【誤訳訂正書】
【提出日】令和2年5月14日(2020.5.14)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】請求項４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【請求項４】
前記の人工多抗原融合タンパク質は、さらに、各抗原領域の間に位置する酵素切断部位配列を含むことを特徴とする請求項1に記載の人工多抗原融合タンパク質。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】請求項５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【請求項５】
前記の酵素切断部位配列はカテプシンの酵素切断部位を含み、かつ
好ましくは、前記のカテプシンの酵素切断部位は、カテプシンSの酵素切断部位（たとえばLeu-Arg-Met-Lysまたは類似の酵素切断部位）、カテプシンBの酵素切断部位（たとえばMet-Lys-Arg-Leuまたは類似の酵素切断部位）、カテプシンKの酵素切断部位（たとえばHis-Pro-Gly-Glyまたは類似の酵素切断部位）、あるいはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、
ことを特徴とする請求項4に記載の人工多抗原融合タンパク質。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】請求項６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【請求項６】
前記融合タンパク質は式Iの構造を有することを特徴とする請求項1に記載の人工多抗原融合タンパク質。
Y-(A-C)n-Z             (I)
（式中において、
Aは抗原領域である。
Cはカテプシンの酵素切断部位配列である。
nは≧3の正整数である。
Yはないか「Y0-B」で表される配列であるが、ここで、Y0はシグナルペプチド配列、タグ配列、膜透過エレメント配列、アジュバントエレメント配列、細胞壊死因子エレメント配列、または上記配列の任意の組み合わせで、Bはないか切断部位（cleavage site）配列である。
Zはないか、あるいはタグ配列、膜透過エレメント配列、アジュバントエレメント配列、細胞壊死因子エレメント配列、または上記配列の任意の組み合わせである。
付加条件は、Zがない場合、最後の一つの「A-C」におけるCはなくてもよい。）
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１３】
もう一つの好適な例において、前記の各抗原領域に、少なくとも一つ（好ましくは少なくとも2つ）の同時にCD8+エピトープとCD4+エピトープとしてのアミノ酸配列が含まれる。
もう一つの好適な例において、前記の各抗原領域の長さは8〜50個のアミノ酸、好ましくは10〜40個のアミノ酸、より好ましくは15〜35個のアミノ酸である。
もう一つの好適な例において、前記の人工多抗原融合タンパク質は、さらに、各抗原領域の間に位置する酵素切断部位配列を含む。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１４】
もう一つの好適な例において、前記の酵素切断部位配列は、カテプシンの酵素切断部位配列を含む。
もう一つの好適な例において、前記のカテプシンの酵素切断部位は、カテプシンSの酵素切断部位（たとえばLeu-Arg-Met-Lysまたは類似の酵素切断部位）、カテプシンBの酵素切断部位（たとえばMet-Lys-Arg-Leuまたは類似の酵素切断部位）、カテプシンKの酵素切断部位（たとえばHis-Pro-Gly-Glyまたは類似の酵素切断部位）、あるいはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記のカテプシンSの酵素切断部位は、Arg-Cys-Gly↓-Leu、Thr-Val-Gly↓-Leu、Thr-Val-Gln↓-Leu、X-Asn-Leu-Arg↓、X-Pro-Leu-Arg↓、X-Ile-Val-Gln↓およびX-Arg-Met-Lys↓からなる群から選ばれるが、ここで、各Xは独立に任意の一つの天然アミノ酸で、↓は酵素切断位置を表す。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１５】
もう一つの好適な例において、前記のカテプシンSの酵素切断部位は、X-Arg-Met-Lys(たとえばLeu-Arg-Met-Lys)、X-Ile-Val-Gln、またはこれらの組み合わせである。
もう一つの好適な例において、前記の人工多抗原融合タンパク質において、各抗原領域は前記の酵素切断部位配列によって直接連結している。
もう一つの好適な例において、前記の各抗原領域を連結するための酵素切断部位配列は同じか、異なる。
もう一つの好適な例において、前記の各抗原領域を連結するための酵素切断部位配列は同じである。
もう一つの好適な例において、前記の各抗原領域自身は前記の酵素切断部位配列を含有しないか、あるいは前記の各抗原領域自身は前記の酵素切断部位配列を含有するが、前記抗原領域が酵素切断されてなる少なとも一つの酵素切断産物（または一部もしくは全部の酵素切断産物）はまだCD8+エピトープまたはCD4+エピトープとされる。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１８】
もう一つの好適な例において、前記融合タンパク質は、式Iの構造を有する。
Y-(A-C)n-Z             (I)
（式中において、
Aは抗原領域である。
Cはカテプシンの酵素切断部位配列である。
nは≧3の正整数である。
Yはないか「Y0-B」で表される配列であるが、ここで、Y0はシグナルペプチド配列、タグ配列、膜透過エレメント配列、アジュバントエレメント配列、細胞壊死因子エレメント配列、または上記配列の任意の組み合わせで、Bはないか切断部位（cleavage site）配列である。
Zはないか、あるいはタグ配列、膜透過エレメント配列、アジュバントエレメント配列、細胞壊死因子エレメント配列、または上記配列の任意の組み合わせである。
付加条件は、Zがない場合、最後の一つの「A-C」におけるCはなくてもよい。）
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２６】
本発明者は幅広く深く研究し、試行錯誤を繰り返したところ、初めて、CD8+T細胞免疫を刺激できる、生産コストが低くて品質管理が便利といった利点を有し、総合機能が優れたタンパク質ワクチンを開発した。また、既存のワクチンと比べ、本発明のワクチンは、さらに、同時に有効にCD4+T細胞免疫を刺激することができる。実験によって、本発明のタンパク質ワクチンは有効にMHCクラスI抗原提示経路によってCD8+細胞を刺激できることが証明された。これに基づき、本発明を完成させた。
具体的に、本発明者は実践を繰り返したところ、意外に、カテプシンの酵素切断部位によって連結した多抗原融合タンパク質ワクチンに基づき、非常に有効に抗原提示細胞によってMHC-I経路を介して提示されることを見出した。体外実験と体内実験では、当該タンパク質ワクチンは有効にCD8+T細胞を刺激することができ、かつ同時にCD4+T細胞を刺激する能力を持つことが示された。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３０】
これに対し、本発明の人工多抗原融合タンパク質は抗原提示細胞によってリソソームに呑み込まれた後、カテプシンSなどのカテプシンの酵素切断部位が存在するため、切断はまず連結配列から発生し、リソソーム内ですぐに1組（複数）のポリペプチドが生成することで、交差提示を実現・促進し、よって同時にCD8+T細胞とCD4+T細胞を刺激する。
本発明の試験では、本発明の融合タンパク質が細胞のリソソームに入った後、リソソームの機能を抑制しても、融合タンパク質はすぐになくなったことが示され、これはリソソームにおいて本発明のタンパク質またはその酵素切断産物は細胞質に漏れることを示す。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３３】
もう一つの好適な例において、ほかのいくつかの提示細胞で発現が比較的に多いカテプシンBおよびカテプシンKの酵素切断部位を使用してもよい。たとえば、Met-Lys-Arg↓-LeuはカテプシンBの酵素切断部位で、そしてHis-Pro-Gly↓-GlyはカテプシンKの酵素切断部位であるが、効果が特に優れたのはカテプシンSの酵素切断部位である。 
もう一つの好適な例において、前記人工多抗原融合タンパク質は様々なカテプシンSの酵素切断部位を使用してもよいが、好適な酵素切断部位として、Arg-Cys-Gly↓-Leu、Thr-Val-Gly↓-Leu、Thr-Val-Gln↓-Leu、X-Asn-Leu-Arg↓、X-Pro-Leu-Arg↓、X-Ile-Val-Gln↓およびX-Arg-Met-Lys↓が含まれるが、これらに限定されず、ここで、Xは任意のアミノ酸で、↓は酵素切断位置を表す。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３６】
製造方法およびエンジニアリング細胞
抗原タンパク質が確定すると、本発明のタンパク質は組み換え法による大量生産で得られる。この場合、通常、人工合成のコードするDNAを発現ベクターにクローンした後、細胞に導入し、さらに通常の方法で宿主細胞または発酵産物からを単離して得る。
一つの典型的な抗原融合タンパク質の製造方法は、以下の工程を含む。
タンパク質抗原のアミノ酸の順番に合わせて一つの人工多抗原融合タンパク質を構築し、当該多抗原融合タンパク質は一連の特定の長さの抗原領域を含有するかそれらからなるもので、ここで、各抗原領域の間は同じか異なるカテプシンの酵素切断部位（たとえばleu-Arg-Met-Lys）で連結する。
また、本発明の融合タンパク質を発現するための細胞も本発明に含まれる。「宿主細胞」は、原核細胞と真核細胞とを含む。よく使用される原核細胞は大腸菌である。よく使用される真核宿主細胞は、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞を含むが、これらに限定されない。本発明の好適な形態として、使用される宿主細胞は大腸菌、たとえばBL21（DE3）および酵母、ならびにCHO細胞である。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５８】
実施例7
結核病皮膚感作性試験
体重が250gくらいのモルモットに対し、PPD 0.1 mlで皮内注射し、皮膚試験の反応を24時間観察した。皮膚試験の反応が陰性のモルモットをランダムに5群に分け、後肢鼠径部において、40mg/mlのマイコバクテリウム・ツベルクローシスH37Rv懸濁液0.2mlを皮下注射し、週に1回、計5回免疫させた。5回目の免疫から1週間後、モルモットをランダムに5群に分け、モルモットの背部の毛を抜き、ホイール法によって陽性コントロール(PPD)、陰性コントロール（結核と無関係の組み換えタンパク質）、組み換えESAT6/CFP10タンパク質および組み換えESAT6-CFP10-抗原融合タンパク質の混合液(1mg/ml、0.1mg/ml)を0.1mlずつ皮内注射し、注射後24時間の時点でモルモットの背部の各注射点の皮膚の腫れの縦、横の直径の大きさ（mm）を測定し、その平均値を記録した。
24時間皮膚反応の結果は図7に示すように、TB-抗原融合タンパク質群(配列番号:1)の平均皮膚硬結直径はPPDおよびESAT6-CFP10天然タンパク質よりも大きかった。コントロール群では、モルモットの局部の皮膚に腫れ、硬結反応がなかった。これは、TB-抗原融合タンパク質は皮膚試験に使用して有効に結核の感染を検出することができることを示す。
図では、E6-C10はESAT6-CFP10-天然タンパク質を、LRMKはTB-抗原融合タンパク質を表し、ここで、各抗原領域の間はカテプシンSの酵素切断部位で連結し、配列は配列番号:1で表され、TEVは配列番号：1におけるすべてのカテプシンSの酵素切断部位の代わりにTEV酵素切断部位(非カテプシンの酵素切断部位)を使用したコントロールタンパク質を表す)。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６５】
本発明において、本発明者は酵素学の原理および生物組み換え技術に基づいて多くの抗原融合タンパク質を設計し、大量の選別を行ったところ、一連の抗原領域を含む長鎖ペプチドの間をカテプシンの酵素切断部位で連結するという、新規な抗原融合タンパク質の構造を確立した。細胞がリソソームに抗原融合タンパク質を呑み込むと、リソソームにおけるカテプシンが抗原融合タンパク質を異なるエピトープを含むポリペプチドに分解する。
本発明の実験では、意外に、本発明のこの特定の構造の融合タンパク質が分解された後、分解後のポリペプチドがリソソームから漏れて細胞質に入り、加工されてMHCクラスI分子に提示されることによって、MHC-I抗原提示経路が始まってCD8+細胞を刺激し、かつ元のCD4+T細胞を刺激する機能が保留または向上することが実証された。