【手続補正書】
【提出日】令和2年8月24日(2020.8.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８３】
表７のデータに基づくと、ＧＴＦ６８５５（配列番号４）への複数のアミノ酸置換の導入により、この酵素のα−１，３−グルカン収率を増加させることができる。例えば、これらの収率を、表３に示される置換を有しないＧＴＦ６８５５（配列番号４）のものと比較されたい。表７に列記されるバリアントＧＴＦ酵素の各々は、ロイクロース、グルコースおよびグルコ−オリゴマーの収率の著しい減少も示した（データは示さず）。
例えば、配列番号６２の５１０位および／または６０７位に対応する位置などで複数の置換を有するＧＴＦがＧＴＦのα−グルカン収率を増加させることができることは明白である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８４】
以上、本発明を要約すると下記の通りである。
１．配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−３７３、Ｌｅｕ−４２８、Ａｌａ−４７２、Ａｌａ−５１０、Ｌｅｕ−５１３、Ｍｅｔ−５２９、Ｐｈｅ−６０７、Ａｓｎ−６１３、Ｇｌｎ−６１６、Ｓｅｒ−６３１、Ｇｌｙ−６３３、Ｐｈｅ−６３４、Ｔｈｒ−６３５またはＰｈｅ−９５１に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含む非天然グルコシルトランスフェラーゼであって、１，３−結合および／または１，６−結合を含むα−グルカンを合成し、
（ｉ）前記置換位置のみで前記非天然グルコシルトランスフェラーゼと異なる第２のグルコシルトランスフェラーゼのα−グルカン収率よりも高いα−グルカン収率、および／または
（ｉｉ）前記第２のグルコシルトランスフェラーゼのロイクロース収率よりも低いロイクロース収率
を有する非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
２．（ｉ）アミノ酸残基Ｌｅｕ−３７３に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、ＰｈｅもしくはＬｅｕ残基によるものであるか；
（ｉｉ）アミノ酸残基Ｌｅｕ−４２８に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、Ｖａ
ｌ残基によるものであるか；
（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ａｌａ−４７２に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、ＳｅｒもしくはＣｙｓ残基によるものであるか；
（ｉｖ）アミノ酸残基Ａｌａ−５１０に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌもしくはＡｓｐ残基によるものであるか；
（ｖ）アミノ酸残基Ｌｅｕ−５１３に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、Ｔｙｒ、ＰｈｅもしくはＴｒｐ残基によるものであるか；
（ｖｉ）アミノ酸残基Ｍｅｔ−５２９に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、ＬｅｕもしくはＡｓｎ残基によるものであるか；
（ｖｉｉ）アミノ酸残基Ｐｈｅ−６０７に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、Ｔｒｐ、ＴｙｒもしくはＡｓｎ残基によるものであるか；
（ｖｉｉｉ）アミノ酸残基Ａｓｎ−６１３に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、ＭｅｔもしくはＬｅｕ残基によるものであるか；
（ｉｘ）アミノ酸残基Ｇｌｎ−６１６に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、Ｇｌｕ残基によるものであるか；
（ｘ）アミノ酸残基Ｓｅｒ−６３１に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、ＧｌｕもしくはＡｒｇ残基によるものであるか；
（ｘｉ）アミノ酸残基Ｇｌｙ−６３３に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、Ｔｒｐ残基によるものであるか；
（ｘｉｉ）アミノ酸残基Ｐｈｅ−６３４に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、Ａｌａ残基によるものであるか；
（ｘｉｉｉ）アミノ酸残基Ｔｈｒ−６３５に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、Ｔｒｐ、ＨｉｓもしくはＴｙｒ残基によるものであるか；または
（ｘｉｖ）アミノ酸残基Ｐｈｅ−９５１に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、Ｔｙｒ残基によるものである、上記１に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
３．２つ以上のアミノ酸置換を含み、前記置換の少なくとも１つは、配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−３７３、Ｌｅｕ−４２８、Ａｌａ−４７２、Ａｌａ−５１０、Ｌｅｕ−５１３、Ｍｅｔ−５２９、Ｐｈｅ−６０７、Ａｓｎ−６１３、Ｇｌｎ−６１６、Ｓｅｒ−６３１、Ｇｌｙ−６３３、Ｐｈｅ−６３４、Ｔｈｒ−６３５またはＰｈｅ−９５１に対応する位置におけるものである、上記１に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
４．配列番号６２のアミノ酸残基Ａｌａ−５１０またはＰｈｅ−６０７に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、上記３に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
５．配列番号６２のアミノ酸残基Ａｌａ−５１０およびＰｈｅ−６０７に対応する位置でアミノ酸置換を含む、上記４に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
６．前記α−グルカンは、不溶性であり、かつ少なくとも約５０％のα−１，３結合を含み、任意選択的に、前記α−グルカンは、少なくとも１００の重量平均重合度（ＤＰｗ）を有する、上記１に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
７．配列番号４の残基５５〜９６０、配列番号６５の残基５４〜９５７、配列番号３０の残基５５〜９６０、配列番号２８の残基５５〜９６０または配列番号２０の残基５５〜９６０と少なくとも約９０％同一である触媒ドメインを含む、上記６に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
８．配列番号４、配列番号６５、配列番号３０、配列番号２８または配列番号２０と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、上記７に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
９．少なくとも約９０％のα−１，３−結合を有する不溶性α−１，３−グルカンを合成する、上記７に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
１０．前記α−グルカンは、不溶性であり、かつ少なくとも約７５％のα−１，６−結合を含む、上記１に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
１１．配列番号６８、配列番号６８の３７〜１３３８位、配列番号６９、配列番号６９の
３７〜１５５４位または配列番号６９の１７０〜１５５４位と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、上記１０に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
１２．前記α−グルカン収率は、前記第２のグルコシルトランスフェラーゼの前記α−グルカン収率よりも少なくとも約１０％高い、上記１に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
１３．上記１に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、任意選択的に、１つ以上の調節配列は、前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結され、好ましくは、前記１つ以上の調節配列は、プロモーター配列を含む、ポリヌクレオチド。
１４．水、スクロースおよび上記１に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼを含む反応組成物。
１５．α−グルカンを生成する方法であって、
（ａ）少なくとも水、スクロースおよび請求項１に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させる工程であって、それにより、α−グルカンは、生成される、工程と；
（ｂ）任意選択的に、工程（ａ）で生成された前記α−グルカンを単離する工程と
を含む方法。
１６．非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を作製する方法であって、
（ａ）（ｉ）配列番号４または配列番号４の５５〜９６０位と少なくとも約３０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ（ｉｉ）１，３−結合および／または１，６−結合を含むα−グルカンを合成する親グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を同定する工程と；
（ｂ）工程（ａ）で同定された前記ポリヌクレオチド配列を改変して、配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−３７３、Ｌｅｕ−４２８、Ａｌａ−４７２、Ａｌａ−５１０、Ｌｅｕ−５１３、Ｍｅｔ−５２９、Ｐｈｅ−６０７、Ａｓｎ−６１３、Ｇｌｎ−６１６、Ｓｅｒ−６３１、Ｇｌｙ−６３３、Ｐｈｅ−６３４、Ｔｈｒ−６３５またはＰｈｅ−９５１に対応する位置で前記親グルコシルトランスフェラーゼの少なくとも１つのアミノ酸を置換し、それにより、
（ｉ）前記親グルコシルトランスフェラーゼのα−グルカン収率よりも高いα−グルカン収率、および／または
（ｉｉ）前記親グルコシルトランスフェラーゼのロイクロース収率よりも低いロイクロース収率
を有する非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を提供する工程と
を含む方法。
１７．前記同定する工程は、
（ａ）インシリコで、
（ｂ）核酸ハイブリダイゼーション工程を含む方法を用いて、
（ｃ）タンパク質シーケンシング工程を含む方法を用いて、および／もしくは
（ｄ）タンパク質結合工程を含む方法を用いて実施され；かつ／または
前記改変する工程は、
（ｅ）インシリコで実施され、その後、前記非天然グルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする前記ポリヌクレオチド配列の合成が行われるか、もしくは
（ｆ）前記親グルコシルトランスフェラーゼをコードする前記ポリヌクレオチド配列の物理的なコピーを使用して実施される、上記１６に記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−３７３、Ｌｅｕ−４２８、Ａｌａ−４７２、Ａｌａ−５１０、Ｌｅｕ−５１３、Ｍｅｔ−５２９、Ｐｈｅ−６０７、Ａｓｎ−６１３、Ｇｌｎ−６１６、Ｓｅｒ−６３１、Ｇｌｙ−６３３、Ｐｈｅ−６３４、Ｔｈｒ−６３５またはＰｈｅ−９５１に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含む非天然グルコシルトランスフェラーゼであって、１，３−結合および／または１，６−結合を含むα−グルカンを合成し、
（ｉ）前記置換位置のみで前記非天然グルコシルトランスフェラーゼと異なる第２のグルコシルトランスフェラーゼのα−グルカン収率よりも高いα−グルカン収率、および／または
（ｉｉ）前記第２のグルコシルトランスフェラーゼのロイクロース収率よりも低いロイクロース収率
を有する非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【請求項２】
請求項１に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、任意選択的に、１つ以上の調節配列は、前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結され、好ましくは、前記１つ以上の調節配列は、プロモーター配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項３】
水、スクロースおよび請求項１に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼを含む反応組成物。
【請求項４】
α−グルカンを生成する方法であって、
（ａ）少なくとも水、スクロースおよび請求項１に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させる工程であって、それにより、α−グルカンは、生成される、工程と；
（ｂ）任意選択的に、工程（ａ）で生成された前記α−グルカンを単離する工程と
を含む方法。
【請求項５】
非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を作製する方法であって、
（ａ）（ｉ）配列番号４または配列番号４の５５〜９６０位と少なくとも約３０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ（ｉｉ）１，３−結合および／または１，６−結合を含むα−グルカンを合成する親グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を同定する工程と；
（ｂ）工程（ａ）で同定された前記ポリヌクレオチド配列を改変して、配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−３７３、Ｌｅｕ−４２８、Ａｌａ−４７２、Ａｌａ−５１０、Ｌｅｕ−５１３、Ｍｅｔ−５２９、Ｐｈｅ−６０７、Ａｓｎ−６１３、Ｇｌｎ−６１６、Ｓｅｒ−６３１、Ｇｌｙ−６３３、Ｐｈｅ−６３４、Ｔｈｒ−６３５またはＰｈｅ−９５１に対応する位置で前記親グルコシルトランスフェラーゼの少なくとも１つのアミノ酸を置換し、それにより、
（ｉ）前記親グルコシルトランスフェラーゼのα−グルカン収率よりも高いα−グルカン収率、および／または
（ｉｉ）前記親グルコシルトランスフェラーゼのロイクロース収率よりも低いロイクロース収率
を有する非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を提供する工程と
を含む方法。