【手続補正書】
【提出日】令和2年10月1日(2020.10.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ヒト対象から血液サンプルを獲得すること；
（ｂ）前記血液サンプルからＲＮＡを抽出すること；
（ｃ）個々の発現レベルを有する２つの患者の群のＲＮＡシーケンシングにより得られる測定された転写産物のライブラリーから抜き出された差異的に発現したＲＮＡ転写産物のサブセットから複数種のＲＮＡ転写産物を選択すること；
ここで、前記サブセットは、
（１）２つの対象の群：
（ｉ）２０％を上回る狭窄を有する冠動脈疾患（ＣＡＤ）患者を含む第１の群と、
（ｉｉ）２０％未満の狭窄と規定されるＣＡＤを有しない患者を含む第２の群と、
においてＲＮＡ発現レベルを定量すること；
（２）前記第１の群と前記第２の群との間で統計学的方法を使用して前記ＲＮＡ発現レベルを比較すること；及び
（３）前記サブセットを、非補正のｐ＜０．００５で前記第１の群と前記第２の群との間で少なくとも１．５倍の差がある発現レベルで個々に存在するＲＮＡ転写産物とみなすこと；
によって規定される；
（ｄ）前記ヒト対象の前記血液サンプルから抽出された前記複数種のＲＮＡ転写産物の個々のＲＮＡ発現レベルを、マイクロアレイより高い感度を有するＲＮＡ定量法を使用することによって測定すること；
を含む方法。
【請求項２】
（ｃ）で規定されたＣＡＤを有する対象の前記発現レベルに対する類似性を計算する統計ツールを（ｄ）で行われる測定に適用することによって、前記ヒト対象を、少なくとも約８０％の精度でＣＡＤを有すると同定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）ヒト対象からの血液サンプルをグアニジニウム変性剤中で安定化すること；
（ｂ）前記血液サンプルからＲＮＡを抽出すること；
（ｃ）表３〜９から選択される複数種のＲＮＡ転写産物に対するＲＮＡ発現レベルを測定すること；
（ｄ）前記ＲＮＡ発現レベルを、ＣＡＤを有しない患者から得られた一連の参照値のＲＮＡ発現レベルと比較すること；
（ｅ）前記一連の参照値に対して少なくとも１．５倍低い、前記表３〜９から選択されるＲＮＡ転写産物に対するＲＮＡ発現レベルを検出すること；及び
（ｆ）前記ヒト対象を、少なくとも約８０％の精度でＣＡＤを有すると同定すること；
を含む方法。
【請求項４】
ＣＡＤの１つまたは複数のリスク要因を有するヒト対象を同定すること；及び
前記ヒト対象がＣＡＤを有するまたは発症する増加した可能性を有することを、請求項１に記載の方法の実施により取得される情報を使用して判定すること
を含む方法。
【請求項５】
前記１つまたは複数のリスク要因は、高血圧、加齢、上昇したコレステロール、及び冠動脈疾患の家族歴からなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記測定は、複数種のシーケンシングの読み取りをカウントすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記測定は、ＲＮＡシーケンシングを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記血液サンプルは全血を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記複数種のＲＮＡ転写産物は、少なくとも７つのＲＮＡ転写産物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記複数種のＲＮＡ転写産物は、ＤＬＧ１、ＤＧＫＡ、ＩＣＯＳＬＧ、ＩＫＺＦ４／Ｅｏｓ、ＳＭＹＤ３、ＴＣＦ３、及びＴＲＩＭ２８の少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記複数種のＲＮＡ転写産物は、表６に列挙されるＲＮＡ転写産物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記精度は、少なくとも約８５％である、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヒト対象を、少なくとも約８０％の陽性予測値でＣＡＤを有すると同定する、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記血液サンプルは全血を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ヒト対象においてＣＡＤの１つまたは複数のリスク要因の存在を同定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記１つまたは複数のリスク要因は、年齢、ＣＡＤの家族歴、コレステロールレベル、高血圧の存在、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記測定前に前記抽出されたＲＮＡからリボソームＲＮＡを枯渇させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記抽出されたＲＮＡからリボソームＲＮＡを枯渇させることは、リボソームＲＮＡに特異的であるプローブで前記ＲＮＡを処理することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記個々のＲＮＡ発現レベルの測定は、ＲＮＡシーケンシングまたはドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）により行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
個々のＲＮＡ発現レベルが測定される前記複数種のＲＮＡ転写産物は、ＤＧＫＡ、ＤＬＧ１、ＩＣＯＳＬＧ、ＩＫＺＦ４／Ｅｏｓ、ＳＭＹＤ３、ＴＣＦ３、及びＴＲＩＭ２８を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ＤＧＫＡ、ＤＬＧ１、ＩＣＯＳＬＧ、ＩＫＺＦ４／Ｅｏｓ、ＳＭＹＤ３、ＴＣＦ３、及びＴＲＩＭ２８のそれぞれに対する個々のＲＮＡ発現レベルを、約１．５倍〜２倍の下方調節について調べる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記統計ツールの適用は、９０％を上回る陽性予測値でＣＡＤを有する対象を同定する、請求項２に記載の方法。
【請求項２３】
前記統計ツールの適用は、部分的最小二乗判別である、請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＣＡＤを有しない個体は、冠動脈カテーテル造影によってＣＡＤを有しないと同定された個体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
個々のＲＮＡ発現レベルが判定される前記複数種のＲＮＡ転写産物の少なくとも２０％は、ＦＯＸＰ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＥＴＳ１、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＡＭＬ１、ＺＡＰ７０、ＣＴＬＡ４、ＣＤ３Ｅ、ＳＭＹＤ３、ＩＫＺＦ４、及びＲＵＮＸ１のうち１種または複数種である、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記血液サンプルから抽出された前記ＲＮＡは、グアニジン塩で安定化される、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記複数種のＲＮＡ転写産物の前記個々のＲＮＡ発現レベルを調べて、ＣＡＤを有しない個体からの経験的発現レベルデータに基づき、対照発現レベルと比較してそれらの８０％超で１．５倍を上回る下方調節があるかどうかを判定する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記個々のＲＮＡ発現レベルを、ＦＯＸＰ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＥＴＳ１、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＡＭＬ１、ＺＡＰ７０、ＣＴＬＡ４、ＣＤ３Ｅ、ＳＭＹＤ３、ＩＫＺＦ４、及びＲＵＮＸ１のすべてについて判定する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
統計ツールの適用と共に、少なくともＦＯＸＰ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＥＴＳ１、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＡＭＬ１、ＺＡＰ７０、ＣＴＬＡ４、ＣＤ３Ｅ、ＳＭＹＤ３、ＩＫＺＦ４、及びＲＵＮＸ１の個々のＲＮＡ発現レベルを使用して、８０％を上回る陽性予測値でＣＡＤを有する対象を同定する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記個々のＲＮＡ発現レベルを調べて、ＣＡＤを有しない個体からの経験的発現レベルデータに基づき、対照発現レベルと比較してそれらの８０％超で１．５倍を上回る下方調節があるかどうかを判定する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記統計ツールの適用は、ＣＡＤを有しない個体におけるＲＮＡ転写産物の発現レベルのデータベースを使用して築かれる、請求項２に記載の方法。
【請求項３２】
前記差異的に発現したＲＮＡ転写産物のサブセットは、表８に列挙されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記差異的に発現したＲＮＡ転写産物のサブセットは、表７に列挙されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記差異的に発現したＲＮＡ転写産物のサブセットは、表６に列挙されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記血液サンプルからの前記ＲＮＡは、陽イオン性界面活性剤以外で安定化される、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記差異的に発現したＲＮＡ転写産物のサブセットは、表４に列挙されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記差異的に発現したＲＮＡ転写産物のサブセットは、表３に列挙されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記差異的に発現したＲＮＡ転写産物のサブセットは、表２に列挙されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記複数種のＲＮＡ転写産物の少なくとも５０％は、表３〜９に列挙される前記ＲＮＡ転写産物から抜き出される、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
前記統計ツールの適用は、前記ヒト対象がＣＡＤを有するまたは発症する増加した可能性を有することを示すために、発現レベルが判定される前記複数種のＲＮＡ転写産物の少なくとも２０％が少なくとも１．５倍下方調節されることを必要とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４１】
前記複数種のＲＮＡ転写産物の少なくとも９５％は、表３〜９に列挙される前記ＲＮＡ転写産物から抜き出される、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
前記血液サンプルは、シュウ酸テトラデシルトリメチルアンモニウム以外の試薬中で安定化される、請求項１に記載の方法。