(57)【要約】【課題】  超好熱菌由来の細胞抽出液を含む無細胞タンパク質翻訳系中または無細胞タンパク質転写・翻訳系中で、高温条件下でタンパク質を製造する方法を提供すること。【解決手段】  超好熱菌由来の細胞抽出液を含む無細胞タンパク質翻訳系中で、目的タンパク質をコードするmRNAの翻訳を高温条件下で行なわせてタンパク質を製造する。超好熱菌由来の細胞抽出液を含む無細胞タンパク質転写・翻訳系中で、目的タンパク質をコードするプラスミドの転写および翻訳を高温条件下で行なわせてタンパク質を製造する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
無細胞タンパク質翻訳系によりタンパク質を製造する方法であって、超好熱菌由来の細胞抽出液を含む無細胞タンパク質翻訳系中で、目的タンパク質をコードするmRNAの翻訳を高温条件下で行なわせてタンパク質を製造する方法。
【請求項２】
無細胞タンパク質翻訳系中に、目的タンパク質をコードするmRNA、Ｍｇ２＋およびアミノ酸が含有されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
さらにＮＨ４＋、Ｋ＋、ポリエチレングリコール、ATP再生系およびエネルギー源のうち、少なくとも１種以上の成分が含有されている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
細胞抽出液がThermococcus kodakaraensis KOD1株または該KOD1株より派生する株由来のものである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
目的タンパク質をコードするmRNAが、目的タンパク質をコードする塩基配列の上流に配列番号４に示すリボソーム結合配列を有する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
無細胞タンパク質翻訳系によりタンパク質を製造するためのキットであって、無細胞タンパク質翻訳系として、超好熱菌由来の細胞抽出液、目的タンパク質をコードするmRNA、Ｍｇ２＋およびアミノ酸が含有されている、前記mRNAの翻訳を高温条件下で行なわせてタンパク質を製造するためのキット。
【請求項７】
無細胞タンパク質翻訳系中に、さらにＮＨ４＋、Ｋ＋、ポリエチレングリコール、ATP再生系およびエネルギー源のうち、少なくとも１種以上の成分が含有されている、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
細胞抽出液がThermococcus kodakaraensis KOD1株または該KOD1株より派生する株由来のものである、請求項６または７に記載のキット。
【請求項９】
目的タンパク質をコードするmRNAが、目的タンパク質をコードする塩基配列の上流に配列番号４に示すリボソーム結合配列を有する、請求項６〜８のいずれかに記載のキット。
【請求項１０】
無細胞タンパク質転写・翻訳系によりタンパク質を製造する方法であって、超好熱菌由来の細胞抽出液を含む無細胞タンパク質転写・翻訳系中で、目的タンパク質をコードするプラスミドの転写および翻訳を高温条件下で行なわせてタンパク質を製造する方法。
【請求項１１】
無細胞タンパク質転写・翻訳系中に、目的タンパク質をコードするプラスミド、RNAポリメラーゼ、Ｍｇ２＋およびアミノ酸が含有されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
RNAポリメラーゼが高温条件下で至適温度を有するものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
細胞抽出液がThermococcus kodakaraensis KOD1株または該KOD1株より派生する株由来のものである、請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
目的タンパク質をコードするプラスミドが、上流から順にプロモーター、配列番号４に示すリボソーム結合配列および目的タンパク質をコードする塩基配列を含む、請求項１０〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
目的タンパク質をコードするプラスミドの転写および翻訳を高温条件下で行なわせるにあたり、転写温度を前記RNAポリメラーゼの至適温度に設定するとともに、翻訳温度を請求項１〜９のいずれかに記載の無細胞タンパク質翻訳系の至適温度に設定することを特徴とする、請求項１１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
無細胞タンパク質転写・翻訳系によりタンパク質を製造するためのキットであって、無細胞タンパク質転写・翻訳系として、超好熱菌由来の細胞抽出液、目的タンパク質をコードするプラスミド、RNAポリメラーゼ、Ｍｇ２＋およびアミノ酸を含有する、前記プラスミドの転写および翻訳を高温条件下で行なわせてタンパク質を製造するためのキット。
【請求項１７】
RNAポリメラーゼが高温条件下で至適温度を有するものである、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
細胞抽出液がThermococcus kodakaraensis KOD1株または該KOD1株より派生する株由来のものである、請求項１６または１７に記載のキット。
【請求項１９】
目的タンパク質をコードするプラスミドが、上流から順にプロモーター、配列番号４に示すリボソーム結合配列及び目的タンパク質をコードする塩基配列を含む、請求項１６〜１８のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高温条件下で、無細胞タンパク質翻訳系または無細胞タンパク質転写・翻訳系によりタンパク質を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
無細胞タンパク質合成系は、細胞抽出液を用いてタンパク質を合成する系であり、大腸菌などの生細胞を用いる系に比べ、タンパク質の合成および精製の操作が非常に簡便であることから、近年その需要が高まっている。この系を用いれば、系を容易に改変することができるので、産業上有用な細胞由来のタンパク質が得られるだけでなく、例えば、細胞にとって毒性の高いタンパク質、目的の変異を導入したタンパク質、非天然アミノ酸を導入したタンパク質なども得られる利点がある。【０００３】
細胞抽出液としては、主として大腸菌、小麦胚およびウサギ網赤血球由来のものが使用されている。従来から、これらの細胞抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系は、タンパク質の合成量が少ないという問題点が指摘されており、かかる問題点を解消するため、例えば、濃縮した細胞抽出液を使用する（特許文献１）、合成反応液中にタンパク質合成の鋳型にならない直鎖状核酸を特定の濃度で添加する（特許文献２）、などの技術が開示されている。【０００４】
また、上述した無細胞タンパク質合成系は常温でタンパク質の合成を行なうものであるが、例えば、鋳型DNAを分解するヌクレアーゼなど常温で合成困難なタンパク質を合成するため、低温で増殖可能なシュードモナス属微生物抽出液またはロドコッカス属微生物抽出液を用いて、低温条件下においてタンパク質を合成する無細胞タンパク質合成系が開示されている（特許文献３）。【０００５】
【特許文献１】特開２０００−１７５６９５号公報
【特許文献２】特開２００１−１３６９７１号公報
【特許文献３】特開２００４−２９０１８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述のように、大腸菌、小麦胚およびウサギ網赤血球由来の細胞抽出液を用いる常温での無細胞タンパク質合成系、前記大腸菌の近縁種由来の細胞抽出液を用いる低温での無細胞タンパク質合成系が開発されている。しかしながら、これまでに高温条件での無細胞タンパク質合成系は開示されていない。【０００７】
仮に高温条件での無細胞タンパク質合成系が確立できれば、従来の無細胞タンパク質合成系に比べてタンパク質の生成速度が向上する、常温で反応が起こりにくいため操作性が向上する、反応中に微生物が混入してもその影響が小さい、高温耐性のあるタンパク質の合成が可能となる、変異DNAライブラリーを導入することで高温耐性のあるタンパク質のスクリーニングが可能となる、などの効果が期待できる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで、本発明者らは、高温条件での無細胞タンパク質合成系を確立するために、超好熱菌の一種であるThermococcus kodakaraensis KOD1株に着目し、該菌株由来の細胞抽出液を含む反応液を用いて、タンパク質合成に適した反応条件を鋭意検討した結果、本発明を完成させるに至った。【０００９】
すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
〔１〕  無細胞タンパク質翻訳系によりタンパク質を製造する方法であって、超好熱菌由来の細胞抽出液を含む無細胞タンパク質翻訳系中で、目的タンパク質をコードするmRNAの翻訳を高温条件下で行なわせてタンパク質を製造する方法、
〔２〕  無細胞タンパク質翻訳系中に、目的タンパク質をコードするmRNA、Ｍｇ２＋およびアミノ酸が含有されている、〔１〕に記載の方法、
〔３〕  さらにＮＨ４＋、Ｋ＋、ポリエチレングリコール、ATP再生系およびエネルギー源のうち、少なくとも１種以上の成分が含有されている、〔２〕に記載の方法、
〔４〕  細胞抽出液がThermococcus kodakaraensis KOD1株または該KOD1株より派生する株由来のものである、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法、
〔５〕  目的タンパク質をコードするmRNAが、目的タンパク質をコードする塩基配列の上流に配列番号４に示すリボソーム結合配列を有する、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法、
〔６〕  無細胞タンパク質翻訳系によりタンパク質を製造するためのキットであって、無細胞タンパク質翻訳系として、超好熱菌由来の細胞抽出液、目的タンパク質をコードするmRNA、Ｍｇ２＋およびアミノ酸が含有されている、前記mRNAの翻訳を高温条件下で行なわせてタンパク質を製造するためのキット、
〔７〕  無細胞タンパク質翻訳系中に、さらにＮＨ４＋、Ｋ＋、ポリエチレングリコール、ATP再生系およびエネルギー源のうち、少なくとも１種以上の成分が含有されている、〔６〕に記載のキット、
〔８〕  細胞抽出液がThermococcus kodakaraensis KOD1株または該KOD1株より派生する株由来のものである、〔６〕または〔７〕に記載のキット、
〔９〕  目的タンパク質をコードするmRNAが、目的タンパク質をコードする塩基配列の上流に配列番号４に示すリボソーム結合配列を有する、〔６〕〜〔８〕のいずれかに記載のキット、
〔１０〕  無細胞タンパク質転写・翻訳系によりタンパク質を製造する方法であって、超好熱菌由来の細胞抽出液を含む無細胞タンパク質転写・翻訳系中で、目的タンパク質をコードするプラスミドの転写および翻訳を高温条件下で行なわせてタンパク質を製造する方法、
〔１１〕  無細胞タンパク質転写・翻訳系中に、目的タンパク質をコードするプラスミド、RNAポリメラーゼ、Ｍｇ２＋およびアミノ酸が含有されている、〔１０〕に記載の方法、
〔１２〕  RNAポリメラーゼが高温条件下で至適温度を有するものである、〔１１〕に記載の方法、
〔１３〕  細胞抽出液がThermococcus kodakaraensis KOD1株または該KOD1株より派生する株由来のものである、〔１０〕〜〔１２〕のいずれかに記載の方法、
〔１４〕  目的タンパク質をコードするプラスミドが、上流から順にプロモーター、配列番号４に示すリボソーム結合配列および目的タンパク質をコードする塩基配列を含む、〔１０〕〜〔１３〕のいずれかに記載の方法、
〔１５〕  目的タンパク質をコードするプラスミドの転写および翻訳を高温条件下で行なわせるにあたり、転写温度を前記RNAポリメラーゼの至適温度に設定するとともに、翻訳温度を〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の無細胞タンパク質翻訳系の至適温度に設定することを特徴とする、〔１１〕〜〔１４〕のいずれかに記載の方法、
〔１６〕  無細胞タンパク質転写・翻訳系によりタンパク質を製造するためのキットであって、無細胞タンパク質転写・翻訳系として、超好熱菌由来の細胞抽出液、目的タンパク質をコードするプラスミド、RNAポリメラーゼ、Ｍｇ２＋およびアミノ酸を含有する、前記プラスミドの転写および翻訳を高温条件下で行なわせてタンパク質を製造するためのキット、
〔１７〕  RNAポリメラーゼが高温条件下で至適温度を有するものである、〔１６〕に記載のキット、
〔１８〕  細胞抽出液がThermococcus kodakaraensis KOD1株または該KOD1株より派生する株由来のものである、〔１６〕または〔１７〕に記載のキット、
〔１９〕  目的タンパク質をコードするプラスミドが、上流から順にプロモーター、配列番号４に示すリボソーム結合配列及び目的タンパク質をコードする塩基配列を含む、〔１６〕〜〔１８〕のいずれかに記載のキット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、超好熱菌由来の細胞抽出液を含む無細胞タンパク質翻訳系中で、高温条件下でタンパク質を製造することができる。また、本発明によれば、超好熱菌由来の細胞抽出液を含む無細胞タンパク質転写・翻訳系中で、高温条件下でタンパク質を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】pTRC1の概略図およびChiAΔ4mRNAの調製方法の概要を示す図である。
【図２】表２に示す試料を用いてChiAΔ4の合成反応を行ない、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンブロット法により分析した結果である。
【図３】表３の試料１，３，４および９を用いてChiAΔ4の合成反応を行ない、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンブロット法により分析した結果である。
【図４】表３の試料１および５〜９を用いてChiAΔ4の合成反応を行ない、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンブロット法により分析した結果である。
【図５】表４の試料１と２を用いてChiAΔ4の合成反応を行ない、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンブロット法により分析した結果である。
【図６】表４の試料１および３〜５を用いてChiAΔ4の合成反応を行ない、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンブロット法により分析した結果である。
【図７】表４の試料２および６〜８を用いてChiAΔ4の合成反応を行ない、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンブロット法により分析した結果である。
【図８】表５の試料１〜９を用いてChiAΔ4の合成反応を行ない、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンブロット法により分析した結果である。
【図９】表５の試料２〜９を用いてChiAΔ4の合成反応を行ない、合成反応終了後におけるChiAΔ4の合成量を示す図である。
【図１０】表５の試料５，７および９を用いてChiAΔ4の合成反応を行ない、該ChiAΔ4の合成量の時間変化を示す図である。
【図１１】表６の試料１〜３を用いてChiAΔ4の合成反応を行ない、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンブロット法により分析した結果である。
【図１２】表６の試料４〜６を用いてChiAΔ4の合成反応を行ない、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンブロット法により分析した結果である。
【図１３】表７の試料１〜３および９を用いてChiAΔ4の合成反応を行ない、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンブロット法により分析した結果である。
【図１４】表７の試料４〜９を用いてChiAΔ4の合成反応を行ない、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンブロット法により分析した結果である。
【図１５】表８の試料１と９を用いてChiAΔ4の合成反応を行ない、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンブロット法により分析した結果である。
【図１６】表８の試料２，３および９を用いてChiAΔ4の合成反応を行ない、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンブロット法により分析した結果である。
【図１７】表８の試料４，５および９を用いてChiAΔ4の合成反応を行ない、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンブロット法により分析した結果である。
【図１８】表８の試料６および９を用いてChiAΔ4の合成反応を行ない、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンブロット法により分析した結果である。
【図１９】表９の試料１〜７を用いてChiAΔ4の合成反応を行ない、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンブロット法により分析した結果である。
【図２０】表１０の試料８と９を用いてChiAΔ4の合成反応を行ない、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンブロット法により分析した結果である。
【図２１】表１１の試料８を用いてChiAΔ4の合成反応を行ない、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンブロット法により分析した結果である。
【図２２】表１２の試料８を用いてChiAΔ4の合成反応を行ない、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンブロット法により分析した結果である。
【図２３】表１３の試料１〜４を用いてChiAΔ4の合成反応を行ない、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンブロット法により分析した結果である。
【図２４】「２．細胞抽出液の調製」に記載した各手順のうち、KOD1株の培養以後の各手順を番号付けしてまとめたプロトコールである。
【図２５】表１４の試料１〜５を用いてChiAΔ4の合成反応を行ない、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンブロット法により分析した結果である。
【図２６】表１５の試料１〜４を用いてChiAΔ4の合成反応を行ない、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンブロット法により分析した結果である。
【図２７】表１８の試料１〜４を用いてChiAΔ4の合成反応を行ない、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンブロット法により分析した結果である。
【図２８】表２０の試料１，２を用いてChiAΔ4の合成反応を行ない、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンブロット法により分析した結果である。
【図２９】S30FP-1G の調製用プロトコールである。
【図３０】表２１の試料１〜５を用いてChiAΔ4の合成反応を行ない、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンブロット法により分析した結果である。
【図３１】表２２の試料６〜１０を用いてChiAΔ4の合成反応を行ない、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンブロット法により分析した結果である。
【図３２】表２３の試料１〜５を用いてChiAΔ4の合成反応を行ない、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンブロット法により分析した結果である。
【図３３】表２４の試料１〜４を用いてChiAΔ4の合成反応を行ない、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンブロット法により分析した結果である。
【図３４】表２５の試料１〜６を用いてChiAΔ4の合成反応を行ない、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンブロット法により分析した結果である。
【図３５】表２７の試料１〜４を用いてChiAΔ4の合成反応を行ない、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンブロット法により分析した結果である。
【図３６】反応液中のＰＥＰ濃度と合成されたChiAΔ4 濃度との関係を示した図である。
【図３７】表２８の試料１〜１１を用いてChiAΔ4の合成反応を行ない、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンブロット法により分析した結果である。
【図３８】反応液中のＭｇ２＋濃度と合成されたChiAΔ4 濃度との関係を示した図である。
【図３９】表２９の試料１〜６を用いてChiAΔ4の合成反応を行ない、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンブロット法により分析した結果である。
【図４０】反応液中のＮＨ４＋濃度と合成されたChiAΔ4 濃度との関係を示した図である。
【図４１】表３０の試料１〜８を用いてChiAΔ4の合成反応を行ない、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンブロット法により分析した結果である。
【図４２】反応液中のアミノ酸濃度と合成されたChiAΔ4 濃度との関係を示した図である。
【図４３】表３１の試料１〜７を用いてChiAΔ4の合成反応を行ない、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンブロット法により分析した結果である。
【図４４】反応液中のポリエチレングリコール濃度と合成されたChiAΔ4 濃度との関係を示した図である。
【図４５】表３２の試料１〜１１を用いてChiAΔ4の合成反応を行ない、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンブロット法により分析した結果である。
【図４６】反応液中のＫ＋濃度と合成されたChiAΔ4 濃度との関係を示した図である。
【図４７】表３４の試料１〜５を用いてChiAΔ4の合成反応を行ない、合成反応終了後におけるChiAΔ4の合成量を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明について詳細に説明する。本発明は、無細胞タンパク質翻訳系によりタンパク質を製造する方法であって、超好熱菌由来の細胞抽出液を含む無細胞タンパク質翻訳系中で、目的タンパク質をコードするmRNAの翻訳を高温条件下で行なわせてタンパク質を製造する方法である。また、本発明は、無細胞タンパク質転写・翻訳系によりタンパク質を製造する方法であって、超好熱菌由来の細胞抽出液を含む無細胞タンパク質転写・翻訳系中で、目的タンパク質をコードするDNA（プラスミド）の転写および翻訳を高温条件下で行なわせてタンパク質を製造する方法である。【００１３】
本発明において「高温条件」とは、通常の微生物の至適増殖温度よりも高い温度をいい、無細胞タンパク質翻訳系によりタンパク質を製造する場合には、４０〜８５℃、好ましくは５５〜８０℃、より好ましくは５７〜７８℃の温度範囲をいい、無細胞タンパク質転写・翻訳系によりタンパク質を製造する場合には、４０〜８５℃、好ましくは４０〜８０℃、より好ましくは４０〜７５℃の温度範囲をいう。【００１４】
「無細胞タンパク質翻訳系」とは、生細胞由来の細胞抽出液と、目的タンパク質をコードするmRNA（該mRNAは前記細胞抽出液由来のものではなく、別途作製したもの）との共存下で、該mRNAの翻訳を介して該タンパク質を合成する系をいう。「無細胞タンパク質転写・翻訳系」とは、生細胞由来の細胞抽出液と、目的タンパク質をコードするDNA（該DNAは前記細胞抽出液由来のものではなく、別途作製したもの）との共存下で、該DNAを鋳型として転写および翻訳を介して、該タンパク質を合成する系をいう。以下の説明では、無細胞タンパク質翻訳系と無細胞タンパク質転写・翻訳系を特に区別しない場合、まとめて「無細胞タンパク質合成系」という。【００１５】
本発明において使用される「超好熱菌」とは、６０℃以上、好ましくは９０℃以上で生育する好熱細菌または好熱始原菌をいう。本発明に適用可能な超好熱菌は前記定義に該当する限り特に限定されない。現在１００種類以上の超好熱菌が分離・同定されており、これらはいずれも本発明に適用することができる。かかる超好熱菌としては、例えば、Aquifex pyrophilus，Geothermobacterium ferrireducens，Thermotoga maritima，Thermotoga neopolitana，Thermotoga petrophila，Thermotoga naphtophila，Acidianus infernus，Aeropyrum pernix，Archaeoglobus fulgidus，Archaeoglobus profundus，Caldivirga maquilingensis，Desulfurococcus amylolyticus，Desulfurococcus mobilis，Desulfurococcus mucosus，Ferroglobus placidus，Geoglobus ahangari，Hyperthermus butylicus，Ignicoccus islandicus，Ignicoccus pacificus，Methanococcus jannaschii，Methanococcus fervens，Methanococcus igneus，Methanococcus infernus，Methanopyrus kandleri，Methanothermus fervidus，Methanothermus sociabilis，Palaeococcus ferrophilus，Pyrobaculum aerophilum，Pyrobaculum calidifontis，Pyrobaculum islandicum，Pyrobaculum oguniense，Pyrococcus furiosus，Pyrococcus abyssi，Pyrococcus horikoshii，Pyrococcus woesei，Pyrodictium abyssi，Pyrodictium brockii，Pyrodictium occultum，Pyrolobus fumarii，Staphylothermus marinus，Stetteria hydrogenophila，Sulfolobus solfataricus，Sulfolobus shibatae，Sulfolobus tokodaii，Sulfophobococcus zilligii，Sulfurisphaera ohwakuensis，Thermococcus kodakaraensis，Thermococcus celer，Thermococcus litoralis，Thermodiscus maritimus，Thermofilum pendens，Thermoproteus tenax，Thermoproteus neutrophilus，Thermosphaera aggregans，Vulcanisaeta distributa，Vulcanisaeta souniana，Acidianus ambivalens，Acidianus brierleyi，Acidianus convivator，Acidianus manzaensis，Acidianus pozzuoliensis，Acidianus tengchongenses，Metallosphaera hakonensis，Metallosphaera prunae，Metallosphaera sedula，Stygiolobus azoricus，Sulfolobus acidocaldarius，Sulfolobus islandicus，Sulfolobus metallicus，Sulfolobus neozealandicus，Sulfolobus tengchongensis，Sulfolobus thuringiensis，Sulfolobus yangmingensis，Sulfurisphaera ohwakuensis，Caldisphaera lagunensis，Acidilobus aceticus，Caldivirga maquilingensis，Thermocladium modestius，Methanothermobacter thermautotrophicus，Methanothermobacter defluvii，Methanothermobacter marburgensis，Methanothermobacter thermoflexus，Methanothermobacter thermophilus，Methanothermobacter wolfeii，Methanothermococcus okinawensis，Methanothermococcus thermolithotrophicus，Picrophilus oshimae，Picrophilus torridus，Thermoplasma acidophilum，Thermoplasma volcanium，Halobacterium salinarium，Chlorobium tepidum，Chloroflexus aurantiacus，Heliothrix oregonensis，Thermomicrobium roseum，Ammonifex degensii，Anaerobranca gottschalkii，Bacillus thermooleovorans，Bacillus caldevelox，Bacillus thermoglucosidasius，Bacillus thermantarcticus，Bacillus thermoalkalophilus，Bacillus thermoamyloliquefaciens，Bacillus thermoamylovorans，Bacillus thermocloaceae，Bacillus thermoproteolyticus，Bacillus thermoterrestris，Bacillus thermozeamaize，Caldicellulosiruptor saccharolyticus，Carboxydothermus hydrogenoformans，Clostridium acetobutylicum，Clostridium caminithermale，Clostridium cellulose，Clostridium isatidis，Clostridium stercorarium，Clostridium straminisolvens，Clostridium thermoalcaliphilum，Clostridium thermobutyricum，Clostridium thermocellum，Clostridium thermopalmarium，Clostridium thermosuccinogenes，Coprothermobacter proteolyticus，Geobacillus kaustophilus，Geobacillus thermocatenulatus，Geobacillus thermodenitrificans，Geobacillus thermoglucosidasius，Geobacillus stearothermophilus，Geobacillus thermoleovorans，Heliobacterium modesticaldum，Moorella thermoacetica，Thermoanaerobacter acetoethylicus，Thermoanaerobacter brockii，Thermoanaerobacter ethanolicus，Thermoanaerobacter italicus，Thermoanaerobacter keratinophilus，Thermoanaerobacter kivui，Thermoanaerobacter mathranii，Thermoanaerobacter siderophilus，Thermoanaerobacter subterraneus，Thermoanaerobacter sulfurigignens，Thermoanaerobacter sulfurophilus，Thermoanaerobacter tengcongensis，Thermoanaerobacter thermocopriae，Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus，Thermoanaerobacter wiegelii，Thermoanaerobacter yonseiensis，Thermoanaerobacterium aotearoense，Thermoanaerobacterium bryantii，Thermoanaerobacterium polysaccharolyticum，Thermoanaerobacterium saccharolyticum，Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum，Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes，Thermoanaerobacterium xylanolyticum，Thermoanaerobacterium zeae，Thermovenabulum ferriorganovorum，Methylococcus capsulatus，Symbiobacterium thermophilum，Acidothermus cellulolyticus，Rubrobacter xylanophilus，Rubrobacter radiotolerans，Thermobifida fusca，Thermosynechococcus elongatus，Thermus antranikianii，Thermus aquaticus，Thermus brockianus，Thermus caldophilus，Thermus filiformis，Thermus igniterrae，Thermus kawarayensis，Thermus nonproteolyticus，Thermus oshimai，Thermus rehai，Thermus scotoductus，Thermus thermophilus，Deinococcus geothermalis，Persephonella marina，Sulfurihydrogenibium azorense，Dictyoglomus thermophilum，Thermodesulfobacterium commune，Thermodesulfovibrio yellowstoniiなどが挙げられる（例えば、跡見晴幸ら，生化学，第７５巻，第７号，pp.561-575，2003を参照）。【００１６】
本発明では、上記の超好熱菌のうち、実施例においてThermococcus kodakaraensis KOD1 株（以下、必要に応じて「KOD1株」という）とAeropyrum pernix Ｋ１株が使用されている。KOD1株は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターに寄託されており、その受託番号は、JCM 12380である。また、Aeropyrum pernix Ｋ１株も独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターに寄託されており、その受託番号は、JCM 9820である。【００１７】
本発明において製造し得るタンパク質は、超好熱菌に由来するタンパク質の他、非天然アミノ酸を導入したタンパク質、目的の変異を導入したタンパク質、複数のアミノ酸残基から構成される任意の分子量のペプチドも含む。超好熱菌由来のタンパク質は一般に耐熱性が高く、例えば、工業上の利用の点から、超好熱菌由来の耐熱性酵素などは本発明の目的に適したものといえる。【００１８】
細胞抽出液とは、リボソーム、tRNAなどのタンパク質合成に必要な成分を含む超好熱菌の抽出液をいう。この細胞抽出液は、Prattらの方法により調製することができる（Pratt，Transcription and Translation− a practical approach，Henes，B．D． and Higgins,S．J．ed．，pp.179-209，IRL Press，Oxford．，pp.179-209（1984））。具体的には、フレンチプレスによる破砕またはグラスビーズを用いた破砕などによって調製することができる。【００１９】
無細胞タンパク質翻訳系には、上述した細胞抽出液の他に、目的タンパク質をコードするmRNA、ATP再生系、ATP，GTP，CTP，UTPなどのエネルギー源、緩衝液、塩類、アミノ酸、RNアーゼ阻害剤、tRNA、ジチオスレイトール（DTT），スペルミン，スペルミジン，ポリエチレングリコール（例えば、PEG8000など）などの安定剤、抗菌剤などを含むことができる。無細胞タンパク質転写・翻訳系には、上述した成分をベースとして、目的タンパク質をコードするmRNAに代えて目的タンパク質をコードするプラスミドを含み、さらにRNAポリメラーゼを含むことができる。ここで、本発明において目的タンパク質をコードするmRNAおよび目的タンパク質をコードするプラスミドは、前記細胞抽出液由来のものではなく、別途作製したものをいう。【００２０】
ATP再生系は特に限定されず、公知のリン酸ドナーおよびキナーゼの組合わせを用いることができる。この組合わせとしては、例えば、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）とピルビン酸キナーゼ（PK）の組合わせ、クレアチンリン酸（CP）とクレアチンキナーゼ（CK）の組合わせ、アセチルリン酸（AP）とアセテートキナーゼ（AK）の組合わせなどが挙げられる。これらの組合わせからなるATP再生系を無細胞タンパク質合成系に添加すればよい。また、上記のキナーゼが細胞抽出液に内在する場合、上記のリン酸ドナーだけを無細胞タンパク質合成系に添加することもできる。【００２１】
緩衝液としては、当該技術分野で公知の緩衝液を用いればよく、例えば、Ｔｒｉｓ−酢酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液、Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨなどが挙げられる。塩類としては、当該技術分野で公知の塩類を用いればよく、例えば、酢酸塩（酢酸マグネシウム、酢酸アンモニウム、酢酸カリウムなど）、グルタミン酸塩などが挙げられる。抗菌剤としては、例えば、アジ化ナトリウム、アンピシリンなどが挙げられる。【００２２】
目的タンパク質をコードするプラスミドとしては、上流から順に、プロモーター、リボソーム結合配列（RBS）および目的タンパク質をコードする塩基配列を含むプラスミドが好適である。また、目的タンパク質をコードする塩基配列の下流には、転写反応を終結させるため、適当なターミネーターを導入してもよい。また、ターミネーターを導入しない場合は、あらかじめ適当な制限酵素で処理して切断断片としたものを用いてもよい（run off法）。本発明において使用し得るプラスミドは特に限定されず、公知のものが用いられ、公知の遺伝子工学的手法により、適当なプロモーターやRBS、その他必要に応じてターミネーターなどを適宜導入して用いることができる。【００２３】
プロモーターとしては、上述した細胞抽出液の調製の際に用いる超好熱菌が有する内在性のプロモーターを用いてもよいし、外来性のプロモーターを用いてもよい。内在性のプロモーターとしては、用いる超好熱菌の染色体DNAにコードされる遺伝子産物が大量生産され得る強力なプロモーターを適宜選択すればよく特に限定されない。超好熱菌としてKOD1株を用いる場合は、例えば、耐熱性グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（GDH）遺伝子の転写を制御するGDHプロモーターを用いることができる（R.N.Z.A.Rahman et al.,Mol Gen Genet．257．pp.338-449，（1998），特開2000-41680）。また、外来性のプロモーターを用いる場合は、上述した高温条件下で作用し得ることが必要とされるが、かかる条件を満たすプロモーターとしては、例えば、T7プロモーターが挙げられる。【００２４】
RBSとしては、上述した細胞抽出液の調製の際に用いる超好熱菌が有する内在性のRBSを適宜選択して用いることができる。本発明者らは、従来から、KOD1株に由来する数多くの遺伝子の単離および機能解析を行なっており、該遺伝子の開始コドンの上流配列を数多く比較した結果、KOD1株のRBSのコンセンサス配列は、5’−GG(T/A)G(A/G)(T/G)−3’（配列番号４）であると推定している。したがって、超好熱菌としてKOD1株を用いる場合は、配列番号４の塩基配列に基づいてRBSを適宜選択することができる。
後述する実施例では、上述した耐熱性グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（GDH）遺伝子のRBS（5’−GGTGGT−3’，配列番号５）を使用している。【００２５】
目的タンパク質は、上述したように特に限定されないが、本発明における無細胞タンパク質合成系の挙動を知るためには、その特性が理解されているタンパク質をコードするレポーター遺伝子を標的遺伝子として発現させて、当該系の効率などを評価する必要がある。そこで、本発明者らは、後述する実施例において説明するように、KOD1株由来のキチナーゼ（配列番号１）に着目し、その部分欠失断片（ChiAΔ4，配列番号２）をコードする遺伝子をレポーター遺伝子として用いることにした。本発明者らは、従来から、KOD1株由来の数多くのタンパク質を単離してその機能解析を行なっており、そのうちキチナーゼについても単離および機能解析を行なっている（特開平１１−３１３６８８号）。そして、本発明者らの検討によれば、配列番号１の９１０番目のGlyをMetに置換し、これをＮ末端として、その下流の９１１〜１２１５番目のアミノ酸残基からなる部分欠失断片（ChiAΔ4，配列番号２）は、１００℃で３時間の熱処理後においても７０％以上の残存活性を示すなど極めて高い熱安定性を有する。そこで、本発明では、上述した高温条件下でタンパク質の合成を行なうことを考慮して、レポーター遺伝子としてChiAΔ4をコードする遺伝子を選択して、合成されたChiAΔ4の分析を通じて無細胞タンパク質合成系の効率を検討することにした。【００２６】
ターミネーターとしては、上述した細胞抽出液の調製の際に用いる超好熱菌が有する内在性のターミネーターを用いてもよいし、外来性の公知のターミネーターを用いてもよい。外来性のターミネーターを用いる場合は、使用するプロモーターとの組合わせを考慮して適宜選択することができる。例えば、外来性のプロモーターとしてT7プロモーターを用いる場合、外来性のターミネーターとしてT7ターミネーターを選択することができる。【００２７】
目的タンパク質をコードするmRNAとしては、目的タンパク質をコードする塩基配列の上流にリボソーム結合配列（RBS）を有するmRNAが好適である。ここで、目的タンパク質をコードする塩基配列およびリボソーム結合配列については、上述した目的タンパク質をコードするプラスミドと同様の基準で適宜選択することができる。本発明で用いるmRNAは、例えば、まず、上述したプラスミドを作製し、その後該プラスミドを転写させることにより容易に作製することができる。【００２８】
RNAポリメラーゼとしては、高温条件下で至適温度を有するものが好適である。ここで、「高温条件」とは、４０℃以上、好ましくは５０℃以上、更に好ましくは６０℃以上をいう。上記特性を示すRNAポリメラーゼとしては、上述した細胞抽出液の調製の際に用いる超好熱菌由来のRNAポリメラーゼを用いてもよいし、外来性のRNAポリメラーゼを用いてもよい。RNAポリメラーゼは、上述したプロモーターとの組合わせを考慮して適宜選択すればよく、例えば、プロモーターとしてT7プロモーターを用いる場合は、RNAポリメラーゼとしてT7RNAポリメラーゼ（例えば、Thermo T7 RNA Polymerase，東洋紡績社）を選択することができる。【００２９】
無細胞タンパク質翻訳系によりタンパク質を製造する場合、超好熱菌由来の細胞抽出液の他に上述したように種々の成分を添加して反応液を調製することができる。そして、該成分のうち、細胞抽出液、目的タンパク質をコードするmRNA、Ｍｇ２＋および２０種のアミノ酸が反応液中に含まれていれば目的タンパク質を製造することができる。また、上記成分に加えてＮＨ４＋、Ｋ＋、ポリエチレングリコール、ATP再生系およびエネルギー源のうち、少なくとも１種以上の成分が反応液中に含まれていれば、目的タンパク質の発現量を増加させることができる。上記各成分の濃度は、用いる細胞抽出液、反応温度、反応時間、反応スケールなどに応じて適宜設定することができる。【００３０】
また、無細胞タンパク質翻訳系を用いて目的タンパク質の発現量を増加させるには、それに適した細胞抽出液を調製することが好ましい。ここで、超好熱菌由来の細胞抽出液は、菌体を培養する工程、培養した菌体を人工海水に懸濁する工程、該菌体懸濁液の破砕工程、破砕後のライセートに表１に記載のPre-incubation mixを添加してインキュベーションを行なう工程（以下、該工程を「プレインキュベーション」という場合がある）及びその後の透析工程等を含み、大腸菌由来の細胞抽出液と概ね同様の方法で調製することができる。本発明では、上記の工程のうち、菌体の破砕手段としてフレンチプレスを用いる場合、菌体の破砕が効率よく行なわれる限りにおいては、プレス時の圧力をできるだけ小さくすること、プレス回数をできるだけ少なくすること、または菌体の懸濁液としてできるだけ浸透圧の低い低張液を用いることが好ましい。また、破砕後のライセートにはプレインキュベーションおよび透析をしない方が好ましい。本発明では、上記好ましいとされる工程のうち、１ないし複数の工程を採用することにより、目的タンパク質の発現量を増加させるのに適した細胞抽出液を調製することができる。【００３１】
具体的には、例えば、KOD1株由来の細胞抽出液を調製するにあたり培養後の菌体の破砕手段としてフレンチプレスを用いる場合、プレス時の圧力は７，０００〜８，０００p.s.iが好ましく、プレス回数は１回が好ましく、菌体の懸濁液は後記「２．細胞抽出液の調製」に記載のＳ３０バッファーが好ましく、破砕後のライセートにはプレインキュベーションおよび透析をしない方が好ましい。そして、上記好ましい実施態様でKOD1株由来の細胞抽出液を調製した場合、目的タンパク質をバッチ式で６μｇ／ｍｌ以上製造することができる。【００３２】
さらに、本発明では上述した各種の添加成分のうち、１ないし複数の成分濃度を好適化した反応液を用いることにより、目的タンパク質の発現量をさらに増加させることができる。具体的には、Ｍｇ２＋の好適濃度は０．５〜６ｍＭであり、さらに好ましくは２〜４ｍＭである。Ｋ＋の好適濃度は１００〜４５０ｍＭであり、さらに好ましくは１７０〜３５０ｍＭである。ＮＨ４＋の好適濃度は５０〜１２０ｍＭであり、さらに好ましくは６５〜１００ｍＭである。２０種のアミノ酸の好適濃度は１〜７ｍＭであり、さらに好ましくは２〜７ｍＭである。ホスホエノールピルビン酸の好適濃度は２．５〜２５ｍＭであり、さらに好ましくは５〜２０ｍＭである。ポリエチレングリコールの好適濃度は０〜２．５％(w/v)である。なお、上記各成分の濃度は反応液中の最終濃度である。【００３３】
そして、本発明では、上述したように、目的タンパク質の発現量を増加させるのに好ましい実施態様でKOD1株由来の細胞抽出液を調製し、かつ上記各成分を好適濃度に設定した場合、目的タンパク質を６０μｇ／ｍｌ以上製造することができる。【００３４】
無細胞タンパク質転写・翻訳系によりタンパク質を製造する場合、超好熱菌由来の細胞抽出液の他に上述したように種々の成分を添加して反応液を調製することができる。そして、該成分のうち、細胞抽出液、目的タンパク質をコードするプラスミド、RNAポリメラーゼ、Ｍｇ２＋および２０種のアミノ酸が反応液中に含まれていれば目的タンパク質を製造することができる。また、上記成分に加えてＮＨ４＋、Ｋ＋、ポリエチレングリコール、ATP再生系およびエネルギー源のうち、少なくとも１種以上の成分が反応液中に含まれていれば、目的タンパク質の発現量を増加させることができる。上記各成分の濃度は、用いる細胞抽出液、反応温度、反応時間、反応スケールなどに応じて適宜設定することができる。【００３５】
無細胞タンパク質転写・翻訳系は、転写と翻訳を組合わせた反応であるので、目的タンパク質を効率的に発現させるには、転写反応と翻訳反応とで反応温度を分けて考え、各反応において当該反応に適した温度を設定することができる（以下、「第１の温度設定基準」という）。転写反応の温度設定は、反応液中のRNAポリメラーゼの至適温度に合わせて設定され得る。また、翻訳反応の温度設定は、翻訳反応が効率よく進行する温度、すなわち、上述した無細胞タンパク質翻訳系により目的タンパク質をコードするmRNAを用いてタンパク質を発現させたときに、該タンパク質が効率的に発現し得る温度（以下、かかる温度を「翻訳反応の至適温度」という）に合わせて設定され得る。ここで、転写反応と翻訳反応のそれぞれの至適温度は、目的タンパク質を最も効率的に発現し得る温度（以下、かかる温度を「最適温度」という）を含めて、ともに通常５〜１５℃程度の温度幅を有する。したがって、転写反応と翻訳反応のそれぞれの至適温度が部分的に重複する場合には、転写反応と翻訳反応とで反応温度を同一に設定にして（すなわち、前記重複温度に設定して）目的タンパク質を発現させることもできる。【００３６】
また、転写反応と翻訳反応とで反応温度を分けて考えることなく、転写反応と翻訳反応とで反応温度を同一に設定して目的タンパク質を発現させることもできる（以下、「第２の温度設定基準」という）。すなわち、各反応において当該反応に適した至適温度があり、かつ各反応の至適温度が重ならないときでも、各反応の至適温度の略中間温度を設定すれば、該温度で転写反応と翻訳反応を行なわせて目的タンパク質を発現させることができる。【００３７】
現状入手し得る耐熱性のRNAポリメラーゼの至適温度は４５〜５０℃であり、超好熱菌（例えば、KOD1株）由来の細胞抽出液を用いた場合の無細胞タンパク質翻訳系の至適温度は６０〜７０℃である。このことから、本発明において無細胞タンパク質転写・翻訳系におけるタンパク質合成を効率よく進めるには、第１の温度設定基準に基づけば、転写温度を４５〜５０℃に設定するとともに、翻訳温度を６０〜７０℃に設定すればよい。また、第２の温度設定基準に基づけば、転写温度と翻訳温度をともに約５０℃に設定すればよい。【００３８】
なお、無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の合成は、上述した反応液を一つの容器中に混合して行なう公知のバッチ法を用いることができる。また、タンパク質の発現量を増やすには、前記無細胞タンパク質合成系に、アミノ酸、ATP、GTPなどの反応基質を限外ろ過膜を介して連続的に供給することによって反応を行なわせるなどの公知の連続法を用いてもよいし、あるいは濃縮した細胞抽出液を用いることもできる。【００３９】
本発明は、上述した本発明の方法により目的タンパク質を製造するためのキットをも包含する。該キットとしては、無細胞タンパク質翻訳系によりタンパク質を製造するためのキットおよび無細胞タンパク質転写・翻訳系によりタンパク質を製造するためのキットが含まれる。前者のキットは、少なくとも超好熱菌由来の細胞抽出液、目的タンパク質をコードするmRNA、Ｍｇ２＋およびアミノ酸を含有する。後者のキットは、少なくとも超好熱菌由来の細胞抽出液、目的タンパク質をコードするプラスミド、RNAポリメラーゼ、Ｍｇ２＋およびアミノ酸を含有する。さらに、これらの試薬はそれぞれ独立した形態で供してもよいし、あるいは２種以上組合わせた形態で供することもできる。【００４０】
本発明の方法により製造されたタンパク質の精製は、生細胞からの分離と比べて混在する汚染物質の量および種類が格段に少ないため、比較的容易に行なうことができる。精製法としては、例えば、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、電気泳動など従来公知のものを単独でまたは適宜組合わせて用いることができる。
【実施例】
【００４１】
以下、本発明の実施例として、KOD1株由来の超耐熱性キチナーゼ（配列番号１）のうち、９１０番目のGlyをMetに置換し、これをＮ末端として、その下流の９１１〜１２１５番目のアミノ酸残基からなる部分欠失断片（ChiAΔ4，配列番号２）を目的タンパク質として、本発明の方法について検討した結果を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。【００４２】
１．ChiAΔ4をコードするプラスミドとmRNAの作製
無細胞タンパク質転写・翻訳系によりChiAΔ4を合成するため、ChiAΔ4をコードする遺伝子の上流にT7プロモーターとグルタミン酸脱水素酵素（GDH）のリボソーム結合配列（RBS）を組み込んだプラスミド（pTRC1）を作製した。また、無細胞タンパク質翻訳系によりChiAΔ4を合成するため、上記で得られた無細胞タンパク質転写・翻訳用プラスミド（pTRC1）を転写させて無細胞タンパク質翻訳用mRNA（ChiAΔ4mRNA ）を作製した。【００４３】
1.1  T7プロモーターを組み込んだプラスミドの作製
プラスミドpUC118内に存在する制限酵素認識配列XbaIを除去した。具体的には、まずpUC118をXbaIで処理し、次いでBlunting Highキット（東洋紡績社）を用いて、使用説明書にしたがってXbaI切断断片を平滑化し、その後得られた平滑末端を結合させた。【００４４】
つぎに、プラスミドpET-21a（Novagen社）をBglIIおよびEcoRIで二重消化して、T7プロモーターを含むDNA断片（配列番号３）を切り出した。そして、XbaIの認識配列が除去された前記pUC118をBamHIおよびEcoRIで二重消化し、T7プロモーターを含む前記DNA断片と結合させた。以下、得られたプラスミドを「pT」という。【００４５】
1.2  RBSを含むDNA断片の作製
グルタミン酸脱水素酵素（GDH）のリボソーム結合配列（RBS）（配列番号５）を含むDNA断片を作製するため、以下のことを行なった。すなわち、XbaIの認識配列を含むオリゴDNA（5’−AAAATCTAGACGCAGATTACCGAAATGAGGT−3’，配列番号６）とNdeIの認識配列を含むオリゴDNA（5’−AAAACATATGTACCACCTCATTTCGGTAATCTGCG−3’，配列番号７）を合成して、それぞれのオリゴDNAをアニーリングし、前記RBSを含むDNA断片（配列番号８）を作製した。その後、このDNA断片をPCRにより増幅し、得られた増幅断片をXbaIおよびNdeIで二重消化した。以下、得られた切断断片（配列番号９）を「RBS断片」という。【００４６】
1.3  ChiAΔ4を含むDNA断片の作製
ChiAΔ4を含むDNA断片は、KOD1株の染色体DNAを鋳型として、後述する２種類のプライマーを用いてChiAΔ4遺伝子をPCRにより増幅させることにより作製した。以下では、まずKOD1株の染色体DNAの調製方法について説明する。【００４７】
（KOD1株の染色体DNAの調製）
人工海水（１．６％ＮａＣｌ、０．２４％ＭｇＣｌ２・６Ｈ２０、０．４８％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０、０．４８％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０８％ＮａＨＣＯ３、０．０１６％ＣａＣｌ２・２Ｈ２０、０．０４％ＫＣｌ、０．０３３６％ＫＨ２ＰＯ４、０．００４％ＮａＢｒ、０．００１６％ＳｒＣｌ２・６Ｈ２０、０．０００８％Ｆｅ（ＮＨ４）２Ｈ（Ｃ６Ｈ５０７）２）、０．５％酵母エキス及び０．５％トリプトンからなる培地を２リットル容の培養ボトルに入れ、オートクレーブ（１２１℃、２ａｔｏｍ、２０分間）で滅菌処理を行なった。滅菌処理された前記培地に対して硫黄を０．１％添加し、この培地１００ｍｌにKOD1株を接種して培養を行なった。培養は８５℃で約１６時間嫌気的に行なった。培養終了後、培養液を８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより菌体を回収した。回収した菌体から上清を除去した後、該菌体を前記人工海水に懸濁し、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する操作を２回繰り返して菌体を洗浄した。【００４８】
洗浄後の菌体５ｇをＴＥ緩衝液Ａ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１０ｍＭ ＥＤＴＡ）１．６ｍｌに懸濁し、この懸濁液に１０％ドデシル硫酸ナトリウム２０μｌとプロテイナーゼＫ ２０μｌを添加し、５５℃で１時間反応させた。次に、前記懸濁液に中性フェノールを１ｍｌ添加して１０分間混合した。得られた混合液を２０，０００×ｇで１０分間遠心分離した後、上層にある水層部分を取り出した。取り出した水層と等量（約１．５ｍｌ）のＰＣＩ（フェノール／クロロホルム／イソプロピルアルコール）（５０：４８：２ ％（ｖ／ｖ））を添加して１０分間混合し、得られた混合液を２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、次いで上層にある水層部分を取り出した。取り出した水層にエタノール約３ｍｌと３Ｍ 酢酸ナトリウム溶液１５０μｌを添加し、−２０℃で３０分間静置した。そして、静置後の混合液を２０，０００×ｇで１０分間遠心分離することにより核酸の沈殿を得た。【００４９】
この沈殿に７０％エタノールを５ｍｌ添加し、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離を行って核酸をリンスした。上清を除去後、沈殿を乾燥させ、該乾燥した沈殿にＴＥ緩衝液Ｂ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ）を４００μｌ添加して核酸を溶解した。次に、得られた核酸溶液４００μｌにリボヌクレアーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）を４μｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。反応終了後の核酸溶液に前記ＰＣＩを４００μｌ添加して５分間混合した。この混合液を２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、水層部分を取り出した。そして、前記ＰＣＩの添加、遠心分離、水層部分の取り出し操作を再度行なった。取り出した水層部分（約４００μｌ）にエタノール約３ｍｌと３Ｍ 酢酸ナトリウム溶液４０μｌを添加し、−２０℃で３０分間静置した。【００５０】
静置処理した溶液を２０，０００×gで１０分間遠心分離してDNAの沈殿を得た。この沈殿に７０％エタノールを０．５ｍｌ添加し、次いで２０，０００×gで１０分間遠心分離を行った。上清を除去した後、沈殿を乾燥させ、ＴＥ緩衝液Ｂ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ）を２００μｌ添加することにより染色体DNAを得た。【００５１】
（ChiAΔ4 遺伝子の増幅）
NdeIの認識配列を含むプライマーChiA-Nd（5’−AAAACATATGCTTCCCGAGCACTTCTTCGCCC−3’，配列番号１０）およびEcoRIの認識配列を含むプライマーChiA-T1（5’−AAAAGAATTCTCCAATTTCATTATGGAC−3’，配列番号１１）を使用して、上記で得られた染色体DNAを鋳型としてPCRを行ない、ChiAΔ4遺伝子のDNA断片を増幅した。PCRは、上記で調製した染色体DNA（４００ｎｇ）、各プライマー２０ｐmol及びKOD-plus-DNAポリメラーゼ（東洋紡績社製）を含む５０μｌの反応液中で、まず９４℃で１８０秒間反応させ、９４℃で１５秒間、６３℃で３０秒間および７２℃で６０秒間のサイクルを２５回繰り返し、最後に７２℃で３００秒間反応させた。続いて、得られた増幅断片をNdeIおよびEcoRIで二重消化した。以下、得られた切断断片を「ChiAΔ4 断片」という。【００５２】
1.4  ChiAΔ4 をコードするプラスミド（pTRC1）の作製
上記で得られたプラスミドpTをXbaIおよびEcoRIで二重消化した。そして、得られた切断断片、上述したRBS断片およびChiAΔ4 断片をそれぞれ混合し、それぞれのDNA断片を結合することにより、ChiAΔ4 をコードするプラスミドpTRC1を作製した。得られたpTRC1の概略図を図１に示す。【００５３】
1.5   ChiAΔ4 をコードするmRNA（ChiAΔ4mRNA）の作製
上述したpTRC1をEcoRIで処理して、得られたEcoRI処理断片を鋳型としてT7 RNA合成キット（T7 RiboMAXTMExpress Large Scale RNA Production System（Promega社））を使用して、付属のプロトコールにしたがってpTRC1の転写産物であるChiAΔ4mRNA を作製した。ChiAΔmRNAの調製方法の概要を図１に示す。【００５４】
２．細胞抽出液の調製
細胞抽出液は、KOD１株を培養し、得られた菌体を回収・洗浄し、Pre-incubation Mixを添加すること等により調製した。具体的には、前記の人工海水に０．５％ピルビン酸ナトリウムを添加した培地を３リットル容の培養ボトルに入れ、オートクレーブ（１２１℃、２ａｔｏｍ、２０分間）で滅菌処理を行なった。滅菌処理された前記培地に対してKOD1株を接種して培養を行なった。培養は８５℃で約１６時間嫌気的に行なった。【００５５】
培養終了後、得られた培養物を、４℃、６，０００×ｇで１０分間遠心分離を行なうことで菌体を集菌した。つぎに、集菌した菌体を上述した人工海水に懸濁し、４℃、６，０００×ｇで５分間遠心分離を行なうことで菌体を洗浄した。そして、洗浄した菌体を人工海水に再度懸濁し、あらかじめ重量を測定しておいた遠沈管に移し、４℃、６，０００×ｇで１０分間遠心分離を行ない、上清を除去した後の菌体の重量を測定した（菌体量４．７８ｇ）。これ以降の操作は全てRNase-freeの条件で行なった。得られた菌体を１．２７ｍｌ／ｇの人工海水で懸濁し、vortexで緩やかに混合した。そして、この懸濁液をフレンチプレスに移し、１０，０００p.s.i，３回の条件でプレスした。得られたライセートを遠心チューブに移し、該ライセート１０ｍｌあたり０．１ＭのＤＴＴを１００ｍｌ加えてから、４℃、３０，０００×ｇで３０分間遠心分離した。上清を分取し、該分取した上清を４℃、３０，０００×ｇで３０分間遠心分離した。そして、上清の８０％を分取し、該分取した上清１ｍｌあたり表１に示すPre-incubation Mixを０．３ｍｌ添加した。この混合物を３７℃で８０分間インキュベーションし、進行中のmRNAの翻訳を終了させた。インキュベーション終了後、前記混合物をＳ３０バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７．４），１．０ｍＭ ＤＴＴ，１４ｍＭ 酢酸マグネシウム，６０ｍＭ 酢酸カリウム）で透析した（４５分間、３回）。透析後の混合物を４，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を分取し、これを本発明に使用する細胞抽出液とした（タンパク濃度：３４ｍｇ／ｍｌ）。【００５６】
【表１】
2006109751.tif 000002
【００５７】
３．無細胞タンパク質合成反応およびその解析
後述する無細胞タンパク質合成反応は、上記細胞抽出液と後述する各種試薬を氷上にて混合して反応液を調製し、PCR装置を用いて反応温度を一定に保持することにより行なった。そして、所定時間経過後、反応液を氷上にて静置することにより合成反応を終了させ、反応結果を次に示すウェスタンブロット法により解析した。まず、無細胞タンパク質合成反応終了後の溶液をミリＱ水を用いて３０倍に希釈した。希釈後の溶液について、常法にしたがってＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なった（アクリルアミド濃度１２．５％）。泳動終了後、ホライズブロット（アトー社）を用いてゲル中の試料をＰＶＤＦ膜（Hybond−P、Amersham Biosciences社）に転写した。次に、このＰＶＤＦ膜に、一次抗体として抗ウサギChiAΔ4抗体を加え、室温で１時間インキュベートした。ついで二次抗体としてHRP−rec−ProteinG（Zymed社）を加え、室温で１時間インキュベートした。そして、二次抗体をインキュベートしたＰＶＤＦ膜に、ECL Advance Western Blot Detection Kit（Amersham Biosciences社）を使用して、使用説明書に記載の反応条件にしたがって化学発光を行なわせた。目的バンドはHyperfilm ECL（Amersham Biosciences社）を使用して検出した。なお、前記抗ウサギChiAΔ4抗体は、特開平１１−３１３６８８号公報に記載の方法にしたがって得られた精製ChiAΔ4を抗原とし、ウサギを免疫動物として常法にしたがって作製したポリクローナル抗体である。【００５８】
４．無細胞タンパク質翻訳系
4.1  ChiAΔ4mRNAの影響
ChiAΔ4mRNAを用いたタンパク質翻訳反応は、表２に示す試薬，組成および終濃度の試料を用いて、反応液の全量を３０μｌとして、４８℃で９０分間行なった。なお、表２のT.kodakaraensis tRNAは、まずKOD1株を上述した方法で培養し、得られた培養液から回収した菌体を、Nucleobond AX（Macherey-Nagel社）を使用して、付属のプロトコールにしたがって単離したものである。また、T.kodakaraensis tRNAは以後の実験でも同じものを使用した。結果を図２に示す。図２においてレーン１〜４およびＣ（対照試料）は表２の各試料番号に対応している。図２において矢印で示した３３．８kDaのバンドはChiAΔ4であり、レーン１〜４のすべてにChiAΔ4のバンドが確認されたが、レーンＣにはChiAΔ4のバンドが認められなかった。このことから、ChiAΔ4mRNAはChiAΔ4を合成するための必須成分であることがわかり、レーン２，３および４の比較から、ChiAΔ4mRNAの濃度を増やすことによりChiAΔ4の合成量が増加することがわかった。【００５９】
【表２】
2006109751.tif 000003
【００６０】
4.2  反応温度の影響
ChiAΔ4の合成反応における反応温度の影響を検討するため、表３の試料１，３，４に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を３０μｌとして、４８℃または６８℃で９０分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。なお、試料９は、ChiAΔ4mRNAを添加していない対照試料である。結果を図３に示す。図３においてレーン１，３，４およびレーン９は表３の各試料番号に対応しており、レーンＣは分子量マーカーとしてのEscherichia coli由来のChiAΔ4を示す。なお、このE.coli由来のChiAΔ4は、特開平１１?３１３６８８号公報に記載されているように、ChiAΔ4発現ベクターを有する大腸菌を培養・集菌・破砕・熱処理して粗酵素液を取得し、次いで該粗酵素液を陰イオン交換カラムおよびゲル濾過カラムにかけるとともに、SDS-PAGEで単一バンドとして観察されるまで精製したものである。また、E.coli由来のChiAΔ4は以後の実験でも同じものを使用した。図３においてレーン１，３，４のすべてにChiAΔ4のバンドが確認され、各レーンの比較から、反応温度が高くなるほど、具体的には４８℃よりも６８℃の方がChiAΔ4の合成量が増加することがわかった。また、レーン１においてChiAΔ4の合成が確認されたこと、さらに、レーン３とレーン４のChiAΔ4のバンド量が同等であることから、tRNA（本実験では、T.kodakaraensis tRNA）はChiAΔ4の翻訳反応に影響を及ぼさないといえる。【００６１】
4.3  マグネシウムイオンの影響
ChiAΔ4の合成反応におけるマグネシウムイオン濃度の影響を検討するため、表３の試料１および５〜８に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を３０μｌとして、４８℃で９０分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。なお、試料９はChiAΔ4mRNAを添加していない対照試料である。結果を図４に示す。図４においてレーン１，５〜８は表３の各試料番号に対応しており、レーンＣは分子量マーカーとしてのE.coli由来のChiAΔ4を示す。図４においてレーン１，５〜７にはChiAΔ4のバンドが確認されたが、レーン８にはChiAΔ4のバンドが確認されなかった。このことから、マグネシウムイオン濃度が増加するとChiAΔ4の合成量が増加すること、その好適な濃度は５〜１０ｍＭであるが、２５ｍＭを超えると翻訳反応が阻害されChiAΔ4が合成されないことがわかった。【００６２】
【表３】
2006109751.tif 000004
【００６３】
4.4  ポリエチレングリコールの影響１
ChiAΔ4の合成反応におけるポリエチレングリコールの影響を検討するため、表４の試料１，２に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を３０μｌとして、６８℃で９０分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。結果を図５に示す。図５においてレーン１とレーン２は表４の各試料番号に対応しており、レーンＣは分子量マーカーとしてのE.coli由来のChiAΔ4を示す。図５においてレーン１（PEG8000：０％）に比べてレーン２（PEG8000：２％）の方がChiAΔ4の合成量が増えていることから、ポリエチレングリコールを添加すると、ChiAΔ4の合成量が増加することがわかった。【００６４】
4.5  スペルミン、スペルミジンの影響
ChiAΔ4の合成反応におけるスペルミンとスペルミジンの影響を検討するため、表４の試料１および３〜５に示す試薬、組成および終濃度で、反応液の全量を３０μｌとして、６８℃で９０分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。結果を図６に示す。図６においてレーン１，３〜５は表４の各試料番号に対応しており、レーンＣは分子量マーカーとしてのE.coli由来のChiAΔ4を示す。図６において、レーン３〜５におけるChiAΔ4のバンドに有意差が認められないことから、スペルミンまたはスペルミジンは翻訳反応に影響を及ぼさないことがわかった。【００６５】
4.6  ナトリウムイオンの影響
ChiAΔ4の合成反応におけるナトリウムイオンの影響を検討するため、表４の試料２および６〜８に示す試薬、組成および終濃度で、反応液の全量を３０μｌとして、６８℃で９０分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。結果を図７に示す。図７においてレーン２，６〜８は表４の各試料番号に対応しており、レーンＣは分子量マーカーとしてのE.coli由来のChiAΔ4を示す。図７においてレーン２（Ｎａ＋：０ｍＭ）に比べてレーン６（Ｎａ＋：１００ｍＭ）、レーン７（Ｎａ＋：３００ｍＭ）、レーン８（Ｎａ＋：５００ｍＭ）の方がChiAΔ4の合成量が少ないことから、ナトリウムイオンは翻訳反応に正の影響を及ぼさないことがわかった。【００６６】
【表４】
2006109751.tif 000005
【００６７】
4.7  反応温度の最適化の検討
ChiAΔ4の合成反応における反応温度の影響を検討するため、表５の試料１〜９に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を３０μｌとして、３０〜８０℃で９０分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。なお、試料１は、ChiAΔ4mRNAを添加していない対照試料である。結果を図８に示す。図８においてレーン１〜９は表５の各試料番号に対応しており、レーンＣは分子量マーカーとしてのE.coli由来のChiAΔ4を示す。図８においてレーン３〜８（反応温度：４０〜７５℃）ではChiAΔ4のバンドが明確に確認されたが、レーン２（反応温度：３０℃）とレーン９（反応温度：８０℃）にはChiAΔ4のバンドが確認されなかった。【００６８】
【表５】
2006109751.tif 000006
【００６９】
上記の結果を詳細に検討するため、上記の各温度で９０分間反応させた合成終了時点のChiAΔ4の量を活性測定により定量した。ChiAΔ4の活性測定法を以下に述べる。０．１M酢酸緩衝液(ｐＨ５．０)に溶解した蛍光基質GlcNAc2−４−メチルウンベリフェロン(０．０２ｍＭ)５００μｌ、精製水４８０μｌ、および反応液２０μｌを８０℃で１０〜３０分間反応させた。反応終了後、反応液５００μｌを５００μｌの氷冷１００ｍＭグリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ１１）に添加して酵素反応を停止した。この試料の３５０ｎｍにおける励起光および４４０ｎｍにおける蛍光を分光蛍光光度計を使用して測定し、ChiAΔ4の比活性値を用いて、翻訳反応により合成されたChiAΔ4の量を算出した。結果を図９に示す。図９より、表５の試料２〜９のすべてについてChiAΔ4が合成され、その合成量は６０〜７０℃で最大となることがわかった。このことから、本実験系では６０〜７０℃が最適温度といえる。そこで、以後の実験では反応温度を最適温度範囲に位置する６０℃に設定して、各種成分の影響を検討することにした。【００７０】
また、表５の試料５，７および９のそれぞれについて、反応後５，１５，３０，６０，９０，１２０分でサンプリングし、上記と同様の方法により分析して、ChiAΔ4の発現量の時間依存性を検討した。結果を図１０に示す。図１０より、７０℃では反応開始後３０分程度でChiAΔ4の合成量がほぼ飽和していること、ChiAΔ4の合成量は最大で０．８μｇ／ｍｌに達することが判明した。【００７１】
4.8  カリウムイオンの影響
ChiAΔ4の合成反応におけるカリウムイオンの影響を最適温度条件で検討するため、表６の試料１〜３に示す試薬、組成および終濃度で、反応液の全量を３０μｌとして、６０℃で９０分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。結果を図１１に示す。図１１においてレーン１〜３は表６の各試料番号に対応しており、レーンＣは分子量マーカーとしてのE.coli由来のChiAΔ4を示す。図１１においてレーン１（Ｋ＋：１００ｍＭ）からレーン３（Ｋ＋：７００ｍＭ）にいくにしたがって、ChiAΔ4のバンドが小さくなっており、このことからChiAΔ4の合成量を増加させるには、カリウムイオンの濃度を低くすることが効果的といえる。【００７２】
4.9  ポリエチレングリコールの影響２
ChiAΔ4の合成反応におけるポリエチレングリコールの影響を最適温度条件で検討するため、表６の試料４〜６に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を３０μｌとして、６０℃で９０分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。結果を図１２に示す。図１２においてレーン４〜６は表６の各試料番号に対応しており、レーンＣは分子量マーカーとしてのE.coli由来のChiAΔ4を示す。図１２においてレーン４（PEG8000：１％）からレーン６（PEG8000：５％）にいくにしたがってChiAΔ4のバンドが大きくなっており、このことからChiAΔ4の合成量を増加させるには、ポリエチレングリコールの濃度を高くすることが効果的であるといえる。【００７３】
【表６】
2006109751.tif 000007
【００７４】
4.10  各種無機イオンの影響
ChiAΔ４の合成に及ぼすマグネシウムイオン、アンモニウムイオンおよびカリウムイオンの影響を最適温度条件で検討するため、表７の試料１〜３および９に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を３０μｌとして、６０℃で９０分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。結果を図１３に示す。図１３においてレーン１〜３および９は表７の各試料番号に対応しており、レーンＣは分子量マーカーとしてのE.coli由来のChiAΔ4を示す。図１３においてレーン１（Ｍｇ２＋：０ｍＭ）にはChiAΔ4のバンドが確認されなかったのに対し、レーン９（Ｍｇ２＋：７．５ｍＭ）にはChiAΔ4のバンドが確認された。このことから、マグネシウムイオンはChiAΔ4を合成するための必須成分であるといえる。【００７５】
図１３においてレーン２（ＮＨ４＋：０ｍＭ）に比べてレーン９（ＮＨ４＋：８０ｍＭ）の方がChiAΔ４のバンドが大きいことが確認された。このことから、アンモニウムイオンはChiAΔ4を合成するための必須成分ではないが、ChiAΔ4の合成量を増加させるのに必要な成分であるといえる。また、レーン３（Ｋ＋：０ｍＭ）に比べてレーン９（Ｋ＋：１００ｍＭ）の方がChiAΔ４のバンドが大きいことが確認された。このことから、カリウムイオンはChiAΔ4を合成するための必須成分ではないが、ChiAΔ4の合成量を増加させるのにある程度必要な成分であるといえる。【００７６】
4.11  ホスホエノールピルビン酸の影響
ChiAΔ4の合成反応におけるホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）の影響を最適温度条件で検討するため、表７の試料４〜９に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を３０μｌとして、６０℃で９０分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。結果を図１４に示す。図１４においてレーン４〜９は表７の各試料番号に対応しており、レーンＣは分子量マーカーとしてのE.coli由来のChiAΔ4を示す。図１４においてレーン６（ＰＥＰ：０ｍＭ）に比べてレーン９（ＰＥＰ：３３ｍＭ）の方がChiAΔ４のバンドが大きいことが確認された。ここで、本反応液には、上述したようにPre-incubation Mixに由来するピルビン酸キナーゼ（PK）が含有されている。またKOD1株自体にもPKが存在していることが判明している。これらのことを併せて考えると、ＰＥＰはATP再生系のための基質として作用し、ChiAΔ4の合成量を増加させるのに必要な成分であるといえる。また、レーン４〜８の比較から、ＰＥＰをPKの基質としてATPが再生していることが確認されるとともに、ATPの濃度を高くしすぎるとChiAΔ4の合成量が減少する傾向にあるといえる。各種エネルギー源とＰＥＰの関係は、後記4.16で再び検討を行う。【００７７】
【表７】
2006109751.tif 000008
【００７８】
4.12  トリス−酢酸緩衝液の影響
ChiAΔ4の合成反応におけるトリス−酢酸緩衝液の影響を最適温度条件で検討するため、表８の試料１と９に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を３０μｌとして、６０℃で９０分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。結果を図１５に示す。図１５においてレーン１と９は表８の各試料番号に対応しており、レーンＣは分子量マーカーとしてのE.coli由来のChiAΔ4を示す。図１５においてレーン１（トリス酢酸：０ｍＭ）とレーン９（トリス酢酸：５６．２ｍＭ）はほぼ同サイズのバンドを示した。このことから、トリス−酢酸緩衝液は、ChiAΔ4の合成反応において影響を及ぼさないことがわかった。【００７９】
4.13  アミノ酸の影響
ChiAΔ4の合成反応における２０種のアミノ酸の影響を最適温度条件で検討するため、表８の試料２，３および９に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を３０μｌとして、６０℃で９０分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。結果を図１６に示す。図１６においてレーン２，３および９は表８の各試料番号に対応しており、レーンＣは分子量マーカーとしてのE.coli由来のChiAΔ4を示す。図１６においてレーン２（各アミノ酸：０ｍＭ）にはChiAΔ4のバンドが確認されなかったのに対し、レーン３（各アミノ酸：４ｍＭ）と９（各アミノ酸：２ｍＭ）にはChiAΔ4のバンドが確認された。このことから、２０種類のアミノ酸はChiAΔ4を合成するための必須成分であるといえる。【００８０】
4.14  スペルミジンの影響２
ChiAΔ4の合成反応におけるスペルミジンの影響を最適温度条件で検討するため、表８の試料４，５および９に示す試薬、組成および終濃度で、反応液の全量を３０μｌとして、６０℃で９０分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。結果を図１７に示す。図１７においてレーン４，５および９は表８の各試料番号に対応しており、レーンＣは分子量マーカーとしてのE.coli由来のChiAΔ4を示す。図１７において、レーン４（スペルミジン：０．５ｍＭ），５（スペルミジン：１ｍＭ）および９（スペルミジン：０ｍＭ）におけるChiAΔ4のバンドには有意差が特に認められないことから、スペルミジンは翻訳反応に影響を及ぼさないことがわかった。【００８１】
4.15  GTP，CTPおよびUTPの影響
ChiAΔ4の合成反応におけるGTP，CTPおよびUTP（以下、「GCU混合物」という。）の影響を最適温度条件で検討するため、表８の試料６および９に示す試薬、組成および終濃度で、反応液の全量を３０μｌとして、６０℃で９０分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。結果を図１８に示す。図１８においてレーン６およびレーン９は表８の各試料番号に対応しており、レーンＣは分子量マーカーとしてのE.coli由来のChiAΔ4を示す。図１８においてレーン６（GCU混合物：０ｍＭ）およびレーン９（GCU混合物：０．８５ｍＭ each）におけるChiAΔ4のバンドには有意差が特に認められないことから、エネルギー源としてのGCU混合物は翻訳反応に影響を及ぼさないことがわかった。【００８２】
【表８】
2006109751.tif 000009
【００８３】
4.16  各種エネルギー源とＰＥＰの関係
ChiAΔ4の合成反応におけるGCU混合物／ATPとＰＥＰとの関係を最適温度条件で検討するため、表９の試料１〜７に示す試薬、組成および終濃度で、反応液の全量を３０μｌとして、６０℃で９０分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。結果を図１９に示す。図１９においてレーン１〜７は表９の各試料番号に対応しており、レーンＣは分子量マーカーとしてのE.coli由来のChiAΔ4を示す。まずATPおよびGCU混合物が共に存在していないレーン４（ＰＥＰのみ）においてもChiAΔ4のバンドが確認された。翻訳反応に必要なエネルギー物質はATPとGTPであるので、細胞抽出液にこれらの物質が存在するか、もしくはそれらの前駆体であるADPとGDPが存在しＰＥＰにより再生され使用されていることがわかる。ＰＥＰが存在しない条件であるレーン５（ATPのみ）およびレーン６（GCU混合物のみ）ではChiAΔ4のバンドが見られない一方で、両者を混合させたレーン１（ATPおよびGCU混合物）ではバンドが確認できた。ATPとGTPは菌体内酵素（nucleoside-diphosphate kinase）により相互変換が可能であるので、この場合の相乗効果はエネルギー再生物質であるＰＥＰが存在しない条件下でエネルギー物質を単純に増量した結果であると考えられる。またＰＥＰ存在下でATP（レーン３）またはGCU混合物（レーン２）を加えると、相乗的にChiAΔ4の合成量が増加していることから、ATPまたはGCU混合物のいずれか一方とＰＥＰが存在すれば、ChiAΔ4の合成に必要なエネルギーを効率的に得ることが可能であるといえる。【００８４】
【表９】
2006109751.tif 000010
【００８５】
５．無細胞タンパク質転写・翻訳系
5.1  反応温度の影響１
pTRC1を用いたタンパク質合成反応は、表１０の試料８および９に示す試薬、組成および終濃度で、反応液の全量を３０μｌとして、４０℃または６０℃で９０分間行なった。本試験で用いた反応液は、上述した翻訳反応系におけるChiAΔ4mRNAに代えてpTRC1を用いた点、およびT7RNAポリメラーゼ（東洋紡績社）を新たに添加した点を除き上述した翻訳反応系における反応液と基本的に同一である。なお、pTRC1は、あらかじめEcoRIで処理しておき、ChiAΔ4遺伝子の下流にあるEcoRI認識部位を切断した切断断片としたものを用いた。また、前記T7RNAポリメラーゼ（商品名：Thermo T7 RNA Polymerase）は、活性上限温度が５０℃であり、高い熱安定性を有するものである。結果を図２０に示す。図２０においてレーン８およびレーン９は表１０の各試料番号に対応しており、レーンＣは分子量マーカーとしてのE.coli由来のChiAΔ4を示す。図２０において、レーン８（反応温度：４０℃）およびレーン９（反応温度：６０℃）のいずれにもChiAΔ4のバンドは確認されなかった。このことから、本実験系では、転写反応と翻訳反応のいずれかの最適温度に設定して転写・翻訳反応を行なっても、転写反応または翻訳反応のいずれかで反応が効率的に進まず、効果が小さいことがわかった。【００８６】
【表１０】
2006109751.tif 000011
【００８７】
5.2  反応温度の影響２
ChiAΔ4の合成反応における反応温度の影響を検討するため、表１１の試料８に示す試薬、組成および終濃度で、反応液の全量を３０μｌとして、４０℃で６０分間反応させた後、６０℃で９０分間反応させた。結果を図２１に示す。なお、図２１においてレーン８は表１１の試料番号に対応しており、レーンＣは分子量マーカーとしてのE.coli由来のChiAΔ4を示すものである。図２１においてレーン８には微量ではあるがChiAΔ4のバンドが確認された。このことから、本実験系における転写・翻訳反応を効率的に行なわせるには、転写反応時と翻訳反応時に、それぞれの反応における最適温度に温度設定することが効果的であるといえる。【００８８】
【表１１】
2006109751.tif 000012
【００８９】
5.3  RNアーゼ阻害剤の影響
ChiAΔ4の合成反応におけるRNアーゼの影響を検討するため、表１２の試料８に示す試薬、組成および終濃度で、反応液の全量を３０μｌとして、４０℃で６０分間反応させた後、６０℃で９０分間反応させた。結果を図２２に示す。なお、図２２においてレーン８は表１２の試料番号に対応しており、レーンＣは分子量マーカーとしてのE.coli由来のChiAΔ4を示すものである。レーン８には、上述したRNアーゼ阻害剤を添加しない実験系（図２１を参照のこと）に比べて、ChiAΔ4のバンドが明確に確認された。このことから、本実験系における転写・翻訳反応を効率的に行なわせるには、RNアーゼ阻害剤を添加することが効果的であるといえる。【００９０】
【表１２】
2006109751.tif 000013
【００９１】
5.4  RNAポリメラーゼの影響
ChiAΔ4の合成反応におけるRNAポリメラーゼの添加量の影響を検討するため、表１３の試料１〜４に示す試薬、組成および終濃度で、反応液の全量を３０μｌとして、４０℃で６０分間反応させた後、６０℃で９０分間反応させた。結果を図２３に示す。なお、図２３においてレーン１〜４は表１３の各試料番号に対応しており、レーンＣは分子量マーカーとしてのE.coli由来のChiAΔ4を示すものである。図２３においてレーン３からレーン１にいくにしたがって、ChiAΔ4のバンドが大きくなっている。このことから、本実験系では、T7 RNA ポリメラーゼの濃度が高すぎると、転写反応を阻害するといえる。また、レーン３とレーン４の比較から、本実験系では、RNアーゼ阻害剤が機能していることが再確認された。【００９２】
【表１３】
2006109751.tif 000014
【００９３】
６．無細胞タンパク質翻訳系２（目的タンパク質の合成量増加を目的とした細胞抽出液の好適な調製方法の検討）
6.1  フレンチプレスの回数の影響
図２４は前記「２．細胞抽出液の調製」に記載した各手順のうち、KOD1株の培養以後の各手順を番号付けしてまとめたプロトコールである。図２４の手順９では、フレンチプレスの回数を３回としているが、フレンチプレスの回数が増加するとタンパク質の転写・翻訳に必要な要素（例えば、RNA ポリメラーゼなど）が破壊される可能性があると考えられる。そこで、フレンチプレスの回数を少なくしてchiAΔ4の合成量に与える影響を検討した。具体的には、図２４の各手順のうち、手順９におけるフレンチプレスの回数を１回、２回または３回とした以外は同じ手順で細胞抽出液を調製し、表１４の試料１〜５に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を３０μｌとして、６０℃で９０分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。表１４のうち、S30画分は前記「４．無細胞タンパク質翻訳系」および「５．無細胞タンパク質転写・翻訳系」で用いた細胞抽出液を示し、S30-FP1，S30-FP2 および S30-FP3 は、それぞれフレンチプレスを１回，２回および３回行なって得られた細胞抽出液である。なお、各々の細胞抽出液の後には、該細胞抽出液のタンパク濃度をカッコ書きで示している。図２５において各レーンは表１４の各試料番号に対応しており、レーンＣは分子量マーカーとしてのE.coli由来のChiAΔ4を示し、レーン１はChiAΔ4mRNAを添加していない対照試料である。レーン２〜５のうち、ChiAΔ4のバンドを比較すると、レーン３（フレンチプレス１回）のバンドが最も大きかった。このことから、フレンチプレスの回数を減らすことでChiAΔ4の合成量が増加することが分かるとともに、フレンチプレスの回数は１回で十分であることが分かった。【００９４】
【表１４】
2006109751.tif 000015
【００９５】
6.2  フレンチプレスの圧力の影響
フレンチプレスの圧力が目的タンパク質の合成量にどのように影響するか検討するため、図２４の各手順のうち、手順９におけるフレンチプレスの回数を１回とし、圧力を８，４００ p.s.iと低くした以外は同じ手順で細胞抽出液を調製し（この細胞抽出液を「S30FP-1A」という）、表１５の試料１〜４に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を３０μｌとして、６５℃で９０分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。なお、表１５の試料１と２は、前記「6.1  フレンチプレスの回数の影響」で調製したS30FP-1を細胞抽出液として用いた試料である。図２６にウェスタンブロット法による分析結果を示す。図２６において各レーンは表１５の各試料番号に対応しており、レーンＣは分子量マーカーとしてのE.coli由来のChiAΔ4を示す。また、表１５には図２６の各レーンに対応する試料について、化学発光検出装置（Lumi Vision PRO 400EX，アイシン精機）を用いて求めたChiAΔ4の合成量を示した。試料３（圧力：８，４００ p.s.i）と試料１（圧力：１０，０００ p.s.i）（または試料４（圧力：８，４００ p.s.i）と試料２（圧力：１０，０００ p.s.i））についてChiAΔ4の合成量を比べると、試料３（または試料４）の方が約５倍多い値を示した。このことから、フレンチプレスの圧力を従来の１０，０００ p.s.iより低く設定することは、ChiAΔ4の合成量増加に有効であることが分かった。【００９６】
【表１５】
2006109751.tif 000016
【００９７】
6.3  低張液の影響
上述した人工海水とＳ３０バッファーの浸透圧を比べると、Ｓ３０バッファーの方が明らかに低い。そこで、細胞破砕時に人工海水に代えてＳ３０バッファーを分散媒としたときに目的タンパク質の合成量にどのように影響するか検討することにした。具体的には、図２４の各手順のうち、手順７の人工海水をＳ３０バッファーに代え、手順９のうち、フレンチプレスの回数を１回とし、圧力を２，５００ p.s.i、５，０００ p.s.iまたは７，５００ p.s.iに設定するとともに、手順１６のインキュベーションを６０℃、４０分の条件で行なうことで細胞抽出液を調製した。そして、得られた細胞抽出液のタンパク濃度を比較することで、細胞破砕時に低張液を用いた場合の効果を評価した。結果を表１６に示す。なお、表１６中、S30FP-1Aは前記「6.2  フレンチプレスの圧力の影響」で調製した細胞抽出液である。表１６に示した各細胞抽出液のタンパク濃度から、細胞を低張液に十分な時間浸透させることによりフレンチプレスの圧力が低くても得られるタンパク量は十分なものであった。【００９８】
【表１６】
2006109751.tif 000017
【００９９】
6.4  プレインキュベーションの影響
プレインキュベーションの有無により、目的タンパク質の合成量がどのように増減するか検討した。具体的には、図２４の各手順のうち、手順７の人工海水をＳ３０バッファーに代え、手順９のうち、フレンチプレスの回数を１回とし、圧力を７，５００ p.s.iに設定するとともに、手順１５および手順１６を表１７に示す条件で行なうことで３種類の細胞抽出液を調製した。次いで、得られた細胞抽出液（S30FP-1E、S30FP-1F、S30FP-1G）を用いて、表１８の試料２，３，４に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を３０μｌとして、６０℃で９０分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。なお、表１８のうち、試料１は、前記「6.2  フレンチプレスの圧力の影響」で調製したS30FP-1Aを細胞抽出液として用いた参照試料である。なお、各々の細胞抽出液の後には、該細胞抽出液のタンパク濃度をカッコ書きで示している。図２７にウェスタンブロット法による分析結果を示す。図２７において各レーンは表１８の各試料番号に対応している。図２７のレーン２〜４のうち、ChiAΔ4のバンドを比べると、レーン４はレーン２，３に比べて大きなバンドを示した。このことから、ChiAΔ4の合成量を増加させるには、Pre-Incubationを添加せず、かつプレインキュベーションをしない方が好ましいことが分かった。【０１００】
【表１７】
2006109751.tif 000018
【０１０１】
【表１８】
2006109751.tif 000019
【０１０２】
6.5  透析の影響
透析の有無により、目的タンパク質の合成量がどのように増減するか検討した。具体的には、図２４の各手順のうち、手順７の人工海水をＳ３０バッファーに代え、手順９のうち、フレンチプレスの回数を１回とし、圧力を７，５００ p.s.iに設定するとともに、手順１７の透析を行なって、または行なわずに細胞抽出液を調製した（表１９参照）。次いで、得られた細胞抽出液（S30FP-1H、S30FP-1I）を用いて、表２０の試料１，２に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を３０μｌとして、６０℃で９０分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。図２８にウェスタンブロット法による分析結果を示す。レーン１と２のうち、ChiAΔ4のバンドを比べると、レーン２のバンドの方がやや大きかった。このことから、ChiAΔ4の合成量を増加するためには、透析をしない方が好ましいといえる。【０１０３】
【表１９】
2006109751.tif 000020
【０１０４】
【表２０】
2006109751.tif 000021
【０１０５】
７．無細胞タンパク質翻訳系３（mRNAと細胞抽出液について、目的タンパク質の合成量増加に適した濃度の検討）
前記「６．無細胞タンパク質翻訳系２」では、目的タンパク質の合成量増加に適した細胞抽出液の調製方法について検討した。次に、該細胞抽出液を用いて無細胞タンパク質翻訳反応を行なうにあたり、ChiAΔ4の合成量を増加させることを目的として、反応液中のmRNAと細胞抽出液の好適濃度を検討することにした。以下の実験では、細胞抽出液として、前記「6.4  プレインキュベーションの影響」で調製した S30FP-1G （タンパク濃度：35.3μｇ／μｌ）を用いることにした。図２９は S30FP-1G の調製用プロトコールである。【０１０６】
7.1  mRNAの好適濃度
ChiAΔ4の合成反応におけるChiAΔ4mRNAの好適濃度を検討するため、表２１の試料１〜５に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を３０μｌとして、６５℃で９０分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。なお、表２１の各試料中のChiAΔ4mRNA濃度は、０ｍｇ／ｍｌ（試料１）、０．３３ｍｇ／ｍｌ（試料２）、０．４２ｍｇ／ｍｌ（試料３）、０．５０ｍｇ／ｍｌ（試料４）、０．５８ｍｇ／ｍｌ（試料５）である。図３０にウェスタンブロット法による分析結果を示す。図３０において各レーンは表２１の各試料番号に対応しており、レーンＣは分子量マーカーとしてのE.coli由来のChiAΔ4を示す。図３０より、レーン２（ChiAΔ4mRNA：０．３３ｍｇ／ｍｌ）からレーン５（ChiAΔ4mRNA：０．５８ｍｇ／ｍｌ）にいくにしたがってChiAΔ4のバンドが大きくなる傾向を示した。以上の結果から、ChiAΔ4mRNAの好適濃度は０．４０〜０．６０ｍｇ／ｍｌであり、０．５０ｍｇ／ｍｌ付近が最も好ましいといえる。【０１０７】
【表２１】
2006109751.tif 000022
【０１０８】
7.2  細胞抽出液の好適濃度
ChiAΔ4の合成反応におけるS30FP-1Gの好適濃度を検討するため、表２２の試料６〜１０に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を３０μｌとして、６５℃で９０分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。なお、表２２の各試料中のS30FP-1G濃度は、１０．０ｍｇ／ｍｌ（試料６）、１２．０ｍｇ／ｍｌ（試料７）、１４．０ｍｇ／ｍｌ（試料８）、１６．０ｍｇ／ｍｌ（試料９）、１８．０ｍｇ／ｍｌ（試料１０）である。図３１にウェスタンブロット法による分析結果を示す。図３１において各レーンは表２２の各試料番号に対応しており、レーンＣは分子量マーカーとしてのE.coli由来のChiAΔ4を示す。図３１より、S30FP-1Gの好適濃度は１２．０〜１６．０ｍｇ／ｍｌであることが分かった。【０１０９】
【表２２】
2006109751.tif 000023
【０１１０】
7.3  ChiAΔ4の合成量の確認
前記「7.1  mRNAの好適濃度」と「7.2  細胞抽出液の好適濃度」の結果を受けて、ChiAΔ4mRNAを０．４８ｍｇ／ｍｌ、S30FP-1Gを１３．０ｍｇ／ｍｌに設定して無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。ChiAΔ4の合成量は、前記「4.7  反応温度の最適化の検討」で説明したのと同様に活性測定により定量した。その結果、ChiAΔ4の合成量は６．２μｇ／ｍｌであることが確認され、これまでに上記方法で定量した最大合成量１．０μｇ／ｍｌ（図９参照）に比べて６倍以上の合成量が得られた。【０１１１】
８．無細胞タンパク質翻訳系４（目的タンパク質の合成量増加に適した反応液各成分の好適濃度の検討）
前記「６．無細胞タンパク質翻訳系２（目的タンパク質の合成量増加を目的とした細胞抽出液の好適な調製方法）」と「７．無細胞タンパク質翻訳系３（mRNAと細胞抽出液について、目的タンパク質の合成量増加に適した濃度の検討）」で得られた結果を踏まえて、さらにChiAΔ4の合成量を増加させるため、反応液各成分の好適濃度を検討した。【０１１２】
8.1  マグネシウムイオンの好適濃度
ChiAΔ4の合成反応におけるマグネシウムイオンの好適濃度を検討するため、表２３に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を３０μｌとして、６５℃で９０分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。なお、表２３の各試料中のＭｇ２＋濃度は、１．８７ｍＭ（試料１）、３．７３ｍＭ（試料２）、５．６０ｍＭ（試料３）、７．４７ｍＭ（試料４）、９．３３ｍＭ（試料５）である。図３２にウェスタンブロット法による分析結果を示す。図３２において各レーンは表２３の各試料番号に対応している。図３２より、マグネシウムイオンの好適濃度は１．８７〜３．７３ｍＭであることが分かった。【０１１３】
【表２３】
2006109751.tif 000024
【０１１４】
8.2  ホスホエノールピルビン酸の好適濃度
ChiAΔ4の合成反応におけるホスホエノールピルビン酸の好適濃度を検討するため、表２４に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を３０μｌとして、６５℃で９０分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。なお、表２４の各試料中のＰＥＰ濃度は、８．３３ｍＭ（試料１）、１６．７ｍＭ（試料２）、２５．１ｍＭ（試料３）、３３．３ｍＭ（試料４）である。図３３にウェスタンブロット法による分析結果を示す。図３３において各レーンは表２４の各試料番号に対応している。図３３より、ＰＥＰの好適濃度は８．３３〜２５．１ｍＭであることが分かった。【０１１５】
【表２４】
2006109751.tif 000025
【０１１６】
8.3  アミノ酸の好適濃度
ChiAΔ4の合成反応における２０種のアミノ酸の好適濃度を検討するため、表２５に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を３０μｌとして、６５℃で９０分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。なお、表２５の各試料中のアミノ酸濃度は、各２．４ｍＭ（試料１）、各２．０ｍＭ（試料２）、各１．６ｍＭ（試料３）、各１．２ｍＭ（試料４）、各０．８ｍＭ（試料５）、各０．４ｍＭ（試料６）である。図３４にウェスタンブロット法による分析結果を示す。図３４において各レーンは表２５の各試料番号に対応している。図３４より、他のレーンに比べてレーン１のバンドが特に大きいことから、アミノ酸の好適濃度は約２．４ｍＭ eachであることが分かった。【０１１７】
【表２５】
2006109751.tif 000026
【０１１８】
９．無細胞タンパク質翻訳系５（目的タンパク質の合成量増加を目的とした反応液各成分の好適濃度の検討）
前記「６．無細胞タンパク質翻訳系２（目的タンパク質の合成量増加を目的とした細胞抽出液の好適な調製方法）」、「７．無細胞タンパク質翻訳系３（mRNAと細胞抽出液について、目的タンパク質の合成量増加に適した濃度の検討）」および「８．無細胞タンパク質翻訳系４（目的タンパク質の合成量増加に適した反応液各成分の好適濃度の検討）」で得られた結果を踏まえて、さらにChiAΔ4の合成量を増加させるため、反応液各成分の好適濃度を検討した。具体的には、表２６に示す反応液組成をベースにして、各成分濃度を変化させて無細胞タンパク質翻訳反応を行ない、ウェスタンブロット解析を行なった後、合成されたChiAΔ4を、Lumi Vision Analyzer（アイシン精機）を用いて定量化することで各成分の好適濃度を検討した。【０１１９】
【表２６】
2006109751.tif 000027
【０１２０】
9.1  ホスホエノールピルビン酸の好適濃度
ChiAΔ4の合成反応におけるホスホエノールピルビン酸の好適濃度を検討するため、表２７に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を３０μｌとして、６５℃で９０分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。なお、表２７の各試料中のＰＥＰ濃度は、０ｍＭ（試料１）、１０ｍＭ（試料２）、２０ｍＭ（試料３）、３０ｍＭ（試料４）である。図３５にウェスタンブロット法による分析結果を示す。図３５において各レーンは表２７の各試料番号に対応している。また、図３６は、反応液中のＰＥＰ濃度と合成されたChiAΔ4濃度との関係を示した図である。図３６より、ＰＥＰの好適濃度は２．５〜２５ｍＭであり、さらに好ましくは５〜２０ｍＭであり、１０ｍＭ付近が最適であることが分かった。【０１２１】
【表２７】
2006109751.tif 000028
【０１２２】
9.2  マグネシウムイオンの好適濃度
ChiAΔ4の合成反応におけるマグネシウムイオンの好適濃度を検討するため、表２８に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を３０μｌとして、６５℃で９０分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。なお、表２８の各試料中のＭｇ２＋濃度は、０ｍＭ（試料１）、１．０ｍＭ（試料２）、２．０ｍＭ（試料３）、３．０ｍＭ（試料４）、４．０ｍＭ（試料５）、５．０ｍＭ（試料６）、６．０ｍＭ（試料７）、７．０ｍＭ（試料８）、８．０ｍＭ（試料９）、９．０ｍＭ（試料１０）、１０．０ｍＭ（試料１１）である。図３７にウェスタンブロット法による分析結果を示す。図３７において各レーンは表２８の各試料番号に対応している。また、図３８は、反応液中のＭｇ２＋濃度と合成されたChiAΔ4濃度との関係を示した図である。図３８より、Ｍｇ２＋の好適濃度は０．５〜６ｍＭであり、さらに好ましくは２〜４ｍＭであり、３ｍＭ付近が最適であることが分かった。【０１２３】
【表２８】
2006109751.tif 000029
【０１２４】
9.3  アンモニウムイオンの好適濃度
ChiAΔ4の合成反応におけるアンモニウムイオンの好適濃度を検討するため、表２９に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を３０μｌとして、６５℃で９０分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。なお、表２９の各試料中のＮＨ４＋ 濃度は、０ｍＭ（試料１）、２５ｍＭ（試料２）、５０ｍＭ（試料３）、７５ｍＭ（試料４）、１００ｍＭ（試料５）、１２５ｍＭ（試料６）である。図３９にウェスタンブロット法による分析結果を示す。図３９において各レーンは表２９の各試料番号に対応している。また、図４０は、反応液中のＮＨ４＋ 濃度と合成されたChiAΔ4濃度との関係を示した図である。図４０より、ＮＨ４＋の好適濃度は５０〜１２０ｍＭであり、さらに好ましくは６５〜１００ｍＭであり、７５ｍＭ付近が最適であることが分かった。【０１２５】
【表２９】
2006109751.tif 000030
【０１２６】
9.4  アミノ酸の好適濃度
ChiAΔ4の合成反応における２０種のアミノ酸の好適濃度を検討するため、表３０に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を３０μｌとして、６５℃で９０分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。なお、表３０の各試料中のアミノ酸濃度は、０ｍＭ（試料１）、１．０ｍＭ（試料２）、２．０ｍＭ（試料３）、３．０ｍＭ（試料４）、４．０ｍＭ（試料５）、５．０ｍＭ（試料６）、６．０ｍＭ（試料７）、７．０ｍＭ（試料８）である。図４１にウェスタンブロット法による分析結果を示す。図４１において各レーンは表３０の各試料番号に対応している。また、図４２は、反応液中のアミノ酸濃度と合成されたChiAΔ4濃度との関係を示した図である。図４２より、アミノ酸の好適濃度は１〜７ｍＭであり、さらに好ましくは２〜７ｍＭであることが分かった。【０１２７】
【表３０】
2006109751.tif 000031
【０１２８】
9.5  ポリエチレングリコールの好適濃度
ChiAΔ4の合成反応におけるポリエチレングリコールの好適濃度を検討するため、表３１に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を３０μｌとして、６５℃で９０分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。なお、表３１の各試料中のポリエチレングリコール濃度は、０％（w/v）（試料１）、１．０％（w/v）（試料２）、２．０％（w/v）（試料３）、３．０％（w/v）（試料４）、４．０％（w/v）（試料５）、５．０％（w/v）（試料６）、６．０％（w/v）（試料７）である。図４３にウェスタンブロット法による分析結果を示す。図４３において各レーンは表３１の各試料番号に対応している。また、図４４は、反応液中のポリエチレングリコール濃度と合成されたChiAΔ4濃度との関係を示した図である。図４４より、ポリエチレングリコールの好適濃度は０〜２．５％（w/v）であり、２％（w/v）付近が最適であることが分かった。【０１２９】
【表３１】
2006109751.tif 000032
【０１３０】
9.6  カリウムイオンの好適濃度
ChiAΔ4の合成反応におけるカリウムイオンの好適濃度を検討するため、表３２に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を３０μｌとして、６５℃で９０分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。なお、表３２のＫ＋濃度は、０ｍＭ（試料１）、５０ｍＭ（試料２）、１００ｍＭ（試料３）、１５０ｍＭ（試料４）、２００ｍＭ（試料５）、２５０ｍＭ（試料６）、３００ｍＭ（試料７）、３５０ｍＭ（試料８）、４００ｍＭ（試料９）、４５０ｍＭ（試料１０）、５００ｍＭ（試料１１）である。図４５にウェスタンブロット法による分析結果を示す。図４５において各レーンは表３２の各試料番号に対応している。また、図４６は、反応液中のＫ＋濃度と合成されたChiAΔ4濃度との関係を示した図である。図４６より、Ｋ＋の好適濃度は１００〜４５０ｍＭであり、さらに好ましくは１７０〜３５０ｍＭであり、特に好ましくは２１０〜３２０ｍＭであり、２５０ｍＭ付近が最適であることが分かった。【０１３１】
【表３２】
2006109751.tif 000033
【０１３２】
9.7  ChiAΔ4の最大合成量
表３３は、前記「9.1  ホスホエノールピルビン酸について」〜「9.6  カリウムイオンについて」で得られた各成分の最適濃度をまとめたものである。そこで、表３３に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を３０μｌとして、６５℃で９０分間無細胞タンパク質翻訳反応を行ない、ChiAΔ4の最大合成量がどの程度になるか検討した。結果、ChiAΔ4の合成量は６５．５μｇ／ｍｌとなった。【０１３３】
【表３３】
2006109751.tif 000034
【０１３４】
１０．A.pernix由来の細胞抽出液を用いた無細胞タンパク質翻訳系
10.1  菌体の培養と細胞抽出液の調製
人工海水（２．２％ＮａＣｌ、１％ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１４％ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．３７％ＮａＳＯ４、０．０６３％ＫＣｌ、０．０１８％ＮａＨＣＯ３、０．００９％ＫＢｒ、０．００３６％ＮａＢ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ、０．００１３％ＳｒＣｌ２、０．０００３％ＮａＦ、０．０００１％ＬｉＣｌ、０．０００００７％ＫＩ、０．０００００００８％ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．０００００００２％ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．００００００８％ＡｌＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、０．００００００５％ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、０．０００００００２％Ｎａ２ＷＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０００００２％（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ）、０．２％酵母エキス、０．４％トリプトン及びチオ硫酸ナトリウム５水和物（Ｎａ２Ｓ２Ｏ３・５Ｈ２０）からなる培地３００ｍｌをｐＨ７．０に調製後、５００ｍｌの坂口フラスコに入れシリコ栓を付け、オートクレーブ（１２１℃、２ａｔｏｍ、２０分間）で滅菌処理を行なった。この培地にA.pernix Ｋ１株を接種し、坂口フラスコを９０℃で約３８時間振盪培養を行なった（振盪速度１５０回／分）。培養終了後の培養液の吸光度（６６０ｎｍ）は０．６５６であった。以降の細胞抽出液の調製は、図２４の方法に従って行った。得られた細胞抽出液のタンパク濃度は１３．５ｍｇ／ｍｌであった。【０１３５】
10.2  無細胞タンパク質翻訳反応
A.pernix由来の細胞抽出液を用いて、表３４の試料１〜５に示す試薬、組成および終濃度で、反応液の全量を３０μｌとして、６０〜８０℃で６０分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。反応終了後、生成したChiΔ4の量を、蛍光基質を用いた活性測定により定量した。その結果を図４７に示す。図４７より、表３４の試料１〜５のすべてについてChiAΔ4が合成され、その合成量は６０〜６５℃で最大となることがわかった（反応温度６５℃の合成量：１．５２ｍｇ／ｍｌ）。以上のことより、T.kodakaraensisとは別種の超好熱菌を用いた場合においても、図２４と同様のプロトコールにより細胞抽出液を調製すれば、高温での無細胞タンパク質翻訳系が確立できることが判明した。【０１３６】
【表３４】
2006109751.tif 000035
【産業上の利用可能性】
【０１３７】
本発明は、超好熱菌由来の細胞抽出液を含む無細胞タンパク質合成系中で、高温条件下におけるタンパク質の製造方法として広く利用可能である。
【図１】
2006109751.tif 000036
【図２】
2006109751.tif 000037
【図３】
2006109751.tif 000038
【図４】
2006109751.tif 000039
【図５】
2006109751.tif 000040
【図６】
2006109751.tif 000041
【図７】
2006109751.tif 000042
【図８】
2006109751.tif 000043
【図９】
2006109751.tif 000044
【図１０】
2006109751.tif 000045
【図１１】
2006109751.tif 000046
【図１２】
2006109751.tif 000047
【図１３】
2006109751.tif 000048
【図１４】
2006109751.tif 000049
【図１５】
2006109751.tif 000050
【図１６】
2006109751.tif 000051
【図１７】
2006109751.tif 000052
【図１８】
2006109751.tif 000053
【図１９】
2006109751.tif 000054
【図２０】
2006109751.tif 000055
【図２１】
2006109751.tif 000056
【図２２】
2006109751.tif 000057
【図２３】
2006109751.tif 000058
【図２４】
2006109751.tif 000059
【図２９】
2006109751.tif 000060
【図３６】
2006109751.tif 000061
【図３８】
2006109751.tif 000062
【図４０】
2006109751.tif 000063
【図４２】
2006109751.tif 000064
【図４４】
2006109751.tif 000065
【図４６】
2006109751.tif 000066
【図４７】
2006109751.tif 000067
【図２５】
2006109751.tif 000068
【図２６】
2006109751.tif 000069
【図２７】
2006109751.tif 000070
【図２８】
2006109751.tif 000071
【図３０】
2006109751.tif 000072
【図３１】
2006109751.tif 000073
【図３２】
2006109751.tif 000074
【図３３】
2006109751.tif 000075
【図３４】
2006109751.tif 000076
【図３５】
2006109751.tif 000077
【図３７】
2006109751.tif 000078
【図３９】
2006109751.tif 000079
【図４１】
2006109751.tif 000080
【図４３】
2006109751.tif 000081
【図４５】
2006109751.tif 000082
【配列表】
2006109751000001.app
【国際調査報告】
2006109751.tif 000083
2006109751.tif 000084
2006109751.tif 000085
2006109751.tif 000086