【手続補正書】
【提出日】令和2年10月12日(2020.10.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステビオール配糖体組成物を調製する方法であって、
（ａ）構造：
2019535238.tif 000001

を有するレバウジオシドＷ、及び
（ｂ）β−グルコシダーゼ
を含む反応混合物を調製することと、
レバウジオシドＷＢ１、レバウジオシドＷＢ２、又はそれらの組合せを含むステビオール配糖体組成物を生成するのに十分な時間、前記反応混合物をインキュベートすることとを含み、
レバウジオシドＷＢ１が以下の構造を有し、
2019535238.tif 000002

レバウジオシドＷＢ２が以下の構造を有する、
2019535238.tif 000003

前記方法。
【請求項２】
前記β−グルコシダーゼが、配列番号５のアミノ酸配列を有する、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）β−グルコシダーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
レバウジオシドＷＢ１を含む粗生成物を得ることを更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
レバウジオシドＷＢ１を、レバウジオシドＤ４を生成するのに十分な時間、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼとインキュベートすることを更に含み、前記ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼが、ＨＶ１ＵＧＴ酵素であり、レバウジオシドＤ４が以下の構造を有する、
2019535238.tif 000004

請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼを、スクロース、ウリジンジホスフェート（ＵＤＰ）、及びウリジンジホスフェート−グルコース（ＵＤＰ−グルコース）の存在下、スクロースシンターゼとインキュベートする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
レバウジオシドＤ４を、レバウジオシドＭを生成するのに十分な時間、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼとインキュベートすることを更に含み、当該ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼが、配列番号１のアミノ酸配列を有するＵＧＴ７６Ｇ１又はその機能的相同体である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
レバウジオシドＤ４を、レバウジオシドＭを生成するのに十分な時間、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼとインキュベートすることを更に含み、当該ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼが、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
レバウジオシドＤ４を、レバウジオシドＭを生成するのに十分な時間、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼとインキュベートすることを更に含み、前記ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼが、配列番号３のアミノ酸配列を有する酵素の突然変異体であり、前記突然変異体が、配列番号３の３位、６位、９０位、９１位、９３位、１８１位、１８３位、１８４位、１８５位、３５０位、３８９位、４１０位、４１８位、４５０位、４５１位、４５２位、及び４５４位から選択される位置に対応するアミノ酸残基位置で少なくとも１つの突然変異を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
甘味料としての使用のために、前記反応混合物からこのように生成されたレバウジオシドＭを得ること更に含む、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
構造：
2019535238.tif 000005

を有するレバウジオシドＷＢ１を含む甘味料組成物。
【請求項１１】
構造：
2019535238.tif 000006
を有するレバウジオシドＷＢ２。
【請求項１２】
構造：
2019535238.tif 000007
を有するレバウジオシドＤ４。
【請求項１３】
請求項１１又は１２に記載の合成レバウジオシドを含む甘味料組成物。
【請求項１４】
甘味化量の請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のレバウジオシドを含み、飲料製品または他の消費製品から選択される、経口消費製品。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９３】
産業上の利用可能性／技術分野の記述
本開示は、食品、飼料、飲料、および薬理学的な産業における適用性を有する。本開示は、一般に、改変された微生物株によるステビオール配糖体の生合成製造法に関する。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕培地内で成長する形質転換細胞系によって産生される、対象のステビオール配糖体。
〔２〕前記形質転換細胞系が、酵母、非ステビオール配糖体産生植物、藻類および細菌からなる群から選択される、前記〔１〕に記載の対象のステビオール配糖体。
〔３〕前記ステビオール配糖体が構造：
2019535238.tif 000008

のＲｅｂ  Ｄ４である、前記〔１〕に記載の対象のステビオール配糖体。
〔４〕前記ステビオール配糖体がＲｅｂ  ＷＢ１である、前記〔１〕に記載の対象のステビオール配糖体。
〔５〕前記ステビオール配糖体がＲｅｂ  ＷＢ２である、前記〔１〕に記載の対象のステビオール配糖体。
〔６〕原料物質がステビオールである、前記〔１〕に記載の対象のステビオール配糖体。
〔７〕前記細胞系が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、前記〔２〕に記載の対象のステビオール配糖体。
〔８〕前記ステビオール配糖体含量が少なくとも７０％純粋である、前記〔２〕に記載の対象のステビオール配糖体。
〔９〕甘味化量の前記〔３〕に記載のステビオール配糖体を含む消費製品。
〔１０〕甘味化量の前記〔４〕に記載のステビオール配糖体を含む消費製品。
〔１１〕甘味化量の前記〔５〕に記載のステビオール配糖体を含む消費製品。
〔１２〕飲料、菓子類、ベーカリー製品、クッキー、およびチューインガムからなる群から選択される、前記〔９〕に記載の消費製品。
〔１３〕配列番号３に対して少なくとも８０％の同一性を有するＤＮＡ配列を含むＣＰ１組換えポリペプチド。
〔１４〕アミノ酸配列が配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有する、前記〔１３〕に記載の組換えポリペプチド。
〔１５〕前記細胞系が細菌であり、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メチロサイナス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロモナス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ジゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デバリオミセス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アルツロボトリス属（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｌｙｓ）、ブレビバクテリア属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ）、ミクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、シトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パンテア属（Ｐａｎｔｏｅａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）  コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）；およびクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）からなる群から選択される、前記〔２〕に記載の対象のステビオール配糖体。
〔１６〕対象のステビオール配糖体を製造する生合成方法であって、
ａ）形質転換細胞系においてＣＰ１酵素を発現させることと、
ｂ）前記細胞系を培地中で成長させることと、
ｃ）対象のステビオール配糖体を産生させることと
を含む方法。
〔１７〕組換えスクロースシンターゼを基質と共にインキュベートすることをさらに含む、前記〔１６〕に記載の方法。
〔１８〕組換えＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼＵＧＴ８５Ｃ２を、前記スクロースシンターゼ、前記基質、およびＣＰ１組換えポリペプチドと共にインキュベートすることをさらに含む、前記〔１７〕に記載の方法。
〔１９〕βグルコシダーゼ酵素を反応混合物に添加することをさらに含む、前記〔１８〕に記載の方法。
〔２０〕前記スクロースシンターゼが、アラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）スクロースシンターゼ１、アラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）スクロースシンターゼ３およびビグナ・ラディアテ（Ｖｉｇｎａ  ｒａｄｉａｔｅ）スクロースシンターゼからなる群から選択される、前記〔１７〕に記載の方法。
〔２１〕前記スクロースシンターゼが、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）スクロースシンターゼ１である、前記〔１７〕に記載の方法。
〔２２〕産生される前記ステビオール配糖体が、Ｒｅｂ  Ｄ４およびＲｅｂ  Ｍの混合物である、前記〔１６〕に記載の方法。
〔２３〕前記産生方法がさらに、ｉ）粗産物を精製することと、ｉｉ）溶媒を真空下で除去して、濃縮産物を提供することとを含む、前記〔２〕に記載の対象のステビオール配糖体。
〔２４〕前記粗産物がカラムクロマトグラフィにより精製される、前記〔２３〕に記載の対象のステビオール配糖体。
〔２５〕前記粗産物が酸−塩基抽出により精製される、前記〔２３〕に記載の対象のステビオール配糖体。
〔２６〕前記粗産物が真空蒸留により精製される、前記〔２３〕に記載の対象のステビオール配糖体。
〔２７〕セミ分取ＨＰＬＣを用いて前記ステビオール配糖体を精製することをさらに含む、前記〔２３〕に記載の対象のステビオール配糖体。
〔２８〕前記ステビオール配糖体がＲｅｂ  ＷＢ１である、前記〔１６〕に記載の方法。
〔２９〕前記ステビオール配糖体がＲｅｂ  ＷＢ２である、前記〔１６〕に記載の方法。
〔３０〕前記ステビオール配糖体がＲｅｂ  Ｄ４である、前記〔１６〕に記載の方法。
〔３１〕前記ステビオール配糖体がＲｅｂ  Ｍである、前記〔１６〕に記載の方法。
〔３２〕ＨＶ１（配列番号９）の使用をさらに含む、前記〔１６〕に記載の方法。
〔３３〕ＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号１）の使用をさらに含む、前記〔３２〕に記載の方法。
〔３４〕構造：
2019535238.tif 000009

を有するステビオール配糖体Ｒｅｂ  Ｄ４。
〔３５〕前記〔３４〕に記載のステビオール配糖体を含む組成物であって、該組成物中の前記ステビオール配糖体含量が少なくとも７０％純粋である組成物。
〔３６〕甘味化量の前記〔３４〕に記載のステビオール配糖体を含む消費製品。
〔３７〕飲料、菓子類、ベーカリー製品、クッキー、およびチューインガムからなる群から選択される、前記〔３６〕に記載の消費製品。
〔３８〕Ｒｅｂ  Ｄ４およびＲｅｂ  Ｍの混合物を含む組成物。
〔３９〕構造：
2019535238.tif 000010

を有するステビオール配糖体Ｒｅｂ  ＷＢ１。
〔４０〕前記〔３９〕に記載のステビオール配糖体を含む組成物であって、該組成物中の前記ステビオール配糖体含量が少なくとも７０％純粋である組成物。
〔４１〕甘味化量の前記〔３９〕に記載のステビオール配糖体を含む消費製品。
〔４２〕飲料、菓子類、ベーカリー製品、クッキー、およびチューインガムからなる群から選択される、前記〔４１〕に記載の消費製品。
〔４３〕構造：
2019535238.tif 000011

を有するステビオール配糖体Ｒｅｂ  ＷＢ２。
〔４４〕前記〔４３〕に記載のステビオール配糖体を含む組成物であって、該組成物中の前記ステビオール配糖体含量が少なくとも７０％純粋である組成物。
〔４５〕甘味化量の前記〔４３〕に記載のステビオール配糖体を含む消費製品。
〔４６〕飲料、菓子類、ベーカリー製品、クッキー、およびチューインガムからなる群から選択される、前記〔４５〕に記載の消費製品。
〔４７〕適切な成長条件下で組換え細胞を培養することを含み、前記組換え細胞がステビオール配糖体を産生する能力を示す、レバウジオシドＭの製造方法であって、
前記組換え細胞と、ステビオシド、スクロースシンターゼおよびスクロースを含有する反応組成物とを接触させることを含み、
前記組換え細胞が、前記ステビオシド基質を使用してレバウジオシドＥを産生することができる第１のＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）またはその触媒活性部分を発現し、
前記組換え細胞が、前記レバウジオシドＥを使用してレバウジオシドＤ４を産生することができる第２のＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）またはその触媒活性部分を発現し、かつ
前記組換え細胞が、前記レバウジオシドＤ４を使用してレバウジオシドＭを産生することができる第３のＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）またはその触媒活性部分を発現する、前記方法。
〔４８〕スクロースシンターゼ遺伝子またはその触媒活性部分が、前記組換え細胞内で発現されることをさらに含む、前記〔４７〕に記載の方法。
〔４９〕前記反応組成物にスクロースシンターゼが添加されることをさらに含む、前記〔４７〕に記載の方法。
〔５０〕前記〔４７〕に記載の方法により製造されるＲｅｂ  Ｍ。
〔５１〕前記〔４７〕に記載の生合成経路を発現する組換え細胞。
〔５２〕前記細胞が酵母細胞である、前記〔５１〕に記載の組換え細胞。
〔５３〕前記細胞が細菌細胞である、前記〔５１〕に記載の組換え細胞。
〔５４〕前記細胞が植物細胞である、前記〔５１〕に記載の組換え細胞。