(57)【要約】軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列表１またはそれと２ないし３アミノ酸異なる配列で規定され、かつ重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列表２またはそれと２ないし３アミノ酸異なる配列で規定される、マウスモノクローナル抗体。【特許請求の範囲】
【請求項１】
軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号：２またはそれと２ないし３アミノ酸異なる配列で規定され、かつ重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号：４またはそれと２ないし３アミノ酸異なる配列で規定される、マウスモノクローナル抗体。
【請求項２】
Ｎε−アセチルリジンを認識する、請求項１に記載のマウスモノクローナル抗体。
【請求項３】
前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号：２で規定され、かつ前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号：４で規定される、請求項１に記載のマウスモノクローナル抗体。
【請求項４】
Ｎε−アセチルリジンを認識する、請求項３に記載のマウスモノクローナル抗体。
【請求項５】
寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３５１で規定されるマウスハイブリドーマにより産生される、請求項４に記載のマウスモノクローナル抗体。
【請求項６】
抗アセチルリジン抗体を還元して露出させたスルフヒドリル基に標識分子を結合させることにより得られる、抗アセチルリジン標識抗体。
【請求項７】
前記標識分子が西洋ワサビペルオキシダーゼである、請求項６に記載の抗アセチルリジン標識抗体。
【請求項８】
標識前の抗アセチルリジン抗体が請求項２に記載の抗アセチルリジン抗体である、請求項６又は７に記載の抗アセチルリジン標識抗体。
【請求項９】
標識前の抗アセチルリジン抗体が請求項４に記載の抗アセチルリジン抗体である、請求項６又は７に記載の抗アセチルリジン標識抗体。
【請求項１０】
標識前の抗アセチルリジン抗体が請求項５に記載の抗アセチルリジン抗体である、請求項６又は７に記載の抗アセチルリジン標識抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、タンパク質の翻訳後修飾の一つであるアセチルリジンの検出に使用しうる抗体に関する。
【背景技術】  タンパク質は、多くの場合、翻訳されたそのままの形で機能を発揮するのではなく、様々な翻訳後修飾を受けた後に、本来の機能を発揮することが知られている（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４，１９−２８，１９９２）。例えば、タンパク質のリン酸化は細胞外シグナルを核まで伝達する際のシグナルカスケードとして、あるいは正常な細胞周期が進行するための制御因子として重要であるし、ヒストンのアセチル化は転写が効率的に進行するために重要である。タンパク質がユビキチン化されるとプロテアソームに運ばれて分解して活性を失うが、小胞体膜に存在するシグナルペプチダーゼによってシグナルペプチドが切り取られることにより、多くのタンパク質は活性型になる。この様に、タンパク質は翻訳後に様々な修飾を受けることにより適切な時期に適切な場所でそれぞれの機能を発揮することになる。
タンパク質中のリジン残基のアセチル化は、１９６０年代に発見された翻訳後修飾である。最初にリジンアセチル化が発見されたタンパク質はコアヒストンである（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ５１，７８６−７９４，１９６４）。発見当初から、アセチル化と遺伝子の発現の関係が示唆されていたが、分子レベルでその理解が進んだのは最近になってのことである。ヒストンのアセチル化に加えて、多くのタンパク質のアセチル化が見出される様になり、リン酸化に匹敵する重要な翻訳後修飾である可能性が示唆されている（ＥＭＢＯ  Ｊ．１９，１１７６−１１７９，２０００）。従って、今後もこれまでに見出されていない、多くのアセチルリジン含有タンパク質が発見されると思われ、その内のいくつかは、治療薬の標的分子や、疾患の診断目的で重要な分子である可能性があり、効率的に未知のアセチル化タンパク質を見出す手段が望まれている。
その様な目的のために有効な一つの方法は、アセチルリジン残基のまわりのアミノ酸配列に依存せずにアセチルリジン残基を認識できる抗体を用いる方法である。その様な抗体は、未知のアセチルリジン含有タンパク質に対して結合するので、免疫学的な検出や、アフィニティー精製、免疫沈降等の手法により効率的に新規アセチルリジン含有タンパク質を検出精製することができる。
周辺配列にあまり依存しない抗体としては、いくつかのものが市販、または発表されている。市販されているモノクローナル抗体としては、例えば、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社から市販されているモノクローナル抗体であるＡｃ−Ｋ−１０３が一例として挙げられる。また、小松らはアセチルリジン含有ペプチドをＫｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ）または化学的にアセチル化したＫＬＨを用いた免疫により、４種類の異なった抗アセチルリジンマウスモノクローナル抗体の樹立を行っている（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７２，１６１−１７５，２００３；ＷＯ０２０７４９６２Ａ１）。
これらの抗体の可変領域の配列はいずれもただ一つのフレームワーク配列に収斂することが分かっているが、個々のアミノ酸配列は完全には同じではなかった。未知のアセチルリジン含有タンパク質を検出するためには、少しでも検出力に優れた抗アセチルリジン抗体が望まれており、共通のフレームワークを持つ抗体であっても、部分的な配列のいくつかの違いにより、反応性の改善が図れる可能性がある。
【特許文献１】ＷＯ０２０７４９６２Ａ１
【非特許文献１】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４，１９−２８，１９９２
【非特許文献２】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ５１，７８６−７９４，１９６４
【非特許文献３】ＥＭＢＯ  Ｊ．１９，１１７６−１１７９，２０００
【非特許文献４】Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７２，１６１−１７５，２００３
【発明の開示】
タンパク質中のアセチルリジン残基を、タンパク質の種類やアセチルリジン残基の周辺アミノ酸の種類にあまり影響されずに認識する、従来よりも感度の良い方法を獲得することが本研究の課題である。特に、そのためのプローブ分子として用いうる新規抗アセチルリジン抗体及びその標識体の取得が本発明の主たる課題である。
上記課題を解決するために鋭意努力を行った結果、本発明者らは特定の可変領域アミノ酸配列を有する抗体、及びその標識体により上記課題を解決できることを見いだした。すなわち、上記課題は以下の手段により解決できる。
（１）軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号：２に記載の配列またはそれと２ないし３アミノ酸異なる配列で規定され、かつ重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号：４またはそれと２ないし３アミノ酸異なる配列で規定される、マウスモノクローナル抗体。
（２）Ｎε−アセチルリジンを認識する、上記（１）に記載のマウスモノクローナル抗体。
（３）軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号：２で規定され、かつ重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号：４で規定される、上記（１）に記載のマウスモノクローナル抗体。
（４）Ｎε−アセチルリジンを認識する、上記（３）に記載のマウスモノクローナル抗体。
（５）寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３５１で規定されるマウスハイブリドーマにより産生される、上記（４）に記載のモノクローナル抗体。
（６）抗アセチルリジン抗体を還元して露出させたスルフヒドリル基に標識分子を結合させることにより得られる、抗アセチルリジン標識抗体。
（７）前記標識分子が西洋ワサビペルオキシダーゼである、上記（６）に記載の抗アセチルリジン標識抗体。
（８）標識前の抗アセチルリジン抗体が上記（２）に記載の抗アセチリジン抗体である、上記（６）又は（７）に記載の抗アセチルリジン標識抗体。
（９）標識前の抗アセチルリジン抗体が上記（４）に記載の抗アセチルリジン抗体である、上記（６）又は（７）に記載の抗アセチルリジン標識抗体。
（１０）標識前の抗アセチルリジン抗体が上記（５）に記載の抗アセチルリジン抗体である、上記（６）又は（７）に記載の抗アセチルリジン標識抗体。
（１１）抗アセチルリジン抗体に標識分子を結合させる手法として、抗体のアミノ基以外の部分を用いて結合させる方法を用いることにより得る、上記（７）〜（１０）のいずれかに記載の抗アセチルリジン標識抗体。
（１２）アミノ基以外の部分が抗体を還元することにより露出したスルフヒドリル基である、上記（１１）に記載の抗アセチルリジン標識抗体。
【図面の簡単な説明】  図１は、非アセチル化ＢＳＡ（Ａ）及びアセチル化ＢＳＡ（Ｂ）に対するＡＣＫ２Ｆ１２抗体及びＡＫＬ５Ｃ１抗体の反応性の違いを示した図である。いずれの抗体もアセチル化ＢＳＡに対しては反応するが、非アセチル化ＢＳＡに対しては反応しない。
図２は、リジン、Ｎα−アセチルリジン、及びＮε−アセチルリジンの構造を示した図である。
図３は、アセチル化ＢＳＡに対するＡＣＫ２Ｆ１２抗体及びＡＫＬ５Ｃ１抗体の結合に及ぼすＮα−アセチルリジン（Ａ）及びＮε−アセチルリジン（Ｂ）の影響を示した図。どちらの抗体の結合も、Ｎα−アセチルリジンによっては競合されず、Ｎε−アセチルリジンによって競合されることが分かる。
図４は、図５の実験に使用したアセチルリジン含有ペプチド及び非含有ペプチドの配列を示した図である。
図５Ａは、抗アセチルリジンマウスモノクローナル抗体ＡＫＬ５Ｃ１の、各種アセチルリジン含有ペプチドに対する反応性を示した図である。
図５Ｂは、抗アセチルリジンマウスモノクローナル抗体ＡＣＫ２Ｆ１２の、各種アセチルリジン含有ペプチドに対する反応性を示した図である。
図５Ｃは、抗アセチルリジンマウスモノクローナル抗体Ａｃ−Ｋ−１０３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）の、各種アセチルリジン含有ペプチドに対する反応性を示した図である。
図５Ｄは、ＵｐＳｔａｔｅ社から市販されている抗ヒストンＨ３（Ａｃ−Ｌｙｓ−１４）の、各種アセチルリジン含有ペプチドに対する反応性を示した図である。
図５Ｅは、ＵｐＳｔａｔｅ社から市販されている抗ヒストンＨ４（Ａｃ−Ｌｙｓ−１６）ウサギポリクローナル抗体の、各種アセチルリジン含有ペプチドに対する反応性を示した図である。
図６は、ＡＫＬ５Ｃ１、ＡＣＫ２Ｆ１２、及びＡｃ−Ｋ−１０３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）の３種類の抗アセチルリジンマウスモノクローナル抗体（Ａ）並びにＵｐＳｔａｔｅ社から市販されている抗ヒストンＨ３（Ａｃｅ−Ｌｙｓ−１４）及び抗ヒストンＨ４（Ａｃ−Ｌｙｓ−１６）ウサギポリクローナル抗体（Ｂ）の検出力をＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔで比較した結果を示した図である。各レーンには６μｇタンパク質相当のｌｙｓａｔｅを流動している。一次抗体濃度としては、抗ヒストンＨ４（Ａｃ−Ｌｙｓ−１６）以外は１μｇ／ｍｌを使用した。抗ヒストンＨ４（Ａｃ−Ｌｙｓ−１６）は原液を１０００倍希釈して使用した。ＡＣＫ２Ｆ１２抗体が最も多くのバンドを検出できることが分かる。
図７は、ＡＫＬ５Ｃ１及びＡＣＫ２Ｆ１２抗体の検出力を、３種類の培養細胞（ＭＯＬＴ−４Ｆ、ＨｅｐＧ２、及び１Ｂ２Ｃ６）ｌｙｓａｔｅ（３０μｇ／ｌａｎｅ）を用いてＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔで比較した結果を示した図である。ＡＣＫ２Ｆ１２抗体の方がＡＫＬ５Ｃ１抗体よりも多くのバンドを検出できる。
図８は、抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識する二つの方法の違いを模式的に示した図である。
図９は、トリコスタチンＡ処理、未処理のＭＯＬＴ−４Ｆ細胞ｌｙｓａｔｅを電気泳動後（２μｇ／レーン）、ＰＶＤＦ膜にトランスファーした後に、Ａｃ−Ｋ−１０３、ＡＫＬ５Ｃ１、ＡＣＫ２Ｆ１２抗体を非標識のまま一次抗体として用い、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を二次抗体として用いてＭＯＬＴ−４Ｆ細胞ｌｙｓａｔｅ中のアセチル化タンパク質を検出した場合（Ａ）と、ＡＣＫ２Ｆ１２抗体に直接ＨＲＰ標識したものを用いて検出した場合（Ｂ）を比較した結果を示した図である。ＳＨ基を介してＨＲＰ標識したＡＣＫ２Ｆ１２抗体が最も検出力が高いことが分かる。
図１０は、化学的にアセチル化したＢＳＡをＡＣＫ２Ｆ１２−ＨＲＰ−ＳＨ標識抗体を用いたＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔにて検出した結果を示した図であり、少なくとも８０ｐｇのタンパク質を検出することが可能である。
図１１は、マウス臓器ｌｙｓａｔｅを電気泳動で展開後（３０μｇ／レーン）、ＰＶＤＦ膜に転写し、各臓器中のアセチルリジン含有タンパク質をＡＣＫ２Ｆ１２−ＨＲＰ−ＳＨを用いて検出した結果を示した図である。
図１２は、マウス脳及び胃ｌｙｓａｔｅを電気泳動で展開後（１５μｇ／レーン）、ＰＶＤＦ膜に転写し、ＡＣＫ２Ｆ１２−ＨＲＰ−ＳＨを反応させる際に、１０ｍＭのリジン、Ｎα−アセチルリジン、またはＮε−アセチルリジンを共存させた時の結果を示す図である。Ｎε−アセチルリジンを共存させた時のみ、抗体によるバンドの検出が阻害されていることが分かる。
図１３Ａは、ＡＣＫ２Ｆ１２抗体の軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡの配列をＡＬ３Ｄ５、ＡＬ１１、ＡＫＬ３Ｈ６、及びＡＫＬ５Ｃ１抗体の可変領域をコードするｃＤＮＡ配列と並べて示した図である。一致している箇所は、白抜き文字で示される。
図１３Ｂは、ＡＣＫ２Ｆ１２抗体の重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡの配列をＡＬ３Ｄ５、ＡＬ１１、ＡＫＬ３Ｈ６、及びＡＫＬ５Ｃ１抗体の重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列と並べて示した図である。一致している箇所は、白抜き文字で示される。
図１４は、ＡＣＫ２Ｆ１２抗体の可変領域のアミノ酸配列を、ＡＬ３Ｄ５、ＡＬ１１、ＡＫＬ３Ｈ６、及びＡＫＬ５Ｃ１抗体の可変領域のアミノ酸配列と並べて示した図である。（Ａ）軽鎖、（Ｂ）重鎖。一致している箇所は、白抜き文字で示される。
図１５は、ＡＣＫ２Ｆ１２、ＡＬ３Ｄ５、ＡＬ１１、ＡＫＬ３Ｈ６、及びＡＫＬ５Ｃ１抗体の可変領域のｃＤＮＡ配列（Ａ）、及びアミノ酸配列（Ｂ）において、お互いに異なる塩基またはアミノ酸の数を一覧にまとめた図である。対角線の右上が軽鎖、左下が重鎖における結果を、それぞれ示す。
図１６は、ＡＬ１１、ＡＬ３Ｄ５、ＡＫＬ３Ｈ６、ＡＫＬ５Ｃ１、ＡＣＫ２Ｆ１２、及び市販のＡｃ−Ｋ−１０３抗体の軽鎖及び重鎖のＮ末から１０残基までのアミノ酸配列を、プロテインシーケンサーで決定した結果を示す図。軽鎖に関しては全て結果が得られたが、重鎖については、ＰＴＨアミノ酸の切り出しが起こらず、配列を決定できなかった。
【発明を実施するための最良の形態】  抗アセチルリジン抗体を作製する方法としては、いかなる方法を用いても良いが、免疫するのに用いる抗原としては、例えば化学的にアセチル化したスカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）やウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等のタンパク質を用いることもできるし、アセチルリジン残基を含むペプチドをＫＬＨ等のタンパク質に結合させたものを用いることができる。上記目的に実用的に用いうるタンパク質としては、ＫＬＨ、ＢＳＡに加えて、オボアルブミン、ヒト血清アルブミン、トランスフェリン、チログロブリン等を挙げることができるが、これらに限定されるものでない。
本発明においては、抗体の可変領域のアミノ酸配列を規定しているが、抗体の可変領域のアミノ酸配列は、例えば次の方法で決定することができる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマからＲＮＡを抽出し、それを鋳型としてｃＤＮＡを作製する。次いで、抗体の可変領域を挟む部分に対応したプライマーセットを用いてＰＣＲ反応を行い、可変領域をコードするｃＤＮＡを増幅する。増幅されたｃＤＮＡはそのままＤＮＡシーケンサーにかけ配列を読んでも良いし、一旦クローニングベクターに入れ、大腸菌に組み込み増やした後に配列を読んでも良い。得られたｃＤＮＡ配列をアミノ酸配列に翻訳することにより、可変領域のアミノ酸配列を知ることができる。別の方法としては、抗体分子を還元して軽鎖と重鎖に分けた後に、電気泳動等の手段で分離し、それぞれのアミノ酸配列をエドマン分解の原理を利用した気相シーケンサー等の手段を用いて直接決定することもできる。
アセチルリジン含有タンパク質を検出する手段としては、抗体を用いたＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ等の手法が考えられる。その際、樹立した抗体をそのまま使用して、二次抗体として対応する標識抗イムノグロブリン抗体を用いても良いが、本発明者らは、それよりも抗体を直接レポーター酵素により標識することにより検出感度が大きく向上することを見出した。また、抗体をＨＲＰ等の標識分子で標識する方法としては、いくつかの方法が報告されているが、抗アセチルリジン抗体に関しては抗体分子上のアミノ基を用いる方法よりも、抗体の弱い還元により露出したスルフヒドリル基を用いる方法が優れていることを見出した。即ち、抗アセチルリジン抗体に関しては、抗体上のアミノ基を他分子との結合に使用しない方が望ましいと考えられる。
以下、化学的にアセチル化したスカシガイ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン（ＫＬＨ）を用いて免疫したマウス脾臓細胞を用いて樹立したハイブリドーマの産生する抗アセチルリジン抗体を例に、本発明について詳しく述べるが、本発明の実施の形態はこれに限定されるものではない。
化学的にアセチル化したＫＬＨは既報（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７２，１６１−１７５，２００３）に従って作製できる。
動物を免疫する方法を、マウスを例に取り説明する。アセチル化ＫＬＨ溶液をフロインド完全アジュバント、ＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄ（ＣｙｔＲｘ社）等のアジュバンドと１：１に混ぜ、交流ジョイントで結合した二本の注射筒で繰り返しジョイントを通過させる、あるいは超音波処理する等の方法によりエマルジョンを作製する。作製した抗原含有エマルジョンを、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内のいずれか、または複数部位に注入する。一回目の免疫終了の後、１〜４週間の間隔を開け、二回目の免疫を同様に実施する。その際、一回目にフロインド完全アジュバントを使用した場合は二回目以降の免疫にはフロインド不完全アジュバントを使用することが望ましい。以後同様に血中の抗アセチルリジン抗体の抗体価が上昇するまで、免疫を続ける。
抗体価の測定は以下の様に行うことができる。ＫＬＨと同様の方法でアセチル化したウシ血清アルブミンを１０μｇ／ｍｌの濃度にＰＢＳに溶解し、ｗｅｌｌあたり５０μｌの容量で９６穴ＥＬＩＳＡプレートの各ウエルに添加し、４℃で一晩吸着する。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０入りＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で各ウエルを洗浄後アッセイに用いる。アッセイの前に、１％ＢＳＡ入りＰＢＳＴ等でブロッキングを行っても良い。眼窩静脈叢、尾静脈または尾動脈等から採血し、ＰＢＳＴで３０倍に希釈した後遠心を行う。得られた上清をＰＢＳＴで希釈系列を作成し、アセチル化ＢＳＡをコートしたＥＬＩＳＡ  ｐｌａｔｅの各ウエルに５０μｌずつ添加する。室温で３０分反応後、ＰＢＳＴで洗浄し、ＰＢＳＴで適切に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ溶液を各ウエルに５０μｌずつ添加する。更に室温で３０分反応後、オルトフェニレンジアミン等のＨＲＰ基質液を添加することにより発色させる。
十分にタイターが上昇していることを確認した後、脾臓を取り出し、脾臓細胞を単離する。別に培養しておいてマウスミエローマ（例えばＳＰ２／０−Ａｇ１４等）と、ポリエチレングリコール等を用いることにより融合する。融合に成功した細胞をＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン）培地で選択培養する。７〜１４日程度、数日おきに培地を半量交換しながら培養を継続した後、培養上清の抗体価を測定する。ポジティブ・ウェルの細胞を限界希釈法にてクローニングし、目的の抗体産生ハイブリドーマを得る。上記方法により得られたハイブリドーマクローンとしてＡＣＫ２Ｆ１２（寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３５１）を挙げることができる。このクローンは、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に平成１６年６月１８日にＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３５１として国際寄託されている（平成１６年６月１８日に寄託されたＦＥＲＭ  Ｐ−２００８９より移管）。
上記方法で得られた抗体が、周囲のアミノ酸配列にあまり依存せずにアセチルリジン残基を認識していることは、例えば以下の様な方法で確認することができる。まず、当該抗体が、アセチルリジン残基を認識していることは、固相化したアセチル化タンパク質に対する抗体の反応性が、外部から添加したアセチルリジンにより阻害されることにより確認できる。更に、周囲のアミノ酸配列にあまり依存しないことは、種々の周辺配列をもつアセチルリジン含有ペプチドのいずれに対しても抗体が反応するかどうかを調べることで判定できる。更に、動物細胞可溶化物を電気泳動後、ＰＶＤＦ膜あるいはニトロセルロース膜に転写し、抗体によりＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔの手法で染色した時に、複数のタンパク質が染色されることでも示される。
抗体を酵素や蛍光色素等のレポーター分子で標識する方法としては、いかなる方法を用いても良いが、抗アセチルリジン抗体を標識するに際しては、抗体分子上のアミノ基を使用しない様にした方が、好ましい。具体的には、抗体をシステアミン等の還元剤で穏やかに還元することにより、分子内のスルフヒドリル基を露出させ、そこにマレイミド等で活性化した標識分子を結合させることにより、抗体分子上のアミノ基を使用しないで抗体をレポーター分子で標識することができる。
作製した抗体及び修飾抗体が従来の抗体よりも優れているかどうかは、例えば同じ濃度の抗体または修飾抗体を使用した際に、より多くのアセチルリジン含有タンパク質のバンドを検出できることで確認できる。
本発明により提供される抗体及び修飾抗体は、疾病の診断や治療に有用な新たな標的分子としてのアセチルリジン含有タンパク質の探索に有用であるのみならず、有望な標的分子の発見の暁には、その機能制御の目的や、診断の目的で使用することができる。例えば、抗体によるアセチル化レベルの変動をＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔあるいはＥＬＩＳＡ等の手段でモニタして、その変動と標的分子機能の変動を比較する実験を行うことが可能である。また、有望な標的分子に対する特異的な抗体を作製して、その抗体と組み合わせたサンドイッチＥＬＩＳＡ系、ＲＩＡ系、等の免疫学的な測定手段を構築することにより、修飾された状態の標的分子の量を定量することが可能となり、例えば疾病の診断に有効である。
【実施例】  次に、実施例により本発明を更に具体的に説明する。
実施例１． 抗アセチルリジンマウスモノクローナル抗体産生ハイブリドーマＡＣＫ２Ｆ１２の作製
軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列番号：２に、重鎖の可変領域のアミノ酸配列が配列番号：４に示される抗アセチルリジンモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマＡＣＫ２Ｆ１２は以下の方法で作製した。
免疫用の抗原としては化学的にアセチル化したスカシガイ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン（以下ＫＬＨと記載）を用いた。アセチル化ＫＬＨは以下の方法で作製した。１０ｍｇのＫＬＨを１ｍＬのホウ酸バッファー（２０ｍＭ  Ｎａ２Ｂ４Ｏ７，ｐＨ９．３）に溶かし、氷冷下１０Ｎ  ＮａＯＨ  ５０μｌ及び無水酢酸２２．６μｌを添加して、３０分インキュベートした。ゲルろ過カラム（ＰＤ−１０、アマシャム）で溶媒をＰＢＳに置換して、免疫に用いた。
マウスの免疫は以下の様に実施した。アセチル化ＫＬＨ溶液をＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄ（ＣｙｔＲｘ社）と１：１に混ぜ、交流ジョイントで結合した二本の注射筒で繰り返しジョイントを通過させ、エマルジョンを作製した。作製した抗原含有エマルジョンを、皮下あるいは腹腔内のいずれかに、１〜４週間の間隔を開け、三回免疫を行った。一回の抗原量としては５０〜１００μｇを使用した。ＫＬＨと同様の方法でウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡを記載する）をアセチル化したものをＥＬＩＳＡプレートに固相化し、後述の方法で血液中の抗体価の上昇を確認したら、ミエローマとの融合の４日前にＰＢＳで溶解したアセチル化ＫＬＨを腹腔内に、３日前に尾静脈内に投与した（投与量は、１００μｇ／マウス）。
抗体価の測定は以下の様に行った。ＫＬＨと同様の方法でアセチル化したウシ血清アルブミンを１０μｇ／ｍｌの濃度にＰＢＳに溶解し、ｗｅｌｌあたり５０μｌの容量で９６穴ＥＬＩＳＡプレートの各ウエルに添加し、４℃で一晩吸着した。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０入りＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で各ウエルを洗浄後アッセイに用いた。採血は尾動脈から行い、ＰＢＳＴで３０倍に希釈した後遠心を行った。得られた上清をＰＢＳＴで希釈系列を作成し、アセチル化ＢＳＡをコートしたＥＬＩＳＡプレートの各ウエルに５０μｌずつ添加した。室温で３０分反応後、ＰＢＳＴで洗浄し、ＰＢＳＴで適切に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ抗体溶液を各ｗｅｌｌに５０μｌずつ添加した。更に室温で３０分反応後、オルトフェニレンジアミンを基質として用い４９２ｎｍにおける吸光度を測定することにより活性を評価した。
抗体産生細胞とミエローマの融合は以下の様に行った。静脈内への抗原投与の三日後に脾臓を取り出し、脾臓細胞を単離した。その５×１０７個を、別に培養しておいてマウスミエローマＳＰ２／０−Ａｇ１４の１×１０７個と、ポリエチレングリコールを用いることにより融合した。融合に成功した細胞をＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン）培地で選択培養した。１１日間、数日おきに培地を半量交換しながら培養を継続した後、培養上清の抗体価を測定した。ポジティブ・ウェルの細胞を限界希釈法にてクローニングし、目的の抗体産生ハイブリドーマＡＣＫ２Ｆ１２（寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３５１）を得た。産生モノクロのアイソタイプはＩｇＧｌκであった。
実施例２． アセチル化タンパク質に対する抗体の反応性の測定
今回樹立したモノクローナル抗体がアセチル化したタンパク質に反応することを確かめるために、固相化したアセチル化ＢＳＡ及び非アセチル化ＢＳＡに対する反応性をＥＬＩＳＡ法にて調べた。１０μｇ／ｍｌの濃度にＰＢＳで希釈したアセチル化ＢＳＡまたは非アセチル化ＢＳＡを５０μｌ／ウエルの容量でＥＬＩＳＡプレートの各ウエルに添加し、４℃で一晩吸着させた後に、ＰＢＳＴで洗浄した。各精製抗体はＰＢＳＴで段階希釈を行い、各ウエルに５０μｌ添加して、３０分室温で反応させた。
ＰＢＳＴで洗浄後、二次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を反応させ、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）を基質として用いて結合した抗体量をモニターした。結果を図１に示す。比較のために、これまでに報告されている汎反応性の抗アセチルリジンマウスモノクローナル抗体であるＡＫＬ５Ｃ１を用いた結果を併せて示した。図１に示される様に、これら二つの抗体は、非アセチル化ＢＳＡに対しては、全く反応を示さなかったが、アセチル化したＢＳＡに対しては強い反応性を示した。このことから、これら両者はアセチル化されたタンパク質に対して特異的に反応する抗体であると考えられる。
実施例３． アセチルリジンによるＥＬＩＳＡ反応の競合
図２に示した様に、アセチルリジンには二種類の違った分子が存在する。Ｎα−アセチルリジンとＮε−アセチルリジンの二種類である。実施例２と同様の方法でアセチル化ＢＳＡを固相化して、１μｇ／ｍｌの濃度のＡＫＬ５Ｃ１抗体またはＡＣＫ２Ｆ１２抗体を種々の濃度のＮα−アセチルリジンまたはＮε−アセチルリジンと共存させて反応させた際の発色の結果を図３に示した。この図に示される通り、どちらの抗体もＮε−アセチルリジンによっては競合されたが、Ｎα−アセチルリジンによっては全く競合されなかった。この結果は、これらの抗体がリジンのε−アミノ基がアセチル化されたものに対して特異的に結合する能力が高いことを示している。
実施例４． 種々のアセチルリジン含有ペプチドに対する抗アセチルリジン抗体の反応
抗体がアセチルリジンの周辺のアミノ酸配列にあまり依存しないでアセチルリジンを認識することができるかどうかを確かめるために、図４にリストした種々のアセチルリジン含有ペプチドをＥＬＩＳＡプレート（ＡｑｕａＢｉｎｄ、Ｍ  ＆  Ｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に共有結合で結合し、実施例２と同様の方法で各抗体の反応性を調べた。ペプチドの結合はメーカーの指示に従って実施したが、結合に用いたペプチドの濃度は１０μｇ／ｍｌである。
用いた抗体はＡＫＬ５Ｃ１、ＡＣＫ２Ｆ１２の抗アセチルリジンマウスモノクローナル抗体に加えて、やはり汎反応性が謳われている市販の抗アセチルリジンマウスモノクローナル抗体であるＡｃ−Ｋ−１０３、及び部位特異的な抗体の例として抗−アセチル化ヒストンＨ３（Ｌｙｓ−１４）（ａｎｔｉ−Ａｃ−Ｈ３−Ｋ１４と略記）及び抗−アセチル化ヒストンＨ４（Ｌｙｓ−１６）（ａｎｔｉ−Ａｃ−Ｈ４−Ｋ１６と略記）の二つのウサギポリクローナル抗体である。
結果を図５Ａ〜図５Ｅに示した。市販のＡｃ−Ｋ−１０３を含めた３種の抗アセチルリジンマウスモノクローナル抗体に関しては、ＡＣＫ２Ｆ１２が若干他の二つに較べてまんべんなく反応する傾向は認められるものの、今回調べた全てのアセチルリジン含有ペプチドに対して反応性を示した。しかし、いずれも非アセチル化ペプチドであるＨ３ＲＡには全く反応しなかった。
一方、部位特異的抗アセチルリジン抗体の二つは、それぞれ謳われているアセチル化部位を含むペプチドに対して、最も強く反応した。
実施例５． ＭＯＬＴ−４Ｆ細胞ｌｙｓａｔｅを用いた各抗体の反応性の比較
各抗体の反応性を比較するために、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇを用いた実験を実施した。ヒトＴ細胞白血病細胞株であるＭＯＬＴ−４Ｆ細胞をヒストンデアセチラーゼ阻害剤であるトリコスタチンＡにより１μＭの濃度で６時間処理した後に細胞ｌｙｓａｔｅを調製した。対照としてトリコスタチンＡ未処理の細胞ｌｙｓａｔｅも併せて調製した。比較した抗アセチルリジン抗体は、実施例４と同様にＡＫＬ５Ｃ１、ＡＣＫ２Ｆ１２、Ａｃ−Ｋ−１０３、ａｎｔｉ−Ａｃ−Ｈ３−Ｋ１４、及びａｎｔｉ−Ａｃ−Ｈ４−Ｋ−１６の５つである。結果を図６に示した。各レーンには６μｇタンパク量相当を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、ＰＶＤＦ膜に転写した。二次抗体としてはＨＲＰ標識した抗マウスＩｇＧ抗体を用い、アマシャム社のＥＣＬ  Ｐｌｕｓにてバンドを検出した。
まず、３つのマウスモノクローナル抗体の比較においては、今回樹立したＡＣＫ２Ｆ１２抗体が一番多くのアセチルリジン含有タンパク質を検出することが出来た。次いでＡＫＬ５Ｃ１で、一番悪かったのが市販のＡｃ−Ｋ−１０３であった。反応はいずれも１μｇ／ｍｌの濃度での結果である。これらの抗体の種々のアセチルリジン含有ペプチドに対する反応性をＥＬＩＳＡで調べる限りでは大きな差が認められなかったが（図５）、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔの手法を用いると検出能力に大きな差があることが分かった。いずれの抗体も、トリコスタチンＡ処理による複数のタンパク質のアセチル化の蓄積を検出できた。一方、アセチル化部位特異的な二つの抗体については、ａｎｔｉ−Ａｃ−Ｈ３−Ｋ１４はヒストンＨ３のみをほぼ選択的に認識し、トリコスタチンＡ処理によるこの分子のアセチル化の蓄積を検出した。ａｎｔｉ−Ａｃ−Ｈ４−Ｋ１６はトリコスタチン処理した時のヒストンＨ４にのみ弱く反応した。
実施例６． 細胞種によるアセチル化レベルの違いの検出と抗体の比較
ＭＯＬＴ−４Ｆ、ＨｅｐＧ２、１Ｂ２Ｃ６の３種類の細胞株の細胞ｌｙｓａｔｅを調製し、１レーン当たり３０μｇ泳動後に、ＰＶＤＦ膜にトランスファーした。ＡＫＬ５Ｃ１抗体及びＡＣＫ２Ｆ１２抗体それぞれ１μｇ／ｍｌの濃度で用いて、それ以外は同じ条件でＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔを実施して、各細胞のベーサルレベルでのアセチル化タンパク質の検出を試みた。結果を図７に示した。図６における結果と同様に、ＡＣＫ２Ｆ１２抗体はＡＫＬ５Ｃ１抗体に比してより多くのバンドを検出でき、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔにおける検出力はＡＣＫ２Ｆ１２の方が優れていることが確認された。
実施例７． 抗アセチルリジン抗体の直接標識による検出力増強
樹立した抗アセチルリジン抗体を用いて種々のアセチルリジン含有タンパク質を検出できることは分かったので、その検出力を更に増強させることを企図して、抗体を直接レポーター酵素で標識することを試みた。試みた方法は二種類。一つは、Ｐｉｅｒｃｅ社のＥＺ−ｌｉｎｋ  Ｐｌｕｓ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｅｒｉｏｘｉｄａｓｅを用いる方法である。これは、抗体分子中のアミノ基に反応する様にアルデヒド基を導入されたＨＲＰを用いる方法である。標識はメーカー提供のプロトコールに従って実施した。この方法で作製した標識抗体をＡｂ−ＨＲＰ−ＮＨ２と略記する。
もう一つは、システアミンで弱く還元して、重鎖間のジスルフィド結合を切り離し、露出したフリーのスルフヒドリル基にマレイミドで活性化したＨＲＰを結合させるという方法である。具体的には以下の手順で標識を実施した。０．５ｍｇの抗体を０．５ｍｌの０．１Ｍ  リン酸ナトリウム、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ６に溶解し、３ｍｇのシステアミンを添加した。３７℃で１．５時間反応後、ゲルろ過で溶媒を５ｍＭ  ＥＤＴＡ入りＰＢＳ（ＰＢＳ−ＥＤＴＡ）に置換し、還元された抗体を得た。一方３ｍｇのＨＲＰを１．５ｍｌのＰＢＳ−ＥＤＴＡに溶解し、そこに３ｍｇのｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ）を添加して３７℃で３０分反応させた。
ゲルろ過で溶媒をＰＢＳ−ＥＤＴＡに置換してマレイミドで活性化されたＨＲＰを得た。還元された抗体液と、マレイミドで活性化されたＨＲＰ液を混合し、排除分子量５００００の限外ろ過膜で５００μｌまで濃縮した後に４℃で一晩反応を進めた。反応終了後１ｍｇのシステアミンを添加し、室温で３０分反応させて未反応のマレイミドを潰した後に、ゲルろ過で溶媒をＰＢＳに置換して標識抗体を得た。この方法で作製した標識抗体をＡｂ−ＨＲＰ−ＳＨと略記する。二つの標識方法を比較した模式図を図８に示した。
実施例５に記載したのと同様の方法で調製した、ＭＯＬＴ−４Ｆ細胞のｌｙｓａｔｅを用いて、これら標識抗体の検出力の比較を行った。結果を図９に示した。トリコスタチンＡ処理及び無処理のＭＯＬＴ−４Ｆ細胞ｌｙｓａｔｅを２μｇ／レーンの用量で１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動を行い、ＰＶＤＦに転写した。検出はいずれも１μｇ／ｍｌ濃度相当の抗体を用いて実施した。図９のＡには非標識抗体を用いる方法を示したが、図６の結果と同様に、ＡＣＫ２Ｆ１２が最も検出力が高いことが分かる。
図９のＢには同じサンプルをＨＲＰ標識したＡＣＫ２Ｆ１２抗体で検出した結果を示したが、非標識の抗体の検出力に較べて明らかに多くのバンドが検出されており、直接標識された抗アセチルリジン抗体によってより多くのアセチルリジン含有タンパク質を検出できる様になることが分かる。特にその効果は、スルフヒドリル基を介してＨＲＰを結合した場合に顕著であった。このことは、抗体のアセチルリジン認識に抗体分子中のアミノ基が重要な役割を果たしている可能性を示唆しているものと思われる。
実施例８． ＡＣＫ２Ｆ１２−ＨＲＰ−ＳＨによる化学的にアセチル化されたＢＳＡの検出
ＡＣＫ２Ｆ１２−ＨＲＰ−ＳＨによる化学的にアセチル化されたＢＳＡの検出をＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔの手法にて行うことにより、どれくらい少量の修飾タンパク質まで検出できるかを調べた。結果を図１０に示した。各レーンには実施例１に記載のやり方で作製したアセチル化ＢＳＡを最大５０ｎｇ／レーンから、最少８０ｐｇ／レーンまでの量で電気泳動し、ＰＶＤＦ膜に転写後にＡＣＫ２Ｆ１２−ＨＲＰ−ＳＨ標識抗体にて検出したものである。図に示される通り、化学的に修飾したＢＳＡであればわずか８０ｐｇであっても十分検出することが可能であることが分かった。この、化学的に修飾されたＢＳＡは複数箇所がアセチル化しているものと思われるので、一分子内に一ヶ所ないし数カ所しかアセチル化されていないと思われるインタクトなタンパク質の検出にそのまま外挿できる訳ではないが、この結果は本修飾抗体の高い検出力を示すものである。
実施例９． マウス臓器ｌｙｓａｔｅ中のアセチルリジン含有タンパク質の検出
高感度にアセチルリジン含有タンパク質を検出できる系を手に出来たので、それを用いてマウス各臓器ｌｙｓａｔｅ中のアセチルリジン含有タンパク質の検出を試みた。Ｂａｌｂ／ｃマウス（♀）の各臓器を、９．８Ｍ  尿素、４％  ＣＨＡＰＳ、１００ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）中で超音波破砕し、遠心した上清を分析に用いた。各レーンのタンパク量が３０μｇとなる様に各臓器ｌｙｓａｔｅを１２％ゲルで電気泳動し、ＰＶＤＦ膜に転写後にＡＣＫ２Ｆ１２−ＨＲＰ−ＳＨにてＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔを実施した。
電気泳動前のサンプルは、１３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８，４％  ＳＤＳ，１５％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ，８０ｍＭ  ＤＴＴ，０．０１％  ブロモフェノールブルーで希釈し、３７℃で３０分処理した。結果を図１１に示した。臓器によって非常に特徴的な染色パターンを示し、特に、脳において複数のバンドが強く染色された。その他、肺、胃、肝臓等においても特徴的なバンドが認められた。ほとんどの臓器ではヒストンと思われる低分子量位置（１４．４−２１．５Ｋ）に顕著なバンドが認められたが、骨格筋では認められなかった。
次に、ここで検出されたバンドがアセチルリジンを含むタンパク質であり、抗アセチルリジン抗体により特異的に認識されていることを確認するために、同じマウス臓器ｌｙｓａｔｅの内、脳及び胃のｌｙｓａｔｅを１レーン当たり１５μｇ流し、同様の方法でＰＶＤＦ膜に転写した後、１０ｍＭのリジン、Ｎα−アセチルリジン、Ｎε−アセチルリジンを標識抗体と共存させ、競合実験を行った。結果は図１２に示した。Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔで検出されている多くのバンドは、Ｎε−アセチルリジンを共存させた時のみに消失したことから、これらのバンドは抗体の非特異的な結合の結果見えたものではなく、特異的に検出されたもの、即ちアセチルリジン含有タンパク質であることが強く示唆される。この様に、本発明の標識抗体を使用することにより、新規アセチルリジン含有タンパク質を効率良く検出することが可能になるものと思われる。
実施例１０． ＡＣＫ２Ｆ１２抗体可変領域の配列決定
ＡＣＫ２Ｆ１２抗体が、これまでに報告されている汎反応性の抗アセチルリジン抗体よりも優れた性質を有することを示して来たが、この違いが、抗体分子の構造上のどのような違いに起因するかを調べるために、既報に従い本抗体の可変領域をクローニングして、軽鎖、重鎖それぞれの可変領域をコードするｃＤＮＡの塩基配列を決定した。結果を、これまでに報告されている抗アセチルリジン抗体可変領域のｃＤＮＡ配列と並べて図１３Ａ及び図１３Ｂに示した。また、ｃＤＮＡの配列から予想されるアミノ酸配列を、やはり既報の抗体の配列と並べて図１４に示した。更に、配列番号：１及び３にはそれぞれＡＣＫ２Ｆ１２抗体軽鎖及び重鎖可変領域のｃＤＮＡ配列と対応するアミノ酸配列を並べて示した。
図に示される様に、ＡＣＫ２Ｆ１２抗体もこれまでに配列が報告されている４種類の抗体と、基本的には同じフレームワーク配列を有することが分かった。しかし、その配列は完全に同じではなく、既報告の抗体と塩基配列においては軽鎖で最低６箇所、重鎖で最低２３箇所、アミノ酸配列においては軽鎖で最低４箇所、重鎖で最低１４箇所の違いがあることが分かった。各配列間での不一致数をまとめた結果を図１５に示した。この結果から、今回樹立したＡＣＫ２Ｆ１２抗体は、基本的なフレームワーク配列は既報の配列と良く似てはいるが、尚多くの配列上の違いがあり、これらの違いによってこの抗体の高検出力がもたらされているものと考えられる。
また、市販のＡｃ−Ｋ−１０３抗体に関しては、ハイブリドーマは手に入らないが、、電気泳動で展開後ＰＶＤＦ膜に転写し、重鎖、軽鎖を切り出し、Ｎ末配列をプロテインシーケンサー（Ｂｅｃｋｍａｎ，ＬＦ−３０００）で決定した。同じ方法でＡＬ１１、ＡＬ３Ｄ５、ＡＫＬ３Ｈ６、及びＡＫＬ５Ｃ１抗体についても調べた結果と併せて図１６に示した。図に示される様に、Ａｃ−Ｋ−１０３抗体のＬ鎖のＮ末配列はＤＡＶＭＴＱＴＰＬＳであり、ＡＣＫ２Ｆ１２を除く他の抗体のＮ末配列と完全に一致した。また、重鎖のＮ末配列はいずれの抗体に関しても決定できなかった。これは、どの抗体のＮ末もブロックされているからであると思われる。
以上の結果から、周辺配列にあまり依存しないでアセチルリジン残基を認識するマウスモノクローナル抗体は基本的に共通のフレームワーク配列を有することが分かった。しかし、可変領域配列のいくつかの違いにより、抗体の検出力等の性質に大きな影響が出ることもまた分かった。
【産業上の利用可能性】  本発明により提供される抗アセチルリジンモノクローナル抗体及びその酵素標識体は、疾患の原因や診断マーカーとなりうる新たなアセチルリジン含有タンパク質の探索に有用である。更に、本発明により提供される抗アセチルリジンモノクローナル抗体及び酵素標識体は、リジン残基のアセチル化が重要な役割を果たす生体分子機能の制御や、アセチルリジン含有タンパク質の検出による疾病診断においても有用である。
【図１】
2006006695.tif 000002
【図２】
2006006695.tif 000003
【図３】
2006006695.tif 000004
【図４】
2006006695.tif 000005
【図５Ａ】
2006006695.tif 000006
【図５Ｂ】
2006006695.tif 000007
【図５Ｃ】
2006006695.tif 000008
【図５Ｄ】
2006006695.tif 000009
【図５Ｅ】
2006006695.tif 000010
【図６】
2006006695.tif 000011
【図７】
2006006695.tif 000012
【図８】
2006006695.tif 000013
【図９】
2006006695.tif 000014
【図１０】
2006006695.tif 000015
【図１１】
2006006695.tif 000016
【図１２】
2006006695.tif 000017
【図１３Ａ】
2006006695.tif 000018
【図１３Ｂ】
2006006695.tif 000019
【図１４】
2006006695.tif 000020
【図１５】
2006006695.tif 000021
【図１６】
2006006695.tif 000022
【配列表】
2006006695000001.xml
【国際調査報告】
2006006695.tif 000030
2006006695.tif 000031
2006006695.tif 000032
2006006695.tif 000033
2006006695.tif 000034
2006006695.tif 000035