(57)【要約】  表面微細孔を有する多孔性リン酸カルシウムと、水を含まないキャリアとを含む注入及び成形可能なセラミック材料が開示され、前記キャリアは生理学的環境下で分解するように選ばれる。キャリアは、人体への（例えば注入又は移植による）配置後に溶解、解離、又は他に分解するキャリアの特性を示す。表面微細孔を有するリン酸カルシウムに組み合わされた水を含まないポリマー又はポリマーブレンドを選ぶことによって、表面微細孔による好ましい骨誘導特性が長期の寿命にわたって保持されることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面微細構造、特に表面微細孔を有する多孔性リン酸カルシウムと、水を含まないキャリアとを含み、前記キャリアが脂質、多糖類ポリマー、合成有機ポリマー、ポリオール、又はそれらのブレンド若しくは混合物から成る群から選ばれる、成形、打ち延ばし、混練及び／又は注入可能なセラミック材料。
【請求項２】
骨誘導性である、請求項１に記載のセラミック材料。
【請求項３】
前記水を含まないキャリアが生体内で、投与後６週間以内、好ましくは３週間以内に分解する、請求項１又は２に記載のセラミック材料。
【請求項４】
前記キャリアが、１週間以内、好ましくは３日以内、より好ましくは１日以内の体外での３７℃の生理学的塩水における溶解時間を有する、請求項１から３の何れか１項に記載のセラミック材料。
【請求項５】
前記水を含まないキャリアが、最長１週間、好ましくは最長３日、及びより好ましくは最長１日の寸法安定時間を有する、請求項１から４の何れか１項に記載のセラミック材料。
【請求項６】
前記キャリアが、Ｐ８４、Ｐ８５、Ｆ８７、Ｆ８８などのポロキサマー；ＰＥＧ４００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ４０００などのＰＥＧ；大豆レシチンなどの脂質；キサンタン、デキストラン、でんぷん、ＣＭＣなどの多糖類；グリセロールなどのポリオール；及び界面活性剤／乳化剤  ソリュートル（登録商標）ＨＳ  １５、又はそれらの混合物若しくはブレンドである、請求項１から５の何れか１項に記載のセラミック材料。
【請求項７】
前記多孔性リン酸カルシウムが２０から９０％の全孔隙率を有し、マクロ孔が０．１から１．５ｍｍのサイズを有して存在し、微細孔が前記マクロ孔の表面に存在し、前記微細孔が０．０５から２０μｍのサイズを有する、請求項１から６の何れか１項に記載のセラミック材料。
【請求項８】
孔が０．１から１．５０μｍの範囲のサイズの微細孔を含み、１０から４０％の範囲の微細孔の表面積割合を有する、０．１から１．５０μｍの範囲の平均粒子サイズを有する請求項１から７の何れか１項に記載の材料。
【請求項９】
骨形成を必要としている対象者での骨形成の促進に使用するための請求項１から８の何れか１項に記載の材料であって、前記使用は前記材料に生体適合性キャリアを組み合わせることを含み、前記水を含まないキャリアは前記対象者の体への導入後であって前記材料の骨誘導性作用の開始前に分解を開始する加工助剤である、使用のための請求項１から８の何れか１項に記載の材料。
【請求項１０】
前記水を含まないキャリアが、骨形成の完了前に、実質的に完全に溶解されるか又は解離される、請求項９に記載の材料。
【請求項１１】
前記水を含まないキャリアが、骨形成の開始前に、実質的に完全に溶解されるか又は解離される、請求項９又は１０に記載の材料。
【請求項１２】
前記水を含まないキャリアが、前もって混合されたパテの保存寿命を長くできる水を含まない組成物を含む、請求項９、１０又は１１の何れか１項に記載の材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物活性のセラミック材料、特にリン酸カルシウムを示し、好ましくは、とりわけそれらの表面微細構造、及び特にそれらの表面微細孔に基づいた骨誘導特性を明らかにする。この特定の種類のリン酸カルシウムを以下では、表面微細構造、特に表面微細孔を有するリン酸カルシウムと呼ぶ。本発明は、好ましくは注入及び／又は成形可能な骨誘導性セラミック材料を好ましくは示す。
【背景技術】
【０００２】
好ましくは骨誘導性であるセラミック材料の発展は、骨の欠損を治療する医学の分野での重要な進歩である。摘出できる自己骨は珍しいため、これは患者自身の骨から自己骨を摘出する必要性を最小限にする助けとなる。骨誘導性材料は、新しい骨組織の成長を誘導することが出来る。通常このような骨誘導は、間葉組織がその細胞構造体から造骨に変化するよう誘導される機構として定義される。
【０００３】
多孔性リン酸カルシウムによって示される骨誘導性の背景となる文献は、非特許文献１である。これらの材料は、表面微細孔性を示す多孔性リン酸カルシウムとして特徴付けられることができる。それ以来、山崎らによって開示された材料と比べた大きな進歩として、多孔性リン酸カルシウム材料は改善された骨誘導特性を示すものとして利用可能になった。表面微細構造、特に表面微細孔を有する本発明のリン酸カルシウムは、幅広い範囲の微細孔及び顆粒サイズ、並びに高い全孔隙率を示す。
【０００４】
骨誘導性であり表面微細孔を有するリン酸カルシウムの１つの代表的な文献は、特許文献１である。更に改善された骨誘導性であり表面微細孔を有するリン酸カルシウムを対象にした別の代表的な文献は、特許文献２である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第６５１１５１０号明細書
【特許文献２】国際公開第２００７／９４６７２号
【特許文献３】国際公開第２００７／０６８４８９号
【特許文献４】国際公開第２００３／０２８７７９号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】山崎ら著、バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）、１９９２年、第１３号、第３０８−３１２頁
【非特許文献２】Ｈ．ユアン（Ｈ．Ｙｕａｎ）ら著、バイオマテリアルズ、１９９９年、第２０号、第１７９９−１８０６頁
【非特許文献３】Ｐ．ハビボビック（Ｐ．Ｈａｂｉｂｏｖｉｃ）ら著、バイオマテリアルズ、２００５年、第２６号、第３５６５−３５７５頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
骨欠損の治療の別の改善は、骨の形成に貢献する活性を有する材料の、ペースト、ゲル、パテなどの糊のような材料との合体にある。この点に関して背景となる文献は、例えば特許文献３などである。ここでペースト材料は、微粒子の固体多孔性材料とともに、骨の置換又は増強に使用できる母材を形成するために用いられる。微粒子の固体多孔性材料は、リン酸カルシウムであり得る。結果として、細胞、成長因子、又は骨誘導剤などの活性成分が好ましくは提供された、骨成長のためのマクロ孔を有する骨格が得られる。骨を充填するための注入可能な調合（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）に対する別の背景となる文献は、特許文献４である。ここでカルシウム塩粒子を含む骨充填剤には、有機バインダー、並びに幹細胞、骨形成原細胞及び骨幹細胞などの細胞が提供される。これらの文献の何れも、それ自体が骨誘導性である多孔性リン酸カルシウムの使用に関連せず、記載されたリン酸カルシウム材料は前述の表面微細構造、特に表面微細孔を有するタイプではない。それどころか、これらの文献に記載されたシステムが前述の種類の骨誘導性であり表面微細孔を有するリン酸カルシウムに使用される場合、特許文献３のペースト材料、特許文献４のバインダーはそれぞれリン酸カルシウムの表面を覆うことになる。材料の表面構造がその目的とする機能のための要点である場合、表面を覆う技術を選ぶことは、明らかに直観と相いれない。本発明に内在する課題は、改善された骨誘導性効果を有し、成形及び／又は注入可能であるという利点を有するリン酸カルシウムを特に含む材料を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一側面では、本発明は、好ましくは骨誘導性であり、表面微細構造、特に表面微細孔を有する多孔性リン酸カルシウムと、生理学的環境下で分解する、水を含まないポリマー又は水を含まないポリマーブレンドであるキャリアと、を含む生体材料を示す。
【０００９】
別の側面では、本発明は、好ましくは骨誘導性であり、表面微細孔を有する多孔性リン酸カルシウムと、キャリアとを含む生体材料を対象とし、前記キャリアは骨成長を開始するための所定の時間内に、特に６週間以内に、生体内で分解する。
【００１０】
更なる側面では、本発明は、好ましくは骨誘導性であり、表面微細孔を有する多孔性リン酸カルシウムと、キャリアとを含む生体材料に関し、前記キャリアは３７℃の生理学的塩水において好ましくは１週間の溶解時間を有する。
【００１１】
更に別の側面では、本発明は、好ましくは骨誘導性であり、表面微細孔を有する多孔性リン酸カルシウムと、水を含まないキャリアとを含む生体材料を示し、前記キャリアは最長１週間の寸法安定時間（Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  Ｌｉｆｅ）を有するが、それは人間の体温の環境においてポリマーが実質的に溶解しないか又は解離しない時間である。
【００１２】
更なる側面では、本発明は、好ましくは骨誘導性であり表面孔を有する生体材料を、その骨誘導性を保ったまま供給し収容するのを補助するための、上述のような水を含まないキャリアの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】描写された組織部位は、２１２から３００μｍ（Ａ）、１０６から２１２μｍ（Ｂ）、及び４５から１０６μｍ（Ｃ）のＢＣＰサンプルにおける十分な骨形成を示すが、４５μｍより小さいサンプル（Ｄ）では骨が存在しないことを示す図面である（脱灰されていない切片はメチレンブルー及び塩基性フクシンで、骨は赤で、移植された材料は暗色で染められている）。
【図２】全サンプルにおける骨の面積の割合、利用可能な空間における骨の面積の割合、及び異なる粒子サイズを有するＢＣＰ粒子のサンプルにおける骨の体積を示す組織形態計測データである。
【図３】Ｐ８４／Ｆ８７セラミックパテ、Ｃ：Ｐ８５／ＰＥＧ４０００セラミックパテ、及びＴＣＰ粒子のみ（コントロール）で移植された臨界サイズの腸骨の翼状の部位の欠損の、描写された組織部位の断面図である。
【図４ａ）】１２週間の時点での骨誘導性である水を含まないパテ及び注入可能材料を含むイヌ科の大腿骨欠損の、描写された組織部位の断面図であり、骨形成を視覚化するために塩基性フクシン及びメチレンブルーで染められている。大腿骨欠損が、ＴＣＰ顆粒（黄褐色、黒色）が広域の骨（ピンク）の再生によって囲まれた欠損に保持されたことを示す。
【図４ｂ）】１２週間の時点での骨誘導性である水を含まないパテ及び注入可能材料を含むイヌ科の筋肉内移植片の、描写された組織部位の断面図であり、骨形成を視覚化するために塩基性フクシン及びメチレンブルーで染められている。骨誘導性ＴＣＰ顆粒（１５０から５００μｍ）を含むＣＭＣＧキャリア（Ａ）又はＴＣＰ顆粒（１５０から５００μｍ）のみ（Ｂ）の筋肉内移植部位である。ＣＭＣＧ移植（Ａ）による広域な骨形成（ピンク）は、このような水を含まないキャリアを含むＴＣＰ顆粒の骨誘導性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
［好ましくは骨誘導性である、表面微細構造（微細孔）を有する生体材料］
従来の研究では、筋肉などの異所性であり非骨性である部位において特定の材料が骨形成を誘導できることが示されてきた。材料の表面微細構造がこの骨の誘導（骨誘導）プロセスにおいて重要な役割を担うことが示されてきた。材料に誘導される骨形成に対する現在の仮説では、タンパク質及び成長因子の吸収、それに続く幹細胞又は前駆細胞の移動及び付着並びにそれらの後に続く増殖及び骨形成分化が重要な役割を担うとされる。[非特許文献２；非特許文献３]
【００１５】
リン酸カルシウムなどの材料の骨誘導性は、移植前に骨形成細胞又は骨成長因子を追加することなく非骨性部位において異所性の骨形成を材料が誘導する特性として定義される。通常このような骨誘導は、間葉組織がその細胞機能から造骨に変化するよう誘導される機構として定義される。
【００１６】
本発明は、好ましくは骨誘導性であり、表面微細構造、特に表面微細孔を有するリン酸カルシウム材料を対象としている。微細孔はここでは、水銀圧入及び走査型電子顕微鏡で決められたサイズが１．５μｍ未満である孔に関連するものとして定義される。表面微細構造は通常、表面がマイクロスケール、つまり１０μｍ未満、好ましくは５μｍ未満、より好ましくは１．５μｍ未満の突起部及び／又は刻み目を備えることを示す。
【００１７】
表面微細孔を有するリン酸カルシウムを得る１つの方法は、特許文献１で開示される。ここでは（マクロ）孔を有する材料が提供され、マクロ孔の表面に微細孔を作るために酸処理が施される。この材料は全体で２０から９０％の孔隙率を有し、０．１から１．５ｍｍのサイズを有するマクロ孔が存在し、０．０５から２０μｍのサイズを有する微細孔が存在する。
【００１８】
好ましくは、セラミック材料はリン酸カルシウムである。好ましいリン酸カルシウムは、リン酸オクタカルシウム、水酸化アパタイト又は炭酸アパタイトなどのアパタイト、[アルファ]−リン酸三カルシウム及び[ベータ]−リン酸三カルシウムなどのウイトロカイト、並びにそれらの組み合わせである。
【００１９】
好ましくは骨誘導性であるこれらのセラミック材料の重要な側面は、特に生体材料である材料の物理的構造である。材料はマクロ孔と微細孔の両方を含む。全孔隙率は２０から９０％に及び、好ましくは４０から８０％であり、最も好ましくは５０から８０％である。材料のマクロ孔は０．１から１．５ｍｍのサイズを有する；好ましくは、マクロ孔のサイズは０．２から１ｍｍである。マクロ孔のサイズは、特にマクロ孔が相互接続されている場合、例えば材料の骨誘導特性に対して著しく有益な影響を与える。
【００２０】
材料の微細孔は０．０５から２０μｍのサイズを有する。微細孔のサイズの好ましい範囲は０．１から１０μｍ、０．１から３μｍ、又は０．１から５μｍであり、好ましくは０．１から１．５μｍである。好ましくは、微細孔は少なくともマクロ孔内に位置する。この実施形態によると、骨組織の形成は高く促進される。代わりに、微細孔は少なくともマクロ孔の表面に存在する。
【００２１】
材料表面の微細孔率は、好ましくは２０から６０％の間、好ましくは３０から５０％の間である。特許文献１によると、生体材料は好ましくは結晶から成る。好ましくは、結晶のサイズは微細孔のサイズと同様であるが、それはこれが生体材料の好ましい多くの微細なしわをもたらすからである。故に、結晶のサイズは好ましくは０．０５から２０μｍの間であり、より好ましくは０．１から１０μｍ、０．１から３μｍ、又は０．１から５μｍ、最も好ましくは０．１から１．５μｍの間である。
【００２２】
表面微細孔を有するリン酸カルシウムを得る別の好ましい方法が、特許文献２に開示される。これは、好ましくは骨誘導性であり、０．１から１．５μｍの平均粒子サイズを有し、孔が０．１から１．５０μｍの範囲のサイズの微細孔を含み、１０から４０％の範囲の微細孔の表面積割合を有する多孔性リン酸カルシウム材料を示す。微細孔の表面積割合は、好ましくは４０％未満、より好ましくは１から３０％又は１から２０％、最も好ましくは１０から２５％に及ぶ。
【００２３】
本発明の多孔性リン酸カルシウムは、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは４０から１００％、５０から１００％、６０から１００％、７０から１００％、８０から１００％又は９０から１００％のタンパク質吸収容量を有する。吸収容量は、３７℃で２４時間経過した後、２５ｐｐｍのアジ化ナトリウム（ＮａＮ３）の存在下での体積３ｍｌのウシ胎仔血清（ＦＢＳ）の１％水溶液から、体積１．０ｍｌの前記リン酸カルシウムによって吸収されたタンパク質の割合として表される。
【００２４】
好ましい実施形態では、多孔性リン酸カルシウム材料の孔は、本質的に特定のサイズ範囲にある微細孔のみから成り、マクロ孔は存在しない。
【００２５】
本発明では、表面微細構造、特に表面微細孔を有するリン酸カルシウムはキャリアと混合できる。この目的を達成するために、リン酸カルシウムは通常不規則に又は規則的に形作られた粒子状物質、好ましくは顆粒又は粉末の形態であり、例えば非晶質又は立方体、直並行六面体、球体若しくは円柱などの単純な幾何学的角柱である。
【００２６】
本発明で使用されるような、好ましくは骨誘導性である多孔性リン酸カルシウムは、好ましくは略４５から略１５００μｍ、より好ましくは略２００から略３００μｍ、最も好ましくは４５から１０６μｍ、１０６から２１２μｍ、又は２１２から３００μｍに及ぶ粒子サイズを有する微粒子の形態である。
【００２７】
本発明の別の好ましい実施形態では、リン酸カルシウム粉末はＴＣＰ又はＢＣＰである。ＢＣＰはＴＣＰ及びＨＡの混合物であり、ＨＡは混合物の０％より大きく１００％より小さい範囲を構成し、最も好ましくは４５μｍより大きい顆粒を有する。
【００２８】
本発明の更なる別の好ましい実施形態では、焼結されたリン酸カルシウムを粉砕した後に集められた微粒子は、続いて例えばアセトン、エタノール及び／又は水で超音波などによって洗浄され、随意に乾燥され殺菌される。
【００２９】
本発明の更に好ましい実施形態では、リン酸カルシウム粉末は不規則な形状の粒子を有する、オーブンで乾燥され粉砕された粉末である。
【００３０】
最適な骨誘導特性を得る目的で、リン酸カルシウムは好ましくは少なくとも４５μｍの粒子サイズを有する。粒子サイズの好ましい上限は４０００μｍであるが、より大きな粒子サイズは排除されず、医療従事者にとって扱い易いという点で有利である。粒子サイズは、４５から１０００μｍ、４５から５００μｍ、より好ましくは４５から３００μｍ、４５から１５０μｍ、１５０から１０００μｍ、１５０から５００μｍ、５００から１０００μｍ、１０００から２０００μｍ、１０００から４０００μｍ、及びそれらの混合物から成る群からより好ましくは選ばれる。好ましい実施形態では、示された任意の粒子サイズを有するリン酸カルシウムが、本発明の成形及び／又は注入可能な調剤、つまり任意の注入可能材料又はパテの準備に使用される。
【００３１】
本発明で開示したように、リン酸カルシウム粒子及び水を含まないキャリアの組み合わせによって作られたが、結果として生じる好ましくは骨誘導性であるセラミック材料は、好ましくはパテ又は注入可能材料の形態である。パテは手又は手術器具によって手術部位に適用されるが、成形、打ち延ばし、及び／又は混練可能であるという取扱い特性を具体化する。注入可能材料は流動性があり、標準又は特注のシリンジノズルを通して、手動力又は機械的な分注装置（例えばコーキングガンなど）の助けとともに押し出すことができ、押出においてもまた成形可能であり得る。
【００３２】
好ましくは、本発明の注入可能なセラミック材料を押し出すのに必要な力は、１００Ｎ未満である。一般論として、パテは最適な成形性をもたらす高い剛性によって特徴付けられ、一方、注入可能材料は標準又は特注のシリンジによる最適な押出をもたらす低い剛性及び流動性を特徴とする。
【００３３】
［水を含まないキャリア］
水を含まないキャリアは、活性成分を物理的に保持する例えばペースト、ゲル、粉末又は顆粒などの任意の分子形態のバインダーとして定義される。本発明の水を含まないキャリアの使用は、最適化された取扱い性、及び治療部位への活性成分の適用を可能にする。例えば、好ましくは骨誘導性である本発明のセラミック材料は、セラミック粒子を含む水を含まないキャリアの流動性のある特性により、低侵襲治療の間に注入できる。別の例では、好ましくは骨誘導性である本発明のセラミック材料は、水を含まないキャリアによって与えられた成形及び打ち延ばしが可能であるという特徴により、複雑な形状の欠損に適合し治療部位における活性成分の長期間にわたる保持を可能にする成形可能なパテである。
【００３４】
本発明の水を含まないキャリアは、好ましくは骨誘導性であるセラミック粒子の表面微細構造を良好に保つために、含水性キャリア（例えば、カルボキシメチルセルロース水性ゲルを含む、スミス＆ネフュー（Ｓｍｉｔｈ＆Ｎｅｐｈｅｗ）のジャックスボーンボイドフィラー（ＪＡＸ  Ｂｏｎｅ  Ｖｏｉｄ  Ｆｉｌｌｅｒ）（登録商標））に対して好ましい。リン酸カルシウムセラミックの結晶構造の性質及び化学的性質は、水性環境下での分解の影響を受けやすくする。故に、含水性リン酸カルシウム材料は制限された寿命を示すか、又は不便なことに移植前に手術部位において再構築若しくは混合される必要がある。
【００３５】
更に、本願のようにリン酸カルシウムが微細構造を有する場合、この分解は骨誘導性などのその所望の効果に悪影響を及ぼし得る。それ故に、このような微細構造を有するセラミック材料の寿命を引き延ばすために、水を含まないキャリアはリン酸カルシウム粒子を含み貯蔵することが好ましい。更に水を含まないキャリアは、好ましくは骨誘導性であるセラミック材料を移植前の再構築又は成分混合なしにすぐに使える、という利便性を可能にするため好ましい。
【００３６】
好ましくは骨誘導性である、含まれるリン酸カルシウム粒子の表面微細構造を最も都合良く移植環境にさらすことができ、それ故に移植後に早急に骨誘導性反応に影響を及ぼすことができるように、水を含まないキャリアが速い溶解時間を有することがまた好ましい。
【００３７】
水を含まないキャリアは、
（ｉ）例えばペプチド、ポリペプチド、タンパク質、脂質、糖類、好ましくは単糖類及び／又はデキストラン、キサンタンなどの多糖類、ポリビニルアルコール及びグリセロールなどのポリオール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）、乳化剤、可溶化剤、界面活性剤（例えばソリュートル（Ｓｏｌｕｔｏｌ）（登録商標）  ＨＳ  １５）などの他の合成ポリマー、及びそれらの混合物をベースとするポリマーなどの有機成分
（ｉｉ）例えばシリコンベースのゲル、リン酸カルシウムセメント、硫酸カルシウム及び／又はそれらの混合物などの無機成分
及び／又は
（ｉｉｉ）例えばグリセロールに分散されたキサンタン；グリセロールに分散されたカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）；ポロキサマーと組み合わされたソリュートル（登録商標）  ＨＳ  １５、非イオン性界面活性剤、乳化剤、及びヒドロキシステアリン酸をベースとした可溶化剤；グリセロールに分散されたデキストラン、キサンタン及び／又はでんぷん；グリセロール及びＰＥＧ４００に分散されたＣＭＣ；若しくは実施例４から６に記載された他の調合など、それらの混合物
を含む。好ましい実施形態では、水を含まないキャリアは、相溶性のある含水性キャリア、つまり例えば特に水及び／又は生理学的塩水などの生理的に受け入れ可能な溶媒を有するポリマーゲルなどの水性ポリマーより顕著に長い例えば骨誘導性粒子などの含有物の寿命を提供する水を含まないポリマー又は水を含まないポリマーブレンドである。上述のように、水を含まないキャリアはリン酸カルシウム粒子に対するバインダーとして働き、故に本発明のリン酸カルシウム材料の対象者への投与（例えば注入又は移植など）の際に存在する。キャリアは、リン酸カルシウム材料が骨誘導性などのその特徴的な性質を保持できるように選ばれる。
【００３８】
好ましい実施形態では、骨誘導性のような特徴的な性質は、
（ｉ）微細構造が、例えば水を含まないキャリアを有する骨誘導性粒子などの粒子を前もってパックすることによって保存される場合、
（ｉｉ）水を含まないキャリアが、例えば骨形成が起こる前に溶解するか又は分解する、グリセロールに懸濁されたキサンタン、デキストラン及びでんぷん；グリセロールに懸濁されたキサンタン、デキストラン及びソリュートル（登録商標）ＨＳ  １５；グリセロールに懸濁されたＣＭＣ；ＰＥＧ４００及びグリセロールに懸濁されたＣＭＣ；ポロキサマーＦ８８に懸濁された大豆レシチン；ソリュートル（登録商標）ＨＳ  １５と混合されたポロキサマーＦ１２７；又は実施例４から６に記載された他の水を含まないキャリア；から成る群から好ましくは選ばれる場合、に好ましくは保持される。分解とは、（例えば、注入又は手作業での移植による）人体への配置後に、水を含まないキャリアを任意の可能な方法で溶解、解離、又は他の方法で崩れる（ｆａｌｌ  ａｐａｒｔ）特性を意味する。ここで溶解とは、水溶液中（つまり生理学的塩水又は血液）においてポリマー分子を解すこと及び分離することによって定義され、時間に対して視覚的に評価される。例えば表面微細孔を有する骨誘導性材料に対して特異的な水を含まないキャリアは、例えば前述の特許文献４などの従来技術に前例がない。必要条件は、ここで使用される有機バインダーが、例えば生きている骨の機能を引き継ぐほど十分に骨形成が起こるまで消えない、つまり溶解するか又は解離されることである。
【００３９】
それ故に本質的に、水を含まないキャリアは、好ましくは骨誘導性であり表面微細孔を有する材料の投与（注入又は移植による体内への導入）において運搬手段としての役割を果たすが、その後、溶解又は他のモードの分解による解離が原因で、例えばインサイチュでの能動的な骨形成などを可能にする。
【００４０】
この点に関して、本発明はまた、骨成長を必要としている対象者の体に好ましくは骨誘導性である材料を注入することによって対象者における骨成長を促進する方法に関し、その材料は生体適合性の水を含まないキャリアに組み合わされ、水を含まないキャリアは対象者の体への導入後、及び材料の骨形成の発現前に溶解又は解離を開始する加工助剤である。より具体的には、ここでの水を含まないキャリアは、骨形成の完了前、及び好ましくは骨形成の発現前に実質的に溶解されるか又は解離される。後者は、好ましくは骨誘導性である存在している材料の表面微細孔からの恩恵を十分に受け取る。
【００４１】
好ましい水を含まないキャリアは、以下の種類：
−炭水化物：例えば、単糖類、セルロース化合物（例えばＣＭＣ、ヒドロキシエチルセルロースなど）、アルギン酸塩、キトサン、デキストラン、グアー、グルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、フルクトース、ペクチン、でんぷん、キサンタン、キシラン、マンナン、及びそれらの混合物などの糖類など
−タンパク質、ペプチド又はポリペプチド：例えば、フィブリン、ゼラチン、コラーゲン及びそれらの混合物など
−脂質：例えば、脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール脂質、プレノール脂質、サッカロ脂質、大豆レシチン、及びそれらの混合物など
−ポリオール：例えば、グリセロール、プロピレングリコール（１，２−プロピレングリコール、１，３−プロピレングリコール）、ブチレングリコール、ヘキシレングリコール、及びその混合物など
−合成有機ポリマー：例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、ポリエチレンオキシドＰＥＯとも名付けられる）、及び／又はポロキサマー（例えば、Ｐ６５、Ｐ８４、Ｐ８５、Ｆ８７、Ｆ８８、Ｆ９８（ビーエーエスエフ（ＢＡＳＦ）ベネルクスなど）及びＦ１２７（シグマ（Ｓｉｇｍａ）など）のようなプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）（登録商標））、界面活性剤及び乳化剤（例えば、ソリュートル（登録商標）ＨＳ  １５など）、ワックス、及びそれらの混合物など
−無機物ペースト：水硬性のリン酸カルシウムのセメント、硫酸カルシウムの石膏、及びそれらの混合物など
並びに、キサンタン、デキストラン、でんぷん及びグリセロール（ＸＤＳ）；ＣＭＣ、ＰＥＧ４ｋ、ＰＥＧ４００及びグリセロール（ＣＭＣ／ＰＥＧ）；大豆レシチン及びＦ８８（ＳＬＦ８８）；キサンタン、デキストラン及びソリュートル（登録商標）ＨＳ  １５（ＸＤＨＳ）；ＣＭＣ及びグリセロール（ＣＭＣＧ）；キサンタン及びグリセロール（ＸＧ）；及びソリュートル（登録商標）ＨＳ  １５及びＦ１２７（ＨＳＦ）；などのこれらの水を含まないキャリアの混合物から選ばれる。
【００４２】
適時に消えるために、キャリアは人間の体温（３７℃）において水への適切な溶解性を有することによって分解され、且つ好ましくは溶解され、又は任意の他の生物学的な方法によって解離される。本発明の水を含まないキャリアは、好ましくは人間の体温（３７℃）において生理学的緩衝液（例えば、リン酸緩衝液ＰＢＳなど）に溶解する。
【００４３】
好ましい水を含まないキャリアは、以下の特性によって特徴付けられる：第一側面において、水を含まないキャリアは、生体内で１週間未満の溶解時間を有するように選ばれ、それは好ましくは３日未満、より好ましくは１日未満であり、好ましくは１０から１００％、１０から９０％、１０から８０％、１０から７０％、１０から６０％、１０から５０％、より好ましくは５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％が溶解される。より好ましくは、この溶解時間は１２時間、６時間、３時間、２時間、１時間、又は３０分未満である。好ましい実施形態では、キャリアのうち１０から１００％、１０から９０％、１０から８０％、１０から７０％、１０から６０％、１０から５０％、より好ましくは５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％が溶解時間で溶解される。
【００４４】
溶解速度に関して、外科手術の間、外科医が材料を形作るか又は注入し、且つ粒子が分散するリスクなしに傷を縫合できる最短の溶解時間を、水を含まないキャリアが有する場合が好ましい。その後、溶解が速いほど骨形成には都合が良い。グリセロール、ポリキサマー、ポリエチレングリコール、ＣＭＣ、キサンタン及び／又はソリュートル（登録商標）ＨＳ  １５をベースとした水を含まないキャリアが、この点において好ましい。この点において、少なくとも１時間で生体内において溶解が開始することが好ましい。全体で、キャリアのうち１０から１００％、１０から９０％、１０から８０％、１０から７０％、１０から６０％、１０から５０％、より好ましくは５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％が溶解される場合、溶解開始が１から３時間内に起こり、溶解の完了が３時間から１日（２４時間）以内、好ましくは６から１２時間以内に起こることが好ましい。
【００４５】
キャリアは水を含まないように選ばれるため、骨誘導性粒子の微細構造面は、表面特性の変化、故に骨誘導性などの特徴的な性質の変化をもたらし得る滞在的な溶解／沈殿現象を有しない。一般的に、例えば骨誘導性などの特徴的な性質が保持されるようにキャリアが水を含まないことが好ましい。故に、水を含まないキャリアの使用は、他の任意のタイプのキャリアに比べて、好ましくは骨誘導性である事前に混合されたパテの寿命を長くすることができる。
【００４６】
別の側面では、好ましくは骨誘導性であるリン酸カルシウム粒子に組み合わされた場合に、３７℃のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）又は生理学的塩水における標準測定で、１週間以内、好ましくは３日以内、より好ましくは１日以内、最も好ましくは１から１２時間以内の完全な溶解時間を有するように、水を含まないキャリアは選ばれる。本発明による標準測定は、任意の体積（１．０ｃｃ）を有するシリンダーで行われ、その中で好ましくは骨誘導性である粒子は、水を含まないキャリアに対するリン酸カルシウム粒子が任意の比率で分散される。このテストにおいて、溶解開始はバルク形状の変化によって分かるため、溶解開始はシリンダーの目視検査によって観察される。このテストで定義付けられたような完全な溶解は、リン酸カルシウム粒子の全体積が、認識できるバルク形状又は組織、つまり自由なリン酸カルシウム粒子の平坦層なしに溶液内で自由に分散しているように視覚的に観察される場合に生じる。
【００４７】
本発明によると、溶解は外科的な投与の後、０．５から６時間、好ましくは１から６時間、最も好ましくは１から３時間以内に始まり、１から２４時間、３から２４時間、又は６から２４時間以内、好ましくは１から１２、３から１２、６から１２時間、より好ましくは１から８、２から８、３から８又は６から８時間以内に完了することが好ましい。
【００４８】
例えば生理学的に受け入れられる流体、好ましくは水、塩水又はＰＢＳなどの緩衝液における好ましくは骨誘導性であるパテの溶解時間は、好ましくは１から７２０分、１から１８０分、１から１２０分、１から１００分、１から６０分、５から６０分、１０から６０分、２０から６０分、又は３０から６０分であり、溶解時間は緩衝液への浸水後、好ましくは７２００分未満、１８０分未満、１２０分未満、１００分未満、６０分未満、３０分未満、又は５分未満である。
【００４９】
更に別の側面では、最長１週間、好ましくは最長３日、より好ましくは最長１日の寸法安定時間（ＤＳＬ）を有するようにキャリアが選ばれる。ＤＳＬは、人間の体温の環境においてポリマーが実質的に溶解しないか又は解離されない間の時間を意味し、上述と同一の標準シリンダーの同一の目視検査によって決定される。評価は、シリンダーから解離される粒子の程度ではなくシリンダーの寸法を検査する点で異なる。ＤＳＬは前述の溶解開始と好ましくは類似であり、故に人間の体温の環境への配置後に最長１から２４、１から１２、１から６時間、好ましくは最長１から３時間である溶解時間を有するＤＳＬが好ましい。
【００５０】
前述の値を良好に得ることが出来る好ましい水を含まないキャリアは、（ｉ）多糖類（例えばデキストラン、キサンタン、でんぷん、ペクチン、ＣＭＣなど）、（ｉｉ）脂質（例えば大豆レシチンなど）、（ｉｉｉ）ポリオール（例えばグリセロールなど）、（ｉｖ）ＰＥＧ（例えばＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ４０００又はＰＥＧ２００００など）、（ｖ）ポロキサマー（例えばＰ２３７、Ｐ２３８、Ｐ２８８、Ｐ４０７、Ｐ１８５、Ｐ２３４、Ｐ２３５、Ｐ６５、Ｐ８４、Ｐ８５、Ｆ８７、Ｆ８８、Ｆ９８、Ｆ１２７など）、（ｖｉ）界面活性剤及び／又は乳化剤（例えばソリュートル（登録商標）ＨＳ  １５など）、及びそれらの混合物から成る群から選ばれる。
【００５１】
好ましい実施形態では、本発明の水を含まないキャリアは、リン酸カルシウム粒子と組み合わされるとき、チューイングガムと同様の凝集性、適度な粘着性、及び適度な堅さとして説明される取扱い特性を有する。好ましい実施形態では、リン酸カルシウム粒子を含む水を含まないキャリアは、外科用手袋に過剰な残渣又は粘性を与えることなしに、取り扱われ、形作られ、操作されることができる。別の好ましい実施形態では、リン酸カルシウム粒子と組み合わされた水を含まないキャリアは、標準シリンジを用いて注入できる。好ましい実施形態では、リン酸カルシウム粒子と組み合わされた水を含まないキャリアは、適用できる外科での治療において典型的である塩水又は水での外科的洗浄に耐えることができる。機能的に、これらの水を含まないキャリアは、（ｉ）形成、打ち延ばし、混練、成形及び／又は注入できる、つまり圧縮圧力下で変形するか、若しくは流れることができる、（ｉｉ）物理的に粒子と結合し、周囲の骨に接着できるように十分な凝集性及び粘性がある、及び（ｉｉｉ）水溶解性であり３７℃で素早く分解するが、典型的な外科的洗浄に対して一時的な耐久性がある、という利点を提供する。単独若しくは好ましくは骨誘導性である多孔性リン酸カルシウムと組み合わされた、本発明の水を含まないキャリア又は水を含まないキャリアの組み合わせは、それらの“調節可能な”化学組成に基づいたこれらの有利な取扱い特性を示す。具体的に、本発明の水を含まないキャリアは、含有された化学成分の比率、硬化時間、及び／又は硬化温度を変えることによって、理想的に成形可能であるか、又は理想的に注入可能であるように作られることができる。例えば、グリセロールに懸濁された１％（ｗ／ｖ）のＣＭＣは注入可能材料として使用される一方、グリセロールに懸濁された１５％（ｗ／ｖ）のＣＭＣはパテとして使用される；更に、グリセロールに懸濁され、８０℃で４５分間硬化された２％（ｗ／ｖ）のキサンタンは注入可能材料として使用される一方、９８．５℃で１．５時間硬化された同一調合はパテとして使用される。
【００５２】
［製造］
好ましくは骨誘導性であり表面微細孔を有するリン酸カルシウム材料は、例えば前述の参考文献：特許文献１及び特許文献２に従って調製されることができる。故に１つの方法は、上述のような好ましくは骨誘導性である生体材料が得られるような条件下でセラミック材料を焼結する段階を含む。セラミック材料は、焼結段階の前は焼成された状態である。焼結は好ましくは１０００から１２７５℃の間の温度で実施され、有機酸の水溶液で処理され、酸を除去するために洗浄される。より好ましくは、焼結は１１５０から１２５０℃の間の温度で実施される。焼結段階の持続時間は、６から１０時間、好ましくは７から９時間の間で適切に選ばれることができる。セラミック材料がセラミック材料の粉末に沈んでいる間に焼結を実施することが有利であることが更に分かっている。これは材料表面の反応性、それ故に例えば溶解、再沈殿などに基づいた生物活性にも有益な影響を与える。焼結の後、表面の化学的な不純物を除去するために、材料は好ましくはＳｉ−Ｃ研磨紙などの研磨紙で研磨される。続いて、材料は酸水溶液で処理される。この点において適切な酸は、任意のエッチング酸、つまりリン酸カルシウムベースの材料の僅かな溶解をもたらす任意の酸である。例えばマレイン酸、塩酸、リン酸、及びそれらの組み合わせなどの酸の使用は、非常に好ましい結果をもたらすことが分かっている。溶液中の酸濃度は、溶液のｐＨが０から４の間、より好ましくは１から３の間になるように好ましくは選ばれる。好ましくは３から１５分間続く酸処理の後、セラミック材料は酸を除去するために洗浄される。洗浄は、エタノール、水、又はそれらの組み合わせを用いて、適切に行われることができる。
【００５３】
好ましい方法では、セラミック材料は、好ましくは骨誘導性であり、１．０から８．０μｍ、好ましくは２．０から４．０μｍの粒子サイズを有するリン酸カルシウム粉末と、発泡剤と、随意に細孔形成（ｐｏｒｏｇｅｎｉｃ）剤との水性スラリーを水中で含む多孔性リン酸カルシウムセラミックを作る；前記スラリーの泡を発生させる条件にスラリーをさらす；多孔性の素地（ｇｒｅｅｎ  ｂｏｄｙ）を提供するために、結果として得られた発泡スラリーを乾燥させ、随意に細孔形成剤を除去し、多孔性の焼結リン酸カルシウムを提供するために１０５０から１１５０℃の間の温度で多孔性の素地を焼結する；随意に焼結リン酸カルシウムを粉砕して粒子にし、略４０から略１５００μｍの範囲の粒子サイズを有する粒子を集める方法によって調製される。好ましい実施形態では、注入可能な調合を調製するために、その方法は焼結リン酸カルシウムを粉砕して粒子にする段階を更に含み、その粒子はふるいを用いて集められ、好ましくは４５から５００μｍの微粒子分画を提供するために４５から５００μｍのふるいが用いられ、より好ましくは４５から３００μｍの微粒子分画を提供するために４５から３００μｍのふるいが用いられ、最も好ましくは４５から１５０μｍの微粒子分画を提供するために４５から１５０μｍのふるいが用いられる。最も好ましくは、微粒子は４５から１０６μｍ、１０６から２１２μｍ、又は２１２から３００μｍのサイズを有する。好ましい実施形態では、成形可能なパテ調合又は注入可能材料を準備するために、その方法は焼結リン酸カルシウムを粉砕して粒子にする段階を更に含み、その粒子はふるいを用いて集められ、好ましくはそれぞれ１５０から５００μｍ、５００から１０００μｍ、及び１０００から２０００μｍの微粒子分画を提供するために、１５０から５００μｍ、５００から１０００μｍ、及び１０００から２０００μｍのふるいが用いられる。
【００５４】
本発明の方法の好ましい実施形態では、リン酸カルシウム粉末は０．０１から１μｍ、好ましくは０．０５から０．５μｍの結晶サイズを有する結晶から成る粉末である。本発明の方法の別の好ましい実施形態では、発泡剤は過酸化水素である。本発明の方法の更に好ましい実施形態では、細孔形成剤はナフタレン粒子を含み、細孔形成剤は８０から１１０℃での蒸発によって除去される。
【００５５】
本発明の方法の更に別の好ましい実施形態では、細孔形成剤はワックス粒子を含み、細孔形成剤は、５０から７０℃で泡立て、続いて９８０から１０２０℃で前焼結することによって除去される。本発明の方法の更に別の好ましい実施形態では、前記スラリーの発泡をもたらす前記条件は、スラリーを略５０から７０℃に加熱する段階を含む。
【００５６】
本発明の方法の別の好ましい実施形態では、乾燥され発泡されたスラリーは、ＴＣＰの場合は１０５０から１１００℃、より好ましくは１０５０から１０７５℃の温度で焼結され、又はＨＡ及び／又はＢＣＰの場合は１１００から１１５０℃の温度で焼結される。リン酸カルシウム粒子は、好ましくは骨誘導性である材料を作るために、１：１０から１０：１、好ましくは２：５から５：２の体積比率で、より好ましくは１：２から２：１の間、最も好ましくは３：２から成る比率で、水を含まないキャリアと混合される。好ましい実施形態では、水を含まないキャリアは、水を含まないキャリアのブレンドを含むか、又はそれらから成り、それらは例えば、２つのポロキサマーのブレンド、１つのポロキサマー及びポリエチレングリコールのブレンド、ポリエチレンオキシドポリマー及びグリセロールのブレンド、又はポロキサマー及びグリセロールのブレンドなどである。
【００５７】
更に好ましい実施形態（例えば実施例４及び５参照）では、水を含まないキャリアは同一の一般的な手順に従って作られる：
−乾燥粉末成分の質量は質量又は体積によって測定され、室温又は例えば２２から９８．５℃などのより高い温度で非水性溶媒に完全に混合される。
−ＰＥＧ、ポロキサマー、又は界面活性剤などの合成ポリマーが溶解され、次いでこの混合物に組み合わされ、完全なキャリア溶液をもたらす。
−キャリア溶液は、９８．５℃で加熱されたＸＤＳなどの特定の温度で、例えば４５分などの特定の時間、撹拌とともに又は撹拌なしで加熱される。
−キャリア溶液は加熱から外され、撹拌とともに又は撹拌なしで自然に室温まで冷却されるか又は冷凍で急激に冷却される。それらは次いで、組み合わせのために室温で保存される。
【００５８】
例えばＴＣＰ又はＢＣＰなどのリン酸カルシウム粒子は、含水性キャリアとともに保存されるべきではない。例えばパテ提示物又は注入可能材料などの好ましくは骨誘導性である本発明の材料は、
−適切な容器（シリンジ又は小びん）における、好ましくは骨誘導性である前もって混合されたパテ又は注入可能材料：好ましくは骨誘導性である粒子及び水を含まない水溶性キャリアのブレンド
−好ましくは骨誘導性である乾燥したパテのブレンド又は注入可能材料、１つの容器は水を含まない（つまり凍結乾燥された）粉末形状である水を含まないキャリアに好ましくは骨誘導性である粒子を組み合わせる
として好ましくは調製される。パテ又は注入可能材料は、無菌食塩水若しくは患者の血液、骨髄、又は任意の他の体液を用いて、手術室で再水和される。
【００５９】
［使用］
本発明の材料は、動物及び好ましくは人間において骨成長が必要とされる任意の用途で使用することができる。特に本発明は合成骨空隙フィラーとしての使用がある。目的とされる好適な集団は、外傷又は手術によって生じた骨欠損を有する個体である。好ましい解剖場所は：骨格組織、つまり四肢、脊柱、及び骨盤、頭顎顔面の領域における骨空隙又は割れ目である。従って、注入可能材料又はパテは、非耐力骨構造における空隙及び割れ目のための骨空隙フィラーとしての使用を目的としている。それは外科手術で作られた骨欠損、又は骨への外傷から生じた骨欠損の治療に使用されることを目的とする。注入可能材料又はパテは、骨格組織（つまり、四肢、脊柱及び骨盤）における骨空隙又は割れ目の中に詰められることを目的とする。
【００６０】
骨誘導性などの存在している表面微細孔を有するリン酸カルシウムの特性に関して、骨成長を促進するために活性物質を添加することは必要ない。例として生物学的活性物質、成長因子及びホルモン、幹細胞、骨形成原細胞、及び骨幹細胞などの細胞を含むような活性物質はすべて使用することができる。
【００６１】
本発明は、以下の実施例及び図面を参照して、以下で更に説明される。実施例及び図面は単に例示であり、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）、生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）、及び体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での使用による結果を推定することができるが、本発明を限定しない。
【実施例】
【００６２】
［実施例１：生体内での注入可能セラミック粒子の骨誘導性］
４５μｍ未満、４５から１０６μｍ、１０６から２１２μｍ及び２１２から３００μｍのセラミック粒子（二相性リン酸カルシウムセラミック、ＢＣＰ）がふるいを用いて調製され、超音波で洗浄され、乾燥され、次いで殺菌された。
【００６３】
セラミック粒子（サンプル毎１０００±１０ｍｇ）が、誘導的な骨形成を評価するために８匹の雑種犬の傍脊柱筋群に１２週間移植された。地元の動物保護委員会の許可とともに、地元のストックブリーダーから得られた８匹の痩せた雑種成犬（オス、１０から１５ｋｇ）に外科手術が行われた。ペントバルビタールナトリウム（体重に対して３０ｍｇ／ｋｇ）の腸内注入によって犬を麻酔した後、背中の毛が剃られ、肌がヨウ素で洗浄された。次いで縦切開が行われ、傍脊柱筋群が鈍分離（ｂｌｕｎｔ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）によって露出された。縦筋肉切開が外科用メスによって続いて行われ、筋肉袋（ｍｕｓｃｌｅ  ｐｏｕｃｈ）が鈍分離によって作られた。セラミック粒子は２ｍｌシリンジの補助によって筋肉袋の中に次いで押し込まれ、傷はシルク縫合糸を用いて層に閉じられた。少なくとも２ｃｍ離れた４つの別個の筋肉ポケットが傍脊柱筋群のそれぞれの側面に作られ、それぞれのポケットに１つのサンプルが移植された。手術の後、それぞれの犬は感染を防ぐために、連続した３日間筋肉注射でペニシリンを与えられた。
【００６４】
移植の１２週間後、動物は犠牲とされて移植片が周囲の組織とともに採取され、直ちに４％の緩衝化されたホルムアルデヒド溶液（ｐＨ＝７．４）に入れられた。リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄した後、外植片を囲む軟組織が丁寧に切り取られ、外植片の体積（Ｖｅ）が水の置換によって測定された。次いで外植片は一連のアルコール溶液（７０％、８５％、９０％、９５％、及び１００％×２）で脱水され、メチルメタクリレート（ＭＭＡ）に埋め込まれた。薄い部位（１０から２０マイクロメートル）がダイヤモンド・ソー（ＳＰ１６００、レイカ（Ｌｅｉｃａ）、ドイツ）でサンプルの中心を横切って作られた。部位はメチレンブルー及び塩基性フクシンで染められた。
【００６５】
組織形態計測がアドビフォトショップソフトウェア（Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて行われた。第１に、サンプル全体が関心領域（ＲＯＩ）として選ばれ、その領域の画素が読み込まれ（ＲＯＩ）、次いでＢＣＰ及び石灰化した骨の両方が疑似的に着色され、ＢＣＰ及び骨の画素がそれぞれＭ及びＢとして読み込まれた。サンプル中の材料の面積割合（移植片に対してはＭｉ％、外植片に対してはＭｅ％）がＭ＊１００／ＲＯＩとして計算され、利用可能な空間の割合（孔隙率、移植片に対してはＰｉ％、外植片に対してはＰｅ％）は（ＲＯＩ−Ｍ）＊１００／ＲＯＩとして計算され、外植片の利用可能な空間における骨の割合（ＢＰ％）はＢ＊１００／（ＲＯＩ−Ｍ）として計算され、サンプル全体における骨の面積割合（ＢＲＯＩ％）はＢ＊１００／ＲＯＩとして計算された。
【００６６】
以下のデータは分析及び比較に利用できる：Ｖｉ（移植片の体積）、Ｖｅ（外植片の体積）、Ｍｉ％（移植片におけるＢＣＰの面積割合）、Ｍｅ％（外植片におけるＢＣＰの面積割合）、Ｐｉ％（移植片における利用可能な空間の面積割合）、Ｐｅ％（外植片における利用可能な空間の面積割合）、ＢＰ％（外植片の利用可能な空間における骨の面積割合）、及びＢＲＯＩ％（外植片における骨の面積割合）。移植片におけるＢＣＰ材料の体積は概略でＶｉ＊Ｍｉとして決めることができ、外植片におけるＢＣＰの体積はＶｅ＊Ｍｅとして決めることができ、外植片における骨の体積は概略でＶｅ＊ＢＲＯＩ％として決めることができる。
【００６７】
［結果］
４５μｍより大きいＢＣＰ粒子を含む全ての移植片で骨は形成されたが、４５μｍより小さいＢＣＰ粒子を含む全ての移植片で骨は形成されなかった（図１及び２）。２１２から３００μｍの粒子、１０６から２１２μｍの粒子、及び４５から１０６μｍの粒子の間での骨形成における顕著な差異は見られなかった。
【００６８】
［考察］
この研究では、粒子サイズが、ＣａＰセラミックスの骨誘導性に影響を与えることが示された。４５μｍより大きい粒子は骨誘導特性を示し、故に適切なポリマーキャリアとともに骨誘導性セラミック材料の開発に用いることができる。
【００６９】
［実施例２：適合した体外での分解特性を有する水を含まないキャリアの調合］
この研究では、適合した成形性、注入性及び溶解速度を得ることを目的として、様々な水を含まないキャリアの調合が開発された。これらの調合は、実績のある生体適合性、医学的使用の履歴、迅速な溶解性、及び潤滑効果を有する原材料を用いて作られたが、それらは以下に要約される：
−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）：ＰＥＧ４００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ２００００（例えばメルク化学工業（Ｍｅｒｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ）など）
−プルロニック（登録商標）：Ｐ６５、Ｐ８４、Ｐ８５、Ｆ８７、Ｆ８８、Ｆ９８（例えばビーエーエスエフベネルクスなど）及びＦ１２７（例えばシグマなど）
−ポリオ−ル：グリセロール（例えばメルク化学工業など）
−乳化剤：大豆レシチン（例えばエーエムディー特殊成分（ＡＭＤ  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ）など）
−炭水化物：スクロース（例えばシグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）など）
【００７０】
調合は上記の成分のうち２つを容量で混合することによって作られた。予備の調合は、定性的な取扱い評価に基づいた粒子バインダーとしての適性によって選別された。プラスに評価されたキャリアのみがその後、キャリア：ＴＣＰ＝２：３の体積比率で、ＴＣＰ粒子（５００から１０００μｍ）とブレンドされた。これらの結果として生じたセラミックパテ材料はそして、取扱い性、凝集性、及び粘性に基づいて記録された。最終的にそれぞれの調合の溶解速度は、以下のように評価された：セラミック材料の１ｃｃシリンダーが生理学的な体液を模倣するための３７℃、８ｃｃリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に浸された。サンプルは次いで、溶解に対して視覚的に観察されたが、溶解はここでリン酸カルシウム粒子がバルク材料から自由に解離され、容器の底部に粒子の非晶質層を形成するときとして定義された。約７５％までの溶解に必要な時間が記録された。
【００７１】
［結果］
単一の成分、つまりプルロニック（登録商標）、ＰＥＧ、グリセロール、大豆レシチン又はスクロースポリマーをＴＣＰ粒子とブレンドすることで、凝集性があり成形可能なパテ調合は生じなかったが、これらの成分のうち２つをブレンドすることにより、滞在的に凝集性があり成形可能な調合が生じた。以下の表に要約された５つのセラミック材料において、最良の取扱い性、凝集性及び粘性値が観察された。
【００７２】
【表１】
2012533373.tif 000002
【００７３】
［考察］
２つの水を含まない成分の組み合わせはキャリアの特性に実質的な影響を与えるが、全ての組み合わせが適切なキャリアに役立つわけではない。表１に要約された材料は、この研究で開発された優良キャリアを含む。これらの水を含まないキャリアは微細構造を有するＣａＰ粒子と組み合わせることが好ましいが、それは含水性キャリアに比べて水を含まないキャリアが機能的な寿命を実質的に長くするからである。
【００７４】
［実施例３：３つの異なる水を含まないキャリアの生体内での有効性］
様々な水を含まないキャリアが準備され、実施例２に記載されたパテを形成するためにＴＣＰ顆粒と組み合わせた。これらの調合は取扱い特性に基づいて無分別に評価され、５つのうち２つが生体内での移植のために選ばれた。これらのパテは、ヤギの腸骨の翼状の部位における臨界サイズの欠損（１９ｍｍ）に１６週間にわたって移植された。外植の後、サンプルはホルマリンに入れられ、エタノールを用いて脱水され、メチルメタクリレートに埋め込まれた。石灰化した部位が作られ、骨形成を視覚化するためにメチレンブルー及び塩基性フクシン溶液で染められた。パテサンプルにおける骨形成は、同一のヤギにコントロールとして更に移植されたキャリアを含まないＴＣＰ顆粒の骨形成と比較された。実験的な設計は以下の表２に要約される。
【００７５】
【表２】
2012533373.tif 000003
【００７６】
［結果］
腸骨の翼状の部位における欠損の外植片の中心から取られた組織部位は、全ての移植片における骨形成を示した。両方の水を含まない調合に対して、新しい骨形成は構成されたＴＣＰ粒子と接触しているが、それは骨欠損への材料の真の統合を示す。Ｐ８５／ＰＥＧ４０００（図３Ａ）及びＰ８４／Ｆ８７（図１４Ｂ）サンプルにおける骨形成は、５００から１０００μｍのＴＣＰ顆粒のみ（図３Ｃ）と匹敵した。
【００７７】
［考察］
骨形成の質は、全ての治療群に対して類似した。つまり、新しい骨形成はＣａＰ粒子と直接接触した。これはテストされた水を含まないキャリアが新しい骨形成を妨げないことを示す。更に、残留キャリアの残部は観察されず、それはこれらの水を含まない調合が以前に体外で観察されたように生体内でも迅速に分解することを示す。要約すると、これらの結果はこれらの水を含まないキャリアが骨欠損治療のために骨誘導性ＣａＰ材料を運搬するのに役立つという結論を支持する。
【００７８】
［実施例４：水を含まない骨誘導性パテの調合］
様々な自然発生材料成分及び合成材料成分の両方が、調節可能な取扱い特性及び特定の分解速度を有し、生体適合性で水を含まない成形可能なキャリアを構築するために選ばれた。それらは溶媒又は増粘剤の何れかとして一般的に分類される：
溶媒：
−ポリエチレングリコール、ｍｗ＝４００（メルク）（“ＰＥＧ４００”）
−グリセロール（シグマ）（“Ｇｌｙ”）
増粘剤：
−ポリエチレングリコール、ｍｗ＝４，０００（フルカ（Ｆｌｕｋａ））（“ＰＥＧ４ｋ”）
−デキストラン、ｍｗ＝４０，０００（ファーマコスモス（Ｐｈａｒｍａｃｏｓｍｏｓ））（“Ｄｅｘ”）
−キサンタン  ＸＧＦ  ＦＮＨＶ（ジャングブンズラウア（Ｊｕｎｇｂｕｎｚｌａｕｅｒ））（“Ｘａｎ”）
−ブラノーズ（Ｂｌａｎｏｓｅ）（登録商標）  カルボキシメチルナトリウムセルロース、７Ｈ４ＸＦ  ＰＨ（ハークルス（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ））（“ＣＭＣ７Ｈ”）
−でんぷん、溶解性（シグマ）
−大豆レシチン（エーエムディー）
−プルロニック（登録商標）Ｆ８８（ビーエーエスエフ）（“Ｆ８８”）
−ソリュートル（登録商標）ＨＳ  １５（ビーエーエスエフ）（“ＨＳ１５”）
【００７９】
複数の調合が、異なる明確な剛性、均一性、及び粘性を有する成形可能なキャリアを開発するために、これらの成分の異なる組み合わせを用いて調製された。調合は以下の一般的な手順に従って作られた：溶媒及び増粘剤が体積及び質量によってそれぞれ測定され、次いで均一になるまでブレンドされた。
【００８０】
成形可能な粒子バインダーとして有益なキャリア調合は、次いでＴＣＰ粒子（５００から１０００μｍ）に組み合わされた。このようなキャリア調合は、例えば：キサンタン、デキストラン、でんぷん、及びグリセロール（ＸＤＳ）；ＣＭＣ７Ｈ、ＰＥＧ４ｋ、ＰＥＧ４００、及びグリセロール（ＣＭＣ／ＰＥＧ）；大豆レシチン及びＦ８８（ＳＬＦ８８）；及びキサンタン、デキストラン、及びソリュートル（登録商標）ＨＳ  １５（ＸＤＨＳ）である。キャリア及びＴＣＰ粒子は、キャリア：粒子が１：２から３：４の範囲の体積比率で、均一になるまで混合された。これらは次いで成形可能なセラミックパテとして評価され、それらの取扱い特性−特に、凝集性、粘性、及び延性−について記録された。
【００８１】
これらのパテ−例えば：ＸＤＳ、ＣＭＣ／ＰＥＧ、及びＳＬＦ８８など−の溶解速度を評価するために、それらは３７℃でＰＢＳに浸され（１：１０ｖ／ｖ）、実施例２と同様に溶解に対して視覚的に観察された。
【００８２】
［結果］
取扱い特性及び溶解データの両方によって、所望の要件を満たしたもののみに達した水を含まないキャリアの集団を絞り込む基準が提供されたが、所望の要件は例えば２日以内は成形可能であり水溶性であることなどである。
【００８３】
【表３】
2012533373.tif 000004
【００８４】
［考察］
表３に記載されたような広範な成分を使用することで、成形可能であり骨誘導性であるパテ−例えば、ＸＤＳ（キサンタン、デキストラン、でんぷん、及びグリセロール）、ＣＭＣ／ＰＥＧ（ＣＭＣ、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ４ｋ、及びグリセロール）、ＳＬＦ８８（大豆レシチン及びプル  Ｆ８８）、及びＸＤＨＳが、２日以内に溶解するようにカスタマイズされた取扱い特性を有するように開発された。水を含まないため、これらのパテはＴＣＰ粒子の加水分解を引き起こすことなく延長された寿命を提供する。
【００８５】
［実施例５：水を含まず骨誘導性である注入可能材料の調合］
様々な自然発生材料成分及び合成材料成分の両方が、所望の取扱い特性及び特定の分解速度を有し、生体適合性で水を含まない注入可能なキャリアを構築するために選ばれた：
−ＣｅＫｏｌ５００００  カルボキシメチルセルロース（シーピーケルコ（ＣＰ  Ｋｅｌｃｏ））（“ＣＭＣ５０ｋ”）
−グリセロール（シグマ）（“Ｇｌｙ”）
−ルトロール（登録商標）Ｆ１２７（ビーエーエスエフ）（“Ｆ１２７”）
−ソリュートル（登録商標）ＨＳ  １５（ビーエーエスエフ）（“ＨＳ１５”）
−キサンタン  ＸＧＦ  ＦＮＨＶ（ジャングブンズラウア）（“Ｘａｎ”）
【００８６】
複数の調合が、ルアーチップシリンジ（ｌｕｅｒ  ｔｉｐ  ｓｙｒｉｎｇｅ）による押出に対して最適な剛性、均一性、及び粘性を有する注入可能なキャリアを開発するために、異なる成分の組み合わせを用いて調製された。調合は以下の同一の一般的な手順で作られた：成分量は体積又は質量によって測定され、次いで均一になるまでブレンドされた。
【００８７】
注入可能な粒子バインダーとして有益なこれらのキャリア調合は、次いでＴＣＰ粒子（１５０から５００μｍ）に組み合わされた。例えばこのようなキャリア調合は、キサンタン及びグリセロール（ＸＧ）；Ｆ１２７及びＨＳ１５（ＨＳＦ）；ＣＭＣ５０ｋ及びグリセロール（ＣＭＣＧ）；並びにキサンタン、ソリュートル（登録商標）ＨＳ  １５、及びグリセロール（ＸＨＳ）から成る。キャリア及びＴＣＰ粒子は、キャリア：粒子が０．６：１から１：１の範囲の体積比率で、均一になるまで混合され、次いで様々なルアーチップシリンジに移された。注入可能な粒子バインダーは次いで、それらの取扱い特性−例えば、凝集性、粘性、及び押出の簡易性−に基づいて評価された。
【００８８】
それらの溶解特性を評価するために、これらのパテ−例えば：ＸＧ、ＨＳＦ、及びＣＭＣＧ−は３７℃のＰＢＳに浸され（１：１０ｖ／ｖ）、実施例２と同様に溶解に対して視覚的に観察された。
【００８９】
［結果］
取扱い特性及び溶解データの両方によって、所望の要件を満たしたもののみに達した水を含まないキャリアの集団を絞り込む基準が提供されたが、所望の要件は例えば２日以内は注入可能であり水溶性であることなどである。これらの調合は表４に要約された。
【００９０】
【表４】
2012533373.tif 000005
【００９１】
［考察］
表４に記載されたような様々な成分を使用することで、骨誘導性である注入可能材料−例えば、ＸＧ（キサンタン及びグリセロール）、ＨＳＦ（ソリュートル（登録商標）ＨＳ  １５及びプル  Ｆ１２７）、ＣＭＣＧ（ＣＭＣ及びグリセロール）、及びＸＨＳ（キサンタン、ソリュートル（登録商標）ＨＳ  １５、及びグリセロール）−が、２日以内に溶解するようなカスタマイズされた取扱い特性を有するように開発された。水を含まないため、これらの注入可能材料はＴＣＰ粒子の加水分解を引き起こすことなく延長された寿命を提供する。
【００９２】
［実施例６：水を含まず骨誘導性であるパテ及び注入可能材料の生体内での骨形成］
ＴＣＰ粒子を含み、パテ又は注入可能材料の形態である骨誘導性の水を含まない材料（実施例４及び５で事前に記載された）が、それらの生体内での骨形成の滞在能力を評価するために、８匹のオスの犬に移植された。材料は骨の部位及び非骨性の部位−それぞれ大腿骨及び傍脊柱筋群−の両方に移植された。５ｍｍ直径の大腿骨欠損は０．５ｃｃ未満の材料テストサンプルで満たされ、１ｃｃサンプルが筋肉に移植された。リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）粒子（５００から１０００μｍ及び１５０から５００μｍ）のみがコントロールとして移植された。移植片は１２週間後に採取され、組織評価のために調製された。テストサンプルは骨形成を視覚化するために、メチレンブルー及びフクシンで染められた。
【００９３】
加えて、キャリア調合は、生理学的な体液と類似したリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に完全溶解するのに必要な時間について評価された。リン酸カルシウム顆粒を含まない、１ｃｃのそれぞれのキャリア調合のサンプルは８ｃｃのＰＢＳに浸され、３７℃で保存された。サンプルは完全溶解に対して視覚的に観察された−ここで完全溶解は、キャリアの認識できるバルクの輪郭、形状及び断片がＰＢＳ中に見られず、キャリア−ＰＢＳ混合物が視覚的に均一であるときとして定義された。完全溶解のための時間が記録された。
【００９４】
【表５】
2012533373.tif 000006
【００９５】
【表６】
2012533373.tif 000007
【００９６】
［結果］
大腿骨移植（図４ａ））の組織染色は、ＴＣＰ粒子が意図された通り欠損において水を含まないキャリアによって保持されたことを示す。更に、広範囲に及ぶ骨再生が欠損にわたって明らかであった。顕著に、残留キャリア材料は検査された如何なる移植部位においても観察されなかった。
【００９７】
筋肉内移植（図４ｂ））の染色は、ＳＬＦ８８を除く全ての調合における筋肉での異所性の骨形成（例としてＣＭＣＧが示された）から明らかなように、水を含まないキャリアを含むＴＣＰ顆粒によって骨誘導性が保持されることを示す。
【００９８】
体外でのキャリアの溶解テストだけでも、ＳＬＦ８８が体外で２日以内に完全に溶解しない唯一のキャリアであることが示された。
【００９９】
［考察］
この研究の結果は、骨誘導性セラミックを運搬するために、ここで開発されたような水を含まないキャリアを適用することの実用性及び有効性を示す。これらのキャリアはセラミック材料を欠損部位に容易に運搬することができ、それらを最適な骨治療のためにインサイチュで保持できる。顕著に、体外での溶解データは、骨形成滞在能力と骨誘導性パテで使用されたキャリアの体外での溶解時間との間の重要な関係を示した。具体的に、早く溶ける水を含まないキャリアは遅く溶けるキャリアより好ましいが、それは遅い溶解が含まれる微細構造を有するリン酸カルシウム粒子の骨誘導性を抑制し得るからである。しかしながら、遅く溶けるキャリア（例えばＳＬＦ８８など）は、キャリアの化学組成（例えば、濃度、分子量など）、硬化温度（例えば、９８．５℃ではなく６０℃で硬化する）、及び硬化時間（例えば、９０分ではなく４５分）を修正することによって早く溶けるように“調節”することができる。
【図１】
2012533373.tif 000008
【図３】
2012533373.tif 000009
【図４ａ）】
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【図４ｂ）】
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【図２】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年3月22日(2012.3.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
０．１から１．５μｍの間の結晶サイズを有し、表面微細構造、特に表面微細孔を有する多孔性リン酸カルシウムと、水を含まないキャリアとを含み、前記水を含まないキャリアが、単糖類、ＣＭＣ、ヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸塩、キトサン、デキストラン、グアー、グルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、フルクトース、ペクチン、でんぷん、キサンタン、キシラン、及びマンナンから成る群から選ばれた炭水化物、フィブリン、ゼラチン、及びコラーゲンから成る群から選ばれたタンパク質、脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール脂質、プレノール脂質、サッカロ脂質、及び大豆レシチンから成る群から選ばれた脂質、グリセロール、１，２−プロピレン、１，３−プロピレングリコール、ブチレングリコール、及びヘキシレングリコールから成る群から選ばれたポリオール、ポリエチレングリコール、Ｐ６５、Ｐ８４、Ｐ８５、Ｆ８７、Ｆ８８、Ｆ９８、及びＦ１２７から成る群から選ばれた合成有機ポリマー、並びにポリエチレングリコール−６６０−１２−ヒドロキシステアリン酸である界面活性剤／乳化剤、又はそれらのブレンド若しくは混合物である、成形、打ち延ばし、混練及び／又は注入可能なセラミック材料。
【請求項２】
骨誘導性である、請求項１に記載のセラミック材料。
【請求項３】
前記水を含まないキャリアが生体内で、投与後６週間以内、好ましくは３週間以内に分解する、請求項１又は２に記載のセラミック材料。
【請求項４】
前記キャリアが、１週間以内、好ましくは３日以内、より好ましくは１日以内の体外での３７℃の生理学的塩水における溶解時間を有する、請求項１から３の何れか１項に記載のセラミック材料。
【請求項５】
前記水を含まないキャリアが、最長１週間、好ましくは最長３日、及びより好ましくは最長１日の寸法安定時間を有する、請求項１から４の何れか１項に記載のセラミック材料。
【請求項６】
前記キャリアが、Ｐ８４、Ｐ８５、Ｆ８７、Ｆ８８から成る群から選ばれたポロキサマー；ＰＥＧ４００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ４０００から成る群から選ばれたＰＥＧ；大豆レシチンである脂質；キサンタン、デキストラン、でんぷん、ＣＭＣから成る群から選ばれた多糖類；グリセロールであるポリオール；及びポリエチレングリコール−６６０−１２−ヒドロキシステアリン酸である界面活性剤／乳化剤、又はそれらの混合物若しくはブレンドである、請求項１から５の何れか１項に記載のセラミック材料。
【請求項７】
前記多孔性リン酸カルシウムが２０から９０％の全孔隙率を有し、マクロ孔が０．１から１．５ｍｍのサイズを有して存在し、微細孔が前記マクロ孔の表面に存在し、前記微細孔が０．０５から２０μｍのサイズを有する、請求項１から６の何れか１項に記載のセラミック材料。
【請求項８】
孔が０．１から１．５０μｍの範囲のサイズの微細孔を含み、１０から４０％の範囲の微細孔の表面積割合を有する、０．１から１．５０μｍの範囲の平均粒子サイズを有する請求項１から７の何れか１項に記載の材料。
【請求項９】
骨形成を必要としている対象者での骨形成の促進に使用するための請求項１から８の何れか１項に記載の材料であって、前記使用は前記材料に生体適合性キャリアを組み合わせることを含み、前記水を含まないキャリアは前記対象者の体への導入後であって前記材料の骨誘導性作用の開始前に分解を開始する加工助剤である、使用のための請求項１から８の何れか１項に記載の材料。
【請求項１０】
前記水を含まないキャリアが、骨形成の完了前に、実質的に完全に溶解されるか又は解離される、請求項９に記載の使用のための材料。
【請求項１１】
前記水を含まないキャリアが、骨形成の開始前に、実質的に完全に溶解されるか又は解離される、請求項９又は１０に記載の使用のための材料。
【請求項１２】
前記水を含まないキャリアが、前もって混合されたパテの保存寿命を長くできる水を含まない組成物を含む、請求項９、１０又は１１の何れか１項に記載の使用のための材料。
【国際調査報告】
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