【手続補正書】
【提出日】令和2年9月8日(2020.9.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的核酸を増幅及び検出する方法であって、
（ａ）単一の反応容器内で前記標的核酸配列を含む前記試料を、
（ｉ）各オリゴヌクレオチドプライマーが前記標的核酸の部分配列の逆鎖にハイブリダイズできる１つのオリゴヌクレオチドプライマー対、
（ｉｉ）アニーリング部分及びタグ部分を含むオリゴヌクレオチドプローブであって、前記タグ部分が、前記標的核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列又は非ヌクレオチド分子を含み、前記アニーリング部分が、前記標的核酸配列に少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記オリゴヌクレオチドプライマー対によって画定される前記標的核酸の前記部分配列の領域にハイブリダイズし、前記オリゴヌクレオチドプローブが、さらに前記タグ部分上又は前記アニーリング部分上に位置するレポーター部分と、前記アニーリング部分に位置する第１のクエンチャー部分とを含む相互作用二重標識をさらに含み、前記レポーター部分がヌクレアーゼ感受性切断部位によって前記第１のクエンチャー部分から隔てられ、そして前記タグ部分がクエンチング分子に温度依存的に可逆的結合され、前記クエンチング分子が前記タグ部分に結合している場合に、前記レポーター部分をクエンチできる１つ以上のクエンチャー部分を含むか又はそれと連携されるオリゴヌクレオチドプローブ
と接触させるステップ、
（ｂ）各ＰＣＲサイクルの伸長ステップの間に、５’から３’へのポリメラーゼの前記ヌクレアーゼ活性が、前記オリゴヌクレオチドプローブの前記アニーリング部分の前記第１のクエンチャー部分からの前記タグ部分の切断及び分離を可能にするように、５’から３’へのヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で前記標的核酸を増幅するステップ、
（ｃ）前記クエンチング分子が前記タグ部分に結合している第１の温度で前記レポーター部分からの抑制シグナルを測定するステップ、
（ｄ）前記クエンチング分子が前記タグ部分に結合していない第２の温度に温度を上昇させるステップ、
（ｅ）前記第２の温度で前記レポーター部分からの温度補正シグナルを測定するステップ、
（ｆ）前記第２の温度で検出された温度補正シグナルから前記前記第１の温度で検出された前記抑制シグナルを減算することによって算出シグナル値を得るステップ、
（ｇ）複数のＰＣＲサイクルを通してステップ（ｂ）から（ｆ）を繰り返すステップ、
（ｈ）前記複数のＰＣＲサイクルからの前記算出シグナル値を測定して、前記標的核酸の存在を検出するステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記レポーター部分が、前記オリゴヌクレオチドプローブの前記タグ部分にある請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タグ部分が、前記標的核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含み、前記クエンチング分子が、前記オリゴヌクレオチドプローブの前記タグ部分に少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであり、ハイブリダイゼーションによって前記タグ部分に結合する請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記タグ部分が、核酸ポリメラーゼによって伸長できないように修飾を含む請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドプローブの前記タグ部分又は前記クエンチング分子又は前記タグ部分と前記クエンチング分子の両方が、１つ以上のヌクレオチド修飾を含み、そして
前記１つ以上のヌクレオチド修飾が、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、架橋化核酸（ＢＮＡ）、２’−Ｏ−アルキル置換、Ｌ−エナンチオマーヌクレオチド、又はそれらの組み合わせからなる群より選択される請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
試料中の２つ以上の標的核酸配列を検出する方法であって、
（ａ）単一の反応容器内で前記２つ以上の標的核酸配列を含むこ疑われる前記試料を、
（ｉ）第１の標的核酸配列の各鎖に相補的なヌクレオチド配列をもつ第１のオリゴヌクレオチドプライマー対及び第２の標的核酸配列の各鎖に相補的なヌクレオチド配列をもつ第２のオリゴヌクレオチドプライマー対、
（ｉｉ）前記第１の標的核酸配列に少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマー対によって画定される前記第１の標的核酸配列の領域内にアニーリングする、第１オリゴヌクレオチドプローブであって、第１オリゴヌクレオチドプローブが、検出可能なシグナルを生成できる蛍光部分と、前記蛍光部分によって生成される前記検出可能なシグナルをクエンチできる第１のクエンチャー部分とを含み、前記蛍光部分が、ヌクレアーゼ感受性切断部位によって第１のクエンチャー部分により隔てられる、第１のオリゴヌクレオチドプローブ、
（ｉｉｉ）２つの異なる部分：
−前記第２の標的核酸配列に少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドプライマー対によって画定される前記第２の標的核酸配列の領域内にアニーリングする、アニーリング部分であって、アニーリング部分が第２のクエンチャー部分を含むアニーリング部分と、
−前記アニーリング部分の前記５’末端若しくは３’末端に結合されるか、又は前記アニーリング部分の領域にリンカーを介して結合され、前記２つ以上の標的核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含むタグ部分であって、前記タグ部分が、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記蛍光部分と同一であり、その検出可能なシグナルが前記アニーリング部分の前記第２のクエンチャー部分によってクエンチできる蛍光部分を含み、前記蛍光部分が、ヌクレアーゼ感受性切断部位によって前記第２のクエンチング部分から分離されている、タグ部分と
を含む、第２のオリゴヌクレオチドプローブ、
（ｉｖ）前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記タグ部分に少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして前記タグ部分にハイブリダイズして二本鎖を形成するクエンチングオリゴヌクレオチドであって、前記タグ部分にハイブリダイズしたときに前記タグ部分の前記蛍光部分によって生成される前記検出可能なシグナルをクエンチする第３のクエンチャー部分を含むクエンチングオリゴヌクレオチド、
と接触させるステップ、
（ｂ）各ＰＣＲサイクルの伸長ステップの間に、前記核酸ポリメラーゼの前記５’から３’へのヌクレアーゼ活性が、
（i) 前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記第１のクエンチング部分からの前記蛍光部分の切断及び分離 並びに
(ii)前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記アニーリング部分の前記第２のクエンチング部分からの前記タグ部分の前記蛍光部分の切断及び分離
を可能にするように、前記第１及び第２の標的核酸配列を、５’から３’へのヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し、前記伸長ステップの間に、前記クエンチングオリゴヌクレオチドが前記タグ部分にハイブリダイズしたままであるステップ、
（ｃ）前記クエンチングオリゴヌクレオチドが、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記タグ部分にハイブリダイズされている第１の温度で蛍光シグナルを測定するステップ、
（ｄ）前記クエンチングオリゴヌクレオチドが前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記タグ部分にハイブリダイズされない、前記第１の温度より高い第２の温度に温度を上昇させるステップ、
（ｅ）前記第２の温度で蛍光シグナルを測定するステップ、
（ｆ）前記第２の温度で検出された前記蛍光シグナルから前記第１の温度で検出された前記蛍光シグナルを減算することによって算出シグナル値を得るステップ、
（ｇ）ステップ（ｂ）から（ｆ）を複数のＰＣＲサイクルで繰り返して、第１及び第２の標的核酸配列から所望の量の増幅産物を生成するステップ、
（ｈ）前記複数のＰＣＲサイクルからの前記第１の温度で検出された前記蛍光シグナルから第１の標的核酸配列の存在を決定し、前記複数のＰＣＲサイクルからの前記算出シグナル値から前記第２の標的核酸配列の存在を決定するステップ
を含む方法。
【請求項７】
前記タグ部分が、前記アニーリング部分の５’末端に結合されている請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記タグ部分が、核酸ポリメラーゼによって伸長できないように修飾を含む請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記クエンチングオリゴヌクレオチドが、ステムループ構造を介して前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記タグ部分に連結されている請求項６〜８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記タグ部分又は前記クエンチングオリゴヌクレオチド又は前記タグ部分と前記クエンチングオリゴヌクレオチドの両方が、１つ以上のヌクレオチド修飾を含み、そして
前記１つ以上のヌクレオチド修飾が、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、架橋化核酸（ＢＮＡ）、２’−Ｏ−アルキル置換、Ｌ−エナンチオマーヌクレオチド、又はそれらの組み合わせからなる群より選択される請求項６〜９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
試料中の２つ以上の標的核酸配列を検出する方法であって、
（ａ）単一の反応容器内で前記２つ以上の標的核酸配列を含むことが疑われる前記試料を、
（ｉ）第１の標的核酸配列の各鎖に相補的なヌクレオチド配列をもつ第１のオリゴヌクレオチドプライマー対及び第２の標的核酸配列の各鎖に相補的なヌクレオチド配列をもつ第２のオリゴヌクレオチドプライマー対、
（ｉｉ）２つの異なる部分：
−前記第１の標的核酸配列に少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマー対によって画定される前記第１の標的核酸配列の領域内にアニーリングする、第１アニーリング部分であって、ここで第１アニーリング部分が、第１のクエンチャー部分を含み、３’末端でブロックされて核酸ポリメラーゼによる伸長を妨げられる、第１のアニーリング部分と；
−前記第１のアニーリング部分の５’末端若しくは３’末端に結合されるか、又は前記アニーリング部分の領域にリンカーを介して結合され、前記２つ以上の標的核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む、第１のタグ部分であって、前記第１のタグ部分が、検出可能なシグナルが前記第１のアニーリング部分の前記第１のクエンチャー部分によってクエンチできる蛍光部分を含み、前記蛍光部分が、ヌクレアーゼ感受性切断部位によって前記第１のクエンチング部分から隔てられている第１のタグ部分と
を含む、第１オリゴヌクレオチドプローブ、
（ｉｉｉ）前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記第１のタグ部分に少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記第１のタグ部分にハイブリダイズして二本鎖を形成する第１クエンチングオリゴヌクレオチドであって、前記第１のタグ部分にハイブリダイズされたときに前記第１のタグ部分の前記蛍光部分によって生成される前記検出可能なシグナルをクエンチする第２のクエンチング部分を含む、第１のクエンチングオリゴヌクレオチド、
（ｉｖ）２つの異なる部分：
−前記第２の標的核酸配列に少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドプライマー対によって画定される前記第２の標的核酸配列の領域内にアニーリングする第二のアニーリング部分であって、第２のアニーリング部分が第３のクエンチャー部分を含み、３’末端でブロックされて核酸ポリメラーゼによる伸長を妨げる、第２のアニーリング部分と、
−前記第２のアニーリング部分の５’末端若しくは３’末端に結合されるか、又は前記アニーリング部分の領域に結合され、前記２つ以上の標的核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含み、そして前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記第１のタグ部分の前記ヌクレオチド配列と比較して異なる核酸配列若しくは異なるヌクレオチド修飾を有する、第２のタグ部分であって、前記第２のタグ部分が、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの第１タグ部分の前記蛍光部分と同一であり、検出可能なシグナルが、前記第２のアニーリング部分の前記第３のクエンチャー部分によってクエンチできる蛍光部分を含み、前記蛍光部分が、ヌクレアーゼ感受性切断部位によって前記第３のクエンチング部分から隔てられている第２のオリゴヌクレオチドプローブ、
（ｖ）前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記第２のタグ部分に少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記第２のタグ部分にハイブリダイズして二本鎖を形成する第２のクエンチングオリゴヌクレオチドであって、前記第２のクエンチングオリゴヌクレオチドが前記第２のタグ部分にハイブリダイズされたときに前記第２のタグ部分の前記蛍光部分によって生成される前記検出可能なシグナルをクエンチする第４のクエンチング部分を含む、第２のクエンチングオリゴヌクレオチド
と接触させ、ここで前記第２のクエンチングオリゴヌクレオチドと前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記第２のタグ部分の間の前記二本鎖が、前記第１のクエンチングオリゴヌクレオチドと前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記第１のタグ部分の間の前記二本鎖より高い融解温度（Ｔｍ）値を有するステップ、
（ｂ）各ＰＣＲサイクルの伸長ステップの間に、前記核酸ポリメラーゼの前記５’から３’へのヌクレアーゼ活性が、
（ｉ）前記伸長ステップにおいて、前記第１のクエンチングオリゴヌクレオチドが前記第１のタグ部分にハイブリダイズしたままである、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記第１のアニーリング部分の前記第１のクエンチング部分からの前記第１のタグ部分の前記蛍光部分の切断及び分離、及び
（ｉｉ）前記伸長ステップにおいて、前記第２のクエンチングオリゴヌクレオチドが前記第２のタグ部分にハイブリダイズしたままである、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記第２のアニーリング部分の前記第３のクエンチング部分からの前記第２のタグ部分の前記蛍光部分の切断及び分離
を可能にするように、５’から３’へのヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって前記第１及び第２の標的核酸配列を増幅するステップ、
（ｃ）前記第１のクエンチングオリゴヌクレオチドが、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブからの前記第１のタグ部分にハイブリダイズされず、前記第２のクエンチングオリゴヌクレオチドが、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブからの前記第２のタグ部分にハイブリダイズしたままである第１の温度に温度を上昇させるステップ、
（ｄ）前記第１の温度で蛍光シグナルを測定するステップ、
（ｅ）前記第２のクエンチングオリゴヌクレオチドが、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記第２のタグ部分にハイブリダイズされない、前記第１の温度より高い第２の温度に温度を上昇させるステップ、
（ｆ）前記第２の温度で蛍光シグナルを測定するステップ、
（ｇ）前記第２の温度で検出された前記蛍光シグナルから前記第１の温度で検出された前記蛍光シグナルを減算することによって算出シグナル値を得るステップ、
（ｈ）ステップ（ｂ）から（ｆ）を複数のＰＣＲサイクルで繰り返して、第１及び第２の標的核酸配列から所望の量の増幅産物を生成するステップ、
（ｉ）前記複数のＰＣＲサイクルからの前記第１の温度で検出された前記蛍光シグナルから第１の標的核酸配列の存在を決定し、前記複数のＰＣＲサイクルからの前記算出シグナル値から前記第２の標的核酸配列の存在を決定するステップ
を含む方法。
【請求項１２】
前記第１のタグ部分が、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記第１のアニーリング部分の５’末端に結合され、前記第２のタグ部分が、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記第２のアニーリング部分の５’末端に結合されている請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１のクエンチングオリゴヌクレオチドが、ステムループ構造を介して前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記第１のタグ部分に連結されているか、及び／又は
前記第２のクエンチングオリゴヌクレオチドが、ステムループ構造を介して前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記第２のタグ部分に連結されている、請求項１１〜１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１のタグ部分と前記第２のタグ部分がともに、両方のタグ部分が核酸ポリメラーゼによって伸長できないように修飾を含む請求項１１〜１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記第１のタグ部分、若しくは前記第１のクエンチングオリゴヌクレオチド、若しくは前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記第２のタグ部分、若しくは前記第２のクエンチングオリゴヌクレオチドのいずれか又はそれらのいずれかの組み合わせが、１つ以上のヌクレオチド修飾を含み、そして
前記１つ以上のヌクレオチド修飾が、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、架橋化核酸（ＢＮＡ）、２’−Ｏ−アルキル置換、Ｌ−エナンチオマーヌクレオチド、又はそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１１〜１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
試料中の２つ以上の標的核酸配列を検出するためのキットであって、
（ａ）前記２つ以上の標的核酸配列の各鎖に相補的なヌクレオチド配列をもつ２つ以上のオリゴヌクレオチドプライマー対、
（ｂ）２つの異なる部分：
−前記２つ以上の標的核酸配列の１つに少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を含み、オリゴヌクレオチドプライマーの２以上の対のうちの１対により結合される前記２つ以上の標的核酸配列のうちの一つの領域内でアニーリングする、アニーリング部分であって、アニーリング部分が第１のクエンチャー部分を含む、前記アニーリング部分と；
−前記アニーリング部分の５’末端若しくは３’末端に結合されるか又は前記アニーリング部分の領域にリンカーを介して結合され、そして前記２つ以上の標的核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む、タグ部分であって、前記タグ部分が、検出可能なシグナルが前記アニーリング部分の前記第１のクエンチャー部分でクエンチできる蛍光部分を含み、前記蛍光部分が、ヌクレアーゼ感受性切断部位によって前記第１のクエンチング部分から隔てられている、前記タグ部分と
を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブ、
（ｃ）前記オリゴヌクレオチドプローブの前記タグ部分に少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記タグ部分にハイブリダイズして二本鎖を形成する少なくとも１のクエンチングオリゴヌクレオチドえあって、前記クエンチングオリゴヌクレオチドが前記タグ部分にハイブリダイズしたときに前記タグ部分の前記蛍光部分によって生成される前記検出可能なシグナルをクエンチする第２のクエンチャー部分を含む少なくとも１つのクエンチングオリゴヌクレオチド
を備えるキット。
【請求項１７】
前記オリゴヌクレオチドプローブの前記タグ部分、又は前記クエンチングオリゴヌクレオチド、又は前記オリゴヌクレオチドプローブの前記タグ部分と前記クエンチングオリゴヌクレオチドの両方が、もう１つの（one more）ヌクレオチド修飾を含み、前記１つ以上のヌクレオチド修飾が、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、架橋化核酸（ＢＮＡ）、２’−Ｏ−アルキル置換、Ｌ−エナンチオマーヌクレオチド、又はそれらの組み合わせからなる群より選択される請求項１６に記載のキット。