(57)【要約】  本発明は、目的の化合物を産生するための組換え宿主細胞に関する。本発明はさらに、そのような宿主細胞の産生方法に関する。本発明はさらに、目的の化合物の産生に関する。本発明はさらに、単離されたポリヌクレオチドならびに前記ポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞に関する。
2012533312.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の化合物を産生するための組換え宿主細胞であって、前記宿主細胞が目的のポリヌクレオチドの１コピー以上の組込みに好適な少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインを含み、ここで、前記少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインのうちの少なくとも１つは、それが由来する前記実質的に相同なＤＮＡドメインと比較して前記目的のポリヌクレオチドに対する増強された組込み選好を有するように適合され、かつ前記適合された実質的に相同なＤＮＡドメインが由来する前記実質的に相同なＤＮＡドメインは、前記少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインの他の１つよりも少なくとも１０％高い遺伝子変換頻度を有する、組換え宿主細胞。
【請求項２】
前記適合された実質的に相同なＤＮＡドメインが、独特の配列タグによって前記実質的に相同なＤＮＡドメインの他のバージョンと区別される、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項３】
前記適合された実質的に相同なＤＮＡドメインが、標的化ＤＮＡドメインを含み、前記標的化ＤＮＡドメインが、増強された組込み選好を有する配列を含む、請求項１または２のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項４】
前記実質的に相同なＤＮＡドメインのうちの少なくとも２つが各々、組み込まれた目的のポリヌクレオチドの少なくとも１コピーを有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５】
組込み経路をＨＲの方向に導くことによる、前記宿主細胞のゲノム中の所定の部位への標的化されたポリヌクレオチドの組込み効率の増大をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項６】
前記少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインが、ｇｌａＡの遺伝子座であるかまたはａｍｙＢＩ、もしくはａｍｙＢＩＩ）の遺伝子座である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項７】
前記目的のポリヌクレオチドがコドン最適化されたポリヌクレオチドである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項８】
ｇｌａＡ、ａｍｙＡ、ａｍｙＢＩ、ａｍｙＢＩＩ、ｏａｈＡ、毒素関連ポリヌクレオチドおよびｐｒｔＴの群から選択されるポリヌクレオチドをさらに含み、前記ポリヌクレオチドが改変を含み、ここで、前記宿主細胞は、同等の条件下で培養したとき、それが由来する親細胞と比較して、前記改変を含むポリヌクレオチドによってコードされる産物を欠損している、請求項１〜７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項９】
ｐｅｐＡの欠損をさらに含む、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
ＳＥＣ６１の改変をさらに含む、請求項８または９のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
前記宿主細胞が選択マーカーを含まない宿主細胞である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
前記宿主細胞が真菌宿主細胞である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
前記宿主細胞が糸状菌宿主細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
目的の化合物を産生するための組換え宿主細胞の産生方法であって、前記宿主細胞が目的のポリヌクレオチドの１コピー以上の組込みに好適な少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインを含み、別の実質的に相同なＤＮＡドメインと比較してより高い遺伝子変換頻度を有する実質的に相同なＤＮＡドメインを、それが由来する前記実質的に相同なＤＮＡドメインと比較して前記目的のポリヌクレオチドに対する増強された組込み選好を有するように適合させ、前記より高い遺伝子変換頻度を有する実質的に相同なＤＮＡドメインに標的化ＤＮＡドメインを提供することを含み、ここで、前記標的化ＤＮＡドメインは、増強された組込み選好を有する配列を含む、方法。
【請求項１５】
ａ．請求項１４で得られた前記細胞を目的のポリヌクレオチドで形質転換することと、
ｂ．前記実質的に相同なＤＮＡドメインのうちの少なくとも１つに組み込まれた少なくとも１コピーの前記目的のポリヌクレオチドの少なくとも１コピーを有する細胞を選択またはスクリーニングすることと、
ｃ．（ｂ）で得られた前記細胞を繁殖させ、実質的に相同なＤＮＡドメインのさらなるコピーに組み込まれた前記目的のポリヌクレオチドの少なくとも１コピーを有する細胞を選択またはスクリーニングすることと
をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記実質的に相同なＤＮＡドメインの各々のコピーが、組み込まれた前記目的のポリヌクレオチドの少なくとも１コピーを有するまで、工程（ｃ）を繰り返す工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
目的の化合物を産生する方法であって、
ａ．前記化合物の産生をもたらす条件下で請求項１〜１３のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養することと、
ｂ．前記培養培地から前記目的の化合物を回収することと
を含む方法。
【請求項１８】
目的の化合物を産生する方法であって、
ａ．組換え宿主細胞を前記化合物の産生をもたらす条件下で培養することであって、前記宿主細胞は目的のポリヌクレオチドの１コピー以上の組込みに好適な少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインを含み、ここで、前記少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインのうちの少なくとも１つは、それが由来する前記実質的に相同なＤＮＡドメインと比較して前記目的のポリヌクレオチドに対する増強された組込み選好を有するように適合され、かつ前記実質的に相同なＤＮＡドメインのうちの少なくとも２つは、組み込まれた目的のポリヌクレオチドの少なくとも１コピーを有する、と、
ｂ．前記培養培地から前記目的の化合物を回収することと
を含む方法。
【請求項１９】
前記宿主細胞が選択マーカーを含まない宿主細胞である、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記宿主細胞が真菌宿主細胞である、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記宿主細胞が糸状菌宿主細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記目的の化合物がポリペプチドである、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ポリペプチドが酵素である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記目的の化合物が代謝産物である、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
配列番号：２によるポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチド、またはその機能性断片。
【請求項２６】
配列番号：３によるポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチド、またはその機能性断片。
【請求項２７】
請求項２５または２６に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２８】
請求項２５もしくは２６に記載のポリヌクレオチドを含むか、または請求項２７に記載のベクターを含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、目的の化合物を産生するための組換え宿主細胞に関する。本発明はさらに、そのような宿主細胞の産生方法に関する。本発明はさらに、目的の化合物の産生に関する。本発明はさらに、単離されたポリヌクレオチドならびに前記ポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞に関する。
【０００２】
［背景技術］
本発明は、目的の化合物を産生するための組換え宿主細胞に関する。
【０００３】
そのような宿主細胞は、とりわけ、国際公開第１９９８／０４６７７４号パンフレットおよび国際公開第１９９８／４６７７２号パンフレットから知られており、ここで、宿主細胞は、前記宿主細胞の染色体の少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインの１つに目的のポリヌクレオチドを含み、かつ目的のポリヌクレオチドのコピー数は、遺伝子変換によって増加している。
【０００４】
しかしながら、高コピーの遺伝子変換株（例えば、国際公開第１９９８／０４６７７４号パンフレットおよび国際公開第１９９８／４６７７２号パンフレットによる方法によって得られる株）を得ることは、多くの場合、長い時間と労力を要すると考えられることが示されている。それゆえ、長い時間と労力をあまり要さない高コピーの遺伝子変換株の構築を可能にするために方法を改善することができれば有利であろう。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】置換ベクターｐＧＢＤＥＬの物理的地図を示す。フランキング領域をクローニングするための多重クローニング部位がａｍｄＳマーカーに対して示されている。
【図２】アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）（Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ））のｈｄｆＡ遺伝子を不活化するために用いられる置換ベクターｐＤＥＬ−ＨＤＦＡの物理的地図を示す。この置換ベクターは、ｈｄｆＡフランキング領域、ａｍｄＳマーカーおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡを含む。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡは、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株の形質転換前に、制限酵素ＡｓｃＩおよびＮｏｔＩによる消化によって除去することができる。
【図３】宿主株から遺伝子または遺伝子断片を欠失させるために用いられる戦略を示す。使用されるＤＮＡコンストラクトは、欠失させようとする遺伝子の相同領域（５’および３’）が両隣にあるａｍｄＳ選択マーカーを含む（１）。このコンストラクトは、対応するゲノム遺伝子座での二重相同組換え（Ｘ）によって組み込まれ（２）、ゲノム遺伝子コピーに置き換わる（３）。その後、直接反復上での組換え（Ｕ）によって、ａｍｄＳマーカーが除去され、欠失させようとする遺伝子または遺伝子断片の正確な切除が生じる（４）。
【図４】親Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株ＣＢＳ１２４．９０３におけるｇｌａＡ（グルコアミラーゼ）遺伝子座および組換え株ＧＢＡ３００における３つの切断された「Ｘの印がある」ΔｇｌａＡ遺伝子座（「Ｘ」は、ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩまたはＢｇｌＩＩ制限部位を表す）の物理的地図を示す。
【図５】Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ１２４．９０３由来の組換え株ＧＢＡ３００のｇｌａＡ  ＤＮＡアンプリコンにおける３つのΔｇｌａＡ遺伝子座の概略図を示す。各々の遺伝子座は、異なる制限部位（ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩまたはＢｇｌＩＩ）でマークが付けられている。ｇｌａＡ遺伝子座は各々、約２０〜６０ｂｐだけ長さが異なっており、ＰＣＲに基づくＤＮＡフラッグテストによって、切断された異なるｇｌａＡ遺伝子座を可視化することができる。
【図６】実質的に相同なＤＮＡドメインを適合させるために用いられるベクターｐＧＢＧＬＡ−６５の物理的地図を示す。基本的に、このベクターは、２つのＰｇｌａＡ断片と３’ｇｌａＡおよび３”ｇｌａＡ領域の間にａｍｄＳ選択マーカーを含む。３’ｇｌａＡおよび３”ｇｌａＡ領域は、ΔｇｌａＡ遺伝子座の対応するゲノム領域への標的化および組込みに用いられる。２つのＰｇｌａＡ断片は、図３に見られるような対抗選択によるａｍｄＳ選択マーカーの切除に用いられる。１つのＰｇｌａＡ断片は、（ＭｌｕＩ部位の３’にあるＰｇｌａＡプロモーターの最後の６００ｂｐを欠く）切断されたＰｇｌａＡプロモーター断片であり、これは、ａｍｄＳ対抗選択後にゲノム中に存在したまま残る。
【図７】適合されたＢａｍＨＩアンプリコンを有する株のｇｌａＡ  ＤＮＡアンプリコンにおける３つのΔｇｌａＡ遺伝子座の物理的地図を示す。ＢａｍＨＩアンプリコンは、ゲノムｇｌａＡ遺伝子座の相同な３’ｇｌａＡ遺伝子座と３”ｇｌａＡ遺伝子座の間に切断された相同なグルコアミラーゼプロモーター断片を導入することによって適合された。
【図８】新規のアセトアミダーゼ選択マーカーおよび適合されたＢａｍＨＩアンプリコン標的化ベクターｐＧＢＡＡＳ−３の物理的地図を示す。ｇｌａＡプロモーターは、標的化領域としておよびａｍｄＳ遺伝子のプロモーターとして機能する。
【図９】新規のアセトアミダーゼ選択マーカーおよび適合されたＢａｍＨＩアンプリコン標的化ベクターｐＧＢＡＡＳ−４の物理的地図を示す。（切断された）ｇｌａＡプロモーターは標的化領域として機能し、ｇｐｄＡプロモーターは、ａｍｄＳ遺伝子の発現を駆動する。
【図１０】新規の発現および適合されたＢａｍＨＩアンプリコン標的化ベクターｐＧＢＴＯＰ−１１の物理的地図を示す。ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を用いて、ベクターを線状化し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）部分を除去することができる。
【図１１】新規の発現および適合されたＢａｍＨＩアンプリコン標的化ベクターｐＧＢＴＯＰ−１２の物理的地図を示す。ＮｏｔＩ制限酵素を用いて、ベクターを線状化し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）部分を除去することができる。
【図１２】置換ベクターｐＤＥＬ−ＡＭＹＢＩＩの物理的地図を示す。５’ａｍｙＢＩＩフランキング領域、３’ａｍｙＢＩＩフランキング領域がａｍｄＳマーカーに対して示されている。ａｍｙＢＩＩの３’配列の配列は少なくとも２〜３００ｂｐ重複している。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡは、宿主株の形質転換前に、制限酵素ＮｏｔＩによる消化によって除去することができる。
【図１３】置換ベクターｐＧＢＤＥＬ−ＦＵＭ３の物理的地図を示す。ｆｕｍＢコード配列の一部を含む５’ｆｕｍＢ領域と３’ｆｕｍＢフランキング領域とがａｍｄＳマーカーに対して示されている。ｆｕｍＢの５’配列の配列は少なくとも２〜３００ｂｐ重複している。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡは、宿主株の形質転換前に、制限酵素ＡｓｃＩおよびＮｏｔＩによる消化によって除去することができる。
【図１４】置換ベクターｐＧＢＤＥＬ−ＯＣＨ２の物理的地図を示す。フランキング領域としてのＡｎ１５ｇ０７８６０遺伝子配列の一部とＡｎ１５ｇ０７９３０遺伝子配列の一部がａｍｄＳマーカーに対して示されている。Ａｎ１５ｇ０７９３０遺伝子の配列は少なくとも２〜３００ｂｐ重複し、相同組換えによる対抗選択を可能にしている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡは、宿主株の形質転換前に、制限酵素ＡｓｃＩおよびＮｏｔＩによる消化によって除去することができる。
【図１５】置換ベクターｐＧＢＤＥＬ−ＰＲＴ２の物理的地図を示す。５’ｐｒｔＴフランキング領域、３’ｐｒｔＴフランキング領域がａｍｄＳマーカーに対して示されている。ｐｒｔＴ３’配列の配列は少なくとも２〜３００ｂｐ重複している。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡは、宿主株の形質転換前に、制限酵素ＢｓｔＢＩおよびＸｍａＩによる消化によって除去することができる。
【図１６】置換ベクターｐＧＢＤＥＬ−Ｓｅｃ６１＊の物理的地図を示す。Ｓｅｃ６１＊突然変異体遺伝子および３’Ｓｅｃ６１＊突然変異体遺伝子断片がａｍｄＳマーカーに対して示されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡは、宿主株の形質転換前に、制限酵素ＡｓｃＩおよびＮｏｔＩによる消化によって除去することができる。
【図１７】ＰＬＡ２発現ベクターｐＧＢＴＯＰＰＬＡ−２ａの物理的地図を示す。ｇｌａＡフランキング領域が、ｇｌａＡプロモーター、切断されたｇｌａＡ遺伝子およびｐｒｏ−ｐｌａ２コード配列に対して示されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡは、宿主株に形質転換する前に、制限酵素ＮｏｔＩによる消化によって除去することができる。
【図１８】ＰＬＡ２発現ベクターｐＧＢＴＯＰＰＬＡ−２ｂの物理的地図を示す。ｇｌａＡプロモーター、切断されたｇｌａＡ遺伝子、ｐｒｏ−ｐｌａ２コード配列および３’ｇｌａＡフランキング配列が示されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡは、宿主株への形質転換前に、制限酵素ＮｏｔＩによる消化によって除去することができる。
【図１９】発現ベクターｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−２の物理的地図を示す。ｇｌａＡプロモーターおよびＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ａｍｙＢコドン最適化配列に対してｇｌａＡフランキング領域が示されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡは、宿主株の形質転換前に、制限酵素ＮｏｔＩによる消化によって除去することができる。
【図２０】ＦＵＡ発現ベクターｐＧＢＴＯＰＦＵＡ−３の物理的地図を示す。ｇｌａＡプロモーター、切断されたｇｌａＡ遺伝子、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ａｍｙＢコドン最適化配列および３’ｇｌａＡフランキング配列が示されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡは、宿主株への形質転換前に、制限酵素ＮｏｔＩによる消化によって除去することができる。
【図２１】（例えば、実施例中のＧＢＡ３０３に基づく株のような）適合されたＢａｍＨＩアンプリコンを有する株における単一の相同組換えによる組込みの概略図を示す。発現ベクターは、特定の標的化配列を有する選択可能なａｍｄＳマーカーと目的の遺伝子とを含む。標的化配列は、最も高い頻度の遺伝子変換を有する適合されたアンプリコンへの特異的なゲノム標的化（「賢明な組込み戦略」）を可能にする。
【０００６】
［発明の詳細な説明］
驚くことに、宿主細胞（例えば、国際公開第１９９８／０４６７７４号パンフレットおよび国際公開第１９９８／４６７７２号パンフレットに記載されているような宿主細胞）が少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインを含む場合、これらのＤＮＡドメインの遺伝子変換頻度は必ずしも同じというわけではないことが解析から明らかになった。これらのＤＮＡドメインのうちのいくつかは、他の実質的に相同なＤＮＡドメインの遺伝子変換頻度よりも実質的に低い遺伝子変換頻度を有することが明らかになった。そのような場合、目的のポリヌクレオチドが、高い遺伝子変換頻度を有するＤＮＡドメインではなく、低い遺伝子変換頻度を有するＤＮＡドメインに組み込まれるのは不利である。より高い遺伝子変換頻度を有するＤＮＡドメインは、大方の場合、より低い遺伝子変換頻度を有する（目的のポリヌクレオチドを含む）ＤＮＡドメインに優る。その結果として、より低い遺伝子変換頻度を有するＤＮＡドメインに組み込まれた目的のポリヌクレオチドを有する細胞から高コピーの遺伝子変換宿主細胞を得るには、より多くの時間と労力を要する。
【０００７】
それゆえ、目的のポリヌクレオチドを実質的により高い遺伝子変換頻度を有する実質的に相同なＤＮＡドメインに含めることができれば有利であろう。というのは、これによって、あまり時間と労力を要さないで目的のポリヌクレオチドの複数コピーを含む宿主株（高コピーの遺伝子変換株）を構築することが可能になるからである。
【０００８】
その結果として、目的のポリヌクレオチドが実質的により高い遺伝子変換頻度を有する相同なＤＮＡドメインに優先的に組み込まれる宿主細胞が必要とされている。それゆえ、本発明の目的はそのような宿主細胞を提供することである。
【０００９】
したがって、本発明は、目的の化合物を産生するための組換え宿主細胞であって、前記宿主細胞が目的のポリヌクレオチドの１コピー以上の組込みに好適な少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインを含み、ここで、少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインのうちの少なくとも１つは、それが由来する実質的に相同なＤＮＡドメインと比較して目的のポリヌクレオチドに対する増強された組込み選好を有するように適合されている、組換え宿主細胞を提供する。前記組換え宿主細胞は、本明細書中、本発明による組換え宿主細胞と称される。
【００１０】
本発明はまた、目的の化合物を産生するための組換え宿主細胞の産生方法であって、前記宿主細胞が目的のポリヌクレオチドの１コピー以上の組込みに好適な少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインを含み、別の実質的に相同なＤＮＡドメインと比較してより高い遺伝子変換頻度を有する実質的に相同なＤＮＡドメインを、それが由来する実質的に相同なＤＮＡドメインと比較して目的のポリヌクレオチドに対する増強された組込み選好を有するように適合させることを含む方法を提供する。
【００１１】
本発明はまた、目的の化合物を産生する方法であって、
ａ．前記化合物の産生をもたらす条件下で本発明による宿主細胞を培養することと、
ｂ．培養培地から目的の化合物を回収することと
を含む方法を提供する。
【００１２】
本発明はまた、目的の化合物を産生する方法であって、
ａ．前記化合物の産生をもたらす条件下で組換え宿主細胞を培養すること、前記宿主細胞は目的のポリヌクレオチドの１コピー以上の組込みに好適な少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインを含み、ここで、少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインのうちの少なくとも１つは、それが由来する実質的に相同なＤＮＡドメインと比較して目的のポリヌクレオチドに対する増強された組込み選好を有するように適合され、かつ実質的に相同なＤＮＡドメインのうちの少なくとも２つは、組み込まれた目的のポリヌクレオチドの少なくとも１コピー以上を有する、と、
ｂ．培養培地から目的の化合物を回収することと
を含む方法を提供する。
【００１３】
したがって、本発明による組換え宿主細胞は、目的のポリヌクレオチドの１コピー以上の組込みに好適な少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインを含み、ここで、少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインのうちの少なくとも１つは、それが由来する実質的に相同なＤＮＡドメインと比較して目的のポリヌクレオチドに対する増強された組込み選好を有するように適合されている。前記目的のポリヌクレオチドの１コピー以上の組込みに好適な前記実質的に相同なＤＮＡドメインは、好ましくは、互いの実質的な複製物であり、より好ましくは、前記ＤＮＡドメインはアンプリコンである。
【００１４】
本発明との関連で、「組換え」という用語は、天然のプロセスおよび／または宿主細胞をランダムな突然変異誘発に供することによって誘導される遺伝子改変を含む任意の遺伝子改変だけでなく、例えば、遺伝子の破壊および／または欠失および／または特異的な突然変異誘発も指す。その結果として、組換えによるプロセスと天然のプロセスの組合せおよび／または宿主細胞をランダムな突然変異誘発に供することによって誘導される遺伝子改変は、組換えであると解釈される。
【００１５】
本発明による宿主細胞は、そのゲノム中に目的のポリヌクレオチドの１コピー以上の組込みに好適な少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインを含む。野生型株では、これらのＤＮＡドメインは、単一コピーとしてまたは複数コピーとして前記細胞のゲノム中に生じ得る。天然の複数コピーＤＮＡドメインの例は、ｒＤＮＡドメインである。したがって、ｒＤＮＡドメインを本発明で好ましく用いてもよいし、または用いなくてもよい。本発明によって提供されるような、これらの実質的に相同なＤＮＡドメインの複数のコピーを含む株は、例えば、前記ＤＮＡドメイン中の遺伝子によってコードされる遺伝子産物の産生が改善された株を選択することによる古典的な株改良によって、ＤＮＡドメインの単一コピーを含む株から得ることができる。多くの場合、そのような産生改善は、選択された株におけるＤＮＡドメインの増幅の結果である。そのような増幅されたＤＮＡドメインは、これ以降アンプリコンとも称される。そのようなアンプリコンを含む宿主細胞の例は、例えば、ｖａｎ  Ｄｉｊｃｋら、２００３，Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２８；２７−３５：Ｏｎ  ｔｈｅ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＳＭ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ｅｎｚｙｍｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｓｔｒａｉｎｓに記載されている。ｖａｎ  Ｄｉｊｃｋらには、７つの増幅されたグルコアミラーゼ遺伝子座（すなわち、アンプリコン）を含むアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）株が記載されている。本発明は、そのようなアンプリコンを組換えＤＮＡ分子の組込み用のＤＮＡドメインとして用いることが好ましいが、本発明は、決してそれに限定されない。実際、１）ＤＮＡドメインは、目的のポリヌクレオチドの組込みを受け入れるのに好適であるべきである；２）ＤＮＡドメインは、遺伝子変換による組み込まれた組換えＤＮＡ分子の増加を達成するために、真菌ゲノム中のＤＮＡドメインの他の実質的に相同なバージョンとの組換えが可能であるべきであるという２つの機能的基準が満たされる限り、２つ以上の実質的に相同なバージョンが宿主細胞のゲノム中に生じる任意のＤＮＡドメインを用いることができる。
【００１６】
第１の基準を満たすには、ＤＮＡドメインは、相同組換えによって目的のポリヌクレオチドをＤＮＡドメインに標的化するのを可能にするために十分な長さでなければならない。この目的のために、ＤＮＡドメインは、少なくとも１００ｂｐ、好ましくは少なくとも５００ｂｐ、より好ましくは少なくとも１ｋｂおよびより好ましくは少なくとも２ｋｂを含むべきである。好ましくは、目的のポリヌクレオチドのその中への組込みに対するＤＮＡドメインの好適性は、ＤＮＡドメインへの組込みが、問題になっている宿主細胞の生存に必須の機能を破壊するべきではないという要件によってさらに決定される。
【００１７】
第２の機能的基準、すなわち、宿主細胞のゲノム中の他の実質的に相同なバージョンのＤＮＡドメインとの組換えの能力は、異なるバージョンのＤＮＡドメイン間の遺伝子変換を可能にするために必要とされる。この目的のための最低限の必要条件は、フランキング配列間の相同組換えを可能にするよう、各々のバージョンのＤＮＡドメインが、ＤＮＡドメインの両端で、他のバージョンのＤＮＡドメインの対応するフランキング配列に十分相同なＤＮＡ配列に隣接していることである。この相同組換えの結果が遺伝子変換であり、その場合、これらのバージョンのＤＮＡドメインの１つは、組み込まれた組換えＤＮＡ分子を含む複製されたバージョンの他のＤＮＡドメインに置き換えられる。遺伝子変換をなおも可能にするフランキング配列の長さおよび相同性の程度に関する最低限の必要条件は、問題となっている生物によって異なり得る。おそらく、全体的な相同性が少なくとも６０％の最低１００ｂｐの長さであれば、遺伝子変換がなおも可能となるであろう。明らかに、遺伝子変換の頻度は、フランキング配列の長さと相同性が増大するとともに増加する。好ましくは、異なるＤＮＡドメインは、少なくとも８０％の相同性を共有する少なくとも１ｋｂのフランキング配列を含む。さらにより好ましくは、異なるＤＮＡドメインは、少なくとも９５％の相同性を共有する少なくとも５ｋｂのフランキング配列を含む。より好ましい実施形態では、異なるＤＮＡドメインは、少なくとも９９％の相同性を共有する少なくとも１０ｋｂのフランキング配列を含む。最も好ましい実施形態では、異なるＤＮＡドメインは、少なくとも９９％の相同性を共有する少なくとも５０ｋｂのフランキング配列を含む。本明細書で実質的な複製物として示される、互いの完全なコピーではない実質的に相同なＤＮＡドメインの例は、アレル変異体、遺伝子ファミリーおよび／またはアイソザイムをコードする遺伝子である。最も好ましいのは、組み込まれた目的のポリヌクレオチドが存在するときにせいぜい異なる互いの正確なコピーである実質的に相同なＤＮＡドメインである。そのような同一なＤＮＡドメインの例は、アンプリコンである。あるいは、人工ＤＮＡドメインをＤＮＡ合成および／または組換えＤＮＡ技術を用いて作り出してもよく、また次に、そのような人工ＤＮＡドメインを所望の真菌に導入し、増幅させてもよい。したがって、そのような人工ＤＮＡドメインを本発明で好ましく用いてもよいし、または用いなくてもよい。
【００１８】
実質的に相同なＤＮＡドメインの全体的な長さ、すなわち、フランキング配列を含む全体的な長さは、１ｋｂ未満から数百ｋｂまで様々であってもよく、例えば、ＤＮＡドメインの長さは、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）の親株ＩＦ０４１７７（国際公開第９８１２３００号パンフレットおよび米国特許第５，７６６，９１２号明細書でＡ１５６０として開示されている）中に存在する３つのＴＡＫＡアミラーゼ遺伝子の１ユニット当たり２〜３ｋｂの範囲であることが以前に示されており、これらの遺伝子は、ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）中の増幅されたペニシリンクラスターの１ユニット当たり約５７ｋｂおよびアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）の増幅されたｇｌａＡ遺伝子座の１ユニット当たり８０ｋｂ超までＡ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＢＥＣｈ２（国際公開第００３９３２２号パンフレットに開示されている）において不活化されている（国際公開第９８４６７７２号パンフレットを参照されたい）。
【００１９】
遺伝子変換は、目的のポリヌクレオチドを含むＤＮＡドメインが増加している宿主細胞を同定することによりモニタリングすることができる。例えば、目的のポリヌクレオチドによってコードされる産物の産生レベルがより高い宿主細胞を単にスクリーニングすることなどの、当業者に公知の任意の方法を用いることができる。また、例えば、ＤＮＡコピー数を決定するための定量的方法（例えば、本明細書で以下に概説するような「ＤＮＡフラッグ」テスト、定量的ＰＣＲ、サザン解析もしくは比較ゲノムハイブリダイゼーションによる宿主細胞の遺伝子型の解析など）、またはＲＮＡレベルを決定するための定量的方法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザン解析もしくはＧｅｎｅＣｈｉｐもしくはマイクロアレイ解析など）を用いることもできる。
【００２０】
本発明によれば、各々のバージョンの実質的に相同なＤＮＡドメインは、好ましくは、同定目的のための独特の配列タグによって糸状菌中の他のバージョンのＤＮＡドメインと区別される。そのような配列タグは、異なるＤＮＡドメイン間の遺伝子変換の検出およびモニタリングを可能にし、それにより、所望の遺伝子型を有する遺伝子変換体のスクリーニングおよび／または選択を容易にする。異なるバージョンのＤＮＡドメインの検出を可能にする限り、例えば、サザンブロット上で検出される制限部位から簡単にアッセイ可能な表現型を提供する完全な選択可能マーカー遺伝子にまで及ぶ任意の形態の配列タグを用いることができる。特に有用な配列タグ法は、国際公開第９８４６７７２号パンフレット、国際公開第９８４６７７４号パンフレットおよびｖａｎ  Ｄｉｊｃｋら（上記）に記載されている。この方法は、単一のオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマー対を用いる単一のＰＣＲにおいて各々のＤＮＡドメインを検出することを可能にする。ＤＮＡドメインは、ＰＣＲにおいて、各々のバージョンのＤＮＡドメインが独特の長さのＰＣＲ断片を生じるように改変される。得られるＰＣＲ断片の長さおよび強度は、それぞれ、各々のＤＮＡドメインの存在およびコピー数を示す。「ＤＮＡフラッグ」と称されるこの形態の配列タグは、所望の遺伝子型を有する変換体を得るために、多数の変換体コロニーの遺伝子型の迅速な解析を可能にする。
【００２１】
本発明によれば、本発明による宿主細胞の少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインの１つは、それが由来する実質的に相同なＤＮＡドメインと比較して目的のポリヌクレオチドに対する増強された組込み選好を有するように適合されている。好ましくは、宿主細胞の少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインの１つの標的化ＤＮＡドメインは、相同組換えによって目的の組換えＤＮＡ分子／ポリヌクレオチドを適合された標的化ＤＮＡドメインにより特異的に標的化することを可能にするように適合されている。標的化ＤＮＡ配列またはＤＮＡドメインが宿主細胞中に２回以上現れる場合、目的のポリヌクレオチドの相同組換えは、宿主細胞の複数の標的化ＤＮＡドメインについて見出される。標的化ＤＮＡドメインを実質的に相同なＤＮＡドメインの１つに適合させて、宿主中の他の実質的に相同なバージョンのＤＮＡドメインとの組換えに影響を及ぼすことなく、その適合された標的化ＤＮＡドメインへのより特異的な標的化を支持することが可能である。最適な標的化選好のために、標的化に用いられるＤＮＡ配列の適合は、目的の組換えＤＮＡ分子／ポリヌクレオチド中および宿主中で行なわれる。したがって、マッチした宿主と組込みベクターの組が得られる。
【００２２】
好ましくは、標的化ＤＮＡドメインの適合は、増強された組込み選好を有する配列を実質的に相同なＤＮＡドメインに導入することによって実施される。好ましくは、増強された組込み選好を有する前記配列は、遺伝子置換によって導入される。したがって、本発明はまた、目的の化合物を産生するための組換え宿主細胞であって、前記宿主細胞が目的のポリヌクレオチドの１コピー以上の組込みに好適な少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインを含み、ここで、少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインのうちの少なくとも１つは、それが由来する実質的に相同なＤＮＡドメインと比較して目的のポリヌクレオチドに対する増強された組込み選好を有するように適合され、ここで、適合された実質的に相同なＤＮＡドメインは標的化ＤＮＡドメインを含み、ここで、前記標的化ＤＮＡドメインは、増強された組込み選好を有する配列を含む、組換え宿主細胞を提供する。より好ましくは、標的化ドメインの適合は、本明細書中の実施例に従って実施される。
【００２３】
本発明によれば、標的化に用いられる適合されたＤＮＡドメインの標的化配列は、好ましくは、宿主のゲノム内で独特であるように適合される。好ましくは、宿主のゲノム内で独特であるように適合される標的化配列は、異種ＤＮＡポリヌクレオチド配列、宿主から事前に除去され、再導入されるＤＮＡポリヌクレオチド配列、宿主内の野生型状況と比較して異なる順序で組み合わされた相同なＤＮＡポリヌクレオチド断片、および人工ＤＮＡポリヌクレオチドの群から選択される配列を含む。
【００２４】
本発明によれば、適合されたＤＮＡドメインへの標的化に用いられる目的のポリヌクレオチドの一方または両方のフランキング配列は、好ましくは宿主のゲノム内で独特である。好ましくは、適合されたＤＮＡドメインへの標的化に用いられる目的のポリヌクレオチドの一方または両方のフランキング配列は、異種ＤＮＡポリヌクレオチド配列、宿主から事前に除去され、再導入されるＤＮＡポリヌクレオチド配列、宿主内の野生型状況と比較して異なる順序で組み合わされた相同なＤＮＡポリヌクレオチド断片、および人工ＤＮＡポリヌクレオチドの群から選択される配列を含む。
【００２５】
好ましくは、適合されたＤＮＡドメインの標的化配列が宿主のゲノム内で独特であるように適合されているとともに、適合されたＤＮＡドメインへの標的化に用いられる目的のポリヌクレオチドの一方または両方のフランキング配列も宿主のゲノム内で独特である。
【００２６】
本発明によれば、適合されたＤＮＡドメインへの標的化に用いられる配列は、好ましくは、目的のポリヌクレオチドの導入および／または発現に用いられる遺伝子エレメントである。遺伝子エレメントの例は、遺伝子、プロモーター、ターミネーター、ｃＤＮＡ、イントロン、遺伝子間領域、またはそれらの一部および／もしくは組合せである。より好ましくは、適合されたＤＮＡドメインへの標的化に用いられる配列は、目的のポリヌクレオチドの導入および／または発現用の１つ以上の異種遺伝子エレメントを含む。さらにより好ましくは、適合されたＤＮＡドメインへの標的化に用いられる目的のポリヌクレオチドの一方または両方のフランキング配列は、目的のポリヌクレオチドの導入および／または発現用の１つ以上の異種遺伝子エレメントを含む。さらにより好ましくは、適合されたＤＮＡドメインへの標的化に用いられる配列は、目的のポリヌクレオチドの導入および／または発現用の１つ以上のＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）遺伝子エレメントを含む。さらにより好ましくは、適合されたＤＮＡドメインへの標的化に用いられる目的のポリヌクレオチドの一方または両方のフランキング配列は、目的のポリヌクレオチドの導入および／または発現用の１つ以上のＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）遺伝子エレメントを含む。さらにより好ましくは、適合されたＤＮＡドメインへの標的化に用いられる配列は、目的のポリヌクレオチドの導入および／または発現用のＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ｇｌａＡグルコアミラーゼ遺伝子エレメントおよび／またはフランキング領域を含む。さらにより好ましくは、適合されたＤＮＡドメインへの標的化に用いられる目的のポリヌクレオチドの一方または両方のフランキング配列は、目的のポリヌクレオチドの導入および／または発現用のＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ｇｌａＡグルコアミラーゼ遺伝子エレメントおよび／またはフランキング領域を含む。さらにより好ましくは、適合されたＤＮＡドメインへの標的化に用いられる配列は、目的のポリヌクレオチドの導入および／または発現用のＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ｇｌａＡグルコアミラーゼプロモーターおよび／またはグルコアミラーゼターミネーター領域を含む。さらにより好ましくは、適合されたＤＮＡドメインへの標的化に用いられる目的のポリヌクレオチドの一方または両方のフランキング配列は、目的のポリヌクレオチドの導入および／または発現用のＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ｇｌａＡグルコアミラーゼプロモーターおよび／またはグルコアミラーゼターミネーター領域を含む。さらにより好ましくは、適合されたＤＮＡドメインへの標的化に用いられる配列は、目的のポリヌクレオチドの導入および／または発現用の、野生型状況と比較して逆の順序のＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ｇｌａＡグルコアミラーゼターミネーター領域およびｇｌａＡグルコアミラーゼプロモーターを含む。さらにより好ましくは、適合されたＤＮＡドメインへの標的化に用いられる目的のポリヌクレオチドの一方または両方のフランキング配列は、目的のポリヌクレオチドの導入および／または発現用の、野生型状況と比較して逆の順序のＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ｇｌａＡグルコアミラーゼターミネーター領域およびｇｌａＡグルコアミラーゼプロモーターを含む。さらにより好ましくは、適合されたＤＮＡドメインへの標的化に用いられる配列は、目的のポリヌクレオチドの導入および発現用の、配列番号：２で特定されるようなＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ｇｌａＡグルコアミラーゼターミネーター領域およびｇｌａＡグルコアミラーゼプロモーターを含む。さらにより好ましくは、適合されたＤＮＡドメインへの標的化に用いられる目的のポリヌクレオチドの一方または両方のフランキング配列は、目的のポリヌクレオチドの導入および発現用の、配列番号：２で特定されるようなＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ｇｌａＡグルコアミラーゼターミネーター領域およびｇｌａＡグルコアミラーゼプロモーターを含む。最も好ましくは、適合されたＤＮＡドメインへの標的化に用いられる配列および適合されたＤＮＡドメインへの標的化に用いられる目的のポリヌクレオチドの両方のフランキング配列は同じであり、目的のポリヌクレオチドの導入および発現用の、配列番号：２で特定されるようなＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ｇｌａＡグルコアミラーゼターミネーター領域およびｇｌａＡグルコアミラーゼプロモーターを含む。
【００２７】
したがって、本発明は、配列番号：２によるポリヌクレオチドまたはその機能性断片を含むポリヌクレオチドならびに配列番号：２によるポリヌクレオチドまたはその機能性断片を含むポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。機能性は、プロモーター活性を有することおよび増強された組込み選好を有する標的化配列であることと本明細書では解釈されるべきである。好ましくは、配列番号：２によるポリヌクレオチドの機能性断片は、少なくとも１００ｂｐ、より好ましくは少なくとも２００ｂｐ、より好ましくは少なくとも３００ｂｐ、より好ましくは少なくとも５００ｂｐ、より好ましくは少なくとも６００ｂｐ、より好ましくは少なくとも７００ｂｐ、より好ましくは少なくとも８００ｂｐ、より好ましくは少なくとも９００ｂｐ、より好ましくは少なくとも１０００ｂｐ、より好ましくは少なくとも１２００ｂｐ、より好ましくは少なくとも１５００ｂｐ、より好ましくは少なくとも２０００ｂｐ、より好ましくは少なくとも３０００ｂｐ、およびさらにより好ましくは少なくとも４０００ｂｐを含む。好ましくは、機能性断片は、少なくとも約５０％同一な、より好ましくは少なくとも約６０％同一な、さらにより好ましくは少なくとも約７０％同一な、さらにより好ましくは少なくとも約８０％同一な、さらにより好ましくは少なくとも約８５％同一な、さらにより好ましくは少なくとも約９０％同一な、さらにより好ましくは少なくとも約９５％同一な、さらにより好ましくは少なくとも約９７％同一な、さらにより好ましくは少なくとも約９８％同一な、さらにより好ましくは少なくとも約９９％同一な一致率（すなわち、位置同一性）を有し、かつさらに好ましくは、一致率（すなわち、同一性）は１００％に等しい。
【００２８】
最も好ましくは、配列番号：２によるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、配列番号：３またはその機能性断片を含む。機能性は、プロモーター活性を有することおよび増強された組込み選好を有する標的化配列であることと本明細書では解釈されるべきである。
【００２９】
したがって、本発明は、配列番号：３によるポリヌクレオチドまたはその機能性断片を含むポリヌクレオチドならびに配列番号：３によるポリヌクレオチドまたはその機能性断片を含むポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。好ましくは、配列番号：３による機能性断片は、少なくとも１００ｂｐ、より好ましくは少なくとも２００ｂｐ、より好ましくは少なくとも３００ｂｐ、より好ましくは少なくとも５００ｂｐ、より好ましくは少なくとも６００ｂｐ、より好ましくは少なくとも７００ｂｐ、より好ましくは少なくとも８００ｂｐ、より好ましくは少なくとも９００ｂｐ、より好ましくは少なくとも１０００ｂｐ、より好ましくは少なくとも１２００ｂｐ、より好ましくは少なくとも１３００ｂｐ、およびさらにより好ましくは少なくとも１４００ｂｐを含む。好ましくは、機能性断片は、少なくとも約５０％同一な、より好ましくは少なくとも約６０％同一な、さらにより好ましくは少なくとも約７０％同一な、さらにより好ましくは少なくとも約８０％同一な、さらにより好ましくは少なくとも約８５％同一な、さらにより好ましくは少なくとも約９０％同一な、さらにより好ましくは少なくとも約９５％同一な、さらにより好ましくは少なくとも約９７％同一な、さらにより好ましくは少なくとも約９８％同一な、さらにより好ましくは少なくとも約９９％同一な一致率（すなわち、位置同一性）を有し、かつ最も好ましくは、一致率（すなわち、同一性）は１００％に等しい。
【００３０】
ポリヌクレオチドの例は、一本鎖または二本鎖のいずれかの、リボ核酸（ＲＮＡ）分子およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子であるが、これらに限定されない。当業者であれば、本明細書で特許請求されるポリヌクレオチドの相補体および逆相補体が本発明の範囲内に含まれることが意図されることを理解するであろう。
【００３１】
本発明の実施形態によれば、適合されたＤＮＡドメインへの標的化に用いられる配列は、好ましくは、目的のポリヌクレオチドの導入および／または発現用の遺伝子エレメントであり、ここで、適合されたＤＮＡドメイン中の遺伝子エレメントの機能性はコンストラクトの組込みによって破壊される。本発明の別の実施形態によれば、適合されたＤＮＡドメインへの標的化に用いられる配列は、好ましくは、目的のポリヌクレオチドの導入および／または発現用の遺伝子エレメントであり、ここで、適合されたＤＮＡドメイン中の遺伝子エレメントの機能性はコンストラクトの組込みによって回復される。
【００３２】
実質的に相同なＤＮＡドメインは遺伝子変換によっておよび／または遺伝子増幅によって増加することができることが以前に証明されている。本明細書における使用では、異なるものであるが、遺伝子変換および遺伝子増幅という用語は両方とも互換的に用いられる。実質的に相同な異なるＤＮＡドメインは、異なる増加頻度（すなわち、遺伝子変換頻度）を有することが明らかになった。最も高い遺伝子変換頻度を有する実質的に相同なＤＮＡドメインの標的化ＤＮＡドメインを適合させる利点は、とりわけ、遺伝子変換および／または増幅によって目的のポリヌクレオチドのコピー数が増加した宿主のスクリーニングおよび選択がはるかにより効率的であることである。
【００３３】
したがって、適合された実質的に相同なＤＮＡドメインが由来する実質的に相同なＤＮＡドメインは、好ましくは、他の少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインの１つよりも少なくとも１０％高い遺伝子変換頻度を有する。より好ましくは、遺伝子変換頻度は、少なくとも１５％高く、さらにより好ましくは少なくとも２０％高く、さらにより好ましくは少なくとも３０％高く、さらにより好ましくは少なくとも４０％高く、さらにより好ましくは少なくとも５０％高く、さらにより好ましくは少なくとも６０％高く、さらにより好ましくは少なくとも７０％高く、さらにより好ましくは少なくとも８０％高く、さらにより好ましくは少なくとも９０％高く、さらにより好ましくは少なくとも１００％高く、さらにより好ましくは少なくとも１５０％高く、さらにより好ましくは少なくとも２００％高く、さらにより好ましくは少なくとも３００％高く、さらにより好ましくは少なくとも４００％高く、さらにより好ましくは少なくとも５００％より高く、およびさらにより好ましくは少なくとも１０００％高い。
【００３４】
本発明によれば、より高い遺伝子変換頻度を有する実質的に相同なＤＮＡドメインは、宿主細胞の実質的に相同なＤＮＡドメインの遺伝子変換頻度を決定することによって同定することができる。遺伝子変換頻度は、当業者に公知の任意の手段によって決定することができる。好ましい方法は、本明細書中、実施例３．１に記載されている方法である。この方法では、３つの実質的に相同なＤＮＡドメインを含む宿主細胞を目的のポリヌクレオチドで形質転換する。各々、単一の実質的に相同なＤＮＡドメイン中に目的のポリヌクレオチドの単一コピーを含み、各々の形質転換体がそのポリヌクレオチドを異なる実質的に相同なＤＮＡドメインに組み込んでいる、３つの形質転換体を選択する。形質転換体を子孫クローンへと増殖させた後、同定目的のための独特の配列タグによって、すなわち、本明細書で上に記載した「フラッグＤＮＡ」解析を用いて、子孫クローンの遺伝子型を決定する。次に、前記実質的に相同なＤＮＡドメインを含む形質転換体の遺伝子変換体の量を前記特定の形質転換体のクローンの総数で割ることによって、実質的に相同なＤＮＡドメインの遺伝子変換頻度を算出する。
【００３５】
好ましくは、本発明による宿主細胞は、実質的に相同なＤＮＡドメインのうちの少なくとも２つが各々、組み込まれた目的のポリヌクレオチドの少なくとも１コピーを有する細胞である。より好ましくは、各々の前記ドメインは、組み込まれた目的のポリヌクレオチドを少なくとも２コピー、さらにより好ましくは少なくとも３コピー、さらにより好ましくは４コピー、さらにより好ましくは４〜６コピー有する。好ましくは、本発明による宿主細胞の各々の実質的に相同なＤＮＡドメインは、同じ数の組み込まれた目的のポリヌクレオチドを有する。
【００３６】
目的のポリヌクレオチドのコピー数は、当業者に利用可能な任意の方法、例えば、サザン解析または（半）定量的ＰＣＲによる遺伝子型の解析、ノーザン解析、ＧｅｎｅＣｈｉｐまたはマイクロアレイ解析または（半）定量的ＲＴ−ＰＣＲによる発現解析、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、酵素活性アッセイによる目的のポリヌクレオチドによってコードされる産物の解析によって決定することができる。目的のポリヌクレオチドのコピー数を決定する方法は国際公開第９８４６７７２号パンフレットに広範に記載されており、目的のポリヌクレオチドのコピー数を決定する好ましい方法は本発明によるものである。
【００３７】
好ましくは、本発明による宿主細胞は、それが由来する実質的に相同なＤＮＡドメインと比較して目的のポリヌクレオチドに対する増強された組込み選好を有するように適合された少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメイン、より好ましくは３つの適合されたＤＮＡドメイン、さらにより好ましくは４つの適合されたＤＮＡドメイン、さらにより好ましくは５つの適合されたＤＮＡドメイン、さらにより好ましくは６つの適合されたＤＮＡドメインを含む。最も好ましくは、本発明による前記宿主細胞の各々の実質的に相同なＤＮＡドメインは、適合されたＤＮＡドメインである。好ましくは、適合されたＤＮＡドメインは、少なくとも２コピーの組み込まれた目的のポリヌクレオチドを少なくとも２コピー有し、さらにより好ましくは少なくとも３コピー、さらにより好ましくは少なくとも４コピーの組み込まれた目的のポリヌクレオチドを有し、さらにより好ましくは適合されたＤＮＡドメインは、少なくとも５コピー、さらにより好ましくは少なくとも６コピー、少なくとも７コピー、少なくとも８コピー、少なくとも９コピー、少なくとも１０コピーの組み込まれた目的のポリヌクレオチドを有する。最も好ましくは、適合されたＤＮＡドメインは、組み込まれた目的のポリヌクレオチドの５または６コピーを有する。好ましくは、各々の前記適合されたＤＮＡドメインは、同じ数の組み込まれた目的のポリヌクレオチドを有する。
【００３８】
好ましくは、それが由来する実質的に相同なＤＮＡドメインと比較して目的のポリヌクレオチドに対する増強された組込み選好を有するように適合され、ここで、好ましくは、各々の適合されたＤＮＡドメインは複数コピーの組み込まれた目的のポリヌクレオチドを有する、複数の実質的に相同なＤＮＡドメインを含む前記宿主細胞は、複数コピーの組み込まれた目的のポリヌクレオチドを有する単一の適合されたＤＮＡドメインを含む宿主細胞から得られる；すなわち、複数コピーの組み込まれた目的のポリヌクレオチドを有するさらなるコピーの適合されたＤＮＡドメインは、遺伝子変換によって生成される。
【００３９】
好ましくは、本発明による宿主細胞のゲノム中の所定の部位へのポリヌクレオチドの標的化組込みの効率は、組込み経路をＨＲの方向に導くことによって増大する。そのような誘導は、ＨＲ経路の効率を高めることによって、および／またはＮＨＲ経路の効率を下げる（低下させるという意味）ことによっておよび／またはＮＨＲ／ＨＲ比を減少させることによって達成することができる。
【００４０】
真核細胞は、少なくとも２つの別々の経路（相同組換え（ＨＲ）による経路および非相同組換え（ＮＨＲ）による経路）を有しており、これらの経路によって、ポリヌクレオチドを宿主ゲノム中に組み込むことができる。本発明との関連で、ＨＲ経路は、宿主のゲノム中へのポリヌクレオチドの標的化組込みの制御に関与する全ての遺伝子およびエレメントとして定義され、前記ポリヌクレオチドは、組込みが標的化される宿主のゲノムのある所定の部位との一定の相同性を有する。ＮＨＲ経路は、前記ポリヌクレオチドと宿主のゲノム配列との相同性の程度とは無関係な、宿主のゲノム中へのポリヌクレオチドの標的化組込みの制御に関与する全ての遺伝子およびエレメントとして定義される。
【００４１】
非相同組換えと相同組換えの比（ＮＨＲ／ＨＲ）は、宿主細胞のゲノム中の所定の部位へのポリヌクレオチドの標的化組込みの効率を決定する。ＮＨＲ／ＨＲ比が高い場合、標的化組込みの効率は比較的低い。ＮＨＲ／ＨＲ比が低い場合、標的化組込みの効率は比較的高い。ＮＨＲ／ＨＲの比は、ＮＨＲとＨＲの頻度を評価し、その後、それぞれの頻度を割り算することにより、当業者に公知の方法によって決定することができ、方法の一例は、国際公開第０２／０５２０２６号パンフレットに記載されている方法である。好ましくは、本発明による宿主細胞は、改変を含むＮＨＲ構成要素をコードするポリヌクレオチドを含み、ここで、前記宿主細胞は、同等の条件下で培養したとき、それが由来する親細胞と比較して、前記ＮＨＲ構成要素の産生を欠損している。前記改変は、ＮＨＲ／ＨＲ比の減少をもたらし、それに伴って、宿主細胞のゲノム中の所定の部位へのポリヌクレオチドの標的化組込みの効率を増大させる。前記ＮＨＲ構成要素の欠損をもたらす、ＮＨＲ構成要素をコードするポリヌクレオチドの改変によって、宿主細胞のＮＨＲ／ＨＲ比がＨＲの方向に導かれ、その結果として、標的化組込みの効率が増大することになる。
【００４２】
好ましくは、本発明による宿主細胞は、前記ＮＨＲ構成要素の少なくとも５％欠損、より好ましくは少なくとも１０％欠損、より好ましくは少なくとも２０％欠損、より好ましくは少なくとも３０％欠損、より好ましくは少なくとも４０％欠損、より好ましくは少なくとも５０％欠損、より好ましくは少なくとも６０％欠損、より好ましくは少なくとも７０％欠損、より好ましくは少なくとも８０％欠損、より好ましくは少なくとも９０％欠損、より好ましくは少なくとも９５％欠損、より好ましくは少なくとも９７％欠損、より好ましくは少なくとも９９％欠損を示す。最も好ましくは、宿主細胞は、前記ＮＨＲ構成要素の１００％欠損を示す。
【００４３】
改変すべきＮＨＲ構成要素は、当業者に公知の任意のＮＨＲ構成要素であることができる。好ましい改変すべきＮＨＲ構成要素は、ＫＵ７０、ＫＵ８０、ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５２、ＸＲＳ２、ＳＩＲ４、ＬＩＧ４、またはそれらのホモログの群から選択される。より好ましい改変すべきＮＨＲ構成要素は、ＫＵ７０およびＫＵ８０、ｈｄｆＡおよびｈｄｆＢまたはそれらのホモログである。最も好ましい改変すべきＮＨＲ構成要素は、ＫＵ７０もしくはｈｄｆＡ、またはそれらのホモログである。好ましくは、本発明による宿主細胞は、国際公開第２００５／０９５６２４号パンフレットに記載されているような破壊または欠失を含むＮＨＲ構成要素をコードするポリヌクレオチドを含む。そのような宿主細胞を得る方法は当業者に公知であり、かつ国際公開第２００５／０９５６２４号パンフレットに広範に記載されている。好ましくは、本発明によるＮＨＲ欠損宿主細胞におけるＮＨＲ／ＨＲ比は、同一の条件下でアッセイしたとき、非欠損親宿主細胞と比較して、少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも１００％、より好ましくは少なくとも２００％、およびさらにより好ましくは少なくとも１０００％減少している。
【００４４】
その代わりに、またはＮＨＲ構成要素の欠損と組み合わせて、本発明による宿主細胞は、宿主細胞が由来している細胞内の同じ遺伝子の発現レベルと比較して、ＨＲに関与する少なくとも１つ遺伝子の発現レベルが上方調節されている。これは、ＨＲに関与する構成要素をコードする遺伝子の発現レベルを増大させることによっておよび／またはＨＲに関与する構成要素の発現レベルを増大させることによっておよび／またはＨＲに関与する構成要素の活性を（一時的に）増大させることによって達成することができる。
【００４５】
その代わりに、または本明細書で上に記載したようなＮＨＲ／ＨＲ比の改変と組み合わせて、国際公開２００７／１１５８８６号パンフレットおよび国際公開２００７／１１５８８７号パンフレットに記載されている方法を用いて、目的のポリヌクレオチドが相同組換えによって組み込まれている宿主細胞を前向きに選択し、かつ／または組込みが非相同組換えによって生じた細胞を除外することができる。国際公開２００７／１１５８８６号パンフレットおよび国際公開２００７／１１５８８７号パンフレットには、そのような選択または除外用の（さらなる）選択マーカーの使用が記載されている。そのような選択の例は、組込みが非相同組換えによって生じた細胞をジフテリア毒素Ａによって選択的に死滅させることである（国際公開２００７／１１５８８７号パンフレット）。
【００４６】
ポリヌクレオチドの改変は、ポリヌクレオチドの配列の変化をもたらす任意の事象として本明細書で定義される。改変は１つ以上の改変と解釈される。改変は、ヌクレオチド配列中の１つ以上のヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの転写もしくは翻訳に必要とされる調節エレメントの導入（挿入）、置換または除去（欠失）によって遂行することができる。例えば、ヌクレオチドは、終止コドンの導入、開始コドンの除去またはポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームの変化もしくはフレームシフトをもたらすように挿入または除去することができる。配列またはその調節エレメントの改変は、当技術分野で公知の方法に従って、部位特異的もしくはランダムな突然変異誘発、ＤＮＡシャッフリング法、ＤＮＡ再構築法、遺伝子合成（例えば、ＹｏｕｎｇおよびＤｏｎｇ（２００４），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２（７）電子アクセスｈｔｔｐ：／／ｎａｒ．ｏｕｐｊｏｕｒｎａｌｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｒｅｐｒｉｎｔ／３２／７／ｅ５９もしくはＧｕｐｔａら（１９６８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，６０：１３３８−１３４４；Ｓｃａｒｐｕｌｌａら（１９８２），Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２１：３５６−３６５；Ｓｔｅｍｍｅｒら（１９９５），Ｇｅｎｅ  １６４：４９−５３を参照されたい）、またはＰＣＲによる突然変異誘発によって遂行することができる。ランダムな突然変異誘発手順の例は当技術分野で周知であり、例えば、化学的（例えば、ＮＴＧ）突然変異誘発または物理的（例えば、ＵＶ）突然変異誘発などがある。特異的突然変異誘発手順の例は、クイックチェンジ（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ）（商標）部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、Ｔｈｅ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｓｉｔｅｓ（登録商標）ＩＩ  インビトロ突然変異誘発システム（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）またはＧｅｎｅ．１９８９  Ａｐｒ  １５；７７（１）：５１−９（Ｈｏ  ＳＮ，Ｈｕｎｔ  ＨＤ，Ｈｏｒｔｏｎ  ＲＭ，Ｐｕｌｌｅｎ  ＪＫ，Ｐｅａｓｅ  ＬＲ  “Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ”）に記載されているようなＰＣＲを用いるかもしくはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｔｒｅｎｄｓ．（Ａ．Ｍ．ＧｒｉｆｆｉｎおよびＨ．Ｇ．Ｇｒｉｆｆｉｎ編．ＩＳＢＮ  １−８９８４８６−０１−８；１９９５  Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＰＯ  Ｂｏｘ  １，Ｗｙｍｏｎｄｈａｍ，Ｎｏｒｆｏｌｋ，Ｕ．Ｋ．）に記載されているようなＰＣＲを用いる重複伸長によるものである。
【００４７】
好ましい改変の方法は、遺伝子置換、遺伝子欠失、または遺伝子破壊の手法を基にしている。例えば、遺伝子破壊法では、内在性ポリヌクレオチドに対応するポリヌクレオチドにインビトロで突然変異を誘発して、欠損のあるポリヌクレオチドを生じさせる。次に、これを親細胞に形質転換して、欠損のあるポリヌクレオチドを生じさせる。相同組換えによって、欠損のあるポリヌクレオチドは内在性ポリヌクレオチドに置き換わる。欠損のあるポリヌクレオチドは、核酸配列が改変された形質転換体の選択に使用し得るマーカーもコードすることが望ましい場合がある。内在性ポリヌクレオチドの欠失または置換の場合、適切なＤＮＡ配列は、欠失または置換しようとする標的遺伝子座に導入しなければならない。適切なＤＮＡ配列は、好ましくは、クローニングベクター上に存在する。好ましい組込みクローニングベクターは、この所定の遺伝子座へのクローニングベクターの組込みを標的化するために欠失または置換しようとするポリヌクレオチドに相同なＤＮＡ断片を含む。標的化組込みを促進するために、宿主細胞の形質転換前に、クローニングベクターを線状化することが好ましい。線状化は、クローニングベクターの少なくとも一方の末端、しかし、好ましくは両方の末端に、欠失または置換しようとするＤＮＡ配列に相同な配列が隣接するように行なわれることが好ましい。
【００４８】
その代わりにまたは他の言及された手法と組み合わせて、Ａ  ｒａｐｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｕｓ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ（２０００）  Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ，Ｍ−Ｋ．，Ｇｈｉｃｏ，Ｊ−Ｍ．およびｄ’Ｅｎｆｅｒｔ  Ｃ；Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第２８巻，第２２号に記載されているような、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのコスミドのインビボ組換えに基づく手法を用いることができる。
【００４９】
あるいは、前記宿主細胞がポリヌクレオチドの産生を欠損する改変を、ポリヌクレオチドの核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を用いる確立されたアンチセンス技術によって実施することもできる。より具体的には、宿主細胞によるポリヌクレオチドの発現は、細胞内で転写されることができ、かつ細胞内で産生されるｍＲＮＡにハイブリダイズすることが可能な、ポリヌクレオチドの核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を導入することによって低下させるかまたは削減することができる。相補的なアンチセンスヌクレオチド配列がｍＲＮＡにハイブリダイズするのを可能にする条件下で、翻訳されるタンパク質の量をこのように低下させるかまたは削減する。アンチセンスＲＮＡを発現する例は、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０００  Ｆｅｂ；６６（２）：７７５−８２．（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆｏｌｄａｓｅ，ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  Ａ，ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ．Ｎｇｉａｍ  Ｃ，Ｊｅｅｎｅｓ  ＤＪ，Ｐｕｎｔ  ＰＪ，Ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ  ＣＡ，Ａｒｃｈｅｒ  ＤＢ）または（Ｚｒｅｎｎｅｒ  Ｒ，Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ  Ｌ，Ｓｏｎｎｅｗａｌｄ  Ｕ．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｔａｔｏ  ｕｒｉｄｉｎｅｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ．Ｐｌａｎｔａ．（１９９３）；１９０（２）：２４７−５２．）に示されている。
【００５０】
さらに、遺伝子の改変、下方調節または不活化は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術によって得ることができる（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｌｅｔｔ．２３７（２００４）：３１７−３２４）。この方法では、その発現に影響を及ぼそうとするヌクレオチド配列の同一のセンス部分およびアンチセンス部分を、ヌクレオチドスペーサーを間に入れて、互いの背後にクローニングし、発現ベクターに挿入する。そのような分子が転写された後で、小さいヌクレオチド断片の形成により、影響を及ぼそうとするｍＲＮＡの標的化分解がもたらされる。特定のｍＲＮＡの削減は様々な程度までであることができる。国際公開第２００８／０５３０１９号パンフレット、国際公開第２００５／０５６７２Ａ１号パンフレット、国際公開第２００５／０２６３５６Ａ１号パンフレット、Ｏｌｉｖｅｉｒａら，“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ”（２００８）  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ８０（５）：９１７−９２４および／またはＢａｒｎｅｓら，“ｓｉＲＮＡ  ａｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ”（２００８）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３０（５）：８８５−８９０に記載されているＲＮＡ干渉技術を、遺伝子の下方調製、改変または不活化に用いることができる。
【００５１】
ポリヌクレオチドの改変後、得られた株を、ポリヌクレオチドによってコードされる産物の欠損についてスクリーニングする。ポリヌクレオチドの発現レベルの下方調節および／または上方調節は、例えば、ノーザン解析（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．）によって細胞内に存在する対応するｍＲＮＡの量を定量化することによっておよび／または例えば、ウェスタンブロッティングもしくはＥＬＩＳＡによって細胞内に存在する対応するタンパク質の量を定量化することによってモニタリングすることができる。ｍＲＮＡ量の違いは、ＤＮＡアレイ解析によって定量化することもできる（Ｅｉｓｅｎ，Ｍ．Ｂ．およびＢｒｏｗｎ，Ｐ．Ｏ．ＤＮＡ  ａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９９：３０３：１７９−２０５）。
【００５２】
宿主細胞の欠損は、細胞が、未改変のポリヌクレオチドを含む親細胞と比較したときに、改変されたポリヌクレオチドによってコードされる産物をそれほど産生せず、かつ／または改変されたポリヌクレオチドの発現レベルが低下し（すなわち、ｍＲＮＡレベルが低下し）、かつ／または改変されたポリヌクレオチドによってコードされる産物の特定の（タンパク質）活性が減少する表現型特徴、およびこれらの可能性の組合せとして本明細書で定義される。
【００５３】
本発明によれば、実質的に相同なＤＮＡドメインは、そのネイティブ（ｎａｔｉｖｅ）の状態で高レベルの発現が可能な内在性遺伝子を含むＤＮＡドメインまたは遺伝子座（これらの用語は、本明細書で互換的に用いられる）である。「内在性」遺伝子という用語は、問題になっている生物のゲノム中の天然の遺伝子コピーとして本明細書で定義される。
【００５４】
組み込まれた組換え遺伝子の発現レベルは、その遺伝子が組み込まれるゲノム遺伝子座によって大きく異なり得ることが一般に知られている。発現させようとする組換え遺伝子の組込みのために、高発現されるＤＮＡドメインを用いる利点は、これらのＤＮＡドメインが、少なくとも内在性遺伝子の高レベル発現を支持することができるということである。それゆえ、そのようなＤＮＡドメインは、組み込まれた組換え遺伝子の高レベル発現も支持する可能性が高い。これまでに、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のｇｌａＡ遺伝子座における組込みおよびＰ．クリソゲヌム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）のペニシリンクラスターにおける組込みは、いくつかの他のゲノム遺伝子座における組込みと比較して遺伝子１コピー当たりでより高い発現レベルを提供することが明らかにされた（国際公開第９８４６７７２号パンフレットを参照されたい）。この関連で、高レベル発現が可能な遺伝子は、最大レベルで発現されたときに、全ｍＲＮＡ集団の少なくとも０．１％、好ましくは全ｍＲＮＡの少なくとも０．５％および最も好ましくは全ｍＲＮＡの少なくとも１％を占めるｍＲＮＡを産生する遺伝子と定義されることが理解されるであろう。そのような高発現可能な内在性遺伝子（これらがその中に含まれるＤＮＡドメインは、本発明による実質的に相同なＤＮＡドメインとして特に好適である）の例は、糖分解酵素、デンプン分解酵素、セルロース分解酵素および／または抗生物質生合成酵素をコードする遺伝子である。さらにより好ましいのは、グルコアミラーゼ遺伝子、ＴＡＫＡアミラーゼ遺伝子、セロビオヒドロラーゼ遺伝子およびペニシリン生合成遺伝子などの、工業プロセスに関与し、かつ高レベルで発現されることが知られている遺伝子を含む遺伝子座である。
【００５５】
好ましくは、本発明による宿主細胞の少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインは、ｇｌａＡの遺伝子座であるかまたはａｍｙＡの遺伝子座であるかまたはａｍｙＢの遺伝子座であるかまたはこれらの遺伝子座の断片もしくはホモログである。より好ましい遺伝子座は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）のｇｌａＡ、ａｍｙＡおよびａｍｙＢ遺伝子座である。さらにより好ましい遺伝子座は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）のｇｌａＡ、およびａｍｙＢ遺伝子座である。さらにより好ましい遺伝子座は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ５１３．８８のｇｌａＡ、ａｍｙＢＩおよびａｍｙＢＩＩ遺伝子座である（遺伝子は、国際公開第２００５／０９５６２４号パンフレットと同じように命名されている）。さらにより好ましい遺伝子座は、ｇｌａＡ、ａｍｙＢＩおよびａｍｙＢＩＩ遺伝子座（ｇｌａＡ遺伝子のヌクレオチド配列（Ａｎ０３ｇ０６５５０）およびそのゲノムコンテクストａ．ｏ．はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／から得ることができる；ａｍｙＢＩ遺伝子配列（Ａｎ１２ｇ０６９３０）およびａｍｙＢＩＩ遺伝子配列（Ａｎ０５ｇ０２１００）についても同上かまたはこれらの遺伝子座の断片もしくはホモログである。
【００５６】
本発明の目的のために、「相同性」および「同一性」という用語は、互換的に用いられる。２つの核酸配列間の相同性（同一性）の程度は、本明細書ではＢＬＡＳＴプログラムによって決定されることが好ましい。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公に入手可能である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータのＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムでは、ワード長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９８９）を参照されたい）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較がデフォルトとして用いられる。
【００５７】
本発明によれば、内在性遺伝子の発現が必要ない場合、高度に発現される内在性遺伝子は、本発明による宿主細胞において各々のコピーのＤＮＡドメインで不活化されていることが好ましい。そのような場合、内在性遺伝子の高レベル発現の不活化によって、目的のポリヌクレオチドの発現にさらに利用することができるエネルギーおよび資源が放出される。さらに、目的のポリヌクレオチドの組込みによって産生されるべき所望の化合物と内在性遺伝子によってコードされる酵素が両方とも分泌型酵素である場合、内在性酵素の不活化によって、所望の酵素のより純粋な調製がもたらされる。不活化の逆転を排除するために、内在性遺伝子は、内在性遺伝子の少なくとも一部の不可逆的な欠失によって不活化されていることが好ましい。内在性遺伝子の不活化は、プロモーターおよび上流の活性化配列の少なくとも一部を含む不可逆的な欠失によってもたらされることがより好ましい。これは、組換えＤＮＡ分子の組込みによって産生されるべき酵素をコードする所望の遺伝子の発現が内在性遺伝子に由来するプロモーターから駆動される場合に、特に有利であるが、それは、所望の遺伝子の発現に必要な転写因子を潜在的に制限する競合を排除するからである。
【００５８】
目的のポリヌクレオチドは任意のポリヌクレオチドであってもよい。目的のポリヌクレオチドは、任意の原核生物、真核生物、または他の供給源から得ることができる。目的のポリヌクレオチドおよびそれと関連するプロモーターは、宿主細胞にとって相同であり、自己クローンとなる組換え宿主細胞を生じさせることが好ましい。
【００５９】
本発明によれば、目的のポリヌクレオチドは、例えば、国際公開第２００６０７７２５８号パンフレットに記載されているような、最適化されたターミネーター配列を含む、変異型の最適化されたポリヌクレオチドであってもよい。目的のポリヌクレオチドは、部分的合成ポリヌクレオチドまたは完全合成核酸配列であってもよい。目的のポリヌクレオチドは、好ましくは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００６／０７７２５８号パンフレットおよび／または国際公開第２００８／０００６３２号パンフレットに記載の方法に従って、そのコドン使用について最適化されてもよい。国際公開第２００８／０００６３２号パンフレットは、コドン対最適化に対処している。コドン対最適化は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の改善された発現および／またはコードされたポリペプチドの改善された産生を得るために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列がそのコドン使用頻度（特に、使用されるコドン対）に関して改変されている方法である。コドン対は、コード配列中の２つの引き続くトリプレット（コドン）の組として定義される。
【００６０】
したがって、本発明によれば、目的のポリヌクレオチドは、コドン最適化されたポリヌクレオチドであることが好ましい。
【００６１】
ポリヌクレオチドはコード配列を含み、かつ目的のポリヌクレオチドによってコードされる化合物のクローニング、形質転換、発現および／または産生を促進するプロモーターおよび制御配列をさらに含む、核酸コンストラクト中および／またはベクター中に含めることができることが好ましい。
【００６２】
「核酸コンストラクト」は、天然の遺伝子から単離されるかまたはさもなければ自然には存在しないような形で組み合わされ、並置された核酸のセグメントを含むように改変されている一本鎖または二本鎖のいずれかの核酸分子として本明細書で定義される。核酸コンストラクトという用語は、核酸コンストラクトがコード配列の発現に必要な全ての制御配列を含む場合、「発現カセット」という用語と同義である。本明細書で定義するような「コード配列」という用語は、ｍＲＮＡに転写され、ポリペプチドに翻訳される配列である。コード配列の境界は、通常、ｍＲＮＡの５’末端のＡＴＧ開始コドンおよびｍＲＮＡの３’末端でオープンリーディングフレームを終結させる翻訳停止コドン配列によって決定される。コード配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および組換え核酸配列を含むことができるが、これらに限定されない。
【００６３】
「制御配列」という用語は、ポリペプチドの発現に必要または有利な全ての構成要素を含むよう、本明細書で定義される。各々の制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列にとってネイティブまたは外来性であってもよい。そのような制御配列には、リーダー、最適な翻訳開始配列（Ｋｏｚａｋ，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７−１９８７０に記載されているもの）、ポリアデニル化配列、プロ−ペプチド配列、プレ−プロ−ペプチド配列、プロモーター、シグナル配列、および転写ターミネーターが含まれるが、これらに限定されない。最低でも、制御配列は、プロモーター、ならびに転写および翻訳停止シグナルを含む。
【００６４】
制御配列には、制御配列とポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域とのライゲーションを容易にする特定の制限部位を導入する目的のためのリンカーが備えられていてもよい。「機能的に連結された」という用語は、制御配列がポリペプチドの産生を導くよう、制御配列がＤＮＡ配列のコード配列に対して適切な位置に置かれている配置として本明細書で定義される。
【００６５】
制御配列は、核酸配列の発現用の宿主細胞によって認識される適切なプロモーター配列、核酸配列であってもよい。プロモーター配列は、ポリペプチドの発現を仲介する転写制御配列を含む。プロモーターは、突然変異体プロモーター、切断型プロモーター、およびハイブリッドプロモーターを含む、細胞で転写活性を示す任意の核酸配列であってもよく、また、宿主細胞にとって相同または異種のいずれかの細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られてもよい。
【００６６】
プロモーターはまた、ｍＲＮＡへの転写後の翻訳のための（プロモーターと翻訳開始点の間にある）５’非コード領域、シス作用転写制御エレメント（例えば、エンハンサー）、および転写因子と相互作用することができる他のヌクレオチド配列と理解されるので。
【００６７】
プロモーターは、発現させようとするコード配列とネイティブに関連するプロモーターであってもよい。プロモーターはまた、発現させようとするコード配列にとって外来性の構成的または誘導性プロモーターであってもよい。哺乳動物細胞での使用に好適なプロモーターの例は、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（上記）に記載されている。酵母での使用に好適なプロモーターの例には、例えば、糖分解プロモーターが含まれる。
【００６８】
使用可能な好ましい誘導性プロモーターの例は、デンプン、銅、オレイン酸誘導性プロモーターである。
【００６９】
プロモーターは、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）のＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）のアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）の中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）の酸安定性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）またはＡ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）のグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒ．ミエヘイ（Ｒ．ｍｉｅｈｅｉ）のリパーゼ、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）のアルカリプロテアーゼ、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）のトリオースリン酸イソメラーゼ、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）のアセトアミダーゼをコードする遺伝子から得られるプロモーター、ＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）の中性α−アミラーゼをコードする遺伝子由来のプロモーターとＡ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）のトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子由来のプロモーターのハイブリッド、国際公開第０３／００８５７５号パンフレット）、ならびにそれらの突然変異体プロモーター、切断型プロモーター、およびハイブリッドプロモーターを含むが、これらに限定されない群から選択されることが好ましい。糸状菌細胞での使用に特に好ましいプロモーターは、プロテアーゼ遺伝子由来（例えば、Ｆ．オキシスポルム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のトリプシン様プロテアーゼ遺伝子（米国特許第４，２８８，６２７号明細書）、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）のアルカリプロテアーゼ遺伝子（ａｌｐ）、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のｐａｃＡ遺伝子、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）のアルカリプロテアーゼ遺伝子、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）の中性メタロプロテアーゼ遺伝子、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のアスペルギロペプシンプロテアーゼｐｅｐＡ遺伝子、もしくはＦ．ベネナツム（Ｆ．ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）のトリプシン遺伝子、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のアスパラギン酸プロテアーゼｐｅｐＢ遺伝子由来）のプロモーター、またはその機能性部分である。
【００７０】
単一の適切なプロモーター配列を目的のポリヌクレオチドの発現用の制御配列として用いてもよいし、または複数の別個のプロモーター配列を目的のポリヌクレオチドの発現用の制御配列として用いてもよい。複数の別個のプロモーター配列を用いる場合、少なくとも２つの別個のプロモーター配列が各々、国際公開第２００８／０９８９３３号パンフレットに従って、目的のポリヌクレオチドに機能的に連結されていることが好ましい。
【００７１】
制御配列はまた、好適な転写ターミネーター配列、すなわち、糸状菌細胞によって認識されて、転写を終結させる配列であってもよい。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に機能的に連結されている。細胞内で機能的な任意のターミネーターを本発明で用いてもよい。
【００７２】
糸状菌細胞のための好適なターミネーターは、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）のＴＡＫＡアミラーゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）のアントラニル酸シンターゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のα−グルコシダーゼ、ｔｒｐＣ遺伝子およびフサリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のトリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子から得られる。
【００７３】
制御配列はまた、好適なリーダー配列、糸状菌細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域であってもよい。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に機能的に連結されている。細胞内で機能的な任意のリーダー配列を本発明で使用してもよい。
【００７４】
糸状菌細胞のための好適なリーダーは、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）のＴＡＫＡアミラーゼおよびＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）のトリオースリン酸イソメラーゼおよびＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のｇｌａＡをコードする遺伝子から得られる。
【００７５】
他の制御配列は、ペニシリウムＩＰＮＳ遺伝子、またはｐｃｂＣ遺伝子、βチューブリン遺伝子から単離されてもよい。国際公開第０１／２１７７９号パンフレットに引用されている全ての制御配列は、本発明での使用が想定されることが企図される。
【００７６】
制御配列はまた、ポリアデニル化配列、すなわち、核酸配列の３’末端に機能的に連結され、かつ転写されたときに、糸状菌細胞によって、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして認識される配列であってもよい。細胞内で機能的な任意のポリアデニル化配列を本発明で用いてもよい。
【００７７】
糸状菌細胞のための好ましいポリアデニル化配列は、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）のＴＡＫＡアミラーゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のグルコアミラーゼ、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）のアントラニル酸シンターゼ、フサリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のトリプシン様プロテアーゼおよびＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のα−グルコシダーゼをコードする遺伝子から得られる。
【００７８】
好ましくは、ＤＮＡコンストラクトは、目的の化合物をコードする目的のポリヌクレオチドと、本明細書で上に記載したようなプロモーターＤＮＡ配列と、好ましい制御配列、例えば、
−  以下の配列リスト：ＴＡＡＧ、ＴＡＧＡおよびＴＡＡＡ、好ましくはＴＡＡＡから選択される５’から３’の方向に配向された１つの翻訳終結配列、ならびに／または
−  以下の配列リスト：ＧＣＴＡＣＣＣＣＣ；ＧＣＴＡＣＣＴＣＣ；ＧＣＴＡＣＣＣＴＣ；ＧＣＴＡＣＣＴＴＣ；ＧＣＴＣＣＣＣＣＣ；ＧＣＴＣＣＣＴＣＣ；ＧＣＴＣＣＣＣＴＣ；ＧＣＴＣＣＣＴＴＣ；ＧＣＴＧＣＣＣＣＣ；ＧＣＴＧＣＣＴＣＣ；ＧＣＴＧＣＣＣＴＣ；ＧＣＴＧＣＣＴＴＣ；ＧＣＴＴＣＣＣＣＣ；ＧＣＴＴＣＣＴＣＣ；ＧＣＴＴＣＣＣＴＣ；およびＧＣＴＴＣＣＴＴＣ、好ましくはＧＣＴ  ＴＣＣ  ＴＴＣから選択される５’から３’の方向に配向された１つの翻訳イニシエーターコード配列、ならびに／または
−  以下の配列リスト：ヌクレオチドの多義性暗号：ｍ（Ａ／Ｃ）；ｗ（ＡＴＴ）；ｙ（Ｃ／Ｔ）；ｋ（ＧＴＴ）；ｈ（Ａ／Ｃ／Ｔ）を用いた、５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＡＡ−３’；５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＣＡ−３’もしくは５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＡＧ−３’、好ましくは５’−ＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡ−３’もしくは５’−ＣＧＣＡＧＴＣＡＡＧ−３’から選択される１つの翻訳イニシエーター配列と
を含む。
【００７９】
本発明との関連で、「翻訳イニシエーターコード配列」という用語は、ＤＮＡコード配列のオープンリーディングフレームのイニシエーターまたは開始コドンのすぐ下流にある９個のヌクレオチドとして定義される。イニシエーターまたは開始コドンは、ＡＡメチオニンをコードする。イニシエーターコドンは、典型的にはＡＴＧであるが、ＧＴＧなどの任意の機能的な開始コドンであってもよい。
【００８０】
本発明との関連で、「翻訳終結配列」という用語は、オープンリーディングフレームまたはヌクレオチドコード配列の３’末端にある翻訳停止コドンから始まり、５’から３’の方向に配向されている４個のヌクレオチドとして定義される。
【００８１】
本発明との関連で、「翻訳イニシエーター配列」という用語は、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のオープンリーディングフレームのイニシエーターまたは開始コドンのすぐ上流にある１０個のヌクレオチドとして定義される。イニシエーターまたは開始コドンは、ＡＡメチオニンをコードする。イニシエーターコドンは、典型的にはＡＴＧであるが、ＧＴＧなどの任意の機能的な開始コドンであってもよい。ＲＮＡでは、ウラシル（Ｕ）がデオキシヌクレオチドのチミン（Ｔ）に置き換わることが当技術分野で周知である。
【００８２】
目的の化合物をコードする目的のポリヌクレオチド、または目的のポリヌクレオチドおよび上記の制御配列を含むＤＮＡコンストラクトを連結させて、最適なポリヌクレオチド配列の挿入または置換を可能にする１つ以上の好都合な制限部位を含み得る組換え発現ベクターを産生することができる。
【００８３】
あるいは、目的のポリヌクレオチドは、配列または目的のポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクトを発現用の適切なベクターに挿入することによって発現させることができる。発現ベクターを作製する際、コード配列が発現、および場合によっては分泌用の適切な制御配列と機能的に連結されるようにコード配列をベクター内に位置させる。
【００８４】
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に好都合に供することができ、かつ目的のポリヌクレオチドの発現をもたらすことができる任意のベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であってもよい。ベクターの選択は、通常、ベクターとベクターを導入しようとする宿主細胞との適合性によって決まる。ベクターは、線状または閉環状プラスミドであってもよい。ベクターは、自律複製ベクター、すなわち、その複製が染色体複製に依存しない染色体外実体として存在するベクター（例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体）であってもよい。自律的に維持されるクローニングベクターは、ＡＭＡ１配列を含んでいてもよい（例えば、ＡｌｅｋｓｅｎｋｏおよびＣｌｕｔｔｅｒｂｕｃｋ（１９９７），Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．２１：３７３−３９７を参照されたい）。
【００８５】
あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入したときに、ゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体とともに複製するベクターであってもよい。組込み型クローニングベクターは、この所定の遺伝子座へのクローニングベクターの組込みを標的化するために、宿主細胞のゲノム中の所定の標的遺伝子座のＤＮＡ配列と相同なＤＮＡ断片を含むことが好ましい。標的化組込みを促進するために、宿主細胞の形質転換前に、クローニングベクターを線状化することが好ましい。線状化は、クローニングベクターの少なくとも一方の、しかし、好ましくは両方の末端に、標的遺伝子座と相同な配列が隣接するように行なわれることが好ましい。標的遺伝子座に隣接する相同配列の長さは、好ましくは少なくとも３０ｂｐ、好ましくは少なくとも５０ｂｐ、好ましくは少なくとも０．１ｋｂ、さらに好ましくは少なくとも０．２ｋｂ、より好ましくは少なくとも０．５ｋｂ、さらにより好ましくは少なくとも１ｋｂ、最も好ましくは少なくとも２ｋｂである。
【００８６】
ベクター系は、単一のベクターもしくはプラスミドまたは糸状菌細胞のゲノム中に導入しようとする全ＤＮＡを一緒に含有する、２つ以上のベクターもしくはプラスミド、またはトランスポゾンであってもよい。
【００８７】
ベクターは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にする１つ以上の選択可能マーカーを含むことが好ましい。共形質転換の方法を用いると、１つのベクターは選択可能マーカーを含むことができ、一方、別のベクターは、目的のポリヌクレオチドまたは目的の核酸コンストラクトを含むことができる。これらのベクターは、宿主細胞の形質転換に同時に用いられる。本発明による宿主細胞は、共形質転換効率が非常に高く、最大で１００％となることができる能力を有する（実施例１２．２を参照されたい）。
【００８８】
選択可能マーカーは、その産物が殺生物剤またはウイルスに対する耐性、重金属に対する耐性、栄養要求株に対する原栄養性などを提供する遺伝子である。糸状菌宿主細胞で用いられる選択可能マーカーは、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｂｌｅＡ（フレオマイシン結合）、ｈｙｇＢ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸還元酵素）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびに他の種由来の等価物を含むが、これらに限定されない群から選択することができる。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）細胞での使用に好ましいのは、ａｍｄＳ（欧州特許第６３５５７４Ｂ１号明細書、国際公開第９７／０６２６１号パンフレット）およびＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはＡ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）のｐｙｒＧ遺伝子およびストレプトミセス・ハイグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）のｂａｒ遺伝子である。より好ましくはａｍｄＳ遺伝子、さらにより好ましくはＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のａｍｄＳ遺伝子を用いる。最も好ましい選択マーカー遺伝子は、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）のｇｐｄＡプロモーターに融合されたＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）のａｍｄＳコード配列である（欧州特許第６３５５７４Ｂ１号明細書を参照されたい）。他の糸状菌由来のＡｍｄＳ遺伝子も用いることができる（国際公開第９７／０６２６１号パンフレット）。
【００８９】
上記のエレメントを連結して本発明の組換え発現ベクターを構築するために用いられる手順は、当業者に周知である（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（上記）；ならびにＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ，１９９５を参照されたい）。
【００９０】
好ましくは、本発明による宿主細胞は、適合されたＤＮＡドメインおよび場合により標的化組込みの増大した効率に加えて、ｇｌａＡ、ａｍｙＡ、ａｍｙＢＩ、ａｍｙＢＩＩ、ｏａｈＡ、毒素関連ポリヌクレオチドおよびｐｒｔＴの群から選択されるポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドは改変を含み、ここで、宿主細胞は、同等の条件下で培養したとき、それが由来する親細胞と比較して、改変を含むポリヌクレオチドによってコードされる産物を欠損している。改変は本明細書で先に定義されている。
【００９１】
好ましくは、本発明による宿主細胞はＳｅｃ６１の改変をさらに含む。宿主細胞の欠損は、先に本明細書にあるように、細胞が、未改変のポリヌクレオチドを含む親細胞と比較したとき、改変されたポリヌクレオチドによってコードされる産物をそれほど産生せず、かつ／または改変されたポリヌクレオチドの発現レベルが低下し（すなわち、ｍＲＮＡレベルが低下し）、かつ／または改変されたポリヌクレオチドによってコードされる産物の特定の（タンパク質）活性が減少する表現型特徴、およびこれらの特徴の組合せとして本明細書で定義される。
【００９２】
好ましくは、本発明による宿主細胞は、ｇｌａＡ、ａｍｙＡ、ａｍｙＢＩ、ａｍｙＢＩＩ、ｏａｈＡ、毒素関連ポリヌクレオチドまたはｐｒｔＴのうちの少なくとも１つの少なくとも５％の欠損、より好ましくは少なくとも１０％の欠損、より好ましくは少なくとも２０％の欠損、より好ましくは少なくとも３０％の欠損、より好ましくは少なくとも４０％の欠損、より好ましくは少なくとも５０％の欠損、より好ましくは少なくとも６０％の欠損、より好ましくは少なくとも７０％の欠損、より好ましくは少なくとも８０％の欠損、より好ましくは少なくとも９０％の欠損、より好ましくは少なくとも９５％の欠損、より好ましくは少なくとも９７％の欠損、より好ましくは少なくとも９９％の欠損を示す。最も好ましくは、宿主細胞は、ｇｌａＡ、ａｍｙＡ、ａｍｙＢＩ、ａｍｙＢＩＩ、ｏａｈＡ、毒素関連ポリヌクレオチドまたはｐｒｔＴのうちの少なくとも１つの１００％の欠損を示す。
【００９３】
目的の化合物の産生におけるグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、酸安定性α−アミラーゼ（ａｍｙＡ）、中性α−アミラーゼ（ａｍｙＢＩおよびａｍｙＢＩＩ）ならびにシュウ酸ヒドロラーゼ（ｏａｈＡ）の群から選択される１つ以上のポリペプチドの欠損の利点は、エネルギーおよび資源がこれらの副産物に利用されないとうことである。このエネルギーおよび資源は、目的のポリヌクレオチドによってコードされる化合物の産生に用いることができる。さらに、副産物がほとんど存在しないので、下流での目的の化合物の処理が簡単になる。
【００９４】
シュウ酸ヒドロラーゼ（ｏａｈＡ）は、多くの宿主細胞におけるシュウ酸の合成経路の構成要素である。ｏａｈＡを欠損している宿主細胞は、シュウ酸を欠損している。シュウ酸は、食品用途などの多くの用途において望ましくない副産物である。さらに、シュウ酸は、この構成要素を産生する宿主細胞の培地培養のｐＨを低下させ、収率の低下をもたらす。すなわち、シュウ酸欠損宿主細胞では収率が増加する。それゆえ、本発明による宿主細胞がｏａｈＡを欠損していれば有利である。ＯａｈＡ欠損宿主細胞および前記宿主細胞を産生する好ましい方法は、国際公開第２０００／５０５７６号パンフレットおよび国際公開第２００４／０７００２２号パンフレットに広範に記載されている。ｏａｈＡ欠損宿主細胞を産生する好ましい方法は、国際公開第２０００／５０５７６号パンフレットに記載されている組換えによる破壊法である。好ましくは、本発明による宿主細胞は、ｏａｈＡを欠損している。好ましくは、ｏａｈＡは、真菌のｏａｈＡである。より好ましくは、ｏａｈＡは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来のｏａｈＡである。さらにより好ましくは、ｏａｈＡは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のｏａｈＡである。さらにより好ましくは、ｏａｈＡは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ５１３．８８由来のｏａｈＡである。最も好ましくは、ｏａｈＡは、Ａｎ１０ｇ００８２０の配列を含む。
【００９５】
ｐｒｔＴは、真核細胞におけるプロテアーゼの転写アクチベーターである。最近、プロテアーゼのいくつかの真菌転写アクチベーターが、国際公開第００／２０５９６号パンフレット、国際公開第０１／６８８６４号パンフレット、国際公開第２００６／０４０３１２号パンフレットおよび国際公開第２００７／０６２９３６号パンフレットに記載されている。これらの転写アクチベーターは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）（Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ））、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）（Ａ．フミガーツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ））、ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）（Ｐ．クリソゲヌム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ））およびアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）（Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ））から単離された。プロテアーゼ遺伝子のこれらの転写アクチベーターは、真菌細胞でポリペプチドを産生するための方法を改善するために用いることができ、その場合、ポリペプチドは、プロテアーゼ分解に感受性がある。宿主細胞がｐｒｔＴを欠損しているとき、宿主細胞は、ｐｒｔＴの転写制御下にあるプロテアーゼをあまり産生しない。それゆえ、本発明による宿主細胞がｐｒｔＴを欠損していれば有利である。ｐｒｔＴ欠損宿主およびこれらの宿主を産生する好ましい方法は、国際公開第０１／６８８６４号パンフレット、国際公開第２００６／０４０３１２号パンフレットに広範に記載されている。国際公開第０１／６８８６４号パンフレットおよび国際公開第２００６／０４０３１２号パンフレットには、ｐｒｔＴコード配列を破壊するための組換えによる、古典的な方法が記載されている。国際公開第２００７／０６２９３６号パンフレットには、プロテアーゼプロモーター内のｐｒｔＴ結合部位の破壊が記載されている。結合部位の破壊は、ｐｒｔＴが結合部位に結合するのを妨げる。その結果として、プロテアーゼの転写はｐｒｔＴによって活性化されず、プロテアーゼはあまり産生されない。
【００９６】
好ましくは、本発明による宿主細胞は、ｐｒｔＴをコードするポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドは改変を含み、ここで、宿主細胞は、同等の条件下で培養したとき、それが由来する親細胞と比較して、ｐｒｔＴの産生を欠損している。好ましくは、ｐｒｔＴは、真菌のｐｒｔＴである。より好ましくは、ｐｒｔＴは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来のｐｒｔＴである。さらにより好ましくは、ｐｒｔＴは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のｐｒｔＴである。さらにより好ましくは、ｐｒｔＴは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ５１３．８８由来のｐｒｔＴである。最も好ましくは、ｐｒｔＴは、Ａｎ０４ｇ０６９４０の配列を含む。
【００９７】
「グルコアミラーゼ」（ｇｌａＡ）という用語は、「アミログルコシダーゼ」という用語と同一であり、１，４結合α−Ｄ−グルコース残基および末端１，４結合α−Ｄ−グルコース残基の鎖中の分岐点における１，６−α−Ｄ−グルコシド結合のエンド加水分解を触媒するデキストリン６−α−Ｄ−グルカノヒドロラーゼ活性を有する酵素として本明細書で定義される。グルコアミラーゼ活性は、基質のｐ−ニトロフェニル−ａ−Ｄ−グルコピラノシド（シグマ（Ｓｉｇｍａ））からのパラニトロフェノールの遊離を測定することによって、ＡＧＩＵ／ｍｌとして測定することができる。これにより黄色い色が生じ、その吸光度は、分光光度計を用いて４０５ｎｍで測定することができる。１ＡＧＩＵは、可溶性のデンプン基質からｐＨ４．３および６０℃で１分間に１μモルのグルコースを生じさせる酵素の分量である。国際公開第９８／４６７７２号パンフレットに、アッセイのさらなる詳細を見出すことができる。
【００９８】
好ましくは、本発明による宿主細胞は、ｇｌａＡをコードするポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドは改変を含み、ここで、宿主細胞は、同等の条件下で培養したとき、それが由来する親細胞と比較して、ｇｌａＡの産生を欠損している。好ましくは、ｇｌａＡは、真菌のｇｌａＡである。より好ましくは、ｇｌａＡは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来のｇｌａＡである。さらにより好ましくは、ｇｌａＡは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のｇｌａＡである。さらにより好ましくは、ｇｌａＡは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ５１３．８８由来のｇｌａＡである。最も好ましくは、ｇｌａＡは、Ａｎ０３ｇ０６５５０の配列を含む。
【００９９】
「α−アミラーゼ」という用語は、水の存在下で３つ以上のα−１，４結合グルコースユニットを有する多糖のマルトオリゴ糖へのエンド加水分解を触媒する１，４−α−Ｄ−グルカングルカノヒドロラーゼ活性として本明細書で定義される。（中性）α−アミラーゼ活性を測定するために、供給元のプロトコルに従って、メガザイム（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）の穀物α−アミラーゼキットを用いる（メガザイム、ＣＥＲＡＬＰＨＡαアミラーゼアッセイキット、カタログ参照番号Ｋ−ＣＥＲＡ、２０００−２００１年）。測定される活性は、過剰のグルコアミラーゼおよびα−グルコシダーゼの存在下、ｐＨ７．０での、非還元末端がブロックされたｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシドの加水分解に基づく。形成されたｐ−ニトロフェノールの量は、試料中に存在するα−アミラーゼ活性の尺度である。
【０１００】
「酸安定性α−アミラーゼ」（ａｍｙＡ）という用語は、酸性ｐＨ範囲で最適な活性を有するα−アミラーゼ活性を有する酵素として本明細書で定義される。酸安定性α−アミラーゼ活性を測定するために、これも、供給元のプロトコルに従うが、酸性ｐＨでメガザイムの穀物α−アミラーゼキットを用いる（メガザイム、ＣＥＲＡＬＰＨＡαアミラーゼアッセイキット、カタログ参照番号Ｋ−ＣＥＲＡ、２０００−２００１年）。測定される活性は、過剰のグルコアミラーゼおよびα−グルコシダーゼの存在下、ｐＨ４．５での、非還元末端がブロックされたｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシドの加水分解に基づく。形成されたｐ−ニトロフェノールの量は、試料中に存在する酸安定性α−アミラーゼ活性の尺度である。
【０１０１】
好ましくは、本発明による宿主細胞は、ＡｍｙＡをコードするポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドは改変を含み、ここで、宿主細胞は、同等の条件下で培養したとき、それが由来する親細胞と比較して、ａｍｙＡを欠損している。好ましくは、ａｍｙＡは、真菌のａｍｙＡである。より好ましくは、ａｍｙＡは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来のａｍｙＡである。さらにより好ましくは、ａｍｙＡは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のａｍｙＡである。さらにより好ましくは、ａｍｙＡは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ５１３．８８由来のａｍｙＡである。最も好ましくは、ａｍｙＡは、Ａｎ１１ｇ０３３４０の配列を含む。
【０１０２】
「中性α−アミラーゼ活性」（ａｍｙ）という用語は、中性ｐＨ範囲で最適な活性を有するα−アミラーゼ活性を有する酵素として本明細書で定義される。
【０１０３】
好ましくは、本発明による宿主細胞は、ＡｍｙＢをコードするポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドは改変を含み、ここで、宿主細胞は、同等の条件下で培養したとき、それが由来する親細胞と比較して、ａｍｙＢＩおよび／またはａｍｙＢＩＩの産生を欠損している。より好ましくは、宿主細胞は、ａｍｙＢＩおよびａｍｙＢＩＩを欠損している。好ましくは、ａｍｙＢは、真菌のａｍｙＢである。より好ましくは、ａｍｙＢは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来のａｍｙＢである。さらにより好ましくは、ａｍｙＢは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のａｍｙＢＩである。さらにより好ましくは、ａｍｙＢは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ５１３．８８由来のａｍｙＢＩである。最も好ましくは、ａｍｙＢＩは、Ａｎ１２ｇ０６９３０の配列を含む。さらにより好ましくは、ａｍｙＢは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のａｍｙＢＩＩである。さらにより好ましくは、ａｍｙＢは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ５１３．８８由来のａｍｙＢＩＩである。最も好ましくは、ａｍｙＢＩＩは、Ａｎ０５ｇ０２１００の配列を含む。
【０１０４】
毒素関連ポリヌクレオチドという用語は、化合物をコードする遺伝子クラスター、多数の遺伝子、遺伝子もしくはその部分、または少なくとも１つの毒素もしくは毒素中間体化合物の生合成もしくは分泌に関与する生化学的経路として本明細書で定義される。前記化合物は、例えば、ポリペプチドであり、これは、酵素であってもよい。
【０１０５】
目的のポリペプチドの産生において宿主細胞として用いられるいくつかの宿主細胞（とりわけ、真菌）は、様々な毒素の生合成に関与する酵素をコードする遺伝子を有する。例えば、シクロピアゾン酸、コウジ酸、３−ニトロプロピオン酸およびアフラトキシンは、例えば、アスペルギルス・フラブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）で形成される既知の毒素である。同様に、トリコテセンは、いくつかの真菌、例えば、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の種（例えば、フサリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）で形成され、オクラトキシンは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）によって産生され得る。最近、工業用アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）宿主株のゲノムの配列決定により、フモニシン遺伝子クラスターが明らかになった（Ｐｅｌら，“Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒｙ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＣＢＳ５１３．８８”．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７  Ｆｅｂ；２５（２）：２２１−２３１）。これらの毒素は、操作者、消費者および環境に健康被害を提示する可能性があるので、目的の化合物の発酵時のそのような毒素の形成は極めて望ましくない。その結果として、毒素欠損宿主細胞は目的の化合物を、毒素を含まずに産生するのを可能にする。産物から毒素を取り除く必要がないので、毒素を含まない化合物は産生するのがより簡単である。さらに、化合物の規制認可手続きは、より簡単である。
【０１０６】
好ましくは、本発明による宿主細胞は、化合物（例えば、酵素であり得るポリペプチドであってもよい）または生化学的経路をコードする毒素関連ポリヌクレオチドを含み、前記毒素関連ポリヌクレオチドは改変を含み、ここで、宿主細胞は、同等の条件下で培養したとき、それが由来する親細胞と比較して、前記毒素または毒素中間体化合物の産生を欠損している。好ましくは、毒素または毒素中間体化合物は、真菌の毒素または毒素中間体化合物である。より好ましくは、毒素または毒素中間体化合物は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来の毒素または毒素中間体化合物である。さらにより好ましくは、毒素または毒素中間体化合物は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来の毒素または毒素中間体化合物である。さらにより好ましくは、毒素または毒素中間体化合物は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ５１３．８８由来の毒素または毒素中間体化合物である。さらにより好ましくは、毒素または毒素中間体化合物は、フモニシンまたはフモニシン中間体化合物である。さらにより好ましくは、毒素または毒素中間体化合物は、オクラトキシンまたはオクラトキシン中間体化合物である。最も好ましくは、毒素または毒素中間体化合物は、オクラトキシンまたはフモニシンまたはオクラトキシン中間体またはフモニシン中間体化合物である。
【０１０７】
好ましくは、毒素関連ポリヌクレオチドは、化合物（例えば、酵素であり得るポリペプチドであってもよい）または真菌の毒素もしくは毒素中間体化合物の産生に関与する生化学的経路をコードする。より好ましくは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来の毒素または毒素中間体化合物。さらにより好ましくは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来の毒素または毒素中間体化合物。さらにより好ましくは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ５１３．８８由来の毒素または毒素中間体化合物。さらにより好ましくは、フモニシンまたはフモニシン中間体化合物。さらにより好ましくは、フモニシン−Ｂまたはフモニシン−Ｂ中間体化合物。さらにより好ましくは、フモニシン−Ｂ２またはフモニシン−Ｂ２中間体化合物。さらにより好ましくは、毒素関連ポリヌクレオチドは、Ａｎ０１ｇ０６８２０からＡｎ０１ｇ０６９３０までのフモニシンクラスターの配列を含む。最も好ましくは、毒素関連ポリヌクレオチドは、Ａｎ０１ｇ０６９３０の配列を含む。
【０１０８】
別の好ましい実施形態では、毒素関連ポリヌクレオチドは、化合物（例えば、酵素であり得るポリペプチドであってもよい）またはオクラトキシンもしくはオクラトキシン中間体化合物の産生に関与する生化学的経路をコードする。より好ましくは、オクラトキシンＡまたはオクラトキシンＡ中間体化合物。より好ましくは、毒素関連ポリヌクレオチドは、Ａｎ１５ｇ０７８８０からＡｎ１５ｇ０７９３０までのクラスターの配列を含む。最も好ましくは、毒素関連ポリヌクレオチドは、Ａｎ１５ｇ０７９１０の配列および／またはＡｎ１５ｇ０７９２０の配列を含む。
【０１０９】
好ましくは、本発明による宿主細胞は、化合物（例えば、酵素であり得るポリペプチドであってもよい）または生化学的経路をコードする少なくとも１つの毒素関連ポリヌクレオチドを含み、前記毒素関連ポリヌクレオチドは少なくとも１つの改変を含み、ここで、宿主細胞は、同等の条件下で培養したとき、それが由来する親細胞と比較して、毒素または毒素中間体化合物の産生を欠損している。
【０１１０】
より好ましくは、本発明による宿主細胞は、２つの毒素関連ポリヌクレオチドを含み、前記２つの毒素関連ポリヌクレオチドは各々、少なくとも１つの改変を含み、ここで、宿主細胞は、同等の条件下で培養したとき、それが由来する親細胞と比較して、フモニシンおよびオクラトキシンの産生を欠損していることが好ましい。
【０１１１】
さらにより好ましくは、本発明による宿主細胞は、３つ以上の毒素関連ポリヌクレオチドを含み、前記３つ以上の毒素関連ポリヌクレオチドは各々、少なくとも１つの改変を含み、ここで、宿主細胞は、同等の条件下で培養したとき、それが由来する親細胞と比較して、フモニシン、オクラトキシンおよび少なくとも１つのさらなる毒素または毒素中間体化合物の産生を欠損していることが好ましい。
【０１１２】
好ましくは、本発明による宿主細胞は、ｇｌａＡおよび前記構成要素をコードするポリヌクレオチドに改変を有するために、ｇｌａＡならびにａｍｙＡ、ａｍｙＢＩ、ａｍｙＢＩＩ、ｏａｈＡ、毒素関連化合物およびｐｒｔＴの群から選択される構成要素のうちの少なくとも１つを欠損している。より好ましくは、本発明による宿主細胞は、ｇｌａＡ、ｏａｈＡならびにａｍｙＡ、ａｍｙＢＩ、ａｍｙＢＩＩ、毒素関連化合物およびｐｒｔＴの群から選択される構成要素のうちの少なくとも１つを欠損している。さらにより好ましくは、本発明による宿主細胞は、ｇｌａＡ、ｏａｈＡ、毒素関連化合物ならびにａｍｙＡ、ａｍｙＢＩ、ａｍｙＢＩＩ、およびｐｒｔＴの群から選択される構成要素のうちの少なくとも１つを欠損している。さらにより好ましくは、本発明による宿主細胞は、ｇｌａＡ、ｏａｈＡ、ａｍｙＡ、ａｍｙＢＩ、ａｍｙＢＩＩならびに毒素関連化合物およびｐｒｔＴの群から選択される構成要素のうちの少なくとも１つを欠損している。さらにより好ましくは、本発明による宿主細胞は、ｇｌａＡ、ｏａｈＡ、ａｍｙＡ、ａｍｙＢＩ、ａｍｙＢＩＩ、ｐｒｔＴおよび毒素関連化合物を欠損している。最も好ましくは、目的のポリヌクレオチドの１コピー以上の組込みに好適な少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインを含み、ここで、少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインのうちの少なくとも１つは、それが由来する実質的に相同なＤＮＡドメインと比較して目的のポリヌクレオチドに対する増強された組込み選好を有するように適合されている、本発明による宿主細胞は、ｇｌａＡ、ｏａｈＡ、ａｍｙＡ、ａｍｙＢＩ、ａｍｙＢＩＩ、ｐｒｔＴおよび毒素関連化合物を欠損しており、かつＮＨＲ構成要素、好ましくはｋｕ７０またはそのホモログをさらに欠損している。
【０１１３】
本明細書で上に記載した構成要素の欠損または改変の他に、本発明による宿主細胞は、他の構成要素（例えば、ｐｅｐＡのような主要なプロテアーゼ）を欠損していてもよい。好ましくは、ｐｅｐＡは、真菌のｐｅｐＡである。より好ましくは、ｐｅｐＡは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来のｐｅｐＡである。さらにより好ましくは、ｐｅｐＡは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のｐｅｐＡである。さらにより好ましくは、ｐｅｐＡは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ５１３．８８由来のｐｅｐＡである。最も好ましくは、ｐｅｐＡは、Ａｎ１４ｇ０４７１０の配列を含む。好ましくは、本発明による宿主細胞は、ｐｅｐＡの少なくとも５％の欠損、より好ましくは少なくとも１０％の欠損、より好ましくは少なくとも２０％の欠損、より好ましくは少なくとも３０％の欠損、より好ましくは少なくとも４０％の欠損、より好ましくは少なくとも５０％の欠損、より好ましくは少なくとも６０％の欠損、より好ましくは少なくとも７０％の欠損、より好ましくは少なくとも８０％の欠損、より好ましくは少なくとも９０％の欠損、より好ましくは少なくとも９５％の欠損、より好ましくは少なくとも９７％の欠損、より好ましくは少なくとも９９％の欠損を示す。最も好ましくは、宿主細胞は、ｐｅｐＡの１００％の欠損を示す。
【０１１４】
その代わりに、または本明細書で上に記載した欠損と組み合わせて、宿主細胞は、目的のポリペプチドの産生能力を高めるために、野生型細胞と比較して上昇した小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）を含む。ＵＰＲは、米国特許出願公開第２００４／０１８６０７０Ａ１号明細書および／または米国特許出願公開第２００１／００３４０４５Ａ１号明細書および／または国際公開第０１／７２７８３Ａ２号明細書および／または国際公開第２００５／１２３７６３号パンフレットに記載の手法によって増大させることができる。より具体的には、ＵＰＲが上昇した宿主細胞を得るために、ＨＡＣ１および／もしくはＩＲＥ１および／もしくはＰＴＣ２のタンパク質レベルが調節され、かつ／またはＳＥＣ６１タンパク質が操作されている。好ましいＳＥＣ６１改変は、ＳＥＣ６１の一方向の突然変異体、すなわち、デノボ合成タンパク質がＳＥＣ６１を介してＥＲに侵入することができるが、タンパク質がＳＥＣ６１を介してＥＲを離れることができない突然変異体を生じさせる改変である。そのような改変は、国際公開第２００５／１２３７６３号パンフレットに広範に記載されている。最も好ましくは、ＳＥＣ６１改変は、セリン３７６がトリプトファンに置き換えられているＳ３７６Ｗ突然変異である。
【０１１５】
本発明による好ましい宿主細胞は、目的の化合物を産生するための組換えアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）組換え宿主細胞であり、前記宿主細胞は、目的のポリヌクレオチドの１コピー以上の組込みに好適な少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインを含み、ここで、少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインのうちの少なくとも１つは、それが由来する実質的に相同なＤＮＡドメインと比較して目的のポリヌクレオチドに対する増強された組込み選好を有するように適合され、かつ適合された実質的に相同なＤＮＡドメインが由来する実質的に相同なＤＮＡドメインは、少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインの他の１つよりも少なくとも１０％高い遺伝子変換頻度を有し、ここで、適合された実質的に相同なＤＮＡドメインは、独特の配列タグによって他のバージョンの実質的に相同なＤＮＡドメインと区別され、かつ適合された実質的に相同なＤＮＡドメインは、標的化ＤＮＡドメインを含み、ここで、前記標的化ＤＮＡドメインは、増強された組込み選好を有する配列を含み、かつ前記宿主細胞は、ｇｌａＡ、ｐｅｐＡ、ｈｄｆＡ、ａｍｙＢＩＩ、ａｍｙＢＩ、ａｍｙＡ、ｏａｈＡ、ｆｕｍＢ、ｏｃｈを欠損している。好ましくは、前記宿主細胞は、ｓｅｃ６１  Ｓ３７６Ｗ突然変異、すなわち、セリン３７６がトリプトファンに置き換えられているＳ３７６Ｗ突然変異を有する。より好ましくは、前記宿主細胞はさらに、ｐｒｔＴを欠損している。そのような宿主細胞は、実施例９、１０および１１に記載されている。
【０１１６】
好ましくは、本発明による宿主細胞は、選択マーカーを含まない宿主細胞である。
【０１１７】
この状況は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のアセトアミーゼ遺伝子（ａｍｄＳ）などの、二方向性の優性選択マーカーの対抗選択によって得てもよい。このマーカーを用いて、アセトアミドを唯一の炭素および／または窒素源として用いて選択することによって、この遺伝子を有する形質転換体を選択することができる一方、例えば、フルオロアセトアミドで、対抗選択（この用語は、以下、マーカー遺伝子の不在についての選択に用いられる）を行なうことができる。特定の宿主細胞で作用する他の二方向性の優性選択マーカーを類似のやり方で用いることができる。二方向性マーカー遺伝子の除去組換え（ｏｕｔ−ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）は、導入しようとするプラスミド上に直接反復が両側にある遺伝子を挿入することによって容易になる。
【０１１８】
欧州特許第０６３５５７４Ｂ１号明細書に開示されているように、ａｍｄＳ二方向性マーカーは両方向に優性であり、これは、任意の遺伝子バックグラウンドの形質転換された細胞を（アセトアミドを唯一の炭素源および／または唯一の窒素源として用いて）マーカーの存在について選択することができることを意味する。他の二方向性マーカーは、ＵＲＡ３、ＬＹＳ２、ｐｙｒＧ、ｆａｃＡなどである。
【０１１９】
マーカーを含まない細胞の使用はより簡単に規制当局に認可され、同時に、工業用の発酵条件下における酵母のエネルギー収支にあまり負担をかけない。
【０１２０】
本発明による宿主細胞は、任意の宿主細胞であってもよい。本発明による宿主細胞で産生される化合物の特定の使用について、宿主細胞の選択は、そのような使用に従って行なうことができる。例えば、本発明による宿主細胞で産生される化合物を食品用途で用いることになっている場合、宿主細胞は、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの食品等級の生物から選択することができる。特定の使用には、食品用途、（動物）飼料用途、医薬品用途、農業用途（例えば、作物保護）、および／またはパーソナルケア用途が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２１】
一実施形態によれば、本発明による宿主細胞は、真核宿主細胞である。好ましくは、真核細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞、または藻類細胞である。好ましい哺乳動物細胞には、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、ＰｅｒＣ６細胞、およびハイブリドーマが含まれる。好ましい昆虫細胞には、例えば、Ｓｆ９およびＳｆ２１細胞ならびにその派生物が含まれる。より好ましくは、真核細胞は、真菌細胞、すなわち、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、スキゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、またはヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株などの酵母細胞である。より好ましくは、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、または糸状菌細胞由来のものである。最も好ましくは、真核細胞は糸状菌細胞である。
【０１２２】
「糸状菌」には、（ＡｉｎｓｗｏｒｔｈおよびＢｉｓｂｙのＤｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｉ，第８版，１９９５，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫでＨａｗｋｓｗｏｒｔｈらによって定義されているような）全ての糸状形態の真菌類および卵菌類という亜門が含まれる。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、および他の複合多糖から構成される菌糸壁を特徴とする。栄養増殖は菌糸伸長によるものであり、炭素代謝は偏性好気性である。糸状菌株には、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アガリクス（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリヌス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロミセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、パネロカエテ（Ｐａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、ヒラタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、スエヒロタケ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、テルモアスクス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、ティエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の株が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２３】
好ましい糸状菌細胞は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、クリロスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の種、および最も好ましくはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティヅス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ソヤエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、タラロミセス・エメルソニイ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フサリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）またはペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）の種に属する。より好ましい宿主細胞は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）である。本発明による宿主細胞がアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）宿主細胞である場合、宿主細胞は、好ましくは、ＣＢＳ５１３．８８、ＣＢＳ１２４．９０３またはそれらの派生物である。最も好ましくは、本発明による組換え宿主細胞は、本明細書中の実施例に記載されているような宿主細胞、好ましくは実施例４〜１１に見られるような宿主細胞である。
【０１２４】
糸状菌のいくつかの株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  Ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）、およびＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＲＲＬ）アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ５１３．８８、ＣＢＳ１２４．９０３、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＡＴＣＣ２０４２３、ＩＦＯ４１７７、ＡＴＣＣ１０１１、ＣＢＳ２０５．８９、ＡＴＣＣ９５７６、ＡＴＣＣ１４４８８−１４４９１、ＡＴＣＣ１１６０１、ＡＴＣＣ１２８９２、Ｐ．クリソゲヌム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ＣＢＳ４５５．９５、ペニシリウム・シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）ＡＴＣＣ３８０６５、アクレモニウム・クリソゲヌム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）Ｐ２、タラロミセス・エメルソニイ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）ＣＢＳ１２４．９０２、ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ＡＴＣＣ３６２２５またはＡＴＣＣ４８２７２、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ＡＴＣＣ２６９２１またはＡＴＣＣ５６７６５またはＡＴＣＣ２６９２１、アスペルギルス・ソヤエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）ＡＴＣＣ１１９０６、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）ＡＴＣＣ４４００６およびそれらの派生物などのいくつかの培養コレクションにおいて一般に容易に入手可能なものがある。
【０１２５】
別の実施形態によれば、本発明による宿主細胞は原核細胞である。好ましくは、原核宿主細胞は細菌細胞である。「細菌細胞」という用語には、グラム陰性微生物とグラム陽性微生物の両方が含まれる。好適な細菌は、例えば、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、カウロバクター（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）（シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ））、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエルラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）またはストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）から選択してもよい。好ましくは細菌細胞は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．プンティス（Ｂ．ｐｕｎｔｉｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．ハロヅランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、Ｇ．オキシダンス（Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ）、カウロバクター・クレスケンツス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）ＣＢ１５、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、ロドバクター・スファエロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、シュードモナス・ゼアキサンティニファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）、パラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｃ．グルタミクム（ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、スタフィロコッカス・カルノースス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓ）、ストレプトミセス・リウィダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、シノリゾビウム・メリオティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｏｔｉ）およびリゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択される。
【０１２６】
本発明による宿主細胞は、様々な目的、例えば、目的の化合物の産生ならびに国際公開第１９９９／０３２６１７号パンフレットおよび国際公開第２００８／１３８８３５号パンフレットに記載されているような発現クローニングに好都合に用いることができる。これらの特許出願では、糸状菌細胞を宿主細胞として用いる発現クローニングの便宜性が記載されている。
【０１２７】
本発明はまた、目的の化合物を産生するための組換え宿主細胞の産生方法であって、前記宿主細胞が目的のポリヌクレオチドの１コピー以上の組込みに好適な少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインを含み、別の実質的に相同なＤＮＡドメインと比較してより高い遺伝子変換頻度を有する実質的に相同なＤＮＡドメインを、好ましくはより高い遺伝子変換頻度を有する実質的に相同なＤＮＡドメインに標的化ＤＮＡドメインを提供することによって、それが由来する実質的に相同なＤＮＡドメインと比較して目的のポリヌクレオチドに対する増強された組込み選好を有するように適合させることを含み、ここで、前記標的化ＤＮＡドメインは、増強された組込み選好を有する配列を含む、方法を提供する。
【０１２８】
別の実質的に相同なＤＮＡドメインと比較してより高い遺伝子変換比率を有する実質的に相同なＤＮＡドメインを、それが由来する実質的に相同なＤＮＡドメインと比較して目的のポリヌクレオチドに対する増強された組込み選好を有するように適合させることは、当業者に公知の任意の手段によって実施することができる。好ましくは、適合された実質的に相同なＤＮＡドメインは、宿主のゲノム内で部分的にまたは完全に独特である。実施例３に示すように、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）におけるアンプリコンは、事前にゲノムから除去されたグルコアミラーゼプロモーター配列を用いて適合させる。これにより、独特の標的化配列を有する実質的に相同なＤＮＡドメインが得られた。目的のポリヌクレオチドのプロモーターおよびターミネーター部分は、実施例１１に示すような形質転換の後、適合された実質的に相同なＤＮＡドメインでの組込みに好適なＤＮＡ配列として機能する。当業者のための、これらの実験を実施するための全ての手段は、本明細書ならびにＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ（上記）に記載されている。
【０１２９】
好ましくは、目的の化合物を産生するための組換え宿主細胞の産生方法は、
ａ．得られた細胞を、目的のポリヌクレオチドを含む、より高い遺伝子変換比率を有する適合された実質的に相同なＤＮＡドメインで形質転換する工程と、
ｂ．実質的に相同なＤＮＡドメインの少なくとも１つに組み込まれた目的のポリヌクレオチドを有する細胞を選択またはスクリーニングする工程と、
ｃ．（ｂ）で得られた細胞を繁殖させ、さらなるコピーの実質的に相同なＤＮＡドメインに組み込まれた前記目的のポリヌクレオチドの少なくとも1コピーを有する細胞を選択またはスクリーニングする工程と
をさらに含む。
【０１３０】
より好ましくは、目的の化合物を産生するための組換え宿主細胞の産生方法は、本明細書中の実施例で記載されているような方法である。
【０１３１】
細胞の形質転換のための方法は当業者に周知である。任意のそのような方法を本発明の目的のために用いてもよい。形質転換は、それ自体公知の方法でのプロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、および細胞壁の再生からなるプロセスを含んでいてもよい。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞の形質転換の好適な手順は、欧州特許第２３８０２３号明細書およびＹｅｌｔｏｎら，１９８４，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ８１：１４７０−１４７４に記載されている。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を用いるアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）および他の糸状菌宿主細胞の形質転換の好適な手順は、例えば、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８  Ｓｅｐ；１６（９）：８３９−４２．（誤記あり（Ｅｒｒａｔｕｍ  ｉｎ：））Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９９８  Ｎｏｖ；１６（１１）：１０７４．Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ．ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ  ＭＪ，Ｂｕｎｄｏｃｋ  Ｐ，Ｈｏｏｙｋａａｓ  ＰＪ，Ｂｅｉｊｅｒｓｂｅｒｇｅｎ  ＡＧ．Ｕｎｉｌｅｖｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ中の訂正に記載されている。フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種を形質転換する好適な方法は、Ｍａｌａｒｄｉｅｒら，１９８９，Ｇｅｎｅ  ７８：１４７１５６によってまたは国際公開第９６／００７８７号パンフレットに記載されている。Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｂｌｉｇａｔｅ  ｐｌａｎｔ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｆｕｎｇｕｓ，Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｆ．ｓｐ．ｈｏｒｄｅｉ．Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ  ＳＫ，Ｋｎｕｄｓｅｎ  Ｓ，Ｇｉｅｓｅ  Ｈ．Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ．１９９５  Ｄｅｃ；２９（１）：１００−２に記載されているような微粒子銃による形質転換を用いる方法などの他の方法を適用することができる。酵母は、Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．およびＳｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．編，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１９４巻，１８２−１８７頁，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ中のＢｅｃｋｅｒおよびＧｕａｒｅｎｔｅ；ｌｔｏら，１９８３，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １５３：１６３；ならびにＨｉｎｎｅｎら，１９７８，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ７５：１９２０によって記載されている手順を用いて形質転換してもよい。
【０１３２】
得られた形質転換体のうちのどれが、そのＤＮＡドメインの１つに組換えＤＮＡ分子の組込みを有するのかを明らかにするために、いくつかの日常的な手法が当業者に利用可能である。
【０１３３】
さらなる工程では、選択された形質転換体を繁殖させ、その子孫から、ＤＮＡドメインのうちの少なくとも２つが組み込まれた目的のポリヌクレオチドを含む株を選択する。これは、組み込まれた目的のポリヌクレオチドを含むＤＮＡドメインが、「空の」ＤＮＡドメインによる遺伝子変換を通じてかまたは増幅を通じてかのいずれかで増加している株を選択することを意味する。そのような遺伝子変換および／または増幅事象は、低い頻度で自然に起こる。これらの事象が起こる正確な頻度は、問題となっている宿主細胞ならびにＤＮＡドメインの数、長さおよび相同性の程度を含むいくつかの変数によって決まり得る。しかしながら、これらの頻度は、これらの事象が起こった株を当業者に公知の解析手法を用いてスクリーニングおよび選択するのを可能にするほど十分に高い。組み込まれた目的のポリヌクレオチドを含むＤＮＡドメインが増加している株は、例えば、目的のポリヌクレオチドによってコードされる産物の産生レベルがより高い株を単にスクリーニングすることによって、またはあるいはその遺伝子型を、例えば、上で概説したような「ＤＮＡフラッグ」テストで解析することによって同定することができる。
【０１３４】
本発明による組換え宿主細胞の産生方法は、組み込まれた目的のポリヌクレオチドを含むＤＮＡドメインの増加が起こった株の１つを繁殖させ、その子孫から、さらなるコピーのＤＮＡドメインが、組み込まれた目的のポリヌクレオチドを含む株を選択する、さらなる工程を含んでいてもよい。その後、各々のＤＮＡドメインが、組み込まれた目的のポリヌクレオチドを含む株が得られるまで、これらの株に再びこの手順を受けさせてもよい。
【０１３５】
好ましくは、上記の方法の工程（ｃ）を実質的に相同なＤＮＡドメインのうちの少なくとも３つが組み込まれた目的のポリヌクレオチドの少なくとも1コピーを有するまで繰り返す。より好ましくは、工程（ｃ）を実質的に相同なＤＮＡドメインのうちの少なくとも４つが少なくとも１コピーの組み込まれた目的のポリヌクレオチドを有するまで繰り返す。さらにより好ましくは、工程（ｃ）を実質的に相同なＤＮＡドメインのうちの少なくとも５つが少なくとも１コピーの組み込まれた目的のポリヌクレオチドを有するまで繰り返す。さらにより好ましくは、工程（ｃ）を実質的に相同なＤＮＡドメインのうちの少なくとも６つが少なくとも１コピーの組み込まれた目的のポリヌクレオチドを有するまで繰り返す。最も好ましくは、工程（ｃ）を実質的に相同なＤＮＡドメインの各々が少なくとも１コピーの組み込まれた目的のポリヌクレオチドを有するまで繰り返す。
【０１３６】
本発明はまた、目的の化合物を産生する方法であって、
ａ．前記化合物の産生をもたらす条件下で本発明による宿主細胞を培養することと、
ｂ．培養培地から目的の化合物を回収することと
を含む方法を提供する。
【０１３７】
本発明はまた、目的の化合物を産生する方法であって、
ａ．前記化合物の産生をもたらす条件下で組換え宿主細胞を培養することであって、前記宿主細胞は、目的のポリヌクレオチドの１コピー以上の組込みに好適な少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインを含み、ここで、少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインのうちの少なくとも１つは、それが由来する実質的に相同なＤＮＡドメインと比較して目的のポリヌクレオチドに対する増強された組込み選好を有するように適合され、かつ実質的に相同なＤＮＡドメインのうちの少なくとも２つは、組み込まれた目的のポリヌクレオチドを少なくとも1コピー有する、と、
ｂ．培養培地から目的の化合物を回収することと
を含む方法を提供する。
【０１３８】
本発明による産生方法では、当技術分野で公知の方法を用いて、目的の化合物（例えば、ポリペプチドまたは代謝産物）の産生に好適な栄養培地中で宿主細胞を培養する。本発明を限定するものと解釈されるべきでない培養方法の例は、深部発酵、固体状態での表面発酵および液体基質上での表面発酵である。例えば、細胞は、好適な培地中ならびにコード配列の発現および／またはポリペプチドの単離を可能にする条件下での実験用または工業用発酵槽における振盪フラスコ培養、小規模または大規模発酵（連続発酵、回分発酵、流加発酵、または固体状発酵を含む）によって培養することができる。培養は、当技術分野で公知の手順を用いて、炭素および窒素源ならびに無機塩を含む好適な栄養培地中で起こる。好適な培地は、商業的供給業者から入手可能であるかまたは（例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のカタログで）公表されている組成に従って調製することができる。ポリペプチドまたは代謝産物が栄養培地中に分泌される場合、ポリペプチドまたは代謝産物を培地から直接回収することができる。ポリペプチドまたは代謝産物が分泌されない場合、細胞ライセートから回収することができる。
【０１３９】
ポリペプチドは、ポリペプチドに特異的な当技術分野で公知の方法を用いて検出することができる。これらの検出方法は、特異的抗体の使用、酵素産物の形成、または酵素基質の消失が含むことができる。
【０１４０】
得られる目的の化合物（例えば、ポリペプチドまたは代謝産物）は、当技術分野で公知の方法によって回収することができる。例えば、ポリペプチドまたは代謝産物は、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、または沈殿を含むが、これらに限定されない、従来の手順によって栄養培地から回収することができる。
【０１４１】
ポリペプチドは、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除）、電気泳動手順（例えば、分取等電点電気泳動法）、示差溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または抽出を含むが、これらに限定されない、当技術分野で公知の種々の手順によって精製することができる（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊ．−Ｃ．ＪａｎｓｏｎおよびＬａｒｓ  Ｒｙｄｅｎ編，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９を参照されたい）。
【０１４２】
好ましくは、本発明による方法における宿主細胞は、本発明で先に記載したような選択マーカーを含まない宿主細胞である。
【０１４３】
好ましくは、本発明による方法における宿主細胞は、本発明で先に記載したような真菌宿主細胞である。
【０１４４】
好ましくは、本発明による方法における宿主細胞は、本発明で先に記載したような糸状菌宿主細胞である。
【０１４５】
本発明の目的の化合物は、任意の生体化合物であることができる。生体化合物は、任意の生体ポリマーまたは代謝産物であってもよい。生体化合物は、生合成経路もしくは代謝経路を構成する単一のポリヌクレオチドもしくは一連のポリヌクレオチドによってコードされていてもよいし、または単一のポリヌクレオチドの産物もしくは一連のポリヌクレオチドの産物の直接の結果であってもよい。生体化合物は、宿主細胞にとってネイティブであっても、または異種であってもよい。
【０１４６】
「異種の生体化合物」という用語は、細胞にとってネイティブでない生体化合物；またはネイティブな生体化合物を変化させるために構造的な改変がなされたネイティブな生体化合物として本明細書で定義される。
【０１４７】
「生体ポリマー」という用語は、同一の、同様の、または異なるサブユニット（モノマー）の鎖（またはポリマー）として本明細書で定義される。生体ポリマーは、任意の生体ポリマーであってもよい。生体ポリマーは、例えば、核酸、ポリアミン、ポリオール、ポリペプチド（もしくはポリアミド）、または多糖であってもよいが、これらに限定されない。
【０１４８】
生体ポリマーはポリペプチドであってもよい。ポリペプチドは、目的の生体活性を有する任意のポリペプチドであってもよい。「ポリペプチド」という用語は、本明細書では、特定の長さのコードされた産物を指すことを意味するものではなく、それゆえ、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質を包含する。ポリペプチドには、上述のポリペプチドおよびハイブリッドポリペプチドの天然のアレルバリエーションおよび操作されたバリエーションがさらに含まれる。ポリペプチドは、宿主細胞にとってネイティブであっても、または異種であってもよい。ポリペプチドは、コラーゲンもしくはゼラチン、またはそれらの変異体もしくはハイブリッドであってもよい。ポリペプチドは、抗体またはその部分、抗原、凝固因子、酵素、ホルモンまたはホルモン変異体、受容体またはその部分、調節タンパク質、構造タンパク質、受容体、または輸送体タンパク質、分泌過程に関与するタンパク質、フォールディング過程に関与するタンパク質、シャペロン、ペプチドアミノ酸輸送体、グリコシル化因子、転写因子、合成ペプチドまたはオリゴペプチド、細胞内タンパク質であってもよい。細胞内タンパク質は、プロテアーゼ、セラミダーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、アミノペプチダーゼ、アシラーゼ、アルドラーゼ、ヒドロキシラーゼ、アミノペプチダーゼ、リパーゼなどの酵素であってもよい。ポリペプチドは、細胞外に分泌される酵素であってもよい。そのような酵素は、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、デキストラナーゼ、エステラーゼの群に属してもよい。酵素は、カルボヒドラーゼ、例えば、セルラーゼ（例えば、エンドグルカナーゼ、β−グルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、もしくはβ−グルコシダーゼ）、ヘミセルラーゼもしくはペクチン分解酵素（例えば、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、ガラクトシダーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、ペクチン酸リアーゼ、エンドポリガラクツロナーゼ、エキソポリガラクツロナーゼ、ラムノーガラクツロナーゼ、アラバナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、アラビノキシランヒドロラーゼ、ガラクツロナーゼ、リアーゼ、もしくはデンプン分解酵素）；ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、もしくはリガーゼ、ホスファターゼ（例えば、フィターゼ）、エステラーゼ（例えば、リパーゼ）、タンパク質分解酵素、オキシドレダクターゼ（例えば、オキシダーゼ）、トランスフェラーゼ、またはイソメラーゼであってもよい。酵素はフィターゼであってもよい。酵素は、アミノペプチダーゼ、アスパラギナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、エンドプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼカタラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、タンパク質デアミナーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはグルコースオキシダーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、モノオキシゲナーゼであってもよい。
【０１４９】
本発明の方法では、ポリペプチドは、別のポリペプチドがポリペプチドまたはその断片のＮ末端もしくはＣ末端で融合された融合ポリペプチドまたはハイブリッドポリペプチドであることもできる。融合されたポリペプチドは、あるポリペプチドをコードする核酸配列（またはその一部）を別のポリペプチドをコードする核酸配列（またはその一部）に融合することによって産生される。
【０１５０】
融合ポリペプチドを産生するための技術は当技術分野で公知であり、かつそれらがインフレームとなり、融合されたポリペプチドの発現が同じプロモーターおよびターミネーターの制御下となるようにポリペプチドをコードするコード配列を連結させることを含む。ハイブリッドポリペプチドは、１つまたは複数が宿主細胞にとって異種であってもよい少なくとも２つの異なるポリペプチドから得られる部分的なまたは完全なポリペプチド配列の組合せを含んでいてもよい。
【０１５１】
生体ポリマーは多糖であってもよい。多糖は、ムコ多糖（例えば、ヘパリンおよびヒアルロン酸）ならびに窒素含有多糖（例えば、キチン）を含むが、これらに限定されない、任意の多糖であってもよい。より好ましい選択肢では、多糖はヒアルロン酸である。
【０１５２】
本発明による目的のポリヌクレオチドは、有機酸、カロテノイド、（β−ラクタム）抗生物質、およびビタミンなどの、一次または二次代謝産物の合成に関与する酵素をコードしていてもよい。そのような代謝産物は、本発明による生体化合物とみなしてもよい。
【０１５３】
「代謝産物」という用語は、一次代謝産物と二次代謝産物の両方を包含し、代謝産物は、任意の代謝産物であってもよい。好ましい代謝産物は、クエン酸、グルコン酸およびコハク酸である。
【０１５４】
代謝産物は、例えば、生合成経路または代謝経路内の１つ以上の遺伝子によってコードされていてもよい。一次代謝産物は、エネルギー代謝、増殖、および構造に関する細胞の一次代謝または一般的な代謝の産物である。二次代謝産物は、二次代謝の産物である（例えば、Ｒ．Ｂ．Ｈｅｒｂｅｒｔ，Ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ，Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８１を参照されたい）。
【０１５５】
一次代謝産物は、アミノ酸、脂肪酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、糖、トリグリセリド、またはビタミンであってもよいが、これらに限定されない。
【０１５６】
二次代謝産物は、アルカロイド、クマリン、フラボノイド、ポリケチド、キニーネ、ステロイド、ペプチド、またはテルペンであってもよいが、これらに限定されない。二次代謝産物は、抗生物質、摂食阻害物質、誘引物質、殺細菌物質、殺真菌物質、ホルモン、殺虫物質、または殺鼠物質であってもよい。好ましい抗生物質は、セファロスポリンおよびβ−ラクタムである。
【０１５７】
生体化合物はまた、選択可能マーカーの産物であってもよい。選択可能マーカーは、目的のポリヌクレオチドの産物であり、この産物は、殺生物剤またはウイルスに対する耐性、重金属に対する耐性、栄養要求株に対する原栄養性などを提供する。選択可能マーカーには、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｙｇＢ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸還元酵素）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、ｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ｂｌｅ（フレオマイシン耐性タンパク質）、およびそれらの等価物が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５８】
本発明によれば、本発明による方法における目的の化合物は、本明細書に記載したようなポリペプチドであることが好ましい。
【０１５９】
本発明による方法におけるポリペプチドは、本明細書に記載したような酵素であることが好ましい。
【０１６０】
本発明によれば、本発明による方法における目的の化合物は、代謝産物であることが好ましい。
【０１６１】
本発明の別の態様によれば、宿主細胞の少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインの適合されたＤＮＡドメインは、遺伝子変換および／または増幅によって、最も低い増加頻度を有する。異なる実質的に相同なＤＮＡドメインは、異なる増加頻度、すなわち、遺伝子変換頻度を有することが明らかになった。最も低い増加頻度を有する実質的に相同なＤＮＡドメインの標的化ＤＮＡドメインを適合させる利点は、実質的に相同なＤＮＡドメインにおける組換えの頻度が低い遺伝的に安定な宿主が得られることである。
【０１６２】
誤って同定された塩基を含む必要があるため、本明細書で提供されている配列情報は、それほど狭義に解釈されるべきではない。本明細書に開示されている特定の配列を容易に用いて、それぞれの宿主細胞から完全な遺伝子を単離することができ、次に、この完全な遺伝子をさらなる配列解析に容易にかけ、それにより、シークエンシングのエラーを同定することができる。
【０１６３】
別途示されない限り、本明細書中のＤＮＡ分子をシークエンシングすることによって決定される全てのヌクレオチド配列は、自動化ＤＮＡシークエンサーを用いて決定され、本明細書で決定されるＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチドの全てのアミノ酸配列は、上記のように決定された核酸配列の翻訳によって予想された。それゆえ、この自動化された手法によって決定される任意のＤＮＡ配列について当技術分野で知られているように、本明細書で決定される任意のヌクレオチド配列は、いくつかのエラーを含んでいてもよい。自動化によって決定されるヌクレオチド配列は、典型的には、シークエンシングされたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％同一、より典型的には、少なくとも約９５％から少なくとも約９９．９％同一である。実際の配列は、当技術分野で周知の手動のＤＮＡシークエンシング法を含む他の手法によってより正確に決定することができる。これも当技術分野で知られているように、実際の配列と比較した、決定されたヌクレオチド配列における単一の挿入または欠失は、決定されたヌクレオチド配列によってコードされる予想アミノ酸配列が、そのような挿入点または欠失点から、シークエンシングされたＤＮＡ分子によって実際にコードされるアミノ酸配列と完全に異なるように、ヌクレオチド配列の翻訳においてフレームシフトを生じさせる。
【０１６４】
当業者は、そのような誤って同定された塩基を同定することができ、そのようなエラーを訂正する方法を知っている。
【０１６５】
本明細書に含まれる特定の実施形態は、本発明のいくつかの態様の実例であることが意図されるので、本明細書に記載され、特許請求された本発明は、これらの実施形態によって範囲が限定されるべきではない。等価な実施形態はいずれも、本発明の範囲内であることが意図される。実際、本明細書に示され、記載された変更に加えた、本発明の様々な変更が、前述の記載から当業者に明らかになるであろう。そのような変更も、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。矛盾がある場合、定義を含む本開示が指針と考えられる。
【０１６６】
［実施例］
［株］
ＷＴ１：このアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）株を野生型株として用いる。この株は、寄託番号ＣＢＳ５１３．８８でＣＢＳ研究所（ＣＢＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）に寄託されている。
【０１６７】
ＷＴ２：このＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）突然変異体株は、国際公開第９８／４６７７２号パンフレットに本質的に記載されているような方法による古典的な株改良によってＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ５１３．８８から得られる。ＮＴＧまたはＵＶによるＷＴ１の胞子の突然変異誘発後、振盪フラスコにおける突然変異体株の改善されたグルコアミラーゼ産生について選択を行なった。いくつかの改善されたＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株が同定され、そのうち、優良な株は、３〜４倍増加したグルコアミラーゼ活性レベルを生じさせた。この突然変異体株は、寄託番号ＣＢＳ１２４．９０３でＣＢＳ研究所に寄託されている。振盪フラスコ解析および遺伝子解析から、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ１２４．９０３株は、ｇｌａＡ遺伝子座（アンプリコン）の増幅に起因する（３）ｇｌａＡ遺伝子コピー数の増加を伴って、グルコアミラーゼ産生が３〜４倍増加しているという結論が得られた。
【０１６８】
ＧＢＡ３００：このＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株は、３つのｇｌａＡアンプリコンの改変を含むＷＴ２株である。ＧＢＡ３００株の構築は、国際公開第９８／４６７７２号パンフレットに記載の方法に従って行なわれた。この特許出願では、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ゲノムを含むアンプリコンから３つのｇｌａＡ特異的ＤＮＡ配列を欠失させて、３つの切断されたｇｌａＡアンプリコンを有するａｍｄＳ陰性株を生じさせる方法が広範に記載されている。この手順により、最終的に外来性のＤＮＡ配列を全く有さない、マーカー遺伝子を含まない（ＭＡＲＫＥＲ−ＧＥＮＥ  ＦＲＥＥ）ΔｇｌａＡ組換えＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＷＴ２株が得られた。この３つの切断されたｇｌａＡアンプリコンをＢａｍＨＩ切断アンプリコン、ＳａｌＩ切断アンプリコンおよびＢｇｌＩＩ切断アンプリコンと命名する。
【０１６９】
［Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）振盪フラスコ発酵］
Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株を、国際公開第９９／３２６１７号パンフレットの実施例「アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）振盪フラスコ発酵」の節に記載されているように、２０ｍｌの前培養培地中で前培養した。一晩増殖させた後、この培養物１０ｍｌを、国際公開第９９／３２６１７号パンフレットに記載されているような７％グルコースを含む発酵培地１（ＦＭ１）に移した。このＦＭ１は、１リットル当たりに、以下のものを含有する：カゼイン加水分解物２５ｇ、酵母抽出物１２．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  １ｇ、Ｋ２ＳＯ４  ２ｇ、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ  ０．５ｇ、ＺｎＣｌ２  ０．０３ｇ、ＣａＣｌ２  ０．０２ｇ、ＭｎＳＯ４．４Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ、ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ  ０．３ｇ、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（５０００ＩＵ／ｍｌのＰｅｎ−５ｍｇ／ｍｌのＳｔｒｅｐ）  １０ｍｌ、４ＮのＨ２ＳＯ４でｐＨ５．６に調整。発酵は、表示された日数の間、３４℃および１７０ｒｐｍで、１００ｍｌの発酵ブロスを含むバッフル付きの５００ｍｌフラスコ中で行なわれる。
【０１７０】
発酵培地２（ＦＭ２）はＰＬＡ２発酵に用いられ、１リットル当たりに、以下のものを含有する：グルコース．１Ｈ２Ｏ  ８２．５ｇ、Ｍａｌｄｅｘ１５（ブーム・メッペル（Ｂｏｏｍ  Ｍｅｐｐｅｌ）、オランダ）  ２５ｇ、クエン酸２ｇ、ＮａＨ２ＰＯ４．１Ｈ２Ｏ  ４．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ９ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  １５ｇ、ＺｎＣｌ２  ０．０２ｇ、ＭｎＳＯ４．１Ｈ２Ｏ  ０．１ｇ、ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ  ０．０１５ｇ、ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ  ０．０１５ｇ、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ  ０．１ｇ、ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ  ０．３ｇ、ＭＥＳ（２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸）  ３０ｇ、ｐＨ＝６。
【０１７１】
［毒素測定用のＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）寒天培地］
以下の培地上で株を培養し、オクラトキシンＡ（ＯＴＡ）およびフモニシンＢ２（ＦＢ２）の産生について試験した：ＦｒｉｓｖａｄおよびＦｉｌｔｅｎｂｏｒｇ，１９８９（Ｔｅｒｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｅ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉａ：ｃｈｅｍｏｔａｘｏｎｏｍｙ  ａｎｄ  ｍｙｃｏｔｏｘｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｍｙｃｏｌｏｇｉａ  ８１：８３７−８６１）ならびにＦｒｉｓｖａｄおよびＴｈｒａｎｅ，１９９３（Ｌｉｑｕｉｄ  ｃｏｌｕｍｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓｍ  Ｉｎ：Ｂｅｔｉｎａ（編）：Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓ．Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｊ．ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ５４：２５３−３７２  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）によって本質的に記載されているようなツァペック酵母自己分解物寒天（ＣＹＡ）および酵母抽出物ショ糖寒天（ＹＥＳ）。ペトリ皿を暗所２４℃で７日間インキュベートし、その後、抽出用に単一コロニーから寒天プラグを採取した。８４％ＣＨ３ＣＮ水を用い、超音波浴に１時間置いて抽出を行ない、その後、０．４５μｍのＰＴＦＥフィルターに通して溶媒を濾過した。
【０１７２】
規定量のＦＢ２およびＯＴＡになるよう内部標準溶液をサンプルに添加して、定量を行なった。Ｍｏｇｅｎｓｅｎら，２０１０（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｍｏｎｉｓｉｎ  Ｂ２  ａｎｄ  Ｂ４  ｂｙ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ｉｎ  ｒａｉｓｉｎｓ  ａｎｄ  ｇｒａｐｅｓ，Ｊ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５８：９５４−９５８）によって記載され、Ｎｉｅｌｓｅｎら、２００９（Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ａｎｄ  ｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ｇｒｏｕｐ，Ａｎａｌ  Ｂｉｏａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ３９５：１２２５−１２４２）に概説されているようにＬＣ−ＭＳ／ＭＳを行なった。
【０１７３】
［実施例１．アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＧＢＡ３０１（ΔｇｌａＡ、ΔｐｅｐＡ）の構築］
このＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株は、主要な細胞外アスパラギン酸プロテアーゼＰｅｐＡをコードするｐｅｐＡ遺伝子の欠失を含むＧＢＡ３００株である。ＧＢＡ３０１株は、欧州特許第０６３５５７４号明細書に記載されているような「マーカー遺伝子を含まない（ＭＡＲＫＥＲ−ＧＥＮＥ  ＦＲＥＥ）」アプローチを用いて構築される。この特許に記載されている方法を用いて、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｍｂｅｒｇｈら（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｍｂｅｒｇｈ  ＪＰ，Ｓｏｌｌｅｗｉｊｎ  Ｇｅｌｐｋｅ  ＭＤ，ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｏｎｄｅｒｖｏｏｒｔ  ＰＪ，Ｂｕｘｔｏｎ  ＦＰ，Ｖｉｓｓｅｒ  Ｊ．（１９９７）−Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ｉｎ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ−ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ，ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ，ａｎｄ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４７（２）：６０５−１３）によって記載されているように、ＧＢＡ３００のゲノム中のｐｅｐＡ特異的ＤＮＡ配列を欠失させる。この手順により、ＧＢＡ３００株バックグラウンドでｐｅｐＡ遺伝子が不活化されているマーカー遺伝子を含まないＧＢＡ３０１株が得られた。
【０１７４】
［実施例２．アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＧＢＡ３０２（ΔｇｌａＡ、ΔｐｅｐＡ、ΔｈｄｆＡ）の構築］
既知の原理に従ってｈｄｆＡ用の遺伝子置換ベクターを設計し、日常的なクローニング手順に従って構築した。基本的には、これらのベクターは、所定のゲノム遺伝子座での相同組換え用に、ｈｄｆＡ  ＯＲＦの約１〜２ｋｂのフランキング領域を含む。さらに、これらは、直接反復と直接反復の間にＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）二方向性ａｍｄＳ選択マーカーを含む。欠失ベクターの一般的な設計は、以前に欧州特許出願公開第６３５５７４Ｂ号明細書および国際公開第９８／４６７７２号パンフレットに記載されており、欠失ベクターを構築するための一般的なクローニングベクターｐＧＢＤＥＬ（図１）の使用は、国際公開第０６／０４０３１２号パンフレットに記載されている。
【０１７５】
ベクターｐＤＥＬ−ＨＤＦＡ（図２）は、相同組換え用にｈｄｆＡ  ＯＲＦの約１ｋｂフランキング領域を含む。Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）遺伝子の全ヌクレオチド配列およびそのゲノムコンテクストは、例えば、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）またはＥＭＢＬ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｌ／）から得ることができる。欠失ベクターｐＤＥＬ−ＨＤＦＡの線状ＤＮＡを単離し、これを用い、国際公開第０５／０９５６２４号パンフレットに以前に詳細に記載されているような方法を用いて、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＧＢＡ３０１を形質転換し、ｈｄｆＡ遺伝子を欠失させた。本明細書中の全ての実施例における遺伝子欠失に適用された方法では、線状ＤＮＡが用いられた。この線状ＤＮＡは、二重交差によってフランキング配列の相同な遺伝子座でゲノム中に組み込まれ、その結果、欠失しようとする遺伝子をａｍｄＳ遺伝子に置き換える。その後、フルオロアセトアミド培地上にプレーティングすることによって、ａｍｄＳマーカーを除去し、マーカー遺伝子を含まない株を選択した。遺伝子破壊の一般的手順は、図３に示されている。ＧＢＡ３０１株バックグラウンドでｈｄｆＡ遺伝子が不活化されている代表的な株として株ＧＢＡ３０２を選択した。
【０１７６】
［実施例３．アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＧＢＡ３０３（ΔｇｌａＡ、ΔｐｅｐＡ、ΔｈｄｆＡ、適合されたＢａｍＨＩアンプリコン）の構築］
この実施例では、最も高い頻度の遺伝子変換を有するΔｇｌａＡアンプリコンを適合させて、標的化組込み用の独特の遺伝子座を生じさせ、賢明な組込み戦略を利用できるようにした。適合されたアンプリコンは、この実施例中のグルコアミラーゼプロモーターおよびターミネーターなどのフランキング制御配列を標的化領域として利用できるようにもする。
【０１７７】
［実施例３．１  最も高い頻度の遺伝子変換を有するアンプリコンの同定］
株ＧＢＡ３０１は、ゲノム中に３つの改変されたΔｇｌａＡ遺伝子座を含む。３つ全ての遺伝子座について、約４．３ｋｂのｇｌａＡ配列（２ｋｂのｇｌａＡプロモーターおよび全ｇｌａＡコード配列）が欠失している（国際公開第９８／４６７７２号パンフレットの図４に見られる）。３つの異なる欠失ベクターを用いたので、各々のΔｇｌａＡ遺伝子座はわずかに異なっており、その特徴を用いて、ＰＣＲテストで各々の切断されたΔｇｌａＡ遺伝子座を可視化することができる（国際公開第９８／４６７７２号パンフレットの図５）。組み込まれたこの違いを用いて、切断されたｇｌａＡアンプリコンの中に遺伝子変換事象を追跡することもできる。３つの切断されたｇｌａＡアンプリコンはＢａｍＨＩ切断アンプリコン、ＳａｌＩ切断アンプリコンおよびＢｇｌＩＩ切断アンプリコンと命名されており、いわゆる「ＤＮＡフラッグ」テストにおいて、それぞれ、２４０、２６０および３００ｂｐのサイズのバンドを示す（国際公開第９８／４６７７２号パンフレットの図５）。
【０１７８】
株ＧＢＡ３０１から、ＧＢＡ３０１の３つの切断されたｇｌａＡアンプリコンの１つに全て標的化される複数のフィターゼ発現カセットを含む、複数のフィターゼ産生株を（ｐＧＢＡＡＳ−１とｐＧＢＴＯＰＦＹＴ−１を共形質転換することによって）作製した（国際公開第９８／４６７７２号パンフレットの実施例１．４に本質的に記載されている）。得られる株は各々、３つの切断されたｇｌａＡアンプリコンの１つにフィターゼカセットを有し、フィターゼカセット組込み部位に従って、ＢＡＭ−ＰＨＹ、ＳＡＬ−ＰＨＹおよびＢＧＬ−ＰＨＹと呼ばれる。
【０１７９】
３つの異なる株、ＢＡＭ−ＰＨＹ、ＳＡＬ−ＰＨＹおよびＢＧＬ−ＰＨＹについてフィターゼカセットのコピー数が増加した変換体を同定した（国際公開第９８／４６７７２号パンフレットの実施例１．５に本質的に記載されている）。フィターゼコピー数が増加した変換体について、フィターゼ含有ｇｌａＡアンプリコンの特定のアンプリコンの頻度および遺伝子型を「ＤＮＡフラッグ」テストを用いて決定した。「ＤＮＡフラッグ」テストによってそれぞれの株の何千もの個々の子孫を解析することにより、特定の切断されたｇｌａＡアンプリコン（例えば、ＳａｌＩ）の欠失と同時に、別の特定の切断されたｇｌａＡアンプリコン（例えば、ＢａｍＨＩ）の増幅によって遺伝子変換を検出することができる。
【０１８０】
３つの異なる株の何百もの個々の子孫のＰＣＲスコアリングおよびタイピングの結果を表１に見ることができる。さらに、いくつかの単離された株について単一の遺伝子変換事象後に同様の手法を取った。これらの株は、同じ種類の２つのアンプリコンを含んでいた。３種類の株の何百もの個々の子孫をＰＣＲでスコアリングしたこれらの結果を表２に見ることができる。この３つの異なる株に関しては、第１の遺伝子変換事象と第２の遺伝子変換事象の両方について、ＢａｍＨＩアンプリコン中にあるフィターゼカセットを遺伝子変換によって最も高い頻度で増加させることができる。
【０１８１】
【表１】
2012533312.tif 000003
【０１８２】
【表２】
2012533312.tif 000004
【０１８３】
［実施例３．２  最も高い頻度の遺伝子変換を有するＢａｍＨＩアンプリコンの適合］
この実施例のこの部分では、（株ＧＢＡ３００を生じさせるＣＢＳ１２４．９０３中のｇｌａＡ遺伝子座の３倍の改変によって）事前に除去されたグルコアミラーゼプロモーターＰｇｌａＡを、ゲノム中の単一の遺伝子座に、しかし、適合させようとするアンプリコン中の異なる位置に再導入し、標的化組込み用の独特のかつ改善された遺伝子座を生じさせる方法が記載されている。
【０１８４】
アンプリコンを適合させることができるように、ΔｇｌａＡ遺伝子座用の遺伝子置換型のベクターを既知の原理に従って設計し、日常的なクローニング手順に従って構築した。この目的のために、ベクターｐＧＢＧＬＡ−６５を構築した（図６）。基本的に、このベクターは、２つのＰｇｌａＡ断片と３’ｇｌａＡおよび３”ｇｌａＡ領域の間にａｍｄＳ選択マーカーを含む。３’ｇｌａＡおよび３”ｇｌａＡ領域は、ΔｇｌａＡ遺伝子座の同一のゲノム領域中への標的化および組込みに用いられる。２つのＰｇｌａＡ断片は、対抗選択によるａｍｄＳ選択マーカーのループアウトに用いられる（図３）。１つのＰｇｌａＡ断片は、切断されたＰｇｌａＡプロモーター断片（ＭｌｕＩ部位の３’にあるＰｇｌａＡプロモーターの最後の６００ｂｐを欠く）であり、これは、ａｍｄＳ対抗選択後にゲノム中に存在したまま残る。
【０１８５】
ゲノム中にＢａｍＨＩアンプリコンを適合させることができるように、ベクターｐＤＥＬ−ＧＬＡ６５（図６）をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ゲル精製して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）骨格を除去した。欠失ベクターｐＤＥＬ−ＧＬＡ６５の線状ＤＮＡを用い、国際公開第０５／０９５６２４号パンフレットに以前に詳細に記載されているような方法を用いて、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＧＢＡ３０２を形質転換した。ｐＤＥＬ−ＧＬＡ６５の線状ＤＮＡは、二重交差によって３’ｇｌａＡ配列および３”ｇｌａＡ配列でアンプリコンに組み込まれ得る。いくつかのコロニーを純化し、３つのｇｌａＡ遺伝子座の存在およびＢａｍＨＩアンプリコンでのカセットの組込みについてＰＣＲで解析した（標的ＰＣＲ）。ＢａｍＨＩアンプリコンの標的化頻度は、２０〜３０％と推定された。合計７つの株をフルオルアセトアミド対抗選択について選択した。フルオルアセトアミド耐性コロニーをＰＤＡに移し、「フラッグ」−ＰＣＲでテストした。適合されたＢａｍＨＩ遺伝子座を有し、組み込まれたｐＤＥＬ−ＧＬＡ６５カセットのＰｇｌａＡ反復上での組換えによってａｍｄＳマーカーが正確に欠失している代表的な株としてある株を選択した（図７）。この選択された株をＧＢＡ３０３と命名した。これは、ｐｅｐＡおよびｈｄｆＡ遺伝子が不活化され、ＢａｍＨＩアンプリコンが適合された、３つ全てのΔｇｌａＡ遺伝子座を有するＧＢＡ３００株バックグラウンドを表す。ｇｌａＡアンプリコン全体はサイズが大きい（＞８０ｋｂ）ので、ＢａｍＨＩアンプリコンが適合されている（２〜６ｋｂ）としても、かなりの実質的に相同なＤＮＡドメインを有する断片が依然としてゲノム中に存在したまま残る。
【０１８６】
ΔｇｌａＡアンプリコンの３’断片および３”断片を含むゲノム領域の配列（図７）は、配列番号：１の下に見出すことができる。３’断片、切断されたＰｇｌａＡプロモーター断片および適合されたＢａｍＨＩアンプリコンの３”断片を含むゲノム領域の配列は、配列番号：２の下に見出すことができる。
【０１８７】
［実施例３．３  新規の組込みベクターの構築］
欧州特許出願公開第０６３５５７４Ａ１号明細書、国際公開第９８／４６７７２号パンフレットおよび国際公開第９９／３２６１７号パンフレットには、標的化された株構築、とりわけ、単一の交差を用いる標的化株構築で用いられる組込みおよび発現ベクターｐＧＢＡＡＳ−１（欧州特許第０６３５５７４号明細書中のｐＧＢＧＬＡ−５０）およびｐＧＢＴＯＰ−８が記載されている。これらの組込みベクターの調整は、ＧＢＡ３０２型の株の適合されたＢａｍＨＩアンプリコンへの特異的標的化を可能にするために必要である。
【０１８８】
ａｍｄＳマーカーを含み、かつ共形質転換で用いられるｐＧＢＡＡＳ−１ベクターのうち、２つの異なる変異体が、適合されたＢａｍＨＩアンプリコンへの標的化組込み用に構築されている。グルコアミラーゼプロモーターＰｇｌａＡの制御下で発現されるａｍｄＳマーカー遺伝子を有するｐＧＢＡＡＳ−３（図８）と呼ばれるベクターを構築した。ＰｇｌａＡプロモーターは、ａｍｄＳマーカー遺伝子の発現を駆動する際に機能を有する。さらに、ＰｇｌａＡプロモーターおよび３’ｇｌａＡ断片は、特に、適合されたＢａｍＨＩ  ΔｇｌａＡアンプリコンの標的化配列として機能する（図２１）。ｐＧＢＡＡＳ−１のａｍｄＳマーカーカセット（ｇｐｄＡプロモーターの制御下のａｍｄＳ）を含むｐＧＢＡＡＳ−４と呼ばれる第２のベクター（図９）を構築した。ここで、切断されたＰｇｌａＡプロモーター断片および３’ｇｌａＡ断片は、適合されたＢａｍＨＩ  ΔｇｌａＡアンプリコンに標的化する際に機能を有する（図２１）。
【０１８９】
ｐＧＢＴＯＰ型のベクターについては、適合されたＢａｍＨＩ  ΔｇｌａＡアンプリコンへの標的化を可能にするために、２つの新規の組込みおよび発現ベクターを構築した。ｐＧＢＴＯＰ−１１（図１０）およびｐＧＢＴＯＰ−１２（図１１）ベクターは、基本的には、それぞれ、３”ｇｌａＡ断片が除去されたｐＧＢＴＯＰ−８ベクターおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ベクター除去用の制限部位のさらなる改変を含むｐＧＢＴＯＰ−８ベクターである。ここで、ＰｇｌａＡプロモーターおよび３’ｇｌａＡターミネーター断片は二重の機能を有する。すなわち、目的の遺伝子を発現させるためのプロモーターおよびターミネーターとしてのその役割の他に、適合されたＢａｍＨＩ  ΔｇｌａＡアンプリコンに標的化する役割を有する（図２１）。
【０１９０】
［実施例４．アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＧＢＡ３０４（ΔｇｌａＡ、ΔｐｅｐＡ、ΔｈｄｆＡ、適合されたＢａｍＨＩアンプリコン、ΔａｍｙＢＩＩ）の構築］
α−アミラーゼをコードするａｍｙＢＩＩ  ＯＲＦの遺伝子フランキング領域を実施例２で本質的に記載したようにクローニングし、ベクターｐＤＥＬ−ＡＭＹＢＩＩを得た（図１２）。欠失ベクターｐＤＥＬ−ＡＭＹＢＩＩの線状ＤＮＡを単離し、これを用い、国際公開第０５／０９５６２４号パンフレットに以前に記載されているような方法を用いて、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＧＢＡ３０３を形質転換し、ａｍｙＢＩＩ遺伝子を欠失させた。二重交差事象による相同なａｍｙＢＩＩ遺伝子座でのゲノム中へのｐＤＥＬ−ＡＭＹＢＩＩの組込みによってａｍｙＢＩＩ  ＯＲＦが除去された形質転換体を選択した。その後、フルオロアセトアミド培地上にプレーティングすることによって、ａｍｄＳマーカーを除去し、マーカー遺伝子を含まない株を選択した。ＧＢＡ３０３株バックグラウンドでａｍｙＢＩＩ遺伝子が不活化された代表的な株として株ＧＢＡ３０４を選択した。
【０１９１】
［実施例５．アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＧＢＡ３０５（ΔｇｌａＡ、ΔｐｅｐＡ、ΔｈｄｆＡ、適合されたＢａｍＨＩアンプリコン、ΔａｍｙＢＩＩ、ΔａｍｙＢＩ）の構築］
α−アミラーゼをコードするａｍｙＢＩ  ＯＲＦの遺伝子フランキング領域を実施例２で本質的に記載したようにクローニングし、ベクターｐＤＥＬ−ＡＭＹＢＩを得た（ｐＤＥＬ−ＡＭＹＢＩのレイアウトの代表的な図を図１２に見ることができる）。欠失ベクターｐＤＥＬ−ＡＭＹＢＩの線状ＤＮＡを単離し、これを用い、国際公開第０５／０９５６２４号パンフレットに以前に記載されているような方法を用いて、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＧＢＡ３０４を形質転換し、ａｍｙＢＩ遺伝子を欠失させた。二重交差事象による相同なａｍｙＢＩ遺伝子座でのゲノム中へのｐＤＥＬ−ＡＭＹＢＩの組込みによってａｍｙＢＩ  ＯＲＦが除去された形質転換体を選択した。その後、フルオロアセトアミド培地上にプレーティングすることによって、ａｍｄＳマーカーを除去し、マーカー遺伝子を含まない株を選択した。ＧＢＡ３０４株バックグラウンドでａｍｙＢＩ遺伝子が不活化された代表的な株として株ＧＢＡ３０５を選択した。
【０１９２】
［実施例６．アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＧＢＡ３０６（ΔｇｌａＡ、ΔｐｅｐＡ、ΔｈｄｆＡ、適合されたＢａｍＨＩアンプリコン、ΔａｍｙＢＩＩ、ΔａｍｙＢＩ、ΔａｍｙＡ）の構築］
酸安定性α−アミラーゼをコードするａｍｙＡ  ＯＲＦの遺伝子フランキング領域を実施例２で本質的に記載したようにクローニングし、ベクターｐＤＥＬ−ＡＭＹＡを得た（ｐＤＥＬ−ＡＭＹＡのレイアウトの代表的な図を図１２に見ることができる）。欠失ベクターｐＤＥＬ−ＡＭＹＡの線状ＤＮＡを単離し、これを用い、国際公開第０５／０９５６２４号パンフレットに以前に記載されているような方法を用いて、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＧＢＡ３０５を形質転換し、ａｍｙＡ遺伝子を欠失させた。二重交差事象による相同なａｍｙＡ遺伝子座でのゲノム中へのｐＤＥＬ−ＡＭＹＢＩの組込みによってａｍｙＡ  ＯＲＦが除去された形質転換体を選択した。その後、フルオロアセトアミド培地上にプレーティングすることによって、ａｍｄＳマーカーを除去し、マーカー遺伝子を含まない株を選択した。ＧＢＡ３０５株バックグラウンドでａｍｙＡ遺伝子が不活化された代表的な株として株ＧＢＡ３０６を選択した。
【０１９３】
［実施例７．アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＧＢＡ３０７（ΔｇｌａＡ、ΔｐｅｐＡ、ΔｈｄｆＡ、適合されたＢａｍＨＩアンプリコン、ΔａｍｙＢＩＩ、ΔａｍｙＢＩ、ΔａｍｙＡ、ΔｏａｈＡ）の構築］
このＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のオキサラート欠損株は、オキサロ酢酸ヒドロラーゼをコードするｏａｈＡ遺伝子の欠失によって得ることができる。これは、欧州特許第１１５７１００号明細書および米国特許第６，９３６，４３８号明細書に詳細に記載されている。ＧＢＡ３０６株バックグラウンドでｏａｈＡ遺伝子が不活化された代表的な株として株ＧＢＡ３０７を選択した。
【０１９４】
あるいは、国際公開第０４／０７００２２号パンフレットおよび欧州特許第１５９０４４４号明細書に記載されているような古典的な株改良によってＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＧＢＡ３０６から突然変異体株を得ることができる。これらの文献では、オキサラート欠損Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株についてスクリーニングする方法が広範に記載されている。これらを欧州特許第１５９０４４４号明細書の実施例１および２の方法に従って単離した。
【０１９５】
［実施例８．アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＧＢＡ３０８（ΔｇｌａＡ、ΔｐｅｐＡ、ΔｈｄｆＡ、適合されたＢａｍＨＩアンプリコン、ΔａｍｙＢＩＩ、ΔａｍｙＢＩ、ΔａｍｙＡ、ΔｏａｈＡ、ΔｆｕｍＢ）の構築］
ＣＢＳ５１３．８８のゲノム配列において、マイコトキシンのフモニシンをコードする、ギベレラ・モニリフォルミス（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）中の遺伝子クラスターとの相同性に基づいて、推定上のフモニシン遺伝子クラスターを同定した（Ｐｅｌら，“Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒｙ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＣＢＳ５１３．８８”．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７  Ｆｅｂ；２５（２）：２２１−２３１）。
【０１９６】
【表３】
2012533312.tif 000005
【０１９７】
遺伝子Ａｎ０１ｇ０６９３０は、フモニシン産生に関与する可能性があるポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）をコードする。プロモーター側に推定上のｆｕｍＢ遺伝子（Ａｎ０１ｇ０６９３０）のコード配列のごく一部分も含む、遺伝子フランキング領域を、実施例２で本質的に記載したように、かつ国際公開第０６／０４０３１２号パンフレットにさらに詳述されているように、ベクターｐＧＢＤＥＬ（図１）にクローニングし、ベクターｐＧＢＤＥＬ−ＦＵＭ３（図１３）を得た。欠失ベクターｐＧＢＤＥＬ−ＦＵＭ３の線状ＤＮＡを単離し、これを用いて、国際公開第０６／０４０３１２号パンフレットに以前に記載されているように、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＧＢＡ３０７を形質転換し、ｆｕｍＢ遺伝子を欠失させた。二重交差事象による相同なＡｎ０１ｇ０６９３０遺伝子座でのゲノム中へのｐＧＢＤＥＬ−ＦＵＭ３の組込みによってｆｕｍＢ  ＯＲＦが除去され、結果として約８ｋｂのゲノム配列が除去された形質転換体を選択した。その後、フルオロアセトアミド培地上にプレーティングすることによって、ａｍｄＳマーカーを除去し、マーカー遺伝子を含まない株を選択した。ＧＢＡ３０７株バックグラウンドでｆｕｍＢ遺伝子が不活化された代表的な株として株ＧＢＡ３０８を選択した。
【０１９８】
株ＷＴ１およびＧＢＡ３０８をＣＹＡおよびＹＥＳ寒天培地上で増殖させ、フモニシン産生を測定した。ＦＢ２測定の結果を以下の表に示す。
【０１９９】
【表４】
2012533312.tif 000006
【０２００】
これらの結果から、ＰＫＳをコードするｆｕｍＢ遺伝子の破壊によってフモニシン産生が障害された株が得られることは明らかである。フモニシン陰性株バックグラウンドは、商業的なタンパク質産生にとって明らかな利点がある。
【０２０１】
さらに、遺伝子Ａｎ０１ｇ０６８２０を含む巨大な遺伝子クラスターが（約３８ｋｂのゲノム配列が除去された）Ａｎ０１ｇ０６９３０まで破壊されている株は、同一の表現型を示す、すなわち、上で詳述したような試験でフモニシン産生が陰性であることが示された（データは示さない）。
【０２０２】
［実施例９．アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＧＢＡ３０９（ΔｇｌａＡ、ΔｐｅｐＡ、ΔｈｄｆＡ、適合されたＢａｍＨＩアンプリコン、ΔａｍｙＢＩＩ、ΔａｍｙＢＩ、ΔａｍｙＡ、ΔｏａｈＡ、ΔｆｕｍＢ、Δｏｃｈ）の構築］
ＣＢＳ５１３．８８のゲノム配列において、オクラトキシン産生に関与するＡ．オクラセウス（Ａ．ｏｃｈｒａｃｅｕｓ）のＰＫＳ断片に基づいて、推定上のオクラトキシン遺伝子クラスターを同定した（Ｐｅｌら，“Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒｙ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＣＢＳ５１３．８８．”  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７  Ｆｅｂ；２５（２）：２２１−２３１）。
【０２０３】
【表５】
2012533312.tif 000007
【０２０４】
このＰＫＳ様遺伝子は、Ａｎ１５ｇ０７９２０（ｏｃｈＡと呼ばれる）と注釈付けられている。さらに、遺伝子Ａｎ１５ｇ０７９１０（ｏｃｈＢと呼ばれる）は、オクラトキシン産生に関与する潜在的なペプチド合成酵素に相当し得る。ペプチド合成酵素および／またはＰＫＳをコードする遺伝子の破壊は、オクラトキシン産生が障害された株をもたらし得る。
【０２０５】
二重交差用の標的化配列を用いて完全なオクラトキシン遺伝子クラスターを破壊することができるように、一方の側のＡｎ１５ｇ０７８６０  ＯＲＦの遺伝子配列断片およびもう一方の側のＡｎ１５ｇ０７９３０  ＯＲＦの遺伝子配列断片を、実施例２で本質的に記載したように、かつ国際公開第０６／０４０３１２号パンフレットにさらに詳述されているようにクローニングして、ベクターｐＧＢＤＥＬ−ＯＣＨ２（図１４）を得た。欠失ベクターｐＧＢＤＥＬ−ＯＣＨ２の線状ＤＮＡを単離し、これを用いて、国際公開第０６／０４０３１２号パンフレットに以前に記載されているように、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＧＢＡ３０８を形質転換し、推定上のオクラトキシン遺伝子クラスターを欠失させた。二重交差事象による相同な遺伝子座でのゲノム中へのｐＧＢＤＥＬ−ＯＣＨ２の組込みによってｏｃｈ  ＯＲＦが除去された形質転換体を選択した。その後、フルオロアセトアミド培地上にプレーティングすることによって、ａｍｄＳマーカーを除去し、マーカー遺伝子を含まない株を選択した。ＧＢＡ３０８株バックグラウンドでオクラトキシンゲノム遺伝子クラスター（遺伝子Ａｎ１５ｇ０７８６０と遺伝子Ａｎ１５ｇ０７９３０の間にある；遺伝子型はΔｏｃｈと表示される）が除去された代表的な株として株ＧＢＡ３０９を選択した。
【０２０６】
株ＷＴ１およびＧＢＡ３０９をＣＹＡおよびＹＥＳ寒天培地上で増殖させ、オクラトキシンＡを測定した。ＯＴＡ測定の結果を以下の表に示す。
【０２０７】
【表６】
2012533312.tif 000008
【０２０８】
これらの結果から、ＯＴＡ生合成に関与する推定上のペプチド合成酵素およびＰＫＳを含むオクラトキシン遺伝子クラスターの破壊によって、オクラトキシンＡ産生が低下した株が得られることは明らかである。オクラトキシンＡ陰性および場合によってはフモニシン陰性との組合せの株バックグラウンドは、商業的なタンパク質産生にとって明らかな利点がある。
【０２０９】
［実施例１０．アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＧＢＡ３１０（ΔｇｌａＡ、ΔｐｅｐＡ、ΔｈｄｆＡ、適合されたＢａｍＨＩアンプリコン、ΔａｍｙＢＩＩ、ΔａｍｙＢＩ、ΔａｍｙＡ、ΔｏａｈＡ、ΔｆｕｍＢ、Δｏｃｈ、ΔｐｒｔＴ）の構築］
プロテアーゼ調節因子をコードするｐｒｔＴ  ＯＲＦの遺伝子フランキング領域を、実施例２で本質的に記載したように、かつ国際公開第０６／０４０３１２号パンフレットにさらに詳述されているようにクローニングし、ベクターｐＧＢＤＥＬ−ＰＲＴ２（図１５）を得た。欠失ベクターｐＧＢＤＥＬ−ＰＲＴ２の線状ＤＮＡを単離し、これを用いて、国際公開第０６／０４０３１２号パンフレットに以前に記載されているように、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＧＢＡ３０９を形質転換し、ｐｒｔＴ遺伝子を欠失させた。二重交差事象による相同なｐｒｔＴ遺伝子座でのゲノム中へのｐＧＢＤＥＬ−ＰＲＴ２の組込みによってｐｒｔＴ  ＯＲＦが除去された形質転換体を選択した。その後、フルオロアセトアミド培地上にプレーティングすることによって、ａｍｄＳマーカーを除去し、マーカー遺伝子を含まない株を選択した。ＧＢＡ３０９株バックグラウンドでｐｒｔＴ遺伝子が不活化された代表的な株として株ＧＢＡ３１０を選択した。
【０２１０】
［実施例１１．アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＧＢＡ３１１（ΔｇｌａＡ、ΔｐｅｐＡ、ΔｈｄｆＡ、適合されたＢａｍＨＩアンプリコン、ΔａｍｙＢＩＩ、ΔａｍｙＢＩ、ΔａｍｙＡ、ΔｏａｈＡ、ΔｆｕｍＢ、Δｏｃｈ、ΔｐｒｔＴ、ｓｅｃ６１  Ｓ３７６Ｗ突然変異）の構築］
この実施例では、セリン３７６がトリプトファンに置き換えられているＳｅｃ６１＊タンパク質をコードする改変されたｓｅｃ６１遺伝子（ｓｅｃ６１＊と呼ぶ）の導入を記載する。そうするために、遺伝子フランキング配列および改変されたＳｅｃ６１輸送チャネルをコードするｓｅｃ６１＊コード配列を、国際公開第２００５１２３７６３号パンフレットに本質的に詳細に記載されているようにクローニングし、ベクターｐＧＢＤＥＬ−ＳＥＣ６１＊（図１６）を得た。欠失ベクターｐＧＢＤＥＬ−ＳＥＣ６１＊の線状ＤＮＡを単離し、これを用いて、国際公開第２００５１２３７６３号パンフレットに以前に記載されているように、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＧＢＡ３１０を形質転換し、Ｓｅｃ６１遺伝子を改変した。二重交差事象による相同なＳｅｃ６１遺伝子座でのゲノム中へのｐＧＢＤＥＬ−ＳＥＣ６１＊の組込みによってＳｅｃ６１＊ＯＲＦが改変された形質転換体を選択した。その後、フルオロアセトアミド培地上にプレーティングすることによって、ａｍｄＳマーカーを除去し、マーカー遺伝子を含まない株を選択した。ＧＢＡ３１０株バックグラウンドでＳｅｃ６１遺伝子が改変された代表的な株として株ＧＢＡ３１１を選択した。
【０２１１】
［実施例１２．適合されたアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）株およびプラスミドを用いる改善された酵素産生および産生株構築］
ブタホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）タンパク質（Ｒｏｂｅｒｔｓ  Ｉ．Ｎ．，Ｊｅｅｎｅｓ  Ｄ．Ｊ．，ＭａｃＫｅｎｚｉｅ  Ｄ．Ａ．，Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ  Ａ．Ｐ．，Ｓｕｍｎｅｒ  Ｉ．Ｇ．およびＡｒｃｈｅｒ  Ｄ．Ｂ．（１９９２）  “Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ．ａ  ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ−ｐｏｒｃｉｎｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  ｔｏ  ｙｉｅｌｄ  ｍａｔｕｒｅ  ｅｎｚｙｍｅ”  Ｇｅｎｅ  １２２：１５５−１６１）を、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のＣＢＳ５１３．８８＆ＧＢＡ株系統における酵素発現のモデルタンパク質として選択した。ＰＬＡ２の過剰発現用の断片をｐｒｏＰＬＡ２とＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のネイティブなグルコアミラーゼＡ遺伝子との融合体として作製し、原則的に、Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９２）によって記載されているように調製した。このｇｌａＡ−ｐｌａ２融合遺伝子をｐＧＢＴＯＰ−８およびｐＧＢＴＯＰ−１２にクローニングし、それぞれ、ｐＧＢＴＯＰＰＬＡ−２ａ（図１７）およびｐＧＢＴＯＰＰＬＡ−２ｂ（図１８）を得た。
【０２１２】
さらに、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のα−アミラーゼを、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のＣＢＳ５１３．８８＆ＧＢＡ株系統における酵素発現の第２のモデルタンパク質として用いた。過剰発現に用いたａｍｙＢコード配列は、（国際公開第２００８／０００６３２号パンフレットに詳細に記載されているように）ａｍｙＢ遺伝子をコードするα−アミラーゼの単一コドンおよびコドン対が最適化されたコード配列を含んでいた。グルコアミラーゼｇｌａＡプロモーターの翻訳開始配列は、（これも国際公開第２００６／０７７２５８号パンフレットに詳述されているように）作製されたａｍｙＢ発現コンストラクトにおいて５’−ＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡ  ＡＴＧ−３’へと改変されている。さらに、最適な翻訳終結配列が用いられたため、野生型５’−ＴＧＡ−３’翻訳終結配列は、全ての発現コンストラクトにおいて、（国際公開第２００６／０７７２５８号パンフレットに詳述されているように）５’−ＴＡＡＡ−３’に置き換えられた。最適化されたａｍｙＢ  ｃＤＮＡ配列を含むＥｃｏＲＩ−ＳｎａＢＩ断片を完全に合成し、サブクローニングし、配列解析によって配列を確認した。ａｍｙＢ断片をｐＧＢＴＯＰ−８およびｐＧＢＴＯＰ−１２にクローニングし、それぞれ、ｐＧＢＴＯＰＦＵＡ−２（図１９）およびｐＧＢＴＯＰＦＵＡ−３（図２０）を得た。
【０２１３】
［実施例１２．１  適合された発現ベクターのＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株のΔｇｌａＡ遺伝子座への改善された標的化］
構築された組込みベクター（実施例３．３および１２）は２つのタイプ、すなわち、適合されていないΔｇｌａＡ遺伝子座に対して３’ｇｌａＡ配列および３”ｇｌａＡ配列に標的化するために用いることができる組込みベクターと、ベクターｐＧＢＴＯＰＰＬＡ−２ａ、ｐＧＢＴＯＰＦＵＡ−２およびｐＧＢＡＡＳ−１である組込みベクターとに分けることができる。さらに、切断されたＰｇｌａＡプロモーター断片および３’ｇｌａＡ断片に適合されたＢａｍＨＩ  ΔｇｌａＡアンプリコン（適合されたΔｇｌａＡ遺伝子座）に特異的に標的化するために用いることができる新規の組込みベクターを構築した。適合されたＢａｍＨＩアンプリコンに標的化するために用いることができるベクターは、ｐＧＢＴＯＰＰＬＡ−２ｂ、ｐＧＢＴＯＰＦＵＡ−３、ｐＧＢＡＡＳ−３およびｐＧＢＡＡＳ−４である。
【０２１４】
以下のスキーム（表３）に従って、２つのＰＬＡ２発現ベクター（ｐＧＢＴＯＰＰＬＡ−２ａおよびｐＧＢＴＯＰＰＬＡ−２ｂ）を、ｐＧＢＢＡＡＳ−１およびｐＧＢＡＡＳ−４との共形質転換によって、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のＧＢＡ３０１（ΔｇｌａＡ、ΔｐｅｐＡ）、ＧＢＡ３０２（ΔｇｌａＡ、ΔｐｅｐＡ、ΔｈｄｆＡ）およびＧＢＡ３０３（ΔｇｌａＡ、ΔｐｅｐＡ、ΔｈｄｆＡ、適合されたＢａｍＨＩアンプリコン）に導入した。形質転換およびその後の形質転換体の選択は、国際公開第９８／４６７７２号パンフレットおよび国際公開第９９／３２６１７号パンフレットに記載されているように実施した。原則的に、４つ全てのベクターの線状ＤＮＡを単離し、これを用いて、３つのＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株を共形質転換した。両方の線状化プラスミドの組込みは、単一の交差事象によってΔｇｌａＡ遺伝子座の１つで起こる。形質転換体をアセトアミド培地上で選択し、標準的な手順に従ってコロニーを純化した。３つ全ての株について、ａｍｄＳマーカー遺伝子とＰＬＡ２発現カセットの両方を有する数百個の形質転換体を、ａｍｄＳおよびＰＬＡ２特異的プライマーを用いるＰＣＲにより同定した。同定された共形質転換体に対して（国際公開第９８／４６７７２号パンフレットの実施例１．４に詳述されているように）標的化ＰＣＲテストを実施し、ａｍｄＳおよび／またはＰＬＡ２カセットのいずれかがΔｇｌａＡ遺伝子座に組み込まれている株のパーセンテージを決定した。
【０２１５】
さらに、フルオロアセトアミド培地上にプレーティングすることにより、同定されたΔｇｌａＡ標的化共形質転換体からａｍｄＳマーカー遺伝子を含まない株を選択した。ＰＣＲに基づくＤＮＡ「フラッグテスト」を実施して、ａｍｄＳを含まない子孫におけるアンプリコンの潜在的な喪失を検出した。国際公開第９８／４６７７２号パンフレットの実施例１．４．ｆで説明されているように、これは、組換えによるａｍｄＳマーカーと全ｇｌａＡアンプリコンの同時喪失を示すものであり、そのようなものとして元のカセットの位置を示すものである。この試験を用いて、３つ全ての株におけるＢａｍＨＩアンプリコンへの標的化頻度を決定した。データを表３に示す。
【０２１６】
【表７】
2012533312.tif 000009
【０２１７】
表３から結論付けることができるように、適合された発現ベクターを適合された標的化ＤＮＡドメイン（適合されたＢａｍＨＩアンプリコン）と組み合わせて用いると、標的化された株構築における明らかな利点が与えられ、より集中的でかつ効率的な株構築がもたらされる。
【０２１８】
［実施例１２．２  適合されたコンストラクトおよびＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株を用いる改善された共形質転換］
以下のスキーム（表４）に従って、ＦＵＡ発現ベクターｐＧＢＴＯＰＦＵＡ−３を、参照セットとしてのｐＧＢＴＯＰＦＵＡ−２およびｐＧＢＡＡＳとともに、ｐＧＢＡＡＳ−３およびｐＧＢＡＡＳ−４の共形質転換によって、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＧＢＡ３０７（ΔｇｌａＡ、ΔｐｅｐＡ、ΔｈｄｆＡ、適合されたＢａｍＨＩアンプリコン、ΔａｍｙＢＩＩ、ΔａｍｙＢＩ、ΔａｍｙＡ、ΔｏａｈＡ）に導入した。形質転換およびその後の形質転換体の選択は、国際公開第９８／４６７７２号パンフレットおよび国際公開第９９／３２６１７号パンフレットに記載されているように実施した。原則的に、５つのベクターの線状ＤＮＡを単離し、これを用いて、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＧＢＡ３０７株を共形質転換した。両方の線状化プラスミドの組込みは、単一の交差事象によって、それぞれ、適合されたＢａｍＨＩ  ΔｇｌａＡアンプリコンまたはΔｇｌａＡアンプリコンで起こる。形質転換体をアセトアミド培地上で選択し、標準的な手順に従ってコロニーを純化した。ａｍｄＳおよびａｍｙＢ特異的（コドン対が最適化されたａｍｙＢコード配列）プライマーを用いるＰＣＲにより、各々のプラスミド組合せの５０個の形質転換体について（国際公開第９８／４６７７２号パンフレットの実施例１．４に原理的に詳述されているような）共形質転換パーセンテージを決定した。データを表４に示す。
【０２１９】
【表８】
2012533312.tif 000010
【０２２０】
これまでに知られているｐＧＢＡＡＳ−１および改善された標的化のためのその変異体ｐＧＢＡＡＳ−４の場合、典型的な共形質転換頻度が得られる（通常２５〜７５％）。驚くことに、表４から結論付けることができるように、ｐＧＢＢＡＡＳ−３変異体（ｇｌａＡプロモーターの制御下のａｍｄＳ遺伝子）を適合された標的化コンストラクト（例えば、ｐＧＢＴＯＰＦＵＡ−３）と組み合わせて用いると、非常に高い共形質転換頻度が得られる。ｐＧＢＡＡＳ−３を用いると、共形質転換頻度が劇的に増加し、標的化された株構築において株をさらに操作する前に共形質転換体を選択する必要が回避され、そのため、より効率的な株構築がもたらされる。
【０２２１】
これらの形質転換体のＦＭ１における振盪フラスコ解析は、ＧＢＡ３０７で発現された異なるコンストラクトについて、遺伝子１コピー当たりに同様のＦＵＡ発現レベルを示した。
【０２２２】
［実施例１２．３  適合されたＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株における改善された株構築］
工業用の組換えＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）産生株を構築する１つの方法は、ΔｇｌａＡ遺伝子座の１つに発現カセットを組み込み、その後、組み込まれた発現カセットを有するΔｇｌａＡ遺伝子座を遺伝子変換または増幅によって増加させることである。
【０２２３】
発現カセットは、例えば、国際公開第２００５／１００５７３号パンフレット、国際公開第２００６／０７７２５８号パンフレット、国際公開第２００６／０９２３９６号パンフレットまたは国際公開第２００８／０００６３２号パンフレットに詳述されているようないくつかの方法によって改善することができる。株構築での遺伝子変換または増幅の使用は、例えば、国際公開第１９９８／４６７７２号パンフレットにより詳細に記載されている。先の実施例では、株およびプラスミド適合によって、どのようにして共形質転換および／または特定の遺伝子座への標的化を改善することができるかということが示されている。この実施例では、新規のＧＢＡタイプの株を用いる株構築での遺伝子変換または増幅の使用が示されている。
【０２２４】
Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＧＢＡ３１１（実施例１１）株に、発現ベクターの２つの組合せ（すなわち、ｐＧＢＴＯＰＰＬＡ−２ａとｐＧＢＢＡＡＳ−１の混合物；ｐＧＢＴＯＰＰＬＡ−２ｂとｐＧＢＢＡＡＳ−３の混合物）を共形質転換した。形質転換およびその後の形質転換体の選択は、国際公開第９８／４６７７２号パンフレットおよび国際公開第９９／３２６１７号パンフレットに記載されているように実施した。原則的に、使用した全てのベクターの線状ＤＮＡを単離し、これを用いて、ＧＢＡ３１１  Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株を共形質転換した。両方の線状化プラスミドの組込みは、単一の交差事象によって、ΔｇｌａＡ遺伝子座で起こる（標的化配列の詳細については、実施例１２．１を参照されたい）。形質転換体をアセトアミド培地上で選択し、標準的な手順に従ってコロニーを純化した。ａｍｄＳマーカー遺伝子とＰＬＡ２発現カセットの両方を有する数百個の形質転換体を、ａｍｄＳおよびＰＬＡ２特異的プライマーを用いるＰＣＲにより同定した。同定された共形質転換体に対して、（国際公開第９８／４６７７２号パンフレットの実施例１．４に詳述されているように）標的化ＰＣＲテストを実施し、ａｍｄＳおよび／またはＰＬＡ２カセットのいずれかがΔｇｌａＡ遺伝子座に組み込まれている株のパーセンテージを決定した。さらに、ＰＣＲを用いて、コロニーをＰＬＡ２コピー数について診断した。サザン解析（国際公開第９８／４６７７２号パンフレット）を用いて、高コピーと考えられる株のコピー数をより正確に決定した。ｐＧＢＴＯＰＰＬＡ−２とｐＧＢＢＡＡＳ−１の混合物については、さらなる形質転換体をスクリーニングし、純化して、より高いコピー数のＰＬＡ２発現カセットを有する形質転換体を単離した。６００個の個々の形質転換体をスクリーニングした後、６コピーのＢｇｌＩＩ標的化形質転換体を単離した。得られたデータを表５に示す。
【０２２５】
【表９】
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【０２２６】
ＧＢＡ３００バックグラウンドの２つの高コピー株（すなわち、６コピーのＢｇｌＩＩ標的化株および７コピーのＢａｍＨＩ標的化株）について、ＰＬＡ２コピー数が増加している変換体を単離した（実験の詳細については、本明細書中の実施例３．１および国際公開第９８／４６７７２号パンフレットを参照されたい）。両方の株の５００個の個々の子孫をスクリーニングすることによって、ＢａｍＨＩ標的化株については、遺伝子変換の結果としてＰＬＡ２コピー数が増加した２つの株が同定されたが、ＢｇｌＩＩ標的化株については全く同定されなかった。この２つの変換体は、それぞれ、１３コピーおよび１４コピーのＰＬＡ−２を含んでいた。この実施例およびデータは、（例えば、増強された遺伝子変換または増幅頻度を有する）ゲノム標的化ＤＮＡドメインの適合は、明確でかつ制御された多コピー（産生）株の構築の過程を促進および加速することによって、株構築に大きな影響を及ぼすことを明らかに示している。これらの形質転換体のＦＭ２における振盪フラスコ解析は、ＧＢＡ３１１で発現された異なるコンストラクトについて、遺伝子１コピー当たりに同様のＰＬＡ２発現レベルを示した。
【図１】
2012533312.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2012533312.tif 000020
【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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