(57)【要約】本発明は、加齢の組織特異的なバイオマーカーを開発する方法、これらの方法によって同定される強力なバイオマーカーセット、並びに抗老化特性を有する栄養素及び他の機能的な成分又は作用剤を同定するための、バイオマーカーの使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ある種の多数の系統、種族又は民族において、事前に決定された有意性レベルで示差的に発現されるという基準を用いて、若齢の対象と比較して高齢の対象中の組織において示差的に発現される１つ又は複数の遺伝子を選択するステップを含む、選択された組織中の加齢の遺伝子発現マーカーを同定する方法。
【請求項２】
前記選択される遺伝子が、３つ以上の系統、種族又は民族において示差的に発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記選択される遺伝子が、５つ以上の系統、種族又は民族において示差的に発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記選択される遺伝子が、試験される系統、種族又は民族の少なくとも５０％において示差的に発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記選択される遺伝子が、試験される系統、種族又は民族の少なくとも７５％において示差的に発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
組織が心臓、筋肉、脳又は脂肪組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
有意性レベルがｐ＜０．１０、ｐ＜０．０５、又はｐ＜０．０１である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
若齢の対象と比較して高齢の対象において示差的に発現される遺伝子の示差的な発現が、カロリー制限によって少なくとも部分的に逆転されるという基準をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
若齢の対象と比較して高齢の対象において示差的に発現される遺伝子が、１つ又は複数の加齢関連の生理的機能に関連していることが知られている又は疑われるという基準をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
種がイヌ科又はネコ科である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
若齢の対象と比較して高齢の対象中の選択された組織において示差的に発現される複数のポリヌクレオチドを含む組合せであって、前記選択された組織が心臓、脂肪、脳又は筋肉組織であり、前記ポリヌクレオチドが、表２、表５、表８若しくは表１０に記載のタンパク質、又はその断片をコードしている遺伝子から選択される、組合せ。
【請求項１２】
前記選択された組織が心臓であり、前記ポリヌクレオチドが、Ａｍｙ１、Ａｐｏｄ、Ｂｄｈ１、Ｃ３、Ｃａｓｑ１、Ｃｃｌ８、Ｋｃｎｄ２、Ｌｃｎ２、Ｍｔ２、Ｍｙｏｔ、Ｐａｈ、Ｐｒｋｃｑ、Ｓｅｒｐｉｎａ３ｎ、Ｓｋａｐ２、Ｔｍｅｍ１６ｋ、及びＶｇｌｌ２のうちの２つ以上をコードしている遺伝子から選択される、請求項１１に記載の組合せ。
【請求項１３】
前記示差的な発現がカロリー制限によって逆転され、前記ポリヌクレオチドが、Ｃ３、Ｃｃｌ８、Ｌｃｎ２、Ｍｔ２、Ｐａｈ、Ｐｒｋｃｑ、Ｓｅｒｐｉｎａ３ｎ、Ｔｍｅｍ１６ｋ、及びＶｇｌｌ２のうちの２つ以上をコードしている遺伝子から選択される、請求項１２に記載の組合せ。
【請求項１４】
前記選択された組織が脂肪であり、前記ポリヌクレオチドが、Ａｓｐｎ、Ｃｌｅｃ４ｎ、Ｃｏｌ６ａ２、Ｃｏｌ１８ａ１、Ｃｏｘ８ｂ、Ｃｒｉｐ２、Ｅａｒｌ１、Ｅｍｉｌｉｎ２、Ｏｔｏｐ１、Ｐｌａ２ｇ２ｄ、Ｒｈｂｄｌ３、Ｓｌｃ６ａ１３、及びＳｙｃｐ３のうちの２つ以上をコードしている遺伝子から選択される、請求項１１に記載の組合せ。
【請求項１５】
前記示差的な発現がカロリー制限によって逆転され、前記ポリヌクレオチドが、Ａｓｐｎ、Ｃｏｌ６ａ２、Ｃｒｉｐ２、Ｅｍｉｌｉｎ２、Ｏｔｏｐ１、Ｐｌａ２ｇ２ｄ、Ｒｈｂｄｌ３、及びＳｌｃ６ａ１３のうちの２つ以上をコードしている遺伝子から選択される、請求項１４に記載の組合せ。
【請求項１６】
前記選択された組織が脳であり、前記ポリヌクレオチドが、Ａｐｏｄ、Ｂ２ｍ、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、Ｃｄ６８、Ｃｌｅｃ７ａ、Ｃｓｔ７、Ｃｔｓｄ、Ｇｆａｐ、Ｉｌ３３、Ｌｇａｌｓ３、Ｌｙｚｓ、及びＳｐｐ１のうちの２つ以上をコードしている遺伝子から選択される、請求項１１に記載の組合せ。
【請求項１７】
前記示差的な発現がカロリー制限によって逆転され、前記ポリヌクレオチドが、Ａｐｏｄ、Ｂ２ｍ、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、Ｃｔｓｄ、Ｇｆａｐ、Ｉｌ３３、Ｌｙｚｓ、及びＳｐｐ１のうちの２つ以上をコードしている遺伝子から選択される、請求項１６に記載の組合せ。
【請求項１８】
前記選択された組織が筋肉であり、前記ポリヌクレオチドが、Ｃ４、Ｃｄｋｎ２ｃ、Ｃｄｓ１、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２、Ｃｏｌ３ａ１、Ｄｕｓｐ２６、Ｅｄｇ２、Ｉｇｈ−６、Ｍｔ２、Ｐｌｋ２、Ｒｈｐｎ２、及びＳｙｔ９のうちの２つ以上をコードしている遺伝子から選択される、請求項１１に記載の組合せ。
【請求項１９】
前記示差的な発現がカロリー制限によって逆転され、前記ポリヌクレオチドが、Ｃ４、Ｃｄｋｎ２ｃ、Ｃｄｓ１、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２、Ｃｏｌ３ａ１、Ｅｄｇ２、Ｉｇｈ−６、Ｍｔ２、Ｐｌｋ２、及びＳｙｔ９のうちの２つ以上をコードしている遺伝子から選択される、請求項１８に記載の組合せ。
【請求項２０】
前記ポリヌクレオチドがイヌ科又はネコ科のポリヌクレオチドである、請求項１１に記載の組合せ。
【請求項２１】
若齢の対象と比較して高齢の対象中の選択された組織において示差的な遺伝子発現を検出するための２つ以上のプローブを含む組成物であって、前記選択された組織が心臓、脂肪、脳又は筋肉組織であり、前記プローブが、
ａ）表２、表５、表８若しくは表１０に記載のタンパク質、又はその断片をコードしている２つ以上の遺伝子と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド、又は
ｂ）表２、表５、表８若しくは表１０に記載のタンパク質、又はその断片から選択される２つ以上のポリペプチドと特異的に結合するポリペプチド結合剤
を含む、組成物。
【請求項２２】
ポリペプチド結合剤が抗体である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
（ａ）前記選択された組織が心臓であり、前記示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質が、Ａｍｙ１、Ａｐｏｄ、Ｂｄｈ１、Ｃ３、Ｃａｓｑ１、Ｃｃｌ８、Ｋｃｎｄ２、Ｌｃｎ２、Ｍｔ２、Ｍｙｏｔ、Ｐａｈ、Ｐｒｋｃｑ、Ｓｅｒｐｉｎａ３ｎ、Ｓｋａｐ２、Ｔｍｅｍ１６ｋ、及びＶｇｌｌ２であり、（ｂ）前記選択された組織が脂肪であり、前記示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質が、Ａｓｐｎ、Ｃｌｅｃ４ｎ、Ｃｏｌ６ａ２、Ｃｏｌ１８ａ１、Ｃｏｘ８ｂ、Ｃｒｉｐ２、Ｅａｒｌ１、Ｅｍｉｌｉｎ２、Ｏｔｏｐ１、Ｐｌａ２ｇ２ｄ、Ｒｈｂｄｌ３、Ｓｌｃ６ａ１３、及びＳｙｃｐ３であり、（ｃ）前記選択された組織が脳であり、前記示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質が、Ａｐｏｄ、Ｂ２ｍ、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、Ｃｄ６８、Ｃｌｅｃ７ａ、Ｃｓｔ７、Ｃｔｓｄ、Ｇｆａｐ、Ｉｌ３３、Ｌｇａｌｓ３、Ｌｙｚｓ、及びＳｐｐ１であり、又は（ｄ）前記選択された組織が筋肉であり、前記示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質が、Ｃ４、Ｃｄｋｎ２ｃ、Ｃｄｓ１、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２、Ｃｏｌ３ａ１、Ｄｕｓｐ２６、Ｅｄｇ２、Ｉｇｈ−６、Ｍｔ２、Ｐｌｋ２、Ｒｈｐｎ２、及びＳｙｔ９である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記示差的な発現がカロリー制限によって逆転され、前記示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質が、（ａ）Ｃ３、Ｃｃｌ８、Ｌｃｎ２、Ｍｔ２、Ｐａｈ、Ｐｒｋｃｑ、Ｓｅｒｐｉｎａ３ｎ、Ｔｍｅｍ１６ｋ、及びＶｇｌｌ２、（ｂ）Ａｓｐｎ、Ｃｏｌ６ａ２、Ｃｒｉｐ２、Ｅｍｉｌｉｎ２、Ｏｔｏｐ１、Ｐｌａ２ｇ２ｄ、Ｒｈｂｄｌ３、及びＳｌｃ６ａ１３、（ｃ）Ａｐｏｄ、Ｂ２ｍ、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、Ｃｔｓｄ、Ｇｆａｐ、Ｉｌ３３、Ｌｙｚｓ、及びＳｐｐ１、又は（ｄ）Ｃ４、Ｃｄｋｎ２ｃ、Ｃｄｓ１、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２、Ｃｏｌ３ａ１、Ｅｄｇ２、Ｉｇｈ−６、Ｍｔ２、Ｐｌｋ２、及びＳｙｔ９である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記プローブが、イヌ科又はネコ科のポリヌクレオチド又はポリペプチドと特異的にハイブリダイズ又は結合する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２６】
若齢の対象と比較して高齢の対象中の選択された組織において示差的な遺伝子発現を検出するための複数のプローブを含むアレイが固定された、固体担体を備えた装置であって、前記組織が心臓、脂肪、脳又は筋肉であり、前記プローブが、
ａ）表２、表５、表８若しくは表１０に記載のタンパク質、又はその断片をコードしている２つ以上の遺伝子と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド、又は
ｂ）表２、表５、表８若しくは表１０に記載のタンパク質、又はその断片から選択される２つ以上のポリペプチドと特異的に結合するポリペプチド結合剤
を含む、装置。
【請求項２７】
ポリペプチド結合剤が抗体である、請求項２６に記載の装置。
【請求項２８】
（ａ）前記選択された組織が心臓であり、前記示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質が、Ａｍｙ１、Ａｐｏｄ、Ｂｄｈ１、Ｃ３、Ｃａｓｑ１、Ｃｃｌ８、Ｋｃｎｄ２、Ｌｃｎ２、Ｍｔ２、Ｍｙｏｔ、Ｐａｈ、Ｐｒｋｃｑ、Ｓｅｒｐｉｎａ３ｎ、Ｓｋａｐ２、Ｔｍｅｍ１６ｋ、及びＶｇｌｌ２であり、（ｂ）前記選択された組織が脂肪であり、前記示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質が、Ａｓｐｎ、Ｃｌｅｃ４ｎ、Ｃｏｌ６ａ２、Ｃｏｌ１８ａ１、Ｃｏｘ８ｂ、Ｃｒｉｐ２、Ｅａｒｌ１、Ｅｍｉｌｉｎ２、Ｏｔｏｐ１、Ｐｌａ２ｇ２ｄ、Ｒｈｂｄｌ３、Ｓｌｃ６ａ１３、及びＳｙｃｐ３であり、（ｃ）前記選択された組織が脳であり、前記示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質が、Ａｐｏｄ、Ｂ２ｍ、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、Ｃｄ６８、Ｃｌｅｃ７ａ、Ｃｓｔ７、Ｃｔｓｄ、Ｇｆａｐ、Ｉｌ３３、Ｌｇａｌｓ３、Ｌｙｚｓ、及びＳｐｐ１であり、又は（ｄ）前記選択された組織が筋肉であり、前記示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質が、Ｃ４、Ｃｄｋｎ２ｃ、Ｃｄｓ１、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２、Ｃｏｌ３ａ１、Ｄｕｓｐ２６、Ｅｄｇ２、Ｉｇｈ−６、Ｍｔ２、Ｐｌｋ２、Ｒｈｐｎ２、及びＳｙｔ９である、請求項２６に記載の装置。
【請求項２９】
前記示差的な発現がカロリー制限によって逆転され、前記示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質が、（ａ）Ｃ３、Ｃｃｌ８、Ｌｃｎ２、Ｍｔ２、Ｐａｈ、Ｐｒｋｃｑ、Ｓｅｒｐｉｎａ３ｎ、Ｔｍｅｍ１６ｋ、及びＶｇｌｌ２、（ｂ）Ａｓｐｎ、Ｃｏｌ６ａ２、Ｃｒｉｐ２、Ｅｍｉｌｉｎ２、Ｏｔｏｐ１、Ｐｌａ２ｇ２ｄ、Ｒｈｂｄｌ３、及びＳｌｃ６ａ１３、（ｃ）Ａｐｏｄ、Ｂ２ｍ、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、Ｃｔｓｄ、Ｇｆａｐ、Ｉｌ３３、Ｌｙｚｓ、及びＳｐｐ１、又は（ｄ）Ｃ４、Ｃｄｋｎ２ｃ、Ｃｄｓ１、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２、Ｃｏｌ３ａ１、Ｅｄｇ２、Ｉｇｈ−６、Ｍｔ２、Ｐｌｋ２、及びＳｙｔ９である、請求項２８に記載の装置。
【請求項３０】
前記プローブが、イヌ又はネコのポリヌクレオチド又はポリペプチドと特異的にハイブリダイズ又は結合する、請求項２６に記載の装置。
【請求項３１】
標準又は若齢の対象と比較して高齢の対象中の選択された組織において示差的に発現される、１つ又は複数の遺伝子の示差的な発現を検出する方法であって、前記組織が心臓、脂肪、脳又は筋肉であり、前記方法は、
ａ）（ｉ）表２、表５、表８若しくは表１０に記載のタンパク質、又はその断片をコードしている２つ以上の遺伝子と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド、又は（ｉｉ）表２、表５、表８若しくは表１０に記載のタンパク質、又はその断片から選択される２つ以上のポリペプチドと特異的に結合するポリペプチド結合剤を含むプローブを用意するステップと、
ｂ）プローブと試料中のｍＲＮＡ又はタンパク質とのハイブリダイゼーション又は結合を可能にすることによって、試料中でハイブリダイゼーション又は結合複合体を形成するように、プローブを、高齢の対象由来のｍＲＮＡ又はタンパク質を含む試料に加えるステップと、
ｃ）任意選択で、プローブと第２の試料中のｍＲＮＡ又はタンパク質とのハイブリダイゼーション又は結合を可能にすることによって、もう一方の試料中でハイブリダイゼーション又は結合複合体を形成するように、プローブを、若齢の対象由来のｍＲＮＡ又はタンパク質を含む別の試料に加えるステップと、
ｄ）試料又は複数の試料中のハイブリダイゼーション複合体を検出するステップと、
ｅ）標準試料又は任意選択のもう一方の試料と比較した、試料中のハイブリダイゼーション又は結合の量の間の少なくとも１つの差異が、高齢の対象において示差的に発現される１つ又は複数の遺伝子の示差的な発現を示す、第１の試料からのハイブリダイゼーション又は結合複合体を、標準試料、又は任意選択でもう一方の試料のハイブリダイゼーション又は結合複合体とを、比較するステップと
を含む、方法。
【請求項３２】
（ａ）前記選択された組織が心臓であり、前記示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質が、Ａｍｙ１、Ａｐｏｄ、Ｂｄｈ１、Ｃ３、Ｃａｓｑ１、Ｃｃｌ８、Ｋｃｎｄ２、Ｌｃｎ２、Ｍｔ２、Ｍｙｏｔ、Ｐａｈ、Ｐｒｋｃｑ、Ｓｅｒｐｉｎａ３ｎ、Ｓｋａｐ２、Ｔｍｅｍ１６ｋ、及びＶｇｌｌ２であり、（ｂ）前記選択された組織が脂肪であり、前記示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質が、Ａｓｐｎ、Ｃｌｅｃ４ｎ、Ｃｏｌ６ａ２、Ｃｏｌ１８ａ１、Ｃｏｘ８ｂ、Ｃｒｉｐ２、Ｅａｒｌ１、Ｅｍｉｌｉｎ２、Ｏｔｏｐ１、Ｐｌａ２ｇ２ｄ、Ｒｈｂｄｌ３、Ｓｌｃ６ａ１３、及びＳｙｃｐ３であり、（ｃ）前記選択された組織が脳であり、前記示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質が、Ａｐｏｄ、Ｂ２ｍ、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、Ｃｄ６８、Ｃｌｅｃ７ａ、Ｃｓｔ７、Ｃｔｓｄ、Ｇｆａｐ、Ｉｌ３３、Ｌｇａｌｓ３、Ｌｙｚｓ、及びＳｐｐ１であり、又は（ｄ）前記選択された組織が筋肉であり、前記示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質が、Ｃ４、Ｃｄｋｎ２ｃ、Ｃｄｓ１、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２、Ｃｏｌ３ａ１、Ｄｕｓｐ２６、Ｅｄｇ２、Ｉｇｈ−６、Ｍｔ２、Ｐｌｋ２、Ｒｈｐｎ２、及びＳｙｔ９である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記示差的な発現がカロリー制限によって逆転され、前記示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質が、（ａ）Ｃ３、Ｃｃｌ８、Ｌｃｎ２、Ｍｔ２、Ｐａｈ、Ｐｒｋｃｑ、Ｓｅｒｐｉｎａ３ｎ、Ｔｍｅｍ１６ｋ、及びＶｇｌｌ２、（ｂ）Ａｓｐｎ、Ｃｏｌ６ａ２、Ｃｒｉｐ２、Ｅｍｉｌｉｎ２、Ｏｔｏｐ１、Ｐｌａ２ｇ２ｄ、Ｒｈｂｄｌ３、及びＳｌｃ６ａ１３、（ｃ）Ａｐｏｄ、Ｂ２ｍ、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、Ｃｔｓｄ、Ｇｆａｐ、Ｉｌ３３、Ｌｙｚｓ、及びＳｐｐ１、又は（ｄ）Ｃ４、Ｃｄｋｎ２ｃ、Ｃｄｓ１、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２、Ｃｏｌ３ａ１、Ｅｄｇ２、Ｉｇｈ−６、Ｍｔ２、Ｐｌｋ２、及びＳｙｔ９である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記プローブが、イヌ科又はネコ科のポリヌクレオチド又はポリペプチドと特異的にハイブリダイズ又は結合する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記プローブが基板と結合している、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記プローブがアレイ中にある、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記検出ステップが間隔を置いて行われ、少なくとも１つの選択された組織における動物の加齢プロセスを監視するために使用される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
動物に投与された場合に試験物質が少なくとも１つの選択された組織において加齢プロセスの逆転又は遅延に有用である可能性が高いかどうかを決定する方法であって、
ａ）試験物質の非存在下で試験系において、表２、表５、表８若しくは表１０に記載のタンパク質、又はその断片をコードしている遺伝子から選択される２つ以上のポリヌクレオチドの転写又は翻訳産物を測定することによって、第１の遺伝子発現プロファイルを決定するステップと、
ｂ）試験物質の存在下で試験系において、表２、表５、表８若しくは表１０に記載のタンパク質、又はその断片をコードしている遺伝子から選択される２つ以上のポリヌクレオチドの転写又は翻訳産物を測定することによって、第２の遺伝子発現プロファイルを決定するステップと、
ｃ）第１の遺伝子発現プロファイルと、第２の遺伝子発現プロファイルとを比較するステップであって、第１の遺伝子発現プロファイルと比較した第２の遺伝子発現プロファイルの変化が、動物に投与された場合に試験物質が加齢プロセスの逆転又は遅延に有用である可能性が高いことを示す、ステップと
を含む、方法。
【請求項３９】
少なくとも第２の遺伝子発現プロファイルを、動物に投与された場合に少なくとも１つの選択された組織の加齢プロセスを逆転又は遅延させることが知られている参照物質の存在下で試験系において、表２、表５、表８若しくは表１０に記載のタンパク質、又はその断片をコードしている遺伝子から選択される２つ以上のポリヌクレオチドの転写又は翻訳産物を測定することによって得られる参照遺伝子発現プロファイルと比較するステップをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
（ａ）前記選択された組織が心臓であり、前記示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質が、Ａｍｙ１、Ａｐｏｄ、Ｂｄｈ１、Ｃ３、Ｃａｓｑ１、Ｃｃｌ８、Ｋｃｎｄ２、Ｌｃｎ２、Ｍｔ２、Ｍｙｏｔ、Ｐａｈ、Ｐｒｋｃｑ、Ｓｅｒｐｉｎａ３ｎ、Ｓｋａｐ２、Ｔｍｅｍ１６ｋ、及びＶｇｌｌ２であり、（ｂ）前記選択された組織が脂肪であり、前記示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質が、Ａｓｐｎ、Ｃｌｅｃ４ｎ、Ｃｏｌ６ａ２、Ｃｏｌ１８ａ１、Ｃｏｘ８ｂ、Ｃｒｉｐ２、Ｅａｒｌ１、Ｅｍｉｌｉｎ２、Ｏｔｏｐ１、Ｐｌａ２ｇ２ｄ、Ｒｈｂｄｌ３、Ｓｌｃ６ａ１３、及びＳｙｃｐ３であり、（ｃ）前記選択された組織が脳であり、前記示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質が、Ａｐｏｄ、Ｂ２ｍ、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、Ｃｄ６８、Ｃｌｅｃ７ａ、Ｃｓｔ７、Ｃｔｓｄ、Ｇｆａｐ、Ｉｌ３３、Ｌｇａｌｓ３、Ｌｙｚｓ、及びＳｐｐ１であり、又は（ｄ）前記選択された組織が筋肉であり、前記示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質が、Ｃ４、Ｃｄｋｎ２ｃ、Ｃｄｓ１、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２、Ｃｏｌ３ａ１、Ｄｕｓｐ２６、Ｅｄｇ２、Ｉｇｈ−６、Ｍｔ２、Ｐｌｋ２、Ｒｈｐｎ２、及びＳｙｔ９である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記示差的な発現がカロリー制限によって逆転され、前記示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質が、（ａ）Ｃ３、Ｃｃｌ８、Ｌｃｎ２、Ｍｔ２、Ｐａｈ、Ｐｒｋｃｑ、Ｓｅｒｐｉｎａ３ｎ、Ｔｍｅｍ１６ｋ、及びＶｇｌｌ２、（ｂ）Ａｓｐｎ、Ｃｏｌ６ａ２、Ｃｒｉｐ２、Ｅｍｉｌｉｎ２、Ｏｔｏｐ１、Ｐｌａ２ｇ２ｄ、Ｒｈｂｄｌ３、及びＳｌｃ６ａ１３、（ｃ）Ａｐｏｄ、Ｂ２ｍ、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、Ｃｔｓｄ、Ｇｆａｐ、Ｉｌ３３、Ｌｙｚｓ、及びＳｐｐ１、又は（ｄ）Ｃ４、Ｃｄｋｎ２ｃ、Ｃｄｓ１、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２、Ｃｏｌ３ａ１、Ｅｄｇ２、Ｉｇｈ−６、Ｍｔ２、Ｐｌｋ２、及びＳｙｔ９である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
試験系が培養細胞の集団を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
試験系が動物を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
プローブが基質と結合している、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
プローブがアレイ中にある、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
試料が、イヌ科又はネコ科由来のｍＲＮＡ又はタンパク質を含有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４７】
請求項３８に記載の方法によって、動物に投与された場合に選択された組織において加齢プロセスを逆転又は遅延させる可能性が高いと同定される物質。
【請求項４８】
単一パッケージ中の別々の容器、又は仮想パッケージ中の別々の容器中に、若齢の対象と比較して高齢の対象中の選択された組織において示差的な遺伝子発現を検出するための２つ以上のプローブを含むキットであって、前記組織が心臓、脂肪、脳又は筋肉であり、前記プローブが、（ａ）表２、表５、表８若しくは表１０に記載のタンパク質、又はその断片をコードしている２つ以上の遺伝子と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド、又は（ｂ）表２、表５、表８若しくは表１０に記載のタンパク質、又はその断片から選択される２つ以上のポリペプチドと特異的に結合するポリペプチド結合剤を含み；前記キットは、（１）対象の選択された組織における示差的な遺伝子発現を検出するための遺伝子発現アッセイにおける前記プローブの使用法の指示、（２）前記プローブを使用するための試薬及び機器、並びに（３）対象に投与された場合に、選択された組織において加齢プロセスを逆転又は遅延させることが知られている組成物、のうちの少なくとも１つをさらに含む。
【請求項４９】
（ａ）前記選択された組織が心臓であり、前記示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質が、Ａｍｙ１、Ａｐｏｄ、Ｂｄｈ１、Ｃ３、Ｃａｓｑ１、Ｃｃｌ８、Ｋｃｎｄ２、Ｌｃｎ２、Ｍｔ２、Ｍｙｏｔ、Ｐａｈ、Ｐｒｋｃｑ、Ｓｅｒｐｉｎａ３ｎ、Ｓｋａｐ２、Ｔｍｅｍ１６ｋ、及びＶｇｌｌ２であり、（ｂ）前記選択された組織が脂肪であり、前記示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質が、Ａｓｐｎ、Ｃｌｅｃ４ｎ、Ｃｏｌ６ａ２、Ｃｏｌ１８ａ１、Ｃｏｘ８ｂ、Ｃｒｉｐ２、Ｅａｒｌ１、Ｅｍｉｌｉｎ２、Ｏｔｏｐ１、Ｐｌａ２ｇ２ｄ、Ｒｈｂｄｌ３、Ｓｌｃ６ａ１３、及びＳｙｃｐ３であり、（ｃ）前記選択された組織が脳であり、前記示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質が、Ａｐｏｄ、Ｂ２ｍ、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、Ｃｄ６８、Ｃｌｅｃ７ａ、Ｃｓｔ７、Ｃｔｓｄ、Ｇｆａｐ、Ｉｌ３３、Ｌｇａｌｓ３、Ｌｙｚｓ、及びＳｐｐ１であり、又は（ｄ）前記選択された組織が筋肉であり、前記示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質が、Ｃ４、Ｃｄｋｎ２ｃ、Ｃｄｓ１、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２、Ｃｏｌ３ａ１、Ｄｕｓｐ２６、Ｅｄｇ２、Ｉｇｈ−６、Ｍｔ２、Ｐｌｋ２、Ｒｈｐｎ２、及びＳｙｔ９である、請求項４８に記載のキット。
【請求項５０】
前記示差的な発現がカロリー制限によって逆転され、前記示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質が、（ａ）Ｃ３、Ｃｃｌ８、Ｌｃｎ２、Ｍｔ２、Ｐａｈ、Ｐｒｋｃｑ、Ｓｅｒｐｉｎａ３ｎ、Ｔｍｅｍ１６ｋ、及びＶｇｌｌ２、（ｂ）Ａｓｐｎ、Ｃｏｌ６ａ２、Ｃｒｉｐ２、Ｅｍｉｌｉｎ２、Ｏｔｏｐ１、Ｐｌａ２ｇ２ｄ、Ｒｈｂｄｌ３、及びＳｌｃ６ａ１３、（ｃ）Ａｐｏｄ、Ｂ２ｍ、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、Ｃｔｓｄ、Ｇｆａｐ、Ｉｌ３３、Ｌｙｚｓ、及びＳｐｐ１、又は（ｄ）Ｃ４、Ｃｄｋｎ２ｃ、Ｃｄｓ１、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２、Ｃｏｌ３ａ１、Ｅｄｇ２、Ｉｇｈ−６、Ｍｔ２、Ｐｌｋ２、及びＳｙｔ９である、請求項４９に記載のキット。
【請求項５１】
前記プローブが、既知の位置で固体担体に固定されている、請求項４８に記載のキット。
【請求項５２】
ポリペプチド結合剤が抗体である、請求項４８に記載のキット。
【請求項５３】
前記プローブが、イヌ科又はネコ科のポリヌクレオチド又はポリペプチドと結合又はハイブリダイズする、請求項４８に記載のキット。
【請求項５４】
若齢の対象と比較して高齢の対象の選択された組織において示差的に発現される１つ又は複数のポリヌクレオチドの発現レベルを同定する情報を収容するデータベースと、ユーザがデータベース中の情報を入手又は操作することを可能にするユーザインターフェースとを含み、前記ポリヌクレオチドが、表２、表５、表８及び表１０のいずれかに記載のタンパク質、又はその断片をコードしている遺伝子から選択される、コンピュータシステム。
【請求項５５】
（１）若齢の対象と比較して高齢の対象の選択された組織において示差的に発現される遺伝子の発現の検出のために、表２、表５、表８若しくは表１０のいずれかに記載のタンパク質をコードしているポリヌクレオチド、若しくはそれによってコードされているタンパク質、又はその断片を使用すること、（２）若齢の対象と比較して高齢の対象の選択された組織において示差的に発現される遺伝子の発現に対する試験物質の効果を測定するために、表２、表５、表８若しくは表１０のいずれかに記載のタンパク質をコードしているポリヌクレオチド、若しくはそれによってコードされているタンパク質、又はその断片を使用すること、（３）若齢の対象と比較して高齢の対象の選択された組織において示差的に発現される遺伝子の発現を調節する可能性が高いかどうかを判定する試験物質をスクリーニングのために、表２、表５、表８若しくは表１０のいずれかに記載のタンパク質をコードしているポリヌクレオチド、若しくはそれによってコードされているタンパク質、又はその断片を使用すること、（４）若齢の対象と比較して高齢の対象の選択された組織において示差的に発現される１つ又は複数の遺伝子の発現の調節のために、表２、表５、表８若しくは表１０のいずれかに記載のタンパク質をコードしているポリヌクレオチド、若しくはそれによってコードされているタンパク質、又はその断片を使用すること、（５）若齢の対象と比較して高齢の対象の選択された組織において示差的に発現される１つ又は複数のポリヌクレオチドの発現レベルを同定する情報を収容するデータベースを含むコンピュータシステムの使用であって、前記ポリヌクレオチドが、表２、表５、表８若しくは表１０のいずれかに記載のタンパク質又はその断片をコードしている遺伝子から選択される、使用、（６）表２、表５、表８又は表１０のいずれかに記載のタンパク質をコードしている１つ又は複数の遺伝子の示差的な発現を引き起こす能力によって、動物に投与された場合に選択された組織において加齢プロセスの逆転又は遅延に有用である可能性が高いと同定された物質を投与すること、のうちの１つ又は複数に関する情報又は指示を通信する媒体であって、前記情報又は指示を含有する文書、デジタル記憶媒体、光学的記憶媒体、音声表現又は画像表示のうちの１つ又は複数を含む、媒体。
【請求項５６】
表示されるウェブサイト、キオスク、冊子、製品ラベル、添付文書、広告、ちらし、公示、オーディオテープ、ビデオテープ、ＤＶＤ、ＣＤ、コンピュータで読取り可能なチップ、コンピュータで読取り可能なカード、コンピュータで読取り可能なディスク、コンピュータメモリ、又はそれらの組合せである、請求項５５に記載の媒体。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、本参照によってその開示が本明細書中に組み込まれている、２００９年３月１１日に出願の米国特許仮出願第６１／２０９８５４号の優先権を主張するものである。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、一般に、動物における健康及び長寿の栄養サポートの分野に関する。特に、本発明は、動物における加齢の組織特異的な汎用バイオマーカーを開発する方法、及びこれらの方法によって同定される強力なバイオマーカーセット、並びに動物において抗老化特性を有する栄養素及び他の機能的な成分又は作用剤を同定するための、組織特異的な汎用加齢バイオマーカーの使用を提供する。
【背景技術】
【０００３】
随意レベルを十分に下回るカロリー摂取量の制限は、げっ歯類及び霊長類などの哺乳動物を含めた数々の動物種において、寿命を延ばし、多くの加齢関連の状態の発症を低減又は遅延させ、ストレス耐性を向上させ、機能低下を減速させることが示されている（例えば、Ｄ．Ｋ．Ｉｎｇｒａｍら（２００４）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１０１９：４１２〜４２３を参照）。実際に、ヒトにおけるカロリー制限（ＣＲ）の長寿促進効果を評価するための臨床治験が開始されている。しかし、必要な制限の度合及び長さのために、ヒト及び動物ともに、ＣＲがほとんどの個体において長寿を増やすための実行可能な戦略である可能性は低いと考えられる。そのため、研究は、食事摂取量の実質的な変化なしにＣＲの効果を模倣することができる物質、例えば、薬剤、栄養物質などの同定に着目されてきた。
【０００４】
ＣＲの生理的若しくは生化学的な効果のうちの１つ若しくは複数を模倣することができる作用剤（例えば、Ｉｎｇｒａｍら、２００４、上記を参照）、又は特定の組織及び器官においてＣＲに関連する遺伝子発現プロファイルを模倣することができる作用剤（例えば、Ｓｐｉｎｄｌｅｒ、米国特許第６，４０６，８５３号、米国特許出願公開第２００３／０１２４５４０号）の同定に向けた取り組みがなされている。後者に関連して、ＣＲに関連する遺伝子を分析する方法及び遺伝子発現プロファイリングに基づいてＣＲ模倣体をスクリーニングする方法が開示されている（Ｓｐｉｎｄｌｅｒら、米国特許出願公開第２００４／０１８０００３号、第２００４／０１９１７７５号及び第２００５／００１３７７６号、Ｐａｎら、米国特許出願公開第２００７／０２３１３７１号）。
【０００５】
上記要約した手法が利用可能であるにもかかわらず、健康的な加齢を促進して長寿を増やすために、加齢プロセスを遅延又は逆転させることができる作用剤をスクリーニングする、より強力で速くて安価な方法の必要性が依然として存在する。本発明はこの必要性を満たす。
【発明の概要】
【０００６】
したがって、本発明の１つの目的は、選択された組織における強力で汎用的に適用可能な加齢の遺伝子発現マーカーを同定する方法を提供すること、及びこれらの方法によって同定された強力で汎用的に適用可能な遺伝子発現マーカーセットを提供することである。
【０００７】
本発明の別の目的は、若齢の対象と比較して高齢の対象の選択された組織において示差的に発現される、１つ又は複数の遺伝子又は遺伝子セグメントを提供することである。
【０００８】
本発明のさらなる目的は、若齢の対象と比較して高齢の対象の選択された組織において示差的に発現される複数のポリヌクレオチドを含む組合せを提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、若齢の対象と比較して高齢の対象の選択された組織において示差的に発現される遺伝子の発現の検出に適した、２つ以上のポリヌクレオチド又はポリペプチドプローブの組成物、及びプローブを含有する基材アレイなどの装置を提供することである。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、若齢の対象又は標準参照と比較して高齢の対象の選択された組織において示差的に発現される１つ又は複数の遺伝子の示差的な発現を検出するための方法を提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、若齢の対象又は標準参照と比較して高齢の対象の選択された組織において示差的に発現される１つ又は複数の遺伝子の発現プロファイルに対する試験物質の効果を測定するための方法を提供することである。
【００１２】
これらの他の目的のうちの１つ又は複数は、組織特異的な加齢バイオマーカーを同定する新規方法、並びに若齢の対象と比較して高齢の対象の選択された組織において示差的に発現される遺伝子及び遺伝子セグメントを表すポリヌクレオチド又はポリペプチドの新規組合せを用いて達成される。ポリヌクレオチドは、組成物、プローブ、プローブに基づく装置、及び若齢の対象又は標準参照と比較して高齢の対象の選択された組織において示差的に発現されるポリヌクレオチドの状態を判定するための方法を作り出すために使用し、これらは、上記で特定されている目的、例えば、選択された組織における加齢関連の状態を予後診断及び診断すること、並びに物質をスクリーニングして特定の組織において抗老化効果を有する可能性があるかどうかを判定することの達成に有用である。プローブの組合せ、プローブを利用した装置、及び物質を含む様々なキットも提供され、また、情報を操作するための様々なコンピュータプログラム、並びに示差的に発現される遺伝子及びその使用方法に関する情報を通信するための通信媒体も提供される。
【００１３】
本発明の他の及びさらなる目的、特徴、及び利点は、当業者に容易に明らかとなるであろう。
【発明の詳細な説明】
【００１４】
定義
【００１５】
本明細書中で全体にわたって使用する範囲は、範囲内のそれぞれ且つすべての値を詳細に述べて記載する必要性を回避するために、省略した表現である。必要に応じて、範囲内の任意の適切な値を範囲の上限値、下限値、又は終端として選択することができる。本明細書中に記載の任意の範囲又は間隔の間の任意且つすべての全整数又は部分的な整数が本明細書中に含まれることを理解されたい。
【００１６】
文脈により明らかにそうでないと指示される場合以外は、本明細書及び添付の特許請求の範囲中で使用する単語の単数形には複数形が含まれ、逆もそうである。したがって、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」の言及には、一般にそれぞれの用語の複数形が含まれる。例えば、「１つの（ａｎ）動物」、「１つの（ａ）方法」、又は「１つの（ａ）物質」への言及には、複数のそのような「動物」、「方法」、又は「物質」が含まれる。同様に、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、排他的ではなく包括的に解釈されるべきである。
【００１７】
用語「動物」とは、ヒト並びに鳥類、ウシ亜科、イヌ科、ウマ科、ネコ科、ヤギ科、ネズミ科、ヒツジ科、及びブタ科の動物を含めた他の動物を意味する。試験対象を比較するコンテキストにおいてこの用語を使用した場合、比較する動物は同じ種の動物であり、場合によっては同じ血統又は種族である。「コンパニオンアニマル」は任意の飼いならされた動物であり、それだけには限定されないが、ネコ、イヌ、ウサギ、モルモット、フェレット、ハムスター、マウス、アレチネズミ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ブタなどが含まれる。好ましくは、動物はヒト又はイヌ科若しくはネコ科などのコンパニオンアニマルである。
【００１８】
用語「抗体」とは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ抗体を含めた、特異的抗原と結合する任意の免疫グロブリンを意味する。この用語には、ポリクローナル、モノクローナル、一価、ヒト化、ヘテロコンジュゲート、多エピトープ特異性を有する抗体組成物、キメラ、二重特異性抗体、二特異性抗体、単鎖抗体、並びにＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖなどの抗体断片、又は他の抗原結合断片が含まれる。
【００１９】
用語「アレイ」とは、基材上の少なくとも２つのプローブの秩序化された配置を意味する。プローブのうちの少なくとも１つは対照又は標準であり、プローブのうちの少なくとも１つは診断的プローブである。基材上に約２〜約４０，０００個のプローブを配置することで、プローブと試料ポリヌクレオチド又はポリペプチドとの間に形成されるそれぞれの標識された複合体の大きさ及びシグナル強度が個々に識別可能であることが保証される。
【００２０】
用語「結合複合体」とは、試料中のポリペプチドが抗体又はその機能的断片などの結合パートナーと特異的に結合する際（本明細書中に定義されるように）に形成される複合体をいう。
【００２１】
用語「カロリー制限（ｃａｌｏｒｉｅ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）」又は「カロリーの制限（ｃａｌｏｒｉｃ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）」とは、栄養不足とならずに低カロリーである任意の食事レジメンをいう。一般に、制限は炭水化物、脂肪、及びタンパク質に由来する全カロリーのものである。制限は、典型的には、それだけには限定されないが、随意の消費と比較してカロリー摂取量の約２５％〜約４０％である。
【００２２】
用語「栄養補助食品」とは、動物の通常の食事に加えて経口摂取することを意図する製品を意味する。栄養補助食品は、任意の形態、例えば、固体、液体、ゲル、錠剤、カプセル、散剤などであってもよい。好ましくは、これらは好都合な剤形で提供される。一部の実施形態では、これらはバルクの散剤又は液体などの、バルクの消費者包装で提供される。他の実施形態では、補助食品は、軽食、おやつ、栄養補助バー、飲料などの他の食料品中に含めるバルクの量で提供される。
【００２３】
用語「示差的な発現」又は「示差的に発現される」とは、試料中の転写されたメッセンジャーＲＮＡ又は翻訳されたタンパク質の存在、非存在、又は量の少なくとも２倍の変化によって検出される、増加した若しくは上方調節された遺伝子発現を意味するか、又は、減少した若しくは下方調節された遺伝子発現を意味する。
【００２４】
用語「有効量」とは、本明細書中に記載のように、選択された組織において加齢を逆転又は遅延させるなどの特定の生物学的結果を達成するために有効な、化合物、材料、組成物、医薬品、又は他の材料の量を意味する。
【００２５】
用語「食品」又は「食品組成物」とは、ヒトを含めた動物による消費が意図され、それに栄養を与える組成物を意味する。本明細書中で使用する「ヒト消費用に配合された食物製品」とは、人間による摂取を具体的に意図する任意の組成物である。「ペット食品」とは、ペット、好ましくはコンパニオンアニマルによる消費を意図する組成物である。「完全且つ栄養バランスのとれたペット食品」とは、例えばコンパニオンアニマルの栄養の分野の認められた権威の推奨に基づいて、適切な量及び割合で、食品の意図するレシピエント又は消費者におけるすべての知られている必要な栄養素を含有するものである。したがって、そのような食品は、補助的な栄養源を加えずに、生命を維持する又は繁殖を促進するための食餌摂取の唯一の供給源として役割を果たすことができる。栄養バランスのとれたペット食品組成物は当分野で広く知られており、幅広く使用されている。
【００２６】
用語「断片」とは、（１）完全な配列の一部分であり、完全なポリヌクレオチド配列としての特定の使用について同じ若しくは同様の活性を有するオリゴヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド配列、又は、（２）完全な配列の一部分であり、完全なポリペプチド配列としての特定の使用について同じ若しくは同様の活性を有するペプチド若しくはポリペプチド配列を意味する。そのような断片は、特定の使用に適切とみなされる任意の数のヌクレオチド又はアミノ酸を含むことができる。一般に、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド断片は、完全な配列からの少なくとも約１０、５０、１００、又は１０００個のヌクレオチドを含有し、ポリペプチド断片は少なくとも約４、１０、２０、又は５０個の連続したアミノ酸を含有する。この用語には、断片のポリヌクレオチド及びポリペプチド変異体が包含される。
【００２７】
用語「遺伝子」又は「複数の遺伝子」とは、コーディング領域の前及び後の領域（リーダー及びトレーラー）並びに個々のコーディングセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含めた、ポリペプチドの生成に関与するＤＮＡの完全又は部分的なセグメントを意味する。この用語には、遺伝子のコーディング配列の相補体とハイブリダイズする任意のＤＮＡ配列が包含される。
【００２８】
用語「遺伝子産物」とは、ｍＲＮＡ若しくはその誘導体（例えばｃＤＮＡ）などの遺伝子の転写産物、又は遺伝子転写物の翻訳産物を意味する。用語「遺伝子産物」とは、一般に、タンパク質である翻訳産物をいう。用語「遺伝子産物」は、本明細書中で用語「タンパク質」と互換性があるように使用してもよい。
【００２９】
用語「相同体」とは、（１）参照ポリヌクレオチドに対して３０％、５０％、７０％、若しくは９０％を超える配列類似度を有し、参照ポリヌクレオチドと同じ若しくは実質的に同じ特性を有し、且つ同じ若しくは実質的に同じ機能を果たし、又はストリンジェントな条件下で参照ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする能力を有する、同じ又は異なる動物種からのポリヌクレオチドを含めたポリヌクレオチド、或いは、（２）参照ポリペプチドに対して３０％、５０％、７０％、若しくは９０％を超える配列類似度を有し、参照ポリペプチドと同じ若しくは実質的に同じ特性を有し、且つ同じ若しくは実質的に同じ機能を果たし、又は参照ポリペプチドと特異的に結合する能力を有する、同じ又は異なる動物種からのポリペプチドを含めたポリペプチドを意味する。完全長のコーディング配列の断片に言及する場合、これらの断片の機能は、単純に、特定の配列のポリペプチドの選択された一部分をコードしていることであっても良く、又はそのポリペプチドをコードしている別のポリヌクレオチド断片とハイブリダイズするために適切に類似した配列であることであってもよい。ポリペプチドの断片に言及する場合、これらの断片の機能は、単純に、抗体の産生に適したエピトープを形成することであってもよい。２つのポリペプチド配列又は２つのポリヌクレオチド配列の配列類似度は、当業者に知られている方法、例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：２２６４〜２２６８（１９９０））のアルゴリズムを使用して決定する。そのようなアルゴリズムは、ＡｌｔｓｃｈｕｌらのＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム内に組み込まれている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜４１０（１９９０））。比較目的でギャップ付きアラインメントを得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌらが記載したようにギャップ付きＢｌａｓｔを利用することができる（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５：３３８９〜３４０２（１９９７））。ＢＬＡＳＴ及びギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合は、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）の初期設定パラメータを使用する。ｈｔｔｐ：／／ｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照。
【００３０】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」とは、１つのポリヌクレオチドのプリンが相補的ポリヌクレオチドのピリミジンと水素結合した際に試料ポリヌクレオチド間で形成される複合体、例えば、５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−３’は、３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ−５’と塩基対を作ることを意味する。相補性の度合及びヌクレオチド類似体の使用はハイブリダイゼーション反応の効率及びストリンジェンシーに影響を与える。
【００３１】
用語「併用」とは、薬物、食品、又は他の物質を、（１）組成物、特に食品組成物中で一緒に、又は（２）別々に、同じ若しくは異なる頻度で、同じ若しくは異なる投与経路で、ほぼ同時若しくは周期的に、動物に投与することを意味する。「周期的」とは、物質を、その具体的な物質で許容される投与計画で投与することを意味する。「ほぼ同時」とは、一般に、物質（食品又は薬物）を同時に又は互いに約７２時間以内投与することを意味する。「併用」には、薬物などの物質を規定された期間の間投与し、本発明の組成物を無制限に投与する投与スキームが具体的に含まれる。
【００３２】
動物に言及する場合の用語「個体」とは、任意の種又は種類の個々の動物を意味する。この用語は、用語「対象」と互換性があるように使用してもよい。
【００３３】
用語「長寿」とは、一般に、特定の種、又は種内の区別が存在する場合はその種内の特定の系統、種族若しくは民族の平均寿命を超えた寿命をいう。「長寿の強化」又は「長寿の増加」とは、動物が属する種の平均寿命を超えた、特定の動物のすべての有意な寿命の延期をいう。
【００３４】
用語「ポリヌクレオチド」又は「オリゴヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのポリマーを意味する。この用語には、一本鎖或いは二本鎖のＤＮＡ及びＲＮＡ（ｃＤＮＡ及びｍＲＮＡが含まれる）、また、一本鎖の場合、直鎖状或いは環状のその相補的な配列が包含される。また、この用語には、元の配列と同じ又は実質的に同じ特性を有し、且つ同じ又は実質的に同じ機能を果たす、配列に適切な断片、変異体、相同体、及び対立遺伝子も包含される。特に、この用語には、異なる種、例えば、マウス及びイヌ又はネコからの相同体が包含される。配列は、アラインメントした際に完全に相補的（ミスマッチなし）であってもよく、又は約３０％までの配列ミスマッチを有していてもよい。好ましくは、ポリヌクレオチドでは、鎖は約５０〜１０，０００個のヌクレオチド、より好ましくは約１５０〜３，５００個のヌクレオチドを含有する。好ましくは、オリゴヌクレオチドでは、鎖は約２〜１００個のヌクレオチド、より好ましくは約６〜３０個のヌクレオチドを含有する。ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの正確な大きさは、様々な要因並びにポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの特定の応用及び使用に依存する。この用語には、合成したヌクレオチドポリマー並びに天然源から単離及び精製したヌクレオチドポリマーが含まれる。用語「ポリヌクレオチド」には「オリゴヌクレオチド」が包含される。
【００３５】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、又は「タンパク質」とは、アミノ酸のポリマーを意味する。この用語には、天然に存在する及び天然に存在しない（合成）ポリマー、並びに人工的な化学模倣体で１つ又は複数のアミノ酸が置換されたポリマーが包含される。また、この用語には、元の配列と同じ又は実質的に同じ特性を有し、且つ同じ又は実質的に同じ機能を果たす断片、変異体、及び相同体も包含される。この用語には、任意の長さのポリマー、好ましくは約２〜１０００個のアミノ酸、より好ましくは約５〜５００個のアミノ酸を含有するポリマーが包含される。この用語には、合成されたアミノ酸ポリマー並びに天然源から単離及び精製されたアミノ酸ポリマーが含まれる。
【００３６】
用語「プローブ」とは、（１）プローブに相補的な配列を有するポリヌクレオチドとアニーリング若しくは特異的にハイブリダイズすることができる、精製された制限酵素消化物などのように天然に存在するものであっても合成で生成されたものであっても良く、ＲＮＡ若しくはＤＮＡであるオリゴヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド、又は、（２）他のタンパク質若しくはタンパク質断片を実質的に排除するまで特定のタンパク質若しくはタンパク質断片と特異的に結合することができる、ペプチド若しくはポリペプチドを含めた化合物若しくは物質を意味する。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドプローブは、一本鎖又は二本鎖のどちらであってもよい。プローブの正確な長さは、温度、供給源、及び使用を含めた多くの要因に依存する。例えば、診断的用途には、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプローブは、典型的には約１０〜１００、１５〜５０、又は１５〜２５個のヌクレオチドを含有する。特定の診断的用途では、ポリヌクレオチドプローブは、約１００〜１０００、３００〜６００個のヌクレオチド、好ましくは約３００個のヌクレオチドを含有する。本明細書中のプローブは、特定の標的配列の様々な鎖に対して「実質的に」相補的であるように選択される。このことは、プローブが、１組の事前に決定された条件下でその対応する標的配列と特異的にハイブリダイズ又はアニーリングするように十分に相補的でなければならないことを意味する。したがって、プローブの配列は、標的の正確な相補的配列を反映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド断片がプローブの５’又は３’末端に付着しており、プローブ配列の残りの部分が標的配列に相補的であってもよい。或いは、プローブ配列が、標的ポリヌクレオチドと特異的にアニーリングするために標的ポリヌクレオチドの配列と十分な相補性を有する場合は、非相補的塩基又はより長い配列をプローブ内に散在させることができる。ペプチド又はポリペプチドプローブは、ＤＮＡ（ＤＮＡ結合タンパク質の場合）、抗体、細胞膜受容体、ペプチド、補因子、レクチン、糖、多糖、細胞、細胞膜、オルガネラ及びオルガネラ膜を含めた、タンパク質又はペプチドが特異的に結合する任意の分子であってもよい。
【００３７】
用語「試料」とは、ＤＮＡ及びＲＮＡを含有する細胞及び他の組織を含む、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、代謝物などを含有する任意の動物の組織又は体液を意味する。例には、脂肪、血液、軟骨、結合組織、上皮、リンパ系、筋肉、神経、痰などが含まれる。試料は固体又は液体であってもよく、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、血液又は尿などの体液、細胞、細胞調製物又はその可溶性画分若しくは培地アリコート、染色体、オルガネラなどであってもよい。
【００３８】
用語「単一パッケージ」とは、キットの構成要素が１つ又は複数の容器内で、又はそれと、物理的に結びつけられており、製造、分布、販売、又は使用の単位とみなされることを意味する。容器には、それだけには限定されないが、バッグ、箱、ボトル、収縮包装パッケージ、ステープル若しくは他の様式で固定された構成要素、又はその組合せが含まれる。単一パッケージは、製造、分布、販売、又は使用の単位とみなされるように物理的に結びつけられている、個々の食品組成物の容器であってもよい。
【００３９】
用語「特異的に結合する」とは、その構造、特にその分子側基に依存する、２つの分子間の特殊且つ正確な相互作用を意味する。例えば、ＤＮＡ分子の主溝内への調節タンパク質のインターカレーション、２本の一本鎖核酸間の主鎖に沿った水素結合、又はタンパク質のエピトープと作動薬、拮抗薬、若しくは抗体との間の結合である。
【００４０】
用語「特異的にハイブリダイズする」とは、当分野で一般に使用される事前に決定された条件下においてそのようなハイブリダイゼーションを可能にするために十分に相補的な（しばしば「実質的に相補的」と呼ばれる）配列の２本の一本鎖ポリヌクレオチド間の会合を意味する。例えば、この用語は、本発明の一態様に従って、ポリヌクレオチドプローブと一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子内に含有される実質的に相補的な配列とのハイブリダイゼーション、ポリヌクレオチドプローブと非相補的な配列の一本鎖ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの実質的な排除を指してもよい。
【００４１】
用語「標準」とは、例えば、試験物質が、その使用のコンテキストにおいて適切な示差的な遺伝子の発現を引き起こすかどうかを判定するために、試験物質を投与した対象からの組織を含有する試料と比較した、対照若しくは参照物質を投与した、又は物質を投与していない対象からの組織を含有する対照試料を意味する。
【００４２】
用語「ストリンジェントな条件」とは、（１）０．１％のウシ血清アルブミン、０．１％のフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、０．１％のポリビニルピロリドン、７５０ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ６．５における５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、及び７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む、５０％（体積／体積）のホルムアミドを用いた、４２℃でのハイブリダイゼーション、（２）５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、及び１０％の硫酸デキストランを用いた、４２℃でのハイブリダイゼーションであり、４２℃で０．２×ＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳを用いた洗浄又は５０℃で０．０１５ＭのＮａＣｌ、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、０．１％のＮａ２ＳＯ４を用いた洗浄、又は同様の低イオン強度及び高温の洗浄剤並びに同様の変性剤を用いた同様の手順を伴うことを意味する。
【００４３】
本明細書中で使用する用語「組織特異的なマーカー」又は「組織特異的なバイオマーカー」とは、若齢と比較した高齢の対象の選択された組織において示差的に発現される遺伝子及びその発現産物をいう。用語「組織特異的」には組織及び器官が包含されることを意図する。例えば、選択された組織は、心臓からの平滑筋組織であってもよく、組織特異的なマーカーは「心臓に特異的」であるといわれてもよい。別の例として、選択された組織は、脂肪組織であってもよく、任意の特定の器官に関連していなくてもよい。当業者には、本明細書の全体にわたるコンテキストにおいて使用されるこれらの用語が理解されるであろう。
【００４４】
用語「変異体」とは、（１）あるポリヌクレオチド配列から又はそれへの１つ又は複数のヌクレオチドの任意の置換、変異、修飾、置換え、欠失、又は付加を含有し、元の配列と同じ又は実質的に同じ特性を有し、且つ同じ又は実質的に同じ機能を果たすポリヌクレオチド配列、及び（２）あるポリペプチド配列から又はそれへの１つ又は複数のアミノ酸の任意の置換、変異、修飾、置換え、欠失、又は付加を含有し、元の配列と同じ又は実質的に同じ特性を有し、且つ同じ又は実質的に同じ機能を果たすポリペプチド配列を意味する。したがって、この用語には一塩基多型（ＳＮＰ）及び対立遺伝子変異体が含まれ、ポリペプチド中の保存的及び非保存的アミノ酸置換が含まれる。また、この用語には、必要に応じて、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの化学的誘導体化、及びヌクレオチド又はアミノ酸を天然に存在しないヌクレオチド又はアミノ酸で置換することも包含される。
【００４５】
用語「仮想パッケージ」とは、他の構成要素をどのように得るのかをユーザに指示する、１つ又は複数の物理的又は仮想的キットの構成要素に関する指示書によって、キットの構成要素が関連付けられていることを意味し、例えば１つの構成要素と、ユーザにウェブサイトを訪れ、録音メッセージに接触すること、視覚メッセージを見ること、又はキットをどのように使用するかに関する指示を得るために管理人若しくは指導者に連絡することを指示する指示書を含有するバッグの中である。
【００４６】
「若齢」とは、一般に、既知のパラメータに従って、種、又は種内の系統、種族若しくは民族によって定義される、若年成人期にある、すなわち思春期又は青年期を超えて成長した個体をいう。本明細書中で使用する「加齢」又は「高齢」とは、既知のパラメータに従って、種、又は種内の系統、種族若しくは民族によって決定される、物理的又は年齢的にその平均寿命の最後の３０％以内にある個体をいう。
【００４７】
当業者には、本明細書中に記載の特定の方法、プロトコル、及び試薬が変化してもよいことが理解されるため、ここで開示する方法及び組成物並びに他の進歩はこれらに限定されない。さらに、本明細書中で使用する用語は、特定の実施形態を説明することのみが目的であり、開示又は特許請求されている範囲を限定することを意図せず、また限定しない。
【００４８】
別段に定義されない限り、本明細書中で使用するすべての技術用語及び科学用語、専門用語、並びに頭字語は、本発明の分野（複数可）、又は用語が使用される分野（複数可）における当業者によって一般的に理解される意味を持つ。本明細書中に記載したものに類似又は均等な任意の組成物、方法、製品、又は他の手段若しくは材料を本発明の実施に使用することができるが、好ましい組成物、方法、製品、又は他の手段若しくは材料は、本明細書中に記載されている。
【００４９】
本明細書中で引用又は言及したすべての特許、特許出願、出版物、及び他の参照は、支配法によって許可される程度まで、本明細書中に参考として組み込まれている。これらの参考文献の記述は、それ中に記載されている主張を要約することのみを意図する。そのような特許、特許出願、出版物若しくは参照、又はその任意の一部分のいずれも、関連する、重要である、又は従来技術であるという認証は行っていない。そのような特許、特許出願、出版物、及び他の参照が関連する、重要である、又は従来技術であるといういかなる主張の正確性及び妥当性に異議を申し立てる権利は明確に留保される。
【００５０】
本発明
【００５１】
本発明は、部分的に、本発明者らが開発した選択された組織において強力な加齢の遺伝子発現マーカーを同定する方法から生じる。本方法は、ある種の複数の系統、種族又は民族において選択された組織中の示差的な遺伝子発現をスクリーニングするステップを含み、候補遺伝子発現マーカーが、スクリーニングされる系統、種族又は民族の大多数において示差的に発現されなければならないという基準を用いる。この基準及び任意選択で１つ又は複数の二次スクリーニング基準を用いて、いくつかの選択された組織における強力な加齢の遺伝子発現マーカーセットが同定された。
【００５２】
本発明の特定の実施形態では、マーカーは、少なくとも１つの示差的に発現される遺伝子の発現を測定するために使用される。好ましい実施形態では、マーカーは、２つ以上の示差的に発現される遺伝子の発現を測定するために使用される。２つ以上の示差的に発現される遺伝子を測定することで、選択された組織の遺伝子発現パターン又は遺伝子発現プロファイルが提供される。より好ましくは、いくつかの選択された組織における示差的に発現される遺伝子の多数の測定を行ってもよく、それにより遺伝子発現パターン又はプロファイルのさらなる情報が提供される。
【００５３】
本発明の様々な実施形態では、遺伝子発現の変化は、２つの方法、すなわち、（１）特定の遺伝子によって産生されるｍＲＮＡの検出を介して転写を測定すること、及び（２）特定の転写物によって産生されるタンパク質の検出を介して翻訳を測定すること、のうちの一方又は両方で測定してもよい。
【００５４】
減少又は増加した発現は、例えば、ＰＣＲ（それだけには限定されないがＲＴ−ＰＣＲ及びｑＰＣＲが含まれる）、ＲＮａｓｅ保護、ノーザンブロッティング、マイクロアレイ、マクロアレイ、並びに他のハイブリダイゼーション方法などの、ポリヌクレオチドを定量するための当分野で周知の方法のうちの任意の方法を用いて、ＲＮＡレベルで測定することができる。本発明に従って分析される又は調べられる遺伝子は、典型的にはｍＲＮＡ又は逆転写したｍＲＮＡの形態である。遺伝子は、クローニング及び／又は増幅されたものであってもよい。クローニング自体は集団内の遺伝子の表現を偏らせないようである。しかし、より少ないプロセスステップで使用できるため、ポリＡ＋ＲＮＡを供給源として使用することが好ましいことがある。
【００５５】
したがって、一態様では、本発明は、選択された組織中の加齢の遺伝子発現マーカーを同定する方法を提供する。本方法は、ある種の系統、種族又は民族の多数において、好ましくは事前に決定された有意性レベル（例えば、ｐ＜０．１０、ｐ＜０．０５、又はｐ＜０．０１）で、選択された組織中で示差的に発現されるという基準を用いて、若齢の対象と比較して高齢の対象中の組織において示差的に発現される１つ又は複数の遺伝子を選択するステップを含む。特定の実施形態では、遺伝子は、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個以上の系統、種族又は民族において示差的に発現される。他の実施形態では、基準は、遺伝子が試験される系統、種族又は民族の大多数において示差的に発現されるように設定され、また、遺伝子が試験される系統、種族又は民族の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％において示差的に発現されるように上げてもよい。
【００５６】
本方法は、任意の種の系統、種族又は民族で実施することができる。特定の実施形態では、種は、哺乳動物、特にヒト又はイヌ科若しくはネコ科などのコンパニオンアニマル、又は上記で定義された他のコンパニオンアニマルである。
【００５７】
本方法を実施するために選択される組織は、ほんの数例を挙げれば、それだけには限定されないが、脂肪、膀胱、血液、骨、骨髄、腸、脳及び中枢神経系、乳房、気管支、軟骨、結腸直腸、結合組織、内分泌系、眼、雌性生殖器、腺、心臓、腸管、腎臓、肝臓、肺及び鼻／気管支系、リンパ節及びリンパ系の器官、雄性生殖器、口及び舌、脳／ＣＮＳ以外の神経組織、膵臓、腹膜、脾臓、並びに胃を含めた、任意の組織又は器官であってもよい。代表的な実施形態では、組織は心臓、筋肉、脳又は脂肪組織から選択される。
【００５８】
上述の方法には、選択された組織中で強力な加齢のマーカーを同定するためのさらなる基準を含むことができる。例えば、本方法は、若齢の対象と比較して高齢の対象において示差的に発現される遺伝子の示差的な発現が、カロリー制限によって少なくとも部分的に逆転されるという基準をさらに含むことができる。また、本方法は、若齢の対象と比較して高齢の対象において示差的に発現される遺伝子が、１つ又は複数の加齢関連の生理的機能に関連していることが知られている又は疑われるという基準をさらに含むこともできる。遺伝子産物の機能性は、実験又は当業者が入手可能な文献から判断することができる。
【００５９】
上述の方法は、選択された組織中の加齢のバイオマーカーの同定に使用される。したがって、別の態様では、本発明は、若齢の対象と比較して高齢の対象の選択された組織において示差的に発現される、それらのバイオマーカーから発現された複数のポリヌクレオチド又はタンパク質を含む組合せを提供し、ポリヌクレオチドは、表２、表５、表８若しくは表１０に記載のタンパク質、又はその断片をコードしている遺伝子から選択される。これらの表は、遺伝子記号、遺伝子名及び「Ｅｎｔｒｅｚ」番号を記載し、これにより、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  ＨｅａｌｔｈのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のデータベースにおける遺伝子及び遺伝子産物に関する完全な説明がアクセス可能となる。
【００６０】
一実施形態では、選択された組織は心臓であり、ポリヌクレオチドは、Ａｍｙ１、Ａｐｏｄ、Ｂｄｈ１、Ｃ３、Ｃａｓｑ１、Ｃｃｌ８、Ｋｃｎｄ２、Ｌｃｎ２、Ｍｔ２、Ｍｙｏｔ、Ｐａｈ、Ｐｒｋｃｑ、Ｓｅｒｐｉｎａ３ｎ、Ｓｋａｐ２、Ｔｍｅｍ１６ｋ、及びＶｇｌｌ２のうちの２つ以上をコードしている遺伝子から選択される。この群のうち、Ｃ３、Ｃｃｌ８、Ｌｃｎ２、Ｍｔ２、Ｐａｈ、Ｐｒｋｃｑ、Ｓｅｒｐｉｎａ３ｎ、Ｔｍｅｍ１６ｋ、及びＶｇｌｌ２において、示唆的な発現は、カロリー制限によって逆転される。
【００６１】
別の実施形態では、選択された組織は脂肪であり、ポリヌクレオチドは、Ａｓｐｎ、Ｃｌｅｃ４ｎ、Ｃｏｌ６ａ２、Ｃｏｌ１８ａ１、Ｃｏｘ８ｂ、Ｃｒｉｐ２、Ｅａｒｌ１、Ｅｍｉｌｉｎ２、Ｏｔｏｐ１、Ｐｌａ２ｇ２ｄ、Ｒｈｂｄｌ３、Ｓｌｃ６ａ１３、及びＳｙｃｐ３のうちの２つ以上をコードしている遺伝子から選択される。この群のうち、Ａｓｐｎ、Ｃｏｌ６ａ２、Ｃｒｉｐ２、Ｅｍｉｌｉｎ２、Ｏｔｏｐ１、Ｐｌａ２ｇ２ｄ、Ｒｈｂｄｌ３、及びＳｌｃ６ａ１３において、示差的な発現は、カロリー制限によって逆転される。
【００６２】
別の実施形態では、選択された組織は脳であり、ポリヌクレオチドは、Ａｐｏｄ、Ｂ２ｍ、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、Ｃｄ６８、Ｃｌｅｃ７ａ、Ｃｓｔ７、Ｃｔｓｄ、Ｇｆａｐ、Ｉｌ３３、Ｌｇａｌｓ３、Ｌｙｚｓ、及びＳｐｐ１のうちの２つ以上をコードしている遺伝子から選択される。この群のうち、Ａｐｏｄ、Ｂ２ｍ、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、Ｃｔｓｄ、Ｇｆａｐ、Ｉｌ３３、Ｌｙｚｓ、及びＳｐｐ１において、示差的な発現は、カロリー制限によって逆転される。
【００６３】
別の実施形態では、選択された組織は筋肉であり、ポリヌクレオチドは、Ｃ４、Ｃｄｋｎ２ｃ、Ｃｄｓ１、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２、Ｃｏｌ３ａ１、Ｄｕｓｐ２６、Ｅｄｇ２、Ｉｇｈ−６、Ｍｔ２、Ｐｌｋ２、Ｒｈｐｎ２、及びＳｙｔ９のうちの２つ以上をコードしている遺伝子から選択される。この群のうち、Ｃ４、Ｃｄｋｎ２ｃ、Ｃｄｓ１、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２、Ｃｏｌ３ａ１、Ｅｄｇ２、Ｉｇｈ−６、Ｍｔ２、Ｐｌｋ２、及びＳｙｔ９において、示差的な発現は、カロリー制限によって逆転される。
【００６４】
一実施形態では、組合せは、２つ以上のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドから発現されるタンパク質を含む。好ましくは、組合せは、特定の種、組織及び使用に適切な複数のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドから発現されたタンパク質、一般に、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００個以上のポリヌクレオチド又はタンパク質若しくはその断片を含む。組合せが１つ又は複数の断片を含む場合、断片は、元のポリヌクレオチド又はタンパク質の特性及び機能、を保持する任意の大きさであることができ、好ましくは元の約３０％、６０％、又は９０％である。
【００６５】
ポリヌクレオチド及びタンパク質は、ヒトを含む任意の動物、特にイヌ科及びネコ科、更に、特にイヌ科の動物からのものであることができる。様々な動物種からのポリヌクレオチド及びタンパク質の相同体は、当業者に周知の標準の情報検索及び分子学的方法によって得ることができる。例えば、遺伝子又はタンパク質の名称、公開データベースの登録番号、又は機能の説明を、いくつかの公的に利用可能なデータベースのうちの１つに入力してもよく、これにより、配列情報を含めた様々な種からのその遺伝子に関する情報を提供する情報源のリストが生成される。そのようなデータベースの１つは「Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｈｙｐｅｒｌｉｎｋｅｄ  ｏｖｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ｉＨＯＰ）データベースであり、これは、ｕｒｌ：ｉｈｏｐ−ｎｅｔ．ｏｒｇからインターネット上でアクセス可能である。或いは、既知の遺伝子又はタンパク質の公開データベースの登録番号を利用して、その遺伝子又はタンパク質の配列情報にアクセスし、配列比較検索を使用して他の種における相同体又は相同分子種を検索してもよい。例えば、マウスからの遺伝子又はタンパク質のＧｅｎＢａｎｋ登録番号を国立衛生研究所の国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のデータベースに入力し、それによりそのマウス遺伝子のＤＮＡ又はポリペプチド配列にアクセスしてもよい。同じデータベースを用いて、十分な相同性を有する他の種、例えばイヌからの配列を同定するために、ＢＬＡＳＴ検索を、マウスのＤＮＡ若しくはタンパク質配列、又は遺伝子若しくはタンパク質を定義するために十分な長さのそれらの断片に対して行ってもよい。その後、これらの完全長のヌクレオチド又はタンパク質配列に関する情報、及び他の説明的な情報を得るため、他の目的の種からの配列の受託番号をデータベース内に入力してもよい。
【００６６】
別の態様では、本発明は、若齢の対象と比較して高齢の対象における選択された組織において示差的な遺伝子発現を検出するための２つ以上のプローブを含む組成物を提供する。特定の実施形態では、選択された組織は心臓、脂肪、脳又は筋肉組織であり、プローブは、（ａ）表２、表５、表８若しくは表１０に記載のタンパク質、又はその断片をコードしている２つ以上の遺伝子と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド、或いは（ｂ）表２、表５、表８若しくは表１０に記載のタンパク質、又はその断片から選択される２つ以上のポリペプチドと特異的に結合するポリペプチド結合剤を含む。
【００６７】
一実施形態では、選択された組織は心臓であり、示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質は、Ａｍｙ１、Ａｐｏｄ、Ｂｄｈ１、Ｃ３、Ｃａｓｑ１、Ｃｃｌ８、Ｋｃｎｄ２、Ｌｃｎ２、Ｍｔ２、Ｍｙｏｔ、Ｐａｈ、Ｐｒｋｃｑ、Ｓｅｒｐｉｎａ３ｎ、Ｓｋａｐ２、Ｔｍｅｍ１６ｋ、及びＶｇｌｌ２である。別の実施形態では、選択された組織は脂肪であり、示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質は、Ａｓｐｎ、Ｃｌｅｃ４ｎ、Ｃｏｌ６ａ２、Ｃｏｌ１８ａ１、Ｃｏｘ８ｂ、Ｃｒｉｐ２、Ｅａｒｌ１、Ｅｍｉｌｉｎ２、Ｏｔｏｐ１、Ｐｌａ２ｇ２ｄ、Ｒｈｂｄｌ３、Ｓｌｃ６ａ１３、及びＳｙｃｐ３である。別の実施形態では、選択された組織は脳であり、示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質は、Ａｐｏｄ、Ｂ２ｍ、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、Ｃｄ６８、Ｃｌｅｃ７ａ、Ｃｓｔ７、Ｃｔｓｄ、Ｇｆａｐ、Ｉｌ３３、Ｌｇａｌｓ３、Ｌｙｚｓ、及びＳｐｐ１である。さらに別の実施形態では、選択された組織は筋肉であり、示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質は、Ｃ４、Ｃｄｋｎ２ｃ、Ｃｄｓ１、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２、Ｃｏｌ３ａ１、Ｄｕｓｐ２６、Ｅｄｇ２、Ｉｇｈ−６、Ｍｔ２、Ｐｌｋ２、Ｒｈｐｎ２、及びＳｙｔ９である。
【００６８】
特定の実施形態では、示差的な発現はカロリー制限によって逆転され、示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質は、（ａ）心臓中のＣ３、Ｃｃｌ８、Ｌｃｎ２、Ｍｔ２、Ｐａｈ、Ｐｒｋｃｑ、Ｓｅｒｐｉｎａ３ｎ、Ｔｍｅｍ１６ｋ、及びＶｇｌｌ２、（ｂ）脂肪組織中のＡｓｐｎ、Ｃｏｌ６ａ２、Ｃｒｉｐ２、Ｅｍｉｌｉｎ２、Ｏｔｏｐ１、Ｐｌａ２ｇ２ｄ、Ｒｈｂｄｌ３、及びＳｌｃ６ａ１３、（ｃ）脳中のＡｐｏｄ、Ｂ２ｍ、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、Ｃｔｓｄ、Ｇｆａｐ、Ｉｌ３３、Ｌｙｚｓ、及びＳｐｐ１、又は（ｄ）筋肉中のＣ４、Ｃｄｋｎ２ｃ、Ｃｄｓ１、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２、Ｃｏｌ３ａ１、Ｅｄｇ２、Ｉｇｈ−６、Ｍｔ２、Ｐｌｋ２、及びＳｙｔ９である。
【００６９】
好ましくは、組成物は、特定の種、組織及び使用に適切なポリヌクレオチド若しくはタンパク質、又はその断片を検出するために、複数のプローブ、一般に約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００個以上のプローブを含む。当業者には、プローブを利用するアッセイの感度又は正確さを洗練させるために、単一の標的遺伝子又はタンパク質のために複数の異なるプローブを利用してもよいことが理解されよう。例えば、１つの標的ポリヌクレオチド上の異なる配列と特異的にハイブリダイズするいくつかのオリゴヌクレオチドプローブを用いてもよい。同様に、１つの標的タンパク質上の異なるエピトープに対して免疫学的に特異的ないくつかの抗体を利用してもよい。
【００７０】
試料を調べるための１つ又は複数のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドプローブは、本明細書中に記載の任意の遺伝子の配列情報を用いて、任意の種、好ましくはイヌ科又はネコ科から調製してもよい。プローブは、適切な相補的な遺伝子又は転写物と実質的に排他的に、特異的にハイブリダイズするように十分な長さのものであるべきである。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも約１０、１２、１４、１６、１８、２０又は２５個のヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、少なくとも約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００個のヌクレオチドのより長いプローブが望ましく、また、一部の実施形態では、約１００個のヌクレオチドより長いプローブが適切なことがある。プローブは、機能的タンパク質をコードしている完全長配列を含んでいてもよい。核酸プローブは、当業者に知られている方法、例えば、ヌクレオチドからのｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成、天然源からの単離及び精製、又は本発明のポリヌクレオチドの酵素的切断を用いて作製又は得る。
【００７１】
本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイズした核酸プローブを含むハイブリダイゼーション複合体は、当分野で知られている様々な方法によって検出されてもよい。本発明の特定の実施形態では、固定した核酸プローブを、ポリヌクレオチド及びその発現パターンの迅速且つ特異的な検出に使用してもよい。典型的には、核酸プローブを固体担体と連結させ、標的ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子、転写産物、単位複製配列、又は最も一般的には増幅した混合物）をプローブとハイブリダイズさせる。プローブ若しくは標的又は両方を、典型的にはフルオロフォア又はストレプトアビジンなどの他のタグで標識することができる。標的を標識する場合、ハイブリダイゼーションは、結合した蛍光を検出することによって検出されてもよい。プローブを標識する場合、ハイブリダイゼーションは、典型的には標識の消光によって検出される。プローブ及び標的の両方を標識する場合、ハイブリダイゼーションの検出は、典型的には、２つの結合した標識が近接していることから生じる色シフトを監視することによって行う。様々な標識戦略、標識など、特に蛍光に基づいた応用のためのものが当分野で知られている。
【００７２】
別の実施形態では、プローブは、本明細書中に記載されているポリペプチドのうちの１つ若しくは複数の発現によって産生されるポリペプチド又はその断片と特異的に結合するポリペプチド結合剤を含む。そのようなタンパク質結合プローブは、表２、表５、表８及び表１０に同定されているタンパク質のうちの任意のもの、又はその断片について利用可能な配列情報を用いて調製してもよい。
【００７３】
試料中のタンパク質のレベルを決定するために使用することができるアッセイ技法も、当業者に周知である。そのようなアッセイ方法には、ラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセイ、ウエスタンブロット分析及びＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。抗体を利用するアッセイ方法では、ポリクローナル及びモノクローナル抗体がどちらも、本発明で使用するために適切である。そのような抗体は、当業者には十分に理解されるように、特定のタンパク質、又はタンパク質のエピトープ、又はタンパク質断片に免疫学的に特異的であってもよい。タンパク質又はペプチドに免疫学的に特異的なポリクローナル及びモノクローナル抗体を作製する方法も当分野で周知である。
【００７４】
本発明の好ましい実施形態では、本明細書中に記載の遺伝子の発現によって産生されたタンパク質を検出及び定量するために抗体を利用してもよい。タンパク質は免疫沈降、親和性分離、ウエスタンブロット分析などによって検出されてもよいが、好ましい方法では、抗体を固体担体上に固定し、標的タンパク質又はペプチドを固定した抗体に曝露させる、ＥＬＩＳＡ型の方法を利用する。プローブ若しくは標的又は両方を標識することができる。様々な標識戦略、標識などが当分野で知られている。
【００７５】
別の態様では、本発明は、若齢の対象と比較して高齢の対象中の選択された組織において示差的な遺伝子発現を検出するための複数のプローブを含むアレイが固定された、固体担体を備えた装置を提供する。特定の実施形態では、選択された組織は心臓、脂肪、脳又は筋肉組織であり、プローブは、（ａ）表２、表５、表８若しくは表１０に記載のタンパク質、又はその断片をコードしている２つ以上の遺伝子と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド、又は（ｂ）表２、表５、表８若しくは表１０に記載のタンパク質、又はその断片から選択される２つ以上のポリペプチドと特異的に結合するポリペプチド結合剤を含む。好ましい実施形態では、装置は、イヌ科又はネコ科からの遺伝子の示差的な発現を検出するために使用する。
【００７６】
一実施形態では、選択された組織は心臓であり、示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質は、Ａｍｙ１、Ａｐｏｄ、Ｂｄｈ１、Ｃ３、Ｃａｓｑ１、Ｃｃｌ８、Ｋｃｎｄ２、Ｌｃｎ２、Ｍｔ２、Ｍｙｏｔ、Ｐａｈ、Ｐｒｋｃｑ、Ｓｅｒｐｉｎａ３ｎ、Ｓｋａｐ２、Ｔｍｅｍ１６ｋ、及びＶｇｌｌ２である。別の実施形態では、選択された組織は脂肪であり、示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質は、Ａｓｐｎ、Ｃｌｅｃ４ｎ、Ｃｏｌ６ａ２、Ｃｏｌ１８ａ１、Ｃｏｘ８ｂ、Ｃｒｉｐ２、Ｅａｒｌ１、Ｅｍｉｌｉｎ２、Ｏｔｏｐ１、Ｐｌａ２ｇ２ｄ、Ｒｈｂｄｌ３、Ｓｌｃ６ａ１３、及びＳｙｃｐ３である。別の実施形態では、選択された組織は脳であり、示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質は、Ａｐｏｄ、Ｂ２ｍ、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、Ｃｄ６８、Ｃｌｅｃ７ａ、Ｃｓｔ７、Ｃｔｓｄ、Ｇｆａｐ、Ｉｌ３３、Ｌｇａｌｓ３、Ｌｙｚｓ、及びＳｐｐ１である。さらに別の実施形態では、選択された組織は筋肉であり、示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質は、Ｃ４、Ｃｄｋｎ２ｃ、Ｃｄｓ１、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２、Ｃｏｌ３ａ１、Ｄｕｓｐ２６、Ｅｄｇ２、Ｉｇｈ−６、Ｍｔ２、Ｐｌｋ２、Ｒｈｐｎ２、及びＳｙｔ９である。
【００７７】
特定の実施形態では、示差的な発現はカロリー制限によって逆転され、示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質は、（ａ）心臓中のＣ３、Ｃｃｌ８、Ｌｃｎ２、Ｍｔ２、Ｐａｈ、Ｐｒｋｃｑ、Ｓｅｒｐｉｎａ３ｎ、Ｔｍｅｍ１６ｋ、及びＶｇｌｌ２、（ｂ）脂肪組織中のＡｓｐｎ、Ｃｏｌ６ａ２、Ｃｒｉｐ２、Ｅｍｉｌｉｎ２、Ｏｔｏｐ１、Ｐｌａ２ｇ２ｄ、Ｒｈｂｄｌ３、及びＳｌｃ６ａ１３、（ｃ）脳中のＡｐｏｄ、Ｂ２ｍ、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、Ｃｔｓｄ、Ｇｆａｐ、Ｉｌ３３、Ｌｙｚｓ、及びＳｐｐ１、又は（ｄ）筋肉中のＣ４、Ｃｄｋｎ２ｃ、Ｃｄｓ１、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２、Ｃｏｌ３ａ１、Ｅｄｇ２、Ｉｇｈ−６、Ｍｔ２、Ｐｌｋ２、及びＳｙｔ９である。
【００７８】
一実施形態では、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドプローブのアレイを利用してもよく、別の実施形態では、示差的に発現される遺伝子産物と特異的に結合する抗体又は他のタンパク質のアレイを利用してもよい。そのようなアレイは、例えば、固体担体上でｉｎ−ｓｉｔｕ合成すること又は事前に合成したプローブをマイクロプリント技法によって固体担体に付着させることなどの、既知の方法に従ってあつらえて作製してもよい。好ましい実施形態では、核酸又はタンパク質結合プローブのアレイは、本明細書中に記載の示差的に発現される遺伝子又は遺伝子断片のうちの２つ以上によって産生される転写物又はタンパク質を特異的に検出するために、あつらえて作製される。
【００７９】
別の態様では、本発明は、標準又は若齢の対象と比較して高齢の対象中の選択された組織において示差的に発現される、１つ又は複数の遺伝子の示差的な発現を検出する方法を提供する。特定の実施形態では、組織は心臓、脂肪、脳又は筋肉であり、本方法は、一般に、（ａ）（ｉ）表２、表５、表８若しくは表１０に記載のタンパク質、又はその断片をコードしている２つ以上の遺伝子と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド、又は（ｉｉ）表２、表５、表８若しくは表１０に記載のタンパク質、又はその断片から選択される２つ以上のポリペプチドと特異的に結合するポリペプチド結合剤を含むプローブを用意するステップと、（ｂ）プローブと試料中のｍＲＮＡ又はタンパク質とのハイブリダイゼーション又は結合を可能にすることによって、試料中でハイブリダイゼーション又は結合複合体を形成するように、プローブを高齢の対象由来のｍＲＮＡ又はタンパク質を含む試料に加えるステップと、（ｃ）任意選択で、プローブと第２の試料中のｍＲＮＡ又はタンパク質とのハイブリダイゼーション又は結合を可能にすることによって、もう一方の試料中でハイブリダイゼーション又は結合複合体を形成するように、プローブを、若齢の対象由来のｍＲＮＡ又はタンパク質を含む別の試料に加えるステップと、（ｄ）試料又は複数の試料中のハイブリダイゼーション複合体を検出するステップと、（ｅ）標準試料又は任意選択のもう一方の試料と比較した、試料中のハイブリダイゼーション又は結合の量の間の少なくとも１つの差異が、高齢の対象において示差的に発現される１つ又は複数の遺伝子の示差的な発現を示す、第１の試料からのハイブリダイゼーション又は結合複合体を、標準試料、又は任意選択でもう一方の試料のハイブリダイゼーション又は結合複合体とを、比較するステップを含む。
【００８０】
本方法は、表２、５、８若しくは１０又はそのサブセットに記載の遺伝子産物をコードしている遺伝子の示差的な発現を検出するために使用してもよい。したがって、一実施形態では、選択された組織は心臓であり、示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質は、Ａｍｙ１、Ａｐｏｄ、Ｂｄｈ１、Ｃ３、Ｃａｓｑ１、Ｃｃｌ８、Ｋｃｎｄ２、Ｌｃｎ２、Ｍｔ２、Ｍｙｏｔ、Ｐａｈ、Ｐｒｋｃｑ、Ｓｅｒｐｉｎａ３ｎ、Ｓｋａｐ２、Ｔｍｅｍ１６ｋ、及びＶｇｌｌ２である。別の実施形態では、選択された組織は脂肪であり、示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質は、Ａｓｐｎ、Ｃｌｅｃ４ｎ、Ｃｏｌ６ａ２、Ｃｏｌ１８ａ１、Ｃｏｘ８ｂ、Ｃｒｉｐ２、Ｅａｒｌ１、Ｅｍｉｌｉｎ２、Ｏｔｏｐ１、Ｐｌａ２ｇ２ｄ、Ｒｈｂｄｌ３、Ｓｌｃ６ａ１３、及びＳｙｃｐ３である。別の実施形態では、選択された組織は脳であり、示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質は、Ａｐｏｄ、Ｂ２ｍ、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、Ｃｄ６８、Ｃｌｅｃ７ａ、Ｃｓｔ７、Ｃｔｓｄ、Ｇｆａｐ、Ｉｌ３３、Ｌｇａｌｓ３、Ｌｙｚｓ、及びＳｐｐ１である。さらに別の実施形態では、選択された組織は筋肉であり、示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質は、Ｃ４、Ｃｄｋｎ２ｃ、Ｃｄｓ１、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２、Ｃｏｌ３ａ１、Ｄｕｓｐ２６、Ｅｄｇ２、Ｉｇｈ−６、Ｍｔ２、Ｐｌｋ２、Ｒｈｐｎ２、及びＳｙｔ９である。
【００８１】
特定の実施形態では、示差的な発現はカロリー制限によって逆転され、示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質は、（ａ）心臓中のＣ３、Ｃｃｌ８、Ｌｃｎ２、Ｍｔ２、Ｐａｈ、Ｐｒｋｃｑ、Ｓｅｒｐｉｎａ３ｎ、Ｔｍｅｍ１６ｋ、及びＶｇｌｌ２、（ｂ）脂肪組織中のＡｓｐｎ、Ｃｏｌ６ａ２、Ｃｒｉｐ２、Ｅｍｉｌｉｎ２、Ｏｔｏｐ１、Ｐｌａ２ｇ２ｄ、Ｒｈｂｄｌ３、及びＳｌｃ６ａ１３、（ｃ）脳中のＡｐｏｄ、Ｂ２ｍ、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、Ｃｔｓｄ、Ｇｆａｐ、Ｉｌ３３、Ｌｙｚｓ、及びＳｐｐ１、又は（ｄ）筋肉中のＣ４、Ｃｄｋｎ２ｃ、Ｃｄｓ１、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２、Ｃｏｌ３ａ１、Ｅｄｇ２、Ｉｇｈ−６、Ｍｔ２、Ｐｌｋ２、及びＳｙｔ９である。
【００８２】
好ましい実施形態では、本方法は、イヌ科又はネコ科からの遺伝子の示差的な発現を検出するために使用する。特定の実施形態では、プローブは、好ましくはアレイ中で、基板と結合している。
【００８３】
ステップ（ｃ）並びにステップ（ｄ）及び（ｅ）の一部は任意選択であり、２つ以上の試験系（すなわち高齢及び若齢の対象由来の組織）の比較的同時期の比較を実施する場合に使用する。しかし、別の実施形態では、比較に用いる標準は、本方法を用いて以前に得られたデータに基づく。本実施形態では、プローブを試料に曝露させてハイブリダイゼーション又は結合複合体を形成させ、これを検出し、標準のものと比較する。試料と標準からのハイブリダイゼーション又は結合複合体の間の差異はポリヌクレオチドの示差的な発現を示し、したがって、高齢の対象の組織対若齢の対象又は別の種類の参照対象から事前に単離されたｍＲＮＡを含み得る標準において示差的に発現される遺伝子を示す。好ましい実施形態では、プローブは、本発明によって同定されたうちの１つ又は複数の遺伝子又は遺伝子断片によって産生されたポリヌクレオチド又はその断片を特異的に検出するために作製される。ハイブリダイゼーション複合体を検出する方法は当業者に知られている。
【００８４】
加齢関連の転写及び翻訳産物を検出するための組織特異的なバイオマーカーを利用する、本明細書中に記載のアッセイは、対象中の組織の生理的年齢を判定する方法において有用である。そのような方法は、カロリー制限及び／又は栄養レジメンなどの抗老化レジメンの実行、促進、又は指導に有用なことがある。そのような方法は、そのようなレジメンを受けている対象から選択された組織の試料を得ることを含む。その後、遺伝子若しくはタンパク質アレイ又は本明細書中に記載の他の検出方法を用いて、組織試料を若齢対高齢の表現型に関連する１つ又は複数の遺伝子の調節された発現について分析する。分析の結果により、レジメンが組織において加齢プロセスを遅延又は逆転させるために有効であるかどうかが明らかとなる。
【００８５】
別の態様では、本発明は、試験物質を動物に投与した場合にそれが少なくとも１つの選択された組織において加齢プロセスの逆転又は遅延に有用である可能性が高いかどうかを決定する方法を提供する。本方法は、（ａ）試験物質の非存在下で試験系において、表２、表５、表８若しくは表１０に記載のタンパク質、又はその断片をコードしている遺伝子から選択される２つ以上のポリヌクレオチドの転写又は翻訳産物を測定することによって、第１の遺伝子発現プロファイルを決定するステップと、（ｂ）試験物質の存在下で試験系において、表２、表５、表８若しくは表１０に記載のタンパク質、又はその断片をコードしている遺伝子から選択される２つ以上のポリヌクレオチドの転写又は翻訳産物を測定することによって、第２の遺伝子発現プロファイルを決定するステップと、（ｃ）第１の遺伝子発現プロファイルと、第２の遺伝子発現プロファイルとを、比較するステップであって、第１の遺伝子発現プロファイルと比較した第２の遺伝子発現プロファイルの変化が、動物に投与された場合に試験物質が加齢プロセスの逆転又は遅延に有用である可能性が高いことを示す、ステップとを含む。第１の遺伝子発現プロファイルと、第２の遺伝子発現プロファイルとを、比較する際、比較は、個々の転写若しくは翻訳産物のレベルで、又はすべての転写若しくは翻訳産物の加齢性変化の平均として行うことができる。この方法は加齢遅延指数の生成に有用である。
【００８６】
一実施形態では、選択された組織は心臓であり、示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質は、Ａｍｙ１、Ａｐｏｄ、Ｂｄｈ１、Ｃ３、Ｃａｓｑ１、Ｃｃｌ８、Ｋｃｎｄ２、Ｌｃｎ２、Ｍｔ２、Ｍｙｏｔ、Ｐａｈ、Ｐｒｋｃｑ、Ｓｅｒｐｉｎａ３ｎ、Ｓｋａｐ２、Ｔｍｅｍ１６ｋ、及びＶｇｌｌ２である。別の実施形態では、選択された組織は脂肪であり、示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質は、Ａｓｐｎ、Ｃｌｅｃ４ｎ、Ｃｏｌ６ａ２、Ｃｏｌ１８ａ１、Ｃｏｘ８ｂ、Ｃｒｉｐ２、Ｅａｒｌ１、Ｅｍｉｌｉｎ２、Ｏｔｏｐ１、Ｐｌａ２ｇ２ｄ、Ｒｈｂｄｌ３、Ｓｌｃ６ａ１３、及びＳｙｃｐ３である。別の実施形態では、選択された組織は脳であり、示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質は、Ａｐｏｄ、Ｂ２ｍ、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、Ｃｄ６８、Ｃｌｅｃ７ａ、Ｃｓｔ７、Ｃｔｓｄ、Ｇｆａｐ、Ｉｌ３３、Ｌｇａｌｓ３、Ｌｙｚｓ、及びＳｐｐ１である。さらに別の実施形態では、選択された組織は筋肉であり、示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質は、Ｃ４、Ｃｄｋｎ２ｃ、Ｃｄｓ１、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２、Ｃｏｌ３ａ１、Ｄｕｓｐ２６、Ｅｄｇ２、Ｉｇｈ−６、Ｍｔ２、Ｐｌｋ２、Ｒｈｐｎ２、及びＳｙｔ９である。
【００８７】
特定の実施形態では、示差的な発現はカロリー制限によって逆転され、示差的に発現される遺伝子によってコードされているタンパク質は、（ａ）心臓中のＣ３、Ｃｃｌ８、Ｌｃｎ２、Ｍｔ２、Ｐａｈ、Ｐｒｋｃｑ、Ｓｅｒｐｉｎａ３ｎ、Ｔｍｅｍ１６ｋ、及びＶｇｌｌ２、（ｂ）脂肪組織中のＡｓｐｎ、Ｃｏｌ６ａ２、Ｃｒｉｐ２、Ｅｍｉｌｉｎ２、Ｏｔｏｐ１、Ｐｌａ２ｇ２ｄ、Ｒｈｂｄｌ３、及びＳｌｃ６ａ１３、（ｃ）脳中のＡｐｏｄ、Ｂ２ｍ、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、Ｃｔｓｄ、Ｇｆａｐ、Ｉｌ３３、Ｌｙｚｓ、及びＳｐｐ１、又は（ｄ）筋肉中のＣ４、Ｃｄｋｎ２ｃ、Ｃｄｓ１、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２、Ｃｏｌ３ａ１、Ｅｄｇ２、Ｉｇｈ−６、Ｍｔ２、Ｐｌｋ２、及びＳｙｔ９である。
【００８８】
特定の実施形態では、本方法には、少なくとも第２の遺伝子発現プロファイルと、動物に投与された場合に特定の組織又は複数の組織において加齢を逆転又は遅延させることが知られている参照物質又は組成物の存在下の試験系において、表２、５、８若しくは１０に記載のタンパク質、又はその断片をコードしている遺伝子から選択される２つ以上のポリヌクレオチドの転写又は翻訳産物を測定することによって得られる参照又は標準の遺伝子発現プロファイルとを、比較するステップがさらに含まれていてもよい。
【００８９】
一実施形態では、試験系は培養細胞の集団を含む。本発明による加齢関連遺伝子を含む核酸構築物を培養した宿主細胞内に導入する。宿主細胞は、それだけには限定されないが、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨＥＬＡ、及びＣＯＳなどの哺乳類細胞株であることができるが、酵母、細菌及び昆虫細胞などの非哺乳動物細胞も使用することができる。遺伝子のコード配列は、利用する特定の宿主細胞に適した適切な調節性発現要素に作動可能に連結されている。核酸構築物は、それだけには限定されないが、形質移入、形質転換、リン酸カルシウム沈殿、電気穿孔及びリポフェクションを含めた、当分野の任意の許容される手段に従って、宿主細胞内に導入することができる。そのような技法は、当分野で周知且つ日常的である。また、形質転換細胞は、加齢関連遺伝子の発現を調節する化合物を同定するためにも使用することができる。
【００９０】
遺伝子発現アッセイは、レポーター遺伝子と作動可能に連結した、選択された加齢関連遺伝子のプロモーターを含む遺伝子構築物を用いて実施することができる。レポーター構築物は、それだけには限定されないが、上述の標準宿主細胞株、又は、脂肪若しくは筋肉細胞などの、対象から新しく単離した細胞を含めた、適切な培養細胞内に導入してもよい。アッセイは、試験化合物の存在又は非存在下でのレポーター遺伝子の発現を監視することによって行う。
【００９１】
好ましい実施形態では、試験系は動物を含む。典型的には、本発明の加齢関連遺伝子の転写若しくは翻訳又は遺伝子産物に対する試験化合物の効果を判定するため、試験化合物を対象に投与し、対象の選択された組織中での遺伝子発現プロファイルを分析する。遺伝子発現をｉｎ  ｓｉｔｕ又はｅｘ  ｖｉｖｏで分析して、試験化合物の効果を判定することができる。別の実施形態では、目的のタンパク質の活性に対する試験化合物の効果を判定するため、試験化合物を対象に投与し、遺伝子から発現されたタンパク質の活性を、当分野の適切な任意の手段に従ってｉｎ  ｓｉｔｕ又はｅｘ  ｖｉｖｏで分析する。さらに、試験化合物を対象に投与する場合、化合物の生理的、全身的、及び物理的な効果、及び化合物の潜在的な毒性も評価することができる。
【００９２】
試験物質は、高齢対若齢の対象の選択された組織において示差的に発現されるポリヌクレオチド又は遺伝子に対する効果を有する可能性がある、任意の物質及び物質の組合せであることができる。適切な試験物質には、それだけには限定されないが、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、小分子、巨大分子、ビタミン、鉱物、単糖、複合糖、多糖、炭水化物、中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）、トリアシルグリセリド（ＴＡＧ）、ＤＨＡ、ＥＰＡ、ＡＬＡを含めたｎ−３（オメガ−３）脂肪酸、ＬＡ、γ−リノレン酸（ＧＬＡ）及びＡＲＡを含めたｎ−６（オメガ−６）脂肪酸、ＳＡ、共役リノール酸（ＣＬＡ）、レシチンなどのコリン源、ビタミンＡ及びカロテノイド（例えばβ−カロテン）などのその前駆体、ビタミンＤ２（エルゴカルシフェロール）及びビタミンＤ３（コレカルシフェロール）などのビタミンＤ源、トコフェロール（例えばα−トコフェロール）及びトコトリエノールなどのビタミンＥ源、並びにビタミンＫ１（フィロキノン）及びビタミンＫ２（メナジオン）などのビタミンＫ源を含めた脂溶性ビタミン、リボフラビン、ナイアシン（ニコチンアミドやニコチン酸が含まれる）、ピリドキシン、パントテン酸、葉酸、ビオチン及びコバラミンなどのＢビタミン、並びにビタミンＣ（アスコルビン酸）を含めた水溶性ビタミン、上記のビタミンの一部、特にビタミンＥ及びＣを含めた抗酸化剤、また、カテキン、ケルセチン及びテアフラビンなどのビオフラボノイド、ユビキノンなどのキノン、リコペン及びリコキサンチン（ｌｙｃｏｘａｎｔｈｉｎ）などのカロテノイド、レスベラトロール、α−リポ酸、Ｌ−カルニチン、Ｄ−リモネン、グルコサミン、Ｓ−アデノシルメチオニン、及びキトサンが含まれる。好ましい実施形態では、試験物質は、食品に添加してもよい又は補助食品として消費されてもよい栄養素である。前述の方法によって同定された物質も本発明の一部として企図される。
【００９３】
別の態様では、本発明は、単一パッケージ中の別々の容器、又は仮想パッケージ中の別々の容器中に、若齢の対象と比較して高齢の対象中の選択された組織において示差的な遺伝子発現を検出するための２つ以上のプローブを含むキットを提供する。特定の実施形態では、組織は心臓、脂肪、脳又は筋組織であり、プローブは、（ａ）表２、表５、表８若しくは表１０に記載のタンパク質、又はその断片をコードしている２つ以上の遺伝子と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド、又は（ｂ）表２、表５、表８若しくは表１０に記載のタンパク質、又はその断片から選択される２つ以上のポリペプチドと特異的に結合するポリペプチド結合剤を含み、キットは、（１）対象の選択された組織における示差的な遺伝子発現を検出するための遺伝子発現アッセイにおけるプローブの使用法の指示、（２）プローブを使用するための試薬及び機器、並びに（３）対象に投与された場合に、選択された組織において加齢プロセスを逆転又は遅延させることが知られている組成物、のうちの少なくとも１つをさらに含む。
【００９４】
キットが仮想パッケージを含む場合、キットは、１つ又は複数の物理的キット構成要素と組み合わせた仮想環境中の指示に限定される。一実施形態では、キットはプローブ及び／又は他の物理的構成要素並びにプローブを使用するための指示を含有し、他の構成要素はインターネットから入手可能である。キットは、試料、プローブ、及び試薬を混合するための装置並びにキットを使用するための装置、例えば試験管又は混合用具などの、さらなる物品を含有していてもよい。
【００９５】
別の態様では、本発明は、若齢の対象と比較して高齢の対象の選択された組織において示差的に発現されるポリヌクレオチドに関する情報を収容するデータベースを含む、コンピュータシステムを提供する。データベースは、表２、５、８若しくは１０に記載のタンパク質をコードしている遺伝子から選択される１つ若しくは複数のポリヌクレオチド、及び／又は表２、５、８若しくは１０に記載のタンパク質と特異的に結合するポリペプチドの発現レベルを同定する情報、並びに、データベースと情報交換するための、特に、異なる動物又は動物の分類の情報を入力、操作、及び見直すためのユーザインターフェースを含有することができる。一実施形態では、データベースは、表２、５、８又は１０に記載の１つ又は複数のポリペプチドの活性レベルを同定する情報をさらに含有する。別の実施形態では、データベースは、好ましくは様々な種からの、表２、５、８又は１０に記載のポリヌクレオチド又はポリペプチドのうちの１つ又は複数に関する配列情報をさらに含む。他の実施形態では、データベースは、１つ又は複数の動物種における遺伝子の説明に関するさらなる情報を含有する。コンピュータシステムは、データを含有及び操作し、ユーザと情報交換することができる任意の電子装置、例えば、本発明の使用を容易にし、動物の状態に関する結果を出力するように設計された、典型的なコンピュータ又は分析装置である。
【００９６】
別の態様では、本発明は、本明細書中に記載の組成物及び方法のうちの１つ又は複数に関する情報又は指示を通信するための媒体を提供する。そのような媒体は、典型的には、情報又は指示を含有する、文書、デジタル記憶媒体、光学式記憶媒体、音声表現、視覚ディスプレイなどを含む。例えば、通信媒体は、表示されたウェブサイト、キオスク、冊子、製品ラベル、添付文書、広告、ちらし、公示、オーディオテープ、ビデオテープ、ＤＶＤ、ＣＤ、コンピュータで読取り可能なチップ、コンピュータで読取り可能なカード、コンピュータで読取り可能なディスク、コンピュータメモリ、又は任意のその組合せであってもよい。有用な情報には、（１）動物の健康及びウェルネスを促進する方法、並びに（２）本発明及びその使用に関する質問がある場合に動物の世話人が使用するための問合せ情報のうちの１つ又は複数が含まれる。有用な指示には、プローブを使用するための技法、遺伝子発現アッセイを行うための指示、並びに物質の投与の量及び頻度が含まれる。通信手段は、本発明の使用の利点を指示するために有用である。
【実施例】
【００９７】
本発明の様々な態様は、以下の実施例によってさらに例示することができる。これらの実施例は例示目的のみのために提供され、他に具体的に指定されない限り、本明細書中に開示された本発明の範囲を限定しないことを理解されたい。
【００９８】
実施例１
【００９９】
本実施例では、食餌摂取を減らさずにカロリー制限（ＣＲ）の延命効果を模倣する、物質の特定の組合せの能力を試験するための研究を、手短に説明する。Ｃ５７ＢＬ６マウスに、ＡＩＮ９３Ｍ処方（アメリカ栄養学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）（ＡＩＮ）、成体げっ歯類を維持するための精製食餌処方）に基づいた対照食餌、又は同様の栄養素組成を有するが２５％のカロリー制限（ＣＲ）を表す食餌を与えた。
【０１００】
対照食餌を与えたマウスから組織を５及び２５カ月齢で採取し、栄養素を補充したマウスからの組織は２５カ月齢で採取した。ＲＮＡを組織から単離し、遺伝子発現の変化はエッペンドルフ「リアプレックス２（ｒｅａｌｐｌｅｘ２）」装置を用いたｑＰＣＲによって判定した。個々の遺伝子のデータは、続く実施例の特定のものに記載する。
【０１０１】
実施例２
【０１０２】
本実施例では、心臓組織における加齢のバイオマーカーの同定を説明する。
【０１０３】
アフィメトリックス  マウス  ゲノム４３０  ２．０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ４３０  ２．０）アレイを用いて、７系統のマウス（１２９、Ｃ５７ＢＬ６、Ｂａｌｂｃ、Ｃ３Ｈ、ＣＢＡ、ＤＢＡ及びＢ６Ｃ３ＨＦ１）の心臓における遺伝子発現の変化を同定した。若齢対高齢のマウスに両側ｔ検定を用いて、有意な発現の変化が判定された（Ｐ＜０．０５、ｎ＝７匹のマウス／系統／年齢群）。若齢のマウスは５カ月齢で試験し、高齢のマウスは２５カ月齢で試験した。表１は、それぞれの系統において、年齢に伴って発現が有意に変化した遺伝子の数を示し（Ｐ＜０．０５）、表２は、７系統のうちの少なくとも４系統において発現が変化した遺伝子を記載する。
【０１０４】
【表１】
2012520072.tif 000002
【０１０５】
【表２−１】
2012520072.tif 000003
【表２−２】
2012520072.tif 000004
【表２−３】
2012520072.tif 000005
【表２−４】
2012520072.tif 000006
【０１０６】
心臓の加齢の１６個の潜在的なマーカーを、ｑＰＣＲによるアレイデータの確認のために選択した。遺伝子は、（それだけには限定されないが）マイクロアレイ実験における豊富な発現、Ｂ６系統における発現の強力な変化、遺伝子が心臓の加齢に関連しているという以前の報告を含めた複数の要因に基づいて選択された。アレイ研究で使用したＢ６からのＲＮＡ試料を使用して、ｑＰＣＲ分析により、１６個の遺伝子すべてが年齢に伴った発現の変化を示したことが明らかとなった。これらの遺伝子を表３に示す。１６個のｑＰＣＲで確認された心臓の加齢のマーカーのうち、ｑＰＣＲにより、９個のマーカーにおいて加齢関連の発現パターンがＣＲによって少なくとも約３２％逆転されたことが、さらに明らかとなった。これらの９個のマーカーは、Ｃ３、Ｃｃｌ８、Ｌｃｎ２、Ｍｔ２、Ｐａｈ、Ｐｒｋｃｑ、Ｓｅｒｐｉｎａ３ｎ、Ｔｍｅｍ１６ｋ、及びＶｇｌｌ２である。
【０１０７】
【表３】
2012520072.tif 000007
【０１０８】
心臓の加齢の特定のマーカーに対する実施例１に記載の食餌介入の効果を、それぞれのマーカーの報告されている機能（複数可）と共に以下に記載する。
【０１０９】
ストレス応答
【０１１０】
メタロチオネイン２（Ｍｔ２）：メタロチオネイン遺伝子は酸化的ストレスに応答して誘導されることが知られており、心臓に特異的なプロモーターからヒトメタロチオネイン２Ａを過剰発現するトランスジェニックマウスはドキソルビシン心毒性から保護されていた。報告により、Ｍｔ２は、酸化的ストレスの誘導の前に存在している場合にのみ、心臓を酸化的傷害から保護できることが示されている。この遺伝子は、マイクロアレイデータ分析から骨格筋の加齢の潜在的なスーパーマーカーとして同定されたが、この遺伝子の発現の変化はｑＰＣＲによって確認されなかったことに注意されたい。心臓中では、本発明者らにより年齢に伴ったこの遺伝子の発現の増加が観察され、これはＣＲによって部分的に妨害された。
【０１１１】
アポリポタンパク質Ｄ（Ａｐｏｄ）：アポリポタンパク質Ｄはリポカリン遺伝子ファミリーのメンバーであり、免疫及びストレス応答に関与している。Ａｐｏｄは脳中でストレスに応答して誘導され、本発明者らはこの遺伝子をマウスの新皮質の加齢のスーパーマーカーとして以前に同定した。マウスの心臓では、この遺伝子は年齢に伴って約２．５倍増加したが、この増加はＣＲによって防止されなかった。
【０１１２】
リポカリン２（Ｌｃｎ２）。数々の報告により、リポカリン２が炎症及び酸化的なストレスによって誘導されることが示されており、この増加は、活性酸素種捕捉剤であるシステアミン及びＤＭＳＯの存在下で妨害される。したがって、Ｌｃｎ２は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏのどちらでも酸化的ストレスを同定するための有用なバイオマーカーとなる可能性がある。マウスの心臓では、この遺伝子は年齢に伴ってほぼ３倍増加し、この増加はＣＲによって完全に鈍くなった。
【０１１３】
免疫応答／炎症
【０１１４】
補体成分３（Ｃ３）：補体成分３は補体系の活性化において中心的な役割を果たす。その活性化は、古典的及び代替の補体活性化経路のどちらにも必要である。本発明者らは、密接に関連した遺伝子（Ｃ４）をマウスの骨格筋における加齢のスーパーマーカーとして以前に同定した。これらのデータは、年齢に伴った免疫活性化の増加の多くの報告と一致している。マウスの心臓では、Ｃ３は年齢に伴って発現がほぼ２倍となり、この増加はＣＲによって防止された。
【０１１５】
ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド８（Ｃｃｌ８）：このサイトカインは単球、リンパ球、好塩基球及び好酸球の走化活性を示し、白血球を炎症部位に動員することで、このサイトカインは、腫瘍関連の白血球浸潤及びＨＩＶ感染症に対する抗ウイルス状態に寄与する可能性がある。マウスの心臓では、この遺伝子は年齢に伴って強く増加し（ほぼ６倍）、この増加はＣＲによって部分的に防止された。
【０１１６】
プロテインキナーゼｃシータ（Ｐｒｋｃｑ）：プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）ファミリーメンバーは、広範囲のタンパク質標的をリン酸化し、多様な細胞シグナル伝達経路に関与していることが知られている。ＰＫＣファミリーのそれぞれのメンバーは特異的な発現プロファイルを有し、明確な役割を果たすと考えられている。ＰｒｋｃｑはＴ−リンパ球の活性化に必要である。興味深いことに、密接に関連している遺伝子（Ｐｒｋｃｚ）の発現が複数系統のマウスの骨格筋中で増加していたが、これはｑＰＣＲによって確認されていない。心臓では、発現は年齢に伴ってほぼ３倍増加し、ＣＲによってわずかに妨害された。
【０１１７】
セリン（又はシステイン）ペプチダーゼ阻害剤、クレードＡ、メンバー３Ｎ（Ｓｅｒｐｉｎａ３ｎ）：この遺伝子は、細胞傷害性Ｔ−リンパ球においてグランザイムＢ媒介性アポトーシスを抑制することが示されており、この遺伝子の発現の増加の正味の効果は、免疫細胞のアポトーシスの阻害である。マウスの心臓では、この遺伝子は年齢に伴って４倍増加し、この増加はＣＲによってほぼ完全に防止された。
【０１１８】
ｓｒｃファミリー関連リンタンパク質２（Ｓｋａｐ２）：この遺伝子によってコードされているタンパク質は、炎症部位への免疫細胞の接着を促進する。マウスの心臓では、この遺伝子は年齢に伴ってほぼ２倍増加し、この増加はＣＲによって影響を受けなかった。
【０１１９】
代謝
【０１２０】
３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、１型（Ｂｄｈ１）：この遺伝子は短鎖デヒドロゲナーゼ／レダクターゼ遺伝子ファミリーのメンバーをコードしており、脂肪酸の異化中に産生される２つの主要なケトン体であるアセトアセテート及び３−ヒドロキシ酪酸の相互変換を触媒することによって、ケトン体の産生に関与している。マウスの心臓では、本発明者らはこの遺伝子の発現の年齢に伴ったわずかな増加を観察し、これはＣＲによってさらに上昇した。
【０１２１】
フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（Ｐａｈ）：Ｐａｈは、フェニルアラニンからチロシンへの異化の律速ステップである酵素フェニルアラニンヒドロキシラーゼをコードしている。この酵素活性の欠損は、常染色体劣性障害であるフェニルケトン尿症をもたらす。マウスの心臓では、この遺伝子の発現は、年齢に伴ってほぼ発現が１０倍増加し、ＣＲはこの遺伝子の発現を、高齢の対照で見られるものの約半分まで低下させた。
【０１２２】
心臓の機能
【０１２３】
アミラーゼ１（Ａｍｙ１）。アミラーゼは、オリゴ糖及び多糖中の１，４−アルファ−グルコシド結合を加水分解し、したがって食事性デンプン及びグリコーゲンの消化の第１のステップを触媒する、分泌タンパク質である。このタンパク質の増加した血漿レベルが慢性心不全に罹患しているヒトにおいて報告されているため、この遺伝子によってコードされているタンパク質は、心臓の機能に関連している可能性がある。この遺伝子は筋肉中のスーパーマーカーとして同定されなかったが、本発明者らは、複数系統のマウスの骨格筋においてこの遺伝子の発現の増加を以前に観察した。マウスの心臓では、この遺伝子の発現は年齢に伴って約２．５倍増加し、ＣＲによって顕著に影響されなかった。
【０１２４】
痕跡様２相同体（ショウジョウバエ）（Ｖｇｌｌ２）：この遺伝子は骨格筋の分化を促進する転写補因子をコードしているため、心臓中でのその発現は、恐らく心筋の維持一般に関連している。マウスの心臓では、この遺伝子の発現は年齢に伴って約７．５倍増加し、ＣＲは発現の加齢関連の増加の約半分を防止した。
【０１２５】
ミオチリン（Ｍｙｏｔ）：この遺伝子は、横紋筋のｚ板領域中に見つかるタンパク質をコードしており、筋肉構造及び筋節組織化の維持に関与している。ヒトでは、この遺伝子の突然変異は筋ジストロフィーの一形態に関連している。この遺伝子の発現は、マウスの心臓において年齢に伴って中程度に増加し、この増加はＣＲによって妨害されなかった。
【０１２６】
カルセケストリン（Ｃａｓｑ１）：カルセケストリンは筋小胞体中の主要なカルシウム結合タンパク質であり、Ｃａｓｑ１と結合したカルシウムイオンの放出が筋収縮をもたらす。この遺伝子の発現は年齢に伴って発現が低下し、これは、年齢に伴った筋収縮の一般的な減退を反映している可能性がある。この遺伝子の発現はＣＲによって変化しなかった。
【０１２７】
カリウム電位作動型チャネル、Ｓｈａｌ関連ファミリー、メンバー２（Ｋｃｎｄ２）：この遺伝子によってコードされているタンパク質は心臓における外向きのカリウム輸送を担っており、この遺伝子の発現は、カルシウム状態に感受性のある他の遺伝子によって調節されている。この遺伝子の発現は年齢に伴って約２５％減少したが、ＣＲによって変化しなかった。
【０１２８】
膜貫通タンパク質１６Ｋ（Ｔｍｅｍ１６ｋ）：この遺伝子には利用可能な機能データが存在しないが、しかし、ジーンオントロジー共同事業体（Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）により、電子アノテーションから推論すると、これは内在性膜タンパク質であることが示されている。この遺伝子の発現は年齢に伴って約５０％増加し、ＣＲは、この遺伝子の発現を若齢の対照マウスで見られるよりも低くまで低下させた。
【０１２９】
遺伝子発現における加齢関連の変化を妨害するために設計された介入の全体的な有効性を計るために、心臓の加齢のマーカーの発現の妨害における介入の有効性の比較を可能にする指標を作成することが有用であった。以下に２つの指標を記載するが、他の分析も考案してもよい。それぞれの指標は、遺伝子発現における加齢関連の変化を妨害する食餌介入の効果の平均である。第１の指標は、本報告中に記載されている心臓の加齢の１６個の汎用マーカーすべてを考慮し、第２の指標は、年齢及びＣＲの両方によって変化した９個の汎用マーカーのみを考慮する。それぞれの遺伝子について、「パーセント防止」は介入によって妨害された加齢性変化のパーセントとして計算された。例えば、「１００％」の値は、食餌介入が、遺伝子の発現を若齢の対照で見られるものと同じレベルに維持したことを示す。１００％より高い防止の推定は、遺伝子の発現が、若齢の対照で観察されるものよりも「より若い」レベルにシフトされたことを示し、逆に、負のパーセント防止は、遺伝子の発現が、高齢の対照群で見られるものを超えて増悪したことを示す。その後、それぞれの遺伝子の値を処置全体にわたって平均し、その結果生じた指標により、介入が心臓の加齢のマーカーの発現における加齢関連の変化を妨害できる程度が明らかとなる。どちらの指標でも、穏やかなＣＲが、心臓の加齢のマーカーの発現における加齢関連の変化を妨害する能力が最大であった。
【０１３０】
実施例３
【０１３１】
本実施例では、脂肪組織における加齢の転写マーカーの同定を説明する。
【０１３２】
アフィメトリックス  マウス  ゲノム４３０  ２．０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ４３０  ２．０）アレイを用いて、７系統のマウス（１２９、Ｃ５７ＢＬ６、Ｂａｌｂｃ、Ｃ３Ｈ、ＣＢＡ、ＤＢＡ及びＢ６Ｃ３ＨＦ１）の精巣上体の脂肪組織における遺伝子発現の変化を同定した。若齢対高齢のマウスに両側ｔ検定を用いて、有意な発現の変化が判定された（Ｐ＜０．０５、ｎ＝７匹のマウス／系統／年齢群）。若齢のマウスは５カ月齢で試験し、高齢のマウスは２５カ月齢で試験した。表４は、それぞれの系統において、年齢に伴って有意に変化した遺伝子の数を示し、表５は、７系統のうちの少なくとも５系統において発現が変化したすべての遺伝子を記載する。
【０１３３】
【表４】
2012520072.tif 000008
【０１３４】
【表５−１】
2012520072.tif 000009
【表５−２】
2012520072.tif 000010
【表５−３】
2012520072.tif 000011
【０１３５】
脂肪組織の加齢の３１個の潜在的なマーカーを、ｑＰＣＲによるアレイデータの確認のために選択した。ＲＴ  ＰＣＲによる検証の候補遺伝子を選択する際、すべての系統で変化した遺伝子をさらなる試験において最優先した。他の考慮事項には、低い発現（マイクロアレイ実験からの平均シグナル強度によって判断）を有する遺伝子を回避すること、及び少なくとも５０％の発現の変化（＜１．５又は＞１．５倍の変化）を示さなかった遺伝子を回避することが含まれていた。７系統すべてで変化していた４つの遺伝子は市販のプライマーを有さず、したがって、これらの遺伝子はｑＰＣＲによってスクリーニングできなかった。ベータアクチン（Ａｃｔｂ）はどの系統でも変化しておらず、ｑＰＣＲ分析のハウスキーピング遺伝子として役割を果たした。
【０１３６】
脂肪組織の加齢の候補マーカーとして同定された残りの２７個の遺伝子について、ｑＰＣＲ分析を用いて、実施例１の栄養素供給研究からの試料を、加齢性変化及び穏やかなＣＲによる加齢性変化の妨害のを検証するために試験した。ｑＰＣＲによって分析した際、２７個の遺伝子のうちの１３個で、年齢に伴った発現の統計的に有意な変化が観察された。これらを表６に示す。これら１３個の遺伝子のうちの８個は、年齢によって変化することがさらに決定され、加齢性変化の少なくとも約３３％がＣＲによって防止された。これらの８個の遺伝子は、Ａｓｐｎ、Ｃｏｌ６ａ２、Ｃｒｉｐ２、Ｅｍｉｌｉｎ２、Ｏｔｏｐ１、Ｐｌａ２ｇ２ｄ、Ｒｈｂｄｌ３、及びＳｌｃ６ａ１３である。
【０１３７】
【表６】
2012520072.tif 000012
【０１３８】
脂肪組織の加齢のマーカーの機能的有意性を以下に述べられる。
【０１３９】
成長因子応答性遺伝子
【０１４０】
アスポリン（Ａｓｐｎ）：トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦベータ）は、細胞骨格の維持に関与している遺伝子の発現を調節することによって、細胞外基質（ＥＣＭ）の維持に役割を果たす分泌タンパク質である（１）。アスポリンはＥＣＭの構成要素であり、アスポリンの発現は、関節軟骨中でＴＧＦベータによって誘導されることが示されている（２）。本発明者らは、年齢に伴って脂肪組織においてアスポリンの発現が減少することを観察した（２．０倍）。総合すると、これらのデータは、脂肪組織においてＥＣＭの維持が年齢に伴って減退することを示唆している。Ａｓｐｎの発現の加齢関連の減退はＣＲによってほぼ完全に防止されたため（高齢の対照マウスに対して高齢のＣＲで１．８倍の増加）、この減退はＣＲによって防止され得る。
【０１４１】
システインリッチタンパク質２（Ｃｒｉｐ２）：Ｃｒｉｐ２の機能に関してはわずかしか知られていないが、細胞骨格リモデリングに関与するタンパク質のファミリーに属するようであり（３）、アスポリン（上記）と同様、Ｃｒｉｐ２の発現はＴＧＦベータによって誘導されることが示されている（４）。Ｃｒｉｐ２発現のパターンは、ＣＲによって防止される（２．０倍）、年齢に伴った有意な発現の変化（２．３倍）を含めて、アスポリンで観察されたものに非常に類似していた。
【０１４２】
ロンボイド、小静脈様３（Ｒｈｂｄ１３）：Ｒｈｂｄｌ３遺伝子によってコードされているタンパク質は、表皮成長因子シグナル伝達によって調節されるショウジョウバエ遺伝子ｒｈｏの最も進化的に保存されたｃＤＮＡとして特徴づけられており、マウスの神経発生において役割を果たす。この遺伝子は、年齢に伴って発現が強く減少し、ＣＲがこの遺伝子の発現の加齢関連の変化を完全に防止した（年齢に伴って６．２倍の変化及びＣＲで７．２倍の増加）。
【０１４３】
要約すると、上記３つの遺伝子は、その発現を食餌によって調節することができる、成長因子によって調節される脂肪組織の加齢の汎用マーカーを表す。
【０１４４】
年齢に伴ったＥＣＭマイクロファイバーアセンブリの減少
【０１４５】
コラーゲン、ＶＩ型、アルファ２（Ｃｏｌ６ａ２）：コラーゲンＶＩは細胞外基質の構成要素であり、ヒトにおけるＣｏｌ６ａ２遺伝子の突然変異は、破壊されたマイクロファイバー形成が原因でいくつかの先天性筋疾患に関連している（６、７）。本発明者らは、マウスの骨格筋の加齢の汎用マーカーの研究において、いくつかのコラーゲン遺伝子（Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２及びＣｏｌ３ａ１）は年齢に伴って発現が減少し、この減退がＣＲによって妨害されることを以前に示してきた。脂肪組織におけるＣｏｌ６ａ２の有意な低下（２．１倍の減少）は、減少したマイクロファイバーアセンブリが原因で年齢に伴ったＥＣＭの維持の低下を示唆する。
【０１４６】
エラスチンマイクロフィブリル界面因子２（Ｅｍｉｌｉｎ２）。Ｅｍｉｌｉｎ２はＥＣＭ中で合成され、ＥＣＭ中に局在していると報告されているが、Ｅｍｉｌｉｎ２の機能に関してはわずかしか知られていない。アポトーシス因子とＥｍｉｌｉｎ２との結合がカスパーゼ活性化をもたらすため、Ｅｍｉｌｉｎ２は、外因性のアポトーシス経路を介した細胞死において役割を果たすことがある。或いは、他の者は、この遺伝子によってコードされているタンパク質の血清レベルの上昇が、卵巣癌のバイオマーカーであり得ることを示唆してきた。いずれにしても、脂肪組織においてＥｍｉｌｉｎ２発現の有意な低下が年齢に伴って観察され（年齢に伴って−２．１倍の変化）、ＣＲは加齢性変化の約３５％を妨害した。
【０１４７】
年齢に伴った炎症の増加
【０１４８】
ホスホリパーゼＡ２、ＩＩＤ群（Ｐｌａ２ｇ２ｄ）：ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）は、脂肪酸をリン脂質から移動させる能力が周知であり、これは、続いて炎症誘発性プロスタグランジン及びロイコトリエンへと変換される（１１）。興味深いことに、増加した細胞外ＰＬＡ２は増加したレベルの炎症誘発性サイトカインＴＮＦα及びインターロイキン１に関連しているため、上昇したＰＬＡ２のレベルは、脂質の移動を越える結果をもたらす可能性がある（１２）。Ｐｌａ２ｇ２ｄ遺伝子の発現は年齢に伴って３．１倍増加し、ＣＲによって部分的に（ただし有意ではない）防止された（１．４倍の発現の変化）。
【０１４９】
特徴づけがあまりなされていない遺伝子
【０１５０】
オトペトリン１（Ｏｔｏｐ１）：Ｏｔｏｐ１の機能に関する唯一の報告は、これが重力及び加速の認知を担っている内耳の構造である、耳石の形成に重要であることを示している（１３）。これらの構造は炭酸カルシウムのミネラル化によって形成されるため、脂肪組織におけるこの遺伝子の機能は、カルシウム恒常性に関連している可能性が高い。Ｏｔｏｐ１の発現は、年齢に伴って発現が３．０倍増加し、ＣＲによって部分的に（有意ではない）妨害された（１．５倍の発現の変化）。
【０１５１】
溶質担体ファミリー６、メンバー１３（Ｓｌｃ６ａ１３）：マウス又はヒトにおけるこの遺伝子の機能に関する報告は存在しない。しかし、ラットにおける単一の研究から（１４）、Ｓｌｃ６ａ１３遺伝子によってコードされているタンパク質が神経伝達物質ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の輸送に関与していることを推測することができる。Ｓｌｃ６ａ１３は年齢に伴って発現が減少し（１．８倍の変化）、これは、ＣＲによって部分的に（有意ではない）妨害された（高齢の対照と比較して１．３倍の変化）。
【０１５２】
加齢の汎用マーカーにおける加齢関連の変化を妨害するために設計された介入の全体的な有効性を計るために、介入がどのように加齢の汎用マーカーの発現を妨害するかの比較を可能にする指標を作成することが有用であった。したがって、脂肪組織の加齢の８個の汎用マーカーの発現の加齢関連の変化に対する介入の平均的な効果を説明するために、「加齢防止指標」を計算した。
【０１５３】
脂肪組織の加齢の８個の汎用マーカーのそれぞれについて、「パーセント防止」は介入によって妨害された加齢性変化のパーセントとして計算された。例えば、「１００％」の値は、食餌介入が、遺伝子の発現を若齢の対照で見られるものと同じレベルに維持したことを示す。１００％より高い防止の推定は、遺伝子の発現が、若齢の対照で観察されるものよりも「より若い」レベルにシフトされたことを示し、逆に、負のパーセント防止は、遺伝子の発現が、高齢の対照群で見られるものを超えて増悪したことを示す。その後、それぞれの遺伝子の値を処置全体にわたって平均し、その結果生じた指標により、介入が加齢関連の変化を転写レベルで妨害できる全体的な程度が明らかとなる。
【０１５４】
実施例４
【０１５５】
本実施例では、脳組織における加齢の転写マーカーの同定を説明する。
【０１５６】
アフィメトリックス  マウス  ゲノム４３０  ２．０（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ４３０  ２．０）アレイを用いて、６系統のマウス（Ｃ５７ＢＬ６、Ｂａｌｂｃ、Ｃ３Ｈ、ＣＢＡ、ＤＢＡ及びＢ６Ｃ３ＨＦ１）の新皮質における遺伝子発現の変化を同定した。若齢対高齢のマウスに両側ｔ検定を用いて、有意な発現の変化が判定された（Ｐ＜０．０５、ｎ＝７匹のマウス／系統／年齢群）。若齢のマウスは５カ月齢で試験し、高齢のマウスは２５カ月齢で試験した。
【０１５７】
表７は、それぞれの系統において、年齢に伴って有意に変化した遺伝子の数を示す。表８は、６系統のうちの少なくとも３系統において発現が変化したすべての遺伝子を記載する。
【０１５８】
【表７】
2012520072.tif 000013
【０１５９】
【表８−１】
2012520072.tif 000014
【表８−２】
2012520072.tif 000015
【表８−３】
2012520072.tif 000016
【表８−４】
2012520072.tif 000017
【表８−５】
2012520072.tif 000018
【０１６０】
脳の加齢の１８個の潜在的なマーカーを、ｑＰＣＲによるアレイデータの確認のために選択した。遺伝子は、それだけには限定されないが、マイクロアレイ実験における豊富な発現、Ｂ６系統における発現の強力な変化、遺伝子が脳の加齢に関連しているという以前の報告を含めた複数の要因に基づいて選択された。アレイ研究で使用したＢ６マウスからのＲＮＡ試料を使用して、ｑＰＣＲ分析により、１３／１８個の遺伝子が年齢に伴った発現の変化を示したことが明らかとなった。これらの１３個の遺伝子を表９に示す。１３個の遺伝子のうちの８個は、年齢によって変化し、その加齢性変化の少なくとも約３３％がＣＲによって防止されたことがさらに判定された。これらの８個の遺伝子は、Ａｐｏｄ、Ｂ２ｍ、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、Ｃｔｓｄ、Ｇｆａｐ、Ｉｌ３３、Ｌｙｚｓ、及びＳｐｐ１である。
【０１６１】
【表９】
2012520072.tif 000019
【０１６２】
上記同定した脳の加齢のマーカーを用いて、脳の加齢における加齢関連の変化を妨害するＣＲの有効性を評価した。以前の実施例に記載の指標を用いて、年齢に伴った発現の変化がＣＲによって妨害された程度（「パーセント防止」）を判定した。
【０１６３】
Ｃｄ６８、Ｃｔｓｄ及びＧｆａｐを含めた、以前に加齢のバイオマーカーであると報告されている多くの遺伝子がアレイ研究で同定され、ｑＰＣＲによって確認された。ＣＲはＣｔｓｄの発現の変化を妨害したが、Ｃｄ６８及びＧｆａｐには中等度にしか有効でなかった。
【０１６４】
急性に発現された際に神経保護作用を有するが、慢性的な時間尺度（例えば加齢）で過剰発現された際に有害な影響を与える、いくつかの遺伝子が同定された。これらの遺伝子の一部には、Ａｐｏｄ、Ｃ１ｑａ及びＣ１ｑｂが含まれる。穏やかなＣＲ食餌によりＡｐｏｄの変化が妨害された。年齢に伴って見られたＣ１ｑｂの発現の増加は、ＣＲによって、及び補充したすべてのマウスにおいて妨害された。
【０１６５】
免疫及び炎症反応に関与する遺伝子の発現（例えば、Ｂ２ｍ、Ｃｌｅｃ７１、Ｃｓｔ７、Ｉｌ３３、Ｌｇａｌｓ３）が顕著に増加していた。これは、年齢に伴って神経炎症が増加するという以前の報告と強く一致している。ＣＲは、神経炎症性遺伝子の発現における加齢関連の変化を妨害することが報告されているが、ＣＲはＢ２ｍ発現において年齢関連の増加のみを妨害するようである。全体的に、炎症性スーパーマーカーの発現の変化は大きく（特にＣｌｅｃ７ａ及びＣｓｔ７）、本研究における食餌介入に対して耐性であった。しかし、神経炎症性遺伝子の加齢関連の変化が、より高いカロリー摂取の制限（約４０％）により妨害されることが示されており、したがって、代替の介入は、これらのスーパーマーカーの加齢関連の変化を妨害する潜在性を有する。
【０１６６】
最後に、マーカーの多くがアルツハイマー病などの神経変性障害に関連づけられている（例えば、Ａｐｏｄ、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、Ｃｔｓｄ、Ｌｙｚｓ、Ｓｐｐ１）。カロリー制限がヒト及びマウスの疾患モデルにおいてアルツハイマー病の進行を妨害することが提案されている。したがって、本研究で用いた穏やかなＣＲが、これらの遺伝子の多くの加齢関連の変化を妨害した。
【０１６７】
報告又は提案された、マーカーによって表される遺伝子機能の背景情報を以下に記載する。
【０１６８】
Ａｐｏｄ：増加したアポリポタンパク質Ｄの発現が、アルツハイマー病、統合失調症、及び脳卒中を含めた様々な神経障害、並びに加齢の脳において報告されている。ショウジョウバエにおけるこの遺伝子の過剰発現は神経保護及び寿命延長をもたらすことが報告されているため、Ａｐｏｄはストレス応答タンパク質であり得る。したがって、Ａｐｏｄのレベルは内在性ストレスのレベルに相関する。
【０１６９】
Ｂ２Ｍ：ベータ２−ミクログロブリン（クラスＩ主要組織適合複合体分子の一部）も炎症の報告されたマーカーであり、高齢のヒト及びパーキンソン病様脳の脳脊髄液において年齢に伴って増加することが以前に示されている。
【０１７０】
Ｃ１ｑａ及びＣ１ｑｂ：これらの遺伝子は自然免疫に関与していると報告されており、マウス脳において年齢に伴って活性化されることを本発明者らが以前に示した、またアルツハイマー病などのヒト神経変性疾患においても活性化されることも以前に示されている、炎症のマーカーである。
【０１７１】
Ｃｄ６８：マクロシアリンとしても知られるＣｄ６８は、マクロファージ特異的なタンパク質であり、雄Ｃ５７ＢＬ／６ＮＮｉａマウスの選択された脳領域において加齢によって増加すると報告されており、ミクログリア中で発現されると考えられている。
【０１７２】
Ｃｌｅｃ７ａ：デクチン−１としても知られ、この受容体は、貪食、呼吸バースト及びサイトカイン産生を含めた、マクロファージにおける様々な細胞応答を誘導できると報告されている。この遺伝子は、Ｃ型レクチン／Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬ／ＣＴＬＤ）スーパーファミリーのメンバーをコードしている。コードされている糖タンパク質は、細胞外Ｃ型レクチン様ドメインフォルド並びに免疫受容体チロシン活性化モチーフを有する細胞質のドメインを有する、小さなＩＩ型膜受容体である。これは、真菌及び植物からの様々なベータ−１，３結合及びベータ−１，６結合グルカンを認識するパターン認識受容体として機能することが報告されており、このようにして、自然免疫応答において役割を果たす。異なるアイソフォームをコードしている選択的転写スプライシング変異体が特徴づけられている。この遺伝子は、ナチュラルキラー遺伝子複合体領域において、染色体１２ｐ１３上の他のＣＴＬ／ＣＴＬＤスーパーファミリーメンバーと密接に連結している。
【０１７３】
Ｃｓｔ７：シスタチンＦは、グリコシル化ヒト低分子量システインプロテイナーゼ阻害剤である。シスタチンは、カテプシン及びクルジパインなどの寄生生物プロテアーゼを含めた、主にパパイン様システインプロテアーゼだけでなく、哺乳動物アスパラギニルエンドペプチダーゼをも、標的とする重要な天然のシステインプロテアーゼ阻害剤である。ほぼ排他的に造血細胞中で発現され、リソソーム様オルガネラ中に蓄積される哺乳動物シスタチンＦは、抗原提示の調節及び他の免疫プロセスに関連づけられている。これは、酸化還元で調節される活性化機構及び制限される特異性プロファイルを有することが報告されている、普通でないシスタチンスーパーファミリーメンバーである。
【０１７４】
Ｃｔｓｄ：カテプシンＤは主要なリソソームプロテアーゼであり、神経セロイドリポフスチン症／バッテン疾患のサブセットにおいて、それを酵素的に欠陥にするＣｔｓｄの突然変異が最近報告されている。疾患の表現型はＢａｘ媒介性のアポトーシスを必要とせず、むしろ自己貪食によって媒介されるようである。アポリポタンパク質ＥのカテプシンＤ媒介性のタンパク質分解は、アルツハイマー病において役割を有し得る。また、神経傷害の実験モデルにおけるリソソーム系の上方制御も報告されている。
【０１７５】
Ｇｆａｐ：グリア原線維酸性タンパク質は星細胞活性化の古典的なマーカーであり、恐らく最も良好に確立された脳の加齢のマーカーである。この遺伝子は、成熟星細胞の主要な中間フィラメントタンパク質のうちの１つをコードしている。これは、発生中に星細胞を他のグリア細胞から識別するためのマーカーとして使用される。この遺伝子の突然変異は、中枢神経系における星細胞の稀な障害であるアレキサンダー病を引き起こす。
【０１７６】
Ｉｌ３３：特徴づけの乏しいサイトカインであるＩＬ−３３は、炎症誘発性サイトカイン及び転写調節特性を有する細胞内核因子の両方として機能し得る、二重機能的タンパク質と報告されている。
【０１７７】
Ｌｇａｌｓ３：ガレクチン−３は多機能的タンパク質であり、炎症性反応の媒介に関与することが報告されている。ガレクチン−３は、ミクログリア細胞中で上方調節されることが報告されている。興味深いことに、ガレクチン−３は、神経細胞の接着及び神経突起の成長を促進することも報告されている。
【０１７８】
Ｌｙｚｓ：リゾチームとしても知られ、特徴づけが乏しく、恐らくは、白血球中に豊富であり炎症性反応に関与しているリソソームタンパク質である。
【０１７９】
Ｓｐｐ１：分泌リンタンパク質−１はオステオポンチンとしても知られ、分泌アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）含有リンタンパク質である。Ｓｐｐ１はパーキンソン病において過剰発現されるようである。オステオポンチン（ＯＰＮ）は、自己免疫性ブドウ膜炎を含めた炎症及び創傷治癒のプロセスに関連づけられている。
【０１８０】
実施例５
【０１８１】
本実施例では、筋組織における加齢の転写マーカーの同定を説明する。マウスの骨格筋において加齢の強力なマーカーである可能性の高い遺伝子のパネルを作成するために、アフィメトリックス  マウス  ゲノム４３０  ２．０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ４３０  ２．０）アレイを用いて、７個のマウス系統、すなわち、１２９／Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６、ＣＢＡ／Ｊ、ＤＢＡ２Ｊ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ、Ｂａｌｂ／ｃ、及びＢ６Ｃ３ＨＦ１からの腓腹筋肉で転写プロファイリングを行った。プロファイリングは、それぞれの系統からの７匹の若齢（５カ月齢）及び７匹の高齢（２８〜３０カ月）のマウスで行った。年齢に伴った遺伝子発現の変化の統計的有意性について試験するため、両側ｔ検定を行った。アレイ上に提示された約２１，０００個の転写物のうち、１７２個の転写物が、７系統のうちの少なくとも６系統で年齢に伴って有意に（Ｐ＜０．０５）変化した（表１０）。
【０１８２】
【表１０−１】
2012520072.tif 000020
【表１０−２】
2012520072.tif 000021
【表１０−３】
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【表１０−４】
2012520072.tif 000023
【０１８３】
マイクロアレイ分析で同定された１７２個の転写物のうち、年齢及びＣＲに伴った発現の変化を判定するため、２１個の遺伝子をｑＰＣＲによって分析した。遺伝子はいくつかの基準を用いて選択された。遺伝子は、既知の生物学的機能を有するか、アレイ研究において比較的豊富な発現を有するか、及び／又は査読された文献の研究により筋肉の加齢における役割が示唆されているかに基づいて選択された。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって設計された既成のＰＣＲプライマーを使用したＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７０００装置を用いて行った。ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（Ｔｂｐ）は年齢又はＣＲに伴って変化しないことが以前に示されているため、この遺伝子をすべてのＲＴ−ＰＣＲ分析の内部対照として使用した。試験された２１個の遺伝子のうち、１３個の遺伝子が、７系統のうちの少なくとも６系統で年齢に伴った発現の変化を示した（表１１）。１３個の遺伝子のうち、１１個がＣＲによる逆転を示した。これら１１個の遺伝子は、Ｃ４、Ｃｄｋｎ２ｃ、Ｃｄｓ１、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２、Ｃｏｌ３ａ１、Ｅｄｇ２、Ｉｇｈ−６、Ｍｔ２、Ｐｌｋ２、及びＳｙｔ９である。
【０１８４】
【表１１−１】
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【表１１−２】
2012520072.tif 000025
【０１８５】
表１１に示した遺伝子のうち、２個を炎症反応に関与していると大まかに分類することができ（Ｃ４及びＩｇｈ６）、２個をＤＮＡ損傷／細胞周期チェックポイントに大まかに分類することができ（Ｃｄｋｎ２ｃ及びＰｌｋ２）、２個をストレス応答に分類することができ（Ｍｔ２及びＤｕｓｐ２６）、１個（Ｃｄｓ１）を生合成に関与していると大まかに分類することができ、１個をカルシウム代謝に関与していると分類することができ（Ｓｙｔ９）、そして５個の遺伝子（Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２、Ｃｏｌ３ａ１、Ｅｄｇ２、Ｒｈｐｎ２）を細胞骨格リモデリングに関与していると分類することができる。
【０１８６】
バイオマーカーの適切なパネルをｑＰＣＲによって検証した後（年齢に伴って変化し、ほとんどの例では変化がＣＲによって逆転された）、これらの遺伝子の発現を実施例１の栄養素研究由来のｍＲＮＡ試料で分析した。特定のマーカーに関する結果を、これらのマーカーの報告されている機能的有意性の説明と共に、以下に述べられる。
【０１８７】
補体Ｃ４：補体カスケードの第４構成要素は自然免疫の必須因子である。その活性化は、ヒトにおける正常な脳の加齢中、そしてアルツハイマー病の脳中でも観察されている。ヒトにおけるＣ４の様々な対立遺伝子が健康及び生存に関連づけられており、これは、Ｃ４の状態が健康に直接影響を与えることを示唆している。また、補体Ｃ４は自己免疫疾患にも関連づけられている。
【０１８８】
Ｉｇｈ−６：Ｉｇｈ６は、Ｂ細胞成熟に必要なＢ細胞抗原である。Ｉｇｈ６欠損マウスは、Ｂ細胞欠損のモデルとして一般的に使用されている。したがって、年齢に伴った骨格筋中のＩｇｈ−６の増加は、この組織中のＢ細胞浸潤の増加の二次的なものである可能性があり、これは、これらの研究ではＣＲによって完全に防止された。
【０１８９】
Ｃｄｋｎ２Ｃ（ｐ１８）：ｐ１８ＩＮＫ４ｃとしても知られるＣｄＫｎ２Ｃは、Ｇ１期サイクリンキナーゼ阻害剤（ＣＫＩ）である。ＤＮＡ損傷に応答した細胞周期停止に関与するいくつかのＣＫＩのうちの１つである。ｐ１８又は関連するｐ１６のどちらかの突然変異が腫瘍化をもたらすため、ＣＫＩ阻害剤は癌抑制遺伝子である。ｐ１６は、成体幹細胞集団画分の細胞老化に特に関連づけられている。観察された加齢関連のｐ１８活性化は、自然に生じるＤＮＡ損傷を反映している可能性が高い。
【０１９０】
Ｐｌｋ２：ポロキナーゼ２は、培養細胞のＧ１及び特定の動物組織で発現され、ＤＮＡ損傷応答において機能するポロ様キナーゼである。この遺伝子ファミリーの創設メンバーであるポロは、ショウジョウバエで同定され、細胞分裂の調整において役割を果たす。
【０１９１】
Ｍｔ２：メタロチオネイン（Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ）は、広範囲の生物中で見つかり、幅広い種類のストレス条件下で誘導されることが知られている、低分子量のシステインリッチの金属結合タンパク質である。これらのタンパク質は細胞内亜鉛の輸送を調整するため、メタロチオネインによる亜鉛レベルの調整は、ストレスに対する細胞防御の重要な側面であると考えられている。
【０１９２】
Ｄｕｓｐ２６：ＤＵＳＰ（二重特異性チロシンホスファターゼ）は、その触媒活性に関与するチロシンホスファターゼのシグネチャドメイン（Ｉ／Ｖ）ＨＣＸＡＧＸＧＲ（Ｓ／Ｔ）を保有することによって、チロシンホスファターゼに類似である。ＤＵＳＰ１〜９、ＤＵＳＰ１６及びＭＫＰ８としても知られるＤＵＳＰ−２６を含めた、このクラスの多くのメンバーが同定されている。これらのタンパク質はすべて、異なるＭＡＰキナーゼメンバー上のセリン／スレオニン及びチロシン残基を脱リン酸化して、その失活をもたらす。ＤＵＳＰは、熱ショック、マイトジェン及び低酸素症などのＭＡＰキナーゼ経路を始動させる刺激によって活性化される。Ｄｕｓｐ２６は熱ショック転写因子４ｂと関連することが最近示され、これにより、このＤＵＳＰと熱ショック応答との関連が確立された。驚くべきことに、ＣＲはＤｕｓｐ２６の加齢関連の誘導を防止することができなかった。
【０１９３】
Ｃｄｓ１：ＣＤＰ−ジアシルグリセロール合成酵素は、ホスホイノシチド及びホスファチジルグリセロールの両方の前駆体として役割を果たす、グリセロ脂質の生合成に関与する律速酵素でる。ＣＤＰ−ジアシルグリセロール合成酵素は、リン脂質の生合成経路の活性を調節すると考えられている。
【０１９４】
Ｅｄｇ２：Ｅｄｇ２（内皮分化、リゾホスファチジン酸Ｇ−タンパク質共役型受容体２）の発現は年齢に伴って減少し、この減少はＣＲによってほぼ完全に防止された。リゾホスファチジン酸は細胞骨格の再配置を誘導し、Ｅｄｇ２はこの分子の受容体であるため、これらの発見は、細胞骨格リモデリングがマウスの骨格筋における加齢の共通の特徴であるという、この研究で見られる一般パターンを要約している。
【０１９５】
Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２、Ｃｏｌ３ａ１：Ｃｏｌ１ａ及びＣｏｌ１ａ２はＩ型プロコラーゲンの鎖をコードしている。これらの遺伝子中の突然変異は、ヒト疾患の骨形成不全症に関連している。本発明者らが知る限り、これは、加齢に伴ったコラーゲン遺伝子の協調的な下方制御の最初の発見である。３つのプロコラーゲン遺伝子（Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２、Ｃｏｌ３ａ１）が、年齢に伴った変化及びＣＲによる妨害を示した。
【０１９６】
Ｒｈｐｎ２：ロフィリン２はＲｈｏ  ＧＴＰａｓｅ結合タンパク質である。これはエンドサイトーシスにおいて役割を果たすことが仮定されており、酵母ツーハイブリッドスクリーニングにより、細胞骨格の構成要素がロフィリン２のパートナーであることが示唆されている。
【０１９７】
Ｓｙｔ９：シナプス前神経終末及び神経内分泌細胞内へのカルシウム流入が、シナプス及び分泌小胞の開口放出を始動させる。Ｓｙｔ９を含めたシナプトタグミンは、開口放出のカルシウムセンサーであると考えられている、カルシウム結合タンパク質である。
【０１９８】
本明細書は、本発明の典型的な好ましい実施形態を開示している。特定な用語を用いたが、これらは一般的及び説明的な意味でのみ使用し、特許請求の範囲に記載した本発明の範囲を限定する目的ではない。明らかに、上記教示に鑑みて、本発明の多くの改変及び変形が可能である。したがって、添付の特許請求の範囲内で、本発明を具体的に記載したものとは異なる様式で実施してもよいことを理解されたい。
【国際調査報告】
2012520072.tif 000026
2012520072.tif 000027
2012520072.tif 000028
2012520072.tif 000029