【手続補正書】
【提出日】令和1年12月24日(2019.12.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スクリーニング方法であって、
（ｉ）結合メンバーの親ライブラリーを用意することであって、前記ライブラリー中のそれぞれの結合メンバーが融合タンパク質および必要に応じて、前記融合タンパク質と結合したパートナードメインを含み、
前記融合タンパク質が、レシピエント多様性足場ドメイン中に挿入されたドナー多様性足場ドメインを含み、必要に応じて、前記ドナー多様性足場ドメインのＮおよびＣ末端が、４個までのアミノ酸のリンカーを用いて、前記レシピエント多様性足場ドメインに連結されており、
前記ドナー多様性足場ドメインがドナー足場およびドナー相互作用配列を含み、前記レシピエント多様性足場ドメインがレシピエント足場およびレシピエント相互作用配列を含み、前記ドナー相互作用配列、前記レシピエント相互作用配列および前記リンカーの内の１つ、２つまたは３つ全てが、前記親ライブラリー中で多様性を有すること、
（ｉｉ）結合活性を示す結合メンバーで前記ライブラリーをスクリーニングすること、および
（ｉｉｉ）結合活性を示す、前記親ライブラリー中の１個または複数の結合メンバーを特定すること、を含む、方法。
【請求項２】
下記により前記１個または複数の結合メンバーをさらに濃縮することを含む、請求項１に記載の方法：
（ａ）前記１個または複数の結合メンバーを回収すること、
（ｂ）前記回収した結合メンバーを前記結合活性による選択に供すること、
（ｃ）前記１個または複数の選択された結合メンバーを回収すること、
（ｄ）必要に応じて、ステップ（ｂ）および（ｃ）を１回または複数回繰り返すこと。
【請求項３】
下記をさらに含む、請求項１又は２に記載の方法：
（ｉｖ）１個または複数の特定された親結合メンバーのアミノ酸配列中の、１個または複数の位置に多様なアミノ酸残基を導入し、結合メンバーの改変ライブラリーを生成すること、
（ｖ）前記改変ライブラリーから結合活性を示す改変結合メンバーをスクリーニングすること、および
（ｖｉ）前記改変ライブラリー中の、前記結合活性を示す１個または複数の改変結合メンバーを特定すること。
【請求項４】
下記により前記１個または複数の結合メンバーをさらに濃縮することを含む、請求項３に記載の方法：
（ｅ）前記１個または複数の改変結合メンバーを回収すること、
（ｆ）前記回収した改変結合メンバーを前記結合活性による選択に供すること、
（ｇ）前記１個または複数の選択された結合メンバーを回収すること、および
（ｈ）必要に応じて、ステップ（ｆ）および（ｇ）を１回または複数回繰り返すこと。
【請求項５】
下記を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法：
（ｖｉｉ）前記１個または複数の特定された結合メンバーまたは改変結合メンバー由来の前記融合タンパク質を、結合パートナーの多様性集団と結合させて、結合メンバーのシャッフルライブラリーを生成すること、
（ｖｉｉｉ）前記シャッフルライブラリーから結合活性を示すシャッフル結合メンバーをスクリーニングすること、
（ｉｘ）前記結合活性を示す１個または複数のシャッフル結合メンバーを特定すること。
【請求項６】
下記により前記１個または複数のシャッフル結合メンバーをさらに濃縮することを含む、請求項５に記載の方法：
（ｉ）前記１個または複数のシャッフル結合メンバーを回収すること、
（ｊ）前記回収したシャッフル結合メンバーを前記結合活性による選択に供すること、  （ｋ）前記１個または複数の選択された結合改変メンバーを回収すること、および
（ｌ）必要に応じて、ステップ（ｊ）および（ｋ）を１回または複数回繰り返すこと。
【請求項７】
前記融合タンパク質のドナーおよびレシピエントの両方の多様性足場が、前記融合タンパク質の結合活性に寄与する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ライブラリー由来の１個または複数の特定された結合メンバーを単離および／または精製することを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ライブラリー中の結合メンバーが、前記結合メンバーをコードする核酸を含むリボソーム、細胞またはウイルスの表面上に提示される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ライブラリー由来の前記１個または複数の特定された結合メンバーを提示する前記リボソーム、細胞またはウイルスを単離および／または精製することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ライブラリー由来の前記１個または複数の特定された結合メンバーをコードする前記核酸を単離および／または精製することを含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ライブラリー由来の前記１個または複数の特定された結合メンバーをコードする前記核酸を増幅および／またはクローニングすることを含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ライブラリー由来の１個または複数の特定された結合メンバーを合成または組み換え発現させることを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ライブラリーから特定された前記１個または複数の結合メンバーの標的分子の活性に対する効果を測定することを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的分子が、イオンチャネルであり、前記１個または複数の特定された結合メンバーの、前記チャネルを通るイオン流に対する効果が測定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記親ライブラリー由来の１個または複数の特定された結合メンバーから単離されたドナー多様性足場ドメインを合成または組み替え発現させることを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
１個または複数の前記特定された結合メンバーを、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｆｃ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭまたはＩｇＧとして再フォーマットすることを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
治療薬部分、半減期延長部分または検出可能な標識を、前記１個または複数の特定された結合メンバーに付加することを含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
結合メンバーのライブラリー生成方法であって、
レシピエント多様性足場ドメインに挿入されたドナー多様性足場ドメインを含む融合タンパク質の多様性集団をコードする核酸の集団を用意することであって、
前記ドナー多様性足場ドメインがドナー足場およびドナー相互作用配列を含み、前記レシピエント多様性足場ドメインがレシピエント足場およびレシピエント相互作用配列を含み、必要に応じて、前記ドナー多様性足場ドメインのＮおよびＣ末端が、４個までのアミノ酸リンカーを用いて前記レシピエント多様性足場ドメインに連結されて、前記ドナー相互作用配列、前記レシピエント相互作用配列および前記リンカーの内の１つ、２つまたは３つ全てが、前記集団中で多様性を有すること、
前記核酸集団を発現させて、前記多様性集団を生成すること、および
必要に応じて、前記融合タンパク質をパートナードメインの集団と結合させて、それにより、結合メンバーのライブラリーを生成すること、を含む、方法。
【請求項２０】
前記核酸が、細胞中でまたは無細胞のリボソーム中で発現される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が原核細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞が真核細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記真核細胞が、植物、酵母、昆虫または哺乳動物細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
結合メンバーのライブラリーであって、
レシピエント多様性足場ドメインに挿入されたドナー多様性足場ドメインを含む融合タンパク質の多様性集団を含み、
前記ドナー多様性足場ドメインがドナー足場およびドナー相互作用配列を含み、前記レシピエント多様性足場ドメインがレシピエント足場およびレシピエント相互作用配列を含み、必要に応じて、前記ドナー多様性足場ドメインのＮおよびＣ末端が、４個までのアミノ酸リンカーを用いて前記レシピエント多様性足場ドメインに連結され、
前記ドナー相互作用配列、前記レシピエント相互作用配列および前記リンカーの内の１つ、２つまたは３つ全てが、前記集団中で多様性を有し、
必要に応じて、前記融合タンパク質が結合パートナーに結合してヘテロダイマーを形成する、ライブラリー。
【請求項２５】
レシピエント多様性足場ドメイン中に挿入されたドナー多様性足場ドメインを含む融合タンパク質であって、前記ドナー多様性足場ドメインがドナー足場およびドナー相互作用配列を含み、前記レシピエント多様性足場ドメインがレシピエント足場およびレシピエント相互作用配列を含む、融合タンパク質。
【請求項２６】
請求項２５に記載の融合タンパク質およびパートナードメインを含む、結合メンバー。
【請求項２７】
結合メンバーの生成方法であって、
ドナー多様性足場ドメインをコードする核酸を、レシピエント多様性足場ドメインをコードする核酸に挿入して、融合タンパク質をコードするキメラ核酸を生成することであって、
前記ドナー多様性足場ドメインがドナー足場およびドナー相互作用配列を含み、前記レシピエント多様性足場ドメインがレシピエント足場およびレシピエント相互作用配列を含むこと、
前記キメラ核酸を発現させて、前記融合タンパク質を生成すること、および
必要に応じて、前記融合タンパク質をパートナードメインに付加すること、を含む、方法。
【請求項２８】
片方または両方の多様性足場ドメインが、複数のジスルフィド結合を含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
【請求項２９】
前記レシピエント多様性足場ドメインが、免疫グロブリン、免疫グロブリンドメイン、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ノッチン、プロテインＡ、「設計アンキリンリピートタンパク質」（ＤＡＲＰｉｎ）、ａｄｈｉｒｏｎ、フィブロネクチンドメイン、アンチカリンおよびＴ７ファージ遺伝子２タンパク質（Ｇｐ２）からなる群から選択される、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
【請求項３０】
前記レシピエント多様性足場ドメインが、免疫グロブリンの全体またはその一部である、請求項２９に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
【請求項３１】
前記レシピエント多様性足場ドメインが、抗体可変ドメインの全体またはその一部である、請求項３０に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
【請求項３２】
前記レシピエント多様性足場ドメインが、抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインである、請求項３１に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
【請求項３３】
前記パートナードメインが、抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメインである、請求項３２に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
【請求項３４】
前記ＶＬドメインおよび前記ＶＨドメインが可撓性リンカーにより連結されている、請求項３３に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
【請求項３５】
前記ドナー多様性足場ドメインが、前記抗体可変ドメインのＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２またはＶＬ  ＣＤＲ３の全体またはその一部を置換する、請求項２９〜３３のいずれか１項に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
【請求項３６】
前記ドナー多様性足場ドメインが、前記抗体ＶＬドメインのＣＤＲ１またはＣＤＲ２の全体またはその一部を置換する、請求項３２に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
【請求項３７】
前記ドナー多様性足場ドメインが、免疫グロブリン、免疫グロブリンドメイン、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、プロテインＡ、毒液ペプチドまたはノッチンなどのシステインリッチペプチド、「設計アンキリンリピートタンパク質」（ＤＡＲＰｉｎ）、ａｄｈｉｒｏｎ、フィブロネクチンドメイン、アンチカリンおよびＴ７ファージ遺伝子２タンパク質（Ｇｐ２）からなる群から選択される、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
【請求項３８】
前記ドナー多様性足場ドメインが、システインリッチペプチドである、請求項３７に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
【請求項３９】
ドナー多様性足場ドメインが、毒液ペプチドである、請求項３８に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
【請求項４０】
前記ドナー多様性足場ドメインがノッチンである、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
【請求項４１】
前記ドナー多様性足場ドメインが、テッポウウリトリプシン阻害剤−ＩＩ（ＥＥＴＩ−ＩＩ）、ＫＣｏＴＩ−ＩＩ、Ｈｕｗｅｎｔｏｘｉｎ−ＩＶ、ＰｒｏＴｘ−ＩＩ、ＳＳｍ６ａ、カリオトキシン，ＭｏＫａ−１、Ｓｈｋ、ＰｃＴｘ１若しくはコノトキシン−ω、またはこれらのバリアントである、請求項４０に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
【請求項４２】
前記ドナー多様性足場ドメインの天然のＮおよびＣ末端が、前記レシピエント多様性足場ドメインに連結されている、請求項３７〜４１のいずれか１項に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
【請求項４３】
前記ドナー多様性足場ドメインの環化および直線化により生成された人工のＮおよびＣ末端が、前記レシピエント多様性足場ドメインに連結されている、請求項３７〜４１のいずれか１項に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
【請求項４４】
請求項２５及び２８〜４３のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項４５】
請求項２４および２８〜４３のいずれか１項に記載のライブラリーをコードする核酸の集団。