【手続補正書】
【提出日】令和2年9月7日(2020.9.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸配列に特異的なガイド核酸、
該ガイド核酸の該標的核酸配列への結合により、該標的核酸配列を改変および／または切断するヌクレアーゼ、
ナノ粒子、および必要に応じて、
該標的核酸配列の切断部位への挿入のための核酸配列を含むドナー核酸分子
を含む組成物であって、
少なくとも１つの該ガイド核酸および該ヌクレアーゼが、少なくとも１つの該ナノ粒子にコンジュゲートしている組成物。
【請求項２】
複数のナノ粒子を含み、前記ガイド核酸、前記ヌクレアーゼ、および前記ドナー核酸分子が同一のナノ粒子または異なるナノ粒子へと任意の組み合わせでコンジュゲートしている、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ガイド核酸および前記ヌクレアーゼが、前記同一のナノ粒子にコンジュゲートしている、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ガイド核酸および前記ドナー核酸分子が、前記同一のナノ粒子にコンジュゲートしている、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記ヌクレアーゼおよび前記ドナー核酸分子が、前記同一のナノ粒子にコンジュゲートしている、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記ガイド核酸、前記ヌクレアーゼ、および前記ドナー核酸分子が、前記同一のナノ粒子にコンジュゲートしている、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
前記ガイド核酸、前記ヌクレアーゼ、および前記ドナー核酸分子がそれぞれ、異なるナノ粒子にコンジュゲートしている、請求項２に記載の組成物。
【請求項８】
前記ナノ粒子が、該ナノ粒子にコンジュゲートしている少なくとも１つの細胞貫通ペプチド（ＣＰＰ）を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記少なくとも１つのＣＰＰが、５から９の塩基性アミノ酸を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのＣＰＰが、５から９の連続する塩基性アミノ酸を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＣＰＰが、５から９の連続する塩基性アミノ酸を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ナノ粒子が、直径１ｎｍから５０ｎｍの範囲のサイズである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ナノ粒子が、超常磁性である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ナノ粒子の中心が、鉄を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ナノ粒子が、高分子コートを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ナノ粒子が、固体コアを有さない、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ナノ粒子が、リポソーム、ミセルなどの高分子性である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ナノ粒子が、ＰＬＡおよび／またはＰＬＧＡなどの、１以上の型の生物分解性モノマーをベースとする高分子性である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ガイド核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ガイド核酸が、目的の前記標的遺伝子配列に対して相補的／相同な配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ガイド核酸が、合わせて融合されるｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ガイド核酸がｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含み、前記ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは別個のナノ粒子にコンジュゲートして会合できる、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記標的核酸配列が、細胞のゲノムＤＮＡ内にある、請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記標的核酸配列が、ＤＮＡ配列である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記標的核酸配列が、細胞のゲノムＤＮＡ内にある、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記標的核酸配列が、ＲＮＡ配列である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２７】
前記ヌクレアーゼが、前記ガイド核酸と結合する第１のドメインおよび前記標的核酸配列を切断する第２のドメインを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２８】
前記標的核酸が二本鎖であり、そして前記第２のドメインが該標的核酸を切除して、二本鎖切断（ＤＳＢ）または一本鎖切断（ＳＳＢ）を生産する、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記ヌクレアーゼが融合タンパク質であり、そして前記第１および第２のドメインが、別個のタンパク質供給源に由来する、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、ニッカーゼ、Ａｇｏ、Ｃｐｆ１、またはこれらの相同体の機能的ドメインを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３１】
前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、ニッカーゼ、Ａｇｏ、Ｃｐｆ１、これらの相同体、または前記ヌクレアーゼのいずれか１つの１以上のドメインの融合体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３２】
取り付けられたタンパク質が、ヒストン脱アセチル化酵素、メチレース、あるいは１以上の酵素活性を有する他のタンパク質、またはこれらの相同体もしくはこれらのタンパク質の１以上のドメインの融合体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記組成物が、前記切断部位で相同組み換えし得るドナー核酸分子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３４】
前記ドナー核酸分子が、前記改変および／または切断部位に隣接する前記標的配列へとハイブリダイズし得る配列を含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３５】
第２の標的核酸配列に特異的な第２のガイド核酸をさらに含み、該第２の標的核酸配列が同じ核酸分子内の前記標的核酸配列の１０塩基、１００塩基、５００塩基、７５０塩基、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、もしくはそれ以上、またはこれらの中の任意の数もしくは範囲以内である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３６】
請求項１から３５のいずれか１項に記載の組成物を含む細胞。
【請求項３７】
細胞のゲノムを変える方法において使用するための請求項１から３５のいずれか１項に記載の組成物であって、該方法が該細胞と該組成物とを接触させることを含むことを特徴とする組成物。
【請求項３８】
前記ナノ粒子が磁気を帯び、そして前記方法がさらに前記細胞に磁場を印加することを含むことを特徴とする、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
細胞のゲノムまたは転写産物を変える方法において使用するための組成物であって、該組成物は、
該ゲノムまたは該転写産物内の標的核酸配列に特異的なガイド核酸、
該ガイド核酸が該標的核酸配列に結合することにより該標的核酸配列を改変し得るタンパク質、および必要に応じて
該標的核酸配列の切断部位への挿入のための核酸配列を含むドナー核酸分子
にコンジュゲートする１つ以上の機能化されたナノ粒子
を含み、該方法は、該組成物と、該細胞とを接触させることを含むことを特徴とする組成物。
【請求項４０】
前記タンパク質が、前記標的核酸配列をメチル化する、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記タンパク質が、前記ガイド核酸が前記標的核酸配列に結合することにより、該標的核酸配列を切断するヌクレアーゼである、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４２】
前記ナノ粒子が磁気を帯び、そして前記方法がさらに前記細胞に磁場を印加することを含むことを特徴とする、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４３】
前記１以上のナノ粒子が、該ナノ粒子にコンジュゲートしている少なくとも１つの細胞膜貫通ペプチド（ＣＰＰ）を含む、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４４】
前記ガイド核酸、前記ヌクレアーゼ、および前記ドナー核酸分子が、同一のナノ粒子または異なるナノ粒子に、任意の組み合わせでコンジュゲートしている、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４５】
前記細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで接触されることを特徴とする、請求項３７または３９に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
下記の詳細な説明と添付される図面とを併せて参照すれば、本開示の、これらの、および他の側面は、本分野の当業者に対して、よりただちに明白になる。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
標的核酸配列に特異的なガイド核酸、
該ガイド核酸の該標的核酸配列への結合により、該標的核酸配列を改変および／または切断するヌクレアーゼ、
ナノ粒子、および必要に応じて、
該標的核酸配列の切断部位への挿入のための核酸配列を含むドナー核酸分子
を含む組成物であって、
少なくとも１つの該ガイド核酸および該ヌクレアーゼが、少なくとも１つの該ナノ粒子にコンジュゲートしている組成物。
（項目２）
複数のナノ粒子を含み、前記ガイド核酸、前記ヌクレアーゼ、および前記ドナー核酸分子が同一のナノ粒子または異なるナノ粒子へと任意の組み合わせでコンジュゲートしている、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記ガイド核酸および前記ヌクレアーゼが、前記同一のナノ粒子にコンジュゲートしている、項目２に記載の組成物。
（項目４）
前記ガイド核酸および前記ドナー核酸分子が、前記同一のナノ粒子にコンジュゲートしている、項目２に記載の組成物。
（項目５）
前記ヌクレアーゼおよび前記ドナー核酸分子が、前記同一のナノ粒子にコンジュゲートしている、項目２に記載の組成物。
（項目６）
前記ガイド核酸、前記ヌクレアーゼ、および前記ドナー核酸分子が、前記同一のナノ粒子にコンジュゲートしている、項目２に記載の組成物。
（項目７）
前記ガイド核酸、前記ヌクレアーゼ、および前記ドナー核酸分子がそれぞれ、異なるナノ粒子にコンジュゲートしている、項目２に記載の組成物。
（項目８）
前記ナノ粒子が、該ナノ粒子にコンジュゲートしている少なくとも１つの細胞貫通ペプチド（ＣＰＰ）を含む、項目１に記載の組成物。
（項目９）
前記少なくとも１つのＣＰＰが、５から９の塩基性アミノ酸を含む、項目８に記載の組成物。
（項目１０）
前記少なくとも１つのＣＰＰが、５から９の連続する塩基性アミノ酸を含む、項目８に記載の組成物。
（項目１１）
前記ＣＰＰが、５から９の連続する塩基性アミノ酸を含む、項目１０に記載の組成物。
（項目１２）
前記ナノ粒子が、直径１ｎｍから５０ｎｍの範囲のサイズである、項目１に記載の組成物。
（項目１３）
前記ナノ粒子が、超常磁性である、項目１に記載の組成物。
（項目１４）
前記ナノ粒子の中心が、鉄を含む、項目１に記載の組成物。
（項目１５）
前記ナノ粒子が、高分子コートを含む、項目１に記載の組成物。
（項目１６）
前記ナノ粒子が、固体コアを有さない、項目１に記載の組成物。
（項目１７）
前記ナノ粒子が、リポソーム、ミセルなどの高分子性である、項目１６に記載の組成物。
（項目１８）
前記ナノ粒子が、ＰＬＡおよび／またはＰＬＧＡなどの、１以上の型の生物分解性モノマーをベースとする高分子性である、項目１６に記載の組成物。
（項目１９）
前記ガイド核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの組み合わせを含む、項目１に記載の組成物。
（項目２０）
前記ガイド核酸が、目的の前記標的遺伝子配列に対して相補的／相同な配列を含む、項目１に記載の組成物。
（項目２１）
前記ガイド核酸が、合わせて融合されるｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、項目１に記載の組成物。
（項目２２）
前記ガイド核酸がｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含み、前記ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは別個のナノ粒子にコンジュゲートして会合できる、項目１に記載の組成物。
（項目２３）
前記標的核酸配列が、細胞のゲノムＤＮＡ内にある、項目１に記載の組成物。
（項目２４）
前記標的核酸配列が、ＤＮＡ配列である、項目１に記載の組成物。
（項目２５）
前記標的核酸配列が、細胞のゲノムＤＮＡ内にある、項目２４に記載の組成物。
（項目２６）
前記標的核酸配列が、ＲＮＡ配列である、項目１に記載の組成物。
（項目２７）
前記ヌクレアーゼが、前記ガイド核酸と結合する第１のドメインおよび前記標的核酸配列を切断する第２のドメインを含む、項目１に記載の組成物。
（項目２８）
前記標的核酸が二本鎖であり、そして前記第２のドメインが該標的核酸を切除して、二本鎖切断（ＤＳＢ）または一本鎖切断（ＳＳＢ）を生産する、項目２７に記載の組成物。
（項目２９）
前記ヌクレアーゼが融合タンパク質であり、そして前記第１および第２のドメインが、別個のタンパク質供給源に由来する、項目２７に記載の組成物。
（項目３０）
前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、ニッカーゼ、Ａｇｏ、Ｃｐｆ１、またはこれらの相同体の機能的ドメインを含む、項目１に記載の組成物。
（項目３１）
前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、ニッカーゼ、Ａｇｏ、Ｃｐｆ１、これらの相同体、または前記ヌクレアーゼのいずれか１つの１以上のドメインの融合体である、項目１に記載の組成物。
（項目３２）
取り付けられたタンパク質が、ヒストン脱アセチル化酵素、メチレース、あるいは１以上の酵素活性を有する他のタンパク質、またはこれらの相同体もしくはこれらのタンパク質の１以上のドメインの融合体である、項目１に記載の組成物。
（項目３３）
前記組成物が、前記切断部位で相同組み換えし得るドナー核酸分子を含む、項目１に記載の組成物。
（項目３４）
前記ドナー核酸分子が、前記改変および／または切断部位に隣接する前記標的配列へとハイブリダイズし得る配列を含む、項目２８に記載の組成物。
（項目３５）
第２の標的核酸配列に特異的な第２のガイド核酸をさらに含み、該第２の標的核酸配列が同じ核酸分子内の前記標的核酸配列の１０塩基、１００塩基、５００塩基、７５０塩基、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、もしくはそれ以上、またはこれらの中の任意の数もしくは範囲以内である、項目１に記載の組成物。
（項目３６）
項目１から３５のいずれか１項に記載の組成物を含む細胞。
（項目３７）
細胞のゲノムを変える方法であって、該細胞と項目１から３５のいずれか１項に記載の前記組成物とを接触させることを含む方法。
（項目３８）
前記ナノ粒子が磁気を帯び、そして前記方法がさらに前記細胞に磁場を印加することを含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
細胞のゲノムまたは転写産物を変える方法であって、
該ゲノムまたは該転写産物内の標的核酸配列に特異的なガイド核酸、
該ガイド核酸が該標的核酸配列に結合することにより該標的核酸配列を改変し得るタンパク質、および必要に応じて
該標的核酸配列の切断部位への挿入のための核酸配列を含むドナー核酸分子
にコンジュゲートする１つ以上の機能化されたナノ粒子と、該細胞とを接触させることを含む方法。
（項目４０）
前記タンパク質が、前記標的核酸配列をメチル化する、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記タンパク質が、前記ガイド核酸が前記標的核酸配列に結合することにより、該標的核酸配列を切断するヌクレアーゼである、項目３９に記載の方法。
（項目４２）
前記ナノ粒子が磁気を帯び、そして前記方法がさらに前記細胞に磁場を印加することを含む、項目３９に記載の方法。
（項目４３）
前記１以上のナノ粒子が、該ナノ粒子にコンジュゲートしている少なくとも１つの細胞膜貫通ペプチド（ＣＰＰ）を含む、項目３９に記載の方法。
（項目４４）
前記ガイド核酸、前記ヌクレアーゼ、および前記ドナー核酸分子が、同一のナノ粒子または異なるナノ粒子に、任意の組み合わせでコンジュゲートしている、項目３９に記載の方法。
（項目４５）
前記細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで接触される、項目３７または３９に記載の方法。