(57)【要約】  本発明は、必須脂肪酸に結合したＬ−ＤＯＰＡ又はドパミンを含む化合物を提供する。化合物は下記一般式で表される。  Ｒ1−Ｚ−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＣＨ（Ｒ3）−（ＣＨ2）m−Ｏ−Ｙ−Ｒ2  式中、Ｒ1は脂肪酸に由来し、Ｒ2はＬ−ＤＯＰＡ又はドパミンに由来する。好ましい連結基は１，３−プロパンジオール構造を有する。【選択図】図９【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式３で表される化合物。
【化１】
2012520274.tif 000027
式中、Ｒ1は、望ましくは２以上のシス又はトランス二重結合を有する、Ｃ12〜Ｃ30脂肪酸、好ましくはＣ16〜Ｃ30脂肪酸に由来する、アシル基又は脂肪酸基であり、
Ｒ3はＨ又はＣＨ3であり、
ｎは０又は１であり、
ｍは０又は１であり、
Ｙは、単結合であるか、又は各末端に−Ｃ（＝Ｏ）−基もしくは−Ｐ（＝Ｏ）−基を有する連結基であり、
Ｚは、単結合であるか、又は各末端に−Ｃ（＝Ｏ）−基もしくは−Ｐ（＝Ｏ）−基を有する連結基であり、
Ｒ2は下記式
【化２】
2012520274.tif 000028
又は
【化３】
2012520274.tif 000029
もしくは
【化４】
2012520274.tif 000030
のいずれかで表される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は必須脂肪酸化合物及びその治療用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
レボドパ（Ｌ−ＤＯＰＡ：３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン）は下記式１で表される。
【化１】
2012520274.tif 000002
【０００３】
ドパミン（ＤＡ）はＬ−ＤＯＰＡの脱炭酸により形成され、下記式２で表される。
【化２】
2012520274.tif 000003
【０００４】
Ｌ−ＤＯＰＡは、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：ＰＤ）の制御においてドパミンレベルを上昇させるプロドラッグとして使用されている。Ｌ−ＤＯＰＡは、パーキンソン病患者に対して容易に使用できる侵襲性の低い唯一の治療法である。Ｌ−ＤＯＰＡは血液脳関門を通過することができるが、ドパミン自体は血液脳関門を通過することができない。Ｌ−ＤＯＰＡが中枢神経系（ＣＮＳ）に入ると、芳香族Ｌ−アミノ酸脱炭酸酵素によってドパミンに代謝される。
【０００５】
パーキンソン病の初期段階では、Ｌ−ＤＯＰＡによってパーキンソン病患者の生活の質（クオリティ・オブ・ライフ）が顕著に向上する。しかし、Ｌ−ＤＯＰＡ治療（特に５〜１０年の継続的治療後）には重大な問題点がある。例えば、Ｌ−ＤＯＰＡに対する運動応答（ｍｏｔｏｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）に変動が生じる。運動症状の変動（ｍｏｔｏｒ  ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎｓ）は、次回投薬前に生じる薬の「ウェアリングオフ（ｗｅａｒｉｎｇ  ｏｆｆ）現象」（薬の切れ際の症状の悪化（ｅｎｄ−ｏｆ−ｄｏｓｅ  ｆａｉｌｕｒｅ）ともいう）といった比較的単純なものから、運動機能の不規則で重篤な変動まで、多岐に渡る。そのため、患者は、重篤なパーキンソン病様症状（「オフ」状態）、正常に近い運動状態（「オン」状態）、そして著しい不随意運動（ジスキネジア）の状態を、急激且つ予測不可能に交互に示す場合がある（「オン−オフ（ｏｎ−ｏｆｆ）」現象）。運動症状の変動は、前シナプスに関する問題（Ｌ−ＤＯＰＡ吸収のばらつき、前シナプスにおける貯蔵容量の低下等）と関連している。それにより、薬剤の連続的な送達ではなく、ドパミン受容体の過度の脈動性刺激（ｐｕｌｓａｔｉｌｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）が生じる。
【０００６】
ドパミンへの転換は末梢組織においても生じ、そうすると有害作用が引き起こされ、ＣＮＳに到達するドパミンが減少する。そのため、通常は末梢ＤＯＰＡ脱炭酸酵素阻害剤（カルビドパ又はベンセラジド）並びに多くの場合にはカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害剤を共投与する。
【０００７】
Ｌ−ＤＯＰＡは末梢において、芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＤＣ）によってドパミンに、またカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）によって３−Ｏ−メチルドパに、急速に代謝される。Ｌ−ＤＯＰＡの消失半減期（ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）は約９０分である。一回の経口投与後に最終的に脳に到達するＬ−ＤＯＰＡの量は、胃内容排出速度、腸管輸送における他のアミノ酸の競合の有無、及び特に末梢代謝の程度に応じて決まる。Ｌ−ＤＯＰＡの投与後、Ｌ−ＤＯＰＡの約５％しか血液脳関門を通過することができない。患者は、非常に高用量のＬ−ＤＯＰＡを１日に数回摂取する必要があり、血漿中薬物濃度が著しく変動する。生物学的利用能の向上は、パーキンソン病患者にとって大きな利点となり、その利点としては例えば変動の低減があるが、それだけでなく用量に関連する末梢性副作用（悪心、嘔吐、低血圧等）の低減も得られる。血液脳関門を通過したＬ−ＤＯＰＡは線条体ニューロンに吸収され、神経細胞内のＡＡＤＣによってドパミン（ＤＡ）に転換され、そのドパミンがシナプス前から放出される。ドパミンは強力な酸化剤であるため、高用量のＬ−ＤＯＰＡの投与によって酸化ストレスの悪化に起因するさらなる神経変性が生じる可能性が報告されている。したがって、非常にわずかなＬ−ＤＯＰＡしか脳に到達しないとしても、線条体の末端部位数の減少によって貯蔵容量が低下しているパーキンソン病患者の脳においてＬ−ＤＯＰＡが適切に貯蔵されない場合には、貯蔵されなかったＬ−ＤＯＰＡがドパミンに転換された後に酸化ストレスを生じさせる可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ９８／１６２１６
【特許文献２】ＷＯ００／４４３６１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
現在販売されているＬ−ＤＯＰＡ製剤は不十分且つ不規則に吸収され、末梢部における分解が著しい。そのため、経口投与したＬ−ＤＯＰＡの１％程度しか脳に到達することができない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、必須脂肪酸とＬ−ＤＯＰＡ又はドパミンとの化合物を提供する。本発明の化合物は、下記式３で表される。
【化３】
2012520274.tif 000004
式中、
Ｒ1は、望ましくは２以上のシス又はトランス二重結合を有する、Ｃ12〜Ｃ30脂肪酸、好ましくはＣ16〜Ｃ30脂肪酸に由来する、アシル基又は脂肪酸基であり、
Ｒ3はＨ又はＣＨ3であり、
ｎは０又は１であり、
ｍは０又は１であり、
Ｙは、単結合、又は各末端に−Ｃ（＝Ｏ）−基もしくは−Ｐ（＝Ｏ）−基を有する連結基（例えば、式−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ2）p−Ｃ（＝Ｏ）−（式中、ｐは０〜４の整数である）で表される連結基）であり、
Ｚは、単結合、又は各末端に−Ｃ（＝Ｏ）−基もしくは−Ｐ（＝Ｏ）−基を有する連結基（例えば、式−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ2）p−Ｃ（＝Ｏ）−（式中、ｐは０〜４の整数である）で表される連結基）であり、
Ｒ2は、Ｙが単結合である場合には例えば下記式で表され、
【化４】
2012520274.tif 000005
Ｙが連結基である場合には例えば下記式のいずれかで表される。
【化５】
2012520274.tif 000006
【化６】
2012520274.tif 000007
【００１１】
本発明の化合物は、Ｌ−ＤＯＰＡのカルボキシル基もしくはアミノ基又はドパミンのアミノ基を基にする脂肪酸誘導体であり、該誘導体は単一の明確に定義された化学物質として形成される。化合物が分割される部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）の数という視点から言えば、誘導体を形成するカップリングは、二連化合物を形成するような直接結合であってもよく、又は、三連化合物を形成するような、適当な連結基を介するものとしてもよい。連結基Ｙ及びＺは、リン酸エステル、コハク酸エステル又は二官能性酸に由来する基であってもよい。
【００１２】
好ましい化合物は、１，３−プロパンジオール構造（ｎ＝１、ｍ＝１、Ｒ3＝Ｈ）を有する。
【化７】
2012520274.tif 000008
【００１３】
リン酸、コハク酸又は二官能性酸に由来する連結基Ｚ又はＹが、Ｒ1及び／又はＲ2基と１，３−プロパンジオール残基との間に介在していてもよい（上記式３参照）。例えば、連結基Ｙが、ジオールとＬ−ＤＯＰＡ部分又はドパミン部分との間に介在していてもよい。
【００１４】
任意の脂肪酸（好適には、望ましくは２以上のシス又はトランス炭素−炭素二重結合を有するＣ12〜Ｃ30又はＣ16〜Ｃ30脂肪酸）を使用することができる。脂肪酸としては、ｎ−６又はｎ−３系の必須脂肪酸又はオレイン酸、コルンビン酸、パリナリン酸もしくは共役リノール酸が好ましい。
【００１５】
図１に１２種類の（ｎ−６）及び（ｎ−３）必須脂肪酸を示す。自然界ではシス配置のみを有する必須脂肪酸は、対応するオクタデカン酸、エイコサン酸又はドコサン酸の誘導体（例えば、ｚ，ｚ−オクタデカ−９，１２−ジエン酸又はｚ，ｚ，ｚ，ｚ，ｚ，ｚ−ドコサ−４，７，１０，１３，１６，１９−ヘキサン酸）として体系的に命名されるが、炭素数、不飽和中心の数、及び鎖末端から不飽和結合開始位置までの炭素数に基づく数値表現（例えばそれぞれ１８：２ｎ−６又は２２：６ｎ−３）が簡便である。また、頭文字（例えば、ＥＰＡ）及び名称の短縮形（例えば、エイコサペンタエン酸）が慣用名として用いられる。ＣＮＳ疾患の治療における親油性必須脂肪酸の使用は、例えば国際公開第ＷＯ９８／１６２１６号及び国際公開第ＷＯ００／４４３６１号に開示されている。血液脳関門は実質的に脂質で構成されており、必須脂肪酸は血液脳関門を通過することができる。
【００１６】
ガンマ−リノレン酸（ＧＬＡ）又はジホモ−ガンマ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）は、ＣＮＳ疾患の治療において様々な望ましい作用を示す脂肪酸である。その他の脂肪酸（例えば、任意の必須脂肪酸（ＥＦＡ）、特に、図１に示されるｎ−６及びｎ−３系の１２種類の天然脂肪酸）も使用することができる。これらの１２種の脂肪酸のうち、アラキドン酸、アドレン酸、ステアリドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸ｎ−３及びドコサヘキサエン酸が特に有用である。図１には示していないが、共役リノール酸（ｃＬＡ）、オレイン酸及びコルンビン酸（ＣＡ）も、有用であると見込まれるその他の脂肪酸の例である。
【００１７】
また、本発明は、パーキンソン病又はその他の運動障害（例えば、ハンチントン病及び特定の遺伝子における過剰な数のトリヌクレオチド反復に関連することが知られているその他の病気（脆弱性Ｘ症候群、フリートライヒ運動失調、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調Ｉ型、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、ハウリバー症候群（Ｈａｗ  Ｒｉｖｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、マシャド・ジョセフ病及び筋強直性ジストロフィー等））を治療するための、本発明の化合物を含む医薬組成物を提供する。
【００１８】
本発明は、前記薬剤の製造方法、並びに、上記疾患の症状を治療もしくは予防する、又は上記疾患の発症を遅延させる方法も提供する。
【００１９】
本発明の化合物は脳内ドパミンレベルを有意に上昇させることが判明している。安定した脳内ドパミンレベルが得られ、末梢部におけるＬ−ＤＯＰＡの分解が減少する。その結果、１日あたりの投与回数を少なくすることができ、オン−オフ及び／又は運動異常サイクルの原因になると考えられるピークと谷間（ｔｒｏｕｇｈ）を減少させることができる。
【００２０】
本発明の化合物によれば、Ｌ−ＤＯＰＡ又はドパミンをより良好にＣＮＳに取り込むことができる。
【００２１】
本発明の化合物は安定しており、医薬の制御に関して有利である。本発明の化合物は、経口、非経口又は局所製剤として体内に容易に取り込まれ、身体によく許容される。化合物の各部分は単一の分子として同時に送達される。そのため、２以上の分子が別個の化合物として投与される場合に生じる制御上の問題並びにキラル中心が生じる可能性を回避することができる。いったん血液脳関門を通過すると、該化合物は容易に分解し、Ｌ−ＤＯＰＡ又はドパミンが放出される。また、必須脂肪酸も放出される。
【００２２】
Ｌ−ＤＯＰＡ又はドパミンの親油性を高めることにより、脂質バリアを容易に通過する特性に加えて興味深い所定の特性が得られることが判明している。そのような特性としては、長い作用持続時間、副作用（特に胃腸副作用）の低減、肝初回通過代謝の回避、及び各種物質の部位特異的送達の可能性が挙げられる。
【００２３】
様々な特定の脂肪酸が、Ｌ−ＤＯＰＡ又はドパミンの作用を増大させることができると考えられる。治療における特に有用な点として、ほとんどの場合には脂肪酸は無毒であり、重い副作用が生じるリスクを伴わずに安全に大量投与できることが挙げられる。
【００２４】
各脂肪酸は、天然動物源、植物源又は微生物源から精製するか、当業者に公知の方法又は今後開発される方法によって化学的に合成することができる。
【００２５】
誘導体化には１以上のエステル結合の形成が必要となる。そのようなエステル結合は、適当なエステル合成法、特に以下の方法で形成することができる。
（ａ）第三級有機塩基（例えばピリジン）の存在下又は非存在下、適当な不活性溶媒（例えばジクロロメタン）中において、アルコールと、酸塩化物、酸無水物又は活性化エステルとを０〜１２０℃の温度で反応させる。
（ｂ）適当な酸性触媒（例えば４−トルエンスルホン酸）の存在下、適当な不活性溶媒（例えばトルエン）を使用し又は使用せずに、アルコールと、酸又は酸の短鎖又は中鎖アルキルエステルとを、反応で形成された水が除去される状態で（例えば真空下において）５０〜１８０℃の温度で反応させる。
（ｃ）適当な第三級有機塩基（例えば４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン））の存在下又は非存在下、不活性溶媒（例えばジクロロメタン）中において、アルコールと酸を縮合剤（例えば１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド）の存在下で０〜５０℃の温度で反応させる。
（ｄ）加水分解酵素（例えばブタ肝臓エステラーゼ）の存在下、適当な溶媒（例えばヘキサン）を使用し又は使用せずに、アルコールと、酸、酸の短鎖又は中鎖アルキルエステル又は酸の活性化エステル（例えばビニルエステル）とを、反応で形成された水またはアルコールもしくはアルデヒド副生成物が除去される状態で（例えば真空下において）２０〜８０℃の温度で反応させる。
（ｅ）適当な不活性溶媒（例えばジメチルホルムアミド）中、適当な塩基（例えば炭酸カリウム）を使用し又は使用せずに、酸と適当なアルコール誘導体（例えばヨウ化物）とを０〜１８０℃の温度で反応させる。
（ｆ）触媒量のＭ+ＯＹ-アルコキシド（式中、Ｍはアルカリ又はアルカリ土類金属（例えばナトリウム）であり、Ｙは炭素数１〜４の分岐又は非分岐の飽和又は不飽和アルキル基である）の存在下、適当な溶媒（例えばトルエン）を使用し又は使用せずに、低級アルコール（ＨＯＹ）が反応混合物から除去される状態で（例えば真空下において）、アルコールと、酸の短鎖又は中鎖アルキルエステルとを５０〜１８０℃の温度で反応させる。
【００２６】
ある種の生体活性物質の誘導体化ではアミド結合の形成が必要となる。そのようなアミド結合は、適当なアミド合成法、特に以下の方法で形成することができる。
（ｇ）第三級有機塩基（例えばピリジン）の存在下又は非存在下、適当な不活性溶媒（例えばジクロロメタン）中において、アミンと、酸塩化物、酸無水物又は活性化エステルとを０〜１２０℃の温度で反応させる。
（ｈ）適当な第三級有機塩基（例えば４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン））の存在下又は非存在下、不活性溶媒（例えばジクロロメタン）中において、アミンと酸を縮合剤（例えば１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド）の存在下において０〜５０℃の温度で反応させる。
（ｉ）加水分解酵素（例えばブタ肝臓エステラーゼ）の存在下、適当な溶媒（例えばヘキサン）を用いるか又はそのような溶媒を用いずに、水またはアルコールもしくはアルデヒド副生成物が除去される状態で（例えば真空下において）、アミンと、酸、酸の短鎖又は中鎖アルキルエステル又は酸の活性化エステル（例えばビニルエステル）とを２０〜８０℃の温度で反応させる。
【００２７】
一般的に言って、これらの化学反応は、結合させる化合物の性質及び結合が直接結合か間接結合かに応じて当然異なる。例えば、脂肪酸の対は、脂肪酸−脂肪アルコールエステル又は無水物として直接結合させ得る。また、ジオール連結基を用いる場合には、通常はより簡便である脂肪酸とのエステル結合の代替として、脂肪アルコールとのエーテル結合を用いることができる。いずれの場合にも、結合は公知の化学反応によって行うことができる。
【００２８】
活性物質の対（１，３−プロパンジオール結合により結合）の例
Ｌ−ＤＯＰＡ＋ＧＬＡ
Ｌ−ＤＯＰＡ＋ＤＧＬＡ
Ｌ−ＤＯＰＡ＋ＥＰＡ
Ｌ−ＤＯＰＡ＋ＤＨＡ
【００２９】
医薬製剤
さらなる態様において、本発明は、第一の態様に係るドパミン又はＬ−ＤＯＰＡ化合物を含む医薬製剤を提供する。これらの医薬組成物の有効成分は、実質的に本発明に係るドパミン又はＬ−ＤＯＰＡ化合物のみを含んでいてもよい。
【００３０】
化合物は、医薬、スキンケア製品又は食品製造分野の当業者に公知のあらゆる適当な方法によって製剤化することができる。化合物は、経口、経腸、局所、非経口（皮下、筋肉内又は静脈内）、経直腸、経膣又はその他の適当な経路により投与することができる。
【００３１】
１，３−プロパンジオールジエステルは、リン脂質乳化剤又は特にガラクト脂質乳化剤を用いて容易に乳化させることができる。そのような乳化物は、経口、経腸及び静脈内経路による投与に特に有用である。
【００３２】
また、抗菌性保存剤（例えばソルビン酸カリウム）及び香味料を経口投与用乳化物に添加してもよい。
【００３３】
活性物質の投与量は、概して１ｍｇ／日〜２００ｇ／日、好ましくは１０ｍｇ／日〜１０ｇ／日、より好ましくは１０ｍｇ／日〜３ｇ／日の範囲である。化合物は１日に１回又は２回のみ投与すればよい。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】必須脂肪酸及びその代謝を示す。
【図２】実施例５の実験１におけるオープンフィールド試験の立ち上がり行動の結果を示す。
【図３】実施例５の実験１における線条体中のドパミンレベルを示す。
【図４】実施例５の実験１における皮質中の神経伝達物質量を示す。
【図５】実施例５の実験２におけるオープンフィールド試験の行動結果を示す。
【図６】実施例５の実験２における線条体中のドパミンレベルを示す。
【図７】実施例５の実験２における皮質中の神経伝達物質量を示す。
【図８】実施例５の実験３におけるロータロッド行動結果を示す。
【図９】実施例５の実験３におけるオープンフィールド行動結果を示す。
【図１０】実施例５の実験３における線条体中のドパミンレベルを示す。
【図１１】実施例５の実験３における線条体中のＤＰＯＡ／ドパミン比を示す。
【図１２】実施例５の実験３における線条体中のＬ−ＤＯＰＡレベルを示す。
【実施例】
【００３５】
実施例１：ＧＬＡ−ドパミン複合体（式５）の合成
【化８】
2012520274.tif 000009
【００３６】
試薬
2012520274.tif 000010
【００３７】
手順
式１で表されるＧＬＡ（５．５６ｇ、０．０２ｍｏｌ、１．１１当量）のアセトニトリル（６０ｍＬ）溶液にトリエチルアミン（３．２ｍＬ）を窒素下で添加した後、式２で表されるクロロギ酸イソブチル（２．３２ｍＬ、０．０１８ｍｏｌ、１．０当量）を添加した。クロロギ酸イソブチルの添加直後に白い沈殿物が生じた。得られた溶液を０℃で３時間撹拌し続けた。混合物をロータリーエバポレーターで蒸発乾固させ、得られた式３で表される混合無水物に、トリエチルアミン（２．７８ｍＬ）含有無水ＤＭＦ（５０ｍＬ）中の塩酸ドパミン（３．２ｇ）の溶液を添加した。得られた混合物を０℃で撹拌した後、１８時間にわたって撹拌を続けて室温までゆっくりと昇温させた。反応混合物を水（４００ｍＬ）で希釈し、ジエチルエーテル（２５０ｍＬ×２回）で抽出した。有機相を水（３００ｍＬ×３回）及び食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮乾固させて黄色がかったオイル（８．１ｇ）を粗生成物として得た。得られた粗生成物をカラム（溶離溶媒：２％メタノール−ジクロロメタン）で精製して式５で表される生成物（５．３９ｇ、収率：７２．５％）を得た。
【００３８】
分析結果
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，５００ＭＨｚ）：δH：６．８０（ｄ，１Ｈ），６．７４（ｓ，１Ｈ），６．５５（ｄ，１Ｈ），５．７３（ｔ，１Ｈ），５．２５〜５．４５（ｍ，６Ｈ），３．４６（ｍ，２Ｈ），２．８０（ｍ，４Ｈ），２．６７（ｔ，２Ｈ），２．１７（ｍ，２Ｈ），２．０５（ｍ，４Ｈ），１．６１（ｍ，２Ｈ），１．２４〜１．３８（ｍ，８Ｈ），０．８８（ｔ，３Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｍ+＋１：４１４．１
【００３９】
実施例２：ＧＬＡ−ドパミン複合体（式１１）の合成
【化９】
2012520274.tif 000011
【００４０】
試薬
2012520274.tif 000012
【００４１】
手順
ＤＣＭ（２５０ｍＬ）中の１，３−ジヒドロキシプロパン（９６ｇ、１．２６ｍｏｌ）、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（６０．３５ｇ、０．２９ｍｏｌ）及び４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン（３９．７ｇ、０．３２ｍｏｌ）の混合物に、式１で表されるＺ，Ｚ，Ｚ−オクタデカ−６，９，１２−トリエン酸（ＧＬＡ、７０ｇ）の溶液を窒素下において室温で添加した。前記混合物を１８時間撹拌しながら反応させた。粗反応混合物を濾過し、濾過物を希釈塩酸（１Ｍ）、水及び食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。真空濾過後、濾過物を濃縮して粗生成物を得た。得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィ（溶出溶媒：ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１０〜３０％））で精製して式７で表されるＧＬＡ−モノエステルを黄色いオイルとして得た（６８ｇ、収率：８０．１％）。
【００４２】
分析結果
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，５００ＭＨｚ）：δH：５．３０〜５．４５（ｍ，６Ｈ），４．２３（ｔ，２Ｈ），３．６７（ｍ，２Ｈ），２．７９（ｍ，４Ｈ），２．５０（ｂｒ，１Ｈ），２．３１（ｔ，２Ｈ），２．０８（ｍ，４Ｈ），１．８８（ｍ，２Ｈ），１．６５（ｍ，２Ｈ），１．２０〜１．４０（ｍ，８Ｈ），０．８８（ｔ，３Ｈ）
【化１０】
2012520274.tif 000013
【００４３】
試薬
2012520274.tif 000014
【００４４】
手順
式７で表されるＧＬＡ−モノエステル（４０ｇ、０．１１９ｍｏｌ）及び無水コハク酸（１１．９ｇ、０．１１９ｍｏｌ）のＴＨＦ（５８０ｍＬ）溶液を、窒素雰囲気下で撹拌しながら０℃まで冷却した（塩／氷浴）。冷却した溶液にＤＢＵ（１８．１ｇ、０．１１９ｍｏｌ）のＴＨＦ（２２０ｍＬ）溶液を０℃で滴下した。滴下終了後、反応混合物を室温に戻し、６時間撹拌した。ＴＨＦを減圧下で除去し、残渣をジエチルエーテル（１Ｌ）に溶解し、分液漏斗へ移した。有機相をＨＣｌ（２Ｍ、１Ｌ）、水（１Ｌ）及び食塩水（１Ｌ）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ4で乾燥させ、濾過し、濃縮乾固させて粗生成物を得た。得られた粗生成物は、シリカプラグを通過させ、ヘキサンで溶離して非極性不純物を除去して精製した。不純物の除去（ＴＬＣにて確認）後、生成物を４０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶離して式９で表される中間体を黄色いオイルとして得た（４６．７７ｇ、収率：９０％）。
【００４５】
分析結果
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，５００ＭＨｚ）：δH：５．３０〜５．４５（ｍ，６Ｈ），４．１０〜４．２０（ｍ，４Ｈ），２．７９（ｍ，４Ｈ），２．６８（ｍ，２Ｈ），２．６２（ｍ，２Ｈ），２．３１（ｔ，２Ｈ），２．０９（ｍ，４Ｈ），１．９６（ｍ，２Ｈ），１．６２（ｍ，２Ｈ），１．２０〜１．４０（ｍ，８Ｈ），０．８９（ｔ，３Ｈ）
【化１１】
2012520274.tif 000015
【００４６】
試薬
2012520274.tif 000016
【００４７】
手順
式９で表される脂肪酸中間体（１２．０ｇ、０．０２７５２ｍｏｌ、１．１１当量）のアセトニトリル（１２０ｍＬ）溶液に、トリエチルアミン（４．９６ｍＬ、０．０３５６７ｍｏｌ、１．４４当量）を窒素下で添加した後、クロロギ酸イソブチル（３．２１ｍＬ、０．０２４７７ｍｏｌ、１．０当量）を添加した。クロロギ酸イソブチルの添加直後に白い沈殿物が生じた。得られた溶液を０℃で３時間撹拌し続けた。得られた混合物をロータリーエバポレーターを使用して蒸発乾固させ（未反応のクロロギ酸塩が蒸発したことを確認）、得られた式１０で表される混合無水物に、塩酸ドパミン（４．９２ｇ、０．０２６ｍｏｌ、１．０当量）のトリエチルアミン（３．６１６ｍＬ）含有無水ＤＭＦ（１００ｍＬ）溶液を添加した。得られた混合物を０℃で撹拌した後、室温までゆっくりと昇温させた。混合物を室温で１８時間撹拌し続けた。反応混合物を水（５００ｍＬ）で希釈し、ジエチルエーテル（５００ｍＬ）で抽出した。有機相を水（５００ｍＬ×３回）及び食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮乾固させて黄色がかったオイル（１４．８ｇ）を粗生成物として得た。得られた粗生成物をカラム（溶離溶媒：１．２％メタノール−ジクロロメタン）で精製して式１１で表される生成物を得た（７．２５ｇ、収率：５０．６％）。
【００４８】
分析結果
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，５００ＭＨｚ）：δH：６．７９（ｄ，１Ｈ），６．７０（ｓ，１Ｈ），６．５７（ｄ，１Ｈ），５．９５（ｔ，１Ｈ），５．２５〜５．４５（ｍ，６Ｈ），４．１５（ｍ，４Ｈ），３．４６（ｍ，２Ｈ），２．８０（ｍ，４Ｈ），２．６７（ｍ，４Ｈ），２．４４（ｔ，２Ｈ），２．３２（ｔ，２Ｈ），２．０９（ｍ，４Ｈ），１．９６（ｍ，２Ｈ），１．６５（ｍ，２Ｈ），１．２４〜１．３８（ｍ，８Ｈ），０．８８（ｔ，３Ｈ）；ＭＳ（ＡＰＣＩ）：Ｍ+＋１：５７２．３
【００４９】
実施例３：ＧＬＡ−レボドパ複合体（式１８）の合成
【化１２】
2012520274.tif 000017
【００５０】
試薬
2012520274.tif 000018
【００５１】
手順
式１２で表されるＬ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）アラニン（レボドパ、１５ｇ）をジオキサン（１５０ｍＬ）に溶解し、１Ｍ  ＮａＯＨ（１２０ｍＬ）を添加してｐＨを約１２に調整した。得られた溶液を０℃に冷却し、式１３で表される二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（１８．２７ｇ）を添加した。反応混合物を室温で４時間撹拌し続けた。次に、溶媒を蒸発させ、得られた水性の残渣を酢酸エチル（２５０ｍＬ）に添加した後、激しく撹拌しながらｐＨが約２となるまで１Ｍ  ＨＣｌ溶液を添加した。次に、有機相を分離し、水性部分を再度酢酸エチル（２００ｍＬ）で抽出した。有機相を水（３００ｍＬ×２回）及び食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮乾固させて式１４で表される中間体（２０．１ｇ）を得た。
【００５２】
分析結果
ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6，５００ＭＨｚ）：δH：６．９２（ｄ，１Ｈ），６．６１（ｍ，２Ｈ），６．４７（ｍ，１Ｈ），３．９９（ｍ，１Ｈ），２．８２（ｄｄ，１Ｈ），２．６５（ｄｄ，１Ｈ），１．３４（ｓ，９Ｈ）
【化１３】
2012520274.tif 000019
【００５３】
試薬
2012520274.tif 000020
【００５４】
手順
式１４で表されるＢｏｃ−レボドパ（２０．１ｇ）及びｔｅｒｔ−ブチルジメチルクロロシラン（２９．５ｇ）のアセトニトリル（２５０ｍＬ）溶液を氷浴中で０℃まで冷却した。１０分間撹拌した後、ＤＢＵ（２９．８７ｇ）を１０分かけて添加した。得られた混合物を０℃で撹拌した後、室温で１６時間撹拌した。溶媒のアセトニトリルを真空下で除去し、残渣を酢酸エチル（４００ｍＬ）及び水（４００ｍＬ）の間で抽出（ｐａｒｔｉｔｉｏｎｅｄ）した。有機相を水（４００ｍＬ×３回）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮乾固させて粗生成物（４１．２ｇ）を得た。得られた粗生成物をカラム（溶離溶媒：２％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ、その後５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して式１５で表される中間体（２３．０ｇ）を得た。
【００５５】
分析結果
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，５００ＭＨｚ）：δH：６．７５（ｄ，１Ｈ），６．６６（ｓ，１Ｈ），６．６２（ｄ，１Ｈ），４．９７（ｍ，１Ｈ），４．５７（ｍ，１Ｈ），２．９９（ｍ，２Ｈ），１．４２（ｓ，９Ｈ），０．９８（ｓ，１８Ｈ），０．１８（ｓ，１２Ｈ）
【化１４】
2012520274.tif 000021
【００５６】
試薬
2012520274.tif 000022
【００５７】
手順
実施例２で得られた式７で表される脂肪酸アルコール（１４．７ｇ）及び式１５で表されるＴＢＳ−ｂｏｃ−レボドパ（２３ｇ）のＤＣＭ溶液にＤＣＣ（１０．５４ｇ）及びＤＭＡＰ（７．０５ｇ）を添加し、得られた反応混合物を室温で１８時間撹拌した。混合物中の固体を濾過によって取り除き、濾液を濃縮乾固した。残渣を酢酸エチル（３００ｍＬ）及び１Ｍ  ＨＣｌ（３００ｍＬ）の間で抽出した。有機相を水及び食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮乾固させて粗生成物を得た。得られた粗生成物をカラム（溶離溶媒：１％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して式１６で表される中間体（１９．７ｇ）を得た。
【００５８】
分析結果
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，５００ＭＨｚ）：δH：６．７３（ｄ，１Ｈ），６．６２（ｓ，１Ｈ），６．５５（ｄ，１Ｈ），５．３０〜５．４５（ｍ，６Ｈ），４．９０（ｍ，１Ｈ），４．５０（ｍ，１Ｈ），４．１８（ｍ，２Ｈ），４．１２（ｍ，２Ｈ），２．９５（ｍ，２Ｈ），２．８１（ｍ，４Ｈ），２．３１（ｔ，２Ｈ），２．０９（ｍ，４Ｈ），１．９４（ｍ，２Ｈ），１．６４（ｍ，２Ｈ），１．４２（ｓ，９Ｈ），１．２０〜１．４０（ｍ，８Ｈ），０．９８（ｓ，９Ｈ），０．９７（ｓ，９Ｈ），０．８９（ｔ，３Ｈ），０．１８（ｓ，１２Ｈ）
【化１５】
2012520274.tif 000023
【００５９】
試薬
2012520274.tif 000024
【００６０】
手順
式１６で表される保護中間体（１９．７ｇ）をＴＨＦ（２００ｍＬ）に溶解した。得られた溶液を１０分間かけて０℃まで冷却した。前記溶液にＴＢＡＦ（ＴＨＦ中、１Ｍの溶液、４６．７ｍＬ）を添加した。得られた混合物を０℃で３０分間撹拌した。反応混合物に飽和塩化アンモニウム水溶液（４００ｍＬ）を添加し、酢酸エチル（５００ｍＬ）で抽出した。有機相を水及び食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮乾固させて式１７で表される中間体（１３．５ｇ）を得た。
【００６１】
式１７で表されるＲ−ＮＨ−ｂｏｃ（１３．５ｇ）のＤＣＭ（２５０ｍＬ）溶液にＴＦＡ（６０ｍＬ）を０℃で添加した。得られた混合物を０℃で撹拌した後、１６時間かけて室温までゆっくりと昇温させた。溶媒及び過剰のＴＦＡをロータリーエバポレーターを用いて減圧下で蒸発させた。次に、残渣を酢酸エチル（４００ｍＬ）及び水（４００ｍＬ）の間で抽出した。有機相を水及び食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮乾固させて粗生成物を得た。得られた粗生成物をカラム（溶離溶媒：５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して式１８で表される生成物（９．０ｇ）を得た。
【００６２】
分析結果
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，５００ＭＨｚ）：δH：６．７５（ｓ，１Ｈ），６．７０（ｄ，１Ｈ），６．４５（ｄ，１Ｈ），５．３０〜５．４５（ｍ，６Ｈ），４．１８（ｍ，３Ｈ），４．０９（ｍ，２Ｈ），３．１５（ｍ，１Ｈ），３．０１（ｍ，１Ｈ），２．７８（ｍ，４Ｈ），２．３１（ｔ，２Ｈ），２．０５（ｍ，４Ｈ），１．９５（ｍ，２Ｈ），１．６３（ｍ，２Ｈ），１．２０〜１．４０（ｍ，８Ｈ），０．８７（ｔ，３Ｈ）；ＭＳ（ＡＰＣＩ）：Ｍ+＋１：５１６．３
【００６３】
実施例４：ＧＬＡ−レボドパ複合体（式１９）の合成
【化１６】
2012520274.tif 000025
【００６４】
試薬
2012520274.tif 000026
【００６５】
手順
実施例２で得られた式９で表される脂肪酸誘導体（１５ｇ、０．０３４４ｍｏｌ）のアセトニトリル（１５０ｍＬ）溶液に、トリエチルアミン（６．２ｍＬ、０．０４４６ｍｏｌ）を窒素下で添加し、次いで式２で表されるクロロギ酸イソブチル（４．２３ｇ、０．０３１ｍｏｌ）を添加した。クロロギ酸イソブチルの添加直後に白い沈殿物が生じた。得られた溶液を０℃で３時間撹拌し続けた。混合物をロータリーエバポレーターを使用して蒸発乾固させた。レボドパ（６．４１ｇ、０．０３２５ｍｏｌ）をジオキサン（７５ｍＬ）に溶解した後、ＮａＯＨ（１Ｍ、約６５ｍＬ）を添加してｐＨ＝１２に調整した。得られた溶液を０℃まで冷却した後、脂肪酸及びクロロギ酸イソブチルから生成され式１０で表される混合無水物に添加した。得られた混合物を０℃で撹拌した後、室温までゆっくりと昇温させ、１８時間撹拌した。反応混合物をＨＣｌ（１Ｍ）で酸性化してｐＨ＝３とし、酢酸エチル（２５０ｍＬ）で抽出した。その後、水（２５０ｍＬ×２回）及び食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮乾固させて粗生成物（１３．８ｇ）を得た。得られた粗生成物をカラム（溶離溶媒：１〜１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して式１９で表される生成物を黄色みがかったオイルとして得た（５．０ｇ、収率：２６％）。
【００６６】
分析結果
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，５００ＭＨｚ）：δH：６．７０（ｍ，２Ｈ），６．６４（ｓ，１Ｈ），６．５０（ｄ，１Ｈ），５．３０〜５．４５（ｍ，６Ｈ），４．７３（ｍ，１Ｈ），４．１２（ｍ，４Ｈ），２．９６（ｍ，２Ｈ），２．８１（ｍ，４Ｈ），２．５８（ｍ，２Ｈ），２．４９（ｍ，２Ｈ），２．３１（ｔ，２Ｈ），２．０５（ｍ，４Ｈ），１．９４（ｍ，２Ｈ），１．６３（ｍ，２Ｈ），１．２０〜１．４０（ｍ，８Ｈ），０．８８（ｔ，３Ｈ）；ＭＳ（ＡＰＣＩ）：Ｍ+＋１：６１６．６
【００６７】
Ｌ−ＤＯＰＡの作用は、パーキンソン病のげっ歯類モデル（例えば、レセルピン又はＭＰＴＰ誘発モデル）を通常は使用して研究されている。レセルピンモデルは最初の動物モデルであり、抗パーキンソン病薬の作用を調べるために広く使用されてきた。抗高血圧薬であるレセルピンがパーキンソニズムを誘発するメカニズムは十分には理解されていないが、シナプス小胞内の神経伝達物質の枯渇（特にドパミンであるが、その他の神経伝達物質も含む）及び末端における神経伝達物質の再取り込み量の減少が関与する。レセルピンの利点としては、比較的即効性であり、行動に対して強い作用を示し、無毒であることが挙げられる。一方、ＭＰＴＰは黒質線状体ニューロンを選択的に破壊するものの、非常に有毒なために扱いにくく、動物の行動に対する作用はずっと小さい。
【００６８】
実施例５：実施例３及び４の複合体の作用
【００６９】
５．１．実験１
動物：Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社（カナダ）からＣ５７ＢＬ／６雄マウス（１０〜１２週齢、体重：２５ｇ）を５６匹入手した。実験に先立ち、マウスを標準的な１２時間明暗サイクル（午前６時〜午後６時点灯）下の動物飼育室（２１±１℃）で１週間飼育して新しい環境に慣れさせた。飼料及び水は自由に摂取させた。
【００７０】
薬剤：Ｌ−ＤＯＰＡ（Ｓｉｇｍａ社、カナダ）、ＤＲＵＧ１（実施例３の複合体）及びＤＲＵＧ２（実施例４の複合体）を植物油に溶解した（１ｍｇ／ｍＬ）。調製した溶液を氷上に置き、４℃で一晩保管した。
【００７１】
実験手順：薬剤溶液の調製、強制投与（ｇａｖａｇｅ）及びオープンフィールドテストは全て同じ室内（動物飼育室）で行った。薬剤は２日間連続して投与した。薬剤投与１日目の前日の午後９時に飼料を動物ケージから取り除き、翌日の飼料摂取の際にマウスが空腹となっているようにした。１日目には、１）体重を測定する段階、２）強制投与する段階、３）ケージ内に通常の飼料を戻す段階からなる強制投与セッションを各マウスに対して行った。強制投与は各群毎（下記参照）に行い、時刻による影響をコントロールした。１日目の午後９時にケージから飼料を再度取り除いた。２日目には、上記強制投与セッションを再度行った。強制投与セッションの２時間後、各マウスに対して３分間のオープンフィールドセッションを行って歩行行動及び不安関連行動を記録した後、ＨＰＬＣで神経伝達物質を生化学分析するためにマウスを殺した。用いた実験群は下記の通りである。
【００７２】
薬剤の種類及び投与量に応じて７つの小群にマウスを分けた。１：対照、２：Ｌ−ＤＯＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）、３：Ｌ−ＤＯＰＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）、４：ＤＲＵＧ１（１０ｍｇ／ｋｇ）、５：ＤＲＵＧ１（１００ｍｇ／ｋｇ）、６：ＤＲＵＧ２（１０ｍｇ／ｋｇ）、７：ＤＲＵＧ２（１００ｍｇ／ｋｇ）。薬剤は柔軟な栄養チューブ（５ＦＲ  １５”、ＭＥＤ−ＲＸ社（カナダ））を用いて強制投与した。
【００７３】
行動：オープンフィールド（Ｈａｌｌ、１９３４年）により、標準的な動物室照明下での自発的歩行行動及び不安関連行動を測定した。マウスは標準的な照明（動物飼育室照明）に慣れているため、この照明下では不安関連行動よりも歩行活動が測定される可能性が高い。標準的な照明下のオープンフィールドにマウスを３分間おき、ライン横断（ｌｉｎｅ  ｃｒｏｓｓｉｎｇ）（移動距離）、立ち上がり行動（探索的行動）及び毛繕い（転位反応（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ））を手動で測定した。
【００７４】
生化学分析：オープンフィールド試験の直後にマウスを手術室に移し、頸椎脱臼によって殺した。線条体及びその他の脳部位を切り取り、ＨＰＬＣ分析を行うためにバッファ（Ｈ2Ｏ：２５０ｍＬ、Ｌ−アスコルビン酸：２．２ｍｇ、７０％ＨＣｌＯ4：２．３３ｍＬ、ＥＤＴＡ：２５ｍｇ）を入れたエッペンドルフ型チューブに保存した。試料に対して２５分間遠心分離（１１，０００ｒｐｍ、４℃）を行った。その後、ＨＰＬＣ装置を使用してドパミン、ＤＯＰＡＣ及びその他の神経伝達物質を分析した。ここではドパミン及びＤＯＰＡＣの分析結果のみ報告する。
【００７５】
統計：全ての測定結果（神経伝達物質及び行動）に対して要因を薬剤（Ｌ−ＤＯＰＡ、ＤＲＵＧ１及びＤＲＵＧ２）とした一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行って薬剤作用を分析した。主効果が有意である場合（ｐ＜０．０５）、ボンフェローニ事後試験（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ｔｅｓｔ）を行って全ての群を対照条件と比較した。
【００７６】
５．２．実験２
動物：Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社（カナダ）からＣ５７ＢＬ／６雄マウス（１０〜１２週齢、体重：２５ｇ）を４０匹入手した。実験に先立ち、マウスを標準的な１２時間明暗サイクル（午前６時〜午後６時点灯）下の動物飼育室（２１±１℃）で１週間飼育して新しい環境に慣れさせた。飼料及び水は自由に摂取させた。
【００７７】
薬剤：実施例５．１．に記載の通りである。実験手順は全て実施例５．１．の手順と同じとした。用いた実験群は下記の通りである。１：対照、２：Ｌ−ＤＯＰＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）、３：ＤＲＵＧ１（１００ｍｇ／ｋｇ）、４：ＤＲＵＧ２（１００ｍｇ／ｋｇ）。
【００７８】
統計：全ての測定結果（神経伝達物質及び行動）に対して要因を薬剤（Ｌ−ＤＯＰＡ、ＤＲＵＧ１及びＤＲＵＧ２）とした一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）により薬剤作用を分析した。主効果が有意である場合（ｐ＜０．０５）、ボンフェローニ事後試験を行って処置群を対照群と比較した。
【００７９】
５．３．実験３
動物：Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社（カナダ）からＣ５７ＢＬ／６雄マウス（１０〜１２週齢、体重：２５ｇ）を４２匹入手した。実験に先立ち、マウスを１２時間明暗サイクル（午前６時〜午後６時点灯）下の動物飼育室（２１±１℃）で１週間飼育して新しい環境に慣れさせた。飼料及び水は自由に摂取させた。
【００８０】
薬剤：Ｌ−ＤＯＰＡ及びＤＲＵＧ２（実施例５．１．参照）。レセルピン（Ｓｉｇｍａ社、カナダ）を、１％酢酸の滅菌ｄｄＨ2Ｏ溶液（Ｖｉｓａｎｊｉ等、２００６年）に溶解した。全ての薬剤は実施例５．１．と同様に調製した。
【００８１】
実験手順：薬剤を２日間連続して投与した。薬剤投与１日目の前日の午後９時に飼料を動物ケージから取り除き、翌日の飼料摂取の際にマウスが空腹となっているようにした。１日目には、１）体重を測定する段階、２）強制投与する段階、３）ケージ内に通常の飼料を戻す段階からなる強制投与処置を各マウスに対して行った。強制投与は各群毎に行い、時刻による影響をコントロールした。１日目の強制投与直後にレセルピン（１ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。１日目の午後９時にケージから飼料を再度取り除いた。２日目には、上記強制投与セッションを再度行った。強制投与セッションから２時間後及びレセルピン投与から２４時間後、各マウスに対してロータロッドセッションを行い、続いてオープンフィールドセッションを行った。オープンフィールドの手順は上述したものと同様である。ロータロッド（Ｒｏｚａｓ及びＬａｂａｎｄｅｉｒａ、１９９７年）は歩行、運動協応、平衡性及び耐久力を測定する試験であり、全体的な運動能力を測定する。ＤＲＵＧ２により、能力がベースラインを上回る増進を示すと予測されたが、事前訓練を行ったとするとＤＲＵＧ２による能力の増進が測定不可能になり得ると考えられたため、実験対象のマウスに対して事前訓練は行わなかった。加速回転させた棒の上にマウスを載せ、マウスが落ちるまでの時間とその際の回転速度を自動センサにより記録した。連続して２回行ったロータロッド試験の平均移動距離（ｍ）を算出した。各ロータロッド試験の間にはマウスを１分間休ませた。
【００８２】
その他の全ての手順は上記実験と同じとした。
マウスを処置の種類に応じて６つの小群に分けた。１：対照、２：レセルピン（１ｍｇ／ｋｇ）、３：Ｌ−ＤＯＰＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）、４：ＤＲＵＧ２（１００ｍｇ／ｋｇ）、５：Ｌ−ＤＯＰＡ＋レセルピン（各１００ｍｇ／ｋｇ）、６：ＤＲＵＧ２＋レセルピン（各１００ｍｇ／ｋｇ）。
【００８３】
統計：全ての測定結果（神経伝達物質及び行動）に対して要因をレセルピン（ＲＥＳ）及び薬剤（ＤＲＵＧ）とした二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行って薬剤作用を分析した。主効果が有意である場合（ｐ＜０．０５）、ボンフェローニ事後試験を行った。
【００８４】
結果
【００８５】
実験１
行動：薬剤は、オープンフィールドのライン横断又は毛繕いに対する作用は示さなかった（データは図示せず）。薬剤は立ち上がり行動に対して作用を示した（ＤＲＵＧ：Ｆ（ｄｆ  ６，５０）＝２．３３２、ｐ＜０．０５）（図２）。事後分析から、ＤＲＵＧ２（１００ｍｇ／ｋｇ）によって立ち上がり行動回数が対照及びＬ−ＤＯＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）と比較して有意に増加したことが明らかになった（＊ｐ＜０．０５）。
【００８６】
線条体中の神経伝達物質：薬剤はドパミンに対する主効果を示した（ＤＲＵＧ：Ｆ（ｄｆ  １，６０）＝７．９０、ｐ＜０．０５）。事後分析から、ＤＲＵＧ１（１００ｍｇ／ｋｇ）及びＤＲＵＧ２（１００ｍｇ／ｋｇ）によってドパミンが対照と比較して有意に増加したことが明らかになった（＊ｐ＜０．０５）（図３）。ＤＯＰＡＣに対する作用はみられなかった（データは図示せず）。
【００８７】
皮質中の神経伝達物質：薬剤はドパミンに対する主効果を示した（ＤＲＵＧ：Ｆ（ｄｆ  １，６３）＝１１．３３、ｐ＜０．０５）。事後分析から、ＤＲＵＧ２（１００ｍｇ／ｋｇ）によってドパミンが対照と比較して有意に増加したことが明らかになった（＊ｐ＜０．０５）（図３上）。ＤＲＵＧ２はＤＯＰＡＣに対しても有意な主効果を示した（ＤＲＵＧ：Ｆ（ｄｆ  １，６３）＝８．５２、ｐ＜０．０５）。事後分析から、高用量のＤＲＵＧ２によってＤＯＰＡＣが対照と比較して有意に増加したことが明らかになった（＊ｐ＜０．０５）（図４下）。
【００８８】
５．２．実験２
行動：薬剤はライン横断に対する有意な作用を示した（ＤＲＵＧ：Ｆ（ｄｆ  ３，１８）＝４．５１０、ｐ＜０．０５）。事後分析から、ＤＲＵＧ２によってライン横断が対照と比較して有意に増大したことが明らかになった（＊ｐ＜０．０５）（図５上）。ＤＲＵＧ２は立ち上がり行動に対する作用も示した（ＤＲＵＧ：Ｆ（ｄｆ  ３，１８）＝３．２６１、ｐ＜０．０５）。事後分析から、ＤＲＵＧ２により、立ち上がり行動回数が対照と比較して有意に増加したことが明らかになった（＊ｐ＜０．０５）（図５下）。毛繕いに対する作用はみられなかった（データの図示なし）。
【００８９】
線条体中の神経伝達物質：薬剤はドパミンに対する有意な作用を示した（ＤＲＵＧ：Ｆ（ｄｆ  ３，３１）＝４．６１１、ｐ＜０．０１）（図６上）。事後分析から、ＤＲＵＧ２によってドパミンが対照と比較して有意に増加したことが明らかになった（＊ｐ＜０．０１）。ＤＲＵＧ２はＤＯＰＡＣに対して有意な作用を示した（ＤＲＵＧ：Ｆ（ｄｆ  ３，３２）＝３．４８５、ｐ＜０．０５）（図６下）。ＤＲＵＧ２によってＤＯＰＡＣが対照と比較して有意に増加した（＊ｐ＜０．０５）。
【００９０】
皮質中の神経伝達物質：皮質中のドパミン又はＤＯＰＡＣに対する有意な作用はみられなかったが、ドパミン及びＮＥに関する明確な傾向がみられた（図７）。
【００９１】
５．３．実験３
行動（ロータロッド）：図８に結果を示す。二元配置分散分析から、レセルピン（ＲＥＳ：Ｆ（ｄｆ  １，３３）＝１６．７５，ｐ＜０．００１）及び薬剤（ＤＲＵＧ：Ｆ（ｄｆ  ２，３３）＝６．２４８，ｐ＜０．０１）の有意な主効果が明らかとなった。事後分析から以下の作用が明らかになった。１）レセルピンによってロータロッド能力が対照と比較して有意に低下した（＊ｐ＜０．０５）。２）Ｌ−ＤＯＰＡの併用によってレセルピン誘発によるロータロッド能力の低下が軽減されることはなかった。３）ＤＲＵＧ２によってロータロッド能力が対照と比較して有意に向上し（＊＊ｐ＜０．０１）、ＤＲＵＧ２の併用によってレセルピン誘発による能力低下が改善された（＃Ｐ＜０．０５）。
【００９２】
行動（オープンフィールド）：図９に結果を示す。歩行行動（ライン横断）に対し、レセルピンは強い主効果を示したが（ＲＥＳ：Ｆ（ｄｆ  １，３４）＝３２９．７、ｐ＜０．０００１）、薬剤は有意な主効果を示さなかった（図９上）。レセルピンによってライン横断が対照と比較して著しく減少した（＊＊＊ｐ＜０．００１）。Ｌ−ＤＯＰＡ又はＤＲＵＧ２によってライン横断が対照と比較して増加することはなかった。Ｌ−ＤＯＰＡの併用によってレセルピン処置マウスにおけるライン横断低下が軽減されることはなかったが、ＤＲＵＧ２の併用によってレセルピン処置マウスにおけるライン横断低下が軽減された（＃ｐ＜０．０５）。同様の結果が立ち上がり行動においても確認された（図９中）。レセルピンは立ち上がり行動に対して強い主効果を示したが（ＲＥＳ：Ｆ（ｄｆ  １，３３）＝１１９．８、ｐ＜０．０００１）、ＤＲＵＧは主効果を示さなかった。レセルピンによって立ち上がり行動回数が減少したが（＊＊＊ｐ＜０．００１）、ＤＲＵＧ２の併用によってレセルピン誘発による減少傾向が有意に改善され（＃ｐ＜０．０５）、Ｌ−ＤＯＰＡの併用においてはそのような改善はみられなかった。レセルピンは毛繕いに対して主効果を示さなかったが、ＤＲＵＧは作用を示した（ＤＲＵＧ：Ｆ（ｄｆ  ２，３２）＝９、ｐ＜０．００１）（図９下）。事後分析から、レセルピンが毛繕い行動に対して有意な影響を与えることはなく、Ｌ−ＤＯＰＡ又はＤＲＵＧ２については、毛繕い行動に与える影響は対照と比較して有意なものではないものの増加傾向は存在することが明らかになった。レセルピン単独処置マウスと比較して、レセルピン及びＬ−ＤＯＰＡ併用処置マウスにおける毛繕い行動の変化はなかったが、レセルピン及びＤＲＵＧ２併用処置マウスにおいてはＤＲＵＧ２による毛繕いの有意な増加がみられた（＃＃ｐ＜０．０１）。
【００９３】
線条体中の神経伝達物質：レセルピンは線条体中のドパミンに対して有意な主効果を示し（ＲＥＳ：Ｆ（ｄｆ  １，３４）＝２４．３９、ｐ＜０．０００１）、ＤＲＵＧも有意な主効果を示した（ＤＲＵＧ：Ｆ（ｄｆ  ２，３３）＝３．７０５、ｐ＜０．０５）。事後分析から、レセルピンによって線条体中のドパミンが対照と比較して大きく減少したことが明らかになった（＊＊＊ｐ＜０．００１）（図１０）。線条体中のドパミンに対するＬ−ＤＯＰＡの作用は対照と比較して有意なものではなかったが、ＤＲＵＧ２によって線条体中のドパミンが対照と比較して有意に増加した（＊ｐ＜０．０５）。レセルピン及びＬ−ＤＯＰＡ併用処置マウスでは、レセルピンによるドパミンの減少がＬ−ＤＯＰＡによって軽減されることはなかったが、レセルピン及びＤＲＵＧ２併用処置マウスでは、ＤＲＵＧ２によってレセルピン単独処置マウスと比較してドパミンがわずかに増加した（ｐ＝０．０７及びｐ＜０．０５、スチューデントのｔ−検定）。図８（ロータロッド行動）と図１０（線条体中のドパミン）を比較すると、ロータロッド行動と線条体中のドパミンには強い相関関係がみられ、ロータロッド行動に対するＤＲＵＧ２の作用は線条体中のドパミンによって媒介されていることを示唆している。
【００９４】
線条体中のＤＯＰＡＣ／ドパミン比：レセルピンは、線条体中のＤＯＰＡＣ／ドパミン比に対して有意な主効果を示した（ＲＥＳ：Ｆ（ｄｆ１，３１）＝７６，２５、ｐ＜０．０００１）。事後分析から、レセルピン（＊＊＊ｐ＜０．００１）により、線条体中のドパミンが対照と比較して非常に増加し、またその作用はＬ−ＤＯＰＡにより軽減されないことが明らかになった（図１１）。レセルピンの作用はＤＲＵＧ２によって若干軽減された。また、ＤＲＵＧ２とレセルピンを併用することにより、レセルピン単独処置の場合と比較してＤＯＰＡＣ／ドパミン比が有意に低下することが示された（＃ｐ＜０．０５）。
【００９５】
線条体中のＬ−ＤＯＰＡ濃度：レセルピンの主効果がみられたが（ＲＥＳ：Ｆ（ｄｆ  ２，３２）＝５．１９１、ｐ＜０．０５）、ＤＲＵＧの作用はみられなかった。レセルピンによってＬ−ＤＯＰＡ濃度が有意に増加し（＊ｐ＜０．０５）、Ｌ−ＤＯＰＡ濃度の増加はＬ−ＤＯＰＡ又はＤＲＵＧ２の併用によって軽減された（＃＃ｐ＜０．０１）（図１２）。
【００９６】
Ｌ−ＤＯＰＡを脂肪酸と結合させることによって線条体末端におけるＬ−ＤＯＰＡの到達及び貯蔵が向上しており、それに伴いドパミン（及び代謝産物）に対するＬ−ＤＯＰＡの効果並びに運動行動（実施例５のオープンフィールド実験１及び２）が向上している。このメカニズムにより、通常のＬ−ＤＯＰＡではなく、本発明に係るＬ−ＤＯＰＡ複合体を用いることによって線条体におけるレセルピン誘発によるドパミンの枯渇並びにロータロッド及びオープンフィールドにおける運動障害をより容易に防ぐことができる。
【００９７】
ライン横断及び毛繕いに関してはＤＲＵＧ１及びＤＲＵＧ２による有意な変化はなかったが、ＤＲＵＧ２（１００ｍｇ／ｋｇ）によって立ち上がり行動回数が対照と比較して有意に増加した。Ｌ−ＤＯＰＡやＤＲＵＧ１は立ち上がり行動回数に対する作用は示さなかった。立ち上がり行動は線条体中のドパミンと相関があることが報告されているため、ＤＲＵＧ２の立ち上がり行動に対する作用と線条体中のドパミンに対する作用とは関連していることが示唆される。実際、高用量のＤＲＵＧ２の投与によって線条体中及び皮質中のドパミンは対照と比較して有意に増加したが、その他の薬剤は有意な変化を生じさせなかった。また、高用量の通常型Ｌ−ＤＯＰＡの投与によっても皮質中のＤＯＰＡＣは増加したが、上記結果を踏まえると、（ＤＲＵＧ１ではなく）ＤＲＵＧ２は通常型Ｌ−ＤＯＰＡよりも神経伝達物質レベルの変化に対してより効果的であることが示唆される。
【００９８】
実験１で得られた知見に基づき、高用量のＤＲＵＧ１及びＤＲＵＧ２を繰り返し実験（実験２）において再度比較した。結果は行動レベル及び神経伝達物質レベルの両方で確認された。パターンは非常に明確だった。ＤＲＵＧ２のみがオープンフィールドのライン横断及び立ち上がり行動の増加を生じさせ、線条体中のドパミン及びＤＯＰＡＣを対照と比較して増加させた。有意ではなかったが、ＤＲＵＧ２処置後には皮質中のドパミン及びＮＥが対照と比較して増加する傾向にあり、その一方で、通常型Ｌ−ＤＯＰＡ及びＤＲＵＧ１はいかなる作用も示さなかった。これらの結果はやはり、（ＤＲＵＧ１ではなく）ＤＲＵＧ２は通常型Ｌ−ＤＯＰＡよりも神経伝達物質レベル及び行動をより効果的に変化させることを示唆している。
【００９９】
実験３において、ＤＲＵＧ２はＬ−ＤＯＰＡよりも強くロータロッド能力を向上させた（対照との比較）。ロータロッド能力における対照マウスとＤＲＵＧ２処置マウスとの差は顕著だった。対照と比較して、オープンフィールドの移動距離及び立ち上がり行動に対するＬ−ＤＯＰＡ又はＤＲＵＧ２の明確な作用はみられなかったが、ＤＲＵＧ２によって毛繕いが増加した（増加傾向があった）。そのような増加は実験１及び２においてはみられなかったものであり、この差異は現時点でのデータ解析では説明不可能である。毛繕い行動に対する線条体中のドパミンの作用は複雑で、どのドパミン受容体が刺激されるかに応じて変化し得る。レセルピン（１ｍｇ／ｋｇ）は、投与から２４時間後に行動に対する強力な作用を示した。ロータロッド能力は有意に低下し、オープンフィールドのライン横断及び立ち上がり行動も有意に減少した。レセルピンは毛繕い行動に対する作用は示さなかった。レセルピンの作用のほとんどはＬ−ＤＯＰＡによって軽減されることはなかったが、ＤＲＵＧ２はロータロッド能力並びにオープンフィールドのライン横断及び立ち上がり行動に対するレセルピンの作用を有意に低下させた。レセルピン及びＤＲＵＧ２処置マウスは、レセルピン単独処置マウスだけではなく、レセルピン及びＬ−ＤＯＰＡ処置マウスと比較しても、ケージ内でより活動的だったことは言及されるべきである。これらのレセルピン及びＤＲＵＧ２処置マウスは、オープンフィールドにおいては必ずしもケージ内と同様の運動性増大を示さなかった。この知見は、オープンフィールドだけではなく、ケージ内でも活動測定を行うことによって薬剤間の差異をよりよく把握することができることを示唆している。
【０１００】
実験１及び２によると、実験２におけるＤＲＵＧ２は線条体中のドパミンに対する強力な作用を示したが、Ｌ−ＤＯＰＡは線条体中のドパミンに対する作用を示さなかった。予想通り、レセルピンによって線条体中のドパミンが有意に減少し、ＤＯＰＡＣ／ドパミン比が上昇した。レセルピンのドパミンに対する作用はＤＲＵＧ２の併用によってわずかに軽減されたが、Ｌ−ＤＯＰＡは作用を示さなかった。レセルピンのＤＯＰＡＣ／ドパミン比に対する作用はＤＲＵＧ２の併用によって有意に軽減されたが、Ｌ−ＤＯＰＡはレセルピンに対して作用を示さなかった。レセルピン誘発によるドパミンの枯渇に対するＤＲＵＧ２の緩やかな作用は、行動測定におけるＤＲＵＧ２のレセルピンに対する強い作用とは対照的である。特に線条体中のドパミンが閾値（Ｄａｕｅｒ及びＰｒｚｅｄｂｏｒｓｋｉ、２００３年）より低くなった場合には運動行動は線条体中のドパミンに大きく依存するため、レセルピン処置後のＤＲＵＧ２による線条体中ドパミンのごくわずかな増加が行動に対して比較的大きな影響をもたらすのかもしれない。このことが、レセルピンに対するＤＲＵＧ２の作用に関して、線条体中のドパミンと行動の結果に差異がみられる理由と考えられる。
【０１０１】
図１２（線条体中のＬ−ＤＯＰＡレベル）により、薬剤の作用に関する興味深い手がかりが得られる。これら薬剤の正確なメカニズムが知られていないために、脳内Ｌ−ＤＯＰＡレベルについて予測をすることは困難である。仮説としては、ＤＲＵＧ２によって脳へのＬ−ＤＯＰＡ到達が増加し、ニューロンへの吸収量が増加することが考えられる。吸収量の増加は、脳内Ｌ−ＤＯＰＡ量の増加を示唆するものである。その後、Ｌ−ＤＯＰＡはドパミンに転換される。投与したＬ−ＤＯＰＡの全てが測定時にはドパミンに転換されている可能性もあるため、ドパミンへの転換率によっては、ＤＲＵＧ２処置後に総Ｌ−ＤＯＰＡレベルに差がみられない可能性もある。そのような場合、ＤＲＵＧ２処置後のドパミンレベルの上昇は確認できても、Ｌ−ＤＯＰＡレベルの上昇は確認できないであろう。実際、その通りであった。レセルピン処置後のＬ−ＤＯＰＡレベルの上昇は説明が困難である。この実験結果には非常にばらつきがあり、信頼性が低い可能性がある。レセルピンは小胞モノアミン輸送体（ＶＭＡＴ）を阻害するため、小胞中にはより少量のドパミンしか貯蔵されず、モノアミンオキシダーゼによって代謝される。したがって、ドパミンの減少は予想されるが、Ｌ−ＤＯＰＡの増加は予想し得ない。レセルピンはチロシン水酸化酵素を阻害しないため、Ｌ−ＤＯＰＡレベルの上昇はＬ−ＤＯＰＡのドパミンへの転換の減少によって説明することはできない。Ｌ−ＤＯＰＡ及びＤＲＵＧ２の両方がレセルピンのこの作用を弱めた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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