(57)【要約】  サイズ安定化剤の存在下で機械的力を利用して、試料を破壊せしめて、利用可能なサイズ範囲内の核酸分子を取得することによって、試料を準備する方法。
2012510296.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸フラグメントを抽出する方法であって
前記方法は、
生体試料を準備するステップと、
前記生体試料を、サイズ安定化剤を含む懸濁溶液に懸濁するステップと、
機械的力を前記生体試料に対して印加して、核酸分子を抽出するステップと、を含み、
前記サイズ安定化剤の存在下における前記機械的力の印加は、メディアン数の塩基対を有するメディアンフラグメントサイズまで、前記核酸分子を低減せしめ、
前記核酸分子の少なくとも６０％は、前記メディアン数の塩基対の５０％以内にある多数の塩基対を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記機械的力は剪断力であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記機械的力は音波振動であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記音波振動は１００００Ｈｚから１０ＭＨｚまでの剪断周波数を有することを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸分子の少なくとも７５％は、前記機械力の印加後に、２００〜５００の塩基対を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸分子の少なくとも７５％は、前記機械力の印加後に、１０００より多くの塩基対を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記懸濁溶液は、破砕ビーズをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記破砕ビーズはガラスビーズであるであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記サイズ安定化剤は、リン酸ナトリウム、グアニジウム塩酸塩、硫酸デキストランドデシル硫酸ナトリウム、ナトリウムドデシルベンゼン硫酸、ポリエチレングリコール、陰イオン界面活性剤、ダイポールアプロチック溶媒、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセタミド、ヘキサメチルリン酸アミド、テトラメチル尿素、ｋａｏｔｒｏｐｉｃ塩、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸及び他の高分子酸からなるグループから選択された少なくとも一つの化合物を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記サイズ安定化剤は、ナトリウムドデシル硫酸及びナトリウムドデシルベンゼン硫酸から成るグループから選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸分子を磁性ナノ粒子に結合せしめるステップをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記磁性ナノ粒子及び結合された核酸分子を収集するステップと、
磁性ナノ粒子及び結合された核酸分子を洗浄するステップと、をさらに含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸分子を前記磁性ナノ粒子から溶出せしめるステップをさらに含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
アルコールを含む溶出溶液を準備して、前記核酸分子を前記磁性ナノ粒子から溶出せしめるステップをさらに含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
磁場を印加して、前記磁性ナノ粒子及び前記結合された核酸分子を凝縮せしめるステップをさらに含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記核酸分子は、２００〜１００００の塩基対のメディアン数の塩基対まで低減されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記サイズ安定化剤は、１５０の塩基対に対する前記剪断力によって達成可能である前記核酸分子の最小サイズを制限することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記生体試料は、バクテリア細胞、胞子、ウイルス及び生物組織から成るグループから選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記機械的力は、噴霧器又はホモジェナイザを介して印可されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記核酸分子の少なくとも７５％は、前記メディアン数の塩基対として前記メディアン数の塩基対の５０％以内にある多数の塩基対を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願のクロスリファレンス】
【０００１】
本出願は、２００８年１２月３日に出願された米国仮特許出願第６１／１１９，５９７号の優先権の利益を主張し、その内容が本明細書によって参考として組み入れられている。
【技術分野】
【０００２】
本発明は生体試料から核酸分子を準備する処理方法に関する。特に、本発明は、サイズ安定化剤の存在下において、生体試料を破壊することによって試料を準備して、利用可能な塩基対の範囲内の核酸分子を取得する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
生体試料の核酸ベースの識別は、まず、試料からの核酸分子（NAMs:nucleic acid molecules）の分離を必要とする。ユーザの要求を有効的に且つ効率的に満たすようなシステムを達成するために、ユニバーサルな試料準備処理が必要とされている。現行の試料準備処理は、困難であり、時間を要し、そして、研究能力を必要とする。ユニバーサル性を維持するために、処理は、広範な様々な入力材料を処理できなければならない。これは、ウイルス、胞子、有機物、バクテリア、及び、血液、生体組織、唾液、尿、糞等の医学的診断材料を含むものの、これらに限定されない。
【０００４】
試験方法を改良し、臨床検査に要する時間要求を低減せしめる継続的な関心が存在する。特定の試験は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ等の核酸分子を抽出するために、サンプルが破壊されていることを必要とする。
【０００５】
約３０００万の分子診断試験が、２００７年、米国医療設備において行われたと見積もられている。この数は、２００９年に６７００万まで増加すると予想されている。これら分析のすべてではないものの、多くの分析が、使用が容易であり、オペレータの介入を必要とせず、費用効率性がよく、小さいサイズの試料に敏感である迅速な試料準備処理から利益を得るであろう。
【０００６】
研究及び医用診断の分野における分子的診断と遺伝子配列決定の利用が、急速に、増加している。分子技術は、抗体法よりも高いレベルの特定性及び感度を提供する。遺伝子配列決定法は、以前には利用可能でなかった多量の情報の収集を可能にする。しかしながら、試料の準備は、ＰＣＲ法の実行、リアルタイムＰＣＲ法、遺伝子配列決定分析及び混成試験に関して主にコストがかかる要素である。さらに、それは、試験結果を遅延せしめ、これら分析を実行する能力をよく訓練された人員を有する研究室に制限してしまう。
【０００７】
ビーズ破砕は、核酸分子を試料から分離するために長年使用されてきた。ビーズ破砕は、通常、試料に添加されたミクロンサイズのガラスビーズの超音波による振動である。それは、胞子又は生体組織等の固体を用いて使用に良好に適応されたロバスト方法である。
【０００８】
ビーズ破砕はいくつかの欠点を有する。一方、試料があまりにも長時間処理され又は過大な出力レベルで処理される場合、１００未満の塩基対の長さの短いフラグメントのみが生成される。他方において、試料が簡潔で且つ低出力扇動により処理される場合、広範なサイズのフラグメントを有する少量の核酸が生成される。特定のサイズ範囲の核酸が必要であるとき、試料のゲル電気泳動が、時には採用され、処理されたゲルから正確なサイズの範囲のゲルセクションを切断し、ゲルから核酸フラグメントを抽出する。この処理は、遅く且つ冗長である。
【０００９】
生物学的、化学的試験を実行する際には、所望のサイズ範囲の核酸分子を取得し、所定の分析物を凝集せしめ且つ維持することが、多くの場合、望まれる所定の分析物を凝集せしめ且つ維持する。試料を凝縮することは、困難な処理であり得る。生体試料を凝縮する従来の方法は、フィルタ処理、洗浄処理、遠心分離処理及び／又は化学反応処理を含む。多くの場合、これらのステップは、単一の処理チャンバにおいて事前処理され得ないだろう。サンプルが他のデバイス又はチャンバに搬送される必要がある。
【００１０】
磁性ナノ粒子は、磁場に引き付けられる粒子である。磁性ナノ粒子を核酸ポリマに付着させ、磁場を試料に印加することによって、核酸ポリマは所望の位置に移動せしめられ、その結果、核酸ポリマを有する試料の一部が凝縮される。試料は、多量の核酸ポリマを生成する凝縮部分から引き抜かれる。
【００１１】
磁場を印加することによって、核酸ポリマを操作することがさらに可能となる。例えば、核酸ポリマの安定状態を維持することによって、洗浄が、核酸ポリマを洗い流すことなく、行われ得る。
【００１２】
したがって、あらゆるソースから、所望のサイズ範囲の核酸分子を迅速且つ経済的に準備する方法に対する需要がある。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、多数のタイプの生体試料に対してユニバーサルな新規な試料準備手法を開示する。処理は、細胞、組織又は他の材料を破壊して、核酸分子を放出せしめる。この処理中に、核酸分子は、処理しやすいサイズまで破壊される。１実施例においては、核酸分子は、凝縮され且つ洗浄される。粒子は、洗浄するためにフロー中で維持され得る。核酸分子は、緩衝液又は熱処理を使用して、粒子から溶離される。
【００１４】
ユニバーサルな試料準備処理を提供することは、コストを大幅に低減せしめ、再現精度を高めることができる。例えば、自動化された遺伝子配列決定システムは、分析対象のＤＮＡを準備するために、試料について大規模な処理を必要とする。ほとんどのＤＮＡ配列決定手法が、個々のＤＮＡ分子を増殖せしめるために、生体外のクローニングステップを使用する。エマルジョンＰＣＲは、油相の水性液滴におけるプライマ被覆されたビーズと共に、個々のＤＮＡ分子を分離する。そして、ＰＣＲ法はＤＮＡ分子のクローンコピーを有する各ビーズを被覆する。それに続いて、後の配列決定のために固定化が実行される。エマルジョンＰＣＲは、Ｍａｒｇｕｉｌｉｓ他による方法（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって商業化されている）、ＳｈｅｎｄｕｒｅとＰｏｒｒｅｃａ他による方法（「ポークソーセージ配列決定法」としても知られている）、及び、ＳＯＬｉＤ配列決定法（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ、すなわち、現在のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって開発された）において使用される。生体外クローン増殖のための別の方法はブリッジＰＣＲ法である。当該ブリッジＰＣＲ法において、フラグメントは、固体表面に付着されたプライマにおいて増殖される。単一分子法は、Steve Quakeの研究室によって開発され（後にＨｅｌｉｃｏｓによって商業化された）、この増殖ステップを省略して、ＤＮＡ分子を表面に直接固定する。
【００１５】
超音波処理されたＤＮＡフラグメントの双方が、一本鎖末端を含み得るので、ほとんどの処理手順は、平滑末端ベクター（１０、１１）に対する結合前に、ＤＮＡを末端修復するステップを含む。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ及びクレノウＤＮＡポリメラーゼの結合は、結合相補ヌクレオチドを、５’オーバーハングを有する得られた２本鎖のフラグメントに対して触媒作用を及ぼすことによって、ＤＮＡフラグメントを「充満せしめる」のに使用される。さらに、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの一本鎖３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、３’オーバーハングを劣化せしめるために使用される。反応に含まれる２つの酵素、バッファ、及びデオキシヌクレオチドは、約３７℃で培養される。フラグメントは、エタノールの沈殿によって凝縮され、それに続いて、キナーゼバッファにおける再懸濁及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼとｒＡＴＰを使用したリン酸化が行われた。ポリヌクレオチドキナーゼは、フェノールの抽出によって除去され、ＤＮＡフラグメントは、エタノールの沈殿によって凝縮され、乾燥され、緩衝液において再懸濁され、そして、平滑末端クローニングベクターに結合される。音波処理されたＤＮＡの大部分は、末端修復又はキナーゼ処理を行うことなく、容易にクローン化されるので、これら２つのステップは、得られた形質転換クローンの総数に対して顕著な影響を及ぼすことなく、組み合わされ得る。
【００１６】
現在、フラグメント末端修復に続いて、ＤＮＡ試料は、サイズマーカに対する予備的低溶解温度のアガロースゲルに電気泳動され、適切な分離の後に、１−２Ｋｂｐ及び２−４Ｋｂｐのサイズ範囲のフラグメントは、切除されて、ゲルから別々に溶離される。あるいは、フラグメントは、セファクリルＳ−５００等のスピンカラムにおける細分化によって、精製され得る。
【００１７】
実施例の試料準備処理は、１００と１００００との間の塩基対のサイズ範囲のＤＮＡ及びリＲＮＡのフラグメントを準備し得る。サイズの正確な分布は、表面活性剤の濃度、使用される表面活性剤又は超音波処理周波数によって変化せしめられ得る。所望のサイズ範囲でフラグメントを生成する能力は、電気泳動又はカラム分離の必要性を排除する。また、これは、精製ステップの必要性を排除することによって、有益なフラグメントの全収率を増加せしめる。
【００１８】
一つの態様において、本発明は、核酸分子を取得するために試料を破壊する試料準備チャンバを含む。機械的力は、サイズ安定化剤の存在下において印加され、試料が破壊され、且つ、所望のサイズ範囲の核酸フラグメントが取得される。
【００１９】
本発明は、ある態様において、ターゲット分析結合要素を含む磁性ナノ粒子を利用して、磁性ナノ粒子をターゲット分析物質に結合せしめる方法を含む。磁性ナノ粒子は磁場内で操作され得る。磁性ナノ粒子がターゲット分析物質に結合されるので、ターゲット分析物質は磁場の印加によって間接的に操作される。
【００２０】
１実施例においては、磁性ナノ粒子は、熱を加えることを介して、核酸分子から放出される。９５℃辺りの温度は、磁性ナノ粒子を効率的に放出することが示されている。別の実施例では、磁性ナノ粒子は、溶出溶液を介して、核酸分子から放出される。溶出溶液は、洗浄剤又は塩類であり得る。好ましい実施形態において、溶出溶液はリン酸又はクエン酸を含む。１実施例においては、溶出溶液は、リン酸カリウム若しくはクエン酸カリウム、又は、リン酸カリウム若しくはクエン酸ナトリウムである。
【００２１】
本発明は、所望のサイズ範囲内にある核酸試料を準備することを目的とする。
【００２２】
本発明の１つの利点は、試料準備方法を用いて高収量の核酸を得ることができることである。
【００２３】
本発明の別の利点は、動物生体組織、バクテリア細胞、胞子、昆虫、植物及びウイルス性細胞を含むいかなる核酸試料ソースを用いても使用され得るということである。
【００２４】
本発明のさらに別の利点は、タンパク質、脂質、及び細胞破片等の他の生物的物質による汚染がなく、純度が高く、清浄であるということである。
【００２５】
本発明のさらなる利点は、フラグメントの大部分が使用可能なサイズ範囲内にあるので、試料準備処理が高い全収率を達成するということである。
【００２６】
本発明の別の利点は、１実施例において、磁性ナノ粒子の利用が、追加の処理ステップを実行せずとも、磁場を印可することによって、試料の凝縮を可能にせしめるということである。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
添付図面を参照して、以下に本発明を説明する。
【図１】図１は、サイズ安定化剤を用いた超音波ビーズ破砕を使用した、胞子の溶解からの核酸分子の有効な放出を示している。
【図２】図２は、ショウジョウバエから分離された核酸分子を示しており、レーン２及び３においてサイズ安定化剤を添加することによって、核酸分子が過剰剪断されることが防止されるものの、変性剤のない試料は１００未満の塩基レベルまで剪断されたことを示している。
【図３】図３は、この処理過程を使用して、広範な異なる試料からの核酸分子が同じ電力レベルと処理時間の超音波処理によって処理され、同一サイズのフラグメント分布が得られることを示している。
【図４】図４は、牛の耳の生体組織を用いて得られた核酸分子の分離を示している。
【図５】図５は、土壌で汚染されたショウジョウバエを使用して得られた核酸分子の分離を示している。
【図６】図６は、磁性粒子からの核酸分子の放出を示すグラフ表示である。
【図７】図７は、ショウジョウバエから回復された精製ＤＮＡを示している。
【図８】図８は、種々の緩衝液を用いてショウジョウバエから回復された精製ＤＮＡを示している。
【図９】図９は、酵母、草及びブルーベリーからの核酸分子の回復を示している。
【図１０】図１０は、大腸菌からの核酸分子の回復を示しており、長時間の超音波処理時間がサイズ分布を変化せしめないことを示している。
【図１１】図１１は、本発明の実施例、すなわち、ＤＮＡ回復のための市販のＱｉａｇｅｎキット及び教本フェノール／クロロホルム法を使用した、容積が増大したバクテリア細胞培養液からのＤＮＡの回復を示すグラフ表示である。
【００２８】
対応する参照符号は、いくつかの図面の対応する箇所を示している。本明細書の実施例は、本発明のいくつかの実施形態を示しているものの、いかなる場合であっても、本発明を限定するものとして解釈されるべきでない。
【発明の詳細な説明】
【００２９】
機械的力が前記生体試料へ印加されて、試料を破壊せしめて、核酸分子を放出させる。サイズ安定化剤は、利用可能な範囲内の核酸分子を取得するために、存在する。１実施例においては、高速ナノ粒子を利用する超音波処理を用いて、試料物質は細かく断片化される。この処理は、細胞、組織又は他の材料を破壊して、核酸分子を放出せしめる。機械的力は、核酸分子を放出せしめるため、試料を引き裂くのに適切ないかなる力でもあり得ると理解される。適切な機械的力は、超音波処理、噴霧化又は均質化処理を含むがこれらに限定されない。１実施例においては、核酸分子は、長さ２００〜１０００の塩基対のサイズまで低減される。別の実施例において、核酸分子は、長さ３００〜３０００の塩基対のサイズまで低減され得る。別の実施例では、核酸分子は、長さ４００〜２０００の塩基対のサイズまで低減され得る。別の実施例では、核酸分子は、長さ２００〜５００の塩基対のサイズまで低減される。所望の塩基対の長さはダウンストリームの試料処理技術に依存して、異なるだろうと理解される。試料処理技術は、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ法、逆転写ＰＣＲ法、「ラブ・オン・チップ」プラットフォーム及びＤＮＡ塩基配列決定を含むがこれらに限定されない。
【００３０】
生体試料は、核酸を含むすべての生物学的有機物を含む。バクテリア、胞子、血液、組織、糸状菌、植物及び昆虫を含むがこれらに限定されない。
【００３１】
ビーズ破砕は、核酸分子を試料から分離する処理である。それは、胞子又は生体組織を用いた使用に良好に適応されたロバスト方法である。ビーズ破砕において、直径約１００ミクロンのガラスビーズが、試料を破壊せしめて、核酸分子を放出するのに用いられる。粒子は、超音波源を使用して運動せしめられる。図１は、胞子の試料からの核酸分子の有効な放出を例証している。
【００３２】
胞子溶解の効率を決定するために、胞子から予想された最大の量の核酸出力が推定されて、図１でゲルの上で測定された量と比較された。この技術を使用して、その方法において、８５−９０％の効率が見積もられた。あるいは、胞子溶解の効率は、超音波処理の後に生存する胞子を測定することによって、計られ得る。表１に示されているように、生存試験に基づいて、実験中に２分の超音波処理の後の効率は、胞子の８６％であった。
【００３３】
【表１】
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【００３４】
しかしながら、超音波処理を用いたビーズ破砕は、核酸分子は溶解ステップの間において、劣化されるという欠点を持っていた。超音波ビーズ破砕は、核酸分子を、もはや利用できない短いフラグメントに剪断する。ほとんどの使用に対して、フラグメントは、１００の塩基の長さよりも長い必要がある。ビーズ破砕によって、フラグメントは、００の塩基の長さよりもはるかに短くなってしまう。
【００３５】
試料と伴に、溶液中のサイズ安定化剤を利用することによって、核酸分子は、達成可能な最小サイズを所望の塩基対長に限定するために、保護され得る。試料準備の際にサイズ安定化剤を添加することによって、限定的なサイズの多量の核酸が生成される。サイズ安定化剤は、洗浄剤、表面活性剤、ポリマ、塩及び石鹸を含む。
【００３６】
本発明の他のサイズ安定化剤は、グアニジウムチオシアネート等のカオトロピックな塩を含む。かかる塩類は、核酸に関連付けられたタンパク質の通常の折り重なりを破粋せしめて、自由形状の核酸を放出すると知られている。
【００３７】
生体試料の懸濁は、緩衝液を混ぜることによって行われる。所定の試料サイズに維持するために、緩衝液はサイズ安定化剤として機能する。サイズ安定化剤は、塩類、洗浄剤、補助溶剤又はポリマを含み得る水溶液である。サイズ安定化剤によって、その後の剪断ステップにおいて、過小であるため、混成、遺伝子配列決定、合成酵素連鎖反応（ＰＣＲ）増幅等の操作において有用でない核酸分子のフラグメントが生成されることが防止される。混成において、約１８の塩基対よりも小なる核酸分子のフラグメントは、特定性を喪失し、常温で不安定である。遺伝子配列決定法とＰＣＲアプリケーションに対して、約２００〜約５００の塩基対からの核酸分子フラグメントが、望ましい。純水緩衝液を使用することによって、約１００の塩基対よりも小なる核酸分子フラグメントが与えられる。これは、多くのアプリケーションに対して過小である。
【００３８】
サイズ安定化剤の使用によって、所望の塩基対範囲において核酸分子フラグメントを収集することが可能となる。従来のビーズ破砕処理において、所望の塩基対範囲内の核酸分子フラグメントの量を最大化するために要する特定時間の後、機械的剪断力は、オフにされる。しかしながら、処理が時間敏感であるので、広範囲の長さを有する塩基対が試料に存在していたままで残存する。サイズ安定化剤を利用することによって、試料の大部分の塩基対長は、所望の塩基対範囲に収まるよう断片化され得る。１実施例においては、核酸分子の少なくとも６０％は、試料における、メディアン核酸分子フラグメント塩基対の長さの５０％以内の長さにある。前述とは別に、メディアン核酸分子フラグメントが４００の塩基対を有する場合、試料の６０％は、２００〜６００の塩基対を有するだろう。別の実施例では、前記核酸分子の少なくとも７５％は、試料における、メディアン核酸分子フラグメント塩基対の長さの５０％以内の長さにある。さらに別の例示実施形態において、前記核酸分子の少なくとも７５％は、試料における、メディアン核酸分子フラグメント塩基対の長さの３０％以内の長さにある。
【００３９】
サイズ安定化剤が存在しない場合、核酸分子は、超音波処理等の機械的力を印加するときに、劣化する傾向がある。サイズ安定化剤が存在している状態で、超音波ビーズ破砕は、核酸分子を、１００の塩基対長よりも短い短フラグメントに剪断する（図２，レーン５及び６を参照されたい）。ほとんどのアプリケーションに対しては、フラグメントは、１００の塩基よりも大である必要がある。図２に示されているように、精製されたＤＮＡ及びＲＮＡによって剪断されたポリマを、４００塩基よりも小さくなるように超音波処理する一連の試験が実行された。かかる試験は、長時間の超音波処理下においてさえも実行された。複雑な試料において、核酸分子は、より小なるフラグメントまで分解しつつ、細胞膜及びタンパク質に吸着する。この問題を克服するために、溶解緩衝液は、ナトリウムドデシル硫酸（ＳＤＳ）等の洗浄剤等のサイズ安定化剤を含むように、修飾される。図２に示されているように、レーン３及び４に示されたサイズ安定化剤の添加によって、核酸分子が過剰剪断されることが防止される。サイズ安定化剤のない試料は、レーン５及び６に示されているように、１００未満の塩基にまで剪断された。
【００４０】
サイズ安定化剤は、保護的な緩衝溶液に含まれる。保護的な緩衝溶液は所望の範囲の塩基対を得るために多数のサイズ安定化剤を含み得ると理解される。保護的な緩衝溶液において使用され得る塩類は、リン酸ナトリウム、グアニジウム塩酸塩及びデキストラン硫酸を含む。保護的な緩衝溶液は。さらに、例えば、ナトリウムドデシル硫酸、ナトリウムドデシルベンゼン硫酸及びポリエチレングリコール等の洗浄剤を含み得る。Ａｌｋａｎｏｌ  ＸＣ等の多くの市販の陰イオン界面活性剤も使用され得る。別の実施例では、保護的な緩衝溶液は、補助溶剤を含む。補助溶剤は、例えば、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセタミド、ヘキサメチルリン酸アミド及びテトラメチル尿素等のダイポールアプロチック溶媒を含む。別の実施例では、保護溶液は、例えば、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸及び他の高分子酸等のポリマを含む。塩類、洗浄剤、補助溶媒及びポリマの濃度は、１０ｍＭから５Ｍまでの範囲内にあり得るし、望ましくは１００ｍＭから１Ｍまでである。
【００４１】
ユニバーサルな試料準備方法として使用されるビーズ破砕等の機械的剪断に対しては、異なるターゲット材料（ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質）とそれらソース（環境、血液又は生体組織）に関する操作パラメータを特徴付け且つ最適化することが、必要である。単一のシステムが異なるタイプの試料を破砕するのに適切であるものの、入力パワー及び音波扇動適用時間等の結果パラメータを最適化することは、異なるタイプの細胞に関して変動し得る。その上、サイズ安定化剤の濃度、ガラスビーズのサイズ、並びに、コラゲナーゼ及びヒアルロナーゼ等の酵素の含有物のすべてが、本発明のさらなる実施形態であり、決して限定するものではないと理解される。
【００４２】
磁性粒子、ガラスビーズ又はそれら双方の組み合わせが本発明から出発することなく破砕に使用され得ると理解される。１実施例においては、磁性粒子は、鉄酸化物から形成される。１実施例において、粒子は、４０−２００ｎｍのサイズ範囲内にある。粒子は、超音波力を使用して加速され得るし、試料を破断し得る。１実施例においては、ガラスビーズは、胞子の効率的な溶解のための抽出混合物において使用される。
【００４３】
１実施例において、核酸分子を放出するのに用いられる機械的力は音波振動である。当該音波振動は、保護的緩衝液において懸濁されたフラグメントの容器を、音波振動のソースに接触せしめることによって達成される。かかるソースは、超音波振動子又は交流電圧により活性化されるピエゾ電気的水晶であり得る。かかるデバイスは、当業者には周知のものである。剪断周波数は、１００００Ｈｚから１０ＭＨｚまで、望ましくは、２０ＫＨｚから４ＭＨｚまで、及び望ましくは２０ＫＨｚから４０ＫＨｚまでであり得る。例えば、胞子等、保護された核酸分子試料の剪断を促進するために、小なるビーズは試料に添加され得る。音波によって誘起されたビーズの運動は、胞子の壁を破壊して、そこに含まれる核酸分子を放出せしめる。ビーズのサイズは、約１ミクロンから約１ｍｍまで、望ましくは約１０ミクロンから約５００ミクロンまで及び最も望ましくは約５０ミクロンから約２００ミクロンまでの範囲内にあり得る。ビーズは、例えば、ステンレス等の金属、ガラス、又はジルコニウム酸化物等の高密度金属酸化物であり得る。核酸分子を剪断するのに必要とされる時間は、部分的には、試料のサイズ及び試料からトランスデューサまで伝送された出力に依存する。しかしながら、剪断された試料が、保護的な緩衝液の成分に依存する定常状態に達するとき、さらなる超音波処理によって、核酸分子のサイズ分布において更なる変化はない。実際、１５秒から２分の超音波処理時間は、１ワットから２ワットの出力レベルにおいて、１マイクログラムの核酸分子のバッファを含む１００ｕｌの試料サイズにおいて、定常状態に至らしめるのに十分である。
【００４４】
別の実施例では、試料の準備処理は、試料の劣化を防ぐためのＲＮアーゼ阻害剤の添加をさらに含む。１実施例においては、試料の準備処理は、ジエチルピロカルボン酸（ＤＥＰＣ：ｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ：ethylene diamine tetraacetic acid）、プロテナーゼＫ又はそれらの組合せを含む。
【００４５】
別の実施例では、サイズ安定装置の存在はリボ核酸をも安定せしめる。ＳＤＳ及びグアニジニウムチオシアン酸塩は、試料内のＲＮＡｓｅｓを破砕せしめて、ＲＮＡを保護する。
【００４６】
１実施例において、磁性ナノ粒子は、マグネタイトナノ粒子である。マグネタイト粒子は、性質において一般的であり、磁石を用いてスクリーニングすることによって、海辺の海砂から収集され得る。これら粒子を研摩すると、比較的粗い磁性粉末が生成されるであろう。より小なるサイズの粒子は、混合された第二鉄塩化物及び第一鉄塩化物の溶液を、ナトリウム若しくは水酸化アンモニウムの攪拌された水溶性アルカリ性水溶液に添加することによって、製造され得る。より小なるサイズの粒子は、ヘキサデカンジオール、オレイルアミン及びオレイン酸の存在下において、ジベンジルエーテルにおける鉄アセトニルアセトナートの熱分解によって生成される。マグネタイトを製造する多数の方法が、知られている。例えば、Sun他は、混合された第二鉄塩化物及び第一鉄塩化物の混合物を、攪拌アンモニアにゆっくりと添加するステップを開示している（Langmuir, 2009, 25 (10), pp 5969-5973.）。米国特許第4,698,302号において、第二鉄塩化物及び第一鉄塩化物を水酸化ナトリウムに混合するステップが教唆されている。Samanta他は、不活性雰囲気においてアンモニアを第二鉄塩化物及び第一鉄塩化物に添加するステップを開示している（Journal of Materials Chemistry, 2008, 18, 1204-1208.）。Ｄｕａｎ他は、マグネタイトナノ粒子を形成する錯体を形成するために、３００℃まで加熱して、オレイン酸における酸化鉄を溶解するステップを教唆している（J. Phys. nucleic acid molecule Chem.C, 2008, 112 (22), pp 8127-8131.）。さらに、Yin他は、オレイン酸の存在下において、鉄カルボニルを熱的に分解するステップを開示している（Journal of Materials Research, 2004, 19, 1208-1215.）。
【００４７】
多くのタイプの試料が、試料を破壊せしめて、核酸分子を放出するために、機械的力を印加することによって処理され得る。試料準備処理は、液体、固体、土壌試料、動物組織、昆虫骨組、ＤＮＡ、バクテリア細胞、胞子、及びウイルスにおける使用において、適切である。図３に示されているように、いくつかの異種の試料が、同じパラメータを用いて処理された。精製されたＤＮＡ、バクテリア細胞、胞子、ウイルス、およびショウジョウバエの試料のすべてが、以下の方法を使用して処理された。各試料は、磁性ナノ粒子及び１００ミクロンのガラスビーズが存在下において、２分間超音波処理にかけられた。図３に示されているように、すべてのタイプの試料において、類似のフラグメント分布が得られた。
【００４８】
さまざまなタイプの試料を使用できるので、準備処理を変更することなく、広範な種々のターゲット有機体を用いて、単一のシステムが使用され得る。その上、試料が２つの異なるターゲットを含む場合であっても、核酸分子は、双方の組成成分から精製され得る。
【００４９】
試料準備システムは少量で動作し、分析のための核酸分子フラグメントについて狭小な分布を提供する。任意で、準備システムは、剪断力を印加する前に、試料にフィルタをかけるステップを通過する。
【００５０】
図３は、この処理過程を使用して、広範な異なる試料からの核酸分子が、同じ電力レベルと処理時間の超音波処理によって処理されて、同一のフラグメントサイズ分布が与えられ得ることを示している。
【００５１】
１実施例においては、処理は、核酸分子を洗浄するのに必要なステップをさらに含む。核酸分子の放出後、及び、核酸分子を有益なサイズ範囲にまで剪断するステップの後、細胞破片からの核酸分子、タンパク質、超音波処理ビーズ及び保護緩衝液を洗浄して、その後の核酸分子の操作及び処理手順に適応する緩衝液において、精製された核酸分子溶液が提供されることは、有利な点である。
【００５２】
１実施例においては、磁石が、磁場を生成するのに利用される。磁石は、磁性粒子を引き寄せ又は押し得る。磁石は、あらゆる磁性粒子をも誘導することによって、磁性粒子を凝集せしめ又は拡散処理の速度を高めることができる。
【００５３】
１実施例においては、磁性ナノ粒子は、ターゲット分析物とともに、サンプルチャンバに設けられる。磁性ナノ粒子は、ターゲット分析物に対して親和性を有する。磁性ナノ粒子をターゲット分析物質に付着させ磁場を印加することによって、ターゲット分析物はサンプルチャンバ内の所望の位置に移動される。
【００５４】
１実施例においては、ターゲット分析物フラグメント及び磁性ナノ粒子を有する溶液で沈殿緩衝液は、ターゲット分析物質を溶液から沈殿せしめ、そして、ターゲット分析物質は磁性ナノ粒子に引きつけられる。沈殿緩衝液は、ターゲット分析物質を溶液から沈殿せしめるいかなる緩衝液でもあり得る。タンパク質に対しては、沈殿緩衝液は、例えば、硫酸アンモニウム、三塩化酢酸、アセトン又はクロロホルムとメタノールの混合物等の有機沈澱剤を含むがこれらに限定されない。ＤＮＡ等の核酸分子に対しては、適切な沈殿緩衝液は、水溶性有機溶剤、アセトン、ジオキサン及びテトラヒドロフランを含むがこれらに限定されない。沈殿緩衝液の実施例が与えられているものの、本願の特許請求の範囲に記載された発明から逸脱することなく、いかなる適切な沈殿緩衝液をも利用され得ることが理解される。
【００５５】
別の実施例では、磁性ナノ粒子は、超常磁性粒子を含む。超常磁性粒子は鉄酸化物等の金属酸化物を含む。好ましい鉄酸化物はマグネタイト（ＦｅａＣＵ）である。
【００５６】
一旦、試料が溶解されると、核酸分子は、試料のリマインダから磁気的に分離され得る。核酸分子は磁性ナノ粒子に結合する。１実施例においては、結合は高塩類／アルコール条件下で生じ、クエン酸ナトリウム等の低塩キレート化バッファを使用することで、高温で溶離される。１実施例においては、試料は、溶出から生成物を増加せしめるために、少なくとも６００℃まで加熱される。
【００５７】
一旦、磁性ナノ粒子がターゲット分析物質に付着されると、磁場が反応チャンバに印加される。磁場の印加によって、磁性ナノ粒子及び付着されたあらゆるターゲット分析物質は、反応チャンバの一部分に集中せしめられる。試料は、試料チャンバの高濃度領域から引き抜かれて、抽出された体積量と同程度の大量なターゲット分析物質が提供される。試料を凝縮することによって、より敏感な試験が実行され得る。
【００５８】
別の実施例では、残存する試料がチャンバから除去されるので、磁場は磁性ナノ粒子を安定な状態に維持する。磁性ナノ粒子とターゲット分析物質との結合力は、ターゲット分析物質が除去されることを防止するのに、十分である。
【００５９】
１実施例においては、分散化した磁性ナノ粒子が試料に添加される。混合物は、結合を促進するために約６００℃で培養される。沈殿緩衝液は、混合物に添加される。核酸分子及びマグネタイトの結合された合成体は、磁場中で収集される。１実施例においては、合成体は容器の側壁で収集される。よって、結合されていないあらゆる固体が、除去の容易にせしめるために、容器の底まで落下し得る。緩衝液及び結合されていない固体が、試料から除去される。
【００６０】
任意で、さらなる洗浄ステップが、サンプルを精製するために使用される。洗浄は、核酸分子の結合を抑制するであろう化合物を除去する。合成体は、付加的沈殿緩衝液、又は、合成体を阻害しない洗浄緩衝液を用いて洗浄され得る。洗浄後、緩衝液は合成体から排出されて、精製され且つ凝縮した試料が得られる。
【００６１】
適切な結合性緩衝液が、溶液に任意に添加される。核酸分子／マグネタイト合成物に対する結合性緩衝液は、概ね、核酸分子が不溶である緩衝液である。核酸分子の沈殿は、マグネタイト粒子に対する核酸分子の結合を促進する。核酸分子及びマグネタイト合成物に対する結合性緩衝液は、水、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化リチウム、酢酸アンモニウム、塩化マグネシウム、エタノール、プロパノール、ブタノール、グリコーゲン若しくは他の糖類、ポリアクリルアミド又はそれの混合物を含み得る。１実施例においては、結合性緩衝液はイソプロパノールである。グネタイト粒子に対する核酸分子の結合は、瞬時的ではない。１実施例においては、混合物は、結合処理を促進せしめるために、室温より高温で培養される。
【００６２】
核酸分子の更なる処理のために、いくつかの処理において、マグネタイト粒子を除去する必要がある。１実施例において、核酸分子は、溶出緩衝液とその合成体の混合物を９５℃まで加熱することによって、核酸分子及びマグネタイトの合成体から溶出される。マグネタイトは、磁場又は遠心沈殿により収集されて、精製された核酸分子が溶出緩衝液において提供される。１実施例において、溶出緩衝液は、鉄酸化物表面と強く相互作用する塩類を含む。好ましい緩衝液は、リン酸塩水溶液及びクエン酸塩水溶液である。
【００６３】
実施例
実施例１
超音波処理ビーズ破粋
胞子が準備され、胞子形成媒体＋からの枯草菌から分離された。培養液から取られた胞子の１００μｌ既知少量に対して、等容積である０．１ｍｍのガラスビーズが、マイクロフュージチューブ内に添加された。マイクロフュージチューブの先は、ブランソン超音波処理器のソケットに、載置された。２の出力設定を使用して、チューブ内のビーズは、２分間、激しく動かされた。その後、グラム染色は、胞子のうちの９０％以上がこの処理によって破粋されたことを示した。これは、この処理を生存した胞子から形成されたコロニーを計数することによって、プレーティング分析を用いて確認された。放出されたＤＮＡの量に関する推定が、既知少量の溶解物を、１ｍｇ／ｍｌのエチジウム臭素を含む１％のアガロースゲルの表面に対して染みつけることによって、得られた。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｆｌｕｏｒ−Ｓイメージャは、ゲル表面で染みなって周知の標準量ＤＮＡに対する試料蛍光の強度を比較した。この技術を使用して、約１０ｎｇのＤＮＡが、２．５×１０5の胞子から分離され得る。
【００６４】
実施例２
生体組織試料
図４に示すように、診断試料のために、牛の耳の生体組織を使用するアプローチが、評価された。耳の生体組織は、評価するために、多くの場合、牛から取られ、皮膚、髪、大量の軟骨量を有し、血液が豊富である。直径約３ｍｍの耳栓に対して試験が行われた。約１マイクログラムの核酸分子のロバスト試料が、超音波処理及び４０ｎｍのフェライト粒子を使用して、耳栓から分離された。核酸分子は、予想されたサイズ範囲内にあった。ガラスビーズが、生体組織からの抽出のために必要とされなかった。ビーズ破砕を用いた耳栓の後処理によって、さらなる核酸分子は抽出されなかった。超音波処理の出力及び時間設定は、先の実施例で使用されたものと同じであった。
【００６５】
実施例３
土壌で汚染された試料
図５に示されているように、複雑な試料を評価するためには、土壌に混合された細菌性試料及び胞子試料が処理された。土壌は、ＰＣＲベースのシステムを抑制することが知られた複合培地である。土壌は、６つのショウジョウバエを含む試料に添加された。ハエが、マラリア等の疾病を運ぶと評価され得る昆虫を代表するものと意図されている。最大３２ミリグラムの土壌が、１ミリリットルの試料あたり添加された。ショウジョウバエは、フェライト粒子の存在下で二分間、超音波処理を使用して破砕された。ＤＮＡ及びＲＮＡは、エタノールを添加したフェライト粒子を使用して得られた。粒子は、磁気的に収集され、汚染物を除去するために緩衝液及びエタノールを用いて洗浄され、そして、磁性を用いて凝集された。核酸分子は、９００℃のハイブリダイゼーション用緩衝液において溶離されて、ＤＮＡの要素が変性された。最小量の損失が、試料の土壌レベルが１００マイクロリットル当たり３２ミリグラム（レーン８）に達するまで、観測された。ここで、溶液は粘着性になり、粒子運動は、現行の試験条件下では困難である。破粋パワーを増大させ、溶液を変更し、破粋粒子サイズ及び特性を変更することによって、結果は、極端に汚染された試料に対して最適化され得ることが理解される。
【００６６】
実施例４
マグネタイトクラスタの準備
塩化第２鉄（０．８Ｍ）、塩化第１鉄（０．４Ｍ）及び塩酸（０．４Ｍ）からなる第１溶液が、混合されて、０．２ミクロンのフィルタにかけられた。第２溶液は、水を有する７２ｍｌの水酸化アンモニウム（３０％）が１リットルとなるように準備された。
【００６７】
１ｍｌの塩化第２鉄／塩化第１鉄溶液が、２０ｍｌのアンモニウム水酸化物水溶液を攪拌するのに、添加された。攪拌は、１５秒継続された。（２０ｍｌの小びんの）溶液は、強磁石上に載置され、１分間、置かれた。その後に、すべての生成物が、小びんの下部に引っ張られた。透明な上澄液が、静かに注がれ、水と置換され、混ぜられ、磁石の近くで載置された。再び、生成物は、小びんの下部に引っ張れた。この処理は、残留アンモニウム及び鉄塩が全くない生成物を洗浄するために、３回繰り返された。小びんは、２０ｍｌの水で満たされて、５分間、４ワットの出力にて、超音波処理された。懸濁液は、１ミクロンのガラスろ過器を介してフィルタにかけられ、マグネタイト粒子の安定懸濁液が得られた。マグネタイト粒子は、磁場又は遠心沈殿によって引き下げられるまで懸濁液に残存する。
【００６８】
実施例５
磁性粒子の付着
核酸分子は、ショウジョウバエから精製され、フェライト粒子で溶解された。それに続いて、磁気的な分離及び溶出処理が実行された。磁気ヘッドは９０％より大なる利用可能な核酸分子を捕らえた。
【００６９】
実施例６
複雑な試料からのＤＮＡ
バシラス細胞が、牛の耳の生体組織又はショウジョウバエと混合された。混合物は、試料準備処理を介して得られた。得られた核酸は、センサーチップで観察するために混成された。チップは、混成されたＤＮＡを検出するために、ＹＯＹＯ−Ｉ色素を用いて処理された。細胞における標的ＤＮＡ配列は、別々に処理されたバシラス細胞と同程度のレベルにて、センサーチップに混成された。バシラス細胞のいない負の制御は、混成されたＤＮＡを全く示さなかった。実験は、試料に添加された上述の土壌を用いて繰り返された。少なくとも６０％の混成を残す混成効率が、真核生物細胞及び土壌がない試料において示した。
【００７０】
実施例７
粒子を流液で洗浄する
磁性粒子は、ＤＮＡに結合され、２ｍｍの直径を有する透明なプラスチック容器に導入された溶液に結合された。磁石は、チューブの中心下で載置された。洗浄緩衝液は、シリンジポンプを使用してチューブに押し込められた。粒子は、洗浄を介して、見たところ、その場所に留まった。洗浄後、磁石が除去され、粒子は、チューブから洗浄。ＤＮＡが高温にて溶出されゲル上で動かされた。顕著なＤＮＡの損失は観測されなかった。
【００７１】
実施例８
磁性粒子の結合効率と放出
放射性標識化ＤＮＡが、フェライトに対する結合効率及び核酸分子の放出を判定するために、使用された。マグネタイト懸濁液及び３つの容積のエタノールを有する放射性標識化ＤＮＡは、混合された。マグネタイトは、磁石を使用して、チューブ下部に引き付けられた。上澄み液が、ペレットから除去された。両方の断片が、シンチレーション計数器では、計数された。上澄みは７７０ｃｐｍを含み、再懸濁液されたペレットは19330cpmを含んだ。したがって、放射性標識化ＤＮＡの約９０％が、フェライトに結合された。
【００７２】
実施例９
核酸分子の放出
放射性標識化ＤＮＡが使用されて、フェライトに対する結合効率と核酸分子の放出が決定された。磁性懸濁溶液及び３つの容積のエタノールを有する放射性標識化ＤＮＡが、混合された。マグネタイトは、磁石を使用して、チューブ下部に引き付けられた。上澄み液が、ペレットから除去された。両方の断片が、シンチレーション計数器では、計数された。結合は、混合物のエタノールの成分の関数として、測定された。結果が図６に示されている。
【００７３】
放出効率を判定するために、結合されたＤＮＡペレットが、以下で表に示されるように、１００μｌの緩衝液において懸濁され、１０分間、９５℃にて培養され、磁石で収集された。上澄み液が、ペレットから除去され、双方が計数された。
【００７４】
【表２】
2012510296.tif 000004
【００７５】
実施例１０
複雑な試料からのＤＮＡ
ＢＧ細胞が、牛の耳の生体組織又はショウジョウバエと混合された。混合物は、試料準備処理を介された。得られた核酸は、センサーチップで観察するために混成された。チップは、混成されたＤＮＡを検出するために、ＹＯＹＯ−Ｉ色素を用いて処理された。細胞における標的ＤＮＡ配列は、別々に処理されたバシラス細胞と同程度のレベルにて、センサーチップに混成された。ＢＧのいない負の制御は、混成されたＤＮＡを全く示さなかった。実験は、試料に添加された上述の土壌を用いて繰り返された。少なくとも６０％の混成を残す混成効率が、真核生物細胞及び土壌がない試料において示した。
【００７６】
実施例１１
３つのショウジョウバエが、２つの１．５ｍｌのエッペンドルフチューブの各々に載置された。一方は、１０ＯｍＭのＴＲＩＳヒドロクロリド(pH7.5)、１．５％のデキストラン硫酸及び０．２％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）からなる１００マイクロリットルの混合物を用いて搭載された。もう一方は、１００マイクロリットルのイソプロピルアルコール及び１００マイクロリットルの２０％ドデシル硫酸が搭載された。双方のチューブは、１０μｌの０．６％マグネタイトナノ粒子を搭載された。双方のチューブは、２０ｋＨｚにて、４５秒間（２ワット）、超音波処理された。そして、１ｍｌのイソプロピルアルコールが、第１のチューブに添加された。１／２ミリリットルのイソプロピルアルコールが、第２のチューブに添加された。磁気ペレットは、永久磁石により収集され、静かに注がれた上澄み液尾帯50μlの１００ｍＭリン酸水素ナトリウムが、各チューブに添加された、ピペットは、反復性ピペットによって再懸濁し、９５℃にて２分間培養された。ペレットは、磁石により再び収集された。溶離されたＤＮＡは、TEA緩衝液において、７７ボルトで１％のアガロースゲル上で動かされた。ＤＮＡのラダーも、ゲル上で動かされた。
【００７７】
図７に示されているように、ゲルは、エチジウム臭素により染み付けられ、３０２ｎｍの励起及び６１０ｎｍのフィルタを用いてカメラで撮像された。精製されたＤＮＡは写真で明確に目に見えるものでる。最上部のレーンは第２のチューブを表している。中央のレーンは第１のチューブを表している。最下部のレーンは、ＤＮＡのラダーを表している。
【００７８】
実施例１２
４つのチューブの各々が、３つのショウジョウバエ、１００マイクロリットルの緩衝液及び１０μｌの０．６％マグネタイトナノ粒子を有し、３０秒間、５ワットで、２ＯｋＨｚで超音波処理された。図８に示すように、ＤＮＡは、実施例１１と同様に、収集され、溶離され、ゲルにおいて作用され、染み付けされ及び撮像された。４つの緩衝液は、下記の通りであった。
【００７９】
1.１００ｍｍのＴＲＩＳ、１．５％のデキストラン硫酸及び０．２％のＳＤＳ
2.イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）
3.９０％のＩＰＡ、１％のドデシルベンゼン硫酸、９％の水
4.９０％のＩＰＡ、１％のポリアクリル酸ナプタラム、９％の水
実施例１３
酵母、草及びブルーベリーの一部が、１０ＯｍＭのＴＲＩＳにおいて超音波処理された、
実施例１１と同様に、１．５％のデキストラン硫酸及び０．２％のＳＤＳ。精製、ゲル及び写真が実施例１１と同様に得られ、図９に示されている。
【００８０】
実施例１４
３つの１．５ｍｌのエッペンドルフチューブの各々は、約１００億の大腸菌細胞及び（直径約１００ミクロンの）３０ｍｇのガラスビーズ及び４０マイクロリットルの０．５モルリン酸ナトリウムｐＨ７．５を含み、４ｍｍの音波のチップをチューブ内に挿入して、４０ｋＨｚ、１０％の振幅で、１５秒間、３０秒間及び６０秒間、超音波処理された。精製、ゲル及び写真が、実施例１１と同様に行われ、図１０に示されている。
【００８１】
この例は、長時間の超音波処理時間がサイズ分布を変化せしめないこと、すなわち、定常状態条件が適用されることを示している。
【００８２】
実施例１５
この実施例では、２つの標準方法を使用して、ＤＮＡは、容積が増大したバクテリア細胞培養から回復される。当該２つの標準方法は、ＤＮＡ回復のための市販のＱｉａｇｅｎキット及び教本のＰｈｅｎｏｌ／クロロホルム法である。これらは、緩衝液として０．２％のＳＤＳと０．５Ｍのリン酸ナトリウムを使用して、実施例１１における方法と比較された。結果が図１１に示されている。
【００８３】
グラフは、本発明の方法はＱｉａｇｅｎキットとフェノール／クロロホルム法の双方よりも優れていることを示している。
本発明について特定の実施例を参照して説明してきたものの、当業者であれば、本願発明の範囲から逸脱しないで、種々の変更がなされ得るし、均等物が変更後の要素に置換され得ることを容易に理解できるであろう。さらに、本発明の範囲から逸脱することなく、特定の状況若しくは物質が本発明の教唆に適合するように、多くの変更がなされ得る。
【００８４】
したがって、本発明は、本発明を実施するために想定されたベストモードとして開示された特定の実施形態に限定されるべきではなく、本発明は、添付した特許請求の範囲に記載された発明の範囲及び趣旨の範囲内にあるすべての実施形態を含むことを、意図している。
【図７】
2012510296.tif 000005
【図８】
2012510296.tif 000006
【図１】
2012510296.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2012510296.tif 000011
【図６】
2012510296.tif 000012
【図９】
2012510296.tif 000013
【図１０】
2012510296.tif 000014
【図１１】
2012510296.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成23年10月18日(2011.10.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】明細書
【発明の名称】ユニバーサルな生物学的試料処理
【０００１】
米国政府は、本発明の実施権、及び、特許権者が適当な条件で他の者に使用許諾することを要求する限定された状況下の権利を有する。当該適当な条件は、科学基金によって与えられた助成金第ＤＭＩ−０４５０４７２号及び第ＩＩＰ−０４５０４７２号、米軍医療研究および物資司令部によって与えられた契約第Ｗ８１ＸＷＨ−０７−２−０１０９号、米軍RDECOM ACQ CTRによって与えられた契約番号第Ｗ９１１ＮＦ−０６−１−０２３８号及び第Ｗ９１１ＮＦ０９Ｃ０００１号のうちの１つ以上の条件であたえられる。
【関連出願のクロスリファレンス】
【０００２】
本出願は、２００８年１２月３日に出願された米国仮特許出願第６１／１１９，５９７号の優先権の利益を主張し、その内容が本明細書によって参考として組み入れられている。
【技術分野】
【０００３】
本発明は生体試料から核酸分子を準備する処理方法に関する。特に、本発明は、サイズ安定化剤の存在下において、生体試料を破壊することによって試料を準備して、利用可能な塩基対の範囲内の核酸分子を取得する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
生体試料の核酸ベースの識別は、まず、試料からの核酸分子（NAMs:nucleic acid molecules）の分離を必要とする。ユーザの要求を有効的に且つ効率的に満たすようなシステムを達成するために、ユニバーサルな試料準備処理が必要とされている。現行の試料準備処理は、困難であり、時間を要し、そして、研究能力を必要とする。ユニバーサル性を維持するために、処理は、広範な様々な入力材料を処理できなければならない。これは、ウイルス、胞子、有機物、バクテリア、及び、血液、生体組織、唾液、尿、糞等の医学的診断材料を含むものの、これらに限定されない。
【０００５】
試験方法を改良し、臨床検査に要する時間要求を低減せしめる継続的な関心が存在する。特定の試験は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ等の核酸分子を抽出するために、サンプルが破壊されていることを必要とする。
【０００６】
約３０００万の分子診断試験が、２００７年、米国医療設備において行われたと見積もられている。この数は、２００９年に６７００万まで増加すると予想されている。これら分析のすべてではないものの、多くの分析が、使用が容易であり、オペレータの介入を必要とせず、費用効率性がよく、小さいサイズの試料に敏感である迅速な試料準備処理から利益を得るであろう。
【０００７】
研究及び医用診断の分野における分子的診断と遺伝子配列決定の利用が、急速に、増加している。分子技術は、抗体法よりも高いレベルの特定性及び感度を提供する。遺伝子配列決定法は、以前には利用可能でなかった多量の情報の収集を可能にする。しかしながら、試料の準備は、ＰＣＲ法の実行、リアルタイムＰＣＲ法、遺伝子配列決定分析及び混成試験に関して主にコストがかかる要素である。さらに、それは、試験結果を遅延せしめ、これら分析を実行する能力をよく訓練された人員を有する研究室に制限してしまう。
【０００８】
ビーズ破砕は、核酸分子を試料から分離するために長年使用されてきた。ビーズ破砕は、通常、試料に添加されたミクロンサイズのガラスビーズの超音波による振動である。それは、胞子又は生体組織等の固体を用いて使用に良好に適応されたロバスト方法である。
【０００９】
ビーズ破砕はいくつかの欠点を有する。一方、試料があまりにも長時間処理され又は過大な出力レベルで処理される場合、１００未満の塩基対の長さの短いフラグメントのみが生成される。他方において、試料が簡潔で且つ低出力扇動により処理される場合、広範なサイズのフラグメントを有する少量の核酸が生成される。特定のサイズ範囲の核酸が必要であるとき、試料のゲル電気泳動が、時には採用され、処理されたゲルから正確なサイズの範囲のゲルセクションを切断し、ゲルから核酸フラグメントを抽出する。この処理は、遅く且つ冗長である。
【００１０】
生物学的、化学的試験を実行する際には、所望のサイズ範囲の核酸分子を取得し、所定の分析物を凝集せしめ且つ維持することが、多くの場合、望まれる所定の分析物を凝集せしめ且つ維持する。試料を凝縮することは、困難な処理であり得る。生体試料を凝縮する従来の方法は、フィルタ処理、洗浄処理、遠心分離処理及び／又は化学反応処理を含む。多くの場合、これらのステップは、単一の処理チャンバにおいて事前処理され得ないだろう。サンプルが他のデバイス又はチャンバに搬送される必要がある。
【００１１】
磁性ナノ粒子は、磁場に引き付けられる粒子である。磁性ナノ粒子を核酸ポリマに付着させ、磁場を試料に印加することによって、核酸ポリマは所望の位置に移動せしめられ、その結果、核酸ポリマを有する試料の一部が凝縮される。試料は、多量の核酸ポリマを生成する凝縮部分から引き抜かれる。
【００１２】
磁場を印加することによって、核酸ポリマを操作することがさらに可能となる。例えば、核酸ポリマの安定状態を維持することによって、洗浄が、核酸ポリマを洗い流すことなく、行われ得る。
【００１３】
したがって、あらゆるソースから、所望のサイズ範囲の核酸分子を迅速且つ経済的に準備する方法に対する需要がある。
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、多数のタイプの生体試料に対してユニバーサルな新規な試料準備手法を開示する。処理は、細胞、組織又は他の材料を破壊して、核酸分子を放出せしめる。この処理中に、核酸分子は、処理しやすいサイズまで破壊される。１実施例においては、核酸分子は、凝縮され且つ洗浄される。粒子は、洗浄するためにフロー中で維持され得る。核酸分子は、緩衝液又は熱処理を使用して、粒子から溶離される。
【００１５】
ユニバーサルな試料準備処理を提供することは、コストを大幅に低減せしめ、再現精度を高めることができる。例えば、自動化された遺伝子配列決定システムは、分析対象のＤＮＡを準備するために、試料について大規模な処理を必要とする。ほとんどのＤＮＡ配列決定手法が、個々のＤＮＡ分子を増殖せしめるために、生体外のクローニングステップを使用する。エマルジョンＰＣＲは、油相の水性液滴におけるプライマ被覆されたビーズと共に、個々のＤＮＡ分子を分離する。そして、ＰＣＲ法はＤＮＡ分子のクローンコピーを有する各ビーズを被覆する。それに続いて、後の配列決定のために固定化が実行される。エマルジョンＰＣＲは、Ｍａｒｇｕｉｌｉｓ他による方法（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって商業化されている）、ＳｈｅｎｄｕｒｅとＰｏｒｒｅｃａ他による方法（「ポークソーセージ配列決定法」としても知られている）、及び、ＳＯＬｉＤ配列決定法（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ、すなわち、現在のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって開発された）において使用される。生体外クローン増殖のための別の方法はブリッジＰＣＲ法である。当該ブリッジＰＣＲ法において、フラグメントは、固体表面に付着されたプライマにおいて増殖される。単一分子法は、Steve Quakeの研究室によって開発され（後にＨｅｌｉｃｏｓによって商業化された）、この増殖ステップを省略して、ＤＮＡ分子を表面に直接固定する。
【００１６】
超音波処理されたＤＮＡフラグメントの双方が、一本鎖末端を含み得るので、ほとんどの処理手順は、平滑末端ベクター（１０、１１）に対する結合前に、ＤＮＡを末端修復するステップを含む。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ及びクレノウＤＮＡポリメラーゼの結合は、結合相補ヌクレオチドを、５'オーバーハングを有する得られた２本鎖のフラグメントに対して触媒作用を及ぼすことによって、ＤＮＡフラグメントを「充満せしめる」のに使用される。さらに、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの一本鎖３'−５'エキソヌクレアーゼ活性は、３'オーバーハングを劣化せしめるために使用される。反応に含まれる２つの酵素、バッファ、及びデオキシヌクレオチドは、約３７℃で培養される。フラグメントは、エタノールの沈殿によって凝縮され、それに続いて、キナーゼバッファにおける再懸濁及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼとｒＡＴＰを使用したリン酸化が行われた。ポリヌクレオチドキナーゼは、フェノールの抽出によって除去され、ＤＮＡフラグメントは、エタノールの沈殿によって凝縮され、乾燥され、緩衝液において再懸濁され、そして、平滑末端クローニングベクターに結合される。音波処理されたＤＮＡの大部分は、末端修復又はキナーゼ処理を行うことなく、容易にクローン化されるので、これら２つのステップは、得られた形質転換クローンの総数に対して顕著な影響を及ぼすことなく、組み合わされ得る。
【００１７】
現在、フラグメント末端修復に続いて、ＤＮＡ試料は、サイズマーカに対する予備的低溶解温度のアガロースゲルに電気泳動され、適切な分離の後に、１−２Ｋｂｐ及び２−４Ｋｂｐのサイズ範囲のフラグメントは、切除されて、ゲルから別々に溶離される。あるいは、フラグメントは、セファクリルＳ−５００等のスピンカラムにおける細分化によって、精製され得る。
【００１８】
実施例の試料準備処理は、１００と１００００との間の塩基対のサイズ範囲のＤＮＡ及びリＲＮＡのフラグメントを準備し得る。サイズの正確な分布は、表面活性剤の濃度、使用される表面活性剤又は超音波処理周波数によって変化せしめられ得る。所望のサイズ範囲でフラグメントを生成する能力は、電気泳動又はカラム分離の必要性を排除する。また、これは、精製ステップの必要性を排除することによって、有益なフラグメントの全収率を増加せしめる。
【００１９】
一つの態様において、本発明は、核酸分子を取得するために試料を破壊する試料準備チャンバを含む。機械的力は、サイズ安定化剤の存在下において印加され、試料が破壊され、且つ、所望のサイズ範囲の核酸フラグメントが取得される。
【００２０】
本発明は、ある態様において、ターゲット分析結合要素を含む磁性ナノ粒子を利用して、磁性ナノ粒子をターゲット分析物質に結合せしめる方法を含む。磁性ナノ粒子は磁場内で操作され得る。磁性ナノ粒子がターゲット分析物質に結合されるので、ターゲット分析物質は磁場の印加によって間接的に操作される。
【００２１】
１実施例においては、磁性ナノ粒子は、熱を加えることを介して、核酸分子から放出される。９５℃辺りの温度は、磁性ナノ粒子を効率的に放出することが示されている。別の実施例では、磁性ナノ粒子は、溶出溶液を介して、核酸分子から放出される。溶出溶液は、洗浄剤又は塩類であり得る。好ましい実施形態において、溶出溶液はリン酸又はクエン酸を含む。１実施例においては、溶出溶液は、リン酸カリウム若しくはクエン酸カリウム、又は、リン酸カリウム若しくはクエン酸ナトリウムである。
【００２２】
本発明は、所望のサイズ範囲内にある核酸試料を準備することを目的とする。
【００２３】
本発明の１つの利点は、試料準備方法を用いて高収量の核酸を得ることができることである。
【００２４】
本発明の別の利点は、動物生体組織、バクテリア細胞、胞子、昆虫、植物及びウイルス性細胞を含むいかなる核酸試料ソースを用いても使用され得るということである。
【００２５】
本発明のさらに別の利点は、タンパク質、脂質、及び細胞破片等の他の生物的物質による汚染がなく、純度が高く、清浄であるということである。
【００２６】
本発明のさらなる利点は、フラグメントの大部分が使用可能なサイズ範囲内にあるので、試料準備処理が高い全収率を達成するということである。
【００２７】
本発明の別の利点は、１実施例において、磁性ナノ粒子の利用が、追加の処理ステップを実行せずとも、磁場を印可することによって、試料の凝縮を可能にせしめるということである。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
添付図面を参照して、以下に本発明を説明する。
【図１】図１は、サイズ安定化剤を用いた超音波ビーズ破砕を使用した、胞子の溶解からの核酸分子の有効な放出を示している。
【図２】図２は、ショウジョウバエから分離された核酸分子を示しており、レーン２及び３においてサイズ安定化剤を添加することによって、核酸分子が過剰剪断されることが防止されるものの、変性剤のない試料は１００未満の塩基レベルまで剪断されたことを示している。
【図３】図３は、この処理過程を使用して、広範な異なる試料からの核酸分子が同じ電力レベルと処理時間の超音波処理によって処理され、同一サイズのフラグメント分布が得られることを示している。
【図４】図４は、牛の耳の生体組織を用いて得られた核酸分子の分離を示している。
【図５】図５は、土壌で汚染されたショウジョウバエを使用して得られた核酸分子の分離を示している。
【図６】図６は、磁性粒子からの核酸分子の放出を示すグラフ表示である。
【図７】図７は、ショウジョウバエから回復された精製ＤＮＡを示している。
【図８】図８は、種々の緩衝液を用いてショウジョウバエから回復された精製ＤＮＡを示している。
【図９】図９は、酵母、草及びブルーベリーからの核酸分子の回復を示している。
【図１０】図１０は、大腸菌からの核酸分子の回復を示しており、長時間の超音波処理時間がサイズ分布を変化せしめないことを示している。
【図１１】図１１は、本発明の実施例、すなわち、ＤＮＡ回復のための市販のＱｉａｇｅｎキット及び教本フェノール／クロロホルム法を使用した、容積が増大したバクテリア細胞培養液からのＤＮＡの回復を示すグラフ表示である。
【００２９】
対応する参照符号は、いくつかの図面の対応する箇所を示している。本明細書の実施例は、本発明のいくつかの実施形態を示しているものの、いかなる場合であっても、本発明を限定するものとして解釈されるべきでない。
【発明の詳細な説明】
【００３０】
機械的力が前記生体試料へ印加されて、試料を破壊せしめて、核酸分子を放出させる。サイズ安定化剤は、利用可能な範囲内の核酸分子を取得するために、存在する。１実施例においては、高速ナノ粒子を利用する超音波処理を用いて、試料物質は細かく断片化される。この処理は、細胞、組織又は他の材料を破壊して、核酸分子を放出せしめる。機械的力は、核酸分子を放出せしめるため、試料を引き裂くのに適切ないかなる力でもあり得ると理解される。適切な機械的力は、超音波処理、噴霧化又は均質化処理を含むがこれらに限定されない。１実施例においては、核酸分子は、長さ２００〜１０００の塩基対のサイズまで低減される。別の実施例において、核酸分子は、長さ３００〜３０００の塩基対のサイズまで低減され得る。別の実施例では、核酸分子は、長さ４００〜２０００の塩基対のサイズまで低減され得る。別の実施例では、核酸分子は、長さ２００〜５００の塩基対のサイズまで低減される。所望の塩基対の長さはダウンストリームの試料処理技術に依存して、異なるだろうと理解される。試料処理技術は、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ法、逆転写ＰＣＲ法、「ラブ・オン・チップ」プラットフォーム及びＤＮＡ塩基配列決定を含むがこれらに限定されない。
【００３１】
生体試料は、核酸を含むすべての生物学的有機物を含む。バクテリア、胞子、血液、組織、糸状菌、植物及び昆虫を含むがこれらに限定されない。
【００３２】
ビーズ破砕は、核酸分子を試料から分離する処理である。それは、胞子又は生体組織を用いた使用に良好に適応されたロバスト方法である。ビーズ破砕において、直径約１００ミクロンのガラスビーズが、試料を破壊せしめて、核酸分子を放出するのに用いられる。粒子は、超音波源を使用して運動せしめられる。図１は、胞子の試料からの核酸分子の有効な放出を例証している。
【００３３】
胞子溶解の効率を決定するために、胞子から予想された最大の量の核酸出力が推定されて、図１でゲルの上で測定された量と比較された。この技術を使用して、その方法において、８５−９０％の効率が見積もられた。あるいは、胞子溶解の効率は、超音波処理の後に生存する胞子を測定することによって、計られ得る。表１に示されているように、生存試験に基づいて、実験中に２分の超音波処理の後の効率は、胞子の８６％であった。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
しかしながら、超音波処理を用いたビーズ破砕は、核酸分子は溶解ステップの間において、劣化されるという欠点を持っていた。超音波ビーズ破砕は、核酸分子を、もはや利用できない短いフラグメントに剪断する。ほとんどの使用に対して、フラグメントは、１００の塩基の長さよりも長い必要がある。ビーズ破砕によって、フラグメントは、００の塩基の長さよりもはるかに短くなってしまう。
【００３６】
試料と伴に、溶液中のサイズ安定化剤を利用することによって、核酸分子は、達成可能な最小サイズを所望の塩基対長に限定するために、保護され得る。試料準備の際にサイズ安定化剤を添加することによって、限定的なサイズの多量の核酸が生成される。サイズ安定化剤は、洗浄剤、表面活性剤、ポリマ、塩及び石鹸を含む。
【００３７】
本発明の他のサイズ安定化剤は、グアニジウムチオシアネート等のカオトロピックな塩を含む。かかる塩類は、核酸に関連付けられたタンパク質の通常の折り重なりを破粋せしめて、自由形状の核酸を放出すると知られている。
【００３８】
生体試料の懸濁は、緩衝液を混ぜることによって行われる。所定の試料サイズに維持するために、緩衝液はサイズ安定化剤として機能する。サイズ安定化剤は、塩類、洗浄剤、補助溶剤又はポリマを含み得る水溶液である。サイズ安定化剤によって、その後の剪断ステップにおいて、過小であるため、混成、遺伝子配列決定、合成酵素連鎖反応（ＰＣＲ）増幅等の操作において有用でない核酸分子のフラグメントが生成されることが防止される。混成において、約１８の塩基対よりも小なる核酸分子のフラグメントは、特定性を喪失し、常温で不安定である。遺伝子配列決定法とＰＣＲアプリケーションに対して、約２００〜約５００の塩基対からの核酸分子フラグメントが、望ましい。純水緩衝液を使用することによって、約１００の塩基対よりも小なる核酸分子フラグメントが与えられる。これは、多くのアプリケーションに対して過小である。
【００３９】
サイズ安定化剤の使用によって、所望の塩基対範囲において核酸分子フラグメントを収集することが可能となる。従来のビーズ破砕処理において、所望の塩基対範囲内の核酸分子フラグメントの量を最大化するために要する特定時間の後、機械的剪断力は、オフにされる。しかしながら、処理が時間敏感であるので、広範囲の長さを有する塩基対が試料に存在していたままで残存する。サイズ安定化剤を利用することによって、試料の大部分の塩基対長は、所望の塩基対範囲に収まるよう断片化され得る。１実施例においては、核酸分子の少なくとも６０％は、試料における、メディアン核酸分子フラグメント塩基対の長さの５０％以内の長さにある。前述とは別に、メディアン核酸分子フラグメントが４００の塩基対を有する場合、試料の６０％は、２００〜６００の塩基対を有するだろう。別の実施例では、前記核酸分子の少なくとも７５％は、試料における、メディアン核酸分子フラグメント塩基対の長さの５０％以内の長さにある。さらに別の例示実施形態において、前記核酸分子の少なくとも７５％は、試料における、メディアン核酸分子フラグメント塩基対の長さの３０％以内の長さにある。
【００４０】
サイズ安定化剤が存在しない場合、核酸分子は、超音波処理等の機械的力を印加するときに、劣化する傾向がある。サイズ安定化剤が存在している状態で、超音波ビーズ破砕は、核酸分子を、１００の塩基対長よりも短い短フラグメントに剪断する（図２，レーン５及び６を参照されたい）。ほとんどのアプリケーションに対しては、フラグメントは、１００の塩基よりも大である必要がある。図２に示されているように、精製されたＤＮＡ及びＲＮＡによって剪断されたポリマを、４００塩基よりも小さくなるように超音波処理する一連の試験が実行された。かかる試験は、長時間の超音波処理下においてさえも実行された。複雑な試料において、核酸分子は、より小なるフラグメントまで分解しつつ、細胞膜及びタンパク質に吸着する。この問題を克服するために、溶解緩衝液は、ナトリウムドデシル硫酸（ＳＤＳ）等の洗浄剤等のサイズ安定化剤を含むように、修飾される。図２に示されているように、レーン３及び４に示されたサイズ安定化剤の添加によって、核酸分子が過剰剪断されることが防止される。サイズ安定化剤のない試料は、レーン５及び６に示されているように、１００未満の塩基にまで剪断された。
【００４１】
サイズ安定化剤は、保護的な緩衝溶液に含まれる。保護的な緩衝溶液は所望の範囲の塩基対を得るために多数のサイズ安定化剤を含み得ると理解される。保護的な緩衝溶液において使用され得る塩類は、リン酸ナトリウム、グアニジウム塩酸塩及びデキストラン硫酸を含む。保護的な緩衝溶液は。さらに、例えば、ナトリウムドデシル硫酸、ナトリウムドデシルベンゼン硫酸及びポリエチレングリコール等の洗浄剤を含み得る。Ａｌｋａｎｏｌ  ＸＣ等の多くの市販の陰イオン界面活性剤も使用され得る。別の実施例では、保護的な緩衝溶液は、補助溶剤を含む。補助溶剤は、例えば、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセタミド、ヘキサメチルリン酸アミド及びテトラメチル尿素等のダイポールアプロチック溶媒を含む。別の実施例では、保護溶液は、例えば、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸及び他の高分子酸等のポリマを含む。塩類、洗浄剤、補助溶媒及びポリマの濃度は、１０ｍＭから５Ｍまでの範囲内にあり得るし、望ましくは１００ｍＭから１Ｍまでである。
【００４２】
ユニバーサルな試料準備方法として使用されるビーズ破砕等の機械的剪断に対しては、異なるターゲット材料（ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質）とそれらソース（環境、血液又は生体組織）に関する操作パラメータを特徴付け且つ最適化することが、必要である。単一のシステムが異なるタイプの試料を破砕するのに適切であるものの、入力パワー及び音波扇動適用時間等の結果パラメータを最適化することは、異なるタイプの細胞に関して変動し得る。その上、サイズ安定化剤の濃度、ガラスビーズのサイズ、並びに、コラゲナーゼ及びヒアルロナーゼ等の酵素の含有物のすべてが、本発明のさらなる実施形態であり、決して限定するものではないと理解される。
【００４３】
磁性粒子、ガラスビーズ又はそれら双方の組み合わせが本発明から出発することなく破砕に使用され得ると理解される。１実施例においては、磁性粒子は、鉄酸化物から形成される。１実施例において、粒子は、４０−２００ｎｍのサイズ範囲内にある。粒子は、超音波力を使用して加速され得るし、試料を破断し得る。１実施例においては、ガラスビーズは、胞子の効率的な溶解のための抽出混合物において使用される。
【００４４】
１実施例において、核酸分子を放出するのに用いられる機械的力は音波振動である。当該音波振動は、保護的緩衝液において懸濁されたフラグメントの容器を、音波振動のソースに接触せしめることによって達成される。かかるソースは、超音波振動子又は交流電圧により活性化されるピエゾ電気的水晶であり得る。かかるデバイスは、当業者には周知のものである。剪断周波数は、１００００Ｈｚから１０ＭＨｚまで、望ましくは、２０ＫＨｚから４ＭＨｚまで、及び望ましくは２０ＫＨｚから４０ＫＨｚまでであり得る。例えば、胞子等、保護された核酸分子試料の剪断を促進するために、小なるビーズは試料に添加され得る。音波によって誘起されたビーズの運動は、胞子の壁を破壊して、そこに含まれる核酸分子を放出せしめる。ビーズのサイズは、約１ミクロンから約１ｍｍまで、望ましくは約１０ミクロンから約５００ミクロンまで及び最も望ましくは約５０ミクロンから約２００ミクロンまでの範囲内にあり得る。ビーズは、例えば、ステンレス等の金属、ガラス、又はジルコニウム酸化物等の高密度金属酸化物であり得る。核酸分子を剪断するのに必要とされる時間は、部分的には、試料のサイズ及び試料からトランスデューサまで伝送された出力に依存する。しかしながら、剪断された試料が、保護的な緩衝液の成分に依存する定常状態に達するとき、さらなる超音波処理によって、核酸分子のサイズ分布において更なる変化はない。実際、１５秒から２分の超音波処理時間は、１ワットから２ワットの出力レベルにおいて、１マイクログラムの核酸分子のバッファを含む１００ｕｌの試料サイズにおいて、定常状態に至らしめるのに十分である。
【００４５】
別の実施例では、試料の準備処理は、試料の劣化を防ぐためのＲＮアーゼ阻害剤の添加をさらに含む。１実施例においては、試料の準備処理は、ジエチルピロカルボン酸（ＤＥＰＣ：ｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ：ethylene diamine tetraacetic acid）、プロテナーゼＫ又はそれらの組合せを含む。
【００４６】
別の実施例では、サイズ安定装置の存在はリボ核酸をも安定せしめる。ＳＤＳ及びグアニジニウムチオシアン酸塩は、試料内のＲＮＡｓｅｓを破砕せしめて、ＲＮＡを保護する。
【００４７】
１実施例において、磁性ナノ粒子は、マグネタイトナノ粒子である。マグネタイト粒子は、性質において一般的であり、磁石を用いてスクリーニングすることによって、海辺の海砂から収集され得る。これら粒子を研摩すると、比較的粗い磁性粉末が生成されるであろう。より小なるサイズの粒子は、混合された第二鉄塩化物及び第一鉄塩化物の溶液を、ナトリウム若しくは水酸化アンモニウムの攪拌された水溶性アルカリ性水溶液に添加することによって、製造され得る。より小なるサイズの粒子は、ヘキサデカンジオール、オレイルアミン及びオレイン酸の存在下において、ジベンジルエーテルにおける鉄アセトニルアセトナートの熱分解によって生成される。マグネタイトを製造する多数の方法が、知られている。例えば、Sun他は、混合された第二鉄塩化物及び第一鉄塩化物の混合物を、攪拌アンモニアにゆっくりと添加するステップを開示している（Langmuir, 2009, 25 (10), pp 5969-5973.）。米国特許第4,698,302号において、第二鉄塩化物及び第一鉄塩化物を水酸化ナトリウムに混合するステップが教唆されている。Samanta他は、不活性雰囲気においてアンモニアを第二鉄塩化物及び第一鉄塩化物に添加するステップを開示している（Journal of Materials Chemistry, 2008, 18, 1204-1208.）。Ｄｕａｎ他は、マグネタイトナノ粒子を形成する錯体を形成するために、３００℃まで加熱して、オレイン酸における酸化鉄を溶解するステップを教唆している（J. Phys. nucleic acid molecule Chem.C, 2008, 112 (22), pp 8127-8131.）。さらに、Yin他は、オレイン酸の存在下において、鉄カルボニルを熱的に分解するステップを開示している（Journal of Materials Research, 2004, 19, 1208-1215.）。
【００４８】
多くのタイプの試料が、試料を破壊せしめて、核酸分子を放出するために、機械的力を印加することによって処理され得る。試料準備処理は、液体、固体、土壌試料、動物組織、昆虫骨組、ＤＮＡ、バクテリア細胞、胞子、及びウイルスにおける使用において、適切である。図３に示されているように、いくつかの異種の試料が、同じパラメータを用いて処理された。精製されたＤＮＡ、バクテリア細胞、胞子、ウイルス、およびショウジョウバエの試料のすべてが、以下の方法を使用して処理された。各試料は、磁性ナノ粒子及び１００ミクロンのガラスビーズが存在下において、２分間超音波処理にかけられた。図３に示されているように、すべてのタイプの試料において、類似のフラグメント分布が得られた。
【００４９】
さまざまなタイプの試料を使用できるので、準備処理を変更することなく、広範な種々のターゲット有機体を用いて、単一のシステムが使用され得る。その上、試料が２つの異なるターゲットを含む場合であっても、核酸分子は、双方の組成成分から精製され得る。
【００５０】
試料準備システムは少量で動作し、分析のための核酸分子フラグメントについて狭小な分布を提供する。任意で、準備システムは、剪断力を印加する前に、試料にフィルタをかけるステップを通過する。
【００５１】
図３は、この処理過程を使用して、広範な異なる試料からの核酸分子が、同じ電力レベルと処理時間の超音波処理によって処理されて、同一のフラグメントサイズ分布が与えられ得ることを示している。
【００５２】
１実施例においては、処理は、核酸分子を洗浄するのに必要なステップをさらに含む。核酸分子の放出後、及び、核酸分子を有益なサイズ範囲にまで剪断するステップの後、細胞破片からの核酸分子、タンパク質、超音波処理ビーズ及び保護緩衝液を洗浄して、その後の核酸分子の操作及び処理手順に適応する緩衝液において、精製された核酸分子溶液が提供されることは、有利な点である。
【００５３】
１実施例においては、磁石が、磁場を生成するのに利用される。磁石は、磁性粒子を引き寄せ又は押し得る。磁石は、あらゆる磁性粒子をも誘導することによって、磁性粒子を凝集せしめ又は拡散処理の速度を高めることができる。
【００５４】
１実施例においては、磁性ナノ粒子は、ターゲット分析物とともに、サンプルチャンバに設けられる。磁性ナノ粒子は、ターゲット分析物に対して親和性を有する。磁性ナノ粒子をターゲット分析物質に付着させ磁場を印加することによって、ターゲット分析物はサンプルチャンバ内の所望の位置に移動される。
【００５５】
１実施例においては、ターゲット分析物フラグメント及び磁性ナノ粒子を有する溶液で沈殿緩衝液は、ターゲット分析物質を溶液から沈殿せしめ、そして、ターゲット分析物質は磁性ナノ粒子に引きつけられる。沈殿緩衝液は、ターゲット分析物質を溶液から沈殿せしめるいかなる緩衝液でもあり得る。タンパク質に対しては、沈殿緩衝液は、例えば、硫酸アンモニウム、三塩化酢酸、アセトン又はクロロホルムとメタノールの混合物等の有機沈澱剤を含むがこれらに限定されない。ＤＮＡ等の核酸分子に対しては、適切な沈殿緩衝液は、水溶性有機溶剤、アセトン、ジオキサン及びテトラヒドロフランを含むがこれらに限定されない。沈殿緩衝液の実施例が与えられているものの、本願の特許請求の範囲に記載された発明から逸脱することなく、いかなる適切な沈殿緩衝液をも利用され得ることが理解される。
【００５６】
別の実施例では、磁性ナノ粒子は、超常磁性粒子を含む。超常磁性粒子は鉄酸化物等の金属酸化物を含む。好ましい鉄酸化物はマグネタイト（ＦｅａＣＵ）である。
【００５７】
一旦、試料が溶解されると、核酸分子は、試料のリマインダから磁気的に分離され得る。核酸分子は磁性ナノ粒子に結合する。１実施例においては、結合は高塩類／アルコール条件下で生じ、クエン酸ナトリウム等の低塩キレート化バッファを使用することで、高温で溶離される。１実施例においては、試料は、溶出から生成物を増加せしめるために、少なくとも６００℃まで加熱される。
【００５８】
一旦、磁性ナノ粒子がターゲット分析物質に付着されると、磁場が反応チャンバに印加される。磁場の印加によって、磁性ナノ粒子及び付着されたあらゆるターゲット分析物質は、反応チャンバの一部分に集中せしめられる。試料は、試料チャンバの高濃度領域から引き抜かれて、抽出された体積量と同程度の大量なターゲット分析物質が提供される。試料を凝縮することによって、より敏感な試験が実行され得る。
【００５９】
別の実施例では、残存する試料がチャンバから除去されるので、磁場は磁性ナノ粒子を安定な状態に維持する。磁性ナノ粒子とターゲット分析物質との結合力は、ターゲット分析物質が除去されることを防止するのに、十分である。
【００６０】
１実施例においては、分散化した磁性ナノ粒子が試料に添加される。混合物は、結合を促進するために約６００℃で培養される。沈殿緩衝液は、混合物に添加される。核酸分子及びマグネタイトの結合された合成体は、磁場中で収集される。１実施例においては、合成体は容器の側壁で収集される。よって、結合されていないあらゆる固体が、除去の容易にせしめるために、容器の底まで落下し得る。緩衝液及び結合されていない固体が、試料から除去される。
【００６１】
任意で、さらなる洗浄ステップが、サンプルを精製するために使用される。洗浄は、核酸分子の結合を抑制するであろう化合物を除去する。合成体は、付加的沈殿緩衝液、又は、合成体を阻害しない洗浄緩衝液を用いて洗浄され得る。洗浄後、緩衝液は合成体から排出されて、精製され且つ凝縮した試料が得られる。
【００６２】
適切な結合性緩衝液が、溶液に任意に添加される。核酸分子／マグネタイト合成物に対する結合性緩衝液は、概ね、核酸分子が不溶である緩衝液である。核酸分子の沈殿は、マグネタイト粒子に対する核酸分子の結合を促進する。核酸分子及びマグネタイト合成物に対する結合性緩衝液は、水、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化リチウム、酢酸アンモニウム、塩化マグネシウム、エタノール、プロパノール、ブタノール、グリコーゲン若しくは他の糖類、ポリアクリルアミド又はそれの混合物を含み得る。１実施例においては、結合性緩衝液はイソプロパノールである。グネタイト粒子に対する核酸分子の結合は、瞬時的ではない。１実施例においては、混合物は、結合処理を促進せしめるために、室温より高温で培養される。
【００６３】
核酸分子の更なる処理のために、いくつかの処理において、マグネタイト粒子を除去する必要がある。１実施例において、核酸分子は、溶出緩衝液とその合成体の混合物を９５℃まで加熱することによって、核酸分子及びマグネタイトの合成体から溶出される。マグネタイトは、磁場又は遠心沈殿により収集されて、精製された核酸分子が溶出緩衝液において提供される。１実施例において、溶出緩衝液は、鉄酸化物表面と強く相互作用する塩類を含む。好ましい緩衝液は、リン酸塩水溶液及びクエン酸塩水溶液である。
【００６４】
実施例
実施例１
超音波処理ビーズ破粋
胞子が準備され、胞子形成媒体＋からの枯草菌から分離された。培養液から取られた胞子の１００μｌ既知少量に対して、等容積である０．１ｍｍのガラスビーズが、マイクロフュージチューブ内に添加された。マイクロフュージチューブの先は、ブランソン超音波処理器のソケットに、載置された。２の出力設定を使用して、チューブ内のビーズは、２分間、激しく動かされた。その後、グラム染色は、胞子のうちの９０％以上がこの処理によって破粋されたことを示した。これは、この処理を生存した胞子から形成されたコロニーを計数することによって、プレーティング分析を用いて確認された。放出されたＤＮＡの量に関する推定が、既知少量の溶解物を、１ｍｇ／ｍｌのエチジウム臭素を含む１％のアガロースゲルの表面に対して染みつけることによって、得られた。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｆｌｕｏｒ−Ｓイメージャは、ゲル表面で染みなって周知の標準量ＤＮＡに対する試料蛍光の強度を比較した。この技術を使用して、約１０ｎｇのＤＮＡが、２．５×１０5の胞子から分離され得る。
【００６５】
実施例２
生体組織試料
図４に示すように、診断試料のために、牛の耳の生体組織を使用するアプローチが、評価された。耳の生体組織は、評価するために、多くの場合、牛から取られ、皮膚、髪、大量の軟骨量を有し、血液が豊富である。直径約３ｍｍの耳栓に対して試験が行われた。約１マイクログラムの核酸分子のロバスト試料が、超音波処理及び４０ｎｍのフェライト粒子を使用して、耳栓から分離された。核酸分子は、予想されたサイズ範囲内にあった。ガラスビーズが、生体組織からの抽出のために必要とされなかった。ビーズ破砕を用いた耳栓の後処理によって、さらなる核酸分子は抽出されなかった。超音波処理の出力及び時間設定は、先の実施例で使用されたものと同じであった。
【００６６】
実施例３
土壌で汚染された試料
図５に示されているように、複雑な試料を評価するためには、土壌に混合された細菌性試料及び胞子試料が処理された。土壌は、ＰＣＲベースのシステムを抑制することが知られた複合培地である。土壌は、６つのショウジョウバエを含む試料に添加された。ハエが、マラリア等の疾病を運ぶと評価され得る昆虫を代表するものと意図されている。最大３２ミリグラムの土壌が、１ミリリットルの試料あたり添加された。ショウジョウバエは、フェライト粒子の存在下で二分間、超音波処理を使用して破砕された。ＤＮＡ及びＲＮＡは、エタノールを添加したフェライト粒子を使用して得られた。粒子は、磁気的に収集され、汚染物を除去するために緩衝液及びエタノールを用いて洗浄され、そして、磁性を用いて凝集された。核酸分子は、９００℃のハイブリダイゼーション用緩衝液において溶離されて、ＤＮＡの要素が変性された。最小量の損失が、試料の土壌レベルが１００マイクロリットル当たり３２ミリグラム（レーン８）に達するまで、観測された。ここで、溶液は粘着性になり、粒子運動は、現行の試験条件下では困難である。破粋パワーを増大させ、溶液を変更し、破粋粒子サイズ及び特性を変更することによって、結果は、極端に汚染された試料に対して最適化され得ることが理解される。
【００６７】
実施例４
マグネタイトクラスタの準備
塩化第２鉄（０．８Ｍ）、塩化第１鉄（０．４Ｍ）及び塩酸（０．４Ｍ）からなる第１溶液が、混合されて、０．２ミクロンのフィルタにかけられた。第２溶液は、水を有する７２ｍｌの水酸化アンモニウム（３０％）が１リットルとなるように準備された。
【００６８】
１ｍｌの塩化第２鉄／塩化第１鉄溶液が、２０ｍｌのアンモニウム水酸化物水溶液を攪拌するのに、添加された。攪拌は、１５秒継続された。（２０ｍｌの小びんの）溶液は、強磁石上に載置され、１分間、置かれた。その後に、すべての生成物が、小びんの下部に引っ張られた。透明な上澄液が、静かに注がれ、水と置換され、混ぜられ、磁石の近くで載置された。再び、生成物は、小びんの下部に引っ張れた。この処理は、残留アンモニウム及び鉄塩が全くない生成物を洗浄するために、３回繰り返された。小びんは、２０ｍｌの水で満たされて、５分間、４ワットの出力にて、超音波処理された。懸濁液は、１ミクロンのガラスろ過器を介してフィルタにかけられ、マグネタイト粒子の安定懸濁液が得られた。マグネタイト粒子は、磁場又は遠心沈殿によって引き下げられるまで懸濁液に残存する。
【００６９】
実施例５
磁性粒子の付着
核酸分子は、ショウジョウバエから精製され、フェライト粒子で溶解された。それに続いて、磁気的な分離及び溶出処理が実行された。磁気ヘッドは９０％より大なる利用可能な核酸分子を捕らえた。
【００７０】
実施例６
複雑な試料からのＤＮＡ
バシラス細胞が、牛の耳の生体組織又はショウジョウバエと混合された。混合物は、試料準備処理を介して得られた。得られた核酸は、センサーチップで観察するために混成された。チップは、混成されたＤＮＡを検出するために、ＹＯＹＯ−Ｉ色素を用いて処理された。細胞における標的ＤＮＡ配列は、別々に処理されたバシラス細胞と同程度のレベルにて、センサーチップに混成された。バシラス細胞のいない負の制御は、混成されたＤＮＡを全く示さなかった。実験は、試料に添加された上述の土壌を用いて繰り返された。少なくとも６０％の混成を残す混成効率が、真核生物細胞及び土壌がない試料において示した。
【００７１】
実施例７
粒子を流液で洗浄する
磁性粒子は、ＤＮＡに結合され、２ｍｍの直径を有する透明なプラスチック容器に導入された溶液に結合された。磁石は、チューブの中心下で載置された。洗浄緩衝液は、シリンジポンプを使用してチューブに押し込められた。粒子は、洗浄を介して、見たところ、その場所に留まった。洗浄後、磁石が除去され、粒子は、チューブから洗浄。ＤＮＡが高温にて溶出されゲル上で動かされた。顕著なＤＮＡの損失は観測されなかった。
【００７２】
実施例８
磁性粒子の結合効率と放出
放射性標識化ＤＮＡが、フェライトに対する結合効率及び核酸分子の放出を判定するために、使用された。マグネタイト懸濁液及び３つの容積のエタノールを有する放射性標識化ＤＮＡは、混合された。マグネタイトは、磁石を使用して、チューブ下部に引き付けられた。上澄み液が、ペレットから除去された。両方の断片が、シンチレーション計数器では、計数された。上澄みは７７０ｃｐｍを含み、再懸濁液されたペレットは19330cpmを含んだ。したがって、放射性標識化ＤＮＡの約９０％が、フェライトに結合された。
【００７３】
実施例９
核酸分子の放出
放射性標識化ＤＮＡが使用されて、フェライトに対する結合効率と核酸分子の放出が決定された。磁性懸濁溶液及び３つの容積のエタノールを有する放射性標識化ＤＮＡが、混合された。マグネタイトは、磁石を使用して、チューブ下部に引き付けられた。上澄み液が、ペレットから除去された。両方の断片が、シンチレーション計数器では、計数された。結合は、混合物のエタノールの成分の関数として、測定された。結果が図６に示されている。
【００７４】
放出効率を判定するために、結合されたＤＮＡペレットが、以下で表に示されるように、１００μｌの緩衝液において懸濁され、１０分間、９５℃にて培養され、磁石で収集された。上澄み液が、ペレットから除去され、双方が計数された。
【００７５】
【表２】
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【００７６】
実施例１０
複雑な試料からのＤＮＡ
ＢＧ細胞が、牛の耳の生体組織又はショウジョウバエと混合された。混合物は、試料準備処理を介された。得られた核酸は、センサーチップで観察するために混成された。チップは、混成されたＤＮＡを検出するために、ＹＯＹＯ−Ｉ色素を用いて処理された。細胞における標的ＤＮＡ配列は、別々に処理されたバシラス細胞と同程度のレベルにて、センサーチップに混成された。ＢＧのいない負の制御は、混成されたＤＮＡを全く示さなかった。実験は、試料に添加された上述の土壌を用いて繰り返された。少なくとも６０％の混成を残す混成効率が、真核生物細胞及び土壌がない試料において示した。
【００７７】
実施例１１
３つのショウジョウバエが、２つの１．５ｍｌのエッペンドルフチューブの各々に載置された。一方は、１０ＯｍＭのＴＲＩＳヒドロクロリド(pH7.5)、１．５％のデキストラン硫酸及び０．２％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）からなる１００マイクロリットルの混合物を用いて搭載された。もう一方は、１００マイクロリットルのイソプロピルアルコール及び１００マイクロリットルの２０％ドデシル硫酸が搭載された。双方のチューブは、１０μｌの０．６％マグネタイトナノ粒子を搭載された。双方のチューブは、２０ｋＨｚにて、４５秒間（２ワット）、超音波処理された。そして、１ｍｌのイソプロピルアルコールが、第１のチューブに添加された。１／２ミリリットルのイソプロピルアルコールが、第２のチューブに添加された。磁気ペレットは、永久磁石により収集され、静かに注がれた上澄み液尾帯50μlの１００ｍＭリン酸水素ナトリウムが、各チューブに添加された、ピペットは、反復性ピペットによって再懸濁し、９５℃にて２分間培養された。ペレットは、磁石により再び収集された。溶離されたＤＮＡは、TEA緩衝液において、７７ボルトで１％のアガロースゲル上で動かされた。ＤＮＡのラダーも、ゲル上で動かされた。
【００７８】
図７に示されているように、ゲルは、エチジウム臭素により染み付けられ、３０２ｎｍの励起及び６１０ｎｍのフィルタを用いてカメラで撮像された。精製されたＤＮＡは写真で明確に目に見えるものでる。最上部のレーンは第２のチューブを表している。中央のレーンは第１のチューブを表している。最下部のレーンは、ＤＮＡのラダーを表している。
【００７９】
実施例１２
４つのチューブの各々が、３つのショウジョウバエ、１００マイクロリットルの緩衝液及び１０μｌの０．６％マグネタイトナノ粒子を有し、３０秒間、５ワットで、２ＯｋＨｚで超音波処理された。図８に示すように、ＤＮＡは、実施例１１と同様に、収集され、溶離され、ゲルにおいて作用され、染み付けされ及び撮像された。４つの緩衝液は、下記の通りであった。
【００８０】
1.１００ｍｍのＴＲＩＳ、１．５％のデキストラン硫酸及び０．２％のＳＤＳ
2.イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）
3.９０％のＩＰＡ、１％のドデシルベンゼン硫酸、９％の水
4.９０％のＩＰＡ、１％のポリアクリル酸ナプタラム、９％の水
実施例１３
酵母、草及びブルーベリーの一部が、１０ＯｍＭのＴＲＩＳにおいて超音波処理された、
実施例１１と同様に、１．５％のデキストラン硫酸及び０．２％のＳＤＳ。精製、ゲル及び写真が実施例１１と同様に得られ、図９に示されている。
【００８１】
実施例１４
３つの１．５ｍｌのエッペンドルフチューブの各々は、約１００億の大腸菌細胞及び（直径約１００ミクロンの）３０ｍｇのガラスビーズ及び４０マイクロリットルの０．５モルリン酸ナトリウムｐＨ７．５を含み、４ｍｍの音波のチップをチューブ内に挿入して、４０ｋＨｚ、１０％の振幅で、１５秒間、３０秒間及び６０秒間、超音波処理された。精製、ゲル及び写真が、実施例１１と同様に行われ、図１０に示されている。
【００８２】
この例は、長時間の超音波処理時間がサイズ分布を変化せしめないこと、すなわち、定常状態条件が適用されることを示している。
【００８３】
実施例１５
この実施例では、２つの標準方法を使用して、ＤＮＡは、容積が増大したバクテリア細胞培養から回復される。当該２つの標準方法は、ＤＮＡ回復のための市販のＱｉａｇｅｎキット及び教本のＰｈｅｎｏｌ／クロロホルム法である。これらは、緩衝液として０．２％のＳＤＳと０．５Ｍのリン酸ナトリウムを使用して、実施例１１における方法と比較された。結果が図１１に示されている。
【００８４】
グラフは、本発明の方法はＱｉａｇｅｎキットとフェノール／クロロホルム法の双方よりも優れていることを示している。
本発明について特定の実施例を参照して説明してきたものの、当業者であれば、本願発明の範囲から逸脱しないで、種々の変更がなされ得るし、均等物が変更後の要素に置換され得ることを容易に理解できるであろう。さらに、本発明の範囲から逸脱することなく、特定の状況若しくは物質が本発明の教唆に適合するように、多くの変更がなされ得る。
【００８５】
したがって、本発明は、本発明を実施するために想定されたベストモードとして開示された特定の実施形態に限定されるべきではなく、本発明は、添付した特許請求の範囲に記載された発明の範囲及び趣旨の範囲内にあるすべての実施形態を含むことを、意図している。
【国際調査報告】
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