(57)【要約】  本発明は、肝臓における骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路のアンタゴニストを用いて、損傷、切除または移植後に肝修復を強化する方法に関する。
2012533545.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓の治療における使用のための、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路のアンタゴニスト。
【請求項２】
肝損傷または肝疾患の治療における使用のための、請求項１に記載のアンタゴニスト。
【請求項３】
前記治療が予防的治療である、請求項１または請求項２の中に記載された前記使用のためのアンタゴニスト。
【請求項４】
前記アンタゴニストが肝細胞の増殖を増大させる、請求項１〜３のいずれか一項に記載された前記使用のためのアンタゴニスト。
【請求項５】
前記アンタゴニストが、構成的に活性のあるＢＭＰシグナル伝達経路を阻害するかまたは下方調節する、請求項１〜４のいずれか一項に記載された前記使用のためのアンタゴニスト。
【請求項６】
前記ＢＭＰシグナル経路が、ＢＭＰ２またはＢＭＰ４介在性シグナル伝達経路である、請求項５に記載された前記使用のためのアンタゴニスト。
【請求項７】
前記ＢＭＰシグナル伝達経路の前記アンタゴニストがＩ型ＢＭＰ受容体シグナル伝達を阻害する、請求項５に記載された前記使用のためのアンタゴニスト。
【請求項８】
前記ＢＭＰシグナル伝達経路の前記アンタゴニストが、前記Ｉ型受容体に結合することによってＩ型ＢＭＰ受容体シグナル伝達を阻害する、請求項７に記載された前記使用のためのアンタゴニスト。
【請求項９】
前記Ｉ型ＢＭＰ受容体が、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３またはＡＬＫ６である、請求項７または８に記載された前記使用のためのアンタゴニスト。
【請求項１０】
前記Ｉ型ＢＭＰ受容体がＡＬＫ２またはＡＬＫ３である、請求項９に記載された前記使用のためのアンタゴニスト。
【請求項１１】
前記ＢＭＰシグナル伝達経路の前記アンタゴニストが、ｓｍａｄ−１、５または８のリン酸化を阻害する、請求項５に記載された前記使用のためのアンタゴニスト。
【請求項１２】
前記ＢＭＰシグナル伝達経路の前記アンタゴニストが、ＢＭＰ２もしくは４のＢＭＰ受容体への結合またはＩＩ型ＢＭＰ受容体とＩ型ＢＭＰ受容体との相互作用を阻害する、請求項５に記載された前記使用のためのアンタゴニスト。
【請求項１３】
前記アンタゴニストが化学薬品である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載された前記使用のためのアンタゴニスト。
【請求項１４】
前記化学薬品が、ドルソモルフィン、ＬＤＮ１９３１８９、または前述のもののいずれかの類似体である、請求項１３に記載された前記使用のためのアンタゴニスト。
【請求項１５】
肝再生における使用のための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載されたアンタゴニスト。
【請求項１６】
肝臓の部分的喪失または損傷の治療における使用のための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載されたアンタゴニスト。
【請求項１７】
前記喪失または損傷が外科手術または移植術によって引き起こされる、請求項１６に記載された前記使用のためのアンタゴニスト。
【請求項１８】
前記外科手術が肝切除である、請求項１７に記載された前記使用のためのアンタゴニスト。
【請求項１９】
前記喪失または損傷が肝不全である、請求項１７に記載された前記使用のためのアンタゴニスト。
【請求項２０】
前記治療が前記損傷に先行する、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載された前記使用のためのアンタゴニスト。
【請求項２１】
前記使用が哺乳動物の治療に関するものである、請求項１〜２０のいずれか一項に記載された前記使用のためのアンタゴニスト。
【請求項２２】
前記使用がヒトの治療に関するものである、請求項１〜２１のいずれか一項に記載された前記使用のためのアンタゴニスト。
【請求項２３】
前記使用が肝移植ドナーの治療に関するものである、請求項１〜２２のいずれか一項に記載された前記使用のための、アンタゴニスト。
【請求項２４】
前記使用が肝移植レシピエントの治療に関するものである、請求項１〜２２のいずれか一項に記載された前記使用のためのアンタゴニスト。
【請求項２５】
前記肝損傷が肝毒性のある化学薬品によって引き起こされる、請求項２、またはそれに従属する任意の請求項のいずれか一項に記載された前記使用のためのアンタゴニスト。
【請求項２６】
前記肝毒性のある化学薬品がアセトアミノフェンである、請求項２５に記載された前記使用のためのアンタゴニスト。
【請求項２７】
Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、他の肝炎ウイルス感染症、自己免疫性肝炎、肝硬変、胆汁性肝硬変、急性肝不全、慢性肝不全、急性肝不全、急性肝感染症、癌、ウィルソン病、ジルベール症候群、ライ症候群、アラジール症候群、ヘモクロマトーシス、フェニルケトン尿症および他のアミノ酸症、血友病および他の凝固因子欠乏症、家族性高コレステロール血症および他の脂質代謝障害、尿素サイクル異常症、果糖血症、糖原病、チロシン血症、ガラクトース血症、タンパク質および糖質の代謝欠乏症、有機酸尿、ミトコンドリア病、ペルオキシソームおよびリソソーム異常、タンパク質合成異常、肝細胞トランスポーター欠損、グリコシル化欠損、急性化学毒性、胆管炎、α１−アンチトリプシン欠乏症、胆道閉鎖症、肝嚢胞症、脂肪肝、ガラクトース血症、胆石、ポルフィリン症、原発性硬化性胆管炎、サルコイドーシス、チロシン血症、ならびに１型糖原病からなる群から選択される肝疾患によって引き起こされる肝損傷の治療における使用のための、請求項１〜２６のいずれか一項に記載されたアンタゴニスト。
【請求項２８】
ヒトまたは動物の体外で行なわれる方法であって、肝臓に、肝臓の一部に、または肝細胞にアンタゴニストを投与することを含み、前記アンタゴニストが、請求項１〜２７のいずれか一項に記載された前記アンタゴニストである、方法。
【請求項２９】
肝臓、肝臓の一部、または肝細胞を含む組成物であって、アンタゴニストをさらに含み、前記アンタゴニストが、請求項１〜２８のいずれか一項に記載された前記アンタゴニストであり、かつ前記肝臓、肝臓の一部、または肝細胞が、前記ヒトまたは動物の体内にない、組成物。
【請求項３０】
移植における使用のための、請求項２９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００９年７月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／２２５，３８８号明細書の恩典を主張する。上記の出願の教示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府支援
本発明は、全体または部分的に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ａｎｄ  Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（米国国立糖尿病・消化器・腎疾病研究所）からの助成金Ｋ０８により支援された。米国政府は、本発明における一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
再生医療の分野では、肝不全患者または肝損傷もしくは切除手術の後に肝臓量が不足している患者の生存率を改善する努力がなされている。これらの病状を有する患者を治療するときと同じくらい成否の境界がくっきりした臨床的状況はほとんどない。損傷後の肝臓の回復が成功すれば、通常、健康は完全に回復するが、回復が不成功に終われば、肝移植が必要になるかまたは死に至る。肝再生または肝修復の改善がごくわずかであっても、転帰を死から完全な健康の回復へと変化させるのに十分である可能性がある。
【０００４】
急性肝不全患者において、修復を強化する能力により、回復不可能な肝臓の状態を、罹患した肝臓が完全に健康に戻り得る状態に転換させることができた。この集団には、米国における年間２万（２０，０００）人のＴｙｌｅｎｏｌ（登録商標）（アセトアミノフェン）過剰摂取、急性ウイルス性肝炎もしくは他の感染原因、代謝異常、または毒性傷害を有する患者が含まれる（Ｈｏｏｆｎａｇｌｅら，１９９５）。これらの疾病に罹患している患者は、多くの場合、若くて、他の病状がほとんどなく、そのため、罹患した肝臓を回復または再生するように誘導することができれば、完全に回復する可能性が極めて高い。
【０００５】
肝臓の手術を受けた患者集団は、スモール・フォー・サイズ（ｓｍａｌｌ−ｆｏｒ−ｓｉｚｅ）症候群を経験することがある。これは、癌の切除後または臓器全体、分割した臓器、もしくは生きたドナーを用いる場合の移植後に起こる。これらの場合の多くでは、残存肝臓量は生命を維持するのに不十分である。このスモール・フォー・サイズ（ｓｍａｌｌ−ｆｏｒ−ｓｉｚｅ）症候群は、移植片機能不全として現われ、死に至る場合がある（ＴｕｃｋｅｒおよびＨｅａｔｏｎ，２００５）。
【０００６】
肝臓癌患者は、通常、切除後に結果として残る肝臓量の予測が難しいために、肝切除の候補とはならない。毎年、肝臓癌と診断される全世界の５０万（５００，０００）人を超える患者（Ｐａｒｋｉｎら，２００２）のうち、その約８０％は、診断時に切除不能であると判断される（Ｚｈｕら，２００６）。それにもかかわらず切除を行なえば、これらの患者は、高ビリルビン血症（すなわち、黄疸）、そして最終的には肝不全を発症する可能性が高い。癌患者の他の選択肢は非常に限られているので、肝再生または肝修復を強化または増大させる潜在的治療であれば、それ以外の場合には切除不能な肝臓癌を有するさらに多くの患者の肝切除の可能性を大いに高めるであろう。より多くのこれらの患者を切除可能にする薬理学的治療の開発は、肝臓癌の治療に大きな影響を与えるであろう。
【０００７】
生体肝移植時の１つの極めて重要な留意事項は、残ったドナーの肝臓のサイズおよびレシピエントに移植されている移植片のサイズである。成人から子供への肝臓提供において、ドナー手術は左葉一部切除術であり、これは、安全な手術であることが知られている。対照的に、成人間の生体肝移植時には、右葉または左葉全体の胚葉切除術を必然的に使用することにより、ドナーに大きな危険がもたらされる。というのは、残った肝臓では、生命を維持するのに不十分である可能性があるからである（Ｐｏｍｐｏｓｅｌｌｉら，２００６）。それゆえ、肝再生が強化されれば、より小さいサイズの移植片の使用を可能にすることで、成人間の生体肝移植に大変革をもたらすであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
肝不全の治療法としての肝移植の大きな成果および肝臓の恒常性に関与する分子経路の科学的知識にもかかわらず、肝修復および肝再生を強化するための薬理学的治療および方法は、開発の必要性が依然として大いにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、肝修復および肝再生の過程を支える生化学的事象を解明するものであり、かつ肝細胞増殖を強化し、肝再生を増大させ、肝損傷を予防および治療するための方法を様々な臨床背景の幅広い患者グループに提供するものである。
【００１０】
本発明は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路が肝細胞増殖の活性阻害因子であり、この経路のアンタゴニストで処理すると、肝損傷の後にインビボで肝細胞増殖が強化され、肝再生が増大するという発見に基づいている。
【００１１】
第１の態様では、本発明は、肝細胞を有効量の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路のアンタゴニストと接触させることによって肝細胞の増殖を増大させる方法を提供する。一実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路のアンタゴニストは、構成的に活性のあるＢＭＰシグナル伝達経路を阻害するかまたは下方調節する。例えば、ＢＭＰシグナル経路は、ＢＭＰ２またはＢＭＰ４介在性シグナル伝達経路である。また別の実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路のアンタゴニストは、Ｉ型ＢＭＰ受容体シグナル伝達を阻害する。一実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路のアンタゴニストは、Ｉ型受容体に結合することによってＩ型ＢＭＰ受容体シグナル伝達を阻害する。別の実施形態では、Ｉ型受容体には、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３またはＡＬＫ６が含まれる。別の実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路のアンタゴニストは、ＳＭＡＤ１、５または８のリン酸化を阻害する。一実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路のアンタゴニストは、ＢＭＰ受容体へのＢＭＰ２もしくは４の結合またはＩＩ型ＢＭＰ受容体とＩ型ＢＭＰ受容体との相互作用を阻害する。別の実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路のアンタゴニストは、化学薬品である。化学薬品は、ドルソモルフィン、ＬＤＮ１９３１８９またはこれらの類似体であることができる。
【００１２】
第２の態様では、本発明は、有効量の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路のアンタゴニストを対象に投与することによって、それを必要とする哺乳動物対象において肝臓の部分的喪失または損傷後に肝再生を増大させる方法に関する。一実施形態では、肝臓の部分的喪失または損傷は、外科手術または移植術（例えば、肝切除）によって引き起こされる。別の実施形態では、必要とする対象は、切除的肝臓外科手術後の肝不全に罹患している。一実施形態では、必要とする対象は、哺乳動物（例えば、ヒト）である。例えば、必要とする対象は、肝移植レシピエントまたは移植ドナーである。
【００１３】
また別の実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路のアンタゴニストは、構成的に活性のあるＢＭＰシグナル伝達経路を阻害するかまたは下方調節する。一実施形態では、ＢＭＰシグナル経路は、ＢＭＰ２またはＢＭＰ４介在性シグナル伝達経路である。一実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路のアンタゴニストは、Ｉ型ＢＭＰ受容体シグナル伝達を阻害する。一実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路のアンタゴニストは、Ｉ型ＢＭＰ受容体に結合することによってＩ型ＢＭＰ受容体シグナル伝達を阻害する。一実施形態では、Ｉ型ＢＭＰ受容体には、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３またはＡＬＫ６が含まれる。一実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路のアンタゴニストは、ＳＭＡＤ１、５または８のリン酸化を阻害する。また別の実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路のアンタゴニストは、ＢＭＰ受容体へのＢＭＰ２もしくは４の結合またはＩＩ型ＢＭＰ受容体とＩ型ＢＭＰ受容体との相互作用を阻害する。ＢＭＰシグナル伝達経路のアンタゴニストは、化学薬品である。化学薬品には、ドルソモルフィン、ＬＤＮ１９３１８９およびそれらの類似体が含まれ得るが、これらに限定されない。
【００１４】
別の態様では、本発明は、有効量の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路のアンタゴニストを投与することによって恩恵を受ける対象の肝損傷を予防または治療する方法を含む。ＢＭＰシグナル伝達経路のアンタゴニストは、上記のような構成的に活性のあるＢＭＰシグナル伝達経路を阻害するかまたは下方調節する。肝損傷は、肝毒性のある化学薬品によって引き起こされることがある。肝毒性のある化学薬品には、アセトアミノフェンが含まれ得る。一実施形態では、肝損傷は、例えば、肝炎ウイルス感染症、自己免疫性肝炎、肝硬変、急性もしくは慢性肝不全、または癌を含む肝疾患によって引き起こされる。
【００１５】
また別の態様では、本発明は、有効量の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）経路のアンタゴニストを対象に投与することによって、それを必要とする対象の肝再生を強化する方法を提供する。この経路において、アンタゴニストは、肝臓におけるＢＭＰ２またはＢＭＰ４介在性のＳＭＡＤ１、５または８のリン酸化を阻害する。一実施形態では、アンタゴニストは、肝臓の部分的喪失または障害の前に対象に投与される。
【００１６】
また別の態様では、本発明は、肝細胞を、肝細胞におけるＢＭＰ２またはＢＭＰ４介在性のＳＭＡＤ１、５または８のリン酸化を阻害する有効量のドルソモルフィンまたはＬＤＮ１９３１８９と接触させることによって、肝細胞の増殖を増大させる方法に関する。
【００１７】
過去において、肝臓がどのようにして損傷に応答するのかということの根幹を明らかにすることは困難であった。数多くの分子経路が肝臓の恒常性に関与しているが、特に、肝再生および肝修復を強化することによる、肝損傷を有するかまたは切除後の肝臓量が十分でない患者に対する有効な治療はない。本明細書に記載のシグナル伝達経路は、肝細胞増殖を構成的に阻害することによって肝臓増殖を負に制御することがその機能であるが、これは、肝臓がどのようにしてそのサイズを感知し、その増殖を調節するのかということに関する基本的な謎を解決するのに役立ち、潜在的な治療にまたとない機会を提供することができる。より重要なことに、そのようなシグナル伝達経路は、潜在的薬剤の有用な標的としての役割を果たし、肝損傷を有するかまたは切除後の肝臓量が十分でない患者に対する有効な治療の開発の成功をもたらすことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】３分の２（「２／３」）肝切除後にリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）で定量したときの、マウスにおける骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）の発現レベルを示す。対照（すなわち、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ））と比較したときのＢＭＰ４の相対発現レベルを示す（１２〜２４時間の時点について、ｐ＜０．０５）。
【図２】対照（ＧＡＰＤＨ）と比較したときの、マウスにおける０時間および３６時間の時点でのＢＭＰ４のＲＴ−ＰＣＲ産物の相対量を示す。
【図３】ＡＬＫ３タンパク質に対するモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学で示したときの、ＡＬＫ３タンパク質（ＢＭＰ２およびＢＭＰ４リガンドのＩ型ＢＭＰ受容体）のマウス肝臓における発現パターンを示す（ＰＶ：門脈、ＨＮ：肝細胞核）。
【図４】野生型の肝臓におけるＢＭＰ４タンパク質発現と比較したときの、Ｃｒｅリコンビナーゼに曝露されたｆｌｏｘ化ＢＭＰ４トランスジェニックマウス（すなわち、「ＢＭＰ４ヌル」）の肝臓におけるＢＭＰ４タンパク質発現のウェスタンブロット解析を示す。
【図５】ＢＭＰ４ヌルマウスおよび野生型同腹子の２／３肝切除後のＫｉ６７増殖指数を示す（ｐ＜０．０５）。
【図６】ドルソモルフィン（１０ｍｇ／ｋｇ）または対照としての食塩水で処理した８週齢のマウスの２／３肝切除後のＢｒｄＵ増殖指数を示す。
【図７】残存肝臓を、肝切除の３６時間後および４８時間後に測定したときの全体重のパーセンテージとして示す。
【図８】ドルソモルフィンの類似体の模式図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路は、哺乳動物の肝臓において構成的に活性があること、そして、ＢＭＰシグナル伝達経路に活性があるとき、この経路は、肝臓における肝細胞増殖を抑制するかまたは阻害するように働くことが今までに発見されている。ＢＭＰシグナル伝達経路のアンタゴニスト（例えば、ＢＭＰシグナル伝達の薬物阻害剤）の投与によって、肝細胞増殖が強化され、肝損傷後の肝修復および肝再生が増大することが見出されている。
【００２０】
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、軟骨および骨の形成をインビボで誘導するその能力によってもともと同定され、特徴付けられたタンパク質のファミリーである（Ｒｅｄｄｉ，Ａ．Ｈ．（１９９２）  Ｃｕｒｒ，Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４，８５０−８５５）。２０を超えるＢＭＰがこれまでに同定され、２つの異なるセリン−トレオニンキナーゼ受容体、すなわち、Ｉ型およびＩＩ型ＢＭＰ受容体によって認識されることが報告されている。少なくとも３つの異なるＩ型セリン−トレオニンキナーゼ受容体および少なくとも３つの異なるＩＩ型セリン−トレオニンキナーゼ受容体が同定されている。これら３つの同定されたＩ型ＢＭＰ受容体は、アクチビン受容体様キナーゼ−２（ＡＬＫ２）（別名、アクチビン受容体−Ｉ）、ＡＬＫ３（別名、ＢＭＰＲ−ＩＡ）、およびＡＬＫ６（別名、ＢＭＰＲ−ＩＢ）であり、他の３つの同定されたＩＩ型ＢＭＰ受容体には、ＢＭＰＲＩＩ、ＡｃｔＲＩＩａおよびＡｃｔＲＩＩｂが含まれる。
【００２１】
Ｉ型ＢＭＰ受容体とＩＩ型ＢＭＰ受容体は両方とも、その形質膜表面に受容体を発現する標的細胞の細胞質に細胞外ＢＭＰシグナルを伝達することができる。二量体ＢＭＰリガンドは、Ｉ型受容体とＩＩ型受容体の会合を容易にして、ヘテロ二量体を形成させることが知られており、この受容体の二量体化によって、ＩＩ型受容体によるＩ型受容体のリン酸化が可能になる。リン酸化されているとき、Ｉ型ＢＭＰ受容体は、ＢＭＰ応答性ＳＭＡＤエフェクター（例えば、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５およびＳＭＡＤ８）をリン酸化することが示されている。次いで、これらのエフェクターのリン酸化は、ＳＭＡＤ４との複合体を形成したエフェクターの核への移動をもたらす。標的細胞の核内では、リン酸化されたＳＭＡＤが、ＢＭＰシグナルに応答する一連の遺伝子の発現を上方調節する。この遺伝子には、Ｉｄ−１が含まれるが、これに限定されない。ＢＭＰは、ＩＩ型ＢＭＰ受容体を介するＳＭＡＤ非依存的シグナル伝達を誘発することもできる。ＩＩ型ＢＭＰ受容体は、ＢＭＰと結合すると、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）ｐ３８介在性の応答を独立に活性化することができる。
【００２２】
全てのＢＭＰは、特徴的な７つの高度に保存されたシステインをそのカルボキシル末端部分に含み、したがって、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリー（例えば、ＴＧＦ−β、アクチビン、インヒビン、およびミュラー管阻害物質）に属する（Ｍａｓｓａｇｕｅ，Ｊ．（１９９０）  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６，５９７−６４１）。ＢＭＰの中では、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６およびＢＭＰ７が研究の中心である。これらのＢＭＰのいくつかの代表的なメンバーがある。ＢＭＰ２およびＢＭＰ４は、約９０％のアミノ酸同一性を有することにより、互いに密接に関連している。しかしながら、それらの配列は、ＢＭＰ３、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６およびＢＭＰ７の配列とは異なっている。第２のグループ（ＢＭＰ５、ＢＭＰ６およびＢＭＰ７）は、互いに約８０％のアミノ酸同一性を示し、ＢＭＰ３およびその他のものは、このタンパク質ファミリーの第３のグループとなる。
【００２３】
ＢＭＰは、Ｉ型ＢＭＰ受容体とＩＩ型ＢＭＰ受容体の両方に結合することが知られている。例えば、ＢＭＰ２は、Ｉ型ＢＭＰ受容体とＩＩ型ＢＭＰ受容体の両方に対して高い特異性を示す（Ｋｅｌｌｅｒ，Ｓら（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１１：４８１−４８８）。それにもかかわらず、ＩＩ型受容体の利用は、ＢＭＰ２または４とＢＭＰ６または７との間で顕著に異なっている。ＢＭＰＲＩＩへのより大きな依存が、ＢＭＰ６または７と比べてＢＭＰ２または４で認められるのに対し、ＡｃｔＲＩＩａは、ＢＭＰ２または４よりもＢＭＰ６または７によるシグナル伝達にとって重要である（Ｌａｖｅｒｙ，Ｋら（２００８）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：２０９４８−２０９５８）。顕著な違いは、Ｉ型受容体についても認められる。ＡＬＫ３およびＡＬＫ６は、ＢＭＰ２およびＢＭＰ４によってより多く利用されるのに対し、ＡＬＫ２は、ＢＭＰ６またはＢＭＰ７の好ましいＩ型受容体である（Ｌａｖｅｒｙ，Ｋら（２００８）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：２０９４８−２０９５８；Ｒｏら（２００４）  Ｏｎｃｏｇｅｎ，２３：３０２４−３０３２）。
【００２４】
本発明は、ＢＭＰシグナル伝達経路のアンタゴニストを用いてＢＭＰシグナル伝達を阻害することによって肝細胞の増殖を強化する方法に関する。本発明は、ＢＭＰシグナル伝達経路のアンタゴニストを用いてＢＭＰシグナル伝達を阻害することによって哺乳動物の肝再生を強化する方法に関する。本発明は、ＢＭＰシグナル伝達経路のアンタゴニストを用いてＢＭＰシグナル伝達を阻害することによって肝修復を強化する方法を含む。本発明は、肝臓において有効量の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路のアンタゴニストを投与することによって、それを必要とする対象における肝損傷を予防および治療する方法に関する。
【００２５】
本明細書で使用するとき、「肝損傷」には、肝切除、肝臓の切除、肝移植、または肝臓の一部の外科的除去によって生じる他の物理的外傷もしくは状態が含まれるが、これらに限定されない。急性肝不全に関する肝損傷は、肝細胞癌、肝移植、または肝臓の一部の外科的除去によって生じる他の急性の物理的外傷もしくは状態によって引き起こされることがある。本明細書で使用される「肝損傷」には、肝組織の損傷もしくは障害、またはアポトーシス、壊死もしくは肝毒性のある薬剤もしくは化合物によって引き起こされる他の物理的状態による肝細胞もしくは肝組織の喪失が含まれるが、これらに限定されない。急性肝不全に関する肝損傷は、１種以上の医薬品（例えば、アセトアミノフェン／パラセタモール）の過剰摂取または毒性量の１種以上の肝毒性のある化学薬品の摂取に起因することもある。あるいは、本明細書で使用される「肝損傷」には、組織の損傷もしくは障害、またはアポトーシス、壊死もしくは限定するものではないが、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、他の肝炎ウイルス感染症、自己免疫性肝炎、肝硬変、胆汁性肝硬変、急性肝不全、急性肝毒性、慢性肝不全、急性肝感染症、肝臓癌、ウィルソン病、ジルベール症候群、ライ症候群、アラジール症候群、ヘモクロマトーシス、フェニルケトン尿症および他のアミノ酸症、血友病および他の凝固因子欠乏症、家族性高コレステロール血症および他の脂質代謝障害、尿素サイクル異常症、果糖血症、糖原病、チロシン血症、ガラクトース血症、タンパク質および糖質の代謝欠乏症、有機酸尿、ミトコンドリア病、ペルオキシソームおよびリソソーム異常症、タンパク質合成異常、肝細胞トランスポーター欠損、グリコシル化欠損、急性化学毒性、胆管炎、α１−アンチトリプシン欠乏症、胆道閉鎖症、肝嚢胞症、脂肪肝、ガラクトース血症、胆石、ポルフィリン症、原発性硬化性胆管炎、サルコイドーシス、チロシン血症、または１型糖原病を含む肝疾患によって引き起こされる他の物理的状態による肝細胞もしくは肝組織の喪失も含まれるが、これらに限定されない。
【００２６】
本明細書で使用するとき、「対象」という用語は、哺乳動物を指し、これには、ヒト、霊長類、家畜動物、または実験動物が含まれるが、これらに限定されない。「対象」は、好ましくはヒトであるが、ＢＭＰシグナル伝達のアンタゴニストによる治療を必要とする動物、例えば、コンパニオン動物（例えば、イヌ、ネコなど）、農場動物（例えば、ウシ、ブタ、ウマなど）および実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモットなど）であることもできる。
【００２７】
本明細書で使用するとき、「治療する」および「予防する」という用語は、肝損傷のありとあらゆる状態、作用または原因、および肝損傷に関連する症状または疾患を予防するか、阻止するか、抑制するか、阻害するか、低下させるか、軽減するか、改善するかもしくは逆転させること；状態、症状または作用の消失とその再発の間の時間を延長すること；肝損傷と関連する有害な症状を安定化すること；または肝損傷と関連する状態の進行を低下させるか、遅延させるか、もしくは安定化することを指す。
【００２８】
本明細書で使用するとき、「移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」という用語は、他人もしくは対象自身の肝臓から採取されたかまたは他人もしくは対象自身の肝臓に由来する１つ以上の部分肝組織または肝細胞の移植（ｇｒａｆｔｉｎｇ）を指す。
【００２９】
本明細書で使用するとき、「切除（ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ）」という用語は、臓器または他の構造の一部または全ての切除（ｅｘｃｉｓｉｏｎ）を指す。例えば、肝切除は、肝臓の一部の外科的除去を指し、通常、切除される肝臓の部分にある罹患した肝臓の部分（例えば、肝臓癌）を除去するために行なわれる。
【００３０】
本明細書で使用するとき、「アンタゴニスト」という用語は、ＢＭＰシグナル伝達経路の生理的作用に拮抗する化学薬品、医薬品、薬物、化学化合物、小分子、タンパク質、ペプチドまたは抗体を指す。例えば、化学薬品は、１つ以上のＢＭＰ受容体への１つ以上のＢＭＰの結合によって通常誘発される１つ以上のＢＭＰ受容体関連応答に拮抗することができる。
【００３１】
本明細書で使用するとき、「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、これには、天然または合成のアミノ酸ならびにコードされたおよびコードされていないアミノ酸、ペプチド、デプシペプチド、環式、二環式、デプシ環式またはデプシ二環式ペプチド骨格を有するポリペプチド、単鎖タンパク質ならびに多量体、ならびに無傷タンパク質分子の任意の断片または部分が含まれ得る。
【００３２】
本明細書で使用するとき、「ペプチド」とは、互いに化学結合したアミノ酸、アミノ酸類似体から構成される任意の分子を意味する。一般に、アミノ酸は、アミノ結合（ＣＯＮＨ）で化学結合しているが、アミノ酸は、当技術分野で公知の他の化学結合で結合していてもよい。例えば、アミノ酸は、アミン結合で結合していてもよい。本明細書で使用されるペプチドには、アミノ酸、アミノ酸類似体、または小ペプチドおよび巨大ペプチドのオリゴマー（ポリペプチドを含む）が含まれる。
【００３３】
本明細書で使用するとき、「抗体」という用語は、免疫グロブリンまたはその断片もしくは誘導体を指し、インビトロで産生されたものであるか、またはインビボで産生されたものであるかを問わず、抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを含む。この用語には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単特異的抗体、ポリ特異的抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、突然変異抗体、および移植抗体が含まれる。「抗体」という用語には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂなどの抗体断片、および抗原結合機能（すなわち、特異的抗原に結合する能力）を保持する他の抗体断片も含まれる。通常、そのような断片は、抗原結合ドメイン（すなわち、抗体と抗原の特異的結合に関与するアミノ酸を含む抗体分子の部分）を含む。抗原結合ドメインは、通常、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含むが、必ずしも両方を含む必要はない。
【００３４】
本明細書で使用するとき、「類似体」という用語は、その構造が、対応するアンタゴニストの構造と関連しているが、同一ではない分子である。類似体は、対応するアンタゴニストと同様のまたは類似した化学的および生物学的特性を有する。例えば、化学的類似体は、対応するアンタゴニストの化学的活性を保持すると同時に、１つ以上の化学的修飾を有する。ポリペプチド類似体は、対応するポリペプチドアンタゴニストの生物学的活性を保持すると同時に、ポリペプチドアンタゴニストからの特定の生化学的修飾を有する。そのような修飾は、例えば、ＢＭＰシグナル伝達経路に関与する１つ以上の生体分子に対する結合特異性を変化させることなく、例えば、類似体の安定性または半減期を増大させ得る。類似体は、合成化学薬品またはポリペプチドを含むことができる。
【００３５】
本明細書で使用するとき、「有効量」は、肝損傷の経過および重症度に影響を及ぼし、肝損傷の予防、低下、阻害、軽減または寛解をもたらすのに十分なＢＭＰシグナル伝達の活性アンタゴニストの量を指す。例えば、ＢＭＰアンタゴニストの有効量は、肝細胞におけるＢＭＰシグナル伝達を阻害し、肝損傷の予防、低下、阻害、軽減または寛解をもたらすのに十分な量である。当業者には明らかであるように、必要とする所与の対象にとっての有効量は、サイズ、年齢、体重、状態および治療に対する対象の応答性によって異なり得る。有効量は、投与の経路および必要とする対象の状態によっても決まる。
【００３６】
本明細書で使用するとき、「用量」という用語は、一度に投与される分量、例えば、ＢＭＰシグナル伝達のアンタゴニストの一定かつ有効な量を指す。
【００３７】
本明細書で使用するとき、「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」または「調節する（ｒｅｇｕｌａｔｅ）」という用語は、変化（例えば、減少または増加）を指す。例えば、変化は、生物学的活性を指すこともある。望ましくは、変化は、参照または対照活性（例えば、１つ以上のＳＭＡＤ、１つ以上のＢＭＰ、または１つ以上のＢＭＰ受容体の生物学的活性）と比べた、生物学的活性の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の増加または減少のいずれかである。
【００３８】
本発明によれば、ＢＭＰシグナル伝達のアンタゴニストの投与は、１つ以上のＢＭＰ受容体を阻害することによって、肝細胞増殖を強化することができる。ＢＭＰ受容体の阻害は、１つ以上のＩ型ＢＭＰ受容体または１つ以上のＩＩ型ＢＭＰ受容体に結合することによって達成することができる。ＢＭＰ受容体の阻害は、１つ以上のＩ型ＢＭＰ受容体または１つ以上のＩＩ型ＢＭＰ受容体に同時に結合することによって達成することができる。本発明のアンタゴニストは、限定するものではないが、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３およびＡＬＫ６を含むＩ型ＢＭＰ受容体を特異的に阻害することができる。Ｉ型ＢＭＰ受容体には、アクチビン受容体様キナーゼ−２（ＡＬＫ２）（別名、アクチビン受容体−Ｉ）、ＡＬＫ３（別名、ＢＭＰＲ−ＩＡ）、およびＡＬＫ６（別名、ＢＭＰＲ−ＩＢ）が含まれるが、これらに限定されない。ＩＩ型ＢＭＰ受容体には、ＢＭＰＲＩＩ、ＡｃｔＲＩＩａおよびＡｃｔＲＩＩｂが含まれるが、これらに限定されない。Ｉ型ＢＭＰ受容体とＩＩ型ＢＭＰ受容体は両方とも、細胞外ＢＭＰシグナルを標的細胞の細胞質に伝達する。ＢＭＰリガンドは、Ｉ型受容体とＩＩ型受容体の会合を容易にして、ヘテロ二量体を形成させることができ、しかも、受容体のヘテロ二量体化によって、ＩＩ型受容体によるＩ型受容体のリン酸化が可能になる。活性化（「リン酸化」）されているとき、Ｉ型ＢＭＰ受容体は、ＢＭＰ応答性のＳＭＡＤエフェクター（例えば、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５およびＳＭＡＤ８）をリン酸化する。しかしながら、Ｉ型ＢＭＰ受容体がリン酸化されていないとき、ＩＩ型ＢＭＰ受容体へのＢＭＰの特異的結合は、限定するものではないが、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）ｐ３８を含む細胞内エフェクターを活性化することによって、ＳＭＡＤ非依存的シグナル伝達を誘発する。
【００３９】
ＢＭＰ経路のアンタゴニストは、１つ以上のＢＭＰ、特に、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６およびＢＭＰ７に直接結合することによって、ＢＭＰシグナル伝達を阻害することができる。ＢＭＰ経路のアンタゴニストは、ＢＭＰ２またはＢＭＰ４に直接結合することによって、ＢＭＰシグナル伝達を阻害することができる。ＢＭＰシグナル伝達経路のアンタゴニストは、ＢＭＰ２または４とＢＭＰ受容体との相互作用を阻害することによって、ＢＭＰシグナル伝達を阻害することができる。
【００４０】
二量体ＢＭＰリガンドは、Ｉ型ＢＭＰ受容体とＩＩ型ＢＭＰ受容体の会合を容易にして、ヘテロ二量体を形成させることができ、しかも、受容体のヘテロ二量体化によって、ＩＩ型受容体によるＩ型受容体のリン酸化が可能になるので、ＢＭＰシグナル伝達のアンタゴニストは、１つ以上のＢＭＰとＩ型またはＩＩ型受容体との結合相互作用を妨げることによって、ＩＩ型ＢＭＰ受容体とＩ型ＢＭＰ受容体との相互作用を阻害することができる。ＢＭＰシグナル伝達のアンタゴニストは、ＩＩ型受容体によるＩ型のリン酸化を妨げることによって、ＩＩ型ＢＭＰ受容体とＩ型ＢＭＰ受容体との相互作用を阻害することもできる。
【００４１】
ＢＭＰシグナル伝達のアンタゴニストは、ＢＭＰ２もしくはＢＭＰ４のいずれかに特異的に結合することによるか、またはＢＭＰ２もしくはＢＭＰ４特異的ＢＭＰ受容体に結合することによって、ＢＭＰ２またはＢＭＰ４介在性シグナル伝達経路を阻害することができる。ＢＭＰシグナル伝達経路のアンタゴニストは、１つ以上のＢＭＰの活性を阻害する。好ましくは、ＢＭＰシグナル伝達のアンタゴニストは、１つ以上のＢＭＰに直接結合することによって、１つ以上のＢＭＰの活性を阻害する。
【００４２】
本発明は、１つ以上のＩ型受容体を阻害する薬剤の使用方法を含む。ＢＭＰシグナル伝達のアンタゴニストは、Ｉ型ＢＭＰ受容体による１つ以上のＳＭＡＤのリン酸化を阻害することによって、ＢＭＰシグナル伝達を阻害することができる。Ｉ型受容体は、限定するものではないが、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ８またはＳＭＡＤ９を含む１つ以上の受容体調節型ＳＭＡＤ（Ｒ−ＳＭＡＤ）をリン酸化する。好ましくは、本発明のアンタゴニストは、限定するものではないが、ＳＭＡＤ１、５または８を含む１つ以上のＳＭＡＤのリン酸化を阻害する。
【００４３】
ＢＭＰシグナル伝達のアンタゴニストは、医薬品、化学薬品、タンパク質、ペプチドまたは抗体であることができる。好ましくは、ＢＭＰシグナル伝達のアンタゴニストは、１つ以上のＢＭＰ受容体に直接結合する化学薬品である。好適なアンタゴニストの例は、国際公開第２００８／０３３４０８号パンフレットに記載されており、この文献の教示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明で使用される化学薬品には、ドルソモルフィン、ＬＤＮ１９３１８９またはこれらの類似体もしくは誘導体が含まれるが、これらに限定されない。国際公開第２００８／０３３４０８号パンフレットに教示された方法によって同定され、かつＢＭＰシグナル伝達経路を阻害するその能力について評価された任意のＢＭＰ特異的阻害剤化合物または化学薬品が本発明で想定されている。国際公開第２００８／０３３４０８号パンフレットの教示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４４】
ドルソモルフィンは、ＡＭＰキナーゼシグナル伝達経路の阻害因子である（Ｚｈｏｕら（２００１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０８：１１６７−１１７４）。ドルソモルフィンは、ゼブラフィッシュ胚においてＢＭＰシグナル伝達に拮抗し、ゼブラフィッシュ胚における背側化を効果的に促進することも示されている（国際公開第２００８／０３３４０８号パンフレット）。ゼブラフィッシュにおいて、ドルソモルフィンは、ＢＭＰ４またはＢＭＰ６によってインビトロで誘導される骨形成分化を阻害し、阻害は、ＢＭＰシグナル伝達の天然阻害因子ｎｏｇｇｉｎによる処理で見られるものよりも強力であることが示されている（国際公開第２００８／０３３４０８号パンフレット）。ドルソモルフィンは、Ｉ型ＢＭＰ受容体、すなわち、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、およびＡＬＫ６を選択的に阻害することによって、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７およびＢＭＰ９の活性を阻害し（国際公開第２００８／０３３４０８号パンフレット）、ＭＡＰＫ  ｐ３８の活性化に影響を及ぼすことなく、ＢＭＰ介在性のＳＭＡＤ１、５および８のリン酸化を遮断することが記載されている（Ｙｕら（２００７）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４：３３−４１）。ドルソモルフィンは、下記の構造式Ｉに示すような化学構造を含む。
【化１】
2012533545.tif 000003
【００４５】
ドルソモルフィン（６−［４−（２−ピペリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル）］−３−ピリンジン−４−イル−ピラゾロ［１，５−ａ］−ピリミジン）の生物学的機能および構造は、Ｚｈｏｕら（Ｚｈｏｕら（２００１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０８：１１６７−１１７４）およびＹｕら（Ｙｕら（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４：３３−４１）によって詳細に記載されており、これらの文献の教示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４６】
ＬＤＮ１９３１８９は、ペンダントフェニル環の３位または４位にアミンを含む、ピラゾロ［１，５−ａ］−ピリミジンの誘導体である。医薬品として許容されるいくつかのドルソモルフィン類似体を図８に示す。これは、国際公開第２００８／０３３４０８号パンフレットにも記載されており、この文献の教示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。ＬＤＮ１９３１８９およびその類似体を合成する方法は、その分子構造を含めて、Ｃｕｎｙら（Ｃｕｎｙら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１８：４３８８−４３９２（２００８））によって詳細に記載されており、この文献の教示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。当業者が当技術分野で公知の方法を用いてこれらの類似体を容易に調製することができることも理解される。
【００４７】
ＢＭＰシグナル伝達を調節する化学薬品（例えば、ドルソモルフィンまたはＬＤＮ１９３１８９の潜在的類似体および他の潜在的アンタゴニスト候補）の肝再生に対する生物学的影響は、ＳＭＡＤ１、５または８のリン酸化に対する薬品の効果を決定することによって評価することができる。ＢＭＰ介在性のＳＭＡＤリン酸化は、例えば、抗ホスホＳＭＡＤ１、５または８（ＣＥＬＬ  ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ（登録商標））を用いるイムノブロット解析によって決定することができる。あるいは、ＢＭＰ介在性のＳＭＡＤリン酸化は、透過処理した肝細胞を用いる免疫沈降および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定することができる。肝細胞タンパク質を、例えば、氷冷メタノールを１０〜１５分間用いるメタノール処理によって沈殿させる。肝細胞タンパク質を、例えば、０．２５％〜２％のグルタルアルデヒドを導入し、それをアミン（例えば、リジン、エチレンジアミンまたはフィニレンジアミン）でクエンチすることによって、グルタルアルデヒドで架橋する。リン酸化アッセイの詳細なプロトコルは、国際公開第２００８／０３３４０８号パンフレットに記載されており、この文献の教示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で使用するとき、増大したＳＭＡＤのリン酸化が検出されることは、薬品がＢＭＰシグナル伝達を活性化することを示すのに対し、減少したＳＭＡＤのリン酸化が検出されることは、薬品がＢＭＰシグナル伝達を阻害することを示す。
【００４８】
あるいは、ＢＭＰシグナル伝達を調節する化学薬品の肝再生に対する潜在的な影響は、本明細書に記載したような５−ブロモ−２−デオキシ−ウリジン（ＢｒｄＵ）標識またはＫｉ−６７標識を用いて肝細胞増殖を測定することによって決定することができる。
【００４９】
ＢＭＰシグナル伝達のアンタゴニストは、医薬品として許容される塩の形態で存在することができる。医薬品として許容される塩形態には、医薬品として許容される酸性／アニオン性または塩基性／カチオン性塩が含まれる。医薬品として許容される酸性／アニオン性塩には、酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重酒石酸塩、臭化物塩、エデト酸カルシウム、カンシラート、炭酸塩、塩化物塩、クエン酸塩、二塩酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストラート、エシラート、フマル酸塩、グリセプタート、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニラート、ヘキシルレゾルシン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエート、ヨウ化物塩、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メチル硫酸塩、ムカート、ナプシラート、硝酸塩、パモ酸塩、パントテン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクラート、トシル酸塩、およびトリエチオジド塩が含まれる。医薬品として許容される塩基性／カチオン性塩には、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン塩、Ｌ−リジン塩、Ｌ−アルギニン塩、アンモニウム塩、エタノールアミン塩、ピペラジン塩およびトリエタノールアミン塩が含まれる。
【００５０】
ＢＭＰアンタゴニストは、肝損傷の前、肝損傷の間または肝損傷の後いつでも、必要とする対象に投与される。ＢＭＰアンタゴニストは、肝損傷の前に投与される。ＢＭＰアンタゴニストは、肝損傷の進行中いつでも投与される。ＢＭＰアンタゴニストは、肝損傷の後に投与される。ＢＭＰアンタゴニストは、いくつかの間隔で、複数回投与で投与される。ＢＭＰアンタゴニストは、肝損傷の発症前１、２、３、４、５、６、１２、２４および／または４８時間の時点で投与することができる。ＢＭＰアンタゴニストは、肝損傷の発症前１、２、３、４、５、６、１２、２４および／もしくは４８時間の時点でならびに／または肝損傷の発症前１、２、３、４、５、６、１２、２４および／もしくは４８時間以内に投与することができる。ＢＭＰアンタゴニストは、肝損傷後２４、３６、４８、６０、７２、もしくは９６時間の時点でおよび／または肝損傷後２４、３６、４８、６０、７２、もしくは９６時間以内に投与することができる。ＢＭＰアンタゴニストは、肝損傷の発症後３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０日の時点でおよび／または肝損傷の発症後３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０日以内に投与することができる。あるいは、ＢＭＰアンタゴニストは、肝損傷後０〜４８時間、１〜３日、２〜４日、３〜７日、５〜８日または７〜１０日の間に投与することができる。ＢＭＰアンタゴニストは、これらの期間内に１回、またはあるいは、これらの期間内に、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、もしくはさらに多くの回数、投与することができる。一実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達のアンタゴニストによる治療は、これらの期間の後に終了する；あるいは、治療は、この期間が終了した後、例えば、肝損傷の発症後、最大１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月または６カ月まで継続することができる。
【００５１】
ＢＭＰシグナル伝達のアンタゴニストは、任意の好適な経路で必要とする対象に有効量で投与することができる。例えば、有効量のＢＭＰシグナル伝達のアンタゴニストは、静脈内投与することができる。有効量のＢＭＰシグナル伝達のアンタゴニストは、経口投与することができる。ＢＭＰシグナル伝達のアンタゴニストは、例えば、肝臓カテーテル法による、肝臓への局所導入によって投与することができる。ＢＭＰシグナル伝達のアンタゴニストは、門脈または他の門脈の支流（例えば、脾静脈、上腸間膜静脈、および幽門静脈）への注入によって局所投与することができる。あるいは、ＢＭＰシグナル伝達のアンタゴニストは、注射によって肝組織に局所投与することができる。「注射によって肝組織に局所投与される」とは、肝臓の内面または外面に送達されることを意味する。局所投与または局所注射では、ＢＭＰアンタゴニストの送達点は、ＢＭＰアンタゴニストが拡散して、肝臓でＢＭＰシグナル伝達経路が活性化された少なくとも１つ以上の肝細胞と接触することができるよう、肝臓の十分近くにすることができる。ＢＭＰアンタゴニストは、分散し、肝臓で増殖することができる肝細胞の少なくとも大部分（５０％以上）と接触することができることが好ましい。ＢＭＰアンタゴニストは、徐放性処方物に含めて対象に投与することができ、またはポンプもしくは埋込み可能な装置によるか、もしくは担体（例えば、以下で論じるようなポリマー）によって送達することができる。
【００５２】
ＢＭＰシグナル伝達のアンタゴニストは、医薬品組成物の一部として許容される医薬品担体とともに対象に投与することができる。医薬品組成物の処方は、選択される投与の様式によって異なる。好適な医薬品担体は、ＢＭＰアンタゴニストと相互作用しない不活性成分を含み得る。担体は、生体適合性であり、すなわち、非毒性、非炎症性、非免疫原性であり、かつ投与部位での他の望ましくない反応がないものであるべきである。医薬品として許容される担体の例には、例えば、食塩水、市販の不活性ゲル、またはアルブミン、メチルセルロースもしくはコラーゲンマトリックスが補充された液体が含まれる。さらなる例には、滅菌水、生理食塩水、静菌性食塩水（約０．９％ｍｇ／ｍｌのベンジルアルコールを含む食塩水）、リン酸緩衝食塩水、ハンクス溶液、乳酸リンゲルなどが含まれる。標準的な医薬品処方技術（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．ＸＶＩＩＩ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９０））に記載されているような技術）を利用することができる。
【００５３】
ＢＭＰシグナル伝達のアンタゴニストは、徐放性処方物に含めて投与することができる。ポリマーは、多くの場合、徐放性処方物を形成するために用いられる。これらのポリマーの例には、ポリα−ヒドロキシエステル（例えば、ポリ乳酸／ポリグリコール酸ホモポリマーおよびコポリマー、ポリホスファゼン（ＰＰＨＯＳ）、ポリ無水物およびポリ（プロピレンフマラート）が含まれる。ポリ乳酸／ポリグリコール酸（ＰＬＧＡ）のホモポリマーおよびコポリマーは、徐放性媒体として当技術分野で周知である。放出の速度は、当業者がポリ乳酸対ポリグリコール酸比およびポリマーの分子量を変えることによって調整することができる（Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９９７）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２８：５を参照されたく、この文献の教示全体は、参照により本明細書に組み込まれる）。ポリエチレングリコールを混合物としてポリマーに組み入れて微粒子担体を形成させることにより、活性成分の放出プロファイルをさらに変化させることができる（Ｃｌｅｅｋら，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ４８：２５９（１９９７）を参照されたく、この文献の教示全体は、参照により本明細書に組み込まれる）。セラミック（例えば、リン酸カルシウムおよびハイドロキシアパタイト）を処方物に組み入れて、機械的品質を改善することもできる。
【００５４】
本発明は、以下の実施例により説明されるが、いかなる点においても限定されることを意図しない。
【実施例】
【００５５】
実施例１
Ｉ．実験手順
本発明は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路が肝細胞増殖の活性阻害因子であり、この経路のアンタゴニストで処理すると、肝損傷の後にインビボで肝細胞増殖が強化され、肝再生が増大するという発見に基づいている。
【００５６】
Ａ．部分肝切除の実験手順
動物を用いて、損傷後の肝臓量の回復におけるＢＭＰシグナル伝達の様々なメンバーの役割を調べた。マウスに、３分の２（「２／３」）または大規模８０パーセント（８０％）肝切除を施した。少なくとも８週齢の成体マウスに対して手術を行なった。手術のために、腹腔内に注射されるケタミン１００ｍｇ／ｋｇおよびキシラジン１０ｍｇ／ｋｇを用いて、マウスに麻酔をかけた。対象が意識を失わない場合、追加のケタミン２５ｍｇ／ｋｇおよびキシラジン２．５ｍｇ／ｋｇを同様のやり方で注射した。対象が意識を失うまでこれを繰り返した。クリッパーを用いて手術部位を除毛し、無菌的技術およびベタジン（ｂｅｔａｄｙｎｅ）を用いて皮膚を消毒した。消毒した部分を７０％アルコールで濯いだ。低体温を避けるために、動物は必要以上に濡らさなかった。臍孔に向かって約１センチメートルの剣状突起の位置に滅菌鋏で切開を作った。鋏で腹膜内に侵入し、剣状突起の先端を切除した。２／３肝切除では、脇腹を軽く圧迫し、切開部を通して先に準備した部分の上に肝臓を露出させた。露出した肝臓の部分の周囲に４−０絹結紮糸を置いて、結紮した。次に、この結紮より遠位の肝臓の前方部分を切除した。４−０プロリンを用いて筋膜を縫合し、４−０ナイロンを用いて皮膚を皮下縫合した。８０％肝切除では、より大きい切開を用い、個々の葉を４−０絹結紮糸で結紮し、尾状葉のみを残した。次に、この結紮より遠位の肝臓の前方部分を切除した。４−０プロリンを用いて筋膜を縫合し、４−０ナイロンを用いて皮膚を皮下縫合した。
【００５７】
Ｂ．対象のジェノタイピングおよび選択
ジェノタイピングのために、尾を約２ｍｍ切除することにより、２週齢のマウスに対して尾生検を行なった。全ての手順に滅菌器具を用いた。遠位部の尾を７０％アルコールで拭い、鋏を用いて切り取った。切断端に、少なくとも３０秒間、強い圧力をかけた。出血の停止が確認された後で、マウスをケージに戻した。出血が生じる場合は、尾の切断端にＮＥＸＡＢＡＮＤ（登録商標）液を１滴かけた。各時点に５匹の動物として、雄の成体マウスを実験に用いた。実験のばらつきを減らすために、近交マウス系統を用いた。
【００５８】
Ｃ．肝臓におけるＢＭＰのｍＲＮＡおよびタンパク質の発現レベルの決定
ＢＭＰのｍＲＮＡおよびタンパク質の発現は、部分肝切除の後、肝臓で顕著に減少した。まず、ｍＲＮＡ発現のレベル（例えば、標的ＢＭＰ４遺伝子の発現レベル）を測定することにより、内在性遺伝子発現を決定した。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、またはハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロッティングおよびＲＮアーゼ保護）を用いて、遺伝子発現のレベルを測定した。特に、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を利用して、肝切除後のＢＭＰ４  ｍＲＮＡのレベルを定量した。直接的にまたは間接的に標識された検出薬剤（例えば、蛍光標識または放射性標識された核酸、放射性標識または酵素標識された抗体など）を用いて、タンパク質またはｍＲＮＡのレベルを検出した。タンパク質およびｍＲＮＡのレベルを検出するための方法は、Ｇｅｌｆａｎｄに対する米国特許第５，２１０，０１５号明細書、Ｌｉｖａｋらに対する米国特許第５，５３８，８４８号明細書、およびＨａａｌａｎｄに対する米国特許第５，８６３，７３６号明細書、ならびにＨｅｉｄ，Ｃ．Ａ．ら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６：９８６−９９４（１９９６）；Ｇｉｂｓｏｎ，Ｕ．Ｅ．Ｍら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９９５−１００１（１９９６）；Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｐ．Ｍ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７２７６−７２８０（１９９１）；およびＬｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．ら，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ３５７−３６２（１９９５）に記載されている。これらの参考文献の教示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５９】
Ｄ．肝臓で条件的ＢＭＰ４欠失を示すトランスジェニックマウスの作出
ＢＭＰ４の完全な欠失は胚性致死であることが知られている。したがって、ＢＭＰの肝臓特異的な条件的遺伝子欠失（「ノックアウト）の戦略を利用した。通常、ノックアウトシステムでは、標的遺伝子の改変は、標的遺伝子改変を促進する物質に動物を曝露させたときに、例えば、標的遺伝子部位での組換えを促進する酵素（例えば、ｃｒｅ−ｆｌｏｘシステムにおけるＣｒｅ）を導入したときに生じる。本発明では、ｆｌｏｘ化ＢＭＰ４マウスを用意し、ＡＡＶ−８−ＭＵＰ−ｃｒｅ（Ｈｏら，２００８）か、またはアルブミンおよびα−フェトタンパク質プロモーターの制御下のＣｒｅリコンビナーゼ（Ａｌｆｐ−Ｃｒｅ）を発現するトランスジェニックマウスのいずれかによってｃｒｅリコンビナーゼを送達した。研究技術として、肝臓を研究するためのウイルスベクターの使用は非常に有用である。残念ながら、レンチウイルスおよびアデノウイルスは、管理の難しさ、炎症、または肝毒性のために有用性が限られている（Ｍａｈａｓｒｅｓｈｔｉら，２００３）。この問題を克服するために、マウス尿タンパク質プロモーターを含むアデノ随伴ウイルス８（ＡＡＶ−８−ＭＵＰ）を開発し、利用した。このウイルスは、損害をほとんど与えずに、また、損傷後の修復に全く影響を与えずに肝臓に感染する。
【００６０】
Ｅ．Ｋｉ−６７の抗体標識
ＢＭＰ４シグナル伝達の喪失の機能的結果を調べるために、Ｋｉ−６７標識指数を利用して、ＢＭＰヌルマウスと野生型における肝細胞増殖を明らかにした。８〜１０週齢の成体雄マウスに上記のように２／３肝切除を施し、２／３肝切除後の様々な時点（例えば、０、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８および１９２時間）で肝細胞増殖を調べた。細胞増殖マーカーとして、Ｋｉ−６７タンパク質は、細胞の増殖および分裂と強く関連する。間期には、Ｋｉ−６７タンパク質（抗原）は、核内にのみ検出されるが、有糸分裂期には、このタンパク質の大半は、染色体に局在する。Ｋｉ−６７タンパク質は、細胞周期の全ての活動期（Ｇ１、Ｓ、Ｇ２、および有糸分裂）に検出されるが、休止細胞（Ｇ０）には全く見られない。したがって、Ｋｉ−６７は、所与の細胞集団の増殖画分を決定するための優れたマーカーとして役立つ。Ｋｉ−６７陽性細胞の割合（Ｋｉ−６７標識指数）は、細胞の分裂および増殖の経過と相関する。モノクローナル抗体ＭＩＢ−１を用いて、マウスから抽出された肝細胞でＫｉ−６７抗原を検出した。その教示全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｕｚｕｋｉら（Ｓｕｚｕｋｉら（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１５：３１７−２０）に記載されているように、Ｋｉ−６７抗体標識指数を含む免疫染色を行なった。Ａｌｆｐ−Ｃｒｅ／ＢＭＰ４ｆ／ｆおよびＡｌｆｐ−Ｃｒｅ＋ＢＭＰ４＋／ｆマウス、ならびにＡＡＶ−８−ＭＵＰ−緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）対照ウイルスを投与されたマウスを含む、種々の対照を行なった。
【００６１】
Ｆ．５−ブロモ−２−デオキシ−ウリジン（ＢｒｄＵ）標識および免疫細胞化学
肝臓および肝細胞を上記のようにマウスから抽出し、１０％ＦＢＳを含む従来のＤＭＥＭに入れてＴフラスコ中で増殖させた。トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を用いて細胞を解離させ、１ｍＬの適切な培地中に１２ｍｍカバースリップを入れた、またはその代わりに（ＰＢＳ中０．０５〜０．１％、１５０〜３００Ｋモル重量を用いて、一晩）ポリリジンでコーティングしたカバースリップを入れた、２４ウェルプレートもしくはチャンバースライド中のシェルバイアルに移した。回復させるために、細胞を３７℃で２時間インキュベートした。ＢｒｄＵを最終濃度１０μＭになるまで各シェルバイアルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。シェルバイアルから培地を完全に吸引し、カバースリップをＰＢＳ中で３回洗浄した。１ｍＬのカルノワ固定液（３部のメタノール：１部の氷酢酸）を各シェルバイアルに添加し、完全に吸引した。さらに１ｍＬのカルノワ固定液をすぐに添加した。シェルバイアルを−２０℃で２０分間固定した。固定液をシェルバイアルから吸引し、カバースリップをＰＢＳ中で３回洗浄した。２ＭのＨＣｌを含む水０．２ｍＬを各シェルバイアルに添加し、３７℃で１時間インキュベートすることにより、細胞を変性させた。酸をシェルバイアルから完全に吸引し、ホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．５）中で３回洗浄することにより、カバースリップを中和した。シェルバイアルをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０［ＰＢＳ／Ｔ２０］中で３回洗浄し、２〜８℃で保存した。
【００６２】
免疫染色
当技術分野で一般に知られているように免疫染色を行なった。具体的には、０．２ｍＬのＰＢＳ／Ｔ２０／２％正常ヤギ血清を各バイアルに添加し、３７℃で１０〜３０分間インキュベートすることにより、細胞をブロッキングした。溶液を完全に吸引し、ＰＢＳ／Ｔ２０／２％正常ヤギ血清に希釈した抗ＢｒｄＵモノクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）カタログ番号ＭＡＢ３４２４、ＭＡＢ４０７２）を０．２ｍＬ添加した。バイアルを３７℃で３０分間インキュベートした（ＢｒｄＵストック溶液：１０ｍＭ、ＰＢＳに溶解させ、０．２μｍのフィルターで滅菌し、−２０℃で保存したもの）。ＢｒｄＵストック溶液を培養培地に１／１００希釈して、１００μＭ溶液（１０×）を得た。この１０×溶液を最終濃度１０μＭになるまで各バイアルに添加した。バイアルをＰＢＳ／Ｔ２０中で３回洗浄し、０．２ｍＬのヤギ抗マウスＦＩＴＣ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）カタログ番号ＡＰ１２４Ｆ）を添加した。バイアルを暗所３７℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳ／Ｔ２０中で３回洗浄した。バイアルからカバースリップを取り出し、ＤＩ水に浸し、蛍光用のマウント剤（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）カタログ番号５０１３）を用いて、ガラススライド上に標本化した。蛍光顕微鏡観察を用いて、スライドを評価した。
【００６３】
ＩＩ．結果
Ａ．ＢＭＰ４は、成体の肝臓によって構成的に発現され、肝再生を阻止するものとして働き、種々の方法を用いてこの阻害を取り除くことにより、肝再生が強化される。
【００６４】
大規模な遺伝子スクリーニングにより、骨形成タンパク質シグナル伝達が、損傷後の肝修復時に高度に阻害されていることが確認された。これには、アンタゴニストの誘導とアゴニストの阻害とが含まれた。増殖の阻害因子の拮抗作用が損傷後の正常な肝修復に必要とされる肝再生における新しいパラダイムを理解するための潜在的標的としてのこれらの分子。ＢＭＰは分泌型のシグナル伝達分子であり、したがって、潜在的に操作することができるので、これは、特に魅力のある治療標的となった。
【００６５】
肝切除後のＢＭＰ４のリアルタイムＰＣＲを図１に示す。肝切除後１８時間までに、このレベルは、損傷していない肝臓と比較して２５％にまで低下する。ＢＭＰ４タンパク質レベルも同様に減少し、肝切除後３６時間で顕著に低下する（図２）。同様の結果がＢＭＰ２のＲＮＡについて認められた。  
【００６６】
Ｂ．肝臓におけるＢＭＰ４受容体の発現
ＢＭＰの受容体が肝臓に存在することを明らかにするために、ＢＭＰ４によって利用される２つの受容体であるＡＬＫ２およびＡＬＫ３について免疫組織化学検査を行なった。ＡＬＫ２は、主に、ＢＭＰ６およびＢＭＰ７によって利用されるのに対し、ＡＬＫ３は、主に、上で論じたようなＢＭＰ２およびＢＭＰ４によって利用される。図３に示すように、ＡＬＫ３は、門脈に隣接した肝臓で発現される（赤の染色）。同様の結果がＡＬＫ２について認められた。
【００６７】
Ｃ．マウス肝臓におけるＢＭＰ４の条件的遺伝子欠失の作出
ＢＭＰ４の完全な欠失は胚性致死であることが知られている。したがって、ＢＭＰの肝臓特異的な条件的遺伝子欠失（「ノックアウト）の戦略を利用した。具体的には、ＡＡＶ−８−ＭＵＰ（Ｈｏら，２００８）か、またはアルブミンおよびα−フェトタンパク質プロモーターの制御下のＣｒｅリコンビナーゼ（Ａｌｆｐ−Ｃｒｅ）を発現するトランスジェニックマウスのいずれかによってＣｒｅリコンビナーゼが送達されるｆｌｏｘ化ＢＭＰ４マウスを利用した。肝臓におけるＢＭＰ４の条件的欠失の有効性を確認するために、組換え後に、ＢＭＰ４タンパク質についてのウェスタンブロットアッセイを行なった。図４に示すように、ＢＭＰ４タンパク質レベルの大幅な低下が、Ｃｒｅリコンビナーゼによる影響を受けたｆｌｏｘ化マウスで認められた（図４）。
【００６８】
Ｄ．ＢＭＰ４の喪失による肝再生の強化
次に、Ｋｉ−６７標識指数を用いて、ＢＭＰ４シグナル伝達の喪失の機能的結果を調べた。８〜１０週齢の成体マウスに上記のように２／３肝切除を施し、２／３肝切除後の様々な時点（例えば、０、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８および１９２時間）で肝細胞増殖を調べた。図５に示すように、トランスジェニックマウスにおけるＢＭＰ４の肝臓特異的欠失は、Ｋｉ−６７標識で測定したとき、対照と比較して、４８時間で２倍を超える量の肝細胞増殖をもたらした（図５）（ｐ＜０．０５）。Ａｌｆｐ−Ｃｒｅ／ＢＭＰ４ｆ／ｆおよび  Ａｌｆｐ−Ｃｒｅ＋ＢＭＰ４＋／ｆマウス、ならびにＡＡＶ−８−ＭＵＰ−緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）対照ウイルスを投与されたマウスを含む、種々の対照を行なって、同様の結果を得た（全てのデータが示されているわけではない）。それゆえ、肝臓でのＢＭＰ４の喪失は、肝再生の構成的障害物を放出することによって、肝再生を顕著に強化した。
【００６９】
Ｅ．肝損傷後の正常な肝修復のためのＢＭＰ４発現の低下
ＢＭＰ４シグナル伝達の低下または阻害が肝損傷後の正常な肝修復の必要条件であることを立証するために、肝切除後のＢＭＰ４発現レベルを維持する必要があった。これを達成するために、ＡＡＶ−８−ＭＵＰ−ＢＭＰ４を開発した。肝切除時および肝切除後にＢＭＰ４ウイルスを発現させると、ビヒクル（食塩水）またはＡＡＶ−８−ＭＵＰ−ＧＦＰ対照ウイルスと比較して肝細胞増殖の７０％減少が認められた（Ｐ＜０．０５）。
【００７０】
肝臓特異的なＢＭＰ４の喪失によって肝再生に影響を及ぼす全身作用が生じなかったことを立証するために、ＢＭＰ４ウイルス（すなわち、ＡＡＶ−８−ＭＵＰ−ＢＭＰ４）を肝臓特異的ＢＭＰ４ヌルマウスに注射した。予想された通り、肝臓でのＢＭＰ４の発現により、肝細胞増殖は、野生型マウスで見られる、より低い正常レベルにまで戻った。
【００７１】
これらの結果は、ＢＭＰシグナル伝達の低下が肝切除後の正常な肝細胞増殖に必要であることを強く示すものである。さらに、これらの結果は、ＢＭＰ４シグナル伝達の程度が肝切除後の肝細胞増殖の速度を制御する強い証拠を示すものである。これらの結果は、阻害経路の解放が、図５に示すような損傷後の肝再生の極めて重要なメカニズムであるという観察とも一致している。ＢＭＰ４は分泌型のシグナル伝達分子であるので、優れた治療標的候補として役立つ。
【００７２】
Ｆ．部分肝切除後のＢＭＰシグナル伝達の薬理学的阻害による肝再生の強化
上で論じた知見の臨床的意義を示すために、８週齢のマウスにＢＭＰシグナル伝達のアンタゴニストを注射した。２／３肝切除の前、２／３肝切除の間、および２／３肝切除の後に、ドルソモルフィンを４８時間注射した。具体的には、肝切除の２４時間および１２時間前に、肝切除の時に、ならびに肝切除の１２、２４、および３６時間後に、ドルソモルフィンを複数回注射した。図６で、ＢｒｄＵの取込みを２／３肝切除の３６時間および４８時間後に測定した。図６に示すように、ドルソモルフィンの投与により、肝細胞増殖が著しく強化された。最大６０日間のドルソモルフィン投与により、全身毒性は生じなかった。特に、骨髄、増殖、または白血球数に対する影響はなかった。
【００７３】
実施例２
Ｉ．肝切除およびＴｙｌｅｎｏｌ過剰摂取後の肝再生を評価するための一般的アプローチ
遺伝的または薬理学的介入の効果を調べるために、３つの実験手法：２／３肝切除、大規模肝切除、またはＴｙｌｅｎｏｌ過剰摂取を利用する。２／３肝切除のために、上に記載され、かつ他の者（Ｏｔｕら，２００７）によって記載されているように、胆嚢を含む左葉および中葉の除去を行なう。大規模肝切除（８０％）のためには、右葉も切除する。Ｔｙｌｅｎｏｌ過剰摂取のために、３００ｍｇ／ｋｇを静脈内灌流で投与する。
【００７４】
２／３肝切除動物を解析するために、肝切除後６、１２、２４、３６、４８、および７２時間、ならびに７日で肝臓を摘出する。動物を屠殺する２時間前にＢｒｄＵを注射し、ＢｒｄＵの取込みおよびＫｉ−６７標識を用いて、肝細胞増殖を明らかにする。屠殺時に肝重量を解析し、肝重量／体重比を測定して、再生速度を評価する。リアルタイムＰＣＲ解析およびウェスタンブロッティング用に、ＲＮＡおよびタンパク質試料を回収する。一般に、肝切除後の増殖の開始が遅延しているかまたは加速しているかを評価する。再生が始まった後に再生のペースが変化するかどうか、および最終的な肝臓サイズの設定点が変化するかどうかも明らかにする。また、組織学検査を検討して、肝臓における脂肪蓄積、空胞形成、壊死、または構造変化を探す。肝細胞の健康および機能をさらに評価するために、ベースライン時および屠殺した動物において、ａｓｔ、ａｌｔ、およびビリルビンを含む肝機能検査を測定する。肝損傷に応答したプログラムされた細胞死（アポトーシス）または壊死の潜在的レベルを評価するために、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）を行ない、ＤＮＡ断片化を解析する。上で論じたように、全ての実験で８〜１０週齢の雄マウスを利用し、可能な限り同腹子を対照として用いる。生存実験のために、カプラン−マイヤー生存曲線を作成する。出力計算に基づいて、２２匹の実験マウスを２２匹の対照マウスと比較する。
【００７５】
実施例３
Ｉ．どのＢＭＰリガンドおよび受容体が損傷後の肝修復に影響を及ぼすかを決定し、その分子作用メカニズムを解明するためのインビボ研究
Ａ．肝臓特異的ＢＭＰヌルマウスにおける損傷後の肝修復強化のメカニズムの決定
野生型マウス、ウイルスを有する野生型マウス、対照ＡＡＶ−８−ＭＵＰ−ＥＧＦＰウイルスを投与されたトランスジェニックｆｌｏｘ化マウスおよびＡＡＶ−８−ＭＵＰ−ＢＭＰウイルスを投与された実験トランスジェニックｆｌｏｘ化マウスを用いた対照は、上で記載されている。肝臓特異的ＢＭＰ４ヌルマウスにおける肝切除後の肝細胞増殖強化の経時的シグネチャーを図５に示す。
【００７６】
肝臓特異的ＢＭＰ４ヌルマウスにおける損傷後の肝修復強化のより具体的なメカニズムをさらに明らかにするために、およびＢＭＰ４が増殖を抑制しているメカニズムを評価するために、以下の研究を行なう。
【００７７】
いくつかのアンタゴニストが存在するので、ＢＭＰ発現のフィードバックループが存在する可能性が高い。ＢＭＰシグナル伝達のフィードバックループが存在するかどうかを明らかにするために、ＢＭＰ経路の他の構成要素、例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ６またはＢＭＰ７、Ｉ型ＢＭＰ受容体（例えば、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ６）ならびにアンタゴニスト（例えば、ＮｏｇｇｉｎおよびＣｅｒｂｅｒｕｓ様１）が、ＢＭＰ４の非存在下でどのように経時変化するかをＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロッティングを用いて明らかにする。
【００７８】
ＢＭＰ４は、サイクリン発現をこれらのタンパク質の上流エフェクターとして増大させる可能性が高い。ＢＭＰ４の喪失が細胞周期進行にどのような影響を及ぼすのかを評価するために、例えば、ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロッティングによって、サイクリンＡおよびＤを調べる。
【００７９】
ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ＥＢＰ−αはＢＭＰ４の転写標的ではない可能性が高いが、関係性を確認することは重要である。ＢＭＰ４の喪失が正の調節経路の転写調節にどのような影響を及ぼすのかを調べるために、例えば、ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロッティングによって、ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ＥＢＰ−αの発現を明らかにする。
【００８０】
サイトカインおよび増殖因子はＢＭＰ４の標的ではない可能性が高い。ＢＭＰ４が肝細胞増殖の他の刺激因子を調節するかどうかを明らかにするために、例えば、ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロッティングによって、サイトカインであるＩＬ−６ならびに増殖因子である上皮増殖因子および肝細胞増殖因子の発現を調べる。また、ＢＭＰ４シグナル伝達が反対の調節タンパク質であるｐ２１およびｐ５３を転写調節するかどうかをＲＴ−ＰＣＲまたはノーザン解析によって調べる。
【００８１】
ＳＭＡＤ１、５および８を含むＢＭＰシグナル伝達の細胞内メディエーターの局在およびそのリン酸化状態を、ウェスタンブロッティングを用いて明らかにする。
【００８２】
Ｔｏｂ１は、ＢＭＰ４の転写標的として機能し得る。ＢＭＰシグナル伝達と相互作用する抗増殖性分子であるＥｒｂＢ２．１（Ｔｏｂ１）のトランスデューサーの変化によって、ＢＭＰシグナル伝達がＴｏｂ１発現を調節するかどうかが明らかになる。
【００８３】
Ｂ．肝臓特異的なＢＭＰ２の除去が損傷後の肝修復を強化するかどうかの決定
従来のＢＭＰ２ノックアウトは胚性致死であるので、上記のＢＭＰ４に用いた戦略と同様の「ｆｌｏｘ化」ＢＭＰ２（ＢＭＰ２ｆ／ｆ）マウスを用いる戦略を利用する。ウイルスまたはトランスジェニックによるアプローチを用いて、ＢＭＰ２ｆ／ｆにおけるＢＭＰ２の不活化を２つの別々の方法で行なうことができる。組換えはマウスに注射したときにのみ起こり、出生前には起こらないので、ＡＡＶ−８−ＭＵＰ−Ｃｒｅが好ましい。このウイルスを用いて達成することができる時間特異性は、解析を複雑にする可能性のある低いＢＭＰ２レベルに動物をあまり曝露させないことを意味する。ウイルスに基づくアプローチの対照は、ＢＭＰ４の対照ならびにＢＭＰ２ｆ／ｆおよびｅＧＦＰウイルスに基づく対照と同様とし、ｆｌｏｘ化されているが、組み換えられていないアレル、またはウイルスそれ自体がマウスに影響を及ぼす可能性を排除する。
【００８４】
組換え事象を探すために、遺伝子欠失の成功の確認を別々のＰＣＲアッセイで行なう。これらのアッセイは当業者によってルーチンに行なわれている。図４に示すアッセイと同様に、ＢＭＰ２の欠失を保証するための追加の対照として、ウェスタンブロットアッセイを行なう。
【００８５】
条件的ヌルマウスが肝切除の非存在下で表現型を有するかどうかを明らかにするために。肝重量により、ＢＭＰ２が肝臓サイズを調節するかどうかが決定される。肝臓および骨髄に対する考えられるあらゆる影響について、肝機能検査および血球数を測定する。ＳＭＡＤはＢＭＰシグナル伝達を仲介し、また、ＳＭＡＤ４はヘプシジン発現を介して鉄代謝に関与することが示されているので（Ｗａｎｇら，２００５）、Ｙｕら（Ｙｕら（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４：３３−４１）（この文献の教示全体は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、鉄、トランスフェリンおよびフェリチンのレベルについて、これらのマウスに関するさらなる研究を行なう。
【００８６】
ｆｌｏｘ化ＢＭＰ２マウスにＡＡＶ−８−Ｃｒｅを感染させることにより、上記のような対照とともに、肝臓特異的ＢＭＰ２ヌルマウスを作製する。これらのマウスを２／３肝切除後６時間から７時間の肝細胞増殖について調べる。作用メカニズムを明らかにするために、リアルタイムＰＣＲおよびウェスタンブロッティングを用いて、ＢＭＰ２ヌルマウスについてＢＭＰ４ヌルマウスと同様の解析を行なう。ＢＭＰ２の欠失が肝切除後の肝細胞増殖強化をもたらすかどうかをさらに明らかにするために、ＢＭＰ２ヌルマウスを用いてＢｒｄＵ取込みおよびＫｉ−６７染色も行なう。ＢＭＰ２マウスとＢＭＰ４マウスの増殖の違いは、ＢＭＰ２とＢＭＰ４の特異的機能を示し、この経路の異なるメンバーがいかにして異なる機能に関与するかを示唆する。
【００８７】
Ｃ．肝臓特異的なＡＬＫ２／ＡＬＫ３の除去が損傷後の肝修復を強化するかどうかの決定
Ａｌｋ３の除去によって、肝切除後の肝細胞増殖が増大し、より速やかな肝臓量の回復がもたらされるかどうかを肝臓特異的Ａｌｋ３ヌルマウスで明らかにする。目的は、損傷後の肝修復に対するＢＭＰ受容体ＡＬＫ３の喪失の効果を特徴付けることである。特異性の高い医薬品アンタゴニストを同定する際、どのＢＭＰ受容体が関連シグナルを仲介しているのかを明らかにすることが極めて重要である。「ｆｌｏｘ化」ＡＬＫ３（Ａｌｋ３ｆ／ｆ）マウスを上記のように作出する。条件的ヌルマウスが、肝切除がないときの表現型を有するかどうかを明らかにするために、これらのマウスについての広範囲に及ぶ調査を行ない、鉄、トランスフェリン、フェリチン、ヘマトクリットのレベル、および貧血または異常な赤血球形態の証拠を明らかにする。
【００８８】
ＢＭＰ４と同様に、ＡＬＫ３の不活化を、２つの別々の方法、すなわち、ウイルスによるアプローチとトランスジェニックによるアプローチで行なうことができる。ウイルスに基づくアプローチの対照では、ｅＧＦＰウイルスとともにＡＬＫ３ｆ／ｆを用いて、ｆｌｏｘ化されているが組み換えられていないアレルが解析を複雑にし得る全身作用を有する可能性、またはウイルスそれ自体が再生に影響を及ぼす可能性を排除する。
【００８９】
組換え事象を探すためのＰＣＲアッセイとタンパク質の除去を保証するウェスタンブロットとを用いて、遺伝子欠失を確認する。ＡＡＶ−８−ＭＵＰ−Ｃｒｅの感染によって作製される肝臓特異的なＡｌｋ３ヌルマウスを、ＡＡＶ−８−ＭＵＰ−ＧＦＰ対照ウイルスを投与したｆｌｏｘ化Ａｌｋ３マウスと比較する。肝切除後６時間から７日までの２／３肝切除後の肝細胞増殖について、これらのマウスを調べる。作用メカニズムを明らかにするために、リアルタイムＰＣＲおよびウェスタンブロッティングを用いて、ＢＭＰ４ヌルマウスと同様の解析を行なう。肝臓量が７日後に依然として対照と異なっているならば、Ａｌｋ３が長期間の肝臓サイズの調節に関与し得ることを示唆する。
【００９０】
同様に、肝再生におけるこれらの構成要素の特定の分子メカニズムを明らかにするために利用されるのと同様の方法を用いて、肝臓特異的Ａｌｋ２単一ノックアウトおよびＡｌｋ２／Ａｌｋ３二重ノックアウト（「ヌル」）マウスを利用する。
【００９１】
実施例４
Ｉ．ＢＭＰシグナル伝達を阻害する医薬品または化学薬品が、部分肝切除後の肝細胞増殖を改善し、損傷後の肝修復を強化し、かつ大規模肝切除またはアセトアミノフェン（Ｔｙｌｅｎｏｌ（登録商標））過剰摂取後の生存を改善することができるかどうかの決定
Ａ．ＢＭＰシグナル伝達を阻害する医薬品または化学薬品が、損傷（２／３肝切除）後の肝修復を強化することができるかどうかの決定
Ｃ５７Ｂ６マウスに、ＢＭＰシグナル伝達の選択的阻害剤であるドルソモルフィンまたはＬＤＮ１９３１８９を用いる一連の投薬レジメンを施す。国際公開第２００８／０３３４０８号パンフレット号に記載されている他の化合物または国際公開第２００８／０３３４０８号パンフレットに記載されている方法によって同定される化合物も利用する。まず、これらの化合物の肝臓についての用量応答曲線を作成する。ＢＭＰシグナル伝達の阻害はＩｄ−１およびヘプシジン発現に影響を及ぼすことが知られているので、リアルタイムＰＣＲおよびウェスタンブロッティングを独立した出力として行ない、医薬品による遮断の効率を評価する。化合物の全身作用があるかどうかを明らかにするために、肝機能検査、鉄、フェリチンレベルも調べる。適切な用量は、２／３肝切除（「部分肝切除」）後の肝細胞増殖の最大の強化をもたらす最小用量として決定する。ひとたびこれを決定すれば、ドルソモルフィンまたはＬＤＮ１９３１８９を投与した後に、マウスに２／３肝切除を施す。６、２４、３６、４８、７２、９６、および１６８時間で肝臓を摘出する。対照マウスは食塩水のみで処理する。ドルソモルフィンが肝細胞増殖に影響を及ぼすメカニズムを上記のようなＢｒｄＵ取込みおよびＫｉ−６７標識アッセイによって評価する。同様に、リアルタイムＰＣＲおよびウェスタンブロッティングも行ない、上で論じたようなＢＭＰ発現のレベルを決定する。
【００９２】
Ｂ．ドルソモルフィンまたはＬＤＮ１９３１８９が大規模肝切除（８０％肝切除）後の生存を延長するかどうかの決定
記載したような種々の投与レジメンを用いて、Ｃ５７／Ｂ６マウスに上記のような８０％肝切除を施す。ドルソモルフィンまたはＬＤＮ１９３１８９を投与されたマウスを、対照として食塩水を投与されたマウスと比較する。カプラン−マイヤー曲線を作成する。肝細胞の健康を評価するための組織学検査および肝細胞増殖を評価するためのＢｒｄＵ取込みのために、４８時間および９６時間、そしてその後、７日の時点で、生き残ったものから肝臓を摘出する。ＴＵＮＥＬ標識を用いて、アポトーシスのレベルを評価する。事前の観察結果に基づくと、介入なしでの３０％生存が期待される。出力計算により、２２匹の対照マウスと薬物を投与された２２匹で十分であることが示唆される。
【００９３】
Ｃ．ドルソモルフィンまたはＬＤＮ１９３１８９がアセトアミノフェン（Ｔｙｌｅｎｏｌ（登録商標））過剰摂取後の生存を延長するかどうかの決定
ドルソモルフィンまたはＬＤＮ１９３１８９を投与した後、３００ｍｇ／ｋｇのアセトアミノフェン（Ｔｙｌｅｎｏｌ（登録商標））をマウスに投与する。実験動物において７０％の死亡率をもたらすように用量を調整する。食塩水を投与された対照動物が対照の役目を果たす。少なくとも２２匹の対照マウスと２２匹の実験マウスを利用する。生存についての用量応答曲線を作成する。４８時間および９６時間で、そして再度７日で組織学検査を行なって、肝細胞の健康を評価し、ＢｒｄＵアッセイで肝細胞増殖を評価する。ＴＵＮＥＬ染色を用いてアポトーシスを評価する。
【００９４】
肝細胞増殖を強化することで、形勢を生存に傾かせることができる可能性が高いが、アセトアミノフェン（Ｔｙｌｅｎｏｌ（登録商標））による肝細胞壊死によって、肝細胞が増殖刺激に応答することができなくなる可能性がある。ヒトでは、肝細胞は、アセトアミノフェン（Ｔｙｌｅｎｏｌ（登録商標））毒性の後に増殖するが、マウスでは、生命維持がないとき、これは実現可能でない可能性がある。
【００９５】
本明細書で引用される全ての特許、公開出願および参考文献の教示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００９６】
本発明は、特に、その実例実施形態を参照しながら示され、記載されているが、形態および詳細における様々な変更が、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲を逸脱することなく、その中で行なわれ得ることが当業者に理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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