【手続補正書】
【提出日】令和2年6月26日(2020.6.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のプロモーターポリヌクレオチド配列に機能的に連結した異種細菌ヘモグロビン遺伝子を含む宿主細胞であって、該第１のプロモーターポリヌクレオチド配列が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来であり、長さが１００塩基対未満であり、異なる成長条件にわたって遺伝子を構成的に発現することができ、協調して、プロモーター活性のレベルが漸増して上昇する複数のプロモーターを含むプロモーターのラダーを形成することができる、宿主細胞。
【請求項２】
前記第１のプロモーターポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８から選択される配列を含む、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項３】
前記細菌ヘモグロビン遺伝子が、配列番号１２、配列番号１０、配列番号１１、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、および配列番号２０から選択されるヌクレオチド配列を有する遺伝子である、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項４】
前記細菌ヘモグロビン遺伝子が、配列番号２６、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２３、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項５】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、請求項１から４までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項６】
生体分子を産生させる方法であって、請求項１から５までのいずれか一項に記載の宿主細胞を該生体分子の産生に適した条件下で培養するステップであって、前記生体分子が、低分子、アミノ酸、ヌクレオチド、有機酸、またはアルコールからなる群より選択される、ステップを含む方法。
【請求項７】
生体分子の産生を増加させることが可能な微生物を生成するための方法であって、
ａ）宿主微生物を遺伝子改変するステップであって、該改変するステップは、細菌ヘモグロビン遺伝子のライブラリー由来の細菌ヘモグロビン遺伝子を、該宿主微生物のゲノムに導入することを含み、細菌ヘモグロビン遺伝子の該ライブラリー由来の細菌ヘモグロビン遺伝子のそれぞれは、プロモーターに機能的に連結しており、該プロモーターは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来であり、長さが１００塩基対未満であり、異なる成長条件にわたって遺伝子を構成的に発現することができ、協調して、プロモーター活性のレベルが漸増して上昇する複数のプロモーターを含むプロモーターのラダーを形成することができ、該改変は、該細菌ヘモグロビン遺伝子を発現する該宿主微生物の株を生成させる、ステップと；
ｂ）該宿主微生物の複数の株が生成するまで、ステップａ）を複数ラウンド繰り返すステップであって、該宿主微生物の該複数の株の各株は、細菌ヘモグロビン遺伝子の該ライブラリー由来の別々の細菌ヘモグロビン遺伝子を発現する、ステップと；
ｃ）該宿主微生物の該複数の株の各株を、発酵条件下で、炭素源と接触させるステップと；
ｄ）対照微生物から産生される生体分子の量と比較して増加した量の該生体分子を産生する該宿主微生物の各株を選択するステップであって、前記生体分子は、医薬、低分子、アミノ酸、ヌクレオチド、有機酸、またはアルコールからなる群より選択され、該対照微生物は、細菌ヘモグロビン遺伝子の該ライブラリー由来の細菌ヘモグロビン遺伝子を発現しない、ステップと
を含む方法。
【請求項８】
前記プロモーターが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
細菌ヘモグロビン遺伝子の前記ライブラリーが、配列番号１２、配列番号１０、配列番号１１、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、および配列番号２０から選択されるヌクレオチド配列を有する１種または複数種の細菌ヘモグロビン遺伝子を含む、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
細菌ヘモグロビン遺伝子の前記ライブラリーが、配列番号２６、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２３、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４から選択される１種または複数種のポリペプチド配列をコードする１種または複数種の細菌ヘモグロビン遺伝子を含む、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１１】
細菌ヘモグロビン遺伝子の前記ライブラリーが、表２に列挙された微生物の株、種、または亜種に由来する１種または複数種の細菌ヘモグロビン遺伝子を含む、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１２】
前記細菌ヘモグロビン遺伝子が、細菌フラボヘモグロビン遺伝子であり、該細菌フラボヘモグロビン遺伝子のライブラリーが、表２に列挙された微生物の株、種、または亜種に由来する１種または複数種の細菌フラボヘモグロビン遺伝子を含む、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１３】
ヘモグロビンの前記ライブラリー内の前記細菌ヘモグロビンの少なくとも１種が、細菌フラボヘモグロビンであり、該細菌ヘモグロビン遺伝子の前記ライブラリーが、表２に列挙された微生物の株、種、または亜種に由来する１種または複数種の細菌ヘモグロビン遺伝子および表２に列挙された微生物の株、種、または亜種に由来する１種または複数種の細菌フラボヘモグロビン遺伝子を含む、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１４】
細菌ヘモグロビン遺伝子のライブラリーであって、細菌ヘモグロビン遺伝子の該ライブラリー内の各細菌ヘモグロビン遺伝子が、プロモーターに機能的に連結しており、該プロモーターが、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来であり、長さが１００塩基対未満であり、異なる成長条件にわたって遺伝子を構成的に発現することができ、協調して、プロモーター活性のレベルが漸増して上昇する複数のプロモーターを含むプロモーターのラダーを形成することができる、ライブラリー。
【請求項１５】
前記プロモーターが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１４に記載のライブラリー。
【請求項１６】
細菌ヘモグロビン遺伝子の前記ライブラリーが配列番号１２、配列番号１０、配列番号１１、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、および配列番号２０から選択される１種または複数種の細菌ヘモグロビン遺伝子を含む、請求項１４または１５に記載のライブラリー。
【請求項１７】
細菌ヘモグロビン遺伝子の前記ライブラリーが配列番号２６、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２３、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４から選択される１種または複数種のポリペプチド配列をコードする１種または複数種の細菌ヘモグロビン遺伝子を含む、請求項１４または１５に記載のライブラリー。
【請求項１８】
細菌ヘモグロビン遺伝子の前記ライブラリーが、表２に列挙された微生物の株、種、または亜種に由来する１種または複数種の細菌ヘモグロビン遺伝子を含む、請求項１４または１５に記載のライブラリー。
【請求項１９】
前記ライブラリー内の前記細菌ヘモグロビン遺伝子のそれぞれが、細菌フラボヘモグロビン遺伝子であり、細菌フラボヘモグロビン遺伝子の前記ライブラリーが、表２に列挙された微生物の株、種、または亜種に由来する１種または複数種の細菌フラボヘモグロビン遺伝子を含む、請求項１４または１５に記載のライブラリー。
【請求項２０】
細菌ヘモグロビン遺伝子の前記ライブラリー内の前記細菌ヘモグロビン遺伝子の少なくとも１種が、細菌フラボヘモグロビン遺伝子であり、細菌ヘモグロビン遺伝子の前記ライブラリーが、表２に列挙された微生物の株、種、または亜種に由来する１種または複数種の細菌ヘモグロビン遺伝子および表２に列挙された微生物の株、種、または亜種に由来する１種または複数種の細菌フラボヘモグロビン遺伝子を含む、請求項１４または１５に記載のライブラリー。
【請求項２１】
生体分子を産生させる方法であって、請求項１４から２０までのいずれか一項に記載のライブラリーに由来する細菌ヘモグロビン遺伝子を宿主細胞に導入するステップと、該宿主細胞を該生体分子の産生に適した条件下で培養するステップとを含み、該生体分子が、医薬、低分子、アミノ酸、ヌクレオチド、有機酸、またはアルコールからなる群より選択される、方法。
【請求項２２】
前記宿主細胞が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
配列番号１２、配列番号１０、配列番号１１、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０から選択される配列を有するコドン最適化ポリヌクレオチドを含む、単離された、合成または組換えポリヌクレオチドであって、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、単離された、合成または組換えポリヌクレオチド。
【請求項２４】
前記宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉおよび／またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、請求項２３に記載の単離された、合成または組換えポリヌクレオチド。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
さらなる態様では、配列番号１２、配列番号１０、配列番号１１、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０から選択されるコドン最適化ポリヌクレオチドを含む配列を有する単離された、合成または組換えポリヌクレオチドであって、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、ポリヌクレオチドが本明細書に提供される。一部の場合では、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉおよび／またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
第１のプロモーターポリヌクレオチドに機能的に連結した異種細菌ヘモグロビン遺伝子を含む宿主細胞であって、該第１のプロモーターポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８から選択される配列を含む、宿主細胞。
（項目２）
前記細菌ヘモグロビン遺伝子が、配列番号１２、配列番号１０、配列番号１１、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、および配列番号２０から選択されるヌクレオチド配列を有する遺伝子である、項目１に記載の宿主細胞。
（項目３）
前記細菌ヘモグロビン遺伝子が、配列番号２６、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２３、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、項目１に記載の宿主細胞。
（項目４）
前記細菌ヘモグロビン遺伝子が、表２に列挙された微生物の株、種、または亜種に由来する、項目１に記載の宿主細胞。
（項目５）
前記細菌ヘモグロビン遺伝子が、細菌フラボヘモグロビン遺伝子である、項目１に記載の宿主細胞。
（項目６）
前記細菌フラボヘモグロビン遺伝子が、表２に列挙された微生物の株、種、または亜種に由来する、項目５に記載の宿主細胞。
（項目７）
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する、項目１から６までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
（項目８）
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、項目１から７までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
（項目９）
生体分子を産生させる方法であって、項目１から８までのいずれか一項に記載の宿主細胞を該生体分子の産生に適した条件下で培養するステップを含む方法。
（項目１０）
前記生体分子が、低分子、アミノ酸、ヌクレオチド、有機酸、またはアルコールである、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記アミノ酸が、リシン、グルタミン酸、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、またはメチオニンである、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記有機酸が、スクシネート、ラクテートまたはピルベートである、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
前記アルコールが、エタノールまたはイソブタノールである、項目１０に記載の方法。
（項目１４）
生体分子の産生を増加させることが可能な微生物を生成するための方法であって、
ａ）宿主微生物を遺伝子改変するステップであって、該改変するステップは、細菌ヘモグロビン遺伝子のライブラリー由来の細菌ヘモグロビン遺伝子を、該宿主微生物のゲノムに導入することを含み、細菌ヘモグロビン遺伝子の該ライブラリー由来の細菌ヘモグロビン遺伝子のそれぞれは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８から選択されるヌクレオチド配列を含むプロモーターに機能的に連結しており、該改変は、該細菌ヘモグロビン遺伝子を発現する該宿主微生物の株を生成させる、ステップと；
ｂ）該宿主微生物の複数の株が生成するまで、ステップａ）を複数ラウンド繰り返すステップであって、該宿主微生物の該複数の株の各株は、細菌ヘモグロビン遺伝子の該ライブラリー由来の別々の細菌ヘモグロビン遺伝子を発現する、ステップと；
ｃ）該宿主微生物の該複数の株の各株を、発酵条件下で、炭素源と接触させるステップと；
ｄ）対照微生物から産生される生体分子の量と比較して増加した量の該生体分子を産生する該宿主微生物の各株を選択するステップであって、該対照微生物は、細菌ヘモグロビン遺伝子の該ライブラリー由来の細菌ヘモグロビン遺伝子を発現しない、ステップと
を含む方法。
（項目１５）
細菌ヘモグロビン遺伝子の前記ライブラリーが、配列番号１２、配列番号１０、配列番号１１、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、および配列番号２０から選択されるヌクレオチド配列を有する１種または複数種の細菌ヘモグロビン遺伝子を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
細菌ヘモグロビン遺伝子の前記ライブラリーが、配列番号２６、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２３、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４から選択される１種または複数種のポリペプチド配列をコードする１種または複数種の細菌ヘモグロビン遺伝子を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
細菌ヘモグロビン遺伝子の前記ライブラリーが、表２に列挙された微生物の株、種、または亜種に由来する１種または複数種の細菌ヘモグロビン遺伝子を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１８）
前記細菌ヘモグロビン遺伝子が、細菌フラボヘモグロビン遺伝子である、項目１４に記載の方法。
（項目１９）
細菌フラボヘモグロビン遺伝子のライブラリーが、表２に列挙された微生物の株、種、または亜種に由来する１種または複数種の細菌フラボヘモグロビン遺伝子を含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
ヘモグロビンの前記ライブラリー内の前記細菌ヘモグロビンの少なくとも１種が、細菌フラボヘモグロビンである、項目１４に記載の方法。
（項目２１）
細菌ヘモグロビン遺伝子の前記ライブラリーが、表２に列挙された微生物の株、種、または亜種に由来する１種または複数種の細菌ヘモグロビン遺伝子および表２に列挙された微生物の株、種、または亜種に由来する１種または複数種の細菌フラボヘモグロビン遺伝子を含む、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記宿主微生物が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する、項目１４から２１までのいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記宿主微生物が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、項目１４から２２までのいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記導入することが、形質転換、形質導入または電気穿孔によって実施される、項目１４から２３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記生体分子が、低分子、アミノ酸、ヌクレオチド、有機酸、またはアルコールである、項目１４から２４までのいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記アミノ酸が、リシン、グルタミン酸、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、またはメチオニンである、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記有機酸が、スクシネート、ラクテートまたはピルベートである、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
前記アルコールが、エタノールまたはイソブタノールである、項目２５に記載の方法。
（項目２９）
細菌ヘモグロビン遺伝子のライブラリーであって、細菌ヘモグロビン遺伝子の該ライブラリー内の各細菌ヘモグロビン遺伝子が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８から選択されるヌクレオチド配列を含むプロモーターに機能的に連結している、ライブラリー。
（項目３０）
細菌ヘモグロビン遺伝子の前記ライブラリーが配列番号１２、配列番号１０、配列番号１１、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、および配列番号２０から選択される１種または複数種の細菌ヘモグロビン遺伝子を含む、項目２９に記載のライブラリー。
（項目３１）
細菌ヘモグロビン遺伝子の前記ライブラリーが配列番号２６、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２３、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４から選択される１種または複数種のポリペプチド配列をコードする１種または複数種の細菌ヘモグロビン遺伝子を含む、項目２９に記載のライブラリー。
（項目３２）
細菌ヘモグロビン遺伝子の前記ライブラリーが、表２に列挙された微生物の株、種、または亜種に由来する１種または複数種の細菌ヘモグロビン遺伝子を含む、項目２９に記載のライブラリー。
（項目３３）
前記ライブラリー内の前記細菌ヘモグロビン遺伝子のそれぞれが、細菌フラボヘモグロビン遺伝子である、項目２９に記載のライブラリー。
（項目３４）
細菌フラボヘモグロビン遺伝子の前記ライブラリーが、表２に列挙された微生物の株、種、または亜種に由来する１種または複数種の細菌フラボヘモグロビン遺伝子を含む、項目３３に記載のライブラリー。
（項目３５）
細菌ヘモグロビン遺伝子の前記ライブラリー内の前記細菌ヘモグロビン遺伝子の少なくとも１種が、細菌フラボヘモグロビン遺伝子である、項目２９に記載のライブラリー。
（項目３６）
細菌ヘモグロビン遺伝子の前記ライブラリーが、表２に列挙された微生物の株、種、または亜種に由来する１種または複数種の細菌ヘモグロビン遺伝子および表２に列挙された微生物の株、種、または亜種に由来する１種または複数種の細菌フラボヘモグロビン遺伝子を含む、項目３５に記載のライブラリー。
（項目３７）
生体分子を産生させる方法であって、項目２９から３６までのいずれか一項に記載のライブラリーに由来する細菌ヘモグロビン遺伝子を宿主細胞に導入するステップと、該宿主細胞を該生体分子の産生に適した条件下で培養するステップとを含む方法。
（項目３８）
前記生体分子が、低分子、アミノ酸、ヌクレオチド、有機酸、またはアルコールである、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記アミノ酸が、リシン、グルタミン酸、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、トレオニン、イソロイシン、またはメチオニンである、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記有機酸が、スクシネート、ラクテートまたはピルベートである、項目３８に記載の方法。
（項目４１）
前記アルコールが、エタノールまたはイソブタノールである、項目３８に記載の方法。
（項目４２）
前記宿主細胞が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する、項目３７から４１までのいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記宿主細胞が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、項目３７から４２までのいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記導入するステップが、形質転換、形質導入または電気穿孔によって実施される、項目３７から４３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
配列番号１２、配列番号１０、配列番号１１、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０から選択される配列を有するコドン最適化ポリヌクレオチドを含む、単離された、合成または組換えポリヌクレオチドであって、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、単離された、合成または組換えポリヌクレオチド。
（項目４６）
前記宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉおよび／またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、項目４５に記載の単離された、合成または組換えポリヌクレオチド。