(57)【要約】  脳機能を改善または悪化を予防するための新規な治療剤、およびこの治療剤の新規な投与方法を提供すること。  本発明は、細胞増殖因子を含む、脳機能の悪化を予防するか、または脳機能を改善するための組成物を提供する。さらに好ましくは、この細胞増殖因子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）からなる群より選択される。さらに、本発明は、脳機能の悪化を予防するか、または脳機能を改善するための方法であって：細胞増殖因子を患者に投与する工程、を包含する、方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞増殖因子を有効成分として含む、脳機能の悪化を予防するか、または脳機能を改善するための組成物。
【請求項２】
前記細胞増殖因子は、血管増殖作用を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記細胞増殖因子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記細胞増殖因子は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記脳機能は、認知機能または運動機能である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記脳機能は、脳梗塞、脳血流障害、脳出血または脳血管障害による認知機能障害または運動機能障害を受けている、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記脳機能は、記憶機能および空間学習機能からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記脳機能の悪化の予防または脳機能の改善は、星状細胞の活性化により達成される、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記細胞増殖因子は、タンパク質形態または核酸形態で提供される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記細胞増殖因子は、ウイルスエンベロープとともに投与される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ウイルスエンベロープは、不活性化されている、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ウイルスエンベロープは、ＲＮＡウイルスのエンベロープである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ウイルスエンベロープは、パラミクソウイルス科のウイルスのエンベロープである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ウイルスエンベロープは、ＨＶＪのエンベロープである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１５】
前記細胞増殖因子は、前記ウイルスエンベロープ中に含有される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物は、クモ膜下腔または大槽内投与によって送達される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物は、脳梗塞、脳血流障害、脳出血、脳血管障害または脳機能の障害の発症後６日以降に投与される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記細胞増殖因子は、核酸形態であり、脳梗塞、脳血流障害、脳出血、脳血管障害または脳機能の障害の発症後６日以降に投与される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
脳機能の悪化を予防するか、または脳機能を改善するための方法であって：
Ａ）細胞増殖因子を患者に投与する工程、
を含む、方法。
【請求項２０】
前記細胞増殖因子は、血管増殖作用を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞増殖因子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）からなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞増殖因子は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞増殖因子は、ウイルスエンベロープとともに投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記ウイルスエンベロープは、ＨＶＪのエンベロープである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記脳機能は、認知機能または運動機能である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記脳機能は、脳梗塞、脳血流障害、脳出血または脳血管障害による認知機能障害または運動機能障害を受けている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記脳機能は、記憶機能および空間学習機能からなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞増殖因子は、タンパク質形態または核酸形態である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞増殖因子は、クモ膜下腔または大槽内投与によって送達される、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞増殖因子は、脳梗塞、脳血流障害、脳出血、脳血管障害または脳機能の障害の発症後６日以降に投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
脳機能の悪化を予防するか、または脳機能を改善するための医薬の製造における、細胞増殖因子の使用。
【請求項３２】
前記細胞増殖因子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）からなる群より選択される、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
前記細胞増殖因子は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）である、請求項３１に記載の使用。
【請求項３４】
前記細胞増殖因子は、タンパク質形態または核酸形態である、請求項３１に記載の使用。
【請求項３５】
細胞増殖因子を含む、神経突起伸長またはシナプス形成の促進のための組成物。
【請求項３６】
前記細胞増殖因子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）からなる群より選択される、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記細胞増殖因子は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）である、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３８】
前記細胞増殖因子は、タンパク質形態または核酸形態である、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３９】
神経突起伸長またはシナプス形成の促進のための方法であって：
Ａ）細胞増殖因子を該神経突起伸長またはシナプス形成の促進を必要とする個体に投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項４０】
前記細胞増殖因子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）からなる群より選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞増殖因子は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞増殖因子は、タンパク質形態または核酸形態である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
神経突起伸長の促進またはシナプス形成のための医薬を製造するにおける、細胞増殖因子の使用。
【請求項４４】
前記細胞増殖因子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）からなる群より選択される、請求項４３に記載の使用。
【請求項４５】
前記細胞増殖因子は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）である、請求項４３に記載の使用。
【請求項４６】
前記細胞増殖因子は、タンパク質形態または核酸形態である、請求項４３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳機能改善のための医薬および方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、細胞増殖因子などを有効成分として含有する脳機能改善のための医薬および方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
脳は、各種臓器の中で、最も重要な臓器であるが、最も研究が遅れている分野でもあり、その中でも、脳機能の制御については、全く分かっていないのが現状である。特に、脳の生理的条件の改善（例えば、血管新生）を行っても、機能に直結するかどうか不明な点が多く、脳機能の制御（例えば、改善または悪化の予防など）については、未知の点が多い。【０００３】
脳動脈のアテローム性動脈硬化症によって引き起こされる脳閉塞性疾患、もやもや病等はしばしば脳の慢性的な血流量低下を引き起こす。この状態から、その後の脳虚血性事象だけでなく痴呆を含む神経病理学的変化、すなわち脳機能の低下を引き起こすことがある（非特許文献１＝Ｓｅｋｈｏｎ  ＬＨ，Ｍｏｒｇａｎ  ＭＫ，Ｓｐｅｎｃｅ  Ｉ，Ｗｅｂｅｒ  ＮＣ．，Ｓｔｒｏｋｅ  ２５，１０２２−１０２７（１９９４）；非特許文献２＝Ｓｔｒｏｋｅ  ２９，１０５８−１０６２（１９９８）；非特許文献３＝Ｓｔｒｏｋｅ２４，２５９−２６４（１９９３）；非特許文献４＝Ｋａｌａｒｉａ  ＲＮ，Ｂｈａｔｔｉ  ＳＵ，Ｌｕｓｔ  ＷＤ，Ｐｅｒｒｙ  Ｇ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９５，１９０−１９３（１９９３））。しかし、これらの脳機能の低下を改善する有効な治療法は未だ確立されていない。【０００４】
新しい血管の発生や血管新生は親血管の内皮細胞の活性化と共に開始されるが、インビボでこの血管新生を刺激するだけでなく、インビトロで内皮細胞に対してマイトジェニックであることが示されている増殖因子を「血管新生増殖因子」と称している。血管新生増殖因子の治療的な関与は、Ｆｏｌｋｓｍａｎらによって最初に文献発表された（非特許文献５＝Ｆｏｌｋｓｍａｎら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２８５，１１８２−１１８６（１９７１））。またその後の研究によって、組換え血管新生因子、例えば繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリー（非特許文献６＝Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７，１４０１−１４０３（１９９２）、非特許文献７＝Ｎａｔｕｒｅ  ３６２，８４４−８４６（１９９３））、内皮細胞増殖因子（非特許文献８＝Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ，５４，５７５−５８３（１９９３））、および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）などを使用して心筋および後肢虚血症の動物モデルにおける側副血行路の発達を促進および／または増進させ得ることが確認されている（非特許文献９＝Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９０，ＩＩ−２２８−ＩＩ−２３４（１９９４））。さらに本発明者らは、ＨＧＦがＶＥＧＦと同様に内皮特異的増殖因子として作用することを見出している（非特許文献１０＝Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．１４，１０６７−１０７２（１９９６））。【０００５】
血管障害を治療するために前記の如き血管新生増殖因子を用いる戦略は、「治療的血管新生」と称されている。より最近では、この戦略はヒトの虚血性疾患に適用されている。しかしながら、脳機能の低下の改善または悪化の予防に対してもこの戦略が有効であるかどうかは、今日までのところ知られていないし、これまでの知見からは予測不可能である。【０００６】
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、多様な細胞に対して分裂誘発活性、運動性促進活性および形態形成活性を示すプレイオトロフィックなサイトカインである（非特許文献１１＝Ｎａｔｕｒｅ  ３４２，４４０−４４３（１９８９））。【０００７】
ＨＧＦの脳における作用については、以下のような報告がなされている。すなわち、ＨＧＦと膜貫通型チロシンキナーゼのｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦレセプターは共に脳の種々の領域で発現しており、ＨＧＦとｃ−Ｍｅｔ間の機能的な結合によって初代培養海馬のニューロンの生存が高められることや、インビトロでのニューロン発達において神経突起の伸長が誘導されることが知られている（非特許文献１２＝Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２６，４８５−４９４（１９９４）、特許文献１＝特開平７−８９８６９号公報）。最近、ＨＧＦが虚血中のニューロン内で誘導されることが報告されており（非特許文献１３＝ＢｒａｉｎＲｅｓ．７９９，３１１−３１６（１９９８））、また組換えＨＧＦが海馬における虚血後の遅発性神経細胞死に対して神経保護効果を有していることや、組換えＨＧＦを脳内に連続的に注入することにより梗塞の大きさの減少に有効であったことが報告されている（非特許文献１４＝Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．１８，３４５−３４８（１９９８）。これらの知見から、ＨＧＦは脳虚血中の重要な神経栄養因子として作用するものと考えられる。しかし、脳機能の改善にＨＧＦが有効であるかどうか知られておらず、また予測可能でもない。【０００８】
他方、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、内皮細胞に対してマイトジェニックな二量体糖タンパク質であり、そして血管透過性を高める能力を有している。ＶＥＧＦは内皮細胞に対して直接的且つ特異的なマイトジェニックな効果を有している（非特許文献１５＝Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６１，８５１−８５８（１９８９））。チロシンキナーゼレセプターＦｌｔ、Ｆｌｋ−１およびＫＤＲを含むＶＥＧＦの結合部位は、他のタイプの細胞ではなく内皮細胞上に存在しているため、ＶＥＧＦの効果は内皮細胞に限定されている。【０００９】
ＶＥＧＦの脳における作用に関しては、中枢神経系においてＶＥＧＦは虚血性障害によって脳内に急速に誘導されることが報告されており（非特許文献１６＝Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，４６０４−４６１３（１９９６））、また組換えＶＥＧＦの脳表面への投与が、梗塞量の減少に有効であったことが報告されている（非特許文献１７＝Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．１８，８８７−８９５（１９９８））。しかし詳しいことは分かっていない。また、脳機能の改善にＨＧＦが有効であるかどうか知られておらず、また予測可能でもない。【００１０】
ＦＧＦの脳における作用に関しても、ほとんどが不明であり、脳機能の改善にＦＧＦが有効であるかどうか知られておらず、また予測可能でもない。【００１１】
別の観点において、上のようなＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦなどの細胞増殖因子の作用の他、前述の如くこれらの因子は強力な血管新生増殖因子である（非特許文献１５、非特許文献１８＝Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１９，６２９−６４１（１９９２））。それ故、血管新生は脳虚血症の回復または将来の発作予防で重要な役割を果たすと考えられる。しかしながら、血管新生の作用が、脳の機能低下の改善または悪化の予防（例えば、記憶機能の改善、学習機能の改善）に関与することは知られていないし、予測可能でもない。【００１２】
さらに、組換え血管新生増殖因子は急速に消失するので脳内に連続的に注入しなければならず、そしてこの操作は臨床状況下ではかなり危険であり、非現実的である。それ故、遺伝子導入技術を適用して虚血性の脳内や周辺で血管新生増殖因子を持続して発現および分泌できれば合理的であると考えられる。しかしながら、ＨＧＦやＶＥＧＦの脳虚血性障害への適用（遺伝子治療）については全く例がなく、また脳という組織の特殊性を反映してか、現在までのところ脳機能に関する研究はほとんどなされておらず、機能改善に有効かどうか不明であるのが現状である。【００１３】
脳の疾患および障害は、ほとんどの疾患について何らかの解決策が見出されている現代において、解決策がさほど見出されていない最後の領域といえ、特に脳機能の低下の改善または悪化の予防という目的において、その治療および予防に対する需要は年々増えるばかりである。脳疾患の中でも、大脳動脈のアテローム性動脈硬化症、モヤモヤ病などによって引き起こされる大脳閉塞疾患は、しばしば、脳の慢性的な灌流不足を引き起こす。このような状態は、大脳虚血事象を導くのみでなく痴呆を含む神経病理学変化もまた導く（非特許文献１〜４）が、脳機能の改善のための有効な処置は、未だ確立されていない。【００１４】
このように、前臨床研究によって、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のような血管形成増殖因子が、動物脳虚血モデルにおいて側副血管の発達を刺激することは報告があるものの（非特許文献１９＝Ｈａｒｒｉｇａｎ  ＭＲ，Ｅｎｎｉｓ  ＳＲ，Ｍａｓａｄａ  Ｔ，Ｋｅｅｐ  ＲＦ．，Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ．２００２；５０：５８９−９８；非特許文献２０＝Ｌｙｏｎｓ  ＭＫ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＲＥ，Ｍｅｙｅｒ  ＦＢ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１９９１；５５８：３１５−２０．；および非特許文献２１＝Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．２００２；３９：１０２８−３４．）。脳機能の改善に有効であるという話は分かっていないし、予測可能でないのが現状である。
【非特許文献１】Ｓｅｋｈｏｎ  ＬＨ，Ｍｏｒｇａｎ  ＭＫ，Ｓｐｅｎｃｅ  Ｉ，Ｗｅｂｅｒ  ＮＣ．，Ｓｔｒｏｋｅ  ２５，１０２２−１０２７（１９９４）
【非特許文献２】Ｋｕｒｕｍａｔａｎｉ  Ｔ，Ｋｕｄｏ  Ｔ，Ｉｋｕｒａ  Ｙ，Ｔａｋｅｄａ  Ｍ．，Ｓｔｒｏｋｅ２９，１０５８−１０６２（１９９８）
【非特許文献３】Ｋｕｄｏ  Ｔ，Ｔａｋｅｄａ  Ｍ，Ｔａｎｉｍｕｋａｉ  Ｓ，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  Ｔ．，Ｓｔｒｏｋｅ２４，２５９−２６４（１９９３）
【非特許文献４】Ｋａｌａｒｉａ  ＲＮ，Ｂｈａｔｔｉ  ＳＵ，Ｌｕｓｔ  ＷＤ，Ｐｅｒｒｙ  Ｇ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９５，１９０−１９３（１９９３）
【非特許文献５】Ｆｏｌｋｓｍａｎら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２８５，１１８２−１１８６（１９７１）
【非特許文献６】Ｙａｎａｇｉｓａｗａ−Ｍｉｗａ  Ａ，  Ｕｃｈｉｄａ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７，１４０１−１４０３（１９９２）
【非特許文献７】Ｎａｂｅｌ  ＥＧ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６２，８４４−８４６（１９９３）
【非特許文献８】Ｐｕ  ＬＱ，  Ｓｎｉｄｅｒｍａｎ  ＡＤ，  Ａｒｅｋａｔ  Ｚ，  Ｇｒａｈａｍ  ＡＭ，  Ｂｒａｓｓａｒｄ  Ｒ，  Ｓｙｍｅｓ  ＪＦ．，  Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ，５４，５７５−５８３（１９９３）
【非特許文献９】Ｔａｋｅｓｈｉｔａ  Ｓ，  Ｐｕ  ＬＱ，  Ｓｔｅｉｎ  ＬＡ，  Ｓｎｉｄｅｒｍａｎ  ＡＤ，  Ｂｕｎｔｉｎｇ  Ｓ，  Ｆｅｒｒａｒａ  Ｎ，  Ｉｓｎｅｒ  ＪＭ，  Ｓｙｍｅｓ  ＪＦ，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９０，ＩＩ−２２８−ＩＩ−２３４（１９９４）
【非特許文献１０】Ｙ．Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｒ．Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ，  Ｊ．Ｈｉｇａｋｉ，  Ｉ．ｋｉｄａ，  Ｍ．Ａｏｋｉ，  Ａ．Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉ，  Ｋ．Ｙａｍａｄａ，  Ｓ．Ｈａｙａｓｈｉ，  Ｙ．Ｙｏ，  Ｈ．Ｎａｋａｏ，  Ｋ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，  Ｔ．Ｎａｋａｍｕｒａ  ａｎｄ  Ｔ．Ｏｇｉｈａｒａ  ，Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．１４，１０６７−１０７２（１９９６）
【非特許文献１１】Ｔ．Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｔ  Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，  Ｍ  Ｈａｇｉｙａ，  Ｔ．Ｓｅｋｉ，  Ｍ．Ｓｈｉｍｏｎｉｓｈｉ，  Ａ．Ｓｕｇｉｍｕｒａ，Ｋ．Ｔａｓｈｉｒｏ  ａｎｄ  Ｓ．Ｓｈｉｍｉｚｕ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４２，４４０−４４３（１９８９）
【非特許文献１２】Ｊｕｎｇ  Ｗ，  Ｃａｓｔｒｅｎ  Ｅ，  Ｏｄｅｎｔｈａｌ  Ｍ，  Ｖａｎｄｅ  Ｗｏｕｄｅ  ＧＦ，  Ｉｓｈｉｉ  Ｔ，  Ｄｉｅｎｅｓ  ＨＰ，  Ｌｉｎｄｈｏｌｍ  Ｄ，  Ｓｃｈｉｒｍａｃｈｅｒ  Ｐ．Ｊ，  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２６，４８５−４９４（１９９４）
【非特許文献１３】Ｈａｙａｓｈｉ  Ｔ，  Ａｂｅ  Ｋ，  Ｓａｋｕｒａｉ  Ｍ，  Ｉｔｏｙａｍａ  Ｙ．，  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．７９９，３１１−３１６（１９９８）
【非特許文献１４】Ｍｏｒｉｔａ  Ｆ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．１８，３４５−３４８（１９９８）
【非特許文献１５】Ｆｅｒｒａｒａ，  Ｎ．ａｎｄ  Ｈｅｎｚｅｌ，  ＷＪ  ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６１，８５１−８５８（１９８９）
【非特許文献１６】Ｆｏｒｓｙｔｈｅ，  ＪＡ，  Ｊｉａｎｇ，  ＢＨ，  Ｉｙｅｒ，  ＮＶ，  Ａｇａｎｉ，  Ｆ，  Ｌｅｕｎｇ，  ＳＷ，  Ｋｏｏｓ，  ＲＤ，  ａｎｄ  Ｓｅｍｅｎｚａ，  ＧＬ，  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，４６０４−４６１３（１９９６）
【非特許文献１７】Ｈａｙａｓｈｉ，  Ｔ．，  Ａｂｅ，  Ｋ．，  ＆  Ｉｔｏｙａｍａ，  Ｙ．Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．１８，８８７−８９５（１９９８）
【非特許文献１８】Ｂｕｓｓｏｌｉｎｏ，  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１９，６２９−６４１（１９９２）
【非特許文献１９】Ｈａｒｒｉｇａｎ  ＭＲ，Ｅｎｎｉｓ  ＳＲ，Ｍａｓａｄａ  Ｔ，Ｋｅｅｐ  ＲＦ．，Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ．２００２；５０：５８９−９８
【非特許文献２０】Ｌｙｏｎｓ  ＭＫ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＲＥ，Ｍｅｙｅｒ  ＦＢ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１９９１；５５８：３１５−２０．
【非特許文献２１】Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．２００２；３９：１０２８−３４．
【特許文献１】特開平７−８９８６９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、脳機能を改善または悪化を予防するための新規な治療剤、およびこの治療剤の新規な投与方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子または肝実質細胞増殖因子）遺伝子および／またはＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）遺伝子などの増殖因子を有効成分として含有する組成物が、脳機能の障害の治療または悪化の予防の効果および神経突起伸長の促進またはシナプス形成の効果を有することを見出したことによって上記課題を解決した。【００１７】
従って、本発明は以下に関する：
（１）細胞増殖因子を有効成分として含む、脳機能の悪化を予防するか、または脳機能を改善するための組成物。
（２）上記細胞増殖因子は、血管増殖作用を有する、項目１に記載の組成物。
（３）上記細胞増殖因子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）からなる群より選択される、項目１に記載の組成物。
（４）上記細胞増殖因子は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）である、項目１に記載の組成物。
（５）上記脳機能は、認知機能または運動機能である、項目１に記載の組成物。
（６）上記脳機能は、脳梗塞、脳血流障害、脳出血または脳血管障害による認知機能障害または運動機能障害を受けている、項目１に記載の組成物。
（７）上記脳機能は、記憶機能および空間学習機能からなる群より選択される、項目１に記載の組成物。
（８）上記脳機能の悪化の予防または脳機能の改善は、星状細胞の活性化により達成される、項目１に記載の組成物。
（９）上記細胞増殖因子は、タンパク質形態または核酸形態で提供される、項目１に記載の組成物。
（１０）上記細胞増殖因子は、ウイルスエンベロープとともに投与される、項目１に記載の組成物。
（１１）上記ウイルスエンベロープは、不活性化されている、項目１０に記載の組成物。
（１２）上記ウイルスエンベロープは、ＲＮＡウイルスのエンベロープである、項目１０に記載の組成物。
（１３）上記ウイルスエンベロープは、パラミクソウイルス科のウイルスのエンベロープである、項目１０に記載の組成物。
（１４）上記ウイルスエンベロープは、ＨＶＪのエンベロープである、項目１０に記載の組成物。
（１５）上記細胞増殖因子は、上記ウイルスエンベロープ中に含有される、項目１０に記載の組成物。
（１６）上記組成物は、クモ膜下腔または大槽内投与によって送達される、項目１に記載の組成物。
（１７）上記組成物は、脳梗塞、脳血流障害、脳出血、脳血管障害または脳機能の障害の発症後６日以降に投与される、項目１に記載の組成物。
（１８）上記細胞増殖因子は、核酸形態であり、脳梗塞、脳血流障害、脳出血、脳血管障害または脳機能の障害の発症後６日以降に投与される、項目１に記載の組成物。
（１９）脳機能の悪化を予防するか、または脳機能を改善するための方法であって：
Ａ）細胞増殖因子を患者に投与する工程、
を含む、方法。
（２０）上記細胞増殖因子は、血管増殖作用を有する、項目１９に記載の方法。
（２１）上記細胞増殖因子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）からなる群より選択される、項目１９に記載の方法。
（２２）上記細胞増殖因子は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）である、項目１９に記載の方法。
（２３）上記細胞増殖因子は、ウイルスエンベロープとともに投与される、項目１９に記載の方法。
（２４）上記ウイルスエンベロープは、ＨＶＪのエンベロープである、項目２３に記載の方法。
（２５）上記脳機能は、認知機能または運動機能である、項目１９に記載の方法。
（２６）上記脳機能は、脳梗塞、脳血流障害、脳出血または脳血管障害による認知機能障害または運動機能障害を受けている、項目１９に記載の方法。
（２７）上記脳機能は、記憶機能および空間学習機能からなる群より選択される、項目１９に記載の方法。
（２８）上記細胞増殖因子は、タンパク質形態または核酸形態である、項目１９に記載の方法。
（２９）上記細胞増殖因子は、クモ膜下腔または大槽内投与によって送達される、項目１９に記載の方法。
（３０）上記細胞増殖因子は、脳梗塞、脳血流障害、脳出血、脳血管障害または脳機能の障害の発症後６日以降に投与される、項目１９に記載の方法。
（３１）脳機能の悪化を予防するか、または脳機能を改善するための医薬の製造における、細胞増殖因子の使用。
（３２）上記細胞増殖因子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）からなる群より選択される、項目３１に記載の使用。
（３３）上記細胞増殖因子は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）である、項目３１に記載の使用。
（３４）上記細胞増殖因子は、タンパク質形態または核酸形態である、項目３１に記載の使用。
（３５）細胞増殖因子を含む、神経突起伸長またはシナプス形成の促進のための組成物。
（３６）上記細胞増殖因子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）からなる群より選択される、項目３５に記載の組成物。
（３７）上記細胞増殖因子は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）である、項目３５に記載の組成物。
（３８）上記細胞増殖因子は、タンパク質形態または核酸形態である、項目３５に記載の組成物。
（３９）神経突起伸長またはシナプス形成の促進のための方法であって：
Ａ）細胞増殖因子を上記神経突起伸長またはシナプス形成の促進を必要とする個体に投与する工程、
を包含する、方法。
（４０）上記細胞増殖因子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）からなる群より選択される、項目３９に記載の方法。
（４１）上記細胞増殖因子は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）である、項目３９に記載の方法。
（４２）上記細胞増殖因子は、タンパク質形態または核酸形態である、項目３９に記載の方法。
（４３）神経突起伸長の促進またはシナプス形成のための医薬を製造するにおける、細胞増殖因子の使用。
（４４）上記細胞増殖因子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）からなる群より選択される、項目４３に記載の使用。
（４５）上記細胞増殖因子は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）である、項目４３に記載の使用。
（４６）上記細胞増殖因子は、タンパク質形態または核酸形態である、項目４３に記載の使用。【００１８】
本発明者らは、ＨＧＦ、ＦＧＦおよびＶＥＧＦなどの細胞増殖因子の脳への投与によって、脳機能を改善することができるかどうかをｉｎ  ｖｉｖｏで検討した。その結果、記憶機能および空間学習機能などの脳機能において顕著な改善を示したこと、および神経突起伸長の促進またはシナプス形成を、特に、脳梗塞領域またはその周囲における状態を改善したことを明らかにした。本発明は、以上のような知見に基づき完成するに至ったものである。【００１９】
以下に、本発明の好ましい実施形態を示すが、当業者は本発明の説明および当該分野における周知慣用技術からその実施形態などを適宜実施することができ、本発明が奏する作用および効果を容易に理解することが認識されるべきである。【００２０】
従って、本発明のこれらおよび他の利点は、添付の図面等を参照して、以下の詳細な説明を読みかつ理解すれば、当業者には明白になることが理解される。
【発明の効果】
【００２１】
本発明は、脳機能の低下を改善または悪化を予防するため、および神経突起伸長の促進またはシナプス形成を、特に、脳梗塞領域またはその周囲における状態の改善のための組成物を提供する。このような脳機能の制御に直接関わるような組成物も神経突起伸長の促進またはシナプス形成を、特に、脳梗塞領域またはその周囲における状態を改善するための組成物もこれまでに知られておらず、従って、本発明は、従来にない格別の効果を示すことが示される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、処置プロトコルを示す。認知機能障害に対する肝（実質）細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子の治療効果を試験するために、ＨＧＦを、その発作の７日後に注射した。虚血後の第５６日において、認知機能障害を、モリスの水迷路および一回性受動的回避学習によって評価した。
【図２】図２は、脳の核磁気共鳴像を示す。（ａ）Ｔ２強調画像によるラットの梗塞の体積を示す。両方の群における差異は存在しなかった。強度の高い領域は、梗塞領域を示す。（ｂ）ラット脳の前頭部のＴ２強調画像の代表的な画像である。これらの画像は、３つの群に分類される。Ａ型：高い強度の領域が皮質および脳幹神経節（基底核）において見出される。Ｂ型：高い強度の領域が皮質においてかまたは脳幹神経節の幾つかの部分において見出される。Ｃ型：高い強度の領域が皮質および脳幹神経節のいくつかの部分において見出される。（ｃ）各タイプにおけるラットの数。殆どのラットがＡ型であることを示し、殆どのものがＢ型およびＣ型ではなかった。Ａ型における挙動を解析した。（ｄ）Ａ型における梗塞の体積である。有意差は見出されない。
【図３】図３は、知覚運動欠損および自発運動を示す。（ａ）知覚運動欠損のスコアを示す。知覚運動欠損は、各々の群において自発的に回復され、そして、有意差は存在しなかった。（ｂ）自発運動。中大脳動脈閉塞に供されたラットは、野外における交差点数が増大したが、群の間で差異は存在しなかった（ビヒクル処理ラットでｎ＝１５、ＨＧＦ処置ラットでｎ＝１７であり、擬似処理ラットでｎ＝１０）。
【図４】図４は、モリスの水迷路試験を示す。（ａ）不可視プラットホーム試験。中大脳動脈閉塞に供したラットは、擬似処理ラットと比較して不可視プラットホームにほとんど到達しなかった。第４〜６日で、ＨＧＦ処置ラットは、ビヒクル処置したラットよりも速く到達することができたことが顕著であった。（ｂ）可視プラットホーム試験。不可視プラットホーム試験と違って、両方の群におけるラットは、そのプラットホームに到達し得た。これらの群の間に有意差は存在しなかった（ビヒクルでｎ＝１５，ＨＧＦ処理ラットでｎ＝１７、擬似処理ラットにおいてｎ＝１０，＊ｐ＜０．０５）
【図５】図５は、一回性受動的回避学習を示す。（ａ）習得試験（Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｔｒｉａｌ）。記憶の習得について必要とされる学習の数は、中大脳動脈梗塞に供したラットおいて有意に高かった。しかし、ビヒクルとＨＧＦ処理ラットとの有意差は認められなかった。（ｂ）維持試験。照明室に滞在するラットの潜伏時間は、第１日および第３日では、ビヒクル処理ラットと比較してＨＧＦ処理ラットで長かった。（ビヒクル処理ラットでｎ＝１５、ＨＧＦ処理ラットでｎ＝１７、擬似処理ラットでｎ＝１０，＊ｐ＜０．０５）。
【図６】図６は、ＧＦＡＰについて免疫組織化学を示す。第１４日および第５６日での、同側の皮質におけるＧＦＡＰについての免疫組織化学の代表的画像である。ＨＧＦ処理ラットの梗塞周辺領域（＃）において、免疫反応性は、第１４日で増大し、そして、第５６日で減少した。ＩＣ：虚血中心（各群においてｎ＝３であり、ｂａｒ＝１００μｍである）。
【図７】図７は、ＭＡＰ２陽性細胞またはＧＦＡＰ陽性細胞についての定量分析である。皮質における、ＭＡＰ２陽性細胞またはＧＦＡＰ陽性細胞の定量。ＭＡＰ２陽性細胞の数は２群の間で差異はなかったが、ＨＧＦ処理ラットのＧＦＡＰに対する免疫反応性は、ビヒクル処理ラットと比較して第１４日で高く、そして、第５６日で低かった。（ＰＩ：梗塞周辺領域、Ｃ：対側領域、各々群においてｎ＝３である。＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１である）。
【図８】図８は、Ｃｄｃ４２についての免疫組織化学を示す。（ａ）第１４日での同側の皮質におけるＣｄｃ４２についての免疫組織化学の代表的画像である。Ｃｄｃ４２に対する免疫反応性の数は、ＨＧＦ処理マウスにおける梗塞周辺領域（＃）において有意に増大した。（ＩＣ：虚血中心，Ｂａｒ＝１００μｍ）。（ｂ）Ｃｄｃ４２免疫反応性細胞についての定量分析。この数は、梗塞周辺領域（＃）において計数した。ＨＧＦ処理ラットは、Ｃｄｃ４２免疫反応性細胞の増大を示す。（各群においてｎ＝３である。＊ｐ＜０．０５）。
【図９】図９は、ＡＬＰ染色の代表的な図である。同側皮質におけるＡＬＰによって染色される冠状切片。梗塞周辺領域（＃）の動脈の構造は、第１４日では変わっていなかった。しかし、ＨＧＦ処理したラットの動脈は、第５６日でより複雑なパターンを示した（ＩＣ：虚血中心）。
【図１０】図１０は、ＡＬＰ染色の定量分析を示す。皮質でのＡＬＰによって染色した血管の定量を示す。血管の面積および長さは、第１４日で異なっており、それらは、第５６日にてＨＧＦ処理ラットで有意に増大した（ｎ＝３，＊ｐ＜０．０５）。
【図１１】図１１は、コントロール遺伝子またはＨＧＦ遺伝子を投与したときの、梗塞領域および対側領域におけるＣｄｃ４２およびシナプトフィシンについての免疫組織化学の代表的画像である。ａは、領域をＣｄｃ４２について免疫染色した結果を示し、ａの左側は、梗塞領域を示し、ａの右側は対側領域を示す。ａの上段は、コントロール遺伝子（ベクター）を投与した結果を示し、ａの下段は、ＨＧＦ遺伝子を投与したときの結果を示す。ＩＣは、虚血中心であり、＃は梗塞周辺領域を示し、バーは、１００μｍを示す。ｂは、梗塞領域（Ｐｉ）および対側領域（Ｃ）におけるＣｄｃ４２陽性細胞数を示す。＊は、統計学的有意を示す（ｐ＜０．０５）。斜線は、ＨＧＦ遺伝子投与群を示し、水玉模様はコントロールベクター群を示す。ｃは、領域をシナプトフィシンについて免疫染色した結果を示し、ｃの左側は、梗塞領域を示し、ｃの右側は対側領域を示す。ｃの上段は、コントロール遺伝子（ベクター）を投与した結果を示し、ｃの下段は、ＨＧＦ遺伝子を投与したときの結果を示す。バーは１００μｍを示す。ｄは、梗塞領域（Ｐｉ）および対側領域（Ｃ）におけるシナプトフィシン陽性細胞数を示す。＊は、統計学的有意を示す（ｐ＜０．０５）。斜線は、ＨＧＦ遺伝子投与群を示し、水玉模様はコントロールベクターを示す。
【配列表の説明】
【００２３】
（配列表）
配列番号１：ＨＧＦの核酸配列
配列番号２：ＨＧＦのアミノ配列
配列番号３：ＶＥＧＦの核酸配列
配列番号４：ＶＥＧＦのアミノ酸配列
配列番号５：ａＦＧＦの核酸配列
配列番号６：ａＦＧＦのアミノ酸配列
配列番号７：ｐｃＤＮＡ３．１（−）ＨＧＦ
配列番号８：ｐＶＡＸ１ＨＧＦ／ＭＧＢ１
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。【００２５】
以下に本発明を、必要に応じて、添付の図面を参照して例示の実施例により記載する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の表現（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。【００２６】
（定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。【００２７】
本明細書において「脳機能」とは、大脳のいくつものパートが共同して行う複雑な活動をいい、例えば、言語機能、認知機能、運動機能、記憶機能、学習機能、注意機能などを挙げることができる。【００２８】
本明細書において、「認知機能」とは、ある生物が、他の生物の同一性を識別することができる能力をいう。「認知機能」は、例えば、行動試験、自発活動試験、モリスの水迷路試験などによって確認することができる。【００２９】
本明細書において「運動機能」とは、神経または脳が、運動を司ることをいう。「運動機能」は、例えば、行動試験、自発活動試験、モリスの水迷路試験などによって確認することができる。【００３０】
本明細書において「記憶機能」とは、脳または神経系が、以前に受けた状態または情報について、記録しておく機能をいう。「記憶機能」は、例えば、行動試験、モリスの水迷路試験、受動回避学習などによって確認することができる。【００３１】
本明細書において、「学習機能」とは、脳または神経系が、以前に受けた状態を記録し、そして利用することができる機能をいう。「学習機能」は、例えば、行動試験、モリスの水迷路試験、受動回避学習などによって確認することができる。【００３２】
本発明において使用される「肝（実質）細胞増殖因子」（ＨＧＦ）とは、例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３４２，４４０（１９８９）、特許第２５７７０９１号公報、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６３，９６７（１９８９）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ，Ｃｏｍｍｕｎ．，１７２，３２１（１９９０）などに記載されている。代表的な配列を、配列番号１および２（それぞれ、核酸およびアミノ酸の配列）に示す。そのようなＨＧＦを発現させる際には、ＨＧＦのｃＤＮＡを後述の如き適当な発現ベクター（非ウイルスベクター、ウイルスベクター）に組み込んだものを使用することができる。ここでＨＧＦをコードするｃＤＮＡの塩基配列は、前記文献に記載されている他、Ｇｅｎｂａｎｋ等のデータベースにも登録されている。従ってこれらの配列情報に基づき適当なＤＮＡ部分をＰＣＲのプライマーとして用い、例えば肝臓や白血球由来のｍＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲ反応を行うことなどにより、ＨＧＦのｃＤＮＡをクローニングすることができる。これらのクローニングは、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｔ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９）等の基本書に従い、当業者ならば容易に行うことができる。【００３３】
さらに、本発明のＨＧＦは前述のものに限定されず、発現されるタンパク質がＨＧＦと実質的に同じ作用を有するタンパク質である限り、本発明のＨＧＦとして使用できる。例えば、前記ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質等の公知のＨＧＦタンパク質のアミノ酸配列に対して、１もしくは複数（好ましくは数個）のアミノ酸配列が置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＨＧＦと実質的に同じ作用を有するタンパク質もまた、本発明のＨＧＦに包含される。【００３４】
また、これらのタンパク質をコードする核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）を、上記タンパク質に代えて本発明に用いることができる。なお、本明細書中、細胞増殖因子について言う「タンパク質形態」とは、細胞増殖因子そのもの（すなわち、タンパク質）またはそれと実質的に同じ作用を有するタンパク質を指し、「核酸形態」とは、細胞増殖因子そのものまたはそれと実質的に同じ作用を有するタンパク質をコードする核酸、またはこの核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸（本明細書中、これらの拡散を遺伝子と表記する場合がある）を含み、被験体に投与された場合、該核酸がコードするタンパク質が被験体で発現される形態にあることを指す。「核酸形態」で被験体に投与された場合、該核酸がコードするタンパク質が被験体内で発現され、該タンパク質が細胞増殖因子としての作用を発揮する。【００３５】
本発明において使用される「血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）」は、例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１９，９８３（１９８３）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８４，１４７０（１９８９）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６１，８５１（１９８９）などに記載されている。代表的な配列を、配列番号３および４に示す（それぞれ、核酸およびアミノ酸の配列）。ＶＥＧＦは、例えば、ＶＥＧＦのｃＤＮＡを後述の如き適当な発現ベクター（非ウイルスベクター、ウイルスベクター）に組み込んだものを使用することにより調製することができる。ＶＥＧＦは、ヒトにおいては転写に際しての選択的スプライシングにより、４種類のサブタイプ（ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ２０６）の存在が報告されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１９，９８３（１９８３）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８４，１４７０（１９８９）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６１，８５１（１９８９））。本発明においてはこれらのいずれのＶＥＧＦをも使用することが可能であるが、生物学的に最も活性が強いという観点から、ＶＥＧＦ１６５遺伝子がより好ましい。さらに前記のＨＧＦの場合と同様に、これらＶＥＧＦの遺伝子に対して改変等を施した遺伝子であっても、ＶＥＧＦとしての作用を有するタンパク質をコードする遺伝子である限り、本発明のＶＥＧＦの範疇に含まれる。【００３６】
ＶＥＧＦもＨＧＦと同様に、文献（例えばＳｃｉｅｎｃｅ，２４６，１３０６（１９８９））記載の配列およびデータベースに登録されている配列情報に基づき、当業者ならば容易にクローニングすることができ、またその改変等も容易に行うことができる。【００３７】
本明細書において「繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）」は、例えば、Ｄｉｌｂｅｒ  ＭＳ，  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２２（１２）：１１２９−３３に記載されており、種々の正常細胞，癌細胞中で発現している．遺伝子産物は，ヘパリンに対する強い結合性を示すなど，構造ならびに機能の類似した少なくともｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ）、ａＦＧＦ（ａｃｉｄｉｃ），ｉｎｔ−２遺伝子産物のＦＧＦ３，Ｋ−ｆｇｆ／ｈｓｔ１遺伝子産物のＦＧＦ４，ＦＧＦ５，ｈｓｔ２遺伝子産物のＦＧＦ６，角化細胞増殖因子（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ＫＧＦ），アンドロゲン誘導増殖因子（ＡＩＧＦ），ＦＧＦ９の９種類の関連した増殖因子が知られている。代表的な配列を、配列番号５および６に示す（それぞれ、核酸およびアミノ酸の配列＝ａＦＧＦ）。【００３８】
本明細書において「血管新生」とは、血管が新たに形成されることおよびそのように形成する活性をいう。【００３９】
本明細書において用いられる「血管新生作用（活性）」とは、ある因子が標的に作用したとき、その標的において血管を新たに形成する能力をいう。【００４０】
本明細書において「神経突起伸長」とは、任意の神経の突起が伸長することをいい、顕微鏡などによって神経の突起を観察し、実質的な突起伸長の存在により確認される。【００４１】
本明細書において「シナプス」とは、ニューロン相互またはニューロンと他細胞間の接合関係(シナプス結合)、またはその接合部位をいう。シナプスは、電子顕微鏡の観察により観察され得、例えば、シナプスを定義する主な指標としては、(1)シナプス小胞；(2)シナプス間隙；(3)シナプス前膜および下膜(後膜)の肥厚の存在等を挙げることができる。従って、本明細書では、「シナプス形成」とは、シナプスが無かった場所にシナプスが形成されることをいい、上記方法に基づきシナプスの不存在および存在を確認することによって形成したかどうかを確認することができる。【００４２】
本明細書において「センダイウイルス」または「ＨＶＪ」（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）とは、互換的に用いられ、パラミクソウイルス科パラミクソウイルス属に属する、細胞融合作用を有するウイルスをいう。Ｍ．Ｋｕｒｏｙａら（１９５３）がセンダイウイルスとして報告した。ゲノムは，約１５５００塩基長のマイナス鎖ＲＮＡである。センダイウイルスのウイルス粒子にはエンベロープがあり、直径１５０〜３００ｎｍの多形性を示す。センダイウイルスは、ＲＮＡポリメラーゼを有する。熱に不安定で，ほとんどあらゆる種類の赤血球を凝集し、溶血性も示す。発育鶏卵および／または各種動物の腎臓由来培養細胞の細胞質中で増殖する。センダイウイルスは、株細胞に感染させた場合は持続感染を起こしやすい。種々の細胞を融合する能力をもつことから、細胞のヘテロカリオン形成、雑種細胞の作製などの細胞融合に広く利用されている。【００４３】
本明細書において「（ウイルス）エンベロープ」とは、センダイウイルスなどの特定のウイルスに存在するヌクレオキャプシドの周囲を取り囲む脂質二重層を基本とする膜構造をいう。エンベロープは、通常、細胞から出芽によって成熟するウイルスにみられる。エンベロープは、概してウイルス遺伝子によりコードされたスパイクタンパク質からなる小突起構造物と宿主由来の脂質とからなる。したがって、「（ウイルス）エンベロープベクター」は、エンベロープをベクター（運び屋）として利用する際の名称であり、本明細書では、場合に応じて（ウイルス）エンベロープと互換可能に使用され得る。【００４４】
中枢神経系（ＣＮＳ）への遺伝子（すなわち、本発明における細胞増殖因子の核酸形態のもの）の移入は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（Ｆａｎ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ．１９９８；２４８：６１−４）、レトロウイルス（Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｉ  ＩＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ．２００１；６５：２０８−１９）、アデノウイルス（Ｍｉｙａｇｕｃｈｉ  Ｋ，Ｍａｅｄａ  Ｙ，Ｃｏｌｌｉｎ  Ｃ，Ｓｉｈａｇ  ＲＫ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｂｕｌｌ．２０００；５１：１９５−２０２．）、および単純疱疹ウイルス  １（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＰＡ，Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｋ，Ｇａｇｅ  ＦＨ，Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ  Ｔ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１９９２；１２：９５−１０２．）を含む種々のウイルスベクターを用いて達成されている。これらのベクター系は、ヒト遺伝子治療に関して利点および不利益を有する。これらの方法は、中枢神経系へのインビボ遺伝子移入には有効であるが、安全性および産生量のような多数の問題が、特にヒトの場合の遺伝子治療に関して生じている。ＨＶＪ−Ｅベクターは、いずれもの明らかな毒性も伴わずに、遺伝子を中枢神経系にトランスフェクトする高い効力を有する。ＨＶＪ−Ｅベクターは、本発明において利用され得る。【００４５】
これらの問題を克服するために、本発明者らは、非ウイルスベクター系である、ＨＶＪ（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  Ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ＝センダイウイルス）エンベロープベクター上述のように開発し、利用している。このベクター系は、ウイルスエンベロープおよびリポソームを用いた第１世代のＨＶＪベースの遺伝子移入（ＨＶＪリポソーム方法）（Ｙａｍａｄａ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９６；２７１：Ｒ１２１２−２０；Ｋａｎｅｄａ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１９８７；１７３：５６−６９．）に基づいて開発された。第１世代のＨＶＪベクターは、ラットおよび霊長類の中枢神経系へのトランスフェクションに対して大きな可能性を有するが（Ｙａｍａｄａ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．前出；Ｈａｇｉｈａｒａ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０００；７：７５９−６３．）、複雑な手順および保存の困難さなどの理論上の不利益がある。新規の非ウイルスベクター系である、ＨＶＪ−エンベロープ（ＨＶＪ−Ｅ）ベクターは、外来遺伝子を移入するためにＨＶＪのエンベロープのみを利用する。【００４６】
本明細書において「不活性化」とは、ウイルス（例えば、センダイウイルス）について言及されるとき、ゲノムが不活性化されることをいう。不活性化されたウイルスは、複製欠損である。不活性化は、本明細書において記載される方法（例えば、アルキル化など）によって達成される。そのような不活性化の方法としては、例えば、（ａ）ウイルス（例えば、ＨＶＪ）をアルキル化剤で処理して不活性化する工程、（ｂ）ウイルスまたは不活性化されたウイルスの濃縮液を得る工程、並びに（ｃ）ウイルスまたは不活性化されたウイルスをカラムクロマトグラフィー次いで限外濾過により精製する工程を含む方法、ならびにこれらの工程の順序を入れ替えた方法などが挙げられるがそれらに限定されない。【００４７】
本明細書において「アルキル化」とは、有機化合物の水素原子をアルキル基で置換する作用を有すことをいい、「アルキル化剤」（ａｌｋｙｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）とは、アルキル基を与える化合物をいう。アルキル化剤としては、例えば、ハロゲン化アルキル，硫酸ジアルキル、スルホン酸アルキル、アルキル亜鉛などの有機金属化合物が挙げられる。好ましいアルキル化剤としては、β−プロピオラクトン、ブチロラクトン、ヨウ化メチル、ヨウ化エチル、ヨウ化プロピル、臭化メチル、臭化エチル、臭化プロピル、ジメチル硫酸、ジエチル硫酸などが挙げられるがそれらに限定されない。【００４８】
1つの局面において、本発明はまた、脳機能の改善または悪化の予防のための方法または治療に関する。【００４９】
別の局面において、本発明は、神経突起伸長の促進またはシナプス形成（特に、脳梗塞領域またはその周囲において生じるものを対象とするがそれに限定されない。）のための方法または治療に関する。【００５０】
本発明の薬学的組成物および医薬の投与は、経口または非経口により達成される。非経口送達の方法としては、局所、動脈内（例えば、頚動脈を介する）、筋肉内、皮下、髄内、クモ膜下腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、または鼻孔内の投与が挙げられる。本発明は、処置部位に到達する経路であれば、どのような経路でもよい。【００５１】
本明細書において「遺伝子治療」または「遺伝子療法」とは、患者に核酸（例えば、ＤＮＡ）を導入することにより疾患を治療しようとする方法をいう。遺伝子治療には、裸で核酸を注入する工程を利用する方法もあるが、何らかのベクターを利用することが多く、本発明では、ウイルスエンベロープをそのようなベクターとして使用し得る。遺伝子治療は、発現されたか、または発現可能な核酸の、被験体への投与により行われる。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらのコ−ドタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。【００５２】
当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法が、本発明に従って使用され得る。例示的な方法は、遺伝子治療の方法の一般的な概説書である、ＧｏｌｄｓｐｉｅＬｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５  （１９９３）；  Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５  （１９９１）；  Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６  （１９９３）；  Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２  （１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７  （１９９３）；  Ｍａｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５  （１９９３）に記載されている。遺伝子治療において使用される一般的に公知の組換えＤＮＡ技術は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ  （１９９３）；  およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ  （１９９０）に記載される。【００５３】
本発明の一つの実施形態では、導入にはウイルスエンベロープが使用され得るが、ウイルスエンベロープに加えて、本発明の組成物および医薬は、賦形剤または薬学的に使用できる製剤を調製するために、エンベロープのプロセシングを促進する他の化合物を含む、適切な、薬学的に受容可能なキャリアーを含み得る。【００５４】
本明細書において「薬学的に受容可能なキャリア」は、医薬または動物薬を製造するときに使用される物質であり、有効成分に有害な影響を与えないものをいう。そのような薬学的に受容可能なキャリアとしては、例えば、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的アジュバントなどが挙げられるがそれらに限定されない。【００５５】
本発明の薬学的組成物および医薬は、任意の無菌生体適合性薬学的キャリア（生理食塩水、緩衝化生理食塩水、および水を含むが、それらに限定されない）中で投与され得る。これらの分子のいずれも、アジュバント、および／または薬学的に受容可能なキャリアと混合する薬学的組成物中にて、単独で、あるいは他の薬剤と組み合わせて患者に投与され得る。本発明のある実施形態において、薬学的に受容可能なキャリアは薬学的に不活性である。【００５６】
非経口投与用の薬学的製剤は活性化合物の水溶液であってもよい。注射のために、本発明の薬学的組成物は水溶液、好ましくはハンクスの溶液、リンゲル溶液、または緩衝化生理食塩水のような生理学的に適合する緩衝液中に処方され得る。さらに、活性化合物の懸濁物は、リポソームを含み得る。【００５７】
本発明の薬学的組成物は、本発明のエンベロープが意図される目的を達成するのに有効な量で含有される組成物を含む。「治療的有効量」または「薬理学的有効量」は当業者に十分に認識される用語であり、意図される薬理学的結果を生じるために有効な薬剤の量をいう。従って、治療的有効量は、処置されるべき疾患の症状を軽減するのに十分な量である。所定の適用のための有効量（例えば、治療的有効量）を確認する１つの有用なアッセイは、標的疾患の回復の程度を測定することである。実際に投与される量は、処置が適用されるべき個体に依存し、好ましくは、所望の効果が顕著な副作用をともなうことなく達成されるように最適化された量である。治療的有効用量の決定は十分に当業者の能力内にある。【００５８】
いずれの化合物についても、治療的有効用量は、最初に、細胞培養アッセイまたは任意の適切な動物モデルのいずれかにおいて、見積もられ得る。動物モデルはまた、所望の濃度範囲および投与経路を達成するために用いられる。次いで、このような情報を用いて、ヒトにおける投与に有用な用量および経路を決定することができる。【００５９】
治療的有効量とは、疾患の程度または状態を軽減するエンベロープの量をいう。このような化合物の治療効果および毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順（例えば、ＥＤ５０、集団の５０％において治療的に有効な用量；およびＬＤ５０、集団の５０％に対して致死的である用量）によって決定され得る。治療効果と毒性効果との間の用量比は治療係数であり、それは比率ＥＤ５０／ＬＤ５０として表され得る。大きな治療係数を呈する薬学的組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータが、ヒトでの使用のための量の範囲を公式化するのに使用される。このような化合物の用量は、好ましくは、毒性をほとんどまたは全くともなわないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。この用量は、使用される投与形態、患者の感受性、および投与経路に依存してこの範囲内で変化する。一例として、エンベロープの投与量は、年齢その他の患者の条件、疾患の種類、使用するエンベロープの種類等により適宜選択される。【００６０】
ヒトに本発明のエンベロープベクターを利用して細胞増殖因子を投与する場合、１被験体あたり、４００〜４００，０００ＨＡＵ相当の、好ましくは１，２００〜１２０，０００ＨＡＵ相当の、より好ましくは４，０００〜４０，０００ＨＡＵ相当のエンベロープベクターが投与され得る。投与されるエンベロープ中に含まれる外来遺伝子の量は、１被験体あたり、２〜２，０００μｇ、好ましくは６〜６００μｇ、より好ましくは２０〜２００μｇであり得る。【００６１】
本明細書において「ＨＡＵ」とは、ニワトリ赤血球０．５％を凝集可能なウイルスの活性をいう。１ＨＡＵは、ほぼ２４００万ウイルス粒子に相当する（Ｏｋａｄａ，Ｙ．ら、Ｂｉｋｅｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ４，２０９−２１３、１９６１）。上記の量は、例えば、１日１回から数回投与することができる。【００６２】
正確な用量は、治療されるべき患者を考慮して、個々の臨床医によって選択される。用量および投与は、十分なレベルの活性部分を提供するか、または所望の効果を維持するように調整される。考慮され得るさらなる因子としては、疾患状態の重症度（例えば、腫瘍のサイズおよび位置；患者の年齢、体重、および性別；投与の食餌制限時間、および頻度、薬物組合せ、反応感受性、および治療に対する耐性／応答）が挙げられる。特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて、持続作用性薬学的組成物は、３〜４日毎に、毎週、２週間に１回、または１ヶ月の１回投与され得る。特定の用量および送達の方法に関するガイダンスは当該分野で公知の文献に提供されている。【００６３】
本発明の方法において使用される組成物および医薬の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、被験体の年齢、体重、性別、既往歴、細胞生理活性物質の形態または種類、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。【００６４】
本発明の方法を被検体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間−１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。【００６５】
本発明の組成物および医薬は、ヒト用途でも使用され得るが、その他の宿主（例えば、哺乳動物など）を対象として使用されてもよい。【００６６】
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら  （１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。【００６７】
本発明では、脳内に細胞増殖因子を送達する方法であって、１）頭部または頸部の動脈を一過的に閉鎖する工程；および２）該頭部または頸部の動脈が閉鎖されている間に、細胞増殖因子を脳内に導入する工程、を包含する方法を利用することができる。ここで、一過的に動脈を閉鎖することによって、細胞増殖因子が脳内に効率よく（例えば、２倍以上）導入される。一過的に閉鎖する方法は、バルーンカテーテル、クリッピング、生理的には脳梗塞などが挙げられる。バルーンカテーテル、クリッピングが好ましい。一過的とは、ここでは、細胞増殖因子を投与するのに十分な時間（例えば、少なくとも１分、少なくとも５分など）であるが、好ましくは、１〜１２０分間であり得る。【００６８】
本発明は、脳機能障害の処置のための医薬を製造するための使用に関する。この使用において、細胞増殖因子として好ましい実施形態は、本明細書において記載される任意の形態が使用され得る。【００６９】
製剤中のＤＮＡの含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調節することができるが、通常、本発明のＤＮＡとして０．０００１−１００ｍｇ、好ましくは０．００１−１０ｍｇであり、これを数日ないし数ヶ月に１回投与するのが好ましい。【００７０】
（好ましい実施形態の説明）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。【００７１】
本発明は、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦなどの細胞増殖因子により、脳機能障害が改善または予防されることを初めて明らかにした。従来は、脳の生理的現象として、血管、細胞レベルでの結果は出ていたが、脳がシステム全体として機能（特に、記憶機能など）が改善されることが本発明において初めて明らかにされた。従って本発明は、ＨＧＦまたはＶＥＧＦを導入することによって、機能レベルの改善または予防を実証した。従ってＨＧＦおよびＶＥＧＦは、脳虚血に起因する脳機能低下または障害、脳の血流量低下に起因する脳機能低下または障害等の、種々の脳機能低下または障害に対する治療または予防剤として、有効に使用される。【００７２】
具体例として、脳血管閉塞、脳梗塞、脳血栓、脳塞栓、脳卒中（クモ膜下出血や一過性脳虚血、脳動脈硬化症などを含む）、脳出血、もやもや病、頭部外傷、脳血管性痴呆、アルツハイマー型痴呆、脳出血後遺症または脳梗塞後遺症などに起因する、脳機能低下または障害を治療または予防する薬剤として有効に使用される。【００７３】
また、例えばアルツハイマー病、アルツハイマー型老年痴呆症、筋萎縮性側索硬化症、あるいはパーキンソン氏病といった神経変性疾患に起因する脳機能低下または障害を治療または予防する薬剤としても、有効に使用することができる。【００７４】
本発明においては、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦなどは各々単独で用いることもできれば、または、両者を併用して使用することも可能である。また、他の血管内皮増殖因子の遺伝子と共に用いることもできる。さらに、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦなどの核酸形態と、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦなどのタンパク質とを併用することも可能である。好ましくはＨＧＦ核酸形態とＨＧＦタンパク質との組み合わせ、またはＶＥＧＦ核酸形態とＶＥＧＦタンパク質との組み合わせであり、さらに好ましくはＨＧＦ核酸形態とＨＧＦタンパク質との組み合わせである。【００７５】
なお、ここで用いるＨＧＦタンパク質としては、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば如何なる方法で調製されたものでも良く、また市販品（例えば東洋紡績株式会社、ＣｏｄｅＮｏ．ＨＧＦ−１０１等）を使用することもできる。前記クローニングにより得られたＨＧＦのｃＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、これを宿主細胞に導入して形質転換体を得、この形質転換体の培養上清から目的とする組換えＨＧＦタンパク質を得ることができる（例えばＮａｔｕｅ，３４２，４４０（１９８９）、特許第２５７７０９１号等参照）。またＶＥＧＦタンパク質も同様にして得ることができる。【００７６】
ＦＧＦは、科研製薬から市販されるものまたはＧｅｎＢａｎｋにおいて得られた配列から作製して使用することができる。【００７７】
次に、本発明の遺伝子治療において用いられる遺伝子導入方法、導入形態および導入量等について具体例を記述する。【００７８】
ＨＧＦのｃＤＮＡを発現しうる形で含む発現ベクターなど、核酸形態にあるＨＧＦなどの増殖因子を有効成分とする組成物を患者に投与する場合、その投与形態としては非ウイルスベクターを用いた場合と、ウイルスベクターを用いた場合の二つに大別され、実験手引書などにその調製法、投与法が詳しく解説されている（別冊実験医学，遺伝子治療の基礎技術，羊土社，１９９６、別冊実験医学，遺伝子導入＆発現解析実験法，羊土社，１９９７、日本遺伝子治療学会編遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス，１９９９）。以下、具体的に説明する。【００７９】
Ａ．非ウイルスベクターを用いる場合  慣用の遺伝子発現ベクターに目的とする遺伝子が組み込まれた組換え発現ベクターを用いて、以下のような手法により目的遺伝子を細胞や組織に導入することができる。【００８０】
細胞への遺伝子導入法としては、リポフェクション法、リン酸−カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、微小ガラス管を用いたＤＮＡの直接注入法などが挙げられる。また、組織への遺伝子導入法としては、内包型リポソーム（ｉｎｔｅｒｎａｌｔｙｐｅｌｉｐｏｓｏｍｅ）による遺伝子導入法、静電気型リポソーム（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｔｙｐｅｌｉｐｏｓｏｍｅ）による遺伝子導入法、ＨＶＪ−リポソーム法、改良型ＨＶＪ−リポソーム法（ＨＶＪ−ＡＶＥリポソーム法）、レセプター介在性遺伝子導入法、パーティクル銃で担体（金属粒子）とともにＤＮＡ分子を細胞に移入する方法、ｎａｋｅｄ−ＤＮＡの直接導入法、正電荷ポリマーによる導入法等のいずれかの方法に供することにより、組換え発現ベクターを細胞内に取り込ませることが可能である。【００８１】
このうちＨＶＪ−リポソームは、脂質二重膜で作られたリポソーム中にＤＮＡを封入し、さらにこのリポソームと不活化したセンダイウイルス（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆＪａｐａｎ：ＨＶＪ）とを融合させたものである。当該ＨＶＪ−リポソーム法は従来のリポソーム法と比較して、細胞膜との融合活性が非常に高いことを特徴とするものであり、好ましい導入形態である。ＨＶＪ−リポソームの調製法については文献（実験医学別冊，遺伝子治療の基礎技術，羊土社，１９９６、遺伝子導入＆発現解析実験法，羊土社，１９９７、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３，１４５８−１４６４（１９９４）、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７１，Ｒ１２１２−１２２０（１９９６））などに詳しく述べられており、また後述の実施例にも詳しく記載されているため、それらを参照されたい。なおＨＶＪとしてはＺ株（ＡＴＣＣより入手可能）が好ましいが、基本的には他のＨＶＪ株（例えばＡＴＣＣ  ＶＲ−９０７、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１０５など）も用いることができる。【００８２】
さらに、ｎａｋｅｄ−ＤＮＡの直接導入法は、上記手法のうち最も簡便な手法であり、この観点から好ましい導入法である。【００８３】
ここで用いられる発現ベクターとしては、生体内で目的遺伝子を発現させることのできるベクターであれば如何なる発現ベクターであっても良いが、例えばｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ  １０８，１９３−２００（１９９１））や、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＺｅｏＳＶ（インビトロゲン社、ストラタジーン社）などの発現ベクターが挙げられる。【００８４】
Ｂ．ウイルスベクターを用いる場合  ウイルスベクターとしては、組換えアデノウイルス、レトロウイルス等のウイルスベクターを用いた方法が代表的なものである。より具体的には、例えば、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０、免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに目的とする遺伝子を導入し、細胞に組換えウイルスを感染させることによって、細胞内に遺伝子を導入することが可能である。【００８５】
本発明の遺伝子治療剤の患者への導入法としては、遺伝子治療剤を直接体内に導入するｉｎ  ｖｉｖｏ法、および、ヒトからある種の細胞を取り出して体外で遺伝子治療剤を該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すｅｘ  ｖｉｖｏ法がある（日経サイエンス、１９９４年４月号、２０−４５頁、月刊薬事、３６（１），２３−４８（１９９４）、実験医学増刊、１２（１５）、（１９９４）、日本遺伝子治療学会編  遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス、１９９９）。本発明では、ｉｎ  ｖｉｖｏ法が好ましい。【００８６】
患者への投与部位としては、治療目的の疾患、症状などに応じた適当な投与部位が選択される。例えば、頭蓋内へ直接穴を開けて遺伝子を導入する方法の他、側脳室への投与、あるいはクモ膜下腔または大槽内への投与などが挙げられる。このうちクモ膜下腔への投与は、本発明において開示された効率的な投与法であり、本発明の目的、すなわち脳の血流量低下を血管新生で治療し、および／または脳の神経細胞死を抑制しようとする際には、クモ膜下腔への投与が好ましい。【００８７】
製剤形態としては、上記の各投与形態に合った種々の製剤形態（例えば液剤など）をとり得る。例えば有効成分である遺伝子を含有する注射剤とされた場合、当該注射剤は常法により調製することができ、例えば適切な溶剤（ＰＢＳ等の緩衝液、生理食塩水、滅菌水等）に溶解した後、必要に応じてフィルター等で濾過滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。当該注射剤には必要に応じて慣用の担体等を加えても良い。また、ＨＶＪ−リポソーム等のリポソームにおいては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤などのリポソーム製剤の形態とすることができる。【００８８】
また、疾患部位の周囲に遺伝子を存在し易くするために、徐放性の製剤（ミニペレット製剤等）を調製し患部近くに埋め込むことも可能であり、あるいはオスモチックポンプなどを用いて患部に連続的に徐々に投与することも可能である。【００８９】
従って、１つの局面において、本発明は、細胞増殖因子を含む、脳機能の悪化を予防するか、または脳機能を改善するための組成物を提供する。従来、細胞増殖因子が、脳の血管系などの物理的または外面的な改善を支持することは示されてきているが、機能が実際に改善されたとの報告はない。また、神経ネットワークの機能は、外面的な改善（例えば、血管の新生）だけでは、改善されるとは言えず、また、その連関関係も明らかでない。従って、たとえ、血管の新生がある因子によって観察されていたとしても、実際の機能改善が証明されない限り、機能の改善または悪化の予防に効果があるとは予測できない。従って、本発明は、当業者に予想外の格別の効果を示すということができる。本発明は、脳機能の改善または悪化の予防という従来達成できなかった効果を達成する。本発明では、ＨＧＦなどの増殖因子の脳への投与により、モリスの水迷路試験において機能改善が示された。【００９０】
あるいは、別の局面において、本発明は、細胞増殖因子を有効成分として含む、神経突起伸長の促進またはシナプス形成のための組成物を提供する。従来、細胞増殖因子が、脳の血管系などの物理的または外面的な改善を支持することは示されてきているが、神経突起伸長の促進またはシナプス形成が改善されたとの報告はない。また、神経ネットワークの機能は、外面的な改善（例えば、血管の新生）だけでは、改善されるとは言えず、また、その連関関係も明らかでない。従って、たとえ、血管の新生がある因子によって観察されていたとしても、実際の神経突起伸長またはシナプス形成改善が証明されない限り、機能の改善または悪化の予防に効果があるとは予測できない。従って、本発明は、当業者に予想外の格別の効果を示すということができる。本発明は、神経突起伸長の促進またはシナプス形成が改善されたという従来達成できなかった効果を達成する。本発明では、ＨＧＦなどの増殖因子の脳などのへの投与により、神経突起伸長の促進またはシナプス形成が促進されたことが見出された。【００９１】
１つの実施形態において、本発明で用いられる細胞増殖因子は、血管増殖作用を有することが好ましく、そのような細胞増殖因子としては、例えば、代表的に、ＶＥＧＦ、ＦＧＦおよびＨＧＦなどを挙げることができ、さらに好ましくは、ＨＧＦが使用される。【００９２】
このような細胞増殖因子は、ウイルスエンベロープとともに投与され得る。ここで、ウイルスエンベロープとしては、どのような物を使用してもよいが、好ましくは、不活性化されているものが使用される。ウイルスエンベロープのタイプとしては、どのようなものでもよいが、好ましくは、ＲＮＡウイルスのエンベロープが使用され得る。ここで、このウイルスエンベロープは、パラミクソウイルス属のウイルスのエンベロープであることが好ましく、より好ましくは、ＨＶＪ（センダイウイルス）のエンベロープである望ましい。理論に束縛されることは望まないが、遺伝子導入の効率がよく遺伝子治療により適切であるからであるが、本発明はそれに限定されないことが理解される。【００９３】
１つの実施形態では、本発明において使用される細胞増殖因子は、ウイルスエンベロープ中に含有される形態で提供される。【００９４】
本発明の組成物または方法が対象とし、改善または悪化予防が意図される脳機能は、認知機能を含み、例えば、脳機能のうち認知機能または運動機能に障害を受けているような状態にあるものが代表例として挙げられる。このような障害は、脳梗塞、脳血流障害、脳出血または脳血管障害によって生じ、その結果、認知機能障害または運動機能障害を受けているものが例示される。【００９５】
別の実施形態では、本発明が対象とする脳機能は、記憶機能および空間学習機能が挙げられる。特に、記憶機能および空間学習機能からなる群より選択される機能が改善されることを特徴とする薬物は、これまでほとんど知られておらず、その優位性が留意されるべきである。理論に束縛されることは望まないが、この脳機能の改善は、星状細胞の活性化により達成され得るがそれに限定されない。【００９６】
本発明において使用される細胞増殖因子は、最終的に脳で機能が発揮される限り、どのような形態で投与されてもよいが、代表的には、タンパク質形態または核酸形態で提供される。核酸形態で投与される場合、遺伝子治療の一形態と呼ばれる。【００９７】
本発明の組成物は、脳に送達され、機能の改善または悪化の予防が達成される限り、どのような経路で投与されてもよいが、例えば、クモ膜下腔または大槽内投与であることが好ましい。【００９８】
本発明の特徴の一つは、脳機能の障害が発生してかなり時間が経過して（例えば、１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上など）も機能を改善させる効果が見出された点にある。従って、障害の発生の数時間以内などの緊急性を要しない点でその効果が認められるべきである。１つの好ましい実施形態としては、例えば、脳機能の障害の発症後６日以降（すなわち、発症した日を第１日と数えた場合の第７日以降）に投与される。【００９９】
特に、遺伝子治療形態として、本発明は、１つの実施形態では、使用される細胞増殖因子が核酸形態であり、しかも、脳機能の障害の発症後６日以降に投与される形態をとっても効果が認められる。【０１００】
別の局面において、本発明は、脳機能の悪化を予防するか、または脳機能を改善するための方法であって：Ａ）細胞増殖因子を患者に投与する工程、を包含する。本発明の対象とする患者は、脳の機能（高次機能、例えば、記憶または学習機能など）を有する生物（例えば、げっ歯網、霊長網などの哺乳動物）であれば、どのような生物を対象としてもよいことが理解される。好ましくは、ヒトを含む霊長類が対象とされ、より好ましくはヒトが対象とされる。本発明は、脳機能の改善または悪化の予防という用途において細胞増殖因子が有効であることを初めて示したという点でその意義は深い。【０１０１】
あるいは、別の局面において、神経突起伸長の促進またはシナプス形成のための方法であって：Ａ）細胞増殖因子を該神経突起伸長の促進またはシナプス形成を必要とする個体に投与する工程、を包含する、方法を提供する。本発明の対象とする患者は、神経系（神経突起成長またはシナプス形成が観察される系）を有する生物（例えば、げっ歯網、霊長網などの哺乳動物）であれば、どのような生物を対象としてもよいことが理解される。好ましくは、ヒトを含む霊長類が対象とされ、より好ましくはヒトが対象とされる。本発明は、脳梗塞領域またはその周囲において神経突起成長またはシナプス形成を促進させるという用途において細胞増殖因子が有効であることを初めて示したという点でその意義は深い。【０１０２】
本発明のこの方法において使用される細胞増殖因子は、本明細書において説明される任意の組成物の形態を採り得ることが理解される。【０１０３】
別の局面において、本発明は、脳機能の悪化を予防するか、または脳機能を改善するための医薬を製造するにおける、細胞増殖因子の使用を提供する。本発明のこの使用において使用される細胞増殖因子は、本明細書において説明される任意の組成物の形態を採り得ることが理解される。好ましくは、この細胞増殖因子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）などを利用することができ、最も好ましくは肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を用いることができる。【０１０４】
あるいは、別の局面において、本発明は、神経突起伸長の促進またはシナプス形成のための医薬を製造するにおける、細胞増殖因子の使用を提供する。本明細書において説明される任意の組成物の形態を採り得ることが理解される。好ましくは、この細胞増殖因子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）などを利用することができ、最も好ましくは肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を用いることができる。【０１０５】
（投与方法例）
次に、実際の遺伝子の投与方法例を説明する。本発明は、以下のように実施しても良いが、他の実施形態でも実験または投与することができることが理解される。【０１０６】
実験Ｉ．ＨＧＦ、ＶＥＧＦによる脳の機能改善効果の検討のための実験プロトコル例
材料および実験方法
１）両側頸動脈の結紮
例えば、雄スプラーグ・ドゥリーラット（３５０〜４００ｇ；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｊａｐａｎ、日本国厚木市）をペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔し、そして外科手術の間中自然呼吸させることができる。頚部中線切開によって、両側頸動脈を露出させ、そして２−０シルクで堅く結紮することができる。【０１０７】
２）ＨＶＪ−リポソームコンプレックスの調製
ＨＶＪ−リポソームを調製するために使用した方法は、文献（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３，１４５８−１４６４（１９９４）、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７１，Ｒ１２１２−１２２０（１９９６））に記載されている技術を使用することができる。簡単に述べると、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリンおよびコレステロールを１：４．８：２の重量比で混合することができる。この脂質混合物（１０ｍｇ）はロータリーエバポレーター内でテトラヒドロフランを除去してフラスコの側面に沈着させることができる。乾燥した脂質は、目的遺伝子の挿入された発現ベクターを有する２００μｌの平衡塩類溶液（ＢＳＳ；１３７μＭ  ＮａＣｌ、５．４μＭＫＣｌ、１０μＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６）中で水和させることができる。対照群のリポソームは、目的遺伝子の挿入のない発現ベクターを含有している（ＢＳＳ２００μｌ）。振とうおよび超音波処理によってリポソームを調製することができる。【０１０８】
精製ＨＶＪ（Ｚ株）は、使用直前に３分間ＵＶ照射（１秒当たり１１０エルグ／ｍｍ２）して不活性化した。リポソーム懸濁液（０．５ｍｌ、１０ｍｇの脂質を含有する）をＨＶＪ（総容量４ｍｌのＢＳＳ中１０，０００血球凝集単位）と混合することができる。この混合物を４℃で５分間、そしてその後静かに振とうしながら３７℃で３０分間インキュベートした。フリーのＨＶＪはショ糖密度勾配遠心によってＨＶＪ−リポソームから除去した。ショ糖勾配の頂部層を集めて使用することができる。プラスミドＤＮＡの最終濃度は、以前の報告（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３，１４５８−１４６４（１９９４）、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７１，Ｒ１２１２−１２２０（１９９６））に従って計算したとき、２０μｇ／ｍｌと同等であった。この調製方法は、最大のトランスフェクション効率を達成するように最適化されている。【０１０９】
３）インビボ遺伝子導入
インビボでの効率的な遺伝子導入法を確立するために、我々はＨＶＪ−リポソームとコンプレックスを形成したプラスミドを送達する３つの異なる方法：１）内頸動脈への直接注入、２）側脳室への注入、および３）大槽（クモ膜下腔）への注入を試験することができる。【０１１０】
内頸動脈への注入では、雄スプラーグ・ドゥリーラット（３５０〜４００ｇ）をペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔し、そして左総頸動脈まで切開してポリエチレンカテーテル（ＰＥ−５０、ＣｌａｙＡｄａｍｓ、ニュージャージー州パーシッパニー）を左外頸動脈に導入することができる（Ｒａｋｕｇｉ等）。遠位外頸動脈区域は一時的結紮糸で短時間隔離した。ＨＶＪ−リポソームコンプレックス（１ｍｌ）を外頸動脈区域に注入した。注入後注入カニューレを除去し、そして結紮糸を緩めて総頸動脈への血流を回復させることができる。【０１１１】
側脳室への注入では、麻酔したラットを定位固定枠（Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、日本国東京都）に置き、そして頭蓋を露出させることができる。特別に設計したテフロン（登録商標）連結器（ＦＥＰ管、Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、インディアナ州ウェストラファイアット）を有するステンレス鋼カニューレ（３０ゲージ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州フランクリンレイクス）を、文献（Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７１，Ｒ１２１２−１２２０（１９９６））に記載されているようにして左側脳室に導入することができる。定位固定座標は次のとおりのようにすることができる：ブレグマの後ろ１．３ｍｍ、中線の側方２．１ｍｍ、および頭蓋表面の下３．６ｍｍ。ＨＶＪ−リポソームコンプレックスを側脳室に注入した（２０μｌ）。ＨＶＪ−リポソームコンプレックスを注入した後、注入カニューレを除去することができる。四肢の痙攣または異常運動のような挙動変化は、注入を受けたどの動物でも観察されないことを観察する。【０１１２】
クモ膜下腔への注入では、各動物の頭部を臥位に固定し、そして後頭骨頚中線切開によって環椎後頭膜を露出させた。ステンレス鋼カニューレ（２７ゲージ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州フランクリンレイクス）をクモ膜下腔に導入した。カニューレの位置を確認しそして脳内圧の上昇を回避するために１００μｌの脳脊髄液を除去した後に、ＨＶＪ−リポソーム溶液（１００μｌ：１００μｇ／ｍｌ）を大槽（クモ膜下腔）に１分以上かけて注意深く注入した。その後、動物は３０分間頭部を下にして置いた。予防的投与量の抗生物質（３０，０００ＵのペニシリンＧ）を投与して無菌手順を完了させることができる。【０１１３】
４）記録
例えば、レーザードップラー画像化レーザードップラーイメージャー（ＬＤＩ）を使用して、手術後２週間に亘って連続的血流測定を記録することができる。ＬＤＩシステム（Ｍｏｏｒｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．、英国デボン）には、１２×１２ｃｍの組織表面を６００μｍの深さまで連続的に走査する光線を発生させるために２ｍＷのヘリウム−ネオンレーザーが組み込まれている。走査中に、血管系を移動する血球はドップラー原理に従って投射光の振動数を変化させる。フォトダイオードは逆方向の散乱光を集めるので、元の光強度の変動は０〜１０Ｖの範囲の電圧変動に転換される。０Ｖの灌流出力値を０％の灌流に目盛り付けし、一方１０Ｖを１００％の灌流に目盛り付けすることができる。走査が終了しそして逆方向の散乱光が全ての測定部位から集められると、血流分布を示す色分けされた画像がテレビモニターに表示される。灌流シグナルは６つの異なる区分に分けられ、そして各々は別個の色として表示される。血流量低下または灌流無しは暗青色として示され、一方最大灌流は赤色として表示することができる。【０１１４】
ＬＤＩを使用して、閉塞前、直後、７日目および１４日目の脳表面の灌流を記録することができる。頭皮中線切開部を通して、電気ドリルで１２×１２ｍｍの骨窓を作ることができる。この骨窓上で連続的測定値が得ることができる。色分けされた画像が記録され、そして分析は各ラットについて灌流平均値を計算して実施した。周辺光や温度を含む変数を考慮するために、灌流計算値は後（虚血）対前（非処置）の脳の比として表すことができる。【０１１５】
５）組織病理学的検査
３％のパラホルムアルデヒド／２０％のショ糖溶液中で１日間固定した後に、Ｘ−ｇａｌ染色用に、２５μｍの冠状面冷凍切片を１００μｍごとに作製することができる。切片をＸ−ｇａｌで染色してβ−ガラクトシダーゼを発現している染色されたニューロンを同定することができる。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）染色用に、２５μｍの冠状面冷凍切片を１００μｍごとに作製することができる。これらの切片を０．３％の過酸化水素を含有するＰＢＳと共にインキュベートして、内因性ペルオキーダーゼ活性を下げ、そしてその後、１０％のウマ血清を有するＰＢＳ中で希釈した一次抗体またはレクチンと共に室温で６０分間インキュベートすることができる。２％のウマ血清を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩液中で３回洗浄した後、種に適するビオチン付加二次抗体、続いてアビジン−ビオチンペルオキシダーゼコンプレックス（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ  ｋｉｔ，ＰＫ６１００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州バーリンゲーム）をインキュベートすることができる。抗体結合はジアミノベンジジンを使用して視覚化することができる。一次抗体を省略し、そしてタイプおよびクラスに適合した無関係な免疫グロブリンで染色して各抗体の陰性対照として使用することができる。【０１１６】
６）脳脊髄液（ＣＳＦ）中のＨＧＦおよびＶＥＧＦに対するＥＬＩＳＡ法
両側頸動脈の閉塞前並びに７および１４日後のラットから得られたＣＳＦ（１００μｌ）をこれらの実験用に使用した。ラットおよびヒトＨＧＦはＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、東京都）で測定し、そしてヒトＶＥＧＦもＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）で測定することができる。【０１１７】
７）実験材料
ヒトＨＧＦは、ヒトのＨＧＦのｃＤＮＡ（特許第２５７７０９１号）を常法によりクローニングし、これを発現ベクターｐｃＤＮＡ（インビトロゲン社製）に挿入したものを用いることができる。【０１１８】
ヒトＶＥＧＦは、ヒトＶＥＧＦ１６５のｃＤＮＡ（Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６，１３０６（１９８９））を常法によりクローニングし、これを発現ベクターｐＵＣ−ＣＡＧＧＳに挿入したものを用いることができる。【０１１９】
ヒト組換えＨＧＦは、ヒトＨＧＦｃＤＮＡ（特許第２５７７０９１号）を発現ベクターｐｃＤＮＡ（インビトロゲン社製）に挿入した組換え発現ベクターでチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＡＴＣＣ）またはＣ−１２７細胞（ＡＴＣＣ）をトランスフェクションした後、その培養培地から常法により精製したものを用いることができる。【０１２０】
上記の材料および実験方法に基づき、本発明の投与を行うことができるがそれに限定されない。【０１２１】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。【０１２２】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【実施例】
【０１２３】
以下、実施例により、本発明の構成をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。以下において使用した試薬類は、特に言及した場合を除いて、東洋紡績（大阪、日本）などから市販されているものを使用した。マウスなどは、日本クレア（神奈川、日本）などから入手した。動物の扱いは、大阪大学の倫理規定または日本国政府が推奨する倫理規定に従った。【０１２４】
（実施例１：脳機能改善）
（方法）
（ＨＶＪ−エンベロープベクターの調製）
ＨＶＪ−エンベロープベクターを、公知の方法にもとづき調製した（Ｋａｎｅｄａ，Ｙ．ら，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ６，２１９−２６（２００２），Ｓｈｉｍａｍｕｒａ，Ｍ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３００，４６４−７１（２００３））。簡単にいうと、ウイルス懸濁物（１５，０００赤血球凝集単位）をＵＶ照射（９９ｍＪ／ｃｍ２）により不活性化し、そしてプラスミドＤＮＡ（４００μｇ）および０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘと混合した。遠心分離後、これを１ｍｌの平衡塩溶液（ＢＳＳ；１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．５、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ）で洗浄して界面活性剤および組み込まれなかったＤＮＡを除去した。遠心分離後、このエンベロープベクターを１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した。このベクターを、使用するまで４℃で保存した。【０１２５】
（プラスミドの構築）
ＨＧＦ発現ベクターを作製するために、ヒトＨＧＦ  ｃＤＮＡ（２．２ｋｂ）を、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター／エンハンサーを利用する真核生物発現プラスミドに挿入した（Ｋｏｉｋｅ，Ｈ．ら，Ｆａｓｅｂ  Ｊ５，５（２００３）。このプロモーター／エンハンサーを用いて、種々の細胞型においてレポーター遺伝子を発現させ、そしてそれは構成的であるとみなせる。このコントロールベクターは、プロモーターを含むがＨＧＦ  ｃＤＮＡを含まない同一構造の発現ベクタープラスミドであった。プラスミドは、ＱＩＡＧＥＮプラスミド単離キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製した。作製した配列は、配列番号７（pcDNA3.1(-)HGF）および配列番号８（pVAX1HGF/MGB1）に示す。【０１２６】
（外科手順）
ウィスター雄ラット（２７０〜３００ｇ；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｊａｐａｎ，Ａｔｓｕｇｉ，Ｊａｐａｎ）をこの研究に使用した。永久ＭＣＡｏモデルを作成するために、以前に記載されたように、ポリ−Ｌ−リジンコート４−０ナイロンをＭＣＡ源の周囲に配置することにより、右中大脳動脈を閉塞した（Ｂｅｌａｙｅｖ，Ｌ．ら，Ｓｔｒｏｋｅ  ２７，１６１６−２２（１９９６））。簡単に言うと、動物に、フェイスマスクを用いてハロタン（７０％Ｎ２Ｏおよび３０％Ｏ２の混合物中に１〜３．５％）で麻酔した。フィードバック調節加熱パッドを用いて、直腸および頭蓋の温度（Ｕｎｉｑｕｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を、外科手順を通じて３７±０．５℃で維持した。手術用顕微鏡を用いて、右総頸動脈、右外頸動脈、および右内頸動脈を、正中切開を通じて隔離した。右外頸動脈から４−０ナイロンを挿入し、そして２０ｍｍ押し込んだ。右外頸動脈は、６−０ナイロンで結紮した。【０１２７】
公知の方法にもとづき、大槽内注入により、インビボ遺伝子移入を実施した（Ｓｈｉｍａｍｕｒａ，Ｍ．ら，２００３，前出）。簡単に言うと、ラットをケタミン（Ｓａｎｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）およびキシラジン（Ｂａｙｅｒ  Ｌｔｄ，Ｊａｐａｎ）で麻酔した。各動物の頭をうつ伏せで固定し、そして環椎後頭骨膜を、後部正中切開を通じて曝した。ステンレス製カニューレ（２７ゲージ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を大槽（クモ膜下腔）に導入した。１００μｌの脳脊髄液（ＣＳＦ）を除去した後に、ヒトＨＧＦを含有するＨＪＶ−エンベロープベクター（１００μｌ）を５０μｌ／分の速度で注入した。次いで、この動物を、頭を下にして３０分間置いた。【０１２８】
（処置および行動試験のプロトコル）
行動試験のプロトコルの要約を、図１に示す。１０匹のラットに麻酔のみを施し（擬似手術）、そして６０匹のラットをＭＣＡｏに曝した（第１日）。第７日に評価した神経筋機能および体重に基づき、これらのラットを、ビヒクル処置ラット（ｎ＝２３）またはＨＧＦ処置ラット（ｎ＝２３）に等分した。第７日に麻痺症状を示さないかまたは第７日までに死亡したラットをこの実験から除外した（ｎ＝１４）。第５５日に、生存ラット（ビヒクル処置ラットについてはｎ＝２０、ＨＧＦ処置ラットについてはｎ＝２２）において、神経筋機能および自発運動を評価した。次いで、第５６日〜第９０日まで、ＭＷＭおよび受動回避学習により認知機能を試験した。第９６日に、ＭＲＩを実施し、梗塞体積を評価した。【０１２９】
第１４日および第５６日の組織病理学的分析のために、他のラット（各実験において、ビヒクル処置ラット（ｎ＝４）またはＨＧＦ処置ラット（ｎ＝４））を上記と同様に処置し、そして第１４日および第５６日に屠殺した。【０１３０】
（知覚運動障害）
知覚運動障害用に種々のバッテリーが存在するが、本発明者らは、以下のカテゴリー（最大スコアは４）を利用する知覚運動障害を評価するための簡単なプロトコルを用いた（Ｐｅｔｕｌｌｏ，Ｄ．ら，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ６４，１０９９−１０８（１９９９））。前肢の屈折：ラットを、平坦面上に尾で固定した。前肢の麻痺を、左前肢の屈折の程度により評価した。胴のねじれ：ラットを、平坦面上に尾で固定した。身体の回転の程度を調査した。側方への押し：ラットを左か右いずれかに押した。右側にＭＣＡ閉塞を有するラットは、左への押しに対する弱さを示したかまたは抵抗性がなかった。後肢の配置：１つの後肢を表面から取り除いた。右側にＭＣＡ閉塞を有するラットは、後肢を表面から取り除いた場合、後肢の配置が遅いかまたは配置しなかった。【０１３１】
（自発活動）
自発活動を、自動活動ボックス（Ｍｕｒｏｍａｃｈｉ  Ｋｉｋａｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて、３０分間のオープンフィールド試験を通じて測定した。【０１３２】
（モリスの水迷路学習）
直径１．５ｍの円柱タンクに水（２５℃）を充填し、そして直径１５ｃｍの透明なプラットホームを、４つの四分円弧のうちの１つの中心の固定位置に置いた（Ｏ’ＨＡＲＡ  ＆  ＣＯ．，ＬＴＤ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）。試験前に慣れさせるために、ラットを１分間自由に泳がせた。不可視プラットホーム試験においては、プラットホームを水面レベル以下に設置し、そしてラットから見えないようにした。このプラットホームを１つの四分円弧に固定し、出発点を試験毎に変更した。以前の研究は、試験を１日に２度実施した場合、１２〜１４週前にＭＣＡｏに曝したラットとコントロールラットとの間で、セッションの６日目までプラットホームに到達する潜伏時間の差が存在しないことを示している（Ｍｏｄｏ，Ｍら，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０４，９９−１０９（２０００））。これらの結果に基づき、本発明者らは、６日間、１日に２度試験を実施した。ラットがプラットホームに到達できなかった場合、その潜伏時間を６０秒とした。可視プラットホーム試験において、ラットから見えるように、プラットホーム上にフラッグを設置した。この試験を６日間、１日に２度実施した。この試験において、プラットホームおよび出発点を、実験毎に変更した。これらの試験を通して、ＣＣＤビデオカメラにより遊泳経路を撮影し、そしてＮＩＨ画像により分析した。【０１３３】
（受動回避学習）
本実験において、ステップスルー型の受動回避学習を用いた。照明室および暗室を有する装置（ＭＥＤＩＣＡＬ  ＡＧＥＮＴ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を使用した。慣れさせるために、ラットを照明室に入れ、そして暗室に入れるようにドアを開けておいた。ラットは暗所を好むので、暗室に向かう習慣を有する。習得試験において、ラットを照明室に入れ、そして暗室に入ったときに６．０ｍＡのショックを足に与えた。各試験は、ラットが３００秒間、暗室に入らないことを学習するまで継続した。記憶試験において、習得試験の１、３、５、７日後にラットを照明室に入れた。本発明者らは、ラットが照明室に滞在する潜伏時間（最大３００秒）を評価した。【０１３４】
（免疫組織化学）
免疫組織化学のために、ラットを屠殺し、そして通常の生理食塩水、次いで４％パラホルムアルデヒドで経心腔灌流固定を行った。脳を取り出し、固定し、凍結保護処置し、そして低温槽にて１２μｍまたは３０μｍに切断した。ブロッキング後、３％通常のヤギ血清および抗ＭＡＰ２抗体（１：１０００，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、抗ＧＦＡＰ抗体（１：１０００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、抗Ｃｄｃ４抗体２（１：５００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）中で、その後、抗マウス蛍光抗体（ＮＡＰ２およびＧＦＡＰについては１：１０００、Ｃｄｃ４２については１：５００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ４８８，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，ＵＳＡ）中で切片をインキュベートした。【０１３５】
梗塞領域および対側領域におけるＣｄｃ４２およびシナプトフィシン（ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ）の免疫組織化学には次の抗体を使用した：抗Ｃｄｃ４２抗体（マウスモノクローナル；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）および抗シナプトフィシン抗体（マウスモノクローナル；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）。【０１３６】
（免疫組織化学のための定量分析）
ＧＦＡＰの免疫反応性を定量化するために、取得した画像をＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（バージョン７．０、Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）にインポートした。そのカラー画像を、グレースケール画像に変換した。これを、Ｍａｃ  ＳＣＯＰＥ（バージョン２．５、ＭＩＴＡＮＩ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ，Ｆｕｋｕｉ，Ｊａｐａｎ）にインポートした。ＲＯＩを、梗塞領域に隣接する大脳皮質の領域として設定した。シグナルが２５以上であったピクセル数を計数した。その免疫反応性を、次式：％領域＝［高シグナルのピクセル数］／［総ピクセル数］を用いて算出した。【０１３７】
（ＡＬＰ染色）
ＡＬＰ染色のために、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで切片を洗浄し、そして基質溶液（ＡＳ−ＢＩホスフェート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびファーストレッドバイオレットＬＢ塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の混合物）中で３０分間インキュベートした。【０１３８】
各ラットにおける５つの隣接する切片を観察し、そして得られた画像をＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐにインポートした。そのカラー画像を、グレースケール画像に変換した。次いで、ＲＯＩを梗塞周辺領域の領域として設定した。Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（バージョン１．０、ＫＵＲＡＢＯ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて、血管の面積および長さを分析した。【０１３９】
（磁気共鳴画像）
虚血体積の形態学的評価のために、高分解性Ｔ２強調磁気共鳴画像（ＭＲＩ）（２Ｄ  ＦＳＥ、ＴＲ＝５０００ｍ秒、ＴＥ＝１０２ｍ秒）を、３Ｔ  ＭＲＩスキャナ（Ｓｉｇｍａ  ＬＸ  ＶＡＨ／Ｉ，ＧＥ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＵＳＡ）を用いて得た。画像は、マトリクス２５６×２５６×２１およびピクセルサイズ０．３９×０．３９×１．５ｍｍで作製した。【０１４０】
（結果）
脳梗塞の重度を調査するために、第９６日にＴ２強調ＭＲＩで全てのラットを観察した（図１）。Ｔ２強調画像から算出した梗塞の総体積は、グループ間で差がなかったが（図２ａ）、脳梗塞のパターンは、３のグループ：高強度領域が、皮質および脳幹神経節に見られたグループ（Ａ型）、皮質および脳幹神経節の一部に見られたグループ（Ｂ型）、およびそれらよりも小さい領域で見られたグループ（Ｃ型）、に分けられた（図２ｂ、ｃ）。本発明者らは、ＭＣＡｏモデルの多様性に基づく認知障害の多様性の可能性を排除するため、本研究でＡ型ラットに注目した。本発明者らは、Ａ型ラットにおける梗塞体積を再評価したが（図２ｄ、ｎ＝１５（ベシクル処置ラット）、ｎ＝１７（ＨＧＦ処置ラット））、これらのグループの間に有意な差はなかった。【０１４１】
知覚運動障害および自発運動は、認知機能の試験にある程度影響するため、それらを試験した（ＤｅＶｒｉｅｓ，Ａ．Ｃ．ら，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｂｉｏｂｅｈａｖ  Ｒｅｓ  ２５，３２５−４２（２００１））。知覚運動障害は、第５５日までに、両方のグループで、自発的にある程度回復し、グループ間の差は見られなかった（図３ａ）。ラットの自発運動を測定する自発運動試験（ＤｅＶｒｉｅｓ，Ａ．Ｃ．ら，前出）において、ＭＣＡｏに供したラットは、以前に記載されたように（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｒ．Ｇ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０５，７０７−１０（１９７９））、擬似手術ラットと比較して増加した活動を示したが、ビヒクル処置ラットとＨＧＦ処置ラットとの間に差はなかった（図３ｂ）。【０１４２】
次に、モリスの水迷路（ＭＷＭ）を実施し、空間学習および記憶を評価した（ＤｅＶｒｉｅｓ，Ａ．Ｃ．ら，前出）。ＭＷＭは、ＭＣＡｏに供した全ラットにおいて、ゴールまでの潜伏時間の増加を示したが、この潜伏時間は、不可視プラットホーム試験において、ＨＧＦ処置ラットで徐々に減少した（図４ａ）。視力喪失、知覚運動障害、および意欲の結果への影響の可能性を排除するため（ＤｅＶｒｉｅｓ，Ａ．Ｃ．ら，前出）、本発明者らはまた、可視プラットホーム試験を実施した。ＭＣＡｏに供した全ラットにおいて、増加した潜伏時間を観察したが、ビヒクル処置ラットとＨＧＦ処置ラットとの間に有意な差はなかった（図４ｂ）。この試験を通じて、ビヒクル処置ラットとＨＧＦ処置ラットとの間に、遊泳速度の差は見られなかった。従って、ＨＦＧ処置ラットにおいて、空間学習および記憶は、部分的にではあるが有意に回復した。【０１４３】
関連学習を測定するために使用した受動回避学習において（ＤｅＶｒｉｅｓ，Ａ．Ｃ．ら，前出）、ＭＣＡｏに供したラットは、この学習を習得するのにより多くの刺激を必要とし、また、ビヒクル処置ラットとＨＧＦ処置ラットとの間に差はなかった（図５ａ）。しかし、記憶試験における潜伏時間は、習得試験の３日後まで、ＨＧＦ処置ラットの方が有意に長かった（図５ｂ）。このことは、ＨＧＦ処置ラットが、ビヒクル処置ラットよりも長く、記憶を維持し得ることを示す。従って、本発明の処置方法により、脳の機能改善が図られることが明らかになった。【０１４４】
次に、本発明者らは、ＨＧＦ療法による機能回復の機構の調査を試みた。両グループにおいて、星状細胞マーカーであるＧＦＡＰに対する免疫反応性は、第１４日および第５６日に梗塞周辺領域で増加したが、ＨＧＦ処置ラットにおける免疫反応性は、ビヒクル処置ラットと比較して、第１４日で有意に高く、第５６日目で有意に低かった（図６、図７ａ）。成熟ニューロンのマーカーであるＭＡＰ２に対する免疫反応細胞は、両グループにおいて梗塞周辺領域で減少したが、両グループの間に有意な差はなかった（図７ｂ）。以前に記載されたように、全ラットの海馬において、Ｃｄｃ４２（ＲｈｏファミリーのＧＴＰａｓｅの一種であり、ニューロン突起の伸長に対して正の効果を有する）に対する免疫反応性を観察した（データは示していない）（Ｏ’Ｋａｎｅ，Ｅ．Ｍ．ら，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  １１４，１−８（２００３））。両グループにおいて、大脳皮質の梗塞周辺領域は、Ｃｄｃ４２に対する免疫反応細胞を示したが（図８ａ）、Ｃｄｃ４２免疫反応細胞の数は、ＨＧＦ処置ラットにおいて有意に多かった（図８ｂ）。【０１４５】
第１４日および第５６日における梗塞周辺領域または対側領域の動脈を、ＡＬＰ染色により調査した。梗塞周辺領域において、動脈は、第５６日のＨＧＦ処置ラットにおいて有意に増加していた（図９）。また、定量分析により、ＨＧＦ処置グループの梗塞周辺領域において、第５６日の動脈の領域が増加し、かつ動脈が長くなっていたことが示された（図１０）。対側領域においては、第１４日および第５６日の両グループに差はなかった（図１０）。【０１４６】
次に、脳梗塞7日目にコントロール遺伝子、HGF遺伝子を投与した。脳梗塞14日目にラットを屠殺し、神経突起伸長の際に発現するsmallGタンパクであるCdc42についての免疫染色と、56日目にシナプスに発現するシナプトフィシン（synaptophysin）の免疫染色を施行したところ、脳梗塞周囲において、いずれもHGF投与群で染色性が増加していた（図１１）。【０１４７】
（考察）
本発明により、第５６日のＨＧＦ処置ラットにおいて、ＭＷＭおよび受動回避学習の結果が有意に良好であり、しかも梗塞の大きさおよびパターンに変化がなかったことが示された。以前の報告（Ｄｉｊｋｈｕｉｚｅｎ，Ｒ．Ｍ．ら，前出，Ｚｈａｎｇ，Ｌ．ら，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ  １７４，１４１−６（２０００））と同様、知覚運動障害は、ＭＣＡｏに供したラットにおいて自発的に回復し、これは、グループ間で有意な差を示さなかった。以前のいくつかの研究は、虚血障害後１月以内で、知覚運動障害の回復に対して神経栄養因子が有益な効果を生じることを示しているが（Ｋａｗａｍａｔａ，Ｔら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４，８１７９−８４（１９９７））、本研究において、第５６日の障害は、その違いが検出できる程度に大きくなかった。また、ＭＷＭにおける自発運動および可視プラットホーム試験においても、有意な差が存在しなかった。これらの結果は、ＭＷＭおよび受動回避学習の結果が、知覚運動障害または自発運動の差ではなく、学習および記憶の差を反映していることを示唆している（ＤｅＶｒｉｅｓ，Ａ．Ｃ．ら，前出）。本発明者らは、得られた差が、大脳皮質の梗塞周辺領域の機能に依存していると考える。なぜならば、ＭＷＭにおける空間学習記憶および受動回避学習における記憶の維持が見られなかったことは、大脳皮質に対する損傷と関連しており（Ｙｏｎｅｍｏｒｉ，Ｆ．ら，Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ  １９，４８３−９４（１９９９），Ｈｉｒａｋａｗａ，Ｍら，Ｓｔｒｏｋｅ  ２５，２４７１−５（１９９４））、かつ大脳皮質の梗塞周辺領域にいくらかの組織学的な差が存在したからである。最近の研究は、その機能的回復が、主に、梗塞半球の皮質における活動の保護および回復と関連することを示しており（Ｄｉｊｋｈｕｉｚｅｎ，Ｒ．Ｍ．ら，前出）、今回の結果は、最近の研究によっても支持されている。【０１４８】
最近の報告から、ＨＧＦおよびｃ−Ｍｅｔが、主に、ＭＣＡｏ後４〜２８日後の梗塞周辺領域において、星状細胞でアップレギュレートされること、ならびに虚血後の脳組織の修復に関連することが明らかになっている（Ｎａｇａｙａｍａ，Ｔら，前出）。これらの観点から、本発明者らは、梗塞周辺領域における組織学的変化に注目した。本実施例において、星状細胞は、第１４日に活性化されたが、第５６日には不活性化された。これは、虚血障害に対するＢＤＮＦの効果を示した以前の研究（Ｓｃｈａｂｉｔｚ，Ｗ．Ｒ．ら，Ｓｔｒｏｋｅ  ３５，９９２−７（２００４））と類似する。言い換えると、星状細胞は、この障害の急性期に一過的に活性化されたと言える。星状の活性化は、当初、軸索の成長を阻害するグリア瘢痕の形成の一部と考えられていた（Ｅｎｇ，Ｌ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｇ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ７１，４３９−５５（１９８７），Ｓｉｌｖｅｒ，Ｊら，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ５，１４６−５６（２００４））。しかし、別の報告では、一過的に活性化された星状細胞が、ニューロンの生存および軸索の成長を促進し得ることを示している（Ａｌｂｒｅｃｈｔ，Ｐ．Ｊ．ら，Ｅｘｐｏ  Ｎｅｕｒｏｌ  １７３，４６−６２（２００２））。本発明者らは、外因性のＨＧＦが、星状細胞を一過的に活性化し、軸索の成長を促進し、そして／または軸索の成長を直接的に促進するが、それらを増殖して星状細胞の瘢痕とすることはないと考える（Ｓｕｎ，Ｗ．ら，前出）。この考察は、ニューロン細胞における突起の伸長に対して正の効果を有する（Ｏ’Ｋａｎｅ，Ｅ．Ｍ．ら，前出）、Ｃｄｃ４２に対する梗塞周辺領域における増強された免疫反応性により支持されている。残念ながら、ニューロン細胞におけるインビボでの外因性ＨＧＦによるＣｄｃ４２の誘導を示す報告は存在しないが、内皮細胞のＨＧＦ刺激は、糸状偽足およびラメリポディウムの形成を伴ってＣｄｃ４２を活性化することが報告されている（Ｒｏｙａｌ，Ｉ．ら，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １１，１７０９−２５（２０００））。星状細胞と軸索成長との間の相互作用に対するＨＧＦの作用を明確にするためにはさらなる研究が必要であるが、可能性のある機能のひとつは、梗塞周辺領域におけるニューロンネットワークの再形成により、ＨＧＦ処置ラットにおいてより良い結果が導かれ得るということである。【０１４９】
別の可能性のある機構は、梗塞周辺領域における新脈管形成の影響であり得る。新脈管形成の程度が機能的回復に関連するか否かは依然として不明であるが、最近の報告は、皮質脳卒中周辺の側副枝の成長および新規の毛細管が、虚血の境界領域における灌流の回復を支持し、かつラットにおける長期的回復を支持し得ることを実証している（Ｗｅｉ，Ｌ．ら，Ｓｔｒｏｋｅ  ３２，２１７９−８４（２００１））。さらに、ｔＰＡ療法を受け、早期に再疎通したもののすぐに臨床的改善が見られなかった数人の患者が、遅れて臨床的改善を示したことが報告されている（Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖ，Ａ．Ｖ．ら，Ｓｔｒｏｋｅ  ３５，４４９−５２（２００４））。その著者らは、微小環境の改善による、「気絶した脳（ｓｔｕｎｎｅｄ  ｂｒａｉｎ）」の回復が可能性のある機構のひとつであると推測している。この観点では、梗塞周辺領域における微小環境の回復は、その結果に対していくらかの影響を有し得、そしてＨＧＦ処置ラットにおける動脈の増加が認知機能の回復を支持し得る。【０１５０】
大脳虚血に対する臨床用途において、遺伝子療法は、開始するタイミングが重要である。ほとんどの以前の報告は、その障害の前またはその発症の数時間内に標的遺伝子を注入することによる遺伝子療法の効果を示しており、それらの目的は、アポトーシスおよび虚血病巣の拡大を阻害することであった（Ｓｈｉｒａｋｕｒａ，Ｍら，２００４，前出，Ｓｈｉｒａｋｕｒａ，Ｍら，２００４，前出，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｋら，２００１，前出，Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら，２００２，前出，Ｚｈａｎｇ，Ｗ．Ｒ．ら，２００２，前出）。これまでの遺伝子療法に関する研究と異なり、本発明者らの標的は、虚血障害の準急性〜慢性段階でのニューロンネットワークの再構成および新脈管形成である。重要なことは、本発明者らが、遅いタイミングでの遺伝子療法により機能的回復を達成し得たことである。臨床用途において、その障害の数時間内に標的遺伝子を投与することは不可能である。なぜならば、標的遺伝子を含むベクターを調製し、成長因子を用いて遺伝子療法の前に悪性腫瘍を排除することには時間がかかるからである。「７日間」は、ベクターを調製し、その全般的状態を評価するのに十分な時間であるので、本実験は、遺伝子療法の臨床用途への実現性を示したと言える。遺伝子療法の最良のタイミングを明確にするには、さらなる研究が必要である。【０１５１】
図１１に示す結果から、HGFにより脳梗塞周囲の神経突起伸張が促進され新たなシナプス形成が行われた可能性が示され、脳機能の改善が実際に神経突起伸長、シナプス形成などの神経の物理的変化によって支持されていることが明らかになった。【０１５２】
まとめると、大脳虚血の７日後のＨＧＦの外的適用は、梗塞周辺領域における軸索成長の促進、新脈管形成、およびグリオーシスの阻害を通じてより良好な機能的成果を生じる。臨床用途におけるベクターの安全面および代替の投与経路を評価するのにさらなる研究が必要であるが、ＨＧＦを用いる遺伝子療法は、大脳虚血の処置に、新たな治療的選択肢を提供し得る。【０１５３】
（実施例２：ＶＥＧＦでの脳機能回復例）
次に、他の細胞増殖因子での脳機能の回復を実験した。実施例１のＨＧＦに代えて、ＶＥＧＦ（配列番号４）を使用した以外は、すべて、実施例１に記載のように実験した。ヒトＶＥＧＦ１６５のｃＤＮＡ（Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６，１３０６（１９８９））を常法によりクローニングし、これを発現ベクターｐＵＣ−ＣＡＧＧＳに挿入したものを用いる。【０１５４】
その結果、同様に記憶機能および空間学習機能が改善していることが実証される。【０１５５】
（実施例３：ＦＧＦでの脳機能回復例）
次に、さらに他の細胞増殖因子での脳機能の回復を実験した。実施例１のＨＧＦに代えて、ａＦＧＦ（配列番号６）を使用した以外は、すべて、実施例１に記載のように実験した。ＦＧＦは、科研製薬より入手可能である。【０１５６】
その結果、同様に記憶機能および空間学習機能が改善していることが実証される。【０１５７】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１５８】
本発明は、脳機能を改善するまたは悪化を予防するための医薬を製造する医薬品業界などにおいて産業上の利用可能性を有する。
【図１】
2006011600.tif 000002
【図２】
2006011600.tif 000003
【図３】
2006011600.tif 000004
【図４】
2006011600.tif 000005
【図５】
2006011600.tif 000006
【図６】
2006011600.tif 000007
【図７】
2006011600.tif 000008
【図８】
2006011600.tif 000009
【図９】
2006011600.tif 000010
【図１０】
2006011600.tif 000011
【図１１】
2006011600.tif 000012
【配列表】
2006011600000001.app
【国際調査報告】
2006011600.tif 000013
2006011600.tif 000014
2006011600.tif 000015
2006011600.tif 000016
2006011600.tif 000017
2006011600.tif 000018
2006011600.tif 000019