【手続補正書】
【提出日】令和2年10月13日(2020.10.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）そのＣ末端においてインテイン−Ｎに融合したCas9タンパク質のＮ末端部分をコードする第１のヌクレオチド配列；ならびに
（ｉｉ）Cas9タンパク質のＣ末端部分のＮ末端に融合したインテイン−Ｃをコードする第２のヌクレオチド配列、
を含む、組成物であって；
ここで、第１のヌクレオチド配列および／または第２のヌクレオチド配列は、少なくとも１つの二分核定位シグナルをコードするヌクレオチド配列に作動的に連結している、およびここで、Cas9タンパク質のＮ末端部分は、配列番号１のアミノ酸１〜５７１、１〜５７２、１〜５７３、１〜５７４、１〜５７５、１〜６３５、１〜６３６、１〜６３７、１〜６３８、または１〜６３９に対応する、配列番号１〜２７５および３９４〜３９７のうちのいずれか１つの一部を含む、およびここで、Cas9タンパク質のＣ末端部分は、配列番号１のアミノ酸５７２〜１３６８、５７３〜１３６８、５７４〜１３６８、５７５〜１３６８、５７６〜１３６８、６３６〜１３６８、６３７〜１３６８、６３８〜１３６８、６３９〜１３６８、または６４０〜１３６８に対応する、配列番号１〜２７５および３９４〜３９７のうちのいずれか１つの一部を含む、
前記組成物。
【請求項２】
Cas9タンパク質のＮ末端部分が、配列番号１のアミノ酸１〜５７３または１〜６３７に対応する、配列番号１〜２７５および３９４〜３９７のうちのいずれか１つの一部を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Cas9タンパク質のＣ末端部分が、配列番号１のアミノ酸５７４〜１３６８または６３８〜１３６８に対応する、配列番号１〜２７５および３９４〜３９７のうちのいずれか１つの一部を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
インテイン−Ｎが、配列番号３５１または３５５に記載のアミノ酸配列を含む；および／または、インテイン−Ｃが、配列番号３５３または３５７に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
Cas9タンパク質が、触媒として不活性なCas9（dCas9）またはCas9ニッカーゼ（nCas9）であり、ここで、（ｉ）の第１のヌクレオチド配列が、Cas9タンパク質のＮ末端部分のＮ末端に融合した核酸塩基修飾酵素をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、および／または、Cas9タンパク質が、触媒として不活性なCas9（dCas9）またはCas9ニッカーゼ（nCas9）であり、ここで、（ｉｉ）の第２のヌクレオチド配列が、Cas9タンパク質のＣ末端部分のＣ末端に融合した核酸塩基修飾酵素をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
核酸塩基修飾酵素がデアミナーゼである、任意にここで、デアミナーゼがシトシンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
（ｉｉ）の第２のヌクレオチド配列が、第２のヌクレオチド配列の３’末端においてウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、および／または、（ｉ）の第１のヌクレオチド配列が、第１のヌクレオチド配列の５’末端においてウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、任意にここで、ＵＧＩが、配列番号２９９〜３０２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項５または６に記載の組成物。
【請求項８】
第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列とが、２つの異なるベクター上にある、任意にここで、２つの異なるベクターの各々が、組み換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）のゲノムである、さらに任意にここで、各々のベクターが、ｒＡＡＶ粒子中にパッケージングされている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
（ｉ）そのＣ末端においてインテイン−Ｎに融合したCas9タンパク質のＮ末端部分をコードする第１のヌクレオチド配列を含む、第１の組み換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子；ならびに
（ｉｉ）Cas9タンパク質のＣ末端部分のＮ末端に融合したインテイン−Ｃをコードする第２のヌクレオチド配列を含む、第２の組み換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子、
を含む、組成物であって、
ここで、第１のヌクレオチド配列および／または第２のヌクレオチド配列は、少なくとも１つの二分核定位シグナルをコードするヌクレオチド配列に作動的に連結している、およびここで、Cas9タンパク質のＮ末端部分は、配列番号１のアミノ酸１〜５７１、１〜５７２、１〜５７３、１〜５７４、１〜５７５、１〜６３５、１〜６３６、１〜６３７、１〜６３８、または１〜６３９に対応する、配列番号１〜２７５および３９４〜３９７のうちのいずれか１つの一部を含む、およびここで、Cas9タンパク質のＣ末端部分は、配列番号１のアミノ酸５７２〜１３６８、５７３〜１３６８、５７４〜１３６８、５７５〜１３６８、５７６〜１３６８、６３６〜１３６８、６３７〜１３６８、６３８〜１３６８、６３９〜１３６８、または６４０〜１３６８に対応する、配列番号１〜２７５および３９４〜３９７のうちのいずれか１つの一部を含む、
前記組成物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物を含む細胞であって、任意に、Cas9タンパク質のコードされたＮ末端部分とCas9タンパク質のコードされたＣ末端部分とが、細胞において一緒に連結されて、Cas9タンパク質を形成する、前記細胞。
【請求項１１】
（ｉ）そのＣ末端においてインテイン−Ｎに融合した核酸塩基エディターのＮ末端部分をコードする第１のヌクレオチド配列；ならびに
（ｉｉ）核酸塩基エディターのＣ末端部分のＮ末端に融合したインテイン−Ｃをコードする第２のヌクレオチド配列
を含む、組成物。
【請求項１２】
核酸塩基エディターが、触媒として不活性なCas9またはCas9ニッカーゼのＮ末端に融合したシトシンデアミナーゼを含む、任意にここで、シトシンデアミナーゼが、APOBEC1、APOBEC3、AIDおよびpmCDA1からなる群より選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
核酸塩基エディターが、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）をさらに含む、任意にここで、ＵＧＩが、配列番号２９９〜３０２のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列とが、２つの異なるベクター上にある、任意にここで、２つの異なるベクターの各々が、組み換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）のゲノムである、さらに任意にここで、ベクターが、ｒＡＡＶ粒子中にパッケージングされている、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
第１のヌクレオチド配列または第２のヌクレオチド配列が、プロモーターに作動的に連結されたガイドＲＮＡ（gRNA）をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１〜９および１１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
第１のヌクレオチド配列および／または第２のヌクレオチド配列が、転写ターミネーターをさらに含む、任意にここで、転写ターミネーターが、bGH遺伝子、hGH遺伝子、またはSV40遺伝子からの転写ターミネーターである、請求項１〜９および１１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
第１のヌクレオチド配列および／または第２のヌクレオチド配列が、転写ターミネーターの５’に挿入されたウッドチャック肝炎転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
二分核定位シグナルが、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号３４４）、ＫＫＴＥＬＱＴＴＮＡＥＮＫＴＫＫＬ（配列番号３４５）、ＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＧＲＫＴＲ（配列番号３４６）、およびＲＫＳＧＫＩＡＡＩＶＶＫＲＰＲＫ（配列番号３４７）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、任意にここで、二分核定位シグナルが、配列番号３４４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１〜９および１１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
（ｉ）そのＣ末端においてインテイン−Ｎに融合した核酸塩基エディターのＮ末端部分をコードする第１のヌクレオチド配列を含む、第１の組み換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子；ならびに
（ｉｉ）核酸塩基エディターのＣ末端部分のＮ末端に融合したインテイン−Ｃをコードする第２のヌクレオチド配列を含む、第２の組み換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子、
を含む、組成物。
【請求項２０】
請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の組成物を含む細胞であって、任意に、核酸塩基エディターのコードされたＮ末端部分と核酸塩基エディターのコードされたＣ末端部分とが、細胞において一緒に連結されて、核酸塩基エディターを形成する、前記細胞。
【請求項２１】
原核細胞である、任意にここで、細菌細胞である、請求項１０または２０に記載の細胞。
【請求項２２】
真核細胞である、任意にここで、酵母細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞である、さらに任意にここで、ヒト細胞である、請求項１０または２０に記載の細胞。
【請求項２３】
細胞を、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含むin vitroまたはex vivoの方法であって、ここで、接触させることが、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列の細胞中への送達をもたらし、およびここで、Cas9タンパク質のＮ末端部分とCas9タンパク質のＣ末端部分とが、連結されて、Cas9タンパク質を形成する、前記方法。
【請求項２４】
細胞を、請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含むin vitroまたはex vivoの方法であって、ここで、接触させることが、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列の細胞中への送達をもたらし、およびここで、核酸塩基エディターのＮ末端部分と核酸塩基エディターのＣ末端部分とが、連結されて、核酸塩基エディターを形成する、前記方法。
【請求項２５】
医薬としての使用のための、請求項１〜９および１１〜１９のいずれか一項に記載の組成物、または請求項１０および２０〜２２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２６】
対象において疾患または障害を処置することにおける使用のための、請求項１〜９、１１〜１９および２５のいずれか一項に記載の組成物、または請求項１０、２０〜２２および２５のいずれか一項に記載の細胞であって、疾患または障害が、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、表皮溶解性角化症（ＥＨＫ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、４Ｊ型シャルコー・マリー・トゥース病、神経芽細胞腫（ＮＢ）、フォン・ヴィルブランド病（ｖＷＤ）、先天性筋強直症、遺伝性腎アミロイドーシス、拡張型心筋症、遺伝性リンパ浮腫、家族性アルツハイマー病、プリオン病、慢性乳児神経皮膚関節症候群（ＣＩＮＣＡ）、およびデスミン関連心筋症（ＤＲＭ）からなる群より選択される、前記組成物または前記細胞。
【請求項２７】
核酸塩基エディターが、配列番号３０３〜３１３または３９９〜４０６に記載の配列のいずれかと少なくとも９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
核酸塩基エディターが、配列番号３２３〜３４２、４５８〜４７８、または４８０に記載の配列のいずれかと少なくとも９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の組成物。