【手続補正書】
【提出日】令和2年1月9日(2020.1.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リプログラミングベクターを本質的に含まないヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法であって、以下を含む方法：
（ａ）リプログラミングベクターをヒト体細胞に導入し、第１の細胞集団を作製すること、ここでリプログラミングベクターはウイルスの複製起点、ｉＰＳＣリプログラミング因子、合成転写因子またはその両方をコードする発現カセットおよび自殺遺伝子を含む；
（ｂ）第１の細胞集団を培養し、リプログラミング因子、合成転写因子またはその両方の発現をもたらし、胚性幹細胞と一致した形質を有する第２の細胞集団を作製すること；
（ｃ）第２の細胞集団を自殺遺伝子基質と接触させ、リプログラミングベクターを本質的に含まないｉＰＳＣを作製すること。
【請求項２】
自殺遺伝子がチミジンキナーゼおよびシトシンデアミナーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
複製起点がＯｒｉＰである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
発現カセットが、ＥＢＶのＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−１の６５〜８９残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、ＥＢＮＡ−１の９０〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、またはＥＢＮＡ−１の６５〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
体細胞が、ヒト末梢血単核細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、造血細胞、間葉細胞、肝細胞、胃細胞およびβ細胞からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ｉＰＳＣリプログラミング因子が、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、Ｌｉｎ−２８およびｐ５３ＤＤのうち１つ以上からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
（ｄ）エピソーマルリプログラミングベクターの存在に対して、（ｃ）の細胞集団をスクリーニングすることをさらに含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
（ｅ）エピソーマルリプログラミングベクターを含まない、（ｄ）のスクリーニングされた細胞を培養することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｂ）後、工程（ｃ）の前に、第２の細胞集団の細胞を継代培養することをさらに含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
エピソーマルリプログラミングベクターを本質的に含まないヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法であって、以下を含む方法：
（ａ）エピソーマルリプログラミングベクターを体細胞に導入し、第１の細胞集団を作製すること、ここでエピソーマルリプログラミングベクターは、
（ｉ）ＯｒｉＰ複製起点、
（ｉｉ）ｉＰＳＣリプログラミング因子、合成転写因子またはその両方をコードする発現カセット、
（ｉｉｉ）ＥＢＶのＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−１の６５〜８９残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、ＥＢＮＡ−１の９０〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、または６５〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするポリヌクレオチド、および
（ｉｖ）チミジンキナーゼまたはシトシンデアミナーゼ自殺遺伝子を含む；
（ｂ）第１の細胞集団を培養し、リプログラミング因子、合成転写因子またはその両方の発現をもたらし、胚性幹細胞と一致した形質を有する第２の細胞集団を作製すること；
（ｃ）第２の細胞集団を自殺遺伝子基質と接触させ、エピソーマルリプログラミングベクターを本質的に含まないｉＰＳＣを作製すること。
【請求項１１】
リプログラミングベクターを本質的に含まないヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法であって、以下を含む方法：
（ａ）リプログラミングベクターを体細胞に導入し、第１の細胞集団を作製すること、ここでリプログラミングベクターは、（ｉ）ウイルスの複製起点、（ｉｉ）ｉＰＳＣリプログラミング因子、合成転写因子またはその両方をコードする発現カセット、（ｉｉｉ）リプログラミングベクターの染色体外での複製および分配を制御する遺伝子、および（ｉｖ）制御されたプロモーターシステムを含む；
（ｂ）第１の細胞集団を培養し、リプログラミング因子、合成転写因子またはその両方の発現をもたらし、胚性幹細胞と一致した形質を有する第２の細胞集団を作製すること、ここで第１の細胞集団の培養中に、エピソーマルリプログラミングベクターは複製される；
（ｃ）第２の細胞集団を培養すること、ここでリプログラミングベクターの染色体外での複製および分配を制御する遺伝子は、リプログラミングベクターが細胞分裂中に消失するように制御され、リプログラミングベクターを本質的に含まないｉＰＳＣを作製する。
【請求項１２】
エピソーマルリプログラミングベクターの転写を制御する遺伝子が、テトラサイクリン活性化システムまたはテトラサイクリン誘導体活性化システムを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
（ｄ）エピソーマルリプログラミングベクターの存在に対して、（ｃ）の細胞集団をスクリーニングすることをさらに含む、請求項１１−１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
（ｅ）エピソーマルリプログラミングベクターを含まない、（ｄ）のスクリーニングされた細胞を培養することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
スクリーニングがｑＰＣＲベクター検出アッセイを含む、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
エピソーマルリプログラミングベクターを本質的に含まないヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法であって、以下を含む方法：
（ａ）エピソーマルリプログラミングベクターを体細胞に導入し、第１の細胞集団を作製すること、ここでエピソーマルリプログラミングベクターは、
（ｉ）ＯｒｉＰ複製起点、
（ｉｉ）ｉＰＳＣリプログラミング因子、合成転写因子またはその両方をコードする発現カセット、
（ｉｉｉ）ＥＢＶのＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−１の６５〜８９残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、ＥＢＮＡ−１の９０〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、またはＥＢＮＡ−１の６５〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするポリヌクレオチド、および
（ｉｖ）テトラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体に制御されたプロモーターシステム（ＴｅｔＯｎまたはＴｅｔＯｆｆ）を含む；
（ｂ）第１の細胞集団を培養し、胚性幹細胞と一致した形質を有する第２の細胞集団を作製すること、ここで培養中にエピソーマルリプログラミングベクターは複製される；
（ｃ）第２の細胞集団を培養し、第３の細胞集団を作製すること、ここで培養中にエピソーマルリプログラミングベクターは複製されない；
（ｄ）コロニーを第３の細胞集団から選択し、第４の細胞集団を作製すること；および
（ｅ）第４の細胞集団を培養し、エピソーマルリプログラミングベクターを本質的に含まないｉＰＳＣを作製すること。
【請求項１７】
リプログラミングベクターを本質的に含まないヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法であって、以下を含む方法：
（ａ）リプログラミングベクターを体細胞に導入し、第１の細胞集団を作製すること、ここでリプログラミングベクターは、（ｉ）ウイルスの複製起点、（ｉｉ）ｉＰＳＣリプログラミング因子、合成転写因子またはその両方をコードする発現カセット、（ｉｉｉ）リプログラミングベクターの染色体外での複製および分配を制御する遺伝子、（ｉｖ）制御されたプロモーターシステム、および（ｖ）自殺遺伝子を含む；
（ｂ）第１の細胞集団を培養し、リプログラミング因子、合成転写因子またはその両方の発現をもたらし、胚性幹細胞と一致した形質を有する第２の細胞集団を作製すること、ここで培養中にリプログラミングベクターは複製される；
（ｃ）第２の細胞集団を培養すること、ここで染色体外での複製および分配を制御する遺伝子は、リプログラミングベクターが細胞分裂中に消失するように制御され、リプログラミングベクターを実質的に含まないｉＰＳＣを含む第３の細胞集団を作製する；
（ｄ）第３の細胞集団を自殺遺伝子基質と接触させ、リプログラミングベクターを本質的に含まないｉＰＳＣを作製すること。
【請求項１８】
エピソーマルリプログラミングベクターを本質的に含まないヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法であって、以下を含む方法：
（ａ）エピソーマルリプログラミングベクターを体細胞に導入し、第１の細胞集団を作製すること、ここでエピソーマルリプログラミングベクターは、
（ｉ）ＯｒｉＰ複製起点、
（ｉｉ）ｉＰＳＣリプログラミング因子、合成転写因子またはその両方をコードする発現カセット、
（ｉｉｉ）ＥＢＶのＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−１の６５〜８９残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、ＥＢＮＡ−１の９０〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、またはＥＢＮＡ−１の６５〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするポリヌクレオチド、
（ｉｖ）テトラサイクリンまたは誘導体に制御されたプロモーターシステム（ＴｅｔＯｎまたはＴｅｔＯｆｆ）、および
（ｖ）チミジンキナーゼまたはシトシンデアミナーゼ自殺遺伝子を含む；
（ｂ）第１の細胞集団を培養し、リプログラミング因子の発現をもたらし、胚性幹細胞と一致した形質を有する第２の細胞集団を作製すること、ここで培養中にエピソーマルリプログラミングベクターは複製される；
（ｃ）第２の細胞集団を培養し、エピソーマルリプログラミングベクターを実質的に含まないｉＰＳＣを含む第３の細胞集団を作製すること、ここで第２の細胞集団の培養中にエピソーマルリプログラミングベクターは複製されない；
（ｄ）第３の細胞集団を自殺遺伝子基質と接触させ、エピソーマルリプログラミングベクターを本質的に含まないｉＰＳＣを作製すること。
【請求項１９】
（ａ）ＯｒｉＰ複製起点；
（ｂ）ｉＰＳＣリプログラミング因子、合成転写因子またはその両方をコードする発現カセット、および
（ｃ）ＥＢＶのＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−１の６５〜８９残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、ＥＢＮＡ−１の９０〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、またはＥＢＮＡ−１の６５〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするポリヌクレオチド分子； 
（ｃ）自殺遺伝子；および
（ｄ）
（ｄ１）自殺遺伝子；
（ｄ２）チミジンキナーゼまたはシトシンデアミナーゼ自殺遺伝子；
（ｄ３）制御されたプロモーターシステム；
（ｄ４）ＴｅｔＯｎまたはＴｅｔＯｆｆシステム；
（ｄ５）ＴｅｔＯｎもしくはＴｅｔＯｆｆシステムならびに自殺遺伝子；ならびに
（ｄ６）ＴｅｔＯｎもしくはＴｅｔＯｆｆシステムならびにチミジンキナーゼもしくはシトシンデアミナーゼ自殺遺伝子；
から選択される要素、
を含む、エピソーマルリプログラミングベクター。
【請求項２０】
ｉＰＳＣリプログラミング因子が、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、Ｌｉｎ−２８およびｐ５３ＤＤのうち１つ以上からなる群から選択される、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２１】
ｉＰＳＣリプログラミング因子が、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、またはＳｏｘ−２およびＯｃｔ−４を含む、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２２】
リプログラミング因子が、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、ならびにＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、Ｌｉｎ−２８およびｐ５３ＤＤのうち１つ以上を含む、請求項１９に記載のベクター。