【手続補正書】
【提出日】令和2年6月4日(2020.6.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
前駆細胞を分化させるための方法であって、
基礎培地を含み、かつ1つまたは複数のEGFR経路阻害剤、Notch阻害剤、および1つまたは複数のWnt阻害剤をさらに含む分化培地中で、該細胞を培養する工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
（a）前記1つまたは複数のEGFR経路阻害剤が、
（i）（1）EGFR阻害剤、（2）EGFRおよびErbB2阻害剤、（3）RAS-RAF-MAPK経路の阻害剤、（4）PI3K/AKT経路の阻害剤、ならびに（5）JAK/STAT経路の阻害剤から選択される；ならびに/または
（ii）（A）ゲフィチニブなどのEGFR阻害剤；（B）アファチニブなどのEGFRおよびErbB-2阻害剤；ならびに/または（C）RAS-RAF-MAPK経路の阻害剤、例えばPD0325901などのMEK阻害剤および/もしくはSCH772984などのERK阻害剤を含む；
（b）前記Notch阻害剤が、γ-セクレターゼ阻害剤、任意でDAPTもしくはジベンザゼピン（DBZ）もしくはベンゾジアゼピン（BZ）もしくはLY-411575である；ならびに/または
（c）前記1つまたは複数のWnt阻害剤が、（1）Wnt分泌の阻害剤、（2）WntもしくはRスポンジンとWnt受容体複合体との相互作用の競合的もしくは非競合的阻害剤、（3）Wnt受容体複合体の成分の分解を促進する阻害剤、（4）Dishevelledファミリータンパク質の阻害剤、（5）分解複合体活性を促進する活性化剤、（6）分解複合体の脱オリゴマー化の阻害剤、および/または（7）β-カテニン標的遺伝子発現の阻害剤から選択され、任意で、該1つまたは複数のWnt阻害剤が、Wnt分泌の阻害剤、例えばIWP 2、LGK974およびIWP 1から選択されるPorc阻害剤を含む、
請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記分化培地が、
p38阻害剤、TGF-β阻害剤、ガストリン、糖質コルチコイド、受容体チロシンキナーゼリガンド、BMP経路活性化剤、cAMP経路活性化剤、ヘッジホッグ活性化剤、ヘッジホッグ阻害剤、mTORシグナル伝達のモジュレータ、B27、およびN2からなる群より選択される1つもしくは複数の成分;
p38阻害剤、TGF-β阻害剤、ガストリン、糖質コルチコイド、受容体チロシンキナーゼリガンド、BMP阻害剤、cAMP経路活性化剤、ヘッジホッグ活性化剤、ヘッジホッグ阻害剤、mTORシグナル伝達のモジュレータ、B27、およびN2からなる群より選択される1つもしくは複数の成分;
BMP7、BMP4、もしくはBMP2などのBMP活性化剤;または
ノギン、スクレロスチン、コーディン、CTGF、フォリスタチン、グレムリン、tsg、sog、LDN193189、もしくはドルソモルフィンなどのBMP阻害剤
をさらに含み、任意で、該分化培地が1mM未満のEGFを含む、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
請求項1〜3のいずれか一項記載の分化培地。
【請求項５】
腸内分泌細胞を豊富に含む腸細胞の集団を得るために腸前駆細胞を分化させるための方法であって、請求項4記載の分化培地中で腸前駆細胞を培養する工程を含む、前記方法。
【請求項６】
増殖した上皮幹細胞を得るために、上皮幹細胞用の増殖培地の存在下で上皮幹細胞を培養する工程;およびその後、
請求項4記載の分化培地中で、1つまたは複数の増殖した細胞を培養する工程
を含む、上皮幹細胞を培養するための方法。
【請求項７】
（a）前記細胞を、細胞外マトリックスと接触させて培養する；
（b）前記方法が、分化細胞集団もしくは分化オルガノイドを得る工程および/もしくは単離する工程をさらに含む；
（c）前記前駆細胞が、腸、胃、膵臓、肝臓、前立腺、肺、乳房、卵巣、唾液腺、毛包、皮膚、食道、膀胱、耳、もしくは甲状腺に由来する；
（d）前記前駆細胞が、腸、胃、膵臓、もしくは肺に由来する；ならびに/または
（e）前記前駆細胞が哺乳動物前駆細胞、例えばヒト前駆細胞である、
請求項1〜3、5および6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
好ましくは分化腸オルガノイドを得るために、腸上皮幹細胞を培養するための方法であって、
増殖培地の存在下で、1つまたは複数の腸上皮幹細胞を、細胞外マトリックスと接触させて培養する工程であって、好ましくは、該増殖培地が、基礎培地を含み、かつ受容体チロシンキナーゼリガンド、BMP阻害剤、およびWntアゴニスト、ならびに任意で、バルプロ酸およびGSK-3阻害剤（例えばCHIR99021）をさらに含む、工程;ならびにその後、
請求項4記載の分化培地の存在下で、1つまたは複数の増殖した腸上皮幹細胞を、細胞外マトリックスと接触させて培養する工程
を含む、前記方法。
【請求項９】
請求項1〜3および6〜8のいずれか一項記載の方法によって得ることのできるまたは得られたオルガノイド。
【請求項１０】
肝臓、膵臓、腸、胃、前立腺、肺、乳房、卵巣、唾液腺、毛包、皮膚、食道、膀胱、耳、または甲状腺に由来し、好ましくは腸、胃、膵臓、または肺に由来する、請求項9記載のオルガノイド。
【請求項１１】
（a）前記オルガノイドがヒトに由来し、かつ少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、もしくは少なくとも99％の細胞が腸内分泌細胞マーカーを発現するか；または
（b）前記オルガノイドがマウスに由来し、かつ少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、もしくは少なくとも99％の細胞が腸内分泌細胞マーカーを発現し；
任意で、該腸内分泌細胞マーカーが、Chga、Chgb、Tac1、Tph1、Gip、Fabp5、Ghrl、Pyy、Nts、Neurod1、Sst、Sct、コレシストキニン、グルカゴンおよび/もしくはプログルカゴンから選択される、
請求項9または10記載のオルガノイド。
【請求項１２】
オルガノイド、例えば請求項9〜11のいずれか一項記載のオルガノイドと、請求項4記載の分化培地とを含む、組成物。
【請求項１３】
創薬スクリーニング;毒性アッセイ;診断法;組織発生学、細胞系譜、および分化経路の調査;各ホルモンの放出をもたらす化学および/もしくは神経シグナルを同定する調査;組換え遺伝子発現を含む遺伝子発現試験;組織の損傷と修復に関与する機構の調査;炎症性および感染性疾患の調査;発症機構の研究;または細胞形質転換の機構およびがんの病因の研究における、請求項9〜11のいずれか一項記載のオルガノイドまたは該オルガノイドに由来する細胞の使用。
【請求項１４】
医療における使用のための、例えば障害、状態、もしくは疾患の治療における使用のためのオルガノイドまたは該オルガノイドに由来する細胞であって、任意で、該医療が再生医療であり、例えば、該使用が該オルガノイドまたは該細胞の患者への移植を含む、請求項9〜11のいずれか一項記載のオルガノイドまたは該オルガノイドに由来する細胞。
【請求項１５】
1つまたは複数のEGFR経路阻害剤、Notch阻害剤、および1つまたは複数のWnt阻害剤を含む、薬学的製剤。
【請求項１６】
請求項9〜11のいずれか一項記載の分化オルガノイドを候補分子（または候補分子のライブラリ）と接触させる工程；
該オルガノイドを、任意の作用（例えば増殖の減少もしくは消失、形態学的変化、および/または細胞死などの、細胞における何らかの変化）またはオルガノイドの変化（例えばオルガノイドのサイズもしくは運動性）について評価する工程；
該作用を引き起こす候補分子を、薬物または化粧品の可能性を有するものとして同定する工程；ならびに任意で、
該候補分子を医薬または化粧品として調製する工程
を含む、治療用もしくは予防用の医薬薬物または化粧品をスクリーニングするための方法。
【請求項１７】
Lgr5＋幹細胞静止を誘導するための方法であって、
該細胞を1つまたは複数のEGFR経路阻害剤で処理する工程
を含む、前記方法。
【請求項１８】
前記細胞が、例えばFACSによって評価されるような継続的なLgr5発現、ならびに/または例えばpTOPFLASHおよびpFOPFLASH Tcfルシフェラーゼレポーター構築物によって評価されるようなWntシグナル伝達を有し、任意で、
（a）静止が、KI67発現の喪失によって示される；ならびに/または
（b）前記細胞を、1つもしくは複数のEGFR経路阻害剤で少なくとも1週間処理する、
請求項17記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が、Lgr5およびLef1を発現し、かつKI367およびM期マーカーであるホスホヒストンH3を発現しない、請求項17または18記載の方法によって得られた静止幹細胞集団。
【請求項２０】
EECを豊富に含む細胞の集団を得る方法であって、請求項4記載の分化培地中で上皮前駆細胞の集団を培養する工程を含む、前記方法。
【請求項２１】
（a）前記細胞の集団がGLP1分泌EECを豊富に含み、かつ前記分化培地がBMP阻害剤を含むか；または
（b）前記細胞の集団がセクレチン分泌EECを豊富に含み、かつ前記分化培地がBMP経路活性化剤を含む、
請求項20記載の方法。
【請求項２２】
治療有効量のBMP阻害剤をそれを必要とする対象へ投与することを含む糖尿病または関連する疾患もしくは障害を治療または予防する方法において使用するための、BMP阻害剤。
【請求項２３】
治療有効量のBMP活性化剤をそれを必要とする対象へ投与することを含む過塩酸症または肥満を治療する方法において使用するための、BMP活性化剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
本発明はさらに、過塩酸症または肥満を治療する方法において使用するためのBMP活性化剤を提供し、この方法は、治療有効量のBMP活性化剤を、それを必要とする対象に投与する工程を含む。
[本発明1001]
前駆細胞を分化させるための方法であって、
基礎培地を含み、かつ1つまたは複数のEGFR経路阻害剤、Notch阻害剤および1つまたは複数のWnt阻害剤をさらに含む分化培地中で、該細胞を培養する工程
を含む、方法。
[本発明1002]
1つまたは複数のEGFR経路阻害剤が、（1）EGFR阻害剤、（2）EGFRおよびErbB2阻害剤、（3）RAS-RAF-MAPK経路の阻害剤、（4）PI3K/AKT経路の阻害剤ならびに（5）JAK/STAT経路の阻害剤から選択される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
1つまたは複数のEGFR経路阻害剤が、ゲフィチニブなどのEGFR阻害剤を含む、本発明1002の方法。
[本発明1004]
1つまたは複数のEGFR経路阻害剤が、アファチニブなどのEGFRおよびErbB-2阻害剤を含む、本発明1002または1003の方法。
[本発明1005]
1つまたは複数のEGFR経路阻害剤が、RAS-RAF-MAPK経路の阻害剤、例えば、PD0325901などのMEK阻害剤、および/またはSCH772984などのERK阻害剤を含む、本発明1002〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
Notch阻害剤が、γ-セクレターゼ阻害剤、任意でDAPTまたはジベンザゼピン（DBZ）またはベンゾジアゼピン（BZ）またはLY-411575である、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
1つまたは複数のWnt阻害剤が、（1）Wnt分泌の阻害剤、（2）WntもしくはRスポンジンとWnt受容体複合体との相互作用の競合的もしくは非競合的阻害剤、（3）Wnt受容体複合体の成分の分解を促進する阻害剤、（4）Dishevelledファミリータンパク質の阻害剤、（5）分解複合体活性を促進する活性化剤、（6）分解複合体の脱オリゴマー化の阻害剤、および/または（7）β-カテニン標的遺伝子発現の阻害剤から選択される、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
1つまたは複数のWnt阻害剤が、Wnt分泌の阻害剤、例えば、IWP 2、LGK974およびIWP 1から選択されるPorc阻害剤を含む、本発明1007の方法。
[本発明1009]
分化培地が、1mM未満のEGFを含む、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
分化培地が、
p38阻害剤、TGF-β阻害剤、ガストリン、糖質コルチコイド、受容体チロシンキナーゼリガンド、BMP経路活性化剤、cAMP経路活性化剤、ヘッジホッグ活性化剤、ヘッジホッグ阻害剤、mTORシグナル伝達のモジュレータ、B27およびN2からなる群より選択される1つもしくは複数の成分;または
p38阻害剤、TGF-β阻害剤、ガストリン、糖質コルチコイド、受容体チロシンキナーゼリガンド、BMP阻害剤、cAMP経路活性化剤、ヘッジホッグ活性化剤、ヘッジホッグ阻害剤、mTORシグナル伝達のモジュレータ、B27およびN2からなる群より選択される1つもしくは複数の成分;または
BMP7、BMP4もしくはBMP2などのBMP活性化剤;または
ノギン、スクレロスチン、コーディン、CTGF、フォリスタチン、グレムリン、tsg、sog、LDN193189もしくはドルソモルフィンなどのBMP阻害剤
をさらに含む、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
本発明1001〜1010のいずれかの分化培地。
[本発明1012]
本発明1011の分化培地中で腸前駆細胞を培養する工程
を含む、腸内分泌細胞を豊富に含む腸細胞の集団を得るために腸前駆細胞を分化させるための方法。
[本発明1013]
増殖した上皮幹細胞を得るために、上皮幹細胞用の増殖培地の存在下で上皮幹細胞を培養する工程;およびその後、
本発明1011の分化培地中で、1つまたは複数の該増殖した細胞を培養する工程
を含む、上皮幹細胞を培養するための方法。
[本発明1014]
前記細胞を、細胞外マトリックスと接触させて培養する、本発明1001〜1010、1012および1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
分化細胞集団または分化オルガノイドを得る工程および/または単離する工程をさらに含む、本発明1001〜1010および1012〜1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
前駆細胞が、例えば腸、胃、膵臓、肝臓、前立腺、肺、乳房、卵巣、唾液腺、毛包、皮膚、食道、膀胱、耳または甲状腺由来の、上皮細胞である、本発明1001〜1010および1013〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
前駆細胞が、腸、胃、膵臓または肺に由来する、本発明1016の方法。
[本発明1018]
前駆細胞が哺乳動物前駆細胞、例えばヒト前駆細胞である、本発明1001〜1010および1012〜1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
好ましくは分化腸オルガノイドを得るために、腸上皮幹細胞を培養するための方法であって、
増殖培地の存在下で、1つまたは複数の腸上皮幹細胞を、細胞外マトリックスと接触させて培養する工程であって、好ましくは、該増殖培地が、基礎培地を含み、かつ受容体チロシンキナーゼリガンド、BMP阻害剤およびWntアゴニスト、ならびに任意で、バルプロ酸およびGSK-3阻害剤（例えばCHIR99021）をさらに含む、工程;ならびにその後、
本発明1011の分化培地の存在下で、該1つまたは複数の増殖した腸上皮幹細胞を、細胞外マトリックスと接触させて培養する工程
を含む、方法。
[本発明1020]
本発明1001〜1010および1012〜1019のいずれかの方法によって得ることのできるまたは得られたオルガノイド。
[本発明1021]
肝臓、膵臓、腸、胃、前立腺、肺、乳房、卵巣、唾液腺、毛包、皮膚、食道、膀胱、耳または甲状腺に由来する、好ましくは腸、胃、膵臓または肺に由来する、本発明1020のオルガノイド。
[本発明1022]
ヒトに由来し、かつ少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも99％の細胞が腸内分泌細胞マーカーを発現する、本発明1020または1021のオルガノイド。
[本発明1023]
マウスに由来し、かつ少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも99％の細胞が腸内分泌細胞マーカーを発現する、本発明1020または1021のオルガノイド。
[本発明1024]
腸内分泌細胞マーカーが、Chga、Chgb、Tac1、Tph1、Gip、Fabp5、Ghrl、Pyy、Nts、Neurod1、Sst、Sct、コレシストキニン、グルカゴンおよび/またはプログルカゴンから選択される、本発明1022または1023のオルガノイド。
[本発明1025]
オルガノイド、例えば本発明1020〜1024のいずれかのオルガノイドと、本発明1011の分化培地とを含む、組成物。
[本発明1026]
創薬スクリーニング;毒性アッセイ;診断法;組織発生学、細胞系譜および分化経路の調査;各ホルモンの放出をもたらす化学および/もしくは神経シグナルを同定する調査;組換え遺伝子発現を含む遺伝子発現試験;組織の損傷と修復に関与する機構の調査;炎症性および感染性疾患の調査;発症機構の研究;または細胞形質転換の機構およびがんの病因の研究における、本発明1020〜1024のいずれかのオルガノイドまたは該オルガノイドに由来する細胞の使用。
[本発明1027]
医療における使用のための、例えば、障害、状態または疾患の治療における使用のための、本発明1020〜1024のいずれかのオルガノイド、または該オルガノイドに由来する細胞。
[本発明1028]
前記医療が再生医療であり、例えば、前記使用が前記オルガノイドまたは前記細胞の患者への移植を含む、本発明1027の使用のためのオルガノイドまたは該オルガノイドに由来する細胞。
[本発明1029]
1つまたは複数のEGFR経路阻害剤、Notch阻害剤および1つまたは複数のWnt阻害剤を含む薬学的製剤。
[本発明1030]
本発明1020〜1024のいずれかの分化オルガノイドを候補分子（または候補分子のライブラリ）と接触させる工程、
該オルガノイドを、任意の作用（例えば増殖の減少もしくは消失、形態学的変化および/もしくは細胞死などの、細胞における何らかの変化）またはオルガノイドの変化（例えばオルガノイドのサイズもしくは運動性）について評価する工程、
該作用を引き起こす候補分子を、薬物または化粧品の可能性を有するものとして同定する工程、ならびに任意で、
該候補分子を医薬または化粧品として調製する工程
を含む、治療用もしくは予防用の医薬薬物または化粧品をスクリーニングするための方法。
[本発明1031]
Lgr5＋幹細胞静止を誘導するための方法であって、
該細胞を1つまたは複数のEGFR経路阻害剤で処理する工程
を含む、方法。
[本発明1032]
前記細胞が、例えばFACSによって評価されるような、継続的なLgr5発現、および/または例えばpTOPFLASHおよびpFOPFLASH Tcfルシフェラーゼレポーター構築物によって評価されるような、Wntシグナル伝達を有する、本発明1031の方法。
[本発明1033]
静止が、KI67発現の喪失によって示される、本発明1031または1032の方法。
[本発明1034]
前記細胞を、1つまたは複数のEGFR経路阻害剤で少なくとも1週間処理する、本発明1031〜1033のいずれかの方法。
[本発明1035]
前記細胞が、Lgr5およびLef1を発現し、かつ、KI367、およびM期マーカーであるホスホヒストンH3を発現しない、本発明1031〜1034のいずれかの方法によって得られる静止幹細胞集団。
[本発明1036]
本発明1011の分化培地中で細胞の集団を培養する工程を含む、EECを豊富に含む細胞の集団を得る方法。
[本発明1037]
BMP阻害剤を含む本発明1011の分化培地中で細胞の集団を培養する工程を含む、GLP1分泌EECを豊富に含む細胞の集団を得る方法。
[本発明1038]
BMP経路活性化剤を含む本発明1011の分化培地中で細胞の集団を培養する工程を含む、セクレチン分泌EECを豊富に含む細胞の集団を得る方法。
[本発明1039]
治療有効量のBMP阻害剤を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、糖尿病または関連する疾患もしくは障害を治療するまたは予防する方法における使用のためのBMP阻害剤。
[本発明1040]
治療有効量のBMP活性化剤を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、過塩酸症または肥満を治療する方法における使用のためのBMP活性化剤。