(57)【要約】多角体病ウイルス由来の多角体タンパク質（外殻タンパク質）が、結晶状態で目的タンパク質を内部または表面に取り込んで固定して形成された粒子状のタンパク質複合体であって、目的タンパク質が外殻タンパク質の内部または表面に固定された構造のタンパク質複合体を用いた該目的タンパク質に特異的に結合する物質の検出法の提供。  検体中の被検出物質を検出する方法であって、該被検出物質に特異的に結合し得るタンパク質を多角体に固定化し、この多角体タンパク質複合体を遊離の状態で検体と接触させ、該接触によりできた多角体タンパク質複合体と被検出物質との複合体の存在を検出することを含む、被検出物質を検出する方法ならびに検体中の被検出物質を検出するキットであって、該被検出物質に特異的に結合し得るタンパク質を固定した遊離の多角体タンパク質複合体を含む検出キット。【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の被検出物質を検出する方法であって、該被検出物質に特異的に結合し得るタンパク質を多角体に固定化し、この多角体タンパク質複合体を遊離の状態で検体と接触させ、該接触によりできた多角体タンパク質複合体と被検出物質との複合体の存在を検出することを含む、被検出物質を検出する方法。
【請求項２】
被検出物質に特異的に結合し得るタンパク質を多角体に固定化し、この多角体タンパク質複合体を遊離の状態で検体と接触させ、被検出物質を介して前記多角体タンパク質複合体を凝集させ、該凝集の存在を検出することを含む、請求項１記載の被検出物質を検出する方法。
【請求項３】
被検出物質に特異的に結合し得るタンパク質を多角体に固定化し、この多角体タンパク質複合体を遊離の状態で検体と接触させ、多角体タンパク質複合体−被検出物質複合体を形成させ、該多角体タンパク質複合体−被検出物質複合体を、前記被検出物質に結合する物質であって、固相支持体に固定化した物質と接触させ、多角体タンパク質複合体−被検出物質−被検出物質と結合する物質の複合体を形成させ、該多角体タンパク質複合体−被検出物質−被検出物質と結合する物質の複合体の存在を検出することを含む、請求項１記載の被検出物質を検出する方法。
【請求項４】
多角体タンパク質複合体が、さらにシグナルを発生し得る標識タンパク質を固定している、請求項１から３のいずれか１項に記載の被検出物質を検出する方法。
【請求項５】
シグナルを発生し得る標識タンパク質がグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、請求項４記載の被検出物質を検出する方法。
【請求項６】
免疫検出法である請求項１から５のいずれか１項に記載の被検出物質を検出する方法。
【請求項７】
多角体タンパク質複合体に固定されたタンパク質がウイルスまたは細菌に対する抗体である、ウイルスまたは細菌感染を検出する、請求項６記載の被検出物質を検出する方法。
【請求項８】
多角体タンパク質複合体に固定されたタンパク質がアレルゲンである、検体中の抗アレルゲン抗体を検出する、請求項６記載の被検出物質を検出する方法。
【請求項９】
検体中の被検出物質を検出するキットであって、該被検出物質に特異的に結合し得るタンパク質を固定した遊離の多角体タンパク質複合体を含む検出キット。
【請求項１０】
多角体タンパク質複合体が、さらにシグナルを発生し得る標識タンパク質を固定している、請求項９記載の検出キット。
【請求項１１】
凝集法を利用した検出キットであり、さらに凝集反応を行わせるためのプレートを含む請求項９または１０に記載の検出キット。
【請求項１２】
免疫検出キットである、請求項９から１１のいずれか１項に記載の検出キット。
【請求項１３】
多角体タンパク質複合体に固定されたタンパク質がウイルスまたは細菌に対する抗体である、ウイルスまたは細菌感染を検出する、請求項１１または１２に記載の検出キット。
【請求項１４】
多角体タンパク質複合体に固定されたタンパク質がアレルゲンである、検体中の抗アレルゲン抗体を検出する、請求項１１または１２に記載の検出キット。
【請求項１５】
検体中の被検出物質を検出する方法であって、該被検出物質に特異的に結合し得るタンパク質を多角体に固定化し、この多角体タンパク質複合体を担体に結合させた状態で検体と接触させ、該接触によりできた多角体タンパク質複合体と被検出物質との複合体の存在を検出することを含む、被検出物質を検出する方法。
【請求項１６】
酵素結合抗体法（ＥＬＩＳＡ）である請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
多角体タンパク質複合体に固定されたタンパク質がウイルスまたは細菌に対する抗体である、ウイルスまたは細菌感染を検出する、請求項１５または１６に記載の被検出物質を検出する方法。
【請求項１８】
多角体タンパク質複合体に固定されたタンパク質がアレルゲンである、検体中の抗アレルゲン抗体を検出する、請求項１５または１６に記載の被検出物質を検出する方法。
【請求項１９】
検体中の被検出物質を検出するキットであって、該被検出物質に特異的に結合し得るタンパク質を固定した遊離の多角体タンパク質複合体が担体に結合された請求項９から１４のいずれか１項に記載の検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、多角体病ウイルス由来の多角体タンパク質（外殻タンパク質）が、目的タンパク質を結晶状態で取り込んで形成された粒子状のタンパク質複合体であって、目的タンパク質が外殻タンパク質で包み込まれた構造のタンパク質複合体を用いた該目的タンパク質に特異的に結合する物質の検出に関する。
【背景技術】  細胞質多角体病ウイルス（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ，ＣＰＶ）は、レオウイルス科のＣｙｐｏｖｉｒｕｓ属に分類され、分節した１０から１２本の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）セグメントを有する球状ウイルスである。主に昆虫の中腸皮膜組織の円筒細胞で増殖し、このウイルスに感染した昆虫は感染細胞の細胞質に多角体と呼ばれるウイルス封入体が多数形成されるため、感染後期には中腸が白濁するのが特徴である。このウイルス封入体である多角体の中には数万個のウイルス粒子が固定されている。ＣＰＶは約２００種の昆虫から見出されており、そのＲＮＡの泳動パターンから１２の型に分類されている。
一方、バキュロウイルス科に分類される核多角体病ウイルス（ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ，ＮＰＶ）は核に多角体を作り、その中には多数の棒状ウイルス粒子が固定されている。また同科に属するウイルスで、顆粒病ウイルス（ｇｒａｎｕｌｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ，ＧＶ）と呼ばれるウイルスも、細胞質にカプセルと呼ばれる封入体を形成するが、その中には１つのウイルスのみが固定されている。これらのバキュロウイルスの封入体もＣＰＶの場合と同様に昆虫によって餌と共に食下されると中腸内がアルカリであるために溶解し、封入体内に固定されていたウイルスが放出されて感染が起こる。
ウイルス封入体である多角体は、感染後期に合成される多角体タンパク質（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）が会合し結晶化した構造物である。この多角体を昆虫が餌と共に食下すると消化管の中で、多角体が溶解し、大量のウイルスが放出され感染が生じる。すなわち、多角体はウイルスを感染細胞まで運ぶベクターとしての機能を持っている。さらに、多角体はその中に固定したウイルスを乾燥や紫外線などから守る「金庫」としての役割も果たしている。特に、多くの溶媒や界面活性剤によっても溶解せず、またさらに細菌による腐敗によっても影響を受けず、固定されているウイルスは自身の感染力に関して全く影響を及ぼされない。
これまでの研究で、カイコ細胞質多角体病ウイルス（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓｅｓ，ＢｍＣＰＶ）は、１０本に分節した二本鎖ＲＮＡ（セグメント１〜１０をＳ１〜Ｓ１０と表記する）をゲノムにもち、多角体を構成するタンパク質である多角体タンパク質（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）は分子量は２７ｋ〜３０ｋであり、最も小さいセグメントであるＳ１０によってコードされていることがわかっている。また、ＢｍＣＰＶのウイルス粒子はｖｉｒａｌ  ｃａｐｓｉｄｐｒｏｔｅｉｎ１：以下ＶＰ１と表記する（１５１ｋＤａ）、ＶＰ２（１４２ｋＤａ）、ＶＰ３（１３０ｋＤａ）、ＶＰ４（６７ｋＤａ）、ＶＰ５（３３ｋＤａ）の５種類のタンパク質から構成されており、１２５Ｉを用いたＢｍＣＰＶの標識実験からＶＰ１とＶＰ３がウイルスの外殻を構成しているタンパク質であることが明らかになっている（非特許文献１参照）。また、ウサギの網状赤血球を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ実験から、このウイルスの外殻タンパク質であるＶＰ１とＶＰ３はそれぞれＳ１とＳ４によってコードされていることがわかっている（非特許文献２参照）。
一方、ウイルス粒子が多角体に固定される現象は、Ｓ４にコードされているＶＰ３とＳ１０にコードされている多角体タンパク質の相互作用によるものであることが明らかにされている（非特許文献３参照）。例えば、ＶＰ３と緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）からなる融合タンパク質をＢｍＣＰＶのポリヘドリンとともに培養細胞中で発現させると、多角体にこの融合タンパク質が特異的に取り込まれる（非特許文献３参照）。この多角体を、アルカリ溶液（ｐＨ１１．０）で処理すると多角体が溶解し、中に固定されていた融合タンパク質が放出される。このことは、ＢｍＣＰＶの外殻タンパク質であるＶＰ３がウイルス粒子を多角体中に固定させるためのシグナルとしての役割を担っていることを意味している。つまり、ＶＰ３をシグナルとして機能性タンパク質に導入し、ポリヘドリンとともに培養細胞中で発現すれば、産生されたタンパク質は発現と同時に多角体中に固定される。
本発明者らは、上述の背景技術に鑑みて、目的タンパク質の保護、保存、安定性向上に寄与するタンパク質複合体及びその製造方法に関する発明を完成し、先に出願した（特許文献１参照）。上記発明は、多角体中に高分子性の目的タンパク質を固定し、またその固定効率を高めることを目的としていた。さらに、多角体中に目的タンパク質を固定したタンパク質複合体のプロテインチップを開発し（特許文献２参照）、無細胞タンパク質合成系を利用して多角体中に目的タンパク質を固定したタンパク質複合体の製造する方法をも開発した（特許文献３参照）。該多角体中に目的タンパク質を固定したタンパク質複合体のプロテインチップを用いて化合物の検出が可能であったが、検出に約２時間要し、より迅速な検出系の開発が望まれていた。
動物やヒトが病原体に感染しているかどうかを調べる方法としては、（１）病原体に対する特異的抗体の検索、（２）病原体の分離、（３）病原体の遺伝子の検出、があげられる。しかし現状では、いずれの方法も大掛かりな装置や熟練した技術を必要とし、さらに判定までの日数がかかるなどの問題を抱えていた。特に感染症の場合、どのような疾病が発生しているのか、あるいはどの範囲にまで蔓延しているのかを即座に判断し対応しなければならない。２００４年に日本国  京都府丹波町で発生したようなトリインフルエンザウイルスによる２４万羽の鶏の処分では膨大な経済的損失をもたらし、現在でも土中に埋められている殺処分された鶏と鶏ふんの最終処分費７億６千万円をどうするか決められていない。
この例を見ても明らかなように、新興・再興感染症と呼ばれる治療方法が確立されていない感染症のアウトブレークに対応する手段としては、感染源をできるだけすみやかに検知し、その移動を極力最小限に抑えることが重要である。例えば、「病原体に対する特異的抗体の検索」についてはウイルス感染症の場合、その多くが中和抗体価の検出によることが多い。しかし、中和抗体価を測定する場合には一般に約１週間を要していた。一方、「病原体の分離」については病原体の分離・培養を要しており、この場合にも同様の時間を必要とする。また「病原体の遺伝子の検出」については、遺伝子操作やＰＣＲ装置などを必要としており、感染症が発生している現場や、病原体が持ち込まれる恐れのある場所での迅速な判定は不可能である。このため、比較的大掛かりな装置を必要としないことや特殊な技術を必要としないことなどから、感染症の判定の多くがこの「病原体に対する特異的抗体の検索」に頼っているのが現状であるが、この方法でも判定までに時間を要するという欠点が見られた。しかし、最近ではヒトのインフルエンザのように患者が病院ですぐにインフルエンザウイルスに感染しているかどうかという判定ができるようになってきた。このように動物の感染症の診断も飼育現場などで迅速な判定ができれば、上記の昨年の丹波町での大規模な鶏の殺処分などといったことは避けられたかも知れない。また、トリインフルエンザウイルスの他にも動物や昆虫によって媒介される感染症がいくつも報告されつつあり、動物の感染症を迅速にしかも簡便に判定するキットの開発は単に経済的損失を防ぐのみならず、人命を保護するということにも直結する。
【特許文献１】  国際公開第ＷＯ０２／３６７８５号パンフレット
【特許文献２】  特開２００３−１５５３００号公報
【特許文献３】  特開２００３−３１９７７８号公報
【非特許文献１】  Ｌｅｗａｎｄｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１０，ｐｐ．１０５３−１０７０，１９７２
【非特許文献２】  ＭｃＣｒａｅ  ａｎｄ  Ｍｅｒｔｅｎｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，ｐｐ．３５−４１，１９８３
【非特許文献３】  Ｉｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５，ｐｐ．９８８−９９５，２００１
【発明の開示】
本発明は、多角体病ウイルス由来の多角体タンパク質（外殻タンパク質）が、結晶状態で目的タンパク質を内部または表面に取り込んで固定して形成された粒子状のタンパク質複合体であって、目的タンパク質が外殻タンパク質の内部または表面に固定された構造のタンパク質複合体を用いた該目的タンパク質に特異的に結合する物質の迅速な検出法および該タンパク質複合体を含む目的タンパク質に特異的に結合する物質の検出キットの提供を目的とする。
目的のタンパク質を固定した多角体タンパク質複合体は、結晶状態の目的タンパク質の入手源として、あるいはプロテインチップ等への利用が考えられていた。本発明者らは、さらに該多角体タンパク質複合体の利用について鋭意検討を行い、該多角体タンパク質複合体が多角体タンパク質中に固定されたタンパク質に特異的に結合し得る物質の検出に利用できることを見出した。目的のタンパク質が固定された多角体タンパク質複合体は、その内部および表面に目的のタンパク質が固定されており、大きさが１００ｎｍから１０μｍ程度の粒子形状を有しており、また比重も水に比べて大きい。多角体タンパク質複合体には目的のタンパク質が固定されているので、固定されたタンパク質に結合する物質と複合体を形成することができる。さらにある程度の大きさを有しているので、遊離の多角体タンパク質が多数集合することにより、該集合体を容易に認識することができる。すなわち、本発明者らは、被検出物質と被検出物質に特異的に結合し得る物質との結合を利用して遊離の多角体タンパク質を集合させ得ること、多角体タンパク質の集合体の存在を検出することにより、被検出物質の存在を検出できることを見出した。本発明者等は、多角体タンパク質複合体を集合させる方法として、多角体タンパク質複合体と多角体タンパク質に固定されたタンパク質に結合する物質との複合体を遠心分離操作等により集合させる方法、適当な固相支持体に局在固定化した、多角体タンパク質に固定されたタンパク質に特異的に結合し得る物質に多角体タンパク質を結合させて、前記局在固定化部位に多角体タンパク質を集合させる方法、および多角体タンパク質複合体と多角体タンパク質複合体に固定されたタンパク質と結合し得る物質を接触混合することにより、該物質を介して多角体タンパク質複合体が凝集集合させる方法を見出した。さらに、適当な検出手段により該集合体の存在を検出し、すなわち被検出物質の存在を検出しうることを見出し、本発明を完成させるに至った。本発明の方法によれば、十数分以内で被検出物質の検出が可能であり、多角体中に目的タンパク質を固定したタンパク質複合体のプロテインチップを用いた検出よりも迅速に検出が可能である。
本発明では、「迅速にしかも簡便に感染症を判定する」という目的から、ＥＬＩＳＡ法の他に凝集法による血清中の特異的抗体の検出法を提供する。本発明により、抗原抗体反応を１５〜３０分程度で肉眼で判定できる。
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］  検体中の被検出物質を検出する方法であって、該被検出物質に特異的に結合し得るタンパク質を多角体に固定化し、この多角体タンパク質複合体を遊離の状態で検体と接触させ、該接触によりできた多角体タンパク質複合体と被検出物質との複合体の存在を検出することを含む、被検出物質を検出する方法、
［２］  被検出物質に特異的に結合し得るタンパク質を多角体に固定化し、この多角体タンパク質複合体を遊離の状態で検体と接触させ、被検出物質を介して前記多角体タンパク質複合体を凝集させ、該凝集の存在を検出することを含む、［１］の被検出物質を検出する方法、
［３］  被検出物質に特異的に結合し得るタンパク質を多角体に固定化し、この多角体タンパク質複合体を遊離の状態で検体と接触させ、多角体タンパク質複合体−被検出物質複合体を形成させ、該多角体タンパク質複合体−被検出物質複合体を、前記被検出物質に結合する物質であって、固相支持体に固定化した物質と接触させ、多角体タンパク質複合体−被検出物質−被検出物質と結合する物質の複合体を形成させ、該多角体タンパク質複合体−被検出物質−被検出物質と結合する物質の複合体の存在を検出することを含む、［１］の被検出物質を検出する方法、
［４］  多角体タンパク質複合体が、さらにシグナルを発生し得る標識タンパク質を固定している、［１］から［３］のいずれかの被検出物質を検出する方法、
［５］  シグナルを発生し得る標識タンパク質がグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、［４］の被検出物質を検出する方法、
［６］  免疫検出法である［１］から［５］のいずれかの被検出物質を検出する方法、
［７］  多角体タンパク質複合体に固定されたタンパク質がウイルスまたは細菌に対する抗体である、ウイルスまたは細菌感染を検出する、［６］の被検出物質を検出する方法、
［８］  多角体タンパク質複合体に固定されたタンパク質がアレルゲンである、検体中の抗アレルゲン抗体を検出する、［６］の被検出物質を検出する方法、
［９］  検体中の被検出物質を検出するキットであって、該被検出物質に特異的に結合し得るタンパク質を固定した遊離の多角体タンパク質複合体を含む検出キット、
［１０］  多角体タンパク質複合体が、さらにシグナルを発生し得る標識タンパク質を固定している、［９］の検出キット、
［１１］  凝集法を利用した検出キットであり、さらに凝集反応を行わせるためのプレートを含む［９］または［１０］の検出キット、
［１２］  免疫検出キットである、［９］から［１１］のいずれかの検出キット、
［１３］  多角体タンパク質複合体に固定されたタンパク質がウイルスまたは細菌に対する抗体である、ウイルスまたは細菌感染を検出する、［１１］または［１２］の検出キット、
［１４］  多角体タンパク質複合体に固定されたタンパク質がアレルゲンである、検体中の抗アレルゲン抗体を検出する、［１１］または［１２］の検出キット、
［１５］  検体中の被検出物質を検出する方法であって、該被検出物質に特異的に結合し得るタンパク質を多角体に固定化し、この多角体タンパク質複合体を担体に結合させた状態で検体と接触させ、該接触によりできた多角体タンパク質複合体と被検出物質との複合体の存在を検出することを含む、被検出物質を検出する方法、
［１６］  酵素結合抗体法（ＥＬＩＳＡ）である［１５］の方法、
［１７］  多角体タンパク質複合体に固定されたタンパク質がウイルスまたは細菌に対する抗体である、ウイルスまたは細菌感染を検出する、［１５］または［１６］の被検出物質を検出する方法、
［１８］  多角体タンパク質複合体に固定されたタンパク質がアレルゲンである、検体中の抗アレルゲン抗体を検出する、［１５］または［１６］の被検出物質を検出する方法、ならびに
［１９］  検体中の被検出物質を検出するキットであって、該被検出物質に特異的に結合し得るタンパク質を固定した遊離の多角体タンパク質複合体がマイクロタイタープレート（ｏｒ担体）に結合された［９］から［１４］のいずれかの検出キット。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００４−０８７８４１号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】  図１は、Ｄｅｒ  ｆ  １５遺伝子とＶＰ３遺伝子を連結した転写ユニットを示す図である。
図２は、本発明で用いる多角体タンパク質複合体の製造方法を示す図である。
図３は、本発明で用いる多角体タンパク質における目的のタンパク質であるダニアレルゲンＤｅｒ  ｆ  １５タンパク質が固定される態様を示す図である。
図４は、ダニアレルゲン自然感作犬血清（以下、ダニアレルギー罹患イヌ血清）を用いたＤｅｒ  ｆ  １５固定化多角体凝集反応の結果を示すマイクロタイタープレートの写真である。
図５は、顕微鏡で観察したダニアレルギー罹患イヌ血清によるＤｅｒ  ｆ  １５固定化多角体の凝集結果（拡大倍率１００）を示す写真である。
図６は、顕微鏡で観察したダニアレルギー罹患イヌ血清によるＤｅｒ  ｆ  １５固定化多角体の凝集結果（拡大倍率２００）を示す写真である。
図７は、Ｇａｔｅｗａｙクローニングシステムを用いた発現ベクターの構築の原理を示す図である。
図８は、デスティネーションベクター（組換えイヌジステンパーウイルス構造タンパク質）の構造を示す図である。図中、ＶＰ（Ｘ）は固定化シグナルを表し、ＶＰ（５２）：１３７−２９２ｂｐ（５２ａａ）、ＶＰ（Ｘｂａ）：１４−１３６４（４５０ａａ）、ＶＰ（Ａ）：１４−３１３ｂｐ（１００ａａ）、ＶＰ（Ｃ）：１３７−２９２ｂｐ（５２ａａ）がある。ＶＰ（Ｘ）の左の斜め線の部分は、６×Ｈｉｓ配列（塩基配列：ＡＴＧＣＧＧＧＧＴＴＣＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴ（配列番号１１）、アミノ酸配列：Ｍｅｔ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ（配列番号１２）を表す。また、ＶＰ（Ｘ）の右の斜め線部分は、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｓｉｔｅ（塩基配列：ＣＴＧＧＡＡＧＴＴＣＴＧＴＴＣＣＡＧＧＧＧＣＣＣ（配列番号１３）、アミノ酸配列：Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ（配列番号１４）を表し、横線の部分はＡｔｔ配列を表し、ドットの部分は、ＣＤＶ−Ｆ，Ｈを表す。
図９は、組換えイヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）構造タンパク質の発現を示す写真である。
図１０は、イヌジステンパーウイルスのタンパク質を含む多角体タンパク質複合体の作製方法を示す図である。
図１１は、イヌジステンパーウイルスのタンパク質を含む多角体タンパク質複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
図１２は、イヌジステンパーウイルスのタンパク質を含む多角体タンパク質複合体を用いた凝集反応の結果を示す写真である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明について詳細に説明する。
１．タンパク質複合体の作製
本発明の検出方法においては、多角体病ウイルス由来の多角体タンパク質（外殻タンパク質）が、結晶状態で目的タンパク質を内部または表面に固定して形成された粒子状のタンパク質複合体であって、目的タンパク質が外殻タンパク質の内部または表面に固定された構造のタンパク質複合体を利用する。該タンパク質複合体をプロテインビーズともいう。
該タンパク質複合体は、国際公開第ＷＯ０２／３６７８５号パンフレットに記載の方法で作製することができる。該方法の概要は以下の通りである。
本発明の多角体病ウイルス由来の多角体タンパク質（外殻タンパク質）は、例えば昆虫の細胞質多角体病ウイルスコート外殻タンパク質であり、カイコ細胞質多角体病ウイルス（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ，ＢｍＣＰＶ）の外殼タンパク質（細胞質多角体タンパク質）が例示される。
多角体タンパク質をコードする遺伝子を組込んだウイルスベクターは、例えばオートグラファ・キャルホニカ・核多角体病ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ，ＡｃＮＰＶ）由来のバキュロウイルスベクターに公知の方法、例えばＪ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．７４，ｐｐ．９９−１０２，１９９３に記載の方法を用いてポリヘドリン遺伝子を組込むことによって調製し得る。ポリヘドリン遺伝子を組込んだＡｃＮＰＶ由来のバキュロウイルスベクターとして、ＡｃＣＰ−Ｈが例示でき、該ベクターは、バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターの下流にＢｍＣＰＶのＨ系統の多角体タンパク質遺伝子を組込んである。
他方、目的のタンパク質をコードする遺伝子を組込んだウイルスベクターは、例えばカイコ細胞質多角体病ウイルス（ＢｍＣＰＶ）の外層構成タンパク質のひとつであるＶＰ３のＣ末端またはＮ末端に目的のタンパク質を連結した融合タンパク質をコードするキメラ遺伝子を作製し、次いで前記のオートグラファ・キャルホニカ・核多角体病ウイルス由来のバキュロウイルスベクターに導入することにより行われる。この場合もバキュロウイルス由来のプロモーターを目的のタンパク質をコードする遺伝子の上流に連結すればよい。
ポリヘドリン遺伝子または目的のタンパク質をコードする遺伝子を組込んだベクターを構築する際には、プロモーターとして例えば、バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターやｐ１０プロモーターを発現させようとする遺伝子の上流に組み込めばよい。
次に、このように調製した２種のウイルスベクターを昆虫の組織細胞に同時感染させる。同時感染させるには、この２種のウイルスベクターを液体状態で同時に昆虫細胞に接種し、室温で０．５〜３時間放置して、ウイルスを細胞に十分に吸着させた後、ウイルス液を除去し、ウシ胎児血清を含む培養液を添加し、２０〜３０℃で２〜１０日間培養すればよい。
次いで、この培養液から感染細胞を分離し、冷却しながら磨砕し、該磨砕液からろ過または遠心分離により多角体を含む固形分を回収することにより、目的のタンパク質が固定されたタンパク質複合結晶体が得られる。このようにして、結晶性多角体タンパク質に対し、質量比１／１０〜１／１０００の範囲で目的のタンパク質微結晶を含むタンパク質複合結晶体が得られる。
細胞中で製造された目的のタンパク質が固定された多角体タンパク質複合体は、培養細胞をホモジナイザー等を用いて磨砕し、遠心分離を行うことにより回収することができる。該タンパク質複合体は培養細胞の状態で、またはその磨砕片を除去した状態で保存し、被検出物質の検出に用いることができる。さらに、精製が必要な場合は、多角体の比重が１．２８であることを利用して、ショ糖密度勾配遠心分離によりさらに高純度で精製することができる。
なお、目的タンパク質の固定とは、目的タンパク質が多角体タンパク質内に完全に包み込まれた状態と多角体タンパク質外に一部露出して埋入された状態とを含むことを意味する。目的タンパク質の固定は、目的タンパク質の包囲、包埋または封入ともいう。また、複合体の形状としては、立方体、直方体、円柱などの定形や不定形の粒子状が含まれる。固定される目的タンパク質の量を増加させたり、目的タンパク質のサイズを大きくすることができる。固定される目的タンパク質の量を増加させることにより、例えば検出の際の検出感度を高めることが可能である。
本発明のタンパク質複合体の製造において、外殻タンパク質であるＶＰ３は、目的のタンパク質を多角体タンパク質に固定させる多角体固定シグナルとして作用する。この際、ＶＰ３の限定された領域を多角体固定シグナルとして有していてもよい。ＶＰ３の限定された領域は、Ｎ末端から４０までに加え、４１アミノ酸残基から７９アミノ酸残基の範囲である。また、Ｎ末端から４１アミノ酸残基から７９アミノ酸残基の領域とその領域のＮ末端もしくはＣ末端に１０アミノ酸残基付加したものも使用することも可能である。配列番号１にＢｍＣＰＶのＳ４をコードする遺伝子のＤＮＡ配列、配列番号２にＳ４のアミノ酸配列を示す。
例えば、以下のようにして本発明のタンパク質複合体を製造することができる。ＶＰ３をコードしているＳ４の１３５８番目と２７１１番目に存在する制限酵素サイトＸｂａＩ間を欠落させたＶＰ３をコードする遺伝子／目的タンパク質（ダニアレルゲン、Ｄｅｒ  ｆ  １５をコードする遺伝子のキメラ遺伝子（ＶＰ３（ＸｂａＩ）／Ｄｅｒ  ｆ  １５）を作製する。次に、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ（ＡｃＮＰＶ）由来のバキュロウイルスベクターに導入し、このＶＰ３（ＸｂａＩ）とＤｅｒ  ｆ  １５の融合タンパク質を昆虫細胞Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来のＩＰＬＢ−Ｓｆ２１−ＡＥ（Ｓｆ２１）で発現させる。その際、ＢｍＣＰＶの立方体の多角体を形成するために、ポリヘドリン遺伝子を組み込んだ組み換えＡｃＮＰＶ（ＡｃＣＰ−Ｈ）（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７４，９９−１０２，１９９３）も同時にＳｆ２１細胞に接種する。２つのウイルスに感染したＳｆ２１細胞から多角体を精製することができる。
このように、目的のタンパク質のＮ末端またはＣ末端に細胞質多角体病ウイルスの外層を構成するタンパク質であるＶＰ３のアミノ酸配列を導入し、このＶＰ３と目的のタンパク質の融合タンパク質をバキュロウイルスベクターで発現させるが、この際、細胞質多角体病ウイルスの多角体を発現するウイルスとともに、昆虫細胞に感染させることにより、多角体中に融合タンパク質が固定される。このために、バキュロウイルスベクターで発現させた外来タンパク質、すなわち目的のタンパク質が、細胞質多角体病ウイルスの構成タンパク質のＮ末端またはＣ末端に挿入されるように、細胞質多角体病ウイルスの構成タンパク質をコードするｃＤＮＡと外来タンパク質遺伝子とを結合させる。この際、構成タンパク質と外来タンパク質遺伝子のタンパク質をコードするＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）がインフレームになるようにする。このようにして、細胞質多角体病ウイルスの構成タンパク質と外来タンパク質を１つのタンパク質複合体として発現させることのできる組換えバキュロウイルスが形成される。
ここで、本発明でタンパク質複合体中に固定されるタンパク質は、本発明の多角体タンパク質複合体を用いたアッセイで検出しようとする物質（被検出物質）に特異的に結合し得るタンパク質である。例えば、検出しようとする物質に特異的に結合する抗体が挙げられる。また、検出しようとする物質が抗体である場合は、該抗体が特異的に結合する抗原が挙げられる。すなわち、検出しようとする物質と多角体タンパク質複合体に固定させるタンパク質が、受容体−リガンドあるいはリガンド−受容体の関係にあればよい。本発明の方法における被検出物質は限定されず、例えば、ＨＩＶ、肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ジステンパーウイルス等のウイルス、黄色ぶどう球菌、肺炎双球菌、腸管出血性大腸菌等の細菌などが挙げられる。また、ダニアレルゲン（例えばＤｅｒ  ｆ  １５）などの各種アレルゲンが挙げられる。インフルエンザウイルスの型として、Ａ型（Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ１Ｎ１等）、Ｂ型、Ｃ型、ヒト分離型、トリ分離型（トリインフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ７等））、ブタ分離型（ブタインフルエンザウイルス）、その他ウマ等の哺乳類の分離型等のインフルエンザウイルスが挙げられる。また、これらに対する抗体も検出可能である。ウイルス、細菌、アレルゲン等を検出する場合、これらの抗原に対する抗体が固定された本発明の多角体タンパク質複合体を用いればよいし、これらの抗原が固定された本発明の多角体タンパク質複合体を用いることによりこれらの抗原に対する抗体を検出することができる。抗アレルゲン抗体等のアレルゲンに特異的に結合し得る物質の検出に用いることができる。さらに、目的のタンパク質にグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等のタンパク質を融合させた形で発現させてもよい。目的のタンパク質をＧＦＰと融合させてタンパク質複合体に固定した場合、該タンパク質複合体自体が蛍光を発生し得る。従って、被検出物質と結合した多角体タンパク質複合体が発生する蛍光をトレースすることにより、各種物質の検出を行うことができる。ＧＦＰには、種々の改変型ＧＦＰが知られており、これらの改変型ＧＦＰを本発明のＧＦＰとして用いることもできる。このような改変型ＧＦＰとしてＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＧＦＰＵＶ、ＧＦＰｍｕｔ３．１、ＢＦＰ２（すべてＣｌｏｎｅｔｅｃｈ社から入手可能）、Ｖｅｎｕｓ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊａｎｕａｒｙ  ２００２  Ｖｏｌ．２０−１，８７−９０）、Ｓ６５Ｔが挙げられる。また、ＧＦＰの蛍光色の変異体である、ＥＢＦＰ（Ｂｌｕｅ）、ＥＣＦＰ（Ｃｙａｎ）、ＥＹＦＰ（Ｙｅｌｌｏｗ）（すべてＣＬＯＮＴＥＣＨ社から入手可能）も本発明のＧＦＰとして使用できる。これらの改変型ＧＦＰは例えば、『実験医学別冊  ポストゲノム時代の実験講座３  ＧＦＰとバイオイメージング』  宮脇敦史  編、２０００年１０月２５日第１版第１刷発行、羊土社  に詳細に記載されており、この記載を参照して入手することができる。なお、多角体タンパク質複合体に固定するタンパク質は、全体でもよいが、被検出物質と結合し得る部位が存在する限り断片でもよい。固定するタンパク質が��体の場合は、全長抗体の他、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、１個のＦａｂと完全なＦｃを有するＦａｂ／ｃ、またはＨ鎖若しくはＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）等の断片を固定すればよい。
さらに、複数の目的タンパク質を一つのタンパク質複合体中に固定化してもよい。この場合、それぞれの目的のタンパク質をコードする遺伝子を含む複数のベクターを調製し、ポリヘドリンをコードする遺伝子を含むベクターと同時に細胞で発現させればよい。例えば、以下のように検出しようとする物質に特異的に結合する目的のタンパク質の固定と同時に酵素、蛍光タンパク質、色素蛋白質等の、光などのシグナルを発生し得るタンパク質を固定すればよい。例えば、検出しようとする物質に特異的に結合するタンパク質と上述のＧＦＰを同時に発現させれば、タンパク質複合体中に該タンパク質とＧＦＰの両方が固定されるので、タンパク質複合体は、前記検出しようとする物質に結合するという機能および蛍光シグナルを発生するというトレーサーとしての機能を有するので、物質の検出に有利に用いることができる。また、蛍光タンパク質ではなく、適当な色を有する色素タンパク質を用いてもよい。この場合も、色素タンパク質の呈するシグナル（色）により、多角体タンパク質複合体をトレースすることができる。色素タンパク質として、例えばヘモグロビン、クロロフィルタンパク質等が存在する。さらに、多角体タンパク質複合体に適当な色素を結合させてもよく、該色素の呈する色により多角体タンパク質複合体をトレースすることができる。例えば、金コロイドを多角体タンパク質複合体に結合させればよい。
さらに、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等の酵素を目的のタンパク質と同時に多角体タンパク質に固定してもよい。このような酵素を固定化したタンパク質の存在は、該酵素に特異的な基質を用いることによる発色反応により発生するシグナル（色）を指標に検出することができるので、後述の被検出物質の検出に用いることができる。
さらに、上記では目的タンパク質を含むベクターと多角体タンパク質を含むベクターを別々に調製し、それらのベクターを細胞に導入し、タンパク質複合体を作製する方法を例示したが、目的タンパク質と多角体タンパク質を一つのベクター中に導入することもできる。例えば、オートグラファ・キャルホニカ・核多角体病ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ）由来のバキュロウイルスベクターに公知の方法、例えばＪ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．７４，ｐｐ．９９−１０２，１９９３に記載の方法を用いてポリヘドリン遺伝子を組込み、さらにカイコ細胞質多角体病ウイルス（ＢｍＣＰＶ）の外層構成タンパク質のひとつであるＶＰ３（全長または部分長）のＣ末端に目的のタンパク質を連結した融合タンパク質をコードするキメラ遺伝子をポリヘドリン遺伝子を組込んだオートグラファ・キャルホニカ・核多角体病ウイルス由来のバキュロウイルスベクターに導入すればよい。このように、目的タンパク質と多角体タンパク質を一つのベクター中に導入した場合、多角体タンパク質の発現量と目的タンパク質の発現量の比を調節できるので、得られたタンパク質複合体中に固定される目的のタンパク質の量を調節することができる。この場合、バキュロウイルスベクター中に、バキュロウイルスのポリヘドリンをコードする遺伝子がプロモーターの下流に連結している転写ユニットおよび目的タンパク質をコードする遺伝子がプロモーターの下流に連結している転写ユニットの少なくとも２つの独立した転写ユニットを組込めばよい。ここで用いるプロモーターとしては、例えばポリヘドリンプロモーターやｐ１０プロモーターが挙げられる。例えば、Ｇａｔｅｗａｙクローニングシステムを用いることができる（図７）。図７中の左図の上は、ａｔｔＲ配列を持ったデスティネーションベクター、下はａｔｔＬ配列を持つエントリークローンを示す。これらの２つのベクターを用いたＬＲ反応によってｉｎ  ｖｉｔｒｏでの組換え反応が起きる。図７中右図はＤｅｒ  ｆ  １５ｃＤＮＡ配列を導入した発現ベクターである。
タンパク質複合体を産生するために用いる細胞は、ウイルスに感染できる細胞であれば限定されず、昆虫細胞も植物細胞も用いることができる。鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）に属するもの、特にシヤクガ科（Ｇｅｏｍｅｔｒｉｄａｅ）、ヤママユガ（ｓａｌｕｒｎｉｉｄａｅ）、カイコガ科（Ｂｏｍｂｙｃｉｄａｅ）、ヒトリガ科（Ａｒｃｔｉｉｄａｅ）、ヤガ科（Ｎｏｅｔｕｉｄａｅ）に属するものが用いられる。入手が容易で取り扱いやすい点で、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ  Ｌ）、ムガサン（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ａｓｓａｍｅｎｓｉｓ Ｈｅｌｆｅｒ）、ネキリムシ（Ｐｅｒｉｄｒｏｍａｓｐ．）、アワヨトウ（Ｌｅｕｃａｎｉａ ｕｎｉｐｕｎｃｔａｔａ  ｈｏｗｏｒｔｈ）などが通常用いられている。また、昆虫体および植物体も用いることができる。昆虫体および植物体を用いての多角体タンパク質複合体の製造は、公知の方法により行うことができる。
さらに、無細胞翻訳系を利用して、本発明で用いるタンパク質複合体を作製することもできる。無細胞翻訳系による多角体タンパク質複合体の作製は、例えば特開２００３−３１９７７８号公報の記載に従い行うことができる。
このようにして得られた多角体タンパク質複合体は、一辺が１００ｎｍから１０μｍの立方体、直方体または円柱上のタンパク質であり、該立方体の中に目的のタンパク質が固定され、一部のタンパク質は立方体内部に存在し、一部のタンパク質は、タンパク質の一部を外側に露出した状態で表面に存在する。
本発明の多角体タンパク質複合体中に目的のタンパク質が固定されているかどうかは、例えば金粒子で標識された目的のタンパク質に対する抗体を用いた免疫電子顕微鏡による観察により評価することができる。また、多角体タンパク質複合体がＧＦＰ等の蛍光タンパク質を含む場合は、蛍光測定することにより評価することができる。
本発明の多角体タンパク質複合体において、固定される目的のタンパク質は、結晶状態で固定される。タンパク質は、アモルファス状態である乾燥標品の状態よりも、結晶状態の方がより安定である。また、目的とするタンパク質は、多角体タンパク質によりコーティングされた状態にあるので、その点でも本発明の多角体タンパク質複合体中の目的のタンパク質の安定性は高い。このように、多角体タンパク質の安定性が高いので、長期間保存することができる。例えば、前述のようにして精製したタンパク質複合体は、乾燥させた状態でも、水に懸濁した状態でも長期間保存することができる。また、多角体タンパク質複合体中に固定された目的のタンパク質はその立体構造を維持したまま固定化されている。従って、抗原を固定化して該抗原に結合する抗体を検出しようとする場合、天然状態の立体構造が維持され、エピトープも維持されている。従って、立体構造の喪失による抗体との結合性の低下が起こらないので、本発明の多角体タンパク質複合体を利用することにより、被検出物質を高感度に検出することができる。また、多角体タンパク質中にＧＦＰ等の蛍光タンパク質や酵素等が固定されている場合は、これらのタンパク質も安定に存在し、長期間蛍光を発するという機能、酵素反応を触媒するという機能を保持し得る。
さらに、本発明で用いるタンパク質複合体は、調製したベクターを細胞に導入し、該細胞を培養し、所望の遺伝子を発現させるだけで製造でき、培養上清から容易に得られるので、少ない工程で大量に製造できる。例えば、培養上清中の多角体を水を用いて洗浄しつつ遠心分離等により回収するだけで、本発明の方法に用いることができる。これに対して、例えば抗原または抗体を感作したラテックス粒子を用いる従来の凝集法を行おうとした場合、所望の遺伝子を導入したベクターを細胞に導入し、該細胞を培養し、複雑な工程で純粋なリコンビナントタンパク質を精製させる必要がある。さらに、ラテックス粒子を調製し、所定の粒径の粒子を精製し、次いで前記のようにして調製した被検出物質に特異的に結合する物質をラテックス粒子に結合させ、該物質が結合したラテックス粒子と結合していないラテックス粒子を分離するというように、製造工程が多い。この点でも、本発明のタンパク質複合体は有利に検出に用いることができる。
２．目的のタンパク質が固定された多角体タンパク質複合体を遊離の状態で利用した被検出物質の検出
目的のタンパク質が固定された多角体タンパク質複合体を用いて以下のようにして、検体中に含まれる被検出物質の検出を行うことができる。この場合、目的のタンパク質が固定された多角体タンパク質複合体は、遊離の状態、すなわち適当な担体や支持体に結合していない状態で存在し、被検出物質と結合することにより集合し得る。
用いる検体は限定されず、例えば、全血、血清、血漿、尿、唾液、喀痰、汗または鼻、咽頭もしくは鼻咽頭の分泌物等の動物由来の生体試料、食物等の抽出液を用いることができる。被検出物質も限定されないが、上記検体中の抗原または抗体が例示できる。被検出物質が抗原の場合は、多角体タンパク質複合体に固定されたタンパク質は該抗原に特異的に結合する抗体であり、非検出物質が抗体の場合は、多角体タンパク質複合体に固定されたタンパク質は該抗体が特異的に結合する抗原である。
抗原抗体反応を利用した被検出物質の免疫検出において、抗原または抗体に結合した被検出物質と結合していない被検出物質を分離（Ｂ／Ｆ分離）する必要がある。本発明の多角体タンパク質複合体を該分離に利用することができる。すなわち、被検出物質に特異的に結合するタンパク質を固定した多角体タンパク質複合体を、被検出物質を含む検体と混合し、固定されたタンパク質と被検出物質を接触させ結合させる。次いで、多角体タンパク質複合体と検体との混合物を静置するか、または遠心分離することにより、多角体タンパク質複合体−被検出物質の複合体を沈殿させ、遊離の被検出物質と分離させる。その後、多角体タンパク質に結合した被検出物質を測定する。被検出物質の測定は、例えば被検出物質に特異的に結合する物質を西洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼ等の酵素、１２５Ｉ等の放射性同位体、フルオレセイン等の蛍光物質等で標識したもの（標識試薬）を多角体タンパク質−被検出物質複合体に添加し、形成された多角体タンパク質−被検出物質−標識試薬複合体を標識物質の発するシグナルを指標に測定する。このような方法により検体中の被検出物質を検出することができる。また、多角体タンパク質複合体中に西洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼ等の酵素が固定されていてもよい。この場合、前記の多角体タンパク質複合体−被検出物質複合体に酵素の基質を添加することにより、多角体タンパク質複合体中に固定された酵素の触媒反応により、発色が生じ、多角体タンパク質複合体−被検出物質複合体の存在を調べることができる。
また、被検出物質に対する抗原又は抗体を、多角体タンパク質中に固定した多角体タンパク質複合体を被検出物質を含む可能性のある検体と接触させ、被検出物質を介した多角体タンパク質複合体の免疫凝集反応を検出することにより検体中に被検出物質が含まれている否か、あるいは被検出物質の含有量を測定することができる。
凝集反応は、スライドグラス、９６ウェル平底プレート、９６ウェルＵ底プレート、９６ウェルＶ底プレート等を用いて行わせることができる。９６ウェルプレートを利用して凝集物の形成を目視により判定する場合、多角体タンパク質複合体の比重が大きいため、ウェル中での重量による落下速度が大きい。従って、重力によるウェル底への落下集合と被検出物質を介した凝集とを区別できるよう、平底プレートを用いるのが望ましい。
タンパク質複合体と検体を適当な緩衝液中で混合し、スライドグラス上またはプレートのウェル中に添加し、一定時間攪拌または静置し、凝集が生じたかどうかを測定すればよい。タンパク質複合体の量および検体の量は、検出しようとする被検出物質の種類や検体中の予測含有量等により、適宜決定することができる。例えば、タンパク質複合体１０７から１０１０／ｍｌの０．５μＬを９．５μＬの緩衝液と混合し、さらに数十μＬの生理食塩水または緩衝液を添加し、これに１０μＬから１００μＬの検体を混合すればよい。なお、タンパク質の複合体の濃度（単位体積当りの数）は、顕微鏡下で血球計算盤を用いて計測した。凝集反応を行う際に用いる緩衝液も限定されないが、例えばｐＨ５〜９、好ましくは６〜９のリン酸緩衝液、トリス緩衝液、炭酸緩衝液等を用いることができる。反応温度は、限定されないが、４℃〜５０℃、好ましくは１５℃〜４０℃、さらに好ましくは３０℃〜４０℃である。また、反応時間も限定されないが、好ましくは１分〜３０分である。また、凝集反応を行わせる際に、非特異的な反応を抑制するために、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０等の適当な界面活性剤を添加してもよい。
凝集の有無は、肉眼で判定することができる。また、光学的機器を用いれば、大量にかつ正確に判定することができる。光学的機器を用いる場合、最終的な凝集像を得る必要は必ずしもなく、凝集反応に伴う反応液系の濁度の変化を測定すればよい。光学的機器による測定は、散乱光、吸光度または透過光強度を検出することにより行うことができる。また、タンパク質複合体がＧＦＰなどの蛍光タンパク質を含む場合は、凝集物中の蛍光強度を測定してもよい。
さらに、本発明のタンパク質複合体をイムノクロマトグラフィーの標識試薬として用いることができる。イムノクロマトグラフィーにおいては、ニトロセルロース膜等の適当な固相支持体上に抗体等の被検出物質と結合し得る物質を固定化し、該固相支持体に毛管現象を利用して、金コロイド等の適当な標識物質で標識した被検出物質（標識試薬）と結合し得る物質と被検出物質の複合体を展開移動させる。この結果、固定化した物質−被検出物質−標識試薬の複合体が固相支持体上に形成され、該複合体から発する標識試薬のシグナル（金コロイドの場合は、被検出物質と結合し得る物質を固定化した固相支持体部分が赤くなる）を検出することにより、被検出物質を検出することができる。
被検出物質に特異的に結合し得るタンパク質を含むタンパク質複合体をイムノクロマトグラフィーにおける標識試薬として用いることができる。この際、タンパク質複合体が固相支持体上で認識し得るシグナルを発生するようにする必要があるが、例えば、蛋白質複合体を適当な色素で染色すればよい。また、タンパク質複合体を製造する際に、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質あるいは色素タンパク質等の色を発するタンパク質を固定させればよい。
イムノクロマトグラフィー装置の製造およびイムノクロマトグラフィーによる検出は公知の方法で行うことができる。
本発明の目的のタンパク質を固定した多角体タンパク質複合体を用いた検出法によれば、被検出物質を３０分以内、好ましくは１５分以内、さらに好ましくは１０分以内で検出することが可能である。
さらに、本発明の方法は、担体を用いた態様も包含する。ＥＬＩＳＡ用マイクロタイタープレートやスライドガラス等の担体に多角体タンパク質に結合し得る物質、例えば抗多角体タンパク質抗体または多角体タンパク質複合体に含まれる目的のタンパク質に結合し得る物質、例えば目的のタンパク質に対する抗体をあらかじめ結合させておく。多角体タンパク質複合体と被検出物質を含み得る検体試料とを混合し、多角体タンパク質複合体を遊離の状態で検体と接触させ多角体タンパク質複合体と被検出物質との複合体を形成させる。次いで、多角体タンパク質複合体と被検出物質との複合体を前記の多角体タンパク質または目的のタンパク質に結合し得る物質を固相化させた担体と接触させ、固相化物質−多角体タンパク質複合体−被検出物質複合体を形成させる。さらに、ここに被検出物質に結合し得る物質、例えば被検物質に対する抗体をペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等の酵素や蛍光物質などで標識した２次抗体を接触させ、固相化物質−多角体タンパク質複合体−被検出物質−２次抗体複合体を形成させる。２次抗体による呈色または蛍光を測定することにより、被検出物質を測定することができる。この方法は、検体中の被検出物質を検出する方法であって、該被検出物質に特異的に結合し得るタンパク質を多角体に固定化し、この多角体タンパク質複合体を遊離の状態で検体と接触させ、該接触によりできた多角体タンパク質複合体と被検出物質との複合体の存在を担体上で検出する方法である。
３．  目的のタンパク質が固定された多角体タンパク質複合体を担体に結合した状態で利用した被検出物質の酵素結合抗体法による（ＥＬＩＳＡ）検出
本発明の多角体タンパク質を用いて酵素結合抗体法（ＥＬＩＳＡ）により、被検出物質を検出することができる。この場合、目的のタンパク質（抗体または抗原）を固定化した多角体タンパク質複合体をマイクロタイタープレート等の担体に吸着等により結合させる。この多角体タンパク質複合体を結合したマイクロタイタープレートやスライドグラスは使用時まで、保存しておくことができる。多角体タンパク質複合体を結合したＥＬＩＳＡ用マイクロタイタープレートやスライドグラス等の担体に固定化したタンパク質と結合し得る被検出物質（抗原または抗体）を含む試料を添加し、被検出物質と多角体タンパク質複合体を結合させ、さらにペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼ等の酵素で標識した２次抗体であって、被検出物質と結合する抗体を添加し、被検出物質−多角体タンパク質複合体−２次抗体の複合体を形成させ、酵素酵素の基質を添加して発色させ、発色を測定することにより、被検出物質を検出することができる。
ＥＬＩＳＡにおいて、目的のタンパク質を固定化した多角体タンパク質複合体を固相化することにより、１ウェル当りの目的のタンパク質量を多くすることができる。また、多角体タンパク質複合体という、高分子量の物質を固相化するため、ウェルへの固相化効率や結合の強さも大きくなり、ウェルの洗浄工程でも離脱しにくい。また、従来のＥＬＩＳＡにおいては目的タンパク質を直接ＥＬＩＳＡ用マイクロタイタープレートのウェル内表面に固相化していた。このため、マイクロタイタープレートのウェル内部の表面積に限りがあるため、固相化量には限度があった。しかしながら、本発明の多角体タンパク質複合体を用いる場合、多角体タンパク質複合体自体の固相化量に限りはあるが、多角体タンパク質複合体に含ませる目的のタンパク質量を多くすることにより、１ウェル当りに固相化される目的のタンパク質量を増加させることができ、従来のＥＬＩＳＡよりも感度を上昇させることができる。さらに、抗原抗体反応において抗体は抗原の抗原決定基を認識して抗原に結合するが、この際抗体の認識のために抗原決定基の３次元構造が重要になってくる。従来のＥＬＩＳＡにおいては目的タンパク質を直接ＥＬＩＳＡ用マイクロタイタープレートのウェル内表面に固相化していたため、固相化により固相化抗原または抗体の立体的構造が天然のものから変化し、抗体が抗原決定基を認識できなくなることがあった。本発明においては、目的のタンパク質は多角体タンパク質の中に埋め込まれるように天然の立体的構造を保持した状態で存在する。従って、従来のＥＬＩＳＡのように固相化により抗原抗体反応の反応性が減少することがなく、従来法に比較して感度が高い。このように、目的のタンパク質を固定化した多角体タンパク質複合体を固相化した担体を用いることにより、従来のＥＬＩＳＡと比較しても高感度かつ迅速な検出が可能になる。さらに、従来のＥＬＩＳＡにおいて、担体に固相化した抗原または抗体は安定性が高くないので、調製後時間が経過するにつれ、反応性が低下した。従って、抗原または抗体を固相化した担体は、調製後すぐに使用するか、または乾燥後凍結保存しておく必要があった。本発明の多角体タンパク質複合体は、安定性が高いため、多角体タンパク質複合体を固相化した担体を室温や２〜１０℃で保存しておいても、反応性の低下は少ない。従って、本発明のＥＬＩＳＡにおいて、多角体タンパク質複合体を固相化した担体の保存安定性が高いという利点もあり、担体調製後、長期間にわたって感度よく測定することができる。
また、従来ウイルス感染や感染細菌の診断において、中和抗体法による測定が主に行われていたが、該方法では測定に長時間を要し、また感度も高くなかった。本発明の目的のタンパク質を固定化した多角体タンパク質複合体を用いた酵素結合抗体法によれば、従来の中和抗体法に比較してウイルスまたは細菌感染を高感度かつ迅速に検出することができる。
また、酵素で標識した２次抗体の代わりに、蛍光物質、化学発光物質等で標識した抗体を用いてもよい。この場合は、最終的に蛍光物質、化学発光物質から発する光を測定することにより、被検出物質を検出することができる。
上記の説明では、抗原−抗体反応を利用する測定法について記載したが、抗原と抗体の組合わせだけでなく、リガンドとリガンドレセプターの組合わせ等の相互に結合する化合物同士の組合わせを利用することにより、一方の化合物を検出することができる。
４．  目的のタンパク質を固定した多角体タンパク質複合体を含む検出用試薬
本発明は、目的のタンパク質を固定した多角体タンパク質複合体を含む検出用試薬を包含する。目的のタンパク質を固定した多角体タンパク質複合体は、目的のタンパク質に加えて、シグナルを発生し得るタンパク質を固定していてもよい。該検出用試薬において、目的のタンパク質を固定した多角体タンパク質複合体は乾燥状態であってもよく、この場合は用時に精製水、生理食塩水、適当な緩衝液等で復元して用いればよい。さらに、該検出用試薬において、目的のタンパク質を固定した多角体タンパク質複合体は、精製水、生理食塩水、適当な緩衝液等に懸濁した状態で存在していてもよい。目的のタンパク質を固定した多角体タンパク質複合体を含む検出用試薬は、界面活性剤、抗菌剤等を含んでいてもよい。
さらに、本発明は、目的のタンパク質を固定した多角体タンパク質複合体を含む検出用キットをも包含する。該キットは、前述の目的のタンパク質を固定した多角体タンパク質複合体を含む検出用試薬を含み、さらに凝集反応を行わせるプレート、イムノクロマトグラフィー装置ストリップ、ブロッシャー等を含む。また、目的のタンパク質を固定した多角体タンパク質複合体はマイクロタイタープレートやスライドガラス等の担体に結合されていてもよい。本発明は、多角体タンパク質複合体を結合させたマイクロタイタープレート等の担体をも包含する。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】  ダニアレルゲンを含む多角体タンパク質複合体の調製
ダニのアレルゲンＤｅｒ  ｆ  １５を以下の方法でアレルゲンが固定された多角体タンパク質複合体を製造した。
１．デスティネーションベクターの構築
（１）Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ  Ｃａｓｓｅｔｔｅの決定
Ｉｎｖｉｒｏｇｅｎ社のＧａｔｅｗａｙクローニングシステムを用いて、目的遺伝子であるダニアレルゲンＤｅｒ  ｆ  １５遺伝子をバキュロウイルスベクター系に導入するために、まずＶＰ３遺伝子とＤｅｒ  ｆ  １５遺伝子からなるキメラ遺伝子を作製するためには、コドンの読み枠が連続して翻訳される必要があることから、この読み枠を調整するための適切なＧａｔｅｗａｙクローニングシステムのＲｅａｄｉｎｇ  Ｃａｓｓｅｔｔｅを選択した。Ｇａｔｅｗａｙクローニングシステムのデスティネーションベクターに挿入するためのＶＰ３断片は、Ｓ４のＸｂａＩサイト部分（１〜１３５８ｂｐ）である。つまり、１３５８ｂｐでコドンにすると２ｂｐ余分となるので、この部分に１ｂｐを補い、フレームシフトが起こらないように設計されたＣａｓｓｅｔｔｅ  Ｂを選択した。
（２）バキュロウイルスベクターの改変
バキュロウイルストランスファーベクターであるｐＶＬ１３９２（Ｐｈａｒ  Ｍｉｎｇｅｎ社製）のポリヘドリンプロモーター下流に、ＶＰ３をコードするＳ４  ｃＤＮＡをＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩサイトでクローニングし、プラスミドｐＡｃＶＰ３を作製した（Ｉｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。次に、これをＸｂａＩで消化し、ライゲーションキット（ＴａＫａＲａ社製）を用いてセルフライゲーションさせたプラスミドｐＡｃＶＰ３（ＸｂａＩ）を作製した
（３）Ｃａｓｓｅｔｔｅ  Ｂの挿入
ｐＡｃＶＰ３（ＸｂａＩ）をＸｂａＩで消化し、このＸｂａＩサイトの平滑化、脱リン酸化処理を行ってからＣａｓｓｅｔｔｅ  Ｂとのライゲーションを行った。ライゲーション組成は以下の通りである。
2005090982.tif 000002
反応液は、室温で一時間インキュベートし、そのうち１．０μｌを１００ｇｌのＤＢ．３．１コンピテントセルでプロトコールに従い形質転換を行った。形質転換した大腸菌は３０μｇ／μｌのクロラムフェニコール含む２×ＴＹプレート（１６．０ｇ  Ｔｒｙｐｔｏｎ，１０．０ｇ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，５．０ｇ  ＮａＣｌ／Ｌ）に接種し、３７℃で一晩培養した。プレートに生じたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む１．５ｍｌの２×ＴＹ培地（１６．０ｇＴｒｙｐｔｏｎ，１０．０ｇ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，５．０ｇ  ＮａＣｌ／Ｌ）に接種し、３７℃で一晩培養した。プラスミドＤＮＡの抽出はＰｒｏｍｅｇａ社製のＷｉｚａｒｄＲ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてプロトコールに従って行った。このようにしてデスティネーションベクターを構築した。
２．エントリークローンの構築
（１）ａｔｔ  Ｂ配列で修飾されたＰＣＲ産物の調製
ＢＰ反応に必要なａｔｔ  Ｂ１配列（Ｎ末端側）、ａｔｔ  Ｂ２配列（Ｃ末端側）で修飾されたＰＣＲ産物を得るため、プライマーを設計した（配列番号３および４）。その構造を以下に示す。
2005090982.tif 000003
これらのプライマーを４０μＭに濃度調節し、ＰＣＲ反応を行った。その他反応にはＡｍｐｌｉ  Ｅｘ  Ｔａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）および、付属の１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．３］５００ｍＭ  ＫＣｌ  １５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ（ｄＡＴＰ  ｄＣＴＰ  ｄＧＴＰ  ｄＴＴＰ濃度各２．０ｍＭ）を用いた。反応液量は５０μｌとし、Ｍｉｃｒｏ  Ａｍｐ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｔｕｂｅ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）に以下の反応液を調製した。
2005090982.tif 000004
2005090982.tif 000005
反応にはＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ２４００あるいはＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ９７００（いずれもＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて行った。まず９４℃で５分間インキュベートした後、９４℃で１分間（変性）、５０℃で１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）の温度調節を１サイクルとし、これを３５サイクル繰り返した。その後は速やかに温度を下げ、反応を終了させた。ＰＣＲの増幅産物は、インサート部分を切り出すために制限酵素処理したあと１．０％のアガロースゲルで電気泳動を行い、それぞれの大きさにおけるバンドの有無を確認した。
（２）ａｔｔ−ＰＣＲ産物の純化
プライマーやプライマーダイマーを除去するため、上記の５０μｌのＰＣＲ増幅産物に１５０μｌのＴＥを加え、さらに１００μｌの３０％  ＰＥＧ  ８０００／３０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を加えてよく攪拌してから、１０，０００ｇで１５分間遠心し、上清を除去した。これを５０μｌのＴＥに溶解し、そのうちの１０．０μｌを１％アガロースゲルで電気泳動してバンドを確認した。
（３）ＢＰ反応
ａｔｔ  Ｌ配列をベクターの両末端にもつエントリークローンを得るためＢＰ反応を行った。反応液量は１０μｌとし、１．５ｍｌエッペンドルフチューブに室温で以下の組成を調製した。
2005090982.tif 000006
2005090982.tif 000007
反応液を調製後、２５℃で一晩インキュベートしてからｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ液を１μｌ加え、３７℃で１０分間インキュベートした。このうちの１μｌを１．５ｍｌチューブに移して５０μｌのＬＩＢＲＡＲＹ  ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ  ＤＨ５  αコンピテントセル（東洋紡社製）でプロトコールに従い形質転換を行った。
形質転換した大腸菌は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２×ＴＹプレートに接種し、３７℃で一晩培養した。
プレートに生じたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む１．５ｍｌの２×ＴＹ培地に接種し、３７℃で一晩培養した。プラスミドＤＮＡの抽出はＰｒｏｍｅｇａ社製のＷｉｚａｒｄＲ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてプロトコールに従い、行った。
（４）エントリークローンの配列確認
（３）で得られたエントリークローンの配列を確認するため、以下のようなプライマーを設計した（配列番号５および６）。
ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｔｏ  ａｔｔ  Ｌ１  ＴＣＧ−ＣＧ  Ｔ−ＴＡＡ−ＣＧＣ−ＴＡＧ−ＣＡＴ−ＧＧＡ−ＴＣＴ−Ｃ
ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｔｏ  ａｔｔ  Ｌ２  ＧＴＡ−ＡＣ−ＡＴＣ−ＡＧ−ＡＧＡ−ＴＴＴ−ＴＧＡ−ＧＡＣ−ＡＣ
これらのプライマーを用いて、ダイデオキシ法によるＰＣＲ反応をＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２４００で行った。ＰＣＲ反応の組成は以下に示す。
2005090982.tif 000008
反応は９６℃で１０秒間、５０℃で５秒間、６０℃で４分間の温度調整を１サイクルとし、これを２５サイクル繰り返した。その後速やかに温度を下げ、反応を終了させた。その後プロトコールに従ってＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒにより電気泳動を行い、塩基配列の解析を行った。
３．発現ベクターの構築（ＬＲ反応）
多角体に固定されるため必要なＶＰ３配列と、目的遺伝子をキメラにもつ発現ベクターを得るためＬＲ反応を行った（図１）。
2005090982.tif 000009
反応液を調製後、２５℃で一晩インキュベートしてからｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ液を２μｌ加え、３７℃で１０分間インキュベートした。このうちの１μｌを１．５ｍｌチューブに移して５０μｌのＬＩＢＲＡＲＹ  ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ  ＤＨ５  αコンピテントセルを用いてプロトコールに従い形質転換を行った。
形質転換した大腸菌は、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＴＹプレート（１６．０ｇ  Ｔｒｙｐｔｏｎ，１０．０ｇ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，５．０ｇ  ＮａＣｌ／Ｌ）に接種し、３７℃で一晩培養した。
プレートに生じたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１．５ｍｌの２×ＴＹ培地（１６．０ｇ  Ｔｒｙｐｔｏｎ，１０．０ｇ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，５．０ｇ  ＮａＣｌ／Ｌ）に接種し、３７℃で一晩培養した。プラスミドＤＮＡの抽出はＰｒｏｍｅｇａ社のＷｉｚａｒｄＲＰｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてプロトコールに従っておこなった。このようにしＤｅｒ  ｆ  １５遺伝子発現トランスファーベクターｐＡｃＶＰ３／Ｄｅｒ  ｆ  １５を作製した。
４．組換えウイルスの作製とＳｆ２１細胞での組換えタンパクの発現
（１）組換えウイルスの作成
作製したＤｅｒ  ｆ  １５遺伝子発現トランスファーベクターｐＡｃＶＰ３／Ｄｅｒ  ｆ  １５を２５μｌ（０．２μｇ／μｌ）と線状化されたバキュロウイルスＤＮＡであるＢａｃｕｌｏｇｏｌｄ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）２．０μｌ（０．１μｇ／μｌ）に、リポフェクチン（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）１４．０μｌをピペットマンで混合した後、無血清培地ＴＣ−１００に置き換えたＳｆ２１細胞（１×１０６ｃｅｌｌｓ／３５ｍｍシャーレ）の上に滴下し、一日培養した。翌日無血清培地を抜き、１０％仔ウシ胎児血清を含むＴＣ−１００培地と交換してさらに三日間培養し、培養上清を回収した。その後プラーク純化を行い、組み換えウイルスＡｃＶＰ３／Ｄｅｒ  ｆ  １５を得た。
（２）Ｓｆ２１細胞での組換えタンパク質の発現
（１）で得られた培養上清を３，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清（ウイルス液）２００μｌをＳｆ２１細胞（１×１０６ｃｅｌｌｓ／３５ｍｍシャーレ）に滴下して室温で吸着させた。一時間後、ウイルス液を除去し、２ｍｌの１０％仔ウシ胎児血清を含むＴＣ−１００培地を加えて２７℃で４日間インキュベートした（ウイルス接種）。この４日後の培養上清を回収し、これを大量発現の際のウイルス液として用いた。
５．多角体の精製
（１）Ｓｆ２１細胞からの多角体の回収
ＡｃＶＰ３／Ｄｅｒ  ｆ  １５とＡｃＣＰ−Ｈをそれぞれ５ｐ．ｆ．ｕ．／ｃｅｌｌずつＳｆ２１細胞（５×１０７ｃｅｌｌｓ  ｐｅｒ  ７５ｃｍ２  ｆｌａｓｋ）に接種した。これによって、図２および図３に示す通り、Ｄｅｒ  ｆ  １５が多角体に固定化される。感染後２７℃で４日間経過した細胞をフラスコから回収、遠心（３，０００ｒｐｍ  １０ｍｉｎ）して沈殿を回収した。ＰＢＳ溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ，２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．２）で洗浄した後、氷中でホモジナイザーを用いて磨砕した。磨砕後、１％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を加えて遠心（１５，０００ｒｐｍ  ５ｍｉｎ）を繰り返し、多角体と細胞片を分離した。
得られた多角体複合体タンパク質は、滅菌水中で保存しておいた。
【実施例２】  ダニアレルゲンを含む多角体タンパク質複合体を用いた検出
実施例１により得られたＤｅｒ  ｆ  １５タンパク質を固定化した多角体と目的タンパク質分子を固定化していない空の多角体の懸濁溶液（５×１０の８乗個の多角体／ｍｌ）を０．５μｌとり、これにリン酸緩衝液９．５μｌ加えた。
平底９６穴のマイクロタイタープレート（ＦＡＬＣＯＮ社）の各穴に８０μｌのリン酸緩衝液を加えた。
次に、犬から採取した血清１０μｌを加え、さらに上記の１０倍希釈した多角体懸濁液１０μｌを加え、振とう機で攪拌した。
振とう開始後、３０分を経過すると穴の中央付近に多角体の凝集塊が確認されるようになった（図４）。さらに、この凝集塊は顕微鏡下で図５及び６に示すとおり、明瞭に観察された。
【実施例３】  外来ウイルス抗原を含む多角体タンパク質複合体を用いた検出
１．  ウイルスと細胞の調製
ＢｍＣＰＶ  Ｈ株は、細胞質に立方体の多角体を形成するウイルス株であり、このＨ株の多角体タンパク質のみを発現するように構築された組換えバキュロウイルスＡｃＣＰ−Ｈを使用した。また、昆虫培養細胞はＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来のＩＰＬＢ−Ｓｆ２１−ＡＥ（ＳＦ２１）を、１０％仔ウシ胎児血清を含むＴＣ−１００（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）培地で継代したものを使用した。
２．  イヌジステンパーウイルスのＨ及びＦタンパク質の発現のためのベクター
の構築
（１）エントリークローンの作製
イヌジステンパーウイルスのＨ及びＦタンパク質のＮ末端に固定化シグナルを入れるために、以下２種類のプライマーの構築を行った。
プライマー５’Ｆ（Ｎ）：５’−ＣＡＣＣＣＡＡＧＣＡＡＴＣＣＡＡＴＣＴＣＴＴＡＧ−３’（配列番号７）
プライマー３’Ｆ（Ｃ）：５’−ＴＣＡＡＴＴＡＡＡＧＧＡＡＧＡＧＣＧＣＣＴＡＡＣ−３’（配列番号８）
プライマー５’Ｈ（Ｎ）：５’−ＣＡＣＣＴＴＴＣＡＣＣＡＡＧＴＡＴＣＡＡＣＴＡＧ−３’（配列番号９）
プライマー３’Ｈ（Ｃ）：５’−ＴＣＡＡＧＧＴＴＴＴＧＡＡＣＧＧＴＴＡＣ−３’（配列番号１０）
イヌジステンパーウイルスＦ及びＨタンパク質のｃＤＮＡがクローニングされているプラスミドＣＤＶ−Ｆ／ｐＣＲとＣＤＶ−Ｈ／ｐＣＲをテンプレートにプライマー５’Ｆ（Ｎ）とプライマー３’Ｆ（Ｃ）で、またプライマー５’Ｈ（Ｎ）とプライマー３’Ｈ（Ｃ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動で泳動した後、Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてプロトコールに従って、精製した。精製したＰＣＲ産物は、以下で示す方法により、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）ベクターにクローニングし、それぞれＶＰ３−ＣＤＶ−Ｆ／ｐＥＮＴＲとＶＰ３−ＣＤＶ−Ｈ／ｐＥＮＴＲを作製した。作製したエントリークローンはシークエンスにより配列の確認を行った。
（２）ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯへのクローニング
ａｔｔＬ配列をＰＣＲ産物の両末端にもつエントリークローンを得るために、精製したＰＣＲ産物をｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。
反応液組成（一試料あたり）は以下の通りであった。
2005090982.tif 000010
反応液を調整後２５℃で１５分インキュベートした。このうち２μｌを１．５ｍｌチューブに移して５０μｌのＴＯＰ１０  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）でプロトコールに従い形質転換を行った。
形質転換した大腸菌は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２×ＴＹプレートに接種し、３７℃で一晩培養した。
プレートに生じたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む１．５ｍｌの２×ＴＹ培地に接種し、３７℃で一晩培養した。プラスミドＤＮＡの抽出はＰｒｏｍｅｇａ社製のＷｉｚａｒｄＲ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてプロトコールに従い行った。
（３）トランスファーベクターの選択
デスティネーションベクターは多角体への固定化シグナル配列を目的タンパク質のＮ末側に挿入するためのベクターであるｐＡｃＶＰ３（Ａ）、ｐＡｃＶＰ３（Ｃ）と固定化シグナル配列の長さが４５０残基であるｐＡｃＶＰ３（Ｘｂａ）、また同じく５２残基であるｐＡｃＶＰ３（５２）の４種類である（図８）。
（４）発現ベクターの構築（ＬＲ反応）
多角体に固定されるため必要なＶＰ３配列と、目的遺伝子をキメラにもつ発現ベクターを得るためＬＲ反応を行った。
反応液組成（一試料あたり）は以下の通りであった。
2005090982.tif 000011
反応液を調製後、２５℃で一晩インキュベートしてからｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ液を２μｌ加え、３７℃で１０分間インキュベートした。このうちの１μｌを１．５ｍｌチューブに移して５０μｌのＬＩＢＲＡＲＹ  ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ  ＤＨ５  αコンピテントセルを用いてプロトコールに従い形質転換を行った。
形質転換した大腸菌は、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＴＹプレート（１６．０ｇ  Ｔｒｙｐｔｏｎ，１０．０ｇ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，５．０ｇ  ＮａＣｌ／Ｌに接種し、３７℃で一晩培養した。
プレートに生じたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１．５ｍｌの２×ＴＹ培地（１６．０ｇ  Ｔｒｙｐｔｏｎ，１０．０ｇ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，５．０ｇ  ＮａＣｌ／Ｌ）に接種し、３７℃で一晩培養した。プラスミドＤＮＡの抽出はＰｒｏｍｅｇａ社のＷｉｚａｒｄＲ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてプロトコールに従っておこなった。このようにしてイヌジステンパーウイルスＦ及びＨタンパク質発現トランスファーベクターｐＡｃＶＰ３（Ａ）−Ｆ、ｐＡｃＶＰ３（Ｃ）−Ｆ、ｐＡｃＶＰ３（Ｘｂａ）−Ｆ、ｐＡｃＶＰ３（５２）−ＦとｐＡｃＶＰ３（Ａ）−Ｈ、ｐＡｃＶＰ３（Ｃ）−Ｈ、ｐＡｃＶＰ３（Ｘｂａ）−Ｈ、ｐＡｃＶＰ３（５２）−Ｈを作製した。
３．  組換えウイルスの作製とＳｆ２１細胞での組換えタンパクの発現
（１）  組換えウイルスの作成
作製したそれぞれ８種類のトランスファーベクター２５μｌ（０．２μｇ／μｌ）と線状化されたバキュロウイルスＤＮＡであるＢａｅｕｌｏｇｏｌｄ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）２．０μｌ（０．１μｇ／μｌ）に、リポフェクチン（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）１４．０μｌをピペットマンで混合した後、無血清培地ＴＣ−１００に置き換えたＳｆ２１細胞（１×１０６ｃｅｌｌｓ／３５ｍｍシャーレ）の上に滴下し、一日培養した。翌日無血清培地を抜き、１０％仔ウシ胎児血清を含むＴＣ−１００培地と交換してさらに三日間培養し、培養上清を回収した。その後プラーク純化を行い、組み換えウイルスＡｃＶＰ３（Ａ）−Ｆ、ＡｃＶＰ３（Ｃ）−Ｆ、ＡｃＶＰ３−（Ｘｂａ）−Ｆ、ＡｃＶＰ３（５２）−ＦとＡｃＶＰ３（Ａ）−Ｈ、ＡｃＶＰ３（Ｃ）−Ｈ、ＡｃＶＰ３（Ｘｂａ）−Ｈ、ＡｃＶＰ３（５２）−Ｈを得た。
（２）Ｓｆ２１細胞での組換えタンパク質の発現
（１）で得られた培養上清を３．０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清（ウイルス液）２００μｌをＳｆ２１細胞（１×１０６ｃｅｌｌｓ／３５ｍｍシャーレ）に滴下して室温で吸着させた。一時間後、ウイルス液を除去し、２ｍｌの１０％仔ウシ胎児血清を含むＴＣ−１００培地を加えて２７℃で４日間インキュベートした（ウイルス接種）。この４日後の培養上清を回収し、これを大量発現の際のウイルス液として用いた。なお、目的タンパクの発現はＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。
４．  多角体の精製
８種類の組み換えウイルスＡｃＶＰ３（Ａ）−Ｆ、ＡｃＶＰ３（Ｃ）−Ｆ、ＡｃＶＰ３（Ｘｂａ）−Ｆ、ＡｃＶＰ３（５２）−ＦとＡｃＶＰ３（Ａ）−Ｈ、ＡｃＶＰ３（Ｃ）−Ｈ、ＡｃＶＰ３（Ｘｂａ）−Ｈ、ＡｃＶＰ３（５２）−Ｈのそれぞれと多角体を作る組み換えウイルスＡｃＣＰ−Ｈを両者５ｐ．ｆ．ｕ．／ｃｅｌｌずつＳｆ２１細胞（５×１０７ｃｅｌｌｓ  ｐｅｒ  ７５ｃｍ２  ｆｌａｓｋ）に接種した。これによって、ＡｃＣＰ−Ｈが作る多角体にイヌジステンパーウイルスのＦもしくはＨタンパク質が固定化される。感染後２７℃で４日間経過した細胞をフラスコから回収、遠心（３，０００ｒｐｍ  １０ｍｉｎ）して沈殿を回収した。ＰＢＳ溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ，２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．２）で洗浄した後、氷中でホモジナイザーを用いて磨砕した。磨砕後、１％Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を加えて遠心（１５，０００ｒｐｍ  ５ｍｉｎ）を繰り返し、多角体と細胞片を分離した。
得られたイヌジステンパーウイルスＦ及びＨタンパク質固定化多角体は滅菌水中で保存した。
５．  ９６穴マイクロタイタープレートを用いたＥＬＩＳＡ法による抗原抗体反応定量試験
９６穴マイクロタイタープレート（ＦＡＬＣＯＮ社）の各ウエルにＰＢＳを５０μｌ入れ、次に多角体懸濁液（１  ｘ  １０１０個／ｍｌ）を２μｌ分注し、１２時間放置した。上清を除きウエルを３７℃で１２時間放置し、乾燥させた（多角体の吸着）。抗原抗体反応を行うまでは、この９６穴マイクロタイタープレートは室温で保管した。
抗原抗体反応を見る場合、まずウエルをＰＢＳ（１００ｍｌ）で２回洗浄し、次にＢｌｏｃｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（５％Ｗ／Ｖ  Ｇｅｌａｔｉｎ／ＰＢＳ）１００ｍｌを加え３７℃２時間放置した。ＰＢＳで２回洗浄後、２倍段階希釈したイヌジステンパーウイルスで人工的に感作したイヌの血清（中和抗体価  ５１２倍）を５０ｍｌずつ加え室温で２時間反応させた。続いて、Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（０．１％Ｖ／Ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ）１００ｍｌで４回洗浄し、ＨＲＰ−ＤｏｇＩｇＧ：Ｂｅｔｈｙｌ社製（１００００倍希釈）を５０ｍｌ加え、室温で２時間反応させた。反応後、Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで４回洗浄し、ＡＢＴＳ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを１００ｍｌ加え室温で３０分間反応させた。１％ＳＤＳを７０ｍｌ加え反応を停止させた後、反応液を１００ｍｌずつ回収し４０５ｎｍで測定を行った。
Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎの組成は５％Ｇｅｌａｔｉｎ／ＰＢＳで、Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒは０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで、希釈Ｂｕｆｆｅｒは１％Ｇｅｌａｔｉｎ／ＰＢＳである。
６．  凝集法による抗原抗体反応の検出
イヌジステンパーウイルスのＦタンパク質（ＶＰ３（Ｃ）−Ｆ）とＨタンパク質（ＶＰ３（Ｃ）−Ｈ）を固定化した多角体と目的タンパク質分子を固定化していない空の多角体の懸濁液（５×１０８個の多角体／ｍｌ）を０．５μｌとり、これにリン酸緩衝液９．５μｌ加えた。平底９６穴のマイクロタイタープレート（ＦＡＬＣＯＮ社）の各穴に８０μｌのリン酸緩衝液を加えた。
次に、イヌジステンパーウイルスで人工的に感作したイヌから採取した血清（中和抗体価  ５１２倍）１０μｌを加え、全量を１００μｌとし、振とう機で攪拌した。
本実施例において、以下の結果が得られた。
１．  イヌジステンパーウイルスＦ、Ｈタンパク質の多角体への固定化
組み換えウイルスＡｃＶＰ３（Ａ）−Ｆ、ＡｃＶＰ３（Ｃ）−Ｆ、ＡｃＶＰ３（Ｘｂａ）−Ｆ、ＡｃＶＰ３（５２）−ＦとＡｃＶＰ３（Ａ）−Ｈ、ＡｃＶＰ３（Ｃ）−Ｈ、ＡｃＶＰ３（Ｘｂａ）−Ｈ、ＡｃＶＰ３（５２）−ＨのそれぞれをＳｆ２１細胞に接種し、目的とするタンパク質が発現していることをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した（図９）。この結果から、多角体固定化シグナルが短い方が、後の抗原抗体反応の検出において非特異的な反応が生じないものと考え、Ｆたんぱく質についてはＡｃＶＰ３（Ｃ）−ＦとまたＨタンパク質の方はＡｃＶＰ３（Ｃ）−Ｈを選択した。これらのウイルスをそれぞれ多角体タンパク質を発現する組み換えウイルスＡｃＣＰ−Ｈと共にＳｆ２１細胞に同時に接種し（図１０）、イヌジステンパーウイルスのＦ及びＨタンパク質の多角体への固定化を試みた。このようにして得られた多角体複合体をプロテインビーズともいう。なお、多角体へのＦ及びＨタンパク質の固定化の確認は精製して得られた多角体のＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した（図１１）
２．  ＥＬＩＳＡ法による抗体価の測定
イヌジステンパーウイルスのＦ及びＨタンパク質を固定化した多角体を９６穴マイクロタイタープレートの各ウエルの底に貼り付け、十分乾燥させた後、抗原抗体反応を行った。イヌジステンパーウイルスに感作させたイヌの血清を２倍段階希釈し、各ウエルに加えて抗原抗体反応を行った。次に、この抗原抗体反応したイヌの抗体を酵素標識した抗イヌ抗体に対する二次抗体を用いて検出した。
一連の操作は以下のようにして行った。
１．  多角体懸濁液を分注し１２時間放置（１本のチューブに作製して、その懸濁液を分注）
２．  上清を除きウエルを乾燥（多角体の吸着）３７℃１２時間放置
３．  ウエルをＰＢＳ（１００ｍｌ）で２回洗浄
４．  ブロッキング溶液（５％Ｗ／Ｖ  ゼラチン／ＰＢＳ）１００ｍｌを加え３７℃２時間放置
５．  ＰＢＳで２回洗浄
６．  ２倍段階希釈した犬血清を５０ｍｌずつ加え室温２時間反応
７．  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（０．１％Ｖ／Ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ）１００ｍｌで４回洗浄
８．  ＨＲＰ−ＤｏｇＩｇＧ：Ｂｅｔｈｙｌ社製（１００００倍希釈）を５０ｍｌ加え室温２時間反応
９．  洗浄用バッファーで４回洗浄
１０．ＡＢＴＳ  Ｓｏｌｎ．１００ｍｌ加え室温３０分間反応
１１．１％ＳＤＳを７０ｍｌ加え反応を停止
１２．１００ｍｌずつ回収し４０５ｎｍを測定
用いた希釈バッファーは、１％ゼラチン／ＰＢＳであった。
その結果、今回用いたイヌジステンパーウイルスに感作させたイヌ血清は中和抗体価としては５１２倍のイヌ血清を用いた。このサンプル血清を２倍段階希釈し反応の確認をしたところ、１６、３２、６４、・・・、５１２倍はもとより、さらに１０２４、２０４８、４０９６倍までの希釈段階までその抗体の存在を検出できなかった。つまり、イヌジステンパーウイルス抗体の測定方法としては、中和抗体法よりも検出感度はさらに４〜８倍程度高いことが示唆された（表１）。
【表１】
2005090982.tif 000012
表１中、上段はＦタンパク質固定化プロテインビーズとイヌジステンパーウイルス抗血清との反応を、中段はＨタンパク質固定化プロテインビーズとイヌジステンパーウイルス抗血清との反応を、下段は空のプロテインビーズとイヌジステンパーウイルス抗血清との反応を示す。
表１に示すように、従来法よりもさらに４ないし８倍感度を上げることに成功した。また、この方法の場合、正常血清・ＣＤＶ陽性血清と反応、プロテインビーズを９６穴プレートに固定、ゼラチンを用いてブロッキング、ペルオキシダーゼ標識抗体と反応、発色および４０５ｎｍの吸光度を測定の操作を半日で完了することができ、約半日で血清中に含まれる抗体価を定量することが可能となる。
３．  凝集反応による抗原抗体反応の検出
イヌジステンパーウイルスのＦタンパク質（ＶＰ３（Ｃ）−Ｆ）とＨタンパク質（ＶＰ３（Ｃ）−Ｈ）を固定化したそれぞれの多角体及び目的タンパク質分子を固定化していない空の多角体の懸濁液（５×１０８個の多角体／ｍｌ）を０．５μｌとり、これにリン酸緩衝液９．５μｌ加えた。平底９６穴のマイクロタイタープレートの各ウエルに８０μｌのリン酸緩衝液を加えた。これに、イヌジステンパーウイルスで感作したイヌから採取した血清１０μｌ（ＣＤＶ陽性血清）および正常血清を加え、振とう機で攪拌した。
振とう開始後、１５分から３０分程度経過するとイヌジステンパーウイルスのＦタンパク質もしくはＨタンパク質を固定化した多角体を加えたウエルでは、その中央付近に多角体の凝集塊が確認されるようになった。さらに、この凝集塊は肉眼でも、また低倍率の顕微鏡下でも明瞭に観察された（図１２）。
本発明の多角体タンパク質複合体を用いた酵素結合抗体法（ＥＬＩＳＡ）と従来法（中和抗体価測定法）を比較すると表２のようになる。
【表２】
2005090982.tif 000013
表２に示すように、本発明の多角体タンパク質複合体（プロテインビーズ）を用いたほうが、短時間で、より高感度・簡便に血清中の抗体の検出（感染の有無の判定）を行うことが出来ることが判明した。
【産業上の利用可能性】  本発明の検出法で用いる被検出物質に特異的に結合するタンパク質を固定させた多角体タンパク質複合体を該被検出物質と接触させることにより、集合させることができ、形成された集合体を検出することにより被検出物質を検出することができる。例えば、本発明の多角体タンパク質複合体は、免疫反応を利用した検出に利用することができる。多角体タンパク質複合体に固定されたタンパク質は、立体構造を維持しているので、立体構造の喪失による反応性の低下も生じず、高感度に迅速に被検出物質を検出することが可能である。また、多角体タンパク質複合体に固定されたタンパク質は、結晶構造をとっており、また多角体タンパク質にコーティングされているので安定であるので、本発明の検出キットは安定に長期間保存できる。さらに、多角体タンパク質複合体は、目的のタンパク質と多角体タンパク質をコードするベクターを細胞に組込んで発現させることにより、容易に大量に得られるので、本発明の検出キットを容易に製造できる。
また、被検出物質に特異的に結合するタンパク質を固定させた多角体タンパク質複合体をマイクロタイタープレート等の担体に結合させ、該担体を用いて酵素抗体結合法で被検出物質を検出することもでき、該方法により高感度かつ迅速に検出することが可能である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【配列表フリーテキスト】配列番号３〜６  プライマー
【図１】
2005090982.tif 000014
【図２】
2005090982.tif 000015
【図３】
2005090982.tif 000016
【図４】
2005090982.tif 000017
【図５】
2005090982.tif 000018
【図６】
2005090982.tif 000019
【図７】
2005090982.tif 000020
【図８】
2005090982.tif 000021
【図９】
2005090982.tif 000022
【図１０】
2005090982.tif 000023
【図１１】
2005090982.tif 000024
【図１２】
2005090982.tif 000025
【配列表】
2005090982000001.xml
【国際調査報告】
2005090982.tif 000046
2005090982.tif 000047
2005090982.tif 000048