【手続補正書】
【提出日】令和2年9月28日(2020.9.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
【図１】図１は、Ｅ１３．３およびＰＬ−Ｌ１−ＧＲペプチドなどの２つの標的化分子（黒丸および四角）およびＴｏｘ１および／またはＴｏｘ２などの毒素（白丸）が搭載される多アーム型ＰＥＧ複合体の模式的な構造を示す。
【図２】図２は、２つの異なるインキュベート時間１．５分および３０分（ＴＢ２−Ｔｏｘ２、ＧＷ−Ｔｏｘ１）でのｅＥＦ２またはＢＳＡへのいくつかのペプチド（毒素）の結合を表すＥＬＩＳＡ実験の結果を示す。
【図３】図３は、インビトロ転写／翻訳系で試験したいくつかのペプチド（毒素）の活性の結果を示す（ＴＢ２−Ｔｏｘ２、ＧＷ−Ｔｏｘ１、ＧＲ−非ｅＥＦ２−結合対照）。
【図４】図４〜７は、Ａ４３１およびＭＣＦ−７細胞に対するＰＥＧ−Ｅ１３．３−毒素コンストラクトの効果を示す。対照（処置なし）：図４Ａおよび４Ｂ：それぞれＴ＝０および４８ｈでのＡ４３１細胞；図４Ｃおよび４Ｄ：それぞれＴ＝０および４８ｈでのＭＣＳ−７細胞。
【図５】図５は、様々な濃度でのＡ４３１細胞に対するＰＥＧ−Ｅ１３．３−ＢＩＭ（図５Ａ〜Ｃ）コンストラクトおよびＰＥＧ−Ｅ１３．３−Ｔｏｘ１−Ｔｏｘ２（図５Ｄ〜５Ｆ）の効果を示す：１μＭ（図５Ａおよび５Ｄ）、３μＭ（図５Ｂおよび５Ｅ）および８μＭ（図５Ｃおよび５Ｆ）。写真は処置の４８時間後に撮影した。
【図６】図６は、様々な濃度でのＭＣＦ−７細胞に対するＰＥＧ−Ｅ１３．３−ＢＩＭ（図６Ａ〜Ｃ）コンストラクトおよびＰＥＧ−Ｅ１３．３−Ｔｏｘ１−Ｔｏｘ２（図６Ｄ〜６Ｆ）の効果を示す：１μＭ（図６Ａおよび６Ｄ）、３μＭ（図６Ｂおよび６Ｅ）および８μＭ（図６Ｃおよび６Ｆ）。写真は処置の４８時間後に撮影した。
【図７】図７は、様々な濃度でのＰＥＧ−ＢＩＭ（Ｅ１３．３なし）の複合体でのＡ４３１細胞（図７Ａ〜７Ｃ）およびＭＣＦ−７（図７Ｄ〜７Ｆ）の処理を示す：１μＭ（図７Ａおよび６Ｄ）、３μＭ（図７Ｂおよび７Ｅ）および８μＭ（図７Ｃおよび７Ｆ）。写真は処置の４８時間後に撮影した。
【図８】図８は、様々な濃度での、様々なコンストラクト：ＰＥＧ−ＢＩＭ（図８Ｂ〜Ｄ）、ＰＥＧ−Ｅ１３．３−ＢＩＭ（図８Ｅ〜Ｇ）、ＰＥＧ−ＰＤ−Ｌ１−ＧＲ−ＢＩＭ（図８Ｈ〜Ｊ）およびＰＥＧ−ＰＤ−Ｌ１  ＧＲ−Ｅ１３．３−ＢＩＭ（図８Ｋ〜Ｍ）でのＡ４３１細胞の処理の効果を示す：１０ｎＭ（図８Ｂ、８Ｅ、８Ｈおよび８Ｋ）、１００ｎＭ（図８Ｃ、８Ｆ、８Ｉおよび８Ｌ）および１μＭ（図８Ｄ、８Ｇ、８Ｊおよび８Ｍ）。図８Ａは対照である。写真は処置の４８時間後に撮影した。
【図９】図９は、ＰＥＧ−Ｅ１３．３−（ＰＤ−Ｌ１−ＧＲ）−Ｔｏｘ１−Ｔｏｘ２：３および１０μＭ（それぞれ図９Ｃおよび９Ｄ）またはＰＥＧ−Ｅ１３．３−（ＰＤ−Ｌ１−ＧＲ）−ＢＩＭ  １０μＭでのＡ−５４９細胞の処置の効果を示す。図９Ａ（Ｔ＝０）および９Ｂ（Ｔ＝４８ｈ）は対照として使用する。図９Ｂ〜９Ｄは、処置の４８時間後に撮影した。
【図１０】図１０は、選択されたペプチドの、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓで染色した電気泳動ゲルを示す：レーン（左から右）：１−Ｅ７．１；２−Ｅ１０．２；３−Ｅ１３．３；４−Ｅ１４．１．１；５−Ｅ１４．１．４；６−Ｅ２３Ｉ３；７−Ｅ２３Ｉ５；８−Ｅ１５．１．３−Ｔ；９−Ａ４．３．１２−Ｔ；１０−タンパク質マーカー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）。
【図１１】図１１は、ＥＧＦＲの自己リン酸化を測定することによる選択ペプチドの阻害分析の正規化した結果を示す。
【図１２】図１２は、様々な期間の間ウシ血清中でインキュベートした選択ペプチドの安定性の測定についての結果を示す。
【図１３】図１３は、様々な濃度での選択ペプチドの阻害活性の評価の結果を示す（図１３Ａは全体図であり、図１３ＢはＥ１３．３のみを示す）。
【図１４】図１４は、Ｅ１３．３ペプチドの単独でのまたは８本アーム型ＰＥＧとの複合体でのインビボ安定性を示す。
【図１５】図１５は、２つの癌細胞株の生存能に対するＥ１３．３の効果を示す。
【図１６】図１６は、マウスでの腎臓、肝臓および腫瘍におけるＥ１３．３−ＰＥＧ複合体の蓄積を示す。
【図１７】図１７は、蛍光マークしたＥ１３．３−ＰＥＧ複合体のＩＶ注射から１時間（左パネル）および２４時間（右パネル）後の、マウス中の腫瘍から単離された癌細胞の写真を示す。
【図１８】図１８は、対照としてＰＢＳを用いた（１８Ａ）、１μＭのＰＥＧ−Ｅ１３．３−ＢＩＭ（１８Ｂ）、ＰＥＧ−（ＰＤ−Ｌ１−ＧＲ）−ＢＩＭ（１８Ｃ）およびＰＥＧ−Ｅ１３．３−（ＰＤ−Ｌ１−ＧＲ）−ＢＩＭ（１８Ｄ）でのＡ−５４９細胞の処置の効果を示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３９】
１．５ｍＬチューブに、１００μＬのブロッキング溶液＋次のペプチド：ｅＥＦ２−結合：ＲＢ、ＬＢＲｌ、ＴＢ２（Ｔｏｘ２）、ＹＯ２、ＧＷ（Ｔｏｘ１）、ＤＲＢ、ＰＹ、ＢＷを発現する１０９ｐｆｕ（プラーク形成単位）のＭ１３ファージを添加した。プレートを２５℃で１時間インキュベートした。溶液を廃棄し、２８０μＬの洗浄溶液（Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０５％）でウェルを７回洗浄した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４１】
プレートを、１．５分間および３０分間のインキュベート時間後にスキャナーを使用して写真撮影した。図２から、Ｔｏｘ２（図面中でＴＢ２として示される）が最強の効果を有したことが分かり得る。
【手続補正４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの異なる細胞外腫瘍抗原に結合する少なくとも２つの異なるペプチドと、少なくとも１つの毒素と、を含むコンストラクトであって、前記ペプチドおよび前記毒素が直接共有結合しているかまたは担体を介して共有結合しており、前記コンストラクトが前記ペプチドの少なくとも１つまたは前記毒素を複数コピー含む、コンストラクト。
【請求項２】
前記ペプチドの少なくとも１つが、ヒト上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）およびヒトプログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）から選択される細胞外腫瘍抗原に特異的に結合し、前記少なくとも２つのペプチドの別の１つが、ＥＧＦＲ、ＰＤ−Ｌ１、ＨＥＲ２、アンドロゲン受容体、ベンゾジアゼピン受容体、カドヘリン、ＣＸＣＲ４、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２、ＣＤ１９、エンドセリン受容体、ＥＲＢＢ４、ＦＧＦＲ、葉酸受容体、ＨＥＲ４、ＨＧＦＲ、ムチン１、ＯＧＦＲ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤＧＦＲ、およびＶＥＧＦＲからなる群から選択される細胞外腫瘍抗原に特異的に結合する、請求項１に記載のコンストラクト。
【請求項３】
前記ペプチドのそれぞれが、５〜３０個または１０〜２５個のアミノ酸残基からなる、請求項１〜２の何れか１項に記載のコンストラクト。
【請求項４】
前記コンストラクトが、３〜１０個の異なるペプチドまたは２〜１０個の異なる毒素を含む、請求項１〜３の何れか１項に記載のコンストラクト。
【請求項５】
前記ペプチドの１つが、ＥＧＦＲに特異的に結合しかつ前記ペプチドの１つが、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する、請求項１〜５の何れか１項に記載のコンストラクト。
【請求項６】
ＥＧＦＲに特異的に結合するペプチドが、配列番号１を有するペプチドまたはその類似体であり、かつＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するペプチドが、配列番号２を有するペプチドまたはその類似体である、請求項５に記載のコンストラクト。
【請求項７】
前記少なくとも１つの毒素が、真核細胞伸長因子２に特異的に結合する毒素、配列番号５のＢＩＭ−ＢＨ３、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素、炭疽毒素、ボツリヌス毒素、リシン、ＰＡＰ、サポリン、ゲロニン、モモルジン、ＰｒｏＴｘ−Ｉ  ＰｒｏＴｘ−ＩＩ、コヌス・カリフォルニクス（Ｃｏｎｕｓ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｓ）毒素、ヘビ毒毒素、およびシアノトキシンからなる群から選択される、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質である、請求項１〜６の何れか１項に記載のコンストラクト。
【請求項８】
前記少なくとも１つの毒素が、配列番号３、４および５から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のコンストラクト。
【請求項９】
配列番号３を有する毒素を複数コピー含み、配列番号４を有する毒素を複数コピー含む、請求項８に記載のコンストラクト。
【請求項１０】
配列番号１を有するペプチドまたはその類似体を少なくとも１コピー含み、配列番号２を有するペプチドまたはその類似体を少なくとも１コピー含み、配列番号３、４および５から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの毒素を含む、請求項１に記載のコンストラクト。
【請求項１１】
前記ペプチドの少なくとも１つまたは毒素が、有機足場担体を介して共有結合している、請求項１〜１０の何れか１項に記載のコンストラクト。
【請求項１２】
前記有機足場が、前記ペプチドおよび前記毒素を結合するために利用可能な部位を複数含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子または修飾ＰＥＧ分子を含む、請求項１１に記載のコンストラクト。
【請求項１３】
前記コンストラクトが、複数コピーの（ｉ）配列番号１を有するペプチド、（ｉｉ）配列番号２を有するペプチド、（ｉｉｉ）配列番号３を有する毒素および（ｉｖ）配列番号４を有する毒素を含み、前記ペプチドのそれぞれ１つおよび前記毒素が、前記足場に結合している、請求項１２に記載のコンストラクト。
【請求項１４】
前記ペプチドの少なくとも１つまたは前記毒素の少なくとも１つが、リンカーまたはスペーサーを介して前記足場に連結されている、請求項１１〜１３の何れか１項に記載のコンストラクト。
【請求項１５】
請求項１〜１４の何れか１項に記載のコンストラクトと、薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む医薬組成物。
【請求項１６】
癌の処置における使用のための、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
ヒト真核細胞伸長因子２（ｅＥＦ２）に特異的に結合するペプチドであって、配列番号３、配列番号４から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド、前記ペプチドに対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の配列同一性を有するその類似体、または前記ペプチドもしくはその類似体の環状形態。
【請求項１８】
細胞死の誘導における使用のための、請求項１７に記載のペプチド。
【請求項１９】
ヒト上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）およびヒトプログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）から選択される細胞外腫瘍抗原に特異的に結合するペプチドであって、配列番号１および配列番号２から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド、前記ペプチドに対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の配列同一性を有する前記ペプチドの類似体、または前記ペプチドもしくは前記類似体の環状形態。
【請求項２０】
癌細胞への標的化における使用のための、請求項１９に記載のペプチド。
【請求項２１】
少なくとも１つの請求項１７〜２０の何れか１項に記載のペプチドを含む、抱合体。
【請求項２２】
複数の請求項１７〜２０の何れか１項に記載のペプチドまたは請求項２１に記載の抱合体と、薬学的に許容可能な担体と、を含む医薬組成物。
【請求項２３】
癌の処置における使用のための、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
請求項１７〜２０の何れか１項に記載のペプチドをコードする核酸配列を含む、単離ポリヌクレオチドまたはその核酸コンストラクト。
【請求項２５】
（ｉ）少なくとも１コピーの配列番号１；（ｉｉ）少なくとも１コピーの配列番号２；（ｉｉｉ）少なくとも１コピーの、配列番号３、配列番号４およびそれらの組み合わせから選択される配列；を含むポリペプチドをコードする配列を含む、単離ポリヌクレオチド。