(57)【要約】  本願は、対象における癌の症状を治療または軽減するための方法であって、ａ）前記対象におけるニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）のレベルを決定する段階；ならびにｂ）ＮＡＰＲＴレベルが所定の閾値未満である場合、i）有効量のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＮＡＭＰＲＴｉ）およびii）有効量のニコチン酸、ニコチン酸前駆体もしくはニコチン酸のプロドラッグにより連続的／同時に前記対象を治療する；または２）ＮＡＰＲＴレベルが所定の閾値以上である場合、ii）有効量のニコチン酸、ニコチン酸前駆体もしくはニコチン酸のプロドラッグによる連続／同時治療の非存在下で、i）有効量のＮＡＭＰＲＴｉにより前記対象を治療する段階を含む方法を開示する。
2012533530.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における癌の症状を治療または軽減するための方法であって、
ａ）前記対象におけるニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）のレベルを決定する段階と、
ｂ）１）上記段階ａ）において決定されたように、ＮＡＰＲＴレベルが所定の閾値未満である場合、i）有効量のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＮＡＭＰＲＴｉ）およびii）有効量のニコチン酸、ニコチン酸前駆体もしくはニコチン酸のプロドラッグにより連続的もしくは同時に前記対象を治療する；または
２）上記段階ａ）において決定されたように、ＮＡＰＲＴレベルが所定の閾値以上である場合、ii）有効量のニコチン酸、ニコチン酸前駆体もしくはニコチン酸のプロドラッグによる連続もしくは同時治療の非存在下で、i）有効量のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＮＡＭＰＲＴｉ）により前記対象を治療する段階
とを含む方法。
【請求項２】
段階ｂ）１）におけるi）有効量のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＮＡＭＰＲＴｉ）と、ii）有効量のニコチン酸、ニコチン酸前駆体またはニコチン酸のプロドラッグによる前記連続または同時治療が、連続的かつ治療の２４時間以内である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階ｂ）２）における有効量のニコチン酸、ニコチン酸前駆体またはニコチン酸のプロドラッグによる連続または同時治療の前記非存在が、連続的かつ治療の２４時間以内である、請求項１および２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記対象を、有効量のニコチン酸、ニコチン酸前駆体またはニコチン酸のプロドラッグによる段階ｂ）における治療に連続して、かつ２４時間以内に治療する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＮＡＰＲＴレベルを前記対象の腫瘍組織において決定する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）レベルを、ＲＴ−ＰＣＲなどによる、ＮＡＰＲＴをコードする核酸のレベルに基づき決定する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）レベルを、ＮＡＰＲＴに対する特異的抗体またはその他の特異的結合パートナーに基づくアッセイなどにおけるタンパク質レベルに基づき決定する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ニコチン酸、ニコチン酸前駆体またはニコチン酸のプロドラッグがニコチン酸である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＮＡＭＰＲＴｉ）が、
【化１】
2012533530.tif 000009
【化２】
2012533530.tif 000010
からなるリストから選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
有効量の前記ニコチン酸、ニコチン酸前駆体またはニコチン酸のプロドラッグを、約１ｍｇ／日〜約３，０００ｍｇ／日、例えば約１０ｍｇ／日〜約１，０００ｍｇ／日の範囲、例えば約１０ｍｇ／日〜約１００ｍｇ／日の範囲などの用量で静脈内投与する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
有効量の前記ニコチン酸、ニコチン酸前駆体またはニコチン酸のプロドラッグを経口投与する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＮＡＭＰＲＴｉ）を、前記ニコチン酸、ニコチン酸前駆体またはニコチン酸のプロドラッグの前に投与する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＮＡＭＰＲＴｉ）を、前記ニコチン酸、ニコチン酸前駆体またはニコチン酸のプロドラッグと同時に投与する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象に有効量のＤＮＡ傷害剤を投与することをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
i）有効量のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＮＡＭＰＲＴｉ）およびii）有効量のニコチン酸、ニコチン酸前駆体またはニコチン酸のプロドラッグによる連続または同時治療に応答する患者の選択におけるバイオマーカーとしてのニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）の使用。
【請求項１６】
有効量のニコチン酸、ニコチン酸前駆体またはニコチン酸のプロドラッグによる連続または同時治療の非存在下での有効量のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＮＡＭＰＲＴｉ）のよる治療が有効な患者の選択におけるバイオマーカーとしてのニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）の使用。
【請求項１７】
対象における癌の症状の治療または軽減のための薬物調製におけるニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＮＡＭＰＲＴｉ）の使用であって、前記治療が、
ａ）前記対象におけるニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）のレベルを決定する段階と、
ｂ）１）上記段階ａ）において決定されたように、ＮＡＰＲＴレベルが所定の閾値未満である場合、i）有効量のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＮＡＭＰＲＴｉ）およびii）有効量のニコチン酸、ニコチン酸前駆体もしくはニコチン酸のプロドラッグにより連続的もしくは同時に前記対象を治療する；または
２）上記段階ａ）において決定されたように、ＮＡＰＲＴレベルが所定の閾値以上である場合、有効量のニコチン酸、ニコチン酸前駆体もしくはニコチン酸のプロドラッグによる連続もしくは同時治療の非存在下で、i）有効量のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＮＡＭＰＲＴｉ）により前記対象を治療する段階
とを含む使用。
【請求項１８】
有効量の前記ＮＡＭＰＲＴｉによる対象における癌の治療において、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＮＡＭＰＲＴｉ）の副作用を軽減するための方法であって、
ａ）前記対象におけるニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）のレベルを決定する段階と、
ｂ）上記段階ａ）において決定されたように、ＮＡＰＲＴレベルが所定の閾値未満である場合、前記有効量のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＮＡＭＰＲＴｉ）による治療と連続的または同時に、有効量のニコチン酸、ニコチン酸前駆体またはニコチン酸のプロドラッグにより前記対象を治療する段階
とを含む方法。
【請求項１９】
前記副作用が、リンパ球および主要な腸細胞のような正常組織におけるものである、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＲＴ）阻害剤のような治療剤による癌治療の副作用の重症度を低下させるためにビタミンＰＰ化合物を投与することの有効性を予測するための方法において有用なバイオマーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＲＴ）の阻害はＮＦ−ｋＢの阻害を結果的に生じ、ＮＦ−ｋＢの阻害は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）の細胞内濃度の低下の結果である（Ｂｅａｕｐａｒｌａｎｔら（２００７）ＡＡＣＲ−ＮＣＩ−ＥＯＲＴＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２００７  Ｏｃｔ  ２２−２６  Ａｂｓｔｒａｃｔ  ｎｒ  Ａ８２；およびＲｏｕｌｓｏｎら（２００７）ＡＡＣＲ−ＮＣＩ−ＥＯＲＴＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２００７  Ｏｃｔ  ２２−２６  Ａｂｓｔｒａｃｔ  ｎｒ  Ａ８１）。腫瘍細胞は、ＤＮＡの修復、ゲノム安定性およびテロメア維持に必要な高いＡＤＰリボシル化活性により、ＮＡＭＰＲＴの発現が上昇しＮＡＤターンオーバーの速度が速いため、ＮＡＭＰＲＴ阻害に対する感受性が正常細胞よりも高くする。このことはまた、将来の臨床試験に本発明の化合物をＤＮＡ傷害剤と併用して使用することの論理的根拠を与える。
【０００３】
ＮＡＤ生合成の経路を図１に示す。
【０００４】
ＮＡＭＰＲＴはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）およびＮＡＤ（Ｐ）の生合成に関与する。ＮＡＤは哺乳動物細胞において、キノリン酸を介したトリプトファンから、ニコチン酸（ナイアシン）から、またはニコチンアミド（ナイアシンアミド）から出発する異なる３つの経路により合成され得る。
【０００５】
キノリン酸は、肝臓、腎臓および脳において見られる酵素キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ３を用いてホスホリボシルピロリン酸と反応し、ナイアシンモノヌクレオチドを形成する。
【０００６】
ニコチン酸（ナイアシン）は、様々な組織に広く分布する酵素ナイアシンホスホリボシルトランスフェラーゼ２を用いてＰＲＰＰと反応し、ナイアシンモノヌクレオチド（ｄＮＡＭ）を形成する。ニコチンアミド（ナイアシンアミド）は、同様に様々な組織に広く分布する酵素ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＲＴ）１を用いてＰＲＰＰと反応し、ナイアシンアミドモノヌクレオチド（ＮＡＭ）を生じる。
【０００７】
それに続くモノヌクレオチドへのアデノシン一リン酸付加により、対応するジヌクレオチドの形成が生じる：ナイアシンモノヌクレオチドおよびナイアシンアミドモノヌクレオチドはＡＴＰと反応して、それぞれナイアシンアデニンジヌクレオチド（ｄＮＡＤ）およびナイアシンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を形成する。２つの反応は異なる経路において生じるが、同じ酵素ＮＡＤピロホスホリラーゼ４により触媒される。
【０００８】
ナイアシンアデニンジヌクレオチド（ｄＮＡＤ）をナイアシンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）に変換するためには、さらなるアミド化段階が必要である。この反応を触媒する酵素はＮＡＤ合成酵素５である。ＮＡＤはナイアシンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤ（Ｐ））の直接の前駆体である。この反応はＮＡＤキナーゼにより触媒される。詳細に関しては、例えば、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ，第３版，Ｄｅｖｌｉｎ，Ｔ，Ｗｉｌｅｙ，Ｂｒｉｓｂａｎｅ  １９９２，ｐｐ．５２９−５７４のＣｏｒｙ  Ｊ．Ｇ．，Ｐｕｒｉｎｅ  ａｎｄ  ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍを参照されたい。
【０００９】
正常細胞は通常、ＮＡＤ（Ｐ）合成にナイアシンおよびナイアシンアミドの両前駆体、ならびに多くの場合、さらにトリプトファンまたはその代謝産物を利用することができる。したがって、マウスグリア細胞はナイアシン、ナイアシンアミドおよびキノリン酸を用いる（Ｇｒａｎｔら（１９９８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７０：１７５９−１７６３）。ヒトリンパ球はナイアシンおよびナイアシンアミドを用いる（Ｃａｒｓｏｎら（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：１９０４−１９０７；Ｂｅｒｇｅｒら（１９８２）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１３７；７９−８８）。ラット肝細胞はナイアシン、ナイアシンアミドおよびトリプトファンを用いる（Ｙａｍａｄａら（１９８３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｖｉｔ．Ｎｕｔｒ．Ｒｅｓ．５３：１８４−１２９１；Ｓｈｉｎら（１９９５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｖｉｔ．Ｎｕｔｒ．Ｒｅｓ．６５：１４３−１４６；Ｄｉｅｔｒｉｃｈ（１９７１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８Ｂ；１４４−１４９）。ヒト赤血球はナイアシンおよびナイアシンアミドを用いる（Ｒｏｃｃｈｉｇｉａｎｉら（１９９１）Ｐｕｒｉｎｅ  ａｎｄ  ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｍａｎ  ＶＩＩ  Ｐａｒｔ  Ｂ  ｅｄ．Ｈａｒｋｎｅｓｓら，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ｐｐ３３７−３４９０）。モルモットの白血球はナイアシンを用いる（Ｆｌｅｃｈｎｅｒら（１９７０），Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９：１５３−１６２）。
【００１０】
ＮＡＤ（Ｐ）は、細胞に不可欠な様々な生化学反応に関与し、またそのため徹底的に研究されてきた。腫瘍の発達および成長におけるＮＡＤ（Ｐ）の役割も研究されてきた。多くの腫瘍細胞が細胞内ＮＡＤ（Ｐ）合成にナイアシンアミドを利用することが見出されている。多くの正常な細胞型において代わりの前駆体を構成するナイアシンおよびトリプトファンは、腫瘍細胞においては利用され得ないか、または少なくとも細胞の生存に十分な程度までは利用され得ないと考えられている。ナイアシンアミド経路のみに存在する酵素（ＮＡＭＰＲＴなど）の選択的阻害は、腫瘍特異的薬物の選択のための方法を構成する。抗癌剤として臨床研究されてきたＮＡＭＰＲＴ阻害剤、すなわちＦＫ８６６／ＡＰＯ８６６（Ｈａｓｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｍａｉｎｄａ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６３（２１）：７４６３−７４４２を参照されたい）、ＣＨＳ８２８／ＧＭＸ１７７８およびそのプロドラッグＥＢ１６２７／ＧＭＸ１７７７（Ｈｊａｒｎａａら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５９；５７５１−５７５７；Ｂｉｎｄｅｒｕｐ，Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ  １５：２４９１−２４９４を参照されたい）がその例である。さらなるＮＡＭＰＲＴ阻害剤は、国際公開第２００６／０６６５８４号、同第２００３／０９７６０２号、同第２００３／０９７６０１号、同第２００２／０９４８１３号、同第２００２／０９４２６５号、同第２００２／０４２２６５号、同第２０００／６１５６１号、同第２０００／６１５５９号、同第１９９７／０４８６９５号、同第１９９７／０４８６９６号、同第１９９７／０４８３９７号、同第１９９９／０３１０６３号、同第１９９９／０３１０６０号および同第１９９９／０３１０８７号に見られる。
【００１１】
ＮＡＭＰＲＴ阻害剤の投与は胃腸毒性および骨髄抑制を伴う（Ｒａｖａｕｄら，Ｅｕｒ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４１：７０２−７０７；Ｈｏｖｓｔａｄｉｕｓら，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８：２８４３−２８５０；ＷＯ  １９９９／０５３９２０）。この毒性は至適用量以下のＮＡＭＰＲＴｉの使用、プロドラッグの使用および経口投与から静注投与への切替えにより、ある程度回避されてきた（Ｂｉｎｄｅｒｕｐら，Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ  １５：２４９１−２４９４）。この毒性は、主要なリンパ球および主要な腸細胞に対するＮＡＭＰＲＴｉ  ＡＰＯ８６６の細胞毒性効果を中和するビタミンＰＰ化合物により、かなり軽減され得る。残念ながら、ビタミンＰＰ化合物は白血病細胞に対するＮＡＭＰＲＴｉ  ＡＰＯ８６６の細胞毒性も中和し（国際公開第１９９９／０５３９２０を参照されたい）、またビタミンＰＰ化合物ニコチン酸は、ＮＡＭＰＲＴｉ投与の２４時間後にニコチン酸が投与されなければ、骨髄腫に対するＮＡＭＰＲＴｉ  ＧＭＸ１７７７の抗腫瘍効果を無効にする（Ｂｅａｕｐａｒｌａｎｔら，Ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇｓ  ２０［５］：３４６−３５４）。Ｂｅａｕｐａｒｌａｎｔらは、偶発的なＮＡＭＰＲＴｉの過剰投与の場合にニコチン酸が有用であり得ることを示唆している。
【００１２】
従来技術では、ＮＡＤ代謝における酵素の略記の使用において一致していない。誤解を避けるために、本明細書では以下の酵素を扱う：
【００１３】
【表１】
2012533530.tif 000003
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、腫瘍細胞のような標的細胞におけるＮＡＰＲＴ発現が、ビタミンＰＰ化合物、例えばニコチン酸、ニコチン酸前駆体、またはニコチン酸エステルのようなニコチン酸のプロドラッグなどによるＮＡＭＰＲＴ阻害剤に対する防御のマーカーとして作用することを示す。この発見は、ＮＡＭＰＲＴ阻害剤による治療前または治療中における対象の層別化の新たな手段をもたらした。選択されたビタミンＰＰ化合物、例えばニコチン酸、ニコチン酸前駆体またはニコチン酸のプロドラッグなど、および関連化合物を用いて、ＮＡＭＰＲＴ阻害剤の抗腫瘍活性を維持しながら、ＮＡＭＰＲＴ阻害剤の有害な副作用を軽減することができ；治療濃度域は、腫瘍のＮＡＰＲＴ発現が最も低いときに最も広い。
【００１５】
したがって、腫瘍のＮＡＰＲＴ発現が低い場合、有効量のＮＡＭＰＲＴ阻害剤とニコチン酸、ニコチン酸前駆体またはニコチン酸のプロドラッグを連続的または同時に投与することが有効であることが本発明者（ら）により見出された。
【００１６】
したがって、第一の態様では、本発明は対象における癌の症状を治療または軽減するための方法に関し、この方法は、ａ）前記対象におけるニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）のレベルを決定する段階；ならびにｂ）１）上記段階ａ）において決定されたように、ＮＡＰＲＴレベルが所定の閾値未満である場合、i）有効量のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＮＡＭＰＲＴｉ）およびii）有効量のニコチン酸、ニコチン酸前駆体もしくはニコチン酸のプロドラッグにより連続的もしくは同時に前記対象を治療する；または２）上記段階ａ）において決定されたように、ＮＡＰＲＴレベルが所定の閾値以上である場合、ii）有効量のニコチン酸、ニコチン酸前駆体もしくはニコチン酸のプロドラッグによる連続もしくは同時治療の非存在下で、i）有効量のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＮＡＭＰＲＴｉ）により前記対象を治療する段階を含む。
【００１７】
本発明はまた、i）有効量のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＮＡＭＰＲＴｉ）およびii）有効量のニコチン酸、ニコチン酸前駆体またはニコチン酸のプロドラッグによる連続または同時治療に応答する患者の選択におけるバイオマーカーとしてのニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）の使用、ならびに有効量のニコチン酸、ニコチン酸前駆体またはニコチン酸のプロドラッグによる連続または同時治療の非存在下での有効量のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＮＡＭＰＲＴｉ）による治療が有効な患者の選択におけるバイオマーカーとしてのニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）の使用に関する。
【００１８】
さらに本発明は、対象における癌の症状の治療または軽減のための薬物の調製におけるニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＮＡＭＰＲＴｉ）の使用に関し、この治療は、ａ）前記対象におけるニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）のレベルを決定する段階；ならびにｂ）１）上記段階ａ）において決定されたように、ＮＡＰＲＴレベルが所定の閾値未満である場合、i）有効量のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＮＡＭＰＲＴｉ）およびii）有効量のニコチン酸、ニコチン酸前駆体もしくはニコチン酸のプロドラッグにより連続的もしくは同時に前記対象を治療する；または２）上記段階ａ）において決定されたように、ＮＡＰＲＴレベルが所定の閾値以上である場合、有効量のニコチン酸、ニコチン酸前駆体もしくはニコチン酸のプロドラッグによる連続もしくは同時治療の非存在下で、i）有効量のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＮＡＭＰＲＴｉ）により前記対象を治療する段階を含む。
【００１９】
さらなる態様では、本発明は、有効量の前記ＮＡＭＰＲＴｉによる、対象における癌の治療において、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＮＡＭＰＲＴｉ）の副作用を軽減するための方法に関し、この方法は、ａ）前記対象におけるニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）のレベルを決定する段階；およびｂ）上記段階ａ）において決定されたように、ＮＡＰＲＴレベルが所定の閾値未満である場合、前記有効量のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＮＡＭＰＲＴｉ）による治療と連続的または同時に、有効量のニコチン酸、ニコチン酸前駆体またはニコチン酸のプロドラッグにより前記対象を治療する段階を含む。いくつかの実施形態では、副作用は、リンパ球および主要な腸細胞のような正常細胞におけるものである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＮＡＤ合成経路を示す図である（Ｂｉｅｄｅｒｍａｎｎ  Ｅら，国際公開第００／５０３９９号より）。
【図２】高用量のＡＰＯ８６６処置に対するマウスの累積生存率を示す図である。処置は６０ｍｇのＡＰＯ８６６を１日２回、４日間である。ＮＡ＝ニコチン酸。
【図３】４０ｍｇ／ｋｇのＡＰＯ８６６静注×２／日、４日間、±２０ｍｇ／ｋｇのニコチン酸（ＮＡ）経口×１／日、５日間で処置したマウスにおける、最終処置日の尾静脈血小板計数を示す図である（ＮＡ処置はＡＰＯ８６６処置の前日に開始）。比較のために媒体対照群を含めた。ｔ検定の結果を図に示す。
【図４】皮下Ａ２７８０異種移植片を有するマウスの累積生存率：各マウス個体の腫瘍が８００ｍｍ３のサイズに達するまでにかかった時間を示す図である。１５または５０ｍｇ／ｋｇ用量のＡＰＯ８６６×２／日を２回の週４日サイクルで、媒体経口または５０ｍｇ／ｋｇのニコチン酸（ＮＡ）と組み合わせて、マウスに腹腔内処置を行った。図の説明：各群を比較したログランク解析のｐ値が図示されている。
【図５】皮下ＭＬ−２異種移植片を有するマウスの累積生存率：各マウス個体の腫瘍が８００ｍｍ３のサイズに達するまでにかかった時間を示す図である。１５または５０ｍｇ／ｋｇ用量のＡＰＯ８６６×２／日を２回の週４日サイクルで、媒体経口または５０ｍｇ／ｋｇのニコチン酸（ＮＡ）と組み合わせて、マウスに腹腔内処置を行った。図の説明：各群を比較したログランク解析のｐ値が図示されている。
【図６】異なる癌細胞系におけるアクチンと比較したＮＡＰＲＴのｍＲＮＡ発現を示す図である。
【図７】培地に１ｍＭのニコチン酸を添加するまたは添加しないＣＨＳ−８２８処置の３日後にＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（登録商標）により測定した、卵巣癌細胞系Ａ２７８０における細胞生存能を示す図である。
【図８】培地に様々な濃度のニコチン酸を添加するまたは添加しない化合物１０５０処置の３日後にＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（登録商標）により測定した、結腸癌細胞系ＨＣＴ１１６における細胞生存能を示す図である。
【図９】培地に１ｍＭのニコチン酸を添加するまたは添加しない化合物１０５０処置の３日後にＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（登録商標）により測定した、小細胞肺癌細胞系ＮＹＨにおける細胞生存能を示す図である。
【図１０】ニコチン酸により防御された細胞系（ＭＬ−２、ＨＣＴ−１１６およびＡ４３１；それぞれ１、２および３）およびニコチン酸により防御されなかった細胞（Ａ２７８０、ＮＹＨおよびＰＣ−３；それぞれ４、５および６）におけるＮＡＰＲＴのタンパク質レベルを示す図である。
【図１１】ニコチン酸によりＮＡＭＰＲＴ阻害剤から防御された細胞および防御されなかった細胞を示す図である；ＰＣ−３ではＮＡＰＲＴに対して陽性反応性はない（図１１のＡおよびＣ）；ＨＣＴ−１１６細胞ではＮＡＰＲＴに対して強い反応性がある（図１１のＢおよびＤ）。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の方法
上で述べたように、本発明は特に、対象における癌の症状を治療または軽減するための方法に関し、この方法は、
ａ）前記対象におけるニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）のレベルを決定する段階と、
ｂ）１）上記段階ａ）において決定されたように、ＮＡＰＲＴレベルが所定の閾値未満である場合、i）有効量のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＮＡＭＰＲＴｉ）およびii）有効量のニコチン酸、ニコチン酸前駆体もしくはニコチン酸のプロドラッグにより連続的もしくは同時に前記対象を治療する；または
２）上記段階ａ）において決定されたように、ＮＡＰＲＴレベルが所定の閾値以上である場合、ii）有効量のニコチン酸、ニコチン酸前駆体もしくはニコチン酸のプロドラッグによる連続もしくは同時治療の非存在下で、i）有効量のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＮＡＭＰＲＴｉ）により前記対象を治療する段階と
を含む。
【００２２】
段階ａ）
本発明の方法の鍵となる段階は、問題となっている対象におけるニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＲＴ）のレベルを決定する段階である。本知見により、１）ＮＡＭＰＲＴ（ＮＡＭＰＲＴｉ）阻害剤とニコチン酸、ニコチン酸前駆体もしくはニコチン酸のプロドラッグ、特にニコチン酸もしくはそのプロドラッグによる併用療法、または２）ニコチン酸、ニコチン酸前駆体もしくはニコチン酸のプロドラッグの非存在下でのＮＡＭＰＲＴ（ＮＡＭＰＲＴｉ）阻害剤による処置の治療ための対象の層別化および／または選択が可能となる。
【００２３】
対象の層別化は、例えば、複数の患者、例えば少なくとも５人の患者、または少なくとも２０人の患者、または少なくとも５０人の患者からの医師によるデータにより設定される所定の閾値に基づく。
【００２４】
したがって、閾値設定の基礎を築くためには、まず、存在する患者のコホートからデータを確立または入手して、その腫瘍組織のＮＡＰＲＴレベルを決定する必要がある。腫瘍組織のＮＡＰＲＴレベルは、問題の組織において、ＮＡＰＲＴを直接測定するかまたはより間接的にＮＡＰＲＴレベルと関連する（または関連することが予想される）、数多くの方法の１つにより決定し得る。
【００２５】
参照するコホートは、腫瘍タイプ、年齢、性別または疾患の重症度の１つ以上、特に腫瘍タイプに一致することが望ましい。
【００２６】
しかし、一変形においては、ヒト母集団において腫瘍組織とは異なる組織タイプのＮＡＰＲＴレベルに基づいて閾値を設定し得る。これは、同様のまたは同一の患者であり得、または代わりに健常な対象であり得る。しかし、閾値は、問題の腫瘍組織と同じ腫瘍組織のような組織におけるＮＡＰＲＴレベルに基づいて設定し、同じ癌の兆候を有する複数の患者から入手することが好ましい。
【００２７】
（問題の患者の）問題の組織における、および閾値設定のためのＮＡＰＲＴレベルは、例えばＲＴ−ＰＣＲを用いて、ｍＲＮＡレベルで決定し得る。別の変形では、例えば抗体ベースのアプローチを用いて、より直接的にＮＡＰＲＴレベルを決定する。さらに、機能的酵素活性に基づいてＮＡＰＲＴレベルを決定し得る。腫瘍細胞におけるＮＡＰＲＴ活性の減少はいずれも、少ない酵素量、酵素の不活性変異体またはスプライスバリアントにより引き起こされ得るが、これは配列決定により検出することができる。このような方法は当業者に公知である。さらなる変形では、腫瘍におけるそのレベルがＮＡＰＲＴレベルと相関すると予想される、ナイアシンモノヌクレオチド（ｄＮＡＭ）およびナイアシンアデニンジヌクレオチド（ｄＮＡＤ）の一方または両方のレベルを決定することにより、ＮＡＰＲＴレベルを決定し得る。
【００２８】
いくつかの変形では、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）レベルを、例えばＲＴ−ＰＣＲなどによる、ＮＡＰＲＴをコードする核酸のレベルに基づいて決定する。
【００２９】
他の変形では、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）レベルを、例えばＮＡＰＲＴに対する特異的抗体またはその他の特異的結合パートナーに基づくアッセイなどによる、タンパク質のレベルに基づいて決定する。
【００３０】
ＮＡＰＲＴレベルは、対象の腫瘍組織または腫瘍細胞から直接的または間接的に決定し得ることが理解されるべきである。正確なＮＡＰＲＴレベルを決定するのに必要な腫瘍組織または細胞の量は、腫瘍もしくは腫瘍細胞の少量の試料から大量の試料、または代わりに腫瘍全体まで様々であり得、使用する特定のアッセイおよびその感度によって決まるが、これらはすべて当業者に公知である。いくつかの実施形態では、ＮＡＰＲＴレベルを、腫瘍もしくは腫瘍細胞内もしくはその付近の生物試料から、および／または対象の特定の腫瘍もしくは腫瘍細胞に応じて、腫瘍組織もしくは腫瘍細胞におけるＮＡＰＲＴレベルの指標となる他の生物試料、例えば血液、血清、尿、毛髪、唾液、皮膚、組織、血漿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、羊水、乳頭吸引液、痰、糞便、滑液、爪などから決定する。
【００３１】
発現レベルは通常、低値、中間値および高値の間に分布する。低値、中間値および高値であると判定されるものは、例えば、出生前診断で使用される生化学的マーカーと同様に、任意の特定の治療センターにより適用される基準によってある程度任意に指定されることが理解されるであろう。しかし、本発明に従って、新たな対象におけるＮＡＰＲＴの閾値レベルを決定し、収集されたデータと比較して予測または用量を確立する限り、このことによりこの方法の実施が妨げられることはない。
【００３２】
本発明の方法の大部分の実施形態では、ＮＡＰＲＴレベルを決定する段階の次に、対象とする対象における前記レベルを、患者のコホートにおいて決定されたように、値に基づき予め設定された閾値レベルと比較する段階がある。
【００３３】
比較の段階は歴史的なのデータに基づいて行われ得ること、また上記方法を実施するごとにそのコホートに対する決定を繰り返す必要はないことが理解されるであろう。
【００３４】
いくつかの実施形態では、閾値よりも低い値が、コホートの分布の下位３分の１、好ましくは下位４分の１の対象により表されるように、所定の閾値を設定する。
【００３５】
段階ｂ）
本発明の第二段階では、対象とする対象のＮＡＰＲＴレベルを所定の閾値と比較する。この比較により、ＮＡＭＰＲＴｉ治療の副作用の重症度を軽減するためにニコチン酸、ニコチン酸前駆体もしくはニコチン酸のプロドラッグ（例えば、ニコチン酸）を用いることが有効であるか否か（すなわち、レベルが閾値未満である場合）、またはニコチン酸、ニコチン酸前駆体もしくはニコチン酸のプロドラッグ（例えば、ニコチン酸）の非存在下でＮＡＭＰＲＴ阻害剤を、好ましくは低い初回用量で投与することが有効であるか否かを決定するための基準が与えられる。
【００３６】
後者の場合、治療の副作用をモニターすることが可能であり、かつ副作用を軽減するために、ＮＡＭＰＲＴｉ投与の２４時間以上後にニコチン酸、ニコチン酸前駆体またはニコチン酸のプロドラッグ（例えば、ニコチン酸）を使用することが可能である。
【００３７】
したがって、上記段階ａ）において決定されたように、ＮＡＰＲＴレベルが所定の閾値未満である場合、i）有効量のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＮＡＭＰＲＴｉ）およびii）有効量のニコチン酸、ニコチン酸前駆体またはニコチン酸のプロドラッグにより連続的または同時に前記対象を治療すること。
【００３８】
同様に、上記段階ａ）において決定されたように、ＮＡＰＲＴレベルが所定の閾値以上である場合、ii）有効量のニコチン酸、ニコチン酸前駆体またはニコチン酸のプロドラッグによる連続または同時治療の非存在下で、i）有効量のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＮＡＭＰＲＴｉ）により前記対象を治療すること。
【００３９】
一実施形態では、段階ｂ）２）における有効量のニコチン酸、ニコチン酸前駆体またはニコチン酸のプロドラッグによる連続または同時治療の非存在は、連続的であり、かつ治療の２４時間以内である。
【００４０】
別の実施形態では、有効量のニコチン酸、ニコチン酸前駆体またはニコチン酸のプロドラッグによる段階ｂ）における治療に続いて２４時間後に前記対象を治療する、上記請求項のいずれか１つによる方法。
【００４１】
治療法のいくつかの変形では、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＮＡＭＰＲＴｉ）を、前記ニコチン酸、ニコチン酸前駆体またはニコチン酸のプロドラッグの前に投与する。
【００４２】
治療法の他の変形では、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＮＡＭＰＲＴｉ）を、前記ニコチン酸、ニコチン酸前駆体またはニコチン酸のプロドラッグの投与と同時に投与する。
【００４３】
ＮＡＭＰＲＴ阻害剤
癌およびその他の疾患の治療での使用に適するＮＡＭＰＲＴ阻害剤は、当該技術分野で公知である。ＮＡＭＰＲＴの阻害剤の例は、国際公開第２００９／０８６８３５号、同第２００９／１５６４２１号、同第２０１０／０２３３０７号、同第２０１０／０６６７０９号、国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５８１０２号、国際公開第２００６／０６６５８４号、同第２００３／０９７６０２号、同第２００３／０９７６０１号、同第２００２／０９４８１３号、同第２００２／０９４２６５、同第２００２／０４２２６５号、同第２０００／６１５６１号、同第２０００／６１５５９号、同第１９９７／０４８６９５号、同第１９９７／０４８６９６号、同第１９９７／０４８３９７号、同第１９９９／０３１０６３号、同第１９９９／０３１０６０号および同第１９９９／０３１０８７号において見られる。
【００４４】
ＮＡＭＰＲＴ阻害剤の特に興味ある例は、以下のものを含む：
【００４５】
【化１】
2012533530.tif 000004
【化２】
2012533530.tif 000005
【００４６】
上記化合物またはその薬学的に許容される塩はすべて、本発明に従って使用し得る。
【００４７】
ニコチン酸、ニコチン酸前駆体およびニコチン酸のプロドラッグ
ＮＡＭＰＲＴ阻害剤の副作用を軽減するためのビタミンＰＰ化合物（ニコチン酸および誘導体を包含する）の使用は、国際公開第１９９９／５３９２０号において教示されている。この明細書に記載されている、ＮＡＭＰＲＴ阻害剤からの細胞の防御におけるＮＡＰＲＴの重要な役割の知見を考慮すれば、本発明は、ニコチン酸、ニコチン酸前駆体またはニコチン酸のプロドラッグ、例えばニコチン酸が使用される場合に特に適切であると思われる。
【００４８】
ニコチン酸（ナイアシン）
【化３】
2012533530.tif 000006
ニコチン酸のプロドラッグは当該技術分野で公知である。いくつかの例を以下に示す。
【００４９】
【化４】
2012533530.tif 000007
【００５０】
好適な実施形態では、ニコチン酸、ニコチン酸前駆体またはニコチン酸のプロドラッグはニコチン酸である。
【００５１】
腫瘍の治療
本発明は、任意の対象、特にヒトのような哺乳動物の治療に関する。この方法は、対象（特にヒト）が癌であると診断された場合、または対象が癌を有することが疑われる場合に特に適切であることが理解されるべきである。
【００５２】
最も典型的な実施形態では、癌は乳房、前立腺、肺、結腸、子宮頸部、卵巣、皮膚、ＣＮＳ、膀胱、膵臓、白血病およびリンパ腫の癌から選択される。
【００５３】
治療法は放射線療法をさらに含み得る。
【００５４】
本明細書に記載の癌治療は抗癌剤、好ましくはＮＡＭＰＲＴ阻害剤を必要とするが、この治療は、本明細書に記載の追加の治療剤、非治療剤または化学療法剤も含み得る。
【００５５】
ＮＡＭＰＲＴ阻害剤の使用を含む治療レジメンへの言及は、ＮＡＭＰＲＴ阻害剤と１つ以上の化学療法剤の使用からなる治療レジメンのみならず、ＮＡＭＰＲＴ阻害剤、本明細書に記載の１つ以上の化学療法剤および１つ以上の追加の治療剤または非治療剤の使用を含むレジメンも含む。
【００５６】
一実施形態では、治療法は、前記対象に有効量のＤＮＡ傷害剤を投与することをさらに含む。ＤＮＡ傷害剤の例は、例えばクラドリビン、ペントスタチン、メトトレキサート、トリメトレキサート、グルクロン酸塩、ペメトレキセド、トレオスルファン、ブスルファン、ダカルバジン、テモゾロミド、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、イホスファミド、メルファラン、チオテパ、メクロレタミン、カルムスチン、ベンダムスチン、フォテムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、カルボプラチン、シスプラチン、ロバプラチン、オキサリプラチン、ブレオマイシン、ヒドロキシウレア、アクチノマイシンＤ、アザシチジン、デシタビン、ネララビン、シタラビン、フルダラビン、クロファラビン、ボリノスタット、ゲムシタビン、５‐フルオロウラシル、カペシタビン、フロクスウリジン、ラルチトレキセド、ペメトレキセド、イリノテカン、トポテカン、アムルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、ミトキサントロン、テニポシド、バルルビシンおよびアロプリノールならびにそれらの薬学的に許容される塩から選択されるものである。
【００５７】
本明細書で使用される場合、治療への言及は、腫瘍細胞の殺作用または増殖阻害のための任意の治療を含む。これは、腫瘍の重症度を軽減することを意図した治療、例えば、腫瘍を治療することまたは腫瘍に関連した症状の軽減をもたらすことを意図した治療などを含む。それはまた、腫瘍が発達する危険性のある個人における腫瘍発達の防止または停止に向けた予防的治療も含む。例えば、治療は、微小転移が多過ぎて従来の手段では検出できなくなる前にそれらを撲滅することに向けられ得る。
【００５８】
上記のことを考慮して、本発明は、i）有効量のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＮＡＭＰＲＴｉ）およびii）有効量のニコチン酸、ニコチン酸前駆体またはニコチン酸のプロドラッグでの連続または同時治療に応答する患者の選択におけるバイオマーカーとしてのニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）の使用も提供する。
【００５９】
本発明はさらに、有効量のニコチン酸、ニコチン酸前駆体またはニコチン酸のプロドラッグによる連続または同時治療の非存在下での有効量のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＮＡＭＰＲＴｉ）による治療が有効な患者の選択におけるバイオマーカーとしてのニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）の使用を提供する。
【００６０】
さらに、本発明は、対象における癌の症状の治療または軽減のための薬物の調製におけるニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＮＡＭＰＲＴｉ）の使用を提供し、この治療は、
ａ）前記対象におけるニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）のレベルを決定する段階と、
ｂ）１）上記段階ａ）において決定されたように、ＮＡＰＲＴレベルが所定の閾値未満である場合、i）有効量のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＮＡＭＰＲＴｉ）およびii）有効量のニコチン酸、ニコチン酸前駆体もしくはニコチン酸のプロドラッグにより連続的もしくは同時に前記対象を治療する；または
２）上記段階ａ）において決定されたように、ＮＡＰＲＴレベルが所定の閾値以上である場合、有効量のニコチン酸、ニコチン酸前駆体もしくはニコチン酸のプロドラッグによる連続もしくは同時治療の非存在下で、i）有効量のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＮＡＭＰＲＴｉ）により前記対象を治療する段階と
を含む。
【００６１】
用量
一実施形態では、医薬組成物は各活性化合物の単位投与剤形である。このような実施形態では、各単位投与剤形は通常、０．１〜５００ｍｇ、例えば０．１〜２００ｍｇ、例えば０．１〜１００ｍｇなどの各化合物を含む。
【００６２】
より一般的には、各化合物は、１日に体重１ｋｇ当たり約０．１〜２５０ｍｇ、例えば１日に体重１ｋｇ当たり約０．５〜１００ｍｇなどの量で投与するのが好ましい。
【００６３】
いくつかの実施形態では、有効量のニコチン酸、ニコチン酸前駆体またはニコチン酸のプロドラッグを、約１ｍｇ／日〜約３，０００ｍｇ／日、例えば約１０ｍｇ／日〜約１，０００ｍｇ／日の範囲、例えば約１０ｇ／日〜約１００ｍｇ／日の範囲などの用量で静脈内に投与する。
【００６４】
いくつかの変形では、ニコチン酸、ニコチン酸前駆体またはニコチン酸のプロドラッグを経口投与する。
【００６５】
全身的使用のための経口投与に適合した組成物では通常、治療される疾患に応じて１用量当たり０．５ｍｇ〜１ｇの各化合物の用量を１日に１〜４回、１週間〜１２ヶ月間投与する。
【００６６】
疾患または状態を予防するための組成物の経口投与のための各化合物の用量は通常、１日に体重１ｋｇ当たり１ｍｇ〜１００ｍｇである。この用量を、疾患への曝露の１週間前から始めて曝露の４週間後までの期間に、毎日１回または２回投与し得る。
【００６７】
疾患予防のための直腸内使用に適合した組成物では、若干高い量、すなわち、１日に体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ〜１００ｍｇの各化合物が通常好ましい。
【００６８】
非経口投与では、１日に体重１ｋｇ当たり約０．１〜約１００ｍｇの各化合物の用量が好都合である。静脈内投与では、１日に体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜約２０ｍｇの各化合物の用量を１日〜３ヶ月間投与するが好都合である。関節内投与では、１日に体重１ｋｇ当たり約０．１１ｍｇ〜約５０ｍｇの各化合物の用量が通常好ましい。一般的な非経口投与では、各有効成分が０．５〜２％以上の水性媒体の溶液を用い得る。
【００６９】
皮膚への局所投与では、約１ｍｇ〜約５ｇの各化合物の用量を１日に１〜１０回、１週間〜１２ヶ月間投与するが通常好ましい。
【実施例】
【００７０】
材料および方法
細胞系：ＨＣＴ−１１６、ＭＬ−２、Ａ４３１、ＰＣ−３、Ｔ２４およびＡ２７８０をＡＴＣＣから入手した。ＮＹＨはＧＬＣ−２として既に記載されている（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９８５  Ｄｅｃ；４５（１２  Ｐｔ  ｌ）：６０２４−３３）。
【００７１】
クローン形成法：細胞を異なる濃度のＡＰＯ８６６と共に、１００μＭのニコチン酸を加えるかまたは加えずにインキュベートし、ヒツジ赤血球および増殖培地を含む半固体寒天基質上に播種した。３週間のインキュベーション期間後、コロニーを数え、対照（未処置）細胞に対する％生存率を計算した。異なる濃度のＡＰＯ８６６における生存率に基づき、ＩＣ５０値を計算した。
【００７２】
マウス実験：毒性および異種移植実験において、ＮＭＲＩマウスおよびヌードマウスをそれぞれ、１日１回、水中０．５％のＨＰＭＣまたは同じ媒体中のニコチン酸を経口で、３％ＨＰβＣＤを含むＰＢＳ／生理食塩水中のＡＰＯ８６６の１日２回の注射と組み合わせて処置した。マウスは２回の週４日サイクルで処置した。
【００７３】
異種移植実験では、ＰＢＳ／マトリゲル混合物中の１０７個の癌細胞を、胸腺欠損ヌードマウスに皮下注射した。腫瘍が成長し始めるまでマウスを毎日観察し、腫瘍体積が約１００ｍｍ３になったとき、上記のようにニコチン酸およびＡＰＯ８６６による処置を開始した。
【００７４】
ｍＲＮＡ定量化：細胞からのｍＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）標準プロトコールを用いて精製し、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によりｃＤＮＡを作製した。発現をアクチンおよびＮＡＰＲＴに対するプローブならびにＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて７５００  ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）で解析した。データをＰｅｉｒｓｏｎら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００３  ＪｕＩ  １５；３１（１４）：ｅ７３）により記載されている方法で解析した。
【００７５】
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（登録商標）発光細胞生存アッセイ：細胞を使用の２４時間前に不透明９６ウェルプレート中に播き（５，０００細胞／ウェル）、次いでニコチン酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を培地に添加するかまたは添加せずに、示された濃度で薬物と共に７２時間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（登録商標）アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造者の説明書に従って行い、生物発光を測定した。解析およびＩＣ５０値の決定をＰｒｉｚｍにより行った。
【００７６】
ウエスタンブロット解析
細胞を２０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＭＯＰＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、０，１％ＮＰ−４０、１０％グリセロールおよび１％Ｅｔｔａｎ（商標）プロテアーゼ阻害剤混合物（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含有する緩衝液中で、超音波処理を用いて溶解させた。タンパク質濃度をＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により製造者の説明書に従って決定した。ＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  ＢｉｓＴｒｉｓ（ＸＣｅＩＩ  ＳｕｒｅＬｏｃｋ（商標））システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））を用いて、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離しニトロセルロース膜にブロットした。ＮＡＰＲＴ一次抗体（ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈ  Ｇｒｏｕｐ、＃１３５４９−１−ＡＰ）を１：５００の希釈で、次いで抗ウサギＨＲＰコンジュゲート抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を１：５０００の希釈で用いた。ＨＲＰコンジュゲートＧＡＰＤＨヤギ−抗体をＳａｎｔａＣｒｕｚ（登録商標）から購入し、１：２０００の希釈で用いた。ＨＲＰコンジュゲート抗体の検出をＥＣＬ  Ｐｌｕｓ（登録商標）Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ａｇｅｎｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）により行った。
【００７７】
免疫組織化学解析
ホルマリン固定およびパラフィン包埋の前に、血漿およびトロンビンを用いて細胞ペレットを凝集させた。熱によるＮＡＰＲＴのエピトープ回復のためにクエン酸溶液（ｐＨ６）を用いた。３％Ｈ２Ｏ２溶液を加えて、内因性のペルオキシダーゼ活性をブロックした。一次抗体添加の前にスライドを１％ＢＳＡ中でプレインキュベートした（インキュベーション：１時間、室温、１：５００）。検出のために、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（登録商標）（ＤＡＫＯ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ、Ｋ４０１１）抗ウサギおよびジアミノベンジジン／ＤＡＢ＋（ＤＡＫＯ、Ｋ３４６８）を加えた。最後に、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリンを用いてスライドを対比染色した。反応性（赤褐色）と非反応性（青色）を白黒で区別し視覚化するために、ＰｈｏｔｏＳｈｏｐ  ＣＳ３（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）での「白黒」調整を、「ハイコントラストブルーフィルター」（プリセット設定：赤、黄および緑：−５０％、シアン、青およびマゼンタ：１５０％）を一律に用いて、帯赤色が帯青色に比べて暗く染色されるように行った。
【００７８】
マウスにおける最大耐量のＡＰＯ８６６に対するニコチン酸の効果
Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＡＰＯ８６６の最大耐量（ＭＴＤ）は１５ｍｇ／ｋｇで１日２回である（データ不掲載）。本発明者らは、ニコチン酸経口投与がどの程度までマウスをＡＰＯ８６６による死から防御し得るかを調べた。本発明者らは、マウスに６０ｍｇ／ｋｇのＡＰＯ８６６を１日２回、４日間連続で、５０ｍｇ／（ｋｇ・日）のニコチン酸と併用して経口処置し、また対照群には経口による媒体のみを投与した。図２からわかるように、対照マウスの大部分が３日目および４日目に死亡した。しかし、最初の中毒を生き延びた場合、マウスは回復する（７匹中、１匹）。それに比べて、ニコチン酸で処置した群のマウスはすべて、実験を終了する２６日目までＡＰＯ８６６投与を生き延びた。本発明者らは、血小板計数に対するニコチン酸レスキューの効果を調べた（図３）。本発明者らは、ＡＰＯ８６６処置における血小板計数が、対照に比べてニコチン酸投与群において有意に改善されることを見出した。
【００７９】
インビトロでのＡＰＯ８６６に対するニコチン酸による防御
増殖培地へのニコチン酸の添加は、代替経路によりニコチンアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を合成することで、ＡＰＯ８６６を含めたニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＲＴ）阻害剤の細胞毒性効果から防御し得る。癌細胞系であるＨＥＰＧ２は、ＮＡＤ合成にニコチン酸を利用できないことが示されている（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００３  Ｎｏｖ  １；６３（２１）：７４３６−４２）。本発明者らは、異なる起源の細胞系のパネルにおいて、ＡＰＯ８６６誘導性細胞死からのニコチン酸の防御効果を調べた。細胞系は、ＡＰＯ８６６に対して１〜１３ｎＭの間のＩＣ５０値で感受性であった。本発明者らは、クローン形成法においてＡＰＯ８６６による継続処置を用いた。２つの細胞系Ａ２７８０およびＮＹＨは、１００μＭのニコチン酸を含有する培地中でインキュベートした場合、ＡＰＯ８６６から防御されなかった（表１）。ＭＬ−２、ＨＣＴ−１１６およびＡ４３１細胞は、ニコチン酸含有培地において、標準培地に比べて４０〜９０倍を超えるＩＣ５０値の増加を示している。培地への１００μＭのニコチン酸の添加それ自体は、細胞生存率への影響がなかった（データ不掲載）。
【００８０】
Ａ２７８０およびＭＬ−２異種移植のＡＰＯ８６６処置に対するニコチン酸の防御効果
本発明者らは、Ａ２７８０およびＭＬ−２細胞の異種移植腫瘍を有するヌードマウスに対するニコチン酸のインビボレスキュー効果を調べた。ＡＰＯ８６６を１日２回、週４日のサイクルで２週間、腫瘍が１００ｍｍ３のサイズに到達した時点から始めて投与した。Ａ２７８０異種移植に対して１５ｍｇ／ｋｇのＭＴＤ用量のＡＰＯ８６６を腹腔内に処置することにより、対照群に比べ、５０％の生存期間（％ＩＬＳ−８００ｍｍ３の腫瘍サイズまで）増加が得られた（図４）。これに比べて、５０ｍｇ／ｋｇの腹腔内ＡＰＯ８６６と５０ｍｇ／ｋｇの経口ニコチン酸による併用処置では、１８０の％ＩＬＳ増加が得られた。興味深いことに、Ａ２７８０細胞はニコチン酸を利用することができないが、本発明者らは、５０ｍｇ／ｋｇのニコチン酸が１５ｍｇ／ｋｇの低用量ＡＰＯ８６６の抗増殖性効果を打ち消すことを見出した。実験期間中、群間での体重の有意な差はなかった（データ不掲載）。ＡＰＯ８６６のみによるＭＬ−２異種移植の処置は非常に効果的であり、１０日目より前に腫瘍が完全に除去された（図５）。ニコチン酸を共投与した場合、同じＡＰＯ８６６用量の抗増殖性効果は部分的に打ち消され、大部分の腫瘍が存続する。１５ｍｇ／ｋｇのＡＰＯ８６６とニコチン酸の組合せを投与したマウスにおける生存率は、対照と有意な差がなく（ｐ＝０．１４）、ＡＰＯ８６６の用量を５０ｍｇ／ｋｇまで増加させ、ニコチン酸と併用しても、腫瘍サイズに対する効果はこの群に比べて有意に改善されることはない（ｐ＝０．９７）。しかし、ＡＰＯ８６６とニコチン酸による５０ｍｇ／ｋｇの処置は、未処置対照と比べて腫瘍成長を減少させた（ｐ＝０．００２）。実験群間において、体重変化における全体的な差は見られなかった（データ不掲載）。
【００８１】
癌細胞における多様なＮＡＭＰＲＴ阻害剤のニコチン酸レスキュー
本発明者らは、上記所見がＮＡＭＰＲＴｉに一般的に適用可能であって、ＡＰＯ８６６に特異的ではないことを示すために、様々なＮＡＭＰＲＴ阻害剤で処置した腫瘍細胞に対するニコチン酸のインビトロレスキュー効果を調べた。図７に示す結果は、卵巣癌細胞系Ａ２７８０が、ニコチン酸によりＮＡＭＰＲＴ阻害剤ＣＨＳ８２８の細胞毒性からわずかにレスキューされることを示している。このことは、表１にまとめたＡＰＯ８６６で処置したＡ２７８０の結果と一致している。図８および９の結果は、ニコチン酸がＮＡＭＰＲＴ阻害剤である化合物１０５０による処置からＨＣＴ１１６結腸癌細胞をレスキューし得るが、ＮＹＨ小細胞肺癌細胞は同じようには防御されないことを示している。このことも同様に、表１に示す上記細胞系におけるＡＰＯ８６６の結果と一致している。
【００８２】
表１．ニコチン酸によるＡＰＯ８６６からのインビトロ防御を示す。レスキュー効果はＡＰＯ８６６処置に対するＩＣ５０の３９倍超の増加として定義される。レスキュー効果なしは２倍未満のＩＣ５０増加として定義される。ＮＡ＝ニコチン酸。
【表２】
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【００８３】
ＮＡＰＲＴ発現は癌細胞におけるニコチン酸レスキュー用のマーカーである
ＡＰＯ８６６細胞毒性からのニコチン酸レスキューに対する論理的根拠は、基質としてニコチン酸を有する代替ＮＡＤ合成経路の利用である。この経路の最初の段階は、酵素ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）により触媒される。本発明者らは、癌細胞系のパネルにおいてＮＡＰＲＴのｍＲＮＡ発現を調べた。本発明者らは、ＮＡＰＲＴの発現が、ニコチン酸によりレスキューされる細胞系において最も高く、ＡＰＯ８６６から防御されない細胞系において最も低いことを見出す（図6）。ＭＬ−２細胞における発現は、Ａ２７８０細胞において見られる発現よりも２４倍高い。
【００８４】
ニコチン酸を利用しない細胞はタンパク質レベルでＮＡＰＲＴを発現しない
ＮＡＭＰＲＴ阻害剤に対する防御のためにニコチン酸を利用する能力を有する細胞系または有さない細胞系を同定した後、本発明者らは、ニコチン酸からのＮＡＤ合成における律速段階であるタンパク質レベルのＮＡＰＲＴを調べた。注目すべきことに、本発明者らは、ＰＣ−３細胞では、ＡＰＯ８６６に対するＬＤ５０値がニコチン酸により影響されないことを見出した（ニコチン酸（１００μＭ）なしで４．８±３．０ｎＭ、有りで５．５±１．４ｎＭ）。本発明者らは、ニコチン酸により防御される細胞系（ＭＬ−２、ＨＣＴ−１１６およびＡ４３１）ではＮＡＰＲＴが発現されるのに対し、ニコチン酸により防御されない細胞（Ａ２７８０、ＮＹＨおよびＰＣ−３）では検出可能なＮＡＰＲＴタンパク質が存在しないことを見出した（図１０）。さらに、本発明者らは、この違いが免疫組織化学により観察可能か否かを調べた。本発明者らは、ＮＡＰＲＴに対して、ＰＣ−３細胞（図１１のＡおよびＣ）では陽性反応性が見られないのに対し、ＨＣＴ−１１６細胞（図１１のＢおよびＤ）では強い反応性が見られることを見出した。したがって、ニコチン酸によりＮＡＭＰＲＴ阻害剤から防御される細胞と防御されない細胞は、ウエスタンブロット法および免疫組織化学を用いて、ＮＡＰＲＴの発現レベルにより明確に区別することができる。
【００８５】
腫瘍細胞に対するＡＰＯ８６６の細胞毒性効果は、細胞ＮＡＤレベルの減少に起因する。本発明者らは、マウスにおいて、ニコチン酸の添加による代替ＮＡＤ合成経路の活性化がインビボで副作用および死亡から防御し得るか否かを調べた。ニコチン酸はマウスにおいて、ＡＰＯ８６６と同じ日に投与した場合、通常のＭＴＤの４倍のＡＰＯ８６６でも死亡から防御する。副作用の主要なマーカーである血小板減少症も改善される。この点において、偶発的な過剰投与により引き起こされるＡＰＯ８６６中毒に対する解毒剤としてニコチン酸を使用することができる。このことはＮＡＭＰＲＴ阻害剤ＧＭＸ１７７７に関しても既に見出されており、ニコチン酸の防御効果がＮＡＭＰＲＴ阻害剤に対して一般的に有効であることを示している（Ｂｅａｕｐａｒｌａｎｔら，Ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇｓ  ２０［５］：３４６−３５４）。またこれらの結果は、ＡＰＯ８６６の用量制限毒性が標的特異的であることも示している。これにより、ＡＰＯ８６６が併用治療に適したものとなり得る。
【００８６】
ＡＰＯ８６６の作用機序が発見されたとき、ＨＥＰＧ２細胞によるニコチン酸の防御効果の欠如は、驚くべきことではあるが、稀な例であると認識された。しかし、本発明者らは意外にも、癌細胞系の広範なパネルにおいて、ニコチン酸を利用してＮＡＤを合成し、ＮＡＭＰＲＴ阻害剤から防御する能力は、６０％の細胞系においてのみ見られることを見出す。このことは、ニコチン酸と併用処置した場合、ＡＰＯ８６６を通常のＭＴＤよりも４倍高い用量で使用し得るという事実を利用する可能性も開く。本発明者らは、ニコチン酸と高用量のＡＰＯ８６６で併用処置した場合、Ａ２７８０異種移植マウスにおいて％ＩＬＳが劇的に増加することを示している。このことは、ニコチン酸を利用することができない腫瘍におけるより優れた治療の機会を示している。低濃度のＡＰＯ８６６において、ニコチン酸はＡ２８７０細胞がそれを利用できなくてもいくらかの防御を示すことは注目すべきことである。これは、ニコチン酸のニコチンアミドおよびニコチンアミドモノヌクレオチドへの局所的または全身的な変換が、これらの代謝産物の循環血中濃度を、ＡＰＯ８６６処置を阻害するのに十分なだけ増加させることに起因し得る。本発明者らはまた、ＭＬ−２の異種移植において、ニコチン酸との併用処置がＡＰＯ８６６の抗増殖性効果を完全に無効にすることも示している。このことは高濃度のＡＰＯ８６６においても見られる。このことは、ニコチン酸による防御のマーカーの必要性を強調している。論理的には、細胞がニコチン酸を利用する能力は、ＮＡＤ合成に関与する酵素の発現レベルに起因し得る。ＮＡＰＲＴは、ニコチン酸からのＮＡＤ合成の第一段階であり、この酵素はＡＰＯ８６６により阻害されない。本発明者らは、ｍＲＮＡレベルでのＮＡＰＲＴ発現がニコチン酸による防御と相関することを見出した。本発明者らは、ＮＡＰＲＴの発現が高用量のＡＰＯ８６６とニコチン酸による併用治療に適した癌の同定のためのマーカーであることを提唱する。このことは腫瘍組織または生検におけるＮＡＰＲＴのｍＲＮＡ発現の検出に由来し得る。さらに、ニコチン酸を利用しない腫瘍を同定するための代替法としての免疫組織化学、ＥＬＩＳＡまたはその他の抗体ベースの検出法によりタンパク質レベルを検出し得る。同時に、ニコチン酸によるＡＰＯ８６６の用量耐性の増加、ならびにニコチン酸によりＡＰＯ８６６およびその他のＮＡＭＰＲＴ阻害剤から防御されない腫瘍の同定の可能性は、層別化された癌患者サブグループにおけるＮＡＭＰＲＴ阻害剤治療の可能性を高め得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【国際調査報告】
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