(57)【要約】本発明の目的は、繊維状等への加工特性に優れた超高分子量のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を高レベルで蓄積する微生物株を提供すること、およびそれを利用した安全かつ安価な共重合ポリエステルの製造方法を提供することである。本発明は、ＰＨＡ合成酵素遺伝子と３−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ遺伝子とを、ラルストニア属、アエロモナス属、アルカリゲネス属及びシュードモナス属からなる群より選択される少なくとも１種の宿主微生物に導入して作出した形質転換微生物と、この形質転換微生物を炭素源存在下で増殖させ、この増殖微生物から共重合ポリエステルを単離・精製することを特徴とする共重合ポリエステルの製造方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子と３−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ遺伝子とを、ラルストニア属、アエロモナス属、アルカリゲネス属及びシュードモナス属からなる群より選択される少なくとも１種の宿主微生物に導入して形質転換した微生物であって、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸のモノマーユニットで構成される共重合ポリエステルを蓄積する微生物。
【請求項２】
宿主微生物がラルストニア・ユートロファであることを特徴とする、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
３−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ遺伝子が大腸菌由来の遺伝子であることを特徴とする、請求項１または２に記載の微生物。
【請求項４】
ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子が、アエロモナス・キャビエ由来の酵素又はその変異体をコードするものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項５】
変異体が、以下の（ａ）、（ｂ）いずれかのアミノ酸置換を少なくとも一つ以上行ったものである、請求項４に記載の微生物。
（ａ）１４９番目のアミノ酸のアスパラギンをセリンに置換
（ｂ）１７１番目のアミノ酸のアスパラギン酸をグリシンに置換
【請求項６】
ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子が、１７１番目のアミノ酸のアスパラギン酸をグリシンに置換したアエロモナス・キャビエ由来の変異体酵素をコードするものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の微生物を用いたポリエステルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、加工特性に優れた性質を示す超高分子量の生分解性ポリエステルの製造方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子と３−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ遺伝子とを発現させた微生物を用いる、超高分子量の生分解性ポリエステルの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）は、広範な微生物によって生成されるポリエステル型有機分子ポリマーである。これらのポリマーは生分解性を有し、熱可塑性高分子であること、また、再生可能資源から産生されることから、環境調和型素材または生体適合型素材として工業的に生産し、多様な産業へ利用する試みが行われている。
このポリエステルを構成するモノマー単位は一般名３−ヒドロキシアルカン酸であって、具体的には３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、あるいはよりアルキル鎖の長い３−ヒドロキシアルカン酸が単重合もしくは共重合することにより、ポリマー分子が形成されている。【０００３】
３−ヒドロキシ酪酸（以下３ＨＢと略す）のホモポリマーであるポリ−３−ヒドロキシ酪酸（以下、Ｐ（３ＨＢ）と略す）は、１９２５年にバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）で最初に発見されたが、このＰ（３ＨＢ）は結晶性が高いため、硬くて脆い性質を持っており、実用的には応用範囲が限られている。
また、３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）と３−ヒドロキシ吉草酸（３ＨＶ）とからなる共重合体（以下Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）と略す）はＰ（３ＨＢ）に比べると柔軟性に富むことが知られ、製造方法も開示されている（例えば、特許文献１、特許文献２参照）。しかしながら、実際にはＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）は３ＨＶモル分率を増加させても、それに伴う物性の変化が乏しく、特に柔軟性が向上しないため、シャンプーボトルや使い捨て剃刀の取っ手等、硬質成型体の分野にしか利用されなかった。【０００４】
また、アルキル鎖の炭素数が６から１６の３−ヒドロキシアルカン酸で構成される中鎖ＰＨＡは、Ｐ（３ＨＢ）やＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）よりも結晶性が低く、弾力性に富んでいるので（非特許文献１参照）、異なる分野への用途が期待されている。中鎖ＰＨＡの製造研究は、シュードモナス属のＰＨＡ合成酵素遺伝子を、シュードモナス属、ラルストニア属、大腸菌に導入することによって行われてきたが、いずれも生産性が低く工業生産に適したものではなかった（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４参照）。【０００５】
また、ポリヒドロキシアルカン酸の一種として、３ＨＢと３−ヒドロキシヘキサン酸（以下、３ＨＨと略す）との２成分共重合ポリエステル（以下Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）と略す）が知られており、その製造方法が開示されている（特許文献３、特許文献４参照）。また、非特許文献５では３ＨＨ組成が１１〜１９ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を発酵生産し、３ＨＨ組成の増加にともなって硬くて脆い性質から次第に柔軟な性質を示すようになり、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）を上回る柔軟性を示したことが報告されている。すなわちＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は３ＨＨ組成を変えることで、硬質ポリエステルから軟質ポリエステルまで応用可能な幅広い物性を持つため、テレビの筐体等のように硬さを要求されるものからフィルム等のように柔軟性を要求されるものまで、幅広い分野への応用が期待できる。【０００６】
ポリエステルはその分子量によって特性が変化し、繊維などに加工する際にはできるだけ高分子量であることが望ましい。微生物が産生するポリヒドロキシアルカン酸の分子量は、微生物毎に異なるものの、おおむね５万ダルトンから１００万ダルトンであるので、より高分子量のＰＨＡの生産が研究された。
ラルストニア・ユートロファ由来のＰＨＡ合成に関する遺伝子を組み込んだ大腸菌を用い、培養時のｐＨ及びグルコース濃度をコントロールすることにより重量平均分子量が１０００万を越える超高分子量Ｐ（３ＨＢ）の生産方法が示された。その中で超高分子量Ｐ（３ＨＢ）では繊維状等への加工時に重要な物性（例えば引張り強度や再伸延性）が向上することが明らかにされている（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８参照）。
また、試験管内でのＰ（３ＨＢ）生産では、ＰＨＡ合成酵素濃度を変化させることにより、３００万〜１２００万ダルトンの重量平均分子量を有するＰ（３ＨＢ）を生産可能であることも明らかにされた（非特許文献９参照）。【０００７】
更に、誘導性プロモーターにより制御されたＰＨＡ合成酵素遺伝子等を有する発現ベクターを用いた大腸菌によるＰ（３ＨＢ）の生産では、誘導剤添加量で発現する酵素量を制御した結果、重量平均分子量を７８万〜４００万ダルトンでコントロール可能であることが開示されている（特許文献５参照）。
また、特許文献６ではＰＨＡ合成酵素遺伝子をバクテリアの染色体上に組み込んで発現させると、組み込み部位によって４０万から１００万ダルトンまでの異なる分子量のＰＨＡを生産できることが開示されている。ラルストニア・ユートロファの染色体上にアエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子と基質モノマーを供給する遺伝子を組み込んだ例では４０万から１０００万ダルトンの分子量を有する３−ヒドロキシヘキサン酸と３−ヒドロキシオクタン酸からなる共重合ポリエステルが蓄積された。しかしながらその生産性については言及されていない。【０００８】
更にＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産研究も多く報告されている。
アエロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）を用いた培養では、オレイン酸を炭素源とした４３時間の流加培養において、菌体生産量９５．７ｇ／Ｌ、ポリエステル含量４５．２％、３ＨＨ組成１７％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）が生産された（非特許文献１０参照）。また、アエロモナス・ハイドロフィラを、炭素源としてグルコース及びラウリン酸を用いて培養し、菌体生産量５０ｇ／Ｌ、ポリエステル含量５０％を達成し、分子量は１００万ダルトンであった（非特許文献１１参照）。しかしながら、アエロモナス・ハイドロフィラはヒトに対して病原性を有する（非特許文献１２参照）ことから、工業生産に適した種とはいえない。また、これらの培養生産では高価な炭素源を使用するため、製造コストの観点より安価な炭素源の利用も求められている。【０００９】
安全な宿主を用いたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産研究としては、アエロモナス・キャビエよりクローニングされたＰＨＡ合成酵素遺伝子をラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）に導入した形質転換体を用いたものがある。菌体生産性は４ｇ／Ｌ、ポリエステル含量は３０％であった（特許文献７、非特許文献１３参照）。更に本形質転換体を、炭素源として植物油脂を用いて培養した結果、菌体生産量４ｇ／Ｌ、ポリエステル含量８０％が達成され、重量平均分子量は５１万ダルトンであった（非特許文献１４参照）。また、プロモーターとしてラルストニア・ユートロファのｐｈｂオペロンのものを利用した形質転換体の場合は、オクタン酸を単一炭素源とした培養で、ポリエステル含量５６％、重量平均分子量が３１０万のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）が蓄積されたことが示されている（非特許文献１５参照）。しかしながら、安価な植物油脂等を炭素源とした培養での超高分子量のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）生産に関しての報告は無い。【００１０】
一方で、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産性向上並びに３ＨＨ組成制御を目指して、ＰＨＡ合成酵素の人為的な改変が行なわれた。アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素変異体のなかで、１４９番目のアミノ酸アスパラギンがセリンに置換された変異体酵素や、１７１番目のアスパラギン酸がグリシンに置換された変異体酵素は、大腸菌内でのＰＨＡ合成酵素活性や３ＨＨ組成が向上していることが示された。しかしながら、分子量は天然型酵素の２６０万ダルトンよりも低下していた（非特許文献１６参照）。また、ナイルレッドの染色性増強を指標に選択された同酵素の変異体は大腸菌でのＰＨＡ合成酵素活性が向上し、平均分子量も最大１．８倍、３５．８万ダルトンに増大したことが報告されている（非特許文献１７参照）。【００１１】
また一方で、脂肪酸合成酵素遺伝子をＰＨＡ合成酵素遺伝子とともに宿主微生物に導入してＰＨＡの生産性を向上させる試みが報告されている（特許文献８、非特許文献１８参照）。これらの報告では、大腸菌由来の３−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ遺伝子や脂肪酸合成酵素遺伝子群をアエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子とともに大腸菌に導入し、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）やＰ（３ＨＢ）の生産性向上に成功しているが、産生されるポリエステルの分子量には言及していない。
上記のように、高分子量Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を製造する従来の技術は、重量平均分子量３１０万ダルトン程度までのＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）しか製造できず、しかも生産性が低かったり、高価な炭素源を使用するものであったりした。
【特許文献１】特開昭５７−１５０３９３号公報
【特許文献２】特開昭５９−２２０１９２号公報
【特許文献３】特開平５−９３０４９号公報
【特許文献４】特開平７−２６５０６５号公報
【特許文献５】米国特許５８１１２７２号明細書
【特許文献６】米国特許６５９３１１６号明細書
【特許文献７】特開平１０−１０８６８２号公報
【特許文献８】特開２０００−１３５０８３号公報
【非特許文献１】Ｍａｄｉｓｏｎ等、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，６３：２１−５３（１９９９）
【非特許文献２】Ｍａｔｓｕｓａｋｉ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８０：６４５９−６４６７（１９９８）
【非特許文献３】Ｍａｔｓｕｓａｋｉ等、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３：４０１−４０９（２０００）
【非特許文献４】Ｌａｎｇｅｎｂａｃｈ等、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１５０：３０３−３０９（１９９７）
【非特許文献５】Ｄｏｉ等、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２８：４８２２−４８２８（１９９５）
【非特許文献６】Ｋｕｓａｋａ等、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４７：１４０−１４３（１９９７）
【非特許文献７】Ｋｕｓａｋａ等、Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．，Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．，Ａ３５：３１９−３３５（１９９８）
【非特許文献８】Ｋｕｓａｋａ等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，２５：８７−９４（１９９９）
【非特許文献９】Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：６２７９−６２８３（１９９５）
【非特許文献１０】Ｌｅｅ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，６７：２４０−２４４（２０００）
【非特許文献１１】Ｃｈｅｎ等、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５７：５０−５５（２００１）
【非特許文献１２】国立感染症研究所  病原体等安全管理規定  別表１付表１（１９９９）
【非特許文献１３】Ｆｕｋｕｉ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９：４８２１−４８３０（１９９７）
【非特許文献１４】Ｆｕｋｕｉ等、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ．，４９：３３３―３３６（１９９８）
【非特許文献１５】Ｋｉｃｈｉｓｅ等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，２５：６９−７７（１９９９）
【非特許文献１６】Ｋｉｃｈｉｓｅ等、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６８：２４１１−２４１９（２００２）
【非特許文献１７】Ａｍａｒａ等、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５９：４７７−４８２（２００２）
【非特許文献１８】Ｔａｇｕｃｈｉ等、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１７６：１８３−１９０（１９９９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
以上のような状況に鑑み、本発明の目的は、超高分子量のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を高レベルで蓄積する微生物株を提供すること、およびそれを利用した安全かつ安価な共重合ポリエステルの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、上述の課題を解決するために鋭意検討した結果、ＰＨＡ合成酵素遺伝子（ｐｈａＣ）と３−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ遺伝子とを導入した形質転換微生物が、３１０万ダルトン以上の重量平均分子量を持つ超高分子量Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を高レベルで蓄積できることを見いだした。本形質転換微生物が蓄積できるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の分子量の上限は、工業的生産を考慮すると１０００万ダルトンであり、より好ましくは７００万ダルトンである。
実施例に示したように、ラルストニア・ユートロファにアエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素変異体遺伝子（Ｄ１７１Ｇ変異体遺伝子）と大腸菌由来の３−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ遺伝子（ｆａｂＧ）とを導入した形質転換株は、６４時間の培養で菌体生産量１０９．２ｇ／Ｌ、ポリエステル含量６８．６％、重量平均分子量５１０万ダルトンのＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産した。【００１４】
即ち本発明は以下の通りである。
［１］ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子と３−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ遺伝子とを、ラルストニア属、アエロモナス属、アルカリゲネス属及びシュードモナス属からなる群より選択される少なくとも１種の宿主微生物に導入して形質転換した微生物であって、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸のモノマーユニットで構成される共重合ポリエステルを蓄積する微生物。
［２］宿主微生物がラルストニア・ユートロファであることを特徴とする、［１］に記載の微生物。
［３］３−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ遺伝子が大腸菌由来の遺伝子であることを特徴とする、［１］または［２］に記載の微生物。
［４］ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子が、アエロモナス・キャビエ由来の酵素又はその変異体をコードするものである、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の微生物。
［５］変異体が、以下の（ａ）、（ｂ）いずれかのアミノ酸置換を少なくとも一つ以上行ったものである、［４］に記載の微生物。
（ａ）１４９番目のアミノ酸のアスパラギンをセリンに置換
（ｂ）１７１番目のアミノ酸のアスパラギン酸をグリシンに置換
［６］ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子が、１７１番目のアミノ酸のアスパラギン酸をグリシンに置換したアエロモナス・キャビエ由来の変異体酵素をコードするものである、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の微生物。
［７］［１］〜［６］のいずれか１項に記載の微生物を用いたポリエステルの製造方法。【００１５】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明における３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）と３−ヒドロキシヘキサン酸（３ＨＨ）のモノマーユニットで構成される共重合ポリエステル（Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ））とは、以下の一般式：【００１６】
【化１】
2006101176.tif 000002
【００１７】
（式中、ｍおよびｎは該ポリマーのモノマー単位数を表し、１以上である。）で表される共重合ポリマーである。
本発明の微生物より得られるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は、重量平均分子量（Ｍｗ）が３１０万〜１０００万のものが好ましく、より好ましくは４２０万〜７００万である。上記重量平均分子量（Ｍｗ）は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー法により得られる値である。【００１８】
本発明で用いる宿主微生物は、特に制限はないが、天然から単離された微生物や、菌株の寄託機関（例えばＩＦＯ、ＡＴＣＣ等）に寄託されている微生物等を使用できる。具体的にはラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属等の細菌類のポリエステル非生産菌を使用することができる。安全性及び生産性の観点から好ましくはラルストニア属であり、より好ましくはラルストニア・ユートロファである。上記宿主微生物としては、変異剤処理又は相同組換えに基づく遺伝子破壊処理によってポリエステル合成酵素が不活性化されたものであってもよく、例えばラルストニア・ユートロファＰＨＢ−４株等が挙げられる。ラルストニア・ユートロファＰＨＢ−４株は、ＤＳＭＺ等の機関から入手可能である。【００１９】
本発明で用いるポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子は、各種のＰＨＡ蓄積生物に由来する遺伝子のうちＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を蓄積させるものであればどのようなものでもよい。そのような遺伝子としては例えば、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ（非特許文献１３）およびＮｏｃａｒｄｉａ  ｃｏｒａｌｌｉｎａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０１９９６４）などから単離されているポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子がある。
また、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子としては、目的とする酵素活性が失われない範囲内でアミノ酸配列が改変するように、それらの遺伝子の塩基配列の一部を改変したものも使用することができる。例えば、非特許文献１６に記載されている、１４９番目のアミノ酸のアスパラギンがセリンに置換されたアエロモナス・キャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子（Ｎ１４９Ｓ変異体遺伝子）、１７１番目のアミノ酸のアスパラギン酸がグリシンに置換されたアエロモナス・キャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子（Ｄ１７１Ｇ変異体遺伝子）、または、上記の２つのアミノ酸置換が組み合わされたアエロモナス・キャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子等を好ましく用いることができる。本発明で用いるポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子としては、アエロモナス・キャビエ由来の酵素又はその変異体をコードするものが好ましく、１７１番目のアミノ酸のアスパラギン酸をグリシンに置換したアエロモナス・キャビエ由来の変異体酵素をコードするものがより好ましい。【００２０】
本発明で用いる３−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ遺伝子は、脂肪酸生合成系の酵素３−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．１００）をコードする真核生物や微生物由来の公知の遺伝子（ｆａｂＧ）である。例えば大腸菌由来の３−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ遺伝子（Ｒａｗｌｉｎｇｓ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．２６７，ｐ５７５１，（１９９２）、ＤＤＢＪ  Ｍ８４９９１）、およびそのプロモーター配列（Ｐｏｄｋｏｖｙｒｏｖ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．ｖｏｌ．２４，ｐ１７４７，（１９９６）、Ｚｈａｎｇ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．ｖｏｌ．１８０，ｐ３２９５，（１９９８））、モラキセラ・カタルハリス由来の３−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ遺伝子（米国特許６６３２６３６号）、ブラシカ・ナプス由来の３−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ遺伝子（米国特許６０１１２０１号）、スタフィロコッカス・アウレウス由来の３−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ遺伝子（米国特許６１１０７０４号）等が挙げられ、これらを単独もしくは複数組み合わせて使用することができる。上記３−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ遺伝子としては、大腸菌由来のものが好ましい。
上記のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子および３−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ遺伝子は、構造遺伝子のほかに、プロモーター、ターミネーター等、宿主菌で機能する発現ユニットを有していればよい。なお、発現用プラスミドには、上記発現ユニットが１個以上存在していればよく、複数個存在してもよい。【００２１】
本発明において、宿主微生物に遺伝子を導入するために用いるベクターは公知の微生物用ベクターを用いることができる。例えば、大腸菌用ベクターのｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩなどや、広宿主域ベクターのｐＪＲＤ２１５（ＡＴＣＣ３７５３３）やｐＢＢＲ１（Ｋｏｖａｃｈ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、５：８００−８０２（１９９４））などが挙げられる。また、これらのベクターを改変して作製したベクターを用いることもできる。特にｐＪＲＤ２１５を非接合伝達性に改変したベクターは安全性の点で好適に使用できる。このような改変の例としてはｍｏｂ遺伝子および／またはｏｒｉＴ配列の領域に塩基の欠失、挿入、置換等を行うことによってその機能を低下または欠失させることが挙げられる。また、不要な領域を欠失させて小型化したベクターも形質転換効率の向上の点で好適に使用できる。本明細書中の実施例で作製したｐＪＲＤｄＴｃは、ｐＪＲＤ２１５を非接合伝達性に改変し、小型化したベクターの一例として好適に使用することができる。【００２２】
ベクターにポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子と３−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ遺伝子を組み込んだ発現用プラスミドの作製は、公知の方法により行うことができ、全体的な遺伝子操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８９））に記載されているように行うことができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主等は、市場の供給者から購入し、その説明に従い使用することができる。なお、酵素としては、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。また、クローニング宿主としては、特に限定はないが、例えば大腸菌ＤＨ５α株等が挙げられる。【００２３】
ベクターにポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子と３−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ遺伝子を組み込んだ発現用プラスミドは、公知の方法により宿主微生物に導入することができる。例えば、エレクトロポレーション法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１巻、１．８．４頁、１９９４年）や、カルシウム法（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１１９：１０７２−１０７４（１９７４））等を用いることができる。【００２４】
本発明の好ましい形質転換体としては、例えば、宿主としてのラルストニア・ユートロファＰＨＢ−４株に、１７１番目のアミノ酸のアスパラギン酸をグリシンに置換したアエロモナス・キャビエ由来の変異体酵素をコードするＰＨＡ合成酵素遺伝子と、大腸菌由来の３−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ遺伝子を導入した形質転換体が挙げられる。【００２５】
このようにして作製した形質転換体を炭素源存在下で増殖させることにより、微生物体内に共重合ポリエステルを蓄積させることができる。炭素源としては、糖、油脂または脂肪酸を用いることができる。炭素源以外の栄養源として、窒素源、無機塩類、そのほかの有機栄養源を任意に用いることができる。
糖としては、例えばグルコース、フラクトース等の炭水化物が挙げられる。油脂としては、炭素数が１０以上である飽和・不飽和脂肪酸を多く含む油脂、例えばヤシ油、パーム油、パーム核油等が挙げられる。脂肪酸としては、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸等の飽和・不飽和脂肪酸、あるいはこれら脂肪酸のエステルや塩等の脂肪酸誘導体が挙げられる。
窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。
無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。
そのほかの有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸；ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。【００２６】
作製した形質転換体の培養温度は、その菌が生育可能な温度であればよいが、２０℃から４０℃が好ましい。培養時間は、特に制限はないが、１〜１０日間程度で良い。
得られた該培養菌体に蓄積されたポリエステルは、公知の方法により回収することができる。
例えば次のような方法により行うことができる。培養終了後、培養液から遠心分離器等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水およびメタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてポリエステルを抽出する。このポリエステルを含んだ有機溶剤溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてポリエステルを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてポリエステルを回収することができる。
ポリエステル生産確認の簡易法としては、Ｎｉｌｅｒｅｄを用いた染色法を利用できる。すなわち、組換え菌が生育する寒天培地にＮｉｌｅｒｅｄを加え、組換え菌を１〜７日間培養し、組換え菌が赤変するか否かを観察することにより、ポリエステル生産の有無を確認できる。
上述の形質転換された微生物を用いるポリエステルの製造方法も本発明の一つである。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、繊維等への加工特性に優れた超高分子量のＰＨＡを高生産できる組換え微生物株が提供され、高純度の超高分子量ＰＨＡが簡便かつ大量に、しかも安価に製造することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下に実施例で本発明を説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら制限されるものではない。
（実施例１）  ｐＪＲＤｄＴｃベクターの作製
ベクターｐＪＲＤ２１５（配列番号１）を制限酵素ＳｐｅＩとＢｇｌＩＩで切断したものを、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造製）を用いて平滑末端化し、自己連結させた。これをｐＪＲＤｄｃとした（図１）。当該ｐＪＲＤｄｃは、配列番号１に示されるｐＪＲＤ２１５のｃｏｓ領域等を含む８９１５〜１００５５番の塩基を欠失させたものである。
次に、ｐＪＲＤｄｃを鋳型として、配列番号２と配列番号３で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、約０．５ｋｂのＤＮＡ断片を得た。また、同様にｐＪＲＤｄｃを鋳型として、配列番号４と配列番号５で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、約２．４ｋｂのＤＮＡ断片を得た。得られた２断片に重複部分があることを利用して、オーバーラップＰＣＲ法を行った。ポリメラーゼとしてはＰｙｒｏｂｅｓｔ（宝酒造製）を用いた。このオーバーラップＰＣＲ法により得られた約２．８ｋｂの断片を制限酵素ＥｃｏＯ１０９ＩとＡｆｌＩＩＩで切断し、同様にＥｃｏＯ１０９ＩとＡｆｌＩＩＩで切断しておいた上記のｐＪＲＤｄｃと連結させた。これにより、ｐＪＲＤｄＴｃを得た（図１参照）。すなわち当該ベクターｐＪＲＤｄＴｃは、ｐＪＲＤ２１５のｏｒｉＴ領域（配列番号１の３１３２〜３１６９番の塩基）を欠失させ、かつ、ｃｏｓ領域等（配列番号１の８９１５〜１００５５番の塩基）を欠失させたものである。【００２９】
（実施例２）  発現プラスミドの構築
超高分子量ポリエステル生産用の発現プラスミドは以下のようにして構築した。
ポリエステル合成酵素遺伝子であるＤ１７１Ｇ変異体遺伝子断片は、ＰＣＲ法により作製した。Ｄ１７１Ｇ変異体遺伝子は、配列番号１４に示すように、アエロモナス・キャビエ由来ＰＨＡ合成酵素の１７１番目のアミノ酸であるアスパラギン酸がグリシンに置換されている。従って、特開平１０−１０８６８２号公報に記載されているアエロモナス・キャビエ由来の遺伝子断片ＥＥ３２ｄ１３を、一旦ｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングしておき、配列番号６と配列番号７で示される合成ＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲを行った。その条件は（１）９４℃で２分、（２）９４℃で３０秒、（３）５５℃で３０秒、（４）７２℃で２分、（２）から（４）を２５サイクル、（５）７２℃で５分であり、ポリメラーゼとしてはＥｘ  Ｔａｑポリメラーゼ（宝バイオ製）を用いた。制限酵素ＥｃｏＲＩで切断してＤ１７１Ｇ断片を調製し、実施例１で作製したｐＪＲＤｄＴｃを同酵素で切断した部位に挿入してｐＪＲＤｄＴｃ１７１ＤＧを作製した。次に大腸菌ｆａｂＧ遺伝子は大腸菌ＨＢ１０１株の染色体遺伝子を鋳型とし、配列番号８および９をプライマーとしてＰＣＲを行ってその構造遺伝子部分を増幅させた。ＰＣＲ条件は（１）９４℃で２分、（２）９４℃で３０秒、（３）４５℃で３０秒、（４）７２℃で１分、（２）から（４）を３０サイクル、（５）７２℃で５分であり、ポリメラーゼとしてはＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼ（宝バイオ製）を用いた。その後、ＳａｃＩおよびＢａｍＨＩで切断した。ｆａｂＧ遺伝子のターミネーター配列（Ｒａｗｌｉｎｇｓ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：５７５１−５７５４（１９９２）参照）を含む、配列番号１０および１１の合成ＤＮＡをアニーリングさせた後、ＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＳａｃＩおよびＢａｍＨＩで切断されたｆａｂＧ構造遺伝子断片とともにｐＵＣ１９のＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローニングした。これをＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断してｆａｂＧ遺伝子を含む断片を調製し、ｆａｂＧ遺伝子のプロモーター配列（Ｐｏｄｋｏｖｙｒｏｖ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２４：１７４７−１７５２（１９９６）参照）を含む、配列番号１２および１３の合成ＤＮＡをアニーリングさせた後にＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩで切断した断片とともにｐＵＣ１９のＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローニングした。そこからＨｉｎｄＩＩＩ断片としてｆａｂＧ遺伝子断片を調製し、ｐＪＲＤｄＴｃ１７１ＤＧのＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入して発現プラスミドｐＪＲＤｄＴｃＥｆａｂＧＬ１７１ＤＧを完成した（図２参照）。【００３０】
（実施例３）  形質転換体の作製
この発現プラスミドを含むラルストニア・ユートロファＰＨＢ−４株の形質転換体を電気パルス法により作製した。つまり、遺伝子導入装置はＢｉｏｒａｄ社製のジーンパルサーを用い、キュベットは同じくＢｉｏｒａｄ社製のｇａｐ０．２ｃｍのものを用いた。キュベットに、コンピテント細胞４００μｌと発現プラスミド２０μｌを注入してパルス装置にセットし、静電容量２５μＦ、電圧１．５ｋＶ、抵抗値８００Ωの条件で電気パルスをかけた。パルス後、キュベット内の菌液をＮｕｔｒｉｅｎｔＢｒｏｔｈ培地（ＤＩＦＣＯ社製）で３０℃、３時間振とう培養し、選択プレート（ＮｕｔｒｉｅｎｔＡｇａｒ培地（ＤＩＦＣＯ社製）、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌ）で、３０℃にて２日間培養して、形質転換体を取得した。【００３１】
（実施例４）  形質転換体の選択
実施例３で得られた形質転換体を、Ｎｉｌｅｒｅｄ含有培地（リン酸水素２ナトリウム・１２水塩  ９ｇ、リン酸２水素カリウム  １．５ｇ、塩化アンモニウム  ０．０５ｇ、硫酸マグネシウム・７水塩  ０．０２ｇ、フルクトース  ０．５ｇ、塩化コバルト・６水塩  ０．２５ｐｐｍ、塩化鉄（ＩＩＩ）・６水塩  １６ｐｐｍ、塩化カルシウム・２水塩  １０．３ｐｐｍ、塩化ニッケル・６水塩  ０．１２ｐｐｍ、硫酸銅・５水塩  ０．１６ｐｐｍ、Ｎｉｌｅｒｅｄ  ０．５ｍｇ、寒天  １５ｇ／１Ｌ）に播種し、３０℃で１週間培養した。その結果、コロニーが赤変したことから菌体内にポリエステルが蓄積していることを確認し、そのコロニーを選択してポリエステルの生産を行った。【００３２】
（実施例５）  ポリエステルの生産および精製
種母培地の組成は１ｗ／ｖ％  Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％  Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．２ｗ／ｖ％Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％ＫＨ２ＰＯ４、（ｐＨ６．８）とした。
前培養培地の組成は１．１ｗ／ｖ％  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％  ＫＨ２ＰＯ４、１．２９ｗ／ｖ％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．５ｗ／ｖ％パームＷオレイン油、０．５ｖ／ｖ％  微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％  ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの。）、５×１０−６ｗ／ｖ％  カナマイシンとした。
ポリエステル生産培地の組成は０．３８５ｗ／ｖ％  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．０６７ｗ／ｖ％  ＫＨ２ＰＯ４、０・２９１ｗ／ｖ％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｖ／ｖ％  微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％  ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの。）、０．０５ｗ／ｖ％ＢＩＯＳＰＵＲＥＸ２００Ｋ（消泡剤：コグニスジャパン製）、５×１０−６ｗ／ｖ％  カナマイシンとした。炭素源はパーム核油を分別した低融点画分であるパーム核油オレインを単一炭素源として用い、培養全般を通じ、比基質供給速度が０．０８〜０．１（油脂（ｇ））×（正味乾燥菌体重量（ｇ））−１×（ｈ）−１となるように流加した。
実施例４で得られた形質転換体のグリセロールストック（５０μｌ）を種母培地（１０ｍｌ）に接種して２４時間培養し、１．８Ｌの前培養培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ−３００型）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３０℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７〜６．８の間でコントロールしながら２８時間培養した。ｐＨコントロールには７％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。【００３３】
ポリエステル生産培養は６Ｌの生産培地を入れた１０Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ−１０００型）に前培養種母を５．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度２８℃、攪拌速度４００ｒｐｍ、通気量３．６Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７から６．８の間でコントロールした。ｐＨコントロールには７％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。培養は約６４時間行い、培養終了後、遠心分離によって菌体を回収、メタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した結果、１０９．２ｇ／Ｌであった。
得られた乾燥菌体約１ｇに１００ｍｌのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のポリエステルを抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が約３０ｍｌになるまで濃縮後、約９０ｍｌのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、１時間放置した。析出したポリエステルをろ別後、５０℃で３時間真空乾燥した。乾燥ポリエステルの重量を測定し、菌体内のポリエステル含量を算出した。その結果、形質転換体によるポリエステル含量は６４時間で６８．６（ｗｔ％）という高含量であった。【００３４】
（実施例６）  ポリエステルの３ＨＨ組成（ｍｏｌ％）分析
形質転換体により生産されたポリエステルの３ＨＨ組成分析は以下のようにガスクロマトグラフィーによって測定した。
乾燥ポリエステルの約２０ｍｇに２ｍｌの硫酸−メタノール混液（１５：８５）と２ｍｌのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱することでポリエステル分解物のメチルエステルを得た。冷却後、これに１．５ｇの炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えて中和し、炭酸ガスの発生がとまるまで放置した。４ｍｌのジイソプロピルエーテルを添加してよく混合した後、遠心して、上清中のポリエステル分解物のモノマーユニット組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析した。ガスクロマトグラフは島津製作所社製ＧＣ−１７Ａ、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＮＥＵＴＲＡ  ＢＯＮＤ−１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。キャリアガスとしてＨｅを用い、カラム入口圧１００ｋＰａとし、サンプルは１μｌを注入した。温度条件は、初発温度１００〜２００℃まで８℃／分の速度で昇温、さらに２００〜２９０℃まで３０℃／分の速度で昇温した。上記条件にて分析した結果、６４時間培養終了時のポリエステルの３ＨＨ組成は４．０（ｍｏｌ％）であった。【００３５】
（実施例７）  ポリエステルの重量平均分子量（Ｍｗ）分析
ポリエステルの重量平均分子量（Ｍｗ）分析はゲルパーミエーションクロマトグラフィー法により行った。抽出したポリエステル約５ｍｇを１０ｍｌのクロロホルムに溶解し、０．２μｍのフィルターで濾過して測定用サンプルとし、その０．０５ｍｌを用いて分析した。測定システムはＳＬＣ−１０Ａ（島津製作所製）、カラムはＳｈｏｄｅｘ  ＧＰＣ  Ｋ−８０６Ｌ（昭和電工製）を２本直列に接続し、４０℃で測定した。移動層は１．０ｍｌ／分のクロロホルムとし、ＲＩ検出器（ＲＩＤ−１０Ａ、島津製作所製）を用いた。標準品としては同様に処理したポリスチレン（昭和電工製、重量平均分子量：約７００万、約１０７万、１５万、３万）を用い、検量線によりポリエステルの重量平均分子量を算出した。その結果、形質転換体により生産されたポリエステルの重量平均分子量（Ｍｗ）は約５１０万と超高分子量であった。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明によれば、繊維等への加工特性に優れた超高分子量のＰＨＡを高生産できる組換え微生物株が提供され、高純度の超高分子量ＰＨＡが簡便かつ大量に、しかも安価に製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】実施例１で構築したｐＪＲＤｄＴｃベクターの作製工程を示した図である。
【図２】実施例２で構築した発現プラスミドｐＪＲＤｄＴｃＥｆａｂＧＬ１７１ＤＧの構成を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2006101176.tif 000006
2006101176.tif 000007
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