(57)【要約】  本発明は、ＰＤＫｌ活性を阻害する化合物を提供する。本発明はまた、かかる阻害化合物を含んでなる組成物、及び癌の治療を必要とする患者に該化合物を投与することによりＰＤＫｌ活性を阻害する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ａ：
【化１】
2012511000.tif 000034
［式中、
ｎは、０、１、２、３、４、又は５であり；
Ｗは、独立して、Ｃ又はＮであり、Ｙは、独立して、Ｃ又はＮであり、Ｚは、独立して、Ｃ又はＮであり、ただし、Ｗ、Ｙ、及びＺの少なくとも１つはＮであり；
Ｘは、Ｏ、ＣＨ２、又はＮＨであり；
環Ｋは、アリール又はヘテロアリールであり；
Ｌ１は、Ｃ０−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、又はヘテロアリールであり、ここで、前記アルキルは、Ｃ１−Ｃ６アルキル又はフェニルで置換されていてもよく、ここで、前記フェニルは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキル−ＯＨ、Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ハロ、及びＯＨで置換されていてもよく；
Ｌ２は、Ｃ０−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、又はヘテロアリールであり、ここで、前記アルキルは、Ｃ１−Ｃ６アルキル又はフェニルで置換されていてもよく；
Ｒ１は、ヘテロシクリルであり、これは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキル−ＯＨ、Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、ＣＯ２Ｈ、ハロ、ＯＨ、オキソ、及びＮＲ８Ｒ９で置換されていてもよく；
Ｒ２は、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキル−ＯＨ、Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、ＣＯ２Ｈ、ハロ、ＯＨ、及びＮＲ８Ｒ９から選択され；
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキル−ＯＨ、Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、ＣＯ２Ｈ、ハロ、ＯＨ、及びＮＲ８Ｒ９から選択され；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキル−ＯＨ、Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、ＣＯ２Ｈ、ハロ、ＯＨ、及びＮＲ８Ｒ９から選択され；
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキル−ＯＨ、Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、ＣＯ２Ｈ、ハロ、ＯＨ、及びＮＲ８Ｒ９から選択され；
Ｒ６及びＲ７は、独立して、Ｈ及びＣ１−Ｃ６アルキルから選択され；かつ
Ｒ８及びＲ９は、独立して、Ｈ及びＣ１−Ｃ６アルキルから選択される］
の化合物、又はその薬学的に許容される塩若しくは立体異性体。
【請求項２】
式Ｂ：
【化２】
2012511000.tif 000035
［式中、
ｎが、１、２、又は３であり；
Ｗが、独立して、Ｃ又はＮであり、かつＹが、独立して、Ｃ又はＮであり、ただし、Ｗ又はＹの少なくとも１つがＮであり；
Ｘが、Ｏ、ＣＨ２、又はＮＨであり；
Ｌ１が、Ｃ０−Ｃ５アルキル、又はＣ２−Ｃ５アルケニルであり；
Ｌ２が、Ｃ０−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、又はヘテロアリールであり、ここで、前記アルキルは、Ｃ１−Ｃ６アルキル又はフェニルで置換されていてもよく；
Ｒ１が、ヘテロシクリルであり、これは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキル−ＯＨ、Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、ＣＯ２Ｈ、ハロ、ＯＨ、オキソ、及びＮＲ８Ｒ９で置換されていてもよく；
Ｒ２が、ハロであり；
Ｒ３が、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキル−ＯＨ、Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、ＣＯ２Ｈ、ハロ、ＯＨ、及びＮＲ８Ｒ９から選択され；
Ｒ４が、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキル−ＯＨ、Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、ＣＯ２Ｈ、ハロ、ＯＨ、及びＮＲ８Ｒ９から選択され；
Ｒ５が、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキル−ＯＨ、Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、ＣＯ２Ｈ、ハロ、ＯＨ、及びＮＲ８Ｒ９から選択され；
Ｒ６及びＲ７が、独立して、Ｈ及びＣ１−Ｃ６アルキルから選択され；かつ
Ｒ８及びＲ９が、独立して、Ｈ及びＣ１−Ｃ６アルキルから選択される］
の、請求項１に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩若しくは立体異性体。
【請求項３】
式Ｃ：
【化３】
2012511000.tif 000036
［式中、
Ｗが、独立して、ＣＨ又はＮであり、かつＹが、独立して、ＣＨ又はＮであり、ただし、Ｗ又はＹの少なくとも１つがＮであり；
Ｘが、Ｏ、又はＮＨ２であり；
Ｌ１が、Ｃ０−Ｃ３アルキルであり；
Ｌ２が、Ｃ０−Ｃ３アルキルであり；かつ
Ｒ２が、ハロである］
の、請求項２に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩若しくは立体異性体。
【請求項４】
１−（３，４−ジフルオロベンジル）−６−オキソ−Ｎ−｛（１Ｒ）−２−［（２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンズイミダゾール−５−イル）オキシ］−１−フェニルエチル｝−１，６−ジヒドロピリミジン−５−カルボキサミド；及び
４−（３，４−ジフルオロベンジル）−３−オキソ−Ｎ−｛（１Ｒ）−２−［（２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンズイミダゾール−５−イル）オキシ］−１−フェニルエチル｝−３，４−ジヒドロピラジン−２−カルボキサミド；
から選択される、請求項１に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩若しくは立体異性体。
【請求項５】
医薬担体と、そこに分散された治療有効量の請求項１に記載の化合物とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項６】
その処置を要する哺乳類における癌の治療又は予防に有用な医薬の製造のための、請求項１に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
３−ホスホイノシチド依存性タンパク質キナーゼ−１（ＰＤＫ１）は、Ｃ−末端プレクストリン相同（ＰＨ）ドメイン（残基４５９−５５０）及びＮ−末端キナーゼドメイン（残基７０−３５９）を含んでなる、５５６個のアミノ酸を含有する酵素である。ＰＤＫｌのＰＨドメインは、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）などのホスファチジルイノシトールキナーゼによって産生されるホスファチジルイノシトール（例えば、ホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸及びホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸）と結合し、そのレベルは一部、ＰＴＥＮ（ホスファターゼ及びテンシンホモログ）などのホスファターゼによって調節されている。ＰＤＫｌは、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路において中心的役割を果たしており、重要な上流活性化キナーゼとしての役割の故に、「マスターレギュレーター」キナーゼと呼ばれてきたが、その役割は、ＰＫＢの３種のアイソフォーム全て（ＰＫＢα、ＰＫＢβ、ＰＫＢγ、各々Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、及びＡｋｔ３としても公知）、ＲＳＫ（３種のアイソフォーム、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ｐ９０ＲＳＫとしても公知）、ｐ７０Ｓ６Ｋ（２種のアイソフォーム、Ｓ６Ｋ１及びＳ６Ｋ２）、ＳＧＫ１、及びＰＫＣを包含するがこれに限定されない、キナーゼＡＧＣファミリーの多くのキナーゼに対し、いわゆるＴ−ループリン酸化部位をリン酸化するというものである。
【０００２】
インスリン、インスリン様成長因子−１、及び血小板由来成長因子を包含する数種のペプチド成長因子からのシグナルは、ＰＫＢによって伝達される。ＰＤＫｌと同様、ＰＫＢは、ホスファチジル３，４，５−三リン酸と結合するＰＨドメインを含有する。ＰＫＢは、原形質膜へ移行し、ＰＩ３Ｋにより産生され、第２のメッセンジャーであるホスファチジル３，４，５−三リン酸に応答して、残基Ｔ−３０８／３０９（この２つのリン酸化部位は、異なるアイソフォームに対応する）においてＰＤＫｌによりリン酸化される。腫瘍細胞におけるＰＫＢの活性化は、抗アポトーシスシグナルによる細胞生存の増大をもたらし、また増殖をもたらす結果となる。ＰＫＢβの増幅は、卵巣癌、乳癌、及び膵臓癌を包含する数種の腫瘍タイプの一部に観察されてきた。同様に、ＰＫＢαの増幅は、胃腺癌標本においてある割合で観察されてきた。最近、ＰＫＢαの活性化された突然変異型（Ｅ１７Ｋ）が、いくつかの乳癌（８％）、結腸直腸癌（６％）、及び卵巣癌（２％）で検出された。ＰＤＫｌキナーゼ阻害剤は、ＰＤＫｌによるＰＫＢシグナリングの活性化を妨げることで、ＰＫＢシグナリングの関連疾患（例えば、癌、コーデン症候群、レルミット−デュクロス病、及びバンナヤン−ゾナナ（Ｂａｎｎａｙａｎ−Ｚｏｎａｎａ）症候群）の治療剤として有用である。
【０００３】
同様に、ＰＤＫｌキナーゼ阻害剤は、ＰＤＫｌによるｐ７０Ｓ６Ｋの活性化を阻止することにより、癌又は他の増殖性疾患の治療に有用である。ｐ７０Ｓ６Ｋの数種類の基質（リボソームＳ６タンパク質、ｅＩＦ４Ｂ、ＰＤＣＤ４など）があり、これらは翻訳阻害複合体形成又はリボソームタンパク質合成に関与する。リボソームＳ６タンパク質のリン酸化の阻害を介したタンパク質合成の阻害は、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）による腫瘍細胞増殖を阻害すると考えられる。ｐ７０Ｓ６Ｋ遺伝子の増幅は、乳癌の標本において観察されてきた。ｐ７０Ｓ６Ｋ及びＨＥＲ−２の同時増幅は、癌患者における低い生存率と相関する。ｐ７０Ｓ６Ｋの過剰活性化（Ｔ３８９のリン酸化によって測定される）は、乳癌、頭頚部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、神経膠芽腫、肺及び肝臓の原発腫瘍標本の免疫組織化学的分析により観察されてきた。
【０００４】
同様に、ＰＤＫｌキナーゼ阻害剤は、ＰＤＫｌによるＲＳＫ１（ｐ９０ＲＳＫとしても公知）の活性化を阻止することにより、癌の治療に有用である。ＲＳＫ１は、ＢＡＤ、ＬＫＢ１、ＴＳＣ２、ＮＦｋＢ、ｍＴＯＲのリン酸化を直接又は間接的に媒介することにより、抗アポトーシス及び増殖シグナルを伝達する。Ｒａｓ／ＭＡＰＫ経路は、原発腫瘍の＞５０％において活性化されている。ＲＳＫ１活性は、ＭＡＰＫ活性と相関する。ＲＳＫ１は、原発性の乳癌及び前立腺癌標本において過剰発現されている。
【０００５】
ＰＤＫｌシグナリングは、血管形成における多数の重要な段階を調節している。それ故ＰＤＫｌ活性の阻害剤は、癌、特に、ＰＴＥＮの機能喪失変異、ＰＩ３Ｋの機能獲得変異、及び受容体チロシンキナーゼの機能獲得変異を包含するがこれに限定されない、ＰＴＥＮ／ＰＩ３Ｋ経路の活性調節解除に関連した癌の治療において有用である。
【０００６】
ＰＤＫｌシグナリングはまた、腫瘍発生にも関連づけられてきており、ＰＤＫｌ阻害剤は腫瘍の予防及び腫瘍再発の予防に有用である。ＰＴＥＮのヘテロ接合（ＰＴＥＮ＋／−）遺伝子型をもつマウスが、自然発生的に腫瘍を発生させることは周知である。アレッシー（Ａｌｅｓｓｉ）及びその共同研究者らは、正常ＰＤＫｌタンパク質レベルの＜３０％を発現するＰＤＫｌ低次形態ＰＴＥＮ＋／−マウスが、正常レベルのＰＤＫｌタンパク質を発現する同腹子コントロールに比較して、腫瘍形成において有意な遅延を示すことを見出した（「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、２００５年、第１５巻、ｐ．１８３９−１８４６）。
【０００７】
ＳＧＫ１（血清及びグルココルチコイド調節キナーゼ−１）活性は、インスリン媒介性のＮａ＋保持及び高血圧作用にとり重要である。ＰＤＫｌキナーゼ阻害剤によるＳＧＫ１活性の阻害は、高血圧及び／又は低インスリン血症の治療に有用である。
【発明の概要】
【０００８】
ＰＤＫｌの阻害剤である新規化合物を提供することが、本発明の目的である。
【０００９】
ＰＤＫｌの阻害剤である新規化合物を含んでなる医薬組成物を提供することも、本発明の目的である。
【００１０】
かかるＰＤＫｌ活性阻害剤を投与することを含んでなる、癌を治療するための方法を提供することも、本発明の目的である。
【００１１】
かかるＰＤＫｌ活性阻害剤を投与することを含んでなる、腫瘍再発を治療するための方法を提供することも、本発明の目的である。
【００１２】
かかるＰＤＫｌ活性阻害剤を投与することを含んでなる、高血圧を治療するための方法を提供することも、本発明の目的である。
【００１３】
かかるＰＤＫｌ活性阻害剤を投与することを含んでなる、糖尿病を治療するための方法を提供することも、本発明の目的である。
【００１４】
発明の要旨
本発明は、ＰＤＫｌ活性を阻害する化合物を提供する。本発明はまた、かかる阻害化合物を含んでなる組成物、及び癌の治療を必要とする患者に該化合物を投与することによりＰＤＫｌ活性を阻害する方法も提供する。
【００１５】
発明の詳細な記載
本発明の化合物は、ＰＤＫｌの活性の阻害において有用である。本発明の第１の実施態様においては、ＰＤＫｌ活性の阻害剤は、式Ａ：
【００１６】
【化１】
2012511000.tif 000002
【００１７】
［式中、
ｎは、０、１、２、３、４、又は５であり；
Ｗは、独立して、Ｃ又はＮであり、Ｙは、独立して、Ｃ又はＮであり、Ｚは、独立して、Ｃ又はＮであり、ただし、Ｗ、Ｙ、及びＺの少なくとも１つはＮであり；
Ｘは、Ｏ、ＣＨ２、又はＮＨであり；
環Ｋは、アリール又はヘテロアリールであり；
Ｌ１は、Ｃ０−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、又はヘテロアリールであり、ここで、前記アルキルは、Ｃ１−Ｃ６アルキル又はフェニルで置換されていてもよく、ここで、前記フェニルは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキル−ＯＨ、Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ハロ、及びＯＨで置換されていてもよく；
Ｌ２は、Ｃ０−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、又はヘテロアリールであり、ここで、前記アルキルは、Ｃ１−Ｃ６アルキル又はフェニルで置換されていてもよく；
Ｒ１は、ヘテロシクリルであり、これは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキル−ＯＨ、Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、ＣＯ２Ｈ、ハロ、ＯＨ、オキソ、及びＮＲ８Ｒ９で置換されていてもよく；
Ｒ２は、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキル−ＯＨ、Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、ＣＯ２Ｈ、ハロ、ＯＨ、及びＮＲ８Ｒ９から選択され；
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキル−ＯＨ、Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、ＣＯ２Ｈ、ハロ、ＯＨ、及びＮＲ８Ｒ９から選択され；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキル−ＯＨ、Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、ＣＯ２Ｈ、ハロ、ＯＨ、及びＮＲ８Ｒ９から選択され；
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキル−ＯＨ、Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、ＣＯ２Ｈ、ハロ、ＯＨ、及びＮＲ８Ｒ９から選択され；
Ｒ６及びＲ７は、独立して、Ｈ及びＣ１−Ｃ６アルキルから選択され；かつ
Ｒ８及びＲ９は、独立して、Ｈ及びＣ１−Ｃ６アルキルから選択される］
又はその薬学的に許容される塩若しくは立体異性体により例示される。
【００１８】
本発明の第２の実施態様においては、ＰＤＫｌ活性の阻害剤は、式Ｂ：
【００１９】
【化２】
2012511000.tif 000003
【００２０】
［式中、
ｎは、１、２、又は３であり；
Ｗは、独立して、Ｃ又はＮであり、かつＹは、独立して、Ｃ又はＮであり、ただし、Ｗ又はＹの少なくとも１つはＮであり；
Ｘは、Ｏ、ＣＨ２、又はＮＨであり；
Ｌ１は、Ｃ０−Ｃ５アルキル、又はＣ２−Ｃ５アルケニルであり；
Ｌ２は、Ｃ０−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、又はヘテロアリールであり、ここで、前記アルキルは、Ｃ１−Ｃ６アルキル又はフェニルで置換されていてもよく；
Ｒ１は、ヘテロシクリルであり、これは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキル−ＯＨ、Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、ＣＯ２Ｈ、ハロ、ＯＨ、オキソ、及びＮＲ８Ｒ９で置換されていてもよく；
Ｒ２は、ハロであり；
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキル−ＯＨ、Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、ＣＯ２Ｈ、ハロ、ＯＨ、及びＮＲ８Ｒ９から選択され；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキル−ＯＨ、Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、ＣＯ２Ｈ、ハロ、ＯＨ、及びＮＲ８Ｒ９から選択され；
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキル−ＯＨ、Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、ＣＯ２Ｈ、ハロ、ＯＨ、及びＮＲ８Ｒ９から選択され；
Ｒ６及びＲ７は、独立して、Ｈ及びＣ１−Ｃ６アルキルから選択され；かつ
Ｒ８及びＲ９は、独立して、Ｈ及びＣ１−Ｃ６アルキルから選択される］
又はその薬学的に許容される塩若しくは立体異性体により例示される。
【００２１】
本発明の第３の実施態様においては、ＰＤＫｌ活性の阻害剤は、式Ｃ：
【００２２】
【化３】
2012511000.tif 000004
【００２３】
［式中、
Ｗは、独立して、ＣＨ又はＮであり、かつＹは、独立して、ＣＨ又はＮであり、ただし、Ｗ又はＹの少なくとも１つはＮであり；
Ｘは、Ｏ、又はＮＨ２であり；
Ｌ１は、Ｃ０−Ｃ３アルキルであり；
Ｌ２は、Ｃ０−Ｃ３アルキルであり；かつ
Ｒ２は、ハロである］
又はその薬学的に許容される塩若しくは立体異性体により例示される。
【００２４】
本発明の具体的な化合物は、
１−（３，４−ジフルオロベンジル）−６−オキソ−Ｎ−｛（１Ｒ）−２−［（２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンズイミダゾール−５−イル）オキシ］−１−フェニルエチル｝−１，６−ジヒドロピリミジン−５−カルボキサミド；及び
４−（３，４−ジフルオロベンジル）−３−オキソ−Ｎ−｛（１Ｒ）−２−［（２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンズイミダゾール−５−イル）オキシ］−１−フェニルエチル｝−３，４−ジヒドロピラジン−２−カルボキサミド；
又はその薬学的に許容される塩若しくは立体異性体を包含する。
【００２５】
本発明の化合物は、不斉中心、キラル軸、及びキラル面を有してもよく（エリエル（Ｅ．Ｌ．Ｅｌｉｅｌ）及びウィレン（Ｓ．Ｈ．Ｗｉｌｅｎ）、「Ｓｔｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（炭素化合物の立体化学）」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９４年、ｐ．１１１９−１１９０に記載の通り）、かつラセミ体として、ラセミ混合物、及び個々のジアステレオマーとして存在し、全ての可能な異性体及びそれらの混合物が、光学異性体を含めて、本発明に包含される。さらに、本明細書に開示された化合物は、互変異性体として存在してもよく、たとえ一方の互変異性体構造のみが描かれている場合でも、双方の互変異性体型が本発明の範囲によって包含されることが意図されている。
【００２６】
任意の変数（例えば、Ｒ２）が任意の構成成分において２回以上出現する場合、その出現ごとの定義は、他のあらゆる出現とは無関係である。また、置換基及び変数の組合せは、かかる組合せが結果として安定な化合物を生じる場合にのみ許容される。置換基から環系内へ描かれた線は、示された結合が、置換可能な任意の環原子へ結合されてよいことを表わしている。環系が二環式である場合、結合は該二環式基のいずれかの環上の任意の適当な原子に結合されることが意図されている。
【００２７】
本発明の化合物上の置換基及び置換パターンが、当業者により選択されて、容易に入手可能な出発物質から、化学的に安定な化合物であり、かつ当該技術分野における技術上既知の方法並びに以下に示す方法により、容易に合成し得る化合物を提供し得ることが理解される。１個の置換基自体が２個以上の基で置換されている場合、結果として安定な構造を生じる限り、これらの多数の基が、同じ炭素上若しくは異なる炭素上にあってもよいことが理解される。語句「１個以上の置換基で置換されていてもよい」は、語句「少なくとも１個の置換基で置換されていてもよい」と同等であると理解されるべきであり、かかる場合、好適な実施態様は、ゼロないし３個の置換基をもつことができる。
【００２８】
本発明の化合物中に、１個以上のＳｉ原子が当業者により取り込まれて、容易に入手可能な出発物質から、化学的に安定な化合物であり、かつ当該技術分野における技術上既知の方法により容易に合成し得る化合物を提供し得ることが理解される。
【００２９】
本明細書で用いる場合、「アルキル」は、特定の数の炭素原子を有している、分枝及び直鎖双方の飽和脂肪族炭化水素基を包含することを意図している。例えば、「Ｃ１−Ｃ６アルキル」における場合、Ｃ１−Ｃ６は、１、２、３、４、５、又は６個の炭素を、直鎖又は分枝状の配置中に有する基を包含するものと定義される。例えば、「Ｃ１−Ｃ６アルキル」は、具体的には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｉ−ブチル、ペンチル、ヘキシルなどを包含する。
【００３０】
炭素原子の数が指定されていない場合、用語「アルケニル」は、２ないし１０個の炭素原子と、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合とを含有する、直鎖、分枝鎖、又は環式の非芳香族炭化水素基を指す。好ましくは、１つの炭素−炭素二重結合が存在し、かつ４個までの非芳香族炭素−炭素二重結合が存在してもよい。したがって、「Ｃ２−Ｃ６アルケニル」は、２ないし６個の炭素原子を有するアルケニル基を意味する。アルケニル基は、エテニル、プロペニル、ブテニル、２−メチルブテニル、及びシクロヘキセニルを包含する。アルケニル基の直鎖、分枝鎖、又は環式部分が、二重結合を含有してもよく、かつ置換アルケニル基が示されている場合には置換されていてもよい。
【００３１】
本明細書で用いる場合、「アリール」は、各環が７個までの原子からなる任意の安定な単環又は二環式の炭素環を意味することを意図しており、ここで、少なくとも１つの環は芳香族である。かかるアリール基の例は、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、ビフェニル、フェナントリル、アントリル、又はアセナフチルを包含する。アリール置換基が二環式であり、かつ一方の環が非芳香族である場合、結合は芳香族環を介するものと理解される。
【００３２】
用語「ヘテロアリール」は、本明細書で用いる場合、各環が７個までの原子からなる安定な単環又は二環式の環を表わし、ここで、少なくとも１つの環は芳香族であり、かつ、Ｏ、Ｎ、及びＳからなる群より選択される１ないし４個のヘテロ原子を含有する。この定義の範囲内のヘテロアリール基は、アクリジニル、カルバゾリル、シンノリニル、キノキサリニル、ピラゾリル、インドリル、ベンゾトリアゾリル、フラニル、チエニル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、キノリニル、イソキノリニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、インドリル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリジニル、ピリミジニル、ピロリル、テトラヒドロキノリンを包含する。以下の複素環の定義と同様に、「ヘテロアリール」はまた、任意の窒素含有ヘテロアリールのＮ−オキシド誘導体を包含するものと理解される。ヘテロアリール置換基が二環式であり、かつ一方の環が非芳香族であるか又は何らヘテロ原子を含有しない場合、結合はそれぞれ、芳香族環又はヘテロ原子含有環を介するものと理解される。
【００３３】
当業者により理解されるように、「ハロ」又は「ハロゲン」は、本明細書で用いる場合、クロロ（Ｃｌ）、フルオロ（Ｆ）、ブロモ（Ｂｒ）、及びヨード（Ｉ）を包含することが意図されている。
【００３４】
用語「複素環」又は「ヘテロシクリル」は、本明細書で用いる場合、Ｏ、Ｎ、及びＳからなる群より選択される１ないし４個のヘテロ原子を含有する、３ないし１０員の、芳香族又は非芳香族複素環を意味することが意図されており、かつ二環式、三環式、四環式の基を包含する。それ故「ヘテロシクリル」は、上述のヘテロアリール、並びにそのジヒドロ及びテトラヒドロ類似体を包含する。「ヘテロシクリル」のさらなる例は、ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾフラザニル、ベンゾピラゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリル、カルバゾリル、カルボリニル、クロマニル、シンノリニル、フラニル、イミダゾリル、インドリニル、インドリル、インドラジニル、インダゾリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ナフトピリジニル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、オキサゾリン、イソオキサゾリン、オキセタニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリドピリジニル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、テトラヒドロピラニル、テトラゾリル、テトラゾロピリジル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、アゼチジニル、１，４−ジオキサニル、ヘキサヒドロアゼピニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピロリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ジヒドロベンゾイミダゾリル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾチオフェニル、ジヒドロベンゾオキサゾリル、ジヒドロフラニル、ジヒドロイミダゾリル、ジヒドロインドリル、ジヒドロイソクロメニル、ジヒドロイソオキサゾリル、ジヒドロイソチアゾリル、ジヒドロオキサジアゾリル、ジヒドロオキサゾリル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロピロリル、ジヒドロキノリニル、ジヒドロテトラゾリル、ジヒドロチアジアゾリル、ジヒドロチアゾリル、ジヒドロチエニル、ジヒドロトリアゾリル、ジヒドロアゼチジニル、メチレンジオキシベンゾイル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロイソキノリニル、テトラヒドロキノリニル、及びテトラヒドロチエニル、及びそのＮ−オキシドを包含する。ヘテロシクリル置換基の結合は、炭素原子を介するか、又はヘテロ原子を介して生じ得る。
【００３５】
式Ａの１つの実施態様においては、環Ｋは、フェニルである。
【００３６】
式Ａの別の実施態様においては、Ｚは、ＣＨである。
【００３７】
式Ａの別の実施態様においては、Ｘは、Ｏである。
【００３８】
式Ａの１つの実施態様においては、Ｘは、ＮＨ２である。
【００３９】
式Ａの別の実施態様においては、Ｘは、ＣＨ２であり、Ｌ１は、Ｃ０−Ｃ３アルキルであり、ここで、前記アルキルは、フェニルで置換されている。
【００４０】
式Ａの別の実施態様においては、Ｘは、ＮＨ２であり、Ｌ１は、Ｃ０−Ｃ３アルキルであり、ここで、前記アルキルは、フェニルで置換されている。
【００４１】
式Ａの別の実施態様においては、Ｌ２は、Ｃ０−Ｃ３アルキルである。
【００４２】
式Ａの別の実施態様においては、Ｌ２は、存在しない。
【００４３】
式Ａの別の実施態様においては、Ｒ１は、以下の：
【００４４】
【化４−１】
2012511000.tif 000005
【００４５】
【化４−２】
2012511000.tif 000006
【００４６】
から選択され、これらは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキル−ＯＨ、Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、ＣＯ２Ｈ、ハロ、ＯＨ、及びＮＲ８Ｒ９で置換されていてもよい。
【００４７】
式Ａの別の実施態様においては、Ｒ２は、ハロである。
【００４８】
式Ａの別の実施態様においては、Ｒ２は、Ｆである。
【００４９】
式Ａの別の実施態様においては、Ｒ３は、Ｈ及びハロから選択される。
【００５０】
式Ａの別の実施態様においては、Ｒ４は、Ｈ及びハロから選択される。
【００５１】
式Ａの別の実施態様においては、Ｒ５は、Ｈ及びハロから選択される。
【００５２】
式Ａの別の実施態様においては、Ｒ６及びＲ７は、Ｈである。
【００５３】
式Ｂの１つの実施態様においては、Ｘは、Ｏである。
【００５４】
式Ｂの１つの実施態様においては、Ｘは、ＣＨ２である。
【００５５】
式Ｂの１つの実施態様においては、Ｘは、ＮＨ２である。
【００５６】
式Ｂの別の実施態様においては、Ｌ１は、Ｃ０−Ｃ３アルキルである。
【００５７】
式Ｂの別の実施態様においては、Ｌ２は、Ｃ０−Ｃ３アルキルである。
【００５８】
式Ｂの別の実施態様においては、Ｒ１は、以下の：
【００５９】
【化５−１】
2012511000.tif 000007
【００６０】
【化５−２】
2012511000.tif 000008
【００６１】
から選択され、これらは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキル−ＯＨ、Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、ＣＯ２Ｈ、ハロ、ＯＨ、及びＮＲ８Ｒ９で置換されていてもよい。
【００６２】
式Ｂの別の実施態様においては、Ｒ２は、ハロである。
【００６３】
式Ｂの別の実施態様においては、Ｒ２は、Ｆである。
【００６４】
式Ｂの別の実施態様においては、Ｒ３は、Ｈ及びハロから選択される。
【００６５】
式Ｂの別の実施態様においては、Ｒ４は、Ｈ及びハロから選択される。
【００６６】
式Ｂの別の実施態様においては、Ｒ５は、Ｈ及びハロから選択される。
【００６７】
式Ｂの別の実施態様においては、Ｒ６及びＲ７は、Ｈである。
【００６８】
式Ｃの別の実施態様においては、Ｘは、Ｏである。
【００６９】
式Ｃの別の実施態様においては、Ｘは、ＨＮである。
【００７０】
式Ｃの別の実施態様においては、Ｌ１は、ＣＨ２である。
【００７１】
式Ｃの別の実施態様においては、Ｌ２は、存在しない。
【００７２】
式Ｃの１つの実施態様においては、Ｒ２は、Ｆである。
【００７３】
本発明に包含されるのは、式Ａの化合物の遊離型、並びにその薬学的に許容される塩及び立体異性体である。本明細書に例示された単離された具体的な化合物のあるものは、アミン化合物のプロトン化された塩である。用語「遊離型」は、非塩型のアミン化合物を指す。包含される薬学的に許容される塩は、本明細書に記載の具体的な化合物に代表される単離された塩ばかりでなく、式Ａの化合物の遊離型の全ての典型的な薬学的に許容される塩も包含する。記載された具体的な塩化合物の遊離型は、当該技術分野における技術上既知の方法を用いて単離されてよい。例えば、遊離型は、その塩を、適当な塩基の希釈水溶液、例えばＮａＯＨ、炭酸カリウム、アンモニア、及び炭酸水素ナトリウムの希釈水溶液、で処理することにより再生してもよい。遊離型は、極性溶媒中の溶解度のような、ある物理的性質において、その各々の塩型と幾分異なってもよいが、本発明では、酸及び塩基塩は、その他の点ではその各々の遊離型と医薬的に同等である。
【００７４】
当該化合物の薬学的に許容される塩は、塩基性又は酸性の基を含有する本発明化合物から、通常の化学的方法により合成可能である。一般に、塩基性化合物の塩は、イオン交換クロマトグラフィーによるか、又は、遊離塩基を化学量論的な量の、又は過剰の、所望の塩形成性無機又は有機酸と、適当な溶媒又は溶媒の種々の組合せの中で反応させることにより調製される。同様に、酸性化合物の塩は、適切な無機又は有機塩基との反応により形成される。
【００７５】
したがって、本発明化合物の薬学的に許容される塩は、塩基性の当該化合物を無機又は有機酸と反応させることにより形成される、本発明化合物の通常の非毒性塩を包含する。例えば、通常の非毒性塩は、無機酸（例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸など）から誘導される塩、並びに有機酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）など）から調製される塩を包含する。
【００７６】
本発明化合物が酸性である場合、適当な「薬学的に許容される塩」は、無機塩基及び有機塩基を含む、薬学的に許容される非毒性塩基から調製される塩を指す。無機塩基から誘導される塩は、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、第二マンガン、第一マンガン、カリウム、ナトリウム、亜鉛などの塩を包含する。特に好適な塩は、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、カリウム、及びナトリウムの塩である。薬学的に許容される有機の非毒性塩基から誘導される塩は、第一級、第二級、及び第三級のアミンの塩；天然産置換アミンを含む置換アミンの塩；環状アミン及び塩基性イオン交換樹脂、例えば、アルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ１−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リジン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミンなどの塩を包含する。
【００７７】
上記記載の薬学的に許容される塩及び他の典型的な薬学的に許容される塩の調製は、バーグ（Ｂｅｒｇ）ら著、「ジャーナル・オブ・ファーマシューティカル・サイエンセズ（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．）、ファーマシューティカル・ソルツ（‘Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ’  （医薬用塩類）」、１９７７年、第６６巻、ｐ．１−１９により、さらに充分に記載されている。
【００７８】
生理的条件下では、該化合物中の脱プロトン化された酸性基、例えばカルボキシル基がアニオン性であってよく、この電子電荷が次に、プロトン化又はアルキル化された塩基性基、例えば第四級窒素原子のカチオン性電荷に対し、内部で平衡化されてもよいことから、本発明の化合物が潜在的に内部塩又は両性イオンであることもまた注目されるであろう。
【００７９】
有用性
３−ホスホイノシチド依存性タンパク質キナーゼ−１（ＰＤＫ１）は、Ｃ−末端プレクストリン相同（ＰＨ）ドメイン（残基４５９−５５０）及びＮ−末端キナーゼドメイン（残基７０−３５９）を含んでなる、５５６個のアミノ酸を含有する酵素である。ＰＤＫｌのＰＨドメインは、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）などのホスファチジルイノシトールキナーゼによって産生されるホスファチジルイノシトール（例えば、ホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸及びホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸）と結合し、そのレベルは一部、ＰＴＥＮ（ホスファターゼ及びテンシンホモログ）などのホスファターゼによって調節されている。ＰＤＫｌは、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路において中心的役割を果たしており、重要な上流活性化キナーゼとしての役割の故に、「マスターレギュレーター」キナーゼと呼ばれてきたが、その役割は、ＰＫＢの３種のアイソフォーム全て（ＰＫＢα、ＰＫＢβ、ＰＫＢγ、各々Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、及びＡｋｔ３としても公知）、ＲＳＫ（３種のアイソフォーム、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＲＳＫ３、ｐ９０ＲＳＫとしても公知）、ｐ７０Ｓ６Ｋ（２種のアイソフォーム、Ｓ６Ｋ１及びＳ６Ｋ２）、ＳＧＫ１、及びＰＫＣを包含するがこれに限定されない、キナーゼＡＧＣファミリーの多くのキナーゼに対し、いわゆるＴ−ループリン酸化部位をリン酸化するというものである。
【００８０】
インスリン、インスリン様成長因子−１、及び血小板由来成長因子を包含する数種のペプチド成長因子からのシグナルは、ＰＫＢによって伝達される。ＰＤＫｌと同様、ＰＫＢは、ホスファチジル３，４，５−三リン酸と結合するＰＨドメインを含有する。ＰＫＢは、原形質膜へ移行し、ＰＩ３Ｋにより産生され、第２のメッセンジャーであるホスファチジル３，４，５−三リン酸に応答して、残基Ｔ−３０８／３０９（この２つのリン酸化部位は、異なるアイソフォームに対応する）においてＰＤＫｌによりリン酸化される。腫瘍細胞におけるＰＫＢの活性化は、抗アポトーシスシグナルによる細胞生存の増大をもたらし、また増殖をもたらす結果となる。ＰＫＢβの増幅は、卵巣癌、乳癌、及び膵臓癌を包含する数種の腫瘍タイプの一部に観察されてきた。同様に、ＰＫＢαの増幅は、胃腺癌標本においてある割合で観察されてきた。最近、ＰＫＢαの活性化された突然変異型（Ｅ１７Ｋ）が、いくつかのの乳癌（８％）、結腸直腸癌（６％）、及び卵巣癌（２％）で検出された。ＰＤＫｌキナーゼ阻害剤は、ＰＤＫｌによるＰＫＢシグナリングの活性化を妨げることで、ＰＫＢシグナリングの関連疾患（例えば、癌、コーデン症候群、レルミット−デュクロス病、及びバンナヤン−ゾナナ（Ｂａｎｎａｙａｎ−Ｚｏｎａｎａ）症候群）の治療剤として有用である。
【００８１】
同様に、ＰＤＫｌキナーゼ阻害剤は、ＰＤＫｌによるｐ７０Ｓ６Ｋの活性化を阻止することにより、癌又は他の増殖性疾患の治療に有用である。ｐ７０Ｓ６Ｋの数種類の基質（リボソームＳ６タンパク質、ｅＩＦ４Ｂ、ＰＤＣＤ４など）があり、これらは翻訳阻害複合体形成又はリボソームタンパク質合成に関与する。リボソームＳ６タンパク質のリン酸化の阻害を介したタンパク質合成の阻害は、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）による腫瘍細胞増殖を阻害すると考えられる。ｐ７０Ｓ６Ｋ遺伝子の増幅は、乳癌の標本において観察されてきた。ｐ７０Ｓ６Ｋ及びＨＥＲ−２の同時増幅は、癌患者における低い生存率と相関する。ｐ７０Ｓ６Ｋの過剰活性化（Ｔ３８９のリン酸化によって測定される）は、乳癌、頭頚部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、神経膠芽腫、肺及び肝臓の原発腫瘍標本の免疫組織化学的分析により観察されてきた。
【００８２】
同様に、ＰＤＫｌキナーゼ阻害剤は、ＰＤＫｌによるＲＳＫ１（ｐ９０ＲＳＫとしても公知）の活性化を阻止することにより、癌の治療に有用である。ＲＳＫ１は、ＢＡＤ、ＬＫＢ１、ＴＳＣ２、ＮＦｋＢ、ｍＴＯＲのリン酸化を直接又は間接的に媒介することにより、抗アポトーシス及び増殖シグナルを伝達する。Ｒａｓ／ＭＡＰＫ経路は、原発腫瘍の＞５０％において活性化されている。ＲＳＫ１活性は、ＭＡＰＫ活性と相関する。ＲＳＫ１は、原発性の乳癌及び前立腺癌標本において過剰発現されている。
【００８３】
ＰＤＫｌシグナリングは、血管形成における多数の重要な段階を調節している。それ故ＰＤＫｌ活性の阻害剤は、癌、特に、ＰＴＥＮの機能喪失変異、ＰＩ３Ｋの機能獲得変異、及び受容体チロシンキナーゼの機能獲得変異を包含するがこれに限定されない、ＰＴＥＮ／ＰＩ３Ｋ経路の活性調節解除に関連した癌の治療において有用である。
【００８４】
ＰＤＫｌシグナリングはまた、腫瘍発生にも関連づけられてきており、ＰＤＫｌ阻害剤は腫瘍の予防及び腫瘍再発の予防に有用である。ＰＴＥＮのヘテロ接合（ＰＴＥＮ＋／−）遺伝子型をもつマウスが、自然発生的に腫瘍を発生させることは周知である。アレッシー（Ａｌｅｓｓｉ）及びその共同研究者らは、正常ＰＤＫｌタンパク質レベルの＜３０％を発現するＰＤＫｌ低次形態ＰＴＥＮ＋／−マウスが、正常レベルのＰＤＫｌタンパク質を発現する同腹子コントロールに比較して、腫瘍形成において有意な遅延を示すことを見出した（「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、２００５年、第１５巻、ｐ．１８３９−１８４６）。
【００８５】
ＳＧＫ１（血清及びグルココルチコイド調節キナーゼ−１）活性は、インスリン媒介性のＮａ＋保持及び高血圧作用にとり重要である。ＰＤＫｌキナーゼ阻害剤によるＳＧＫ１活性の阻害は、高血圧及び／又は低インスリン血症の治療に有用である。
【００８６】
本発明の化合物は、腫瘍再発の治療に有用である。
【００８７】
本発明の化合物は、高血圧の治療に有用である。
【００８８】
本発明の化合物は、糖尿病の治療に有用である。
【００８９】
本発明は、かかるＰＤＫｌ活性阻害剤を投与することを含んでなる、腫瘍再発を治療
するための方法を提供する。
【００９０】
本発明は、かかるＰＤＫｌ活性阻害剤を投与することを含んでなる、高血圧を治療するための方法を提供する。
【００９１】
本発明は、かかるＰＤＫｌ活性阻害剤を投与することを含んでなる、糖尿病を治療するための方法を提供する。
【００９２】
本明細書において提供された化合物、組成物、及び方法は、特に癌の治療に有用であると考えられる。本発明の化合物、組成物、及び方法によって治療され得る癌は、制限されることなく：心臓：肉腫（血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫）、粘液腫、横紋筋腫、線維腫、脂肪腫、及び奇形腫；肺：気管支原性癌（扁平上皮細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌）、肺胞（細気管支）癌、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨腫様過誤腫、中皮腫；胃腸：食道（扁平上皮細胞癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫）、胃（癌腫、リンパ腫、平滑筋肉腫）、膵臓（腺管腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、ビポーマ）、小腸（腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫）、大腸（腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫）；結腸直腸；尿生殖路：腎臓（腺癌、ウィルムス腫瘍［腎芽細胞腫］、リンパ腫、白血病）、膀胱及び尿道（扁平上皮細胞癌、移行上皮癌、腺癌）、前立腺（腺癌、肉腫）、精巣（精上皮腫、奇形腫、胎児性癌、奇形癌、絨毛上皮腫、肉腫、間質細胞癌、線維腫、線維腺腫、類腺腫瘍、脂肪腫）；肝臓：肝癌（肝細胞癌）、胆管癌、肝芽細胞腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫；骨：骨原性肉腫（骨肉腫）、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網肉腫）、多発性骨髄種、悪性巨細胞腫軟骨腫、骨軟骨腫（骨軟骨性外骨症）、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、類骨骨腫及び、巨細胞腫；神経系：頭蓋（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）、髄膜（髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症）、脳（星状細胞腫、髄芽細胞腫、神経膠腫、上衣細胞腫、胚細胞腫［松果体腫］、多形性神経膠芽腫、乏突起神経膠腫、神経鞘種、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍）、脊髄神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫）；婦人科系：子宮（子宮内膜癌）、子宮頚（子宮頚癌、前腫瘍性子宮頚部異形成）、卵巣（卵巣癌［漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、分類不能癌腫］、顆粒膜卵胞膜細胞腫、セルトリ−ライディッヒ細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫）、外陰（扁平上皮細胞癌、上皮内癌、腺癌、線維肉腫、黒色腫）、膣（明細胞癌、扁平上皮細胞癌、ブドウ状肉腫（胎児性横紋筋肉腫）、卵管（癌腫）、乳癌；血液系：血液（骨髄性白血病［急性及び慢性］、急性リンパ芽球生白血病、慢性リンパ球性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、脊髄異形成症候群）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫［悪性リンパ腫］；皮膚：悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、カポジ肉腫、色素性異形成毋斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維種、ケロイド、乾癬；及び副腎：神経芽細胞腫を包含する。したがって、本明細書に提供された、用語「癌性細胞」は、上記に定義された症状の任意の１つに苦しむ細胞を包含する。
【００９３】
本発明の化合物、組成物、及び方法によって治療され得る癌は、制限されることなく：乳癌、前立腺癌、結腸癌、結腸直腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、脳癌、精巣癌、胃癌、膵臓癌、皮膚癌、小腸癌、大腸癌、咽頭癌、頭頸部癌、口腔癌、骨癌、肝臓癌、膀胱癌、腎臓癌、甲状腺癌、及び血液癌を包含する。
【００９４】
本発明の化合物、組成物、及び方法によって治療され得る癌は、乳癌、前立腺癌、結腸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、及び甲状腺癌を包含する。
【００９５】
本発明の化合物、組成物、及び方法によって治療され得る癌は、乳癌、及び前立腺癌を包含する。
【００９６】
本発明の化合物はまた、癌の治療において有用な医薬の調製において有用である。
【００９７】
本発明化合物はまた、以下の治療薬との併用において、癌の治療に有用であってもよい：アバレリックス（プレナキシス・デポ（Ｐｌｅｎａｘｉｓ  ｄｅｐｏｔ）（登録商標））；アルデスロイキン（プロカイン（Ｐｒｏｋｉｎｅ）（登録商標））；アルデスロイキン（プロロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）（登録商標））；アレムツズマブ（キャンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）（登録商標））；アリトレチノイン（パンレチン（Ｐａｎｒｅｔｉｎ）（登録商標））；アロプリノール（ザイロプリム（Ｚｙｌｏｐｒｉｍ）（登録商標））；アルトレタミン（ヘキサレン（Ｈｅｘａｌｅｎ）（登録商標））；アミフォスチン（エチヨル（Ｅｔｈｙｏｌ）（登録商標））；アナストロゾール（アリミデックス（Ａｒｉｍｉｄｅｘ）（登録商標））；三酸化ヒ素（トリセノックス（Ｔｒｉｓｅｎｏｘ）（登録商標））；アスパラギナーゼ（エルスパル（Ｅｌｓｐａｒ）（登録商標））；アザシチジン（ビダザ（Ｖｉｄａｚａ）（登録商標））；ベバシズマブ（アバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）（登録商標））；ベキサロテン・カプセル（タルグレチン（Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ）（登録商標））；ベキサロテン・ゲル（タルグレチン（Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ）（登録商標））；ブレオマイシン（ブレノキサン（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ）（登録商標））；ボルテゾミブ（ベルケード（Ｖｅｌｃａｄｅ）（登録商標））；ブスルファン・静脈内（ブスルフレックス（Ｂｕｓｕｌｆｌｅｘ）（登録商標））；ブスルファン・経口（マイレラン（Ｍｙｌｅｒａｎ）（登録商標））；カルステロン（メトサーブ（Ｍｅｔｈｏｓａｒｂ）（登録商標））；カペシタビン（ゼローダ（Ｘｅｌｏｄａ）（登録商標））；カルボプラチン（パラプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ）（登録商標））；カルムスチン（ＢＣＮＵ（登録商標）、ＢｉＣＮＵ（登録商標））；カルムスチン（グリアデル（Ｇｌｉａｄｅｌ）（登録商標））；インプラント型ポリフェプロサン２０カルムスチン（グリアデル・ウエファー（Ｇｌｉａｄｅｌ  Ｗａｆｅｒ）（登録商標））；セレコキシブ（セレブレックス（（Ｃｅｌｅｂｅｘ）（登録商標））；セツキシマブ（アービタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ）（登録商標））；クロランブシル（ロイケラン（Ｌｅｕｋｅｒａｎ）（登録商標））；シスプラチン（プラチノール（Ｐｌａｔｉｎｏｌ）（登録商標））；クラドリビン（ロイスタチン（Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ）（登録商標）、２−ＣｄＡ（登録商標））；クロファラビン（クロラール（Ｃｌｏｌａｒ）（登録商標））；シクロホスファミド（サイトキサン（Ｃｙｔｏｘａｎ）（登録商標）、ネオサール（Ｎｅｏｓａｒ）（登録商標））；シクロホスファミド（サイトキサン注射薬（Ｃｙｔｏｘａｎ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）（登録商標））；シクロホスファミド（サイトキサン・錠剤（Ｃｙｔｏｘａｎ  Ｔａｂｌｅｔ）（登録商標））；シタラビン（サイトサール−Ｕ（Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ）（登録商標））；リポソーム化シタラビン（ＤｅｐｏＣｙｔ（登録商標））；デカルバジン（ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標））；ダクチノマイシン、アクチノマイシンＤ（コスメゲン（Ｃｏｓｍｅｇｅｎ）（登録商標））；ダルベポエチン・アルファ（アラネスプ（Ａｒａｎｅｓｐ）（登録商標））；リポソ���ム化ダウノルビシン（ＤａｎｕｏＸｏｍｅ（登録商標））；ダウノルビシン、ダウノマイシン（ダウノルビシン（Ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）（登録商標））；ダウノルビシン、ダウノマイシン（セルビジン（Ｃｅｒｂｉｄｉｎｅ）（登録商標））；デニロイキン・ｄｉｆｔｉｔｏｘ（オンタック（Ｏｎｔａｋ）（登録商標））；デクスラゾキサン（ザインカード（Ｚｉｎｅｃａｒｄ）（登録商標））；ドセタキセル（タキソテール（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）（登録商標））；ドキソルビシン（アドリアマイシンＰＦＳ（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ  ＰＦＳ）（登録商標））；ドキソルビシン（アドリアマイシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）（登録商標）、ルベックス（Ｒｕｂｅｘ）（登録商標））；ドキソルビシン（アドリアマイシンＰＦＳ注射薬（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ  ＰＦＳ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）（登録商標））；リポソーム化ドキソルビシン（ドキシル（Ｄｏｘｉｌ）（登録商標））；プロピオン酸ドロモスタノロン（ドロモスタノロン（Ｄｒｏｍｏｓｔａｎｏｌｏｎｅ）（登録商標））；プロピオン酸ドロモスタノロン（マステロン注射薬（Ｍａｓｔｅｒｏｎｅ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）（登録商標））；エリオットのＢ溶液（エリオットのＢ溶液（Ｅｌｌｉｏｔｔ’ｓ  Ｂ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（登録商標））；エピルビシン（エレンス（Ｅｌｌｅｎｃｅ）（登録商標））；エポエチン・アルファ（エポジェン（ｅｐｏｇｅｎ）（登録商標））；エルロチニブ（タルセバ（Ｔａｒｃｅｖａ）（登録商標））；エストラムスチン（Ｅｍｃｙｔ（登録商標））；エトポシドリン酸塩（エトポフォス（Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ）（登録商標））；エトポシド、ＶＰ−１６（ベペシド（Ｖｅｐｅｓｉｄ）（登録商標））；エキセメスタン（アロマシン（Ａｒｏｍａｓｉｎ）（登録商標））；フィルグラスチム（ノイポゲン（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）（登録商標））；フロクスウリジン（動脈内）（ＦＵＤＲ（登録商標））；フルダラビン（フルダラ（Ｆｌｕｄａｒａ）（登録商標））；フルオロウラシル、５−ＦＵ（アドルシル（Ａｄｒｕｃｉｌ）（登録商標））；フルベストラント（ファスロデックス（Ｆａｓｌｏｄｅｘ）（登録商標））；ゲフィチニブ（イレッサ（Ｉｒｅｓｓａ）（登録商標））；ゲムシタビン（ゲムザール（Ｇｅｍｚａｒ）（登録商標））；ゲムツズマブ・オゾガマイシン（マイロターグ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）（登録商標））；ゴセレリン酢酸塩（ゾラデックス・インプラント（Ｚｏｌａｄｅｘ  Ｉｍｐｌａｎｔ）（登録商標））；ゴセレリン酢酸塩（ゾラデックス（Ｚｏｌａｄｅｘ）（登録商標））；ヒストレリン酢酸塩（ヒストレリン・インプラント（Ｈｉｓｔｒｅｌｉｎ  ｉｍｐｌａｎｔ）（登録商標））；ヒドロキシウレア（ハイドレア（Ｈｙｄｒｅａ）（登録商標））；イブリツモマブ・チウキセタン（ゼヴァリン（Ｚｅｖａｌｉｎ）（登録商標））；イダルビシン（イダマイシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ）（登録商標））；イフォスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標））；イマチニブメシル酸塩（グリベック（Ｇｌｅｅｖｅｃ）（登録商標））；インターフェロンアルファ２ａ（ロフェロンＡ（Ｒｏｆｅｒｏｎ  Ａ）（登録商標））；インターフェロンアルファ−２ｂ（イントロンＡ（Ｉｎｔｒｏｎ  Ａ）（登録商標））��イリノテカン（カンプトサール（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）（登録商標））；レナリドマイド（レブリミド（Ｒｅｖｌｉｍｉｄ）（登録商標））；レトロゾール（フェマーラ（Ｆｅｍａｒａ）（登録商標））；ロイコボリン（ウェルコボリン（Ｗｅｌｌｃｏｖｏｒｉｎ）（登録商標）、ロイコボリン（Ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ）（登録商標））；酢酸ロイプロリド（エリガード（Ｅｌｉｇａｒｄ）（登録商標））；レバミソール（エルガミゾール（Ｅｒｇａｍｉｓｏｌ）（登録商標））；ロムスチン、ＣＣＮＵ（ＣｅｅＢＵ（登録商標））；メクロレタミン・ナイトロジェンマスタード（マスタルゲン（Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ）（登録商標））；酢酸メゲストロール（メゲース（Ｍｅｇａｃｅ）（登録商標））；メルファラン、Ｌ−ＰＡＭ（アルケラン（Ａｌｋｅｒａｎ）（登録商標））；メルカプトプリン、６−ＭＰ（プリネトール（Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ）（登録商標））；メスナ（メスネックス（Ｍｅｓｎｅｘ）（登録商標））；メスナ（メスネックス錠（Ｍｅｓｎｅｘ  ｔａｂｓ）（登録商標））；メトトレキサート（メトトレキセート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）（登録商標））；メトキサレン（ウヴァデクス（Ｕｖａｄｅｘ）（登録商標））；マイトマイシンＣ（ミュータマイシン（Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ）（登録商標））；ミトタン（リソドレン（Ｌｙｓｏｄｒｅｎ）（登録商標））；ミトキサントロン（ノバントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）（登録商標））；フェンプロピオン酸ナンドロロン（デュラボリン−５０（Ｄｕｒａｂｏｌｉｎ−５０）（登録商標））；ネララビン（アラノン（Ａｒｒａｎｏｎ）（登録商標））；ノフェツモマブ（ヴァールマ（Ｖｅｒｌｕｍａ）（登録商標））；オプレルベキン（ニューメガ（Ｎｅｕｍｅｇａ）（登録商標））；オキサリプラチン（エロキサチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ）（登録商標））；パクリタキセル（パクセン（Ｐａｘｅｎｅ）（登録商標））；パクリタキセル（タキソール（Ｔａｘｏｌ）（登録商標））；パクリタキセル・タンパク質結合粒子（アブラキサン（Ａｂｒａｘａｎｅ）（登録商標））；パリフェルミン（ケピバンス（Ｋｅｐｉｖａｎｃｅ）（登録商標））；パミドロネート（アレディア（Ａｒｅｄｉａ）（登録商標））；ペグアデマーゼ（アダジェン（Ａｄａｇｅｎ）（ウシ・ペグアデマーゼ（Ｐｅｇａｄｅｍａｓｅ  Ｂｏｖｉｎｅ））（登録商標））；ペグアスパラガーゼ（オンキャスパー（Ｏｎｃａｓｐａｒ）（登録商標））；ペグフィルグラスチム（ニューラスタ（Ｎｅｕｌａｓｔａ）（登録商標））；ペメトレキセド２ナトリウム（アリムタ（Ａｌｉｍｔａ）（登録商標））；ペントスタチン（ナイペント（Ｎｉｐｅｎｔ）（登録商標））；ピポブロマン（バーサイト（Ｖｅｒｃｙｔｅ）（登録商標））；プリカマイシン、ミトラマイシン（ミトラシン（Ｍｉｔｈｒａｃｉｎ）（登録商標））；ポルフィマー・ナトリウム（フォトフリン（Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ）（登録商標））；プロカルバジン（マツラン（Ｍａｔｕｌａｎｅ）（登録商標））；キナクリン（アタブリン（Ａｔａｂｒｉｎｅ）（登録商標））；ラスブリカーゼ（エリテック（Ｅｌｉｔｅｋ）（登録商標））；リツキシマブ（リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）（登録商標））；サルグラモス���ン（リューカイン（Ｌｅｕｋｉｎｅ）（登録商標））；サルグラモスチン（プロカイン（Ｐｒｏｋｉｎｅ）（登録商標））；ソラフェニブ（ネクサバール（Ｎｅｘａｖａｒ）（登録商標））；ストレプトゾシン（ザノサール（Ｚａｎｏｓａｒ）（登録商標））；スニチニブ・マレイン酸塩（スーテント（Ｓｕｔｅｎｔ）（登録商標））；タルク（スクレロゾール（Ｓｃｌｅｒｏｓｏｌ）（登録商標））；タモキシフェン（ノルバデックス（Ｎｏｌｖａｄｅｘ）（登録商標））；テモゾロミド（テモダール（Ｔｅｍｏｄａｒ）（登録商標））；テニポシド、ＶＭ−２６（ヴァモン（Ｖｕｍｏｎ）（登録商標））；テストラクトン（テスラク（Ｔｅｓｌａｃ）（登録商標））；チオグアニン、６−ＴＧ（チオグアニン（Ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）（登録商標））；チオテパ（チオプレックス（Ｔｈｉｏｐｌｅｘ）（登録商標））；トポテカン（ハイカムチン（Ｈｙｃａｍｔｉｎ）（登録商標））；トレミフェン（フェアストン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）（登録商標））；トシツモマブ（ベキサール（Ｂｅｘｘａｒ）（登録商標））；トシツモマブ／Ｉ−１３１  トシツモマブ（ベキサール（Ｂｅｘｘａｒ）（登録商標））；トラツズマブ（ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（登録商標））；トレチノイン、ＡＴＲＡ（ベサノイド（Ｖｅｓａｎｏｉｄ）（登録商標））；ウラシル・マスタード（ウラシル・マスタード・カプセル（Ｕｒａｃｉｌ  Ｍｕｓｔａｒｄ  Ｃａｐｓｕｌｅｓ）（登録商標））；バルルビシン（バルスター（Ｖａｌｓｔａｒ）（登録商標））；ビンブラスチン（ベルバン（Ｖｅｌｂａｎ）（登録商標））；ビンクリスチン（オンコビン（Ｏｎｃｏｖｉｎ）（登録商標））；ビノレルビン（ナベルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）（登録商標））；ゾレドロネート（ゾメタ（Ｚｏｍｅｔａ）（登録商標））及びボリノスタット（ゾリンザ（Ｚｏｌｉｎｚａ）（登録商標））。
【００９８】
本発明の化合物は、タキサンとの併用において、癌を治療するために有用である。
【００９９】
本発明の化合物は、ドセタキセル（タキソテール（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）（登録商標））との併用において、癌を治療するために有用である。
【０１００】
本発明の化合物は、ボリノスタット（ゾリンザ（Ｚｏｌｉｎｚａ（登録商標））との併用において、癌を治療するために有用である。
【０１０１】
本発明の化合物は、ｍＴＯＲ阻害剤、ＡＰ２３５７３との併用において、癌を治療するために有用である。
【０１０２】
本発明の化合物は、１ＧＦ１Ｒ阻害剤、ＭＫ−０６４６との併用において、癌を治療するために有用である。
【０１０３】
本発明の化合物は、サトラプラチンとの併用において、癌を治療するために有用である。
【０１０４】
本発明の化合物は、ラパチニブ（タイケルブ（Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標））との併用において、癌を治療するために有用である。
【０１０５】
本発明の化合物は、ヒトを含む哺乳類に対し、単独で、又は薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤と組合せて、標準的薬学のプラクティスに従い、医薬組成物において投与されてよい。該化合物は、経口的に、又は、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、直腸内、及び局所の投与経路を含め、非経口的に投与可能である。
【０１０６】
活性成分を含有する医薬組成物は、例えば、錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性又は油性懸濁液、分散性粉末又は顆粒、エマルジョン、硬又は軟カプセル、又はシロップ又はエリキシルのような、経口使用に適した形状であってよい。経口使用を意図した組成物は、医薬組成物の製造のための当該技術分野において周知の任意の方法に従って調製されてよく、かかる組成物は、医薬的にエレガントで美味な製剤を提供するため、甘味剤、着香剤、着色剤、及び保存剤からなる群より選択される、１種以上の薬剤を含有してもよい。錠剤は、活性成分を、錠剤の製造に適した非毒性の薬学的に許容される賦形剤との混合物中に含有する。これらの賦形剤は、例えば、不活性な希釈剤、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、又はリン酸ナトリウム；造粒及び崩壊剤、例えば、微結晶セルロース、クロスカルメロースナトリウム、コーンスターチ、又はアルギン酸；結合剤、例えば、デンプン、ゼラチン、ポリビニル−ピロリドン、又はアラビアゴム、及び潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、又はタルクであってよい。錠剤は、コートされていなくてもよく、或いはそれらは、薬物の不快な味をマスクするか、又は消化管内での崩壊及び吸収を遅延させ、そしてそれにより長期間にわたる持続作用を提供するようにするため、周知の技術によりコートしてもよい。例えば、水溶性の味覚マスキング剤、例えばヒドロキシプロピルメチル−セルロース又はヒドロキシプロピルセルロース、又は時間遅延物質、例えば、エチルセルロース、セルロースアセテートブチレートを使用してもよい。
【０１０７】
経口使用用の製剤はまた、活性成分が、不活性な固形希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、又はカオリンと混合されている硬ゼラチンカプセルとして、或いは、活性成分が、水溶性担体、例えばポリエチレングリコール、又は油性媒体、例えば、ラッカセイ油、流動パラフィン、又はオリーブ油と混合されている軟ゼラチンカプセルとして供してもよい。
【０１０８】
水性懸濁液は、活性成分を、水性懸濁液の製造に適した賦形剤との混合物中に含有する。かかる賦形剤は、懸濁剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル−ピロリドン、トラガカントゴム、及びアラビアゴムであり；分散又は湿潤剤は、天然産ホスファチド、例えばレシチン、又は、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合産物、例えばステアリン酸ポリオキシエチレン、又は、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合産物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、又はエチレンオキシドと、脂肪酸及びヘキシトールから誘導される部分エステルとの縮合産物、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール、又はエチレンオキシドと、脂肪酸及びヘキシトール無水物から誘導される部分エステルとの縮合産物、例えばモノオレイン酸ポリエチレンソルビタンでよい。水性懸濁液はまた、１種以上の保存剤、例えば、エチル、又はｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾアート、１種以上の着色剤、１種以上の着香剤、及び１種以上の甘味剤、例えばスクロース、サッカリン、又はアスパルテームを含有してもよい。
【０１０９】
油性懸濁液は、活性成分を、植物油、例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油又はヤシ油か、又は鉱物油、例えば流動パラフィン中に懸濁することにより製剤してもよい。油性懸濁液は、増粘剤、例えば、蜜蝋、固形パラフィン、又はセチルアルコールを含有してもよい。上記に示されたような甘味剤、及び着香剤を、美味な経口用製剤を提供するために添加してもよい。これらの組成物は、酸化防止剤、例えば、ブチル化ヒドロキシアニソール又はアルファー−トコフェロールの添加により保存してもよい。
【０１１０】
水の添加による水性懸濁液の調製に適した分散性粉末及び顆粒は、活性成分を、分散又は湿潤剤、懸濁化剤、及び１種以上の保存剤との混合物中に提供する。適当な分散又は湿潤剤、及び懸濁化剤は、上記のすでに列挙されたものに例示される。付加的な賦形剤、例えば、甘味剤、着香剤、及び着色剤もまた存在してよい。これらの組成物を、アスコルビン酸のような酸化防止剤の添加により保存してもよい。
【０１１１】
本発明の医薬組成物はまた、水中油型エマルジョンの形状であってもよい。油性相は、植物油、例えばオリーブ油又はラッカセイ油、或いは鉱物油、例えば流動パラフィン、又はこれらの混合物でよい。適当な乳化剤は、天然産ホスファチド、例えばダイズレシチン、及び、脂肪酸とヘキシトール無水物とから誘導されるエステル又は部分エステル、例えばモノオレイン酸ソルビタン、及び、前記部分エステルと、エチレンオキシドとの縮合産物、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンでよい。エマルジョンはまた、甘味、着香剤、保存剤、及び酸化防止剤を含有してもよい。
【０１１２】
シロップ及びエリキシルは、甘味剤、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、又はスクロースを用いて製剤してもよい。かかる製剤はまた、粘滑剤、保存剤、着香剤及び着色剤、及び酸化防止剤を含有してもよい。
【０１１３】
医薬組成物はまた、無菌の注射用水溶液の形態であってもよい。使用してもよい許容されるビヒクル及び溶媒は、なかんずく、水、リンガー液、及び等張の塩化ナトリウム溶液である。
【０１１４】
無菌の注射用製剤はまた、活性成分が油性相中に溶解されている、無菌の注射可能な水中油型マイクロエマルジョンでもよい。例えば、活性成分を、まず、ダイズ油及びレシチンの混合物中に溶解してもよい。この油性溶液を、次に水とグリセロールとの混合物中に投入し、マイクロエマルジョンを形成するべく加工する。
【０１１５】
注射用溶液又はマイクロエマルジョンは、局所ボーラス注射により、患者の血中へ投入してもよい。別法として、該溶液又はマイクロエマルジョンを、本発明化合物の一定の循環濃度を維持するように投与することが有利であってもよい。かかる一定濃度を維持するため、持続静脈内送達装置を利用してもよい。かかる装置の一例は、デルテック（Ｄｅｌｔｅｃ）ＣＡＤＤ−ＰＬＵＳ（登録商標）モデル５４００静脈内ポンプである。
【０１１６】
医薬組成物は、筋肉内及び皮下投与用の、無菌の注射用水性又は油脂性懸濁液の形状でもよい。この懸濁液は、当該技術分野において周知の方法に従い、上記に列挙されてきた適当な分散又は湿潤剤及び懸濁化剤を用いて製剤してもよい。無菌の注射用製剤はまた、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液のような、非毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の、無菌の注射用溶液又は懸濁液であってもよい。さらに、無菌の固定油が、溶媒又は懸濁媒体として慣習的に使用される。この目的のためには、合成モノ−、又はジグリセリドを含む、任意の無刺激性の固定油を使用してもよい。さらに、オレイン酸のような脂肪酸は、注射用物質の調製において用途がある。
【０１１７】
式Ａの化合物はまた、薬剤の直腸投与用の坐剤の形態で投与してもよい。これらの組成物は、該薬剤を、常温では固定であるが直腸温度では液体であり、それ故直腸内では融解して該薬物を放出することができる、適当な非刺激性の賦形剤と混合することにより調製可能である。かかる物質は、カカオバター、グリセリンゼラチン、硬化植物油、種々の分子量のポリエチレングリコールの混合物、及びポリエチレングリコールの脂肪酸エステルを包含する。
【０１１８】
局所使用には、式Ａの化合物を含有するクリーム、軟膏、ゼリー、溶液又は懸濁液その他が使用される。（本出願では、局所適用はマウスウォッシュ及びうがい薬を含むものとする。）
【０１１９】
本発明の化合物は、鼻腔内形態において、適当な鼻腔内ビヒクル及び送達装置の局所使用により、或いは、経皮経路により、当業者に周知の経皮パッチの形態のものを用いて投与可能である。経皮送達系の形態において投与されるためには、用量投与は、もちろん、用法用量全体を通し、断続的であるよりもむしろ連続的となるであろう。本発明化合物はまた、例えば、カカオバター、グリセリンゼラチン、硬化植物油、種々の分子量のポリエチレングリコールの混合物、及びポリエチレングリコールの脂肪酸エステルといった、基剤を用いた坐剤として送達してもよい。
【０１２０】
本発明による化合物がヒト患者へ投与される場合、１日用量は、通常、処方する医師により、一般的には、年齢、体重、及び個々の患者の応答、並びに患者の症状の重さによって異なる用量を用いて決定されるであろう。
【０１２１】
１つの実施態様においては、所望の量のＰＤＫｌ阻害剤を、癌の治療を受けている哺乳類に投与する。投与は、１日当たり約０．１ｍｇ／体重ｋｇないし約６０ｍｇ／体重ｋｇの間、又は、１日当たり０．５ｍｇ／体重ｋｇないし約４０ｍｇ／体重ｋｇの間、の阻害剤の量で行なわれる。本組成物を含んでなる別の治療用の量は、ＰＤＫ１阻害剤約０．０１ｍｇないし約１０００ｍｇを含む。別の実施態様においては、用量は、ＰＤＫ１阻害剤約１ｍｇないし約１０００ｍｇを含む。
【０１２２】
本化合物はまた、治療剤、化学治療剤、及び抗癌剤との併用においても有用である。本開示化合物と、治療剤、化学治療剤、及び抗癌剤との併用もまた、本発明の範囲内である。かかる薬剤の例は、デビータ（Ｖ．Ｔ．Ｄｅｖｉｔａ）及びヘルマン（Ｓ．Ｈｅｌｌｍａｎ）共編による、「キャンサー・プリンシプルズ・アンド・プラクティス・オブ・オンコロジー（Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）（癌の原理及び腫瘍学のプラクティス）」、第６版、リピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス出版（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、２００１年２月１５日、において見出すことができる。当業者は、薬物及び関係する癌の、特定の性質に基づき、どの薬剤の組合せが有用であるかを識別することができるであろう。かかる抗癌剤は、以下：エストロゲン受容体モジュレータ、アンドロゲン受容体モジュレータ、レチノイド受容体モジュレータ、細胞傷害剤／細胞増殖抑制剤、抗増殖剤、プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤及び他の血管新生阻害剤、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、細胞増殖及び生存シグナリングの阻害剤、ビスホスホネート、アロマターゼ阻害剤、ｓｉＲＮＡ治療剤、γ−セクレターゼ阻害剤、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を妨害する薬剤、及び細胞周期チェックポイントを妨害する薬剤、を包含する。本化合物は、放射線療法と同時投与された場合、特に有用である。
【０１２３】
したがって、本発明の範囲は、ここにクレームした化合物の、エストロゲン受容体モジュレータ、アンドロゲン受容体モジュレータ、レチノイド受容体モジュレータ、細胞傷害剤／細胞増殖抑制剤、抗増殖剤、プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、血管形成阻害剤、ＰＰＡＲ−γアゴニスト、ＰＰＡＲ−δアゴニスト、生来多剤耐性の阻害剤、抗嘔吐剤、貧血症の治療において有用な薬剤、好中球減少症の治療において有用な薬剤、免疫強化剤、細胞増殖及び生存シグナリングの阻害剤、ビスホスホネート、アロマターゼ阻害剤、ｓｉＲＮＡ治療剤、γ−セクレターゼ阻害剤、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を妨害する薬剤、及び細胞周期チェックポイントを妨害する薬剤から選ばれる、第２の化合物との併用における使用を包含する。
【０１２４】
用語「投与」及びその変形（例えば、化合物を「投与すること」）は、本発明の化合物に関し、当該化合物又は当該化合物のプロドラッグを、治療を必要とする動物の系内へ投入することを意味する。本発明化合物又はそのプロドラッグが１以上の他の活性成分（例えば、細胞傷害剤など）と組合せて提供される場合、「投与」及びその変形は、各々、当該化合物又はそのプロドラッグと、他の薬剤との、同時の及び連続した投入を包含するものと理解される。
【０１２５】
本明細書において用いられる、用語「組成物」は、指定された量の指定された成分を含んでなる生成物、並びに指定された量の指定された成分の組合せから、結果として直接又は間接的に得られる任意の生成物を包含することを意図する。
【０１２６】
本文において用いられる、用語「治療上有効な量」は、組織、系、動物、又はヒトにおいて生物学的又は医学的応答を誘起する活性化合物又は医薬物質の量であって、研究者、獣医師、医師、又は他の臨床家によって探し求められている量を意味する。
【０１２７】
用語「癌を治療すること」又は「癌の治療」は、癌の症状に苦しむ哺乳類への投与を指し、かつ癌性細胞を殺すことにより癌性症状を緩和する作用を指すが、また、結果として癌の増殖及び／又は転移の阻害を生じる作用も指す。
【０１２８】
本発明はまた、癌の治療又は予防のために有用である医薬組成物であって、治療上有効な量の本発明化合物と：エストロゲン受容体モジュレータ、アンドロゲン受容体モジュレータ、レチノイド受容体モジュレータ、細胞傷害剤／細胞増殖抑制剤、抗増殖剤、プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、血管新生阻害剤、ＰＰＡＲ−γアゴニスト、ＰＰＡＲ−δアゴニスト、細胞増殖及び生存シグナリングの阻害剤、ビスホスホネート、アロマターゼ阻害剤、ｓｉＲＮＡ治療剤、γ−セクレターゼ阻害剤、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を妨害する薬剤、及び細胞周期チェックポイントを妨害する薬剤から選ばれる、第２の化合物とを含んでなる該組成物も包含する。
【０１２９】
特定された全ての特許、公開物、及び係属中の特許出願は、本明細書に援用される。
【０１３０】
化学の記載において、及び以下の実施例において使用された略号は、以下の通りである：ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）；ＢＯＣ（炭酸ｔｅｒｔ−ブチル）；ＢＯＣ２Ｏ（二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル）；ＣＤＣｌ３（クロロホルム−ｄ）；ＣＤＩ（１，１’−カルボニルジイミダゾール）；Ｃ２Ｄ６ＳＯ（ジメチルスルホキシド−ｄ６）；ＣＨ２Ｃｌ２（ジクロロメタン）；ＣＨ３ＯＨ（メタノール）；ＣＯ２（二酸化炭素）；ＤＩＰＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）；ＤＭＡ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド）；ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）；ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）；ＤＴＴ（ジチオスレイトール）；ＥＤＴＡ（エチレン−ジアミン−四酢酸）；ＥＧＴＡ（エチレン−グリコール−四酢酸）；Ｅｔ（エチル）；ＥｔＯＡｃ（酢酸エチル）；ＥｔＯＨ（エタノール）；ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）；Ｆｅ（鉄金属）；ＨＡＴＵ（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート）；ＨＣｌ（塩酸／塩酸塩）；ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）；ＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析法）；ＬＲＭＳ（低分解能質量スペクトル）；ＭｅＯＨ（メタノール）；ＭｇＣｌ２（塩化マグネシウム）；ＭＷ（分子量）；ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）；ＮａＦ（フッ化ナトリウム）；ＮａＨ（水素化ナトリウム）；ＮａＨＣＯ３（炭酸水素ナトリウム）；ＮａＯＨ（水酸化ナトリウム）；Ｎａ２ＳＯ４（硫酸ナトリウム）；ＮＨ４Ｃｌ（塩化アンモニウム）；ＮＭＰ（１−メチル−２−ピロリジノン）；ＮＭＲ（核磁気共鳴）；ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）；ＲＢＦ（丸底フラスコ）；ＲＴ（室温）；ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）；ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）；Ｚｎ（亜鉛金属）；及びμＷ（マイクロ波照射）。
【０１３１】
本発明の化合物は、文献において公知であるか又は実験法において例証されている他の標準的な操作に加えて、以下の反応スキームに示したような反応を用いることにより、調製してもよい。以下の例示的な反応スキームは、それ故、リストされた化合物により、又は例示を目的として用いた任意の特定の置換基により、限定されるものではない。反応スキームにおいて示した置換基の付番は、特許請求の範囲において用いたものと必ずしも相関せず、しばしば、上記の式Ａの定義下で多数の置換基が任意選択的に可能である場合、明確さのため、単一の置換基が化合物に結合して示される。
【０１３２】
本発明の化合物を生成するのに使用した反応は、反応スキーム１−７に示したような反応を用いることにより処理される。
【０１３３】
反応スキームの要約
【０１３４】
【化６】
2012511000.tif 000009
【０１３５】
反応スキーム１は、カルボン酸３を得るための経路を示す。ピリミドン１は、ジエチルエトキシメチレンマロナートを、酸を含むエタノール中で、イミドアミドを用いて環化することにより生成する。次にピリミドン１を、臭化ベンジルでアルキル化して、中間体２を産生する。次いでエチルエステル２を、水酸化ナトリウムで鹸化して、酸３を産生する。
【０１３６】
【化７】
2012511000.tif 000010
【０１３７】
反応スキーム２は、カルボン酸５を得るための経路を示す。ピリミドン１は、ジエチルエトキシメチレンマロナートを、酸を含むエタノール中で、イミドアミドを用いて環化することによって生成する。次にピリミドン１を、ヘテロアリールメチルブロミドでアルキル化して、中間体４を産生する。次いでエチルエステル４を、水酸化ナトリウムで鹸化して、酸５を産生する。
【０１３８】
【化８】
2012511000.tif 000011
【０１３９】
反応スキーム３は、アミド７を生成するための、ＨＡＴＵなどのカップリング剤の作用を介しての、アミン又はアミン塩６とカルボン酸３とのカップリングを示す。
【０１４０】
【化９】
2012511000.tif 000012
【０１４１】
反応スキーム４は、アミド８を生成するための、ＨＡＴＵなどのカップリング剤の作用を介しての、アミン又はアミン塩６とカルボン酸５とのカップリングを示す。
【０１４２】
表１中の、式Ｒ１−Ｌ２−Ｘ−Ｌ１−ＮＨ２の、以下のアミン（遊離塩基として又は、ＨＣｌ若しくはＴＦＡのいずれかの塩として）の合成は、ＷＯ２００８／００５４５７に記載された。表１のアミン又はアミン塩を、基質として、反応スキーム３及び反応スキーム４に記載した反応において使用して、アミド７及び８を得ることができる。
【０１４３】
【表１−１】
2012511000.tif 000013
【０１４４】
【表１−２】
2012511000.tif 000014
【０１４５】
【表１−３】
2012511000.tif 000015
【０１４６】
【表１−４】
2012511000.tif 000016
【０１４７】
【表１−５】
2012511000.tif 000017
【０１４８】
【表１−６】
2012511000.tif 000018
【０１４９】
【化１０】
2012511000.tif 000019
【０１５０】
反応スキーム５は、Ｄ−フェニルグリシノールから出発することによる、アミン１３の合成を示す。Ｄ−フェニルグリシノールにより、５−フルオロ−２−ニトロアニリンからフッ化物をＳＮＡｒ置換して９を得た後、アミンをＢＯＣ保護して１０を得、鉄／塩化アンモニウムで還元してビス−アニリン１１を得て、これを次にＣＤＩの作用により環化して、最後から２番目の尿素１２を得た。次いで、ＢＯＣ保護された尿素１２を、ＨＣｌを使用して脱保護して、アミンの塩酸塩１３を得た。
【０１５１】
【化１１】
2012511000.tif 000020
【０１５２】
反応スキーム６は、化合物１５の調製法を示す。酸１３を、ＨＡＴＵを用いてＤ−フェニルグリシノールにカップリングして、アルコール１４を得て、これを次にＳＮＡｒ反応により４−ニトロ−３−アミノ−フルオロベンゼンにカップリングし、続いてＺｎ及びＨＣｌで還元し、ＣＤＩによる環状尿素生成を受けて、化合物１５を得た。
【０１５３】
中間体１
【０１５４】
【化１２】
2012511000.tif 000021
【０１５５】
エチル６−オキソ−１，６−ジヒドロピリミジン−５−カルボキシラート
エタノール（４．９９ｍｌ）中の、塩酸ホルムアミジン（４．０２ｇ、４９．９ｍｍｏｌ）及びジエチルエトキシメチレンマロナート（５ｍｌ、２４．９５ｍｍｏｌ）の混合物を、１２０℃（マイクロ波照射による）で１５時間加熱した。反応混合物を室温に冷却した後、酢酸エチル、塩酸（１Ｍ）、及び水を添加した。水層を、酢酸エチルで洗浄し、次に３：１  クロロホルム：イソプロパノールで抽出した。合わせた有機抽出物を、硫酸マグネシウム上で乾燥し、減圧下で濃縮して、エチル６−オキソ−１，６−ジヒドロピリミジン−５−カルボキシラートを、橙色の固体として得た。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）（Ｃ７Ｈ９Ｎ２Ｏ３）［Ｍ＋Ｈ］＋，計算値１６９．１；実測値１６９．１．
【０１５６】
中間体２
【０１５７】
【化１３】
2012511000.tif 000022
【０１５８】
エチル１−（３，４−ジフルオロベンジル）−６−オキソ−１，６−ジヒドロピリミジン−５−カルボキシラート
水素化ナトリウム（０．２６２ｇ、６．５４ｍｍｏｌ、鉱物油中６０％分散物）及び
エチル６−オキソ−１，６−ジヒドロピリミジン−５−カルボキシラート（１ｇ、５．９５ｍｍｏｌ）の混合物を、ＤＭＦ（１１．８９ｍｌ）中に溶解した。室温で３０分後、３，４−ジフルオロベンジルブロミド（０．７６１ｍｌ、５．９５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、室温で一晩攪拌し、次いで塩酸水溶液（１０％）に注入した。水層を、酢酸エチルで抽出した。合わせた有機抽出物を、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣を、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにより、酢酸エチル／ヘキサンで溶出して精製し、エチル１−（３，４−ジフルオロベンジル）−６−オキソ−１，６−ジヒドロピリミジン−５−カルボキシラートを、オフホワイトの固体として得た。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）（Ｃ１４Ｈ１３Ｆ２Ｎ２Ｏ３）［Ｍ＋Ｈ］＋，計算値２９５．１；実測値２９５．１．
【０１５９】
中間体３
【０１６０】
【化１４】
2012511000.tif 000023
【０１６１】
１−（３，４−ジフルオロベンジル）−６−オキソ−１，６−ジヒドロピリミジン−５−カルボン酸
メタノール（３１９５μｌ）中のエチル１−（３，４−ジフルオロベンジル）−６−オキソ−１，６−ジヒドロピリミジン−５−カルボキシラート（４７０ｍｇ、１．５９７ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃で、水酸化ナトリウム水溶液（１９１７μｌ、１．９１７ｍｍｏｌ、１Ｍ）を滴下添加した。室温に２時間温めた後、反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣に、水（５ｍＬ）及び酢酸エチル（２．５ｍＬ）を添加した。水層を、酢酸エチルで洗浄し、次に塩酸水溶液（１Ｍ）でｐＨ１に酸性化した。次いで水層を、酢酸エチルで抽出した。合わせた有機抽出物を、水及び食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、減圧下で濃縮して、１−（３，４−ジフルオロベンジル）−６−オキソ−１，６−ジヒドロピリミジン−５−カルボン酸を、白色固体として得た。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）（Ｃ１２Ｈ９Ｆ２Ｎ２Ｏ３）［Ｍ＋Ｈ］＋，計算値２６７．１；実測値２６７．０．
【０１６２】
中間体４
【０１６３】
【化１５】
2012511000.tif 000024
【０１６４】
５−［（２Ｒ）−２−アミノ−２−フェニルエトキシ］−２−ニトロアニリン
（Ｒ）−（−）−２−フェニルグリシノール（５．０４３ｇ、３６．８ｍｍｏｌ）を、２５０ｍＬのＲＢＦ（丸底フラスコ）中に入れ、窒素雰囲気下においた。ＤＭＦ（１００ｍＬ）を添加し、透明な無色の溶液が得られるまで反応を攪拌した。次いでＮａＨ（２．２０６ｇ、５５．１ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＤＭＦ（１０ｍＬ）を洗浄液として添加し、激しい反応（ガス発生）を生じた。反応を室温で、ガス発生が鎮まるまで攪拌し、赤みがかった不均一の混合物を得た。次いで５−フルオロ−２−ニトロアニリン（６．８９ｇ、４４．１ｍｍｏｌ）を、続いてＤＭＦ（１０ｍＬ）を添加し、これにより直ちに鮮紅色を生じた。反応を、室温で攪拌させておき、ＬＣ−ＭＳでモニターした。これを、酢酸エチル（２００ｍＬ）及びＮａＨＣＯ３希釈水溶液（２５０ｍＬ）を含有するエレンマイヤーフラスコに添加することにより、反応をクエンチした。分液漏斗中で相を分離し、有機層を水（１５０ｍＬ）で、次に食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、真空中で濃縮した。次いで反応を、シリカゲルカラム（５−７５％  ＥｔＯＡｃ（ｎ−ヘプタン中））により精製して、高純度の５−［（２Ｒ）−２−アミノ−２−フェニルエトキシ］−２−ニトロアニリンの２つの分画を、黄色−橙色の油として得たが、双方ともに残留性ＤＭＦが混入していた。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）（Ｃ１４Ｈ１６Ｎ３Ｏ３）［Ｍ＋Ｈ］＋，計算値２７４．１；実測値２７４．１．
【０１６５】
中間体５
【０１６６】
【化１６】
2012511000.tif 000025
【０１６７】
ｔｅｒｔ−ブチル［（１Ｒ）−２−（３−アミノ−４−ニトロフェノキシ）−１−フェニルエチル］カルバメート
５−［（２Ｒ）−２−アミノ−２−フェニルエトキシ］−２−ニトロアニリン（中間体４）（２．３５ｇ、８．６０ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で、１００ｍＬのＲＢＦに入れ、続いてＴＨＦ（３０ｍＬ）を入れた。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２．２５ｍＬ、１２．９ｍｍｏｌ）を添加し、反応を１０分間攪拌し、続いて二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（２．４０ｍＬ、１０．３ｍｍｏｌ）を添加した。次いで反応を、室温で３時間攪拌し、次にＬＣ−ＭＳにより分析し、これにより反応が完了したことが示された。反応を、酢酸エチル（３００ｍＬ）及びＮａＨＣＯ３希釈水溶液（１５０ｍＬ）を含有する分液漏斗に添加し、相を分離し、有機層を食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、真空中で濃縮して、ｔｅｒｔ−ブチル［（１Ｒ）−２−（３−アミノ−４−ニトロフェノキシ）−１−フェニルエチル］カルバメートを、黄色の固体として得た。
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）（Ｃ１９Ｈ２３Ｎ３ＮａＯ５）［Ｍ＋Ｎａ］＋，計算値３９６．２；実測値３９６．２．
【０１６８】
中間体６
【０１６９】
【化１７】
2012511000.tif 000026
【０１７０】
ｔｅｒｔ−ブチル［（１Ｒ）−２−（３，４−ジアミノフェノキシ）−１−フェニルエチル］カルバメート
ｔｅｒｔ−ブチル［（１Ｒ）−２−（３−アミノ−４−ニトロフェノキシ）−１−フェニルエチル］カルバメート（中間体５）（３４６ｍｇ、０．９３ｍｍｏｌ）を、マイクロ波反応バイアル（１０−２０ｍＬ）に入れ、続いて鉄（２５９ｍｇ、４．６３ｍｍｏｌ）、水（４ｍＬ）、塩化アンモニウム（４０ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ）、及び最後にエタノール（４ｍＬ）を入れた。反応バイアルを密封し、設定により８０℃で２０時間加熱した。反応を、酢酸エチル（１００ｍＬ）及び食塩水（７５ｍＬ）を含有する分液漏斗に添加し、相を分離し、有機層を食塩水（７５ｍＬ）で再度洗浄した。次いで、酢酸エチル層を真空中で濃縮して、ｔｅｒｔ−ブチル［（１Ｒ）−２−（３，４−ジアミノフェノキシ）−１−フェニルエチル］カルバメートを、橙色の固体として得た。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）（Ｃ１９Ｈ２６Ｎ３Ｏ３）［Ｍ＋Ｈ］＋，計算値３４４．２；実測値３４４．２．
【０１７１】
中間体７
【０１７２】
【化１８】
2012511000.tif 000027
【０１７３】
ｔｅｒｔ−ブチル｛（１Ｒ）−２−［（２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）オキシ］−１−フェニルエチル｝カルバメート
ｔｅｒｔ−ブチル［（１Ｒ）−２−（３，４−ジアミノフェノキシ）−１−フェニルエチル］カルバメート（中間体６）（３１８ｍｇ、０．９３ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で、５０ｍＬのＲＢＦに入れ、ＤＭＦ（５ｍＬ）中に溶解した。ＣＤＩ（１３５ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）を添加し、反応を室温で４時間攪拌した。反応を、酢酸エチル（１２５ｍＬ）及びＮａＨＣＯ３希釈水溶液（７５ｍＬ）を含有する分液漏斗に添加し、相を分離し、有機層を食塩水（７５ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、その後、真空中で濃縮した。次いで粗生成物混合物を、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、ｔｅｒｔ−ブチル｛（１Ｒ）−２−［（２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンズイミダゾール−５−イル）オキシ］−１−フェニルエチル｝カルバメートを、白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｃ２Ｄ６ＳＯ）δ１０．４９（ｓ，１Ｈ），１０．３７（ｓ，１Ｈ），７．５４（ｄ，１Ｈ），７．３４（ｍ，４Ｈ），７．２５（ｔ，１Ｈ），６．７７（ｄ，１Ｈ），６．４８（ｓ，２Ｈ），４．８６（ｑ，１Ｈ），３．９８（ｍ，２Ｈ），１．３７（ｓ，９Ｈ）．ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）（Ｃ１６Ｈ１６Ｎ３Ｏ４）［Ｍ−Ｃ４Ｈ８＋Ｈ］＋，計算値３１４．１；実測値３１４．１．
【０１７４】
中間体８
【０１７５】
【化１９】
2012511000.tif 000028
【０１７６】
５−［（２Ｒ）−２−アミノ−２−フェニルエトキシ］−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−オン塩酸塩
ｔｅｒｔ−ブチル｛（１Ｒ）−２−［（２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンズイミダゾール−５−イル）オキシ］−１−フェニルエチル｝カルバメート（中間体７）（６７ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で、１０ｍＬのＲＢＦに入れ、ＴＨＦ（２ｍＬ）中に溶解した。ＨＣｌ（１ｍＬ、４．０ｍｍｏｌ）（１，４−ジオキサン中４Ｍ）を添加し、反応を室温で１６時間攪拌した。反応を次に、真空中で濃縮し、ＴＨＦによる希釈／濃縮のサイクルを繰り返し、残留するＨＣｌを最少化して、５−［（２Ｒ）−２−アミノ−２−フェニルエトキシ］−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−オン塩酸塩を、黄色の固体として得た。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）（Ｃ１５Ｈ１６Ｎ３Ｏ２）［Ｍ＋Ｈ］＋，計算値２７０．１；実測値２７０．１．
【０１７７】
【化２０】
2012511000.tif 000029
【０１７８】
反応スキーム７は、実施例１のアミドを産生するための、アミン塩８とカルボン酸３とのカップリングを示す。
【０１７９】
実施例１
【０１８０】
【化２１】
2012511000.tif 000030
【０１８１】
１−（３，４−ジフルオロベンジル）−６−オキソ−Ｎ−｛（１Ｒ）−２−［（２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）オキシ］−１−フェニルエチル｝−１，６−ジヒドロピリミジン−５−カルボキサミド
ＤＭＡ（７１０μｌ）中の、５−［（２Ｒ）−２−アミノ−２−フェニルエトキシ］−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−オン塩酸塩（３８ｍｇ、０．１２４ｍｍｏｌ）、１−（３，４−ジフルオロベンジル）−６−オキソ−１，６−ジヒドロピリミジン−５−カルボン酸（３３．１ｍｇ、０．１２４ｍｍｏｌ）、及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６５．１μｌ、０．３７３ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（５４．３ｍｇ、０．１４３ｍｍｏｌ）を添加した。室温で９０分間の攪拌後、反応混合物を水、アセトニトリル、及びＤＭＳＯで希釈した。この溶液を、逆相分取ＨＰＬＣ（Ｃ−１８）により、アセトニトリル／水＋０．０５％  ＴＦＡで溶出して精製し、１−（３，４−ジフルオロベンジル）−６−オキソ−Ｎ−｛（１Ｒ）−２−［（２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）オキシ］−１−フェニルエチル｝−１，６−ジヒドロピリミジン−５−カルボキサミドを、ＨＰＬＣ分画の中和、抽出、及び乾燥の後に、白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｃ２Ｄ６ＳＯ）δ１０．５１（ｓ，１Ｈ），１０．３８（ｓ，１Ｈ），９．７３（ｄ，１Ｈ），８．９５（ｓ，１Ｈ），８．６７（ｓ，１Ｈ），７．５２（ｍ，１Ｈ），７．４１（ｍ，３Ｈ），７．３４（ｔ，２Ｈ），７．２５（ｍ，２Ｈ），６．７４（ｄ，１Ｈ），６．４９（ｄ，２Ｈ），５．３６（ｍ，１Ｈ），５．１９（ｔ，２Ｈ），４．２６（ｍ，１Ｈ），４．１９（ｍ，１Ｈ）．ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）（Ｃ２７Ｈ２２Ｆ２Ｎ５Ｏ４）［Ｍ＋Ｈ］＋，計算値５１８．２；実測値５１８．１．
【０１８２】
中間体９
【０１８３】
【化２２】
2012511000.tif 000031
【０１８４】
メチル４−（３，４−ジフルオロベンジル）−３−オキソ−３，４−ジヒドロピラジン−２−カルボキシラート
メチル２−ヒドロキシ−３−ピラジンカルボキシラート（１０３ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ）（フルクルム・サイエンティフィック社（Ｆｕｌｃｒｕｍ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌｔｄ．）から入手）を、窒素雰囲気下で、２５ｍＬのＲＢＦに入れた。ＤＭＦ（３ｍＬ）を、続いてＮａＨ（３３ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）を添加し、反応を室温で２０分間攪拌した。３，４−ジフルオロベンジルブロミド（０．０９４ｍＬ、０．７３５ｍｍｏｌ）を添加し、反応を室温で一晩攪拌し、ＬＣ−ＭＳにより反応の完了を検出した。反応を、酢酸エチル（１２５ｍＬ）及びＮａＨＣＯ３希釈水溶液（７５ｍＬ）を含有する分液漏斗に添加し、相を分離し、有機層を食塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、次に真空中で濃縮した。粗生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーにより、１０−１００％  ＥｔＯＡｃ（ｎ−ヘプタン中）を使用して精製し、メチル４−（３，４−ジフルオロベンジル）−３−オキソ−３，４−ジヒドロピラジン−２−カルボキシラートを、黄色の固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｃ２Ｄ６ＳＯ）δ８．０８（ｄ，１Ｈ），７．４９（ｔ，１Ｈ），７．４４（ｄ，１Ｈ），７．４２（ｔ，１Ｈ），７．２３（ｍ，１Ｈ），５．０９（ｓ，２Ｈ），３．８０（ｓ，３Ｈ）．ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）（Ｃ１３Ｈ１１Ｆ２Ｎ２Ｏ３）［Ｍ＋Ｈ］＋，計算値２８１．１；実測値２８１．１．
【０１８５】
中間体１０
【０１８６】
【化２３】
2012511000.tif 000032
【０１８７】
４−（３，４−ジフルオロベンジル）−３−オキソ−３，４−ジヒドロピラジン−２−カルボン酸
メチル４−（３，４−ジフルオロベンジル）−３−オキソ−３，４−ジヒドロピラジン−２−カルボキシラート（１１０ｍｇ、０．３９ｚｍｏｌ）を、１０ｍＬのＲＢＦに入れ、ＴＨＦ（３ｍＬ）中に溶解した。ＮａＯＨ（１ｍＬ、２．０００ｍｍｏｌ）（２Ｎ溶液）を添加し、反応を室温で攪拌した。次に反応を、室温で一晩攪拌させておき、次いでＬＣ−ＭＳで分析したところ、反応の完了を示した。次に反応を、１Ｎ  ＨＣｌ（２ｍＬ）の添加により中和し、次いで飽和塩化ナトリウムで飽和した。得られた混合物を、次に酢酸エチル（３ｘ５０ｍＬ）で洗浄し、合わせた有機層を、次いで食塩水（２５ｍＬ）で洗浄し、真空中で濃縮して、４−（３，４−ジフルオロベンジル）−３−オキソ−３，４−ジヒドロピラジン−２−カルボン酸を、黄色の固体として得た。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）（Ｃ１２Ｈ９Ｆ２Ｎ２Ｏ３）［Ｍ＋Ｈ］＋，計算値２６７．１；実測値２６７．０．
【０１８８】
実施例２
【０１８９】
【化２４】
2012511000.tif 000033
【０１９０】
４−（３，４−ジフルオロベンジル）−３−オキソ−Ｎ−｛（１Ｒ）−２−［（２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）オキシ］−１−フェニルエチル｝−３，４−ジヒドロピラジン−２−カルボキサミド
４−（３，４−ジフルオロベンジル）−３−オキソ−３，４−ジヒドロピラジン−２−カルボン酸（４８ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で、２５ｍＬのＲＢＦに入れ、続いてＨＡＴＵ（８２ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を、次にＮＭＰ（１．０ｍＬ）を、最後にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１１ｍＬ、０．６３ｍｍｏｌ）を入れた。反応を、室温で５分間攪拌し、ＮＭＰ（１．０ｍＬ）中の５−［（２Ｒ）−２−アミノ−２−フェニルエトキシ］−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−オン（５５ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。反応を、室温で４０分間攪拌し、次に、酢酸エチル（７５ｍＬ）及びＮＨ４Ｃｌ希釈水溶液（５０ｍＬ）を含有する分液漏斗に添加し、相を分離し、有機層を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）で、次に食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、次に真空中で濃縮した。粗生成物を、シリカゲルクロマトグラフィー（１０グラムカラム）により、０−１０％  ＣＨ３ＯＨ（ＣＨ２Ｃｌ２中）を使用して精製し、生成物を８％  ＣＨ３ＯＨ（ＣＨ２Ｃｌ２中）において溶出して、４−（３，４−ジフルオロベンジル）−３−オキソ−Ｎ−｛（１Ｒ）−２−［（２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）オキシ］−１−フェニルエチル｝−３，４−ジヒドロピラジン−２−カルボキサミドを、明黄色の固体として溶出した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｃ２Ｄ６ＳＯ）δ１０．５１（ｓ，１Ｈ），１０．３８（ｓ，１Ｈ），９．８２（ｄ，１Ｈ），８．０５（ｄ，１Ｈ），７．５７（ｄ，１Ｈ），７．５０（ｍ，１Ｈ），７．４３（ｍ，３Ｈ），７．３５（ｔ，２Ｈ），７．２７（ｔ，１Ｈ），７．２４（ｍ，１Ｈ），６．７５（ｄ，１Ｈ），６．５１（ｄ，２Ｈ），５．３４（ｍ，１Ｈ），５．１６（ｓ，２Ｈ），４．０９（ｍ，２Ｈ）．ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）（Ｃ２７Ｈ２３Ｆ２Ｎ５Ｏ４）［Ｍ＋Ｈ］＋，計算値５１８．２；実測値５１８．２．
【０１９１】
本発明の化合物を、以下の生物学的アッセイにおいて試験し、３０μＭ未満のＩＣ５０値を持つことが判明した。
【０１９２】
生物学的アッセイ
インビトロのＰＤＫｌキナーゼアッセイ
活性化された組換え完全長の、ｍＴ（Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ）タグ付きヒトＰＤＫ１を使用して、本発明の化合物がこのキナーゼの酵素活性を調節するかどうかを測定した。
【０１９３】
完全長ＰＤＫ１をコードしているｃＤＮＡを、インフレームのミドルＴタグ（ＭＥＹＭＰＭＥ）をそのＮ末端に含有するバキュロウイルス発現ベクターｐＢｌｕｅＢａｃ４．５（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にサブクローニングした。可溶性の活性化組換え完全長ｍＴ（Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ）タグ付きヒトＰＤＫ１を、バキュロウイルス感染したＳｆ９昆虫細胞（ケンプ・バイオテクノロジーズ（Ｋｅｍｐ  Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、製造業者により推奨されるプロトコールに従って発現させた。昆虫細胞溶解物からの、ＰＤＫ１キナーゼのイムノアフィニティ精製は、プロテインＧ−ＥＥカラムに結合したミドルＴタグ抗体を用いて行なった。５０ｍＭ  トリス  ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．５ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍＭ  ＮａＦ、ピロリン酸Ｎａ、Ｎａ−β−グリセロリン酸、１０％  グリセロール、コンプリート（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ）、１μＭ  ミクロシステイン、及び５０μｇ／ｍｌ  ＥＹＭＰＭＥペプチドを使用した溶出により、ＰＤＫ１タンパク質を含有する分画を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析に基づき一緒にプールし、次にタンパク質濃度を、ＢＳＡを標準として、ＢＣＡプロテインアッセイ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ）（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ））を使用して分析した。最終産物をアリコートに分け、液体窒素中で急速冷凍した後、−８０℃で保存した。得られたＰＤＫ１タンパク質は、分子量６４ｋＤａを有し、「デフォルトにより（ｂｙ  ｄｅｆａｕｌｔ）」リン酸化され、昆虫細胞から活性化キナーゼとして精製された。
【０１９４】
化合物の、ＰＤＫ１キナーゼ阻害能を測定するための方法は、以下の工程を含んでなる：
１．  ３８４ウェルプレートにて、３倍連続希釈された化合物溶液を、１００％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で、所望の終濃度の２０倍に調製する。
２．  ６２．５ｍＭ  ヘペス（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ７．５）、１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１３％  Ｂｒｉｊ−３５、１．２５ｍＭ  ＥＧＴＡ、２．５ｍＭ  ジチオスレイトール、１．２５ｎＭ  組換えＰＤＫ１、及び３７５ｎＭ  ビオチン化合成ペプチド基質（ビオチン−ＧＧＤＧＡＴＭＫＴＦＣＧＧＴＰＳＤＧＤＰＤＧＧＥＦＴＥＦ−ＣＯＯＨ（配列番号：１）を含有する、主反応混合物を調製する。
３．  黒色のアッセイプレートにて、ウェル当たり、化合物溶液（又はＤＭＳＯ）  ２．５μｌ、及び主反応混合物  ２２．５μｌを添加する。１０分間プレインキュベートする。ウェル当たり６μｌの０．２５ｍＭ  ＭｇＡＴＰを添加することにより、キナーゼ反応を開始する。反応を、室温で２５分間進行させる。反応の最終条件は、１ｎＭ  ＰＤＫ１、３００ｎＭ  ペプチド基質、５μＭ  ＭｇＡＴＰ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍＭ  ヘペス（ｐＨ７．５）、０．０１％  Ｂｒｉｊ−３５、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、及び５％ＤＭＳＯである。
４．  キナーゼ反応を、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｘランス検出バッファー（Ｌａｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ）（カタログＮｏ．ＣＲ９７−１００、パーキンエルマー）、ＴＢＳ中の１％  スーパーブロッキング（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋｉｎｇ）（カタログＮｏ．３７５３５、ピアース）、５ｎＭ  ホスホ−Ａｋｔ（Ｔ３０８）モノクローナル抗体（カタログＮｏ．４０５６、セル・シグナリング・テクノロジーズ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、５ｎＭ  ランス（Ｌａｎｃｅ）標識Ｅｕ−抗ウサギＩｇＧ（カタログＮｏ．ＡＤ００８３、パーキンエルマー）、及び１００ｎＭ  ストレプトアビジン−アロフィコシアニンコンジュゲート（カタログＮｏ．ＰＪ２５Ｓ、プロザイム（Ｐｒｏｚｙｍｅ））を含有する、停止／検出バッファー  ３０μｌで停止する。
５．  ６０分後、ＨＴＲＦモードのエンビジョン（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ）リーダー（パーキンエルマー）でＨＴＲＦシグナルを読み取る。
６．  化合物濃度とＨＴＲＦシグナルとの間に観察された関係を、４−パラメータロジスティック方程式にあてはめることにより、ＩＣ５０を決定する。
【０１９５】
ＰＤＫｌ阻害の細胞生化学アッセイ
目的：
ＰＩ３’Ｋ経路に対するＰＤ１阻害剤の阻害能（ＩＣ５０）を、ＰＣ３細胞において、
オデッセイ（Ｏｄｙｓｓｅｙ）ウエスタンブロット分析、及びＰＤＫｌの２つの直接の基質である、ＲＳＫ（Ｓｅｒ２２１）及びＡＫＴ（Ｔｈｒ３０８）と、下流のエフェクター分子Ｓ６ＲＰ（２３５／２３６）とに対するリン酸特異的抗体のカクテル、を使用して測定すること。
【０１９６】
細胞：
ＰＣ−３細胞を、１０％  ＦＢＳ、１ｘ  Ｌ−グルタミン、１ｘ  非必須アミノ酸、１ｘ  ピルビン酸ナトリウム、及び１ｘ  Ｈｅｐｅｓを加えたイーグルＭＥＭ中で増殖させる。他の細胞を使用してもよい。
【０１９７】
試薬：
一次抗体：
Ｐ＊Ａｋｔ３０８−セル・シグナリング、カタログＮｏ．４０５６
Ｐ＊ＲＳＫＳ２２１−バイオソース（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）カタログＮｏ．４４  ９２４Ｇ
Ｐ＊Ｓ６ＲＰ２３５／２３６−セル・シグナリング  カタログＮｏ．２２１１
Ｐ＊−ｐ４４／４２  ＭＡＰキナーゼ（Ｔｈｒｅ２０２／Ｔｙｒ２０４）−セル・シグナリング  カタログＮｏ．９１０１
Ｔｏｔａｌ  ｅＩＦ４Ｅ−セル・シグナリング  カタログＮｏ．９７４２
二次抗体：
赤外線（ＩＲ）標識ヤギ抗マウスＩＲＤｙｅ６００（ＬＩ−ＣＯＲ  カタログＮｏ．９２６−３２２２１）
赤外線（ＩＲ）標識ヤギ抗ウサギＩＲＤｙｅ８００ＣＷ（ＬＩ−ＣＯＲ  カタログＮｏ．９２６−３２２１０）
参考化合物（経路阻害剤）
ラパマイシン−カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、５５３２１１
ＬＹ２９４００２−カルビオケム、４４０２０４
プロテアーゼ・インヒビター・タブレット−ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）１１８３６１４５００１
ペイジルーラー・プレステインド・プロテイン・ラダー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ）−ファーメンタス（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、ＳＭ０６７１
ニトロセルロース膜
【０１９８】
バッファー／溶液
溶解ストック（４℃で保存）
２０ｍＭ  トリスＨＣｌ、ｐＨ７．５
１５０ｍＭ  ＮａＣｌ
１５％  グリセロール
１％  イゲパル（Ｉｇｅｐａｌ）
完全溶解バッファー
１Ｍ  β−グリセロールリン酸            １．２５ｍＬ
０．５Ｍ  ＮａＦ                        ５ｍＬ
０．１Ｍ  ＮａＰＰｉ                    ５ｍＬ
１００ｍＭ  オルトバナジン酸ナトリウム  ０．５ｍＬ
プロテアーゼ・インヒビター・タブレット  １
溶解ストックを５０ｍＬまで充填し、１０ｍＬのアリコートを作成し、凍結する。使用に先立ち、１つのアリコートに、２００ｍＭ  ＰＭＳＦ  １００ｕＬを添加する。
【０１９９】
ＴＢＳ−ツイーン
２０ｍＭ  トリスＨＣｌ、ｐＨ７．５
１５０ｍＭ  ＮａＣｌ
０．０５％  ツイーン−２０
ＴＢＳ
２０ｍＭ  トリスＨＣｌ、ｐＨ７．５
１５０ｍＭ  ＮａＣｌ
ブロッキングバッファー
オデッセイ・ブロッキングバッファー（ＬＩ−ＣＯＲ、カタログＮｏ．９２７−４００００）
一次希釈剤
４％  ＢＳＡフラクション５（ＰＢＳ中）
０．０２％  ツイーン−２０
０．５％  アジ化ナトリウム
４ｘ  ＳＤＳサンプルバッファー
【０２００】
サンプルプロトコール
完全増殖培地中での化合物刺激の２４時間前の細胞播種
１．  ＰＣ−３細胞を、Ｔ１５０フラスコ内で、標準的な組織培養法を用いて、細胞が近集密状態（１．０ｘ１０７）に達するまで増殖させる。
２．  増殖培地を除去し、細胞を無菌の１ｘＰＢＳで洗浄し、トリプシン  ３ｍｌの使用により、細胞をトリプシン処理して移動させる。
３．  移動した細胞を、培地  ３０ｍｌで中和し、５０ｍｌのチューブに移す。
４．  チューブを短時間ボルテックス処理して再懸濁させ、細胞懸濁液を完全に混合する。
５．  細胞を計数し、培地で希釈して、１ｍＬ当たり１５０，０００細胞の濃度とする。
６．  細胞懸濁液  １ｍｌを、１２ウェルプレートの各ウェルに、リピートピペッターを用いて分配し、３７℃、５％ＣＯ２にて２４時間インキュベートする。
【０２０１】
化合物刺激
１．  ９６ウェルマスタープレートを使用して、ＰＤＫｌ阻害剤の３倍希釈シリーズを、ＤＭＳＯ中に作成する（７つの異なる化合物濃度、及び化合物を含まないＤＭＳＯコントロール）。濃度は、アッセイにおいて使用する最終濃度の２００倍とする。
２．  細胞を刺激するため、化合物／ＤＭＳＯ  ５μＬを、細胞を入れた各ウェルに添加し、３７℃、５％ＣＯ２にて、２４時間インキュベートする。
【０２０２】
細胞溶解
１．  翌日、増殖培地を除去し、冷却した１ｘ  ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳを完全に除去した後、溶解バッファー  １００ｕＬを各ウェルに添加する。
２．  低温室内で、シェーカー上でプレートを１０分間振盪する。
３．  各ウェルから溶解物を収集し、氷上に立たせた１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移す。
４．  ４℃で、１３，０００ｒｐｍで５分間遠沈する。
５．  溶解物  ９０ｕＬを、４ｘ  ＳＤＳローディングバッファー  ３０ｕＬを含有する新たなエッペンドルフチューブに移し入れる。
６．  チューブを、７０℃のヒートブロック中に７分間置き、−８０℃でサンプルを保存する。
【０２０３】
ウエスタンブロット検出
１．  １８ウェルの、１０％又は４−２０％  トリスグリシンバイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ）ゲル上で、ウェル当たりサンプル  ３０ｕＬ及び着色分子量マーカー  ２ｕＬを負荷することにより、サンプルを流す（７０Ｖ、一定、４０分間）。１番目と９番目のウェルに、ラダーを負荷する。
２．  バイオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）システムを用いてニトロセルロース上にブロットする（７０Ｖ、３５０ｍＡ、４０分間）。
３．  膜の非特異的結合を、オデッセイ・ブロッキングバッファー中で、室温で１時間ブロックする。
４．  一次抗体を、０．１％  ツイーン２０を含有するオデッセイ・ブロッキングバッファー中に希釈する（すなわち、各々を１：１０００に希釈することにより、３種の抗体（Ｐ＊ＡＫＴ、Ｐ＊Ｓ６ＲＰ、Ｐ＊ＲＳＫ）のカクテルを作成する）。低温室中で一晩、振盪しながらインキュベートする。
５．  ０．１％  ツイーン２０を加えたＰＢＳ中で、室温で４ｘ５分間、膜を洗浄する。
６．  ０．１％  ツイーンを含有するオデッセイ・ブロッキングバッファー中で、蛍光標識二次抗体を希釈する（１：１０，０００）。
７．  ブロットを、二次抗体中で、室温で６０−９０分間インキュベートする。長時間の光への暴露を避ける。
８．  ０．１％  ツイーン２０を加えたＰＢＳ中で、室温で４ｘ５分間、膜を洗浄する。光から保護する。
９．  膜をＰＢＳ中ですすぎ、残留するツイーン２０を除去する。この時点で、膜はスキャンできるようになっている。
【０２０４】
膜のスキャン
１．  適切なチャンネルでスキャンし、スキャン完了まで膜を光から保護する。シグナルは、光から保護した場合、数カ月間は安定である。膜は、４℃のＰＢＳバッファー中に保存するか、又は乾燥して保存してもよい。
２．  オデッセイ・ソフトウェアを使用してバンドを定量し、負荷コントロール（ｍＡｂ）に対し標準化する。
【配列表】
2012511000000001.app
【国際調査報告】
2012511000.tif 000037