【手続補正書】
【提出日】令和2年1月24日(2020.1.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中における微生物の有無を判断する方法であって、
ｉ）複数の油中水エマルジョンの液滴に試料を封入し、前記油中水エマルジョンの液滴は、微生物増殖培地をさらに封入し、
ｉｉ）前記複数の油中水エマルジョンの液滴を、標的微生物の増殖を許容する温度で、かつ、前記標的微生物が５〜４５回倍加するのに十分な時間培養し、
ｉｉｉ）標的微生物を含有する油中水エマルジョンの液滴を同定し、
ｉｖ）少なくとも１つの油中水エマルジョンの液滴において標的微生物を同定したことに応答して、前記試料中に前記標的微生物が存在すると判断し、
前記標的微生物は、酵母及びカビから選択され、
前記培養は、
前記標的微生物が酵母であるときは、少なくとも約６時間〜約１２時間、及び
前記標的微生物がカビであるときは、少なくとも約８時間〜約３６時間
実施される
判断方法。
【請求項２】
試料中における微生物の有無を判断する方法であって、
ｉ）インターカレーティング色素を含有するが溶解剤を含有しない複数の油中水エマルジョンの液滴に試料を封入し、前記油中水エマルジョンの液滴は、微生物増殖培地をさらに封入し、
ｉｉ）前記インターカレーティング色素を検出することにより、標的微生物を含有する油中水エマルジョンの液滴を同定し、
ｉｉｉ）少なくとも１つの油中水エマルジョンの液滴において標的微生物を同定したことに応答して、前記試料中に前記標的微生物が存在すると判断する
判断方法。
【請求項３】
請求項２に記載の判断方法であって、
前記油中水エマルジョンの液滴は、標識タンパク質をさらに含有し、
前記油中水エマルジョンの液滴は、溶解剤を含有せず、
前記標的微生物を含有する油中水エマルジョンの液滴を同定することは、前記標識タンパク質を検出することを含み、
好ましくは、前記油中水エマルジョンの液滴は、牛血清アルブミンをさらに含有する
判断方法。
【請求項４】
請求項２に記載の判断方法であって、
前記試料は、環境試料、レクリエーションの主体となる水から取得した水、表面から採取される試料、又は臨床試料である
判断方法。
【請求項５】
単位質量又は単位体積当たりの標的微生物の数について食品マトリックスを迅速にアッセイする方法であって、
ｉ）食品マトリックスの一部を均質化し、前記食品マトリックスの一部の質量又は体積は既知であり、
ｉｉ）前記均質化されたマトリックスを複数の油中水エマルジョンの液滴に封入し、前記油中水エマルジョンの液滴は、微生物増殖培地をさらに封入し、
ｉｉｉ）前記複数の油中水エマルジョンの液滴を、標的微生物の増殖を許容する温度で、かつ、前記標的微生物が５〜４５回倍加するのに十分な時間培養し、
ｉｖ）前記培養した油中水エマルジョンの液滴から、微生物を含有する油中水エマルジョンの液滴の数を決定することにより、陽性の液滴の数を決定し、
微生物を含有しない油中水エマルジョンの液滴の数を決定することにより、陰性の液滴の数を決定し、
ｖ）前記陽性の液滴の数と前記陰性の液滴の数から、前記標的微生物の総数を決定することにより、前記食品マトリックスの単位質量又は単位体積当たりの前記標的微生物の数を決定する
判断方法。
【請求項６】
請求項５に記載の判断方法であって、
前記標的微生物は、細菌、酵母、及びカビからなる群から選択され、
前記培養は、
前記標的微生物が細菌であるときは、少なくとも約４時間〜約１６時間、
前記標的微生物が酵母であるときは、少なくとも約６時間〜約１２時間、及び
前記標的微生物がカビであるときは、少なくとも約８時間〜約３６時間
実施される
判断方法。
【請求項７】
請求項５に記載の判断方法であって、
前記微生物増殖培地は、
（ａ）部分的に消化されたタンパク質、
（ｂ）緩衝ペプトン水（ＢＡＭ培地Ｍ１９２）、又は
（ｃ）界面活性剤
を含む
判断方法。
【請求項８】
請求項７に記載の判断方法であって、
（ｉ）前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤であり、好ましくは前記非イオン性界面活性剤がポロキサマーであり、より好ましくは前記ポロキサマーの分子量が約１，８００ｇ／ｍｏｌであり、最も好ましくは前記ポロキサマーがポリオキシエチレンを約８０％含み、又は
（ｉｉ）前記微生物増殖培地は、界面活性剤を少なくとも約０．０１％〜約５％の濃度で含む
判断方法。
【請求項９】
請求項５に記載の判断方法であって、
（ａ）前記培養の前において、前記封入した微生物増殖培地のｐＨは約７．２であり、又は
（ｂ）前記食品マトリックスは、動物性タンパク質、乳製品、チーズ、牛挽肉、ハム、低温殺菌されていない牛乳、植物、又は２０〜４５％の脂肪を含む
判断方法。
【請求項１０】
試験抗菌剤の最小阻害濃度について標的微生物を迅速にアッセイする方法であって、
ｉ）複数の油中水エマルジョンの液滴に試料を封入し、
前記油中水エマルジョンの液滴は、微生物増殖培地をさらに封入し、
ａ）前記油中水エマルジョンの液滴の第１の部分は、前記試験抗菌剤を第１の濃度で封入し、又は前記試験抗菌剤を封入せず、
ｂ）前記油中水エマルジョンの液滴の第２の部分は、前記試験抗菌剤を前記第１の濃度と異なる第２の濃度で封入し、
ｉｉ）前記複数の油中水エマルジョンの液滴を、前記試験抗菌剤の非存在下、標的微生物の増殖を許容する温度で、かつ、前記標的微生物が前記試験抗菌剤に阻害されない場合、５〜２０回又はそれ以上分裂するのに十分な時間培養し、
ｉｉｉ）前記培養した油中水エマルジョンの液滴の各部分から、
閾値を超える数の前記標的微生物を含有する油中水エマルジョンの液滴の第１の数を決定することにより、陽性の液滴の数を決定し、
前記閾値を下回る数の前記標的微生物を含有する油中水エマルジョンの液滴の第２の数を決定することにより、陰性の液滴の数を決定し、
ｉｖ）前記油中水エマルジョンの液滴の各部分について前記第１の数及び前記第２の数を決定したことに応答して、前記試験抗菌剤の最小阻害濃度を決定する
判断方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の判断方法であって、
（ａ）前記培養は、
前記標的微生物が細菌であるときは、少なくとも約２時間〜約８時間、及び
前記標的微生物が酵母であるときは、少なくとも約４時間〜約１２時間、
実施され、
（ｂ）前記試験抗菌剤は、βラクタム抗生物質、アミノグリコシド抗生物質、グリコペプチド抗生物質、マクロライド抗生物質、キノロン抗生物質、フルオロキノロン抗生物質、ポリエン抗真菌剤、イミダゾール抗真菌剤、トリアゾール抗真菌剤、チアゾール抗真菌剤、アリルアミン抗真菌剤、エキノカンジン抗真菌剤、又は５−フルオロシトシン抗真菌剤であり、又は
（ｃ）前記各油中水エマルジョンの液滴における抗菌剤の濃度を決定することは、勾配に従って決定することを含む
判断方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の判断方法であって、
ａ）前記油中水エマルジョンの液滴の第３の部分は、前記試験抗菌剤を第３の濃度で封入し、
ｂ）前記油中水エマルジョンの液滴の第４の部分は、前記試験抗菌剤を第４の濃度で封入し、
ｃ）前記油中水エマルジョンの液滴の第５の部分は、前記試験抗菌剤を第５の濃度で封入し、
ｄ）前記油中水エマルジョンの液滴の第６の部分は、前記試験抗菌剤を第６の濃度で封入し、
前記油中水エマルジョンの液滴における前記試験抗菌剤の第１、第２、第３、第４、第５、及び第６の濃度は、前記試験抗菌剤の最小阻害濃度以上及び以下の両方の濃度範囲に及ぶ
判断方法。
【請求項１３】
請求項５に記載の判断方法であって、
（ａ）前記油中水エマルジョンの液滴がｐＨ感受性蛍光プローブをさらに含有し、前記ｐＨ感受性蛍光プローブが、約５未満のｐＨの水溶液中では、検出波長で検出可能な蛍光性を有するが、約６．５より大きいｐＨの水溶液中では、前記検出波長で検出可能な蛍光性を有さず、
好ましくは、前記陽性の液滴の数を決定すること及び前記陰性の液滴の数を決定することが前記複数の油中水エマルジョンの液滴における前記ｐＨ感受性蛍光プローブの蛍光を検出することを含み、前記陽性の液滴の数が前記検出波長で前記ｐＨ感受性蛍光プローブが検出された液滴の数であり、前記陰性の液滴の数が前記検出波長で前記ｐＨ感受性蛍光プローブが検出されなかった液滴の数であり、
（ｂ）前記陽性の液滴の数を決定すること及び前記陰性の液滴の数を決定することが前記複数の油中水エマルジョンの液滴における自己蛍光を検出することを含み、前記陽性の液滴の数が前記自己蛍光の存在を示した液滴の数であり、前記陰性の液滴の数が前記自己蛍光の存在を示さなかった液滴の数であり、
（ｃ）前記陽性の液滴の数を決定すること及び前記陰性の液滴の数を決定することが前記複数の油中水エマルジョンの液滴における可視光吸光度を検出することを含み、前記陽性の液滴の数が前記複数の油中水エマルジョンの液滴における実質的な可視光吸光度を示した液滴の数であり、前記陰性の液滴の数が前記複数の油中水エマルジョンの液滴における実質的な可視光吸光度を示さなかった液滴の数であり、
（ｄ）前記陽性の液滴の数を決定すること及び前記陰性の液滴の数を決定することが目視又はコンピュータ画像処理により前記液滴における細菌胞子、酵母、又はカビの菌糸の有無を検出することを含み、前記陽性の液滴の数が前記複数の油中水エマルジョンの液滴における前記細菌胞子、酵母、又はカビの菌糸の存在を示した液滴の数であり、前記陰性の液滴の数が前記複数の油中水エマルジョンの液滴における前記細菌胞子、酵母、又はカビの菌糸の存在を示さなかった液滴の数であり、
（ｅ）前記微生物増殖培地が前記標的微生物によって産生される酵素についての発色基質、比色基質、又は蛍光発生基質を含み、前記基質と前記標的微生物により産生された酵素との反応生成物が検出され、
好ましくは、（Ｉ）前記標的微生物が、（ｉ）大腸菌群（coliforms）であり、前記基質がβ−ガラクトシダーゼ基質であり、（ｉｉ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び／又は赤痢菌であり、前記基質がβ−グルクロニダーゼ基質であり、（ｉｉｉ）リステリア種、クレブシエラ、エンテロバクター、セラチア、シトロバクター、腸球菌、又はその組み合わせであり、前記基質がβ−グルコシダーゼ基質であり、（ｉｖ）クロノバクターであり、前記基質がα−ガラクトシダーゼ基質であり、（ｖ）ブドウ球菌、腸球菌、又はその組み合わせであり、前記基質がα−グルコシダーゼ基質であり、（ｖｉ）黄色ブドウ球菌、腸内細菌科、ウェルシュ菌、又はその組み合わせであり、前記基質がホスファターゼ基質であり、（ｖｉｉ）カンジダであり、前記基質がＮ−アセチルグルコサミニダーゼ基質であり、（ｖｉｉｉ）サルモネラ、カンピロバクター、シュードモナス、又はその組み合わせであり、前記基質がエステラーゼ基質であり、（ｉｘ）シュードモナスであり、前記基質がアミノペプチダーゼ基質であり、又は、（ｘ）リステリア・モノサイトゲネス、セレウス菌、又はその組み合わせであり、前記基質がホスホリパーゼ基質であり、又は、（ＩＩ）前記基質が蛍光発生基質であり、前記標的微生物の酵素で開裂した後、分子内アルドール縮合を経ることにより、蛍光指標化合物を生成し、
（ｆ）前記陽性の液滴の数を決定すること及び前記陰性の液滴の数を決定することは、同時に前記複数の油中水エマルジョンの液滴を撮影することを含み、又は
（ｇ）前記陽性の液滴の数を決定することは、さらに、単一の液滴における複数の標的微生物の包含を勘定するためにポアソン分布補正を適用することにより、前記陽性の液滴の数を補正することを含む
判断方法
【請求項１４】
請求項５に記載の判断方法であって、
前記陽性の液滴の数を決定すること及び前記陰性の液滴の数を決定することは、検出デバイスの検出領域を連続的に移動する前記液滴からデータを収集することを含み、
好ましくは、前記標的微生物がカビであり、前記油相が少なくとも１つの抗真菌剤を含み、
より好ましくは、前記少なくとも１つの抗真菌剤は、２，６−ジクロロ−４−ニトロアニリン、４，５，６，７−テトラクロロ−２'，４'，５'，７'−テトラヨードフルオレセイン、（ＲＳ）−１−［２−（アリルオキシ）−２−（２，４−ジクロロフェニル）エチル］−１Ｈ−イミダゾール、及びキトサンからなる群から選択され、
最も好ましくは、
（ａ）前記２，６−ジクロロ−４−ニトロアニリンの濃度は、約５ｍｇ／Ｌ〜約２００ｍｇ／Ｌであり、
（ｂ）前記４，５，６，７−テトラクロロ−２'，４'，５'，７'−テトラヨードフルオレセインの濃度は、約５０ｍｇ／Ｌ〜約３７５ｍｇ／Ｌであり、又は
（ｃ）前記（ＲＳ）−１−［２−（アリルオキシ）−２−（２，４−ジクロロフェニル）エチル］−１Ｈ−イミダゾールの濃度は、約０．１ｇ／Ｌ〜約２．５ｇ／Ｌである
判断方法。
【請求項１５】
組成物であって、
水性液滴と、
前記水性液滴を封入し、油と、フルオロ界面活性剤と、抗真菌剤とを含む油相と
を含む組成物。