードされたいかなる他の検出タグに関しても固有のものである。ポリペプチドライブラリーに含まれる各ポリペプチドは、少なくとも１つの検出タグと会合する。特定の実施形態では、ポリペプチドライブラリーに含まれる各ポリペプチドは、少なくとも２つの検出タグと会合する。特定の実施形態では、ポリペプチドライブラリーに含まれる各ポリペプチドは、少なくとも５つの検出タグと会合する。特定の実施形態では、ポリペプチドライブラリーに含まれる各ポリペプチドは、少なくとも１０個の検出タグと会合する。特定の実施形態では、ポリペプチドライブラリーに含まれる各ポリペプチドは、おおよそ２０この検出タグと会合する。各ポリペプチド分子は、ただ１つの検出タグを含む。
【０１３９】
ｂ．データベースが提供される。データベースは次の情報を含む。
ｉ複数の核酸および／またはアミノ酸配列。複数の配列が核酸ライブラリーの全てのメンバーの配列を含む。配列の各々はポリペプチドを特定する配列および検出タグを特定する配列を含む。
ii．核酸ライブラリーによりコードされた各検出タグに対する質量分析フラグメンテーションパターン。
【０１４０】
ｃ．ポリペプチドライブラリーは酸ライブラリーから発現される。
【０１４１】
ｄ．ポリペプチドライブラリーのメンバーは、選択工程において選択され、選択されたポリペプチドを得る。
【０１４２】
ｅ．第１の分離可能なエレメントが切断される。検出タグは、選択されたポリペプチドから分離され、単離された検出タグが得られる。
【０１４３】
ｆ．単離された検出タグは、次の方法で同定される。
ｉ．単離された検出タグのフラグメンテーションパターンは、質量分析法により記録される。
ii．工程ｉで得られた前記フラグメンテーションパターンは、提供されたデータベースにおいて予想された前記フラグメンテーションパターンとマッチングされた。それにより単離された検出タグは同定される。タグが付された核酸ライブラリーの質量分析により得られた情報とシークエンシングにより得られた情報とを組み合わせることにより、所定の検出タグの明白な同定が可能となる。
【０１４４】
ｇ．工程ｆで同定された検出タグを特定する配列は、データベースに含まれる前記複数の配列から選択される。それにより、工程ｆで同定された検出タグと会合するポリペプチドライブラリーのメンバーが同定される。
【０１４５】
特定の実施形態では、ポリペプチドライブラリーの各メンバーはアフィニティタグと会合される。
【０１４６】
特定の実施形態では、各検出タグはアフィニティタグと会合する。
【０１４７】
特定の実施形態では、アフィニティタグは、Ｈｉｓ−タグ、ＣＢＰ−タグ、ＣＹＤ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、ＳｔｒｅｐII−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、ＨＰＣ−タグ、ＧＳＴ−タグ、Ａｖｉ−タグ、ビオチン化タグ、Ｍｙｃ−タグ、３ｘＦＬＡＧタグ、およびＭＢＰ−タグを含む群から選択される。
【０１４８】
特定の実施形態では、アフィニティタグは、検出タグから第２の分離可能なエレメントにより分離され、上記第２の分離可能なエレメントが、工程ｆより前に分離される。したがって、会合したアフィニティタグのない検出タグのみが質量分析により分析される。
【０１４９】
検出タグの質量およびフラグメンテーションパターンの仕様は、会合したポリペプチドおよびアフィニティタグから分離された後、すなわち第１および第２の分離可能なエレメントの切断後のタグの質量およびフラグメンテーションパターンに関する。当業者は、質量分析に先立ち、検出タグが会合したアフィニティタグから遊離していない場合には、そのことが質量分析の結果に影響を与えることを認識している。すべての検出タグが同じアフィニティタグに会合されている場合、質量およびフラグメンテーションパターンの変化を考慮に入れることができるため、検出タグが第２の分離可能なエレメントの切断によりアフィニティタグから分離されている場合ほど効率的で明確ではないが、検出タグを同定することは依然として可能であろう。
【０１５０】
特定の実施形態では、アフィニティタグはＨｉｓ−タグである。
【０１５１】
当業者は、工程ｄ〜工程ｇは、ポリペプチドライブラリーの多数の異なるメンバーに対して並行して行われることを認識している。数個のポリペプチドのプールは、工程ｇにおいて選択され、これらのポリペプチドの全てが、それらの検出タグの質量分析を経て同定される。当業者は、技術的な理由のために、すべての単一ポリペプチドがこの工程において同定され得るのではないことを認識している。
【０１５２】
工程ｆにおいて行われる質量分析は定量的であり、したがって本発明の方法は、ポリペプチドの同定を可能とするのみならず、サンプルにおけるこのポリペプチドの量の定量も可能とする。
【０１５３】
ポリペプチドを固有の検出タグと会合する方法
また別の実施態様によれば、ポリペプチドを固有の検出タグと会合する方法が提供される。その方法は、次の工程を含む。
ａ．第１の核酸ライブラリーが提供される。第１の核酸ライブラリーの各メンバーは、第１のポリペプチドライブラリーのメンバーをコードするポリペプチド−エンコーディング配列を含む；
ｂ．第２の核酸ライブラリーが提供される。第２の核酸ライブラリーの各メンバーは検出タグをコードするタグ−エンコーディング配列を含む。検出タグは次の特徴を有する。
ｉ．タグは、第２の核酸ライブラリーによりコードされたいかなる他の検出タグのアミノ酸配列とも異なるアミノ酸配列により特徴づけられる。
ii．タグは２００から５０００Ｄａの間の分子量により特徴付けられる。特定の実施形態では、タグは５００から２５００Ｄａの間の分子量により特徴付けられる。特定の実施形態では、おおよそ９００からおおよそ２２００Ｄａの間の分子量により特徴づけられる。特定の実施形態では、タグは、９０３から２１８０Ｄａの間の分子量により特徴付けられる。
ｃ．第１の核酸ライブラリーのメンバーに含まれるポリペプチド−エンコーディング配列は、第２の核酸ライブラリーのメンバーに挿入される。それにより、複数のポリペプチド−タグ組み合わせプラスミドが生成される。
第１の核酸ライブラリーは５〜１０００００のサイズを有する。特定の実施形態では、第１の核酸ライブラリーは１００〜５００００のサイズを有する。特定の実施形態では、第１の核酸ライブラリーは５００〜５０００のサイズを有する。
第２の核酸ライブラリーは１０3〜１０11のサイズを有する、特定の実施形態では、第２の核酸ライブラリーは１０5〜１０10のサイズを有する。特定の実施形態では、第２の核酸ライブラリーは１０6〜１０9のサイズを有する。特定の実施形態では、第２の核酸ライブラリーはおおよそ１０8のサイズを有する。
複数のポリペプチド／タグ組み合わせプラスミド内で、第１の核酸ライブラリーの各ポリペプチド−エンコーディング配列は、第２の核酸ライブラリーのタグ−エンコーディング配列に会合される。会合は、同じリーディングフレーム内で生じる。
ｄ．複数のポリペプチド−タグ組み合わせプラスミドのサブセットが選択される。この選択工程は、規定の数のクローンを選択することを含み、各クローンは、複数のポリペプチド−タグ組み合わせプラスミドの１つのメンバーを含む。それにより、タグが付されたポリペプチドライブラリーをコードするタグが付された核酸ライブラリーを生成する。タグが付されたポリペプチドライブラリーの各メンバーは、ポリペプチドおよび検出タグを含む。各タグは、タグが付されたポリペプチドライブラリーのただ１つのメンバーに含まれる。言い換えれば、各検出タグは、タグが付されたポリペプチドライブラリー内にただ１つである。しかしながら、各ポリペプチドは、タグが付されたポリペプチドライブラリーの数個のメンバーを含む（冗長タグ化）。
特定の実施形態では、各ポリペプチドは、少なくとも１つの検出タグと会合する。特定の実施形態では、各ポリペプチドは、少なくとも２つの検出タグと会合する。特定の実施形態では、各ポリペプチドは、少なくとも５つの検出タグと会合する。特定の実施形態では、各ポリペプチドは、少なくとも１０個の検出タグと会合する。特定の実施形態では、各ポリペプチドは、おおよそ２０個の検出タグと会合する。
【０１５４】
本発明のこの実施態様の特定の実施形態では、複数のポリペプチド−タグ組み合わせプラスミドの選択されたサブセットは、第１の核酸ライブラリーのメンバーの数の少なくとも１０倍である。特定の実施形態では、複数のポリペプチド−タグ組み合わせプラスミドの選択されたサブセットは、第１の核酸ライブラリーのメンバーの数の少なくとも２０倍である。
【０１５５】
本発明のこの実施態様の特定の実施形態では、複数のポリペプチド−タグ組み合わせプラスミドの選択されたサブセットは、第２の核酸ライブラリーのメンバーの数の５０％未満である。本発明のこの実施態様の特定の実施形態では、複数のポリペプチド−タグ組み合わせプラスミドの選択されたサブセットは、第２の核酸ライブラリーのメンバーの数の５％未満である。本発明のこの実施態様の特定の実施形態では、複数のポリペプチド−タグ組み合わせプラスミドの選択されたサブセットは、第２の核酸ライブラリーのメンバーの数の０．０５％未満である。
【０１５６】
複数のポリペプチド−タグ組み合わせプラスミドの選択されたサブセットの最適なサイズを選択することにより、タグが付されたポリペプチドライブラリーにおいて、各検出タグはただ１つである（１回だけ存在）が、各ポリペプチドは、数回存在し、各回は異なる検出タグと会合する。
【０１５７】
単一の分離可能な特徴に対する代替物が本明細書において「実施形態」として配置される場合は常に、そのような代替物が自由に組み合わされて本明細書に開示される本発明の個別の実施形態を形成し得ることが理解されるべきである。
【０１５８】
本発明は、以下の実施例および図面によってさらに説明され、これから、さらなる実施形態および利点を引き出すことができる。これらの実施例は本発明を説明するためのものであり、その範囲を限定するためのものではない。
【実施例】
【０１５９】
フライコード配列ライブラリー
短いＤＮＡ−コードペプチドのランダム化ライブラリーは、質量分析（ＭＳ）、特にＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ連結液体逆相クロマトグラフィー）により最適に検出可能となるように設計された。ペプチドは、９０３と２１８０Ｄａとの質量範囲であり、ＥＳＩ−ＭＳによる敏感な検出に最適である。フライコードは、生理学的ｐＨおよびそれ以下で、２つの正の電荷、すなわちＣ−末端およびＮ−末端第１級アミンにＲを担持する。Ｃ−末端での正の電荷は、質量分析検出のためのペプチドのイオン化を容易にし、特有のトリプシン切断部位として作用する。各フライコードにおいて、Ｎ−末端アミンは、第１級アミンのみであり、単純なＮＨＳ化学によりアミン結合に使用される。これは、例えばｉＴＲＡＱ（相対的定量および絶対的定量に対する同重体タグ）を行うために量的質量分析のためのラベルを取り付けることを可能とする。フライコードを標準逆相クロマトグラフィーカラムによるペプチド分離に理想的に適した疎水性の範囲を表示するように設計した。
【０１６０】
フライコードライブラリーは、２つの部分に加えて、一定、すなわちＮ−末端にＧＳ、Ｃ−末端にＲである隣接アミノ酸からなる。Ｎ−末端「ＧＳ」配列は、トロンビンプロテアーゼ切断部位の一部であり、切断後にフライコードに残るものである。
【０１６１】
第１部：バーコード領域は、７つの連続して任意抽出されたアミノ酸位置を含む。アミノ酸の平均頻度は、上記表１に示す（％で）。
【０１６２】
１２個の天然アミノ酸のすべてがバーコードに存在するとは限らない（Ｃ、Ｍ、Ｋ、Ｒ、ＨおよびＩを欠いている）。ＣおよびＭは酸化されやすいため除外した。Ｋ、ＲおよびＨは、フライコード配列に追加の正電荷を付加するであろうことから除外した。付加は、そのような場合にペプチドがＥＳＩ−ＭＳ検出の間に追加の電荷を帯び、最適な検出範囲を外れるため望ましくなかった。ＫおよびＲは、フライコード配列にさらなるトリプシン切断部位を付加するであろうが、これは望ましくない。Ｋはもう１つの第一級アミンを加えるであろうが、それはＮＨＳ化学によるペプチド標識を複雑にするだろう。イソロイシンは、質量においてロイシンと区別できないため除外した。
【０１６３】
第２部：フライコードライブラリーにおいて頻度が等しく、すべての末端にＲを有する５つの異なる変異体においてＣ−末端を構築した。それらは、同様にＣ、Ｍ、Ｋ、ＨおよびＩを欠いている。したがって、フライコードは最小で１１個のアミノ酸および最大で１５個のアミノ酸からなる（ＧＳ＋７個のランダム化残基＋２〜６個のＣ−末端残基）。５つの異なるＣ−末端の終わりがここにリストされている。
配列番号１（ＷＲ）、配列番号２（ＷＬＲ）、配列番号３（ＷＱＳＲ）、配列番号４（ＷＬＴＶＲ）および配列番号５（ＷＱＥＧＧＲ）
【０１６４】
フライコードを含むＮｅｓｔＬｉｎｋ発現ベクターｐＬＮｘ
ＮｅｓｔＬｉｎｋ発現ベクターｐＬＮｘは、多様な１０8配列変異体を有するフライコードライブラリー（図２）を抱え、目的のタンパク質ライブラリー（ＰＬＯＩ）を、フライコードを有するフレームに導入することができる。２つのライブラリー（ＰＬＯＩおよびフライコードライブライ）が互いに入れ子になるので、この工程の結果は「ネスト化ライブライ」となる。発現ベクターは、ネスト化ライブラリー（フライコードに融合されたＰＬＯＩ）の制限酵素による切り出しも可能とし、ディープシークエンシングプラスミドへの挿入を可能とし、また二本鎖オリゴヌクレオチド（アダプター）を用いて直接的なイルミナ  ＭｉＳｅｑアダプターライゲーションを行うこともできる。ＰＬＯＩは任意の遺伝的にコードされたライブラリーであっても良い点に注意。
【０１６５】
ＰＬＯＩは、ライブラリーをコードする供給源ＤＮＡを制限消化し、続いて発現ベクターにライゲーションすることにより発現ベクターに導入される。本発明者らはこの目的のためにＩＩＳ型制限酵素（ＳａｐＩ）を使用する。供給源ＤＮＡは、典型的には、ファージディスプレイ選択後に得られ、ＰＬＯＩがＰＣＲ増幅なしでＮｅｓｔＬｉｎｋ発現ベクター（このベクターの説明、下記参照）にサブクローニングすることができるように方向付けられたＳａｐＩ部位を含むファージミドに由来する。ＰＬＯＩが挿入されると、それはネガティブ選択カセット（ｃｃｄＢ）に置き換わり、挿入工程の効率を大いに向上させる。
【０１６６】
フライコードはトロンビンによってＰＬＯＩから切り離され、Ｈｉｓ−タグがトリプシンによりフライコードから除去される。これらの開裂は、最適な質量、最適な疎水性および最適な電荷を有するペプチドが質量分析のために単離されることを確実にする（上記のフライコードの説明を参照）。プロテアーゼの他の任意の組み合わせが同じ目的のために使用され得ることもまた考えられる。
【０１６７】
注目すべきは、フライコードのＣ−末端アルギニン（Ｒ）が重要な役割を果たすことである：第一に、リジンまたは他のアルギニンがフライコードライブラリーにおいて除外されているため、Ｃ−末端アルギニンはフライコードの唯一の正電荷アミノ酸である。このため、トリプシン（正に荷電した残基の後ろで開裂し、それ故にかなり非特異的であると考えられるプロテアーゼ）はアルギニンとＨｉｓ−タグとの間のペプチド結合を特異的に開裂するために使用できる（フライコードは、質量分析についてＨｉｓタグでかなり重過ぎるであろうし、Ｈｉｓタグは、質量分析の前の逆相クロマトグラフィーにおいて分離を低下させるであろう。）。質量分析用のＨｉｓタグおよびＨｉｓタグは、質量分析前の逆相クロマトグラフィーにおける分離を減少させるであろう）。第二に、Ｃ−末端アルギニンを有するペプチドは、質量分析法によって特に良好に検出可能であることが知られている（好ましいイオン化特性）。そして第三に、フライコード中に存在するこの単一の正に荷電したアミノ酸のために、総電荷は常に２＋（Ｎ末端＋アルギニン、他の全ての残基は検出の低いｐＨで中性である）であり、それはデータ分析を容易にする。
【０１６８】
この技術の重要な側面は、目的のタンパク質ライブラリーの同一のメンバーに数個の固有のフライコードを付けることが可能である（そして必要である）という事実である。例えば、１００種類のタンパク質のプールを分析するには、平均してプールの各タンパク質が異なるフライコードに２０回リンクされるように、２０００種類のフライコードをこれらの１００種類のタンパク質に取り付ける（プールメンバーとフライコードとの比率は実際要望に応じて変えることができる）。冗長タグ付けは、多重フライコード配列を介したプールメンバーの明白な検出を容易にし、そして分析された目的のタンパク質の生物物理学的性質に対するフライコード配列の潜在的な影響を平均化する。冗長タグ付けはまた、選択されたサンプル内の異なるタンパク質ライブラリーメンバーの相対量、または異なる選択されたサンプル内の同じタンパク質ライブラリーメンバーの相対量の決定を可能にする。冗長性は技術的な理由からさらに必要とされる。フライコードは質量分析による最適検出用に設計されているが、一部のフライコードはサンプル調製中に失われるか、質量分析によって分析される逆相カラムの疎水性ウィンドウ内に溶出しないため検出されない。
【０１６９】
さらに、ＮｅｓｔＬｉｎｋ発現ベクターは、ディープシークエンシングプラスミドに挿入できるように、またはイルミナ  ＭｉＳｅｑアダプターを、二本鎖オリゴヌクレオチド（アダプター）を用いて直接連結することができるように、ネスト化ライブラリー（フライコードに融合したＰＬＯＩ）の切り出しを可能にする２つのＳｆｉＩ制限酵素認識部位を含む。この重要な工程の根拠を以下に示す。
【０１７０】
注目すべきは、ＰＬＯＩ内もしくはＰＬＯＩとフライコードとの間のいずれかのＳｆｉＩ制限部位および／または他の制限部位が、ネスト化ライブラリーにさらなる配列を加えるために使用できるということである。したがって、これらの追加の配列は、（フライコードとＰＬＯＩとの間、またはネスト化ライブラリーに隣接して）ネスト化ライブラリーへの融合として表現することができる。重要なことに、これらの追加の配列を導入する前に、ディープシークエンシングプラスミドへの移動（またはオリゴヌクレオチドによる直接のディープシークエンシングアダプターライゲーション）が行われるので、かかる配列はディープシークエンシングリード長（技術的理由により制限される）を増加させない。さらに、このように追加の配列を追加することは、フライコードとＰＬＯＩとの間の物理的連結を維持する。これは、ＰＬＯＩメンバーへのフライコードの正しい割り当てにとって絶対に重要である。
【０１７１】
ディープシークエンシングプラスミド
ディープシークエンシングプラスミドは、イルミナ  ＭｉＳｅｑによるディープシークエンシングに必要なすべての配列を担持し、ＮｅｓｔＬｉｎｋ発現ベクターからのネスト化ライブラリーメンバーのプールの挿入を可能にするベクターのセットである。
【０１７２】
ネスト化ライブラリーのディープシークエンシングプラスミドへの移動（図１および２）は、制限消化とライゲーションによって行われる。本発明者らは、制限酵素ＳｆｉＩを十分に高い特異性を有するのでこの目的のために使用した。このことは、偶然制限部位をコードしている可能性のあるライブラリー全体を消化する場合に極めて重要である。さらに、選択されたＳｆｉＩ認識部位は、発現構築物においてリンカーアミノ酸として使用することができる適度に柔軟で親水性のアミノ酸に翻訳される。
【０１７３】
本発明者らは、ＮｅｓｔＬｉｎｋ発現ベクターからディープシークエンシングプラスミドへの移動工程がネスト化ライブラリーのＰＣＲ増幅工程を含まないことがＮｅｓｔＬｉｎｋにとって極めて重要であることを実験により示すことができた。タンパク質−フライコード配列のＰＣＲ増幅は、必然的にライブラリーメンバー間の非相同領域（例えばＣＤＲ）とフライコードの組換えをもたらす（ある目的のタンパク質のフライコードの、ＮｅｓｔＬｉｎｋ発現ベクターにおいて結合されていないもう１つのタンパク質上への意図しない結合）。それによって、フライコードとタンパク質との間のリンケージが破壊される。
【０１７４】
上記のように、ネスト化ライブラリーはＳｆｉＩを介して発現ベクターから切り出される。その後、それをディープシークエンシングプラスミドに連結する。これはネガティブ選択カセット（ｃｃｄＢ）に代わるもので、挿入工程の効率にとって非常に重要である。挿入後、イルミナ  ＭｉＳｅｑによるディープシークエンシングに必要な（そして頻繁に使用される）配列に隣接する。シークエンシングは両側から中心に向かって行われる。したがって、関連領域は反対方向にインサートの両側に存在する（インデックスを除く逆相補配列）。
【０１７５】
ここでは、内側部分（インサート）から外側領域への配列について説明する。
【０１７６】
ＳｆｉＩ部位：ｃｃｄＢをネスト化ライブラリーで置き換えるために使用される。
【０１７７】
多様性：イルミナ  ＭｉＳｅｑ技術は、プライマー結合部位の隣の配列に基づいて最初のシークエンシングシグナルを生成する。最初の数塩基は、検出チャンネルのシグナル過負荷およびシークエンシング実行の中止を防ぐために多様（同一でない）でなければならない。
【０１７８】
プライマー結合部位：シークエンシング用プライマーがここに結合する。
【０１７９】
インデックス（番号５０１および７０１でラベル付けされている）：イルミナ  ＭｉＳｅｑ技術は多重化を可能にする。すなわち、１回のシークエンシング実行で数個のサンプルを分析できる。どの読み取りがどのサンプルに属するかを決定するために、インデックス（可変８ｂｐストレッチ）もまた読まれる。１回のディープシークエンシング実行において数個のＮｅｓｔＬｉｎｋ実験をシークエンシングできるようにするために、本発明者らは、それぞれ異なるインデックスペアを担持する１１個のディープシークエンシングプラスミドを作成した（インサートの両側にインデックス配列があることに留意）。
【０１８０】
アダプター：イルミナ  ＭｉＳｅｑフローセルでのディープシークエンシング用ＤＮＡテンプレートを固定するために使用される。
【０１８１】
ＢｓｅＲＩ制限酵素部位：これは、イルミナ  ＭｉＳｅｑディープシークエンシングに必要な直鎖状ＤＮＡフラグメントを作製するために使用される。ＢｓｅＲＩがＩＩＳ型制限酵素（その認識配列の外側で切断する）であるという事実は、アダプターでの突出を最小限に抑えるのに特に有用である。
【０１８２】
従来の方法では、これらすべてのイルミナ  ＭｉＳｅｑ配列エレメントは、ＰＣＲ、イルミナアダプターのライゲーション、それに続くＰＣＲ増幅、またはＴＲｕＳｅｑ  ＤＮＡ  ＰＣＲフリーサンプルプレップキット（イルミナ）のいずれかによって配列決定されるＤＮＡに結合される。本発明者らのプロトコルでは、配列決定されるＤＮＡ（ここではタンパク質−フライコード配列）を、制限および連結によってドナーベクター（ここではＮｅｓｔＬｉｎｋ発現ベクター）からディープシークエンシングベクターにサブクローニングし、それによってＰＣＲを回避する。最終段階において、ディープシークエンシングベクターはＢｓｅＲＩを用いて切断される。これにより、ＤＮＡアガロースゲルによってベクター骨格から分離され、ゲル抽出によって精製された完全なイルミナ  ＭｉＳｅｑシークエンシングテンプレートが放出されます。
【０１８３】
ディープシークエンシングのための二本鎖アダプターオリゴヌクレオチド
ＰＬＯＩへのイルミナ  ＭｉＳｅｑディープシークエンシングに必要なアダプター配列のＰＣＲ非依存的結合を可能にする第二の戦略は、ディープシークエンシングプラスミドについて記載したのと同じセットのアダプター配列を担持する二本鎖オリゴヌクレオチドに依存し、ディープシークエンシングプラスミドは、一本鎖オリゴヌクレオチドの合成とその後のアニーリング反応により作製できる。相補的一本鎖は、長さが異なるように合成され、その結果、アニールされたアダプターの付着突出が生じる。この突出は、切断されたＳｆｉＩ制限部位の相補的配列に相当し、これはフライコード化されたＰＬＯＩがＮｅｓｔＬｉｎｋ発現ベクターから切り出されるときに生成される。したがって、アニールされたオリゴヌクレオチドは、高効率でフライコードされたＰＬＯＩに連結されて、イルミナ  ＭｉＳｅｑディープシークエンシングに必要なアダプター配列を結合することができる。連結産物は、ディープシークエンシングの前にアガロースゲルを介して精製される。
【０１８４】
ここで、内側部分（インサート）から外側領域への最終的なディープシークエンシングテンプレートの配列について説明する。
【０１８５】
フライコード化されたＰＬＯＩ：フライコード化されたＰＬＯＩは、ＳｆｉＩ制限消化を介してＮｅｓｔＬｉｎｋ発現ベクターから切り出される。
【０１８６】
ＳｆｉＩ制限部位の残り：この酵素はＮｅｓｔＬｉｎｋ発現ベクターからの切り出しを可能にし、生成された付着末端は深部シークエンシングアダプターを部位特異的に結合するために使用される。
【０１８７】
多様性：イルミナ  ＭｉＳｅｑ技術は、プライマー結合部位の隣の配列に基づいて最初のシークエンシングシグナルを生成する。最初の数塩基は、検出チャンネルのシグナル過負荷およびシークエンシング実行の中止を防ぐために多様（同一でない）でなければならない。
【０１８８】
プライマー結合部位：シークエンシング用プライマーがここに結合する。
【０１８９】
インデックス（番号５０１および７０１でラベル付けされている）：イルミナ  ＭｉＳｅｑ技術は多重化を可能にする。すなわち、１回のシークエンシング実行で数個のサンプルを分析できる。どの読み取りがどのサンプルに属するかを決定するために、インデックス（可変８ｂｐストレッチ）もまた読まれる。１回のディープシークエンシング実行において数個のＮｅｓｔＬｉｎｋ実験をシークエンシングできるようにするために、本発明者らは、７つのディープシークエンシングアダプター（一端に３つ、他端に４つ）を作製し、それにより１２の異なるインデックス対を生成できる。
【０１９０】
アダプター：イルミナ  ＭｉＳｅｑフローセルでのディープシークエンシング用ＤＮＡテンプレートを固定するために使用される。
【０１９１】
フライコードによるＰＬＯＩメンバーの定量化
多くのＮｅｓｔＬｉｎｋ適用は、フライコード化ＰＬＯＩメンバーの絶対的定量化を必要とする。ＬＣ−ＭＳはプロテオミクスにおける個々のペプチドの定量では不正確であるが、ＮｅｓｔＬｉｎｋは各ＰＬＯＩメンバーに付着している複数のフライコードと、質量分析による最適な検出のために設計された同種のフライコードライブラリーの恩恵を受ける。この考察に基づいて、本発明者らは、任意の所定のＰＬＯＩメンバーの全フライコードの合計ＭＳ１強度は、サンプル中のこのＰＬＯＩメンバーの量に比例しなければならないと仮定した。本発明者らは、可変数のフライコードに連結した既知量の８つのシボディを、それぞれ大腸菌（E. coli）およびスメグマ菌（M. smegmatis）由来のライセートを含む２つのサンプルに添加すること（spiking）によってこの仮説を検証した（図３）。各フライコード化シボディのすべてのフライコードの合計されたＭＳ１強度とその添加された量との間の観察された線形関係は仮説の正しさを証明し、そして本明細書に記載のＮｅｓｔＬｉｎｋ手法がプール内の個々のＰＬＯＩメンバーを定量するために使用できることを実証する。個々のＰＬＯＩメンバーの絶対量は、ＬＣ−ＭＳのためのフライコード単離の前に、既知量の１つまたは複数のフライコードタンパク質（標準）がサンプル中に添加される場合に決定することができる。
【０１９２】
ファージディスプレイ選択用のファージミド（ＮｅｓｔＬｉｎｋ以前）
本発明者らの現在の適用のほとんどにおいて、ＰＬＯＩは、シボディと呼ばれる濃縮合成ナノボディのプールである。典型的には、大型のシボディライブラリーは、標的タンパク質に結合するためにファージディスプレイを用いて濃縮される。非相同領域（すなわちＣＤＲ）の組換えを回避するために、ファージディスプレイ選択後にＰＬＯＩをＰＣＲによって増幅してはならない。この目的のために、ファージミドベクター（図２Ａ）を、ＰＬＯＩがＳａｐＩ制限部位を介してＮｅｓｔＬｉｎｋ発現ベクターにサブクローニングできるように構築した。注目すべきことに、ＳａｐＩ部位は翻訳産物の一部であり、それはファージ表面に表示される。本発明者らは、ＳａｐＩ部位に由来するこれらのさらなるアミノ酸がファージディスプレイ効率を妨害しないことを実験的に示すことができた。
【０１９３】
ＳａｐＩ部位とは別に、ファージディスプレイベクターは、Ｍ１３ファージ上にタンパク質をディスプレイするために使用されるファージミド中に典型的に存在する全てのエレメントを含み、そしてベクターｐＭＥＳｙ４（ｇｅｎｂａｎｋ  ＫＦ４１５１９２）の誘導体である。
【０１９４】
本明細書に記載されているすべてのベクターに関連する追加の一般的な注意事項：あるベクターから別のベクターへのインサートの効率的な移動を可能にするために、ベクターが異なる抗生物質耐性を有することが重要である。したがって、ＮｅｓｔＬｉｎｋ発現ベクターはクロラムフェニコール耐性マーカーを、ディープシークエンシングベクターはカナマイシンマーカーを担持する。さらに、ファージディスプレイ選択用のファージミドは、アンピシリン耐性マーカーを含む。
【０１９５】
概念実証実験
この実験において、本発明者らは、ＮｅｓｔＬｉｎｋを用いて前例のない方法でタンパク質候補の大きなプール内の個々のタンパク質を特徴付けることができ、そして選択の下流適用に最も有望な特徴を有するプールメンバーを同定できることを実証した。
【０１９６】
より具体的には、以下に説明する概念実証実験は、ｉ）良好に制御されたライブラリー多様性におけるライブラリーネスト化のための効率的な方法が開発されたこと、およびii）結合剤のプールに対する前例のない選択圧の基礎として役立ち得ることを実証する。
【０１９７】
この実施例において、本発明者らは、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）に対してリボソームおよびファージディスプレイを介して予め濃縮された（記載されていない）シボディのプールからなるＰＬＯＩを用いて研究した。
【０１９８】
本発明者らは、この特許に記載されたＮｅｓｔＬｉｎｋ方法を使用して、以下の選択圧を一度にシボディの多様なプールに課した：ｉ）最高発現シボディの選択、ii）最高溶解性シボディの選択、およびiii）溶液結合アッセイにおいて標的に結合するシボディの選択。
【０１９９】
材料と方法のセクションに記載されているプロトコルを使用して、本発明者らは、約１２００の異なるシボディプールメンバーを約１７，０００の固有のフライコードにリンクすることを意図し、いわゆる「ネスト化ライブラリー」をもたらした。これは、最初にシボディ−エンコーディングファージミドを含む細胞の適切なクローン数を１つの容器で培養し、続いてそれらのプラスミドＤＮＡを単離することによって行った。個々のシボディクローンを選ぶ代わりに、寒天プレート上にプレーティングすることによる形質転換後に、回収された細菌の体積当たりのコロニー形成単位数（ｃｆｕ）を推定した。それ故、適切な量の回収された細菌（約１２００ｃｆｕ）を培養物の接種のために使用し、その後これをプラスミドＤＮＡ単離のために回収した。次に、これらの多様性制限ファージミドのＤＮＡインサートを、約１０８個の異なる変異体のフライコードライブラリーを含む発現ベクターｐＮＬｘに連結した。上記で概説したｃｆｕ推定値を使用して、クローンの数は約１７０００に制限された。１０８個の変異体のうち約１７，０００個のフライコード含有ベクター（ｃｆｕ推定により決定される）しか使用されなかったので、本発明者らは、９９．９７４％のフライコードが固有であり、それゆえ、フライコードの大部分は、ただ１つのシボディを標的化すると予測した。さらに、彼らは約１７０００のフライコード含有ベクター内に約１，２００のシボディ遺伝子を入れ子にしているので、平均的なシボディは１４の異なるフライコードでタグ付けされていると予想した。
【０２００】
ベクターｐＮＬｘにおけるネスト化ライブラリーを単一のフラスコ中の細菌中で発現させ、選択実験を実施するためにフライコード結合剤プールとして精製した（下記参照）。ネスト化ライブラリーをシークエンシングするために、フライコード化シボディを、ＭｉＳｅｑ装置を用いるイルミナディープシークエンシングのための全ての関連配列を保有するディープシークエンシングベクターｐＮＬに移した。ネスト化ライブラリーのディープシークエンシングは、全てのフライコードの対応するシボディへの明白な割り当てを与えた。データのフィルタリング後に、１３，６２０個の固有のフライコードにリンクされた１０８０個の異なるシボディ配列が得られたため、ディープシークエンシングデータは、ネスト化ライブラリー内の予想されるシボディおよびフライコード番号と一致していた。したがって、平均して各シボディは１２．６１回、異なるフライコードにリンクされていた。本発明者らは、データフィルタリングをシークエンシングした後にシボディへのあいまいなフライコード結合を観察しなかった（すなわち、同じフライコードが２つ以上の異なるシボディに結合していた）。本発明者らの知る限りでは、よく制御された多様性を用いてライブラリーを互いに入れ子にするというこの成功した試みは前例のないことである。
【０２０１】
ディープシークエンシングデータを使用して、ネスト化ライブラリーの全配列情報を含むデータベースを、各シボディの全てのフライコードを、対応するシボディを識別子として有する理論的連続タンパク質配列に連結することによって構築した。次いで、このデータベースは、後のＭＳ／ＭＳイオン検索で使用するためにＭａｓｃｏｔサーバーにアップロードされた。
【０２０２】
この技術の新規な適用の例として、本発明者らはネスト化ライブラリーを使用し、特定の見かけの流体力学的半径を有するこれらのシボディおよび溶液中のＭＢＰに対して高いアフィニティ相互作用を示すものを選択および同定した。これらの特徴は両方とも、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定され、遺伝子型は表示されるタンパク質のサイズを通常１００倍以上増加させ、ディスプレイ粒子をタンパク質レベルでの小さなサイズの違いに対して鈍感にさせるので、遺伝子型−表現型連鎖を必要とする現在の最先端の表示システムを使用することには適していない。
【０２０３】
この目的のため、ネスト化ライブラリーを発現させ、そしてフライコード化結合剤をＮｉ−ＮＴＡ樹脂を介して精製し、そしてＳＥＣに付した。単量体タンパク質に対応するシボディの溶出画分（最高の溶解度を有する結合剤候補）をプールし、そして２つの等価なアリコートに分けた。一方のアリコートをＭＢＰとインキュベートし、他方を緩衝液のみとインキュベートした。２つのサンプルをＳＥＣ上で別々に分析し（ＭＢＰなしの実験を対照として使用した）、そしてシボディ−ＭＢＰ複合体のサイズに対応する溶出画分を集めた。その後、ＭＢＰおよび対照実験の収集した画分のフライコードを単離し、２回の別々のＬＣ−ＭＳ実行に供するか、または単離したフライコードの同重体タグ標識後の１回のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実行に組み合わせた。次に、以前に生成されたディープシークエンシングデータベース（フライコードからシボディへの割り当て）を使用してＭａｓｃｏｔ検索でフライコードを同定し、それによってシボディ−ＭＢＰ複合体のサイズで溶出するシボディを明確に同定する。この実験により、本発明者らは、全てよく発現され、単量体であり、そして溶液中で標的タンパク質に結合する３００を超える固有のシボディを同定することを可能にした。
【０２０４】
オフレート決定のためのＮｅｓｔＬｉｎｋの適用
上述の原理実証実験で同定されたＭＢＰ特異的シボディをそれらの結合オフレートに従ってスコア付けするために、本発明者らは、ビオチン化ＭＢＰを介して等量の単離されたＭＢＰ−シボディ複合体を２つのストレプトアビジン−セファロースカラムに固定化した（図４）。次に、過剰の非ビオチン化ＭＢＰを用いたオフレート選択（３分間洗浄）を一方のカラムで実施し、他方のカラムは緩衝液のみで洗浄した。洗浄後、両方のカラムから残ったシボディを溶出し、それらのフライコードを２回のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析にかけた。上記の溶液内結合実験（ＳＥＣ実行）と同様に、ディープシークエンスデータベースは、フライコードによるシボディ同定のためのＭａｓｃｏｔ検索において使用された。さらに、Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓソフトウェアを使用して、すべての同定されたフライコードのＭＳ１強度を各シボディについて合計した。上記で決定されたＭＳ１ピーク強度の量的性質のために、本発明者らは、２つのカラム間の各シボディに対するフライコード−強度−合計の間の比率は、過剰な非ビオチン化標的でのオフレート選択前後のそれらの相対濃度に対応すると予測した。各解離反応が単一指数関数的減衰に続くと仮定し、過剰な標的を用いた洗浄時間（３分）についての知識を使用して、著者らは一度に３００超の結合剤についておおよそのオフレートを決定することができた。この分析は、表面プラズモン共鳴を用いて１１個の個々の結合剤のオフレートを測定することによって確認された。１回の実験で結合剤候補のプール内のオフレートを決定することは、著者の知る限りでは前例のないことである。個々のタンパク質を処理する必要があるために以前には数週間を必要としたプロセスは、今回本明細書に記載の技術を使用して一度に実行することができる。
【０２０５】
免疫ラクダ科動物からの結合剤同定のためのＮｅｓｔＬｉｎｋの適用
免疫化アルパカ（ラクダ）のＢ細胞からのｃＤＮＡ単離を介して得られた天然ナノボディのプールにＮｅｓｔＬｉｎｋを適用した。免疫化に使用された抗原は、サーモトガマリティマ（Thermotoga maritima）由来のＡＢＣトランスポーター（内在性膜タンパク質）であるＴＭ２８７／２８８であった。ラクダ科動物由来のナノボディ産生の伝統的なプロトコルとは反対に、このナノボディプールはファージディスプレイを用いた標的に対して強化されなかった。
【０２０６】
ナノボディをＰＣＲ増幅し、多様性を制限し、フライコードライブラリーとインターレースして、イルミナ  ＭｉＳｅｑディープシークエンシングによって決定されるように５９，９７４の固有のフライコードに結合した３，４６９の固有のナノボディ配列を得た（材料および方法のセクション参照）。ネスト化ライブラリーを発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡを介して精製し、続いてＳＥＣを介して単量体プールメンバーを単離した。原理実証実験（上記）と同様に、発現しなかったかまたは可溶性でなかった好ましくない結合剤候補は、これらの予備選択工程において排除された。溶出後、Ｎｉ−ＮＴＡカラムから、およびＳＥＣ実行の単量体画分から、ＬＣ−ＭＳサンプルを収集した。続いて、漸増量のプールをＴＭ２８７／２８８と共に約０．１：１、２：１および１００：１の比率でインキュベートし、抗原／プール混合物を再び３回のＳＥＣ実行に供した（図５）。標的／ナノボディ複合体のサイズに対応する画分を集めた。収集したすべてのサンプルのフライコードを別々に単離し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。これにより、発現レベル、溶解性（ＳＥＣ上の単量体）、および溶液中の抗原に対する結合強度をすべての結合剤に対して一度に比較できた。
【０２０７】
免疫ラクダ科動物由来の３，４６９の固有なナノボディのこの分析において、本発明者らは、安定性、発現レベルおよび溶解性が良好な２７種の高親和性結合剤ファミリーを同定した。驚くべきことに、ＮｅｓｔＬｉｎｋは、ＥＬＩＳＡおよびＳａｎｇｅｒ配列が使用され、かつかなり長い処理時間の間に同じプールにおいてこれらのファミリーのたった５つが同定されるファージディスプレイの選択や過剰な従来のスクリーニングよりもはるかに効率的である。まとめると、ＮｅｓｔＬｉｎｋは免疫ラクダ科動物から最も有望な候補生体分子を同定するために使用することができ、現在の最先端の手法では達成されていないスループットと精度であると言える。
【０２０８】
細胞表面のタンパク質を標的とする結合剤を同定するためのＮｅｓｔＬｉｎｋの適用
上記の実験は、溶液中の精製された標的／抗原に対する結合タンパク質を同定する目的で行われ、結晶学のようなインビトロ用途のための好ましい研究ツールをもたらした。ここで、本発明者らは、細胞表面で高い特異性および親和性で標的タンパク質を認識する膜タンパク質結合剤の同定という、薬物開発の中心的ボトルネックを解決することを意図した。膜タンパク質標的に対して生体分子薬を開発することは、典型的には２つの連続した工程を必要とし、それらは根本的に異なる。第一に、結合剤候補の多様なプールがディスプレイ手法または免疫化を介して生成される。第二に、多様なプールを細胞アッセイにおける結合および機能についてスクリーニングする。後者は、個々の結合剤候補を一つずつ（典型的には小型化されたフォーマットで）分析する必要があるため、本質的に非効率的で遅い。この実験において、本発明者らは、個々の結合剤候補を１つずつ面倒に分析することなく、内在性膜タンパク質標的に対して特異的な細胞表面結合剤を同定するために、ＮｅｓｔＬｉｎｋにより第２の（スクリーニング）工程を置き換えた。
【０２０９】
本発明者らは最初に、グラム陰性菌の純粋な界面活性剤可溶化外膜タンパク質抗原に対するシボディライブラリーのインビトロディスプレイを行った（工程１、結合剤候補の多様なプールの生成）。細胞表面結合についてこの多様なプールの個々の各結合剤候補を個々に試験する代わりに（通常は工程２）、本発明者らはＮｅｓｔＬｉｎｋを行い、一度に大きな候補プールを試験した（図６Ａ）。１，４５６のシボディがフライコードライブラリーとインターレースされ、３１，５００のフライコードがリンクされた（平均２２のフライコード／シボディ）。上記のように、フライコード−結合剤の割り当てはディープシークエンシングによって得られ、ネスト化ライブラリーは発現され、精製され、そして単量体プールメンバーが単離された（カウンター−選択／望ましくない結合剤候補の排除）。したがって、発現レベルが低く、溶解度が低いプールメンバーを最初に排除し、各プールメンバーの発現レベルおよび溶解度特性をモニターした。よって、ＮｅｓｔＬｉｎｋプロセスは、もっぱら有望な結合剤候補を細胞表面選択に注ぎ込み、それは以下のように行われた：単量体プールメンバーを４つの等価画分に分け、各画分を別の細菌株と共にインキュベートした。ペレット化し、緩衝液を用いて再懸濁／洗浄することにより、非結合性のシボディ候補を除去した。続いて、細菌株のうちの１つに結合したシボディのすべてのフライコードを単離し、ＬＣ−ＭＳ分析にかけた。１シボディ当たりの全フライコードの全ＭＳ１強度の合計を、各標的細胞におけるプール中の各個別シボディの相対濃度の尺度として用いた。これは正確な細胞特異性の読み取りを可能にした（図６Ｂ）。
【０２１０】
プール中の１，４５６個の結合剤候補から、目的のグラム陰性菌（株４）の外膜に埋め込まれた天然型のタンパク質標的を特異的に認識する６個の十分に発現された可溶性シボディが同定された。本発明者らは、（蛍光標識した後に）これら６つの同定されたシボディを４つの菌株に対してフローサイトメトリーによって個々に分析することによって確認した。試験された全ての候補はこの単一クローンアッセイにおいて、ＮｅｓｔＬｉｎｋを介して観察のと同じ特異性プロファイルを示した。注目すべきことに、同定された各結合剤は、イルミナ  ＭｉＳｅｑディープシークエンシングによって決定されるように、ネスト化プール中に０．０５％未満しか存在しなかった。最先端のスクリーニングは結合剤候補の一つの特性（例えば標的結合）のみを考慮に入れているが、発現レベルまたは溶解度／オリゴマー化傾向を報告するには不十分であることを考えると、これら６つの結合剤のいずれもが、古典的な単一クローンスクリーニングアプローチによって同定されるとは思われない。それゆえ、この実験は、遺伝子型−表現型連鎖の欠如および２つのライブラリーの交錯のおかげで、ＮｅｓｔＬｉｎｋがこれまでにない深さで結合剤ライブラリーをスクリーニングすることを可能にすることを実証する。
【０２１１】
モデル生物における生体内分布および薬物動態学的パラメータを監視するためのＮｅｓｔＬｉｎｋの適用
先の実施例において、本発明者らは、遺伝子型−表現型連鎖が存在しないことにより、ＮｅｓｔＬｉｎｋ選択が前例のない選択圧を可能にすることを示した（例えば、ＳＥＣ上の単量体プール／ライブラリーメンバーの選択）。ここでは、物理的な遺伝子型−表現型連鎖の場合には達成することができない別の選択圧が導入される：特定の生体内分布および生体内での薬物動態学的性質を有するタンパク質の選択。生体分子治療候補のネスト化（フライコードタグ付き）プールを動物モデルに注入してもよく、各プールメンバーの相対濃度をＬＣ−ＭＳにより、身体の各位置で（例えば、異なる器官、組織または腫瘍で）一定の経過時間後に測定してもよい。このタイプの分析は、ある特定の時点で、体内の個々のプールメンバーに対し包括的／広範囲な生体内分布分析をもたらす。様々な異なる時点の後に同種の類似個体がこの分析にかけられた場合、ＮｅｓｔＬｉｎｋ生体内分布分析は時間次元に拡張され、したがって各候補について低いまたは中程度の時間分解能での薬物動態学的データ取得が可能になる。
【０２１２】
本発明者らは、以前に異なる量のフライコードシボディを添加したホモジナイズマウス組織からのフライコード抽出手順を試験および最適化することにより、この種の分析の基礎を設定した。詳細には、いくつかのシボディが最初に少数のフライコード（２０〜３０）にリンクされ、シボディからフライコードへの割り当て（assignment）がイルミナ  ＭｉＳｅｑディープシークエンシングによって決定された。次に、フライコードタグ化シボディを個別に発現および精製し、それらの濃度を吸光度測定によって決定した。次いで個々のシボディを異なる濃度（一桁に渡る）で混合した。
【０２１３】
並行して、マウスの凍結臓器（肝臓、肺、腎臓）および血液を解凍し、変性緩衝液条件およびポッターを用いてホモジナイズした。予め調製した滴定混合物をホモジネートに添加し、室温で３０分間インキュベートして、潜在的なプロテアーゼまたはフライコード修飾酵素を作用させた。続いて、それらの残りのフライコードと共にシボディを抽出し、フライコードをプロテアーゼ切断により単離し、そしてＬＣ−ＭＳにより分析した。滴定混合物の個々のシボディの検出に基づいて、本発明者らは、そのような均質化された臓器および組織からのＬＣ−ＭＳによるシボディ検出は典型的には３０〜１００ｎｇ（シボディ）の量まで信頼できることを見出した。１ｍｇまでの治療薬が典型的にはマウスモデルに注射され得ることを考えると、体内の最も関連のある場所において、ネスト化プールの注射後に数十マイクログラムが存在することは明らかである。したがって、広範囲な生体内分布を監視し、結合剤プールの薬物動態分析を実施するのに十分な非分解型および非改変型のフライコードが存在する。
【０２１４】
材料および方法
以下に、ＮｅｓｔＬｉｎｋ方法の一般的なプロトコルが提供される。それは、上に概説したように実験を実施するために必要とされる全ての工程を包含し、ライブラリーのネスト化、ディープシークエンシング、フライコード化結合剤プールの発現および精製、フライコード抽出、ＬＣ−ＭＳおよびデータ分析に関する詳細を提供する。
【０２１５】
ライブラリーネスト化によるフライコード化ナノボディのクローニング
１．シボディ／ナノボディプールの多様性制限
ＮｅｓｔＬｉｎｋ実験は、ファージディスプレイまたは免疫化によりインビトロの結合剤選択からそれぞれ得られた、シボディまたは天然のナノボディのプールを用いて行われた。ファージディスプレイを結合剤選択に使用した場合、ファージミドにコードされた２００ｎｇのインビトロ選択された潜在的結合剤プールを５０μｌの大腸菌ＭＣ１０６１化学的コンピテントセルに形質転換した（プロメガ社のプロトコル、Subcloning Notebook 2004により達成した能力（competence））１２０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む寒天プレートに希釈系列を蒔き、３０℃で一晩インキュベートした。所望のコロニー形成単位（上記の例では１０００〜１５００ｃｆｕの範囲の数）を含むプレートのコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ｍｌのＬＢ培地に再懸濁し、懸濁液を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地の２００ｍｌの培養液に移した。この培養物を３７℃で一晩増殖させ、ＤＮＡ調製のために使用した（キット：＃７４０４１２．１０、マッハライ−ナーゲル）。調製したファージミド１５μｇを、緩衝液ＮＥＢ３．１（ニュー・イングランド・バイオ・ラボ、＃Ｂ７２０３Ｓ）中の１００単位のＢｓｐＱＩ（ニュー・イングランド・バイオ・ラボ、＃Ｂ０７１２Ｌ）で、５０℃で１時間、１４０μｌの反応容量で消化し、その後、８０℃で２０分間、酵素を熱失活させた。２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上で電気泳動を行い、結合剤プールに対応するバンドを切り出し、抽出した（キット：＃７４０６０９．２５０、マッハライ−ナーゲル（MACHERY-NAGEL））。免疫化アルパカの場合、ナノボディ配列を記載されているように（Pardon et al., Nat Protc., 2014 Mar; 9(3): 674-93）Ｂ細胞のｃＤＮＡから増幅し、ＢｓｐＱＩ制限部位を含むプライマーで増幅した。５μｇの精製ＰＣＲ産物を、緩衝液ＮＥＢ３．１（ニュー・イングランド・バイオ・ラボ、＃Ｂ７２０３Ｓ）中の１００単位のＢｓｐＱＩ（ニュー・イングランド・バイオ・ラボ、＃Ｂ０７１２Ｌ）によって、１４０μｌの反応容量で、５０℃で１時間消化し、その後、８０℃で２０分間、酵素を熱失活させた。２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上で電気泳動を行い、結合剤プールに対応するバンドを切り出し、抽出した（キット：＃７４０６０９．２５０、マッハライ−ナーゲル）。消化されたＰＣＲフラグメントをカナマイシン耐性マーカー（Geertsma et al., Biochemistry, 2011 Apr 19;50(15):3272-8）を用いてＦＸクローニング初期ベクターにクローニングし、３，５００ｃｆｕを、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２ｍｌのＬＢ培地に再懸濁し、懸濁液を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地の２００ｍｌの培養液に移した。この培養物を３７℃で一晩増殖させ、ＤＮＡ調製のために使用した（キット：＃７４０４１２．１０、マッハライ−ナーゲル）。調製したファージミド１５μｇを、緩衝液ＮＥＢ３．１（ニュー・イングランド・バイオ・ラボ、＃Ｂ７２０３Ｓ）中の１００単位のＢｓｐＱＩ（ニュー・イングランド・バイオ・ラボ、＃Ｂ０７１２Ｌ）で、５０℃で１時間、１４０μｌの反応容量で消化し、その後、８０℃で２０分間、酵素を熱失活させた。２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上で電気泳動を行い、そして結合剤プールに対応するバンドを切り出し、抽出���た（キット：＃７４０６０９．２５０、マッハライ−ナーゲル）。
【０２１６】
フライコードのシボディ／ナノボディプールへの付加およびフライコード−多様性制限
フライコードライブラリーを含むベクターｐＮＬｘを、ファージミドについて上述したようにＢｓｐＱ１により消化し、そして１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上での電気泳動を行った。開かれたベクターに対応するバンドを切り出しそして抽出した（キット：＃７４０６０９．２５０、ＭＡＣＨＥＲＹ−ＮＡＧＥＬ）。２００ｎｇの結合剤プールを、Ｔ４リガーゼ緩衝液（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ＃Ｂ６９）中の２．５単位のＴ４リガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ＃ＥＬ００１１）を用いて、２８μｌの反応容量で３７℃で１時間、４００ｎｇの消化ｐＮＬｘに連結し、６５℃で１０分間、加熱不活化した。２５μｌの連結反応物を１５０μｌのエレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＭＣ１０６１細胞（Ｈｏｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｋａｓｅｒ  ２００７、抗体の作成および使用、１７０ページに従って調製）への形質転換に使用した。細胞をＳＯＣ培地中、３７℃で３０分間回収し、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有する２００ｍｌの培養物に、希釈サンプルの２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む寒天プレート上へのプレーティングにより決定される、所望の数のコロニー形成単位に相当する回収された容量の細菌を接種した（上記の例では１３，０００〜３０，０００の範囲のｃｆｕ数）。培養物を３７℃で一晩増殖させた後、ＤＮＡの調製（キット：＃７４０４１２．１０、ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）および１ｍｌの５０％（ｖ／ｖ）グリセロールと混合した１ｍｌの固定相培養物を含むグリセロールストックを生成した。
【０２１７】
ディープシークエンシング
1.イルミナアダプター配列の結合
フライコード結合剤を含む１５μｇのｐＮＬｘを、緩衝液Ｇ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ＃ＢＧ５）中の１２０単位のＳｆｉＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ＃ＥＲ１８２１）により、１４０μｌの反応容量中、５０℃で３時間消化し、続いて酵素を不活化するために０．５Ｍ  ＥＤＴＡを１２μｌ加えた。２％アガロースゲル上での電気泳動を行い、フライコードに結合した結合剤プールに対応するバンドを切り出し、抽出した（キット：＃７４０６０９．２５０、ＭＡＣＨＥＲＹ−ＮＡＧＥＬ）。抗ＭＢＰシボディを用いた最初の例として、適切なインデックス（この場合、５０２および７０３が二重インデックス作成のために使用された）を有するイルミナＭｉＳｅｑによるＤＮＡディープシークエンシングに関連するアダプターを含むベクターｐＮＬｓは、ｐＮＬｘについて上述したように、Ｓｆｉｌにより消化され、（この場合、５０２および７０３をデュアルインデックスに使用した）、１％アガロースゲル上で電気泳動を行った。ベクター骨格に対応するバンドを切り出し、抽出した（キット：＃７４０６０９．２５０、ＭＡＣＨＥＲＹ−ＮＡＧＥＬ）。Ｔ４リガーゼ緩衝液（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ＃Ｂ６９）中の２．５単位のＴ４リガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ＃ＥＬ００１１）を用いて４００ｎｇのフライコード化された結合剤プールを３００ｎｇの消化されたｐＮＬｘに、反応容量２８μｌ、３７℃で１時間連結し、６５℃で１０分間、加熱不活化した。２５μｌの連結反応物を２５０μｌのエレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＭＣ１０６１細胞（Ｈｏｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｋａｓｅｒ  ２００７、抗体の作成および使用、１７０ページに従って調製）への形質転換に使用した。細胞をＳＯＣ培地中３７℃で４５分間回収し、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２００ｍｌの培養物に全ての回収された細胞を接種した。ライゲーションおよび形質転換効率がネスト化ライブラリー全体の移行に十分であることを確認するために、試験サンプルをカナマイシン選択寒天プレート上にプレーティングした（合計で＞２００，０００ｃｆｕ）。培養物を３７℃で一晩増殖させた後、ＤＮＡを調製した（キット：＃２７１０６、ＱＵＩＡＧＥＮ）。フライコード化された結合剤プールを含む調製されたｐＮＬｓ１μｇの制限消化を、ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液（ニュー・イングランド・バイオ・ラボ、＃Ｂ７２０４Ｓ）中の５単位のＢｓｅＲＩ（ニュー・イングランド・バイオ・ラボ、＃Ｂ０５８１Ｓ）を用いて、合計反応容量２０μｌ、３７℃で２時間行い、続いて８０℃で２０分間、加熱不活化した。この時点で（ＢｓｅＲＩ消化の前に）さまざまな標的に対する複数のフライコードプールをプールでき、それぞれ異なるインデックスのｐＮＬｓに配置された。続いて、ＭｉＳｅｑアダプターに結合したフライコード結合剤プールを含むインサートを１％アガロースゲルから抽出した。
【０２１８】
上記の他の実施例では、付着性ＳｆｉＩ突出を含む３００〜４００ｎｇのアニーリングオリゴヌクレオチドを、反応容量２０μｌ、３７℃で１時間、Ｔ４リガーゼ緩衝液（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ＃Ｂ６９）中の５単位のＴ４リガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ＃ＥＬ００１１）を用いてＳｆｉＩによりｐＮＬｘから切り出した６００ｎｇのフライコード結合剤プールと混合し、その後６５℃で１０分間、加熱不活化した。続いて、ＭｉＳｅｑアダプターに結合したフライコード結合剤プールを２％アガロースゲル（キット：＃７４０６０９．２５０、ＭＡＣＨＥＲＹ−ＮＡＧＥＬ）から抽出した。この時点で、様々な標的に対するいくつかのフライコードプールをプールすることができ、それぞれが異なる対の連結アダプターを含むことに留意されたい。
【０２１９】
２．ナノボディ−フライコード連鎖の決定
ディープシークエンシングは、ペアエンドプロトコル（ＭｉＳｅｑ試薬キットｖ２（３００サイクル））を用いて、イルミナ製のＭｉＳｅｑデバイス上で行った。分析の最初の工程では、ペアエンド読み取りは、標準ソフトウェア（イルミナ）を用いてペアエンドリードをつなぎ合わせた。所定のインデックスペアについて、合計８００，０００−８Ｍｉｏの読み取りが得られた。これは、２５〜７０の平均読み取り冗長度に相当する（この数は、読み取りの合計数を、所定のネスト化ライブラリーの合計予測フライコード数で割ったものである）。カスタムメイドのスクリプトを用い、得られた生の読み取りを、以下の正の基準を適用することによってフィルタリングした：ｉ）フライコードの不変部分の正しい隣接パターン、ii）ナノボディの不変部分の正しい隣接パターン、iii）配列がＮを含まない、iv）配列が可能なナノボディ−フライコード融合の予想されるサイズ範囲内にある、ｖ）ナノボディ−フライコード融合の配列がインフレームである（すなわち３で割ることができる）、vi）配列に終止コドンがない。フィルタリングの後、固有のフライコードのリストが生成された。少なくとも５回読み取られたフライコードは正しいと見なされた。各正しいフライコードについて、すべての連結ナノボディ配列のコンセンサス配列が生成された。ナノボディ配列中のシークエンシングエラーを修正するためにコンセンサス配列アプローチが必要とされた。同一のフライコードに結合したナノボディ配列間の変動性をモニターするためにコンセンサススコアを導入した。同一のフライコードに付着した１つまたはいくつかのナノボディが他のものと明らかに異なる場合、スコアは大きなペナルティを与え、それによってさらなる分析から２つ以上の異なるナノボディにリンクされたフライコードを除外する。高いコンセンサススコアを有するナノボディ−フライコード対のみをさらに検討した。最終工程において、同一の（コンセンサス）ナノボディ配列およびそのすべての連結されたフライコード（上記の例ではナノボディあたり平均１２〜４０のフライコード）が同定された。同一のナノボディに接続された全てのフライコードは、ナノボディ配列を識別子として使用して仮想タンパク質配列に連結され、このデータベースはｆａｓｔａ−ｆｉｌｅフォーマットで保存された。
【０２２０】
単量体フライコード化シボディ／ナノボディの発現および精製
フライコード結合剤プールを有するｐＮＬｘを含有するＥ．ｃｏｌｉ  ＭＣ１０６１グリセロールストックを、５０ｍｌの１％グルコースを含有するＬＢ前培養物の接種に使用し、これを３７℃で一晩培養した。６００ｍｌのＴＢ培養物を、０．０５のＯＤまでの前培養によって接種し、そして３７℃で１．５時間培養し、続いて２０℃で一晩培養した。誘導は、０．８のＯＤ６００、０．０５％（ｗ／ｖ）のアラビノースで行った。細胞を５，０００ｇで２０分間回転させることによって回収した。上清をデカントし、そして細胞を、少量のＤＮａｓｅＩ（ＳＩＧＭＡ＃ＤＮ２５）を追加した２５ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５（２０℃）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭイミダゾール  ｐＨ８．０（２０℃）中に再懸濁した。氷上で冷却しながら、マイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ＃１１０Ｐ）を用いて３０，０００ｐｓｉで２回細胞を溶解した。細胞片を５，０００ｇで３０分間ペレット化し、上清を１．５ｍｌのＮｉ−ＮＴＡスーパーフローカラム（ＱＵＩＡＧＥＮ＃１０１８１４２）に重力流によって適用した。カラムを２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５（２０℃）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび３０ｍＭ  イミダゾール  ｐＨ８（２０℃）を含有する３０ｍｌの洗浄緩衝液で洗浄した。これを６ｍｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５（２０℃）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび３００ｍＭ  イミダゾール  ｐＨ８（２０℃）で溶出した。５ｍｌの溶出液をＨｉＬｏａｄ  １６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（ＧＥヘルスケアライフサイエンス（Healthcare Life Sciences）＃２８９８９３３５）に注入し、単量体画分に対応する領域を回収し、そして上記実施例において概説したように、さらなる選択実験のための緩衝液に対して、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００ｃ（サーモサイエンティフィック（Thermo Scientific））の吸光度（２８０ｎｍ）２．１で、１．２ｍｌの容量まで濃縮した。
【０２２１】
フライコードの単離
フライコード化ＰＬＯＩ含有サンプルを緩衝液Ｅｘ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１２５％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム、１０ｍＭイミダゾール  ｐＨ８．０、４．５Ｍ  ＧｄｍＣｌ）によって１０〜２０倍希釈した、濾過し（シリンジフィルター０．２μｍカットオフ）、１００μｌのＮｉ−ＮＴＡスーパーフロースラリー（ＱＵＩＡＧＥＮ＃１０１８１４２）と共に室温で２時間インキュベートした。続いて樹脂を５００ｇで１０分間ペレット化し、ミニバイオスピンクロマトグラフィーカラムに移し、続いて緩衝液Ｅｘを用いて３×５００μｌ洗浄し、３０ｍＭ  イミダゾール  ｐＨ８．０を含む緩衝液ＴＨ（２０ｍＭ  ＴＥＡＢ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）を用いて３×５００μｌ、そして緩衝液ＴＨ３×５００μｌで洗浄した。カラムの下端を閉じた後、樹脂を２．４Ｕのトロンビンを含む緩衝液ＴＨ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ＃６９６７１−３）１００μｌ中に再懸濁し、続いて室温で一晩インキュベートした。次にカラムを排水し、３０ｍＭ  イミダゾール  ｐＨ８．０を含む３×５００μｌの緩衝液ＴＨ、続いて３×５００μｌの緩衝液ＴＲＹ（２０ｍＭ  ＴＥＡＢ  ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）で洗浄し、そして３００ｍＭ  イミダゾール  ｐＨ８．０を含む緩衝液ＴＲＹで溶出した。溶出液を、予め平衡化した（Ｈ２Ｏ）Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  １０ｋＤａカットオフ濃縮器（ＡＭＩＣＯＮ：ＹＭ−１０）を通して回転させ（１５，０００ｇ）、１μｇのトリプシン（ＰＲＯＭＥＧＡ＃Ｖ５１１３）をろ過物に添加し、続いて３７℃で一晩インキュベートした。
【０２２２】
続いて、溶出したフライコードサンプルをＺｉｐＴｉｐ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ＃ＺＴＣ１８Ｓ９６０）クリーンアップ手順に付した。ＺｉｐＴｉｐｓを２００μｌのメタノール、２００μｌの６０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル（ＡＣＮ）および２００μｌの０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を含む３％（ｖ／ｖ）アセトニトリルで予備洗浄した。１００μｌのフライコードサンプルをロードし、続いて２００μｌの０．１％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸を含む３％（ｖ／ｖ）アセトニトリルで洗浄し、２×４０μｌの０．１％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸を含む６０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルで溶出した。続いて溶媒を蒸発させ（ｓｐｅｅｄｖａｃ）、フライコードを１５μｌの０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸を含む３％（ｖ／ｖ）アセトニトリルに再懸濁した。
【０２２３】
ＬＣ−ＭＳ
Ｅａｓｙ−ｎＬＣ  １０００  ＨＰＬＣシステムを用い、２μｌの再懸濁フライコード溶液を、逆相材料を充填した自家製のキャピラリーカラム（ＲｅｐｒｏＳｉｌ−Ｐｕｒ  １２０  Ｃ１８−ＡＱ、１．９μｍ；カラム寸法１５０  ｍｍ×０．０７５ｍｍ）に注入した。カラムを溶媒Ａ（水中０．１％ギ酸（ＦＡ））で平衡化した。次の勾配：０−６０分；５−２０％Ｂ（ＡＣＮ中０．１％ＦＡ）、６０−７０分：２０−９７％Ｂを使用して、ペプチドを流速０．３μｌ／分で溶出した。９７％Ｂで１０分間洗浄した後、カラムを溶媒Ａで５分間再平衡化した。次のパラメータを用いてＯｒｂｉｔｒａｐ  Ｆｕｓｉｏｎ質量分析計（サーモサイエンティフィック）で高精度質量スペクトルを取得した。走査範囲３００〜１５００ｍ／ｚ、ＡＧＣターゲット５ｅ５、分解能１２０，０００（ｍ／ｚ１９０）、および最大注入時間１００ｍｓ。四重極型分離（１．６ｍ／ｚウィンドウ）、１ｅ４のＡＧＣターゲット、３５ｍｓの最大注入時間、３０％の衝突エネルギーでのＨＣＤフラグメンテーション、３秒の最大サイクルタイムを用いて、データ依存型ＭＳ／ＭＳスペクトルを線形イオントラップの最高速度モードで記録し、利用可能なすべての並列化可能時間が有効であった。単同位体前駆体シグナルは、２から６の間の荷電状態および５ｅ４の最小シグナル強度を有するＭＳ／ＭＳについて選択された。動的排除は２５秒に設定され、排除ウィンドウは１０ｐｐｍであった。データ収集後、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ  １．４（サーモサイエンティフィック）を用いてピークリストを作成した。
【０２２４】
データ分析および定量化
ＬＣ−ＭＳ分析（フライコード抽出物／サンプルにつき１分析）をソフトウェアＸｃａｌｉｂｕｒにより事前検査し、Ｘｃａｌｉｂｕｒの生ファイルをインポートし、Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓによりｍｚｎｌｄファイルに変換した。続いてＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓを用いて目的のＬＣ−ＭＳランを整列させ（整列スコア＞８０％）、分析から＋１および＋ ５から＋２０の電荷のペプチドイオンを除去した。続いて、すべての整列されたＬＣ−ＭＳランの複合ｍｇｆファイルをＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓからエクスポートし（ランク閾値＜５、イオンフラグメント数＞１，０００、脱同位体化および電荷デコンボリューション）、そしてＰＬＯＩメンバー割り当てに対する事前に決定されたフライコードと共にマスコットサーバにアップロードした（ｆａｓｔａファイルフォーマットのディープシークエンシングデータベース、上記参照）。Ｍａｓｃｏｔの識別情報はソフトウェアＳｃａｆｆｏｌｄに直接インポートされ、続いてデータ変換とスペクトルレポートのエクスポートが行われ、その後、Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓにインポートされて、対応するフライコードに特徴を割り当てることができる。Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓを用い、特徴強度は通常スパイク標準に正規化され、各ＰＬＯＩメンバーのすべての固有のフライコードが定量化に使用された。生強度および正規化強度を続いてエクスポートし（ＣＳＶ形式）、さらにＥｘｃｅｌで分析した。