【手続補正書】
【提出日】令和2年8月17日(2020.8.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された光で活性化されるイオンチャネルポリペプチドであって、
１以上のアミノ酸修飾を含む配列番号２のアミノ酸配列を含み、
前記光で活性化されるイオンチャネルポリペプチドが、細胞膜で発現され、活性化光に接触されると、配列番号２の前記光で活性化されるイオンチャネルポリペプチドと比べて高いレベルのイオン流及び高いレベルのプロトン流の少なくとも一方を有する、前記単離された光で活性化されるイオンチャネルポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが配列番号３〜１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の光で活性化されるイオンチャネルポリペプチド。
【請求項３】
配列番号３〜１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項４】
１以上のアミノ酸修飾を含む、配列番号３〜１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項５】
前記１以上の修飾が、置換、欠失または挿入である、請求項４に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む細胞。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項８】
前記核酸配列がプロモーター配列に操作可能に連結される、請求項７に記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
請求項７または８に記載の単離された核酸分子を含む細胞。
【請求項１０】
請求項７または８に記載の単離された核酸分子を含む組成物。
【請求項１１】
前記細胞が試験管内、生体外、または生体内にある、請求項６または９に記載の細胞。
【請求項１２】
請求項７または８に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
【請求項１３】
前記細胞が、光受容体、双極細胞、桿体双極細胞、ＯＮ型錐体双極細胞、網膜神経節細胞、光感受性網膜神経節細胞、水平細胞、アマクリン細胞、またはＡＩＩアマクリン細胞である、請求項６または９に記載の細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６２】
実施例１：突然変異体ＣｏＣｈｏｐポリペプチドの作製及び分析
ＣｈＲ２のようなチャネルロドプシン（ＣｈＲ）は視力回復のための有望な光操作での光センサーである。視力回復でＣｈＲ２を使用するための主要な障害はその低い光感受性である。我々は以前、部位特異的変異誘発を介してその動態を最適化することによって、最も光感受性のＣｈＲ２突然変異体、ＣｈＲ２−Ｌ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ｓを含むさらに光感受性のＣｈＲ２を作製した。最近、藻類の新たなトランスクリプトームの配列決定によって多数のＣｈＲ変異体が報告されている（Ｋｌａｐｏｅｔｋｅ，ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１１（３）：３３８−４６）。我々は、変異体の１つであるＣｏＣｈＲが大きな光電流を示すことを見いだした。本発明では、我々は、部位特異的変異誘発を介してその動態を最適化することによって幾つかの高度に光感受性のＣｏＣｈＲ突然変異体（すなわち、突然変異体ＣｏＣｈｏｐ）を作製した。これらの突然変異体には、ＣｏＣｈＲ−Ｌ１１２Ｃ（配列番号３）、ＣｏＣｈＲ−Ｔ１３９Ｃ（配列番号５）、Ｃ６８Ｓ／Ｖ６９Ｉ（配列番号４）、Ｃ６８Ｔ／Ｖ６９Ｉ（配列番号７）、ＣｏＣｈＲ−Ｔ１４５Ａ／Ｓ１４６Ａ（配列番号６）、ＣｏＣｈＲ−Ｌ１１２Ｃ／Ｔ１３９Ｃ（配列番号８）、ＣｏＣｈＲ−Ｌ１１２Ｃ／Ｈ９４Ｅ（配列番号９）、及びＣｏＣｈＲ−Ｌ１１２Ｃ／Ｈ９４Ｅ／Ｋ２６４Ｔ（配列番号１０）が挙げられる。ＣｏＣｈＲ及びその突然変異体は、４８０ｎｍでのピークスペクトルを伴ってＣｈＲ２よりもやや赤色にシフトしたスペクトル曲線を示す（図１）。ＣｏＣｈＲ突然変異体の光感受性（ＣｏＣｈＲ−Ｌ１１２Ｃについて示されるような）は、ＨＥＫ細胞における電気生理学の記録（図２〜５）、及び網膜神経細胞からの多重電極アレイの記録（図６）、及び生体内での盲目マウスに由来する視運動行動試験（図７）に基づいて、最も光感受性のＣｈＲ２突然変異体ＣｈＲ２−Ｌ１３２Ｃ／Ｔ１５９Ｓのそれよりもはるかに高い。さらに、周囲の光条件下でＣｏＣｈＲ−Ｌ１１２Ｃを発現しているマウスについて視運動反応を観察することができる（図８）。加えて、ＣｏＣｈＲ−Ｌ１１２Ｃ突然変異体の長期の安定した発現が網膜神経細胞にて観察された（図９）。
本発明は、例えば以下の実施形態を包含する：
［実施形態１］単離された光で活性化されるイオンチャネルポリペプチドであって、
１以上のアミノ酸修飾を含む配列番号２のアミノ酸配列を含み、
前記光で活性化されるイオンチャネルポリペプチドが、細胞膜で発現され、活性化光に接触されると、配列番号２の前記光で活性化されるイオンチャネルポリペプチドと比べて高いレベルのイオン流及び高いレベルのプロトン流の少なくとも一方を有する、前記単離された光で活性化されるイオンチャネルポリペプチド。
［実施形態２］前記ポリペプチドが配列番号３〜１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の光で活性化されるイオンチャネルポリペプチド。
［実施形態３］配列番号３〜１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
［実施形態４］１以上のアミノ酸修飾を含む、配列番号３〜１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
［実施形態５］前記１以上の修飾が、置換、欠失または挿入である、実施形態４に記載の単離されたポリペプチド。
［実施形態６］実施形態１〜５のいずれかに記載のポリペプチドを含む細胞。
［実施形態７］実施形態１〜５のいずれかに記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
［実施形態８］前記核酸配列がプロモーター配列に操作可能に連結される、実施形態７に記載の単離された核酸分子。
［実施形態９］実施形態７または８に記載の単離された核酸分子を含む細胞。
［実施形態１０］実施形態７または８に記載の単離された核酸分子を含む組成物。
［実施形態１１］前記細胞が試験管内、生体外、または生体内にある、実施形態６または９に記載の細胞。
［実施形態１２］実施形態７または８に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
［実施形態１３］前記細胞が、光受容体、双極細胞、桿体双極細胞、ＯＮ型錐体双極細胞、網膜神経節細胞、光感受性網膜神経節細胞、水平細胞、アマクリン細胞、またはＡＩＩアマクリン細胞である、実施形態６または９に記載の細胞。
［実施形態１４］膜の導電率を変える方法であって、
ａ．宿主の膜にて実施形態１〜５のいずれかに記載のポリペプチドを発現させることと、
ｂ．好適な条件下で前記ポリペプチドを光に接触させて前記宿主の膜の導電率を変化させることとを含む、前記方法。
［実施形態１５］前記宿主の膜が細胞膜である、実施形態１４に記載の方法。
［実施形態１６］前記宿主の膜が、神経細胞、神経系の細胞、心臓細胞、循環細胞、視覚系の細胞または聴覚系の細胞の細胞膜である、実施形態１５に記載の方法。
［実施形態１７］対象にて疾患または状態を治療する方法であって、
それを必要とする対象に治療上有効な量の、実施形態１〜５に記載のポリペプチドまたは実施形態７〜８に記載の核酸を投与することを含む、前記方法。
［実施形態１８］前記疾患または状態が、負傷、脳損傷、脊髄損傷、てんかん、代謝性障害、心機能不全、視力喪失、失明、難聴、聴覚喪失、または神経学的状態である、実施形態１７に記載の方法。
［実施形態１９］視力を改善するまたは回復させる方法であって、実施形態１〜５に記載のポリペプチドまたは実施形態７〜８に記載の核酸を対象に投与することを含む、前記方法。
［実施形態２０］前記対象が眼疾患を患っている、実施形態１９に記載の方法。
［実施形態２１］前記眼疾患が黄班変性症または網膜色素変性症である、実施形態２０に記載の方法。
［実施形態２２］前記視力を改善するまたは回復させることが、以下：光感受性を高めること；光電流を誘起するのに必要とされる閾値光強度を下げること；及び視覚野における視覚誘発電位を高めることのいずれかを含む、実施形態１９〜２１のいずれかに記載の方法。
［実施形態２３］網膜色素変性症または加齢性黄班変性症を治療する方法であって、それを必要とする対象に実施形態１〜５に記載のポリペプチドまたは実施形態７〜８に記載の核酸を投与することを含む、前記方法。
［実施形態２４］前記組成物が硝子体内または網膜下の注射によって投与される、実施形態１９〜２３のいずれかに記載の方法。