【手続補正書】
【提出日】令和2年4月1日(2020.4.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）細胞形質導入を可能にする条件下で、レシチンレチノールアシルトランスフェラーゼ（ＬＲＡＴ）を発現する細胞を、イソメロヒドロラーゼタンパク質をコードする導入遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターと接触させるステップと、
（ｂ）コードされた前記イソメロヒドロラーゼタンパク質の発現を可能にする条件下で形質導入細胞をインキュベートするステップと、
（ｃ）前記形質導入細胞を収集し、溶解して、コードされた前記イソメロヒドロラーゼタンパク質を含む抽出物を生成するステップと、
（ｄ）前記イソメロヒドロラーゼタンパク質による基質の反応生成物への変換を可能にする時間及び条件下で前記抽出物を前記基質とインキュベートするステップと、
（ｅ）前記反応生成物をカラムクロマトグラフィーに供し、それによってカラムクロマトグラフィーにより精製された反応生成物を生成するステップと、
（ｆ）前記カラムクロマトグラフィーにより精製された反応生成物を質量分析に供し、それによって前記反応生成物を定量するステップであって、前記反応生成物の量はイソメロヒドロラーゼ活性を反映し、それによってイソメロヒドロラーゼ活性を測定するステップと
を含む、イソメロヒドロラーゼ活性を測定する方法。
【請求項２】
前記イソメロヒドロラーゼタンパク質が、網膜色素上皮特異的タンパク質、６５−ＫＤ（ＲＰＥ６５）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記イソメロヒドロラーゼタンパク質が、野生型網膜色素上皮特異的タンパク質、６５−ＫＤ（ＲＰＥ６５）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記イソメロヒドロラーゼタンパク質が、バリアント又は突然変異体網膜色素上皮特異的タンパク質、６５−ＫＤ（ＲＰＥ６５）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記イソメロヒドロラーゼタンパク質が、哺乳動物網膜色素上皮特異的タンパク質、６５−ＫＤ（ＲＰＥ６５）を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記イソメロヒドロラーゼタンパク質が、ヒト網膜色素上皮特異的タンパク質、６５−ＫＤ（ＲＰＥ６５）を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が哺乳動物細胞を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞がヒト細胞を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞がヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞がＬＲＡＴを安定に又は一過性に発現する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記基質がオール−トランス−レチニルエステルを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｄ）が、前記基質の前駆体を前記抽出物に添加することを含み、前記前駆体が、発現された前記ＬＲＡＴによって前記基質に変換される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｄ）が、細胞性レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）及び前記基質の前駆体を前記抽出物に添加することを含み、前記前駆体が、発現された前記ＬＲＡＴによって前記基質に変換される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
添加されるＣＲＡＬＢＰの量が５０〜５００μｇである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞が、細胞性レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）も安定に又は一過性に発現する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記前駆体が、オール−トランスレチノールを含むか、又はオール−トランスレチノールからなる、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記オール−トランスレチノールが、最終濃度が１〜２０ｍＭであるように添加される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記反応生成物が、１１−シス−レチノールを含むか、又は１１−シス−レチノールからなる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｄ）、（ｅ）及び／又は（ｆ）が、暗所、薄暗い光の下又は薄暗い黄色の光の下で実施される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記基質、前駆体又は反応生成物が非放射性である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ｄ）の前記時間が、３０分〜２４０分である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ｄ）の後であるが、ステップ（ｅ）の前に、前記反応が停止又はクエンチされる、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ステップ（ｄ）の後であるが、ステップ（ｅ）の前にアルコールが添加される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ステップ（ｄ）が、前記反応生成物を抽出することを更に含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記反応生成物が有機溶媒により抽出される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記反応生成物がヘキサンにより抽出される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
ステップ（ａ）〜（ｄ）のいずれかが実施例１に記載されているように実施される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
ステップ（ｅ）〜（ｆ）のいずれかが実施例２に記載されているように実施される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９及びＡＡＶ１０から選択されるいずれかの血清型のカプシドタンパク質配列又は逆方向末端反復配列と７０％以上の配列同一性を有するカプシドタンパク質配列又は逆方向末端反復配列を含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０から選択されるいずれかの血清型のカプシドタンパク質又は逆方向末端反復を含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
（ａ）細胞を接触させる前記ステップが、１個の細胞当たり５００〜５００万個のＡＡＶベクター粒子の量である、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
（ａ）細胞を接触させる前記ステップが、１個の細胞当たり１，０００〜１，０００，０００個のＡＡＶベクター粒子の量である、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
（ａ）細胞を接触させる前記ステップが、１個の細胞当たり２，０００〜５００，０００個のＡＡＶベクター粒子の量である、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
（ｂ）前記形質導入細胞をインキュベートする前記ステップが、６時間〜９６時間の時間である、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
（ｃ）の前記形質導入細胞を溶解する前記ステップが、凍結融解、超音波処理又はそれらの組合せによる、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
ステップ（ｃ）の後に生成される総細胞タンパク質の量が決定される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
ステップ（ｃ）の後に生成される総細胞タンパク質の量が、ブラッドフォードアッセイによって決定される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記前駆体が、ＤＭＦの１０〜１００％溶液と混合される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
細胞を収集した後であるが、（ｃ）溶解する前記ステップの前に、前記収集した細胞が緩衝液に再懸濁される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
（ｃ）前記形質導入細胞を溶解して抽出物を生成する前記ステップの後、前記抽出物が緩衝液に希釈される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記緩衝液が塩緩衝液である、請求項３９又は４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記緩衝液がＮａＣｌ緩衝液である、請求項３９又は４０に記載の方法。
【請求項４３】
ステップ（ｃ）によって生成された前記抽出物が、１０μｇ〜２，０００μｇの総細胞タンパク質を含むか、又は１０μｇ〜２，０００μｇの総タンパク質となるように調整される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
ステップ（ｃ）によって生成された前記抽出物が、５０μｇ〜７５０μｇの総細胞タンパク質を含むか、又は５０μｇ〜７５０μｇの総タンパク質となるように調整される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
（ｄ）インキュベートする前記ステップが３０〜４０℃の温度である、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記カラムクロマトグラフィーが、１１−シス−レチノールを９−シス−レチノール及び／又は１３−シス−レチノールから分離する、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記カラムクロマトグラフィーが逆相クロマトグラフィーを含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記カラムクロマトグラフィーが逆相固定相を含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記固定相がＣ１８鎖を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記固定相が親水性基を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記親水性基がカルバメート基を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記固定相がＣ１８鎖内に親水性カルバメート基を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
前記固定相がシリルカルバメート基を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
細胞当たり１×１０４〜２×１０６個のＡＡＶベクターゲノムの線形である、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
決定係数（Ｒ２）が０．８５より大きい、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の方法。