(57)【要約】配列番号１に記載の塩基配列を有する核酸、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、前記核酸からなる遺伝子を含有する組換えベクター、又は当該組換えベクターを含む形質転換細胞を用いることにより、ヒト以外の霊長類のＯＲＬ１遺伝子等が提供され、また、ＯＲＬ１に作用する化合物の評価、スクリーニング等が可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載の塩基配列からなる単離された核酸。
【請求項２】
配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする単離された核酸。
【請求項３】
配列番号１に記載の塩基配列又はこれと相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＯＲＬ１としての活性を有するタンパク質をコードする、サル由来の単離された核酸。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸からなるサルＯＲＬ１遺伝子。
【請求項５】
請求項４に記載のサルＯＲＬ１遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の組換えベクターを含む形質転換細胞。
【請求項７】
配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる単離されたタンパク質。
【請求項８】
配列番号２に記載のアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつＯＲＬ１としての活性を有する単離されたタンパク質。
【請求項９】
サルＯＲＬ１遺伝子を導入し、該遺伝子を発現する細胞を調製する工程と、
該細胞に被検化合物を接触させる工程と、
該遺伝子の発現によって得られるタンパク質に対する該被検化合物の特異的結合を検出する工程と、を含む化合物の評価方法。
【請求項１０】
サルＯＲＬ１遺伝子を導入し、該遺伝子を発現する細胞を調製する工程と、
該細胞に被検化合物を接触させる工程と、
該細胞と被検化合物との接触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程と、
該活性と被検化合物を接触させない場合の該細胞内情報伝達物質の活性とを比較する工程と、を含む化合物の評価方法。
【請求項１１】
被検化合物を、ＯＲＬ１としての活性を有するサル由来のタンパク質に接触させる工程と、
該タンパク質と被検化合物との接触による該タンパク質の活性の変化を検出する工程と、を含む化合物の評価方法。
【請求項１２】
前記サルがアカゲザルである、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の化合物の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、新規のサルＯＲＬ１（ｏｐｉｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ  １）遺伝子、ＯＲＬ１タンパク質、前記遺伝子を含む組換えベクター、前記組換えベクターを含む形質転換細胞、及び前記遺伝子又はタンパク質を用いた化合物の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  ノシセプチン（オルファニンＦＱと同一物質）は、オピオイドペプチドと類似の構造を持つ１７アミノ酸よりなるペプチドである。ノシセプチンは、侵害刺激に対する反応性の増強活性、食欲増進活性、空間学習能力を低下させる活性、古典的オピエイト作動薬の鎮痛作用に対する拮抗作用、ドーパミン放出抑制作用、水利尿作用、血管拡張作用、全身血圧降下作用などを有しており、脳内でノシセプチン受容体であるＯＲＬ１を介して痛みや食欲の調節又は記憶・学習等に関与していると考えられている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５及び非特許文献６）。【０００３】  また、ＯＲＬ１の発現が阻止されたノックアウト・マウスにおいては、モルヒネ耐性が減弱されること又は記憶・学習能力が向上することが知られている（非特許文献７及び非特許文献８）。【０００４】  したがって、ＯＲＬ１へのノシセプチンの結合を特異的に阻害する物質は、癌性疼痛、術後疼痛、偏頭痛、痛風、慢性リウマチ、慢性疼痛、神経痛等の痛みを伴う疾患に対する鎮痛薬、モルヒネに代表される麻薬性鎮痛薬への耐性克服薬、モルヒネに代表される麻薬性鎮痛薬への依存性克服薬、鎮痛作用増強薬、抗肥満薬、脳機能改善薬、アルツハイマー病治療薬、抗痴呆薬、精神分裂症治療薬、パーキンソン病及び舞踏病に代表される退行性神経変性疾患の治療薬、抗うつ薬、尿崩症治療薬、多尿症治療薬又は低血圧治療薬として有用であることが期待できる。【０００５】  ところで、ヒトＯＲＬ１は、オピオイド受容体のクローニングの過程でオピオイド受容体遺伝子と高い相同性を有するオーファン受容体としてクローニングされた（非特許文献９）。この受容体は、従来のオピオイドリガンドとの結合は認められず、その機能が不明であったが、その後、ＯＲＬ１のｃＤＮＡが発現した細胞に脳ペプチド画分を反応させることにより、ノシセプチン又はオルファニンＦＱがｃＡＭＰを減少させる活性を有する内因性リガンドとして同定、単離された（非特許文献１０及び非特許文献１１）。【０００６】  一方、治療薬や診断薬の開発において、候補化合物は、げっ歯類及び霊長類においてその生理学的作用が評価される。これは、候補化合物が動物種によって異なる薬効を示すことがあるためであり、よりヒトに近い霊長類において評価することが効率的な治療薬や診断薬の開発に結びつく。
【非特許文献１】ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９９５年、３７７巻、５３２頁
【非特許文献２】ソサイエティー・フォー・ニューロサイエンス（Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９６年、２２巻、４５５頁
【非特許文献３】ニューロレポート（ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ）、１９９７年、８巻、４２３頁
【非特許文献４】ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９７年、９巻、１９４頁
【非特許文献５】ニューロサイエンス（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９６年、７５巻、１頁及び３３３頁
【非特許文献６】ライフ・サイエンス（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１９９７年、６０巻、ＰＬ１５頁及びＰＬ１４１頁
【非特許文献７】ニューロサイエンス・レターズ（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）、１９９７年、２３７巻、１３６頁
【非特許文献８】ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９９８年、３９４巻、５７７頁
【非特許文献９】フェブス・レターズ（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）、１９９４年、３４１巻、３３頁
【非特許文献１０】ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９９５年、３７７巻、５３２頁
【非特許文献１１】サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９５年、２７０巻、７９２頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  しかしながら、ヒト以外の霊長類のＯＲＬ１遺伝子は未だ単離されておらず、ヒト以外の霊長類の遺伝子を用いた治療薬や診断薬の評価は不可能な状況であった。【０００８】  本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、ヒト以外の霊長類のＯＲＬ１遺伝子及びＯＲＬ１タンパク質を提供することを目的とする。また、当該遺伝子又はタンパク質を用いた化合物の評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】  本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、アカゲザルＯＲＬ１遺伝子を単離することに成功するとともに、当該受容体（アカゲザルＯＲＬ１）を用いた結合実験によりリガンドの評価を行うことに成功し、本発明を完成した。【００１０】  すなわち、本発明の核酸は、配列番号１に記載の塩基配列を含むことを特徴とする。【００１１】  また、本発明の核酸は、配列番号１に記載の塩基配列からなることを特徴とする。さらに、本発明の核酸は、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるクンパク質をコードすることを特徴とする。このような核酸からなるサルＯＲＬ１遺伝子（ＯＲＬ１としての活性を有するタンパク質をコードする、サル由来の遺伝子）も本発明によって提供される。【００１２】  また、本発明の核酸は、配列番号１に記載の塩基配列又はこれと相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＯＲＬ１タンパク質（ＯＲＬ１としての活性を有するタンパク質）をコードする、サル由来の単離された核酸であることを特徴とする。このような核酸からなるサルＯＲＬ１遺伝子も本発明によって提供される。【００１３】  さらに、本発明の組換えベクターは、前述の核酸又は遺伝子を含有することを特徴とする。また、本発明の形質転換細胞は、前記組換えベクターを含むことを特徴とする。【００１４】  また、本発明のタンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。さらに、本発明のタンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする。さらに、本発明のタンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつＯＲＬ１としての活性を有する単離されたタンパク質であることを特徴とする。【００１５】  このような核酸、遺伝子、タンパク質、発現ベクター又は宿主細胞を利用することにより、霊長類ＯＲＬ１又はその変異体の発現系の構築が可能となるとともに、当該発現系を用いた化合物の評価系の構築が可能となる。【００１６】  また、本発明の化合物の評価方法は、サルＯＲＬ１遺伝子を導入し、当該遺伝子を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該遺伝子の発現によって得られるタンパク質（ＯＲＬ１としての活性を有するサル由来のタンパク質）に対する当該被検化合物の特異的結合を検出する工程と、を含むことを特徴とする。【００１７】  さらに、本発明の化合物の評価方法は、サルＯＲＬ１遺伝子を導入し、当該遺伝子を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該細胞と被検化合物との接触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程と、当該活性と被検化合物を接触させない場合の当該細胞内情報伝達物質の活性とを比較する工程と、を含むことを特徴とする。【００１８】  さらに、本発明の化合物の評価方法は、被検化合物を、サルＯＲＬ１タンパク質（ＯＲＬ１としての活性を有するサル由来のタンパク質）に接触させる工程と、当該ＯＲＬ１タンパク質と被検化合物との接触による前記ＯＲＬ１タンパク質の活性の変化を検出する工程と、を含むことを特徴とす���。【００１９】  このような化合物の評価方法によれば、霊長類ＯＲＬ１を使用した治療薬・診断薬の候補化合物の評価やスクリーニングが可能となり、よりヒトに近いモデルシステムによって効率的な薬剤の開発が可能となる。
【発明の効果】
【００２０】  本発明の核酸、タンパク質及び化合物の評価方法によれば、ヒト以外の霊長類のＯＲＬ１遺伝子及びＯＲＬ１タンパク質を得ることが可能となるとともに、当該遺伝子又はタンパク質を用いて化合物の評価、スクリーニングを行うことが可能となる。従って、当該遺伝子又はタンパク質を用いた治療薬や診断薬の評価、開発が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）及びヒト（ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）のＯＲＬ１タンパク質のアミノ酸配列の相同性を比較した図である。
【図２】図２は、アカゲザルＯＲＬ１を用いた結合実験において、［１２５Ｉ］［Ｔｙｒ１４］ノシセプチンの濃度とＯＲＬ１への特異的結合量との関係を示すグラフである。
【図３】図３は、ヒトＯＲＬ１を用いた結合実験において、［１２５Ｉ］［Ｔｙｒ１４］ノシセプチンの濃度とＯＲＬ１への特異的結合量との関係を示すグラフである。
【図４】図４は、アカゲザル又はヒトのＯＲＬ１を用いた結合実験において、ノシセプチンの濃度と［３５Ｓ］ＧＴＰγＳのＯＲＬ１への特異的結合量の関係を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】  以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。【００２３】  本発明における「核酸」とは、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ若しくは修飾されたＤＮＡ又はＲＮＡをいい、好ましくはＤＮＡをいう。また、前記ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡであるとｃＤＮＡであるとを問わず、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。【００２４】  また、本発明における「単離された」核酸又はタンパク質とは、組換えＤＮＡ技術により作成された場合は細胞物質、培養培地を実質的に含有せず、化学合成された場合には前駆体物質又はその他の物質を実質的に含まない、核酸又はタンパク質をいう。【００２５】  また、本発明における「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、二つの核酸断片が、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールドスプリングハーバー（１９８９）、９．４７−９．６２及び１１．４５−１１．６１に記載されたハイブリダイゼーション条件下で、相互にハイブリダイズすることを意味する。より具体的には、例えば、約４５℃にて６．０×ＳＳＣでハイブリダイゼーションを行った後に、５０℃にて２．０ｘＳＳＣで洗浄する条件が挙げられる。ストリンジェンシー選択のため、洗浄工程における塩濃度を、例えば低ストリンジェンシーとしての約２．０ｘＳＳＣ、５０℃から、高ストリンジェンシーとしての約０．２×ＳＳＣ、５０℃まで選択することができる。さらに、洗浄工程の温度を低ストリンジェンシー条件の室温、約２２℃から、高ストリンジェンシー条件の約６５℃まで増大させることができる。【００２６】  次に、本発明に係るアカゲザルＯＲＬ１について説明する。【００２７】  本発明に係るアカゲザルＯＲＬ１遺伝子は、１１１３塩基のオープンリーディングフレーム（配列番号１）を有し、３７０アミノ酸のタンパク質（配列番号２）をコードする。【００２８】  アカゲザルＯＲＬ１遺伝子のクローニング方法としては特に制限はないが、具体的には、例えば、アカゲザルＯＲＬ１遺伝子又は当該遺伝子に相同性の高い遺伝子由来の核酸断片をもとに５’−ＲＡＣＥ又は３’−ＲＡＣＥで全長ｃＤＮＡを増幅する方法、適切なベクター（プラスミドベクター、バクテリオファージ等）を用いて構築されたｃＤＮＡライブラリーをアカゲザルＯＲＬ１遺伝子の核酸断片を用いてスクリーニングする方法が挙げられる。【００２９】  また、アカゲザルＯＲＬ１遺伝子とヒトＯＲＬ１遺伝子との間の相同性は、コーディング領域において約９５．９％であり、４４塩基が相違する。本発明の核酸には、配列番号１に記載の塩基配列において１又は２以上の塩基の置換、欠失、挿入又は付加があるものも含まれる。かかる置換、欠失、挿入又は付加された塩基の数としては、１〜４３塩基であることが好ましく、１〜３０塩基であることがより好ましく、１〜２０塩基であることがさらに好ましく、１〜１０塩基であることが特に好ましく、１〜５塩基であることがさらに好ましい。また、このような核酸は、その相同性に基づけば、配列番号１に記載の塩基配列との相同性が９６％以上であることが好ましく、９７％以上であることがより好ましく、９８％以上であることがさらに好ましく、９���％以上であることが特に好ましい。ここで、このような核酸は、配列番号１に記載の塩基配列又はこれと相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を単離することにより得ることができる。また、そのような核酸は、その由来となる動物種は特に限定されないが、具体的には、例えば、サル由来のＯＲＬ１遺伝子（ＯＲＬ１としての活性を有するタンパク質をコードする遺伝子）であることが好ましく、サル由来のＯＲＬ１遺伝子としては、例えば、アカゲザル、カニクイザル、ニホンザル、リスザル、ミドリザル、アヌビスヒヒ又はコモンマーモセットのＯＲＬ１遺伝子が挙げられる。【００３０】  配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質（アカゲザルＯＲＬ１タンパク質）は、上述したように、３７０アミノ酸からなる。図１に示されるように、アカゲザルＯＲＬ１タンパク質（配列番号２）とヒトＯＲＬ１タンパク質（配列番号３）との間の相同性は９７．８％であり、７アミノ酸が相違する。【００３１】  アカゲザルＯＲＬ１の調製方法としては特に制限はないが、具体的には、例えば、単離したアカゲザルＯＲＬ１遺伝子を発現ベクターに挿入した後、この発現ベクター（組換えベクター）を動物細胞、昆虫細胞又は大腸菌等の宿主細胞に導入して前記遺伝子を発現させ、その遺伝子産物であるタンパク質を精製する方法が挙げられる。【００３２】  本発明は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体を含む。前記変異体としては、配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１又は２以上６以下のアミノ酸が置換、欠失又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質や、１又は２以上のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。このような変異タンパク質は、生物学的に活性であることが好ましく、ＯＲＬ１としての活性を有することがより好ましい。【００３３】  また、本発明は以下のいずれかの核酸又は遺伝子を含有する発現ベクター（組換えベクター）をも提供する。
１．配列番号１に記載の塩基配列を含む単離された核酸。
２．配列番号１に記載の塩基配列からなる単離された核酸、又はこの核酸からなるサルＯＲＬ１遺伝子。
３．配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする単離された核酸、又はこの核酸からなるサルＯＲＬ１遺伝子。
４．配列番号１に記載の塩基配列又はこれと相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＯＲＬ１としての活性を有するタンパク質をコードする、サル由来の単離された核酸、又はこの核酸からなるサルＯＲＬ１遺伝子。【００３４】  本発明の組換えベクターは、公知の方法に従って、本発明の核酸又は遺伝子を適当な発現ベクターに挿入することにより得ることができる。ここで、前記発現ベクターとしては、当業者に周知のベクターであれば特に制限はなく、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、ｐＣＩ−ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＭＣ１ｎｅｏ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＥＦ１／Ｖ５−ＨｉｓＢ、ｐＣＲ２．１、ｐＥＴ１１、λｇｔ１１又はｐＣＲ３．１が挙げられる。本発明の組換えベクターは、宿主細胞中で自律複製が可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列（ＳＤ配列）及びターミネーターを含んだものであることが好ましい。【００３５】  また、前記１．における「配列番号１に記載の塩基配列を含む」とは、前記塩基配列に、ベクターとのリンカー配列や遺伝子組換えに使用可能な制限酵素切断部位等の遺伝子の改変に必要な配列が付加されていることをいう。【００３６】  さらに、本発明は、前記組換えベクターを含む宿主細胞（形質転換細胞）をも提供する。【００３７】  本発明の形質転換細胞は、公知の方法に従って、本発明の組換えベクターを適当な宿主細胞中に導入することにより得ることができる。当該宿主細胞としては、当業者に周知の細胞であれば特に制限はなく、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、微生物のいずれでもよい。かかる細胞としては、具体的には、例えば、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＣＨＯ、ＮＩＨ／３Ｔ３、２９３、Ｒａｊｉ、ＣＶ１１、Ｃ１２７１、ＭＲＣ−５、ＣＰＡＥ、Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）、ＨｅＬａ、２９３Ｔ又はＳｆ９が挙げられる。前記組換えベクターを宿主細胞に導入する方法としては、公知の方法であれば特に限定されないが、具体的には、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポフェクション法又は遺伝子銃法が挙げられる。【００３８】  また、本発明は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変異体に対する抗体を含む。当該抗体は、前記タンパク質又はその一部のペプチドを抗原として調製することができ、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれであってもよい。当該抗体はエピトープとなるアミノ酸配列によってサルＯＲＬ１タンパク質のみならず、異種のＯＲＬ１タンパク質にも反応する場合があるが、サルＯＲＬ１タンパク質にのみ選択性を有する抗体を調製する場合には、サルＯＲＬ１タンパク質において異種のＯＲＬ１タンパク質との相同性の低い領域をペプチド抗原として使用してモノクローナル抗体を調製することにより、所望の特異性を有する抗体を調製することができる。【００３９】  次に、本発明にかかる、配列番号１に記載の塩基配列を有する核酸、及び配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の用途について列挙し、それぞれ説明する。【００４０】（１）化合物の評価
本発明の核酸又はタンパク質を用いて、ＯＲＬ１に作用する化合物の評価をすることができる。ＯＲＬ１に対する作用を検出する方法として、被検化合物の当該受容体に対する特異的結合を検出する方法、被検化合物の接触によって変化した遺伝子の発現量を検出する方法、及び、当該接触によって生じたＯＲＬ１を介した細胞内情報伝達の活性を検出する方法が挙げられる。以下、順に説明する。【００４１】  先ず、被検化合物の当該受容体に対する特異的結合を検出することにより、被検化合物を評価する方法について説明する。【００４２】  本発明の化合物の評価方法は、サルＯＲＬ１遺伝子を導入し、当該遺伝子を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該遺伝子の発現によって得られるタンパク質（サルＯＲＬ１タンパク質）に対する当該被検化合物の特異的結合を検出する工程と、を含むことを特徴とする。【００４３】  また、本発明の第２の化合物の評価方法は、サルＯＲＬ１遺伝子を導入し、当該遺伝子を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、当該細胞と被検化合物との接触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程と、当該活性と被検化合物を接触させない場合の該細胞内情報伝達物質の活性とを比較する工程と、を含むことを特徴とする。【００４４】  被検化合物としては、特に制限はなく、例えば、タンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、人工的に合成された化合物が挙げられる。【００４５】  また、サルＯＲＬ１遺伝子を発現する細胞は、当業者が公知の方法で調製すればよく、具体的な方法としては特に制限はないが、例えば以下の方法によることができる。すなわち、先ず、本発明の配列番号１に記載の塩基配列を有する核酸又はその一部からなる核酸を好適なプロモーター及び転写調節エレメントを含む発現ベクターにクローニングする。ここで、前記ベクターとしては、発現ベクターとして利用可能なものであれば特に限定されないが、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、ｐＣＩ−ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＭＣ１ｎｅｏ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＥＦ１／Ｖ５−ＨｉｓＢ、ｐＣＲ２．１、ｐＥＴ１１、λｇｔ１１又はｐＣＲ３．１が挙げられる。【００４６】  次に、本発明の核酸が挿入された発現ベクター（組換えベクター）を宿主細胞に導入する。かかる宿主細胞としては、遺伝子の発現に通常使用されるものであれば特に限定されず、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、微生物のいずれであってもよく、具体的には、例えば、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＣＨＯ、ＮＩＨ／３Ｔ３、２９３、Ｒａｊｉ、ＣＶ１１、Ｃ１２７１、ＭＲＣ−５、ＣＰＡＥ、ＨｅＬａ、２９３Ｔ又はＳｆ９が挙げられる。また、前記組換えベクターを宿主細胞に導入する方法としては、公知の方法であれば特に限定されないが、具体的には、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポフェクション法又は遺伝子銃法が挙げられる。【００４７】  次に、このようにして調製したＯＲＬ１遺伝子を発現する細胞（形質転換細胞）に被検化合物を接触させる。接触させる方法としては特に制限はなく、例えば、水溶液や緩衝液のような溶液中で接触さ��る方法が挙げられる。【００４８】  細胞表面に発現した受容体と被検化合物との結合は、例えば、結合した化合物に付された標識による検出（例えば、結合量を放射活性や蛍光強度により検出する）のほか、被検化合物の細胞表面上の前記受容体への結合による細胞内へのシグナル伝達（例えば、Ｇタンパク質の活性化、Ｃａ２＋、又はｃＡＭＰの濃度変化、ホスホリパーゼＣの活性化、ｐＨの変化、受容体のインターナリゼーション）を指標に検出することができる。また、前記シグナル伝達によって生じたシグナル伝達経路上の分子の発現レベルや活性を指標にすることもできる。ここで、当該発現レベルを指標とする場合、発現レベルの測定法は特に制限されないが、例えば、ノーザンブロッティング、ウェスタンブロッティング又はＤＮＡチップが挙げられる。ここで、本発明における「発現レベル」とは、ＯＲＬ１を介した情報伝達経路上に存在するタンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ又はｍＲＮＡ）の転写産物（ｍＲＮＡ）又は翻訳産物（タンパク質）の絶対量又は相対量をいう。また、シグナル伝達経路上の分子の活性を指標にする場合、活性測定方法は特に制限されず、測定の対象となる分子の種類によって好適な方法を選択すればよい。【００４９】  一方、単離されたサルＯＲＬ１タンパク質（ＯＲＬ１としての活性を有するサル由来のタンパク質）を化合物の評価に直接使用することもできる。すなわち、被検化合物をサルＯＲＬ１タンパク質に接触させ、次に、接触によって生じた前記ＯＲＬ１タンパク質の活性の変化を検出する方法である。【００５０】  かかる接触の方法としては特に制限はなく、具体的には、例えば、緩衝液（リン酸緩衝液等）等の溶液中で混合することにより接触させる方法や、ＯＲＬ１タンパク質をメンブレン上に固定し、メンブレン上で被検化合物と接触させる方法が挙げられる。【００５１】  次に、接触によって生じた前記ＯＲＬ１タンパク質の活性の変化を検出する。【００５２】  タンパク質の活性変化の検出方法としては、使用するタンパク質の性質により適宜設定すればよく、具体的には、例えば、ＯＲＬ１に対するノシセプチンの結合活性を指標にする方法が挙げられる。【００５３】  前記のノシセプチンの結合活性を指標にする方法としては特に制限はないが、具体的には、例えば、ＯＲＬ１タンパク質が固定されたメンブレンに対する被検化合物の親和性を測定することによって結合活性を測定する方法が挙げられる。ここで用いられる被検化合物は、検出が容易なように放射性同位体等で標識されていてもよい。また、前記結合活性の検出方法として、放射性同位体で標識したノシセプチンと競合してＯＲＬ１へ結合する化合物を検出する方法も挙げられ、かかる方法を用いた場合には、被検化合物の標識は不要である。【００５４】  以上のように、本発明の化合物の評価方法により化合物を検出した結果、被検化合物の存在下におけるノシセプチンの結合活性が、被検化合物の非存在下におけるノシセプチンの結合活性（対照）より低い値を示した場合には、当該被検化合物は、ＯＲＬ１とリガンド又はそのアナログとの結合を阻害すると判定される。このような化合物は、前記受容体（ＯＲＬ１）に結合して細胞内へのシグナル伝達を誘導する活性を有する化合物（アゴニスト）及び当該活性を有しない化合物（アンタゴニスト）などが含まれる。アゴニストは、ＯＲＬ１に対するリガンド及びそのアナログと同様の生理活性を有しており、一方、アンタゴニストは、ＯＲＬ１に対するリガンド及びそのアナログが有する生理活性を有しておらず、リガンド及びそのアナログのＯＲＬ１への結合を阻害する。このため、これらアゴニストやアンタゴニストは、ＯＲＬ１を介したシグナル伝達系の異常などに起因する疾患の治療などのための医薬組成物として有用である。【００５５】  また、本発明の化合物の評価方法により、ＯＲＬ１への被検化合物の結合後の細胞内シグナル伝達を促進又は阻害する物質のスクリーニングを行うことができる。すなわち、上述した方法によって複数の被検化合物を評価することにより、アゴニスト又はアンタゴニストとして機能する化合物を選択することができる。かかる選択の結果、被検化合物非存在下においてノシセプチン及びそのアナログを作用させた場合の細胞内シグナル伝達の変化と比較して、その変化が抑制されれば、当該被検化合物は、ＯＲＬ１への被検化合物の結合後の細胞内シグナル伝達を阻害する化合物であると判定される。逆に、被検化合物が細胞内シグナル伝達を増強させれば、当該化合物は、ＯＲＬ１への被検化合物の結合後の細胞内シグナル伝達を促進する化合物であると判定される。このようなスクリーニング方法によって選択された化合物は、ノシセプチン及びＯＲＬ１が関与する各種疾患に対する医薬、例えば癌性疼痛、術後疼痛、偏頭痛、痛風、慢性リウマチ、慢性疼痛、神経痛等の痛みを伴う疾患に対する鎮痛薬、モルヒネに代表される麻薬性鎮痛薬への耐性克服薬、モルヒネに代表される麻薬性鎮痛薬への依存性克服薬、鎮痛作用増強薬、抗肥満薬、脳機能改善薬、アルツハイマー病治療薬、抗痴呆薬、精神分裂症治療薬、パーキンソン病及び舞踏病に代表される退行性神経変性疾患治療薬、抗うつ薬、尿崩症治療薬、多尿症治療薬又は低血圧治療薬として有用であると考えられる。【００５６】  また、上述した本発明の化合物の評価方法により、ＰＥＴ（ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）に用いるリガンドの評価を行うことができる。ＰＥＴは、水、酸素、ブドウ糖、アミノ酸といった生体内に存在する物質あるいは目的とする受容体に対するリガンドを放射性同位体で標識して体内に投与することにより、非侵襲的に生体機能を観察する方法であり、研究や臨床において利用されている。ＰＥＴの特徴は、トレーサーとして用いるリガンドに依存した機能特異的なイメージングを可能にする点にあり、新たなトレーサーの開発は未知の生体機能の解明や疾患の診断に不可欠である。本発明の化合物の評価方法によれば、被検化合物としてＰＥＴリガンド候補物質を適用することにより、当該物質のインビトロでの評価を行うことが可能となる。【００５７】（２）ハイブリダイゼーションに用いるプローブ
本発明の配列番号１に記載の塩基配列の一部、又は全部からなる核酸をハイブリダイゼーション用のプローブとして使用することにより、ＯＲＬ１遺伝子を検出することが可能である。かかる検出としては、生体由来の組織や細胞を被検体としたＯＲＬ１遺伝子の検出のみならず、ＯＲＬ１遺伝子又は当該遺伝子と相同性の高い遺伝子のクローニング等にも応用可能である。また、前記核酸をプローブとして使用し、種々の組織における遺伝子発現を調べることにより、遺伝子発現の分布を同定することも可能である。【００５８】  前記核酸をプローブとして使用する場合、ハイブリダイゼーションの方法としては特に制限はなく、例えば、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、ドットハイブリダイゼーション、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＦＩＳＨ）、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＩＳＨ）、ＤＮＡチップ法が挙げられる。【００５９】  前記核酸をハイブリダイゼーション用のプローブとして使用する場合、少なくとも連続する２０塩基の長さの核酸が必要であり、好ましくは４０塩基、さらに好ましくは６０塩基、特に好ましくは８０塩基以上のものが使用される。また、当該プローブは、必要に応じて検出可能なように標識して用いてもよい。具体的には、例えば、３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、３５Ｓ等の放射性同位体で標識されていてもよく、ビオチン、蛍光色素、酵素、金コロイド等で標識されていてもよい。【００６０】  また、前記核酸をハイブリダイゼーション用のプローブとして使用する場合のハイブリダイゼーションの条件としては、プローブの長さやハイブリダイゼージョンの対象となる遺伝子の種類に応じて当業者が適宜選択すればよいが、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールドスプリングハーバー（１９８９）、９．４７−９．６２及び１１．４５−１１．６１を参照して行うことができる。より具体的には、約４５℃にて６．０×ＳＳＣでハイブリダイゼーションを行った後に、５０℃にて２．０ｘＳＳＣで洗浄する条件が挙げられる。ストリイジェンシー選択のため、洗浄工程における塩濃度を、例えば低ストリンジェンシーとしての約２．０ｘＳＳＣ、５０℃から、高ストリンジェンシーとしての約０．２×ＳＳＣ、５０℃まで選択することができる。さらに、洗浄工程の温度を低ストリンジェンシー条件の室温、約２２℃から、高ストリンジェンシー条件の約６５℃まで増大させることができる。【００６１】（３）ＰＣＲに使用するプライマー
ＯＲＬ１遺伝子を検出する方法として、本発明の配列番号１に記載の塩基配列の一部をプライマーとして使用したＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法を挙げることができる。【００６２】  このようなプライマーの長さは、その塩基配列や単離する遺伝子の塩基配列等によって適宜設定することができるが、一般に、連続した１０〜６０塩基であることが好ましく、１５〜３０塩基であることがより好ましい。
【実施例】
【００６３】  以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００６４】（実施例１：アカゲザルＯＲＬ１ｃＤＮＡの単離）
全ＲＮＡはＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン社製）を用いてアカゲザル前頭前野皮質から調製した。オリゴｄＴプライマー及びＡＭＶトランスクリプターゼ（ライフサイエンス社製）を用いて、全ＲＮＡから１ｓｔストランドｃＤＮＡを合成した。ヒトＯＲＬ１の５’及び３’非翻訳領域に設定したプライマー（５’−ＴＡＣＣＧＴＡＣＡＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＣ（配列番号３）、３’−ＡＣＧＧＧＴＡＣＣＡＣＧＧＡＣＡＧ（配列番号４））を用いて、アカゲザル前頭前野皮質ｃＤＮＡから全長のＯＲＬ１を増幅した。遺伝子の増幅にはＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を用い、９４℃で４５秒、５０℃で７２秒、７２℃で９０秒を３０サイクル行った。このようにして増幅された１．２ｋｂの核酸断片を単離し、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（インビトロゲン社製）を用いて発現ベクターｐＣＲ３．１にサブクローニングした。アカゲザルＯＲＬ１の種々の箇所に設定したプライマーを用いてシークエンサーにより両鎖の塩基配列を決定した。塩基配列の確認は複数のクローンの塩基配列をシークエンスすることにより行った。【００６５】（実施例２：アカゲザルＯＲＬ１安定発現細胞の構築）
アカゲザルＯＲＬ１全長を含む発現ベクター（組換えベクター）をＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍ  Ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガ社製）を用いてＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ）−Ｋ１細胞にトランスフェクトした。この細胞は１０％牛胎児血清及び１ｍｇ／ｍＬジェネティシン（ギブコ社製）を含むＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。ジェネティシン抵抗性を示した細胞をクローニングし、［１２５Ｉ］［Ｔｙｒ１４］ノシセプチンを用いたバインディングアッセイによりＯＲＬ１を発現しているクローン（ＣＨＯ−ｒｈＯＲＬ１）を同定した。【００６６】（実施例３）
メンブレンの調製：
先ず、ＣＨＯ−ｒｈＯＲＬ１細胞を、１５４ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、０．８ｍＭ  ＣａＣｌ２及び２０％スクロースを含む１０ｍＭ  ３−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＭＯＰＳ）緩衝液（ｐＨ７．４）中でホモジナイズした。ホモジナイズした溶液を１０，０００ｇで遠心分離した後、上清を１００，０００ｇで遠心分離した。得られた沈殿物を５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）中でホモジナイズした。タンパク質濃度は、ＢＣＡプロテインアッセイキット（シグマ社製）により、ＢＳＡを対照として測定した。【００６７】ラジオリガンド結合実験：
メンブレンを、種々の濃度（１０〜３２０ｐＭ）の［１２５Ｉ］［Ｔｙｒ１４］ノシセプチン、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．０２５％バシトラシンを含む総量２００μＬの溶液と、ｐＨ７．４、３７℃の条件下で６０分間インキュベートした。また、メンブレンを１μｍｏｌ／Ｌの非標識のノシセプチン存在下でインキュベートした後に残存する放射活性の総量を非特異的結合とみなし、測定値から非特異的結合値を引いた数値を特異的結合値とした。インキュベーションは、セルハーベスターを用いて、０．５％ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）中で予浸したＧＦ／Ｃフィルターを急速に通過させることにより停止させた。その後、フィルターは４℃の５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／Ｔｒｉｓ、０．１％ＢＳＡ（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。フィルター上に残った放射活性はガンマカウンター（パッカード社製）により測定した。また、得られた結果はプリズムソフトウエアパッケージ（Ｇｒａｐｈｐａｄ社製）により解析した。【００６８】（比較例１）
アカゲザルＯＲＬ１遺伝子に代えてヒトＯＲＬ１遺伝子を用いた以外は実施例３と同様にして解析を行った。【００６９】  実施例３及び比較例１の結果（図２及び図３）より、アカゲザルＯＲＬ１に対する［１２５Ｉ］［Ｔｙｒ１４］ノシセプチンの解離定数（ｋｄ）は２７プラスマイナス４ｐＭであり、ノシセプチンがサルＯＲＬ１に対してもヒトと同様に高い親和性を有することが明らかとなった。【００７０】（実施例４：［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合実験）
実施例３において調製したメンブレンを、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び５μＭ  ＧＤＰ、ｐＨ７．４の溶液中の２００ｐＭ［３５Ｓ］ＧＴＰγＳとインキュベートした。この溶液にはコムギ胚芽アグルチニン（ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）でコートされたＳＰＡビーズを加えてあり、種々の濃度のノシセプチン存在下又は非存在下、２５℃で２．５時間インキュベートした。また、メンブレンを非標識のＧＴＰγＳ（１０μｍｏｌ／Ｌ）存在下でインキュベートした後に残存する放射活性の総量を非特異的結合とみなし、測定値から非特異的結合値を引いた数値を特異的結合値とした。メンブレンに結合した放射活性は、トップカウントマイクロプレートシンチレーションカウンター（ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔｅｒ）（パッカード社製）により検出した。【００７１】（比較例２）
アカゲザルＯＲＬ１遺伝子に代えてヒトＯＲＬ１遺伝子を用いた以外は実施例４と同様にして解析を行った。【００７２】  実施例４及び比較例２の結果（図４に示すノシセプチンの用量反応曲線）より、アカゲザルＯＲＬ１のＥＣ５０は２．３プラスマイナス０．４ｎＭであり、サルＯＲＬ１がノシセプチンに対してヒトＯＲＬ１と同様な機能を有していると判断できた。
【産業上の利用可能性】
【００７３】  本発明の核酸、タンパク質及び化合物の評価方法によれば、ヒト以外の霊長類のＯＲＬ１遺伝子及びＯＲＬ１タンパク質を得ることが可能となるとともに、当該遺伝子又はタンパク質を用いて化合物の評価、スクリーニングを行うことが可能となる。従って、当該遺伝子又はタンパク質を用いた治療薬や診断薬の評価、開発が可能となる。従って、ヒトの医薬の研究、開発の効率化に大きく貢献をするものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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