(57)【要約】  本発明は、ゲノム上のＤＮＡのメチル化の状態を定量的に評価する方法に関する。本発明による方法によれば、目的のヌクレオチド残基のメチル化によってゲノム上の特定の切断点における切断作用が阻害される制限酵素を用いてゲノムＤＮＡを消化し、得られた消化産物を鋳型として、ゲノム上の前記切断点を含む領域を増幅しうるプライマーを用いる核酸増幅反応を行ない、これにより得られる増幅産物の量を、前記切断点を含まない近位の領域を増幅しうるプライマーによる増幅産物の量と比較することにより、前記ヌクレオチド残基のメチル化の状態が定量的に評価される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
制限酵素によるゲノムＤＮＡの切断を阻害する、ゲノム上のヌクレオチド残基のメチル化の状態を定量的に評価する方法であって、
（ａ）ゲノムＤＮＡを含むサンプル中のＤＮＡを、目的のヌクレオチド残基のメチル化によってゲノム上の標的切断部位における切断作用が阻害される少なくとも１種の制限酵素で消化し、かつ、ゲノム上の標的切断部位よりも５’側および３’側において前記ＤＮＡを切断する工程、
（ｂ）ゲノム上において、標的切断部位から５’側および３’側に向けて最も近位に位置する工程（ａ）による２つの切断点の間に存在し、かつ、標的切断部位を含むゲノム上の標的領域を増幅しうるプライマーを用いて、工程（ａ）によって得られる消化産物を鋳型とする核酸増幅反応を行ない、得られる増幅産物の量を測定する工程、
（ｃ）ゲノム上において、標的切断部位から５’側および３’側に向けて最も近位に位置する工程（ａ）による２つの切断点の間に存在し、かつ、標的切断部位を含まないゲノム上の対照領域を増幅しうるプライマーを用いて、工程（ａ）によって得られる消化産物を鋳型とする核酸増幅反応を行ない、得られる増幅産物の量を測定する工程、ならびに
（ｄ）工程（ｂ）によって得られる測定値と、工程（ｃ）によって得られる測定値とを比較する工程
を含んでなる、方法。
【請求項２】
目的のヌクレオチド残基が、前記制限酵素の認識配列中に含まれるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記制限酵素が、その認識配列に含まれるヌクレオチド残基のメチル化によって阻害されるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（ａ）が、ゲノムＤＮＡを含むサンプル中のＤＮＡを、標的切断部位よりも５’側および３’側においてゲノムＤＮＡを切断しうる制限酵素で消化することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）が、ゲノムＤＮＡを含むサンプル中のＤＮＡを、標的切断部位よりも５’側においてゲノムＤＮＡを切断しうる制限酵素、および標的切断部位よりも３’側においてゲノムＤＮＡを切断しうる制限酵素で消化することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｂ）および工程（ｃ）の一方または両方における核酸増幅反応が、リアルタイムＰＣＲである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｂ）および工程（ｃ）の一方または両方における増幅産物量の測定が、インターカレーターからのシグナル強度の測定によって行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｂ）および工程（ｃ）の一方または両方における増幅産物量の測定が、ＴａｑＭａｎプローブに起因する蛍光強度の測定によって行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｂ）によって得られる測定値を、工程（ｃ）によって得られる測定値で除して得られる値が、前記サンプルにおける目的のヌクレオチド残基のメチル化の量的な指標とされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
制限酵素によるゲノムＤＮＡの切断を阻害する、ゲノム上のヌクレオチド残基のメチル化の状態を定量的に評価するためのキットであって、
（ａ）目的のヌクレオチド残基のメチル化によってゲノム上の標的切断部位における切断作用が阻害される少なくとも１種の制限酵素、
（ｂ）ゲノム上の標的切断部位よりも５’側および３’側においてゲノムＤＮＡを切断しうる試薬、
（ｃ）ゲノム上において、標的切断部位から５’側および３’側に向けて最も近位に位置する前記制限酵素または前記試薬による２つの切断点の間に存在し、かつ、標的切断部位を含むゲノム上の標的領域を増幅しうるプライマー、ならびに
（ｄ）ゲノム上において、標的切断部位から５’側および３’側に向けて最も近位に位置する、前記制限酵素または前記試薬による２つの切断点の間に存在し、かつ、標的切断部位を含まないゲノム上の対照領域を増幅しうるプライマー
を含んでなる、キット。
【請求項１１】
目的のヌクレオチド残基が、前記制限酵素の認識配列中に含まれるものである、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記制限酵素が、その認識配列に含まれるヌクレオチド残基のメチル化によって阻害されるものである、請求項１０に記載のキット。
【請求項１３】
前記試薬が、標的切断部位よりも５’側および３’側においてゲノムＤＮＡを切断しうる制限酵素を含んでなるものである、請求項１０に記載のキット。
【請求項１４】
前記試薬が、標的切断部位よりも５’側においてゲノムＤＮＡを切断しうる制限酵素、および標的切断部位よりも３’側においてゲノムＤＮＡを切断しうる制限酵素を含んでなるものである、請求項１０に記載のキット。
【請求項１５】
前記（ｃ）および（ｄ）の一方または両方のプライマーによる核酸増幅反応において増幅産物の量に対応する強度のシグナルを発生するシグナル発生物質をさらに含んでなる、請求項１０に記載のキット。
【請求項１６】
前記シグナル発生物質がインターカレーターである、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記シグナル発生物質がＴａｑＭａｎプローブである、請求項１５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【０００１】
本特許出願は、先に出願された日本国における特許出願である特願２００４−１５４５５８号（出願日：２００４年５月２５日）に基づく優先権の主張を伴うものである。この先の特許出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
【発明の背景】
【０００２】
技術分野
本発明は、ＤＮＡのメチル化の状態を定量的に評価する方法に関する。
【０００３】
背景技術
ゲノムＤＮＡのメチル化は、エピジェネティックなゲノム修飾の一つである。このようなゲノムＤＮＡのメチル化は、高等生物にとって重要なゲノム調節因子（要素）として働くものと考えられており、例えば、組織特異的な遺伝子発現制御、クロマチン構造の維持、Ｘ染色体の不活性化、ゲノムインプリンティング等に関与することが知られている（En Li, Nat. Rev. Genet. 3, 662-673, 2002）。
【０００４】
ゲノムＤＮＡの異常なメチル化は、様々な疾患と関連することが知られており、特に、細胞の癌化と関連することがよく知られている（Esteller M. et al., J. Pathol. 196, 1-7, 2002）。最近では、ゲノムＤＮＡの異常なメチル化が精神疾患と関連している可能性も指摘されている（Popendikyte V. et al., Neuroreport. 10, 1249-1255, 1999；Chen Y. et al., Nucleic Acids Res. 30, 2930-2939, 2002）。
【０００５】
従って、ゲノムＤＮＡ上のメチル化ＤＮＡを定性的または定量的に評価することは、上述のゲノム調節機構の理解、ＤＮＡのメチル化と疾患との新たな関連の調査等において、極めて有用である。
【０００６】
現在までに、ゲノム上のメチル化ＤＮＡを検出するための様々な方法が開発されている。このような方法としては、例えば、ＤＮＡを重亜硫酸塩（bisulfite）処理すると、シトシンはウラシルに変換されるのに対し、メチル化されたシトシン（５’−メチルシトシン）はウラシルに変換されないという現象を利用した方法がある（Takeo Kubota et al., Hum. Genet. 104, 49-55, 1999；Clark S.J. et al., Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997, 1994）。この方法では、重亜硫酸塩によって処理したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、そのＰＣＲ産物を適当なプラスミドベクターにクローニングし、その後、塩基配列決定によってシトシン残基のメチル化パターンを検出する。この方法は、ＤＮＡのメチル化パターンを定性的に解析する上で優れているが、メチル化程度を定量的に評価する上では適していない。
【０００７】
さらに、ゲノムＤＮＡ上のメチル化ＤＮＡを検出する方法として、ゲノムＤＮＡをメチル感受性の制限酵素で処理した後にサザンブロット解析を行なう方法がある（Huang T. H. et al., Hum. Mol. Genet. 8, 459-470, 1999）。この方法では、ＤＮＡ上のメチル化の程度を定量的に検出することが可能となるが、大量のサンプルが必要とされ、解析に時間がかかり、また、その検出感度も十分に高いとはいえない。
【発明の概要】
【０００８】
本発明者らは、今般、目的のヌクレオチド残基のメチル化によってゲノム上の特定の切断点における切断作用が阻害される制限酵素を用いてゲノムＤＮＡを消化し、得られた消化産物を鋳型として、ゲノム上の前記切断点を含む領域を増幅しうるプライマーを用いる核酸増幅反応を行ない、これにより得られる増幅産物の量を、前記切断点を含まない近位の領域を増幅しうるプライマーによる増幅産物の量と比較することにより、前記ヌクレオチド残基のメチル化の状態を定量的に評価できることを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
【０００９】
従って、本発明の目的は、ゲノム上のＤＮＡのメチル化の状態を定量的に評価する方法を提供することにある。
【００１０】
そして、本発明による方法は、制限酵素によるゲノムＤＮＡの切断を阻害する、ゲノム上のヌクレオチド残基のメチル化の状態を定量的に評価する方法であって、（ａ）ゲノムＤＮＡを含むサンプル中のＤＮＡを、目的のヌクレオチド残基のメチル化によってゲノム上の標的切断部位における切断作用が阻害される少なくとも１種の制限酵素で消化し、かつ、ゲノム上の標的切断部位よりも５’側および３’側においてゲノムＤＮＡを切断する工程、（ｂ）ゲノム上において、標的切断部位から５’側および３’側に向けて最も近位に位置する工程（ａ）による２つの切断点の間に存在し、かつ、標的切断部位を含むゲノム上の標的領域を増幅しうるプライマーを用いて、工程（ａ）によって得られる消化産物を鋳型とする核酸増幅反応を行ない、得られる増幅産物の量を測定する工程、（ｃ）ゲノム上において、標的切断部位から５’側および３’側に向けて最も近位に位置する工程（ａ）による２つの切断点の間に存在し、かつ、標的切断部位を含まないゲノム上の対照領域を増幅しうるプライマーを用いて、工程（ａ）によって得られる消化産物を鋳型とする核酸増幅反応を行ない、得られる増幅産物の量を測定する工程、ならびに（ｄ）工程（ｂ）によって得られる測定値と、工程（ｃ）によって得られる測定値とを比較する工程、を含んでなるものである。
【００１１】
本発明によれば、ゲノム上のヌクレオチド残基のメチル化の状態を、簡便な手順によって定量的に評価することが可能となる。本発明による方法は、エピジェネティックなゲノム変化を解析するための基礎的研究および応用研究などにおいて、幅広い有用性を有する。さらに、本発明による方法は医療分野において利用することができ、例えば、ゲノム上の特定のヌクレオチド残基のメチル化が特定の疾患（例えば、癌、腫瘍、および精神疾患）に関連している場合には、その疾患の診断等に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明の一つの態様による方法の工程を模式的に示す図である。
【図２】図２は、リーリン遺伝子プロモーター中の特定の部位におけるメチル化について、（ターゲットＰＣＲにおける測定値）／（内部コントロールＰＣＲにおける測定値）を対数グラフ上にプロットした図である。
【図３】図３は、ＤＲＤ２遺伝子プロモーター中の特定の部位におけるメチル化について、（ターゲットＰＣＲにおける測定値）／（内部コントロールＰＣＲにおける測定値）を対数グラフ上にプロットした図である。
【図４】図４は、リーリン遺伝子プロモーターの制御下においてホタルルシフェラーゼを発現するプラスミドｐＲＥＬＮ−Ｌｕｃの構造を示す図である。
【図５】図５は、各プラスミドのプロモーター領域におけるメチル化度と、各プラスミドによるルシフェラーゼの発現量とを示すグラフである。
【図６Ａ】図６Ａは、躁うつ病患者における死亡時年齢とリーリン遺伝子プロモーター中の特定部位のメチル化度との関係を示す図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、統合失調症患者における死亡時年齢とリーリン遺伝子プロモーター中の特定部位のメチル化度との関係を示す図である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、健常者における死亡時年齢とリーリン遺伝子プロモーター中の特定部位のメチル化度との関係を示す図である。
【発明の具体的説明】
【００１３】
本発明による方法では、ゲノム上の特定のヌクレオチド残基がメチル化されたときに、ゲノム上の特定の位置における特定の制限酵素の切断作用が阻害されるという現象を利用している。よって、本発明において評価の対象となるヌクレオチド残基は、そのメチル化によってゲノムＤＮＡ上のいずれかの位置におけるいずれかの制限酵素の切断作用が阻害されるものである。本発明による方法では、ゲノムＤＮＡを含むサンプル中のＤＮＡが、目的のヌクレオチド残基のメチル化によってゲノム上の特定の切断点（標的切断点）における切断作用が阻害される制限酵素によって消化される。その結果、標的切断点においてゲノムＤＮＡが切断されていない場合には、目的のヌクレオチド残基がメチル化されていることが示され、標的切断点においてゲノムＤＮＡが切断された場合には、目的のヌクレオチド残基がメチル化されていないことが示される。
【００１４】
標的切断点における酵素的切断の有無は、ゲノム上における標的切断点を含む標的領域を増幅しうるプライマーを用いた核酸増幅反応において増幅産物が得られるか否かによって示される。ここで、本発明による方法では、標的切断点の５’側および３’側においてゲノムＤＮＡが確実に切断されるため、前記標的領域は、標的切断点から５’側および３’側に向けて最も近位に位置する２つの切断点の間に存在するように選択される。前記核酸増幅反応によって得られる増幅産物のコピー数は、前記サンプル中に存在する数多くのコピー数のゲノムＤＮＡのうちの、目的のヌクレオチド残基がメチル化されているコピーの比率を示す指標となる。
【００１５】
本発明による方法では、さらに、前記２つの切断点の間に存在し、かつ、標的切断点を含まない対照領域を増幅しうるプライマーを用いた核酸増幅反応が行なわれ、得られる増幅産物のコピー数を内部コントロールとすることにより、目的のヌクレオチド残基におけるメチル化を定量的に評価することが可能となる。
【００１６】
さらに、上述の原理を利用することにより、複数のヌクレオチド残基または複数の標的切断点についてメチル化の定量的評価を行なうことも可能であり、そのような方法も本発明に包含される。
【００１７】
以上のように、本発明による方法は、ＤＮＡ切断処理工程、標的領域の増幅工程、および対照領域の増幅工程を含んでなる。
【００１８】
ＤＮＡ切断処理工程では、ゲノムＤＮＡを含むサンプル中のＤＮＡが、目的のヌクレオチド残基のメチル化によってゲノム上の標的切断部位における切断作用が阻害される少なくとも１種の制限酵素で消化される。
【００１９】
本明細書において「目的のヌクレオチド残基」とは、メチル化の定量的評価の対象とするゲノム上のヌクレオチド残基を意味する。このようなヌクレオチド残基は、そのメチル化によってゲノム上の特定の位置における特定の制限酵素による切断作用が阻害されるものであればよく、当業者により適宜選択される。また、選択される制限酵素によっては、複数の異なるヌクレオチド残基のいずれかのメチル化によって、同一箇所におけるその切断作用が阻害される場合もある。本発明による方法では、これら複数のヌクレオチド残基を目的のヌクレオチド残基とすることもできる。その場合には、本発明による方法によって定量評価されるメチル化は、前記複数のヌクレオチド残基のうちのいずれかにおけるメチル化である。さらに、本発明による方法では、複数の標的切断点における制限酵素による切断を阻害する複数のヌクレオチド残基のメチル化を評価の対象とすることもできる。目的のヌクレオチド残基は、前記制限酵素の認識配列中に含まれることが多い。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、目的のヌクレオチド残基は、上述のＤＮＡ消化処理に用いられる制限酵素の認識配列中に含まれるものとされる。
【００２０】
本明細書において「標的切断点」とは、いずれかの制限酵素によって切断されるゲノムＤＮＡ上の特定の位置であって、目的のヌクレオチド残基のメチル化によって制限酵素による切断が阻害される位置を意味する。さらに、「標的切断部位」とは、本発明による方法において単一の標的切断点が利用される場合にはその標的切断点そのものを意味し、複数の標的切断点が利用される場合には、これら複数の標的切断点のうち、最も５’側に存在するものと最も３’側に存在するものとによって挟まれるゲノム上の領域を意味する。
【００２１】
上述のＤＮＡ消化処理に用いられる制限酵素は、目的のヌクレオチド残基のメチル化によってゲノム上の特定の切断点（標的切断点）における切断作用が阻害されるものである。このような制限酵素は、目的のヌクレオチド残基またはその周辺の配列に応じて、当業者によって適宜選択される。また、このような制限酵素は、その認識配列に含まれるヌクレオチド残基のメチル化によって阻害されることが多い。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、上述のＤＮＡ消化処理に用いられる制限酵素は、その認識配列に含まれるヌクレオチド残基のメチル化によって阻害されるものとされる。このような多くの制限酵素が、メチル化感受性制限酵素として、その活性（切断作用）を阻害するメチル化部位およびその他の性質とともに当技術分野においてよく知られている（例えば、Nelson M. et al., Nucleic Acids Research, Vol. 21, No. 13, 3139-3154, 1993）。従って、当業者であれば、目的に応じて制限酵素を容易に選択することができる。また、上述のＤＮＡ消化処理に用いられる制限酵素として、複数種の制限酵素を用いることもできる。
【００２２】
さらに、ＤＮＡ切断処理工程では、ゲノム上の標的切断部位よりも５’側および３’側において前記ＤＮＡが切断される。これにより、後に行なわれる核酸増幅反応において鋳型として用いるのに好適なＤＮＡ断片を得ることが可能となる。このようなＤＮＡの切断は、当業者であれば容易に行なうことができる。例えば、上述のＤＮＡ消化処理に用いられる制限酵素が、標的切断部位の５’側および３’側においてゲノムＤＮＡを確実に切断しうる場合には、このＤＮＡ切断は、上述のＤＮＡ消化処理において同時に行なうことができる。また、このＤＮＡ切断は、必要に応じて、ゲノム上の標的切断部位よりも５’側および３’側においてゲノムＤＮＡを切断しうる試薬を用いて行なうこともできる。このような試薬としては、例えば、制限酵素が挙げられる。よって、本発明の一つの実施態様によれば、ＤＮＡ切断処理工程は、ゲノムＤＮＡを含むサンプル中のＤＮＡを、標的切断部位よりも５’側および３’側においてゲノムＤＮＡを切断しうる制限酵素で消化することを含んでなる。また、本発明の他の実施態様によれば、ＤＮＡ切断処理工程は、ゲノムＤＮＡを含むサンプル中のＤＮＡを、標的切断部位よりも５’側においてゲノムＤＮＡを切断しうる制限酵素、および標的切断部位よりも３’側においてゲノムＤＮＡを切断しうる制限酵素で消化することを含んでなる。これらのＤＮＡ切断に用いられる制限酵素は、ゲノム上の目的の位置において確実にゲノムＤＮＡを切断しうるように、当業者によって適宜選択される。また、これらの制限酵素はメチル化感受性制限酵素であってもよく、この場合には、これらの制限酵素の活性（切断作用）を阻害するメチル化ヌクレオチド残基が存在しないか、または存在するメチル化ヌクレオチド残基によって前記制限酵素の活性がほとんど阻害されないことが必要となる。
【００２３】
ＤＮＡ切断処理工程では、制限酵素によるＤＮＡ消化処理と、標的切断部位の５’側および３’側におけるＤＮＡ切断とを別々に行なってもよいし、あるいは、同時に行なってもよい。特に、標的切断部位の５’側および３’側におけるＤＮＡ切断が制限酵素によって行なわれる場合には、これに必要な制限酵素とＤＮＡ消化処理に用いられる制限酵素とを含む制限酵素組成物を用いてＤＮＡを消化することにより、ＤＮＡ切断処理工程を一工程で行なうことが可能である。
【００２４】
ゲノムＤＮＡを含むサンプルは、対象となる生物、例えばヒトから採取したサンプルから、一般的な制限酵素処理に好適なものとなるように、当業者によって適宜調製される。また、制限酵素によるＤＮＡの消化は、一般的な制限酵素処理の条件として知られる反応条件に従って、当業者により適宜実行される。
【００２５】
標的領域の増幅工程では、ゲノム上において、標的切断部位から５’側および３’側に向けて最も近位に位置する前記ＤＮＡ切断処理工程による２つの切断点の間に存在し、かつ、標的切断部位を含むゲノム上の標的領域を増幅しうるプライマーを用いて、前記ＤＮＡ切断処理工程によって得られる消化産物を鋳型とする核酸増幅反応が行なわれ、さらに、得られる増幅産物の量が測定される。この核酸増幅反応では、標的切断部位に含まれるいずれの標的切断点においてもゲノムＤＮＡが切断されていない場合にのみ増幅産物が得られるため、それぞれの標的切断点に対応する目的のヌクレオチド残基（一の標的切断点に対応する目的のヌクレオチド残基が複数存在する場合には、そのうちのいずれか一つ）の全てがメチル化されている場合にのみ、増幅産物が得られる。一方で、標的切断部位に含まれるいずれかの標的切断点においてゲノムＤＮＡが切断されている場合には増幅産物が得られないため、それぞれの標的切断点に対応する目的のヌクレオチド残基（一の標的切断点に対応する目的のヌクレオチド残基が複数存在する場合には、その全て）のいずれかがメチル化されていない場合には、増幅産物が得られない。従って、この増幅産物の量は、標的切断部位に含まれる標的切断点のそれぞれに対応する目的のヌクレオチド残基（一の標的切断点に対応する目的のヌクレオチド残基が複数存在する場合には、そのうちのいずれか一つ）の全てがメチル化されているゲノムＤＮＡのコピー数に対応するため、目的のヌクレオチド残基（群）におけるメチル化の量を示す指標となる。例えば、標的切断部位に一つの標的切断点が含まれる場合には、増幅産物の量は、その標的切断点に対応する目的のヌクレオチド残基（その標的切断点に対応する目的のヌクレオチド残基が複数存在する場合には、そのうちのいずれか一つ）がメチル化されているゲノムＤＮＡのコピー数に対応するため、目的のヌクレオチド残基（群）におけるメチル化の量を示す指標となる。
【００２６】
対照領域の増幅工程では、ゲノム上において、標的切断部位から５’側および３’側に向けて最も近位に位置する前記ＤＮＡ切断処理工程による２つの切断点の間に存在し、かつ、標的切断部位を含まないゲノム上の対照領域を増幅しうるプライマーを用いて、前記ＤＮＡ切断処理工程によって得られる消化産物を鋳型とする核酸増幅反応が行なわれ、さらに、得られる増幅産物の量が測定される。この核酸増幅反応では、目的のヌクレオチド残基がメチル化されているか否かにかかわらず、一定のコピー数の増幅産物が得られる。従って、この増幅産物の量は、目的のヌクレオチド残基におけるメチル化の状態を定量的に評価するための内部コントロールとなる。
【００２７】
前記核酸増幅反応は、鋳型となるＤＮＡ配列中の特定の領域を増幅することのできる方法に従って、当業者により適宜実行される。このような方法としては、当技術分野において多くの方法が知られており、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法：米国特許第４６８３１９５号明細書）、リガーゼ連鎖反応法（ＬＣＲ法：欧州特許出願公開第０３２０３０８号明細書）等が挙げられる。これらの方法は、複数の温度条件を含む温度サイクルの数によって増幅産物の理論上のコピー数を制御することができるという利点を有する。また、前記核酸増幅反応としては、一定の温度において核酸を増幅する方法を用いることもでき、このような方法としては、例えば、ＳＤＡ法（特開平５−１９２１９５号公報）、ＬＡＭＰ法（国際公開第００／２８０８２号パンフレット）、ＩＣＡＮ法（国際公開第０２／１６６３９号パンフレット）等が挙げられる。
【００２８】
前記標的領域または前記対照領域を増幅しうるプライマーは、選択された核酸増幅反応の作用機序に応じて、当業者であれば容易に設計することができる。例えば、このようなプライマーは、増幅の対象とする領域の第一鎖の３’末端部分に特異的にハイブリダイズする配列を少なくとも含んでなる第一のプライマーと、前記領域の第二鎖の３’末端部分に特異的にハイブリダイズする配列を少なくとも含んでなる第二のプライマーとを少なくとも含んでなるものとすることができる。
【００２９】
本明細書において「特異的にハイブリダイズする」とは、前記プライマーがストリンジェントな条件下で増幅の対象とする領域のいずれかの鎖の３’末端部分にハイブリダイズし、かつ、核酸増幅反応に用いられる反応溶液中に存在する他のヌクレオチド分子またはその一部にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、２つのヌクレオチド分子のハイブリダイズにより形成される二重鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度などに依存して決定することができ、例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)等を参照することができる。例えば、プライマーとして用いられるヌクレオチド分子の融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行なうと、前記プライマーを所定の領域に特異的にハイブリダイズさせることができる。本発明の好ましい実施態様によれば、ある領域（配列部分）に特異的にハイブリダイズするプライマーは、その領域に相補的なヌクレオチド配列を含んでなるものとされる。
【００３０】
前記核酸増幅反応において鋳型として用いられる消化産物としては、前記ＤＮＡ切断処理工程によって得られる消化産物をそのままの形で用いてもよいし、該消化産物を含む溶液を核酸増幅反応に好適な溶液となるように改変した溶液を用いてもよい。また、前記ＤＮＡ切断処理工程によって得られる消化産物を、エタノール沈澱法などの標準的な方法によって単離し、これを核酸増幅反応のための溶液中に溶解させることもできる。
【００３１】
本発明の好ましい実施態様によれば、標的領域の増幅工程および対照領域の増幅工程の一方または両方における核酸増幅反応は、その反応中において増幅産物の増加に対応して検出可能なシグナルの強度が増加する方法によって行なわれ、より好ましくはリアルタイムＰＣＲとされる。このような方法により、核酸増幅反応の終了と同時に、さらなる複雑な工程を要することなく、増幅産物の量を測定することが可能となる。このような方法は、例えば、増幅産物の量に対応する強度のシグナルを発生するシグナル発生物質を予め核酸増幅反応のための反応溶液の中に添加しておくことによって行なうことができる。
【００３２】
前記シグナル発生物質としては、例えば、インターカレーターが挙げられる。従って、本発明の一つの実施態様によれば、標的領域の増幅工程および対照領域の増幅工程の一方または両方における増幅産物量の測定は、インターカレーターからのシグナル強度の測定によって行なわれる。本明細書において「インターカレーター」とは、二本鎖ＤＮＡを形成している二本のＤＮＡ鎖の間に侵入して蛍光を発する物質を意味する。インターカレーターとしては様々な物質が知られており、例えば、臭化エチジウム、アクリジン色素、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（「ＳＹＢＲ」はMolecular Probes社の登録商標である）等が挙げられる。
【００３３】
また、前記シグナル発生物質としては、ＴａｑＭａｎプローブを挙げることができる。従って、本発明の他の実施態様によれば、標的領域の増幅工程および対照領域の増幅工程の一方または両方における増幅産物量の測定は、ＴａｑＭａｎプローブに起因する蛍光強度の測定によって行なわれる。ＴａｑＭａｎプローブを用いたＰＣＲ法は、ＴａｑＭａｎＰＣＲ法として当技術分野においてよく知られている。従って、本発明に用いるためのＴａｑＭａｎプローブは、当業者によって容易に設計され、調製される。
【００３４】
上述の標的領域の増幅工程によって得られる測定値は、対照領域の増幅工程によって得られる測定値と比較される。これにより、標的領域の増幅工程によって得られる測定値が内部コントロールによって標準化され、目的のヌクレオチド残基（群）のメチル化の量的な指標を得ることができる。本発明の好ましい実施態様によれば、標的領域の増幅工程によって得られる測定値を、対照領域の増幅工程によって得られる測定値で除して得られる値が、サンプルにおける目的のヌクレオチド残基（群）のメチル化の量的な指標とされる。
【００３５】
本発明の一つの好ましい実施態様による方法を、図１に従って説明する。図１に示す方法では、上述のＤＮＡ消化処理に用いられる制限酵素としてＢｓｓＨ ＩＩが用いられ、その認識配列中に存在するシトシン残基のメチル化の状態が定量的に評価される。標的切断部位の５’側および３’側におけるＤＮＡ切断には、制限酵素としてＥｃｏＲ Ｉが用いられる。
【００３６】
まず、サンプル中に含まれるゲノムＤＮＡ上には、ＥｃｏＲ Ｉ部位とＢｓｓＨ ＩＩ部位とが交互に存在しており、左側のＢｓｓＨ ＩＩ部位（標的ＢｓｓＨ ＩＩ部位）に目的のシトシン残基が含まれている（図１上段）。このゲノムＤＮＡを、ＢｓｓＨ ＩＩとＥｃｏＲ Ｉとを含む制限酵素組成物で消化すると、ＢｓｓＨ ＩＩ部位にメチル化シトシンが存在する場合にはその制限酵素部位は切断されず、ＢｓｓＨ ＩＩ部位にメチル化シトシンが存在しない場合にはその制限酵素部位は切断される。よって、消化産物中には、目的のシトシン残基がメチル化されているゲノムＤＮＡコピーに由来するＥｃｏＲ Ｉ−ＥｃｏＲ Ｉ断片と、目的のシトシン残基がメチル化されていないゲノムＤＮＡコピーに由来するＥｃｏＲ Ｉ−ＢｓｓＨ ＩＩ断片およびＢｓｓＨ ＩＩ−ＥｃｏＲ Ｉ断片とが混在する（図１中段）。また、目的のシトシン残基を含まない非標的ＢｓｓＨ ＩＩ部位においても同様の反応が起こる。よって、消化産物中には、非標的ＢｓｓＨ ＩＩ部位とその周辺の領域に由来するＥｃｏＲ Ｉ−ＥｃｏＲ Ｉ断片、ＥｃｏＲ Ｉ−ＢｓｓＨ ＩＩ断片およびＢｓｓＨ ＩＩ−ＥｃｏＲ Ｉ断片も存在する（図１中段の右側）。
【００３７】
次いで、標的ＢｓｓＨ ＩＩ部位を含むＥｃｏＲ Ｉ−ＥｃｏＲ Ｉ断片を鋳型とした場合に該標的ＢｓｓＨ ＩＩ部位を含む標的領域を増幅しうるプライマーを用いて、消化産物を鋳型とするリアルタイムＰＣＲが行なわれる。このＰＣＲでは、標的ＢｓｓＨ ＩＩ部位を含むＥｃｏＲ Ｉ−ＥｃｏＲ Ｉ断片から増幅産物が得られるのに対し、ＥｃｏＲ Ｉ−ＢｓｓＨ ＩＩ断片およびＢｓｓＨ ＩＩ−ＥｃｏＲ Ｉ断片から増幅産物は得られない（図１下段の左側の増幅）。なお、前記プライマーは、前記標的領域に特異的な配列を有するため、非標的ＢｓｓＨ ＩＩ部位とその周辺の領域に由来するＥｃｏＲ Ｉ−ＥｃｏＲ Ｉ断片から増幅産物が得られることはない。
【００３８】
さらに、標的ＢｓｓＨ ＩＩ部位を含むＥｃｏＲ Ｉ−ＥｃｏＲ Ｉ断片を鋳型とした場合に該標的ＢｓｓＨ ＩＩ部位を含まない対照領域を増幅しうるプライマーを用いて、消化産物を鋳型とするリアルタイムＰＣＲが行なわれる。このＰＣＲでは、標的ＢｓｓＨ ＩＩ部位を含むＥｃｏＲ Ｉ−ＥｃｏＲ Ｉ断片と、ＥｃｏＲ Ｉ−ＢｓｓＨ ＩＩ断片およびＢｓｓＨ ＩＩ−ＥｃｏＲ Ｉ断片のいずれか一方とから増幅産物が得られる（図１下段の右側の増幅）。よって、このＰＣＲによれば、標的ＢｓｓＨ ＩＩ部位におけるＤＮＡ切断の有無にかかわらず、一定量の増幅産物が得られる。
【００３９】
最後に、前記標的領域におけるＰＣＲ増幅量を前記対照領域におけるＰＣＲ増幅量で除することによって、目的のシトシン残基におけるメチル化の状態についての定量的な評価値が得られる。
【００４０】
本発明による方法によって目的のヌクレオチド残基におけるメチル化の状態を定量的に評価するために、必要な試薬をまとめてキットとすることができる。従って、本発明によれば、制限酵素によるゲノムＤＮＡの切断を阻害する、ゲノム上のヌクレオチド残基のメチル化の状態を定量的に評価するためのキットであって、（ａ）目的のヌクレオチド残基のメチル化によってゲノム上の標的切断部位における切断作用が阻害される少なくとも１種の制限酵素、（ｂ）ゲノム上の標的切断部位よりも５’側および３’側においてゲノムＤＮＡを切断しうる試薬、（ｃ）ゲノム上において、標的切断部位から５’側および３’側に向けて最も近位に位置する前記制限酵素または前記試薬による２つの切断点の間に存在し、かつ、標的切断部位を含むゲノム上の標的領域を増幅しうるプライマー、ならびに（ｄ）ゲノム上において、標的切断部位から５’側および３’側に向けて最も近位に位置する、前記制限酵素または前記試薬による２つの切断点の間に存在し、かつ、標的切断部位を含まないゲノム上の対照領域を増幅しうるプライマー、を含んでなるキットが提供される。
【００４１】
本発明によるキットの具体的な構成は、これにより実施しようとする具体的な方法およびその作用機序によって異なり、例えば、本発明による方法について上述した説明に従って設計することができる。
【００４２】
従って、目的のヌクレオチド残基は、好ましくは前記制限酵素の認識配列中に含まれるものとされる。また、前記制限酵素は、好ましくは、その認識配列に含まれるヌクレオチド残基のメチル化によって阻害されるものとされる。
【００４３】
さらに、本発明の一つの実施態様によれば、前記試薬は、標的切断部位よりも５’側および３’側においてゲノムＤＮＡを切断しうる制限酵素を含んでなるものとされる。また、本発明の他の実施態様によれば、前記試薬は、標的切断部位よりも５’側においてゲノムＤＮＡを切断しうる制限酵素、および標的切断部位よりも３’側においてゲノムＤＮＡを切断しうる制限酵素を含んでなるものとされる。
【００４４】
また、本発明によるキットは、好ましくは、前記（ｃ）および（ｄ）の一方または両方のプライマーによる核酸増幅反応において増幅産物の量に対応する強度のシグナルを発生するシグナル発生物質をさらに含んでなるものとされる。前記シグナル発生物質としては、例えば、上述のインターカレーター、ＴａｑＭａｎプローブ等が挙げられる。
【００４５】
さらに、本発明によるキットは、二本鎖ＤＮＡの制限酵素処理に用いられる他の試薬類、核酸増幅反応に用いられる他の試薬類、反応容器、本発明による方法の具体的手順を記載した説明書等を含んでいてもよい。制限酵素処理に用いられる他の試薬類としては、例えば緩衝液等が挙げられる。核酸増幅反応に用いられる他の試薬類としては、例えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム等の触媒、ｄＮＴＰミックス等の基質、緩衝液などが挙げられる。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これら実施例は本発明を限定するものではない。【００４７】
実施例１：リーリン遺伝子プロモーター領域内のＢｓｓＨ ＩＩ部位におけるメチル化の定量的評価
１１１名のヒト被験者からゲノムＤＮＡサンプルを採取し、各サンプルについて、リーリン遺伝子プロモーター領域内の特定のＢｓｓＨ ＩＩ部位におけるメチル化状態を定量的に評価した。具体的な手順および結果は、以下に示すとおりである。【００４８】
（１）ＤＮＡの制限酵素消化
ゲノムＤＮＡを、２種の制限酵素を用いて消化した。ここで、一方の制限酵素は、その認識配列が目的のメチル化部位を包含するメチル化感受性制限酵素ＢｓｓＨ ＩＩとし、他方の制限酵素は、その認識配列が前記メチル化部位の５’側および３’側に存在する制限酵素ＥｃｏＲ Ｉとした。具体的には、５００ｎｇのゲノムＤＮＡ、６ＵのＢｓｓＨ ＩＩ、６ＵのＥｃｏＲ Ｉ、５μｌの１０×Ｈ緩衝液、および蒸留水を含む５０μｌの反応溶液を調製し、得られた反応溶液を、通気下、３７℃で一晩インキュベートした。【００４９】
次いで、切断されたＤＮＡ断片をエタノール沈澱によって回収し、これをＴＥ溶液に溶解した。具体的には、上述のようにして得られた反応溶液に１００μｌのエタノール（１００％）および５μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムを添加し、これを−２０℃に２０分間置いた。この溶液を遠心分離（１７，８００×ｇ、４℃、１５分間）した後に上清を除去した。この溶液に２００μｌの７０％エタノールを添加し、遠心分離（１７，８００×ｇ、４℃、５分間）した後に、エタノールを完全に蒸発させた。得られた残渣を５０μｌのＴＥ溶液に溶解させた。この溶液中のＤＮＡ濃度は、２６０ｎｍでの吸光度測定（Dilution Facter: X20 (4:76ddw)）により決定した。【００５０】
（２）リアルタイムＰＣＲ
上述のようにして得られたＤＮＡ断片を鋳型として、２通りのリアルタイムＰＣＲを行なった。一方のＰＣＲ（内部コントロールＰＣＲ）では、ゲノムＤＮＡ上において上述のＢｓｓＨ ＩＩ部位から５’側および３’側に向かって最初に存在する２つのＥｃｏＲ Ｉにより挟まれたＥｃｏＲ Ｉ−ＥｃｏＲ Ｉ領域中の、目的のメチル化部位を含まない領域（対照領域）を増幅しうるプライマーペアを用いた。内部コントロールＰＣＲでは、増幅産物の量を示すシグナル発生手段として、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを用いた。他方のＰＣＲ（ターゲットＰＣＲ）では、前記ＥｃｏＲ Ｉ−ＥｃｏＲ Ｉ領域中の、目的のメチル化部位を含む領域（標的領域）を増幅しうるプライマーペアを用いた。ターゲットＰＣＲでは、増幅産物の量を示すシグナル発生手段として、ＴａｑＭａｎプローブを用いた。これらのＰＣＲに用いたプライマーおよびプローブのヌクレオチド配列は、以下のとおりである。【００５１】
内部コントロールＰＣＲ：
フォワード(RC-F1)：5'-GAACAGTCCGGCGAAGAGAG-3'（配列番号１）；
リバース(RC-R1)：5'-CAGAGCCTCATCTGTAGAGGATTT-3'（配列番号２）。
ターゲットＰＣＲ：
フォワード(RC-F3)：5'-CGGCGTCTCCAAAACTGAATGA-3'（配列番号３）；
リバース(RC-R3)：5'-GTGGGGTTGCCCGCAATATGCAG-3'（配列番号４）；
TaqManプローブ：5'-FAM-CTAGCGCTGTTGCTGGGGGCGACGCTG-TAMRA-3'（配列番号５）。【００５２】
内部コントロールＰＣＲのための反応溶液は、６０ｎｇの鋳型ＤＮＡ、それぞれ２００ｎＭの各プライマー、１２．５μｌの２×Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（SYBR Green PCR Master Mix: Applied Biosystems）、および蒸留水を含む計２５μｌの溶液とした。ターゲットＰＣＲのための反応溶液は、６０ｎｇの鋳型ＤＮＡ、それぞれ２００ｎＭの各プライマー、１００ｎＭのＴａｑＭａｎプローブ、１２．５μｌの２×Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（TaqMan Universal PCR Master Mix: Applied Biosystems）、および蒸留水を含む計２５μｌの溶液とした。【００５３】
リアルタイムＰＣＲは、ABI PRISM（登録商標）7000 Sequence Detection System（Applied Biosystems）を用いて行なった。温度条件は、反応溶液を５０℃で２分間処理し、さらに９５℃で１０分間処理した後に、９５℃で２０秒間および６０℃で１分間の処理を４８サイクルとした。【００５４】
また、標準サンプルとして、１０倍、１００倍および１０００倍に希釈した標準ＤＮＡを用いた。【００５５】
（３）結果
上述の２通りのリアルタイムＰＣＲにおけるシグナル強度の測定値から、（ターゲットＰＣＲにおける測定値）／（内部コントロールＰＣＲにおける測定値）を算出し、その値を対数グラフ上にプロットした。その結果を図２に示す。図２において、各データは、３回の独立した実験の平均値を示している。図２によれば、リーリン遺伝子プロモーター中の上述の部位におけるメチル化の程度は、被験者の間で大幅に異なることが明らかとなった。【００５６】
実施例２：ＤＲＤ２遺伝子プロモーター領域内のＢｓｓＨ ＩＩ部位におけるメチル化の定量的評価
１１１名のヒト被験者からゲノムＤＮＡサンプルを採取し、各サンプルについて、ＤＲＤ２遺伝子プロモーター領域内の特定のＢｓｓＨ ＩＩ部位におけるメチル化状態を定量的に評価した。具体的な手順および結果は、以下に示すとおりである。【００５７】
（１）ＤＮＡの制限酵素消化
ゲノムＤＮＡを、２種の制限酵素を用いて消化した。ここで、一方の制限酵素は、その認識配列が目的のメチル化部位を包含するメチル化感受性制限酵素ＢｓｓＨ ＩＩとし、他方の制限酵素は、その認識配列が前記メチル化部位の５’側および３’側に存在する制限酵素ＥｃｏＲ Ｉとした。具体的には、５００ｎｇのゲノムＤＮＡ、６ＵのＢｓｓＨ ＩＩ、６ＵのＥｃｏＲ Ｉ、５μｌの１０×Ｈ緩衝液、および蒸留水を含む５０μｌの反応溶液を調製し、得られた反応溶液を、通気下、３７℃で一晩インキュベートした。【００５８】
次いで、切断されたＤＮＡ断片をエタノール沈澱によって回収し、これをＴＥ溶液に溶解した。具体的には、上述のようにして得られた反応溶液に１００μｌのエタノール（１００％）および５μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムを添加し、これを−２０℃に２０分間置いた。この溶液を遠心分離（１７，８００×ｇ、４℃、１５分間）した後に上清を除去した。この溶液に２００μｌの７０％エタノールを添加し、遠心分離（１７，８００×ｇ、４℃、５分間）した後に、エタノールを完全に蒸発させた。得られた残渣を５０μｌのＴＥ溶液に溶解させた。この溶液中のＤＮＡ濃度は、２６０ｎｍでの吸光度測定（Dilution Facter: X20 (4:76ddw)）により決定した。【００５９】
（２）リアルタイムＰＣＲ
上述のようにして得られたＤＮＡ断片を鋳型として、２通りのリアルタイムＰＣＲを行なった。一方のＰＣＲ（内部コントロールＰＣＲ）では、ゲノムＤＮＡ上において上述のＢｓｓＨ ＩＩ部位から５’側および３’側に向かって最初に存在する２つのＥｃｏＲ Ｉにより挟まれたＥｃｏＲ Ｉ−ＥｃｏＲ Ｉ領域中の、目的のメチル化部位を含まない領域（対照領域）を増幅しうるプライマーペアを用いた。他方のＰＣＲ（ターゲットＰＣＲ）では、前記ＥｃｏＲ Ｉ−ＥｃｏＲ Ｉ領域中の、目的のメチル化部位を含む領域（標的領域）を増幅しうるプライマーペアを用いた。これらのＰＣＲでは、増幅産物の量を示すシグナル発生手段として、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを用いた。これらのＰＣＲに用いたプライマーのヌクレオチド配列は、以下のとおりである。【００６０】
内部コントロールＰＣＲ：
フォワード(DRD2-5FABconF2)：5'-CCTGTCATCAATCACACAGTGC-3'（配列番号６）；
リバース(DRD2-5FABconR2)：5'-CATGGCTGAGTGGATTTCATGCT-3'（配列番号７）。
ターゲットＰＣＲ：
フォワード(DRD2-5FABmetF2)：5'-AGGTACAGCTCCTTTGGTGG-3'（配列番号８）；
リバース(DRD2-5FABmetR1)：5'-CAGCAGCTCGGCCGGCTCT-3'（配列番号９）。【００６１】
ＰＣＲのための反応溶液は、６０ｎｇの鋳型ＤＮＡ、それぞれ２００ｎＭの各プライマー、１２．５μｌの２×Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（SYBR Green PCR Master Mix: Applied Biosystems）、および蒸留水を含む計２５μｌの溶液とした。【００６２】
リアルタイムＰＣＲは、ABI PRISM（登録商標）7000 Sequence Detection System（Applied Biosystems）を用いて行なった。温度条件は、反応溶液を５０℃で２分間処理し、さらに９５℃で１０分間処理した後に、９５℃で２０秒間および６０℃で１分間の処理を４８サイクルとした。【００６３】
また、標準サンプルとして、１０倍、１００倍および１０００倍に希釈した標準ＤＮＡを用いた。【００６４】
（３）結果
上述の２通りのリアルタイムＰＣＲにおけるシグナル強度の測定値から、（ターゲットＰＣＲにおける測定値）／（内部コントロールＰＣＲにおける測定値）を算出し、その値を対数グラフ上にプロットした。その結果を図３に示す。図３において、各データは、３回の独立した実験の平均値を示している。図３によれば、ＤＲＤ２遺伝子プロモーター中の上述の部位におけるメチル化の程度は、被験者の間でほぼ同様であることが明らかとなった。【００６５】
実施例３：リーリン遺伝子プロモーター領域内のＢｓｓＨ ＩＩ部位におけるメチル化の定量的評価
リーリン遺伝子（ＲＥＬＮ）プロモーターの作用によりホタルルシフェラーゼを発現するプラスミドを作製し、ＲＥＬＮプロモーター領域におけるメチル化の程度とホタルルシフェラーゼの発現効率との関係を調べた。具体的な手順および結果は、以下に示すとおりである。【００６６】
（１）プラスミドの作製
プロモーター領域および第一エクソンを含むリーリン遺伝子（ＲＥＬＮ）領域を、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型とし、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるＰＣＲによって増幅した。
RELN-532F：5'-GTTCTAGATCTTCCCAGGAAAAACAGGGCACACTG-3'（配列番号１０）；
RELN+misR：5'-AATATCCATGGTGGCGAGCACCTCGCCCTGC-3'（配列番号１１）。【００６７】
次いで、得られた増幅産物をＢｇｌ ＩＩおよびＮｃｏ Ｉで消化し、同じくＢｇｌ ＩＩおよびＮｃｏ Ｉで消化したｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌベクター（Promega社製）に挿入した。得られるｐＲＥＬＮ−Ｌｕｃに含まれるルシフェラーゼ発現カセットの構造を、図４に示す。ｐＲＥＬＮ−Ｌｕｃでは、ｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌベクター中に含まれていたＳＶ４０プロモーターに代えて、ＲＥＬＮ遺伝子プロモーターがホタルルシフェラーゼのコード配列に連結されている。【００６８】
得られたｐＲＥＬＮ−Ｌｕｃをコンピテント細胞である大腸菌ＪＭ１０９株に導入してこれを培養した後、HiSpeed Plasmid Midi Kit（QIAGEN社製）を用いて該培養物からプラスミドを抽出した。【００６９】
（２）プラスミドの部分メチル化
ｐＲＥＬＮ−Ｌｕｃを、ＣｐＧメチラーゼであるＭ．ＳｓｓＩを用いて部分的にメチル化した。具体的には、５．０μｌの１０×NEB Buffer2、４ＵのＭ．ＳｓｓＩ、１０ｎｇのｐＲＥＬＮ−Ｌｕｃ、１０×ＳＡＭ基質、および蒸留水を含む１００μｌの反応液を調製し、これを３７℃でインキュベートした。ここで、異なるメチル化度を有する３種のｐＲＥＬＮ−Ｌｕｃを作製するため、ＳＡＭ基質の終濃度を２×、１×および０．２×とし、反応時間をそれぞれ６時間、３時間および２時間とした。反応後のプラスミドの精製はWizard SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega社製）を用いて行ない、５０μｌの蒸留水で溶出した。このようにして、メチル化度の異なる３種のプラスミドを得た（メチル化度の高い順に、「ｐＲＥＬＮ−Ｌｕｃ（Ｈ Ｍ）」、「ｐＲＥＬＮ−Ｌｕｃ（Ｍ Ｍ）」、および「ｐＲＥＬＮ−Ｌｕｃ（Ｌ Ｍ）」という）。【００７０】
（３）メチル化の定量的評価
各メチル化ｐＲＥＬＮ−Ｌｕｃを、２種の制限酵素を用いて消化した。ここで、一方の制限酵素は、その認識配列が目的のメチル化部位を包含するメチル化感受性制限酵素ＢｓｓＨ ＩＩとし、他方の制限酵素は、その認識配列が前記メチル化部位の５’側および３’側に存在する制限酵素ＢａｍＨＩとした。具体的には、２５ｎｇのプラスミド、６ＵのＢｓｓＨ ＩＩ、６ＵのＢａｍＨＩ、５μｌの１０×Ｈ緩衝液、および蒸留水を含む５０μｌの反応溶液を調製し、得られた反応溶液を、通気下、３７℃で一晩インキュベートした。【００７１】
次いで、切断されたＤＮＡ断片をエタノール沈澱によって回収し、これをＴＥ溶液に溶解した。具体的には、上述のようにして得られた反応溶液に１００μｌのエタノール（１００％）および５μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムを添加し、これを−２０℃に２０分間置いた。この溶液を遠心分離（１７，８００×ｇ、４℃、１５分間）した後に上清を除去した。この溶液に２００μｌの７０％エタノールを添加し、遠心分離（１７，８００×ｇ、４℃、５分間）した後に、エタノールを完全に蒸発させた。得られた残渣を５０μｌのＴＥ溶液に溶解させた。この溶液中のＤＮＡ濃度は、２６０ｎｍでの吸光度測定（Dilution Facter: X20 (4:76ddw)）により決定した。【００７２】
上述のようにして得られたＤＮＡ断片を鋳型として、２通りのリアルタイムＰＣＲを行なった。一方のＰＣＲ（内部コントロールＰＣＲ）では、プラスミド上において上述のＢｓｓＨ ＩＩ部位から５’側および３’側に向かって最初に存在する２つのＢａｍＨＩにより挟まれたＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ領域中の、目的のメチル化部位を含まない領域（対照領域：１５０ｂｐ）を増幅しうるプライマーペアを用いた。内部コントロールＰＣＲでは、増幅産物の量を示すシグナル発生手段として、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを用いた。他方のＰＣＲ（ターゲットＰＣＲ）では、前記ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ領域中の、目的のメチル化部位を含む領域（標的領域：２７５ｂｐ）を増幅しうるプライマーペアを用いた。ターゲットＰＣＲでは、増幅産物の量を示すシグナル発生手段として、ＴａｑＭａｎプローブを用いた。これらのＰＣＲに用いたプライマーおよびプローブのヌクレオチド配列は、以下のとおりである。【００７３】
内部コントロールＰＣＲ：
フォワード(pGL3ss1044)：5'-TTTGATATGTGGATTTCGAG-3'（配列番号１２）；
リバース(pGL3as1194)：5'-ATCGTATTTGTCAATCAGAG-3'（配列番号１３）。
ターゲットＰＣＲ：
フォワード(RC-F3)：5'-CGGCGTCTCCAAAACTGAATGA-3'（配列番号３）；
リバース(RC-R3)：5'-GTGGGGTTGCCCGCAATATGCAG-3'（配列番号４）；
TaqManプローブ：5'-FAM-CTAGCGCTGTTGCTGGGGGCGACGCTG-TAMRA-3'（配列番号５）。【００７４】
内部コントロールＰＣＲのための反応溶液は、１ｎｇの鋳型ＤＮＡ、それぞれ２００ｎＭの各プライマー、１２．５μｌの２×Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（SYBR Green PCR Master Mix: Applied Biosystems）、および蒸留水を含む計２５μｌの溶液とした。ターゲットＰＣＲのための反応溶液は、１ｎｇの鋳型ＤＮＡ、それぞれ２００ｎＭの各プライマー、１００ｎＭのＴａｑＭａｎプローブ、１２．５μｌの２×Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG: Applied Biosystems）、および蒸留水を含む計２５μｌの溶液とした。【００７５】
リアルタイムＰＣＲは、ABI PRISM（登録商標）7000 Sequence Detection System（Applied Biosystems）を用いて行なった。温度条件は、反応溶液を５０℃で２分間処理し、さらに９５℃で１０分間処理した後に、９５℃で２０秒間および６０℃で１分間の処理を４８サイクルとした。【００７６】
（４）デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ
レチノイン酸（ＲＡ）で３週間処理したヒトＮＴｅｒａ２Ｄ１細胞に、各メチル化ｐＲＥＬＮ−Ｌｕｃ（０．２μｇ／ｔｅｓｔ）を、ウミシイタケルシフェラーゼを発現するｐｈＲＬ−ＴＫ（Promega社製）（０．０５μｇ／ｔｅｓｔ）とともに共トランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega社製）を用いてルシフェラーゼの活性を調べた。対照として、非メチル化ｐＲＥＬＮ−Ｌｕｃ（「ｐＲＥＬＮ−Ｌｕｃ（ｎｏ Ｍ）」）、ＳＶ４０プロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼを発現するｐＧＬ３−ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Promega社製）、およびプロモーターにもエンハンサーにも連結されていないホタルルシフェラーゼ配列を有するｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ（Promega社製）を用いた。【００７７】
（５）結果
メチル化の定量的評価の結果およびルシフェラーゼアッセイの結果を、図５に示す。図５の左側に示される棒グラフは、上述の２通りのリアルタイムＰＣＲにおけるシグナル強度の測定値から、（ターゲットＰＣＲにおける測定値）／（内部コントロールＰＣＲにおける測定値）を算出し、その値を棒グラフとして示したものである。図５の右側に示される棒グラフは、デュアルルシフェラーゼアッセイにおける蛍光の測定値を、（ホタルルシフェラーゼの測定値）／（ウミシイタケルシフェラーゼの測定値）を算出することにより標準化し、その値を棒グラフとして示したものである。図５によれば、プロモーター領域におけるメチル化度が高くなるにつれて、そのプロモーターの作用が弱くなり、発現効率が低下することが確認された。【００７８】
実施例４：躁うつ病患者、統合失調症患者および健常者からのリーリン遺伝子プロモーター領域内のＢｓｓＨ ＩＩ部位におけるメチル化の定量的評価
死亡した３５名の躁うつ病（bipolar disorder）患者（男性：１７名、女性：１８名、死亡年齢：１９〜６４歳、平均死亡年齢：４６歳）、死亡した３５名の統合失調症（schizophrenia）患者（男性：２６名、女性：９名、死亡年齢：１９〜５９歳、平均死亡年齢：４３歳）、および死亡した３５名の健常者（男性：２６名、女性：９名、死亡年齢：３１〜６０歳、平均死亡年齢：４５歳）の脳前頭葉からゲノムＤＮＡサンプルを採取し、各サンプルについて、リーリン遺伝子プロモーター領域内の特定のＢｓｓＨ ＩＩ部位におけるメチル化状態を定量的に評価した。具体的な手順および結果は、以下に示すとおりである。【００７９】
（１）ＤＮＡの制限酵素消化
ゲノムＤＮＡを、２種の制限酵素を用いて消化した。ここで、一方の制限酵素は、その認識配列が目的のメチル化部位を包含するメチル化感受性制限酵素ＢｓｓＨ ＩＩとし、他方の制限酵素は、その認識配列が前記メチル化部位の５’側および３’側に存在する制限酵素ＥｃｏＲ Ｉとした。具体的には、５００ｎｇのゲノムＤＮＡ、６ＵのＢｓｓＨ ＩＩ、６ＵのＥｃｏＲ Ｉ、５μｌの１０×Ｈ緩衝液、および蒸留水を含む５０μｌの反応溶液を調製し、得られた反応溶液を、通気下、３７℃で一晩インキュベートした。【００８０】
次いで、切断されたＤＮＡ断片をエタノール沈澱によって回収し、これをＴＥ溶液に溶解した。具体的には、上述のようにして得られた反応溶液に１００μｌのエタノール（１００％）および５μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムを添加し、これを−２０℃に２０分間置いた。この溶液を遠心分離（１７，８００×ｇ、４℃、１５分間）した後に上清を除去した。この溶液に２００μｌの７０％エタノールを添加し、遠心分離（１７，８００×ｇ、４℃、５分間）した後に、エタノールを完全に蒸発させた。得られた残渣を５０μｌのＴＥ溶液に溶解させた。この溶液中のＤＮＡ濃度は、２６０ｎｍでの吸光度測定（Dilution Facter: X20 (4:76ddw)）により決定した。【００８１】
（２）リアルタイムＰＣＲ
上述のようにして得られたＤＮＡ断片を鋳型として、２通りのリアルタイムＰＣＲを行なった。一方のＰＣＲ（内部コントロールＰＣＲ）では、ゲノムＤＮＡ上において上述のＢｓｓＨ ＩＩ部位から５’側および３’側に向かって最初に存在する２つのＥｃｏＲ Ｉにより挟まれたＥｃｏＲ Ｉ−ＥｃｏＲ Ｉ領域中の、目的のメチル化部位を含まない領域（対照領域）を増幅しうるプライマーペアを用いた。内部コントロールＰＣＲでは、増幅産物の量を示すシグナル発生手段として、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを用いた。他方のＰＣＲ（ターゲットＰＣＲ）では、前記ＥｃｏＲ Ｉ−ＥｃｏＲ Ｉ領域中の、目的のメチル化部位を含む領域（標的領域）を増幅しうるプライマーペアを用いた。ターゲットＰＣＲでは、増幅産物の量を示すシグナル発生手段として、ＴａｑＭａｎプローブを用いた。これらのＰＣＲに用いたプライマーおよびプローブのヌクレオチド配列は、以下のとおりである。【００８２】
内部コントロールＰＣＲ：
フォワード(RC-F1)：5'-GAACAGTCCGGCGAAGAGAG-3'（配列番号１）；
リバース(RC-R1)：5'-CAGAGCCTCATCTGTAGAGGATTT-3'（配列番号２）。
ターゲットＰＣＲ：
フォワード(RC-F3)：5'-CGGCGTCTCCAAAACTGAATGA-3'（配列番号３）；
リバース(RC-R3)：5'-GTGGGGTTGCCCGCAATATGCAG-3'（配列番号４）；
TaqManプローブ：5'-FAM-CTAGCGCTGTTGCTGGGGGCGACGCTG-TAMRA-3'（配列番号５）。【００８３】
内部コントロールＰＣＲのための反応溶液は、６０ｎｇの鋳型ＤＮＡ、それぞれ２００ｎＭの各プライマー、１２．５μｌの２×Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（SYBR Green PCR Master Mix: Applied Biosystems）、および蒸留水を含む計２５μｌの溶液とした。ターゲットＰＣＲのための反応溶液は、６０ｎｇの鋳型ＤＮＡ、それぞれ２００ｎＭの各プライマー、１００ｎＭのＴａｑＭａｎプローブ、１２．５μｌの２×Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（TaqMan Universal PCR Master Mix: Applied Biosystems）、および蒸留水を含む計２５μｌの溶液とした。【００８４】
リアルタイムＰＣＲは、ABI PRISM（登録商標）7000 Sequence Detection System（Applied Biosystems）を用いて行なった。温度条件は、反応溶液を５０℃で２分間処理し、さらに９５℃で１０分間処理した後に、９５℃で２０秒間および６０℃で１分間の処理を４８サイクルとした。【００８５】
（３）結果
上述の２通りのリアルタイムＰＣＲにおけるシグナル強度の測定値から、（ターゲットＰＣＲにおける測定値）／（内部コントロールＰＣＲにおける測定値）を算出し、その値を対数グラフ上にプロットした。その結果を図６に示す。図６において、縦軸はメチル化度を示し、横軸は被験者の死亡時の年齢を示している。また、各データは、３回の独立した実験の平均値を示している。【００８６】
図６Ａは、躁うつ病患者におけるメチル化度と死亡時年齢との関係を示す。図６Ｂは、統合失調症患者におけるメチル化度と死亡時年齢との関係を示す。図６Ｃは、健常者におけるメチル化度と死亡時年齢との関係を示す。図６Ａ、ＢおよびＣによれば、疾患群（躁うつ病患者および統合失調症患者）と健常者とでは分布像が異なっており、健常者では年齢とメチル化度との間に有意な相関が見られたのに対し、患者群ではこのような相関は見られない。また、疾患群では、比較的若い年代に高メチル化度を示すサンプルが存在する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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