(57)【要約】  本発明の目的は、認知学習異常を示す動物モデルの作製方法とその応用を提供することである。本発明によれば、分泌型ニューレグリン遺伝子を過剰発現する精神疾患モデル動物、その作製方法、その利用、並びに分泌型ニューレグリンを特異的に認識する抗体を含む精神疾患の診断薬が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の何れかの塩基配列から成る分泌型ニューレグリン遺伝子。
（１）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列；又は
（２）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列であって、統合失調症様認知障害に関与する分泌型ニューレグリンをコードする塩基配列。
【請求項２】
以下の何れかの塩基配列から成る分泌型ニューレグリン遺伝子。
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列；又は
（２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列であって、統合失調症様認知障害に関与する分泌型ニューレグリンをコードする塩基配列。
【請求項３】
以下の何れかのアミノ酸配列から成る分泌型ニューレグリン。
（１）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列；又は
（２）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列あって、統合失調症様認知障害に関与する分泌型ニューレグリンを構成するアミノ酸配列
【請求項４】
請求項３に記載の分泌型ニューレグリンを特異的に認識する抗体を含む、精神疾患の診断薬。
【請求項５】
請求項３に記載の分泌型ニューレグリンを特異的に認識する抗体を用いて分泌型ニューレグリンを検出することを含む、精神疾患の診断方法。
【請求項６】
発達期の幼若非ヒト哺乳動物にニューレグリン１(NRG1)又はそれをコードする遺伝子を投与することを含む、持続的な脳機能異常を呈する認知学習障害を誘発した非ヒト哺乳動物を作製する方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法により作製した非ヒト哺乳動物。
【請求項８】
請求項７に記載の非ヒト哺乳動物を、認知学習障害のモデルとして使用する方法。
【請求項９】
発達後の非ヒト哺乳動物にニューレグリン１(NRG1)又はそれをコードする遺伝子を投与することを含む、急性の脳機能異常を呈する認知学習障害を誘発した非ヒト哺乳動物を作製する方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法により作製した非ヒト哺乳動物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の非ヒト哺乳動物を、認知学習障害のモデルとして使用する方法。
【請求項１２】
請求項１又は２に記載のニューレグリン遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１３】
ニューレグリン１(NRG1)の遺伝子を過剰発現させることにより、脳機能異常を誘導し、認知学習障害を誘発している、NRG1遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１４】
請求項１２又は１３に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を、認知学習障害のモデルとして使用する方法。
【請求項１５】
分泌型ニューレグリンを産生できないように変異をいれたニューレグリン１(NRG1)を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精神疾患モデル動物、その作製方法、及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
精神疾患の多くは、未だ生物学的な発症原因や病態が明らかではなく、難病の一つである。例えば、自閉症は500〜2500人に１例の割合で発症し、社会性忌避などの認知障害や学習障害などの精神遅延に代表される精神疾患であり、有効な治療薬はない。また統合失調症は、人口の0.7〜1.0％の人に発症し、日本でも数十万人の長期入院患者がいる。本疾患の主な症状は、妄想、幻覚、幻聴といった陽性症状に加えて、知覚異常といった認知障害や引きこもりや鬱症状といった陰性症状に至るまで、多様な精神的異常を伴う。現在のところ、その発症原因は解明されておらず、生物学的な病態の理解も不十分である。上記の通り、認知学習障害を伴う精神疾患に関する基礎医学は未知の部分が多い。【０００３】
統合失調症は青年期から壮年期にかけて知覚・思考・感情・行動面に特徴的な症状で発病し、多くは慢性に経過し、社会適応に多様な困難を生じる精神障害である。精神症状について陽性症状（幻覚、妄想、減弱思考、緊張症状、奇異な行動など）と、陰性症状（感情の平板化、意欲低下、社会的引きこもりなど）の分類がある。社会的には、本疾患の病態の特殊性から早期発見、治療、社会復帰活動、再発予防といった一貫した包括的治療体系の確立が望まれている。【０００４】
統合失調症の陽性症状を改善する治療薬としては、神経伝達物質、ドパミンやセロトニンと拮抗する薬物が有用だとされている。多くの場合、これらの薬物は長期投与が不可欠であり、具体的にはフェノチアジン系化合物、チオキサンチン系化合物、ブチロフェノン系化合物、ベンザアミド系化合物が患者に多用されている。これらの薬物の作用機序の研究に加えて、アンフェタミンを代表とする覚せい剤が、人において統合失調症の陽性症状を誘起することから、ドパミンの作用異常により統合失調症が発症するという仮説が提唱されている。また、これらの事実より、アンフェタミンを慢性投与した動物を統合失調症のモデルとして使用する場合もある。同様に、ヒトにおいて幻覚誘発作用のある薬物も、動物に投与することで統合失調症モデル動物として利用されることがある。例えば、記憶や学習の脳生理機能に関連するといわれているグルタミン酸受容体の阻害剤であるフェンサイクリジンの投与動物が挙げられる。【０００５】
これら従来の統合失調症動物モデルでは、薬物の投与に依存した一過性の脳機能異常を呈するものが多く、ヒトで見られるような慢性的な統合失調症の病態を必ずしも再現しているとはいえなかった。また、ドパミン拮抗薬の作用も、陽性症状の改善が主たるものであり、陰性症状の治療薬は極めて限られていた。その原因としては、適切な統合失調症の動物モデルが存在しなかったことが挙げられる。【０００６】
自閉症については、統合失調症にくらべ遺伝性が高いものの、その原因については未知の部分が多い。動物では胎児の母体に繰り返し強いストレスを付加することにより、出生した子供に、類似の認知学習障害が出るとの報告がある。最近、脳幹部のセロトニン神経の発達異常性が論議されている。その意味で、統合失調症と同様、脳神経の発達機能障害であるとの仮説が有力であるが、有効な治療薬はほとんどない。【０００７】
多機能性神経栄養因子であるニューレグリン（NRG）１は、アイスランドにおける連鎖解析により統合失調症との関連が報告され、その後、様々な角度からの基礎研究と臨床研究から統合失調症関連遺伝子の最有力候補と考えられている。ニューレグリンの機能は神経系だけでなく、初期発生や心臓をはじめとする末梢組織の形態形成に重要であり、受容体が原細胞性腫瘍遺伝子であることもあり、癌の分野でよく研究されてきた（Fischbach GD and Rosen KM: ARIA: a neuromuscular junction neuregulin.  Annu. Rev. Neurosci. 20: 429-458, 1997；及びFalls D L: Neuregulins: functions, forms, and signaling strategies. Exp Cell Res 284: 14-30, 2003）。神経系に限れば、神経伝達物質受容体の活性を調節する遺伝子、或いはグリア細胞成長因子として、異なる研究テーマをもつ研究室が個別に異なる機能をもつ蛋白をクローニングしたところ、それらが全て同一遺伝子であることが判った（Buonanno A and Fischbach GD: Neuregulin and ErbB receptor signaling pathways in the nervous system. Cur.r Opin. Neurobiol.11: 287-296, 2001；及びOzaki M: Neuregulins and the shaping of synapses. Neuroscientist 7: 146-154, 2001）。報告されている遺伝子としては、NRG1-4があり、その機能の多様性と特殊性は特にNRG1でよく研究されている（Fischbach GD and Rosen KM: ARIA: a neuromuscular junction neuregulin.  Annu. Rev. Neurosci. 20: 429-458, 1997；Falls D L: Neuregulins: functions, forms, and signaling strategies. Exp Cell Res 284: 14-30, 2003；Buonanno A and Fischbach GD: Neuregulin and ErbB receptor signaling pathways in the nervous system. Cur.r Opin. Neurobiol.11: 287-296, 2001；及びOzaki M: Neuregulins and the shaping of synapses. Neuroscientist 7: 146-154, 2001）。NRG１は更にタイプIからタイプIIIまであり、タイプIとタイプIIは、Epidermal growth factor (EGF)様ドメインとImmunoglobulin(Ig)様ドメインをもち、タイプIIIはEGF様ドメインとシステインを多く含むドメインを持つ（Falls D L: Neuregulins: functions, forms, and signaling strategies. Exp Cell Res 284: 14-30, 2003；及びBuonanno A and Fischbach GD: Neuregulin and ErbB receptor signaling pathways in the nervous system. Cur.r Opin. Neurobiol.11: 287-296, 2001）。更にα型とβ型に別れ、中枢神経系では主にNRGβが発現している。その受容体はErbBと呼ばれるチロシンキナーゼのサブファミリーであり、４種類からなる。ErbB１はEGF受容体であり、基本的にはErbB２〜４がNRG受容体であり、ホモダイマ？かヘテロダイマーを形成し、受容体として機能する。NRGの基本的な定義は、ErbB3かB4に結合し、最低限ErbB2をリン酸化できる分子をいう(ErbB3には自己リン酸化能力はない)。【０００８】
特に、統合失調症の臨床例をよく説明できるNRGの機能としては、シナプスでの可塑性、ミエリン形成、神経細胞移動、青春期における内分泌系の制御とホルモン産生と放出制御が挙げられる（Kennedy JL, Farrer LA, Andreasen NC et al: The genetics of adult-onset neuropsychiatric disease: complexities and conundra Science302:822-6, 2003；Stefansson H, Steinthorsdottir V, Thorgeirsson TE et al: Neuregulin 1 and schizophrenia. Ann Med 36: 62-71, 2004；及びCorfas G, Roy K and Buxbaum JD: Neuregulin 1-erbB signaling and the molecular/cellular basis of schizophrenia. Nat Neurosci 7:575-80, 2004）。最近では、ヒト脳でのNRG1の発現と蛋白の分布が詳しく解析され、海馬、大脳皮質、脳幹、小脳と幅広い領域で蛋白発現が観察され、基礎研究により示されたNRG機能をサポートするデータが報告されている（Hashimoto R, Straub RE, Weickert CS et al: Expression analysis of neuregulin-1 in the dorsolateral prefrontal cortex in schizophrenia. Mol Psychiatry 9:299-307, 2004；Law AJ, Weickert CS, Hyde TM et al: Neuregulin-1 (NRG-1) mRNA and protein in the adult human brain. Neuroscience127:125-36, 2004；及びHarrison PJ and Weinberger DR: Schizophrenia genes, gene expression, and neuropathology: on the matter of their convergence. Mol Psychiatry Jul 20, 1-29, 2004）。【０００９】
ここでは、特にシナプスの可塑性とNRG1との関係を述べる。NRG1はカリウムチャンネルやナトリウムチャンネルの活性を制御したり、NMDA受容体、GABAA受容体、アセチルコリン受容体サブユニットの発現を調節している（Fischbach GD and Rosen KM: ARIA: a neuromuscular junction neuregulin.  Annu. Rev. Neurosci. 20: 429-458, 1997； Falls D L: Neuregulins: functions, forms, and signaling strategies. Exp Cell Res 284: 14-30, 2003；Buonanno A and Fischbach GD: Neuregulin and ErbB receptor signaling pathways in the nervous system. Cur.r Opin. Neurobiol.11: 287-296, 2001；及びOzaki M: Neuregulins and the shaping of synapses. Neuroscientist 7: 146-154, 2001）。統合失調症においては、これまでグルタミン酸受容体、特にNMDA受容体の関与が多数報告されている。NMDA 受容体には、NR1, NR2 (A, B, C, D), NR3のサブユニットが存在し、NR1とNR2の組み合わせにより機能的受容体を形成する。NR3はNR3だけでは機能せず、NR1/NR2との組み合わせにより受容体として働く。NMDA受容体は異なるサブユニットの組み合わせにより、チャンネル活性が異なり、その多様性が、発生発達の方向性、シナプスの可塑性、疾患との関与を決定付けている（Cull-Candy S, Brickley S and Farrant M: NMDA receptor subunits: diversity, development and disease Curr Opin Neurobiol. 11:327-335, 2001）。最近では、NMDA受容体と各サブユニットに結合する後シナプス細胞内結合蛋白（PSD95、PSD93, SAP102, NF-Lなど)の分布も統合失調症患者の死後脳を使って報告されている（Mueller HT, Haroutunian V, Davis KL et al: Expression of the ionotropic glutamate receptor subunits and NMDA receptor-associated intracellular proteins in the substantia nigra in schizophrenia Mol Brain Res 121: 60-69, 2004）。【００１０】
NRG受容体ErbBもまた後シナプス細胞内裏打ち蛋白と結合し、ErbB4のC末端はPSD95, SAP97とSAP102に ErbB2はErbin, PICK1とPDZドメインを介して結合する（ErbB3に結合する蛋白は今のところ見つかっていない）（Huang YZ, Wang Q, Won S, et al: Compartmentalized NRG signaling and PDZ domain-containing proteins in synapse structure and function. Int J Dev Neurosci 20:173-85, 2002；Huang YZ, Wang Q, Xiong et al : Erbin is a protein concentrated at postsynaptic membranes that interacts with PSD-95. J Biol Chem 276:19318-26, 2001；及びHuang YZ, Won S, Ali DW et al: Regulation of neuregulin signaling by PSD-95 interacting with ErbB4 at CNS synapses. Neuron 26:443-55, 2000）。また、小脳顆粒細胞の実験では、NMDA受容体サブユニットの発現調節には、NMDA受容体とNRG受容体（ErbB2とErbB4）の両経路の活性化が必要であった（Ozaki M, Sasner M, Yano R et al: Neuregulin induces expression of an NMDA receptor subunit. Nature 39: 691-694, 1997； Ozaki M, Tohyama K, Kishida H et al: Roles of neuregulin in synaptogenesis between mossy fibers and cerebellar granule cells. J. Neurosci. Res 59: 612-623, 2000；及びOzaki M, Kishigami S and Yano R: Expression of receptors for neuregulins, ErbB2, ErbB3 and ErbB4 in developing mouse cerebellum. Neurosci. Res 30: 351-354, 1998）。上記の結果は、NRG-ErbB経路はNMDA受容体のモジュレーターとして働き、PSD95をはじめとする後シナプス細胞内結合蛋白との結合の組み合わせにより、mitogen-activated protein kinase (MAPK)やphosphatidylinositol-3-0H kinase (PI3K)経路を活性化するなど、異なる細胞内伝達系の活性化と抑制を引き起こし、最終的にNMDA受容体やGABAA受容体の発現調節を行い、シナプスにおける可塑性を制御している可能性を示唆している（Ozaki M: Neuregulins and the shaping of synapses. Neuroscientist 7: 146-154, 2001；Ozaki M: Profiling for patterned neuronal impulses and the roles of neuregulin, NeuroSignals 11: 158-174, 2002；及びOzaki M: Analysis of patterned neuronal impulses and function of neuregulin, NeuroSignals 11: 191-196, 2002）。【００１１】
また、NRG1には膜貫通型と分泌型のアイソフォームがある。膜貫通型NRGには細胞内ドメインとしてNRG間でよく保存されている３〜４個のドメイン構造が存在する（Ozaki M, Tohyama K, Kishida H et al: Roles of neuregulin in synaptogenesis between mossy fibers and cerebellar granule cells. J. Neurosci. Res 59: 612-623, 2000）。本発明者の実験では、膜貫通型NRGはある特異的な電気刺激パターン（特異的な周波数；50Hz）により、膜貫通ドメインのすぐ細胞外の部分で高率よく切り出され、放出される（Ozaki M. Itoh K, Miyakawa Y et al: Protein processing and releases of neuregulin-1 are regulated in an activity-dependent manner. J Neurochem: inpress, 2004）。また、切り出される際には、細胞内ドメインも必要であり、残った細胞内ドメインは核に移行し機能する（Bao J, Wolpowitz D, Role LW et al: Back signaling by the Nrg-1 intracellular domain. J. Cell Biol 161:1133-1141, 2003）。このことは、神経細胞がもつ神経インパルスの周波数依存的なNRGの放出量に違いがあることを示しており、神経インパルスを変化させる環境要因はシナプスの可塑性を変化させうることを示している。分泌型NRGの産生と放出は、シナプスの可塑性に関与するばかりでなく、ミエリン形成に際にも重要であると言う報告もある。統合失調症の発症経過を考えた場合、遺伝学的要因と同等にあるいはそれ以上に環境要因により支配を受ける疾患と考えられる。また、発達過程に於いても環境要因により何らかの影響を受け、その結果として神経の可塑性（神経回路形成と発達も含め）に個人差が生じ、成人における発病までの閾値に違いが観られる疾患と捉えることもできる。本発明者の研究結果は、NRG蛋白のプロセッシング機構と分泌型NRG産生、放出と発病との関係は、遺伝学的要因だけでなく、環境要因による影響も受けていることを示しており、複雑な統合失調症発症機構を矛盾なく説明できる可能性をもっている。【００１２】
特表２００４−５２７２０３号公報には、NRGが精神疾患に関与していることが示唆されているが、疾患の発症に関与している分泌型NRGの構造については未だ不明であった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、認知学習異常を示す動物モデルの作製方法とその応用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、分泌型ニューレグリンの産生及び放出と高次機能との関係を明らかにするために、（１）分泌型NRGをラットの末梢および脳内に投与することによって統合失調症様認知障害を示すかどうか、（２）分泌型NRGを大量に産生するトランスジェニックマウスと分泌型NRGを産生できない変異型NRGを大量に発現させたトランスジェニックマウスを作成しその行動を観察し、更にNRGノックアウトマウスとも比較することによって分泌型NRGの産生放出と統合失調症様認知障害との関係を明らかにした。その結果、NRGノックアウトマウスと分泌型NRGを産生できない変異型NRGを大量に発現させたトランスジェニックマウスでは、統合失調症様認知障害を示す指標の一つである驚愕反応に大きな違いは観られなかったが、分泌型NRGを投与したラットおよび分泌型NRGを大量に産生するトランスジェニックマウスでは驚愕反応に異常が観られた。これらの結果は、分泌型NRGが産生及び放出される効率と認知障害との間の関係を示すものである。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。【００１５】
即ち、本発明によれば、以下の何れかの塩基配列から成る分泌型ニューレグリン遺伝子が提供される。
（１）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列；又は
（２）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列であって、統合失調症様認知障害に関与する分泌型ニューレグリンをコードする塩基配列。【００１６】
本発明によればさらに、以下の何れかの塩基配列から成る分泌型ニューレグリン遺伝子が提供される。
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列；又は
（２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列であって、統合失調症様認知障害に関与する分泌型ニューレグリンをコードする塩基配列。【００１７】
本発明によればさらに、以下の何れかのアミノ酸配列から成る分泌型ニューレグリンが提供される。
（１）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列；又は
（２）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列あって、統合失調症様認知障害に関与する分泌型ニューレグリンを構成するアミノ酸配列【００１８】
本発明によればさらに、本発明の分泌型ニューレグリンを特異的に認識する抗体を含む、精神疾患の診断薬が提供される。【００１９】
本発明によればさらに、本発明の分泌型ニューレグリンを特異的に認識する抗体を用いて分泌型ニューレグリンを検出することを含む、精神疾患の診断方法が提供される。【００２０】
本発明によればさらに、発達期の幼若非ヒト哺乳動物にニューレグリン１(NRG1)又はそれをコードする遺伝子を投与することを含む、持続的な脳機能異常を呈する認知学習障害を誘発した非ヒト哺乳動物を作製する方法が提供される。【００２１】
本発明によればさらに、上記方法により作製した非ヒト哺乳動物が提供される。
本発明によればさらに、上記の非ヒト哺乳動物を、認知学習障害のモデルとして使用する方法が提供される。【００２２】
本発明によればさらに、発達後の非ヒト哺乳動物にニューレグリン１(NRG1)又はそれをコードする遺伝子を投与することを含む、急性の脳機能異常を呈する認知学習障害を誘発した非ヒト哺乳動物を作製する方法が提供される。【００２３】
本発明によればさらに、上記方法により作製した非ヒト哺乳動物が提供される。
本発明によればさらに、上記の非ヒト哺乳動物を、認知学習障害のモデルとして使用する方法が提供される。【００２４】
本発明によればさらに、本発明のニューレグリン遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物が提供される。
本発明によればさらに、ニューレグリン１(NRG1)の遺伝子を過剰発現させることにより、脳機能異常を誘導し、認知学習障害を誘発している、NRG1遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物が提供される。【００２５】
本発明によればさらに、上記のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を、認知学習障害のモデルとして使用する方法が提供される。
本発明によればさらに、分泌型ニューレグリンを産生できないように変異をいれたニューレグリン１(NRG1)を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
（１）本発明の遺伝子
本発明の遺伝子は、以下の何れかの塩基配列から成る分泌型ニューレグリン遺伝子である。
（１）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列；又は
（２）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列であって、統合失調症様認知障害に関与する分泌型ニューレグリンをコードする塩基配列。【００２７】
本発明の遺伝子の具体例としては、以下の何れかの塩基配列から成る分泌型ニューレグリン遺伝子が挙げられる。
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列；又は
（２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列であって、統合失調症様認知障害に関与する分泌型ニューレグリンをコードする塩基配列。【００２８】
本発明において、「分泌型ニューレグリン」とは、膜貫通型ニューレグリンからタンパク質分断により産出され、細胞外へ分泌される可溶性タンパク質のことを言う。また、「統合失調症様認知障害に関与する分泌型ニューレグリン」とは、当該分泌型ニューレグリンを生体内で過剰に発現させた場合に、統合失調症様認知障害を引き起こすことができる分泌型ニューレグリンを意味する。統合失調症様認知障害は、本明細書中の実施例に記載した評価方法により評価することができる。【００２９】
本発明の遺伝子は、例えば、ヒト、マウス、ハムスター、モルモット、ニワトリ、ラット、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシなどの哺乳動物から単離できる。【００３０】
本明細書で言う「１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から４０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。【００３１】
上記したような配列表の配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列は、例えば、配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとして単離することができる。ここで言う「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０MのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989、（以下、モレキュラークローニング第２版と略す）又はCurrent Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。【００３２】
本発明の遺伝子の取得方法は特に限定されない。本明細書中の配列表の配列番号１および２に記載した塩基配列及びアミノ酸配列の情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いてヒトやマウスなどの哺乳動物のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより本発明の遺伝子を単離することができる。ｃＤＮＡライブラリーは、本発明の遺伝子を発現している細胞から常法により作製することができる。【００３３】
また、ＰＣＲ法により本発明の遺伝子を取得することもできる。上記した哺乳動物由来の染色体ＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１に記載した塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを用いてＰＣＲを行うことができる。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応工程を1サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができる。次いで、増幅されたＤＮＡ断片を、大腸菌等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。【００３４】
上記したプローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、モレキュラークローニング第２版、又はカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。【００３５】
また、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列であって、統合失調症様認知障害に関与する分泌型ニューレグリンをコードする塩基配列、又は配列表の配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列であって、統合失調症様認知障害に関与する分泌型ニューレグリンをコードする塩基配列を有する遺伝子（以下、これらの遺伝子を変異遺伝子と称する）については、配列番号１及び２に記載の塩基配列およびアミノ酸配列の情報に基づいて、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。【００３６】
例えば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。【００３７】
（２）本発明のタンパク質
本発明のタンパク質は、以下の何れかのアミノ酸配列から成る分泌型ニューレグリンである。
（１）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列；又は
（２）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列あって、統合失調症様認知障害に関与する分泌型ニューレグリンを構成するアミノ酸配列【００３８】
本明細書で言う「１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。【００３９】
本発明のタンパク質の取得方法は特に制限されず、化学合成により合成したタンパク質でもよいし、遺伝子組み換え技術により作製した組み換えタンパク質でもよい。組み換えタンパク質を作製する場合には、先ず、当該タンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を取得する。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明のタンパク質を産生することができる。発現系でのタンパク質の発現について以下に説明する。【００４０】
先ず、本発明の遺伝子を適当な発現ベクターに挿入する。発現ベクターにおいて本発明の遺伝子は、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモーターは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。【００４１】
宿主が哺乳動物細胞である場合、哺乳動物細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＳＶ４０プロモータ、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモータ、またはアデノウイルス２主後期プロモータなどがある。宿主が昆虫細胞である場合、昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ、またはバキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。また、酵母宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、ＴＰＩ１プロモータ、ＡＤＨ2-4cプロモータなどが挙げられる。糸状菌細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＡＤＨ３プロモータまたはｔｐｉＡプロモータなどがある。【００４２】
本発明の遺伝子を含む発現ベクターは、適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。発現ベクターを導入するための宿主細胞は、本発明の遺伝子を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。【００４３】
細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevis1ae)またはサッカロマイセス・クルイベリ(Ｓaccharomyces kluyveri)等が挙げられる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。【００４４】
上記の形質転換体は、導入された遺伝子の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、本発明のタンパク質を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いればよい。例えば、本発明のタンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。【００４５】
（３）本発明の抗体と診断薬
本発明で用いる抗体は、上記（２）に記載した本発明の分泌型ニューレグリンを特異的に認識する抗体である。本発明は、上記抗体を含む精神疾患の診断薬、並びに上記抗体を用いて分泌型ニューレグリンを検出することを含む精神疾患の診断方法を提供する。【００４６】
本発明の抗体は、ニューレグリン分子のなかでも分泌型ニューレグリンを特異的に認識する。好ましい態様によれば、本発明の抗体は、Glu-Leu-Tyr-Gln及び／又はGlu-Leu-Tyr-Gln-Lysのアミノ酸配列を認識する。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。【００４７】
本発明の抗体の作製方法について先ず説明する。
本発明のニューレグリンを認識するポリクローナル抗体は、ニューレグリンまたはその断片から成るペプチドを抗原として哺乳動物を免疫感作し、該哺乳動物から血液を採取し、採取した血液から抗体を分離・精製することにより得ることができる。例えば、マウス、ハムスター、モルモット、ニワトリ、ラット、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシ等の哺乳動物を免疫することができる。免疫感作の方法としては、例えばJ.ASSOC.OFF.ANAL.CHEM 70(6) 1025-1027 (1987)等に記載されるW.H.Newsome 等の通常の免疫感作の方法を用いて、例えば抗原を１回以上投与することにより行うことができる。【００４８】
抗原としては、分泌型ニューレグリンのＣ末端を含む短いペプチド（5merあるいは6mer）、または該ペプチドにシステイン残基を付加したペプチドを用いることが好ましい。例えば、Cys-Glu-Leu-Tyr-Gln（配列番号３）及びCys-Glu-Leu-Tyr-Gln-Lys（配列番号４）などのペプチドが挙げられる。なお、抗原ペプチドの長さは5merと6merのどちらでも同様の結果が得られており、標的タンパク質の１次構造の動物種差がある場合や、類似した切断配列が存在する場合などに適当な方を選べばよい。【００４９】
抗原投与は、例えば、７から３０日、特に１２から１６日間隔で２または３回投与することが好ましい。投与量は１回につき、例えば抗原約０．０５から２ｍｇ程度を目安とすることができる。投与経路も特に限定されず、皮下投与、皮内投与、腹膜腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与等を適宜選択することができるが、静脈内、腹膜腔内もしくは皮下に注射することにより投与することが好ましい。また、抗原は適当な緩衝液、例えば完全フロイントアジュバント、ＲＡＳ〔MPL(Monophosphoryl Lipid A)＋TDM(Synthetic Trehalose Dicorynomycolate)+CWS(Cell Wall Skeleton) アジュバントシステム〕 、水酸化アルミニウム等の通常用いられるアジュバントを含有する適当な緩衝液に溶解して用いることができるが、投与経路や条件等によっては、上記したアジュバントは使用しない場合もある。ここでアジュバントとは抗原とともに投与したとき、非特異的にその抗原に対する免疫反応を増強する物質を意味する。【００５０】
免疫感作した哺乳動物を０．５から４ケ月間飼育した後、該哺乳動物の血清を耳静脈等から少量サンプリングし、抗体価を測定する。抗体価が上昇してきたら、状況に応じて抗原の投与を適当回数実施する。例えば１００μｇ〜１０００μｇの抗原を用いて追加免疫を行なう。最後の投与から１〜２ケ月後に免疫感作した哺乳動物から通常の方法により血液を採取して、該血液を、例えば遠心分離、硫酸アンモニウムまたはポリエチレングリコールを用いた沈澱、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等のクロマトグラフィー等の通常の方法によって分離・精製することにより、ポリクローナル抗血清として、本発明のニューレグリンを認識するポリクローナル抗体を得ることができる。なお血清は、たとえば、５６℃で３０分間処理することによって補体系を不活性化してもよい。【００５１】
また、本発明のニューレグリンを認識する抗体のグロブリンタイプは特に限定されず、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ等が挙げられる。【００５２】
ニューレグリンを認識する本発明のモノクローナル抗体を得るためには、モノクローナル抗体を産生する細胞株を取得することが好ましい。本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞株は特に制限されないが、例えば、抗体産生細胞とミエローマ細胞株との細胞融合によりハイブリドーマとして得ることができる。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、以下のような細胞融合法によって得ることができる。【００５３】
抗体産生細胞としては、免疫された動物からの脾細胞、リンパ節細胞、Ｂリンパ球等を使用する。抗原としては、ポリクローナル抗体の作製に関して上述した場合と同様に、ニューレグリン又はその部分ペプチドを使用する。【００５４】
免疫される動物としてはマウス、ラット等が使用され、これらの動物への抗原の投与は常法に従って行う。例えば完全フロインドアジュバント、不完全フロインドアジュバントなどのアジュバントと抗原との懸濁液もしくは乳化液を調製し、これを動物の静脈、皮下、皮内、腹腔内等に数回投与することによって動物を免疫化する。免疫化した動物から抗体産生細胞として例えば脾細胞を取得し、これとミエローマ細胞とをそれ自体公知の方法（G.Kohler et al .,Nature,256 495(1975)）により融合することにより、ハイブリドーマを作製することができる。【００５５】
細胞融合に使用するミエローマ細胞株としては、例えばマウスではＰ３Ｘ６３Ａｇ８、Ｐ３Ｕ１株、Ｓｐ２／０株などが挙げられる。細胞融合を行なうに際しては、ポリエチレングリコール、センダイウイルスなどの融合促進剤を用い、細胞融合後のハイブリドーマの選抜にはヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地を常法に従って使用することができる。【００５６】
細胞融合により得られたハイブリドーマは限界希釈法等によりクローニングする。更に、ニューレグリンを用いた酵素免疫測定法によりスクリーニングを行なうことにより、本発明のニューレグリンを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生する細胞株を得ることができる。【００５７】
このようにして得られたハイブリドーマから目的とするモノクローナル抗体を製造するには、通常の細胞培養法や腹水形成法により該ハイブリドーマを培養し、培養上清あるいは腹水から該モノクローナル抗体を精製すればよい。培養上清もしくは腹水からのモノクローナル抗体の精製は、常法により行なうことができる。例えば、硫安分画、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて使用できる。【００５８】
また、上記したような各種抗体の断片も本発明の範囲内である。抗体の断片としては、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント等が挙げられる。【００５９】
本発明のニューレグリンを認識する抗体は、標識抗体として使用することもできる。即ち、上記のようにして作製した本発明の抗体はさらに標識して使用することもできる。標識抗体を作製することにより、ニューレグリンの定量を行うことができる。
抗体の標識の種類及び標識方法は当業者に知られているものから適宜選択することができる。【００６０】
標識として酵素を使用する場合には、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、炭酸アンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、マレートデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ等を標識として使用することができる。これらの酵素を本発明の抗体又はその断片（Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント等）に標識する方法としては、酵素の糖鎖を過ヨウ素酸で酸化し、生成したアルデヒド基に該抗体などのアミノ酸を結合させる方法や、酵素にマレイミド基あるいはピリジルスルフィド基等を導入し、該抗体のＦａｂ’フラグメントに存在するチオール基と結合させる方法等を挙げることができる。【００６１】
標識として酵素を使用する場合、試験試料と標識抗体とをインキュベートした後、遊離した標識抗体を洗浄して除去してから、上記の標識酵素の基質を作用させて発色等で反応を測定することによって標識抗体を検出することができる。例えば、ペルオキシダーゼで標識される場合には、基質として過酸化水素、発色試薬としてジアミノベンジジンまたはＯ−フェニレンジアミンと組み合わさって褐色または黄色を生じる。グルコースオキシダーゼで標識される場合には、基質として、たとえば２，２’ −アシド−ジ−（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）等を用いる。【００６２】
標識として蛍光色素を使用する場合には、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）又はＴＲＩＴＣ（テトラメチルローダミンＢイソチオシアネート）等の蛍光色素で本発明の抗体又はその断片を標識することができる。  本発明の抗体又はその断片と蛍光色素との結合は常法によって行うことができる。【００６３】
標識として呈色標識物質を使用する場合には、例えば、コロイド金属および着色ラテックスなどを標識として使用できる。コロイド金属の代表例としては、金ゾル、銀ゾル、セレンゾル、テルルゾルおよび白金ゾルなどのそれぞれの分散粒子である金属コロイド粒子を挙げることができる。コロイド金属の粒子の大きさは、通常は、直径３〜６０nm程度とされる。また、着色ラテックスの代表例としては、赤色および青色などのそれぞれの顔料で着色されたポリスチレンラッテクスなどの合成ラテックスを挙げることができる。ラテックスとして天然ゴムラテックスのような天然ラッテクスを使用することができる。着色ラテックスの大きさは、直径数十nm〜数百ｎｍ程度から選択することができる。これらの呈色標識物質は市販品をそのまま使用することができるが、場合によりさらに加工し、または、それ自体公知の方法で製造することもできる。【００６４】
本発明の抗体又はその断片と呈色標識物質との結合は常法によって行うことができる。例えば、呈色標識物質が金ゾルの分散粒子である金コロイド粒子の場合には、通常は、抗体と金ゾルとを室温下で混合することによって両者を物理的に結合することが可能である。【００６５】
なお、標識としては、上記以外にもアフィニティー標識（例えば、ビオチン等）、又は、同位体標識（例えば、125Ｉ等）等を使用することもできる。【００６６】
上記した本発明のニューレグリンを認識する抗体又はその断片の標識抗体又はその断片は本発明の範囲内であり、更に、上記した標識抗体又はその断片をＰＢＳ(リン酸緩衝液)等の緩衝液中に含有する反応試薬も本発明の範囲内である。該試薬には、当業者に周知のゼラチン等の添加剤が含まれていてもよい。さらに、本発明の反応試薬を構成要素として含み、目的とする検出方法に応じて、その他の抗体及び／又は各種測定用器具、緩衝液及び試薬等から成る各種検出（測定）用キットも本発明の範囲内である。【００６７】
本発明の抗体を用いるニューレグリンの免疫測定方法としては、例えば酵素免疫測定法、ラジオイムノアッセイ、蛍光免疫測定法、発光免疫測定法等を例示することができる。酵素免疫測定法においては、本発明の抗体を不溶性担体に結合させて抗体結合不溶性担体を調製し、この抗体結合不溶性担体を用いた、いわゆるサンドイッチ酵素免疫測定法を行なうこともできる。【００６８】
本発明の標識抗体を用いた酵素抗体法、免疫組織染色法、免疫ブロット法、直接蛍光抗体法又は間接蛍光抗体法等の分析は当業者に周知の方法で行なうことができ、その実験条件も当業者ならば適宜選択することができる。【００６９】
本発明の分泌型ニューレグリンを特異的に認識する抗体を用いることにより、生体試料又は組織中において、分泌型ニューレグリンを検出又は測定することができ、これにより精神疾患（特に、認知学習障害など）（例えば、統合失調症、自閉症など）を診断することができる。【００７０】
本発明の分泌型ニューレグリンを特異的に認識する抗体を用いた分泌型ニューレグリンの検出又は測定は、上記の通り酵素免疫測定法、ラジオイムノアッセイ、蛍光免疫測定法、発光免疫測定法などにより行うことができ、より具体的には、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫沈降、スロット或いはドットブロットアッセイ、免疫組織染色、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ、アビジン−ビオチン又はストレプトアビジン−ビオチン系を用いるイムノアッセイなどにより行うことができ、これらの分析は当業者に周知の方法である。【００７１】
例えば、ＥＬＩＳＡは、サンドイッチＥＬＩＳＡ法により行うこともできる。サンドイッチＥＬＩＳＡ法では、ＥＬＩＳＡ用のプレートにあらかじめ本発明の分泌型ニューレグリンを特異的に認識する抗体をコートしておき、試料中の分泌型ニューレグリンをプレート上にトラップする。よく洗浄した後に、トラップされた分泌型ニューレグリンを、分泌型ニューレグリン中の別のエピトープを認識することができる抗ニューレグリン抗体と反応させる。２次抗体としてホースラディッシュ・パーオキシダーゼでラベルした抗ウサギIgGを反応させる。発色基質を加えて発色させ、その濃度を吸光光度計を用いて測定する。あらかじめ既知の濃度の分泌型ニューレグリンを含む標準試料によって検量線作製しておき、これによって定量値を算出することができる。【００７２】
また本発明によれば、本発明の分泌型ニューレグリンを特異的に認識する抗体を含む、精神疾患の診断薬を提供することができる。本発明の診断薬は、上記の抗体を有効成分として含み、精神疾患（特に、認知学習障害など）（例えば、統合失調症、自閉症など）を診断するために用いられる。ここで言う診断とは、精神疾患の発症可能性の診断、精神疾患の症状の度合いの診断、治療効果の診断、並びに予後の予測などを含むが、これらに限定されるものではない。一般に、抗体 を含む診断薬は種々の形態で調製できることが知られており、本発明の診断薬 も適宜の形態の製剤として調製可能である。例えば、凍結乾燥形態の製剤、又は溶液状の形態の製剤などとして提供することができる。本発明の診断薬は、その形態に応じて、適宜の製剤用添加物の１種又は２種以上を用いて調製することが可能である。製剤用添加物としては、例えば、pH調節剤、溶解補助剤、防腐剤、緩衝剤、賦形剤などを用いることができるが、これらに限定されることはない。【００７３】
（４）モデル動物とその利用
本発明ではさらに、発達期の幼若非ヒト哺乳動物にニューレグリン１(NRG1)又はそれをコードする遺伝子（例えば、上記（２）に記載した本発明のタンパク質又は上記（１）に記載した本発明の遺伝子）を投与することによって、持続的な脳機能異常を呈する認知学習障害を誘発した非ヒト哺乳動物を作製することができる。同様に、発達後の非ヒト哺乳動物にニューレグリン１(NRG1)又はそれをコードする遺伝子（例えば、上記（２）に記載した本発明のタンパク質又は上記（１）に記載した本発明の遺伝子）を投与することによって、急性の脳機能異常を呈する認知学習障害を誘発した非ヒト哺乳動物を作製することができる。このような方法により作製した非ヒト哺乳動物、並びに当該非ヒト哺乳動物を認知学習障害のモデルとして使用する方法も本発明の範囲内に含まれる。【００７４】
モデルとして用いる動物の種類は、哺乳類であれば任意の動物を使用することができ、例えば、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ネズミなどが挙げられる。通常は、これまでに多くのデータの蓄積があるネズミやサルなどが最適である。【００７５】
ニューレグリン１(NRG1)又はそれをコードする遺伝子を投与もしくは発現させる手段としては、大きく２つの方法が考えられる。第一の方法は、これらタンパク質を直接、動物の腹腔か皮下、脳内等に注入する方法である。この方法だと体内における当該タンパク質の代謝分解によりその体内濃度がすぐ低下するので、何日間かに渡って複数回、注射する必要がある。また、末梢からの投与では、その作用部位が脳であることから、まだ脳血液関門の未成熟な乳児期の投与が理想的である。通常、これらのタンパク質は、遺伝子組み換え法により細菌内で大量生成されたものか、もしくは、動物細胞から精製されたもの等を用いることができる。NRG1の投与量については、全身投与で動物１キログラム体重あたり0.25ｍｇ/1日ぐらい、もしくは脳内投与で脳重１キログラムあたり0.25ｍｇ/1日ぐらいが適当であるが、それ以上でもよい。ただし、ニューレグリン１(NRG1)については、体重低下作用を有しているので過度の投与は、極度の体重低下を起こしてしまう点で注意を要する。投与回数は、1回では不十分で、できれば３回もしくは３日間、またそれ以上の回数、日数が望ましい。【００７６】
第二の方法は、NRG１や類縁体タンパク質をコードする遺伝子を、近年の胚操作法により動物個体に導入し、脳を含むいずれかの臓器で強制遺伝子発現させることで、結果として当該タンパク質の投与を達成させるものである。この方法によると、一度、その遺伝子導入動物を作製すれば、その動物を系統維持するだけで、そのまま当該モデル動物となりうる。また、同様の目的で、ここに特定したタンパク因子が本来細胞内で活性化すると知られている細胞内情報伝達分子を、あたかもそのタンパク因子がその細胞に作用したかのように遺伝子操作等を用いて変異・改変した動物を発生工学的に作製し、代用することも可能である。【００７７】
同様に、適当な遺伝子発現ベクターにNRG1や類縁体タンパク質の遺伝子をクローニングして、それを生後の動物の脳内に遺伝子導入、発現させることで、結果的に当該タンパク質の投与と同等の効果をもたらすことも可能である。用いうる遺伝子発現ベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターなどが存在する。【００７８】
本手法により作製された認知学習の動物モデルは、自閉症患者や統合失調症患者に見られるような認知行動異常や学習障害を呈するようになる。その認知行動異常は、以下の方法により評価することができる。第一には、驚愕反応のプレパルスインヒビション、各種学習課題での認知遂行能力、動物運動量などの行動学的測定が、それに相当する。【００７９】
（５）本発明のトランスジェニック動物
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、ニューレグリン遺伝子（好ましくは、上記（１）に記載した本発明のニューレグリン遺伝子）が導入されていることにより、好ましくは当該遺伝子を脳で発現することを特徴とするトランスジェニック動物である。好ましくは、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、ニューレグリン１(NRG1)の遺伝子を過剰発現させることにより、脳機能異常を誘導し、認知学習障害を誘発していることを特徴とするものである、認知学習障害のモデルとして使用することができる。【００８０】
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物において、ニューレグリン遺伝子の発現量は、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ又は免疫組織染色などにより測定又は分析することができる。さらに、認知行動異常は、驚愕反応のプレパルスインヒビション、各種学習課題での認知遂行能力、動物運動量などの行動学的測定などにより評価することができる。【００８１】
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法は特に限定されないが、例えば、ニューレグリン遺伝子をプロモーターの制御下に組み込んだ発現ベクターを受精卵などに導入することにより作製することができる、以下、ニューレグリン遺伝子の導入により該遺伝子を過剰発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法について説明する。【００８２】
トランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製のために用いる導入遺伝子としては、ニューレグリン遺伝子（好ましくは、上記（１）に記載した本発明のニューレグリン遺伝子）を適当な哺乳動物用プロモーターの下流に連結した組換え遺伝子を使用することが好ましい。当該ニューレグリン遺伝子の下流には、所望により、ポリＡシグナルを連結することができる。【００８３】
導入遺伝子の構築に用いる哺乳動物用プロモーターの種類は特に制限されないが、ニューレグリン遺伝子を脳において発現させることができるプロモーターを用いることが好ましい。このようなプロモーターの具体例としては、ＥＦ１ａプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。その他にも、ニューレグリン遺伝子を所望の細胞で発現させることができるプロモーターであれば、各種哺乳動物（例えば、ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来遺伝子のプロモーターを適宜使用することができる。【００８４】
上記導入遺伝子に組み込まれたニューレグリン遺伝子が細胞内で発現すると、細胞内にニューレグリン遺が産生されるようになる。【００８５】
ニューレグリン遺伝子の導入によりニューレグリンを過剰に発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、例えば、非ヒト哺乳動物の受精卵にニューレグリン遺伝子を導入し、当該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物に移植し、当該非ヒト哺乳動物からニューレグリン遺伝子が導入された非ヒト哺乳動物を分娩させることにより作製することができる。【００８６】
非ヒト哺乳動物としては、例えば、マウス、ハムスター、モルモット、ラット、ウサギ等のげっ歯類の他、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、サル等を使用することができるが、作製、育成及び使用の簡便さなどの観点から見て、マウス、ハムスター、モルモット、ラット、ウサギ等のげっ歯類が好ましく、そのなかでもマウスが最も好ましい。【００８７】
本発明で用いるトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、胚芽細胞と、生殖細胞あるいは体細胞とが、非ヒト哺乳動物またはこの動物の先祖に胚発生の段階（好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）において外来性のニューレグリン遺伝子を含む組み換え遺伝子を導入することによって作出される。【００８８】
受精卵細胞段階におけるニューレグリン遺伝子の導入は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように維持されるように行うことができる。遺伝子導入後の作出動物の胚芽細胞において、ニューレグリン遺伝子が存在することは、作出動物の後代がすべてその胚芽細胞および体細胞のすべてにニューレグリン遺伝子が存在することを意味する。遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてにニューレグリン遺伝子を有する。【００８９】
本発明のトランスジェニック動物は、交配により遺伝子を安定に保持することを確認した後、当該遺伝子保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することができる。導入遺伝子を相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該遺伝子を過剰に有するように繁殖継代することができる。ニューレグリン遺伝子の発現部位を同定するためにはニューレグリン遺伝子の発現を個体、臓器、組織、細胞の各レベルで観察することができる。また、ニューレグリンに対する抗体を用いた酵素免疫検定法によりその発現の程度を測定することも可能である。【００９０】
以下、トランスジェニック非ヒト哺乳動物がトランスジェニックマウスの場合を例に挙げて具体的に説明する。ニューレグリン遺伝子をコードするｃＤＮＡをプロモーターの下流に含有する導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子をマウス受精卵の雄性前核にマイクロインジェクションし、得られた卵細胞を培養した後、偽妊娠雌性マウスの輸卵管に移植し、その後被移植動物を飼育し、産まれた仔マウスから前記ｃＤＮＡを有する仔マウスを選択することにより、本発明のトランスジェニックマウスを作製することができる。上記マウスの受精卵としては、例えば、１２９／ｓｖ、Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ３Ｈ、ＳＪＬ／Ｗｔ等に由来するマウスの交配により得られるものなら任意のものを使用できる。【００９１】
また、注入する導入遺伝子の数は受精卵１個当たり１００〜３０００分子が適当である。そしてまた、ｃＤＮＡを有する仔マウスの選択は、マウスの尻尾等よりＤＮＡを抽出し、導入したニューレグリン遺伝子をプローブとするドットハイブリダイゼーション法や、特異的プライマーを用いたＰＣＲ法等により行うことができる。【００９２】
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、ニューレグリンを過剰発現することを特徴とするものであり、認知学習障害のモデルとして有用である。【００９３】
また、上記した本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の一部としては、非ヒト哺乳動物の細胞、細胞内小器官、組織および臓器のほか、頭部、指、手、足、腹部、尾などが挙げられ、これらも全て本発明の範囲内に属する。【００９４】
本発明では、上記した本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を認知学習障害のモデルとして使用することにより、例えば、精神疾患の治療剤及び／又は予防剤のスクリーニングを行うことができる。即ち、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物（例えば、トランスジェニックマウスなど）に、被検物質を投与し、該トランスジェニック非ヒト哺乳動物の生理学的データを測定したり、認知行動の異常を評価することにより、該被検物質の精神疾患に対する治療効果や予防効果を評価することができる。【００９５】
あるいはまた、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、投与後におけるニューレグリンの発現状態、分泌型ニューレグリンの蓄積状態、並びに、投与した被験物質の生体内における動態を分析することなどにより、該被検物質の精神疾患に対する治療効果や予防効果を評価することもできる。【００９６】
すなわち、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を利用することにより、精神疾患の治療効果及び予防効果を評価することが可能であり、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、各種精神疾患の病態評価モデル動物として利用することができる。例えば、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いて、これらの病態回復および重篤程度を判定し、この疾患の治療方法の検討を行うことも可能である。【００９７】
さらにまた、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いることによって、ニューレグリンの発現と、上記疾病の進行度などを分析することにより、該疾患の発症・進行のメカニズムを解明することができる。【００９８】
本発明のスクリーニング方法に供される被験物質としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。またペプチドライブラリーや化合物ライブラリーなど、多数の分子を含むライブラリーを被験物質として使用することもできる。【００９９】
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に被験物質を投与する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられる。また、被験物質の投与量は、投与方法、被験物質の性質などにあわせて適宜選択することができる。【０１００】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる物質は、上記した被験物質から選ばれた物質であり、精神疾患に対して予防・治療効果を有するので、精神疾患に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた物質から誘導される化合物も同様に医薬として用いることができる。
【実施例】
【０１０１】
（Ａ）方法
（１）遺伝子のクローニング
小脳顆粒細胞の発生分化段階でNMDA受容体NR２Cサブユニットの発現は苔状線維の神経支配を受けることにより小脳後方から前方に向かって、側頭部から中心に向かって発現が広がっていき、マウスでは生後１４日過ぎくらいに全小脳顆粒細胞で発現が観察されるようになる。よって、NR２Cサブユニットの発現に先立ち、変化している遺伝子を生後１日目、５日目、７日目、１８日目の小脳からmRNAを抽出し、一本鎖cDNA作成のため、オリゴdTを用い、次いでランダムプライマーのセットによりRT-PCRを行い（RNAimage; GenHunter Corporation）Differential displayを行い、NR2Cより先に遺伝子発現がはじまり、成熟マウスでさがるシグナルに着目し、網羅的にcDNA断片のシークエンスを行い候補遺伝子を絞っていった。次いで、橋核と小脳顆粒細胞の培養細胞に１００Hz、３０分の刺激を与え遺伝子発現が変わる（上がる）遺伝子で、橋核の神経細胞と顆粒細胞に比較的多いシグナルに限定して候補遺伝子を決定した。この時点で、プロトオンコジーン遺伝子ErbBのリガンド（Hereigulin, new differentiation factor (NDF)）と, Acetylcholine receptor inducible activity (ARIA)が候補となった。また、この時、これらの遺伝子が同一の遺伝子座をもつ遺伝子であることがわかってきたため、報告されている種を超えた関連遺伝子のアラインメントから５‘CCAACCGGGTCCGCGTAGAG3'（配列番号５）, 5'GTGTGGAAATCTACAGGTGA3' （配列番号６）の配列を決めPCRを行って、次いで、NRGN末側のクローニングのために5'ATGTCTGAGCGCAAAGAAGG3' （配列番号７）, 5'CCTTTCGCTATGAGGAGGAGAGTC3' （配列番号８）でセカンドPCRを行うことにより、遺伝子クローニングの特異性を上げた。C末側のためには５’ACTCTCCTCATAGCGAAAGG3' （配列番号９）と5'TTATACAGCAATAGGGTC3' （配列番号１０）のプライマーでセカンドPCRを行うことによりその配列を決定した。更に、常法により、小脳皮質mRNAからcDNAライブラリーを作成し、（BRLcDNAライブラリーキット）、PCRにより得られたシグナルのイントロン、エクソンの境界を同定し、多数あるNRGアイソフォームから小脳顆粒細胞において多く発現し、機能的なアイソフォームであることを確認し配列表の配列番号１に記載の遺伝子を同定し、配列を決定した（塩基配列を配列番号１に記載し、アミノ酸配列を配列番号２に記載する）。図１に記載のヒトアミノ酸配列は、本発明者がクロ-ニングした遺伝子のアミノ酸配列から最も相同性が高くなるように並べたものであり、AからDまでの機能ドメインと思われる配列を有している。【０１０２】
（２）プラスミドの構築と変異マウス
ノックアウトマウスはDr. Grerald D. Fischbachから分与された。その後B６にバッククロスした。ホモは胎生期に致死であり、ヘテロマウスを用い解析を行っているマップの詳細は図２に示す。シナプスの可塑性制御に重要と考えられているNRG１のIg-likeドメインのみを欠損させたマウスを作成した。図２のＡは、ニューレグリン遺伝子の模式図である。Ig-Lドメインexon 3と隣接するイントロンをコードするマウスゲノムクローン４を用いて、ターゲティングベクターを作製した。図２のＢは、オリゴヌクレオチドa, exon3.3及びneo2を用いたPCRによる、ヘテロ接合体の交配からのマウスの遺伝子型を分析した結果を示す。150bpの断片が野生型アレルから生成し、450bpの断片が変異体アレルから生成した。図２のＣでは、 中心葉におけるNRGタンパク質の発現をNRG抗体で調べた。【０１０３】
本発明者らは、小脳の解剖学的、形態学的研究行い、神経回路網のデーター多く蓄積していたので、本NRGのアイソフォームの機能解析をするにあたり、橋・小脳路系苔状線維（mossy fibers）の投射が多く観られる中脳（central lobe）を用いて、NRG蛋白の発現量を調べた。【０１０４】
トランスジェニックマウスに関しては図３に示す。全長膜貫通型NRGのIg様ドメインと EGF様ドメインの間にタグとしてGreen Fluorescence protein (GFP)を挿入し全長2592bpのcDNAとした。ベクター（T１１３）にNdeIとEcoRIサイトでLigationし全体のプラスミトをTF-NRGとした。遺伝子発現はEF1aのプロモータ？により制御される。蛋白のプロセッシングに必要なサイト622-649bを欠損させ、C末端側のフレームを合わせた欠損型NRGにGFPを挿入したプラスミドをTD-NRGとし、622-649bpの欠損以外はTF-NRGと同じ条件のプラスミドを構築した。【０１０５】
トランスジェニックマウスの作成に用いたマウスの系統はBDFである。トランスジェニックマウスの作製は、Transgenicanimal technology, a laboratory Handbook edited by Carl A. Pinkert,  Manipulating the Mouse Embryo a laboratory manual, edited by Brigid Hogan Rosa Beddington, Frank Costantini, Elizabeth Lacyに記載の方法に従って行った。【０１０６】
（３）分泌型ニューレグリンの検出
抗体Anti-sNRGの作製は、特開2003-137900号公報に記載の方法と同様に行った。具体的には以下の通りである。
（ｉ）抗原ハプテンペプチドの設計
タンパク質の限定分解反応を補足する抗ペプチド抗体を調製するためには、標的とする基質タンパク質の切断部位に関する情報が必要である。本実施例では分泌型ニューレグリンのＣ末端を含む短いペプチド（５merあるいは６mer）にシステイン残基を付加したペプチドを合成し、ハプテンとして用いた。具体的には、Cys-Glu-Leu-Tyr-Gln及びCys-Glu-Leu-Tyr-Gln-Lysの混合ペプチドを抗原として用いた。【０１０７】
（ｉｉ）用いた試薬
・合成ハプテンペプチド
・KLH(keyhole limpet hemocyanin) in 50%グリセロール(約80%mg/ml)  〔Calibiochem社〕
・DMFA (ジメチルホルムアルデヒド)
・MBS (ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル)〔Pierce社〕
・ゲル濾過カラム（ファルマシアPD-10）
・50mMリン酸ナトリウムバッファー (pH7.5)
・100mMリン酸ナトリウムバッファー (pH7.2)【０１０８】
免疫
・フロイント完全アジュバント（FCA）
・フロイント不完全アジュバント（FIA）
・シリンジ・注射針など【０１０９】
抗体のアフィニティー精製
・100mM  HEPESバッファー (pH7.5)
・Affigel 10または15〔バイオラッド社〕
・30%酢酸
・20%エタノール
・PBS
・50mMクエン酸バッファー(pH3.0)
・２Mトリスバッファー(pH9.5)
・20%グリセロール含Na-PBS【０１１０】
（ｉｉｉ）抗原(ハプテン／キャリア複合体)の調製
MBS／活性化KLHを調製する。KLH約40mg(0.5ml)を50mM リン酸ナトリウムバッファー(pH7.5)1.5mlに加え、スターラーを用いて撹拌する。次に、9.3mgのMBSを0.38mlのDMFAに溶解したものを（用時調製）、これに加える。MBS添加後、室温で30分撹拌する。その後、2,000rpmで2分程度遠心し、上清を以下で用いた。【０１１１】
MBS／活性化KLHをフリーのMBSから分離する。ファルマシアPD-10カラムをを50mM リン酸ナトリウムバッファー（pH7.5）40〜50mlで洗浄し、平衡化しておく。これに上記の遠心上清2mlを添加し、ゲルに浸潤した後に0.5mlのバッファーを加える。浸潤し終わった時点で溶出液の回収を始め（最初の2.5mlをprevoidとして捨てる）、2mlの溶出液（MBS／活性化KLH）を回収する。これで4回分のカップリングに使用することのできる標品が得られる。【０１１２】
合成ハプテンペプチドを活性化KLHにカップリングする。合成ペプチド5mg程度を4.5mlの100mMリン酸Naバッファー（pH7.2）に溶解し、撹拌する。この際、pH試験紙を用いて溶液のpHが下がっていないことを確認する。これに、0.5mlのMBS／活性化KLHを加え、4℃で一昼夜撹拌する。その後、透析する必要はない。これを免疫原として使用する。保存は−20℃または−80℃で行う。【０１１３】
（ｉｖ）免疫
ウサギを用いてポリクローナル抗体を調製した。まず、体重約3kgのウサギに対して１次免疫を行う。抗原溶液0.3mlに対して0.6mlのFCAを加え、撹拌後、超音波処理〔Branson Sonifier 185 (bath type)、power７〜１０、3分程度〕によってエマルジョンを調製する。これを、左右の背筋上に位置する皮下部分に10ヶ所程度に分けて注射する。注射針は18Gあるいは21Gを用いる。
約1ヵ月後に2次免疫を行う。この場合は、0.3mlの抗原溶液に対して0.6mlのFLAを用いて、同様にエマルジョンを調製する。左右の大腿筋に注射する。
2次免疫の2週間後と4週間後に、3次免疫及び４次免疫を行う。この場合は、0.15mlの抗原溶液を0.45mlのPBSで希釈し、上記と同様に背中に皮下注射を行う。用いる注射針は26Gでよい。
4次免疫の約1週間後に、部分採血を行う。40〜50ml程度採血し抗体の生成状態をチェックした後、アフィニティー精製を行う。良好であれば、約1ヶ月休ませて、2回ほど追加免疫を行って、全採血を行う。【０１１４】
（ｖ）抗体のアフィニティー精製
アフィニティーゲルを調製する。アフィニティー担体としてはAffigel 10または15を用いる。まず、ハプテンペプチド1〜5mgを4mlの100mM HEPESバッファー（pH7.5）に溶解する。次に、1〜2mlのAffigelをグラスフィルター上で吸引洗浄し（氷冷蒸留水10ml×2回）、直ちにペプチド溶液に加える。一昼夜4℃で回転撹拌した後、フリーのペプチドを除くために、再度グラスフィルター上で吸引洗浄する。この場合は、十分量の蒸留水以外に30%酢酸や20%エタノールを用いて完全に洗浄し、最後にPBSで平衡化しておく。保存は冷蔵で行う。【０１１５】
特異的抗体をアフィニティーカラムに吸着させる。アフィニティーゲルをカラムに（内径5〜10mm程度）に詰め、PBSで洗浄する。非働化血清10mlを同量のPBSで希釈し、フィルター（0.22または0.45μｍ）を通し、カラムに添加する。透過液を回収し、3〜4回再添加を繰り返す（流速は1ml/分程度）。さらに、約50mlのPBSでカラムを洗浄する。【０１１６】
抗体を回収する。あらかじめ0.5mlの２Mトリスバッファー（pH9.5）を入れておいたチューブに、アフィニティーゲルから抗体を溶出させる。溶出は、5mlの50mMクエン酸バッファー（pH3.0）を1ml/分程度の速度で添加して行う。次に、溶出液を透析チューブに移し、20%グリセロール含Na-PBSに対して透析を行う（4℃、一昼夜）。抗体の定量は、280nmの吸収を計測して行う（1mg IgG/ml、A280＝1.4）。通常、1〜10mgの特異的IgGが回収される。保存は、分注後−80℃で行う。【０１１７】
また、抗体ANB102は、KHLGIEFMに対するポリクローナル抗体である。作成は、上記した特開2003-137900号公報に記載の方法と同様に行った。【０１１８】
また、抗体ANB104は、Ig-likeドメインに対するポリクローナル抗体である。抗原はIg-like domainをバクテリアに大量発現したものを使用した。Ig-like domainを大腸菌発現用ベクターpET-3536につなぎIPTG(イソプロピル-β-D-ガラクトピラノシド)により蛋白の発現を誘導した。蛋白をHisTrapTM (Pharmacia Biotech 17-1880-01)のプロトコールに従い精製した。【０１１９】
いずれの抗体もNRG１のデリーションミュータントを大腸菌で発現精製したリコンビナント蛋白と市販の蛋白（ヘリグリンβ１：NeoMarker）を用いることにより抗体の特異性を評価した。【０１２０】
抗体を用いた分泌型ニューレグリンの検出実験は、Ozaki M et al 2000, J. Neurosci. Res. 50, 612-623に記載の方法に準じて行った。【０１２１】
（４）形態学的解析
（苔状繊維のDiI標識及びプロジェクションパターンのトレーシング）
深いエーテル麻酔下、野生型マウス（WT)、NRG1のノックアウトマウス(KO)及びNRG1のトランスジェニックマウス(TD及びTF)を生理食塩水で灌流し、４％パラホルムアルデヒドを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（pH 7.3)で固定した。脳を頭蓋骨から取り出し、４％パラホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝液に浸し、１±３週間保持した。それから、小針を用いて、DiI(親油性追跡色素; Molecular Probes, Inc., OR, USA)の結晶片を、橋腕の背面部分に置いて、橋核から生じる苔繊維を標識した。色素が沈着した後、脳を固定液に戻し、室温で３ヶ月間暗室で保管し、切片を作製した。小脳皮質をvibroslicer（Microslicer DTK-1500, Dosaka EM Co. Ltd, 日本）を用いて、200mmで、側矢状平面又は前頭面で切片にした。切片を０．１Ｍリン酸緩衝液に回収し、YHSフィルターシステムを用いてレーザー共焦点顕微鏡で観察した(Bio-Rad Inc., CA, USA及びCarl Zeiss 510, ドイツ)。苔繊維末端の数を変異体及び野生型マウスで数え、小脳表面上の分布図を作成した。【０１２２】
（ニューロン数の計測及び橋核の３D再構成）
マウスの前頭切片を、野生型及び変異体マウスから、厚さ２０μｍの連続切片として作製し、ピロニン±メチルグリーンで染色した。橋核のニューロンはMDプロット(Minnesota datametrics, MN, USA)を用いてプロットして計測した。核の三次元構造はStrata Vision 3d (Strata Inc., USA)を用いて再構成した。小脳皮質の解析の場合、矢状の切片を作製し、ピロニン±メチルグリーンで染色した。【０１２３】
（５）行動解析
驚愕反応におけるプレパルスインヒビションとは、ヒトと動物で共通に評価が可能な驚愕反応を指標とする知覚−運動反応能力のテストである。このテストでは、 統合失調症や自閉症の病態の中心を成すと考えられている注意力と脳内情報処理力の異常性が、科学的に、客観的に評価できる特徴を有する。テスト自身は、１２０デシベル程度の大きな音でびっくり驚愕反応をおこす前、３０ー１５０ミリ秒に、それ自身はびっくり驚愕反応を起こしえない弱い音刺激（プレバルス）をあらかじめ聴かせておくと、本来の大きな音でびっくり驚愕反応が減少することを測定する。このプレパルスによる減少分をプレパルスインヒビションと呼び、これは、統合失調症患者や自閉症患者で異常な低下を示すことが知られている（Braff DL, Geyer MA. Arch Gen Psychiatry 47: 181-188 (1990)）。【０１２４】
動物での各種学習課題での遂行能力は、例えばパブロフ型のコンデイショニング学習において、電気ショックと回避行動の学習、水迷路の空間学習、８方向迷路の餌位置学習などで測定することができる（Sams-Dodd F.  Rev Neurosci. 10(1):59-90. (1999)）。【０１２５】
（Ｂ）結果
（１）配列表の配列番号１にNRG１の塩基配列を示す。また、図１には、NRG１のマウスとヒトのアミノ酸配列を示す。また、図２はノックアウトマウス遺伝子を示す、図３は、トランスジェニックマウス作成のための遺伝子構築を示す。【０１２６】
（２）ノックアウトマウス橋核の異常
図４にノックアウトマウス橋核の異常を示す。橋・小脳路系（pontocerebellar mossyfiber system）は学習を必要とする運動制御に関与した神経回路網である。pontocerebellar mossyfiberの細胞体は橋核に位置し、軸索を小脳皮質まで延ばし、小脳顆粒細胞層において顆粒細胞をシナプスを形成する。橋は、大脳皮質と小脳を結ぶ中継点であり、motorcordinationの制御を司る重要な器官である。ノックアウトマウスでは、橋核が萎縮し、神経細胞数も少ない。【０１２７】
（３）ノックアウトマウス小脳皮質の異常
図５にノックアウトマウス小脳皮質の異常を示す。橋核から多くの投射をうける小脳６、７付近では小脳の形状に異常がみられ、野生マウスに比べノックアウトマウスの小脳６、７の発達は悪い。【０１２８】
（４）トランスジェニックマウス橋核の異常
図６にトランスジェニックマウス橋核の異常を示す。はじめに、TF、TD変異マウスにおいて、分泌型ニューレグリンがどの程度産生されるかを調べた。コントロールマウスと変異マウスの小脳全体を２５０μmの厚さの切片にし、９５％酸素、５％二酸化炭素の混合ガスで飽和されたリンゲル液につけながら、３３℃で２時間PMA で処理をする。この処理により、切り出されるであろう分泌型NRGを溶液外に放出させることができる。その後、切り出されたNRGのみを検出できる抗体を用いNRGを回収する。その後、NRG１β１のみを認識する抗体を用いブロッテイングを行った。TFでは多量の分泌型NRGが検出され、TDではWTに比べ分泌型NRGの産生、放出が抑えられていた（図６のＡ）。マウスの成長過程で長期的に分泌型ニューレグリンの産生量が高い場合、橋核の発達が悪く、神経細胞数も少ない（図６のＢ）。【０１２９】
（５）トランスジェニックマウス小脳皮質の異常
図７に、トランスジェニックマウス小脳皮質の異常を示す。各種トランスジェニックマウスを用いることにより、橋・小脳路系苔状線維のみの投射が観られる、小葉６bと７の糸球体の数を数えた。その結果、コントロールマウス（BDF１）に比べ、変異マウスでは小脳皮質への苔状線維の投射数が少なく、かつ特にTDマウスでは、シナプス末端に膜貫通型ニューレグリンが切り出されす蓄積されており、糸球体構造が乱れている様子が観察された。【０１３０】
（６）移動運動及びRota-rod試験
図８に、移動運動及びRota-rod試験の結果を示す。【０１３１】
移動運動（Locomotion）:
各動物 (野生型, n=14; NRG (+/-) マウス, n=16, TF, n=15, TD, n=18)を白色アクリルケージ (50 x 50 x 60 cm)に静かに置き,移動運動活性を、NIHイメージ付きのビデオキャプチャーシステム(O'HARA, 東京,日本）を用いて１５分間測定した。活性モニター捕集システムは、移動距離を同時に測定した。移動運動活性試験では、野生型(2019.7±173.4) 及びNRG (+/-)マウス (2089.3±133.2)の間に、運動の有意差はなかった。【０１３２】
Rota-Rod試験:
運動神経を、プラットホームの４０ｃｍの高さに上げられた３ｃｍ径の回転棒からなり、同時に複数のマウスを試験するために５個の区分けされたRota-Rodトレッドミルにより試験した(Ugo Basile, Comerio, Italy)。マウスを３５ｒｐｍで回転するrota-rodの中心に置いた。一個体当たり、最大３００秒行った。試験は、１日につき３回の区分で行った。各マウスがRota-Rodから落ちた時点をストップウオッチで記録した。落下までの平均待ち時間を記録し、値を２つの群の間で比較した。【０１３３】
マウスは共に地面上を正常に動いた。回転運動タスクへの適応能力を評価した。野生型マウスは、回転条件下で棒の上に容易に立つことができた。しかし、NRG (+/-)マウスは、長時間立つことは難しく、前足で握ったり引っ張ることによって棒に沿って徐行した。
野生型(129.4±11.5)とNRG (+/-) マウス(96.4.5±9.9)との間には棒上での滞在には有意差(p<0.05)が見られた。【０１３４】
統計解析：
結果は、平均±標準偏差で示す。２つの群の比較には、Studentのt検定を使用した。P値が0.05未満の場合は、統計的に有意とみなした。【０１３５】
ここでの動物運動量とは、自閉症患者や陰性症状を有する統合失調症患者が、新規環境との接触をいやがり、社会から引きこもる現象を反映していると考える。一般に、動物では、新規でストレスのある環境下での探索運動量を測定している。一般に動物モデルにおいて、この指標は低下すると推定される。【０１３６】
（７）NRG1蛋白の末梢投与で生じたプレパルスインヒビションの異常
図９は、NRG1蛋白の末梢投与で生じたプレパルスインヒビションの異常を示す。
動物は，SDラット（日本SLC）生後２日齢より使用した．試薬は，大腸菌内で組換え蛋白として作製、精製したマウス・NRG1（ベータ１型）を用いた．生後２日目より１日おきに計９回（生後1０日目まで），頚部にラット体重1g当たり0.75μgを毎日、皮下投与した．生後３０日より小動物驚愕反応測定装置（San Diego Instruments）にて驚愕反応強度およびプレパルスインヒビションを測定した．すなわち，驚愕反応を誘発する感覚刺激としては，音刺激を用い，プレパルス刺激として環境騒音（バックグラウンドノイズ）レベルより5、10, 15デシベル高い音圧の刺激を与え，その100ミリセコンド後に，音圧が120デシベルのパルス刺激を与えた．120 dB単独の時の驚愕反応に対してプレパルスを組み合わせた時の反応の低下比率（％）をプレパルスインヒビション(PPI)とした．生後１ヶ月齢の時点において、ニューレグリンー１投与群では生理食塩水投与群に比べ、プレパルスインヒビションの有意な低下（図９のＡ）を示したが、音圧120デシベルに対する驚愕反応強度は変化無かった（図９のＢ）。【０１３７】
（７）NRG1遺伝子を過剰発現させたマウスのプレパルスインヒビションの異常
図１０は、RG1遺伝子を過剰発現させたマウスのプレパルスインヒビションの異常を示す。
マウストランスジェニックマウスは受精卵への遺伝子注入法をもちいた遺伝子導入により作製した。導入した遺伝子は、マウス脳より分離したNRG１（ベータ１型）ｃＤＮＡで、EF1a-321promotorを５’側に連結することで、GFPをタグとしてニューレグリン１(NRG1)のIg-likeドメイン とEGFドメインの間に挿入し、全身において過剰発現させたものである。このトランスジェニックマウスと対照としての野生型マウスを、生後６０日より小動物驚愕反応測定装置（San Diego Instruments）にて驚愕反応強度およびプレパルスインヒビションを測定した。すなわち、驚愕反応を誘発する感覚刺激としては、音刺激を用い、プレパルス刺激として環境騒音（バックグラウンドノイズ）レベルより4,8,12デシベル高い音圧の刺激を与え、その100ミリセコンド後に、音圧が120デシベルのパルス刺激を与えた。120 dB単独の時の驚愕反応に対してプレパルスを組み合わせた時の反応の低下比率（％）をプレパルスインヒビション(PPI)とした。生後２ヶ月齢の時点において、ニューレグリン−１を全身で過剰に発現しているトランスジェニックマウスでは生理食塩水投与群に比べ、プレパルスインヒビションの有意な低下（図１０のＡ）を示したが、１２０ｄＢに対する音驚愕反応には変化が無かった（図１０のＢ）。【０１３８】
これらの実験は、主に小脳を用い、シナプスの形成と可塑性におけるNRG１の機能を評価している。行動解析は運動協調機能の試験であるrota-rodテストで、NRGKO及びTFにおいて運動能力の低下が観察されている。これらの結果は、分泌型ニューレグリンの量が多くても、少なすぎても運動能力の低下を招くことを示している。この結果は、橋核の萎縮と橋・小脳路系のシナプス形成効率が悪いこととも一致している。また、プレパルスインヒビション（PPI）の結果は、分泌型ニューレグリンの量が多い方（TF）が、異常をきたし（これは、分泌型ニューレグリン長期投与実験の結果と一致している）、本発明者の実験ではKOとTDは異常を示さなかった（その後、マウスの遺伝的バックグラウンドが異なると反対の結果がでることがわかった。B６が強い程、PPIは正常になる）。しかし、Stefansson H (deCORD), et al (Am. J. Hum. Genet. 71:877-892, 2002)の実験ではkoマウスでもPPIに異常が観察されたと報告しており、これらの結果は本発明におけるRota-Rodの結果に一致している。要するに、分泌型ニューレグリンの量のバランスをとることが神経回路網を統合する上で重要なのではないかと考えられる。以前、分泌型ニューレグリンの産生が神経の持つ特定の電気的活動パターンに依存して観察され、このバランスがシナプスの可塑性を維持する上で重要なのではないかという可能性が報告されている（Ozaki M, et al, J. Neurochem, 2004）。本発明の変異マウスを用いることにより更なる認知障害の分子機構を明らかにすることが可能であり、分泌型ニューレグリンの産生・放出量との関係を明らかにすることにより、統合失調症の診断薬・治療薬の開発に貢献することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１３９】
本発明によれば、統合失調症とそれに類似する認知障害の動物モデルを簡便に提供することが可能である。本発明の動物モデルを用いることにより、統合失調症の認知障害の基礎医学研究材料を提供するとともに、統合失調症とそれに類する認知障害性の精神疾患の治療薬、診断薬を開発、評価することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】図１は、NRG１のマウスとヒトのアミノ酸配列を示す。
【図２】図２は、ノックアウトマウス遺伝子を示す。
【図３】図３は、トランスジェニックマウス作成のための遺伝子構築を示す。
【図４】図４は、ノックアウトマウス橋核の異常を示す結果を示す。
【図５】図５は、ノックアウトマウス小脳皮質の異常を示す結果を示す。
【図６】図６は、トランスジェニックマウス橋核の異常を示す結果を示す。
【図７】図７は、トランスジェニックマウス小脳皮質の異常を示す結果を示す。黒丸は橋小脳苔状線維を示す。ＣＩ：アンチ型小葉脚ＩＣＩＩ：アンチ型小葉脚ＩＩＦＬ：片葉ＬＳ：単小葉ＰＦ：傍片葉ＰＭ：傍内側小葉
【図８】図８は、移動運動及びRota-rod試験の結果を示す。
【図９】図９は、NRG1蛋白の末梢投与で生じたプレパルスインヒビションの異常を示す。Ａはプレパルスインヒビションを示し、Ｂは１２０ｄＢ音驚愕反応を示す。
【図１０】図１０は、RG1遺伝子を過剰発現させたマウスのプレパルスインヒビションの異常を示す。Ａはプレパルスインヒビションを示し、Ｂは１２０ｄＢ音驚愕反応を示す。
【図１】
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【図３】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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