(57)【要約】  本発明は、炎症性腸疾患発病学に対する遺伝子発現プロファイリングの方法に関し、哺乳類被験体からの試験試料における一又は複数のＩＢＤマーカーの、コントロールに対する異なる発現が決定され、試験試料における異なる発現は試験試料が得られた哺乳類被験体おけるＩＢＤを示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類被験体における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の存在を診断する方法であって、被験体から得られた試験試料における配列番号：５、６、８、１１、１２、２、１４、１６、１８、２０及び２２の何れか一つに示されるポリペチドをコードする核酸の、コントロールの発現レベルに対する異なる発現レベルを決定することを含んでなり、前記異なる発現レベルは試験試料が得られた被験体におけるＩＢＤの存在を示す方法。
【請求項２】
異なる発現レベルが、配列番号：５、６、８、１１、１２、２、１４及び１６の何れか一つに示されるポリペチドをコードする核酸のより低いレベルの発現であり、より低いレベルの発現は試験試料が得られた被験体におけるＩＢＤの存在を示す請求項１に記載の方法。
【請求項３】
異なる発現レベルが、配列番号：１８、２０、及び２２の何れか一つに示されるポリペチドをコードする核酸のより高いレベルの発現であり、より高いレベルの発現は試験試料が得られた被験体におけるＩＢＤの存在を示す請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記哺乳類被験体がヒト患者である請求項１、２、又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記発現レベルのエビデンスが、遺伝子発現プロファイリングの方法によって得られる請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記方法が、ＰＣＲに基づいた方法である請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記発現レベルが、一又は複数の参照遺伝子、又はそれらの発現産物の発現レベルに対して正規化される請求項５に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも２つの前記遺伝子、又はそれらの発現産物の発現レベルのエビデンスを決定することを含んで成る請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも３つの前記遺伝子、又はそれらの発現産物の発現レベルのエビデンスを決定することを含んで成る請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも４つの前記遺伝子、又はそれらの発現産物の発現レベルのエビデンスを決定することを含んで成る成る請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも５つの前記遺伝子、又はそれらの発現産物の発現レベルのエビデンスを決定することを含んで成る成る請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＩＢＤ検出をまとめたレポートを作成する工程を更に含んで成る請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＩＢＤが、クローン病である請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項１４】
前記試験試料が、結腸組織生検からである請求項１、２、又は３に記載の方法。
【請求項１５】
前記生検が、回腸結腸、上行結腸、下行結腸、及びＳ状結腸からなる群から選択される組織からである請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記生検が、炎症性結腸領域由来である請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記生検が、非炎症性結腸領域由来である請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記決定工程は前記哺乳類被験体におけるＩＢＤの再発を示し、且つ前記哺乳類被験体は以前にＩＢＤと診断され、以前に診断された前記ＩＢＤに対して治療を受けている請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項１９】
前記治療が手術を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記決定工程が、前記哺乳類被験体における前記ＩＢＤの再発を示す請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項２１】
治療を必要とする哺乳類被験体の炎症性腸疾患ＩＢＤを治療する方法であって、
（ａ）被験体から得られた試験試料における配列番号：５、６、８、１１、１２、２、１４、１６、及び１８の何れか一つに示されるポリペチドをコードする核酸の、コントロールの発現レベルに対する異なる発現レベルを決定する工程；及び
（ｂ）前記被験体に有効量のＩＢＤ治療薬を投与する工程
を含んでなる方法。
【請求項２２】
異なる発現レベルが、配列番号：５、６、８、１１、１２、２、１４及び１６の何れか一つに示されるポリペチドをコードする核酸のより低いレベルの発現であり、より低いレベルの発現は試験試料が得られた被験体におけるＩＢＤの存在を示す請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
異なる発現レベルが、配列番号：１８、２０、及び２２の何れか一つに示されるポリペチドをコードする核酸のより高いレベルの発現であり、より高いレベルの発現は試験試料が得られた被験体におけるＩＢＤの存在を示す請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記哺乳類被験体がヒト患者である請求項２１、２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記発現レベルのエビデンスが、遺伝子発現プロファイリングの方法によって得られる請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記方法がＰＣＲに基づいた方法である請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記発現レベルが、一又は複数の参照遺伝子、又はそれらの発現産物の発現レベルに対して正規化される請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも２つの前記遺伝子、又はそれらの発現産物の発現レベルのエビデンスを決定することを含んで成る請求項２１、２２又は２３に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも３つの前記遺伝子、又はそれらの発現産物の発現レベルのエビデンスを決定することを含んで成る請求項２１、２２又は２３に記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも４つの前記遺伝子、又はそれらの発現産物の発現レベルのエビデンスを決定することを含んで成る請求項２１、又は２２に記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも５つの前記遺伝子、又はそれらの発現産物の発現レベルのエビデンスを決定することを含んで成る請求項２１、又は２２に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＩＢＤ検出をまとめたレポートを作成する工程を更に含んで成る請求項２１、２２又は２３に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＩＢＤがクローン病である請求項２１、２２、又は２３に記載の方法。
【請求項３４】
前記試験試料が、結腸組織生検からである請求項２１、２２又は２３に記載の方法。
【請求項３５】
前記生検が、回腸結腸、上行結腸、下行結腸、及びＳ状結腸からなる群から選択される組織からである請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記生検が、炎症性結腸領域からである請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記生検が、非炎症性結腸領域からである請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記決定工程は前記哺乳類被験体におけるＩＢＤの再発を示し、且つ前記哺乳類被験体は以前にＩＢＤと診断され、以前に診断された前記ＩＢＤに対して治療を受けている請求項２１、２２又は２３に記載の方法。
【請求項３９】
前記治療が手術を含む請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記決定工程が、前記哺乳類被験体における前記ＩＢＤの再発を示す請求項２１、２２又は２３に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＩＢＤ治療薬が、アミノサリチル酸である請求項２１、２２、又は２３に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＩＢＤ治療薬がコルチコステロイドである請求項２１、２２又は２３に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＩＢＤ治療薬が、免疫抑制剤である請求項２１、２２又は２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症性腸疾患の検出及び診断における使用を含む、炎症性腸疾患病理発生における遺伝子発現プロファイルに関する。
【０００２】
（関連出願の詳細）
免疫関連及び炎症疾患は、正常な生理機能では、発作又は傷害に反応して、発作又は傷害からの修復を開始し、外来生物体に対する生得的及び後天的防御を開始するのに重要な、かなり複雑で、多くの場合は多重に相互関連した生物学的経路の現れ又は結果である。疾患又は病理は、これらの正常な生理学的経路が、反応の強さに直接関連してか又は、異常な調節又は過度な刺激の結果として、自己に対する反応として、又はこれらの組合せとして、更なる発作又は傷害を引き起こすときに生じる。
【０００３】
これらの疾患の発生は、多くの場合、多段階経路及びしばしば多数の異なった生物学的システム／経路に関与しているが、一又は複数のこれら経路の重要な点における介在により改善又は治療効果を有し得る。治療的介在は有害なプロセス／経路の拮抗作用又は有益なプロセス／経路の刺激のいずれかにより生じる。
【０００４】
多くの免疫関連疾患が知られており、広範囲にわたって研究されている。このような疾患には、免疫媒介炎症疾患、非免疫媒介炎症疾患、感染疾患、免疫欠損症、異常増殖等が含まれる。
【０００５】
炎症性腸疾患（「ＩＢＤ」）という用語は、腸管（腸）に炎症を起こし、時に反復性の筋痙攣又は下痢を起こす原因不明の慢性炎症性障害の一群を意味する。米国におけるＩＢＤの罹患率は、人口１０万人あたり約２００人と推定されている。ＩＢＤ患者は、潰瘍性大腸炎（「ＵＣ」）を伴うグループ、及びクローン病（「ＣＤ」）を伴うグループの、２つの主要グループに分けられる。ＵＣ及びＣＤ共、慢性の再発性疾患であり、未だはっきり分かっていない環境的刺激にさらされている遺伝的に感受性の固体に生じる複雑な臨床的実体である。(Bonen及びCho, Gastroenterology. 2003; 124:521-536; Gaya等. Lancet. 2006;367:1271-1284)。
【０００６】
臨床的に、ＩＢＤは、しばしば慢性の、予測不可能な経過となる多様な徴候によって特徴づけられる。血性下痢及び腹痛には、発熱及び体重減少がしばしば伴う。貧血が一般的に見られ、重度の疲労も同様である。関節痛から急性関節炎におよぶ関節症状、並びに肝機能の異常が、一般的にＩＢＤに伴う。ＩＢＤ患者はまた、一般集団と比較して結腸癌の増加した危険度を有する。ＩＢＤの急性「攻撃」の間、仕事及び他の通常の活動は普通不可能であり、患者はしばしば入院する。
【０００７】
ＩＢＤの原因は依然として不明であるが、遺伝的、感染性、及び免疫学的感受性等の複数の要因が関係していると思われている。ＩＢＤは白人にはるかに一般的であり、特にユダヤ系の白人に多い。症状が慢性的炎症性の性質であることにより、感染的原因の可能性に対する熱心な調査が急ぎ行われた。急性炎症を刺激する薬剤が見つかったものの、ＩＢＤに関連した慢性的炎症の原因となるものは見つかっていない。ＩＢＤが自己免疫性疾患であるという仮説は、前述した関節炎等のＩＢＤの腸外の症状、及び免疫反応を抑制することが知られている副腎性グルココルチコイド、シクロスポリン及びアザチオプリン等の治療薬を用いた治療によるＩＢＤに対する既知の陽性反応により支持されている。加えて、胃腸管は、身体の他のどの器官よりも、連続的に食物由来のタンパク質、細菌性副産物（ＬＰＳ）等の潜在的抗原性物質に連続的に曝されている。ＩＢＤのサブタイプは、ＵＣ及びＣＤである。
【０００８】
しばしば所定の患者がどちらの病気に罹っているのか言うのが難しいほど、ＵＣとＣＤの診断基準には十分な重複がある；しかしながら、局在性のように、典型的に見られる病変のタイプは異なっている。ＵＣは殆どは直腸に近位の結腸中に見られ、特徴的な病変は粘膜の表在性潰瘍であり；ＣＤは腸の何処にでも見られ、胃、食道及び十二指腸にも時折併発し、病変は通常は広汎な直線状の裂溝として記述される。炎症が腸壁の全ての層に広がり、腸間膜並びにリンパ節も関与する点で、ＣＤはＵＣと異なる。ＣＤは、口から肛門まで消化管のいかなる一部にも影響を及ぼし得る。疾患はしばしば不連続であり、すなわち、腸の重症の部分は、明らかに疾患のない領域から分けられる。ＣＤにおいて、腸壁はまた、厚くなり閉塞に至ることがある。加えて、瘻孔及び亀裂は珍しくない。
【０００９】
ＩＢＤの現在の治療法は、通常は、抗炎症剤又は免疫抑制剤、例えばスルファサラジン、コルチコステロイド、６-ルカプトプリン／アザチオプリン、又はシクロスポリンの投与を含み、これは通常は部分的な結果をもたらすだけである。抗炎症／免疫抑制療法が失敗すると、結腸切除術が防御の最後ラインである。直腸に関連しないＣＤに対する典型的な手術は切除術（腸の疾患部分の除去）及び瘻造設術なしの吻合術（再結合）である。小腸又は大腸の部分は取り除かれ得る。ＣＤ患者の約３０％が診断後最初の年の内に手術を必要とする。その後の年では、割合は一年当たり約５％である。不幸にも、ＣＤは高い再発率を特徴とする；患者の約５％が最初の手術後、毎年二回目の手術を必要とする。
【００１０】
炎症性腸疾患の診断の精密化は、標準的な分類基準を使用して疾患の進行状態を評価することを含む。ＩＢＤにおいて使用される分類システムは、大腸炎を軽度、中程度、又は重篤として分類するＴｒｕｅｌｏｖｅ及びＷｉｔｔｓインデクス（Truelove S.C.及びWitts, L.J. Br Med J. 1955;2:1041-1048）、並びにLennard-Jones（Lennard-Jones JE. Scand J Gastroenterol Suppl 1989;170:2-6）及び単純な臨床大腸炎活性指数（ＳＣＣＡＩ）（Walmsley等 Gut. 1998;43:29-32）である。これらのシステムは、毎日の便通、 直腸出血、体温、心拍数、ヘモグロビンレベル、 赤血球沈降速度、体重、 ヘマトクリットスコア、及び血清アルブミン値のような変量を追跡する。
【００１１】
症例のおよそ１０−１５％において、潰瘍性大腸炎又はクローン病の確定診断は行うことはできず、かかる症例はしばしば「不確定大腸炎」と称される。診断を補助し得、それぞれが血液中の抗体をアッセイする二つの抗体検出試験が利用できる。抗体は「核周辺型抗好中球抗体」（ｐＡＮＣＡ）と「抗出芽酵母抗体」（ＡＳＣＡ）である。潰瘍性大腸炎の殆どの患者はｐＡＮＣＡ抗体を持っているがＡＳＣＡ抗体を持っておらず、クローン病の殆どの患者は抗体を持っているがｐＡＮＣＡ抗体を持っていない。しかしながら、これらの二つの試験は、ある患者は何れの抗体も持っておらず、あるクローン病患者はｐＡＮＣＡ抗体のみを持っている場合があるので、難がある。臨床実務では、多数の変量の測定よりも分子マーカーに基づきＩＢＤの存在及び／又は進行を示しうる信頼性ある試験は、ＩＢＤの患者を同定し及び／又は治療するために有用であろう。無仮説の連鎖・連関研究では、ＵＣに関連している遺伝子座、特に染色体６上のＭＨＣ領域（Rioux等Am J Hum Genet. 2000;66:1863-1870；Stokkers等Gut. 1999; 45:395-401；Van Heel等Hum Mol Genet. 2004;13:763-770）、染色体１２上のＩＢＤ２遺伝子座（Parkes等Am J Hum Genet. 2000;67:1605-1610；Satsangi等Nat Genet. 1996;14:199-202）及び染色体５上のＩＢＤ５遺伝子座（Giallourakis 等 Am J. Hum Genet. 2003;73:205-211；Palmieri等 Aliment Pharmacol Ther. 2006;23:497-506；Russell等 Gut. 2006;55:1114-1123；Waller等 Gut. 2006;55:809-814）が同定されている。染色体７ｑ上にＵＣに対する連関の推定遺伝子座を同定するＵＫ規模の連鎖スキャンの後、更なる研究で、ＵＣの細胞性解毒に関与するＡＢＣＢ１（ＭＤＲ１）遺伝子の変異体を結びつけた(Satsangi等 Nat Genet. 1996;14:199-202；Brant等 Am J Hum Genet. 2003;73:1282-1292；Ho 等 Gastroenterology. 2005;128:288-296)。
【００１２】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）において観察される慢性的小腸炎を生じる複雑な遺伝子-遺伝子及び遺伝子-環境関係の同定と理解に向けての補完的アプローチは、マイクロアレイ遺伝子発現解析である。マイクロアレイは、組織及び細胞レベルでの遺伝子発現の包括的な像を明らかにし、根底にある病態生理学的過程の理解を助ける（Stoughton等 Annu Rev Biochem. 2005;74:53-82）。マイクロアレイ解析は最初は１９９７年にＩＢＤの患者に応用され、ＣＤの患者の手術切除中の９６遺伝子の発現を、関節リウマチの患者の滑液組織と比較した（Heller 等 Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;94:2150-2155）。 ＩＢＤ患者からの手術標本を調べるためにマイクロアレイプラットフォームを使用する更なる研究により、疾患試料をコントロールと比較した場合に異なるように調節された多くの新規遺伝子が同定された（Dieckgraefe等 Physiol Genomics. 2000;4:1-11；Lawrance等 Hum Mol Genet. 2001;10:445-456）。
【００１３】
現在のエビデンスは、炎症性腸疾患、クローン病（ＣＤ）及び潰瘍性大腸炎（ＵＣ）が、重要な環境的相互作用及び刺激を伴う複雑な非メンデル型多遺伝子性疾患であることを示唆する（Gaya等. Lancet 2006;367:1271-1284）。ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子の多様体が、ＣＤに対する感受性と関係しているという発見は画期的な発見とされ、ＣＤの進行における自然及び適応免疫反応の役割への広範な感心をもたらした。
【００１４】
近年、全ゲノムスキャン（ＧＷＳ）が、ＣＤに関与する多くの遺伝性多様体を同定してきた。最初の全ゲノムスキャンは、日本人のＣＤ集団で実行され（Yamazaki等. Hum Mol Genet 2005;14:3499-3506）、その後の研究は、北アメリカ及びヨーロッパのＣＤ集団において試みられている。
【００１５】
染色体１ｐ３１上のＩＬ-２３Ｒ遺伝子の多型が、ＣＤに関与することがまず最初に米国の研究において観察され（Duerr等. Science 2006;314:1461-1463）、これが現在欧州で広く再現されＩＬ-２３／Ｔｈ１７経路への興味をもたらしている（The Wellcome Trust Case Control Consortium, Nature 2007;447:661-678）。過去２年間、ヨーロッパ系の集団における多くの全ゲノム相関解析（ＧＷＡＳ）は、３２の確認されたＣＤ感受性遺伝子／遺伝子座を同定した。（Barrett等. Nat Genet 2008, Aug;40(8):955-62）。これらは、ＣＤに特異的である自然免疫遺伝子；ＮＯＤ２（２００１年に最初に記述(Hugot等. Nature 2001;411(6837):599-603; Ogura等. Nature 2001;411(6837):603-6））及びオートファジー遺伝子ＡＴＧ１６Ｌ１及びＩＲＧＭ（The Wellcome Trust Case Control Consortium, Nature 2007;447:661-678）を含み、細菌の細胞内プロセスにおける欠陥がＣＤの病変形成における中心的特性を構成することを明瞭に示す。ＩＬ-２３Ｒの生殖細胞変異体がＣＤにおいて保護的であることは、Ｔｈ１７作動性慢性腸炎への（ｐ４０サブユニットを共有するＩＬ-１２より）ＩＬ-２３の貢献を詳述しているネズミの実験と一致した（Duerr等. Science 2006;314(5804):1461-3; Maloy等. Mucosal Immunol 2008;1(5):339-49）。ＵＣにおけるメタアナリシス及びその後の研究は、３つの他のＩＬ-２３経路遺伝子（ＩＬ１２Ｂ、ＪＡＫ２及びＳＴＡＴ３）が全てＩＢＤ感受性遺伝子であることを実証した（Barrett等. Nat Genet 2008, Aug;40(8):955-62）。
【００１６】
現在、ＣＤにおける大規模な腸全ゲノム発現研究はない。今、新規な遺伝子相関（genetic associations）の詳細な機能及び発現を検証する早急な必要性がある。我々は以前に、ＵＣ患者からの結腸生検における遺伝子プロファイルを調査するために全ゲノム発現技術を用いた（Noble等. Gut 2008, Oct;57(10):1398-405）。調査結果は、健康な成人結腸における発現勾配及び多くの新規遺伝子並びにαデフェンシン５及び６等の確立された候補遺伝子の発現変化を含んだ。健康な成人結腸クラスタ解析は、左右結腸間の遺伝子発現における差異を示し、発生遺伝子ＨＯＸＡ１３、ＨＯＸＢ１３、ＧＬＩ１及びＧＬＩ３が主にこの分離を促進した。ＵＣでは、血清アミロイドＡ１（ＳＡＡ１）及びαデフェンシンＡ５及び６が増加され、ＤＥＦＡ５及び６発現における増加は免疫組織化学及びin sutuハイブリダイゼーションによりパネート細胞化生に更に特徴づけられた。
【００１７】
ますます、腸上皮性細胞（ＩＥＣ）は、腸免疫ホメオスタシスにおいて重要な役割を果たすことが観察されている。実際、腸病原体の認識及び細胞性ストレスシグナルへの応答における、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５の役割の発見及び病原体関連分子構造（ＰＡＭＰ）受容体の働きは、ＩＥＣを腸の免疫学的防御の最前線に持ち出した（Strober等, J.Clin.Invest 2007;117(3):514-21.）。ＩＥＣ反応は、この経路の中心的な調整因子である核転写因子ＮＦ-ｋＢを標的にする。
【００１８】
活性及び炎症中の遺伝子発現における異なりを理解するために、多くのマイクロアレイ研究が免疫細胞サブセットにおいて実施されてきた。６つの細胞タイプの集合からの全ゲノム発現は、研究者に免疫細胞において特異的な発現特性を持つインシリコ免疫反応遺伝子のコレクションの同定を可能にした（Abbas等. Genes Immun 2005;6:319-331）。これらの遺伝子は、研究者が、免疫細胞サブセットにおけるシグナル経路を差別化すること、及び免疫反応において役割を果たすことが知られる遺伝子及び未知機能の遺伝子の炎症性反応を特徴付けることを可能にした。
【００１９】
内視鏡で採取した粘膜生検は、研究者が、重篤ではない疾患の患者を包含する大きな範囲の患者由来の組織をマイクロアレイすることを可能にした。Langmann等はマイクロアレイを使用し、結腸及び回腸末端の巨視的に非罹患の領域からの生検標本中の２２２８３の遺伝子を分析した（Langmann 等 Gastroenterology. 2004;127:26-40）。細胞解毒及び生体内分解に関与した遺伝子（プレグナンＸレセプター及びＭＤＲ１）はＵＣの患者の大腸において有意に下方制御されたが、ＣＤの患者からの生検中におけるこれら遺伝子の発現には差がなかった。Costelloと同僚達(Costello 等 PLoS Med. 2005;2:e199)は、健常なコントロール、ＣＤ及びＵＣの患者由来の内視鏡Ｓ状結腸生検中における３３７９２配列の発現を調べた。新規なタンパク質を表す多くの配列が異なって調節されており、インシリコ解析では、これらのタンパク質が疾患病理-転写因子、シグナル伝達分子及び細胞接着に関する推定機能を有していたことが示唆された。
【００２０】
ＵＣの患者の研究において、Okahara等 (Aliment Pharmacol Ther. 2005;21:1091-1097)は、非炎症生検と比較した場合、炎症生検において、遊走阻止因子関連タンパク質１４（ＭＲＰ１４）、増殖関連癌遺伝子ガンマ（ＧＲＯγ）及び血清アミロイドＡ１（ＳＡＡ１）が上方制御される一方、ＴＩＭＰ１及びｅｌｆｉｎが下方制御されていることを観察した。４１のケモカインと２１のケモカインレセプターを観察し、Puleston等は、ケモカインＣＸＣＬｓ１-３及び８及びＣＣＬ２０がアクティブな大腸ＣＤ及びＵＣにおいて上方制御されていたことを証明した(Aliment Pharmacol Ther. 2005;21:109-120)。総括してこれらの研究は、初期のマイクロアレイプラットホーム及び組織収集の異質性を例証している。しかしながら、これらの問題にかかわらず、多くの遺伝子の差次的発現が一貫して観察された。
ＩＢＤの研究における上記の進歩にもかかわらず、哺乳動物においてＩＢＤを検出することができ、この疾患を効果的に治療するための更なる診断及び治療剤に対して大なる需要が存在している。
【００２１】
ここで述べた全ての刊行物は、その刊行物が引用されているものに関連した方法及び／又は材料を開示し記述するために出典明示によりここに援用される。ここに引用された刊行物は本出願の出願日前の開示に対して引用している。本発明のより早い優先日又は先の日付が刊行物に先立つことができないことを発明者が自認していると見なされるべきではない。更に、実際の公開日は示されたものとは異なる場合があり、個々に立証を要する。
【発明の概要】
【００２２】
本発明は、正常な組織と比較して炎症性腸疾患（ＩＢＤ）中において過剰発現されるポリヌクレオチド及びポリペプチド、及びその哺乳動物被験体におけるＩＢＤの存在を検出又は診断し、その後ＩＢＤが適切なＩＢＤ治療剤で検出される被験体を続いて治療するために、ポリペプチド及びそのコード核酸を使用する方法を提供する。
【００２３】
本発明はまた、クローン病（ＣＤ）を含むＩＢＤの存在を検出し進行を決定するための方法を提供する。
【００２４】
ここに開示される発明は、哺乳類動物組織又は細胞試料における一又は複数の遺伝子発現マーカーの発現を調査する方法及びアッセイを提供し、かかる一又は複数のバイオマーカーは、組織又は細胞試料が得られた哺乳類動物被験体が、よりＩＢＤに罹患し易いかを予測する。本発明の様々な実施態様では、発明及びアッセイは、表１に挙げられるような遺伝子発現マーカーの発現を調査し、発現がコントロールサンプルと比較して異なって発現されるか決定する。
【００２５】
一態様では、発明は、該被験体から得られた試験試料において、（ｉ）表１から選択された一又は複数のポリペプチドをコードする一又は複数の核酸；又は（ｉｉ）表１に挙げられた一又は複数の遺伝子のＲＮＡ転写物又はその発現産物のコントロールにおける発現レベルに対する異なる発現レベルを決定することを含んで成り、発現の異なるレベルは、試験試料が得られた被験体におけるＩＢＤの存在を示す。全ての実施態様において、配列番号：５、６、８、１１、１２、２、１４、１６、１８、２０及び２２の何れか一つに示されるポリペプチドをコードする核酸の発現レベルが決定される。
【００２６】
一実施態様では、哺乳類動物被験体におけるＩＢＤの存在を診断又は検出する方法は、（ｉ）表１から選択された一又は複数のポリペプチドをコードする一又は複数の核酸；又は（ｉｉ）表１に列挙された一又は複数の遺伝子のＲＮＡ転写物又はその発現産物の発現レベルが、コントロールにおける発現レベルに対して低いことを決定することを含み、上記発現の低いレベルが、試験試料が得られた被験体におけるＩＢＤの存在を示す。全ての実施態様において、配列番号：５、６、８、１１、１２、２、１４、及び１６の何れか一つに示されるポリペプチドをコードする核酸の発現レベルが決定される。
【００２７】
別の実施態様では、哺乳類動物被験体におけるＩＢＤの存在を診断又は検出する方法は、（ｉ）表１から選択された一又は複数のポリペプチドをコードする一又は複数の核酸；又は（ｉｉ）表１に列挙された一又は複数の遺伝子のＲＮＡ転写物又はその発現産物の発現レベルが、コントロールにおける発現レベルに対して高いことを決定することを含み、上記発現の高いレベルが、試験試料が得られた被験体におけるＩＢＤの存在を示す。全ての実施態様において、配列番号：１８、２０及び２２の何れか一つに示されるポリペプチドをコードする核酸の発現レベルが決定される。
【００２８】
一態様では、発明は、以前にＩＢＤを診断され現在は寛解している哺乳類動物におけるＩＢＤの再発を診断又は検出することを対象とする。被験体は、ＩＢＤの治療を終えていてもよく、又は現在ＩＢＤの治療を受けていてもよい。一実施態様では、該方法は、該被験体から得られた試験試料において、（ｉ）表１から選択された一又は複数のポリペプチドをコードする一又は複数の核酸；又は（ｉｉ）表１に挙げられた一又は複数の遺伝子のＲＮＡ転写物又はその発現産物の、コントロールでの発現レベルに対する異なる発現レベルを決定することを含み、発現の差は、被験体がＩＢＤの再発をより起こし易いことを示す。全ての実施態様において、配列番号：５、６、８、１１、１２、２、１４、１６、１８、２０及び２２の何れか一つに示されるポリペプチドをコードする核酸の発現レベルが決定される。全ての実施態様において、試験サンプルは、入手可能であれば、最初のＩＢＤ診断時、前又は後に得られた哺乳類動物被験体の前の試験サンプルと比較され得る。
【００２９】
全態様において、哺乳類動物被験体は好ましくはヒト患者であり、例えばＩＢＤと診断された又はＩＢＤを発症する危険性があるヒト患者である。被験体は、また、以前にＩＢＤの治療を受けたがＩＢＤの再発の危険性があるＩＢＤ患者であり得る。
【００３０】
本発明の方法の全態様について、ここに記載される一又は複数の遺伝子（又は一又は複数のこのような遺伝子により発現されるポリペプチドをコードする一又は複数の核酸）の発現レベルを決定することは、例えば遺伝子発現プロファイリングの方法によって得られうる。遺伝子発現プロファイリングの方法は、例えばＰＣＲに基づいた方法でありうる。
【００３１】
様々な実施態様では、診断は、免疫組織化学（ＩＨＣ）及び／又は蛍光インサイツハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）等によって、（ｉ）表１から選択された一又は複数のポリペプチドをコードする一又は複数の核酸；又は（ｉｉ）表１から選択された一又は複数の遺伝子のＲＮＡ転写物又はその発現産物の発現レベルの定量化を含む。
【００３２】
本発明の全態様について、遺伝子の発現レベルは、一又は複数の参照遺伝子、又はそれらの発現産物の発現レベルに対して正規化され得る。
【００３３】
本発明の全態様に対して、方法は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８又は９の前記遺伝子、又はそれらの発現産物の発現レベルのエビデンスを決定することを更に含み得る。
【００３４】
別の態様では、本発明の方法は、発現のレベルのエビデンスに基づいたこのような遺伝子の（つまりここに開示されるようなＩＢＤマーカー）「パネル」の使用も考える。幾つかの実施態様では、ＩＢＤマーカーのパネルは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、又は９のＩＢＤマーカーを含む。パネルは、コントロールに対してＩＢＤにおいて過剰発現されるＩＢＤマーカー、コントロールに対してＩＢＤにおいて過剰発現及び過少発現の双方が生じるＩＢＤマーカー、コントロールに対してＩＢＤにおいて過剰発現も過少発現もされるＩＢＤマーカーを含みうる。かかるパネルは、ＩＢＤが被験体に存在するか決定するために、一又は複数のＩＢＤマーカーの異なる発現に対して哺乳類動物被験体をスクリーニングするために使用され得る。
【００３５】
一実施態様では、パネルを作るＩＢＤマーカーは表１から選択される。好ましい実施態様では、哺乳動物被験体においてＩＢＤの存在を診断又は検出する方法は、被験体から得られた試験試料中のＩＢＤマーカーのパネルからのＲＮＡ転写物又はその発現産物の、コントロールにおける発現レベルに対する発現レベル差を決定することを含み、ここで、発現レベルの差が、試験試料が得られた被験体におけるＩＢＤの存在を示している。試験試料中の発現差異は、ここで検討されたようにコントロールに対して高い及び／又は低いものでありうる。
【００３６】
本発明の全態様について、方法は、前記予測をまとめたレポートを作成する工程を更に含み得る。
【００３７】
全態様について、本発明の方法により診断又は検出されるＩＢＤは、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、又はＣＤ及びＵＣ双方である。
【００３８】
本発明の全態様について、哺乳類動物被験体から得られた試験試料は、結腸組織生検に由来しうる。好ましい実施態様では、生検は、回腸結腸、上行結腸、下行結腸、及びＳ状結腸からなる群から選択される組織である。他の好ましい実施態様では、生検は、炎症性結腸領域又は非炎症性結腸領域から得られる。炎症性結腸領域は、急性炎症又は慢性炎症でありうる。
【００３９】
全態様について、発現レベルの決定は一回以上生じうる。本発明の全態様について、発現レベルの決定は、患者が、何れかの手術の前及び／又は後の何れかの治療に課される前に行われうる。幾つかの実施態様では、決定工程は、術後の哺乳類動物におけるＩＢＤの再発、又は前記哺乳類動物における前記ＩＢＤの突然の再発を示す。好ましい実施態様では、ＩＢＤはクローン病である。
【００４０】
別の態様では、本発明は、ＩＢＤの存在がここに記載された方法によって検出された哺乳類動物を治療する方法に関する。例えば、哺乳類動物から得られた試験試料が、ここに記載されるＩＢＤマーカーの一又は複数のＲＮＡ転写物又は対応遺伝子産物のコントロールに対する異なる発現を呈することを決定した後に、哺乳類動物被験体はＩＢＤ治療薬を投与されうる。
【００４１】
一実施態様では、治療を必要とする哺乳類動物にてＩＢＤを治療する方法は、（ａ）被験体から得られた試験試料において、（ｉ）表１から選択された一又は複数のポリペプチドをコードする一又は複数の核酸；又は（ｉｉ）表１から選択された一又は複数の遺伝子のＲＮＡ転写物又はその発現産物の、コントロールの発現レベルに対する異なる発現レベルを決定する工程であって、前記異なる発現レベルは、試験試料が得られた被験体におけるＩＢＤの存在を示す工程；及び（ｂ）前記被験体に有効量のＩＢＤ治療剤を投与する工程を含む。全ての実施態様において、配列番号：５、６、８、１１、１２、２、１４、１６、１８、２０及び２２の何れか一つに示されるポリペプチドをコードする核酸の発現レベルが決定される。
【００４２】
好ましい実施態様では、ＩＢＤを治療する方法は、（ａ）被験体から得られた試験試料において、（ｉ）表１から選択された一又は複数のポリペプチドをコードする一又は複数の核酸；又は（ｉｉ）表１に列挙された一又は複数の遺伝子のＲＮＡ転写物又はその発現産物の発現レベルが、コントロールにおける発現レベルに対して低いことを決定する工程であって、発現のより低いレベルが、試験試料が得られた被験体におけるＩＢＤの存在を示す工程；及び（ｂ）前記被験体に有効量のＩＢＤ治療剤を投与する工程ことを含む。全ての実施態様において、配列番号：５、６、８、１１、１２、２、１４、及び１６の何れか一つに示されるポリペプチドをコードする核酸のより低いレベルの発現が決定される。
【００４３】
別の好ましい実施態様では、ＩＢＤを治療する方法は、（ａ）被験体から得られた試験試料において、（ｉ）表１から選択された一又は複数のポリペプチドをコードする一又は複数の核酸；又は（ｉｉ）表１に列挙された一又は複数の遺伝子のＲＮＡ転写物又はその発現産物の発現レベルが、コントロールにおける発現レベルに対してより高いことを決定する工程であって、発現のより高いレベルが、試験試料が得られた被験体におけるＩＢＤの存在を示す工程を含む。全ての実施態様において、配列番号：８、２０及び２２の何れか一つに示されるポリペプチドをコードする核酸のより高いレベルの発現が決定される。
【００４４】
幾つかの好ましい実施態様では、ＩＢＤ治療剤は、一又は複数のアミノサリチル酸、コルチコステロイド及び免疫抑制剤である。
【００４５】
一態様では、上で検討されたＩＢＤマーカーのパネルは、哺乳類動物においてＩＢＤを治療する方法において有益である。一実施態様では、哺乳類動物は、マーカーのパネルに対してスクリーニングされ、ＩＢＤの存在が決定された場合にはＩＢＤ治療剤がここで検討されたように投与されうる。
【００４６】
他の態様では、本発明は、本発明の方法を実施するのに適した一又は複数の（１）抽出緩衝液／試薬及びプロトコル；（２）逆転写緩衝液／試薬及びプロトコル；及び（３）ｑＰＣＲ緩衝液／試薬及びプロトコルを含んでなるキットに関する。キットは、データ検索及び解析ソフトウェアを含んでもよい。  
【００４７】
一実施態様では、異なる発現がＩＢＤを示す遺伝子は、一又は複数のＣＣＬ２３、ＣＸＣＬ１３、ＩＲＴＡ１、ＡＴＧ１６Ｌ１、ＡＴＧ４Ｄ、ＡＴＧ３、ＡＴＧ１２、ＡＴＧ１６Ｌ２、ＬＣ３Ｂ、又はそれらの何れかの組合せである。
【００４８】
本発明のこれらの及び更なる実施態様は、当業者にとって明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、ヒトＩＲＴＡ１ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１）  を示す。
【図２】図２は、図１の核酸配列によりコード化されるアミノ酸配列（配列番号：２）  を示す。
【図３】図３は、ヒトＣＣＬ２３ポリペプチドのＣＫｂｅｔａ８-１転写物をコードする核酸配列（配列番号：３）を示す。
【図４】図４は、ヒトＣＣＬ２３ポリペプチドのＣＫｂｅｔａ８転写物をコードする核酸配列（配列番号：４）を示す。
【図５】図５は、図３の核酸配列によりコード化されるアミノ酸配列（配列番号：５）  を示す。
【図６】図６は、図４の核酸配列によりコード化されるアミノ酸配列(配列番号：６) を示す。
【図７】図７は、ヒトＣＸＣＬ１３ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：７）を示す。
【図８】図８は、図７の核酸配列によりコード化されるアミノ酸配列（配列番号：８）を示す。
【図９】図９は、ヒトＡＴＧ１６Ｌ１ポリペチド（アイソフォーム２）をコードする核酸配列（配列番号：９）を示す。
【図１０】図１０は、ヒトＡＴＧ１６Ｌ１ポリペチド（アイソフォーム１）をコードする核酸配列（配列番号：１０）を表す。
【図１１】図１１は、図９の核酸配列によりコード化されるアミノ酸配列（配列番号：１１）を表す。
【図１２】図１２は、図１０の核酸配列によりコード化されるアミノ酸配列（配列番号：１２）を表す。
【図１３】図１３は、ヒトＡＴＧ４Ｄポリペチドをコードする核酸配列（配列番号：１３）を表す。
【図１４】図１４は、図１３の核酸配列によりコード化されるアミノ酸配列（配列番号：１４）を表す。
【図１５】図１５は、ヒトＡＴＧ３ポリペチドをコードする核酸配列（配列番号：１５）を表す。
【図１６】図１６は、図１５の核酸配列によってコード化されるアミノ酸配列（配列番号：１６）を表す。
【図１７】図１７は、ヒトＡＴＧ１２ポリペチドをコードする核酸配列（配列番号：１７）を表す。
【図１８】図１８は、図１７の核酸配列によってコード化されるアミノ酸配列（配列番号：１８）を表す。
【図１９】図１９は、ヒトＡＴＧ１６Ｌ２ポリペチドをコードする核酸配列（配列番号：１９）を表す。
【図２０】図２０は、図１９の核酸配列によってコード化されるアミノ酸配列（配列番号：２０）を表す。
【図２１】図２１は、ヒトＬＣ３Ｂポリペチドをコードする核酸配列（配列番号：２１）を表す。
【図２２】図２２は、図２１の核酸配列によってコード化されるアミノ酸配列（配列番号：２２）を表す。
【図２３】図２３は、クローン病及びコントロールを有する女性からの回腸末端部生検の階層的クラスタ分析を示す。データはＣＤ患者８人、正常の回腸末端部病理学を有する健康なコントロール３人、正常の回腸末端部病理学を有したＵＣ患者１人からの回腸末端部生検を含み、クラスタ化された。ＣＤ、ＵＣ及びコントロール患者は、生検の炎症状態で注記された。赤で記す上方制御及び青で記す下方制御の度合いは、対数関数キーを使用して定量化されることができる。二面積がこの分離を推進すると考えられこれらは下方制御を実線の円で、上方制御を破線の円でハイライトされた。
【図２４】図２４は遺伝子発現における倍率変化を示し、コントロールに対するＣＤ生検を比較する。遺伝子注記：ＳＡＡ１-血清アミロイドＡ１、ＲＥＧＬ- ラット再生膵島由来様ヒト相同体、Ｓ１００Ａ８＆９-カルシウム結合タンパクＡ８及びＡ９、ＴＮＩＰ３-ＴＮＦＡＩＰ３相互作用プロテイン３、ＩＬ-８-インターロイキン８、ＩＦ-Ｉ因子（補体）、ＫＣＮＤ３-カリウム電位依存性チャネル（Ｓｈａｌ関連サブファミリー）メンバー３、ＣＬＥＣＳＦ１２-Ｃ-タイプ（カルシウム依存、糖質認識ドメイン）レクチン、再生膵島由来３ガンマ-膵臓関連プロテイン２、ＴＦＥＣ転写因子ＥＣ、ＩＧＳＦ６-免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー６、Ａ_３２_Ｐ９０３８５-未知、ＧＷ１１２-オルファクトメジン-４前駆体（ＯＬＭ４）、ＭＧＣ２７１６５-４免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインを含むタンパク質、ＭＭＰ３-マトリックスメタロプロテアーゼ３、ＫＬＫ１２-カリクレイン１２、ＴＺＦＰ-精巣Ｚｎフィンガータンパク質、ＲＥＧ４-再生膵島由来ファミリー、メンバー４、ＣＬＥＣＳＦ９-Ｃ-タイプ（カルシウム依存、糖質認識ドメイン）レクチン、スーパーファミリーメンバー９、ＩＦ-Ｉ因子（補体）、ＡＶＰ-プレプロアルギニンバソプレシン-ニューロフィジンＩＩ、ＡＡＴＫ-アポトーシス関連チロシンキナーゼ、ＥＣＴ２-上皮細胞形質転換配列２がん遺伝子、ＳＬＣ２６Ａ２-溶質担体ファミリー２６、ＸＲＲＡ１-Ｘ線放射線耐性関連１、ＲＰＳ２８-リボソーム蛋白質Ｓ２８、ＩＳＬ１-インスリン遺伝子エンハンサータンパク質１、ＭＧＣ２９６４３-ＬＹ６／ＰＬＡＵＲドメイン含有１、ＡＱＰ８-アクアポリン８、ＦＬＪ２５７７０-仮定タンパク質、ＡＮＫＲＤ１７-アンキリンリピートドメイン１７、Ａ_３２_Ｐ１９１０６６-ＰＮ００９９に弱類似、ＦＬＪ１２５７２-仮定タンパク質、ＬＯＣ３３９８８１-真核生物翻訳開始因子４Ｂに類似、ＮＫＤ１-ネイキッドクチクラ相同体１、ＣＡ１＆２-炭酸脱水酵素１及び２、ＰＲＡＣ-前立腺、直腸及び結腸発現遺伝子タンパク質、ＬＯＣ３３９８８１-仮定遺伝子、ＳＬＣ１４Ａ２-溶質担体ファミリー１４。
【図２５】図２５は遺伝子発現における倍率変化を示し、回腸結腸のＣＤ及びコントロール生検を比較する。遺伝子注記：ＵＢＤ-ジユビキチン、ＴＩＭＤ４-Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有プロテイン４前駆体、ＦＬＪ２５３９３＆ＦＬＪ２７０９９-仮定タンパク質、ＳＯＸ１４-ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）-ボックス１４、ＢＸ１０８８３３-ソアレス乳児脳１ＮＩＢ、ＨＫ２-ヘキソキナーゼ-２、ＲＰ１１-６５３Ａ５．１-新規タンパク質、ＴＥＸ１２-精巣発現配列１２、ＩＩＩ-前立腺特異性膜抗原様タンパク質、Ｓ１００Ｐ-Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｐ、Ｃ１ｏｒｆ３４-ＤＥＭＥ-６プロテイン、プリオンタンパク質のＳｐｒｎシャドー（Sprn-shadow）、ＦＯＬＨ１-葉酸ヒドロラーゼ、ＬＯＣ９２５５２-ＭＪＤの相同体に類似、ＥＹＡ２-アイズアブセント相同体２、ＣＥＡＣＡＭ３-癌胎児性抗原関連の細胞接着分子３、Ｃ１４ｏｒｆ８１-仮定タンパク質ＬＯＣ９０９２５、ＭＵＣ４-ムチン４、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ-腫瘍壊死因子-スーパーファミリーメンバー１３Ｃ、ＨＥＢＰ１-ヘム結合タンパク質、ＡＲＨＧＡＰ２４-Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼ活性プロテイン２４、ＬＯＣ３７５１８０-ヒトＬＯＣ３８８９２０、ＳＵＳＤ２-スシドメイン含有２、ＡＧＸＴ２-アラニングリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ２、ＣＹＦＩＰ２-細胞質ＦＭＲ１相互作用プロテイン２、ＦＮＢＰ１-フォーミン（Formin）結合タンパク質１、ＳＬＣ２８Ａ２-溶質担体ファミリー２８メンバー２、ＯＴＴＨＵＭＰ００００００１１５２２-仮定タンパク質ＭＧＣ２７１６９、ＰＡＸ８-ペアードボックス遺伝子８、ＣＸＣＲ４-ＣＸＣケモカイン受容体４、ＡＰＯＡ１-アポリポタンパク質ＡＩ、Ｃ６ｏｒｆ３２-第６染色体翻訳領域３２、ＮＰＰＣ-Ｃタイプナトリウム利尿ペプチド、ＣＣＬ２３-ケモカイン（Ｃ-Ｃのモティーフ）リガンド２３、ＡＰＯＣ３-アポリポタンパク質Ｃ-ＩＩＩ、ＩＲＴＡ１-免疫グロブリンスーパーファミリー受容体転座関連１、ＭＧＣ２７１６９-仮定タンパク質。
【図２６】図２６は遺伝子発現における倍率変化を示し、非炎症性ＣＤ及びコントロールＳ状結腸生検を比較する。
【図２７】図２７は遺伝子発現における倍率変化を示し、炎症性及び非炎症性ＣＤＳ状結腸生検を比較する。
【図２８】図２８は、クローン病及びコントロールにおけるＩＬ-２３／Ｔｈ１７経路の表現分析を例示する。ＩＬ-２３経路を炎症状態により分けられるＣＤ及びコントロール生検における構成分子の遺伝子発現と共に描写する。遺伝子発現を箱髭図として示す。箱は２５パーセンタイルから７５パーセンタイルである。ＩＬ-２３経路は、コントロールと比較してＣＤ生検において、及び非炎症性ＣＤ生検と比較して炎症性ＣＤ生検において上方制御された。
【図２９】図２９は、クローン病及びコントロールにおけるオートファジー経路の発現分析を示す。遺伝子発現を伴うオートファジー経路を箱髭図として示す。調査された２０遺伝子の内６において異なる遺伝子発現が観察され、ＡＴＧ１６ＬＩ、ＡＴＧ４Ｄ及びＡＴＧ３は下方制御され、ＡＴＧ１２、ＡＴＧ１６Ｌ２及びＬＣ３Ｂはわずかに上方制御された。ＰＥ-ホスファチジルエタノールアミンは、ＡＴＧ８／ＬＣ３に共有結合し自己貪食的膜へのその接着を介在する脂質である。
【図３０】図３０は、上皮細胞マーカーによりクラスタ化されたＳ状結腸クローン病及びコントロール生検を示す。結腸生検を図の上部に沿って注記する：コントロール（例えば番号１−５及び７−１１）、非炎症性ＣＤ（番号６、１２、３４、５０−５１及び５７）、炎症性ＣＤ（番号１５、４５、４９、５２−５５、５８及び６０−６１）、未処置ＣＤ（番号４２、４６−４８、５６及び５９）。図の右に上皮性細胞サイトカインを注記する。赤で記す上方制御及び青で記す下方制御の度合いは、対数関数キーを使用して定量化されることができる。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
（発明の詳細な説明）
Ａ．定義
特に定義しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。Singleton 等, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2版, J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994)、及びMarch, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4版, John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992)により当業者は本出願に使用した多くの用語の一般的な理解が得られる。
【００５１】
当業者は、本発明の実施に使用することができるであろう、ここに記載のものと同様もしくは等価な多くの方法及び材料が分かるであろう。実際、本発明は記載された方法及び材料に決して限定されるものではない。本発明の目的のために、次の用語を以下に定義する。
【００５２】
「炎症性腸疾患」又は「ＩＢＤ」なる用語は、潰瘍性大腸炎及びクローン病に対する集合的な用語として使用される。該二種の疾患は一般には二つの異なった実体と考えられているが、表面上皮の斑状壊死、腺性陰窩に隣接した白血球の局所性蓄積、及び増加した数の上皮内リンパ球（ＩＥＬ）及びある種のマクロファージサブセットのようなその共通する特性は単一の疾患群としてのその治療を正当なものにする。
【００５３】
「クローン病」又は「ＣＤ」なる用語は、ここでは胃腸管の慢性的な炎症を含む症状を意味するために使用される。クローン関連炎症は通常は腸管を冒すが口から肛門までの至る所で発生し得る。ＣＤは、腸管壁の全層にわたって広がり、腸間膜並びにリンパ節を含む点でＵＣとは異なる。該疾病はしばしば非連続的であり、つまり、腸の重篤に罹患しているセグメントが明らかに疾患がない領域から分離している。ＣＤでは、腸壁がまた厚くなり、これが閉塞を生じ得、瘻孔及び裂溝の発生が珍しくはない。ここで使用される場合、ＣＤは、限定するものではないが、（回腸及び大腸を冒す）回結腸炎；（回腸を冒す）回腸炎；胃十二指腸ＣＤ（胃及び十二指腸の炎症）；空回腸炎（空腸における炎症の斑状パッチ）；及びクローン（肉芽腫性）大腸炎（大腸のみを冒す）を含むＣＤの幾つかのタイプの一又は複数でありうる。
【００５４】
「潰瘍性大腸炎」又は「ＵＣ」なる用語は、ここでは大腸及び直腸の炎症を含む症状を意味するために使用される。ＵＣの患者では、結腸粘膜を主として含む炎症反応がある。炎症は典型的には一様で連続的であり、正常な粘膜が介在する領域はない。表面粘膜細胞並びに陰窩上皮及び粘膜下層が好中球浸潤を伴う炎症反応に関与する。最終的には、この反応は典型的には上皮損傷及び上皮細胞の消失まで進行し、多発性潰瘍、線維症、異形成及び結腸の縦方向の退縮を生じる。
【００５５】
「非活動的」ＩＢＤなる用語は、ここでは、個体において過去に診断されたが現在は寛解しているＩＢＤを意味するために使用される。これは、個体が診断されたが治療を受けていない活動的ＩＢＤと対照的なものである。加えて、活動的ＩＢＤは、 寛解（つまり、不活動的ＩＢＤになる）になった過去に診断され治療されたＩＢＤの再発であり得る。かかる再発はここではＩＢＤの「突然の再発」とも称され得る。ＩＢＤのような活動的な自己免疫疾患を有する哺乳動物被験体は、高まった疾患活動の期間又は対応する徴候の戻りである突然の再発を被りうる。突然の再発は、深刻な感染、アレルギー反応、肉体的ストレス、情動性トラウマ、手術、又は環境因子に応答して生じ得る。
【００５６】
「調節する」なる用語は、ここでは、遺伝子の発現、又は一又は複数のタンパク質又はタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子又は等価なＲＮＡ分子のレベル、又は一又は複数のタンパク質又はタンパク質サブユニットの活性が、発現、レベル又は活性がモジュレータの不存在下で観察されたものより大きいか又は少ないように、上方制御され又は下方制御されることを意味するために使用される。
【００５７】
「阻害する」、「下方制御する」、「低発現する」及び「減少する」なる用語は、交換可能に使用され、遺伝子の発現、又は一又は複数のタンパク質又はタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子又は等価なＲＮＡ分子のレベル、又は一又は複数のタンパク質又はタンパク質サブユニットの活性が、一又は複数のコントロール、例えば一又は複数の正及び／又は負の制御に対して低減されることを意味する。
【００５８】
「上方制御する」又は「過剰発現する」なる用語は、遺伝子の発現、又は一又は複数のタンパク質又はタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子又は等価なＲＮＡ分子のレベル、又は一又は複数のタンパク質又はタンパク質サブユニットの活性が、一又は複数のコントロール、例えば一又は複数の正及び／又は負の制御に対して上昇されることを意味する。
【００５９】
「診断」なる用語は、ここでは、分子的又は病理学的状態、疾患又は状態の同定を意味し、例えばＩＢＤの同定等である。
【００６０】
「予後」なる用語は、ここでは、自己免疫の突然の再発及び手術後の再発を含むＩＢＤの発生又は進行の可能性の予測を意味する。予後因子は、ＩＢＤをひとたび発症したら患者の再発率及び結果に影響を及ぼすＩＢＤの自然経過に関連した変量である。悪い予後に関連しうる臨床的パラメータは、例えば、腹部腫瘤又は圧痛、皮疹、関節腫脹、 口腔内潰瘍、及び腹鳴（腸にわたる腹鳴又は振とう音）を含む。予後因子は、異なったベースライン再発リスクを持つサブグループに患者を分類するために使用することができる。
【００６１】
ＩＢＤの「病理」は、患者の良好な状態を危うくさせる全ての現象を含む。ＩＢＤの病理は、主として、任意の既知の外来抗原の不在下での慢性又は急性炎症と続いての潰瘍を生じうる腸内の免疫系の異常な活性化に起因する。臨床的には、ＩＢＤは、しばしば慢性的な予測できない経過を生じる多様な徴候によって特徴付けられる。血性下痢及び腹痛はしばしば発熱及び体重減少を伴う。貧血は重度の疲労のように、希ではない。関節痛から急性関節炎にわたる関節の症状並びに肝機能の異常が通常ＩＢＤに伴う。ＩＢＤの急性の「攻撃」の間、仕事や他の通常の活動が普通不可能であり、しばしば患者は入院する。
【００６２】
これらの疾患の病因論は知られておらず、初期の病変ははっきりとは定まっていない；しかし、表面上皮の斑状壊死、腺性陰窩に隣接する白血球の局所性蓄積、及び増加した数の上皮内リンパ球及びある種のマクロファージサブセットが、特にクローン病における推定される初期の変化として記述されている。
【００６３】
「処置（治療）」なる用語は、ＩＢＤに対する、治療的処置及び予防的又は防止的手段の双方を意味し、目的は標的の病理症状又は疾患を防止し又は遅延させ（低減させ）ることである。治療を必要とする者は、既にＩＢＤである者並びにＩＢＤになる傾向がある者又はＩＢＤが防止されなければならない者を含む。ＩＢＤの診断がここに開示された方法によってひとたびなされたら、治療の目標は寛解を誘導し維持することである。
【００６４】
「ＩＢＤ治療剤」としての使用に適した様々な薬剤は当業者に知られている。ここに記載しているように、かかる薬剤には、限定なしに、アミノサリチル酸類、副腎皮質ステロイド、及び免疫抑制剤が含まれる。
【００６５】
「試験試料」なる用語は、ＩＢＤになっていることが疑われ、ＩＢＤであることが知られ、又はＩＢＤからの寛解にあることが知られている哺乳動物被験体からの試料を意味する。試験試料は、限定しないが、血液、精液、血清、尿、糞便、骨髄、粘膜、組織等を含む哺乳動物被験体における様々な供給源に由来し得る。試験試料は、限定するものではないが、上行結腸組織、下行結腸組織、Ｓ状結腸組織、回腸コロン及び終端の回腸組織を含む胃腸管の組織生検から得られ得る。
【００６６】
「コントロール」又は「コントロール試料」なる用語は、ネガティブな結果が試験試料におけるポジティブな結果を相関付けるのに役立つことが期待されるネガティブコントロールを意味する。本発明に適したコントロールには、限定しないが、正常なレベルの遺伝子発現を有していることが知られている試料、ＩＢＤとなっていないことが知られている哺乳動物被験体から得られた試料、及び正常であることが知られている哺乳動物被験体から得られた試料が含まれる。コントロールはまた過去にＩＢＤと診断され治療され現在は寛解にある被験体から得られた試料であり得；かかるコントロールは寛解にある被験体におけるＩＢＤの再発を決定するのに有用である。また、コントロールは、試験試料に含まれる細胞と同じ由来の正常細胞を含む試料でありうる。当業者であれば本発明での使用に適した他のコントロールが分かるであろう。
【００６７】
「マイクロアレイ」なる用語は、基質上の、ハイブリダイズ可能なアレイ要素、好ましくはポリヌクレオチドプローブの秩序だった配置を意味する。
【００６８】
単数又は複数で使用される場合、「ポリヌクレオチド」なる用語は、一般に任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを意味し、これは未修飾ＲＮＡ又はＤＮＡ又は修飾ＲＮＡ又はＤＮＡであり得る。よって、例えば、ここで定義されるポリヌクレオチドには、限定するものではないが、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖領域を含むＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、及び一本鎖及び二本鎖領域を含むＲＮＡ、一本鎖であってもよく、又はより典型的には二本鎖であっても又は一本鎖又は二本鎖領域を含んでもよいＤＮＡ及びＲＮＡを含む混成分子が含まれる。また「ポリヌクレオチド」なる用語は、ここで使用される場合ＲＮＡ又はＤＮＡ又はＲＮＡとＤＮＡの双方を含む三本鎖領域を意味する。そのような領域のストランドは同じ分子由来でも又は異なった分子由来でもよい。その領域は一又は複数の分子の全てを含みうるが、より典型的には幾らかの分子の領域のみを含む。三本ヘリックス領域の分子の一つがしばしばオリゴヌクレオチドである。「ポリヌクレオチド」なる用語は特にｃＤＮＡｓを含む。その用語には、一又は複数の修飾塩基を含むＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）及びＲＮＡが含まれる。よって、安定性又は他の理由のために修飾された骨格を持つＤＮＡ又はＲＮＡは、その用語がここで意図するところの「ポリヌクレオチド」である。更に、イノシンのような希な塩基又はトリチウム化塩基のような修飾された塩基を含むＤＮＡ又はＲＮＡはここで定義される「ポリヌクレオチド」という用語内に含まれる。一般に、「ポリヌクレオチド」という用語は未修飾のポリヌクレオチドの全ての化学的、酵素的及び／又は代謝的に修飾された形態並びに単純細胞及び複雑細胞を含む細胞及びウイルスに特徴的なＤＮＡ及びＲＮＡの化学的形態を包含する。
【００６９】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、限定するものではないが、一本鎖デオキシリボヌクレオチド、一本鎖又は二本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド及び二本鎖ＤＮＡを含む比較的短いポリヌクレオチドを意味する。一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドのようなオリゴヌクレオチドは、例えば市販されている自動オリゴヌクレオチド合成機を使用して、化学的方法によってしばしば合成される。しかしながら、オリゴヌクレオチドは、インビトロ組換えＤＮＡ媒介法を含む様々な他の方法によって、及び細胞及び生物中でのＤＮＡの発現によって、作製することができる。
【００７０】
「異なって（差次的に）発現された遺伝子」、「異なる（差次的）遺伝子発現」という用語及びその同義語は、交換可能に使用され、正常な又はコントロール患者でのその発現と比較して、疾患、特にＵＣ又はＣＤのようなＩＢＤに罹患している患者においてより高いか又はより低いレベルまで発現が活性化される遺伝子を意味する。その用語はまた発現が同じ疾患の異なった段階でより高いか又はより低いレベルまで活性化される遺伝子を含む。異なって発現された遺伝子は核酸レベル又はタンパク質レベルで活性化されるか又は阻害されうるか、あるいは選択的スプライシングを受けて異なったポリペプチド産物になりうることがまた理解される。そのような差異は、例えばｍＲＮＡレベル、ポリペプチドの表面発現、分泌又は他の分割の変化によって裏付けられうる。異なる遺伝子発現は、正常な被験者と疾患、特にＩＢＤに罹患している患者との間で、あるいは同じ疾患の様々な段階の間で異なる、二又はそれ以上の遺伝子又はその遺伝子産物間での発現の比較、又は二又はそれ以上の遺伝子又はその遺伝子産物間での発現の比の比較、又は更には同じ遺伝子の二つの異なってプロセシングされた産物の比較を含む。異なる発現は、例えば正常細胞及び疾患細胞の間、又は異なった疾患事象又は疾患段階を被った細胞間で、遺伝子又はその発現産物における時間的又は細胞性発現パターンの定量的な差異並びに定性的な差異の双方を含む。本発明の目的に対して、「異なる遺伝子発現」は、正常な被験者と疾患の患者における、又は疾患の患者の疾患の進行の様々な段階における所与の遺伝子の発現において少なくとも約１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍の差があるときに、存在すると考えられる。
【００７１】
ＲＮＡ転写物に関する「過剰発現」なる用語は、検体において検出される全ての又はｍＲＮＡの参照セットであり得る、参照ｍＲＮＡのレベルに対する正規化によって決定される転写物のレベルを意味するために使用される。
【００７２】
「遺伝子増幅」なる語句は、遺伝子又は遺伝子断片の複数コピーが特定の細胞又は細胞株中で形成される過程を意味する。複製領域（増幅ＤＮＡの伸展）はしばしば「アンプリコン（増幅産物）」と称される。通常、生産されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量、つまり遺伝子発現のレベルは、発現した特定の遺伝子から作製されたコピー数の割合でまた増加する。
【００７３】
一般に、「マーカー」又は「バイオマーカー」なる用語は、その遺伝がモニタできる制限酵素認識部位又は遺伝子のような染色体上の同定可能な物理的位置を意味する。マーカーは「遺伝子発現マーカー」と称される遺伝子の発現領域、又は既知のコードディング機能のないＤＮＡのあるセグメントでありうる。ここで使用される「ＩＢＤマーカー」は表１に挙げられた遺伝子を意味する。
【００７４】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に相補鎖がその融点より低い環境で存在する場合における変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間の所望のホモロジーの度合いが高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をよりストリンジェントにするが、低い温度はストリンジェンシーを低下させる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの更なる詳細及び説明は、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
【００７５】
ここに定義される「ストリンジェントな条件」又は「高いストリンジェントな条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃で０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いる；（２）ハイブリダイゼーションの間にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃で７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含むｐＨ６．５の０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファーによる５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドを用いる；又は（３）０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、５０％ホルムアミド中での４２℃での洗浄とその後の５５℃でのＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高いストリンジェンシーの洗浄を伴う、４２℃での５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸を用いる。
【００７６】
「中程度のストリンジェントな条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Press, 1989に記載されているようにして同定され、上述のものよりストリンジェンシーが低い洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度のストリンジェントな条件の一例は、３７℃で、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハード液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液での終夜にわたるインキュベーションと、それに続く３７−５０℃で１×ＳＳＣでのフィルターの洗浄である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかが分かるであろう。
【００７７】
本発明の文脈において、任意の特定の遺伝子セットに列挙された遺伝子の「少なくとも１つ」、「少なくとも２つ」、「少なくとも５つ」等の標記は、列挙された遺伝子の何れか一つ又は任意のかつ全ての組合せを意味する。
【００７８】
「スプライシング」及び「ＲＮＡスプライシング」なる用語は交換可能に使用され、イントロンを除去し、エキソンを結合させて、真核生物細胞の細胞質中に移動する連続したコード化配列を有する成熟ｍＲＮＡを生産するＲＮＡプロセシングを意味する。
【００７９】
理論的には、「エキソン」なる用語は、成熟ＲＮＡ産物に提示される介在遺伝子の任意のセグメントを意味する(B. Lewin. Genes IV Cell Press, Cambridge Mass. 1990)。理論的には、「イントロン」なる用語は、転写されているがその何れかの側のエキソンを共にスプライシングすることによって転写物内から除去されるＤＮＡの任意のセグメントを意味する。作用的には、エキソン配列は参照配列番号によって定義される遺伝子のｍＲＮＡ配列で生じる。作用的には、イントロン配列は、エキソン配列によって一括されその５’及び３’境界にＧＴ及びＡＧスプライスコンセンサス配列を有する遺伝子のゲノムＤＮＡ内の介在配列である。
「干渉ＲＮＡ」又は「低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）」は、標的遺伝子の発現を低減させる通常は約３０ヌクレオチド長未満の二本鎖ＲＮＡ分子である。干渉ＲＮＡは既知の方法を使用して同定し合成することができ（Shi Y., Trends in Genetics 19(1):9-12 (2003)、国際公開第２００３０５６０１２号及び国際公開第２００３０６４６２１号）、ｓｉＲＮＡライブラリは例えば Dharmacon, Lafayette, Coloradoから商業的に入手できる。
【００８０】
「天然配列」ポリペプチドは、天然に生じる又は対立遺伝子変異体を含む天然由来のポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するものである。かかる天然配列ポリペプチドは天然から単離することができ、又は組換え又は合成手段によって生産されうる。よって、天然配列ポリペプチドは、天然に生じるヒトポリペプチド、マウスポリペプチド、又は任意の他の哺乳動物種由来のポリペプチドのアミノ酸配列を有しうる。
【００８１】
ここでの「抗体」なる用語は最も広義に使用され、特にモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及びそれらが所望の生物活性を示す限り抗体断片を包含する。本発明はここに開示されたＩＢＤマーカーの一又は複数に対する抗体を特に考慮する。かかる抗体は「抗ＩＢＤマーカー抗体」と称されうる。
【００８２】
ここで使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す、すなわち、その集団を構成する個々の抗体が、モノクローナル抗体の生産中に生じ得、一般には少量で存在しうる可能な変異体を除いて、同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。かかるモノクローナル抗体には典型的には標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体が含まれ、ここで、標的結合ポリペプチド配列は複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選択することを含む方法によって得られた。
【００８３】
ここに記載のモノクローナル抗体は、特に、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種から由来するか、特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一か相同である一方、鎖の残りが、他の種から由来するか、他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一か相同である「キメラ」抗体、並びにそれらが所望の生物活性を示す限りはその抗体の断片を含む（米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)）。ここで興味のあるキメラ抗体は、非ヒト霊長類（例えば旧世界ザル、類人猿等）由来の可変ドメイン抗原結合配列及びヒト定常領域配列を含む「プリマタイズ」抗体、並びに「ヒト化」抗体を含む。
【００８４】
非ヒト（例えば齧歯類）抗体の「ヒト化」型とは、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小配列を含むキメラ抗体である。大部分では、ヒト化抗体はレシピエントの高頻度可変領域由来の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）の高頻度可変領域由来の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。
【００８５】
ここでの「インタクトな抗体」は二つの抗原結合領域とＦｃ領域を含むものである。好ましくは、インタクトな抗体は機能性Ｆｃ領域を有する。
【００８６】
「抗体断片」は、好ましくはその抗原結合領域を含む、インタクトな抗体の一部を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２及びＦｖ断片；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
【００８７】
「天然抗体」は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖からなる約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド架橋を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン（ＶＨ）を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を、他端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
【００８８】
「可変」なる用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つの高頻度可変領域により連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲをそれぞれ含んでいる。各鎖の高頻度可変領域は、ＦＲ領域に近接して結合され、他の鎖の高頻度可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabat等, Sequence of Proteins ofImmunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, BEthesda, MD(1991)を参照)。
【００８９】
ここで使用される場合の「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」なる用語は、配列において高頻度可変であり、及び／又は構造的に定まったループを形成する抗体可変ドメインの領域を意味する。一般に、抗体は６つのＨＶＲを含む；つまり、ＶＨに３つ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、ＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）である。天然の抗体では、Ｈ３及びＬ３は６つのＨＶＲの最大の多様性を示し、特にＨ３は抗体に微細な特異性を付与するのに独特の役割を果たすと考えられている。例えばXu等, Immunity 13:37-45 (2000)；Johnson及びWu, Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo編, Human Press, Totowa, NJ, 2003)を参照。確かに、重鎖のみからなる天然に生じるラクダ抗体は軽鎖の不存在下で機能的で安定である。例えば、Hamers-Casterman等, Nature 363:446-448 (1993)及びSheriff等, Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)を参照。
【００９０】
多数の高頻度可変領域の描写が使用され、ここに包含される。カバット相補性決定領域(ＣＤＲ)は配列変化に基づいており、最も一般的に使用されている(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。Chothiaは、代わりに構造的ループの位置に言及している(Chothia及びLesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。ＡｂＭ高頻度可変領域は、カバット高頻度可変領域とChothia構造的ループの間の妥協を表し、Oxford MolecularのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用される。「接触」高頻度可変領域は、利用できる複合体結晶構造の分析に基づく。これらの高頻度可変領域のそれぞれからの残基を以下に示す。
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高頻度可変領域は次の通り「伸展高頻度可変領域」を含みうる：ＶＬ中に２４−３６又は２４−３４（Ｌ１）、４６−５６又は５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７又は８９−９６（Ｌ３）と、ＶＨ中の２６−３５（Ｈ１）、５０−６５又は４９−６５（Ｈ２）及び９３−１０２、９４−１０２、又は９５−１０２（Ｈ３）。これらの定義の各々に対して上掲のKabat等に従って、可変ドメイン残基を番号付けした。
【００９１】
「カバットに記載の可変ドメイン残基番号付け」又は「カバットに記載のアミノ酸位置番号付け」なる表現、及びそれらの変異形は、上掲のカバット等における、抗体の収集の重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインに使用される番号付けシステムを意味する。この番号付けシステムを用いると、実際の線状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＨＶＲの短縮又はＦＲ又はＨＶＲへの挿入に対応するより少ない又は更なるアミノ酸を含有しうる。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一アミノ酸挿入（カバットによる残基５２ａ）、及び重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入残基（例えばカバットによる残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃ等）を含みうる。残基のカバット番号付けは、「標準の」カバット番号配列を有する抗体の配列の相同領域でのアラインメントにより、任意の抗体に対して決定され得る。
【００９２】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、各々が単一の抗原結合部位と、名前が容易に結晶化するその能力を反映する残留「Ｆｃ」断片を有する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を持ち、抗原になお架橋できるＦ(ａｂ')２断片を生じる。
【００９３】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、強固な非共有結合の一つの重鎖と一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。各可変ドメインの３つの高頻度可変領域が相互作用してＶＨ-ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を形成するのはこの構造においてである。集団的には、６つの高頻度可変領域が抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つの高頻度可変領域だけを含んでなるＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりは低い親和性でではあるが、抗原を認識しそれに結合する能力を有している。
【００９４】
Ｆａｂ断片は軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）をまた含んでいる。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に２，３の残基が付加される点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’-ＳＨは、ここでは、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも一つの遊離チオール基を担持しているＦａｂ’についての標記である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、その間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片対として元々は生産された。抗体断片の他の化学的カップリングもまた知られている。
【００９５】
任意の脊椎動物種由来の抗体の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる二つの明確に区別される型の一つに割り当てられることができる。
【００９６】
ここでの「Ｆｃ領域」なる用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化するかも知れないが、通常、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６の位置又はＰｒｏ２３０からそのカルボキシル末端までの位置のアミノ酸残基から伸長すると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン(ＥＵ番号付けシステムによれば残基４４７)は、例えば抗体の産生又は精製中に、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組換え的に操作することによって、取り除かれてもよい。従って、インタクトな抗体の組成物は、全てのＫ４４７残基が除去された抗体群、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体群、及びＫ４４７残基を有する抗体と有さない抗体の混合を含む抗体群を含みうる。
【００９７】
別の定義が示されていないならば、ここでは、免疫グロブリン重鎖における残基の番号付けは、出典明示によりここに明示的に援用されるKabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)におけるようなＥＵインデクスのものである。「カバットにおけるようなＥＵインデクス」はヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号付けを意味する。
【００９８】
「天然配列Ｆｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然配列のヒトＦｃ領域には、天然配列のヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域(非Ａ-及びＡ-アロタイプ)；天然配列のヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域；天然配列のヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域；及び天然配列のヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域；並びにその自然に生じる変異体が含まれる。
【００９９】
「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも一のアミノ酸修飾、好ましくは一又は複数のアミノ酸置換により、天然配列のＦｃ領域とは異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、変異体Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域もしくは親ポリペプチドのＦｃ領域と比較した場合、少なくとも一のアミノ酸置換、例えば、天然配列のＦｃ領域又は親のポリペプチドのＦＣ領域に約１から約１０のアミノ酸置換、好ましくは約１から約５のアミノ酸置換を有する。ここでの変異体Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域と好ましくは少なくとも約８０％の相同性を有し、最も好ましくは少なくとも約９０％の相同性を、より好ましくは少なくとも約９５％の相同性を有するであろう。
【０１００】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、インタクトな抗体は異なる「クラス」に分類できる。インタクトな抗体の五つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、それらの幾つかは更に「サブクラス」(アイソタイプ)、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３，ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分類される。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び３次元構造はよく知られている。    
【０１０１】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にするポリペプチドリンカーをＶＨ及びＶＬドメイン間に更に含む。ｓｃＦｖの概説については、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照のこと。
【０１０２】
「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持ち、その断片が同一のポリペプチド鎖（ＶＨ-ＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む抗体断片を指す。非常に短いために同一鎖上で二つのドメイン間での対形成を可能にするリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディは、例えば欧州特許出願公開第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；及びHudson等, Nat. Med. 9:129-134 (2003)；及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)に更に十分に記載されている。  
【０１０３】
「ネイキッド抗体」は、小分子又は放射標識等の異種分子にコンジュゲートされていない抗体である。
【０１０４】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、その抗体の研究、診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれうる。好ましい実施態様では、抗体は、（１）ローリー法で測定して９５重量％抗体を越えるまで、最も好ましくは９９重量％を越えるまで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端又は内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、（３）クーマシーブルー又は好ましくは銀染色を用いた還元又は非還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一になるまで、精製される。単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一つの精製工程により調製される。
【０１０５】
「親和性成熟」抗体とは、その変更を有しない親抗体と比較し、抗原に対する抗体の親和性に改善を生じせしめる抗体の一又は複数の高頻度可変領域における一又は複数の変更を伴っている抗体である。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル又はピコモルさえの親和性を有する。親和性成熟抗体は、当該分野において知られている手順を使用して生産される。Marks等 Bio/Technology, 10:779-783(1992)は、ＶＨ及びＶＬドメインシャッフリングによる親和性成熟について記載している。ＨＶＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、Barbas等, Proc Nat Acad. Sci, USA 91: 3809-3813(1994)；Schier 等, Gene, 169:147-155(1995)；Yelton等, J. Immunol., 155:1994-2004(1995)；Jackson等, J. Immunol., 154(7):3310-9(1995)；及びHawkins等, J. Mol. Biol., 226:889-896(1992)に記載されている。
【０１０６】
ここでの「アミノ酸配列変異体」抗体は、主な種抗体と異なるアミノ酸配列を有する抗体である。通常、アミノ酸配列変異体は、主な種抗体と少なくとも約７０％の相同性を有し、好ましくは、それらは主な種抗体と少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％の相同性である。アミノ酸配列変異体は、主な種抗体のアミノ酸配列内の、又は主な種抗体のアミノ酸配列に隣接した、所定の位置で置換、欠失及び／又は付加を有する。ここでのアミノ酸配列変異体の例には、酸性変異体(例えば脱アミド化された抗体変異体)、塩基性変異体、抗体の一又は二の軽鎖上にアミノ末端リーダー伸展(例えばＶＨＳ-)を有する抗体、抗体の一又は二の重鎖上にＣ末端リジン残基を有する抗体などが含まれ、重鎖及び／又は軽鎖のアミノ酸配列に対する変異体の組合せが含まれる。ここで特に興味のある抗体変異体は、抗体の一又は二の軽鎖上にアミノ末端リーダー伸展を含み、場合によっては主な種抗体に対して他のアミノ酸配列及び／又はグリコシル化の相違を更に含んでなる抗体である。
【０１０７】
ここでの「グリコシル化変異体」抗体は、主な種抗体に結合した一又は複数の炭水化物部分と異なる一又は複数のそれに結合した炭水化物部分を有する抗体である。ここでのグリコシル化変異体の例には、そのＦｃ領域に接着した、Ｇ０オリゴ糖構造の代わりにＧ１又はＧ２オリゴ糖構造を有する抗体、その一又は二の軽鎖に結合した一又は二の炭水化物部分を有する抗体、抗体の一又は二の重鎖に結合した炭水化物がない抗体等、及びグリコシル化変異の組合せを有する抗体が含まれる。
【０１０８】
抗体がＦｃ領域を有する場合、オリゴ糖構造は、例えば残基２９９（残基のＥｕ番号付けでは２９８）で、抗体の一又は二の重鎖に結合していてもよい。パーツズマブでは、Ｇ０が主要なオリゴ糖構造で、例えばＧ０-Ｆ、Ｇ-１、Ｍａｎ５、Ｍａｎ６、Ｇ１-１、Ｇ１（１-６）、Ｇ１（１-３）及びＧ２のような他のオリゴ糖構造はパーツズマブ組成物中により少量で見出される。特に明記しない限り、ここでの「Ｇ１オリゴ糖構造」は、Ｇ-１、Ｇ１-１、Ｇ１（１-６）及びＧ１（１-３）構造を含む。
【０１０９】
ここでの「アミノ末端リーダー伸展」は、抗体の何れか一又は複数の重鎖又は軽鎖のアミノ末端に存在するアミノ末端リーダー配列の一又は複数のアミノ酸残基を指す。例示的なアミノ末端リーダー伸展は、抗体変異体の一方又は両方の軽鎖に存在する３つのアミノ酸残基、ＶＨＳを含むか又はこれらからなる。
【０１１０】
「脱アミド化」抗体は、その一又は複数のアスパラギン残基が、例えばアスパラギン酸、スクシンイミド又はイソ-アスパラギン酸に誘導体化されているものである。
【０１１１】
Ｂ．１  本発明の一般的説明
本発明の実施には、別段の記載がない限り、当業者の技量の範囲内にある分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、及び生化学の一般的な技術を使用する。かかる技術は、例えば“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, ２版 (Sambrook等, 1989)；“Oligonucleotide Synthesis” (M. J. Gait編, 1984)；“Animal Cell Culture” (R. I. Freshney編, 1987)；“Methods in Enzymology” (Academic Press, Inc.)；“Handbook of Experimental Immunology”, 4版(D.M. Weir及びC.C. Blackwell編, Blackwell Science Inc., 1987)；“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells”(J.M. Miller及びM.P. Calos編, 1987)；“Current Protocols in Molecular Biology”(F. M. Ausubel等編, 1987)；及び“PCR:  The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis等編, 1994)のような文献に十分に説明されている。  
【０１１２】
上で検討されたように、ＩＢＤの検出又は診断は、患者に観察される多くの変量に依存する様々な分類システムによって現在は達成されている。本発明は、ＩＢＤに関連する遺伝子の同定に基づく。従って、かかる遺伝子の発現レベルは、ＩＢＤの患者を同定するための診断マーカーとなりうる。実施例に記載されているように、ＩＢＤ患者における多くの遺伝子の発現差異が観察されている。よって、本発明によれば、表１に列挙された遺伝子はＩＢＤで異なって発現されるものとして同定されている。
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【０１１３】
ａ．本発明のバイオマーカー
本発明は表１に列挙されたＩＢＤに対する数多くの遺伝子発現マーカー又はバイオマーカーを提供する。本発明の一実施態様では、バイオマーカーは（ここに記載の）マーカーパネルでの使用に適している。かかるパネルは、表１からの一又は複数のマーカーからの一又は複数のマーカーを含みうる。当業者であれば、ここに記載のパネルで使用するのに適した表１からのバイオマーカーの様々な組合せが分かるであろう。
【０１１４】
表１の遺伝子は、正常及び病気の被験体における任意の遺伝子の発現間に、又は病気の被験体における病気の進行の様々な段階において、少なくとも約１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、又は少なくとも約１０倍の違いがある時に異なって発現されると考えられる。
本発明の一実施態様では、マイクロアレイ分析によって同定されるＩＢＤマーカーの好ましい一組は、ＩＢＤにおいて上方制御されるマーカーを含む。好ましくは、上方制御されるマーカーの該一組は、ＡＴＧ１２、ＡＴＧ１６Ｌ２及びＬＣ３Ｂ（オートファジー経路の調節因子）を含む。
【０１１５】
下方制御されるマーカーの好ましい一組は、免疫関連遺伝子ＩＲＴＡ１-新規の表面Ｂ細胞受容体、ＣＣＬ２３、ＣＸＣＬ１３、及びＡＴＧ１６Ｌ１、ＡＴＧ４Ｄ；及びＡＴＧ３を含むオートファジー経路の調整因子を含む。ＩＲＴＡ１は、ＦＣＲＨ４；ＩＧＦＰ２；ＩＲＴＡ１；ＭＧＣ１５０５２２；  ＭＧＣ１５０５２３；ｄＪ８０１Ｇ２２．１；ＦＣＲＬ４としても知られる。ＣＣＬ２３は、ＣＫｂ８；ＭＩＰ３；Ｃｋｂ-８；ＭＩＰ-３；ＭＰＩＦ-１；ＳＣＹＡ２３；Ｃｋｂ-８-１；ＣＫ-ＢＥＴＡ-８；ＣＣＬ２３としても知られる。ＣＸＣＬ１３は、ＢＬＣ；ＢＣＡ１；ＡＮＧＩＥ；ＢＣＡ-１；ＢＬＲ１Ｌ；ＡＮＧＩＥ２；ＳＣＹＢ１３；ＣＸＣＬ１３としても知られる。ＡＴＧ１６Ｌ１は、ＩＢＤ１０；ＷＤＲ３０；ＡＰＧ１６Ｌ；ＡＴＧ１６Ｌ；ＦＬＪ０００４５；ＦＬＪ１００３５；ＦＬＪ１０８２８；ＦＬＪ２２６７７；ＡＴＧ１６Ｌ１としても知られる。ＡＴＧ４Ｄは、ＡＰＧ４Ｄ；ＡＵＴＬ４；ＡＰＧ４-Ｄ；ＡＴＧ４Ｄとしても知られる。ＡＴＧ３は、ＡＰＧ３；ＡＰＧ３Ｌ；ＰＣ３-９６；ＦＬＪ２２１２５；ＭＧＣ１５２０１；ＡＰＧ３-ＬＩＫＥ；ＤＫＦＺｐ５６４Ｍ１１７８；ＡＴＧ３としても知られる。ＡＴＧ１２は、ＡＰＧ１２；ＦＢＲ９３；ＡＰＧ１２Ｌ；ＨＡＰＧ１２；ＡＴＧ１２としても知られる。ＡＴＧ１６Ｌ２は、ＷＤＲ８０；ＦＬＪ０００１２；ＡＴＧ１６Ｌ２としても知られる。ＬＣ３Ｂは、ＬＣ３Ｂ；ＭＡＰ１Ａ／１ＢＬＣ３；ＭＡＰ１ＬＣ３Ｂとしても知られる。ここで記載されるバイオマーカーのパネルは、これらのマーカーの一つ、一以上、又は全てを含み得る。パネルはＣＣＬ２３を含み得る。または、パネルはオートファジー経路の調整因子に該当する少なくとも一つのマーカーを含み得る。パネルは、一又は複数のＩＲＴＡ１、ＣＣＬ２３及びＣＸＣＬ１３を更に含み得る。
【０１１６】
バイオマーカーのパネルは、表１のマーカーの一又は複数又は全てに加えて図２４、２５、２６又は２７から少なくとも一つのマーカーを含みうる。パネルは、全て図２４、２５、２６又は２７から少なくとも一つのマーカーを含みうる。
【０１１７】
上に提供された一覧表のメンバーは、単一のマーカーとして又は任意の組合せで、本発明の予後及び診断アッセイに使用するのに好ましい。本発明のＩＢＤマーカーは異なるように発現された遺伝子又は遺伝子の領域である。哺乳動物被験体からの試験試料中のコントロールに対する一又は複数のマーカーの発現のレベル差は、以下に更に詳細に記載する方法の一又は複数によって検出されるＲＮＡ転写物又は発現産物のレベルから決定することができる。
【０１１８】
正常細胞及びＩＢＤの哺乳動物被験体からの細胞におけるＲＮＡ転写物の発現差異のエビデンスに基づいて、本発明はＩＢＤのための遺伝子マーカーを提供する。本発明によってもたらされるＩＢＤマーカーと関連した情報によって、医師はより賢明な処置の決定をなし、個々の患者の必要性に対してＩＢＤの治療をあつらえ、それによって治療の恩恵を最大にし、有意な恩恵を提供せず毒性の副作用による深刻な危険性をしばしばもたらす不要な治療に患者を暴露することを最小にする。
【０１１９】
多重分析物遺伝子発現試験は、幾つかの関連する生理プロセス又は成分細胞性特性の各々に関与する一又は複数の遺伝子の発現レベルを測定することができる。ある例では、試験の予測力と従ってその有用性は、個々の遺伝子の発現値よりも結果に高度に相関するスコアを計算するために個々の遺伝子に対して得られた発現値を使用することによって改善できる。例えば、エストロゲン受容体陽性でリンパ節陰性の乳癌の再発の可能性を予測する定量スコア（再発スコア）の計算は米国特許出願公開第２００５００４８５４２号に記載されている。そのような再発スコアを計算するために使用される等式は再発スコアの予測値を最大にするために遺伝子をグループ化する場合がある。遺伝子のグループ化は、上で検討されたような生理機能又は成分細胞性特性へのその寄与の知識に少なくとも部分的に基づいて実施されうる。グループの形成はまた様々な発現値の再発スコアに対する寄与の数学的重み付けを容易にしうる。生理学的プロセス又は成分細胞性特性を表す遺伝子群の重み付けは、ＩＢＤの病理及び臨床的結果に対するそのプロセス又は特性の寄与を反映しうる。従って、重要な態様では、本発明はまた併せて個々の遺伝子又は同定された遺伝子のランダムな組合せよりも更に信頼性があり強力な結果の予測指標であるここで同定される遺伝子の特定の群を提供する。
【０１２０】
また、再発スコアの決定に基づいて、再発スコアの特定の値で患者をサブグループに分割するよう選択することができ、ここで、与えられた範囲に値を有する全ての患者を特定のリスクグループに属するものとして分類できる。よって、選択される値がそれぞれより大なる又は小なるリスクを持つ患者のサブグループを定めるであろう。
【０１２１】
ＩＢＤの発症又は進行の予測における遺伝子マーカーの有用性はそのマーカーに独特なものでなくともよい。特定の試験マーカーと非常に類似した発現パターンを有する代替マーカーを試験マーカーに置換するか又は試験マーカーに加えて使用することができ、試験の全体的な予測上の有用性に影響は殆どない。二つの遺伝子の非常に類似した発現パターンは、特定のプロセスにあり、及び／又は共通の調節コントロール下にある双方の遺伝子の関連から生じうる。本発明は、本発明の方法でのそのような代替遺伝子又は遺伝子セットの使用を含み、また考える。
【０１２２】
ＩＢＤの発症及び／又は進行を予測する本発明によって提供されるマーカー及び関連情報はまたＩＢＤの患者の治療のための薬剤化合物の効能を試験する臨床治験に含める患者をスクリーニングする際に有用性を有している。
【０１２３】
ＩＢＤの存在、発症及び／又は進行を予測する本発明によって提供されるマーカー及び関連情報は、ＩＢＤ治療が適切かどうかを決定するための基準として有用である。例えば、試験の結果が、ＩＢＤマーカーがコントロール試料に対して個体からの試験試料で異なって発現されることを示している場合、ＩＢＤ治療が適切でありうる。個体は、ＩＢＤであることが知られていない個体、ＩＢＤであることが知られている個体、ＩＢＤであると過去に診断されＩＢＤの治療を受けている個体、又はＩＢＤであると過去に診断されＩＢＤに立ち向かうために手術をした個体でありうる。また、本発明はＩＢＤを治療する方法を考える。以下に記載のように、本発明の診断方法は、一又は複数のＩＢＤマーカーの発現差異がコントロールに対して観察された試験試料を提供した哺乳動物被験体にＩＢＤ治療剤を投与する工程を更に含みうる。かかる治療方法はよって（ａ）哺乳動物被験体におけるＩＢＤの存在を決定し、（ｂ）哺乳動物被験体にＩＢＤ治療剤を投与することを含む。
【０１２４】
他の実施態様では、ＩＢＤマーカー及び関連する情報は、遺伝子の転写物又はその発現産物のレベル又は活性を調節する試薬を設計し又は製造するために使用される。上記試薬には、限定しないが、アンチセンスＲＮＡ、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リボザイム、モノクローナル又はポリクローナル抗体が含まれうる。更なる実施態様では、上記遺伝子又はその転写物、又はより特定的には上記転写物の発現産物は薬剤化合物を同定する（スクリーニング）アッセイにおいて使用され、ここで、上記薬剤化合物はＩＢＤを治療するための薬剤の開発において使用される。
【０１２５】
本発明の様々な実施態様では、以下に記載される様々な技術的アプローチ法が、開示された遺伝子の発現レベルの決定に利用できる。特定の実施態様では、各遺伝子の発現レベルは、エキソン、イントロン、タンパク質エピトープ及びタンパク質活性を含む遺伝子の発現産物の様々な特徴に関して決定されうる。他の実施態様では、遺伝子の発現レベルは、遺伝子の構造の解析から、例えば遺伝子のプロモーターのメチル化パターンの解析から推量されうる。
【０１２６】
ｂ．発明の診断方法
本発明はＩＢＤマーカーの発現差異に基づき哺乳動物被験体におけるＩＢＤを検出又は診断する方法を提供する。一実施態様では、該方法は上で検討されたＩＢＤマーカーのパネルの使用を含む。パネルは表１から選択される一又は複数のＩＢＤマーカーを含みうる。他の一実施態様では、パネルは、ＡＴＧ１６Ｌ１及び表１から選択された更なる１つのＩＢＤマーカーを含む。
【０１２７】
ある実施態様では、ＩＢＤマーカーのパネルは、少なくとも１のＩＢＤマーカー、少なくとも２のＩＢＤマーカー、少なくとも３のＩＢＤマーカー、少なくとも４のＩＢＤマーカー、少なくとも５のＩＢＤマーカー、少なくとも６のＩＢＤマーカー、少なくとも７のＩＢＤマーカー、少なくとも８のＩＢＤマーカー、少なくとも９のＩＢＤマーカーを含む。一実施態様では、パネルは５の増分でマーカーを含む。別の実施態様では、パネルは１０の増分でマーカーを含む。該パネルは、コントロールに対してＩＢＤにおいて過剰発現されるＩＢＤマーカー、コントロールに対してＩＢＤにおいて過少発現されるＩＢＤマーカー、又はコントロールに対してＩＢＤにおいて過剰発現及び過少発現の双方が生じるＩＢＤマーカーを含みうる。好ましい実施態様では、該パネルは、ＣＤにおいて上方制御された一又は複数のマーカーと、ＣＤにおいて下方制御された一又は複数のマーカーを含む。
【０１２８】
他の実施態様では、本発明のパネルは、コントロールに対して活動的ＩＢＤにおいて過剰発現されるＩＢＤマーカー、コントロールに対して活動的ＩＢＤにおいて過少発現されるＩＢＤマーカー、又はコントロールに対して活動的ＩＢＤにおいて過剰発現及び過少発現の双方が生じるＩＢＤマーカーを含みうる。他の実施態様では、本発明のパネルは、コントロールに対して非活動的ＩＢＤにおいて過剰発現されるＩＢＤマーカー、コントロールに対して非活動的ＩＢＤにおいて過少発現されるＩＢＤマーカー、又はコントロールに対して非活動的ＩＢＤにおいて過剰発現及び過少発現の双方が生じるＩＢＤマーカーを含みうる。好ましい実施態様では、活動的ＩＢＤはＣＤである。他の好ましい実施態様では、非活動的ＩＢＤはＣＤである。
【０１２９】
好ましい実施態様では、哺乳動物被験体においてＩＢＤの存在を診断又は検出する方法は、被験体から得られた試験試料中のＩＢＤマーカーのパネルからのＲＮＡ転写物又はその発現産物の、コントロールにおける発現レベルに対する発現レベル差を決定することを含み、ここで、発現レベルの差が、試験試料が得られた被験体におけるＩＢＤの存在を示している。試験試料中の発現差異は、ここで検討されたようにコントロールに対して高い及び／又は低いものでありうる。
【０１３０】
コントロールに対して、患者から得られた生物学的試料中における、上記リストに提供された遺伝子、又は対応するＲＮＡ分子又はコード化タンパク質の一又は複数の発現又は活性の差が患者におけるＩＢＤの存在を示している。コントロールは、例えば、ＩＢＤ患者において上方制御（又は下方制御）されることが知られている同じ細胞中に存在する遺伝子（ポジティブコントロール）でありうる。あるいは、又は加えて、コントロールは、同じ細胞型の正常細胞中の同じ遺伝子（ネガティブコントロール）の発現レベルでありうる。発現レベルは、例えばグリセルアルデヒド-３-ホスフェート-デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）及び／又はβ-アクチンのようなハウスキーピング遺伝子の発現レベルに、あるいは試験された試料中の全ての遺伝子の発現レベルに正規化することがまたできる。一実施態様では、上述の遺伝子の一又は複数の発現は、それが例えば同じ型の他の試料と比較して中央値以上ならばポジティブな発現と見なされる。中央値発現レベルは遺伝子発現の測定と本質的に同時に決定することができるか、又は予め決定されうる。これら及び他の方法は当該分野でよく知られており、当業者には明らかである。
【０１３１】
ＩＢＤ患者を同定するための方法がここに提供される。この患者集団のうち、ＩＢＤの患者は、患者から得られた細胞を含む生物学的試料中における遺伝子、対応するＲＮＡ分子又はコード化タンパク質の一又は複数の発現レベルを決定することによって同定することができる。生物学的試料は、例えばここに記載された組織生検でありうる。
【０１３２】
本発明の方法は、ＩＢＤ診断アッセイ及びイメージング方法に関する。一実施態様では、アッセイは、ここに記載された抗体を使用して実施される。本発明はまたタンパク質の検出及び定量のために有用な様々な免疫学的アッセイを提供する。これらのアッセイは、限定しないが、様々なタイプのラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光アッセイ（ＥＬＩＦＡ）等を含む当該分野でよく知られた様々な免疫学的アッセイ様式で実施される。また、限定しないが、標識された抗体を使用する放射シンチグラフィーイメージング法を含むここに記載された分子の発現によって特徴付けられるＩＢＤを検出可能な免疫学的なイメージング法がまた本発明によって提供される。かかるアッセイは、ここに記載された一又は複数の分子の発現によって特徴付けられるＩＢＤの検出、モニター、診断及び予後に臨床的に有用である。
【０１３３】
本発明の他の態様は、ここに記載された分子を発現する細胞を同定するための方法に関する。ここに記載の分子の発現プロファイルは、それをＩＢＤに対する診断マーカーにする。従って、分子の発現の状態は、疾患の進行段階の罹患率、進行速度、及び／又は活動的ＩＢＤ又は非活動的ＩＢＤにおける徴候の突然且つ深刻な発症、つまり突然の再発を含む様々な因子を予測するのに有用な情報を提供する。
【０１３４】
一実施態様では、本発明はＩＢＤを検出する方法を提供する。哺乳動物被験体からの試験試料と既知の正常な哺乳動物からのコントロール試料がそれぞれ抗ＩＢＤマーカー抗体又はその断片に接触させられる。ＩＢＤマーカーの発現レベルが測定され、コントロール試料に対する試験試料中の発現レベルの差が、試験試料が得られた哺乳動物被験体におけるＩＢＤを示すものである。ある実施態様では、試験試料中におけるＩＢＤマーカー発現のレベルは、コントロールにおける発現のレベルよりも高いことが決定され、高い発現レベルが、試験試料が得られた被験体におけるＩＢＤの存在を示す。他の実施態様では、試験試料中におけるＩＢＤマーカー発現のレベルは、コントロールにおける発現のレベルよりも低いことが決定され、低い発現レベルが、試験試料が得られた被験体におけるＩＢＤの存在を示す。
【０１３５】
他の実施態様では、本発明の方法によって検出されるＩＢＤは、哺乳動物被験体におけるＩＢＤの再発又は突然の再発である。
【０１３６】
好ましい実施態様では、該方法は、薬剤療法又は外科手術ようなＩＢＤの治療を受けたＩＢＤと過去に決定された哺乳動物被験体においてＩＢＤの突然の再発又はＩＢＤの再発を検出するために用いられる。ＩＢＤの最初の検出後に、更なる試験試料を、ＩＢＤとなっていることが見出された哺乳動物被験体から得てもよい。更なる試料は、最初の試料が取られた後、数時間後、数日後、数週間後、又は数ヶ月後に得ることができる。当業者であれば、第二、第三、第四、第五、第六等の試験試料を含みうるかかる更なる試料を得るために適切なスケジュールは分かるであろう。最初の試験試料と更なる試料（及び代わりにここに記載されたコントロール試料）が抗ＩＢＤマーカー抗体と接触させられる。ＩＢＤマーカーの発現レベルを測定し、最初の試験試料と比較した更なる試験試料中の発現レベルの差が、試験試料が得られた哺乳動物被験体におけるＩＢＤの突然の再発又は再発を示すものである。
【０１３７】
一態様では、本発明の方法は決定工程に関する。一実施態様では、決定工程は、コントロールに対しての試験試料中の一又は複数のＩＢＤマーカーの発現レベルを測定することを含む。典型的には、ここに記載されたように、ＩＢＤマーカーの発現レベルの測定は、ここに記載された技術の一又は複数を実施することにより、コントロールに対してＩＢＤマーカーの発現差異について試験試料を分析することを含む。試験試料とコントロールから得られた発現レベルデータを、発現レベル差について比較する。他の実施態様では、決定工程は、試験試料が得られた被験体にＩＢＤが存在しているかどうかを評価するための試験試料及びコントロール発現データの検査を更に含む。
【０１３８】
本発明の方法は、ＩＢＤマーカーを検出するための有益な手段である。バイオマーカー発現又はタンパク質レベルの測定は、適切なプロセッサにより実行されるソフトウエアプログラムを用いて実行され得る。適切なソフトウェア及びプロセッサは、公知技術であり市販されている。プログラムは、プロセッサに関連付けられたＣＤ-ＲＯＭ、フロッピーディスク、ハードディスク、ＤＶＤ又はメモリのような有形媒体に格納されるソフトウェアにおいて具体化され得るが、当業者は、全プログラム又はそれらの一部があるいは、プロセッサ以外の装置によって実行、及び／又はファームウェア及び／又は専用ハードウエアにおいて周知の方法で具体化されることを容易に理解するだろう。
【０１３９】
一又は複数のＩＢＤマーカーの測定の後、アッセイの結果、所見、診断、予測及び／又は治療推奨が、典型的には記録され、例えば技術者、医師及び／又は患者に伝えられる。ある実施態様では、例えば患者及び／又は主治医等の関係者にかかる情報を伝えるために、コンピュータが使用される。幾つかの実施態様では、結果又は診断が伝えられる国又は管轄区域とは異なる国又は管轄区域で、アッセイが実施され又はアッセイ結果が解析される。
【０１４０】
診断を容易にするために、一又は複数のＩＢＤマーカーのレベルは表示装置に表示されることが出来、電気的に、又は限定するものではないが中でもＶＣＲ、ＣＤ-ＲＯＭ、ＤＶＤ-ＲＯＭ、ＵＳＢフラッシュメディアによって読取り可能なもの等のアナログテープ等の機械が読取り可能な媒体に収められる。このような機械読取り可能媒体はまた、例えば制限するものではないが、臨床パラメータ及び一般的な実験リスクファクタ等の更なる試験結果を含むことが出来る。あるいは又は加えて、機械読取り可能媒体は、病歴及び何れかの関連家族歴等の被験体情報を含んでもよい。
【０１４１】
本発明の方法は、商業的な診断目的のために実践される時は一般的に、ここに記載される一又は複数のバイオマーカーの正規化レベルのレポート又はまとめを作成する。本発明の方法は、患者及びＩＢＤに関する一又は複数の予測を含んで成るレポートを作成する。
【０１４２】
本発明の方法及び報告は、レポートをデータベースに格納することを更に含むことができる。あるいは、方法は更に、被験体についてデータベースに記録を作り、データを追加することが出来る。一実施態様では、レポートは紙のレポートであり、別の実施態様では、レポートは聴覚性レポートであり、別の実施態様では、レポートは電子記録である。レポートが医師及び／又は患者に提供されることが考えられる。レポートの受領は、データ及び報告を含むサーバコンピュータへのネットワーク接続の樹立、及びサーバコンピュータからデータ及びレポートを要求することを更に含むことができる。本発明によって提供される方法は、また、全てにおいて又は部分的に自動化され得る。
【０１４３】
幾つかの実施態様では、決定工程は、（ｉ）試験試料及びコントロールにおけるＩＢＤマーカー発現の異なるレベルを測定する；及び／又は（ｉｉ）試験試料及びコントロールにおけるＩＢＤマーカー発現の異なるレベルの測定から得られたデータを分析する目的のために適切なプロセッサによって実行されるソフトウエアプログラムの使用を含む。適切なソフトウェア及びプロセッサは、公知技術であり市販されている。プログラムは、プロセッサに関連付けられたＣＤ-ＲＯＭ、フロッピーディスク、ハードディスク、ＤＶＤ又はメモリのような有形媒体に格納されるソフトウェアにおいて具体化され得るが、当業者は、全プログラム又はそれらの一部があるいは、プロセッサ以外の装置によって実行、及び／又はファームウェア及び／又は専用ハードウエアにおいて周知の方法で具体化されることを容易に理解するだろう。
【０１４４】
決定工程後、測定結果、所見、診断、予想及び／又は推奨治療が典型的には記録され、例えば技師、医師及び／又は患者に伝えられる。ある実施態様では、コンピュータを使用して、患者及び／又は担当医師のような関係者にそのような情報を伝える。ある実施態様では、結果又は診断が伝えられる国又は管轄区域とは異なる国又は管轄区域で、アッセイが実施され又はアッセイ結果が解析される。
【０１４５】
好ましい実施態様では、ここでのＩＢＤマーカーの一又は複数を有する被験体において測定されたここに開示された一又は複数のＩＢＤマーカーの発現レベルに基づく診断、予測及び／又は推奨治療は、アッセイが完了し、診断及び／又は予測が作成された後に出来るだけ早く被験体に伝えられうる。結果及び／又は関連情報は、被験体を治療する医師によって被験体に伝えられうる。あるいは、結果は、書面、伝達の電子形態、例えば電子メール、又は電話を含む任意の伝達手段によって被験体に直接伝えることができる。伝達は、電子メール通信の場合におけるように、コンピュータの使用により容易にすることができる。ある実施態様では、診断試験の結果及び／又は導かれた結論及び／又は試験に基づく治療の推奨を含む伝達が作成され、テレコミュニケーションの熟練した技術者にはよく知られているコンピュータハードウェア及びソフトウェアの組合せを使用して被験体に自動的に配信されうる。ヘルスケア向けのコミュニケーションシステムの一例は米国特許第６２８３７６１号に記載されている；しかしながら、本発明はこの特定のコミュニケーションシステムを利用する方法に限られるものではない。本発明の方法のある実施態様では、試料のアッセイ、疾患の診断、及びアッセイ結果又は診断の伝達を含む方法工程の全て又は一部が異なった（例えば外国の）管轄区域で実施されうる。
【０１４６】
本発明は、限定しないが、上行結腸組織、下行結腸組織、Ｓ状結腸組織、及び回腸末端組織を含む胃腸管に関連した組織におけるＩＢＤマーカーの発現差異と血清、精液、骨、前立腺、尿、細胞調製物等のような他の生物学的試料における発現も検出するためのアッセイを提供する。ＩＢＤマーカーの発現差異を検出するための方法はまたよく知られており、例えば免疫沈降、免疫組織化学分析、ウェスタンブロット分析、分子結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＦＡ等を含む。例えば、生物学的試料中のＩＢＤマーカーの発現差異を検出する方法は、最初に試料を抗ＩＢＤマーカー抗体、そのＩＢＤマーカー反応性断片、又は抗ＩＢＤマーカー抗体の抗原結合領域を含む組換えタンパク質に接触させ；ついで試料中のＩＢＤマーカータンパク質の結合を検出することを含む。
【０１４７】
本発明の様々な実施態様では、限定しないが、ＲＴ-ＰＣＲ、マイクロアレイ、遺伝子発現の連続解析（ＳＡＧＥ）及びMassively Parallel Signature Sequencing（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現解析（以下に詳細に検討する）を含む様々な技術的アプローチ法が、開示された遺伝子の発現レベルの決定に利用できる。特定の実施態様では、各遺伝子の発現レベルは、エキソン、イントロン、タンパク質エピトープ及びタンパク質活性を含む遺伝子の発現産物の様々な特徴に関連して決定れうる。他の実施態様では、遺伝子の発現レベルは、遺伝子の構造解析から、例えば遺伝子プロモータのメチル化パターンの解析から推定されうる。
【０１４８】
一実施態様では、本発明は、被験体から得られた試験試料において、表１のポリペプチドをコードする核酸の発現のレベルが、コントロールにおける発現のレベルに対して異なることを決定することによって哺乳類動物被験体におけるＩＢＤの存在を診断する方法を提供し、異なる発現のレベルは、試験試料が得られた被験体におけるＩＢＤの存在を示す。
【０１４９】
ここに記載される方法において、決定工程は、哺乳類動物被験体から試験試料を得る工程によって先行されうる。決定工程は、また、哺乳類動物被験体からの試験試料を、異なる発現のレベルの検出のための薬剤と接触させる工程によって先行されうる。
【０１５０】
別の実施態様では、本発明は、被験体から得られた試験試料において、表１のポリペプチドをコードする核酸の発現のレベルが、コントロールにおける発現のレベルに対して異なることを決定することによって、哺乳類動物被験体のＩＢＤ関連炎症の度合いを診断する方法を提供し、異なる発現のレベルは試験試料が得られた被験体におけるＩＢＤ関連炎症の度合いを示す。別の実施態様では、決定工程は、哺乳類動物被験体から試験試料を得る工程によって先行されうる。一他の実施態様では、決定工程は、また、哺乳類動物被験体からの試験試料を、異なる発現のレベルの検出のための薬剤と接触させる工程によって先行されうる。
【０１５１】
ｃ．本発明の治療方法
本発明は、ここに記載の診断方法によって哺乳動物被験体におけるＩＢＤの存在を検出し、ついで該哺乳動物被験体にＩＢＤ治療剤を投与することを含む治療を必要とする被験体においてＩＢＤを治療する方法を提供する。当業者であれば、本発明での使用に適しているであろう様々なＩＢＤ治療剤を把握できる（その全体を出典明示によりここに援用するSt Clair Jones, Hospital Pharmacist, May 2006, Vol. 13; pages 161-166を参照）。本発明は治療を必要とする被験体に一又は複数のＩＢＤ治療剤が投与されるＩＢＤの治療方法を考慮する。一実施態様では、ＩＢＤ治療剤は、アミノサリチル酸、副腎皮質ステロイド、及び免疫抑制剤の一又は複数である。好ましい実施態様では、アミノサリチル酸は、スルファサラジン、オルサラジン、メサラミン、バルサラジド、及びアサコールの一つである。他の好ましい実施態様では、例えばスルファサラジンとオルサラジンの組合せのような複数のアミノサリチル酸類が同時投与される。他の好ましい実施態様では、副腎皮質ステロイドは、ブデソニド、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、６-メルカプトプリン（６-ＭＰ）、アザチオプリン、メトトレキセート、及びシクロスポリンでありうる。他の好ましい実施態様では、ＩＢＤ治療剤は抗生物質、例えばシプロフロキサシン及び／又はメトロニダゾール；又は抗体ベースの薬剤、例えばインフリキシマブ  （レミケード（登録商標））でありうる。
【０１５２】
患者が典型的に治療される毒性が最小のＩＢＤ治療剤はアミノサリチル酸類である。典型的には一日４回投与されるスルファサラジン（アザルフィジン）は、スルファピリジンにアゾ結合によって結合されるアミノサリチル酸（５-ＡＳＡ）の活性分子からなる。結腸中の嫌気性菌がアゾ結合を分裂させて活性な５-ＡＳＡを放出する。しかしながら、少なくとも２０％の患者は、可逆性精子異常、胃腸障害又はスルファ成分に対するアレルギー反応のような顕著な副作用が伴うため、スルファピリジンに耐えることができない。これらの副作用はオルサラジンを摂る患者では低減される。しかしながら、スルファサラジンもオルサラジンも何れも小腸炎症の治療に効果的ではない。小腸に放出される５-ＡＳＡの他の製剤（例えばメサラミン及びアサコール）が開発されている。通常は、５-ＡＳＡ治療法が十分な効能を示すのに６−８週かかる。５-ＡＳＡ治療法に応答しない患者又はより重篤な疾患を持つ患者には、副腎皮質ステロイド類が処方される。しかしながら、これは、短期の治療法であり、維持療法として使用することはできない。臨床的寛解が副腎皮質ステロイドを用いて２−４週内で達成されるが、副作用が顕著であり、クッシングゴールドフェース(Cushing goldface)、顔ひげ、深刻な気分変動及び不眠を含む。スルファサラジン及び５-アミノサリチル酸調製物への応答はＣＤでは乏しく、初期の潰瘍性大腸炎ではまずまずから中程度で、重篤なＵＣでは乏しい。これらの薬剤が失敗した場合、強力な免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、プレドニゾン、６-メルカプトプリン又はアザチオプリン（肝臓において６-メルカプトプリンに転換）が典型的には試される。ＣＤの患者に対しては、副腎皮質ステロイド類及び他の免疫抑制剤の使用は、この疾患にありふれた瘻孔及び膿瘍に由来する腹部内敗血症の高いリスクのため、注意深くモニターされなければならない。およそ２５％のＩＢＤ患者が疾患の過程で手術（結腸切除術）を必要とする。
【０１５３】
ＩＢＤの治療は、限定しないが、腸切除術、吻合術、結腸切除術、直腸結腸切除術、及び造瘻術、又はその任意の組合せを含む外科手技を含みうる。
【０１５４】
薬学的医薬及び手術に加えて、栄養療法のようなＩＢＤに対する非常套的な治療法もまた試みられている。例えば、Ｆｌｅｘｉｃａｌ（登録商標）という半成分的処方物が、ステロイドのプレドニゾロンと同じ効果を有することが示されている。Sanderson等、Arch. Dis. Child. 51:123-7 (1987)。しかしながら、半成分的処方物は比較的高価であり、通常は好まれず、その使用は制限されている。タンパク質全体を導入する栄養療法はまたＩＢＤの症状を軽減するために試みられてきた。Giafer等、Lancet 335:816-9 (1990)。米国特許第５４６１０３３号には、牛乳から単離された酸性カゼイン及びＴＧＦ-２の使用が開示されている。Beattie等, Aliment. Pharmacol. Ther. 8:1-6 (1994)には、ＩＢＤの子供の幼児期の処方にカゼインを使用する方法が開示されている。米国特許第５９５２２９５号には、ＩＢＤの治療用の腸溶性製剤にカゼインを使用する方法が開示されている。しかしながら、栄養療法は、非毒性ではあるが対症療法に過ぎず、疾病の根源にある原因を治療することはできない。
【０１５５】
本発明は、例えばインビトロ、エキソビボ及びインビボ治療法を含むＩＢＤ治療方法を考慮している。本発明は、増加した及び／又は減少したＩＢＤマーカーの発現のようなここに開示された一又は複数のＩＢＤマーカーの発現を伴う被験体においてＩＢＤ疾患状態を検出した際に、治療を必要とする被験体におけるＩＢＤを治療するための有用な方法を提供する。好ましい一実施態様では、該方法は、（ａ）該被験体から得られた試験試料において、（ｉ）表１から選択された一又は複数のポリペプチドをコードする一又は複数の核酸；又は（ｉｉ）表１に列挙された一又は複数の遺伝子のＲＮＡ転写物又はその発現産物の、発現レベルが、コントロールにおける発現レベルに対して高い、及び／又は低いことを決定し、上記発現の高い及び／又は低いレベルが、試験試料が得られた被験体におけるＩＢＤの存在を示しており；（ｂ）上記被験体に有効量のＩＢＤ治療剤を投与することを含む。決定工程（ａ）は多重ＩＢＤマーカーの発現の測定を含みうる。
【０１５６】
該治療方法はＩＢＤを検出し、かかる治療を必要とする被験体に有効量のＩＢＤ治療剤を投与することを含む。ある実施態様では、ＩＢＤ疾患状態には、一又は複数のＩＢＤマーカーの発現の増加及び／又は減少が伴う。
【０１５７】
一態様では、本発明は、ＩＢＤを治療又は予防するための方法を提供し、該方法は、被験体におけるＩＢＤの存在を検出し、被験体に有効量のＩＢＤ治療剤を投与することを含む。ここで検討されるようにアミノサリチル酸類、副腎皮質ステロイド類、及び免疫抑制剤を含む任意の適切なＩＢＤ治療剤を治療方法において使用することができる。
【０１５８】
ここでの方法の何れにおいても、ここで検討された単一のＩＢＤ治療剤と共に、被験体又は患者に、治療を必要とする被験体の症状を治療することができる他の活性剤である有効量の第二の医薬（ここでの単一のＩＢＤ治療剤が第一の医薬である）を投与することができる。例えば、アミノサリチル酸は、副腎皮質ステロイド、免疫抑制剤、又は他のアミノサリチル酸と同時投与されうる。かかる第二医薬のタイプは、ＩＢＤのタイプ、その重篤度、患者の状態及び年齢、用いた第一医薬のタイプと用量等を含む様々な因子に依存する。
【０１５９】
第一医薬と第二医薬を使用するかかる治療は、併用投与（二以上の薬剤が同じ又は別個の製剤に含まれる）、及び第一医薬の投与が第二医薬の投与の前、及び／又は次に生じうる別個の投与を含む。一般に、かかる第二医薬は、第一医薬が投与された後、４８時間以内に、又は２４時間以内に、又は１２時間以内に、又は第一医薬後３−１２時間以内に投与され得、あるいは、好ましくは約１から２日、約２から３日、約３から４日、約４から５日、約５から６日、又は６から７日である予め選択された時間にわたって投与されうる。  
【０１６０】
第一及び第二医薬は、同時に、連続的に、又は第一及び第二医薬を交互に、又は他の治療法で応答性がない場合に投与することができる。よって、第二医薬の併用投与は、別個の製剤又は単一の薬学的製剤を使用する同時投与（同時的投与）と、好ましくは双方の（又は全ての）医薬が同時にその生物学的活性を作用させる間には時間間隔がある何れかの順の連続投与を含む。これらの第二医薬は全て第一医薬と互いに又はそれら自体と併用されて使用され得、よって、ここで使用される「第二医薬」という表現はそれが第一医薬とは別の唯一の医薬であることは意味していない。従って、第二医薬は一つの医薬である必要はなく、一を越えるかかる医薬を構成し又は含みうる。ここで記載するこれら第二医薬は、一般に第一医薬と同じ投薬量及び投与経路で、又は第一医薬の投薬量のおよそ１から９９％で使用される。かかる第二医薬が仮に使用される場合、好ましくは、それらは、それらによって引き起こされる副作用を除去し又は減少させるため、第一医薬が存在していない場合よりも低い量で、特に第一医薬での初期投薬量を越えた続く投薬量で使用される。
【０１６１】
本発明の方法がＩＢＤを治療又は予防するために一又は複数のＩＢＤ治療剤を投与することを含む場合、ＩＢＤを治療又は予防するためにまた実施される外科手技と投与工程を結合することが特に望ましい場合がある。本発明によって考えられるＩＢＤ外科手技は、限定しないが、腸切除術, 吻合術、結腸切除術、直腸結腸切除術、及び造瘻術、又はその任意の組合せを含む。例えば、ここに記載されたＩＢＤ治療剤は、例えばＩＢＤの治療における治療スキームにおいて結腸切除術と組み合わせることができる。かかる併用療法は、ＩＢＤ治療剤の投与が外科手技の前、及び／又は後に生じうる別個の投与を含む。
【０１６２】
一又は複数のＩＢＤ治療剤の組合せ、又は一又は複数の治療剤とここに記載の外科手技の組合せでの治療は、好ましくはＩＢＤの徴候又は症状の改善を生じる。例えば、かかる治療法は、ＩＢＤの病理の重篤性の減少によって裏付けられるように、ＩＢＤ治療剤治療計画と外科手技を受ける被験体に改善を生じうる。
【０１６３】
ＩＢＤ治療剤は、非経口、皮下、 腹腔内、肺内、及び鼻腔内を含む任意の適切な手段によって投与され、局所治療が望まれるならば、病巣内投与される。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与を含む。投薬は、投与が短期か慢性的かどうかに部分的に依存して、任意の適した経路、例えば静脈内又は皮下注射のような注射によってなされうる。
【０１６４】
本発明の方法に従って投与されるＩＢＤ治療剤は、良好な医療実務に一致した態様で製剤され、用量決定され、投与される。この点において考慮される因子には、治療されている特定の疾患、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療実務者に知られている他の因子が含まれる。第一医薬はその必要はないが、場合によってはここに記載された一又は複数の更なる医薬（例えば第二、第三、第四等の医薬）と共に製剤化される。かかる更なる医薬の有効量は、製剤中に存在する第一医薬の量、疾患又は治療のタイプ、及び上で検討した他の因子に依存する。これらは一般にこれまで使用したものと同じ投薬量及び投薬経路で使用され、又はこれまで用いられた投薬量のおよそ１から９９％で用いられる。
【０１６５】
ＩＢＤの予防又は治療のために、（単独で又は他の薬剤との併用で使用される場合）ＩＢＤ治療剤の適切な投薬量は、治療される疾患のタイプ、ＩＢＤ治療剤のタイプ、疾患の重篤度及び経過、ＩＢＤ治療剤が予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、患者の臨床病歴及びＩＢＤ治療剤に対する応答性、及び担当医師の裁量に依存する。ＩＢＤ治療剤は一度に又は一連の治療にわたって適切に患者に投与される。疾患のタイプ及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ(例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ)のＩＢＤ治療剤が、例えば一又は複数の分割投与でも又は連続注入でも、患者投与の初期候補用量である。ある典型的な１日投薬量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であるかもしれない。症状に応じて、数日間以上にわたる繰り返し投与は、疾患症状の所望の抑制が得られるまで持続される。ＩＢＤ治療剤の例示的な一投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。よって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ（又は任意のその組合せ）を患者に投与することができる。このような用量は、間欠的、例えば毎週又は３週ごとに投与されうる（例えば患者に約２から約２０、例えば約６用量のＩＢＤ治療剤が投与されるように)。初期のより高い負荷投与量の後、一又は複数のより低い用量が投与されうる。例示的用量療法は、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷投与量の後、約２ｍｇ／ｋｇのＩＢＤ治療剤の毎週の維持用量を投与することを含む。しかしながら、他の投与計画も有用であり得る。この治療法の進行は、常套的な技術及びアッセイによって容易にモニターされる。
【０１６６】
Ｂ．２．  遺伝子発現プロファイリング
一般に、遺伝子発現プロファイリングの方法は、二つの大きなグループに分けることができる：ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション解析に基づく方法と、生化学的検出又はポリヌクレオチドの配列決定に基づく他の方法である。試料中のｍＲＮＡ発現を定量化するために当該分野で最も広く用いられている方法には、ノーザンブロット及びインサイツハイブリダイゼーション（Parker及びBarnes, Methods in Molecular Biology 106: 247-283(1999)；ＲＮＡｓｅ保護アッセイ（Hod, Biotechniques 13: 852-854(1992)；及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ-ＰＣＲ）（Weis等, Trends in Genetics 8: 263-264(1992)）が含まれる。あるいは、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、及びＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド二重鎖又はＤＮＡ-タンパク質二重鎖を含む特定の二重鎖を認識できる抗体を用いてもよい。ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を決定するための様々な方法には、限定されないが、遺伝子発現プロファイリング、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ-ＰＣＲ）を含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、例えばアフィメトリックス・ジーンチップ技術を用いるなど、製造者のプロトコルに従って市販の装置によって実施することができるマイクロアレイ解析、連続遺伝子発現解析（ＳＡＧＥ）（Velculescu等, Science 270:484-487 (1995)；及びVelculescu等, Cell 88:243-51 (1997)）、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ，Massively Parallel Signature Sequencing (MPSS)による遺伝子発現解析（Brenner等, Nature Biotechnology 18:630-634 (2000)）、プロテオミクス、免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）等が含まれる。好ましくは、ｍＲＮＡが定量される。かかるｍＲＮＡ解析は、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の技術を使用して、又はマイクロアレイ解析によって実施される。ＰＣＲが用いられる場合、ＰＣＲの好ましい形態は定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ-ＰＣＲ）である。
【０１６７】
ａ．逆転写ＰＣＲ（ＲＴ-ＰＣＲ）
上に列挙した技術のうち、最も感度が良く最も柔軟性がある定量法はＲＴ-ＰＣＲであり、これは、正常及び試験試料中の異なった試料集団におけるｍＲＮＡレベルを比較し、遺伝子発現のパターンを特徴付けし、密接に関連したｍＲＮＡ間を識別し、ＲＮＡ構造を解析するために使用することができる。
【０１６８】
第一工程は標的試料からのｍＲＮＡの単離である。出発材料は典型的には結腸組織生検から単離された全ＲＮＡである。よって、ＲＮＡは、限定されないが、回腸末端、上行結腸、下行結腸、及びＳ状結腸を含む様々な組織から単離することができる。また、生検が得られる結腸組織は、炎症及び／又は非炎症結腸領域由来でありうる。
【０１６９】
一実施態様では、ｍＲＮＡは、左結腸又は右結腸から得られた生検である上で定義された生検から得られる。ここで使用される場合、「左結腸」はＳ状結腸及び直腸Ｓ状結腸を意味し、「右結腸」は盲腸を意味する。
【０１７０】
ｍＲＮＡ抽出に関する一般的方法は当該分野で良く知られており、Ausubel等, Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997)を含む分子生物学の標準的教科書に開示されている。特に、ＲＮＡの単離は、Ｑｉａｇｅｎ等の商業的製造者の精製キット、バッファーセット及びプロテアーゼを、製造者の指示書に従って使用することで実施することができる。組織試料からの全ＲＮＡは、ＲＮＡ Ｓｔａｔ-６０（Ｔｅｌ-Ｔｅｓｔ）を使用して単離できる。生検から調製したＲＮＡは、例えば、塩化セシウム密度勾配遠心分離によって単離できる。
【０１７１】
ＲＮＡはＰＣＲのテンプレートとならないので、ＲＴ-ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリングの最初のステップはＲＮＡテンプレートのｃＤＮＡへの逆転写と、それに続くＰＣＲ反応でのそれの指数関数的な増幅である。２つの最も広く用いられている逆転写酵素はトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ-ＲＴ）及びモロニーマウス白血球ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ-ＲＴ）である。逆転写段階は、典型的には、発現プロファイリングの環境及び目的に依存し、特異的プライマー、ランダムヘキサマー、又はオリゴ-ｄＴプライマーを使用してプライムされる。例えば、製造者指示書に従い、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＲＮＡ ＰＣＲキット（Perkin Elmer, CA, USA）を使用して抽出ＲＮＡを逆転写することができる。誘導したｃＤＮＡは、ついで、後のＰＣＲ反応のテンプレートとして使用できる。
【０１７２】
ＰＣＲ工程では、様々な熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用することができるが、典型的には、５’-３’ヌクレアーゼ活性を有するが３’-５’プルーフリーディングエンドヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いる。よって、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲでは、典型的には、Ｔａｑ又はＴｔｈポリメラーゼの５’-ヌクレアーゼ活性を用いて、その標的アンプリコンに結合したハイブリダイゼーションプローブを加水分解するが、５’ヌクレアーゼ活性と同等の任意の酵素を用いることができる。ＰＣＲ反応にとって典型的なアンプリコンを生成するために２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。三番目のオリゴヌクレオチド、又はプローブを、２つのＰＣＲプライマーの間に位置するヌクレオチド配列を検出するために設計する。該プローブは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって伸長せず、レポーター蛍光色素及び消光蛍光色素で標識される。このレポーター色素のどんなレーザー誘導放射も、プローブ上でこの２つの色素が近接して位置している場合には、消光色素によって消光する。増幅反応の間、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、テンプレートに依存する形でプローブを切断する。生じたプローブ断片は溶液中で解離し、放出されたレポーター色素からのシグナルは、二番目のフルオロフォアの消光効果とは無関係である。新しい分子が合成される度にレポーター色素の１分子が遊離させられ、消光しないレポーター色素の検出がデータの定量的な解釈の基礎を提供する。
【０１７３】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＴ-ＰＣＲは、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＺＭ ７７００（商品名）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（商品名）（Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）、又はＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany）等の商業的に入手可能な装置を使用しておこなうことができる。好ましい実施態様では、５' ヌクレアーゼ手法は、ＡＢＩ ＰＲＩＺＭ ７７００（商品名）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（商品名）等のリアルタイム定量ＰＣＲ装置ですすめられる。該システムは、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）、カメラ及びコンピューターからなる。該システムでは、サーモサイクラー上の９６-ウェルフォーマットで試料を増幅する。増幅の間、９６ウェル全てに関する光ファイバーケーブルを通してレーザー励起した蛍光シグナルがリアルタイムで収集され、ＣＣＤカメラで検出される。該システムは、装置を作動し、データを分析するソフトウェアを含む。
【０１７４】
５'-ヌクレアーゼアッセイのデータは、Ｃｔ又は閾値サイクルとして最初に表される。上で検討したように、蛍光値は毎サイクルの間に記録され、増幅反応においてそのポイントまでに増幅した産物の量を表す。蛍光シグナルが統計的に有意であるとして最初に記録されたポイントが閾値サイクル（Ｃｔ）である。
【０１７５】
エラー及び試料と試料間の変化による効果を最小限にするために、通常は内部標準を使用してＲＴ-ＰＣＲを実施する。理想的な内部標準は、異なる組織間では一定のレベルで発現し、実験上の処理によって影響を受けない。遺伝子発現のパターンを正規化するために最も頻繁に使用されているＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド-３-リン酸-デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）及びβ-アクチンのｍＲＮＡである。
【０１７６】
ＲＴ-ＰＣＲ技術のより最近の変形例は、二重標識蛍光発生プローブ（つまり、TaqMan（登録商標）プローブ）によってＰＣＲ産物の蓄積を測定するリアルタイム定量的ＰＣＲである。リアルタイムＰＣＲは、各標的配列に対する内部競合体が正規化のために使用される定量的競合ＰＣＲと、試料内に含まれる正規化遺伝子、又はＲＴ-ＰＣＲのためのハウスキーピング遺伝子を使用する定量的比較ＰＣＲの双方に匹敵する。更なる詳細については、例えばHeld等, Genome Research 6:986-994 (1996)を参照のこと。
【０１７７】
本発明の一態様によれば、増幅される遺伝子中に存在するイントロン配列に基づいてＰＣＲプライマー及びプローブが設計される。この実施態様では、プライマー／プローブ設計の第一工程は遺伝子内のイントロン配列の 描写である。これは、公に入手可能なソフトウェア、例えばKent, W.J., Genome Res. 12(4):656-64 (2002)によって開発されたＤＮＡ ＢＬＡＴソフトウェア、あるいはその変形形を含むＢＬＡＳＴソフトウェアによって行うことができる。ＰＣＲプライマー及びプローブ設計の十分に確立された方法が次の工程として続く。
【０１７８】
非特異的シグナルを避けるために、プライマーとプローブを設計する場合、イントロン内において反復配列をマスクすることが重要である。これは、反復エレメントのライブラリに対してＤＮＡ配列をスクリーニングし、反復エレメントがマスクされる問い合わせ配列を返すベイラー医科大学からオンラインで入手可能なＲｅｐｅａｔ Ｍａｓｋｅｒプログラムを使用して容易に達成することができる。ついで、マスクされたイントロン配列を使用し、例えばＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ(Applied Biosystems)；ＭＧＢアッセイ-バイ-デザイン(Applied Biosystems)；プライマー３(Steve Rozen及びHelen J. Skaletsky (2000) Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In: Krawetz S, Misener S編 Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386)のような任意の商業的に又は他の好適に入手できるプライマー／プローブ設計パッケージを使用して、プライマー及びプローブ配列を設計することができる。
【０１７９】
ＰＣＲプライマー設計で考慮される最も重要な因子は、プライマー長、融解温度（Ｔｍ）、及びＧ／Ｃ含有量、特異性、相補的プライマー配列、及び３’末端配列を含む。一般に、最適なＰＣＲプライマーは、一般に１７−３０塩基長であり、約２０−８０％、例えば約５０−６０％のＧ＋Ｃ塩基を含む。５０から８０℃の間、例えば約５０から７０℃のＴｍが典型的には好ましい。
【０１８０】
ＰＣＲプライマー及びプローブ設計のための更なる指針については、その開示全体が出典明示によりここに明示的に援用される例えばDieffenbach, C.W.等, “General Concepts for PCR Primer Design” in: PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1995, pp. 133-155；Innis 及びGelfand, “Optimization of PCRs” in: PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, CRC Press, London, 1994, pp. 5-11；及びPlasterer, T.N. Primerselect: Primer and probe design. Methods Mol. Biol. 70:520-527 (1997)を参照のこと。
【０１８１】
更なるＰＣＲベース技術は、例えば、ディファレンシャルディスプレイ(Liang及びPardee, Science 257:967-971 (1992))；増幅断片長多型（ｉＡＦＬＰ）(Kawamoto 等, Genome Res. 12:1305-1312 (1999))；ＢｅａｄＡｒｒａｙ（登録商標）技術 (Illumina, San Diego, CA;  Oliphant 等, Discovery of Markers for Disease  (Supplement to Biotechniques), June 2002；Ferguson等, Analytical Chemistry 72:5618 (2000))；遺伝子発現のための迅速なアッセイで市販のＬｕｍｉｎｅｘ１００ ＬａｂＭＡＰシステム及び多重カラーコードミクロスフィアを使用する遺伝子発現の検出のためのＢｅａｄｓＡｒｒａｙ（ＢＡＤＧＥ）(Luminex Corp., Austin, TX)(Yang等, Genome Res. 11:1888-1898 (2001))；及び高適用範囲の発現プロファイリング（ＨｉＣＥＰ）解析(Fukumura等, Nucl. Acids. Res. 31(16) e94 (2003))を含む。
【０１８２】
ｂ．マイクロアレイ
ディファレンシャル遺伝子発現も、マイクロアレイ技術を用いて同定し、又は確かめることができる。よって、ＩＢＤ関連遺伝子の発現プロファイルを、マイクロアレイ技術を使用して新鮮組織又はパラフィン包埋組織の何れかで測定することができる。この方法では、興味あるポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ及びオリゴヌクレオチドを含む）をマイクロチップ基板上にプレートし、整列させる。ついで、この整列させた配列を、興味ある細胞又は組織からの特異的ＤＮＡプローブでハイブリダイズする。丁度ＲＴ-ＰＣＲ法のように、ｍＲＮＡのソースは、典型的にはＩＢＤの患者から得られた細胞由来の生検組織又は細胞株、及び対応する正常な組織又は細胞株からの全ＲＮＡである。よって、様々な結腸組織又は結腸組織由来細胞株からＲＮＡを単離することができる。
【０１８３】
マイクロアレイ技術の特定の実施態様では、ｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅挿入部分を高密度アレイの基板へ塗布する。好ましくは、少なくとも１００００のヌクレオチド配列を基板へ塗布する。それぞれ１００００エレメントがマイクロチップ上に固定化された、マイクロアレイ遺伝子は、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションに適している。蛍光標識ｃＤＮＡプローブは、興味ある組織から抽出したＲＮＡの逆転写によって蛍光ヌクレオチドを取り込むことで作製できる。チップへ塗布した標識ｃＤＮＡプローブは、アレイ上の各スポットのＤＮＡと特異性をもってハイブリダイズする。非特異的に結合したプローブを除くためにストリンジェントに洗浄した後、チップを共焦点レーザー顕微鏡によって又はＣＣＤカメラのような他の検出法によってスキャンする。各整列したエレメントのハイブリダイゼーションの定量化によって、対応するｍＲＮＡ発生量の評価が可能となる。二色蛍光によって、２つのソースのＲＮＡから作製した別々の標識ｃＤＮＡプローブを２つ１組でアレイへハイブリダイズする。従って、各特定の遺伝子に対応する２つのソースからの転写物の相対発生量が、同時に決定される。小型化したハイブリダイゼーションのスケールによって、非常に多くの遺伝子に関する発現パターンの簡便で迅速な評価が可能となる。このような方法が、細胞当たり少しのコピーが発現する希な転写物の検出するため、また発現レベルにおける少なくともおよそ２倍の違いを再現可能に検出するために必要とされる感度を有していることが示されている（Schena等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(20): 106-49(1996)）。マイクロアレイ解析は、製造者のプロトコルに従って、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎＣｈｉｐ技術、又はＩｎｃｙｔｅのマイクロアレイ技術、又はＡｇｉｌｅｎｔの全ヒトゲノムマイクロアレイ技術を使用することによって、市販の装置によって実施することができる。
【０１８４】
ｃ．遺伝子発現連続解析（ＳＡＧＥ）
遺伝子発現連続解析（ＳＡＧＥ）は、各転写物に対して個々のハイブリダイゼーションプローブを提供することを要せず、多数の遺伝子転写物の同時の定量解析を可能にせしめる方法である。先ず、タグが各転写物内の独特の位置から得られるとの前提で、転写物をユニークに同定するのに十分な情報を含む短い配列タグ（約１０−１４ｂｐ）が生成される。ついで、多くの転写物を互いに結合させて長い連続の分子を形成し、これを配列決定して、複数タグの同一性を同時に明らかにすることができる。転写物の任意の集団の発現パターンは、個々のタグの存在量を決定し、各タグに対応する遺伝子を同定することによって定量的に評価することができる。更なる詳細については、例えばVelculescu等, Science 270:484-487 (1995)；及びVelculescu等, Cell 88:243-51 (1997)を参照のこと。
【０１８５】
ｄ．ＭａｓｓＡＲＲＡＹ技術
ＲＮＡの単離及び逆転写の後に、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ社(San Diego, CA)によって開発されたＭａｓｓＡＲＲＡＹベースの遺伝子発現プロファイリング法では、得られたｃＤＮＡに、単一の塩基を除く全ての位置で標的ｃＤＮＡ領域に一致し内部標準となる合成ＤＮＡ分子（競合体）が添加される。ｃＤＮＡ／競合体混合物をＰＣＲ増幅し、これにＰＣＲ後エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）酵素処理を施し、残りのヌクレオチドの脱リン酸化を生じせしめる。アルカリホスファターゼの不活化後、競合体及びｃＤＮＡからのＰＣＲ産物にプライマー伸長を施し、これが競合体及びｃＤＮＡ駆動ＰＣＲ産物の区別される質量シグナルを生成する。精製後、これらの産物をチップアレイ上に分配し、これを、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ）での解析に必要なコンポーネントと共に前負荷する。ついで、反応物中に存在するｃＤＮＡを、生成された質量スペクトルにおけるピーク面積の比を解析することによって定量する。更なる詳細については、例えばDing及びCantor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:3059-3064 (2003)を参照のこと。
【０１８６】
ｅ．Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現解析
Brenner 等, Nature Biotechnology 18:630-634 (2000)によって記載されたこの方法は、非ゲルベースのサイン配列決定を、別個の５ｍｍ径のマイクロビーズでの何百万のテンプレートのインビトロクローニングと組み合わせる配列決定アプローチである。先ず、ＤＮＡテンプレートのマイクロビーズライブラリがインビトロクローニングによって構築される。これに、高密度(典型的には３×１０６マイクロビーズ／ｃｍ２より多い）でのフローセル中のテンプレート含有マイクロビーズの平面状アレイのアセンブリが続く。各マイクロビーズ上のクローン化テンプレートの遊離端を、ＤＮＡ断片分離を必要としない蛍光ベースのサイン配列決定法を使用して、同時に分析する。この方法は、酵母ｃＤＮＡライブラリから何十万ものサイン配列を単一の操作で同時にかつ精確に提供することが示されている。
【０１８７】
ｍＲＮＡ単離、精製、プライマー伸長及び増幅を含むＲＮＡ源として固定したパラフィン包埋組織を使用する遺伝子発現をプロファイリングするための代表的なプロトコルの工程は、様々な刊行されたジャーナル記事（例えば、Godfrey等 J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000)；Specht等, Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001)）に与えられている。簡単に述べると、代表的な方法は、パラフィン包埋組織試料の約１０ミリグラム厚の切片を切り取ることで始まる。ついで、ｍＲＮＡが抽出され、タンパク質とＤＮＡが取り除かれる。ｍＲＮＡ抽出に関する一般的方法は当該分野でよく知られており、Ausubel等, Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997)を含む分子生物学の標準的な教科書に開示されている。パラフィン包埋組織からのＲＮＡ抽出法は、例えば、Rupp及びLocker, Lab Invest. 56:A67 (1987)、及びDe Andres等, BioTechniques 18:42044 (1995)に開示されている。特に、ＲＮＡの単離は、Ｑｉａｇｅｎ等の商業的製造者の精製キット、バッファーセット及びプロテアーゼを、製造者の指示書に従って使用することで実施することができる。例えば、培養している細胞からの全ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙミニカラムを使用して単離することができる。他の市販のＲＮＡ単離キットは、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅａ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＤＮＡ及びＲＮＡ精製キット(EPICENTREO, Madison, WI)、及びパラフィンブロックＲＮＡ単離キット(Ambion, Inc.)を含む。組織試料からの全ＲＮＡは、ＲＮＡ Ｓｔａｔ-６０（Ｔｅｌ-Ｔｅｓｔ）を使用して単離できる。組織から調製したＲＮＡは、例えば、塩化セシウム密度勾配遠心分離によって単離できる。ＲＮＡ濃度の分析後、必要ならば、ＲＮＡ修復及び／又は増幅工程を含めることができ、ＲＮＡは、ＰＣＲの前に、遺伝子特異的プロモーターを使用して逆転写される。好ましくは、各標的配列に対する内部競合体が正規化のために使用される定量的競合ＰＣＲと、試料内に含まれる正規化遺伝子、又はＲＴ-ＰＣＲのためのハウスキーピング遺伝子を使用する定量的比較ＰＣＲの双方に匹敵するリアルタイムＰＣＲが使用される。 更なる詳細については、例えば“PCR:  The Polymerase Chain Reaction”, Mullis等編, 1994；及びHeld等, Genome Research 6:986-994 (1996)を参照のこと。最後に、データを解析して、検査した試料中に同定された特徴的な遺伝子発現パターンに基づいて患者が利用できる最善の治療選択肢を同定する。
【０１８８】
ｆ．免疫組織化学
免疫組織化学法はまた本発明のＩＢＤマーカーの発現レベルを検出するのに適している。よって、抗体又は抗血清、好ましくはポリクローナル抗血清、最も好ましくは各マーカーに特異的なモノクローナル抗体が発現の検出に使用される。抗体は、例えば、放射標識、蛍光標識、例えばビオチン等のハプテン標識、又は西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼのような酵素によって、検出することができる。あるいは、未標識一次抗体が、抗血清、ポリクローナル抗血清又は一次抗体に特異的なモノクローナル抗体を含む、標識二次抗体との関連で使用される。免疫組織化学プロトコル及びキットは当該分野でよく知られており、商業的に入手可能である。
【０１８９】
発現レベルはまた例えば様々なタイプのイムノアッセイ又はプロテオミクス技術を使用して、タンパク質レベルで決定することができる。
【０１９０】
イムノアッセイでは、標的診断タンパク質マーカーは、マーカーに特異的に結合する抗体を使用して検出される。抗体は典型的には検出可能な部分で標識される。一般に次の範疇に分類できる数多くの標識が利用できる：
【０１９１】
放射性同位体、例えば、３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ及び１３１Ｉ。抗体は、例えばCurrent Protocols in Immunology, 1及び2巻, Coligen等編, (1991) Wiley-Interscience, New York, Pubs.に記載された技術を用いて放射性同位体で標識され、放射能はシンチレーションカウンターを使用して測定できる。
【０１９２】
蛍光標識、例えば希土類キレート（ユーロピウムキレート）又はフルオレセインとその誘導体、ローダミンとその誘導体、ダンシル、リサミン(Lissamine)、フィコエリトリン及びテキサスレッドが利用できる。蛍光標識は、例えば上掲のCurrent Protocols in Immunologyに開示された技術を用いて抗体にコンジュゲートさせることができる。蛍光は蛍光光度計によって定量できる。
【０１９３】
様々な酵素-基質標識が利用でき、米国特許第４２７５１４９号は、これらの幾つかの概説を提供している。酵素は一般に様々な技術を用いて測定可能な色素原基質の化学変換を触媒する。例えば、酵素は基質における色変化を触媒し、それは分光学的に測定可能である。あるいは、酵素は基質の蛍光又は化学発光を変化させうる。蛍光変化を定量する技術は上述した。化学発光基質は化学反応によって電子的に励起され、ついで（例えば化学発光計を用いて）測定されうる光を放出するか、又は蛍光受容体にエネルギーを供与する。酵素標識の例には、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４７３７４５６号）、ルシフェリン、２,３-ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸塩デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）等のペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リソザイム、糖類オキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース-６-ホスフェートデヒドロゲナーゼ）、ヘテロ環オキシダーゼ（ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ等）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ等が含まれる。酵素を抗体に結合させる技術は、O'Sullivan等 (1981) Methods for Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (J. Langone及びH. Van Vunakis編), Academic press, New York, 73: 147-166に記載されている。
【０１９４】
酵素-基質の組み合わせの例は、例えば以下を含む：西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）と基質としての過酸化水素で、過酸化水素が染料前駆物質（例えば、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）又は３,３',５,５'-テトラメチルベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ））を酸化する；アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と色素原基質としてのパラ-ニトロフェニルホスフェート；及びβ-Ｄ-ガラクトシダーゼ（β-Ｄ-Ｇａｌ）と色素原基質（例えば、ｐ-ニトロフェニル-β-Ｄ-ガラクトシダーゼ）又は蛍光原基質４-メチルウンベリフェリル-β-Ｄ-ガラクトシダーゼ。
【０１９５】
数多くの他の酵素-基質の組み合わせが当業者には利用可能である。これらの一般的な概説は、米国特許第４２７５１４９号及び第４３１８９８０号を参照のこと。
【０１９６】
標識は抗体に間接的に結合される場合もある。当業者であれば、これを達成するための様々な技術を知っているであろう。例えば、抗体をビオチンに結合させ、上述した３つの広い範疇の標識の何れかをアビジンに結合させるか、又はその逆が可能である。ビオチンはアビジンに選択的に結合し、よってこの間接的な方式で抗体に標識をコンジュゲートさせることができる。あるいは、抗体との標識の間接的な結合を達成するために、抗体に小さなハプテン（例えばジゴキシン）をコンジュゲートさせ、上述の異なるタイプの標識を抗ハプテン抗体（例えば抗ジゴキシン抗体）にコンジュゲートさせる。よって、抗体との標識の間接的なコンジュゲートを達成できる。イムノアッセイ技術の他の型では、抗体は標識される必要はなく、その存在が、抗体に結合する標識抗体を用いて検出されうる。
【０１９７】
よって、ここでの診断イムノアッセイは、例えば競合結合アッセイ、直接及び間接サンドウィッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイを含む任意のアッセイ形式でありうる。Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987)。
【０１９８】
競合結合アッセイは、限られた量の抗体との結合について試験試料分析物と競合する標識標準物質の能力に依存する。試験試料中の抗原の量は抗体に結合するようになる標準物質の量に反比例する。結合するようになる標準物質の量の決定を容易にするために、抗体は一般に競合の前又は後に不溶化され、抗体に結合する標準物質と分析物が未結合のままの標準物質と分析物から簡便に分離されうる。
【０１９９】
サンドウィッチアッセイは、それぞれが検出されるタンパク質の異なった免疫原性部分又はエピトープに結合可能である二つの抗体の使用を含む。サンドウィッチアッセイでは、試験試料分析物に、固形担体に固定された第一抗体が結合し、その後、第二抗体が分析物に結合し、よって不溶性の３部分複合体を形成する。例えば米国特許第４３７６１１０号を参照のこと。第二抗体自体は検出可能な部分で標識され（直接的サンドウィッチアッセイ）、又は検出可能な部分で標識される抗免疫グロブリン抗体を使用して測定されうる（間接的サンドウィッチアッセイ）。例えば、サンドウィッチアッセイの一つのタイプは、検出可能な部分が酵素であるＥＬＩＳＡアッセイである。
【０２００】
ｇ．プロテオミクス
「プロテオーム」なる用語は、ある時点での試料（例えば組織、生物、又は細胞培養物）中に存在するタンパク質の全体として定義される。 プロテオミクスは、とりわけ、試料中のタンパク質発現の網羅的変化の研究を含む（「発現プロテオミクス」とも称される）。プロテオミクスは典型的には次の工程を含む：（１）２-Ｄゲル電気泳動（２-Ｄ  ＰＡＧＥ）による試料中の個々のタンパク質の分離；（２）例えば質量スペクトル又はＮ末端配列決定によるゲルから回収された個々のタンパク質の同定、及び（３）バイオインフォマティクスを使用するデータ解析。プロテオミクス法は、遺伝子発現プロファイリングの他の方法に対する貴重な補充手段であり、単独で又は他の方法と組み合わせて、本発明のマーカーの産物を検出するために使用することができる。
【０２０１】
ｈ．逆転写の５’-マルチプレックス遺伝子特異的プライミング
ＲＴ-ＰＣＲは第一工程として試験ＲＮＡ集団の逆転写を必要とする。逆転写のために最も一般的に使用されるプライマーはオリゴ-ｄＴであり、これはＲＮＡがインタクトな場合に良好に機能する。しかしながら、このプライマーは、ＲＮＡが高度に断片化されている場合は効果的ではないであろう。
【０２０２】
本発明は、５８℃と６０℃の間に最適なＴｍを有し大ざっぱに２０塩基長である遺伝子特異的プライマーの使用を含む。これらのプライマーはまたＰＣＲ  ＤＮＡ増幅を駆動する逆方向プライマーとなる。
【０２０３】
代替アプローチ法は、ｃＤＮＡ合成のためのプライマーとしてランダムヘキサマーを使用することに基づいている。しかしながら、我々は、多重の遺伝子特異的プライマーの使用方法がランダムヘキサマーを使用する既知のアプローチ法よりも優れていることを実験的に証明した。
【０２０４】
ｉ．プロモーターメチル化分析
ＲＮＡ転写物（遺伝子発現解析）又はそのタンパク質翻訳産物の多くの定量方法をここで検討する。遺伝子の発現レベルは、例えば遺伝子プロモーター及び他の調節エレメントのメチル化状態及びヒストンのアセチル化状態のようなクロマチン構造に関する情報から推測することもできる。
特に、プロモーターのメチル化状態はそのプロモーターによって調節される遺伝子の発現レベルに影響を及ぼす。特定の遺伝子プロモーターの異常なメチル化は、例えば腫瘍抑制因子遺伝子のサイレンシングのような発現調節に関係していた。よって、遺伝子のプロモーターのメチル化状態の検査はＲＮＡレベルの直接の定量の代替として利用することができる。
【０２０５】
メチル化特異的ＰＣＲ(Herman J.G.等(1996) Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 93, 9821-9826.)及び亜硫酸水素ＤＮＡ配列決定(Frommer M.等(1992) A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 89, 1827-1831.)を含む特定のＤＮＡエレメントのメチル化状態を測定するための幾つかのアプローチ法が案出されている。更に最近では、マイクロアレイベースの技術がプロモーターメチル化状態を特徴付けるために使用されている(Chen C.M. (2003) Methylation target array for rapid analysis of CpG island hypermethylation in multiple tissue genomes. Am. J. Pathol. 163, 37-45.)。
【０２０６】
ｊ．遺伝子の同時発現
本発明の更なる態様は遺伝子発現クラスターの同定である。遺伝子発現クラスターは、ピアソン相関係数に基づく相関の対解析(Pearson K.及びLee A. (1902) Biometrika 2, 357)を含む当該分野で知られている統計解析法を使用する発現データの解析によって同定することができる。
【０２０７】
一実施態様では、ここで同定される発現クラスターは左結腸で上方制御される遺伝子を含む（図１）。
【０２０８】
他の実施態様では、ここで同定される発現クラスターは右結腸で上方制御される遺伝子を含む。
【０２０９】
他の一実施態様では、ここで同定される発現クラスターは回腸末端で上方制御される遺伝子を含む。
【０２１０】
他の実施態様では、ここで同定される発現クラスターは、における遺伝子を含む。
【０２１１】
ある実施態様では、ここで同定される発現クラスターは免疫応答下で分類される遺伝子を含む。
【０２１２】
他の実施態様では、ここで同定される発現クラスターは創傷への応答下で分類される遺伝子を含む。
【０２１３】
ｋ．イントロンベースのＰＣＲプライマー及びプローブの設計
本発明の一態様によれば、増幅される遺伝子中に存在するイントロン配列に基づいてＰＣＲプライマー及びプローブが設計される。従って、プライマー／プローブ設計の第一工程は遺伝子内のイントロン配列の 描写である。これは、公に入手可能なソフトウェア、例えばKent, W.J., Genome Res. 12(4):656-64 (2002)によって開発されたＤＮＡ ＢＬＡＴソフトウェア、あるいはその変形形を含むＢＬＡＳＴソフトウェアによって行うことができる。ＰＣＲプライマー及びプローブ設計の十分に確立された方法が次の工程として続く。
【０２１４】
非特異的シグナルを避けるために、プライマーとプローブを設計する場合、イントロン内において反復配列をマスクすることが重要である。これは、反復エレメントのライブラリに対してＤＮＡ配列をスクリーニングし、反復エレメントがマスクされる問い合わせ配列を返すベイラー医科大学からオンラインで入手可能なＲｅｐｅａｔ Ｍａｓｋｅｒプログラムを使用して容易に達成することができる。ついで、マスクされたイントロン配列を使用し、例えばＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ(Applied Biosystems)；ＭＧＢアッセイ-バイ-デザイン(Applied Biosystems)；プライマー３(Steve Rozen及びHelen J. Skaletsky (2000) Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In: Krawetz S, Misener S編 Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386)のような任意の商業的に又は他の好適に入手できるプライマー／プローブ設計パッケージを使用して、プライマー及びプローブ配列を設計することができる。
【０２１５】
ＰＣＲプライマー設計で考慮される最も重要な因子は、プライマー長、融解温度（Ｔｍ）、及びＧ／Ｃ含有量、特異性、相補的プライマー配列、及び３’末端配列を含む。一般に、最適なＰＣＲプライマーは、一般に１７-３０塩基長であり、約２０−８０％、例えば約５０−６０％のＧ＋Ｃ塩基を含む。５０から８０℃の間、例えば約５０から７０℃のＴｍが典型的には好ましい。
【０２１６】
ＰＣＲプライマー及びプローブ設計のための更なる指針については、その開示全体が出典明示によりここに明示的に援用される例えばDieffenbach, C.W.等, “General Concepts for PCR Primer Design” in: PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1995, pp. 133-155；Innis 及びGelfand, “Optimization of PCRs” in: PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, CRC Press, London, 1994, pp. 5-11；及びPlasterer, T.N. Primerselect: Primer and probe design. Methods Mol. Biol. 70:520-527 (1997)を参照のこと。
【０２１７】
ｌ．ＩＢＤ遺伝子セット、アッセイした遺伝子サブ配列、及び遺伝子発現データの臨床的利用
本発明の重要な態様は、結腸組織によるある種の遺伝子の測定した発現を使用して、診断情報を提供することである。この目的のために、アッセイされたＲＮＡの量の差と使用されたＲＮＡの質の変動の双方について修正する（標準化する）ことが必要である。従って、該アッセイは、よく知られたハウスキーピング遺伝子、例えばＧＡＰＦＤＨ及びＣｙｐ１を含むある種の基準化遺伝子の発現を典型的には測定し取り込む。あるいは、基準化はアッセイされた遺伝子の全て又はその大きなサブセットの平均又は中央値シグナル（Ｃｔ）に基づくことができる（包括的正規化アプローチ）。遺伝子毎のベースで、患者の結腸組織ｍＲＮＡの測定された基準化量が、適切な組織参照セットに見出される量と比較される。この参照セット中の組織の数（Ｎ）は、異なった参照セットが（全体として）本質的に同じように挙動するようにするためには十分に多くしなければならない。この条件が満たされる場合、特定のセットに存在する個々の結腸組織の同一性はアッセイされる遺伝子の相対量に有意な影響は持たないであろう。通常、組織参照セットは少なくとも約３０，好ましくは少なくとも約４０の異なったＩＢＤ組織検体からなる。別の記載がなされない限り、各ｍＲＮＡ／試験組織／患者の正規化発現レベルは、参照セットにおいて測定された発現レベルの割合として表される。より詳細には、ＩＢＤ試料の十分に多い数（例えば４０）の参照セットが、各ｍＲＮＡ種の正規化レベルの分布を生じる。分析される特定の試料において測定されるレベルはこの範囲内のあるパーセンタイルになり、これは当該分野でよく知られた方法によって決定することができる。以下、別段の記載がない場合は、遺伝子の発現レベルに対する参照は、これは常に明示的に述べるとは限らないが、参照セットに対して正規化された発現を想定する。
【０２１８】
ｍ．抗体の産生
本発明は抗ＩＢＤマーカー抗体を更に提供する。例示的な抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性、及びヘテロコンジュゲート抗体が含まれる。ここで検討したように、抗体はＩＢＤの診断方法において、ある場合にはＩＢＤの治療方法において使用されうる。
【０２１９】
（１）ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）注射することにより動物に産生されうる。免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターに関連抗原を、二官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基によるコンジュゲーション）、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基による）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲとＲ１が異なったアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲによりコンジュゲートさせることが有用でありうる。
【０２２０】
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ（それぞれウサギ又はマウスの場合）を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫化する。１か月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物は、同じ抗原のコンジュゲートであるが、異なったタンパク質にコンジュゲートさせた、及び／又は異なった架橋剤によってコンジュゲートさせたコンジュゲートで追加免疫する。コンジュゲートはまたタンパク融合として組換え細胞培養中で調製することもできる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
【０２２１】
（２）モノクローナル抗体
ここでのモノクローナル抗体を作製するための様々な方法が当該分野で利用できる。例えば、モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４８１６５６７号)によって作製することができる。
【０２２２】
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記したようにして免疫し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を生産するか又は生産することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融剤を用いてミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,59-103頁(Academic Press, 1986))。
【０２２３】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親のミエローマ細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を含みうる適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親のミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠失しているならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含むであろう（ＨＡＴ培地）。
【０２２４】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの生産を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫細胞株には、マウス骨髄腫系、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、San Diego, California USAから入手し得るＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及びアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション、Rockville, Maryland USAから入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されたものが含まれる。ヒト骨髄腫及びマウス-ヒトヘテロ骨髄腫細胞株もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために記載されている(Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；及びBrodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
【０２２５】
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
【０２２６】
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson等, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のスキャッチャード分析法によって測定することができる。
【０２２７】
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地には、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地が包含される。加えて、該ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
【０２２８】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような常套的な免疫グロブリン精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。
【０２２９】
モノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、常法を用いて（例えば、マウスの重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）即座に単離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、そうしないと抗体タンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はミエローマ細胞のような宿主細胞中にトランスフェクトし、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を達成することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌中での組換え発現に関する概説論文には、Skerra等, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993)及びPlueckthum, Immunol. Revs., 130:151-188(1992)がある。
【０２３０】
更なる実施態様では、モノクローナル抗体又は抗体断片は、McCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリから単離することができる。Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marks等, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の単離を記述している。続く刊行物は、鎖混合による高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生産(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783(1992))、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266(1993))を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
【０２３１】
ＤＮＡはまた、例えばヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード化配列を、相同的マウス配列に代えて置換することにより(米国特許第４８１６５６７号；Morrison等, Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有結合させることで修飾できる。
【０２３２】
典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインに置換され、又は抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインに置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
【０２３３】
（３）ヒト化抗体
非ヒト抗体をヒト化する方法の例は当該分野で記載されている。好ましくは、ヒト化抗体は非ヒト由来のものに導入した一又は複数のアミノ酸残基を有する。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる（Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536(1988)）。ヒト化は、本質的には、ウィンター及び共同研究者（Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)）の方法に従って、高頻度可変領域配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施されうる。従って、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体である（米国特許第４８１６５６７号）。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかの高頻度可変領域残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。ＩＢＤを治療するために使用されるヒト化抗体の例は、操作されたマウス-ヒトキメラモノクローナル抗体であるインフリキシマブ（レミケード（登録商標））である。抗体はサイトカインＴＮＦ-αに結合し、そのレセプターへの結合を防止して炎症反応を惹起し維持する。インフリキシマブはＣＤとＵＣの双方を治療するために使用される。
【０２３４】
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク領域(ＦＲ)として受け入れる(Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークを幾つかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等, J. Immunol., 151:2623(1993))。
【０２３５】
抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが更に重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは入手可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原と結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性を高めるといった、望ましい抗体特徴が得られるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【０２３６】
ヒト化抗体の様々な形態が考えられる。例えば、ヒト化抗体は、抗体断片、例えばＦａｂ、場合によっては免疫コンジュゲートを作成するために一又は複数の細胞傷害剤とコンジュゲートされたものであってもよい。あるいは、ヒト化抗体又は、親和性成熟抗体は、インタクトな抗体、例えばインタクトなＩｇＧ１抗体であってもよい。
【０２３７】
（４）ヒト抗体
ヒト化の代わりにヒト抗体を産生することができる。例えば、内在性の免疫グロブリン産生がない状態で、ヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作ることが現在では可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子の同型接合欠損が内因性抗体産生を完全に阻害することが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列イムノグロブリン遺伝子列の移入は、抗原チャレンジ時にヒト抗体の産生をもたらす。例としてJakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993)；Bruggermann等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第５５９１６６９号、第５５８９３６９号及び第５５４５８０７号を参照。あるいは、ファージディスプレイ技術（McCafferty等, Nature 348：552-553(1990)）を、非免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産出させるために使用することができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３又はｆｄの大きい又は小さいコートタンパク質遺伝子の何れかにインフレームでクローニングし、ファージ粒子の表面上に機能的抗体断片としてディスプレイさせる。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択により、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択がなされる。よって、ファージはＢ細胞の特性の幾つかを模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)を参照のこと。Ｖ-遺伝子セグメントの幾つかの供給源がファージディスプレイのために使用可能である。Clackson等, Nature, 352：624-628(1991)は、免疫化されたマウス脾臓から得られたＶ遺伝子の小ランダムコンビナトリアルライブラリからの抗オキサゾロン抗体の異なった配列を単離した。非免疫化ヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構成可能で、抗原(自己抗原を含む)とは異なる配列の抗体を、Marks等, J. Mol. Biol. 222：581-597(1991)、又はGriffith等, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術に従って単離することができる。また、米国特許第５５６５３３２号及び同５５７３９０５号を参照のこと。
【０２３８】
上で検討したように、ヒト抗体はまたインビトロ活性化Ｂ細胞により産生されうる（米国特許第５５６７６１０号及び同第５２２９２７５号を参照）。
【０２３９】
（５）抗体断片
一又は複数の抗原結合領域を含む抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、抗体断片は上記した抗体ファージライブラリから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。抗体断片の産生のための他の技術は熟練した実務者に明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は一本鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦＶ)である。国際公開第９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照のこと。また、抗体断片は、例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているような直鎖状抗体であってもよい。このような直鎖状抗体断片は単一特異性又は二重特異性であってもよい。
【０２４０】
（６）二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。例示的二重特異性抗体はＩＢＤマーカータンパク質の２つの異なるエピトープに結合しうる。二重特異性抗体はＩＢＤマーカータンパク質を発現する細胞に薬剤を局在化させるために使用することもできる。
【０２４１】
これらの抗体はＩＢＤマーカー結合アームと薬剤(例えば、アミノサリチル酸)に結合するアームを有している。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片（例えばＦ（ａｂ’）２二重特異性抗体)として調製することができる。
【０２４２】
二重特異性抗体を作製する方法は当該分野において知られている。完全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Millstein等, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開第９３／０８８２９号及びTraunecker等, EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
【０２４３】
異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原-抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが好ましい。免疫グロブリン重鎖の融合体と、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これにより、コンストラクトに使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が特に重要性を持たないときは、２又は３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【０２４４】
このアプローチ法の一実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
【０２４５】
米国特許第５７３１１６８号に開示された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーの割合を最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【０２４６】
二特異性抗体は架橋又は「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートの一方の抗体がアビジンと結合し、他方はビオチンと結合しうる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせること(米国特許第４６７６９８０号)及びＨＩＶ感染の治療(国際公開第９１／００３６０号、国際公開第９２／００３７３号及び欧州特許出願公開第０３０８９号)への用途が提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は任意の簡便な架橋方法によって作製できる。適切な架橋剤は当該分野において周知であり、多くの架橋法と共に米国特許第４６７６９８０号に記されている。
【０２４７】
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) はインタクトな抗体をタンパク分解性に切断してＦ（ａｂ'）２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルヒド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート（ＴＮＢ）誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。生産された二重特異性抗体は酵素の選択的固定化のための薬剤として使用することができる。
【０２４８】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Kostelny等, J.Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させた。抗体ホモダイマーはヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、ついで再酸化させて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作製する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするのに十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用する他の二重特異性抗体断片の製造方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol., 152:5368 (1994)を参照のこと。
【０２４９】
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等 J.Immunol. 147:60(1991)。
【０２５０】
（７）他のアミノ酸配列の修飾
ここに記載された抗体のアミノ酸配列の修飾を考える。例えば、抗体の結合親和性及び／又は生物学的特性を向上することができれば望ましい。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体の核酸に適切なヌクレオチド変化を導入して、又はペプチド合成により調製されうる。そのような修飾は、抗体のアミノ酸配列内の残基の、例えば、欠失型、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終構成物が所望する特徴を有していれば、欠失、挿入及び置換をどのように組合せてもよい。アミノ酸変化は、またグリコシル化部位の数又は位置を変化させるなど、抗体の翻訳後プロセスを変更してもよい。
【０２５１】
突然変異誘発に好ましい位置である抗体のある種の残基又は領域の同定に有益な方法は、Cunningham及びWells Science, 244:1081-1085 (1989)に記載されているように「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的残基又は残基の組が同定され(例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕなどの荷電した残基)、中性の又は負に荷電したアミノ酸(最も好ましくはアラニン又はポリアラニン)で置換され、アミノ酸の抗原との相互作用に影響を与える。ついで、置換に対する機能的感受性を示しているそれらアミノ酸位置を、置換の部位において、又は置換の部位のために、更なる又は他の変異体を導入することにより精製する。このように、アミノ酸配列変異体を導入する部位は予め決定されるが、突然変異自体の性質は予め決定される必要はない。例えば、与えられた部位における突然変異のパーフォーマンスを分析するために、標的コドン又は領域においてａｌａスキャンニング又はランダム突然変異誘発を実施し、発現した免疫グロブリンを所望の活性についてスクリーニングする。
【０２５２】
アミノ酸配列挿入には、１残基から１００以上の残基を有するポリペプチドまでの長さに亘るアミノ末端融合及び／又はカルボキシ末端融合、並びに単一又は複数アミノ酸残基の配列内挿入を含む。端末挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を持つ抗体又は細胞傷害性ポリペプチドに融合させた抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体の血清半減期を増加させるポリペプチド又は(例えばＡＤＥＰＴのための)酵素への抗体のＮ末端又はＣ末端の融合が含まれる。
【０２５３】
他の型の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、異なる残基によって置換された抗体分子に少なくとも一つのアミノ酸残基を有する。置換突然変異について最も興味ある部位は高度可変領域を含むが、ＦＲ改変も考慮される。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表１に示す。これらの置換により生物学的活性に変化が生じる場合、次表に「例示的置換」と題した又はアミノ酸の分類を参照して以下に更に記載するような、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングしてもよい。
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抗体の生物学的性質における実質的な修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩に影響を及ぼす置換を選択することにより達成される。アミノ酸は、その側鎖の特性の類似性に従ってグループ化することができる(A. L. Lehninger, in Biochemistry, 2版, pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975))：無極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ），Ｔｒｐ（Ｗ），Ｍｅｔ（Ｍ）；無電荷極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）；酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）；及び塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）。
【０２５４】
別法では、天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいて群に分けることができる：疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０２５５】
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
【０２５６】
抗体の適切な高次構造を維持するために関与しない任意のシステイン残基も、一般的には、セリンと置換して、分子の酸化的安定性を改善して、異常な架橋を防いでもよい。逆に、システイン結合を抗体に付加して、その安定性を改善してもよい(特に抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合)。
【０２５７】
ある好ましい型の置換変異体は、親抗体（例えばヒト化又はヒト抗体）の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的に、更なる発展のために選択され、得られた変異体は、それらが作製された親抗体と比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を作製する簡便な方法は、ファージディスプレイを使用する親和性突然変異である。簡潔に言えば、幾つかの高頻度可変領域部位(例えば６−７部位)を突然変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された多価抗体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物としてディスプレイされる。ファージディスプレイ変異体は、ついで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングされる。修飾のための候補となる高頻度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。別法として、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体と抗原の接点を特定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここに述べた技術に従う置換の候補である。そのような変異体が生成されると、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択することができる。
【０２５８】
三以上（好ましくは４の）機能的抗原結合部位を有する操作された抗体もまた考えられる（Miller等の米国特許出願公開第２００２／０００４５８７Ａ１号）。
【０２５９】
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は当該分野で知られている様々な方法により調製される。これらの方法は、天然源からの単離(天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合)又はオリゴヌクレオチド媒介性(又は部位特異的)突然変異による調製、ＰＣＲ突然変異誘発、及び前もって調製された変異体又は抗体の非変異型のカセット変異導入法を含むが、これらに限定されない。
【０２６０】
Ｂ．３  炎症の決定
一態様では、本願明細書において記載される差別的に発現されたバイオマーカーの被験体における同定は、被験体における炎症の決定と相関し得る。一実施態様では、バイオマーカーの発現が炎症の代用として使用され得る（Sands等. (2005) Inflamm Bowel Dis. 11(1):S22-S28）。別の実施態様では、バイオマーカーの発現は他の技術による炎症の決定に対して確証される。他の一実施態様では、本発明の診断及び／又は治療の方法は、被験体において炎症を決定する工程を含む。別の実施態様では、決定工程は、炎症細胞浸潤に対して、被験体から得られた試験試料の組織学的評価を含む。一実施態様では、試験試料は、被験体から得られた組織生検である。
【０２６１】
別の実施態様では、決定工程は、被験体からの試験試料として非組織生検の評価を含む。一実施態様では、試験試料は被験体の糞便物質から得られる生検である。別の実施態様では、試験試料は血液である。他の一実施態様では、決定工程は糞便中カルプロテクチン又は糞便中ラクトフェリン試験（Joishy等. (2008) J Pediatr Gastroenterol Nutr. 48(1):48-54）又はＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）血液検査（Henriksen等. (2008) Gut. 57:1518-1523）を含む。
【０２６２】
Ｂ．４  発明のキット
本発明の方法で使用するための材料は、良く知られた手順に従って生産されるキットの調製に適している。よって、本発明は、ＩＢＤに対する開示された遺伝子の発現を定量するための遺伝子特異的又は遺伝子選択的プローブ及び／又はプライマーを含みうる薬剤を含むキットを提供する。このようなキットは、場合によっては、試料、特にパラフィン包埋組織試料からＲＮＡを抽出するための試薬、及び／又はＲＮＡ増幅のための試薬を含みうる。加えて、キットは、本発明の方法での使用に関する記載又はラベル又は指示書と共に試薬を含んでいてもよい。該キットは、例えば、それぞれ、前もって製造されたマイクロアレイ、バッファー、適切なヌクレオチド三リン酸（例えばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ；又はｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰ及びＵＴＰ）、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、及び本発明の一又は複数のプローブ及びプライマー（例えばＲＭＡポリメラーゼと反応性のプロモーターに結合した適切な長さのポリ（Ｔ）又はランダムプライマー）を含む該方法で利用される（典型的には濃縮形態の）様々な試薬の一又は複数と共に、（方法の自動化された実施に使用するのに適したマイクロタイタープレートを含む）容器を含みうる。
【０２６３】
Ｂ．５  発明のレポート
この発明の方法は、商業的な診断目的に対して実施される場合、選択された遺伝子の一又は複数の正規化された発現レベルのレポート又はまとめを一般に作成する。この発明の方法及びレポートは、ＩＢＤを治療するための何れかの外科的手順の前後に、ＩＢＤであると診断された被験体の臨床転帰の予測を含んでなるレポートを作成する。該方法及びレポートは、データベース中にレポートを保存することを更に含みうる。あるいは、該方法は、被験体のためにデータベース中に記録を更に作成し、記録にデータを追加することができる。 一実施態様では、レポートは紙のレポートであり、他の実施態様では、レポートは聴覚性レポートであり、他の実施態様では、レポートは電子的レポートである。レポートは医師及び／又は患者に提供されることが考えられる。レポートの受領は、データ及びレポートを含むサーバーコンピュータにネットワーク接続を樹立し、サーバーコンピュータからデータ及びレポートを要求することを更に含みうる。
【０２６４】
本発明によって提供される方法はまた全体を又は部分的に自動化することもできる。
本発明の全ての態様は、開示された遺伝子に加えて、及び／又はその代わりに、例えば高いピアソン相関係数によって裏付けられているように、開示された遺伝子と同時発現される限られた数の更なる遺伝子が予後又は予想試験に含められるようにまた実施することができる。
【０２６５】
本発明を記載したが、本発明は、例示のために提供され、発明を限定するものでは決してない次の実施例を参照すると、より容易に理解されるであろう。
【０２６６】
実施例
実施例１-全ゲノムマイクロアレイ解析によるクローン病の腸遺伝子発現プロファイルの特徴付け
全ゲノムマイクロアレイ発現解析は、細胞レベルでの遺伝子発現の包括的描写を作成する。この研究の目的は、クローン病（ＣＤ）患者及びコントロールにおける異なる腸遺伝子発現を調査することであり、確認されたＣＤ感受性遺伝子、関連経路及び細胞系譜のサブ解析を伴った。
【０２６７】
５３人のＣＤ及び３１人のコントロール被験者-２３人の正常及び８人の炎症性の非炎症性腸疾患患者を研究した。ＲＮＡ抽出及び組織学のために、対内視鏡生検を５つの特定の解剖学的部位から採取した。４１０５８の発現遺伝子配列タグを、アジレント（Agilent）のプラットフォームを使用して解析した。
【０２６８】
クラスタ解析は、ＣＤ及びコントロール回腸末端（ＴＩ）生検を、結腸生検及びＣＤ及びコントロールＴＩ生検から分けた。ＣＤ ＴＩ生検では、ジユビキチン（FC+11.3, p<1x10-45）、ＭＭＰ３(FC+7.4, p=1.3x10-11)、ＩＲＴＡ１(FC-11.4, p=4.7x10-12)及びＣＣＬ２３(FC-7.1, p=1.6x10-10)が、コントロールと比較して異なって発現された。結腸において、非炎症性ＣＤ及びコントロール生検と比較するとＳＡＡ１（FC+6.3、p=5.3x10-8）は上方制御され、ＴＳＬＰ（FC-2.3、p=2.7x10-6）は下方制御され、結腸炎症性ＣＤ特性は、下方制御された有機溶質担体-ＳＬＣ３８Ａ４、ＳＬＣ２６Ａ２及びＯＳＴアルファによって特徴付けられた。ＩＬ-２３経路の分析は、コントロールと比較したＣＤグループ及び非炎症性ＣＤ生検と比較した炎症性において、ＩＬ-２３Ａ、ＪＡＫ２及びＳＴＡＴ３が上方制御されたことを示した。異なる発現は、また多くのオートファジー遺伝子、特にＡＴＧ１６Ｌ１において観察された。
【０２６９】
方法
患者の動員
大腸内視鏡検査を受けていたＣＤ患者５３人（表２）及びコントロール患者３１人が集められた。全てのＣＤ患者は、エディンバラのWestern General Hospitalに通院し、ＣＤの診断はレナード-ジョーンズの基準に準拠した（Lennard-Jones JE. Scand J Gastroenterol Suppl 1989;170:2-6）。休止期のＣＤは、腸管前処置の前にHarvey-Bradshawスコア＜３、及び正常の組織学又は軽度の慢性炎症のみを示す組織学として分類された。活動性ＣＤは、腸管前処置の前に４以上のHarvey-Bradshawスコア、及び慢性活動性炎症又は急性の慢性炎症を示す組織学として分類された。
2012533322.tif 000005
【０２７０】
表現型データを、問診及び症例記録により収集した。コントロールの内１１人が男性、２０人が女性であり、彼らは内視鏡検査時に年齢中央値が４３であった。（Noble等. Gut 2008, Oct;57(10):1398-405）。コントロールの内６人が、結腸癌スクリーニングに対して正常の大腸内視鏡検査を有し、１０人のコントロールが過敏性腸症候群と整合した症状を有し正常の大腸鏡検査を有し、７人の患者が他の徴候に対して大腸内視鏡検査を受け、組織学的に正常の生検が得られた。８人のコントロール患者が異常炎症性結腸生検を有した（偽膜性大腸炎１人、憩室炎１人、アメーバ症１人、顕微鏡的大腸炎２人、好酸球浸潤が１人、散乱リンパ球凝集及び胃腸炎歴２人）。女性のＴＩクラスタ解析には、非炎症性回腸末端を有する１人の女性ＵＣ患者を含んだ。表現型データを、問診及び症例記録により収集した。Lothian Local Research Ethics Committeeが研究プロトコルを承認した：ＲＥＣ０４／Ｓ１１０３／２２。
【０２７１】
生検収集
対生検を、回腸末端部（ＴＩ）及び結腸において４部位から得た（表３）。一生検を組織検査に送り、他はＲＮＡ抽出のために液体窒素において瞬間冷凍した。各生検は、炎症性のエビデンス無しのもの、慢性炎症及び慢性炎症性細胞浸潤のエビデンス有りの生検、及び急性炎症及び急性炎症性細胞浸潤を有するものに組織学的にグレード化した。
2012533322.tif 000006
【０２７２】
マイクロアレイ分析  
幾千もの遺伝子配列を殆ど場合において含む核酸マイクロアレイは、組織の正常な対応物と比較して、疾患組織において異なって発現している遺伝子を同定するために有用である。核酸マイクロアッセイを用いると、試験及びコントロール組織試料からの試験及びコントロールｍＲＮＡ試料が逆転写され、ｃＤＮＡプローブを生成するために標識される。次いで、このｃＤＮＡプローブは、固体支持体上に固定化さた多くの核酸とハイブリダイズされる。このアレイは、アレイの各メンバーの配列と位置がわかるように構成されている。例えば、ある疾患段階で発現することが知られている遺伝子から選ばれたものを固体支持体上に整列してもよい。標識プローブとある特定のアレイのメンバーとのハイブリダイゼーションは、プローブが誘導された試料がその遺伝子を発現していることを示す。試験（疾患組織）からのプローブのハイブリダイゼーションシグナルが、コントロール（正常組織）試料からのプローブのハイブリダイゼーションシグナルより大きい場合は、疾患組織において過剰発現している遺伝子又は複数遺伝子が同定される。この結果の意味は、疾患組織で過剰発現しているタンパク質は、疾患症状の存在のための診断的マーカーとしてだけではなく、疾患症状の治療のための治療上の標的としても有用であるということである。
【０２７３】
核酸のハイブリダイゼーション及びマイクロアレイ技術の方法論は、当業者には良く知られている。一実施例では、ハイブリダイゼーション及びプローブ、スライドのための核酸の特別な調製、並びにハイブリダイゼーションの条件は、２０００年３月３１日に出願されたＰＣＴ特許出願公開第ＰＣＴ／ＵＳ０１／１０４８２号に詳細に記載され、その内容は出典明記により本明細書中に援用される。詳細なマイクロアレイ方法論は、また、Noble等により以前に報告された（Gut 2008, Oct;57(10):1398-405）。
【０２７４】
動物組織からのマイクロ全ＲＮＡ単離プロトコル（Qiagen, Valencia, CA）を使用して、全ＲＮＡを各生検から抽出した。１μｇの全ＲＮＡを、低ＲＮＡインプット蛍光線形増幅（Low RNA Input Fluorescent Linear Amplification）プロトコル（Agilent Technologies, Palo Alto, CA）を使用して増幅した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの単回線形増幅を実施し、ｃＲＮＡにシアニン-３及びシアニン-５標識を導入した。ｃＲＮＡをRNeasy Miniキット (Qiagen)を使用して精製した。１μｌの全ＲＮＡを、NanoDrop ND-1000分光光度計（NanoDrop Technologies, Delaware）を使用して定量化した。シアニン-３で標識された７５０ｎｇのUniversal Human Reference (Stratagene, La Jolla, CA)ｃＲＮＡ及び シアニン-５で標識された試験試料ｃＲＮＡを、３３２９６の遺伝子を表すとされるAgilent Whole Human Genome マイクロアレイ (Agilent Technologies, Palo Alto, CA)に投入する前に、６０°Ｃで３０分間断片化した。試料を、一定の回転で６０°Ｃで１８時間ハイブリダイズした。マイクロアレイを洗い、乾燥させ、製造者のプロトコルに従いアジレントのスキャナでスキャンした。マイクロアレイ画像ファイルを、アジレントのFeature Extraction software 7.5.版を使用して分析した。遺伝子を、Stratagene Universal Human Referenceを使用して正規化した。各サンプルのログ強度の分布を、プロットし異常値サンプル（すなわち平均から２標準偏差を超えるもの）を解析から除外した。全データセットは、National Center for Biotechnology InformationウェブサイトのGene Expression Omnibusにてオンラインで利用可能である。
【０２７５】
リアルタイムＰＣＲ
リアルタイムＰＣＲ解析を、１５人のＣＤ及び６人のコントロールＴＩ生検からのＲＮＡの５遺伝子ＩＬ-８、ＳＡＡ１、ＤＥＦＡ５及び６及びＭＭＰ３において実施した。ＩＬ-８及びＳＡＡ１を上皮性炎症の頑強マーカーとして選択し、ＤＥＦＡ５及び６をＴＩ ＣＤにおけるそれらの発現への高い関心のため選択した。リアルタイムＰＣＲ分析の前に一ＲＮＡ増幅サイクルを、MessageAmpＴＭ II aRNA Amplification Kitプロコトル（Applied Biosystems, Foster City, CA）を使用して実行した。次に、逆転写ＰＣＲを、Stratagene model MX4000を使用して５０ｎｇのＲＮＡについて実施した。ＴａｑＭａｎプライマー及びプローブは社内で製造した（表４）。ＰＣＲ条件は、３０分間４８°Ｃ、１０分間９５°Ｃを保持、続いて９５°Ｃ３０秒の溶融及び１分６０°Ｃのアニール／伸長の４０サイクルであった。産物の絶対定量を、ＲＰＬ１９に対して正規化することによって算出した。
2012533322.tif 000007
【０２７６】
データ分析
マイクロアレイデータを、Rosetta Resolver（登録商標）ソフトウェア (Rosetta Inpharmatics, Seattle)を使用して解析した。マイクロアレイデータの統計的有意性を、スチューデントの独立ｔ検定によって決定した。ｐ＜０．０１。倍率変化データをRosetta Resolverソフトウェアを使用して算出した。多重仮説検定を補正するために、各試験特性に対してｑ値を計算し、偽陽性率ではなく偽発見率（ＦＤＲ）に関して有意性を推定した。各異なる発現分析についてｑ値を算出し、ＦＤＲをStorey等により提案された方法を使用して算出した（Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100:9440-9445）。５％未満のＦＤＲを、各々の提示分析に対して算出した。階層的クラスタリング分析をピアソン相関法を使用して行った。遺伝子オントロジー（Gene ontology）を、Ingenuityソフトウェア（Ingenuity Systems, Mountain View, CA）を使用して分析した。マン・ホイットニーのＵ検定を使用してリアルタイムＰＣＲデータを解析した。ｐ＜０．０５を有意とした。
【０２７７】
遺伝子オントロジーを、Ingenuityソフトウェア（Ingenuity Systems, Mountain View, CA）を使用して分析した。６つの免疫細胞型の集合からのインシリコ免疫反応遺伝子のコレクションを使用して階層的クラスタリング分析を行った（Abbas等. Genes Immun 2005;6(4):319-31）。また、階層的クラスタリング分析を１４の上皮細胞サイトカイン群-ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２  ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ７、ＣＣＬ２０、ＩＬ-８、ＩＬ-１２Ａ、ＩＬ-２３Ａ及びＭＤＫを使用して行った（Dwinell等. Gastroenterology 2001;120(1):49-59; Lee等. J Immunol 2008;181(9):6536-45; Yang等. Gastroenterology 1997;113(4):1214-23）。
【０２７８】
結果
本研究の目的は、マイクロアレイ発現解析を使用して、ＣＤ患者及びコントロールにおいて結腸及び回腸末端における転写プロファイルを記述することであった。この無仮説スキャニングに加えて、ＧＷＡＳ及び細胞特異系譜解析により同定された生殖系多様体の発現も調査した。
【０２７９】
教師なし階層的クラスタリング分析
全てのＣＤ（ｎ＝９９）及びコントロール生検（ｎ＝７３）を、教師なし階層的クラスタリング解析を使用して共にクラスタ化した時に、疾病状態又は炎症の度合いによる生検の分離は観察されなかった。生検が採られた解剖学的部位を考慮した時、１８のＴＩ生検が共にクラスタ化された（６コントロール及び１２ＣＤ）（p<0.001）。
【０２８０】
図２３はＴＩ生検の教師なし階層的クラスタリング解析を示し、最初は患者の性別により交絡したが、ある程度の監視（supervision）を導入し女性患者及びコントロールからのＴＩ生検のみをクラスタ化した時、疾病状態によるクラスタリングが観察された。
【０２８１】
生物学的プロセスによりグループ化した５９３の下方制御された配列の遺伝子オントロジーは、カルボン酸代謝プロセス（全４６４遺伝子の内３９遺伝子がオントロジーソフトウェアによりこの生物学的グループに分類された：OR 3.4, p=7x10-13）、有機酸代謝プロセス（38/464; OR 3.1 p=1x10-12）及び脂質代謝プロセス（46/620; OR 3.0, p=6.6x10-12）に関連する遺伝子の優勢を示した。下方制御された配列を生物学的機能によりグループ化した時、溶質／カチオン輸送体活性（23/188; OR 5.16, p=2.7x10-14）、電気化学ポテンシャル駆動輸送体活性（23/188; OR 5.16, p=2.7x10-14）及び溶質／ナトリウム輸送体活性（10/46; OR 10.1, p=2.4x10-13）の下グループ化された遺伝子は不釣合いに下方制御された。輸送体活性に関与する全遺伝子を包含するためにこれらの遺伝子のグループを組合せた時、下方制御された遺伝子におけるこのグループの著しい過剰提示が見られた（64/1138; OR 2.3, p=3.6x10-
【０２８２】
３６７配列が、コントロールと比較してＣＤ試料のサブセットで上方制御された。生物学的プロセスによりグループ化したこれらの遺伝子のオントロジーは、構造分子活性（22/603; OR 2.62, p=4.5x10-5）及び細胞外マトリックス構造成分（6/87; OR 5.5, p=0.0003）にグループ化した遺伝子が過剰発現されるのを示した。生物学的機能によりグループ化した時、上方制御された遺伝子は配列特異的ＤＮＡ結合（11/430; OR 2.28, p=0.007）及び転写因子活性（20/810; OR 1.7, p=0.043）にグループ化された。
【０２８３】
クローン病及びコントロールにおける遺伝子発現
９９のＣＤ生検が７３のコントロール生検と比較した時、２５９配列が上方制御され８７配列が下方制御された（図２４）。ＣＤ生検において特に上方制御された遺伝子は、急性期タンパク質血清アミロイドＡ１（ＳＡＡ１; FC +7.5, p=1.47x10-41）、再生Ｃ型レクチンファミリーメンバー（ＲＥＧＬ; FC +7.3, p=2.3x10-16）、急性期タンパク質（Ｓ１００Ａ９; FC +4.4, p=2.4x10-22）及び（Ｓ１００Ａ８; FC +4.0, p= 3.5x10-18)を含んだ。粘膜炎症の頑強マーカーＩＬ-８は６番目に最も上方制御された遺伝子であった（FC +3.6, p=5.6x10-19）。最も下方制御された遺伝子では、細胞解毒に関与する遺伝子-(ＳＬＣ１４Ａ２; FC -2.49, p=0.00002)、(炭酸脱水酵素２; FC -2.4, p=8.4x10-10)及び(炭酸脱水酵素１; FC -2.3, p=7.5x10-6)があった。
【０２８４】
回腸末端における遺伝子発現
６の非炎症性生検、７の慢性炎症性生検及び３の急性炎症性生検から成る、ＣＤ患者１６人からのＴＩ生検を、６の健康なコントロールＴＩ生検と比較した。全てのＣＤ回腸末端（ＴＩ）生検をコントロールＴＩ生検と比較した時、１０４５配列が１．５より大きい倍率変化であり、１０４４配列は-１．５未満の倍率変化であった（ｐ＜０．０１）（図２５）。ＣＤ生検における興味深い上方制御された遺伝子は、シナプス伝達に関与するジユビキチン（ＵＢＤ）；FC +11.3, p<1x10-45 、(ＭＭＰ３; FC +7.4, p=1.3x10-11)、(ＩＬ-８; FC +4.9, p=2.3x10-8)、(粘膜表面バリヤを維持するために胃腸管において作用するトレフォイル因子１（ＴＦＦ１); FC +4.3, p=1.3x10-7)及びサイトカイン (ケラチン５β; FC +4.2, p=0.005) を含んだ（表５）。下方制御された遺伝子は、免疫関連遺伝子（ＩＲＴＡ１-新規表面Ｂ細胞受容体; FC -11.1, p=4.7x10-12)、(ＣＣＬ２３; FC -7.1, p=1.6x10-10)、(ＣＸＣＲ４; FC -6.0, p=8.2x10-18)、及びコレステロール代謝に関与する遺伝子（ＡＰＯＣ３; FC -8.2, p=7.0x10-8)及び(ＡＰＯＡ１; FC -6.9, p=0.0031)を含んだ。
2012533322.tif 000008
【０２８５】
結腸遺伝子発現分析
生検の解剖学的位置に関連する異なる遺伝子発現の影響を最小化するために、Ｓ状結腸生検を解析のために使用した（Noble等. Gut 2008, Oct;57(10):1398-405）。また、急性炎症性発現特性を排除するために、非炎症性ＣＤ生検（ｎ＝１７）を非炎症性コントロール生検（ｎ＝１８）と比較した（図２６）。ＳＡＡ１が依然最も上方制御された遺伝子であり；FC +6.3, p=5.3x10-8 全体で２７９配列が上方制御された。３４９配列が下方制御され、最も下方制御された遺伝子は（ＭＭＰ１; FC -3.6, p=2.4x10-15)、（ＣＸＣＬ１３; FC ?2.7, p=0.005)及びＴＳＬＰ-胸腺間質性リンパタンパク質; FC -2.3, p=2.7x10-6(表６）を含んだ。
【０２８６】
Ｓ状結腸において急性炎症シグナルを調査し、１６の炎症性ＣＤ生検を１７の非炎症性ＣＤ生検と比較した時、２７９配列は上方制御され、１４８配列は下方制御された（図２７）。炎症性生検において最も上方制御された遺伝子は、ＯＬＦＭ４-抗アポトーシス分子でありカスパーゼカスケードを阻害し、またＧＲＩＭ１９に結合する; FC +6.2, p=2.9x10-14。下方制御された遺伝子は、有機溶質担体（ＳＬＣ３８Ａ４; FC -2.7, p=0.005)、（ＳＬＣ２６Ａ２; FC -2.5, p=0.00001)及び（ＯＳＴアルファ; FC -2.5, p=0.008)を含んだ。
【０２８７】
ＧＷＡＳメタアナリシスによる遺伝子の発現
Barrett等によりＧＷＡＳメタアナリシスで同定された感受性遺伝子の発現（Nat Genet 2008, Aug;40(8):955-62）を、ＩＬ-２３及びオートファジー経路の更なる詳細な分析と共に調査した（表７）。コントロールと比較してＣＤ生検において上方制御された遺伝子は、（ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５; FC +1.23, p=0.000243) （ＰＴＧＥＲ４-プロスタグランジンＥ受容体４; FC +1.1, p=0.00010)及びＮＫＸ２．３、３エクソンホメオボックス遺伝子; FC +1.37, p=0.001を含んだ。細胞周期調節遺伝子（ＣＤＫＡＬ１; FC -1.1, p=0.0096)は、コントロールと比較してＣＤ生検において下方制御された。ＩＧＲＭに対するアジレントチップにおいて何の発現データも示されず、ＴＮＦＳＦ１５、ＰＴＰＮ２２、ＩＣＯＳＬＧ、ＩＴＬＮ１、ＺＮＦ３６５、ＬＲＲＫ２及びＰＴＰＮ２の発現を調査した時、疾病グループ間で何の差異も観察されなかった。
【０２８８】
炎症性及び非炎症性ＣＤのＳ状結腸生検を比較した時、ＭＳＴ１-マクロファージ刺激タンパク質; FC -1.58, p=0.0037及び（Ｃ１１ｏｒｆ３０; FC -1.22, p=0.0078）が炎症性生検において下方制御された。
2012533322.tif 000009
2012533322.tif 000010
【０２８９】
ＩＬ-２３経路
図２８はコントロールと比較したＣＤを示し(ＩＬ-２３A/p19; FC +2.32, p=0.000099), （ＴＹＫ２; FC +1.18, p=0.0052）及び（ＪＡＫ２; FC +1.90, p=9.4x10-7）、（ＳＴＡＴ３; FC +2.23, p=0.0004）、（ＩＮＦγ; FC +2.31,  p=0.0019)及び（ＩＬ１７Ｆ; FC +1.11, p<0.0001)がＣＤ生検において著しく上方制御された。炎症性ＣＤ生検を非炎症性ＣＤ生検と比較した時(ＩＬ-２３A/p19; FC +2.11, p=0.000031）、（ＴＹＫ２; FC +1.14, p=0.0052）、（JAK2; FC +1.90, p=0.00003）、（STAT3; FC +1.66, p=0.0002）及び（ＩＮＦγ; FC +2.33, p<0.0001)が炎症性生検において発現が増加された。ＩＬ-２３Ｒ発現においては有意な変化は観察されなかった。
【０２９０】
オートファジー経路
図２９は、ＡＴＧ１６ＬＩ及びオートファジー経路の１９の他の遺伝子及び主要調整因子に対する分析を示す。ＡＴＧ１６ＬＩは、（ＡＴＧ４Ｄ; FC -1.14, p=0.0007）及び（ＡＴＧ３; FC -1.06, p=0.0052)と同様にコントロールと比較して炎症状態にかかわらずＣＤ生検において下方制御された；FC -1.16, p=1.96x10-5。（ＡＴＧ１２; FC +1.1, p=0.041）、（ＡＴＧ１６Ｌ２; FC +1.1, p=0.045）及び（ＬＣ３Ｂ; FC +1.18, p=0.0003)は、コントロールと比較してＣＤ生検においてわずかに上方制御された。
【０２９１】
特定のプローブサブセットによる階層的クラスタ解析：インシリコ免疫反応（ＩＲＩＳ）プローブ
異なる発現を検出するために所定のＩＲＩＳを使用して、上行及び下行結腸からのＣＤ及びコントロール生検を比較した（Abbas等. Genes Immun 2005;6(4):319-31）。Ｂ細胞、単球及びＴ細胞プローブを用い、我々は、教師なしクラスタリングによる生検のＣＤ及びコントロール生検への分離を観察することをができた-カイ二乗検定を用いＢ細胞プローブ（p=0.0006, OR 2.74）、単球プローブ（p<0.0001 OR 5.22）及びＴ細胞プローブ（p=0.0047 OR 2.4) 。単球クラスタでは遺伝子ＣＸＣＬ１及びＭＭＰ１が、ＣＤ生検及びコントロールで顕著に異なって調節された。検査された何れのプローブに対しても、ＴＩクラスタ化は観察されなかった。
【０２９２】
上皮性細胞マーカーによる階層的クラスタ解析
図３０は、１４の上皮性細胞サイトカインのパネル、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２  ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＩＬ-８、ＣＣＬ７（ＣＣＬ２０）ＩＬ-１２Ａ、ＩＬ-２３Ａ、及びＭＤＫを使用した教師なしクラスタ解析を示し（Dwinell等, Gastroenterology 2001; 120(1):49-59; Lee等, J. Immunol. 2008; 181(9):6536-45; Yang等, Gastroenteroloty 1997;113 (4):1214-23）、ＣＤ患者及びコントロールからの結腸生検間に明らかな分離を示した（p<0.00001）。ＴＩ生検を考慮した時、この分離は観察されなかった（p=0.052）。
【０２９３】
マイクロアレイ結果のリアルタイムＰＣＲ確認
生検の組織学的分類、及びマイクロアレイ結果と一致して、コントロールＴＩ生検と比較したＣＤ ＴＩ生検において（p=0.0045）及び非炎症性ＣＤ  ＴＩ生検と比較した炎症性ＣＤ  ＴＩ生検において（p=0.0046）著しく高いＩＬ-８レベルが観察された（表８）。傾向はＳＡＡ１にも観察され、コントロールと比較したＣＤ生検において、及び非炎症性ＣＤ ＴＩ生検と比較した炎症性においてより高く発現された。ＣＤ  ＴＩ生検のコントロールＴＩ生検との比較おいてＤＥＦＡ５及び６発現の差は観察されず（それぞれp=0.73及びp=0.97）、炎症性ＣＤ  ＴＩ生検とが非炎症性ＣＤ  ＴＩ生検を比較した場合も観察されなかった（それぞれp=0.39及びp=0.69）。
2012533322.tif 000011
【０２９４】
考察
この正確に表現型化されたデータセットにおいて、ＣＤ患者及びコントロールの全ゲノム発現プロファイルを調べるためにクラスタ解析を使用した。現在ほとんどデータが入手できないＧＷＡＳからの多数の新規なＣＤ感受性遺伝子に対して、我々はヒト結腸及びＴＩにおける発現プロファイルを調査することができた。
【０２９５】
マイクロアレイ発現データの再現性に対する現在の懸念においては、我々の結果が、Ｓ１００及びＲＥＧ遺伝子ファミリーの増加された発現が観察されたＣＤ患者における過去のマイクロアレイ研究の知見と一致することはまず安心させることである。（Lawrance等. Hum Mol Genet 2001;10(5):445-56）。更に、Costello等の結果と平行して我々は異なって発現される新規なタンパク質を表す多くの配列を観察し、またオントロジー及びインシリコ分析を用いて我々は遺伝子をＣＤ病変形成に関連した機能に特徴付けることができた。（Costello等. PLoS Med 2005;2(8):e199）
【０２９６】
これは、全ゲノム発現がＣＤ患者及びコントロールからの非プールＴＩ内視鏡生検において調査された最初の研究である。クラスタ解析は、ＣＤ患者及びコントロールからの生検を区別することを我々に可能にし、観察された分離は、ＴＩの正常のホメオスタシス-有機酸及び脂質代謝プロセス、及び溶質／カチオン輸送体活性に関与する下方制御された遺伝子クラスタ、及び構造分子活性にグループ化される上方制御された遺伝子クラスタによって推進された。コントロールＴＩ生検と比較したＣＤにおいて最も上方制御された遺伝子は、ジユビキチン又はユビキチン様タンパク質ＦＡＴ１０であった。ユビキチン様タンパク質のファミリーは、真核生物細胞におけるタンパク質分解の重要な経路であるユビキチン・プロテアソーム系の一部として機能する（Madsen等, BMC.Biochem. 2007;8 Suppl 1:S1）。該遺伝子は、第６染色体上の主要組織適合遺伝子複合体遺伝子座に位置し（Fan等, Immunogenetics 1996;44(2):97-103）、確立されたＣＤ感受性遺伝子座及びその発現は、９０％の肝細胞癌及び８０％の結腸癌において増加されることが観察された（Lee等,ジユビキチンはｐ５３の下流の標的であり、ｐ５３欠損細胞においてその発現は増加され染色体不安定性を導く（Ren等, J.Biol.Chem. 21-4-2006;281(16):11413-21; Zhang等., Oncogene 2006;25(16):2318-27）。全ＣＤ生検がコントロールと比較された時、このデータセット全体で、１．５の倍率変化でジユビキチンは上方制御された。更に、肝細胞性癌及び結腸癌におけるジユビキチン発現は、ＩＦＮ-γ及びＴＮＦαの発現増加と相関し、この炎症促進性環境における発癌機構を示唆する（Lukasiak等, Oncogene 9-10-2008;27(46):6068-74）。
【０２９７】
ＴＩ生検にて観察された異なる発現特性は、疾患特異的よりむしろ主に炎症性駆動と考えられ、なぜなら、炎症性及び非炎症性ＣＤ生検が比較された時より非炎症性分析において変化が不明瞭だったからである。これらの調節不全のプローブは、回腸ＣＤを診断してその重症度をグレード化することを助けるための診断用発現チップの基礎を形成することを可能にした。
【０２９８】
ＴＩ分析における別の注目すべき観察は、生検における炎症の程度にかかわらず、ＣＤ患者及びコントロールのαデフェンシン５及び６（ＤＥＦＡ５＆６）の発現にデータが何の違いも示さないことである。これらの結果は、リアルタイムＰＣＲによって確認され、炎症の程度にかかわらずＣＤ患者のＴＩにおいて低減されたＤＥＦＡ５及び６発現が観察された過去のデータと反対である（Wehkamp等. Proc Natl Acad Sci U S A 2005;102(50):18129-34）。
【０２９９】
最近では、Simms等もまた、ＤＥＦＡ５及び６の発現がＴＩ ＣＤ生検で下方調整されることを示した（Simms等. Gut 2008;57(7):903-10）。しかしながら、この下方制御は、炎症特異性であり、おそらく持続的炎症の結果としての上皮層の損失及び上皮及びパネート細胞の減少を反映する。我々のデータセットにおいて、ＣＤ患者のＳ状結腸生検にてＤＥＦＡ５及び６の発現増加が観察され、これは生検の炎症の程度と相関した。以前に我々は、ＵＣ患者のＤＥＦＡ５及び６の結腸発現における増加は、パネート細胞化生により主に媒介され、また、結腸において上方制御されたパネート細胞分化及びＤＥＦＡ５＆６発現に伴う増加は粘膜炎症を永続させ得ることを示した（Noble等. Gut 2008, Oct;57(10):1398-405）。
【０３００】
結腸分析をＵＣにおける我々の過去の発現研究と比較した時、コントロールと比較したそれぞれのＣＤ及びＵＣ分析における異なって調節された遺伝子間に２３％の相同性があった（Noble等. Gut 2008, Oct;57(10):1398-405）。ＣＤ生検で観察された結腸炎症性発現特性はまた、ＵＣ生検で観察されたものと類似し、双方のデータセットにおいて最も異なって調節された遺伝子の一つは血清アミロイドＡ１（ＳＡＡ１）であった。
【０３０１】
ＳＡＡ１はＨＬＡ-関連アポリポ蛋白急性期反応物質であり、炎症、外傷及び異常増殖においてレベルは上昇する。その転写は、炎症促進性サイトカインＩＬ-２、ＩＬ-６、ＴＮＦα及び細菌ＬＰＳにより誘導され、関節リウマチ又はＣＤ等の慢性免疫介在疾患における二次性ＡＡアミロイドーシスの進行に対する主要要因である。（Gutfeld等. J Histochem Cytochem 2006;54(1):63-73）。ＣＤにおいて反応性ＡＡアミロイドーシスは希であり、ＳＡＡ１のより魅力的な役割は、そのＴＮＦαによる誘導のため、疾病活性、重症度、及び潜在性のマーカーとしての抗ＴＮＦ療法に対する応答の予測因子だろう。
【０３０２】
ＣＤでの一般的なＴｈ１及び新規Ｔｈ１７パラダイムを反映する結腸ＣＤ生検における発現の更なる興味深い変化は、非炎症性コントロールと比較した非炎症性結腸ＣＤサンプルにおける胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）のダウンレギュレーションであった。ＴＳＬＰは、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ２分化を促進するその作用を樹状細胞を通して媒介するサイトカインである（Al Shami等 J Exp Med 2005;202(6):829-39）。更には、内因性ＩκＢキナーゼ欠失腸上皮性細胞（ＩＥＣ）のマウスは、低減されたＴＳＬＰ発現を有し、結果として乏しいＴｈ２免疫反応を持ち感染を根絶することが不可能となる（Zaph 等. Nature 2007;446(7135):552-6）。これらのマウスは、樹状細胞誘導Ｔｈ１及びＴｈ１７経路活性化の結果として高度の腸炎も発生し、非炎症性ヒトＣＤ結腸において、ＴＳＬＰのレベルがその後の持続的で過剰な炎症を永続化し得ると推測することは興味深い。
【０３０３】
ＣＤ感受性遺伝子としてのＩＬ-２３Ｒの同定は、研究を異なるＴｈ１７系譜へ集中させた（Cho等. Gastroenterology 2007;133(4):1327-39）。我々はこの炎症促進性の多くの構成要素-ＩＬ-２３Ａ、ＴＹＫ２、ＳＴＡＴ３、ＪＡＫ２、ＩＦＮγ及びＩＬ-１７の発現が、コントロールと比較してＣＤにおいて増加されること、及びこの変化が休止期疾患ではなく活動性疾患により推進されることを観察した。これらの説得力のある遺伝子及び発現データは、ＣＤの病変形成における炎症促進性経路の重要性を強調する。多数の治療標的がこの経路において同定され、ＩＬ-２３のｐ４０サブユニットに対するモノクローナル抗体の臨床試験は有望な早期臨床データを生じた（Sandborn等. Gastroenterology 2008;135(4):1130-41）。
【０３０４】
ＣＤ特異的な感受性遺伝子としてのＡＴＧ１６Ｌ１の発見は、オートファジー経路をＣＤの病変形成に強く関係付けた。オートファジーは高く保存された細胞プロセスであり、細胞は自身の細胞形質の一部を消化し、細胞から毒性物質又は細胞内細菌を取除く通常の生理応答として機能する。経路はアルツハイマー病及びパーキンソン病などの神経変性疾患の病変形成にも関係した。
【０３０５】
我々のデータセットでは、我々が調査した２０のオートファジー遺伝子の内６が調節不全であり、ＣＤにおけるこの経路の重要性を強調する。最近のデータは、自然免疫反応及びオートファジーをＴｏｌｌ-様レセプター（ＴＬＲ）を介して連結させた（Sanjuan等. Nature 2007;450(7173):1253-7）。マクロファージ内でのＴＬＲ誘導ファゴソームは、ＡＴＧ５及びＡＴＧ７媒介の酸性化を誘発し、摂取生物の殺害を強化した。自然免疫系及びオートファジー経路間のこれらの相互作用は、研究者にＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５及びオートファジー間の特異的相互作用について推測させ、そしてこれは活発な研究分野である。例えば、ＮＯＤ１及びＮＯＤ２は、細胞への細菌侵入部位での原形質膜にＡＴＧ１６Ｌ１を動員することが示され、ＮＯＤ２変異細胞ではこの反応は損なわれている（Travassos等, Nat.Immunol. 8-11-2009）。
【０３０６】
全ゲノム発現を解釈する別の方法は、細胞系譜に関係した遺伝子のサブセットを用いてサンプルをクラスタ化する（Abbas等. Genes Immun 2005;6(4):319-31）。我々は、我々のサンプルにおいて主要免疫細胞タイプからの遺伝子によって分離することでこの分析を試み、結腸生検のクラスタリングを観察した。これにより、我々は生検における免疫細胞浸潤を明瞭に同定し最も異なって発現される遺伝子を特徴付けることが出来る。これらの発現特性はまた、未知の機能の遺伝子への洞察を取得するために及び健常及び異なる免疫介在疾患において免疫細胞分化を調べるための資源を提供するために使用されることができる。
【０３０７】
最終的な関心領域は、炎症プロセスにおける腸上皮性細胞（ＩＥＣ）の役割であった。我々が調査した１４のＩＥＣマーカーは、ＣＤ患者とコントロールを分離する優れた能力をクラスタ解析により示し、大部分のケモカインは慢性ＣＤ生検において炎症依存的に上方制御された。これらの結果は、調整されたＩＥＣ炎症性反応において、ケモカインのサブセットＣＸＣＬｓ １-３及びＣＣＬ２０がそれらの受容体と共に慢性ＩＢＤにおいて上方制御されることを観察したPulestonと同僚からの過去のデータと一致した（Puleston等. Aliment Pharmacol Ther 2005;21(2):109-20）。これらのケモカインの上方制御は、既知の白血球ケモカインより著しく高く、結腸炎症におけるＩＥＣの中心的役割を強調する。
【０３０８】
ヒト結腸ＩＢＤ生検、ヒト結腸細胞株及びヒト胎児腸異種移植片で実施された更なる研究は全て、ＣＤ及びＵＣ双方の結腸にて観察される病原性炎症反応を媒介、調整、及び持続させることにおけるＩＥＣの中心的役割を確認した（Dwinell等. Gastroenterology 2001;120(1):49-59; Banks等. J Pathol 2003;199(1):28-35; Kwon等. Gut 2002;51(6):818-26）。
【０３０９】
このデータの強みは、我々が解析した生検の数、サンプルの貯蔵の欠乏、及び生検の炎症状態、及びそれらの解剖学的位置への厳密な注意であった。我々のデータは、また、炎症性腸疾患の過去の発現研究と一致し、ＩＬ-２３及びオートファジー経路の詳細分析と共に優れたヒト結腸及び回腸発現データを提供することにおいて最近の全ゲノム相関解析に多くを加える。
【０３１０】
最後に、この有益なデータセットは、粘膜レベルでのＣＤの病変形成の新規な洞察を得ることを可能にした。データは、ＩＬ-２３及びオートファジー経路の詳細分析と共に優れたヒト結腸及び回腸発現データを提供することにおいて最近の全ゲノム相関解析にかなりを加える。これらの興味深い新しい候補遺伝子並びにＩＥＣ特異的分析の徹底した分析は、更なる調査に値する多くの潜在的治療薬を生成した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２４−３】
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【図２４−７】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２５−６】
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【図２６−１３】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２７−３】
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【図２７−４】
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【図２７−５】
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【図２７−６】
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【図２７−７】
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【図２７−８】
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【図２７−９】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
2012533322000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年4月13日(2012.4.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２５−１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２５−１４】
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【国際調査報告】
2012533322.tif 000113
2012533322.tif 000114
2012533322.tif 000115
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