(57)【要約】  本発明は、以下の（ａ）及び（ｂ）の理化学的性質を有するα−ケト酸還元酵素、該酵素をコードするＤＮＡ、該酵素を生産する形質転換体、並びに、該酵素または該形質転換体を利用して、α−ケト酸を還元しＳ体のα−ヒドロキシ酸を製造する方法に関する。（ａ）α−ケト酸を不斉的に還元し、Ｓ体のα−ヒドロキシ酸を生成する、（ｂ）Ｓ体のα−ヒドロキシ酸１５０ｍＭ存在下におけるα−ケト酸還元活性の値が、Ｓ体のα−ヒドロキシ酸非存在下でのα−ケト酸還元活性の値の１０％以上である。  本発明によれば、医薬、農薬等の中間体として有用なＳ体のα−ヒドロキシ酸を、高い蓄積濃度で効率よく製造することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）及び（ｂ）の理化学的性質を有するα−ケト酸還元酵素：
（ａ）α−ケト酸を不斉的に還元し、Ｓ体のα−ヒドロキシ酸を生成する、
（ｂ）Ｓ体のα−ヒドロキシ酸１５０ｍＭ存在下におけるα−ケト酸還元活性の値が、Ｓ体のα−ヒドロキシ酸非存在下でのα−ケト酸還元活性の値の１０％以上である。
【請求項２】
前記（ｂ）の理化学的性質として、下記（ｂ’）の理化学的性質を有する請求項１記載のα−ケト酸還元酵素：
（ｂ’）（Ｓ）−フェニル乳酸１５０ｍＭ存在下でのフェニルピルビン酸還元活性の値が、（Ｓ）−フェニル乳酸非存在下でのフェニルピルビン酸還元活性の値の１０％以上である。
【請求項３】
更に、以下の（ｃ）の理化学的性質を有する請求項１もしくは２に記載のα−ケト酸還元酵素：
（ｃ）（Ｓ）−フェニル乳酸３００ｍＭ存在下におけるピルビン酸還元活性の値が、（Ｓ）−フェニル乳酸非存在下でのピルビン酸還元活性の値の２０％以上である。
【請求項４】
更に、以下の（ｄ）の理化学的性質を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載のα−ケト酸還元酵素：
（ｄ）（Ｓ）−フェニル乳酸４２０ｍＭ存在下におけるピルビン酸還元活性の値が、（Ｓ）−フェニル乳酸非存在下でのピルビン酸還元活性の値の１０％以上である。
【請求項５】
ラクトバシラス（Lactobacillus）属、ペディオコッカス（Pediococcus）属、エンテロコッカス（Enterococcus）属及びアクロモバクター（Achromobacter）属からなる群より選ばれた微生物由来である請求項１〜４のいずれか１項に記載のα−ケト酸還元酵素。
【請求項６】
ラクトバシラス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバシラス・アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバシラス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）、エンテロコッカス・ファエカリス（Enterococcus faecalis）及びアクロモバクター・キシロソキシダンス・サブスピー・キシロソキシダンス（Achromobacter xylosoxidans subsp. xylosoxidans）からなる群より選ばれた微生物由来である請求項１〜４のいずれか１項に記載のα−ケト酸還元酵素。
【請求項７】
ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）に属する微生物由来である請求項１〜４のいずれか１項に記載のα−ケト酸還元酵素。
【請求項８】
ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）ＪＣＭ８７９７株由来である請求項１〜４のいずれか１項に記載のα−ケト酸還元酵素。
【請求項９】
Ｌ−乳酸脱水素酵素である請求項１〜８のいずれか１項に記載のα−ケト酸還元酵素。
【請求項１０】
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなる請求項１〜９のいずれか１項に記載のα−ケト酸還元酵素。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のα−ケト酸還元酵素をコードするＤＮＡ。
【請求項１２】
配列表の配列番号２で示される塩基配列を含むＤＮＡ。
【請求項１３】
請求項１１又は１２に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項１４】
図１で示されるプラスミドｐＮＴＰＡ（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０４３４）である組換えベクター。
【請求項１５】
更にグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する請求項１３記載の組換えベクター。
【請求項１６】
グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドがバシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）由来のグルコース脱水素酵素である、請求項１５記載のベクター。
【請求項１７】
請求項１３〜１６のいずれかに記載の組換えベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項１８】
宿主細胞が大腸菌である請求項１７記載の形質転換体。
【請求項１９】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のα−ケト酸還元酵素、又は、請求項１７もしくは１８に記載の形質転換体を、α−ケト酸と反応させることを特徴とするＳ体のα−ヒドロキシ酸の製造方法。
【請求項２０】
前記α−ケト酸が、一般式（１）
【化１】
2006109632.tif 000010
（式中、ｎは１〜３の整数を表し、Ｘは水素原子、アルカリ金属またはアルカリ土類金属を表す。また、Ａｒは置換されていても良いアリール基を表す。）で示されるアリール基を有するα−ケト酸であり、一般式（２）
【化２】
2006109632.tif 000011
（ｎ、Ｘ及びＲは前記に同じ）で表されるアリール基を有するＳ体のα−ヒドロキシ酸を製造することを特徴とする、請求項１９記載の製造方法。
【請求項２１】
Ａｒが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５のチオアルキル基、アミノ基、ニトロ基およびメルカプト基からなる群より選択される１種以上の置換基で置換されていてもよい、フェニル基もしくはナフチル基である、請求項２０に記載の製造方法。
【請求項２２】
Ｓ体のα−ヒドロキシ酸を、反応液中２００ｍＭ以上の濃度に蓄積させることを特徴とする請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α−ケト酸還元酵素、該酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、及び該ベクターで形質転換された形質転換体に関する。本発明はまた、該酵素または該形質転換体を用いた、Ｓ体のα−ヒドロキシ酸、とりわけアリール基を有するＳ体のα−ヒドロキシ酸の製造方法に関する。Ｓ体のα−ヒドロキシ酸、特にアリール基を有するＳ体のα−ヒドロキシ酸は、各種医薬品、農薬の中間体として非常に有用な化合物である。
【背景技術】
【０００２】
微生物菌体や酵素などの生体触媒を用いたα−ケト酸の不斉還元によるＳ体のα−ヒドロキシ酸の製造法は、これまでいくつか報告されている。【０００３】
Ｓ体のα−ヒドロキシ酸の１つである（Ｓ）−フェニル乳酸の製造法としては、例えば、人工的にアミノ酸配列を改変したバシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）由来のＬ−乳酸脱水素酵素を用いた方法（非特許文献１）が挙げられる。また、光学活性２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸の製造法としては、例えば、各種微生物を用いた方法（特許文献１）、ウシ心臓由来のＬ−乳酸脱水素酵素を用いた方法（特許文献２）等が挙げられる。更に、光学活性２−ヒドロキシ−４−フェニル−３−ブテン酸の製造法としては、例えば、各種微生物を用いた方法（特許文献３、４）等が挙げられる。このように報告例は数多いものの、いずれの方法についても、生成物の蓄積量（濃度）は低く、満足できるものではない。【０００４】
また、装置に膜を組み込んだ連続膜反応器を用いる光学活性α−ヒドロキシ酸の製造方法も報告されている（特許文献５、非特許文献２、３）。しかし、設備が複雑であり、かつその設備は高価なため、工業的に採用するには有利な方法とは言い難い。
【特許文献１】特許第２７５２７５４号
【特許文献２】特許第２８７３２３６号
【特許文献３】特許第２５１９９８０号
【特許文献４】特許第３０６７９０１号
【特許文献５】特公昭６３−３５
【非特許文献１】J. Am. Chem. Soc., 114, 4551 (1992)
【非特許文献２】Organic Process Research & Development, 6, 520 (2002)
【非特許文献３】Ｊ. Biotechnol., 24, 315 (1992)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記に鑑み、本発明は、Ｓ体のα−ヒドロキシ酸、特にアリール基を有するＳ体のα−ヒドロキシ酸の製造において極めて有用なα−ケト酸還元酵素、該酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、および該ベクターで形質転換された形質転換体を提供することを目的とする。【０００６】
また、本発明は、該酵素または該形質転換体を用いた、Ｓ体のフェニル乳酸を始めとする種々のＳ体のα−ヒドロキシ酸の効率的な製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
従来の生体触媒による還元方法では、生成物であるＳ体のα−ヒドロキシ酸が還元酵素の活性を阻害するために、高い蓄積量で生成物を得ることが出来なかった。本研究者らは鋭意検討の結果、Ｓ体のα−ヒドロキシ酸、特にアリール基を有するＳ体のα−ヒドロキシ酸の存在下でも高いα−ケト酸還元活性を有するα−ケト酸還元酵素を新たに見出した。また、該酵素に関連して、それをコードするＤＮＡを単離し、組換えベクター並びに該酵素を大量発現する形質転換体を新たに創製することにも成功した。更に、上記α−ケト酸還元酵素または形質転換体を用いたα−ケト酸の不斉還元により、Ｓ体のα−ヒドロキシ酸、特にアリール基を有するＳ体のα−ヒドロキシ酸を反応液中高濃度で蓄積させることに成功し、本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち本発明は、以下の（ａ）及び（ｂ）の理化学的性質を有するα−ケト酸還元酵素に関する：
（ａ）α−ケト酸を不斉的に還元し、Ｓ体のα−ヒドロキシ酸を生成する、
（ｂ）Ｓ体のα−ヒドロキシ酸１５０ｍＭ存在下におけるα−ケト酸還元活性の値が、Ｓ体のα−ヒドロキシ酸非存在下でのα−ケト酸還元活性の値の１０％以上である。【０００９】
また本発明は、該酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、及び該ベクターで形質転換された形質転換体に関する。【００１０】
また本発明は、該酵素または該形質転換体を用いた、Ｓ体のα−ヒドロキシ酸の製造方法、とりわけ下記一般式（１）【００１１】
【化３】
2006109632.tif 000002
【００１２】
（式中、ｎは１〜３の整数を表し、Ｘは水素原子、アルカリ金属またはアルカリ土類金属を表す。また、Ａｒは置換されていても良いアリール基を表す。）で示されるアリール基を有するα−ケト酸と、該酵素または該形質転換体を反応させることを特徴とする、下記一般式（２）【００１３】
【化４】
2006109632.tif 000003
【００１４】
（ｎ、Ｘ及びＡｒは前記に同じ）で表されるアリール基を有するＳ体のα−ヒドロキシ酸の製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１５】
各種医薬品、農薬の中間体として非常に有用な化合物であるＳ体のα−ヒドロキシ酸、特にアリール基を有するＳ体のα−ヒドロキシ酸の効率的な製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】組換えベクターｐＮＴＰＡの作製法および構造を示す。
【図２】組換えベクターｐＮＴＰＡＧの作製法および構造を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書において記述されている、ＤＮＡの単離、ベクターの調製、形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、Molecular Cloning 2nd Edition（Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）等の成書に記載されている方法により実施できる。また、本明細書の記述に用いられる％は、特に断りのない限り、％（ｗ／ｖ）を意味する。【００１８】
本発明のα−ケト酸還元酵素は、以下の（ａ）及び（ｂ）の理化学的性質を有する。
（ａ）α−ケト酸を不斉的に還元し、Ｓ体のα−ヒドロキシ酸を生成する、
（ｂ）Ｓ体のα−ヒドロキシ酸１５０ｍＭ存在下におけるα−ケト酸還元活性の値が、Ｓ体のα−ヒドロキシ酸非存在下でのα−ケト酸還元活性の値の１０％以上である。【００１９】
これら（ａ）及び（ｂ）の理化学的性質を有せば、いかなるα−ケト酸還元酵素も本発明に含まれる。ここで、（ａ）におけるα−ヒドロキシ酸（還元生成物してのα−ヒドロキシ酸）と、（ｂ）におけるα−ヒドロキシ酸（酵素の阻害要因としてのα−ヒドロキシ酸）とは、必ずしも同じでなくても良い。好ましくは、（ｂ）におけるＳ体のα−ヒドロキシ酸が（Ｓ）−フェニル乳酸であり、α−ケト酸還元活性がフェニルピルビン酸還元活性であるα−ケト酸還元酵素である。すなわち、本発明のα−ケト酸還元酵素は、前記（ｂ）の理化学的性質として、下記（ｂ’）の理化学的性質を有することが好ましい：
（ｂ’）（Ｓ）−フェニル乳酸１５０ｍＭ存在下でのフェニルピルビン酸還元活性の値が、（Ｓ）−フェニル乳酸非存在下でのフェニルピルビン酸還元活性の値の１０％以上である。【００２０】
また、（ｂ）の理化学的性質において、Ｓ体のα−ヒドロキシ酸１５０ｍＭ存在下におけるα−ケト酸還元活性の値は、Ｓ体のα−ヒドロキシ酸非存在下でのα−ケト酸還元活性の値の１０％以上であるが、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上である。【００２１】
α−ケト酸還元酵素が、本発明の（ｂ）の理化学的性質を有するか否かの判定方法について、（ｂ）におけるＳ体のα−ヒドロキシ酸として（Ｓ）−フェニル乳酸、還元反応の基質となるα−ケト酸としてフェニルピルビン酸を用いた場合を例にし、以下に説明する。【００２２】
（Ｓ）−フェニル乳酸非存在下でのフェニルピルビン酸還元活性の値は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）にフェニルピルビン酸２０ｍＭ、ＮＡＤＨ０．２５ｍＭ及び酵素溶液０．０５ｍｌを含む３．０ｍｌの反応液中、３０℃で３分間反応させた際の波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度から算出することができる。（Ｓ）−フェニル乳酸１５０ｍＭ存在下でのフェニルピルビン酸還元活性の値は、上記の活性測定系に（Ｓ）−フェニル乳酸１５０ｍＭを添加して同様に実施することで測定可能である。すなわち、上記（ｂ）におけるＳ体のα−ヒドロキシ酸の濃度は反応初期時における濃度である。これら両条件下での酵素活性値を測定することにより、本発明の（ｂ）の理化学的性質を有するかどうかを容易に判定することができる。【００２３】
上記判定法において、上記フェニルピルビン酸を別のα−ケト酸、例えばピルビン酸などに置き換えた場合、フェニルピルビン酸還元活性以外のα−ケト酸還元活性（例えば、ピルビン酸還元活性）が判定される。さらに（Ｓ）−フェニル乳酸を別のα−ヒドロキシ酸に置き換えて測定して判定を行うことも出来る。これらの場合、適宜他の反応条件も必要に応じて別途調整する。【００２４】
また、本発明のα−ケト還元酵素は、上記（ａ）および（ｂ）の理化学的性質にあわせて、以下の（ｃ）もしくは／同時に（ｄ）の理化学的性質を有しているのが好ましい。
（ｃ）（Ｓ）−フェニル乳酸３００ｍＭ存在下におけるピルビン酸還元活性の値が（Ｓ）−フェニル乳酸非存在下での還元活性の値の２０％以上である。
（ｄ）（Ｓ）−フェニル乳酸４２０ｍＭ存在下におけるピルビン酸還元活性の値が、（Ｓ）−フェニル乳酸非存在下での還元活性の値の１０％以上である。【００２５】
α−ケト酸還元酵素が、本発明の（ｃ）、（ｄ）の理化学的性質を有するかどうかは、先に述べた（ｂ）の理化学的性質を有するかどうかの判定方法において、還元活性の測定基質であるフェニルピルビン酸２０ｍＭをピルビン酸３０ｍＭに変更し、添加する（Ｓ）−フェニル乳酸の濃度を１５０ｍＭから３００ｍＭあるいは４２０ｍＭに変更して同様に実施すれば良い。【００２６】
本発明のα−ケト酸還元酵素は、α−ケト酸に対して還元活性を有する微生物から単離することができる。該微生物は、例えば、以下の方法で見いだすことができる。微生物を適当な培地で培養し、集菌後、緩衝液中、グルコースなどの栄養存在下でα−ケト酸と反応させる。反応後、反応液を高速液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィーなどの既知の方法で分析することにより、α−ヒドロキシ酸の生成を確認すればよい。微生物を培養するための培地としては、その微生物が増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いることができる。【００２７】
本発明のα−ケト酸還元酵素の起源となる微生物は、特に限定されないが、例えばラクトバシラス（Lactobacillus）属、ペディオコッカス（Pediococcus）属、エンテロコッカス（Enterococcus）属またはアクロモバクター（Achromobacter）属に属する微生物が挙げられ、好ましくはラクトバシラス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバシラス・アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバシラス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）、エンテロコッカス・ファエカリス（Enterococcus faecalis）またはアクロモバクター・キシロソキシダンス・サブスピー・キシロソキシダンス（Achromobacter xylosoxidans subsp. xylosoxidans）などが挙げられる。【００２８】
より好ましいものとしてはペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）が、特に好ましいものとしてはペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）ＪＣＭ８７９７株をあげることができる。当該微生物は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室（ＪＣＭ：〒351-0198  埼玉県和光市広沢2-1）より入手することができる。【００２９】
本発明のα−ケト酸還元酵素は、上述したようなα−ケト酸還元活性を有する微生物から単離される。酵素の単離は、通常公知の蛋白質精製法を適当に組み合わせて用いることにより実施できる。例えば、以下のように実施できる。【００３０】
まず、当該微生物を適当な培地で培養し、培養液から遠心分離、あるいは、濾過により菌体を集める。得られた菌体を、超音波破砕機、あるいは、グラスビーズ等を用いた物理的手法で破砕した後、遠心分離にて菌体残さを除き、無細胞抽出液を得る。そして、塩析（硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（アセトンまたはエタノールなどによる蛋白質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等の手法を単独で、または組み合わせて用いることにより、該無細胞抽出液から本発明のα−ケト酸還元酵素を単離する。【００３１】
本発明のα−ケト酸還元酵素は、先述の（ａ）、（ｂ）の理化学的性質を有せば、いかなるα−ケト酸還元酵素も含まれるが、好ましくは乳酸脱水素酵素、より好ましくはＬ−乳酸脱水素酵素である。【００３２】
本発明のＤＮＡは、上述の本発明のα−ケト酸還元酵素をコードするＤＮＡであり、後述する方法に従って導入された宿主細胞内で該酵素を発現し得るものであればいかなるものでもよく、任意の非翻訳領域を含んでいてもよい。該酵素が取得できれば、該酵素の起源となる微生物より、当業者であれば公知の方法で、このようなＤＮＡを取得できる。例えば、以下に示した方法で取得できる。【００３３】
まず、単離された本発明のα−ケト酸還元酵素を適当なエンドペプチダーゼを用いて消化し、生じたペプチド断片を逆相ＨＰＬＣにより分取する。そして、例えば、ＡＢＩ４９２型プロテインシークエンサー（Applied Biosystems社製）により、これらのペプチド断片のアミノ酸配列の一部または全部を決定する。【００３４】
このようにして得られたアミノ酸配列情報をもとにして、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部を増幅するためのＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）プライマーを合成する。次に、通常のＤＮＡ単離法、例えば、Ｖｉｓｓｅｒ等の方法（Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 415 (2000)）により、該ポリペプチドの起源となる微生物の染色体ＤＮＡを調製する。この染色体ＤＮＡを鋳型として、先述のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部を増幅し、その塩基配列を決定する。塩基配列の決定は、例えば、 ＡＢＩ３７３Ａ型  DNA Sequencer（Applied Biosystems社製）等を用いて行うことができる。【００３５】
該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部の塩基配列が明らかになれば、例えば、インバースＰＣＲ法（Nucl. Acids Res., 16, 8186 (1988)）によりその全体の配列を決定することができる。【００３６】
このようにして得られる本発明のＤＮＡの例としては、配列表の配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡを挙げることができる。【００３７】
本発明のα−ケト酸還元酵素の例としては、配列表の配列番号２に示す塩基配列によってコードされる、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなる還元酵素を挙げることができる。【００３８】
本発明のＤＮＡを宿主微生物内に導入し、導入された宿主微生物内で発現させるために用いられるベクターは、適当な宿主微生物内で当該ＤＮＡがコードする遺伝子を発現できるものであれば、特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。【００３９】
このようなベクターは、通常、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の制御因子を含み、本発明のＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、ｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３公報）が好適に使用できる。【００４０】
本明細書で用いる用語「制御因子」は、機能的プロモーター及び、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。【００４１】
本明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプ及び種類が、宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。【００４２】
本発明の組換えベクターの例としては、上記ベクターｐＵＣＮＴに、配列番号２に示すＤＮＡを導入した、プラスミドｐＮＴＰＡ（図１）を挙げることができる。本組換えベクターは、ＦＥＲＭ  Ｐ−２０４３４の受託番号で、２００５年３月２日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566  茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に寄託されている。【００４３】
本発明のＤＮＡを含むベクターを導入する宿主細胞としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞などが挙げられるが、導入及び発現効率から細菌が好ましく、大腸菌が特に好ましい。本発明のＤＮＡを含むベクターは、公知の方法により宿主細胞に導入できる。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、例えば、市販のＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を用いることにより、当該ベクターを宿主細胞に導入できる。【００４４】
本発明の形質転換体の例としては、上記Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１に、上記プラスミドｐＮＴＰＡを導入して得られる、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＰＡ）が挙げられる。【００４５】
本発明のα−ケト酸還元酵素と、基質となるα−ケト酸及びＮＡＤＨ等の補酵素を接触せしめ、反応させることにより、α−ケト酸を不斉的に還元し、Ｓ体のα−ヒドロキシ酸を製造することができる。【００４６】
特に、α−ケト酸として、下記一般式（１）【００４７】
【化５】
2006109632.tif 000004
【００４８】
（式中、ｎは１〜３の整数を表し、Ｘは水素原子、アルカリ金属またはアルカリ土類金属を表す。また、Ａｒは置換されていても良いアリール基を表す。）で示されるアリール基を有するα−ケト酸を用いることにより、下記一般式（２）【００４９】
【化６】
2006109632.tif 000005
【００５０】
（ｎ、Ｘ及びＡｒは前記に同じ）で表されるアリール基を有するＳ体のα−ヒドロキシ酸を効率良く製造することができる。【００５１】
この場合、効率良く製造できるとは、生成物であるα−ヒドロキシ酸を、最終生成量として、反応液中１００ｍＭ、好ましくは１５０ｍＭ、さらに好ましくは２００ｍＭ以上の濃度で蓄積させることを意味する。【００５２】
上記式（１）及び（２）において、ｎは１〜３の整数を示すが、１の場合が好ましい。また、Ｘは水素原子、アルカリ金属またはアルカリ土類金属を表し、特に限定されないが、例えば、水素原子、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどが挙げられる。また、Ａｒは置換されていてもよいアリール基を示すが、好ましくは、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５のチオアルキル基、アミノ基、ニトロ基およびメルカプト基からなる群より選択される１種以上の置換基で置換されていてもよいフェニル基もしくはナフチル基であり、より好ましくは、無置換のフェニル基もしくはパラ位がｔｅｒｔ−ブチルオキシ基で置換されたフェニル基である。【００５３】
また、還元反応に用いられるα−ケト酸還元酵素は、精製された酵素であっても良いし、粗酵素であっても良い。さらには上述したようなα−ケト酸還元活性を有する微生物の菌体やその処理物なども本発明の酵素に含まれる。ここで言う「その処理物」とは、例えば、界面活性剤や有機溶媒で処理した細胞、乾燥細胞、破砕処理した細胞、細胞の粗抽出液等を意味する。これら酵素や菌体、その処理物などは公知の方法で固定化されたものでもかまわない。【００５４】
これら還元反応においては、当該反応の進行に伴い、ＮＡＤＨ等の補酵素は酸化型に変換される。しかし、この酸化型の補酵素を還元型に変換する能力（以後、補酵素再生能と呼ぶ）を有するポリペプチド、および、当該ポリペプチドの基質となる化合物を、本発明のポリペプチドと共存させて当該反応を行うことにより、高価な補酵素の使用量を大幅に削減できる。補酵素再生能を有するポリペプチドとしては、例えば、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素およびグルコース脱水素酵素などを使用できる。好適には、グルコース脱水素酵素が使用される。【００５５】
本発明のα−ケト酸還元酵素のかわりに、該酵素をコードするＤＮＡを含む本発明の形質転換体を使用しても、同様にＳ体のα−ヒドロキシ酸を製造することができる。また、本発明の酵素をコードするＤＮＡ、及び補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体を使用しても、同様にＳ体のα−ヒドロキシ酸を製造することができる。とりわけ、本発明の酵素をコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体を使用した場合には、補酵素を再生するための酵素を別途調製・添加する必要がなく、α−ヒドロキシ酸をより効率良く製造することができる。【００５６】
なお、本発明のα−ケト酸還元酵素をコードするＤＮＡを含む形質転換体、若しくは、本発明のα−ケト酸還元酵素をコードするＤＮＡおよび補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体は、培養菌体は言うまでもなく、その処理物としてもＳ体のα−ヒドロキシ酸の製造に使用することができる。ここで言う「形質転換体の処理物」とは、例えば、界面活性剤や有機溶媒で処理した細胞、乾燥細胞、破砕処理した細胞、細胞の粗抽出液等のほか、公知の手段でそれらを固定化したものを意味する。【００５７】
本発明のα−ケト酸還元酵素をコードするＤＮＡ、及び補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体は、本発明の酵素をコードするＤＮＡ、及び補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を、一つのベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られるほか、これら２種のＤＮＡを不和合性グループの異なる２種のベクターにそれぞれ組み込み、それら２種のベクターを同一の宿主細胞に導入することによっても得られる。【００５８】
本発明のα−ケト酸還元酵素をコードするＤＮＡ及び補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者が組込まれたベクターの例としては、前記発現ベクターｐＵＣＮＴにペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）ＪＣＭ８７９７株由来のα−ケト酸還元酵素遺伝子とバシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）由来のグルコース脱水素酵素遺伝子の両方を導入した、ｐＮＴＰＡＧ１Ｅ（図２）が挙げられる。【００５９】
また、本発明のα−ケト酸還元酵素をコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体の例としては、当該ベクターでＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１を形質転換して得られる、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＰＡＧ１Ｅ）が挙げられる。【００６０】
本発明のα−ケト酸還元酵素をコードするＤＮＡを含む形質転換体の培養、及び本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡと補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体の培養は、それらが増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いて実施できる。【００６１】
形質転換体中のα−ケト酸還元酵素の活性は、上述した単離酵素の活性測定法と同様に測定できる。この場合、酵素液として形質転換体或いはその処理物を含む培養液やその他溶液を使用すればよい。形質転換体中の補酵素再生能を有するポリペプチドの活性は、常法により測定することができる。例えば、グルコース脱水素酵素の活性は、１Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、１００ｍＭのグルコース、２ｍＭの補酵素ＮＡＤＰまたはＮＡＤ、および酵素液を添加し、２５℃で１分間反応させた際の、波長３４０ｎｍにおける吸光度の増加速度から算出できる。【００６２】
本発明のα−ケト酸還元酵素、又は該酵素をコードするＤＮＡを含む形質転換体のいずれかを用いたＳ体のα−ヒドロキシ酸の製造は、適当な溶媒中に、基質となるα−ケト酸、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ等の補酵素、及び、本発明のα−ケト酸還元酵素又は該酵素をコードするＤＮＡを含む形質転換体を添加し、ｐＨ調整下、攪拌することにより実施できる。【００６３】
一方、本発明のα−ケト酸還元酵素と補酵素再生能を有するポリペプチドを組み合わせて反応を行う場合は、上記反応組成に、補酵素再生能を有するポリペプチド（例えば、グルコース脱水素酵素）と、その基質となる化合物（例えば、グルコース）をさらに添加する。なお、後者の場合においても、本発明のα−ケト酸還元酵素をコードするＤＮＡと補酵素再生能を有するポリペプチド（例えば、グルコース脱水素酵素）をコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体、または、その処理物を用いる場合は、補酵素再生能を有するポリペプチド（例えば、グルコース脱水素酵素）を別途添加する必要はない。【００６４】
反応には水系溶媒を用いてもよいし、水系と有機系の溶媒を混合して用いてもよい。有機系溶媒としては、例えば、トルエン、酢酸エチル、酢酸ｎ−ブチル、ヘキサン、イソプロパノール、ジイソプロピルエーテル、メタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。反応は１０℃〜７０℃の温度で行われ、反応液のｐＨは３〜１０に維持する。反応は、バッチ方式の場合、反応基質は０．１％から７０％（ｗ／ｖ）の仕込み濃度で添加され、一括に添加しても良いし、分割して添加しても良い。
【実施例】
【００６５】
以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、以下の実施例において用いた組換えＤＮＡ技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている：
Molecular Cloning 2nd Edition（Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）、
Current Protocols in Molecular Biology（Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience）。【００６６】
（比較例１）市販のバシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）由来のＬ−乳酸脱水素酵素（ＢＳＬＤＨ）を用いたフェニルピルビン酸の還元反応
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）４０ｍｌに、グルコース５．３ｇ、バシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）由来のＬ−乳酸脱水素酵素（シグマ社製）（以下ＢＳＬＤＨと略す）２，９００Ｕ、グルコース脱水素酵素（天野エンザイム社製）２，２７０Ｕ、ＮＡＤ+  ５ｍｇおよびフェニルピルビン酸のナトリウム塩０．４ｇを添加後、５規定水酸化ナトリウム水溶液を添加することにより反応液のｐＨを６．５に調整しながら、３０℃で攪拌した。反応０．６時間目に０．４ｇのフェニルピルビン酸のナトリウム塩を、更に３．５時間目、５時間目、７時間目、９時間目及び２４時間目にそれぞれフェニルピルビン酸のナトリウム塩を０．２ｇづつ追加添加した。反応中、反応液を適時サンプリングし、サンプリングした液を塩酸で酸性にしたのち酢酸エチルを加えて抽出後、前記の条件で分析することによりフェニル乳酸の生成量を測定した。反応開始後３０時間目にフェニル乳酸量の増加がほぼ止まり、この時のフェニル乳酸の蓄積濃度は３２．１ｇ／ｌ（１９３ｍＭ）であった。生成したフェニル乳酸の絶対立体配置はＳ体で、その光学純度は９９％ｅｅ以上であった。【００６７】
なお、フェニル乳酸の定量は、以下のＨＰＬＣ条件で分析することにより行なった。
［定量分析（ＨＰＬＣ分析条件）］
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ（Ａ３０３）（４．６ｍｍＩ．Ｄ．×２５０ｍｍ）（ＹＭＣ社製）、カラム温度：室温、移動相：０．１％リン酸二水素カリウム（ｐＨ３）／アセトニトリル＝７／３、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２５４ｎｍ、保持時間：５．９分。【００６８】
また、フェニル乳酸の光学純度は、フェナシルクロライドで誘導体としたのち下記条件で分析することにより求めた。
［光学純度分析（ＨＰＬＣ条件）］
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＡＤ−Ｈ（４．６ｍｍＩ．Ｄ．×２５０ｍｍ）（ダイセル化学社製）、カラム温度：室温、移動相：ｎ−ヘキサン／エタノール＝１／１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２４３ｎｍ、保持時間：Ｓ体−１８．５分、Ｒ体−２０．７分。【００６９】
（比較例２）ＢＳＬＤＨの還元活性に及ぼす（Ｓ）−フェニル乳酸の影響
（Ｓ）−フェニル乳酸存在下におけるＢＳＬＤＨのピルビン酸に対する還元活性を測定した。ピルビン酸に対する還元活性は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）にピルビン酸を終濃度３０ｍＭ、補酵素ＮＡＤＨを終濃度０．２５ｍＭとなるよう溶解し、さらに酵素液を添加して３０℃で１分間反応を行った際の、当該反応液の波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度から算出した。本反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨをＮＡＤに酸化する活性を、１Ｕと定義した。本活性測定系に（Ｓ）−フェニル乳酸を終濃度０〜２１０ｍＭとなるように添加した条件下で、ＢＳＬＤＨの還元活性を測定した。その結果を、（Ｓ）−フェニル乳酸を添加しなかった時の酵素活性を１００％とし、（Ｓ）−フェニル乳酸添加時での酵素活性を相対活性として表１にまとめた。なお検討には、約２Ｕ／ｍｌのＢＳＬＤＨ溶液を調製し、これを酵素液として用いた。【００７０】
【表１】
2006109632.tif 000006
【００７１】
（Ｓ）−フェニル乳酸濃度の上昇に伴ってＢＳＬＤＨの還元活性は低下し、（Ｓ）−フェニル乳酸１８０ｍＭ存在下でその活性はほぼ消失した。本結果から、比較例１において生成物のフェニル乳酸を高濃度で蓄積させることができなかったのは、α−ヒドロキシ酸であるフェニル乳酸によりＢＳＬＤＨ活性の阻害が原因であろうと推測された。【００７２】
（実施例１）α−ヒドロキシ酸（（Ｓ）−フェニル乳酸）による阻害を受けにくいα−ケト酸還元酵素の探索
表２に示す各種微生物を大型試験管で培養し、各培養液５ｍｌを遠心分離にかけて菌体を集めた。なお、表２に示す微生物のうち、Lactobacillus、Lactococcus、Pediococcus、EnterococcusもしくはStreptococcusのいずれかに属する微生物は下記の（ａ）の条件で、それ以外の属の微生物は下記の（ｂ）の条件で培養した。
（ａ）市販のDifco Lactobacilli MRS Broth（Becton, Dickinson社製）の液体培地（ｐＨ７）１５ｍｌを大型試験管に分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。これらの液体培地に微生物を無菌的に一白金耳接種して、３０℃で約７２〜９６時間静置培養した。
（ｂ）肉エキス１０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム３ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）７ｍｌを大型試験管に分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。これらの液体培地に微生物を無菌的に一白金耳接種して、３０℃で３６時間振とう培養した。【００７３】
採取した各菌体をグルコース８％を含んだ１００ｍＭリン酸緩衝液１ｍｌ（ｐＨ７．０）に懸濁した。この菌体懸濁液を、あらかじめフェニルピルビン酸のナトリウム塩を１０ｍｇいれた試験管に加えて、３０℃で２０時間反応させた。反応液を塩酸で酸性にしたのち、酢酸エチルを加えて抽出後、比較例１に記載の方法で分析することにより、生成したフェニル乳酸の定量及びその光学純度を測定した。表２にフェニル乳酸のモル収率、その光学純度及び絶対配置を、菌体反応のカラムにまとめた。これら微生物はいずれもフェニルピルビン酸に対して高還元活性及び高立体選択性を示した。【００７４】
また、上記と同様に培養した培養液１０ｍｌを遠心分離にかけて菌体を集め、各菌体を５ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２ｍｌに懸濁した。これをＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて菌体を破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、それぞれの無細胞抽出液を得た。これら無細胞抽出液のフェニルピルビン酸に対する還元活性を測定した。フェニルピルビン酸に対する還元活性の測定は、比較例２に記載のピルビン酸に対する還元活性の測定系において、ピルビン酸３０ｍＭのかわりにフェニルピルビン酸２０ｍＭを添加して同様に実施した。また、還元活性が認められたものについては、活性測定系に（Ｓ）−フェニル乳酸を終濃度１５０ｍＭ（２．５％（ｗｔ／ｖｏｌ））となるように添加した条件下で同様に活性測定を行った。【００７５】
（Ｓ）−フェニル乳酸無添加時での酵素活性に対する、（Ｓ）−フェニル乳酸１５０ｍＭ添加時での酵素活性の相対比として表２にまとめた。（Ｓ）−フェニル乳酸１５０ｍＭ存在下でも比較的高い還元活性、具体的には、（Ｓ）−フェニル乳酸１５０ｍＭ存在下においても（Ｓ）−フェニル乳酸非存在下の還元活性の１０％以上の残存活性を有する酵素をもつ微生物７種を新たに見いだすことができた。【００７６】
【表２】
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【００７７】
（実施例２）ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）ＪＣＭ８７９７株からのＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子のクローニング
先の検討において（Ｓ）−フェニル乳酸存在下でも比較的高い還元活性を有したペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）ＪＣＭ８７９７株より、α−ケト酸還元酵素の一つであるＬ−乳酸脱水素酵素（以下ＰＡＬＤＨと略す）の遺伝子を以下の方法でクローニングした。【００７８】
（ＰＣＲプライマーの作成）
遺伝子データバンクに登録されている既知のＬ−乳酸脱水素酵素の推定アミノ酸配列情報をもとに、ＰＡＬＤＨをコードする遺伝子の一部をＰＣＲにより増幅するためのプライマー１（5'−ACNTAYGCNACNTGGAARYT−3'：配列表の配列番号３）、およびプライマー２（5'−CCRTARAANGTNGCNCCYTT−3'：配列表の配列番号４）を合成した。【００７９】
（ＰＣＲによる遺伝子の増幅）
実施例１と同様に培養したペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）ＪＣＭ８７９７株の菌体からの染色体ＤＮＡの調製は、UltraClean Microbiol DNA Isolation kit（MO BIO社製）を用いて行ない、その取り扱い説明書に従って実施した。次に、上記で調製したＤＮＡプライマー１および２を用い、得られた染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行ったところ、目的遺伝子の一部と考えられる約０．３ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ−ゼとしてTaKaRa Ex Taq（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。【００８０】
このＤＮＡ断片を、ベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Novagen社製）にクローニングし、BigDye Terminator Sequencing Standard Kit（Applied Biosystem社製）およびABI PRISM 3100 Genetic Analyzer（Applied Biosystem社製）を用いてその塩基配列を解析した。【００８１】
（逆ＰＣＲ（Inverse PCR）法による目的遺伝子の全長配列の決定）
上記で調製したペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）ＪＣＭ８７９７株の染色体ＤＮＡを、制限酵素ＦｂａＩで完全消化し、得られたＤＮＡ断片の混合物をＴ４リガーゼにより分子内環化させた。これを鋳型として用い、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法（Nucl. Acids Res., 16, 8186 (1988)）により、上述の約０．３ｋｂｐのＤＮＡ断片に相当する領域を含む酵素遺伝子の全塩基配列を決定した。その結果を配列表の配列番号２に示した。Inverse PCRは、ＤＮＡポリメラ−ゼとしてTaKaRa Ex Taq（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。また、配列番号２に示した塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列番号１に示した。【００８２】
（実施例３）  発現ベクターの構築
プライマー３（5'−GGGAATGGACATATGTCTAATATTCAAAATCATC−3'：配列表の配列番号５）と、プライマー４（5'−GATAAGAATTCTTATTATTTGTCTTGTTTTTCAGCAAGAG−3'：配列表の配列番号６）を用い、実施例２で得たペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）ＪＣＭ８７９７株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。その結果、配列表の配列番号２に示す塩基配列からなる遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ認識部位が付加され、かつ終始コドンの直後に終止コドンＴＡＡ及びＥｃｏＲＩ認識部位が付加された二本鎖ＤＮＡを得た。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ−ゼとしてＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。このＤＮＡをＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで部分消化し、ベクターｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３公報）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＥｃｏＲＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＴＰＡを構築した。この組換えベクターは、ＦＥＲＭ  Ｐ−２０４３４の受託番号で、２００５年３月２日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566  茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に寄託されている。ｐＮＴＰＡの作製法およびその構造を図１に示す。【００８３】
（実施例４）  グルコース脱水素酵素遺伝子をさらに含む発現ベクターの構築
プライマー５（5'−GCCGAATTCTAAGGAGGTTAACAATGTATAAA−3'：配列表の配列番号７）と、プライマー６（5'−GCGGTCGACTTATCCGCGTCCTGCTTGG−3'：配列表の配列番号８）を用い、ベクターｐＧＤＫ１（Eur. J. Biochem., 186, 389 (1989)）を鋳型としてＰＣＲを行い、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）ＩＡＭ１０３０株由来のグルコース脱水素酵素（以後、ＧＤＨと呼ぶ）遺伝子の開始コドンから５塩基上流に大腸菌のリボゾーム結合配列が、さらにその直前にＥｃｏＲＩ切断点が付加され、かつ、終止コドンの直後にＳａｌＩ切断点が付加された、二本鎖ＤＮＡを取得した。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化し、ベクターｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３公報）のｌａｃプロモーターの下流のＥｃｏＲＩ認識部位とＳａｌＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＴＧを構築した。【００８４】
次に、配列表の配列番号２に示す塩基配列からなる遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ認識部位が付加され、かつ終始コドンの直後にＥｃｏＲＩ認識部位が付加された二本鎖ＤＮＡを、実施例３と同様に調製し、これを上記の組換えベクターｐＮＴＧのＮｄｅＩ認識部位とＥｃｏＲＩ認識部位の間に挿入して、組み換えベクターｐＮＴＰＡＧを構築した。ｐＮＴＰＡＧの作製法およびその構造を図２に示す。【００８５】
（実施例５）  形質転換体の作製
実施例３で構築した組換えベクターｐＮＴＰＡを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＰＡ）を得た。また、同様に、実施例４で構築した組換えベクターｐＮＴＰＡＧを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＰＡＧ）を得た。【００８６】
（実施例６）  形質転換体における遺伝子の発現
実施例５で得た２種の形質転換体、およびベクターｐＵＣＮＴを含む形質転換体であるＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＵＣＮＴ）を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５０ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。遠心分離により菌体を集め、５０ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液のピルビン酸還元活性（以下、ＰＡＬＤＨ活性という）、およびＧＤＨ活性を測定し、比活性として表したものを表３に示した。実施例５で得られた２種の形質転換体のいずれにおいても、ＰＡＬＤＨの発現が認められた。また、ＧＤＨ遺伝子を含むＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＰＡＧ）では、ＧＤＨ活性の発現も認められた。ＰＡＬＤＨ活性は、比較例２に記載のピルビン酸に対する還元活性の測定法と同様に測定した。ＧＤＨ活性は、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、グルコース０．１Ｍ、補酵素ＮＡＤＰ２ｍＭ、および粗酵素液を添加して２５℃で１分間反応を行い、波長３４０ｎｍにおける吸光度の増加速度より算出した。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元する酵素活性を１Ｕと定義した。また、無細胞抽出液中の蛋白質濃度は、プロテインアッセイキット（BIO-RAD社製）を用いて測定した。【００８７】
【表３】
2006109632.tif 000008
【００８８】
（実施例７）ＰＡＬＤＨの還元活性に及ぼす（Ｓ）−フェニル乳酸の影響
比較例２に記載と同じ方法で、（Ｓ）−フェニル乳酸０〜６００ｍＭ存在下におけるＰＡＬＤＨのピルビン酸に対する還元活性を測定した。なお検討には、ＢＳＬＤＨの時と同様、約２Ｕ／ｍｌのＰＡＬＤＨ溶液を調製し、これを酵素液として用いた。その結果を、（Ｓ）−フェニル乳酸を添加しなかった時の酵素活性を１００％とし、（Ｓ）−フェニル乳酸添加時での酵素活性を相対活性として表４にまとめた。【００８９】
【表４】
2006109632.tif 000009
【００９０】
（Ｓ）−フェニル乳酸濃度の上昇に伴ってＰＡＬＤＨの還元活性は低下するものの、ＢＳＬＤＨの活性がほぼ消失した（Ｓ）−フェニル乳酸１８０ｍＭ存在下においても、４９％の相対活性を有した。また、（Ｓ）−フェニル乳酸６００ｍＭ存在下においても、酵素活性を検出することができた。本結果から、ＰＡＬＤＨはＢＳＬＤＨに比べて、より高濃度のフェニル乳酸の存在下でも活性を保持することがわかった。【００９１】
（実施例８）  形質転換体を用いたフェニルピルビン酸の還元反応
実施例６と同様に培養したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＰＡＧ）の培養液４０ｍｌに、グルコース８ｇ、ＮＡＤ  ５ｍｇ、及びフェニルピルビン酸０．８ｇを添加し、５Ｍの水酸化ナトリウムの滴下によりｐＨ６．５に調整しつつ、３０℃で攪拌した。反応０．４時間目、０．８時間目、１．２時間目、１．６時間目、２．３時間目及び２．９時間目にそれぞれフェニルピルビン酸のナトリウム塩を０．８ｇづつ追加添加した。更に３．６時間目、４．２時間目、及び５時間目にそれぞれフェニルピルビン酸のナトリウム塩を０．４ｇづつ追加添加した。反応中、反応液を適時サンプリングし、塩酸で酸性にしたのち酢酸エチルを加えて抽出後、比較例１に記載の条件で分析することによりフェニル乳酸の生成量を測定した。反応開始後７．３時間目のフェニル乳酸量の蓄積濃度は１０４．１ｇ／ｌ（６２６ｍＭ）であった。生成したフェニル乳酸はＳ体で、その光学純度は９９％ｅｅ以上であった。【００９２】
（参考例１）２−オキソ−３−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシフェニル）プロピオン酸ナトリウムの製造
４−ｔｅｒｔ−ブトキシベンズアルデヒド（３０．０ｇ、１６８ｍｍｏｌ）、ヒダントイン（３３．７３ｇ、３３７ｍｍｏｌ、２ｅｑ．）、１−アミノ−２−プロパノール（１２．７３ｇ、１６８ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）の蒸留水（３００ｍL）懸濁液を還流条件下で４時間撹拌した。室温まで冷却後、析出物を減圧濾過すると、５−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシベンジリデン）ヒダントイン（４３．０ｇ、収率９８％）が得られた。【００９３】
引き続き、上記で合成した５−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシベンジリデン）ヒダントイン（３０．０ｇ、１１５ｍｍｏｌ）、ＮａＯＨ（２４．０ｇ、５７６ｍｍｏｌ、５ｅｑ．）の蒸留水（３００ｍL）懸濁液を還流条件下で４．５時間撹拌した。室温に冷却後、塩酸を用いてｐＨ７．９４へと調整した。ＮａＣｌ（３５．３ｇ、６００ｍｍｏｌ）投入後、室温にてさらに１５時間撹拌した。析出した目的物を減圧濾過により分取し、メタノールにて洗浄後、真空乾燥すると、目的とする２−オキソ−３−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシフェニル）プロピオン酸ナトリウム（２５．９ｇ、収率８８％）が得られた。
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ／ｐｐｍ）：δ１．１９（ｓ，９Ｈ），３．９２（ｓ，２Ｈ），６．９１−６．９４（ｍ，２Ｈ），７．０４−７．０６（ｍ，２Ｈ）。【００９４】
（実施例９）  形質転換体を用いた２−オキソ−３−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシフェニル）プロピオン酸の還元反応
実施例６と同様に培養したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＰＡＧ）の培養液６０ｌを遠心分離にかけて菌体を集め、２０ｍｌの培養上清に懸濁した。これにグルコース２．５ｇ、ＮＡＤ  ３ｍｇ、及び参考例１で合成した２−オキソ−３−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシフェニル）プロピオン酸ナトリウム０．２５ｇを添加し、５Ｍの水酸化ナトリウムの滴下によりｐＨ６．５に調整しつつ、３０℃で攪拌した。反応０．６時間目及び１．０時間目にそれぞれ２−オキソ−３−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシフェニル）プロピオン酸ナトリウムを０．４ｇづつ追加添加した。更に１．５時間目、２．０時間目、２．５時間目、３．１時間目、３．８時間目、４．７時間目、５．６時間目、６．３時間目及び７．３時間目にそれぞれ２−オキソ−３−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシフェニル）プロピオン酸ナトリウムを０．１８８ｇづつ追加添加した。反応中、反応液を適時サンプリングし、塩酸で酸性にしたのち酢酸エチルを加えて抽出後、下記のＨＰＬＣ条件で分析することにより２−ヒドロキシ−３−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシフェニル）プロピオン酸の生成量及び光学純度を測定した。
［ＨＰＬＣ分析条件］
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＡＤ−Ｈ（４．６ｍｍＩ．Ｄ．×２５０ｍｍ）（ダイセル化学社製）、カラム温度：室温、移動相：ｎ−ヘキサン／エタノール／トリフルオロ酢酸＝９５０／５０／１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２３０ｎｍ、保持時間：Ｒ体−１５．６分、Ｓ体−２１．３分。【００９５】
反応開始後２７時間目の２−ヒドロキシ−３−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシフェニル）プロピオン酸の蓄積濃度は８１．３ｇ／ｌであった。生成した２−ヒドロキシ−３−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシフェニル）プロピオン酸の絶対立体配置はＳ体で、その光学純度は９９％ｅｅ以上であった。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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