(57)【要約】  本発明は、光学イメージング造影剤を含んでなる、腫瘍周囲の腫瘍マージンのインビボ光学イメージング方法に関する。光学イメージング造影剤は、近赤外色素と、１５〜４５ｋＤａの範囲内の分子量を有する合成ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーとのコンジュゲートを含んでいる。また、光学イメージング造影剤、医薬組成物及びキットも開示される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上の腫瘍を有することが知られている生きた被験体において腫瘍の腫瘍マージンのインビボ光学イメージングを行う方法であって、
（ｉ）分子量１５〜４５ｋＤａの合成ポリエチレングリコールポリマーと１つ又は２つのＯｐｔR基とのコンジュゲートを含む、インビボイメージングのためにに適した光学イメージング造影剤を用意する段階、及び
（ｉｉ）前記腫瘍を含む前記被験体の検査対象領域であって、前記造影剤を投与した検査対象領域の光学画像を生成する段階
を含んでなり、各ＯｐｔRは独立に波長６００〜８５０ｎｍの光を用いる光学イメージング操作で直接又は間接に検出できる生体適合性光学レポーター基である、方法。
【請求項２】
ポリマーがＯｐｔR基のみにコンジュゲートされている、請求項１記載の方法。
【請求項３】
コンジュゲートが次の式Ｉを有する、請求項１又は請求項２記載の方法。
Ｙ1−Ｘa−［ＰＯＬＹＭＥＲ］−Ｘb−Ｙ2
（Ｉ）
（式中、
［ＰＯＬＹＭＥＲ］は合成ポリエチレングリコールポリマーであり、
Ｘa及びＸbは前記ポリエチレングリコールポリマーの末端に結合していて、独立に化学結合又はＬ基であり、Ｌは式−（Ａ）m−（式中、各Ａは独立に−ＣＲ2−、−ＣＲ＝ＣＲ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＲ2ＣＯ2−、−ＣＯ2ＣＲ2−、−ＮＲＣＯ−、−ＣＯＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ−、−ＳＯ2ＮＲ−、−ＮＲＳＯ2−、−ＣＲ2ＯＣＲ2−、−ＣＲ2ＳＣＲ2−、−ＣＲ2ＮＲＣＲ2−、Ｃ4-8シクロへテロアルキレン基、Ｃ4-8シクロアルキレン基、Ｃ5-12アリーレン基又はＣ3-12へテロアリーレン基、アミノ酸或いは糖であり、各Ｒは独立にＨ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ2-4アルケニル、Ｃ2-4アルキニル、Ｃ1-4アルコキシアルキル及びＣ1-4ヒドロキシアルキルから選択され、ｍは１〜２０の値を有する整数である。）のリンカー基であり、
Ｙ1及びＹ2は独立にＯｐｔR（ここで、ＯｐｔRは請求項１で定義した通りである。）であるか、或いは−ＯＨ、−Ｏ（Ｃ1-10アルキル）、−ＮＨ2及び−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ1-10アルキル）から選択される官能基であり、
Ｙ1及びＹ2の少なくとも一方はＯｐｔRであることを条件とする。）
【請求項４】
Ｙ1及びＹ2の各々がＯｐｔRである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
Ｙ1及びＹ2のＯｐｔR基の各々が同一の生体適合性光学レポーターを含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
生体適合性光学レポーターがシアニン色素である、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
生体適合性光学レポーター基がベンゾピリリウム色素である、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
ポリエチレングリコールポリマーが２２〜４０ｋＤａの分子量を有する、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
ポリエチレングリコールポリマーが線状ポリマーである、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
造影剤が、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載のコンジュゲートを生体適合性キャリヤーと共に含む医薬組成物からなる、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の方法であって、
（ｉ）請求項１記載の生きた被験体内の検査対象領域を含む組織表面を励起光で照明する段階、
（ｉｉ）ＯｐｔRの励起によって造影剤から発生する蛍光を、蛍光検出器を用いて検出する段階、
（ｉｉｉ）蛍光検出器によって検出された光を任意に濾光して蛍光成分を分離する段階、及び
（ｉｖ）段階（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の蛍光から前記組織表面の画像を形成する段階
を含んでなる方法。
【請求項１２】
段階（ｉ）の励起光が連続波（ＣＷ）の性質を有する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の方法であって、
（ａ）前記生きた被験体の検査対象領域をなす、不均質組成を有する光散乱性生体組織を、所定の経時変動強度を有する光源からの光に暴露して造影剤を励起する段階であって、組織が励起光を多重散乱させる段階、
（ｂ）前記暴露に応答した組織からの多重散乱発光を検出する段階、
（ｃ）組織内の様々な位置における蛍光特性のレベルにそれぞれ対応する複数の値をプロセッサーで確定することにより、発光から組織全体の蛍光特性を定量化する段階であって、蛍光特性のレベルが組織の不均質組成に応じて変化する段階、及び
（ｄ）段階（ｃ）の値に従って組織の不均質組成のマッピングを行うことで組織の画像を生成する段階
を含んでなる方法。
【請求項１４】
前記被験体からの腫瘍の切除に際して外科医を支援するため、光学イメージングが手術中に実施される、請求項１乃至請求項１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
哺乳動物体のインビボ光学イメージングのために適した造影剤であって、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載のコンジュゲートを含んでなる造影剤。
【請求項１６】
請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載のコンジュゲートを生体適合性キャリヤーと共に含んでなる医薬組成物。
【請求項１７】
１人の患者用に適した用量を有し、適当な注射器又は容器に入れて提供される、請求項１６記載の医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１６又は請求項１７記載の医薬組成物を製造するためのキットであって、当該キットは請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載のコンジュゲートを無菌固体形態で含んでいて、生体適合性キャリヤーの無菌供給物で再構成すれば溶解が起こって所望の医薬組成物を与える、キット。
【請求項１９】
無菌固体形態が凍結乾燥固体である、請求項１８記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学イメージング造影剤を含んでなる、腫瘍周囲の腫瘍マージンのインビボ光学イメージング方法に関する。光学イメージング造影剤は、近赤外色素と、１５〜４５ｋＤａの範囲内の分子量を有する合成ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーとのコンジュゲートを含んでいる。また、光学イメージング造影剤、医薬組成物及びキットも開示される。
【背景技術】
【０００２】
化学知識の大きな進歩及び各種の治療モダリティーの開発にもかかわらず、外科手術は今なお、初期段階の固形腫瘍に対して最も頻繁に使用されている唯一の最も有効な治療法である。腫瘍を物理的に除去することは、症状を低減させ、癌の拡散の可能性を低下させ、体内の癌の量を減少させ、他の治療法を一層有効にするために役立つ。６０〜７０％の癌患者が、単独で（すべての癌の４０％が外科手術のみで処置されている）又は他の療法（通常は放射線療法又は化学療法）との組合せで外科手術を受けている。すべての癌患者の９０％以上において、外科手術は疾患の経過中に合併症の診断、ステージング、治療及び管理のために使用されている。しかし、外科手術は最も古くかつ最も普通の形態の癌療法であるものの、多くの点でそれは最も標準化されていない介入でもあり、罹患臓器の追跡並びに正常組織と癌組織との識別を助けるための新しいツールが必要である。
【０００３】
外科医は従来から、腫瘍の位置を確認するため、視覚及び触覚（視診及び触診）並びに何らかの手術前診断イメージング情報に頼っている。しかし、癌組織は正常組織から識別するのが難しいことが多く、或いは（例えば、潜在腫瘍のように）小さすぎて検出できない。したがって、従来の外科的技法はすべての癌組織が発見又は除去されたことを保証せず、非常に高い分解能及び感度をもって癌組織（特に腫瘍マージン）を特異的に同定できる薬剤に対するニーズが存在している。
【０００４】
Ｗｏｈｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ［Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｓｙｍｐ．，５９，１７−３３（１９９２）］は、癌の光力学療法のためにインビボで標的組織中への取込みを向上させる可能な方法として、ポルフィリン光増感剤に対するポリマーコンジュゲーションを研究した。研究したポリマーはラット血清アルブミン、合成ポリエーテル及びポリアルコールであった。Ｗｏｈｒｌｅ  ｅｔ  ａｌは、ポリマーキャリヤーのコンジュゲーションが腫瘍取込みを向上させ得ると結論づけた。
【０００５】
米国特許第５６２２６８５号には、ポルフィリン、フタロシアニン又はナフタロシアニンを含むポリエーテル置換抗腫瘍剤がインビボでの腫瘍診断及び治療の両方にとって向上した性質を示すことが開示されている。ポリエーテル置換基は、その末端ヒドロキシル基がそれぞれＣ1-12アルキル基又はＣ1-12アシル基でエーテル化又はエステル化されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなっている。米国特許第５６２２６８５号は、コンジュゲートの総分子量が好ましくは１００００Ｄａ（１０ｋＤａ）以上であることを（縦欄２に）教示している。
【０００６】
米国特許第６０８３４８５号及びその対応特許は、２．０以下のオクタノール−水分配係数を有するシアニン色素を用いるインビボ近赤外（ＮＩＲ）光学イメージング方法が開示されている。また、前記色素と、特定の細胞集団に結合し、或いはレセプターと選択的に結合し、或いは組織又は腫瘍中に集積する３０ｋＤａまでの分子量の「生物学的検出単位」とのコンジュゲートも開示されている。米国特許第６０８３４８５号の色素は、ポリリシン、デキストラン、カルボキシデキストラン、ポリエチレングリコール、メトキシポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール又はカスケードポリマー様構造のような一定範囲の「非選択的結合性」巨大分子にコンジュゲートすることもできる。コンジュゲートの分子量は、１００Ｄａから１０００００Ｄａ以上まで（０．１ｋＤａから１００ｋＤａ以上まで）の範囲内にあると教示されている。特定の色素−巨大分子コンジュゲートは開示されていない。
【０００７】
米国特許第６３５０４３１号（Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ＡＳ）には、５００〜５０００００Ｄａの範囲内の分子量を有する光イメージング造影剤であって、２以上の発色団（即ち、色素分子）が結合した分子量６０〜１０００００Ｄａのポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）を含む造影剤が開示されている。ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）部分は、好ましくは２００〜１０００００Ｄａ、さらに好ましくは２５０〜５００００Ｄａ、特に好ましくは２５０〜２５０００Ｄａ、最も好ましくは４００〜１５０００Ｄａの分子量範囲を有すると教示されている。米国特許第６３５０４３１号の造影剤は、さらに標的化ベクターを含み得る。米国特許第６３５０４３１号の実施例は、下記のＰＡＯポリマーを使用している。
（ｉ）分子量３４００ＤａのＰＥＧ−ジアミン：実施例１、２、６、１６、１８及び２５。
（ｉｉ）分子量５０００ＤａのＰＥＧ−ジアミン：実施例３、４及び２０。
（ｉｉｉ）分子量１００００ＤａのＰＥＧ−ジアミン：実施例７、１５、１７及び２６。
（ｉｖ）分子量３４００ＤａのＰＥＧ−ジチオール：実施例１２。
（ｖ）分子量１００００ＤａのＰＥＧ−ジチオール：実施例１３。
（ｖｉ）平均分子量約１４６００のポリ（オキシエチレン−ｃｏ−オキシプロピレン−ｃｏ−オキシエチレン）ブロックコポリマー：実施例２７。
このように、米国特許第６３５０４３１号の実施例はすべて、３．４〜１４．６ｋＤａの分子量範囲内にある。ＰＥＧポリマーのみに関しては、例示された分子量範囲は３．４〜１０ｋＤａである。
【０００８】
Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ［Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５，３７５２−３７５６（１９９５）］は、色素標識巨大分子に対するヒト腫瘍細胞の血管透過性を研究し、腫瘍血管は一般に正常細胞より高い漏出性及び低い透過選択性を有すると結論づけた。腫瘍細胞の透過性は、２５〜１６０ｋＤａの巨大分子分子量範囲内で２倍変化すると報告された。
【０００９】
Ｄｅｌｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ［Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８２（９），１５１３−１５１８（２０００）］は、ヒト腫瘍細胞の血管透過性に対する分子電荷の効果を研究した。彼等は、正に帯電した分子は同様な分子量の中性化合物又は負に帯電した化合物に比べて固形分腫瘍中により速く溢出すると結論づけた。
【００１０】
Ｌｉｃｈａ  ｅｔ  ａｌ［ＳＰＩＥ  Ｖｏｌ  ３１９６  ｐ．９８−１０２（１９９８）］は、メトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）に基づくポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）ポリマーを含むインビボ蛍光イメージング用造影剤を開示している。したがって、コンジュゲートはＰＥＧポリマーの一端にコンジュゲートしたヘプタメチンシアニン色素を有し、他端にメチル基を有している。
【００１１】
【化１】
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【００１２】
【表１】
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Ｌｉｃｈａはまた、２つのＭＰＥＧ鎖がただ１つのシアニン色素にコンジュゲートした色素コンジュゲート（ＮＩＲ９６３０７、分子量約４１ｋＤａ）も開示した。
【００１３】
【化２】
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ＮＩＲ９６３０７に関しては、ｎは決定されなかったが、コンジュゲートの平均分子量は４１ｋＤａであると述べられている。Ｌｉｃｈａのポリマーコンジュゲートは、対応するＭＰＥＧアミン（即ち、Ｈ2ＮＣＨ2［ＣＨ2ＯＣＨ2］nＣＨ2ＯＣＨ3）から合成された。
【００１４】
関連する出版物［Ｌｉｃｈａ  ｅｔ  ａｌ，ＳＰＩＥ  Ｖｏｌ  ３１９６，ｐ．１０３−１１０（１９９８）］には、上記のＭＰＥＧコンジュゲートを用いた動物での腫瘍検出が記載されている。特に、興味の対象は、（ｉ）ＰＥＧコンジュゲートの許容性、（ｉｉ）薬物動態学的挙動及び（ｉｉｉ）悪性組織と正常組織との間のコントラストに対するその分子量の効果にあった。彼等は、分子量を増加させるとインビボでの血中循環時間が長くなることを認めた。彼等は、６ｋＤａを超える分子量を有する色素−ＭＰＥＧコンジュゲートに関し、遅れた時間に腫瘍環境中への保持量の増加及び腫瘍コントラストの向上が認められると結論づけた。
【００１５】
Ｍｏｎｔｅｔ  ｅｔ  ａｌ［Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，２４２（３），７５１−７５８（２００７）］は、近赤外プローブであるＡｎｇｉｏＳｅｎｓｅ  ６８０及びＡｎｇｉｏＳｅｎｓｅ  ７５０を用いた血管新生の蛍光分子断層撮影（ＦＭＴ）を報告した。これらは、非消光のために最適化されたインドシアニン型発蛍光団を有する高分子量（２５０ｋＤａ）のＰＥＧ化グラフトコポリマーとして記載された。この薬剤は、ポリリシン主鎖に結合したＭＰＥＧを含んでいる。Ｍｏｎｔｅｔ  ｅｔ  ａｌは、この薬剤が（５時間を超える）長い血中半減期を示し、投与後３０分までは腫瘍溢出が起こらないが、それ以後は腫瘍取込み（したがってイメージング輝度）が経時的に増加することを報告している。
【００１６】
Ｓａｄｄ  ｅｔ  ａｌ［Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．，１３０，１０７−１１４（２００８）］は、化学療法の効力並びにインビトロ及びインビボでのイメージングに関して３種のナノキャリヤー（線状ポリマー、デンドリマー及びリポソーム）の特性を研究した。研究した線状ポリマーは、次式のタイプの標的化ＰＥＧポリマーからなっていた。
［ＬＨＲＨ］−［ＰＥＧポリマー］−Ｃｙ５．５
式中、ＬＨＲＨは黄体形成ホルモン放出ペプチドの合成類似体であり、Ｃｙ５．５は特定のシアニン色素である。使用したＰＥＧポリマーは、約３ｋＤａの分子量を有していた。Ｓａｄｄ  ｅｔ  ａｌの図４（１１１頁）では、上記コンジュゲートの腫瘍取込みが非標的化類似体（ＰＥＧ−Ｃｙ５．５）と比較されている。Ｓａｄｄ  ｅｔ  ａｌは、ＬＨＲＨ標的化ポリマーコンジュゲートが非標的化類似体に比べて癌細胞中への蓄積の増強を示すと結論づけた。
【００１７】
治療目的の外科手術では、たとえ顕微鏡サイズのものでも腫瘍を全く残さないことが肝要である。一次手術の際に検出できなかった残留腫瘍組織及び潜在腫瘍組織は、再発癌に成長することがある。そのような理由より、外科医はいかなる腫瘍も後に残さないこと及び切除した腫瘍の周囲の「マージン」が陰性であることを保証しなければならない。「切除マージン」としても知られるマージンとは、腫瘍と、それと共に除去される周囲組織の縁端との距離をいう。次いで、切除した腫瘍及び周囲組織は病理学者によってインビトロで検査される。それを特殊なインク中でころがすことで、マージンが顕微鏡下ではっきりと見えるようになる。臨床上は、外科的に切除した腫瘍の周囲のマージンは下記のように記載される。
（ｉ）陽性マージン：インクが存在する組織の縁端まで癌細胞が延在している。
（ｉｉ）陰性マージン：インク中に癌細胞が見出されない。
（ｉｉｉ）近接マージン：陽性と陰性との間に位置する任意の状況を「近接」と見なす。
【００１８】
癌細胞が切除された組織の縁端にいかに近接しているかを知ることは、患者治療の決定を行う際の助けとなる。マージンが陽性であれば、追加の手術が必要となる。マージンが近接であれば、手術が必要となることもあれば必要でないこともあり、或いはさらなる手術及び放射線療法又は化学療法の追加が必要な場合もある。マージンが陰性であれば、手術は十分である。「陰性マージン」の定義は病院ごとに異なっている。ある場所では、インクと癌細胞との間にたとえ１個でも正常細胞が存在すれば、これは陰性マージンと見なされる。別の場所では、インクと腫瘍との間に癌細胞を含まない２ミリメートル以上の組織が存在する場合に初めて、病理学者は「陰性マージン」というカテゴリーを使用する。通例、この分析は手術が完了した後に実施されるから、患者が手術台から離れる前に「陰性マージン」を同定することは大いに有益であろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
英国特許出願公開第２３３７５２３号明細書
【発明の概要】
【００２０】
本発明は、光学イメージング造影剤を用いて腫瘍周囲のマージンのインビボ光学イメージングを行う方法を提供する。光学イメージング造影剤は、近赤外色素と、１５〜４５ｋＤａの範囲内の分子量を有する合成ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーとのコンジュゲートを含んでいる。また、光学イメージング造影剤、医薬組成物及びキットも開示される。
【００２１】
ＭａｔＢＩＩＩ正所ラット乳癌モデル及びプロトタイプ蛍光画像誘導手術システムを用いて、腫瘍マージンをハイライトすることに関する本発明の薬剤の効力を決定した。定量化はマージン／包囲スキン比（ＭＳＲ）によって達成された。能動標的化薬剤に比べて、巨大分子の受動標的化薬剤は改善された結果を与えた。
【００２２】
本発明は、切開レベルで（最小０．２〜０．３ｍｍまでの）サブミリメートルの疾患病巣を検出し得るイメージング剤を提供する。それにより、外科医は手術中に癌病巣の検出を行うことができる。かかるイメージング剤は、手術の誘導及び／又は残留疾患の同定を可能にする。かかるイメージング剤は、外科医が手術する癌患者の件数及び／又は病理学者の経験に関係なく、外科手術を標準化するために役立つ。かかるイメージング剤は腫瘍手術の能率を向上させ、患者からの正常組織の不要な切除を最小限に抑えながら（上記に定義した）「陰性マージン」を最大化するために役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、ＭＳＲ比に対するＰＥＧ分子量の効果を示している。
【図２】図２は、ビス−ジアミノ−ＰＥＧ３１Ｋコンジュゲートに対する色素の効果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
第１の態様では、本発明は、１以上の腫瘍を有することが知られている生きた被験体において腫瘍の腫瘍マージンのインビボ光学イメージングを行う方法であって、
（ｉ）分子量１５〜４５ｋＤａの合成ポリエチレングリコールポリマーと１つ又は２つのＯｐｔR基とのコンジュゲートを含む、インビボイメージングのために適した光学イメージング造影剤を用意する段階、並びに
（ｉｉ）前記腫瘍及び腫瘍マージンを含む前記被験体の検査対象領域であって、前記造影剤を投与した検査対象領域の光学画像を生成する段階
を含んでなり、各ＯｐｔRは独立に波長６００〜８５０ｎｍの光を用いる光学イメージング操作で直接又は間接に検出できる生体適合性光学レポーター基である方法を提供する。
【００２５】
「光学イメージング」という用語は、緑色乃至近赤外領域（波長５００〜１２００ｎｍ）の光との相互作用に基づいて、疾患の検出、ステージング又は診断、疾患進展の追跡或いは疾患治療の追跡のための画像を形成する任意の方法を意味する。光学イメージングはさらに、いかなる装置も使用しない直接可視化並びに各種スコープ、カテーテル及び光学イメージング装置（例えば、断層撮影表示用のコンピューター支援ハードウェア）のような装置の使用を伴う直接可視化のためのあらゆる方法を包含する。かかるモダリティ及び測定技法には、特に限定されないが、ルミネセンスイメージング、内視鏡検査、蛍光内視鏡検査、光学コヒーレンス断層撮影、透過率イメージング、時間分解透過率イメージング、共焦点イメージング、非線形顕微鏡検査、光音響イメージング、音響光学イメージング、スペクトル分析、反射スペクトル分析、干渉分析、コヒーレンス干渉分析、拡散光学断層撮影及び蛍光媒介拡散光学断層撮影（連続波、時間ドメイン及び周波数ドメインシステム）、並びに光の散乱、吸光、偏光、ルミネセンス、蛍光寿命、量子収量及び消光の測定がある。これらの技法のさらなる詳細は、Ｔｕａｎ  Ｖｏ−Ｄｉｎｈ（ｅｄｉｔｏｒ）：“Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”（２００３），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＣＣ、Ｍｙｃｅｋ  ＆  Ｐｏｇｕｅ（ｅｄｉｔｏｒｓ）：“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ”（２００３），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、及びＳｐｌｉｎｔｅｒ  ＆  Ｈｏｐｐｅｒ：“Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｐｔｉｃｓ”（２００７），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＣＣに示されている。
【００２６】
「光学イメージング造影剤」という用語は、インビボで完全な（即ち、無傷の）哺乳動物体の検査対象領域の光学イメージングを行うのに適した化合物を意味する。好ましくは、哺乳動物は生きているヒト被験体である。イメージングは侵襲的（例えば、手術中検査又は内視鏡検査）であってもよいし、或いは非侵襲的であってもよい。イメージングは、腫瘍マージンの同定によって（例えば、手術処置中に）腫瘍切除を容易にするために使用される。
【００２７】
「腫瘍マージン」という用語は、新しい腫瘍血管の内腔と腫瘍の本体を取り巻く腫瘍細胞及び正常細胞との間に位置する腫瘍周辺の間隙空間を意味する。ここでは、新しい腫瘍血管が漏出性を有するため、大きい巨大分子が血液から溢出し、その間隙領域内に捕捉されるか又は一時的に濃縮される。このような現象は、透過性上昇及び保持（ＥＰＲ）として知られている。このように、癌細胞はその増加した増殖速度を維持するために追加の栄養素を必要とし、これは血管新生によって達成される。血管新生は新しい血管の形成過程である。これらの新しい血管は確立された血管より構造化の程度が低い傾向にあり、これらの血管を内張りする内皮細胞間の接合部が確立された血管の場合ほど緊密かつ剛直でないため、時には「漏出性」血管網と呼ばれる。血管新生による漏出性微細血管網の発生は、すべての固形腫瘍に共通している［Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．，３，６５−７１（１９９２）及びＦｏｌｋｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，１，２７−３１（１９９５）］。
【００２８】
「生きた被験体」という用語は、生きている哺乳動物被験体、好ましくは生きているヒト被験体を意味する。
【００２９】
「合成」という用語は、その通常の意味を有し、即ち天然の供給源から単離されたものではなく人造のものである子とを意味する。かかる化合物は、その製造及び不純物プロファイルが完全に管理できるという利点を有する。
【００３０】
「ポリエチレングリコールポリマー」又は「ＰＥＧ」という用語は、例えば“Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ”，１４th  Ｅｄｉｔｉｏｎ，見出し７５６８に記載されているようなその通常の意味を有し、即ち一般式Ｈ（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＨ（式中、ｎは４以上の整数である。）の液体又は固体ポリマーである。本発明のポリエチレングリコールポリマーは線状のもの又は枝分れしたもの（即ち、デンドリマー）であり得るが、好ましくは線状のものである。ポリエチレングリコールポリマーは好適には多分散性である。「ポリマー末端」という用語は、ＰＥＧポリマーのポリエーテル鎖の末端を形成する官能基（上記の一般式では２つのヒドロキシ（−ＯＨ）基）を意味する。
【００３１】
「コンジュゲート」という用語は、「光学レポーター」（ＯｐｔR）がポリエチレングリコールポリマーと共有結合している誘導体を意味する。
【００３２】
「生体適合性」という用語は、無毒性であり、したがって副作用或いは投与時の苦痛又は不快感なしに哺乳動物体（特に人体）に投与するのに適していることを意味する。
【００３３】
「光学レポーター」（即ち、ＯｐｔR）という用語は、波長６００〜８５０ｎｍの光を用いる光学イメージング操作で直接又は間接に検出できる蛍光色素まま発色団を意味する。光学レポーターはインビボでの哺乳動物体のイメージングに適していなければならないので、それはまた生体適合性でもなければならない。好ましくは、ＯｐｔRは蛍光性を有しており、好ましくは生体適合性の蛍光色素からなる。
【００３４】
「検査対象領域」又はＲＯＩという用語は、インビボ医学イメージングの分野におけるその通常の意味を有する。
【００３５】
好ましい特徴
ポリエチレングリコールポリマーの分子量は、好ましくは２０〜４３ｋＤａ、さらに好ましくは２２〜４０ｋＤａ、最も好ましくは２５〜３８ｋＤａであり、２７〜３５ｋＤａが理想的である。ポリエチレングリコールポリマーは好ましくは線状ポリマーである。
【００３６】
ポリエチレングリコールポリマーには、好ましくはＯｐｔR基のみがコンジュゲートされている。即ち、好ましくは生物学的標的化分子又は他のポリマーはこのポリマーにコンジュゲートされていない。「生物学的標的化部分」という用語は、投与後、哺乳動物体の特定部位に選択的に取り込まれるか又は特定部位に局在する化合物を意味する。かかる部位は、例えば、特定の疾患状態に関係するものであるか、或いは器官又は代謝過程がいかに機能しているかを表すものであり得る。生物学的標的化部分は、通例、線状ペプチド、環状ペプチド又はこれらの組合せであり得る３〜１００量体ペプチド、ペプチド類似体、ペプトイド又はペプチド模倣体、或いは酵素基質、酵素拮抗剤又は酵素阻害剤、或いは合成レセプター結合化合物、或いはオリゴヌクレオチド、オリゴＤＮＡフラグメント又はオリゴＲＮＡフラグメントからなる。
【００３７】
第１の態様のコンジュゲートは、好ましくは次の式Ｉを有する。
Ｙ1−Ｘa−［ＰＯＬＹＭＥＲ］−Ｘb−Ｙ2
（Ｉ）
式中、
［ＰＯＬＹＭＥＲ］は合成ポリエチレングリコールポリマーであり、
Ｘa及びＸbは前記ポリエチレングリコールポリマーの末端に結合していて、独立に化学結合又はＬ基であり、Ｌは式−（Ａ）m−（式中、各Ａは独立に−ＣＲ2−、−ＣＲ＝ＣＲ−、−Ｃ≡Ｃ−、−ＣＲ2ＣＯ2−、−ＣＯ2ＣＲ2−、−ＮＲＣＯ−、−ＣＯＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ−、−ＳＯ2ＮＲ−、−ＮＲＳＯ2−、−ＣＲ2ＯＣＲ2−、−ＣＲ2ＳＣＲ2−、−ＣＲ2ＮＲＣＲ2−、Ｃ4-8シクロへテロアルキレン基、Ｃ4-8シクロアルキレン基、Ｃ5-12アリーレン基又はＣ3-12へテロアリーレン基、アミノ酸或いは糖であり、各Ｒは独立にＨ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ2-4アルケニル、Ｃ2-4アルキニル、Ｃ1-4アルコキシアルキル及びＣ1-4ヒドロキシアルキルから選択され、ｍは１〜２０の値を有する整数である。）のリンカー基であり、
Ｙ1及びＹ2は独立にＯｐｔR（ここで、ＯｐｔRは上記に定義した通りである。）であるか、或いは−ＯＨ、−Ｏ（Ｃ1-10アルキル）、−ＮＨ2及び−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ1-10アルキル）から選択される官能基であり、
Ｙ1及びＹ2の少なくとも一方はＯｐｔRであることを条件とする。
【００３８】
「アミノ酸」という用語は、Ｌ−又はＤ−アミノ酸、アミノ酸類似体（例えば、ナフチルアラニン）或いはアミノ酸模倣体を意味し、これらは天然のもの又は純粋に合成由来のものであってよく、光学的に純粋なもの（即ち、単一の鏡像異性体）、したがってキラルなものであるか、或いは鏡像異性体の混合物であってよい。
【００３９】
「糖」という用語は、単糖、二糖又は三糖を意味する。好適な糖には、グルコース、ガラクトース、マルトース、マンノース及びラクトースがある。任意には、アミノ酸への容易なカップリングを可能にするように糖を官能化することができる。即ち、例えばアミノ酸のグルコサミン誘導体は、ペプチド結合を介して他のアミノ酸にコンジュゲートすることができる。（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ社から商業的に入手できる）アスパラギンのグルコサミン誘導体はこれの一例である。
【００４０】
【化３】
2012520856.tif 000006
式Ｉにおいて、Ｙ1及びＹ2の一方のみがＯｐｔRである場合、他方は好ましくは−ＯＨ及び−ＮＨ2から選択される官能基であり、さらに好ましくは−ＯＨである。
【００４１】
式Ｉにおいては、Ｙ1及びＹ2の各々がＯｐｔRであることが好ましい。その場合、Ｘ及びＸ’は好ましくは、ジアミノ−ＰＥＧ又はジカルボキシ−ＰＥＧポリマーからコンジュゲートが製造されるように−ＮＨＣＯ−又は−ＣＯＮＨ−となるように選択される。即ち、かかるＰＥＧポリマーはそれぞれＨ2Ｎ−［ＰＯＬＹＭＥＲ］−ＮＨ2又はＨＯＯＣ−［ＰＯＬＹＭＥＲ］−ＣＯＯＨに相当しており、この場合にはＯｐｔRの生体適合性色素がアミド結合を介してポリマーの各末端にコンジュゲートされる。
【００４２】
Ｙ1及びＹ2の各々がＯｐｔRである場合、Ｙ1及びＹ2のＯｐｔR基はそれぞれ同一の生体適合性レポーターからなることが好ましい。それは３つの利点を有している。第一に、生体適合性レポーターの２つの発色団が同一である場合、造影剤は（レポーターの分子量はポリマーの分子量よりはるかに小さいので）実質的に同一の分子量に対して増強された蛍光信号を示す。第二に、２種の生体適合性レポーターからの信号間において起こり得る蛍光の不溶の干渉及び／又は消光が回避される。第三に、対称的な二官能性ＰＥＧは合成するのが容易である。
【００４３】
式Ｉにおいて、Ｌ基のｍは好ましくは１〜５、最も好ましくは１〜３の値を有する整数である。
【００４４】
ＯｐｔRは、好ましくは波長６１０〜８００ｎｍ、さらに好ましくは波長７００〜７８０ｎｍ、最も好ましくは波長７３０〜７７０ｎｍの光を用いる光学イメージング操作で直接又は間接に検出できる生体適合性色素からなる。ＯｐｔRの生体適合性色素は、好ましくは蛍光性を有する。かかる色素の特定の例には、インドシアニングリーン、シアニン色素であるＣｙ５、Ｃｙ５．５及びＣｙ７、並びにＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０がある。
【００４５】
生体適合性色素は、好ましくはシアニン色素又はベンゾピリリウム色素であり、最も好ましくはシアニン色素である。発蛍光団である好ましいシアニン色素は、次の式ＩＩのものである。
【００４６】
【化４】
2012520856.tif 000007
式中、
各Ｘ’は独立に−Ｃ（ＣＨ3）2、−Ｓ−、−Ｏ−及び−Ｃ［（ＣＨ2）aＣＨ3］［（ＣＨ2）bＭ］−（式中、ａは０〜５の値を有する整数であり、ｂは１〜５の値を有する整数であり、ＭはＧ基であるか、或いはＳＯ3Ｍ1及びＨから選択される。）から選択され、
各Ｙ’は独立にＨ、−ＣＨ2ＮＨ2、−ＳＯ3Ｍ1、−ＣＨ2ＣＯＯＭ1、−ＮＣＳ、Ｆ及びＧ基からなる群から選択される１〜４の基を表し、Ｙ’基は芳香環の任意の位置に配置されており、
Ｑ’は独立にＨ、ＳＯ3Ｍ1、ＮＨ2、ＣＯＯＭ1、アンモニウム、エステル基、ベンジル及びＧ基からなる群から選択され、
Ｍ1はＨ又はＢc（ここで、Ｂcは生体適合性陽イオンである。）であり、
ｚは２又は３の値を有する整数であり、
ｍは１〜５の整数であり、
Ｘ’、Ｙ’及びＱ’の少なくとも１つはＧ基からなり、
ＧはＰＥＧポリマーへの結合のために適した反応基又は官能基である。
【００４７】
「生体適合性陽イオン」（Ｂc）という用語は、イオン化して負に帯電した基と共に塩を形成する正に帯電した対イオンを意味する。この場合、前記正に帯電した対イオンも無毒性であり、したがって哺乳動物体（特に人体）への投与に適している。好適な生体適合性陽イオンの例には、アルカリ金属であるナトリウム及びカリウム、アルカリ土類金属であるカルシウム及びマグネシウム、並びにアンモニウムイオンがある。好ましい生体適合性陽イオンはナトリウム及びカリウムであり、最も好ましくはナトリウムである。
【００４８】
Ｇ基はＰＥＧポリマーの相補的な基と反応して、シアニン色素発蛍光団とポリマーとの間に共有結合を形成する。式ＩＩ中でのＧ基の位置は、ＰＥＧがＱ’、Ｘ’又はＹ’の位置に適宜にコンジュゲートされ得るようなものである。ＧはＰＥＧの相補的な官能基と反応し得る反応基であってもよいし、或いは別法としてＰＥＧの反応基と反応し得る官能基を含んでいてもよい。反応基及び官能基の例には、活性エステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、酸ハライド、ヒドラジド、ビニルスルホン、ジクロロトリアジン、ホスホラミダイト、ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボン酸及びチオホスフェートがある。好ましくは、Ｇは活性エステルである。
【００４９】
「活性化エステル」又は「活性エステル」という用語は、良好な脱離基であり、したがってアミンのような求核性化合物との一層容易な反応を可能にするように設計された関連カルボン酸のエステル誘導体を意味する。好適な活性エステルの例は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、スルホスクシンイミジルエステル、ペンタフルオロフェノール、ペンタフルオロチオフェノール、ｐ−ニトロフェノール、ヒドロキシベンゾトリアゾール及びＰｙＢＯＰ（即ち、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）である。好ましい活性エステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド又はペンタフルオロフェノールエステル、特にＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。
【００５０】
シアニン色素の好ましい特徴
式ＩＩに基づく好ましいシアニン色素は、次の式ＩＩａで定義されるものである。
【００５１】
【化５】
2012520856.tif 000008
式中、
Ｙ3及びＹ4は独立に−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ5−又は−ＣＲ6Ｒ7−であり、Ｙ3及びＹ4の少なくとも一方が−ＣＲ6Ｒ7−であるように選択され、
Ｒ1及びＲ2は独立にＨ、−ＳＯ3Ｍ1又はＲaであり、
Ｒ3〜Ｒ5は独立にＣ1-5アルキル、Ｃ1-6カルボキシアルキル又はＲaであり、
Ｒ6はＨ又はＣ1-3アルキルであり、
Ｒ7はＲa又はＣ1-6カルボキシアルキルであり、
Ｒaは独立にＣ1-4スルホアルキルであり、
Ｍ1及びｚ式ＩＩで定義した通りであり、
式ＩＩａのシアニン色素は１以上のＲa基並びにＲ1、Ｒ2及びＲa基に由来する全部で１〜６のスルホン酸置換基を有することを条件とする。
【００５２】
「スルホン酸置換基」という用語は、式−ＳＯ3Ｍ1（式中、Ｍ1は上記に定義した通りである。）の置換基を意味する。式ＩＩａの好ましい色素はｚ＝３を有する。好ましいかかる色素はまた、２〜６のスルホン酸置換基を有する。−ＳＯ3Ｍ1置換基は炭素原子に共有結合しており、炭素原子はアリール（即ち、Ｒ1又はＲ2基）又はアルキル（即ち、Ｒa基）であり得る。式ＩＩａ中では、Ｒa基は好ましくは式−（ＣＨ2）kＳＯ3Ｍ1である。式中、Ｍ1は上記に定義した通りであり、ｋは１〜４の値を有する整数である。ｋは好ましくは３又は４である。式ＩＩａのさらに好ましいシアニン色素は、ｚ＝３を有するもの、即ちヘプタメチンシアニン色素である。
【００５３】
特に好ましいシアニン色素は、次の式ＩＩｂのものである。
【００５４】
【化６】
2012520856.tif 000009
式中、
Ｒ9及びＲ10は独立にＨ又はＳＯ3Ｍ1であって、Ｒ9及びＲ10の少なくとも一方はＳＯ3Ｍ1であり、
Ｒ11及びＲ12は独立にＣ1-4アルキル又はＣ1-6カルボキシアルキルであり、
Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15及びＲ16は独立にＲb基（式中、ＲbはＣ1-4アルキル、Ｃ1-6カルボキシアルキル又は−（ＣＨ2）qＳＯ3Ｍ1であり、ｑは３又は４の値を有する整数である。）であり、
Ｍ1は式ＩＩ及び式ＩＩａに関して定義した通りであり、
シアニン色素はＲ9、Ｒ10及びＲb基中に全部で１〜４のＳＯ3Ｍ1置換基を有することを条件とする。
【００５５】
式ＩＩｂの好ましいシアニン色素は、ＰＥＧポリマーへのコンジュゲーションを容易にするため、１以上のＣ1-6カルボキシアルキル基又はその活性化エステルを含むように選択される。式ＩＩｂの特に好ましいかかる色素は次式のＣｙ７である。
【００５６】
【化７】
2012520856.tif 000010
「ベンゾピリリウム色素」という用語は、その通常の意味を有する。
本発明の好適なベンゾピリリウム色素はＢｚｐMで表され、次の式ＩＩＩを有する。
【００５７】
【化８】
2012520856.tif 000011
式中、
Ｙ5は次の式Ｙa又は式Ｙbの基であり、
【００５８】
【化９】
2012520856.tif 000012
Ｘは−ＣＲ34Ｒ35−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−ＮＲ36−又は−ＣＨ＝ＣＨ−（式中、Ｒ34〜Ｒ36は独立にＲg基である。）であり、
Ｒ21〜Ｒ24及びＲ29〜Ｒ33は独立にＨ、−ＳＯ3Ｍ1、Ｈａｌ、Ｒg及びＣ3-12アリールから選択され、
Ｒ25はＨ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-6カルボキシアルキル、Ｃ3-12アリールスルホニル又はＣｌであるか、或いはＲ25は任意にはＲ26、Ｒ34、Ｒ35又はＲ36の１つと共に五員又は六員の不飽和脂肪族環、不飽和ヘテロ脂肪族環又は芳香環を形成でき、
Ｒ26及びＲ36は独立にＲg基であり、
Ｒ27及びＲ28は独立にＣ1-4アルキル、Ｃ1-4スルホアルキル又はＣ1-6ヒドロキシアルキルであるか、或いはＹaに関しては任意にはＲ29及び／又はＲ30の一方又は両方と共に五員又は六員のＮ含有複素環又はヘテロアリール環を形成でき、或いはＹbに関しては任意にはＲ30及び／又はＲ30の一方又は両方と共に五員又は六員のＮ含有複素環又はヘテロアリール環を形成でき、
ＲgはＣ1-4アルキル、Ｃ1-4スルホアルキル、Ｃ1-6カルボキシアルキル又はＣ1-6ヒドロキシアルキルであり、
ｗは１又は２であり、
Ｊは生体適合性陰イオンであり、
Ｍ1は式ＩＩに関して定義した通りであり、
ＢｚｐMはＲ21〜Ｒ36基から選択される１以上のスルホン酸置換基を含むことを条件とする。
【００５９】
「生体適合性陰イオン」（Ｊ）という用語は、イオン化して正に帯電した基（この場合にはインドリニウム基）と共に塩を形成する負に帯電した対イオンを意味する。この場合、前記負に帯電した対イオンも無毒性であり、したがって哺乳動物体（特に人体）への投与に適している。対イオン（Ｊ-）は、モル相当量で存在することでＢｚｐM色素上の正電荷をバランスさせる陰イオンを表す。電荷をバランスさせる量が存在する限り、陰イオン（Ｊ）は好適には単一又は複数の電荷を有する。陰イオンは好適には無機酸又は有機酸から導かれる。好適な陰イオンの例には、塩化物イオン又は臭化物イオンのようなハロゲン化物イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、クエン酸イオン、酢酸イオン、リン酸イオン及びホウ酸イオンがある。好ましい陰イオンは塩化物イオンである。
【００６０】
本発明の好適な造影剤は、ＢｚｐMが次の式ＩＩＩａ又は式ＩＩＩｂを有するものである。
【００６１】
【化１０】
2012520856.tif 000013
式中、Ｘ、ｗ、Ｊ及びＲ21〜Ｒ33は式ＩＩＩに関して定義した通りである。
【００６２】
Ｒ25がＲ26／Ｒ34〜Ｒ36の１つと共に五員又は六員の不飽和脂肪族環、不飽和ヘテロ脂肪族環又は芳香環を形成する場合、好適なかかる芳香環には、フェニル、フラン、チアゾール、ピリジル、ピロール及びピラゾール環がある。好適な不飽和環は、少なくともＲ25が結合したＣ＝Ｃを含んでいる。
【００６３】
Ｒ27及び／又はＲ28が（Ｙ1が上記に記載したようなＹa又はＹbであるのに応じて）Ｒ29、Ｒ30又はＲ31の少なくとも１つと共に五員又は六員のＮ含有複素環又はヘテロアリール環を形成する場合、好適なかかる環には、チアゾール、ピリジル、ピロール及びピラゾール環並びにこれらの部分水素化バージョンがある。好ましくは、ピリジル又はジヒドロピリジルである。
【００６４】
ベンゾピリリウム色素の好ましい特徴
ＰＥＧポリマーは、好ましくは式ＩＩＩのＢｚｐMのＲ25、Ｒ26、Ｒ34、Ｒ35又はＲ36の位置、さらに好ましくはＲ26、Ｒ34、Ｒ35又はＲ36の位置、最も好ましくはＲ26、Ｒ34又はＲ35の位置に結合している。結合を容易にするため、関連するＲ25、Ｒ26、Ｒ34、Ｒ35又はＲ36置換基は好ましくはＣ1-6カルボキシアルキル、さらに好ましくはＣ3-6カルボキシアルキルからなる。
【００６５】
ベンゾピリリウム色素（ＢｚｐM）は、好ましくは２以上のスルホン酸置換基、さらに好ましくは２〜６のスルホン酸置換基、最も好ましくは２〜４のスルホン酸置換基を有する。好ましくは、スルホン酸置換基の少なくとも１つはＣ1-4スルホアルキル基である。かかるスルホアルキル基は、好ましくは式ＩＩＩのＲ26、Ｒ27、Ｒ28、Ｒ34、Ｒ35又はＲ36の位置にあり、さらに好ましくはＲ26、Ｒ27、Ｒ28、Ｒ34又はＲ35の位置にあり、最も好ましくはＲ27及びＲ28の一方又は両方と共にＲ26の位置にある。式ＩＩＩのスルホアルキル基は、好ましくは式−（ＣＨ2）kＳＯ3Ｍ1（式中、Ｍ1はＨ又はＢcであり、ｋは１〜４の値を有する整数であり、Ｂcは（上記に定義したような）生体適合性陽イオンである。）を有する。ｋは好ましくは３又は４である。
【００６６】
式ＩＩＩにおいて、ｗは好ましくは２である。Ｒ25は好ましくはＨ又はＣ1-4カルボキシアルキルであり、最も好ましくはＨである。Ｘは好ましくは−ＣＲ34Ｒ35−又は−ＮＲ36−であり、最も好ましくは−ＣＲ34Ｒ35−である。ｗ＝２を有する特に好ましいベンゾピリリウム色素はＤＹ−７５０及びＤＹ−７５２であり、これらはＤｙｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨから商業的に入手できる。
【００６７】
第１の態様の方法では、造影剤は好ましくは、コンジュゲートを生体適合性キャリヤーと共に含む医薬組成物からなる。かかる医薬組成物は、第３の態様（下記）に記載される通りである。
【００６８】
第１の態様の方法は、前記被験体からの腫瘍の切除に際して外科医を支援するため、好ましくは手術中に実施される。第６の態様の好ましい光学イメージング方法は、蛍光反射イメージング（ＦＲＩ）である。ＦＲＩでは、本発明の造影剤を診断すべき被験体に投与し、次いで被験体の組織表面を励起光（通常は連続波（ＣＷ）励起）で照明する。光は造影剤のＯｐｔRを励起する。励起光によって造影剤から発生する蛍光を、蛍光検出器を用いて検出する。好ましくは、戻る光を濾光することで蛍光成分を（単独に又は部分的に）分離する。蛍光から画像を形成する。通常、最小限の処理が実施され（寿命、量子収量などの光学パラメーターを計算するためのプロセッサーは使用されない）、画像は蛍光強度をマップする。造影剤は、疾患領域に集中して高い蛍光強度を生み出すように設計されている。したがって、疾患領域は蛍光強度画像中に正のコントラストを生み出す。画像は好ましくはＣＣＤカメラ又はチップを用いて取得される結果、リアルタイムイメージングが可能である。
【００６９】
励起用の波長は、使用する特定の色素に応じて変化する。励起光を発生するための装置は、レーザー（例えば、イオンレーザー、色素レーザー又は半導体レーザー）、ＬＥＤアレイ、ハロゲン光源又はキセノン光源のような通常の励起光源であり得る。任意には、各種の光学フィルターを用いて最適の励起波長を得ることができる。
【００７０】
第１の実施形態では、好ましいＦＲＩ方法は、
（ｉ）生きた被験体内の検査対象領域を含む組織表面を励起光で照明する段階、
（ｉｉ）ＯｐｔRの励起によって造影剤から発生する蛍光を、蛍光検出器を用いて検出する段階、
（ｉｉｉ）蛍光検出器によって検出された光を任意に濾光して蛍光成分を分離する段階、及び
（ｉｖ）段階（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の蛍光から前記組織表面の画像を形成する段階
を含んでなる。段階（ｉ）〜（ｉｖ）を含む方法において、段階（ｉ）の励起光は好ましくは連続波（ＣＷ）の性質を有する。
【００７１】
第２の実施形態では、光学イメージングは好ましくはＦＤＰＭ（周波数ドメイン光子移動）からなる。これは、組織内における色素の検出深度が大きいことが重要である場合、連続波（ＣＷ）方法に比べて利点を有する［Ｓｅｖｉｃｋ−Ｍｕｒａｃａ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，６４２−６５０（２００２）］。かかる周波数／時間ドメインイメージングのためには、ＣｚDが、画像化すべき病変の組織深度及び使用する計装のタイプに応じて変調できる蛍光特性を有するならば有利である。好ましいＦＤＰＭ方法は下記のようなものである。即ち、
（ａ）前記生きた被験体の検査対象領域をなす、不均質組成を有する光散乱性生体組織を、所定の経時変動強度を有する光源からの光に暴露して造影剤を励起する段階であって、組織が励起光を多重散乱させる段階、
（ｂ）前記暴露に応答した組織からの多重散乱発光を検出する段階、
（ｃ）組織内の様々な位置における蛍光特性のレベルにそれぞれ対応する複数の値をプロセッサーで確定することにより、発光から組織全体の蛍光特性を定量化する段階であって、蛍光特性のレベルが組織の不均質組成に応じて変化する段階、及び
（ｄ）段階（ｃ）の値に従って組織の不均質組成のマッピングを行うことで組織の画像を生成する段階
を含んでいる。
【００７２】
段階（ｃ）の蛍光特性は、好ましくは造影剤の取込みに対応し、好ましくはさらに前記造影剤の投与前における組織の吸着係数及び散乱係数に対応する複数の量のマッピングを含んでいる。段階（ｃ）の蛍光特性は、好ましくは蛍光寿命、蛍光量子効率、蛍光収量及び造影剤取込みの１以上に対応する。蛍光特性は、好ましくは発光強度に無関係であり、また造影剤濃度に無関係である。
【００７３】
段階（ｃ）の定量化は、好ましくは、（ｉ）値の推定値を設定し、（ｉｉ）推定値の関数として計算発光を求め、（ｉｉｉ）計算発光を前記検出段階の発光と比較して誤差を求め、（ｉｖ）誤差の関数として蛍光特性の修正推定値を得ることを含んでいる。定量化は、好ましくは、組織の多重光散乱挙動をモデル化する数学的関係から値を求めることを含んでいる。第１のオプションの方法は、好ましくはさらに、前記蛍光特性の変動を検出することでインビボでの組織の代謝特性をモニターすることを含んでいる。
【００７４】
第１の態様の造影剤は次のようにして製造できる。ＰＥＧポリマーに対するＯｐｔRのコンジュゲーションを容易にするため、ＯｐｔRの色素には好適には反応性官能基（Ｑa）が結合されている。Ｑa基は、ポリマーの相補的な官能基と反応することで色素とポリマーとの間に共有結合を形成するように設計されている。好適なＱa基は、カルボキシル、活性化エステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、ヒドラジド、ビニルスルホン、ジクロロトリアジン及びホスホラミダイトから選択できる。好ましくは、Ｑaはカルボン酸の活性化エステル、イソチオシアネート、マレイミド又はハロアセトアミドである。最も好ましくは、Ｑaは活性化エステルである。かかる活性化エステルの好ましい態様は下記に記載される通りである。
【００７５】
シアニン色素を生物学的分子にコンジュゲートするための一般的方法は、Ｌｉｃｈａ  ｅｔ  ａｌ［Ｔｏｐｉｃｓ  Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．，２２２，１−２９（２００２）；Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，５７，１０８７−１１０８（２００５）］によって記載されている。シアニン色素をＰＥＧポリマーにコンジュゲートするための方法は、Ｌｉｃｈａ  ｅｔ  ａｌ［ＳＰＩＥ  Ｖｏｌ  ３１９６  ｐ．９８−１０２（１９９８）］によって教示されている。
【００７６】
コンジュゲートがＰＥＧポリマーの各末端に１つずつ２つのＯｐｔR基を含む場合、好ましい出発原料はジアミノ−ＰＥＧである。Ｅｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ［Ｅｌｂｅｒｔ  ＆  Ｈｕｂｂｅｌｌ；Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌ．，２，４３０−４４１（２００１）］によって記載されている通り、かかるジアミノ−ＰＥＧ材料は低純度のものであってよい。本発明のコンジュゲートに関しては、ＰＥＧ−ジアミンは好ましくは９０％を超える純度を有し、さらに好ましくは９５％を超える純度を有し、最も好ましくは９９％を超える純度を有する。Ｅｌｂｅｒｔによって記載された合成法は、所要の純度を有するＰＥＧ−ジアミンを与える。実施例１にはさらなる詳細が示されている。
【００７７】
ペプチドへのコンジュゲーションに適するように官能化されたシアニン色素は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ａｔｔｏ−Ｔｅｃ社、Ｄｙｏｍｉｃｓ社、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社などから商業的に入手できる。大抵のかかる色素はＮＨＳエステルとして入手できる。リンカー基（Ｌ）をポリマーにコンジュゲートする方法は、色素のみをコンジュゲートする方法（上記参照）と類似の化学作用を使用し、当技術分野で公知である。ベンゾピリリウム色素は、Ｄｙｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ，Ｗｉｎｚｅｒｌａｅｒ  Ｓｔｒ．２Ａ，Ｄ−０７７４５，イェナ，ドイツ；（ｗｗｗ．ｄｙｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ）から商業的に入手できる。
【００７８】
第２の態様では、本発明は、哺乳動物体のインビボ光学イメージングのために適した造影剤であって、第１の態様で定義したコンジュゲートを含んでなる造影剤を提供する。
【００７９】
第３の態様では、本発明は、第１の態様で定義したコンジュゲートを生体適合性キャリヤーと共に含んでなる医薬組成物を提供する。医薬組成物中のコンジュゲートの好ましい実施形態は、第１の態様で記載した通りである。
【００８０】
「生体適合性キャリヤー」は、組成物が生理学的に認容され得るようにして（即ち、毒性又は過度の不快感なしに哺乳動物体に投与できるようにして）イメージング剤を懸濁又は溶解できる流体（特に液体）である。生体適合性キャリヤーは、好適には、無菌のパイロジェンフリー注射用水、（有利には注射用の最終生成物が等張性になるように平衡させ得る）食塩水のような水溶液、或いは１種以上の張度調整物質（例えば、血漿陽イオンと生体適合性対イオンとの塩）、糖（例えば、グルコース又はスクロース）、糖アルコール（例えば、ソルビトール又はマンニトール）、グリコール（例えば、グリセロール）又は他の非イオン性ポリオール物質（例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど）の水溶液のような注射可能なキャリヤー液体である。巨大分子ポリオールを使用する場合、それは好適には１０ｋＤａ以下、好ましくは５ｋＤａ未満の分子量を有する。それより高い分子量の化学種は、本発明の造影剤と競合することがあるからである。好ましくは、生体適合性キャリヤーはパイロジェンフリー注射用水又は等張食塩水である。
【００８１】
造影剤及び生体適合性キャリヤーはそれぞれ、注射器又はカニューレによる溶液の追加及び抜取りを許しながら、無菌保全性及び／又は放射能安全性の維持、さらに任意には不活性ヘッドスペースガス（例えば、窒素又はアルゴン）の維持を可能にする密封容器からなる適当なバイアル又は容器に入れた状態で供給される。好ましいかかる容器は、気密クロージャーを（通例はアルミニウムからなる）オーバーシールと共にクリンプ加工した隔壁密封バイアルである。クロージャーは、無菌保全性を維持しながら皮下注射針による１回又は数回の穿刺に適したもの（例えば、クリンプ加工した隔壁シールクロージャー）である。かかる容器は、（例えば、ヘッドスペースガスの変更又は溶液のガス抜きのために）所望される場合にはクロージャーが真空に耐え得ると共に、酸素又は水蒸気のような外部大気ガスの侵入を許すことなしに減圧のような圧力変化にも耐え得るという追加の利点を有している。
【００８２】
好ましい複数用量容器は、複数の患者用量を含む（例えば、容積１０〜３０ｃｍ3の）単一のバルクバイアルからなり、したがって臨床的状況に合わせて製剤の実用寿命中に様々な時間間隔で１回分の患者用量を臨床グレードの注射器中に抜き取ることができる。予備充填注射器は１回分のヒト用量又は「単位用量」を含むように設計され、したがって好ましくは臨床用に適した使い捨て注射器又は他の注射器である。本発明の医薬組成物は、好ましくは１人の患者用に適した用量を有し、上述したような適当な注射器又は容器に入れて供給される。
【００８３】
かかる医薬組成物は、抗菌防腐剤、ｐＨ調整剤、フィラー、安定剤又は重量オスモル濃度調整剤のような追加賦形剤を任意に含むことができる。「抗菌防腐剤」という用語は、潜在的に有害な微生物（例えば、細菌、酵母又はかび）の増殖を阻止する薬剤を意味する。抗菌防腐剤はまた、使用する用量に応じて多少の殺菌性を示すこともある。本発明の抗菌防腐剤の主な役割は、医薬組成物中におけるこのような微生物の増殖を阻止することである。しかし、抗菌防腐剤は、任意には投与に先立って前記組成物を製造するために使用されるキットの１種以上の成分中における潜在的に有害な微生物の増殖を阻止するためにも使用できる。好適な抗菌防腐剤には、パラベン類（即ち、メチル、エチル、プロピル又はブチルパラベン或いはこれらの混合物）、ベンジルアルコール、フェノール、クレゾール、セトリミド及びチオメルサールがある。好ましい抗菌防腐剤はパラベン類である。
【００８４】
「ｐＨ調整剤」という用語は、組成物のｐＨがヒト又は哺乳動物への投与のために許容し得る範囲（およそｐＨ４．０〜１０．５）内にあることを保証するために有用な化合物又は化合物の混合物を意味する。好適なかかるｐＨ調整剤には、トリシン、リン酸塩又はＴＲＩＳ［即ち、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］のような薬学的に許容し得る緩衝剤、及び炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム又はこれらの混合物のような薬学的に許容し得る塩基がある。組成物をキットの形態で使用する場合には、ｐＨ調整剤を任意には独立のバイアル又は容器に入れて供給することができ、その結果としてキットのユーザーは多段操作の一部としてｐＨを調整することができる。
【００８５】
「フィラー」という用語は、製造及び凍結乾燥中における材料の取扱いを容易にすることができる薬学的に許容し得る増量剤を意味する。好適なフィラーには、塩化ナトリウムのような無機塩、及びスクロース、マルトース、マンニトール又はトレハロースのような水溶性糖又は糖アルコールがある。
【００８６】
かかる医薬組成物は、無菌製造条件下で（即ち、クリーンルーム内で）製造して所望の無菌で非発熱性の生成物を得ることができる。基本構成部分、特に関連する試薬並びにイメージング剤に接触する装置部品（例えば、バイアル）は無菌であることが好ましい。かかる構成部分及び試薬は、無菌濾過或いは（例えば、γ線照射、オートクレーブ処理、乾熱又は（例えば、エチレンオキシドによる）化学処理を用いる）終末滅菌をはじめとする、当技術分野で公知の方法によって滅菌できる。一部の構成部分を予め滅菌しておけば、最小数の操作を実施すれば済むので好ましい。しかし、予防策として、医薬組成物の製造における最終段階として少なくとも無菌濾過段階を含めることが好ましい。
【００８７】
かかる医薬組成物は、好ましくは第４の態様に関して下記に記載するようなキットから製造される。
【００８８】
第４の態様では、本発明は、第２の態様の医薬組成物を製造するためのキットであって、当該キットは第１の態様の造影剤を無菌固体形態で含んでいて、（第３の態様で記載した）生体適合性キャリヤーの無菌供給物で再構成すれば溶解が起こって所望の医薬組成物を与えるキットを提供する。
【００８９】
その場合、造影剤及び上述したような他の任意賦形剤は、凍結乾燥粉末として適当なバイアル又は容器に入れて供給できる。かかる薬剤は、次いで所望の生体適合性キャリヤーを用いて再構成することで、哺乳動物への投与が可能な無菌で非発熱性の形態の医薬組成物を与えるように設計される。
【００９０】
造影剤の好ましい無菌固体形態は凍結乾燥固体である。無菌固体形態は、好ましくは医薬組成物に関して（上記に）記載したような医薬品用容器に入れて供給される。キットを凍結乾燥する場合、配合物は糖類（好ましくはマンニトール、マルトース及びトリシン）から選択される凍結保護剤を任意に含むことができる。
【実施例】
【００９１】
以下に詳述する非限定的な実施例によって本発明を例証する。実施例１は、本発明のＰＥＧ−ビス（色素）コンジュゲートの合成法を示している。実施例２は、本発明の他のＰＥＧ−色素コンジュゲートの合成法を示している。実施例３は、使用した生物学的スクリーニングモデルを示している。結果は図１に示されている。臨床状況により密接に関係するという点で、早い時点がやや重要であると見なされた。ＰＥＧ３．４Ｋコンジュゲートは、すべての時点で顕著に劣ったＭＳＲ値を有している。ＰＥＧ３０Ｋコンジュゲートは優れていて、すべての時点で良好なＭＳＲ値を示した。ＰＥＧ２０Ｋ及びＰＥＧ４３Ｋコンジュゲートは早い時点では良好なＭＳＲ値を示したが、２４時間後には劣っていた。
【００９２】
実施例４では、色素をＣｙ５（励起：６５０ｎｍ、発光：６７０ｎｍ）からＣｙ７（励起：７４３ｎｍ、発光：７６７ｎｍ）に変えることの効果を調べた。Ｃｙ７コンジュゲートに関しては、ＭＳＲスコアは増加したか又は同様であった。さらに、Ｄｙｏｍｉｃｓ社から商業的に入手できるＣｙ７類似体色素であるＤＹ７５２及びＤＹ７５０を評価したところ、Ｃｙ７に比べて非常にに類似したＭＳＲスコアが示された。
【００９３】
略語
通常の三文字及び一文字アミノ酸略語を使用する。
Ａｃｍ：        アセトアミドメチル
ＡＣＮ：        アセトニトリル
Ｂｏｃ：        ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル
ＤＭＦ：        Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：      ジメチルスルホキシド
ＧＦＣ：        ゲル濾過クロマトグラフィー
ＨＣｌ：        塩酸
ＨＰＬＣ：      高速液体クロマトグラフィー
ＭＡＬＤＩ：    マトリックス支援レーザ脱着イオン化
ＭＳＲ：        マージン／包囲スキン比
ＮＨＳ：        Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＰＢＳ：        リン酸塩緩衝食塩水
ＴＦＡ：        トリフルオロ酢酸。
【００９４】
実施例１：ビス−Ｃｙ７  ＰＥＧ−３１ｋコンジュゲート（化合物１）の合成
ジアミノ−ＰＥＧはＬａｙｓａｎＢｉｏ社から購入した。それは、Ｅｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ［Ｅｌｂｅｒｔ  ＆  Ｈｕｂｂｅｌｌ；Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２，ｐ  ４３０−４４１（２００１）］の方法を用いて、対応するＰＥＧ−ジオール（Ｓｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ社）から合成された。ジアミノ−ＰＥＧは、ＧＦＣによれば約３１ｋＤａ、ＭＡＬＤＩによれば約３５ｋＤａの平均質量を有していた。アミン置換度は約１００％であり、プロトンＮＭＲによれば他の不純物は検出されず、特にＣＨ2−ＯＭｓ又はＣＨ2−ＯＨプロトンは認められなかった。
【００９５】
蛍光色素Ｃｙ７−ＮＨＳはＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社から入手した。それは８１．３％の活性エステル含有量を有していた。このコンジュゲートは下記のようにして製造された。
【００９６】
【化１１】
2012520856.tif 000014
即ち、
（ｉ）ジアミノ−ＰＥＧ−３１ｋを０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ3緩衝液に溶解する（１０ｍｇ／ｍｌ）。１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨを８．５〜８．８に調整する。
（ｉｉ）３当量のＣｙ７−ＮＨＳ溶液（ＤＭＳＯ中約１ｍｇ／１００μＬ、濃度は使用前にＵＶ／ＶＩＳで測定する）を添加する。室温で一晩撹拌する。
（ｉｉｉ）ＡＫＴＡ精製装置を用いる分取ＲＰ−ＬＣに付する。
（ｉｖ）真空中において室温で濃縮し、次いで水（×３）を用いて共蒸発乾固するか、又は凍結乾燥する。
（ｖ）ＰＢＳ中に７５μＭの濃度で製剤化する。
【００９７】
Ｃｙ５コンジュゲート並びにベンゾピリリウム色素Ｄｙ７５０及びＤｙ７５２（Ｄｙｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ，Ｄ−０７７４５，イェナ，ドイツ）とのコンジュゲートは、類似の方法で製造した。
【００９８】
実施例２：他のＰＥＧ色素コンジュゲートの合成
単一の色素分子で官能化されたＰＥＧは、適当なＰＥＧ−モノアミンを色素の活性エステル（約１．２〜１．５当量）と共に用いて、実施例１と類似の方法で合成した。
【００９９】
ＰＥＧ４３ｋＤａコンジュゲートは、モノアミノ−ＰＥＧ２０Ｋを二官能性色素（Ｃｙ５−ビスＮＨＳエステル）と３．３３：１のモル比で反応させることで製造した。即ち、ＰＥＧ２０Ｋ（１００ｍｇ）を無水ＤＭＦ（３×）と共蒸発させ、無水ＤＭＦ（５ｍｌ）に再溶解した。この溶液にＮ−メチルモルホリン（４μｌ）を添加し、次いでＣｙ５−ビスＮＨＳの溶液（１４６μｌのＤＭＳＯ中０．３当量）を添加した。混合物を暗所で一晩撹拌し、次いでＨＰＬＣによって精製した。Ａｍｉｃｏｎ  ５Ｋ  ＭＷＣＯフィルターを用いて純粋画分を濃縮した。
【０１００】
実施例３：スクリーニングモデル
すべての細胞株はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、マナサス、米国ヴァージニア州）から入手し、推奨された通りに培養した。１３７６２  ＭａｔＢＩＩＩ（ラット乳腺腺癌、ＡＴＣＣ  ＃ＣＲＬ−１６６６）細胞株は、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補ったＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＃１０５６４−０１１）中で培養した。細胞を空気：ＣＯ2（９５％：５％）の混合物中において３７℃でインキュベートした。細胞が８０％コンフルエンス以上に達した後、細胞を集め、計数し、注射のため１０×１０6個／ｍＬ培地に濃縮した。
【０１０１】
動物及びインビボ腫瘍モデル
それぞれ４〜８週齢の雌Ｆｉｓｃｈｅｒ  ３４４ラット又は重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスを用いてインビボ試験を実施した。動物は非蛍光食（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｓ社、カタログ＃ＴＤ．９７１８４）及び水を随意に与えると共に、標準の１２時間昼夜照明サイクル下で飼育した。２７番の注射針を用いて、１×１０6個の細胞（１００μＬ）を動物の乳房脂肪パッド中に直接正所的に注射した。７日間にわたりＭａｔＢＩＩＩ腫瘍を増殖（直径約１ｃｍ）させた後、動物に試験薬剤を注射してイメージングを行った。
【０１０２】
イメージング
２５０の利得で運動のアーティファクトを最小にするため、６０ｍｓの最短露光時間で動物の画像を取得した。解析ソフトウェアを用いて画像を解析した。マージンを自動的に選択し、マージンの外側の４１ピクセルのマージン領域をハイライトした。結果として、マージン及び腫瘍が画像のバックグラウンドから識別された。下記の式を用いてマージン／スキン比（ＭＳＲ）を算出する。
【０１０３】
【数１】
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図１は、様々な分子量のＰＥＧの効果を示している。各ＰＥＧの数値は薬剤の分子量を表している（即ち、ＰＥＧ３０Ｋは３０ｋＤａのＭＷを有している）。
【０１０４】
実施例４：色素の効果
さらに長い励起波長及び発光波長を有する様々な色素を、実施例１に記載したようにしてビス−ジアミノ−ＰＥＧ３１Ｋ主鎖にコンジュゲートした。ＭＳＲの結果を図２に示す。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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