(57)【要約】〔課題〕  本発明は、多分化能を有する細胞を、アドレノメデュリン(AM)および／または血管内皮増殖因子（VEGF）を含む培地で培養することにより、エクスビボにおいても高い増殖能を示し、血管新生または心筋再生を促進する前駆細胞を製造する方法の提供を課題とする。また、本発明は、該前駆細胞、およびその利用法を提供することも課題とする。〔解決手段〕  上記課題を解決するために、本願発明者らは、アドレノメデュリン(AM)および／または血管内皮増殖因子（VEGF）を用いることで、脂肪組織から従来よりも効率的に前駆細胞を作製する新たな培養技術を開発することに成功した。本発明者らが作製した前駆細胞は、強力な増殖能、血管再生能、および心筋再生能を持った特殊な細胞であり、また脂肪細胞への分化誘導をかけても脂肪細胞にはならないという特徴を持つため、難治性の脳・肺・肝・腎疾患等に対する有効な薬剤となりうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多分化能を有する細胞を以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかに記載の増殖因子を含む培地で培養する工程を含む、前駆細胞の製造方法。
（ｉ）アドレノメデュリン(AM) 
（ｉｉ）血管内皮増殖因子（VEGF）
（ｉｉｉ）アドレノメデュリン(AM)および血管内皮増殖因子（VEGF）
【請求項２】
多分化能を有する細胞が、脂肪間質細胞、胚性幹細胞、成人幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯血細胞、または人為的に多分化能を獲得した細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
多分化能を有する細胞が、脂肪組織中に含まれる脂肪間質細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
多分化能を有する細胞が、哺乳類動物由来の細胞である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の方法により製造された前駆細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の前駆細胞を対象に投与する工程を含む、対象における障害組織を再生または修復する方法。
【請求項７】
請求項５に記載の前駆細胞を対象に投与する工程を含む、対象における障害組織の末梢血管を新生または再生させる方法。
【請求項８】
請求項５に記載の前駆細胞を対象に投与する工程を含む、対象における障害組織の細胞を新生または再生させる方法。
【請求項９】
増殖因子を前駆細胞と同時に対象に投与する工程を含む、請求項６〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
増殖因子が以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかに記載の増殖因子である、請求項９に記載の方法。
（ｉ）アドレノメデュリン(AM) 
（ｉｉ）血管内皮増殖因子（VEGF）
（ｉｉｉ）アドレノメデュリン(AM)および血管内皮増殖因子（VEGF）
【請求項１１】
障害組織が、虚血性心疾患、または肺高血圧症における障害組織である、請求項６〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
請求項５に記載の前駆細胞を有効成分とする、障害組織を再生または修復させる薬剤
【請求項１３】
請求項５に記載の前駆細胞を有効成分とする、障害組織の末梢血管を新生または再生させる薬剤。
【請求項１４】
請求項５に記載の前駆細胞を有効成分とする、障害組織の細胞を新生または再生させる薬剤。
【請求項１５】
障害組織が、虚血性心疾患、末梢動脈閉塞症、または肺高血圧症における障害組織である、請求項１２〜１４のいずれかに記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪組織由来の前駆細胞、該細胞の製造方法、および、該細胞の利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺動脈高血圧症は、進行性肺高血圧および右心不全を特徴とし、稀ではあるものの命に関わる疾患である（非特許文献１）。これら肺高血圧症の発症には肺血管内皮の機能不全が重要な役割を果たしていると考えられている。このため、肺血管内皮は原発性肺高血圧症をはじめとする肺高血圧症の治療のための治療標的となると思われる（非特許文献２）。
また、虚血性心疾患（狭心症や心筋梗塞）は冠動脈の狭窄や閉塞によって心筋が虚血や壊死に陥った状態であり、陳旧性心筋梗塞は、慢性心不全の原因として重要である。慢性心不全に対しては不整脈や心筋梗塞の再発、動脈硬化の進展の防止等を目的とした薬物治療が行われるが、壊死した心筋を回復させる有効な治療法は存在しない。近年、顆粒球コロニー刺激因子を用いて骨髄細胞を心筋障害部位に動員し、血管や心筋の再生を促すことで心機能を改善させる試みがなされ始めたが、副作用の問題などから治療薬としては定着していない。【０００３】
骨髄・成体末梢血・臍帯血中に血管内皮前駆細胞が存在することが知られており（非特許文献３）、現在、血管内皮前駆細胞を用いた血管再生治療が行われている。これらの血管内皮前駆細胞は、組織虚血または外傷性損傷に応答して骨髄から末梢血に移動し、損傷を来した血管内皮部位に遊走して、その場で成熟内皮細胞に分化することがわかっている（非特許文献４〜６）。さらに、本発明者らおよび他の研究者により、血管内皮前駆細胞の投与によってモノクロタリン（以下MCTと表記することもある）誘発性肺高血圧症が改善されることがわかっている（非特許文献７、８）。
しかしながら、従来の幹細胞移植法において移植されてきた血管内皮前駆細胞は、増殖能が低いため体外での培養による細胞数確保が難しいとされてきた。また、虚血性心疾患・末梢動脈閉塞症・肺高血圧症などの炎症性疾患を持つ患者においては、患者体内の血管内皮前駆細胞機能や細胞生存能・分化能が低下していると報告されている。【０００４】
治療に必要な細胞数の採取のために、600〜800 mlの骨髄液、もしくは大量の末梢血を患者から採取する必要があり、これは高侵襲な処置を患者へ施し危険を伴うため、十分な数の血管内皮前駆細胞を入手することは困難であるとされていた。そのため、従来の前駆細胞に代わりうる移植細胞の開発が必要とされてきた。
脂肪組織は近年、多能性幹細胞の供給源として大きな注目を集めている（非特許文献９）。脂肪組織は成熟脂肪細胞および脂肪間質細胞からなり、後者は多様な細胞系譜に分化しうることがわかっている（非特許文献１０〜１７）。脂肪間質細胞には接着性があり、培養下で増殖可能なため、脂肪組織の小塊から培養により大量の脂肪間質細胞を得ることは容易である（非特許文献１８）。しかしながら、脂肪細胞から効率よく血管内皮前駆細胞を誘導する培養技術は確立していない。【０００５】
なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
【非特許文献１】Rich S, et al. Ann Intern Med. 1987 ; 107 : 216-223.
【非特許文献２】Archer S, et al. Circulation. 2000 ; 102 : 2781-2791.
【非特許文献３】Asahara T, et al. Science. 1997 ; 275 : 965-967.
【非特許文献４】Takahashi T, et al. Nat Med. 1999 ; 5 : 434-438.
【非特許文献５】Shintani S, et al. Circulation. 2001 ; 103 : 897-903.
【非特許文献６】Shintani S, et al. Circulation. 2001 ; 103 : 2776-2779.
【非特許文献７】Nagaya N, et al. Circulation. 2003 ; 108 : 889-895.
【非特許文献８】Takahashi M, et al. Tissue Eng. 2004 ; 10 : 771-779.
【非特許文献９】Zuk PA, et al. Mol Biol Cell. 2002 ; 13 : 4279-4295.
【非特許文献１０】Zuk PA, et al. Tissue Eng. 2001 ; 7 : 211-228.
【非特許文献１１】Hicok KC, et al. Tissue Eng. 2004 ; 10 : 371-380.
【非特許文献１２】Erickson GR, et al. Biochem Biophys Res Commun. 2002 ; 290 : 763-769.
【非特許文献１３】Cousin B, et al. Biochem Biophys Res Commun. 2003 ; 301 : 1016-1022.
【非特許文献１４】Safford KM, et al. Biochem Biophys Res Commun. 2002 ; 294 : 371-379.
【非特許文献１５】Miranville A, et al. Circulation. 2004 ; 110 : 349-355.
【非特許文献１６】Planat-Benard V, et al. Circ Res. 2004 ; 94 : 223-229.
【非特許文献１７】Planat-Benard V, et al. Circulation. 2004 ; 109 : 656-663.
【非特許文献１８】Ailhaud G, , et al. Annu Rev Nutr. 1992 ; 12 : 207-233.
【非特許文献１９】Kitamura K, et al. Biochem Biophys Res Commun. 1993 ; 192 : 553-560.
【非特許文献２０】Nagaya N, et al. Peptides. 2004 ; 25 : 2013-2018.
【非特許文献２１】Nagaya N, et al. Circulation. 2000 ; 101 : 498-503.
【非特許文献２２】Nagaya N, et al. Circulation. 2004 ; 109 : 351-356.
【非特許文献２３】Nakamura R, et al. Circulation. 2004 ; 110 : 426-431.
【非特許文献２４】Tokunaga N, et al. Circulation. 2004 ; 109 : 526-531.
【非特許文献２５】Okumura H, et al. Circulation. 2004 ; 109 : 242-248.
【非特許文献２６】Okumura H, et al. Hypertens Res. 2003 ; 26 : S99-S104.
【非特許文献２７】Zachary I. Am J Physiol Cell Physiol. 2001 ; 280 : C1375-C1386.
【非特許文献２８】Gehling UM, et al. Blood. 2000 ; 95 : 3106-3112.
【非特許文献２９】Dimmeler S, et al. J Clin Invest. 2001 ; 108 : 391-397.
【非特許文献３０】Oswald J, et al. Stem Cell. 2004 ; 22 : 377-384.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
アドレノメデュリン（以下AMと表記することもある）は強力な血管拡張性ペプチドであり、最初はヒト褐色細胞腫から単離された（非特許文献１９〜２３）。AMは、少なくとも部分的にはホスファチジルイノシトール3-キナーゼ（PI3K）／Akt経路を介して、血管新生を誘導することが示されている（非特許文献２４〜２６）。また、AMの血管新生促進能力は血管内皮増殖因子（vascular endothelial growth factor ：以下VEGFと表記することもある）のものとは関係しないことが知られている（非特許文献２７〜３０）。AMとVEGFの併用が、脂肪間質細胞の内皮細胞系譜または心筋細胞系譜への分化にどのような影響を与えるかは、これまでに検討されてこなかった。【０００７】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、多分化能を有する細胞を、アドレノメデュリン(AM)および／または血管内皮増殖因子（VEGF）を含む培地で培養することにより、エクスビボにおいても高い増殖能を示し、血管新生や心筋再生を促進する前駆細胞を製造する方法を提供することにある。また、本発明は、該細胞、または該細胞を有効成分とする、障害組織を再生または修復する薬剤を提供することも課題とする。さらに、該細胞を対象に投与する工程を含む、対象における障害組織を再生または修復する方法を提供することも課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために、まず、ラットの腹部皮下脂肪組織から採取した脂肪間質細胞を、アドレノメデュリン（AM）および／または血管内皮増殖因子（VEGF）とともに培養を行った。その結果、培養細胞は血管内皮カドヘリンおよびCD31などの内皮細胞系譜マーカーを発現し、さらに、AMとVEGFの併用により、PI3Kシグナル伝達経路を介した脂肪間質細胞の血管内皮分化が増強されることが明らかとなった。
次に、脂肪間質細胞由来の前駆細胞の細胞性機能を調べた所、マトリゲルアッセイでは、AMおよびVEGFはいずれも単独で脂肪間質細胞の血管新生促進能力を増強し、AMとVEGFとの併用は、AMまたはVEGFのいずれか単独の場合と比べて、脂肪間質細胞の血管新生促進能力をさらに増強することが明らかとなった。【０００９】
また、脂肪細胞形成アッセイにより、AMまたはVEGFを添加しないで培養した脂肪間質細胞は、脂肪細胞形成を誘導した場合、容易に脂肪細胞に分化するのに対し、AMおよび／またはVEGFとともに培養した脂肪間質細胞は、脂肪細胞形成を誘導しても脂肪細胞に分化しにくいことがわかった。
また、本発明者らは、モノクロタリン（MCT）による肺高血圧症モデルラットに対する、本発明の前駆細胞の効果について検討を行った。MCT注射から3日後に脂肪由来前駆細胞を静脈内に投与したところ、前駆細胞の一部は肺血管に組み込まれ、肺での血管生成に加わることが明らかとなった。さらに、本発明の細胞をMCTラットに投与することによって、肺毛細血管密度の低下は減弱し、MCT誘発性肺高血圧症を有意に回復させるとともに、MCTラットの生存期間を改善することも明らかとなった。
また、本発明の前駆細胞を心筋梗塞モデルラットに投与することによって、心筋梗塞域の縮小と血行動態の改善がみられることが明らかとなった。また本発明の前駆細胞は、新生児ラットの心筋細胞と共培養することにより、自己拍動を起こすことを確認した。さらに、心筋特異的マーカーを用いることで、本発明の前駆細胞が心筋細胞へ分化していることを明らかにした。【００１０】
即ち、本発明者らは、循環調節ペプチドであるアドレノメデュリンを用いて、脂肪組織から従来よりも効率的に血管内皮細胞および心筋細胞の両系譜に分化しうる前駆細胞を作製する新たな培養技術を開発することに成功し、これにより本発明を完成するに至った。本発明者らが作製した前駆細胞は、強力な増殖能、血管再生能、心筋再生能を持った特殊な細胞であり、また脂肪細胞への分化誘導をかけても脂肪細胞にはならないという特徴を持つため、難治性の脳・肺・肝・腎疾患等に対する有効な薬剤となりうる。
即ち、本発明は、以下の〔１〕〜〔１５〕を提供するものである。
〔１〕多分化能を有する細胞を以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかに記載の増殖因子を含む培地で培養する工程を含む、前駆細胞の製造方法。
（ｉ）アドレノメデュリン(AM) 
（ｉｉ）血管内皮増殖因子（VEGF）
（ｉｉｉ）アドレノメデュリン(AM)および血管内皮増殖因子（VEGF）
〔２〕多分化能を有する細胞が、脂肪間質細胞、胚性幹細胞、成人幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯血細胞、または人為的に多分化能を獲得した細胞である、〔１〕に記載の方法。
〔３〕多分化能を有する細胞が、脂肪組織中に含まれる脂肪間質細胞である、〔１〕に記載の方法。
〔４〕多分化能を有する細胞が、哺乳類動物由来の細胞である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法により製造された前駆細胞。
〔６〕〔５〕に記載の前駆細胞を対象に投与する工程を含む、対象における障害組織を再生または修復する方法。
〔７〕〔５〕に記載の前駆細胞を対象に投与する工程を含む、対象における障害組織の末梢血管を新生または再生させる方法。
〔８〕〔５〕に記載の前駆細胞を対象に投与する工程を含む、対象における障害組織の細胞を新生または再生させる方法。
〔９〕増殖因子を前駆細胞と同時に対象に投与する工程を含む、〔６〕〜〔８〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕増殖因子が以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかに記載の増殖因子である、〔９〕に記載の方法。
（ｉ）アドレノメデュリン(AM) 
（ｉｉ）血管内皮増殖因子（VEGF）
（ｉｉｉ）アドレノメデュリン(AM)および血管内皮増殖因子（VEGF）
〔１１〕障害組織が、虚血性心疾患、または肺高血圧症における障害組織である、〔６〕〜〔１０〕のいずれかに記載の方法。
〔１２〕〔５〕に記載の前駆細胞を有効成分とする、障害組織を再生または修復させる薬剤。
〔１３〕〔５〕に記載の前駆細胞を有効成分とする、障害組織の末梢血管を新生または再生させる薬剤。
〔１４〕〔５〕に記載の前駆細胞を有効成分とする、障害組織の細胞を新生または再生させる薬剤。
〔１５〕障害組織が、虚血性心疾患、末梢動脈閉塞症、または肺高血圧症における障害組織である、〔１２〕〜〔１４〕のいずれかに記載の薬剤。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】脂肪間質細胞の形態変化を示す写真である。培養第7日目の脂肪間質細胞は紡錘状の形態を呈し、対照培地中では第28日まで不変のまま保たれた。アドレノメデュリン（AM）および血管内皮増殖因子（VEGF）とともに培養した脂肪間質細胞は第28日目には敷石状の外観を示した。スケールバー：100μm。
【図２−１】28日間の培養期間中の脂肪間質細胞の特徴を蛍光活性化セルソーター（FACS）により分析した結果を示す図である。AM群、VEGF群およびAM＋VEGF群では、血管内皮（VE）-カドヘリン（A）およびCD31（B）などの内皮細胞特異的マーカーを発現する脂肪間質細胞が徐々に増加したが、対照群では増加しなかった。
【図２−２】第28日の対照群およびAM＋VEGF群におけるVE-カドヘリン、CD31、フォンビルブラント因子（vWF）、CD34およびCD45の発現を示す図である。データは平均±SEMである。
【図３】AMおよびVEGFは脂肪間質細胞の内皮分化を、少なくとも部分的にはホスファチジルイノシトール3-キナーゼシグナル伝達経路を介して誘導する。脂肪間質細胞を第21日から第28日までウォルトマンニンの存在下または非存在下で培養し、VE-カドヘリンの発現をFACSにより第28日に分析した。データは平均±SEMである。*P<0.05、対照との比較；†P<0.05、VEGFとの比較；P<0.05、AMとの比較；§P<0.05、AM＋VEGFとの比較。
【図４】マトリゲル上での血管新生測定を示す写真および図である。A：管形成の代表的写真を示す。スケールバー：100μm。B：管形成領域の定量分析を示す。この場合には対照群を1.0に指定した。 データは平均±SEMである。*P<0.05、対照との比較；†P<0.05、AMとの比較；‡P<0.05、VEGFとの比較。
【図５】脂肪細胞形成測定を示す写真および図である。A：第7日にオイルレッドO溶液で染色した脂肪間質細胞の脂肪細胞化の代表的写真、ならびに第28日の対照群およびAM＋VEGF群の写真を示す。スケールバー：100μm。B：脂肪細胞化の定量分析を示す図である。脂肪細胞形成を行わなかった第7日の脂肪間質細胞を1.0に指定した。データは平均±SEMである。*P<0.05、脂肪細胞形成を行わなかった第7日の脂肪間質細胞との比較；†P<0.05、脂肪細胞形成を行った第7日の脂肪間質細胞との比較；‡P<0.05、脂肪細胞形成を行った第28日の対照との比較。
【図６】モノクロタリン（MCT）を投与したラット（MCTラット）の肺における、インビボでの脂肪由来前駆細胞の組み込み、分布および分化を示す写真である。A：静脈内投与した蛍光（PKH26）標識脂肪由来前駆細胞は肺細動脈壁に取り込まれた。矢印は蛍光標識された脂肪由来前駆細胞を示す。B：DAPI染色により、細胞核が示されている。C：移植したPKH26標識脂肪由来前駆細胞は肺組織上に分布した。肺血管はFITCを結合させた抗vWFによって検出した。Ｄ：内皮再生の代表的写真。PKH26／vWF二重陽性細胞が肺肺胞の間に観察され、これはDAPI染色を伴っていた。矢印はPKH26／vWF二重陽性細胞を示す。スケールバー：20 μm。
【図７】A：培地を投与した偽処置ラット（偽処置群）、培地を投与したMCTラット（賦形剤群）および脂肪由来前駆細胞を投与したMCTラット（脂肪由来前駆細胞群）の肺における免疫組織化学法によるvWFの存在を示す写真である。脂肪由来前駆細胞群における毛細血管密度は賦形剤群のものよりも有意に高かった。スケールバー：100 μm。B：毛細血管密度の定量分析を示す図である。データは平均±SEMである。*P<0.05、偽処置との比較；†P<0.05、賦形剤との比較。
【図８】A,B：右室（RV）収縮期圧（A）およびRV重量と体重との比（RV／BW）（B）に対する脂肪由来前駆細胞移植の影響を示す図である。データは平均±SEMである。*P<0.05、偽処置との比較；†P<0.05、賦形剤との比較。C：MCT注射から3週後の末梢肺動脈の代表的写真である。スケールバー：10 μm。D：末梢肺動脈の壁厚の変化率に関する定量分析を示す図である。データは平均±SEMである。*P<0.05、偽処置との比較；†P<0.05、賦形剤との比較。E：Kaplan-Meier生存曲線を示す図である。これは脂肪由来前駆細胞群（●）の方が賦形剤群（○）よりも生存率が有意に高いことを示している（ログランク検定、P<0.05）。  偽処置（Sham）、培地を投与した偽処置ラット；賦形剤（Vehicle）、培地を投与したMCTラット；脂肪由来前駆細胞、脂肪由来前駆細胞を投与したMCTラット；RV、右室；RV／BW、RV重量と体重との比；LV＋S／BW、左室＋中隔重量と体重との比。データは平均±SEMである。*P<0.05、偽処置との比較；†P<0.05、賦形剤との比較。
【図９】急性心筋梗塞後4週間での、脂肪由来前駆細胞移植の影響を示す写真および図である。Ａ：マッソントリクロム染色した、対照群および脂肪由来前駆細胞移植群の梗塞域の代表写真。Ｂ：脂肪由来前駆細胞移植で顕著に梗塞サイズが減少したことを実証する半定量分析の結果を示す図。データは平均±SEMである。*P < 0.05、対照との比較。
【図１０】血行動態パラメータにおける脂肪由来前駆細胞移植の影響を示す図である。Ａ：LV拡張終期圧（LVEDP）、Ｂ：LV短縮率（FS%）、Ｃ：LV最大dP/dt (Max dP/dt)およびＤ：LV最小dP/dt (Min dP/dt)。データは平均±SEMである。*P < 0.05、偽処置との比較；†P < 0.05、対照との比較。
【図１１】虚血心筋における移植脂肪由来前駆細胞の生着および分化を示す写真である。Ａ−Ｃ：GFP陽性脂肪由来前駆細胞は、心臓troponin I陽性であることを示す写真。倍率400倍。Ｄ−Ｆ：GFP陽性脂肪由来前駆細胞が血管構造を形成し、vWFが染色されることを示す写真。倍率630倍。核はDAPIで染色した。
【図１２】Ａ：梗塞周辺部位においてvWFを免疫組織化学的に示した写真である。倍率200倍。Ｂ：梗塞周辺部位における毛細血管密度の定量分析を示す図である。脂肪由来前駆細胞群の毛細血管密度は対照群と比較して顕著に高かった。データは平均±SEMである。*P < 0.05、偽処置との比較；†P < 0.05、対照との比較。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、多分化能を有する細胞を、増殖因子を含む培地で培養する工程を含む、前駆細胞の製造方法に関する。
本発明において、「多分化能を有する細胞」としては、例えば脂肪間質細胞、胚性幹細胞（ES細胞）、成人幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯血細胞、または人為的に多分化能を獲得した細胞が挙げられるが、種々の種類の細胞に分化する能力を有している細胞であれば、本発明の多分化能を有する細胞に含まれる。本発明の多分化能を有する細胞としては、好ましくは脂肪組織中に含まれる脂肪間質細胞を挙げることが出来る。また、成熟脂肪細胞から分化された脂肪間質細胞も、脂肪間質細胞として本発明に使用することが出来る。本発明の多分化能を有する細胞は、好ましくは哺乳動物由来の細胞が挙げられるが、特に由来は限定されるものではない。「人為的に多分化能を獲得した細胞」としては、例えば遺伝子操作を含むクローン技術により多分化能を獲得した体細胞を挙げることができる。【００１３】
本発明において、「増殖因子」としては、アドレノメデュリン(AM)、血管内皮増殖因子（VEGF）を挙げることができる。これらの増殖因子は分化誘導時に、それぞれ単独で培地に添加されていても良いし、混合した状態で培地に添加されていてもよい。混合する際には、各増殖因子の濃度は特に限定されず、同濃度であってもよいし、違う濃度であってもよい。また、培養中に途中から各増殖因子を段階的に培地に添加してもよい。
本発明において「アドレノメデュリン」とは、血小板中のcAMPの増加活性を指標にヒト褐色細胞腫組織抽出液より発見された強力な降圧作用を有する生理活性ペプチドである。「アドレノメデュリン」の前駆体のcDNAの塩基配列を配列番号：１に、該DNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。【００１４】
本発明の「アドレノメデュリン」の前駆体としては、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなる天然由来のタンパク質であって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を挙げることが出来る。また、配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする天然由来のDNAよりコードされるタンパク質であって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質も、「アドレノメデュリン」の前駆体として挙げることができる。
活性型の「アドレノメデュリン」は、該「アドレノメデュリン」前駆体の一部分であり、配列番号：３に示すアミノ酸配列を有する。本発明において用いられるアドレノメデュリンは、好ましくは配列番号：３に示すアミノ酸配列を有するが、それらに限定されず、配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなる天然由来のタンパク質であって、配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質も挙げることが出来る。また、配列番号：１に記載の塩基配列の447位から602位に相当するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする天然由来のDNAよりコードされるタンパク質であって、配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質も、活性型「アドレノメデュリン」として挙げることができる。【００１５】
本発明において、変異するアミノ酸数は特に制限されないが、通常、30アミノ酸以内であり、好ましくは15アミノ酸以内であり、さらに好ましくは5アミノ酸以内（例えば、3アミノ酸以内）であると考えられる。変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（R、K、H）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。あるアミノ酸配列に対する1又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することは当業者に公知な事項である。【００１６】
本発明において「機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が、該タンパク質と同等の生物学的機能や生化学的機能を有することを指す。本発明において、該タンパク質の生物学的機能や生化学的機能としては、対象における障害組織を再生または修復させる機能、該障害組織の末梢血管を新生または再生させる機能、または、該障害組織の細胞を新生または再生させる機能等を挙げることが出来る。このような機能の測定方法としては、実施例に記載の方法が例示できるが、それらの方法に限定されない。生物学的な性質には発現する部位の特異性や、発現量等も含まれる。
目的のタンパク質と「機能的に同等なタンパク質」をコードするDNAを調製するために、当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者にとっては、「アドレノメデュリン」の塩基配列（配列番号：１）もしくはその一部をプローブとして、また「アドレノメデュリン」の塩基配列（配列番号：１）に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、「アドレノメデュリン」と高い相同性を有するDNAを単離することは通常行いうることである。このようにハイブリダイズ技術やPCR技術により単離しうる「アドレノメデュリン」と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNAもまた本発明のDNAに含まれる。【００１７】
このようなDNAを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、6M尿素、 0.4%SDS、0.5xSSCの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M尿素、0.4%SDS、0.1xSSCの条件を用いることにより、より相同性の高いDNAの単離を期待することができる。これにより単離されたDNAは、アミノ酸レベルにおいて、目的タンパク質のアミノ酸配列と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で、少なくとも50％以上、さらに好ましくは70％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95%,96%,97%,98%,99%以上）の配列の同一性を指す。アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムBLASTを用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。【００１８】
本発明において、「血管内皮増殖因子（VEGF）」とは、血管内皮細胞に特異的な増殖因子であり、血管内皮増殖因子は血管の内側にある内皮細胞の受容体に結合して増殖を促す。血管内皮増殖因子には分子量の異なる5種類（VEGF121,145,165,189,206）のアイソフォームが知られているが、本発明において培地に添加される血管内皮増殖因子の種類は特に限定されるものではない。
上記、アドレノメデュリンおよび血管内皮増殖因子の由来は特に限定されるものではないが、好ましくは哺乳動物由来であり、より好ましくはヒト由来である。
本発明の培養方法において、脂肪間質細胞を用いる場合、分化誘導前に、実施例のように前培養を行ってもよいが、この工程を省略することもできる。この前培養工程において、多分化能を維持した状態で、未分化脂肪間質細胞を増殖させることが可能である。
前培養における、培地条件は特に制限されるものではなく、当業者に公知の培地および添加物（好ましくはヘパリンまたは抗生物質）を用いることが出来る。前培養の期間は特に制限されるものではなく、好ましくは7日〜28日の期間を挙げることが出来る。【００１９】
本発明における細胞培養法は、マトリクスコーティングが異なる培養皿、またはマトリクスコーティングの有無が異なる培養皿を用いた二次元培養法、マトリジェル等のソフトゲルやコラーゲンスポンジ等を用いた三次元培養法、またはそれらを併用する方法が挙げられるが、好ましくは、マトリクスコーティングが異なる培養皿を挙げることが出来る。前培養段階においては、上記の培養皿を用いなくてもよい。
また、本発明の方法において、脂肪間質細胞以外の多分化能を有するヒト由来の細胞を用いる場合は、実施例の脂肪間質細胞の例を参考に、適宜、培養皿を選択することが出来る。
また、本発明の実施例において、前培養工程および分化誘導後の培養工程の詳細な培養条件が開示されているが、本発明の方法の培養条件はこれら特定の条件に限定されるものではなく、一般的に許容される条件を取りうる。
本発明の方法における培養期間は、特に制限はないが、本発明の方法において、脂肪間質細胞を用いる場合、好ましくは7日〜28日の期間を挙げることが出来る。【００２０】
本発明においては、上記分化誘導方法によって、前駆細胞を製造できる。本発明において、前駆細胞は特に限定されないが、好ましくは血管内皮前駆細胞、心筋前駆細胞を挙げることが出来る。
本発明において製造させた分化細胞が、前駆細胞であることは、各組織の細胞マーカー、または各細胞の機能を指標に確認できる。
各組織の細胞マーカーとして、好ましくは血管内皮細胞マーカー、心筋細胞マーカーを用いることが出来る。血管内皮細胞マーカーとしては、モノクローナル抗体： CD31（クローンTLD-3A12、Becton Dickinson）、血管内皮（VE）-カドヘリン（クローンF-8、Santa Cruz）、CD45（クローンOX-1、Becton Dickinson）、CD34（クローンICO115、Santa Cruz）およびフォンビルブラント因子（vWF）に対するウサギポリクローナル抗体（Dako）を挙げることが出来る。心筋細胞マーカーとしては、troponin I, ANP, connexin43を挙げることが出来る。【００２１】
血管内皮前駆細胞の機能は、血管新生を誘導するか否かをインビトロまたはインビボで確認することによって確認が出来る。例えば、実施例のように、マトリゲル上での管形成アッセイを行っても良いし、肺高血圧症モデル動物であるMCTラットに本発明の細胞を投与して、肺高血圧症が改善されるかを確認してもよい。
心筋前駆細胞の機能は、心筋細胞新生を誘導するか否かをインビトロまたはインビボで確認することによって確認が出来る。例えば、実施例のように、新生児ラットの心筋細胞と共培養することにより、培養細胞が自己拍動を行うかどうか確認してもよいし、心筋梗塞モデルラットに本発明の細胞を投与して、心筋細胞が新生されるかどうかを確認してもよい。
本発明の方法において、脂肪間質細胞以外の多分化能を有するヒト由来の細胞を用いる場合でも、当業者に公知の検出方法（各細胞のマーカーを用いた検出方法や、各細胞特有のアッセイ方法）により、製造された前駆細胞の確認を行うことができる。【００２２】
本発明は、本発明の方法により製造された前駆細胞を提供する。本発明の方法により製造された前駆細胞は、従来の方法により製造された前駆細胞に比べエクスビボにおける製造が容易に行える。また、本発明の方法では脂肪間質細胞等から前駆細胞を分化誘導することが出来るため、患者に対し低侵襲の処置のみで、治療に必要な量の前駆細胞を得られるという利点がある。よって、本発明の前駆細胞は、例えば医療分野（例えば再生医療分野）において有用である。【００２３】
本発明は、本発明の前駆細胞を対象に投与する工程を含む、対象における障害組織を再生または修復する方法に関する。本発明において、障害組織を再生または修復するとは、より具体的には、障害組織の末梢血管を新生または再生する、または障害組織の細胞を新生または再生することも含まれる。
本発明において、「対象」とは、本発明の方法によって処置されるべき生物体、該生物体の体内の一部分（例えば脳、肺、心臓、肝臓、腎蔵等の臓器、およびそれらの臓器中の血管または一組織）、または生物体より摘出または排出されたその一部分をいう。生物体は、動物（例えば、ヒト、家畜動物種、野生動物）であれば特に限定されるものではないが、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを含む。本発明において、「対象」とは、障害を受けている組織（障害組織）そのものを示すこともできる。【００２４】
本発明において、「投与する」とは、非経口的に投与することが含まれる。
非経口的な投与としては、注射剤という形での投与を挙げることができ、注射剤としては、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を挙げることができる。注射剤を投与する方法としては、対象となる生物体の体内の一部分（臓器等の一組織）を標的として局所的に投与を行っても良いし、血管に投与することにより、生物体全体に本発明の細胞を循環させてもよい。また、複数箇所の標的に同時に投与を行ってもよい。また、本発明の細胞を、処置を施したい領域に局所的に投与することもできる。例えば、手術中の局所注入、カテーテルの使用により投与することも可能である。【００２５】
投与量は、患者の年齢、性別、体重および症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該細胞に含有される活性成分の種類などにより異なり特に制限されるものではない。
また、生物体より摘出または排出された生物体の一部分に投与を行う際には、本発明の細胞を生物体の一部に「接触」させてもよい。
また、本発明において「接触」は、生物体の状態に応じて行う。例えば、生物体の一部への本発明の細胞の散布、あるいは、生物体の一部の破砕物への本発明の細胞の添加等を挙げることができるが、これらの方法に制限されない。
本発明の方法を実践する際に、本発明の細胞は、少なくとも1つの既知の化学療法剤と共に薬学的組成物の一部として投与されてもよい。一つの態様において、本発明の細胞および既知の化学療法剤は、実質的に同時に投与されてもよい。
また、本発明の細胞は、少なくとも１つの既知の増殖因子と供に同時に投与されてもよい。同時に投与される増殖因子は特に制限されないが、好ましくはアドレノメデュリンまたは血管内皮増殖因子を挙げることが出来る。アドレノメデュリンおよび血管内皮増殖因子はそれぞれ単独で投与されてもよいし、同時に投与されてもよい。
また、生物体より摘出または排出された生物体の一部分に本発明の細胞を投与し、摘出または排出を行った生物体または他の生物体に、該生物体の一部分を戻すことも可能である。【００２６】
本発明における「障害組織」とは、何らかの理由により障害を受けた組織を挙げることが出来る。通常、正常細胞に外的または内的刺激が加わった場合には、直ちに細胞障害に至らず適応現象が生じ、細胞組織の萎縮、肥大、過形成が起こることがある。しかし、外的または内的刺激が適応範囲を超えると、それらの刺激に伴った形態変化、例えば変性、壊死が起こり、本発明ではこれらの現象を「障害」と定義することにする。
本発明において、障害組織における「変性」とは、可逆性細胞障害として普遍的に認められる細胞・組織変化のことを表す。変性の際に蓄積する物質は生体に正常に存在するものと存在しない病的なものがあり、蓄積した物質によって蛋白変性または脂肪変性と呼ばれる。変性状態としては、粘液変性、アミロイド変性、α１アンチトリプシン欠損症における変性、尿酸代謝障害における変性、硝子滴変性、水腫様変性、空胞変性、フィブリノイド変性、または角質変性等を挙げることが出来る。
本発明において、「壊死」とは、細胞・組織の不可逆的変化のことを表す。壊死状態としては、凝固壊死（循環障害）、融解壊死、壊疽（壊死に細菌感染が合併した状態）、または枯死（細胞障害による病的死ではなく組織内で生じる生理的な死）等を挙げることが出来る。【００２７】
本発明において「対象における障害組織」としては、循環器、呼吸器、脳神経系、消化器、内分泌系、泌尿器、または皮膚等に発症する疾患における障害組織を挙げることが出来る。
上記の疾患としては、心筋梗塞、不整脈、動脈硬化、血液攣縮、虚血再循環障害、肺炎、感染症、肺線維症（制ガン剤副作用）、ARDS、パラコート中毒、喫煙障害、肺気腫、高酸素療法、インフルエンザ、脳浮腫、脳梗塞、脳出血、てんかん、脳欠陥攣縮、パーキンソン病、自律神経障害（Reilly現象）、遅発性神経障害、脊髄損傷、神経原性肺浮腫、急性胃粘膜障害、胃潰瘍、潰瘍性大腸炎、クローン病、ベーチェット病、肺炎、肝硬変、薬物性肝障害、肝移植病態、各種の黄疸病態、膵炎、糸球体腎炎、溶血性腎障害、薬物性腎障害、火傷、日光皮膚炎、アトピー性皮膚炎、皮膚漬瘍、網膜変症、白内障、角膜腫瘍等を挙げることができ、好ましくは、難治性心肺疾患、末梢性血管疾患、腎疾患、肝疾患または脳血管疾患、より好ましくは、肺高血圧症または虚血性心疾患（心筋梗塞または狭心症）を挙げることができる。
本発明の「対象における障害組織」として、より具体的には肺胞、肺血管における障害組織、または心筋細胞を挙げることが出来る。【００２８】
本発明において「再生または修復する」とは、上記の障害組織を、変性が起こる以前の状態に再生すること、または壊死してしまった障害組織を、新たに新生することを表す。例えば、対象における障害組織の末梢血管を新生または再生させること、または障害組織の細胞組織を新生または再生させることも、本発明における「再生または修復」に該当することとして挙げることができる。
障害組織の再生または修復が起こる期間は特に限定されないが、一時的な再生または修復であってもよいし、一定期間の再生または修復であってもよい。また、再生または修復が完全に進む、すなわち組織が元の状態に完全に戻ることが好ましいが、組織の部分的な再生または修復であってもよい。
「再生または修復」の、より具体的な例としては、肺気腫状態の肺胞または肺血管における、変性した末梢血管の修復、また壊死した末梢血管に置き換わる新たな血管の再生を挙げることが出来る。結果として、肺高血圧症が改善された場合にも、肺組織の修復・再生が行われたと解釈することが出来る。また、心筋梗塞や狭心症における、変性した心筋細胞または末梢血管の修復を挙げることもできる。結果として、心筋梗塞または狭心症の症状が改善された場合にも、心臓組織の修復・再生が行われたと解釈することが出来る。【００２９】
本発明は、本発明の前駆細胞を有効成分とする、障害組織を再生または修復させる薬剤に関する。また、本発明の前駆細胞を有効成分とする、障害組織の末梢血管を新生または再生させる薬剤、または障害組織の細胞を新生または再生させる薬剤に関する。
本発明の薬剤には、保存剤や安定剤等の製剤上許容しうる担体を添加してもよい。製剤上許容しうるとは、それ自体は上記の活性を有さない材料であって、上記の薬剤とともに投与可能な製剤上許容される材料を意味する。【００３０】
注射剤を調製する場合、必要により、pH 調製剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤等を添加し、常法により、皮下、筋肉内、静脈内注射剤とする。また、一投与量を容器に収納してもよく、また、投与量を同一の容器に収納してもよい。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。本実施例においては、データはすべて平均±SEMとして表した。群間のパラメーターの比較は、片側ANOVA検定の後にNewman-Keuls検定によって行った。また、群間のパラメーターの経時的推移の比較は、反復測定値に対する両側ANOVA検定の後にNewman-Keuls検定によって行った。生存曲線をKaplanMeier方法によって作成し、ログランク検定によって比較した。値がP<0.05であれば統計学的に有意であるとみなした。【００３２】
〔実施例１〕脂肪組織からの脂肪間質細胞の単離および培養
体重90〜110gの雄性Wistarラットを本実施例に用いた。ラットの手術を行い、両側腹部の小切開により皮下脂肪組織を摘出した。脂肪組織を破砕して、0.1mg／mlの1型コラゲナーゼ（Worthington Biochemical）を含むリン酸緩衝食塩水に入れ、静かに攪拌しながら37℃で1時間消化処理を行った。未消化断片を25μmのフィルターによる濾過によって除去し、遠心処理（2000rpm、10分間）によって成熟脂肪細胞を脂肪間質細胞のペレットから分離した。以前の報告の通りに（Bjorntorp P, et al. J Lipid Res. 1978;19:316-324.）、上清を除去し、細胞ペレットを再懸濁した上で通常の培養皿に播き、10％ウシ胎仔血清（FCS）、ヘパリンおよび抗生物質を含むα培地中で培養した。【００３３】
培養第7日に付着性脂肪間質細胞を継代し、以下の4つの群に分けた：10％FCSおよび抗生物質を含むα培地（対照培地）中で培養した脂肪間質細胞（対照群）、10−７mol／lのAMを含む対照培地中で培養した脂肪間質細胞（AM群）、20ng／mlのVEGFを含む対照培地中で培養した脂肪間質細胞（VEGF群）、10−７mol／lのAMおよび20ng／mlのVEGFの両方を含む対照培地中で培養した脂肪間質細胞（AM＋VEGF群）。
培養第7日の脂肪間質細胞は紡錘状の形態を呈し、対照培地中では第28日まで不変のまま保たれた（図1）。これに対して、AMおよびVEGFとともに培養した脂肪間質細胞は第28日には敷石様の外観を示した（図1）。【００３４】
〔実施例２〕蛍光活性化セルソーターによる分析
培養細胞の内皮表現型は、VE-カドヘリン、CD31およびvWFといった内皮細胞特異的マーカーの存在を実証することによって確認した。具体的には、培養第7日、第14日、第21日および第28日の時点で、各群の脂肪間質細胞を蛍光活性化細胞分取法（FACS；FACS SCANフローサイトメーター、Becton Dickinson）により分析した。これらの脂肪間質細胞を、以下のそれぞれに対するマウスモノクローナル抗体：CD31（クローンTLD-3A12、Becton Dickinson）、血管内皮（VE）-カドヘリン（クローンF-8、Santa Cruz）、CD45（クローンOX-1、Becton Dickinson）、CD34（クローンICO115、Santa Cruz）およびフォンビルブラント因子（vWF）に対するウサギポリクローナル抗体（Dako）とともに4℃で30分間インキュベートした。VE-カドヘリンの細胞内染色のために透過化処理用緩衝液（Santa Cruz）を用いた。アイソタイプが同一な抗体を対照として用いた。【００３５】
これらの結果、脂肪間質細胞の大半はVE-カドヘリンに関して陰性であることがわかった（第7日には6.4±1.8％、第28日には7.2±2.4％）（図2-1上図）。しかし、VE-カドヘリンを発現する脂肪間質細胞は、AMまたはVEGFのいずれかと培養することによって徐々に増加することがわかった（第28日にそれぞれ28±7％および22±3％）。また重要なことに、AMおよびVEGFの両方と培養すると、VE-カドヘリンを発現する脂肪間質細胞はさらに増加（第28日に49±7％）することがわかった。CD31を発現する脂肪間質細胞の数は対照培地中では徐々に減少したが（第7日の6.4±1.2％から第28日には2.6±0.7％に）、AMまたはVEGFのいずれかと培養した場合には有意に増加（第28日にそれぞれ16±11％および11±7％）することがわかった（図2-1下図）。AMとVEGFとの併用により、CD31を発現する脂肪間質細胞の数はさらに増加（第28日で26±11％）し、同様に、vWFを発現する脂肪間質細胞も、AMおよびVEGFの両方との培養により、第7日の12±3％から第28日には70±13％に増加することがわかった（図2-2）。一方、CD34およびCD45の発現はどの群も変化しなかった。
培養下でVE-カドヘリンまたはCD31の発現が増加するという以上の結果より、AMはVEGFと同様に、脂肪間質細胞の内皮細胞系譜への分化を増強する能力があることが分かった。
さらに、分化シグナル伝達へのAMの関与に関しては、以前の報告の通りに（Kim W, et al. FASEB J. 2003;17:1937-1939.）、脂肪間質細胞を第21日から第28日まで、PI3K阻害剤であるウォルトマンニン（Sigma）30nmol／lの存在下または非存在下で、培地を24時間毎に交換しながら培養することで検討した。VE-カドヘリンの発現は、FACSにより第28日目に分析した。【００３６】
その結果、AM、VEGFまたはAM＋VEGFによるVE-カドヘリンの発現増強はPI3K阻害剤投与により、減弱することがわかった（図3）。VE-カドヘリンを発現する脂肪間質細胞の数に関しては、三群間に有意差はないことが明らかとなった：20ng／ml VEGFで22±3％、50ng／ml VEGFで25±6%、および100ng／ml VEGFで20±4％。
以前の研究により、PI3Kシグナル伝達における下流因子が、胚性幹細胞におけるVEGF誘導性内皮分化に重要な役割を果たすことが示されている（Miyashita H, et al. Blood. 2002;99:3241-3249., Yamazaki T, et al. Blood. 2004;104:2345-2352.）。本発明においては、PI3K阻害剤との培養により、AMまたはVEGFの存在下でのVE-カドヘリンを発現する脂肪間質細胞数の増加が抑制された。これらの結果から、PI3Kシグナル伝達がAMまたはVEGFで誘導される脂肪間質細胞の内皮細胞への分化に重要な役割を果たすものと示唆される。
また、比較的高濃度のVEGF（20ng/mlを上回る）でもVE-カドヘリンを発現する脂肪間質細胞の数は増加しなかったのに対し、AMとVEGFの併用はAMまたはVEGFのいずれか単独に比べて脂肪間質細胞の内皮細胞系譜への分化をより強力に誘導した。これらの結果は、脂肪間質細胞のVEGF誘導性内皮分化の増強にAMが重要な役割を果たすことを示唆している。【００３７】
〔実施例３〕マトリゲル上での血管新生測定
脂肪間質細胞による血管様構造の形成、すなわち脂肪間質細胞が血管新生を誘導するか否かを、基底膜マトリックス調製物（マトリゲル）上で評価した。各群の培養脂肪間質細胞を、マトリゲル（Becton Dickinson）をコーティングした12ウェルプレートに2.0×10５個／ウェルとして播き、37℃で6時間インキュベートした。管形成を光学顕微鏡を用いて観察し、コンピュータシステムを用いて画像を取り込んだ。管形成領域のピクセル解析は以前の報告の通りに行った（Miura S, et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003;23:802-808.）。簡潔に述べると、この領域の画像をモノクロスケール（black-scale）に変換し、ピクセルの総数を算出するための画像処理を行った。各試料に関してピクセル数を5つの異なる領域で計測し、平均値を求めた。【００３８】
その結果、AM群およびVEGF群では対照群に比べて1.9倍および1.6倍、管形成の増加が検出された（図4AおよびB）。さらに重要なことに、管形成のさらなる増加がAM＋VEGF群で検出され、その定量により、対照群に比べて2.3倍高度である上に、AM群またはVEGF群のいずれよりも有意に高度であることが示された。
以上の結果より、AMおよびVEGFはいずれも単独で脂肪間質細胞の血管新生促進能力を増強し、AMとVEGFの併用はAMまたはVEGF単独に比べて、さらに血管新生促進能力を増強することが明らかとなった。【００３９】
〔実施例４〕脂肪細胞形成に対するAMの阻害作用の検出
脂肪細胞形成に対するAMの阻害作用について検討を行った。
各群の第7日および第28日の脂肪間質細胞を、10％FCSおよび抗生物質を含むダルベッコ変法イーグル培地（DMEM：標準培地）中に再懸濁し、直径22mmのウェル1つ当たり1.2×10５個を播いた。0.5mmol／lの3-イソブチル-1-メチルキサンチンおよび1μmol／lのデキサメタゾンを含む標準培地中で48時間培養した後に、10μg／mlのインスリンを含む標準培地中で48時間培養することにより、脂肪間質細胞は脂肪細胞に分化した。添加物質を含まない標準培地中に48時間保った後に、細胞をオイルレッドO溶液によって染色した。オイルレッドO染色の定量によって脂質蓄積を計測するために、以前の報告の通りに（Landsberg RL, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003;100:2456-2461., Selvarajan S, et al. Nat Cell Biol. 2001;3:267-275.）、染色処理を行った培養皿にイソプロピルアルコールを添加し、抽出された色素を穏やかなピペッティングによって直ちに採取した上で、その490nmでの吸光度を分光光度計によってモニターした。【００４０】
上記の結果、脂肪細胞形成条件下で脂肪細胞に分化した第7日の脂肪間質細胞のオイルレッドO染色は、脂肪細胞形成を行わなかった第7日の脂肪間質細胞に比して2.2倍高度であることがわかった（図5AおよびB）。対照培地中の第28日の脂肪間質細胞も第7日の脂肪間質細胞とほとんど同じレベルで脂肪細胞に分化した。しかしながら、興味深いことに、第28日の脂肪間質細胞の脂肪細胞化（adipose conversion）は、脂肪細胞形成条件下でもAM、VEGFおよびAM＋VEGFによってほぼ完全に抑制されることがわかった。
脂肪細胞形成評価により、AMおよび／またはVEGFとともに培養した脂肪間質細胞は脂肪細胞形成を誘導しても脂肪細胞に分化しないことが示されたが、脂肪間質細胞の脂肪細胞化の能力は長時間の培養を通じて維持された。以上の結果より、脂肪由来前駆細胞はインビボで脂肪細胞化を伴わずに血管新生を誘導する可能性が示唆された。【００４１】
〔実施例５〕モノクロタリン（MCT）ラットへの脂肪由来前駆細胞の導入
肺高血圧症誘発剤であるモノクロタリン（MCT）は肺内皮損傷を誘導するとともに肺毛細血管の数を減少させ（Rosenberg H, et al. Am J Physiol. 1988;255:H1484-H1491., Schraufnagel DE, et al. Am Rev Respir Dis. 1989;140:1405-1409.）、これはMCT誘発性肺高血圧症が発症する一因となる。そこで、本発明者らは、MCTを投与し擬似的に肺高血圧症を発症させたラットに対する、脂肪由来前駆細胞の効果について検討を行った。【００４２】
末梢脂肪組織から入手した脂肪間質細胞を10−７mol／lのAMおよび20ng／mlのVEGFとともに3週間培養した。本発明者らは、この脂肪間質細胞の培養によって誘導された細胞を、脂肪由来前駆細胞と定義した。培養第18日目に、ラットに無作為に、60mg／kgのMCT（MCTラット郡）または0.9％食塩水（偽処置ラット郡）の皮下注射を行った。MCT注射から3日後（培養第２１日目）に、1.5×10６個の自己脂肪由来前駆細胞または培地（各500μL）を左頸静脈から静脈内投与した。偽処置ラットに対しても同じく培地500μLを静脈内投与した。用量反応実験に基づいて移植の最大限の効果を得るため、ラット1匹当たり1.5×10６個を用いた。このプロトコールの結果、以下の3つの群が生じた。
脂肪由来前駆細胞を投与したMCTラット（脂肪由来前駆細胞群、n＝10）、培地のみを投与したMCTラット（賦形剤群、n＝10）および培地のみを投与した偽処置ラット（偽処置群、n＝10）。【００４３】
〔実施例６〕免疫蛍光染色および免疫組織化学染色
60mg／kgのMCT注射から3日後に、赤色蛍光色素（PKH26、Sigma）で標識した1.5×10６個の自己脂肪由来前駆細胞を静脈内投与した。MCT注射から3週後に肺を摘出して凍結した。凍結切片に対する免疫蛍光染色を、vWFモノクローナル抗体（Dako）および対応するFITC標識二次抗体（Dako）を用いて行った。【００４４】
脂肪由来前駆細胞の静脈内投与から18日後の時点で脂肪由来前駆細胞はMCTラットの肺細動脈壁に組み込まれ、肺血管を構成していた（図6A）。移植した脂肪由来前駆細胞は肺組織上に分布していた（図6B）。さらに、移植した脂肪由来前駆細胞の一部はvWFによって染色され、肺動脈の血管形成に加わっていた（図6C）。【００４５】
各群の個々のラットの右肺から4μm厚のパラフィン切片を入手した。切片に対する免疫組織化学染色を、vWFに対して産生されたウサギポリクローナル抗体（DAKO）を用いて行った。肺胞およびvWF陽性毛細血管（直径100μm未満）の数を算定した。毛細血管密度は、以前の報告の通り（Itoh T, et al. Am J Respir Crit Care Med. 2004;170:1204-1211.）、肺胞100個当たりの毛細血管数として表した。
その結果、毛細血管密度はMCT注射後に有意に低下したが、MCTラットへの脂肪由来前駆細胞移植後に有意に上昇することが明らかとなった（図7AおよびB）。
上記の結果より、導入した脂肪由来前駆細胞の一部が成熟内皮細胞に分化して内皮細胞を誘導することが示唆された。【００４６】
〔実施例７〕肺高血圧症に対する脂肪由来前駆細胞の効果
MCT注射から3週間後に血行動態試験を行った。心拍数および平均動脈圧を測定するためにポリエチレン製カテーテル（PE-50）を右頸動脈に挿入し、RV圧の測定のためにポリエチレン製カテーテル（PE-50）を右頸静脈から右室（RV）に挿入した。その後、2mmolの塩化カリウムをカテーテルを介して注入することによって心停止を誘導した。心室および肺を摘出して単離した。以前の報告の通りに（Nagaya N, et al. Circulation. 2000;102:2005-2012.）、RV重量と体重との比（RV／BW）、左室＋中隔の重量と体重との比（LV＋S／BW）を心室肥大の指標として算出した。プロトコールはいずれも、国立循環器病センター研究所（大阪、日本）の動物管理倫理委員会の指針に準拠して行った。【００４７】
上記の結果、RV収縮期圧はMCT注射から3週後に有意に上昇することが明らかとなった（図8A）。しかし、この上昇は脂肪由来前駆細胞群では有意に減弱した（-17％）。同様に、MCTラットにおけるRV／BWの上昇は脂肪由来前駆細胞群では有意に減弱した（-23％）（図8B）。三群間に心拍数および平均動脈圧に関する有意差は認められなかった（表1）。【００４８】
【表１】
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【００４９】
〔実施例８〕肺動脈の形態計測的分析
4μm厚のパラフィン切片を右肺の中央部から入手し、光学顕微鏡による検査のためにヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。肺細動脈の外径および内壁厚を20本の筋性動脈（外径25〜100μmの範囲）で測定した。内壁厚は以下の通りに表した：壁厚＝（［内壁厚×2］／外径）×100。以前の報告（Itoh T, et al. Am J Respir Crit Care Med. 2004;169:34-38.）の通りに、肺切片を3つの群の個々のラット（それぞれn＝5）から入手した。
これらの結果、代表的な写真により、脂肪由来前駆細胞群では賦形剤群に比してMCT注射肺血管壁の肥厚化が減弱していることが示された（図8C）。定量分析でMCT注射後に壁厚百分率の有意な増加が示されたが、この変化は脂肪由来前駆細胞群では改善することが明らかとなった（図8D）。【００５０】
〔実施例９〕ラットの生存期間分析
MCT注射から3日後に、ラット20匹に対して、自己脂肪組織由来の1.5×10６個の脂肪由来前駆細胞（脂肪由来前駆細胞群、n＝10）または培地（賦形剤群、n＝10）の静脈内注射を行った。生存期間の評価はMCT注射日からラットの死亡日またはMCT注射から6週後まで行った。
これらの結果、Kaplan-Meier生存曲線からは、脂肪由来前駆細胞を移植したMCTラットの方が培地を投与した群よりも生存率が有意に高いことが示された（図8E）。
上記のことより、脂肪由来前駆細胞の導入によって誘導される血管内皮細胞は肺血管再生の調節に重要な役割を果たし、肺高血圧症の改善をもたらすことが考えられる。【００５１】
〔実施例１０〕心筋梗塞モデルラットへの脂肪由来血管前駆細胞の導入
ラットに対して開胸術後に冠動脈前下降枝を結さつして心筋梗塞を作成した。心筋梗塞作成数分後に梗塞境界域の心筋に5×10６個の脂肪由来前駆細胞を注入した(脂肪由来前駆細胞群)。また対照群として同様に心筋梗塞を作成後にPBS100μLを梗塞境界域の心筋に注入した(対照群)。偽処置群には開胸術後に心筋梗塞を作成せずにPBS100μLを心筋注入した(偽処置群)。
心筋梗塞作成日より4週間後に脂肪由来前駆細胞による治療効果を評価した。
対象群および脂肪由来前駆細胞群のラットの左心室の心筋梗塞部位（各群n=5）を10％ホルマリンで固定してパラフィン包埋し、マッソントリクロム染色を行った。また心筋梗塞域の大きさを測定した（図9AおよびB）。
次に、対象群および脂肪由来前駆細胞群のラットの冠動脈の結さつ４週間後の血行動態を検討するため、血行動態パラメータとなる、LV拡張終期圧（LVEDP）、LV短縮率（FS%）、LV最大dP/dt (Max dP/dt)および最小dP/dt (Min dP/dt)を測定した（図10A-D）。1.5−Ｆｒマイクロナノメーターチップを付けたカテーテル（ミラーインスツルメント社）を右頚動脈より挿入し、平均動脈圧を測定した。次に、カテーテルを左心室まで進めてLV圧を測定した。測定は圧ドランスデューサーをポリグラフに連結して記録した。梗塞サイズは既報（Chien YW. Et al., Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 254:R185-91, 1988）の通り測定を行った。
上記結果より、脂肪由来前駆細胞群では対照群と比較し心筋梗塞域の縮小と血行動態の改善を認めた。また、心エコー検査では脂肪由来前駆細胞群では心機能の改善を認めた。【００５２】
〔実施例１１〕培養上での脂肪由来前駆細胞の心筋細胞への分化
EGFP-transgenicラットの末梢脂肪組織から入手した脂肪間質細胞を初期培養1週間後から10−７mol／lのAM添加培地にて1週間培養して脂肪由来前駆細胞を作製した。また、生後1〜2日の新生児ラットから心筋細胞を分離培養して、培養2日目に脂肪由来前駆細胞を加え共培養を開始した。共培養開始５日目には脂肪由来前駆細胞は自己拍動を始めた。自己拍動は心筋細胞に特異的な現象であるため、新生児ラットの心筋細胞との共培養によって脂肪由来前駆細胞が心筋細胞に分化したことが確認された。脂肪由来前駆細胞が自己拍動を行う様子をビデオ画像に収めることに成功した。
共培養5日目に培養皿上の細胞をパラホルムアルデヒドにて固定後に、心筋特異的マーカーであるtroponin I, ANP, connexin43の蛍光免疫染色を施行した。troponin I, ANP, connexin43を赤色に染色することにより、緑色の脂肪由来前駆細胞との重染色を認めた。そのため、脂肪由来前駆細胞が心筋細胞へ分化したことが示唆された。【００５３】
〔実施例１２〕心筋梗塞移植後の心筋切片での蛍光免疫染色および免疫組織化学染色
EGFP-transgenicラットの末梢脂肪組織から入手した脂肪間質細胞を初期培養1週間後から10−７mol／lのAM添加培地にて1週間培養して脂肪由来前駆細胞を作製した。脂肪由来前駆細胞を心筋梗塞作成後のラットに移植して2週間後に心臓を摘出した。心臓をホルマリンにて固定後にパラフィン切片を作成して、 troponin I, connexin43, desmin, vWFを染色した。troponin Iを染色した結果を図11A-Cに、vWFを染色した結果を図11D-Fに示す。心筋梗塞後の移植により脂肪由来前駆細胞が心筋細胞や血管内皮細胞へ分化していることが示唆された。【００５４】
また、各群の個々のラットの心筋からパラフィン切片を作成した。切片に対する免疫組織化学染色を、vWFに対する抗体（Dako）にて施行した（図12A）。vWF陽性毛細血管（直径100μm未満）の数を算定した（図12B）。その結果、心筋梗塞作成後の梗塞境界域の毛細血管密度は有意に低下していたが、脂肪由来前駆細胞移植後には有意に上昇することが明らかとなった。脂肪由来前駆細胞の移植により血管形成が促進されて心筋梗塞後の治療効果をもたらすことが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の方法を用いて、低侵襲の処置にて得た少量の脂肪細胞をエクスビボにて培養することにより、治療必要数の前駆細胞を作製することができる。そのため、本発明の細胞の製造方法および、製造された該細胞を用いた細胞移植治療は、患者に対し高侵襲の処置を施す必要が無いという点で、従来の課題を克服した画期的な治療法となる。
本発明の前駆細胞を、障害組織等に移植導入することにより、虚血下肢や虚血心筋における血流増加、血管新生増加、または心筋再生が期待できる。また、難治性の脳・肺・肝・腎疾患等に対して本発明の前駆細胞を用いることにより、血管再生または細胞再生を介して組織の修復が促進されることで、病変の縮小と機能改善が図れるものと考えられる。さらに、本発明の方法は自己由来の細胞を用いるため、免疫応答による拒絶反応の心配や倫理的な問題も少なく、画期的な治療法となる。
【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図１０】
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【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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