(57)【要約】 Porphyromonas gingivalisが関与する歯周組織、特に歯根膜の破壊を抑制する歯根膜保護剤、およびその歯根膜保護剤を含有する歯根膜の損傷に関わる疾患の予防、治療効果を有する口腔用剤または飲食品を提供する。 Porphyromonas gingivalisによる歯根膜に対する障害性を低減する効果を有するプロアントシアニジン類、特に好ましくはリンゴ未熟果またはホップ苞に由来するプロアントシアニジン類である歯根膜保護剤、およびその歯根膜保護剤を有効成分として含有する、口腔用剤および飲食品である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Porphyromonas gingivalis菌による、歯根膜の破壊を抑制するプロアントシアニジン様のポリフェノールである、歯根膜保護剤。
【請求項２】
ホップ、特に好ましくはホップ苞に由来する請求項１記載の歯根膜保護剤。
【請求項３】
リンゴに由来する請求項１記載の歯根膜保護剤。
【請求項４】
請求項１記載の歯根膜保護剤を含む口腔用剤。
【請求項５】
請求項２記載の歯根膜保護剤を含む口腔用剤。
【請求項６】
請求項３記載の歯根膜保護剤を含む口腔用剤。
【請求項７】
請求項１記載の歯根膜保護剤を含む飲食品。
【請求項８】
請求項２記載の歯根膜保護剤を含む飲食品。
【請求項９】
請求項３記載の歯根膜保護剤を含む飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯周組織のひとつである、歯根膜に対するPorphyromonas gingivalisの障害性を低減する効果を有するプロアントシアニジン様のポリフェノール、特に好ましくはホップ苞またはリンゴ未熟果に由来するポリフェノールである歯根膜保護剤、およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
俗に「噛む喜びは人生の喜び」ともいわれ、歯の喪失がヒトのＱＯＬ（クオリティ・オブ・ライフ、人生の質）の大きな低下をもたらすことは疑いようのない事実である。
近年、日本における医療費の総額は約３０兆円を数え、歯科の医療費は２兆５０００億円にも達する。口腔の健康増進は歯科医療費を軽減させるばかりではなく、全医療費の削減にも貢献すると期待される。すなわち、アメリカを中心とする近年の研究の結果、口腔の健康、特に歯周病罹患の有無は全身の健康と密接に関連しているとの報告が数多く成されている。また本邦においても兵庫県歯科医師会の調査（『「８０２０運動」と医療費との関係』第２回調査、２００２年）によれば、喪失歯が少ない人（自分の歯が多く残っている人）ほど全身健康状態が良好であり、給付された医療費が少ないという報告もあり、これから日本において確実に進行する高齢化社会の中で、口腔衛生の重要性は益々高くなっていくものと思われる。
ＱＯＬについてだけでなく、医療費の抑制・削減の観点から見ても、歯の喪失を予防する優れた方法が開発されれば、産業的にも大いに意義のあるものである。【０００３】
また近年、歯科領域においては失われた歯および歯周組織を再生する、いわゆる再生医療が実用段階に入りつつある。上記の観点から、この技術の確立も大いに意義のあることであると言える。
歯周組織疾患、いわゆる歯周病は世界的に蔓延する口腔疾患であり、歯の喪失の主要な原因のひとつとなっている。歯周病は、細菌によって引き起こされる感染症であるとほぼ結論付けられており、その原因は、歯周ポケット中のプラーク中に生息する様々な菌であると考えられるが、中でもPorphyromonas gingivalisがその主要な原因菌であると考えられている。
P.gingivalisは、歯周病患者の歯周ポケットから高頻度に検出される菌であり、強い炎症性を持つ蛋白質分解酵素（Arg-gingipainおよびLys-gingipain）やLPS（リポ多糖）を産生・放出することにより、歯周組織（歯根膜、歯槽骨）の破壊をもたらすと考えられている。その結果、歯周組織が歯を支持することができなくなり、歯の喪失に至るものである。【０００４】
歯根膜は主としてコラーゲン線維からできている組織で、その線維の片側が歯槽骨の中に、もう一方がセメント質の中に埋まっている。歯根膜は歯と歯槽骨とを結合させる働きをもっており、歯に加わる力を吸収して直接骨に力が加わらないように働いている、重要な組織である。先に触れたように、歯周病の進展の過程において、特に重大な過程のひとつが、歯根膜および歯槽骨の破壊である。この両組織なくして、歯は摂食に必要な力に耐えることはできない。
また、歯科領域における再生医療の試みとして、失われた歯根膜を、歯根膜細胞に対する増殖因子を用いて再度形成させる方法や、歯根膜をシート状に培養し、ヒトに移植する方法が検討されている。しかし、その際にも、患者がP.gingivalisに感染している状態では、再生誘導あるいは移植された歯根膜がP. gingivalisにより傷害されてしまうため、その目的を達するには至らず大きな問題となっている。【０００５】
歯周病を予防・改善する技術としては、日常的な個々人による歯磨きなどの物理的なプラークの除去のほか、緑茶に由来するポリフェノールによるもの（特許文献１）、樹木に由来するポリフェノールによるもの（特許文献２）などが知られている。これらの抗歯周病効果は、P. gingivalisの蛋白質分解酵素の阻害効果、あるいはP. gingivalisの培養細胞への付着を阻害することにより、歯周病の発症、進行を抑止することをその根拠としている。
【特許文献１】特開平５−９４４号公報
【特許文献２】特開平８−８１３８０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、P.gingivalisの上皮細胞への付着を効果的に抑制したとしても、わずかに定着したP. gingivalisを足がかりとして、そこからプラークが形成されたり、P.gingivalisの蛋白質分解酵素を効果的に抑制したとしても、P.gingivalisは他にもＬＰＳなどの炎症性の因子を分泌するものであるので、これらの例では、歯周病における病状悪化の重要な過程である、歯周組織の破壊を抑制する直接の証拠となってはいなかった。
また再生医療の現場における歯周組織の保護効果に関して、言及した先行技術は見られない。
これらの問題、すなわちP.gingivalisによる歯根膜の障害を抑える方法を提供することが、本発明における課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の課題について鋭意検討した結果、ホップ苞またはリンゴ未熟果に由来する、プロアントシアニジン様のポリフェノールが、P.gingivalis 菌による歯根膜への障害性を強力に阻害し、保護する効果を持っていることを見出した。また、同ポリフェノールが、誘導された歯根膜細胞膜の再生に対するP.gingivalis菌の障害も軽減する効果を有することも確認した。更にこの物質を、歯根膜保護素材として医薬品、洗口剤などの医薬部外品、飲食品に利用することにより本発明を完成するに至った。
ここでいうポリフェノールとは、主に植物体に含まれる分子内に複数のフェノール性水酸基を有する化合物の総称であり、プロアントシアニジン様のポリフェノールとは、加水分解により赤色系の色素であるアントシアニジン（シアニジンまたはデルフィニジンまたはペラルゴニジン）を生じる化合物をいう。
すなわち、本発明の第１は、プロアントシアニジン様のポリフェノールである歯根膜保護剤に関し、第２は、リンゴ未熟果に由来するプロアントシアニジン様のポリフェノールである歯根膜保護剤に関し、第３は、ホップ苞に由来するプロアントシアニジン様のポリフェノールである歯根膜保護剤に関する。
【発明の効果】
【０００８】
すでに述べたように、歯周病の進行（病状の悪化）において、最も重要な課程のひとつが歯根膜の破壊であり、歯周病による喪失歯の問題を解決するためにも、歯根膜を保護する技術が求められている。また、口腔分野の再生医療の現場では、再生歯の形成に目処がついているとされるが、再生歯をそのままヒトの口腔に装着しても、歯根膜という組織が失われていると、歯は定着することができない。そこで歯を失った後も、歯根膜を保護する技術が求められている。本発明によれば、P.gingivalis 菌による歯根膜への障害性を強力に阻害し、保護する効果を持ち、歯根膜保護素材として医薬品、洗口剤などの医薬部外品、飲食品に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例１２における歯根膜細胞保護効果を示す図である。縦軸は吸光度を示す。
【図２】実施例１３における歯根膜細胞保護効果を示す図である。縦軸は歯根膜再生率（％）、横軸は時間（ｈ）を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の原料となるリンゴ未熟果とは、リンゴの果実が成熟する前に人為的に摘果したもの、あるいは落下などにより自然にリンゴ果樹より脱落したものをいう。
また、本発明の原料となるホップ苞とは、ホップ毬果よりルプリン部分を取り除いて得られるものであり、一般に、ホップ毬果を粉砕後、ふるい分けによってルプリン部分を除くことによってホップ苞を得る。しかし、最近のビール醸造においては、ホップ苞をふるい分けして除去する手間を省くために、ビール醸造に有用でないホップ苞を取り除かずにホップ毬果そのままペレット状に成形し、ホップペレットとして、ビール醸造に利用する傾向にある。従って、本発明の原料としては、ホップ苞を含むものであれば特に限定せず、ホップ苞を含むホップ毬果やホップペレットを原料としてもなんら問題ない。【００１１】
これらの原料を、圧搾により搾汁あるいはアルコール水溶液などで抽出し、歯根膜保護素材を含む溶液とし、そのまま粉末として用いることもでき、必要に応じて歯根膜保護素材をポリフェノールに親和性のある粒状の樹脂などを充填したカラムなどを用いて精製し、精製度を上げて用いることもできる。
得られた歯根膜保護素材は、菓子類、食品類、飲料などの飲食品、特に好ましくは、キャンディ、チョコレート、キャラメル、チューインガムなど、口腔滞留時間の比較的長い飲食品に用いることができる。また、うがい液、歯磨剤などの口腔用剤に添加して用いることもできる。これらの飲食品、口腔用剤に歯根膜保護素材を添加する際には、歯根膜保護素材を粉末のまま添加してもよいが、好ましくは、歯根膜保護素材を１〜２％の水溶液またはアルコール水溶液の溶液あるいはアルコール溶液とし、飲食品または口腔用剤に対し最終濃度が１〜５０００ｐｐｍ、好ましくは１００〜２０００ｐｐｍとなるように添加することが望ましい。
【実施例１】
【００１２】
（リンゴ未熟果からの歯根膜保護素材の調製）
リンゴ未熟果（平均重量５．０３ｇ）４００ｇを１％塩酸酸性メタノールと共にホモジナイズした後、加熱還流しながら抽出し（３回）、抽出液を減圧濃縮してメタノールを留去後、クロロホルムを加えて分配し（２回）、水層を回収し、濾過後蒸留水で２００ｍｌにメスアップした。さらにSep-pak C18 を用いた固相抽出法により精製し、凍結乾燥して歯根膜保護素材８．９ｇを得た。リンゴ未熟果からの収率は２．２％であった。
【実施例２】
【００１３】
（ホップ苞からの歯根膜保護素材の調製）
ホップ苞５０ｇを１，０００ｍｌの４０％エタノール水溶液で、攪拌下、５０℃、６０分間抽出した。ろ過後、容積が５００ｍｌになるまで減圧濃縮し、その濃縮液をスチレン−ジビニルベンゼン樹脂（三菱化学社製セパビーズ  ＳＰ７０）１５０ｍｌを充填したカラムに通液し、次いで５００ｍｌの水で洗浄した。さらに同カラムに５０％エタノール水溶液６００ｍｌを通液し、同溶出液を回収し、凍結乾燥して、歯根膜保護素材１．７ｇを無臭のかすかに苦味を呈した淡黄色の粉末として得た。ホップ苞からの収率は３．４％であった。
【実施例３】
【００１４】
（限外ろ過膜を用いた歯根膜保護素材のさらなる精製）
実施例２と同様にして得た歯根膜保護素材５ｇを、５００ｍｌの５０％エタノール水溶液に溶解し、分画分子量が１０，０００の限外ろ過膜で処理した。この膜を通過しなかった上残り液を濃縮した後凍結乾燥し、さらに精製された歯根膜保護素材２．２ｇを黄色〜茶色の粉末として得た。
【実施例４】
【００１５】
（歯磨剤）
第２リン酸カルシウム    ４２．０
グリセリン              １８．０
カラギナン                ０．７
ラウリル硫酸ナトリウム    １．２
サッカリンナトリウム      ０．０９
パラオキシ安息香酸ブチル  ０．００５
実施例１で得た素材        ０．００
香料                      １．０
水                      ３７．０
合計                  １００．０
上記の各重量部の各成分を用い、常法に従って歯磨剤とした。なお実施例１で得た素材の代わりに、それぞれ実施例２および３で得た素材を添加した歯磨剤も同様に得た。
【実施例５】
【００１６】
（洗口液）
グリセリン                ７．０
ソルビトール              ５．０
エチルアルコール        １５．０
ラウリル硫酸ナトリウム    ０．８
サッカリンナトリウム      ０．１
1-メントール              ０．０５
香料                      ０．０４５
実施例１で得た素材        ０．００５
水                      ７２．０
合計                  １００．０
上記の各重量部の各成分を用い、常法に従って洗口液とした。なお実施例１で得た素材の代わりに、実施例２および３で得た素材を添加した洗口剤も同様に得た。
【実施例６】
【００１７】
（トローチ剤）
アラビアゴム              ６．０
ステアリン酸マグネシウム  ３．０
ブドウ糖                ７３．０
乳糖                    １７．６
リン酸第２カリウム        ０．２
リン酸第１カリウム        ０．１
香料                      ０．０９５
実施例１で得た素材        ０．００５
合計                  １００．０
上記の各重量部の各成分を用い、常法に従ってトローチ剤とした。なお実施例１で得た素材の代わりに、実施例２および３で得た素材を添加したトローチ剤も同様に得た。
【実施例７】
【００１８】
（飴）
ショ糖                  ２０．０
水飴（75％固形分）      ７０．０
水                        ９．５
着色料                    ０．４５
香料                      ０．０４５
実施例１で得た素材        ０．００５
合計                  １００．０
上記の各重量部の各成分を用い、常法に従って飴とした。なお実施例１で得た素材の代わりに、実施例２および３で得た素材を添加した飴も同様に得た。
【実施例８】
【００１９】
（チューインガム）
ガムベース              ２０．０
炭酸カルシウム            ２．０
乳糖                    ７７．０
ステビオサイド            ０．０９５
実施例１で得た素材        ０．００５
香料                      ０．９
合計                  １００．０
上記の各重量部の各成分を用い、常法に従ってチューインガムとした。なお実施例１の代わりに、実施例２および３を添加したチューインガムも同様に得た。
【実施例９】
【００２０】
（ジュース）
濃縮ミカン果汁          １５．０
果糖                      ５．０
クエン酸                  ０．２
香料                      ０．１
色素                      ０．１５
アスコルビン酸ナトリウム  ０．０４８
実施例１で得た素材        ０．００２
水                      ７９．５
合計                  １００．０
上記の各重量部の各成分を用い、常法に従ってジュースとした。なお実施例１で得た素材の代わりに、実施例２および３で得た素材を添加したジュースも同様に得た。
【実施例１０】
【００２１】
（クッキー）
薄力粉                  ３２．０
全卵                    １６．０
バター                  １６．０
砂糖                    ２５．０
水                      １０．８
ベーキングパウダー        ０．１９８
実施例１で得た素材        ０．００２
合計                  １００．０
上記の各重量部の各成分を用い、常法に従ってクッキーとした。なお実施例１で得た素材の代わりに、実施例２および３で得た素材を添加したクッキーも同様に得た。
【実施例１１】
【００２２】
（キャラメル）
グラニュー糖            ３１．０
水飴（７５％固形分）    ２０．０
粉乳                    ４０．０
硬化油                    ５．０
食塩                      ０．６
香料                      ０．０２５
実施例１で得た素材        ０．００５
水                        ３．３７
合計                  １００．０
上記の各重量部の各成分を用い、常法に従ってキャラメルとした。なお実施例１で得た素材の代わりに、実施例２および３で得た素材を添加したキャラメルも同様に得た。
【実施例１２】
【００２３】
（歯根膜細胞保護効果）：
歯根膜細胞には、抜歯したヒト第３大臼歯の歯根中央部より剥離した歯根膜に由来する細胞を、ＤＭＥＭ培地にて５〜７代継代培養したものを、アルカリホスファターゼ活性を確認した後に用いた。ポリフェノールとしては緑茶に由来するエピガロカテキンガレートを比較例とし、実施例１、２および３で得た歯根膜保護剤を用いた。P.gingivalis菌は、ＡＴＣＣ３３２７７株を用いた。
９６穴プレートに１×１０4の歯根膜細胞をまき、ＦＣＳ１０％含有ＤＭＥＭ培地中、３７℃で１２時間インキュベートして細胞の単一層を形成させた。培地をＦＣＳを含有しないＤＭＥＭ培地に替えた後、３７℃で１２時間インキュベートした。その後エピガロカテキンガレート（比較例）、実施例１、２および３を培地に加え、さらに細胞数の１００倍のP.gingivalis菌を培地中に添加して細胞に感染させ、３７℃で６時間インキュベートした。インキュベート後、ＰＢＳで３回洗浄し、２５％グルタルアルデヒド水溶液で５分間処理し、細胞を固定した。固定した細胞をさらにＰＢＳで３回洗浄し、０．５％クリスタルバイオレットの２０％メタノール溶液で細胞を染色した。細胞をさらにＰＢＳで５回洗浄し、５９０ｎｍにおける吸光度をプレートリーダー（ＢＩＯ−Ｒａｄ社６８０型）で測定した。【００２４】
クリスタルバイオレットは細胞を染色する色素であるので、P.gingivalis菌による細胞のダメージが少なければ、細胞の単層膜がよく保存され、よく染色されるので５９０ｎｍにおける吸光度は高くなり、逆に細胞のダメージが大きく、細胞の単層膜が破壊されていれば、染色される細胞は少なくなるので５９０ｎｍにおける吸光度は小さくなる。
試験結果を図１に示す。実施例１、２および３（各１μｇ／ｍｌ）を加えた場合には対照（ポリフェノール無添加）と比べ細胞膜のダメージが低く、細胞膜はよく保存され、高い吸光度を示していた。この効果は１０μｇ／ｍｌのエピガロカテキンガレート（比較例）による効果と同等か、より強かった。すなわち、実施例１−３の効果は１０倍量の比較例と同等か優れていることが明らかとなった。
【実施例１３】
【００２５】
（歯根膜細胞保護効果）
歯根膜細胞には、抜歯したヒト第３大臼歯の歯根中央部より剥離した歯根膜に由来する細胞を、ＤＭＥＭ培地にて５〜７代継代培養したものを、アルフォス活性を確認した後に用いた。ポリフェノールとしては緑茶に由来するエピガロカテキンガレートを比較例とし、実施例１、２および３で得た歯根膜保護剤を用いた。P.gingivalis菌は、ＡＴＣＣ３３２７７株を用いた。歯根膜の再生誘導剤としては、エムドゲイン（登録商標、ＥＭＤ）を用いた。
あらかじめエムドゲインをコートした９６穴プレートに１×１０4の歯根膜細胞をまき、ＦＣＳ１０％含有ＤＭＥＭ培地中、３７℃で１２時間インキュベートして細胞の単一層を形成させた。培地をＦＣＳを含有しないＤＭＥＭ培地に替えた後、さらに３７℃で１２時間インキュベートした。
その後、鋭利な針先で膜に傷をつけ、エピガロカテキンガレート（比較例）、実施例１、２および３を培地に加え、さらに細胞数の１００倍のP.gingivalis菌を培地中に添加して細胞に感染させ、37℃で40時間インキュベートした。インキュベート前およびインキュベート開始後２０時間、４０時間において、傷をつけた膜の様子を顕微鏡下写真撮影し、膜の再生状態を、画像処理装置で数値化した。
試験結果を図２に示す。実施例１、２および３（各１０μｇ／ｍｌ）を加えた場合には対照（ポリフェノール無添加、ＥＭＤ＋Ｐｇ）および１０μｇ／ｍｌのエピガロカテキンガレート（比較例：ＥＧＣｇ）と比べ、明確に歯根膜の再生が見られた。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明による歯根膜保護剤は再生医療の現場における歯周組織の保護効果を有し、医薬品、洗口剤などの医薬部外品、飲食品に利用できる。
【図２】
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【図１】
2005092327.tif 000003
【国際調査報告】
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