(57)【要約】末梢血単核球からγδＴ細胞を選択的に活性化及び／又は増殖させ、高純度かつ大量培養させることが可能なγδＴ細胞の培養方法、該方法によって培養されたγδＴ細胞並びにがん患者や感染症を対象とした免疫療法において、該方法によって培養されたγδＴ細胞を含む治療・予防剤を提供する。末梢血単核球に０．０５〜１００μＭのビスホスホネートを添加することにより末梢血単核球中のγδＴ細胞を選択的に活性化及び／又は増殖させ、更に５０〜２０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２で刺激することにより活性化及び／又は増殖させ、高純度かつ大量に増殖させることができる。このようにして得られたγδＴ細胞には高い細胞傷害活性を有するＣＤ５６陽性細胞が多く含まれるため、がん患者や感染症を対象とした治療・予防剤として有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
末梢血単核球にビスホスホネート系骨代謝改善薬の濃度が０．０５〜１００μＭ及びＩＬ−２の濃度が５０〜２０００Ｕ／ｍＬとなるように添加して培養することを特徴とするγδＴ細胞の培養方法。
【請求項２】
前記ビスホスホネート系骨代謝改善薬を濃度が０．１〜３０μＭになるように添加することを特徴とする請求項１に記載のγδＴ細胞の培養方法。
【請求項３】
前記ビスホスホネート系骨代謝改善薬を、培養開始時に添加することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のγδＴ細胞の培養方法。
【請求項４】
前記ビスホスホネート系骨代謝改善薬が、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸、それらの塩及び／又はそれらの水和物であることを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載のγδＴ細胞の培養方法。
【請求項５】
前記パミドロン酸、その塩又はそれらの水和物の濃度が、１〜３０μＭであることを特徴とする請求項４に記載のγδＴ細胞の培養方法。
【請求項６】
前記アレンドロン酸、その塩又はそれらの水和物の濃度が、１〜３０μＭであることを特徴とする請求項４に記載のγδＴ細胞の培養方法。
【請求項７】
前記ゾレドロン酸、その塩又はそれらの水和物の濃度が、０．１〜１０μＭであることを特徴とする請求項４に記載のγδＴ細胞の培養方法。
【請求項８】
前記ＩＬ−２を濃度が、４００〜１０００Ｕ／ｍＬとなるように添加することを特徴とする請求項１乃至請求項７のいずれか一項に記載のγδＴ細胞の培養方法。
【請求項９】
末梢血単核球にビスホスホネート系骨代謝改善薬及びＩＬ−２を夫々濃度が０．０５〜１００μＭ及び５０〜２０００Ｕ／ｍＬとなるように添加して培養して得られることを特徴とするγδＴ細胞。
【請求項１０】
前記γδＴ細胞が、ＣＤ５６陽性γδＴ細胞を少なくとも２５％以上含んでいることを特徴とする請求項９に記載のγδＴ細胞。
【請求項１１】
前記γδＴ細胞が、ＣＤ５６陽性γδＴ細胞を少なくとも４０％以上含んでいることを特徴とする請求項９に記載のγδＴ細胞。
【請求項１２】
末梢血単核球にビスホスホネート系骨代謝改善薬及びＩＬ−２を夫々濃度が０．０５〜１００μＭ及び５０〜２０００Ｕ／ｍＬとなるように添加して培養されたγδＴ細胞を含有することを特徴とするがん及び／又は感染症の治療・予防剤。
【請求項１３】
前記γδＴ細胞が、ＣＤ５６陽性γδＴ細胞を少なくとも２５％以上含んでいることを特徴とする請求項１２に記載のがん及び／又は感染症の治療・予防剤。
【請求項１４】
前記γδＴ細胞が、ＣＤ５６陽性γδＴ細胞を少なくとも４０％以上含んでいることを特徴とする請求項１２に記載のがん及び／又は感染症の治療・予防剤。
【請求項１５】
前記γδＴ細胞が自己リンパ球由来であることを特徴とする請求項１２乃至１４のいずれか一項に記載のがん及び／又は感染症の治療・予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明はγδＴ細胞の培養方法に関する。更に、該培養方法によって培養されたγδＴ細胞、該培養方法によって培養されたγδＴ細胞を含有する治療・予防剤に関する。
【背景技術】  日本人の最も多い死亡原因として悪性新生物（以下、がんという）が挙げられる。がんの治療法としては、三大療法と言われる外科療法、化学療法、放射線療法があるが、夫々治療の困難性や副作用等といった問題がある。
近年、上記三大療法の他にがんの新しい治療法として免疫細胞療法が行われており、この免疫細胞療法は、上記の三大療法のような治療の困難性や副作用といった問題が少ないため注目されている。
この免疫細胞療法の中に、ＬＡＫ（ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｌｌｅｒ；リンフォカイン活性化キラー）療法というＴ細胞を活性化させる療法がある。Ｔ細胞は、αβ型のＴＣＲ（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を発現するαβＴ細胞とγδ型のＴＣＲを発現するγδＴ細胞との２種類があり、このＬＡＫ療法ではＴ細胞の中でも主にαβＴ細胞を活性化させる療法である。ここで、αβＴ細胞は獲得免疫を中心に担っているＴ細胞のことである。
一方、γδＴ細胞は、自然免疫を担う細胞である。最近ではがん細胞に対して細胞傷害活性（非特異的活性）を有することがわかり、このγδＴ細胞の有する強い抗腫瘍活性を利用した免疫療法の研究が行われている。
γδＴ細胞は非ペプチド抗原を認識して活性化するため、非ペプチド抗原として例えば、アルキルアミンやビスホスホネートでγδＴ細胞を刺激し、活性化及び／又は増殖させることが可能であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで末梢血から分離したγδＴ細胞に非ペプチド抗原を認識させ活性化及び／又は増殖に関する研究がなされている（Ｆｕｍｉ  Ｍｉｙａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００１；１６６（９）：５５０８−５５１４）。
しかしながら、γδＴ細胞は通常、末梢血中に１〜５％しか存在しないので、少量の血液を採取してγδＴ細胞を活性化及び／又は増殖させても治療に十分な純度及び細胞数を確保することができないといった問題がある。また、治療に十分な純度及び細胞数を確保するために患者からの採血量を多くすると、患者に多大な負担がかかるといった問題もある。
ところで、γδＴ細胞にはＣＤ５６を発現している細胞（以下ＣＤ５６陽性γδＴ細胞という）と発現していない細胞（以下ＣＤ５６陰性γδＴ細胞という）が存在し、ＣＤ５６陽性γδＴ細胞はＣＤ５６陰性γδＴ細胞に比べて、細胞傷害活性が高いことがわかっており（Ｆｕｊｉｍｉｙａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．３，６３３−６４３，Ａｐｒｉｌ  １９９７）、がんや感染症治療への応用が期待されている。
ここで、前記文献（Ｆｕｊｉｍｉｙａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．３，６３３−６４３，Ａｐｒｉｌ  １９９７）にはＣＤ５６陽性γδＴ細胞の作成方法が記載されているが、純度の高いＣＤ５６陽性γδＴ細胞群を得るために磁気ビーズを用いて少なくとも３回以上の選別を行わなくてはならず、工程が複雑であり、費用も高くなるという問題点が存在する。
また、特開２００１−３１４１８３においては５０％以上のＣＤ５６陽性細胞を含む細胞群を用いた治療剤と実施例があげられているが、ここで用いられているＣＤ５６陽性細胞はγδＴ細胞とナチュラルキラー細胞（以下ＮＫ細胞という）が混在したものであり、γδＴ細胞については１０％前後含まれているのみである。
【発明の開示】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、末梢血単核球からγδＴ細胞を選択的に活性化及び／又は増殖させ、高純度かつ大量培養させることが可能なγδＴ細胞の培養方法、該方法によって培養されたγδＴ細胞並びにがん患者や感染症等を対象とした免疫療法において、該方法によって得られたγδＴ細胞を含む治療・予防剤を提供することを目的とする。
本発明のγδＴ細胞の培養方法は、末梢血単核球にビスホスホネート系骨代謝改善薬（以下、ビスホスホネートと略記する）の濃度が０．０５〜１００μＭ及びインターロイキン２（以下、ＩＬ−２と略記する）の濃度が５０〜２０００Ｕ／ｍＬとなるように添加して培養することを特徴とする。
本発明のこのような構成によると、培養液中の末梢血単核球にビスホスホネートを０．０５〜１００μＭとなるように添加することにより、末梢血単核球中のγδＴ細胞を選択的に活性化及び／又は増殖させ、更にＩＬ−２を５０〜２０００Ｕ／ｍＬとなるように添加して刺激することにより活性化及び／又は増殖されたγδＴ細胞を高純度かつ大量に得ることが可能である。また、得られたγδＴ細胞にはＣＤ５６を発現した細胞が少なくとも４０％以上含まれている。
前記ビスホスホネートは、培養開始時に添加することを特徴とする。
このような構成によると、培養開始時にビスホスホネートを添加することにより、従来のように末梢血単核球からγδＴ細胞を分離して培養する場合と異なり、γδＴ細胞を分離する工程を経ずに選択的に活性化及び／又は増殖させるので、培養の一工程を省き効率的に培養することが可能となる。
本発明により得られたγδＴ細胞は非特異的な細胞傷害性機能、がん抗原特異的な細胞傷害性機能若しくは両方の細胞傷害性機能を有する。従って、がん疾患や感染症に対する治療・予防剤として用いることが可能である。
また、本発明により得られたγδＴ細胞は高い細胞傷害性機能を有するＣＤ５６陽性γδＴ細胞を多く含んでいる。従って、ＣＤ５６陽性γδＴ細胞について選択することにより、同じ細胞数を投与した場合により高い治療・予防効果を得ることが可能である。
さらには、本発明により作成された治療・予防剤は、非特異的な細胞傷害性機能、がん抗原特異的な細胞傷害性機能若しくは両方の細胞傷害性機能を有するγδＴ細胞の含有量が高く、γδＴ細胞の中でも細胞傷害性機能の高いＣＤ５６陽性γδＴ細胞を多く含むため、正常細胞を攻撃することなしに、がん細胞若しくは感染細胞を特異的に攻撃する機能を有し、様々ながん種および感染症の治療に有効である。特にγδＴ細胞が自己リンパ球由来であれば患者に投与された際に、患者自身の免疫系によって排除されることなく、その機能を発揮することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明の実施形態について説明する。
本発明のγδＴ細胞の培養方法は、末梢血単核球にビスホスホネート系骨代謝改善薬の濃度が０．０５〜１００μＭ及びＩＬ−２の濃度が５０〜２０００Ｕ／ｍＬとなるように添加して培養することによりγδＴ細胞を選択的に活性化及び／又は増殖させγδＴ細胞を高純度で含む細胞集団を得ることを特徴とする。
ビスホスホネートは、骨吸収抑制作用を有し、一般的に骨粗鬆症治療薬として使用されるものであればよく、その例として、パミドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物（例えば、パミドロン酸二ナトリウム・五水和物（Ａｒｅｄｉａ、ノバルティスファーマ））、アレンドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物（例えば、アレンドロン酸ナトリウム・三水和物（Ｏｎｃｌａｓｔ、萬有製薬））、ゾレドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物（例えば、ゾレドロン酸ナトリウム・水和物（Ｚｏｍｅｔａ、ノバルティスファーマ））、リセドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物（例えば、リセドロン酸ナトリウム・水和物）、イバンドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物（例えば、イバンドロン酸二ナトリウム）、インカドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物（例えば、インカドロン酸二ナトリウム）、エチドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物（例えば、エチドロン酸二ナトリウム）が挙げられ、これらの中で、とりわけパミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物等の窒素原子を有するもの（アミノビスホスホネート）が好ましい。
（１）第一の実施形態；γδＴ細胞の培養方法
以下に、本発明のγδＴ細胞の培養方法について、順に説明する。
１）採血により、末梢血を得る。量としては１５〜２５ｍＬが適量である。これだけの量を得られれば、好適に培養することが可能である。ただし、培養開始時に十分な末梢血量であればこの範囲に限らず、また、採血するドナーの負担が少ないようであれば、上限値が更に高くなってもよい。
２）例えば密度勾配遠心法により、末梢血単核球を得る。個数としては１５〜２５ｍＬの末梢血からはおおむね１０７個の末梢血単核球を得ることができる。
３）２）で得られたおよそ１０７個の末梢血単核球を培養液ＡＩＭ−Ｖ（インビトロジェン）中に懸濁する。ここで末梢血単核球を懸濁した液を細胞懸濁液という。なお、ここで示した培養液以外にも、ＲＰＭＩ−１６４０培地（インビトロジェン）、ダルベッコ改変イーグル培地（インビトロジェン、以下ＤＭＥＭという）、イスコフ培地（インビトロジェン、以下ＩＭＥＭという）等の細胞の培養に使用される市販の培養液を使用してもよい。
また、必要に応じて血清を０．１〜２０％添加してもよい。血清として、例えば、牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ、以下ＦＣＳという）、ＡＢ血清又は自己血漿等を使用してもよい。
４）３）で得られた細胞懸濁液をフラスコ、バッグ又はプレートに播種する。
５）フラスコ、バッグ又はプレート中に播種された末梢血単核球に濃度が０．０５〜１００μＭ、好ましくは０．１〜３０μＭとなるようにビスホスホネートを添加する。ここで、更に、パミドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物であれば１〜３０μＭ、アレンドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物であれば１〜３０μＭ、ゾレドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物では０．１〜１０μＭにすることが好ましい。
６）更に、上記培養液にＩＬ−２を濃度が５０〜２０００Ｕ／ｍＬ、より好ましくは４００〜１０００Ｕ／ｍＬとなるように添加する。
７）６）でＩＬ−２を添加した後３４〜３８℃、より好ましくは３７℃で、２〜１０％、より好ましくは５％ＣＯ２存在下で培養する。この際、培養する細胞数に応じ、培養液を適宜添加する。更に、培養液の増加に伴い、ＩＬ−２の濃度が５０〜２０００Ｕ／ｍＬ、より好ましくは４００〜１０００Ｕ／ｍＬとなるように適宜添加する。
培養期間としては７日間以上であれば高純度でγδＴ細胞を含む細胞群が得られるが、更にγδＴ細胞の細胞数を増やすには、１４日間程度培養することが好ましい。
８）このようにして得られたγδＴ細胞には細胞傷害性機能の高いＣＤ５６陽性γδＴ細胞が多く含まれており、ＣＤ５６陽性γδＴ細胞について選別し、使用することも可能である。ＣＤ５６陽性γδＴ細胞を選別する方法として、例えば磁気細胞分離法（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ、以下ＭＡＣＳという）やフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｅｍｅｔｒｙ）等が挙げられる。
以上の方法により、γδＴ細胞を効率よく増殖することができる。
（２）第二の実施形態；γδＴ細胞を用いた治療・予防剤
次に、本発明の培養方法によって得られた活性化γδＴ細胞を用いた治療・予防剤について説明する。
１）本発明の培養方法によって得られた細胞を遠心分離等により回収する。
２）回収した細胞を洗浄液で洗浄する。洗浄液は、細胞と浸透圧が等しい等張液であることが好ましく、医薬品として使用可能な液体であればより好ましい。ここで、患者に投与することを考慮すると、例えば生理食塩水、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ；リン酸緩衝生理食塩水）等を利用することが好ましい。
３）洗浄後に得られたγδＴ細胞を遠心分離法等を用いて回収し、医薬品として可能な液体、例えば、生理食塩水等に懸濁して本発明の治療・予防剤を調製することができる。この際、懸濁用液体の使用量は投与する細胞数や投与方法に応じて適宜調整される。
本発明の治療・予防剤に用いるγδＴ細胞数は、投与方法、疾病の種類、患者の症状等に応じて適宜選択されるが、通常、１０８〜１０１２個／人であることが好ましく、より好ましくは１０９個／人以上である。
４）生理食塩水に懸濁してγδＴ細胞を用いた治療・予防剤を得る。
また、がんの治療・予防剤として使用する場合には、ＩＬ−２及びＩＬ−１２等のサイトカインと本発明の予防・治療剤とを組み合わせることも可能である。
更に、ウイルス感染症の治療・予防剤として使用する場合には、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）等と本発明の予防・治療剤とを組み合わせることも可能である。
５）投与する方法としては、例えば静脈内、皮内、皮下等へ注射することも、病変部に直接注入しても、また点滴として全身投与してもよい。更に、病変部近辺の動脈から注入してもよい。
本発明の治療・予防剤は、非特異的な細胞傷害性機能、がん抗原特異的な細胞傷害性機能若しくは両方の細胞傷害性機能を有するγδＴ細胞の含有量が高く、特に細胞傷害性機能の高いＣＤ５６陽性γδＴ細胞を多く含んでいるので、正常細胞を攻撃することなしに、がん細胞若しくは感染細胞を特異的に攻撃する機能を有し、様々ながん種および感染症の治療に有効な治療・予防剤となる。特にγδＴ細胞が自己リンパ球由来であれば患者に投与された際に、患者自身の免疫系によって排除されることなく、その機能を発揮することが可能となる。
【実施例】  以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１
＜γδＴ細胞の培養方法における各種ビスホスホネートによる好適濃度の検討＞
１）まず、健常人ドナーから末梢血を１８０ｍＬ採血し、血球分離用比重液を用いて末梢血単核球を分離した。
２）得られた末梢血単核球を、ＦＣＳを１０％となるように添加した培養液ＡＩＭ−Ｖ（以下ＡＩＭ−Ｖ（１０％ＦＣＳ）という）に懸濁した。
３）２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（ＳＵＭＩＬＯＮ）に、１×１０６／１ｍＬの健常人末梢血単核球を播種した。
４）γδＴ細胞を活性化及び／又は増殖するためのビスホスホネートとしてＡｒｅｄｉａ、Ｏｎｃｌａｓｔ、Ｚｏｍｅｔａをそれぞれ添加し、３７℃、５％ＣＯ２濃度条件下で培養を開始した。
５）次に、培養開始０、５、７、９、１１日後にＩＬ−２を濃度が４００、１０００、２０００Ｕ／ｍＬとなるように添加した。更に細胞の増殖に応じて培養液ＡＩＭ−Ｖを添加し、１４日間培養を行った。
６）上述の通り、１４日間培養した後に得られた細胞群中にγδＴ細胞を発現している細胞の割合をＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ（以下ＦＡＣＳという、Ｅｐｉｃｓ  ＸＬ−ＭＣＬ  ＡＤＣ、ベックマン・コールター）により測定した。測定により、得られた値を以下表１〜３に示す。
これらの結果により、高純度量なγδＴ細胞を得るには、ビスホスホネート系骨代謝改善薬の濃度を０．１〜３０μＭに、またＩＬ−２は４００〜２０００Ｕ／ｍＬなるように添加することが好ましいことが確認された。またＡｒｅｄｉａは１〜３０μＭ、Ｏｎｃｌａｓｔは１〜３０μＭ、Ｚｏｍｅｔａは０．１〜１０μＭの濃度で添加することがより好ましいことが確認された。
【表１】
2006006720.tif 000002
【表２】
2006006720.tif 000003
【表３】
2006006720.tif 000004
実施例２
＜γδＴ細胞の効率的増殖に係るＩＬ−２の最適濃度の検討＞
１）健常人末梢血を採血し、血球分離用比重液を用いて末梢血単核球を分離した。
２）培養液ＡＩＭ−Ｖ（１０％ＦＣＳ）に１）で得られた末梢血単核球を懸濁した。
３）２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１×１０６／１ｍＬの末梢血単核球懸濁液を播種した。
４）末梢血単核球懸濁液に濃度が１０μＭとなるようにＡｒｅｄｉａを添加した。
５）培養開始０、３、７、９、１１、１４日後にＩＬ−２の濃度が２００、４００、７００、１０００、１５００Ｕ／ｍＬとなるように添加した。
６）細胞の増殖に応じて培養液ＡＩＭ−Ｖ（１０％ＦＣＳ）を添加した。
７）１４日間培養を行った。
８）１４日間の培養後に得られた細胞の生細胞数をトリパンブルーを用いて調べた。
９）また、１４日間の培養後に得られた細胞の表面抗原をＦＡＣＳにより調べ、γδＴ細胞の割合を測定した。その結果ＩＬ−２を４００〜１０００Ｕ／ｍＬを添加すると大量のγδＴ細胞を得ることができることが確認された。
ＩＬ−２の量を変化させた時のγδＴ細胞の割合（％）を表４と、表５に示す。表４は培養７日、９日、１１日、１４日目の、表５は培養０日、３日、７日、９日、１１日、１４日目の細胞数（×１０６個）をそれぞれ示した。
なお、表４ａ）と表５ａ）の末梢血単核球は、同一のドナー由来のものであり、表４ｂ）と表５ｂ）の末梢血単核球は、同一のドナー由来のものである。
この結果により、高純度かつ多量なγδＴ細胞を得るには、ＩＬ−２の量は４００〜１５００Ｕ／ｍＬ、培養日数は１１日以上がより好ましいことが確認された。
【表４】
2006006720.tif 000005
【表５】
2006006720.tif 000006
2006006720.tif 000007
実施例３
＜ＣＤ５６陽性、ＣＤ５６陰性γδＴ細胞の選別とそれぞれの細胞傷害活性の比較＞
１）健常人ドナーから末梢血を４０ｍｌ採血し、血球分離用比重液を用いて末梢血単核球を分離した。
２）得られた末梢血単核球を、ＡＩＭ−Ｖ（１０％ＦＣＳ）に懸濁した。
３）２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（ＳＵＭＩＬＯＮ）に、１×１０６／１ｍＬの末梢血単核球を播種した。ＩＬ−２を７００Ｕ／ｍＬ、Ａｒｅｄｉａを１０μＭ添加し、３７℃、５％ＣＯ２濃度条件下で培養を開始した。
４）培養を開始してから０、５、７、９、１１日後にＩＬ−２を濃度が７００Ｕ／ｍＬとなるように添加した。更に細胞の増殖に応じて培養液ＡＩＭ−Ｖを添加し、１４日間培養を行った。
５）１４日間培養後、得られた細胞群の表面抗原をＦＡＣＳにより測定した。その結果、末梢血単核球にＡｒｅｄｉａを添加し、活性化及び／または増殖させたγδＴ細胞はＮＫＧ２Ｄを発現していることが明らかとなった。ここでＮＫＧ２Ｄとは活性型ＮＫ細胞レセプターの１つで、ＮＫ細胞やγδＴ細胞やＣＤ８陽性Ｔ細胞に発現しており、そのリガンドであるＭＩＣＡ／Ｂ分子を発現している細胞をＮＫＧ２Ｄ／ＭＩＣＡ相互反応を介して傷害することが知られている。また、ＣＤ５６を発現している細胞群が約５０％存在していることが確認された。
【表６】
2006006720.tif 000008
６）得られた細胞群をＣＤ５６マイクロビーズ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）により標識し、ＭＡＣＳにより、ポジティブフラクション（ＣＤ５６陽性細胞群）とネガティブフラクション（ＣＤ５６陰性細胞群）を回収した。得られた細胞を反応細胞とした。
【表７】
2006006720.tif 000009
７）標的細胞としてＵ２６６（多発性骨髄腫細胞株）を使用し、標的細胞と反応細胞を区別するために、標的細胞をＰＫＨ−２６（ＰＫＨ２６  Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｋｅｒ  Ｋｉｔ、ＳＩＧＭＡ）で染色した。
８）反応細胞と標的細胞の比（以下Ｅ／Ｔ比という）が０：１（標的細胞のみの対照群）、１：１、１０：１となるように２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播種し、３７℃、５％ＣＯ２濃度条件下で４時間共培養を行った。
９）次に、共培養した細胞を回収し、アポトーシスの初期段階を同定するＡｎｎｅｘｉｎＶとアポトーシス後期およびネクローシスを同定する７−ＡＡＤ（ＡＮＮＥＸＩＮ  Ｖ−ＦＩＴＣ／７−ＡＡＤ  ＫＩＴ、ベックマン・コールター）により染色し、Ｕ２６６に対する細胞傷害活性をＦＡＣＳにより測定した。ＦＡＣＳ解析においてＰＫＨ−２６陽性細胞にゲートをかけることで標的細胞のみを解析することができる。
表８において、Ａｎｎ＋はＡｎｎｅｘｉｎＶの蛍光を発色していた細胞数、Ａｎｎ−は発色していない細胞数を示す。また、７ＡＡＤ＋は７−ＡＡＤの蛍光を発色していた細胞数、７ＡＡＤ−は発色していなかった細胞数を示している。すなわち、Ａｎｎ−７ＡＡＤ＋はネクローシスを起こしている細胞、Ａｎｎ＋７ＡＡＤ＋はアポトーシス後期である細胞、Ａｎｎ＋７ＡＡＤ−はアポトーシス初期である細胞、Ａｎｎ−７ＡＡＤ−は生存している細胞であることを示す。
なお、細胞傷害活性の値は式１により算出した。
式１
2006006720.tif 000010
これにより、ＣＤ５６陽性γδＴ細胞はＣＤ５６陰性γδＴ細胞に比べＵ２６６に対する細胞傷害活性が高いことが確認された。また、ＣＤ５６陰性γδＴ細胞にもＮＫＧ２Ｄの発現が確認されていることから、ＮＫＧ２ＤおよびＣＤ５６両方を発現したγδＴ細胞がより効率の良い細胞傷害活性を持つことが確認された。
【表８】
2006006720.tif 000011
【国際調査報告】
2006006720.tif 000012
2006006720.tif 000013
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