(57)【要約】  本発明の目的は、アルブミンなどの有用物質を極力損失せず、体液、特に全血へ直接ブラジキニンを適度に発生させた体液を得るための体液処理材、適度に発生させる方法、および適度に発生させるカラムを提供することである。  本発明は、水不溶性多孔質担体にトリプトファン誘導体およびポリアニオン性化合物を固定化してなる体液処理材であって、ポリアニオン性化合物の固定化量が湿潤体積の体液処理材１ｍｌ当たり０．１０μｍｏｌ以上１．５μｍｏｌ以下であり、かつトリプトファン誘導体の固定化量とポリアニオン性化合物の固定化量のモル比が１以上７０以下である体液処理材である。本発明の体液処理材を用いることにいより、全血処理により適量のブラジキニンを安全に発生させることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
水不溶性多孔質担体にトリプトファン誘導体およびポリアニオン性化合物を固定化してなる体液処理材であって、ポリアニオン性化合物の固定化量が湿潤体積の体液処理材１ｍｌ当たり０．１０μｍｏｌ以上１．５μｍｏｌ以下で、かつトリプトファン誘導体の固定化量とポリアニオン性化合物固定化量とのモル比が１以上７０以下である全血処理が可能なブラジキニンを発生させる体液処理材。
【請求項２】
ポリアニオン性化合物がデキストラン硫酸である請求項１記載の全血処理が可能なブラジキニンを発生させる体液処理材。
【請求項３】
トリプトファン誘導体がトリプトファンである請求項１あるいは２記載の全血処理が可能なブラジキニンを発生させる体液処理材。
【請求項４】
水不溶性多孔質担体がセルロース担体である請求項１から３のいずれかに記載の全血処理が可能なブラジキニンを発生させる体液処理材。
【請求項５】
水不溶性多孔質担体の球状蛋白質の排除限界分子量が５×１０5以上１×１０8以下である請求項１から４のいずれかに記載の全血処理が可能なブラジキニンを発生させる体液処理材。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の全血処理が可能なブラジキニンを発生させる体液処理材を体液と接触させることを特徴とする体液中にブラジキニンを発生させる方法。
【請求項７】
液の入口および出口を有し、かつ体液処理材の容器外への流出防止手段を備えた容器内に、請求項１から５のいずれかに記載の全血処理が可能なブラジキニンを発生させる体液処理材を充填してなることを特徴とする、全血処理が可能な程度ブラジキニンを発生させるカラム。
【請求項８】
カラムの容積が１００ｍｌ以上４００ｍｌ以下である請求項７記載の全血処理が可能な程度にブラジキニンを発生させるカラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、適度にブラジキニンを含んだ体液を得るための体液処理材、ならびにこの体液処理材を利用した体液中にブラジキニンを発生させる方法、およびこの体液処理材を利用した適度にブラジキニンを体液中へ発生させるカラムに関するものであり、特に全血処理が可能な体液処理材に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ブラジキニンは１９４９年にＲｏｃｈａｅ  Ｓｉｌｖａにより発見されたアミノ酸９個からなる生理活性を有するペプチドである。ブラジキニンはカリクレインが高分子キニノーゲンに作用することにより遊離され、遊離されたブラジキニンはキニナーゼＩＩ（アンジオテンシンＩ変換酵素と同一）により分解される。【０００３】
ブラジキニン生成のメカニズムは次のように考えられている。すなわち、血液凝固系のＸＩＩ因子が活性化されＸＩＩａ因子となる。このＸＩＩａ因子は血中のプレカリクレインをカリクレインに変換する。さらにこのカリクレインは血中の高分子キニノーゲンに作用しブラジキニンを遊離させる。一方、この過程で現れるカリクレインはＸＩＩ因子を活性化する性質を有している。【０００４】
特に血液中のブラジキニン濃度の上昇は、ＸＩＩ因子が異物面へ接触することにより活性化されて引き起こされるが、活性化させる物質として古くからガラス、セライト、カオリン、コラーゲンなどが知られている。その他にはステアリン酸、エラジン酸、スルファチドやプラスミン、カリクレインなどによって活性化されることは公知である。特許文献１によると多くの陰性荷電を持つ医療材料表面との接触によりＸＩＩ因子が活性化し、それに伴いブラジキニン濃度の上昇が起こると記載されている。【０００５】
ブラジキニンには、強力な血管平滑筋弛緩作用があり、血管を拡張させて血圧を低下させる働きを有する。これは、ブラジキニンが、血管内皮細胞のブラジキニン２受容体に結合し、血管内皮細胞を収縮させ、毛細血管透過性が亢進し、その際、一酸化窒素が産生されて、細動脈平滑筋が弛緩し、血管が拡張するためと考えられている。【０００６】
代表的な生活習慣病である高血圧症は、身体障害や致死的左室不全、心筋梗塞、脳出血、脳梗塞、腎不全を若年期に発症する恐れが非常に高く、脳卒中を誘発する最も重要な危険因子である。アンジオテンシン変換酵素阻害剤は、これら高血圧患者に対する降圧薬として一般的に用いられるが、薬理作用としては、アンジオテンシン変換酵素阻害活性のほかに、血管拡張物質の一酸化窒素を内皮細胞に産生させるブラジキニンを加水分解するキニナーゼＩＩ活性も抑制し、ブラジキニンの分解を遅らせることにより降圧作用を示す。【０００７】
さらに近年、食生活の欧米化や高齢化に伴い動脈硬化症を発症する患者が増加しており、動脈硬化症は高血圧症と密接に関係している。高血圧のために常に動脈に強い圧力がかかると、動脈壁に傷が発生し、この傷から血液中の脂肪分が浸透して動脈硬化を引き起こす。また、動脈硬化が進むと血管が狭くなるため血液の流れが悪化し、それを改善するため心臓が拍動を強め血圧が上昇するという悪循環をもたらしている。【０００８】
動脈硬化症のなかでも、末梢血管の閉塞をきたす疾患は閉塞性動脈硬化症と呼ばれる。該疾患では末梢の血管が狭小化、閉塞により末梢の血液循環状態が悪くなり、手足の冷感、しびれ感、間歇性跛行、安静時疼痛、潰瘍、壊疽などの症状が出現し、ひいては四肢切断に至る。このため、血管拡張作用を有するブラジキニンの働きにより血流が改善し、これら症状を改善することが期待されている。【０００９】
一方で、ブラジキニンの強力な血管拡張作用により血中濃度が高くなると、急激な血圧低下、吐き気などのアナフィラキシー様症状を引き起こす場合がある。特に近年盛んに行われている体外循環による血液浄化療法は、血液中から病因物質を除去する治療であるが、その際、ある種の医療材料と血液／血漿が接触することによりブラジキニンを過度に生成し、アナフィラキシー様症状を起こすことがあり問題となっている。特許文献１によると血漿中のブラジキニン濃度が４０００ｐｇ／ｍｌ以上になると上記症状が現れるとある。【００１０】
これら問題を解決するため、特許文献１、特許文献２では、血液中からブラジキニンの除去を目的として疎水性を利用した吸着体を記載しているが、いずれもブラジキニンの吸着除去を目的としたものである。【００１１】
以上のように、従来の技術では全血処理において血液中にブラジキニンを無秩序に発生させるか、ブラジキニンの除去を行う方法しか存在せず、アナフィラキシー様症状など引き起こさずに血管拡張作用により血圧を下げる、あるいは閉塞性動脈硬化症の患者に対して血流を改善する程度にブラジキニンを発生させる全血処理方法の開発が望まれていた。
【特許文献１】特開平６−２９６８６１
【特許文献２】特開平６−２９６８６４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、上記の様な現状に鑑み、大きな副作用なく血管拡張作用による降圧、あるいは血流を改善できる程度にブラジキニンを体液中に発生させることを特徴とする体液処理材、ならびにこの体液処理材を利用した体液中へブラジキニンを発生させる方法、およびこの体液処理材を利用したブラジキニンを発生させるカラムであって、アルブミンなどの有用物質を極力損失せず、血球の損失を最低限に抑え、安全に全血処理が可能であることを特徴とする体液処理材、及びカラムを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、アルブミンなどの有用物質を極力損失せず、全血処理が可能で、かつ制御された量のブラジキニンを体液、特に血液中に発生させる体液処理材について鋭意研究を行った。その結果、水不溶性多孔質担体にトリプトファン誘導体およびポリアニオン性化合物を固定化してなる体液処理材であって、ポリアニオン性化合物が一定量固定化され、かつトリプトファン誘導体の固定化量とポリアニオン性化合物の固定化量のモル比が特定の範囲である体液処理材が、適度にブラジキニンを体液、特に血液中に発生させる体液処理材であり、かつ血球の損失を最低限に抑えることにより安全に全血処理が行える体液処理材であることを見出し、本発明の完成に至った。【００１４】
即ち、本発明の第１発明は、水不溶性多孔質担体にトリプトファン誘導体およびポリアニオン性化合物を固定化してなる体液処理材であって、ポリアニオン性化合物の固定化量が湿潤体積の体液処理材１ｍｌ当たり０．１０μｍｏｌ以上１．５μｍｏｌ以下であり、かつ湿潤体積の体液処理材１ｍｌ当たりのトリプトファン誘導体固定化量とポリアニオン性化合物固定化量とのモル比が１以上７０以下である全血処理が可能なブラジキニンを発生させる体液処理材に関する。第２発明は、前記体液処理材を体液と接触させることを特徴とするブラジキニンの発生方法に関する。第３発明は液の入口および出口を有し、かつ体液処理材の容器外への流出防止手段を備えた容器内に、ブラジキニンを発生させる体液処理材を充填してなることを特徴とする、全血処理が可能なブラジキニンを発生させるカラムに関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、アルブミンなどの有用物質を極力損失せず、体液、特に全血へ直接ブラジキニンを適度に発生させた体液を得ることができる。本発明は、高血圧症患者の血圧を下げる、あるいは動脈硬化症、特に閉塞性動脈硬化症の患者の血流を改善する方法として有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明のブラジキニンを発生させるカラムの一実施例の概略断面図である。
【図２】３種類のゲルを用いて流速と圧力損失との関係を調べた結果を示すグラフである。
【符号の説明】
【００１７】
１    体液流入口
２    体液流出口
３    ブラジキニンを発生させる体液処理材
４、５  メッシュ（体液処理材流出防止手段）
６    カラム
７    ブラジキニンを発生させるカラム
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明における体液とは、血液、または血漿、血清を指す。【００１９】
本発明におけるポリアニオン性化合物とは、分子内に複数のアニオン性官能基を有する化合物をいう。本発明におけるアニオン性官能基とは、カルボキシル基、スルホン酸基、硫酸エステル基、リン酸エステル基など、ｐＨが中性で負に帯電する官能基をいう。このうち、ブラジキニンを適度に発生させる能力の点でカルボキシル基、スルホン酸基、硫酸エステル基が好ましく、中でも発生量を制御できる能力が優れている点で特に硫酸エステル基が好ましい。【００２０】
このようなポリアニオン性化合物の代表例としては、ポリアクリル酸、ポリビニルスルホン酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、スチレン−マレイン酸共重合体などの合成ポリアニオン性化合物、デキストラン硫酸、カルボキシメチルセルロースなどの合成酸性多糖類、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケタラン硫酸などの硫酸エステル基を有する生体由来の酸性ムコ多糖類、ヘパリン、ヘパラン硫酸などのＮ−スルホン酸基および硫酸エステル基を有する酸性ムコ多糖類、コンドロイチン、ホスホマンナンなどの生体由来のアニオン性官能基を有する多糖類、ならびにデオキシリボ核酸、リボ核酸などの生体由来の核酸などがあげられるが、これらの代表例に限定されるわけではない。【００２１】
これらに代表される化合物のなかでも、安価に純度の高い物質がえられる、さらにはアニオン性官能基の導入量をコントロールできるなどの理由から、生体由来の化合物をそのまま用いるよりも、合成化合物を用いるほうがより実用的である。これらの点より、ポリアクリル酸、ポリビニル硫酸、ポリビニルスルホン酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、スチレン−マレイン酸共重合体などの合成ポリアニオン性化合物や、デキストラン硫酸、カルボキシメチルセルロースなどの合成酸性多糖類が好ましく用いられる。中でも安価であるという点から、ポリアクリル酸、ポリスチレンスルホン酸、デキストラン硫酸が好ましく、安全性の点からデキストラン硫酸が特に好ましい。【００２２】
ポリアニオン性化合物の分子量は１０００以上、特に３０００以上であることが、ブラジキニン発生の面で好ましく用いられる。ポリアニオン性化合物の分子量の上限はとくに制限はないが、実用上の面から１００万以下が好ましい。【００２３】
本発明において、水不溶性多孔質担体にポリアニオン性化合物を固定化する方法は種々あり、いかなる方法でもよいが、代表的な方法としては、（１）ポリアニオン性化合物を、放射線や電子線を用いたグラフト法によって水不溶性多孔質担体表面に共有結合する方法、（２）水不溶性多孔質担体の官能基を介して化学的方法によりポリアニオン性化合物を共有結合する方法などがある。【００２４】
このなかでも、本発明がポリアニオン性化合物とトリプトファン誘導体とを固定化してなる体液処理材であることを考慮し、官能基を介して化学的にポリアニオン性化合物を共有結合させる方法が、トリプトファン誘導体の固定化が同じ方法でおこなえるため、本発明においてはより簡便で好ましい方法といえる。【００２５】
本発明におけるトリプトファン誘導体とは、トリプトファン、トリプトファンエチルエステル、トリプトファンメチルエステルなどのトリプトファンエステル類、トリプタミン、トリプトファノールなどのインドール環を有するトリプトファンと類似した構造を有する化合物をいう。またこれらのトリプトファン誘導体はＬ体、Ｄ体、ＤＬ体、またこれらの混合物のいずれであってもよい。さらに２種類以上のトリプトファン誘導体の混合物であってもよい。これらのトリプトファン誘導体のなかでも、トリプトファンが安全上好ましく、その中でもＬ−トリプトファンが天然型のアミノ酸であること、その安全性に関するデータが豊富であること、最も安価で入手しやすいことから、実用上最も好ましく用いられる。【００２６】
本発明におけるトリプトファン誘導体の固定化方法としては、水不溶性多孔質担体の官能基を介して化学的方法によりトリプトファン誘導体を共有結合する方法が好ましく用いられる。【００２７】
本発明におけるポリアニオン性化合物の固定化量は湿潤体積の体液処理材１ｍｌ当たり０．１０μｍｏｌ以上１．５μｍｏｌ以下であり、かつトリプトファン誘導体固定化量とポリアニオン性化合物固定化量とのモル比が１以上７０以下であることが必要である。【００２８】
本発明におけるトリプトファン誘導体固定化量とポリアニオン性化合物固定化量モル比（ＴＲ／ＰＡ比）とは、下式により算出される値をいう。
ＴＲ／ＰＡ比＝湿潤体積の体液処理材１ｍｌ当たりのトリプトファン誘導体固定化モル数／湿潤体積の体液処理材１ｍｌ当たりのポリアニオン固定化モル数
本発明者らは、ポリアニオン性化合物の固定化量、並びにトリプトファン誘導体の固定化量と、全血を直接処理した時の血球通過性につき鋭意検討した結果、驚くべきことに、ポリアニオン性化合物の固定化量を湿潤体積の体液処理材１ｍｌ当たり０．１０μｍｏｌ以上１．５μｍｏｌ以下とし、かつＴＲ／ＰＡ比を１以上７０以下に制御することにより、アナフィラキシー様症状が引き起こされにくいレベルのブラジキニンを発生しつつ、白血球および血小板の通過性が良好であることを見いだした。【００２９】
本発明において、ポリアニオン性化合物の固定化量は、体液処理材１ｍｌ（湿潤体積）当たり０．１０μｍｏｌ以上１．５μｍｏｌ以下である。この固定化量を０．１０μｍｏｌより少なくした場合、ブラジキニンの発生が少なく、かつ白血球および血小板の通過性が悪くなり、全血灌流処理を行った場合にプール血液中の白血球数が減少する。また、１．５μｍｏｌより多くすると、トリプトファン誘導体を固定化しても多量のブラジキニンが発生してしまう。ポリアニオン性化合物の固定化量は、適度なブラジキニン発生量と良好な血球通過性が発揮できる点から好ましくは０．１２μｍｏｌ以上１．０μｍｏｌ以下であり、最も好ましくは０．１５μｍｏｌ以上０．５０μｍｏｌ以下である。【００３０】
また、本発明において、トリプトファン誘導体固定化量とポリアニオン性化合物固定化量とのモル比（ＴＲ／ＰＡ比）は１以上７０以下である。ＴＲ／ＰＡ比が１より小さくなると、ブラジキニンが多量に発生してしまう。逆にＴＲ／ＰＡ比が７０より大きくなると、ブラジキニンがほとんど発生しなくなる。また、白血球および血小板の通過性が徐々に悪くなり、全血灌流処理を行った場合にプール血液中の白血球数が減少する。適度なブラジキニンの発生と良好な血球通過性が発揮できる点から好ましくは５以上６０以下であり、最も好ましくは１０以上５０以下である。【００３１】
なお、本発明における湿潤状態の体液処理材の体積は以下のように求める。すなわち、体液処理材は水に浸漬したスラリーとしてメスシリンダーなどの計量容器に移しとり、計量容器内のスラリー状の体液処理材を自然に沈降させる。この後、計量容器が割れないようゴム製のマットなどを敷き、その上に計量容器を５〜１０ｃｍ程度の高さから鉛直方向に５回ないし１０回程度軽く（一度沈降した体液処理材が極度に舞い上がらない程度に）叩きつけることにより振動を加える。１５分以上静置した後、体液処理材の沈降体積を読みとる。この振動、静置の操作を繰り返し、体液処理材の沈降体積が変化しなくなった段階を湿潤状態の体液処理材の沈降体積とする。【００３２】
本発明におけるポリアニオン性化合物の固定化量の測定方法としては、ポリアニオン性化合物に含まれる元素の体液処理材中の含有量を定量する方法（例えばデキストラン硫酸の場合、体液処理材の硫黄含有量を定量する）、ポリアニオン性化合物と結合する性質を有する色素溶液と体液処理材を接触させ、溶液中の色素の減少量から測定する方法などがあるが、その中でも色素溶液を用いる方法は簡便でしかも正確にポリアニオン性化合物の固定化量を測定することができる。具体的には実施例１においてその方法を示す通り、ポリアニオン性化合物がデキストラン硫酸やポリアクリル酸などの場合には、該化合物がトルイジンブルーと結合する性質を有していることを利用し、トルイジンブルー溶液と体液処理材を接触させた時のトルイジンブルーの吸着量からその固定化量を非常に簡便に測定することができる。【００３３】
本発明におけるトリプトファン誘導体の固定化量は、強酸性条件下でｐ−ジメチルベンズアルデヒドなどのアルデヒドをトリプトファン誘導体の分子内に存在するインドール環に縮合させるときに発色する性質を利用して定量することができる（山田浩一編、アミノ酸発酵（下）各論、４３〜４５頁、共立出版、１９７２年）。また、トリプトファン誘導体の分子内に存在するインドール環が２８０ｎｍ付近の光で励起させたときに３５０ｎｍ付近に極大を有する蛍光を発する性質を利用して定量する方法や、担体自身が窒素を含有しない化合物である場合は、実施例１において具体的方法を示す通り、体液処理材中の窒素含有量の定量により測定することもできる。【００３４】
本発明における水不溶性多孔質担体は、常温常圧で固体であり水不溶性であり、かつ適当な大きさの細孔を有する、すなわち多孔構造を有する。水不溶性多孔質担体の形状としては、球状、粒状、平膜状、繊維状、中空糸状等いずれも有効に用いられるが、取り扱いの容易さから球状または粒状がより好ましく用いられる。【００３５】
水不溶性多孔質担体が球状または粒状である場合、本発明の体液処理材が全血処理が可能である点を考えれば担体の平均粒径は大きいほどよいが、ブラジキニン発生の点では、体液と処理材との接触面積が大きくなることから平均粒径は小さいほどよい。本発明における体液処理材として、全血処理と適度なブラジキニンを発生できる体液処理材の平均粒径は１００μｍ以上１０００μｍ以下であることが好ましく、良好な血球通過性とブラジキニンの発生が制御できる点からさらに好ましくは２００μｍ以上８００μｍ以下であり、最も好ましくは４００μｍ以上６００μｍ以下である。【００３６】
水不溶性多孔質担体の球状蛋白質の排除限界分子量は５×１０5以上のものが好ましく用いられる。排除限界分子量とは、成書（サイズ排除クロマトグラフィー、森定雄著、共立出版）に述べられているとおり、サイズ排除クロマトグラフィーにおいて種々の分子量を有する試料を流した際に、細孔内に侵入できない（排除される）分子の内最も小さい分子量をもつものの分子量をいう。球状蛋白質の排除限界分子量が５×１０5を下回るとブラジキニンの発生量が多くなり、実用に耐えない。また球状蛋白質の排除限界分子量が１×１０8を超えると、ポアサイズが大きくなりすぎ表面積が低下する結果、ブラジキニンの発生量が低下する。以上より、本発明における水不溶性多孔質担体の球状蛋白質の排除限界分子量は５×１０5以上、１×１０8以下のものが好ましく、ブラジキニンの発生量を制御する観点からより好ましくは１×１０6以上、１×１０8以下、さらに好ましくは２×１０6以上、１×１０8以下である。【００３７】
本発明における水不溶性多孔質担体は、ポリアニオン性化合物、およびトリプトファン誘導体を固定化するために、結合に利用しうる官能基を有することが好ましい。このような官能基の代表例としては、アミノ基、アミド基、カルボキシル基、酸無水物基、スクシンイミド基、水酸基、チオール基、アルデヒド基、ハロゲン基、エポキシ基、シラノール基、トレシル基などがあげられるが、これらに限定されるわけではない。また、水不溶性多孔質担体は、たとえばハロゲン化シアン化法、エピクロロヒドリン法、ビスエポキシド法、ブロモアセチルブロミド法などの方法で活性化されていてもよく、このなかで実用上、安全上の観点から、エピクロロヒドリン法がとくに好ましく用いられる。【００３８】
本発明の水不溶性多孔質担体の強度としては、あまり柔らかいもの、容易に壊れるものは好ましくない。体液を流した場合に、圧密化が生じると充分な体液流量が得られなくなり処置時間の延長さらに処置続行不可能となりうるので、体液処理材の圧密を防ぐためには、体液処理材は充分な機械的強度を有するもの（硬質）であることが好ましい。ここでいう硬質とは、後記参考例に示すごとく、体液処理材を円筒状カラムに均一に充填し、水性液体を流した際の圧力損失と流量の関係が、少なくとも０．３ｋｇｆ／ｃｍ2まで直線関係にあるものをいう。【００３９】
本発明における水不溶性多孔質担体の材質は特に限定されないが、セルロース、酢酸セルロース、デキストリンなどの多糖類からなる有機担体、ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル、ポリビニルアルコールなどの合成高分子などが代表例として挙げられる。これらは、ヒドロキシエチルメタクリレート等のヒドロキシ基を有する高分子材料や、ポリエチレンオキサイド鎖を有する単量体と他の重合性単量体との共重合のようなグラフト共重合体等のコーティング層を有していてもよい。これらの中でセルロースや、ポリビニルアルコール等からなる合成高分子が、担体表面に活性基を導入しやすいため、実用上好ましく用いられる。【００４０】
なかでもセルロースからなる担体が最も好ましく用いられる。セルロースからなる担体は、（１）機械的強度が比較的高く、強靱であるため破壊されたり微粒子を生じたりすることが少なく、カラムに充填した場合に体液を高流速で流しても圧密化しにくいため高流速で体液を流すことが可能となる、（２）安全性が合成高分子担体に比べて高いなどの優れた点を有しており、本発明における水不溶性多孔質担体として最も好適に用いることができる。【００４１】
本発明のカラムを用いた体外循環治療の抗凝固剤としては、ヘパリン、低分子量ヘパリン、メシル酸ナファモスタット、メシル酸ガベキサート、アルガトロバン、ならびにクエン酸ナトリウム液、アシッド・シトレート・デキストロース液（ＡＣＤ液）やシトレート・フォスフェート・デキストロース液（ＣＰＤ液）などのクエン酸含有抗凝固剤などいずれを用いてもよい。なかでも全血処理の観点からクエン酸含有抗凝固剤、ヘパリン、低分子ヘパリン、メシル酸ナファモスタットはとくに好ましく用いられる抗凝固剤としてあげることができる。【００４２】
本発明の体液処理材を用いて、体液中にブラジキニンを発生させる方法には種々ある。代表的な方法としては、体液を取り出してバッグなどに貯留し、これに体液処理材を混合してブラジキニンを発生させた後、体液処理材を濾別してブラジキニンを発生させた体液を得る方法、体液の流入口および流出口を有し、体液は通過するが体液処理材は通過しないフィルターを流出口に装着した容器へ体液処理材を充填したカラムを作製し、これに体液を流す方法などがある。いずれの方法を用いても良いが、後者の方法は操作も簡単であり、また体外循環回路に組み込むことにより、患者の体液に効率よくオンラインでブラジキニンを供給することが可能であり、本発明の体液処理材を用いたブラジキニンを発生させる方法として最も好ましい。【００４３】
本発明のカラムは、体液の流入口および流出口を有し、体液は通過するが体液処理材は通過しないフィルターを流出口に装着した容器に本発明の体液処理材を充填してなる。本発明のカラムの容量は適度のブラジキニンを発生させるといった観点から１００ｍｌ以上であることが必要である。カラムの容量に制限はないが、容量があまりに大きすぎるとブラジキニンを多量に発生させてしまうこと、および体外に持ち出される血液量があまりに多すぎると血圧低下を引き起こす危険性があるため、カラム容量は１０００ｍｌ、さらに好ましくは８００ｍｌ以下であることが好ましく、血液透析など他の血液浄化療法の回路中に組み込んでも血液の体外循環量が極端に大きくならず、血液が体外に出ることに伴い発生する可能性がある血圧低下をできる限り防ぐ観点から、最も好ましくは４００ｍｌ以下である。【００４４】
つぎに、本発明のカラムを、一実施例の概略断面図である図１にもとづき説明する。【００４５】
図１中、１は体液の流入口、２は体液の流出口、３はブラジキニンを適度に発生させる体液処理材、４および５はメッシュ、６はカラム、７はブラジキニンを発生させるカラムである。しかしながら本発明におけるブラジキニンを発生させるカラムはこのような具体例に限定されるものではなく、液の入口および出口を有し、かつ体液処理材の容器外への流出を防止する手段を備えた容器内に、ブラジキニンを適度に発生させる体液処理材を充填したものであれば、形状は特に限定されない。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明の方法を実施例に基づいて具体的に説明する。【００４７】
（参考例）
両端に孔径１５μｍのフィルターを装着したガラス製円筒カラム（内径９ｍｍ、カラム長１５０ｍｍ）にアガロース材料（バイオラッド(Ｂｉｏ−ｒａｄ）社製のＢｉｏｇｅｌＡ−５ｍ、粒径５０〜１００メッシュ）、ビニル系高分子材料（東ソー（株）製のトヨパールＨＷ−６５、粒径５０〜１００μｍ）およびセルロース材料（チッソ（株）製のセルロファインＧＣ−７００ｍ、粒径４５〜１０５μｍ）をそれぞれ均一に充填し、ペリスタティックポンプにより水を流し、流量と圧力損失ΔＰとの関係を求めた。その結果を図２に示す。【００４８】
図２に示すごとく、トヨパールＨＷ−６５およびセルロファインＧＣ−７００ｍが圧力の増加にほぼ比例して流量が増加するのに対し、ＢｉｏｇｅｌＡ−５ｍは圧密化を引き起こし、圧力を増加させても流量が増加しないことがわかる。本発明においては前者のごとく、圧力損失ΔＰと流量の関係が０．３ｋｇｆ／ｃｍ2までの直線関係にあるものを硬質という。【００４９】
（実施例１）
平均粒径約４５０μｍ、球状蛋白質の排除限界分子量が５×１０7の多孔質セルロースビーズ２３５ｍｌに水８５ｍｌ、４Ｎ  ＮａＯＨ水溶液７６ｍｌおよびエピクロロヒドリン６８ｍｌを加え、４０℃で２時間攪拌して反応させた。反応後ビーズを水で十分洗浄してエポキシ化セルロースビーズを得た。エポキシ化セルロースビーズのエポキシ基量は１９．９μｍｏｌ／ｍｌ（湿潤体積）であった。【００５０】
デキストラン硫酸（硫黄含量約１８％、分子量約４０００）３５．４ｇを１００ｍｌの水に溶解したデキストラン硫酸水溶液を調製し、水に湿潤した状態のエポキシ化セルロースビーズ２２０ｍｌを加え、ＮａＯＨ水溶液でアルカリ性とした後、４５℃で３時間反応させた。反応後、ビーズを水および食塩水で十分洗浄した後、Ｌ−トリプトファン３．６８ｇを希ＮａＯＨ水１２０ｍｌに溶解させた液を加え、５５℃で６時間反応させた。その後、ビーズを水および食塩水で十分洗浄してデキストラン硫酸およびトリプトファン固定化セルロースビーズ（Ａ）を得た。【００５１】
このＡを０．２ｍｌ試験管にとり、血液１ｍｌに対し５単位のヘパリンを添加し抗凝固した健常人血液３ｍｌを加え、３７℃で１０分間振盪させた。上清のブラジキニン濃度をラジオイムノアッセイ法により測定した結果、２９１ｐｇ／ｍｌであった。【００５２】
また、両端に目開き１５０μmのポリエチレンテレフタレート製メッシュを装着した内径１０ｍｍ、長さ３４ｍｍのアクリル製カラム（容積２．７ｍｌ）にＡを充填し、血液１ｍｌに対し５単位のヘパリンを添加し抗凝固した健常人血液４０ｍｌを、流速６．５ｍｌ／ｍｉｎで２時間循環させた。２時間循環前後のプール血液の血球数は表２に示す通りであり、いずれの血球も良好な通過性を示した。【００５３】
なお、Ａのトリプトファン固定化量は、体液処理材の窒素含有量から求めた。すなわち１ｍｌのＡを水で充分洗浄した後、６０℃で６時間以上減圧乾燥した後、微量全窒素分析装置により定量した。表１に示すとおり、Ａのトリプトファン固定化量は１０．０μｍｏｌ／ｍｌであった。【００５４】
また、Ａのデキストラン硫酸固定化量は、デキストラン硫酸とトルイジンブルーが親和性を有することを利用して測定した。すなわち３ｍｌのＡに対し、約９０ｍｇ／ｌに調整したトルイジンブルー（ベーシック・ブルー１７（東京化成））水溶液を１００ｍｌ程度加え、１０分間攪拌、静置後、上清のトルイジンブルーを６３０ｎｍにおける吸光度により定量し、その減少量から求めた。表１に示すとおり、Ａのデキストラン硫酸固定化量は０．２０μｍｏｌ／ｍｌであり、ＴＲ／ＰＡ比は５０．０であった。【００５５】
（実施例２）
実施例１と同じセルロースビーズ１２７ｍｌに水６８ｍｌ、４Ｎ  ＮａＯＨ水溶液１９ｍｌおよびエピクロロヒドリン１７．２ｍｌを加え、４０℃で２時間攪拌して反応させた。反応後ビーズを水で十分洗浄してエポキシ化セルロースビーズを得た。エポキシ化セルロースビーズのエポキシ基量は８．８μｍｏｌ／ｍｌ（湿潤体積）であった。【００５６】
実施例１と同じデキストラン硫酸７．２ｇを２０ｍｌの水に溶解したデキストラン硫酸水溶液を調製し、水に湿潤した状態のエポキシ化セルロースビーズ４８ｍｌを加え、ＮａＯＨ水溶液でアルカリ性とした後、４５℃で６時間反応させた。反応後、ビーズを水および食塩水で十分洗浄した後、Ｌ−トリプトファン０．７６ｇを希ＮａＯＨ水２５ｍｌに溶解させた液を加え、５０℃で８時間反応させた。その後、ビーズを水および食塩水で十分洗浄して、デキストラン硫酸およびトリプトファン固定化セルロースビーズ（Ｂ）を得た。表１に示すとおり、このＢのトリプトファン固定化量は５．１μｍｏｌ／ｍｌ、デキストラン硫酸固定化量は０．２８μｍｏｌ／ｍｌ、ＴＲ／ＰＡ比は１８．２であった。【００５７】
このＢを実施例１と同様に０．２ｍｌ試験管にとり、血液１ｍｌに対し５単位のヘパリンを添加し抗凝固した健常人血液３ｍｌを加え、３７℃で１０分間振盪させた。上清のブラジキニン濃度をラジオイムノアッセイ法により測定した結果、２２２０ｐｇ／ｍｌであった。【００５８】
また、実施例１と同様にＢをカラムに詰め、健常人血液４０ｍｌを２時間循環させた。循環前後のプール血液の血球数は表２に示す通りであり、いずれの血球も良好な通過性を示した。【００５９】
（実施例３）
実施例１と同じセルロースビーズ１２５ｍｌに水５ｍｌ、４Ｎ  ＮａＯＨ水溶液４０ｍｌおよびエピクロロヒドリン３６．３ｍｌを加え、４０℃で２時間攪拌して反応させた。反応後ビーズを水で十分洗浄してエポキシ化セルロースビーズを得た。エポキシ化セルロースビーズのエポキシ基量は１９．９μｍｏｌ／ｍｌ（湿潤体積）であった。【００６０】
実施例１と同じデキストラン硫酸２３．８ｇを２６ｍｌの水に溶解したデキストラン硫酸水溶液を調製し、水に湿潤した状態のエポキシ化セルロースビーズ６０ｍｌを加え、ＮａＯＨ水溶液でアルカリ性とした後、４５℃で６時間反応させた。反応後、ビーズを水および食塩水で十分洗浄した後、Ｌ−トリプトファン０．７４ｇを希ＮａＯＨ水２４．５ｍｌに溶解させた液を加え、５０℃で８時間反応させた。その後、ビーズを水および食塩水で十分洗浄して、デキストラン硫酸およびトリプトファン固定化セルロースビーズ（Ｃ）を得た。表１に示すとおり、このＣのトリプトファン固定化量は８．４μｍｏｌ／ｍｌ、デキストラン硫酸固定化量は０．３４μｍｏｌ／ｍｌ、ＴＲ／ＰＡ比は２４．７であった。【００６１】
このＣを実施例１と同様に０．２ｍｌ試験管にとり、血液１ｍｌに対し５単位のヘパリンを添加し抗凝固した健常人血液３ｍｌを加え、３７℃で１０分間振盪させた。上清のブラジキニン濃度をラジオイムノアッセイ法により測定した結果、２５４０ｐｇ／ｍｌであった。【００６２】
また、実施例１と同様にＣをカラムに詰め、健常人血液４０ｍｌを２時間循環させた。循環前後のプール血液の血球数は表２に示す通りであり、いずれの血球も良好な通過性を示した。【００６３】
（比較例１）
実施例１において、Ａのかわりに生理食塩水を０．２ｍｌ試験管にとり、血液１ｍｌに対し５単位のヘパリンを添加し抗凝固した健常人血液３ｍｌを加え、３７℃で１０分間振盪させた。上清のブラジキニン濃度をラジオイムノアッセイ法により測定した結果、２２ｐｇ／ｍｌであった。【００６４】
（比較例２）
デキストラン硫酸の反応時間を６時間から０．５時間に、またデキストラン硫酸の量を１９．８ｇから７．２ｇにかえたほかは実施例２と同様にしてデキストラン硫酸およびトリプトファン固定化セルロースビーズ（Ｄ）を得た。表１に示すとおり、このＤのトリプトファン固定化量は７．３μｍｏｌ／ｍｌ、デキストラン硫酸固定化量は０．０７μｍｏｌ／ｍｌ、ＴＲ／ＰＡ比は１０４．３であった。【００６５】
このＤを実施例１と同様に０．２ｍｌ試験管にとり、血液１ｍｌに対し５単位のヘパリンを添加し抗凝固した健常人血液３ｍｌを加え、３７℃で１０分間振盪させた。上清のブラジキニン濃度をラジオイムノアッセイ法により測定した結果、２５ｐｇ／ｍｌであった。【００６６】
また、実施例１と同様にＤをカラムに詰め、健常人血液４０ｍｌを２時間循環させた。循環前後のプール血液の血球数は表２に示す通りであり、赤血球は良好な通過性を示したが、白血球および血小板は循環前後でそれぞれ６６％、６３％に減少しており、通過性がやや不良であった。【００６７】
（比較例３）
実施例１と同じセルロースビーズ５２０ｍｌに水１１４ｍｌ、４Ｎ  ＮａＯＨ水溶液１６１ｍｌおよびエピクロロヒドリン１６６．４ｍｌを加え、４０℃で２時間攪拌して反応させた。反応後ビーズを水で十分洗浄してエポキシ化セルロースビーズを得た。エポキシ化セルロースビーズのエポキシ基量は１６．４μｍｏｌ／ｍｌ（湿潤体積）であった。【００６８】
実施例１と同じデキストラン硫酸３６．８ｇを１０４ｍｌの水に溶解したデキストラン硫酸水溶液を調製し、水に湿潤した状態のエポキシ化セルロースビーズ２４５ｍｌを加え、ＮａＯＨ水溶液でアルカリ性とした後、４５℃で１．５時間反応させた。反応後、ビーズを水および食塩水で十分洗浄した後、Ｌ−トリプトファン０．８０ｇを水４４ｍｌに加温溶解させた液を加え、ＮａＯＨ水溶液でｐＨをアルカリ性にした後、５０℃で８時間反応させた。その後、ビーズを水および食塩水で十分洗浄して、デキストラン硫酸およびトリプトファン固定化セルロースビーズ（Ｅ）を得た。表１に示すとおり、このＦのトリプトファン固定化量は１０．０μｍｏｌ／ｍｌ、デキストラン硫酸固定化量は０．１４μｍｏｌ／ｍｌ、ＴＲ／ＰＡ比は７１．４であった。【００６９】
このＥを実施例１と同様に０．２ｍｌ試験管にとり、血液１ｍｌに対し５単位のヘパリンを添加し抗凝固した健常人血液３ｍｌを加え、３７℃で１０分間振盪させた。上清のブラジキニン濃度をラジオイムノアッセイ法により測定した結果、３２ｐｇ／ｍｌであった。【００７０】
また、実施例１と同様にＥをカラムに詰め、健常人血液４０ｍｌを２時間循環させた。循環前後のプール血液の血球数は表２に示す通りであり、赤血球および血小板は良好な通過性を示した。【００７１】
【表１】
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【００７２】
【表２】
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【００７３】
表１及び表２から明らかなように、ポリアニオン性化合物の固定化量が１ｍｌ当たり０．１０μｍｏｌ以上１．５μｍｏｌ以下であり、かつトリプトファン固定化量とポリアニオン性化合物固定化量とのモル比が１以上７０以下である実施例１から３においては、ブラジキニン濃度が上昇した。しかしながら、これらの範囲を外れる比較例２、および比較例３においては、処理材を入れていない比較例１と同様ブラジキニンの発生が認められなかった。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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