【手続補正書】
【提出日】令和2年1月23日(2020.1.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の部分が多成分のTCR ORF再構成及び操作システム(TORES)であり、第２の部分が多成分の操作TCR提示細胞システム(eTPCS)であり、
TORESが、２つの別々の成分を含み、第１の成分1Aが、可変及び定常(Ｖ-Ｃ)Ｔ細胞受容体(TCR)遺伝子セグメントを有するベクターであり、第２の成分1Bが、連結(Ｊ)TCR遺伝子セグメントを有するベクターであり、
TORESが、
ａ．天然型TCR鎖
ｂ．配列が多様化されたTCR鎖
ｃ．合成TCR鎖
から選択される被分析物TCR ORFを各々コードする１以上の遺伝子組込みベクターである成分2C及び/又は2Eをもたらすように働き、
eTPCSが、成分2Aと呼ばれる第１の成分であるeTPCを含み、
成分2Aが、
ａ．TCRアルファ、ベータ、デルタ及びガンマ鎖の内因性発現を欠き、
ｂ．細胞がTCR鎖の相補対を発現する場合にのみ該細胞の表面で条件的に提示されるCD3タンパク質を発現し、
ｃ．各々が１つの被分析物TCRアルファ、ベータ、デルタ又はガンマ鎖をコードする単一ORFの組込みのためのゲノム受容部位である2B及び2Dと呼ばれる更なる成分を含み、
ゲノム受容部位2B及び2Dが、各々
ａ．リコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)のために設計された合成構築物
ｂ．部位特異的相同組換えのために設計された合成構築物
から選択され、
成分2C及び2Eが、それぞれ成分2B及び2Dにマッチしており、成分2C及び2Eが、１つの被分析物TCRアルファ、ベータ、デルタ及び/又はガンマ鎖をコードする単一ORFを送達するように設計され、2C及び/又は2Eが、所望により、組込みの選択マーカーをコードし、被分析物TCR鎖が、成分2Aに、CD3と複合体化したTCR表面タンパク質(TCRsp)として発現され得る、二部分装置。
【請求項２】
１以上の遺伝子組込みベクターである成分2C及び/又は2Eが、第２の部分のインプットとして用いられる、請求項１に記載の二部分装置。
【請求項３】
eTPCSが、１以上のTORES由来被分析物TCR鎖を提示する１以上の被分析物eTPCをもたらし、１以上の被分析物eTPCが、
ａ．TCR対を発現するeTPC(eTPC-t)及び/又は
ｂ．TCR鎖を発現するeTPC(eTPC-x)及び/又は
ｃ．その１以上のライブラリ
から選択される、請求項１に記載の二部分装置。
【請求項４】
被分析物TCR鎖対が、被分析物eTPCにより、CD3と複合体化したTCR表面タンパク質(TCRsp)として発現される、請求項３に記載の二部分装置。
【請求項５】
成分1Aが、
ａ．複製起点、
ｂ．第１のポジティブ選択マーカー、
ｃ．１以上の５'遺伝子エレメント、
ｄ．コザック配列、
ｅ．TCR可変遺伝子セグメント、
ｆ．IIS型制限酵素による部位特異的認識及び切断のための第１のIIS型配列、
ｇ．ネガティブ選択マーカー、
ｈ．第２のIIS型配列、
ｉ．TCR定常遺伝子セグメント、及び
ｊ．１以上の３'遺伝子エレメント
を含むＶ-Ｃエントリーベクターである、請求項１に記載の二部分装置。
【請求項６】
成分1Bが、
ａ．複製起点、
ｂ．第２のポジティブ選択マーカー、
ｃ．第３のIIS型配列、
ｄ．TCR連結遺伝子セグメント、
ｅ．定常遺伝子セグメントの小さい５'部分に相当するＣ部、及び
ｆ．第４のIIS型配列
を含むＪドナーベクターである、請求項１又は５に記載の二部分装置。
【請求項７】
成分1Aの５'遺伝子エレメントが、
ａ．遺伝子シスエレメント、
ｂ．リコンビナーゼ酵素のための異種特異的認識部位、
ｃ．興味対象のゲノム部位についての５'相同組換えアーム、
ｄ．mRNAスプライスアクセプター部位、
ｅ．配列内リボソーム進入部位、及び
ｆ．エピジェネティックインスレータ配列
から選択される１以上のエレメントを更に含み、
ｇ．５'遺伝子エレメントが、少なくともｂ又はｃを必ず含む、請求項５又は６に記載の二部分装置。
【請求項８】
成分1Aにおけるネガティブ選択マーカーが、以下：
ａ．第１の成分の他の場所にもTCR連結遺伝子セグメント内にも含まれない制限酵素認識部位、
ｂ．条件的殺菌性因子をコードする遺伝子、及び
ｃ．レポーターエレメント
の１以上から選択される、請求項６又は７に記載の二部分装置。
【請求項９】
成分1Aの３'遺伝子エレメントが、
ａ．ターミネータエレメント、
ｂ．リコンビナーゼ酵素のための異種特異的認識部位、
ｃ．興味対象のゲノム部位についての３'相同組換えアーム、
ｄ．mRNAスプライスドナー部位、
ｅ．配列内リボソーム進入部位、及び
ｆ．エピジェネティックインスレータ配列
から選択される１以上のエレメントを更に含み、３'遺伝子エレメントが、少なくともｂ又はｃを必ず含む、請求項５〜７のいずれか一項に記載の二部分装置。
【請求項１０】
第１の部分の第１及び第２のポジティブ選択マーカーが、互いに異なり、抗生物質耐性遺伝子及び/又は栄養要求性補完遺伝子から選択される、請求項５〜９のいずれか一項に記載の二部分装置。
【請求項１１】
第１の部分が、CDR3をコードするオリゴヌクレオチド二重鎖(odeCDR3)を含む第３の成分1Cを更に含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の二部分装置。
【請求項１２】
1Cが、
ａ．1Aにおける第１のIIS型制限酵素認識及び切断部位に相補的な第１の一本鎖オーバーハング配列、
ｂ．TCR CDR3領域をコードし、1Aにおけるネガティブ選択エレメントを含まず、成分1A及び1BのいずれのIIS型制限配列も含まない二本鎖セグメント、及び
ｃ．1Bにおける第３のIIS型制限酵素認識及び切断部位に相補的な第２の一本鎖オーバーハング配列
を含むか、或いは、1Cが、
ｄ．IIS型制限酵素部位に挟まれたTCR CDR3をコードし、切断されたときに請求項１１のａ〜ｃに規定される分子を生じる単一の二本鎖DNA分子
を含む、請求項１１に記載の二部分装置。
【請求項１３】
成分2Aが、被分析物 抗原提示複合体(aAPX)及び/又は被分析物 抗原性分子(aAM)の少なくとも１つのファミリーの内因性表面発現を欠く細胞である、請求項１に記載の二部分装置。
【請求項１４】
aAPXのファミリーが、以下：
ｉ．HLAクラスＩ
ii．HLAクラスII
iii．非HLA抗原提示複合体
のいずれかであってよい、請求項１３に記載の二部分装置。
【請求項１５】
成分2Aが、
ａ．TCRアルファ、ベータ、デルタ及びガンマ鎖の内因性発現を欠き、
ｂ．細胞がTCR鎖の相補対を発現する場合にのみ該細胞の表面で条件的に提示されるCD3タンパク質を発現し、
ｃ．少なくとも１つの被分析物TCRアルファ、ベータ、デルタ若しくはガンマ鎖をコードする単一のORFの組込みのため、及び/又は一対の被分析物TCR鎖をコードする２つのORFの組込みのためのゲノム受容部位である2Bと呼ばれる更なる成分を含み、
成分2Cが、成分2Bにマッチしている遺伝子組込みベクターを含み、成分2Cが、
ａ．少なくとも１つの被分析物TCRアルファ、ベータ、デルタ及び/又はガンマ鎖をコードする単一のORF、及び/又は
ｂ．一対の被分析物TCR鎖をコードする２つのORF
を送達するように設計され、ａ及び/又はｂは、所望により、組込みの選択マーカーをコードし、被分析物TCR鎖が、成分2Aに、CD3と複合体化したTCR表面タンパク質(TCRsp)として発現され得る、請求項１に記載の二部分装置。
【請求項１６】
成分2Aが、
ａ．少なくとも１つの天然型プロモータ及び/又は少なくとも１つの合成プロモータと少なくとも１つのレポーターとを含む単一成分合成構築物、
ｂ．少なくとも１つの天然型プロモータ及び/又は少なくとも１つの合成プロモータと少なくとも１つのレポーターとを有するように設計された多成分合成構築物
から選択される合成ゲノムTCR刺激応答エレメントである2Fと呼ばれる成分を更に含み、
ａ及び/又はｂの活性化が、合成経路、天然型経路又はその組合せから選択される少なくとも１つのシグナル伝達経路に依存する、請求項１又は１５に記載の二部分装置。
【請求項１７】
ゲノム受容部位2B及び2Dが、リコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)のために設計された合成構築物である、請求項１に記載の二部分装置。
【請求項１８】
aAMが、
ａ．被分析物 抗原性分子ORFから翻訳されたポリペプチド又はポリペプチドの複合体
ｂ．被分析物 抗原性分子ORFから翻訳されたポリペプチドに由来するペプチド
ｃ．成分Ａプロテオームの変更に由来するペプチド
ｄ．成分Ａプロテオームの変更に由来するポリペプチド
ｅ．成分Ａメタボロームの変更に由来する代謝産物
から選択される、請求項１３又は１４に記載の二部分装置。
【請求項１９】
成分2Aが、CD4及び/又はCD8を発現する、請求項１３、１４及び１８のいずれか一項に記載の二部分装置。
【請求項２０】
成分2Aが、更なるTCR共受容体を発現する、請求項１３、１４、１８及び１９のいずれか一項に記載の二部分装置。
【請求項２１】
成分2Aが、CD28及び/又はCD45を発現する、請求項１３、１４及び１８〜２０のいずれか一項に記載の二部分装置。
【請求項２２】
成分2B及び2Dを含み、成分2B及び2Dが以下の遺伝子エレメント：
ａ．異種特異的リコンビナーゼ部位
ｂ．相同アーム
ｃ．真核生物性プロモータ
ｄ．真核生物性条件的調節エレメント
ｅ．真核生物性ターミネータ
ｆ．選択マーカー
ｇ．スプライスアクセプター部位
ｈ．スプライスドナー部位
ｉ．タンパク質非コーディング遺伝子
ｊ．インスレータ
ｋ．可動遺伝子エレメント
ｌ．メガヌクレアーゼ認識部位
ｍ．配列内リボソーム進入部位(IRES)
ｎ．ウイルス性自己切断型ペプチドエレメント
ｏ．コザックコンセンサス配列
の少なくとも１つで構成される、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の二部分装置。
【請求項２３】
成分2C及び2Eを含み、成分2C及び2Eが以下の遺伝子エレメント：
ａ．異種特異的リコンビナーゼ部位
ｂ．相同アーム
ｃ．真核生物性プロモータ
ｄ．真核生物性条件的調節エレメント
ｅ．真核生物性ターミネータ
ｆ．選択マーカー
ｇ．組込みの選択マーカー
ｈ．スプライスアクセプター部位
ｉ．スプライスドナー部位
ｊ．タンパク質ノンコーディング遺伝子
ｋ．インスレータ
ｌ．可動遺伝子エレメント
ｍ．メガヌクレアーゼ認識部位
ｎ．配列内リボソーム進入部位(IRES)
ｏ．ウイルス性自己切断型ペプチドエレメント
ｐ．抗生物質耐性カセット
ｑ．細菌性複製起点
ｒ．酵母性複製起点
ｓ．クローニング部位
ｔ．コザックコンセンサス配列
の少なくとも１つで構成される、請求項１３〜２２のいずれか一項に記載の二部分装置。
【請求項２４】
成分2B及び2Dを含み、成分2B及び2Dが単一ORFのRMCE組込みのためであり、
ａ．真核生物性プロモータ
ｂ．2C及び2Eのものとマッチした一対の異種特異的リコンビナーゼ部位
ｃ．コザックコンセンサス配列
ｄ．選択マーカー
ｅ．真核生物性ターミネータ
を含む、請求項１４〜２３のいずれか一項に記載の二部分装置。
【請求項２５】
成分2C及び2Eが存在し、各々が単一ORFのRMCE組込みのためであり、成分1Aが寄与する以下の遺伝子エレメント：
ａ．2B及び2Dのものとマッチした一対の異種特異的リコンビナーゼ部位
ｂ．コザックコンセンサス配列
ｃ．第１の部分であるTORESの働きにより再構成されるTCR ORF
を含む、請求項１４〜２４のいずれか一項に記載の二部分装置。
【請求項２６】
成分2C及び2Eを含み、成分2C及び2Eが、TORESの働きにより、単一の被分析物TCR鎖対をもたらす、請求項１４〜２５のいずれか一項に記載の二部分装置。
【請求項２７】
成分2C及び/又は2Eが含まれ、2C及び/又は2Eが、TORESの働きにより、2C及び/又は2Eによりコードされる被分析物TCR鎖対のライブラリをもたらす、請求項１４〜２６のいずれか一項に記載の二部分装置。
【請求項２８】
被分析物TCR鎖をコードする配列が、
ａ．初代Ｔ細胞からのTCR鎖ORF配列のペア型シーケンシング及び第１の部分であるTORESにおける再構成
ｂ．初代Ｔ細胞からのTCR鎖ORF配列の非ペア型シーケンシング及び第１の部分であるTORESにおける再構成
ｃ．TORESの働きにより生じる合成TCR鎖ORF配列
から導かれる、請求項２６又は２７に記載の二部分装置。
【請求項２９】
１以上の成分2C及び/又は2Eが、成分2C及び/又は2Eにコードされる２つの相補被分析物TCR鎖を成分2B及び/又は2Dに組み込んでeTPC-tと呼ばれる細胞を得るために成分2Aと組み合わされ、成分2B及び/又は2Dが、成分2Aの表面で被分析物TCRspを発現する成分2B'及び/又は2D'になる、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の二部分装置。
【請求項３０】
成分2C又は2Eの一方が、成分2C又は2Eにコードされる１つの被分析物TCR鎖を成分2B又は2Dに組み込んでeTPC-xと呼ばれる細胞を得るために成分2Aと組み合わされ、成分2B又は2Dが、eTPC-xで単一TCR鎖を発現する成分2B'又は2D'になる、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の二部分装置。
【請求項３１】
成分2C又は2Eの一方が、成分2C又は2Eにコードされる１つの被分析物TCR鎖をeTPC-xの成分2B又は2Dに組み込んでeTPC-tを得るためにeTPC-xと組み合わされ、１つの被分析物TCR鎖が、eTPC-xに発現されるTCR鎖に相補的であり、成分2B又は2Dが、eTPC-tの表面でTCRspを発現する成分2B'又は2D'になる、請求項３０に記載の二部分装置。
【請求項３２】
少なくとも１つの被分析物eTPC-tを作製に使用するための請求項１〜３１のいずれか一項に記載の二部分装置。