(57)【要約】  角膜上皮に類似した細胞層を備える角膜上皮シートを提供する。a)自己細胞である第１細胞と、及び該第１細胞と由来が異なる第２細胞とをそれぞれ調製するステップ、b)前記第１細胞及び前記第２細胞をコラーゲン層上に播種し、培養するステップ、及びc)前記第１細胞及び前記第２細胞が増殖して細胞層が形成された後、該細胞層の最表層を空気に接触させるステップを行い、角膜上皮シートを得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己細胞である第１細胞と、及び該第１細胞と由来が異なる第２細胞とを含み、重層化した細胞層、
を備える角膜上皮シート。
【請求項２】
前記第１細胞が、口腔粘膜上皮由来の細胞、結膜上皮由来の細胞、鼻腔粘膜上皮由来の細胞、及びその他の粘膜上皮由来の細胞、並びにこれらいずれかの粘膜上皮を構築可能な未分化細胞に由来する細胞からなる群より選択される一種以上の自己細胞であって、
前記第２細胞が、角膜上皮由来の細胞、結膜上皮由来の細胞、及び羊膜上皮由来の細胞からなる群より選択される一種以上の細胞である、
請求項１に記載の角膜上皮シート。
【請求項３】
前記第１細胞が口腔粘膜上皮由来の細胞である、請求項２に記載の角膜上皮シート。
【請求項４】
前記第２細胞が他人の細胞である、請求項２又は３に記載の角膜上皮シート。
【請求項５】
前記第２細胞が、角膜上皮由来の細胞又は羊膜上皮由来の細胞である、請求項２〜４のいずれかに記載の角膜上皮シート。
【請求項６】
コラーゲン層を更に備え、該コラーゲン層上に前記細胞層が形成されている、請求項１〜５のいずれかに記載の角膜上皮シート。
【請求項７】
前記コラーゲン層が、羊膜又は上皮を除去した羊膜に由来する、請求項６に記載の角膜上皮シート。
【請求項８】
前記細胞層が、以下の性状ないしは特性の一つ以上を備える、請求項１〜７のいずれかに記載の角膜上皮シート：
最表層の細胞が角化していない；
最表層の細胞が扁平形状である；
バリア機能を備える。
【請求項９】
以下のステップを含む、角膜上皮シートの作製方法：
a)自己細胞である第１細胞と、及び該第１細胞と由来が異なる第２細胞とをそれぞれ調製するステップ；
b)前記第１細胞及び前記第２細胞をコラーゲン層上に播種し、培養するステップ；及び
c)前記第１細胞及び前記第２細胞が増殖して細胞層が形成された後、該細胞層の最表層を空気に接触させるステップ。
【請求項１０】
前記第１細胞が、口腔粘膜上皮細胞、結膜上皮細胞、鼻腔粘膜上皮細胞、及びその他の粘膜上皮細胞、並びにこれらいずれかの粘膜上皮を構築可能な未分化細胞からなる群より選択される一種以上の自己細胞であって、
前記第２細胞が、角膜上皮細胞、結膜上皮細胞、及び羊膜上皮細胞からなる群より選択される一種以上の細胞である、
請求項９に記載の作製方法。
【請求項１１】
前記第１細胞が口腔粘膜上皮細胞である、請求項１０に記載の作製方法。
【請求項１２】
前記第２細胞が他人の細胞である、請求項１０又は１１に記載の作製方法。
【請求項１３】
前記第２細胞が、角膜上皮細胞又は羊膜上皮細胞である、請求項１０〜１２のいずれかに記載の作製方法。
【請求項１４】
前記ステップbが以下のいずれかの条件で行われる、請求項９〜１３のいずれかに記載の作製方法：
1)支持細胞の共存下；
2)支持細胞の共存下であって、支持細胞と前記コラーゲン層との間に支持細胞が通過できないポアサイズの隔離膜が存在した状態。
【請求項１５】
前記コラーゲン層が、羊膜又は上皮を除去した羊膜に由来する、請求項９〜１４のいずれかに記載の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は角膜上皮シート及びその作製方法に関する。本発明は、角膜上皮の移植が必要な疾患（眼表面疾患）の治療に利用できる。本発明は、特に両眼性の角膜性疾患に対して有効な治療手段を提供する。
【背景技術】
【０００２】
角膜が結膜上皮で覆われ混濁を生じる眼表面疾患に対する外科的治療として現在は角膜上皮移植術が行われているが、強い炎症を伴った難治性角結膜疾患（Stevens-Johnson症候群や眼類天疱瘡、角膜腐食など）においては、その予後が極めて不良である。その最大の理由として、強い抗原性を有する異系（アロ）の角膜上皮が宿主の免疫系に認識され拒絶を受けることが挙げられる。更に、拒絶反応の予防のため術後に多量の免疫抑制剤を全身及び局所投与することによる合併症もその予後不良の大きな要因となっている。一方、アロの角膜上皮を利用する場合には、ドナー不足の問題がある。従って、アロではなく自己の角膜上皮組織を用いた移植を行うことが理想と考えられる。しかし、片眼性の疾患（角膜腐食など）では、健眼からの角膜上皮を患眼に移植することで良好な成績を収めた報告は過去にもみられるが、難治性角膜疾患の多くは両眼性でありこうした手法を用いることができないのが現実である。
一方、これまで角膜移植の適応外とされてきたスチーブンス・ジョンソン症候群や眼類天疱瘡、化学外傷、再発翼状片などの難治性角結膜疾患に対する外科的治療法として、本発明者らは平成１１年より京都府立医科大学倫理委員会において承認された羊膜を基質とした培養角膜上皮移植術を施行し比較的良好な治療成績を得てきた（非特許文献１〜３を参照）。また、平成１４年より京都府立医科大学における人間を対象とする医学研究審査委員会において承認された自己培養口腔粘膜上皮移植術を施行し、治療成績の向上につなげている（特許文献１、非特許文献４を参照）。【０００３】
【特許文献１】国際公開第０３／０４３５４２号パンフレット
【非特許文献１】Noriko Koizumi et al., Ophthalmology 2001; 108: 1569-74.
【非特許文献２】Noriko Koizumi et al., Arch Ophthalmol 2001;119:298-300.
【非特許文献３】Nakamura T et al., Cornea. 22; 70-71: 2003.
【非特許文献４】Nakamura T et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003; 44: 106-16.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
難治性角結膜疾患の多くは両眼性であるため、羊膜を基質とした培養角膜上皮移植術による治療法の多くは、他人（アロ）からの組織を用いた移植に頼らざるをえず、拒絶反応や細菌感染症等の問題が術後成績に大きく影響を与えているのが現状である。他方、自己培養口腔粘膜上皮移植術による治療法は、自己（オート）口腔粘膜を使用することができるため拒絶反応等の危険性を回避できるが、培養上皮シートの透明性の問題や、術後に血管新生等を生じる症例があり、今後さらなる治療法の開発が期待されている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
以上の状況の中、本発明者らは自己組織を用いた眼表面再建術のさらなる発展的な可能性を模索した。その結果、自己の細胞と、及びこれと由来の異なる細胞とを組み合わせて培養することでハイブリッド化させ、これによって角膜上皮様の粘膜上皮層を構築するという新たな手法を思いつくに至った。そこで、自己細胞として口腔粘膜上皮細胞を選択し、一方でこれと由来の異なる細胞として角膜上皮細胞を選択して角膜上皮シートの構築を試みたところ、二種類の細胞に由来する細胞がハイブリッド化してなる細胞群が、角膜上皮に類似の分化、重層化した粘膜上皮層を形成することが確認された。また、このようにして得られた粘膜上皮層が眼表面の恒常性を保つとともに、良好な生着性を備えることが、動物を用いた移植実験で確認された。
ここで、生体には様々な粘膜上皮組織が存在し、それらは粘膜上皮に特有の多くの共通点を有する。このことを考慮すれば、例えば結膜上皮細胞や鼻腔粘膜上皮細胞等、他の粘膜組織を構成する細胞であっても、口腔粘膜上皮細胞と同様に、上記のごとき角膜上皮様の粘膜上皮層を形成するための自己細胞として利用できると考えられる。特に、結膜上皮細胞は角膜上皮の近隣組織を構成する細胞であることから有効な細胞源であると考えられる。
また一般に、組織を形成する細胞は、外部シグナル等を受けることによってその前駆細胞又は更に未分化の細胞から生ずる。このことを考え合わせれば、上記細胞（口腔粘膜上皮細胞、結膜上皮細胞等）への分化能を有する限り未分化の細胞であっても、これらの細胞と同様に、粘膜上皮層を形成する際の自己細胞として使用できると考えられる。
一方、後述の実施例に示すように、ヒト口腔粘膜上皮細胞とヒト羊膜上皮細胞をハイブリッド化した場合においても、角膜上皮に類似した粘膜上皮層を形成可能であることが実験的に確認された。即ち、自己細胞としての口腔粘膜上皮細胞に組み合わせる細胞として角膜上皮細胞以外を用いてハイブリッド化させた場合においても、角膜上皮様の粘膜上皮層を形成可能であることが判明した。ここで羊膜上皮細胞と同様に使用できる細胞の有力候補の一つとして、角膜上皮の近隣組織を構成する結膜上皮細胞が想定される。【０００６】
以上のように、本発明者らの鋭意検討の結果、自己の細胞を含む二種類以上の細胞を培養し、ハイブリッド化させることによって、角膜上皮様の粘膜上皮層を構築できることが実験的に確認された。本発明は以上の成果に基づくものであって、以下の構成を提供する。
即ち、本発明は第一の局面として、自己細胞である第１細胞と、及び該第１細胞と由来が異なる第２細胞とを含み、重層化した細胞層、を備える角膜上皮シートを提供する。
本発明の一態様では、前記第１細胞が、口腔粘膜上皮由来の細胞、結膜上皮由来の細胞、鼻腔粘膜上皮由来の細胞、及びその他の粘膜上皮由来の細胞、並びにこれらいずれかの粘膜上皮を構築可能な未分化細胞に由来する細胞からなる群より選択される一種以上の自己細胞であって、前記第２細胞が、角膜上皮由来の細胞、結膜上皮由来の細胞、及び羊膜上皮由来の細胞からなる群より選択される一種以上の細胞である。
本発明の他の一態様は、前記第１細胞が口腔粘膜上皮由来の細胞であることを特徴とする。
本発明のさらに他の一態様は、前記第２細胞が他人の細胞であることを特徴とする。
本発明のさらに他の一態様は、前記第２細胞が、角膜上皮由来の細胞又は羊膜上皮由来の細胞であることを特徴とする。
本発明は他の形態として、前記細胞層に加えてコラーゲン層を備える角膜上皮シートを提供する。この形態では、コラーゲン層上に前記細胞層が形成されている。コラーゲン層が、羊膜又は上皮を除去した羊膜に由来することが好ましい。
本発明の角膜上皮シートにおける細胞層は、以下の性状ないしは特性の一つ以上を備えることが好ましい：
最表層の細胞が角化していない；
最表層の細胞が扁平形状である；
バリア機能を備える。【０００７】
本発明は第２の局面として、角膜上皮シートの作製方法を提供する。本発明の作製方法は、
a)自己細胞である第１細胞と、及び該第１細胞と由来が異なる第２細胞とをそれぞれ調製するステップ；
b)前記第１細胞及び前記第２細胞をコラーゲン層上に播種し、培養するステップ；及び
c)前記第１細胞及び前記第２細胞が増殖して細胞層が形成された後、該細胞層の最表層を空気に接触させるステップ、を含む。
本発明の一態様では、前記第１細胞が、口腔粘膜上皮細胞、結膜上皮細胞、鼻腔粘膜上皮細胞、及びその他の粘膜上皮細胞、並びにこれらいずれかの粘膜上皮を構築可能な未分化細胞からなる群より選択される一種以上の自己細胞であって、前記第２細胞が、角膜上皮細胞、結膜上皮細胞、及び羊膜上皮細胞からなる群より選択される一種以上の細胞である。
本発明の他の一態様では前記第１細胞として口腔粘膜上皮細胞が用いられる。
本発明のさらに他の一態様では前記第２細胞として他人の細胞が用いられる。
本発明のさらに他の一態様では前記第２細胞として角膜上皮細胞又は羊膜上皮細胞が用いられる。
前記ステップbは以下のいずれかの条件で行なうことができる。
1)支持細胞の共存下；
2)支持細胞の共存下であって、支持細胞と前記コラーゲン層との間に支持細胞が通過できないポアサイズの隔離膜が存在した状態。
前記コラーゲン層は、羊膜又は上皮を除去した羊膜に由来することが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、羊膜上に口腔粘膜上皮細胞及び角膜上皮細胞を培養する際の器具等の状態を模式的に示した断面図である。culture dish１内にculture insert２が静置され、culture dish１底面には3T3細胞層５が形成される。また、culture insert２の底面上に羊膜３が静置され、その上に口腔粘膜上皮細胞及び角膜上皮細胞４が培養される状態が示される。符号６は培地である。１  culture dish（培養皿、第１の容器）、２  culture insert（培養挿入容器、第２の容器）、３  羊膜、４  口腔粘膜上皮細胞及び角膜上皮細胞、５  3T3細胞層、６  培地。
【図２】図２は、口腔粘膜上皮細胞及び角膜上皮細胞を羊膜上で１日間培養した後の光学顕微鏡像（左）、及び蛍光染色像（右）である。ROはウサギ口腔粘膜上皮細胞（rabbit oral epithelium）を表す。蛍光染色像では、口腔粘膜上皮細胞由来の細胞の存在を示すDilシグナル（橙色）が認められる。
【図３】図３は、口腔粘膜上皮細胞及び角膜上皮細胞を羊膜上で３日間培養した後の光学顕微鏡像（左）、及び蛍光染色像（右）である。ROはウサギ口腔粘膜上皮細胞（rabbit oral epithelimum）を表す。蛍光染色像では、口腔粘膜上皮細胞由来の細胞の存在を示すDilシグナル（橙色）が認められる。
【図４】図４は、口腔粘膜上皮細胞及び角膜上皮細胞を羊膜上で７日間培養した後の光学顕微鏡像（左）、及び蛍光染色像（右）である。ROはウサギ口腔粘膜上皮細胞（rabbit oral epithelimum）を表す。蛍光染色像では、口腔粘膜上皮細胞由来の細胞の存在を示すDilシグナル（橙色）が認められる。
【図５】図５は、羊膜上に形成された細胞層を免疫染色した結果を示す。左はケラチン１（Ｋ１）及び１０（Ｋ１０）に対する染色性、中央はケラチン３（Ｋ３）及びケラチン１２（Ｋ１２）に対する染色性、右はケラチン４（Ｋ４）及びケラチン１３（Ｋ１３）に対する染色性である。
【図６】図６は、実施例の角膜上皮シートを移植した後、２日経過した時点の眼表面（前眼部）の状態（左）、及び眼表面のフルオレセイン染色像（右）である。
【図７】図７は、実施例の角膜上皮シートを移植した後、１週間経過した時点における眼表面（前眼部）の状態（左）、及び眼表面のフルオレセイン染色像（右）である。
【図８】図８は、実施例の角膜上皮シートを移植した後、２週間経過した時点における眼表面（前眼部）の状態（左）、及び眼表面のフルオレセイン染色像（右）である。
【図９】図９は、移植後２週間経過した時点における角膜上皮シートのHE（ヘマトキシリン−エオジン）染色像である。
【図１０】図１０は、移植後２週間経過した時点における角膜上皮シートを免疫染色した結果を示す。左はケラチン１（Ｋ１）及び１０（Ｋ１０）に対する染色性、中央はケラチン３（Ｋ３）及びケラチン１２（Ｋ１２）に対する染色性、右はケラチン４（Ｋ４）及びケラチン１３（Ｋ１３）に対する染色性である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の第１の局面は角膜上皮シートに関する。ここで「角膜上皮シート」とは、角膜上皮に類似する特徴を少なくともその一部に有するシート状の構造体をいう。
本発明の角膜上皮シートは特有の細胞層を備える。当該細胞層は、自己細胞（本明細書において「第１細胞」ともいう）、及び当該自己細胞と由来が異なる細胞（本明細書において「第２細胞」ともいう）を含み、重層化していることを特徴とする。本明細書では、このように由来の異なる二種類以上の細胞を含んで構成されていることを「ハイブリッド化」ともいう。一方、「重層化している」とは、複数の細胞層によって構成されていることをいう。本発明の角膜上皮シートは、典型的には、４〜８層程度の細胞層を備える。
細胞層における細胞の含有形態（ハイブリッド化の状態）は特に限定されず例えば、各細胞が散在していてもよいし、いずれかの細胞（又は複数種類の細胞）が一定のまとまりをもって存在していてもよい。また、各細胞の含有率が細胞層全体に亘って均一でなくてもよい。【００１０】
本発明における第１細胞は自己細胞である。本明細書において「自己」とは、本発明の角膜上皮シートを使用する対象、即ち移植を受ける者（レシピエント）をいう。一方、このような「自己」以外の者を「他人」という。
後述の第２細胞とハイブリッド化させた場合に角膜上皮様の粘膜上皮層を形成可能である限り、第１細胞の種類は特に限定されない。第１細胞の例としては、口腔粘膜上皮、結膜上皮、鼻腔粘膜上皮等の粘膜上皮に由来する細胞、或いはこのような粘膜上皮を構築可能な未分化細胞（即ち粘膜上皮の幹細胞）に由来する細胞を挙げることができる。ここで本明細書において「由来する又は由来の」とは出発材料を特定する目的で使用される。従って例えば、口腔粘膜上皮に由来する（又は由来の）細胞といえば、口腔粘膜上皮細胞を出発材料として得られた細胞を意味する。また、本発明において「粘膜上皮を構築可能な未分化細胞」とは、当該粘膜上皮を構成する細胞への分化能を有する細胞をいう。例えば、口腔粘膜上皮を構築可能な未分化細胞といえば、口腔粘膜上皮細胞へと分化し得る細胞をいう。未分化細胞の具体例としては、口腔粘膜上皮や結膜上皮など、特定の組織を構成する細胞の前駆又は幹細胞、或いはさらに分化度の低い上皮系幹細胞などが挙げられる。【００１１】
本発明における細胞層が、異なる二種以上の第１細胞を含んでいてもよい。例えば、口腔粘膜上皮に由来する細胞と、結膜上皮に由来する細胞とを含んだ状態で細胞層が構築されていてもよい。【００１２】
本発明における「口腔粘膜上皮」には、口腔内縁粘膜上皮部、口唇部、口蓋部、頬部などが含まれる。それが口腔粘膜上皮に由来する細胞であることは、口腔粘膜上皮特異的なケラチン４、又はケラチン１３が発現していることを指標として確認することができる。又は、ケラチン３を発現していることを指標とすることもできる。このケラチン３は、角膜特異的ケラチンの一つと知られているが、口腔粘膜上皮においても発現していることが確認されている。尚、この角膜特異的ケラチンであるケラチン３を発現している点において、口腔粘膜上皮細胞を角膜上皮移植用の組成物を作製する材料として用いることは好ましいといえる。
一方、口腔粘膜上皮細胞特異的な遺伝子の発現を調べることによっても、それが口腔粘膜上皮由来であることを確認することができる。
尚、口腔粘膜上皮以外の組織に由来する細胞の場合も同様に、当該組織に特異的なマーカー或いは遺伝子の発現を調べることによってその由来を確認することができる。【００１３】
第２細胞の具体例としては、角膜上皮、結膜上皮、又は羊膜上皮に由来する細胞を挙げることができる。中でも、第２細胞が角膜上皮又は結膜上皮に由来する細胞であることが好ましい。眼表面組織に由来する細胞によって構築された細胞層では、角膜上皮により近い特性を備えることができるからである。第２細胞が角膜上皮に由来する細胞であることが特に好ましい。角膜上皮に一層近似した特性の細胞層となるからである。
第２細胞は自己細胞又は他人の細胞のいずれであってもよい。自己細胞によって構築された細胞層であれば、免疫拒絶の問題のない又は少ない細胞層となる。他人の細胞によって構築された細胞層であれば、原材料となる細胞の入手が容易となることから、その作製の観点から有利な細胞層となる。本発明の細胞層が、異なる二種以上の第２細胞を含んでいてもよい。例えば、角膜上皮に由来する細胞と、結膜上皮に由来する細胞とを含んだ状態で細胞層が構築されていてもよい。【００１４】
本発明の角膜上皮シートにおける細胞層が角膜上皮に由来する細胞であることは例えば、角膜上皮特異的なケラチン３、又はケラチン１２が発現していることを指標として確認することができる。又は、ケラチン４を発現していることを指標とすることもできる。
尚、角膜上皮以外の組織に由来する細胞の場合も同様に、当該組織に特異的なマーカー或いは遺伝子の発現を調べることによってその由来を確認することができる。【００１５】
本発明の角膜上皮シートにおける細胞層は、好ましくは以下の性状ないしは特性のいくつかを備えるものである。特に好ましくは、以下の全ての性状ないしは特性を備えるものである。
(1)最上層の細胞が角化していない。これは、角膜上皮が備える特徴の一つである。この特徴が認められることにより、本発明の角膜上皮シートは角膜上皮に類似し、角膜上皮と同様の機能を発揮することが期待される。尚、角化とは、別名角質化とも呼ばれ、細胞内にケラチンを生じ、核等の細胞内小器官が失われる現象をいう。細胞が角化しているか否かは、例えば細胞の扁平化や核の有無を指標として確認することができる。
(2)最上層の細胞が扁平形状である。すなわち口腔粘膜上皮細胞層が、略円柱形状の細胞からなる層の上に扁平形状の細胞からなる層が形成されて構成される。扁平形状の細胞が最上層を覆うことにより、細胞間の気密性が高まり以下のバリア機能が奏されると考えられる。角膜上皮においても最上層の細胞は扁平形状である。この特徴が認められることにより、本発明の角膜上皮シートは角膜上皮に類似し、角膜上皮と同様の機能を発揮することが期待される。
(3)バリア機能を備える。バリア機能とは、表層からの液体、気体などの浸潤や、表層を介して液体の放散などを防止する機能をいう。かかるバリア機能を有することにより、移植後その表面に水分（涙）を保持することができ、また必要以上の水分が放散することを防止することができる。角膜は、バリア機能を備えることによりその表面に水分を保持でき、これによって瞬目に耐えることができるという機能を発揮する。したがってバリア機能を備えることは、角膜用移植材料に求められる重要な一つの特性である。この特徴が認められることにより、本発明の角膜上皮シートは角膜上皮に類似し、角膜上皮と同様の機能を発揮することが期待される。バリア機能を備えるか否かは、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Horseradish peroxidase）等の標識物質を含む溶液の浸潤の程度によって調べることができる。
本発明の角膜上皮シートは、角膜を損傷、欠損等した患者に対する移植材料（角膜上皮の代替）として用いることができる。移植の際には、手術用縫合糸を用いて移植片を周囲の組織と固定し、生着を促すことが好ましい。また、移植後、治療用コンタクトレンズで移植部表面を一時的に被覆して保護することが好ましい。【００１６】
本発明の角膜上皮シートの一態様では、上記細胞層がコラーゲン層上に形成されている。即ち、当該態様では細胞層に加えてコラーゲン層が備えられる。ここでのコラーゲン層は羊膜由来であることが好ましい。羊膜の高い生体親和性及び低免疫原性によって、生体親和性に一層優れ且つ免疫原性の低い角膜上皮シートとなるからである。羊膜由来のコラーゲン層を使用することは、角膜上皮シートの作製の点からも好ましい。即ち、後述のように、コラーゲン層を備える角膜上皮シートは、コラーゲン層を基質としてその上に所定の細胞を播種、培養することによって形成され得るところ、羊膜はその上に細胞が良好に接着及び増殖するという特性を備えることから、羊膜由来のコラーゲン層を使用すれば良好な細胞の接着、増殖、そして細胞層の形成が可能となる。
コラーゲン層が、掻爬処理などにより上皮を除去した羊膜に由来することが更に好ましい。上皮成分が含まれないことによって免疫原性がさらに低下した角膜上皮シートとなるからである。また、上皮が除去された羊膜ではその上に細胞が一層良好に接着及び増殖することから、より短時間で高い品質の角膜上皮シートを構築することができるという、作製上の利点も得られる。
コラーゲン層が、上皮を除去した羊膜を原材料としたものであることは、コラーゲン層に羊膜上皮層の細胞が含まれていないことを調べることによって確認できる。尚、羊膜としてヒト羊膜を用いることが特に好ましい。【００１７】
上述のように、本発明の角膜上皮シートは、角膜を損傷、欠損等した患者に対する移植材料（角膜上皮の代替）として用いることができるが、コラーゲン層を備える角膜上皮シートの場合、コラーゲン層が眼球側となるように角膜上皮欠損部に移植される。一方、コラーゲン層上に細胞層を形成した後、コラーゲン層を除去することによって得られる角膜上皮シートの場合は通常、コラーゲン層が存在していた側が眼球側となるように角膜上皮欠損部に移植される。
移植の際には、手術用縫合糸を用いて移植片を周囲の組織と固定し、生着を促すことが好ましい。また、移植後、治療用コンタクトレンズで移植部表面を一時的に被覆して保護することが好ましい。【００１８】
本発明の角膜上皮シートは以下の方法（本発明の第２の局面）により作製することができる。本発明の第２の局面は角膜上皮シートの作製方法に関し、次のステップを含んで構成される。
a)自己細胞である第１細胞と、及び該第１細胞と由来が異なる第２細胞とをそれぞれ調製するステップ。
b)前記第１細胞及び前記第２細胞をコラーゲン層上に播種し、培養するステップ。
c)前記第１細胞及び前記第２細胞が増殖して細胞層が形成された後、該細胞層の最表層を空気に接触させるステップ。【００１９】
本発明の作製方法は二種類以上の細胞を共培養することを特徴の一つとする。後述の実施例（口腔粘膜上皮細胞と角膜上皮細胞とを共培養）に示されるように、このような特徴を備える方法によれば、良好な細胞増殖及びそれに伴う迅速な細胞層の形成が認められた。このように、二種類以上の細胞を共培養することによって、細胞層の形成をより短時間で行えるという効果も奏される。【００２０】
第１細胞としては、口腔粘膜上皮細胞、結膜上皮細胞、鼻腔粘膜上皮細胞、又はその他の粘膜上皮細胞、或いはこれらいずれかの粘膜上皮を構築可能な未分化細胞が好適に用いられる。他方第２細胞としては、角膜上皮細胞、結膜上皮細胞、又は羊膜上皮細胞が好適に用いられる。これらの細胞は、それが存在する生体組織より採取される。具体的には例えば、目的の細胞が存在する組織の一部をメスなどで採取した後、結合組織の除去、細胞の分離等の処理を経て細胞浮遊液（懸濁液）の形態に調製する。尚、第１細胞として異なる二種以上の細胞を用いてもよい。第２細胞についても同様に、異なる二種以上の細胞を用いてもよい。【００２１】
第１細胞の採取源として好適な口腔粘膜上皮には幹細胞の存在が示唆されており、上皮細胞層を形成する細胞へと分化誘導を行い易いと考えられる。また、口腔粘膜上皮細胞を用いることは、採取が容易なこと、多量の細胞を採取可能なこと、更には両眼性の患者を処置する場合においても自己の細胞を用いて移植材料を調製できること等の利点を有する。特に、角膜上皮細胞を採取不可能な患者に対して、自己の細胞由来の移植材料を適用できるという利点は、臨床上極めて重要な拒絶反応の問題を大幅に解消するものと期待される。
口腔粘膜上皮細胞としては歯根部に存在する細胞（口腔内縁粘膜上皮細胞）、口唇部の細胞、口蓋部の細胞、頬部の細胞などが用いられる。中でも口腔内縁粘膜上皮細胞はその増殖能が高く、また抗原性が低いことから、これを用いることが特に好ましい。口腔粘膜上皮細胞は、目的とする細胞が存在する場所をメスなどで切除したり、掻爬したりすることにより採取することができる。口腔内縁粘膜上皮細胞にあっては、抜歯に付着している口腔粘膜上皮をエナメルセメント移行部より分離し、これより採取することができる。尚、結合組織などの不純物を除去するために、ディスパーゼやトリプシンなどの酵素による処理や、フィルター処理を施すことが好ましい。
本発明によって作製される角膜上皮シートを移植する予定の患者以外の口腔より採取した口腔粘膜上皮細胞を用いることもできるが、免疫拒絶反応を考慮すれば、患者自身の口腔より口腔粘膜上皮細胞を採取し、培養に供することが好ましい。
口腔粘膜は増殖能が高く、通常、術後数日間の抗生剤内服、イソジン消毒等で創傷治癒するため、粘膜採取による患者自身の侵襲は軽度であると思われる。【００２２】
一方、第２細胞としては、他人（アロ）の角膜上皮細胞を好適に利用できる。このような角膜上皮細胞は例えば、感染症フリーのドナー眼球をアイバンク（Northwest eye bank等）より入手することができる。第２細胞として使用可能な細胞は角膜上皮細胞に限られず、結膜上皮細胞、羊膜上皮細胞等を用いてもよい。但し、生体における角膜上皮を構成する細胞である角膜上皮細胞、又はその近隣に存在する結膜上皮細胞を採用すれば、角膜上皮の特性をより良好に再現する角膜上皮シートを構築できると考えられる。後述の実施例に示されるように第２細胞として角膜上皮細胞を使用した場合には、角膜上皮に近似した細胞層を構築できることが確認された。この事実は、上記の予想を支持するものであるとともに、第２細胞として角膜上皮細胞が特に好適であることを裏付けるものである。一方、後述の実施例に示されるように、第２細胞として羊膜上皮細胞を用いた場合にも、角膜として求められる特性を良好に再現した細胞層を形成できることが確認された。この事実は、第２細胞として羊膜上皮細胞も好適に使用できることを示すものである。【００２３】
第２細胞として自己の細胞を用いることもできるが、他人の細胞を用いることにすれば細胞をより容易に入手することができる。例えば、両眼性の患者の治療用に角膜上皮シートを作製する場合においても、第２細胞としての角膜上皮細胞を入手可能となる。【００２４】
それぞれ調製された第１細胞と第２細胞（以下、これらをまとめて「第１細胞等」ともいう）はコラーゲン層上に播種され、培養に供される（ステップb）。通常、細胞浮遊液の形態に調製された第１細胞と第２細胞とをそれぞれコラーゲン層上に滴下し、培養を実施する。
典型的には、第１細胞の播種と第２細胞の播種とを同時（ここでの「同時」は、文字通りの同時は勿論のこと、片方の播種の後に実質的な時間的間隔を置かずに他方を播種する場合を含む）に実施するが、例えば、第１細胞の播種後、数分〜数時間経過した時点で第２細胞を播種する等、両者を異なるタイミングで播種してもよい。このように播種の時期をずらすことによって例えば、第１細胞に由来する細胞に富む領域が局在している細胞層を構築するなど、細胞層の構成及びそれに伴う特性を変化ないし調整することが可能となる。【００２５】
播種される第１細胞等の比率は特に限定されないが、典型的には、およそ同数の第１細胞と第２細胞が播種されるようにする。尚、第１細胞として口腔粘膜上皮細胞を、第２細胞として角膜上皮細胞を用いた実験において、第１細胞の数：第２細胞の数が３：７の場合、５：５の場合、及び７：３の場合を比較したところ、細胞の増殖の点及び重層化の点についてこれらの間に明確な差異は認められなかった（データ示さず）。【００２６】
ここで、コラーゲン層の原材料となるコラーゲンの種類は特に限定されず、Ｉ型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲンなどを用いることができる。複数の種類のコラーゲンが混在するものを用いることもできる。これらのコラーゲンは、ブタ、ウシ、ヒツジなどの動物の皮膚、軟骨などの結合組織から、酸可溶化法、アルカリ可溶化法、酵素可溶化法などにより抽出、精製することができる。尚、抗原性を低下させる目的から、ペプシンやトリプシンなどの分解酵素で処理することによりテロペプチドを除去した、いわゆるアテロコラーゲンとしたものを用いることが好ましい。
コラーゲン層として、羊膜由来、特にヒト羊膜由来のものを用いることが特に好ましい。ここで、羊膜由来とは、広く羊膜を出発原料として得られたものであることを意味する。ヒト羊膜は子宮と胎盤の最表層を覆う膜であって、コラーゲンに富む実質組織上に基底膜、上皮層が形成されて構成される。ヒト羊膜は、例えば分娩時に後産として得られるヒト胎仔膜、胎盤などから採取することができる。具体的には、分娩直後に得られるヒト胎仔膜、胎盤及び臍帯からなる一体物を処理、精製することによりヒト羊膜を調製することができる。処理、精製方法は、特開平５−５６９８号に記載される方法などの公知の方法を採用できる。すなわち、分娩時に得られる胎仔膜より羊膜を剥離し、超音波洗浄等の物理的処理及び酵素処理などにより残存組織を除去し、適宜洗浄工程を経てヒト羊膜を調製することができる。
このように調製したヒト羊膜は、使用時まで凍結して保存しておくことができる。ヒト羊膜の凍結は、例えば-80℃、DMEM（Dulbecco's modified Eagle's medium）とグリセロールとを体積比で等量混合した液中で行うことができる。凍結保存することにより操作性が向上することは勿論のこと、抗原性が低下することも期待できる。
羊膜をそのままコラーゲン層として利用することもできるが、羊膜から掻爬処理などによって上皮を除去したものを利用することが好ましい。例えば、上記のように凍結保存したヒト羊膜を解凍した後、EDTAやタンパク分解酵素で処理して細胞間の接着を緩め、そしてセルスクレイパーなどを用いて上皮を掻爬することにより、上皮が除去されたヒト羊膜を調製することができる。【００２７】
コラーゲン層として上皮を除去したヒト羊膜を利用する場合には、上皮を除去して表出した面側（即ち、基底膜側）に第１細胞等を播種することが好ましい。この面側には、IV型コラーゲンがリッチに含まれており、播種された第１細胞等の増殖、重層化が良好に行われると考えられるからである。
第１細胞及び第２細胞をそれぞれ、例えば細胞密度が約1×103個／cm2以上、好ましくは約1×103個／cm2〜約1×105個／cm2、更に好ましくは約1×104個／cm2〜約1×105個／cm2となるようにコラーゲン層上に播種することができる。【００２８】
第１細胞等の培養を支持細胞の存在下で行うことが好ましい。支持細胞とは、feeder細胞とも呼ばれ培養液中に成長因子等などを供給する。支持細胞との共存下で培養することにより、細胞の増殖効率が向上する。支持細胞には、例えば3T3細胞（スイスマウス3T3細胞、マウスNIH3T3細胞、3T3J2細胞など）などを用いることができる。中でも、増殖効率、取り扱いの容易さなどの観点からマウスNIH3T3細胞を支持細胞として用いることが好ましい。
支持細胞を予めマイトマイシンCなどを用いて不活性化しておくことが好ましい。支持細胞自体が増殖することによって第１細胞等の増殖が阻害されることを防止し、第１細胞等の増殖効率を上昇させるためである。このような不活性化は、放射線処理などによっても行うことができる。【００２９】
支持細胞の細胞密度は、例えば約1×102個／cm2以上、好ましくは約1×102個／cm2〜約1×107個／cm2、更に好ましくは約1×103個／cm2〜約1×105個／cm2とすることができる。第１細胞等との対比でいえば、使用する支持細胞数を、例えば第１細胞と第２細胞の合計数に対して1／103倍〜1×102倍、好ましくは1／102〜１倍となるような条件で培養を行うことができる。支持細胞数が少ないと第１細胞等の増殖率が低下し、少なすぎる場合には良好な第１細胞等の増殖及び重層化が得られない。一方、支持細胞数が多すぎる場合には、かえって第１細胞等の増殖率を低下させることとなり好ましくない。【００３０】
第１細胞等の培養を支持細胞の共存下で行う場合には、支持細胞とコラーゲン層との間に支持細胞が通過できないポアサイズの隔離膜を存在させることが好ましい。この隔離膜の利用によって、培養時にコラーゲン層側（即ち、第１細胞等側）に支持細胞が侵入することを防止できる。その結果、最終的に得られる角膜上皮シート内に支持細胞が混在するおそれが無くなる。このことは、支持細胞による免疫拒絶の問題のない角膜上皮シートの作製が可能になることを意味し、臨床上極めて有意義である。
隔離膜としては、支持細胞が通過できないポアサイズを有する公知のものを適宜選択して使用することができる。例えば、ポリカーボネート製、ポアサイズが約0.4μｍ〜3.0μｍの膜を用いることができる。隔離膜の材質は特に限定されず、ポリカーボネートの他、ポリエステルなどであってもよい。このような隔離膜は市販されており、容易に入手することができる。
隔離膜を用いた場合の培養方法の例として以下の方法を挙げることができる。まず、シャーレ等の容器（第１の容器）に不活性化した支持細胞を播種して培養することにより、容器表面に支持細胞層を形成させる。次に、隔離膜で底面を形成した第２の容器を、第１の容器内に設置する。この際、第２の容器の底面が培養液中となるように第２の容器の位置を調整する。続いて、第２の容器の底面、即ち隔離膜上にコラーゲン層を形成する。そして、コラーゲン層上に第１細胞等を播種し、培養する。
第２の容器の底面に予めコラーゲン層を形成しておき（例えば、第２の容器の底面に上皮を除去した羊膜をのせる。この状態で一旦乾燥処理を行ってもよい。）、この第２の容器を、支持細胞を播種した第１の容器内に設置し、そしてコラーゲン層上に第１細胞等を播種し、培養を行ってもよい。【００３１】
第１細胞等を培養する際に用いられる培養液は、当該細胞を増殖させ、重層化できるものであれば特に限定されない。例えば、上皮細胞の成長に通常用いられるDMEM（Dulbecco's modified Eagle's medium）とハムF12培地（Ham's F12 medium）とを所定割合で混ぜ、FBS、成長因子、抗生物質等を添加した培地を使用することができる。具体例としては、FBS（10%）、インシュリン（5 mg/ml）、コレラトキシン（0.1 nM）、上皮細胞増殖因子（EGF）（10 ng/ml）、及びペニシリン−ストレプトマイシン（50 IU/ml）を添加した、DMEMとハムF12培地の混合培地（混合体積比１：１）が挙げられる。また、トリヨードサイロニン（例えば、2 nM）、グルタミン（例えば、4 mM）、トランスフェリン（例えば、5 mg/ml）、アデニン（例えば、0.18 mM）、及び／又はハイドロコルチゾン（例えば、0.4 mg/ml）を更に添加したDMEM／ハムF12混合培地を用いることもできる。【００３２】
コラーゲン層上で第１細胞及び第２細胞を培養することによって、これらの細胞が増殖して細胞層を形成する（この過程において少なくとも一部の細胞が分化すると考えられる）。細胞層が形成された後、当該細胞層の表層を空気に接触させるステップ（ステップc）を実施する。尚、このステップを本明細書においてエアーリフティング（Air-lifting）とも呼ぶ。このステップcは、細胞層を形成する細胞の分化、及びバリア機能の誘導のために行われる。
このステップは、培養液の一部をスポイト、ピペットなどを用いて一時的に除去することにより培養液表面を低下させ、これにより細胞層の最表層を一時的に培養液外に露出させることによって行うことができる。又は、細胞層をコラーゲン層ごと持ち上げて、最表層を培養液表面から一時的に露出させることにより行うこともできる。更には、チューブなどを用いて空気を培養液中に送り込み、細胞層の最上層に空気を接触させてもよい。操作の容易さの観点から、培養液表面を低下させて細胞層の最表層を露出させる方法により行うことが好ましい。
ステップcを行う時間、即ち重層化した細胞層の最表層を空気に接触させる時間は、細胞の状態や培養条件などによって変動するが、例えば３日〜２週間程度であり、好ましくは１週間以内、更に好ましくは３日以内である。
以上の本発明の方法により、コラーゲン層上において、第１細胞等が重層化した角膜上皮様の細胞層が形成される。このようにして得られた角膜上皮シートは、第１細胞等のの培養基質として用いられるコラーゲン層とともに、角膜を損傷、欠損等した患者に対する移植材料（角膜上皮の代替）として用いることができる。この場合、コラーゲン層が眼球側となるように角膜上皮欠損部に移植される。移植の際には、手術用縫合糸を用いて移植片を周囲の組織と固定し、生着を促すことが好ましい。また、移植後、治療用コンタクトレンズで移植部表面を一時的に被覆して保護することが好ましい。
尚、コラーゲン層の一部除去したもの、又は全部を除去したものを移植片として用いることもできる。このコラーゲン層の除去は、EDTA等による化学処理、タンパク分解酵素等による酵素処理、ピンセット等による掻爬などの物理的処理を適宜組み合わせて行うことができる。【００３３】
具体的な移植術の一例を以下に示す。まず、角結膜疾患患者の角膜輪部で瘢痕組織を切開する。続いて、角膜上に侵入した瘢痕結膜組織を切除して角膜実質を露出した後、輪部よりもやや内側で角膜上皮シートを縫着する。手術手技は原則、本発明者らの所属機関において既に７０例以上の臨床応用実績がある移植術（角膜上皮細胞を培養して得られた角膜上皮シートや、口腔粘膜上皮細胞を培養して得られた角膜上皮シートに関する移植術）と同様であり、その手法は極めて安定して施行できると思われる。
以下、本発明の実施例（実験例を含む）を説明する。
【実施例１】
【００３４】
＜ハイブリッド型角膜上皮シートの作製及び評価＞
１−１．羊膜の採取
羊膜は、全身的合併症のない帝王切開予定の妊婦に対して事前に産婦人科医とともに十分なインフォームドコンセントを行った後、手術室で帝王切開時に採取した。操作は清潔に気をつけ、手術操作に準じて手洗いの後に専用ガウンを装用した。分娩前に清潔な羊膜採取用のバットと洗浄用の生理食塩水を準備した。分娩後に胎盤組織をバットに移し、用手的に羊膜組織を胎盤より剥離した。羊膜と胎盤との癒着が強い部分はハサミで切除した。【００３５】
１−２．羊膜の処理
羊膜処理の過程は（１）洗浄、（２）トリミング、（３）保存の順で行った。すべての過程において、操作は清潔なドラフト内で行うのが望ましく、使用する容器や器具もすべて滅菌されたものを使用し、シャーレ等は滅菌された使い捨て（ディスポーザブル）タイプのものを使用した。採取した羊膜に付着した血液成分を生理食塩水にて洗浄しながら除去し、さらに十分量の生理食塩水（0.005% ofloxacin添加）にて洗浄した。次に羊膜をシャーレ内のリン酸緩衝液（PBS）に移し、ハサミを用いて約4×3cm程度のサイズに分割した。分割後さらに数個のシャーレに保存液を浸し、その中で状態のよい羊膜を選別した。【００３６】
１−３．羊膜の保存
2ccの滅菌クライオチューブに1ccずつ保存液を入れ、そこに採取、洗浄して選別された羊膜を１枚ずついれラベルした後、-80℃の冷蔵庫に保存した。保存液には50％滅菌済みグリセロール in DMEM (Dulbecco’S Modofied Eagle Medium: GIBCOBRL社)を使用した。保存された羊膜の使用期限は３ヶ月とし、期限が過ぎれば焼却処分した。【００３７】
１−４．羊膜上皮の処理
羊膜はその上皮を処理した後、培養に使用した。まず、-80℃で保存していた羊膜を室温で解凍した後、シャーレ内の滅菌済みリン酸緩衝液（PBS）で十分に洗浄した。洗浄後0.02％EDTA溶液 (Nacalai tesque社)に2時間37℃で保存した後、cell scraper (Nunc社 USA)を用いて機械的に上皮を掻爬し、培養の基質として使用した。尚、この処理方法によって、１層の羊膜上皮が完全に掻爬されたことを光学的及び電子顕微鏡的操作（走査型電子顕微鏡）において確認した。【００３８】
１−５．口腔粘膜上皮細胞の回収
６週令の日本白色家兎を抜歯後、歯に付着されている口腔粘膜上皮をエナメルセメント移行部より丁寧に分離した。尚、一連の操作は、滅菌済みの器具を使用してできるだけ滅菌的に行った。
採取した口腔粘膜上皮を50 IU/mlのペニシリンストレプトマイシン、ゲンタシンを含有するリン酸緩衝液（PBS）に30分、室温の条件で2回浸漬した。その後、組織を1.2 Uディスパーゼ(Nacalai tesque社)を含有するリン酸緩衝液（PBS）に1時間、37℃の条件で浸漬し、続いて0.05％トリプシン−EDTA溶液 (GIBCOBRL社)で30分間、浸漬処理して細胞を分離した。酵素活性は10％ウシ胎児血清(FBS)を含有するDMEMに浸漬させることにより停止させた。その後、60μmのcell filterで余分な組織を除去し、口腔粘膜上皮細胞（口腔内縁粘膜上皮細胞）を単離した（口腔粘膜上皮細胞浮遊液）。【００３９】
１−６．角膜上皮細胞の回収
６週令の日本白色家兎（口腔粘膜上皮細胞の採取を行った個体とは異なるもの）の角膜輪部より手術用メスを用いて約5×10mmの角膜輪部組織片を採取した。
採取した組織片を50 IU/mlのペニシリンストレプトマイシン、ゲンタシンを含有するリン酸緩衝液（PBS）に30分、室温の条件で2回浸漬した。その後、組織を1.2 Uディスパーゼ(Nacalai tesque社)を含有するリン酸緩衝液（PBS）に1時間、37℃の条件で浸漬し、続いて0.05％トリプシン−EDTA溶液 (GIBCOBRL社)で１５分間、浸漬処理して細胞を分離した。酵素活性は10％ウシ胎児血清(FBS)を含有するDMEMに浸漬させることにより停止させた。その後、60μmのcell filterで余分な組織を除去し、角膜上皮細胞を単離した（角膜上皮細胞浮遊液）。【００４０】
１−７．共培養細胞の調製
共培養の細胞（支持細胞）として、NIH-3T3細胞（以下、「3T3細胞」と略称する）を使用した。事前に培養して75Fフラスコ(BD Falcon社)でコンフレントになった3T3細胞を0.05％マイトマイシンＣ溶液に2時間浸漬させ、3T3の増殖活性を抑えた。続いてリン酸緩衝液（PBS）で数回洗浄してマイトマイシンＣを除去した後、0.05％トリプシン−EDTA溶液で処理することにより、3T3細胞浮遊液を調製した。【００４１】
１−８．細胞培養及び粘膜上皮の誘導
上皮を掻爬したヒト羊膜を基質として、口腔粘膜上皮細胞及び角膜上皮細胞を、上記処理を施した3T3細胞と以下の手順で共培養した。培養器具としては6wellのculture dish（培養皿）（Corning社, NY）とculture insert（培養挿入容器）（ポリカーボネート製、平均ポアサイズ3.0μm、Corning社, NY）を用いた。
まず、culture dish上に約1×104個／cm2の細胞密度となるように3T3細胞浮遊液を播種し、37℃、5％CO2の条件下で培養した。また、culture insert上に掻爬した上皮側を上にして羊膜基質を静置して貼り付け、室温で10分乾燥させた。その後、羊膜を貼り付けたculture insert上にそれぞれ約1×10４個／cm2の細胞密度となるように口腔粘膜上皮細胞浮遊液及び角膜上皮細胞浮遊液を播種した。
以上の操作後、図１に示すように、culture insertをculture dish内に設置し、3T3細胞、口腔粘膜上皮細胞及び角膜上皮細胞を同じ培地中で培養した。尚、図１は培養中の状態を示した模式断面図である。culture dish１内にculture insert２が静置され、culture dish１底面には3T3細胞層５が形成される。また、culture insert２の底面上に羊膜３が静置され、その上に口腔粘膜上皮細胞及び角膜上皮細胞４が培養される状態が示される。符号６は培地である。
培地には、DMEM/ハムF12混合培地（混合体積比１：１）に、10％FBS、インシュリン(5 mg/ml)、コレラトキシン(0.1nM)、ペニシリンストレプトマイシン(50 IU/ml)、ヒトリコンビナント上皮細胞増殖因子(EGF)(10 ng/ml)を添加したものを使用した。
上記の培地中で約７日間培養した(Submerge)。その後、粘膜上皮を分化誘導すべく、いわゆるAir-lifting法を用いて約３日間培養した。Air-lifting法とは、培地の液面を、羊膜上に形成された細胞層面までにし、当該細胞層の表面を空気中に暴露する方法である。Submerge中は隔日で培地を交換し、air-lifting後は毎日培地交換して培養を行った。
以上の方法で培養することによって、約１０日間（Air-lifting法による３日間の培養を含む）で５〜６層の重層化した細胞層を形成した。【００４２】
１−９．細胞層を構成する細胞の特定
以上の方法で得られる、羊膜上の細胞層が、口腔粘膜上皮細胞と角膜上皮細胞とがハイブリッド化して形成されていることを以下の手順で確認した。まず、羊膜上に播種する前の口腔粘膜上皮細胞浮遊液にDil色素を添加し、室温で約１５分放置した（Dilラベル）。これによって得られたラベル化口腔粘膜上皮細胞を角膜上皮細胞とともに、上皮を除去した羊膜上に播種した。その後、上記と同様の条件で培養した。培養開始後１日、３日、及び７日経過した時点において、形成された細胞層を光学顕微鏡及び蛍光顕微鏡で観察した。その結果を図２（培養１日）、図３（培養３日）、及び図４（培養７日）に示す。各図において左欄に学顕微鏡像を、右欄に蛍光顕微鏡像をそれぞれ示した。培養１日目において細胞が良好に増殖している様子がわかる（図２左）。また、Dilシグナルが点在して認められ（図２右）、口腔粘膜上皮細胞と角膜上皮細胞が混在した状態であることがわかる。培養３日目には細胞が規則正しく整列している状態が観察される（図３左）。また、Dilシグナルが依然として点在して認められ（図３右）、二種類の細胞（口腔粘膜上皮細胞と角膜上皮細胞）がハイブリッド化した状態で増殖して細胞層を形成していることを確認できる。培養７日目においても培養３日目と同様に良好な細胞増殖、及び細胞のハイブリッド化が認められる（図４）。また、細胞の増殖及び重層化に伴い、Dilシグナルが認められる領域が増加している（図４右）。【００４３】
１−１０．細胞層の組織学的特性の評価
上記の方法（１−１．〜１−８．）によって最終的に得られた細胞層を光学顕微鏡で観察した。その結果、細胞層の基底側（羊膜側）には比較的円柱形をした基底細胞類似の細胞群が存在していた。また、最表層の細胞は扁平型を呈していたが核を有しており、皮膚とは異なりその表面は角化していないことが確認された。以上より、光学的顕微鏡観察では羊膜上に角膜類似の上皮層（角膜上皮シート）が形成されていることが示された。【００４４】
次に、細胞層の組織学的特性を検討するために免疫染色を行った。まず、得られた細胞層を羊膜とともに適切な大きさに切除してOCT compoundに凍結包埋した。その後クライオスタットにて薄切りし、スライド切片を作製した。免疫染色にあたっては、代表的な細胞骨格蛋白であるケラチン関連の検討を行った。すなわち、表皮に特異的なケラチン１／１０、角膜特異的なケラチン３／１２、及び粘膜特異的なケラチン４／１３を検討した。方法は以下のとおりである。スライド切片をリン酸緩衝液（PBS）で洗浄した後、1％ウシ胎仔血清（FBS）でブロッキングを行い非特異的な抗体反応を抑制した。その後、各ケラチンに対する抗体（１次抗体）を室温で1時間反応させた。反応後triton-X含有のPBSにて15分、3回の条件で洗浄し、続いて蛍光標識化抗体（２次抗体）を室温で1時間反応させた。反応後、リン酸緩衝液（PBS）にて15分、3回の条件で洗浄し、封入した後コンフォーカルマイクロスコープにて組織を観察した。
細胞層に対する各種ケラチンの抗体反応は以下の通りである。まず、表皮特異的ケラチン１及び１０に対する染色性はいずれも認められなかった（図５左）。一方、角膜特異的ケラチン３に対する染色性が広範囲に亘って認められた（図５中央上）。ケラチン３は角膜上皮細胞及び口腔粘膜上皮に認められるものであり、培養条件下でもその性質が保持されていると考えられた。尚、ケラチン３に対する染色性は細胞層の上部において強い。ケラチン１２に対する染色性も広範囲に認められた（図５中央下）。特に細胞層の上部において強い染色性が観察された。この染色性は、使用した角膜上皮細胞によるものであると考えられ、培養後もその性質が保持されていることを示唆する。
粘膜特異的ケラチン４および１３に対してもほぼ全体に亘って染色性が認められた（図５右）。
以上の結果から、形成された細胞層の組織学的性質としては、細胞骨格の面からは、角膜特異的なケラチン（ケラチン３及び１２）を保持し、生体における角膜上皮に近似している。また、表皮のように角化の方向へ分化しているのではなく、非角化型の粘膜上皮としての性質を持ちながら、角膜特異的なケラチンも同時に保持していることがわかった。【００４５】
１−１１．移植実験
上記方法（１−１．〜１−８．）に従って、羊膜上に細胞層が形成されてなるシート（以下、「角膜上皮シート」という）を作製した。具体的にはまず、６週令日本白色家兎より口腔粘膜上皮細胞（自己細胞）を調製するとともに、異なる個体（６週令日本白色家兎）より角膜上皮細胞（他家角膜上皮細胞）を調製した。その後、上皮を除去した羊膜上に両細胞を播種し、次いで培養し、角膜上皮シートを得た。
一方、口腔粘膜上皮細胞の採取を行った家兎に対し、輪部より4mm外側からクレセントナイフを用いて角膜および結膜上皮を100μmの厚さですべて除去した。この操作により角膜上皮幹細胞を含む上皮細胞が存在しなくなるため、人為的な眼表面幹細胞疲弊症が再現されると考えることができる。次に、前述の角膜上皮シートを輪部よりやや内側の領域に移植した。移植の際には１０−０ナイロン糸を用いて周囲の組織に縫合した。移植後、移植片の上に治療用ソフトコンタクトレンズを縫着した。術後、抗生剤およびステロイド眼軟膏を２回／日塗布した。移植後の時点で、眼表面は、移植前の角膜上皮移植用シートと同様の透明性を示していた（結果を図示せず）。【００４６】
移植術を施した眼表面を移植後２日、１週、及び２週に観察した。併せて、フルオレセイン染色試験を実施した。尚、フルオレセイン染色試験は、フルオレセイン試験紙に抗生剤の点眼などの水分を含ませて直接眼表面に塗布し、２、３度瞬目をさせた後、眼表面のフルオレセイン染色性を観察することにより行った。角膜上皮が残存していると、そのタイトな細胞間接着構造によってフルオレセイン色素は浸潤せず、フルオレセインによる染色が見られない。
移植後２日において、移植片（角膜上皮シート）は透明性を維持していた（図６左）。またフルオレセイン染色によって、角膜上皮シートが眼表面に欠損なく残存していることが確認された（図６右）。一方、移植片（角膜上皮シート）がフルオレセイン染色性を示さないことにより、角膜上皮シートが角膜上皮同様のバリア機能を備えていることが確認された。さらに、移植片の周囲では全周に渡ってフルオレセインの染色性が認められ、移植部に存在する組織が周囲の残存結膜上皮のコンタミネーションではないことが確認された。
尚、通常の角膜上皮では細胞同士がタイトな接着構造で結合しているため、その表面よりフルオレセインの色素が浸潤しない。即ち、フルオレセイン染色試験において染色性を示さない。一方、細胞間の接着が緩んだり、細胞自体が剥離してバリア機能が障害されたときには、フルオレセイン色素の浸潤が生じて組織を染色する。したがって、フルオレセイン染色による染色性を調べることにより、移植した角膜上皮シートが角膜上皮同様のバリア機能を備えるか否かを確認できる。【００４７】
一方、移植後１週においても移植片（角膜上皮シート）は眼表面に残存しており、しかも移植後２日の状態と比較して周囲へ伸展していることが確認された（図７左）。また、移植片はフルオレセイン染色性を示さず、角膜上皮に必要とされるバリア機能を維持していることが確認された（図７右）。透明性についても移植後２日の時点と変わらず、依然として高い透明性が維持されていた（図７左）。
移植後２週の眼表面の状態は、移植後１週と比較して特に変化がなかった。即ち、移植片（角膜上皮シート）が眼表面に残存し、その透明性は高いものであった（図８左）。また、移植片はフルオレセイン染色性を示さず（図８右）、バリア機能も維持されていることが確認された。【００４８】
以上の結果から、上記方法で得られる角膜上皮シートは、眼表面への良好な生着性を備え、それは長期に亘って維持されることが実証された。また、移植後に周囲に伸展するとともに、角膜上皮として必要なバリア機能を長期間に亘って発揮し、併せて高い透明性を維持することも確認された。即ち、上記方法で得られる角膜上皮シートは角膜上皮の代替として良好に機能するものであり、角膜の損傷、欠損などの場合に眼表面を再建するための移植材料として好適に利用できるものであることが証明された。【００４９】
１−１２．移植後の角膜上皮シートの組織学的特性評価
次に、移植後２週の角膜上皮シートを摘出し、その組織学的特性を検討した。図９に角膜上皮シートのHE染色像を示す（右は拡大図）。羊膜（記号＊）の上に、角膜上皮と同様、細胞が規則正しく整列して構成された細胞層を確認できる。この細胞層は上層ほど扁平形状の細胞が多く、角膜上皮に極めて近似した構造を維持している。
図１０に、各種ケラチンに対する染色試験の結果を示す。概ね、移植前の角膜上皮シートと同様の染色性を示した。即ち、表皮特異的ケラチン１及び１０対する染色性は認められず（図１０左）、角膜特異的ケラチン３及び１２に対する染色性が認められ（図１０中央）、また、粘膜特異的ケラチン４および１３に対しても染色性が認められた（図１０右）。以上のように、角膜上皮シートは移植後においても、角膜上皮特異的なケラチン（ケラチン３及び１２）を維持していることが確認された。この結果は、角膜上皮シートが角膜上皮と同様の機能を長期に亘って発揮するであろうことを組織学的見地から強く支持するものである。
【実施例２】
【００５０】
＜ヒト細胞を用いたハイブリッド型角膜上皮シートの作製及び評価＞
上記１−５．（口腔粘膜上皮細胞の回収）に記載した方法と同様にして同意を得た後、健常ボランティアからヒト口腔粘膜上細胞浮遊液を調製した。一方、アイバンク（Northwest eye bank）より入手した角膜を、上記１−６．（角膜上皮細胞の回収）に記載したのと同様の方法で処理し、ヒト角膜上皮細胞浮遊液を得た。このように調製したヒト口腔粘膜上皮細胞及びヒト角膜上皮細胞を、上皮を掻爬したヒト羊膜を基質として3T3細胞と共培養したところ約１４日間の培養（Air-lifting法による３日間の培養を含む）によって、角膜上皮様の細胞層が形成された。尚、上皮を掻爬したヒト羊膜の調製方法、及び3T3との共培養条件については上記１−１．（羊膜の採取）〜１−４．（羊膜上皮の処理）に記載した通りとした。
得られた細胞層の形態、組織、免疫染色等を調べた結果、家兎動物モデと同様であった。すなわち、作成されたハイブリッド型培養細胞層は４〜８層の重層化した細胞層を形成しており、表皮特異的ケラチン１及び１０対する染色性は認められず、角膜特異的ケラチン３及び１２に対する染色性が認められ、また、粘膜特異的ケラチン４および１３に対しても染色性が認められた。
以上の結果から、ヒト口腔粘膜上皮細胞とヒト角膜上皮細胞とを用いた場合においても、これらがハイブリッド化することによって角膜上皮様の細胞層を形成できることが確認された。
【実施例３】
【００５１】
＜羊膜上皮細胞を用いたハイブリッド型角膜上皮シートの作製及び評価＞
上記１−５．（口腔粘膜上皮細胞の回収）に記載した方法と同様にして同意を得た後、健常ボランティアからヒト口腔粘膜上細胞浮遊液を調製した。一方、上記１−１．（羊膜の採取）及び１−２．（羊膜の処理）に記載した方法に従ってヒト羊膜を得た。その後、0.05％トリプシン−EDTA溶液 (GIBCOBRL社)で１５分間の処理によって上皮細胞を分離した（ヒト羊膜上皮細胞浮遊液）。このように調製したヒト口腔粘膜上皮細胞及びヒト羊膜上皮細胞を、上皮を掻爬したヒト羊膜を基質として3T3細胞と共培養したところ約１４日間の培養（Air-lifting法による  ３日間の培養を含む）によって、角膜上皮様の細胞層が形成された。尚、上皮を掻爬したヒト羊膜の調製方法、及び3T3との共培養条件については上記１−１．（羊膜の採取）〜１−４．（羊膜上皮の処理）に記載した通りとした。
得られた細胞層の形態、組織、免疫染色等を調べた結果、作成されたハイブリッド型培養細胞層は４〜８層の重層化した細胞層を形成し、表皮特異的ケラチン１及び１０対する染色性は認められず、角膜特異的ケラチン３及び１２に対する染色性が認められ、また、粘膜特異的ケラチン４および１３に対しても染色性が認められた。
以上の結果から、ヒト口腔粘膜上皮細胞とヒト羊膜上皮細胞とを用いた場合においても、これらがハイブリッド化することによって角膜上皮様の細胞層を形成できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明の角膜上皮シートは、角膜上皮に極めて類似する構造を有し、移植後の生着が良好である。また、角膜上皮がその機能を発揮するために必要なバリア機能も備え、また透明度も高い。このように、本発明により提供される角膜上皮シートは、角膜上皮を再建するための移植材料として極めて優れたものである。
難治性角結膜疾患に対する外科的再建術は近年飛躍的に進歩し、羊膜移植、培養角膜移植術の登場により、その手法はほぼ確立している。しかし難治性角結膜疾患の大部分が両眼性の疾患であることから他人（アロ）の組織移植であり、術後長期にわたり免疫抑制剤の投与による拒絶反応抑制や、細菌感染予防の術後管理を厳密に行わなければならず、患者のクオリティー・オブ・ライフ(QOL)を著しく低下させているのが現状である。本発明のハイブリッド型角膜上皮シートを用いた移植術は、自己（オート）の細胞を含んだ組織による眼表面再建術となり、術後の免疫抑制剤の投与は限定的となり、また自己組織を含むためその生着率も従来のアロ移植より良好であると考えられ、患者のQOLを著しく向上させると思われる。【００５３】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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