【手続補正書】
【提出日】令和2年3月30日(2020.3.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）細胞をタンパク質分解経路阻害薬と接触させること；
ｂ）前記阻害薬と接触していない細胞と比較して、産生されたポリペプチド産物の量またはポリペプチド産物の品質において、前記阻害薬の効果を評価すること；および
ｃ）前記阻害薬と接触していない細胞と比較して、前記細胞またはその子孫細胞がポリペプチド産物の増大した産生能および／または増大した品質を有する場合に、該細胞またはその子孫細胞を選択すること
を含む、組換えポリペプチド産物の増大した産生能を有する、および／または、組換えポリペプチド産物の増大した品質を生ずる細胞を選択する方法。
【請求項２】
前記阻害薬がプロテアソーム阻害薬、ユビキチン経路阻害薬またはＥＲＡＤ阻害薬である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）のポリペプチドが、外因性核酸にコードされた組換えタンパク質である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｃ）において選択された細胞またはその子孫細胞から細胞株を確立することを更に含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
阻害薬に接触していない細胞によって産生されたレベル、量または数量に比較して、阻害薬の存在下において産生された工程（ｂ）におけるポリペプチド産物の量が増加しており、および／または、産物の改善された品質が、
例えば不要なアイソフォーム形態、断片形態または切断型形態に対する所望の産物の増大したレベル、量もしくは割合；
適正にフォールディングされた産物の増大したレベル、量もしくは割合；
機能的、例えば酵素的に活性な産物の増大したレベル、量もしくは割合；
凝集産物の減少したレベル、量もしくは割合；または
断片化アイソフォームまたは不要なアイソフォームの減少したレベル、量もしくは割合
の１以上を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
該阻害薬がプロテアソーム阻害薬であり、該プロテアソーム阻害薬が、２０Ｓコアサブユニット、１９Ｓ調節サブユニット、１１Ｓ調節粒子、またはプロテアソームの集合を支援するシャペロンタンパク質、例えば、Ｈｓｍ３／Ｓ５ｂ、Ｎａｓ２／ｐ２７、Ｒｐｎ１４／ＰＡＡＦ１およびＮａｓ６／ガンキリンのうちの１種類以上の活性を阻害または低下させるものであってもよく、該プロテアソーム阻害薬がＭＧ１３２、エポキソミシン、ボルテゾミブ、イキサゾミブ、カルフィルゾミブ、ジスルフィラム、ＣＥＰ−１８７７０、ＯＮＸ  ０９１２、サリノスポラミド、ＬＬｎＶ、ＣＥＰ１６１２、ラクタシスチン、ＰＳ−３４１およびエポノミシンから選択されるものであってもよい、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
該阻害薬がＥＲＡＤ阻害薬であり、該ＥＲＡＤ阻害薬が、カルネキシン／カルレティキュリン、ＵＤＰ−グルコース−糖タンパク質グルコシルトランスフェラーゼ、ＥＲ分解促進α−マンノシダーゼ様タンパク質（ＥＤＥＭ）、ＥＲマンノシダーゼＩ、Ｓｅｃ６１、ＣＤＣ４８ｐ（ＶＣＰ／ｐ９７）、Ｈｒｄ１、Ｄｏａ１０、Ｕｂｃ６、Ｕｂｃ１、Ｃｕｅ１またはＵｂｃ７のうちの１種類以上の活性を阻害または低下させるものであってもよく、前記タンパク質分解阻害薬がイーヤレスタチン（ｅｅｙａｒｅｓｔａｔｉｎ）Ｉであってもよい、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
該阻害薬がユビキチン経路阻害薬であり、該ユビキチン経路阻害薬が、Ｅ１ユビキチン活性化酵素、Ｅ２ユビキチン結合酵素またはＥ３ユビキチンリガーゼのうちの１種類以上の活性を阻害または低下させてもよい、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
該細胞を第２のタンパク質分解経路阻害薬と接触させることを更に含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法であって、該細胞を、第１および第２のタンパク質分解阻害薬と例えば並行して、または逐次、接触させてもよい、前記方法。
【請求項１０】
（ｉ）第１のタンパク質分解阻害薬および第２のタンパク質分解経路阻害薬が、ＭＧ１３２、エポキソミシンまたはイーヤレスタチン１から選択される；
（ｉｉ）第１の阻害薬がプロテアソーム阻害薬であり、第２の阻害薬がプロテアソーム阻害薬である；
（ｉｉｉ）第１の阻害薬がプロテアソーム阻害薬であり、第２の阻害薬がＥＲＡＤ阻害薬もしくはユビキチン経路阻害薬である；
（ｉｖ）第１の阻害薬がＥＲＡＤ阻害薬であり、第２の阻害薬がＥＲＡＤ阻害薬である；
（ｖ）第１の阻害薬がＥＲＡＤ阻害薬であり、第２の阻害薬がユビキチン経路阻害薬もしくはプロテアソーム阻害薬である；
（ｖｉ）第１の阻害薬がユビキチン経路阻害薬であり、第２の阻害薬がユビキチン経路阻害薬である；または
（ｖｉｉ）第１の阻害薬がユビキチン経路阻害薬であり、第２の阻害薬がＥＲＡＤ阻害薬もしくはプロテアソーム阻害薬である、
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
該細胞を、培養物のバイアビリティを例えば該培養物を該タンパク質分解阻害薬と接触させる前の該培養物のバイアビリティと比べて、または該阻害薬と接触させない培養物と比べて約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％または７５％低下させるのに充分な濃度の該阻害薬と接触させ、ここで、前記タンパク質分解阻害薬の該濃度は、１つ以上の細胞が増殖し続ける濃度であってもよい、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
タンパク質分解阻害薬の濃度が、０．５  μＭ未満  ＭＧ−１３２、例えば約０．０６２５  μＭ  ＭＧ−１３２、または、０．０５  μＭ未満  エポキソミシン、例えば約０．０２５  μＭ  エポキソミシンである、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
該細胞を、例えば、該タンパク質分解阻害薬の存在下での培養によって、該タンパク質分解阻害薬と２４、４８、７２、９６時間またはそれ以上接触させる、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
該細胞を該タンパク質分解阻害薬と、選択工程、例えばＭＳＸ選択の２４、４８、７２、９６もしくは１６８時間前もしくは後、または該工程と同時に、もしくは該工程と並行して接触させる、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
該組換えポリペプチドが、表１または２から選択される抗体分子、二重特異性分子、血液凝固因子、抗凝固因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキンまたは酵素から選択される、請求項３〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
細胞が真核細胞、例えば哺乳動物細胞である、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
該細胞が、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、サル、類人猿、ヒト、イヌ、ラクダ、ウマ、フェレットまたはネコに由来するものであるか、または、該細胞が、哺乳動物細胞以外の真核細胞、例えば、昆虫、植物、アヒル、オウム、魚類または酵母に由来するものである、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
該細胞が、ＣＨＯ細胞、例えば、ＣＨＯＫ１、ＣＨＯＫ１ＳＶ、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  ＣＨＯＫ１ＳＶ、ＣＨＯ  ＧＳノックアウト型、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ、ＣＨＯＳ、ＣＨＯ  ＤＧ４４、ＣＨＯ  ＤＸＢ１１、ＣＨＯＺＮ、またはＣＨＯに由来する細胞である、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
該細胞が、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、Ｈ９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、ジャーカット、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＢＨＫ、ＶＥＲＯ、ＳＰ２／０、ＮＳ０、ＹＢ２／０、ＥＢ６６、Ｃ１２７、Ｌ細胞、ＣＯＳ、例えばＣＯＳ１およびＣＯＳ７、ＱＣ１−３、ＣＨＯＫ１、ＣＨＯＫ１ＳＶ、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  ＣＨＯＫ１ＳＶ、ＣＨＯ  ＧＳノックアウト型、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ、ＣＨＯＳ、ＣＨＯ  ＤＧ４４、ＣＨＯ  ＤＸＢ１１ならびにＣＨＯＺＮから選択される、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
工程（ｂ）のポリペプチド産物を、物理的または機能的特性に関するパラメータ、例えば、一次配列、グリコシル化、一次、二次、三次もしくは四次構造、活性、グリコシル化度、凝集度、事前に選択した特性を有する発現タンパク質、例えば、事前に選択した単量体型、二量体型もしくは三量体型構造を有する発現タンパク質の割合もしくはレベル、または事前に選択した構造、例えば、非変性型もしくは非凝集型構造を有する発現ポリペプチドのレベルもしくは割合について評価する、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
ａ）請求項１〜２０のいずれかに記載の方法によって細胞を選択すること；
および
ｂ）該細胞または細胞集団を培養し、細胞株または細胞集団を得ること
を含む、細胞株または細胞集団の作製方法。
【請求項２２】
組換えポリペプチドをコードする外因性核酸を、該細胞株または細胞集団へ導入することを更に含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
該細胞株、細胞集団またはその子孫細胞から該組換えペプチドを発現させることを更に含む、請求項２２に記載の方法。