【手続補正書】
【提出日】令和2年4月22日(2020.4.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号７の核酸配列または配列番号７によりコードされるアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドコンストラクトから発現したポリペプチド生成物を調製する方法であって、
前記ポリヌクレオチドコンストラクト及び前記ポリヌクレオチドコンストラクトから発現したポリペプチド生成物を含む試料に界面活性剤を添加することと、
前記試料を大豆トリプシンインヒビター（ＳＴＩ）ベースのアフィニティークロマトグラフに充填し、第１の溶出緩衝液で前記ポリペプチドを溶出し、第１の溶出された試料を生成することであって、前記充填された試料は有機溶媒を含まない、前記生成することと、
前記第１の溶出された試料をイオン交換及び混合モードクロマトグラフに充填し、少なくとも１Ｍの無機塩を含む第２の溶出緩衝液で前記ポリペプチドを溶出し、第２の溶出された試料を生成することと、
前記第２の溶出された試料を疎水性相互作用クロマトグラフに充填し、少なくとも２ｍＭの塩化ナトリウムを含む第３の溶出緩衝液で前記ポリペプチドを溶出することと、を含み、
それにより、前記ポリペプチド生成物を含む精製された試料を調製する、前記方法。
【請求項２】
前記界面活性剤が、トリトンＸ−１００（ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の溶出緩衝液が０．５Ｍ〜２Ｍのアルギニンを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の溶出緩衝液のｐＨが約５〜５．４である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記イオン交換及び混合モードクロマトグラフが、セラミックヒドロキシアパタイトタイプＩクロマトグラフを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記第２の溶出緩衝液が、少なくとも２Ｍの無機塩を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記無機塩が塩化ナトリウムである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記疎水性相互作用クロマトグラフが、オクチルセファロースクロマトグラフを含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
アニオン交換クロマトグラフでの精製ステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記アニオン交換クロマトグラフが、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）イオン交換膜を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料の１つ以上を、ナノフリースフィルタでの濾過に供することを更に含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記ナノフリースフィルタでの前記濾過が、前記試料の前記ＳＴＩベースのアフィニティークロマトグラフへの充填に先行する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記精製された試料が、約１％未満の、前記ポリヌクレオチドコンストラクトから発現
されたものではない汚染タンパク質を含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリペプチド生成物が前記ポリヌクレオチドコンストラクトを含む細胞において発現される、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞が、培養液１リットルあたり少なくとも１００ｍｇの前記ポリペプチド生成物を産生する条件下で、培養液中で増殖される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞が、培養液１リットルあたり少なくとも２００ｍｇの前記ポリペプチド生成物を産生する条件下で、培養液中で増殖される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記精製された試料が、約５０％を超える前記培養液中で産生された前記ポリペプチド生成物を含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記精製された試料が、前記培養液のリットルあたりの産生量から約１００ｍｇを超える前記ポリペプチド生成物を含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリペプチド生成物が、軽鎖及び重鎖を含む二重鎖ポリペプチドである、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記精製された試料における約２０％〜５０％の前記ポリペプチド生成物が、配列番号５のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
約５％〜９５％の配列番号５のアミノ酸配列からなる前記重鎖が、２つのＯ−結合グリコシル化を有し、約５％〜９５％の配列番号５のアミノ酸配列からなる前記重鎖が、１つのＯ−結合グリコシル化を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記精製された試料における約４０％〜８０％の前記ポリペプチド生成物が、配列番号８のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも約９０％の配列番号８のアミノ酸配列からなる前記重鎖が、１つのＯ−結合グリコシル化を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記精製された試料における約２％〜１２％の前記ポリペプチド生成物が、配列番号９のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、請求項１９〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記精製された試料における約０．１％〜１．５％の前記ポリペプチド生成物が、配列番号１０のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、請求項１９〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記精製された試料における約２％〜８％の前記ポリペプチド生成物が、配列番号１１のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記精製された試料における約３５％〜６０％の前記ポリペプチド生成物が、配列番号４のアミノ酸配列からなる軽鎖を有する、請求項１９〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法により調製されたポリペプチド。
【請求項２９】
医薬的に許容される担体及び二重鎖ポリペプチドのポリペプチド部分を含む医薬組成物であって、
約３５％〜６０％の前記二重鎖ポリペプチドが配列番号４のアミノ酸配列からなる軽鎖を有し、
約２０％〜６０％の前記二重鎖ポリペプチドが配列番号５のアミノ酸配列からなる重鎖を有し、
約４０％〜６０％の前記二重鎖ポリペプチドが配列番号８のアミノ酸配列からなる重鎖を有し、
１０％未満の前記二重鎖ポリペプチドが配列番号９のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、前記医薬組成物。
【請求項３０】
５％未満の前記二重鎖ポリペプチドが配列番号９のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
３％未満の前記二重鎖ポリペプチドが配列番号９のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
約０．１％〜１．５％の前記二重鎖ポリペプチドが配列番号１０のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
約２％〜８％の前記二重鎖ポリペプチドが配列番号１１のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、請求項２９〜３２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
約３０％〜７０％の配列番号５のアミノ酸配列からなる前記重鎖が、２つのＯ−結合グリコシル化を有する、請求項２９〜３３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
約３０％〜７０％の配列番号５のアミノ酸配列からなる前記重鎖が、１つのＯ−結合グリコシル化を有する、請求項２９〜３４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
少なくとも約９０％の配列番号８のアミノ酸配列からなる前記重鎖が、１つのＯ−結合グリコシル化を有する、請求項２９〜３５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
前記製剤が、凍結乾燥される、請求項２９〜３６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
Ｌ−アルギニンＨＣｌまたはＬ−アルギニンアセテートを更に含む、請求項２９〜３７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
スクロースを更に含む、請求項２９〜３８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
マンニトールを更に含む、請求項２９〜３９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
第Ｘａ因子インヒビターでの抗凝固療法を受けている患者における抗凝固を拮抗または阻害するための、請求項２９〜４０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
いくつかの実施形態においては、製剤は凍結乾燥される。いくつかの実施形態においては、組成物はＬ−アルギニンＨＣｌまたはＬ−アルギニンアセテートを更に含む。いくつかの実施形態においては、組成物はスクロースを更に含む。いくつかの実施形態においては、組成物はマンニトールを更に含む。
一実施形態においては、第Ｘａ因子インヒビターでの抗凝固療法を受けている患者において、抗凝固を拮抗または阻害するための方法であって、患者に本開示の実施形態のいずれか１つに記載の医薬組成物を投与することを含む、方法もまた提供される。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
配列番号７の核酸配列または配列番号７によりコードされるアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドコンストラクトから発現したポリペプチド生成物を調製する方法であって、
前記ポリヌクレオチドコンストラクト及び前記ポリヌクレオチドコンストラクトから発現したポリペプチド生成物を含む試料に界面活性剤を添加することと、
前記試料を大豆トリプシンインヒビター（ＳＴＩ）ベースのアフィニティークロマトグラフに充填し、第１の溶出緩衝液で前記ポリペプチドを溶出し、第１の溶出された試料を生成することであって、前記充填された試料は有機溶媒を含まない、前記生成することと、
前記第１の溶出された試料をイオン交換及び混合モードクロマトグラフに充填し、少なくとも１Ｍの無機塩を含む第２の溶出緩衝液で前記ポリペプチドを溶出し、第２の溶出された試料を生成することと、
前記第２の溶出された試料を疎水性相互作用クロマトグラフに充填し、少なくとも２ｍＭの塩化ナトリウムを含む第３の溶出緩衝液で前記ポリペプチドを溶出することと、を含み、
それにより、前記ポリペプチド生成物を含む精製された試料を調製する、前記方法。
（項目２）
前記界面活性剤が、トリトンＸ−１００（ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル）を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記第１の溶出緩衝液が０．５Ｍ〜２Ｍのアルギニンを含む、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記第１の溶出緩衝液のｐＨが約５〜５．４である、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記イオン交換及び混合モードクロマトグラフが、セラミックヒドロキシアパタイトタイプＩクロマトグラフを含む、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目６）
前記第２の溶出緩衝液が、少なくとも２Ｍの無機塩を含む、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記無機塩が塩化ナトリウムである、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記疎水性相互作用クロマトグラフが、オクチルセファロースクロマトグラフを含む、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目９）
アニオン交換クロマトグラフでの精製ステップを更に含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記アニオン交換クロマトグラフが、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）イオン交換膜を含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記試料の１つ以上を、ナノフリースフィルタでの濾過に供することを更に含む、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
前記ナノフリースフィルタでの前記濾過が、前記試料の前記ＳＴＩベースのアフィニティークロマトグラフへの充填に先行する、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記精製された試料が、約１％未満の、前記ポリヌクレオチドコンストラクトから発現
されたものではない汚染タンパク質を含む、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目１４）
前記ポリペプチド生成物が前記ポリヌクレオチドコンストラクトを含む細胞において発現される、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目１５）
前記細胞が、培養液１リットルあたり少なくとも１００ｍｇの前記ポリペプチド生成物を産生する条件下で、培養液中で増殖される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記細胞が、培養液１リットルあたり少なくとも２００ｍｇの前記ポリペプチド生成物を産生する条件下で、培養液中で増殖される、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記精製された試料が、約５０％を超える前記培養液中で産生された前記ポリペプチド生成物を含む、項目１５または１６に記載の方法。
（項目１８）
前記精製された試料が、前記培養液のリットルあたりの産生量から約１００ｍｇを超える前記ポリペプチド生成物を含む、項目１５または１６に記載の方法。
（項目１９）
前記ポリペプチド生成物が、軽鎖及び重鎖を含む二重鎖ポリペプチドである、先行項目のいずれかに記載の方法。
（項目２０）
前記精製された試料における約２０％〜５０％の前記ポリペプチド生成物が、配列番号５のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
約５％〜９５％の配列番号５のアミノ酸配列からなる前記重鎖が、２つのＯ−結合グリコシル化を有し、約５％〜９５％の配列番号５のアミノ酸配列からなる前記重鎖が、１つのＯ−結合グリコシル化を有する、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記精製された試料における約４０％〜８０％の前記ポリペプチド生成物が、配列番号８のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、項目１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３）
少なくとも約９０％の配列番号８のアミノ酸配列からなる前記重鎖が、１つのＯ−結合グリコシル化を有する、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記精製された試料における約２％〜１２％の前記ポリペプチド生成物が、配列番号９のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、項目１９〜２３のいずれか１項に記載の方法。
（項目２５）
前記精製された試料における約０．１％〜１．５％の前記ポリペプチド生成物が、配列番号１０のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、項目１９〜２４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
前記精製された試料における約２％〜８％の前記ポリペプチド生成物が、配列番号１１のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、項目１９〜２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目２７）
前記精製された試料における約３５％〜６０％の前記ポリペプチド生成物が、配列番号４のアミノ酸配列からなる軽鎖を有する、項目１９〜２６のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８）
項目１〜２７のいずれか１項に記載の方法により調製されたポリペプチド。
（項目２９）
医薬的に許容される担体及び二重鎖ポリペプチドのポリペプチド部分を含む医薬組成物であって、
約３５％〜６０％の前記二重鎖ポリペプチドが配列番号４のアミノ酸配列からなる軽鎖を有し、
約２０％〜６０％の前記二重鎖ポリペプチドが配列番号５のアミノ酸配列からなる重鎖を有し、
約４０％〜６０％の前記二重鎖ポリペプチドが配列番号８のアミノ酸配列からなる重鎖を有し、
１０％未満の前記二重鎖ポリペプチドが配列番号９のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、前記医薬組成物。
（項目３０）
５％未満の前記二重鎖ポリペプチドが配列番号９のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、項目２９に記載の医薬組成物。
（項目３１）
３％未満の前記二重鎖ポリペプチドが配列番号９のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、項目２９に記載の医薬組成物。
（項目３２）
約０．１％〜１．５％の前記二重鎖ポリペプチドが配列番号１０のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、項目２９〜３１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目３３）
約２％〜８％の前記二重鎖ポリペプチドが配列番号１１のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、項目２９〜３２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目３４）
約３０％〜７０％の配列番号５のアミノ酸配列からなる前記重鎖が、２つのＯ−結合グリコシル化を有する、項目２９〜３３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目３５）
約３０％〜７０％の配列番号５のアミノ酸配列からなる前記重鎖が、１つのＯ−結合グリコシル化を有する、項目２９〜３４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目３６）
少なくとも約９０％の配列番号８のアミノ酸配列からなる前記重鎖が、１つのＯ−結合グリコシル化を有する、項目２９〜３５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目３７）
前記製剤が、凍結乾燥される、項目２９〜３６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目３８）
Ｌ−アルギニンＨＣｌまたはＬ−アルギニンアセテートを更に含む、項目２９〜３７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目３９）
スクロースを更に含む、項目２９〜３８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目４０）
マンニトールを更に含む、項目２９〜３９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目４１）
第Ｘａ因子インヒビターでの抗凝固療法を受けている患者における抗凝固を拮抗または阻害するための方法であって、前記患者に項目２９〜４０のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。