(57)【要約】本発明は、標的遺伝子に対して高いＲＮＡ干渉効果を有するとともに、標的遺伝子と関係のない遺伝子についてＲＮＡ干渉を生じる危険性が非常に小さいポリヌクレオチドを提供する。ＲＮＡ干渉の標的遺伝子の塩基配列から、下記（ａ）から（ｄ）の規則に従う配列部位を検索し、検索結果に基づきＲＮＡｉを生じさせるポリヌクレオチドの設計、合成等を行う。（ａ）３’末端の塩基が、アデニン、チミンまたはウラシルである。（ｂ）５’末端の塩基が、グアニンまたはシトシンである。（ｃ）３’末端の７塩基の配列において、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基がリッチである。（ｄ）塩基数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的生物の遺伝子の中から選ばれる標的遺伝子について、ＲＮＡ干渉を生じさせるポリヌクレオチドであって、
少なくとも２本鎖領域を有し、
前記２本鎖領域における一方の鎖が、標的遺伝子の塩基配列中に含まれる、下記（ａ）から（ｄ）の規則：
（ａ）３’末端の塩基が、アデニン、チミンまたはウラシルであり；
（ｂ）５’末端の塩基が、グアニンまたはシトシンであり；
（ｃ）３’末端の７塩基の配列において、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基がリッチであり；
（ｄ）塩基数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数であるに従う規定配列と相同な塩基配列からなり、そして
前記２本鎖領域における他方の鎖が、前記規定配列と相同な塩基配列と相補的な配列を有する塩基配列からなる
ことを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記規定配列と相同な塩基配列の少なくとも８０％以上の塩基が、前記規定配列の塩基配列と一致することを特徴とする請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記規則（ｃ）において、７塩基のうち少なくとも３塩基以上がアデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記規則（ｄ）において、塩基数が１３〜２８であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記規定配列が、さらに下記（ｅ）の規則：
（ｅ）１０塩基以上グアニンまたはシトシンが連続する配列を含まない
に従う配列であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記規定配列が、さらに下記（ｆ）の規則：
（ｆ）目的生物の全遺伝子配列のうち、標的遺伝子以外の他の遺伝子の塩基配列中に、当該規定配列と９０％以上の相同性を有する配列が含まれない
に従う配列であることを特徴とする請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記規定配列が、配列表配列番号４７〜配列番号８１７０８１のいずれかに記載の塩基配列からなることを特徴とする請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記規定配列が、図４６の標的配列の欄に記載された配列であることを特徴とする請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号８１７１０２ないし８１７６５１のいずれかの塩基配列を有することを特徴とする請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
２本鎖ポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記２本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖が、前記規定配列と相同な塩基配列の３’末端にオーバーハング部を有する塩基配列からなり、
前記２本鎖ポリヌクレオチドの他方の鎖が、前記規定配列と相同な塩基配列と相補的な配列の３’末端にオーバーハング部を有する塩基配列からなることを特徴とする請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
ヘアピン構造を有する１本鎖ポリヌクレオチドであり、
前記２本鎖領域における一方の鎖の３’末端と、前記２本鎖領域における他方の鎖の５’末端とを連結するループ部を有することを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
発現を抑制しようとする標的遺伝子の発現系に導入するポリヌクレオチドの選択方法であって、
少なくとも２本鎖領域を有し、
前記２本鎖領域における一方の鎖が、標的遺伝子の塩基配列中に含まれる、下記（ａ）から（ｆ）の規則：
（ａ）３’末端の塩基が、アデニン、チミンまたはウラシルであり；
（ｂ）５’末端の塩基が、グアニンまたはシトシンであり；
（ｃ）３’末端の７塩基の配列において、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基がリッチであり；
（ｄ）塩基数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数であり、；
（ｅ）１０塩基以上グアニンまたはシトシンが連続する配列を含まず；
（ｆ）目的生物の全遺伝子配列のうち、標的遺伝子以外の他の遺伝子の塩基配列中に、当該規定配列と９０％以上の相同性を有する配列が含まれない
に従う規定配列と相同な塩基配列からなり、そして、
前記２本鎖領域における他方の鎖が、前記規定配列と相同な塩基配列と相補的な配列を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドを選択することを特徴とするポリヌクレオチドの選択方法。
【請求項１４】
前記選択したポリヌクレオチドから、さらに、前記標的遺伝子の規定配列と相同な塩基配列が、前記標的遺伝子以外の他の遺伝子の塩基配列とのミスマッチ数が少なくとも３塩基であり、かつ、当該少なくとも３塩基のミスマッチを有する塩基配列を有する他の遺伝子の数が最も少ない配列であるポリヌクレオチドを選択することを特徴とする請求項１３に記載のポリヌクレオチドの選択方法。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを、発現を抑制しようとする標的遺伝子の発現系に導入して標的遺伝子の発現を抑制することを特徴とする遺伝子発現抑制方法。
【請求項１６】
請求項１３または１４に記載の方法により選択されたポリヌクレオチドを、発現を抑制しようとする標的遺伝子の発現系に導入して標的遺伝子の発現を抑制することを特徴とする遺伝子発現抑制方法。
【請求項１７】
５０％以下に発現を抑制することを特徴とする請求項１５または１６に記載の遺伝子発現抑制方法。
【請求項１８】
医薬的に有効な量の、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、医薬用組成物。
【請求項１９】
図４６の関連疾患名の欄に記載の疾患を治療または予防するための、請求項１８に記載の医薬用組成物。
【請求項２０】
図４６の遺伝子名の欄に記載された遺伝子に関連する疾患を治療または予防するための、請求項１８に記載の医薬用組成物。
【請求項２１】
以下１）−９）のいずれかに属する遺伝子が関与する疾患を治療または予防するための、請求項１８に記載の医薬組成物
１）アポトーシスに関与している遺伝子；
２）ホスファターゼおよびホスファターゼ活性に関与している遺伝子；
３）細胞周期に関与している遺伝子；
４）レセプターに関与している遺伝子；
５）イオンチャネルに関与している遺伝子；
６）シグナル伝達系に関与している遺伝子；
７）キナーゼおよびキナーゼ活性に関与している遺伝子；
８）転写制御に関与している遺伝子；あるいは
９）Ｇタンパク質共役レセプターまたはＧタンパク質共役レセプターに関与している遺伝子。
【請求項２２】
図４６の配列番号（ヒト）または配列番号（マウス）の欄に記載の配列番号のいずれかの塩基配列を標的配列とするポリヌクレオチドを含む、請求項１８ないし２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
表１の遺伝子名の欄に記載された遺伝子に関連する疾患を治療または予防するための、請求項１８に記載の医薬用組成物。
【請求項２４】
膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、肝細胞癌、肺癌、黒色腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、口腔癌、皮膚癌並びに甲状腺癌から選択される、いずれかの癌を治療または予防するための、請求項１８または２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
配列番号８１７１０２ないし８１７６５１のいずれかの塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１８、２３または２４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、標的遺伝子の発現を抑制するための遺伝子発現抑制用組成物。
【請求項２７】
標的遺伝子が、図４６の関連疾患名の欄に記載の疾患のいずれかの疾患に関連する、請求項２６に記載の遺伝子発現抑制用組成物。
【請求項２８】
標的遺伝子が、図４６の遺伝子名の欄に記載された遺伝子のいずれかである、請求項２６に記載の記載の遺伝子発現抑制用組成物。
【請求項２９】
標的遺伝子が、以下１）−９）のいずれかに属する遺伝子である、請求項２６に記載の記載の遺伝子発現抑制用組成物
１）アポトーシスに関与している遺伝子；
２）ホスファターゼおよびホスファターゼ活性に関与している遺伝子；
３）細胞周期に関与している遺伝子；
４）レセプターに関与している遺伝子；
５）イオンチャネルに関与している遺伝子；
６）シグナル伝達系に関与している遺伝子；
７）キナーゼおよびキナーゼ活性に関与している遺伝子；
８）転写制御に関与している遺伝子；あるいは
９）Ｇタンパク質共役レセプターまたはＧタンパク質共役レセプターに関与している遺伝子。
【請求項３０】
標的遺伝子が、表１の遺伝子名の欄に記載された遺伝子のいずれかである、請求項２６に記載の遺伝子発現抑制用組成物。
【請求項３１】
標的遺伝子が、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、肝細胞癌、肺癌、黒色腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、口腔癌、皮膚癌並びに甲状腺癌から選択される、いずれかの癌に関連する遺伝子である、請求項２６に記載の遺伝子発現抑制用組成物。
【請求項３２】
医薬的に有効な量の、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを投与することを含む、図４６の関連疾患名の欄に記載の疾患を治療または予防するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ＲＮＡ干渉を生じさせるポリヌクレオチドに関する。以下本明細書においてＲＮＡ干渉のことを「ＲＮＡｉ」と表記する場合がある。
【背景技術】  ＲＮＡ干渉は、機能阻害したい遺伝子の特定領域と相同なセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡからなる２本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ、以下「ｄｓＲＮＡ」という）が標的遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの相同部分を干渉破壊するという現象で、１９９８年に線虫を用いた実験により初めて提唱された。しかし、哺乳類においては、約３０塩基対以上の長いｄｓＲＮＡを細胞内へ導入すると、インターフェロンレスポンスが誘導され、細胞がアポトーシスによって死んでしまうため、ＲＮＡｉ法を用いることが困難であった。
一方、マウス初期胚や哺乳類培養細胞では、ＲＮＡ干渉が起こりえることが示され、ＲＮＡ干渉の誘導機構そのものは、哺乳類細胞にも存在することがわかってきた。現在では、およそ２１〜２３塩基対の短い２本鎖ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）が、哺乳類細胞系でも細胞毒性を示さずにＲＮＡ干渉を誘導できることが示され、哺乳類においてもＲＮＡｉ法を利用することが可能となってきている。
【発明の開示】
ＲＮＡｉ法は様々な応用が期待される技術である。しかし、ショウジョウバエや線虫では、ある遺伝子の特定領域と相同なｄｓＲＮＡおよびｓｉＲＮＡは、ほとんどの配列でＲＮＡ干渉効果を示すのに対して、哺乳類では無作為に選択した（２１塩基の）ｓｉＲＮＡの７０〜８０％はＲＮＡ干渉効果を示さない。これは、哺乳類においてＲＮＡｉ法を用いた遺伝子機能解析を行う際に大きな問題点となっている。
また、従来ｓｉＲＮＡを設計するにあたっては、試験者等の経験やセンスに依存する部分が大きく、実際にＲＮＡ干渉効果を示すｓｉＲＮＡを高い確率で設計することが困難であった。さらに、ＲＮＡ合成は、費用、時間等を要することから、ＲＮＡ干渉を行うために無駄なｓｉＲＮＡを合成してしまうことは、ＲＮＡ干渉のさらなる研究や、ＲＮＡ干渉を利用した数々の利用法の普及を妨げる要因となっていた。
本発明は、上記問題の解決のために、ｓｉＲＮＡとして有効に機能しうるポリヌクレオチド、その設計方法、当該ポリヌクレオチドを用いた遺伝子発現抑制方法、当該ポリヌクレオチドを含む医薬組成物、遺伝子発現抑制組成物を提供することを目的とする。
【図面の簡単な説明】  図１は、ヒトとマウスとで共通配列であるｓｉＲＮＡの設計を示す図である。
図２は、ＲＮＡｉ効果を示すｓｉＲＮＡの規則性を示す図である。
図３は、ヒトＦＢＰ１およびマウスＦｂｐ１の塩基配列中の規定配列を有する共通部位（太字部分）を示す図である。
図４は、ヒトＦＢＰ１およびマウスＦｂｐ１に共通の規定配列を列挙した図である。
図５は、ヒトＦＢＰ１およびマウスＦｂｐ１に共通の規定配列にスコアを付した図である。
図６は、標的以外の遺伝子をノックアウトしないよう、規定配列のうちの１つをＢＬＡＳＴ検索した結果を示す図である。
図７は、標的以外の遺伝子をノックアウトしないよう、規定配列のうちの１つをＢＬＡＳＴ検索した結果を示す図である。
図８は、プログラムの出力結果を示す図である。
図９は、ＲＮＡ断片の設計（ａ〜ｐ）を示す図である。
図１０は、ａ〜ｐのｓｉＲＮＡがＲＮＡｉ効果を示すか試験した結果を示す図である。「Ｂ」はショウジョウバエ培養細胞における結果を、「Ｃ」はヒト培養細胞における結果を示す図である。
図１１は、ａ〜ｐのｓｉＲＮＡの配列の特徴を分析した結果を示す図である。
図１２は、本発明の基本原理を示す原理構成図である。
図１３は、本発明が適用される本システムの塩基配列処理装置１００の構成の一例を示すブロック図である。
図１４は、標的遺伝子塩基配列ファイル１０６ａに格納される情報の一例を示す図である。
図１５は、部分塩基配列ファイル１０６ｂに格納される情報の一例を示す図である。
図１６は、判定結果ファイル１０６ｃに格納される情報の一例を示す図である。
図１７は、規定配列ファイル１０６ｄに格納される情報の一例を示す図である。
図１８は、参照配列データベース１０６ｅに格納される情報の一例を示す図である。
図１９は、同一類似度ファイル１０６ｆに格納される情報の一例を示す図である。
図２０は、評価結果ファイル１０６ｇに格納される情報の一例を示す図である。
図２１は、本発明が適用される本システムの部分塩基配列作成部１０２ａの構成の一例を示すブロック図である。
図２２は、本発明が適用される本システムの無関係遺伝子標的評価部１０２ｈの構成の一例を示すブロック図である。
図２３は、本実施形態における本システムのメイン処理の一例を示すフローチャートである。
図２４は、本実施形態における本システムの無関係遺伝子標的評価処理の一例を示すフローチャートである。
図２５は、標的発現ベクターｐＴＲＥＣの構造を示す図である。
図２６は、実施例２の２．（２）におけるプライマーの一方がイントロンを挟む形でデザインされていない場合のＰＣＲの結果を示す図である。
図２７は、実施例２の２．（２）におけるプライマーの一方がイントロンを挟む形でデザインされている場合のＰＣＲの結果を示す図である。
図２８は、ｓｉＲＮＡ；ｓｉＶＩＭ３５の配列および構造を示す図である。
図２９は、ｓｉＲＮＡ；ｓｉＶＩＭ８１２の配列および構造を示す図である。
図３０は、ｓｉＲＮＡ；ｓｉＣｏｎｔｒｏｌの配列および構造を示す図である。
図３１は、ｓｉＶＩＭ８１２およびｓｉＶＩＭ３５のＲＮＡｉ活性をアッセイした結果を示す図である。
図３２は、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ、ｓｉＶＩＭ８１２およびｓｉＶＩＭ３５のビメンチンに対するＲＮＡｉ活性を示す図である。
図３３は、抗体染色の結果を示す図である。
図３４は、プログラムにより設計されたｓｉＲＮＡのルシフェラーゼ遺伝子に対するＲＮＡｉ活性の測定結果を示す図である。
図３５は、プログラムにより設計されたｓｉＲＮＡのＳＡＲＳウイルスが有する配列に対するＲＮＡｉ活性の測定結果を示す図である。
図３６は、プログラムにより設計されたｓｉＲＮＡとのミスマッチ数が小さい配列を含む他の遺伝子に対するＲＮＡｉ活性の測定結果を示す図である。
図３７は、アポトーシスに関与している遺伝子と遺伝子オントロジーにおけるＧＯ＿ＩＤとの関係を示す図である。
図３８は、ホスファターゼおよびホスファターゼ活性に関与している遺伝子と遺伝子オントロジーにおけるＧＯ＿ＩＤとの関係を示す図である。
図３９は、細胞周期に関係している遺伝子と遺伝子オントロジーにおけるＧＯ＿ＩＤとの関係を示す図である。
図４０は、レセプターに関与している遺伝子と遺伝子オントロジーにおけるＧＯ＿ＩＤとの関係を示す図である。
図４１は、イオンチャンネルをコードしている遺伝子と遺伝子オントロジーにおけるＧＯ＿ＩＤとの関係を示す図である。
図４２は、シグナル伝達系に関与している遺伝子と遺伝子オントロジーにおけるＧＯ＿ＩＤ（との関係を示す図である。
図４３は、キナーゼおよびキナーゼ活性に関与している遺伝子と遺伝子オントロジーにおけるＧＯ＿ＩＤの関係を示す図である。
図４４は、転写制御に関与している遺伝子と遺伝子オントロジーにおけるＧＯ＿ＩＤとの関係を示す図である。
図４５は、Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）およびＧＰＣＲに関与している遺伝子と遺伝子オントロジーにおけるＧＯ＿ＩＤとの関係を示す図である。
図４６は、本発明のポリヌクレオチドの標的となる標的配列、遺伝子、生物学的機能カテゴリー、文献情報に基づく生物学的機能、関連する疾患の関係を示す図である。
図４６の「遺伝子名」および「ｒｅｆｓｅｑ＿ＮＯ．」は、ＮＣＢＩの「ＲｅｆＳｅｑ」（ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ”ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／”ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に対応するものであり、ＲｅｆＳｅｑにアクセスすることによって、各遺伝子の情報（遺伝子の配列、機能等）を取得することができる。
図４６中の「標的配列」の欄に記載された配列において、実際にＲＮＡｉの標的となる配列は５’末端から３番目の塩基から３’末端から３番目までの塩基である。即ち、図４６中の「標的配列」の配列では、５’末端および３’末端に２塩基ずつＲＮＡｉの標的となる配列に隣接する配列が記載されている。本願明細書及び請求の範囲中、狭義の「規定配列」とは、実際にＲＮＡｉの標的となる配列を意味し、例えば、図４６中の「標的配列」の５’末端から３番目の塩基から３’末端から３番目までの塩基に相当する。ただし便宜のため、本願明細書及び請求の範囲中、「規定配列」「標的配列」はともに、文意により、狭義の「規定配列」と同義、或いは、図４６中の「標的配列」と同様に、狭義の「規定配列」に５’末端および３’末端に２塩基ずつＲＮＡｉの標的となる配列に隣接する配列が付加された配列、の双方の意味で使用される。
本明細書および請求の範囲の記載において、特に明示しない限り、「５’末端の塩基」とは図４６中の「標的配列」に記載の配列の５’末端から３番目の塩基、そして、「３’末端の塩基」とは図４６中の「標的配列」に記載の配列の３’末端から３番目の塩基を意味する。よって、図４６中の「標的位置」とは、図４６中の「標的配列」の欄に記載した各配列の５’末端から３番目の塩基（例えば、整理番号１の標的配列では「ｇ」）の、各遺伝子の配列中での相当する位置を意味する。
図４６中の「配列番号（ヒト）」および「配列番号（マウス）」は本明細書に添付の配列表中の各標的配列が記載されている配列番号を意味し、同一の整理番号における標的配列はヒトとマウスで同一である。
発明の詳細な説明
本発明者らは、上記課題を解決するために、ＲＮＡｉ法を用いる際最も労力、時間、費用を要する部分の１つである、ｓｉＲＮＡの入手を容易に行う手法について検討を進めた。ｓｉＲＮＡの調製は哺乳類において特に問題となっていることから、本発明者らは哺乳類培養細胞系を用いて、ＲＮＡ干渉に有効なｓｉＲＮＡの配列規則性を同定することを試みたところ、有効なｓｉＲＮＡの配列には所定の規則性があることを見いだし、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、次の通りである。
〔１〕  目的生物の遺伝子の中から選ばれる標的遺伝子について、ＲＮＡ干渉を生じさせるポリヌクレオチドであって、
少なくとも２本鎖領域を有し、
前記２本鎖領域における一方の鎖が、標的遺伝子の塩基配列中に含まれる、下記（ａ）から（ｄ）の規則：
（ａ）３’末端の塩基が、アデニン、チミンまたはウラシルであり；
（ｂ）５’末端の塩基が、グアニンまたはシトシンであり；
（ｃ）３’末端の７塩基の配列において、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基がリッチであり；
（ｄ）塩基数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数であるに従う規定配列と相同な塩基配列からなり、そして
前記２本鎖領域における他方の鎖が、前記規定配列と相同な塩基配列と相補的な配列を有する塩基配列からなる
ことを特徴とするポリヌクレオチド。
〔２〕  前記規定配列と相同な塩基配列の少なくとも８０％以上の塩基が、前記規定配列の塩基配列と一致することを特徴とする〔１〕に記載のポリヌクレオチド。
〔３〕  前記規則（ｃ）において、７塩基のうち少なくとも３塩基以上がアデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする〔１〕または〔２〕に記載のポリヌクレオチド。
〔４〕  前記規則（ｄ）において、塩基数が１３〜２８であることを特徴とする〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔５〕  前記規定配列が、さらに下記（ｅ）の規則：
（ｅ）１０塩基以上グアニンまたはシトシンが連続する配列を含まない
に従う配列であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔６〕  前記規定配列が、さらに下記（ｆ）の規則：
（ｆ）目的生物の全遺伝子配列のうち、標的遺伝子以外の他の遺伝子の塩基配列中に、当該規定配列と９０％以上の相同性を有する配列が含まれない
に従う配列であることを特徴とする〔５〕に記載のポリヌクレオチド。
〔７〕  前記規定配列が、配列表配列番号４７〜配列番号８１７０８１のいずれかに記載の塩基配列からなることを特徴とする〔６〕に記載のポリヌクレオチド。
〔８〕前記規定配列が、図４６の標的配列の欄に記載された配列であることを特徴とする〔６〕に記載のポリヌクレオチド。
〔９〕配列番号８１７１０２ないし８１７６５１のいずれかの塩基配列を有することを特徴とする〔６〕に記載のポリヌクレオチド。
〔１０〕  ２本鎖ポリヌクレオチドであることを特徴とする〔１〕〜〔９〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔１１〕  前記２本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖が、前記規定配列と相同な塩基配列の３’末端にオーバーハング部を有する塩基配列からなり、前記２本鎖ポリヌクレオチドの他方の鎖が、前記規定配列と相同な塩基配列と相補的な配列の３’末端にオーバーハング部を有する塩基配列からなることを特徴とする〔１０〕に記載のポリヌクレオチド。
〔１２〕  ヘアピン構造を有する１本鎖ポリヌクレオチドであり、  前記２本鎖領域における一方の鎖の３’末端と、前記２本鎖領域における他方の鎖の５’末端とを連結するループ部を有することを特徴とする〔１〕〜〔９〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
〔１３〕  発現を抑制しようとする標的遺伝子の発現系に導入するポリヌクレオチドの選択方法であって、
少なくとも２本鎖領域を有し、
前記２本鎖領域における一方の鎖が、標的遺伝子の塩基配列中に含まれる、下記（ａ）から（ｆ）の規則：
（ａ）３’末端の塩基が、アデニン、チミンまたはウラシルであり；
（ｂ）５’末端の塩基が、グアニンまたはシトシンであり；
（ｃ）３’末端の７塩基の配列において、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基がリッチであり；
（ｄ）塩基数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数であり、；
（ｅ）１０塩基以上グアニンまたはシトシンが連続する配列を含まず；
（ｆ）目的生物の全遺伝子配列のうち、標的遺伝子以外の他の遺伝子の塩基配列中に、当該規定配列と９０％以上の相同性を有する配列が含まれない
に従う規定配列と相同な塩基配列からなり、そして、
前記２本鎖領域における他方の鎖が、前記規定配列と相同な塩基配列と相補的な配列を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドを選択することを特徴とするポリヌクレオチドの選択方法。
〔１４〕  前記選択したポリヌクレオチドから、さらに、前記標的遺伝子の規定配列と相同な塩基配列が、前記標的遺伝子以外の他の遺伝子の塩基配列とのミスマッチ数が少なくとも３塩基であり、かつ、当該少なくとも３塩基のミスマッチを有する塩基配列を有する他の遺伝子の数が最も少ない配列であるポリヌクレオチドを選択することを特徴とする〔１３〕に記載のポリヌクレオチドの選択方法。
〔１５〕  〔１〕〜〔１２〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを、発現を抑制しようとする標的遺伝子の発現系に導入して標的遺伝子の発現を抑制することを特徴とする遺伝子発現抑制方法。
〔１６〕  〔１３〕または〔１４〕に記載の方法により選択されたポリヌクレオチドを、発現を抑制しようとする標的遺伝子の発現系に導入して標的遺伝子の発現を抑制することを特徴とする遺伝子発現抑制方法。
〔１７〕  ５０％以下に発現を抑制することを特徴とする〔１５〕または〔１６〕に記載の遺伝子発現抑制方法。
〔１８〕  医薬的に有効な量の、〔１〕〜〔１２〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、医薬用組成物。
〔１９〕  図４６の関連疾患名の欄に記載の疾患を治療または予防するための、〔１８〕に記載の医薬用組成物。
〔２０〕  図４６の遺伝子名の欄に記載された遺伝子に関連する疾患を治療または予防するための、〔１８〕に記載の医薬用組成物。
〔２１〕  以下１）−９）のいずれかに属する遺伝子が関与する疾患を治療または予防するための、〔１８〕に記載の医薬組成物
１）アポトーシスに関与している遺伝子；
２）ホスファターゼおよびホスファターゼ活性に関与している遺伝子；
３）細胞周期に関与している遺伝子；
４）レセプターに関与している遺伝子；
５）イオンチャネルに関与している遺伝子；
６）シグナル伝達系に関与している遺伝子；
７）キナーゼおよびキナーゼ活性に関与している遺伝子；
８）転写制御に関与している遺伝子；あるいは
９）Ｇタンパク質共役レセプターまたはＧタンパク質共役レセプターに関与している遺伝子。
〔２２〕  図４６の配列番号（ヒト）または配列番号（マウス）の欄に記載の配列番号のいずれかの塩基配列を標的配列とするポリヌクレオチドを含む、〔１８〕〜〔２１〕のいずれか一項に記載の医薬組成物。
〔２３〕  表１の遺伝子名の欄に記載された遺伝子に関連する疾患を治療または予防するための、〔１８〕に記載の医薬用組成物。
〔２４〕  膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、肝細胞癌、肺癌、黒色腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、口腔癌、皮膚癌、並びに甲状腺癌から選択される、いずれかの癌を治療または予防するための、〔１８〕または〔２３〕に記載の医薬組成物。
〔２５〕  配列番号８１７１０２ないし８１７６５１のいずれかの塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む、〔１８〕、〔２３〕または〔２４〕のいずれか一項に記載の医薬組成物。
〔２６〕  〔１〕〜〔１２〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、標的遺伝子の発現を抑制するための遺伝子発現抑制用組成物。
〔２７〕  標的遺伝子が、図４６の関連疾患名の欄に記載の疾患のいずれかの疾患に関連する、〔２６〕に記載の遺伝子発現抑制用組成物。
〔２８〕  標的遺伝子が、図４６の遺伝子名の欄に記載された遺伝子のいずれかである、〔２６〕に記載の遺伝子発現抑制用組成物。
〔２９〕  標的遺伝子が、以下１）−９）のいずれかに属する遺伝子である、〔２６〕に記載の遺伝子発現抑制用組成物
１）アポトーシスに関与している遺伝子；
２）ホスファターゼおよびホスファターゼ活性に関与している遺伝子；
３）細胞周期に関与している遺伝子；
４）レセプターに関与している遺伝子；
５）イオンチャネルに関与している遺伝子；
６）シグナル伝達系に関与している遺伝子；
７）キナーゼおよびキナーゼ活性に関与している遺伝子；
８）転写制御に関与している遺伝子；あるいは
９）Ｇタンパク質共役レセプターまたはＧタンパク質共役レセプターに関与している遺伝子。
〔３０〕  標的遺伝子が、表１の遺伝子名の欄に記載された遺伝子のいずれかである、〔２６〕に記載の遺伝子発現抑制用組成物。
〔３１〕  標的遺伝子が、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、肝細胞癌、肺癌、黒色腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、口腔癌、皮膚癌並びに甲状腺癌から選択される、いずれかの癌に関連する遺伝子である、〔２６〕に記載の遺伝子発現抑制用組成物。
〔３２〕  医薬的に有効な量の、〔１〕〜〔１２〕のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを投与することを含む、図４６の関連疾患名の欄に記載の疾患を治療または予防するための方法。
発明の効果
本発明のポリヌクレオチドは、標的遺伝子に対して高いＲＮＡ干渉効果を有するとともに、標的遺伝子と関係のない遺伝子についてＲＮＡ干渉を生じる危険性が非常に小さいため、発現を抑制しようとする標的遺伝子のみに特異的にＲＮＡ干渉を生じさせることができる。したがって、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ干渉を利用する試験、治療方法等に好適に利用することができ、哺乳類などの高等動物、特にヒトを対象とするＲＮＡ干渉を行う際に特に有効性を発揮するものである。
発明を実施するための態様
本発明の実施の形態を、以下の＜１＞から＜７＞の順に従って説明する。
＜１＞ＲＮＡ干渉の標的塩基配列検索方法
＜２＞ＲＮＡ干渉を生じさせるポリヌクレオチドの塩基配列設計方法
＜３＞ポリヌクレオチドの作製方法
＜４＞遺伝子の発現抑制方法
＜５＞ｓｉＲＮＡ配列設計プログラム
＜６＞ｓｉＲＮＡ配列設計ビジネスモデルシステム
＜７＞ｓｉＲＮＡ配列設計プログラムを実行する塩基配列処理装置等
＜８＞医薬用組成物
＜９＞遺伝子発現抑制用組成物
＜１０＞治療または予防方法
＜１＞ＲＮＡ干渉の標的塩基配列検索方法
本発明の検索方法は、目的生物の遺伝子の中から選ばれる標的遺伝子の塩基配列中から、ＲＮＡ干渉の起因となる塩基配列を探し出す方法である。ＲＮＡ干渉を生じさせる対象となる目的生物は、特に限定されず、大腸菌をはじめとする原核生物、酵母、真菌等の微生物、哺乳類をはじめとする動物、昆虫、植物等のいずれでも良い。
具体的には、本発明の検索方法では、ＲＮＡ干渉の標的遺伝子の塩基配列から、下記（ａ）から（ｄ）の規則に従う配列部位を検索する。
（ａ）３’末端の塩基が、アデニン、チミンまたはウラシルである。
（ｂ）５’末端の塩基が、グアニンまたはシトシンである。
（ｃ）３’末端の７塩基の配列において、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基がリッチである。
（ｄ）塩基数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である。
「標的遺伝子」における「遺伝子」とは、遺伝情報をコードする媒体のこという。「遺伝子」はＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡの複合体など遺伝情報をコードする物質により構成されるが、遺伝情報としては物質そのものではなく塩基配列を電子データ化したものをコンピュータ上などで扱うことが可能である。「標的遺伝子」は、１つのコード領域としてもよいし、複数のコード領域に渡り標的としてもよいし、また、配列が判明したすべてのポリヌクレオチドを標的としてもよい。特定の機能を有する遺伝子について検索したい場合には、その特定遺伝子のみを標的とすることにより、当該特定遺伝子に特異的にＲＮＡ干渉を生じさせる塩基配列を効率よく検索することができる。すなわち、ＲＮＡ干渉はｍＲＮＡを干渉破壊する現象として知られており、特定のコード領域を選択することにより検索負荷を軽減できる。また、転写領域のひとまとまりを標的遺伝子として検索してもよい。なお、本明細書において塩基配列は特に断らない限りセンス鎖、すなわち、ｍＲＮＡの配列を基準として示す。また、本明細書中では上記（ａ）から（ｄ）の規則を満たす塩基配列のことを「規定配列」という。上記規則においては、塩基配列がＤＮＡの配列であればチミンが、ＲＮＡの配列であればウラシルが対応する。
規則（ｃ）は、３’末端近傍の配列にアデニン、チミン、およびウラシルからなる群より選ばれる塩基がリッチに含まれていることを規定しており、具体的に検索を行う際の一指標として３’末端部から７塩基の範囲内において、アデニン、チミン、およびウラシルから選ばれる塩基がリッチな配列であることを規定している。
規則（ｃ）において、「リッチな配列」とは特定の塩基が現れる頻度が高いことを意味し、割合を概略的に示すと、規定配列における３’末端側の５〜１０塩基、好ましくは７塩基の配列中にアデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上が、少なくとも４０％以上、より好ましくは５０％以上含まれることを意味する。より具体的には、例えば約１９塩基程度の規定配列の場合を例に挙げると、３’末端側の７塩基のうち好ましくは少なくとも３塩基以上、より好ましくは４塩基以上、特に好ましくは５塩基以上が、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上である。
規則（ｃ）に該当するか否かを確認する手段は特に制限はなく、７塩基中の好ましくは３塩基以上、より好ましくは４塩基以上、特に好ましくは５塩基以上がアデニン、チミンまたはウラシルであることを確認できればよい。例えば、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上が、３’末端側の７塩基の配列中に３つ以上含まれることをリッチであると定義した場合を例として説明すると、３’末端の第１番目の塩基から逐次上記３種の塩基のいずれかであるか照合し、第７番目の塩基に至るまでに３つ現れた場合に、規則（ｃ）に適合すると判断することができる。例えば、第３番目までに３つ現れれば、３つの塩基を調べれば足りる。すなわち、規則（ｃ）について検索する場合、必ずしも３’末端側の７塩基についてすべて照合することは要しない。逆に第７番目までに３つ以上現れなければリッチではなく、規則（ｃ）を満たさないと判断される。
二本鎖ポリヌクレオチドにおいてはアデニンとチミンまたはウラシルとが相補的に水素結合することは周知である。また、グアニンとシトシンとの相補的な水素結合（Ｇ−Ｃ水素結合）においては３つの水素結合部位が形成されるのに対し、アデニンとチミンまたはウラシルとの相補的水素結合（Ａ−（Ｔ／Ｕ）水素結合）においては２つの水素結合部位からなり、一般的に言ってＧ−Ｃ水素結合に対し、Ａ−（Ｔ／Ｕ）水素結合のほうが結合力は弱い。
規則（ｄ）においては、検索する塩基配列の塩基数を規定している。検索する塩基配列の塩基数は、ＲＮＡ干渉を生じさせ得る塩基数である。また、生物の種類などの条件により、塩基数があまりに大きすぎるｓｉＲＮＡでは細胞毒性を生じてしまうことが知られている。塩基数の上限は、ＲＮＡ干渉を生じさせようとする生物の種類などにより異なるが、ｓｉＲＮＡを構成する一本鎖の塩基数はいずれの種にせよ３０以下であることが好ましい。また、哺乳動物の塩基数にあっては、好ましくは２４以下、より好ましくは２２以下である。また、下限はＲＮＡ干渉を生じさせる限りにおいて特に制限されるものではないが、好ましくは１５以上、より好ましくは１８以上、さらに好ましくは２０以上である。ｓｉＲＮＡを構成する一本鎖としての塩基数は、２１で検索することが特に好ましい。
なお、下記にても説明するが、ｓｉＲＮＡには、規定配列の３’末端にオーバーハング部が設けられる。オーバーハング部は塩基数２であることが好適である。したがって、オーバーハング部を含めず、規定配列のみの塩基数の上限としては、好ましくは２８以下、より好ましくは２２以下、さらに好ましくは２０以下であり、下限としては、好ましくは１３以上、より好ましくは１６以上、さらに好ましくは１８以上である。規定配列の最も好ましい塩基数は１９である。ＲＮＡｉの標的塩基配列の検索は、オーバーハング部を含める場合および含めない場合のいずれで検索してもよい。
規定配列に従う塩基配列は、ＲＮＡ干渉を生じさせる確率が極めて高い。したがって、本発明の検索方法により、ＲＮＡ干渉を生じさせる配列を極めて高い確率で検索することが可能であり、ＲＮＡ干渉を生じさせるポリヌクレオチドの設計を簡便化することができる。
また、他の好ましい例として、規定配列が、さらに下記の規則（ｅ）に従う配列であることが挙げられる。（ｅ）１０塩基以上グアニンまたはシトシンが連続する配列を含まない。
規則（ｅ）においては、検索する塩基配列が、１０塩基以上グアニン（Ｇ）および／またはシトシン（Ｃ）が連続した配列を含まない配列であることを規定している。１０塩基以上グアニンおよび／またはシトシンが連続するというのは、例えば、グアニンまたはシトシンの一方のみが連続する場合と、グアニンおよびシトシンとが混在する配列となっている場合の双方を含み、より具体的には、ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣのほか、ＧおよびＣの混合配列であるＧＣＧＧＣＣＣＧＣＧなども含まれる。
また、標的遺伝子と関係のない遺伝子についてまでＲＮＡ干渉を生じさせないようにするためには、設計した配列と同一または類似の配列が他の遺伝子に含まれていないか検索することが好ましい。設計した配列と同一または類似の配列の検索は、一般的なホモロジー検索を行うことができるソフトウエア等を用いて行えばよい。この際、ｓｉＲＮＡの２本の鎖（センス鎖およびアンチセンス鎖）によるＲＮＡｉ効果を考慮して、「設計した配列」および「設計した配列と相補的な塩基配列を有する配列（相補配列）」の両方について、同一または類似の配列が他の遺伝子に含まれていないか検索することがより好ましい。設計した配列のうち、設計した配列またはその相補配列と同一／類似配列を有する配列を除外することにより、標的とする遺伝子のみに特異的にＲＮＡ干渉を生じさせる配列を設計することができる。
したがって、設計した配列のうち、他の遺伝子に塩基配列のミスマッチ数が小さい類似配列が存在するような配列を除外することにより、特異性の高い配列を選別することができる。例えば、塩基数１９の塩基配列を設計する場合、他の遺伝子にミスマッチが２塩基以下の類似配列が存在する配列は、除外することが好ましい。ここで類似性判断の閾値となるミスマッチ数の値を大きく設定するほど、設計する配列の特異性が高まる。塩基数１９の塩基配列を設計する場合、より好ましくは、他の遺伝子にミスマッチが３塩基以下の類似配列が存在する配列を除外することが好ましく、さらに好ましくは、他の遺伝子にミスマッチが４塩基以下の類似配列が存在する配列を除外することが好ましい。また、当該規定配列を有する配列およびその相補配列の両方について、塩基配列のミスマッチ数が小さい類似配列が他の遺伝子に存在するような配列を除外することにより、より特異性の高い配列を設計することができるため、好ましい。
配列の類似性を判断する基準となるミスマッチ数は、設計する配列の塩基数によっても異なるため、一概に規定することは難しい。塩基配列のミスマッチ数を相同性で規定することとすると、下記の規則（ｆ）に従う配列であるか検索すればよい。（ｆ）目的生物の全遺伝子配列のうち、標的遺伝子以外の他の遺伝子の塩基配列中に、当該規定配列を有する配列と９０％以上の相同性を有する配列が含まれない。
規則（ｆ）において、標的遺伝子以外の他の遺伝子の塩基配列中に、規定配列と８５％以上の相同性を有する配列が含まれないことが好ましく、規定配列と８０％以上の相同性を有する配列が含まれないことがより好ましく、規定配列と７５％以上の相同性を有する配列が含まれないことが好ましい。また、ここで、当該規定配列を有する配列およびその相補配列の両方について、塩基配列の相同性が高い類似配列が他の遺伝子に存在するような配列を除外することにより、より特異性の高い配列を設計することができるため、好ましい。
なお、規定配列の検索は、塩基数を定めた上で上記の（ａ）から（ｃ）の規則などに従う部分を検索するようなプログラムを搭載するコンピュータを用いて効率的に検出可能である。より具体的な実施の形態は下記＜５＞ｓｉＲＮＡ配列設計プログラム、および、＜７＞ｓｉＲＮＡ配列設計プログラムを実行する塩基配列処理装置等の欄に示す。
本願の配列表配列番号４７〜８１７０８１に記載のポリヌクレオチドは、上記（ａ）−（ｆ）の規則を満たす規定配列（を含む標的配列）として、選択されたヒト及びマウスの配列である。
＜２＞ＲＮＡ干渉を生じさせるポリヌクレオチドの塩基配列設計方法
本発明の塩基配列設計方法は、上記の検索方法により検索された塩基配列に基づいてＲＮＡ干渉を生じさせるポリヌクレオチドの塩基配列を設計するものである。ＲＮＡ干渉を生じさせるポリヌクレオチドは、上記の検索方法により検索された規定配列に基づいて設計された２本鎖領域を有するポリヌクレオチドであり、標的遺伝子について、ＲＮＡ干渉を生じさせることができるものであれば、特に限定されない。
ＲＮＡ干渉を生じさせるポリヌクレオチドとしては、主として、ｓｉＲＮＡ等の２本鎖ポリヌクレオチド型と、ヘアピン構造を有するＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ：ｓｈＲＮＡ）等の１本鎖ポリヌクレオチド型に分類することができる。
ｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡは、主としてＲＮＡからなるが、一部にＤＮＡが含まれている混成ポリヌクレオチドも含まれる。本発明の塩基配列設計方法では、上記（ａ）から（ｄ）の規則に従う塩基配列を標的遺伝子の塩基配列から検索し、検索された塩基配列と相同な塩基配列を設計する。また、他の好ましい設計例としては、上記（ｅ）および（ｆ）の規則などを考慮してもよい。（ａ）から（ｄ）の規則および検索の手法などについては、上記本発明の検索方法について説明したとおりである。
ＲＮＡ干渉を生じさせるポリヌクレオチドにおける２本鎖領域は、一方の鎖が、標的遺伝子の塩基配列中に含まれる、上記（ａ）から（ｄ）の規則に従う規定配列と相同な塩基配列からなり、他方の鎖が、前記規定配列と相同な塩基配列と相補的な配列を有する塩基配列からなる。「相同な配列」とは、同一の配列および当該ＲＮＡ干渉を生じさせるという機能を失わない範囲で同一配列に対し欠失、置換、挿入などの変異を含む配列のことをいう。標的遺伝子の種類、配列などの条件にもよるが、許容される変異を相同性（ホモロジー）で例示すると、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。許容される変異の程度としての相同性を算出する場合、同一の検索アルゴリズム用いて算出された数値どうしを比較することが望ましい。検索アルゴリズムは特に限定されないが、局所的な配列の検索に適したものが好適であり、より具体的にはＢＬＡＳＴ、ｓｓｅａｒｃｈなどを好適に用いることができる。
より詳細には、核酸（ポリヌクレオチド）の同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算によって決定することが可能である。あるいは、２つの核酸配列のパーセント同一性は、目視検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マジソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７）。この「ＧＡＰ」プログラムの使用により、２つの核酸配列の比較の他に、２つのアミノ酸配列の比較、核酸配列とアミノ酸配列との比較を行うことができる。ここで、「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドについての（同一物について１、および非同一物について０の値を含む）一元（ｕｎａｒｙ）比較マトリックスのＧＣＧ実行と、ＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修「ポリペプチドの配列および構造のアトラス（Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ＳｅｑｕｅｎｃｅおよびＳｔｒｕｃｔｕｒｅ）」国立バイオ医学研究財団、３５３−３５８頁、１９７９により記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６７４５，１９８６の加重アミノ酸比較マトリックス；または他の比較可能な比較マトリックス；（２）アミノ酸の各ギャップについて３０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の１のペナルティ；またはヌクレオチド配列の各ギャップについて５０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の３のペナルティ；（３）エンドギャップへのノーペナルティ：および（４）長いギャップへは最大ペナルティなし、が含まれる。当業者により使用される他の配列比較プログラムでは、例えば、国立医学ライブラリーのウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌｓ．ｈｔｍｌにより使用が利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．２．７、またはＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが使用可能である。ＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕに記載されている。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア付けマトリックスを使用し、使用可能である選択パラメーターは以下の通りである：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎのＳＥＧプログラム（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）により決定され；ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ，１９９６「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ｂｉａｓｅｄ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：５４４−７１も参照されたい）、または、短周期性の内部リピートからなるセグメント（ＣｌａｖｅｒｉｅおよびＳｔａｔｅｓ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）のＸＮＵプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、および（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、またはＥ−スコア（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない）；好ましいＥ−スコア閾値の数値は０．５であるか、または好ましさが増える順に、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ−５、１ｅ−１０、１ｅ−１５、１ｅ−２０、１ｅ−２５、１ｅ−３０、１ｅ−４０、１ｅ−５０、１ｅ−７５、または１ｅ−１００である。
本発明のポリヌクレオチドはまた、上記（ａ）から（ｄ）の規則に従う規定配列と「相同な塩基配列」として、規定配列にストリンジェントな条件下、例えば、中程度または高程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であり、そして、好ましくは、ＲＮＡ干渉を生じさせる活性を有するポリヌクレオチドを含む。
「ストリンジェントな条件下」とは、中程度または高程度にストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，第６−７章，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０−５０℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ−６×ＳＳＣ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。好ましくは中程度にストリンジェントな条件は、約５０℃、６×ＳＳＣのハイブリダイゼーション条件を含む。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。一般に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度および／または低い塩濃度でのハイブリダイゼーション（例えば、約６５℃、６×ＳＳＣないし０．２×ＳＳＣ、好ましくは６×ＳＳＣ、より好ましくは２×ＳＳＣ、最も好ましくは０．２×ＳＳＣのハイブリダイゼーション）および／または洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、およびおよそ６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液では、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）にＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を代用することが可能であり、洗浄はハイブリダイゼーションが完了した後で１５分間行う。
当業者に知られていて、以下にさらに記載したように、ハイブリダイゼーション反応と二本鎖の安定性を支配する基本原理を適用することによって望ましい度合いのストリンジェンシーを達成するためには、洗浄温度と洗浄塩濃度を必要に応じて調整することが可能であると理解すべきである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１を参照されたい）。核酸を未知配列の標的核酸へハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さはハイブリダイズする核酸のそれであると仮定される。既知配列の核酸をハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さは核酸の配列を並列し、最適な配列相補性をもつ単数または複数の領域を同定することによって決定可能である。５０塩基対未満の長さであることが予測されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５−２５℃低くなければならず、Ｔｍは、以下の等式により決定される。長さ１８塩基対未満のハイブリッドに関して、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基数）。１８塩基対を超える長さのハイブリッドに関しては、Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋４１（モル分率［Ｇ＋Ｃ］）−０．６３（％ホルムアミド）−５００／ｎであり、ここで、Ｎはハイブリッド中の塩基数であり、そして［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオン濃度である（１×ＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。
上記のように、検索された配列は若干の改変が許容されるが、設計される塩基配列の塩基数は、検索された配列と同一とすることが特に好ましい。塩基数を同一とした場合について改変の許容度を例示すると、設計される塩基配列の塩基が、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上検索された配列と一致することが好適である。例えば、塩基数１９の塩基配列を設計する場合であれば、好ましくは１６塩基以上、より好ましくは１８塩基以上が、検索された塩基配列と一致することが好ましい。また、検索された塩基配列と相同な配列を設計する場合、検索された塩基配列の３’末端の塩基と設計される塩基配列の３’末端の塩基とは同一であることが望ましく、また、検索された塩基配列の５’末端の塩基と設計される塩基配列の５’末端の塩基とが同一であることが望ましい。
通常ｓｉＲＮＡ分子には、オーバーハング部が設けられる。オーバーハング部とは、２本鎖のｓｉＲＮＡ分子において、各鎖の３’末端に設けられた、一本鎖の状態で突出した部分である。オーバーハング部は、生物の種類などにもよるが、塩基数は２が特に好適である。オーバーハング部の塩基配列は、基本的には任意であるが、検索元の標的遺伝子と同一の塩基配列、ＴＴ、あるいはＵＵなどが好適に用いられる場合がある。上記のように検索された塩基配列と相同な配列となるように設計された規定配列の３’末端に、オーバーハング部を設けることにより、ｓｉＲＮＡを構成するセンス鎖が設計される。
また、最初から規定配列およびオーバーハング部を含めて検索を行い、設計することもできる。オーバーハング部の好ましい塩基数は２である。したがって、例えば、塩基数１９の規定配列および塩基数２のオーバーハング部からなるｓｉＲＮＡを構成する一本鎖の設計をする場合には、オーバーハング部を含めたｓｉＲＮＡの塩基数としては塩基数２１の配列を標的遺伝子から検索すればよく、また２本鎖の状態について検索する場合には、塩基数２３の配列を検索してもよい。
ｓｈＲＮＡは、前記２本鎖領域における一方の鎖の３’末端と、前記２本鎖領域における他方の鎖の５’末端とをループ部で連結することによって１本鎖ポリヌクレオチドとしたものである。ｓｈＲＮＡは、前記一方の鎖の５’末端および／または前記他方の鎖の３’末端に、一本鎖の状態で突出した部分を有していても良い。このようなｓｈＲＮＡは、ＷＯ０１／４９８４４等、公知の手法に従って設計することができる。
本発明の塩基配列設計方法では、上記のように所望の標的遺伝子から所定の配列を検索してくるが、ＲＮＡ干渉を生じさせようとする対象は、標的遺伝子の由来と必ずしも一致せずともよく、類縁種などに適用可能である。例えば、第１の種から単離された遺伝子を標的遺伝子とし、第１の種の類縁種である第２の種に用いるｓｉＲＮＡを設計することもできる。さらに、例えば複数種の哺乳類から共通配列を検索し、この共通配列から上記規定配列を検索して設計することにより、哺乳類に幅広く適用可能なｓｉＲＮＡの設計が可能である。複数の哺乳類に共通する配列は、他の哺乳類においても保存されている確率が高いと考えられるためである。
本発明の設計方法により、ＲＮＡ干渉を生じさせるＲＮＡ分子を、高い確率でしかも容易に設計することができる。ＲＮＡの合成は、未だ労力、時間、費用を要するが、本発明の設計方法によりそれらを大幅に軽減することが可能である。
＜３＞ポリヌクレオチドの作製方法
本発明のポリヌクレオチドの作製方法は、ＲＮＡ干渉を生じさせる確率の高いポリヌクレオチドを作製する方法である。本発明のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの塩基配列が上記本発明の塩基配列設計方法に従って設計され、その配列設計に従うようにポリヌクレオチドが合成される。本発明のポリヌクレオチドには、上述のように、ｓｉＲＮＡ等の２本鎖ポリヌクレオチド型と、ｓｈＲＮＡ等の１本鎖ポリヌクレオチド型があるが、以下、２本鎖ポリヌクレオチドを中心に説明する。
配列の設計における好ましい形態は、上記塩基配列設計方法についての説明と同様である。なお、本発明の製造法により製造される２本鎖ポリヌクレオチドはＲＮＡにより構成されることが好ましいが、一部にＤＮＡを含む混成ポリヌクレオチドであってもよい。本明細書では一部にＤＮＡを含むものもｓｉＲＮＡの概念に含める。また、ポリヌクレオチドを構成するＲＮＡおよびＤＮＡは、例えば、糖の水酸基のメチル化等、化学修飾を施されたものであってもよい。例えば、本明細書におけるｓｉＲＮＡは、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖とのハイブリッド構造を有してもよい。かかるハイブリッド構造は、被導入体に導入した際に標的遺伝子の発現を抑制する活性を有するものであれば構造は特には限定されないが、センス鎖がＤＮＡで構成されアンチセンス鎖がＲＮＡで構成された２本鎖ポリヌクレオチドであることが望ましい。
また、本明細書におけるｓｉＲＮＡは、キメラ構造を有してもよい。キメラ構造とは、１本鎖ポリヌクレオチド中にＤＮＡとＲＮＡとを両方含む構造である。かかるキメラ構造は、被導入体に導入した際に標的遺伝子の発現を抑制する活性を有するものであれば構造は特には限定されない。本発明者らの研究によれば、ｓｉＲＮＡは構造・機能的にアシンメトリー性（非対称性）を有する傾向が認められ、ＲＮＡ干渉を生じさせるという目的からすると、センス鎖の５’末端側の半分、アンチセンス鎖の３’末端側の半分はＲＮＡで構成されることが望ましい。
ところで、キメラ構造を有するｓｉＲＮＡでは、被導入体内おける安定性や製造コスト等の点から、ＲＮＡの含量をできるだけ少なくすることが好ましい。そこで、高い標的遺伝子の発現抑制効果を維持しつつＲＮＡ含量を低減可能なｓｉＲＮＡについて発明者らが鋭意検討したところ、センス鎖の５’末端から９〜１３ポリヌクレオチドの部分、およびアンチセンス鎖の３’末端から９〜１３ポリヌクレオチドの部分（例えば、センス鎖およびアンチセンス鎖の前記各末端から１１ポリヌクレオチド、好ましくは１０ポリヌクレオチド、さらに好ましくは９ポリヌクレオチドの部分）はＲＮＡで構成されることが望ましく、特に、アンチセンス鎖の３’末端側が当該構成を有することが望ましいとの結果が得られた。なお、センス鎖のＲＮＡ部分とアンチセンス鎖のＲＮＡ部分とは、その位置が必ずしも一致していなくてもよい。
２本鎖ポリヌクレオチドは、一方の鎖が標的遺伝子の塩基配列中に含まれる、（ａ）から（ｄ）の規則に従う規定配列と相同な塩基配列の３’末端にオーバーハング部を設けて形成され、他方の鎖が、前記規定配列と相同な塩基配列と相補的な配列の３’末端にオーバーハング部を設けて形成される。各鎖の塩基数はオーバーハング部を含め１８〜２４であり、より好ましくは２０〜２２、特に好ましくは２１である。また、オーバーハング部の塩基数は２であることが好ましい。全体の塩基数が２１、そのうちオーバーハング部が塩基数２で構成されるｓｉＲＮＡは、哺乳類でも細胞毒性を生じさせずに高確率でＲＮＡ干渉を生じさせるｓｉＲＮＡとして好適である。
ＲＮＡの合成は、例えば、化学合成によって合成してもよいし、また、通常のバイオテクノロジー等の手法に従って行うこともでき、所定の配列を有するＤＮＡ鎖を作製し、これを鋳型として転写酵素を用いて一本鎖ＲＮＡを合成し、一本鎖ＲＮＡを２本鎖化するなどの手法により合成することができる。
なお、分子生物学的な基本的手法については、ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（１９８６）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、細胞工学ハンドブック、黒木登志夫ら編、羊土社（１９９２）、新遺伝子工学ハンドブック改訂第３版、村松ら編、羊土社（１９９９）など、多くの標準的な実験マニュアルがある。
上記本発明の製造方法により得られるポリヌクレオチドとして好ましい形態を示すと、ＲＮＡ干渉の標的遺伝子の塩基配列中から前記（ａ）から（ｄ）の規則に従う塩基数１３〜２８の配列部位を検索し、一方の鎖が、標的遺伝子の塩基配列中に含まれる、前記（ａ）から（ｄ）の規則に従う規定配列と相同な塩基配列の３’末端にオーバーハング部を設けて形成され、他方の鎖が、前記規定配列と相同な塩基配列と相補的な配列の３’末端にオーバーハング部を設けて形成され、各鎖の塩基数が１５〜３０であるように合成された、２本鎖ポリヌクレオチドが例示される。当該ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ干渉を生じさせる確率の高いポリヌクレオチドである。
また、ｓｉＲＮＡを発現するような発現ベクターを調製することもできる。規定配列を含む配列を発現するベクターを、発現が行われ得る無細胞系または細胞系の条件下におくことで、発現ベクターを用いて所定のｓｉＲＮＡを供給することができる。
従来、ｓｉＲＮＡの設計は、試験者の経験や勘に依存していたため、試行錯誤を繰り返すことが多かった。しかし、本発明の２本鎖ポリヌクレオチドの作製方法により、ＲＮＡ干渉を生じさせる２本鎖ポリヌクレオチドを高い確率で製造することが可能である。上記本発明の検索方法、配列設計方法またはポリヌクレオチドの作製方法によれば、ＲＮＡ干渉を利用した各種の試験や製造等に要する労力、時間、コストを大幅に削減することが可能である。すなわち、本発明は、遺伝子解析、創薬ターゲットの探索、創薬、遺伝子治療、生物種間の差の研究などのＲＮＡ干渉を利用する様々な試験、研究、開発、製造等を大幅に簡便にし、効率の向上を図ることができる。
本発明はまた一態様として、上述した本発明のポリペプチドの選択方法も提供する。具体的には、発現を抑制しようとする標的遺伝子の発現系に導入するポリヌクレオチドの選択方法であって、
少なくとも２本鎖領域を有し、
前記２本鎖領域における一方の鎖が、標的遺伝子の塩基配列中に含まれる、下記（ａ）から（ｆ）の規則：
（ａ）３’末端の塩基が、アデニン、チミンまたはウラシルであり；
（ｂ）５’末端の塩基が、グアニンまたはシトシンであり；
（ｃ）３’末端の７塩基の配列において、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基がリッチであり；
（ｄ）塩基数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数であり、；
（ｅ）１０塩基以上グアニンまたはシトシンが連続する配列を含まず；
（ｆ）目的生物の全遺伝子配列のうち、標的遺伝子以外の他の遺伝子の塩基配列中に、当該規定配列と９０％以上の相同性を有する配列が含まれない
に従う規定配列と相同な塩基配列からなり、そして、
前記２本鎖領域における他方の鎖が、前記規定配列と相同な塩基配列と相補的な配列を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドを選択することを特徴とするポリヌクレオチドの選択方法、が提供される。
本発明の選択方法によって得られるポリペプチドの標的となる配列は、前述の（ａ）−（ｆ）の規則を満たす規定配列として、選択された配列である。好ましくは、配列番号４７〜配列番号８１７０８１のいずれであってよい。
本発明の選択方法は、前記選択したポリヌクレオチドから、さらに、前記標的遺伝子の規定配列と相同な塩基配列が、前記標的遺伝子以外の他の遺伝子の塩基配列とのミスマッチ数が少なくとも３塩基であり、かつ、当該少なくとも３塩基のミスマッチを有する塩基配列を有する他の遺伝子の数が最も少ない配列であるポリヌクレオチドを選択することを含んでもよい。
即ち、当該標的配列が標的遺伝子に高い特異性を有する配列であれば、ポリヌクレオチドが当該標的配列を含む標的遺伝子に対してのみ選択的に発現抑制効果を奏しそれ以外の遺伝子に対しては発現抑制を生じさせない（すなわち、オフターゲット効果がより低い）ので、副作用の影響等を低減できる。したがって、ポリヌクレオチドの標的配列は、標的遺伝子に特異性が高いことがより好ましく、前述の（ａ）−（ｆ）の規則を満たす規定配列として、選択された配列（例えば、配列番号４７〜配列番号８１７０８１）の中でも、よりオフターゲット効果を低減可能な配列であることが好ましい。好ましい標的遺伝子の規定配列として、他の遺伝子の塩基配列とのミスマッチ数が少なくとも３塩基であり、かつ、少なくとも３塩基のミスマッチを有する塩基配列を有するその他の遺伝子の数が最も少ない配列を選択することができる。「その他の遺伝子の数が最も少ない」とは、「少なくとも３塩基のミスマッチを有する塩基配列を有するその他の遺伝子」、即ち類似する遺伝子、ができるだけ存在しないこと、例えば、好ましくは１０個以内、より好ましくは６個以内、さらにより好ましくは１個のみ存在する、あるいは、最も好ましくは全く存在しない、ことを意味する。
例えば、配列番号４７〜配列番号８１７０８１の中から、他の遺伝子の塩基配列とのミスマッチ数が３塩基であり（言い換えれば、１９塩基からなる（狭義の）規定配列のうち当該ミスマッチ３塩基以外の１６塩基が一致する）、かつ、３塩基のミスマッチを有する塩基配列を有するその他の遺伝子の数が最も少ない配列を選択して得られたのが、図４６に示す５３９９８種の配列である。よって、これらの配列のいずれかであることが特に好ましい。
＜４＞遺伝子の発現抑制方法
本発明の遺伝子発現抑制方法は、所定の塩基配列を検索する工程と、検索された塩基配列に基づいてポリヌクレオチドの塩基配列を設計して合成する工程と、得られたポリヌクレオチドを標的遺伝子を含む発現系に導入する工程とを含む。
所定の塩基配列を検索する工程は、上記ＲＮＡ干渉の標的塩基配列検索方法に従う。好ましい態様も上記の通りである。また、検索された塩基配列に基づいてｓｉＲＮＡの塩基配列を設計して合成する工程は、上記、ＲＮＡ干渉を生じさせるポリヌクレオチドの塩基配列設計方法、ポリヌクレオチドの作製方法に従って行うことができ、好ましい形態も同様である。
得られたポリヌクレオチドは、標的遺伝子の発現系に添加して標的遺伝子の発現を抑制する。標的遺伝子の発現系とは、標的遺伝子が発現している体系のことであり、より具体的には、少なくとも標的遺伝子のｍＲＮＡが形成される反応系を備える系である。標的遺伝子の発現系としては、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、Ｉｎ  ｖｉｖｏのいずれも含まれる。標的遺伝子の発現系として、培養細胞、培養組織、生体などのほか、無細胞系で用いることも可能である。発現抑制をしようとする標的遺伝子（抑制標的遺伝子）は必ずしも検索された配列の由来と一致する生物種のものに限らずともよいが、検索対象遺伝子と抑制対象遺伝子の由来が近縁であればあるほど、特異的かつ効果的に特定遺伝子の抑制を行うことができる。
標的遺伝子の発現系に導入するとは、標的遺伝子の発現反応系の中に取り込ませるということである。具体的に例を挙げると、標的遺伝子を有する培養細胞に２本鎖ポリヌクレオチドをトランスフェクトし、細胞内に取り込ませる、規定配列およびオーバーハング部からなる塩基配列を有する発現ベクターを作製し、標的遺伝子を有する細胞内に導入する（ＷＯ０１／３６６４６、ＷＯ０１／４９８４４）などの手法が挙げられる。
本発明の遺伝子抑制方法によれば、効率よくＲＮＡ干渉を生じさせるポリヌクレオチドを得られるため、効率よく、また簡便に遺伝子を抑制することが可能である。したがって、例えば、対象遺伝子が疾患関連遺伝子の場合、当該疾患関連遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ（またはｓｈＲＮＡ）や、このようなｓｉＲＮＡ（またはｓｈＲＮＡ）を発現するベクターを、疾患関連遺伝子発現細胞へ導入することにより、疾患関連遺伝子を不活性化することができる。
本明細書において後述する実施例２−５では、ヒトビメンチン、ルシフェラーゼ、ＳＡＲＳウイルス等の遺伝子に対する本発明のポリヌクレオチドのＲＮＡｉ効果を、ｍＲＮＡの対照に対する相対的発現量で調べた。図３１、３２および３５は、ｍＲＮＡの発現量を定量ＰＣＲで測定した結果が示されている。ｍＲＮＡの相対発現量は図３１、３２および３５において各々、約７−８％（実施例２、図３１）、約１２−１３％（実施例３、図３２）、数％ないし約１５％未満（実施例５、図３５）と減少し、各遺伝子の発現抑制効果が確認された。また実施例４の図３４は、ＲＮＡｉ効果としてのｍＲＮＡの発現量をルシフェラーゼ活性で調べた結果であるが、同様に、対照と比較して数％ないし約２０％未満に減少した。
さらに、実施例８では、関連疾患や生物学的機能が明らかとなった図４６に示す遺伝子のうち、無作為に選択した約３００種の遺伝子について、ヒト由来ＨｅＬａ細胞でのｍＲＮＡの発現量を相対的発現量で調べた。表１で示したように、当該遺伝子の発現抑制効果、すなわちＲＮＡｉ効果を評価するために算出した後述のＲＱ値は、全て１未満であり、ほぼ全てが０．５未満であった。
本発明の遺伝子発現抑制方法において、「標的遺伝子の発現を抑制する」とは、標的遺伝子のｍＲＮＡ発現量が実質的に減少することを意味する。ｍＲＮＡ発現量が実質的に減少していれば、その変化の幅の大小にかかわらず、発現抑制が実現されている。特に、当該減少量が大きいほど発現抑制の効果が大きいことから、限定されるわけではないが、好ましくは約８０％以下、より好ましくは約５０％以下、さらにより好ましくは約２０％以下、さらにまた好ましくは約１５％以下、さらに好ましくは約８％以下に減少する場合を発現抑制の判定基準としてもよい。本発明の規則に従って選択されたポリヌクレオチドを用いる本発明の遺伝子抑制方法によれば、標的遺伝子のｍＲＮＡ発現量を好ましくは少なくとも５０％以下に減少させることが可能となる。
＜５＞ｓｉＲＮＡ配列設計プログラム
以下、ｓｉＲＮＡ配列設計プログラムの実施形態例を説明する。
（５−１）プログラムの概要
本プログラムは、ゲノムのシークエンスが進んでいない種、たとえばウマ、ブタなどに対してＲＮＡ干渉を行う際に、既に公開されているヒトとマウスのホモログの配列情報をもとに、目的の種で使用可能なｓｉＲＮＡの配列を計算するものである。本プログラムでｓｉＲＮＡを設計すれば、標的遺伝子をシークエンスすることなく迅速にＲＮＡ干渉を行うことができる。ｓｉＲＮＡの設計（計算）にあたっては、ＧまたはＣ配分の規則（上記（ａ）〜（ｄ）で示される規則）を考慮してＲＮＡｉ活性を有する確率が高い配列を選ぶとともに、標的遺伝子とは無関係の遺伝子に対してＲＮＡ干渉が起こらないようホモロジーサーチによるチェックを行っている。なお、本明細書において「ＧまたはＣ」を「Ｇ／Ｃ」と、「ＡまたはＴ」を「Ａ／Ｔ」とそれぞれ表記する場合がある。また、「Ａ／Ｔ（Ｕ）」とは、デオキシリボ核酸による配列の場合Ｔ（チミン）であり、リボ核酸による配列の場合Ｕ（ウラシル）であることを示す。
（５−２）ｓｉＲＮＡ設計の方針
ヒトの遺伝子Ｘおよび、そのホモログであるマウスの遺伝子Ｘの配列が既知であるとする。本プログラムはそれらの配列を読み込み、コード領域（ＣＤＳ）部分から２３塩基以上の完全に共通な配列を探し出す。この共通部分からｓｉＲＮＡを設計すれば、そのｓｉＲＮＡはヒトとマウスの遺伝子Ｘをともに標的とすることができる（図１）。
ヒトとマウスとで完全に共通な部分は、他の哺乳類でも保存されている確率が高いと考えられるので、上記のｓｉＲＮＡはヒトとマウスの遺伝子Ｘのみならず、他の哺乳類の遺伝子Ｘに対しても機能することが期待される。つまり、標的遺伝子の配列が未知の動物種であっても、対応するヒトとマウスのホモログについて配列情報が既知であれば、本プログラムを用いてｓｉＲＮＡを設計することができる。
なお、哺乳類においては、実際に機能するｓｉＲＮＡは配列に規則性があることが判っている（図２）。本プログラムでは、その規則に適合した配列のみを選ぶようにした。図２は、ＲＮＡｉ効果を示すｓｉＲＮＡの配列の規則性（ｓｉＲＮＡのＧ／Ｃ配分の規則）を示す図である。図２において、２１塩基の長さをもつ２本のＲＮＡ鎖が、それぞれ３’側に２塩基のオーバーハングを持つように５’側の１９塩基どうしで塩基対を形成しているようなｓｉＲＮＡで、塩基対を形成している１９塩基のうちコーディング側の配列の、１）３’末端がＡ／Ｕであること、２）５’末端がＧ／Ｃであること、３）３’側の７文字は、Ａ／Ｕの割合が高いこと、が求められる。特に、１）および２）の条件は重要である。
（５−３）プログラムの構造
本プログラムは３つの部分から構成されている。すなわち、（５−３−１）ヒトとマウスとで共通部位の配列（部分配列）を検索する部分、（５−３−２）Ｇ／Ｃ配分の規則に基づいて配列にスコアをつける部分、（５−３−３）無関係の遺伝子を標的にしないようホモロジーサーチによりチェックする部分、である。
（５−３−１）共通配列を検索する部分
複数の塩基配列ファイル（ｆｉｌｅ１，ｆｉｌｅ２，ｆｉｌｅ３，．．．）を読み込み、全ファイルに共通に出現する２３文字の配列をすべて見いだす。
（計算例）
ｆｉｌｅ１としてヒトの遺伝子ＦＢＰ１（ＮＭ＿０００５０７：Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｆｒｕｃｔｏｓｅ−１，６−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ１）、ｆｉｌｅ２としてマウスの遺伝子Ｆｂｐ１（ＮＭ＿０１９３９５：Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｆｒｕｃｔｏｓｅ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １）の配列をプログラムに入力した。その結果、両者の配列（図３）から両者に共通な２３文字の配列（ヒトＦＢＰ１とマウスＦｂｐ１に共通な配列）が１５個見いだされた（図４）。
（５−３−２）配列にスコアをつける部分
前述のＧ／Ｃ配分の規則に適合した配列のみを選択するために、２３文字の配列に対してスコアを付ける。
（方法）
２３文字の配列に対して、以下のようにスコアを付ける。
スコア１：先頭から２１文字目がＡ／Ｕか。［ｎｏ＝０，ｙｅｓ＝１］
スコア２：先頭から３文字目がＧ／Ｃか。［ｎｏ＝０，ｙｅｓ＝１］
スコア３：先頭から１５文字目から２１文字目までの７文字のうち、Ａ／Ｕの数。［０−７］
総合スコア：スコア１〜３の積。ただし積が３以下の場合は０とする。
（計算例）  図４に示した１５個の配列に対して計算を行った結果を、図５に示す。図５は、ヒトＦＢＰ１とマウスＦｂｐ１に共通な配列にスコアを付した図である。なお、図５に示す配列の後には、スコア１、スコア２、スコア３、総合スコアが順に記載されている。
（５−３−３）無関係の遺伝子を標的にしないようチェックする部分
設計したｓｉＲＮＡが、標的遺伝子とは無関係の遺伝子に対して機能しないよう、公開されているヒト・マウスの全ｍＲＮＡに対してホモロジーサーチを行い、無関係の遺伝子がヒットする度合いを評価する。ホモロジーサーチには各種アルゴリズムが使用可能であるが、ここでは、ＢＬＡＳＴを使用した例を示す。なお、ＢＬＡＳＴを用いる場合は、検索配列が２３塩基と短いことを考慮して、Ｗｏｒｄ  Ｓｉｚｅを十分に小さくすることが望ましい。
ＢＬＡＳＴの結果、Ｅ  ｖａｌｕｅが１０．０以下のヒットのうち、標的遺伝子以外の全てのヒットについて、Ｅ  ｖａｌｕｅの逆数の総和を求める（以下、この値をホモロジー・スコアと呼ぶ）。すなわち、ホモロジー・スコア（Ｘ）は、下記式により求められる。
2005116204.tif 000002
注意点：Ｅ  ｖａｌｕｅが低いヒットほど、ｑｕｅｒｙの２３文字とホモロジーが高く、ｓｉＲＮＡの標的とされる危険性が高い。また、ヒットの数が多いほど、より多くの無関係な遺伝子を標的にする確率が高い。この２点を考慮して、ｓｉＲＮＡが標的遺伝子と無関係の遺伝子を標的にする危険性を、上の式を用いて評価している。
（計算例）
２３文字の配列に対して、上記のホモロジーサーチを行った結果と、ホモロジー・スコアを示す（図６、図７）。なお、図６には、ヒトＦＢＰ１とマウスＦｂｐ１に共通な配列「ｃａｃｃｃｔｇａｃｃｃｇｃｔｔｃｇｔｃａｔｇｇ」をＢＬＡＳＴした結果が示されており、最初の２行は、マウスＦｂｐ１とヒトＦＢＰ１がヒットしたものである。ホモロジー・スコアは５．９で、ヒットが少ない例である。この配列のｓｉＲＮＡは、他の遺伝子を標的にする危険性が低い。また、図７には、ヒトＦＢＰ１とマウスＦｂｐ１に共通な配列「ｇｃｃｔｔｃｔｇａｇａａｇｇａｔｇｃｔｃｔｇｃ」をＢＬＡＳＴした結果が示されている。ヒットが多い例で、ホモロジー・スコアは１７０．８である。他の遺伝子を標的にする危険性が高いため、ｓｉＲＮＡとして適さない。
実際には、上記の（５−３−１）、（５−３−２）、（５−３−３）の部分は一体として構成してもよく、図３に示したヒトとマウスの配列を入力すると、図８のような出力が直接得られる。ここで、図８に示す配列の後には、スコア１、スコア２、スコア３、総合スコア、および、ホモロジー・スコアを１０倍した値が順に記載されている。なお、処理時間短縮のため、総合スコアが０の配列はホモロジー・スコアを計算しないようにしてもよい。この結果から、ｓｉＲＮＡとして「３６  ｃａｃｃｃｔｇａｃｃｃｇｃｔｔｃｇｔｃａｔｇｇ」の部分を使えばよいことがわかる。また、（５−３−１）、（５−３−２）、（５−３−３）の部分のうち１つの機能を単独で利用することもできる。
（５−４）実際の計算
ヒト・マウス間のホモログのうち約６４００遺伝子のペアに対して、実際に本プログラムでｓｉＲＮＡの設計をおこなった。その結果、約７割について、ヒトとマウスとに共通な配列で、かつ有効なｓｉＲＮＡの配列規則性の規則を満たし、無関係な遺伝子を標的としないようなｓｉＲＮＡが設計できた。
これらのｓｉＲＮＡはヒトとマウスのみならず、多岐の哺乳類で効果的に標的遺伝子を抑える効果があると期待され、家畜や愛玩動物などへの応用など産業的価値が高いと考えられる。また本プログラムを用い、同種内の複数の遺伝子、たとえばｅＩＦ２Ｃ１とｅＩＦ２Ｃ２を同時に標的とするｓｉＲＮＡを設計することも可能であり、本プログラムが提供するｓｉＲＮＡ設計の手法は、応用範囲が広くきわめて強力なものといえる。さらに、ヒトとマウスの共通な部分の配列を用いてＰＣＲプライマーを設計すれば、多岐の哺乳類で目的の遺伝子を増幅できる、といった利用法もある。
なお、ｓｉＲＮＡ配列設計プログラムを実行する装置の実施の形態は、下記＜７＞ｓｉＲＮＡ配列設計プログラムを実行する塩基配列処理装置等の欄に詳細に示す。
＜６＞ｓｉＲＮＡ配列設計ビジネスモデルシステム
本発明のｓｉＲＮＡ配列設計ビジネスモデルシステムは、ｓｉＲＮＡ配列設計プログラムを適用するにあたり、ゲノムデータベース、ＥＳＴデータベース、進化系統樹データベースを本プログラムのロジックに添って単独で或いは組み合わせて参照し、遺伝子配列情報のａｖａｉｌａｂｌｅ状態に応じた効果的なｓｉＲＮＡを顧客へ提案するというシステムである。ａｖａｉｌａｂｌｅ状態とは、情報が利用可能な状態であることをいう。
（１）ゲノム情報がａｖａｉｌａｂｌｅだがＯＲＦの特定が困難なものについては、ＥＳＴ情報、等を基にエクソン想定部位に対して効果的なｓｉＲＮＡ候補を抽出し、スプライシングバリアントを考慮したｓｉＲＮＡ配列とその評価結果を表示する。
（２）遺伝子配列、遺伝子名が明らかなものは、遺伝子配列または遺伝子名を入力後、効果的なｓｉＲＮＡ候補を抽出し、ｓｉＲＮＡ配列とその評価結果を表示する。
（３）ゲノム情報がａｖａｉｌａｂｌｅでないものについては、同種の遺伝子機能を保存している類縁関係（同属、乃至は起源を同じとする）にある生物種の遺伝子配列、或いは進化系統樹的に挟まれた、ゲノム配列がａｖａｉｌａｂｌｅな２種類以上の生物種の遺伝子配列、を用いて効果的なｓｉＲＮＡ候補を抽出し、ｓｉＲＮＡ配列とその評価結果を表示する。
（４）感染症の遺伝子機能解析、創薬ターゲット発掘には、微生物のゲノムデータベース・進化系統樹データベースへ更に微生物のアポトーシス誘導部位情報、機能発現部位情報を組み合わせて網羅的なｓｉＲＮＡ候補配列を求める手法が有効である。
＜７＞ｓｉＲＮＡ配列設計プログラムを実行する塩基配列処理装置等
以下、上述したｓｉＲＮＡ配列設計プログラムを実行する装置である、本発明にかかる塩基配列処理装置、塩基配列処理方法をコンピュータに実行させるプログラム、記録媒体、および、塩基配列処理システムの実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、この実施の形態によりこの発明が限定されるものではない。
［発明の概要］
以下、本発明の概要について説明し、その後、本発明の構成および処理等について詳細に説明する。図１２は、本発明の基本原理を示す原理構成図である。
本発明は、概略的に、以下の基本的特徴を有する。すなわち、本発明は、ＲＮＡ干渉の標的遺伝子の塩基配列情報を取得して、塩基配列情報の予め定めた塩基数の配列部位である部分塩基配列情報を作成する（ステップＳ−１）。
ここで、ステップＳ−１において、塩基配列情報の標的遺伝子のコード領域、または、転写領域に対応する部位から、予め定めた塩基数の部分塩基配列情報を作成してもよい。また、異なる生物に由来する複数の塩基配列情報（例えば、ヒトの塩基配列情報およびマウスの塩基配列情報など）の間で共通する、予め定めた塩基数の部分塩基配列情報を作成してもよい。また、同じ生物種における類似する複数の塩基配列情報の間で共通する、予め定めた塩基数の共通な部分塩基配列情報を作成してもよい。また、異なる生物に由来する複数の塩基配列情報の標的遺伝子のコード領域、または、転写領域に対応する部位から、予め定めた塩基数の共通な部分塩基配列情報を作成してもよい。また、同じ生物種における類似する複数の塩基配列情報の標的遺伝子のコード領域、または、転写領域に対応する部位から、予め定めた塩基数の共通な部分塩基配列情報を作成してもよい。これにより、標的遺伝子に特異的にＲＮＡ干渉を生じさせる規定配列を効率よく選択することができ、計算負荷を軽減できる。
さらに、ステップＳ−１において、オーバーハング部位を含む部分塩基配列情報を作成してもよい。具体的には、例えば、オーバーハング部位が含まれていることを表すオーバーハング部位含有情報が付加された部分塩基配列情報を作成してもよい。すなわち、部分塩基配列情報とオーバーハング部位含有情報とを相互に関連付けてもよい。これにより、最初から規定配列およびオーバーハング部位を含めて選択を行い、設計することができるようになる。
なお、上述の予め定めた塩基数の上限は、オーバーハング部位を含まない場合は、好ましくは２８以下、より好ましくは２２以下、さらに好ましくは２０以下であり、オーバーハング部位を含む場合は、好ましくは３２以下、より好ましくは２６以下、さらに好ましくは２４以下である。また、予め定めた塩基数の下限は、オーバーハング部位を含まない場合は、好ましくは１３以上、より好ましくは１６以上、さらに好ましくは１８以上であり、オーバーハング部位を含む場合は、好ましくは１７以上、より好ましくは２０以上、さらに好ましくは２２以上である。そして、最も好ましい予め定めた塩基数は、オーバーハング部位を含まない場合は、１９であり、オーバーハング部位を含む場合は、２３である。これにより、哺乳類においても細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせる規定配列を効率よく選択することができる。
ついで、ステップＳ−１にて作成された部分塩基配列情報の３’末端の塩基がアデニン、チミン、または、ウラシルであるか否かを判定する（ステップＳ−２）。なお、具体的には、例えば、３’末端の塩基がアデニン、チミン、または、ウラシルであるときには「１」を、そうでないときには「０」を判定結果として出力してもよい。
ついで、ステップＳ−１にて作成された部分塩基配列情報の５’末端の塩基がグアニン、または、シトシンであるか否かを判定する（ステップＳ−３）。なお、具体的には、例えば、５’末端の塩基がグアニン、または、シトシンであるときには「１」を、そうでないときには「０」を判定結果として出力してもよい。
ついで、ステップＳ−１にて作成された部分塩基配列情報の３’末端の７塩基からなる塩基配列情報が、アデニン、チミン、および、ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基がリッチな塩基配列情報であるか否かを判定する（ステップＳ−４）。なお、具体的には、例えば、部分塩基配列情報の３’末端の７塩基からなる塩基配列情報に含まれる、アデニン、チミン、および、ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基の数を判定結果として出力してもよい。ステップＳ−４における判定の規則は、ステップＳ−１にて作成された部分塩基配列情報の３’末端近傍の塩基配列情報がアデニン、チミン、および、ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基がリッチな塩基配列情報であることを規定しており、具体的に検索を行う際の一指標として３’末端から７塩基の範囲内の塩基配列情報がアデニン、チミン、および、ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基がリッチな塩基配列情報であることを規定している。
ここで、ステップＳ−４において、「リッチな塩基配列情報」は、上述の＜１＞ＲＮＡ干渉の標的塩基配列検索方法に記述されている「リッチな配列」であり、具体的には、例えば、ステップＳ−１にて作成された部分塩基配列情報が１９塩基程度からなる場合、当該部分塩基配列情報の７塩基からなる塩基配列情報が、アデニン、チミン、および、ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基が少なくとも好ましくは３塩基以上、より好ましくは４塩基以上、特に好ましくは５塩基以上含まれる塩基配列情報である。
また、ステップＳ−２からステップＳ−４において、オーバーハング部位を含む部分塩基配列情報を判定する場合、部分塩基配列情報のオーバーハング部位を除いた配列部位を判定対象として判定する。
ついで、ステップＳ−２、ステップＳ−３、および、ステップＳ−４にて判定された結果に基づいて、ステップＳ−１にて作成された部分塩基配列情報から標的遺伝子に特異的にＲＮＡ干渉を生じさせる規定配列情報を選択する（ステップＳ−５）。
具体的には、例えば、ステップＳ−２にて３’末端の塩基がアデニン、チミン、または、ウラシルであると判定され、ステップＳ−３にて５’末端の塩基がグアニン、または、シトシンであると判定され、かつ、ステップＳ−４にて部分塩基配列情報の３’末端の７塩基からなる塩基配列情報が、アデニン、チミン、および、ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基がリッチな塩基配列情報であると判定された部分塩基配列情報を規定配列情報として選択する。ここで、具体的には、例えば、ステップＳ−２、ステップＳ−３、および、ステップＳ−４にて出力される数値の積を算出し、当該積の値に基づいて、ステップＳ−１にて作成された部分塩基配列情報から規定配列情報を選択してもよい。
これにより、哺乳類などにおいて、ＲＮＡ干渉を生じさせる確率が極めて高い、つまりＲＮＡ干渉に有効なｓｉＲＮＡの配列を効率よく、容易に作成することができる。
ここで、ステップＳ−５にて選択された規定配列情報の少なくとも一方の末端にオーバーハング部位を付加してもよい。なお、例えば、ターゲット側を検索する場合は、規定配列情報の両末端にオーバーハング部位を付加してもよい。これにより、ＲＮＡ干渉を生じさせるポリヌクレオチドの設計を簡便化することができる。
なお、上述のオーバーハング部位の塩基数は、上述の＜２＞ＲＮＡ干渉を生じさせるポリヌクレオチドの塩基配列設計方法に記述されている塩基数であり、具体的には、例えば、２が特に好適である。
また、ステップＳ−５にて選択された規定配列情報と同一または類似の塩基配列情報を、他の塩基配列情報（例えばＮＣＢＩのＲｅｆＳｅｑ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐｒｏｊｅｃｔ）などの公的データベースで公開されている塩基配列情報）から、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ｓｓｅａｒｃｈなどの既存のホモロジー検索手法を用いて検索し、検索された同一または類似の塩基配列情報に基づいて、規定配列情報が標的遺伝子とは無関係の遺伝子を標的にするか否かを評価してもよい。
具体的には、例えば、ステップＳ−５にて選択された規定配列情報と同一または類似の塩基配列情報を、他の塩基配列情報（例えばＮＣＢＩのＲｅｆＳｅｑなどの公的データベースで公開されている塩基配列情報）から、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ｓｓｅａｒｃｈなどの既存のホモロジー検索手法を用いて検索し、検索された同一または類似の塩基配列情報のうち標的遺伝子とは無関係の遺伝子の塩基配列情報の総数、および、標的遺伝子とは無関係の遺伝子の塩基配列情報に付された同一類似の度合いを示す値（例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびｓｓｅａｒｃｈの場合は、「Ｅ  ｖａｌｕｅ」）に基づいて、同一類似の度合いを示す値の逆数の総和を算出し、算出された総和に基づいて（例えば、算出された総和の大小などに基づいて）、規定配列情報が標的遺伝子とは無関係の遺伝子を標的にするか否かを評価してもよい。
これにより、規定配列情報から、標的とする遺伝子のみに特異的にＲＮＡ干渉を生じさせる配列を選出することができる。
以上、本発明により選択された、標的遺伝子と関係のない遺伝子についてまでＲＮＡ干渉を生じさせない規定配列情報に基づいてＲＮＡの合成を行えば、それにかかる労力、時間、費用を従来に比べ大幅に軽減することができる。
［システム構成］
まず、本システムの構成について説明する。図１３は、本発明が適用される本システムの構成の一例を示すブロック図であり、該構成のうち本発明に関係する部分のみを概念的に示している。
本システムは、概略的に、ＲＮＡ干渉の標的遺伝子の塩基配列情報を処理する塩基配列処理装置１００と、配列情報や構造情報等に関する外部データベースやホモロジー検索等の外部プログラム等を提供する外部システム２００とを、ネットワーク３００を介して通信可能に接続して構成されている。
図１３において、ネットワーク３００は、塩基配列処理装置１００と外部システム２００とを相互に接続する機能を有し、例えば、インターネット等である。
図１３において、外部システム２００は、ネットワーク３００を介して、塩基配列処理装置１００と相互に接続され、利用者に対して配列情報や構造情報等に関する外部データベースやホモロジー検索やモチーフ検索等の外部プログラムを実行するウェブサイトを提供する機能を有する。
ここで、外部システム２００は、ＷＥＢサーバやＡＳＰサーバ等として構成してもよく、そのハードウェア構成は、一般に市販されるワークステーション、パーソナルコンピュータ等の情報処理装置およびその付属装置により構成してもよい。また、外部システム２００の各機能は、外部システム２００のハードウェア構成中のＣＰＵ、ディスク装置、メモリ装置、入力装置、出力装置、通信制御装置等およびそれらを制御するプログラム等により実現される。
図１３において塩基配列処理装置１００は、概略的に、塩基配列処理装置１００の全体を統括的に制御するＣＰＵ等の制御部１０２、通信回線等に接続されるルータ等の通信装置（図示せず）に接続される通信制御インターフェース部１０４、入力装置１１２や出力装置１１４に接続される入出力制御インターフェース部１０８、および、各種のデータベースやテーブルなどを格納する記憶部１０６を備えて構成されており、これら各部は任意の通信路を介して通信可能に接続されている。さらに、この塩基配列処理装置１００は、ルータ等の通信装置および専用線等の有線または無線の通信回線を介して、ネットワーク３００に通信可能に接続されている。
記憶部１０６に格納される各種のデータベースやテーブル（標的遺伝子塩基配列ファイル１０６ａ〜標的遺伝子アノテーションデータベース１０６ｈ）は、固定ディスク装置等のストレージ手段であり、各種処理に用いる各種のプログラムやテーブルやファイルやデータベースやウェブページ用ファイル等を格納する。
これら記憶部１０６の各構成要素のうち、標的遺伝子塩基配列ファイル１０６ａは、ＲＮＡ干渉の標的遺伝子の塩基配列情報を格納する標的遺伝子塩基配列格納手段である。図１４は、標的遺伝子塩基配列ファイル１０６ａに格納される情報の一例を示す図である。
標的遺伝子塩基配列ファイル１０６ａに格納される情報は、図１４に示すように、ＲＮＡ干渉の標的遺伝子の塩基配列情報を一意に識別する塩基配列識別情報（例えば、図１４の「ＮＭ＿０００５０７」）と、塩基配列情報（例えば、図１４の「ＡＴＧＧＣＴＧＡ・・・ＡＧＴＧＡ」）とを相互に関連付けて構成されている。
また、部分塩基配列ファイル１０６ｂは、ＲＮＡ干渉の標的遺伝子の塩基配列情報の予め定めた塩基数の配列部位である部分塩基配列情報を格納する部分塩基配列格納手段である。図１５は、部分塩基配列ファイル１０６ｂに格納される情報の一例を示す図である。
部分塩基配列ファイル１０６ｂに格納される情報は、図１５に示すように、部分塩基配列情報を一意に識別する部分塩基配列識別情報（例えば、図１５の「ＮＭ＿０００５０７：３６」）と、部分塩基配列情報（例えば、図１５の「ｃａｃｃｃｔ・・・ｔｃａｔｇｇ」）と、オーバーハング部位が含まれていることを表すオーバーハング部位含有情報（例えば、図１５の「含有」）とを相互に関連付けて構成されている。
また、判定結果ファイル１０６ｃは、後述する３’末端塩基判定部１０２ｂ、５’末端塩基判定部１０２ｃ、および、特定塩基含有判定部１０２ｄにて判定された結果を格納する判定結果手段である。図１６は、判定結果ファイル１０６ｃに格納される情報の一例を示す図である。
判定結果ファイル１０６ｃに格納される情報は、図１６に示すように、部分塩基配列識別情報（例えば、図１６の「ＮＭ＿０００５０７：３６」）と、３’末端塩基判定部１０２ｂにて判定された結果である３’末端塩基判定結果（例えば、図１６の「１」）と、５’末端塩基判定部１０２ｃにて判定された結果である５’末端塩基判定結果（例えば、図１６の「１」）と、特定塩基含有判定部１０２ｄにて判定された結果である特定塩基含有判定結果（例えば、図１６の「４」）と、３’末端塩基判定部１０２ｂ、５’末端塩基判定部１０２ｃ、および、特定塩基含有判定部１０２ｄにて判定された結果を総合した結果である総合判定結果（例えば、図１６の「４」）とを相互に関連付けて構成されている。
なお、図１６において、３’末端塩基判定結果および５’末端塩基判定結果は、３’末端塩基判定部１０２ｂ、５’末端塩基判定部１０２ｃのそれぞれにて「含む」と判定された場合「１」を設定し、「含まない」と判定された場合「０」を設定した場合の一例である。また、図１６において、特定塩基含有判定結果は、部分塩基配列情報の３’末端の７塩基からなる塩基配列情報に含まれる、アデニン、チミン、および、ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基の数を設定した場合の一例である。さらに、図１６において、総合判定結果は、３’末端塩基判定結果、５’末端塩基判定結果、および、特定塩基含有判定結果の積を設定した場合の一例である。なお、具体的には、例えば、当該積が３以下の場合は、「０」を設定してもよい。
また、規定配列ファイル１０６ｄは、標的遺伝子に特異的にＲＮＡ干渉を生じさせる部分塩基配列情報である規定配列情報を格納する規定配列格納手段である。図１７は、規定配列ファイル１０６ｄに格納される情報の一例を示す図である。
規定配列ファイル１０６ｄに格納される情報は、図１７に示すように、部分塩基配列識別情報（例えば、図１７の「ＮＭ＿０００５０７：３６」）と、標的遺伝子に特異的にＲＮＡ干渉を生じさせる部分塩基配列情報である規定配列情報（例えば、図１７の「ｃａｃｃｃｔ・・・ｔｃａｔｇｇ」）とを相互に関連付けて構成されている。
また、参照配列データベース１０６ｅは、後述する同一類似塩基配列検索部１０２ｇにて規定配列情報と同一または類似の塩基配列情報を検索するために参照する塩基配列情報である参照塩基配列情報を格納するデータベースである。なお、参照配列データベース１０６ｅは、インターネットを経由してアクセスする外部の塩基配列情報データベースであってもよく、また、これらのデータベースをコピーしたり、オリジナルの配列情報を格納したり、さらに独自のアノテーション情報等を付加したりして作成したインハウスデータベースであってもよい。図１８は、参照配列データベース１０６ｅに格納される情報の一例を示す図である。
参照配列データベース１０６ｅに格納される情報は、図１８に示すように、参照配列識別情報（例えば、図１８の「ｒｅｆ｜ＮＭ＿０１５８２０．１｜」）と、参照塩基配列情報（例えば、図１８の「ｃａｃｃｃｔ・・・ｇｃａｔｇｇ」）とを相互に関連付けて構成されている。
また、同一類似度ファイル１０６ｆは、後述する同一類似塩基配列検索部１０２ｇにて検索された同一または類似の塩基配列情報に付された同一類似の度合いを示す値である同一類似度を格納する同一類似度格納手段である。図１９は、同一類似度ファイル１０６ｆに格納される情報の一例を示す図である。
同一類似度ファイル１０６ｆに格納される情報は、図１９に示すように、部分塩基配列識別情報（例えば、図１９の「ＮＭ＿０００５０７：３６」）と、参照配列識別情報（例えば、図１９の「ｒｅｆ｜ＮＭ＿０１５８２０．１｜」および「ｒｅｆ｜ＮＭ＿００３８３７．１｜」）と、同一類似度（例えば、図１９の「０．５２」）とを相互に関連付けて構成されている。
また、評価結果ファイル１０６ｇは、後述する無関係遺伝子標的評価部１０２ｈにて標的遺伝子とは無関係の遺伝子を標的にするか否かを評価した結果を格納する評価結果格納手段である。図２０は、評価結果ファイル１０６ｇに格納される情報の一例を示す図である。
評価結果ファイル１０６ｇに格納される情報は、図２０に示すように、部分塩基配列識別情報（例えば、図２０の「ＮＭ＿０００５０７：３６」および「ＮＭ＿０００５０７：４４１」）と、後述する総和算出部１０２ｍにて算出された総和（例えば、図２０の「５．９」および「１７０．８」）と、評価結果（例えば、図２０の「非標的」および「標的」）とを相互に関連付けて構成されている。なお、図２０において、「非標的」は、規定配列情報が標的遺伝子とは無関係の遺伝子を標的にしないことを意味し、また、「標的」は、規定配列情報が標的遺伝子とは無関係の遺伝子を標的にすることを意味する。
また、標的遺伝子アノテーションデータベース１０６ｈは、標的遺伝子に関するアノテーション情報を格納する標的遺伝子アノテーション格納手段である。なお、標的遺伝子アノテーションデータベース１０６ｈは、インターネットを経由してアクセスする、遺伝子に関するアノテーション情報を格納する外部のアノテーションデータベースであってもよく、また、これらのデータベースをコピーしたり、オリジナルの配列情報を格納したり、さらに独自のアノテーション情報等を付加したりして作成したインハウスデータベースであってもよい。
標的遺伝子アノテーションデータベース１０６ｈに格納される情報は、標的遺伝子を識別する標的遺伝子識別情報（例えば標的遺伝子の遺伝子名、アクセッション（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号など（例えば、図３の最上部に記載の「ＮＭ＿０００５０７」、「ＦＢＰ１」））と標的遺伝子に関する簡略的な情報（例えば図３の最上部に記載の「Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｆｒｕｃｔｏｓｅ−１，６−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １」）とを相互に関連付けて構成されている。
また、図１３において、通信制御インターフェース部１０４は、塩基配列処理装置１００とネットワーク３００（またはルータ等の通信装置）との間における通信制御を行う。すなわち、通信制御インターフェース部１０４は、他の端末と通信回線を介してデータを通信する機能を有する。
また、図１３において、入出力制御インターフェース部１０８は、入力装置１１２や出力装置１１４の制御を行う。ここで、出力装置１１４としては、モニタ（家庭用テレビを含む）の他、スピーカを用いることができる（なお、以下においては出力装置１１４をモニタとして記載する場合がある）。また、入力装置１１２としては、キーボード、マウス、および、マイク等を用いることができる。また、モニタも、マウスと協働してポインティングデバイス機能を実現する。
また、図１３において、制御部１０２は、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）等の制御プログラム、各種の処理手順等を規定したプログラム、および所要データを格納するための内部メモリを有し、これらのプログラム等により、種々の処理を実行するための情報処理を行う。制御部１０２は、機能概念的に、部分塩基配列作成部１０２ａ、３’末端塩基判定部１０２ｂ、５’末端塩基判定部１０２ｃ、特定塩基含有判定部１０２ｄ、規定配列選択部１０２ｅ、オーバーハング部位付加部１０２ｆ、同一類似塩基配列検索部１０２ｇ、および、無関係遺伝子標的評価部１０２ｈを備えて構成されている。
このうち、部分塩基配列作成部１０２ａは、ＲＮＡ干渉の標的遺伝子の塩基配列情報を取得して、塩基配列情報の予め定めた塩基数の配列部位である部分塩基配列情報を作成する部分塩基配列作成手段である。ここで、部分塩基配列作成部１０２ａは、図２１に示すように、領域指定塩基配列作成部１０２ｉ、共通塩基配列作成部１０２ｊ、および、オーバーハング部位含有塩基配列作成部１０２ｋをさらに含んで構成される。
図２１は、本発明が適用される本システムの部分塩基配列作成部１０２ａの構成の一例を示すブロック図であり、該構成のうち本発明に関係する部分のみを概念的に示している。
図２１において、領域指定塩基配列作成部１０２ｉは、塩基配列情報の標的遺伝子のコード領域、または、転写領域に対応する部位から、予め定めた塩基数の部分塩基配列情報を作成する領域指定塩基配列作成手段である。
また、共通塩基配列作成部１０２ｊは、異なる生物に由来する複数の塩基配列情報の間で共通する、予め定めた塩基数の部分塩基配列情報を作成する共通塩基配列作成手段である。
また、オーバーハング部位含有塩基配列作成部１０２ｋは、オーバーハング部位を含む部分塩基配列情報を作成するオーバーハング部位含有塩基配列作成手段である。
再び図１３に戻り、３’末端塩基判定部１０２ｂは、部分塩基配列情報の３’末端の塩基がアデニン、チミン、または、ウラシルであるか否かを判定する３’末端塩基判定手段である。
また、５’末端塩基判定部１０２ｃは、部分塩基配列情報の５’末端の塩基がグアニン、または、シトシンであるか否かを判定する５’末端塩基判定手段である。
また、特定塩基含有判定部１０２ｄは、部分塩基配列情報の３’末端の７塩基からなる塩基配列情報が、アデニン、チミン、および、ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基がリッチな塩基配列情報であるか否かを判定する特定塩基含有判定手段である。
また、規定配列選択部１０２ｅは、３’末端塩基判定部１０２ｂ、５’末端塩基判定部１０２ｃ、および、特定塩基含有判定部１０２ｃにて判定された結果に基づいて、部分塩基配列情報から標的遺伝子に特異的にＲＮＡ干渉を生じさせる規定配列情報を選択する規定配列選択手段である。
また、オーバーハング部位付加部１０２ｆは、規定配列情報の少なくとも一方の末端にオーバーハング部位を付加するオーバーハング部位付加手段である。
また、同一類似塩基配列検索部１０２ｇは、規定配列情報と同一または類似の塩基配列情報を他の塩基配列情報から検索する同一類似塩基配列検索手段である。
また、無関係遺伝子標的評価部１０２ｈは、同一または類似の塩基配列情報に基づいて、規定配列情報が標的遺伝子とは無関係の遺伝子を標的にするか否かを評価する無関係遺伝子標的評価手段である。ここで、無関係遺伝子標的評価部１０２ｈは、図２２に示すように、総和算出部１０２ｍ、および、総和基準評価部１０２ｎをさらに含んで構成される。
図２２は、本発明が適用される本システムの無関係遺伝子標的評価部１０２ｈの構成の一例を示すブロック図であり、該構成のうち本発明に関係する部分のみを概念的に示している。
図２２において、総和算出部１０２ｍは、同一または類似の塩基配列情報のうち標的遺伝子とは無関係の遺伝子の塩基配列情報の総数、および、標的遺伝子とは無関係の遺伝子の塩基配列情報に付された同一類似の度合いを示す値（同一類似度）に基づいて、同一類似の度合いを示す値の逆数の総和を算出する総和算出手段である。
また、総和基準評価部１０２ｎは、総和算出部１０２ｍにて算出された総和に基づいて、規定配列情報が標的遺伝子とは無関係の遺伝子を標的にするか否かを評価する総和基準標的評価手段である。
なお、これら各部によって行なわれる処理の詳細については、後述する。
［システムの処理］
次に、このように構成された本実施の形態における本システムの処理の一例について、以下に図２３、および、図２４を参照して詳細に説明する。
［メイン処理］
まず、メイン処理の詳細について図２３等を参照して説明する。図２３は、本実施形態における本システムのメイン処理の一例を示すフローチャートである。
まず、塩基配列処理装置１００は、部分塩基配列作成部１０２ａにて行われる部分塩基配列作成処理により、ＲＮＡ干渉の標的遺伝子の塩基配列情報を取得して標的遺伝子塩基配列ファイル１０６ａの所定の記憶領域に格納し、塩基配列情報の予め定めた塩基数の配列部位である部分塩基配列情報を作成し、作成された部分塩基配列情報を部分塩基配列ファイル１０６ｂの所定の記憶領域に格納する（ステップＳＡ−１）。
ここで、ステップＳＡ−１において、部分塩基配列作成部１０２ａは、領域指定塩基配列作成部１０２ｉの処理により、塩基配列情報の標的遺伝子のコード領域、または、転写領域に対応する部位から、予め定めた塩基数の部分塩基配列情報を作成し、作成された部分塩基配列情報を部分塩基配列ファイル１０６ｂの所定の記憶領域に格納してもよい。
また、ステップＳＡ−１において、部分塩基配列作成部１０２ａは、共通塩基配列作成部１０２ｊの処理により、異なる生物に由来する複数の塩基配列情報（例えば、ヒトの塩基配列情報およびマウスの塩基配列情報など）の間で共通する、予め定めた塩基数の部分塩基配列情報を作成し、作成された部分塩基配列情報を部分塩基配列ファイル１０６ｂの所定の記憶領域に格納してもよい。なお、同じ生物種における類似する複数の塩基配列情報の間で共通する、予め定めた塩基数の共通な部分塩基配列情報を作成してもよい。
また、ステップＳＡ−１において、部分塩基配列作成部１０２ａは、領域指定塩基配列作成部１０２ｉ、および、共通塩基配列作成部１０２ｊの処理により、異なる生物に由来する複数の塩基配列情報の標的遺伝子のコード領域、または、転写領域に対応する部位から、予め定めた塩基数の共通な部分塩基配列情報を作成し、作成された部分塩基配列情報を部分塩基配列ファイル１０６ｂの所定の記憶領域に格納してもよい。なお、同じ生物種における類似する複数の塩基配列情報の標的遺伝子のコード領域、または、転写領域に対応する部位から、予め定めた塩基数の共通な部分塩基配列情報を作成してもよい。
さらに、ステップＳＡ−１において、部分塩基配列作成部１０２ａは、オーバーハング部位含有塩基配列作成部１０２ｋの処理により、オーバーハング部位を含む部分塩基配列情報を作成してもよい。具体的には、例えば、部分塩基配列作成部１０２ａは、オーバーハング部位含有塩基配列作成部１０２ｋの処理により、オーバーハング部位が含まれていることを表すオーバーハング部位含有情報が付加された部分塩基配列情報を作成し、作成された部分塩基配列情報とオーバーハング部位含有情報と相互に関連付けて部分塩基配列ファイル１０６ｂの所定の記憶領域に格納してもよい。
なお、上述の予め定めた塩基数の上限は、オーバーハング部位を含まない場合は、好ましくは２８以下、より好ましくは２２以下、さらに好ましくは２０以下であり、オーバーハング部位を含む場合は、好ましくは３２以下、より好ましくは２６以下、さらに好ましくは２４以下である。また、予め定めた塩基数の下限は、オーバーハング部位を含まない場合は、好ましくは１３以上、より好ましくは１６以上、さらに好ましくは１８以上であり、オーバーハング部位を含む場合は、好ましくは１７以上、より好ましくは２０以上、さらに好ましくは２２以上である。そして、最も好ましい予め定めた塩基数は、オーバーハング部位を含まない場合は、１９であり、オーバーハング部位を含む場合は、２３である。
ついで、塩基配列処理装置１００は、３’末端塩基判定部１０２ｂの処理により、ステップＳＡ−１にて作成された部分塩基配列情報の３’末端の塩基がアデニン、チミン、または、ウラシルであるか否かを判定し、判定した結果を判定結果ファイル１０６ｃの所定の記憶領域に格納する（ステップＳＡ−２）。具体的には、例えば、塩基配列処理装置１００は、３’末端塩基判定部１０２ｂの処理により、ステップＳＡ−１にて作成された部分塩基配列情報の３’末端の塩基がアデニン、チミン、または、ウラシルであるときには「１」を、そうでないときには「０」を判定結果ファイル１０６ｃの所定の記憶領域に格納してもよい。
ついで、塩基配列処理装置１００は、５’末端塩基判定部１０２ｃの処理により、ステップＳＡ−１にて作成された部分塩基配列情報の５’末端の塩基がグアニン、または、シトシンであるか否かを判定し、判定した結果を判定結果ファイル１０６ｃの所定の記憶領域に格納する（ステップＳＡ−３）。具体的には、例えば、塩基配列処理装置１００は、５’末端塩基判定部１０２ｃの処理により、ステップＳＡ−１にて作成された部分塩基配列情報の５’末端の塩基がグアニン、または、シトシンであるときには「１」を、そうでないときには「０」を判定結果ファイル１０６ｃの所定の記憶領域に格納してもよい。
ついで、塩基配列処理装置１００は、特定塩基含有判定部１０２ｄの処理により、ステップＳＡ−１にて作成された部分塩基配列情報の３’末端の７塩基からなる塩基配列情報が、アデニン、チミン、および、ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基がリッチな塩基配列情報であるか否かを判定し、判定した結果を判定結果ファイル１０６ｃの所定の記憶領域に格納する（ステップＳＡ−４）。具体的には、例えば、塩基配列処理装置１００は、特定塩基含有判定部１０２ｄの処理により、ステップＳＡ−１にて作成された部分塩基配列情報の３’末端の７塩基からなる塩基配列情報に含まれる、アデニン、チミン、および、ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基の数を判定結果ファイル１０６ｃの所定の記憶領域に格納してもよい。ステップＳＡ−４における判定の規則は、ステップＳＡ−１にて作成された部分塩基配列情報の３’末端近傍の塩基配列情報がアデニン、チミン、および、ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基がリッチな塩基配列情報であることを規定しており、具体的に検索を行う際の一指標として３’末端から７塩基の範囲内の塩基配列情報がアデニン、チミン、および、ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基がリッチな塩基配列情報であることを規定している。
ここで、ステップＳＡ−４において、「リッチな塩基配列情報」は、上述の＜１＞ＲＮＡ干渉の標的塩基配列検索方法に記述されている「リッチな配列」であり、具体的には、例えば、ステップＳＡ−１にて作成された部分塩基配列情報が１９塩基程度からなる場合、当該部分塩基配列情報の３’末端の７塩基からなる塩基配列情報が、アデニン、チミン、および、ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基が少なくとも好ましくは３塩基以上、より好ましくは４塩基以上、特に好ましくは５塩基以上含まれる塩基配列情報である。
また、ステップＳＡ−２からステップＳＡ−４において、オーバーハング部位を含む部分塩基配列情報を判定する場合、部分塩基配列情報のオーバーハング部位を除いた配列部位を判定対象として判定する。
ついで、塩基配列処理装置１００は、規定配列選択部１０２ｅの処理により、ステップＳＡ−２、ステップＳＡ−３、および、ステップＳＡ−４にて判定された結果に基づいて、ステップＳＡ−１にて作成された部分塩基配列情報から標的遺伝子に特異的にＲＮＡ干渉を生じさせる規定配列情報を選択し、規定配列ファイル１０６ｄの所定の記憶領域に格納する（ステップＳＡ−５）。
具体的には、例えば、塩基配列処理装置１００は、規定配列選択部１０２ｅの処理により、ステップＳＡ−２にて３’末端の塩基がアデニン、チミン、または、ウラシルであると判定され、ステップＳＡ−３にて５’末端の塩基がグアニン、または、シトシンであると判定され、かつ、ステップＳＡ−４にて部分塩基配列情報の３’末端の７塩基からなる塩基配列情報が、アデニン、チミン、および、ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基がリッチな塩基配列情報であると判定された部分塩基配列情報を規定配列情報として選択し、規定配列ファイル１０６ｄの所定の記憶領域に格納する。ここで、具体的には、例えば、塩基配列処理装置１００は、規定配列選択部１０２ｅの処理により、ステップＳＡ−２、ステップＳＡ−３、および、ステップＳＡ−４にて出力される数値の積を算出し、当該積の値に基づいて、ステップＳＡ−１にて作成された部分塩基配列情報から規定配列情報を選択してもよい。
ここで、塩基配列処理装置１００は、オーバーハング部位付加部１０２ｆの処理により、ステップＳＡ−５にて選択された規定配列情報の少なくとも一方の末端にオーバーハング部位を付加して、規定配列ファイル１０６ｄの所定の記憶領域に格納してもよい。具体的には、例えば、塩基配列処理装置１００は、オーバーハング部位付加部１０２ｆの処理により、規定配列ファイル１０６ｄの規定配列情報の項に記憶されている規定配列情報を、少なくとも一方の末端にオーバーハング部位が付加された規定配列情報に書き換えてもよい。なお、例えば、ターゲット側を検索する場合は、規定配列情報の両末端にオーバーハング部位を付加してもよい。
なお、上述のオーバーハング部位の塩基数は、上述の＜２＞ＲＮＡ干渉を生じさせるポリヌクレオチドの塩基配列設計方法に記述されている塩基数であり、具体的には、例えば、２が特に好適である。
また、塩基配列処理装置１００は、同一類似塩基配列検索部１０２ｇの処理により、ステップＳＡ−５にて選択された規定配列情報と同一または類似の塩基配列情報を、他の塩基配列情報（例えばＮＣＢＩのＲｅｆＳｅｑなどの公的データベースで公開されている塩基配列情報）から、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ｓｓｅａｒｃｈなどの既存のホモロジー検索手法を用いて検索し、無関係遺伝子標的評価部１０２ｈにて行われる無関係遺伝子標的評価処理により、検索された同一または類似の塩基配列情報に基づいて、規定配列情報が標的遺伝子とは無関係の遺伝子を標的にするか否かを評価してもよい。
具体的には、例えば、塩基配列処理装置１００は、同一類似塩基配列検索部１０２ｇの処理により、ステップＳＡ−５にて選択された規定配列情報と同一または類似の塩基配列情報を、他の塩基配列情報（例えばＮＣＢＩのＲｅｆＳｅｑなどの公的データベースで公開されている塩基配列情報）から、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ｓｓｅａｒｃｈなどの既存のホモロジー検索手法を用いて検索し、無関係遺伝子標的評価部１０２ｈは、総和算出部１０２ｍの処理により、検索された同一または類似の塩基配列情報のうち標的遺伝子とは無関係の遺伝子の塩基配列情報の総数、および、標的遺伝子とは無関係の遺伝子の塩基配列情報に付された同一類似の度合いを示す値（例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびｓｓｅａｒｃｈの場合は、「Ｅ  ｖａｌｕｅ」）に基づいて、同一類似の度合いを示す値の逆数の総和を算出し、無関係遺伝子標的評価部１０２ｈは、総和基準評価部１０２ｎの処理により、算出された総和に基づいて、規定配列情報が標的遺伝子とは無関係の遺伝子を標的にするか否かを評価してもよい。
ここで、無関係遺伝子標的評価部１０２ｈにて行われる無関係遺伝子標的評価処理の詳細について図２４を参照して説明する。
図２４は、本実施形態における本システムの無関係遺伝子標的評価処理の一例を示すフローチャートである。
まず、塩基配列処理装置１００は、同一類似塩基配列検索部１０２ｇの処理により、ステップＳＡ−５にて選択された規定配列情報と同一または類似の塩基配列情報を、他の塩基配列情報（例えばＮＣＢＩのＲｅｆＳｅｑなどの公的データベースで公開されている塩基配列情報）から、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ｓｓｅａｒｃｈなどの既存のホモロジー検索手法を用いて検索し、規定配列情報の識別情報（図１９における「部分塩基配列識別情報」）と、検索された同一または類似の塩基配列情報の識別情報（図１９における「参照配列識別情報」）と、検索された同一または類似の塩基配列情報に付された同一類似の度合いを示す値（例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびｓｓｅａｒｃｈの場合は、「Ｅ  ｖａｌｕｅ」）（図１９における「同一類似度」）とを相互に関連付けて、同一類似度ファイル１０６ｆの所定の記憶領域に格納する。
ついで、無関係遺伝子標的評価部１０２ｈは、総和算出部１０２ｍの処理により、検索された同一または類似の塩基配列情報のうち標的遺伝子とは無関係の遺伝子の塩基配列情報の総数、および、標的遺伝子とは無関係の遺伝子の塩基配列情報に付された同一類似の度合いを示す値（例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびｓｓｅａｒｃｈの場合は、「Ｅ  ｖａｌｕｅ」）に基づいて、同一類似の度合いを示す値の逆数の総和を算出し、規定配列情報の識別情報（図２０における「部分塩基配列識別情報」）と算出された総和（図２０における「総和」）とを相互に関連付けて、評価結果ファイル１０６ｇの所定の記憶領域に格納する（ステップＳＢ−１）。
ついで、無関係遺伝子標的評価部１０２ｈは、総和基準評価部１０２ｎの処理により、ステップＳＢ−１にて算出された総和に基づいて（例えば、ステップＳＢ−１にて算出された総和の大小などに基づいて）、規定配列情報が標的遺伝子とは無関係の遺伝子を標的にするか否かを評価し、評価結果（図２０における「非標的」および「標的」）を評価結果ファイル１０６ｇの所定の記憶領域に格納する（ステップＳＢ−２）。
これにて、メイン処理が終了する。
＜８＞医薬用組成物
本発明はまた、医薬的に有効な量の本発明のポリヌクレオチドを含む、医薬用組成物を提供する。本発明の医薬用組成物の用途は特に限定されず、有効成分たる各ポリヌクレオチドの標的配列を含む遺伝子の発現をＲＮＡｉにより抑制するため、これらの遺伝子が関与する疾患の予防および／または治療に有用である。
本発明の医薬用組成物に含まれるポリヌクレオチドの標的となる配列は、前述の（ａ）−（ｆ）の規則を満たす規定配列として、選択された配列である。好ましくは、配列番号４７〜配列番号８１７０８１のいずれであってよい。特に、当該標的配列が標的遺伝子に高い特異性を有する配列であれば、ポリヌクレオチドが当該標的配列を含む標的遺伝子に対してのみ選択的に発現抑制効果を奏しそれ以外の遺伝子に対しては発現抑制を生じさせない（すなわち、オフターゲット効果がより低い）ので、副作用の影響等を低減できる。したがって、ポリヌクレオチドの標的配列は、標的遺伝子に特異性が高いことがより好ましく、前述の（ａ）−（ｆ）の規則を満たす規定配列として、選択された配列（例えば、配列番号４７〜配列番号８１７０８１）の中でも、よりオフターゲット効果を低減可能な配列であることが好ましい。好ましい標的遺伝子の規定配列として、他の遺伝子の塩基配列とのミスマッチ数が少なくとも３塩基であり、かつ、少なくとも３塩基のミスマッチを有する塩基配列を有するその他の遺伝子の数が最も少ない配列を選択することができる。「その他の遺伝子の数が最も少ない」とは、「少なくとも３塩基のミスマッチを有する塩基配列を有するその他の遺伝子」、即ち類似する遺伝子、ができるだけ存在しないこと、例えば、好ましくは１０個以内、より好ましくは６個以内、さらにより好ましくは１個のみ存在する、あるいは、最も好ましくは全く存在しない、ことを意味する。
例えば、配列番号４７〜配列番号８１７０８１の中から、他の遺伝子の塩基配列とのミスマッチ数が３塩基であり（言い換えれば、１９塩基からなる規定配列のうち当該ミスマッチ３塩基以外の１６塩基が一致する）、かつ、３塩基のミスマッチを有する塩基配列を有するその他の遺伝子の数が最も少ない配列を選択して得られたのが、図４６に示す５３９９８種の配列である。よって、これらの配列のいずれかであることが特に好ましい。これらの配列について、当該標的配列を含む遺伝子、当該遺伝子の関連する疾患名、当該遺伝子の遺伝子オントロジーにおけるＧＯ＿ＩＤに係る生物学的機能カテゴリー、文献に基づく生物学的機能等の関係はその大半が明らかにされている。図４６にこれらの関係を明らかにした。本発明のポリヌクレオチドは、標的配列を含む遺伝子の発現をＲＮＡｉにより抑制するため、当該遺伝子の関連疾患の治療および／または予防、生物学的機能の調節が可能である。当業者は、本明細書、図面等の開示に基づき、ポリヌクレオチドの標的配列が明らかになれば当該ポリヌクレオチドが効果を奏しうる、疾患および／または生物学的機能を容易に把握することが可能である。
よって、本発明の医薬組成物は好ましくは、図４６の関連疾患名の欄に記載の疾患、あるいは、図４６の生物学的機能カテゴリーおよび／または文献に基づく生物学的機能の欄に記載された遺伝子に関連する生物学的機能に係る疾患を治療および／または予防するために有用である。
本発明の医薬組成物はより好ましくは、以下１）−９）のいずれかに属する遺伝子が関与する疾患を治療および／または予防するために有用である、
１）アポトーシスに関与している遺伝子；
２）ホスファターゼおよびホスファターゼ活性に関与している遺伝子；
３）細胞周期に関与している遺伝子；
４）レセプターに関与している遺伝子；
５）イオンチャネルに関与している遺伝子；
６）シグナル伝達系に関与している遺伝子；
７）キナーゼおよびキナーゼ活性に関与している遺伝子；
８）転写制御に関与している遺伝子；あるいは
９）Ｇタンパク質共役レセプターまたはＧタンパク質共役レセプターに関与している遺伝子。
図４６の「生物学的機能カテゴリー」の欄は上記９つのカテゴリーに分類した生物学的機能を記載した。上記１）−９）の各グループに属する遺伝子が、より詳細にどのような生物学的機能を有するかについて、図３７−図４５に各遺伝子と遺伝子オントロジーにおけるＧＯ＿ＩＤとの関係を明らかにした。図３７−図４５に記載の７桁の数値は各グループに属する遺伝子オントロジーでの属性（具体的には、ＩＤ番号）を示す。
遺伝子オントロジーについては、例えば、Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ、“Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ホームページ”、［ｏｎｌｉｎｅ］、１９９９年、Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ、［平成１６年１０月２５日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／＞を参照されたい。
遺伝子オントロジーには、例えば、「ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  （ＧＯ：０００４８７１）」「ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  （ＧＯ：０００４８７２）」のような遺伝子の属性が定義されており、さらに「ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙという属性は、ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙという属性を受け継ぐ」というような属性間の継承関係が定義されている。属性の定義および属性間の継承関係は、ジーン・オントロジー・コンソシアム：Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／）より入手可能である。また、ヒトやマウスの各遺伝子と、Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙの属性との対応関係は、キャンサー・ゲノム・アナトミー・プロジェクト：Ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｔｏｍｙ  ｐｒｏｊｅｃｔ（ｈｔｔｐ：／／ｃｇａｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）等各種データベースより入手可能である。遺伝子のＧｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙとの対応データから、例えばヒトＺＹＸ遺伝子（ＮＭ＿００３４６１）はｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙを持つことがわかり、さらに属性間の継承関係を用いて、ＺＹＸ遺伝子は同時にｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙをもつことを導くことができる。
遺伝子オントロジーでは、遺伝子の属性（ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）について、各属性の定義や属性間の継承関係の定義がされている。この遺伝子のオントロジーにおける属性間の継承関係は、非循環有向グラフ（ＤＡＧ）を形成する。遺伝子オントロジーでは、「遺伝子の機能（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」、「生物学的現象（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓ）」、「細胞内局在（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」により遺伝子を分類・整理している。そして、各分類方法において、属性間の継承関係が定義されている。遺伝子オントロジーにおける属性のＩＤ番号がわかれば、当業者は当該番号から各属性の内容を把握することが可能である。
また、図４６では、上記の遺伝子オントロジーに係る９つの生物学的機能カテゴリーの他に、文献から取得された各遺伝子の生物学的機能情報についても記載している。具体的には、「文献に基づく生物学的機能」の欄に、ＰｕｂＭｅｄから取得される文献に基づいた各遺伝子の生物学的機能情報を記載した。
さらに好ましい態様において、本発明の医薬組成物は、より好ましくは図４６の配列番号（ヒト）または配列番号（マウス）の欄に記載の配列番号のいずれかの塩基配列を標的配列とするポリヌクレオチドを含む。各ポリヌクレオチドは、標的配列の記載された整理番号と同じ整理番号の「関連疾患名」の欄に記載された疾患の治療および／または予防に有用である。あるいは、同じ整理番号の「生物学的機能カテゴリー」または、「文献に基づく生物学的機能」の欄に記載された生物学的機能の調節（例えば、抑制および促進）、当該生物学的機能の関与する疾患の治療および／または予防に有用である。
本明細書において後述する実施例８の表１は、本発明のポリヌクレオチド、具体的には、かかるポリヌクレオチドに相当するｓｉＲＮＡのセンス鎖（表１中の「ｓｉＲＮＡ−センス」の欄に塩基配列を記載）、アンチセンス鎖（表１中の「ｓｉＲＮＡ−アンチセンス」の欄に塩基配列を記載：ただし、ここでは３’から５’方向に配列を示す）、当該ｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ対象となる標的遺伝子（表１中の「遺伝子名」の欄に記載）および当該遺伝子における標的配列の位置を示している。表１に示されたように、本発明のポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ−センスまたはｓｉＲＮＡ−アンチセンスとして、表１の「遺伝子名」の欄に記載された遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を生じさせ、それにより、当該遺伝子の発現を有意に抑制した。よって、本発明のポリヌクレオチドを含む医薬組成物は、表１の「遺伝子名」の欄に記載された遺伝子に関連する疾患、具体的には、図４６の「関連疾患名」の欄に記載した当該遺伝子に対応する疾患や、図４６の「生物学的機能カテゴリー」の欄および／または「文献に基づく生物学的機能」の欄に記載した当該遺伝子に対応する生物学的機能に関連する疾患を治療または予防するために有用である。
実施例８においてｓｉＲＮＡの標的とした配列（表１の「標的配列」の欄参照）は、本発明にかかるポリヌクレオチドの標的となる標的配列のうち、図４６に示す５３９９８種の標的配列の中から無作為に選択したものである。後述するように、ここでは選択した全ての標的配列において、ＲＮＡｉ効果が確認された。このように得られた実施例８での結果を統計学の「母比率を推定する方法」に基づき処理したところ、本発明にかかるポリヌクレオチド、具体的には、配列番号４７〜８１７０８１に示す標的遺伝子の規定配列と相同な配列を２本鎖領域の一方の鎖に含むポリヌクレオチド）が標的遺伝子の発現抑制効果を示すということは統計的に妥当であり、かつ、特に、前記規定配列が図４６に示す５３９９８種の配列のいずれかであるポリヌクレオチドを用いた場合には、そのほぼ全てが標的遺伝子の発現抑制効果を示すということは統計的に妥当である、ということが明らかになった。
本発明にかかるポリヌクレオチドの標的となる遺伝子は、図４６記載の疾患のいずれに関連するものであってもよいが、特に、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、肝細胞癌、肺癌、黒色腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、口腔癌、皮膚癌、甲状腺癌を含む各種癌に関連した遺伝子であると、当該遺伝子の発現抑制効果によって、これらの各種癌を治療または予防することが可能となる。したがって、限定されるわけではないが、本発明の医薬組成物は、これらから選択される、いずれかの癌を治療または予防するために有用である。
本発明の医薬組成物は、最も好ましくは、配列番号８１７１０２ないし８１７６５１のいずれかの塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む。各ポリヌクレオチドは、標的となる遺伝子（表１の「遺伝子名」の欄参照）の発現を抑制することができるため、当該遺伝子に関連する疾患（具体的には、当該遺伝子に関する図４６の「関連疾患」の欄参照）や、当該遺伝子の生物学的機能（具体的には、当該遺伝子に関する図４６の「生物学的機能カテゴリー」および／または「文献に基づく生物学的機能」の欄参照）に関連する疾患の治療および／または予防に有用である。これらの配列番号の塩基配列に対して上述したようなミスマッチ等の変異を有する配列も、ＲＮＡｉ効果を損なわない範囲において、利用可能である。
後述の実施例１〜８において、本発明にかかる選択方法に従って選択された多数のポリヌクレオチドが有意なＲＮＡｉ効果を示すことが実証された。よって、共通する規則に従って選択されたポリヌクレオチドが同様のＲＮＡｉ効果を示すことは当業者にとって容易に理解される。また、当該規則の有効性は、前述の統計的な処理結果からも明らかである。したがって、例えば、表１記載の遺伝子において、具体的に開示された標的配列の標的位置とは異なる位置から、開示された標的配列とは異なる配列を、本発明に従って同じ遺伝子中から選択すれば、同じ遺伝子に対して同様の遺伝子発現抑制効果が得られることは容易に理解される。さらに、ある疾患に関与する遺伝子の発現の抑制効果が示されれば、本発明に従って標的配列を選択してポリヌクレオチドを作成すれば、同じ疾患に関与する他の遺伝子についても、発現の抑制効果に基づく疾患の治療および／または予防が容易に理解される。
さらに、本発明の実施例７は、標的配列と完全に相同な配列を含む遺伝子以外の他の遺伝子であっても、当該他の遺伝子が少数、好ましくは２塩基以下のミスマッチを有する類似配列を含む場合、当該類似配列部分がＲＮＡ干渉の標的となりうることを示した。よって、標的配列と完全に相同な配列を含む遺伝子以外の、類似配列を含む他の遺伝子も、本発明のポリヌクレオチドの標的対象となりＲＮＡ干渉に基づく発現抑制効果が期待される。よって、本発明の医薬組成物はこれらの遺伝子の関与する疾患に対する治療・予防のためにも有用である。
ＲＮＡｉを生じさせるポリヌクレオチドを医薬組成物に利用する場合には、製薬上許容されうる担体または希釈剤と本発明にかかるポリヌクレオチドとを配合して医薬組成物として用いてもよい。この場合の有効成分の担体または希釈剤に対する割合は、約０．０１〜約９９．９重量％の間である。
上記の担体または希釈剤は、気体、液体、固体であってもよい。例えば、担体は、水性またはアルコール性の液剤や懸濁剤、油性の液剤や懸濁剤、水中油型や油中水型乳剤、疎水性担体、液体ビヒクル、微結晶等であってもよい。
また、上記ポリヌクレオチドを含む本発明の医薬組成物は、例えば、他の治療用薬剤、界面活性剤、充填剤、緩衝剤、分散化剤、抗酸化剤、保存剤の少なくとも１つをさらに含んでもよい。このような医薬組成物は、経口、口内、肺内、直腸内、子宮内、腫瘍内、頭蓋内、鼻用、筋肉内、皮下、血管内、鞘内、経皮、皮内、関節内、腔内、接眼用、膣用、眼用、静脈内、腺内、組織内、リンパ管内、埋め込み型、吸入型、徐放用、及び腸溶性被覆の製剤であってよい。
例えば、ポリヌクレオチドを用いた経口製剤は、粉末剤、糖衣丸剤、タブレット、カプセル剤、シロップ剤、エアゾール剤、液剤、懸濁剤、水中油型や油中水型乳剤である乳剤であってもよい。また、局所製剤であって、担体が、クリーム剤、ゲル剤、軟膏剤、シロップ剤、エアゾール剤、パッチ剤、液剤、懸濁剤、乳剤であってもよい。また、注射用製剤や経皮用製剤であって、担体が、水性及びアルコール性の液剤や懸濁剤、油性の液剤や懸濁剤、水中油型や油中水型乳剤であってもよい。また、直腸用製剤、坐剤であってもよい。また、インプラント、カプセル又はカートリッジで供給される製剤、呼吸用又は吸入用製剤、エアゾール剤であってもよい。
このようなポリヌクレオチドを用いた医薬組成物の投与量は、患者の症状、年齢、体重等によって適宜選択される。また、被導入体への投与方法として、被導入体が細胞や組織の場合は、カルシウムフォスフェート法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ウィルス感染、ポリヌクレオチド溶液浸漬法等が用いられ、また、胚に導入する場合は、マイクロインジェクション法やエレクトロポレーション法やウィルス感染等が用いられる。投与には、従来から用いられている市販の試薬、器機、装置、キット等を用いてもよく、例えば、ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ＳｙｓｔｅｍやＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−ＱＲ  Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ともにタカラバイオ株式会社製）等の導入試薬を用いて生体内細胞への投与を行ってもよい。また、ウィルス感染による方法としては、レトロウィルスベクター（例えば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製のＲＮＡｉ  Ｒｅａｄｙ  ｐＳＩＲＥＮ−ＲｅｔｒｏＱ  Ｖｅｃｔｏｒ等）や、アデノウィルスベクター（例えば、同社製のＢＤ  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ＲＮＡｉ  Ｓｙｓｔｅｍ等）や、レンチウィルスベクター（例えば、タカラバイオ株式会社製のレトロネクチン等）を用いてもよい。
被導入体が植物の場合には、植物体の体腔又は間質細胞等への注入又は噴霧による方法等が用いられる。また、被導入体が動物個体の場合には、経口、非経口、経膣、経直腸、経鼻、経眼、腹膜内投与等の方法が用いられる。このような投与方法によって、１種又は２種以上のポリヌクレオチドが、同時又は時期をずらして、全身又は局所的に投与される。経口投与の例として、例えば、ポリヌクレオチドを導入した薬剤または食品を直接摂取してもよい。また、経口、経鼻投与の例として、例えば、吸入装置を用いて投与を行ってもよい。また、非経口投与の例として、例えば、針あり又は針なしの注射器を用いて、皮下、筋肉内、静脈内等へ投与を行ってもよい。
＜９＞遺伝子発現抑制用組成物
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含む、標的遺伝子の発現を抑制するための遺伝子発現抑制用組成物を提供する。
本発明において明らかにされたように、本発明のポリヌクレオチドは各標的配列を含む遺伝子に対して発現抑制効果を奏する。当該遺伝子の発現抑制により、当該遺伝子の生物学的機能が調節、好ましくは抑制される。
好ましくは、標的遺伝子は、図４６の関連疾患名の欄に記載の疾患のいずれかの疾患に関連する。
好ましくは、標的遺伝子は、図４６の遺伝子名の欄に記載された遺伝子のいずれかである。
あるいは、標的遺伝子が、以下１）−９）のいずれかに属する遺伝子である、
１）アポトーシスに関与している遺伝子；
２）ホスファターゼおよびホスファターゼ活性に関与している遺伝子；
３）細胞周期に関与している遺伝子；
４）レセプターに関与している遺伝子；
５）イオンチャネルに関与している遺伝子；
６）シグナル伝達系に関与している遺伝子；
７）キナーゼおよびキナーゼ活性に関与している遺伝子；
８）転写制御に関与している遺伝子；あるいは
９）Ｇタンパク質共役レセプターまたはＧタンパク質共役レセプターに関与している遺伝子。
上記医薬組成物の項において前述したように、本発明にかかるポリヌクレオチド（具体的にはｓｉＲＮＡ）は、ＲＮＡｉ効果を生じることが実施例８の結果および統計的処理結果から明らかである。特に、後述の実施例８では、本発明のポリヌクレオチドが、表１の遺伝子名の欄に記載された全ての遺伝子に関してｍＲＮＡの発現抑制効果（すなわちＲＮＡｉ効果）を奏することが確認された。よって、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子発現抑制用組成物は、図４６に示す標的遺伝子のいずれを標的としてもよいが、より好ましくは、標的遺伝子が、表１の遺伝子名の欄に記載された遺伝子のいずれかである。表１の各遺伝子に対しては、好ましくは、同じ行に記載のｓｉＲＮＡ−センスまたはｓｉＲＮＡ−アンチセンスの配列を使用することが望ましい。これらの塩基配列に対して上述したようなミスマッチ等の変異を有する配列も、発現抑制効果を損なわない範囲において、利用可能である。
標的遺伝子が表１の遺伝子のいずれかであれば、当該遺伝子に関連する疾患（具体的には、当該遺伝子に関する図４６の「関連疾患」の欄参照）や、当該遺伝子の生物学的機能（具体的には、当該遺伝子に関する図４６の「生物学的機能カテゴリー」および／または「文献に基づく生物学的機能」の欄参照）に関連する疾患の治療および／または予防に有用である。
例えば、本発明にかかる遺伝子発現抑制用組成物の標的となる遺伝子は、図４６記載の疾患のいずれに関連するものであってもよいが、特に、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、肝細胞癌、肺癌、黒色腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、口腔癌、皮膚癌、甲状腺癌を含む各種癌に関連した遺伝子であると、当該遺伝子の発現抑制効果によって、これらの各種癌を治療または予防することが可能となる。したがって、限定されるわけではないが、本発明の医薬組成物は、これらから選択される、いずれかの癌を治療または予防するために有用である。
本明細書において後述する実施例２−５では、ヒトビメンチン、ルシフェラーゼ、ＳＡＲＳウイルス等の遺伝子に対する本発明のポリヌクレオチドのＲＮＡｉ効果を、ｍＲＮＡの対照に対する相対的発現量で調べた。図３１、３２および３５は、ｍＲＮＡの発現量を定量ＰＣＲで測定した結果が示されている。ｍＲＮＡの相対発現量は図３１、３２および３５において各々、約７−８％（実施例２、図３１）、約１２−１３％（実施例３、図３２）、数％ないし約１５％未満（実施例５、図３５）と減少し、各遺伝子の発現抑制効果が確認された。また実施例４の図３４は、ＲＮＡｉ効果としてのｍＲＮＡの発現量をルシフェラーゼ活性で調べた結果であるが、同様に、対照と比較して数％ないし約２０％未満に減少した。
さらに、実施例８では、関連疾患や生物学的機能が明らかとなった図４６に示す遺伝子のうち、無作為に選択した約３００種の遺伝子について、ヒト由来ＨｅＬａ細胞でのｍＲＮＡの発現量を相対的発現量で調べた。表１で示したように、当該遺伝子の発現抑制効果、すなわちＲＮＡｉ効果を評価するために算出した後述のＲＱ値は、全て１未満であり、ほぼ全てが０．５未満であった。
本発明の遺伝子発現抑制用組成物において、「標的遺伝子の発現抑制」とは、標的遺伝子のｍＲＮＡ発現量が実質的に減少することを意味する。ｍＲＮＡ発現量が実質的に減少していれば、その変化の幅の大小にかかわらず、発現抑制が実現されている。上記のような実施例２−５および実施例８の結果をふまえると、本発明の遺伝子発現抑制組成物は、標的遺伝子のｍＲＮＡ発現量を好ましくは少なくとも５０％以下に減少させることが明らかである。
＜１０＞治療または予防方法
本発明はさらに、医薬的に有効な量の、本発明のポリヌクレオチドを投与することを含む、図４６の関連疾患名の欄に記載の疾患を治療または予防するための方法。
［他の実施の形態］
さて、これまで本発明の実施の形態について説明したが、本発明は、上述した実施の形態以外にも、請求の範囲に記載した技術的思想の範囲内において種々の異なる実施の形態にて実施されてよいものである。
例えば、塩基配列処理装置１００がスタンドアローンの形態で処理を行う場合を一例に説明したが、塩基配列処理装置１００とは別筐体で構成されるクライアント端末からの要求に応じて処理を行い、その処理結果を当該クライアント端末に返却するように構成してもよい。具体的には、例えば、クライアント端末はＲＮＡ干渉の標的遺伝子の名称（例えば遺伝子名、アクセッション番号など）または標的遺伝子に係る塩基配列情報を塩基配列処理装置１００に送信し、塩基配列処理装置１００は当該名称に対応する塩基配列情報またはクライアント端末より送信された塩基配列情報に対して制御部１０２で行われる上述した各処理を行い、標的遺伝子に特異的にＲＮＡ干渉を生じさせる規定配列情報を選択してクライアント端末に送信してもよい。この場合、例えば、クエリーの遺伝子に対して公共データベースから配列情報を取得してｓｉＲＮＡを選択してもよく、また、例えば、予め全遺伝子のｓｉＲＮＡを計算して記憶しておき、クライアント端末からの要求（遺伝子の名称またはアクセッション番号など）に対して即座にｓｉＲＮＡを選択し、選択したｓｉＲＮＡをクライアント端末に返してもよい。
また、塩基配列処理装置１００は、標的遺伝子とは無関係の遺伝子に対する規定配列情報の特異性を確認してもよい。これにより、標的とする遺伝子のみに特異的にＲＮＡ干渉を生じさせる規定配列情報を選出することができる。
また、クライアント端末と塩基配列処理装置１００とで構成される本システムには、例えば、Ｗｅｂページの利用者から、ｓｉＲＮＡのＲＮＡ干渉効果（例えば、「効く」、「効かない」など）の結果をＷｅｂ上でフィードバックしてもらい、利用者からフィードバックされた実験例を塩基配列処理装置１００に蓄積し、上述したＲＮＡ干渉に有効なｓｉＲＮＡの配列規則性を改善するためのインターフェース機能を導入してもよい。
また、塩基配列処理装置１００は、規定配列情報からｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列情報および当該センス鎖と相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）なアンチセンス鎖の塩基配列情報を計算してもよい。具体的には、例えば、塩基配列処理装置１００は、上述した各処理の結果、規定配列の両端に各２塩基のオーバーハング部を付加した２３塩基の配列情報として「ｃａｃｃｃｔｇａｃｃｃｇｃｔｔｃｇｔｃａｔｇｇ」を選択した場合、センス鎖の塩基配列情報「５’−ＣＣＣＵＧＡＣＣＣＧＣＵＵＣＧＵＣＡＵＧＧ−３’」およびアンチセンス鎖の塩基配列情報「５’−ＡＵＧＡＣＧＡＡＧＣＧＧＧＵＣＡＧＧＧＵＧ−３’」を計算する。これにより、ポリヌクレオチドを発注する時にセンス鎖、アンチセンス鎖を手作業でまとめる必要がなくなり、利便性が高まる。
また、実施形態において説明した各処理のうち、自動的に行なわれるものとして説明した処理の全部または一部を手動的に行うこともでき、あるいは、手動的に行なわれるものとして説明した処理の全部または一部を公知の方法で自動的に行うこともできる。
この他、上記文書中や図面中で示した処理手順、制御手順、具体的名称、各種の登録データや検索条件等のパラメータを含む情報、画面例、データベース構成については、特記する場合を除いて任意に変更することができる。
また、塩基配列処理装置１００に関して、図示の各構成要素は機能概念的なものであり、必ずしも物理的に図示の如く構成されていることを要しない。
例えば、塩基配列処理装置１００の各部または各装置が備える処理機能、特に制御部１０２にて行なわれる各処理機能については、その全部または任意の一部を、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）および当該ＣＰＵにて解釈実行されるプログラムにて実現することができ、あるいは、ワイヤードロジックによるハードウェアとして実現することも可能である。なお、プログラムは、後述する記録媒体に記録されており、必要に応じて塩基配列処理装置１００に機械的に読み取られる。
すなわち、ＲＯＭまたはＨＤなどの記憶部１０６などには、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）と協働してＣＰＵに命令を与え、各種処理を行うためのコンピュータプログラムが記録されている。このコンピュータプログラムは、ＲＡＭ等にロードされることによって実行され、ＣＰＵと協働して制御部１０２を構成する。また、このコンピュータプログラムは、塩基配列処理装置１００に対して任意のネットワーク３００を介して接続されたアプリケーションプログラムサーバに記録されてもよく、必要に応じてその全部または一部をダウンロードすることも可能である。
また、本発明にかかるプログラムを、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に格納することもできる。ここで、この「記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＭＯ、ＤＶＤ、フラッシュディスク等の任意の「可搬用の物理媒体」や、各種コンピュータシステムに内蔵されるＲＯＭ、ＲＡＭ、ＨＤ等の任意の「固定用の物理媒体」、あるいは、ＬＡＮ、ＷＡＮ、インターネットに代表されるネットワークを介してプログラムを送信する場合の通信回線や搬送波のように、短期にプログラムを保持する「通信媒体」を含むものとする。
また、「プログラム」とは、任意の言語や記述方法にて記述されたデータ処理方法であり、ソースコードやバイナリコード等の形式を問わない。なお、「プログラム」は必ずしも単一的に構成されるものに限られず、複数のモジュールやライブラリとして分散構成されるものや、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）に代表される別個のプログラムと協働してその機能を達成するものをも含む。なお、実施の形態に示した各装置において記録媒体を読み取るための具体的な構成、読み取り手順、あるいは、読み取り後のインストール手順等については、周知の構成や手順を用いることができる。
記憶部１０６に格納される各種のデータベース等（標的遺伝子塩基配列ファイル１０６ａ〜標的遺伝子アノテーションデータベース１０６ｈ）は、ＲＡＭ、ＲＯＭ等のメモリ装置、ハードディスク等の固定ディスク装置、フレキシブルディスク、光ディスク等のストレージ手段であり、各種処理やウェブサイト提供に用いる各種のプログラムやテーブルやファイルやデータベースやウェブページ用ファイル等を格納する。
また、塩基配列処理装置１００は、既知のパーソナルコンピュータ、ワークステーション等の情報処理端末等の情報処理装置にプリンタやモニタやイメージスキャナ等の周辺装置を接続し、該情報処理装置に本発明の方法を実現させるソフトウェア（プログラム、データ等を含む）を実装することにより実現してもよい。
さらに、塩基配列処理装置１００等の分散・統合の具体的形態は明細書および図面に示すものに限られず、その全部または一部を、各種の負荷等に応じた任意の単位で、機能的または物理的に分散・統合して構成することができる（例えば、グリッド・コンピューティングなど）。例えば、各データベースを独立したデータベース装置として独立に構成してもよく、また、処理の一部をＣＧＩ（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｇａｔｅｗａｙ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）を用いて実現してもよい。
また、ネットワーク３００は、塩基配列処理装置１００と外部システム２００とを相互に接続する機能を有し、例えば、インターネットや、イントラネットや、ＬＡＮ（有線／無線の双方を含む）や、ＶＡＮや、パソコン通信網や、公衆電話網（アナログ／デジタルの双方を含む）や、専用回線網（アナログ／デジタルの双方を含む）や、ＣＡＴＶ網や、ＩＭＴ２０００方式、ＧＳＭ方式またはＰＤＣ／ＰＤＣ−Ｐ方式等の携帯回線交換網／携帯パケット交換網や、無線呼出網や、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ等の局所無線網や、ＰＨＳ網や、ＣＳ、ＢＳまたはＩＳＤＢ等の衛星通信網等のうちいずれかを含んでもよい。すなわち、本システムは、有線・無線を問わず任意のネットワークを介して、各種データを送受信することができる。
【実施例】  以下、実施例に基づき、本発明についてさらに詳細に説明する。なお、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
＜１＞ＲＮＡｉ効果を測定するための遺伝子、発現ベクター
ｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉ効果を測定するための標的遺伝子としてはホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ，Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ）のｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ｌｕｃ）遺伝子（Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ  ｌｕｃ遺伝子：ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｕ４７２９６）を用い、これを含む発現ベクターとしてはｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いた。Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ  ｌｕｃ遺伝子断片はこのベクター中でＳＶ４０のプロモーターとポリＡシグナルで挟まれた形になっている。また内部コントロール遺伝子はウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ，Ｒ．ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｌｕｃ遺伝子を用い、これを含む発現ベクターとしてｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いた。
＜２＞２１塩基２本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の合成
２１塩基センス鎖と２１塩基アンチセンス鎖ＲＮＡ（図９にしめされている位置のもの；ａ〜ｐ）は、日立計測器サービス株式会社を通じてジェンセット株式会社に合成を委託した。
Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ  ｌｕｃ遺伝子の発現を阻害するために用いた２本鎖ＲＮＡは、センス鎖とアンチセンス鎖とを会合させることで作製した。会合は、センス鎖ＲＮＡとアンチセンス鎖ＲＮＡを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），２０ｍＭ  ＮａＣｌ反応液中で９０℃、３分間加熱し、３７℃で１時間インキュベートし、その後室温になるまで放置することで行った。２本鎖ポリヌクレオチドの形成は、ＴＢＥ緩衝液中での２％アガロースゲルでの電気泳動で検定するが、上記条件では殆どすべての１本鎖ポリヌクレオチドが２本鎖ポリヌクレオチドに会合していた。
＜３＞哺乳類細胞培養法
哺乳類培養細胞としては、ヒトのＨｅＬａ細胞とＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスターのＣＨＯ−ＫＩ細胞（ＲＩＫＥＮ  Ｃｅｌｌ  ｂａｎｋ）を用いた。培地はＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）に非慟化１０％牛胎児血清（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｋａｓｅｉ社製）および抗生物質としてｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（Ｍｅｉｊｉ社製）１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｍｅｉｊｉ社製）５０μｇ／ｍｌを添加したものを用いた。３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。
＜４＞哺乳類培養細胞への標的遺伝子、内部コントロール遺伝子、ｓｉＲＮＡの培養細胞へのトランスフェクション
哺乳類細胞は０．２〜０．３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で２４穴プレートにまき、１日後にＣａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ沈殿法（細胞工学ハンドブック、黒木登志夫ら編、羊土社（１９９２））で１．０μｇ  ｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＤＮＡ、０．５または１．０μｇ  ｐＲＬ−ＴＫ  ＤＮＡ、および０．０１、０．１、１、１０、１００ｎＭの各ｓｉＲＮＡを導入した。
＜５＞ショウジョウバエ細胞培養法
ショウジョウバエ培養細胞としてはＳ２細胞（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．，２７，３５３−３６５（１９７２））を用いた。培地はＳｃｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）に非慟化１０％牛胎児血清（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｋａｓｅｉ社製）および抗生物質としてｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（Ｍｅｉｊｉ社製）１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｍｅｉｊｉ社製）５０μｇ／ｍｌを添加したものを用いた。２５℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。
＜６＞ショウジョウバエ培養細胞への標的遺伝子、内部コントロール遺伝子、ｓｉＲＮＡの培養細胞へのトランスフェクション
このＳ２細胞は１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で２４穴プレートにまき、１日後にＣａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ沈殿法（細胞工学ハンドブック、黒木登志夫ら編、羊土社（１９９２））で１．０μｇ  ｐＧＬ−３  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＤＮＡ、０．１μｇ  ｐＲＬ−ＴＫ  ＤＮＡ、および０．０１、０．１、１、１０、１００ｎＭの各ｓｉＲＮＡを導入した。
＜７＞ＲＮＡｉ効果の測定
ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞は、トランスフェクション後２０時間後に回収し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、２種類のルシフェラーゼ（Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ  ｌｕｃおよびＲ．ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ｌｕｃ）タンパクの発現量（ルシフェラーゼ活性）を測定した。発光量の測定はＬｕｍａｔ  ＬＢ９５０７  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（ＥＧ＆Ｇ  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）を用いて行った。
＜８＞結果
ルシフェラーゼ活性を測定した結果を図１０に示す。また、ルシフェラーゼ活性と各塩基配列との対応を検討した結果を図１１に示す。
図１０中、Ｂで示されるグラフはショウジョウバエでの結果であり、Ｃで示されるグラフはヒトでの結果を示す。図１０に示されるように、ショウジョウバエでは塩基数を２１のＲＮＡを作製することにより、殆どの配列においてルシフェラーゼ活性を抑制できた。他方、ヒトの場合については、単に塩基数を２１としただけではルシフェラーゼ活性を抑制できる配列が得られにくいことが明らかとなった。
そこで、ａ〜ｐのＲＮＡの塩基配列の規則性を分析した。配列の分析は、図１１に示すように２本鎖ＲＮＡの５箇所について塩基配列を分析した。図１１の表中最上段のａのｓｉＲＮＡについてみると、ルシフェラーゼ相対活性（ＲＬＡ）は０．０３、アンチセンス鎖について３’末端側から順に見ると、オーバーハング部（ＯＨ）の塩基配列がＵＣ、続く７塩基（図１１中３’−Ｔ）中のＧ／Ｃ含有量（グアニンまたはシトシンの含有量）は５７％、さらに続く５塩基（図１１中Ｍ）のＧ／Ｃ含有量は２０であり、さらに続く７塩基（図１１中５’−Ｔ）のＧ／Ｃ含有量は１４％であり、５’末端はＵであり、合計のＧ／Ｃ含有量は３２％である。表中、ＲＬＡの値が低いほど、ＲＬＡの活性が低く、すなわちルシフェラーゼの発現が抑制されたことを示す。
この結果から、ＲＮＡ干渉を生じさせるポリヌクレオチドの塩基配列は、３’末端がアデニンまたはウラシルであり５’末端がグアニンまたはシトシンである確率が極めて高いことが明らかになった。また、３’末端側の７塩基ついてはアデニンまたはウラシルが豊富な状態であることが明らかとなった。
［実施例２］
１．標的発現ベクターｐＴＲＥＣの構築
下記のようにして標的発現ベクターを構築した。標的発現分子は、ＲＮＡｉの標的となる配列（以下「標的配列」という場合がある）を有するＲＮＡを発現させる分子である。
ｐＣＩ−ｎｅｏ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｕ４７１２０、プロメガ社製）のＣＭＶエンハンサー／プロモーター下流に標的ｍＲＮＡ配列を構築した（図２５）。すなわち、コザック配列（Ｋｏｚａｋ）、ＡＴＧ配列、標的となる２３塩基対配列クローニングサイト（ｔａｒｇｅｔ）および組み換えのための制限酵素（ＮｈｅＩ、ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ）認識配列を有する下記の２本鎖オリゴマーを合成した。２本鎖オリゴマーは配列表の配列番号１に示す配列とその相補的な配列とからなる。合成した２本鎖オリゴマーをｐＣＩ−ｎｅｏのＮｈｅＩ、ＸｂａＩサイトに挿入し、標的発現ベクターｐＴＲＥＣを構築した（図２５）。なお、イントロンは、ｐＣＩ−ｎｅｏに当初から組み込まれているβ−グロビン由来のイントロン部位を用いた。
５’−ｇｃｔａｇｃｃａｃｃａｔｇｇａａｔｔｃａｃｇｃｇｔｃｔｃｇａｇｔｃｔａｇａ−３’  （配列番号１）
図２５に示すｐＴＲＥＣは、プロモーターおよびエンハンサー（ｐｒｏ／ｅｎｈ）、とＰＣＲプライマーに対応する領域ＰＡＲ（Ｆ）１およびＰＡＲ（Ｒ）１を備ええる。ＰＡＲ（Ｆ）１にはイントロン（Ｉｎｔｒｏｎ）が挟み込まれており、発現ベクターそのものがＰＣＲの鋳型とならないように設計されている。ｐＴＲＥＣは、ＲＮＡの転写後、真核生物の培養細胞などのスプライシングが行われる環境下において、イントロン部位が除去され、ＰＡＲ（Ｆ）１が連結される。ｐＴＲＥＣから形成されたＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲにより増幅できる。イントロンは、ｐＣＩ−ｎｅｏに当初から組み込まれているβ−グロビン由来のイントロン部位を用いた。
ｐＴＲＥＣには、コントロールとしてネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）が組み込まれており、ネオマイシン耐性遺伝子内の配列の一部に対応するＰＣＲプライマーを作製し、ネオマイシン耐性遺伝子の一部についてＲＴ−ＰＣＲを行うことにより、ネオマシン耐性遺伝子を内部標準コントロール（インターナルコントロール）として用いることができる。ＰＡＲ（Ｆ）２およびＰＡＲ（Ｒ）２は、ネオマイシン耐性遺伝子中のＰＣＲプライマー対応領域を示す。なお、図２５の例には示していないが、ＰＡＲ（Ｆ）２またはＰＡＲ（Ｒ）２の少なくとも一方にもイントロンを挟み込んでおくこともできる。
２．標的ｍＲＮＡ検出用プライマーの効果
（１）培養細胞へのトランスフェクション
２４穴プレートの１穴あたりに０．２〜０．３×１０６ｃｅｌｌｓのＨｅＬａ細胞をまき、１日後にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、マニュアルにしたがって０．５μｇのｐＴＲＥＣベクターをトランスフェクトした。
（２）細胞の回収およびｍＲＮＡの定量
トランスフェクションの１日後、細胞を回収し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。このＲＮＡ１００ｎｇを用いて、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとし、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ  ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により逆転写してｃＤＮＡ合成反応を行った。コントロールとして、逆転写酵素を加えないものを用意した。得られたｃＤＮＡの３２０分の１量をＰＣＲテンプレートとし、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、５０μｌの反応系で定量的ＰＣＲを行い、標的ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ（Ｔ）と称する）および、内部コントロールとしてｐＴＲＥＣ上のネオマイシン耐性遺伝子に由来するｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ（Ｃ）と称する）を定量した。定量的ＰＣＲにはリアルタイムモニタリング装置ＡＢＩＰＲＩＺＭ７０００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、ｍＲＮＡ（Ｔ）の定量にはプライマー対Ｔ（配列表配列番号２、３）、ｍＲＮＡ（Ｃ）の定量にはプライマー対Ｃ（配列表配列番号４、５）をそれぞれ使用した。
プライマー対Ｔ：
ａｇｇｃａｃｔｇｇｇｃａｇｇｔｇｔｃ    （配列番号２）
ｔｇｃｔｃｇａａｇｃａｔｔａａｃｃｃｔｃａｃｔａ    （配列番号３）
プライマー対Ｃ
ａｔｃａｇｇａｔｇａｔｃｔｇｇａｃｇａａｇ  （配列番号４）
ｃｔｃｔｔｃａｇｃａａｔａｔｃａｃｇｇｇｔ  （配列番号５）
図２６および図２７に、ＰＣＲの結果を示す。図２６および図２７は、縦軸にそれぞれのＰＣＲ産物を、横軸にＰＣＲのサイクル回数をとり、グラフに表したものである。ネオマイシン耐性遺伝子の場合、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成したもの（＋ＲＴ）と、逆転写酵素を加えないコントロール（−ＲＴ）で、得られたＰＣＲ産物量の増幅の差は小さかった（図２６）。これは、ｃＤＮＡのみならず、細胞内に残っているベクターもＰＣＲの鋳型となって増幅されたことを示す。他方、標的配列ｍＲＮＡでは、逆転写酵素を添加した場合（＋ＲＴ）と添加しない場合（−ＲＴ）とによる差が大きかった（図２７）。この結果は、プライマー対Ｔのうちの一方がイントロンをはさむ形でデザインされているため、イントロンが除去されたｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡが効率的に増幅される一方、イントロンを有する残存ベクターが鋳型となりにくくなっていることを示している。
３．ｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡの発現抑制
（１）ターゲット発現ベクターへの評価配列のクローニング
ヒトビメンチン（ＶＩＭ）遺伝子（ＲｅｆＳｅｑＩＤ：ＮＭ＿００３３８０）コード領域の８１２‐８３４、３５‐５７に相当する配列を評価の対象とした。これらの配列およびＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩの認識配列を有する下記配列表配列番号６および７の合成オリゴヌクレオチド（評価配列フラグメント）を作製した。
評価配列ＶＩＭ３５（ＶＩＭの３５−５７に相当）
５’−ｇａａｔｔｃｇｃａｇｇａｔｇｔｔｃｇｇｃｇｇｃｃｃｇｇｇｃｃｔｃｇａｇ−３’  （配列番号６）
評価配列ＶＩＭ８１２（ＶＩＭの８１２−８３４に相当）
５’−ｇａａｔｔｃａｃｇｔａｃｇｔｃａｇｃａａｔａｔｇａａａｇｔｃｔｃｇａｇ−３’  （配列番号７）
得られた評価配列フラグメントの両端にあるＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩサイトを利用し、ｐＴＲＥＣのＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩサイト間に、新たな標的配列としてクローニングし、ｐＴＲＥＣ‐ＶＩＭ３５、ｐＴＲＥＣ‐ＶＩＭ８１２を構築した。
（２）ｓｉＲＮＡの作製
評価配列ＶＩＭ３５（配列表配列番号８、図２８）、評価配列ＶＩＭ８１２（配列番号９、図２９）、およびコントロール配列（ｓｉＣｏｎｔｏｒｏｌ、配列番号１０、図３０）にそれぞれ相当するｓｉＲＮＡフラグメントを合成し、アニーリングした。下記ｓｉＲＮＡの各配列においては、３’末端にオーバーハング部を設けてある。
ｓｉＶＩＭ３５  ５’−ａｇｇａｕｇｕｕｃｇｇｃｇｇｃｃｃｇｇｇｃ−３’  （配列番号８）
ｓｉＶＩＭ８１２  ５’−ｇｕａｃｇｕｃａｇｃａａｕａｕｇａａａｇｕ−３’  （配列番号９）
コントロールとして、ルシフェラーゼ遺伝子に対するｓｉＲＮＡを用いた。
ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ  ５’−ｃａｕｕｃｕａｕｃｃｇｃｕｇｇａａｇａｕｇ−３’  （配列番号１０）
（３）培養細胞へのトランスフェクション
２４穴プレートの１穴あたりに０．２〜０．３×１０６ｃｅｌｌｓのＨｅＬａ細胞をまき、１日後にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、マニュアルにしたがって０．５μｇのｐＴＲＥＣ‐ＶＩＭ３５またはｐＴＲＥＣ‐ＶＩＭ８１２と、それぞれのＶＩＭ由来配列に相当する１００ｎＭのｓｉＲＮＡ（ｓｉＶＩＭ３５、ｓｉＶＩＭ８１２）を同時にトランスフェクトした。コントロール細胞には、０．５μｇのｐＴＲＥＣ‐ＶＩＭ３５またはｐＴＲＥＣ‐ＶＩＭ８１２と１００ｎＭのルシフェラーゼ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ）を同時にトランスフェクトした。
（４）細胞の回収およびｍＲＮＡの定量
トランスフェクションの１日後、細胞を回収し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。このＲＮＡ１００ｎｇを用いて、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとし、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ  ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により逆転写してｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡの３２０分の１量をＰＣＲテンプレートとし、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲＭａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、５０μｌの反応系で定量的ＰＣＲを行い、評価しようとするＶＩＭ由来の配列を含むｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ（Ｔ）と称する）および内部コントロールとして、ｐＴＲＥＣ上のネオマイシン耐性遺伝子に由来するｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ（Ｃ）と称する）を定量した。
定量的ＰＣＲにはリアルタイムモニタリング装置ＡＢＩ  ＰＲＩＺＭ７０００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、ｍＲＮＡ（Ｔ）の定量にはプライマー対Ｔ（配列表配列番号２および３）、ｍＲＮＡ（Ｃ）の定量にはプライマー対Ｃ（配列表配列番号４および５）をそれぞれ使用した。得られたそれぞれのｍＲＮＡの値の比（Ｔ／Ｃ）を縦軸（標的ｍＲＮＡ相対量（％））としてグラフに表した（図３１）。
コントロール細胞の場合、ルシフェラーゼ遺伝子に対するｓｉＲＮＡは標的ｍＲＮＡに効果を及ぼさないため、Ｔ／Ｃ比はほぼ１になった。ＶＩＭ８１２  ｓｉＲＮＡでは、Ｔ／Ｃ比が著しく下がった。これは、ＶＩＭ８１２  ｓｉＲＮＡが、相当する配列を有するｍＲＮＡを切断したためであり、ＶＩＭ８１２  ｓｉＲＮＡがＲＮＡｉ効果を有することが示された。一方、ＶＩＭ３５  ｓｉＲＮＡの場合、Ｔ／Ｃ比はコントロールとほぼ同じ値であったことから、ＶＩＭ３５の配列にはＲＮＡｉ効果がほとんどないことが示された。
［実施例３］
１．ｓｉＲＮＡによる内在性ビメンチンの発現抑制
（１）培養細胞へのトランスフェクション
２４穴プレートの１穴あたりに０．２〜０．３×１０６ｃｅｌｌｓ  のＨｅＬａ細胞をまき、１日後にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、マニュアルにしたがって、ＶＩＭに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＶＩＭ３５またはｓｉＶＩＭ８１２）またはコントロールｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ）１００ｎＭ、トランスフェクション効率のコントロールとして０．５μｇのｐＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を同時にトランスフェクトした。ｐＥＧＦＰはＥＧＦＰが組み込まれている。
（２）内在性ビメンチンｍＲＮＡの測定
トランスフェクションの３日後、細胞を回収し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。このＲＮＡ１００ｎｇを用いて、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとし、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ  ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により逆転写してｃＤＮＡ合成反応を行なった。得られたｃＤＮＡ産物を鋳型として、ビメンチンに対するプライマーＶＩＭ−Ｆ３−８４、ＶＩＭ−Ｒ３−２７４（配列番号１１、１２）を用いてＰＣＲを行った。
ＶＩＭ−Ｆ３−８４；  ｇａｇｃｔａｃｇｔｇａｃｔａｃｇｔｃｃａ  （配列番号１１）
ＶＩＭ−Ｒ３−２７４；  ｇｔｔｃｔｔｇａａｃｔｃｇｇｔｇｔｔｇａｔ  （配列番号１２）
また、コントロールとして、β−アクチンに対するプライマーＡＣＴＢ−Ｆ２−４８１、ＡＣＴＢ−Ｒ２−６６４（配列番号１３、１４）を用いてＰＣＲを行い、各サンプル間のβ−アクチンの定量値を合わせたうえで、ビメンチンの発現量を評価した。
ＡＣＴＢ−Ｆ２−４８１；  ｃａｃａｃｔｇｔｇｃｃｃａｔｃｔａｃｇａ（配列番号１３）
ＡＣＴＢ−Ｒ２−６６４；  ｇｃｃａｔｃｔｃｔｔｇｃｔｃｇａａｇｔｃ（配列番号１４）
結果を図３２に示す。図３２では、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ（すなわち、標的とは無関係な配列）を入れた場合を１００％として比較し、ＶＩＭに対するｓｉＲＮＡを入れた場合に、ＶＩＭのｍＲＮＡがどの程度減少したかを表している。ｓｉＶＩＭ−８１２は効果的にＶＩＭ  ｍＲＮＡを抑制できたのに対して、ｓｉＶＩＭ−３５を用いた場合はほとんどＲＮＡｉ効果を示さなかった。
（３）細胞の抗体染色
トランスフェクションの３日後、細胞を３．７％のホルムアルデヒドにより固定し、定法によりブロッキングを行った。その後、ウサギ抗ビメンチン抗体（α−ＶＩＭ）または内部コントロールとしてウサギ抗Ｙｅｓ抗体（α−Ｙｅｓ）を加え、室温で反応させた。その後、細胞表面をＰＢＳ（ＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ；リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、二次抗体として蛍光標識抗ウサギＩｇＧ抗体を加え、室温で反応させた。細胞表面をＰＢＳで洗浄の後、蛍光顕微鏡による観察を行った。
蛍光顕微鏡観察の結果を図３３に示す。図３３中、９つの各枠内において白く現れている部分が蛍光部分である。ＥＧＦＰおよびＹｅｓについては、何れの細胞でも同程度の発現が確認された。ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ、ｓｉＶＩＭ３５を導入した細胞では、ビメンチンの抗体染色による蛍光が観察され、内在性ビメンチンの存在が確認された。一方、ｓｉＶＩＭ８１２を導入した細胞では、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ、ｓｉＶＩＭ３５を導入した細胞に比べて蛍光が著しく弱かった。この結果は、ｓｉＶＩＭ８１２により内在性のビメンチンｍＲＮＡが干渉を受けた結果、ビメンチンの蛋白質の発現量が減少したことを示すものであり、ｓｉＶＩＭ８１２は内在性ビメンチンｍＲＮＡにもＲＮＡｉ効果を有することが明らかになった。
本発明のアッセイ系で得られた結果［実施例２］は、実際に内在性遺伝子に対してそれぞれのｓｉＲＮＡを用いた結果［実施例３］とよく一致していたため、このアッセイ系は任意のｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ活性を評価する方法として有効であることが示された。
［実施例４］
上記所定の規則（ａ）〜（ｄ）に基づき塩基配列を設計した。塩基配列の設計は、上記ｓｉＲＮＡ配列設計プログラムを実行する塩基配列処理装置によって行った。塩基配列は、ＲＮＡｉ活性を有すると予測される配列１５種（配列番号１５〜２９）と、ＲＮＡｉ活性を有しないと予測される配列５種（配列番号３０〜３４）を用意した。
設計された配列に基づき標的配列および評価対象のｓｉＲＮＡを調製する以外は、上記実施例１と同様にして、ルシフェラーゼ活性を測定することにより、ＲＮＡｉ活性の評価を行った。結果を図３４に示す。ルシフェラーゼ相対活性値が低いものが効いている状態、すなわちＲＮＡｉ活性を備えたｓｉＲＮＡである。上記プログラムによりＲＮＡｉ活性を有すると予測されたｓｉＲＮＡは、全てルシフェラーゼの発現を効果的に抑制した。
［ＲＮＡｉ活性を示した配列；規定配列部分、オーバーハング部を含まない］
５，ｇａｃｇｃｃａａａａａｃａｔａａａｇａ（配列番号１５）
１８４，ｇｔｔｇｇｃａｇａａｇｃｔａｔｇａａａ（配列番号１６）
２７２，ｇｔｇｔｔｇｇｇｃｇｃｇｔｔａｔｔｔａ（配列番号１７）
３０９，ｃｃｇｃｇａａｃｇａｃａｔｔｔａｔａａ（配列番号１８）
４２８，ｃｃａａｔｃａｔｃｃａａａａａａｔｔａ（配列番号１９）
５１５，ｃｃｔｃｃｃｇｇｔｔｔｔａａｔｇａａｔ（配列番号２０）
６５８，ｇｃａｔｇｃｃａｇａｇａｔｃｃｔａｔｔ（配列番号２１）
６９５，ｃｃｇｇａｔａｃｔｇｃｇａｔｔｔｔａａ（配列番号２２）
７３４，ｇｇｔｔｔｔｇｇａａｔｇｔｔｔａｃｔａ（配列番号２３）
７７４，ｇａｔｔｔｃｇａｇｔｃｇｔｃｔｔａａｔ（配列番号２４）
８９１，ｇｃａｃｔｃｔｇａｔｔｇａｃａａａｔａ（配列番号２５）
９０４，ｃａａａｔａｃｇａｔｔｔａｔｃｔａａｔ（配列番号２６）
１１８６，ｇａｔｔａｔｇｔｃｃｇｇｔｔａｔｇｔａ（配列番号２７）
１３０６，ｃｃｇｃｃｔｇａａｇｔｃｔｃｔｇａｔｔ（配列番号２８）
１５８６，ｃｔｃｇａｃｇｃａａｇａａａａａｔｃａ（配列番号２９）
［ＲＮＡｉ活性を示さなかった配列；規定配列部分、オーバーハング部を含まない］
１４，ａａｃａｔａａａｇａａａｇｇｃｃｃｇｇ（配列番号３０）
２６５，ｔａｔｇｃｃｇｇｔｇｔｔｇｇｇｃｇｃｇ（配列番号３１）
２９５，ａｇｔｔｇｃａｇｔｔｇｃｇｃｃｃｇｃｇ（配列番号３２）
４１１，ａｃｇｔｇｃａａａａａａａｇｃｔｃｃｃ（配列番号３３）
１０４４，ｔｔｃｔｇａｔｔａｃａｃｃｃｇａｇｇｇ（配列番号３４）
［実施例５］
ＳＡＲＳウィルスに対するｓｉＲＮＡを設計し、それらのＲＮＡｉ活性を調べた。標的配列および評価対象の配列をそれぞれ変更する以外は、ＲＮＡｉ活性は上記実施例２と同様のアッセイを行うことにより評価した。
ｓｉＲＮＡは、ＳＡＲＳウィルスのゲノムから、３ＣＬ−ＰＲＯ、ＲｄＲｐ、Ｓｐｉｋｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、Ｓｍａｌｌ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  Ｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｍｅｍｂｒａｎｅｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍ、Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄｐｒｏｔｅｉｎ、ｓ２ｍ  ｍｏｔｉｆの各所について、上記ｓｉＲＮＡ配列設計プログラムを用い所定の規則性に合致するものを設計した。
図３５アッセイの結果、規則性に合致するように設計した１１個のｓｉＲＮＡは、それぞれ対応するｓｉＲＮＡの配列をターゲットとして組み込んだＲＮＡを効果的に抑制した。ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ（ＳＡＲＳとは関係のない配列）を入れた場合を１００％として、ＳＡＲＳの各ｓｉＲＮＡを入れた場合の相対標的ｍＲＮＡ量を示す。各ｓｉＲＮＡを入れた場合、標的のＲＮＡが１０％程度あるいはそれ以下まで減少しており、ＲＮＡｉ活性があることが確認された。
［設計したｓｉＲＮＡの配列（規定配列部分、オーバーハング部を含まない）］
ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ；ｇｇｇｃｇｃｇｇｔｃｇｇｔａａａｇｔｔ（配列番号３５）
３ＣＬ−ＰＲＯ；ＳＡＲＳ−１０７５４；ｇｇａａｔｔｇｃｃｇｔｃｔｔａｇａｔａ（配列番号３６）
３ＣＬ−ＰＲＯ；ＳＡＲＳ−１０８１０；ｇａａｔｇｇｔｃｇｔａｃｔａｔｃｃｔｔ（配列番号３７）
ＲｄＲｐ；ＳＡＲＳ−１４８４１；ｃｃａａｇｔａａｔｃｇｔｔａａｃａａｔ（配列番号３８）
Ｓｐｉｋｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＳＡＲＳ−２３３４１；ｇｃｔｔｇｇｃｇｃａｔａｔａｔｔｃｔａ（配列番号３９）
Ｓｐｉｋｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＳＡＲＳ−２４３７５；ｃｃｔｔｔｃｇｃｇａｃｔｔｇａｔａａａ（配列番号４０）
Ｓｍａｌｌ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  Ｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＳＡＲＳ−２６２３３；ｇｔｇｃｇｔａｃｔｇｃｔｇｃａａｔａｔ（配列番号４１）
Ｓｍａｌｌ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  Ｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＳＡＲＳ−２６２８８；ｃｔａｃｔｃｇｃｇｔｇｔｔａａａａａｔ（配列番号４２）
Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍ；ＳＡＲＳ−２６３９９；ｇｃａｇａｃａａｃｇｇｔａｃｔａｔｔａ（配列番号４３）
Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍ；ＳＡＲＳ−２７０２４；ｃｃｇｇｔａｇｃａａｃｇａｃａａｔａｔ（配列番号４４）
Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＳＡＲＳ−２８６８５；ｃｇｔａｇｔｃｇｃｇｇｔａａｔｔｃａａ（配列番号４５）
ｓ２ｍ  ｍｏｔｉｆ；ＳＡＲＳ−２９６０６；ｇａｔｃｇａｇｇｇｔａｃａｇｔｇａａｔ（配列番号４６）
［実施例６］
上記「＜５＞ｓｉＲＮＡ配列設計プログラム」および「＜７＞ｓｉＲＮＡ配列設計プログラムを実行する塩基配列処理装置等」に従って、下記ｓｉＲＮＡを設計した。なお、プログラム実行の際の設定条件は、下記の通りである。
（設定条件）
（ａ）３’末端の塩基が、アデニン、チミンまたはウラシルである。
（ｂ）５’末端の塩基が、グアニンまたはシトシンである。
（ｃ）３’末端の７塩基の配列において、４塩基以上が、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上である。
（ｄ）塩基数が、１９である。
（ｅ）１０塩基以上グアニンまたはシトシンが連続する配列を含まない。
（ｆ）目的生物の全遺伝子配列のうち、前記標的遺伝子以外の他の遺伝子の塩基配列中に、当該規定配列とのミスマッチ数が２塩基以下の類似配列が含まれない。
設計されたｓｉＲＮＡの配列を配列表の配列番号４７〜配列番号８１７０８１に示す。なお、配列表の配列番号４７〜配列番号８１７０８１に記載された、各ｓｉＲＮＡの目的生物の生物名は、配列表の〈２１３〉に記載されている。また、ＲＮＡｉ対象遺伝子の遺伝子名、対象遺伝子のａｃｃｅｓｓｉｏｎ、および、対象遺伝子の塩基配列において規定配列に該当する部分については、配列表の〈２２３〉（Ｏｔｈｅｒｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に記載されている。なお、ここでの遺伝子名およびａｃｃｅｓｓｉｏｎ情報は、ＮＣＢＩの「ＲｅｆＳｅｑ」（ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ”ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／”ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に対応するものであり、ＲｅｆＳｅｑにアクセスすることによって、各遺伝子の情報（遺伝子の配列、機能等）を取得することができる。
配列番号４７に記載のｓｉＲＮＡを例にして説明すると、目的生物はＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓであり、対象遺伝子の遺伝子名は、ＡＴＢＦ１であり、対象遺伝子のａｃｃｅｓｓｉｏｎは、ＮＭ＿００６８８５．２であり、規定配列に該当する部分は、ＮＭ＿００６８８５．２の塩基配列のうち塩基番号９０８−９２６の１９塩基である。ＲｅｆＳｅｑにアクセスすると、当該対象遺伝子は、ＡＴ−ｂｉｎｄｉｎｇｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １に関連する遺伝子であることが分かる。
［実施例７］
ｓｉＲＮＡとのミスマッチ数が小さい配列を含む他の遺伝子への影響を調べるため、実施例５と同様の手法で、ホタルルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡを設計し、当該ｓｉＲＮＡとミスマッチ数が小さい類似配列に対するＲＮＡｉ効果を調べた。
［設計したｓｉＲＮＡの配列（規定配列部分、塩基数２のオーバーハング部を含む）］
３−３６  ｇｃｃａｔｔｃｔａｔｃｃｇｃｔｇｇａａｇａｔｇ（配列番号８１７０８２）
［設計したｓｉＲＮＡの類似配列（大文字で表記した塩基がミスマッチ部位）］
３−３６．Ｒ１  ｇｃｃａｔｔｃｔａｔｃｃｇｃＧｇｇＣＧｇａｔｇ（配列番号８１７０８３）
３−３６．Ｒ２  ｇｃｃａｔｔｃｔａｔｃｃｇｃＣｇｇＧＧｇａｔｇ（配列番号８１７０８４）
３−３６．Ｒ３  ｇｃｃａｔｔｃｔａｔｃｃｇｃＧｇｇａＣｇａｔｇ（配列番号８１７０８５）
３−３６．Ｒ４  ｇｃｃａｔｔｃｔａｔｃｃｇｃｔｇｇＣＧｇａｔｇ（配列番号８１７０８６）
３−３６．Ｒ５  ｇｃｃａｔｔｃｔａｔｃｃｇｃｔｇｇａＧｇａｔｇ（配列番号８１７０８７）
３−３６．Ｒ６  ｇｃｃａｔｔｃｔａｔｃｃｇｃｔｇＴａａＴａｔｇ（配列番号８１７０８８）
３−３６．Ｒ７  ｇｃｃａｔｔｃｔａｔｃｃｇｃｔＡＡａａｇａｔｇ（配列番号８１７０８９）
３−３６．Ｒ８  ｇｃｃａｔｔｃｔａｔｃｃｇｃｔＡＴａａＡａｔｇ（配列番号８１７０９０）
３−３６．Ｌ１  ｇｃｃＧＧＣｃＣＧｔｃｃｇｃｔｇｇａａｇａｔｇ（配列番号８１７０９１）
３−３６．Ｌ２  ｇｃｃＣＧｔｃＣＧｔｃｃｇｃｔｇｇａａｇａｔｇ（配列番号８１７０９２）
３−３６．Ｌ３  ｇｃｃＧｔＣｃｔＧｔｃｃｇｃｔｇｇａａｇａｔｇ（配列番号８１７０９３）
３−３６．Ｌ４  ｇｃｃａＣＣｃＧａｔｃｃｇｃｔｇｇａａｇａｔｇ（配列番号８１７０９４）
３−３６．Ｌ５  ｇｃｃａｔｔＡｔａｔｃｃｇｃｔｇｇａａｇａｔｇ（配列番号８１７０９５）
３−３６．０１Ａ  ｇｃＡａｔｔｃｔａｔｃｃｇｃｔｇｇａａｇａｔｇ（配列番号８１７０９６）
３−３６．０１Ｇ  ｇｃＧａｔｔｃｔａｔｃｃｇｃｔｇｇａａｇａｔｇ（配列番号８１７０９７）
３−３６．０１Ｕ  ｇｃＴａｔｔｃｔａｔｃｃｇｃｔｇｇａａｇａｔｇ（配列番号８１７０９８）
３−３６．１９Ｇ  ｇｃｃａｔｔｃｔａｔｃｃｇｃｔｇｇａａｇＧｔｇ（配列番号８１７０９９）
３−３６．１９Ｃ  ｇｃｃａｔｔｃｔａｔｃｃｇｃｔｇｇａａｇＣｔｇ（配列番号８１７１００）
３−３６．１９Ｕ  ｇｃｃａｔｔｃｔａｔｃｃｇｃｔｇｇａａｇＴｔｇ（配列番号８１７１０１）
図３６に示すアッセイの結果、塩基数１９の塩基配列を設計する場合、標的遺伝子以外の他の遺伝子がミスマッチ数２塩基以下の類似配列を含む場合、当該類似配列部分がＲＮＡ干渉の標的となりうる可能性が高いことが確認された。
［実施例８］
本実施例においては、表１Ａ−Ｋ記載の塩基配列を有する２１塩基長のセンス鎖ＲＮＡ（表１中の「ｓｉＲＮＡ−センス」の欄に塩基配列を記載）とアンチセンス鎖ＲＮＡ（表１中の「ｓｉＲＮＡ−アンチセンス」の欄に塩基配列を記載：ただし、当該塩基配列は、３’から５’方向に配列を記載している）とからなるｓｉＲＮＡを用いた。表１に示すように、各ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉの対象となる遺伝子（「遺伝子名」の欄参照：以下、標的遺伝子と呼ぶ場合がある）のコード領域の所定位置（「標的位置」の欄参照）に配置された標的配列（「標的配列」の欄参照）、特に、当該標的配列のうちの５’末端から３番目の塩基から３’末端から３番目までの塩基に相当するいわゆる規定配列に基づいて適宜設計を行った。そして、各ｓｉＲＮＡについて、ヒト由来のＨｅＬａ細胞を用いてＲＮＡｉ効果を調べた。具体的には、センス鎖（ｓｉＲＮＡ−センス）として配列番号８１７１０２−８１７６５０中の偶数番号の配列番号の塩基配列を、そして、アンチセンス鎖（ｓｉＲＮＡ−アンチセンス）として配列番号８１７１０２−８１７６５０中の奇数番号の配列番号の塩基配列を調べた。以下、実施例における具体的方法を説明する。
１．ｓｉＲＮＡの合成
センス鎖およびアンチセンス鎖とからなる２本鎖ｓｉＲＮＡを、前述の本発明にかかる規則（実施態様〔１〕等に記載の（ａ）〜（ｄ）の規則）にしたがって、各標的遺伝子の前記規定配列に基づき適切に配列設計した。そして、かかる設計に基づいて、プロリゴ・ジャパン株式会社に合成を委託して用意した。具体的な合成方法として、ここでは、表記した所定の塩基配列を有するセンス鎖とアンチセンス鎖とを、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭのＮａＣｌ反応溶液中、９０℃で３分間加熱した。そして、３７℃で１時間インキュベートし、その後、室温になるまで放置して会合させ２本鎖ｓｉＲＮＡを形成した。このようにして形成した２本鎖ｓｉＲＮＡは、ＴＢＥ緩衝液中で２％アガロースゲルを用いる電気泳動に供し、それによりセンス鎖とアンチセンス鎖との会合の確認を行った。
２．細胞培養
実施例では、ヒト由来のＨｅＬａ細胞を用いた。ＨｅＬａ細胞の培地（以下、細胞培地と呼ぶことがある）としては、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に、非働化１０％牛胎児血清（ＦＢＳ：Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，ｉｎｃ社製）を添加して調製した培地を用いた。かかる培地中で、ＨｅＬａ細胞を３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。
３．ＲＮＡｉの対象となる標的遺伝子
子宮頚部癌の細胞であるＨｅＬａ細胞を用いており、ここでは、かかるＨｅＬａ細胞の内在性遺伝子であって当該細胞内で高発現している表１の各遺伝子が、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉの対象、すなわちＲＮＡｉの標的遺伝子となる。本実施例では、ＨｅＬａ細胞を用いてこれらの各遺伝子における各ｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ効果を調べ、それにより、当該遺伝子に関連する疾患や生物学的機能（具体的には、図４６の「関連疾患名」、「生物学的機能カテゴリー」および／または「文献に基づく生物学的機能」の欄の記載参照）に関するｓｉＲＮＡの効果、すなわち、疾患の予防および治療効果や生物学的機能の調節効果を検討した。なお、ここでは、内部コントロール遺伝子として、ＨｅＬａ細胞の内在性遺伝子であるＧＡＰＤＨを利用した。
４．ｓｉＲＮＡの細胞への導入（トランスフェクション）
まず、ＨｅＬａ細胞を５×１０４細胞／ｗｅｌｌの密度で２４穴プレートにまき、上記の細胞培養条件で２４時間培養した後に、１ｗｅｌｌにつき、５ｎＭのｓｉＲＮＡを導入した。かかる導入後、ＨｅＬａ細胞を３７℃で２４時間培養した。ここでは、かかる導入に関し、導入試薬としてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、導入時に使用する培地としてＤＭＥＭを用いた。また、具体的な導入方法としては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００とｓｉＲＮＡとを含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を細胞培地へ添加し、ＨｅＬａ細胞を培養することにより、ｓｉＲＮＡを細胞内に導入した。このようにｓｉＲＮＡが導入されたＨｅＬａ細胞を、以下では「評価サンプル」と呼ぶ。
一方、後述のＰＣＲにおける標的遺伝子由来のｍＲＮＡ量の補正用に、以下のキャリブレーターサンプルを用意した。キャリブレーターサンプルでは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を含みｓｉＲＮＡを含まないＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を上記細胞培地へ添加してＨｅＬａ細胞を培養し、それ以外は、ｓｉＲＮＡを導入した評価サンプルに対する処理と同様の処理を行って調製した。
５．ＲＮＡｉ効果の測定
上記の導入を行った後、上記評価サンプルおよびキャリブレーターサンプルについて、ＨｅＬａ細胞を回収した。そして、回収した細胞をＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）６７００Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）に供し、マニュアルに従ってかかる装置を操作してＲＮＡの抽出および逆転写によるｃＤＮＡの合成を行った。
続いて、得られたｃＤＮＡを鋳型とし、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、５０μｌの反応系で定量的ＰＣＲを行った。かかる定量的ＰＣＲには、リアルタイムモニタリング装置としてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用い、マニュアルに従ってかかる装置を操作した。また、ＰＣＲのプライマーには、種々検討の結果得られた最適プライマーを用いた。
本実施例では、得られたＰＣＲ定量結果を、「比較Ｃｔ法」と呼ばれる方法により解析した。当該方法については、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のホームページｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏ．ｊｐに説明が開示されているのでここでは詳細説明は省略するが、当該方法の概略を説明すると、この方法は、キャリブレーターサンプルと比較して評価サンプルが何サイクル早く（または遅く）Ｔｈｒｅｄｈｏｌｄ  Ｌｉｎｅに到達するかに着目して相対定量するものである。
具体的には、まず、ＰＣＲにより、評価サンプルおよびキャリブレーターサンプルについて、標的遺伝子由来の塩基配列を含む相対的なｍＲＮＡ量に相当するＣｔ１と、内部コントロール遺伝子由来の塩基配列を含む相対的なｍＲＮＡ量に相当するＣｔ２とを定量した。以下においては、評価サンプルの上記Ｃｔ１を「Ｃｔ１（Ｅ）」と呼び、上記Ｃｔ２を「Ｃｔ２（Ｅ）」と呼ぶ。また、キャリブレーターサンプルの上記Ｃｔ１を「Ｃｔ１（Ｃ）」と呼び、上記Ｃｔ２を「Ｃｔ２（Ｃ）」と呼ぶ。
ここで、「Ｃｔ」は、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｌｉｎｅに達するサイクル数であり、具体的には、下記（１）式で定義される。なお、ここでは増幅効率を１としている。Ｃｔに添付された数字は、「１」が標的遺伝子由来の場合のｍＲＮＡ量であることを示しており、「２」が内部コントロール遺伝子由来の場合のｍＲＮＡ量であることを示している。また、Ｃｔに添付された（Ｅ）および（Ｃ）は、「Ｅ」が評価サンプルであることを示しており、「Ｃ」がキャリブレーションサンプルであることを示している。添付記載の「１」、「２」、「Ｅ」、「Ｃ」にかかわらず、「Ｃｔ」は下記のように定義される。
2005116204.tif 000003
ただし、（１）式中、［ＤＮＡ］ｔは、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｌｉｎｅに達した際のＤＮＡ量を示しており、［ＤＮＡ］０は、ｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡの初期量を示している。
このようにＰＣＲによる定量で取得したＣｔ１（Ｅ）、Ｃｔ２（Ｅ）、Ｃｔ１（Ｃ）、Ｃｔ２（Ｃ）を比較Ｃｔ法に供して解析し、ｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ効果の評価指標となるＲＱ値を取得した。ＲＱ値とは、キャリブレーションサンプルにおける標的遺伝子のｍＲＮＡレベルを１とした時の、評価サンプルにおける標的遺伝子のｍＲＮＡレベルの相対値である。具体的には、ＲＱ値は、下記（２）式で定義される。
2005116204.tif 000004
ただし、（２）式の▲△▼▲△▼Ｃｔは、下記（３）式で定義される。
2005116204.tif 000005
ここで、（３）式中、▲△▼Ｃｔ（Ｅ）は下記（４）式で定義され、▲△▼Ｃｔ（Ｃ）は下記（５）式で定義される。
2005116204.tif 000006
なお、（２）〜（５）式における添付記載「１」、「２」、「Ｅ」および「Ｃ」の説明は、上記の通りである。
６．ＲＮＡｉ効果の評価
上記のようにして取得したＲＱ値を表１Ａ−Ｋに示す。表１の「遺伝子名」の欄の記載、「ｒｅｆｓｅｑ＿ＮＯ．」の欄の記載、「標的配列」の欄に記載された配列において実際にＲＮＡｉの標的となる配列、および「標的位置」の定義については、本明細書中、「図面の簡単な説明」の項目において、図４６に関連して前述した通りである。
本実施例においては、上記のようにして算出されたＲＱ値（表１の「ＲＱ値」の欄参照）に基づいて、各ｓｉＲＮＡの標的遺伝子に対するＲＮＡｉ効果を評価した。表から明らかなように、配列番号８１７１０２−８１７６５０中の偶数番号の配列番号の塩基配列を有するセンス鎖と、配列番号８１７１０２−８１７６５０中の奇数番号の配列番号の塩基配列を有するアンチセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡでは、ＲＱ値が全て１未満、そしてほぼ全てが０．５未満となり、よって、これらのｓｉＲＮＡは表１記載の標的遺伝子の発現を５０％以下に抑制すること示された。このような各ｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ効果は、ＣＯＳ細胞を用いて上記と同様の操作を行った場合においても実現された。
さらに、用いた２９４種の本発明のｓｉＲＮＡ全てがＲＮＡｉ効果を奏するという実施例８の結果から、本発明にかかるポリヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）は、哺乳動物細胞において、標的遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有効に奏し遺伝子発現を５０％以下に抑制することが明らかとなった。
なお、実施例１−８においては、センス鎖およびアンチセンス鎖が全てＲＮＡで構成されたｓｉＲＮＡを用いる場合を示したが、キメラ構造を有するｓｉＲＮＡを用いた場合においても、上記実施例１−８と同様の結果が得られる。ｓｉＲＮＡがキメラ構造を有する場合の詳細な説明はここでは省略するが、例えば、実施例８においてキメラ構造のｓｉＲＮＡを用いた場合、当該ｓｉＲＮＡは、配列番号８１７１０２〜配列番号８１７６５１で示すセンス鎖およびアンチセンス鎖からなる実施例８のｓｉＲＮＡと以下の点で構成が異なる。
すなわち、キメラ構造のｓｉＲＮＡは、表１に示す配列番号８１７１０２〜配列番号８１７６５１で示すセンス鎖およびアンチセンス鎖からなるｓｉＲＮＡと同様の塩基配列を有するが、センス鎖の３’末端（例えば、表１の配列番号８１０２記載のセンス鎖ではＡ）から８〜１２ポリヌクレオチド（例えば１０ポリヌクレオチド、好ましくは１１ポリヌクレオチド、より好ましくは１２ヌクレオチド）の部分と、アンチセンス鎖の５’末端（例えば、表１の配列番号８１０３記載のアンチセンス鎖ではＡ）から８〜１２ポリヌクレオチド（例えば１０ポリヌクレオチド、好ましくは１１ポリヌクレオチド、より好ましくは１２ヌクレオチド）の部分とがＤＮＡで構成されており、よって、表１に示すセンス鎖およびアンチセンス鎖の塩基配列のうち、当該ポリヌクレオチド部分のＵがＴに置換された点が、配列番号８１７１０２〜配列番号８１７６５１で示すｓｉＲＮＡと異なる。
【表１Ａ】
2005116204.tif 000007
【表１Ｂ】
2005116204.tif 000008
【表１Ｃ】
2005116204.tif 000009
【表１Ｄ】
2005116204.tif 000010
【表１Ｅ】
2005116204.tif 000011
【表１Ｆ】
2005116204.tif 000012
【表１Ｇ】
2005116204.tif 000013
【表１Ｈ】
2005116204.tif 000014
【表１Ｉ】
2005116204.tif 000015
【表１Ｊ】
2005116204.tif 000016
【表１Ｋ】
2005116204.tif 000017
【産業上の利用可能性】  以上のように、本発明にかかるポリヌクレオチドは、標的遺伝子に対して高いＲＮＡ干渉効果を有するとともに、標的遺伝子と関係のない遺伝子についてＲＮＡ干渉を生じる危険性が非常に小さいため、発現を抑制しようとする標的遺伝子のみに特異的にＲＮＡ干渉を生じさせることができる。したがって、本発明は、ＲＮＡ干渉を利用する試験、治療方法等に好適に利用することができ、哺乳類などの高等動物、特にヒトを対象とするＲＮＡ干渉を行う際に特に有効性を発揮するものである。
なお、本出願の配列表は８１７６５１個の配列の情報を含む。電子ファイルの容量が余りに大きく（２００ＭＢ近く）、コンピュター環境によっては作業が著しく困難、または不可能になるため、便宜上電子ファイルを２つに分けた。ＹＣＴ１０３９  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｌｉｓｔｉｎｇ（１）は、書誌事項と配列番号１ないし７００００の情報を、ＹＣＴ１０３９  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｌｉｓｔｉｎｇ（２）は、配列番号７００００１ないし８１７６５１の情
【図１】
2005116204.tif 000018
【図２】
2005116204.tif 000019
【図３】
2005116204.tif 000020
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2005116204.tif 000025
【図９】
2005116204.tif 000026
【図１０】
2005116204.tif 000027
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2005116204.tif 000030
【図１４】
2005116204.tif 000031
【図１５】
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【図１６】
2005116204.tif 000033
【図１７】
2005116204.tif 000034
【図１８】
2005116204.tif 000035
【図１９】
2005116204.tif 000036
【図２０】
2005116204.tif 000037
【図２１】
2005116204.tif 000038
【図２２】
2005116204.tif 000039
【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
2005116204.tif 000043
【図２７】
2005116204.tif 000044
【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
2005116204.tif 000047
【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
2005116204.tif 000051
【図３５】
2005116204.tif 000052
【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
2005116204.tif 000055
【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
2005116204.tif 000059
【図４３−１】
2005116204.tif 000060
【図４３−２】
2005116204.tif 000061
【図４４】
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【図４５】
2005116204.tif 000063
【図４６】
2005116204.tif 000064
【図４６−１】
2005116204.tif 000065
【図４６−２】
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【図４６−３】
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【図４６−４】
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【図４６−５】
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【図４６−６】
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【図４６−７】
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【図４６−８】
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【図４６−９】
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【図４６−１０】
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【図４６−１１】
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【図４６−１２】
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【図４６−１３】
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【図４６−１４】
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【図４６−１５】
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【図４６−１６】
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【図４６−１７】
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【図４６−１８】
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【図４６−１９】
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【図４６−２０】
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【図４６−２１】
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【図４６−２２】
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【図４６−２３】
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【図４６−２４】
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【図４６−２５】
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【図４６−２６】
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【図４６−２７】
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【図４６−２８】
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【図４６−２９】
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【図４６−３０】
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【図４６−３１】
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【図４６−３２】
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【図４６−３３】
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【図４６−３４】
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【図４６−３５】
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【図４６−３６】
2005116204.tif 000100
【図４６−３７】
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【図４６−３８】
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【図４６−３９】
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【図４６−４０】
2005116204.tif 000104
【図４６−４１】
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【図４６−４２】
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【図４６−４３】
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【図４６−４４】
2005116204.tif 000108
【図４６−４５】
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【図４６−４６】
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【図４６−４７】
2005116204.tif 000111
【図４６−４８】
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【図４６−４９】
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【図４６−５０】
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【図４６−５１】
2005116204.tif 000115
【図４６−５２】
2005116204.tif 000116
【図４６−５３】
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【図４６−５４】
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【図４６−５５】
2005116204.tif 000119
【図４６−５６】
2005116204.tif 000120
【図４６−５７】
2005116204.tif 000121
【図４６−５８】
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【図４６−５９】
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【図４６−６０】
2005116204.tif 000124
【図４６−６１】
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【図４６−６２】
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【図４６−６３】
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【図４６−６４】
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【図４６−６５】
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【図４６−６６】
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【図４６−６７】
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【図４６−６８】
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【図４６−６９】
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【図４６−７０】
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【図４６−７１】
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【図４６−７２】
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【図４６−７３】
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【図４６−７４】
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【図４６−７５】
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【図４６−７６】
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【図４６−７７】
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【図４６−７８】
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【図４６−７９】
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【図４６−８０】
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【図４６−８１】
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【図４６−８２】
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【図４６−８３】
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【図４６−８４】
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【図４６−８５】
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【図４６−８６】
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【図４６−８７】
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【図４６−８８】
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【図４６−８９】
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【図４６−９０】
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【図４６−９１】
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【図４６−９２】
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【図４６−９３】
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【図４６−９４】
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【図４６−９５】
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【図４６−９６】
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【図４６−９７】
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【図４６−９８】
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【図４６−９９】
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【図４６−１００】
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【図４６−１０１】
2005116204.tif 000165
【図４６−１０２】
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【図４６−１０３】
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【図４６−１０４】
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【図４６−１０５】
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【図４６−１０６】
2005116204.tif 000170
【図４６−１０７】
2005116204.tif 000171
【図４６−１０８】
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【図４６−１０９】
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【図４６−１１０】
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【図４６−１１１】
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【図４６−１１２】
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【図４６−１１３】
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【図４６−１１４】
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【図４６−１１５】
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【図４６−１１６】
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【図４６−１１７】
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【図４６−１１８】
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【図４６−１１９】
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【図４６−１２０】
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【図４６−１２１】
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【図４６−１２２】
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【図４６−１２３】
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【図４６−１２４】
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【図４６−１２５】
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【図４６−１２６】
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【図４６−１２７】
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【図４６−１２８】
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【図４６−１２９】
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【図４６−１３０】
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【図４６−１３１】
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【図４６−１３２】
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【図４６−１３３】
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【図４６−１３４】
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【図４６−１３５】
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【図４６−１３６】
2005116204.tif 000200
【図４６−１３７】
2005116204.tif 000201
【図４６−１３８】
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【図４６−１４０９】
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【図４６−１４１０】
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【図４６−１４１１】
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【図４６−１４１２】
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【図４６−１４１３】
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【図４６−１４１４】
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【図４６−１４１５】
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【図４６−１４１６】
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【図４６−１４１７】
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【国際調査報告】
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