(57)【要約】  テトラサイクリンリプレッサー（TetR）・オペレーター（TetOP）システムを酵母に組み入れ、テトラサイクリンリプレッサー融合タンパク質の細胞内局在性の変化を指標とした検出およびスクリーニングを行う。TetR発現プラスミドライブラリーから発現されるTetR融合タンパク質(11)は、核移行シグナルの働きによって核(14)に移行する。TetR融合タンパク質(11)は、HIS3レポーター遺伝子プロモーターに挿入されたTetOP(12)に結合し、HIS3レポーター遺伝子(13)を抑制する。TetRに融合されたタンパク質に、細胞内特定領域(15)への移行を司る活性が含まれるとき、TetR融合タンパク質(11)は、核質から排出され、HIS3レポーター遺伝子(13)の発現が誘導される。従って、ヒスチジンを欠いた最少培地で生育するクローンを選択することで、細胞内特定領域移行活性を検出できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(1)テトラサイクリンオペレーターの制御下にレポーター遺伝子を発現する酵母に、テトラサイクリンリプレッサーと、対象タンパク質との融合タンパク質を発現するDNA構築物を導入して、前記融合タンパク質を発現させ、(2)前記レポーター遺伝子の発現を検出することを含む、タンパク質の、真核生物の核質以外の細胞内特定領域に局在化する活性を検出する方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法により、タンパク質ライブラリーのタンパク質の、真核生物の核質以外の細胞内特定領域に局在化する活性を検出し、活性の検出されたタンパク質を選択することを含む、真核生物の核質以外の細胞内特定領域に局在化するタンパク質をスクリーニングする方法。
【請求項３】
(1)テトラサイクリンオペレーターの制御下にレポーター遺伝子を発現する酵母に、テトラサイクリンリプレッサーと、対象タンパク質との融合タンパク質を発現するDNA構築物を導入して、前記融合タンパク質を発現させ、(2)前記レポーター遺伝子の発現を検出し、(3)前記レポーター遺伝子の発現が検出された酵母から前記DNA構築物を回収することを含む、真核生物の核質以外の細胞内特定領域に局在化するタンパク質をコードする核酸を取得する方法。
【請求項４】
(1)テトラサイクリンオペレーターの制御下にレポーター遺伝子を発現する酵母に、テトラサイクリンリプレッサーと、可視化可能タンパク質と、対象タンパク質との融合タンパク質を発現するDNA構築物を導入して、前記融合タンパク質を発現させ、(2)前記レポーター遺伝子の発現を検出し、(3)前記レポーター遺伝子が発現された酵母の保持する前記DNA構築物から発現される前記融合タンパク質が局在する細胞内特定領域を、可視化可能タンパク質の検出により同定することを含む、タンパク質の、真核生物の細胞内特定領域に局在化する活性を検出する方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法により、タンパク質ライブラリーのタンパク質の、真核生物の細胞内特定領域に局在化する活性を検出し、活性の検出されたタンパク質を選択することを含む、真核生物の細胞内特定領域に局在化するタンパク質をスクリーニングする方法。
【請求項６】
(1)テトラサイクリンオペレーターの制御下にレポーター遺伝子を発現する酵母に、テトラサイクリンリプレッサーと、可視化可能タンパク質と、対象タンパク質との融合タンパク質を発現するDNA構築物を導入して、前記融合タンパク質を発現させ、(2)前記レポーター遺伝子の発現を検出し、(3)前記レポーター遺伝子が発現された酵母の保持する前記DNA構築物から発現される前記融合タンパク質が局在する細胞内特定領域を、可視化可能タンパク質の検出により同定し、(4)前記融合タンパク質の細胞内特定領域への局在が認められた酵母から前記DNA構築物を回収することを含む、真核生物の細胞内特定領域に局在化するタンパク質をコードする核酸を取得する方法。
【請求項７】
(1)テトラサイクリンオペレーターの制御下にレポーター遺伝子を発現する酵母、(2)テトラサイクリンリプレッサーと、対象タンパク質との融合タンパク質を発現するDNA構築物、および、(3)前記レポーター遺伝子の発現を検出する手段を含む、タンパク質の、真核生物の核質以外の細胞内特定領域に局在化する活性を検出するシステム。
【請求項８】
(1)テトラサイクリンオペレーターの制御下にレポーター遺伝子を発現する酵母、(2)テトラサイクリンリプレッサーと、可視化可能タンパク質と、対象タンパク質との融合タンパク質を発現するDNA構築物、(3)前記レポーター遺伝子の発現を検出する手段、(4)DNA構築物から発現される前記融合タンパク質が局在する細胞内特定領域を、可視化可能タンパク質の検出により同定する手段、および、(5)前記融合タンパク質の細胞内特定領域への局在が認められた酵母から前記DNA構築物を回収する手段を含む、タンパク質の、真核生物の細胞内特定領域に局在化する活性を検出するシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真核生物の細胞内特定領域に局在化するタンパク質、およびこれらの移行を司るシグナル配列を含むペプチドをスクリーニングおよび同定する方法およびシステム並びにその方法およびシステムで使用されるDNA構築物に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、細胞の細胞質、核、ミトコンドリア等の特定の細胞内小器官および細胞内特定領域に移行して機能を発揮する。この移行の多くは、２０アミノ酸以内の短いペプチドからなる細胞内小器官特異的なシグナル配列によって指令される。【０００３】
従来、細胞内小器官へ移行するタンパク質のうち、核へ局在するタンパク質、分泌性の細胞外移行タンパク質、およびレセプター型の膜タンパク質に対するスクリーニングシステムが確立されている（例えば、非特許文献１〜３参照）。これらのシステムは、酵母やほ乳類培養細胞を用いて行うタンパク質の機能的スクリーニング方法であるが、核移行および細胞外移行タンパク質のスクリーニングに限定されるものである。【０００４】
一方、大腸菌由来のテトラサイクリンリプレッサー・オペレーターシステムを酵母で利用する技術が、酵母ツーハイブリッドシステム(yeast two-hybrid system)の変形として、タンパク質間の相互作用を阻害するタンパク質変異や薬剤化合物のスクリーニングに利用されている（例えば、非特許文献４参照）。
【非特許文献１】Ueki N., Oda T., Kondo M., Yano K., Noguchi T., Muramatsu M. Selection system for genes encoding nuclear-targeted proteins. Nat. Biotechnol. 1998 Dec;16(13):1338-13342.
【非特許文献２】Tashiro K., Tada H., Heilker R., Shirozu M., Nakano T., Honjo T. Signal sequence trap: a cloning strategy for secreted proteins and type I membrane proteins. Science. 1993 Jul 30;261(5121):600-603.
【非特許文献３】Klein R.D., Gu Q., Goddard A., Rosenthal A. Selection for genes encoding secreted proteins and receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996 Jul 9;93(14):7108-71013.
【非特許文献４】Shih H.M., Goldman P.S., DeMaggio A.J., Hollenberg S.M., Goodman R.H., Hoekstra M.F. A positive genetic selection for disrupting protein-protein interactions: identification of CREB mutations that prevent association with the coactivator CBP. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996 Nov 26;93(24):13896-13901.
【発明の開示】
【０００５】
ある生物で発現する全タンパク質の細胞内局在性を網羅的に調査する場合や、目的の細胞内小器官へ移行するタンパク質を網羅的に解析およびクローニングしようとする場合、効率的なスクリーニングシステムが要求される。しかし、前述のように、核移行および細胞外移行タンパク質以外のスクリーニングシステムは未だ発明されていない。
【０００６】
本発明は、真核生物の細胞質、細胞内小器官、核小体、核内特定クロマチン領域等の細胞内特定領域に局在化するタンパク質のスクリーニング方法およびシステムを提供することを目的とする。
【０００７】
本発明者らは、大腸菌由来のテトラサイクリンリプレッサー（TetR）・オペレーター（TetOP）の既存のシステムを、特定の様式で酵母スクリーニングシステムに取り入れることで、真核細胞の細胞内特定領域に局在化するタンパク質をスクリーニングすることが可能であることを見出した。以上の知見に基づき、本発明は完成された。
従って、本発明では、以下のものを提供する。
【０００８】
１．  (1)テトラサイクリンオペレーターの制御下にレポーター遺伝子を発現する酵母に、テトラサイクリンリプレッサーと、対象タンパク質との融合タンパク質を発現するDNA構築物を導入して、前記融合タンパク質を発現させ、(2)前記レポーター遺伝子の発現を検出することを含む、タンパク質の、真核生物の核質以外の細胞内特定領域に局在化する活性を検出する方法。
【０００９】
２．  １記載の方法により、タンパク質ライブラリーのタンパク質の、真核生物の核質以外の細胞内特定領域に局在化する活性を検出し、活性の検出されたタンパク質を選択することを含む、真核生物の核質以外の細胞内特定領域に局在化するタンパク質をスクリーニングする方法。
【００１０】
３．  (1)テトラサイクリンオペレーターの制御下にレポーター遺伝子を発現する酵母に、テトラサイクリンリプレッサーと、対象タンパク質との融合タンパク質を発現するDNA構築物を導入して、前記融合タンパク質を発現させ、(2)前記レポーター遺伝子の発現を検出し、(3)前記レポーター遺伝子の発現が検出された酵母から前記DNA構築物を回収することを含む、真核生物の核質以外の細胞内特定領域に局在化するタンパク質をコードする核酸を取得する方法。
【００１１】
４．  (1)テトラサイクリンオペレーターの制御下にレポーター遺伝子を発現する酵母に、テトラサイクリンリプレッサーと、可視化可能タンパク質と、対象タンパク質との融合タンパク質を発現するDNA構築物を導入して、前記融合タンパク質を発現させ、(2)前記レポーター遺伝子の発現を検出し、(3)前記レポーター遺伝子が発現された酵母の保持する前記DNA構築物から発現される前記融合タンパク質が局在する細胞内特定領域を、可視化可能タンパク質の検出により同定することを含む、タンパク質の、真核生物の細胞内特定領域に局在化する活性を検出する方法。
【００１２】
５．  ４記載の方法により、タンパク質ライブラリーのタンパク質の、真核生物の細胞内特定領域に局在化する活性を検出し、活性の検出されたタンパク質を選択することを含む、真核生物の細胞内特定領域に局在化するタンパク質をスクリーニングする方法。
【００１３】
６．  (1)テトラサイクリンオペレーターの制御下にレポーター遺伝子を発現する酵母に、テトラサイクリンリプレッサーと、可視化可能タンパク質と、対象タンパク質との融合タンパク質を発現するDNA構築物を導入して、前記融合タンパク質を発現させ、(2)前記レポーター遺伝子の発現を検出し、(3)前記レポーター遺伝子が発現された酵母の保持する前記DNA構築物から発現される前記融合タンパク質が局在する細胞内特定領域を、可視化可能タンパク質の検出により同定し、(4)前記融合タンパク質の細胞内特定領域への局在が認められた酵母から前記DNA構築物を回収することを含む、真核生物の細胞内特定領域に局在化するタンパク質をコードする核酸を取得する方法。
【００１４】
７．  (1)テトラサイクリンオペレーターの制御下にレポーター遺伝子を発現する酵母、(2)テトラサイクリンリプレッサーと、対象タンパク質との融合タンパク質を発現するDNA構築物、および、(3)前記レポーター遺伝子の発現を検出する手段を含む、タンパク質の、真核生物の核質以外の細胞内特定領域に局在化する活性を検出するシステム。
【００１５】
８．  (1)テトラサイクリンオペレーターの制御下にレポーター遺伝子を発現する酵母、(2)テトラサイクリンリプレッサーと、可視化可能タンパク質と、対象タンパク質との融合タンパク質を発現するDNA構築物、(3)前記レポーター遺伝子の発現を検出する手段、(4)DNA構築物から発現される前記融合タンパク質が局在する細胞内特定領域を、可視化可能タンパク質の検出により同定する手段、および、(5)前記融合タンパク質の細胞内特定領域への局在が認められた酵母から前記DNA構築物を回収する手段を含む、タンパク質の、真核生物の細胞内特定領域に局在化する活性を検出するシステム。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の一実施形態を示すプラスミドpTet-aである。
【図２】本発明の一実施形態を示すプラスミドpTet-aから改変されたプラスミドpTetGFP-aである。
【図３】本発明の一実施形態を示すプラスミドpTet-aから改変されたプラスミドpTetGFP-cである。
【図４】本発明のスクリーニングシステムの仕組みを示した模式図である。
【図５】NESXライブラリーから、本スクリーニングシステムによって選択されたペプチド配列の例を示したものである。
【図６】12Xライブラリーから、本スクリーニングシステムによって選択されたペプチド配列とその細胞内局在性の例を示したものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本明細書においては、タンパク質とペプチドの語は互いに互換可能な意味の語として用いる。【００１８】
本発明では、比較的大きなライブラリーサイズを扱うことができ、スクリーニング操作が容易である酵母を用い、酵母の内生の細胞内特定領域移行活性を利用する。細胞内特定領域への移行は真核生物全般に保存された機構であるため、全真核生物のタンパク質ライブラリーを扱うことができる。【００１９】
本発明の基本原理は、大腸菌由来のテトラサイクリンリプレッサー（TetR）・オペレーター（TetOP）の既存のシステムを酵母スクリーニングシステムに取り入れ、TetRの核質以外の細胞内特定領域への移行に伴うレポーター遺伝子の活性化を指標として、目的のタンパク質を検出およびスクリーニングするものである。【００２０】
レポーター遺伝子のプロモーター中にTetOPを組み込むと、TetRがTetOPに結合することでレポーター遺伝子の発現は抑制された状態に保たれる。TetRにタンパク質を融合させて発現させた時、このタンパク質に細胞内特定領域への移行を促す活性が含まれる場合には、このTetR融合タンパク質の核内存在量が減少することになる。これに伴ってTetR融合タンパク質はTetOPに結合できなくなり、レポーター遺伝子の発現が誘導される。最終的にこのレポーター遺伝子の発現を指標として、酵母の選択を行う。【００２１】
TetRに融合するタンパク質として、ライブラリーを用いること、つまりTetRをコードするDNA構築物にタンパク質をコードするDNA断片を挿入すること、によりレポーター遺伝子の発現を指標にしてスクリーニングが可能となる。【００２２】
従って、本発明の検出方法は、(1)テトラサイクリンオペレーターの制御下にレポーター遺伝子を発現する酵母に、テトラサイクリンリプレッサーと、対象タンパク質との融合タンパク質を発現するDNA構築物を導入して、前記融合タンパク質を発現させ、(2)前記レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする。【００２３】
本発明で使用される酵母は、テトラサイクリンオペレーターの制御下にレポーター遺伝子を発現する。酵母には、特に制限はなく、通常に用いられる酵母でよい。【００２４】
レポーター遺伝子は、酵母で機能するものであればよい。このようなレポーター遺伝子としては、選択マーカーとして用いられる遺伝子が使用できる。例えば、HIS3、LEU2、TRP1、URA3、ADE2などの栄養要求性選択マーカー、YAP1、AUR1-C（TAKARA社より販売されているpAUR系プラスミドに含まれているマーカー遺伝子）、Zeocin（Invitrogen社より販売されているpHybLex/Zeoプラスミド等に含まれているマーカー遺伝子）などの薬剤耐性マーカーが挙げられる。【００２５】
テトラサイクリンオペレーターの制御下にレポーター遺伝子を発現する酵母は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。すなわち、レポーター遺伝子のプロモーターにテトラサイクリンオペレーターを組み込めばよい。【００２６】
本発明で用いられるDNA構築物は、テトラサイクリンリプレッサーと、対象タンパク質との融合タンパク質を発現する。DNA構築物は、通常には、酵母で複製可能なベクターまたはプラスミドであり、酵母におけるプラスミド複製に必要な複製制御領域（複製開始点とも言う）（例えば、２μ ori、ARS、CENなど）を有する。【００２７】
DNA構築物は、酵母で用いられるベクターを、通常の遺伝子工学手法により、テトラサイクリンリプレッサーと、対象タンパク質との融合タンパク質を発現するように改変することによって得ることができる。代表的なベクターとしては、YEp系、YRP系、YCP系などのベクターが挙げられる。発現のために、用いられるプロモーターおよびターミネーターは、酵母で機能するものであれば、制限されない。テトラサイクリンリプレッサーと、対象タンパク質とはどちらがN末端に位置してもよい。【００２８】
DNA構築物は、さらに、酵母での選択マーカーを有することが好ましい。これにより、DNA構築物を保持する酵母を選択できる。選択マーカーの例としては、上記レポーター遺伝子と同様のものが挙げられ、レポーター遺伝子とは異なるものが用いられる。DNA構築物が選択マーカー遺伝子を有する場合には、酵母として、マーカー遺伝子が欠損しているものを用いる。【００２９】
DNA構築物は、酵母と大腸菌とでクローニング可能なシャトルベクターであることが好ましい。このための大腸菌におけるプラスミド複製に必要な複製制御領域としては、ColE1 oriなどが挙げられる。また、大腸菌における選択マーカーをさらに有することが好ましく、その例としては、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子が挙げられる。【００３０】
対象タンパク質のサイズが大きく、拡散による核内への侵入が阻害される場合には、核移行シグナルを融合タンパク質に含ませる。このような核移行シグナルの例としては、Xenopus （カエル）nucleoplasmin由来のもの（KRPAATKKAGQAKKKK(配列番号６１)）、ヒトcMyc由来のもの（PAAKRVKLD(配列番号６２)）、人工的な配列（KRKRY(配列番号６３)）などが挙げられる。核移行シグナルを含ませる位置は、核移行シグナルの性質によって選択すればよく、N末端、C末端、テトラサイクリンリプレッサーと対象タンパク質との間などが挙げられる。【００３１】
レポーター遺伝子の発現は、レポーター遺伝子に適した方法により検出することができる。代表的なレポーター遺伝子の発現の検出方法は、以下の通りである。【００３２】
【表１】
2006062169.tif 000002
【００３３】
本発明の検出方法により、タンパク質ライブラリーのタンパク質の、真核生物の核質以外の細胞内特定領域に局在化する活性を検出することにより、真核生物の核質以外の細胞内特定領域に局在化するタンパク質をスクリーニングすることができる。また、レポーター遺伝子の発現が検出された酵母から、DNA構築物を回収することにより、真核生物の核質以外の細胞内特定領域に局在化するタンパク質を取得することができる。【００３４】
タンパク質ライブラリーから、真核生物の核質以外の細胞内特定領域に局在化するタンパク質をスクリーニングする場合には、テトラサイクリンリプレッサーとライブラリーのタンパク質とが融合タンパク質となるように、テトラサイクリンリプレッサー遺伝子と、ライブラリーのタンパク質をコードするDNAを組み込む、マルチクローニング部位などの制限酵素で切断できる部位を有するDNA構築物を用いることが好ましい。【００３５】
DNA構築物が発現する融合タンパク質にさらに可視化可能タンパク質を融合させると、可視化タンパク質の検出により、細胞内特定領域への局在化する活性を検出することができる。【００３６】
可視化可能タンパク質としては、可視化可能であれば特に限定されず、染色可能なタンパク質や蛍光や発光するものが挙げられるが、蛍光や発光を示すタンパク質を用いることが好ましい。蛍光や発光を示すタンパク質としては、緑色蛍光タンパク質（GFP）が挙げられる。【００３７】
可視化可能タンパク質の検出は、可視化可能タンパク質に応じて選択される方法により行うことができる。例えば、GFPの場合には、蛍光顕微鏡により検出することができる。【００３８】
前記レポーター遺伝子が発現された酵母の保持する前記DNA構築物から発現される前記融合タンパク質が局在する細胞内特定領域を、可視化可能タンパク質の検出により同定する際には、レポーター遺伝子の発現が検出された酵母における前記融合タンパク質が局在する細胞内特定領域を、可視化可能タンパク質の検出により同定してもよいし、あるいは、レポーター遺伝子の発現が検出された酵母からDNA構築物を回収し、回収された前記DNA構築物を酵母に導入して、前記融合タンパク質を発現させ、前記融合タンパク質が局在する細胞内特定領域を、可視化可能タンパク質の検出により同定してもよい。再導入を行う酵母は、レポーター遺伝子を発現するものでなくてもよいが、DNA構築物が選択マーカーを有する場合は、用いる酵母または培養条件を選択マーカーに対応したものすることが好ましい。【００３９】
本発明は、上記の方法を行うための、下記のシステムも提供する。【００４０】
(1)テトラサイクリンオペレーターの制御下にレポーター遺伝子を発現する酵母、(2)テトラサイクリンリプレッサーと、対象タンパク質との融合タンパク質を発現するDNA構築物、および、(3)前記レポーター遺伝子の発現を検出する手段を含む、タンパク質の、真核生物の核質以外の細胞内特定領域に局在化する活性を検出するシステム。【００４１】
(1)テトラサイクリンオペレーターの制御下にレポーター遺伝子を発現する酵母、(2)テトラサイクリンリプレッサーと、可視化可能タンパク質と、対象タンパク質との融合タンパク質を発現するDNA構築物、(3)前記レポーター遺伝子の発現を検出する手段、(4)DNA構築物から発現される前記融合タンパク質が局在する細胞内特定領域を、可視化可能タンパク質の検出により同定する手段、および、(5)前記融合タンパク質の細胞内特定領域への局在が認められた酵母から前記DNA構築物を回収する手段を含む、タンパク質の、真核生物の細胞内特定領域に局在化する活性を検出するシステム。【００４２】
(1)の酵母、および、(2)のDNA構築物は、方法に関して説明したとおりである。【００４３】
レポーター遺伝子の発現を検出する手段は、レポーター遺伝子の検出に関して知られている手段が、レポーター遺伝子の種類に応じて適宜選択される。例えば、レポーター遺伝子がHIS3遺伝子の場合、ヒスチジンを欠いた培地が挙げられる。【００４４】
細胞内特定領域の同定手段は、可視化可能タンパク質の検出に関して知られている手段が、可視化可能タンパク質の種類に応じて適宜選択される。例えば、可視化可能タンパク質がGFPの場合、蛍光顕微鏡が挙げられる。【００４５】
DNA構築物を構築する手段は、酵母からのDNA構築物の回収に関して知られている手段が適宜選択される。例えば、DNA回収キットとして入手可能な手段が挙げられる。【００４６】
以下、本発明を実施するための形態についてさらに説明する。【００４７】
TetR発現に関するDNA構築物の数例を、図１〜図３に模式的に示す。これらは出芽酵母と大腸菌で選択可能なクローニングベクターpGAD424（BD Biosciences社、Genbank accession no. U07647）を基にして構築されたプラスミドである。これらの例では、pGAD424プラスミドに存在する２箇所のHindIII制限酵素部位の間に、プロモーター（１）からターミネーター（４）までのDNA断片を挿入した形になっている。したがって酵母での選択マーカーであるLEU2（７）、大腸菌での選択マーカーampr（９）、酵母におけるプラスミド複製制御領域2μ ori（１０）、大腸菌におけるプラスミド複製制御領域ColE1 ori（８）は、pGAD424に元々存在するものを利用している。なお、基となるベクターは、酵母と大腸菌でクローニングが可能なシャトルベクターであれば、pGAD424ベクターに限定されない。【００４８】
これらのプラスミドは、いずれも大腸菌のTetRを酵母内で発現するようにデザインされたものである。TetR遺伝子（２）（Genbank accession no. AJ307714）の発現のためのプロモーターとして、出芽酵母のelongation factor 1-α（Tef1）遺伝子プロモーター（１）（Genbank accession no. M10992）の翻訳開始点から上流480 bpを、ターミネーターとしてpGAD424ベクター由来のalcohol dehydrogenase（adh1）遺伝子ターミネーター（４）を用いている。なお、プロモーターおよびターミネーターは、酵母で機能するものであれば上記のものに限定されない。【００４９】
図１は、本発明の最も基本的なDNA構築物（pTet-a）を模式的に示したものである。TetR遺伝子は、終止コドンが取り除かれ、その3’末端にSpeI、BamHIおよびSacI制限酵素部位を含むクローニング部位（MCS）（３）が挿入されている。BamHI制限部位とSacI制限部位の間には、３つの読み枠に対応した終止コドンが配置されている。【００５０】
TetRは、分子量が約23KDaと小さいために、拡散によって核膜孔から核内に移行して、自身の結合DNA配列であるTetOPに結合することができる。したがって、本プラスミドを用いてスクリーニングに適用できるライブラリーとしては、分子量の小さなペプチドをコードするDNAライブラリーに限定される。これは、大きなサイズのタンパク質をコードするcDNAを挿入する場合、発現されるTetR融合タンパク質は、拡散による核内への侵入が阻害されるためである。【００５１】
なお、図２および図３に示すように核移行シグナルを付加することにより、cDNAライブラリーを挿入してスクリーニングに用いることができる。【００５２】
タンパク質のN末に位置することで機能するシグナル配列、およびシグナル配列を含むタンパク質をスクリーニングする場合には、図１の場合、クローニング部位３をPtef1プロモーター（１）とTetR遺伝子（２）の間に移し、DNAライブラリーを挿入してスクリーニングに用いることができる。【００５３】
図２は、図１に示したTetR遺伝子２の3'末端に、緑色蛍光タンパク質（GFP）cDNA（６）を挿入し、TetR-GFP融合タンパク質が酵母内で発現するようにデザインされたプラスミド（pTetGFP-a）の模式図である。本プラスミドの構築に用いられたGFP cDNAは、オワンクラゲ（Aequorea victoria）由来のGFP（Genbank accession no. M62653）を改変したsGFP（Chiu W., Niwa Y., Zeng W., Hirano T., Kobayashi H., Sheen J. Engineered GFP as a vital reporter in plants. Curr. Biol. 1996 Mar 1;6(3):325-330.）であり、さらに終始コドンを取り除いている。GFP cDNAの3’末端には、SpeI、BamHIおよびSacI制限部位を含むクローニング部位（３）が挿入されている。BamHI制限部位とSacI制限部位の間には、３つの読み枠に対応した終始コドンが配置されている。なお、GFPに相当するものとして蛍光や発光によってタンパク質の動態を観察できる可視化可能タンパク質であれば、上記のものに限定されない。【００５４】
TetR遺伝子（２）とGFP cDNA（６）の間には、核移行シグナル（５）をコードするDNA断片が挿入されている。このため、TetR-NLS-GFP融合タンパク質は、核内へ能動的に移行される。核移行シグナルに用いる配列としては、SV40ラージT抗原由来の核移行シグナル配列（PKKKRKV(配列番号５１)）を用いることができるが、核移行を誘導できるペプチドおよびタンパク質であればどのようなものであっても構わない。【００５５】
GFPを可視化可能タンパク質としてTetRに付加することにより、本来核に局在化されるTetR-NLS-GFP融合タンパク質に、新たなタンパク質が融合されることによって、どのように酵母での細胞内局在性が変化するかを確認しながらスクリーニング操作を進めることができる。【００５６】
図２に示すプラスミドでは、TetR-GFP融合タンパク質のＣ末端に、ライブラリーからのタンパク質を融合して発現するように構築されている。なお、クローニング部位（３）をPtef1プロモーター（１）とTetR遺伝子（２）の間に移し、DNAライブラリーを挿入して用いることで、タンパク質のN末に位置することで機能するシグナル配列およびシグナル配列を含むタンパク質のスクリーニングに適用できる。【００５７】
これらのプラスミドに挿入するライブラリー由来のDNAの中で、酵母細胞内でのタンパク質発現レベルが極端に低下する配列がある場合、融合タンパク質として発現されるTetRの発現レベルも低下することになる。このことは、TetRによるレポーター遺伝子の抑制状態がTetR融合タンパク質の核質以外の細胞内特定領域への移行に非依存的に解除されることにつながり、スクリーニングの際のバックグランドの上昇につながる。【００５８】
これを解決するために、プラスミドpTetGF-aのLEU2マーカー遺伝子を、TetR-GFP-LEU2融合タンパク質の形で発現するよう改変したものがpTetGF-cで、その模式図を図３に示す。PCRを用いて調製したLEU2のタンパク質コード領域７が、予めEcoRVとPvuII制限酵素処理によって、LEU2マーカー遺伝子が除去されたpTetGF-aプラスミドの、GFPコード領域（６）の3’末端に挿入されている。挿入したLEU2コード領域（７）に終止コドンは含まれず、その3’末端には前記プラスミドと同じクローニング部位（３）が設けられている。なお、GFPコード領域の下流に融合されるマーカー遺伝子は、酵母で選択可能なマーカー遺伝子由来のものであればLEU2に限定されない。【００５９】
前記プラスミドと同じく、クローニング部位（３）をPtef1プロモーター（１）とTetR遺伝子（２）の間に移し、DNAライブラリーを挿入して用いることで、タンパク質のN末に位置することで機能するシグナル配列、およびシグナル配列を含むタンパク質のスクリーニングに適用できる。【００６０】
次にレポーター遺伝子の１例の構成について説明する。基となるベクターとしてpGBT9（BD Biosciences社、Genbank accession no. U07646）を用い、AatII制限部位とSphI制限部位に挟まれたDNA断片を出芽酵母のHIS3遺伝子（Genbank accession no. X03245）と交換している。このプラスミドでは、酵母での複製領域である2μ oriが取り除かれているので、このベクターを酵母染色体挿入プラスミドとして用いる。HIS3遺伝子は、転写開始点から上流-292までのプロモーター領域、タンパク質コーディング領域および翻訳終止コドンから下流201 bpまでのターミネーター領域からなる。HIS3プロモーターには、-22および-53の位置の２カ所にTetOP配列（5’-ACTCTATCATTGATAGAGT-3’(配列番号６０)）がTATAボックスを挟む形で挿入されている。【００６１】
このプラスミドのpGBT9由来Trp1選択マーカーを指標にして、常法に従ってレポーター遺伝子が染色体に組み込まれた組み換え体酵母を得る。なお、基となるベクターおよびレポーター遺伝子となるマーカー遺伝子は、酵母で機能するものであれば、上述のものに限定されない。【００６２】
以上のことから、本実施の形態によれば、図４に示されるように、cDNAおよびペプチドをコードするDNAが挿入されたプラスミドライブラリーを、酵母に導入することで、TetR融合タンパク質（１１）が発現される。TetR融合タンパク質は、核（１４）内へ拡散によって移行するか、またはベクターにコードされる核移行シグナルの働きにより、核（１４）内へ能動的に輸送される。【００６３】
プラスミドを導入する宿主の酵母細胞は、レポーターおよびプラスミド選択マーカー遺伝子として用いられる栄養要求性に関する遺伝子に変異を持ち、レポーターおよびプラスミド選択マーカー遺伝子の働きがなければ最少培地で生育不可能な株を用いる。さらに、用いる酵母株には、プロモーター領域にTetOP（１２）が挿入されているHIS3レポーター遺伝子（１３）が、染色体上に組み込まれた状態にある。【００６４】
このような株では、TetR融合タンパク質（１１）がTetOP（１２）に強く結合し、HIS3レポーター遺伝子（１３）の発現を抑制するため、ヒスチジンを欠いた酵母最少培地では生育できない。ここで、TetRに融合されたタンパク質およびペプチドに、核質以外の領域への移行、つまり細胞内特定領域への移行を促す配列が含まれているとき、核質内に存在するTetR融合タンパク質の量は減少する。それに伴って、TetOPに結合できるTetR融合タンパク質の量も減少するため、HIS3レポーター遺伝子の発現が誘導される。したがって、このようなクローンを持った酵母細胞は、ヒスチジンを欠いた最少培地上でコロニーを形成することができる。【００６５】
また、TetRはテトラサイクリンと結合することによって、TetOPへの結合親和性が減少するため、培地中にテトラサイクリンおよびその類似化合物を適量加えることにより、レポーター遺伝子の抑制レベルを調節することができる。この操作によって、スクリーニングの選択圧を柔軟に調整することができる。【００６６】
以上の効果により、タンパク質およびペプチドライブラリーから、細胞内特定領域に局在化するタンパク質を検出およびスクリーニングすることができる。【００６７】
本発明は上述の実施の形態に限らず本発明の要旨を逸脱することなくその他種々の構成を採り得ることはもちろんである。【００６８】
以下、具体的に本発明の実施例を記述するが、下記の実施例は本発明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものでない。
【実施例１】
【００６９】
（１）ベクターの作製
出芽酵母と大腸菌で選択可能なクローニングベクターpGAD424（BD Biosciences社、Genbank accession no. U07647）を基にして、大腸菌のTetRを酵母内で発現するようにデザインしたプラスミドpTetGFP-aを構築した。プラスミドpTetGFP-aの構造を図２に示す。【００７０】
制限酵素HindIIIで切断後、脱リン酸化したpGAD424ベクターに、出芽酵母のelongation factor 1-α（TEF1）遺伝子プロモーター（１）（Genbank accession no. M10992）の翻訳開始点から上流480 bpを含むDNA断片を挿入した。このプロモーター断片Ptef1（１）は、特異的プライマー（5'-GAGAGGAGAA AAGCTTTTCGAGGACCGCGAATCCTTAC-3’ (配列番号４７)、 5'-GAGAGGAGAA AAGCTTGAGCTCGGTACCCTCGAGTTTGTAATTAAAACTTAGATTAGATTGCTATGC-3’ (配列番号４８)）を用い、出芽酵母染色体DNAを鋳型として行ったPCRにより得られたDNA断片を、制限酵素HindIIIで切断したものである。得られたプラスミドを、制限酵素XhoIとSacIで切断し、TetR遺伝子（２）（Genbank accession no. AJ307714）を挿入した。TetR遺伝子（２）DNA断片は、特異的プライマー（5'-GAGAGGAGAACTCGAGGCCATGGGTTCTAGATTAGATAAAAGTAAA GTG-3’ (配列番号４９)、5'-GAGAGGAGAAGAGCTCTTAGGATCCACTAGTTCTAGAAGACCC ACTTTCACATTTAAG-3’ (配列番号５０)）を用い、TetR遺伝子を含んだ大腸菌ゲノムDNAを鋳型として行ったPCRにより得られたDNA断片を、制限酵素XhoIとSacIで切断したものである。得られたプラスミドを、制限酵素SpeIとSacIで切断し、SV40ラージT抗原由来の核移行シグナル配列（PKKKRKV(配列番号５１)）（５）をコードするDNA断片が5’末端に付加されたGFP cDNA（６）を挿入した。挿入したGFP cDNA（６）は、オワンクラゲ（Aequorea victoria）由来のGFP（Genbank accession no. M62653）を改変したsGFP（Chiu W., Niwa Y., Zeng W., Hirano T., Kobayashi H., Sheen J. Engineered GFP as a vital reporter in plants. Curr. Biol. 1996 Mar 1;6(3):325-330.）をコードするものであり、特異的プライマー（A: 5'-GGAGAGTGCTGCTAGCGCTCCAAAGAAGAAGAGAAAGGTGTCCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3’ (配列番号５２)、B: 5'-GGAGAGTGCTGAGCTCAACTATTCACTCGAGAGATCTGGATCCACTAGTTCTAGACCCGGGCTGCAGGAATTCCTTGTACAGCTCGTCCATG-3’ (配列番号５３)）を用い、sGFP cDNAを鋳型として行ったPCRにより得られたDNA断片を、制限酵素NheIとSacIで切断したものである。プライマーAには、sGFPのN末をコードする配列と、その5’末端に核移行シグナル配列をコードするDNA配列が含まれている。また、プライマーBには、終止コドンが取り除かれたsGFPのC末をコードする配列と、その5’末端にSpeI、BamHIおよびSacI制限酵素部位が含まれている。PCRにより調製された、全てのDNA断片の塩基配列は、シークエンシングにより確認されている。【００７１】
以上の工程を経て構築されたプラスミドpTetGFP-aは、pGAD424プラスミドに存在する２箇所のHindIII制限酵素部位の間に、Ptef1プロモーター（１）、TetR遺伝子（２）、核移行シグナル配列（５）、GFP cDNA（６）、SpeIおよびBamHI制限酵素部位を含むクローニング部位（３）が順に配置されている。また、クローニング部位の下流には、pGAD424ベクター由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（adh1）遺伝子ターミネーター（４）が配置されている。酵母での選択マーカーであるLEU2（７）、大腸菌での選択マーカーampr（９）、酵母におけるプラスミド複製制御領域2μ ori（１０）、大腸菌におけるプラスミド複製制御領域ColE1 ori（８）は、pGAD424に元々存在するものである。【００７２】
（２）ライブラリープラスミドの作製
上記で作製したpTetGFP-aプラスミドに、ペプチドをコードする合成DNAを挿入したライブラリーを作製した。【００７３】
用いた合成DNAは任意の塩基を含む２つのタイプの配列から構成された。１つは、３６の連続した任意塩基を含む12Xで、１２のランダムなアミノ酸配列を持つペプチドを、酵母内で発現するように意図されたタイプのものである。このランダムペプチド配列の中に、細胞内特定領域への移行を促す配列が含まれるとき、本スクリーニングシステムによって、それらの配列をクローニングできることが期待された。【００７４】
もう１つのタイプは、核外移行シグナルの既知コンセンサス配列｛L X X X (L/I/F/M/V) X X L X (L/I)；Xは任意アミノ酸を示す。(配列番号５４)｝をコードするNESXで、その塩基配列は、5’-CTC NNN NNN NNN NT(G/C) NNN NNN CTC NNN (A/C)TC-3’ (配列番号５５)であった。核外移行シグナルの働きで、TetR-GFP融合タンパク質が核から細胞質へ排出され、本スクリーニングシステムによって真に核外移行活性を持った配列を抽出できることが期待された。【００７５】
これらの配列の5’末端側には、XbaI制限酵素部位を含む配列5’-AGAGCCATCTAGAAACTTTGAGAAGGAGAATACCATG-3’ (配列番号５６)が付加され、3’末端側には、BamHI制限酵素部位およびFLAGタグ（DYKDDDDK(配列番号５７)）をコードする配列5’- GACTACAAGGACGATGACGACAAGGGATCCGGTCAAA-3’ (配列番号５８)が付加された。ベクターに挿入するライブラリーDNAを調製するために、5’末端側配列を含んだプライマーおよび3’末端側配列のプライマー（5’-TTTGACCGGATCCCTTGTCGTCATC-3’ (配列番号５９)）を用い、12XまたはNESX合成オリゴヌクレオチドを鋳型として、PCRを行った。増幅されたDNA断片をXbaIとBamHIで消化後、精製を行い、pTetGFP-aベクターのSpeI-BamHI部位に挿入した。【００７６】
（３）HIS3レポーター遺伝子を組み込んだ酵母株の作製
HIS3遺伝子プロモーター領域にTetOP配列を組み入れたDNA構築物の作製は、以下のように行った。pGBT9（BD Biosciences社、Genbank accession no. U07646）の、AatII制限部位とSphI制限部位に挟まれたDNA断片を出芽酵母のHIS3遺伝子（Genbank accession no. X03245）と交換した。HIS3遺伝子は、転写開始点から上流-292までのプロモーター領域、タンパク質コーディング領域および翻訳終止コドンから下流201 bpまでのターミネーター領域からなるものとしたが、HIS3プロモーターには、-22および-53の位置の２カ所にTetOP配列（5’-ACTCTATCATTGATAGAGT-3’ (配列番号６０)）がTATAボックスを挟む形で挿入した。このプラスミドでは、酵母での複製領域である2μ oriが取り除かれている。このDNA構築物を酵母染色体挿入プラスミドとして用いた。【００７７】
得られたプラスミドを、PvuIIで切断後、出芽酵母SFY526（BD Biosciences社）に導入し、HIS3レポーター遺伝子組み換え酵母株を得た。この酵母株はヒスチジンを欠いたSD基本培地で生育したが、pTetGF-aプラスミドを導入することによって、ヒスチジンを欠いたSD基本培地で生育できなくなることが確認された。【００７８】
（４）ライブラリーのスクリーニング操作
HIS3レポーター遺伝子を組み込んだ酵母株を、100 mlのYPD液体培地を用いてOD600が約1.0になるまで培養し、ライブラリープラスミド30 μgを用いて、酢酸リチウム法によって酵母を形質転換した。プラスミドを導入した酵母細胞を、ロイシンとヒスチジンを欠いたSD寒天培地を用いて、30℃で５日間培養した。生じたコロニーをまとめて回収し、抽出したプラスミドを大腸菌に形質転換した。この大腸菌からプラスミドを調製し、シークエンス解析を行うとともに、酵母（出芽酵母SFY526）に再導入し、TetR-GFP融合タンパク質の細胞内局在性について、GFP蛍光観察による確認を行った。また、スクリーニング前のライブラリープラスミドについても、同様に、酵母に再導入してGFP蛍光観察を行った。【００７９】
このスクリーニング操作によって得られた結果は以下の通りであった。プラスミド1 μg当たりの酵母形質転換率は、2x104〜5x104であった。一次スクリーニングの結果、ヒスチジンを欠いたSD基本培地上に出現したコロニーの総数は、12Xペプチドライブラリーで800〜1000個、NESXライブラリーで1.0x104〜1.5x104個のコロニーが形成された。【００８０】
スクリーニング前のNESXライブラリーを導入した酵母について、GFPの蛍光観察を行ったところ、半分以上の細胞でTetR-GFP融合タンパク質が核に局在していた。このことは、このライブラリー中には核外移行活性を示さない多くの配列が含まれていることを示している。NESXライブラリーにおいて、このように多くの核外移行活性を含まないクローンが存在するのは、NESXライブラリーDNA中に生じる終止コドンによる影響と、既知の核外移行シグナルのコンセンサス配列が完全なものではないという理由による。【００８１】
一方、スクリーニング後のNESXライブラリーを導入した酵母では、ほとんどの細胞においてTetR-GFP融合タンパク質の蛍光が細胞質または細胞全体に広がっていた。このことは、スクリーニングによってライブラリーから選択されたほとんどのプラスミドは、核外移行活性のある配列を含んでいることを示すとともに、本スクリーニングシステムが有効に機能していることを示す。【００８２】
NESXライブラリーからのスクリーニングによって選抜された、３０個のプラスミドクローンについてシークエンスを行い、それらの配列から翻訳されるペプチド配列を図５に示した。これらの配列は、すべて核外移行活性を持つことが、各々のプラスミドを酵母に再導入して観察された、GFPの細胞内局在性によって確認された。【００８３】
さらに、12Xライブラリーからのスクリーニングによって選抜された、１７個のプラスミドクローンについてシークエンスを行い、各配列から翻訳されるペプチド配列を図６に示した。これらのプラスミドクローンを酵母に再導入し、GFPの細胞内局在性を観察した結果を、各配列の右に示した。多くのクローンが核小体への移行を示し、そのうちの４クローンは核内に顆粒状または繊維状に不均一な分布を示した。また、１クローンが未特定の細胞内小顆粒への移行を示し、４クローンについてはGFPの蛍光を確認できなかった。【００８４】
この実施例は、本発明によるスクリーニングシステムを用いることによって、多くのタイプの細胞内移行シグナルおよび移行タンパク質をスクリーニングおよび同定できることを示すものである。
【産業上の利用の可能性】
【００８５】
本発明によれば、細胞内特定領域に局在化するタンパク質を検出でき、また、タンパク質ライブラリーからスクリーニングできる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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