(57)【要約】  下記性質（１）〜（３）を有することを特徴とする、ＣＳ又はその塩の画分を提供すること。性質（１）：ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した重量平均分子量が、５，０００〜２０，０００である。性質（２）：硫黄含量が６．５〜８％である。性質（３）：ローリー法によって測定したタンパク質含量が、０．１％以下である。  また、下記工程（１）及び（２）を少なくとも含むことを特徴とする、上記画分の製造方法を提供すること。（１）コンドロイチン硫酸又はその塩にコンドロイチン硫酸分解酵素を接触させる工程。（２）前記接触後の、コンドロイチン硫酸又はその塩を含有する画分から、不純物を除去する工程。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記性質（１）〜（３）を有することを特徴とする、コンドロイチン硫酸又はその塩の画分。
（１）：ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した重量平均分子量が、５，０００〜２０，０００である。
（２）：硫黄含量が、６．５〜８％である。
（３）：ローリー法によって測定したタンパク質含量が、０．１％以下である。
【請求項２】
下記性質（４）をさらに有することを特徴とする、請求項１に記載の画分。
（４）：ゲル濾過クロマトグラフィーで測定した分子量分散度が、１．５〜２．２である。
【請求項３】
下記性質（５）をさらに有することを特徴とする、請求項１又は２に記載の画分。
（５）：極限粘度が０．３〜０．５（dl/g）である。
【請求項４】
下記性質（６）をさらに有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の画分。
（６）：二糖分析の結果が以下の通りである。
ΔＤｉ−０Ｓ：１．８％以上３．５％未満
ΔＤｉ−６Ｓ：４０％以上５０％未満
ΔＤｉ−４Ｓ：２５％以上３３％未満
ΔＤｉ−ｄｉＳD：１５％以上２２％未満
ΔＤｉ−ｄｉＳE：３％以上４％未満
ΔＤｉ−ｔｒｉＳ：０％以上４％未満
【請求項５】
下記性質（７）〜（１１）をさらに有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の画分。
（７）：塩化物含量が０．１４２％以下である。
（８）：無機硫酸塩含量が０．２４％以下である。
（９）：重金属含量が２０ｐｐｍ以下である。
（１０）：ヒ素含量が２ｐｐｍ以下である。
（１１）：窒素含量が２〜４％である。
【請求項６】
下記性質（１２）をさらに有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の画分。
（１２）：本画分１gを１００mlの水溶液としたときのｐＨが６〜７である。
【請求項７】
下記性質（１３）〜（１７）をさらに有することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の画分。
（１３）：旋光度が−１５°〜−１８°である。
（１４）：本画分１gを１００mlの水溶液としたときに、無色澄明である。
（１５）：粉末状態としたときに、白色である。
（１６）：乾燥減量が１〜７％である。
（１７）：強熱残分が２３〜３１％である。
【請求項８】
下記性質（１８）をさらに有することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の画分。
（１８）：還元性末端基測定法により算出される分子量が、１５０，０００〜４００，０００である。
【請求項９】
コンドロイチン硫酸又はその塩が、サメ由来であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の画分。
【請求項１０】
コンドロイチン硫酸又はその塩に、コンドロイチン硫酸分解酵素を作用させることによって得られることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の画分。
【請求項１１】
コンドロイチン硫酸分解酵素が、リアーゼであることを特徴とする、請求項１０に記載の画分。
【請求項１２】
コンドロイチン硫酸分解酵素が、コンドロイチナーゼＡＣＩＩ、コンドロイチナーゼＡＣＩ、又はコンドロイチナーゼＡＢＣであることを特徴とする、請求項１０に記載の画分。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の画分を含有することを特徴とする、医薬原料。
【請求項１４】
下記工程（１）及び（２）を少なくとも含むことを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の画分の製造方法。
（１）コンドロイチン硫酸又はその塩にコンドロイチン硫酸分解酵素を接触させる工程。
（２）前記接触後の、コンドロイチン硫酸又はその塩を含有する画分から、不純物を除去する工程。
【請求項１５】
下記工程（１）及び（２）を少なくとも含むことを特徴とする、請求項１３に記載の医薬原料の製造方法。
（１）コンドロイチン硫酸又はその塩にコンドロイチン硫酸分解酵素を接触させる工程。
（２）前記接触後の、コンドロイチン硫酸又はその塩を含有する画分から、不純物を除去する工程。
【請求項１６】
コンドロイチン硫酸分解酵素が、リアーゼであることを特徴とする、請求項１４又は請求項１５に記載の製造方法。
【請求項１７】
コンドロイチン硫酸分解酵素が、コンドロイチナーゼＡＣＩＩ、コンドロイチナーゼＡＣＩ、又はコンドロイチナーゼＡＢＣであることを特徴とする、請求項１４又は請求項１５に記載の製造方法。
【請求項１８】
下記工程（３）をさらに含むことを特徴とする、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の製造方法。
（３）コンドロイチン硫酸又はその塩を含有する画分に、過酸化水素を作用させる工程。
【請求項１９】
工程（３）が、前記の工程（１）と工程（２）の間に行われることを特徴とする、請求項１８に記載の製造方法。
【請求項２０】
不純物を除去する工程が、アルコール沈殿による分画、および/又は活性炭処理を行う工程を含むことを特徴とする、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２１】
下記工程（１）及び（２）によって得られる、コンドロイチン硫酸又はその塩の画分。
（１）コンドロイチン硫酸又はその塩にコンドロイチン硫酸分解酵素を接触させる工程。
（２）前記接触後の、コンドロイチン硫酸又はその塩を含有する画分から、不純物を除去する工程。
【請求項２２】
請求項２１に記載の画分を含有することを特徴とする医薬原料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規コンドロイチン硫酸画分及びその製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
コンドロイチン硫酸（以下、「ＣＳ」と略記する。）は、グリコサミノグリカンの一種である。
ＣＳを分解する酵素としては、コンドロイチナーゼＡＣＩ、コンドロイチナーゼＡＣＩＩ、コンドロイチナーゼＡＢＣ（非特許文献１参照。）等が知られている。
非特許文献２には、上記の酵素によってＣＳから不飽和二糖を生成させ、これを検出することにより、当該酵素の活性を測定する方法が開示されている。しかし、上記のような酵素を用いて、ある程度のサイズを保持しつつ低分子化されたＣＳ画分を製造すること、及びこのようにして得られた低分子化されたＣＳ画分を医薬原料として利用することについては、記載も示唆もない。【０００３】
【非特許文献１】ハマイら、１９９７年、ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２７２巻、第１４号、ｐ．９１２３−９１３０
【非特許文献２】ヤマガタら、１９６８年、ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２４３巻、第７号、ｐ．１５２３−１５３５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、特に医薬原料として有用な、新規ＣＳ又はその塩の画分及びその製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、医薬原料、特にＣＳ・鉄コロイド製剤（chondroitin sulfate iron colloid）の原料として有用なＣＳ又はその塩の新規な画分を提供するに至り、本発明を完成させた。【０００６】
すなわち本発明は、下記性質（１）〜（３）を有することを特徴とする、ＣＳ又はその塩の画分（以下、「本発明画分１」という。）を提供する。
（１）：ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した重量平均分子量が、５，０００〜２０，０００である。
（２）：硫黄含量が６．５〜８％である。
（３）：ローリー法によって測定したタンパク質含量が、０．１％以下である。
また、本発明画分１は、下記性質（４）をさらに有することが好ましい。
（４）：ゲル濾過クロマトグラフィーで測定した分子量分散度が、１．５〜２．２である。
また、本発明画分１は、下記性質（５）をさらに有することが好ましい。
（５）：極限粘度が０．３〜０．５（dl/g）である。
また、本発明画分１は、下記性質（６）をさらに有することが好ましい。
（６）：二糖分析の結果が以下の通りである。
ΔＤｉ−０Ｓ：１．８％以上３．５％未満
ΔＤｉ−６Ｓ：４０％以上５０％未満
ΔＤｉ−４Ｓ：２５％以上３３％未満
ΔＤｉ−ｄｉＳD：１５％以上２２％未満
ΔＤｉ−ｄｉＳE：３％以上４％未満
ΔＤｉ−ｔｒｉＳ：０％以上４％未満
また、本発明画分１は、下記性質（７）〜（１１）をさらに有することが好ましい。
（７）：塩化物含量が０．１４２％以下である。
（８）：無機硫酸塩含量が０．２４％以下である。
（９）：重金属含量が２０ｐｐｍ以下である。
（１０）：ヒ素含量が２ｐｐｍ以下である。
（１１）：窒素含量が２〜４％である。【０００７】
また、本発明画分１は、下記性質（１２）をさらに有することが好ましい。
（１２）：本画分１gを１００mlの水溶液としたときのｐＨが６〜７である。【０００８】
また、本発明画分１は、下記性質（１３）〜（１７）をさらに有することが好ましい。
（１３）：旋光度が−１５°〜−１８°である。
（１４）：本画分１gを１００mlの水溶液としたときに、無色澄明である。
（１５）：粉末状態としたときに、白色である。
（１６）：乾燥減量が１〜７％である。
（１７）：強熱残分が２３〜３１％である。【０００９】
また、本発明画分１は、下記性質（１８）をさらに有することが好ましい。
（１８）：還元性末端基測定法により算出される分子量が、１５０，０００〜４００，０００である。【００１０】
また、本発明において、ＣＳ又はその塩は、サメ由来であるものが好ましい。【００１１】
また、本発明画分１は、ＣＳ又はその塩に、ＣＳ分解酵素を作用させることによって得られるものであることが好ましい。【００１２】
また、前記ＣＳ分解酵素は、リアーゼであることが好ましく、コンドロイチナーゼＡＣＩＩ、コンドロイチナーゼＡＣＩ、又はコンドロイチナーゼＡＢＣであることがより好ましい。
また、本発明は、本発明画分１を含有することを特徴とする、医薬原料（以下、「本発明医薬原料１」という。）を提供する。
さらに、本発明は、下記工程（１）及び（２）を少なくとも含むことを特徴とする、本発明画分１の製造方法（以下、「本発明製造方法１」という。）を提供する。
（１）ＣＳ又はその塩にＣＳ分解酵素を接触させる工程。
（２）前記接触後の、ＣＳ又はその塩を含有する画分から、不純物を除去する工程。
さらに、本発明は、下記工程（１）及び（２）を少なくとも含むことを特徴とする、本発明医薬原料１の製造方法（以下、「本発明製造方法２」という。）を提供する。
（１）ＣＳ又はその塩にＣＳ分解酵素を接触させる工程。
（２）前記接触後の、ＣＳ又はその塩を含有する画分から、不純物を除去する工程。【００１３】
本発明製造方法１及び２において用いるＣＳ分解酵素は、リアーゼであることが好ましく、コンドロイチナーゼＡＣＩＩ、コンドロイチナーゼＡＣＩ、又はコンドロイチナーゼＡＢＣであることが好ましい。【００１４】
本発明製造方法１及び２は、いずれも、下記工程（３）をさらに含むことが好ましい。
（３）ＣＳ又はその塩を含有する画分に、過酸化水素を作用させる工程。【００１５】
この工程（３）は、本発明製造方法１及び２における工程（１）と工程（２）の間に行われることが好ましい。【００１６】
また、本発明製造方法１及び２における、不純物を除去する工程は、アルコール沈殿による分画、および/又は活性炭処理を行う工程を含むことが好ましい。【００１７】
また、本発明は、下記工程（１）及び（２）によって得られる、ＣＳ又はその塩の画分（以下、「本発明画分２」という。）を提供する。
（１）ＣＳ又はその塩にＣＳ分解酵素を接触させる工程。
（２）前記接触後の、ＣＳ又はその塩を含有する画分から、不純物を除去する工程。【００１８】
また、前記ＣＳ分解酵素は、リアーゼであることが好ましく、コンドロイチナーゼＡＣＩＩ、コンドロイチナーゼＡＣＩ、又はコンドロイチナーゼＡＢＣであることがより好ましい。【００１９】
また、本発明は、本発明画分２を含有することを特徴とする医薬原料（以下、「本発明医薬原料２」という。）を提供する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、医薬としたときに非常に優れた製剤学的特性を発揮しうるＣＳ又はその塩の画分、これを含有する医薬原料、これらの製造方法等を提供できることから極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、発明を実施するための最良の形態により本発明を詳説する。なお、本明細書での「％」表記の単位は、特にことわらない限り「重量％」を意味する。ただし二糖分析における不飽和二糖の含有率については、不飽和二糖の含有モル比を「％」で表す。【００２２】
また、本明細書において、以下に述べる性質（１）〜（１８）に記載されているパラメータは、特にことわりのない場合、本明細書中の実施例に記載した分析方法によって決定されるものである。特に、性質（７）に記載されている塩化物含量は、後述する（f）塩化物含量（実施例２）の方法により決定される値である。また、性質（８）に記載されている無機硫酸塩含量は、後述する（g）無機硫酸塩含量（実施例２）に記載の方法により決定される値である。【００２３】
＜１＞本発明画分１
本発明画分１は、下記性質（１）〜（３）を有することを特徴とする、ＣＳ又はその塩の画分である。
性質（１）：ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した重量平均分子量が、５，０００〜２０，０００である。
性質（２）：硫黄含量が、６．５〜８％である。
性質（３）：ローリー法によって測定したタンパク質含量が、０．１％以下である。
本発明画分１は、ＣＳ又はその塩を含有し、上記の性質（１）〜（３）を有する限りにおいて、特に限定されない。
また、本出願書類において「画分」という場合、その状態も特に限定されず、精製水、緩衝液、生理食塩水等の適当な溶媒に溶解した溶液状態でもよく、固体の状態（粉末等や、溶液が凍結した状態等）でもよい。【００２４】
本発明画分１は、ＣＳ又はその塩の、どちらか一方を含有していてもよく、両方を含有していてもよい。ここで、ＣＳの塩としては、例えばアルカリ金属塩（ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩や、ジエタノールアミン塩、シクロへキシルアミン塩、アミノ酸塩等の有機塩基との塩などが例示される。
また、本発明画分１は、ＣＳ又はその塩のみを含有しても良く、それ以外の成分をさらに含有していても良い。そのような成分としては、医薬、医薬原料、試薬、試薬原料、化粧品、化粧品原料、食品添加物、薬学的に許容される担体（例えば、緩衝剤や安定化剤など。）等が例示されるが、これらに限定されるものではない。
本発明画分１の製造方法も特に限定されないが、例えば天然資源から公知の方法で抽出したＣＳ又はその塩を低分子化することによって製造することが出来る。天然資源から抽出したＣＳ又はその塩は市販のものを使用してもよい。ＣＳ又はその塩の原料として用いることができる天然資源としては、具体的にはサメ、サケ、エイ及びイカ等の水産動物の軟骨、鯨の軟骨（特に鼻軟骨）、牛、豚等の哺乳動物又は鳥類の気管等が例示される。なかでも水産動物としてはサメが好ましく、哺乳動物としては、牛が好ましい。これらの天然資源から抽出したＣＳ又はその塩はいずれも十分に安全性が高いものであるが、人畜共通感染症（例えばウシについては牛海綿状脳症（BSE）、牛痘、偽牛痘等が挙げられる）が見出されていない動物という観点では、サメであることが好ましい。サメとしては、具体的には吉切サメ等のいわゆる水物、アオザメ及びメジロザメ等のいわゆる堅物等が例示される。また、使用するサメの部位も特に限定されないが、ＣＳ又はその塩を豊富に含有するという観点では、軟骨又はヒレであることが好ましい。
上記の様な天然資源からＣＳ又はその塩を抽出する方法としては、粉砕、中性塩法、アルカリ法、タンパク質分解酵素を用いる方法、オートクレーブを用いる方法、第四級アンモニウム塩を用いる方法に例示される、公知の方法を用いることが出来る。
本発明画分１は、このようにして取得したＣＳ又はその塩を低分子化することによって得ることが出来る。低分子化する方法としては、例えば、ＣＳ分解酵素による処理、オートクレーブ等による高温・高圧処理、高回転数による剪断処理、化学的な分解処理等が例示されるが、均一に低分子化され、より高い割合で硫酸基を保持したＣＳ又はその塩の画分が得られ、且つ医薬（例えば、ＣＳ・鉄コロイド製剤）としたときに非常に優れた製剤学的特性（例えば、ろ過性が高い、製剤学的に問題となる異物を生じない、優れた粒子径を有するコロイドを形成する等）を発揮しうるという観点から、ＣＳ分解酵素による処理が好ましい。
ここで、ＣＳ分解酵素による処理とは、ＣＳ又はその塩にＣＳ分解酵素を接触させることにより、ＣＳ又はその塩を低分子化することをいう。
ＣＳ分解酵素としては、コンドロイチナーゼＡＣＩ、コンドロイチナーゼＡＣＩＩ（コンドロイチンＡＣリアーゼ、ともいう。）、Ｉ型及びＩＩ型のコンドロイチナーゼＡＢＣ（コンドロイチンＡＢＣリアーゼ、ともいう。）が例示される。なかでも、コンドロイチナーゼＡＢＣ（特に、Ｉ型のコンドロイチナーゼＡＢＣ）又はコンドロイチナーゼＡＣＩＩを用いることが好ましく、コンドロイチナーゼＡＣＩＩを用いることが、均一に低分子化され、より高い割合で硫酸基を保持したＣＳ又はその塩の画分が得られ、且つ医薬（例えば、ＣＳ・鉄コロイド製剤）としたときに非常に優れた製剤学的特性（例えば、ろ過性が高い、製剤学的に問題となる異物を生じない、優れた粒子径を有するコロイドを形成する等）を発揮しうるという観点からより好ましい。
ここで、上記の「接触させる」方法や条件は、本発明画分１の原料となる前記ＣＳ又はその塩の分子と、ＣＳ分解酵素の分子とが接触することにより、当該ＣＳ分解酵素の分子が当該ＣＳ又はその塩の分子に作用して、ＣＳ又はその塩の低分子化が惹起される限りにおいて特に限定されない。接触させる際の温度も、用いるＣＳ分解酵素が作用しうる限りにおいて特に限定されないが、当該ＣＳ分解酵素の至適温度付近が好ましい。例えば、２０〜４０℃で行うことが好ましく、３０℃〜４０℃で行うことがより好ましく、３７℃で行うことが最も好ましい。また、接触させる際のｐＨも、同様に当該酵素が作用しうる限りにおいて特に限定されないが、当該酵素の至適ｐＨ付近が好ましい。例えば、ｐＨ５〜９の溶液中で行うことが好ましい。【００２５】
例えばコンドロイチナーゼＡＢＣを用いる場合においては、ｐＨ７〜９の溶液中で行うことが好ましく、ｐＨ７．５〜８．５の溶液中で行うことがより好ましく、ｐＨ８で行うことが最も好ましい。例えばコンドロイチナーゼＡＣＩＩを用いる場合においては、ｐＨ５〜７の溶液中で行うことが好ましく、ｐＨ５．５〜６．５の溶液中で行うことがより好ましく、ｐＨ６で行うことが最も好ましい。また、上記接触を行う際の溶液も、ＣＳ分解酵素のＣＳ又はその塩に対する作用が発揮される限りにおいて特に限定されないが、水性溶液が好ましい。水性溶液としては、水、緩衝液、生理的塩類溶液等が例示される。また、低分子化の対象となるＣＳ又はその塩の量も、適宜調節することが出来る。また、反応に使用するＣＳ分解酵素のユニット数（例えば、コンドロイチナーゼＡＢＣを使用する場合、「３７℃、ｐＨ８．０の条件下で、ＣＳＣ（サメ軟骨由来）から１分間あたり１ μmoleの不飽和二糖を生成する酵素量」を１ユニットとし、コンドロイチナーゼＡＣＩＩを使用する場合、「３７℃、ｐＨ６．０の条件下で、ＣＳＣ（サメ軟骨由来）から１分間あたり１ μmoleの不飽和二糖を生成する酵素量」を１ユニットとする。）並びに反応時間は、低分子化の対象となるＣＳ又はその塩や、所望する本発明画分１中のＣＳ又はその塩の量に応じて適宜調節することが出来る。ＣＳ分解酵素のユニット数は、例えば１ｇのＣＳ又はその塩に対して、０．５〜３．０ユニットのＣＳ分解酵素を使用することが好ましく、０．５〜１．５ユニットのＣＳ分解酵素を使用することがより好ましい。また、使用するＣＳ分解酵素のユニット数は、低分子化の対象となるＣＳ又はその塩や、所望する本発明画分１中のＣＳ又はその塩の量に応じて適宜調節することが出来る。また、反応時間は、１〜２０時間であることが好ましく、１〜１０時間であることがより好ましく、１〜６時間であることが最も好ましい。より具体的な方法については、実施例を参照されたい。【００２６】
このようにして低分子化したＣＳ又はその塩から、タンパク質等の不純物を除去することによって、本発明画分１を得ることが出来る。なお本出願書類において「除去」とは、ある物質を完全に除き去ることのみならず、部分的に除き去る（その物質の量を減少させる）ことをも意味する用語として用いる。
タンパク質の除去は、低分子化の対象となるＣＳ又はその塩を含有する画分に対して行ってもよく、低分子化後のＣＳ又はその塩を含有する画分に対して行ってもよいが、低分子化等の際にＣＳ分解酵素のようなタンパク質を用いた場合には、少なくともその後に行う必要がある。なかでも、低分子化の前後両者の画分に対して行うことがより好ましい。尚、ＣＳ分解酵素は、加熱等により失活させることもできる。【００２７】
タンパク質を除去する方法としては、有機溶媒（例えばアルコール）による沈殿及び分画、塩析、活性炭処理、タンパク質分解酵素を用いた除タンパク質処理が例示され、またこれらの方法を組み合わせることによっても行うことが出来るが、アルコール沈殿による分画及び活性炭処理により行うことが好ましい。【００２８】
なお、本発明画分１の製造方法はこのような方法に限定されるものではない。必要に応じて、適宜、工程の途中で得られる画分や最終的に得られる画分を乾燥したり、濃縮したり、別の溶媒に置換したり、脱塩を行う工程等をさらに含んでいてもよい。【００２９】
このようにＣＳ又はその塩を低分子化することによって、本発明画分１を得ることができる。このようにして得られる本発明画分１は、ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した重量平均分子量が、５，０００〜２０，０００であることを１つの特徴とする（性質（１））。なかでも、ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した重量平均分子量が、１０，０００〜１８，０００であることが好ましく、１２，０００〜１６，０００であることがより好ましく、１４，０００〜１５，０００であることが最も好ましい。ゲル濾過クロマトグラフィーによる重量平均分子量は、後述の実施例に記載の通り、重量平均分子量が既知の標準物質をゲル濾過カラムに付して、溶出時間と重量平均分子量との関係についての検量線を作成しておき、次いで重量平均分子量測定の対象とするＣＳ又はその塩を同一条件下でゲル濾過カラムに付して、溶出時間を測定し、この測定値と前記検量線を用いて求めることが出来る。具体的には実施例を参照されたい。【００３０】
また、本発明画分１は、硫黄含量が、６．５〜８％であることをもう１つの特徴とする（性質（２））。なかでも、硫黄含量が、６．８〜８％であることが好ましく、６．８〜７．５％であることがより好ましく、６．９〜７．５％であることがより好ましく、７〜７．５％であることがより好ましく、７．１〜７．５％であることがより好ましく、７．１〜７．３％であることがより好ましく、７．１〜７．２％であることが最も好ましい。また、硫黄含量が７〜８％であることも好ましく、なかでも７〜７．５％であることがより好ましく、７〜７．３％であることがさらに好ましい。硫黄含量の測定は、自動分析装置を用いることによって行うことが出来る。具体的な測定方法については、実施例を参照されたい。【００３１】
また、本発明画分１は、ローリー法によって測定したタンパク質含量が、０．１％以下であることをもう一つの特徴とする（性質（３））。なかでも、ローリー法によって測定したタンパク質含量が、０．０５％以下であることが好ましく、０．０２％以下であることがより好ましく、０．０１％以下であることが最も好ましい。ローリー法によるタンパク質含量の測定は、公知の方法により行うことが出来る。具体的な測定方法については、実施例を参照されたい。【００３２】
また、上記の様に、タンパク質を除去するステップを行うことによって、同時に、後述する、塩化物、無機硫酸塩、重金属、ヒ素といった不純物を除去することが出来る。
また、本発明画分１は、ゲル濾過クロマトグラフィーで測定した分子量分散度が、１．５〜２．２であることが好ましい（性質（４））。なかでも、ゲル濾過クロマトグラフィーで測定した分子量分散度が、１．６〜２．２であることがより好ましく、１．６〜２．０であることが最も好ましい。ゲル濾過クロマトグラフィーによる、分子量分散度の測定方法については、実施例を参照されたい。【００３３】
また、本発明画分１は、極限粘度が０．３〜０．５（dl/g）であることが好ましい（性質（５））。なかでも極限粘度が０．４〜０．５（dl/g）であるものが好ましく、０．３５〜０．４５（dl/g）であることがさらに好ましく、０．３８〜０．４２（dl/g）であることが最も好ましい。極限粘度の具体的な測定方法については、実施例を参照されたい。【００３４】
また、本発明画分１は、二糖分析の結果、ΔＤｉ−６Ｓが４０％以上５０％未満であるものが好ましく、４５％以上５０％未満であるものがより好ましい。
また、本発明画分１は、二糖分析の結果、ΔＤｉ−ｄｉＳDが１５％以上２２％未満であるものが好ましく、１７％以上２０％未満であるものがより好ましい。
なかでも、二糖分析の結果、ΔＤｉ−６Ｓが４０％以上５０％未満であり、且つΔＤｉ−ｄｉＳDが１５％以上２２％未満であるものが好ましく、ΔＤｉ−６Ｓが４０％以上５０％未満であり、且つΔＤｉ−ｄｉＳDが１７％以上２０％未満であるものがより好ましい。
なかでも、二糖分析の結果、ΔＤｉ−６Ｓが４５％以上５０％未満であり、且つΔＤｉ−ｄｉＳDが１５％以上２２％未満であるものが好ましく、ΔＤｉ−６Ｓが４５％以上５０％未満であり、且つΔＤｉ−ｄｉＳDが１７％以上２０％未満であるものがより好ましい。
また、本発明画分１は、二糖分析の結果、ΔＤｉ−０Ｓが１．８％以上３．５％未満であるものが好ましく、１．８％以上３．０％未満であるものがより好ましい。
また、本発明画分１は、二糖分析の結果、ΔＤｉ−４Ｓが２５％以上３３％未満であるものが好ましく、２６％以上２９％未満であるものがより好ましい。
また、本発明画分１は、二糖分析の結果、ΔＤｉ−ｄｉＳEが３％以上４％未満であるものが好ましく、３％以上３．５％未満であるものがより好ましい。
また、本発明画分１は、二糖分析の結果、ΔＤｉ−ｔｒｉＳが０％以上４％未満であるものが好ましく、０％以上３％未満であるものがより好ましく、０％以上２％未満であるものがさらに好ましく、０％以上１％未満であるものが極めて好ましく、０％以上０．２％未満であるものが最も好ましい。【００３５】
また、本発明画分１は、二糖分析の結果が以下の通りのものであることが好ましい（性質（６））。
ΔＤｉ−０Ｓ：１．８％以上３．５％未満
ΔＤｉ−６Ｓ：４０％以上５０％未満
ΔＤｉ−４Ｓ：２５％以上３３％未満
ΔＤｉ−ｄｉＳD：１５％以上２２％未満
ΔＤｉ−ｄｉＳE：３％以上４％未満
ΔＤｉ−ｔｒｉＳ：０％以上４％未満
なお、本出願書類におけるΔＤｉ−０Ｓ、ΔＤｉ−６Ｓ、ΔＤｉ−４Ｓ、ΔＤｉ−ｄｉＳD、ΔＤｉ−ｄｉＳE、ΔＤｉ−ｔｒｉＳは、Analytical Biochemistry 177, p327-332(1989)の定義に従って表記した。
なお、本出願書類における「二糖分析」の用語は、ＣＳまたはその塩に作用して不飽和二糖を生成させる酵素（リアーゼ）でＣＳ又はその塩を酵素処理し、該ＣＳまたはその塩の構成二糖を反映して生成する不飽和二糖を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、同定及び定量することを意味する。より具体的な二糖分析の方法は、実施例を参照されたい。【００３６】
また、本発明画分１は、塩化物含量が０．１４２％以下であるものが好ましい（性質（７））。
また、本発明画分１は、無機硫酸塩含量が０．２４％以下であるものが好ましい（性質（８））。
また、本発明画分１は、重金属含量が２０ｐｐｍ以下であるものが好ましい（性質（９））。
また、本発明画分１は、ヒ素含量が２ｐｐｍ以下であるものが好ましい（性質（１０））。
また、本発明画分１は、窒素含量が２〜４％であるものが好ましい（性質（１１））。なかでも窒素含量が２〜３％であるものが好ましく、２．５〜２．７％であるものがより好ましい。【００３７】
なかでも本発明画分１は、これらの性質（７）〜（１１）を全て有するものが好ましい。【００３８】
上記塩化物含量、無機硫酸塩含量、重金属含量、ヒ素含量及び窒素含量の具体的な測定方法は、実施例を参照されたい。【００３９】
さらに本発明画分１は、本画分１ｇを１００ｍｌの水溶液としたときのｐＨが６〜７であるものが好ましい（性質（１２））。なかでも本画分１ｇを１００ｍｌの水溶液としたときのｐＨが６．５〜７であることがより好ましい。ここで、「本画分１ｇ」とは、乾燥状態の本発明画分１の１ｇを意味する。ｐＨは、公知の方法により測定することが出来る。具体的には、実施例を参照されたい。【００４０】
また、本発明画分１は、旋光度が−１５〜−１８°であるものが好ましい（性質（１３））。なかでも旋光度が−１５．５〜−１７．５°であるものがより好ましく、−１６．０〜−１７．０°であるものが最も好ましい。旋光度は、公知の方法により測定することが出来る。より具体的には、実施例を参照されたい。【００４１】
また、本発明画分１は、本画分１ｇを１００ｍｌの水溶液としたときに、無色澄明であるものが好ましい（性質（１４））。ここで、「本画分１ｇ」とは、乾燥状態の本発明画分１の１ｇを意味する。【００４２】
また、本発明画分１は、粉末状態としたときに、白色であるものが好ましい（性質（１５））。【００４３】
また、本発明画分１は、乾燥減量が１〜７％であるものが好ましい（性質（１６））。なかでも乾燥減量が３〜６％であるものがより好ましく、４〜５．５％であるものが最も好ましい。【００４４】
また、本発明画分１は、強熱残分が２３〜３１％であるものが好ましい（性質（１７））。なかでも強熱残分が２８〜３０％であるものがより好ましい。上記乾燥減量及び強熱残分の具体的な測定方法については、実施例を参照されたい。【００４５】
また、本発明画分１は、還元性末端基測定法により算出した分子量が、１５０，０００〜４００，０００であるものが好ましい（性質（１８））。なかでも還元性末端基測定法により算出した分子量が、２００，０００〜３５０，０００であるものがより好ましく、２５０，０００〜３００，０００であるものが最も好ましい。
還元性末端基測定法による分子量の具体的な測定方法は、実施例を参照されたい。なお、還元性末端基測定法により算出される分子量は、多糖１分子につき１つ存在する還元末端基の還元能力をベースに算出されるものである。したがって、この数値は還元末端基の還元能力を反映するものであって、本来の「重量平均分子量」の数値とは異なることに注意されたい。【００４６】
本発明画分１は、例えば医薬（例えば、ＣＳ・鉄コロイド製剤）としたときに非常に優れた製剤学的特性（例えば、ろ過性が高い、製剤学的に問題となる異物を生じない、優れた粒子径を有するコロイドを形成する等）を発揮しうる。
本発明画分１は、医薬、医薬原料、試薬、試薬原料、化粧品、化粧品原料等や、ゲル化剤や増粘剤等の食品添加物等として使用することが出来る。なかでも、以下に詳説する、本発明医薬原料１として使用することが好ましい。
＜２＞本発明医薬原料１
本発明医薬原料１は、本発明画分１を含有することを特徴とする、医薬原料である。【００４７】
本発明画分１については、＜１＞本発明画分１に記載した通りである。
ここで医薬原料とは、例えば、抗炎症剤、脂血清澄剤、抗凝固剤、細胞賦活剤、解毒剤、鎮痛剤、胃粘膜保護剤、目薬、薬剤の徐放剤、洗口液剤、造影剤、ＣＳ・鉄コロイド製剤（特に、液体状の製剤、特に注射剤、なかでも静脈注射用鉄剤）等に使用する原料が例示される。なかでも、本発明医薬原料１の素材である本発明画分１が有する重量平均分子量、分子量の均一性（分子量分散度）、６．５〜８％という優れた硫黄含量等といった利点を活用することが出来ることから、ＣＳ・鉄コロイド製剤（特に、液体状の製剤、特に注射剤、なかでも静脈注射用鉄剤）の原料であることが好ましい。【００４８】
本発明医薬原料１は、本発明画分１をそのまま用いてもよく、他の成分を含有させてもよい。本発明医薬原料１の使用方法は、医薬原料として使用される限りにおいて、特に限定されない。
＜３＞本発明製造方法１
本発明製造方法１は、下記工程（１）及び（２）を少なくとも含むことを特徴とする、本発明画分１の製造方法である。
（１）ＣＳ又はその塩にＣＳ分解酵素を接触させる工程。
（２）前記接触後のＣＳ又はその塩を含有する画分から、不純物を除去する工程。
本発明画分１については、＜１＞本発明画分１に記載した通りである。
上記工程（１）における、ＣＳ又はその塩については、＜１＞本発明画分１において、低分子化の対象となるＣＳ又はその塩として説明した通りである。
また、用いるＣＳ分解酵素、ＣＳ又はその塩にこれを接触させる方法や条件等についても、＜１＞本発明画分１に記載した通りである。【００４９】
上記工程（２）は、ＣＳ又はその塩にＣＳ分解酵素を接触させた後の画分（低分子化されたＣＳ又はその塩を含有する）から、不純物を除去する工程である。不純物としては、タンパク質、塩化物、無機硫酸塩、重金属、ヒ素が例示される。このような不純物を除去する方法についても、＜１＞本発明画分１に記載した通りである。
本発明製造方法１は、上記工程（１）及び工程（２）が少なくとも含まれている限りにおいて特に限定されず、例えば＜１＞本発明画分１で詳説した様な他の工程等をさらに含んでいてもよい。本発明製造方法１により、本発明画分１を効率的に製造することができる。【００５０】
＜４＞本発明製造方法２
本発明製造方法２は、下記工程（１）及び（２）を少なくとも含むことを特徴とする、本発明医薬原料１の製造方法である。
（１）ＣＳ又はその塩にＣＳ分解酵素を接触させる工程。
（２）前記接触後のＣＳ又はその塩を含有する画分から、不純物を除去する工程。【００５１】
本発明製造方法２は、本発明製造方法１を本発明医薬原料１の製造方法に応用したものであり、各工程の用語の意義や、各工程の詳細については、＜３＞本発明製造方法１に記載した通りである。【００５２】
本発明製造方法２の工程（２）を経ることによって得られた画分は、これをそのまま本発明医薬原料１としてもよく、工程（２）の後にさらに他の工程を設けてこれを経ることによって本発明医薬原料１としてもよい。【００５３】
本発明製造方法１及び２においては、ＣＳ分解酵素を用いた酵素反応によってＣＳ又はその塩を低分子化することから、例えば塩酸等による化学的分解によって低分子化する場合と比較して、よりマイルドな条件でＣＳ又はその塩を低分子化することができる。このような酵素を用いたマイルドな条件下での低分子化は、原料として用いるＣＳ又はその塩の分子中に存在する硫酸基の脱離がなるべく惹起されない低分子化の実現に貢献していると考えられる。このことから、酵素反応によって低分子化を行うという点が、硫黄含量が６．５〜８％であるという条件を有する本発明画分１を選択的に製造することに貢献している主な要因であると考えられる。ここで、本発明画分１を「選択的に」製造するとの具体例としては、例えば後述する実施例４に記載の方法と同様の方法により本発明画分１の製造を複数回（５回以上が好ましく、１０回以上がより好ましい）試み、結果物として複数のロット（５ロット以上が好ましく、１０ロット以上がより好ましい）を得た場合において、８割以上のロットが、本発明画分１の条件、すなわち、ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した重量平均分子量が、５，０００〜２０，０００であり、硫黄含量が６．５〜８％であり、且つローリー法によって測定したタンパク質含量が、０．１％以下であるという条件を満たすものとなることが好ましい例として挙げられ、９割以上のロットがこの条件を満たすものとなることがより好ましい例として挙げられる。また、８割以上のロットが、ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した重量平均分子量が、５，０００〜２０，０００であり、硫黄含量が６．５〜８％であり、且つローリー法によって測定したタンパク質含量が、０．０２％以下であるという条件を満たすものとなることも好ましい例として挙げられ、９割以上のロットがこの条件を満たすものとなることがより好ましい例として挙げられる。【００５４】
本発明製造方法１及び２は、下記工程（３）をさらに含むことをが好ましい。
（３）ＣＳ又はその塩を含有する画分に、過酸化水素を作用させる工程。
さらに、工程（３）は、前記の工程（１）と工程（２）の間に行われることがより好ましい。【００５５】
ここで用いる過酸化水素は市販のものを用いることが出来る。過酸化水素は気体のものをそのまま用いても、その水溶液（過酸化水素水）を用いてもよいが、水溶液を用いることが好ましい。用いる過酸化水素水の濃度も特に限定されないが、例えば、５％以上の過酸化水素水を使用することが好ましく、１０〜５０％のものを使用することがより好ましく、２０〜４０％のものを使用することがさらに好ましく、２５〜３５％のものを使用することが極めて好ましく、３０〜３５％のものを使用することが最も好ましい。【００５６】
また、「作用させる」とは、ＣＳ又はその塩の分子と、過酸化水素の分子とが接触する限りにおいて特に限定されない。したがって、両者を接触させる際の、両者の濃度及び溶液の量、溶媒、温度、時間等の条件も特に限定されないが、好ましくは以下の条件を挙げることが出来る。
例えば、液量１Ｌの画分あたり、１０〜５００ ｍｌの３０％過酸化水素水を加えることが好ましく、２０〜３００ ｍｌの３０％過酸化水素水を加えることがより好ましく、３０ ｍｌ〜２００ ｍｌの３０％過酸化水素水を加えることが極めて好ましく、５０ ｍｌ〜１２０ ｍｌの３０％過酸化水素水を加えることが最も好ましい。
また、過酸化水素水と接触される画分におけるＣＳ又はその塩の濃度は、５０〜５００ mg/mlであることが好ましく、６０〜２００ mg/mlであることがより好ましく、７０〜１５０mg/mlであることがより好ましく、８０〜１２０mg/mlであることが極めて好ましく、１００mg/mlであることが最も好ましい。
また、接触の際に使用する溶媒としては、水、緩衝液、生理食塩水等の水性溶媒を用いることが好ましい。
また、上記接触を行う際の温度は特に限定されないが、２０℃〜８０℃であることが好ましい。
また、両者を接触させる時間は、１時間〜５０時間であることが好ましく、３時間〜２５時間であることがより好ましく、３時間〜１５時間であることが極めて好ましい。
また、上記接触は、過酸化水素以外のその他の成分を共存させた条件下で行うことが出来る。その他の成分としては、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム等の強アルアリが例示される。なかでも、水酸化ナトリウムを共存させた条件下で行うことが好ましい。加える成分の量は適宜決定することが出来るが、例えば水酸化ナトリウムを加える場合、溶液１Ｌに対して、１０ mol/Lの水酸化ナトリウム水溶液を、３０〜２００ｍｌ使用することが好ましく、５０〜１００ｍｌ使用することがより好ましく、７０〜８０ｍｌ使用することが最も好ましい。また、以上は10 mol/Lの水酸化ナトリウムを使用する場合について例示したが、使用する水酸化ナトリウムの濃度も、特に限定されない。例えば、５〜１mol/L）であることが好ましく、７〜１２mol/Lであることがより好ましい。【００５７】
＜５＞本発明画分２
また、本発明は、下記工程（１）及び（２）によって得られる、ＣＳ又はその塩の画分（以下、「本発明画分２」という。）を提供する。
（１）ＣＳ又はその塩にＣＳ分解酵素を接触させる工程。
（２）前記接触後の、ＣＳ又はその塩を含有する画分から、不純物を除去する工程。【００５８】
工程（１）及び（２）における用語の意義や、その条件等については、＜３＞本発明製造方法１及び＜４＞本発明製造方法２で詳説した通りである。【００５９】
また、工程（１）と工程（２）の間に、下記工程（３）をさらに含むことが好ましい。
（３）ＣＳ又はその塩を含有する画分に、過酸化水素を作用させる工程。【００６０】
工程（３）についても、＜４＞本発明製造方法２で詳説した通りである。本発明画分２は、少なくとも上記工程を行うことによって得られる、ＣＳ又はその塩の画分である限りにおいて、特に限定されないが、本発明画分１と同じ性質を有することが好ましい。
＜６＞本発明医薬原料２
また、本発明は、上記本発明画分２を含有することを特徴とする医薬原料（以下、「本発明医薬原料２」という。）を提供する。【００６１】
本発明画分２については、＜５＞本発明画分２で説明した通りである。また、「医薬原料」の用語は、＜２＞本発明医薬原料１で説明した通りである。本発明医薬原料２は、本発明画分２をそのまま用いてもよく、他の成分を含有させてもよい。
【実施例】
【００６２】
以下、本発明を実施例により具体的に詳説する。【００６３】
（実施例１）  コンドロイチナーゼＡＣＩＩを用いた、コンドロイチン硫酸ナトリウム（以下、「ＣＳナトリウム」という。）の画分の製造−その１
サメ軟骨を粉砕し、これにタンパク質分解酵素（エスペラーゼ；ノボザイムズ社製）を作用させることにより、ＣＳナトリウム１９２．２ｇを含有する抽出液１１００ ｍｌ（濃度：１７４．６ｍｇ/ｍｌ）を得た。この溶液を１９２２ｍｌに調製し、１５０ ユニットのコンドロイチナーゼＡＣＩＩ（生化学工業株式会社製）を加え、混合した後、３７℃にて約６時間作用させた。得られた溶液に３０％過酸化水素水溶液 ２１２ｍｌ及び１０ mol/L ＮａＯＨ １６０ ｍｌを添加し、一晩攪拌した。得られた反応後の溶液に対して、アルコール沈殿による分画を行い、続いて活性炭処理を行った。得られた画分の脱塩を行い、低分子化した精製ＣＳナトリウム１２６．６ｇを含有する溶液２リットル（濃度：６３．３ｍｇ/ｍｌ）を得た。このようにして得られた、ＣＳナトリウム溶液を、約６０℃にて減圧乾燥した。乾燥後のＣＳナトリウムは白色であった。また、乾燥後のＣＳナトリウム1.0 gに水を加えて100 mｌとしたとき、無色澄明であった。【００６４】
上記精製ステップにおける各種パラメータは、表１（ロット１）にまとめた。【００６５】
（実施例２）分析
実施例１で得られたＣＳナトリウムに対して、下記の分析を行った。
（a）重量平均分子量
下記の条件で、測定を行い、分子量既知の標準試料と溶出時間を比較することにより、重量平均分子量を算出した。【００６６】
測定試料：実施例１で得られた乾燥後のＣＳナトリウム 5 mgを精製水に溶解し、10 mlにメスアップした後、0.22 μmのフィルターで濾過した。測定においては、得られた上記測定試料の内、100 μlをインジェクションした。
カラム：TSK-GEL（東ソー製、TSKgel G4000PWXLとTSKgel G3000PWXLを連結して使用した。）
バッファー：0.2 mol/L NaCl溶液（0.22 μmのフィルターで濾過したもの。）
流速：0.5 ml/min
測定時間：５５分
測定温度：40 ℃
検出器：ＲＩ（示差屈折計）
標準試料：分子量52200、31400、20000、10200、6570のＣＳナトリウム（生化学工業株式会社製）を使用した。
解析ソフトウェア：Waters ミレニアム32 Ver 3.01（日本ウォーターズ株式会社）【００６７】
（b）分子量分散度（MW/MN）
（a）と同様の条件で測定した数平均分子量（MN）に対する重量平均分子量（MW）の割合を、上記（a）記載の解析ソフトウェアを用いて自動計算し、求めた。【００６８】
（c）硫黄含量
実施例１で得られた乾燥後のＣＳナトリウムについて、堀場硫黄分析装置（EMIA-120）を使用し、硫黄含量を測定した（３回の測定により得られた実測値を、乾燥減量（下記(m)参照）をもとにそれぞれ無水物換算し、得られた値の平均値を測定結果とした）。【００６９】
（d）タンパク質含量
実施例１で得られた乾燥後のＣＳナトリウムに対し、ローリー法によりタンパク質含量を測定した（得られた実測値を、乾燥減量（下記(m)参照）をもとに無水物換算し、測定結果とした）。【００７０】
（e）極限粘度
第十四改正日本薬局方（４５．粘度測定法 第１法 毛細管粘度計法（p.66〜67））に記載の方法に従って、測定を行った（得られた実測値を、乾燥減量（下記(m)参照）をもとに無水物換算し、測定結果とした）。【００７１】
（f）塩化物含量
第十四改正日本薬局方（５．塩化物試験法（p.19））に記載の方法に従って、測定を行った。測定試料としては、実施例１で得られた、乾燥後のＣＳナトリウム 0.1 gを使用した（得られた実測値を、乾燥減量（下記(m)参照）をもとに無水物換算し、測定結果とした）。【００７２】
（g）無機硫酸塩含量
第十四改正日本薬局方（６７．硫酸塩試験法（p.104））に記載の方法に従って、測定を行った（得られた実測値を、乾燥減量（下記(m)参照）をもとに無水物換算し、測定結果とした）。【００７３】
（h）重金属含量
第十四改正日本薬局方（２６．重金属試験法 (2)第２法（p.36〜37））に記載の方法に従って、測定を行った（得られた実測値を、乾燥減量（下記(m)参照）をもとに無水物換算し、測定結果とした）。【００７４】
（i）ヒ素含量
第十四改正日本薬局方（５１．ヒ素試験法 (3)第３法（p.78〜79））に記載の方法に従って、測定を行った（得られた実測値を、乾燥減量（下記(m)参照）をもとに無水物換算し、測定結果とした）。【００７５】
（j）窒素含量
第十四改正日本薬局方（３６．窒素定量法（セミミクロケルダール法）（p.53〜54））に記載の方法に従って、測定を行った（得られた実測値を、乾燥減量（下記(m)参照）をもとに無水物換算し、測定結果とした）。【００７６】
（k）ｐＨ
第十四改正日本薬局方（４８．ｐＨ測定法（p.69〜71））に記載の方法に従って、測定を行った。試料溶液としては、実施例１で得られた、乾燥後のＣＳナトリウム 1gを水に溶解し、100 ccとした溶液を使用した。【００７７】
（l）旋光度
実施例１で得られた乾燥後のＣＳナトリウム 0.5 g（(m)乾燥減量記載の方法により得た乾燥減量をもとに無水物換算した値）を水 50 mLに溶解し、100 mmセルにて測定した。【００７８】
上記測定は、第十四改正日本薬局方（３５．旋光度測定法（p.53））に記載の方法に従って行った。【００７９】
（m）乾燥減量
第十四改正日本薬局方（１０．乾燥減量試験法（p.25〜26））に記載の方法に従って、測定を行った（0.1 g、減圧 0.67 kpa以下、五酸化リン、６０℃、４時間）。【００８０】
（n）強熱残分
第十四改正日本薬局方（１６．強熱残分試験法（p.27〜28））に記載の方法に従って、測定を行った（1g、乾燥後）。【００８１】
（o）還元性末端基測定法による分子量の測定
生物化学還元法１ 還元糖の定量法（第２版）に記載の方法を参考に、測定を行った。【００８２】
（試薬調製）
１．銅試液用 10 %硫酸銅溶液
硫酸銅 3.0 gに水を加えて溶解し30 mLとした。
２．銅試液用Ａ試液
酒石酸カリウムナトリウム四水和物 6.0 g、炭酸ナトリウム 12.0 g に水を加えて溶解し、125 mLとした。更に、炭酸水素ナトリウム 8.0 g 及び10 % 硫酸銅試液 20 mlを加え、溶解した。
３．銅試液用Ｂ試液
硫酸ナトリウム 90 gに水 250 mlを加えて、煮沸溶解し、放冷した。
４．銅試液
上記銅試液用Ａ試液とＢ試液を全量混合し、水を加えて500 mLとした。
５．ヒ素モリブデン酸試液用Ｃ試液
モリブデン酸アンモニウム四水和物25 gに水 450 mLを加え溶解し、更に硫酸21 mLを加え、混合した。
６．ヒ素モリブデン酸試液用Ｄ試液
砒酸二ナトリウム七水和物 3.0 gに水 25 mLを加え、溶解した。
７．ヒ素モリブデン酸試液
Ｃ試液とＤ試液を混合し、37℃、２４〜４８時間放置した後、黄色変色したものを用いた。【００８３】
（標準液調製）
１．ガラクトサミン塩酸塩標準原液
ガラクトサミン塩酸塩を６０℃、5 mmHg以下、シリカゲル下にて、５時間乾燥した。乾燥後、シリカゲル入りデシケーターにて放冷し、100 mgを量り取り、水を加えて溶解し、100 mLとした。
２．ガラクトサミン塩酸塩標準液
凍結保存のガラクトサミン塩酸塩標準原液を室温にて溶解し、5 mlを量り取り、水を加えて50 mlとした。【００８４】
（測定試料の調製）
実施例１で得られた、乾燥後のＣＳナトリウム 200 mgに水を加えて溶解し、100 mLとした。【００８５】
（反応）
水（ブランク）、標準液、測定試料をそれぞれ2 mlずつ試験管に入れ、各試験管に銅試液2 mLを加え、攪拌した後にビー玉にて栓をした。各試験管を沸騰水浴中に入れ、１０分間加熱した。加熱後、水道水にて１０分間冷却し、各試験管にヒ素モリブデン酸試液 2 mLを試験管の壁を伝わらせて静かに注ぎ入れた。共栓をして穏やかに攪拌し、黄色から濃青色へと反応発色させた。発色後、水を加えて25 mLとし、共栓をし、混和した。分光光度計にて、波長550 nmの吸光度を測定した。なお、上記ブランク、標準液、測定試料は、それぞれ３ロットを調製、測定し、平均値を測定値とした。【００８６】
還元性末端基測定法による分子量を、下記の式１によって算出した。
（式１）
分子量=[A×1000/100×As×MW]/標準液濃度(μg/mL)×At
ただし、上記式１中、A、At、As、MWは、下記の通り定義される。
A：測定に供した乾燥後のＣＳナトリウム試料（mg）を、上記(m)乾燥減量に記載の方法により得た乾燥減量をもとに無水物換算した値（mg）。
At：検液吸光度−ブランク吸光度
As：標準液吸光度−ブランク吸光度
MW：２１６（ガラクトサミン塩酸塩分子量）【００８７】
（a）〜（o）の分析結果を、表２（ロット１）に示す。【００８８】
（p） 二糖分析
（測定試料の調製）
実施例１で得られた、乾燥後のＣＳナトリウム 100 mgを精製水に溶解させ、10 mlにメスアップした。氷浴中において、コンドロイチナーゼＡＢＣ 10 ユニット/50 μlに試料溶液 100 μlを添加し、攪拌した。更にTris-HCl緩衝液（pH 7.9）200 μlを添加し、攪拌した。これを３７℃において１時間インキュベーションした後、沸騰浴中において３０秒間加熱処理し、酵素を失活させた。精製水 650 μlを添加し、攪拌した後、0.22 μmのフィルターで濾過した。測定においては、上記試料10 μlをインジェクションした。【００８９】
（測定条件）
カラム：YMC-GEL PA-120-S5（株式会社ワイエムシィ）
標準試料：不飽和ＣＳナトリウム ＨＰＬＣ用（ΔＤｉ−０Ｓ、ΔＤｉ−６Ｓ、ΔＤｉ−４Ｓ、ΔＤｉ−ｄｉＳD、ΔＤｉ−ｄｉＳE、ΔＤｉ−ｔｒｉＳ）（生化学工業株式会社）
バッファー；水と0.8 mol/L NaH2PO4水溶液の濃度勾配により行った（水と0.8 mol/L NaH2PO4水溶液の割合は、４５分の間に、９８：２→２５：７５に変化させた）。
流速：1.0 ml/min
測定温度：４０℃
検出器：ＵＶ（230 nm）【００９０】
各二糖単位の含量（％）は、その溶出パターンの積分値（面積）を、濃度既知の上記標準試料の溶出パターンの積分値（面積）と比較することにより求めた。
結果を表３（ロット１）に示す。【００９１】
（実施例３）コンドロイチナーゼＡＣＩＩを用いたＣＳナトリウム画分の製造及び分析−その２
実施例１に記載の精製ステップにおける各種パラメータを、表１の通りに変えて、精製を行い、ＣＳナトリウム（ロット２〜６）を得た。ロット２〜６において、乾燥後のＣＳナトリウムは白色であり、乾燥後のＣＳナトリウム1.0 gに水を加えて100 mｌとしたとき、無色澄明であった。ロット２〜４について、下記括弧内に規定するものの他、上記（a）〜（p）と同様の分析を行った。（ロット４の塩化物含量については、日本薬局方外医薬品規格２００２（コンドロイチン硫酸ナトリウム、純度試験（２）塩化物（p.296））に記載の方法に従って、測定を行った。また、ロット４の無機硫酸塩含量については、日本薬局方外医薬品規格２００２（コンドロイチン硫酸ナトリウム、純度試験（３）硫酸塩（p.296））に記載の方法に従って、測定を行った。）結果を表２及び表３に示す。また、ロット５及びロット６について、上記（a）、（b）、（p）と同様の分析を行った。結果を表４及び表３に示す。また、ロット５については、上記（f）〜（i）と同様の分析を行い、塩化物含量が0.142 %以下であり、無機硫酸塩含量が0.24 %以下であり、重金属含量が20 ppm以下であり、ヒ素含量が2 ppm以下であることを確認した。【００９２】
本実施例によって、本発明により、重量平均分子量（ゲル濾過クロマトグラフィー）が、５，０００〜２０，０００の範囲に均一に低分子化され、硫黄含量が６．５〜８％に保持され、且つ高純度に精製された、非常に高品質なＣＳナトリウムの画分が得られることが明らかになった。【００９３】
（実施例４）  コンドロイチナーゼＡＣＩＩを用いたＣＳナトリウム画分の製造及び分析−その３
サメ軟骨を粉砕し、これにタンパク質分解酵素（エスペラーゼ；ノボザイムズ社製）を作用させることにより、ＣＳナトリウム１３７．６ｋｇを含有する溶液を得た。この溶液を約１４００Lに調整し、約10.4万ユニットのコンドロイチナーゼＡＣＩＩ（生化学工業株式会社製）を加え、混合した後、３７℃にて約６時間作用させた。得られた反応後の溶液に対して、アルコール沈殿による分画を行い、続いて活性炭処理を行った。得られた画分の脱塩を行い、低分子化した精製ＣＳナトリウム９５．３ｋｇを含有する溶液１５２０リットル（濃度６２．７ｍｇ/ｍｌ）を得た。このようにして得られた、ＣＳナトリウム溶液を、約６０℃にて減圧乾燥した。【００９４】
上記精製ステップにおける各種パラメータは、表１（ロット７）にまとめた。また、上記の精製ステップにおける各種パラメータを、表１（ロット８〜１１）の通りに変えて、精製を行い、ＣＳナトリウム（ロット８〜１１）を得た。ロット７〜１１において、乾燥後のＣＳナトリウムは白色であり、乾燥後のＣＳナトリウム1.0 gに水を加えて100 mｌとしたとき、無色澄明であった。実施例２に記載の（a）〜(e)及び(h)〜（p）の分析を行った結果を、表２（ロット７〜１１）及び表３（ロット７〜９）に示す。また、塩化物含量については、日本薬局方外医薬品規格２００２（コンドロイチン硫酸ナトリウム、純度試験（２）塩化物（p.296））に記載の方法に従って、無機硫酸塩含量については、日本薬局方外医薬品規格２００２（コンドロイチン硫酸ナトリウム、純度試験（３）硫酸塩（p.296））に記載の方法に従って測定を行った。結果を表２（ロット７〜１１）に示す。【００９５】
本実施例によって、本発明の方法により、重量平均分子量（ゲル濾過クロマトグラフィー）が、５，０００〜２０，０００の範囲に均一に低分子化され、硫黄含量が６．５〜８％に保持され、且つ高純度に精製された、非常に高品質なＣＳナトリウムの画分が得られることが明らかになった。【００９６】
（参考例）塩酸を用いたＣＳナトリウムの画分の製造及び分析
以下、塩酸を用いて低分子化を行う場合について、参考例を示す。
コンドロイチナーゼＡＣＩＩに代えて、塩酸を用いてＣＳナトリウムを低分子化するという点以外は、上記実施例４と基本的に同様の方法によって、ＣＳナトリウム画分の製造を行った。塩酸による低分子化を経て得られたＣＳナトリウム溶液を、約６０℃にて減圧乾燥した。乾燥後のＣＳナトリウムは白色であった。また、乾燥後のＣＳナトリウム1.0 gに水を加えて100 mｌとしたとき、無色澄明であった。【００９７】
実施例２に記載の（a）〜(e)及び(h)〜（p）の分析を行った。結果を表２（ロット１２）及び表３（ロット１２）に示す。また、塩化物含量については、日本薬局方外医薬品規格２００２（コンドロイチン硫酸ナトリウム、純度試験（２）塩化物（p.296））に記載の方法に従って、無機硫酸塩含量については、日本薬局方外医薬品規格２００２（コンドロイチン硫酸ナトリウム、純度試験（３）硫酸塩（p.296））に記載の方法に従って測定を行った。結果を表２（ロット１２）に示す。【００９８】
【表１−１】
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【００９９】
【表１−２】
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【０１００】
【表２−１】
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【０１０１】
【表２−２】
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【０１０２】
【表３−１】
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【０１０３】
【表３−２】
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【０１０４】
【表４】
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【産業上の利用可能性】
【０１０５】
本発明により、均一に低分子化され、高い割合で硫酸基が保持され、高純度に精製された、ＣＳ又はその塩の画分が提供される。このようなＣＳ又はその塩の画分は、医薬、医薬原料、試薬、試薬原料、化粧品、化粧品原料等や、ゲル化剤や増粘剤等の食品添加物等として利用することができる。
【国際調査報告】
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