(57)【要約】本発明は、（１）その翻訳を制御することにより該疾患を予防・治療し得る１以上のｍＲＮＡを選択するステップ、（２）上記（１）で選択したｍＲＮＡから、ｍＲＮＡの翻訳を制御し得る局所的二次構造をとり得る配列が分子内に存在するｍＲＮＡを検索するステップ、（３）上記（２）で抽出された特定のｍＲＮＡにおいて、局所的二次構造をとり得る配列の中から特定の配列を選択するステップ、（４）上記（３）で選択された特定の配列における化合物と相互作用し得る部分構造が、他のｍＲＮＡの翻訳の制御に関わる領域に存在しないか、存在しても翻訳制御し得ないことを確認するステップ、および（５）上記（４）で他のｍＲＮＡの翻訳の制御に関わる領域に存在しないことが確認された特定の配列を含むＲＮＡ鎖と試験化合物とを接触させ、該ＲＮＡ鎖の該二次構造の安定性の変化を測定するステップを含む、特定の疾患を予防・治療し得る化合物のスクリーニング方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定のｍＲＮＡの翻訳を制御し得る化合物のスクリーニングのための、該ｍＲＮＡにおいて特定の局所的二次構造をとり得る配列を選択する方法であって、以下のステップを含む方法。
（１）ｍＲＮＡ検索手段が、入力されたｍＲＮＡデータセットを検索して、ｍＲＮＡの翻訳を制御し得る局所的二次構造をとり得る配列が分子内に存在するｍＲＮＡを抽出するステップ
（２）上記（１）で抽出された１以上のｍＲＮＡから特定のｍＲＮＡを選択するステップ
（３）上記（２）で選択された特定のｍＲＮＡにおいて、局所的二次構造をとり得る１以上の配列の中から特定の配列を選択するステップ
（４）特異性確認手段が、入力されたｍＲＮＡデータセットを検索して、上記（３）で選択された特定の配列における該化合物と相互作用し得る部分構造が、他のｍＲＮＡの翻訳の制御に関わる領域に存在しないか、存在しても翻訳制御し得ないことを確認するステップ
【請求項２】
局所的二次構造がステム−ループ構造である請求項１記載の方法。
【請求項３】
ステム−ループ構造が２以上のステム部分を有し、ステム間に相補性を有しないバブル部分を有する請求項２記載の方法。
【請求項４】
特定のｍＲＮＡの翻訳を制御する化合物が、ステム−ループ構造のループ部分またはバブル部分と相互作用し得るものである請求項２または３記載の方法。
【請求項５】
特定のｍＲＮＡの翻訳を抑制し得る化合物のスクリーニングのための、該ｍＲＮＡにおいて特定の局所的二次構造をとり得る配列を選択する方法であって、以下のステップを含む方法。
（１）ｍＲＮＡ検索手段が、入力されたｍＲＮＡデータセットを検索して、ｍＲＮＡの翻訳を抑制し得る局所的二次構造をとり得る配列が分子内に存在するｍＲＮＡを抽出するステップ
（２）上記（１）で抽出された１以上のｍＲＮＡから特定のｍＲＮＡを選択するステップ
（３）上記（２）で選択された特定のｍＲＮＡにおいて、局所的二次構造をとり得る１以上の配列の中から特定の配列を選択するステップ
（４）特異性確認手段が、入力されたｍＲＮＡデータセットを検索して、上記（３）で選択された特定の配列における該化合物と相互作用し得る部分構造が、他のｍＲＮＡの翻訳の抑制に関わる領域に存在しないか、存在しても翻訳を抑制し得ないことを確認するステップ
【請求項６】
特定の局所的二次構造をとり得る配列が５’非翻訳領域およびコード領域からなる領域内に存在する請求項５記載の方法。
【請求項７】
特定の局所的二次構造をとり得る配列が翻訳開始点およびその近傍からなる領域内に存在する請求項６記載の方法。
【請求項８】
特定のｍＲＮＡが、その翻訳を制御することが１以上の疾患の予防・治療上有効なものである請求項１記載の方法。
【請求項９】
特定の疾患を予防・治療し得る化合物のスクリーニングのための、特定のｍＲＮＡにおける特定の局所的二次構造をとり得る配列を選択する方法であって、以下のステップを含む方法。
（１）その翻訳を制御することにより該疾患を予防・治療し得る１以上のｍＲＮＡを選択するステップ
（２）ｍＲＮＡ検索手段が、上記（１）で選択された１以上のｍＲＮＡのデータセットを検索して、ｍＲＮＡの翻訳を制御し得る局所的二次構造をとり得る配列が分子内に存在するｍＲＮＡを抽出するステップ
（３）上記（２）で抽出された１以上のｍＲＮＡから特定のｍＲＮＡを選択するステップ
（４）上記（３）で選択された特定のｍＲＮＡにおいて、局所的二次構造をとり得る１以上の配列の中から特定の配列を選択するステップ
（５）特異性確認手段が、入力されたｍＲＮＡデータセットを検索して、上記（４）で選択された特定の配列における該化合物と相互作用し得る部分構造が、他のｍＲＮＡの翻訳の制御に関わる領域に存在しないか、存在しても翻訳制御し得ないことを確認するステップ
【請求項１０】
請求項１記載の方法により選択された特定の局所的二次構造をとり得る配列と相互作用して特定のｍＲＮＡの翻訳を制御する化合物のスクリーニング方法であって、該配列を含むＲＮＡ鎖と試験化合物とを接触させ、該ＲＮＡ鎖の該二次構造の安定性の変化を測定するステップを含む方法。
【請求項１１】
以下のステップを含む、特定のｍＲＮＡの翻訳を制御する化合物のスクリーニング方法。
（１）ｍＲＮＡの翻訳を制御し得る局所的二次構造をとり得る配列が分子内に存在するｍＲＮＡを検索するステップ
（２）上記（１）で抽出された特定のｍＲＮＡにおける特定の局所的二次構造をとり得る配列を含むＲＮＡ鎖と試験化合物とを接触させ、該ＲＮＡ鎖の該二次構造の安定性の変化を測定するステップ
【請求項１２】
以下のステップを含む、特定のｍＲＮＡの翻訳を抑制する化合物のスクリーニング方法。
（１）ｍＲＮＡの翻訳を抑制し得る局所的二次構造をとり得る配列が分子内に存在するｍＲＮＡを検索するステップ
（２）上記（１）で抽出された特定のｍＲＮＡにおける特定の局所的二次構造をとり得る配列を含むＲＮＡ鎖と試験化合物とを接触させ、該ＲＮＡ鎖の該二次構造の安定性の変化を測定するステップ
【請求項１３】
以下のステップを含む、特定の疾患を予防・治療し得る化合物のスクリーニング方法。
（１）その翻訳を制御することにより該疾患を予防・治療し得る１以上のｍＲＮＡを選択するステップ
（２）上記（１）で選択したｍＲＮＡから、ｍＲＮＡの翻訳を制御し得る局所的二次構造をとり得る配列が分子内に存在するｍＲＮＡを検索するステップ
（３）上記（２）で抽出された特定のｍＲＮＡにおいて、局所的二次構造をとり得る配列の中から特定の配列を選択するステップ
（４）上記（３）で選択された特定の配列における化合物と相互作用し得る部分構造が、他のｍＲＮＡの翻訳の制御に関わる領域に存在しないか、存在しても翻訳制御し得ないことを確認するステップ
（５）上記（４）で他のｍＲＮＡの翻訳の制御に関わる領域に存在しないことが確認された特定の配列を含むＲＮＡ鎖と試験化合物とを接触させ、該ＲＮＡ鎖の該二次構造の安定性の変化を測定するステップ
【請求項１４】
以下のステップを含む、ｍＲＮＡの翻訳を制御することにより副作用を示す化合物の予測方法。
（１）ｍＲＮＡの翻訳を制御し得る局所的二次構造をとり得る配列が分子内に存在するｍＲＮＡを検索するステップ
（２）上記（１）で抽出されたｍＲＮＡにおける局所的二次構造をとり得る配列を含むＲＮＡ鎖と試験化合物とを接触させ、該化合物の存在下で二次構造が安定化されるＲＮＡ鎖の存在の有無を検出するステップ
【請求項１５】
配列番号１および３８〜４１のいずれかで表される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列から実質的になる核酸。
【請求項１６】
請求項１５記載の核酸において、変異が導入されてバブル内に１以上の塩基対が形成され得る核酸。
【請求項１７】
請求項１５または１６記載の核酸が、プロモーターとレポーター遺伝子との間に挿入された発現カセットを含有する発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１７記載の発現ベクターで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項１９】
請求項１５記載の核酸、請求項１７記載の発現ベクターまたは請求項１８記載の形質転換体を含んでなる、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＰＫＣα、Ａ２０、ＮＯＴＣＨ１およびＮＵＰからなる群より選択されるタンパク質をコードするｍＲＮＡの翻訳を抑制し得る化合物のスクリーニング用キット。
【請求項２０】
Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＰＫＣα、Ａ２０、ＮＯＴＣＨ１およびＮＵＰからなる群より選択されるタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子内に局所的二次構造を形成させることによって、該ｍＲＮＡからの翻訳を抑制し得る化合物を含有してなる、癌予防・治療剤。
【請求項２１】
局所的二次構造が配列番号１および３８〜４１のいずれかで表わされる塩基配列において形成される請求項２０記載の剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、特定のｍＲＮＡ、特にそこにコードされるタンパク質の発現が疾患の発症や進展に関与する遺伝子のｍＲＮＡからの翻訳を制御し得る化合物、特に脂溶性低分子化合物のような医薬品として有利な物性を有する化合物のスクリーニング方法、当該化合物が標的とするｍＲＮＡの標的部位となる塩基配列の選択方法、並びにそのためのツール、特にコンピュータ・ソフトウェア等に関する。
【背景技術】  現在行われている医薬品開発のターゲット分子は、ほとんどがタンパク質である。特定のタンパク質に結合することで何らかの特定の薬効を得ることを期待して医薬品開発が行われている。一方、生体内のタンパク質は、遺伝情報の書き込まれたＤＮＡからｍＲＮＡが合成（転写）され、さらにその情報を基に合成（翻訳）される。つまり特定のｍＲＮＡからの翻訳を制御することで、タンパク質の機能を制御した場合と同じ効果を得られる場合があるはずである。
そのようなｍＲＮＡからの翻訳制御によって薬効を得るという考え方は、まさにアンチセンス医薬品やＲＮＡｉ医薬品開発に見られるコンセプトであり、確かに一定の成功を収めている。たとえば、ＩＳＩＳ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社が開発したＶｉｔｒａｖｅｎｅのように上市されているものも現れてきた。また、近年ＲＮＡｉを用いた医薬品はますます注目されている。未知の部分が多く、手を出しにくいとはいえ、それでも今年になってＡｃｕｉｔｙ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓはＲＮＡｉ医薬品のＰｈａｓｅＩ移行を申請している。しかしながら、特定のｍＲＮＡをターゲットとした創薬研究と言う概念自体はすばらしいものの、現在までに開発されているものはすべて核酸（あるいはその誘導体）医薬品である。核酸医薬品は大量合成、体内動態、代謝安定性に問題があるばかりか、Ｌｉｐｉｎｓｋｉ’ｓ  Ｒｕｌｅにも反しているため、医薬品としての理想形とは到底言いがたい。医薬品としてはやはり低分子化合物が望ましい。
一方、ＲＮＡ分子は低分子化合物を認識しうる高次構造をとることができる。特定の低分子化合物を選択的に認識するＲＮＡの低分子化合物結合モチーフ（ａｐｔａｍｅｒ；ＳＥＬＥＸやｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎと呼ばれるコンビナトリアル手法で、特定の低分子化合物に結合するように開発されたモチーフ）は、これまでに数多く報告されている。また、実際に自然界においてもある種のＲＮＡは、タンパク質の関与なしに天然物や人工の低分子化合物と結合できることがわかってきた。古くから天然由来の物質から発見された化合物を用いて、そのようなＲＮＡに対する低分子医薬品も開発されている。例えば、ジェネティシン、トブラマイシンやカナマイシンに代表されるアミノグリコシド系抗生物質は、ｒＲＮＡに結合してリボソームの機能を阻害する。その結合様式はすでに結晶構造解析などで確認されている。その結果にヒントを得て、さらに同系抗生物質に見られる重篤な副作用を回避するため、Ａｂｂｏｔｔ社はそのｒＲＮＡを標的とした低分子化合物創薬を行った。そして、ＮＭＲを用いたハイスループットスクリーニングによって、ＲＮＡ結合低分子化合物を得ることに成功している（Ｙｕ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２５，４４４４−４４５０（２００３））。また、ウイルスのＲＮＡに対する創薬の試みも複数が報告されている（Ｓｗａｙｚｅ，Ｅ．Ｅ．ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｅｙ，Ｒ．Ｈ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔ．，１２，１３６７−１３７４（２００２））。
しかしながら、そのような試みは「構造と機能を持つ」と考えられているＲＮＡにだけ向けて行われてきた。このアプローチの非常に大きな問題点は、機能を持つＲＮＡを利用したヒトの分子機構は、通常、ヒト体内に普遍的に存在するため、特定の疾患を治療する医薬品とはなりえないという点である。結果的に、種差を利用した抗生物質としてしか開発できない。また、得られた低分子化合物は、既存の、タンパク質をターゲットとした医薬品と著しく異なる様相を呈し、従来型の合成対応が行いにくいという点も問題になっている。
近年、このように「（機能と）構造を持つ」ＲＮＡに対しては創薬が可能であるとわかってきたことから、ｍＲＮＡ上の構造に対する創薬研究も行われている。２１世紀に入って、原核生物においてｍＲＮＡと低分子化合物の相互作用に起因する遺伝子発現制御メカニズム（ｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈ）が実験的に観察されるようになってきた（ＷＯ  ２００４／０２７０３５）。現在までにビタミンＢ１２、チアミンピロリン酸、ＦＭＮ、Ｓ−アデノシルメチオニン、グアニン、アデニン、Ｌ−リシン、グルコサミン−６−リン酸に対して、そのような機構が存在することが報告されている。例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおいてはその全遺伝子発現の最低２％（推定１０％以上）がｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈ様式の支配を受けていると考えられている。また、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのｘｐｔ−ｐｂｕＸ  ｍＲＮＡは、分子量がたった１５１．１３しかないグアニンをｎＭレベルで認識する（Ｋｄ＜５ｎＭ）。ＬｙｓＣ  ｍＲＮＡにいたっては、ＲＮＡの誘導体ですらないＬ−リシン（分子量１４６．１９。Ｋｄ＝１μＭ）を選択的に認識する。それら低分子は、５’ＵＴＲに配位し、ｍＲＮＡの二次および三次構造を変化させることで遺伝子の発現を抑えることができる。また、グルコサミン−６−リン酸に対する機構では、そのｍＲＮＡがリボザイム様に自己切断し、本可逆的にそのｍＲＮＡを不活性化する。これらのメカニズムに対し、天然物を修飾する形で創薬の試みが現在行われている。
一方、実験的にアプタマーのモチーフをｍＲＮＡに導入した人工的な系において、そのモチーフに結合する低分子化合物によって真核生物のタンパク質翻訳抑制を行えることが報告されている。これらの事実は、ｍＲＮＡ分子を標的とする低分子医薬品創薬の可能性を示していると言える。
さらに、２００２年と２００４年には、天然のｍＲＮＡ上の構造に対する創薬の報告が行われている。Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ａｍｙｌｏｉｄ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＰＰ）遺伝子はアルツハイマー病の原因遺伝子であるが、そのｍＲＮＡ上にはある程度安定でローカルな高次構造（モチーフ）があることが知られていた。そこで、そのモチーフを導入したレポーター遺伝子を用いて低分子化合物のスクリーニングを行い、翻訳量を９５％以上抑制するようなヒット化合物を得ている（Ｒｏｇｅｒｓ，Ｊ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１９，７７−８２（２００２））。また、ＶＥＧＦはガン関連の遺伝子であるが、同様にＩＲＥＳ様の高次構造があることが知られていた。そのモチーフを導入したレポーター遺伝子を用いて低分子化合物のスクリーニングを行い、ヒット化合物を得ている（Ｌｉａｎｇｘｉａｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＯＲＴＣ−ＡＡＣＲ，ｐｏｓｔｅｒ＃  １４４（２００４））。
低分子化合物での創薬こそが望まれる。しかし、低分子の結合が期待できる「構造をもつとされている」ｍＲＮＡのバラエティは限られており、対象疾患が非常に限定される。さらに、そのような数的に限定されている構造に対して行われた従来のスクリーニングによって見出されたＲＮＡに結合する低分子化合物は、ほとんどがアミノグリコシド系抗生物質をはじめとする水溶性が高すぎる化合物か、核酸鎖にインターカレーションする化合物である。そのような化合物は体内動態が悪いばかりか、予想し得ない他のＲＮＡと結合する可能性を捨てきれないため、重篤な副作用を引き起こすことが懸念される。加えて、それらの化合物は動態改善や選択性向上のための化学修飾を行いにくく、結果として医薬品開発という見地からは成功しているとはいえない（Ｓｗａｙｚｅ，Ｅ．Ｅ．ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｅｙ，Ｒ．Ｈ．（２００２）上述）。
求められているのは、所望の特定のｍＲＮＡ上にある所望のモチーフにしか結合しない低分子化合物によって、特定のタンパク質翻訳だけを自在に制御することである。それを実現するために、目的のｍＲＮＡ上に従来型の低分子医薬品が選択的に結合し翻訳制御可能なモチーフを見つける必要がある。
【発明の開示】
本発明の目的は、目的のｍＲＮＡに低分子化合物が選択的に結合する局所的二次構造（モチーフ）を探索する手段を提供することであり、当該手段を用いて見出されたモチーフにのみ結合する低分子化合物をリアルな系でスクリーニングし、もって所望のｍＲＮＡの翻訳を制御することによって薬効を発揮する低分子医薬品を提供することである。
本発明者らは、上記の目的を解決するにあたって、あらゆる一本鎖のＲＮＡは自発的に構造化し得ると発想した。それが生体内で機能を持つほど安定でないか、機能をただ発揮していないだけであって（そのような生体内の構造はアウトプットとしての分子生物学的現象として現れないので、これまで分子生物学上注目されることはなく、そのため、それに構造があるかどうかということは意識されなかった）、ＲＮＡは相互作用しやすい生体高分子なので、必ず何らかの構造を持っていると考えられる。そして、ＲＮＡが構造を持つのであれば、その構造は低分子によって安定化されうる。
昨今はセレラ社のデータベースや日本のＨ−ｉｎｖｉｔａｔｉｏｎａｌといったヒトｃＤＮＡライブラリーが利用できる状態であり、ｍＲＮＡの個々の配列データについては容易にデータを得ることができる。そして、いくつかのＲＮＡ二次構造予測プログラムの力を借りることで、ｍＲＮＡの配列データからその高次構造を予測することができる。
しかし、ｍｆｏｌｄ（ＧＣＧ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：７７０６−１０（１９８９）参照）に代表されるような既存のＲＮＡ二次構造予測プログラムでは、有意な時間内に大量のデータを処理できない。さらに、大きな（例えば、３００塩基以上）ＲＮＡ鎖を扱う場合には、その精度は著しく低下する。その理由は、ｍｆｏｌｄがＲＮＡ鎖の何ら物理的特性によって高次構造を予測しているのではなく、ただのパターンマッチングを行っているからである。即ち、遠距離の分子内ＲＮＡ鎖のペアリングによるエントロピー的不利さが軽視され、無理やり遠距離のｓｔｅｍが形成されることが多い。たとえｉｎ  ｖｉｔｒｏの系でそのような遠距離のペアリングがあったとしても、生体内でそのペアリングが存在する可能性は少ない。もちろん、そのようなパターンマッチング手法はローカルな構造（１００塩基以下）を見積もるには十分に意味がある（ローカルな構造の場合にはペアリングによるエントロピーのロスが少ないため）。しかし、ローカルな構造を扱うにあたってはｍｆｏｌｄを使う意味が少なく、出力の形式が網羅的検索に向かない等、欠点が多い。その理由は、ｍｆｏｌｄが二次構造予測に特化された設計で、ｍｆｏｌｄが妥当性がないと判断した構造については出力されないからである。ｍｆｏｌｄの信頼性が１００％ではない以上、ｍｆｏｌｄの出力には取りこぼしがある。新しい検索「手法」の確立が不可欠である。
そこで、本発明者らは、天然のｍＲＮＡ配列データから二次構造をパターンマッチングによって推測しつつ検索し、低分子医薬品開発が行えそうな部位を網羅的に探し出し、実際にその部位に対して創薬を行った。即ち、従来型脂溶性低分子化合物が結合可能な高次構造をヒトｃＤＮＡデータベースより網羅的に検索する「手法」プログラム（「ｍｕｌｔｉｓｌ．ｐｌ」プログラムと命名）を開発した。本プログラムは、変形ダイナミック・プログラミングのアルゴリズムを用いて、望みの特徴をもったモチーフをもれなく網羅的に大量のデータの中から探し出すことができる。
具体的には、所望のモチーフとしてステム−ループ構造を選択し、特定のステム−ループ構造のパラメータを入力し、上記プログラムを実行して、当該構造を分子内にとり得る配列を有するｍＲＮＡのデータを、大量のｍＲＮＡ情報を記録したデータセットから検索・抽出し、抽出されたｍＲＮＡから、対象疾患（例：癌）、該ステム−ループ構造の分子上の存在位置（例：開始コドン近傍）などを指標として、特定のｍＲＮＡ（例：ＳｕｒｖｉｖｉｎをコードするｍＲＮＡ群）および該ｍＲＮＡにおける特定の標的配列を選択し、さらに、選択された標的配列の特異性を、上記プログラムを実行してｍＲＮＡのデータセットから検索して、該標的配列が他のｍＲＮＡの翻訳の制御に関わる領域に存在しないことを確認することにより、低分子化合物が特異的に結合し得る標的配列を得ることに成功した。
本発明者らはまた、上記のようにして得られた特定の配列を含むＲＮＡ鎖を試験化合物と接触させ、試験化合物の存在下および非存在下における該ＲＮＡ鎖のステム−ループ構造の安定性の変化を測定・比較することにより、該ステム−ループ構造を安定化して該配列を有するｍＲＮＡの翻訳を制御し得る化合物をスクリーニングする評価系を構築することに成功した。
本発明者は、これらの知見に基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
［１］  特定のｍＲＮＡの翻訳を制御し得る化合物のスクリーニングのための、該ｍＲＮＡにおいて特定の局所的二次構造をとり得る配列を選択する方法であって、以下のステップを含む方法；
（１）ｍＲＮＡ検索手段が、入力されたｍＲＮＡデータセットを検索して、ｍＲＮＡの翻訳を制御し得る局所的二次構造をとり得る配列が分子内に存在するｍＲＮＡを抽出するステップ
（２）上記（１）で抽出された１以上のｍＲＮＡから特定のｍＲＮＡを選択するステップ
（３）上記（２）で選択された特定のｍＲＮＡにおいて、局所的二次構造をとり得る１以上の配列の中から特定の配列を選択するステップ
（４）特異性確認手段が、入力されたｍＲＮＡデータセットを検索して、上記（３）で選択された特定の配列における該化合物と相互作用し得る部分構造が、他のｍＲＮＡの翻訳の制御に関わる領域に存在しないか、存在しても翻訳制御し得ないことを確認するステップ
［２］  局所的二次構造がステム−ループ構造である上記［１］記載の方法；
［３］  ステム−ループ構造が２以上のステム部分を有し、ステム間に相補性を有しないバブル部分を有する上記［２］記載の方法；
［４］  特定のｍＲＮＡの翻訳を制御する化合物が、ステム−ループ構造のループ部分またはバブル部分と相互作用し得るものである上記［２］または［３］記載の方法；
［５］  特定のｍＲＮＡの翻訳を抑制し得る化合物のスクリーニングのための、該ｍＲＮＡにおいて特定の局所的二次構造をとり得る配列を選択する方法であって、以下のステップを含む方法；
（１）ｍＲＮＡ検索手段が、入力されたｍＲＮＡデータセットを検索して、ｍＲＮＡの翻訳を抑制し得る局所的二次構造をとり得る配列が分子内に存在するｍＲＮＡを抽出するステップ
（２）上記（１）で抽出された１以上のｍＲＮＡから特定のｍＲＮＡを選択するステップ
（３）上記（２）で選択された特定のｍＲＮＡにおいて、局所的二次構造をとり得る１以上の配列の中から特定の配列を選択するステップ
（４）特異性確認手段が、入力されたｍＲＮＡデータセットを検索して、上記（３）で選択された特定の配列における該化合物と相互作用し得る部分構造が、他のｍＲＮＡの翻訳の抑制に関わる領域に存在しないか、存在しても翻訳を抑制し得ないことを確認するステップ
［６］  特定の局所的二次構造をとり得る配列が５’非翻訳領域およびコード領域からなる領域内に存在する上記［５］記載の方法；
［７］  特定の局所的二次構造をとり得る配列が翻訳開始点およびその近傍からなる領域内に存在する上記［６］記載の方法；
［８］  特定のｍＲＮＡが、その翻訳を制御することが１以上の疾患の予防・治療上有効なものである上記［１］記載の方法；
［９］  特定の疾患を予防・治療し得る化合物のスクリーニングのための、特定のｍＲＮＡにおける特定の局所的二次構造をとり得る配列を選択する方法であって、以下のステップを含む方法；
（１）その翻訳を制御することにより該疾患を予防・治療し得る１以上のｍＲＮＡを選択するステップ
（２）ｍＲＮＡ検索手段が、上記（１）で選択された１以上のｍＲＮＡのデータセットを検索して、ｍＲＮＡの翻訳を制御し得る局所的二次構造をとり得る配列が分子内に存在するｍＲＮＡを抽出するステップ
（３）上記（２）で抽出された１以上のｍＲＮＡから特定のｍＲＮＡを選択するステップ
（４）上記（３）で選択された特定のｍＲＮＡにおいて、局所的二次構造をとり得る１以上の配列の中から特定の配列を選択するステップ
（５）特異性確認手段が、入力されたｍＲＮＡデータセットを検索して、上記（４）で選択された特定の配列における該化合物と相互作用し得る部分構造が、他のｍＲＮＡの翻訳の制御に関わる領域に存在しないか、存在しても翻訳制御し得ないことを確認するステップ
［１０］  上記［１］記載の方法により選択された特定の局所的二次構造をとり得る配列と相互作用して特定のｍＲＮＡの翻訳を制御する化合物のスクリーニング方法であって、該配列を含むＲＮＡ鎖と試験化合物とを接触させ、該ＲＮＡ鎖の該二次構造の安定性の変化を測定するステップを含む方法；
［１１］  以下のステップを含む、特定のｍＲＮＡの翻訳を制御する化合物のスクリーニング方法；
（１）ｍＲＮＡの翻訳を制御し得る局所的二次構造をとり得る配列が分子内に存在するｍＲＮＡを検索するステップ
（２）上記（１）で抽出された特定のｍＲＮＡにおける特定の局所的二次構造をとり得る配列を含むＲＮＡ鎖と試験化合物とを接触させ、該ＲＮＡ鎖の該二次構造の安定性の変化を測定するステップ
［１２］  以下のステップを含む、特定のｍＲＮＡの翻訳を抑制する化合物のスクリーニング方法；
（１）ｍＲＮＡの翻訳を抑制し得る局所的二次構造をとり得る配列が分子内に存在するｍＲＮＡを検索するステップ
（２）上記（１）で抽出された特定のｍＲＮＡにおける特定の局所的二次構造をとり得る配列を含むＲＮＡ鎖と試験化合物とを接触させ、該ＲＮＡ鎖の該二次構造の安定性の変化を測定するステップ
［１３］  以下のステップを含む、特定の疾患を予防・治療し得る化合物のスクリーニング方法；
（１）その翻訳を制御することにより該疾患を予防・治療し得る１以上のｍＲＮＡを選択するステップ
（２）上記（１）で選択したｍＲＮＡから、ｍＲＮＡの翻訳を制御し得る局所的二次構造をとり得る配列が分子内に存在するｍＲＮＡを検索するステップ
（３）上記（２）で抽出された特定のｍＲＮＡにおいて、局所的二次構造をとり得る配列の中から特定の配列を選択するステップ
（４）上記（３）で選択された特定の配列における化合物と相互作用し得る部分構造が、他のｍＲＮＡの翻訳の制御に関わる領域に存在しないか、存在しても翻訳制御し得ないことを確認するステップ
（５）上記（４）で他のｍＲＮＡの翻訳の制御に関わる領域に存在しないことが確認された特定の配列を含むＲＮＡ鎖と試験化合物とを接触させ、該ＲＮＡ鎖の該二次構造の安定性の変化を測定するステップ
［１４］  以下のステップを含む、ｍＲＮＡの翻訳を制御することにより副作用を示す化合物の予測方法；
（１）ｍＲＮＡの翻訳を制御し得る局所的二次構造をとり得る配列が分子内に存在するｍＲＮＡを検索するステップ
（２）上記（１）で抽出されたｍＲＮＡにおける局所的二次構造をとり得る配列を含むＲＮＡ鎖と試験化合物とを接触させ、該化合物の存在下で二次構造が安定化されるＲＮＡ鎖の存在の有無を検出するステップ
［１５］  配列番号１および３８〜４１のいずれかで表される塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列から実質的になる核酸；
［１６］  上記［１５］記載の核酸において、変異が導入されてバブル内に１以上の塩基対が形成され得る核酸；
［１７］  上記［１５］または［１６］記載の核酸が、プロモーターとレポーター遺伝子との間に挿入された発現カセットを含有する発現ベクター；
［１８］  上記［１７］記載の発現ベクターで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体；
［１９］  上記［１５］記載の核酸、上記［１７］記載の発現ベクターまたは上記［１８］記載の形質転換体を含んでなる、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＰＫＣα、Ａ２０、ＮＯＴＣＨ１およびＮＵＰからなる群より選択されるタンパク質をコードするｍＲＮＡの翻訳を抑制し得る化合物のスクリーニング用キット；
［２０］  Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＰＫＣα、Ａ２０、ＮＯＴＣＨ１およびＮＵＰからなる群より選択されるタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子内に局所的二次構造を形成させることによって、該ｍＲＮＡからの翻訳を抑制し得る化合物を含有してなる、癌予防・治療剤；および
［２１］  局所的二次構造が配列番号１および３８〜４１のいずれかで表わされる塩基配列において形成される上記［２０］記載の剤
等を提供する。
本発明の方法によれば、従来のｍＲＮＡ標的医薬とは異なり、分子量、水溶性、脂溶性、水素結合点数などの医薬品としての物性においてより有利な低分子化合物をスクリーニングすることが可能となる。また、当該方法は、原則的にあらゆるｍＲＮＡおよび生体内で特異的に作用する他の構造を有するＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）など）をターゲットとした低分子医薬品の創薬に適用可能である。さらに、対象分子に応じて新たにＨＴＳ系を構築する必要のある、タンパク質をターゲットとした創薬とは異なり、リード化合物を得るまでのステップが対象疾患によらずすべて同じであるので、創薬スキームの時間短縮と効率化、コストダウンが可能である。
【図面の簡単な説明】  図１は、ステム−ループＡ（図１Ａ）およびステム−ループＢ（図１Ｂ）の構造を示す。
図２は、ステム−ループＡとステム−ループＢとの相違をダイナミックレンジの概念から模式的に示す。
図３は、本発明の配列選択方法を実行するための装置のシステム構成（図３Ａ）および該装置により実行される処理のフロー（図３Ｂ）を示す。
図４は、特許情報から自動取得したアンチセンス医薬品の作用部位の内訳（図４Ａ）および網羅的にｃＤＮＡデータベースより自動検索処理をして確定したアンチセンス医薬品の作用部位の内訳（図４Ｂ）を示す。
図５は、ｈＣＴ１８９５３に現れるステム−ループＢを示す。
図６は、プラスミド（ｐＥＧＦＰ／ＳＬ３１／ＩＣ、ｐＥＧＦＰ／ＳＬ３１／ＩＳ、ｐＥＧＦＰ／ＳＬ３１／ＩＴ）導入後のＥＧＦＰ翻訳量（図６Ａ左）、ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ量（図６Ａ右）、ルシフェラーゼ翻訳量（図６Ｂ左）およびルシフェラーゼｍＲＮＡ量（図６Ｂ右）を示す。
図７は、対照ｓｉＲＮＡ（ｌａｎｅ  １）或いはＳｕｒｖｉｖｉｎに対するｓｉＲＮＡ（ｌａｎｅ  ２）をＨｅＬａ細胞へ導入し４８時間培養した細胞より抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡに含まれるｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｍＲＮＡ量とＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ量のＲＴ−ＰＣＲの結果（図７Ａ）、および該細胞（ネガティブコントロールは対照ｓｉＲＮＡを導入したもの。ＳｕｒｖｉｖｉｎはＳｕｒｖｉｖｉｎに対するｓｉＲＮＡを導入したもの。）におけるミトコンドリア膜崩壊の検出を示す（図７Ｂ）。図７Ｂにおいて、Ｌｉｇｈｔは明視野における細胞の観察、ＮＩＢＡはＮＩＢＡフィルター（励起波長４７０−４９０ｎｍ、吸収波長５１５−５５０ｎｍ）にての蛍光の観察、ＷＩＧはＷＩＧフィルター（励起波長５２０−５５０ｎｍ、吸収波長５８０ｎｍ）にての蛍光の観察をそれぞれ示す。
図８Ａは、Ｓｕｖ  ＳＬ１、Ｓｕｖ  ＳＬ１ｍ１およびＳｕｖ  ＳＬ１ｍ２の二次構造を模式的に示す。図８Ｂは、ｐＧＬ３／ＳＬ１レポータープラスミドの５’ＵＴＲ構造を示す。図８Ｃは、ｐＧＬ３／Ｓｕｖ  ＳＬ１、ｐＧＬ３／Ｓｕｖ  ＳＬ１ｍ１、或いはｐＧＬ３／Ｓｕｖ  ＳＬ１ｍ２をｐＥＧＦＰ−Ｎ１と同時にＣＨＯ細胞へ導入し、ルシフェラーゼとＥＧＦＰ翻訳量を測定するという実験の概念を示す。
図９は、ｐＧＬ３／ＳＬ１，ｐＧＬ／ＳＬ１ｍ１，ｐＧＬ／ＳＬ１ｍ２を導入した細胞におけるルシフェラーゼ翻訳量（図９Ａ左）、ルシフェラーゼｍＲＮＡ量（図９Ａ右）、ＥＧＦＰ翻訳量（図９Ｂ左）およびＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ量（図９Ｂ右）を示す。
図１０は、ｐＧＬ３／ＰＫＣ  ＳＬ１，ｐＧＬ／ＰＫＣ  ＳＬ１ｍ１，ｐＧＬ／ＰＫＣ  ＳＬ１ｍ２、ｐＧＬ３／Ａ２０  ＳＬ１，ｐＧＬ／Ａ２０  ＳＬ１ｍ１を導入した細胞におけるルシフェラーゼ翻訳量を示す。
図１１は、ｐＧＬ３／ＮＯＴＣＨ１  ＳＬ１，ｐＧＬ／ＮＯＴＣＨ１  ＳＬ１ｍ１を導入した細胞におけるルシフェラーゼ翻訳量（図１１Ａ）、ルシフェラーゼｍＲＮＡ量（図１１Ｂ）を示す。
図１２は、ｐＧＬ３／ＮＵＰ  ＳＬ１，ｐＧＬ／ＮＵＰ  ＳＬ１ｍ１，ｐＧＬ／ＮＵＰ  ＳＬ１ｍ２，ｐＧＬ／ＮＵＰ  ＳＬ１ｍ３を導入した細胞におけるルシフェラーゼ翻訳量（図１２Ａ）、ルシフェラーゼｍＲＮＡ量（図１２Ｂ）を示す。
図１３は、それぞれｈＣＴ２０４２９（図１３Ａ）、ｈＣＴ７８２８（図１３Ｂ）、ｈＣＴ１９６１９１５．１（図１３Ｃ）、ｈＣＴ２２５２３７５（図１３Ｄ）に現れるステム−ループＢを示す。
図１４は、ＫａｎａｍｙｃｉｎのＳｕｖ  ＳＬ１（■）およびＰＫＣ  ＳＬ１（▲）の二次構造安定化効果の濃度依存性を示す。
図１５は、ｐＧＬ３／Ｓｕｖ  ＳＬ１／Ｔ７に導入されたＴ７プロモーター配列（図１５Ａ）、ｐＧＬ３／Ｓｕｖ  ＳＬ１／Ｔ７の転写産物の５’末配列（図１５Ｂ；下線を付した部分はＳｕｖ  ＳＬ１を、＊はＳｕｒｖｉｖｉｎ  ｍＲＮＡの翻訳開始点を、Ｌｕｃ＋はルシフェラーゼの翻訳開始点をそれぞれ示す）、Ｓｕｖ  ＳＬ１、Ｓｕｖ  ＳＬ１ｍ１およびＳｕｖ  ＳＬ１ｍ２の二次構造（図１５Ｃ；ａｕｇは開始コドンを、下線を付した部分は塩基挿入もしくは欠失を、囲い文字は塩基置換をそれぞれ示す）、並びにｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳実験の結果（図１５Ｄ）をぞれぞれ示す。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明は、特定のｍＲＮＡの翻訳を制御し得る化合物のスクリーニングのための、該ｍＲＮＡにおいて特定の局所的二次構造をとり得る配列を選択する方法（以下、「本発明の配列選択方法」と略記する場合がある）を提供する。以下、当該方法をコンピュータに実行させるためのプログラムの構成に言及しながら、当該方法を詳細に説明する。
本発明の配列選択方法（および該方法を実行させるためのプログラム）は、上記［１］に示したように（１）〜（４）のステップを有する。また、該方法を実行させるためのプログラムは、コンピュータを少なくともステップ（１）におけるｍＲＮＡ検索手段およびステップ（４）における特異性確認手段として機能させる命令を含む。
本明細書において「ｍＲＮＡデータセット」とは、任意の数の、任意のｍＲＮＡおよびｐｒｅ−ｍＲＮＡに関し、少なくともその名称（ＩＤ番号などのｍＲＮＡを特定し得る何らかの表記を含む）および塩基配列情報を含む一連のデータをいう。該塩基配列情報は、ｍＲＮＡ自体の配列情報であっても、あるいは対応するｃＤＮＡの配列情報であってもよい。また、本データセットは、これを構成するｍＲＮＡに関し、例えば開始および終止コドンの位置、コードするタンパク質の名称および機能の概要、ゲノム上の位置、スプライシングの数と位置、スプライシング・バリアントの数と名称等の付加的情報をさらに含んでいてもよい。また、これらの情報は随時必要に応じてＲＮＡからＤＮＡまたはその逆、あるいは塩基配列の並び順を正逆に情報が変換されてもかまわない。
本データセットに含まれるｍＲＮＡの数は特に制限されず、例えば、ゲノム情報等から得られるすべての仮想的なｍＲＮＡからなるものであってもよいし（例えば、ヒトの場合、約４００００〜約７００００）、例えば何らかの疾患に関与するｍＲＮＡを標的とする低分子医薬品の探索を目的とする場合であれば、何らかの疾患に関与することが既知のｍＲＮＡ（例えば、そのアンチセンス核酸やｓｉＲＮＡが医薬品として臨床もしくは前臨床段階に進んでいる標的ｍＲＮＡ；例えば、表１−１〜表１−１１に記載されるｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡなど）からなるものであってもよい。あるいは、特定の疾患に関与するｍＲＮＡを標的とする低分子医薬品の探索を目的とする場合は、該疾患に関与することが既知のｍＲＮＡ（例えば、後記実施例１における表２−１〜表２−３に記載されるｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡなど）からなるものであってもよい。また、ゲノム全体であってもよい。
網羅的なヒトｃＤＮＡデータセットとしては、例えば、Ｃｅｌｅｒａ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓより提供される「ＣＨＧＤ＿ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ＿Ｒ２７ｆ．ｆａｓｔａ」、Ｈ−ｉｎｖｉｔａｔｉｏｎａｌより提供される「ｎｕｃ＿ａｌｌ．ｆａ」等が利用可能である。任意の、あるいは特定の疾患に関与することが既知のｍＲＮＡのデータセットとしては、例えば、Ｉｓｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社のアンチセンス医薬品パイプライン情報から得られる、任意の、あるいは特定の疾患に対するアンチセンス医薬品候補核酸の標的ｍＲＮＡを、上記の網羅的なｃＤＮＡデータセットの中から抽出することにより得られるサブデータセット等が挙げられる。
あるいは、予め特定のｍＲＮＡを標的として選択しておいてもよい。この場合、ステップ（１）の後、ステップ（２）をスキップしてステップ（３）に進めばよい。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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ｍＲＮＡデータセットは、キーボード、マウス等の入力手段を用いて逐一入力してもよいが、コンピュータの記憶手段に記憶させておくことが好ましい。該記憶手段としては、ＲＡＭ・ＲＯＭ等の半導体記憶手段を用いても、磁気ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ等の記録媒体を用いてもよい。あるいは、イントラネット／インターネット等の電気通信回線を通じて当該データセットが格納されたサーバーに用時アクセスすることにより、データを取得することもできる。ここで「入力された」とは、ｍＲＮＡデータセットが、ステップ（１）を実行し得るように利用可能な状態におかれたことを意味する。従って、入力の手法は、キーボード等を用いた手動入力に限定されず、上記記憶手段に格納されたｍＲＮＡデータセットをオペレータがマウス等を用いて選択したり、任意の記録媒体やサーバー上のｍＲＮＡデータセットをコンピュータが自動的に選択することによりコンピュータに読み込まれることを包含する。
ｍＲＮＡの翻訳を「制御し得る」とは、翻訳を抑制もしくは促進（増強）する能力を有することをいう。ＲＮＡの二次構造とは、分子内の相補的な配列が局所的に二本鎖をとることにより形成される構造をいい、二本鎖部分をステム（ｓｔｅｍ）、ステムを形成する相補的な配列をつなぐ一本鎖部分をループ（ｌｏｏｐ）という。「局所的」とは、二次構造をとり得る配列の長さが約２００塩基以下、好ましくは約１００〜約２０塩基、より好ましくは約６０〜約３０塩基程度であることを意味する。
本発明で選択される局所的二次構造は、ある種の化合物、好ましくは低分子化合物と相互作用して該構造が安定化されることにより、ｍＲＮＡの翻訳を制御し得るものであれば特に限定されないが、なるべく自由エネルギーの低い（安定な）ものであることが望ましい。モチーフの元々の自由エネルギーが低ければ、そのぶん低分子化合物の結合による必要自由エネルギー低下は少なくてすむ（低分子化合物とモチーフが作る相互作用／水素結合数が少なくてすむ）ので、従来型の脂溶性化合物を創薬できる。また、水素結合点が少ないということは、ｍＲＮＡの他の部位と相互作用しても影響がないので、副作用がでにくいという利点もある。逆にいえば、ここでどんなモチーフを選ぶこともできるが、そのようなモチーフを選んだことで目的の低分子化合物を得にくいし、そのような化合物はほぼ間違いなくリピンスキー・ルールに反する。
好ましくは、本発明で選択される局所的二次構造としては、ステム−ループ（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）構造が例示される。本明細書において「ステム−ループ構造」とは、１以上のステム部分と１以上のループ部分を含み且つ全体としてｍＲＮＡに対して局所的であるあらゆる二次構造を意味する。好ましくは、本発明で選択されるステム−ループ構造は、１以上のステム部分と１個のループ部分を有する構造であり、２以上のステム部分を有する場合は、これらのステムは相補的でない（従ってステムを形成しない）配列で繋がれている。本明細書においては、ステム間に存在する相補的でない部分をバブル（ｂｕｂｂｌｅ）という。
また、本明細書においては、バブルを含まない、１個のステムと１個のループよりなるステム−ループ構造をステム−ループＡといい、２個のステム間に１個のバブル部分を有するステム−ループ構造をステム−ループＢという（以下、ステムおよびバブルが１個ずつ増えるごとにステム−ループＣ、Ｄ、・・・と称する）。ステム部分は完全相補的である必要はなく、一定頻度のミスマッチもしくはＧ−Ｕの塩基対形成（ｗｏｂｂｌｉｎｇ）を許す。また、ループおよびバブル部分も完全に非相補的である必要はなく、一定頻度の塩基対形成を許す。従って、ステム−ループＢ（Ｃ、Ｄ、・・・）は、ミスマッチの多いステム−ループＡであって、ミスマッチがある部分に連続して存在する、特殊なステム−ループＡ構造であると捉えることもできる。
より詳細には、本発明において、ステム−ループＡとは、連続した塩基配列の一部において、任意のＳ１配列（長さｘ塩基）と、Ｓ１配列とほぼ相補的なＳ１’配列との間に、長さｙ塩基のＬ配列が挿入されている配列、即ち５’端から見てＳ１−Ｌ−Ｓ１’の順に並んでいる配列（但し、Ｓ１とＳ１’の相補性は、ｉ個のミスマッチと、Ｇ−Ｕのｗｏｂｂｌｉｎｇを許容するものとする。ここで「ミスマッチ」とは、Ｓ１とＳ１’の配列の中か端にあってステム形成に関与しない余分な塩基をいい、相対する塩基がない場合はミスマッチは１個であり、相対する塩基が水素結合しない場合はミスマッチは２個である）を意味する（図１Ａ参照）。上記の定義において、ｘは５〜２５、ｙは３〜２０、ｉは０〜１０の任意の整数である。
また、ステム−ループＢとは、上記ステム−ループＡにおいて、Ｓ１配列より５’側に長さｂ塩基のＢ配列、長さａ塩基の任意の配列Ｓ２配列があり、Ｓ１’配列より３’側に長さｃ塩基のＢ’配列、Ｓ２配列とほぼ相補的なＳ２’配列があるもので、結果的に５’からＳ２−Ｂ−Ｓ１−Ｌ−Ｓ１’−Ｂ’−Ｓ２’の順に並んでいる配列（但し、Ｓ２とＳ２’の相補性は、ｊ個のミスマッチと、Ｇ−Ｕのｗｏｂｂｌｉｎｇを許容するものとする）を意味する（図１Ｂ参照）。ここでｘは２〜２５、ｙは３〜２０、ａは２〜２５、ｂおよびｃは０〜２５（但し、ｂおよびｃの一方は０でない）、ｉおよびｊは０〜５の任意の整数である。
より好ましくは、本発明で選択される局所的二次構造は、ステム−ループＡまたはステム−ループＢであり、いっそう好ましくはステム−ループＢである。図２は、ステム−ループＡとステム−ループＢとをダイナミックレンジの考え方から比較するためのものである。ここで、Ｗ、Ｓを想定される各種ヘリカーゼ活性の限界とし、その自由エネルギーをΔＧＴＩとする。ここでのヘリカーゼ活性は各種の酵素などが、場合場合によって発揮するヘリカーゼ活性の総合的な活性であり、したがってΔＧＴＩは少なくとも温度とｍＲＮＡ上の位置の関数である。生体内においては、ΔＧＴＩよりも自由エネルギーが高い構造はほどかれてタンパク質が合成される。自然界に見られるステム−ループの安定性（ΔＧＴＩ）は間違いなくヘリカーゼ活性（ＳあるいはＷ）より高い。ステム−ループＢでは、図１のステムＢは形成されておらず、従って、その自由エネルギーはステム−ループＡのそれよりも高いと考えられる。低分子医薬品を作用させることによってステム−ループの安定性が増してΔＧＳが低下し、ヘリカーゼ活性よりも安定化することによりタンパク質への翻訳が阻害される。例えば、ステム−ループＡはループ部位への低分子医薬品の結合によって安定化される。一方、ステム−ループＢは、バブル部位への低分子医薬品の結合によってさらなるステム（ステムＢ）が形成されるため、ΔＧＳの下げ幅（ダイナミックレンジ）がステム−ループＡのそれよりも大きい。ダイナミックレンジが大きいければ、ステム−ループの選択の幅が広がるだけでなく、ヘリカーゼ活性を乗り越える可能性が高くなる。即ち、ヘリカーゼ活性が低い場合（Ｗ）にはステム−ループＡでも制御できるが、ヘリカーゼ活性が高い場合（Ｓ）にはステム−ループＢでしか制御できないこともありえる。
図３Ａは、本発明の配列選択方法を実行するための装置のシステム構成図であり、図３Ｂは該装置により実行される処理のフローである。
ステップ（１）局所的二次構造をとり得る配列を有するｍＲＮＡの抽出
まず、キーボードなどの入力手段から、オペレータが取得したい局所的二次構造のパラメータが入力される。例えば、局所的二次構造がステム−ループＡである場合には、上記変数ｘ、ｙおよびｉの数値を、ステム−ループＢの場合は、上記変数ｘ、ｙ、ａ、ｂ、ｃ、ｉおよびｊの数値が入力される。
中央処理装置は、メインメモリ中の制御プログラムの指令を受け、記憶手段（ファイル装置）に記憶されているｍＲＮＡデータセットの塩基配列情報を検索し、入力された変数の組み合わせを満足するすべての部分塩基配列を抽出する。その結果は、記憶手段に抽出データファイル１として記録されるほか、ディスプレイ等の表示手段に表示および／またはプリンタ等の出力手段から出力され得る。記録／表示および／または出力の様式は特に限定されないが、例えば、ｍＲＮＡごとに、局所的二次構造が視覚的に認識しやすいような形式で出力されることが好ましい。１つのｍＲＮＡ内に、所望の局所的二次構造をとり得る配列が１以上存在する場合は、例えば、より５’側の配列から順に記録／表示／出力され得る。また、同じ位置に複数の配列が見つかった場合には、それらをすべて任意の順に記録／表示／出力される。好ましくは、抽出された配列の存在位置に関する情報（例えば、ｍＲＮＡの５’端を１とした始点および終点の塩基の位置番号、翻訳開始コドンを＋１とした始点および終点の塩基の位置番号等）も同時に記録／表示／出力される。
尚、入力された変数値の組み合わせを満足する局所的二次構造が入力されたｍＲＮＡデータセット中に存在しなかった場合、あるいは自動的に、変数値を変更入力して同様の処理を繰り返すことができる。中央処理装置は、メインメモリ中の制御プログラムの指令を受け、オペレータに変数値の変更を要求する画面を表示手段により表示させることができる。
ステップ（２）特定のｍＲＮＡの選択
ステップ（２）では、ステップ（１）で抽出された１以上のｍＲＮＡから特定のｍＲＮＡが選択される。当該ステップは、記録／表示／出力された１以上のｍＲＮＡから、オペレータが使用目的（例えば、創薬標的とする場合には対象疾患など）等を考慮して主観的に選択することによって実行され得る。あるいは、中央処理装置が、メインメモリ中の制御プログラムの指令を受け、入力された選択条件データに基づき、記憶手段に格納された選択ルールファイルに予め記録された選択ルールの中から適用すべき選択ルールを読み出し、当該選択ルールに基づいて自動的に特定のｍＲＮＡを選択することによっても実行され得る。後者の場合、１個の特定のｍＲＮＡが選択されてもよいし、複数のｍＲＮＡが選択ルールに基づいて選出されてもよい。選択されたｍＲＮＡは上記の記録／表示／出力手段により記録／表示／出力され得る。入力される選択条件としては、例えば、使用目的（例：対象疾患の種類など）の他、局所的二次構造をとり得る配列の存在位置、配列の数などが挙げられる。即ち、２以上のｍＲＮＡがそれぞれ異なる位置に所望の局所的二次構造をとり得る配列を有する場合に、よりｍＲＮＡの翻訳制御に寄与し得ると予測される位置に該配列を有するｍＲＮＡが優先される。また、所望の局所的二次構造をとり得る配列を、ｍＲＮＡの翻訳制御への寄与が大きいと予測される位置に１つだけ有するｍＲＮＡと複数有するｍＲＮＡがある場合、前者のｍＲＮＡが優先される。従って、本ステップは次のステップ（３）と同時並行的に行われてもよい。
尚、ステップ（１）で抽出されたｍＲＮＡが１個の場合には本ステップを省略してステップ（３）に進めばよい。また、当該ｍＲＮＡが上記選択条件に照らして標的とすることが不適当であるとオペレータあるいはコンピュータが判断した場合には、変数値を変更してステップ（１）を再度実行することができる。
ステップ（３）局所的二次構造をとり得る特定の配列を選択するステップ
ステップ（３）では、ステップ（２）で選択された特定のｍＲＮＡにおいて、局所的二次構造をとり得る１以上の配列の中から特定の配列が選択される。当該ステップは、選択された特定のｍＲＮＡの分子内に存在する、所望の局所的二次構造をとり得る１以上の配列の中から、オペレータが、各配列の存在位置などを考慮して、より翻訳制御に寄与し得るものを主観的に選択することによって実行され得る。あるいは、中央処理装置が、メインメモリ中の制御プログラムの指令を受け、入力された選択条件データに基づき、記憶手段に格納された選択ルールファイルに予め記録された選択ルールの中から適用すべき選択ルールを読み出し、当該選択ルールに基づいて自動的に特定の配列を選択することによっても実行され得る。後者の場合、１個の特定の配列が選択されてもよいし、複数の配列が選択されてもよい。また、複数の配列が選択ルールに基づいて選出されてもよい。選択された配列は上記の記録／表示／出力手段により記録／表示／出力され得る。入力される選択条件としては、例えば、局所的二次構造をとり得る配列の存在位置などが挙げられる。即ち、２以上の配列がそれぞれ異なる位置に所望の局所的二次構造をとり得る場合に、よりｍＲＮＡの翻訳制御に寄与し得ると予測される位置に存在する配列が優先される。上述したように、当該選択条件は２以上のｍＲＮＡから特定のｍＲＮＡを選択する際の条件ともなるので、本ステップはステップ（２）と同時並行的に行うこともできる。
ｍＲＮＡの翻訳抑制への寄与が大きいと予測される位置としては、例えば、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、５’ＵＴＲとコード領域（ＣＤＳ）にまたがる領域、好ましくは翻訳開始点およびその近傍等が挙げられる。一方、ｍＲＮＡの翻訳増強への寄与が大きいと予測される位置としては、ｍＲＮＡの分解に関わる領域、例えばＲＮＡ分解酵素の標的配列を含む領域等が挙げられる。
ステップ（４）選択された特定の配列の特異性の確認
ステップ（４）では、ステップ（３）で選択された特定の配列が特異的であるか、即ち、該配列のある部分と相互作用して該ｍＲＮＡの翻訳を制御する化合物が、他のｍＲＮＡの翻訳を制御しないかどうかが検定される。当該ステップは、選択された特定の配列中の該化合物と相互作用し得る部分構造が、他のｍＲＮＡの翻訳の制御に関わる領域に存在しないか、存在しても現実に翻訳制御し得ないことを確認することにより行われる。また、当該選択条件は２以上のｍＲＮＡから特定のｍＲＮＡを選択する際の条件、あるいは特定の配列を選択する際の条件ともなるので、本ステップはステップ（２）あるいはステップ（３）と同時並行的に行うこともできる。
まず、キーボードなどの入力手段から、選択された配列のうち、化合物の結合による局所的二次構造の安定化への寄与が大きいと予測される部分の塩基配列が入力される。例えば、局所的二次構造がステム−ループＡである場合にはループ部分、ステム−ループＢの場合は、バブル部分またはループ部分がそれぞれ好ましく挙げられるが、それらに限定されるものではない。その他、ステム−ループＡの場合には、Ｓ１配列の長さｘ（選択された配列の数値以下）およびミスマッチの数ｉ（任意に選択）の数値が入力される。また、ステム−ループＢの場合には、Ｓ１配列とＳ２配列の長さの合計ｘ＋ａ（選択された配列の数値以下；但し、ｘ、ａの各値はとり得る数値範囲内で任意に選択される）、ミスマッチｉ、ｊの各値（それぞれ任意に選択）およびループの長さｙの数値がさらに入力される。尚、ループまたはバブル部分に隣接するステム先端の塩基を、該ループまたはバブル部分に含めて配列を入力することもできる。この場合、その分だけｘおよびｘ＋ａの数値（最大値）は減少する。
中央処理装置は、メインメモリ中の制御プログラムの指令を受け、記憶手段（ファイル装置）に記憶されているｍＲＮＡデータセットの塩基配列情報を検索し、入力された塩基配列および変数の組み合わせを満足するすべての部分塩基配列を抽出する。その結果は、記憶手段に抽出データファイル２として記録されるほか、ディスプレイ等の表示手段に表示および／またはプリンタ等の出力手段から出力される。記録／表示および／または出力の様式は特に限定されないが、例えば、ｍＲＮＡごとに、局所的二次構造が視覚的に認識しやすいような形式で出力されることが好ましい。１つのｍＲＮＡ内に、所望の局所的二次構造をとり得る配列が１以上存在する場合は、例えば、より５’側の配列から順に記録／表示／出力され得る。好ましくは、抽出された配列の存在位置に関する情報（例えば、ｍＲＮＡの５’端を１とした始点および終点の塩基の位置番号、翻訳開始コドンを＋１とした始点および終点の塩基の位置番号、５’ＵＴＲ，ＣＤＳ，３’ＵＴＲの区別等）も同時に記録／表示／出力される。
尚、上記の各変数を数値幅を持たせて入力した場合、中央処理装置は、メインメモリ中の制御プログラムの指令を受け、考えられるすべての変数値の組み合わせについて、ｍＲＮＡデータセットの塩基配列情報の検索を繰り返して実行し、各々の組み合わせを満足する局所的二次構造を抽出して、記録／表示／出力手段に記録／表示／出力させることができる。
抽出されたｍＲＮＡのうち、標的ｍＲＮＡ以外のｍＲＮＡの翻訳の制御に関わる領域、例えば、局所的二次構造をとることにより翻訳が抑制され得る領域としては、５’ＵＴＲ、５’ＵＴＲとＣＤＳにまたがる領域、好ましくは翻訳開始点およびその近傍等が挙げられ、一方、局所的二次構造をとることにより翻訳が増強され得る領域としては、ｍＲＮＡの分解に関わる領域、例えばＲＮＡ分解酵素の標的配列を含む領域等が挙げられる。
上記した本発明の配列選択方法を、その翻訳を制御することが１以上の疾患の予防・治療上有効なｍＲＮＡについて実施すれば、該方法により選択される、当該ｍＲＮＡにおける特定の局所的二次構造をとり得る配列は、当該疾患に対して予防・治療活性を有する化合物をスクリーニングするための有用な標的モチーフとなる。本発明の配列選択方法が、特定の疾患を予防・治療し得る化合物のスクリーニングのために、特定のｍＲＮＡにおける特定の局所的二次構造をとり得る配列を選択するものである場合には、上記ステップ（１）を実行するに際し、その翻訳を制御することにより目的とする疾患を予防・治療し得る１以上のｍＲＮＡのデータセットを予め作成しておくことが好ましい。そのようなｍＲＮＡのデータセットの作成方法としては、例えば、上記したように、Ｉｓｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社のアンチセンス医薬品パイプライン情報から得られる、特定の疾患（例えば、癌）に対するアンチセンス医薬品候補核酸の標的ｍＲＮＡを、網羅的なヒトｃＤＮＡデータセット（例えば、Ｃｅｌｅｒａ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓより提供される「ＣＨＧＤ＿ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ＿Ｒ２７ｆ．ｆａｓｔａ」、Ｈ−ｉｎｖｉｔａｔｉｏｎａｌより提供される「ｎｕｃ＿ａｌｌ．ｆａ」等）の中から抽出する方法などが挙げられる。
本発明の配列選択方法は、ｍＲＮＡに限定されず、局所的二次構造をとり得るすべてのＲＮＡを標的とすることができる。ｍＲＮＡ以外のＲＮＡ、即ちタンパク質に翻訳されないＲＮＡ（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ；ｎｃＲＮＡ）の中で、特定の疾患の予防・治療の標的とすることが期待されるものとしては、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられる。
ｍｉＲＮＡと呼ばれる１８〜２５塩基程度の小さなＲＮＡは、線虫において幼生の第１期から第２期への移行に必要であり、標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに結合することによってその発現を翻訳段階で抑制することが明らかにされて以来、注目を集めるようになった。現在までに２００種類以上のｍｉＲＮＡが報告されており、造血幹細胞や神経幹細胞の分化、癌や白血病などへの関与が示唆されている。ｍｉＲＮＡはｓｉＲＮＡと同様なメカニズムで遺伝子発現の抑制を行うが、標的であるｍＲＮＡ配列に完全に結合するｓｉＲＮＡに対して、ｍｉＲＮＡは標的のｍＲＮＡには部分的にしか結合しないので、ｍＲＮＡは分解されることはなく、物理的にタンパク質への翻訳抑制を引き起こすと考えられている。また、ｍｉＲＮＡは、非翻訳領域のｍＲＮＡを標的にしているので、遺伝子発現の調節に関与する領域に結合して影響を与えると考えられている。
ｍｉＲＮＡはステム−ループ構造を有する前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）からｄｉｃｅｒと呼ばれる酵素で切断されて生成する。従って、低分子化合物によって前駆体のステム−ループ構造を安定化してｍｉＲＮＡの生成を抑制すれば、当該ｍｉＲＮＡの標的ｍＲＮＡの翻訳抑制が妨げられ、結果として該ｍＲＮＡの翻訳を促進することができる。
Ｌｉｍ，Ｌ．らは独自のｍｉＲＮＡ探索ソフトウェアを構築し、ヒトゲノム上に２００〜２５５個のｍｉＲＮＡ遺伝子が存在すると予測している。
本発明者らが開発した、本発明の配列選択方法を実行させるためのプログラムは、所望の局所的二次構造、好ましくはステム−ループ構造を、ｍＲＮＡデータセットの代わりにゲノムＤＮＡの配列を検索して抽出することにより、ゲノム上に存在する新規なｍｉＲＮＡ遺伝子を見出すことができる。
従って、本発明はまた、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡをコードするゲノムＤＮＡの検出方法であって、ゲノムＤＮＡ検索手段が、入力されたゲノムＤＮＡデータセットを検索して、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡにおいて保存されている局所的二次構造、好ましくはステム−ループ構造をとり得る配列を含むゲノムＤＮＡ配列を検出する方法を提供する。
具体的には、たとえばＣｅｌｅｒａ社全ヒトゲノム配列「ＣＨＧＤ＿ｇｅｎｅｓ＿Ｒ２７ｆ．ｆａｓｔａ」などのプラス鎖とマイナス鎖に対し、文献情報などから得られるステム−ループ情報を元に変数を設定した後、「ｍｕｌｔｉｓｌ．ｐｌ」を用いた網羅的検索をかける。
本発明はまた、既知のｍｉＲＮＡについて、その前駆体からの成熟体の生成を抑制し得る化合物のスクリーニングのための、該前駆体において特定の局所的二次構造をとり得る配列を選択する方法を提供する。当該方法は以下のステップ：
（１）相同性検索手段が、入力されたｍｉＲＮＡの塩基配列とゲノムＤＮＡデータセットを対比検索して該ｍｉＲＮＡをゲノム上にマッピングするステップ、
（２）ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ検索手段が、ｍｉＲＮＡ配列近傍のゲノムＤＮＡデータを検索して、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ内に存在するｍｉＲＮＡの生成を抑制し得る局所的二次構造、好ましくはステム−ループ構造をとり得る配列を抽出するステップ、
（３）上記（２）で抽出された、局所的二次構造をとり得る１以上の配列の中から特定の配列を選択するステップ、および
（４）特異性確認手段が、入力されたｍＲＮＡデータセットを検索して、上記（３）で選択された特定の配列における該化合物と相互作用し得る部分が、ｍＲＮＡの翻訳の制御に関わる領域に存在しないことを確認するステップを含むことを特徴とする。
ここで相同性検索手段としては、公知の核酸の相同性検索ソフトウェア（例えば、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）ＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＦＡＳＴＡプログラム等）を用いることができる。また、ゲノムＤＮＡデータセットとしては、例えば、Ｃｅｌｅｒａ社が提供する全ヒトゲノムデータを用いることができる。
ステップ（２）は、上記したｍＲＮＡに関する本発明の配列選択方法におけるステップ（１）と同様にして、記憶手段に格納されるデータファイルをゲノムＤＮＡデータセットに変更することによって実施することができる。
ステップ（３）は、ステップ（２）で抽出された局所的二次構造をとり得る１以上の配列の中から、Ｄｉｃｅｒによるｐｒｅ−ｍＲＮＡの切断を有意に阻害し得る位置に存在する配列を選択することにより実施される。かかる選択は、オペレータが目視して行うこともできるし、上記したｍＲＮＡに関する本発明の配列選択方法におけるステップ（３）と同様に、中央処理装置が、メインメモリ中の制御プログラムの指令を受け、記憶手段に格納された選択ルールファイルから適当な選択ルールを読み出し、該選択ルールに基づいて自動的に特定の配列を選択することによっても行われ得る。
ステップ（４）は、上記したｍＲＮＡに関する本発明の配列選択方法におけるステップ（４）と同様にして行うことができる。
ｍｉＲＮＡの標的遺伝子が次々と明らかにされてきており、特定の疾患に関与するｍＲＮＡの翻訳を制御しているｍｉＲＮＡも既に知られている。そのようなｍｉＲＮＡとしては、例えば、ｍｉＲ１５／ｍｉＲ１６（Ｃａｌｉｎ  ＧＡ，Ｄｕｍｉｔｒｕ  ＣＤ，Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｍ，Ｂｉｃｈｉ  Ｒ，Ｚｕｐｏ  Ｓ，Ｎｏｃｈ  Ｅ，Ａｌｄｌｅｒ  Ｈ，Ｒａｔｔａｎ  Ｓ，Ｋｅａｔｉｎｇ  Ｍ，Ｒａｉ  Ｋ，Ｒａｓｓｅｎｔｉ  Ｌ，Ｋｉｐｐｓ  Ｔ，Ｎｅｇｒｉｎｉ  Ｍ，Ｂｕｌｌｒｉｃｈ  Ｆ，Ｃｒｏｃｅ  ＣＭ．Ｆｒｅｑｕｅｎｔ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ  ｇｅｎｅｓ  ｍｉＲ１５  ａｎｄ  ｍｉＲ１６  ａｔ  １３ｑ１４  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００２；９９：１５５２４−９．）、ｍｉＲＮＡ２３（Ｋａｗａｓａｋｉ  Ｈ，Ｔａｉｒａ  Ｋ．Ｈｅｓｌ  ｉｓ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ−２３  ｄｕｒｉｎｇ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ−ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＴ２  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ．２００３；４２３：８３８−４２）、ｍｉＲ−１８１（Ｃｈｅｎ  ＣＺ，Ｌｉ  Ｌ，Ｌｏｄｉｓｈ  ＨＦ，Ｂａｒｔｅｌ  ＤＰ．ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００４；３０３：８３−６）、ｂｉｃ（Ｔａｍ  Ｗ，Ｂｅｎ−Ｙｅｈｕｄａ  Ｄ，Ｈａｙｗａｒｄ  ＷＳ．ｂｉｃ，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｇｅｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  ｐｒｏｖｉｒａｌ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｖｉａｎ  ｌｅｕｋｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ，ｉｓ  ｌｉｋｅｌｙ  ｔｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｉｔｓ  ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９７；１７：１４９０−５０２）などが挙げられる。
別の本発明は、特定のｍＲＮＡの翻訳を制御する化合物のスクリーニング方法を提供する。当該方法は、以下のステップ：
（１）ｍＲＮＡの翻訳を制御し得る局所的二次構造をとり得る配列が分子内に存在するｍＲＮＡを検索するステップ、および
（２）上記（１）で抽出された特定のｍＲＮＡにおける特定の局所的二次構造をとり得る配列を含むＲＮＡ鎖と試験化合物とを接触させ、該ＲＮＡ鎖の該二次構造の安定性の変化を測定するステップを含むことを特徴とする。
ここで「翻訳を制御し得る」、「局所的二次構造」は、それぞれ上記したｍＲＮＡに関する本発明の配列選択方法におけるそれらと同義である。好ましくは、局所的二次構造はステム−ループ構造であり、より好ましくはステム−ループＡまたはステム−ループＢ、いっそう好ましくはステム−ループＢである。
ステップ（１）は、結果として、ｍＲＮＡの翻訳を制御し得る局所的二次構造をとり得る１以上の配列が分子内に存在する１以上のｍＲＮＡが抽出され得る限り、いかなる手法を用いて行ってもよく、必ずしもコンピュータ等による電算処理を介して行う必要はない。しかしながら、大量のｍＲＮＡのデータセットを迅速に検索して所望の局所的二次構造を有するｍＲＮＡを抽出するためには、上記したｍＲＮＡに関する本発明の配列選択方法のステップ（１）と同様の方法で実施されることが望ましい。
従って、好ましい実施態様においては、本発明のスクリーニング方法は、上記したｍＲＮＡに関する本発明の配列選択方法により選択された特定の局所的二次構造をとり得る配列を含むＲＮＡ鎖と、試験化合物とを接触させ、該ＲＮＡ鎖の該二次構造の安定性の変化を測定する。
ステップ（１）で抽出された、ｍＲＮＡの翻訳を制御し得る局所的二次構造をとり得る１以上の配列が分子内に存在する１以上のｍＲＮＡの中から、特定のｍＲＮＡと特定の局所的二次構造をとり得る配列を選択する方法も特に限定されないが、好ましくは、上記したｍＲＮＡに関する本発明の配列選択方法におけるステップ（２）および（３）と同様にして行うことができる。
選択された特定のｍＲＮＡにおける特定の局所的二次構造をとり得る配列を含むＲＮＡ鎖としては、当該ｍＲＮＡそのものや、当該配列情報に基づいて自体公知の手法により合成されたＲＮＡ鎖などが例示される。
該ＲＮＡ鎖における該二次構造の安定性の変化の測定は、公知のいかなる方法を用いて行ってもよいが、例えば、後述するレポーターアッセイ系を用いた方法や、ＵＶ、ＣＤ、ＮＭＲを用いたＲＮＡ構造変化の解析、ｉｎ−ｌｉｎｅ  ｐｒｏｂｉｎｇ法による解析、ＲＮａｓｅＨ耐性率を測定する方法等により行うことができる。
ＲＮＡの構造変化を解析する方法としては、例えば、マイクロプレートの各ウェルにＲＮＡ鎖を含んだ適当な緩衝液を加え、そこに試験化合物をさらに添加して、試験化合物の非存在下ではＲＮＡの二次構造がほどける温度にプレートを加熱し、各ウェルについて、常法に従ってＵＶスペクトル、円偏光２色性（ＣＤ）スペクトルもしくはＮＭＲスペクトル解析を行う。スペクトルに変化のなかったウェルに含まれる試験化合物を該ＲＮＡ鎖における二次構造を安定化する化合物として選択する。
ＲＮＡの構造変化を解析する別の好ましい方法として、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用する方法が挙げられる。即ち、ＲＮＡ鎖の末端の一方を蛍光物質（例：ＦＡＭ、ＶＩＣ等）で、他方を消光物質（例：ＴＡＭＲＡ等）でそれぞれ標識し、これに試験化合物を添加する。ＲＮＡ鎖がほどけた状態であれば蛍光物質は消光物質の影響を受けずに蛍光が検出されるが、ＲＮＡ鎖が二次構造をとると両末端が接近してクエンチングが起こり、蛍光が減少（消失）する。したがって、試験化合物の存在下で蛍光強度が減少すれば、該試験化合物を該ＲＮＡ鎖における二次構造を安定化する化合物として選択することができる。
試験化合物としては特に制限はなく、例えばタンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これらの化合物は新規なものであってもよいし、公知のものであってもよい。しかしながら、本発明のスクリーニング方法は、医薬品としてより適した化合物のスクリーニングのために特に好ましく用いられ得るので、試験化合物としては、低分子化合物、特に脂溶性の低分子化合物、具体的には、分子量が５００以下、ＣｌｏｇＰが５以下、水素結合ドナーの数が５以下、水素結合アクセプターの数が１０以下の化合物などが、好ましく挙げられる。
レポーターアッセイ系を用いた方法としては、例えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：４５５１８−２８（２００２）に記載の方法等が挙げられる。即ち、特定のｍＲＮＡにおける特定の局所的二次構造をとり得る配列に対応するＤＮＡがプロモーターと第一のレポーター遺伝子の間に挿入され、且つ第一のレポーター遺伝子の下流に内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）が配置され、さらにその下流に第二のレポーター遺伝子が配置された発現ベクターを作成して、適当な宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ７細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞等）に導入して形質転換体を得る。レポーター遺伝子としては、公知慣用のものを用いることができ、例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ遺伝子などが挙げられる。プロモーターとしては、宿主細胞で機能し得るものであれば特に制限はなく、例えば、ＣＨＯ細胞などの動物細胞を用いる場合には、動物もしくは動物ウイルス由来の構成的遺伝子のプロモーターを用いることができる。遺伝子導入方法も公知慣用の方法、例えば、リポフェクショシ法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法などを用いて行うことができる。また、上述の遺伝子導入方法を用いて作製した安定株を用いて解析することもできる。
得られた形質転換体の培地に試験化合物を添加して通常の培養条件下で一定期間培養した後に、各レポーター遺伝子の発現量を測定する。試験化合物が特定のｍＲＮＡにおける特定の局所的二次構造をとり得る配列と相互作用してこれを安定化していれば、第一のレポーター遺伝子の発現は抑制されるが、リボソームはＩＲＥＳを介して第二のレポーター遺伝子の翻訳を行うことができる。従って、第一のレポーター遺伝子の発現が低下し、第二のレポーター遺伝子の発現が変化しない場合に、当該化合物は、該ＲＮＡ鎖における二次構造を安定化する化合物として選択される。
あるいは、例えば、複数の局所的二次構造をとり得る配列について、各配列と特異的に相互作用してその二次構造を安定化する化合物をスクリーニングするような場合には、上記のような特殊なレポータープラスミドを使用することなく、アッセイすることが可能である。即ち、特定の局所的二次構造をとり得る各配列に対応するＤＮＡをプロモーターとレポーター遺伝子の間に挿入した複数種のプラスミドを作製し、これらをそれぞれ別個に適当な宿主細胞に導入する。得られた複数種の形質転換体のそれぞれの培地に試験化合物を添加し、通常の培養条件下で一定期間培養した後に、各細胞におけるレポーター遺伝子の発現量を測定する。試験化合物が特定のｍＲＮＡにおける特定の局所的二次構造をとり得る配列と相互作用してこれを安定化していれば、その配列を含むプラスミドを導入した細胞ではレポーター遺伝子の発現が低下するが、他の配列を含むプラスミドを導入した細胞では発現量に変化がないので、該試験化合物が該特定配列の二次構造を安定化する化合物として選択される。
レポーターアッセイを用いる別の好ましい態様として、無細胞翻訳系を用いたアッセイ法が挙げられる。即ち、適当なプロモーター（例：Ｔ７、Ｔ３プロモーターなど）とレポーター遺伝子との間に、特定のｍＲＮＡにおける特定の局所的二次構造をとり得る配列に対応するＤＮＡを挿入したプラスミドを作製し、これを鋳型として、公知の無細胞転写／翻訳系（例えば、大腸菌由来のものはＥ．ｃｏｌｉ  Ｓ３０  ｅｘｔｒａｃｔ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）やＲＴＳ  ５００  Ｒａｐｉｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ社製）等が挙げられ、ウサギ網状赤血球由来のものはＲａｂｂｉｔ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）等が挙げられ、コムギ胚芽由来のものはＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ（ＴＯＹＯＢＯ社製）等が挙げられる）を用い、該特定の配列を含まないレポータープラスミドを鋳型とした場合と比較して、レポータータンパク質の合成が抑制されていれば、該試験化合物を該特定の配列の二次構造を安定化する化合物として選択することができる。
特定のｍＲＮＡが、その翻訳を制御することにより特定の疾患を予防・治療し得るものであれば、上記スクリーニング方法は、該特定の疾患を予防・治療し得る化合物のスクリーニングに用いることができる。当該方法は以下のステップを含む。
（１）その翻訳を制御することにより該疾患を予防・治療し得る１以上のｍＲＮＡを選択するステップ
（２）上記（１）で選択したｍＲＮＡから、ｍＲＮＡの翻訳を制御し得る局所的二次構造をとり得る配列が分子内に存在するｍＲＮＡを検索するステップ
（３）上記（２）で抽出された特定のｍＲＮＡにおいて、局所的二次構造をとり得る配列の中から特定の配列を選択するステップ
（４）上記（３）で選択された特定の配列における化合物と相互作用し得る部分が、他のｍＲＮＡの翻訳の制御に関わる領域に存在しないことを確認するステップ
（５）上記（４）で他のｍＲＮＡの翻訳の制御に関わる領域に存在しないことが確認された特定の配列を含むＲＮＡ鎖と試験化合物とを接触させ、該ＲＮＡ鎖の該二次構造の安定性の変化を測定するステップ
ステップ（１）〜（４）は、いかなる方法によっても行うことができるが、好ましくは、上記したｍＲＮＡに関する本発明の配列選択方法と同様にして行なわれる。また、ステップ（５）におけるＲＮＡ鎖の二次構造の安定性の変化は、上述した種々の方法を用いて行うことができる。
本発明はまた、以下のステップ：
（１）ｍＲＮＡの翻訳を制御し得る局所的二次構造をとり得る配列が分子内に存在するｍＲＮＡを検索するステップ、および
（２）上記（１）で抽出されたｍＲＮＡにおける局所的二次構造をとり得る配列を含むＲＮＡ鎖と試験化合物とを接触させ、該化合物の存在下で二次構造が安定化されるＲＮＡ鎖の存在の有無を検出するステップを含む、ｍＲＮＡの翻訳を制御することにより副作用を示す化合物の予測方法を提供する。
当該方法は、上記した特定のｍＲＮＡの翻訳を制御する化合物のスクリーニング方法において、ステップ（１）で抽出された１以上のｍＲＮＡの局所的二次構造をとり得る１以上の配列の中から、特定のｍＲＮＡおよび特定の配列を選ぶのではなく、抽出されたすべての配列について網羅的に該配列を含むＲＮＡ鎖を合成し、各ＲＮＡ鎖と試験化合物とを接触させてその相互作用の有無を検出するものである。ステップ（２）では、上記特定のｍＲＮＡの翻訳を制御する化合物のスクリーニング方法において使用される、ＲＮＡの構造変化を解析する方法、もしくはＲＮａｓｅＨに対する感受性を検出する方法等が好ましく用いられ得る。例えば、ＵＶスペクトルなどを用いた構造変化解析の場合、ステップ（１）で抽出された各配列を含むＲＮＡ鎖を適当な緩衝液中に溶解して、マイクロプレートの各ウェルに加え、そこに副作用の有無を評価したい試験化合物をさらに添加して、試験化合物の非存在下ではＲＮＡの二次構造がほどける温度にプレートを加熱し、各ウェルについて、定法に従ってＵＶスペクトル、円偏光２色性（ＣＤ）スペクトルもしくはＮＭＲスペクトル解析を行う。スペクトルに変化のなかったウェル中のＲＮＡ鎖に含まれる特定の配列は試験化合物によって二次構造が安定化され、該配列を含むｍＲＮＡの翻訳は、該化合物の投与によって制御され得ると判定することが出来る。
本発明のｍＲＮＡにおける配列選択方法により得られうる、ｍＲＮＡの翻訳を制御し得る局所的二次構造をとり得る配列の好ましい具体例として、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＰＫＣα、Ａ２０、ＮＯＴＣＨ１、ＮＵＰをそれぞれコードするｍＲＮＡの翻訳開始コドンおよびその近傍に位置するステム−ループＢ構造（順にＳｕｖ  ＳＬ１、ＰＫＣ  ＳＬ１、Ａ２０  ＳＬ１、ＮＯＴＣＨ１  ＳＬ１、ＮＵＰ  ＳＬ１とそれぞれ略記する場合がある）をとり得る配列（順に配列番号１、３８、３９、４０、４１）が挙げられる。これらのｍＲＮＡは、それらに対してガン治療を対象としたアンチセンス医薬品が開発されているように、ガン治療などにおける重要なターゲットである。例えば、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｍＲＮＡは、５’ＵＴＲが短くＯＲＦ内も含めてＳｕｖ  ＳＬ１を上回る高次な構造が認められないことから、Ｓｕｖ  ＳＬ１は、創薬ターゲットとして最良の局所的二次構造の１つであると考えられる。かかる局所的二次構造は、上記した本発明のスクリーニング方法において、それ自体として利用することができる。
従って、本発明はまた、配列番号１および３８〜４１で表されるいずれかの塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列から実質的になる核酸を提供する。ここで「実質的に同一の塩基配列」とは、配列番号１および３８〜４１で表されるいずれかの塩基配列と約９０％以上、好ましくは約９５％以上の同一性を有し（あるいは、配列番号１および３８〜４１で表されるいずれかの塩基配列において１〜数塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加された配列を有し）、配列番号１および３８〜４１で表されるいずれかの塩基配列と同一のステム−ループＢ構造をとることができ、且つ数塩基の改変により翻訳抑制を引き起こすに十分な程度に該構造が安定化される塩基配列を意味する。また、「実質的になる」とは、配列番号１および３８〜４１で表されるいずれかの塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列以外の塩基配列を含むが、当該他の塩基配列が、配列番号１および３８〜４１で表されるいずれかの塩基配列と同一もしくは実質的に同一の塩基配列の上記性質に何ら影響を及ぼさないものであることを意味する。当該核酸はＲＮＡであってもＤＮＡであってもよいが、ＤＮＡの場合、それがＲＮＡに転写され得る状態、例えば、適当なプロモーターの下流に置かれた状態で、好ましくは、該核酸がプロモーターとレポーター遺伝子などの適当な遺伝子との間に挿入された発現カセットを含む発現ベクターとして提供され得る。この場合、例えばＳｕｖ  ＳＬ１などは、ループ内に翻訳開始コドンを有するので、該ＡＵＧコドンから翻訳が開始される場合には、下流の遺伝子が、フレームが合うように翻訳されるべく連結される必要がある。
さらに、本発明また、上記核酸において、変異が導入されてバブル内に１以上の塩基対が形成され得る核酸を提供する。例えば、Ｓｕｖ  ＳＬ１のバブル部位の配列は（ＧＣ．．ＣＣＧＡ）であるので、Ｂ配列のＧＣの５’側にＴＣを挿入し、ＧＣのＣをＧに置換すれば（ＴＣＧＧ．．ＣＣＧＡ）と４つの塩基対が形成される。例えば、塩基対の数を１つずつ増やした改変体のシリーズを作製して翻訳抑制の変化を調べることにより、翻訳抑制に必要な塩基対数（水素結合数）を知ることができ、ΔＧＴＩ値を見積もることができる。当該改変体は、必要に応じて、さらにステム部分のミスマッチ塩基を除くか、もしくはそれとマッチする塩基を挿入することにより、安定性を向上させてもよい。
上述の通り、本発明はまた、上記核酸が、プロモーターとレポーター遺伝子との間に挿入された発現カセットを含有する発現ベクターとして提供され得る。プロモーターおよびレポーター遺伝子としては、上記本発明のスクリーニング方法において用いられ得るものが同様に好ましく例示される。
本発明はまた、上記発現ベクターで適当な宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体を提供する。宿主細胞としては、プロモーター活性が発揮され得る細胞であれば特に制限はないが、上記本発明のスクリーニング方法において用いられ得るものが同様に好ましく例示される。
本発明は、上記核酸、発現ベクターまたは形質転換体を含んでなる、ＳｕｒｖｉｖｉｎをコードするｍＲＮＡの翻訳を抑制し得る化合物のスクリーニング用キットを提供する。当該キットは、上記した本発明のスクリーニング方法に準じた方法で使用することができる。該キットは上記のものの他、適当な緩衝液や培地など本発明のスクリーニング方法を実施するのに必要な、もしくは好ましい他の構成要素を含んでいてもよい。
本明細書において使用される各記号はそれぞれ以下のΔＧもしくはΔΔＧ値を示す。
ΔＧｍ：ｍｆｏｌｄで計算したΔＧ値。本明細書中に表示したΔＧ値はすべてΔＧｕｓ値（下記参照）である。
ΔＧｐ：Ｇｅｎｅｔｙｘのパラメータを使って、ＯＯＰＳｅｑＳｅａｒｃｈにて検索／出力された構造を元に計算したΔＧ値（ΔＧ，ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ）。大体の場合、検索された構造は最適構造ではないため、ｍｆｏｌｄの値と比べて２０〜３０％程度高く出ることが多い。
ΔＧＴＩ：真核生物でｍＲＮＡの構造に起因する翻訳抑制を起こすために必要な、その構造のΔＧ値（ΔＧ，ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）。構造のｍＲＮＡ上の位置、温度、ステム−ループの構造（特にバブルの様子）などの関数である。
ΔＧＵＳ：生理的条件下のｍＲＮＡ構造のΔＧ値（ΔＧ，ｕｎｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ）。化合物の結合などによって安定化されていないもの。
ΔＧＳ：化合物の結合などによって安定化されたｍＲＮＡの、その構造のΔＧ値（ΔＧ，ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ）。
ΔＧＢ：化合物の結合ΔＧ値（ΔＧ，ｂｉｎｄｉｎｇ  ｎｅｔ  ｅｎｅｒｇｙ）。文献情報では、７〜１０ｋｃａｌ／ｍｏｌが一般的（ＤＮＡにおいて）。
ΔΔＧ’：ΔＧＵＳとΔＧＳの差のΔΔＧ値。薬効を得るために、化合物の結合などによって埋めるべき安定性の差。
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
【実施例】実施例１  特定のｍＲＮＡ（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）中の特定の配列（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ＳＬ１）の選択
アンチセンス医薬品の文献および特許調査より、アンチセンス医薬品のターゲットｍＲＮＡを探し出し、本発明のターゲットｍＲＮＡとするために精査を行った。Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙより得ることのできる２９１のアンチセンス医薬品の特許情報より、１９９については塩基配列を得ることができた。それらをＣｅｌｅｒａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＳｙｓｔｅｍおよびＨ−ｉｎｖ  ＤＢにてＢｌａｓｔＮをかけることで、１６１については対象ｍＲＮＡを同定することができた。そのうち、ガンを対象疾患とするものは１３５であり、特許情報から、作用部位は５’ＵＴＲが１０、スタートコドン近辺が８、ＣＤＳが２４、３’ＵＴＲが１２、不明なものが８１であると分かった（図４Ａ）。さらに自動処理によって、配列情報をいちいちｃＤＮＡデータに当てはめることで作用部位を実際に特定した（図４Ｂ）。その情報を分析する段階で、作用部位としてはＣＤＳが過半数を占めるものの、スタートコドン近辺（１４０塩基）という非常に狭い部位に対するアンチセンス医薬品が２１％あることに注目した（図４Ｂ）。本発明のメカニズムとも合致するスタートコドン近辺の構造化によって、翻訳抑制が行われている事がわかる。そこで、最初のターゲットとしては、ＡＵＧ近辺に存在するステム−ループを選ぶことにした。
ついで、抗がんアンチセンス医薬品として配列が分かっている１３３個のターゲットとするｍＲＮＡを中心に、３４３本（表２）のｍＲＮＡを選び出した。ここで、本発明者らが開発したＲＮＡ二次構造検索プログラム「ｍｕｌｔｉｓｌ．ｐｌソフトウェア（Ｐｅｒｌ  ５．８）」を用いて網羅的検索を行った。ステム−ループＢを１１７通り（ｘ＋ａ＝１８、ｙ＝４〜８、ｂ＋ｃ＝４〜８とし、ｘを３から１５までの１３通り（その場合、ａは１５から３に変化する）と各ｘの値について、ｉとｊを０から２まで各３通りずつ場合分けした。結果、１３ｘ３ｘ３＝１１７通りとなる）に場合分けして検索した。その結果、５０９１０個（重複あり）の条件にあうステム−ループＢを発見した。
【表２−１】
2006054788.tif 000013
【表２−２】
2006054788.tif 000014
【表２−３】
2006054788.tif 000015
得られた検索結果を、本発明者らが開発したＲＮＡ二次構造解析プログラム「Ｌｉｃｏｒｉｃｅソフトウェア（Ｐｅｒｌ  ５．８、ＨＴＭＬ、Ｊａｖａ（登録商標）Ｓｃｒｉｐｔ）」で解析した。条件として、「ＡＵＧ領域にステム−ループＢが存在し、そのステムＡの部分にミスマッチがないもの」を設定し、選び出した。１４３本のｍＲＮＡが見つかり、それらは２２のゲノムに由来した。そこから、前臨床段階以上のアンチセンス医薬品のターゲットとなっているものを選び出したところ、アンチセンス医薬品のＩＳＩＳ−２３７２２のターゲットなっているｈＣＧ２７８１１と、ＯＤＮａｓ７５０／１５のターゲットとなっているｈＣＧ１９９９４０４，ｈＣＧ１９７９９６５，ｈＣＧ３７３０６が見つかった。ここでＯＤＮａｓ７５０／１５がターゲットとするｍＲＮＡが複数のゲノムに由来していることを知り、その生物学的意味が不明なことから、ＩＳＩＳ−２３７２２のターゲットとなっているｈＣＧ２７８１１をまず選んだ。
ｈＣＧ２７８１１に対応するｍＲＮＡは、ｈＣＴ１８９５３，ｈＣＴ１９６２３２６，ｈＣＴ２３３６８３７，ｈＣＴ１９６７４４０，ｈＣＴ１９５８６２９，ｈＣＴ２３３６８３５（ｈＣＧ２７８１１に対応するｍＲＮＡとしてあと一つｈＣＴ１９６２３２７があるが、ｅｖｉｄｅｎｃｅレベルが低いので、上記での検索は行っていない。）であり、すべての転写産物において、ＡＵＧをまたぐ形でステム−ループＢ（ｍｕｌｔｉｓｌ．ｐｌでの予想ΔＧは−２４．８３ｋｃａｌ／ｍｏｌ）が存在した。図５にｈＣＴ１８９５３に現れるステム−ループＢを示す。このステム−ループは、これ自体（５４から１０３；各数値はｈＣＴ１８９５３の５’末端を１とした時の該構造の位置を示す。以下同じ）および近傍１００塩基（２９から１２８）の双方において、公知のＲＮＡ二次構造予測プログラム「ｍｆｏｌｄ」（ＧＣＧ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）による解析の結果、この形を維持した（ｍｆｏｌｄでの予想ΔＧは−２５．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ）。文献情報でもこれらの転写産物の一次配列が裏付けられたので（Ｒｅｆｓｅｑ：ＮＭ＿００１１６８）、このモチーフをＳｕｒｖｉｖｉｎ  Ｓｔｅｍ  Ｌｏｏｐ  １（Ｓｕｖ  ＳＬ１）と名づけ、これに対して創薬を試みることにした。
実施例２  Ｓｕｖ  ＳＬ１に選択的に結合し得る化合物に起因する副作用予測
ステム−ループＢにおいて低分子化合物と相互作用する部位としては、バブル部位のほか、ループ部位（場合によってはそれ以外の部位も）が考えられるが、実施例１で得られたステム−ループＢ［Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  Ｓｔｅｍ  Ｌｏｏｐ  １（Ｓｕｖ  ＳＬ１）］の場合には、ループが比較的安定であること、ステム−ループの安定性を落としているのは主にバブルであることから、低分子化合物の結合部位はバブル部位と判断される。全く同じバブル構造の安定なステム−ループが他のｍＲＮＡ上にあった場合、重篤な副作用が懸念される。そこで、同一のバブル部位を持つステム−ループＢを中心に、ｍｕｌｔｉｓｌ．ｐｌプログラムを用いて、本発明者らが保有する全ｃＤＮＡデータ（対象はｈＣＴ＿Ｒ２７ｇ＿ＣＤＳ３．ｆａｓｔａの６２９３６本のｃＤＮＡ）に対して類似構造検索を行った。構造検索は以下の条件１〜３で行った。
（条件１）
ステムＡとステムＢの長さ（ｘ＋ａ）：１６（但し、ｘ，ａは３以上）    １１通り
Ｂ配列のシーケンス                ：ＧＧＣＧ
Ｂ’配列のシーケンス              ：ＣＣＣＧＡＣ
ミスマッチ（ｉ，ｊ）              ：各々０〜２                        ９通り
ループの長さ（ｙ）                ：４〜２０                                  
計９９通り
（条件２）
ステムＡとステムＢの長さ（ｘ＋ａ）：１４（但し、ｘ，ａは３以上）      ９通り
Ｂ配列のシーケンス                ：ＧＧＣＧ
Ｂ’配列のシーケンス              ：ＣＣＣＧＡＣ
ミスマッチ（ｉ，ｊ）              ：各々０〜２                        ９通り
ループの長さ（ｙ）                  ：４〜２０                                  
計８１通り
（条件３）
ステムＡとステムＢの長さ（ｘ＋ａ）：１８（但し、ｘ，ａは４以上）    １１通り
Ｂ配列のシーケンス                ：ＧＣ
Ｂ’配列のシーケンス              ：ＣＣＧＡ
ミスマッチ（ｉ，ｊ）              ：各々０〜２                        ９通り
ループの長さ（ｙ）                  ：４〜２０                                
計９９通り
ここでバブルのシーケンスが検索条件１、２（ＧＧＣＧ．．ＣＣＣＧＡＣ）と３（ＧＣ．．ＣＣＧＡ）とでは異なっている。なぜなら、ループやバブルの末端でステムの形成に関与している塩基対は、そのループやバブルの構造上重要な場合が多いため、真に似ているバブル構造を見つけるには、そこを含んだシーケンスをバブル部位とみたてて検索を行う必要性があるからである。
以上の条件に沿って、Ｐｅｒｌ  ５．８言語（およびＨＴＭＬ、Ｊａｖａ（登録商標）Ｓｃｒｉｐｔ）を用いて記述したｍｕｌｔｉｓｌ．ｐｌプログラムを使用して検索を行った。ＵＮＩＸ（登録商標）コンピュータ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ３６０［３．４０ＧＨｚ  Ｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標）４、１．０ＧＢ  Ｍｅｍｏｒｙ］，Ｍｉｒａｃｌｅ  ３．０，Ｐｅｒｌ  ５．８）を用いた場合、それぞれの計算は１〜２日以内に終了した。
検索結果は、総計約２０００ファイル、約１２ＧＢの容量であったので、ｗｅｂサーバー（Ｔｈｉｎｋ  Ｐａｄ  Ｒ４０ｅ［２．２０ＧＨｚ  Ｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標）４，５１２ＭＢ  Ｍｅｍｏｒｙ，３５ＧＢ  ＨＤ］，Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）２０００  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐａｃｋ  ３，Ａｐａｃｈｅ  ＨＴＴＰ  Ｓｅｒｖｅｒ  ２．０．４９，ＡｃｔｉｖｅＳｔａｔｅ  ＡｃｔｉｖｅＰｅｒｌ  ５．８）に格納した。以下に各検索条件での結果を示す。
Ｓｕｖ  ＳＬ１と全く同じバブル構造の安定なステム−ループがあった場合に特に重篤な副作用が懸念されるため条件１を用いて検索を行った。９９通りの検索を行い、結果として３７個の構造を見つけることができた（５’ＵＴＲ：２１個、ＣＤＳ：８個、３’ＵＴＲ：８個）。そのうち２１個はＳｕｖ  ＳＬ１自体、ＣＤＳと３’ＵＴＲに見られたものはそれぞれ１つと２つの転写産物に集約された（ゲノムは１つ）。翻訳抑制が効果的に起こると考えられるＡＵＧ近傍および５’ＵＴＲにはターゲットとしたステム−ループ以外は存在しないことが確認された。
以下に、条件１を用いて見つかった転写産物を以下に示す。ここでのΔＧｐ値は、実測値でもｍｆｏｌｄで得られた値でもなく、ｍｕｌｔｉｓｌ．ｐｌでの予測ΔＧ値である。予測の対象となる構造が実際に存在する場合、その実際のΔＧ値はこれよりも低いことが多い。
１）Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ＳＬ１Ａ１  ΔＧｐ＝−１９．６５ｋｃａｌ／ｍｏｌ；ΔＧｍ＝−２５．２ｋｃａｌ／ｍｏｌ  ＣＤＳ（１１８６−１２３３）
ｈＣＴ１６４０５７５（ｈＣＧ１６４０４４８）
２）Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ＳＬ１Ａ２  ΔＧｐ＝−１４．７３ｋｃａｌ／ｍｏｌ  ３’ＵＴＲ（１２０１−１２６１）
ｈＣＴ２２８７０４６（ｈＣＧ１７８９３）
３）Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ＳＬ１Ａ３  ΔＧｐ＝−１４．７３ｋｃａｌ／ｍｏｌ  ３’ＵＴＲ（１８５８−１９１８）
ｈＣＴ８９４７（ｈＣＧ１７８９３）
ｈＣＴ１６４０５７５は、Ｒｅｆｓｅｑ：ＮＭ＿０１００４３０２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬＯＣ１５５０６０（ＬＯＣ１５５０６０），ｍＲＮＡ．）および、ｈＣＴ２２８７０４６とｈＣＴ８９４７は、ＲｅｆＳｅｑ：ＮＭ＿００３２７７（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｃｌａｕｄｉｎ  ５（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｌｅｔｅｄ  ｉｎ  ｖｅｌｏｃａｒｄｉｏｆａｃｉａｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＣＬＤＮ５），ｍＲＮＡ）に対応するｃＤＮＡである。Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ＳＬ１Ａ１（ｈＣＴ１６４０５７５）はＳｕｖ  ＳＬ１とほぼ同じバブル構造をもっていると考えられ、このステム−ループＢ構造を保持していることもｍｆｏｌｄは支持している（ΔＧｍ＝−２５．２ｋｃａｌ／ｍｏｌ。また、１１８５位のＣと１２３４位のＧを加えた場合、ΔＧｍ＝−２６．９ｋｃａｌ／ｍｏｌまで強くなる）。Ｓｕｖ  ＳＬ１をターゲットとした薬物がこの部位に副作用として作用することは十分考えられる。ただし、ｍｆｏｌｄをこのモチーフの近傍計１００塩基についてかけた場合、このＳｕｒｖｉｖｉｎ  ＳＬ１Ａ１のステムＢは別の領域と優先的に相互作用し、結果的にＳｕｒｖｉｖｉｎ  ＳＬ１Ａ１のステム塩基対総数は１５に低下する（ΔＧｍ＝−２２．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ）。さらに、このＳｕｒｖｉｖｉｎ  ＳＬ１Ａ１の位置はＡＵＧ近傍ではなく、ＣＤＳの後半である。今のところの知見では、ＣＤＳでの翻訳抑制効果は低いと考えられるため、このＳｕｒｖｉｖｉｎ  ＳＬ１Ａ１によって翻訳抑制があっても、副作用としては重篤ではないと予想される。このｈＣＴ１６４０５７５のコードするタンパク質の機能は、今のところ解析されていない。
一方、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ＳＬ１Ａ２（ｈＣＴ２２８７０４６）とＳｕｒｖｉｖｉｎ  ＳＬ１Ａ３（ｈＣＴ８９４７）については、それらをｍｆｏｌｄした場合に得られる結果ではバブル構造を保持していないこと、ループが大きいためにΔＧ値が低いこと、さらに存在する位置が３’ＵＴＲという翻訳抑制にはあまり関係ない領域であることを確認した。そのため、この２つに見られる構造に起因する副作用が起こることは考えにくいと思われる。
上記と同様にして、Ｓｕｖ  ＳＬ１と全く同じバブル構造を持ち、それなりに安定なステム−ループがあるかどうかを、条件２を用いて検索した。この場合、ステムの数が少なくても十分ΔＧが低いものを取りこぼすことなく拾ってくることができる。反面、ΔＧが高く検索に引っかかってくるものもあるはずである。理論上は、条件１の場合より１６倍以上のヒットがあるはずである。８１通りの検索を行い、結果として５７個の構造を見つけることができた（５’ＵＴＲ：２８個、ＣＤＳ：１９個、３’ＵＴＲ：１０個）。そのうち２１個がＳｕｒｖ  ＳＬ１自体、１８個がＳｕｒｖｉｖｉｎ  ＳＬ１Ａ１、５個がＳｕｒｖｉｖｉｎ  ＳＬ１Ａ２、５個がＳｕｒｖｉｖｉｎ  ＳＬ１Ａ３であった。この検索によっても、翻訳抑制が効果的に起こると考えられるＡＵＧ近傍および５’ＵＴＲには、ターゲットとしたＳｕｖ  ＳＬ１以外の構造は存在しないことが確認された。結局、条件２で新たに見つかったものは、４つのｃＤＮＡ、３つのゲノムに集約された。
１）Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ＳＬ１Ａ４  ΔＧｐ＝−１０．５５ｋｃａｌ／ｍｏｌ；ΔＧｍ＝−２０．２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ  ＣＤＳ（５７８−６２１）
ｈＣＴ１４５１７（ｈＣＧ２３４１０）
２）Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ＳＬ１Ａ５  ΔＧｐ＝−１６．１８ｋｃａｌ／ｍｏｌ；ΔＧｍ＝−３５．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ  ５’ＵＴＲ（３７９−４３９）
ｈＣＴ１８２８４（ｈＣＧ２７１５０）
３）Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ＳＬ１Ａ６  ΔＧｐ＝−１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ  ５’ＵＴＲ（９４−１５６）
ｈＣＴ２３２１００９（ｈＣＧ１７４１８０５）
４）Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ＳＬ１Ａ７  ΔＧｐ＝−１．００ｋｃａｌ／ｍｏｌ  ５’ＵＴＲ（９４−１５６）
ｈＣＴ１７７９９６１（ｈＣＧ１７４１８０５）
ｈＣＴ１４５１７はＲｅｆｓｅｑ：ＮＭ＿００６６０２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ５（ｂａｓｉｃ  ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ）（ＴＣＦＬ５），ｍＲＮＡ．）、ｈＣＴ１８２８４はＲｅｆｓｅｑ：ＮＭ＿０１６３５３（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ，ＤＨＨＣ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ２（ＺＤＨＨＣ２），ｍＲＮＡ．）および、ｈＣＴ２３２１００９とｈＣＴ１７７９９６１は、ＲｅｆＳｅｑ：ＮＭ＿０１７６５０（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：Ｎｏ  ｅｎｔｒｙ）に対応するｃＤＮＡである。
どのモチーフも十分安定ではなく、また個別にｍｆｏｌｄの結果をチェックしたがＳｕｖ  ＳＬ１と同一のバブル構造を与えるものはひとつもなかった。また、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ＳＬ１Ａ５からＳｕｒｖｉｖｉｎ  ＳＬ１Ａ７に関してはループが大きすぎて安定性に欠く。
条件３では、バブル部位の構造を短くとり（ＧＣ．．ＣＣＧＡ）、よりたくさんの類似のステム−ループを見つけることを試みた。すると、５３３個（内訳：５’ＵＴＲ：１４７、ＣＤＳ：２７９、３’ＵＴＲ：１０７；うちＡＵＧ近辺１２７）の類似のバブルを持つステム−ループが発見された。
ここで条件３での検索結果を吟味した。３’ＵＴＲに存在するものを除いた４２６個のステム−ループがみつかった３８７本のｃＤＮＡを１つ１つ調べた結果、それらは７８個のゲノムに由来することがわかった。Ｓｕｖ  ＳＬ１を持つターゲットｍＲＮＡをのぞいた７７個の遺伝子のうち、ｍｆｏｌｄをしてもバブル構造をそのまま維持しているのは、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ＳＬ１Ａ１（ｈＣＴ１６４０５７５；上述）だけであった。また、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ＳＬ１Ａ８（ｈＣＴ２３１１０２８；ｈＣＴ２３１１０３１；ｈＣＴ１９５１００６；ｈＣＴ２３１１０２９）はＧＣＡ．．ＣＣＧＡという類似のバブル構造を維持し、ΔＧｍ＝−３１．２ｋｃａｌ／ｍｏｌのステム−ループ構造をもっている。同様にＳｕｒｖｉｖｉｎ  ＳＬ１Ａ９（ｈＣＴ１９６０５１６；ｈＣＴ２２６４９９８）はＧＣＵ．．ＣＣＧＡという類似のバブル構造を維持し、ΔＧｍ＝−２１．３ｋｃａｌ／ｍｏｌのステム−ループ構造をもっている。後の化合物スクリーニングで得られるヒット化合物の中には、このバブル部位とも相互作用してしまうものがあるかもしれない。ただし、その場合でも、Ｓｕｖ  ＳＬ１とはバブルの構造の違いがあるので、合成対応により副作用を回避することができると考えられる。
以上のように、いずれの条件を用いて検索しても、Ｓｕｖ  ＳＬ１に対して創出される低分子化合物によって重篤な副作用が出る懸念は少ないと考えられる。
尚、条件３での検索過程において、きわめて強いステム−ループＳｕｒｖｉｖｉｎ  ＳＬ１Ａ１０（ｈＣＴ１７８４３１１）、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ＳＬ１Ａ１１（ｈＣＴ２３０９１２１；ｈＣＴ２３５０６７）が見出された。これらはＣＤＳあるいは５’ＵＴＲに存在することから、同領域でのΔＧＴＩはこの値以下であることがわかる。
条件３での検索により見出された特徴的なステム−ループを以下に示す。
１）Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ＳＬ１Ａ８  ΔＧｍ＝−３１．２ｋｃａｌ／ｍｏｌ（バブル：ＧＣＡ．．ＣＣＧＡ）ＣＤＳ又は５’ＵＴＲ
ｈＣＴ２３１１０２８；ｈＣＴ２３１１０３１；ｈＣＴ１９５１００６；ｈＣＴ２３１１０２９（ｈＣＧ１８１０９９１）
Ｒｅｆｓｅｑ：ＮＭ＿００１５０８０；ＮＭ＿１３８７３２；ＮＭ＿１３８７３４
Ｎｅｕｒｅｘｉｎｌ  ｏｒ  ２（ＮＲＸＮ２）
２）Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ＳＬ１Ａ９  ΔＧｍ＝−２１．３ｋｃａｌ／ｍｏｌ（バブル：ＧＣＵ．．ＣＣＧＡ）５’ＵＴＲ
ｈＣＴ１９６０５１６；ｈＣＴ２２６４９９８（ｈＣＧ１８１７９３６）
Ｒｅｆｓｅｑ：ＮＭ＿０２４６００
Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １６  ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ  ３０（Ｃ１６ｏｒｆ３０）；ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＦＬＪ２０８９８）
３）Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ＳＬ１Ａ１０  ΔＧｍ＝−３３．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ  ＣＤＳ
ｈＣＴ１７８４３１１（ｈＣＧ１７４６０３３）
Ｒｅｆｓｅｑ：ＮＭ＿００６１６１
Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ
４）Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ＳＬ１Ａ１１  ΔＧｍ＝−３６．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ  ５’ＵＴＲ
ｈＣＴ２３０９１２１；ｈＣＴ２３５０６７（ｈＣＧ１７８２０７５）
Ｒｅｆｓｅｑ：ＮＭ＿００２８３４
Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ｎｏｎ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  １１（Ｎｏｏｎａｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  １）
実施例３  安定なステム−ループ（ＳＬ３１）による翻訳抑制
安定なステム−ループにて翻訳抑制を示した配列（Ｋｏｚａｋ  Ｍ．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９８６．８３．２８５０−４）を参考にして改良した人工配列ＳＬ３１（自由エネルギー：−５５．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ）をレポーター遺伝子の５’−ＵＴＲに挿入し、該遺伝子の翻訳活性に及ぼす効果を調べた。
（１）発現ベクターの構築
センスオリゴマー（５’−ａａｇｔｔｃａｃｃａｃｇｇｃｃｃｃｃａａｇｃｔｔ；配列番号２）とアンチセンスオリゴマー（５’−ａａｇｔｔｃａｃｃａｃｇｇｃｃｃｃｃａａｇｃｔｔ；配列番号３）を合成した（北海道システムサイエンス）。このオリゴマーを用いてＥｘＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）によりｃＤＮＡを作製し、ｃＤＮＡをｐＴＯＰＯ−ＸＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ挿入した（ｐＳＬ３１）。続いて、ｐＳＬ３１からステム−ループを含むＥｃｏ  ＲＩ断片を切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋のＥｃｏ  ＲＩ部位に挿入した（ｐＳＬ３１Ｅ）。ステム−ループの向きと配列はシークエンスにより確認した。
ｐＥＧＦＰ／ＳＬ３１／ＩＣは、ｐＳＬ３１Ｅからステム−ループを含むＥｃｏ  ＲＶとＢａｍ  ＨＩ断片を切り出し、Ｎｈｅ  Ｉ部位を平滑末端化した後に、Ｂｇｌ  ＩＩ処理を行ったｐＥＧＦＰ−Ｎ１（クロンテック）へ挿入し作製した。ｐＥＧＦＰ／ＳＬ３１／ＩＳは、ｐＳＬ３１Ｅからステム−ループを含むＸｈｏ  ＩとＰｓｔ  Ｉ断片を切り出し、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１のＸｈｏ  ＩとＰｓｔ  Ｉ部位へ挿入し作製した。ｐＥＧＦＰ／ＳＬ３１／ＩＴは、ｐＳＬ３１Ｅからステム−ループを含むＥｃｏ  ＲＶとＳａｃ  ＩＩ断片を切り出し、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１のＳｍａ  ＩとＳａｃ  ＩＩ部位へ挿入し作製した。
ｐＥＧＦＰ／ＳＬ３１／ＩＣは、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１レポータープラスミドの転写開始点直下（ステム−ループは５’−ｃａｐの５塩基目から始まると予測される）にステム−ループ構造（ＳＬ３１）が配置されるようにデザインされており、リボソームによる５’−ｃａｐ認識反応を抑制すると予測される。ｐＥＧＦＰ／ＳＬ３１／ＩＳは、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１レポータープラスミドの５’−ｃａｐと翻訳開始コドンの中間にステム−ループ構造（ＳＬ３１）が配置されるようにデザインされており、リボソームによるＡＵＧコドンのスキャニング反応を阻害すると予測される。ｐＥＧＦＰ／ＳＬ３１／ＩＴは、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１レポータープラスミドの翻訳開始コドン（ＡＵＧ）から、３５ｎｔ上流にステム−ループ構造（ＳＬ３１）が配置されるようにデザインされており、立体障害により翻訳開始コドン上で起こる翻訳開始に必要な三者複合体（ｔｅｒｎａｒｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ）の形成を阻害し得る。
（２）ＣＨＯ細胞培養と遺伝子導入・翻訳活性測定
ＣＨＯ細胞をＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｔ（ａｍａｘａ：ｃａｔ  ｎｏ．５０７−９９０３１）へ懸濁し、上記（１）で構築した試験プラスミドおよび対照プラスミド（ｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ；ルシフェラーゼ遺伝子を含む）；０．５μｇ）を混合しＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを用いてＡ−２３プログラムにより遺伝子導入を行った。遺伝子導入を行った細胞を２４時間培養した後に培養液を取り除き、Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ：ｃａｔ  ｎｏ．Ｅ２５２０）を添加して細胞を溶解し、Ｗａｌｌａｃ  Ａｒｖｏ  ＳＸを用いて励起波長／吸収波長＝４８５ｎｍ／５３５ｎｍにて蛍光値、続いて発光値を測定した。
ｍＲＮＡの定量は以下のようにして行った。遺伝子導入細胞よりｔｏｔａｌ  ＲＮＡを回収し、ＴａｑＭａｎ  Ｇｏｌｄ  ＲＴ−ＲＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｎ８０８−０２３２，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてｃＤＮＡを作製した。続いて、作製したｃＤＮＡを用いてホタルルシフェラーゼ，ＥＧＦＰ，ＧＡＰＤＨに対するＴａｑＭａｎ解析を行った。ルシフェラーゼとＥＧＦＰ遺伝子のｍＲＮＡコピー数は、ＴａｑＭａｎ  ＧＡＰＤＨ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｐａｒｔ  Ｎｕｍｂｅｒ：４０２８６９，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて解析したＧＡＰＤＨ遺伝子ｍＲＮＡ量との比で算出した。ルシフェラーゼとＥＧＦＰ遺伝子に対するプライマーとＴａｑＭａｎプローブは表３の通りである。
【表３】
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結果を図６に示す。ＳＬ３１を５’ＵＴＲへ挿入したプラスミドからのＥＧＦＰタンパク質発現量は、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１からのＥＧＦＰタンパク質発現量に比べ、ｐＥＧＦＰ／ＳＬ３１／ＩＣにおいて１．６４％、ｐＥＧＦＰ／ＳＬ３１／ＩＳにおいて７．００％、ｐＥＧＦＰ／ＳＬ３１／ＩＴにおいて０．９８％であり、いずれも著しい減少を示した（図６Ａ左）。その際のＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ量を測定すると、ｐＥＧＦＰ／ＳＬ３１／ＩＣにおいて５２．９％、ｐＥＧＦＰ／ＳＬ３１／ＩＳにおいて７３．０％、ｐＥＧＦＰ／ＳＬ３１／ＩＴにおいて６２．５％でありわずかな減少を示したが、翻訳に比べ減少は緩やかであった（図６Ａ右）。また、ホタルルシフェラーゼのタンパク質量（図６Ｂ左）及びｍＲＮＡ量（図６Ｂ右）はいずれのサンプルにおいても有意な変動は観察されなかった。
これらの結果より、安定なステム−ループ構造を組むことが予測されるＳＬ３１を５’ＵＴＲへ挿入すると、翻訳活性が減少することが示唆された。さらに、ｐＥＧＦＰ／ＳＬ３１／ＩＴ及びｐＥＧＦＰ／ＳＬ３１／ＩＣへＳＬ３１を挿入したＥＧＦＰ発現量は、ｐＥＧＦＰ／ＳＬ３１／ＩＳへＳＬ３１を挿入したＥＧＦＰ発現量に比べて、ＥＧＦＰ発現量をさらに強く抑制していた。これらの結果より、リボソームによる５’−ｃａｐ認識反応、あるいは翻訳開始に必要なｔｅｒｎａｒｙ  ｃｏｍｐｌｅｘの形成阻害を引き起こすことが予測されるステム−ループは、翻訳の著しい減少を引き起こすことが推測された。このことより、ターゲットステム−ループは、５’−ｃａｐ付近或いはＡＵＧ開始コドン付近を選択することが適すると考えられる。しかし、ｍＲＮＡの５’末端の完全な同定は困難であることから、ＡＵＧ開始コドン付近のターゲットを選び出す方が容易であると考えられる。また、ＡＵＧ開始コドン上で行われるｔｅｒｎａｒｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ形成の形成阻害は、リボソーム半径が４０ｎｔ程度と見積もられることから、ステム−ループの形成開始点が４０塩基以内であると考えられる。
実施例４  Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｍＲＮＡがＲＮＡｉによりノックダウンされた細胞におけるアポトーシス誘導
実施例１で得られたＳｕｖ  ＳＬ１は、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｍＲＮＡのＡＵＧ開始コドンをループ内に有する、ｍｕｌｔｉｓｌ．ｐｌによる予測ΔＧ値が−２５．８ｋｃａｌ／ｍｏｌの比較的安定なステム−ループ構造である。
Ｓｕｒｖｉｖｉｎは、１６．５ｋＤａのタンパク質であり、最も小さなアポトーシス抑制因子（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ＩＡＰ）として知られている。Ｓｕｒｖｉｖｉｎは２つの機能を持つことが知られており、アポトーシス抑制と細胞分裂に関与する因子であることが知られている（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９８；Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）。アポトーシス抑制に関しては、カスパーゼ−３とカスパーゼ−７の活性制御に関与することが示されており、これらのアポトーシス実行因子の活性を抑制していると考えられている（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）。また細胞分裂に関しては、スピンドル微小管及びＡｕｒｏｒａ  Ｂキナーゼとの結合が示されており、細胞周期のＧ２／Ｍ期の制御に関与することが報告されている（Ｂｏｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。
Ｓｕｒｖｉｖｉｎの発現は、幼齢の組織において広く発現しているが、成体の正常組織においては殆ど発現が認められない。実際、本発明者らは、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｅｎｅ  ｌｏｇｉｃ社）のｅ−ｎｏｒｔｈｅｒｎによる発現解析を行うと、成体の正常組織において殆ど発現が認められないことを確認した。ところがＳｕｒｖｉｖｉｎは、肺、大腸、膵臓、乳房、前立腺など、広く共通して癌細胞において選択的に発現していることが見出されている（Ｎａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．２００２；Ｔａｍｍ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）。さらに、発現を抑制するアンチセンス核酸の導入により、細胞増殖抑制及びアポトーシスを誘導することが知られている（Ｂｅｌｔｒａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。
そこで、本発明者らは、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ抑制によりアポトーシスが誘導されることを確認するために、ＨｅＬａ細胞においてＳｕｒｖｉｖｉｎに対するＲＮＡｉによる発現抑制を行い、Ｄｅｐｓｉｐｈｅｒ（ＴＭ）を用いてミトコンドリア膜崩壊を指標にアポトーシス検出を行った。詳細を以下に示す。
（１）ＨｅＬａ細胞培養とＲＮＡｉ
ＨｅＬａ細胞をＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｒ（ａｍａｘａ：ｃａｔ  ｎｏ．５００−９９０２１）に懸濁した。該細胞懸濁液とｓｉＲＮＡ（ＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ：ｃａｔ  ｎｏ．０２１２−３７−２０００）をを混合しＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを用いてＩ−１３プログラムにより導入を行った。ｓｉＲＮＡを導入された細胞を４８時間培養した後にｔｏｔａｌ  ＲＮＡを回収し、ＴａｑＭａｎ  Ｇｏｌｄ  ＲＴ−ＲＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ：ｃａｔ  ｎｏ．Ｎ８０８−０２３２）を用いてｃＤＮＡを作製した。Ｓｕｒｖｉｖｉｎ検出用プライマー（ＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ：ｃａｔ  ｎｏ．０２１２−３７−２０００）、或いはＧＡＰＤＨ検出用プライマー（ＴａｑＭａｎ  ＧＡＰＤＨ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ：ｃａｔ  ｎｏ．４０２８６９）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った後に電気泳動を行い、それぞれのｍＲＮＡ量を検出した。
また、アポトーシス検出はＤｅｐｓｉｐｈｅｒ（ＴＭ）添付プロトコールにしたがって次のように行った。ｓｉＲＮＡを導入した細胞を４８時間培養した後に、培養液を取り除き、Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを含むＲｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒへ置換し、洗浄を行った。その後、Ｄｅｐｓｉｐｈｅｒ（ＴＭ）を含むＲｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを加え、室温で１５分間静置した。Ｄｅｐｓｉｐｈｅｒ（ＴＭ）を含むＲｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを取り除き、Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒで洗浄を行ったのちに、蛍光顕微鏡にて観察を行った。
結果を図７に示す。対照ｓｉＲＮＡを導入した細胞より抽出したＲＮＡに比べて、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｓｉＲＮＡを導入した細胞より抽出したＲＮＡにおいて、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｍＲＮＡは９０％以上減少していた。一方、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｓｉＲＮＡ導入細胞におけるＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの存在量はわずかな減少であった（図７Ａ）。
Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｓｉＲＮＡ導入４８時間後の細胞を倒立型蛍光顕微鏡を用いて観察すると、対照ｓｉＲＮＡを導入した細胞群に比べて、形態が球状化しており、多くの細胞が浮遊していた。さらに、Ｄｅｐｓｉｐｈｅｒ（ＴＭ）を添加してミトコンドリア膜崩壊の様子を観察すると、対照ｓｉＲＮＡ導入細胞においては、ミトコンドリア膜崩壊を示す緑色蛍光は殆ど認められず、生細胞を示す赤色蛍光が観察された。一方、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｓｉＲＮＡを導入した細胞群においては、殆どの細胞が緑色蛍光を示し、アポトーシスが誘導されていることが示唆された（図７Ｂ）。
実施例５  Ｓｕｖ  ＳＬ１への変異導入によるステム−ループ構造の安定化
Ｓｕｖ  ＳＬ１を安定化することにより、強い翻訳抑制効果を得ることができるかどうかを調べるために、Ｓｕｖ  ＳＬ１を安定化するような変異を導入したＳｕｖ  ＳＬ１ｍ１とＳｕｖ  ＳＬ１ｍ２構造を持つホタルルシフェラーゼを用いたレポータープラスミドを作製した（図８Ａ）。レポーターは、ｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＨｉｎｄ  ＩＩＩ／Ｎｃｏ  ＩサイトにＳｕｒｖｉｖｉｎの５’ＵＴＲの全長とＣＤＳの２７塩基を含むようにクローニングした（図８Ｂ）。これにより、ｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ由来の５’ＵＴＲは、すべてＳｕｒｖｉｖｉｎ由来の５’ＵＴＲへ置換された。また、ホタルルシフェラーゼの翻訳フレームを崩さないよう、かつＣＤＳ部位に変異が導入されないように構築を行っており、ホタルルシフェラーゼによるレポーター解析を行うことができる。Ｓｕｖ  ＳＬ１ｍ１はＳｕｖ  ＳＬ１に認められるバブル構造を２塩基挿入（ＴＣ）と１塩基置換（Ｃ→Ｇ）により失わせ、ステム−ループを安定化した（自由エネルギー：−３８．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ）。さらに、Ｓｕｖ  ＳＬ１ｍ２はＳｕｖ  ＳＬ１ｍ１のステムＢ上のミスマッチ（ＡとＴ）を取り除き、ステム−ループを安定化した（自由エネルギー：−４６．７ｋｃａｌ／ｍｏｌ）。これらのプラスミドおよび対照としてｐＥＧＦＰ−Ｎ１を、実施例３（２）に準じて同時にＣＨＯ細胞へ導入し、ルシフェラーゼ活性とＥＧＦＰ活性とを測定した（図８Ｃ）。
ｐＧＬ３／Ｓｕｖ  ＳＬ１，ｐＧＬ３／Ｓｕｖ  ＳＬ１ｍ１，ｐＧＬ３／Ｓｕｖ  ＳＬ１ｍ２プラスミドは次のようにして構築した。センスオリゴマー（最終濃度１２．５μＭ）とアンチセンスオリゴマー（最終濃度１２．５μＭ）をａｎｎｅｌｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ中で混和し、７５℃で５分間保温した後に、室温で５分以上保温した。アニールしたオリゴマー（１２５ｎＭ）を、ＴＯＰＯ−ＸＬクローニングキットを用いてクローニングした。シークエンスにより塩基配列を確認した後に、Ｓｕｖ  ＳＬ１，Ｓｕｖ  ＳＬ１ｍ１，Ｓｕｖ  ＳＬ１ｍ２を含む断片をｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＨｉｎｄ  ＩＩＩ／Ｎｃｏ  Ｉサイトへ挿入した。最終的に、シークエンスにより塩基配列の確認を行った。用いたセンスオリゴマー、アンチセンスオリゴマーは表４の通りである（表中、大文字は５’端を示す）。
【表４】
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結果を図９に示す。Ｓｕｖ  ＳＬ１を持つプラスミドに比べて、Ｓｕｖ  ＳＬ１ｍ１及びＳｕｖ  ＳＬ１ｍ２を持つプラスミドからのルシフェラーゼ翻訳量は１／１０以下に減少した（図９Ａ左）。一方、ＥＧＦＰ翻訳量は、いずれのプラスミド導入細胞においても顕著な減少を示さなかった（図９Ｂ左）。また、いずれのｍＲＮＡ量も大きな変動が確認されなかった（図９Ａ右およびＢ右）。これらの結果から、Ｓｕｖ  ＳＬ１を安定化させることにより強い翻訳抑制効果が得られることが示唆された。そのときの翻訳抑制に必要な化合物のエネルギーは、Ｓｕｖ  ＳＬ１とＳｕｖ  ＳＬ１ｍ１とのエネルギーの差分より、少なくとも−１３．１ｋｃａｌ／ｍｏｌであり、化合物により同程度のエネルギーが加算されれば、著しくｓｕｒｖｉｖｉｎ遺伝子ｍＲＮＡからの翻訳は抑制されると考察できる。
実施例６  各種ステム−ループへの変異導入によるステム−ループ構造の安定化
Ｓｕｖ  ＳＬ１に見られたようなステム−ループを安定化することにより強い翻訳抑制効果を得ることができることの一般性を確かめるため、実施例５と同様の実験を異なるトランスクリプト上に発見された異なるステム−ループに対して４種行った。具体的には、ｈＣＴ２０４２９（ＲｅｆＳｅｑ：ＮＭ＿００２７３７）にみられるＰＫＣ  ＳＬ１、ｈＣＴ７８２８（ＲｅｆＳｅｑ：ＮＭ＿０６２９０）にみられるＡ２０  ＳＬ１、ｈＣＴ１９６１９１５．１（ＲｅｆＳｅｑ：ＮＭ＿０１７６１７）にみられるＮＯＴＣＨ１  ＳＬ１、ｈＣＴ２２５２３７５（ＲｅｆＳｅｑ：ＮＭ＿００５１２４）にみられるＮＵＰ  ＳＬ１である。
用いたセンスオリゴマー、アンチセンスオリゴマーは表５の通りである（表中、大文字は５’端を示す）。
【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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結果を図１０，１１，１２に示す。ＰＫＣ  ＳＬ１、Ａ２０  ＳＬ１、ＮＵＰ  ＳＬ１、ＮＯＴＣＨ１  ＳＬ１を持つプラスミドに比べて、対応する変異ステム−ループを持つプラスミドからのルシフェラーゼ翻訳量は有意に減少した（図１０，１１，１２）。また、ＮＵＰ  ＳＬ１、ＮＯＴＣＨ１  ＳＬ１についてはｍＲＮＡ量も大きな変動が確認されなかった（図１１Ｂ，１２Ｂ）。これらの結果から、一般的にステム−ループ構造を安定化させることにより強い翻訳抑制効果が得られることが示唆された。また、ΔＧＴＩが領域およびステム−ループの構造によって異なることが確認された。いずれにせよ元のステム−ループと変異体とのエネルギーの差分より、化合物により同程度のエネルギーが加算されれば、著しく当該遺伝子ｍＲＮＡからの翻訳は抑制されると考察できる。
実施例７  Ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄスクリーニング
Ｓｕｖ  ＳＬ１、ＰＫＣ  ＳＬ１、Ａ２０  ＳＬ１に結合して翻訳を抑制する化合物のスクリーニングを行った。まず、実施例５に準じてＳｕｖ  ＳＬ１（表４）、ＰＫＣ  ＳＬ１（表５−１）、Ａ２０  ＳＬ１（表５−２）に対するスクリーニング用ベクターｐＧＬ３／Ｓｕｖ  ＳＬ１、ｐＧＬ３／ＰＫＣ  ＳＬ１、ｐＧＬ３／Ａ２０  ＳＬ１をＣＨＯ−Ｋ１細胞へＦｕＧＥＮＥ６を用いて導入した。次に、当社のライブラリー（特定の化合物を１０種類ずつ含むｗｅｌｌからなるライブラリー）を用い、それぞれの細胞を別個にｗｅｌｌと反応させてルシフェラーゼ活性をはかり、得られたルシフェラーゼ活性を比較してどれか一つのルシフェラーゼ活性を選択的に低下させる化合物（化合物を含むｗｅｌｌ）を選択した（一つのモチーフに対するルシフェラーゼ活性を、二つをコントロール実験として用いて実験した）。
実験は具体的に以下のように行った。まず、３μＭの化合物を１０種類ずつ含むｗｅｌｌへそれぞれのスクリーニング用ベクターを導入した細胞を別個に播種した。２２時間後にすべてのｗｅｌｌのルシフェラーゼ活性を測定し、同じｗｅｌｌを用いたそれぞれの細胞からの別個のルシフェラーゼ活性について比較した。あるｗｅｌｌで選択的にルシフェラーゼ活性を低下させた場合、そのｗｅｌｌを選択した（計４００ｗｅｌｌｓを選択）。選択されたｗｅｌｌに含まれる化合物それぞれの１０μＭ溶液を新たに調製して新しいライブラリーとし、それを用いて上述と同様の手順でそれぞれの細胞からの別個のルシフェラーゼ活性を比較した。そしてそこから選択的にルシフェラーゼ活性を低下させる化合物（約８０検体）を選んだ。選択された化合物に関して、対象となる細胞への濃度依存性試験（１，３，１０，３０μＭ）を行い、選択的にある細胞からのルシフェラーゼ活性を低下させる傾向を示す化合物を選択した。
結果として、選択的にルシフェラーゼ活性を低下させる化合物は得られなかった。理由としては、総じて化合物濃度が低すぎたこと、細胞膜を通りやすい化合物はＲＮＡと本質的に相互作用しにくいこと、そしてタンパク質向けに構築されたライブラリーを用いた場合にＲＮＡと相互作用する化合物が得られにくいことなどが考えられる。
実施例８  ＲＮＡ  ＦＲＥＴ法によるスクリーニング
ＲＮＡ  ＦＲＥＴ法においては、対象とするモチーフ構造のステム部分の両端のいずれかにＦＩＴＣとクエンチャーをもったモチーフ（表６）に対し、化合物の存在下においてＴｍ値がどのように変化するかを観測することで当該モチーフに結合して安定化する化合物を見つけるという実験が行われた。当該モチーフ自体はＴｍ値が高すぎて実験上不都合であるので、Ｔｍ値を下げるため当該モチーフの低分子化合物が結合すると目される部位（バブル部位）を中心にステム部分を切り詰めたモデルモチーフ構造を実験に用いた。その配列を表６に示す。それらのモデルモチーフ構造が、低分子が結合すると目される部分についてモチーフ構造と同じ部分構造であることについてはｍｆｏｌｄで確認した。さらに測定温度はｍｆｏｌｄで得られたＴｍ値を参考に、化合物非存在下でのモデルモチーフのＴｍ値をはかるという実際の実験によって得た。その後、ライブラリーを用いてそれぞれのモチーフ構造を安定化させる化合物の探索を試みた。
【表６】
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実際の実験は以下のように行った。使用したライブラリーは当社のライブラリーと市販の抗生物質からＲＮＡに結合することを期待して選んだ２７９個の化合物だった。各ＲＮＡ分子は、タカラバイオ株式会社へ合成を委託した。最終濃度が１２０ｎＭ  ＲＮＡ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ  ＫＣｌ，、０．１μｇ／μｌアセチル化Ｂｏｖｉｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、２〜４μＭ  Ｒｏｘ（５−ＣＡＲＢＯＸＹ−Ｘ−ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ，ＳＵ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）、５μＭ  ＥＤＴＡとなるように１０μｌ溶液を混合し、化合物存在下１０分間室温でインキュベートした。その後、各測定温度にてＦＩＴＣとＲｏｘの値を測定、ＦＩＴＣ／Ｒｏｘの比を算出しその値をＦＩＴＣ値として解析した（あるいは、本実施例では用いないが、化合物分注後、７９℃以上に昇温しインキュベートすることでＦＩＴＣ値を測定してコントロールとし、その後測定温度まで温度を下げることでＲＮＡ構造への低分子化合物の結合を促進し、同様にＦＩＴＣ値を百分率で計算する方法もある）。各化合物を０．１、１、１０、１００μＭになるようにモデルモチーフを含む反応液中へそれぞれ分注し、対応する温度にてＦＩＴＣ値を得ることによってＦＲＥＴの効果を調べた（Ｎ＝１）。化合物を添加していない反応溶液中のＦＩＴＣ値をコントロールとして、化合物を添加した反応溶液中のＦＩＴＣ値を百分率で算出した。そして、濃度依存性グラフを描き、濃度依存的にＦＩＴＣ値を低下させる化合物を選択した。
その結果、２０検体がいずれかのＲＮＡ鎖に対してＦＲＥＴの効果を示し、ＲＮＡの安定化を引き起こすことが示唆された。これら２０検体に関して、３、１０、３０、１００μＭの濃度で濃度依存性試験を行った（Ｎ＝３）。ここで特にＫａｎａｍｙｃｉｎがＳｕｖ  ＳＬ１．４に対して選択的に安定化した結果に着目した。これまでに、ＫａｎａｍｙｃｉｎはＴｈｙｍｉｄｉｌａｔｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｍＲＮＡに見出されているモチーフ（ＴＳ  ＳＬ１）と結合することが示されているが（Ｔｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３８，１９９−２０６１，９９９；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８，２１５８−６３，２０００；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６，１９５６−７，２００４）、本発明者らの解析によると、Ｓｕｖ  ＳＬ１．４はＴＳ  ＳＬ１．１に比べてより低濃度のＫａｎａｍｙｃｉｎにより安定化がおこることが明らかとなった。またＰＫＣ  ＳＬ１．２との選択性も見られた。（図１４）。
実施例９  ｍＲＮＡ上の構造による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ阻害の確認
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ法をスクリーニングに用いることができるかどうか確認するため実験を行った。Ｓｕｖ  ＳＬ１、Ｓｕｖ  ＳＬ１ｍ１、ＳＬ１ｍ２をそれぞれもつルシフェラーゼをコードするＲＮＡを構築し、そのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ系でのルシフェラーゼ活性を測定することで、その活性が導入したモチーフ構造のΔＧ（安定性）と相関して阻害されていることを確かめた。
これまでに検証実験に用いてきたＳｕｖ  ＳＬ１と、Ｓｕｖ  ＳＬ１の塩基改変により安定化されたＳｕｖ  ＳＬ１ｍ１、Ｓｕｖ  ＳＬ１ｍ２を用いて実験を行った（図１５Ｃ）。これらのモチーフを含むＳｕｒｖｉｖｉｎのｍＲＮＡの５’末を、ｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌプラスミドのホタルルシフェラーゼ５’ＵＴＲと置換し、Ｔ７プロモーターより転写を行うプラスミドを作製した。具体的にはまず、Ｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｍｅｒ（ＧＣＴＡＧ  ＣＴＡＡＴ  ＡＣＧＡＣ  ＴＣＡＣＴ  ＡＴＡＧＧ  ＡＡＧＣＴ  ＴＡ（配列番号４６）：最終濃度１２．５μＭ）とａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｍｅｒ（ＡＡＧＣＴ  ＴＣＣＴＡ  ＴＡＧＴＧ  ＡＧＴＣＧ  ＴＡＴＴＡ  ＧＣＴＡＧ  ＣＡ（配列番号４７）：最終濃度１２．５μＭ）をアニーリングバッファー（最終濃度：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣＬ，ｐＨ８．０／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／１００ｍＭ  ＮａＣｌ）中で混和し、９５℃で４分間、さらに室温で５分間インキュベートした。そして、アニーリングを行ったオリゴマーをｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ（登録商標）へクローニングした。さらに、このプラスミドよりＴ７プロモーター領域を含むＮｈｅ  Ｉ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ断片（図１５Ａ）を切り出し、ｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ（プロメガ）、ｐＧＬ３／Ｓｕｖ  ＳＬ１、ｐＧＬ３／Ｓｕｖ  ＳＬ１ｍ１、ｐＧＬ３／Ｓｕｖ  ＳＬ１ｍ２のそれぞれのＮｈｅ  Ｉ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ部位へ挿入した。これにより、これらのプラスミドに含まれたＳＶ４０プロモーターはＴ７プロモーターへ置換された。作製したプラスミドはそれぞれｐＧＬ３／Ｔ７，ｐＧＬ３／Ｓｕｖ  ＳＬ１／Ｔ７，ｐＧＬ３／Ｓｕｖ  ＳＬ１ｍ１／Ｔ７，ｐＧＬ３／Ｓｕｖ  ＳＬ１ｍ２／Ｔ７と名付けた。最終的にシークエンスにより、Ｔ７プロモーターの塩基配列を確認した。
それら、Ｓｕｖ  ＳＬ１を含むｐＧＬ３／Ｓｕｖ  ＳＬ１／Ｔ７、Ｓｕｖ  ＳＬ１ｍ１を含むｐＧＬ３／Ｓｕｖ  ＳＬ１ｍ１／Ｔ７、Ｓｕｖ  ＳＬ１ｍ２を含むｐＧＬ３／Ｓｕｖ  ＳＬ１ｍ２／Ｔ７、著しいモチーフを持たない配列を含むｐＧＬ３／Ｔ７をｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ系と混合し、ルシフェラーゼ活性をモニターすることにより翻訳量を定量した。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎは、ＴＮＴ  Ｔ７  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）を用いて、そのプロトコールに部分的な変更を加えて実施した。すなわち、ＴＮＴ  Ｑｕｉｃｋ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（３．７５μＬ），Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  １ｍＭ（０．０９３７５μＬ），Ｐｌａｓｍｉｄ  ０．５μｇ／μＬ（０．１８７５μＬ）を混和し、最終容量を５μＬとした。そして、３０℃で１時間インキュベートした。その後、蒸留水にて２倍に希釈したＢｒｉｇｈｔ−ＧｌｏＴＭＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）（３０μＬ）を加え、室温で５分間インキュベートした。そして、Ｗａｌｌａｃ  ＡＲＶＯ−ＳＸにてルシフェラーゼ活性を測定した。
その結果、それぞれのプラスミドからのルシフェラーゼ活性は、ｐＧＬ３／Ｔ７は４４５１Ｋ  ｕｎｉｔｓ、ｐＧＬ３／Ｓｕｖ  ＳＬ１／Ｔ７は１９９９Ｋ  ｕｎｉｔｓ、ｐＧＬ３／Ｓｕｖ  ＳＬ１ｍ１／Ｔ７は１９８Ｋ  ｕｎｉｔｓ、ｐＧＬ３／Ｓｕｖ  ＳＬ１ｍ２／Ｔ７は３７Ｋ  ｕｎｉｔｓであり、Ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄレポーターアッセイの結果と一致してモチーフ構造の安定性を増すことにより翻訳量が低下した。この結果は、本ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ系においても、５’ＵＴＲの安定性に相関してタンパク質発現量が変化することを示唆した。さらに、同系を用いてモチーフ構造を安定化し翻訳量を低下させる低分子化合物のスクリーニングを行うことができることを示唆した。
実施例９  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ法によるスクリーニング
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ法による低分子化合物のスクリーニングにおいては、ターゲットモチーフをもつトランスクリプトのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎの系において、一定量の低分子化合物存在下ルシフェラーゼ活性を測定、比較することでスクリーニングを行った。
Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ＳＬ１に対して行ったスクリーニングの例を示す。実施例８のように、ｐＧＬ３／Ｔ７，ｐＧＬ３／Ｓｕｖ  ＳＬ１／Ｔ７，ｐＧＬ３／Ｓｕｖ  ＳＬ１ｍ１／Ｔ７，ｐＧＬ３／Ｓｕｖ  ＳＬ１ｍ２／Ｔ７を構築した。さらに、低分子化合物はＤＭＳＯ溶液とし、超音波や加熱操作によって十分溶解させておいた。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎは、ＴＮＴ  Ｔ７  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）を用いて、同様にそのプロトコールに部分的な変更を加えて実施した。すなわち、ＴＮＴ  Ｑｕｉｃｋ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（３．７５μＬ），Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  １ｍＭ（０．０９３７５μＬ），Ｐｌａｓｍｉｄ  ０．５μｇ／μＬ（０．１８７５μＬ）に低分子化合物（最終濃度が１００μＭ。ただし、最終ＤＭＳＯ濃度は２％以下。）を混和し、最終容量を５μＬとした。そして、３０℃で１時間インキュベートした。その後、蒸留水にて２倍に希釈したＢｒｉｇｈｔ−ＧｌｏＴＭＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）（３０μＬ）を加え、室温で５分間インキュベートした。そして、Ｗａｌｌａｃ  ＡＲＶＯ−ＳＸにてルシフェラーゼ活性を測定した。
そこで、モチーフをもつｐＧＬ３／Ｓｕｖ  ＳＬ１からの活性が、ｐＧＬ３／Ｔ７からの活性より有意に落ちているものは、有望な化合物であると判断できる。さらにｐＧＬ３／Ｓｕｖ  ＳＬ１ｍ１／Ｔ７，ｐＧＬ３／Ｓｕｖ  ＳＬ１ｍ２／Ｔ７からの活性とも比較することで、当該化合物の選択性を見積もることができる。つまりｐＧＬ３／Ｓｕｖ  ＳＬ１／Ｔ７とｐＧＬ３／Ｓｕｖ  ＳＬ１ｍ１／Ｔ７の違いはモチーフ上の構造だけなので、当該化合物はその異なる場所の近辺に結合してモチーフを安定化していると考えられる。この選択性の測定にあたっては、違うターゲットモチーフ（たとえば前述のＰＫＣα）より作られたプラスミドを用いても達成できる場合がある。
【産業上の利用可能性】  本発明の方法は、医薬品としての物性においてより有利な低分子化合物をスクリーニングすることを可能とするとともに、タンパク質をターゲットとした創薬とは異なり、リード化合物を得るまでのステップが対象疾患によらずすべて同じであるので、創薬スキームの時間短縮と効率化とコストダウンをも可能にする点できわめて有用である。また、当該方法は、生体内で特異的に作用する構造と機能を有するあらゆるＲＮＡをターゲットとした低分子医薬品の創薬に適用可能であるので、遺伝子発現制御において重要な役割を担っていることが示唆されているｍｉＲＮＡなどの機能性ＲＮＡに対する創薬にもきわめて有用である。さらに、本発明で用いられる二次構造検索ソフトウェアは、ゲノム上の新規なｍｉＲＮＡの検出にも適用することが出来る。
本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「請求の範囲」の精神および範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
本出願は、日本国で出願された特願２００４−３３６２６７を基礎としており、そこに開示される内容は本明細書にすべて包含されるものである。また、ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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