【手続補正書】
【提出日】令和2年9月15日(2020.9.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載の発明。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
本開示の他の利点および新規な特徴は、添付の図面とともに考慮される場合に、本発明の種々の非限定的実施形態の以下の詳細な説明から明らかになる。本明細書および参考として援用される文献が矛盾するおよび／または一致しない開示を含む場合には、本明細書が優先するものとする。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
分析用の核酸を調製する方法であって、該方法は、
（ａ）１またはこれより多くのヌクレオチドを、標的ヌクレオチド配列を含む２本鎖核酸の３’末端に付加する工程であって、ここで該１またはこれより多くのヌクレオチドのうちの少なくとも１個は、捕捉部分改変ヌクレオチドであり、該２本鎖核酸は、無細胞ＤＮＡから得られる工程；
（ｂ）アダプター核酸を、該捕捉部分改変ヌクレオチドが付加された該２本鎖核酸にライゲーションして、ライゲーション生成物を生成する工程であって、ここで該アダプター核酸の３’末端における１またはこれより多くのヌクレオチドの配列は、工程（ａ）における該２本鎖核酸の３’末端に付加された該１またはこれより多くのヌクレオチドと相補的である工程；ならびに
（ｃ）該ライゲーション生成物と該捕捉部分改変ヌクレオチドの捕捉部分の結合パートナーとを接触させることによって、該ライゲーション生成物を捕捉する工程
を包含する方法。
（項目２）
（ｄ）該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする第１の標的特異的プライマーおよび該アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第１のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって該ライゲーション生成物を増幅する工程、
をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目３）
工程（ｂ）は、前記アダプター核酸、前記２本鎖核酸、およびリガーゼを、該リガーゼが該アダプター核酸を該２本鎖核酸にライゲーションする条件下で合わせる工程を包含し、ここで該２本鎖核酸と合わせられる該アダプター核酸は、二重鎖部分およびオーバーハング配列を含み、ここで該オーバーハング配列は、工程（ａ）における前記２本鎖核酸の３’末端に付加された前記１またはこれより多くのヌクレオチドと相補的な、該アダプター核酸の前記３’末端における１またはこれより多くのヌクレオチドの配列を含む、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
工程（ｂ）は、前記アダプター核酸、前記２本鎖核酸、およびリガーゼを、該リガーゼが該アダプター核酸を該２本鎖核酸にライゲーションする条件下で合わせる工程を包含し、ここで該２本鎖核酸と合わせられる該アダプター核酸は、１本鎖である、項目１または２に記載の方法。
（項目５）
（ｅ）第２のアダプタープライマーおよび第２の標的特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって工程（ｄ）の増幅生成物を増幅する工程、
をさらに包含する、項目２に記載の方法。
（項目６）
前記第２の標的特異的プライマーは、前記第１の標的特異的プライマーに対してネスト化される、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記第２の標的特異的プライマーは、前記標的ヌクレオチド配列にアニールしない５’テールを含む、項目５または６に記載の方法。
（項目８）
前記第２の標的特異的プライマーの５’テールと同一である３’部分を含むさらなるプライマーを添加する工程をさらに包含する、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記捕捉部分は、ビオチン部分である、前述の項目のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記ビオチン部分は、ビオチン−トリエチレングリコール、ビス−ビオチン、光切断性ビオチン、デスチオビオチン、デスチオビオチン−トリエチレングリコール、またはアジ化ビオチンを含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記捕捉部分改変ヌクレオチドは、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、およびシトシン、またはこれらの誘導体からなる群より選択される核塩基を含む、前述の項目のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目１２）
前記捕捉部分改変ヌクレオチドは、アデニン核塩基またはその誘導体を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記捕捉部分は、５位、６位、７位または８位において、前記アデニン核塩基またはその誘導体に共有結合的に連結される、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記捕捉部分は、７位において前記アデニン核塩基に共有結合的に連結される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記アデニン核塩基の７位は、炭素原子である、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記ビオチン部分は、長さが５〜２０個の原子のリンカーを介して前記核塩基に共有結合的に連結される、項目９に記載の方法。
（項目１７）
前記捕捉部分改変ヌクレオチドは、ビオチン−ｎ−ｄＮＴＰであり、ここでｎは、該ビオチン部分のカルボニル基と該ＮＴＰの核塩基上の付着位置との間のリンカー原子の数を表す５〜２０の整数である、前述の項目のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目１８）
前記結合パートナーは、ストレプトアビジンである、前述の項目のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目１９）
前記ストレプトアビジンは、常磁性ビーズに付着される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
工程（ａ）において、１個のヌクレオチドが、前記標的ヌクレオチド配列を含む前記２本鎖核酸の前記３’末端に付加される、前述の項目のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目２１）
工程（ｂ）の後でかつ工程（ｃ）の前に洗浄工程をさらに包含する、前述のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目２２）
工程（ｃ）の後でかつ工程（ｄ）の前に：
ｉ）前記捕捉部分改変ヌクレオチドを含む前記２本鎖核酸を、常磁性表面上に固定化する工程；および
ｉｉ）該固定化された２本鎖核酸を洗浄する工程、
をさらに包含する、項目２〜２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３）
工程（ｉｉ）の後に：
ｉｉｉ）前記洗浄した固定化２本鎖核酸を前記常磁性表面から放出する工程、
をさらに包含する、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
工程（ａ）の前に、前記２本鎖核酸を５’リン酸化する工程をさらに包含する、前述の項目のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目２５）
工程（ａ）の前に：
ｉ）テンプレートとしてＲＮＡ調製物を使用するランダムにプライムした第１鎖合成反応およびテンプレートとして該ランダムにプライムした第１鎖合成反応の生成物を使用する第２鎖合成反応を行うことによって、ｃＤＮＡを調製する工程；ならびに
ｉｉ）該ｃＤＮＡを末端修復して、平滑末端化した２本鎖核酸を生成する工程、
をさらに包含する、前述の項目のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
工程ｉｉ）の後に：
ｉｉｉ）前記捕捉部分改変ヌクレオチドを含む前記２本鎖核酸を、常磁性表面上に固定化する工程；
ｉｖ）該固定化した２本鎖核酸を洗浄する工程；および
ｖ）該洗浄した固定化した２本鎖核酸を該常磁性表面から放出する工程
をさらに包含する、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
工程（ｉｉ）の後でかつ工程（ｉｉｉ）の前に洗浄工程をさらに包含する、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
（ｆ）工程（ｅ）の前記増幅生成物を常磁性表面上に固定化する工程；
（ｇ）該固定化した増幅生成物を洗浄する工程；および
（ｈ）該洗浄した固定化増幅生成物を該常磁性基材または表面から放出する工程、
をさらに包含する、項目５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９）
工程（ｅ）の後でかつ工程（ｆ）の前に洗浄工程をさらに包含する、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
工程（ｂ）において、前記２本鎖核酸は、クラウディング剤の存在下で前記アダプター核酸にライゲーションされる、前述の項目のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目３１）
前記クラウディング剤は、ライゲーション混合物の５％〜５０％に相当する量のポリエチレングリコールである、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記２本鎖核酸は、平滑末端化される、前述の任意の項目に記載の方法。
（項目３３）
分析用の核酸を調製する方法であって、該方法は、
（ａ）テンプレートとして無細胞ＤＮＡ調製物を使用するランダムにプライムした第１鎖合成反応およびテンプレートとして該ランダムにプライムした第１鎖合成反応の生成物を使用する第２鎖合成反応を行うことによって、ｃＤＮＡを調製する工程であって、ここで該無細胞ＤＮＡ調製物は、標的ヌクレオチド配列を含む工程；
（ｂ）該ｃＤＮＡを末端修復して、該標的ヌクレオチド配列を含む平滑末端化した２本鎖核酸を生成する工程；
（ｃ）該平滑末端化した２本鎖核酸を常磁性表面上に固定化する工程；
（ｄ）該固定化した平滑末端化２本鎖核酸を洗浄する工程；
（ｅ）該洗浄した固定化平滑末端化２本鎖核酸を該常磁性表面から放出する工程；
（ｆ）１またはこれより多くのヌクレオチドを該放出した平滑末端化２本鎖核酸の３’末端に付加する工程；
（ｇ）ライゲーション可能な二重鎖部分およびオーバーハング配列を含むアダプターを、工程（ｆ）において生成した該核酸にライゲーションして、ライゲーション生成物を生成する工程であって、ここで該オーバーハング配列は、該１またはこれより多くのヌクレオチドと相補的である工程；
（ｈ）該ライゲーション生成物を洗浄することなく、該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする第１の標的特異的プライマーおよび該アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第１のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、該ライゲーション生成物を増幅する工程；
（ｉ）工程（ｈ）の増幅生成物を、第２のアダプタープライマーおよび第２の標的特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する工程であって、ここで該第２の標的特異的プライマーは、該第１の標的特異的プライマーに対してネスト化される工程；
（ｊ）工程（ｉ）の該増幅生成物を常磁性表面に固定化する工程；
（ｋ）該固定化した増幅生成物を洗浄する工程；ならびに
（ｌ）該洗浄した固定化増幅生成物を該常磁性表面から放出する工程、
を包含する方法。
（項目３４）
前記標的配列は、Ｔ細胞レセプター定常領域または免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖の定常領域に相当する配列内に存在する、前述の項目のうちのいずれかに記載の方法。
（項目３５）
分析用の核酸を調製する方法であって、該方法は、
（ａ）テンプレートとしてｃｆＤＮＡ調製物を使用するランダムにプライムした第１鎖合成反応およびテンプレートとして該ランダムにプライムした第１鎖合成反応の生成物を使用する第２鎖合成反応を行うことによって、ｃＤＮＡを調製する工程であって、ここで該ｃｆＤＮＡ調製物は、標的ヌクレオチド配列を含む工程；
（ｂ）該ｃＤＮＡを末端修復して、該標的ヌクレオチド配列を含む平滑末端化した２本鎖核酸を生成する工程；
（ｃ）該平滑末端化した２本鎖核酸を洗浄する工程；
（ｄ）１またはこれより多くのヌクレオチドを工程（ｃ）において洗浄した該核酸の３’末端に付加する工程であって、必要に応じてここで該１またはこれより多くのヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、捕捉部分改変ヌクレオチドである工程；
（ｅ）工程（ｄ）において生成した該核酸を洗浄する工程；
（ｆ）ライゲーション可能な二重鎖部分およびオーバーハング配列を含むアダプター核酸を、工程（ｅ）において洗浄した該核酸にライゲーションして、ライゲーション生成物を生成する工程であって、ここで該オーバーハング配列は、該１またはこれより多くのヌクレオチドと相補的である工程；
（ｇ）該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする第１の標的特異的プライマーおよび該アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第１のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、該ライゲーション生成物を増幅する工程；
（ｈ）第２のアダプタープライマーおよび第２の標的特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、工程（ｇ）の増幅生成物を増幅する工程であって、ここで該第２の標的特異的プライマーは、該第１の標的特異的プライマーに対してネスト化される工程；ならびに
（ｊ）該工程（ｈ）の増幅生成物を洗浄する工程、
を包含する方法。
（項目３６）
前記洗浄する工程は、可逆的固相固定化技術を使用して行われる、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記１またはこれより多くのヌクレオチドのうちの少なくとも１個は、捕捉部分改変ヌクレオチドであり、前記方法は、工程（ｆ）の後でかつ工程（ｇ）の前に、該捕捉部分改変ヌクレオチドの捕捉部分の固定化した結合パートナーを使用して前記ライゲーション生成物を捕捉する工程；および該捕捉したライゲーション生成物を清浄にする工程をさらに包含する、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記捕捉部分は、ビオチン部分を含み、前記結合パートナーは、ストレプトアビジンを含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記第２のアダプタープライマーは、前記第１のアダプタープライマーに対してネスト化される、項目３５に記載の方法。
（項目４０）
前記第２のアダプタープライマーは、前記アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする、項目３５に記載の方法。