【手続補正書】
【提出日】令和2年6月29日(2020.6.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の生成物を合成するための方法であって、
炭素源として添加される有機酸を含む培養培地を提供するステップと；
前記目的の生成物を生成する微細藻類細胞を提供するステップであって、前記微細藻類細胞が通性従属栄養生物であり、クラミドモナス目（Chlamydomonadales）の一部に分類され；
前記微細藻類細胞を前記培養培地中、暗条件で培養して、前記微細藻類細胞から微細藻類培養物を生成するステップと；
前記微細藻類細胞が約１週間の期間で、乾燥重量で少なくとも６ｇ／Ｌの密度に達したのち、かつ、前記微細藻類培養物中の前記細胞がシストへの細胞分化を受ける前に、前記微細藻類培養物から前記細胞を単離するステップと；
前記微細藻類細胞から前記目的の生成物を精製するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記微細藻類細胞が、偏性従属栄養生物にされた通性従属栄養生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記目的の生成物が、前記微細藻類細胞を含む微細藻類バイオマスである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記目的の生成物が、色素、テルペンまたは、組換え分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記色素が、カロテノイドまたはイソプレノイドである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記カロテノイドまたはイソプレノイドが、アスタキサンチン、ルテイン、リコペン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、カロテン、フィトフルエン、フィトエン、またはその任意の組合せである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記テルペンが、ピネン、リモネン、またはゲラニルゲラニルピロリン酸またはその任意の組合せである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記組換え分子が、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）または異種タンパク質である、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記微細藻類培養物が、少なくとも時間あたり１ｍｇ／Ｌの比生産性率、ｑｐで、シストへ分化せずに、前記カロテノイドまたはイソプレノイドを生成する、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記培養のステップが、１週間未満の間、行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記目的の生成物の従属栄養成長および合成が、前記培養のステップの間に起こり、前記培養のステップが、有機酸供給源と有機酸以外の栄養素のフェドバッチ発酵下で実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記目的の生成物の合成が、炭素の存在下で１以上の硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、および尿素の栄養素を枯渇させた培養培地で起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記有機酸が、酢酸、クエン酸、フマル酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、プロピオン酸、ピルビン酸、コハク酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸、ウロン酸、クロロゲン酸、またはリグノセルロース酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記培養培地が、窒素の主要供給源として尿素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記微細藻類細胞の乾燥、粉砕、溶解、または抽出のうちの１つまたは複数のステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記微細藻類細胞が、ヘマトコッカス属の種（Haematococcus spp.）、クラミドモナス属の種（Chlamydomonas spp.）、クロロモナス属の種（Chloromonas spp.）、ドナリエラ属の種（Dunaliella spp.）、または、クラミドカプサ属の種（Chlamydocapsa spp.）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記微細藻類細胞が、第１の微細藻細胞とは異なる種である第２の細胞と共培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２の細胞が、その成長を支援するために、前記微細藻類細胞の成長を支援する有機酸と比べて異なる固定炭素源を使用する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２の細胞が、窒素源としてアンモニウムを消費する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２の細胞型が、セネデスムス属の種（Scenedesmus spp.）、クロレラ属の種（Chlorella spp.）、モノラフィディウム属の種（Monoraphidium spp.）、ロドトルラ属の種（Rhodotorula spp.）、珪藻植物、スラウストキトリッド（thraustochytrid）またはスラウストキトリッド（thraustochytrid）様微生物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記微細藻類細胞が、ヘマトコッカス種の属（Haematococcus spp.）に属し、前記第２の細胞がクラミドモナス種の属（Chlamydomonas spp.）に属する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の方法により得られるクラミドモナス目（Chlamydomonadales）由来の通性従属栄養微細藻類細胞であって、前記細胞が、ピネン、リモネン、アスタキサンチン、フィトエン、リコペン、ゲラニルゲラニルピロリン酸、バイオ水素、またはタウマチンを生成するための１つまたは複数のＲＮＡまたはタンパク質に関する核酸を発現する組換え細胞であるか；または前記細胞が、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を発現する組換え細胞である、通性従属栄養微細藻類細胞。
【請求項２３】
請求項１に記載の方法により得られるクラミドモナス目（Chlamydomonadales）由来の通性従属栄養微細藻類細胞であって、前記細胞が、元の非変異細胞に関連するイソプレノイドの改変された産生を伴う突然変異体細胞であるか、または鞭毛性突然変異体である、通性従属栄養微細藻類細胞。
【請求項２４】
乾燥重量で少なくとも０．７％以上のアスタキサンチン、乾燥重量４０％以上のタンパク質、乾燥重量１０％未満の灰分を含む組成を有する、請求項１に記載の方法により得られるクラミドモナス目（Chlamydomonadales）の従属栄養微細藻類バイオマスから得られた、着色剤、飼料成分、食料成分、ペットフード成分、ヒトの栄養素サプリメント、またはパーソナルケアもしくは化粧品成分。
【請求項２５】
カロテノイド含有ライセートまたは抽出物である、請求項２４に記載の着色剤、飼料成分、食料成分、ペットフード成分、ヒトの栄養素サプリメント、またはパーソナルケアもしくは化粧品成分。
【請求項２６】
微細藻類脂肪酸をさらに含有する、請求項２４に記載の着色剤、飼料成分、食料成分、ペットフード成分、ヒトの栄養素サプリメント、またはパーソナルケアもしくは化粧品成分。
【請求項２７】
前記目的の生成物の合成が、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩および尿素の１以上において十分な培養培地で起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記目的の生成物の合成が栄養素が欠乏した培養培地で起こり、さらに、２．６ｇ／Ｌを超える浸透圧調節物質、４５ｍＭのＮａＣｌ、３ｇ／Ｌを超える乳酸、成長温度をセ氏２度超える温度増加、およびその任意の組合せから選択される１つまたは複数の外因性因子と組み合わされる、請求項１２に記載の方法。
【請求項２９】
魚の飼料に用いられる、請求項３および２４に記載の微細藻類バイオマス。
【請求項３０】
サケ科魚類飼料に用いられる、請求項３および２４に記載の微細藻類バイオマス。
【請求項３１】
幼虫駆除剤として使用される、請求項３に記載の微細藻類バイオマス。
【請求項３２】
香味料または香りの改変剤として使用される、請求項３に記載の微細藻類バイオマス。
【請求項３３】
微細藻類培養条件によりプロフィールが変化する、請求項２４に記載の着色剤、飼料成分、食品成分、ペットフード成分、ヒトの栄養素サプリメント、またはパーソナルケアもしくは化粧品成分。
【請求項３４】
アスタキサンチンが総カロテノイドの５０％超を構成する、請求項２４に記載の着色剤、飼料成分、食品成分、ペットフード成分、ヒトの栄養素サプリメント、またはパーソナルケアもしくは化粧品成分。
【請求項３５】
アスタキサンチンが総カロテノイドの８５％超を構成する、請求項２４に記載の着色剤、飼料成分、食品成分、ペットフード成分、ヒトの栄養素サプリメント、またはパーソナルケアもしくは化粧品成分。
【請求項３６】
アスタキサンチンが、総カロテノイドの９８％超を構成する、請求項２４に記載の着色剤、飼料成分、食品成分、ペットフード成分、ヒトの栄養素サプリメント、またはパーソナルケアもしくは化粧品成分。
【請求項３７】
前記ｄｓＲＮＡが、少なくとも時間あたり０．０４ｍｇ／Ｌの比生産性率、ｑｐで生成される、請求項８に記載の方法。
【請求項３８】
前記異種タンパク質が、少なくとも時間あたり０．０８ｍｇ／Ｌの比生産性率、ｑｐで生成される、請求項８に記載の方法。
【請求項３９】
前記微細藻類培養物が、少なくとも０．６／日の比成長速度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
前記微細藻類培養物が、少なくとも０．７７／日の比成長速度を有する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記微細藻類培養物が、少なくとも１．０／日の比成長速度を有する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記比成長速度が、９６時間以上の期間にわたる、請求項３９、４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ｑｐが、少なくとも時間あたり３．７５ｍｇ／Ｌである、請求項９に記載の方法。
【請求項４４】
前記ｑｐが、少なくとも時間あたり５．５ｍｇ／Ｌである、請求項９に記載の方法。
【請求項４５】
前記培養のステップが、約４日〜約１週間の間、行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項４６】
前記目的の生成物の合成が、前記培養培地が２．５ｍＭを超えるアンモニウムを有する場合に起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項４７】
前記目的の生成物の合成が、前記培養培地が２．５ｍＭを超えるアンモニウムを有する場合に起こり、さらに２．６ｇ／Ｌを超える浸透圧調節物質の添加、４５ｍＭＮａＣｌの添加、３ｇ／Ｌを超える乳酸の添加、および成長温度をセ氏２度超える温度増加、およびそれらの組み合わせから選択される１以上の外因性因子と組み合わせる、請求項４６の方法。
【請求項４８】
比生産性率が、時間当たり少なくとも５０ｍｇ／Ｌである、請求項３に記載の方法。
【請求項４９】
比生産性率が、時間当たり少なくとも１６７ｍｇ／Ｌである、請求項３に記載の方法。
【請求項５０】
比生産性率が、時間当たり少なくとも２５０ｍｇ／Ｌである、請求項３に記載の方法。