(57)【要約】  本発明の目的は、ポロニウムのガス化を担う微生物種を明らかにし、そのガス化能力を比較検討することで高いガス化能力を持つ微生物を特定し、微生物によるポロニウム分離技術とバイオリメディエーション技術を提供することである。本発明によれば、Chromobacterium属（クロモバクテリウム）又はEscherichia属（大腸菌）に属する微生物を用いることを特徴とする、ポロニウムのガス化方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Chromobacterium属（クロモバクテリウム）又はEscherichia属（大腸菌）に属する微生物を用いることを特徴とする、ポロニウムのガス化方法。
【請求項２】
ポロニウムを含有する試料をChromobacterium属（クロモバクテリウム）又はEscherichia属（大腸菌）に属する微生物に接触させ、上記微生物の作用により試料中のポロニウムをガス化することを含む、ポロニウムのガス化方法。
【請求項３】
微生物としてChromobacterium violaceum又はEscherichia coli K-12を使用する、請求項１又は２に記載のポロニウムのガス化方法。
【請求項４】
請求項１から３の何れかに記載の方法によりガス化したポロニウムを酸性溶液で無機化してから回収する、ポロニウムの回収方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Chromobacterium属（クロモバクテリウム）又はEscherichia属（大腸菌）に属する微生物を用いたポロニウムのガス化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物は化合物や物質を作り出したり分解したりすることで、自然界や産業利用において重要な役割を演じている。微生物の作用は炭素、窒素、水素などの有機化合物の構成元素だけでなく金属元素にも及んでいる。微生物の金属元素への作用のひとつに、金属元素のガス化がある（J. S. Thayer, Biological methylation of less-studied elements, Appl. Organometal. Chem., 16, 677-691 (2002)）。すなわち本来は不揮発性である金属元素を揮発性化合物に変えることで、これらの元素を水相や固相から気相へ移行させる。水銀、砒素などは微生物の働きによりガス化して大気へ移行することが知られている。【０００３】
ポロニウムは周期表で16属に位置し、酸素、硫黄、セレン、テルルの下にある元素で、同位体はすべて放射性の金属元素である。環境中ではウラン系列に属するPo-210（半減期138日）が最も長寿命の放射性核種であり、他にPo-214やPo-218などの短半減期核種がある。ポロニウムはアルファ壊変核種であるため、人の放射線被ばくの観点からは体内被ばくが重要である。最近、我々は室内実験においてポロニウムが微生物の作用によりガス化される可能性を示した（N. Momoshima, Li-X. Song, S. Osaki, Y. Maeda, Biologically induced Po emission from fresh water, J. Environ. Radioactivity, 63, 187-197 (2002)；及びN. Momoshima, Li-X. Song, S. Osaki, Y. Maeda, Formation and emission of volatile polonium compound by microbial activity and polonium methylation with methylcobalamin. Environ. Sci. Technol., 35, 2956-2960 (2001)）。しかし、ガス化を担う微生物種の特定やそのガス化能力については不明であった。【０００４】
実験室や工場レベルでのポロニウムと他放射性核種の分離は放射化学分離法で行っている。すなわちイオン交換法・溶媒抽出法などの基本的な既存の分析技術の組み合わせである。これまで、微生物を用いてポロニウムをガスとして分離回収する技術への応用は検討されておらず、微生物のガス化を利用した産業上のポロニウム分離法の報告例もない。また、微生物によるポロニウムガス化を利用すればポロニウムで汚染された環境を浄化することも可能であるが、このような観点からのバイオリメディエーション技術への展開もない。【０００５】
【非特許文献１】J. S. Thayer, Biological methylation of less-studied elements, Appl. Organometal. Chem., 16, 677-691 (2002).
【非特許文献２】N. Momoshima, Li-X. Song, S. Osaki, Y. Maeda, Biologically induced Po emission from fresh water, J. Environ. Radioactivity, 63, 187-197 (2002).
【非特許文献３】N. Momoshima, Li-X. Song, S. Osaki, Y. Maeda, Formation and emission of volatile polonium compound by microbial activity and polonium methylation with methylcobalamin. Environ. Sci. Technol., 35, 2956-2960 (2001).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ポロニウムは周期表の16属に属し同位体はすべて放射性である。環境中ではウラン系列のPo-210（半減期138日）が最も長寿命の放射性核種である。ポロニウムはアルファ壊変核種であるため、被ばくの観点からは体内被ばくが重要である。室内実験においてポロニウムが微生物の作用によりガス化されるという結果がこれまで得られているが、ガス化を担っている微生物の種類や活性の程度は不明である。【０００７】
本発明では、ポロニウムガス化の実態を解明すること及び微生物を用いてポロニウムを選択的に水溶液から気相へ取り出すことができるバイオリメディエーション技術への展開を目的とした。即ち、本発明の目的は、ポロニウムのガス化を担う微生物種を明らかにし、そのガス化能力を比較検討することで高いガス化能力を持つ微生物を特定し、微生物によるポロニウム分離技術とバイオリメディエーション技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
種名が明らかである微生物を用いてポロニウムのガス化能力を詳細に調べた。その結果Chromobacterium属に属する微生物が特に高いポロニウムガス化能力を有していることがわかった。ガス化されたポロニウムは、それらを含む空気を酸性溶液中に通せば再び回収できることがわかった。以上の発見に基づいて本発明を完成させた。【０００９】
即ち、本発明によれば、Chromobacterium属（クロモバクテリウム）又はEscherichia属（大腸菌）に属する微生物を用いることを特徴とする、ポロニウムのガス化方法が提供される。【００１０】
本発明のある態様によれば、ポロニウムを含有する試料をChromobacterium属（クロモバクテリウム）又はEscherichia属（大腸菌）に属する微生物に接触させ、上記微生物の作用により試料中のポロニウムをガス化することを含む、ポロニウムのガス化方法が提供される。【００１１】
好ましくは、微生物としてChromobacterium violaceum又はEscherichia coli K-12を使用する。【００１２】
本発明のある態様によれば、上記した本発明の方法によりガス化したポロニウムを酸性溶液で無機化してから回収する、ポロニウムの回収方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、高いポロニウムガス化能力を有するChromobacterium属（クロモバクテリウム）又はEscherichia属（大腸菌）に属する微生物によるポロニウム分離技術とバイオリメディエーション技術を提供するものである。【００１４】
本発明において用いる微生物は、Chromobacterium属（クロモバクテリウム）又はEscherichia属（大腸菌）に属する微生物である。Chromobacterium属（クロモバクテリウム）に属する微生物の具体例としては、Chromobacterium violaceum (JCM1249)、及びChromobacterium iodinum (Davis株)などが挙げられる。Escherichia属（大腸菌）に属する微生物の具体例としては、Escherichia coli K-12(IFO330１株)、Escherichia coli B(IFO13168株)、Escherichia coli W-1485 (IFO3302株)、及びEscherichia coli W-3110  (IFO12713株)などが挙げられる。Chromobacterium violaceumは、例えば、独立行政法人 理化学研究所バイオリソースセンター 微生物材料開発室より、登録番号JCM1249として入手可能である。また、Escherichia coli K-12は、例えば、独立行政法人製品評価技術基盤機構  生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）よりNBRC番号NBRC 3301（IFO3301）として入手可能である。但し、本発明で用いることができる微生物は、上記菌株に限定されるわけではなく、Chromobacterium属（クロモバクテリウム）又はEscherichia属（大腸菌）に属する微生物であって、ポロニウムをガス化する作用を有する菌株であれば任意の菌株を使用することができ、またこれらの菌株の変異株などを用いることもできる。【００１５】
Chromobacterium属（クロモバクテリウム）又はEscherichia属（大腸菌）に属する微生物を培養する培地としては通常使用されるものを使用することができる。微生物を培養する培地は、通常は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、天然培地又は合成培地のいずれでもよい。炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等が用いられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。【００１６】
培養は、振盪培養または深部通気撹拌培養などの好気的条件下で行うことができる。培養温度は15〜40℃がよく、培養中pHは、3.0〜9.0に保持することが好ましい。pHの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行うことができる。【００１７】
本発明では、ポロニウムを含有する試料をChromobacterium属（クロモバクテリウム）又はEscherichia属（大腸菌）に属する微生物に接触させることによって、上記微生物の作用により試料中のポロニウムをガス化する。ポロニウムを含有する試料の種類は特に限定されない。例えば、核廃棄物処理施設やウラン関連施設で排出される廃液や、ポロニウムで汚染された土壌や水などの環境媒体を試料として使用することができる。【００１８】
ポロニウムを含有する試料を微生物に接触させる方法としては、試料に微生物の培養液を添加する方法、試料に微生物の菌体を添加する方法、又は試料に担体に吸着させた菌体を添加する方法などが挙げられる。添加する菌体量は特に限定されないが、１０5〜１０9個／ｍｌ程度が好ましい。【００１９】
また、ポロニウムを含有する試料が土壌などの環境媒体である場合には、上記微生物を土壌と接触させることによって土壌中のポロニウムを気化させて除去することにより、土壌を浄化することができる。このような場合、反応槽を用いてポロニウムの気化を行ってもよいが、土壌 に微生物を直接散布又は注入することもできる。汚染の現場で処理を行えば、土壌の移動や浄化後の復土などのコストを省くことができる。散布又は注入する微生物の量は、処理する面積や土壌中のポロニウム濃度によって適宜設定することができる。【００２０】
また、本発明で用いる微生物は、適当な粒状担体に固定して使用してもよい。粒状担体としては、例えば、多孔質ガラス、セラミックス、金属酸化物、活性炭、カオリナイト、ベントナイト、ゼオライト、シリカゲル、アルミナ、アンスラサイトなどの粒子状担体、デンプン、寒天、キチン、キトサン、ポリビニルアルコール、アルギン酸、ポリアクリルアミド、カラギーナン、アガロース、ゼラチンなどのゲル状担体、セルロース、グルタルアルデヒド、ポリアクリル酸、ウレタンポリマーなどの高分子樹脂やイオン交換樹脂、天然あるいは合成の高分子化合物、例えばセルロースを主成分とする綿、麻、パルプ材、あるいは天然物を変性した高分子アセテート、ポリエステル、ポリウレタンなどを挙げることができる。【００２１】
本発明では、上記した方法によりガス化したポロニウムを酸性溶液で無機化してから回収することができる。ここで用いる酸性溶液としては、硝酸、塩酸、硫酸などの無機酸の溶液を挙げることができる。【００２２】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００２３】
ポロニウムガス化能力を調べた微生物とそれらの培養培地及び前培養の条件を表1に示す。【００２４】
【表１】
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【００２５】
ポロニウムガス化能力の評価は、図１に示す実験装置を用いて行った。Po-208トレーサを含む培地20mlを三角フラスコに入れ、120℃で20分加熱滅菌処理した後、前培養した微生物50μl加え30℃で振とう培養を行った（培養実験）。また、Po-208トレーサを三角フラスコに入れ120℃で20分加熱滅菌処理した後、Pb-208トレーサを含まない条件で前培養した後、蒸留水で十分洗浄して調製した懸濁液20mlをフラスコに移し振とう培養した（懸濁実験）。培養中は三角フラスコには0.2μmのメンブランフィルターを通して連続的に空気を導入し、培養液上部の空気をトラップバイアル中の液体シンチレータにバブリングさせることでガス化したポロニウムを捕集した。定期的にトラップバイアルの放射能を液体シンチレーションカウンターで測定することでガス化能力を評価した。【００２６】
（放射能測定の詳細）
トラップバイアルは20mlガラスバイアルを使用し、パーキンエルマー社製Ultima Gold AB液体シンチレータを、それぞれのトラップバイアルに10mlずつ入れた。トラップバイアルは3段で、トラップバイアルに補足されたPo-208から放出される5.1MeVのアルファ線を液体シンチレーションカウンターで測定した。液体シンチレーションカウンターはパッカード社製Tri-Carb2900TRを使用した。3本目のトラップバイアルにはポロニウムの放射能が検出されず、ガス化したポロニウムはすべて前段の2本のトラップバイアルで補足されていた。【００２７】
（培養実験）
Po-208トレーサを含む培地20mlを三角フラスコに入れ、120℃で20分加熱滅菌処理した後、前培養した微生物を少量加え、図１に示す実験装置を用いて30℃で振とう培養を行った。ガス化率は各トラップバイアルに補足されたポロニウム放射能の合計値である。【００２８】
（培養実験の結果の詳細）
調べた３種類の微生物はいずれもポロニウムのガス化能力を有していることが明らかになったが、その能力には大きな違いが見られた。大腸菌の結果を図２に、枯草菌の結果を図３に、そしてクロモバクテリウムの結果を図４に示す。縦軸はトラップバイアルに捕集されたPo-208の放射能から求めた一日当たりのポロニウムのガス化率で横軸は培養時間を示す。本発明の培養実験で使用した培地の量から判断すると培養開始後24時間で三角フラスコの菌量は飽和に達したと考えられる。このことは、Po-208トレーサは含まないが同一の条件で行った培養実験において、微生物の増殖に伴う培養液の懸濁度の増加を吸光度で測定したところ24時間で吸光度が飽和に達したことから確認される。大腸菌とクロモバクテリウムにおける培養初期に見られた高いガス化率は、微生物増加の対数期、すなわち菌数の初期増加に対応したものと考えられる。しかし、枯草菌ではそのような傾向は観察されていないし、他の微生物と比べると培養期間全体におけるガス化率は一桁から二桁低い。大腸菌は対数期に高いガス化率を示したが、その後のガス化率は相対的に低い値で推移した。一方、クロモバクテリウムは培養開始後に最も大きいガス化率を示し、その後も高いガス化率を持続した。クロモバクテリウムの培養実験において、30℃で行っていた培養温度を316時間〜357時間の間は一時的に0℃に下げて培養を続けた。そして再び30℃に戻した。培養温度0℃ではガス化率は低下しほぼゼロを示したが、ガス化率は30℃に戻すと回復した。培養温度によるガス化率の変化は、ポロニウムのガス化が微生物活動によるものであることを支持している。富栄養状態でクロモバクテリウムは高いポロニウムガス化能力を示すことが明らかになった。【００２９】
（懸濁実験）
高いポロニウムガス化能力を示した大腸菌とクロモバクテリウムについて、Pb-208トレーサを含まない条件で前培養した後、菌を蒸留水で十分洗浄して培地を含まない菌懸濁液を得た。Po-208トレーサを三角フラスコに入れ120℃で20分加熱滅菌処理した後、この菌懸濁液20mlを三角フラスコに移して振とう培養を行いポロニウムのガス化率を測定した。図１の実験装置を使用し、放射能測定は上述の培養実験と同様の方法で行った。蒸留水に懸濁している菌量は培養実験における菌飽和量に等しくなるように調製した。微生物は培地がない貧栄養状態に置かれたことになる。【００３０】
（懸濁実験の結果の詳細）
大腸菌の結果を図５にクロモバクテリウムの結果を図６に示す。大腸菌もクロモバクテリウムもポロニウムガス化を行ったが、大腸菌のガス化率は先に行った富栄養状態の培養実験において開始直後に観察された値と比較すると一桁低い値を示した。一方、クロモバクテリウムは貧栄養状態の懸濁液中にも関わらず高いガス化率を示した。このクロモバクテリウム懸濁液を143時間後から790時間までのほぼ27日間4℃で保存した後、再び30℃に戻して培養を続けた。このように長期間に低温で保存したにもかかわらずガス化能力は回復し、クロモバクテリウムの高いポロニウムガス化能力が確認された。1196時間後に栄養源としてトリプトンを懸濁液に添加したところポロニウムのガス化が大幅に増加し、栄養の添加により微生物活性の増加が認められた。また、1363時間後に懸濁液に過酸化水素を加え微生物を殺したところ、ポロニウムのガス化は完全に停止した。【００３１】
（ガス化したポロニウムの回収実験）
図１の実験装置の試験管とトラップバイアルの間に、体積比で0.25%過酸化水素を含む0.5N硝酸を3ml入れた試験管とその後ろに水を3ml入れた試験管を設置し、ガス化したポロニウムを含む空気を硝酸、水、液体シンチレータの順にバブリングさせガス化したポロニウムの回収率を調べた。ガス化したポロニウムを含む空気を一定時間バブリングさせた後、硝酸及び水の各1mlと液体シンチレータ(Ultima Gold AB)10mlをガラスバイアル中で混合し液体シンチレーションカウンター（Tri Carb2900TR）で放射能を測定した。トラップバイアル中の液体シンチレータの放射能は上に述べた方法で測定した。【００３２】
（ガス化したポロニウム回収実験の結果の詳細）
硝酸、水、液体シンチレータに見出された放射能の割合を図７に示す。2回実験を行ったところ硝酸トラップへのポロニウムの回収率は95%と98%であり、ほぼ定量的に体積比で0.25%過酸化水素を含む0.5N硝酸で回収された。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明によれば、ポロニウムガス化能力が高い微生物種が同定され、これらの微生物を用いることによりガス化したポロニウムを回収することができる。即ち、本発明によれば、放射性核種ポロニウムを微生物でガス化させ、ガス化したポロニウムを再び酸性溶液で無機化して回収する技術が提供される。本発明においては、従来の化学的な分離精製法に頼らずに微生物を利用して簡単にポロニウムを分離することができることから、本発明の方法は、原子力産業や放射能・放射線を利用する産業で広く利用可能な技術であり、例えば、核廃棄物処理施設やウラン関連施設でポロニウムの分離回収技術として利用することができる。また、ポロニウムで汚染された土壌や水などの環境媒体を微生物を利用して浄化するバイオリメディエーション技術として利用でき、例えば、放射能汚染地域の環境浄化のために利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、微生物培養装置を示す。
【図２】図２は、培養実験における大腸菌のガス化率を示す。
【図３】図３は、培養実験における枯草菌のガス化率を示す。
【図４】図４は、培養実験におけるクロモバクテリウムのガス化率を示す。
【図５】図５は、懸濁実験における大腸菌のガス化率を示す。
【図６】図６は、懸濁実験におけるクロモバクテリウムのガス化率を示す。
【図７】図７は、ガス化したポロニウムの硝酸による回収率を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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2006112360.tif 000012
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