(57)【要約】 ペプチドの非競合的な検出または定量方法、そのためのキット、および該方法に使用するＶＨポリペプチドまたはＶＬポリペプチドを提供するものである。測定すべきペプチドに特異的に結合し、かつ該ペプチドのアミノ酸配列の連続する配列をエピトープとするモノクローナル抗体の重鎖可変領域を含んでかつ軽鎖可変領域を含まないポリペプチド（ＶＨポリペプチド）と、前記モノクローナル抗体の軽鎖可変領域を含んでかつ重鎖可変領域を含まないポリペプチド（ＶＬポリペプチド）を用い、ＶＨポリペプチドまたはＶＬポリペプチドのいずれか一方を固相に固定化して固定化ポリペプチドとし、他方を標識物質で標識して標識化ポリペプチドとし、測定すべきペプチドを含有する検体および標識化ポリペプチドを固定化ポリペプチドと接触させ、固相に結合した標識物質を検出または定量する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定すべきペプチドに特異的に結合し、かつ該ペプチドのアミノ酸配列の連続する配列をエピトープとするモノクローナル抗体の重鎖可変領域を含んでかつ軽鎖可変領域を含まないポリペプチド（ＶＨポリペプチド）と、前記モノクローナル抗体の軽鎖可変領域を含んでかつ重鎖可変領域を含まないポリペプチド（ＶＬポリペプチド）を用いることを特徴とする測定すべきペプチドの非競合的な検出または定量方法。
【請求項２】
ＶＨポリペプチドまたはＶＬポリペプチドのいずれか一方を固相に固定化して固定化ポリペプチドとし、他方を標識物質で標識して標識化ポリペプチドとし、測定すべきペプチドを含有する検体および標識化ポリペプチドを固定化ポリペプチドと接触させ、固定化ポリペプチド、測定すべきペプチドおよび標識化ポリペプチドからなる複合体を形成せしめ、固相に結合した該複合体の標識物質を検出または定量することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＶＨポリペプチドまたはＶＬポリペプチドのいずれか一方を標識物質で標識して標識化ポリペプチドとし、他方のポリペプチドおよび標識化ポリペプチドを、固相の存在下で測定すべきペプチドを含有する検体に接触させ、固相、他方のポリペプチド、測定すべきペプチドおよび標識化ポリペプチドからなる複合体を形成せしめ、固相に結合した該複合体の標識物質を検出または定量することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
標識物質が繊維状ファージ、酵素、蛍光物質またはビオチンである請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
ＶＨポリペプチドまたはＶＬポリペプチドが、ＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドと免疫学的に区別されるペプチド（タグペプチド）が付加したポリペプチドであって、ＶＨポリペプチドまたはＶＬポリペプチドの固相への固定化が、ＶＨポリペプチドまたはＶＬペプチドに付加した該タグペプチドと該タグペプチドに特異的に結合する固相に固定化した抗体との結合を介した固定化である請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
固相に固定化するＶＨポリペプチドまたはＶＬポリペプチドが、マルトース結合蛋白質が付加したポリペプチドである請求項２に記載の方法。
【請求項７】
ＶＨポリペプチドを標識物質１で標識して標識化ＶＨポリペプチドとし、ＶＬポリペプチドを異なる標識物質２で標識して標識化ＶＬポリペプチドとし、測定すべきペプチドを含有する検体を標識化ＶＨポリペプチドおよび標識化ＶＬポリペプチドへ接触させ、標識物質１と標識物質２の相互作用の変化量を検出することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドが遺伝子組換え産物である請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
測定すべきペプチドに特異的に結合し、かつ該ペプチドのアミノ酸配列の連続する配列をエピトープとするモノクローナル抗体が、該ペプチドのアミノ酸配列の連続する６以上１９以下のアミノ酸の配列からなるペプチドを抗原として動物を免疫することにより得られるモノクローナル抗体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
モノクローナル抗体が、配列番号３のアミノ酸配列の連続する６以上１９以下のアミノ酸の配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
モノクローナル抗体が、配列番号１または２のアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体である請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
測定すべきペプチドが、ヒトオステオカルシンである請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
測定すべきペプチドが、配列番号１または２のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトオステオカルシンであって、モノクローナル抗体が、配列番号１または２のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として動物を免疫することにより得られるモノクローナル抗体である請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
測定すべきペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトオステオカルシンであって、モノクローナル抗体が、以下の（１）〜（３）のいずれかのモノクローナル抗体である請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
（１）重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２および３が、それぞれ配列番号８、９および１０のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
（２）軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３が、それぞれ配列番号１１、１２および１３のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
（３）重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３が、それぞれ配列番号８、９および１０のアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３が、それぞれ配列番号１１、１２および１３のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
【請求項１５】
モノクローナル抗体が、以下の（１）〜（３）のいずれかのモノクローナル抗体である請求項１４に記載の方法。
（１）配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有するモノクローナル抗体
（２）配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体
（３）配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体
【請求項１６】
測定すべきペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトオステオカルシンであって、ＶＨポリペプチドが、配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドである請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
測定すべきペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトオステオカルシンであって、ＶＬポリペプチドが、配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドである請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
測定すべきペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトオステオカルシンであって、ＶＨポリペプチドが、配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、かつＶＬポリペプチドが、配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドである請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
配列番号５または７のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項２０】
配列番号５または７のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項２１】
配列番号４または６の塩基配列を含む請求項２０に記載のＤＮＡ。
【請求項２２】
請求項２０または２１に記載のＤＮＡをベクターに挿入して得られる組換えベクター。
【請求項２３】
請求項２２に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
【請求項２４】
請求項２３に記載の形質転換体を培養液中に培養して、配列番号５または７のアミノ酸配列を含むポリペプチドを生成・蓄積させ、培養液から該ポリペプチドを採取することを特徴とする、ポリペプチドの製造方法。
【請求項２５】
測定すべきペプチドに特異的に結合し、かつ該ペプチドのアミノ酸配列の連続する配列をエピトープとするモノクローナル抗体の重鎖可変領域を含んでかつ軽鎖可変領域を含まないポリペプチド（ＶＨポリペプチド）と、該モノクローナル抗体の軽鎖可変領域を含んでかつ重鎖可変領域を含まないポリペプチド（ＶＬポリペプチド）とを含有することを特徴とする測定すべきペプチドの非競合的な検出または定量用の試薬。
【請求項２６】
ＶＨポリペプチドまたはＶＬポリペプチドのいずれか一方が、標識物質で標識された標識化ポリペプチドであり、他方が固相に固定化された固定化ポリペプチドである請求項２５に記載の試薬。
【請求項２７】
固定化ポリペプチドがタグペプチドを付加したポリペプチドであって、固定化ポリペプチドの固相への固相化が、該タグペプチドと該タグペプチドに特異的に結合する固相に固定化した抗体との結合を介した固定化である請求項２６に記載の試薬。
【請求項２８】
固定化ポリペプチドが、マルトース結合蛋白質が付加したポリペプチドである請求項２６に記載の試薬。
【請求項２９】
ＶＨポリペプチドまたはＶＬポリペプチドのいずれか一方が、標識物質で標識された標識化ポリペプチドであり、他方がタグペプチドを付加したポリペプチドであり、さらに該タグペプチドに特異的に結合する固相に固定化した抗体を含有する請求項２６に記載の試薬。
【請求項３０】
標識物質が繊維状ファージ、酵素、蛍光物質またはビオチンである請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項３１】
ＶＨポリペプチドが標識物質１で標識された標識化ＶＨポリペプチドであり、ＶＬポリペプチドが異なる標識物質２で標識された標識化ＶＬポリペプチドであることを特徴とする請求項２５に記載の試薬。
【請求項３２】
ＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドが遺伝子組換え産物である請求項２５〜３１のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項３３】
測定すべきペプチドに特異的に結合し、かつ該ペプチドのアミノ酸配列の連続する配列をエピトープとするモノクローナル抗体が、該ペプチドのアミノ酸配列の連続する６以上１９以下のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として動物を免疫することにより得られるモノクローナル抗体である、請求項２５〜３２のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項３４】
モノクローナル抗体が、配列番号３のアミノ酸配列の連続する６以上１９以下のアミノ酸の配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体である、請求項２５〜３３のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項３５】
モノクローナル抗体が、配列番号１または２のアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体である請求項２５〜３３のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項３６】
測定すべきペプチドが、ヒトオステオカルシンである請求項２５〜３３のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項３７】
測定すべきペプチドが、配列番号１または２のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトオステオカルシンであって、モノクローナル抗体が、配列番号１または２のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として動物を免疫することにより得られるモノクローナル抗体である請求項２５〜３３のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項３８】
測定すべきペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトオステオカルシンであって、モノクローナル抗体が、以下の（１）〜（３）のいずれかのモノクローナル抗体である請求項２５〜３３のいずれか１項に記載の試薬。
（１）重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２および３が、それぞれ配列番号８、９および１０のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
（２）軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３が、それぞれ配列番号１１、１２および１３のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
（３）重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３が、それぞれ配列番号８、９および１０のアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３が、それぞれ配列番号１１、１２および１３のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
【請求項３９】
モノクローナル抗体が、以下の（１）〜（３）のいずれかのモノクローナル抗体である請求項３８に記載の試薬。
（１）配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有するモノクローナル抗体
（２）配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体
（３）配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体
【請求項４０】
測定すべきペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトオステオカルシンであって、ＶＨポリペプチドが、配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドである請求項２５〜３３のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項４１】
測定すべきペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトオステオカルシンであって、ＶＬポリペプチドが、配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドである請求項２５〜３３のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項４２】
測定すべきペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトオステオカルシンであって、ＶＨポリペプチドが、配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、かつＶＬポリペプチドが、配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドである請求項２５〜３３のいずれか１項に記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドの非競合的な検出および定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の免疫測定法を改良し、簡便かつ迅速な測定方法として、単一のモノクローナル抗体の重鎖可変領域（本発明ではこれをＶＨ領域と呼ぶ）、軽鎖可変領域（本発明ではこれをＶＬ領域と呼ぶ）をそれぞれ別のポリペプチド（本発明ではこれらをそれぞれＶＨポリペプチド、ＶＬポリペプチドと呼ぶ）として発現し、両分子を利用したオープンサンドイッチ法が考案されている。オープンサンドイッチ法としては、ニワトリ卵白リゾチーム（以下、ＨＥＬと省略する）に対するモノクローナル抗体ＨｙＨＥＬ−１０由来のＶＨポリペプチド、ＶＬポリペプチドを利用した２種の測定方法が開示されている。１つは、ＶＬポリペプチドを固相へ固定化し、ＶＨポリペプチドを酵素または蛍光物質などで標識し、サンドイッチ法によって抗原を捕捉、定量する方法であり、他の１種類は、ＶＨポリペプチド、ＶＬポリペプチドを蛍光波長と励起波長の異なる２種の蛍光物質で標識し、抗原補足によって起きる蛍光共鳴エネルギー移動を検出、定量する方法である（特開平１０−７８４３６号公報参照）。２種類の測定方法のうち、前者はオープンサンドイッチＥＬＩＳＡ（Enzyme-linked immunosorbent assay）法と呼ばれている。オープンサンドイッチＥＬＩＳＡ法は抗体と抗原の反応が１回で済むので測定操作が従来法に比べて簡便かつ迅速となるメリットを有する（「ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Journal of immunological methods）」、（オランダ）、１９９９年、第２２４巻、ｐ．１７１−１８４参照）。また、後者はホモジニアスオープンサンドイッチ法と呼ばれている。
ホモジニアスオープンサンドイッチ法は、Ｂ／Ｆ分離（抗原と結合した抗体と、同一液相中の抗原に結合していない抗体とを分離すること）を行わないため、洗浄操作が不要となり、測定時間が短縮される、自動測定装置の簡素化などのメリットを有する（「アナリティカル・ケミストリー（Analytical Chemistry）」、（米国）、２００２年、第７４巻、第１１号、ｐ．２５００−２５０４参照）。【０００３】
上記のようにオープンサンドイッチ法は従来の免疫測定法と比べて優れた測定方法であるが、ペプチド性分子に対する測定例は、ＨｙＨＥＬ−１０のみしか知られていない。すなわち、ＨＥＬ以外のペプチド性分子の抗原をオープンサンドイッチ法で測定できることを示す測定例はなく、実際に測定できるかどうかは不明であった。【０００４】
ＨｙＨＥＬ−１０とＨＥＬとの複合体のＸ線結晶構造解析の結果から、ＨｙＨＥＬ−１０とＨＥＬの特異的結合に関与するＨＥＬ内のアミノ酸は、１５番目のヒスチジン、１６番目のグリシン、１９番目のアスパラギン、２０番目のチロシン、２１番目のアルギニン、６３番目のトリプトファン、７３番目のアルギニン、７５番目のロイシン、８９番目のスレオニン、９３番目のアスパラギン、９６番目のリジン、９７番目のリジン、１００番目のセリン、１０１番目のアスパラギン酸、１０２番目のグリシン、１０３番目のアスパラギンであると報告されている（「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）」、（米国）、１９９９年、第２７４巻、第３９号、ｐ．２７６２３−２７６３１参照）。このことから、ＨｙＨＥＬ−１０はＨＥＬの連続するアミノ酸配列をエピトープとするのではなく、ＨＥＬの３次構造を認識しているといえる。したがって、ある抗原ペプチドの連続するアミノ酸の配列をエピトープとするモノクローナル抗体由来のＶＨポリペプチド、ＶＬポリペプチドを利用したオープンサンドイッチ法で前記抗原ペプチドを測定できることを示す測定例はなく、実際に測定できるかどうかは不明であった。【０００５】
低分子化合物のように分子量的に抗原を２つの抗体で同時にサンドイッチできない場合には、通常のサンドイッチＥＬＩＳＡ法での測定はできないため、競合阻害法による測定が行われていたが、オープンサンドイッチ法は１種類の抗体のＶＨポリペプチドとＶＬポリペプチドで同時にサンドイッチできるため、非競合的に測定することが可能である。低分子化合物４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニル酢酸に対してオープンサンドイッチＥＬＩＳＡ法による測定が可能で、しかも競合法よりも感度がよいことが報告されている（「ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Journal of immunological methods）」、（オランダ）、１９９９年、第２２４巻、ｐ．１７１−１８４参照）。【０００６】
ペプチドに対するモノクローナル抗体を製造しようとするとき、ペプチドエピトープは最低６から１０数個のアミノ酸残基が必要であると一般に知られている。異なるエピトープを認識する２種類以上の抗体を作製するのに、最低必要なペプチドの長さとしては２０個以上のアミノ残基が必要であると考えられる。したがって、アミノ残基数が１９個以下のペプチドの測定も通常は競合法で行われていた。オープンサンドイッチ法が、このようなアミノ残基数が１９個以下のペプチドの測定に用いることができるかどうかは、測定例がなく不明であった。【０００７】
他方、オステオカルシンは、ボ−ン・グラ・プロテイン（bone Gla protein、BGP）またはビタミンＫ依存性カルシウム結合蛋白質とも称され、骨芽細胞によって生合成される４９〜５０個のアミノ酸からなる非コラ−ゲン性蛋白質（分子量約６，０００；ヒトおよびウシは４９個、ラットは５０個のアミノ酸からそれぞれ構成される）であり、骨の蛋白質中に１〜２％程度存在する。オステオカルシンの分子中には、３つのγ−カルボキシグルタミン酸残基（Ｇｌａ残基；Ｎ末端から数えて１７位、２１位および２４位に存在する）と１つのＳ−Ｓ結合が存在し、この３つのＧｌａ残基がハイドロキシアパタイトとの結合に重要な役割を演じているものと考えられている。オステオカルシンは、骨形成の指標となるマーカーペプチドであり、骨粗鬆症や癌の骨転移等の診断にも用いられる。【０００８】
検体中のオステオカルシンを測定する方法としては、ヒトオステオカルシンのＣ末端部（３７位〜４９位）に対する抗体を用いる方法（「ボーン（Bone）」、（米国）、１９８５年、第６巻、第１号、ｐ．９−１３参照）、ウシとヒトのオステオカルシンの共通アミノ酸配列を利用し、２種類の抗ウシオステオカルシンモノクロ−ナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法（特許２６１３０６７号明細書参照）などが報告されている。しかし、ヒトオステオカルシンのオープンサンドイッチ法はこれまで報告されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、ペプチドの非競合的な検出または定量方法、および該方法に使用するＶＨポリペプチドまたはＶＬポリペプチドを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち本発明は、（１）測定すべきペプチドに特異的に結合し、かつ該ペプチドのアミノ酸配列の連続する配列をエピトープとするモノクローナル抗体の重鎖可変領域を含んでかつ軽鎖可変領域を含まないポリペプチド（ＶＨポリペプチド）と、前記モノクローナル抗体の軽鎖可変領域を含んでかつ重鎖可変領域を含まないポリペプチド（ＶＬポリペプチド）を用いることを特徴とする測定すべきペプチドの非競合的な検出または定量方法や、（２）ＶＨポリペプチドまたはＶＬポリペプチドのいずれか一方を固相に固定化して固定化ポリペプチドとし、他方を標識物質で標識して標識化ポリペプチドとし、測定すべきペプチドを含有する検体および標識化ポリペプチドを固定化ポリペプチドと接触させ、固定化ポリペプチド、測定すべきペプチドおよび標識化ポリペプチドからなる複合体を形成せしめ、固相に結合した該複合体の標識物質を検出または定量することを特徴とする上記（１）に記載の方法や、（３）ＶＨポリペプチドまたはＶＬポリペプチドのいずれか一方を標識物質で標識して標識化ポリペプチドとし、他方のポリペプチドおよび標識化ポリペプチドを、固相の存在下で測定すべきペプチドを含有する検体に接触させ、固相、他方のポリペプチド、測定すべきペプチドおよび標識化ポリペプチドからなる複合体を形成せしめ、固相に結合した該複合体の標識物質を検出または定量することを特徴とする上記（１）に記載の方法や、（４）標識物質が繊維状ファージ、酵素、蛍光物質またはビオチンである上記（２）または（３）に記載の方法や、（５）ＶＨポリペプチドまたはＶＬポリペプチドが、ＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドと免疫学的に区別されるペプチド（タグペプチド）が付加したポリペプチドであって、ＶＨポリペプチドまたはＶＬポリペプチドの固相への固定化が、ＶＨポリペプチドまたはＶＬペプチドに付加した該タグペプチドと該タグペプチドに特異的に結合する固相に固定化した抗体との結合を介した固定化である上記（２）〜（４）のいずれか１項に記載の方法や、（６）固相に固定化するＶＨポリペプチドまたはＶＬポリペプチドが、マルトース結合蛋白質が付加したポリペプチドである上記（２）に記載の方法や、（７）ＶＨポリペプチドを標識物質１で標識して標識化ＶＨポリペプチドとし、ＶＬポリペプチドを異なる標識物質２で標識して標識化ＶＬポリペプチドとし、測定すべきペプチドを含有する検体を標識化ＶＨポリペプチドおよび標識化ＶＬポリペプチドへ接触させ、標識物質１と標識物質２の相互作用の変化量を検出することを特徴とする上記（１）に記載の方法や、（８）ＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドが遺伝子組換え産物である上記（１）〜（７）のいずれか１項に記載の方法や、（９）測定すべきペプチドに特異的に結合し、かつ該ペプチドのアミノ酸配列の連続する配列をエピトープとするモノクローナル抗体が、該ペプチドのアミノ酸配列の連続する６以上１９以下のアミノ酸の配列からなるペプチドを抗原として動物を免疫することにより得られるモノクローナル抗体である、上記(１)〜（８）のいずれか１項に記載の方法ｙ、（１０）モノクローナル抗体が、配列番号３のアミノ酸配列の連続する６以上１９以下のアミノ酸の配列���らなるペプチドに特異的に結合する抗体である、上記（１）〜（９）のいずれか１項に記載の方法や、（１１）モノクローナル抗体が、配列番号１または２のアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体である上記(１)〜（９）のいずれか１項に記載の方法に関する。【００１１】
また本発明は、（１２）測定すべきペプチドが、ヒトオステオカルシンである上記（１）〜（９）のいずれか１項に記載の方法や、（１３）測定すべきペプチドが、配列番号１または２のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトオステオカルシンであって、モノクローナル抗体が、配列番号１または２のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として動物を免疫することにより得られるモノクローナル抗体である上記（１）〜（９）のいずれか１項に記載の方法や、（１４）測定すべきペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトオステオカルシンであって、モノクローナル抗体が、以下の[１]〜[３]のいずれかのモノクローナル抗体である上記（１）〜（９）のいずれか１項に記載の方法
[１]重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２および３が、それぞれ配列番号８、９および１０のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
[２]軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３が、それぞれ配列番号１１、１２および１３のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
[３]重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３が、それぞれ配列番号８、９および１０のアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３が、それぞれ配列番号１１、１２および１３のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
や、（１５）モノクローナル抗体が、以下の[１]〜[３]のいずれかのモノクローナル抗体である上記（１４）に記載の方法
[１]配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有するモノクローナル抗体
[２]配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体
[３]配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体
や、（１６）測定すべきペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトオステオカルシンであって、ＶＨポリペプチドが、配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドである上記（１）〜（９）のいずれか１項に記載の方法や、（１７）測定すべきペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトオステオカルシンであって、ＶＬポリペプチドが、配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドである上記（１）〜（９）のいずれか１項に記載の方法や、（１８）測定すべきペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトオステオカルシンであって、ＶＨポリペプチドが、配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、かつＶＬポリペプチドが、配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドである上記（１）〜（９）のいずれか１項に記載の方法や、（１９）配列番号５または７のアミノ酸配列を含むポリペプチドや、（２０）配列番号５または７のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡや、（２１）配列番号４または６の塩基配列を含む上記（２０）に記載のＤＮＡや、（２２）上記（２０）または(２１)に記載のＤＮＡをベクターに挿入して得られる組換えベクターや、（２３）上記（２２）に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体や、（２４）上記（２３）に記載の形質転換体を培養液中に培養して、配列番号５または７のアミノ酸配列を含むポリペプチドを生成・蓄積させ、培養液から該ポリペプチドを採取することを特徴とする、ポリペプチドの製造方法に関する。【００１２】
さらに本発明は、（２５）測定すべきペプチドに特異的に結合し、かつ該ペプチドのアミノ酸配列の連続する配列をエピトープとするモノクローナル抗体の重鎖可変領域を含んでかつ軽鎖可変領域を含まないポリペプチド（ＶＨポリペプチド）と、該モノクローナル抗体の軽鎖可変領域を含んでかつ重鎖可変領域を含まないポリペプチド（ＶＬポリペプチド）とを含有することを特徴とする測定すべきペプチドの非競合的な検出または定量用の試薬や、（２６）ＶＨポリペプチドまたはＶＬポリペプチドのいずれか一方が、標識物質で標識された標識化ポリペプチドであり、他方が固相に固定化された固定化ポリペプチドである上記（２５）に記載の試薬や、（２７）固定化ポリペプチドがタグペプチドを付加したポリペプチドであって、固定化ポリペプチドの固相への固相化が、該タグペプチドと該タグペプチドに特異的に結合する固相に固定化した抗体との結合を介した固定化である上記（２６）に記載の試薬や、（２８）固定化ポリペプチドが、マルトース結合蛋白質が付加したポリペプチドである上記（２６）に記載の試薬や、（２９）ＶＨポリペプチドまたはＶＬポリペプチドのいずれか一方が、標識物質で標識された標識化ポリペプチドであり、他方がタグペプチドを付加したポリペプチドであり、さらに該タグペプチドに特異的に結合する固相に固定化した抗体を含有する上記（２６）に記載の試薬や、（３０）標識物質が繊維状ファージ、酵素、蛍光物質またはビオチンである上記（２６）〜（２９）のいずれか１項に記載の試薬や、（３１）ＶＨポリペプチドが標識物質１で標識された標識化ＶＨポリペプチドであり、ＶＬポリペプチドが異なる標識物質２で標識された標識化ＶＬポリペプチドであることを特徴とする上記（２５）に記載の試薬や、（３２）ＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドが遺伝子組換え産物である上記（２５）〜（３１）のいずれか１項に記載の試薬や、（３３）測定すべきペプチドに特異的に結合し、かつ該ペプチドのアミノ酸配列の連続する配列をエピトープとするモノクローナル抗体が、該ペプチドのアミノ酸配列の連続する６以上１９以下のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として動物を免疫することにより得られるモノクローナル抗体である、上記（２５）〜（３２）のいずれか１項に記載の試薬や、（３４）モノクローナル抗体が、配列番号３のアミノ酸配列の連続する６以上１９以下のアミノ酸の配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体である、上記（２５）〜（３３）のいずれか１項に記載の試薬や、（３５）モノクローナル抗体が、配列番号１または２のアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体である上記（２５）〜（３３）のいずれか１項に記載の試薬や、（３６）測定すべきペプチドが、ヒトオステオカルシンである上記（２５）〜（３３）のいずれか１項に記載の試薬や、（３７）測定すべきペプチドが、配列番号１または２のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトオステオカルシンであって、モノクローナル抗体が、配列番号１または２のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として動物を免疫することにより得られるモノクローナル抗体である上記（２５）〜（３３）のいずれか１項に記載の試薬や、（３８）測定すべきペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトオステオカルシンであって、モノクローナル抗体が、以下の[１]〜[３]のいずれかのモノクローナル抗体である上記（２５）〜（３３）のいずれか１項に記載の試薬
[１]重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２および３が、それぞれ配列番号８、９および１０のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
[２]軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３が、それぞれ配列番号１１、１２および１３のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
[３]重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３が、それぞれ配列番号８、９および１０のアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３が、それぞれ配列番号１１、１２および１３のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
や、（３９）モノクローナル抗体が、以下の[１]〜[３]のいずれかのモノクローナル抗体である上記（３８）に記載の試薬
[１]配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有するモノクローナル抗体
[２]配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体
[３]配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体
や、（４０）測定すべきペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトオステオカルシンであって、ＶＨポリペプチドが、配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドである上記（２５）〜（３３）のいずれか１項に記載の試薬や、（４１）測定すべきペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトオステオカルシンであって、ＶＬポリペプチドが、配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドである上記（２５）〜（３３）のいずれか１項に記載の試薬や、（４２）測定すべきペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトオステオカルシンであって、ＶＨポリペプチドが、配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、かつＶＬポリペプチドが、配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドである上記（２５）〜（３３）のいずれか１項に記載の試薬に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】組換えｓｐＦｖファージミドベクターｐＫＳＴ２／ＫＴＭ２１９のプロモーターの下流の構造を示す。
【図２】ＫＴＭ−２１９由来のＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドを提示したファージを用いたＥＬＩＳＡによるオステオカルシンの検量線である。
【図３】ＫＴＭ−２１９由来のＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドを用いたオープンサンドイッチＥＬＩＳＡによるオステオカルシンの検量線である。
【図４】ＫＴＭ−２１９由来のＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドを用いたオープンサンドイッチＥＬＩＳＡによるＯＣ−１ペプチドの検量線である。
【図５】ＫＴＭ−２１９を用いた競合阻害ＥＬＩＳＡによるＯＣ−１ペプチドの検量線である。
【図６】固定化したＫＴＭ−２１９および標識化したＫＴＭ−２２３を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによるオステオカルシンの検量線である。
【図７】結合性したＫＴＭ−２２３および標識化したＫＴＭ−２１９を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによるオステオカルシンの検量線である。
【図８】ＶＨ−ＡＰ融合蛋白質発現プラスミドｐＥＴ−ＶＨ２１９−ＡＰのプロモーターの下流の構造を示す。
【図９】ＭＢＰ−ＶＬ融合蛋白質発現プラスミドｐＭＡＬ−ＶＬ２１９のプロモーターの下流の構造を示す。
【図１０】ＫＴＭ−２１９のＶＨ−ＡＰ融合蛋白質およびＭＢＰ−ＶＬ融合蛋白質を用いたオープンサンドイッチＥＬＩＳＡによるオステオカルシン（■）およびＯＣ−１ペプチド（●）の検量線である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の測定すべきペプチドの非競合的な検出または定量方法としては、測定すべきペプチドに特異的に結合し、かつ該ペプチドのアミノ酸配列の連続する配列をエピトープとするモノクローナル抗体の重鎖可変領域を含んでかつ軽鎖可変領域を含まないポリペプチド（ＶＨポリペプチド）と、前記モノクローナル抗体の軽鎖可変領域を含んでかつ重鎖可変領域を含まないポリペプチド（ＶＬポリペプチド）を用いる方法であれば特に制限されるものではなく、また、本発明の測定すべきペプチドの非競合的な検出または定量用のキットとしては、測定すべきペプチドに特異的に結合し、かつ該ペプチドのアミノ酸配列の連続する配列をエピトープとするモノクローナル抗体の重鎖可変領域を含んでかつ軽鎖可変領域を含まないポリペプチド（ＶＨポリペプチド）と、前記モノクローナル抗体の軽鎖可変領域を含んでかつ重鎖可変領域を含まないポリペプチド（ＶＬポリペプチド）を有するキットであれば特に制限されるものではなく、本発明において「ペプチド」とは、２以上のアミノ酸がペプチド結合で連結した物質を意味し、かかるペプチドには数十個以上のアミノ酸がペプチド結合で連結したポリペプチドも含まれる。以下、上記モノクローナル抗体の作製、ＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドの調製、ペプチドの検出または定量方法や検出または定量用の試薬について順次説明する。【００１５】
１．測定すべきペプチドのアミノ酸配列の連続する配列をエピトープとするモノクローナル抗体の作製
本発明のペプチドの非競合的な検出または定量方法を完成させるためには、測定すべきペプチドのアミノ酸配列の連続する配列をエピトープとするモノクローナル抗体を作製することが必要である。エピトープとなる連続する配列は、好ましくは６以上１９以下のアミノ酸の配列である。
本発明に用いる測定すべきペプチドに特異的に結合し、かつ該ペプチドのアミノ酸配列の連続する配列をエピトープとするモノクローナル抗体は、例えば以下のようにしてハイブリドーマより産生される抗体として作製することができる。【００１６】
（１）免疫原の調製
本発明に用いる測定すべきペプチドに特異的に結合し、かつ該ペプチドのアミノ酸配列の連続する配列をエピトープとするモノクローナル抗体は、例えば、測定すべきペプチドを直接免疫原として用いて調製することができるが、測定対象とすべきペプチドの部分配列、好ましくは測定すべきペプチドのアミノ酸配列の連続する５以上３０以下、より好ましくは５以上２０以下、特に好ましくは６以上１９以下のアミノ酸の配列を含むペプチドを免疫原として調製される。また、測定すべきペプチドのアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端の領域の、連続する６以上、好ましくは６以上１９以下の配列を含むペプチドを免疫原とすることにより、調製されたモノクローナル抗体が、測定すべきペプチドと特異的に結合する可能性を高くすることができる。【００１７】
免疫原となるペプチドの製造法としては、化学合成法、酵素法、遺伝子組換え法などがあげられる（例えば、「ペプチドと蛋白工学、藤野政彦編、講談社サイエンティフィック」参照）が、化学合成法が好適に用いられる。ペプチドの化学合成法は、官能基の保護されたアミノ酸を順次反応させてペプチドを合成する方法であるが、一般に液相合成法と固相合成法とが知られている。特に固相合成法では自動ペプチド合成機による合成が可能である。酵素法は、蛋白質分解酵素の逆反応を利用してペプチド結合形成を行わせる方法である。酵素法はペプチドの末端の数個のアミノ酸を変更したいときに有効な方法である。【００１８】
遺伝子組換え法では、免疫原となるペプチドをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌（Escherichia coli、以下E.colと表記する）、酵母、昆虫細胞、動物細胞などに導入してリコンビナントペプチドを得る方法があげられる。免疫原となるペプチドをコードするｃＤＮＡを得る方法としては、該ペプチドをコードする塩基配列を含むプライマーを用いてＰＣＲを行うなどの方法があげられる。【００１９】
また、ヒトオステオカルシンのアミノ酸配列（配列番号３）の連続する６〜１９アミノ酸の配列（以下、ＯＣエピトープ配列とよぶ）、例えば配列番号１または２のアミノ酸配列からなるペプチドを免疫原とした場合、オステオカルシンおよび免疫原としたペプチドのＯＣエピトープ配列を含むペプチドに特異的に結合し、免疫原としたペプチドのＯＣエピトープ配列をエピトープとするモノクローナル抗体を得ることができる。このモノクローナル抗体のＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドを利用して、本発明の方法による、オステオカルシンおよび免疫原としたペプチドのＯＣエピトープ配列を含むペプチドの非競合的な検出または定量を行うことができる。【００２０】
免疫原となるペプチド自体を動物に免疫する方法も可能であるが、該ペプチドをキャリア蛋白質とコンジュゲートしたものを免疫原として利用するのがより好ましい態様である。キャリア蛋白質としては、例えばウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略す）やキーホール・リンペット・ヘモシアニン（以下、ＫＬＨと略す）などが用いられる。【００２１】
ペプチドとキャリア蛋白質とのコンジュゲートの方法は、それぞれの官能基の間で、リンカーを介してまたは介さず共有結合を生じる反応によって行うことが可能である。官能基としては、例えばカルボキシル基やアミノ基、グリシジル基、チオール基、水酸基、アミド基、イミノ基、ヒドロキシサクシニルエステル基、マレイミド基などがあげられるが、この官能基同士の間で縮合反応を行わすことが可能である。【００２２】
リンカーを介さない結合方法としては、例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下、ＥＤＣと略す）などのカルボジイミド化合物を使う方法があげられる。反応を増強する物質としてＮ−ヒドロキシサクシイミド（以下、ＮＨＳと略す）またはその誘導体を使用することも可能である。【００２３】
リンカーとしては、例えば、キャリア蛋白質とペプチドの側鎖の官能基をお互いに結び付け合う分子であればどのようなものでもよい。好ましいリンカーとしては、例えば、キャリア蛋白質のアミノ酸残基と反応することができる第１の反応活性基と、ペプチドの側鎖の官能基と反応することができる第２の反応活性基とを同時に持つ分子であり、第１の反応活性基と第２の反応活性基が異なる基であることが好ましい。反応活性基としては例えば、アリルアジド、カルボジイミド、ヒドラジド、ヒドロキシメチルホスフィン、イミドエステル、イソシアネート、マレイミド、ＮＨＳ−エステル、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）−エステル、ソラレン、ピリジルジスルフィド、ビニルスルフォンなどの各反応基が挙げられる。【００２４】
キャリア蛋白質とのコンジュゲートを効率よく行わせるために、ペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれか一方にシステインを有するペプチドを使用することも好ましい。末端にシステインを有するペプチドの合成方法は、上記の化学合成法、酵素法、遺伝子組換え法などを利用することが可能である。【００２５】
この様にして得られたペプチドおよびペプチドのコンジュゲート蛋白質は、以下の抗体産生細胞を作製する際の免疫原として使用されるが、また、抗体産生細胞のスクリーニング、抗体産生細胞が産生するモノクローナル抗体の確認、あるいは測定すべきペプチドの検出方法または定量方法において、標準物質として使用することもできる。【００２６】
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
動物、例えば３〜２０週令のマウス、ラットまたはハムスターに上記（１）に記載の方法で調製した免疫原を投与し免疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。【００２７】
免疫は、動物の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバントとともに免疫原を投与することにより行う。アジュバントとしては、例えば、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、水酸化アルミニウムゲル、百日咳菌ワクチンなどがあげられる。【００２８】
免疫原の投与は、例えば１回目の投与の後１〜２週間おきに５〜１０回行う。各投与後、例えば３〜７日目に眼底静脈叢より採血して血清を調製し、その血清に含まれる抗原ペプチドに特異的に結合する抗体の量を以下の（３）に示す酵素免疫測定法などで調べる。免疫に用いた免疫原に対しその血清が十分な抗体価を示したマウス、ラットまたはハムスターを、抗体産生細胞の供給源とする。【００２９】
免疫原の最終投与後例えば３〜７日目に、免疫したマウス、ラットまたはハムスターより脾臓などを摘出し、脾細胞を採取する。脾臓を培地、例えばＭＥＭ（minimum essential medium）あるいはＲＰＭＩ−１６４０などの培地中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離して細胞を沈降した後、上清を捨て、緩衝液、例えばトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）または市販の赤血球溶解緩衝液などで１〜２分間処理し赤血球を除去し、上記培地で洗浄して抗体産生細胞として提供する。【００３０】
（３）酵素免疫測定法
免疫原となるペプチドとキャリア蛋白質のコンジュゲート蛋白質の１〜５０μｇ／ｍＬの濃度の溶液を９６ウェルのＥＩＡ用プレートに５０〜１００μＬ／ウェルずつ分注し、４℃で一晩ないしは室温で３０分以上放置してプレートにコートする。次いで、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液（以下、ＢＳＡ−ＰＢＳと記す）などを１００〜２００μＬ／ウェルずつ分注し、室温１〜２時間または、４℃で一晩以上放置して、プレート上に残った蛋白質との結合残基をブロッキングする。その後、ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、ＰＢＳでよく洗浄した後、第一抗体として被免疫動物血清、抗ペプチドモノクローナル抗体のハイブリドーマ培養上清もしくは精製抗体１〜１０μｇ／ｍＬを５０〜１００μＬ／ウェルに分注し、４℃で一晩ないしは室温で３０分以上放置する。ＰＢＳまたはツイーン（Tween）２０などの界面活性剤を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと記す）で、よく洗浄した後、第二抗体としてペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼ等の酵素で標識した抗イムノグロブリン抗体１〜５０μｇ／ｍＬを５０〜１００μＬ／ウェルずつ分注し、室温で１〜２時間または、４℃で一晩以上放置する。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳでよく洗浄した後、第二抗体の標識酵素により発色する基質を加えて反応を行ない、プレートリーダーにより吸光度を測定して発色量を測定し、抗体量の指標とする。【００３１】
（４）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使用する。例えば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Curr. Top. Microbiol. Immunol., 81, 1-7, 1978）、ＮＳ１／１−Ａｇ４−１（Eur. J. Immunol., 6, 511-519, 1976）、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４（Nature, 276, 269-270, 1978）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（J.Immunol., 123, 1548-1550, 1979）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Nature, 256, 495-497, 1975）などが用いられる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔正常培地（ＲＰＭＩ−１６４０培地に１．５ｍｍｏｌ／Ｌグルタミン、５０μｍｏｌ／Ｌ２−メルカプトエタノール、１０μｇ／ｍＬゲンタマイシンおよびウシ胎児血清（ＦＣＳ）を加えた培地）に、１５μｇ／ｍＬ８−アザグアニンを加えた培地〕などで継代するが、細胞融合の数日前に正常培地に継代し、融合当日７×１０6個以上の細胞数を確保するのが好ましい。【００３２】
（５）細胞融合とハイブリドーマの選択
上記（２）で免疫した抗体産生細胞と上記（４）で得られた骨髄腫細胞を、ＰＢＳ（phosphate buffered saline、１．８３ｇ／Ｌリン酸二ナトリウム、０．２１ｇ／Ｌリン酸一カリウム、７．６５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）などでよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、遠心分離して細胞を沈降した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングリコール−１０００（以下、ＰＥＧ−１０００と略す）、ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地、およびジメチルスルホキシドの混液を１０8個の抗体産生細胞当たり０．２〜１ｍＬを加え、ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地を徐々に数回に分けて全量がおよそ５０ｍＬになるように滴下する。遠心分離して細胞を沈降した後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、ＨＡＴ培地（正常培地に１００μｍｍｏｌ／Ｌヒポキサンチン、１５μｍｏｌ／Ｌチミジンおよび０．４μｍｏｌ／Ｌアミノプテリンを加えた培地）およそ１００ｍＬ中に、メスピペットによる吐出吸引でゆるやかに細胞を懸濁する。この懸濁液を９６ウェル培養用プレートにおよそ１００μＬ／ウェルずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間程度培養する。【００３３】
培養後、培養上清の一部をとり、前述（３）の酵素免疫測定法または後述（６）の競合阻害法などにより、抗原ペプチドに特異的に結合する抗体が含まれる培養上清をスクリーニングする。ついで、選択された培養上清に対応するハイブリドーマを、限界希釈法によりクローニングを２〜３回繰り返し〔１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目以降は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認められたものを抗ペプチドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。【００３４】
（６）競合阻害法
上記（３）の酵素免疫測定法において、第１抗体を２５〜５０μＬ／ウェルで分注する前あるいは同時に、抗原ペプチド５〜５０μｇ／ｍＬを２５〜５０μＬ／ウェルで分注し、混和したものを４℃で一晩ないしは室温で３０分以上放置する。以降の操作は前述（３）の酵素免疫測定法と同一である。陰性対照ウェルとしては、ペプチドをコンジュゲートしたキャリア蛋白質をコートしないウェルを作製し、陽性対照ウェルとして、抗原ペプチド溶液ではなく、抗原ペプチドを含まない溶液を分注したウェルを作製する。ハイブリドーマの培養上清を測定試料としたとき、陰性対照ウェルで発色がみられず、陽性対照ウェルで発色がみられ、しかも抗原ペプチドを分注したウェルでは陽性対照ウェルの発色が阻害されるような培養上清には、抗原ペプチドに特異的に結合する抗体が含まれることが確認できる。【００３５】
（７）モノクローナル抗体の調製
０．５ｍＬのプリスタン（pristane、２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）を腹腔内に投与し、２週間飼育した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（５）で得られた抗ペプチドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を腹腔内注射する。１０〜２１日程度でハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離して固形分を除去後、４０〜５０％硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−カラム、ゲル濾過カラム等による精製を行なう。【００３６】
抗体のサブクラスの決定は、例えばサブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行うことができる。蛋白質量の定量は、例えばローリー法または２８０ｎｍでの吸光度より算出することができる。【００３７】
測定すべきペプチドに特異的に結合し、かつ該ペプチドのアミノ酸配列の連続する配列をエピトープとするモノクローナル抗体として、例えば、ヒトオステオカルシンのＣ末端１２アミノ酸配列（配列番号１）からなる部分ペプチド（ＯＣ−１ペプチド）を抗原として得られたマウスモノクローナル抗体ＫＴＭ−２１９、ヒトオステオカルシンのＮ末端１３アミノ酸の配列のＣ末にシステインを付加した配列（配列番号２）からなるペプチド（ＯＣ−２ペプチド）を免疫原として得られたマウスモノクローナル抗体ＫＴＭ−２２３をあげることができる。ＫＴＭ−２１９はヒトオステオカルシンおよび配列番号1のアミノ酸配列を含むペプチドに特異的に結合し、配列番号３の３８−４９位の連続したアミノ酸配列をエピトープに有し、ＫＴＭ−２２３はヒトオステオカルシンおよび配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドに特異的に結合し、配列番号３の１−１３位の連続したアミノ酸配列をエピトープに有する。【００３８】
また、モノクローナル抗体の抗原ペプチドとの結合性は、ＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列で決定され、特に相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列が重要であるので、ＶＨ領域のアミノ酸配列が、ＫＴＭ−２１９のＶＨ領域のアミノ酸配列と同じであるモノクローナル抗体、ＶＬ領域のアミノ酸配列が、ＫＴＭ−２１９のＶＬ領域のアミノ酸配列と同じであるモノクローナル抗体、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列が、ＫＴＭ−２１９のＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列と同じであるモノクローナル抗体、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列が、ＫＴＭ−２１９のＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列と同じであるモノクローナル抗体は、ＫＴＭ−２１９と同様に、本発明のＯＣ−１ペプチドおよびオステオカルシンを検出または定量する方法に用いるＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドの調製に用いることができる。また、ＶＨ領域のアミノ酸配列が、ＫＴＭ−２２３のＶＨ領域のアミノ酸配列と同じであるモノクローナル抗体、ＶＬ領域のアミノ酸配列が、ＫＴＭ−２２３のＶＬ領域のアミノ酸配列と同じであるモノクローナル抗体、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列が、ＫＴＭ−２２３のＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列と同じであるモノクローナル抗体、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列が、ＫＴＭ−２２３のＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列と同じであるモノクローナル抗体は、ＫＴＭ−２２３と同様に、本発明のＯＣ−２ペプチドおよびオステオカルシンを検出または定量する方法に用いるＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドの調製に用いることができる。【００３９】
２．ＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドの調製
本発明においてＶＨポリペプチドとは、抗体のＶＨ領域を含み、ＶＬ領域を含まないポリペプチドを意味し、ＶＬポリペプチドとは抗体のＶＬ領域を含み、ＶＨ領域を含まないポリペプチドを意味する。【００４０】
本発明で用いることのできるＶＨポリペプチドとしては、ＶＨ領域を有しかつＶＬ領域を有さないポリペプチドであればどのようなものでもよく、また、本発明で用いることのできるＶＬポリペプチドとしては、ＶＬ領域を有しかつＶＨ領域を有さないポリペプチドであればどのようなものでもよい。すなわち、ＶＨポリペプチドまたはＶＬポリペプチドは抗体の一部であってもよく、可変領域以外の部分である定常領域の全部または一部を含んでいてもよい。ただし、可変領域以外の部分を含む場合は、後述する方法で重鎖（Ｈ鎖）と軽鎖（Ｌ鎖）間のジスルフィド結合を形成するシステイン残基を別のアミノ酸に変換することが好ましい。また、ＶＨ領域またはＶＬ領域にＶＨポリペプチド、ＶＬポリペプチドとは免疫学的に区別されるペプチド（以下タグペプチドとよぶ）を付加したＶＨポリペプチドまたはＶＬポリペプチドであってもよい。なお、ＶＨ領域またはＶＬ領域は抗体の可変領域部分であることから、本発明では、ＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドを総称して可変領域ポリペプチドと呼ぶこともある。【００４１】
本発明のペプチドの検出または定量方法に適した、ＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドの組み合わせは、例えばモノクローナル抗体ＫＴＭ−２１９由来のＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドの組み合わせをあげることができる。また、（ｉ）ＫＴＭ−２１９のＶＨ領域のアミノ酸配列である配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはＫＴＭ−２１９のＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列である、配列番号８、９および１０のアミノ酸配列をそのＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列として含むモノクローナル抗体由来のＶＨポリペプチドと（ii）ＫＴＭ−２１９のＶＬ領域のアミノ酸配列である配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはＫＴＭ−２１９のＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列である、配列番号１１、１２および１３のアミノ酸配列をそのＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列として含むモノクローナル抗体由来のＶＬポリペプチドの組み合わせをあげることができる。これらのＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドは、ヒトオステオカルシンまたは配列番号1のアミノ酸配列を含むペプチドを検出または定量する本発明の方法に用いることができる。【００４２】
ＫＴＭ−２１９由来のＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドは、後述するように遺伝子組換え技術によって得ることができる。ＫＴＭ−２１９由来のＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドの原核生物発現用ｓｐＦｖファージミドベクターｐＫＳＴ２／ＫＴＭ２１９は平成１６（２００４）年９月１４日付でブダペスト条約に基づき独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１２０として寄託されている。【００４３】
可変領域ポリペプチドはモノクローナル抗体から作製することができる。ＶＨポリペプチドとＶＬポリペプチドを分離するための適切なプロテアーゼを用いることによって可変領域ポリペプチドを製造することが可能である。プロテアーゼとしてはエンドペプチダーゼが好適である。あるいは、ＶＨポリペプチドとＶＬポリペプチドを分離するために還元剤で処理することによって、ジスルフィド結合を開裂することも可能である。還元剤としては、２−メルカプトエタノールやジチオスレイトールなどがあげられる。【００４４】
ＶＨポリペプチドとＶＬポリペプチドを分離する別の態様としては、Ｈ鎖とＬ鎖の間のジスルフィド結合を形成する、Ｈ鎖またはＬ鎖内のいずれか一方または両方のシステイン残基を別の適当なアミノ酸残基に変換することがあげられる。別のアミノ酸としては例えばセリン、グリシン、アラニンなどの中性アミノ酸が好適であるがこれには限らない。【００４５】
システイン残基を別のアミノ酸残基に変換する方法としては、ペプチド特異的モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマから、ｍＲＮＡを取得し、次いで該ｍＲＮＡからＶＨ領域またはＶＬ領域を含む抗体または抗体の一部をコードするｃＤＮＡを調製し、Ｈ鎖とＬ鎖の間のジスルフィド結合を形成するシステインのコドンを別の適当なアミノ酸のコドンに公知の方法で変換し、この変換したＶＨ領域またはＶＬ領域を含む抗体または抗体の一部をコードするｃＤＮＡを原核生物発現ベクターあるいは真核生物発現ベクターにそれぞれ導入し、発現させることにより製造することができる。変換の方法としては、所望のコドンに正確に塩基置換を導入できる方法であればどのような方法でもよいが、ＰＣＲを使用する方法が好適である。【００４６】
本発明の可変領域ポリペプチドを製造するより好ましい態様としては、遺伝子組み換え産物として製造する方法があげられる。まず、ペプチド特異的モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマから、ｍＲＮＡを取得し、次いで該ｍＲＮＡからＨ鎖をコードするｃＤＮＡのＶＨ領域を含む断片、およびＬ鎖をコードするｃＤＮＡのＶＬ領域を含む断片をクローニングし、これを原核生物発現ベクターあるいは真核生物発現ベクターにそれぞれ挿入して、組換えベクターを作製し、該組換えベクターで宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養して、ＶＨポリペプチドまたはＶＬポリペプチドを発現させて培養物中に生成・蓄積させ、該培養物中から蓄積したるＶＨポリペプチドまたはＶＬポリペプチドを採取することにより製造することができる。【００４７】
上記ｃＤＮＡをクローニングする方法としてはＰＣＲが好適である。ＶＨ領域およびＶＬ領域のＮ末の領域はフレームワーク領域（ＦＲ）なので、同じ動物種の同じクラスであれば、そのｃＤＮＡの配列が比較的保存されている。したがってフォワードプライマーとして、保存された１７〜３０ヌクレオチドの配列に基づく縮重プライマーを設計できる。このような縮重プライマーとしては、マウスＩｇＧのＦＲ１の配列に対応する配列番号１４または１５の塩基配列からなるＤＮＡ、マウスκ鎖のＦＲ１の配列に対応する配列番号１７または２０の塩基配列からなるＤＮＡがあげられる。また、ＶＨ領域およびＶＬ領域それぞれの直後にある定常領域をコードするｃＤＮＡの配列は、動物種と抗体のクラスが同じであれば保存されているので、この保存された１７〜３０ヌクレオチドの定常領域の配列に基づくリバースプライマーを設計できる。このようなリバースプライマーとしては、マウスＩｇＧ１の定常領域の配列に対応する配列番号１６の塩基配列からなるＤＮＡ、マウスκ鎖の定常領域の配列に対応する配列番号１８の塩基配列からなるＤＮＡがあげられる。ｃＤＮＡ断片の増幅のためには、ペプチド特異的モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマからＲＮＡを取得し、このＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮＡを鋳型とする逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を、上記のフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて行う。ハイブリドーマからのＲＮＡの単離は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001等の実験書の記載に基づいて行うことができる。ＲＴ−ＰＣＲはMolecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001等の実験書の記載に基づいて行うことができる。また、キアゲン・ワンステップＲＴ−ＰＣＲキット（QIAGEN OneStep RT-PCR Kit）等のキットを用いて行うこともできる。
ＰＣＲの方法としては、ＮＡＳＢＡ法（カイノス社）、ＴＭＡ法（バイエルメディカル社）、ＳＤＡ（strand displacement amplification）法（ベクトン・ディキンソン社）、ＩＣＡＮ法（宝酒造社）、ＬＡＭＰ（Loop-mediated Isothermal Amplification）法（栄研化学社）などの等温ＰＣＲと呼ばれる一連の方法あるいはこれらの方法の変法を用いてもよい。以下に、組換えベクターと形質転換体の作製および形質転換体の培養、ポリペプチドの単離について記載する。【００４８】
（１）形質転換体の作製
発現ベクターとしては、宿主細胞において自律複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、宿主細胞中で可変領域ポリペプチドをコードするＤＮＡからｍＲＮＡを転写できるプロモーターを含有しているものが用いられる。【００４９】
宿主細胞としては、原核生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、可変領域ポリペプチドを発現できるものであればいずれも用いることができる。【００５０】
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、発現ベクターは宿主原核生物中で自律複製可能であり、プロモーターおよびその下流にリボソーム結合配列および可変領域ポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入するクローニングサイトを有するものを用いる。必ずしも必要ではないが、該クローニングサイトの直後に転写終結配列を配置する方が好ましい。また、形質転換体の選択のため、薬剤耐性遺伝子等のマーカーとなる遺伝子を発現する配列を含むようにする。リボソーム結合配列の下流のクローニングサイトに可変領域ポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入する。リボソーム結合配列と開始コドンとの間は適当な距離（例えば、E.coli 宿主のベクターの場合６〜１８塩基）に調節されていることが好ましい。【００５１】
プロモーターとしては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えばE.coliを宿主とした場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、Ｔ７プロモーター、ＰＲプロモーター等の、E.coliやファージ等に由来するプロモーター等をあげることができる。またｔｒｐプロモーターを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７ｌａｃプロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。枯草菌を宿主とした場合は、枯草菌のファージであるＳＰＯ１やＳＰＯ２のプロモーター、ＰｅｎＰプロモーター等をあげることができる。【００５２】
発現ベクターとしては、例えば、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−３０（キアゲン社製）、ｐＫＹＰ２００〔Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)〕、pLSA1〔Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)〕、ｐＧＥＬ１〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)〕、ｐＴｒＳ３０〔E.coli JM109/pTrS30(FERM BP-5407)より調製〕、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）、ｐＥＴ１４（ノバジェン社製）、ｐＰＲＯＴｅｔ．Ｅ（クロンテック社製）ｐＲＳＥＴ  Ａ（インビトロジェン社製）等を例示することができる。【００５３】
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、E.coli XL1-Blue、E.coli XL2-Blue、E.coli DH1、E.coli MC1000、E.coli KY3276、E.coli W1485、E.coli JM109、E.coli HB101、E.coli No.49、E.coli W3110、E.coli NY49、E.coli BL21 (DE3) pLysS、Serratiaficaria、Serratia fonticola、Serratia liquefaciens、Serratiamarcescens、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Brevibacteriumammoniagenes、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacteriumsaccharolyticum ATCC14066、Corynebacterium glutamicumATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC14067、Corynebacteriumglutamicum ATCC13869、Corynebacterium acetoacidophilumATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、Pseudomonassp. D-0110等をあげることができる。【００５４】
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)〕、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 69, 2110 (1972); Gene, 17, 107 (1982)〕、プロトプラスト法〔特開昭63-248394; Mol. Gen. Genet., 168, 111 (1979)〕等をあげることができる。【００５５】
また、発現ベクターとして、Ｍ１３ファージやｆ１ファージ等の繊維状バクテリオファージのＤＮＡ複製基点を有するファージミドベクターを用いることもできる。ファージミドベクターを用いる場合は、Ｆ因子を有するE.coliを宿主として組換えベクターを導入する。また、組換えベクターの作製の際に、可変領域ポリペプチドをコードするＤＮＡにファージのコート蛋白質をコードするＤＮＡを連結させて、可変領域ポリペプチドとコート蛋白質との融合蛋白質を発現する構造にして、宿主に導入した後、ヘルパーファージを感染させることにより、培養液中に、表面に可変領域ポリペプチドを提示したファージ粒子を放出させることもできる。この場合、ファージ粒子自体を、ファージで標識された可変領域ポリペプチドとして、３．に後述するペプチドのオープンサンドイッチ法による検出または定量に用いることができる。【００５６】
酵母を宿主細胞として用いる場合の発現ベクターとしては、宿主酵母で転写を行なうプロモーター、転写の終止配列および酵母での形質転換マーカーとなる遺伝子、たとえば薬剤耐性遺伝子やＴＲＰ１、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２等のアミノ酸合成系の遺伝子を発現できる配列を含有しているものが用いられる。また、発現ベクターの作製や維持を容易にするため、E.coli内でも自律複製と遺伝子導入マーカーとなる薬剤耐性遺伝子を発現できるものが好ましい。【００５７】
プロモーターとしては、酵母中で転写を行なえるものであればいずれのものを用いてもよく、例えばSaccharomyces cerevisiaeのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子ＡＤＨ１、ガラクトース代謝系遺伝子ＧＡＬ１やＧＡＬ１０等のプロモーター、酸性フォスファターゼ遺伝子ＰＨＯ５プロモーター、フォスフォグリセレートキナーゼ遺伝子ＰＧＫプロモーター、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ＧＡＰプロモーター、ヒートショック蛋白質遺伝子プロモーター、α接合因子遺伝子ＭＦα１プロモーター、銅メタロチオネイン遺伝子ＣＵＰ１プロモーター、Pichiapastorisのアルコールオキシダーゼ遺伝子ＡＯＸ１のプロモーター等が用いられる。【００５８】
宿主細胞としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、ピヒア属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomycespombe、Pichia pastoris等をあげることができる。【００５９】
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Methods Enzymol., 194, 182 (1991)〕、スフェロプラスト法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 81, 4889 (1984)〕、酢酸リチウム法〔J. Bacteriol., 153, 163 (1983)〕等をあげることができる。【００６０】
動物細胞を宿主として用いる場合の発現ベクターとしては、宿主動物細胞で転写を行なうプロモーター、転写の終止と転写物のポリアデニル化のシグナルの配列を含有しているものが用いられる。またベクターの作製や維持を容易にするため、E.coli 内でも自律複製と遺伝子導入マーカーとなる薬剤耐性遺伝子を発現できるものが望ましい。プロモーターとしては、動物細胞中で転写を行なえるものであればいずれも用いることができるが、ＳＶ４０の初期プロモーター、ヒトサイトメガロウイルスのＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーターおよびエンハンサー、ラウス肉腫ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ、モロニーマウス白血病ウイルス等のレトロウイルスのＬＴＲ等のウイルス由来の配列、あるいはメタロチオネイン遺伝子やβ−アクチン遺伝子、伸長因子−１などの動物細胞由来の遺伝子のプロモーター等をあげることができる。またＳＶ４０の初期プロモーターとヒトＴ細胞白血病ウイルスＩのＬＴＲを組み合わせたＳＲαプロモーター等これらのプロモーターを人為的に組み合わせたプロモーターも用いられる。【００６１】
宿主染色体ＤＮＡに可変領域ポリペプチドをコードするＤＮＡが組み込まれた恒常的な可変領域ポリペプチド発現細胞は、Ｇ４１８、ハイグロマイシン等の薬剤に対する耐性遺伝子を発現できる配列を含む可変領域ポリペプチド発現ベクターを宿主細胞に導入し、薬剤の存在下で培養することにより選択することができる。また、宿主細胞中での可変領域ポリペプチドの生産量を上昇させるために、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子を発現できるような配列を含む可変領域ポリペプチドの恒常的発現ベクターを宿主細胞に導入し、ｄｈｆｒ阻害剤であるメトトレキセート（methotrexate）の濃度を段階的に上げながら培養することにより、ｄｈｆｒ遺伝子とともに可変領域ポリペプチドをコードするＤＮＡのコピー数を増幅させることもできる。このｄｈｆｒ遺伝子を用いた遺伝子増幅を行なう場合の宿主細胞としては、ｄｈｆｒ遺伝子が機能していない細胞、例えばＣＨＯ／ｄｈｆｒ−（ATCC:CRL-9096）などを用いる。【００６２】
具体的な発現ベクターとして、例えば、ｐＥＧＦＰ−Ｃ２（クロンテック社）、Autographa californica 核多角体病ウイルス、カイコ核多角体病ウイルス等が用いられる。昆虫細胞としてはSpodopterafrugiperdaの細胞であるＳｆ９およびＳｆ２１〔Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)〕、Trichoplusia niの細胞であるＨｉｇｈ５（インビトロジェン社製）等を用いることができる。トランスファーベクターには、ポリヘドリンプロモーターおよび相同組換えを起こさせるためのバキュロウイルス由来の配列、ベクターの維持・増殖や外来遺伝子の組み込み等の遺伝子操作をE.coli内で行なうための配列（E.coliでの自律複製可能な配列および薬剤耐性遺伝子ｐＡＧＥ１０７〔特開平3-22979; Cytotechnol., 3, 133, (1990)〕、pAS3-3（特開平2-227075）、ｐＣＤＭ８〔Nature, 329, 840, (1987)〕、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ１（ストラタジーン社製）ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン社）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＭＳＧ（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）、ｐＡＭｏ〔J. Biol. Chem., 268, 22782 (1993)〕等があげられる。【００６３】
宿主細胞としては、ヒト細胞であるＨｅＬａ、ナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）、２９３、アフリカミドリザル腎臓細胞であるＣＯＳ−１やＣＯＳ−７、ハムスターの細胞であるＣＨＯやＢＨＫ、マウス胎児細胞であるＮＨＩ３Ｔ３、マウス・ミエローマ細胞であるＳＰ２／０やＮＳ０、ラット・ミエローマ細胞であるＹＢ２／０等の細胞株をあげることができる。【００６４】
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Cytotechnol., 3, 133 (1990)〕、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad.Sci. USA， 84, 7413 (1987)〕等をあげることができる。【００６５】
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合は、バキュロウイルス発現系〔Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, W.H. Freeman and Company, New York (1992); Bio/Technology, 6, 47 (1988)〕が用いられる。即ち、トランスファーベクターに可変領域ポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入した後、該ベクターとバキュロウイルスを昆虫細胞に同時に導入し、強力なプロモーターであるポリヘドリン遺伝子プロモーター下に可変領域ポリペプチドをコードするＤＮＡが挿入された組換えバキュロウイルスを相同組換えによって作製した後、この組換えバキュロウイルスを再度昆虫細胞に感染させることにより、可変領域ポリペプチドを発現することができる。【００６６】
バキュロウイルスとしてはAutographa californica 核多角体病ウイルス、カイコ核多角体病ウイルス等が用いられる。昆虫細胞としてはSpodoptera frugiperdaの細胞であるSf9およびSf21〔Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)〕、Trichoplusia niの細胞であるHigh5（インビトロジェン社製）等を用いることができる。トランスファーベクターには、ポリヘドリンプロモーターおよび相同組換えを起こさせるためのバキュロウイルス由来の配列、ベクターの維持・増殖や外来遺伝子の組み込み等の遺伝子操作を大腸菌内で行なうための配列（大腸菌での自律複製可能な配列および薬剤耐性遺伝子）が含まれており、具体的にはｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５（ともにインビトロジェン社製）、ｐＢａｃＰＡＫ９（クロンテック社製）等があげられる。【００６７】
可変領域ポリペプチドが、免疫原とした抗原ペプチドに対する特異的な結合性を保持するためには、可変領域ポリペプチドのＮ末に分泌蛋白質のシグナルペプチドが付加したポリペプチドをコードするように、プロモーターと可変領域ポリペプチドをコードする配列の間にシグナルペプチドをコードする配列を挿入して組換え発現ベクターを構築するのが好ましい。このような組換え発現ベクターを導入した形質転換体は、培養液中に、シグナルペプチドが切断され除かれた可変領域ポリペプチドを分泌する。また、下記に記載した可変領域ポリペプチドと抗体以外のポリペプチドとの融合蛋白質を発現させる場合に、抗体以外のポリペプチドが細胞膜上の蛋白質やファージのコート蛋白質であれば、融合蛋白質のＮ末にシグナルペプチドが付加したポリペプチドをコードするように組換え発現ベクターを構築することにより、形質転換体あるいは形質転換体から放出されたファージ粒子の細胞表面に融合蛋白質が提示される。シグナルペプチドとしては、宿主が原核生物の場合は原核生物の分泌蛋白質や膜蛋白質、宿主が真核生物の場合は真核生物の分泌蛋白質や膜蛋白質のシグナルペプチドを用いるのが好ましい。【００６８】
ＶＨ領域またはＶＬ領域にタグペプチドを付加した可変領域ポリペプチド、すなわちタグペプチドと可変領域ポリペプチドとの融合蛋白質を製造する方法としては、上記可変領域ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ断片に抗体以外のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを付加して発現させる方法が好適である。【００６９】
タグペプチドは所望のペプチドを選ぶことが可能であり、本発明の態様の性能を向上させるためにポリペプチドを選ぶことが好ましい。性能とは例えば、本発明の測定方法の感度を向上させること、安定性を向上させること、再現性を向上させること、本発明に使われる操作を簡便にすること、操作時間を短縮すること、必要とする実験器具を簡易なものに変えることを容易にすること、該融合蛋白質の回収・精製を容易にすること、固相への固定化を可能とすることなどがあげられる。また、３．に後述するように可変領域ポリペプチドの標識物質がポリペプチドである場合も、同様に可変領域ポリペプチドと標識用のポリペプチドとの融合蛋白質を製造することができ、得られた融合蛋白質を標識化した可変領域ポリペプチドとして用いることができる。【００７０】
具体的には例えば、該融合蛋白質を精製する操作を簡便かつ迅速に行うことを可能にするために、マルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、精製抗体の認識する蛋白質などとＶＨポリペプチドまたはＶＬポリペプチドの融合蛋白質、あるいは、ヒスチジンの繰り返し構造（一般にはヒスチジンのヘキサマーが用いられる）、精製抗体のエピトープペプチドなどを付加したＶＨポリペプチドまたはＶＬポリペプチドがあげられる。その他市販の融合蛋白質発現システムを用いる方法として、例えば、ビオチンタグ融合蛋白質発現システムを用いるPinPointTM Xa Protein Purification System（プロメガ社）、特定のリジン残基がビオチン化される配列を利用したバイオイーズ発現システム（インビトロジェン社）、キチン結合蛋白質との融合蛋白質として発現させるインパクトＣＮシステムまたはインパクトＴＷＩＮシステム（第一化学社）などがあげられる。【００７１】
また例えば、ファージ表面蛋白質との融合蛋白質として発現することで、該融合蛋白質を精製することなく本発明の検出または定量法を構築することが可能である。ファージコート蛋白質との融合蛋白質として発現させるためには、ＶＨポリペプチドまたはＶＬポリペプチドを含む遺伝子をクローニングし、これを任意のファージミドベクターに組換えることで可能である。あるいは、ＶＨポリペプチドまたはＶＬポリペプチドを含む遺伝子とファージ表面蛋白質との間にアンバーコドンを配置し、これを非サプレッサー株のE.coliへ形質転換することで可溶性蛋白質として発現させることも可能である。【００７２】
（２）形質転換体の培養
可変領域ポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、可変領域ポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物より可変領域ポリペプチドを採取することにより、可変領域ポリペプチドを製造することができる。【００７３】
動物細胞を宿主とした形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ  １６４０培地〔J. Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967)〕、イーグル（Eagle）のＭＥＭ（Mimimum Essential Medium）〔Science, 122, 501 (1952)〕、ダルベッコ（Dalbecco）改変イーグル培地〔Virology, 8, 396 (1959)〕、１９９培地〔Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950)〕またはこれら培地にウシ胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。必要に応じてペニシリンやストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。【００７４】
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地〔ファーミンジェン（Pharmingen）社製〕、Ｓｆ−９００ II ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５〔いずれもJRHバイオサイエンシズ（JRH Biosciences）社製〕、Ｇｒａｃｅの昆虫培地〔Nature, 195, 788 (1962)〕等を用いることができる。培養条件は、ｐＨ６〜７、培養温度２５〜３０℃がよく、培養時間は、通常１〜５日間である。また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。【００７５】
E. coli等の原核生物あるいは酵母等の真核微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。【００７６】
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。【００７７】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。【００７８】
無機塩としては、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。【００７９】
培養は通常、振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養期間は、通常１６〜９６時間である。培養中ｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア水などを用いて行う。必要に応じて、培養期間中にアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。【００８０】
誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、培養中に必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。インデューサーとしては、例えば、ｌａｃプロモーターを誘導するイソプロピルガラクトシド、ｔｒｐプロモーターを誘導するインドールアクリル酸等があげられる。【００８１】
（３）発現させたポリぺプチドの単離精製
上記形質転換体の培養物中に蓄積した可変領域ポリペプチドを単離精製するには、以下のような通常の蛋白質の単離精製法を用いればよい。【００８２】
可変領域ポリペプチドが細胞外に分泌される場合には、培地中に可変領域ポリペプチドが蓄積する。従って培養終了後、遠心分離等の手法により細胞を含まない培地のみを回収する。該培地から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ＤＥＡＥセファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化学社製）、モノＱ（Mono Q、アマシャム・バイオサイエンシズ社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、ＳＰセファロース（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、および等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。【００８３】
可変領域ポリペプチドが、形質転換体の細胞内に蓄積する場合には、培養終了後の培養物から、形質転換体の細胞を遠心分離等の手法により回収し、緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。可変領域ポリペプチドが細胞内で溶解状態で存在する場合には、該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、上記の培地からの精製単離と同様にして精製標品を得ることができる。また、可変領域ポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して存在する場合は、該無細胞抽出液を遠心分離後、沈殿画分として可変領域ポリペプチドの不溶体を回収する。この可変領域ポリペプチドの不溶体を蛋白質変性剤で可溶化した後、該可溶化液を、蛋白質変性剤の濃度を蛋白質が変性しない程度まで希釈するか、あるいは、蛋白質変性剤を含まないかまたは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない程度まで希薄な溶液に透析し、可変領域ポリペプチドを正常な立体構造に復元させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。【００８４】
また、公知の方法〔J. Biomol. NMR, 6, 129 (1998); Science, 242, 1162 (1988); J.Biochem., 110, 166 (1991)〕に準じて、インビトロ転写・翻訳系を用いて可変領域ポリペプチドを生産することができる。すなわち、可変領域ポリペプチドをコードするＤＮＡをＳＰ６、Ｔ７、Ｔ３等のプロモーターの下流につなげ、それぞれのプロモーター特異的なＲＮＡポリメラーゼを反応させることにより大量の可変領域ポリペプチドをコードするＲＮＡをインビトロで合成した後、無細胞系の翻訳系例えばウサギ網状赤血球ライセートやコムギ胚芽抽出液を用いた翻訳系を利用して、可変領域ポリペプチドを生産することができる。【００８５】
精製した可変領域ポリペプチドの構造解析は、蛋白質化学で通常用いられる方法、例えば「遺伝子クローニングのための蛋白質構造解析」（平野久著、東京化学同人発行、1993年）に記載の方法により実施可能である。【００８６】
３．ペプチドの検出または定量方法、及び検出または定量用のキット
本発明のペプチドの検出または定量方法や、ペプチドの検出または定量用のキットは、前記のとおり、測定すべきペプチドに特異的に結合し、かつ該ペプチドのアミノ酸配列の連続する配列をエピトープとするモノクローナル抗体のＶＨポリペプチドと、該モノクローナル抗体のＶＬポリペプチドを用いる測定すべきペプチドの非競合的な検出または定量方法や、上記ＶＨポリペプチドとＶＬポリペプチドを備えた測定すべきペプチドの非競合的な検出または定量用のキットであれば特に制限はないが、例えばオープンサンドイッチＥＬＩＳＡ法、２種類の標識物質を用いるホモジニアスオープンサンドイッチ法などの方法や、そのためのキットがあげられる。【００８７】
（Ａ）オープンサンドイッチＥＬＩＳＡ法
本発明のペプチドの検出または定量方法として、測定すべきペプチドを固相へ捕捉するためにＶＨポリペプチドまたはＶＬポリペプチドのいずれか一方（以下、第１の可変領域ポリペプチドという）を固相へ固定化し、他方（以下、第２の可変領域ポリペプチドという）を測定すべきペプチドを検出するために標識することを特徴とする方法があげられる。この方法では、測定すべきペプチドを、固相に固定化された第１の可変領域ポリペプチド（固定化ポリペプチド）および標識された第２の可変領域ポリペプチド（標識化ポリペプチド）に接触させて結合させ、測定すべきペプチドを介して固定化ポリペプチドと結合した標識化ポリペプチドの標識物質を検出または定量することにより、測定すべきペプチドを検出または定量することが可能である。固定化ポリペプチドへの測定すべきペプチドの接触と、標識化ポリペプチドの測定すべきペプチドへの接触は同時ではなく順次行なうこともできる。また、本発明のペプチドの検出または定量方法として、第１の可変領域ポリペプチドと標識された第２の可変領域ポリペプチド（標識化ポリペプチド）を、固相の存在下で測定すべきペプチドと接触させることによって、固相、第１の可変領域ポリペプチド、標識化ポリペプチドおよび測定すべきペプチドからなる複合体を形成せしめ、同時に第１の可変領域ポリペプチドを同相に固相化させ、固相に結合した、該複合体の標識物質を検出または定量することにより、測定すべきペプチドの検出または定量をする方法もあげられる。第１の可変領域ポリペプチドを固相に固定化させる方法としては、例えば、第1の可変領域ポリペプチドとして、タグペプチドが付加した可変領域ポリペプチドを用い、固相として、該タグペプチドに特異的に結合する抗体を固定化した固相を用いる方法や、第1の可変領域ポリペプチドとして、マルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）が付加した可変領域ポリペプチド（ＭＢＰと融合させた可変領域ポリペプチド）を用いて固定化した固相を用いる方法があげられる。【００８８】
オープンサンドイッチＥＬＩＳＡ法は次の手順によって行うことが可能である。固相に第１の可変領域ポリペプチドを固定化した後、ブロッキング剤によりブロッキングする。ブロッキング剤を捨て洗浄液でよく洗浄した後、濃度既知のペプチド標品あるいは濃度未知の被験サンプルを加え反応させる。洗浄液でよく洗浄した後、標識物質で標識された第２の可変領域ポリペプチドを反応させる。洗浄液で再び洗浄した後、該標識物質に応じた反応を行なう。濃度既知のペプチド標準物質を段階的に希釈して作成した検量線より、被験サンプルの濃度を算出することができる。【００８９】
オープンサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いた検出試薬または定量試薬の構成要素としては、測定すべきペプチドに特異的に結合し、かつ該ペプチドのアミノ酸配列の連続する配列をエピトープとするモノクローナル抗体由来のＶＨポリペプチド、該モノクローナル抗体由来のＶＬポリペプチド、第１の可変領域ポリペプチドを固定化するための固相となる担体、第１の可変領域ポリペプチドが固定化された固相（固相に固定されている第１の可変領域ポリペプチド）、検出に用いる標識された第２の可変領域ポリペプチドや、標識物質１で標識された標識化ＶＨポリペプチドと標識物質２で標識された標識化ＶＬポリペプチドなどがあげられ、また必要に応じ、ブロッキング剤、生体試料の希釈液、反応緩衝液、洗浄液、標識物質の検出用試薬または該ペプチドの標準物質などを含む、キットの形態であっても良い。【００９０】
（１）可変領域ポリペプチドの標識
標識物質としては酵素、蛍光物質、発光物質、放射性同位元素、ビオチン、ジゴキシゲニン、繊維状ファージ、タグ配列を含むポリペプチドなどがあげられる。【００９１】
酵素としては、任意の公知（石川榮次ら編、酵素免疫測定法、医学書院）の酵素標識を用いることができる。例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼなどを用いることができる。【００９２】
蛍光物質としては、任意の公知（川生明著、蛍光抗体法、ソフトサイエンス社）の蛍光物質を用いることができる。例えば、ＦＩＴＣ標識、ＲＩＴＣ標識などを用いることができる。その他の蛍光物質として、例えばｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ（Science, 281,2016-2018, 1998）があげられる。または、フィコエリスリンなどのフィコビリ蛋白質、ＧＦＰ（Green fluorescent Protein）、ＲＦＰ（Red fluorescent Protein）、ＹＦＰ（Yellow fluorescent Protein）、ＢＦＰ（Blue fluorescent Protein）あるいはこれの類縁蛋白質のように蛍光を発する蛋白質であってもよい。【００９３】
発光物質としては、任意の公知[今井一洋編、生物発光と化学発光、廣川書店；臨床検査４２(１９９８)]の発光体標識を用いることができる。例えば、アクリジニウムおよびその誘導体標識、ルテニウム錯体化合物標識、ロフィン標識などを用いることができる。またルテニウム錯体化合物はClin.Chem.37,9,1534-1539(1991)に示されたものが好ましく本化合物は電子供与体と共に電気化学的に発光する。【００９４】
放射性同位元素としては、任意の公知の物質を用いることができる。例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、３２Ｐ、３３Ｐ、１２５Ｉ、５１Ｃｒなどがあげられる。【００９５】
低分子化合物としては、ビオチン、ジゴキシゲニンなどが、繊維状ファージとしては、Ｍ１３ファージやｆ１ファージなどが、タグ配列を含むポリペプチドとしてはＦＬＡＧペプチド（ＦＬＡＧタグ、Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ）、ポリヒスチジン（Ｈｉｓタグ、Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ）、ｍｙｃエピトープペプチド（ｍｙｃタグ、Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ）、ヘマグルチニンエピトープペプチド（ＨＡタグ、Ｔｙｒ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ａｌａ）などがあげられる。【００９６】
可変領域ポリペプチドを上記の標識物質により標識化する方法としては、遺伝子工学的に結合させる方法や、化学的に結合させる方法が用いられる。遺伝子工学的に結合させる方法は、文献（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 974, 1996; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 7826, 1996）記載の方法に従って行うことができる。化学的に結合させる方法は、文献 （Science, 261, 212, 1993）記載の方法に従って行うことができる。また、放射性同位元素を化学的に結合させる方法は、文献（Antibody Immunoconj. Radiopharm., 3, 60, 1990; ）記載の方法に従って行うことができる。【００９７】
標識物質がポリペプチドの場合には、公知の遺伝子組換え技術（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）および上記２．の記載にしたがって、標識物質と可変領域ポリペプチドの融合蛋白質として製造することができる。このような態様に適した標識物質としては、例えば、フィコエリスリンなどのフィコビリ蛋白質、ＧＦＰ（Green fluorescent Protein）、ＲＦＰ（Red fluorescent Protein）、ＹＦＰ（Yellow fluorescent Protein）、ＢＦＰ（Blue fluorescent Protein）あるいはこれの類縁蛋白質のように蛍光を発する蛋白質あるいは、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼなどの酵素、アビジン、抗体の定常領域、タグ配列を含むポリペプチドなどがあげられる。遺伝子組換え技術を用いて融合蛋白質をコードするＤＮＡを作製するには、本発明の可変領域ポリペプチドおよび標識物質をそれぞれコードするＤＮＡをＰＣＲなどでクローニングし、それぞれのＤＮＡをリガーゼ反応で連結する。あるいは、それぞれのＤＮＡのＰＣＲ断片にのりしろの部分を設けるようプライマーを設計し、このプライマーによって１回目のＰＣＲを行い、続いて得られたＰＣＲ断片をのりしろ部分でアニーリングさせ、２回目のＰＣＲを行う方法も好適である。２回目のＰＣＲの時に、融合遺伝子が増幅しやすくなるよう、融合遺伝子の両端または外側に設計されたプライマーを添加する場合もある。【００９８】
ペプチドと標識物質とのコンジュゲートの方法は、それぞれの官能基の間で、リンカーを介してまたは介さず共有結合を生じる反応によって行うことが可能である。官能基としては、カルボキシル基やアミノ基、グリシジル基、チオール基、水酸基、アミド基、イミノ基、ヒドロキシサクシニルエステル基、マレイミド基、イソチオシアネート基などがあげられるが、この官能基同士の間で縮合反応を行わすことが可能である。【００９９】
リンカーを介さない結合方法としては例えば、ＥＤＣなどのカルボジイミド化合物を使う方法があげられる。反応を増強する物質としてＮＨＳまたはその誘導体が使用することも可能である。イソチオシアネート基とアミノ基の間の縮合反応は、他の試薬を必要とせず、中性〜弱アルカリ性の条件で混合するだけで結合できる。【０１００】
リンカーとしては、例えば、キャリア蛋白質とペプチドの側鎖の官能基をお互いに結び付け合う分子であればどのようなものでもよい。好ましい態様は、例えば、キャリア蛋白質のアミノ酸残基と反応することができる第１の反応活性基と、ペプチドの側鎖の官能基と反応することができる第２の反応活性基を同時に持つ分子であり、第１の反応活性基と第２の反応活性基が異なる基であることが好ましい。反応活性基としては例えば、アリルアジド、カルボジイミド、ヒドラジド、ヒドロキシメチルホスフィン、イミドエステル、イソシアネート、マレイミド、ＮＨＳ−エステル、ＰＦＰ−エステル、ソラレン、ピリジルジスルフィド、ビニルスルフォン、イソチオシアネートなどの各反応基が挙げられる。【０１０１】
標識物質の検出手段としては、標識物質に応じて適切なものを選ぶことができる。すなわち、標識物質が発色物質すなわちある波長の光を吸収する物質の場合には、分光光度計やマルチウェルプレートリーダーなどを用いることができる。標識物質が蛍光物質の場合には、蛍光光度計や蛍光マルチウェルプレートリーダーなどを用いることができる。標識物質が発光物質の場合には、発光光度計や発光マルチウェルプレートリーダーなどを用いることができる。標識物質が放射性同位元素である場合、放射性同位元素の量は、放射活性をシンチレーションカウンターなどにより測定することにより決定することができる。【０１０２】
標識が酵素である場合、酵素の基質を当該酵素と反応させ、生成した物質を測定することにより、標識量を測定することができる。【０１０３】
酵素がペルオキシダーゼである場合には、例えば吸光度法、蛍光法などによりペルオキシダーゼ量を測定することができる。吸光度法によりペルオキシダーゼ量を測定する方法としては、例えばペルオキシダーゼとその基質である過酸化水素および酸化発色型色原体の組み合わせとを反応させ、反応液の吸光度を分光光度計やマルチウェルプレートリーダーなどで測定する方法などがあげられる。酸化発色型色原体としては、例えばロイコ型色原体、酸化カップリング発色型色原体などがあげられる。【０１０４】
ロイコ型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼなどの過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質である。具体的には、ｏ−フェニレンジアミン、１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン  ナトリウム塩（ＤＡ−６４）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）などがあげられる。【０１０５】
酸化カップリング発色型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼなどの過酸化活性物質の存在下、２つの化合物が酸化的カップリングして色素を生成する物質である。２つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとアニリン類（トリンダー試薬）との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせなどがあげられる。カプラーとしては、例えば４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラジンなどがあげられる。アニリン類としては、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジ（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−４−フルオロ−３，５−ジメトキシアニリン（Ｆ−ＤＡＯＳ）などがあげられる。フェノール類としては、フェノール、４−クロロフェノール、３−メチルフェノール、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）などがあげられる。【０１０６】
蛍光法によりペルオキシダーゼ量を測定する方法としては、例えばペルオキシダーゼとその基質である過酸化水素および蛍光物質の組み合わせとを反応させ、蛍光光度計や蛍光マルチウェルプレートリーダーなどで生成した蛍光の強度を測定する方法などがあげられる。当該蛍光物質としては、例えば４−ヒドロキシフェニル酢酸、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、クマリンなどがあげられる。【０１０７】
発光法によるペルオキシダーゼ量を測定する方法としては、例えばペルオキシダーゼとその基質である過酸化水素および発光物質の組み合わせとを反応させ、発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダーなどで生成した発光の強度を測定する方法などがあげられる。当該発光物質としては、例えばルミノール化合物、ルシゲニン化合物などがあげられる。【０１０８】
酵素がアルカリフォスファターゼである場合には、例えば発光法などによりアルカリフォスファターゼ量を測定することができる。発光法によりアルカリフォスファターゼ量を測定する方法としては、例えばアルカリフォスファターゼとその基質とを反応させ、生成した発光の発光強度を発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダーなどで測定する方法などがあげられる。アルカリフォスファターゼの基質としては、例えば３−（２'−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３'−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン・二ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）、２−クロロ−５−｛４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２'−（５'−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル｝フェニルホスフェート・二ナトリウム塩（ＣＤＰ−ＳｔａｒＴＭ）、３−｛４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２'−（５'−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル｝フェニルホスフェート・二ナトリウム塩（ＣＳＰＤＴＭ）、［１０−メチル−９（１０Ｈ）−アクリジニルイデン］フェノキシメチルリン酸・二ナトリウム塩（ＬｕｍｉｇｅｎＴＭ  ＡＰＳ−５）などがあげられる。【０１０９】
酵素がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼである場合には、例えば吸光度法（比色法）、発光法または蛍光法などによりβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ量を測定することができる。吸光度法（比色法）によりβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ量を測定する方法としては、例えばσ−ニトロフェルβ−Ｄ−ガラクトピラノシドなどがあげられる。発光法によりβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ量を測定する方法としては、例えばβ−Ｄ−ガラクトシダーゼとその基質とを反応させ、反応液の発光度を発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダーなどで測定する方法などがあげられる。β−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質としては、例えばGalacton-Plus（アプライドバイオシステムズ社）またはその類似化合物などがあげられる。蛍光法によりβ―Ｄ−ガラクトシダーゼ量を測定する方法としては、例えばβ―Ｄ−ガラクトシダーゼとその基質とを反応させ、反応液の蛍光度を蛍光光度計や蛍光マルチウェルプレートリーダーなどで測定する方法などがあげられる。β―Ｄ−ガラクトシダーゼの基質としては、例えば４−メチルウンベリフェルβ―Ｄ−ガラクトピラノシドなどがあげられる。【０１１０】
酵素がルシフェラーゼである場合には、例えば発光法などによりルシフェラーゼ量を測定することができる。発光法によりルシフェラーゼ量を測定する方法としては、例えばルシフェラーゼとその基質とを反応させ、反応液の発光度を発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダーなどで測定する方法などがあげられる。ルシフェラーゼの基質としては、例えばルシフェリン、セレンテラジンなどがあげられる。【０１１１】
標識物質が蛍光物質、発色物質、発光物質、放射性同位元素および酵素以外の場合は、標識物質に特異的に結合する物質を蛍光物質、発色物質、発光物質、放射性同位元素または酵素等で標識したものと第２の可変領域ポリペプチドを標識する標識物質を結合させ、標識物質に特異的に結合する物質を標識している蛍光物質、発色物質、発光物質、放射性同位元素または酵素を用いて、上記の記載と同様にして検出を行う。標識物質をに特異的に結合する物質としては、標識物質を特異的に結合する抗体、また標識物質がビオチンの場合は、アビジンやストレプトアビジンをあげることができる。また、標識物質に特異的に結合する抗体、アビジンまたはストレプトアビジンを標識せずに、第２の可変領域ポリペプチドを標識する標識物質と結合させた後、抗体の定常領域に特異的に結合する抗体またはアビジンまたはストレプトアビジンに特異的に結合する抗体を蛍光物質、発色物質、発光物質、放射性同位元素または酵素で標識したものを結合させ、これらの抗体を標識している蛍光物質、発色物質、発光物質、放射性同位元素または酵素を用いて、上記の記載と同様にして検出を行うこともできる。【０１１２】
これらの検出に用いる抗体、アビジンまたはストレプトアビジンや標識物質に特異的に結合する抗体、抗体の定常領域に特異的に結合する抗体、アビジンまたはストレプトアビジンに特異的に結合する抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよく、あるいはＦａｂ，Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ、およびＣＤＲを含むペプチドなどを用いることができる。【０１１３】
（２）可変領域ポリペプチドの固定化
抗ペプチドモノクローナル抗体由来可変領域ポリペプチドを固定化するための担体としては、抗体を結合させて保持できるものであればいかなるものも包含されるが、各種高分子素材を用途に合うように成形した素材が用いられる。【０１１４】
可変領域ポリペプチドを固定化させる担体の形状としてはチューブ、ビーズ、プレート、ラテックスなどの微粒子、スティックなどが、素材としてはポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ゼラチン、アガロース、セルロース、ポリエチレンテレフタレートなどの高分子素材、ガラス、セラミックス、磁性粒子や金属などがあげられる。【０１１５】
可変領域ポリペプチドの固定化の方法としては物理学的結合を利用した方法と化学的結合を利用した方法またはこれらの併用など、公知の方法が用いられる。物理学的結合としては、例えば物理吸着、静電的結合、水素結合、疎水結合などがあげられる。化学的結合としては、例えば共有結合、配位結合などがあげられる。例えば、ポリスチレン製免疫測定用マイクロタープレートに可変領域ポリペプチドを疎水固定化したものがあげられる。【０１１６】
可変領域ポリペプチドは、直接、固相に固定化してもよいし、可変領域ポリペプチドをビオチン−アビジンなどを介してから、固相に固定化してもよい。また、可変領域ポリペプチドにタグペプチドが付加されている可変領域ポリペプチドにおいては、タグペプチドに対する抗体を固相に固定化し、次いで可変領域ポリペプチドを固定化することが可能である。【０１１７】
あるいは、可変領域ポリペプチドは、リンカーを介して固相に固定化してもよい。リンカーとしては、例えば、蛋白質と固相の側鎖の官能基をお互いに結び付け合う分子であればどのようなものでもよい。好ましい態様は、例えば、蛋白質のアミノ酸残基と反応することができる第１の反応活性基と、固相の側鎖の官能基と反応することができる第２の反応活性基を同時に持つ分子であり、第１の反応活性基と第２の反応活性基が異なる基であることが好ましい。反応活性基としては例えば、アリルアジド、カルボジイミド、ヒドラジド、ヒドロキシメチルホスフィン、イミドエステル、イソシアネート、マレイミド、ＮＨＳ−エステル、ＰＦＰ−エステル、ソラレン、ピリジルジスルフィド、ビニルスルフォンなどの各反応基が挙げられる。【０１１８】
共有結合によって固定化することに適した固相の側鎖の官能基としては、カルボキシル基やアミノ基、グリシジル基、チオール基、水酸基、アミド基、イミノ基、ヒドロキシサクシニルエステル基、マレイミド基、など、反応して化学的に結合できる基があるものが望ましい。【０１１９】
（３）キットのその他の構成要素
上記の可変領域ポリペプチドを固定化させた固相は、ブロッキングにより、担体上に残存する官能基を保護する。免疫学的測定法のブロッキングに用いられる物質としては、通常蛋白質、界面活性剤およびブロックエース（大日本製薬株式会社製）等の市販のブロッキング試薬などが用いられる。ブロッキングに用いることができる蛋白質としては、正常動物血清、ウシ血清アルブミン、スキムミルク、カゼイン溶液などが好適であるが、これには限らない。正常動物血清に用いられる動物としては、ヒトまたはマウス以外ではすべての動物種が使用できるが、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ブタなどが好適である。血清濃度は０．１〜２０％の範囲で任意に選ぶことが可能であるが、１〜５％が最も好適である。ウシ血清アルブミン、スキムミルク、カゼイン溶液などの濃度は０．１〜２０％の範囲で任意に選ぶことが可能であるが、１〜５％が最も好適である。ブロッキングに用いることができる界面活性剤の種類としては、トライトンＸ−１００、ツイーン２０などを用いることができる。ブロッキング温度は４℃〜３７℃の範囲で自由に設定できる。ブロッキング時間は反応温度にしたがって適切に設定可能であるが、室温の場合には１０分以上１時間以内などの条件が好ましい。【０１２０】
生体試料の希釈液としては、界面活性剤、緩衝剤などに安定化剤を含む水溶液などがあげられる。検体として全血を用いる場合には、水性溶液は、赤血球などの血球の膨張や収縮による血清中の成分濃度の変化を防止する目的で、塩類、糖類など、緩衝剤などにより等張液に調製されたものであることが好ましい。塩類としては、特に制限はないが、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウムなどのハロゲン化アルカリ金属塩などがあげられる。糖類としては、特に制限はないが、例えば、マンニトール、ソルビトールなどの糖アルコールなどがあげられる。【０１２１】
反応緩衝液としては、可変領域ポリペプチドと生体試料中の抗原とが結合反応をすることができればいかなるものであってもよい。また、必要に応じて、界面活性剤、防腐剤、安定化剤、反応促進剤あるいは酵素活性調節剤などを添加してもよい。【０１２２】
洗浄液としては、通常未反応の物質を除去、洗浄でき、抗原と可変領域ポリペプチドの反応に影響を与えなければ、いかなるものも使用することができる。また、必要に応じて、緩衝剤、界面活性剤、蛋白質、防腐剤あるいは安定化剤などを添加してもよい。蛋白質としては、正常動物血清、ウシ血清アルブミン、スキムミルク、カゼイン溶液などが好適であるが、これには限らない。これらの蛋白質の濃度は、０．１〜２０％の範囲で任意に選ぶことが可能であるが、１〜５％が最も好適である。界面活性剤の種類としては、トライトンＸ−１００、ツイーン２０などが用いることができる。界面活性剤の濃度は０．００５〜０．５％が好ましく、０．０１〜０．２％がより好ましい。【０１２３】
生体試料の希釈液、反応緩衝液あるいは洗浄液などに用いられる緩衝液としては、緩衝液に用いる緩衝剤は緩衝能を有するものならば特に限定されないが、ｐＨ１〜１１の例えば乳酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、リン酸緩衝剤（但し、標識がアルカリフォスファターゼである場合を除く）、トリエタノールアミン緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤、リジン緩衝剤、バルビツール緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、グッド緩衝剤などがあげられる。グッド緩衝剤としては、例えばＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）緩衝剤、ビス−トリス［ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン］緩衝剤、ＡＤＡ［Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸］緩衝剤、ＰＩＰＥＳ［ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）］緩衝剤、ＡＣＥＳ｛２−［Ｎ−（２−アセトアミド）アミノ］エタンスルホン酸｝緩衝剤、ＭＯＰＳＯ（３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、ＢＥＳ｛２−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］エタンスルホン酸｝緩衝剤、ＭＯＰＳ（３−モルホリノプロパンスルホン酸）緩衝剤、ＴＥＳ〈２−｛Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸〉緩衝剤、ＨＥＰＥＳ［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（２−スルホエチル）ピペラジン］緩衝剤、ＤＩＰＳＯ｛３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸｝緩衝剤、ＴＡＰＳＯ〈２−ヒドロキシ−３−｛［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸〉緩衝剤、ＰＯＰＳＯ［ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸）］緩衝剤、ＨＥＰＰＳＯ［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）ピペラジン］緩衝剤、ＥＰＰＳ［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（３−スルホプロピル）ピペラジン］緩衝剤、トリシン［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン］緩衝剤、ビシン［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン］緩衝剤、ＴＡＰＳ｛３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノプロパンスルホン酸｝緩衝剤、ＣＨＥＳ［２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸］緩衝剤、ＣＡＰＳＯ［３−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸］緩衝剤、ＣＡＰＳ［３−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）プロパンスルホン酸］緩衝剤などがあげられる。【０１２４】
酵素活性調節剤、酵素安定化剤としては、例えばマグネシウムイオン、マンガンイオン、亜鉛イオンなどの金属イオンがあげられる。試薬中のこれらの金属イオンの含量としては、測定において、酵素が安定化される含量であれば特に制限はない。【０１２５】
防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質などがあげられる。試薬中のこれらの防腐剤の含量としては、測定において、検体中の被測定物質が適切に測定されるような含量であれば特に制限はない。【０１２６】
ペプチドの標準物質としては、化学合成、酵素合成、遺伝子組換え技術により取得された、あるいは生体試料から取得された該ペプチドや、該ペプチドが発現している細胞、該ペプチドの部分ペプチドまたは該ペプチドを一部に有するポリペプチドなどがあげられる。あるいは、化学合成、酵素合成によって、該ペプチド、または該ペプチドの部分ペプチド、該ペプチドを一部に有するポリペプチドをペプチド性以外の分子で修飾を施した物質であってもよい。【０１２７】
（４）測定系の工夫
また、本発明の検出または定量方法はすなわち、抗原ペプチドが存在するときに抗原ペプチドを介してＶＨポリペプチドとＶＬポリペプチドが会合することを特徴とする測定系であるが、該測定系をより性能のよいものにするためには、抗原ペプチドが存在しないときに、抗原ペプチドを介さずＶＨポリペプチドとＶＬポリペプチドが会合することはバックグランドの値を上昇することになるため避けるような工夫が施されることがより好ましい。このような工夫としては、例えば抗原ペプチドを介さずＶＨポリペプチドとＶＬポリペプチドが会合することを妨げる凝集阻害剤の添加が考えられる。凝集阻害剤としては例えば、界面活性剤があげられる。本発明に好適な界面活性剤としては、蛋白質の溶解性を増す化合物であれば何でもよく、例えば、カルボン酸型、スルホン酸型、硫酸エステル型、リン酸エステル型の陰イオン界面活性剤、あるいはエステル型、エーテル型、エステルエーテル型、アルカノールアミド型の非イオン界面活性剤、あるいはアルキルアミン塩型、第４級アンモニウム塩型の陽イオン界面活性剤、カルボキシベタイン型、２−アルキルイミダゾリンの誘導型、グリシン型の両性界面活性剤があげられる。【０１２８】
また本発明に好適な上記工夫としては、例えば、反応緩衝液の塩濃度あるいはｐＨを適切に調製することによる方法も可能である。反応緩衝液の種類としては、例えば、（Ａ）オープンサンドイッチＥＬＩＳＡの項に記載の反応緩衝液の態様があげられる。ｐＨは４．０〜１０．０の間から好適なｐＨを見出すことができ、塩濃度は０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの間から好適な塩濃度を見出すことが可能である。塩濃度を調節するために、無機塩を添加することも好ましい。無機塩は、ナトリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩など１価イオンまたは２価イオンの塩などがあげられる。【０１２９】
さらに本発明に好適な上記工夫としては、ＶＨポリペプチドまたはＶＬポリペプチドのどちらか一方または両方のアミノ残基において、抗原ペプチドを介さずＶＨポリペプチドとＶＬポリペプチドが会合することに関与するアミノ残基を別のアミノ残基に変更することであってもよい。ＶＨまたはＶＬのフレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲを抗原に結合することを可能とする立体形成に関与するとともに、ＶＨポリペプチドとＶＬポリペプチドの結合にも関与することが明らかとなっている。例えば、Masudaら（14th Annual International Antibody Engineering Conference, 2003）およびSasajimaら（14th Annual International Antibody Engineering Conference, 2003）の報告に基づいて、ＦＲ２に存在するＶＨポリペプチドとＶＬポリペプチドの結合に重要であると特定されたアミノ酸残基に変異を入れることで、抗原が存在しないときのＶＨポリペプチドとＶＬポリペプチドが会合することを抑制することができる。【０１３０】
（５）測定対象となる物質
本発明のオープンサンドイッチ法はモノクローナル抗体を得るために抗原として用いられたペプチドを検出、定量するばかりでなく、該ペプチドを一部に有する分子であればどのようなものも検出、定量するために適した方法である。該分子としては、該ペプチドを含むペプチド、ポリペプチド、糖、脂質、核酸、有機化合物、無機化合物、高分子ポリマーなど天然に存在、または人工的に創製可能な物質であれば何であってもよい。【０１３１】
該分子と該ペプチドを人工的に結合させる方法としては、遺伝子工学的に結合させる方法、物理学的方法または化学的方法など、公知の方法が用いられる。遺伝子工学的に結合させる方法としては、公知の遺伝子組換え技術（Sambrook, Fritsch, Maniatis; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor）を用いる方法があげられる。
物理学的結合としては、例えば物理吸着、静電的結合、水素結合、疎水結合などがあげられる。化学的結合としては、例えば共有結合、配位結合などがあげられる。【０１３２】
また本発明は、ペプチドを有する細胞または組織を検出、定量するためにも適した方法である。細胞または組織は、動物、昆虫、微生物から得られた細胞または組織、あるいはこれらの生物から樹立された培養細胞などを含む。ペプチドを有する細胞または組織とは、該ペプチドを含むペプチド、ポリペプチド、糖、脂質、核酸、有機化合物を発現している細胞または組織が含まれる。あるいは細胞または組織が発現しているペプチド、ポリペプチド、糖、脂質、核酸、有機化合物を人工的に該ペプチドに結合させたものを検出または定量することにも用いることができる。人工的に該ペプチドを結合する方法は、上述と同様に、遺伝子工学的に結合させる方法、物理的方法または化学的方法など、公知の方法が用いられる。【０１３３】
本発明のペプチドまたは該ペプチドを一部に有する分子の検出試薬または定量試薬は、本発明の検出方法または定量方法を実施するために用いられ、該方法が実施できる構成要素を含むペプチドの検出試薬または定量試薬の各構成要素と実質的に同一、またはその一部と実質的に同一な物質が含まれていれば、構成または形態が異なっていても、本発明の試薬に包含される。【０１３４】
（Ｂ）２種類の標識物質を用いるホモジニアスオープンサンドイッチ法
本発明のホモジニアスオープンサンドイッチ法としては、ＶＨポリペプチドに標識物質１を、ＶＬポリペプチドに標識物質１とは異なる標識物質２をそれぞれ結合し、標識物質１と標識物質２の相互作用の変化量を検出する方法によっても可能である。該標識物質の好適な態様としては例えば、蛍光物質があげられる。励起光を受光することによって生じた蛍光エネルギーが、近接する異なる蛍光物質の蛍光エネルギーとして利用される。この現象は蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ:fluorescence resonance energy transfer）と呼ばれ、２種類の蛍光物質が１〜１０ｎｍまで近接することにより起こる現象である。ＦＲＥＴが起きる蛍光物質の組み合わせとしては、一方の蛍光波長のスペクトルが、他方の励起波長のスペクトルと重なりがあることが必要である。物質としては、低分子有機蛍光色素、無機化合物、ポリペプチドなどがあげられる。低分子有機蛍光色素としては、例えばＣｙ３とＣｙ５の組み合わせがあげられる。無機化合物としては例えばｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ（Science, 281,2016-2018, 1998）があげられる。ポリペプチドとしては、蛍光蛋白質があげられ、例えばクラゲの発光蛋白質あるいはこれらの改変蛋白質があげられる。【０１３５】
また、該標識物質の組み合わせの態様として、化学発光を生じる酵素と蛍光物質の組み合わせをあげることができる。ＢＲＥＴ（bioluminescence resonance energy transfer）はこれに相当する態様である。例えば、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）が基質を分解して生じる発光のスペクトルが、蛍光物質の励起スペクトルと重なる場合に可能である。基質として例えばＤｅｅｐＢｌｕｅＣ（パッカードバイオサイエンス社）を使用すると、Ｒｌｕｃの分解によって３９５ｎｍの光を生じ、これがGreen Fluorescence Protein（ＧＦＰ）に近接する場合エネルギー移動し、５１０ｎｍの波長の光として検出することが可能である。【０１３６】
また、該標識物質の組み合わせの態様としては、標識物質１と標識物質２が近接して、ある配向性をもって結合したときに酵素活性を生じる物質の組み合わせであってもよい。これは例えば、標識物質の組み合わせとしてβガラクトシダーゼのサブユニットの組み合わせ（Yokozeki, Tら、Anal. Chem., 74, 2500-2504, 2002）をあげることができる。好適な態様としては、ＶＨポリペプチドまたはＶＬポリペプチドの一方をβガラクトシダーゼのΔαサブユニットの融合蛋白質とし、他方をβガラクトシダーゼのΔωサブユニットの融合蛋白質とする態様があげられる。別の態様として、Ｒｌｕｃを２つのドメイン（Ｎ末端側ドメインとＣ末端側ドメイン）に分割し、各々をＶＨポリペプチドまたはＶＬポリペプチドの融合蛋白質とする態様でも可能である（Anal. Chem., 75, 4176-4181, 2003）。【０１３７】
２種類の標識物質を用いるホモジニアスオープンサンドイッチ法を用いた検出試薬または定量試薬の構成要素としては、標識化された抗ペプチドモノクローナル抗体由来のVHポリペプチド、標識化された抗ペプチドモノクローナル抗体由来のＶＬポリペプチドなどがあげられ、また必要に応じ、生体試料の希釈液、反応緩衝液、該ペプチドの標準物質、非特異的反応阻害剤などを含む、キットの形態であっても良い。標識物質が酵素の場合には、酵素の基質などが追加される。【０１３８】
本発明の測定キットの最良の態様としては例えば、標識化ＶＨポリペプチド含有液と、標識化ＶＬポリペプチド含有液と、被験サンプルと２種の標識化ポリペプチドの反応場である反応緩衝液との３つの液剤で構成されていてもよいが、前記２種の標識化ポリペプチド含有液があらかじめ混合された混合液であってもよく、また、前記３つの液剤が混合された混合液であってもよい。非特異的反応阻害剤は、前記２種の含有液に添加されていてもよく、あるいは測定キットを構成する他の試薬（前記２種の含有液および前記反応緩衝液以外の試薬）に添加されていてもよい。測定キットを構成するそれぞれの試薬は容器等に収容され、本発明の実施に供されるときに適宜希釈して使用される。【０１３９】
生体試料の希釈液、反応緩衝液、洗浄液、該ペプチドの標準物質に好適な態様は、（１）オープンサンドイッチＥＬＩＳＡ法で述べた態様を適応することが可能である。【０１４０】
非特異的反応阻害剤としては、蛋白質の凝集抑制効果のあるものであれば何であってもよく、例えば、ゼラチン、アルブミン等の蛋白質；グリコール類；ポリアニオン類；Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミド；低級アルキルスルホキシド、界面活性剤、キレート剤、還元剤などを挙げることができる。界面活性剤としては、任意の化合物が使用可能であるが、例えばツイーン−２０、トライトンＸ−１００などがあげられる。キレート剤としては任意の化合物が使用可能であるが、例えばＥＧＴＡ，ＥＤＴＡあるいはこれらの類縁体があげられる。還元剤は、グルタチオン、メルカプトエタノール、ジチオスライトールなどのＳＨ化合物があげられる。【０１４１】
酵素の基質としては、酵素の種類によって（１）オープンサンドイッチＥＬＩＳＡ法で述べた態様の中から任意の態様を選ぶことができる。例えば、酵素がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼである場合には、σ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシドなどを基質として吸光度を測定する態様、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシドなどを基質として蛍光を測定する態様があげられる。あるいは、酵素がＲｌｕｃである場合には、セレンテラジンまたはその類似化合物などを基質として発光度を測定する態様があげられる。【０１４２】
標識物質の検出手段としては、標識物質に応じて適切なものを選ぶことができる。すなわち、標識物質が発色物質すなわちある波長の光を吸収する物質の場合には、分光光度計やマルチウェルプレートリーダーなどを用いることができる。標識物質が蛍光物質の場合には、蛍光光度計や蛍光マルチウェルプレートリーダーなどを用いることができる。標識物質が発光物質の場合には、発光光度計や発光マルチウェルプレートリーダーなどを用いることができる。【０１４３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【０１４４】
抗ヒトオステオカルシンペプチド抗体の作製
（１）免疫原の調製
ヒトオステオカルシンの部分ペプチドとして、配列番号１および２それぞれのアミノ酸配列からなるペプチド（以下、それぞれＯＣ−１ペプチド、ＯＣ−２ペプチドとする。また、両者をまとめてＯＣペプチドと表記する）を株式会社ペプチド研究所にて委託合成をした。配列番号１は、ヒトオステオカルシンのアミノ酸配列（配列番号３）のＣ末端部分３８〜４９位のアミノ酸１２残基からなる配列、配列番号２は、ヒトオステオカルシンのアミノ酸配列のＮ末端部分１〜１３位の配列のＣ末端にシステインを付加したアミノ酸１４残基からなる配列にそれぞれ相当する。ＯＣ−１ペプチドおよびＯＣ−２ペプチドをそれぞれ以下の方法でＫＬＨにコンジュゲートした。ＯＣペプチド４．８ｍｇを１ｍｌの０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に溶解し、ここに０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸バッファー（ｐＨ  ７．０）にＫＬＨを２０ｍｇ／ｍＬになるよう溶解した溶解液を１ｍＬ添加し、攪拌した。６０ｍｇのＥＤＣと、１１．５ｍｇ／ｍＬになるようＮＨＳをＮ，Ｎ−ジメチルフォルムアミドに溶解した液１５０μＬを順次添加し、室温で８時間転倒混和した後、ＰＢＳで、４℃で３回透析した。得られたＯＣペプチドコンジュゲートＫＬＨの濃度は、２８０ｎｍの吸光度で測定した。【０１４５】
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
実施例１（１）で得られた２種類のＯＣペプチドコンジュゲートＫＬＨそれぞれをＰＢＳ  １ｍＬに溶解し、フロイントの完全アジュバンド〔ＭＰバイオメディカルズ（MP Biomedicals）社製〕とともに、１匹あたり０．４ｍｇのＯＣペプチドコンジュゲートＫＬＨを５週令雌マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）の腹腔内に投与した。３週間後に最終免疫として再び、フロイントの不完全アジュバンド（ＭＰバイオメディカルズ社製）とともに１匹あたり０．５ｍｇのＯＣペプチドコンジュゲートＫＬＨを腹腔内に投与した。上記の免疫マウスより採血し、その血清抗体価を以下（３）に示す酵素免疫測定法で調べ、十分な抗体価を示したマウスから最終免疫の３日後に脾臓を摘出した。【０１４６】
脾臓をＭＥＭ（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐした後、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）して細胞を沈降させた。上清を捨て、細胞をトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理して赤血球を除去した後、ＭＥＭで３回洗浄し、（５）の細胞融合に用いた。【０１４７】
（３）酵素免疫測定法
アッセイ用の抗原として、実施例１（１）のＯＣペプチドコンジュゲートＫＬＨの作製と同様な方法で、ＢＳＡをＫＬＨの代わりに用いて、ＯＣペプチドコンジュゲートＢＳＡを作製した。９６ウェルの酵素免疫測定法（ＥＩＡ）用プレートに、ＰＢＳに溶解した１０μｇ／ｍＬのＯＣペプチドコンジュゲートＢＳＡを５０μＬ／ウェルずつ分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。洗浄後、１％のＢＳＡ含有ＰＢＳを１００μＬ／ウェルずつ加え、室温１時間反応させた。ＢＳＡ含有ＰＢＳを捨て、０．１％のＢＳＡ含有ＰＢＳにて適宜希釈した被免疫マウス抗血清を５０μＬ／ウェルずつ分注し室温で１時間反応させた。０．１％のツイーン２０含有ＰＢＳで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリン（ダコ社）を５０μＬ／ウェルずつ加えて室温で１時間反応させた。ツイーン２０含有ＰＢＳで洗浄後、過酸化水素含有ｏ−フェニレンジアミン基質液（シグマ社製）を５０μＬ／ウェルずつ加えて発色させ、次いで２．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸を５０μＬ／ウェルずつ加えて反応を停止させた。４９２ｎｍの吸光度（以下、ＯＤ４９２などと表記する）をプレートリーダー（ＭＴＰ−１２０；コロナ電機社製）にて測定した。対照波長は６６０ｎｍとした。【０１４８】
（４）マウス骨髄腫細胞の調製
８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Curr. Top. Microbiol. Immunol., 81, 1-7, 1978）を正常培地で培養し、細胞融合時に７×１０６以上の細胞を確保し、細胞融合に供した。【０１４９】
（５）ハイブリドーマの作製
実施例１（２）で得られたマウス脾細胞と（４）で得られた骨髄腫細胞とを１０：１になるよう混合し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、３７℃で、ＰＥＧ−１０００  ２ｇ、ＭＥＭ  ２ｍＬおよびジメチルスルホキシド  ０．７ｍＬの混液を１×１０８個マウス脾細胞当たり０．２〜１ｍＬを加え、１〜２分間毎にＭＥＭ  １〜２ｍＬを数回加えた後、ＭＥＭを加えて全量が５０ｍＬになるようにした。９００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吸出しでゆるやかに細胞をＨＡＴ培地１００ｍＬ中に懸濁した。【０１５０】
この懸濁液を９６ウェル培養用プレートに１００μＬ／ウェルずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１０〜１４日間培養した。この培養上清を下記（６）に記載した競合阻害法で調べ、ＯＣペプチドによってＯＣペプチドコンジュゲートＢＳＡとの反応が阻害されるウェルの細胞を選び、さらにＨＴ培地、続いて正常培地を用いる２回クローニングを行って、抗ＯＣペプチドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを確立した。【０１５１】
以上の方法により、ＯＣ−１ペプチド、ＯＣ−２ペプチドそれぞれを抗原ペプチドとして免疫したマウスから、ＯＣ−１ペプチドに特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマおよびＯＣ−２ペプチドに特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマ１株ずつが確立され、それぞれＫＴＭ−２１９株、ＫＴＭ−２２３株と名付けた。以下、ハイブリドーマＫＴＭ−２１９株が産生するＯＣ−１ペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体をＫＴＭ−２１９と、ハイブリドーマＫＴＭ−２２３株が産生するＯＣ−２ペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体をＫＴＭ−２２３と表記する。また、ＫＴＭ−２１９およびＫＴＭ−２２３は、ヒトオステオカルシンに特異的に結合するモノクローナル抗体であり、ＫＴＭ−２１９は、ヒトオステオカルシンのアミノ酸配列（配列番号３）の３８〜４９位の連続するアミノ酸の配列、ＫＴＭ−２２３は、ヒトオステオカルシンのアミノ酸配列（配列番号３）の１〜１３位の連続するアミノ酸の配列にそれぞれエピトープを有する。【０１５２】
（６）競合阻害法
９６ウェルのＥＩＡ用プレートに、ＰＢＳに溶解した１０μｇ／ｍＬのＯＣペプチドコンジュゲートＢＳＡを５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。陰性対照ウェルとして、ＯＣペプチドコンジュゲートＢＳＡを吸着させないウェルを作製した。洗浄後、１％のＢＳＡ含有ＰＢＳを１００μＬ／ウェルで加え、室温１時間反応させた。ＢＳＡ含有ＰＢＳを捨て、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳにて適宜希釈したＯＣペプチド含有液（２５μＬ／ウェル）と、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳにて適宜希釈した抗ＯＣペプチドモノクローナル抗体の培養上清もしくは精製モノクローナル抗体（５０μＬ／ウェル）を分注し室温で１時間反応させた。陽性対照ウェルとして、ＯＣペプチドを含有しない０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（２５μＬ／ウェル）と、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳにて適宜希釈した抗ＯＣペプチドモノクローナル抗体の培養上清もしくは精製モノクローナル抗体（５０μＬ／ウェル）を分注し室温で１時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリン（ダコ社）を５０μＬ／ウェルで加えて室温、１時間反応させ、Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで洗浄後過酸化水素含有ｏ−フェニレンジアミン基質液（シグマ社）を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、次いで２．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸を５０μＬ／ウェルで加えて反応を停止させた。４９２ｎｍの吸光度（以下、ＯＤ４９２などと表記する）をプレートリーダー（ＭＴＰ−１２０；コロナ電機社）にて測定した。対照波長は６６０ｎｍとした。【０１５３】
（６）モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した８週令ヌード雌マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）に実施例１（５）で得られたハイブリドーマ株を５〜２０×１０６細胞／匹それぞれ腹腔内注射した。１０〜２１日後に、ハイブリドーマは腹水癌化した。腹水のたまったマウスから、腹水を採取（１〜８ｍＬ／匹）し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）して固形分を除去した。得られた腹水は、カプリル酸沈殿法［Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,（1988）］により精製し、精製モノクローナル抗体とした。【０１５４】
抗体のサブクラスはサブクラスタイピングキット（ＺＹＭＥＤ社）を用いて酵素免疫測定法により行ない決定した。ＫＴＭ−２１９およびＫＴＭ−２２３はともに抗体サブクラスはＨ鎖がＩｇＧ１でかつＬ鎖がκであった。
【実施例２】
【０１５５】
ＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドの調製
（１）ＫＴＭ−２１９のＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドをそれぞれコードするＤＮＡの調製
ＫＴＭ−２１９のＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドをそれぞれコードするＤＮＡを、以下のようにして調製した。まず、ＫＴＭ−２１９を産生するハイブリドーマＫＴＭ−２１９株より常法に基づき、ＲＮＡを抽出精製した。このＲＮＡを鋳型とし、下記のプライマーを用いて、キアゲン・ワンステップＲＴ−ＰＣＲキット（QIAGEN OneStep RT-PCR Kit）により、添付のプロトコルに従って逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。
フォワードプライマーとしてマウスイムノグロブリン重鎖のフレームワーク１（ＦＲ１）領域に対する縮重プライマーＭＨ１Ｂａｃｋ（配列番号１４）およびＭＨ２Ｂａｃｋ（配列番号１５）の等量混合物を、リバースプライマーとしてマウスＩｇＧ重鎖定常領域に対するプライマーであるマウスＩｇＧ  ＶＨ３’−２（配列番号１６、Novagen-Merck社製、マウスＩｇプライマーセット）を用いて、マウスＩｇＧの重鎖定常領域の一部を含むＶＨポリペプチドをコードするＤＮＡを増幅した。またフォワードプライマーとしてマウスイムノグロブリンκ鎖のＦＲ１領域に対する縮重プライマーであるＶｋ４ＢｋＦＬ２（配列番号１７）を、リバースプライマーとしてマウスイムノグロブリンκ鎖定常領域に対するプライマーであるＭＫＣＦｏｒ（配列番号１８）を用いて、マウスイムノグロブリンκ鎖定常領域の一部を含むＶＬポリペプチドをコードするＤＮＡを増幅した。プライマーは、それぞれの配列番号の配列からなるＤＮＡを化学合成したものを用いた。なおＲＴ−ＰＣＲの反応条件は５０℃で３０分間の逆転写反応の後、９４℃で１５分間の変性反応を行い、その後９４℃で３０秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で１分間を１サイクルとする反応を３０サイクル行い、最後に７２℃で６分間の伸張反応を行った。そして、それぞれのＲＴ−ＰＣＲで増幅された約４５０ｂｐのｃＤＮＡ断片を１．５％アガロースゲル電気泳動で分離し、ウィザードＳＶゲル・アンドＰＣＲクリーンアップ・システム（Wizard SV gel and PCR Clean-Up System、プロメガ社製）を用いて精製した。【０１５６】
得られたｃＤＮＡ断片の塩基配列を決定したところ、ＫＴＭ−２１９のＶＨをコードする領域は配列番号４の塩基配列を有し、配列番号５のアミノ酸配列をコードすること、ＶＬをコードする領域は配列番号６の塩基配列を有し、配列番号７のアミノ酸配列をコードすることが明らかになった。また、ＫＴＭ−２１９のＶＨ領域のＣＤＲ１、２および３は、それぞれ配列番号５のアミノ酸配列の３１〜３５位、５０〜６６位および９９〜１０５位の領域であり、ＶＬ領域のＣＤＲ１、２および３は、それぞれ配列番号７のアミノ酸配列の２４〜３９位、５５〜６１位および９４〜１０２位の領域であった。ＫＴＭ−２１９のＶＨ領域のＣＤＲ１、２および３ならびにＶＬ領域のＣＤＲ１、２および３のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号８〜１３に示した。【０１５７】
（２）ｓｐＦｖファージミドベクターへのクローニング
ＫＴＭ−２１９のＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドをＭ１３ファージを利用して発現させるため、以下のようにしてｓｐＦｖファージミドベクターｐＫＳＴ２（Anal. Chem., 75, 4057-4064, 2003）にサブクローニングした。ｐＫＳＴ２は、プロモーターの下流に、リボゾーム結合配列、シグナルペプチドをコードする配列、ＳｆｉＩサイト、ＮｏｔＩサイト、Ｈｉｓ−ｍｙｃタグをコードする配列、アンバー終止コドン、Ｍ１３ファージコート蛋白質ｐ７をコードする配列を有する。ｐＫＳＴ２のｓｆｉＩとＮｏｔＩ間にＶＨポリペプチドをコードする配列、Ｍ１３ファージコート蛋白質ｐ９をコードする配列、リボゾーム結合配列、シグナルペプチドをコードする配列、ＶＬポリペプチドをコードする配列を挿入することにより、プロモーターの下流に（Ａ）リボゾーム結合配列−シグナルペプチド／ＶＨポリペプチド／ｐ９融合蛋白質をコードする配列および（Ｂ）リボゾーム結合配列−シグナルペプチド／ＶＬポリペプチド／Ｈｉｓ−ｍｙｃタグをコードする配列−アンバー終止コドン−ｐ７をコードする配列を有するファージミドが構築できる。得られたファージミドでE.coliを形質転換した後、ヘルパーファージ感染により、ファージ粒子を得ることができる。E.coliがアンバーサプレッサー株の場合、アンバー終止コドンが一定の割合でグルタミンに翻訳されるため、ＶＨポリペプチド／ｐ９の融合蛋白質と共に、ＶＬポリペプチド／Ｈｉｓ−ｍｙｃタグ／ｐ７の融合蛋白質がファージ粒子上に提示される。一方、非サプレッサー株の場合は、ＶＨポリペプチド／ｐ９の融合蛋白質はファージ粒子上に提示されるが、ＶＬポリペプチド／Ｈｉｓ−ｍｙｃタグはｐ７との融合蛋白質にはならないため、ファージ粒子上には提示されず、培地中に分泌される。【０１５８】
まず（１）で得られた、ＫＴＭ−２１９のＶＨポリペプチドコードするＤＮＡを鋳型にしてフォワードプライマーＭＨ２Ｂａｃｋ（配列番号１５）およびリバースプライマーＶＨ１Ｆｏｒ−２Ｘ（配列番号１９、Anal. Chem., 75, 4057-4064, 2003）を用いて、ＶＨポリペプチドをコードするＤＮＡを、また（１）で得られた、ＫＴＭ−２１９のＶＬポリペプチドコードするＤＮＡを鋳型にしてフォワードプライマーＭｋＢａｃｋ（配列番号２０）およびリバースプライマーＭＪＫ２ＦＯＮＸ（配列番号２１、Antibody Engineering: a Practical Approach, IRL Press, 1996）を用いてＶＬポリペプチドをコードするＤＮＡをそれぞれＥｘ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ(宝バイオ社)を用いたＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲの反応条件は，９４℃で３分間の変性反応の後、９４℃で３０秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で１分間を１サイクルとする反応を３０サイクル行い、最後に７２℃で６分間伸張反応を行った。またこれと同時に、ｐ９をコードする配列、リボゾーム結合配列およびＯｍｐＡシグナルペプチドをコードする配列を含むリンカーＤＮＡを、フォワードプライマーＯｌｉｎｋＢａｃｋ２（配列番号２２）およびリバースプライマーＯｌｉｎｋＦｏｒ（配列番号２３）、ならびに鋳型としてｐＫＳＴ２(HyHEL10)（Anal. Chem., 75, 4057-4064, 2003）を用いて同様に増幅した。（１）と同様に、増幅断片をアガロースゲル電気泳動で分離後、精製した。【０１５９】
得られたＶＨポリペプチドをコードするＤＮＡ、ＶＬポリペプチドをコードするＤＮＡおよびリンカーＤＮＡを、プライスオーバーラップ伸張ＰＣＲ法（Biotechniques, 8, 528-535, 1990）によりリンカーＤＮＡの末端の共通する配列を介してＶＨ−リンカー−ＶＬの順に結合した構造の０．９ｋｂの断片に一本化した。具体的には、ＶＨポリペプチドをコードするＤＮＡ、ＶＬポリペプチドをコードするＤＮＡおよびリンカーＤＮＡを混合し、プライマーを添加せずにＰＣＲを、９４℃で３分間の変性反応の後、９４℃で３０秒間、５６℃で４５秒間、７２℃で９０秒間を１サイクルとする反応を８サイクル行い、最後に７２℃で８分間の伸張反応という条件で行い、３つのＤＮＡ断片がＶＨ−リンカー−ＶＬの順に結合した構造のＤＮＡ断片を増幅させた。さらに、プライマーＭＨ２Ｂａｃｋｓｆｉ（配列番号２４）およびＪＫ２Ｎｏｔ１０（配列番号２５）を添加し、上記と同様の条件で３０サイクルの反応のＰＣＲを行い、５’端にＳｆｉＩサイトおよび３’端にＮｏｔＩサイトを付加した。増幅断片をアガロースゲル電気泳動で分離した後、精製した。精製した増幅断片は制限酵素ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩで切断し，再度アガロースゲル電気泳動で分離した後、精製した。この増幅断片と同様にＳｆｉＩおよびＮｏｔＩで切断したｐＫＳＴ２とライゲーションさせ、ＫＴＭ−２１９のＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドを発現するためのｓｐＦｖファージミドベクターｐＫＳＴ２／ＫＴＭ２１９を作製した。図１にｐＫＳＴ２／ＫＴＭ２１９のプロモーターの下流の構造を示した。実施例２で用いられたプライマーを表１に示した。【０１６０】
【表１】
2006033413.tif 000002
【０１６１】
（３）ＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドの調製
前項で得たｓｐＦｖファージミドベクターｐＫＳＴ２／ＫＴＭ２１９を、アンバーサプレッサー株であるE. coliＴＧ１株（supE, hsdΔ5, thi, Δ(lac-proAB)，／Ｆ’[traD36, proAB+, lacIq, lacZΔM15]）あるいは非サプレッサー株であるＨＢ２１５１株（ara, Δ(lac-proAB), thi/F'proAB+, lacIq, lacZΔM15）（アマシャム・バイオサイエンシズ社）に形質転換した。形質転換細胞を２×ＴＹＡＧ（１６ｇ／Ｌトリプトン、１０ｇ／Ｌイーストエキス、５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、１００μｇ／ｍＬアンピシリン、１％グルコース、ｐＨ７．０）アガープレート（１．５％寒天を含む２×ＴＹＡＧ）で３７℃で一晩培養したのち、シングルコロニーのいくつかをそれぞれ４ｍＬの２×ＴＹＡＧ培地で３７℃で一晩培養した。この一部を新鮮な２×ＴＹＡＧ培地に移して、３７℃で６００ｎｍの吸光度（ＯＤ６００）が約０．５になるまで振盪培養した。ここでヘルパーファージＭ１３ＫＯ７をｍ．ｏ．ｉ  (multiplicity of infection)が２０になるように加え、３７℃で３０分間静置した。その後菌体を２，０００ｇで１５分遠心して回収し、２×ＴＹＡＫ培地（１６ｇ／Ｌトリプトン、１０ｇ／Ｌイーストエキス、５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、１００μｇ／ｍＬアンピシリン、５０μｇ／ｍＬカナマイシン）に再懸濁して２５０ｒｐｍで３０℃、１６時間振盪培養した。【０１６２】
ＴＧ１株を宿主とした場合は、培養液を１０，８００ｇで１０分間遠心分離し、ＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドを提示するＭ１３ファージを含む上清を回収した。この上清に１／５容の２０％ポリエチレングリコール／２．５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを加えてファージを沈殿させた。４℃で１時間放置した後、１１，５００ｇで１５分間遠心分離し、ペレットをＰＢＳに再懸濁させ４℃で保存した。ＨＢ２１５１株を宿主とした場合は、培養液を  １０，８００ｇで１０分間遠心分離し、ＶＨポリペプチドを提示するＭ１３ファージおよびＨｉｓ−ｍｙｃタグが付加したＶＬポリペプチドを含む上清を４℃で保存した。
【実施例３】
【０１６３】
オープンサンドイッチＥＬＩＳＡ法によるヒトオステオカルシンおよびＯＣ−１ペプチドの測定
（１）ＶＨポリペプチドとＶＬポリペプチドの結合性の確認
実施例２（３）で、E. coli ＴＧ１株を宿主として得られたＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドを提示するＭ１３ファージ（以下、ＶＨ／ＶＬ提示ファージと表記する）を用いて、ＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドのヒトオステオカルシンに対する特異的な結合性が保持されていることを、以下のＥＬＩＳＡで確認した。【０１６４】
９６ウェルマイクロプレート（ファルコン３９１４、ベクトン・ディキンソン社製）に１ウェルあたり１００μＬのＰＢＳに溶解した各濃度のヒトオステオカルシン（プリンストン・バイオモレキュールズ社製）を入れ、３７℃で１時間静置してこれを吸着させた。次いで、ＰＢＳで２５％に希釈したブロックエース（Block Ace、大日本製薬社製）（以下、２５％ＢＰＢＳと表記する）で３７℃で１時間、非特異吸着サイトのブロッキングを行った。その後マイクロプレートを０．１％ツイーン−２０を含むＰＢＳ（以下ＰＢＳＴと略す）で３回洗浄し、各ウェルに１０％ＢＰＢＳで１００倍に希釈したＶＨ／ＶＬ提示ファージを１００μＬ加え、２５℃で９０分間反応させた。次にＰＢＳＴによる３回洗浄のあと各ウェルに１０％ＢＰＢＳで５０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識マウス抗Ｍ１３抗体（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）を１００μＬ加え、２５℃で９０分間反応させた。最後にＰＢＳＴでマイクロプレートを６回洗浄し、各ウェルあたり１００μＬの基質溶液（１００ｍＭ酢酸ナトリウム、１００μｇ／ｍＬ３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（以下ＴＭＢと略す、シグマ・アルドリッチ社製）、０．０４μＬ／ｍｌ過酸化水素水、ｐＨ６．０）を加えて１０〜３０分おいた。そして反応をウェルあたり５０μＬの１ｍｏｌ／Ｌ硫酸で停止し，モデル６８０マイクロプレートリーダー（バイオラッド社）で６５５ｎｍを対照として  ４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図２に示した。その結果、ヒトオステオカルシンの濃度依存的に吸光度の上昇が見られ、ＫＴＭ−２１９のＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドは、ヒトオステオカルシンに対する特異的な結合性を有していることが確認された。【０１６５】
（２）オープンサンドイッチＥＬＩＳＡによるＯＣ−１ペプチドおよびヒトオステオカルシンの測定
実施例２（３）で、ｐＫＳＴ２／ＫＴＭ２１９で形質添加したE. coli ＨＢ２１５１株から得られた、ＫＴＭ−２１９のＶＨポリペプチドを提示するＭ１３ファージ、すなわちＭ１３ファージで標識したＶＨポリペプチドおよびＨｉｓ−ｍｙｃタグが付加したＫＴＭ−２１９のＶＬポリペプチド含む培養上清を用いて、ヒトオステオカルシンおよびＯＣ−１ペプチドのオープンサンドイッチＥＬＩＳＡによる測定を、以下のようにして行った。【０１６６】
ファルコン３９１４マイクロプレートに、１ウェルあたり１００μＬのＰＢＳに溶解した０．５μｇ／ｍＬ抗Ｈｉｓタグ抗体Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ（キアゲン社）を分注し，４℃で一晩静置して吸着させた後、２５％ＢＰＢＳで２５℃２時間ブロッキングした。ＰＢＳＴによる３回洗浄のあと各ウェルに測定試料として、１０％ＢＰＢＳで各濃度になるよう希釈したヒトオステオカルシンあるいはＯＣ−１ペプチド（キアゲン社）を１００μＬずつ加えたのち、実施例２（３）で調製したｐＫＳＴ２／ＫＴＭ２１９で形質添加したE. coli ＨＢ２１５１株の培養上清を１０μＬずつ加えてゆるやかに振盪させて混合し、室温で２時間反応させた。この反応において、抗Ｈｉｓタグ抗体を介してＨｉｓ−ｍｙｃタグ付加ＶＬポリペプチドがウェルに固定化され、固定化されたＶＬポリペプチドに添加したヒトオステオカルシンあるいはＯＣ−１ペプチドが結合し、さらにこのヒトオステオカルシンあるいはＯＣ−１ペプチドにＭ１３ファージで標識されたＶＨポリペプチドが結合する。ＰＢＳＴにより３回洗浄し、各１００μＬの１０％ＢＰＢＳ中で５０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗Ｍ１３抗体を加え２５℃９０分反応させた。６回のＰＢＳＴによる洗浄の後、実施例３の（１）と同様に、各ウェルあたり１００μＬのＴＭＢを含む基質溶液を加えて１０〜３０分おいた。そして反応をウェルあたり５０μＬの１ｍｏｌ／Ｌ硫酸で停止し、モデル６８０マイクロプレートリーダーで６５５ｎｍを対照波長として４５０ｎｍの吸光度を測定した。ヒトオステオカルシンの測定結果を図３に、ＯＣ−１ペプチドの測定結果を図４に示した。測定試料中に測定対象のペプチドが存在しないときの吸光度の値はそれぞれヒトオステオカルシンが０．２７８、ＯＣ−１ペプチドが０．１４３であった。ＯＣ−１ペプチドおよびヒトオステオカルシンともに、測定試料中の濃度依存的に吸光度の上昇がみられ、オープンサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定できることが確認された。図３よりオステオカルシンの測定範囲は１〜５００ｎｇ／ｍＬであり、図４よりＯＣ−１ペプチドの測定範囲は０．１〜５０ｎｇ／ｍＬであった。また、濃度が不明なヒトオステオカルシンまたはＯＣ−１ペプチドを含む試料を測定する場合は、上記の方法で、ヒトオステオカルシンあるいはＯＣ−１ペプチドの代わりに試料を添加して測定を行い、得られた吸光度と上記で得られた検量線から濃度を求めることができる。【０１６７】
（３）競合阻害ＥＬＩＳＡによるＯＣ−１ペプチドの測定
ファルコン３９１４マイクロプレートに１ウェルあたり１００μＬのＰＢＳで希釈した２μｇ／ｍＬヒトオステオカルシンを加え、３７℃で１時間おいた後、２５％ＢＰＢＳで３７℃１時間ブロッキングし、ＰＢＳＴにより１回洗浄した。測定試料として１０％ＢＰＢＳで段階希釈したＯＣ−１ペプチドと、０．５μｇ／ｍＬのＫＴＭ−２１９溶液を混合させた後，混合液各１００μＬをマイクロプレートに２ウェルずつアプライし，室温で２時間反応させた。ＰＢＳＴにより３回洗浄し，１０％ＢＰＢＳ中０．２μｇ／ｍＬに希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体１００μＬを加え２５℃９０分間反応させた。６回のＰＢＳＴによる洗浄の後、実施例３の（１）と同様に酵素反応と吸光度測定を行った。実験結果を図５に示した。図５の実験において測定試料中にＯＣ−１ペプチドが存在しないときの吸光度の値はそれぞれ２．２８であった。図５よりＯＣ−１ぺプチドの測定範囲は５〜２０００ｎｇ／ｍＬであった。【０１６８】
以上より、オープンサンドイッチＥＬＩＳＡ法は、競合阻害ＥＬＩＳＡ法に比較して、最小検出感度が低値にまで及び、測定範囲が広がることが確認された。【０１６９】
（４）サンドイッチＥＬＩＳＡによるオステオカルシンの測定
実施例１で得られた、エピトープの異なるヒトオステオカルシンと特異的に反応するモノクローナル抗体ＫＴＭ−２１９およびＫＴＭ−２２３を利用して、ヒトオステオカルシンのサンドイッチＥＬＩＳＡを行い、オープンサンドイッチＥＬＩＳＡと比較した。【０１７０】
ファルコン３９１４マイクロプレートに、１ウェルあたり０．５μｇ／ｍＬのモノクローナル抗体ＫＴＭ−２１９を分注し、３７℃で１時間静置して吸着させた後、２５％  ＢＰＢＳで３７℃１時間ブロッキングした。ＰＢＳＴによる１回洗浄の後、各ウェルに測定試料として、１０％ＢＰＢＳで各濃度になるよう希釈したヒトオステオカルシンを１００μＬずつ加え、室温で１．５時間反応させた。ＰＢＳＴにより３回洗浄した後、１０％ＢＰＢＳで０．３μｇ／ｍＬの濃度に調製したビオチン標識したモノクローナル抗体ＫＴＭ−２２３を１００μＬを加え、室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴにより３回洗浄した後、１０％ＢＰＢＳで２０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識アビジンを加え室温で１時間反応させた。３回のＰＢＳＴによる洗浄の後、実施例３の（１）と同様に酵素反応と吸光度測定を行った。実験結果を図６に示した。また、上記と同様の方法で、プレートに固定化するモノクローナル抗体をＫＴＭ−２２３にし、ビオチン標識したモノクローナル抗体ＫＴＭ−２１９を添加した場合の結果を図７に示した。図６より、ＫＴＭ−２１９を固定化し、標識ＫＴＭ−２２３を用いた場合のサンドイッチＥＬＩＳＡの測定範囲は０．０１〜５ｎｇ／ｍＬであり、図７より、ＫＴＭ−２２３を固定化し、標識ＫＴＭ−２１９を用いた場合のサンドイッチＥＬＩＳＡの測定範囲は０．０５〜５ｎｇ／ｍＬであった。【０１７１】
オープンサンドイッチＥＬＩＳＡは、サンドイッチＥＬＩＳＡと比較して測定範囲の上限の濃度が高く、またその測定範囲の幅は同程度もしくは広いものであった。実際の血中のオステオカルシンを測定する場合の基準値は２．５ｎｇ／ｍＬ程度であり、病的な状態では、血中オステオカルシンの濃度はさらに高くなることが予想される。オープンサンドイッチＥＬＩＳＡ法は、通常のサンドイッチＥＬＩＳＡ法と比較して測定の工程が少なくて簡易なうえ、血中のオステオカルシンの濃度と測定範囲が合っているため、試料の希釈が不要で、より適していると考えられた。
【実施例４】
【０１７２】
ＭＢＰが付加したＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドの調製
ＶＬポリペプチドとして、ＶＬにＭＢＰが付加したＭＢＰ−ＶＬ融合蛋白質を用いることにより、ＶＬポリペプチドを抗Ｈｉｓタグ抗体を介さずに、物理的に直接プレートに固定化できると考えられる。また、標識したＶＨポリペプチドとして、アルカリフォスファターゼと融合させたＶＨ−アルカリフォスファターゼ融合蛋白質（以下、ＶＨ−ＡＰ融合蛋白質と省略する）を用いることにより、ＶＨポリペプチドと結合する酵素標識した抗Ｍ１３抗体の反応が不要となると考えられる。したがって、両者を用いることでオープンサンドイッチ法の工程を簡略化することができると考えられる。このようなオープンサンドイッチ法によるオステオカルシンの測定を目的として、以下のように、ＶＨ−ＡＰ融合蛋白質およびＭＢＰ−ＶＬ融合蛋白質の調製を行った。【０１７３】
（１）ＶＨ−ＡＰ融合蛋白質の調製
以下のようにして、ＶＨ−ＡＰ融合蛋白質発現プラスミドｐＥＴ−ＶＨ２１９−ＡＰを作製した。実施例３で作製したｓｐＦｖファージミドベクターｐＫＳＴ２／ＫＴＭ２１９を鋳型にして、プライマーＭＨ２Ｂａｃｋ−ＥｃｏＲＶ（配列番号２６）およびＶＨ１Ｆｏｒ２−ＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号２７）を用いたＰＣＲにより、ＫＴＭ−２１９のＶＨポリペプチドをコードするＤＮＡを増幅した。増幅断片をＥｃｏＲＶとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、アガロースゲル電気泳動で分離後、精製し、同じくＥｃｏＲＶとＨｉｎｄＩＩＩで切断したプラスミドｐＰｈｏＡ（J. Immunol. Methods, 224, 171-84, 1999）の断片とライゲーションした。ｐＰｈｏＡは、E. coliアルカリフォスファターゼをコードする１４５０ｂｐ断片をベクターｐＥＴ−２０ｂ（ノバジェン、ＥＭＤバイオサイエンシズ社製）のＮｏｔＩサイトに挿入して作製されたプラスミドである。ライゲーション産物をE. coli ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ（ストラタジーン社製）に形質転換し、ＬＢＡＧ寒天培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌイーストエキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、１０ｇ／Ｌグルコース、１００μｇ／ｍＬアンピシリン、ｐＨ７．２、１．５％寒天）にて３７℃一晩培養した。得られた数個のコロニーよりプラスミドを調製し，正しい配列を持つものを選択して、ｐＥＴ−ＶＨ２１９−ＡＰと名付けた。ｐＥＴ−ＶＨ２１９−ＡＰはプロモーターの下流に図８に示す構造を有し、宿主のペリプラズムに、ＫＴＭ−２１９のＶＨポリペプチド／アルカリフォスファターゼ／ＨｉｓタグからなるＶＨ−ＡＰ融合蛋白質を発現するためのプラスミドである。【０１７４】
このプラスミドｐＥＴ−ＶＨ２１９−ＡＰでE. coli ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株を形質転換し，３７℃で一晩ＬＢＡＧ寒天培地で培養したのち、シングルコロニーを４ｍＬのＬＢＡＣ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌイーストエキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、１００μｇ／ｍＬアンピシリン、３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコール、ｐＨ７．２）で３０℃一晩培養し、この培養液３ｍＬを２本の１５０ｍＬのＬＢＡＣ液体培地に移し、３０℃でＯＤ600が０．６〜０．８になるまで培養した。培養液に終濃度０．２ｍｍｏｌ／ＬのＩＰＴＧを添加して、ＶＨ−ＡＰ融合蛋白質の発現を誘導した後、さらに１８〜２４時間２０℃で培養した。【０１７５】
培養終了後の培養液を、６０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、菌体を回収した。得られた菌体を４０ｍＬの浸透圧ショック液（３０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０％スクロース、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に再懸濁し室温で１０分間ゆるやかに混合したのち、８０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。上清を捨て、菌体に氷冷した５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＳＯ4  １０ｍＬを加え、直ちに再懸濁し、ペリプラズム画分のＶＨ−ＡＰ融合蛋白質を細胞外に放出させた。懸濁液を氷上で２０分間時々混ぜながら置いたのち、８０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、ＶＨ−ＡＰ融合蛋白質を含む上清を回収した。この上清を１Ｌのカラム緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨ2ＰＯ4、１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に対して４℃で一晩透析したのち、１ｍＬ  のＴａｌｏｎ金属キレートカラム（クロンテック製）を用いてメーカーのマニュアルに従い精製を行った。溶出緩衝液（２００ｍｍｏｌ／Ｌイミダゾールを含むカラム緩衝液）を用いて得られた各０．５ｍＬの画分を回収し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ＶＨ−ＡＰ融合蛋白質を含む画分を確認した。ＶＨ−ＡＰ融合蛋白質を含む画分を集めてトリス緩衝塩溶液ＴＢＳ（２５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１３７ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、２．６８ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化したＰＤ−１０カラム（アマシャム・バイオサイエンス社製）を用いて、ＶＨ−ＡＰ融合蛋白質溶液の溶媒をＴＢＳに交換した。以上のようにして精製されたＶＨ−ＡＰ融合蛋白質は、蛋白質濃度をブラッドフォード（Bradford）試薬（バイオラッド社製）を用いて決定し、小分けして−８０℃で保存した。精製ＶＨ−ＡＰ融合蛋白質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは推定分子量である６１．９ｋＤａ付近に単一バンドが認められ、その収量は培養液３００ｍＬ培養から約１．５ｍｇであった。【０１７６】
（２）ＭＢＰ−ＶＬ融合蛋白質の調製
以下のようにして、ＭＢＰ−ＶＬ融合蛋白質発現プラスミドｐＭＡＬ−ＶＬ２１９を作製した。ｓｐＦｖファージミドベクターｐＫＳＴ２／ＫＴＭ２１９を鋳型にして、プライマーＭｋＢａｃｋＥＳ（配列番号２８）およびＭｙｃＦｏｒＨｄ（配列番号２９）を用いたＰＣＲにより、ＫＴＭ−２１９のＶＬポリペプチドおよびＨｉｓ−ＭｙｃタグをコードするＤＮＡを増幅した。増幅断片をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、アガロースゲル電気泳動で分離後、精製し、同じくＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断したＭＢＰ融合蛋白質発現プラスミドｐＭＡＬ−ｐ２（ニュー・イングランド・バイオラブズ社製）の断片とライゲーションした。ライゲーション産物をE. coli ＸＬ１０−Ｇｏｌｄに形質転換し、ＬＢＡＧ寒天培地にて３７℃一晩培養した。得られた数個のコロニーよりプラスミドを調製し，正しい配列を持つものを選択して、ｐＭＡＬ−ＶＬ２１９と名付けた。ｐＭＡＬ−ＶＬ２１９はプロモーターの下流に図９に示す構造を有し、宿主のペリプラズムにＭＢＰ／ＫＴＭ−２１９のＶＬポリペプチド／Ｈｉｓ−ＭｙｃタグからなるＭＢＰ−ＶＬ融合蛋白質を発現するためのプラスミドである。
このプラスミドｐＭＡＬ−ＶＬ２１９でE. coli ＴＧ１株を形質転換し、３７℃で一晩ＬＢＡＧ寒天培地で培養した後、シングルコロニーを４ｍＬのＬＢＡＧ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌイーストエキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、１０ｇ／Ｌグルコース、１００μｇ／ｍＬアンピシリン、ｐＨ７．２）で３０℃一晩培養した。この培養液を２本の２５０ｍＬの０．２％グルコースを含むＬＢＡ培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌイーストエキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、１００μｇ／ｍＬアンピシリン、ｐＨ７．２）に添加し、３０℃でＯＤ600が０．６〜０．８になるまで培養した。培養液に終濃度１ｍｍｏｌ／ＬのＩＰＴＧを添加して、ＭＢＰ−ＶＬ融合蛋白質の発現を誘導した後、さらに５時間２７℃で培養した。【０１７７】
培養を終了した培養液を、６０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、菌体を回収した。得られた菌体を５０ｍＬの浸透圧ショック液に再懸濁し、室温で１０分間ゆるやかに混合したのち、８０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。上清を捨て、菌体に氷冷した５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＳＯ4  １５ｍＬを加え、直ちに再懸濁し、ペリプラズム画分のＭＢＰ−ＶＬ融合蛋白質を細胞外に放出させた。懸濁液を氷上で２０分間時々混ぜながら置いたのち、８０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、ＭＢＰ−ＶＬ融合蛋白質を含む上清を回収した。この上清を１Ｌのカラム緩衝液に対して４℃で一晩透析したのち、（１）のＶＨ−ＡＰ融合蛋白質と同様にして、Ｔａｌｏｎ金属キレートカラムを用いて、ＭＢＰ−ＶＬ融合蛋白質の精製を行った。精製ＭＢＰ−ＶＬ融合蛋白質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは推定分子量である５６．５ｋＤａ付近に単一バンドが認められ、その収量は培養液５００ｍＬ培養から約０．７ｍｇであった。
【実施例５】
【０１７８】
ＶＨ−ＡＰ融合蛋白質およびＭＢＰ−ＶＬ融合蛋白質を用いたオープンサンドイッチＥＬＩＳＡ法によるヒトオステオカルシンおよびＯＣ−１ペプチドの測定
実施例４（２）で得られた精製ＭＢＰ−ＶＬ融合蛋白質の５μｇ／ｍＬ溶液（溶媒ＴＢＳ）を調製し、９６ウェルマイクロプレートに、１ウェルあたり１００μＬずつ分注した。４℃で一晩静置して、ＭＢＰ−ＶＬ融合蛋白質を吸着させた後、溶液を捨て、ＴＢＳで２５％に希釈したブロックエース（以下、Ｘ％のブロックエースを含むＴＢＳをＸ％ＢＴＢＳとよぶ）で、室温で２時間ブロッキングした。０．０５％ツイーン−２０を含むＴＢＳ（以下、ＴＢＳＴとよぶ）により１回洗浄した後、各ウェルに測定試料として、１０％ＢＴＢＳで０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、１００、５００、１０００ｎｇ／ｍＬの各濃度になるよう希釈したヒトオステオカルシンあるいはＯＣ−１ペプチド（キアゲン社）を１００μＬずつ加えた。さらに、実施例４（１）で調製した精製ＶＨ−ＡＰ融合蛋白質の２５０μｇ／ｍＬ溶液２μＬを加えて混合し、室温で２時間反応させた。ＴＢＳＴにより３回洗浄し、１００μＬのアルカリフォスファターゼ基質溶液（１ｍｍｏｌ／Ｌ  ｐ−ニトロフェニルリン酸、１ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ2、５０μｍｏｌ／Ｌ  ＺｎＣｌ2、ｐＨ９．５）を各ウェルに加え，室温で３０分間反応させた後、４０５ｎｍの吸光度（ＯＤ４０５）を測定した。【０１７９】
測定結果を図１０に示した。ＯＣ−１ペプチドおよびヒトオステオカルシンともに、測定試料中の濃度依存的に吸光度の上昇がみられ、オープンサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定できることが確認された。測定範囲は実施例３（２）のファージを用いたオープンサンドイッチＥＬＩＳＡ法と同程度であった。本実施例のオープンサンドイッチ法では、実施例３（４）に示した従来のサンドイッチＥＬＩＳＡ法、実施例３（２）に示したオープンサンドイッチＥＬＩＳＡ法によるオステオカルシンの測定方法と比較して、測定工程を簡略化することができた。
【産業上の利用可能性】
【０１８０】
本発明により、ペプチドの非競合的な検出または定量方法、そのための試薬、および該方法に使用するＶＨポリペプチドまたはＶＬポリペプチドが提供される。そして、前記ＨｙＨＥＬ−１０のように、測定すべきペプチドの３次構造を認識しているモノクローナル抗体に由来するＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドを用いた場合、測定すべきペプチドが測定試料中で正常な３次元構造を保持していることが要求されるが、測定すべきペプチドの連続するアミノ酸配列をエピトープとするモノクローナル抗体に由来するＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドを用いることにより、測定すべきペプチドが測定試料中で変性状態であっても測定することができる。また、本発明のオープンサンドイッチＥＬＩＳＡによると、サンドイッチＥＬＩＳＡと比較して測定範囲の上限の濃度が高く、またその測定範囲の幅は同程度もしくは広くなることから、本発明は特に血中のオステオカルシンの濃度測定に適している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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