(57)【要約】  本発明は、アルギニン、トロメタモール、メグルミン、リジン、ヒスチジン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、コハク酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、およびこれらの塩の中から選ばれる少なくとも１つを含有する添加剤に関し、該添加剤は、核酸分子とコラーゲンとの複合体の微細粒子が凝集することを防止し、サイズが制御されており核酸の運搬に適した複合体粒子含有製剤の製造に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルギニン、トロメタモール、メグルミン、リジン、ヒスチジン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、コハク酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、およびこれらの塩の中から選ばれる少なくとも１つを含有する添加剤であって、核酸分子とコラーゲンとの複合体を、制御されたサイズを有する微細粒子に変換するための添加剤。
【請求項２】
制御されたサイズを有する微細粒子として、70％以上が10μｍ以下のサイズに調整できる、pH５〜９の少なくとも1％以上の含量の水溶液を調製するために用いられる請求項１記載の添加剤。
【請求項３】
請求項１記載の添加剤およびコラーゲンを含有する水溶液であって、核酸分子とコラーゲンとの複合体を、制御されたサイズを有する微細粒子に変換するための水溶液。
【請求項４】
請求項１記載の添加剤およびコラーゲン含有する水溶液であって、該水溶液に核酸を加えることによって、制御されたサイズを有する核酸分子とコラーゲンとの微細粒子の複合体を調製するための水溶液。
【請求項５】
核酸分子およびコラーゲンを含有する乾燥製剤を溶液製剤に再構成するための、請求項１記載の添加剤を含有する水溶液であって、核酸分子とコラーゲンとの複合体を、制御されたサイズを有する微細粒子に変換するための水溶液。
【請求項６】
制御されたサイズを有する微細粒子として、70％以上が10μｍ以下のサイズに調整できる、pH５〜９の少なくとも1％以上の含量で請求項１記載の添加剤を含有する水溶液。
【請求項７】
請求項１記載の添加剤、核酸分子およびコラーゲンを含有する製剤であって、核酸分子とコラーゲンとが、制御されたサイズを有する微細粒子の複合体を形成している製剤。
【請求項８】
制御されたサイズを有する微細粒子の複合体が、その70％以上が10μｍ以下のサイズである、請求項７記載の製剤。
【請求項９】
溶液製剤である請求項７または８記載の製剤。
【請求項１０】
アルギニン、トロメタモール、メグルミン、リジン、トリエタノールアミンおよびこれらの塩の中から選ばれる少なくとも１つを含有する添加剤であって、
(1)核酸分子とコラーゲンとの複合体を、制御されたサイズを有する微細粒子に変換し、
(2)核酸分子とコラーゲンとの複合体の制御されたサイズを有する微細粒子を含む溶液製剤において、該微細粒子の凝集を防止し、かつ良好に分散させ、および／または
(3)核酸分子とコラーゲンとの複合体の制御されたサイズを有する微細粒子を含む乾燥製剤から再構成した溶液製剤において、該微細粒子の凝集防止および良好な分散性を維持させるための添加剤。
【請求項１１】
請求項１０記載の添加剤およびアテロコラーゲンを含有する、核酸分子とコラーゲンとの複合体を、制御されたサイズを有する微細粒子に変換するための水溶液。
【請求項１２】
核酸分子およびコラーゲンを含有する乾燥製剤を溶液製剤に再構成するための、請求項１０記載の添加剤を含有する水溶液であって、
(1)  核酸分子とコラーゲンとの複合体を、制御されたサイズを有する微細粒子に変換し、
(2)  核酸分子とコラーゲンとの複合体の制御されたサイズを有する微細粒子を含む、再構成された溶液製剤において、該微細粒子の凝集を防止し、かつ良好に分散させるための水溶液。
【請求項１３】
請求項１０記載の添加剤、核酸分子およびコラーゲンを含有する製剤であって、核酸分子とコラーゲンとが、制御されたサイズを有する微細粒子の複合体を形成している製剤。
【請求項１４】
制御されたサイズを有する微細粒子の複合体が、その70％以上が10μｍ以下のサイズである、請求項１３記載の製剤。
【請求項１５】
請求項１０記載の添加剤を含有する溶液製剤である、請求項１３または１４記載の製剤であって、核酸分子とコラーゲンとの複合体の制御されたサイズを有する微細粒子の凝集が防止され、かつ良好に分散されている製剤。
【請求項１６】
請求項１０記載の添加剤を含有する乾燥製剤である、請求項１３または１４記載の製剤であって、該乾燥製剤から再構成される溶液製剤においても、微細粒子の凝集防止および良好な分散性が維持されている製剤。
【請求項１７】
核酸分子を所望の細胞に運搬するための、請求項７から９、および１３から１６までのいずれか記載の製剤。
【請求項１８】
コラーゲンがアテロコラーゲンである請求項１、２または１０記載の添加剤。
【請求項１９】
コラーゲンがアテロコラーゲンである請求項３から６、１１および１２のいずれか記載の水溶液。
【請求項２０】
コラーゲンがアテロコラーゲンである請求項７から９、１３から１７までのいずれか記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、制御されたサイズを有する核酸分子とコラーゲンの複合体微細粒子を含む製剤に関し、詳細にはある種の添加剤を含有させることにより形成される核酸分子とコラーゲンの微細複合体粒子、該微細複合体粒子を含有することを特徴とする、細胞に核酸分子を導入するための製剤、およびそれらの製造方法、を提供する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは優れた生体適合性を示し、従来から医療用具として生体内埋め込みに用いられているが、再生医療やバイオ関係の試薬、キット類への応用など、幅広い可能性を有する。また、コラーゲンは核酸分子と静電的に相互作用して複合体を形成することにより核酸分子を安定化し、組織への核酸分子の導入を促進する効果が認められており、核酸分子のDDSとしての応用が期待される（特許文献１、２、３）。特に、アテロコラーゲンは抗原性が排除され、可溶性であるため、医薬としての応用価値が高い。【０００３】
一方、正常な遺伝子を細胞に補ったり、遺伝子の欠陥を修復、修正することで病気を治療する遺伝子治療では、目的の酵素、サイトカイン等をコードする核酸分子を患者の細胞内に導入し、その核酸分子から体内に目的とする物質を産生させ、疾患の治療を行う。しかし、遺伝子単独では標的細胞への導入効率が低いことから、その導入効率を高めて治療の有効性を高めるために、アデノウイルス等のウイルスをベクターに用いる方法(非特許文献１−６およびこれらの引用文献)やリポソーム製剤を用いる方法(非特許文献７−９）等が用いられてきた。また、塩基性脂質（非特許文献１０以来、種々の脂質が多く開発されてきた）や塩基性ポリマーをベースにした化合物（代表例としてはポリエチレンイミン（非特許文献１１））等の遺伝子キャリアーも開発されてきた。これらのベクター等は、遺伝子治療に用いられる遺伝子のみならず、細胞内の遺伝子の発現を調節するアンチセンスDNAや、siRNAなどの核酸製剤への応用が可能である。【０００４】
さらに、遺伝子の導入効率を高めて治療の有効性を高めるために、生体高分子であるコラーゲンを用い、核酸分子とコラーゲンとの複合体を利用する方法が提案されている（特許文献３）。コラーゲンは生体適合性に優れていることから医薬への応用が期待される。【０００５】
しかし、核酸分子の安定性や医薬品としての応用を考え併せると、そのような複合体の製造や保存に際して、溶液のpHは中性であることが求められる一方で、コラーゲンは中性pH領域の水溶液中では会合し易いという性質を有し、凝集物が沈殿物として生じるという問題がある。とくに、コラーゲンが生理的条件下で規則正しく会合して線維形成すること、および核酸分子と複合体形成することによって凝集が促進されるということは、加工性や均一な品質の医薬を得るうえで障害となる。さらに、コラーゲンと核酸分子との複合体が不溶性の巨大な凝集物を形成することは、局所滞留性のデポ型徐放製剤として長時間の徐放化には有利な場合もありうるが、広く生体内に分布させたい場合や細胞に効率的に取り込ませたい場合には望ましくない。後者の目的には、数μm以下のサイズであることが好ましく、巨大凝集形成は望ましくない。とくに毛細血管の直径は5〜10μｍであることから、血流を介して広く生体内に分布させたい場合、複合体粒子のサイズは５μｍ以下であることが好ましいとされている。従って、核酸分子とコラーゲンの複合体においてコラーゲンは単分子あるいは分子が数個〜数十個集まった程度の微細線維状のコラーゲンであることが望ましい。【０００６】
繊維状コラーゲンはpH中性では0.9M〜1.0M NaCl存在下で可溶化される傾向にあり、pH中性(塩添加)でコラーゲン線維形成抑制作用をもつグルコースまたはショ糖（0.25〜0.5M）を加えるとより効果的であることが「コラーゲン実験法」（講談社、p3）に書かれている。また、繊維状コラーゲンを非繊維状コラーゲンに分解する繊維分解剤として、生体適合性アルコール、アミノ酸等が特許文献４に記載されている。しかし、特許文献４記載の組成物には核酸分子は含まれておらず、コラーゲンと核酸分子との複合体に関するものではない。
コラーゲン単独では均一で透明な溶解状態にあるが、核酸分子を加えることにより、直ちに数μm以上の複合体を生じ、さらに室温程度の加温によって凝集が著しく促進され易い傾向がある。その結果、10μｍ以上の複合体凝集物となり、白濁して沈殿が生じ易い傾向がある。また保存や凍結融解によっても凝集が促進され易い。
本発明者らは、コラーゲンの会合を防止するために用いられている上記の方法（可溶化または繊維分解剤）は、コラーゲン単独の場合に有効であっても、核酸分子を介する複合体の凝集防止、巨大粒子の形成防止には有効でないことを、新たに見出した。従って、基本的に核酸分子とコラーゲンとからなる複合体を含有する、均一な分散性が安定に維持できる、換言すれば、均一で分散性に優れた実用的な、微細粒子製剤の開発が強く求められている。【０００７】
【特許文献１】特開平９−７１５４２公報
【特許文献２】ＷＯ２００１／９７８５７パンフレット
【特許文献３】ＷＯ２００３／２９７パンフレット
【特許文献４】特開平９−９９０５２公報
【非特許文献１】Cardiovascular Research, 28,445(1994)
【非特許文献２】Science,256,808(1992)
【非特許文献３】Gastroenterology,106,1076(1994)
【非特許文献４】TIBTECH,11,182(1993)
【非特許文献５】J. Biol. Chem,266,3361(1991)
【非特許文献６】Nature Medicine,1,583(1995)
【非特許文献７】Biochem Biophys Acta,1097,1(1991)
【非特許文献８】Human Gene Therapy,3,399(1992)
【非特許文献９】Proc. Natl. Acad. Sci.USA,89,11277(1992)
【非特許文献１０】Proc. Natl. Acad. Sci.USA,84,7413(1987)
【非特許文献１１】Proc. Natl. Acad. Sci.USA,92,7297(1995)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、均一な分散性が安定に維持できる、換言すれば、均一で分散性に優れた実用的な、核酸分子含有微細粒子製剤を提供することを目的とするものである。
より詳しくは、本発明は、核酸分子／コラーゲン／添加剤の3者を必須成分とした制御されたサイズを有する複合体製剤に関し、単にコラーゲンの会合防止剤を核酸分子とコラーゲンの複合体に適用しただけでは解決し得ない技術的課題を解決するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、核酸分子とコラーゲンとの制御されたサイズを有する複合体微細粒子を基本とする。すなわち、核酸分子とコラーゲンにある種の添加剤を含有させることにより形成される複合体の微細粒子および該複合体微細粒子を含有することを特徴とする細胞に核酸分子を運搬するための製剤を提供する。本発明は、そのような複合体微細粒子や製剤の製造方法をも提供する。複合体の粒子サイズは体内動態や効果に影響を与える可能性だけでなく、粒子サイズを制御することは、とくに医薬品への応用において品質管理面から不可欠である。
本発明者らは上記課題に鑑みて鋭意研究を行った結果、添加剤としてある種の有機塩基または酸を共存させることにより、コラーゲンと核酸分子との複合体形成においても両者の結合性を保ったまま、10μm以上の大きなサイズの複合体の形成を抑制する効果があることを見出した。このように、コラーゲンが核酸と複合体を形成する場合にも凝集を抑制することができるということは全く予想外のことである。【００１０】
即ち、本発明の要旨は、
１．アルギニン、トロメタモール、メグルミン、リジン、ヒスチジン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、コハク酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、およびこれらの塩の中から選ばれる少なくとも１つを含有する添加剤であって、核酸分子とコラーゲンとの複合体を、制御されたサイズを有する微細粒子に変換するための添加剤、【００１１】
２．上記１記載の添加剤およびコラーゲンを含有する、核酸分子とコラーゲンとの複合体を、制御されたサイズを有する微細粒子に変換するための水溶液、または、上記１記載の添加剤およびコラーゲン含有する水溶液であって、該水溶液に核酸を加えることによって、制御されたサイズを有する核酸分子とコラーゲンとの微細粒子の複合体を調製するための水溶液、
３．上記２記載の水溶液であって、
(1)添加剤の総濃度が1〜20％であり、
(2)コラーゲンの濃度が0.01%〜2％であり、
(3)添加剤がアルギニン、トロメタモール、メグルミン、リジン、モノエタノールアミン、トリエタノールアミン、クエン酸、酒石酸およびこれらの塩の中から選ばれる水溶液、
４．添加剤がアルギニン、トロメタモール、メグルミン、リジンおよびこれらの塩の中から選ばれる、上記２記載の水溶液、
４-1．添加剤がアルギニン、リジンおよびこれらの塩の中から選ばれる、上記２記載の水溶液、【００１２】
４−２．核酸分子およびコラーゲンを含有する乾燥製剤を溶液製剤に再構成するための、上記１記載の添加剤を含有する水溶液であって、核酸分子とコラーゲンとの複合体を、制御されたサイズを有する微細粒子に変換するための水溶液、
５．上記４記載の水溶液であって、
(1)添加剤の総濃度が1〜10％、および／または
(2)水溶液のpHが5〜9、である水溶液であり、
(3)添加剤がアルギニン、トロメタモール、メグルミン、リジン、モノエタノールアミン、トリエタノールアミン、クエン酸、酒石酸およびこれらの塩の中から選ばれる水溶液であり、さらに好ましくは、添加剤がアルギニン、トロメタモール、メグルミン、リジンおよびこれらの塩の中から選ばれる水溶液であり、さらにより好ましくは、添加剤がアルギニン、リジンおよびこれらの塩の中から選ばれる水溶液、【００１３】
６．上記１記載の添加剤、核酸分子およびコラーゲンを含有する製剤であって、核酸分子とコラーゲンとが、制御されたサイズを有する微細粒子の複合体を形成している製剤、
７．上記６記載の製剤であって、
(1)核酸分子の濃度が0.001〜100mg/ml、好ましくは0.001〜50mg/ml、より好ましくは0.001〜10mg/ml、
(2)コラーゲンの濃度が0.01%〜2％、
(3)添加剤の総濃度が1〜10％、および／または
(4)水溶液のpHが6〜8である製剤、
８．制御されたサイズを有する微細粒子が速やかに沈降することなく分散状態を保つことができるサイズの複合体であって、投与の際に通常の注射針の通過が妨げられない複合体である上記６記載の製剤、
９．制御されたサイズを有する微細粒子が、静脈・動脈内、筋肉内投与に使われる23から21ゲージ（内径約0.4から0.6mm）、さらに好ましくは皮内・皮下投与用に使われる27から24ゲージ（内径約0.2から0.4mm）の注射針を通過するサイズの複合体である上記８記載の製剤、
１０．制御されたサイズを有する微細粒子が100μm以下、好ましくは10μｍ以下の粒子である上記６記載の製剤、
１１．制御されたサイズを有する微細粒子が、その70％以上が10μｍ以下の粒子である上記６記載の製剤、
１２．制御されたサイズを有する微細粒子が、その80%以上が10μm以下のサイズである、上記６記載の製剤、
１３．制御されたサイズを有する微細粒子が、その70％以上が5μｍ以下のサイズである上記６記載の製剤、
１４．制御されたサイズを有する微細粒子が、その80%以上が5μｍ以下のサイズである上記６記載の製剤、【００１４】
１５．上記７記載の溶液製剤を凍結乾燥して得られる、凍結乾燥製剤、
１６．アルギニン、トロメタモール、メグルミン、リジン、ヒスチジン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミンおよびこれらの塩の中から選ばれる少なくとも１つを含有する、核酸分子とコラーゲンからなる複合体微細粒子の凝集防止剤、【００１５】
１７．アルギニン、トロメタモール、メグルミン、リジン、トリエタノールアミンおよびこれらの塩の中から選ばれる少なくとも１つを含有する添加剤であって、
(1)核酸分子とコラーゲンとの複合体を、制御されたサイズを有する微細粒子に変換し、
(2)核酸分子とコラーゲンとの複合体の制御されたサイズを有する微細粒子を含む溶液製剤において、該微細粒子の凝集を防止し、かつ良好に分散させ、および／または
(3)核酸分子とコラーゲンとの複合体の制御されたサイズを有する微細粒子を含む乾燥製剤から再構成した溶液製剤において、該微細粒子の凝集防止および良好な分散性を維持させるための添加剤、【００１６】
１８．上記１７記載の添加剤およびコラーゲンを含有する、核酸分子とコラーゲンとの複合体を、制御されたサイズを有する微細粒子に変換するための水溶液、
１９．上記１８記載の水溶液であって、
(1)添加剤の総濃度が1〜20％、
(2)コラーゲンの濃度が0.01%〜2％である水溶液、【００１７】
２０．核酸分子およびコラーゲンを含有する乾燥製剤を溶液製剤に再構成するための、上記１７記載の添加剤を含有する水溶液であって、
(1)核酸分子とコラーゲンとの複合体を、制御されたサイズを有する微細粒子に変換し、および／または
(2)核酸分子とコラーゲンとの複合体の制御されたサイズを有する微細粒子を含む、再構成された溶液製剤において、該微細粒子の凝集を防止し、良好に分散させるための水溶液、
２１．上記２０記載の水溶液であって、
(1)添加剤の総濃度が1〜10％、および／または
(2)水溶液のpHが5〜9、である水溶液、【００１８】
２２．上記１７記載の添加剤、核酸分子およびコラーゲンを含有する製剤であって、核酸分子とコラーゲンとが、制御されたサイズを有する微細粒子の複合体を形成している製剤、
２３．下記(1)から(4)である上記１８記載の溶液製剤：
(1)核酸分子の濃度が0.001〜100mg/ml、好ましくは0.001〜50mg/ml、より好ましくは0.001〜10mg/ml、
(2)コラーゲンの濃度が0.001%〜10％、より好ましくは0.01%〜2％、さらに好ましくは0.01%〜0.5%、
(3)添加剤の総濃度が1〜10％、および／または
(4)水溶液のpHが5〜9、より好ましくはpHが6〜8である、
２４．制御されたサイズを有する微細粒子が速やかに沈降することなく分散状態を保つことができるサイズの複合体であって、投与の際に通常の注射針の通過が妨げられない複合体である上記６記載の製剤、
２５．制御されたサイズを有する微細粒子が、静脈・動脈内、筋肉内投与に使われる23から21ゲージ（内径約0.4から0.6mm）、さらに好ましくは皮内・皮下投与用に使われる27から24ゲージ（内径約0.2から0.4mm）の注射針を通過するサイズの複合体である上記８記載の製剤、
２６．制御されたサイズを有する微細粒子が100μm以下、好ましくは10μｍ以下の粒子である上記８記載の製剤、【００１９】
２７．制御されたサイズを有する微細粒子の複合体が、その70％以上が10μｍ以下のサイズである、上記８記載の製剤、
２８．制御されたサイズを有する微細粒子の複合体が、そのは80%以上が10μm以下のサイズである、上記８記載の製剤、
２９．制御されたサイズを有する微細粒子の複合体が、その製剤中のコラーゲンと核酸分子の複合体の70％以上が5μｍ以下のサイズである上記８記載の製剤、
３０．制御されたサイズを有する微細粒子の複合体が、その製剤中のコラーゲンと核酸分子の複合体の80%以上が5μｍ以下のサイズである上記８記載の製剤、【００２０】
３１．室温から体温付近の非冷蔵状態において、12時間以上凝集することなく、核酸分子とコラーゲンとの複合体の制御されたサイズを有する微細粒子の凝集が防止され、良好に分散されている上記７記載の製剤、【００２１】
３２．上記３１記載の製剤を有効成分とする、所望の細胞に対する核酸分子の導入剤、
３３．コラーゲンがアテロコラーゲンである上記４記載の水溶液、
３４．コラーゲンがアテロコラーゲンである上記７記載の製剤、
３５．核酸分子が下記(1)から(6)である上記７記載の製剤：
(1)DNAオリゴヌクレオチド
(2)プラスミドDNA 
(3)RNAオリゴヌクレオチド
(4)RNA/DNAキメラオリゴヌクレオチド
(5)アンチセンスDNA、または
(6)siRNA、
３６．核酸分子がアンチセンスDNAである上記３５記載の製剤、
３７．アルギニン、トロメタモール、メグルミン、リジン、ヒスチジン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、コハク酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、およびこれらの塩の中から選ばれる少なくとも１つを有効成分とする、核酸分子とコラーゲンとの複合体のソフトコーテイング剤、
３８．アルギニン、トロメタモール、メグルミン、リジンおよびこれらの塩の中から選ばれる、少なくとも１つを有効成分とする、核酸分子とコラーゲンとの複合体のソフトコーテイング剤、
３９．上記３７、３８のソフトコーテイング剤を有効成分とする、核酸分子とコラーゲンとの複合体の、凝集抑制剤、
４０．核酸分子とコラーゲンの複合体を上記１記載の添加剤の存在下、pH5〜9で形成させることを特徴とする、平均粒子サイズが100μm以下である、核酸分子とコラーゲンの複合体微細粒子製剤の製造法。
に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】複合体微細粒子凝集に対する各種添加剤の防止効果を示す顕微鏡による、図面に代わる写真である。比較例3−5のグリセリン（グリセロール）は特許文献４のコラーゲン繊維分解剤であるが、コラーゲンとDNA混合後に凝集（＞10μm）が認められ、室温保存後にはさらに凝集が大きくなり、コラーゲンとDNA複合体に対する凝集防止効果は認められなかった。
【図２】複合体微細化および温度と凍結融解処理による凝集に対するアルギニンの防止効果を示す顕微鏡による、図面に代わる写真である。
【図３】複合体微細化に対する各種添加剤の効果を示す顕微鏡による、図面に代わる写真である。比較例7−5のプロピレングリコールは特許文献４の代表的なコラーゲン繊維分解剤であるが、コラーゲンとDNA混合後に大きな凝集（＞100μm）が多数認められ、コラーゲンとDNA複合体に対する微細化効果は認められなかった。
【図４】核酸分子を高濃度（40mg/ml）含有する製剤の複合凝集体防止に対する本発明製剤の効果を示す顕微鏡像による、図面に代わる写真である（スケールは１００μm）。
【図５】マウス皮膚炎モデルにおける感作および製剤投与24時間後の耳介腫脹度を示す棒グラフである。アンチセンスICAM-1を含有する本発明製剤は微細複合体製剤として、アンチセンスICAM-1の単独投与よりも優れた抗炎症効果（耳介腫脹抑制効果）を示した。
【図６】マウス皮膚炎モデルにおける感作および製剤投与24時間後の耳介腫脹度を示す棒グラフである。アンチセンスICAM-1を含有する本発明の凍結乾燥製剤は有意な抗炎症効果（耳介腫脹抑制効果）を示した。これより、本発明の微細複合体は凍結乾燥製剤としても有効であることが示された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
（１）添加剤
本発明の製剤は、特定の添加剤、核酸分子およびコラーゲンを含有する製剤であって、核酸分子とコラーゲンとが、制御されたサイズを有する微細粒子の複合体を形成していることを特徴とする。
本発明者らは鋭意研究を行った結果、アルギニン、トロメタモール、メグルミン、リジン、ヒスチジン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、コハク酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、またはこれらの塩が、コラーゲンと核酸分子との複合体形成を阻害することなく、コラーゲンあるいは複合体の会合による凝集を防ぐばかりか、核酸分子とコラーゲンとの複合体を制御されたサイズを有する微細粒子に変換できることを見出した。
この点から、本発明は第１の態様として、アルギニン、トロメタモール、メグルミン、リジン、ヒスチジン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、コハク酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、およびこれらの塩の中から選ばれる少なくとも１つを含有する添加剤であって、核酸分子とコラーゲンとの複合体を、制御されたサイズを有する微細粒子に変換するための添加剤を提供する。【００２４】
さらに、本発明者らは、有機塩基であるアルギニン、トロメタモール、メグルミン、リジン、ヒスチジン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミンおよびこれらの塩が、核酸分子とコラーゲンとの複合体を、制御されたサイズを有する微細粒子に変換するのみならず、核酸分子とコラーゲンとの複合体の制御されたサイズを有する微細粒子を含む溶液製剤において、該微細粒子の凝集を防止し、良好に分散させ、および／または核酸分子とコラーゲンとの複合体の制御されたサイズを有する微細粒子を含む乾燥製剤から再構成した溶液製剤において、該微細粒子の凝集防止および良好な分散性を維持させることを見出した。【００２５】
この点から、本発明は、アルギニン、トロメタモール、メグルミン、リジン、トリエタノールアミンおよびこれらの塩の中から選ばれる少なくとも１つを含有する添加剤であって、
(1)核酸分子とコラーゲンとの複合体を、制御されたサイズを有する微細粒子に変換し、
(2)核酸分子とコラーゲンとの複合体の制御されたサイズを有する微細粒子を含む溶液製剤において、該微細粒子の凝集を防止し、良好に分散させ、および／または
(3)核酸分子とコラーゲンとの複合体の制御されたサイズを有する微細粒子を含む乾燥製剤から再構成した溶液製剤において、該微細粒子の凝集防止および良好な分散性を維持させるための添加剤を提供する。【００２６】
本発明において、「塩」とは、上記有機塩基が塩酸またはリン酸、クエン酸、酒石酸、コハク酸、乳酸、酢酸から選ばれる有機酸との塩が含まれ、および上記酸が水酸化ナトリウム、アルギニン、トロメタモール、メグルミン、リジン、ヒスチジン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミンから選ばれる塩基との塩が含まれる。【００２７】
特定の理論にとらわれるものでないが、本発明の添加剤は、コラーゲンあるいは複合体の周りをイオン的に、いわばソフトコーティングすることにより、コラーゲンと核酸分子との結合性を保ったまま、凝集物の生成を効果的に防ぐものと考えられる。このようなイオンによるソフトコーティング的な効果は、一般にコラーゲンの会合防止剤として用いられるNaClやリン酸Naなどの塩やグルコースには認められない。
本発明の添加剤は、安定化、pH調節、等張化等を目的とした他の添加物質を含有することができる。本発明の添加剤のうち有機塩基添加剤は、pH調整剤として塩酸の他、リン酸、クエン酸、酒石酸、コハク酸、乳酸、酢酸などの有機酸と組み合わせて用いることができる。【００２８】
本発明の効果は、製剤を凍結保存することや凍結乾燥製剤化を可能にすることである。核酸分子とコラーゲンの複合体溶液を長期間安定に保存するには凍結保存が必要となる。本発明を用いない場合では、しばしば凍結保存品の融解後に凝集し粒子の巨大化が起こる。また、他の長期保存法として凍結乾燥製剤化が挙げられる。凍結乾燥製剤の調製には凍結工程につづき乾燥工程があり、使用時には溶解液を加えて用時溶解を行うのが一般的であるが、一連の過程においては凝集が生じ易く溶解性が不良になる場合が多い。本発明では凝集が防止されて、凍結乾燥前と変わらない微細粒子の良好な分散を得ることができる。さらに凍結乾燥製剤には、その他の添加物質として、安定化剤、pH調節剤、等張化剤の他、賦形剤や溶解促進剤を加えることができ、たとえば糖類などが使用できる。【００２９】
（２）添加剤およびコラーゲンを含有する水溶液
特定の添加剤、核酸分子およびコラーゲンを含有する製剤であって核酸分子とコラーゲンとが、制御されたサイズを有する微細粒子の複合体を形成していることを特徴とする本発明の製剤は、本発明の添加剤およびコラーゲンを含有する水溶液を用いることで調製することができる。
この態様として、本発明は、本発明の添加剤およびコラーゲンを含有する、核酸分子とコラーゲンとの複合体を、制御されたサイズを有する微細粒子に変換するための水溶液を提供する。
この水溶液は、核酸凍結乾燥品の溶解や核酸水溶液の希釈に用いることができ、そのような核酸分子に対して適用することにより、核酸分子とこの水溶液中のコラーゲンとが制御されたサイズを有する微細粒子の複合体に形成される。すなわち、本発明の添加剤およびコラーゲンを含有する水溶液を用いることにより、各施設で独自に合成した、あるいは細胞から分離した、あるいは市販の核酸水溶液あるいは凍結乾燥品、あるいはプレート上に核酸が塗布されたものに、この水溶液を加えるだけで、核酸とコラーゲンとの制御されたサイズを有する微細粒子の複合体を形成させることができる。【００３０】
この態様での水溶液は、好ましくは、
(1)  添加剤の総濃度が1〜20％、
(2)  コラーゲンの濃度が0.01%〜2％であり、
より好ましくは、添加剤がアルギニン、トロメタモール、メグルミン、リジン、モノエタノールアミン、トリエタノールアミン、クエン酸、酒石酸およびこれらの塩の中から選ばれる水溶液であり、さらに好ましくは、添加剤がアルギニン、トロメタモール、メグルミン、リジンおよびこれらの塩の中から選ばれる水溶液であり、さらにより好ましくは、添加剤がアルギニン、リジンおよびこれらの塩の中から選ばれる水溶液である。【００３１】
（３）乾燥製剤を溶液製剤に再構成するための水溶液
一般に、注射剤の形態で投与される医薬は、活性成分の安定性を考慮して凍結乾燥品として提供され、それは注射用蒸留水などにより溶液製剤に用事調製される。本発明者らは、乾燥製剤を溶液製剤に再構成するために用いる溶液に本発明の添加剤を含ませていれば、核酸分子およびコラーゲンの複合体を所望の微細粒子に変換できることを見出した。
この態様として、本発明は、核酸分子およびコラーゲンを含有する乾燥製剤を溶液製剤に再構成するための、本発明の添加剤を含有する水溶液であって、核酸分子とコラーゲンとの複合体を、制御されたサイズを有する微細粒子に変換するための水溶液を提供する。
この態様での水溶液は、好ましくは、
(1)  添加剤の総濃度が1〜10％、および／または
(2)  水溶液のpHが5〜9、である水溶液である。
より好ましくは、添加剤がアルギニン、トロメタモール、メグルミン、リジン、モノエタノールアミン、トリエタノールアミン、クエン酸、酒石酸およびこれらの塩の中から選ばれる水溶液であり、さらに好ましくは、添加剤がアルギニン、トロメタモール、メグルミン、リジンおよびこれらの塩の中から選ばれる水溶液であり、さらにより好ましくは、添加剤がアルギニン、リジンおよびこれらの塩の中から選ばれる水溶液である。【００３２】
（４）添加剤、核酸分子およびコラーゲンを含有する製剤
本発明はまた、本発明の添加剤、核酸分子およびコラーゲンを含有する製剤であって、核酸分子とコラーゲンとが、制御されたサイズを有する微細粒子の複合体を形成している製剤を提供する。
本発明に用いられる「核酸分子」は、コラーゲンと核酸分子の複合体形成が中性pH領域における正に荷電したポリカチオンとしてのコラーゲンとの静電的相互作用によることから、中性pH領域においてポリアニオンとしての性質を有するものであれば、ポリヌクレオチドであってもオリゴヌクレオチドであってもよく、またDNAでもRNA、天然型あるいは修飾型のいずれでもあり得る。DNA分子の場合、プラスミドDNA、cDNA、ゲノミックDNAあるいは合成DNAであってもよい。DNAおよびRNAはいずれも２本鎖でも１本鎖でもあり得る。１本鎖の場合、コード鎖あるいは非コード鎖であり得る。また「核酸分子」は、合成品あるいは細胞から分離したもののいずれでもよく、機能的には、遺伝子としてのプラスミドDNA（pDNAと称することもある）や、遺伝子変換に用いるRNA/DNAキメラオリゴヌクレオチドまたはDNAオリゴヌクレオチド、あるいは遺伝子の発現を調節するアンチセンスDNAや、siRNA（small interfering RNA）などのオリゴヌクレオチド、自分自身や他のRNAを切断するリボザイム、転写因子結合部位と同じ配列を含む2本鎖DNAであるデコイオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。修飾型核酸分子としてDNA誘導体またはRNA誘導体が含まれ、該誘導体とは酵素による分解を避ける為にインターヌクレオチドのリン酸部位、糖部分、塩基部分に化学修飾を施した核酸を意味する。例えば、ヌクレアーゼに対する安定性を高める目的で化学的に修飾したもの、例えばリン酸ジエステル結合の酸素原子の１つをイオウに置換したホスホロチオエート、メチル基に置換したメチルホスホネート、あるいはアミノ基に置換したホスホロアミデートを有する核酸分子があり、リン酸ジエステル結合の酸素原子2つをイオウに置換したホスホロジチオエート、またはイオウとメチル基にそれぞれ置換したメチルホスホロチオエートを有する核酸分子が挙げられる。この他、糖の部分を修飾した2'-O-methyl RNA,  2'-O-methoxyethyl RNA、あるいはLocked nucleic acid（商品名）(LNA)などが挙げられる。また、核酸分子にはアデノウイルス、レトロウイルス等のウイルスも含まれる。【００３３】
鎖長についてもとくに制限はない。具体的には、鎖長は通常、核酸分子がオリゴヌクレオチドまたはリボザイムである場合、好ましくは5mer以上100mer以下、より好ましくは5mer以上30mer以下である。アンチセンスまたはsiRNAとして用いられるオリゴヌクレオチドでは20mer程度であり、遺伝子変換用RNA/DNAキメラオリゴヌクレオチドまたはDNAオリゴヌクレオチドでは数十から100mer程度である。本発明の核酸としてのプラスミドDNAのサイズには特に制限はなく、遺伝子工学的手法で効率的に生産でき、細胞に導入された場合、効率的にコードした遺伝情報を細胞内で発現できるサイズの中から適当に選択することができ、通常数千〜数万塩基対の高分子となる。【００３４】
また、本発明における「核酸分子」では配列は特に制限されないことから、市販品あるいは今後開発されるものも包含される。以下に「核酸分子」の例として、現在、臨床で用いられているアンチセンスDNAを列挙する。
Isis Pharmaceuticals社のVitraveneTM（5'-GCG TTT GCT CTT CTT CTT GCG-3'、配列番号１）、AffintakTM（5'-GTT CTC GCT GGT GAG TTT CA-3'、配列番号２）、AlicaforsenTM ISIS2302（5'-GCC CAA GCT GGC ATC CGT CA-3'、配列番号３）、ISIS2503（5'-TCC GTC ATC GCT CCT CAG GG-3'、配列番号４）、ISIS14803（5'-GTG CTC ATG GTG CAC GGT CT-3'、配列番号５）、ISIS104838（5'-GCT GAT TAG AGA GAG GTC CC-3'、配列番号６)、
GENA社のGenasenseTM（5'-TCT CCC AGC GTG CGC CAT-3'、配列番号７）、
Hybridon社のGEMTM231（5'-GCG UGC CTC CTC ACU GGC-3'（配列番号８)、
Epigenesis社のEPI-2010（5'-GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG-3'、配列番号９)。【００３５】
本発明に用いられる「コラーゲン」は哺乳動物の全タンパク質のおよそ3分の1を占める主要なタンパク質であり、基本構造として3本が螺旋を巻いた三重螺旋構造を形成しており、少なくとも19種類の分子種（型）と33種類のα鎖がある。このうち皮、骨、腱の主成分であるのはＩ型のコラーゲンであり、これは分子量約30万で、分子量が約10万のポリペプチド鎖のα1鎖(Ｉ型)2本とα2鎖(Ｉ型)1本とからなる長さ約300nm、直径1.5nmの棒状分子である。コラーゲンは、生理的条件下においては横隣の分子と67nmだけ位相がずれて規則正しく配列して微小繊維（microfibril）を形成し、それが集合して繊維状物質（fibril、fiber）となり、これは不溶性である。本発明では、コラーゲンは単分子分散状態または微細線維状態となり、溶液状態において良好に分散することを特徴とする。
ここに、コラーゲンは特にその起源および分子種（型）を限定されるものではなく、コラーゲンの基本物性を保持したものであればコラーゲン誘導体あってもよく、一般にはウシ、ブタ、ヒトなどの哺乳類および鳥類、魚類由来（培養細胞由来および遺伝子組替え品を含む）のI型コラーゲンを用いることが好ましい。また、遺伝子組換え品として、任意のα鎖3本を選択して新規コラーゲン分子を産生させることも可能であるが、より現実的には、1種類のα鎖のみからなるホモ３量体を調製して使用してもよい。元来、コラーゲンは抗原性が低いタンパク質であるが、異種由来のコラーゲンを用いる場合、コラーゲン分子の両端に存在し主な抗原決定部位が存在するテロペプチド部分を酵素消化により除去したアテロコラーゲンは抗原性がほとんど問題にならないことから、医薬品として人体へ投与するコラーゲンとして、アテロコラーゲンが適している。
コラーゲン誘導体としては、側鎖を修飾したコラーゲン、架橋したコラーゲン等を用いることができる。側鎖を修飾したコラーゲンとしては、例えばメチル化したコラーゲン等が挙げられ、架橋したコラーゲンとしては、例えばグルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアナートまたはポリエポキシ化合物等で処理したコラーゲン等を挙げることができる（フレグランス・ジャーナル  1989-12，104-109、特公平7-59522号公報）。【００３６】
核酸分子およびコラーゲンは、両者を組合わせると静電的におよび／または物理的に相互作用して複合体を形成し、それが核酸分子の細胞への導入を促進し、かつ遺伝子を長期間発現できることが見出されている（非特許文献３）。本発明において「制御されたサイズを有する微細粒子の複合体」とは、速やかに沈降することなく分散状態を保つことができるサイズの複合体であって、投与の際に通常の注射針の通過が妨げられないものを意味する。通常の注射針として使われる30から16ゲージのうち、好ましくは静脈・動脈内、筋肉内投与に使われる23から21ゲージ（内径約0.4から0.6mm）、さらに好ましくは皮内・皮下投与用に使われる27から24ゲージ（内径約0.2から0.4mm）を通過するものである。そのような複合体において、制御されたサイズとは、100μm以下、好ましくは10μｍ以下の粒子を意味し、ここでサイズが10μm以下とは、顕微鏡で観察される粒子の長径が10μmを越えないこと、あるいは孔径が10μｍのフィルター(例えばisopore filter, Millipore製)を通過するものをいう。
よって、「核酸分子とコラーゲンとが、制御されたサイズを有する微細粒子の複合体を形成している」とは好ましくは、製剤中のコラーゲンと核酸分子の複合体が100μm以下の微細粒子であって、100μmを越える複合体凝集物が混在しないこと、あるいは10μm以下の微細粒子が大部分を占めること、すなわち複合体の70%以上、好ましくは80%以上が10μm以下のサイズであること、より好ましくは製剤中のコラーゲンと核酸分子の複合体の70％以上が5μｍ以下のサイズであること、とくに血管内へ投与する場合、より好ましくは80%以上が5μｍ以下のサイズであることを意味する。【００３７】
「速やかに沈降することなく分散状態を保つことができるサイズの複合体」とは、投与の際に通常の注射針の通過が妨げられないものであって、注射針のゲージで規定すれば、23から21ゲージ（内径約0.4から0.6mm）等の注射針を通過するサイズの複合体を言う。この状態の複合体とは、およそ10μｍ以下のものが大部分のものであると考えられる。【００３８】
詳細には、本発明製剤は、アルギニン、トロメタモール、メグルミン、リジン、ヒスチジン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、コハク酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、およびこれらの塩の中から選ばれる少なくとも１つを含有する添加剤、核酸分子およびコラーゲンを含有する製剤であって、核酸分子とコラーゲンとの複合体が、制御されたサイズ、例えばその70％以上が10μｍ以下のサイズを有する微細粒子を形成している製剤である。ここで、特に好ましい添加剤は、アルギニン、リジンおよびこれらの塩の中から選ばれるものである。
本発明の製剤には１つの態様として、好ましくは、
(1)  核酸分子の濃度が0.001〜100mg/ml、好ましくは0.001〜50mg/ml、より好ましくは0.001〜10mg/ml、
(2)  コラーゲンの濃度が0.001%〜10％、より好ましくは0.01%〜2％、
(3)  添加剤の総濃度が1〜10％、および／または
(4)  水溶液のpHが5〜9、より好ましくはpHが6〜8である溶液製剤が挙げられる。【００３９】
別の態様として、本発明は、アルギニン、トロメタモール、メグルミン、リジン、トリエタノールアミンおよびこれらの塩の中から選ばれる少なくとも１つを含有する添加剤、核酸分子およびコラーゲンを含有する製剤であって、核酸分子とコラーゲンとの複合体が、制御されたサイズ、例えばその70％以上が10μｍ以下のサイズを有する微細粒子を形成している製剤が挙げられる。ここで、特に好ましい添加剤は、アルギニン、リジンおよびこれらの塩の中から選ばれるものである。
この製剤には、溶液製剤および乾燥製剤が挙げられる。乾燥製剤を得るための乾燥方法は、核酸の安定性が保持される方法であればとくに限定はなく、例えば、凍結乾燥法、風乾法、スプレードライ法が挙げられる。乾燥製剤として好ましくは、凍結乾燥法で得られた凍結乾燥製剤である。
この態様における溶液製剤は、本発明の上記有機塩基添加剤の作用により、核酸分子とコラーゲンとの複合体の制御されたサイズを有する微細粒子の凝集が防止され、良好に分散されている。また、乾燥製剤は、該乾燥製剤から再構成される溶液製剤においても、微細粒子の凝集防止および良好な分散性が維持される製剤として有用である。
ここに、「微細粒子の凝集が防止され、良好に分散」とは、室温から体温付近の非冷蔵状態において、3時間以上、少なくとも12時間凝集することなく、10μm以下の微細状態を保持し、少なくとも100μmを越える凝集物が存在しない状態を保持していることを意味する。
特に凍結乾燥製剤における有用性は、凍結乾燥後の再構成時（復水時）に凝集することなく分散性が維持されていることである。【００４０】
本発明の製剤は、核酸分子とコラーゲン複合体の微細粒子の他、必要に応じて医薬上許容される添加剤を含有することができる。医薬上許容される添加剤としては、複合体微細粒子を注射剤として用いる場合の等張化剤、ｐＨ調節剤、無痛化剤、あるいは固形剤として用いる場合の賦形剤、崩壊剤等が挙げられ、日本では医薬品添加物事典（日本医薬品添加剤協会編集）に記述されているものである。具体的にはｐＨを６〜８に保つため、あるいは負荷する細胞と等張に保つために用いられる塩類や糖類が挙げられる。【００４１】
核酸分子とコラーゲンとの複合体が制御されたサイズである効果は、複合体粒子のサイズが投与後の生体内での分布や薬効に与える影響のみならず、凝集を防いで製剤調製時および使用時の均一性を改善できることから、医薬品として品質管理面での意義が極めて大きい。本発明の製剤は、複合体粒子の分散性が安定し、室温や体温付近の非冷蔵状態に放置してもおおむね3時間以上に亘って凝集することなく、安定に保持することが可能である。このことは、使用時の製剤準備開始から投与までの間の厳密な温度管理を要さず、ハンドリングを容易にする。また、製造工程での厳密な温度管理を要しないことから工業化におけるメリットは大きい。一方、本発明を用いない核酸分子とコラーゲンの複合体製剤では、しばしば温度上昇により直ちに大きな凝集塊を生じて白濁するなど、性状が大きく変化するばかりか、注射針による投与が困難になったり、製造時の均一性が確保できないなどの問題が生じてしまう。【００４２】
さらに、核酸分子とコラーゲンとの複合体が制御されたサイズである効果は、さらに製剤加工を施すのに適した複合体を提供することにある。たとえば他の製剤キャリアー中に含有させる場合、中でもマイクロカプセルやマイクロスフェア、ナノカプセルやナノスフェア、リポソーム、エマルション等のDDSに用いられる微粒子内に封入する場合、複合体はこれらの封入したい微粒子よりも小さくかつ均一なサイズの粒子を形成している必要がある。従来の複合体は不均一で、かつ封入したい微粒子より大きなサイズであるために微粒子内に入れることができなかったが、本発明の微細複合体は、たとえばArgを添加剤として用いた場合では複合体のほとんどが400nmのフィルターを通過する微細なサイズのものが得られることから、微粒子内にも封入することが可能である。調製には、本発明の複合体を水溶液状態あるいは乾燥状態として用いることにより、通常の製剤化方法が応用できる。【００４３】
（５）核酸分子を所望の細胞に運搬するための製剤
本発明の製剤は、核酸分子を所望の細胞に運搬するために使用できる。本発明の製剤が固体状である場合、精製水、生理的食塩水、生体と等張な緩衝液等を用いて溶液状とし、所望の細胞に負荷する。
所望の細胞としては、通常の実験で使用される動物細胞や、遺伝子治療の対象となる細胞，組織、臓器等が挙げられる。核酸分子は、単独ではインビトロの細胞に血清存在下に投与してもほとんど細胞に導入できないが、コラーゲン複合体微細粒子を形成することにより、初めて効率的に核酸を細胞に導入することができる。そのため、本発明製剤は、スクリーニング方法やそれに用いる試剤に用いられるばかりでなく、遺伝子治療のための製剤として用いることが出来る。
核酸分子がプラスミドDNAまたはウイルス等の遺伝子治療に用いられるベクターである場合、細胞内に導入されたとき、コードした遺伝情報を細胞内で発現するように構成された形態が好ましく、プロモーター等、目的遺伝子の発現に必要な要素を含有する、あるいは染色体への組み込みを可能とする要素を含有するベクター等である。
プラスミドDNAおよびアンチセンスDNA、siRNA等を細胞に導入する場合、細胞に影響を極力与えない方法で行うことは必須である。しかし、一般の導入方法では、細胞障害性が高い方法であることが多いと考えられる。一方、本発明の製剤は、元来生体内に存在し、細胞と接触している物質であるコラーゲンを複合体として使用することから、細胞への影響は極めて低く、導入された核酸分子の機能をノイズなく測定することが可能である。
本発明製剤の具体的な使用方法としては、機能を解明したい遺伝子を発現するプラスミドDNA、アデノウイルスベクターあるいは機能を解明したい遺伝子の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドあるいはsiRNAとのコラーゲン複合体微細粒子からなる製剤を、培養プレート固相上に塗布、整列配置する。ここで使用する固相プレートは９６穴のマルチウエルプレートや、さらにミクロなプレートなどである。塗布した複合体粒子を乾燥して固相上に固定した後、細胞を播種し、数日間プレート上で培養する。塗布された複合体粒子は塗布された部分に接着した細胞に効率的に導入され、機能を調べたい遺伝子を発現あるいはその発現を長期間抑制する。数日後、細胞の形態や細胞内での遺伝子発現の状態、あるいは細胞から産生されたタンパク質の種類や量を調べることによって標的とした遺伝子の機能を明らかにすることができる。
【実施例】
【００４４】
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
実施例１
アルギニンによるオリゴヌクレオチドとコラーゲン複合体の微細化効果
添加剤としてアルギニン塩酸塩を用い、オリゴヌクレオチドとして細胞接着因子の１つであるマウスICAM-1に対するホスホロチオエート型アンチセンスDNA (5'-TGCATCCCCCAGGCCACCAT-3'（配列番号10))とコラーゲンとしてアテロコラーゲン（2%アテロコラーゲン溶液）を用いてそれぞれ最終濃度をアルギニンとして2%、アンチセンスをDNA 0.1mg/ml、コラーゲンを0.05%となるようにPBS（pH7.4）中で混合し、冷蔵庫（4〜10℃）で一晩静置し、コラーゲンとアンチセンスDNAとの複合体を得た。
同様に比較例として、アルギニンを含有させずにオリゴヌクレオチドとアテロコラーゲンを混合した複合体を得た。
同様に、アンチセンスDNAとして、炎症性サイトカインであるTNF-αに対するホスホロチオエート型アンチセンスDNA（5'-AACCCATCGGCTGGCACCAC-3' （配列番号11))を用いた場合についても、アルギニンを2%含有する本発明の複合体と含有しない比較例の複合体を得た。
これらの複合体のサイズを調べるため、孔径が10μmのisopore filter（Millipore製）で濾過を行い、ろ液中のアテロコラーゲン量を測定した。表１に結果を示す。【００４５】
【表１】
2006101173.tif 000002
【００４６】
表１に示すとおり、実施例であるサンプル1−1および1−3は液が澄明であり、孔径10μmのフィルターで濾過したところ、アテロコラーゲンのおよそ90%が通過した。一方、比較例として調製したサンプル1−2および1−4は液がやや白濁しており、孔径10μmのフィルターを通過したアテロコラーゲンは30%程度に過ぎなかった。
本実施例の条件では、アンチセンスDNAをアテロコラーゲンの約10倍のモル濃度で使用しているため、過剰に存在するアンチセンスの一部はフリー体として存在するものの、アテロコラーゲンの全ては、アンチセンスDNAと複合体を形成していると考えられる。従って、本発明の複合体は、アテロコラーゲン量としておよそ90%が10μｍ以下の微細粒子を形成しており、一方、比較例では約70%が10μm以上の大きな凝集物として存在していると言える。【００４７】
実施例２
各種添加剤によるオリゴヌクレオチドとコラーゲン複合体の微細化効果
本発明添加剤（塩酸塩使用または種々の酸により中和）を用いて、マウスICAM-1に対するホスホロチオエート型アンチセンスDNAとアテロコラーゲンを中性水溶液中で混合し、冷蔵庫（4〜10℃）で一晩静置し、複合体を得た。添加物の種類および各成分の最終濃度を表２にまとめた。
これらのサンプルに単鎖核酸蛍光染色試薬YOYO(Molecular Probes)を加えてアンチセンスDNAを蛍光染色し、蛍光顕微鏡により観察を行った。蛍光顕微鏡では数μm以上のサイズの粒子が判別可能であるが、いずれの例においても、均一な染色像となり、10μｍを越える複合体は認められなかった。【００４８】
【表２−１】
2006101173.tif 000003
【００４９】
【表２−２】
2006101173.tif 000004
【００５０】
実施例３
添加剤の種類と温度に対する複合体の微細粒子の凝集防止効果
添加剤としてアルギニンおよびトロメタモール（前者は塩酸塩を使用し、後者は塩酸により中和したものを使用）を用い、オリゴヌクレオチドとしてマウスICAM-1に対するホスホロチオエート型アンチセンスDNAとアテロコラーゲンをそれぞれ最終濃度2%、0.125mg/ml、0.3%となるように中性の0.1M リン酸緩衝液（pH6.5〜7.9）中で混合し、冷蔵庫（4〜10℃）で2日間静置し、複合体を得た。同様に比較例として、添加剤を含有させないもの、あるいは尿素（タンパク変性剤であり可溶化剤）、グリセリン（グリセロール、特許文献４でのコラーゲン繊維分解剤として代表的）、アセチルトリプトファンNa（タンパク製剤の安定化剤）、Tween80（界面活性剤）を選び、それぞれ添加したものを調製した。実施例および比較例のサンプルにおける各成分の最終濃度は表３のとおりである。室温における凝集防止効果を評価するため、各複合体を室温で18時間静置し、静置前後の粒子の状態を比較した。表３に静置後の目視観察の結果、図１に静置前後の蛍光顕微鏡像を示す。
図１より、室温静置前の冷蔵条件下においても、添加剤を含有しない比較例のサンプル3−3では100μmを越える大きな複合体が形成されたのに対し、アルギニン（実施例3−1）、トロメタモール（実施例3−2）、尿素（比較例3−4）、アセチルトリプトファンNa（比較例3−7）では、大きな複合体はほとんど無く微細化効果が認められた。しかし、尿素、アセチルトリプトファンNaでは、室温静置後に粒子の凝集が認められた。またグリセリン（比較例3−5）では、コラーゲンとDNA混合後に凝集（＞10μm）が認められ、室温保存後にはさらに凝集が大きくなった。同様にTween80（比較例3−7）も効果はなく、室温静置後にさらに粒子の凝集が進んで巨大化する傾向が認められた。
一方、アルギニン（実施例3−1）またはトロメタモール（実施例3−2）を含有させたサンプルでは、室温静置後も微細で均一な複合体が保たれており、室温においても凝集防止効果があることが示された。【００５１】
【表３】
2006101173.tif 000005
【００５２】
実施例４
凍結融解に対する添加剤の効果
凍結融解時の複合体粒子状態に対する本発明の添加剤の効果を確認するため、実施例のサンプル2−6および比較例のサンプル1−2を-20℃で凍結し、完全に凍結したことを確認した後、室温にて融解した。融解後、サンプルが室温に戻らないうちに5℃に保冷し、粒子サイズの評価を行った。この操作を2回繰り返した結果、実施例のサンプル2−6では、凍結融解処理前後の蛍光顕微鏡像において10μmを越える複合体は認められず、また孔径0.4μmのフィルターを用いて濾過したところ、コラーゲンの90％以上が通過し、凍結融解後も複合体の微細な粒子状態が保持されていることがわかった。一方、比較例のサンプル1−2では、凍結前後ともに100μmを越える大きな凝集物が観察され、また孔径10μmのフィルター濾過では、通過したコラーゲンは凍結前で20％程度であり、凍結融解後は10〜17％とやや減少する傾向が認められ、凍結融解により複合体粒子の凝集が促進される可能性が考えられた。【００５３】
【表４】
2006101173.tif 000006
【００５４】
実施例５
凍結乾燥に対する添加剤の効果
凍結乾燥時の粒子状態に対する添加剤の効果を調べる目的で、表５に示す組成にて実施例1と同様の方法で複合体を調製した。実施例5−2, 5−3では糖類を賦形剤として含有させた。
評価は、各複合体を調製後、凍結乾燥を行い、凍結乾燥前後での複合体粒子の状態を蛍光顕微鏡により観察した。いずれの実施例の凍結乾燥製剤においても水を加えて復水したところ速やかに溶解し澄明な水溶液となった。顕微鏡観察結果を表５に示す。【００５５】
【表５】
2006101173.tif 000007
【００５６】
実施例６
プラスミドDNAとコラーゲンの複合体に対する微細化ならびに温度と凍結融解処理に対する凝集防止効果
プラスミドDNA（pCMV-LacZ、4079 kb、分子量 約250万）を用いて、実施例１のアンセンスDNAと同様の方法で、プラスミドDNAとコラーゲンの複合体を調製した。組成は表６−1のとおり。各複合体を5℃あるいは室温に静置1日、あるいは−40℃（1日）で凍結後に室温で融解させ、複合体の粒子状態を蛍光顕微鏡で観察した。プラスミドDNAの蛍光染色はpicoGreen dsDNA Quantitation Reagent(Molecular Probes)を用いた。結果を表6-2および図2に示す。【００５７】
【表６−１】
2006101173.tif 000008
【００５８】
【表６−２】
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【００５９】
プラスミドDNAとコラーゲンの複合体形成において、比較例サンプル6−2では10μｍ以上の複合体粒子やその凝集物が認められたのに対し、実施例サンプル6−1は微細粒子の凝集が防止され、良好に分散した複合体を提供することが示された。また、比較例では、室温1日静置や凍結融解の処理によって、凝集が促進される傾向が認められたが、実施例ではこれらの処理によっても凝集が生じず、微細な粒子状態を保持する効果が認められた。【００６０】
実施例７
添加剤の種類に対する複合体の微細粒子の凝集防止効果
以下の表７に示す組成にて実施例３と同様の方法で複合体を調製した。すなわち、添加剤としてヒスチジン（塩酸で中和）、酒石酸（NaOHにより中和）およびクエン酸（Na塩）を用い、オリゴヌクレオチドとしてマウスICAM-1に対するホスホロチオエート型アンチセンスDNAとアテロコラーゲンをそれぞれ最終濃度2%、0.125mg/ml、0.3%となるように中性の0.1M リン酸緩衝液（pH6.5〜7.9）中で混合し、冷蔵庫（4〜10℃）で2日間静置し、複合体を得た。同様に比較例として、添加剤を含有させないもの、あるいは特許文献４でのコラーゲン繊維分解剤として代表的なプロピレングリコールを添加したものを調製した。複合体の状態を目視観察および蛍光顕微鏡観察により評価を行った。表７に目視観察の結果を、図３に蛍光顕微鏡像を示す。【００６１】
【表７】
2006101173.tif 000010
【００６２】
目視観察の結果は、実施例のサンプル7-1から7-3はいずれも澄明であったのに対し、比較例のサンプル7-4および7-5では白濁し不均一であった。
また顕微鏡観察（図３）より、添加剤を含有しない比較例のサンプル7−4では100μmを越える大きな複合体が形成されているのが確認された。同様に、比較例7−5のプロピレングリコールは特許文献４の代表的なコラーゲン繊維分解剤であるが、コラーゲンとDNA混合後に100μmを越える大きな複合体が多数認められ、コラーゲンとDNA複合体に対する微細化効果は認められなかった。これらに対し、本発明の添加剤であるヒスチジン（実施例7−1）、酒石酸（実施例7−2）、クエン酸（比較例7−3）では、大きな複合体はほとんど無く微細化効果が認められた。【００６３】
実施例８
アルギニンによる高濃度のオリゴヌクレオチドとコラーゲン複合体の微細化効果
実施例２と同様の方法により、表8に記載の添加剤等を使用し、以下の条件下で製剤を調製し、蛍光顕微鏡により凝集物の有無を観察した。顕微鏡観察の結果を表8および図4に示す。顕微鏡像は均一な染色像となり、10μｍを超える複合体の凝集物は認められなかった。
【表８】
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【００６４】
試験例１
マウス皮膚炎モデルにおける効果
本発明製剤の薬効を調べるために、核酸分子としてアンチセンスICAM-1を含有する製剤（表9）を実施例２と同様の方法で調製し、マウス皮膚炎モデル（Hum Gene Ther. 2004 Mar;15(3):263に評価系の記載参照）に投与して抗炎症効果を評価した。【００６５】
【表９】
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マウス皮膚炎モデルによる薬効評価は以下の方法で実施した。
8週齢のマウス （BALB/c Cr Slc, ♂）の腹部を電気バリカンおよび剃刀で剃毛した。剃毛部位に0.5% 2,4-Dinitorofluorobenzene（DNFB; 溶媒はアセトン：オリーブオイル＝4:1）25μＬを2日間連続で塗布して、マウスを感作させた。2回目の感作の6日後に、麻酔下でシックネスゲージ(peacock製)を用いて右耳介厚前値を測定した。その後、0.2% DNFBを右耳介に15μＬ塗布して皮膚炎を惹起し、15分後に製剤（実施例9-1または実施例9-2）を、アンチセンスICAM-1として10mL/kgの投与量で尾静脈内投与した。試験対照としては、生理食塩水を投与する群の他、アテロコラーゲンを含有しないアンチセンスICAM-1溶液（比較例9-3）またはアンチセンスICAM-1を含有しないアテロコラーゲン液（比較例9-4）を投与する群を設定した。DNFB塗布24時間後に再度右耳介厚を測定し、皮膚炎惹起前後の差を算出し腫脹指数[耳介腫脹度；Ear swelling index(×10-3mm)]とした。各群（n=5）の平均値（±S.E.）を算出し、図５に示した。【００６６】
マウス皮膚炎モデルによる薬効評価の結果、アンチセンスICAM-1単独（比較例9-3）またはアテロコラーゲン単独（比較例9-4）を投与した場合は、生理食塩水を投与した群（対照）と比較して有意な耳介腫脹抑制効果を示さなかったのに対し、本発明製剤（実施例9-1、9-2）を投与した群では有意な耳介腫脹抑制効果を示した。これより、本発明製剤は、核酸分子とコラーゲンの微細複合体として、アンチセンスICAM-1を単独で投与する以上の薬効を有すること示すことが判った。【００６７】
試験例２
本発明の凍結乾燥製剤の薬効を調べるために、核酸分子としてアンチセンスICAM-1を含有する凍結乾燥製剤（表10）を実施例５と同様の方法で調製し、試験例１と同様にして、マウス皮膚炎モデルに投与して抗炎症効果を評価した。
【表１０】
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マウス皮膚炎モデルによる薬効評価は以下の方法で実施した。
8週齢のマウス （BALB/c Cr Slc, ♂）の腹部を電気バリカンおよび剃刀で剃毛した。剃毛部位に0.5% 2,4-Dinitorofluorobenzene（DNFB; 溶媒はアセトン：オリーブオイル＝4:1）100μＬを1回塗布して、マウスを感作させた。感作の6日後に、麻酔下でシックネスゲージ(peacock製)を用いて左右の耳介厚前値を測定した。その後、0.2% DNFBを両耳介に20μＬ塗布して皮膚炎を惹起し、15分後に凍結乾燥製剤（実施例10-1）に水を加えて復水したものをアンチセンスICAM-1として10mL/kgの投与量で尾静脈内投与した。試験対照としては、生理食塩水を投与する群を設定した。DNFB塗布24時間後に再度両耳介厚を測定し、皮膚炎惹起前後の差を算出して腫脹指数[耳介腫脹度；Ear swelling index(×10-3mm)]とした。各群（n=6）の平均値（±S.E.）を算出した。結果を図６に示す。
マウス皮膚炎モデルによる薬効評価の結果、本発明の凍結乾燥製剤（実施例10-１）を投与した群は、生理食塩水投与群（対照）に対して有意な耳介腫脹抑制効果を示した。これより、本発明の微細複合体は凍結乾燥製剤としても有効であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明により、基本的に核酸分子とコラーゲンとからなる複合体を含有する、均一な分散性が安定に維持できる、換言すれば、均一で分散性に優れた実用的な、微細粒子製剤を提供される。即ち、本発明は、核酸分子とコラーゲンの複合体形成において、コラーゲンに対して添加剤としてある種の有機塩基あるいは酸を共存させることにより中性水溶液中でのコラーゲン自身の凝集を抑制し、さらにコラーゲンと核酸分子との複合体形成において、コラーゲンと核酸分子を介した複合体同士の凝集が進行することによる巨大化を防止し、制御されたサイズを有する複合体微細粒子含有製剤を提供するものである。本発明の製剤は、核酸医薬への応用のほか、核酸分子関連試薬や診断薬、キット類への応用も可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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