【手続補正書】
【提出日】令和2年9月18日(2020.9.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体の腫瘍からの組織試料中のヒアルロン酸（ＨＡ）含有量をスコアリングすることによって、ＨＡ治療が有効である前記個体を同定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ａ）  組織試料をＨＡ染色することによって、組織試料中のＨＡを可視化すること；及び
（ｂ）  全腫瘍表面積で割った、バックグラウンドを上回る任意の強度のＨＡ染色を有する腫瘍関連細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の面積を決定して、ＨＡスコアを作成するための百分率を得ることであって、閾値以上のＨＡスコアは高ＨＡと呼ばれ、閾値未満のＨＡスコアは低ＨＡと呼ばれ、高ＨＡスコアがＨＡ治療が有効である個体を示す、得ること
を含む、方法。
【請求項２】
バックグラウンドを上回る任意の強度の染色が、弱い（１＋）ＨＡ染色、中程度（２＋）のＨＡ染色及び強い（３＋）ＨＡ染色を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
全腫瘍表面積で割った、バックグラウンドを上回る任意の強度のＨＡ染色を有する腫瘍関連ＥＣＭの面積を百分率で決定することが、
（ａ）  （ｉ）全腫瘍表面積にわたって弱い（１＋）ＨＡ染色を有する腫瘍関連ＥＣＭの面積を百分率で；（ｉｉ）全腫瘍表面積にわたって中程度（２＋）のＨＡ染色を有する腫瘍関連ＥＣＭの面積を百分率で；及び（ｉｉｉ）全腫瘍表面積にわたって強い（３＋）ＨＡ染色を有する腫瘍関連ＥＣＭの面積を百分率で、個別に決定すること；並びに
（ｂ）  （ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の合計を計算すること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
腫瘍表面が腫瘍細胞及び関連する間質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
腫瘍表面が壊死領域を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
非腫瘍関連間質が被膜である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
バックグラウンドが、ＨＡの読み取りを妨げない、弱い又は知覚できない非特異的染色を指す、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
閾値が５０％である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
アフィニティー組織化学的なＨＡ染色が施されている、個体の腫瘍からの組織試料のデジタル画像をスコアリングすることによって、ヒアルロン酸（ＨＡ）指向治療が有効な前記個体を同定するためのシステムであり、
プロセッサとプロセッサに結合したメモリとを備える画像解析システムを備えるシステムであって、メモリは、プロセッサにより実行されると：
画像内の腫瘍関連細胞外マトリックス（ＥＣＭ）面積を同定すること；
画像内の全腫瘍表面積を同定すること；及び
画像内のピクセルを：
ピクセルが腫瘍関連ＥＣＭ面積内にあるかどうか、
ピクセルが、バックグラウンド染色とＨＡ特異的染色との間のカットオフである第１の閾値レベル、任意選択的に、ピクセルのＨＡ染色強度が含まれる一組の所定の範囲のうちの１つである第１の閾値レベルを上回る強度を有するかどうか
に従って分類すること；及び
一組のスコアリングルールを画像に適用して、バックグラウンドを上回るＨＡ染色を有する腫瘍関連ＥＣＭの面積を全腫瘍表面積で割った関数であるＨＡスコアを計算することであって、第２の閾値を超えるＨＡスコアがＨＡ治療に対する応答の予測である、計算すること
を含む動作をプロセッサに実行させるコンピュータ実行可能命令を格納する、システム。
【請求項１０】
ＨＡスコアが、式１：
2019533149.tif 000001
［式中、
・  面積（ＥＣＭ）は、バックグラウンドを上回る任意の強度でＨＡ染色を有する腫瘍関連細胞外マトリックスの面積であり、
・  面積（ＴＳ）は腫瘍表面の全表面積である］
に従って計算される、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
一組の所定のＨＡ染色強度範囲が、（ｉ）低染色強度範囲、（ｉｉ）中染色強度範囲、及び（ｉｉｉ）強染色強度範囲を含み、ＨＡスコアは、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）のそれぞれを個別に全腫瘍表面積で割った関数である、請求項９に記載のシステム。
【請求項１２】
ＨＡスコアが、式３：
2019533149.tif 000002
［式中、
・  面積（ＥＣＭｌｏｗ）は、低染色強度範囲内のＨＡ染色強度を有する腫瘍関連細胞外マトリックスの面積であり；
・  面積（ＥＣＭｍｅｄ）は、中染色強度範囲内のＨＡ染色強度を有する腫瘍関連細胞外マトリックスの面積であり；
・  面積（ＥＣＭｈｉｇｈ）は、強染色強度範囲内のＨＡ染色強度を有する腫瘍関連細胞外マトリックスの面積であり；
・  面積（ＴＳ）は、全腫瘍表面積である］
に従って計算される、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
動作が、
ピクセルのＨＡ染色強度に基づいて腫瘍関連ＥＣＭ面積のピクセルを複数の色のうちの１つに変換することによって変換画像を生成することであって、第１の閾値レベルを下回るＨＡ染色強度を有するピクセルが第１の色を有し、第１の閾値レベルを上回るＨＡ染色強度を有するピクセルが第２の色を有し、第１の色は第２の色と異なっている、生成すること
を更に含む、請求項９に記載のシステム。
【請求項１４】
第１の閾値レベルを上回るＨＡ染色強度を有するピクセルが、ピクセルのＨＡ染色強度が含まれる一組の所定の範囲のうちの１つに従って分類され、動作が、
ピクセルのＨＡ染色強度に基づいて腫瘍関連ＥＣＭ面積のピクセルを複数の色のうちの１つに変換することによって変換画像を生成することであって、第１の閾値レベルを下回るＨＡ染色強度を有するピクセルが第１の色を有し、各所定の範囲内のピクセルに、第１の色とは異なり、かつ異なる所定の範囲内のピクセルとも異なる色が割り当てられる、生成すること
を更に含む、請求項９に記載のシステム。
【請求項１５】
画像解析システムに通信可能に接続された出力装置を更に備える請求項９から１４のいずれか一項に記載のシステムであって、
画像解析システムが画像解析システムからの１つ以上の出力を送るよう適合されており、前記出力がＨＡスコア、画像及び変換画像のうちの少なくとも１つを含み、及び／又は
組織試料の組織切片からのデジタル画像を生成するよう適合され、かつ、デジタル画像を画像解析システム又は非揮発性記憶媒体に送るのに適しているスキャナを更に備え、及び／又は
自動ＩＨＣ／ＩＳＨスライド染色機と、組織試料の未染色組織切片とを更に含み、自動ＩＨＣ／ＩＳＨスライド染色機が、ＨＡ未染色の組織切片を染色するよう適合されている、システム。
【請求項１６】
腫瘍が、乳房、肺、前立腺、膵臓、胃腸管又は尿生殖路の腫瘍である、請求項１に記載の方法、又は請求項９から１５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１７】
ＨＡ指向治療がＰＥＧＰＨ２０を含む、請求項１に記載の方法、又は請求項９から１６のいずれか一項に記載のシステム。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
以下の請求項で列挙される参照番号は、本特許出願の審査を容易にするためのみのものであって、例示的であり、図面中の対応する参照番号を有する特定の特徴に特許請求の範囲を限定することを決して意図しない。
＜さらなる実施態様＞
［実施態様１］
個体の腫瘍からの組織試料中のヒアルロン酸（ＨＡ）含有量をスコアリングすることによって、ＨＡ治療が有効である前記個体を同定する方法であって、
（ａ）  組織試料をＨＡ染色することによって、組織試料中のＨＡを可視化すること；及び
（ｂ）  全腫瘍表面積で割った、バックグラウンドを上回る任意の強度のＨＡ染色を有する腫瘍関連細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の面積を決定して、ＨＡスコアを作成するための百分率を得ることであって、閾値以上のＨＡスコアは高ＨＡと呼ばれ、閾値未満のＨＡスコアは低ＨＡと呼ばれ、高ＨＡスコアがＨＡ治療が有効である個体を示す、得ること
を含む、方法。
［実施態様２］
バックグラウンドを上回る任意の強度の染色が、弱い（１＋）ＨＡ染色、中程度（２＋）のＨＡ染色及び強い（３＋）ＨＡ染色を含む、実施態様１に記載の方法。
［実施態様３］
全腫瘍表面積で割った、バックグラウンドを上回る任意の強度のＨＡ染色を有する腫瘍関連ＥＣＭの面積を百分率で決定することが、
（ａ）  （ｉ）全腫瘍表面積にわたって弱い（１＋）ＨＡ染色を有する腫瘍関連ＥＣＭの面積を百分率で；（ｉｉ）全腫瘍表面積にわたって中程度（２＋）のＨＡ染色を有する腫瘍関連ＥＣＭの面積を百分率で；及び（ｉｉｉ）全腫瘍表面積にわたって強い（３＋）ＨＡ染色を有する腫瘍関連ＥＣＭの面積を百分率で、個別に決定すること；並びに
（ｂ）  （ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の合計を計算すること
を含む、実施態様１に記載の方法。
［実施態様４］
腫瘍が、乳房、肺、前立腺、膵臓、胃腸管又は尿生殖路の腫瘍である、実施態様１に記載の方法。
［実施態様５］
腫瘍表面が腫瘍細胞及び関連する間質を含む、実施態様１に記載の方法。
［実施態様６］
腫瘍表面が壊死領域を含まない、実施態様１に記載の方法。
［実施態様７］
非腫瘍関連間質が被膜である、実施態様６に記載の方法。
［実施態様８］
バックグラウンドが、ＨＡの読み取りを妨げない、弱い又は知覚できない非特異的染色を指す、実施態様１に記載の方法。
［実施態様９］
閾値が５０％である、実施態様１に記載の方法。
［実施態様１０］
ＨＡ治療がＰＥＧＰＨ２０を含む、実施態様１に記載の方法。
［実施態様１１］
患者における腫瘍の成長を阻害する方法であって、
（ａ）
（ｉ）  組織試料をＨＡ染色することによって、組織試料中のＨＡを可視化すること；及び
（ｉｉ）  全腫瘍表面積で割った、バックグラウンドを上回る任意の強度のＨＡ染色を有する腫瘍関連細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の面積を決定し、ＨＡスコアを作成するための百分率を得ることであって、閾値以上のＨＡスコアは高ＨＡと呼ばれる、得ること
によって決定される高ヒアルロン酸（ＨＡ）スコアを用いて、腫瘍を有する患者を同定することと、
（ｂ）  腫瘍の成長を阻害するように腫瘍微小環境を変える抗ＨＡ治療を、腫瘍を有する高ＨＡスコアの患者に施すこと
とを含む、方法。
［実施態様１２］
抗ＨＡ治療が、腫瘍に対する他の治療の利用を促進する、実施態様１１に記載の方法。
［実施態様１３］
抗ＨＡ治療がＰＥＧＰＨ２０を含む、実施態様１１に記載の方法。
［実施態様１４］
腫瘍が、乳房、肺、前立腺、膵臓、胃腸管又は尿生殖路の腫瘍である、実施態様１１に記載の方法。
［実施態様１５］
閾値が５０％である、実施態様１１に記載の方法。
［実施態様１６］
患者における腫瘍の腫瘍微小環境を変える方法であって、
（ａ）
（ｉ）  組織試料をＨＡ染色することによって、組織試料中のＨＡを可視化すること；及び
（ｉｉ）  全腫瘍表面積で割った、バックグラウンドを上回る任意の強度のＨＡ染色を有する腫瘍関連細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の面積を決定し、ＨＡスコアを作成するための百分率を得ることであって、閾値以上のＨＡスコアは高ＨＡと呼ばれる、得ること
によって決定される高ヒアルロン酸（ＨＡ）スコアを用いて、腫瘍を有する患者を同定することと、
（ｂ）  腫瘍のＥＣＭ中のＨＡを枯渇させることにより腫瘍微小環境を変える抗ＨＡ治療を、腫瘍を有する高ＨＡスコアの患者に施すこと
とを含む、方法。
［実施態様１７］
抗ＨＡ治療が、腫瘍に対する他の治療の利用を促進する、実施態様１６に記載の方法。
［実施態様１８］
抗ＨＡ治療がＰＥＧＰＨ２０を含む、実施態様１６に記載の方法。
［実施態様１９］
腫瘍が、乳房、肺、前立腺、膵臓、胃腸管又は尿生殖路の腫瘍である、実施態様１６に記載の方法。
［実施態様２０］
閾値が５０％である、実施態様１６に記載の方法。
［実施態様２１］
医学的処置に対する腫瘍の受容性を評価する方法であって、
（ａ）  組織試料をＥＣＭバイオマーカー染色することによって、腫瘍の組織試料中の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）バイオマーカーを可視化すること；並びに
（ｂ）  バックグラウンドを上回る任意の強度のＥＣＭバイオマーカー染色を有する腫瘍関連ＥＣＭの面積を決定し、該面積を全腫瘍表面積で割って、ＥＣＭバイオマーカースコアを得ること
を含み、
閾値以上のＥＣＭバイオマーカースコアは、医学的処置が腫瘍の成長を阻害するか、腫瘍の大きさを縮小するか又は腫瘍を排除するというように、腫瘍が医学的処置に対して受容性であることを示す、
方法。
［実施態様２２］
ＥＣＭバイオマーカーがヒアルロン酸（ＨＡ）である、実施態様２１に記載の方法。
［実施態様２３］
腫瘍が、乳房、肺、前立腺、膵臓、胃腸管又は尿生殖路の腫瘍である、実施態様２２に記載の方法。
［実施態様２４］
腫瘍中の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）バイオマーカーの含有量を決定する方法であって、
（ａ）  腫瘍の組織試料をＥＣＭバイオマーカー染色することによって、腫瘍の組織試料中のＥＣＭバイオマーカーを可視化すること；及び
（ｂ）  バックグラウンドを上回る任意の強度のＥＣＭバイオマーカー染色を有する腫瘍関連ＥＣＭの面積を決定し、該面積を全腫瘍表面積で割って、ECMバイオマーカースコアを得ること
を含み、
閾値以上のＥＣＭスコアは、腫瘍が高いＥＣＭバイオマーカー含有量を有することを示す、
方法。
［実施態様２５］
ＥＣＭバイオマーカーがヒアルロン酸（ＨＡ）である、実施態様２３に記載の方法。
［実施態様２６］
腫瘍が、乳房、肺、前立腺、膵臓、胃腸管又は尿生殖路の腫瘍である、実施態様２４に記載の方法。
［実施態様２７］
（ａ）  組織化学的にヒアルロン酸（ＨＡ）染色された組織切片のデジタル画像上の、腫瘍表面を含む関心領域（ＲＯＩ）にアノテーションをつけること；
（ｂ）  デジタル画像内の組織化学的なＨＡ染色を検出すること；及び
（ｃ）  式１又は式２：
2019533149.tif 000003
2019533149.tif 000004
［式中、
・  面積（ＥＣＭ染色）は、バックグラウンド染色を上回る、ＨＡの任意の染色強度を有する腫瘍関連ＥＣＭの面積であり；
・  面積（ＥＣＭ  ｗ／１＋）は、１＋のＨＡ染色強度を有する腫瘍関連ＥＣＭの面積であり；
・  面積（ＥＣＭ  ｗ／２＋）は、２＋のＨＡ染色強度を有する腫瘍関連ＥＣＭの面積であり；
・  面積（ＥＣＭ  ｗ／３＋）は、３＋のＨＡ染色強度を有する腫瘍関連ＥＣＭの面積であり；かつ、
・  面積（ＴＳ）は、ＲＯＩ内の腫瘍表面の全表面積である］
に従ってＨＡスコアを決定すること
を含む、方法。
［実施態様２８］
組織切片中のＴＳＧ６−Ｆｃ１ｂのＨＡへの特異的結合を促進する条件下で組織切片をＴＳＧ６とウサギＦｃの組換え融合体（ＴＳＧ６−Ｆｃ１ｂ）と接触させ、組織切片のＨＡに近接して色素の付着をもたらす条件下で、組織切片に結合したＴＳＧ６−Ｆｃ１ｂを検出試薬と反応させることによってＨＡ染色が付着する、実施態様２７に記載の方法。
［実施態様２９］
組織切片が、乳房、肺、前立腺、膵臓、胃腸管又は尿生殖路の腫瘍の切片である、実施態様２７又は２８に記載の方法。
［実施態様３０］
ＲＯＩが腫瘍表面からなる、実施態様２７から２９のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様３１］
プロセッサ；及び
プロセッサに結合したメモリであって、プロセッサにより実行されると、実施態様２７から３０のいずれか一項に記載の方法を含む動作をプロセッサに実行させるコンピュータ実行可能命令を格納するメモリ
を備えるシステム。
［実施態様３２］
組織試料のデジタル画像を取得し、該画像をコンピュータ装置に通信するのに適したスキャナ又は顕微鏡を更に備える、実施態様３１に記載のシステム。
［実施態様３３］
組織試料の１つ以上の切片を組織化学的にＨＡ染色するようにブログラムされた自動スライド染色機を更に備える、実施態様３１又は３２に記載のシステム。
［実施態様３４］
試料及び画像のワークフローを追跡するための臨床検査情報システム（ＬＩＳ）を更に備えるシステムであって、ＬＩＳは、組織試料に関する情報を受信及び格納するように構成された中央データベースを含み、情報は、
・  組織切片に対して施される処理工程、
・  組織切片のデジタル画像に対して実行される処理工程、及び
・  組織切片及びデジタル画像の処理履歴
のうちの少なくとも１つを含む、
実施態様３１から３３のいずれか一項に記載のシステム。
［実施態様３５］
実施態様２７から３０のいずれか一項に記載の方法を含む動作を実行するプロセッサによって実行されるコンピュータ実行可能命令を格納するための、非一時的コンピュータ可読記憶媒体。
［実施態様３６］
アフィニティー組織化学的なＨＡ染色が施されている、個体の腫瘍からの組織試料のデジタル画像をスコアリングすることによって、ヒアルロン酸（ＨＡ）指向治療が有効な前記個体を同定するためのシステムであり、
プロセッサとプロセッサに結合したメモリとを備える画像解析システムを備えるシステムであって、メモリは、プロセッサにより実行されると：
画像内の腫瘍関連細胞外マトリックス（ＥＣＭ）面積を同定すること；
画像内の全腫瘍表面積を同定すること；及び
画像内のピクセルを：
ピクセルが腫瘍関連ＥＣＭ面積内にあるかどうか、
ピクセルが、バックグラウンド染色とＨＡ特異的染色との間のカットオフである第１の閾値レベル、任意選択的に、ピクセルのＨＡ染色強度が低下する一組の所定の範囲のうちの１つである第１の閾値レベルを上回る強度を有するかどうか
に従って分類すること；及び
一組のスコアリングルールを画像に適用して、バックグラウンドを上回るＨＡ染色を有する腫瘍関連ＥＣＭの面積を全腫瘍表面積で割った関数であるＨＡスコアを計算することであって、第２の閾値を超えるＨＡスコアがＨＡ治療に対する応答の予測である、計算すること
を含む動作をプロセッサに実行させるコンピュータ実行可能命令を格納する、システム。
［実施態様３７］
ＨＡスコアが、式１：
2019533149.tif 000005
［式中、
・  面積（ＥＣＭ）は、バックグラウンドを上回るＨＡスコアを有する腫瘍関連細胞外マトリックスの面積であり、
・  面積（ＴＳ）は腫瘍表面の全表面積である］
に従って計算される、実施態様３６に記載のシステム。
［実施態様３８］
一組の所定のＨＡ染色強度範囲が、（ｉ）低染色強度範囲、（ｉｉ）中染色強度範囲、及び（ｉｉｉ）強染色強度範囲を含み、ＨＡスコアが、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）のそれぞれを個々に全腫瘍表面積で割った関数である、実施態様３６に記載のシステム。
［実施態様３９］
ＨＡスコアが、式３：
2019533149.tif 000006
［式中、
・  面積（ＥＣＭｌｏｗ）が低染色強度範囲内のＨＡ染色強度を有する腫瘍関連細胞外マトリックスの面積であり；
・  面積（ＥＣＭｍｅｄ）が中染色強度範囲内のＨＡ染色強度を有する腫瘍関連細胞外マトリックスの面積であり；
・  面積（ＥＣＭｈｉｇｈ）が強染色強度範囲内のＨＡ染色強度を有する腫瘍関連細胞外マトリックスの面積であり；
・  面積（ＴＳ）が全腫瘍表面積である］
に従って計算される、実施態様３８に記載のシステム。
［実施態様４０］
動作が、
ピクセルのＨＡ染色強度に基づいて腫瘍関連ＥＣＭ面積のピクセルを複数の色のうちの１つに変換することによって変換画像を生成することであって、第１の閾値レベルを下回るＨＡ染色強度を有するピクセルが第１の色を有し、第１の閾値レベルを上回るＨＡ染色強度を有するピクセルが第２の色を有し、第１の色は第２の色と異なっている、生成すること
を更に含む、実施態様３６に記載のシステム。
［実施態様４１］
第１の閾値レベルを上回るＨＡ染色強度を有するピクセルが、ピクセルのＨＡ染色強度が低下する一組の所定の範囲のうちの１つに従って分類され、動作が、
ピクセルのＨＡ染色強度に基づいて腫瘍関連ＥＣＭ面積のピクセルを複数の色のうちの１つに変換することによって変換画像を生成することであって、第１の閾値レベルを下回るＨＡ染色強度を有するピクセルが第１の色を有し、各所定の範囲内のピクセルに、第１の色とは異なり、かつ異なる所定の範囲内のピクセルとも異なる色が割り当てられる、生成すること
を更に含む、実施態様３６に記載のシステム。
［実施態様４２］
画像解析システムに通信可能に接続された出力装置を更に備える実施態様３６から４１のいずれか一項に記載のシステムであって、画像解析システムが画像解析システムからの１つ以上の出力を送るのに適しており、前記出力がＨＡスコア、画像及び変換画像のうちの少なくとも１つを含む、システム。
［実施態様４３］
組織試料の組織切片からのデジタル画像を生成するのに適し、かつ、デジタル画像を画像解析システム又は非揮発性記憶媒体に送るのに適しているスキャナを更に備える、実施態様３６から４２のいずれか一項に記載のシステム。
［実施態様４４］
自動ＩＨＣ／ＩＳＨスライド染色機と、組織試料の未染色組織切片とを更に含み、自動ＩＨＣ／ＩＳＨスライド染色機が、ＨＡ未染色の組織切片を染色するのに適している、実施態様３６から４３のいずれか一項に記載のシステム。
［実施態様４５］
自動ＩＨＣ／ＩＳＨスライド染色機がＴＳＧ−６ベースのプローブと、ＴＳＧ−６ベースのプローブと適合性のある一組の特異的検出試薬とを含む、実施態様４４に記載のシステム。
［実施態様４６］
ＴＳＧ−６ベースのプローブがＴＳＧ−６−Ｆｃ融合体である、実施態様４５に記載のシステム。
［実施態様４７］
自動ＩＨＣ／ＩＳＨスライド染色機が、表１に記載のＴＳＧ６−Ｆｃ融合体と検出試薬との組み合わせを含む、実施態様４６に記載のシステム。
［実施態様４８］
第２の閾値が５０％である、実施態様３７又は３９に記載のシステム。
［実施態様４９］
腫瘍が、乳房、肺、前立腺、膵臓、胃腸管又は尿生殖路の腫瘍である、実施態様３６から４８のいずれか一項に記載のシステム。
［実施態様５０］
ＨＡ指向治療がＰＥＧＰＨ２０を含む、実施態様３６から４９のいずれか一項に記載のシステム。