【手続補正書】
【提出日】令和2年4月3日(2020.4.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼと、
（ｂ）少なくとも１つの塩と、
（ｃ）少なくとも１つの消泡剤と、
（ｄ）少なくとも１つのｄＮＴＰと、
（ｅ）少なくとも１つのｄＮＴＰ誘導体と
を含む、組成物。
【請求項２】
前記ＤＮＡポリメラーゼが熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであり、
任意に前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｎｅ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＳｔｏｆｆｅｌフラグメントＤＮＡポリメラーゼ、ＶＥＮＴ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、及びそれらの突然変異体、変異体、または誘導体から選択され、
好ましくは前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがＴａｑ由来のＤＮＡポリメラーゼである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記塩が、カリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、及びそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記塩が５ｍＭ〜２００ｍＭの全濃度である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記消泡剤がシリコーン系消泡剤であり、
任意に、前記シリコーン系消泡剤が、ＸＩＡＭＥＴＥＲ（登録商標）ＡＦＥ−１０１０、ＡＦＥ−１４３０、ＡＦＥ−１５１０、ＡＦＥ−１５２０、ＡＦＥ−２２１０、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ａ、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｂ、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｃ、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｈ−１０、Ａｎｔｉｆｏａｍ  ＳＥ−１５、Ａｎｔｉｆｏａｍ  ＳＥ−３５、Ａｎｔｉｆｏａｍ  ＳＯ−２５、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｙ−３０、及びＡｎｔｉｆｏａｍ  ２８９から選択され、又は、
前記消泡剤が非シリコーン系消泡剤であり、
任意に、前記非シリコーン系消泡剤が、有機スルホネート、ポリエーテル、有機ホスフェート、アセチレングリコール、フルオロカーボン、ポリアルケンポリアミン、及びポリアルキレンイミン化合物から選択され、
任意に、前記ポリアルキレンイミン化合物が、Ａｎｔｉｆｏａｍ  ２０４またはＡｎｔｉｆｏａｍ  Ｏ−３０である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記消泡剤が０．００１％〜０．１％の濃度である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ｄＮＴＰがｄＧＴＰである、及び／又は、前記ｄＮＴＰ誘導体が、７−デアザ−ｄＧＴＰ（７−デアザ−２−デオキシ−ｄＧＴＰ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記少なくとも１つのｄＮＴＰと少なくとも１つのｄＮＴＰ誘導体が１：２〜２：１の比である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
アルブミン、ゼラチン、及びそれらの組み合わせから選択されるＰＣＲ阻害因子遮断剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
ｄＵＴＰを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
核酸合成反応を実施する方法であって、
（ａ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物を、標的特異的プライマーと共に標的ポリヌクレオチドを含む生物学的試料と接触させて反応混合物を形成する工程と、
（ｂ）核酸合成を実施する工程と
を含む、方法。
【請求項１２】
前記生物学的試料が溶解物であり、
任意に前記溶解物が、血液、尿、または唾液試料から得られる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
（ｃ）増幅産物を用いて前記標的ポリヌクレオチドの遺伝子型を決定する工程、又は、（ｃ）前記増幅産物を用いて前記標的ポリヌクレオチドのコピー数を決定する工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸合成反応がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、
前記ＰＣＲが、標準的なＰＣＲ反応混合物を用いて実施された同等のＰＣＲと比較して、より短い期間で増幅産物を産生する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記溶解物が、１つまたは複数のＰＣＲ阻害因子を含む粗溶解物である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法が検出工程をさらに含み、
任意に前記検出工程が加水分解プローブを利用し、
好ましくは前記加水分解プローブがＴａｑＭａｎプローブである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物を含むキットであって、前記キットが、少なくとも、第１のプライマー対及び／または第１の標識プローブをさらに含み、前記第１のプライマー対及び前記第１の標識プローブが第１の標的核酸に特異的である、キット。
【請求項１８】
前記キットが、コントロール核酸試料ならびに第２のプライマー対及び／または第２の標識プローブをさらに含み、前記第２のプライマー対及び前記第２の標識プローブが、前記コントロール核酸試料中に存在する第２の標的核酸に特異的である、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記標識プローブが加水分解プローブであり、
好ましくは前記加水分解プローブがＴａｑＭａｎプローブである、請求項１７又は１８に記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５６】
図６Ａ〜図６Ｄに示すように、Ａｎｔｉｆｏａｍ  ＳＥ−１５を添加しないとき、左上のプロットは、サイクリングの前に９２個の気泡が観察され、これらの気泡がサイクル０〜４０の間のいずこかで消失したことを示す（ＲＯＸ蛍光の増加によって示される）。０．０１％のＡｎｔｉｆｏａｍ  ＳＥ−１５を添加するとき、１０個の気泡がＰＣＲの前に計数され、反応の第２のサイクルの前に排除されたようであった。０．０５％及び０．１％のＡｎｔｉｆｏａｍ  ＳＥ−１５を添加するとき、プレートの遠心分離後に気泡は観察されず、ＲＯＸパッシブ信号に影響しなかった。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕（ａ）少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼと、
（ｂ）少なくとも１つの塩と、
（ｃ）少なくとも１つの消泡剤と、
（ｄ）少なくとも１つのｄＮＴＰと、
（ｅ）少なくとも１つのｄＮＴＰ誘導体と
を含む、組成物。
〔２〕前記ＤＮＡポリメラーゼが熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである、前記〔１〕に記載の組成物。
〔３〕前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｎｅ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＳｔｏｆｆｅｌフラグメントＤＮＡポリメラーゼ、ＶＥＮＴ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、及びそれらの突然変異体、変異体、または誘導体から選択される、前記〔２〕に記載の組成物。
〔４〕前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがＴａｑ由来のＤＮＡポリメラーゼである、前記〔３〕に記載の組成物。
〔５〕前記塩が、カリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、及びそれらの任意の組み合わせから選択される、前記〔１〕に記載の組成物。
〔６〕前記塩が５ｍＭ〜２００ｍＭの全濃度である、前記〔５〕に記載の組成物。
〔７〕前記消泡剤がシリコーン系消泡剤である、前記〔１〕に記載の組成物。
〔８〕前記シリコーン系消泡剤が、ＸＩＡＭＥＴＥＲ（登録商標）ＡＦＥ−１０１０、ＡＦＥ−１４３０、ＡＦＥ−１５１０、ＡＦＥ−１５２０、ＡＦＥ−２２１０、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ａ、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｂ、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｃ、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｈ−１０、Ａｎｔｉｆｏａｍ  ＳＥ−１５、Ａｎｔｉｆｏａｍ  ＳＥ−３５、Ａｎｔｉｆｏａｍ  ＳＯ−２５、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｙ−３０、及びＡｎｔｉｆｏａｍ  ２８９から選択される、前記〔７〕に記載の組成物。
〔９〕前記消泡剤が非シリコーン系消泡剤である、前記〔１〕に記載の組成物。
〔１０〕前記非シリコーン系消泡剤が、有機スルホネート、ポリエーテル、有機ホスフェート、アセチレングリコール、フルオロカーボン、ポリアルケンポリアミン、及びポリアルキレンイミン化合物から選択される、前記〔９〕に記載の組成物。
〔１１〕前記ポリアルキレンイミン化合物が、Ａｎｔｉｆｏａｍ  ２０４またはＡｎｔｉｆｏａｍ  Ｏ−３０である、前記〔１０〕に記載の組成物。
〔１２〕前記消泡剤が０．００１％〜０．１％の濃度である、前記〔７〕または〔９〕に記載の組成物。
〔１３〕前記ｄＮＴＰがｄＧＴＰである、前記〔１〕に記載の組成物。
〔１４〕前記ｄＮＴＰ誘導体が、７−デアザ−ｄＧＴＰ（７−デアザ−２−デオキシ−ｄＧＴＰ）である、前記〔１〕に記載の組成物。
〔１５〕前記ｄＧＴＰが０．０５ｍＭ〜１．０ｍＭの濃度である、前記〔１３〕に記載の組成物。
〔１６〕前記７−デアザ−ｄＧＴＰが０．０５ｍＭ〜１．０ｍＭの濃度である、前記〔１４〕に記載の組成物。
〔１７〕１：２〜２：１の比でｄＧＴＰと７−デアザ−ｄＧＴＰを含む、前記〔１〕に記載の組成物。
〔１８〕１：２〜１：１０の比でｄＧＴＰと７−デアザ−ｄＧＴＰを含む、前記〔１〕に記載の組成物。
〔１９〕２：１〜１０：１の比でｄＧＴＰと７−デアザ−ｄＧＴＰを含む、前記〔１〕に記載の組成物。
〔２０〕ＰＣＲ阻害因子遮断剤をさらに含む、前記〔１〕に記載の組成物。
〔２１〕前記ＰＣＲ阻害因子遮断剤がタンパク質である、前記〔２０〕に記載の組成物。
〔２２〕前記ＰＣＲ阻害因子遮断タンパク質が、アルブミン、ゼラチン、及びそれらの組み合わせから選択される、前記〔２１〕に記載の組成物。
〔２３〕ゼラチン及び血清アルブミンを含む、前記〔２２〕に記載の組成物。
〔２４〕前記ゼラチンが、ウシゼラチン、フィッシュゼラチン、及びそれらの組み合わせから選択される、前記〔２２〕に記載の組成物。
〔２５〕前記ウシゼラチンが０．０１％〜１．０％の濃度であり、かつ／または前記フィッシュゼラチンが０．０１％〜１．０％の濃度である、前記〔２４〕に記載の組成物。
〔２６〕前記血清アルブミンがウシ血清アルブミンである、前記〔２３〕に記載の組成物。
〔２７〕前記ウシ血清アルブミンが０．０５ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度である、前記〔２６〕に記載の組成物。
〔２８〕界面活性剤をさらに含む、前記〔１〕に記載の組成物。
〔２９〕前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、前記〔２８〕に記載の組成物。
〔３０〕前記非イオン性界面活性剤が、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（登録商標）、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、ＴＷＥＥＮ  ８０、Ｂｒｉｊ  ３０、Ｂｒｉｊ  ３５、及びＢｒｉｊ  ５８からなる群から選択される、前記〔２９〕に記載の組成物。
〔３１〕前記界面活性剤が、Ｔｗｅｅｎ−２０以外の非イオン性界面活性剤である、前記〔２９〕に記載の組成物。
〔３２〕前記非イオン性界面活性剤が０．００５％〜０．１％の濃度である、前記〔３１〕に記載の組成物。
〔３３〕パッシブリファレンスコントロール色素をさらに含む、前記〔１〕に記載の組成物。
〔３４〕前記パッシブリファレンスコントロール色素が蛍光色素である、前記〔３３〕に記載の組成物。
〔３５〕前記蛍光色素がＲＯＸ色素またはＭＬＵＳＴＡＮＧ  ＰＵＲＰＬＥ色素である、前記〔３４〕に記載の組成物。
〔３６〕前記パッシブリファレンス色素が、５０ｎＭ〜５００ｎＭの濃度である、前記〔３５〕に記載の組成物。
〔３７〕ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及び／またはｄＵＴＰをさらに含む、前記〔１〕に記載の組成物。
〔３８〕核酸合成反応を実施する方法であって、
（ａ）前記態様のいずれか一項に記載の組成物を、標的特異的プライマーと共に標的ポリヌクレオチドを含む生物学的試料と接触させて反応混合物を形成する工程と、
（ｂ）核酸合成を実施する工程と
を含む、方法。
〔３９〕前記核酸合成反応がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である、前記〔３８〕に記載の方法。
〔４０〕前記核酸合成反応が増幅反応である、前記〔３８〕に記載の方法。
〔４１〕前記生物学的試料が溶解物である、前記〔３８〕に記載の方法。
〔４２〕（ｃ）前記増幅産物を用いて前記標的ポリヌクレオチドの遺伝子型を決定する工程をさらに含む、前記〔３８〕に記載の方法。
〔４３〕（ｃ）前記増幅産物を用いて前記標的ポリヌクレオチドのコピー数を決定する工程をさらに含む、前記〔３８〕に記載の方法。
〔４４〕前記ＰＣＲが、標準的なＰＣＲ反応混合物を用いて実施された同等のＰＣＲと比較して、より短い期間で増幅産物を産生する、前記〔３９〕に記載の方法。
〔４５〕前記ＰＣＲがシンプレックスＰＣＲである、前記〔３９〕に記載の方法。
〔４６〕前記ＰＣＲがマルチプレックスＰＣＲである、前記〔３９〕に記載の方法。
〔４７〕前記溶解物が、１つまたは複数のＰＣＲ阻害因子を含む粗溶解物である、前記〔４１〕に記載の方法。
〔４８〕前記溶解物が、血液、尿、または唾液試料から得られる、前記〔４１〕に記載の方法。
〔４９〕前記方法が検出工程をさらに含む、前記〔３８〕に記載の方法。
〔５０〕前記検出工程が加水分解プローブを利用する、前記〔４９〕に記載の方法。
〔５１〕前記加水分解プローブがＴａｑＭａｎプローブである、前記〔５０〕に記載の方法。
〔５２〕前記工程（ｃ）が加水分解プローブの使用を含む、前記〔４２〕または〔４３〕に記載の方法。
〔５３〕前記加水分解プローブがＴａｑＭａｎプローブである、前記〔４２〕に記載の方法。
〔５４〕前記遺伝子型決定が少なくとも９９％正確である、前記〔４２〕に記載の方法。
〔５５〕前記コピー数の変動が、標準的な反応混合物または他の市販の組成物を用いて実施される同等の方法と比較して少なくとも１０％改善される、前記〔４３〕に記載の方法。
〔５６〕前記〔１〕に記載の組成物を含むキットであって、前記キットが、少なくとも、第１のプライマー対及び／または第１の標識プローブをさらに含み、前記第１のプライマー対及び前記第１の標識プローブが第１の標的核酸に特異的である、キット。
〔５７〕前記キットが、コントロール核酸試料ならびに第２のプライマー対及び／または第２の標識プローブをさらに含み、前記第２のプライマー対及び前記第２の標識プローブが、前記コントロール核酸試料中に存在する第２の標的核酸に特異的である、前記〔４９〕に記載のキット。
〔５８〕前記標識プローブが加水分解プローブである、前記〔５３〕または〔５４〕に記載のキット。
〔５９〕前記加水分解プローブがＴａｑＭａｎプローブである、前記〔５５〕に記載のキット。
〔６０〕熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと、
カリウム塩と、
消泡剤と、
ｄＧＴＰと、
０．０５ｍＭ〜０．７ｍＭの濃度である、デアザ−ｄＧＴＰと
を含む、組成物。
〔６１〕熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと、
カリウム塩と、
消泡剤と、
ｄＧＴＰと、
ｄＧＴＰ濃度対デアザ−ｄＧＴＰ濃度の比が１：２〜２：１である、デアザ−ｄＧＴＰと
を含む、組成物。
〔６２〕熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと、
カリウム塩と、
消泡剤と、
ｄＧＴＰと、
ｄＧＴＰ濃度対デアザ−ｄＧＴＰ濃度の比が１：２〜１：１０である、デアザ−ｄＧＴＰと
を含む、組成物。
〔６３〕熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと、
カリウム塩と、
消泡剤と、
ｄＧＴＰと、
ｄＧＴＰ濃度対デアザ−ｄＧＴＰ濃度の比が２：１〜１０：１である、デアザ−ｄＧＴＰと
を含む、組成物。
〔６４〕前記消泡剤がシリコーンを含む、前記〔６０〕〜〔６３〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔６５〕アルブミン、ゼラチン、またはそれらの組み合わせをさらに含む、前記〔６０〕〜〔６３〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔６６〕フィッシュゼラチンとウシゼラチンの組み合わせを含む、前記〔６５〕に記載の組成物。
〔６７〕フィッシュゼラチン及びウシ血清アルブミンを含む、前記〔６５〕に記載の組成物。
〔６８〕Ｔｗｅｅｎ−２０以外の非イオン性界面活性剤をさらに含む、前記〔６０〕〜〔６３〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔６９〕前記非イオン性界面活性剤が０．００５〜０．０５％の濃度である、前記〔６８〕に記載の組成物。
〔７０〕前記非イオン性界面活性剤が、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（登録商標）、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、ＴＷＥＥＮ  ８０、Ｂｒｉｊ  ３０、Ｂｒｉｊ  ３５、またはＢｒｉｊ  ５８からなる群から選択される、前記〔６８〕に記載の組成物。
〔７１〕パッシブリファレンスコントロール色素をさらに含む、前記〔６０〕〜〔６３〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔７２〕熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと、
塩化カリウムと、
シリコーンを含む消泡剤と、
デアザ−ｄＧＴＰが約０．０５ｍＭ〜０．７ｍＭの濃度である、ｄＧＴＰ及びデアザ−ｄＧＴＰと、
Ｔｗｅｅｎ−２０以外の非イオン性界面活性剤と、
０．０１〜０．２５％の濃度であるウシゼラチンと、
０．０５％〜１．０％の濃度であるフィッシュゼラチンと、
０．０５ｍｇ／ｍｌ〜０．８ｍｇ／ｍｌの濃度であるウシ血清アルブミンと
を含む、組成物。
〔７３〕ｄＧＴＰ濃度対デアザ−ｄＧＴＰ濃度の比が１：２〜２：１である、前記〔７２〕に記載の組成物。
〔７４〕ｄＧＴＰ濃度対デアザ−ｄＧＴＰ濃度の比が約１：１である、前記〔７２〕に記載の組成物。
〔７５〕ＰＣＲを実施するための方法であって、
（ａ）前記態様のいずれか一項に記載の組成物を、標的ポリヌクレオチドを含む核酸試料及び標的特異的プライマーと接触させて、反応混合物を形成する工程と、
（ｂ）前記反応混合物にＰＣＲを実施して、増幅産物を形成する工程と
を含む、方法。
〔７６〕（ｃ）前記増幅産物を用いて前記核酸試料の遺伝子型を決定する工程をさらに含む、前記〔７５〕に記載の方法。
〔７７〕（ｃ）前記増幅産物を用いて前記標的ポリヌクレオチドのコピー数を決定する工程をさらに含む、前記〔７５〕に記載の方法。
〔７８〕前記ＰＣＲの実行時間が、標準的なＰＣＲ反応混合物を用いて実施された同等のＰＣＲと比較して減少する、前記〔７５〕に記載の方法。
〔７９〕前記ＰＣＲがシンプレックスＰＣＲである、前記〔７５〕に記載の方法。
〔８０〕前記ＰＣＲがマルチプレックスＰＣＲである、前記〔７５〕に記載の方法。
〔８１〕前記核酸試料が溶解物である、前記〔７５〕に記載の方法。
〔８２〕前記溶解物が、血液または口腔細胞に由来する、前記〔８１〕に記載の方法。
〔８３〕前記核酸試料が唾液、尿、または血清に由来する、前記〔７５〕に記載の方法。
〔８４〕前記〔６０〕〜〔６３〕のいずれか一項に記載の組成物を含むキットであって、ＤＮＡ標的のＰＣＲ増幅及び検出の両方に特異的なプライマー対及び標識プローブをさらに含む、キット。
〔８５〕前記〔６０〕〜〔６３〕のいずれか一項に記載の組成物を含むキットであって、コントロール核酸試料、及び前記コントロール核酸試料中のＤＮＡ標的のＰＣＲ増幅に特異的なプライマー対をさらに含む、キット。