(57)【要約】  褥瘡を主たる対象疾患とする、創傷治癒剤を提供する。主たる成分としてトロンビンを含有してなる創傷治癒剤。創傷治癒効果を多いに期待でき、今後も増加が予想される褥瘡などの疾患治療に大きく貢献する創傷治癒剤を提供できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分としてトロンビンを含むことを特徴とする創傷治癒剤。
【請求項２】
前記トロンビンがプロテアーゼ活性並びにサイトカイン産生および細胞増殖促進活性を有する分子種である、請求項１記載の創傷治癒剤。
【請求項３】
当該治癒剤がトロンビンを含む液状剤型である、請求項１または請求項２に記載の創傷治癒剤。
【請求項４】
トロンビン成分とシート基材の組み合わせよりなる請求項１または請求項２に記載の創傷治癒剤。
【請求項５】
当該治癒剤がシート状剤型である、請求項１、請求項２または請求項４のいずれかに記載の創傷治癒剤。
【請求項６】
トロンビンがシート基材に固定化されていることを特徴とする請求項４または請求項５に記載の創傷治癒剤。
【請求項７】
トロンビン成分の塗布およびこれに引き続いて実施されるシート基材の貼付に用いられ得る、請求項４記載の創傷治癒剤。
【請求項８】
当該治癒剤に用いられるシート基材が、生体適合性の材料から成ることを特徴とする請求項４から請求項７のいずれかに記載の創傷治癒剤。
【請求項９】
当該治癒剤に用いられるシート基材が、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、グリコール酸、キチン、およびキトサンからなる群より選択される材料を含むことを特徴とする請求項８に記載の創傷治癒剤。
【請求項１０】
褥瘡治療に用いられ得る、請求項１から９のいずれかに記載の創傷治癒剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、医療用医薬品の分野に属し、血液に由来する成分を有効成分とする医薬品に関する。詳細には、主たる有効成分としてトロンビンを含有する新たな創傷治癒剤に関する。さらに詳細には、褥瘡治療を主たる対象とする創傷治癒剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
高齢化社会では疾病患者も当然のこととして高齢化しており、寝たきりの患者は年々増加している。２０１０年にはわが国の６５歳以上の人口は全人口の２５％を占め、そのうち１７０万人は寝たきりの状態になると予想される。その寝たきりの高齢者に発症するのが褥瘡であり、５〜１０人に１人の割合で発症すると予想される。褥瘡は、一旦発症すると完治させることがなかなか難しいため、優れた治療薬の開発は患者のＱＯＬと国民の医療経済学の観点からも強く望まれている。傷口を閉鎖して修復させる創傷治癒剤は褥瘡の治療として多く使用されている。本願発明は新たな創傷治癒剤を提供する。本願発明の創傷治癒剤は広範な用途を有するものであるが、ここでは、創傷治癒剤の適応例として代表的で患者数が増加している褥瘡の治癒剤を例にとって詳述することとする。【０００３】
褥瘡は、広く「床ずれ」とも呼ばれ、一般にもよく知られた病態である（非特許文献１参照）。本病態は患部に圧迫が加わることによって患部の組織壊死が生じたものであるが、その直接的な原因は圧迫による局所の阻血性の壊死である。我が国では上述の如く急速な高齢化に伴い、寝たきり老人が増加し、褥瘡は大きな問題となっている。【０００４】
褥瘡の治療法は、軟膏治療と被覆材治療に分けることができるが、広く行なわれているのは創傷被覆材（ドレッシング）を中心としたものである。創傷被覆材については、Winterの研究以来、種々の製品が開発されている（非特許文献２参照）。それらの被覆材は、創面を保護し痛みや圧力を緩和し、適切な湿潤環境を作ることにより創傷治癒を早めることを目的としている。市販の創傷被覆材には、創面を保護し、生体適合性があり、湿潤環境をつくるものとして、コラーゲン、ゼラチン、キチン、アルギン酸塩、ポリウレタン、シリコン、ポリイソブチレン、カルボキシメチルセルロースなどを適当に加工したものがある。例えば、ベスキチン（商品名：ユニチカ社製）、クラビオＡＧ（商品名：クラレ社製）、ハイドロサイト（商品名：スミス・アンド・ネフュー社製）などの製品が市販され臨床的に使用されている。生体への大きな危険性のないものが選ばれているが、それだけで褥瘡が完治するような創傷被覆材はないのが現状である。特に、褥瘡の創面には柔らかい肉芽組織があり、切開や壊死組織の除去により出血を生じるために十分な止血も必要となる。さらに褥瘡が関節や骨などに及ぶ場合には、股関節などの血管壁が炎症に侵され、運動などにより動脈性の大出血を起こすこともあり、止血管理も重要な要素となる【０００５】
【特許文献１】特表平２−５０１０２８号公報
【非特許文献１】石川治編集、「褥瘡の対策と治療」、Visual Dermatology，2003，Vol.2，No.6
【非特許文献２】Winter GD、「Formation of the scab and the rate of epithelisation of superficial wounds in the skin of the young domestic pig.1962.」、J. Wound Care，1995，Sep.，4，8，p.366-367，discussion；p.368-371
【非特許文献３】鈴木宏治、松田道生編集、「止血・血栓・線溶」、1994、中外医学社
【非特許文献４】鈴木宏治、上村みどり、「血栓止血誌」、1999，10，p.195-203
【非特許文献５】Sower LE, Payne DA, Meyers R, Carney DH，「Thrombin peptide, TP508, induces differential gene expression in fibroblasts through a nonproteolytic activation pathway.」，Exp. Cell Res.，1999，247，2，p.422-31
【非特許文献６】Yonemura H, Imamura T, Soejima K, Nakahara Y, Morikawa W, Ushio Y, Kamachi Y, Nakatake H, Sugawara K, Nakagaki T, Nozaki C，「Preparation of Recombinant α-Thrombin: High-Level Expression of Recombinant Human Prethrombin-2 and Its Activation by Recombinant Ecarin.」，J. Biochem. (Tokyo)，2004，135，5，p.577-582
【非特許文献７】江藤義則、松本次郎、和田靖史、中村政記、宮地良樹、今村貞夫、「KT-136の切創治癒作用」、皮膚科紀要、1987，82，3，p.355-357
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
社会的要求の高い褥瘡治療を念頭においた、創傷治癒効果と止血効果を併せ持つ、従来にない効果を有する新たな創傷治癒剤の提供を本願発明の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは上記の諸背景を鑑み、鋭意検討した結果、有効成分としてトロンビンを直接あるいはシートを通して患部に塗布することで極めて優れた創傷治癒効果が発揮されることを見出し、この知見に基づいて本願発明で提供される創傷治癒剤を完成するに至った。本願発明は従来の公知技術とは異なる新しい技術と新規な知見に基づくものである。【０００８】
本願発明では、褥瘡の治療を主たる対象とした創傷治癒剤の開発を念頭に、血漿タンパク質の一種であるトロンビンに着眼した。トロンビンは、生体の血液凝固反応においてフィブリノゲンをフィブリンに変換し、さらにＸＩＩＩ因子を活性化することによりフィブリン形成を強固なものとする血液凝固反応において極めて重要な働きを有する血中タンパクである（鈴木宏治、松田道生編集、「止血・血栓・線溶」、1994、中外医学社参照）。トロンビンは、その止血作用を利用して医療分野では止血剤として普及している。一方、トロンビンには、このような止血作用と同時にサイトカイン産生や細胞増殖を促すなどの多面的な作用も有している（鈴木宏治、上村みどり、「血栓止血誌」、1999，10，p.195-203参照）。そのような作用の応用例として、Carneyらはトロンビンに由来する短いペプチドを合成してそれが細胞増殖を促すことを論文報告し、医薬品への応用も特許出願している（特表平２−５０１０２８号公報およびSower LE, Payne DA, Meyers R, Carney DH，「Thrombin peptide, TP508, induces differential gene expression in fibroblasts through a nonproteolytic activation pathway.」，Exp. Cell Res.，1999，247，2，p.422-31参照）。彼らが用いた分子はトロンビン由来のアミノ酸23個以下のペプチドと限定されており、トロンビン全長分子ではない。従って、それらのペプチドにはトロンビン全長分子が有するプロテアーゼ活性はなく、当然の事として止血効果はない。事実として、トロンビン由来ペプチドによる創傷治療薬は未だに実現化していないことからもトロンビンの断片だけでは医療には適さないと言える。従って、創傷部位、特に褥瘡部位に於いて、止血作用は勿論のこととして、その後の治癒に必要な組織再生などの多重の効能を発揮するためにはトロンビン全長分子そのものを利用した薬剤の開発が合理的かつ現実的となる。しかしながら、トロンビンのそのような多重の作用に注目しトロンビンを主体とした創傷治癒剤や褥瘡治癒剤はこれまでに存在しない。【０００９】
これまでのトロンビンの医療への応用は、前述したように止血剤として単剤利用、あるいはトロンビンの基質であるフィブリノゲンやＸＩＩＩ因子などと組合わせた接着閉鎖剤として開発販売されているが、不思議なことにトロンビンを主成分とした創傷治癒剤や褥瘡治癒剤は開発されていないのが現状である。
【発明の効果】
【００１０】
そのような現状を踏まえ、トロンビンを主成分とした液剤やシート剤を、既に確立されている創傷治癒動物モデルで評価した結果、優れた治癒効果を見出すことができた。本動物モデルは褥瘡などの創傷治癒剤のスクリーニング系として確立・普及しているものであるが、そのような動物モデルでトロンビンを主体としたサンプルが治癒効果を示したのは本願発明者等の結果が初めてであり画期的成果と言える。【００１１】
なお、従来のトロンビンはウシ血液あるいはヒト血液由来であり、量的な制限や病原性微生物（ウイルスや異常プリオン）の混入などの危険性を有しているが、組換えトロンビンの開発により、それらの制限や危険性がなくなれば、これまでにない安全で安価な創傷治療薬となり高齢化社会により増加する褥瘡治療への貢献度は非常に高いと期待できる。【００１２】
本願発明による創傷治癒剤は、以下のような性質を有しており、理想的な創傷治癒剤となることが明らかになった。
１）止血と創傷治癒の両方の効果を併せ持つ、優れた製剤である。
２）成分調製が簡単であり経済的である。
３）適用方法が簡便である。
従って、本願発明により、高齢化社会に伴う寝たきり患者に多発する褥瘡などの治療剤を提供する非常に有用なものとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本願発明の創傷治癒剤は、トロンビンを主たる有効成分とする。
本願発明に使用されるトロンビンは特に限定されることなく、例えばヒト血液より分離する方法あるいは遺伝子組換え技術により作製する方法などによって製造することができる。また、遺伝子組換え技術により作製されたトロンビンは、本質的な生物活性が血漿由来のトロンビンと同様であれば、本来のアミノ酸配列を別のアミノ酸配列に置換した改変体も本願発明に使用できる。【００１４】
具体的には、市販されている動物血漿由来のもの、または本願発明者らの文献（Yonemura H, Imamura T, Soejima K, Nakahara Y, Morikawa W, Ushio Y, Kamachi Y, Nakatake H, Sugawara K, Nakagaki T, Nozaki C，「Preparation of Recombinant α-Thrombin: High-Level Expression of Recombinant Human Prethrombin-2 and Its Activation by Recombinant Ecarin.」，J. Biochem. (Tokyo)，2004，135，5，p.577-582参照）で報告しているような方法で調製した組換えトロンビンを利用することができる。また、トロンビンに加え、薬学的に許容しうる安定剤および添加剤を添加してもよい。そのような安定剤および添加剤の例として、例えば、アルブミン、ポリエチレングリコール、アルギニン、ヒアルロン酸ナトリウム、グリセリン、マンニトールおよび塩化カルシウムなどがある。【００１５】
本願発明で提供される創傷治癒剤の臨床的使用の態様としては、トロンビンを液剤として患部に塗布する方法、あるいはトロンビンを好適なシートに固定化して患部に塗布する方法がある。さらに、トロンビンを液剤として患部に塗布しその後好適なシートを貼付する方法も適用され得る。トロンビンを固定化するあるいはトロンビンの塗布に引き続き貼付するシートの基材は、生体にとって危険性のない安全なものであれば特段の制限はない。例えば、創面を保護し、生体適合性があり、湿潤環境をつくるものとして、コラーゲン、ゼラチン、キチン、アルギン酸塩、ポリウレタン、シリコン、ポリイソブチレン、カルボキシメチルセルロース、およびポリグリコール酸などが例示され、これらを好適に加工したものである。それらの一部は創傷被覆材としても市販されている。なかでも、キチンまたはポリグリコール酸を基材とするシートは好ましい態様である。【００１６】
シートへのトロンビンの固定化は、例えば、以下に記す方法で達成され得る。
トロンビンを生理食塩水または緩衝液に溶かし、さらに選択的にそのトロンビン溶液に安定化剤や添加剤として、アルブミン、ポリエチレングリコール、アルギニン、ヒアルロン酸、グリセリン、マンニトールや塩化カルシウム等を適宜加える。当該溶液にシートを浸漬し、−８０℃、２時間凍結後、乾燥することにより得られる。【００１７】
トロンビンの有効投与量は、治療対象者の症状および重症度などにより変動する。本願発明の創傷治癒剤であるトロンビンあるいはその固定化シートの使用は、創傷部位の簡便かつ早急な処置が可能であり、止血反応と組織再生作用により極めて優れたな創傷治癒を可能とする。特に社会的需要の多い褥瘡の治療に対して顕著な効果を発揮する。しかも、いずれの成分も生体に安全なものを用いているため患者に対して安心して利用できる。【００１８】
以下に実施例を挙げて本願発明を具体的に説明するが、本願発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００１９】
（本願発明の創傷治癒剤のラットを用いた効果の確認）
本願発明の創傷治癒剤の効果を、当該技術分野でラット皮膚切創のモデルとして確立され、評価されているラットを用いた系（江藤義則、松本次郎、和田靖史、中村政記、宮地良樹、今村貞夫、「KT-136の切創治癒作用」、皮膚科紀要、1987，82，3，p.355-357参照）で確認した。
試験材料および方法：
１．被験物質および対照物質
１.１.被験物質
患部に塗布するトロンビン溶液は下記の組成で調製した。
トロンビン溶液Ｈは10mMクエン酸（pH6）/0.1M NaCl溶液にトロンビンが最終濃度5062単位/mlであり、トロンビン溶液Ｌの場合、トロンビンの最終濃度が506単位/mlとした。【００２０】
患部に添付するトロンビン固定化シートの作製は以下の方法に従って行なった。
５％ヒト血清アルブミンを含む溶液に、塩化カルシウムを40mM加え、組換えトロンビン（Yonemura H, Imamura T, Soejima K, Nakahara Y, Morikawa W, Ushio Y, Kamachi Y, Nakatake H, Sugawara K, Nakagaki T, Nozaki C，「Preparation of Recombinant α-Thrombin: High-Level Expression of Recombinant Human Prethrombin-2 and Its Activation by Recombinant Ecarin.」，J. Biochem. (Tokyo)，2004，135，5，p.577-582参照）を必要濃度で添加する。この溶液を、市販の基材であるポリグリコール酸シート（商品名ネオベール/グンゼ）、または、キチンを材料とした創傷被覆材（商品名ベスキチン/ユニチカ）を底に敷いた容器に厚さ１mmとなるように注いだ。このシートを−80℃で２時間凍結後、乾燥させたものをトロンビン固定化シートのサンプルとした。【００２１】
被験物質であるトロンビンシートＮＨは、1枚当たり５cm×1.5cmのネオベールにトロンビンの一定量（135単位/cm2）が染み込んだシート剤である。トロンビン−ＫＨではベスキチンに135単位/cm2のトロンビンを染み込ませてあり、トロンビンシートＫＬではベスキチンに13.5単位/cm2のトロンビンを染み込ませてある。【００２２】
１.２.対照物質
対照物質は、溶液の場合はトロンビンを溶かしている溶液のみでトロンビンは含まないもので、シートの場合はトロンビンを含まないシート基材である。【００２３】
２．動物
試験には、薬効薬理試験で一般的に用いられている動物種で、その系統維持が明らかであり、集積データが揃っているCrj:CD(SD)IGS系ラット(SPF)を使用した。それらの動物は10週齢の雄ラットを日本チャールス・リバー株式会社から入手した。入手した動物は、５日間の検疫期間と７日間の馴化期間を設け、この間に３回の体重測定と一般状態の観察を毎日行なって検疫・馴化とした。一般状態および体重推移に異常の認められなかった動物を群分けに用いた。群分けは、切創作製日に測定したラット体重値を層別に分けた後、各群の平均体重および分散がほぼ等しくなるよう1群7匹の7群に動物を振り分けることにより行なった。【００２４】
動物は、設定温度23℃、設定湿度55%、明暗各12時間、換気回数12回／時(フイルターにより除菌した新鮮空気)に維持された飼育室で飼育した。【００２５】
３．投与
３.１.群構成および投与量
群構成(検体名)、使用動物匹数は、以下の通りとした。液状剤型に主眼をおいたものを試験１として表１に、そして、シート状剤型に主眼をおいたものを表２にまとめた。【００２６】
【表１】
2006033433.tif 000002
【００２７】
【表２】
2006033433.tif 000003
【００２８】
４．試験方法
４.１.全層皮膚切開創の作製
群分け後の12週齢のラット50匹(体重範囲：403〜460g)をペントバルビタールナトリウム[ネンブタール注射液(商品名：大日本製薬株式)40mg/0.8mL/kg,i.p.]で麻酔し、背部を電気バリカンで剃毛した後、皮膚をアルコール綿で消毒して外科用メスで正中線上に約3.4cmの切創を作製した(この日を切創作製１日とした)。切開部の中央部および中央部から頭部側および尾部側の約１cmの位置である計3箇所をミヘル(ミッヘル縫合鋲；大3.0×14mm、夏目製作所)を用いて縫合した。【００２９】
４.２.投与方法
投与方法は、シートの場合はシートを切創部位に貼付し、不織布粘着包帯(メッシュポア、No.50、ニチバン株式会社、サイズ：約６cm×約３cm)でこのシートを覆い、さらに背部から腹部までの胴周りをこの不織布粘着包帯で覆った。溶液の場合は溶液を切創部位に滴下し、上記不織布粘着包帯で覆い、さらに背部から腹部までの胴周りをこの不織布粘着包帯で覆った。【００３０】
４.３.投与回数、投与時刻および投与期間
投与回数は、１日１回、４日間の計４回とした。投与時刻は、午前９時〜１１時の投与としたが、切創作製日およびミヘル除去日は各個体で作業終了後に投与を行なった。投与期間は、切創作製日を切創作製１日として、切創作製１日から４日までの４日間とした。【００３１】
４.４.創傷治癒効果の評価
切創作製４日の投与前に動物をジエチルエーテルで麻酔させミヘルを除去した。切創作製５日に体重を測定し、ジエチルエーテル過麻酔で安楽致死させた後、創傷部周辺の皮膚を剥離した。創傷部を中央とした短冊形の皮膚片(短片約２cm、長片約３cm)を作製し、片側を端から約0.5mmの位置で固定して、創耐張力(切創が開裂するのに要する荷重；g)を創傷治癒測定用引張試験機(TK-251、ユニコム)にて測定した。【００３２】
試験成績：
試験１の結果を表３として以下に示す。【００３３】
【表３】
2006033433.tif 000004
【００３４】
無処置群では、個体別創耐張力は７例平均では128±3gであった。溶解液のみの群においては、溶解群では７例平均では128±8gであり、無処置群との比較では有意差は認められなかった。トロンビン溶液Ｌ（低濃度）群では、個体別創耐張力は７例平均では149±13gであり、無貼付対照群との比較では有意な創耐張力の増加が認められ、その増加率は16%であった。トロンビン溶液Ｈ（高濃度）群では、個体別創耐張力は７例平均では192±18gであり、無貼付対照群との比較では有意な創耐張力の増加が認められ、その増加率は50%であった。【００３５】
ポリグリコール酸を基材にしたシート剤においては、ポリグリコール酸基材のみの群では７例平均では129±13gであり、無貼付対照群との比較では有意差は認められなかった。その基材にトロンビンを固定化したシートＮ群では、個体別創耐張力は７例平均では171±14であり、無貼付対照群との比較では有意な創耐張力の増加が認められ、その増加率は34%であった。【００３６】
次にシートの基材を創傷被覆材にも利用されているキチン基材を用いて行なった試験２の結果を表４に示す。【００３７】
【表４】
2006033433.tif 000005
【００３８】
キチン基材のみの群では、７例平均で149±12gであり、平均創耐張力は無貼付対照群を上回り、その増加率は10.4%であった。トロンビンＫＬ群では、個体別創耐張力は７例平均では149±12gであり、無貼付対照群との比較では創耐張力の増加が認められ、その増加率は45%であった。トロンビンＫＨ群では、個体別創耐張力は７例平均では198±21gであり、無貼付対照群との比較では有意な創耐張力の増加が認められ、その増加率は77%であった。【００３９】
以上のことから、ラット皮膚切創モデルに対してトロンビンは溶液塗布で明らかな治癒効果を示した。また、シート剤にした場合には、その基材により効果の程度が認められた。シートの基材が創傷被覆材として使用されているものを用いれば、それにトロンビンを固定化することにより明らかな創傷治癒効果が示された。従って、トロンビンの作用を活用した本願発明は創傷治癒効果を多いに期待でき、今後も増加が予想される褥瘡などの疾患治療に大きく貢献する有用な発明と考えることができる。
【国際調査報告】
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2006033433.tif 000007
2006033433.tif 000008
2006033433.tif 000009