(57)【要約】  提供されるのは、シリカをベースとする活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）アッセイによる、ＰＥＧ化血液凝固因子の凝固活性の測定方法である。ＰＥＧ化血液凝固因子は、シリカをベースとするＡＰＴＴアッセイでは活性の低下を示すと見出され、ＡＰＴＴ反応混合物へのＰＥＧの添加は、その活性を回復させると示された。ＡＰＴＴアッセイにおけるＰＥＧ化血液凝固因子の凝固活性の測定方法が提供される。
2012510060.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＥＧに結合した血液凝固因子を含有するか、または含有する疑いのあるサンプルの凝固活性の測定方法であって、
ａ）シリカを活性化物質として有するトロンボプラスチン試薬および遊離ポリエチレングリコールを含むトロンボプラスチン試薬混合物を提供すること、
ｂ）ＰＥＧに結合した血液凝固因子を含有するか、または含有する疑いのあるサンプルを、該トロンボプラスチン試薬混合物に添加し、結果的な反応混合物を形成させること、および、
ｃ）該結果的な反応混合物の凝固時間を測定し、それにより、該サンプルの凝固活性を測定すること、
を含む方法。
【請求項２】
該ＰＥＧに結合した血液凝固因子が、ＰＥＧに結合した第Ｉ因子、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子または第ＸＩＩ因子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該ＰＥＧに結合した血液凝固因子が、ＰＥＧに結合した第ＶＩＩＩ因子である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該ＰＥＧに結合した血液凝固因子が、ＰＥＧに結合した、Ｂドメインが除去された第ＶＩＩＩ因子である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該ＰＥＧに結合した血液凝固因子が、組換え型のＰＥＧに結合した血液凝固因子である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
遊離ポリエチレングリコールが、約２ないし１００ｋＤａの分子量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
遊離ポリエチレングリコールが、約６４ないし１００ｋＤａの分子量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
反応混合物中の遊離ポリエチレングリコールの最終濃度が、反応混合物中のＰＥＧに結合した血液凝固因子の最終濃度よりも約５０ないし１０,０００,０００倍高い、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
反応混合物中の遊離ポリエチレングリコールの最終濃度が、反応混合物中のＰＥＧに結合した血液凝固因子の最終濃度よりも約２００,０００ないし２,０００,０００倍高い、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
反応混合物中の遊離ＰＥＧの最終濃度が約１０μＭないし２００μＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
該トロンボプラスチン試薬が、さらにリン脂質、バッファーおよびカルシウムを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＰＥＧに結合した血液凝固因子を含有するか、または含有する疑いのあるサンプルの活性化部分トロンボプラスチン時間の測定方法であって、
ａ）遊離ポリエチレングリコールを、
ｉ）ＰＥＧに結合した血液凝固因子を含有するか、または含有する疑いのあるサンプル、および、
ｉｉ）シリカ粒子を含むトロンボプラスチン試薬
を含有する活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイ反応混合物に添加し、結果的な反応混合物を形成させること、および、
ｂ）該結果的な反応混合物の凝固時間を測定し、それにより、該サンプルの活性化部分トロンボプラスチン時間を測定すること、
を含む方法。
【請求項１３】
反応混合物中の遊離ポリエチレングリコールの最終濃度が、反応混合物中のＰＥＧに結合した血液凝固因子の最終濃度よりも約２００,０００ないし２,０００,０００倍高い、請求項１２に記載の方法。
［請求項１３］
反応混合物中の遊離ＰＥＧの最終濃度が約１０μＭないし２００μＭである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
該ＰＥＧに結合した血液凝固因子が、ＰＥＧに結合した第Ｉ因子、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子または第ＸＩＩ因子である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ＰＥＧに結合した血液凝固因子が第ＶＩＩＩ因子である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
該ＰＥＧに結合した血液凝固因子が、ＰＥＧに結合した、Ｂドメインが除去された第ＶＩＩＩ因子である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
該ＰＥＧに結合した血液凝固因子が、組換え型のＰＥＧに結合した血液凝固因子である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
凝固活性化物質としてシリカを使用する活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイにおいて、ＰＥＧに結合した血液凝固因子の活性を回復させる方法であって、遊離のポリエチレングリコールを、
ａ）該ＰＥＧに結合した血液凝固因子を含有するか、または含有する疑いのあるサンプル、および、
ｂ）シリカ粒子を含むトロンボプラスチン試薬
を含む、活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイの反応混合物に添加することを含む、方法。
【請求項１９】
反応混合物中の遊離ポリエチレングリコールの最終濃度が、結果的な反応混合物中のＰＥＧに結合した血液凝固因子の最終濃度よりも約２００,０００ないし２,０００,０００倍高い、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
得られた反応混合物中の遊離ＰＥＧの最終濃度が約１０μＭないし２００μＭである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
該ＰＥＧに結合した血液凝固因子が、ＰＥＧに結合した第ＶＩＩＩ因子である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
該ＰＥＧに結合した血液凝固因子が、ＰＥＧに結合した、Ｂドメインが除去された第ＶＩＩＩ因子である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
該ＰＥＧに結合した血液凝固因子が、組換え型のＰＥＧに結合した血液凝固因子である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
ＰＥＧに結合した凝固因子で処置された患者における凝固活性の測定方法であって、
ａ）ｉ）患者由来の血液または血漿サンプル、
ｉｉ）シリカ粒子を活性化物質として含むトロンボプラスチン試薬、および、
ｉｉｉ）遊離ポリエチレングリコール
を含有する活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイの反応混合物を提供すること、および、
ｂ）該反応混合物の凝固時間を測定し、それにより患者における凝固活性を測定すること、
を含む。
【請求項２５】
患者が血友病Ａに罹患しており、ＰＥＧに結合した凝固因子が第ＶＩＩＩ因子である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
該ＰＥＧに結合した血液凝固因子が、ＰＥＧに結合した、Ｂドメインが除去された第ＶＩＩＩ因子である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
該ＰＥＧに結合した血液凝固因子が、組換え型のＰＥＧに結合した血液凝固因子である、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
提供されるのは、ポリエチレングリコールに結合した（「ＰＥＧ化」）血液凝固因子の凝固活性の測定方法である。この方法は、ＰＥＧを、シリカをベースとする活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）アッセイに加えることを含む。
【背景技術】
【０００２】
背景
血液凝固は、血液が活性化物質と接触すると起こる、複雑な化学的および物理的反応である。血液凝固過程の全体は、一般的に、３つの活動として見ることができる：血小板粘着、血小板凝集およびフィブリン血餅の形成。インビボでは、血管の裏層、即ち内皮が、血小板の活性化を防止するので、血小板は不活性化状態で血管中を流れる。しかしながら、血管が損傷を受けると、内皮はその完全性を失い、血小板は損傷を受けた部位の下にある組織と接触することにより活性化される。血小板の活性化は、それらを「粘着性」にさせ、一体となって接着させる。この過程は、血小板の「栓」が形成されるまで継続する。この血小板の栓は、次いで、その上で凝血または凝固が進行するマトリックスとして働く。
【０００３】
血液の化学的バランスが適当であるならば、次いで、トロンビンが産生され、それは、フィブリノーゲンを、凝血塊の大部分を形成するフィブリンに変換させる。凝固中に、さらなる血小板が活性化され、形成中の血餅に取り込まれ、血餅形成に寄与する。凝固が進行するにつれて、フィブリンの重合およびクロスリンクは、持続性の血餅をもたらす。凝固は、第ＸＩＩ因子の活性化を伴う内因性経路により、または、組織因子の放出を伴う外因性経路により、開始され得る。
【０００４】
いくつかの異なるインビトロアッセイを使用して凝固活性を評価でき、これには発色アッセイ、トロンビン生成アッセイ、全血凝固アッセイおよび活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）アッセイが含まれる。ＡＰＴＴアッセイは、内因性経路の血液凝固因子の活性を測定する。これらの因子には、第Ｉ（フィブリノーゲン）、第ＩＩ（プロトロンビン）、第Ｖ、第ＶＩＩＩ、第ＩＸ、第Ｘ、第ＸＩおよび第ＸＩＩ因子が含まれる。内因性経路では、凝固因子は不活性前駆体の形態で循環し、それが活性型に変換され、次の凝固因子を順に活性化する。例えば、プロ酵素の第ＸＩＩ因子は、その酵素の第ＸＩＩａ因子に変換され、それは、次いで、酵素原の第ＸＩ因子を酵素の第ＸＩａ因子に変換し、その後、それは、カルシウムの存在下で第ＩＸ因子を活性化する。酵素の第ＩＸａ因子は、第ＶＩＩＩａ因子およびリン脂質の存在下で、第Ｘ因子を活性化する。この反応は、事前の第ＶＩＩＩ因子のトロンビンまたは第Ｘａ因子への曝露により、大幅に増大する。従って、ＡＰＴＴアッセイは、血漿に加えていくつかの成分を必要とし、これには、リン脂質の供給源、カルシウムおよび内因性経路の活性化物質、例えば、微粒子化シリカ、エラグ酸またはカオリンが含まれる。微粒子化シリカビーズは、内因性経路の活性化物質として使用され、ＦＸＩＩからＦＸＩＩａへの変換を開始させる。
【０００５】
ＡＰＴＴアッセイは、凝固因子の欠乏について患者の血漿をスクリーニングするために、そして、ヘパリンなどの抗凝固剤による処置を監視するために、臨床で一般的に使用される。このアッセイは、また、治療用の凝固因子の製造における品質管理の実施にも使用される。しかしながら、治療用タンパク質の共有結合による修飾は、ＡＰＴＴアッセイに干渉し、臨床適用および製造におけるその使用を制限する可能性がある。例えば、タンパク質のインビボでの半減期を延ばすために使用される共有結合による修飾の１つは、ＰＥＧ化である。ＰＥＧ化は、長鎖ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子のタンパク質または他の分子への共有結合である。タンパク質の半減期を延ばすことに加えて、ＰＥＧ化は、抗体の生成を減らし、タンパク質をプロテアーゼ分解から保護し、その物質を腎臓の濾液に入らせないために使用されてきた（Harris et al., 2001, Clinical Pharmacokinetics 40, pp. 539-51）。加えて、ＰＥＧ化は、タンパク質の包括的な安定性および溶解性も高め得る。
【０００６】
多くのタンパク質と同様に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）などの血液凝固因子への結合は、動物における半減期を延長し、治療剤としてのそれらの効力を高める。しかしながら、分子の生物学的活性がＰＥＧ化後に維持されていることを確認するために、ＰＥＧ化凝固因子の分析が必要である。ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩは他の凝固アッセイにおいて正常な生物学的活性を示すが、ＰＥＧ化第ＶＩＩＩ因子の初期の試験は、微粒子化シリカを用いるＡＰＴＴアッセイにおいて、ＡＰＴＴアッセイがＰＥＧ化血液凝固因子の凝固活性を正確に測定しないことを示した。微粒子化シリカをベースとするＡＰＴＴアッセイにおける活性は、非常に信頼性が低い。ＡＰＴＴアッセイは広範に使用されているので、製造および臨床適用を支えるために、このアッセイをＰＥＧ化凝血因子の測定に適合させる必要性があった。
【発明の概要】
【０００７】
要旨
微粒子化シリカをベースとするＡＰＴＴアッセイにおけるＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの活性の低下は、遊離ＰＥＧをアッセイに添加することにより克服され得、他の凝固アッセイで観察されるものと同様のＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの活性レベルをもたらす。
【０００８】
従って、提供されるのは、ＰＥＧに結合した血液凝固因子を含有するか、または含有する疑いのあるサンプルの凝固活性の測定方法であって、ａ）シリカを活性化物質として有するトロンボプラスチン試薬および遊離ポリエチレングリコールを含むトロンボプラスチン試薬混合物を提供すること、および、ｂ）ＰＥＧに結合した血液凝固因子を含有するか、または含有する疑いのあるサンプルを、該トロンボプラスチン試薬混合物に添加し、結果的な反応混合物を形成させること、および、ｃ）該結果的な反応混合物の凝固時間を測定し、それにより、該サンプルの凝固活性を測定することを含む方法である。
【０００９】
本発明は、また、ＰＥＧに結合した血液凝固因子を含有するか、または含有する疑いのあるサンプルの活性化部分トロンボプラスチン時間の測定方法を提供し、それは、ａ）遊離ポリエチレングリコールを、ＰＥＧに結合した血液凝固因子を含有するか、または含有する疑いのあるサンプル、並びに、シリカ粒子を含むトロンボプラスチン試薬を含む活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイ反応混合物に添加し、結果的な反応混合物を形成させること、ｂ）該結果的な反応混合物の凝固時間を測定し、それにより、該サンプルの活性化部分トロンボプラスチン時間を測定することを含む。
【００１０】
本発明は、さらに、凝固活性化物質としてシリカを使用する活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイにおいて、ＰＥＧに結合した血液凝固因子の活性を回復させる方法を提供し、それは、遊離ポリエチレングリコールを、ａ）該ＰＥＧに結合した血液凝固因子を含有するか、または含有する疑いのあるサンプル、および、ｂ）シリカ粒子を含むトロンボプラスチン試薬を含む、活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイの反応混合物に添加することを含む。
【００１１】
加えて、本発明は、ＰＥＧに結合した凝固因子で処置された患者における凝固活性の測定方法を提供し、それは、ａ）患者由来の血液または血漿サンプル、シリカ粒子を活性化物質として含むトロンボプラスチン試薬、および、遊離ポリエチレングリコールを含む活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイの反応混合物を提供すること、および、ｂ）該反応混合物の凝固時間を測定し、それにより患者における凝固活性を測定することを含む。
【００１２】
いくつかの実施態様では、ＰＥＧに結合した血液凝固因子は、ＰＥＧに結合した第Ｉ、第ＩＩ、第Ｖ、第ＶＩＩＩ、第ＩＸ、第Ｘ、第ＸＩまたは第ＸＩＩ因子である。いくつかの実施態様では、ＰＥＧに結合した血液凝固因子は、第ＶＩＩＩ因子またはＢドメインが除去された第ＶＩＩＩ因子である。いくつかの実施態様では、ＰＥＧに結合した血液凝固因子は、組換え型のＰＥＧに結合した血液凝固因子である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
図面の説明
【図１】図１は、位置４９１および１８０４でＰＥＧ化された（ＰＥＧ２＋１４）、Ｂドメインが除去されたＦＶＩＩＩ（ＢＤＤ）およびＢＤＤ変異タンパク質（Ｌ４９１Ｃ／Ｋ１８０４Ｃ）の凝固時間（ＡＰＴＴ時間）を示す。０.０２５および０.０１２５ＩＵ／ｍｌの２種類の濃度でＦＶＩＩＩ活性を試験した。遊離ＰＥＧをＡＰＴＴ試薬に直接（ＰＥＧ＋ＡＰＴＴ）、または、ＦＶＩＩＩサンプル（＋ＰＥＧ）に添加した。
【図２】図２は、改変ＡＰＴＴアッセイにおいて微粒子化シリカと共にインキュベートしたＢＤＤおよびＰＥＧ化ＢＤＤ（ＰＥＧ２＋１４）のウエスタンブロットを示す。微粒子化シリカを遠心沈降させ、ＰＢＳで洗浄し、ウサギ抗−ＦＶＩＩＩポリクローナル抗体を使用するウエスタンブロットで分析した。レーン１および３は、遊離ＰＥＧなしのアッセイを示し、一方、レーン２および４は、遊離ＰＥＧを最終濃度５００μＭで添加したアッセイを表す。ＦＶＩＩＩの重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）が、レーン１に見られる。
【図３】図３は、４種の異なる大きさの遊離ＰＥＧ（２ｋＤ、３５ｋＤ、６４ｋＤおよび１００ｋＤ）を添加した微粒子化シリカをベースとするＡＰＴＴアッセイにおける、ＰＥＧ化ＢＤＤ（ＰＥＧ２＋１４）のＦＶＩＩＩ凝固（ＣＯＡＧ）活性を示す。遊離ＰＥＧを、ＦＶＩＩＩの最終濃度の２０万倍および２００万倍の最終濃度で添加した。
【図４】図４は、微粒子化シリカをベースとするＡＰＴＴアッセイ（BioMerieux）におけるＢＤＤおよび２種のＰＥＧ化ＢＤＤ変異タンパク質（ＰＥＧ−１４およびＰＥＧ−２＋１４）の凝固（ＣＯＡＧ）活性を示す。ＰＥＧ−１４は、位置１８０４でＰＥＧ化されているＢＤＤ変異タンパク質（Ｋ１８０４Ｃ）である。
【図５】図５は、凝血終点試薬 AMAX Alexin（商標）を含有するエラグ酸をベースとするＡＰＴＴアッセイにおける、ＢＤＤおよび２種のＰＥＧ化ＢＤＤ変異タンパク質（ＰＥＧ−１４およびＰＥＧ−２＋１４）の凝固（ＣＯＡＧ）活性を示す。
【図６】図６は、発色アッセイおよび２種の異なるＡＰＴＴアッセイにおけるＰＥＧ化ＢＤＤ−ＰＥＧ１４の凝固活性の比較を示す。ＡＰＴＴアッセイの一方は微粒子化シリカ（BioMerieux）を含み、他方は凝血終点試薬 AMAX Alexin（商標）によりもたらされるエラグ酸を含む。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
詳細な説明
提供されるのは、微粒子化シリカをベースとするＡＰＴＴアッセイにおいて、ＰＥＧ化血液凝固因子の活性の信頼性が低いという課題の解決である。それは、微粒子化シリカをベースとするＡＰＴＴアッセイの反応混合物に遊離ＰＥＧを添加することが、このアッセイにおけるＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの血液凝固活性を回復させることができるという発見に基づく。活性化ＦＩＸ（ＦＩＸａ）またはＦＸＩａおよびＦＸＩＩａの添加によりＡＰＴＴアッセイにおけるＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの活性を回復させる以前の試みは成功しなかったので、この発見は予想外のものである。従って、それは、臨床適用および治療剤の製造に幅広く使用されている十分に確立されたアッセイでの、ＰＥＧ化血液凝固因子の分析を可能にする。
【００１５】
本明細書で使用する「ＰＥＧ」および「ポリエチレングリコール」は、互いに置き換え可能であり、任意の水溶性ポリ（エチレンオキシド）を含む。典型的には、本発明の実施態様に従って使用するためのＰＥＧは、以下の構造「−−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−−」を含み、ここで、（ｎ）は２ないし４０００である。本明細書で使用されるとき、ＰＥＧはまた、末端の酸素が置き換えられているか否かに応じて、「−−ＣＨ２ＣＨ２−−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−−」および「−−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯ−−」も含む。明細書および特許請求の範囲を通じて、用語「ＰＥＧ」は、様々な末端または「端部キャッピング」基、例えば、限定ではないが、ヒドロキシルまたはＣ１−２０アルコキシ基などを有する構造を含むことを念頭に置くべきである。用語「ＰＥＧ」は、また、大部分、即ち、５０％より多くの、−−ＯＣＨ２ＣＨ２−−繰り返しサブユニットを含有するポリマーも意味する。用語「遊離ポリエチレングリコール」または「遊離ＰＥＧ」は、他の分子に結合していないＰＥＧ分子を表す。具体的な形態に関しては、ＰＥＧは、無数の様々な分子量、並びに、構造または配置（geometries）、例えば、分枝状、直鎖状、分岐状および多官能性などをとり得る。いくつかの実施態様では、遊離ＰＥＧは、ＰＥＧ化凝固因子の結合に使用されたＰＥＧと同じ物であり得る。いくつかの実施態様では、ＡＰＴＴ反応混合物に添加するＰＥＧの分子量は、約２ないし１００ｋＤである。いくつかの実施態様では、ＡＰＴＴ反応混合物に添加するＰＥＧの分子量は、約２ないし３５ｋＤであり、いくつかの実施態様では、ＰＥＧの分子量は約３５ないし６４ｋＤであり、いくつかの実施態様では、ＰＥＧの分子量は約６４ないし１００ｋＤである。さらに、他のポリ（アルキル）グリコール類、例えば、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）またはポリブチレングリコール（ＰＢＧ）の使用も、同様の結果を導き得るという見解である。
【００１６】
遊離ＰＥＧは、ＡＰＴＴ反応混合物に様々な濃度範囲で添加できる。サンプル中のＰＥＧ化血液凝固因子の濃度が既知である場合、遊離ＰＥＧは、ＰＥＧ化凝固因子の数倍過剰で反応混合物に添加できる。いくつかの実施態様では、遊離ＰＥＧの濃度は、ＰＥＧの分子量に逆相関する。低分子量のＰＥＧには、高濃度の遊離ＰＥＧを使用できる。一方、高分子量のＰＥＧには、低濃度の遊離ＰＥＧを使用できる。本発明のいくつかの実施態様では、反応混合物中の遊離ＰＥＧの最終濃度は、ＰＥＧ化凝固因子の最終濃度よりも、約５０ないし１００、約１００ないし２００、約２００ないし５００、約１０００ないし５０００、約５０００ないし１０,０００、約１０,０００ないし２００,０００、または、約２００,０００ないし１０,０００,０００倍高い。いくつかの実施態様では、反応混合物中の遊離ＰＥＧの最終濃度は、ＰＥＧ化凝固因子の最終濃度よりも、約２００,０００ないし２,０００,０００倍高い。いくつかの場合では、サンプル中のＰＥＧ化凝固因子の濃度は、例えば、ＰＥＧ化凝固因子を投与された対象からサンプルを取る場合に、未知であり得る。従って、遊離ＰＥＧは、凝固因子の濃度に依存しない濃度で添加することもできる。ある実施態様では、反応混合物中の遊離ＰＥＧの最終濃度は、約１−２００ｎＭ、２００−１０００ｎＭ、１−１０μＭ、１０−１０００μＭまたはそれ以上である。濃度は、遊離ＰＥＧの溶解度を限度として、反応混合物の飽和点に到達するほど高くてもよい。いくつかの実施態様では、反応混合物中の遊離ＰＥＧの最終濃度は、約１０−２００μＭである。
【００１７】
ＰＥＧに結合したタンパク質は、１個またはそれ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子に共有結合しているタンパク質である。用語「ＰＥＧに結合した」および「ＰＥＧ化された」は、互換的に使用される。本発明は、ＰＥＧに結合した血液凝固因子に関するものである。血液凝固因子のＰＥＧ結合の方法は、例えば、米国特許第５,７６６,８９７号、米国特許第６,７５３,１６５号、ＷＯ９０／１２８７４および米国出願番号２００６０１１５８７６に記載されている。様々な方法でタンパク質をＰＥＧに結合させることができ、例えば、第一級アミン類（Ｎ末端およびリジン）のランダムな修飾により、または、部位特異的な戦略、例えば、非天然アミノ酸の導入と、それに続く、その非天然アミノ酸と特異的に反応するＰＥＧ誘導体の添加による。タンパク質の部位特異的ＰＥＧ結合への他のアプローチは、Ｎ末端の骨格のアミンをＰＥＧ−アルデヒドで標的化することによる。システインを挿入するか、または他のアミノ酸と置き換え、次いで、スルフヒドリル反応基を有するＰＥＧ部分を添加することによっても、タンパク質をＰＥＧに結合させることができる。
【００１８】
ＰＥＧに結合したタンパク質の例には、ＢＤＤ−ＰＥＧ−１４およびＢＤＤ−ＰＥＧ−１４＋２が含まれるが、これらに限定されない。ＢＤＤ−ＰＥＧ−１４は、アミノ酸位置４９１（Ｌ４９１Ｃ）に変異を有するＢＤＤ変異タンパク質である。ＢＤＤ−ＰＥＧ−１４＋２は、アミノ酸位置４９１（Ｌ４９１Ｃ）および１８０４（Ｋ１８０４Ｃ）に変異を有するＢＤＤ変異タンパク質である。ＢＤＤ変異タンパク質のアミノ酸の位置番号は、完全長ＦＶＩＩＩタンパク質での位置を表す。
【００１９】
血液凝固因子には、血液凝固および凝血に関与するタンパク質および生理的に活性のあるそれらの断片が含まれる。このアッセイを使用して、第Ｉ、第ＩＩ、第Ｖ、第ＶＩＩＩ、第ＩＸ、第Ｘ、第ＸＩおよび第ＸＩＩ因子が含まれるがこれらに限定されない、内因性経路のＰＥＧ化血液凝固因子の凝固活性を測定できる。第ＶＩＩ因子は、部分トロンボプラスチン時間により影響を受けない唯一の因子であり、従って、その活性はＡＰＴＴアッセイでは検出できない。いくつかの実施態様では、本発明を使用して、ＦＶＩＩＩの凝固活性を測定する。他の実施態様では、Ｂドメインが除去された（ＢＤＤ）ＦＶＩＩＩの凝固活性を測定する。いくつかの実施態様では、タンパク質は組換えタンパク質である。
【００２０】
血液凝固因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）は、肝臓により合成され、血流に放出される糖タンパク質である。循環血中で、それはフォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ、第ＶＩＩＩ因子関連抗原としても知られている）に結合し、安定な複合体を形成している。トロンビンにより活性化されると、それは複合体から分離し、凝固カスケードの他の凝固因子と相互作用し、最終的に血栓の形成を導く。本明細書で使用される用語「第ＶＩＩＩ因子」には、天然産生の第ＶＩＩＩ因子の活性のある変異体が含まれる。
【００２１】
本明細書で使用されるとき、Ｂドメインが除去されたＦＶＩＩＩ（ＢＤＤ）は、Ｂドメインの全部または一部が除去された第ＶＩＩＩ因子の分子である。ＦＶＩＩＩのＢドメインは、ＢＤＤが血友病Ａの補充療法として有効であるとも示されたので、不必要である。ある実施態様では、ＢＤＤは、Ｂドメインの最初の４アミノ酸がＢドメインの最後の１０残基に結合するように、ＦＶＩＩＩのＢドメインの１４アミノ酸を除く全てのアミノ酸の欠損を含むアミノ酸配列を有することを特徴とする。
【００２２】
活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）アッセイは、血餅形成時のフィブリノーゲンのフィブリンへの変換に起因するサンプルの濁度または粘度の増加を測定することにより、サンプルの凝固因子活性を試験する。ＡＰＴＴアッセイは、内因性経路に関連する凝固を評価するために、内因性経路の活性化物質、例えば、微粒子化シリカ、エラグ酸またはカオリン、および、トロンボプラスチン試薬のリン脂質成分を用いる（組織因子なし）。血液凝固は、カルシウムの添加により開始される。カルシウムは、患者から抜き取る際にサンプルに典型的に添加されるシュウ酸塩またはクエン酸塩の抗凝固効果を打ち消すように作用する。凝固時間は、目視検査により、または、自動凝固器具により、測定できる。典型的には、殆どの器具は、光学的濁度または電気伝導度を監視することにより、血餅の形成を検出する。光学的濁度は、血餅の形成に起因する光の透過の減少により感知され得、一方、電気伝導度の増加は、血餅の形成に相関し得る。サンプルの凝固活性は、その凝固時間に対応し、短い凝固時間は高い凝固活性を反映する。ＡＰＴＴアッセイの実施方法は、例えば、米国特許第５,５０６,１４６号および第５,０９１,３０４号に記載されている。ＡＰＴＴアッセイは、様々な方法で、ＰＥＧ化血液凝固因子の分析に使用できる。本発明の方法は、それが患者に投与される前に、例えば、製造中の品質管理工程の一部として、ＰＥＧ化血液凝固因子の凝固活性の測定に使用できる。他の実施態様では、本発明は、ＰＥＧ化血液凝固因子を投与された患者から採取されたサンプルにおいて、凝固活性を試験するのに使用し得る。
【００２３】
トロンボプラスチン試薬は、凝固活性化物質、例えば、シリカ、エラグ酸またはカオリン、および、リン脂質供給源、例えば、ウサギ脳リン脂質を含む。場合により、トロンボプラスチン試薬は、また、バッファー、抗菌薬およびカルシウム（血漿または血液サンプルにしばしば添加されるシュウ酸塩またはクエン酸塩の凝固効果を打ち消す）の１種またはそれ以上を含む。トロンボプラスチン試薬を、ＡＰＴＴアッセイで血液凝固活性を測定するサンプルと混合する。本発明は、シリカを含有するトロンボプラスチン試薬を用いて実施されるＡＰＴＴアッセイに関する。シリカをベースとするトロンボプラスチン試薬の例には、CEPHALINEX（商標）(Bio/Data Corporation) および Automated APTT 試薬 (BioMerieux）が含まれる。CEPHALINEX（商標）は、ウサギ脳リン脂質（セファリン）および粒子状微小シリカ活性化物質の凍結乾燥調製物である。Automated APTT 試薬は、ウサギ脳リン脂質および微粒子化シリカを適当なバッファー中に含有する。
【００２４】
本明細書で使用するとき、用語血漿は、一般的に、ＡＰＴＴ試薬と組み合わせられると凝血原活性を有するタンパク質を含む溶液を表す。血漿中のタンパク質には、血液凝固因子、トロンビンおよびフィブリノーゲンが含まれる。血漿は、また、他の血漿タンパク質、糖および／または塩も含有する。血漿は、ヒトまたは他の動物から得られる全血漿であり得る。血漿は、また、１種またはそれ以上の血液凝固因子を欠くもの、例えば、血友病Ａ患者に由来するＦＶＩＩＩ欠損血漿であり得る。血漿は、また、凝血原活性を有し、１種またはそれ以上の全血漿に由来する、血漿派生物であり得る。血漿派生物は、例えば、精製またはその他の処理によりいくつかのタンパク質、糖、塩または他の成分を除去した血漿画分または血漿であり得る。あるいは、血漿は、天然または人工成分を含む別々の供給源から得られる成分から形成される血漿置換物であり得る。例示的な人工成分には、天然の供給源から実質的に単離および／または精製された血漿タンパク質、および、組換え技術を使用して製造された血漿タンパク質が含まれる。使用し得る血漿の１つは、霊長類の血漿であり、いくつかの実施態様では、ヒトの血漿である。本明細書で使用されるとき、「血液」は、一般的に、全血、クエン酸血、濃縮血小板または血漿と血液細胞の制御混合物を表す。
【実施例】
【００２５】
実施例
実施例１. 微粒子化シリカをベースとするＡＰＴＴアッセイへの遊離ＰＥＧの添加は、測定されるＰＥＧ化第ＶＩＩＩ因子の活性を高める。
ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ分子は、発色（ＦＸａ−基質）アッセイにおいて、正常な生物学的活性または正常に近い生物学的活性を有する。しかしながら、それらの活性は、Automated APTT 試薬（BioMerieux）を Automatic Coagulation Analyzer（Electra 1800C または ACL Advance, Instrumentation Laboratory Co）で使用する、微粒子化シリカをベースとするＡＰＴＴアッセイでは、非常に信頼性が低い。ＢＤＤ−ＰＥＧ１４などのＰＥＧ化ＦＶＩＩＩは、他のインビトロアッセイ（例えば、トロンビン生成アッセイ）および血友病の動物の薬力学モデルでは正常なＦＶＩＩＩ活性を示すので、微粒子化シリカをベースとするＡＰＴＴアッセイにおけるＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの活性の欠如は、アッセイに特異的なものと思われた。ＡＰＴＴアッセイにおいてＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの生物学的活性を阻害するメカニズムを理解するために、高濃度の遊離ＰＥＧをアッセイに添加する効果を測定した。
【００２６】
ＡＰＴＴアッセイのために、使用した試薬は、１％ヒト血清アルブミンを含むトリス緩衝食塩水、血友病Ａ患者由来のＦＶＩＩＩ−欠損血漿、２５ｍＭ ＣａＣｌ２、２種のＡＰＴＴ試薬、即ち、微粒子化シリカを活性化物質として含む Platelet Factor 3 reagent Automated APTT (BioMerieux) またはエラグ酸を活性化物質として含む凝血終点（clot endpoint）試薬 AMAX ALEXIN（商標） (Trinity Biotech）のいずれかであった。Ｂドメインが除去されたＦＶＩＩＩおよび２種のＰＥＧ化ＢＤＤ分子、ＢＤＤ−ＰＥＧ１４およびＢＤＤ−ＰＥＧ２＋１４をこの研究で使用する。この実験では、０.０２５０ＩＵ／ｍｌおよび０.０１２５ＩＵ／ｍｌの２つの異なる最終濃度でＦＶＩＩＩサンプルを試験した。６４ｋＤ遊離ＰＥＧ（Sigma-Aldrich）を、最終濃度４３μＭで使用した。遊離ＰＥＧを、ＦＶＩＩＩサンプルに直接、または、反応混合物にＦＶＩＩＩを添加する前のＡＰＴＴ試薬に、添加した。Automatic Coagulation Analyzer (Electra 1800C, Instrumentation Laboratory Co）の製造業者の指示に従ってアッセイを実施した。各サンプルの凝固時間を測定し、装置により自動的に収集した。
【００２７】
図１および表１に示す結果は、ＦＶＩＩＩサンプルまたはＡＰＴＴ試薬への遊離ＰＥＧの添加が、微粒子化シリカをベースとするアッセイにおけるＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの生物学的活性を回復させたことを示す。微粒子化シリカをベースとするアッセイに添加した遊離ＰＥＧがＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの活性を回復させるという観察は、ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩのＰＥＧ部分が微粒子化シリカに吸着することを示唆する。本発明をどのようにも限定しないが、このシリカへの吸着が、ＦＶＩＩＩ分子が第Ｘ因子活性化複合体で集合および／または機能するのを妨げ得ると考えられる。
【００２８】
実施例２. 遊離ＰＥＧの添加は、ＰＥＧ化第ＶＩＩＩ因子の微粒子化シリカへの結合を妨げる
微粒子化シリカをベースとするＡＰＴＴ試薬のＢＤＤおよびＢＤＤ−ＰＥＧ２＋１４への結合に対する遊離ＰＥＧの効果を、改変したＡＰＴＴアッセイで測定した。遊離ＰＥＧを含有するサンプル中で、微粒子化シリカをベースとするＡＰＴＴ試薬を、１００ｋＤ直鎖状遊離ＰＥＧと、最終ＰＥＧ濃度５００μＭで混合した。次いで、ＦＶＩＩＩをサンプルに、発色アッセイで測定される最終濃度１２ＩＵ／ｍｌで添加した。ＡＰＴＴアッセイを、ＣａＣｌ２の添加を省略することにより改変し、微粒子化シリカのアッセイ混合物からの分離を阻害するであろう迅速な凝固を回避した。３分間室温でインキュベートした後、微粒子化シリカを遠心沈降させ、ＰＢＳで洗浄し、ウサギ抗−ＦＶＩＩＩポリクローナル抗体を使用するウエスタンブロットで分析した。
【００２９】
図２に示す通り、遊離ＰＥＧの非存在下で、ＢＤＤおよびＰＥＧ化ＢＤＤ−ＰＥＧ２＋１４は両方とも微粒子化シリカに結合したが、ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩはより強く結合した（レーン１および３）。５００μＭ遊離ＰＥＧの存在下で、ＢＤＤもＢＤＤ−ＰＥＧ２＋１４も有意に微粒子化シリカに結合しなかった（レーン２および４）。これは、遊離ＰＥＧが微粒子化シリカへの結合と競合するならば、予想し得ることである。
【００３０】
実施例３. 微粒子化シリカをベースとするＡＰＴＴアッセイでのＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの活性の回復における遊離ＰＥＧの効果は、ＰＥＧの大きさと濃度に依存する
このＡＰＴＴアッセイでは、ＢＤＤ−ＰＥＧ２＋１４を最終濃度０.０７７ｎＭ（０.１ＩＵ／ｍＬ）で使用した。４つの異なる大きさのＰＥＧ（２、３５、６４および１００ｋＤ）の１つを、ＢＤＤ−ＰＥＧ２＋１４が大過剰の７つの異なる濃度倍率（５０、１００、２００、５００、１,０００、５,０００および１０,０００倍高い）で添加した。これらの７つの異なる濃度倍率は、各々、最終ＰＥＧ濃度３.８、７.７、１５.４、３８.５、７７.０、３８５および７７０ｎＭに相当する。加えて、４つの異なる大きさのＰＥＧを、ＢＤＤ−ＰＥＧ２＋１４が大過剰の２００,０００および２,０００,０００の濃度倍率で添加した（図３に示す通り）。実施例１に記載の通りに反応を実施した。各サンプルの凝固時間を、微粒子化シリカ産物（Automated APTT, BioMerieux）をＡＰＴＴ試薬として使用して測定した。非ＰＥＧ化ＢＤＤを対照として使用した。
【００３１】
図３は、微粒子化シリカをベースとするＡＰＴＴアッセイでのＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの活性の回復における遊離ＰＥＧの効果が、ＰＥＧの大きさおよび濃度に依存し、大きいＰＥＧ分子および高い濃度が最大の効果を示すことを示す。ＰＥＧは同一部分の繰り返しからなるポリマーであるので、ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの活性の回復における遊離ＰＥＧの効果は、恐らく、ＰＥＧ部分（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）の濃度に応じて決まる。ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩに対して百万倍の範囲で高い割合の遊離ＰＥＧが、ＢＤＤ−ＰＥＧ２＋１４の活性を回復させるために必要であり、これは、遊離ＰＥＧの微粒子化シリカとの相互作用は、比較的低い結合親和性であり得ることを示す。ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの量に対して、微粒子化シリカビーズ上にＰＥＧと相互作用し得るかなり過剰の表面積があったという可能性もある。
【００３２】
実施例４. ＡＰＴＴアッセイにおけるＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの活性の低下は、微粒子化シリカをベースとするアッセイに特異的である
ＡＰＴＴアッセイにおけるＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ活性の測定に伴う問題を克服するために、接触活性化物質として微粒子化シリカを使用しないＡＰＴＴアッセイ試薬を調べた。微粒子化シリカを含有する Automated APTT 試薬（BioMerieux）および微粒子化シリカを含まない凝血終点試薬 AMAX ALEXIN（商標）(Trinity Biotech）をこの調査に使用した。様々な希釈のＢＤＤ、ＢＤＤ−ＰＥＧ１４およびＢＤＤ−ＰＥＧ２＋１４をこの研究で使用し、それらの凝固活性をこれらの２つのアッセイ系により測定した。全てのＦＶＩＩＩサンプルについてのＡＰＴＴアッセイは、ＭＬＡ１８００装置で実施した。実施例１に記載の通りにアッセイを実施した。
【００３３】
結果は、微粒子化シリカをベースとする Automated APTT アッセイは、非ＰＥＧ化ＢＤＤ活性を検出し得たことを示す（図４）。しかしながら、Automated APTT アッセイは、ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ分子の活性を正確に測定する能力を失った。一方、微粒子化シリカの代わりにエラグ酸を使用する凝血終点試薬 AMAX ALEXIN（商標） APTT アッセイは、ＰＥＧ化のある、またはない、全ての３種のＦＶＩＩＩ分子の活性を測定することができた（図５）。微粒子化シリカを用いないＡＰＴＴアッセイにおけるＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ分子の正常な活性の立証は、ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ分子についての発色アッセイとＡＰＴＴアッセイの不一致は、微粒子化シリカをベースとするＡＰＴＴアッセイに特異的であったことを示す。
【００３４】
Automated APTT アッセイ（図４）および凝血終点試薬AMAX ALEXIN（商標） APTT アッセイ（図５）の両方で測定された様々な濃度でのＢＤＤ−ＰＥＧ１４の活性を、それらの発色活性に対して編集した（図６）。結果は、Automated APTT アッセイはＰＥＧ化ＦＶＩＩＩには役に立たないが、凝血終点試薬 AMAX ALEXIN（商標） APTT アッセイにより測定されたＢＤＤ−ＰＥＧ１４のＣｏａｇ単位は、それらの発色単位の２０％以内にあることを示す。従って、ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの正常な活性は、接触活性化物質として微粒子化シリカではなくエラグ酸を使用する凝血終点試薬 AMAX ALEXIN（商標） アッセイで観察された。リン脂質（ウサギ脳セファリン）は、微粒子化シリカまたはエラグ酸を使用するＡＰＴＴ試薬の少なくともいくつかで同等であるので、微粒子化シリカがＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの凝固活性を妨げる原因であると見込まれる。
【００３５】
表１. 微粒子化シリカをベースとするＡＰＴＴアッセイにおけるＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの活性に対する遊離ＰＥＧの効果。全てのサンプルは、希釈倍率１であった。ダッシュは、値が検出範囲外であったことを示す。
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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