【手続補正書】
【提出日】令和2年5月28日(2020.5.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオマーカーパネルの使用方法であって、
ａ．生体試料を準備し、前記バイオマーカーパネルの各バイオマーカーのレベルを前記試料において測定し、前記パネルが、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）／パルミトレイン酸（Ｃ１６：１  ｎ７）、チロシン、フルクトース、フルクトース／グルコース、グリコケノデオキシコール酸（ＧＣＤＣＡ）およびグリココール酸（ＧＣＡ）少なくとも１つのバイオマーカーを含む工程と、
ｂ．測定された前記レベルを肝疾患状態と相関させる工程と、
ｃ．前記相関に基づいて、前記生体試料が前記肝疾患状態を有することを判定する工程とを含む方法。
【請求項２】
前記パネルが、セリン、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、７−ケトリトコール酸（７−ＫＬＣＡ）、アラキドン酸（Ｃ２０：４  ｎ６）、シトルリン、メチオニン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、トレオニン、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、パルミトレイン酸（Ｃ１６：１  ｎ７）、タウロケノデオキシコール酸（ＴＣＤＣＡ）、タウロコール酸（ＴＣＡ）、１２−メチルトリデカン酸（Ｃ１４：０  イソ）、１３−メチルミリスチン酸（Ｃ１５：０  イソ）、リノエライジン酸（Ｃ１８：２  ｎ６ｔ）、エライジン酸（Ｃ１８：１  ｎ９ｔ）、β−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、グリコウルソデオキシコール酸（ＧＵＤＣＡ）、７−ケトコール酸（７−ＫＬＣＡ）、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）、ミリストレイン酸（Ｃ１４：１  ｎ５）、パルミトレイン酸（Ｃ１６：１  ｎ７）、エライジン酸（Ｃ１８：１  ｎ９ｔ）、エルカ酸（Ｃ２２：１  ｎ９）、ドコサテトラエン酸（Ｃ２２：４  ｎ−６）／アラキドン酸（Ｃ２０：４  ｎ６）、リノール酸（Ｃ１８：２  ｎ６）／γ−リノレン酸（Ｃ１８：３  ｎ６）の各々を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記相関させる工程が、前記少なくとも１つのバイオマーカーの測定された前記レベルからスコアを計算する工程であって、前記スコアがモデルからの出力であって、前記モデルが前記パネルの各バイオマーカーの測定された前記レベルの入力に基づいて実行される工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記判定する工程が、計算された前記スコアを閾値スコアと比較する工程であって、前記生体試料が、前記スコアが前記閾値スコアを超える場合に前記肝疾患状態を有すると判定される工程を含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記肝疾患状態が、肝疾患の存在、または肝疾患ステージまたは肝疾患重症度の存在である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記肝疾患状態が、肝炎、脂肪性肝炎、ＮＡＳＨ、線維症および肝硬変から選択される請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記判定する工程が、計算された前記スコアを１つ以上の閾値スコアと比較する工程であって、前記１つ以上の閾値スコアが、肝疾患のより高いステージまたは重症度から前記肝疾患のより低いステージまたは重症度を識別する閾値に対応する工程を含む請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記肝疾患が線維症である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
複数の前記閾値の１つ以上が非肝硬変線維症のステージを識別する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
１つ以上の閾値スコアが肝硬変のステージを識別する請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記１つ以上の閾値スコアが、肝硬変と非肝硬変線維症とを識別する第１の閾値を含み、かつ
非肝硬変線維症のステージを識別する第２の閾値を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記１つ以上の閾値スコアが、肝硬変のステージを識別する第２の閾値を含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記相関させる工程が、前記少なくとも１つのバイオマーカーの各々の測定された前記レベルを各々の対照レベルと比較する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記判定する工程が、質量分析（ＭＳ）によって測定する工程のための前記試料を調製する工程を含み、
前記ＭＳが、飛行時間ＭＳ、イオントラップＭＳ、四重極ＭＳ、磁場セクターＭＳ、イオンサイクロトロン共鳴ＭＳおよび静電場セクター分析計ＭＳの１つ以上を含む請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法が、前記少なくとも１つのバイオマーカーを前記試料から抽出する工程を含み、
前記抽出する工程が、前記試料を濾過して濾液を得る工程、および前記濾液中の前記少なくとも１つのバイオマーカーを測定する工程を含む請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法が、濾過の前にタンパク質沈殿の工程を含み、
前記少なくとも１つのバイオマーカーを１つ以上の他のバイオマーカーから分離する工程を含み、かつ
前記分離する工程が、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）または液体クロマトグラフィー（ＬＣ）を含む請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記測定する工程が、超高速液体クロマトグラフィー−トリプル四重極質量分析（ＵＰＬＣ−ＴＱＭＳ）を含み、
前記ＵＰＬＣ−ＴＱＭＳが負イオンモードで実施される請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記測定する工程が、酵素的分析、化学的分析、比色的分析または蛍光定量的分析を含む請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
表１に列記される複数のバイオマーカーを検出するためのキットであって、
ａ．前記キットが少なくとも１つの内部標準を含み、
ｂ．前記少なくとも１つの内部標準が、
ｉ．天然に存在する血液、血漿、または血清ではなく、
ｉｉ．任意に同位体標識され、かつ
ｉｉｉ．表１に列記される前記バイオマーカーのうちの少なくとも１つに対応するキット。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの内部標準が、複数の内部標準であり、一括して、前記複数の内部標準が、パネルにおける前記バイオマーカーの各々に対応する内部標準を含み、前記パネルが、表３Ａまたは表３Ｂに列記される前記パネルのいずれかを含む請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記複数の内部標準が、ステロイド酸、脂肪酸、アミノ酸、またはそれらの組み合わせを含み、任意に、前記ステロイド酸が、胆汁酸である請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記ステロイド酸、前記脂肪酸、前記アミノ酸、またはそれらの前記組み合わせの各々が、前記パネルのそれぞれのバイオマーカーの安定同位体標識された変形体であり、任意に、前記キットが、前記パネルの各バイオマーカーの安定同位体標識された変形体を含む請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
フィルターをさらに備え、前記少なくとも１つの内部標準が、前記フィルターに含まれ、
容器をさらに備え、前記少なくとも１つの内部標準が、前記容器中に提供され、
前記少なくとも１つの内部標準が、混合物として提供される複数の内部標準であり、
前記少なくとも１つの内部標準が、フリーズドライされ、
前記少なくとも１つの内部標準が、ＧＣ−ＭＳまたはＬＣ−ＭＳ用に構成される請求項１９〜２２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２４】
複数の容器を備え、各容器が、前記少なくとも１つの内部標準の一部を含む請求項１９〜２２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２５】
ａ．請求項１９〜２４のいずれか一項に記載のキットを準備する工程と、
ｂ．請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法を行う工程であって、前記試料を、前記測定する工程の前に前記少なくとも１つの内部標準と混合する工程とを含むキットの使用方法。
【請求項２６】
パルミチン酸（Ｃ１６：０）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）／パルミトレイン酸（Ｃ１６：１  ｎ７）、チロシン、フルクトース、フルクトース／グルコース、グリコケノデオキシコール酸（ＧＣＤＣＡ）、グリココール酸（ＧＣＡ）、セリン、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、７−ケトリトコール酸（７−ＫＬＣＡ）、アラキドン酸（Ｃ２０：４  ｎ６）、シトルリン、メチオニン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、トレオニン、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、パルミトレイン酸（Ｃ１６：１  ｎ７）、タウロケノデオキシコール酸（ＴＣＤＣＡ）、タウロコール酸（ＴＣＡ）、１２−メチルトリデカン酸（Ｃ１４：０  イソ）、１３−メチルミリスチン酸（Ｃ１５：０  イソ）、リノエライジン酸（Ｃ１８：２  ｎ６ｔ）、エライジン酸（Ｃ１８：１  ｎ９ｔ）、β−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、グリコウルソデオキシコール酸（ＧＵＤＣＡ）、７−ケトコール酸（７−ＫＬＣＡ）、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）、ミリストレイン酸（Ｃ１４：１  ｎ５）、パルミトレイン酸（Ｃ１６：１  ｎ７）、エライジン酸（Ｃ１８：１  ｎ９ｔ）、エルカ酸（Ｃ２２：１  ｎ９）、ドコサテトラエン酸（Ｃ２２：４  ｎ−６）／アラキドン酸（Ｃ２０：４  ｎ６）、リノール酸（Ｃ１８：２  ｎ６）／γ−リノレン酸（Ｃ１８：３  ｎ６）の少なくとも１つのバイオマーカーパネル。