(57)【要約】  パーキンソン病患者群と正常コントロール群を対象に、大規模なSNP解析を行い、パーキンソン病と関連する遺伝子(GRK5)を同定することに成功した。また、このGRK5遺伝子の発現が亢進することにより、αシヌクレインのリン酸化が促進され、その結果、可溶性αシヌクレインオリゴマーの形成が促進され、パーキンソン病へ至ることが新たに見出された。GRK5遺伝子の発現を指標とすることにより、パーキンソン病の検査、並びに、パーキンソン病の治療薬のスクリーニングを行うことが可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者におけるGRK5遺伝子の発現を指標とすることを特徴とする、パーキンソン病に感受性か否かの検査方法。
【請求項２】
被検者について、GRK5遺伝子における変異を検出することを特徴とする、パーキンソン病に感受性か否かの検査方法。
【請求項３】
変異が多型変異である、請求項２に記載の検査方法。
【請求項４】
被検者について、GRK5遺伝子における多型部位の塩基種を決定することを特徴とする、パーキンソン病に感受性か否かの検査方法。
【請求項５】
多型部位が、以下の（１）および／または（２）に記載の多型部位である、請求項４に記載の検査方法。
（１）GRK5遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における34799位の多型部位
（２）GRK5遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における60001位の多型部位
【請求項６】
請求項５の（１）および（２）に記載の多型部位における塩基種が、それぞれ以下の（１b）〜（２b）である場合に、被検者はパーキンソン病に感受性であると判定される請求項５に記載の検査方法。
（１b）GRK5遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における34799位の塩基種がＧ
（２b）GRK5遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における60001位の塩基種がＣ
【請求項７】
被検者について、パーキンソン病に感受性か否かの検査方法であって、以下に記載のハプロタイプを示すDNAブロックが検出された場合にパーキンソン病に対して感受性であるものと判定される方法。
（１’）GRK5遺伝子上の多型部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における27377位、54748位、および60001位の多型部位の塩基種が、それぞれＧ、Ａ、およびＣであるハプロタイプ
【請求項８】
以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、被検者について、パーキンソン病に感受性か否かの検査方法。
（ａ）  被検者におけるGRK5遺伝子上の多型部位について、塩基種を決定する工程
（ｂ）（ａ）で決定された塩基種が、以下の（１’）に記載のハプロタイプを示すGRK5遺伝子における前記多型部位の塩基種と同一であった場合に、パーキンソン病に対して感受性であるものと判定する工程
（１’）GRK5遺伝子上の多型部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における27377位、54748位、および60001位の多型部位の塩基種が、それぞれＧ、Ａ、およびＣであるハプロタイプ
【請求項９】
前記（ａ）の多型部位が以下の（１）に記載の多型部位である、請求項８に記載の検査方法。
（１）GRK5遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における27377位、27849位、27876位、28813位、29000位、29855位、30366位、31037位、31706位、31964位、32542位、32723位、32988位、33064位、33618位、33889位、33911位、33994位、34799位、35173位、35188位、35189位、35190位、35240位、35284位、35402位、35415位、35494位、35522位、36405位、36433位、36449位、36546位、36817位、36868位、36882位、37004位、37148位、37295位、37413位、37722位、38393位、39182位、39193位、39301位、39316位、39456位、39487位、39550位、39638位、40097位、40134位、40193位、41149位、41157位、41428位、41498位、41618位、41667位、41843位、42364位、42418位、43017位、43037位、43190位、44600位、44607位、45522位、45998位、48284位、49971位、50122位、50873位、51463位、52944位、53223位、53397位、53703位、53763位、54267位、54748位、54782位、54794位、55139位、55457位、55627位、56254位、56593位、57338位、57606位、57648位、57688位、57843位、57978位、58067位、58456位、58616位、59263位、59908位、または60001位のいずれかの多型部位
【請求項１０】
前記（ａ）の多型部位が、以下の（１）または（２）に記載の多型部位である、請求項８に記載の検査方法。
（１）GRK5遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における34799位の多型部位
（２）GRK5遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における60001位の多型部位
【請求項１１】
パーキンソン病に対して感受性か否かの検査方法であって、被検者におけるGRK5遺伝子の発現量が対照と比較して上昇している場合に、被検者はパーキンソン病に対して感受性であるものと判定する方法。
【請求項１２】
被検者由来の生体試料を被検試料として検査に供する、請求項１〜１１のいずれかに記載の検査方法。
【請求項１３】
パーキンソン病が孤発性パーキンソン病である、請求項１〜１２のいずれかに記載の検査方法。
【請求項１４】
請求項５の（１）または（２）に記載の多型部位を含むDNAにハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、パーキンソン病に対して感受性か否かを検査するための試薬。
【請求項１５】
請求項５の（１）または（２）に記載の多型部位を含むDNAとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された固相からなる、パーキンソン病に対して感受性か否かを検査するための試薬。
【請求項１６】
請求項５の（１）または（２）に記載の多型部位を含むDNAを増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチドを含む、パーキンソン病に対して感受性か否かを検査するための試薬。
【請求項１７】
以下の（ａ）または（ｂ）を有効成分として含有する、パーキンソン病に対して感受性か否かの検査用試薬。
（ａ）GRK5遺伝子の転写産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
（ｂ）GRK5タンパク質を認識する抗体
【請求項１８】
以下の（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：５に記載の塩基配列、または、該塩基配列において１もしくは複数の塩基が付加、欠失もしくは置換された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、YY1転写因子との結合能が低下していることを特徴とするポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号：３に記載の塩基配列、または、該塩基配列において１もしくは複数の塩基が付加、欠失もしくは置換された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、CREB-1転写因子との結合能が上昇していることを特徴とするポリヌクレオチド
【請求項１９】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかを有効成分として含有する、パーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング用試薬。
（ａ）GRK5遺伝子の転写産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
（ｂ）GRK5タンパク質を認識する抗体
（ｃ）129位のセリン残基がリン酸化されたαシヌクレインタンパク質を認識する抗体
（ｄ）請求項１８に記載のポリヌクレオチド
【請求項２０】
パーキンソン病が孤発性パーキンソン病である、請求項１４〜１７、または１９のいずれかに記載の試薬。
【請求項２１】
GRK5遺伝子の発現もしくは該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を抑制する物質を有効成分として含有する、パーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤。
【請求項２２】
GRK5遺伝子の発現抑制物質が、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物である、請求項２１に記載のパーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤。
（ａ）GRK5遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）GRK5遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）GRK5遺伝子の発現をＲＮＡｉ効果による阻害作用を有する核酸
【請求項２３】
GRK5タンパク質の機能抑制物質が、以下の（ａ）または（ｂ）の化合物である、請求項２１に記載のパーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤。
（ａ）GRK5タンパク質に結合する抗体
（ｂ）GRK5タンパク質に結合する低分子化合物
【請求項２４】
可溶性αシヌクレインオリゴマーの形成を阻害する物質を有効成分として含有する、パーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤。
【請求項２５】
GRK5遺伝子の発現量もしくは該遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を低下させる化合物を選択することを特徴とする、パーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法。
【請求項２６】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、パーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法。
（ａ）GRK5遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該GRK5遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
【請求項２７】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、パーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法。
（ａ）GRK5遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
【請求項２８】
GRK5遺伝子が、以下の（ａ）または（ｂ）の発現が亢進した変異型GRK5遺伝子である、請求項２５〜２７のいずれかに記載のスクリーニング方法。
（ａ）GRK5遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における34799位の塩基種がＧである変異型GRK5遺伝子
（ｂ）GRK5遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における60001位の塩基種がＣである変異型GRK5遺伝子
【請求項２９】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、パーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法。
（ａ）GRK5タンパク質およびαシヌクレインと、被検化合物とを接触させる工程
（ｂ）GRK5タンパク質とαシヌクレインとの相互作用活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、相互作用活性を低下させる化合物を選択する工程
【請求項３０】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、パーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法。
（ａ）GRK5タンパク質およびαシヌクレインと、被検化合物とを接触させる工程
（ｂ）GRK5タンパク質のαシヌクレインを基質とするリン酸化活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記リン酸化活性を低下させる化合物を選択する工程
【請求項３１】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、パーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法。
（ａ）GRK5タンパク質および非可溶性αシヌクレインオリゴマーと、被検化合物とを接触させる工程
（ｂ）可溶性αシヌクレインオリゴマーの量を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記可溶性αシヌクレインオリゴマーの量を低下させる化合物を選択する工程
【請求項３２】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、パーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法。
（ａ）YY1認識配列を含むポリヌクレオチドもしくは請求項１８（ａ）に記載のポリヌクレオチド、およびYY1転写因子と、被検化合物とを接触させる工程
（ｂ）前記ポリヌクレオチドと転写因子との結合活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記結合活性を上昇させる化合物を選択する工程
【請求項３３】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、パーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法。
（ａ）CREB認識配列を含むポリヌクレオチドもしくは請求項１８（ｂ）に記載のポリヌクレオチド、およびCREB-1転写因子と、被検化合物とを接触させる工程
（ｂ）前記ポリヌクレオチドと転写因子との結合活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記結合活性を低下させる化合物を選択する工程
【請求項３４】
外来性のGRK5タンパク質およびα-シヌクレインが発現していることを特徴とする、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３５】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、パーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法。
（ａ）請求項３４に記載のトランスジェニック非ヒト動物へ被検化合物を投与する工程
（ｂ）前記動物の神経毒性に起因する行動を観察する工程
（ｃ）前記行動の発生を抑制する化合物を選択する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、GRK5遺伝子の発現もしくは多型変異を指標とするパーキンソン病の検査方法、および、該遺伝子を利用したパーキンソン病治療薬もしくは治療薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病（PD）は、有病率が高い進行性の神経変性疾患である（非特許文献１参照）。PD患者は、動作緩慢、振戦、筋固縮、および／または姿勢反射障害などの症状を示す。PDは、中脳黒質に存在するドーパミン産生ニューロンの選択的な変性・脱落によって、ドーパミンとアセチルコリンのバランスで調節されている大脳・線条体のドーパミン量が不足する結果生じる。なお、ドーパミン産生ニューロンが細胞死する機序についてはいまだ不明である。【０００３】
現在、パーキンソン病におけるドーパミン産生ニューロンの細胞死の進行を防ぐ根治的な治療法は確立されておらず、対症療法が存在するのみである。例えばドーパミンの不足を補うドーパミン補充療法は、早期〜中期の病期の患者に対して症候的には効果がある。しかし、現在行なうことができる治療では、パーキンソン病の進行を止めたり、戻すことはできない。結果として、PD患者は通常、病気が発症してから10〜15年ほどで寝たきりの状態になってしまう。従って、ドーパミン産生ニューロンの細胞死を防ぐ治療法が早急に求められている。【０００４】
PDは孤発性、または単一遺伝子の変異により家族性に発症する。後者の単一遺伝子が原因であるPDはPD患者全体の5〜10 %であり、そのコードする遺伝子として、α-シヌクレイン（αS）（非特許文献２および３参照）、パーキン（非特許文献４参照）、UCH-L1（非特許文献５参照）、DJ-1（非特許文献６参照）、PINK1（非特許文献７参照）などが同定されている。孤発性のPD（sPD）はPD患者の90〜95 %を占め、多因子の遺伝素因と環境的な要因が複雑に関連して発症すると考えられている。【０００５】
sPDが家族集積する事や、陽電子放射型断層撮影法（PET）を用いた双生児の研究から、遺伝素因がsPDに寄与することが推定される。sPDが家族集積性を有することが、ケース−コントロール研究によるコントロール群との比較により示された（非特許文献８参照）。アイスランドの全人口を対象とした研究でも、晩発性のPD患者は互いに血縁関係が強いことが示されている（同胞相対危険が6.7、親子関係で3.2、いとこで2.7）（非特許文献９参照）。PETを用いた双生児研究では、晩発性PD発症が双生児で一致する率は、一卵性双生児で75 ％を示し、二卵性双生児における22 ％と比較して高い値を示す（非特許文献１０および１１参照）。これらの知見はすべて、sPDの発症機序に遺伝的な背景が存在する事を示唆するものである。【０００６】
PDの発病機序におけるαSの重要性は、αS遺伝子の変異により起きる家族性PDが存在する事から明らかである（非特許文献１２および非特許文献３参照）。またαSはsPDのLewy小体に蓄積する（非特許文献１３〜１５参照）。最近、sPD脳のLewy小体に129位Serがリン酸化されたαS (p-αS)が、蓄積していることが明らかにされた。p-αS分子は、インビトロで自己凝集し、不溶性の線維を形成する性質があり（非特許文献１６参照）、αSのリン酸化、特に129位Serのリン酸化の調節はsPDの疾患感受性に影響する事が示唆される（非特許文献１６および非特許文献１７参照）。αSはインビトロでカゼインキナーゼ１（CK1）、CK2、GRK2、GRK5を含むプロテインキナーゼによりリン酸化される事が報告されている（非特許文献１８参照）。これらすべてのプロテインキナーゼは、αSの129位Serをリン酸化する（非特許文献１８参照）。しかし、これらのプロテインキナーゼのsPDとの病態生理学的な関連は明らかではない。【０００７】
ところで、αSは脂肪酸結合蛋白ファミリーに類似した構造学的特性を有し（非特許文献１９参照）、脂肪酸によりその可溶性オリゴマーの形成が促進されることが知られている（非特許文献２０参照）。また、不溶性オリゴマー形成に先行して、この可溶性オリゴマーの蓄積が起こる。αSトランスジェニックマウスやPD脳では、この可溶性オリゴマーが過剰に蓄積している。従って、この可溶性オリゴマーの過剰蓄積がPDにおける神経細胞死の原因ではないかと推察されている（非特許文献２１および非特許文献２２参照）。【０００８】
しかしながら、可溶性αSオリゴマー形成のメカニズムは不明であり、形成促進に関与する因子についても、現在のところ明らかとなっていない。【０００９】
【非特許文献１】Kimura H、外９名著、「Female preponderance of Parkinson's disease in Japan.」、Neuroepidemiology、2002年、Vol.21, p.292-296
【非特許文献２】Polymeropoulos MH, 外19名著、「Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease.」、Science、1997年、Vol.276、p.2045-2047
【非特許文献３】Kruger R（uはウムラウトが付く）、外９名著、「Ala30Pro mutation in the gene encoding alpha-synuclein in Parkinson's disease.」、Nat Genet、1998年、Vol.18、p.106-108
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【非特許文献８】Payami H, 外３名著、「Familial aggregation of Parkinson disease: a comparative study of early-onset and late-onset disease.」、Arch Neurol、2002年、Vol.59、p.848-850
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【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、パーキンソン病と関連する遺伝子の同定を目的とする。さらに、同定された遺伝子について遺伝学的および生化学的な解析を行い、得られた知見を基に該遺伝子を利用したパーキンソン病の検査方法、および治療のための医薬、並びに、該医薬をスクリーニングする方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決すべく鋭意研究を行った。本発明者らは、まず、パーキンソン病と関連する遺伝子を同定すべく、パーキンソン病と有意に関連する多型変異もしくはハプロタイプの同定を試みた。より具体的には、パーキンソン病患者群、および健常者群を対象として、パーキンソン病と関連する遺伝子または多型(SNPs)の大規模なスクリーニングを実施した。【００１２】
本スクリーニングにおいて、パーキンソン病と関連する遺伝子を同定するためには、パーキンソン病患者の確実な選定が必要となる。即ち、スクリーニングに供する大勢の個々の患者に対して、実際にパーキンソン病に罹患しているか否かについて、確定的に診断することが重要である。【００１３】
山形県の主要な医療機関にて、調査対象患者の募集と確定診断を行った。パーキンソン病の診断基準は次の通りとした。
１）潜行性に発症
２）L-dopaなどの抗パーキンソン病薬への明らかな反応
３）パーキンソン病と類似する症状を示す他の疾患を除外（血管性パーキンソニズム、オリーブ橋小脳萎縮症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症など）
４）パーキンソン症候群を起こす薬剤の服薬歴がない事【００１４】
これらの基準により、パーキンソン症候群と呼ばれるパーキンソン病と非常に類似する臨床症状を示す疾患群から、パーキンソン病患者のみを鑑別することができる。パーキンソン症候群は、黒質−線条体の経路に何らかの障害が存在する事によって起きる疾患の総称であり、ドーパミン産生ニューロンの選択的な脱落を伴うパーキンソン病とは異なる発症機序を持つ疾患を含む。従って、パーキンソン病患者のみを鑑別する事は遺伝統計学的な研究を行なう上で非常に重要である。【００１５】
山形県の782医療機関のうち208の病院および診療所に1477人の患者が受診していることを明らかにし、パーキンソン病の有病率はおよそ10万人に118.7人であった。この結果は日本の他の地域で行なわれた調査とほぼ一致する。【００１６】
1477人の患者のうち、963人の臨床データを登録する事ができた。963人のパーキンソン病患者全てを対象に、より精密に他の疾患を除外するため、神経内科医と脳外科医による詳細な神経学的な診察と脳のMRIが実施された。専門医による診察および検査によりパーキンソン病の確定診断が行なわれ、パーキンソン症候群患者の混入を最小限にする事ができる。以上の基準により、スクリーニングされた患者の317人が遺伝疫学的な研究のために血液サンプルを提供する事を承諾した。【００１７】
一方、コントロール群とした496人の集団は次のようにして得た。山形県高畠町および寒河江市の一部の地域では60歳および70歳になった時点で、全員公的な健康診断を受診することができる。この健診受信者のうち、医学的に異常が認められなかった者を対象に、書面による承諾を得た後、MRIおよび神経学的な検査を行ない、神経内科医により神経疾患の有無についてチェックした。以上の方法により、神経内科専門医の診断によりパーキンソン病を含め、神経疾患の症状を全く示していないコントロール群が得られた。また、高齢の健診受診者を対象とする事により、パーキンソン病に罹患し易い遺伝素因を持つ者をより多く除外できていると考えられる。強い遺伝素因を持つ者は、高齢に達する以前に発症していると推測できるからである。【００１８】
以上の通り、疾患群およびコントロール群を正確な診断を下した上で収集する事に成功した。コントロール群と疾患群の両方について、専門医による診察およびMRI検査等を行なった事は、遺伝学的な解析の精度を著しく高めるものであり、このような集団を解析対象として収集した研究は世界にも類を見ないものである。【００１９】
上述のようにして選定された疾患群（患者群）、およびコントロール群（正常群）について、520の遺伝子上の5632のSNPsについてスクリーニングを実施した。【００２０】
その結果、パーキンソン病と有意に関連する2箇所の多型変異（m22.1およびm24）を見出すことに成功した。これらの多型変異は、2箇所とも、Gタンパク共役受容体キナーゼ５（GRK5）をコードする遺伝子のイントロン上に存在していた。【００２１】
さらにインビトロの解析より、本発明者らによって見出された2箇所の多型変異によって、GRK5遺伝子の転写が促進することが判明した。【００２２】
即ち、GRK5遺伝子の発現の亢進が、パーキンソン病の発症と深く関連することが強く示唆された。【００２３】
また、GRK5遺伝子内にパーキンソン病の罹患リスクを上昇させる低頻度ハプロタイプが見出された。即ち、本発明者らは、GRK5遺伝子が、パーキンソン病と関連することを初めて見出した。【００２４】
また、本発明者らは、１塩基の単独の変異によってGRK5遺伝子の発現が大きく変化する多型（m22.1およびm24）を見出すことに成功した。これら多型は、それぞれYY1認識配列、およびCREB認識配列上の転写制御領域に存在している。該多型変異によって該転写制御領域と転写因子との結合能が変化し、GRK5の転写活性が上昇するものと考えられる。該多型変異を有する転写制御領域を含むDNAは、例えば、GRK5遺伝子の発現を抑制させる因子のスクリーニングに利用することが可能である。【００２５】
GRK5は、アゴニストと結合した活性化したGタンパク共役受容体（GPCR）を、リン酸化することにより脱感作する、GRKファミリーの一員であり、GPCRシグナル伝達系の恒常性に重要である（Inglese J, Freedman NJ, Koch WJ, Lefkowitz RJ. Structure and mechanism of the G protein-coupled receptor kinases. J Biol Chem 268, 23735-23738 (1993).、Pitcher JA, Freedman NJ, Lefkowitz RJ. G protein-coupled receptor kinases. Annu Rev Biochem 67, 653-692 (1998).）。脳では、GRK5を含むGRKファミリーは、GPCRファミリーに属するドーパミン受容体の機能を調節する（Tiberi M, Nash SR, Bertrand L, Lefkowitz RJ, Caron MG. Differential regulation of dopamine D1A receptor responsiveness by various G protein-coupled receptor kinases. J Biol Chem 271, 3771-3778 (1996).、Ito K, Haga T, LamehJ, Sadee W. Sequestration of dopamine D2 receptors depends on coexpression of G-protein-coupled receptor kinases 2 or 5. Eur J Biochem 260, 112-119 (1999).）。【００２６】
シャロンらは、可溶性αSオリゴマーが蓄積することによって神経細胞が傷害され、次にそのオリゴマーの不溶化がおこるという仮説を提唱した（Sharon R, Bar-Joseph I, Frosch MP, Walsh DM, Hamilton JA, Selkoe DJ. The formation of highly soluble oligomers of α-synuclein is regulated by fatty acids and enhanced in Parkinson’s disease. Neuron 37, 583-595 (2003).）。sPDは、いくつかの疾患感受性遺伝子と、未解明の環境要因が組み合わさった多因子病であると考えられている。本発明によって、GRK5のイントロンに存在するSNPがsPDのリスクを高めることが立証された。【００２７】
さらに本発明者らは、GRK5について生化学的な解析を行った結果、本発明者らによって見出されたSNPの疾患感受性アレルはGRK5の発現を亢進させ、αSのリン酸化を導き、細胞毒性を持つ可溶性αＳオリゴマーの形成を促進することを見出した。【００２８】
また、GRKの中には、αＳを基質としてリン酸化し得るものが存在することが報告されている(Pronin, A. N. et. al., J. Biol. Chem. 275: 26515-26522 (2000))ものの、GRK5がαＳを細胞膜上でリン酸化すること、細胞膜上でリン酸化されたαＳは、時間経過とともにに細胞質内に移動すること、その結果、可溶性αＳオリゴマー形成が促進される知見は、本発明者によって初めて見出されたものである。【００２９】
本発明者らによって見出された知見に基づき、GRK5の発現もしくは機能を抑制することにより、パーキンソン病を予防もしくは治療することが可能である。即ち、GRK5の発現もしくは機能の亢進を指標とすることにより、パーキンソン病の検査を行うことができる。また、GRK5の発現もしくは機能を抑制する化合物は、パーキンソン病の予防もしくは治療のための薬剤となるものと期待される。さらに、GRK5の発現量もしくは機能、または可溶性オリゴマー形成の促進を指標とすることにより、パーキンソン病の予防もしくは治療のための薬剤をスクリーニングすることが可能である。【００３０】
本発明はまた、GRK5とαSの結合を特異的に阻害することにより、sPDの運動障害の根底にある神経変性の進展を遅くし得るという、新たな神経保護治療の可能性を提供する。即ち、αＳを基質とするキナーゼを見つけ、可溶性オリゴマー形成の促進に関して検討することは、創薬ターゲットを見つける上で重要と考えられる。いずれにしても、本発明者らによる結果は、GRK5がsPDに対するまったく新しい創薬ターゲットとなる可能性を強く示唆するものである。【００３１】
上述のように本発明者らは、パーキンソン病の発症と関連する遺伝子としてGRK5を同定し、さらに遺伝学的解析および生化学的解析によって取得された知見から、パーキンソン病の検査方法、および治療のための医薬、並びに、該医薬をスクリーニングする方法を提供するに至り、本発明を完成させた。【００３２】
本発明は上述のように、専門医による診察およびMRI検査等を行うことによってコントロール群（正常群）と疾患群のそれぞれについて正確な選別（確定診断）を行った。つまり、多型解析の対象とする患者群について正確に選別することはもちろん、コントロール群（正常群）についても正確に選別することは、解析の高い信頼性を得るために必須である。一見健常者と見える場合であっても、専門医による診察およびMRI検査等によってパーキンソン病の症状（兆候）が見出される場合もある。このような被検者をコントロール群（正常群）として多型解析に供した場合、信頼性のある結果を得ることは困難である。本発明においては、多型解析に供する被検者を正確に選別することによって、コントロール群（正常群）と疾患群のそれぞれの被検サンプルの信頼性を高めたことが、パーキンソン病と関連する遺伝子を実際に同定することに成功した大きな要因と言える。【００３３】
本発明は、より具体的には、
〔１〕  被検者におけるGRK5遺伝子の発現を指標とすることを特徴とする、パーキンソン病に感受性か否かの検査方法、
〔２〕  被検者について、GRK5遺伝子における変異を検出することを特徴とする、パーキンソン病に感受性か否かの検査方法、
〔３〕  変異が多型変異である、〔２〕に記載の検査方法、
〔４〕  被検者について、GRK5遺伝子における多型部位の塩基種を決定することを特徴とする、パーキンソン病に感受性か否かの検査方法、
〔５〕  多型部位が、以下の（１）および／または（２）に記載の多型部位である、〔４〕に記載の検査方法、
（１）GRK5遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における34799位の多型部位
（２）GRK5遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における60001位の多型部位
〔６〕  〔５〕の（１）および（２）に記載の多型部位における塩基種が、それぞれ以下の（１b）〜（２b）である場合に、被検者はパーキンソン病に感受性であると判定される〔５〕に記載の検査方法、
（１b）GRK5遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における34799位の塩基種がＧ
（２b）GRK5遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における60001位の塩基種がＣ
〔７〕  被検者について、パーキンソン病に感受性か否かの検査方法であって、以下に記載のハプロタイプを示すDNAブロックが検出された場合にパーキンソン病に対して感受性であるものと判定される方法、
（１’）GRK5遺伝子上の多型部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における27377位、54748位、および60001位の多型部位の塩基種が、それぞれＧ、Ａ、およびＣであるハプロタイプ
〔８〕  以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、被検者について、パーキンソン病に感受性か否かの検査方法、
（ａ）  被検者におけるGRK5遺伝子上の多型部位について、塩基種を決定する工程
（ｂ）（ａ）で決定された塩基種が、以下の（１’）に記載のハプロタイプを示すGRK5遺伝子における前記多型部位の塩基種と同一であった場合に、パーキンソン病に対して感受性であるものと判定する工程
（１’）GRK5遺伝子上の多型部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における27377位、54748位、および60001位の多型部位の塩基種が、それぞれＧ、Ａ、およびＣであるハプロタイプ
〔９〕  前記（ａ）の多型部位が以下の（１）に記載の多型部位である、〔８〕に記載の検査方法、
（１）GRK5遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における27377位、27849位、27876位、28813位、29000位、29855位、30366位、31037位、31706位、31964位、32542位、32723位、32988位、33064位、33618位、33889位、33911位、33994位、34799位、35173位、35188位、35189位、35190位、35240位、35284位、35402位、35415位、35494位、35522位、36405位、36433位、36449位、36546位、36817位、36868位、36882位、37004位、37148位、37295位、37413位、37722位、38393位、39182位、39193位、39301位、39316位、39456位、39487位、39550位、39638位、40097位、40134位、40193位、41149位、41157位、41428位、41498位、41618位、41667位、41843位、42364位、42418位、43017位、43037位、43190位、44600位、44607位、45522位、45998位、48284位、49971位、50122位、50873位、51463位、52944位、53223位、53397位、53703位、53763位、54267位、54748位、54782位、54794位、55139位、55457位、55627位、56254位、56593位、57338位、57606位、57648位、57688位、57843位、57978位、58067位、58456位、58616位、59263位、59908位、または60001位のいずれかの多型部位
〔１０〕  前記（ａ）の多型部位が、以下の（１）または（２）に記載の多型部位である、〔８〕に記載の検査方法、
（１）GRK5遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における34799位の多型部位
（２）GRK5遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における60001位の多型部位
〔１１〕  パーキンソン病に対して感受性か否かの検査方法であって、被検者におけるGRK5遺伝子の発現量が対照と比較して上昇している場合に、被検者はパーキンソン病に対して感受性であるものと判定する方法、
〔１２〕  被検者由来の生体試料を被検試料として検査に供する、〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載の検査方法、
〔１３〕  パーキンソン病が孤発性パーキンソン病である、〔１〕〜〔１２〕のいずれかに記載の検査方法、
〔１４〕  〔５〕の（１）または（２）に記載の多型部位を含むDNAにハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、パーキンソン病に対して感受性か否かを検査するための試薬、
〔１５〕  〔５〕の（１）または（２）に記載の多型部位を含むDNAとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された固相からなる、パーキンソン病に対して感受性か否かを検査するための試薬、
〔１６〕  〔５〕の（１）または（２）に記載の多型部位を含むDNAを増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチドを含む、パーキンソン病に対して感受性か否かを検査するための試薬、
〔１７〕  以下の（ａ）または（ｂ）を有効成分として含有する、パーキンソン病に対して感受性か否かの検査用試薬、
（ａ）GRK5遺伝子の転写産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
（ｂ）GRK5タンパク質を認識する抗体
〔１８〕  以下の（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチド、
（ａ）配列番号：５に記載の塩基配列、または、該塩基配列において１もしくは複数の塩基が付加、欠失もしくは置換された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、YY1転写因子との結合能が低下していることを特徴とするポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号：３に記載の塩基配列、または、該塩基配列において１もしくは複数の塩基が付加、欠失もしくは置換された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、CREB-1転写因子との結合能が上昇していることを特徴とするポリヌクレオチド
〔１９〕  以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかを有効成分として含有する、パーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング用試薬、
（ａ）GRK5遺伝子の転写産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
（ｂ）GRK5タンパク質を認識する抗体
（ｃ）129位のセリン残基がリン酸化されたαシヌクレインタンパク質を認識する抗体
（ｄ）〔１８〕に記載のポリヌクレオチド
〔２０〕  パーキンソン病が孤発性パーキンソン病である、〔１４〕〜〔１７〕、または〔１９〕のいずれかに記載の試薬、
〔２１〕  GRK5遺伝子の発現もしくは該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を抑制する物質を有効成分として含有する、パーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤、
〔２２〕  GRK5遺伝子の発現抑制物質が、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物である、〔２１〕に記載のパーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤、
（ａ）GRK5遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）GRK5遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）GRK5遺伝子の発現をＲＮＡｉ効果による阻害作用を有する核酸
〔２３〕  GRK5タンパク質の機能抑制物質が、以下の（ａ）または（ｂ）の化合物である、〔２１〕に記載のパーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤、
（ａ）GRK5タンパク質に結合する抗体
（ｂ）GRK5タンパク質に結合する低分子化合物
〔２４〕  可溶性αシヌクレインオリゴマーの形成を阻害する物質を有効成分として含有する、パーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤、
〔２５〕  GRK5遺伝子の発現量もしくは該遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を低下させる化合物を選択することを特徴とする、パーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法、
〔２６〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、パーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法、
（ａ）GRK5遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該GRK5遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔２７〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、パーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法、
（ａ）GRK5遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔２８〕  GRK5遺伝子が、以下の（ａ）または（ｂ）の発現が亢進した変異型GRK5遺伝子である、〔２５〕〜〔２７〕のいずれかに記載のスクリーニング方法、
（ａ）GRK5遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における34799位の塩基種がＧである変異型GRK5遺伝子
（ｂ）GRK5遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における60001位の塩基種がＣである変異型GRK5遺伝子
〔２９〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、パーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法、
（ａ）GRK5タンパク質およびαシヌクレインと、被検化合物とを接触させる工程
（ｂ）GRK5タンパク質とαシヌクレインとの相互作用活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、相互作用活性を低下させる化合物を選択する工程
〔３０〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、パーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法、
（ａ）GRK5タンパク質およびαシヌクレインと、被検化合物とを接触させる工程
（ｂ）GRK5タンパク質のαシヌクレインを基質とするリン酸化活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記リン酸化活性を低下させる化合物を選択する工程
〔３１〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、パーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法、
（ａ）GRK5タンパク質および非可溶性αシヌクレインオリゴマーと、被検化合物とを接触させる工程
（ｂ）可溶性αシヌクレインオリゴマーの量を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記可溶性αシヌクレインオリゴマーの量を低下させる化合物を選択する工程
〔３２〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、パーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法、
（ａ）YY1認識配列を含むポリヌクレオチドもしくは〔１８〕（ａ）に記載のポリヌクレオチド、およびYY1転写因子と、被検化合物とを接触させる工程
（ｂ）前記ポリヌクレオチドと転写因子との結合活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記結合活性を上昇させる化合物を選択する工程
〔３３〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、パーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法、
（ａ）CREB認識配列を含むポリヌクレオチドもしくは〔１８〕（ｂ）に記載のポリヌクレオチド、およびCREB-1転写因子と、被検化合物とを接触させる工程
（ｂ）前記ポリヌクレオチドと転写因子との結合活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記結合活性を低下させる化合物を選択する工程
を、提供するものである。【００３４】
また本発明の好ましい態様においては、
〔３４〕  外来性のGRK5タンパク質およびα-シヌクレインが発現していることを特徴とする、トランスジェニック非ヒト動物、
〔３５〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、パーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法、
（ａ）請求項３４に記載のトランスジェニック非ヒト動物へ被検化合物を投与する工程
（ｂ）前記動物の神経毒性に起因する行動を観察する工程
（ｃ）前記行動の発生を抑制する化合物を選択する工程
〔３６〕  GRK5遺伝子の発現抑制物質、またはGRK5タンパク質の機能抑制物質を個体（例えば、患者等）へ投与する工程を含む、パーキンソン病を予防および／または治療する方法、
〔３７〕  GRK5遺伝子の発現抑制物質あるいはGRK5タンパク質の機能抑制物質のパーキンソン病治療薬の製造における使用、
を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】GRK5遺伝子上のm22.1およびm24の多型変異について、位置および配列を模式的に示す図である。
【図２】図２Ａは、多型変異m19〜m33に関するD’の分布を示すグラフである。SNP m24および他のSNPsの間のD’スコアを示す。図２Ｂは、GRK5遺伝子上のSNP m19〜m33およびエクソン1〜16の位置を模式的に示す図である。
【図３】イントロンに存在するSNPm24は転写活性に影響することを示す写真および図である。ＡおよびＢにおける星印（＊）は非特異的なバンドを示す。図３Ａは、SNPm24のゲルシフトアッセイと競合アッセイの結果を示す写真である。SH-SY5Y細胞の核抽出液と32P標識した非疾患感受性であるTアリル（m24T：レーン1-4)、疾患感受性であるCアリル(m24C：レーン 5-8)のオリゴヌクレオチドを反応させた。コンペティターとして、非標識プローブを200倍の過剰量加えた（レーン2-4、6-8）。レーン1,5はコンペティターを加えていないレーンである。図３Ｂは、SNPm24のスーパーシフトアッセイの結果を示す写真である。m24T（レーン１〜５）またはm24C（レーン６〜１０）32P標識オリゴヌクレオチドをSH-SY5Y細胞の核抽出液と反応させた。レーン２〜５およびレーン７〜１０には抗体を添加し、レーン１、６には抗体を添加しなかった。CREB1に対する抗体はシフトバンド（矢尻：レーン５、１０）を減弱させ、２本のスーパーシフトバンド（二重矢尻：レーン５、１０）を生じた。抗c-JUN抗体もまたスーパーシフトバンドを生じさせた（三重矢尻：レーン３、８）。スーパーシフトバンドの強度はm24C（レーン８、１０）の方がm24T（レーン３、５）より大きかった。コントロール抗体（抗STAT-1抗体）はシフトバンドの強度に影響せず、スーパーシフトバンドを生じなかった（レーン２、７）。図３Ｃは、SNPm24のルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフである。１コピーまたは３コピーのm24Tまたはm24CオリゴヌクレオチドをｐGL-3プロモーターベクターにタンデムに挿入し、SH-SY5Y細胞に導入し相対的なルシフェラーゼ活性（RLA）を測定した。cAMP非存在下では、５つのベクターに差はなく、cAMP存在下では、m24Cはm24Tと比較して、１コピーの場合で1.5倍のRLA（p＜0.05）、３コピーの場合に9.7倍のRLA増強が認められた（p＜0.0001）。図３Ｄは、CREB-1がGRK5遺伝子イントロン2にあるm24の領域と結合することを示す写真である。DNA-タンパク質複合体を免疫沈降させた。レーン３は、SH-SY5Y細胞において内在性のCREB-1がm24を含む領域に結合する事を示す。レーン１：抗体なし、レーン２：無関係な抗体、レーン３：抗CREB-1抗体、レーン４：インプット。
【図４】イントロンに存在するSNPm22.1は転写活性に影響することを示す写真および図である。Ａ、Ｂ、Ｃにおける星印（＊）は非特異的なバンドを示す。図４Ａは、SNPm22.1のゲルシフトアッセイと競合アッセイの結果を示す写真である。非疾患感受性であるAアリル（m22.1A：レーン１〜３)、または、疾患感受性であるＧアリル（m22.1G：レーン４〜６）をSH-SY5Y細胞の核抽出液と共に32P標識オリゴヌクレオチドと反応させた。レーン２、３、５、６は400倍過剰量のコンペティターを添加し、レーン１、４にはコンペティターを添加しなかった。シフトバンド（矢尻と二重矢尻）がm22.1Aレーン（１〜３）に認められたが、m22.1G（レーン３）には認められなかった。m22.1Aコンペティター（非標識オリゴヌクレオチドプローブ）の添加によって、シフトバンドは減弱したが、m22.1Gコンペティターではシフトバンドは減弱しなかった（レーン３）。図４Ｂは、YY1結合モチーフオリゴヌクレオチドを用いたSNPm22.1の競合アッセイの結果を示す写真である。レーン２−６では400倍過剰量のコンペティターを添加し、レーン１ではコンペティターを添加せずに反応させた。シフトバンド（二重矢尻）は非標識のYY1結合配列（YY1co：レーン5)の添加により、ほぼ完全に消失を見せた。しかし、非標識の変異型のYY１配列（YY1mu：レーン６)や、非標識の変異m22.1A（m22.1Amu：レーン３）では影響がなかった。図４Ｃは、SNPm22.1のスーパーシフトアッセイの結果を示す写真である。m22.1A（レーン１、２）、m22.1Amu（レーン３、４）、m22.1G（レーン５、６）、YY1co（レーン７、８）またはYY1mu（レーン９、１０）32P標識オリゴヌクレオチドとSH-SY5Y細胞の核抽出液を反応させた。レーン2、4、6、8、10は抗YY1抗体添加、レーン１、３、５、７、９は抗YY1抗体無添加である。シフトバンド（二重矢尻）はm22.1A（レーン１）、YY1co（レーン7）32P標識オリゴヌクレオチドで生じた。このバンドは、抗YY1抗体によりほぼ完全に消失した（レーン２、8）。図４Ｄは、SNPm22.1のルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフである。１コピーまたは３コピーのm22.1Aまたはm22.1GオリゴヌクレオチドをｐGL-3プロモーターベクターにタンデムに挿入し、SH-SY5Y細胞に導入しRLAを測定した。３コピーを導入した場合において、m22.1Aオリゴヌクレオチドは、他の４種類のベクターを用いた時に比べ、RLAが42 ％減少した。（p＜0.0001）。
【図５】sPD患者剖検例の中脳黒質の免疫組織化学染色の結果を示す写真である。抗ヒトGRK5抗体（H-64）は、sPDの黒質ドーパミン産生ニューロンに認められるLewy小体（矢印）を免疫染色した(Ａ)。Lewy neurites（矢印）もGRK5陽性であった（Ｂ、Ｃ）。抗GRK5抗体（Ｄ）と抗αS（LB509）抗体（Ｅ）を用いた共焦点レーザー顕微鏡像は、Lewy小体に両蛋白質が局在する事を示した（Ｄ〜Ｆ）。ＦはＤとＥを合成した像である。バー＝20μm
【図６】GRK5がオカダ酸存在下のHEK293細胞で、αSの129位Serを用量・時間依存的にリン酸化することを表す写真である。図６Ａ：導入30時間後、0,5,10,20 nMの各濃度のオカダ酸を培地に添加し、細胞をさらに16時間培養した。1%NP-40を添加した細胞溶解液（20μg）を12.5%トリスーグリシンゲルの各レーンに加え、泳動後、PVDF膜に転写した。GRK5発現細胞では、psyn#64による染色で、Ser-129のp-αＳがオカダ酸の濃度に比例して検出された。図６Ｂ：導入24時間後、培地に20 nMのオカダ酸を添加し、0,6,12,24時間（最長24時間）培養した。0時間の細胞はオカダ酸処理の開始点としてサンプリングされた。GRK5発現細胞では、Ser-129  p-αＳの量はオカダ酸存在下での培養時間が長くなるに従い増加した。図６Ｃ：GRK5によるαSのリン酸化が、神経芽細胞腫由来SH-SY5Y細胞で観察された。
【図７】図７Ａは、αＳのSer-129のリン酸化とGRK5の発現が相関し、αＳのリン酸化はGRK5の酵素活性に依存することを示す写真である。上のパネル：αＳを安定して発現するHEK239細胞に、表示した量のGRK5-FLAG cDNAを形質導入した。総αＳのが発現量はほぼ一定だが、p-αＳの量はGRK5の量に対応して増加していた。下のパネル： Ser-129のリン酸化は、野生型のGRK5とαＳを共発現している細胞に認められ、S129A変異αＳと野生型GRK5の組み合わせではリン酸化は認められず、野生型αＳとGRK5のK215R変異の組み合わせでもリン酸化は生じなかった。図７Ｂは、HEK293細胞とヒト脳組織を用いたαＳとGRK5の免疫沈降についての実験を示す写真である。上のパネル：GRK5とαSを発現させたHEK293細胞から得られた免疫沈降物において、GRK5とαSの結合が、抗GRK5抗体を用いて行なったウェスタンブロッティング（ＷＢ）で検出された。下のパネル：ヒト側頭葉皮質組織を上記と同様に処理した。組織溶解産物を抗FLAG（陰性対照）、Syn-1、あるいは抗GRK5抗体で免疫沈降した。αSと共に免疫沈降したGRK5が、抗GRK5抗体でウェスタンブロッティングを行うことで検出された。図７Ｃは、GRK5により触媒されるSer-129ｐ-αＳの細胞内局在について示す写真である。固定した細胞を抗GRK5抗体（赤）、抗p-Ser129αS抗体（psy#64、緑）で免疫細胞化学染色した。図７Ｄは、細胞において、脂肪酸(FA)が誘導するαSオリゴマー形成をGRK5がリン酸化を介して促進することを示すゲル写真である。細胞におけるαSのオリゴマー形成を経時的に解析するために、細胞を20mMのオカダ酸と16時間インキュベートし、その後α‐リノレン酸/BSA複合体処理してオカダ酸と表中に示す時間培養した。370,000×g遠心後の上清（S370サイトゾル）を、脂質を除去するために65℃で16時間インキュベートし、イムノブロッティングで解析を行った。左および中央のパネル：αSと、CATまたはGRK5-FLAGを発現するHEK293細胞をα-リノレン酸で表示した時間（最長９時間）処理を行なった。０時間は、処理のスタート点を示す。αSとGRK5を共発現する細胞はオカダ酸処理し、S370サイトゾル（タンパク量で30μg）を加熱処理（65℃、16時間）した試料をゲルにアプライし、Syn-1またはpsyn#64抗体を用いてイムノブロッティングを行った。αSモノマーとオリゴマーの量は、非リン酸化αSが優位な状態であるCAT発現細胞に比べ、リン酸化αSが多いGRK5発現細胞において、より多くのαSオリゴマーが形成された。右のパネル：αSとGRK5を共発現した細胞のS370サイトゾルをゲルろ過カラム（スーパーデックス75）にアプライし、酢酸アンモニウム緩衝液で溶出した。各画分を加熱処理（65 ℃、16時間）して脂質の除去を行なった後、各画分をpsyn#64を用いたイムノブロッティング法で解析した。ゲルろ過によるS370サイトゾルの分画（fractionation）は加熱処理をしない条件（非変性条件）で行っているが、大量のリン酸化されたS129-αSオリゴマーが高分子量画分に溶出された。このことは、加熱処理をしない非変性条件でもαSオリゴマーが形成されることを示している。図中の星印（＊）は濃縮ゲルと分離ゲルの境界を示す。
【図８】αＳがHEK293細胞の細胞膜にGRK5と共に局在することを示す写真である。野生型αＳを安定して発現するHEK293細胞を４チャンバーのスライドで培養し、野生型GRK5-FLAG cDNA（上のパネル）または変異型のGRK5 K215R-FLAG cDNA（下のパネル）をオカダ酸非存在下（左のパネル）、オカダ酸存在下（右のパネル）で培養した。固定された細胞を、ポリクローナルGRK5抗体（すべてのパネル、赤）と、抗αＳモノクローナル抗体（LB509、左パネル、緑）あるいはモノクローナル抗pSer-129 αＳ抗体（psyn#64：右のパネル、緑）のどちらかで処理し、直接免疫蛍光法を行った。野生型GRK5は主として細胞膜に局在し、核周囲細胞質にはほとんど観察されなかった。野生型αＳは、主として細胞質の領域に存在し、細胞膜内側面でGRK5と共に局在した。黄色で示した重ね合わせ像に示す通りである（左のパネル）。野生型GRK5発現細胞では、細胞膜と、Ser-129 p-αＳは核周囲細胞質領域に存在し、変異型GRK5 K215Rを発現する細胞では、Ser-129 p-αＳは観察されなかった。変異型GRK5の局在は野生型と変わりなかった。バー＝10μm。
【図９】トランスジェニック線虫のプラスミドの構成とイムノブロッティング、免疫組織染色を示す図および写真である。A.ヒトα−シヌクレイン、ヒトGRK5の発現ベクターの構成を示す。B.α−シヌクレインのドーパミンニューロンでの発現を示す。ドーパミンニューロンの細胞体（矢尻；三角）と樹状突起（矢印→）が免疫組織化学染色により陽性を示した。C.α−シヌクレインのPLMニューロンでの発現を示す。免疫組織化学染色によりα−シヌクレイン陽性反応はPLMニューロンの細胞質内に散在性に観察された（矢尻；三角）。D.ヒトGRK5を全ニューロンで発現するトランスジェニック線虫の免疫組織化学染色の結果を示す。神経環で強い染色が認められた（矢尻；三角）。腹側神経索がGRK5陽性であった（矢印→）。E.野生型GRK5およびK215R変異型のGRK5を発現する線虫において、抗FLAG抗体を用いたイムノブロッティングにより64kDaの特異的なタンパクのバンドが検出された。
【図１０】ドーパミンニューロンにおいてGRK5がα−シヌクレインの129位セリンをリン酸化し、GRK5によるα−シヌクレインのリン酸化によりドーパミンニューロンの機能の低下が起きたことを示す図、及び写真である。A - C：ドーパミンニューロンにおけるGRK５によるα−シヌクレインの129位セリンのリン酸化を共焦点顕微鏡で観察した。(A)抗α−シヌクレイン抗体（#211）（B）抗リン酸化α−シヌクレイン抗体（PSer129）（C）AとBを重ねあ合わせた写真D：Food-sensing Assayの結果を示す。独立に作成した各系統について60匹をアッセイした。データは平均値±標準誤差で示す。統計解析は、スチューデントｔ検定の両側検定を行った。成長ステージを合わせた野生型GRK5とα−シヌクレインを共発現するトランスジェニック線虫とK215R変異型GRK5とα−シヌクレインを共発現するトランスジェニック線虫との間でP＜0.05と有意差が認められた。＊GRK5とα−シヌクレインの遺伝子型はグラフ下にWT：野生型、M：変異型として示している。また、N2は野生型（遺伝子導入なし）、cat-2はドーパミン合成を欠損する変異を持つ系統の線虫である。Isで始まる番号は線虫の系統を示し、番号が異なる系統は遺伝子型の組み合わせが同一でも独立して作出された系統であることを示す。E：ドーパミン投与をしてから行ったFood-sensing Assayの結果を示す。
【図１１】touch neuronにおいてGRK5がα−シヌクレインの129位セリンをリン酸化し、GRK5によるα−シヌクレインのリン酸化により機械感覚性の欠損が起きることを示す図、及び写真である。A - C：touch neuronにおけるGRK5によるα−シヌクレインの129位セリンのリン酸化を共焦点顕微鏡で観察した。(A)抗α−シヌクレイン抗体（#211）（B）抗リン酸化α−シヌクレイン抗体（PSer129）（C）AとBを重ねあ合わせた写真D：野生型GRK5とα−シヌクレインを共発現するトランスジェニック線虫の系統において、PLMニューロン中のリン酸化α−シヌクレイン陽性ニューロンのパーセンテージを示す。E：Touch assayの結果を示す。独立に作成した各系統について60匹をアッセイした。データは平均値±標準誤差で示す。統計解析は、スチューデントｔ検定の両側検定を行った。成長ステージを合わせた野生型GRK5とα−シヌクレインを共発現するトランスジェニック線虫とK215R変異型GRK5とα−シヌクレインを共発現するトランスジェニック線虫との間でP＜0.05と有意差が認められた。＊GRK5とα−シヌクレインの遺伝子型はグラフ下にWT：野生型、M：変異型として示している。また、N2は野生型（遺伝子導入なし）、cat-2はドーパミン合成を欠損する変異を持つ系統の線虫である。Isで始まる番号は線虫の系統を示し、番号が異なる系統は遺伝子型の組み合わせが同一でも独立して作出された系統であることを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
本発明者らは、パーキンソン病と関連する遺伝子として、GRK5遺伝子（GenBankアクセッション番号：NM_005308）を同定し、さらに、該遺伝子の発現亢進に関与する多型変異を同定した。【００３７】
即ち、GRK5遺伝子の発現亢進はパーキンソン病の発症と深く関連していることが見出された。被検者について、GRK5遺伝子の発現が亢進していれば、パーキンソン病の素因を有する（パーキンソン病感受性である）ものと判定することが可能である。【００３８】
本発明は、まず、被検者（被検者由来の生体試料）におけるGRK5遺伝子の発現を指標とすることを特徴とする、パーキンソン病に感受性か否かの検査方法を提供する。【００３９】
従って、GRK5遺伝子の発現もしくは該遺伝子によってコードされるタンパク質の活性（機能）を指標とすることにより、被検者について、パーキンソン病に感受性か否かを検査することができる。【００４０】
本発明におけるGRK5遺伝子の塩基配列、およびそれら遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列に関する情報は、上記のGenBankのアクセッション番号から、容易に取得することが可能である。また当業者においては、遺伝子表記（遺伝子名）を基に、公共の遺伝子データベースあるいは文献データベース等から遺伝子の塩基配列、および該遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列に関する情報を容易に入手することが可能である。なお、GRK5遺伝子を含むゲノムDNA領域の塩基配列を、配列番号：１に示す。【００４１】
本発明において「被検者」とは、通常ヒトであるが、本発明の検査方法は必ずしもヒトのみを被検対象とする方法に限定されない。ヒト以外の生物（好ましくは、哺乳動物であり、より好ましくはマウス、ラット、サル、イヌ、ネコ等の脊椎動物）を検査対象とする場合は、被検対象とする生物が有する内在性のGRK5遺伝子に相当する遺伝子について、その発現量を指標として検査を行う。従って本発明における「GRK5遺伝子」には、例えば、配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAに対応する他の生物における内在性のDNA（GRK5遺伝子ホモログ等）が含まれる。【００４２】
また、配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAに対応する他の生物の内在性のDNAは、一般的に、配列番号：１に記載のDNAと高い相同性を有する。高い相同性とは、50 ％以上、好ましくは70 ％以上、さらに好ましくは80 ％以上、より好ましくは90 ％以上(例えば、95 ％以上、さらには 96％、97 ％、98 ％または99 ％以上)の相同性を意味する。この相同性は、ｍBLASTアルゴリズム(Altschul et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7)によって決定することができる。また、該DNAは、生体内から単離した場合、配列番号：１に記載のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすると考えられる。ここで「ストリンジェントな条件」としては、例えば「2×SSC、0.1 ％SDS、50 ℃」、「2×SSC、0.1 ％SDS、42 ℃」、「1×SSC、0.1 ％SDS、37 ℃」、よりストリンジェントな条件として「2×SSC、0.1 ％SDS、65 ℃」、「0.5×SSC、0.1 ％SDS、42 ℃」および「0.2×SSC、0.1 ％SDS、65 ℃」の条件を挙げることができる。当業者においては、他の生物におけるGRK5遺伝子に相当する内在性の遺伝子を、GRK5遺伝子の塩基配列を基に適宜取得することが可能である。【００４３】
また本発明は、被検者におけるGRK5遺伝子の発現量が対照と比較して上昇している場合に、被検者はパーキンソン病に対して感受性であるものと判定される、パーキンソン病に対して感受性か否かを検査する方法を提供する。【００４４】
上記方法においては、通常、被検者由来の生体試料を被検試料とする。該被検試料におけるGRK5遺伝子の発現量の測定は、当業者においては公知の技術を用いて適宜実施することが可能である。【００４５】
なお、上記遺伝子の「発現」には、該遺伝子からの「転写」あるいはポリペプチドへの「翻訳」が含まれる。【００４６】
遺伝子の発現量を、該遺伝子の翻訳産物（タンパク質）の生成量を指標として測定する場合、例えば、被検試料からタンパク質試料を調製し、該タンパク質試料に含まれるGRK5の量を測定する。このような方法としては、当業者に周知の方法、例えば、酵素結合免疫測定法(ELISA)、二重モノクローナル抗体サンドイッチイムノアッセイ法、モノクローナルポリクローナル抗体サンドイッチアッセイ法、免疫蛍光法、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、プロテインチップによる解析法（蛋白質 核酸 酵素 Vol.47 No.5（2002）、蛋白質 核酸 酵素 Vol.47 No.8（2002））、2次元電気泳動法、SDSポリアクリルアミド電気泳動法が挙げられるが、これらに限定されない。【００４７】
遺伝子の発現量を、該遺伝子の転写産物（mRNA）の生成量を指標として測定する場合、例えば、被検試料からRNA試料を調製し、該RNA試料に含まれるGRK5をコードするRNAの量を測定する。また、被検試料からcDNA試料を調製し、該cDNA試料に含まれるGRK5をコードするcDNAの量を測定することによって、発現量を評価することも可能である。被検試料からのRNA試料やcDNA試料は、被検者由来の生体試料から、当業者に周知の方法で調製することができる。このような方法としては、当業者に周知の方法、例えばノーザンブロッティング法、RT-PCR法、DNAアレイ法等を挙げることができる。【００４８】
なお、上記「対照」とは、通常、健常者由来の生体試料におけるGRK5遺伝子の発現量を指す。なお、本発明におけるGRK5遺伝子の発現とは、GRK5遺伝子から転写されるmRNAの発現、またはGRK5遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の両方を意味するものである。【００４９】
また本発明は、被検者について、GRK5遺伝子における変異を検出することを特徴とする、パーキンソン病に対して感受性か否かの検査方法を提供する。【００５０】
本発明において「パーキンソン病に対して感受性か否かの検査」とは、被検者についてパーキンソン病に罹患する可能性が高いか低いかを判定するための検査が含まれる。本発明の方法においては、GRK5遺伝子において変異が検出された場合に、被検者はパーキンソン病に対して感受性である、あるいは感受性の素因を有する（パーキンソン病の素因を有する）と判定される。または、パーキンソン病に対して抵抗性ではない、あるいは抵抗性の素因を有さないと判定される。【００５１】
一方、GRK5遺伝子において変異が検出されない場合に、被検者はパーキンソン病に対して抵抗性である、あるいは抵抗性の素因を有すると判定される。または、パーキンソン病に対して感受性ではない、あるいは感受性の素因を有さないと判定される。【００５２】
本発明の方法により、パーキンソン病を罹患していない被検者であっても、パーキンソン病を罹患する可能性が高いか低いかを判定することができる。【００５３】
なお、本明細書で用いられる「治療」とは、通常、薬理学的なおよび／または生理学的な効果を得ることを意味する。効果とは、疾患や症状を完全にあるいは部分的に妨げる点で予防的であってもよく、疾患の症状を完全にあるいは部分的に治療する点で治療的であっても良い。本明細書における「治療」とは、哺乳類、特にヒトにおける疾患の治療すべてを含んでいる。そしてさらに、疾患の素因があるが未だ発病していると診断されていない被検者の発病の予防、疾患の進行を抑制すること、または疾患を軽減させること、発症を遅らせることなどもこの「治療」に含まれる。【００５４】
パーキンソン病は、高齢者に好発し老人病の一面をもつ。発症後は緩やかに病状が進行し、患者は寝たきりになることが多く、本人や介護者のQOLを著しく損なう。そのため、本発明の検査方法により、パーキンソン病に対して感受性か否かを判定し、パーキンソン病に対して感受性であると判定された患者は、発症する前に適切な治療を選択し、パーキンソン病の発症を事前に予防することができると考えられる。本発明により提供される、パーキンソン病治療のための医薬をスクリーニングする方法、並びに該医薬により、疾患の進行を事前に予防あるいは抑制することが可能になれば、高齢者にパーキンソン病が発症した場合にも寝たきりの状態とならない可能性が高い。寝たきりになるまでの期間を延ばすことができるだけでも、患者および介護者の双方にとってQOLの著しい向上が見込まれる。【００５５】
本発明のGRK5遺伝子のDNA配列としては、具体的には、例えば配列番号：１に記載の配列が挙げられる。配列番号：１に記載の配列は、mapping info(NCBI build34)の結果に基づいて作製された配列である。【００５６】
上記本発明の検査方法における「変異」の位置は、予め規定することは困難であるが、通常、上記GRK5遺伝子のORF中、あるいは上記遺伝子の発現を制御する領域（例えば、プロモーター領域、エンハンサー領域、イントロン等）中に存在するが、これらに限定されるものではない。また、この「変異」とは、通常、上記遺伝子の発現量を亢進させる、mRNAの安定性を向上させる、あるいは上記遺伝子によってコードされるタンパク質の有する活性を上昇させるような変異であることが好ましい。本発明の変異の種類としては、例えば、塩基の付加、欠失、置換、挿入変異等を挙げることができる。【００５７】
本発明者らは、被検者におけるGRK5遺伝子において、パーキンソン病に対して有意に関連する多型変異を見出すことに成功した。従って、GRK5遺伝子上の多型部位について変異の有無を指標とする（塩基種を決定する）ことにより、パーキンソン病に対して感受性か否かの検査を行なうことが可能である。【００５８】
本発明の好ましい態様においては、本発明のGRK5遺伝子における多型変異を検出することを特徴とする、パーキンソン病に対して感受性か否かを検査する方法である。【００５９】
多型とは、遺伝学的には、人口中1 %以上の頻度で存在している1遺伝子におけるある塩基の変化と一般的に定義されるが、本発明における「多型」は、この定義に制限されない。本発明における多型の種類としては、例えば、一塩基多型、一から数十塩基（時には数千塩基）が欠失あるいは挿入している多型等が挙げられる。さらに、多型部位の数も、1個に限定されず、複数個の多型であってもよい。【００６０】
また本発明は、被検者について、本発明のGRK5遺伝子における多型部位の塩基種を決定することを特徴とする、パーキンソン病に対して感受性か否かを検査する方法を提供する。【００６１】
本発明のパーキンソン病に対して感受性か否かを検査する方法における「多型部位」は、本発明のGRK5遺伝子上、もしくはその周辺領域に存在する多型であれば、特に制限されない。GRK5遺伝子上に見出される多型部位に関する情報をリスト１にまとめて示す。リストに含まれる各項目（染色体、位置、配列番号：１上の位置、rs ID、タイプ）は、スラッシュ（／）で区切って示す。リスト中「SNP」は一塩基多型変異を、「INDEL」は挿入・欠失変異を表す。【００６２】
〔リスト１〕
染色体／位置／配列（配列番号：１）上の位置／rs ID／タイプ
chr10／120706285／1／rs11198856／SNP
chr10／120706320／36／rs10510056／SNP
chr10／120706320／36／Affymetrix399365／SNP
chr10／120706622／338／rs11198857／SNP
chr10／120707388／1104／rs11198858／SNP
chr10／120707671／1387／rs4752271／SNP
chr10／120708336／2052／rs12269098／SNP
chr10／120708545／2261／rs11198859／SNP
chr10／120709991／3707／rs11198860／SNP
chr10／120710452／4168／rs4752272／SNP
chr10／120711288／5004／rs7393379／SNP
chr10／120711918／5634／rs4752273／SNP
chr10／120712172／5888／rs4752274／SNP
chr10／120712327／6043／rs10886438／SNP
chr10／120712357／6073／rs4751708／SNP
chr10／120713501／7217／rs12264832／SNP
chr10／120713550／7266／rs10749311／SNP
chr10／120713666／7382／rs4752275／SNP
chr10／120713840／7556／rs12250478／SNP
chr10／120714152／7868／rs10886439／SNP
chr10／120714310／8026／rs10886440／SNP
chr10／120714406／8122／rs11198861／SNP
chr10／120714432／8148／rs7097022／SNP
chr10／120714463／8179／rs11198862／SNP
chr10／120714605／8321／rs9325563／SNP
chr10／120714842／8558／rs4752277／SNP
chr10／120714895／8611／rs7097630／SNP
chr10／120715363／9079／rs11198863／SNP
chr10／120715387／9103／rs11198864／SNP
chr10／120716711／10427／rs4752278／SNP
chr10／120716745／10461／rs4752279／SNP
chr10／120716825／10541／rs4752280／SNP
chr10／120716949／10665／rs11312254／INDEL
chr10／120716953／10669／rs10712644／INDEL
chr10／120716960／10676／rs11341250／INDEL
chr10／120717175／10891／rs6585542／SNP
chr10／120717320／11036／rs7910100／SNP
chr10／120717495／11211／rs10128498／SNP
chr10／120718729／12445／rs4752281／SNP
chr10／120718965／12681／rs10886442／SNP
chr10／120719165／12881／rs10437460／SNP
chr10／120719200／12916／rs10886443／SNP
chr10／120719688／13404／rs2168222／SNP
chr10／120719745／13461／rs2168221／SNP
chr10／120720016／13732／rs11198867／SNP
chr10／120721366／15082／rs11815427／SNP
chr10／120721920／15636／rs4752282／SNP
chr10／120723046／16762／rs10886444／SNP
chr10／120723893／17609／rs7905833／SNP
chr10／120723894／17610／rs10532699／INDEL
chr10／120723903／17619／rs5788340／INDEL
chr10／120723910／17626／rs10589661／INDEL
chr10／120723921／17637／rs3981127／INDEL
chr10／120723934／17650／rs1889743／SNP
chr10／120724932／18648／rs12252114／SNP
chr10／120726262／19978／rs7904422／SNP
chr10／120726441／20157／rs7080426／SNP
chr10／120726655／20371／rs10886445／SNP
chr10／120726680／20396／rs11198868／SNP
chr10／120727294／21010／rs1473799／SNP
chr10／120727786／21502／rs4751709／SNP
chr10／120728177／21893／rs12256695／SNP
chr10／120728359／22075／rs7913639／SNP
chr10／120728383／22099／rs10637086／INDEL
chr10／120728428／22144／rs12412957／SNP
chr10／120728458／22174／rs7913438／SNP
chr10／120728727／22443／rs12249291／SNP
chr10／120729190／22906／rs12571005／SNP
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chr10／120785820／79536／rs10787958／SNP
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chr10／120785999／79715／rs4752296／SNP
chr10／120786057／79773／rs1671438／SNP
chr10／120788190／81906／rs291971／SNP
chr10／120788220／81936／rs291970／SNP
chr10／120789088／82804／rs884970／SNP【００６３】
本発明のパーキンソン病に対して感受性か否かの検査方法に利用可能な多型部位としては、上記の多型部位の中でも、GRK5遺伝子もしくは該遺伝子の周辺領域上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における27377位（m22）、34799位（m22.1）、54748位（m23）、60001位（m24）のいずれかの多型部位が好ましい。（なお、本明細書においては、上述の多型部位を単に『本発明の多型部位』と記載する場合がある）。【００６４】
なお、当業者においては掲載されたdbSNPデータベースのrs番号をもとに、当該部位についての塩基種の情報を適宜取得することができる。また、SNP IDの記載内容は、先頭にrsが付くものはdbSNPデータベースの登録IDのうちNCBIにより一配列に一意に定まるIDを付与されたものである。また、dbSNPデータベースはウェブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/index.html）に公開されており、SNP IDに記載された登録ID番号を用いてウェブサイト上で検索することにより、塩基配列におけるSNPsの詳細な情報（例えば、染色体上の位置、多型部位の塩基の種類、前後の配列等）が入手できる。これらの情報を用いた場合、当業者においては、本発明に記載する検査を容易に行うことができる。【００６５】
当業者においては、通常、本明細書において開示された多型に付与された登録ID番号、例えばdbSNPデータベースにおけるrs番号によって、本発明の多型部位の実際のゲノム上の位置および前後の配列等を容易に知ることができる。これによって、知ることができない場合であっても、当業者においては、配列番号：１で示される塩基配列および多型部位等に関する情報から、適宜、該多型部位に相当する実際のゲノム上の位置を知ることは容易である。例えば、公開されているゲノムデータベース等と照会することにより、本発明の多型部位のゲノム上の位置を知ることができる。即ち、配列表に記載の塩基配列とゲノム上の実際の塩基配列との間に若干の塩基配列の相違がみられた場合であっても、配列表に記載の塩基配列を基にゲノム配列と相同性検索等を行うことにより、本発明の多型部位について、実際のゲノム上の位置を正確に知ることが可能である。また、ゲノム上の位置が特定できない場合でも、本明細書に記載の配列表および多型部位の情報から本発明に記載する検査を行うことは容易である。【００６６】
また、ゲノムDNAは、通常、互いに相補的な二本鎖DNA構造を有している。従って、本明細書においては、便宜的に一方の鎖におけるDNA配列を示した場合であっても、当然の如く、当該配列（塩基）に相補的な配列も開示したものと解釈される。当業者にとって、一方のDNA配列（塩基）が判れば、該配列（塩基）に相補的な配列（塩基）は自明である。なお、現在ヒトゲノム配列については、ほぼ最終版といわれているヒトゲノム国際プロジェクトbuild34が発表されており、本明細書に記した配列等はヒトゲノム国際プロジェクトbuild34の結果に基づいている。【００６７】
本発明のパーキンソン病に対して感受性か否かの検査方法においては、以下に記載の多型部位について検査を行なうことが好ましい。
（１）GRK5遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における27377位（m22）、34799位（m22.1）、54748位（m23）、60001位（m24）のいずれかの多型部位が好ましい。【００６８】
また本発明のさらに好ましい態様においては、パーキンソン病に対して感受性か否かの検査方法においては、以下の（１）および／または（２）に記載の多型部位について検査を行う。
（１）GRK5遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における34799位の多型部位
（２）GRK5遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における60001位の多型部位
本発明の上記（１）および（２）に記載の多型部位における塩基種が、それぞれ以下の（１b）〜（２b）である場合に、被検者はパーキンソン病に対して感受性であると判定される。被検者のパーキンソン病罹患の有無に関係無く、パーキンソン病に対して感受性か否かの判定を行うことができる。
（１b）〜（２b）である場合に、被検者はパーキンソン病に感受性であると判定される検査方法。
（１b）GRK5遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における34799位の塩基種がＧ
（２b）GRK5遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における60001位の塩基種がＣ【００６９】
本発明においては、上記多型部位以外であっても、該多型部位とその周辺のDNA領域は強く連鎖しているものと考えられることから、上記多型部位の近傍の多型部位について塩基種を決定することによっても、パーキンソン病に対して感受性か否かの検査が可能である。即ち、多型部位の塩基種が上記（１b）〜（２b）の塩基種であるような、パーキンソン病に罹患している患者を含むヒトの小集団について、この「近傍の多型部位」（例えば、上記リスト１に記載の多型部位）における塩基種を予め決定する。【００７０】
次いで、この「近傍の多型部位」について被検者における塩基種を決定し、予め決定された前記塩基種と比較することにより、パーキンソン病に対して感受性か否かの検査を行うことができる。予め決定された塩基種と同一の塩基種である場合に、被検者はパーキンソン病に対して感受性であると判定される。本発明の検査方法により、被検者のパーキンソン病に対して感受性か否かを判定することができ、治療方針の決定や薬剤投与量の決定等に利用することができる。【００７１】
例えば、GRK5遺伝子上の配列番号：１に記載の塩基配列における34799位の多型部位の塩基種がＧであるパーキンソン病を発症している人を含むヒトの小集団について、近傍の多型部位、例えば33994位の多型部位の塩基種を決定する。この部位の塩基種が上記のパーキンソン病を発症している人においてＡである頻度が、上記パーキンソン病を発症していない人に比べ高かった場合、被検者について33994位の多型部位の塩基種を調べ、この部位の塩基種が同様にＡであった場合には、被検者はパーキンソン病に対して感受性である（感受性の素因を有する）と判定される。【００７２】
以上のように、本発明により、パーキンソン病に関連する遺伝子上の領域が明らかになったことにより、当業者に過度の負担を強いることなく、上記パーキンソン病に対する感受性について検査を行うことができる。【００７３】
また、ヒトゲノムの解析が進み全塩基配列やSNP、マイクロサテライト、VNTR、RFLPsなどの多型情報も充実してきた。ゲノムの塩基配列について詳細が明らかになりつつある現在、最大の関心事は遺伝子あるいは特定の配列と機能（疾患・疾患の進行性などの表現型）との関連を解析することである。これを解決するための有力な手法の一つがハプロタイプを用いた遺伝統計学的解析である。【００７４】
ヒトの染色体は２本１組で存在し、それぞれ父親と母親から由来している。ハプロタイプとは、その一方に関する個体の遺伝子型の組み合わせをいい、それぞれ父母由来の１本の染色体上に遺伝子座がどのように並んでいるかを示すものである。染色体を父母から１本ずつ受け継ぐので、配偶子形成の際に組み換えが起きないとすれば１本の染色体上にのっている遺伝子は必ず一緒に子に伝えられる、すなわち連鎖する事になる。しかし、実際は減数分裂の際に組み換えが起きるため、１本の染色体上にのっている遺伝子であっても必ずしも連鎖しているわけではない。しかし逆に、遺伝的組み換えが起きた場合であっても同一染色体上の距離が近い遺伝子座は強く連鎖する。【００７５】
このような現象を集団において観察し、アリルの非独立が認められる事を連鎖不平衡という。例えば、３つの遺伝子座を観察した場合、これらの間に連鎖不平衡がないとすると、存在するハプロタイプは２3通りと予測され、それぞれの頻度は各遺伝子座の頻度から予測される値となるが、連鎖不平衡がある場合には２3通りより少ないハプロタイプしか存在せず、その頻度も予測と異なる値を示す結果となる。【００７６】
近年、ハプロタイプが連鎖不平衡解析に有用である事が示されており（Genetic Epidemiology 23:221-233）研究が行われているが、ゲノム上には組換えが起きやすい部位と起きにくい部位があり、１つの領域として先祖から子孫へと伝えられる部分（ハプロタイプによって特定される領域）は人種を越えて共通性がある事が明らかになっている（Science 226, 5576:2225-2229）。即ち、強く連鎖するDNA領域が存在し、この領域は一般的にDNAブロックと呼ばれる。本発明においては、本発明の多型部位を含むDNAブロックの存在の有無を検出することによっても、パーキンソン病に対して感受性か否かの検査を行うことができる。【００７７】
即ち本発明の好ましい態様においては、以下に記載のハプロタイプを示すDNAブロックの存在が検出された場合に、パーキンソン病に対して感受性であるものと判定されることを特徴とする、パーキンソン病に対して感受性か否かを検査する方法を提供する。
（１’）GRK5遺伝子上の多型部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における27377位、54748位、及び60001位の多型部位の塩基種が、それぞれＧ、Ａ、およびＣであるハプロタイプ【００７８】
本発明において、DNAブロックとは、各遺伝子座間で強い連鎖不平衡を示す部位（領域）を指す。パーキンソン病と関連するDNAブロックが見出されれば、該DNAブロックを検出することにより、パーキンソン病に対して感受性か否かの検査が可能となる。【００７９】
パーキンソン病と関連するハプロタイプ（を示すDNAブロック）が見出されれば、該ハプロタイプを検出することにより、パーキンソン病に対して感受性か否かの検査が可能となる。本発明者らは、鋭意研究により、パーキンソン病に対する感受性と関連するハプロタイプを見出すことに成功した。【００８０】
従って、本発明はGRK5遺伝子上に存在する、パーキンソン病と関連するハプロタイプ（を示すDNAブロック）を検出することを特徴とする、パーキンソン病に対して感受性か否かの検査方法を提供する。【００８１】
本方法においては、被検者について「パーキンソン病と関連するハプロタイプ」を検出することで、パーキンソン病に対して感受性か否かを判定することができる。これらの判定は例えば治療方針の決定等に利用することができる。【００８２】
上記「パーキンソン病と関連するハプロタイプ（を示すDNAブロック）」とは、具体的には以下のようなハプロタイプ（を示すDNAブロック）を挙げることができる。
（１’）GRK5遺伝子上の多型部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における27377位、54748位、及び60001位の多型部位の塩基種が、それぞれＧ、Ａ、およびＣであるハプロタイプ【００８３】
上記方法の好ましい態様においては、以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、被検者がパーキンソン病に対して感受性か否かの検査方法である。
（ａ）  被検者におけるGRK5遺伝子上の多型部位について、塩基種を決定する工程、
（ｂ）（ａ）で決定された塩基種が、以下の（１’）に記載のハプロタイプを示すGRK5遺伝子における前記多型部位の塩基種と同一であった場合に、パーキンソン病に対して感受性であるものと判定する工程
（１’）GRK5遺伝子上の多型部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における27377位、54748位、および60001位の多型部位の塩基種が、それぞれＧ、Ａ、およびＣであるハプロタイプ【００８４】
なお、上記工程（ａ）における多型部位としては、例えば、上記リスト１に記載の各多型部位を挙げることができるが、好ましくは、以下の部位を示すことができる。
（１）GRK5遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における27377位、27849位、27876位、28813位、29000位、29855位、30366位、31037位、31706位、31964位、32542位、32723位、32988位、33064位、33618位、33889位、33911位、33994位、34799位、35173位、35188位、35189位、35190位、35240位、35284位、35402位、35415位、35494位、35522位、36405位、36433位、36449位、36546位、36817位、36868位、36882位、37004位、37148位、37295位、37413位、37722位、38393位、39182位、39193位、39301位、39316位、39456位、39487位、39550位、39638位、40097位、40134位、40193位、41149位、41157位、41428位、41498位、41618位、41667位、41843位、42364位、42418位、43017位、43037位、43190位、44600位、44607位、45522位、45998位、48284位、49971位、50122位、50873位、51463位、52944位、53223位、53397位、53703位、53763位、54267位、54748位、54782位、54794位、55139位、55457位、55627位、56254位、56593位、57338位、57606位、57648位、57688位、57843位、57978位、58067位、58456位、58616位、59263位、59908位、60001位のいずれかの多型部位【００８５】
好ましくは、上記工程（ａ）の多型部位として、例えば以下の（１）または（２）に記載の部位を示すことができる。
（１）GRK5遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における34799位の多型部位
（２）GRK5遺伝子上の部位であって、配列番号：１に記載の塩基配列における60001位の多型部位【００８６】
本発明の多型部位における塩基種の決定は、当業者においては種々の方法によって行うことができる。一例を示せば、本発明の多型部位を含むDNAの塩基配列を直接決定することによって行うことができる。【００８７】
本発明の検査方法に供する被検試料は、通常、予め被検者から取得された生体試料であることが好ましい。生体試料としては、例えばDNA試料を挙げることができる。本発明においてDNA試料は、例えば被検者の血液、皮膚、口腔粘膜、手術により採取あるいは切除した組織または細胞、検査等の目的で採取された体液等から抽出した染色体DNA、あるいはRNAを基に調製することができる。【００８８】
即ち本発明は、通常、被検者由来の生体試料（予め被検者から取得された生体試料）を被検試料として検査に供する方法である。【００８９】
当業者においては、公知の技術を用いて、適宜、生体試料の調製を行うことができる。例えば、DNA試料は、本発明の多型部位を含むDNAにハイブリダイズするプライマーを用いて、染色体DNA、あるいはRNAを鋳型としたPCR等によって調製することができる。【００９０】
本方法においては、次いで、単離したDNAの塩基配列を決定する。単離したDNAの塩基配列の決定は、当業者においては、DNAシークエンサー等を用いて容易に実施することができる。【００９１】
本発明の多型部位は、通常、その部位の塩基種のバリエーションが既に明らかになっている。本発明における「塩基種の決定」とは、必ずしもその多型部位についてＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃのいずれかの塩基種であるかを判別することを意味するものではない。例えば、ある多型部位について塩基種のバリエーションがＡまたはＧであることが判明している場合には、その部位の塩基種が「Ａでない」もしくは「Ｇでない」ことが判明すれば充分である。【００９２】
予め塩基のバリエーションが明らかにされている多型部位について、その塩基種を決定するための様々な方法が公知である。本発明の塩基種の決定のための方法は、特に限定されない。例えば、PCR法を応用した解析方法として、TaqMan PCR法、AcycloPrime法、およびMALDI-TOF/MS法等が実用化されている。またPCRに依存しない塩基種の決定法としてInvader法やRCA法が知られている。更にDNAアレイを使って塩基種を決定することもできる。以下にこれらの方法について簡単に述べる。ここに述べた方法は、いずれも本発明における多型部位の塩基種の決定に応用できる。【００９３】
［TaqMan PCR法］
TaqMan PCR法の原理は次のとおりである。TaqMan PCR法は、アリルを含む領域を増幅することができるプライマーセットと、TaqManプローブを利用した解析方法である。TaqManプローブは、このプライマーセットによって増幅されるアリルを含む領域にハイブリダイズするように設計される。【００９４】
TaqManプローブのTmに近い条件で標的塩基配列にハイブリダイズさせれば、１塩基の相違によってTaqManプローブのハイブリダイズ効率は著しく低下する。TaqManプローブの存在下でPCR法を行うと、プライマーからの伸長反応は、いずれハイブリダイズしたTaqManプローブに到達する。このときDNAポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性によって、TaqManプローブはその5'末端から分解される。TaqManプローブをレポーター色素とクエンチャーで標識しておけば、TaqManプローブの分解を、蛍光シグナルの変化として追跡することができる。つまり、TaqManプローブの分解が起きれば、レポーター色素が遊離してクエンチャーとの距離が離れることによって蛍光シグナルが生成する。１塩基の相違のためにTaqManプローブのハイブリダイズが低下すればTaqManプローブの分解が進まず蛍光シグナルは生成されない。【００９５】
多型に対応するTaqManプローブをデザインし、更に各プローブの分解によって異なるシグナルが生成されるようにすれば、同時に塩基種の判定を行うこともできる。例えば、レポーター色素として、あるアリルのアリルＡのTaqManプローブに6-carboxy-fluorescein(FAM)を、アリルＢのプローブにVICを用いる。プローブが分解されない状態では、クエンチャーによってレポーター色素の蛍光シグナル生成は抑制されている。各プローブが対応するアリルにハイブリダイズすれば、ハイブリダイズに応じた蛍光シグナルが観察される。すなわち、FAMまたはVICのいずれかのシグナルが他方よりも強い場合には、アリルＡまたはアリルＢのホモであることが判明する。他方、アリルをヘテロで有する場合には、両者のシグナルがほぼ同じレベルで検出されることになる。TaqMan PCR法の利用によって、ゲル上での分離のような時間のかかる工程無しで、ゲノムを解析対象としてPCRと塩基種の決定を同時に行うことができる。そのため、TaqMan PCR法は、多くの被検者についての塩基種を決定できる方法として有用である。【００９６】
［AcycloPrime法］
PCR法を利用した塩基種を決定する方法として、AcycloPrime法も実用化されている。AcycloPrime法では、ゲノム増幅用のプライマー１組と、多型検出用の１つのプライマーを用いる。まず、ゲノムの多型部位を含む領域をPCRで増幅する。この工程は、通常のゲノムPCRと同じである。次に、得られたPCR産物に対して、SNPs検出用のプライマーをアニールさせ、伸長反応を行う。SNPs検出用のプライマーは、検出対象となっている多型部位に隣接する領域にアニールするようにデザインされている。【００９７】
このとき、伸長反応のためのヌクレオチド基質として、蛍光偏光色素でラベルし、かつ3'-OHをブロックしたヌクレオチド誘導体（ターミネータ）を用いる。その結果、多型部位に相当する位置の塩基に相補的な塩基が１塩基だけ取りこまれて伸長反応が停止する。ヌクレオチド誘導体のプライマーへの取りこみは、分子量の増大による蛍光偏光(Fluorescence polarization;FP)の増加によって検出することができる。蛍光偏光色素に波長の異なる２種類のラベルを用いれば、特定のSNPsが２種類の塩基のうちのいずれであるのかを特定することができる。蛍光偏光のレベルは定量することができるので、１度の解析でアリルがホモかヘテロかを判定することもできる。【００９８】
［MALDI-TOF/MS法］
PCR産物をMALDI-TOF/MSで解析することによって塩基種の決定を行うこともできる。MALDI-TOF/MSは、分子量をきわめて正確に知ることができるため、タンパク質のアミノ酸配列や、DNAの塩基配列のわずかな相違を明瞭に識別することができる解析手法として様々な分野で利用されている。MALDI-TOF/MSによる塩基種の決定のためには、まず解析対象であるアリルを含む領域をPCRで増幅する。次いで増幅産物を単離してMALDI-TOF/MSによってその分子量を測定する。アリルの塩基配列は予めわかっているので、分子量に基づいて増幅産物の塩基配列は一義的に決定される。【００９９】
MALDI-TOF/MSを利用した塩基種の決定には、PCR産物の分離工程などが必要となる。しかし標識プライマーや標識プローブを使わないで、正確な塩基種の決定が期待できる。また複数の場所の多型の同時検出にも応用することができる。【０１００】
［IIs型制限酵素を利用したSNPs特異的な標識方法］
PCR法を利用した更に高速な塩基種の決定が可能な方法も報告されている。例えば、IIs型制限酵素を利用して多型部位の塩基種の決定が行われている。この方法においては、PCRにあたり、IIs型制限酵素の認識配列を有するプライマーが用いられる。遺伝子組み換えに利用される一般的な制限酵素（II型）は、特定の塩基配列を認識して、その塩基配列中の特定部位を切断する。これに対してIIs型の制限酵素は、特定の塩基配列を認識して、認識塩基配列から離れた部位を切断する。酵素によって、認識配列と切断個所の間の塩基数は決まっている。従って、この塩基数の分だけ離れた位置にIIs型制限酵素の認識配列を含むプライマーがアニールするようにすれば、IIs型制限酵素によってちょうど多型部位で増幅産物を切断することができる。【０１０１】
IIs型制限酵素で切断された増幅産物の末端には、SNPsの塩基を含む付着末端(conhesive end)が形成される。ここで、増幅産物の付着末端に対応する塩基配列からなるアダプターをライゲーションする。アダプターは、多型変異に対応する塩基を含む異なる塩基配列からなり、それぞれ異なる蛍光色素で標識しておくことができる。最終的に、増幅産物は多型部位の塩基に対応する蛍光色素で標識される。【０１０２】
前記IIs型制限酵素認識配列を含むプライマーに、捕捉プライマー(capture primer)を組み合せてPCR法を行えば、増幅産物は蛍光標識されるとともに、捕捉プライマーを利用して固相化することができる。例えばビオチン標識プライマーを捕捉プライマーとして用いれば、増幅産物はアビジン結合ビーズに捕捉することができる。こうして捕捉された増幅産物の蛍光色素を追跡することにより、塩基種を決定することができる。【０１０３】
［磁気蛍光ビーズを使った多型部位における塩基種の決定］
複数のアリルを単一の反応系で並行して解析することができる技術も公知である。複数のアリルを並行して解析することは、多重化と呼ばれている。一般に蛍光シグナルを利用したタイピング方法では、多重化のために異なる蛍光波長を有する蛍光成分が必要である。しかし実際の解析に利用することができる蛍光成分は、それほど多くない。これに対して、樹脂等に複数種の蛍光成分を混合した場合には、限られた種類の蛍光成分であっても、相互に識別可能な多様な蛍光シグナルを得ることができる。更に、樹脂中に磁気で吸着される成分を加えれば蛍光を発するとともに、磁気によって分離可能なビーズとすることができる。このような磁気蛍光ビーズを利用した、多重化多型タイピングが考え出された(バイオサイエンスとバイオインダストリー, Vol.60 No.12, 821-824)。【０１０４】
磁気蛍光ビーズを利用した多重化多型タイピングにおいては、各アリルの多型部位に相補的な塩基を末端に有するプローブが磁気蛍光ビーズに固定化される。各アリルにそれぞれ固有の蛍光シグナルを有する磁気蛍光ビーズが対応するように、両者は組み合せられる。一方、磁気蛍光ビーズに固定されたプローブが相補配列にハイブリダイズしたときに、当該アリル上で隣接する領域に相補的な塩基配列を有する蛍光標識オリゴDNAを調製する。【０１０５】
アリルを含む領域を非対称PCRによって増幅し、上記の磁気蛍光ビーズ固定化プローブと蛍光標識オリゴDNAをハイブリダイズさせ、更に両者をライゲーションする。磁気蛍光ビーズ固定化プローブの末端が、多型部位の塩基に相補的な塩基配列であった場合には効率的にライゲーションされる。逆にもしも多型のために末端の塩基が異なれば、両者のライゲーション効率は低下する。その結果、各磁気蛍光ビーズには、試料が当該磁気蛍光ビーズに相補的な塩基種であった場合に限り、蛍光標識オリゴDNAが結合する。【０１０６】
磁気によって磁気蛍光ビーズを回収し、更に各磁気蛍光ビーズ上の蛍光標識オリゴDNAの存在を検出することにより、塩基種が決定される。磁気蛍光ビーズは、フローサイトメーターでビーズ毎に蛍光シグナルを解析できるので、多種類の磁気蛍光ビーズが混合されていてもシグナルの分離は容易である。つまり、多種類の多型部位について、単一の反応容器で並行して解析する「多重化」が達成される。【０１０７】
［Invader法］
PCR法に依存しないジェノタイピングのための方法も実用化されている。例えば、Invader法では、アリルプローブ、インベーダープローブ、およびFRETプローブの３種類のオリゴヌクレオチドと、cleavaseと呼ばれる特殊なヌクレアーゼのみで、塩基種の決定を実現している。これらのプローブのうち標識が必要なのはFRETプローブのみである。【０１０８】
アリルプローブは、検出すべきアリルに隣接する領域にハイブリダイズするようにデザインされる。アリルプローブの5'側には、ハイブリダイズに無関係な塩基配列からなるフラップが連結されている。アリルプローブは多型部位の3'側にハイブリダイズし、多型部位の上でフラップに連結する構造を有する。【０１０９】
一方インベーダープローブは、多型部位の5'側にハイブリダイズする塩基配列からなっている。インベーダープローブの塩基配列は、ハイブリダイズによって3'末端が多型部位に相当するようにデザインされている。インベーダープローブにおける多型部位に相当する位置の塩基は任意で良い。つまり、多型部位を挟んでインベーダープローブとアリルプローブとが隣接してハイブリダイズするように両者の塩基配列はデザインされている。【０１１０】
多型部位がアリルプローブの塩基配列に相補的な塩基であった場合には、インベーダープローブとアリルプローブの両者がアリルにハイブリダイズすると、アリルプローブの多型部位に相当する塩基にインベーダープローブが侵入(invasion)した構造が形成される。cleavaseは、このようにして形成された侵入構造を形成したオリゴヌクレオチドのうち、侵入された側の鎖を切断する。切断は侵入構造の上で起きるので、結果としてアリルプローブのフラップが切り離されることになる。一方、もしも多型部位の塩基がアリルプローブの塩基に相補的でなかった場合には、多型部位におけるインベーダープローブとアリルプローブの競合は無く、侵入構造は形成されない。したがってcleavaseによるフラップの切断が起こらない。【０１１１】
FRETプローブは、こうして切り離されたフラップを検出するためのプローブである。FRETプローブは5'末端側に自己相補配列を有し、3'末端側に１本鎖部分が配置されたヘアピンループを構成している。FRETプローブの3'末端側に配置された１本鎖部分は、フラップに相補的な塩基配列からなっていて、ここにフラップがハイブリダイズすることができる。フラップがFRETプローブにハイブリダイズすると、FRETプローブの自己相補配列の5'末端部分にフラップの3'末端が侵入した構造が形成されるように両者の塩基配列がデザインされている。cleavaseは侵入構造を認識して切断する。FRETプローブのcleavaseによって切断される部分を挟んで、TaqMan PCRと同様のレポーター色素とクエンチャーで標識しておけば、FRETプローブの切断を蛍光シグナルの変化として検知することができる。【０１１２】
なお、理論的には、フラップは切断されない状態でもFRETプローブにハイブリダイズするはずである。しかし実際には、切断されたフラップとアリルプローブの状態で存在しているフラップとでは、FRETに対する結合効率に大きな差が有る。そのため、FRETプローブを利用して、切断されたフラップを特異的に検出することは可能である。【０１１３】
Invader法に基づいて塩基種を決定するためには、アリルＡとアリルＢのそれぞれに相補的な塩基配列を含む、２種類のアリルプローブを用意すれば良い。このとき両者のフラップの塩基配列は異なる塩基配列とする。フラップを検出するためのFRETプローブも２種類を用意し、それぞれのレポーター色素を識別可能なものとしておけば、TacMan PCR法と同様の考え方によって、塩基種を決定することができる。【０１１４】
Invader法の利点は、標識の必要なオリゴヌクレオチドがFRETプローブのみであることである。FRETプローブは検出対象の塩基配列とは無関係に、同一のオリゴヌクレオチドを利用することができる。従って、大量生産が可能である。一方アリルプローブとインベーダープローブは標識する必要が無いので、結局、ジェノタイピングのための試薬を安価に製造することができる。【０１１５】
［RCA法］
PCR法に依存しない塩基種の決定方法として、RCA法を挙げることができる。鎖置換作用を有するDNAポリメラーゼが、環状の１本鎖DNAを鋳型として、長い相補鎖を合成する反応に基づくDNAの増幅方法が、Rolling Circle Amplification(RCA)法である(Lizardri PM et al.,Nature Genetics 19, 225, 1998)。RCA法においては、環状DNAにアニールして相補鎖合成を開始するプライマーと、このプライマーによって生成する長い相補鎖にアニールする第２のプライマーを利用して、増幅反応を構成している。【０１１６】
RCA法には、鎖置換作用を有するDNAポリメラーゼが利用されている。そのため、相補鎖合成によって２本鎖となった部分は、より5'側にアニールした別のプライマーから開始した相補鎖合成反応によって置換される。例えば、環状DNAを鋳型とする相補鎖合成反応は、１周分では終了しない。先に合成した相補鎖を置換しながら相補鎖合成は継続し、長い１本鎖DNAが生成される。一方、環状DNAを鋳型として生成した長い１本鎖DNAには、第２のプライマーがアニールして相補鎖合成が開始する。RCA法において生成される１本鎖DNAは、環状のDNAを鋳型としていることから、その塩基配列は同じ塩基配列の繰り返しである。従って、長い１本鎖の連続的な生成は、第２のプライマーの連続的なアニールをもたらす。その結果、変性工程を経ることなく、プライマーがアニールすることができる１本鎖部分が連続的に生成される。こうして、DNAの増幅が達成される。【０１１７】
RCA法に必要な環状１本鎖DNAが多型部位の塩基種に応じて生成されれば、RCA法を利用して塩基種の決定をすることができる。そのために、直鎖状で１本鎖のパドロックプローブが利用される。パドロックプローブは、5'末端と3'末端に検出すべき多型部位の両側に相補的な塩基配列を有している。これらの塩基配列は、バックボーンと呼ばれる特殊な塩基配列からなる部分で連結されている。多型部位がパドロックプローブの末端に相補的な塩基配列であれば、アリルにハイブリダイズしたパドロックプローブの末端をDNAリガーゼによってライゲーションすることができる。その結果、直鎖状のパドロックプローブが環状化され、RCA法の反応がトリガーされる。DNAリガーゼの反応は、ライゲーションすべき末端部分が完全に相補的でない場合には反応効率が著しく低下する。従って、ライゲーションの有無をRCA法で確認することによって、多型部位の塩基種の決定が可能である。【０１１８】
RCA法は、DNAを増幅することはできるが、そのままではシグナルを生成しない。また増幅の有無のみを指標とするのでは、アリル毎に反応を行わなければ、通常、塩基種を決定することができない。これらの点を塩基種の決定のために改良した方法が公知である。例えば、モレキュラービーコンを利用して、RCA法に基づいて１チューブで塩基種の決定を行うことができる。モレキュラービーコンは、TaqMan法と同様に、蛍光色素とクエンチャーを利用したシグナル生成用プローブである。モレキュラービーコンの5'末端と3'末端は相補的な塩基配列で構成されており、単独ではヘアピン構造を形成する。両端付近を蛍光色素とクエンチャーで標識しておけば、ヘアピン構造を形成している状態では蛍光シグナルが検出できない。モレキュラービーコンの一部を、RCA法の増幅産物に相補的な塩基配列としておけば、モレキュラービーコンはRCA法の増幅産物にハイブリダイズする。ハイブリダイズによってヘアピン構造が解消されるため、蛍光シグナルが生成される。【０１１９】
モレキュラービーコンの利点は、パドロックプローブのバックボーン部分の塩基配列を利用することによって、検出対象とは無関係にモレキュラービーコンの塩基配列を共通にできる点である。アリル毎にバックボーンの塩基配列を変え、蛍光波長が異なる２種類のモレキュラービーコンを組み合わせれば、１チューブで塩基種の決定が可能である。蛍光標識プローブの合成コストは高いので、測定対象に関わらず共通のプローブを利用できることは、経済的なメリットである。【０１２０】
これらの方法はいずれも多量のサンプルを高速にジェノタイピングするために開発された方法である。MALDI-TOF/MSを除けば、通常、いずれの方法にも何らかの形で標識プローブなどを用意する必要がある。これに対して、標識プローブなどに頼らない塩基種決定法も古くから行われている。このような方法の一つとして、例えば、制限酵素断片長多型（Restriction Fragment Length Polymorphism／RFLP）を利用した方法やPCR-RFLP法等が挙げられる。【０１２１】
RFLPは、制限酵素の認識部位の変異、あるいは制限酵素処理によって生じるDNA断片内における塩基の挿入または欠失が、制限酵素処理後に生じる断片の大きさの変化として検出できることを利用している。検出対象となる多型を含む塩基配列を認識する制限酵素が存在すれば、RFLPの原理によって多型部位の塩基を知ることができる。【０１２２】
標識プローブを必要としない方法として、DNAの二次構造の変化を指標として塩基の違いを検出する方法も公知である。PCR-SSCPでは、１本鎖DNAの二次構造がその塩基配列の相違を反映することを利用している(Cloning and polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism analysis of anonymous Alu repeats on chromosome 11. Genomics. 1992 Jan 1; 12(1): 139-146.、Detection of p53 gene mutations in human brain tumors by single-strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products. Oncogene. 1991 Aug 1; 6(8): 1313-1318.、Multiple fluorescence-based PCR-SSCP analysis with postlabeling.、PCR Methods Appl. 1995 Apr 1; 4(5): 275-282.)。PCR-SSCP法は、PCR産物を１本鎖DNAに解離させ、非変性ゲル上で分離する工程により実施される。ゲル上の移動度は、１本鎖DNAの二次構造によって変動するので、もしも多型部位における塩基の相違があれば、移動度の違いとして検出することができる。【０１２３】
その他、標識プローブを必要としない方法として、例えば、変性剤濃度勾配ゲル（denaturant gradient gel electrophoresis： DGGE法）等を例示することができる。DGGE法は、変性剤の濃度勾配のあるポリアクリルアミドゲル中で、DNA断片の混合物を泳動し、それぞれの不安定性の違いによってDNA断片を分離する方法である。ミスマッチのある不安定なDNA断片が、ゲル中のある変性剤濃度の部分まで移動すると、ミスマッチ周辺のDNA配列はその不安定さのために、部分的に１本鎖へと解離する。部分的に解離したDNA断片の移動度は、非常に遅くなり、解離部分のない完全な二本鎖DNAの移動度と差がつくことから、両者を分離することができる。【０１２４】
具体的には、まずPCR法等によって多型部位を含む領域を増幅する。増幅産物に、塩基配列がわかっているプローブDNAをハイブリダイズさせて２本鎖とする。これを尿素などの変性剤の濃度が移動するに従って徐々に高くなっているポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、対照と比較する。プローブDNAとのハイブリダイズによってミスマッチを生じたDNA断片では、より低い変性剤濃度位置でDNA断片が一本鎖になり、極端に移動速度が遅くなる。こうして生じた移動度の差を検出することによりミスマッチの有無を検出することができる。【０１２５】
更にDNAアレイを使って塩基種を決定することもできる（細胞工学別冊「DNAマイクロアレイと最新PCR法」,秀潤社,2000.4/20発行,pp97-103「オリゴDNAチップによるSNPの解析」,梶江慎一）。DNAアレイは、同一平面上に配置した多数のプローブに対してサンプルDNA（あるいはRNA）をハイブリダイズさせ、当該平面をスキャンすることによって、各プローブに対するハイブリダイズが検出される。多くのプローブに対する反応を同時に観察することができることから、例えば、多数の多型部位について同時に解析するには、DNAアレイは有用である。【０１２６】
一般にDNAアレイは、高密度に基板にプリントされた何千ものヌクレオチドで構成されている。通常これらのDNAは非透過性(non- porous)の基板の表層にプリントされる。基板の表層は、一般的にはガラスであるが、透過性(porous)の膜、例えばニトロセルロースメンブレムを使用することもできる。【０１２７】
本発明において、ヌクレオチドの固定（アレイ）方法として、Affymetrix社開発によるオリゴヌクレオチドを基本としたアレイが例示できる。オリゴヌクレオチドのアレイにおいて、オリゴヌクレオチドは通常インビトロ(in vitro)で合成される。例えば、photolithographicの技術（Affymetrix社）、および化学物質を固定させるためのインクジェット(Rosetta Inpharmatics社)技術等によるオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成法が既に知られており、いずれの技術も本発明の基板の作製に利用することができる。【０１２８】
オリゴヌクレオチドは、検出すべきSNPsを含む領域に相補的な塩基配列で構成される。基板に結合させるヌクレオチドプローブの長さは、オリゴヌクレオチドを固定する場合は、通常10〜100ベースであり、好ましくは10〜50ベースであり、さらに好ましくは15〜25ベースである。更に、一般にDNAアレイ法においては、クロスハイブリダイゼーション（非特異的ハイブリダイゼーション）による誤差を避けるために、ミスマッチ(MM)プローブが用いられる。ミスマッチプローブは、標的塩基配列と完全に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとのペアを構成している。ミスマッチプローブに対して、完全に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドはパーフェクトマッチ（PM)プローブと呼ばれる。データ解析の過程で、ミスマッチプローブで観察されたシグナルを消去することによって、クロスハイブリダイゼーションの影響を小さくすることができる。【０１２９】
DNAアレイ法によるジェノタイピングのための試料は、被検者から採取された生物学的試料をもとに当業者に周知の方法で調製することができる。生物学的試料は特に限定されない。例えば被検者の血液、末梢血白血球、皮膚、口腔粘膜等の組織または細胞、涙、唾液、尿、糞便または毛髪から抽出した染色体DNAから、DNA試料を調製することができる。判定すべき多型部位を含む領域を増幅するためのプライマーを用いて、染色体DNAの特定の領域が増幅される。このとき、マルチプレックスPCR法によって複数の領域を同時に増幅することができる。マルチプレックスPCR法とは、複数組のプライマーセットを、同じ反応液中で用いるPCR法である。複数の多型部位を解析するときには、マルチプレックスPCR法が有用である。【０１３０】
一般にDNAアレイ法においては、PCR法によってDNA試料を増幅するとともに、増幅産物が標識される。増幅産物の標識には、標識を付したプライマーが利用される。例えば、まず多型部位を含む領域に特異的なプライマーセットによるPCR法でゲノムDNAを増幅する。次に、ビオチンラベルしたプライマーを使ったラベリングPCR法によって、ビオチンラベルされたDNAを合成する。こうして合成されたビオチンラベルDNAを、チップ上のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの反応液および反応条件は、基板に固定するヌクレオチドプローブの長さや反応温度等の条件に応じて、適宜調整することができる。当業者は、適切なハイブリダイゼーションの条件をデザインすることができる。ハイブリダイズしたDNAを検出するために、蛍光色素で標識したアビジンが添加される。アレイをスキャナで解析し、蛍光を指標としてハイブリダイズの有無を確認する。【０１３１】
上記方法をより具体的に示せば、被検者から調製した本発明の多型部位を含むDNA、およびヌクレオチドプローブが固定された固相、を取得した後、次いで、該DNAと該固相を接触させる。さらに、固相に固定されたヌクレオチドプローブにハイブリダイズしたDNAを検出することにより、本発明の多型部位の塩基種を決定する。【０１３２】
本発明において「固相」とは、ヌクレオチドを固定することが可能な材料を意味する。本発明の固相は、ヌクレオチドを固定することが可能であれば特に制限はないが、具体的には、マイクロプレートウェル、プラスチックビーズ、磁性粒子、基板などを含む固相等を例示することができる。本発明の「固相」としては、一般にDNAアレイ技術で使用される基板を好適に用いることができる。本発明において「基板」とは、ヌクレオチドを固定することが可能な板状の材料を意味する。また、本発明においてヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが含まれる。【０１３３】
上記の方法以外にも、特定部位の塩基を検出するために、アリル特異的オリゴヌクレオチド（Allele Specific Oligonucleotide／ASO）ハイブリダイゼーション法が利用できる。アリル特異的オリゴヌクレオチド(ASO)は、検出すべき多型部位が存在する領域にハイブリダイズする塩基配列で構成される。ASOを試料DNAにハイブリダイズさせるとき、多型によって多型部位にミスマッチが生じるとハイブリッド形成の効率が低下する。ミスマッチは、サザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法等によって検出することができる。また、リボヌクレアーゼAミスマッチ切断法によって、ミスマッチを検出することもできる。【０１３４】
上記オリゴヌクレオチドのうち、（１）のいずれかに記載の多型部位を含むDNAにハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドは、パーキンソン病に対して感受性か否かを検査するための試薬（検査薬）として利用できる。これは遺伝子発現を指標とする検査、または遺伝子多型を指標とする検査に使用される。【０１３５】
該オリゴヌクレオチドは、本発明の上記（１）のいずれかの多型部位を含むDNAに特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら,Molecular Cloning,Cold Spring Harbour Laboratory Press,New York,USA,第２版1989に記載の条件）において、他のタンパク質をコードするDNAとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、検出する遺伝子もしくは該遺伝子の近傍DNA領域における、上記（１）の塩基配列に対し、完全に相補的である必要はない。【０１３６】
本発明においてハイブリダイゼーションの条件としては、例えば「2×SSC、0.1 ％SDS、50 ℃」、「2×SSC、0.1％SDS、42 ℃」、「1×SSC、0.1％SDS、37 ℃」、よりストリンジェントな条件として「2×SSC、0.1 ％SDS、65 ℃」、「0.5×SSC、0.1 ％SDS、42 ℃」及び「0.2×SSC、0.1 ％SDS、65 ℃」等の条件を挙げることができる。より詳細には、Rapid-hyb buffer (Amersham Life Science)を用いた方法として、68 ℃で30分間以上プレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して1時間以上68 ℃に保ってハイブリッド形成させ、その後2×SSC、0.1 ％SDS中、室温で20分間の洗浄を3回行い、続いて1×SSC、0.1 ％SDS中、37 ℃で20分間の洗浄を3回行い、最後に1×SSC、0.1 ％SDS中、50 ℃で20分間の洗浄を2回行うことができる。その他、例えばExpresshyb Hybridization Solution (CLONTECH)中、55 ℃で30分間以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識プローブを添加して37〜55 ℃で1時間以上インキュベートし、2×SSC、0.1 ％SDS中、室温で20分間の洗浄を3回、1×SSC、0.1 ％SDS中、37 ℃で20分間の洗浄を1回行うこともできる。ここで、例えば、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションや2度目の洗浄の際の温度をより高く設定することにより、よりストリンジェントな条件とすることができる。例えば、プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの温度を60 ℃、さらにストリンジェントな条件としては68 ℃とすることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、プローブ濃度、プローブの長さ、プローブの塩基配列構成、反応時間等のその他の条件を加味し、条件を設定することができる。【０１３７】
該オリゴヌクレオチドは、上記本発明の検査方法におけるプローブやプライマーとして用いることができる。該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常15 bp〜100 bpであり、好ましくは17 bp〜30 bpである。プライマーは、本発明の上記（１）のいずれかの多型部位を含むDNAの少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。【０１３８】
本発明は、本発明の多型部位を含む領域を増幅するためのプライマー、および多型部位を含むDNA領域にハイブリダイズするプローブを提供する。【０１３９】
本発明において、多型部位を含む領域を増幅するためのプライマーには、多型部位を含むDNAを鋳型として、多型部位に向かって相補鎖合成を開始することができるプライマーも含まれる。該プライマーは、多型部位を含むDNAにおける、多型部位の3'側に複製開始点を与えるためのプライマーと表現することもできる。プライマーがハイブリダイズする領域と多型部位との間隔は任意である。両者の間隔は、多型部位の塩基の解析手法に応じて、好適な塩基数を選択することができる。たとえば、DNAチップによる解析のためのプライマーであれば、多型部位を含む領域として、２０〜５００、通常５０〜２００塩基の長さの増幅産物が得られるようにプライマーをデザインすることができる。当業者においては、多型部位を含む周辺DNA領域についての塩基配列情報を基に、解析手法に応じたプライマーをデザインすることができる。本発明のプライマーを構成する塩基配列は、ゲノムの塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列のみならず、適宜改変することができる。【０１４０】
本発明のプライマーには、ゲノムの塩基配列に相補的な塩基配列に加え、任意の塩基配列を付加することができる。例えば、IIs型の制限酵素を利用した多型の解析方法のためのプライマーにおいては、IIs型制限酵素の認識配列を付加したプライマーが利用される。このような、塩基配列を修飾したプライマーは、本発明のプライマーに含まれる。更に、本発明のプライマーは、修飾することができる。例えば、蛍光物質や、ビオチンまたはジゴキシンのような結合親和性物質で標識したプライマーが各種のジェノタイピング方法において利用される。これらの修飾を有するプライマーも本発明に含まれる。【０１４１】
一方本発明において、多型部位を含む領域にハイブリダイズするプローブとは、多型部位を含む領域の塩基配列を有するポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるプローブを言う。より具体的には、プローブの塩基配列中に多型部位を含むプローブは本発明のプローブとして好ましい。あるいは、多型部位における塩基の解析方法によっては、プローブの末端が多型部位に隣接する塩基に対応するように、デザインされる場合もある。従って、プローブ自身の塩基配列には多型部位が含まれないが、多型部位に隣接する領域に相補的な塩基配列を含むプローブも、本発明における望ましいプローブとして示すことができる。【０１４２】
言いかえれば、ゲノムDNA上の本発明の多型部位、または多型部位に隣接する部位にハイブリダイズすることができるプローブは、本発明のプローブとして好ましい。本発明のプローブには、プライマーと同様に、塩基配列の改変、塩基配列の付加、あるいは修飾が許される。例えば、Invader法に用いるプローブは、フラップを構成するゲノムとは無関係な塩基配列が付加される。このようなプローブも、多型部位を含む領域にハイブリダイズする限り、本発明のプローブに含まれる。本発明のプローブを構成する塩基配列は、ゲノムにおける本発明の多型部位の周辺DNA領域の塩基配列をもとに、解析方法に応じてデザインすることができる。【０１４３】
本発明のプライマーまたはプローブは、それを構成する塩基配列をもとに、任意の方法によって合成することができる。本発明のプライマーまたはプローブの、ゲノムDNAに相補的な塩基配列の長さは、通常１５〜１００、一般に１５〜５０、通常１５〜３０である。与えられた塩基配列に基づいて、当該塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成する手法は公知である。更に、オリゴヌクレオチドの合成において、蛍光色素やビオチンなどで修飾されたヌクレオチド誘導体を利用して、オリゴヌクレオチドに任意の修飾を導入することもできる。あるいは、合成されたオリゴヌクレオチドに、蛍光色素などを結合する方法も公知である。【０１４４】
本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合には、適宜、放射性同位体または非放射性化合物などで標識して用いられる。また、プライマーとして使用する場合には、例えば、オリゴヌクレオチドの3'末端側の領域を標的とする配列に対して相補的にし、5'末端側には制限酵素認識配列、タグ等を付加した形態に設計することができる。このような少なくとも連続した15塩基を含む塩基配列からなるポリヌクレオチドは、GRK5 mRNAに対してハイブリダイズすることができる。【０１４５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、天然以外の塩基、例えば、4-アセチルシチジン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジン、2’-O-メチルシチジン、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、2’-O-メチルプソイドウリジン、β-D-ガラクトシルキュェオシン、2’-O-メチルグアノシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデノシン、1-メチルアデノシン、1-メチルプソイドウリジン、1-メチルグアノシン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアノシン、2-メチルアデノシン、2-メチルグアノシン、3-メチルシチジン、5-メチルシチジン、N6-メチルアデノシン、7-メチルグアノシン、5-メチルアミノメチルウリジン、5-メトキシアミノメチル-2-チオウリジン、β-D-マンノシルキュェオシン、5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウリジン、5-メトキシカルボニルメチルウリジン、5-メトキシウリジン、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデノシン、N-((9-β-D-リボフラノシル-2-メチルリオプリン-6-イル)カルバモイル)トレオニン、N-((9-β-D-リボフラノシルプリン-6-イル)N-メチルカルバモイル)トレオニン、ウリジン-5-オキシ酢酸-メチルエステル、ウリジン-5-オキシ酢酸、ワイブトキソシン、プソイドウリジン、キュェオシン、2-チオシチジン、5-メチル-2-チオウリジン、2-チオウリジン、4-チオウリジン、5-メチルウリジン、N-((9-β-D-リボフラノシルプリン-6-イル)カルバモイル)トレオニン、2’-O-メチル-5-メチルウリジン、2’-O-メチルウリジン、ワイブトシン、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン等を必要に応じて含んでいてもよい。【０１４６】
本発明はまた、パーキンソン病に対して感受性か否かの検査方法に使用するための試薬（検査薬）を提供する。本発明の試薬は、前記本発明のプライマーおよび／またはプローブを含む。パーキンソン病に対して感受性か否かの検査においては（１）（好ましくは、前記（１）〜（２））のいずれかに記載の多型部位を含むDNAを増幅するためのプライマーおよび／またはプローブを用いる。【０１４７】
本発明の試薬には、塩基種の決定方法に応じて、各種の酵素、酵素基質、および緩衝液などを組み合せることができる。酵素としては、DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ、あるいはIIs制限酵素などの、上記の塩基種決定方法として例示した各種の解析方法に必要な酵素を示すことができる。緩衝液は、これらの解析に用いる酵素の活性の維持に好適な緩衝液が、適宜選択される。更に、酵素基質としては、例えば、相補鎖合成用の基質等が用いられる。【０１４８】
更に本発明の試薬には、多型部位における塩基が明らかな対照を添付することができる。対照は、予め多型部位の塩基種が明らかなゲノム、あるいはゲノムの断片を用いることができる。ゲノムは、細胞から抽出されたものでもよいし、細胞あるいは細胞の分画を用いることもできる。細胞を対照として用いれば、対照の結果によってゲノムDNAの抽出操作が正しく行われたことを証明することができる。あるいは、多型部位を含む塩基配列からなるDNAを対照として用いることもできる。具体的には、本発明の多型部位における塩基種が明らかにされたゲノム由来のDNAを含むYACベクターやBACベクターは、対照として有用である。あるいは多型部位に相当する数百ベースのみを切り出して挿入したベクターを対照として用いることもできる。【０１４９】
さらに、本発明における試薬の別の態様は、本発明の（１）のいずれかに記載の多型部位を含むDNAとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された固相からなる、パーキンソン病に対して感受性か否かを検査するための試薬である。【０１５０】
これらは本発明の多型部位を指標とする検査に使用される。これらの調製方法に関しては、上述の通りである。【０１５１】
また、本発明の好ましい態様においては、GRK5遺伝子の転写産物または翻訳産物を検出する工程を含む、パーキンソン病に対して感受性か否かの（パーキンソン病の素因の）検査方法に関する。【０１５２】
従って、該検査方法においてGRK5遺伝子の転写産物の検出の際にプローブとして利用可能な、例えば、GRK5遺伝子の転写産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、本発明の検査用試薬の一例である。【０１５３】
また、該検査方法においてGRK5遺伝子の翻訳産物の検出の際に利用可能な、GRK5タンパク質を認識する抗体（抗GRK5タンパク質抗体）もまた、本発明の検査用試薬の好ましい具体例である。【０１５４】
また、GRK5遺伝子の亢進によってαシヌクレイン(αS)のリン酸化が促進され、その結果、可溶性αシヌクレインオリゴマーの形成が促進され、パーキンソン病に至るものと考えられる。従って、GRK5遺伝子もしくは該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能（活性）を抑制する物質は、パーキンソン病の治療薬もしくは予防薬となるものと考えられる。【０１５５】
本発明は、GRK5遺伝子もしくはGRK5タンパク質の発現、または、GRK5遺伝子によってコードされるタンパク質（GRK5タンパク質）の機能（活性）を抑制する物質を有効成分として含有する、パーキンソン病治療薬を提供する。【０１５６】
本発明の好ましい態様においては、まず、GRK5遺伝子の発現の発現抑制物質を有効成分として含む、パーキンソン病治療薬（パーキンソン病治療もしくは予防のための薬剤・医薬組成物）を提供する。【０１５７】
本発明においてGRK5遺伝子の発現抑制物質には、例えば、GRK5の転写もしくは該転写産物からの翻訳を抑制する物質が含まれる。本発明の上記発現抑制物質の好ましい態様として、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物（核酸）を挙げることができる。
（ａ）GRK5遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）GRK5遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）GRK5遺伝子の発現をRNAi効果による抑制作用を有する核酸【０１５８】
本発明における「核酸」とはRNAまたはDNAを意味する。また、所謂PNA (peptide nucleic acid)等の化学合成核酸アナログも、本発明の核酸に含まれる。PNAは、核酸の基本骨格構造である五単糖・リン酸骨格を、グリシンを単位とするポリアミド骨格に置換したもので、核酸によく似た３次元構造を有する。【０１５９】
特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者によく知られている。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。即ち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害、キャッピング部位やポリ(A)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を阻害する（平島および井上, 新生化学実験講座2 核酸IV遺伝子の複製と発現, 日本生化学会編, 東京化学同人, 1993, 319-347.）。【０１６０】
本発明で用いられるアンチセンス核酸は、上記のいずれの作用によりGRK5遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、GRK5遺伝子のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、GRK5遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も、本発明で利用されるアンチセンス核酸に含まれる。使用されるアンチセンス核酸は、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された核酸は、公知の方法を用いることで、所望の動物へ形質転換できる。アンチセンス核酸の配列は、形質転換される動物が持つ内在性GRK5遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは90 ％以上、最も好ましくは95 ％以上の相補性を有する。アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子(GRK5)の発現を効果的に抑制するには、アンチセンス核酸の長さは少なくとも15塩基以上25塩基未満であることが好ましいが、本発明のアンチセンス核酸は、必ずしもこの長さに限定されない。【０１６１】
本発明のアンチセンスは、特に制限されないが、例えば、配列番号：１に記載の塩基配列を基に作成することができる。【０１６２】
また、GRK5遺伝子の発現の抑制は、リボザイム、またはリボザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子を指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、RNAを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループIイントロン型やRNase Pに含まれるM1 RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子, タンパク質核酸酵素, 1990, 35, 2191.）。【０１６３】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15という配列のC15の3'側を切断するが、その活性にはU14とA9との塩基対形成が重要とされ、C15の代わりにA15またはU15でも切断され得ることが示されている（Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 228, 228.）。基質結合部位が標的部位近傍のRNA配列と相補的なリボザイムを設計すれば、標的RNA中のUC、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切断リボザイムを作出することができる（Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 239, 285.、小泉誠および大塚栄子, タンパク質核酸酵素, 1990, 35, 2191.、Koizumi, M. et al., Nucl Acids Res, 1989, 17, 7059.）。【０１６４】
また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見出される（Buzayan, JM., Nature, 1986, 323, 349.）。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なRNA切断リボザイムを作出できることが示されている（Kikuchi, Y. ＆ Sasaki, N., Nucl Acids Res, 1991, 19, 6751.、菊池洋, 化学と生物, 1992, 30, 112.）。このように、リボザイムを用いて本発明におけるGRK5遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を抑制することができる。【０１６５】
内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖RNAを用いたRNA干渉（RNA interferance；RNAi）によっても行うことができる。本発明のRNAi効果による抑制作用を有する核酸は、一般的にsiRNAとも言われる。RNAiは、標的遺伝子のmRNAと相同な配列からなるセンスRNAとこれと相補的な配列からなるアンチセンスRNAとからなる二本鎖RNAを細胞等に導入することにより、標的遺伝子mRNAの破壊を誘導し、標的遺伝子の発現を抑制し得る現象である。このようにRNAiは、標的遺伝子の発現を抑制し得ることから、従来の煩雑で効率の低い相同組み換えによる遺伝子破壊方法に代わる簡易な遺伝子ノックアウト方法として、または、遺伝子治療への応用可能な方法として注目を集めている。RNAiに用いるRNAは、GRK5遺伝子もしくは該遺伝子の部分領域と必ずしも完全に同一である必要はないが、完全な相同性を有することが好ましい。【０１６６】
本発明の上記（ｃ）の核酸の好ましい態様として、GRK5遺伝子に対してRNAi（RNA interference；RNA干渉）効果を有する二本鎖RNA（siRNA）を挙げることができる。より具体的には、配列番号：１に記載の塩基配列の部分配列に対するセンスRNAおよびアンチセンスRNAからなる二本鎖RNA(siRNA)を挙げることができる。【０１６７】
RNAi機構の詳細については未だに不明な部分もあるが、DICERといわれる酵素（RNase III核酸分解酵素ファミリーの一種）が二本鎖RNAと接触し、二本鎖RNAがsmall interfering RNAまたはsiRNAと呼ばれる小さな断片に分解されるものと考えられている。本発明におけるRNAi効果を有する二本鎖RNAには、このようにDICERによって分解される前の二本鎖RNAも含まれる。即ち、そのままの長さではRNAi効果を有さないような長鎖のRNAであっても、細胞においてRNAi効果を有するsiRNAへ分解されることが期待されるため、本発明における二本鎖RNAの長さは、特に制限されない。【０１６８】
例えば、本発明のGRK5遺伝子のmRNAの全長もしくはほぼ全長の領域に対応する長鎖二本鎖RNAを、例えば、予めDICERで分解させ、その分解産物をパーキンソン病治療薬として利用することが可能である。この分解産物には、RNAi効果を有する二本鎖RNA分子(siRNA)が含まれることが期待される。この方法によれば、RNAi効果を有することが期待されるmRNA上の領域を、特に選択しなくともよい。即ち、RNAi効果を有する本発明のGRK5遺伝子のmRNA上の領域は、必ずしも正確に規定される必要はない。【０１６９】
なお、上記RNA分子において一方の端が閉じた構造の分子、例えば、ヘアピン構造を有するsiRNA(shRNA)も本発明に含まれる。即ち、分子内において二本鎖RNA構造を形成し得る一本鎖RNA分子もまた本発明に含まれる。【０１７０】
本発明の上記「RNAi効果により抑制し得る二本鎖RNA」は、当業者においては、該二本鎖RNAの標的となる本発明のGRK5遺伝子の塩基配列を基に、適宜作製することができる。一例を示せば、配列番号：１に記載の塩基配列をもとに、本発明の二本鎖RNAを作製することができる。即ち、配列番号：１に記載の塩基配列をもとに、該配列の転写産物であるmRNAの任意の連続するRNA領域を選択し、この領域に対応する二本鎖RNAを作製することは、当業者においては、通常の試行の範囲内において適宜行い得ることである。また、該配列の転写産物であるmRNA配列から、より強いRNAi効果を有するsiRNA配列を選択することも、当業者においては、公知の方法によって適宜実施することが可能である。また、一方の鎖（例えば、配列番号：１に記載の塩基配列）が判明していれば、当業者においては容易に他方の鎖（相補鎖）の塩基配列を知ることができる。siRNAは、当業者においては市販の核酸合成機を用いて適宜作製することが可能である。また、所望のRNAの合成については、一般の合成受託サービスを利用することができる。【０１７１】
さらに、本発明の上記RNAを発現し得るDNA（ベクター）もまた、本発明のGRK5遺伝子の発現を抑制し得る化合物の好ましい態様に含まれる。例えば、本発明の上記二本鎖RNAを発現し得るDNA（ベクター）は、該二本鎖RNAの一方の鎖をコードするDNA、および該二本鎖RNAの他方の鎖をコードするDNAが、それぞれ発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有するDNAである。本発明の上記DNAは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、適宜作製することができる。より具体的には、本発明のRNAをコードするDNAを公知の種々の発現ベクターへ適宜挿入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。【０１７２】
また、本発明の発現抑制物質には、例えば、GRK5の発現調節領域（例えば、プロモーター領域）と結合することにより、GRK5の発現を抑制する化合物が含まれる。該化合物は、例えば、GRK5のプロモーターDNA断片を用いて、該DNA断片との結合活性を指標とするスクリーニング方法により、取得することが可能である。また、当業者においては、所望の化合物について、本発明のGRK5の発現を抑制するか否かの判定を、公知の方法、例えば、レポーターアッセイ法等により適宜実施することができる。【０１７３】
また、本発明者らは、GRK5の転写調節領域に存在する多型変異「m22.1」、「m24」によって該GRK5遺伝子の発現が亢進することを示した。【０１７４】
「m22.1」は転写調節因子であるYY1(Yin Yang-1)が認識する配列（YY1認識配列）に存在する多型である（図１）。YY1はGRK5の転写を抑制するように制御する因子である。「m22.1」多型変異によって、YY1と「YY1認識配列」との結合能（相互作用）が減少し、その結果、YY1の転写抑制効果が低下することから、GRK5遺伝子の発現が亢進するものと考えられる。【０１７５】
従って、YY1と「YY1認識配列」との結合能を上昇させる化合物は、GRK5遺伝子の転写を抑制するものと考えられ、本発明の上記発現抑制物質の好ましい態様の一つと言える。なお、該「YY1認識配列」を含むDNAの野生型の塩基配列を配列番号：４に、多型変異「m22.1」を含みYY1転写因子との結合活性が変化したDNAの塩基配列を配列番号：５に示す。【０１７６】
また、「m24」は転写調節因子であるCRE結合タンパク1(CREB-1)が認識する配列（CREB認識配列）に存在する多型である（図１）。CREB-1はGRK5の転写を促進するように制御する因子である。「m24」多型変異によって、CREB-1と「CREB認識配列」との結合能（相互作用）が上昇し、その結果、CREB-1の転写促進効果が上昇することから、GRK5遺伝子の発現が亢進するものと考えられる。【０１７７】
従って、CREB-1と「CREB認識配列」との結合能を低下させる化合物は、GRK5遺伝子の転写を抑制するものと考えられ、本発明の上記発現抑制物質の好ましい態様の一つと言える。また、抗CREB-1抗体もまた、本発明の上記発現抑制物質の一例である。なお、該「CREB認識配列」を含むDNAの野生型の塩基配列を配列番号：２に、多型変異「m24」を含みCREB-1転写因子との結合活性が変化したDNAの塩基配列を配列番号：３に示す。【０１７８】
また、上述のように本発明の多型変異を有する「YY1認識配列」または「CREB認識配列」は、それぞれYY1転写因子またはCREB-1転写因子との結合能が変化しており、該配列を含むポリヌクレオチドは、例えば、後述のパーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法に、好適に用いることが可能であり有用である。本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドを提供する。
（ａ）配列番号：４に記載の塩基配列、または、該塩基配列において１もしくは複数の塩基が付加、欠失もしくは置換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであって、YY1転写因子との結合能が低下していることを特徴とするポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号：２に記載の塩基配列、または、該塩基配列において１もしくは複数の塩基が付加、欠失もしくは置換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであって、CREB-1転写因子との結合能が上昇していることを特徴とするポリヌクレオチド。【０１７９】
また本発明は、GRK5タンパク質の機能抑制物質を有効成分として含有する、パーキンソン病治療薬を提供する。【０１８０】
本発明におけるGRK5タンパク質の機能抑制物質としては、例えば、以下の（ａ）または（ｂ）の化合物を挙げることができる。
（ａ）GRK5タンパク質に結合する抗体
（ｂ）GRK5タンパク質に結合する低分子化合物【０１８１】
GRK5タンパク質に結合する抗体（抗GRK5抗体）は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして得ることができる。天然のGRK5タンパク質、あるいはGSTとの融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発現させたリコンビナント（組み換え）GRK5タンパク質、またはその部分ペプチドをウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、GRK5タンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例えば、GRK5タンパク質若しくはその部分ペプチドをマウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、GRK5タンパク質に結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、GRK5タンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。【０１８２】
本発明の抗体の形態には、特に制限はなく、本発明のGRK5タンパク質に結合する限り、上記ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のほかに、ヒト抗体、遺伝子組み換えによるヒト型化抗体、さらにその抗体断片や抗体修飾物も含まれる。【０１８３】
抗体取得の感作抗原として使用される本発明のGRK5タンパク質は、その由来となる動物種について制限されないが、哺乳動物、例えばマウス、ヒト由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。ヒト由来のタンパク質は、当業者においては、本明細書に開示される遺伝子配列又はアミノ酸配列を用いて、適宜、取得することができる。【０１８４】
本発明において、感作抗原として使用されるタンパク質は、完全なタンパク質あるいはタンパク質の部分ペプチドであってもよい。タンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、タンパク質のアミノ基（N）末端断片やカルボキシ（C）末端断片あるいは中央部のキナーゼ活性部位等が挙げられる。本明細書における「抗体」とはタンパク質の全長又は断片に反応する抗体を意味する。【０１８５】
本発明における抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体(scFv)(Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-83; The Pharmacology of Monoclonal Antibody, Vol. 113, Rosenburg and Moore ed., Springer Verlag (1994) pp. 269-315)、ヒト化抗体、多特異性抗体(LeDoussal et al. (1992) Int. J. Cancer Suppl. 7: 58-62; Paulus (1985) Behring Inst. Mitt. 78: 118-32; Millstein and Cuello (1983) Nature 305: 537-9; Zimmermann (1986) Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 105: 176-260; VanDijk et al. (1989) Int. J. Cancer 43: 944-9)、並びに、Fab、Fab’、F(ab')2、Fc、Fv等の抗体断片が含まれる。このような抗体は必要に応じ、PEG等により修飾されていてもよい。また、β‐ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、GST、緑色蛍光タンパク質(GFP)等との融合タンパク質として製造して、二次抗体を用いずに検出できるようにすることも可能である。また、ビオチン等により抗体を標識することによりアビジン、ストレプトアビジン等を用いて抗体の検出、回収を行い得るように改変することもできる。【０１８６】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばEBウィルスに感染したヒトリンパ球をin vitroでタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、タンパク質への結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる。【０１８７】
本発明のGRK5タンパク質に対する抗体は、GRK5タンパク質と結合することにより、GRK5タンパク質の機能を抑制し、例えば、パーキンソン病の治療や改善効果が期待される。得られた抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型抗体が好ましい。【０１８８】
さらに本発明は、GRK5タンパク質の機能を抑制し得る物質として、GRK5タンパク質に結合する低分子量物質（低分子化合物）も含有する。本発明のGRK5タンパク質に結合する低分子量物質は、天然または人工の化合物であってもよい。通常、当業者に公知の方法を用いることによって製造または取得可能な化合物である。また本発明の化合物は、後述のスクリーニング方法によって、取得することも可能である。【０１８９】
上記（ｂ）のGRK5タンパク質に結合する低分子化合物には、例えば、GRK5に対して親和性が高い化合物が含まれる。【０１９０】
さらに、本発明のGRK5タンパク質の機能を抑制し得る物質として、GRK5タンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するGRK5タンパク質変異体を挙げることができる。「GRK5タンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するGRK5タンパク質変異体」とは、該タンパク質をコードする遺伝子を発現させることによって、内在性の野生型タンパク質の活性を消失もしくは低下させる機能を有するタンパク質を指す。【０１９１】
また、既にGRK5タンパク質の機能を阻害することが知られている物質（化合物）は、本発明の上記「GRK5タンパク質の機能を抑制し得る物質」の具体例として、好適に示すことができる。【０１９２】
GRK5タンパク質の機能を阻害することが知られている化合物としては、以下のようなものが報告されている。本発明者らによってGRK5がパーキンソン病と関連することが初めて見出されたことにより、下記の化合物について、パーキンソン病の予防もしくは治療薬としての新たな用途が見出された。【０１９３】
（１）2-[1-(3-dimethylaminopropyl)-1H-indol-3-yl]-3-(1H-indol-3-yl)-maleimide) (GF 109203X)  （Zhou H. et al., J Pharmacol Exp Ther. 2001 Sep;298(3):1243-51参照）【０１９４】
（２）2-(8-[(dimethylamino)methyl]-6,7,8, 9-tetrahydropyrido[1,2-a]indol-3-yl]-3-(1-methylindol-3-yl)m aleimide hydrochloride (Ro 32-0432)  （Aiyar N. et al., Eur J Pharmacol. 2000 Sep 1;403(1-2):1-7参照）【０１９５】
（３）
2006112456.tif 000002
【０１９６】
〔式中、環Ａは置換されていてもよいピリミジン環を示し、Ｚは置換されていてもよい２ないし４価の直鎖状のＣ1-3炭化水素基を示し、環Ｂはさらに置換されていてもよく、Ｘは置換されていてもよいＣ1-4アルキレンなどを示し、Ａｒ1はＲ以外に置換されていてもよい芳香族炭化水素基またはＲ以外に置換されていてもよい芳香族複素環基を示し、Ｒは水素原子または−Ｙ−Ａｒ2（Ｙは結合手または直鎖部分を構成する原子の数が１〜６のスペーサーを示し、Ａｒ2は置換されていてもよい芳香族炭化水素基または置換されていてもよい芳香族複素環基を示す）を示す。〕で表される化合物またはその塩、またはそのプロドラッグを含有するＧＲＫ阻害剤。【０１９７】
（特開２００３−３２１４７２参照）
（４）
2006112456.tif 000003
【０１９８】
〔式中、環Ａはさらに置換されていてもよい含窒素複素環を示し、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ置換されていてもよいアミノ基を示し、Ｘは直鎖部分を構成する原子の数が１〜４のスペーサーを示し、Ｒ１はＲ２または／およびＸと結合して環を形成していてもよい。〕で表される化合物またはその塩、またはそれらのプロドラッグを含有するＧＲＫ阻害剤。【０１９９】
（特開２００２−１４５７７８参照）
（５）2-(2'-amino-3'-methoxyphenyl)oxanaphthalen-4-one) and U0126 (1,4-diamino-2,3-dicyano-1,4-bis (aminophenylthio) butadiene) (PD98059) （Trincavelli ML et al., Biochim Biophys Acta. 2002 Aug 19;1591(1-3):55-62参照）【０２００】
（６）GRK5タンパク質のN末の14アミノ酸からなるペプチド  （Noble B. et al., J Biol Chem. 2003 Nov 28;278(48):47466-76. Epub 2003 Sep 24参照）【０２０１】
（７）Heparin、Dextran sulfate  (Kunapuli P et al., J Biol Chem. 1994 Jan 14;269(2):1099-105参照)【０２０２】
（８）カルモジュリン  (Pronin AN et al., J Biol Chem. 1997 Jul 18;272(29):18273-80参照)【０２０３】
（９）Zn2+ (Shayo C. et al., Mol Pharmacol. 2001 Nov;60(5):1049-56参照)
また、本発明の機能抑制物質は、本発明のGRK5の有する活性を指標とするスクリーニング方法により、適宜、取得することができる。【０２０４】
また、可溶性αシヌクレイン（αS）オリゴマーの形成を抑制する物質もまた、本発明のパーキンソン病治療薬として有用である。従って本発明は、可溶性αシヌクレインオリゴマーの形成を抑制する物質を有効成分として含有する、パーキンソン病治療薬を提供する。【０２０５】
また本発明は、GRK5遺伝子の発現量もしくは該遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を低下させる化合物を選択することを特徴とする、パーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤（候補化合物）のスクリーニング方法を提供する。【０２０６】
本発明のスクリーニング方法の一態様は、GRK5遺伝子の発現レベルを指標とする方法である。GRK5遺伝子の発現レベルを低下させる化合物は、パーキンソン病治療もしくは予防のための薬剤となることが期待される。【０２０７】
本発明の上記方法は、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、パーキンソン病治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法である。
（ａ）GRK5遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該GRK5遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
本方法においては、まずGRK5遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる。用いられる「細胞」の由来としては、ヒト、マウス、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、鳥など、ペット、家畜等に由来する細胞が挙げられるが、これら由来に制限されない。「GRK5遺伝子を発現する細胞」としては、内因性のGRK5遺伝子を発現している細胞、または外来性のGRK5遺伝子が導入され、該遺伝子が発現している細胞を利用することができる。外来性のGRK5遺伝子が発現した細胞は、通常、GRK5遺伝子が挿入された発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより作製することができる。該発現ベクターは、一般的な遺伝子工学技術によって作製することができる。【０２０８】
本方法に用いる被検化合物としては、特に制限はない。例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が挙げられるが、これらに限定されない。【０２０９】
GRK5遺伝子を発現する細胞への被検化合物の「接触」は、通常、GRK5遺伝子を発現する細胞の培養液に被検化合物を添加することによって行うが、この方法に限定されない。被検化合物がタンパク質等の場合には、該タンパク質を発現するDNAベクターを、該細胞へ導入することにより、「接触」を行うことができる。【０２１０】
本方法においては、次いで、該GRK5遺伝子の発現レベルを測定する。ここで「遺伝子の発現」には、転写および翻訳の双方が含まれる。遺伝子の発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、GRK5遺伝子を発現する細胞からmRNAを定法に従って抽出し、このmRNAを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法またはRT-PCR法を実施することによって該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。また、GRK5遺伝子を発現する細胞からタンパク質画分を回収し、GRK5タンパク質の発現をSDS-PAGE等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。さらに、GRK5タンパク質に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法を実施することにより該タンパク質の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。GRK5タンパク質の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば、特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の両方を利用することができる。【０２１１】
本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する。低下させる化合物は、パーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤となる。【０２１２】
本発明のスクリーニング方法の他の態様は、本発明のGRK5遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を、レポーター遺伝子の発現を指標として同定する方法である。【０２１３】
本発明の上記方法は、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、パーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法である。
（ａ）GRK5遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程【０２１４】
本方法においては、まず、GRK5遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる。ここで「機能的に結合した」とは、GRK5遺伝子の転写調節領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、GRK5遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、GRK5遺伝子の転写調節領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。GRK5遺伝子のcDNA塩基配列に基づいて、当業者においては、ゲノム中に存在するGRK5遺伝子の転写調節領域を周知の方法により取得することが可能である。【０２１５】
本方法に用いるレポーター遺伝子としては、その発現が検出可能であれば特に制限はなく、例えば、CAT遺伝子、lacZ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、およびGFP遺伝子等が挙げられる。「GRK5遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞」として、例えば、このような構造が挿入されたベクターを導入した細胞が挙げられる。このようなベクターは、当業者に周知の方法により作製することができる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法、リポフェクトアミン法、マイクロインジェクション法等によって実施することができる。「GRK5遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞」には、染色体に該構造が挿入された細胞も含まれる。染色体へのDNA構造の挿入は、当業者に一般的に用いられる方法、例えば、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により行うことができる。【０２１６】
「GRK5遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞抽出液」とは、例えば、市販の試験管内転写翻訳キットに含まれる細胞抽出液に、GRK5遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを添加したものを挙げることができる。【０２１７】
本方法における「接触」は、「GRK5遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞」の培養液に被検化合物を添加する、または該DNAを含む上記の市販された細胞抽出液に被検化合物を添加することにより行うことができる。被検化合物がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質を発現するDNAベクターを、該細胞へ導入することにより行うことも可能である。【０２１８】
本方法においては、次いで、該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。レポーター遺伝子の発現レベルは、該レポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がCAT遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。レポーター遺伝子がlacZ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、さらに、GFP遺伝子である場合には、GFPタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。【０２１９】
本方法においては、次いで、測定したレポーター遺伝子の発現レベルを、被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、低下（抑制）させる化合物を選択する。低下（抑制）させる化合物は、パーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤となる。【０２２０】
また、本発明の上記スクリーニング方法におけるGRK5遺伝子は、通常、野生型の遺伝子を用いることができるが、本発明者らによって見出された発現亢進に関与する多型変異（「m22.1」、「m24」）を含むGRK5遺伝子（変異型GRK5遺伝子）を好適に使用することも可能である。【０２２１】
この変異型GRK5遺伝子は、もともと遺伝子の発現が亢進していることから、該遺伝子の発現を抑制する（低下させる）物質のスクリーニングに好適である。また、実際のパーキンソン病患者において見出された変異型GRK5遺伝子について、その亢進された遺伝子発現を抑制する（低下させる）物質は、格好のパーキンソン病の予防もしくは治療薬となることが期待される。【０２２２】
本発明のスクリーニング方法の他の態様は、GRK5タンパク質とαシヌクレインの相互作用活性を指標とする方法である。【０２２３】
本発明の上記方法は、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、パーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法である。
（ａ）GRK5タンパク質およびαシヌクレインと、被検化合物とを接触させる工程
（ｂ）GRK5タンパク質とαシヌクレインとの相互作用活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、相互作用活性を低下させる化合物を選択する工程【０２２４】
本方法においては、まず、GRK5タンパク質およびαシヌクレインと、被検化合物を接触させる。【０２２５】
次いでGRK5タンパク質とαシヌクレインの相互作用活性（結合活性）を測定する。任意のタンパク質同士の相互作用活性は、当業者においては公知の種々の方法を利用して、評価することが可能である。【０２２６】
一例を示せば、免疫沈降法(immunoprecipitation)を利用して、相互作用活性を評価することができる。【０２２７】
具体的には、以下のように行うことができるが、必ずしもこの方法に限定されない。GRK5をコードするDNAを外来遺伝子発現用のベクターに挿入し、細胞等で該遺伝子を発現させる。発現に用いるプロモーターとしては一般的に使用できるプロモーターであれば特に制限されない。【０２２８】
特異性の明らかとなっているモノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）をGRK5のN末またはC末に導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位を有する融合ポリペプチドとしてGRK5を発現させることができる。用いるエピトープ−抗体系としては市販されているものを利用することができる（実験医学 13, 85-90 (1995)）。マルチクローニングサイトを介して、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP）などとの融合ポリペプチドを発現することができるベクターが市販されている。また、融合ポリペプチドにすることによりGRK5の性質をできるだけ変化させないようにするために数個から十数個のアミノ酸からなる小さなエピトープ部分のみを導入して、融合ポリペプチドを調製する方法も報告されている。例えば、ポリヒスチジン（His-tag）、インフルエンザ凝集素 HA、ヒトc-myc、FLAG、Vesicular stomatitis ウィルス糖タンパク質（VSV-GP）、T7 gene10 タンパク質（T7-tag）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（HSV-tag）、E-tag（モノクローナルファージ上のエピトープ）などのエピトープとそれを認識するモノクローナル抗体を、GRK5に結合するポリペプチドのスクリーニングのためのエピトープ−抗体系として利用できる（実験医学 13, 85-90 (1995)）。【０２２９】
免疫沈降においては、これらの抗体を、適当な界面活性剤を利用して調製した細胞溶解液に添加することにより免疫複合体を形成させる。この免疫複合体はGRK5、それと結合能を有するポリペプチド（上記スクリーニングにおいては、例えばαシヌクレイン）、および抗体からなる。上記エピトープに対する抗体を用いる以外に、GRK5に対する抗体を利用して免疫沈降を行うことも可能である。GRK5に対する抗体は、例えば、GRK5をコードする遺伝子を適当な大腸菌発現ベクターに導入して大腸菌内で発現させ、発現させたポリペプチドを精製し、これをウサギやマウス、ラット、ヤギ、ニワトリなどに免疫することで調製することができる。また、合成したGRK5の部分ペプチドを上記の動物に免疫することによって調製することもできる。【０２３０】
免疫複合体は、例えば、抗体がマウスIgG 抗体であれば、Protein A SepharoseやProtein G Sepharoseを用いて沈降させることができる。また、GRK5を、例えば、GSTなどのエピトープとの融合ポリペプチドとして調製した場合には、グルタチオン-Sepharose 4Bなどのこれらエピトープに特異的に結合する物質を利用して、GRK5の抗体を利用した場合と同様に、免疫複合体を形成させることができる。【０２３１】
免疫沈降の一般的な方法については、例えば、文献（Harlow,E. and Lane, D.: Antibodies, pp.511-552, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York (1988) ）記載の方法に従って、または準じて行えばよい。【０２３２】
免疫沈降されたポリペプチドの解析にはSDS-PAGEやウェスタンブロッティングが用いられる。SDS-PAGEの場合、適当な濃度のゲルを用いることでポリペプチドの分子量により結合していたポリペプチドを解析することができる。また、この際、一般的にはGRK5に結合したポリペプチドは、クマシー染色や銀染色といったポリペプチドの通常の染色法では検出することは困難であるので、放射性同位元素である35S-メチオニンや35S-システインを含んだ培養液で細胞を培養し、該細胞内のポリペプチドを標識して、これを検出することで検出感度を向上させることができる。【０２３３】
上記の方法によって、GRK5と相互作用するαシヌクレインの量を解析することにより、GRK5とαシヌクレインとの相互作用（結合）活性を評価することができる。【０２３４】
さらに、被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、相互作用活性を低下（抑制）させる化合物を選択する。低下（抑制）させる化合物はパーキンソン病治療のための薬剤となる。【０２３５】
本発明のスクリーニング方法のさらに他の態様は、GRK5タンパク質のαシヌクレインを基質とするリン酸化活性を指標とする方法である。該リン酸化活性を低下させる化合物は、可溶性αシヌクレインオリゴマーの形成を抑制し、その結果、脳における可溶性オリゴマーが減少し、パーキンソン病に対する治療効果が期待される。【０２３６】
本発明の上記方法は、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、パーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法である。
（ａ）GRK5タンパク質およびαシヌクレインと、被検化合物とを接触させる工程
（ｂ）GRK5タンパク質のαシヌクレインを基質とするリン酸化活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記リン酸化活性を低下させる化合物を選択する工程【０２３７】
本方法においては、まず、GRK5タンパク質およびαシヌクレインと、被検化合物を接触させる。【０２３８】
この「接触」は、例えば、GRK5とαシヌクレインcDNAを共発現させた細胞（例えば、HEK293細胞）と被検化合物を接触させることにより実施することができる。【０２３９】
次いでGRK5タンパク質のαシヌクレインを基質とするリン酸化活性を測定する。上記方法において使用するGRK5タンパク質は、変異を含まない野生型タンパク質であることが好ましいが、αシヌクレインをリン酸化する活性を有するものであれば、GRK5タンパク質の一部のアミノ酸配列が置換・欠失されたタンパク質（ポリペプチド）であって構わない。また、基質となるαシヌクレインも、変異を含まない野生型タンパク質であることが好ましいが、GRK5タンパク質によってリン酸化を受ける部位を含む、部分ポリペプチドもしくは、該部位を含む変異ポリペプチドであってもよい。【０２４０】
これまでの研究からαシヌクレインは129位のセリン(Ser-129)がリン酸化されるものと考えられている。従って、本発明の上記スクリーニング方法に供するαシヌクレインは、Ser-129を含むようなポリペプチド断片であってもよい。【０２４１】
リン酸化活性の測定は、より具体的には、後述の実施例に記載の方法により行うことができる。【０２４２】
なお、これらの活性の測定は当業者に公知の手法によって行うことができるが、例えば、リン酸化特異的抗体を用いたウェスタンブロット法等により測定することができる。【０２４３】
上記方法においてはさらに、被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記リン酸化活性を低下させる化合物を選択する。このようにして選択された化合物は、GRK5タンパク質のαシヌクレインを基質とするリン酸化活性を抑制する結果、可溶性αシヌクレインオリゴマー形成を抑制し、パーキンソン病に対する治療もしくは予防効果を有するものと期待される。【０２４４】
また本発明は、αシヌクレインオリゴマーの可溶性を指標とする、パーキンソン病の治療もしくは予防のためのスクリーニング方法を提供する。【０２４５】
本発明のスクリーニング方法の一態様は、可溶性αシヌクレインオリゴマーの量を指標とする方法である。可溶性αシヌクレインオリゴマーの量を低下させる化合物は、パーキンソン病治療のための薬剤となることが期待される。【０２４６】
本発明の上記方法は、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、パーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法である。
（ａ）GRK5タンパク質および非可溶性αシヌクレインオリゴマーと、被検化合物とを接触させる工程
（ｂ）可溶性αシヌクレインオリゴマーの量を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記可溶性αシヌクレインオリゴマーの量を低下させる化合物を選択する工程【０２４７】
本方法においてはまず、GRK5タンパク質および非可溶性αシヌクレインオリゴマーと、被検化合物とを接触させる。次いで可溶性αシヌクレインオリゴマーの量を測定する。この測定は当業者においては、公知の手法、例えば、抗αシヌクレイン抗体を用いたウェスタンブロット法等により測定することができる。一例を示せば、前記HEK293細胞の可溶分画をゲルろ過することにより、可溶性オリゴマーの量を測定することができる。【０２４８】
上記方法においてはさらに、被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記可溶性αシヌクレインオリゴマーの量を低下させる化合物を選択する。このようにして選択された化合物は、パーキンソン病に対する治療もしくは予防効果を有するものと考えられる。【０２４９】
さらに本発明は、本発明の多型部位を含むDNA転写調節領域と、転写調節因子との結合を指標とするパーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法に関する。【０２５０】
上述のように本発明者らは、GRK5の転写調節領域に存在する多型変異「m22.1」、「m24」によって該GRK5遺伝子の発現が亢進することを示した。【０２５１】
従って、該多型部位を含む転写調節領域は、GRK5遺伝子の発現に関与しており、該転写調節領域と転写因子との結合活性を変化させる物質は、GRK5遺伝子の発現を変化させ得るものと期待される。【０２５２】
また、本発明の多型変異を有する転写調節領域DNAは、野生型の転写調節領域DNAと比べて転写因子との結合活性が変化している。従って、該DNAは、転写因子との結合活性を変化させる物質のスクリーニング方法に好適に利用することができる。【０２５３】
本発明の上記スクリーニング方法の好ましい態様としては、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、パーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法である。
（ａ）YY1認識配列を含むポリヌクレオチド、もしくは本発明の多型変異「22.1」を有しYY1転写因子との結合活性が低下しているポリヌクレオチド、およびYY1転写因子と、被検化合物とを接触させる工程
（ｂ）前記ポリヌクレオチドと転写因子との結合活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記結合活性を上昇させる化合物を選択する工程【０２５４】
また別の態様としては、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、パーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法を挙げることができる。
（ａ）CREB認識配列を含むポリヌクレオチド、もしくは本発明の多型変異「m24」を有しCREB-1転写因子との結合活性が上昇しているポリヌクレオチド、およびCREB-1転写因子と、被検化合物とを接触させる工程
（ｂ）前記ポリヌクレオチドと転写因子との結合活性をを測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記結合活性を低下させる化合物を選択する工程【０２５５】
なお、本発明における「パーキンソン病」とは、好ましくは、孤発性パーキンソン病（sPD）を挙げることができる。【０２５６】
また、上記の各種スクリーニング方法において使用される化合物もまた、パーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング用試薬として有用である。【０２５７】
本発明の上記試薬の具体例としては、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかを有効成分として含有する、パーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング用試薬を挙げることができる。
（ａ）GRK5遺伝子の転写産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
（ｂ）GRK5タンパク質を認識する抗体
（ｃ）129位のセリン残基がリン酸化されたαシヌクレインタンパク質を認識する抗体
（ｄ）（ｄ−１）配列番号：５に記載の塩基配列、または、該塩基配列において１もしくは複数の塩基が付加、欠失もしくは置換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであって、YY1転写因子との結合能が低下していることを特徴とするポリヌクレオチド、または（ｄ−２）配列番号：３に記載の塩基配列、または、該塩基配列において１もしくは複数の塩基が付加、欠失もしくは置換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであって、CREB-1転写因子との結合能が上昇していることを特徴とするポリヌクレオチド。【０２５８】
さらに本発明は、本発明の検査方法またはスクリーニング方法を実施するために用いられる各種薬剤・試薬等を含むキットを提供する。【０２５９】
本発明のキットは、例えば、本発明の上述の各種試薬の中から、実施する検査方法あるいはスクリーニング方法に合わせて適宜選択することができる。例えば、本発明のキットは、本発明のオリゴヌクレオチド、抗体等を構成要素とすることができる。より具体的には、（１）本発明のプライマーオリゴヌクレオチド、およびPCR用反応試薬（Taq ポリメラーゼ、緩衝液等）、または（２）本発明のプローブオリゴヌクレオチド、およびハイブリダイぜーション用緩衝液、（３）本発明の抗GRK5抗体もしくは抗リン酸化αシヌクレイン抗体、およびELISA用試薬、等を例示することができる。【０２６０】
さらに、本発明のキットには、対照サンプル、緩衝液、使用方法を記載した指示書等を適宜含めることができる。【０２６１】
また本発明は、外来性のGRK5タンパク質およびα-シヌクレインが発現していることを特徴とする、トランスジェニック非ヒト動物を提供する。該動物は、神経毒性に起因する行動を呈することが本発明者らによって示された。即ち、GRK5タンパク質およびα-シヌクレインタンパク質を人為的に動物において発現させることにより、野生型と容易に識別可能な表現型を呈する動物を、実際に作製することに成功した。【０２６２】
本発明の上記動物は、その容易に識別可能な表現型を指標とすることにより、パーキンソン病の治療薬のスクリーニングに好適に利用することができる。本発明のスクリーニング方法によって取得（同定）される物質（化合物）は、本発明の動物の表現型を実際に変化（抑制）させ得る物質であることから、神経疾患、特にパーキンソン病に治療効果を有する蓋然性の高い物質であると言うことができる。【０２６３】
本発明の上記方法の好ましい態様においては、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、パーキンソン病の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法、
（ａ）本発明のトランスジェニック非ヒト動物へ被検化合物を投与する工程
（ｂ）前記動物の神経毒性に起因する行動を観察する工程
（ｃ）前記行動の発生を抑制する化合物を選択する工程【０２６４】
本発明のトランスジェニック動物は、一般的な遺伝子工学技術を利用して適宜、作製することができる。通常、GRK5タンパク質およびα-シヌクレインをコードする遺伝子を発現ベクターへ連結させ、それぞれのベクターを動物細胞へ導入することによって作製することができる。具体的には、後述の実施例に記載の方法によって本発明のトランスジェニック動物を作製することができる。当業者であれば、実施例に記載された方法を適宜改変して、所望の動物について本発明のトランスジェニック動物を作製することが可能である。【０２６５】
本発明のトランスジェニック動物は、好ましくは、外来性のGRK5遺伝子、およびα-シヌクレインをコードする遺伝子が発現可能な状態でゲノム中へ挿入された構造を有する。【０２６６】
本発明のトランスジェニック動物としては、GRK5タンパク質およびα-シヌクレインタンパク質、あるいは、該タンパク質に相当するタンパク質（ホモログ等）が細胞内で発現した際に、実質的に機能し得る動物であれば特に制限されないが、好ましくは線虫を挙げることができる。【０２６７】
線虫の場合には、上記（ｂ）における神経毒性に起因する行動として、例えば、後述の実施例で示すような、「ベンディング回数」、「体前部の接触刺激による行動」、「食物探知行動」等を挙げることができる。【０２６８】
本発明の方法においては、被検化合物の中から、上記の行動を正常レベル（野生型動物における上記の各種行動）へ回復させる化合物を選択することにより、パーキンソン病の治療もしくは予防のための候補化合物を取得することができる。
また、被検化合物の投与は、経口、非経口投与のいずれでも可能である。具体的には、注射、経鼻投与、経肺投与、経皮投与、経口投与等が挙げられる。注射の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。被検化合物がDNAである場合、生体内に投与する場合には、レトロウイルス、アデノウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターやリポソームなどの非ウイルスベクターを利用することができる。【０２６９】
また本発明は、本発明の薬剤を個体（例えば、患者等）へ投与することを特徴とする、パーキンソン病の治療もしくは予防方法に関する。【０２７０】
本発明の好ましい態様としては、GRK5遺伝子の発現抑制物質、またはGRK5タンパク質の機能抑制物質を個体（例えば、患者等）へ投与する工程を含む、パーキンソン病を予防および／または治療する方法である。【０２７１】
本発明の治療方法における個体とは、通常、上記疾患の患者を指し、特に制限されないが、好ましくはヒトである。【０２７２】
患者への投与は、一般的には、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射など当業者に公知の方法により行うことができる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、該化合物がDNAによりコードされうるものであれば、該DNAを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。【０２７３】
遺伝子治療用ベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターやリポソームなどの非ウイルスベクターなどを例示することができる。該ベクターを利用して、ex vivo法やin vivo法などにより患者へ目的のDNAの投与を行うことができる。【０２７４】
さらに本発明は、GRK5遺伝子の発現抑制物質あるいはGRK5タンパク質の機能抑制物質のパーキンソン病治療薬の製造における使用に関する。【０２７５】
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０２７６】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により制限されるものではない。なお、本実施例において使用した試薬およびプラスミドは、以下のとおり取得したものである。【０２７７】
αリノレン酸ナトリウム塩、脂肪酸フリーウシ血清アルブミンはシグマより購入した。オカダ酸は和光純薬より購入した。本発明では、次の抗体を用いた。マウスモノクローナル抗αＳ抗体（Syn-1  BDトランスダクションラボラトリーズ）、マウスモノクローナル抗リン酸化Ser-129 αＳ抗体（psyn#64）、マウスモノクローナル抗α-アクチン抗体（AC-15、シグマ）、抗GRK5に対するウサギポリクローナル抗体（H-64、サンタクルスバイオテクノロジー）、全長ヒトαＳcDNA（IMAGE clone #3604532）は、オープンバイオシステム、サブクローン化されたベクターpcDNA3.1はインビトロジェンによって供給された。ヒトGRK5cDNAはヒト脳のRNAより逆転写PCR法により調製した。GRK5cDNAはFLAGタグのC末端で融合しており、pcDNA3.1ベクターにサブクローンされた。【０２７８】
129位のセリンをアラニンに置換変異した変異体cDNAと、GRK5の変異体である215番目のリジンをアルギニンに変異させたcDNAはクイックチェンジサイトディレクティッドミュータジェネシスキット（ストラタジーン）、すべてのcDNAの配列はDNAシークエンシングにより確認をして使用した。【０２７９】
〔実施例１〕  SNPs解析
本発明者らは、上述のようにして得られた山形県内286例のPD患者と496人の正常コントロールを使い、GRK5遺伝子を含む520候補遺伝子内の5632 SNPをsliding window法によりスキャンし、ハプロタイプ関連の有無をスクリーニングした。【０２８０】
その結果、GRK5遺伝子内にPD罹患リスクを上げる低頻度ハプロタイプを見出した。それは、エクソン2周辺に存在するrs871196（m22）、rs7069375（m23）、rs4752293（m24）の3つのイントロンSNPにより形成されるハプロタイプG-A-Cであり、PDリスクを約２倍に高める低頻度ハプロタイプであった（ハプロタイプ頻度=PD 9.3%、コントロール5.1%、OR=1.91、p値＝0.0002）（表１Ａ）。【０２８１】
また、GRK5遺伝子における連鎖不平衡およびハプロタイプブロックについて解析を行った。m22、m23、およびm24の3SNPsを含むハプロタイプブロックがsPDと有意に関連していることが分かった（表１Ａ）。HTR分析の結果も示す。各ハプロタイプの関連試験に対する経験的p値（individual-p）が10000順列によって得られた。全てのハプロタイプ関連試験でも、有意な経験的p値が見られた（10000 順列においてP=0.0152）。【０２８２】
また、この領域におけるD’の分布について調査した。SNP m24および他のSNPsの間のD’スコアを図２Ａに示す。さらに、GRK5遺伝子における遺伝子型SNPsの名前および位置について図２Ｂに示す。GRK5遺伝子をカバーする15のSNPsの間で、m20からm25までの領域をカバーするSNPsは、有意な経験的individual p値を示した。これらのハプロタイプは、m22-m23-m24のSNPsで、同じアリル配列G-A-Cを共有していた。【０２８３】
一方、単一SNP解析では、有意な頻度差は認められなかった（表１Ｂ）。またアミノ酸コードを変える高頻度SNPはエクソン9以外には、見つからず、このSNPsはsPDと関連はなかった。【０２８４】
【表１Ａ】
2006112456.tif 000004
【０２８５】
【表１Ｂ】
2006112456.tif 000005
【０２８６】
そこで、本発明者らは、ドーパミン産生ヒト神経細胞株SH-SY5Yを用い、ゲルシフトアッセイとルシフェラーゼアッセイを行い、このハプロタイプ内の登録SNPの中に、機能性イントロンSNPがないか調べた。その結果、２つのSNPが見つかった。ひとつは、まだタイピングをしていなかったm22.1（rs2420616）であり、もうひとつはすでにタイピングしていたm24であった。新たにタイピングしたm22.1を加えた16SNPについて、同じようにsliding window法によるハプロタイプスキャンを行うと、m22.1を含まない結果と同じ結果を得た。機能性SNPであるm22.1とm24によるハプロタイプを解析すると、頻度が極めて低いOR＝3.434の罹患性ハプロタイプG-Cが同定された（PD群４％とコントロール群1.2%、OR=3.43, 95%信頼限界1.69-6.94、p=0.00012）。なお、ハプロタイプブロックの様子を表２に示す。【０２８７】
【表２】
2006112456.tif 000006
【０２８８】
興味深いことに、m22.1とm24は絶対連鎖不平衡に近い関係にあり（D’=89, Δ＝0.88）、アレル同士の連関が強いことがわかった。実際、罹患性ハプロタイプG-Cのアレルはふたつとも、ルシフェラーゼ活性をあげるほうのアレル（m22.1がG、m24がC）であった。さらに詳細に検討したところ、この罹患性ハプロタイプG-Cの有無は、最初に同定した罹患性ハプロタイプG-A-C（m22m23m24）の有無とほぼ完全に一致した。つまり、元祖ハプロタイプm22m23m24からさらに頻度の低いm22.1m24ハプロタイプが派生していると考えられた。【０２８９】
〔実施例２〕  機能解析
イントロン２に存在するSNP m24の転写活性を確認するために、本発明者らはゲルシフトアッセイ、スーパーシフトアッセイ、およびルシフェラーゼアッセイを行なった。【０２９０】
（２−１）SNP m24のゲルシフトアッセイ
まず、SNP m24のゲルシフトアッセイと競合アッセイを行った。SH-SY5Y細胞の核抽出液と32P標識した非疾患感受性であるTアリル（m24T：5’ cagaagactcTgtcatcaggc／配列番号：２）、疾患感受性であるCアリル（m24C：5’cagaagactcCgtcatcaggc／配列番号：３）のオリゴヌクレオチドを反応させた。コンペティター（競合物質）として、非標識m24Cプローブを200倍の過剰量加えた。【０２９１】
その結果、図３Ａに示すとおり、シフトバンド（矢尻）がレーン１と５に見られたが、m24C（レーン５）はm24T（レーン１）よりもバンド強度が高く、疾患感受性であるＣアレルは、核タンパクと、非疾患感受性であるＴアレルより高い親和性を持つ事が示唆された。このことは、コンペティター（非標識オリゴヌクレオチドプローブ）による阻害が、m24C（レーン４、８）の方がm24T（レーン３、７）よりシフトバンドの減弱が強いことからも示唆された。コントロールではシフトバンドの阻害は起きなかった（レーン２、６）。【０２９２】
（２−２）SNP m24のスーパーシフトアッセイ
このサイトの核酸配列はCRE（cAMP反応性エレメント）（Gonzalez GA, Yamamoto KK, Fischer WH, Karr D, Menzel P, Biggs W 3rd, Vale WW, Montminy MR. A cluster of phosphorylated sites on the cyclic AMP-regulated nuclear factor CREB predicted by its sequence. Nature 337, 749-752 (1989).）と高いホモロジーを持っていた。従って、本発明者らはSNPm24のスーパーシフトアッセイを行った。m24Tまたはm24C  32P標識オリゴヌクレオチドをSH-SY5Y細胞の核抽出液と反応させた。CRE結合タンパク1（CREB-1）に対する抗体、抗c-JUN抗体、コントロール抗体（抗STAT-1抗体）を使用した。【０２９３】
その結果、図３Ｂに示すように、CREB1に対する抗体はシフトバンド（矢尻：レーン５、１０）を減弱させ、シフトバンドよりさらにシフトした２本のスーパーシフトバンド（二重矢尻：レーン５、１０）を生じた。これらのバンドは、ＣアレルでＴアレルより強く認められた。これは、CREB-1がＴアレルに較べてＣアレルに、より強固に結合する事を示している。抗c-JUN抗体もまたスーパーシフトバンドを生じさせた（三重矢尻：レーン３、８）。スーパーシフトバンドの強度はm24C（レーン８、１０）の方がm24T（レーン３、５）より大きかった。コントロール抗体（抗STAT-1抗体）はシフトバンドの強度に影響せず、スーパーシフトバンドを生じなかった（レーン２、７）。【０２９４】
（２−３）SNP m24のルシフェラーゼアッセイ
これらのアレルの転写活性を確認するために、SNP m24を含む配列をpGL-3プロモーターベクターに挿入し、ルシフェラーゼの発現量を測定した。詳しくは、１コピーまたは３コピーのm24Tまたはm24CオリゴヌクレオチドをｐGL-3プロモーターベクターにタンデムに挿入し、SH-SY5Y細胞に導入し相対的なルシフェラーゼ活性（RLA）を測定した。【０２９５】
その結果、図３Ｃに示すようにcAMP非存在下では５つのベクターに差はなく、cAMP存在下では、m24Cはm24Tと比較して、Ｃアレルの１コピー挿入の場合、Ｔアレル挿入の場合と比較して1.5倍のRLA（p＜0.05）、３コピー挿入の場合に9.7倍のRLA増強が認められた（p＜0.0001）
さらに、クロマチン免疫沈降法（ChIP）により、SH-SY5Y細胞で内在性CREB-1がm24の領域に結合する事を見出した（図３Ｄ）。【０２９６】
なお、ChIPはキット製造者のマニュアルに従って行った（Upstate）。SH-SY5Y細胞は、１%ホルムアルデヒドで37 ℃、10分間固定した。細胞は氷冷下でDNA断片長が＜2 kbの可溶性クロマチン複合体を得るよう超音波で破砕された。それぞれ1×106個の細胞を含むサンプルを、抗体なし、5μgの無関係な抗体、5μgの抗CREB-1抗体(C-21)を用いて免疫沈降した。タンパク質を除去した後、DNAをプライマーセット（5’-tgccggagttcgactggtcag-3’（配列番号：１０）および5’-tagcagctcaatggctttgtc-3’（配列番号：１１））を用いて増幅した。【０２９７】
（２−４）SNP m22.1のゲルシフトアッセイと競合アッセイ
本発明者らは、イントロン1に存在するm22.1についてもゲルシフトアッセイによる機能の確認を行なった。非疾患感受性であるAアリル（m22.1A：5’taaactcagatAtggcttcaggg／配列番号：４)、または疾患感受性であるＧアリル（3 m22.1G：5’taaactcagatGtggcttcaggg／配列番号：５）をSH-SY5Y細胞の核抽出液と共に32P標識オリゴヌクレオチドと反応させた。【０２９８】
その結果、図４Ａに示す通り、DNA-タンパク複合体のシフトバンド（矢尻と二重矢尻）が非疾患感受性であるAアリルをプローブとしたm22.1Aレーン（１〜３）に認められたが、疾患感受性であるGアリルをプローブとしたm22.1G（レーン３）には認められなかった。m22.1Aコンペティター（非標識オリゴヌクレオチドプローブ）の添加によって、シフトバンドは減弱したが、m22.1Gコンペティターではシフトバンドは消失しなかった（レーン３）。これらは、核タンパクがm22.1Aと結合する事を示唆している。【０２９９】
（２−５）YY1（Yin Yang-1）結合モチーフオリゴヌクレオチドを用いたSNPm22.1の競合アッセイ
このサイトの核酸配列は、転写を活性化することも抑制することもある転写調節因子であるYY-1（Shrivastava A, Calame K. An analysis of genes regulated by the multi-functional transcriptional regulator Yin Yang-1. Nucleic Acids Res 22, 5151-5155 (1994).）結合部位と相同性があったため、本発明者らはYY-1結合サイトを含むオリゴヌクレオチドによるインヒビションアッセイを行った。m22.1Aの32P標識オリゴヌクレオチドはYY1結合サイト(5’taaactcagatAtggcttcaggg／配列番号：６)を持つ。これを、SH-SY5Y細胞の核抽出液に反応させた。非標識のYY1結合配列（YY1co：5’cagccgccaagatggccggggag／配列番号：７)、非標識の変異型のYY1配列（YY1mu：5’cagccgccaagataatcgcggag／配列番号：８)、非標識の変異m22.1A（m22.1Amu：5’taaactcagatAcacctcaggg／配列番号：９）をそれぞれ添加した。【０３００】
その結果、図４Ｂに示すように、シフトバンド（三重矢尻）は非標識のYY1結合配列（YY1co：レーン５)の添加により、ほぼ完全に消失した。しかし、非標識の変異型のYY１配列（YY1mu：レーン６)、非標識の変異m22.1A（m22.1Amu：レーン３）および非標識のm22.1G（レーン４）では影響がなかった。【０３０１】
（２−６）SNPm22.1のスーパーシフトアッセイ
抗YY-1抗体を用いたスーパーシフトアッセイを行った。m22.1A、m22.1Amu、m22.1G、YY1coまたはYY1mu  32P標識オリゴヌクレオチドとSH-SY5Y細胞の核抽出液を反応させた。【０３０２】
その結果、図４Ｃに示すようにシフトバンド（二重矢尻）は、m22.1A（レーン１）、YY1co（レーン7）32P標識オリゴヌクレオチドで生じた。このバンドは、抗YY1抗体によりほぼ完全に消失した（レーン２、８）。これらの結果は、YY１がYY1coと同様にm22.1A（Aアリル）と結合する事を示唆する。【０３０３】
（２−７）SNP m22.1のルシフェラーゼアッセイ
１コピーまたは３コピーのm22.1Aまたはm22.1Gオリゴヌクレオチドを、pGL-3プロモーターベクターにタンデムに挿入し、SH-SY5Y細胞に導入し、ルシフェラーゼアッセイによりRLAを測定した。【０３０４】
その結果、図４Ｄに示すように、３コピーを導入した場合において、m22.1Aオリゴヌクレオチドは、他の４種類のベクターを用いた時と比べ、42％のRLAの減弱を示した（p＜0.0001）。これは、YY1により転写活性が抑制される事を示している。【０３０５】
（２−８）sPD患者の黒質の免疫組織化学染色
GRK5とsPDの関連を確認するために、本発明者らは、PD患者（ヒト）の脳を用いて免疫組織化学的な研究を行った。【０３０６】
詳しくは、６名の孤発性パーキンソン病患者の剖検時に摘出され、ホルマリン固定し、パラフィン包埋した中脳の組織片（6μm厚）を、脱パラフィンし、抗原の露出のために電子レンジを用いてpH 6.0のクエン酸溶液で加熱した。切片は、1 %過酸化水素水と10分間反応させ内因性ペルオキシダーゼの活性をブロックし、5 %の正常ヤギ血清、0.03 %トリトンXを添加したPBSで30分間、非特異的な反応をブロックするために反応させた。切片は、ヒトGRK1、GRK2、GRK3、GRK4、GRK5およびGRK6に対するポリクローナル抗体（サンタクルスバイオテクノロジー）と４℃でオーバーナイトし、ビオチン化した二次抗体、続いてペルオキシダーゼ標識アビジン−ビオチン複合体と反応させた。3,3’-ジアミノベンチジンテトラヒドロクロライドと硫化ニッケルアンモニウムで発色させた。多系統萎縮症、アルツハイマー病患者の脳の組織片についても同様に免疫組織化学染色を実施した。【０３０７】
その結果、GRK5が、PDの病理学的特徴であるLewy小体に蓄積している事を発見した（図５Ａ）。Lewy neuriteもGRK5陽性であった（図５Ｂ、Ｃ）。共焦点レーザー顕微鏡の像は、GRK5とαSがLewy小体に共存する事を示した（図５Ｄ〜Ｆ）。GRK1、GRK2、GRK3、GRK4、GRK6ではLewy小体は染色されなかった。多系統萎縮症の病理学的な特徴である、αＳ陽性のグリア細胞の細胞質封入体（GCI）にはGRK5は検出されなかった。アルツハイマー病の神経原線維変化（NFT）、老人斑（SP）もGRK5陰性であった。Lewy小体にはGRK5が存在したが、GCI、NFT、SPには存在しないという研究結果から、GRK5はsPDの病態に特異的に関与していると考えられる。【０３０８】
〔実施例３〕  GRK5のαSに及ぼす生物学的効果
本発明では、上記実施例２のように、GRK5とsPDとの関連が明らかにされた。したがって、本発明者らはsPDの発症におけるGRK5の生物学的な役割を、GRK5とαS cDNAを共発現させたHEK293細胞を用いて、GRK5とαSのリン酸化に注目して検討した。【０３０９】
p-αSは速やかに脱リン酸化されるので、本発明者らは、細胞を蛋白質脱リン酸化酵素I型のアイソザイムであるPP1とPP2Aに特異的な阻害剤（Okochi M, Walter J, Koyama A, Nakajo S, Baba M, Iwatsubo T, Meijer L, Kahle PJ, Haass C. Constitutive phosphorylation of the Parkinson's disease associated alpha-synuclein. J Biol Chem. 275, 390-397 (2000).）であるオカダ酸（和光純薬）を用いて細胞を処理した。オカダ酸処理したGRK5発現細胞で、129位Serがリン酸化されたp-αSに対する抗体（Saito Y, Kawashima A, Ruberu NN, Fujiwara H, Koyama S, Sawabe M, Arai T, Nagura H, Yamanouchi H, Hasegawa M, Iwatsubo T, Murayama S. Accumulation of phosphorylated alpha-synuclein in aging human brain. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 62, 644-654 (2003).）によって、p-αSがオカダ酸の用量・時間依存性に検出された（図６）。【０３１０】
詳しくは、まずヒト野生型のαＳを安定して発現しているHEK293細胞に、空ベクターまたはGRK5-FLAG cDNAを導入した。導入30時間後、0,5,10,20 nMの各濃度のオカダ酸を培地に添加し、細胞をさらに16時間培養した。20μgの1%NP-40を添加した細胞溶解液を12.5 %トリス-グリシンゲルの各レーンに加え、泳動後、PVDF膜に転写した。FLAG、マウスモノクローナル抗αＳ抗体Syn-1（BDトランスダクションラボラトリーズ）、マウスモノクローナル抗リン酸化Ser-129 αＳ抗体psyn#64、またはマウスモノクローナル抗β-アクチン抗体AC-15（シグマ）、それぞれGRK5-FLAG、総αＳ、129位Serリン酸化αＳ、β-アクチンを認識する抗体を用いてウェスタンブロッティングを行なった。【０３１１】
ウェスタンブロッティングは以下のように実施した。すべてのタンパクサンプルは、電気泳動の前に2.5% 2-メルカプトエタノールを含むレムリのサンプルバッファー中で５分間煮沸した。等量のタンパクを12.5 %ポリアクリルアミドゲルで電気泳動後、PVDF膜（ミリポア）に転写した。膜を一次抗体と４℃一晩反応させた後に、ホースラディッシュペルオキシダーゼで標識した二次抗体と反応させた。発色は、ECL plusまたは、ECL advance（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いて行なった。【０３１２】
その結果、図６Ａに示すように、psyn#64による染色で、GRK5発現細胞では、129位Serのp-αSがオカダ酸の濃度に比例して検出された。【０３１３】
さらに、ヒト野生型のαＳを安定して発現しているHEK293細胞に、空ベクターまたはGRK5-FLAG cDNAを導入して24時間後、培地に20nMのオカダ酸を添加し、0,6,12,24時間（最長24時間）培養した。0時間の細胞は、オカダ酸処理の開始点としてサンプリングした。【０３１４】
その結果、図６Ｂに示すように、GRK5発現細胞で、129位Ser p-αS（Ser-129 αＳ）の量はオカダ酸存在下での培養時間が長くなるほど増加した。空のベクターを導入しオカダ酸存在下で24時間培養した細胞でも129位Ser p-αSのかすかなシグナルが認められた。これは、未同定のキナーゼが129位Ser αSのリン酸化に関与したものと推察される。【０３１５】
〔実施例４〕αSのリン酸化に対するGRK5の発現量変化と酵素活性変化の影響
αＳの129位Serのリン酸化とGRK5の生物学的関係を検索するため、GRK5-FLAG、総αS、Ser-129 p-αSをそれぞれ認識するFLAG、Syn-1、psyn#64抗体を用いたウェスタンブロッティングを行ない、以下の検討を行った。【０３１６】
HEK293細胞は、10 ％ウシ胎児血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地、ヒト神経芽腫由来細胞SH-SY5Yは、10 ％ウシ胎児血清含有するDMEMとHam’s F-12（インビトロジェン）１：１混合培養液中で、37 ℃、5 %CO2の保温・加湿条件下で培養した。αSを安定して発現するHEK239細胞株は、1mg/mlのG418（インビトロジェン）を用いてネオマイシン耐性を指標として選択した。【０３１７】
αS安定発現HEK239細胞株に、リポフェトアミンプラス試薬（インビトロジェン）を使って、GRK5-FLAG cDNA（0,0.1,0.5,1,2μg）を導入した。形質転換より３０時間後に２０nMのオカダ酸を添加し、１６時間さらに培養した。結果、図７Ａ上パネルに示すように、総αＳの量はほぼ同じだが、p-αSの量はGRK5の量に従い増加していた。【０３１８】
さらに、図７Ａ下パネルに示すように、Ser-129位のαＳリン酸化は、野生型のGRK5とαＳを一過性共発現している細胞に認められた。一方、αSの129番目のセリン残基をアラニンに置換したS129A変異体と野生型GRK5の一過性共発現の組み合わせではリン酸化αＳは観察されず、また野生型αＳとGRK5の酵素活性中心にある２１５番目のリジン残基をアルギニンに置換した変異体の組み合わせでも、αＳのリン酸化は認められなかった。【０３１９】
つまり、GRK5タンパク質の発現量は、オカダ酸により安定化されたp-αSの発現量と正の相関をしていることが示された（図７Ａ）。また、ヒト神経芽腫由来細胞であるSH-SY5Y細胞においても、GRK5によるαSのリン酸化が認められた。【０３２０】
〔実施例５〕免疫沈降法によるGRK5とαSの結合の検討
GRK5がαSと結合するかどうかを検索するために、免疫沈降法を行った。HEK293細胞を界面活性剤含有緩衝液で抽出した細胞溶解液を用いて行う、通常の免疫沈降法（免疫沈降条件は、クロスリンカーを用いない以外、後述する方法と同様にして行った）では、GRK5とαSの結合は観察されなかった。しかし、培養細胞またはヒト脳ホモジェネートを膜透過性のクロスリンカー（架橋剤）で処理する事によりGRK5とαSの結合が検出可能となった。【０３２１】
詳しくは、αＳを安定して発現するHEK293細胞に、空のベクターまたはGRK5-FLAG cDNAを一過性に導入した。形質転換されたHEK293細胞は100 mmのプレートで培養し、冷却したPBSバッファーで２度洗浄し、6 mlの架橋バッファー（10 mM HEPES pH 7.4、2.5 mMジチオビス（サクシニミジルプロピオン酸）を含むPBS）（DSP、ピアース、ロクフォールド、イリノイ、USA）に置換し、室温で30分間反応させた。架橋反応は架橋バッファーを速やかに取り除く事で終了させた。細胞は1 mlの氷冷の溶解バッファー（50 mM Tris-HCl、pH 7.6、150 mM NaCl、1 mM EDTA、10%グリセロール、1%ノニデットP-40、プロテアーゼ阻害剤）を加え、12000×ｇで30分間遠心し、上清を免疫沈降の実験に用いた。細胞溶解液をプロテインGアガロースビーズで３０分間前処理して非特異的結合を除去した後、2μlのSyn-1抗体を加え４℃一晩反応させた。そして、プロテインGアガロースビーズと２時間反応させ、その後ビーズを溶解バッファーで3回洗浄し、免疫沈降したタンパクをレムリのサンプルバッファーで溶出した。等量のサンプルをウェスタンブロッティングで分析した。【０３２２】
その結果、図７Ｂ上パネルに示すように、抗GRK5抗体を用いたウェスタンブロッティングにて、GRK5を発現させた細胞でGRK5とαSの結合が観察された。【０３２３】
さらに、ヒト側頭葉皮質組織を用いて検証した。ヒト脳の側頭葉皮質をプロテアーゼ阻害剤を添加したPBSで、テフロンホモジナイザーを用いてホモジナイズし、800×gで5分間遠心した。上清にDSPを最終濃度が2.5 mMとなるように加え、室温で30分間ゆるやかに振とうした。架橋反応は、反応液中の最終濃度50 mM Tris（pH 7.6）を用いて反応停止させた。脳のホモジネートは100000×gで30分間遠心して生じたペレットに、1:5(重量/容量)の割合で氷冷の溶解バッファーを加え、２７ゲージの注射針を用いて抽出した。抽出物を12000×gで30分間遠心した後、上清を前述したものと同じ方法で免疫沈降を行った。組織溶解液を抗FLAG（陰性対照）、Syn-1、あるいは抗GRK5抗体で免疫沈降した。【０３２４】
その結果、図７Ｂ下パネルに示すように、抗GRK5抗体でウェスタンブロッティングを行うことで、αSと共沈降したGRK5が検出された。【０３２５】
このことは、GRK5とαSの両者は、きわめて近接した距離的関係で存在するが、その結合は弱い、あるいは一過性であることを示唆している（図７Ｂ）。【０３２６】
〔実施例６〕  免疫細胞化学によるGRK5とαSの細胞内局在
GRK5とαSの両者の関連について形態学的に確認するために、共焦点レーザー顕微鏡で細胞を観察した。【０３２７】
αＳを安定して発現するHEK293細胞は、４チャンバースライド（ナルゲヌンク）で培養し、野生型GRK5-FLAGまたは変異型GRK5 K215R-FLAG cDNAを一過性に形質導入し、オカダ酸非存在下あるいはオカダ酸存在下で培養した。形質導入の48時間後にPBSバッファーで２回洗浄し、4 %ホルムアルデヒド溶液で室温で15分間固定した。固定した細胞は、続いてPBSで３回洗浄し、5 %スキムミルクと0.05 %トリトンX-100を添加したPBSで１時間ブロッキングし、ウサギポリクローナル抗GRK5抗体（H-64）マウスモノクローナル抗αＳ抗体（LB509）かpsyn#64によって4℃、オーバーナイトで反応させた。洗浄後、細胞をアレクサ488標識抗マウスIgG（緑）とアレクサ568標識抗ウサギIgG（赤）（モレキュラープローブス）の混合液にて37℃で１時間反応させた。画像はツァイスLSM510METAレーザースキャン顕微鏡で得た。【０３２８】
その結果、図８に示すように、野生型GRK5は主に細胞膜に局在し、核周部にはほとんど観察されなかった。野生型αSは、主に核周部細胞質領域に存在し、細胞膜領域にもGRK5と共に局在した。共局在部位は、重ね合わせ画像で黄色に示される部位である（図８左のパネル）。野生型GRK5発現細胞では、Ser-129 p-αＳは細胞膜と核周部細胞質領域に存在し、変異型GRK5 K215R発現細胞では、Ser-129 p-αＳは観察されなかった。変異型GRK K215R5の細胞内局在は野生型と変わりなかった。オカダ酸存在下では、Ser-129-p-αＳは野生型のGRK5を発現した細胞のみに観察され、変異型GRK5であるK215Rを発現した細胞では観察されなかった。【０３２９】
〔実施例７〕オカダ酸処理に伴うリン酸化αSの細胞内局在変化
さらに、GRK5により触媒されるSer-129ｐ-αSの細胞内局在変化について検証した。野生型のαSを安定して発現するHEK293細胞に対して、野生型のGRK5-FLAG cDNAを一過性に導入した。細胞をオカダ酸で一定時間（0,3,6,12,24時間）処理した。細胞を固定して抗GRK5抗体（赤）、抗p-Ser129αS抗体（psy#64、緑）免疫化学染色した。【０３３０】
その結果、図７Ｃに示すように、オカダ酸存在下で３時間の反応で、GRK5とαＳは共局在している細胞膜の領域において、p-αＳは生じた。その後、p-αSはGRK5が局在する細胞膜の領域を離れ、核周部細胞質領域に移動した。【０３３１】
〔実施例８〕GRK5のαSオリゴマー形成に与える影響
GRK5のαSオリゴマー化における影響を非変性条件下で検討するために、本発明者らは、野生型のαSを安定して発現するHEK293細胞にGRK5のcDNAを導入し、α-リノレン酸とオカダ酸にて一定時間処理を行った。得られた細胞から、可溶性画分（370,000×g遠心後の上清）（Sharon R, Goldberg MS, Bar-Joseph I,Betensky RA, Shen J, Selkoe DJ. α-Synuclein occurs in lipid-rich high molecular weight complexes, binds fatty acids, and shows homology to the fatty acid-binding proteins. Proc Natl Acad Sci USA 98, 9110-9115 (2001).）を抽出し、ゲルろ過を用いて解析した。詳しくは、以下のように実施した。【０３３２】
野生型のαＳを安定して発現するHEK293細胞に、コントロールとしてクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）cDNA、またはGRK5 cDNAを一過性に導入した。形質導入後24時間の時点で、細胞培養液中に20 nM オカダ酸を添加した。さらに8時間培養した時点で、αリノレン酸（不飽和脂肪酸）とBSAを５：１のモル比でバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0 、150 mM NaCl）中に加え、37℃で30分間反応させてαリノレン酸／BSA複合体を作成した。20 nMオカダ酸とともに、αリノレン酸／BSA複合体を最終濃度500μMαリノレン酸、100μM BSAとなるように添加した新鮮な培養液に交換し、さらに16時間培養処理した。【０３３３】
細胞のタンパク分画は、一部変更を加えたシャロンの方法（Sharon et al, 2001）に従って行なった。すべての作業過程は4 ℃で行なった。回収した細胞を、ホモジナイズバッファー（20 mM HEPES、pH 7.4、1 mM MgCl2、0.32 M ショ糖、43 mM 2-メルカプトエタノール、１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュダイアグノスティックス）に１：３（重量／容量）で懸濁し、テフロンホモジナイザーで上下動を２０回繰返しながらホモジナイズした。ホモジネートを200×gで10分間遠心し、上清をさらに8000×gで15分間遠心した。生じた上清をさらに370000×gで1h遠心した（S370サイトゾル）。タンパク濃度をブラッドフォード法（バイオラッドラボラトリーズ）で測定した。【０３３４】
ゲルろ過のため、分子量マーカーまたは細胞より得た300μgのS370サイトゾルをスーパーデックス75 10/300カラム（ベッドボリューム24 ml、アマシャムファルマシアバイオテク）に添加した。溶出は、FPLCシステム（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いて、20 nMオカダ酸を含有した50 mM酢酸アンモニウム（pH 7.4）で流速6 ml/hで行なった。0.5 mlづつ画分を分取し、そのうちの0.25 mlを凍結乾燥後、ホモジナイズバッファーに再懸濁した。このサンプルをシャロンの方法 (Sharon et al, 2001) に従い、65℃、16時間の熱処理することにより脱脂した後、2.5%２−メルカプトエタノールを含むレムリのサンプルバッファーを加え、SDS-PAGE後、PVDF膜に転写し、抗αS抗体（Syn-1）または抗p-Ser129αＳ抗体（psyn＃64）を用いて解析した。【０３３５】
また、不飽和脂肪酸処理時間に伴うαSオリゴマー形成をみるために、HEK293細胞にαSとCAT、またはαSとGRK5を共発現させ、α-リノレン酸/BSA複合体を0, 3, 6, 9時間培養液中に添加した。αSとGRK5を発現させた細胞にはオカダ酸も添加した。これらの細胞からS370サイトゾルを調製し、65℃、16時間の熱処理して脱脂後、ウェスタンブロッッティングで解析した。【０３３６】
その結果、図７Ｄの左および中央のパネルに示すように、α-リノレン酸が誘導するαSオリゴマーの形成量は、ＣＡＴを共発現したHEK293細胞に認められる非リン酸化αSに比べ、GRK5を共発現したHEK293細胞で認められるリン酸化分子種を含むαSで亢進していた。そして、図７の右のパネルに示すように、このαSオリゴマーの形成は、非変性条件、つまりS370サイトゾルを加熱処理する前にゲルろ過カラムで分画しても確認できた。【０３３７】
〔実施例９〕プラスミドの作製
C末端にFLAG tagを付加した野生型およびキナーゼ不活性型（K215R）のGRK5の全長cDNAをPCR法により増幅した。プライマーセットは次のものを使用した。センスプライマー（Spe-I末端を持つ）：5’-CCCACTAGTATGGAGCTGGAAAACATCGT-3’（配列番号：１２）、アンチセンスプライマー（NdeI末端を持つ）：5’-CCCATATGCTACTTGTCATCGTCGTCCTTG-3’（配列番号：１３）である。PCR産物をベクターpFX_UNC-119（Madulo and pilgrim, 141(3):977-988, Genetics）のSpe-IとNde-Iサイトに挿入し、線虫のすべてのニューロンで発現する遺伝子unc-119のプロモーターであるPunc-119とGRK5遺伝子を連結した、Punc-119::GRK5（野生型）、Punc-119::GRK5（K215R、キナーゼ不活性型）を作成した。【０３３８】
α−シヌクレインの全長cDNAは昭和大学薬学部生物化学教室・中条茂先生より提供を受け、α−シヌクレインのリン酸化部位であるS129A変異型のα−シヌクレインのcDNAを既報（Fujiwara H. et al., Nat Cell Biol. 4(2)：160-164, 2002）の通り調製した。ドーパミンンニューロンで発現する遺伝子dat-1のプロモーターであるPdat-1にα−シヌクレイン遺伝子（S129A）を連結し、Pdat-1::α−シヌクレインを作成した（Kuwahara T. et al., J Biol Chem 281(1)：334-340, 2006）。touch neuronで発現する遺伝子であるmec-7のプロモーターであるPmec-7を野生型の線虫であるN2系統のゲノムよりPCR法により増幅して得た（Savage c. et al., J Cell Sci. 107(Pt8)：2165-2175）。次に、PCR産物をpFXneEGFPベクターに挿入し、enhanced green fluorescence protein（EGFP）をPmec-7に連結したPmec-7::EGFPを作成した。さらに、Pmec-7::α−シヌクレインを作成するために、Pmec-7::EGFP のEGFP領域をα−シヌクレインに置換した。【０３３９】
すべてのプラスミドは自動シークエンサー（Li-Cor社、Lincolin、NE）でThermo SequenceTM(アマシャムバイオサイエンス社)を用いてシークエンスを確認した。【０３４０】
〔実施例１０〕トランスジェニック線虫(C. elegans)の作出
線虫は既報の標準的な条件で飼育した（Brenner s. et al., 77(1)：71-94, Genetics, 1974）。より詳細に述べると、NGM培地（nematodes growth medium）アガープレートで20℃で飼育し、バクテリア（Escherichia coli OP50系統）を栄養分として与えた。トランスジェニック線虫の作成には野生型であるN2 Bristol系統を用いた。作成したプラスミドとマーカープラスミドをN2系統の雌雄同体の線虫の生殖腺に注射してトランスジェニック線虫を作成した。【０３４１】
Punc-119::GRK5を導入する系統に関しては、作成したプラスミド180μg/mlと、咽頭で赤色の蛍光を呈するPmyo-2::dsRed（20μg/ml）をマーカーとして共に注射した。Pmec-7::α−シヌクレインを導入する系統に関しては、作成したプラスミド100μg/mlと、roller型表現型を示すマーカーであるpRF4(rol-6)（100μg/ml）をマーカーとして共に注射した。Pdat-1::α−シヌクレインを導入する系統に関しては、作成したプラスミド100μg/mlに、小腸で赤色の蛍光を呈するPges-1::RFP（100μg/ml）をマーカーとして共に注射した。マーカー遺伝子は、東京女子医科大学・三谷昌平先生より提供を受けた。【０３４２】
安定した組換え体の系統を得るために、紫外線照射法（Mitani S. et al., Dev. Growth & Diff. 37:551-557, 1995）によって導入遺伝子を染色体に組み入れた。導入遺伝子が染色体に組み入れられた系統は、安定のために2〜4回の外交配を行った。【０３４３】
GRK5とα−シヌクレインを共に発現する、導入遺伝子が染色体に組み入れられた系統を得るために、GRK5（野生型または変異型（K215R））を過剰発現する系統をα−シヌクレインを過剰発現する系統と交配した。【０３４４】
〔実施例１１〕Age culture
産卵期の成虫を次亜塩素酸塩処理することにより、成長ステージがそろった個体群を得た（Lewis JA. Et al., Methods Cell Biol, 48：3-29, 1995）。M9緩衝液中で20℃で16〜24時間培養し、成長ステージがそろったL1を得た。線虫をNGMアガープレートに播き、20℃で３日間培養した。より遅い成長ステージの線虫群を得るために、３日間培養された線虫を0.2 mg/mlの5’-Fluoro-2’-deoxyuridine（和光純薬）を溶解したM9緩衝液とNGMアガープレートで培養し、次世代の発生を抑制した（Honda S. et al., J Gelontol. 48(2)：B57-61, 1993）。【０３４５】
〔実施例１２〕行動アッセイ＜Food-sensing Behavior Assay＞
Food-sensing Behavior Assayを、線虫のドーパミンニューロンの機能を評価するために既報（Kuwahara T. et al., J Biol Chem 281(1)：334-340, 2006）の通り行った。正常な線虫は、餌に遭遇すると頭部のベンディング回数が減少する。しかし、ドーパミン合成酵素を欠損するcat-2系統の線虫は、餌に遭遇してもベンディング回数が減少しないという異常を呈する。cat-2欠損系統はドーパミンをほとんど産生しないこと以外は野生型であるN2と同等である。従って、餌に遭遇したときのベンディング数の変化を行動学的にアッセイするfood-sensing behavior assayを行うことにより、線虫のドーパミンニューロンの機能を評価することが可能である。具体的に説明すると、充分に栄養を与えられた成長ステージを合わせた線虫をM9緩衝液で洗浄し、餌となるバクテリアを播いたプレート、または播かないプレートの中央に移した。移動の５分後、各線虫の２０秒のインターバル毎のベンディング数を測定した。Slowing rateは、バクテリアなしの場合のベンディング数より、バクテリアありの場合のベンディング数を引き、さらに、バクテリアなしの場合のベンディング数で除してパーセント単位で算出した。（｛バクテリア（−）のときのベンディング数−バクテリア（+）のときのベンディング数｝／バクテリア（−）のときのベンディング数＊100（％））。【０３４６】
各系統について５匹の線虫を試験し、独立に７回の試験を行った。【０３４７】
さらに、既報（Kuwahara T. et al., J Biol Chem 281(1)：334-340, 2006）に従い、ドーパミンの投与を行い、各線虫の運動率を前述の通り測定した。【０３４８】
行動アッセイに際し、測定者は線虫の系統（遺伝子型）を知らされずに測定を行った。【０３４９】
〔実施例１３〕Touch Assay
成長ステージを合わせた各系統の３、６、９日齢のトランスジェニック線虫それぞれ６０匹についてTouchアッセイを行った。ヒト睫毛を用いて虫体に５回づつ触って反応をスコア化した。正常な反応では、線虫は、虫体の前側に軽く接触すると後退、後側に軽く接触すると前進するのが正常な反応である。touchニューロンに異常があれば、線虫は接触刺激を受けても前進を続ける。各個体について正常な反応があった場合に加点する方法でスコアを記録した。【０３５０】
〔実施例１４〕イムノブロッティングと免疫組織化学染色
線虫をM9緩衝液で３回洗浄し回収した（Brenner s. et al., 77(1)：71-94, Genetics, 1974）。イムノブロティングのサンプルは次の通り調製した。線虫を等量のサンプルバッファー（160 mM Tris-HCl, 4% SDS, 30% glycerol）と共に超音波により破砕し、10000 rpmで15分間遠心して上清を集めた。タンパク質濃度をBCA（Bicinchoninic Acid）法により測定し、タンパク量が同じになるようにサンプルを測り取り、SDS-ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。次に、ポリビニリデンジフルオリド（PVDF）メンブレン（ミリポア社）に転写した。5％スキムミルク、0.1% tween-20添加TBS緩衝液中で１時間ブロッキングした後、メンブレンを一次抗体である抗FLAG M2モノクローナル抗体（1:1000）（シグマ社）と共に4℃でオーバーナイトした。次に、二次抗体であるホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体（アマシャムバイオサイエンス社）とインキュベートした。特異的な反応を増強した蛍光化学発光法により染色を行った。【０３５１】
免疫組織化学法のために、線虫を4％パラホルムアルデヒド中で4℃でオーバーナイトで固定した。パラフィンに包埋し3μm厚の切片とした。免疫化学染色は、一次抗体として抗ヒトGRK5抗体C-20（1:500）（サンタクルス社）、抗ヒトα−シヌクレインモノクローナル抗体（LB509 （エピトープ115-121/122位アミノ酸）(Baba M.et al., Am J Pathol. 152, 879-884, 1998) （1:1000）、SYN211（1:1000）(東京大学薬学部藤原先生より提供を受けた)）、抗Ser129位リン酸化α−シヌクレイン（ｐSer129、1:1000）（Fujiwara H. et al., Nat Cell Biol. 4, 160-164, 2002）をそれぞれ用いた。切片を脱パラフィンし、10%仔ウシ血清を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS；pH 7.4）でブロッキングした。次に、切片を一次抗体と共に室温でオーバーナイトし、ビオチン標識した二次抗体（1:500）（ベクター社）と２時間インキュベーションした。アビジンービオチンーペルオキシダーゼ複合体と１時間インキュベーションした後、0.05% 3,3’-ジアミノベンチジンテトラハイドロクロライド（DAB）と0.012% 過酸化水素（H２O２）を加えた0.05 Mトリス緩衝生理食塩水中でペルオキシダーゼ標識を可視化し、茶色の発色を得た。ついで、ヘマトキシリンで対比染色を行った。蛍光染色は、切片をAlexa488またはAlexa546を二次抗体（1:500）（モレキュラープローブ社）として５時間反応させ、FLUOVIEW FV300共焦点顕微鏡（オリンパス社）で観察した。【０３５２】
〔実施例１５〕
＜＜結果＞＞
＜トランスジェニックC.elegans系統の作成＞
α−シヌクレインのリン酸化におけるGRK5の役割を研究するために、発明者らはGRK5とα−シヌクレインを共発現するトランスジェニック線虫の系統を作出した。まず、α−シヌクレインを、２種類のニューロンで特異的に発現する系統をそれぞれ作成した。dat-1プロモーターはドーパミンニューロン特異的な発現をもたらし、mec-7はtouch neuron特異的な発現をもたらす。プラスミドの構造を図９Ａに示す。ヒトGRK5は、unc-119プロモーターの調節下に置くことにより、線虫の全ニューロンで発現するようにした。GRK5のキナーゼ不活性型の変異遺伝子（K215R）をネガティブコントロールとして使用した。GRK5を過剰発現する導入遺伝子を染色体に組み込んだ系統を、α−シヌクレインをドーパミンニューロンまたはtouch neuronで特異的に過剰発現する線虫と交配し、GRK5とα−シヌクレインを共発現するトランスジェニック線虫の系統を得た。α−シヌクレインの発現は免疫組織化学染色により確認した。１つの系統ではα−シヌクレインをmec-7プロモーターを用いて発現させた。mec-7遺伝子は線虫の尾部近くに位置する６つのtouchニューロン、すなわち、ALML/R(anterior lateral microtubule cell left/right)、AVM(anterior ventral microtubule cell)、PVM(posterior ventral microtubule cell)、PLML/R(posterior lateral microtubule cell left/right)で発現する。ニューロン内の細胞体のα−シヌクレイン陽性の免疫反応は、細胞質内で散在性に観察された（図９Ｃ）。ドーパミンニューロンで発現するdat-1遺伝子のプロモーターを用いたとき、α−シヌクレインは８つのドーパミンニューロン、すなわち、２対のCEP(cephalic sencilla)、１対のADE(anterior deirids)、１対のPDE(posterior deirids)で発現した（図９Ｂ）。線虫で発現したヒトGRK5タンパクを免疫組織化学染色とイムノブロット法で確認した。免疫組織化学染色の結果、ヒトGRK5は線虫の神経細胞全体、すなわち神経細胞体および神経突起で発現していた。神経環では特に強いGRK5陽性反応を示し、腹側神経索が抗GRK5抗体で染色された（図９Ｄ）。抗FLAG抗体M2を用いたイムノブロッティングの結果、野生型ヒトGRK5を発現する線虫と、K215R変異型のヒトGRK5を発現する両方の線虫の系統のホモジネートの上清に、ヒトGRK5タンパクの移動度に相当する64 kDaの特異的なタンパクのバンドが検出された（図９Ｅ）。遺伝子導入を行ったすべての系統で行動異常等の表現型は観察されず、導入遺伝子の影響は認められなかった。【０３５３】
〔実施例１６〕Food-sensing assay−ドーパミンニューロンにおけるGRK5によるα−シヌクレイン129位セリンのリン酸化およびα−シヌクレインの毒性の増強−
ドーパミンニューロンで発現するα−シヌクレインをGRK5がリン酸化するか否かを研究するために、３日齢の線虫を、抗α−シヌクレイン抗体、および、抗129位セリンリン酸化α−シヌクレイン抗体を用いた免疫蛍光組織化学染色を行うために処理し切片を作成した。共焦点顕微鏡による観察の結果、野生型のGRK5とα−シヌクレインを共発現するトランスジェニック線虫のドーパミンニューロンでリン酸化α−シヌクレイン陽性が認められた（図１０Ｂ）。しかし、K215R変異型GRK5とα−シヌクレインを共発現するトランスジェニック線虫ではリン酸化α−シヌクレインは認められなかった。【０３５４】
発明者らは、既報にて家族性パーキンソン病の原因となる変異型α−シヌクレインをドーパミンニューロンに発現させたトランスジェニック線虫が、food-sensing bihaviorに特異的な不全をきたすことを報告した（Kuwahara T. et al., J Biol Chem 281(1)：334-340, 2006）。この結果から、GRK5によるα−シヌクレインのリン酸化の促進が食物探知行動に異常をもたらすか否かを検討した（図１０Ｄ）。正常型であるN2系統の線虫は、バクテリアに暴露すると運動率が60％以上低下した。ドーパミンニューロンにおけるドーパミン合成の機能を欠損する変異型であるcat-2ミュータントは食物探知行動に異常がみられ、バクテリアに暴露したときのベンディング数の低下がおよそ20％以下であった。α−シヌクレインと野生型GRK5を共発現するトランスジェニック線虫は、バクテリアに暴露したときの運動率の低下が36％以下であり、陰性コントロールであるα−シヌクレインとK215R変異型GRK5を共発現するトランスジェニック線虫では56％以下であった。【０３５５】
〔実施例１７〕touch assay−touch neuronにおけるGRK5によるα−シヌクレインの129位セリンのリン酸化およびα−シヌクレインの毒性の増強−
実施例３〜７に示す通り、α−シヌクレインの129位のセリンは細胞内でGRK5によりリン酸化される。touch neuronで発現するα−シヌクレインをリン酸化するか否かを調べるために、３日目、６日目、９日目の線虫を、抗α−シヌクレイン抗体、および、抗129位セリンリン酸化α−シヌクレイン抗体を用いた免疫蛍光組織化学染色を行うために処理し切片を作成した。共焦点顕微鏡による観察の結果、野生型のGRK5とα−シヌクレインを共発現するトランスジェニック線虫のtouch neuronでリン酸化α−シヌクレイン陽性が認められた（図１１Ｂ）。しかし、K215R変異型GRK5とα−シヌクレインを共発現するトランスジェニック線虫では９日目においてもリン酸化α−シヌクレインは認められなかった。リン酸化α−シヌクレイン陽性のニューロンは、齢に依存して増加を示した（３日齢、６日齢、９日齢のtouch neuronで40%、60％、90％以上）（図１１Ｄ）。【０３５６】
線虫は、虫体の前側に軽く接触すると後退、後側に軽く接触すると前進するのが正常な反応である。しかし、mec-7欠損（e1506）系統の線虫はこのような接触に対する反応を欠損する（Chalfie et al., Cell. 1981 Apr;24(1):59-69.、Savage et al., J Cell Sci. 1994 Aug;107 ( Pt 8):2165-75.）。したがって、接触に対する反応性の減少は、touch neuronの機能の減少を反映している。α−シヌクレインのリン酸化がGRK5によって増強されることが神経毒性を強めるどうかを研究するために、発明者らはtouch assayによりα−シヌクレインのリン酸化の神経毒性を評価した（図１１Ｅ）。トランスジェニック線虫の接触に対する反応性を３日齢、６日齢、９日齢で評価した。どの成長ステージでも、独立に作出したα−シヌクレインとGRK5を共発現する２系統のトランスジェニック線虫のいずれもが、陰性コントロールであるα−シヌクレインとK215R変異型GRK5を共発現するトランスジェニック線虫と比べて有意に接触に対する反応が低かった。しかし、129位のセリンがアラニンに変異した、この部位がリン酸化を受けないα−シヌクレインとGRK5を共発現するトランスジェニック線虫では、GRK5が野生型の場合とGRK5がK215R変異型の場合との間に有意差は認められなかった。コントロールとして試験したmec-7変異型線虫は顕著な機械感覚性の欠如を示した。さらに、野生型GRK5とα−シヌクレインのcDNAの両方を形質導入すると、有意な進行性の接触反応の低下を示す。線虫の機械感覚性の欠損はα−シヌクレインのリン酸化と関連し、GRK5はα−シヌクレインのリン酸化を増強し、α−シヌクレインの毒性を増やすことが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０３５７】
高齢者に好発し老人病の一面を持つパーキンソン病は、発症後は緩やかに進行し、それ自体が原因で死亡する事はまれである。しかし、寝たきりになる事により本人および介護者のクオリティ・オブ・ライフ（QOL）は著しく損なわれる。さらに、寝たきり状態では全身状態を良好に保つことが困難になり、その結果、肺炎等の感染症に罹患しやすくなり、PD患者の寿命は健常者より短い。【０３５８】
本発明によって、パーキンソン病感受性に関連する遺伝子、および該遺伝子における変異を検出することによって、パーキンソン病の感受性を有するか否かを検査する方法が提供された。本発明の遺伝子もしくは該遺伝子における多型を検出することで、パーキンソン病に罹り易いか否かについて検査することが可能となる。本発明によりパーキンソン病の予防や治療における、より効率的な戦略、治療方針を決める手助けになるものと大いに期待される。【０３５９】
本発明によって提供される、パーキンソン病治療のための医薬をスクリーニングする方法、並びに該医薬により、疾患の進行を抑制する事が可能になれば、パーキンソン病が高齢者に発症した場合には寝たきりという最終的なステージを迎える事なく寿命を全うできる可能性が高い。寝たきりに至るまでの期間を延ばすことが可能となれば、QOLの著しい向上が見込まれる。さらには、パーキンソン病を発症するリスクが高い者を診断し、疾患の進行を抑制する薬剤を投与する事により、パーキンソン病の発症そのものを抑制する事も極めて価値の高い方法であるといえる。高齢化が進む先進諸国においては、パーキンソン病患者の絶対数の増加が見込まれ、患者のQOLの向上は患者本人のみならず、介護者や社会的な経済負担も減らすことに繋がるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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