(57)【要約】本願発明は、筋芽細胞を分化させ、収縮可能な筋繊維を効率的に調製することを課題としている。分化誘導の前に、小胞体特異的な小胞体（ＥＲ）ストレスに曝し、その後分化誘導することにより、筋芽細胞を効率的に筋繊維に分化させること。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程を含む筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞の分化方法。
（１）筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞を小胞体ストレスに曝す工程、及び
（２）小胞体ストレスに曝された筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞を更に分化誘導培地で培養する工程。
【請求項２】
次の工程を含む筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞の分化方法。
（１）筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞を小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤が添加された増殖培地で培養する工程、又は筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞を増殖培地から分化誘導培地に移した直後に分化誘導培地に小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤を添加して培養する工程及び
（２）（１）の工程で培養された筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞を更に分化誘導培地で培養する工程。
【請求項３】
小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤が小胞体特異的Ｎ−グリコシル化トランスフェラーゼ阻害剤、小胞体特異的マンノシダーゼ阻害剤又は小胞体特異的Ｃａ＋＋ＡＴＰａｓｅの阻害剤から選ばれる小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤である請求項２記載の筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞の分化方法。
【請求項４】
小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤としてツニカマイシンを最終濃度が０．０１〜１０００μｇ／ｍｌ、又はタプシガルジンを最終濃度が０．０１〜１０００μＭとなるように添加する請求項２又は３記載の方法。
【請求項５】
筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞が、株化筋芽細胞、株化ヒト筋肉腫由来細胞、又は哺乳類若しくは鳥類の生体組織から調製した初代培養筋芽細胞である請求項１〜４いずれか１項記載の筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞分化方法。
【請求項６】
株化筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞が、マウスＣ２Ｃ１２、マウスＦ−６、マウスＣ２ＢＰ５、ラットＦ−１２、ラットＬ６、Ｈ９Ｃ２、ＲＤから選ばれる請求項５記載の筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞分化方法。
【請求項７】
次の工程を含む筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞の分化方法。
（１）（イ）筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞を小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤が添加された増殖培地で培養した後、分化培地に交換して培養を継続した時に得られる培地から上清を分離する工程、又は（ロ）筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞を小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤を含む分化培地を用いて培養することにより得られる培地より上清を分離する工程、
（２）筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞を（１）で分離された上清を馴化培地として用いて培養する工程、及び
（３）分化誘導培地で培養する工程。
【請求項８】
小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤が小胞体特異的Ｎ−グリコシル化トランスフェラーゼ阻害剤、小胞体特異的マンノシダーゼ阻害剤又は小胞体特異的Ｃａ＋＋ＡＴＰａｓｅの阻害剤から選ばれる小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤である請求項７記載の筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞の分化方法。
【請求項９】
小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤としてツニカマイシンを最終濃度が０．０１〜１０００μｇ／ｍｌ、又はタプシガルジンを最終濃度が０．０１〜１０００μＭを添加する請求項７又は８記載の方法。
【請求項１０】
小胞体特異的ストレス前処理をした筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞を用いて調製した馴化培地で培養を０．５〜４８時間行う請求項７〜９いずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞が、株化筋芽細胞、株化ヒト筋肉腫由来細胞、又は哺乳類若しくは鳥類等の生体組織から調製した初代培養筋芽細胞である請求項７〜１０いずれか１項記載の筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞分化方法。
【請求項１２】
株化筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞が、マウスＣ２Ｃ１２、マウスＦ−６、マウスＣ２ＢＰ５、ラットＦ−１２、ラットＬ６、Ｈ９Ｃ２又はＲＤから選ばれる請求項１１記載の筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞分化方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２いずれか１項記載の方法で筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞を分化させて得られた筋繊維。
【請求項１４】
（イ）株化した筋芽細胞若しくは筋芽細胞様細胞、又は筋芽細胞の初代培養、（ロ）小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤、及び（ハ）分化誘導培地、からなるキット。
【請求項１５】
（イ）小胞体ストレスに曝した筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞から分化した筋繊維細胞、及び（ロ）分化誘導培地からなるキット。
【請求項１６】
請求項１３項記載の筋繊維に筋壊死又は筋破壊に対する予防剤候補を投与し、筋繊維に筋壊死又は筋破壊を生ずる条件下で培養し、筋壊死又は筋破壊に対する予防剤候補をスクリーニングする方法。
【請求項１７】
請求項１３項記載の筋繊維に糖代謝を改善する治療剤候補を投与し、糖尿病等の糖代謝異常に対する治療剤候補をスクリーニングする方法。
【請求項１８】
小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤又は小胞体特異的ストレス前処理後の細胞が培地に分泌するアポトーシス誘導成分を有効成分として含有する筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞分化誘導剤。
【請求項１９】
筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞を小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤が添加された増殖培地で培養した後、分化培地に交換して培養を続行した時に得られる馴化培地又は該馴化培地より得られる遠心上清。
【請求項２０】
請求項１３記載の筋繊維に目的遺伝子を導入した形質転換筋繊維。
【請求項２１】
請求項２０記載の形質転換筋繊維からなる遺伝子治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本願発明は、動物細胞の分化、培養、特に筋細胞の分化及び培養の技術分野に属する。
【背景技術】  筋芽細胞（接着細胞）を栄養度の高い増殖培地で培養して細胞密度を高くし、その後、栄養の少ない分化培地に代えることにより、細胞の増殖が停止し筋分化が開始すると報告されている。分化培地に移した直後は一部の細胞に細胞死（アポトーシス）が起きるが、大多数の生き残った細胞が筋管、さらには筋繊維を形成することが知られている（非特許文献１，２）。
骨格筋の筋芽細胞の増殖と分化は排他的で、増殖中は分化せず、一度分化した細胞は再び増殖する事はないと言われている。骨格筋形成は培地から血清を除去して筋芽細胞を培養することで誘発され、不可逆的に細胞分裂を停止した多核の筋管細胞を形成する。筋肉に特異的な遺伝子産物の協調的誘導は、これらの形態学的な変化と同時に起こる。筋肉に特異的な転写制御因子（ＭｙｏＤ、ミオジェニン（ｍｙｏｇｅｎｉｎ）、Ｍｙｆ−５、ＭＲＦ４）のＭｙｏＤファミリーメンバーがこれらのプロセスを制御している。
一方、種々の非筋肉細胞でＭｙｏＤファミリーメンバーを異所的に発現させると筋形成を誘導することができる。ＭｙｏＤの試験管内での強制発現は分化とは独立して細胞周期進行を阻害することができる。
細胞増殖と分化の間の拮抗の基礎は不明暸なままだったが最近、筋形成の間に細胞周期抑制因子ｐ２１が誘導されると報告され、細胞周期停止が筋分化とリンクしている仕組みの一端が解明された。筋分化と細胞周期の制御に関して、増殖している筋芽細胞がミオサイト（ｍｙｏｃｙｔｅ）へ移行するステップの時間的な前後関係が明らかになっている。筋芽細胞が分化経路へ進む際にはまずミオジェニンの合成が誘導され、ミオジェニン発現の後、ｐ２１の誘導とそれによる細胞周期の停止、次に筋収縮にかかわるタンパク質が発現され、続いてミオサイトが細胞融合を起こして多核の筋管細胞（ｍｙｏｔｕｂｅ）を形成するに至る過程が非常に秩序ある順序で進行する（非特許文献３）。
【非特許文献１】Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．２４，５０８−５１２．（１９６１）．
【非特許文献２】Ｃｅｌｌ  Ｖｏｌ．１５，８５５−８６４．（１９７８）．
【非特許文献３】Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．１３２，６５７−６６６．（１９９６）
【発明の開示】
従来法により筋収縮が可能な筋繊維を形成させるためには、生体の筋組織を材料とし、組織をばらばらにし、筋芽細胞（初代培養細胞）を取り出して用いる事が多い。しかしながら、良質の初代培養細胞を安定に採取する事は容易ではなく、分化効率が必ずしも十分ではない場合がある。更に、材料取得のたびに個体から筋組織を取り出すことが必要であった。
他方、株化した筋芽細胞は大量に入手可能であるが、株化した筋芽細胞を従来法で分化させると、筋繊維の形成能が初代培養細胞に劣るという欠点がある。株化筋芽細胞から筋管を形成させることは比較的容易だが筋繊維まで分化する効率は低く、筋収縮を示す細胞の形成は稀である。また、形成される繊維は生体内の筋繊維、あるいは初代培養細胞によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで作られる筋繊維に比べてはるかに小さい。
そこで、本願発明は、筋芽細胞を分化させ、収縮可能な筋繊維を効率的に調製することを課題としている。
本願発明者は、分化誘導の前に小胞体（ＥＲ）ストレスに曝すことにより、筋芽細胞の分化初期のアポトーシスを昂進させ、その後の分化過程を促進する事に成功した。筋芽細胞は細胞融合を起こして多核の筋管を形成し、さらに効率良く筋繊維にまで分化して筋収縮現象を起こすことを見出した。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００４−１５４８１３号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】  図１は、小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤によるＣ２Ｃ１２細胞のアポトーシスの昂進（分化誘導１日目）。  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇは増殖細胞；ＵＴは前処理なし後の分化；ＴＵＮはツニカマイシン前処理後の分化、ＴＧはタプシガルジン前処理後の分化をそれぞれ意味する。
図２は、Ｃ２Ｃ１２細胞の分化培養中のカスパーゼ１２の活性化。  ＧＭは増殖培地、Ｄ１は分化一日目の試料、Ｄ２は分化２日目の試料、Ｌは生細胞、Ｄは死細胞、ＵＴは未処理、ＴＵＮ／ＤＭはツニカマイシンによる前処理、ＴＧ／ＤＭはタプシガルジンによる前処理、ＴＧはタプシガルジン前処理を意味する。矢印はプロカスパーゼ１２を、矢頭はカスパーゼ１２の活性型を示す。
図３は、小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤による前処理の有無での筋繊維のサイズ比較。  ＵＴは未処理、ＴＵＮはツニカマイシン前処理、ＴＧはタプシガルジン前処理を意味する。スケールバーは２００μｍである。前処理細胞の分化培養では多くの筋繊維が自発的に収縮した。
図４は、小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤前処理後のアポトーシス及び生存のオートクリン因子による制御。  馴化培地中でのＩＧＦ−ＩＩは抗ＩＧＦ−ＩＩ抗体を用いたイムノブロッティングにより検出された。ＵＴは未処理、ＴＵＮはツニカマイシン前処理、ＴＧはタプシガルジン前処理、ＤＭは未使用の分化誘導培地、１−８は分化誘導培地に代えて第１日目から８日目をそれぞれ意味する。
図５は、分化誘導培地に１μｇ／ｍｌのＩＧＦ−ＩＩを添加することによる分化初期のアポトーシスの抑制（分化１日目）。  ＵＴは未処理、ＴＵＮはツニカマイシン前処理をそれぞれ意味する。スケールバーは２００μｍである。
図６は、分化誘導培地中に分泌されたプロカテプシンＢのイムノブロッティングによる検出。  カテプシンのグリコシル型及び非グリコシル形はそれぞれ矢印及び矢頭で示されている。  ＵＴは未処理、ＴＵＮはツニカマイシン前処理、ＴＧはタプシガルジン前処理、１−３は分化誘導培地に代えて第１日目から３日目、ＤＭは未使用分化誘導培地をそれぞれ意味する。
図７は、小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤による前処理されたＣ２Ｃ１２細胞を用いて調製された馴化培地（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ）によるアポトーシスの促進及び大型筋繊維の効率的形成。  増殖中のＣ２Ｃ１２細胞を馴化培地に移して２４時間培養し、その後分化誘導培地で１２日間培養した。ＴＵＮＣＭはツニカマイシン前処理をした細胞を用いて調製した馴化培地、ＴＧＣＭはタプシガルジン前処理をした細胞を用いて調製した馴化培地、ＣＣＭはコントロール細胞（前処理無し）の分化培養から調製される馴化培地を意味する。スケールバーは２００μｍである。
図８は、分化過程にあるＣ２Ｃ１２細胞のアポトーシスに対する抵抗性。  増殖中のＣ２Ｃ１２細胞（ＧＭ）、ツニカマイシンで前処理した分化中のＣ２Ｃ１２細胞（ＴＵＮ）、タプシガルジンで前処理した分化中のＣ２Ｃ１２細胞（ＴＧ）及び前処理していない分化中のＣ２Ｃ１２細胞（ＤＭ）に２μｇ／ｍｌツニカマイシン、１μＭタプシガルジン、１００μｇ／ｍｌエトポシド、０．２μＭスタウロスポリンのいずれかのアポトーシス誘導剤を作用させた。分化中の細胞はいずれも分化開始から３日目のものである。スケールバーは２００μｍである。
図９は、分化過程にあるＣ２Ｃ１２細胞中のＢｃｌ−ｘＬのレベル。  Ｌは生細胞、Ｄは死細胞、ＧＭは増殖細胞、ＵＴは未処理、ＴＵＮはツニカマイシン前処理、ＴＧはタプシガルジン前処理をそれぞれ意味する。分化開始１日目から７日目までの細胞を解析した。
図１０は、分化培地におけるミオジェニンの誘導。  分化開始後、１日目から１０日日のＣ２Ｃ１２細胞内におけるミオジェニンをイムノブロッティングで検出した。ＵＴ，前処理なし；ＴＵＮ，ツニカマイシン前処理；ＴＧ，タプシガルジン前処理。
【発明を実施するための最良の形態】  本願発明は、筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞を筋繊維に分化させる方法を提供する。
本願発明者は、筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞を、分化誘導培地で培養前又は培養開始直後に、小胞体（ＥＲ）ストレスに曝すことにより、筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞が細胞融合を起こし多核体の筋繊維を形成し筋収縮現象を起こすことを見出して本願発明を完成させたものである。本願発明者は試験管内の筋芽細胞培養系及びマウス胎児の筋組織における筋分化過程においてＥＲストレスの発生を検出し、そのストレスによって分化の初期にはアポトーシスが誘起される事を見い出した。培養系の筋分化においては従来、培地の血清濃度を下げることによって分化を誘導していたが、その操作に加えてＥＲストレスを細胞に与える事で筋繊維形成を上昇させる可能性に着目し、本願発明を完成させるに至った。
本願発明には、筋芽細胞を分化誘導培地で分化処理をする前又は培養開始直後に、筋芽細胞を小胞体ストレスに曝す前処理をした後、分化誘導培地で培養することにより筋繊維に分化させる方法及び得られた筋繊維を包含する。
小胞体（ＥＲ）では、リボソームで合成された蛋白質が、例えば、糖鎖修飾、ジスルフィド結合形成などを経て、正しく折り畳まれた立体構造をとり、その後、ゴルジ体へと移送される。しかしながら、タンパク質の突然変異や修飾異常によって正しい折り込みがなされない蛋白質は、小胞体内に蓄積し、この蓄積が過度な場合は、小胞体にストレスを起こし、カスパーゼ１２が関与するアポトーシス（細胞死）が引き起こされると言われている。
従来法による株化筋芽細胞からの分化においては、ミオサイトまでは分化しても、ミオサイトからの細胞融合による筋管細胞の形成及びそれに続く筋繊維の形成が十分ではないために、筋収縮を起こすことができなかった。
本発明者は、細胞死を起こすような小胞体ストレスを一過的に分化誘導前又は分化誘導培養開始直後の筋芽細胞に与えることにより、分化過程初期のアポトーシスを昂進させてストレスに弱い細胞を人工的に除去し、より強い優れた細胞を選抜することで、筋芽細胞の分化を非常に効率的に行えることをはじめて見出したものである。小胞体ストレスを一過的に分化誘導前又は分化誘導開始時の筋芽細胞に与えることが筋芽細胞から分化して生じるミオサイトが細胞融合を起こし筋管細胞、さらには筋繊維を形成する段階に非常に大きな影響を与えていると考えられる。
１．［筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞］
本願発明で用いる筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞としては、種々の動物、例えば鳥類又は哺乳動物由来の初代培養筋芽細胞及び樹立化された筋芽細胞を用いることができる。例えば、ニワトリ、ヒト、サル、ラット、マウス、ブタ、又はウシ等に由来する初代培養筋芽細胞及び樹立化された筋芽細胞または筋芽細胞様細胞を用いることができる。樹立された株化筋芽細胞または株化筋芽細胞様細胞としては、正常筋肉組織から樹立されたものもあれば、横紋筋肉腫などの腫瘍細胞から樹立されたものも用いることができ、具体的には、マウスから樹立化されたＣ２Ｃ１２、マウスＦ−６、マウスＣ２ＢＰ５，ラットＦ−１２、ラットＬ６、ヒトＲＤ（株化筋芽細胞様細胞の例。例えば、ＡＴＣＣのカタログ記載の細胞ＣＣＬ−１３６）等が挙げられ、これらは理化学研究所バイオリソースセンター、米国  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）等より入手できる。
又、任意には、筋芽細胞を実験動物又は患者より摘出し培養した細胞を用いることもできる。例えば、生検で摘出した筋肉をトリプシン−ＥＤＴＡ処理し、初代培養物を作成し、１０％  ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、及び抗生物質を添加したＤＭＥＭ（ダルベッコ変法のイーグル培地）増殖培地で培養し、抗ミオシン重鎖モノクローナル抗体と抗５．１．Ｈ１１抗体両者を用い、フローサイトメトリーで筋芽細胞を分離することができる（Ａｎｎ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ（１９９９）；４：１０３−１０８）。又、例えば、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）；１２５：１２７５−１２８７に記載の方法、又はＣｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（２０００）；１０２（１９  Ｓｕｐｐｌ．３）：ＩＩＩ２１０−２１５．に記載の方法などを利用することもできる。
２．［小胞体ストレス］
小胞体ストレスを与える手段としては、公知の種々の手段、例えば、熱ショック、または、例えば、小胞体ストレス誘導剤に筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞を曝すことにより可能である。好適には、小胞体特異的にストレスを与える手段、具体的には、小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤を用いることができる。更に、筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞を小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤が添加された増殖培地又は分化培地で短時間培養した後、小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤を含まない分化誘導培地中に置き、その分化誘導培地から分離した上清（馴化培地）を用いて、小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤で前処理した場合と同等のアポトーシス促進効果、筋繊維形成促進効果を得る事ができる。
３．［小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤］
本願発明で用いる小胞体ストレス誘導剤としては、種々の小胞体にストレスを与える薬剤が含まれる。好適には、小胞体に特異的にストレスを与える小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤を用いることができる。例えば、小胞体に特異的に発現している酵素の阻害剤、小胞体に特異的な機構の阻害剤も含まれる。例えば、小胞体におけるＮ−グリコシル化を阻害する薬剤、具体的には、ツニカマイシン若しくはコリネトキシン、グリコシダーゼの阻害剤、具体的にはカスタノスペルミン、マンノシダーゼの阻害剤、具体的にはキフネンシン（ｋｉｆｕｎｅｎｓｉｎｅ）若しくはデオキシマンノジリマイシン，小胞体特異的Ｃａ＋＋ＡＴＰａｓｅの阻害剤、具体的には、タプシガルジン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）、又はリアノジン受容体の阻害剤、具体的にはダントロレンを挙げることができる。以下小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤について説明するが、他の小胞体ストレス誘導剤についても、筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞の分化を促進できる限り、同様にして用いることができる。
小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤を用いて、筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞を小胞体特異的小胞体ストレスに曝す手段としては、上記小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤を培地に加える、又は小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤を加えた培地で前処理した後の筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞を分化培地中で培養して得られる培養上清を馴化培地として用いることができる。小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤を培地に加える場合の濃度は、例えば、２４時間後に約半数の筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞がアポトーシスを起こして死滅する程度の濃度を基準として濃度設定することができる。例えば、ツニカマイシンの場合は最終濃度が０．０１〜１、０００μｇ／ｍｌ、好適には、０．５〜１０μｇ／ｍｌ、タプシガルジンの場合は最終濃度が０．０１〜１、０００μＭ、好適には、０．５〜１０μＭとなるように添加することができる。
筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞を小胞体特異的小胞体ストレスに曝す時間としては、筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞に小胞体にストレスが生じて種々の細胞防衛反応（小胞体ストレス応答）は起こるが、しかしアポトーシスを開始するには至らない程度で十分である。例えば、上記薬剤を増殖培地に添加した場合は、上記濃度で０．５〜４８時間程度、好適には、１〜６時間程度筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞を小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤添加培地で培養することにより達成することができる。
小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤を増殖培地に添加して用いた場合は、小胞体ストレスに曝した後、培地を除き、小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤を含まない分化誘導培地を添加する。小胞体特異的小胞体ストレス前処理は増殖培地を用いなくともよく、筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞を通常の増殖培地から分化培地に移す際に、分化培地に小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤を添加して、０．１〜２４時間、好適には、０．５〜３時間程度培養する事も可能である。分化誘導培地としては、従来から知られる標準的な筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞用分化誘導培地を用いることができる。哺乳動物の筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞の分化であれば、例えば、ＤＭＥＭに２％ウマ血清（インビトロジェン）を添加した培地を用いることができる。この時、例えば１μｇ／ｍｌのインスリン（シグマアルドリッチ）をさらに添加してもよい。
４．［分化誘導］
小胞体特異的小胞体ストレスに曝した後、筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞は分化誘導培地で４又は５日間以上、好適には、１週間以上培養を続けることで筋管から筋繊維に分化させることができる。任意には、分化誘導培地での培養を更に３週間以上続けることができる。分化誘導培地としては、例えば、例えば、ＤＭＥＭ（５０単位／ｍｌのペニシリン（インビトロジェン）及び５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（インビトロジェン）を添加したもの）にウマ血清（インビトロジェン）を０〜５％または牛血清（インビトロジェン）（または牛胎児血清（インビトロジェン））を０〜２％添加した培地など、増殖因子の濃度が標準的な増殖培地より低いものを用いることができる。この時、例えば０．１〜１０μｇ／ｍｌのインスリン（インビトロジェン）または０．０５５〜５．５μｇ／ｍｌのトランスフェリン（インビトロジェン）を加えてもよい。
５．［馴化培地（条件培地：調整培地）］
上記小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤が添加された培地で短時間前処理した筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞を、小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤を含まない分化培地で培養した培地又は培養物から分離した上清を馴化培地として用いて小胞体特異的に小胞体ストレスを筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞に与えることができる。
又は、筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞を分化培地に移した後に同培地中で小胞体特異的小胞体ストレスを短時間与え、小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤を含む分化培地、及びその後の培養に用いる小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤を含まない分化培地によって生成される馴化培地を用いてもよい。
より具体的には、例えば、増殖培地中で増殖中の細胞に小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤を加えた増殖培地中で筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞を１〜６時間前処理し、その後、分化誘導培地（誘導剤を含まない）に代えて６〜４８時間、好適には１２時間〜３６時間、更に好適には２４時間培養を継続させて分化させた分化誘導培地の培地又はその上清を、馴化培地として用いることができる。好適には、使用した培地を回収し、低速で遠心して（２，０００ｒｐｍ，２０分間）大きな不純物等を除いて調製することができる。
馴化培地を用いた筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞の前処理は、例えば、０．５〜４８時間、好適には、１２〜３６時間処理することができる。馴化培地での前処理後、通常の分化培地に代えて培養を続けることで、筋繊維への分化を誘導することができる。
なお、筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞を小胞体特異的ストレス誘導剤による前処理後、最初に分化誘導培地に交換し２４時間培養して得られた馴化培地を用いて小胞体特異的ストレスを与えることが好適であるが、前処理後分化誘導培地に２回目の交換後の分化誘導培地での培養により得られた馴化培地、それ以降の培地交換により得られた馴化培地を上記と同様に利用することも可能である。
６．［培養キット］
本願発明には、次の筋繊維培養キットを包含している。
（１）筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞分化キット
（イ）株化した筋芽細胞若しくは筋芽細胞様細胞又は筋芽細胞の初代培養、（ロ）小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤、及び（ハ）分化誘導培地からなる、筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞から筋繊維を分化できるキット。
なお、筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞、小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤及び分化誘導培地は、上述した筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞、誘導剤及び培地を用いる。
具体的には、株化した筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞としては、マウスＣ２Ｃ１２、マウスＦ−６、マウスＣ２ＢＰ５、ラットＦ−１２、ラットＬ６、ラットＨ９Ｃ２、等、又はヒト横紋筋肉腫由来細胞ＲＤ等が挙げられ、小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤としては、例えば、ツニカマイシン又はタプシガルジンが挙げられる。
（２）筋繊維培養キット
（イ）筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞を小胞体ストレスに曝すことにより分化して発生した筋繊維細胞、及び（ロ）分化誘導培地からなるキット。
７．［スクリーニング方法］
本願発明のキットは、筋繊維に作用する薬剤のスクリーニング及び筋繊維を利用した遺伝子発現に用いることができる。
本願発明のキット及びスクリーニング方法は、１）筋再生モデルとして、運動負荷や加齢による筋壊死、筋破壊に対する予防、治療法開発に利用することができる。又さらに、２）筋組織が体内での主要な糖消費組織であることから、形成された筋繊維を糖尿病の病態研究や予防薬、治療薬のスクリーニング、試験に用いることができる。
（１）運動負荷や加齢による筋壊死、筋破壊の予防、治療剤候補のスクリーニング。
（１−１）試験する化合物又は試薬を筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞に投与し、本発明の方法で筋繊維を形成させ、（イ）筋繊維形成のスピードを速める化合物又は試薬、若しくは（ロ）形成効率をさらに上げる化合物又は試薬、又は（ハ）本発明の方法によって形成された筋繊維に対し試験する化合物又は試薬を筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞に投与し、筋繊維を長もち（長生き）させる化合物又は試薬を、筋壊死又は筋破壊に対する予防又は治療のための薬剤候補としてスクリーニングをすることができる。探索された予防又は治療薬候補薬剤は、実際に運動負荷や筋破壊に対して予防、治療効果があるかどうかは実験動物やヒトの治験によって確かめることができる。本発明のスクリーニング方法によれば、筋繊維に直接影響を及ぼす薬剤候補に絞って探索が可能である。
（１−２）  本願発明の方法で形成された筋繊維にたとえば乳酸を注入することで運動負荷の一側面を再現する事ができる。そこで、本願発明の筋繊維に乳酸を注入した後、筋繊維に対し筋壊死又は筋破壊の予防又は治療剤候補のスクリーニング対象となる試薬又は化合物を投与し、筋繊維に対し筋壊死を防止する薬剤を、筋壊死又は筋破壊の予防又は治療剤候補として選択することができる。
（２）筋組織は生体内で最も糖の取り込み量が多く、糖の利用、貯蔵の場として重要で、血中の糖濃度を左右している。そこで、形成された筋繊維は、筋細胞による糖の取り込みと代謝をコントロールする仕組みを研究する材料として、さらに糖取り込み、代謝を人為的にコントロールできる薬剤のスクリーニングの試験系として用いることができる。
具体的には、本発明の方法で形成された筋繊維に対してスクリーニング対象となる試薬又は化合物を投与し、筋繊維における糖の取り込み又は糖の代謝を測定し、筋細胞への糖取り込み、代謝を阻害又は活性化する薬剤候補を選抜することができる。
８．［形質転換筋繊維］
外来遺伝子を導入した筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞から試験管内で分化誘導し筋繊維を形成させることができる。形質転換筋繊維は、生体内に移植して筋組織に同化させる事により、安定な遺伝子発現、遺伝子治療のベクターとして利用する事ができる。
より具体的には、目的とする遺伝子をコードしたｃＤＮＡ又は該ｃＤＮＡで組み換えた組み換え発現ベクターを筋芽培養細胞に導入し、本発明の方法で筋繊維を形成させ、これを生体内に移植して筋組織に同化させる事によって任意の遺伝子発現を継続的に筋組織で行わせる事が、形質転換筋芽細胞と同様に可能である（Ｖａｎｄｅｎｂｕｒｇｈ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ｏｒｇａｎｏｉｄｓ  ｆｏｒ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．７，２１９５−２２００）。従来のように形質転換した筋芽細胞を用いて移植すると、腫瘍を形成する危険性が高まるが、本発明のように、既に分化させた形質転換筋繊維を用いることにより、このような危険性を避けることができる。
筋芽細胞又は筋芽細胞様細胞に導入する遺伝子の種類としては筋組織において機能するタンパク質をコードするものでもよいし、他の組織で機能するタンパク質をコードする遺伝子でもよい。例えば、筋組織では血管系が発達しているので、分泌性のタンパク質を発現させると、血流によって全身性の効果が得ることができる。
以下の実施例で用いる試薬・抗体について：ツニカマイシン、タプシガルジン、スタウロスポリンとエトポシドは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入した。組換え型のＩＧＦ−ＩＩは、ＧｒｏＰｅｐから入手した。抗カスパーゼ−１２は（Ｎａｋａｇａｗａ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０３，９８−１０３）による。抗ＩＧＦ−ＩＩはＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから、抗カテプシンＢはＵｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから、抗Ｂｃｌ−ｘＬはＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。
【実施例１】  小胞体ストレス誘導剤によるＣ２Ｃ１２の前処理の影響
Ｃ２Ｃ１２細胞（ＲＩＫＥＮ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ）はゼラチン・コートのプレートに播いた。１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（シグマアルドリッチ）、５０単位／ｍｌのペニシリン及び５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（インビトロジェン）を添加したＤＭＥＭ（インビトロゲン）を用い、５％のＣＯ２存在下、３７℃で培養を行った。Ｃ２Ｃ１２細胞がほぼコンフレントまで増殖した時点で、培地をフレッシュなＤＭＥＭに交換した。そして、培地に小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤であるツニカマイシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍより購入）又はタプシガルジン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍより購入）をそれぞれ最終濃度がツニカマイシン（２μｇ／ｍｌ）又はタプシガルジン（１μＭ）となるように加えた。なおコントロールの培地には、いずれの小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤も添加しなかった。小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤添加培地で、１時間培養後、培地を、分化誘導培地に交換した。分化誘導培地は２％のウマ血清（インビトロゲン）及び１μｇ／ｍｌのインスリン（シグマアルドリッチ）が添加されたＤＭＥＭ（５０単位／ｍｌのペニシリン及び５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（インビトロジェン）を含む）からなる。分化誘導培地は、２４時間の間隔で新しい培地と交換した。
なお、以下の実施例２−３でも上記と同じ前処理をしている。
（１）  ツニカマイシン又はタプシガルジン前処理後、培地を分化誘導培地に代えて１日後、２日後、３日後のアポトーシス率は次の通りである。
【表１】
2005116194.tif 000002
図１に見られるように、アポトーシスを起こした細胞は細胞体積が大幅に減少し、丸く小さい細胞になり、培養プレートへの接着が悪くなる。丸く接着性の低い細胞は増殖培地中でも少数見られるがこれらは分裂期にある細胞であり、アポトーシス細胞ではない。上記に示されるように、ツニカマイシン又はタプシガルジン前処理後、分化誘導培地に代えて第１日目と第２日目にそれぞれ、培養プレート中のＣ２Ｃ１２細胞の約４０パーセントと２０パーセントがアポトーシスを起こした。このアポトーシス誘導の割合は、分化培地中のコントロール細胞に見られるアポトーシス（１日目、１５％、２日目、１０％未満）より２−３倍高い。
（２）  また、分化誘導培地で、約２週間培養したところ、筋繊維の長さ及び幅、並びに収縮している筋繊維数（３．５ｃｍディッシュあたり）は以下の通りである。
【表２】
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更にその写真を図３に示す。
前処理された筋管のサイズは約２週間増加した。その間細胞融合が起こっており、最終的に長さ１−３ｍｍと幅０．２−０．５ｍｍ程度までになる。これは生体内の筋繊維と同程度の大きさであり、一方、コントロール細胞に比べて１０倍以上の大きさである。これら前処理を行った筋管細胞は分化誘導培地に代えて第７日目に（約１−２サイクル／秒）で自発的に収縮し始めた。このことから、これらの細胞が筋原繊維を含み、機能的な筋繊維（ｍｙｏｆｉｂｅｒ）であったことが分かる。３．５ｃｍのディッシュで５０以上の筋繊維が再現性よく形成された、そして、それらのほとんどは分化培地中で２５日間、収縮を続けた。一方、コントロール細胞はディッシュ１枚当たり２、３の筋繊維を形成し、分化誘導培地に代えて第９日目頃収縮を始めた。しかし、それは分化誘導培地に代えて第１５日目には収縮を停止した。
（３）インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）の発現
Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を分化誘導培地へ移し替えた後、１時間以内にインスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）の誘導が検出されている。インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）は、ＩＧＦ−Ｉレセプターに結合するオートクライン生存因子として作用し、増殖から分化への移行期間に、Ａｋｔに依存する抗アポトーシスの経路を間接的に活性化させている（Ｓｔｅｗａｒｔ及びＲｏｔｗｅｉｎ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２７１，ｐｐ．１１３３０−１１３３８；Ｌａｗｌｏｒ及び、Ｒｏｔｗｅｉｎ  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．１５１，ｐｐ．１１３１−１１４１）。
細胞から培地中に分泌されるＩＧＦ−ＩＩの量的変動について調べるため、細胞を分化誘導培地へ移してから毎日、コントロールの分化培養から調製される馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ、以下ＣＣＭと略す。）及びツニカマイシン前処理をした後、分化誘導培地に移した培養物からの上清である馴化培地（以下ＴＵＮＣＭと略す。）又はタプシガルジン前処理をした後、分化誘導培地に移した培養物からの上清である馴化培地（以下ＴＧＣＭと略す。）を採取し、一定量ずつ分取してＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーによって処理した。処理済みの培地をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット法により分析し、培地に含まれるＩＧＦ−ＩＩを検出した。常法により作製したウエスタンブロットは抗ＩＧＦ−ＩＩ抗体（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、次に西洋わさびペルオキシダーゼ標識抗ＩｇＧ抗体（ジャクソン  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でインキュベートし、ＩＧＦ−ＩＩのシグナルをＥＣＬプラス試薬（アマシャム−ファルマシア）を使用して検出した。
コントロールの分化培養物から調製される馴化培地（ＣＣＭ）中のＩＧＦ−ＩＩが分化誘導培地に代えて第２日目でウエスタンブロット法で検出可能なレベルに達したにもかかわらず、ツニカマイシン前処理をした培養物からの馴化培地（ＴＵＮＣＭ）又はタプシガルジン前処理をした培養物からの馴化培地（ＴＧＣＭ）のＩＧＦ−ＩＩは前処理後、分化誘導培地に代えて第４日目以降に検出された（図４）。この結果は、ツニカマイシン、又はタプシガルジン前処理の影響で分化初期におけるオートクリン生存因子が低下し、アポトーシスが促進された事を示唆している。これは以下の観察によって支持されている。図５に示されるように、組換え型のＩＧＦ−ＩＩを培地に添加して生存因子の濃度を高めることで、小胞体ストレス誘導前処理の有無に関わらず、ほぼ完全に、分化中のＣ２Ｃ１２細胞のアポトーシスを抑制する事ができた。
ＩＧＦ−ＩＩは生存因子として作用するのみならずオートクリン分化因子としても作用するので（Ｆｌｏｒｉｎｉその他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２６６，ｐｐ．１５９１７−１５９２３）、後で示すようにＩＧＦ−ＩＩの低下は筋肉に特異的なタンパク質の誘導の遅れにもつながる。（実施例２参照。）
（４）  小胞体ストレス前処理による細胞外ＩＧＦ−ＩＩのレベル変動の機構：プロカテプシンＢの量
細胞外のＩＧＦ−ＩＩのレベルは、ＩＧＦ−ＩＩ／Ｍａｎ−６Ｐ（マンノース−６−リン酸）レセプターによって、細胞内に取り込まれ分解されることで調節される。ＩＧＦ−ＩＩ／Ｍａｎ−６Ｐの本来のリガンドはＭａｎ−６−Ｐ修飾を受けた、例えばプロカテプシンＢ（Ｈａｎｅｗｉｎｋｅｌその他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２６２，ｐｐ．１２３５１−１２３５５）である。Ｍａｎ−６−Ｐ修飾タンパク質の量的変動がＩＧＦ−ＩＩの分解効率に影響する事が予想された。
細胞を分化誘導培地へ移してから毎日、コントロールの培養物から調製される馴化培地（ＣＣＭ）及びツニカマイシン前処理をした後、分化誘導培地に移された培養物からの上清である馴化培地（ＴＵＮＣＭ）又はタプシガルジン前処理をした後、分化誘導培地に移された培養物からの上清である馴化培地（ＴＧＣＭ）を採取し、プロカテプシンＢの量的変動について検討した。各々一定量の馴化培地をＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロット法により解析した。ウエスタンブロットは抗カテプシンＢ抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、次に西洋わさびペルオキシダーゼ標識抗ＩｇＧ抗体（ジャクソン  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でインキュベートした。プロカテプシンのシグナルは、ＥＣＬプラス試薬（アマシャム−ファルマシア）を使用して検出した。
結果、コントロールの馴化培地（ＣＣＭ）中では第１日目から第３日目まで一定のレベルでＭａｎ−６Ｐ修飾プロカテプシンＢが検出されたにもかかわらず、前処理された培養ではＭａｎ−６Ｐ修飾型が分化誘導培地に代えて第１日目において非常に減少していることがわかった（図６）。ＴＧＣＭの場合はプロカテプシンＢがほとんど検出されず、ＴＵＮＣＭではＭａｎ−６−Ｐ修飾されていない非グリコシル化型プロカテプシンＢだけが検出された。
この結果はプロカテプシンＢをはじめとする細胞外のＭａｎ−６Ｐ修飾タンパク質が小胞体ストレス前処理の影響で減少している事を示唆し、Ｍａｎ−６−Ｐタンパク質の代わりにＩＧＦ−ＩＩがＩＧＦ−ＩＩ／Ｍａｎ−６Ｐレセプターにより結合しやすくなり、分解されやすくなっている事が考えられる。
（５）馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）の利用
アポトーシス及び筋繊維形成促進効果は小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤を細胞に対して直接用いなくても得る事が可能である。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤で１時間、前処理した後、分化誘導培地に移して培養を続けた。分化誘導培地は２４時間ごとに回収して新しい分化誘導培地と交換した。回収した培地は２０分間、２０００ｒｐｍで遠心し、細胞隗や死細胞、及び沈殿物を除き、上清を得てこれを馴化培地とした（上に記載のＴＵＮＣＭ及びＴＧＣＭ）。これとは別に用意したＣ２Ｃ１２細胞をサブコンフルエントまで増殖させ、ＴＵＮＣＭまたはＴＧＣＭで２４時間前処理した。その後、フレッシュな分化誘導培地に移して培養を続けた。このように小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤で前処理した細胞を用いて調製した馴化培地による前処理を加える事により、増殖培地から直接、分化培地に移す通常の分化誘導法に比べて、アポトーシス及び筋繊維形成の促進が見られた。その程度は小胞体待異的小胞体ストレス誘導剤で前処理した細胞の場合と同様のレベルに達した（図７）。ＴＵＮＣＭやＴＧＣＭの代わりにＣＣＭで前処理した場合にはこのような促進効果は見られなかった。
【実施例２】  小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤によるカスパーゼ−１２活性化の確認及びミオジェニンの発現確認
（１）  ウェスタンブロット分析
実施例１と同様に小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤で前処理後、分化誘導培地に代えて第１日目又は第２日目に、生きている又はアポトーシスを起こしたＣ２Ｃ１２細胞をそれぞれ回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル・バッファに溶解して細胞抽出液を作った。抽出液中のタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１４％のアクリルアミド）で分離し、イモビロン−Ｐ膜（ミリポア、ベッドフォード、ＭＡ）に転写した。
ブロッキングの後、上記の膜を抗カスパーゼ−１２抗体（Ｎａｋａｇａｗａ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０３，９８−１０３）で、次に西洋わさびペルオキシダーゼ標識抗ＩｇＧ抗体（ジャクソン  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でインキュベートした。カスパーゼ−１２のシグナルは、ＥＣＬプラス試薬（アマシャム−ファルマシア）を使用して検出した。
図２に示されるように、小胞体ストレス特異的アポトーシスを誘導するプロテアーゼであるカスパース１２がアポトーシス細胞中で活性化しており、小胞体ストレスが生じた事を示している。
（２）  ミオジェニンの発現
ミオジェニンは、筋肉特異的蛋白質である。
実施例１と同様に小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤で前処理後、分化誘導培地に代えて第１日目から１日ごとに第１０日目まで培養したＣ２Ｃ１２細胞を調製し、上記（１）にあるようにしてウエスタンブロットを作製した（図１０）。
ブロッキングの後、上記の膜を抗ミオジェニン抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）で、次に西洋わさびペルオキシダーゼ標識抗ＩｇＧ抗体（ジャクソン  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でインキュベートした。ミオジェニンのシグナルは、ＥＣＬプラス試薬（アマシャム−ファルマシア）を使用して検出した。
コントロール細胞では、第２日目からミオジェニンの発現が確認されたが、小胞体特異的小胞体ストレス誘導剤で前処理された細胞では第４日目ではじめてミオジェニンの発現が確認された。小胞体ストレス前処理によって分化誘導因子、ＩＧＦ−ＩＩの量が減少しており、分化過程の進行が遅くなる事と矛盾しない。
【実施例３】  分化したＣ２Ｃ１２細胞の抵抗性
Ｃ２Ｃ１２細胞をツニカマイシンまたはタプシガルジンで前処理後、分化を開始させ、第３日目にその抵抗性を調べ、増殖中のＣ２Ｃ１２細胞と比べた（図８）。
（１）増殖中のＣ２Ｃ１２細胞、ツニカマイシンで前処理した分化中のＣ２Ｃ１２細胞及び、タプシガルジンで前処理した分化中のＣ２Ｃ１２細胞、前処理していない分化中のＣ２Ｃ１２細胞に２μｇ／ｍｌツニカマイシン、１μＭタプシガルジン、１００μｇ／ｍｌエトポシド、０．２μＭスタウロスポリンのいずれかのアポトーシス誘導剤を作用させた。分化中の細胞はいずれも分化開始から３日目のものである。スタウロスポリンの場合は薬剤添加の３時間後、他のアポトーシス誘導剤の場合は２４時間後に細胞を顕微鏡で観察した。
これらのアポトーシス誘導剤は増殖中のＣ２Ｃ１２細胞に対しては効果が高く、約半数の細胞にアポトーシスを誘導する。一方、前処理された分化誘導培地中の細胞は小胞体ストレス誘導剤（ツイニカマイシン、タプシガルジン）並びにエトポシド及びスタウロスポリンに対してほぼ完全に耐性を示した。この結果は、小胞体ストレスを経験し、アポトーシスを起こさずに生き伸びた細胞はアポトーシス刺激に対してより耐性になったことを示している。
分化誘導培地中でのコントロール細胞（前処理無し）は増殖中の細胞よりわずかに高い抵抗性を示した。これらの結果は、細胞が受けたストレス及びアポトーシスの程度と細胞の薬剤抵抗性との間に正の相関がある（前処理した分化している細胞＞＞前処理なしの分化している細胞＞増殖中の細胞の順に強い）ことを示している。
（２）Ｂｃｌ−ｘＬの発現レベル
増殖中のＣ２Ｃ１２細胞、ツニカマイシン前処理した分化中のＣ２Ｃ１２細胞、タプシガルジン前処理した分化中のＣ２Ｃ１２細胞及び前処理していない分化中のＣ２Ｃ１２細胞中のＢｃｌ−ｘＬの量をウエスタンブロット法によって調べた（図９）。細胞抽出液（実施例２、（１））を電気泳動し、イモビロン−Ｐ膜（ミリポア、ベッドフォード、ＭＡ）に転写して作製したウエスタンブロットをブロッキングの後、抗Ｂｃｌ−ｘＬ抗体（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で、次に西洋わさびペルオキシダーゼ標識抗ＩｇＧ抗体（Ｊａｏｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でインキュベートした。シグナルは、ＥＣＬプラス試薬（アマシャム−ファルマシア）を使用して検出した。
（結果）
Ｂｃｌ−ｘＬは強力な抗アポトーシス活性を持つアポトーシス抑制タンパク質である。生細胞（増殖中、分化培地中）におけるＢｃｌ−ｘＬの量は３者の間で大きな違いは見られない。しかし、アポトーシスを起こした細胞中のＢｃｌ−ｘＬのレベルは生細胞中に比べて顕著に低かった。従ってアポトーシス細胞の示す低い抵抗性は、少なくとも部分的にはＢｃｌ−ｘＬのレベルが低い事で説明される。
Ｃ２Ｃ１２細胞の培養物から複数の単一クローンを分離し、増殖培地で細胞数を増やしてから分化培地に移してアポトーシスについて検討した。その結果、たとえ単一クローンから出発しても細胞集団はアポトーシス細胞と生き残って分化する細胞に分かれた。これは、当初脆弱性とＢｃｌ−ｘＬ発現において均一であったＣ２Ｃ１２培養物が死滅する細胞と生存する細胞に分けられたことを示している。そのような選別を行う正確な機構は現在不明だが、ここにおけるアポトーシスはストレスに弱い細胞の除去に貢献し、大きな筋繊維を形成でき、筋収縮のストレスに耐える細胞を選別する働きがあるのかもしれない。
以上の選別は小胞体ストレスに特異的な現象である可能性が高く、例えば他のアポトーシス誘導刺激（例えばエトポシド）を筋芽細胞に与えたところ、分化過程におけるアポトーシスは昂進するものの効率的な筋繊維形成は見られなかった。
【産業上の利用可能性】  本願発明の方法により、（１）従来法より筋繊維の形成効率を飛躍的に高めることができ、同数の細胞を出発材料とした場合、約１０倍以上形成率を上げることができる。（２）更に、形成される筋繊維の大きさも、従来法に比べ、平均して、長さ及び幅が１０倍の筋繊維を形成できる。（３）又、筋繊維の寿命も、従来法のものは、約２週間であったが、本発明により調製した筋繊維は、３週間以上も生き延びるものである。
本願発明の筋繊維は、筋の再生技術の開発、筋肉に影響を与える試薬のスクリーニング、筋繊維を利用した遺伝子治療に有効である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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