【手続補正書】
【提出日】令和2年4月17日(2020.4.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の発現強化座位内に統合された第一の外因性核酸と、第二の発現強化座位内に統合された第二の外因性核酸を備えた細胞であって、前記第一および第二の外因性核酸はともに抗原結合タンパク質をコードする、細胞。
【請求項２】
前記第一の外因性核酸が、第一の重鎖断片（ＨＣＦ）をコードするヌクレオチド配列を備え、前記第二の外因性核酸が、軽鎖断片（ＬＣＦ）をコードするヌクレオチド配列を備え、必要に応じて、前記抗原結合タンパク質が一特異性である、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記第二の外因性核酸が、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列をさらに備える、請求項２に記載の細胞。
【請求項４】
ａ）前記第一および第二のＨＣＦが異なり、その結果、前記抗原結合タンパク質が二特異性である；または
ｂ）前記第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第一のＣＨ３ドメインをコードし、前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第二のＣＨ３ドメインをコードし、必要に応じて、
ｉ）前記第一および第二のＣＨ３ドメインが、少なくとも１つのアミノ酸位置で異なっている；もしくは
ｉｉ）前記第一および第二のＣＨドメインをコードするヌクレオチド配列が、前記ヌクレオチド配列のうちの１つがコドン改変されているという点で互いに異なっている、
請求項３に記載の細胞。
【請求項５】
前記第一の外因性核酸が、第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列をさらに備え、その結果、前記第一および第二のＬＣＦが同一である、請求項３に記載の細胞。
【請求項６】
第一のリコンビナーゼ認識部位（ＲＲＳ）と第二のＲＲＳはそれぞれ、前記第一の外因性核酸に対して５’と３’に位置し、第三のＲＲＳと第四のＲＲＳはそれぞれ、前記第二の外因性核酸に対して５’と３’に位置しており、前記第一と第二のＲＲＳは異なっており、前記第三と第四のＲＲＳは異なっており、例えば、前記第一、第二、第三、および第四のＲＲＳが、互いに異なっている、請求項２に記載の細胞。
【請求項７】
第一の追加リコンビナーゼ認識部位（ＲＲＳ）が、前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列と前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列の間に存在し、前記追加ＲＲＳが、前記第一、第二、第三、および第四のＲＲＳの各々と異なっており、例えば、前記第一の追加ＲＲＳが、前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列と、前記第二のＨＣＦをコードする隣接ヌクレオチド配列の間に存在する選択マーカー遺伝子のイントロン内に含有される、請求項３に記載の細胞。
【請求項８】
第一のリコンビナーゼ認識部位（ＲＲＳ）と第二のＲＲＳはそれぞれ、前記第一の外因性核酸に対して５’と３’に位置し、第三のＲＲＳと第四のＲＲＳはそれぞれ、前記第二の外因性核酸に対して５’と３’に位置しており、前記第一と第二のＲＲＳは異なっており、前記第三と第四のＲＲＳは異なっており、必要に応じて、前記第一と第二のＨＣＦは、
ａ）同一であり、前記第一と第二のＬＣＦは同一であり、前記第一と第三のＲＲＳが同一であり、前記第二と第四のＲＲＳが同一である；または
ｂ）異なっており、前記第一と第二のＬＣＦは同一であり、前記第一、第二、第三および第四のＲＲＳが互いに異なり；
例えば、第一の追加ＲＲＳが、前記第二の外因性核酸中の前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列と前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列の間に存在し、前記第一の追加ＲＲＳは、前記第一、第二、第三、および第四のＲＲＳと異なっており、結果として
ａ）前記第一の追加ＲＲＳが、前記第二の外因性核酸中の前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列と、前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列の間に存在する第一の選択マーカー遺伝子のイントロン内に含有される；もしくは
ｂ）第二の追加ＲＲＳが、前記第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列と、前記第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列の間に存在し、この場合において前記第一および第二のＲＲＳが、同一または異なっており、各々、前記第一、第二、第三および第四のＲＲＳと異なっており、
必要に応じて、前記第一の追加ＲＲＳが、前記第二の外因性核酸中の前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列と、前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列の間に存在する第一の選択マーカー遺伝子のイントロン内に含有され、前記第二の追加ＲＲＳが、前記第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列と、前記第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列の間に存在する第二の選択マーカー遺伝子のイントロン内に含有され、前記第一および第二の選択マーカー遺伝子が異なっている、
請求項４に記載の細胞。
【請求項９】
第一の発現強化座位内に統合される、５’から３’の方向に、第一のリコンビナーゼ認識部位（ＲＲＳ）、第一の外因性核酸、および第二のＲＲＳ、
第二の発現強化座位内に統合される、５’から３’の方向に、第三のＲＲＳ、第二の外因性核酸、および第四のＲＲＳ、を備える細胞であって、
前記第一および第二のＲＲＳが異なっており、前記第三および第四のＲＲＳが異なっている、細胞。
【請求項１０】
前記第一の外因性核酸が、
ａ）第一の選択マーカー遺伝子を備え、前記第二の外因性核酸が、第二の選択マーカー遺伝子を備え、前記第一と第二の選択マーカー遺伝子が異なっている、例えば、前記第一の外因性核酸が、第一の追加ＲＲＳをさらに備え、前記第一の追加ＲＲＳが、第一および第二のＲＲＳとは異なっており、その結果、前記第二の外因性核酸が、第二の追加ＲＲＳをさらに備え、前記第二の追加ＲＲＳが、前記第三および第四のＲＲＳとは異なっており、必要に応じて、前記第二の外因性核酸が、第二の選択マーカー遺伝子、第二の追加ＲＲＳ、および第二の追加選択マーカー遺伝子を備え、前記第二の選択マーカー遺伝子および第二の追加選択マーカー遺伝子が互いに異なっており、ならびに前記第一の選択マーカー遺伝子および第一の追加選択マーカー遺伝子とも異なっており、前記第二の追加ＲＲＳが、前記第三および第四のＲＲＳとは異なっている；または
ｂ）第一の選択マーカー遺伝子、第一の追加ＲＳＳおよび第一の追加選択マーカー遺伝子を備え、前記第一および第一追加選択マーカー遺伝子が異なっており、前記第一追加ＲＳＳが、前記第一および第二ＲＳＳと異なっている、
請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
前記細胞が、ＣＨＯ細胞であり、必要に応じて、２つの発現強化座位のうちの１つは、配列番号１に対し少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列、配列番号２に対し少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列、および配列番号３に対し少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれかに記載の細胞。
【請求項１２】
細胞において二特異性抗原結合タンパク質を発現するベクターセットであって、
５’から３’の方向に、第一のリコンビナーゼ認識部位（ＲＲＳ）、第一の重鎖断片（ＨＣＦ）をコードするヌクレオチド配列を備えた第一の核酸、および第二のＲＲＳを備えた第一ベクター、
５’から３’の方向に、第三のＲＲＳ、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備えた第二の核酸、および第四のＲＲＳを備えた第二ベクター、
および前記第一ベクター中の前記第一の核酸内、または前記第一および第二ベクターとは異なる第三ベクター中のいずれかにある、第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列を備え、
この場合において前記第一、第二、第三、および第四のＲＲＳが異なっており、
ならびに前記二特異性抗原結合タンパク質が、前記第一のＨＣＦ、前記第二のＨＣＦ、および前記第一の軽鎖断片（ＬＣＦ）を備え、ならびに前記第一および第二のＨＣＦが異なっている、ベクターセット。
【請求項１３】
ａ）前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列が、前記第一ベクター中の前記第一の核酸内にある；
ｂ）前記第一の核酸が、第一の選択マーカー遺伝子をさらに備える；
ｃ）前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、前記第三ベクター中にあり、および５’ＲＲＳと３’ＲＲＳに隣接され、この場合において（ｉ）前記３’ＲＲＳは前記第一のＲＲＳと同じであり、前記５’ＲＲＳは前記第一のＲＲＳおよび第二のＲＲＳとは異なっているか、または（ｉｉ）前記５’ＲＲＳは前記第二のＲＲＳと同じであり、前記３’ＲＲＳは前記第一のＲＲＳおよび第二のＲＲＳとは異なっており、その結果、前記第一および第三ベクターの間の共通ＲＲＳは、前記第一および第三ベクターの内の１つの選択マーカー遺伝子の５’部分の３’末端に配置され、そして前記他方のベクターの選択マーカー遺伝子の残りの３’部分の５’末端に配置される；
ｄ）第二ベクター中の前記第二の核酸内、または前記第一、第二、および第三ベクターとは別の第四ベクター中のいずれかである、第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列をさらに備え、例えば、前記第一および第二のＬＣＦが同一であり、その結果、
ｉ）前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列が、前記第一ベクター中の前記第一の核酸内であり、前記第二のＶＬをコードするヌクレオチド配列が、前記第四ベクター上にあり、必要に応じて、前記第四ベクター上の前記第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、５’ＲＲＳと３’ＲＲＳに隣接され、この場合において（ｉ）前記３’ＲＲＳは、前記第三のＲＲＳと同一であり、前記５’ＲＲＳは、前記第三のＲＲＳおよび第四のＲＲＳとは異なっているか、もしくは（ｉｉ）前記５’ＲＲＳは前記第四のＲＲＳと同一であり、前記３’ＲＲＳは、前記第三のＲＲＳおよび第四のＲＲＳとは異なっている、例えば、前記第二および第四ベクターの間の前記共通ＲＲＳは、前記第二および第四ベクターの内の１つの選択マーカー遺伝子の５’部分の３’末端に配置され、そして前記他方のベクターの選択マーカー遺伝子の残りの３’部分の５’末端に配置される；
ｉｉ）前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列が、前記第一ベクター中の前記第一の核酸内であり、前記第二のＶＬをコードするヌクレオチド配列が、前記第二ベクター上の前記第二の核酸内である；もしくは
ｉｉｉ）前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列が、前記第三ベクター上にあり、前記第二のＶＬをコードするヌクレオチド配列が、前記第四ベクター上にある、例えば、前記第三ベクター上の第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、５’ＲＲＳおよび３’ＲＲＳに隣接され、この場合において（ｉ）前記第三ベクター上の前記３’ＲＲＳは、前記第一のＲＲＳと同一であり、前記第三ベクター上の前記５’ＲＲＳは、前記第一および第二のＲＲＳとは異なっているか、もしくは（ｉｉ）前記第三ベクター上の前記５’ＲＲＳは、前記第二のＲＲＳと同一であり、前記第三ベクター上の前記３’ＲＲＳは、前記第一および第二のＲＲＳとは異なっており、およびこの場合において前記第四ベクター上の前記第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、５’ＲＲＳおよび３’ＲＲＳに隣接され、この場合において（ｉ）前記第四ベクター上の前記３’ＲＲＳは、前記第三のＲＲＳと同一であり、前記第四ベクター上の前記５’ＲＲＳは、前記第三および第四のＲＲＳとは異なっているか、もしくは（ｉｉ）前記第四ベクター上の前記５’ＲＲＳは、前記第四のＲＲＳと同一であり、前記第四ベクター上の前記３’ＲＲＳは、前記第三および前記第四のＲＲＳとは異なっている；
ｅ）前記第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第一のＣＨ３ドメインをコードし、前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、前記第二のＣＨ３ドメインをコードする、例えば、
ｉ）前記第一および第二のＣＨ３ドメインが、少なくとも１つのアミノ酸で異なっている；もしくは
ｉｉ）前記第一および第二のＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列が、前記ヌクレオチド配列のうちの１つがコドン改変されているという点で異なっている；
ｆ）可変領域をコードするヌクレオチド配列の各々が、独立してプロモーターに連結されている；または
ｇ）前記第一および第二のＲＲＳ、ならびに／もしくは前記第三および第四のＲＲＳを認識するリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに備える、
請求項１２に記載のベクターセット。
【請求項１４】
細胞およびベクターセットを備えるシステムであって、
前記細胞が、
第一の発現強化座位内に統合される、５’から３’の方向に、第一のリコンビナーゼ認識部位（ＲＲＳ）、第一の外因性核酸、および第二のＲＲＳ、
第二の発現強化座位内に統合される、５’から３’の方向に、第三のＲＲＳ、第二の外因性核酸、および第四のＲＲＳ、を備え、
この場合において前記第一および第二のＲＲＳが異なっており、前記第三および第四のＲＲＳが異なっており、ならびにこの場合において前記第一および第二の発現強化座位が異なっており、
前記ベクターセットが、
５’から３’の方向に、第一ベクターの５’ＲＲＳ、第一の核酸、および第一ベクターの３’ＲＲＳを備えた第一ベクターであって、前記第一ベクターの５’ＲＲＳと３’ＲＲＳは異なっている、第一ベクター、
５’から３’の方向に、第二ベクターの５’ＲＲＳ、第二の核酸、および第二ベクターの３’ＲＲＳを備えた第二ベクターであって、前記第二ベクターの５’ＲＲＳと３’ＲＲＳは異なっている、第二ベクター、
第一の重鎖断片（ＨＣＦ）をコードするヌクレオチド配列と第一の軽鎖断片（ＬＣＦ）をコードするヌクレオチド配列であって、前記ヌクレオチド配列の内の１つは、前記第一の核酸中にあり、他方のヌクレオチド配列は前記第二の核酸中にあり、この場合において前記第一のＨＣＦと前記第一のＬＣＦは、抗原結合タンパク質の領域である、ヌクレオチド配列、を備え、
この場合において前記ベクターが前記細胞内に導入されると、前記ベクター中の前記第一および第二の核酸がそれぞれ、前記ＲＲＳにより介在される組み換えを介して前記第一の発現強化座位内と前記第二の発現強化座位内に統合する、システム。
【請求項１５】
前記抗原結合タンパク質が、一特異性抗原結合タンパク質であり、必要に応じて、
ａ）前記第一および第三のＲＲＳは同一であり、前記第二および第四のＲＲＳは同一であり、その結果、第一の追加ＲＲＳは、前記第一座位中の前記第一のＲＲＳおよび第二のＲＲＳの間に存在し、例えば前記第一ベクターの５’ＲＲＳは、前記第一のＲＲＳおよび第三のＲＲＳと同一であり、前記第一ベクターの３’ＲＲＳ、前記第二ベクターの５’ＲＲＳ、および前記第一の追加ＲＲＳは同一であり、ならびに前記第二ベクターの３’ＲＲＳは、前記第二および第四のＲＲＳと同一であり、必要に応じて、
ｉ）前記ＶＬをコードするヌクレオチド配列は、前記第一ベクター中にあり、前記ＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、前記第二ベクター中にある；もしくは
ｉｉ）前記第一ベクターの３’ＲＲＳは、選択マーカー遺伝子の５’部分の３’末端に配置され、前記第二ベクターの５’ＲＲＳは、前記選択マーカー遺伝子の残りの３’部分の５’末端に配置される；
ｂ）前記第一ベクターの５’ＲＲＳは、前記第一のＲＲＳと同一であり、前記第一ベクターの３’ＲＲＳは、前記第二のＲＲＳと同一であり、およびこの場合において前記第二ベクターの５’ＲＲＳは、前記第三のＲＲＳと同一であり、前記第二ベクターの３’ＲＲＳは、前記第四のＲＲＳと同一である；
ｃ）前記抗原結合タンパク質が、二特異性抗原結合タンパク質であり、必要に応じて、前記第一のＨＣＦとは異なる第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列をさらに備え、その結果、
ｉ）前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列と、前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は両方とも、前記第一ベクター中の前記第一核酸内に含まれ、および前記第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、前記第二ベクター中にあり、例えば、前記第一ベクターの５’ＲＲＳは、前記第一のＲＲＳと同一であり、前記第一ベクターの３’ＲＲＳは、前記第二のＲＲＳと同一であり、およびこの場合において前記第二ベクターの５’ＲＲＳは、前記第三のＲＲＳと同一であり、前記第二ベクターの３’ＲＲＳは、前記第四のＲＲＳと同一である；
ｉｉ）前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、別個の第三ベクター上にあり、第三ベクターの５’ＲＲＳと第三ベクターの３’ＲＲＳに隣接されており、例えば、前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、前記第一ベクター中にあり、前記第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、前記第二ベクター中にあり、前記第一ベクターの５’ＲＲＳは、前記第一のＲＲＳと同一であり、前記第一ベクターの３’ＲＲＳは、前記第二ベクターの５’ＲＲＳ、および第一の追加ＲＲＳと同一であり、前記第二ベクターの３’ＲＲＳは、前記第二のＲＲＳと同一であり、前記第三ベクターの５’ＲＲＳは、前記第三のＲＲＳと同一であり、前記第三ベクターの３’ＲＲＳは、前記第四のＲＲＳと同一であり、この場合において前記第一の追加ＲＲＳは、前記第一と第二のＲＲＳの間の前記第一の座位中に含まれ、その結果、前記第一ベクターの３’ＲＲＳは、前記第一ベクターに含まれる選択マーカー遺伝子の５’部分の３’末端に配置され、前記第二ベクターの５’ＲＲＳは、前記第二ベクターに含まれる前記残りの選択マーカー遺伝子の５’末端に配置される；もしくは
ｉｉｉ）第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列が、第一のＣＨ３ドメインをコードし、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列が、第二のＣＨ３ドメインをコードし、その結果、
ａ）前記第一および第二のＣＨ３ドメインが、少なくとも１つのアミノ酸で異なる；もしくは
ｂ）前記第一および第二のＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列が、そのヌクレオチド配列のうちの１つがコドン改変されているという点で、互いに異なる；
ｄ）前記第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列および前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列の各々は、プロモーターに動作可能に連結される；または
ｅ）前記細胞はＣＨＯ細胞であり、その結果、２つの発現強化座位は、配列番号１のヌクレオチド配列を含有する座位、および配列番号２のヌクレオチド配列を含有する座位を含む、
請求項１４に記載のシステム。
【請求項１６】
第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列をさらに備え、必要に応じて、前記第一および第二のＬＣＦが同一であり、その結果、前記第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列が、
ａ）前記第二ベクターの前記第二の核酸中にあり、この場合において前記第一ベクターの５’ＲＲＳは、前記第一のＲＲＳと同一であり、前記第一ベクターの３’ＲＲＳは、前記第二のＲＲＳと同一であり、前記第二ベクターの５’ＲＲＳは、前記第三のＲＲＳと同一であり、および前記第二ベクターの３’ＲＲＳは、前記第四のＲＲＳと同一である；または
ｂ）別個の第三ベクター中にあり、第三ベクターの５’ＲＲＳと第三ベクターの３’ＲＲＳに隣接され、必要に応じて、前記第一ベクターの５’ＲＲＳと３’ＲＲＳはそれぞれ、前記第一の座位中の前記第一のＲＲＳと第二のＲＲＳと同一であり；前記第三ベクターの５’ＲＲＳは、前記第三のＲＲＳと同一であり、前記第三ベクターの３’ＲＲＳは、前記第二ベクターの５’ＲＲＳ、および前記第二の座位中の前記第三のＲＲＳと第四のＲＲＳの間に存在する追加ＲＲＳと同一であり、前記第二ベクターの３’ＲＲＳは、前記第四のＲＲＳと同一であり、その結果、前記第三ベクターの３’ＲＲＳは、前記第三ベクター中に含まれる選択マーカー遺伝子の５’部分の３’末端に配置され、前記第二ベクターの５’ＲＲＳは、前記第二ベクター中に含まれる選択マーカー遺伝子の前記残りの３’部分の５’末端に配置される、
請求項１７の（ｃ）（ｉ）に記載のシステム。
【請求項１７】
（ｉ）請求項１４〜１６のいずれか１項に記載のシステムを提供すること、
（ｉｉ）前記細胞内に、前記ベクターを、トランスフェクションにより導入すること、および、
（ｉｉｉ）前記ベクター中の前記核酸が、前記ＲＲＳにより介在される組み換えを介して前記第一および第二の発現強化座位内に統合されている、トランスフェクト細胞を選択すること、を含む方法であって、必要に応じて、
（ｉｖ）前記選択されたトランスフェクト細胞から前記抗原結合タンパク質を発現および取得すること、
をさらに含む方法。
【請求項１８】
抗原結合タンパク質を作製する方法であって、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞を提供すること、ならびに前記細胞から前記抗原結合タンパク質を発現および取得すること、を含む、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
別の実施形態では、当該方法は、本明細書において上述される細胞を単純に利用するものであり、当該細胞は、２つの発現強化座位で統合された外因性核酸を含有し、それら外因性核酸は抗原結合タンパク質をコードし、当該細胞から当該抗原結合タンパク質を発現させる。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
第一の発現強化座位内に統合された第一の外因性核酸と、第二の発現強化座位内に統合された第二の外因性核酸を備えた細胞であって、前記第一および第二の外因性核酸はともに抗原結合タンパク質をコードする、細胞。
（項目２）
前記第一の外因性核酸が、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備え、前記第二の外因性核酸が、ＬＣＦをコードするヌクレオチド配列を備える、項目１に記載の細胞。
（項目３）
前記第二の外因性核酸が、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列をさらに備える、項目２に記載の細胞。
（項目４）
前記第一および第二のＨＣＦが異なっている、項目３に記載の細胞。
（項目５）
前記第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第一のＣＨ３ドメインをコードし、前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第二のＣＨ３ドメインをコードする、項目３に記載の細胞。
（項目６）
前記第一および第二のＣＨ３ドメインが、少なくとも１つのアミノ酸位置で異なっている、項目５に記載の細胞。
（項目７）
前記第一および第二のＣＨドメインをコードするヌクレオチド配列が、前記ヌクレオチド配列のうちの１つがコドン改変されているという点で互いに異なっている、項目５に記載の細胞。
（項目８）
前記第一の外因性核酸が、第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列をさらに備える、項目３に記載の細胞。
（項目９）
前記第一および第二のＬＣＦが同一である、項目８に記載の細胞。
（項目１０）
ＨＣＦまたはＬＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列の各々が、プロモーターに動作可能に連結されている、項目２、３、８のいずれかに記載の細胞。
（項目１１）
第一のＲＲＳと第二のＲＲＳはそれぞれ、前記第一の外因性核酸に対して５’と３’に位置し、第三のＲＲＳと第四のＲＲＳはそれぞれ、前記第二の外因性核酸に対して５’と３’に位置しており、前記第一と第二のＲＲＳは異なっており、前記第三と第四のＲＲＳは異なっている、項目２に記載の細胞。
（項目１２）
前記第一、第二、第三、および第四のＲＲＳが、互いに異なっている、項目１１に記載の細胞。
（項目１３）
第一の追加ＲＲＳが、前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列と前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列の間に存在し、前記追加ＲＲＳが、前記第一、第二、第三、および第四のＲＲＳの各々と異なっている、項目３に記載の細胞。
（項目１４）
前記第一の追加ＲＲＳが、前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列と、前記第二のＨＣＦをコードする隣接ヌクレオチド配列の間に存在する選択マーカー遺伝子のイントロン内に含有される、項目１３に記載の細胞。
（項目１５）
第一のＲＲＳと第二のＲＲＳはそれぞれ、前記第一の外因性核酸に対して５’と３’に位置し、第三のＲＲＳと第四のＲＲＳはそれぞれ、前記第二の外因性核酸に対して５’と３’に位置しており、前記第一と第二のＲＲＳは異なっており、前記第三と第四のＲＲＳは異なっている、項目８に記載の細胞。
（項目１６）
前記第一と第二のＨＣＦは同一であり、前記第一と第二のＬＣＦは同一であり、前記第一と第三のＲＲＳが同一であり、前記第二と第四のＲＲＳが同一である、項目１５に記載の細胞。
（項目１７）
前記第一と第二のＨＣＦは異なっており、前記第一と第二のＬＣＦは同一であり、前記第一、第二、第三および第四のＲＲＳが互いに異なる、項目１５に記載の細胞。
（項目１８）
第一の追加ＲＲＳが、前記第二の外因性核酸中の前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列と前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列の間に存在し、前記第一の追加ＲＲＳは、前記第一、第二、第三、および第四のＲＲＳと異なっている、項目１６または１７に記載の細胞。
（項目１９）
前記第一の追加ＲＲＳが、前記第二の外因性核酸中の前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列と、前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列の間に存在する第一の選択マーカー遺伝子のイントロン内に含有される、項目１８に記載の細胞。
（項目２０）
第二の追加ＲＲＳが、前記第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列と、前記第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列の間に存在し、この場合において前記第一および第二のＲＲＳが、同一または異なっており、各々、前記第一、第二、第三および第四のＲＲＳと異なっている、項目１８に記載の細胞。
（項目２１）
前記第一の追加ＲＲＳが、前記第二の外因性核酸中の前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列と、前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列の間に存在する第一の選択マーカー遺伝子のイントロン内に含有され、前記第二の追加ＲＲＳが、前記第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列と、前記第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列の間に存在する第二の選択マーカー遺伝子のイントロン内に含有され、前記第一および第二の選択マーカー遺伝子が異なっている、項目２０に記載の細胞。
（項目２２）
前記抗原結合タンパク質が、一特異性である、項目２に記載の細胞。
（項目２３）
前記抗原結合タンパク質が、二特異性である、項目４に記載の細胞。
（項目２４）
第一の発現強化座位内に統合される、５’から３’の方向に、第一のＲＲＳ、第一の外因性核酸、および第二のＲＲＳ、
第二の発現強化座位内に統合される、５’から３’の方向に、第三のＲＲＳ、第二の外因性核酸、および第四のＲＲＳ、を備える細胞であって、
前記第一および第二のＲＲＳが異なっており、前記第三および第四のＲＲＳが異なっている、細胞。
（項目２５）
前記第一の外因性核酸が、第一の選択マーカー遺伝子を備え、前記第二の外因性核酸が、第二の選択マーカー遺伝子を備え、前記第一と第二の選択マーカー遺伝子が異なっている、項目２４に記載の細胞。
（項目２６）
前記第一の外因性核酸が、第一の追加ＲＲＳをさらに備え、前記第一の追加ＲＲＳが、第一および第二のＲＲＳとは異なっている、項目２５に記載の細胞。
（項目２７）
前記第二の外因性核酸が、第二の追加ＲＲＳをさらに備え、前記第二の追加ＲＲＳが、前記第三および第四のＲＲＳとは異なっている、項目２６に記載の細胞。
（項目２８）
前記第一の外因性核酸が、第一の選択マーカー遺伝子、第一の追加ＲＲＳ、および第一の追加選択マーカー遺伝子を備え、前記第一の選択マーカー遺伝子および第一の追加選択マーカー遺伝子が異なっており、前記第一の追加ＲＲＳが、前記第一のＲＲＳおよび第二のＲＲＳとは異なっている、項目２４に記載の細胞。
（項目２９）
前記第二の外因性核酸が、第二の選択マーカー遺伝子、第二の追加ＲＲＳ、および第二の追加選択マーカー遺伝子を備え、前記第二の選択マーカー遺伝子および第二の追加選択マーカー遺伝子が互いに異なっており、ならびに前記第一の選択マーカー遺伝子および第一の追加選択マーカー遺伝子とも異なっており、前記第二の追加ＲＲＳが、前記第三および第四のＲＲＳとは異なっている、項目２７に記載の細胞。
（項目３０）
前記細胞が、ＣＨＯ細胞である、項目１〜２９のいずれかに記載の細胞。
（項目３１）
２つの発現強化座位のうちの１つは、配列番号１に対し少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列、配列番号２に対し少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列、および配列番号３に対し少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列からなる群から選択される、項目３０に記載の細胞。
（項目３２）
細胞において二特異性抗原結合タンパク質を発現するベクターセットであって、
５’から３’の方向に、第一のＲＲＳ、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備えた第一の核酸、および第二のＲＲＳを備えた第一ベクター、
５’から３’の方向に、第三のＲＲＳ、第二のＨＣをコードするヌクレオチド配列を備えた第二の核酸、および第四のＲＲＳを備えた第二ベクター、
および前記第一ベクター中の前記第一の核酸内、または前記第一および第二ベクターとは異なる第三ベクター中のいずれかにある、第一のＬＣをコードするヌクレオチド配列を備え、
この場合において前記第一、第二、第三、および第四のＲＲＳが異なっており、
ならびに前記二特異性抗原結合タンパク質が、前記第一のＨＣＦ、前記第二のＨＣＦ、および前記第一のＬＣＦを備え、ならびに前記第一および第二のＨＣＦが異なっている、ベクターセット。
（項目３３）
前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列が、前記第一ベクター中の前記第一の核酸内にある、項目３２に記載のベクターセット。
（項目３４）
前記第一の核酸が、第一の選択マーカー遺伝子をさらに備える、項目３４に記載のベクターセット。
（項目３５）
前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、前記第三ベクター中にあり、および５’ＲＲＳと３’ＲＲＳに隣接され、この場合において（ｉ）前記３’ＲＲＳは前記第一のＲＲＳと同じであり、前記５’ＲＲＳは前記第一のＲＲＳおよび第二のＲＲＳとは異なっているか、または（ｉｉ）前記５’ＲＲＳは前記第二のＲＲＳと同じであり、前記３’ＲＲＳは前記第一のＲＲＳおよび第二のＲＲＳとは異なっている、項目３２に記載のベクターセット。
（項目３６）
前記第一および第三ベクターの間の共通ＲＲＳは、前記第一および第三ベクターの内の１つの選択マーカー遺伝子の５’部分の３’末端に配置され、そして前記他方のベクターの選択マーカー遺伝子の残りの３’部分の５’末端に配置される、項目３５に記載のベクターセット。
（項目３７）
第二ベクター中の前記第二の核酸内、または前記第一、第二、および第三ベクターとは別の第四ベクター中のいずれかである、第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列をさらに備える、項目３２に記載のベクターセット。
（項目３８）
前記第一および第二のＬＣＦが同一である、項目３７に記載のベクターセット。
（項目３９）
前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列が、前記第一ベクター中の前記第一の核酸内であり、前記第二のＶＬをコードするヌクレオチド配列が、前記第四ベクター上にある、項目３８に記載のベクターセット。
（項目４０）
前記第四ベクター上の前記第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、５’ＲＲＳと３’ＲＲＳに隣接され、この場合において（ｉ）前記３’ＲＲＳは、前記第三のＲＲＳと同一であり、前記５’ＲＲＳは、前記第三のＲＲＳおよび第四のＲＲＳとは異なっているか、または（ｉｉ）前記５’ＲＲＳは前記第四のＲＲＳと同一であり、前記３’ＲＲＳは、前記第三のＲＲＳおよび第四のＲＲＳとは異なっている、項目３９に記載のベクターセット。
（項目４１）
前記第二および第四ベクターの間の前記共通ＲＲＳは、前記第二および第四ベクターの内の１つの選択マーカー遺伝子の５’部分の３’末端に配置され、そして前記他方のベクターの選択マーカー遺伝子の残りの３’部分の５’末端に配置される、項目４０に記載のベクターセット。
（項目４２）
前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列が、前記第一ベクター中の前記第一の核酸内であり、前記第二のＶＬをコードするヌクレオチド配列が、前記第二ベクター上の前記第二の核酸内である、項目３８に記載のベクターセット。
（項目４３）
前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列が、前記第三ベクター上にあり、前記第二のＶＬをコードするヌクレオチド配列が、前記第四ベクター上にある、項目３８に記載のベクターセット。
（項目４４）
前記第三ベクター上の第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、５’ＲＲＳおよび３’ＲＲＳに隣接され、この場合において（ｉ）前記第三ベクター上の前記３’ＲＲＳは、前記第一のＲＲＳと同一であり、前記第三ベクター上の前記５’ＲＲＳは、前記第一および第二のＲＲＳとは異なっているか、または（ｉｉ）前記第三ベクター上の前記５’ＲＲＳは、前記第二のＲＲＳと同一であり、前記第三ベクター上の前記３’ＲＲＳは、前記第一および第二のＲＲＳとは異なっており、およびこの場合において前記第四ベクター上の前記第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、５’ＲＲＳおよび３’ＲＲＳに隣接され、この場合において（ｉ）前記第四ベクター上の前記３’ＲＲＳは、前記第三のＲＲＳと同一であり、前記第四ベクター上の前記５’ＲＲＳは、前記第三および第四のＲＲＳとは異なっているか、または（ｉｉ）前記第四ベクター上の前記５’ＲＲＳは、前記第四のＲＲＳと同一であり、前記第四ベクター上の前記３’ＲＲＳは、前記第三および前記第四のＲＲＳとは異なっている、項目４３に記載のベクターセット。
（項目４５）
前記第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第一のＣＨ３ドメインをコードし、前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、前記第二のＣＨ３ドメインをコードする、項目３２に記載のベクターセット。
（項目４６）
前記第一および第二のＣＨ３ドメインが、少なくとも１つのアミノ酸で異なっている、項目４５に記載のベクターセット。
（項目４７）
前記第一および第二のＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列が、前記ヌクレオチド配列のうちの１つがコドン改変されているという点で異なっている、項目４５に記載のベクターセット。
（項目４８）
可変領域をコードするヌクレオチド配列の各々が、独立してプロモーターに連結されている、項目３２に記載のベクターセット。
（項目４９）
前記第一および第二のＲＲＳ、ならびに／または前記第三および第四のＲＲＳを認識するリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに備える、項目３２に記載のベクターセット。
（項目５０）
細胞の第一の発現強化座位内への統合のための５’相同アームと３’相同アームに隣接される、第一の核酸を備える第一ベクター、および
前記細胞の第二の発現強化座位内への統合のための５’相同アームと３’相同アームに隣接される、第二の核酸を備える第二ベクター、を備えるベクターセットであって、
前記第一および第二の核酸がともに抗原結合タンパク質をコードする、ベクターセット。
（項目５１）
細胞およびベクターセットを備えるシステムであって、
前記細胞が、
第一の発現強化座位内に統合される、５’から３’の方向に、第一のＲＲＳ、第一の外因性核酸、および第二のＲＲＳ、
第二の発現強化座位内に統合される、５’から３’の方向に、第三のＲＲＳ、第二の外因性核酸、および第四のＲＲＳ、を備え、
この場合において前記第一および第二のＲＲＳが異なっており、前記第三および第四のＲＲＳが異なっており、ならびにこの場合において前記第一および第二の発現強化座位が異なっており、
前記ベクターセットが、
５’から３’の方向に、第一ベクターの５’ＲＲＳ、第一の核酸、および第一ベクターの３’ＲＲＳを備えた第一ベクターであって、前記第一ベクターの５’ＲＲＳと３’ＲＲＳは異なっている、第一ベクター、
５’から３’の方向に、第二ベクターの５’ＲＲＳ、第二の核酸、および第二ベクターの３’ＲＲＳを備えた第二ベクターであって、前記第二ベクターの５’ＲＲＳと３’ＲＲＳは異なっている、第二ベクター、
第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列と第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列であって、前記ヌクレオチド配列の内の１つは、前記第一の核酸中にあり、他方のヌクレオチド配列は前記第二の核酸中にあり、この場合において前記第一のＨＣＦと前記第一のＬＣＦは、抗原結合タンパク質の領域である、ヌクレオチド配列、を備え、
この場合において前記ベクターが前記細胞内に導入されると、前記ベクター中の前記第一および第二の核酸がそれぞれ、前記ＲＲＳにより介在される組み換えを介して前記第一の発現強化座位内と前記第二の発現強化座位内に統合する、システム。
（項目５２）
前記抗原結合タンパク質が、一特異性抗原結合タンパク質である、項目５１に記載のシステム。
（項目５３）
前記第一および第三のＲＲＳは同一であり、前記第二および第四のＲＲＳは同一である、項目５２に記載のシステム。
（項目５４）
第一の追加ＲＲＳは、前記第一座位中の前記第一のＲＲＳおよび第二のＲＲＳの間に存在する、項目５３に記載のシステム。
（項目５５）
前記第一ベクターの５’ＲＲＳは、前記第一のＲＲＳおよび第三のＲＲＳと同一であり、前記第一ベクターの３’ＲＲＳ、前記第二ベクターの５’ＲＲＳ、および前記第一の追加ＲＲＳは同一であり、ならびに前記第二ベクターの３’ＲＲＳは、前記第二および第四のＲＲＳと同一である、項目５４に記載のシステム。
（項目５６）
前記ＶＬをコードするヌクレオチド配列は、前記第一ベクター中にあり、前記ＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、前記第二ベクター中にある、項目５５に記載のシステム。
（項目５７）
前記第一ベクターの３’ＲＲＳは、選択マーカー遺伝子の５’部分の３’末端に配置され、前記第二ベクターの５’ＲＲＳは、前記選択マーカー遺伝子の残りの３’部分の５’末端に配置される、項目５５に記載のシステム。
（項目５８）
前記第一ベクターの５’ＲＲＳは、前記第一のＲＲＳと同一であり、前記第一ベクターの３’ＲＲＳは、前記第二のＲＲＳと同一であり、およびこの場合において前記第二ベクターの５’ＲＲＳは、前記第三のＲＲＳと同一であり、前記第二ベクターの３’ＲＲＳは、前記第四のＲＲＳと同一である、項目５２に記載のシステム。
（項目５９）
前記抗原結合タンパク質が、二特異性抗原結合タンパク質である、項目５２に記載のシステム。
（項目６０）
前記第一のＨＣＦとは異なる第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列をさらに備える、項目５９に記載のシステム。
（項目６１）
前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列と、前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は両方とも、前記第一ベクター中の前記第一核酸内に含まれ、および前記第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、前記第二ベクター中にある、項目６０に記載のシステム。
（項目６２）
前記第一ベクターの５’ＲＲＳは、前記第一のＲＲＳと同一であり、前記第一ベクターの３’ＲＲＳは、前記第二のＲＲＳと同一であり、およびこの場合において前記第二ベクターの５’ＲＲＳは、前記第三のＲＲＳと同一であり、前記第二ベクターの３’ＲＲＳは、前記第四のＲＲＳと同一である、項目６１に記載のシステム。
（項目６３）
前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、別個の第三ベクター上にあり、第三ベクターの５’ＲＲＳと第三ベクターの３’ＲＲＳに隣接されている、項目６０に記載のシステム。
（項目６４）
前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、前記第一ベクター中にあり、前記第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、前記第二ベクター中にあり、前記第一ベクターの５’ＲＲＳは、前記第一のＲＲＳと同一であり、前記第一ベクターの３’ＲＲＳは、前記第二ベクターの５’ＲＲＳ、および第一の追加ＲＲＳと同一であり、前記第二ベクターの３’ＲＲＳは、前記第二のＲＲＳと同一であり、前記第三ベクターの５’ＲＲＳは、前記第三のＲＲＳと同一であり、前記第三ベクターの３’ＲＲＳは、前記第四のＲＲＳと同一であり、この場合において前記第一の追加ＲＲＳは、前記第一と第二のＲＲＳの間の前記第一の座位中に含まれる、項目６３に記載のシステム。
（項目６５）
前記第一ベクターの３’ＲＲＳは、前記第一ベクターに含まれる選択マーカー遺伝子の５’部分の３’末端に配置され、前記第二ベクターの５’ＲＲＳは、前記第二ベクターに含まれる前記残りの選択マーカー遺伝子の５’末端に配置される、項目６４に記載のシステム。
（項目６６）
第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列をさらに備える、項目６１に記載のシステム。
（項目６７）
前記第一および第二のＬＣＦが同一である、項目６６に記載のシステム。
（項目６８）
前記第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、前記第二ベクターの前記第二の核酸中にあり、この場合において前記第一ベクターの５’ＲＲＳは、前記第一のＲＲＳと同一であり、前記第一ベクターの３’ＲＲＳは、前記第二のＲＲＳと同一であり、前記第二ベクターの５’ＲＲＳは、前記第三のＲＲＳと同一であり、および前記第二ベクターの３’ＲＲＳは、前記第四のＲＲＳと同一である、項目６７に記載のシステム。
（項目６９）
前記第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、別個の第三ベクター中にあり、第三ベクターの５’ＲＲＳと第三ベクターの３’ＲＲＳに隣接されている、項目６７に記載のシステム。
（項目７０）
前記第一ベクターの５’ＲＲＳと３’ＲＲＳはそれぞれ、前記第一の座位中の前記第一のＲＲＳと第二のＲＲＳと同一であり、前記第三ベクターの５’ＲＲＳは、前記第三のＲＲＳと同一であり、前記第三ベクターの３’ＲＲＳは、前記第二ベクターの５’ＲＲＳ、および前記第二の座位中の前記第三のＲＲＳと第四のＲＲＳの間に存在する追加ＲＲＳと同一であり、前記第二ベクターの３’ＲＲＳは、前記第四のＲＲＳと同一である、項目６９に記載のシステム。
（項目７１）
前記第三ベクターの３’ＲＲＳは、前記第三ベクター中に含まれる選択マーカー遺伝子の５’部分の３’末端に配置され、前記第二ベクターの５’ＲＲＳは、前記第二ベクター中に含まれる選択マーカー遺伝子の前記残りの３’部分の５’末端に配置される、項目７０に記載のシステム。
（項目７２）
前記第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第一のＣＨ３ドメインをコードし、前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第二のＣＨ３ドメインをコードする、項目６０に記載のシステム。
（項目７３）
前記第一および第二のＣＨ３ドメインが、少なくとも１つのアミノ酸で異なっている、項目７２に記載のシステム。
（項目７４）
前記第一および第二のＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列が、前記ヌクレオチド配列のうちの１つがコドン改変されているという点で異なっている、項目７２に記載のシステム。
（項目７５）
前記第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列と、前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列が各々プロモーターに動作可能に連結されている、項目５１に記載のシステム。
（項目７６）
前記細胞が、ＣＨＯ細胞である、項目５１に記載のシステム。
（項目７７）
前記２つの発現強化座位が、配列番号１のヌクレオチド配列を備える座位と、配列番号２のヌクレオチド配列を備える座位を含む、項目７６に記載のシステム。
（項目７８）
（ｉ）項目５１〜７７のいずれか１項に記載のシステムを提供すること、
（ｉｉ）前記細胞内に、前記ベクターを、トランスフェクションにより導入すること、および、
（ｉｉｉ）前記ベクター中の前記核酸が、前記ＲＲＳにより介在される組み換えを介して前記第一および第二の発現強化座位内に統合されている、トランスフェクト細胞を選択すること、を含む方法。
（項目７９）
（ｉｖ）前記選択されたトランスフェクト細胞から前記抗原結合タンパク質を発現および取得すること、をさらに含む、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
抗原結合タンパク質を作製する方法であって、項目１〜２３のいずれか１項に記載の細胞を提供すること、ならびに前記細胞から前記抗原結合タンパク質を発現および取得すること、を含む、方法。