【手続補正書】
【提出日】令和2年3月13日(2020.3.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a. 9から14の範囲のpHを有する水溶液での処理によって細胞外小胞またはオルガネラを開口させ、膜を得る工程；
b. 小胞内内容物またはオルガネラ内容物を取り除く工程；および
c. 該膜を再構成し、細胞由来の小胞を形成する工程
を含む、細胞由来の小胞を作製するための方法。
【請求項２】
工程cが、超音波処理、機械的振動、多孔質膜を通しての押し出し、電流、およびそれらの組み合わせの1つまたは複数によって行われる、請求項1記載の方法。
【請求項３】
d.前記細胞由来の小胞内にカーゴを搭載する工程
をさらに含み、
工程dを工程cと同時にまたはその後に実施することができる、
請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
工程dが工程cの後に物理的操作によって行われ、該物理的操作が、エレクトロポレーション、超音波処理、機械的振動、多孔質膜を通しての押し出し、電流の印加、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項3記載の方法。
【請求項５】
前記カーゴが、合成生理活性化合物、天然生理活性化合物、抗菌化合物、抗ウイルス化合物、タンパク質、ヌクレオチド、ゲノム編集システム、マイクロRNA、siRNA、長鎖非コードRNA、アンタゴmir（抗miR）、モルホリノ、mRNA、t-RNA、y-RNA、RNA模倣体、DNA、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項3または4記載の方法。
【請求項６】
前記ゲノム編集システムがCRISPRシステムである、請求項5記載の方法。
【請求項７】
前記細胞由来の小胞が、それから該細胞由来の小胞が産生される細胞外小胞またはオルガネラと比較して異なる少なくとも1つの生理学的特性を有し、該少なくとも1つの異なる生理学的特性が、生体内分布、細胞取り込み、半減期、薬物力学、効力、用量、免疫反応、搭載効率、安定性、または他の化合物との反応性の1つまたは複数に関連する、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも1つの異なる生理学的特性が、細胞由来の小胞へのカーゴの改善された搭載、改善された標的指向性効率、改善された送達、またはレシピエント細胞、器官、もしくは対象への治療用カーゴの増大である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
前記細胞外小胞が、細胞外小胞バルクに由来する細胞外小胞の亜集団であるか、または前記オルガネラが、複数のオルガネラに由来するオルガネラの1つのサブタイプである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
エピトープ特異的結合体を前記細胞外小胞バルクまたは複数のオルガネラと接触させる工程；および
該細胞外小胞バルクまたは複数のオルガネラから、それぞれ前記細胞外小胞の亜集団またはオルガネラのサブタイプを分離する工程
を、工程aの前にさらに含む、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
前記エピトープ特異的結合体が、抗体、ファージ、またはアプタマーである、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
前記エピトープ特異的結合体が、少なくとも1つのミトコンドリア膜タンパク質、好ましくはMTCO2タンパク質に対する抗体、またはCD63に対する抗体である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
天然の小胞内内容物または天然のオルガネラ内容物の低減された量を含む、細胞由来の小胞。
【請求項１４】
カーゴが搭載されている、請求項13記載の細胞由来の小胞。
【請求項１５】
前記カーゴが、合成生理活性化合物、天然生理活性化合物、抗菌化合物、抗ウイルス化合物、タンパク質、ヌクレオチド、ゲノム編集システム、マイクロRNA、siRNA、長鎖非コードRNA、アンタゴ-miR、モルホリノ、mRNA、t-RNA、y-RNA、RNA模倣体、DNA、またはそれらの組み合わせを含む、請求項14記載の細胞由来の小胞。
【請求項１６】
前記カーゴが、（i）ATPの産生を触媒する酵素、（ii）間葉系幹細胞の遊走または抗炎症性機能を増大させるなど、間葉系幹細胞の表現型および/または機能に影響を与える能力を伴う化合物、（iii）抗炎症性機能に関連する化合物、（iv）炎症促進性機能に関連する化合物、または（v）それらの組み合わせを含む、請求項14または15記載の細胞由来の小胞。
【請求項１７】
請求項1〜12のいずれか一項に定義された方法によって得ることができる、請求項13〜16のいずれか一項記載の細胞由来の小胞。
【請求項１８】
治療で使用するための、請求項13〜17のいずれか一項記載の細胞由来の小胞。
【請求項１９】
エピトープ特異的結合体を細胞外小胞バルクと接触させる工程；および
該細胞外小胞バルクから細胞外小胞の亜集団を分離する工程
を含む、細胞外小胞バルクから細胞外小胞の亜集団を分離する方法。
【請求項２０】
前記エピトープ特異的結合体が、抗体、ファージ、またはアプタマーである、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
前記エピトープ特異的結合体が、少なくとも1つのミトコンドリア膜タンパク質、好ましくはMTCO2タンパク質に対する抗体、またはCD63に対する抗体である、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞外小胞の亜集団が、前記細胞外小胞バルクと比較して減少したRNA量を有する、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
治療で使用するための、請求項19〜22のいずれか一項によって作製された細胞外小胞の亜集団。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
これらおよび他の課題は、本開示から当業者には明らかであり、添付の特許請求の範囲に記載しかつ本明細書において概して開示するようなさまざまな局面によって対処される。
[本発明1001]
a. 細胞外小胞またはオルガネラを提供する工程；
b. 9から14の範囲のpHを有する水溶液での処理によって該細胞外小胞または該オルガネラを開口させ、膜を得る工程；
c. 小胞内内容物またはオルガネラ内容物を取り除く工程；および
d. 該膜を再構成し、膜小胞を形成する工程
を含む、膜小胞を作製するための方法。
[本発明1002]
工程dが、超音波処理、機械的振動、多孔質膜を通しての押し出し、電流、およびそれらの組み合わせの1つまたは複数によって行われる、本発明1001の方法。
[本発明1003]
e.前記膜小胞内にカーゴを搭載する工程
をさらに含み、
工程eを工程dと同時にまたはその後に実施することができる、
本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
工程eが工程dの後に物理的操作によって行われ、該物理的操作が、エレクトロポレーション、超音波処理、機械的振動、多孔質膜を通しての押し出し、電流の印加、およびそれらの組み合わせから選択される、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記カーゴが、合成生理活性化合物、天然生理活性化合物、抗菌化合物、抗ウイルス化合物、タンパク質、ヌクレオチド、ゲノム編集システム、マイクロRNA、siRNA、長鎖非コードRNA、アンタゴ-miR、モルホリノ、mRNA、t-RNA、y-RNA、RNA模倣体、DNA、およびそれらの組み合わせから選択される、本発明1003または1004の方法。
[本発明1006]
前記カーゴがTGFβである、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記ゲノム編集システムがCRISPRシステムである、本発明1005の方法。
[本発明1008]
前記CRISPRシステムがCRISPR-Cas9システムである、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記マイクロRNAまたは前記siRNAが、変異したがん遺伝子または未変異のがん遺伝子をコードする転写物に特異的に結合する、本発明1005の方法。
[本発明1010]
前記がん遺伝子が、KRAS G12D、KRAS G12C、KRASG12V、N-Myc、c-Myc、またはL-Mycである、本発明1009の方法。
[本発明1011]
前記膜小胞が、該膜小胞が由来する細胞外小胞またはオルガネラの集団と異なる少なくとも1つの生理学的特性を有し、該生理学的特性が、生体内分布、細胞取り込み、半減期、薬物力学、効力、用量、免疫反応、搭載効率、安定性、または他の化合物との反応性の1つまたは複数に関連する、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記異なる生理学的特性が、改善された標的指向性効率、改善された送達、またはレシピエント細胞、器官、もしくは対象への治療用カーゴの増大である、本発明1011の方法。
[本発明1013]
前記カーゴが、前記膜小胞が由来する細胞外小胞またはオルガネラ内へ該カーゴが搭載される場合より効率的に該膜小胞内に搭載される、本発明1003〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記細胞外小胞が、細胞外小胞バルクに由来する細胞外小胞の亜集団であるか、または前記オルガネラが、複数のオルガネラに由来するオルガネラの1つのサブタイプである、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1015]
エピトープ特異的結合体を前記細胞外小胞バルクまたは前記オルガネラと接触させる工程；および
該細胞外小胞バルクまたは複数のオルガネラから、前記細胞外小胞の亜集団またはオルガネラのサブタイプを分離する工程
を、工程aの前にさらに含む、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記エピトープ特異的結合体が、抗体、ファージ、またはアプタマーである、本発明1015の方法。
[本発明1017]
前記エピトープ特異的結合体が、少なくとも1つのミトコンドリア膜タンパク質、好ましくはMTCO2タンパク質に対する抗体である、本発明1016の方法。
[本発明1018]
前記エピトープ特異的結合体が表面マーカーCD63に対する抗体である、本発明1016の方法。
[本発明1019]
細胞外小胞またはオルガネラに由来する膜から形成された小胞
を含む、治療用膜小胞。
[本発明1020]
治療用カーゴを搭載する、本発明1019の治療用膜小胞。
[本発明1021]
前記治療用カーゴが、合成生理活性化合物、天然生理活性化合物、抗菌化合物、抗ウイルス化合物、タンパク質、ヌクレオチド、ゲノム編集システム、マイクロRNA、siRNA、長鎖非コードRNA、アンタゴ-miR、モルホリノ、mRNA、t-RNA、y-RNA、RNA模倣体、DNA、およびそれらの組み合わせから選択される1つまたは複数の治療用化合物を含む、本発明1020の治療用膜小胞。
[本発明1022]
前記治療用カーゴが、ATPの産生を触媒する酵素を含む、本発明1020または1021の治療用膜小胞。
[本発明1023]
前記酵素がATP合成酵素である、本発明1022の治療用膜小胞。
[本発明1024]
前記治療用カーゴが、間葉系幹細胞の遊走または抗炎症性機能を増大させるなど、間葉系幹細胞の表現型および/または機能に影響を与える能力を伴う化合物を含む、本発明1020または1021の治療用膜小胞。
[本発明1025]
前記治療用カーゴが、抗炎症性機能に関連する化合物または炎症促進性機能に関連する化合物を含む、本発明1020または1021の治療用膜小胞。
[本発明1026]
前記治療用カーゴがTGFβである、本発明1024または1025の治療用膜小胞。
[本発明1027]
前記治療用カーゴがゲノム編集システムを含む、本発明1020または1021の治療用膜小胞。
[本発明1028]
ゲノム編集システムがCRISPRシステムである、本発明1027の治療用膜小胞。
[本発明1029]
CRISPRシステムがCRISPR-Cas9システムである、本発明1028の治療用膜小胞。
[本発明1030]
前記カーゴが、前記膜小胞が由来する細胞外小胞またはオルガネラ内へ該カーゴが搭載される場合より効率的に該膜小胞内に搭載される、本発明1020〜1029のいずれかの治療用膜小胞。
[本発明1031]
前記細胞外小胞が、細胞外小胞バルクとは異なる膜および表面分子のサブセットを有する細胞外小胞バルクの亜集団であるか、または前記オルガネラが、オルガネラバルクとは異なる膜および表面分子のサブセットを有するオルガネラバルクの1つのサブタイプである、本発明1019〜1030のいずれかの治療用膜小胞。
[本発明1032]
前記膜小胞が、以下の少なくとも1つによって特徴付けられる、本発明1031の治療用膜小胞：
i. 表面膜分子が反転している；
ii. 間葉系幹細胞の抗炎症性機能が増大するように間葉系幹細胞の表現型および機能に影響を与える能力を伴う、少なくとも1種類の表面分子；
iii. 細胞外小胞に共通する少なくとも1種類の表面マーカーが存在するかまたは存在しないかのいずれか；
iv. 少なくとも1種類のミトコンドリア膜表面分子が存在する；
v. 少なくとも1種類の核膜表面分子が存在する；ならびに
vi.ゴルジおよび/または小胞体由来の少なくとも1種類の膜分子が存在する。
[本発明1033]
組織を通って遊走する能力を有する、本発明1019〜1032のいずれかの治療用膜小胞。
[本発明1034]
前記膜小胞が由来する細胞外小胞またはオルガネラと比較して、増大した運動性を有する、本発明1019〜1033のいずれかの治療用膜小胞。
[本発明1035]
前記細胞外小胞またはオルガネラが、がん細胞、がん細胞株、炎症細胞、構造細胞、神経/グリア細胞/オリゴデンドロサイト、または間葉系/胚性幹細胞に起源をもつ、本発明1019〜1034のいずれかの治療用膜小胞。
[本発明1036]
前記細胞外小胞またはオルガネラが、腫瘍；骨髄；または血液、リンパ節、もしくは脾臓から単離された免疫細胞を含む、正常組織または病変組織から単離されている、本発明1019〜1035のいずれかの治療用膜小胞。
[本発明1037]
本発明1001〜1018のいずれかに定義された方法によって得ることができる、本発明1019〜1036のいずれかの治療用膜小胞。
[本発明1038]
治療で使用するための、本発明1019〜1037のいずれかの治療用膜小胞。
[本発明1039]
代謝障害の処置で使用するための、本発明1019〜1038のいずれかの治療用膜小胞。
[本発明1040]
本発明1019〜1039のいずれかの治療用膜小胞をその必要がある患者に投与する工程を含む、代謝障害を処置する方法。
[本発明1041]
前記治療用カーゴを標的に向けて送達するための、本発明1020〜1040のいずれかの治療用膜小胞の使用。
[本発明1042]
エピトープ特異的結合体を細胞外小胞バルクと接触させる工程；および
該細胞外小胞バルクから細胞外小胞の亜集団を分離する工程
を含む、細胞外小胞バルクから細胞外小胞の亜集団を分離する方法。
[本発明1043]
前記エピトープ特異的結合体が、抗体、ファージ、またはアプタマーである、本発明1042の方法。
[本発明1044]
前記エピトープ特異的結合体が、少なくとも1つのミトコンドリア膜タンパク質、好ましくはMTCO2タンパク質に対する抗体である、本発明1043の方法。
[本発明1045]
前記エピトープ特異的結合体がCD63に対する抗体である、本発明1043の方法。
[本発明1046]
前記細胞外小胞の亜集団が、前記細胞外小胞バルクと比較して減少したRNA量を有する、本発明1045の方法。
[本発明1047]
治療で使用するための、本発明1042〜1046のいずれかによって作製された細胞外小胞の亜集団。
[本発明1048]
代謝障害の処置で使用するための、本発明1042〜1046のいずれかによって作製された細胞外小胞の亜集団。